Brevet FR2680797A1 — publié le 19930305

La présente invention concerne une nouvelle structure ribozymique pouvant couper en trans une molécule cible d'ADN ou d'ARN. Précisément, cette nouvelle structure ribozymique est une molécule d'ARN dérivée de 1'ARN génomique du virus humain de l'hépatite delta. L'ARN génomique du virus humain de l'hépatite delta présente des activités autocatalytiques. A partir de fragments d'ARN de taille réduite conservant une activité autocatalytique de coupure, dérivés de 1'ARN viral génomique, on a réussi selon l'invention à séparer de façon distincte une partie catalytique et une partie substrat, comme il sera explicité ci-après. Dès lors, une coupure peut être obtenue au cours d'une réaction binaire en mélangeant la structure ribozymique ayant l'activité catalytique avec un ARN ou ADN substrat hétérologue. Cette caractérisation d'un fragment à activité catalytique de coupure permet, selon l'invention, d'utiliser ces structures ribozymiques de L'ART génomique du virus de l'hépatite delta comme structure ribozymique du type "humain" pour le clivage d'ARN cibles, in vitro ou in vivo, à des fins expérimentales, thérapeutiques ou prophylactiques. Les ribozymes sont des molécules d'ARN qui sont naturellement capables d'exercer des activités catalytiques, et particulièrement des activités RNAsiques. On a cherché, à partir de tels ribozymes naturels, à déterminer des structures ribozymiques artificielles capables d'exercer des coupures enzymatiques sur des ARN cibles spécifiques. De tels ribozymes fournissent donc des outils thérapeutiques pouvant être utilisés dans le cadre d'approches de type oligonucléotides "antisens", notamment pour dégrader spécifiquement des ARN cibles de type pathogènes. Les activités ribozymiques semblent largement répandues, et l'on a décrit des ARN catalytiques chez les bactéries, les protozoaires, les plantes, et les systèmes animaux. Les premières activités ribozymiques ont été mises en évidence tout d'abord dans les systèmes d'épissage des introns de classe I, puis dans la RNase P. Plus récemment, on a découvert que les génomes de nombreux virus à ARN, de plantes ou même de mammifères portaient également des activités ribozymiques qui intervenaient au cours du cycle de multiplication virale. Enfin, certains ARN transcrits à partir de régions d'ADN satellite chez le triton présentent également une activité ribozymique naturelle, servant à couper les transcrits concatémériques. L'analyse de la structure des ribozymes génomiques de certains virus de plantes a mis en évidence des séquences réactionnelles communes ainsi que des structures secondaires consensus qui ont permis de construire des ribozymes pouvant agir sur mesure comme agents de clivage de séquences spécifiques d'ARN. L'analyse des régions impliquées dans ces coupures a fait apparaître une structure commune dite en "tête de marteau", ou en "T", nécessaire et suffisante pour effectuer la réaction nucléasique. Une seconde classe de ribozymes, dérivés également d'un virus de plante présente une structure catalytique en "épingle à cheveux", ou structure en "L". Ces différents types de ribozyme fonctionnent in vitro, mais les efficacités de coupure in vivo, dans des cellules animales ou humaines, sont encore peu efficaces. Cette inefficacité relative est vraisemblablement due, au moins en partie, au fait que toutes ces ribozymes sont dérivées de virus végétaux et non de virus animaux ou même humains. Le virus de l'hépatite delta est un virus humain à ARN, que l'on trouve systématiquement associé au virus de l'hépatite B. L'ARN génomique, et également 1'ARN anti-génomique de ce virus présentent tous deux une activité de clivage autocatalytique. La séquence du fragment d'ARN de longueur minimale présentant une activité ribozymique n'offre aucune ressemblance avec les motifs catalytiques déjà connus de type "T" ou "L". Le virus de l'hépatite delta se réplique dans les hépatocytes humains et son activité ribozymique fonctionne parfaitement dans ces cellules. Son activité ribozymique a été naturellement sélectionnée pour fonctionner dans des cellules humaines de foie et on dispose donc avec ce modèle d'un exemple parfait de ce que pourrait être un ribozyme actif chez l'homme. L'ARN génomique du virus de l'hépatite delta, long de 1700 nucléotides, comporte en effet une région capable d'exercer une coupure autocatalytique. Cette coupure autocatalytique peut être effectuée par un sous-fragment d'une longueur de 89 nucléotides dont la structure secondaire peut se schématiser sous la forme représentée à la figure 1. Cette structure longue de 89 nucléotides comporte une conformation de type "pseudo-noeud". La coupure autocatalytique s'effectue au niveau de la liaison phosphodiester indiquée par la flèche sur la figure 1. A partir de ce fragment ribozymique à activité autocatalytique on a, selon la présente invention, fourni des structures ribozymiques comportant une activité catalytique pouvant s'exercer en trans, au cours d'une réaction binaire, sur une seconde molécule d'ARN cible. Cette invention fournit de nouvelles molécules ribozymiques pouvant cliver efficacement des molécules d'ADN ou d'ARN cible, notamment de nature pathologique, à des fins thérapeutiques ou prophylactiques, dans des cellules humaines, animales ou même végétales. I1 s'agit là d'une nouvelle activité ribozymique en trans. La molécule responsable de cette coupure en trans présente une structure et une séquence ne correspondant à aucune autre structure ribozymique agissant en trans précédemment décrite. En utilisant les techniques de synthèse chimique de l'ARN, des sous-fragments d'ARN correspondant à différentes régions de la molécule, représentée figure 1, ont été préparés. Ces différents fragments ont ensuite été testés dans des expériences de reconstructions afin de différencier les fragments substrats des fragments catalytiques. La présente invention a donc pour objet une structure ribozymique dérivée de L'ART génomique du virus de l'hépatite delta consistant dans un ou plusieurs fragments dudit ARN génomique du virus de l'hépatite delta, et capable d'exercer une activité catalytique de coupure en trans sur une autre molécule comportant une séquence spécifique d'acide nucléique ADN ou ARN. Par "autre molécule", on entend selon la présente demande que la coupure s'exerce sur une molécule autre que L'ART génomique du virus de l'hépatite delta. Par "autre molécule comportant une séquence d'acides nucléiques d'ADN ou d'ARN" on entend une molécule d'ADN, d'ARN ou une molécule mixte d'ADN/ARN ou encore un polymère comportant une fraction polynucléotidique ou polyribonucléotidique. Dans un mode de réalisation particulièrement approprié la structure ribozymique est constituée de fragment(s) issu(s) de la séquence de 74 nucléotides comportant les nucléotides de 16 à 89 représentés sur la figure 2. En particulier, la structure ribozymique selon l'invention peut consister dans le fragment de 74 nucléotides comportant les nucléotides de 16 à 89 ou de séquence consistant dans les deux fragments comportant respectivement les nucléotides 16 à 62 et 63 à 82 représentés sur la figure 2, tout ou partie des nucléotides du ou des fragments allant des nucléotides 50 à 77 pouvant être délétés. De préférence, la structure ribozymique selon l'invention comportera une séquence d'au moins 12 nucléotides. Selon l'invention, ladite séquence d'acide nucléique de ladite autre molécule correspond à un fragment de L'ART génomique du virus de i'hépatite delta substrat de ladite activité catalytique de coupure en trans. En particulier, ladite séquence d'acide nucléique de ladite autre molécule substrat de l'activité catalytique comportera la séquence 5'XGGCC3' avec X = T ou U, séquence d'ADN ou d'ARN respectivement, ladite structure ribozymique étant capable d'exercer l'activité nucléasique ou ribonucléasique sur la liaison phosphodiester entre X et G. De préférence, ladite séquence d'acides nucléiques de ladite autre molécule comporte le fragment de 13 nucléotides allant des nucléotides 1 à 13 représentés sur la figure 2. De façon appropriée, l'activité catalytique de coupure a lieu en présence d'ions métalliques divalents, notamment le magnésium. Dans un mode de réalisation de l'invention, la structure ribozymique selon l'invention est insérée dans ladite autre molécule et est capable d'exercer une activité autocatalytique de clivage sur cette autre molécule dans laquelle elle est insérée. Le plus généralement, la structure ribozymique selon l'invention exercera une activité ribonucléasique, notamment endoribonucléasique sur une autre molécule comportant un polyribonucléotîde de séquence spécifique. La structure ribozymique selon l'invention peut être utilisée à des fins thérapeutiques ou prophylactiques dans des cellules procaryotes ou eucaryotes, animales ou végétales, ladite autre molécule pouvant donc être une molécule hétérologue de cellules animales ou végétales. On pourra utiliser la particule virale de l'hépatite delta comme système d'encapsidation ou tout autre vecteur pour la délivrance intra-cellulaire de structures ribozymiques selon l'invention, que ce soit dans des bactéries, des cellules eucaryotes, animales ou vététales. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre. Cette description est faite en référence aux figures I à 4. - La figure 1 représente la structure secondaire potentielle en "pseudo-noeud" d'un fragment autocatalytique de L'ART génomique du virus de l'hépatite delta. - La figure 2 représente la structure potentielle du complexe binaire de coupure en trans par un ribozyme dérivé du brin génomique du virus de l'hépatite delta. - La figure 3 représente l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide 20 % sur lequel on a fait migrer les produits des incubations d'une structure ribozymique selon l'invention avec son substrat, après des temps variables. - La figure 4 représente une analyse sur gel de polyacrylamide 10 %/7 M urée des produits d'une cinétique de coupure autocatalytique d'une structure ribozymique de 71 nucléotides de long comportant une délétion dans la structure auto-appariée 50-77. Exemple 1 Parmi les combinaisons testées on a découvert, comme on l'a vu, qu'il était possible d'effectuer une coupure en trans en utilisant comme substrat un fragment composé, par exemple, de 13 nucléotides (1 à 13) de la figure 2 et en utilisant comme structure ribozymique une molécule composée soit de deux fragments, comportant respectivement les nucléotides de 16 à 62 et 63 à 89, soit d'un seul fragment de 74 nucléotides de long comportant les nucléotides de 16 à 89. Ce ribozyme de 74 nucléotides a été obtenu par transcription in vitro par la RNA polymérase T7 d'une matrice d'ADN bicaténaire. Cette matrice a été obtenue en synthétisant chimiquement les séquences d'ADN, en les hybridant, puis en amplifiant le produit obtenu par une réaction de PCR. Cette réaction de PCR permet, en utilisant les amorces appropriées, d'ajouter les séquences de promotions de la transcription permettant le fonctionnement de la polymérase T7. La figure 2 illustre la structure ribozymique de 74 nucléotides et de son substrat de 13 nucléotides. Ce ribozyme long de 74 nucléotides est capable d'effectuer une coupure rapide du substrat. Si l'on incube le ribozyme en présence du substrat pendant des temps variables de 0 à 60 minutes, dans un tampon contenant 10 mM MgC12, 50 mM Tris pH 8,0 2 mM spermidine, on observe (figure 3) qu'une coupure a lieu. La figure 3 représente l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide 20 % sur lequel on a fait migrer les produits des incubations du ribozyme avec son substrat après des temps variables. Le substrat a été marqué en 5' par du gamma-ATP 32P par la T4 polynucléotide kinase et purifé sur gel de polyacrylamide avant utilisation.On observe qu'une partie importante de ce substrat est clivée dès les premières minutes de l'incubation, clivage matérialisé par une bande marquée longue de 5 nucléotides qui apparaît rapidement dans les conditions de fonctionnement ribozymique, c'est-à-dire en présence de magnésium. Les témoins effectués en présence d'EDTA sont négatifs, ce qui montre que l'on observe bien une réaction enzymatique dépendant de la présence de magnésium (ou d'autres ions divalents) ce qui est une caractéristique des ribozymes. Exemple 2 Les résultats expérimentaux ci-après montrent que la présence de la structure secondaire appariée située entre les nucléotides 50 et 77 n'est pas indispensable à l'activité catalytique de ce ribozyme. En partant de la structure d'un ribozyme de 89 nucléotides de long comme celui décrit dans la figure 1, on procède à des expériences de délétion de certaines régions, et en particulier des délétions de la structure en épingle à cheveux ("hairpin") comprise entre les nucléotides 50 et 77. En effet, cette "hairpin" est une structure secondaire extrêmement stable, que l'on retrouve dans toutes les configurations potentielles calculées par des programmes de minimalisation d'énergie appliqués à l'analyse de la structure de ce ribozyme et est probablement effectivement présente dans la structure active. Afin de déterminer si cette structure secondaire appariée jouait un rôle catalytique ou bien structural, on a délété les nucléotides 53 à 61 et 66 à 74. Ces délétions ont été effectuées en synthétisant un fragment d'ADN comportant la séquence désirée, puis en amplifiant ce fragment par PCR comme décrit précédemment pour le ribozyme de 74 nucléotides. Après amplification avec les amorces appropriées et transcription par l'ARN polymérase de T7, on obtient une structure ribozymique longue de 71 nucléotides conservant son activité autocatalytique et fonctionnant à 37"C et à 600C (figure 4). Le ribozyme a été marqué en 5' par du gamma-ATP 32P par la T4 polynucléotide kinase et purifié sur gel de polyacrylamide avant utilisation. On le dénature à 95"C pendant 1 minute en présence de 1 mM EDTA, puis il est refroidi rapidement à 00C sur glace (snap-cool). Le milieu de réaction est ensuite ajusté en ajoutant 40 mM Tris pH 8,0 et 10 mM MgC12, puis incubé à 37"C (2 à 7) ou à 60"C (8 à 13). Des fractions aliquotes sont prélevées à des temps variables : 1 minute (2 & 8), 2 minutes (3 & 9), 5 minutes (4 à 10), 10 minutes (5 & 11), 20 minutes (6 & 12), et 60 minutes (7 & 13). Dans le contrôle (1), la réaction a été arrêtée au temps t 0 minute avant addition de 10 mM MgCl2. Le ribozyme natif (89 nucléotides de long) coupe son ARN avec un t 1/2 de 15 secondes, alors que le ribozyme délété présente un t 1/2 de 3 minutes. Donc, la délétion modifie la structure générale du ribozyme, ce qui modifie la cinétique de la réaction, mais elle n'affecte pas directement le site catalytique. I1 est donc possible de réduire la taille de la structure ribozymique fonctionnelle de la figure 2 en réduisant totalement ou partiellement la longueur de cette boucle 50-77. REVENDICATIONS 1) Structure ribozymique dérivée de L'ART génomique du virus de l'hépatite delta consistant dans un ou plusieurs fragments dudit ARN génomique du virus de l'hépatite delta, et capable d'exercer une activité catalytique de coupure en trans sur une autre molécule comportant une séquence spécifique d'acide nucléique ADN ou ARN. 2) Structure ribozymique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fragment(s) issu(s) de la séquence de 74 nucléotides comportant les nucléotides de 16 à 89 représentés sur la figure 2. 3) Structure ribozymique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle consiste dans le fragment de 74 nucléotides comportant les nucléotides de 16 à 89 ou de séquence consistant dans les deux fragments comportant respectivement les nucléotides 16 à 62 et 63 à 82 représentés sur la figure 2, tout ou partie des nucléotides du ou des fragments allant des nucléotides 50 à 77 pouvant être délétés. 4) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence d'au moins 12 nucléotides. 5) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite séquence d'acides nucléiques de ladite autre molécule correspond à un fragment de L'ART génomique du virus de l'hépatite delta substrat de ladite activité catalytique de coupure en trans. 6) Structure ribozymique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est capable d'exercer une activité catalytique de coupure sur la liaison phosphodiester entre X et G avec X = T ou U d'une séquence d'acide nucléique ADN ou ARN respectivement comportant la séquence 5'XGGCC3'. 7) Structure ribozymique selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que ladite séquence d'acides nucléiques de ladite autre molécule comporte le fragment de 13 nucléotides allant des nucléotides 1 à 13 représentés sur la figure 2. 8) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est insérée dans ladite autre molécule et est capable d'exercer une activité autocatalytique de clivage sur cette autre molécule dans laquelle elle est insérée. 9) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est capable d'exercer une activité ribonucléasique, notamment endoribonucléasique, sur une autre molécule comportant un polyribonucléotide. 10) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 9 utile pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement thérapeutique ou prophylactique dans des cellules procaryotes ou eucaryotes, animales ou végétales.