Brevet FR2682113A1 — publié le 19930409

Peptides issus de la protéine A de la ribonucléoprotéine snRNP-U1 et leur utilisation pour le diagnostic de la connectivite mixte. L'invention concerne des peptides ayant la propriété d'être reconnus spécifiquement par les anticorps présents chez des patients atteints de connectivite mixte. L'invention concerne également les applications de ces peptides et des compositions les contenant pour le diagnostic in vitro chez l'homme de la connectivite mixte, ainsi que leur utilisation pour la constitution de trousses de diagnostic de cette maladie. L'invention concerne en outre les anticorps formés contre ces peptides et l'application de ces anticorps et des compositions les contenant pour le diagnostic in vitro chez l'homme de la connectivite mixte, ainsi qu'à la production de médicaments contre cette maladie. L'invention a enfin pour objet les applications de ces peptides à la production de compositions immunogènes et de compositions vaccinantes contre cette maladie. Les patients atteints de connectivite mixte produisent des anticorps réagissant avec une variété de composants cellulaires tels que l'ADN, l'ARN, des protéines et des complexes ARN-protéines (Smeenk et al., 1985; Morrow et Isenberg, 1987; Tan, 1989). Certains de ces anticorps constituent des marqueurs spécifiques d'un syndrome clinique; par exemple, les anticorps anti-ADN et les anticorps dirigés contre l'antigène Sm sont des marqueurs du lupus érythémateux disséminé, les anticorps anti-centromère sont des marqueurs du syndrome de CREST et les anticorps anti-topoisomérase I constituent des marqueurs de la sclérodermie. Parmi les nombreux types d'autoanticorps identifiés dans les maladies précédentes, ceux réagissant avec l'antigène Sm sont présents chez 20 à 30 des sujets atteints de lupus érythémateux disséminé et très rarement chez les sujets atteints d'autres maladies autoimmunes systémiques des tissus connectifs. L'antigène Sm est associé à une classe particulière de ribonucléoprotéines dénommées snRNP; ces ribonucléoprotéines contiennent cinq espèces d'ARN riches en uridine, dénommés U1, U2, U4, U5 et U6 (Lerner et Steitz, 1979; Brunel et al., 1985). Il a été identifié dans chaque ribonucléoprotéine snRNP sept protéines, dénommés en fonction de leur mobilité électrophorétique sur gels de polyacrylamide, bande B4 (29 kd), bande B (28 Kd), bande D (16 Kd), bande D'(15,5 Kd), bande E (12 Kd), bande F (11 Kd) et bande G (9 Kd). Outre ces protéines qui constituent le noyau commun, les ribonucléoprotéines snRNP comprennent d'autres protéines; la ribonucléoprotéine snRNP-U1 comprend trois protéines de 70 Kd, 34 Kd et 22 Kd, la protéine de 34 Kd est identifié dans la littérature par la lettre A et dénommée protéine ou polypeptide A ou U1A. La demande de brevet européen 0 313 156 au nom de la Société AKZO N.V. décrit la séquence en acides aminés de la protéine A représentée à la figure 1. Parmi les anticorps réagissant avec les ribonucléoprotéines snRNP et susceptibles d'être détectés en mmunoblot, on peut distinguer les anticorps anti-snRNP-U1 réagissant avec au moins une des trois protéines de snRNP-Uî, les anticorps anti-Sm réagissant avec les protéines B',B et D qui sont communes aux snRNPs U1, U2, U4, U5 et U6, et les anticorps anti (snRNP U1, U2) réagissant avec les protéines A'ou B" de la ribonucléoprotéine snRNP-U2. Le clonage des antigènes snRNP a permis de mettre en évidence des homologies de séquences entre ces protéines. La protéine B" de snRNP-U2 présente des similarités avec la protéine A de snRNP-U1, ces protéines seront dénommées dans ce qui suit U2B" et UlA; notamment la partie aminoterminale de U1A comprise entre les résidus d'amino-acide 7 et 101 présente environ 77 % d'homologie avec le segment de de la protéine U2B" compris entre les résidus d'amino-acide 4 et 98, et la partie carboxy-terminale de U1A comprise entre les résidus d'acides aminés 206 et 283 présente environ 86 % de similarité avec le segment 147-225 de U2B". L'existence de séquences communes entre les deux protéines explique les réactions croisées observées entre les anticorps anti-U2B" et anti-UlA. Les travaux de recherche ayant conduit aux peptides de l'invention ont précisément visé à déterminer dans la séquence en acides aminés de la protéine UlA des segments ne présentant peu ou pas d'homologie avec les séquences des autres antigènes associés aux maladies autoimmunes. Les développements des travaux des inventeurs ont permis d'isoler de la séquence de U1A treize segments, dont trois non décrits à ce jour sont reconnus par les sérums de patients atteints de maladies autoimmunes; parmi ceux-ci les inventeurs ont mis en évidence une séquence d'amino-acides spécifiquement reconnue par les autoanticorps présents chez les patients atteints de connectivite mixte. La présente invention a en conséquence pour objet un peptide comprenant au moins une partie de la séquence en acides aminés de la protéine A de snRNP-Ul, caractérisé en ce qu'il est constitué par ou comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante SQFGQILDILVSRSLKMRGQAFVI (I) La signification des symboles représentant les acides aminés est rappelée en annexe. Dans la formule (I), l'aminoacide serine Nterminal et l'amino-acide isoleucine C-terminal correspondent respectivement aux résidus 35 et 58 de la séquence de U1A représentée à la figure 1. Un peptide préféré comprenant une partie de la séquence de formule (I) est constitué par ou comprend la séquence de formule suivante G Q I L D I LV S R S L K (II) Des peptides préférés comprenant toute la séquence de formule (I) sont constitués par ou comprennent la séquence de formule (I) prolongée à son extrémité N-terminale par un groupe peptidique de 1 à 10 acides aminés correspondant aux résidus 25 à 34 de U1A représenté à la figure 1, et/ou prolongée à son extrémité C-terminale par un groupe peptidique de 1 à 10 acides aminés correspondant aux résidus 59 à 68 de U1A représenté à la figure 1. L'invention a également pour objet les peptides constitués par ou comprenant un fragment et/ou un dérivé et/ou une variante des séquences de formules (I) et (II), dès lors qu'ils sont reconnus spécifiquement par les autoanticorps présents chez les patients atteints de connectivite mixte. On entend par variantes, les séquences précédentes modifiées par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs amino-acides, pour autant que les propriétés antigéniques desdites séquences ne s'en trouvent pas modifiées; on entend aussi par variantes les séquences dans lesquelles la liaison peptidique (-CO-NH-) est remplacé par les structures CO-N(CH3)-, -CH2-CH2-, -CO-CH2-, ou encore les séquences dans lesquelles le squelette peptidique présente un ou plusieurs groupes intercalés tels que les groupes -CH2-, -NH-, -O-. L'invention envisage également les peptides dans lesquels les acides aminés présentant un carbone asymétrique sont sous forme D ou L. L'invention concerne également les conjugués obtenus par couplage des peptides de l'invention avec des molécules porteuses éventuellement physiologiquement acceptables et non toxiques; à titre de molécules porteuses, on peut citer des protéines naturelles comme l'anatoxine tétanique, l'albumine ou des sérums albumines ou encore des transporteurs tels que des liposomes (Frisch et al. Eur. J. Immunol., 1991, 21:185 193) L'invention concerne encore les anticorps formés contre les peptides de l'invention.Anticorps qui peuvent être polyclonaux ou monoclonaux et produits alors par tout hybridome préparé selon les méthodes classiques de fusion cellulaire entre des cellules spléniques activées in vitro par l'antigène ou provenant soit d'un animal immunisé contre l'un des peptides de l'invention soit d'un animal non immunisé autoimmun, et des cellules d'une lignée myélomateuse. En raison de la spécificité des peptides de l'invention vis à vis des autoanticorps présents chez les patients atteints de connectivite mixte, les anticorps préparés à partir des peptides constituent des sondes immunologiques également très spécifiques de la connectivite mixte. Par ailleurs les anticorps formés contre les peptides de l'invention et les autoanticorps des patients réagissant avec lesdits peptides et obtenus après chromatographies d'affinité peuvent être utilisés pour préparer des anticorps anti-idiotypes, lesquels anticorps anti-idiotypes constituent en partie une copie exacte du peptide antigénique initial et donc capables de se lier aux autoanticorps observés chez les patients atteints de connectivite mixte. La présente invention concerne donc ces anticorps anti-idiotypes et les compositions les contenant ainsi que leur application pour le diagnostic in vitro chez l'homme de la présence d'autoanticorps observés dans le cas de connectivite mixte. Les peptides de l'invention présentent des propriétés antigéniques et peuvent donc être utilisés dans des procédés de diagnostic pour la détermination et le suivi de patients atteints de maladies autoimmunes et plus particulièrement pour le diagnostic de la connectivite mixte. L'invention a donc aussi pour objet les compositions contenant au moins un desdits peptides ou encore ces peptides conjugués à une molécule porteuse, et susceptibles d'être reconnues par les autoanticorps présents dans le sérum ou tout autre fluide biologique de patients atteints de connectivite mixte. La détection du complexe peptide-anticorps in vitro est réalisée par des tests immunoenzymatiques du type ELISA, immunofluorescence, radioimmunologique ou de radioimmunoprécipitation, ou encore d'immunot raz s d'immunotransfert (immunoblot ou dot blot). L'invention concerne en conséquence aussi un procédé de diagnostic in vitro de la maladie du tissu connectif, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - la mise en contact d'un fluide biologique susceptible de contenir des autoanticorps avec au moins un peptide selon l'invention ou ce peptide conjugué à une molécule porteuse, dans des conditions permettant la formation d'un complexe immmunologique peptideautoanticorps, - la détection du complexe immunologique formé par des méthodes physiques ou chimiques. Pour la mise en oeuvre de ces tests, l'invention concerne les peptides froids non marqués ou marqués à l'aide d'un marqueur adéquat qui peut être la biotine ou ses dérivés, une enzyme comme la peroxydase, un marqueur fluorescent comme la fluorescéine, un marquer radioactif, etc... De tels tests comprennent par exemple les étapes suivantes - dépôt d'une quantité déterminée d'une composition contenant au moins un peptide de l'invention ou un conjugué du peptide ou encore un anticorps antiidiotype selon l'invention, dans les puits d'une plaque de microtitration ou sur un autre support tel que des billes ou une membrane de nitrocellulose, - dépôt dans les puits du liquide biologique à tester ou incubation de celui-ci avec les billes ou la membrane, en présence d'agents saturant ou après saturation préalable des supports activés, - après incubation et rinçage des microplaques ou des billes, dépôt dans les puits ou incubation avec les bilLes d'un système de révélation du complexe peptide-autoanticorps éventuellement formé. De manière avantageuse, ce test est mis en oeuvre avec un mélange de peptides, d'une part au moins un peptide de l'invention réagissant de manière spécifique avec les anticorps présents dans le sérum de patients atteints de connectivite mixte et d'autre part au moins un peptide réagissant avec les anticorps présents dans le sérums de patients atteints d'une autre maladie autoimmune. Les trousses pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de l'invention comprennent - au moins un peptide selon l'invention, ou ce peptide conjugué à une molécule porteuse, - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'une réaction immunologique entre le ou les peptides et les autoanticorps éventuellement présents dans un échantillon biologique, - un ou plusieurs réactifs éventuellement marqués aptes à réagir avec le ou lesdits peptides pour la détection des complexes peptide-autoanticorps formés, - le cas échéant, au moins un milieu biologique de référence, tel qu'un sérum dépourvu d'autoanticorps. L'invention concerne enfin des compositions immunogènes pour la production de vaccins dont le principe actif est constitué par au moins un peptide ou un anticorps anti-idiotype selon l'invention, éventuellement conjugué à une molécule porteuse, induisant la production d'anticorps contre lesdits peptides et qui sont capables d'interférer avec la pathologies et/ou les manifestations cliniques de la maladie du tissu connectif. Ces compositions pharmaceutiques selon l'invention, utilisables comme vaccins, sont constituées par des solutions ou suspensions injectables ou administrables par d'autres voies, pouvant être données à des doses situés entre 10 Fg/kg et 100 mg/kg de peptide. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui sont illustrés par les figures en annexes, étant entendu que ces exemples ne sauraient être interprétés comme tendant à réduire la portée des revendications. EXEMPLE 1 : PREPARATION DES PEPTIDES Quatorze peptides correspondant aux segments 1-11, 7-37, 35-58, 38-50, 56-77, 74-96, 103-135, 131153, 149-166, 163-184, 180-205, 203-225, 224-251 et 257282 de la protéine A de snRNP-U1 dont la séquence est représentée à la figure 1, ont été préparés selon les techniques classiques de synthèses peptidique en phase solide (Briand et al., 1990), soit par condensation successive des résidus d'acides aminés dans l'ordre requis, soit par condensation des résidus d'acides aminés sur un fragment préalablement formé et contenant déjà plusieurs aminoacides dans l'ordre approprié ou encore par condensation de plusieurs fragments préalablement préparés, en prenant soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par les résidus d'acides aminés ou les fragments, exceptées les fonctions engagées dans la liaison peptidique formée lors de la condensation. Selon un exemple de préparation, la fonction amine de l'acide aminé ajouté est protégé par un groupe terbutyloxycarbonyle (Boc), les chaînes latérales des amino-acides trifonctionnels sont protégées par exemple par les groupes suivants : le cyclohexyle pour l'acide glutamique et l'acide aspartique, le benzyle pour la thréonine et la sérine, le 2-chlorobenzyloxycarbonyle pour la lysine, le 2,6-dichlorobenzyle pour la tyrosine, le p-toluènesulfonyle pour l'arginine et l'histidine; la méthionine est introduite sous forme de terbutyloxycarbonyle (O) sulfoxyde méthionine qui est réduite en methionine lors du clivage final du peptide de la résine par action de l'acide fluorhydrique anhydre. Les Bocs amino-acides sont couplés sous forme d'ester de benzotriazole sauf Boc histidine qui est introduit sous forme d'anhydre symétrique. Le temps de couplage total est d'environ 45 minutes; un test à la ninhydrine est utilisé pour vérifier la bonne réalisation du couplage lequel, si nécessaire, peut être doublé. A la fin de la synthèse et après la dernière étape de déprotection, la résine est lavée et séchée. Selon la présence ou l'absence de (O)méthionine dans la séquence un traitement fort ou faible à l'acide fluorhydrique est utilisé pour la déprotection et le clivage du peptide de la résine. Après lyophilisation le produit brut est dissout dans l'acide acétique 10 % et purifié par chromatographie moyenne pression (Barakat et al., 1990). La pureté finale de chaque peptide est contrôlée et leur caractérisation est réalisée par chromatographie en phase liquide à haute pression ainsi que par l'analyse de leur composition en amino-acides par spectrométrie de masse. Afin d'être utilisés en ELISA, les peptides 1-11 et 38-50 sont conjugués à la sérum albumine bovine (BSA) par l'intermédiaire de la fonction SH d'une cystéine introduite dans les peptides durant la synthèse, en utilisant comme agent de couplage l'ester de m-Maleimido benzoyl-N-hydroxysuccinimide (Muller, 1988). Les peptides 35-58, 56-77, 131-153, 149-166, 163184, 180-205, 203-225 et 224-251 sont conjugués à la sérum albumine bovine (BSA) en utilisant 1 % ou 0,5 % de glutaraldehyde selon la composition de la séquence en lysine (Muller 1988). Les peptides 7-37, 74-96, 103-135 et 257-282 n'ont été conjugués à aucune protéine porteuse. Les peptides synthétisés comportent entre 11 et 33 résidus d'amino-acides et représentent 96 % des 282 résidus d'amino-acides que comportent la protéine A de la ribonucléoprotéine snRNP-U1, ci-après dénommée U1A. Les peptides 149-166, 163-184 et 180-205 correspondent au domaine de la protéine A de snRNP-U1 ne présentant pas d'homologie avec la protéine B" de snRNP U2. Les peptides 7-37, 35-58, 56-77, 74-96, 203-225, 224-251 et 257-282 présentent une forte homologie avec la portion correspondante de la protéine B" de snRNP-U2. Le peptide 38-50 bien que correspondant au domaine de forte homologie entre U1A et U2B", ne comporte que quatre résidus d'amino-acides commun aux positions 38, 42, 43 et 50. EXEMPLE II : ETUDE SEROLOGIOUE 1) Préparation d'antisérums chez le lapin Des antisérums dirigés contre les peptides 1-11, 7-37, 35-58, 56-77, 74-96, 103-135, 131-153, 149166, 163-184, 180-205, 203-225, 224-251 et 257-282 non conjugués ont été obtenus chez le lapin. La réactivité des antisérums avec leur peptide correspondant a été mesuré en ELISA en utilisant des microplaques activées par les différents peptides. Une réponse forte a été obtenue avec chacun des treize peptides précédents, permettant d'établir que les treize peptides étaient liés de manière satisfaisante à la surface des plaques et pouvaient donc être utilisés en tant qu'antigène dans un test ELISA avec les sérums de patients étudiés. 2) Matériels et méthodes La procédure ELISA mise en oeuvre pour mesurer la réaction immunologique entre les peptides précédents et les anticorps présents dans les sérums humains testés a été la suivante - 0,25 à 2 pLM de chaque peptide dilués dans une solution 0,05 M de tampon carbonate sont déposés dans les puits de plaques de microtitration, à une température de 370 Celsius; les plaques sont ensuite mises à incuber 1 heure à 37 C avec une solution à 10 mg/ml de sérum albumine bovine (BSA) en tampon PBS à pH 7,4 et contenant 0,05 % de TWEEN 20(PBS-T-BSA). - Après trois lavages des plaques de microtitration avec le tampon PBS-T, le sérum des patients dilué au 1/1000 dans le tampon PBS-T-BSA est ajouté et laissé incubé 1 heure à 37 OC. - Après plusieurs lavages par le PBS-T, la réaction est détectée par incubation de 30 minutes à 37 OC avec un conjugué anti-IgG humaine de chèvreperoxydase. La réaction est alors visualisée par addition d'un substrat de la peroxydase tel que le 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine en présence de H2O2 pendant 15 minutes à 37 OC. La réaction est stoppée par addition d'HCl (concentration finale 0,25 M) et la densité optique (DO) est lue à 450 nm. Afin de déterminer le seuil de positivité du test, 60 sérums d'individus sains, dilué au 1/1000 ont été testés selon le protocole précédent avec 0,25 ZM du peptide 257-282 et 2 FM des treize autres peptides. L'absorption moyenne est de 0,16 avec une déviation standard de 0,070 pour le peptide 257-282 et inférieure ou égale à 0,12 avec une déviation standard de 0,075 pour les autres peptides. Un sérum a donc été considéré positif lorsque la valeur de sa DO est supérieure à la valeur moyenne de DO trouvé pour le peptide 257-282 additionné de deux fois la déviation standard, soit 0,3 unité de DO. En utilisant cette valeur de seuil, respectivement 5, 1,7 et 5 % des sérums d'individus normaux ont été trouvés positifs avec les peptides 1-11 (DO comprise entre 0,03 et 0,46), 38-50 (DO comprises entre 0,03 et 0,39) et 257-282 (DO comprises entre 0,07 et 0,40); alors qu'aucune réaction positive n'était observée avec les autres peptides. 2) Etude des sérums de patients atteints de maladies autoimmunes Les sérums suivants ont été testés afin de détecter la présence d'anticorps capables de réagir en ELISA avec les peptides synthétisés - 18 sérums de patients atteints de connectivite mixte (MCTD), - 145 sérums de patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED), - 120 sérums de patients atteints d'autres maladies rhumatoïdes : 40 serums de patients atteints du syndrome primaire de Sjôgren (SS), 41 sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR) et 39 sérums de patients atteints d'arthrite chronique juvénile (JCA), - 60 sérums de sujets normaux ont été utilisés comme témoins (NHS). Le tableau I ci-dessous rapporte les résultats observé avec les peptides 1-11, 35-58 et 257282 en utilisant les valeurs seuils de 0,3 et 0,4. Le protocole mis en oeuvre correspond à celui décrit précédemment. Les sérums de patients dilués au 1/1000 sont mis en contact avec 0,25 FM du peptide 1-11 et 2 iM des peptides 35-58 et 257-282 absorbés sur la plaque de microtitration, puis mesure de la DO après incubation de 15 minutes du conjugué anti-IgG humaine peroxydase avec le substrat. Les résultats sont exprimés en pourcentage de sérums positifs par rapport au nombre total de sérums testés. Un sérum est considéré comme positif lorsque la valeur de DO est supérieure ou égale à 0,3 (ce qui correspond à la valeur moyenne de la DO pour les 60 sérums de sujets normaux ajoutée de 4 fois la déviation standard). TABLEAU I Peptides Peptides Nombre de (Seuil 0,30) (Seuile 0,40) Serums patients 1-11 35-58 257-282 1-11 35-58 257-282 MTCD 18 50,0 94,4 94,4 44,4 77,8 94,4 LED 145 33,8 19,3 64,8 17,2 13,8 53,8 SS 40 10,0 0 25,0 10,0 0 17,5 PR 41 4,9 0 14,6 2,4 0 0 JCA 39 2,6 0 10,2 2,6 0 2,6 NHS 60 5 0 5,0 1,7 0 1,7 En utilisant une valeur seuil de 0,30, 39 des 145 sérums de patients de LED (soit 33,8 %) réagissent avec le peptide 1-11, 28 (soit 19,3 %) réagissent avec le peptide 35-58 et 94 (soit 64,8 %) réagissent avec le peptide 257-282. Les valeurs de DO mesurées pour chacun des peptides sont les suivantes - peptide 1-11 : DO comprise entre 0,06 et 1, 11; valeur moyenne de la DO 0,27 avec une déviation standard de 0,19. - peptide 35-58 : DO comprise entre 0,01 et 1,45; valeur moyenne de la DO 0,21 avec une déviation standard de 0,19. - peptide 257-282 : DO comprise entre 0,02 et supérieure ou égale à 2; valeur moyenne de la DO 0,74 avec une déviation standard de 0,69. Ces résultats sont également rapportés à la figure 2 en annexe. Le tableau II ci-dessous montre que parmi les 145 sérums de patients atteints de LED tout ceux comportant des anticorps réagissant avec le peptide 1-11 et/ou le peptide 35-58 réagissent également avec le peptide 257-282. TABLEAU II Réactivité avec Réactivité avec le peptide les peptides Nombre de 257-282 1-11 et/ou 35-58 sérums + + 47 32,4 + ~ 47 32,4 + 5 3,4 46 31,7 Aucun des dix autre peptides 7-37, 56-77, 74-96, 103-135, 131-153, 149-166, 163-184, 180-205, 203225 et 224-251 n'a été reconnu par l'un des sérums. Les treize peptides ont également été testés avec des sérums de patients atteints d'autres maladies rhumatoïdes. On remarque dans le tableau I que seulement quelques uns d'entre eux issus de la région 1-250 réagissent avec moins de 5 % de ces sérums, sauf en ce qui concerne les sérums de patients atteints de SS qui réagissent avec le peptide 1-11 (DO comprises entre 0,10 et 1,21; DO moyenne de 0,21 avec une déviation standard de 0,22).Par ailleurs, on constate que les anticorps liant le peptide 257-282 sont présents dans 25 % des sérums de patients atteints de SS (DO comprises entre 0,07 et 1,89; DO moyenne de 0,29 avec une déviation standard de 0,31), 15 % des sérums de patients atteints de PR (DO comprise entre 0,08 et 0,38; DO moyenne de 0,18 avec une déviation standard de 0,09)et 10 % des sérums de patients atteints de JCA (DO comprises entre 0,05 et 0,41; DO moyenne de 0,33 avec une déviation standard de 0,04). Ces résultats montrent une fréquence importante des anticorps réagissant avec le peptide 257-282 à la fois dans le cas de patients atteints de MCTD (94%) et de LED (65%), et une fréquence plus faible mais tout de même significative de ces anticorps dans le cas de patients atteints des autres maladies autoimmunes étudiées. Au contraire, le peptide 35-58 correspondant au peptide de l'invention de formule I, permet une bonne discrimination entre les sérums de patients atteints de MCTD (94%) et ceux de patients atteints de LED (19%). 3) Réactivité en ELISA de sérums de patients atteints de maladies autoimmunes avec le peptide 38-50 Le peptide 35-58 de la protéine A de snRNP U1 comporte environ 15 résidus d'acides aminés communs avec la séquence 32-55 de la protéine B" de snRNP-U2. En conséquence, une partie des sérums de patioents atteints de LED réagissant avec le peptide 35-58 pourrait correspondre à des sérums contenant des anticorps réagissant avec la protéine snRNP-U2. Afin de disposer d'un marqueur plus spécifique de la maladie du tissu connectif, les inventeurs ont préparé le peptide 38-50, correspondant aux peptides de 1 invention de formule II. Ce peptide ne présente que quatre résidus d'acide aminé communs avec la séquence 35-47 de U2B", il s'agit du résidu glycine en position 38, du résidu acide aspartique en position 42, du résidu isoleucine en position 43 et du résidu lysine en position 50; en outre, il ne contient pas le site RNP1 correspondant au domaine de fixation de l'ARN, et répondant à la formule : RGQAFVIF; lequel site est localisé dans U1A en position 52-59, dans U2B" en position 49-56 et dans la protéine de 70 Kd de snRNP-U1 en position 320-327 dans la séquence déterminée par Spritz et au.(1987). Le peptide 38-50 a été testé en ELISA avec 12 sérums de patients atteints de MCTD, 145 sérums de patients atteints de LED et 60 sérums de sujets normaux en tant que contrôle. Une expérience préliminaire utilisant un antisérum anti-peptide 38-50 préparé chez le lapin a mis en évidence que le peptide 38-50 n'était pas adsorbé sur la phase solide. Les plaques ont donc été activées avec un conjugué du peptide et de sérum albumine bovine, conjugué avec lequel l'antisérum a réagit. Le peptide 38-50 conjugué a été reconnu par 29 % des sérums de patients atteints de MCTD (DO comprises entre 0,07 et 0,82; valeure moyenne de la DO 0,29 avec une déviation standard de 0,19),par seulement 4% des sérums de patients atteints de LED (DO comprises entre 0,07 et 0,63; valeure moyenne de la DO 0,17 avec une déviation standard de 0,09) et par moins de 4% des sérums de patients atteints d'autres maladies rhumatoïdes ou de sujets normaux (1,7%) Le sérum standard de référence AF/CDC 4 fournit par le CDC comme sérum anti-UlRNP, calibré pour être utilisé en fluorescence, a réagit en ELISA avec le peptide 38-50 (titre 80), comme avec les peptides 1-11 (titre 160) et 257-282 (titre 40). EXEMPLE 3 : COMPARAISON ENTRE L'ELISA ET L'IMMUNOBLOT 1) Immunoblot Les expériences d'immunoblot ont été réalisées selon le protocole décrit par Abuaf et al. (1990) en utilisant comme antigène un extrait de thymus de lapin et non de veau qui ne contient pas la protéine de 70 Kd spécifique de U1-SnRNP. Les protéines sont ensuite séparées dans un gel de polyacrylamide-SDS à 13 % et transférées sur des membranes de nitrocellulose comme décrit par Towbin et al. (1979). L'immunoréactivité est détectée sur les taches avec les sérums de patients dilués au 1/100 et un conjugué d'anti-IgG humaine et de peroxydase de raifort. Le titre ANA est mesuré par immunofluorescence (IF) sur des monocouches de cellules HEp-2 et des cryocoupes de foie de rats. Les anticorps dirigés contre l'antigène nucléaire extrait (ENA) sont détectés par immunodiffusion (ID). L'immunoblot constitue une méthode particulièrement adaptée pour la détection des anticorps anti-RNP (Pettersson et al., 1986; Hoch, 1989; Combe et al., 1989) La figure 3 en annexe illustre l'analyse en immunoblot de sérums de patients dont on a détecté par immunodiffusion des anticorps anti-Sm et/ou anti-snRNP U1. L'antigène nucléaire extrait (ENA) est séparé en SDS-PAGE 13% et transféré sur bande de nitrocellulose. Chaque bande est ensuite incubée avec les sérums de patients dilués au 1/100, et mis en contact avec un conjugué anti-IgG humaine de chèvre-peroxydase puis avec un substrat chloronaphtol. Les bandes A,B,C ont été incubées avec un sérum de pateint contenant des anticorps anti-Sm, la bande J a été incubbé avec un sérum de patient contenant des anticorps anti-snRNP-U1 et la bande K avec un sérum de sujet normal; les bandes D, E, F, G, H et I ont été respectivement incubé avec les sérums des pateints 11, 17, 14, 15, 3 et 4 du tableau III ci-après. 2) Résultats Dix neuf sérums de patients hommes (M) ou femmes (F) diagnostiqués MCTD ou SLE sont testés en parallèle en ELISA avec les peptides 1-11, 35-58, 257282 et en immunoblot avec un extrait nucléaire de thymus en tant qu'antigène. Le tableau III ci-dessous rapporte les résultats de cette étude comparée entre immunoblot et ELISA. TABLEAU III Patients Sexe Diagnostic ANA IF Anti ENA ID IMMUNOBLOT ELISA Titre 70Kd A BB' C D 1-11 35-58 257-282 1 M MTCD 1000 RNP + - - - - + + ++ 2 F MTCD > 1000 RNP + + + - - + + ++ 3 M MTCD > 1000 RNP + + + + - + + ++ 4 F MTCD > 1000 RNP + + + + - + + ++ 5 F MTCD 1000 RNP + - - - - + ++ ++ 6 F MTCD 500 RNP + - - - - - + ++ 7 F MTCD 1000 RNP + - - - - - + ++ 8 F MTCD 500 RNP + - - - - - + ++ 9 F MTCD 500 RNP + + + - - - + ++ 10 F MTCD 200 RNP + + - - - + + ++ 11 F MTCD > 1000 RNP - + + + - - + ++ 12 F MTCD 1000 RNP + + - - - - + ++ 13 F MTCD 1000 RNP + + + - - - + ++ 14 F LED 1000 RNP+Sm + + + + + + + ++ 15 F LED 500 RNP + + + - + + + ++ 16 F LED 1000 RNP + - - - - - + ++ 17 M LED > 1000 RNP + + + + + + + ++ 18 F LED > 1000 RNP + + + - - - + ++ 19 F LED 500 RNP + + + - - + + ++ Comme cela apparaît dans le tableau IV ciaprès, 4 des 19 sérums réagissent avec le peptide 1-11 en ELISA et en immunoblot avec le polypeptide A, alors que 4 sérums sont négatifs dans les deux tests; 2 érums positifs en ELISA avec le peptide 1-11 sont négatifs en immunoblot alors que 4 sérums négatifs sont négatifs en ELISA et positif avec le polypeptide A en immunoblot. De manière interessante, tout les sérums réagissant avec la bande A en immunoblot sont positifs en ELISA avec les deux peptides 35-58 et 257-282; en outre, 6 sérums (1 LED et 5 MCTD) ont réagit avec les deux peptides mais nront pas lié le polypeptide A en immunoblot. TABLEAU IV Réactivité en ELISA Réactivité avec la bande A en Peptide 1-11 Peptides immoblot 35 - 48 et 257 - 282 Positif Négatif Positif Négatif Positif 8 5 13 0 Négatif 2 4 6 0 EXEMPLE IV : PREDICTION DES SITES ANTIGENIOUES L'étude précédente a permis aux inventeurs d'identifier plusieurs régions de la protéine A de snRNP-U1 reconnues par les autoanticorps présents dans les sérums de patients atteints de diverses maladies autoimmunes.La protéine A interagit directement avec snRNA-U1 par l'intermédiaire d'un motif de reconnaissance RRM localisé dans la région N-terminale de la protéine en position 12-84. Cette région contient la séquence consensus RNP1 en position 52-59, laquelle est également présente dans les protéines 70Kd et B" et dans l'antigène La 60 Kd. Un second motif RRM localisé dans la région C-terminale de la protéine en position 210-277 n'est pas nécessaire pour la liason spécifique entre l'ARN et U1A (Scherly et al., 1990).Toutefois les protéines U1A et U2B" possèdent une homologie de séquence importante, notamment, environ 77% d'homologie au niveau des résidu 7-101 de U1A et 4-98 de U2B"; la région définie par Scherly et al. (1990) comme déterminant majeur de la liaIson spécifique avec l'ARN est situé tout proche de la séquence consensus RNP dans l'une des régions les plus variables du motif conservé. Ceci semble expliquer la différence entre U1A et U2B" au niveau des propriétés de liaison entre ARN et protéine. Trois des peptides étudiés précédemment sont reconnus par les anticorps présents dans les sérums de patients testés. Le peptide 257-282 et à l'extrémité opposé le peptide 1-11 sont reconnus par les sérums de patients atteints de LED et de MCTD, ainsi que par les anticorps présents dans les sérums de patients atteints d'autres maladies rhumatoïdes. Le peptide 35-58 est reconnu par 94% des sérums de patients atteints de MCTD et seulement par 19% des sérums LED. Les méthodes de prédiction des sites antigéniques mettent en oeuvre des algorithmes basés sur certains paramètres comme lthydrophobicité ou l'hydrophilicité ou encore la mobilité de courts segments de la structure des protéines. La figure 4 en annexe représente les profiles de prédiction antigénique de la protéine U1A construits selon les échelles suivantes - en A : selon l'échelle d'hydrophilicité de Parker et al. (1986) - en B : selon l'échelle de mobilité de Karplus et Schultz (1985). Les échelles ont été normalisées selon la méthode de Pellequer et al. (1991). Les graphiques sont tracés entre le quatrième résidu et le résidu n-3. La localisation des épitopes reconnus les sérums MCTD et LED (régions 1-11, 35-58 et 257-282) sont représentés en traits épais. Le tableau V ci-après, indique pour les trois peptides réactifs en ELSA (peptides 1-11, 35-58 et 258-282) le résultat de la prédiction antigénique obtenue selon les quatres méthodes suivantes - échelle de mobilité, Karplus et Schultz (1985); résultat obtenu à partir des données de la figure 4, - échelle d'hydrophilicité, Parker et al. (1986); résultat obtenu à partir des données de la figure 4, - échelle d'hydrophilicité selon le programme HYDRO 3 de Hopp (1986); Pollard et Cohen (1990) - échelle d'acrophilicité selon le programme ACRO de Hopp (1986); Pollard et Cohen (1990). TABLEAU V PEPTIDE 1-11 35-58 258-282 Echelle de mobilité Karplus et + - + Schultz (1985) Echelle d'hydrophilicité, Parker +/- - + et au.(1986) Echelle d'hydrophilicité selon le programme HYDRO 3 de Hopp - + (1986) Echelle d'acrophilicité selon le programme ACRO de Hopp (1886) - - - Le programme HYDRO 3 (Hopp, 1986) basé sur l'hydrophylicité indique que la séquence 43-56 pourrait contenir un site antigénique de la protéine U1A (Pollard et Cohen, 1990).Ce site n'est toutefois pes remarqué en utilisant l'échelle d'hydrophilicité de Parker et al., l'échelle de mobilité de Karplus et Scultz ou l'échelle d'acrophilicité (ACRO) de Hopp. Les régions 1-11 et 258282 ne sont pas mises en évidence avec les programmes HYDRO 3 et ACRO et 9 régions déterminées par les programmes HYDRO 3 et ACRO comme potentiellement antigéniques n'ont pas été reconnues dans l'étude décrite précédemment, il s'agit des régions 15-28, 8396, 99-112, 106-119, 123-136, 134-147, 153-166, 198-211 et 212-225 décrite par Pollard et Cohen (1990). Ces résultats illustrent les limites des échelles de prédiction antigénique, en particulier lorsqu'elles sont appliquées aux autoantigènes RNP. REFERENCES Abuaf, N., Prost, A., Rouquette-Gally, A.M., Bedda, N., Fermanian, J., Homberg, I.C., 1984. Comparaison cellules tumorales humaines (HEp-2) et foie de rat pour la détection des anticorps antinucléaires en immunofluorescence indirecte. Ann. Biol. Clin. 42 363-369. Abuaf, N., Johanet, C., Homberg, J.C., Buri, J.F., 1985. Autoantigens of nuclear ribonucleoprotein particles. In Protides of the Biological Fluids. Ed. Peeters H., Oxford, Pergamon Press, Vol.33, 261-264. Abuaf, N., Johanet, C., Chretien, P., Absalon, B.I., Homberg, J.C., Buri, J.F., 1990. Detection of autoantibodies to Sm antigen in systemic lupus erythematosus by immunodiffusion, ELISA and immunoblotting: variability of incidence related to assays and ethnic origin of patients. Eur. J. Clin. Invest. 20, 354-359. Barakat, S., Briand, J.P., Weber, J.C., Van Regenmortel, M.H.V. and MuIler, S., 1990. Recognition of synthetic peptides of Sm-D autoantigen by lupus sera. Clin. Exp. Immunol., 81, 256-262. Billings, P.B. and Hoch, S.O., 1983. Isolation of intact Srn/RNP antigens from rabbit thymus. J. Immunol. 131, 347-351. Briand, J.P., Van Dorsselaer, A., Raboy, B. and Muller, S., 1989. Total chemical synthesis of ubiquitin using BOP reagent: biochemical and immunochemical properties of the purified synthetic product. Peptide Res. 2, 381-388. Combe, B., Rucheton, M., Graafland, K., Lussiez, V., Brunel, C. and Sany, J., 1989. Clinical significance of anti-RNP and anti-Sm autoantibodies as determined by immunoblotting and immunoprecipitation in sera from patients with connective tissue diseases. Clin. Exp. Immunol. 75, 18-24. Feeney, R.J., Sauterer, R.A., Longo Feeney, J. and Zieve, G.W., 1989. Cytoplasmic assembly and nuclear accumulation of mature small nuclear ribonucleoprotein particles. J. Biol. Chem. 264 5776-5783. Habets, W.J., Hoet, M.H., Bringmann, P., Lührmann, R. and Van Venrooij, W.J., 1985. Autoantibodies to ribonucleoprotein particles containing U2 small nuclear RNA. EMBO J., 4, 1545-1550. Habets, W.J., Sillekens, P.T.G., Hoet, M.H., Schalken, J.A., Roebroek, A.j.M., Leunissen, J.A.M., Van de Ven, W.J.M. and Van Venrooij, W.J., 1987. Analysais of a cDNA clone expressing a human autoimmune antigen : Full-length sequence of the U2 small nuclear RNA-associated B" antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2421-2425. Habets, W.J., Hoet, M.H., De long, B.A.W.,-Van der Kemp, A. and Van Venrooij, W.J., 1989a. Lapping of B celui epitopes on small nuclear ribonucleoproteins that react with human autoantibodies as well as with experimentally-induced mouse monoclonal antibodies. J. Immunol. 143, 2560-256 Habets, W.J., Sillelcens, P.T.G., Hoet, M.H., McAllister, G., Lerner, M.R., Van Venrooij, W.J., 1989b. Small nuclear RNA-associated proteins are immunologically related as revealed by mapping of autoimmune reactive B-cell epitopes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 4674-4678. Habets, W.J.A., Hoet, M.H., Sillekens, P.T.G., De Rooij, D.J.R.A.M., Van de Putte, L.B.A. and Van Venrooij, W.J., 1989c. Detection of autoantibodies in a quantitative immunoassay using recombinant ribonucleoprotein antigens. Clin. Exp. Immunol. 76 172-177. Hoch, S.O., 1989. Application of Protein Blotting to the Study of Autoimmune Disease. In Protein Blotting. Methodology, resaerch and diagnostic applications. Eds. B.A. Baldo, E.R. Tovey, S. Karger AG, Basel, pp. 140-164. Hopp, T.P., 1986. Methods of identifying antigenic determinants and other interaction sites. J. Immunol. Meth. 88 1-18. Karplus, P.A. and Schulz, G.E., 1985. Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften 72 212. Muller, S., 1988. Peptide-carrier conjugation in synthetic polypeptides as antigen. Laboratory Techniques in Biocbemistry and Molecular Biology, Vol. 19, pp. 159-175 (Burdon, R.H. and Van Knippenberg, P.M., Eds.), Elsevier, Amsterdam. Muller, S., Barakat, S., Watts, R., Joubaud, P., Isenberg, D., 1990. Longitudinal analysis of antibodies to histones, Sm-D peptides and ubiquitin in the serum of patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis and tuberculosis. Clin. Exp. Rheum., 8, 445-453 Morrow, J. ard Isenberg, D., 1987. Autoimmune rheumatic disease. Blackwell Scientific Publications (Oxford), pp. 324. Nagai, K., Oubridge, C., Jessen, T.H., Li, J. and Evans, P.R., 1990. Crystal structure of the RNA-binding domain of the Ul small nuclear ribonucIeoprotein A. Nature 348, 515-520. Parker, J.M.R., Guo, D. and Hodges, R.S., 1986. New hydrophilicity scale derived from high performance liquid chromatography peptide retention data: correlation ofpredicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites. Biochemistry 25, 5425-5432. Pellequer, J.L., Westhof, E. and Van Regenmortel, M.H.V., 1991. Overview of methods for predicting the location of continuous epitopes in proteins from their primary structures. Mets. Enzymol. (in press). Pettersson, I., Wang, G., Smith, E.I., Wigzell, H., Hedfors, E., Horn, J. and Sharp, G.C., 1986. The use of immllnoblotting and immunoprecipitation of (U) small nuclear ribonucleoproteins in the analysis of sera of patients with mixed connective tissue disease and systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 29,986-996. Piaulé, S., Muller, S. and Van Regenmortel, M.H.V., 1989. A branched, synthetic octapeptide of ubiquitinated histone II2A as target of autoantibodies. J. Exp. Med., 169, 1607-1617. Pollard, K.M., Cohen, M.G., 1990. Predicting antigenîc determinants of autoantigens. Autoimmunity 5, 265-275. Reuter, R. and Lührmann, R., 1986. Immunization of mice with purified Ul small nuclear ribonucleoprotein (RNP) induces a pattern of antibody specificities characteristic of the anti-Sm and anti-RNP autoimmune response of patients with lupus erythematosus, as measured by monocIonal antibodies. Proc. Nad. Acad. Sci. USA 83, 8689-8693. Roitt, LM. and Cooke, A., 1987. The role of autoantigen in autoimmunity. Immunol. Lett. 16, de Rooij, D.J.R.A.M., Habets, W.J., Van de Putte, L.B.A., Hoet, M.H., Verbeek, A.L. and Van Venrooij, W.J., 1990. Use of recombinant RNP peptides 70K and A in an ELISA for measurement of antibodies in mixed connective tissue disease: a longitudinal follow up of 18 patients. Ann. Rheum. Dis. SL2, 391-395. Scherly, D., Boelens, W., Dathan, M.A., Van Venrooij, W.I and Mattaj, LW., 1990. Major determinants of the specificity of interaction between small nuclear ribonucleoproteins U1A and U2B" and their cognate RNAs. Nature 345, 502-506. Sillekens, P.T.G., Habits, W.J., Beijer, R.P. and Van Venrooij, W.J., 1987. cDNA cloning of the human Ul snRNA-associated A protein : extensive homology between Ul and U2 snRNP-specific proteins. EMBO J. 6, 3841-3848. Srneenk, R., Westgeest, T. and Swaak, T., 1985. Antinuclear antibody determination : the present state of diagnostic and clinical relevance. Scand. J. Rheum., suppl. 56, 78-92. Spritz, R.A., Strunk, I(., Surowy, C.S., Hoch, S.O., Barton, D.E. and Francke, U., 1987. The human U1-70K snRNP protein cDNA cloning, chromosomal localization, expression, alternative splicing and RNA-binding. Nucl. Acids Res. 15, 10373-10391. Stetler, D.A. and Cavallo, T., 1987. Anti-RNA polymerase I antibodies: Potential role in the induction and progression of murine lupus nephritis. J. Immunol. 138, 2119-2123. Tan, E.M., 1989. Antinuclear antibodies : Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. In Advances in Immunology, Academic Press, Vol. 44, pp. 93-151. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J., 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354. Van Venrooij, W.J. and Sillekens, P.T.G., 1989. Small nuclear RNA associated proteins autoantigens in connective tissue diseases. Clin. Exp. Rheum. 2, 635-645. Woppmann, A., Patschinsky, T., Bringmann, P., Godt, F. and Lührmann, R., 1990. Characterisation of human and murine snRNP proteins by two-dimensional gel electrop horesis and phosphopeptide analysis of U 1 -specific 70K protein variants. Nucl. Acids Res. 18, 4427-4438. Yamanaka, H., Willis, E.H., Penning, CA., Peebles, C.L., Tan, E.M. and Carson, D.A., 1987. Human autoantibodies to poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase. J. Clin. Invest. 80, 900-904. Symboles des acides aminé A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phenylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met methionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser serine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine REVENDICATIONS 1 - Peptide comprenant au moins une partie de la séquence en acides aminés de la protéine A de snRNP-U1, caractérisé en ce qu'il est constitué par ou comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante SQFGQILD ILVSRSLKMRGQAFVI 2 - Peptide selon la revendication 1, caractérié en ce qu'il est constitué par ou comprend la séquence de formule suivante GQILDILVSRSLK 3 - Anticorps caractérisé(s) en ce qu'il(s) est (ou sont) dirigés de façon spécifique contre un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2. 4 - Composition antigènique caractérisée en ce qu'elle contient au moins un peptide selon l'une des revendications 1 et 2, ou un conjugué de ce peptide avec une molécule porteuse. 5 - Procédé de diagnostic in vitro de la maladie du tissu connectif, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - la mise en contact d'un fluide biologique susceptible de contenir des autoanticorps avec au moins un peptide selon l'une des revendications 1 et 2, ou ce peptide conjugué à une molécule porteuse, dans des conditions permettant la formation d'un complexe immmunologique peptide-autoanticorps, - la détection du complexe immunologique formé par des méthodes physiques ou chimiques. 6 - Trousses pour le diagnostic in vitro de la maladie du tissu connectif caractérisé en ce qu'elle comprend - au moins un peptide selon l'une des revendications 1 et 2, ou ce peptide conjugué à une molécule porteuse, - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'une réaction immunologique entre le ou les peptides et les autoanticorps éventuellement présents dans un échantillon biologique, - un ou plusieurs réactifs éventuellement marqués aptes à réagir avec le ou lesdits peptides pour la détection du complexe peptide-autoanticorps formé, - le cas échéant, au moins un milieu biologique de référence, tel qu'un sérum dépourvu d'autoanticorps. 7 - Composition immunogène caractérisée en ce qu'elle contient au moins un peptide selon l'une des revendications 1 et 2, ou un conjugué de ce peptide avec une molécule porteuse.