Brevet FR2673377A1 — publié le 19920904

La présente invention concerne un procédé pour améliorer les qualités organoleptiques, en particulier l'odeur, la sapidité et la tendreté, des animaux domestiques mâles non castrés, notamment des bovins, des ovins et des porcins mâles. Les avantages de l'utilisation du mâle entier sur le mâle castré dans l'engraissement des animaux domestiques destinés à la production de viande ont été soulignés depuis plusieurs décennies par les zootechniciens. Ils concernent un taux de croissance plus élevé, surtout chez les bovins et les ovins, une meilleure utilisation de la ration alimentaire et une carcasse plus maigre mais plus fournie en masse musculaire chez toutes les espèces domestiques (S.C. SEIDEMAN et al. J., of Animal Science, 1982, 55 (4) 826-840 et M. BONNEAU, INRA Prod. Anim., 1988, 1 (2) 133140). Les désavantages principaux de cette utilisation du mâle entier, rappelés dans les revues citées ci-dessus, concernent l'odeur et la sapidité désagréables chez les porcins et ovins mâles, la moindre tendreté de la viande des bovins et ovins mâles entiers et justifient les pratiques actuelles de la castration chirurgicale. En effet, si les stéroïdes androgènes dont l'androsténediol, l'androsténedione et la testostérone sont les éléments déterminants des avantages attendus dans toutes les espèces domestiques pour une croissance plus rapide et une meilleure utilisation de la ration alimentaire, ils sont rendus responsables d'une moindre tendreté de la viande des bovins et ovins mâles entiers. Les stéroïdes non androgènes ou les dérivés des 16androstènes dont l'androsténone, chez le porc mâle, sont responsables en partie de l'odeur et de la sapidité désagréables de la viande d'un certain nombre de porcins mâles entiers dès la puberté, lesquelles déprécient la viande et sont un obstacle à sa commercialisation à l'état frais. Le scatole, produit dérivé du tryptophane et produit par la flore microbienne intestinale, est un composé responsable en partie de l'odeur et de la sapidité désagréables de la viande du porc mâle entier. Sa production dépend de facteurs de l'environnement, de la nutrition, de la race. Son accumulation dans le tissu adipeux est plus importante chez le verrat et serait liée aux sécrétions des stéroïdes sexuels gonadiques. A titre expérimental, on a déjà essayé de diminuer ou de supprimer le développement du caractère mâle chez le jeune animal ou la sécrétion d'hormones testiculaires, notamment stéroïdes testiculaires, y compris par immunoneutralisation active ou passive d'hormones testiculaires, notamment l'hormone gonadolibérine (GnRH) encore appelée Luteinizing Hormone Releasing Hormone (LHRH). Des essais ont été conduits sur le porc pour abaisser le taux tissulaire de la 5 -androsténone, du groupe des 16-androstènes, par l'immunisation active dirigée contre ce composé (E.D. WILLIAMSON et al., Liverstock Production Science, 1985, 12, 251-264) ou par l'immunisation passive contre ce même composé (R. CLAUS, Immunization with Hormones in Reproduction Research, ed. Nieschlag, 1975). La suppression ou la diminution de la sécrétion des stéroïdes testiculaires peut être recherchée par l'immunoneutralisation de l'hormone gonadotrope LH, spécifique de l'espèce considérée (R.E. FALVO et al., J. Anim. Science, 1986, 63, 986-994) ou par l'immunoneutralisation anti-LHRH de la LHRH endogène. Seule l'immunisation active anti-LHRH a été préconisée par différents auteurs. Chez le porc, l'abaissement de 1' 6(-androsténone a été obtenu par cette méthode (A. CARATY et M. BONNEAU, C.R. Acad. Sci. Paris 1986, 303, Série III (16) 673-676 ; R.E. FALVO et al., J. Anim. Sci., 1986, 63, 986-994). Chez le mouton, B.D. SCHANBACHER (Am. J.Physiol., 1982, 242, E201-E205) préconise l'immunisation anti-LHRH pour retarder le développement testiculaire et produire un effet de castration chez les agneaux mâles. Chez les bovins, P.S. ROBERTSON (veut Rec., 1979, 105, 516-517) décrit une castration immunologique anti-LHRH. Les essais d'immunoneutralisation anti-LHRH décrits sur les animaux de laboratoire (ARIMURA et al. Endocrinology, 1973, 93, 1092-1103 ; FRASER H.M. et al., J. Endocr. 1974, 63, 399-406 ; MAKINO T. et al. Contraception, 1973, 8 (2), 133-145 ; CARELLI C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 1982, 79, 5392-5395) et sur plusieurs espèces domestiques (JEFFCOATE et al., Theriogenology, 1978, 10(4), 323-335 ; ROBERTSON I.S. et al., Veterinary Record.,1979, 105, 556 ; SCHANBACHER B.D. Am. J. Physiol., 1982, 242, E201-E205) ont montré qu'il est possible d'obtenir l'arrêt de la sécrétion de la testostérone, l'involution pondérale des testicules et de ses glandes annexes, l'arrêt de la spermatogénèse et, sur le plan du comportement, la disparition de la libido. Ces travaux ont conduit à suggérer le recours à une immunoneutralisation, notamment anti-LHRH, précoce pour remplacer la traditionnelle castration chirurgicale à des fins d'élevage. Dans le brevet US n 4.556.555, il est ainsi décrit une méthode d'immunisation passive d'animaux avant leur puberté, à l'aide d'un antisérum contenant des anticorps dirigés contre la gonadotropine. La demande de brevet internationale WO 90/11298 décrit un procédé d'immunisation anti-LHRH à la naissance, pour améliorer la qualité de la viande chez le porc. La demande de brevet internationale WO 88/00056 décrit une méthode de castration immunologique anti-LHRH destinée à améliorer le comportement social et sexuel des animaux mâles en remplacement de la castration chirurgicale qui affecte le taux de croissance. Les taureaux sont vaccinés à l'âge de 8 à 40 semaines et reçoivent ensuite plusieurs rappels. Un vaccin anti-LHRH vendu sous la marque VAXSTRATE par la sociéte australienne WEBSTERS est utilisé chez la vache. R.E. Falvo et al. (J. Anim. Sci. 1986, 63 : 986-994) ont immunisé plusieurs groupes de verrats à l'aide de conjugués LHRH-séroglobuline humaine en adjuvant complet de Freund ou adjuvant muramylpeptide. Les auteurs ont observé, après vaccination et plusieurs rappels, des titres élevés d'anticorps anti-LHRH, mais avec la nécessité de pratiquer des rappels répétés pour maintenir le titre élevé en anticorps. I.S. Robertson décrit une méthode d'immunisation avec LHRH conjuguée à l'anatoxine tétanique ou à la thyroglobuline et suggère que l'approche immunologique autoriserait une castration tardive avec les avantages que l'on peut en attendre sur le plan de la croissance pondérale. Il conclut cependant que des efforts sont encore à faire pour arriver à une méthode de castration utilisable dans la pratique, que ce soit au niveau de la méthode elle même ou de l'adjuvant, l'adjuvant de Freund étant proscrit en pratique. Enfin, A. Caraty et M. Bonneau (C.R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, ne16, 1986) ont pratiqué une immunisation anti-LHRH chez le porc mâle. Les auteurs suggèrent que le blocage de la production de stéroïdes, 2 à 3 semaines avant l'abattage, permettrait d'exploiter les potentialités élevées de ce type d'animal pour la production de viande en évitant les problèmes posés par l'accumulation d'androstérone dans le tissu adipeux. Ils concluent cependant que d'importants progrès restent à accomplir dans les techniques d'immunisation avant qu'il ne soit possible de proposer l'immunisation active anti-LHRH comme technique utilisable en élevage porcin. Par ailleurs, l'immunoneutralisation tardive pose dans la pratique le problème important de l'innocuité du traitement et notamment des réactions locales engendrées par les vaccins, en particulier les vaccins huileux, avec les risques de rejet ou de déclassement de la viande qui en résultent. L'amélioration des qualités organoleptiques chez les bovins et les ovins n'a pas été suggérée. La déposante a justement trouvé un procédé applicable industriellement permettant d'améliorer les propriétés organoleptiques des animaux, procédé dans lequel, peu avant l'abattage de l'animal, on supprime sensiblement l'action des stéroides androgènes et non androgènes, par immunoneutralisation active ou passive anti-LHRH, tout en maintenant pratiquement jusqu'à l'abattage les avantages dus au caractère mâle de l'animal. Selon un premier mode de réalisation préféré de ce procédé, on administre à l'animal un vaccin anti-LHRH, de préférence en émulsion, de préférence avant la phase d'engraissement de l'animal, puis, peu avant l'abattage de l'animal, on administre à nouveau un vaccin anti-LHRH. Chez le porc, il est particulièrement avantageux d'administrer, avant l'abattage, le vaccin anti-LHRH avec un adjuvant de type aqueux, notamment gel d'hydroxyde d'aluminium et/ou saponine. Cette administration est effectuée de préférence 15 à 21 jours avant l'abattage. Au contraire, chez le bovin, et éventuellement chez l'ovin, l'administration précédant l'abattage est faite de préférence avec un adjuvant en émulsion, et de préférence 1 à 2 mois avant l'abattage. Cette administration est effectuée de préférence au moins 4 semaines, et de préférence plusieurs mois, après la première administration. Dans tous les cas, on préfère, pour le vaccin en émulsion, destiné à la première administration et, chez le bovin, à la deuxième administration, que le vaccin se présente sous forme d'émulsion eau-dans-l'huile. Cependant, d'autres formes d'émulsion sont envisageables. Ce vaccin, de préférence du type en émulsion, est conçu, selon l'invention, pour l'induction d'une première réponse immunitaire de faible intensité, sans effet notable, ou même mesurable, sur la sécrétion des stéroïdes gonadiques. La formulation en émulsion est préférée, mais les autres formulations sont utilisables dès lors qu'elles produisent ce même effet. L'administration qui précède l'abattage est faite avec un vaccin formulé pour produire à ce moment la suppression ou l'abaissement significatif de la sécrétion des stéroïdes sans réaction locale ou générale adverse, susceptible de nuire à l'apparence ou à la qualité de la viande. De façon préférée notamment pour le porc, le conjugué, en solution aqueuse, est mis sous les deux formulations suivantes : la première en émulsion eau-dans-l'huile, stable, faite d'un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensioactifs non ioniques pour l'induction d'une réponse immunitaire de faible intensité, sans effet mesurable sur la sécrétion des stéroïdes gonadiques, la seconde, non émulsionnée, avec gel d'hydroxyde d'aluminium et saponine, déclenchant une réaction immunitaire rapide et intense se traduisant par la production d'anticorps anti LHRH neutralisants, suffisante pour entraîner la diminution ou la suppression des stéroïdes gonadiques et la diminution du transport associé de scatole d'origine intestinale. L'émulsion utilisée est, à la différence de celle qui est obtenue à l'aide de l'adjuvant complet ou incomplet de Freund, une émulsion stable permettant de préparer un vaccin prêt à l'emploi. La réaction inflammatoire cutanée reste très faible et localisée aux points d'administration des deux formulations vaccinales et se traduit sous la forme de papules bien circonscrites à l'examen externe. Son développement interne reste limité au derme superficiel. Elle disparaît sans laisser de granulome apparent au moment de l'abattage des animaux. Selon un autre mode de réalisation de ce procédé, on administre à l'animal, quelques jours avant l'abattage, notamment 5 à 15 jours avant, du sérum ou du plasma hyperimmun anti-LHRH ou encore des anticorps monoclonaux anti-LHRH. L'immunisation passive anti-LHRH entrainant la diminution voire la suppression de la sécrétion des stéroïdes androgènes et non androgènes a été obtenue par l'administration intramusculaire de plasma hyperimmun équin. Portée à un niveau suffisant, mesuré par le titre en anticorps LHRH du sérum de l'animal receveur, elle entraîne la diminution de la testostérone plasmatique des le 3ème jour; maintenue à ce même niveau les 12 jours suivants, elle est suffisante pour entraîner 1' abaissement de l'androstérone tissulaire au-dessous de 0,50 microgramme/g, valeur pour laquelle l'odeur désagréable et la sapidité particulière de la viande du porc mâle ne seraient plus perçues par le consommateur.Cette méthode d'immunisation passive a montré que le maintien pendant 12 jours de la diminution significative de la testostérone est suffisant pour abaisser la concentration d'androstérone tissulaire au-dessous du seuil fixé. Cette immunisation passive peut être envisagée par l'emploi d'anticorps monoclonaux anti LHRH secrétés par les hybridomes ou hétérohybridomes porcins. Le mode d'administration de ces formulations est de préférence transcutané, notamment à l'aide d'un appareil d'injection sans aiguille, par jet sous pression, notamment selon la-demande de brevet FR-A-2.652.257. Le procédé selon l'invention présente l'avantage important de présenter une parfaite innocuité, notamment de ne pas induire des réactions locales susceptibles d'entraîner le déclassement de la viande. La réaction inflammatoire cutanée reste localisée aux points d'administration des deux formulations vaccinales et se traduit sous la forme de papules bien circonscrites à l'examen externe. Son développement interne reste limité au derme superficiel. Elle disparaît sans laisser de granulome apparent au moment de l'abattage des animaux. La réaction inflammatoire, limitée dans le temps et aux points d'administration, traduit la tolérance aux deux formulations vaccinales et est obtenue par l'administration transcutanée de celles-ci, effectuée à l'aide d'un injecteur sans aiguille. L'immunisation anti-LHRH nécessite de conjuguer le peptide LHRH, non immunogène dans les conditions économiques de son emploi, à une protéine immunogène, dite porteuse, par une liaison covalente. La LHRH ou GnRH, qu'elle soit naturelle ou de synthèse, est composée de 10 acides aminés, numérotés de 1 à 10 en allant de la terminaison amino-terminale à la terminaison carboxy-terminale suivant la formule suivante pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly NH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ces symboles, par convention, représentent : pGlu, acide pyroglutamique ; His ; histidine ; Trp, tryptophane Ser, sérine ; Tyr, tyrosine ; Gly, glycine ; Leu, leucine Arg, arginine ; Pro, proline. Les conjugués immunogènes anti-LdIRH, décrits par les différents auteurs peuvent être réalisés en ce qui concerne l'haptène avec a) la LHRH totale ou modifiée en une ou plusieurs de ses parties pour obtenir la conjugaison amino-terminale, carboxy-terminale ou intermédiaire souhaitée, b) avec l'un de ses fragments peptidiques composés de 5 à 7 acides aminés modifiés ou non, pour obtenir la conjugaison aminoterminale, carboxyterminale ou intermédiaire souhaitée, c) avec un agoniste portant un acide aminé substitué, le plus couramment en 6, pour obtenir une conjugaison intermédiaire. En ce qui concerne la protéine porteuse, la sérumaîbumine bovine, la sérumalbumine humaine, la thyroglobuline, l'ovalbumine, les globulines humaine ou équine ont été utilisées. Les agents de conjugaison utilisés peuvent être classés en trois grandes catégories : les agents d'activation, les agents homobifonctionnels, les agents hétérobifonctionnels. Alors que, pour les agents d'activation, la liaison entre les deux molécules se fait entre deux fonctions déjà présentes, pour les autres, la liaison se fait par l'intermédiaire d'un résidu hydrocarboné appelé ligand. Parmi les agents d'activation, on peut citer l'acide periodique employé pour oxyder les résidus oligosaccharidiques des glycoprotéines en aldéhydes, sur lesquels réagiront ultérieurement les groupements amine de l'autre molécule entrant dans le conjugué. Les carbodiimides sont des agents d'activation largement employés pour le couplage d'antigènes sur les protéines et, parmi eux, le plus utilisé est sans doute le chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl) carbodiimide (EDC) qui permet d'effectuer la réaction en milieu aqueux. Leur action conduit à la formation d'une liaison amide entre un groupement carboxyle d'une protéine, activé de façon intermédiaire sous la forme d'une O-alcoylisourée, et un groupement amine porté par une autre molécule. Leur avantage réside dans leur simplicité d'utilisation. Les agents homobifonctionnels sont des molécules qui possèdent deux groupements réactifs identiques séparés par une chaîne hydrocarbonée. Parmi eux, citons le glutaraldéhyde, qui réagit sur deux groupements amine primaires, les bisisothiocyanates d'alkyle ou d'aryle, qui réagissent sur les amines primaires et les thiols, la benzidine bisdiazotée, qui copule avec les résidus aromatiques de la tyrosine. Mentionnons pour mémoire les bismaléimides et les bisamidinates. L'inconvénient majeur des agents homobifonctionnels est de mal maîtriser la nature des conjugués formés car ces agents peuvent réagir sur deux molécules de même nature et conduire à la formation d'oligomères ou de polymères. Pour y remédier, des chimistes ont introduit les agents hétérobifonctionnels, dans lesquels les deux groupements ont des spécificités différentes. Dans le cas général, l'un de ces groupements est un ester du Nhydroxysuccinimide qui, dans des conditions douces, réagit sur les groupements amine libres des protéines pour donner d'une part le N-hydroxysuccinimide et d'autre part la protéine portant pa une liaison covalente amide l'agent de couplage sur lequel se trouve la 2ème fonction.Assez généralement, celle-ci peut réagir sur les thiols apportés par la molécule à coupler, ces thiols étant soit initialement présents dans la molécule sous forme de résidus cystéine (ceux-ci pouvant être constitutifs ou, dans le cas de peptides, introduits intentionnellement lors de la synthèse), soit apportés par des agents tels que l'imino-2 thiolane ou le N-((pyridyl-2)dithio-3 propanoyloxy) succinimide (SPDP), après réduction. La LHRH naturelle est préférée aux agonistes tels que la (D-Lys6)-LHRH par la comparaison de l'activité immunogène des conjugués préparés avec ces deux peptides. Le carbodiimide est préféré au glutaraldéhyde comme agent de conjugaison de la LHRH de forme naturelle sur l'alpha-globuline. L'alpha-globuline humaine ou équine, fraction IV-1 et IV-4, est préférée à la sérumalbumine humaine ou bovine. De préférence, les vaccins comprennent un même principe actif, comprenant préférentiellement un conjugué d d-globuline-LHRH ; la LHRH est de préférence sous forme naturelle et 1'o(-globuline d'origine humaine ou équine, notamment fractions IV-1 et IV-4. Le conjugué est de préférence obtenu par addition sur 1 volume de mélange o(-globuline et LHRH en solution de 2 à 20 mg/ml dans NaC1 0,9 % de 0,5 à 2 volumes de solution de chlorhydrate de N-éthyl-N' - (diméthylamino-3 propyl) carbodiimide (EDC) en solution à 2,5 % dans NaCl 0,9 %. Après agitation, le mélange est laissé une nuit, puis purifié par chromatographie de perméation sur gel. L'invention a également pour objet les nouveaux vaccins décrits et utilisables pour le procédé selon 1' invention. Elle a également trait aux ensembles regroupant dans un même emballage un nombre égal de doses de vaccin à administrer avant l'abattage et de vaccin à administrer en première injection. De préférence ces vaccins sont conditionnés sous volume réduit et concentration augmentée pour l'administration par jet transcutané, par exemple selon la demande de brevet français précitée. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'essais comparant plusieurs produits et procédés de vaccination selon l'invention. A. Plus grande activité immunogène du conjugué maintenant intacte la fraction carboxyterminale la plus étendue du peptide LHRH et choix du conjugué à base de LHRH de formule naturelle de préférence à celui obtenu à l'aide de l'agoniste (D-Lys6)-LHRH. Al. Immunisation anti-LHRH du porc mâle entier et du rat mâle OFA. La comparaison d'activité de deux vaccins anti-LHRH constitués de conjugués entre la LHRH de forme naturelle (B1 et B2) ou la (D-Lys6 )-LHRH (Al et A2) et l'albumine humaine, conjugués obtenus par le carbodiimide en phase aqueuse et le SPDP respectivement, mis dans une émulsion huile-dans-l'eau et administrés par voie intramusculaire chez le porc et par voie sous-cutanée chez le rat, conduit aux conclusions suivantes - Activité plus grande du vaccin à base de LHRH de forme naturelle : masse du peptide LHRH conjugué inférieure à celle du peptide (D-Lys6)-LHRH conjugué pour un recrutement d'un plus grand nombre d'animaux présentant une réponse immunitaire (tableaux 1 et 3). - Effet de dose qui se traduit par un recrutement d'un nombre plus élevé d'animaux présentant une réponse immunitaire par un même conjugué (tableau 3). Al.l Préparation des conjugués (D-Lys6)-LHRH-albumine par le SPDP. La préparation des conjugués (D-Lys6)-LHRH-albumine est réalisée en 3 étapes : préparation de la (N-(pyridyl2)-dithio-3 propanoyl-D-Lys6)-LHRH, préparation de la N (mercapto-3 propanoyl) albumine, puis couplage. La (NE -(pyridyl-2)dithio-3 propanoyl-D-Lys6)-LHRH est préparée en faisant réagir un excès de SPDP sur la LHRH, en solution aqueuse (6 moles de SPDP par mole de LHRH), puis, après une nuit à 4"C, en centrifugeant le produit obtenu. Celui-ci est dissous dans l'urée 8M et les groupements (pyridyl-2)dithio présents sont dosés. La N-(mercapto-3 propanoyl) albumine est obtenue par action de 0,2 mmole de SPDP sur 1 g d'albumine humaine dissoute dans 100 ml de tampon phosphate 0,lM, puis, après une nuit de contact à 4"C et acidification à pH 6, par réduction par le dithiothréitol. Elle est ensuite purifiée par chromatographie de filtration sur gel. Le dosage des thiols et des protéines fournit le niveau de substitution moyen. Le couplage est effectué en prenant un groupement (pyridyl-2)dithio pour 1,25 groupement thiol. Le pH est amené à 7-7,5, puis, une heure après, le rendement est déterminé par mesure de la pyridine thione-2 libérée. Le niveau de substitution moyen s'en déduit. Finalement, le conjugué est purifié par chromatographie et est concentré par ultrafiltration. A1.2 Préparation du conjugué LHRH-albumine par le carbodiimide. A 300 mg de LHRH et 300 mg d'albumine humaine dissous dans 30 ml de NaCl 0,9 % sont additionnés 1000 mg de chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamine-3 propyl) carbodiimide dissous extemporanément dans 40 ml de NaCl 0,9%. Après agitation, le mélange est laissé une nuit à température ambiante à l'abri de la lumière. Ensuite, il est chromatographié sur un gel de Séphadex G-50 ; les fractions correspondant au conjugué sont recueillies, éventuellement concentrées et congelées. A partir des fractions contenant la LHRH non couplée est déterminée la quantité de LHRH non couplée et donc le niveau de conjugaison moyen. Celui-ci est reproductible et varie de 8 à 10 mg de LHRH couplée pour 100 mg d'albumine. A partir des spectres UV du conjugué avant et après chromatographie, sont déduits les rendements de la chromatographie en conjugué et donc la quantité (ou la concentration) de LHRH conjuguée. A1.3 Techniques de dosage Le titre en anticorps est déterminé selon la technique décrite par JEFFCOATE et al., Acta. Endocr., Copenh., 1974, 75 : 625-635. La testostérone est dosée directement sur plasma par une technique RIA utilisant le radioligand Testostérone C19-carboxyméthyl éther (125I)histamine. La liaison au peptide marqué est déterminée après marquage à l'iode 125 des différents peptides selon COPPOLAND et al., Endocr., 1979, 104 : 1504-1506 et titrage selon la technique décrite par JEFFCOATE et al., Acta Endocr., Copenh., 1974, 75, 625-635. A.1.4. Illustrations - Essais sur rats Tableau n" 1 : Réponse anticorps anti-LHRH mesurée par le taux de fixation de LHRH marquée à l'iode125 Tableau n" 2 : Effet de l'immunisation anti-LHRH sur la concentration de testostérone plasmatique Posologie Vaccins Al : 50/cig de (D-Lys6 )-LHRH conjuguée B1 : 12 Xg de LHRH conjuguée - Essais sur porcs mâles entiers Tableau n 3 :Réponse anticorps anti-LHRH mesurée par le taux de fixation de LHRH marquée à l'iode125 Posologie Vaccins Al : 0,5 mg de (D-Lys6)-LHRH conjuguée A2 : 6 mg de (D-Lys6-)LHRH conjuguée B1 : 0,15 mg de LHRH conjuguée B2 : 1,20 mg de LHRH conjuguée Tableau 1 Réponse anticorps anti-LHRH mesurée par le taux de fixation de LHRH marquée à l'iode DRECHERCHE DES ANTICORPS (Z BO/T) DANS LE SERUM (1/100] CHEZ LE RAT | INJECTIONS | TEMPS | GROUPE A1 | GROUPE B1 | TITRE | | | (SEM) | 50 g Diy56-LHRH/HSA/AE1 | 12 g LHRH/ EDC/HSA/AEL | B/T=50% | | | | | | | SC O | | | - | - | - | | | | - | - | - | | | | - | - | - | | | | | | SC | 4 | 0.0 | 15.4 | | | | | 7.8 | 7.6 | | | | | 0.0 | 35.3 | | | | | 0.0 | 51.1 | 100 | | | | | | | | | 5 | 4.3 | 91.1 | 1600 | | | 14.1 | 85.3 : 980 | | | 5.9 | 70.8 | 270 | | | | 15.8 | 94.9 | 2100 | | | | | | | | | 6 | 0.0 | 64.3 | 120 | | | | 11.3 | 67.9 | 220 | | | | 11.7 | 96.1 | 2400 | | | | 0.0 | 68.3 | 280 | | | | | | | | | 7 | 14.5 | 72.5 | 400 | | | | 0.0 | 92.4 | 2100 | | | | 0.0 | 64.2 | 200 | | | | 11.5 | 67.2 | 240 | | | | | | | | 8 | 19.6 | 70.4 | 310 | | | | 0.0 | 93.8 | 3200 | | | | 9.2 | 68.7 | 2200 | | | | 0.0 | 38.8 | 310 | fital Tableau 2 Effet de l'immunisation anti-LHRH sur la concentration testostérone plasmatique DOSAGE DE LA TESTOSTERONE PLASMATIQUE (NG/ML) CHEZ LE RAT | INJECTIONS | TEMPS | TEMOINS | GROUPE A1 | GRDUPE B1 | | | (SEM) | |50 g Dly56-LHRH/PDP/HSA |12 G LHRH/EDC /HSA | | | | | | | - | | SC | 0 | 0.40 | - | - | | | | 0.26 | - | - | | | | 0.47 | - | - | | | | 0.00 | - | | | | | | | | | SC | 4 | 2.25 | 4.16 | 2.51 | | | | 1.05 | 5.83 | 2.38 | | | | 2.34 | 4.43 | 3.63 | | | | | 4.17 | 0.58 | | | | | | | | | 5 | 3.90 | 2.99 | 0.00 | | | | 1.76 | 2.33 | 0.00 | | | | 5.05 | 2.95 | 0.00 | | | | 6.67 | 1.54 | 0.00 | | | | | | | | | 6 | 2.01 | 3.26 | 0.00 | | | | 4.47 | 0.09 | 0.00 | | | | 4.69 | 1.10 | 0.00 | | | | 1.96 | - | | | | | | | 7 | 2.28 | 1.32 | 0.00 | | | | 1.92 | 0.89 | 0.00 | | | | 1.89 | 1.59 | 0.00 | | | | 1.65 | 2.17 | 0.00 | | | | | | | | | 8 | 0.97 | 1.75 | 0.00 | | | | 1.91 | 1.48 | 0.00 | | | | 2.71 | 1.91 | 0.00 | | | | 1.22 | 2.33 | 0.00 | fital TABLEAU 3 REPONSE ANTICORPS ANTI-LHRH NESUREE PARLE TAUX DE FIXATION DE LHRH MAROUEE A L'IODE 125 RECHERCHE DES ANTICORPS ANTI-LHRH DANS LE SERUH (DIL. 1/50) | | TITRE (S/T=502) TEHPS (SEH.) | D LY56-LHRH-PDP-HSR/REl 0.5 g (A1) | D LY56-LHRH-PDP-HSA/RE1 6 G (A2) | A1 | Mo porcs No porcs | No porcs | 211 219 231 243 257 | 205 221 227 245 251 | 221 | | | T0 lere inj. | | T3 | 0 0 0 0 0 | 0 71.8 0 0 0 | 150 T4 | 0 0 0 0 0 | 0 67.3 0 0 0 | 100 T5 2eNe inj. | 0 0 0 0 0 | 0 53.4 0 0 0 | 50 T6 | 0 0 0 0 0 | 17.2 58.5 42.1 6.6 0 | 55 T7 | 0 0 0 0 0 | 7.5 48.5 36.7 5 0 | T8 | 0 0 0 0 0 | 7.7 44.1 28.8 5 0 | T9 | 0 0 0 0 0 | 5 37.5 22.6 5 0 | TEHPS (SEH.) | LHRH-CCARBO)-HSA/RE 1 0,150 mg(B1) | LHRH-@CARSD)-HSA/RE1 1,2mg (B2) | B1 B2 | Mo porcs | No porcs | No porcs No porcs | 213 225 247 255 261| 209 215 235 211 259 | 247 235 259 | | | T0 lere inj. | T3 | 0 0 0 0 0| 0 0 0 0 0 | T4 | 0 0 0 0 0| 0 0 0 0 0 | T5 2eMe inj. | 0 0 0 0 0| 0 0 0 0 0 | T6 | 0 0 S1.2 5 25.1| 48.9 56.2 78.2 51.4 90.1 | 200 130 990 T7 | 0 0 S1.7 5 49.1| 64.7 49.9 86.3 52.3 92.9 | T8 | 0 0 S0.5 5 36.5| 54.1 48.9 80.7 59.3 90.5 | 150 140 640 T9 | 0 0 74.4 5 34.5| 54.4 40.1 68.5 51.8 89.1 | 220 220 490 A2 :Essai comparatif de deux vaccins anti-LHRH composés respectivement d'un conjugué LHRH-&alpha;-globuline par le carbodiimide et d'un conjugué (D-Lys6)-LHRH- t-globuline par le SPDP mis en émulsion huile-dans-l'eau et administrés par voie intramusculaire (IM) ou transcutanée (ID) chez le porc. A2.1 Préparation de conjugué D-Lys6) -LHRH-&alpha;- globuline par le SPDP La méthode décrite dans l'exemple Al est employée exactement de la même façon, mais en remplaçant l'albumine à 10 mg/ml par l'o(-globuline à 6 mg/ml. Le rendement global en (D-Lys6)-LHRH couplée est de l'ordre de 45 à 50 %. Par ailleurs il est possible de modifier à volonté le degré de substitution de l' o(-globuline, donc le niveau de conjugaison, en jouant sur les concentrations en SPDP et/ou en &alpha;-globuline lors de la préparation de la MP-&alpha;- globuline. A2.2 Préparation de conjugué LHRH-ci -globuline humaine, par le carbodiimide (EDC). La méthode décrite dans l'exemple Al est employée exactement de la même façon mais en remplaçant l'albumine humaine par 1' &alpha;-globuline humaine. Le niveau de conjugaison est de 24 à 28 mg de LHRH fixée pour 100 mg d' i-globuline humaine. A3.3 L'efficacité du vaccin à base du conjugué LHRH-&alpha;-globuline par le carbodiimide est supérieure au second. L'efficacité est exprimée par le nombre d'animaux présentant une disparition totale de la testostérone plasmatique (tableau 4). Tableau 4 LHRH-&alpha;-glob.EDC (1,2 mg) |D-Lys6 |-LHRH-&alpha;-glob.SPDP (6 mg) IM + ID IM + ID Suppression de 5/10 2/10 testostérone A.3 Prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH conjugué par le carbodiimide ou de son agoniste (D-Lys6) LHRH conjugué par le SPDP sur 1' d-globuline humaine. Elle est déterminée par la comparaison des pourcentages de fixation des sérums anti-LHRH et anti-(D Lys6)-LHRH par deux fragments marqués de LHRH, respectivement LHRH (3-10) délété de sa fraction aminoterminale et LHRH (1-10) sous forme d'acide libre et de ce fait délété de la fraction amide de sa fraction carboxyterminale naturelle. Ces deux fractions reconnaissent respectivement plus particulièrement les anticorps dirigés contre les fractions carboxyterminale d'une part, et aminoterminale d'autre part. La prédominance de la réponse à la fraction carboxyterminale du peptide se traduit par un nombre d'animaux présentant des anticorps ne fixant que le peptide LHRH (3-10) à l'exclusion de la fixation de LHRH acide libre (10/58 pour le sérum anti-LHRH et 3/10 pour le sérum anti-(D-Lys6)-LHRH). Aucun sérum n'a montré de fixation à 100 % de la fraction LKRH acide libre, laquelle traduirait une reconnaissance exclusive de la fraction aminoterminale. Les réponses mixtes, les plus fréquentes, montrent une meilleure reconnaissance de la fraction aminoterminale par les sérums anti-(D-Lys6)-LHRH que celle des sérums anti LHRH. Chez ces derniers, seuls 3 sérums sur 58 ont une reconnaissance supérieure à 40 % de la fraction aminoterminale, contre 4 sur 10 pour le sérum anti-(D Lys6)-LHRH. B. Plus grande activité immunogène du conjugué LHRH-&alpha;-globuline réalisé par le cabodiimide, comparée à celle qui est obtenue par le conjugué préparé avec le glutaraldéhyde. B.1 Préparation du conjugué LHRH-d -globuline par le glutaraldéhyde. A 10 mg de LHRH et 50 mg d'ok-globuline humaine (Serva) dissous dans 5 ml de tampon phosphate O,lM pH 7,5 sont ajoutés, goutte à goutte et sur une durée de 30 mn, 2,5 ml de solution de glutaraldéhyde à 10 mg/ml, en agitant doucement après chaque addition. Après avoir laissé le mélange 2,5 h à température ambiante, la réaction est arrêtée par addition de 25 mg de bisulfite de sodium dissous dans 0,5 ml d'eau. Le conjugué est dialysé à 4 C contre le tampon NaCl 150mM-phosphate 10mM pH 7,5, puis est concentré par ultrafiltration. B.2 Essai comparatif sur le porc de vaccins anti-LHRH formulés à l'aide de quantités identiques de LHRH conjuguée. L'efficacité est exprimee par le nombre d'animaux présentant une disparition totale de la testostérone plasmatique (tableau 7). Tableau 7 LHRH-&alpha;-glo. par carbodiimide LffRH-a-glo. par glutaraldéhyde administration IM ou ID administration IM ou ID Suppression de testostérone 5/10 0/10 plasmatique C. Plus grande activité immunogène du conjugué utilisant 1' &alpha;-globuline humaine comparée à celle qui est obtenue par le conjugué utilisant de la sérumalbumine humaine. L'efficacité est exprimée par le nombre d'animaux présentant une disparition totale de la testostérone plasmatique (tableau 8). Tableau 8 Essais sur porcs - injection intramusculaire LHRH-HSA par carbodiimide LHRH-a-glo. par carbodiimide Suppression de testostérone 0/5 3/5 plasmatique D. Activité immunogène du conjugué utilisant 1' o(globuline équine, fraction IV-1, équivalente à celle qui est obtenue par le conjugué utilisant 1' &alpha;-globuline humaine. D.1 Préparation de conjugué LHRH-O(-globuline équine par le carbodiimide. La méthode décrite dans l'exemple Al est employée exactement de la même façon, mais en remplaçant l'albumine humaine par l'&alpha;-globuline équine (fraction IV-1). D.2 Administration chez le rat par voie sous-cutanée à 2 reprises à 4 semaines d'intervalle d'un vaccin à la dose de l2jLg de LHRH conjuguée à 1' &alpha; globuline humaine ou équine. Tableau 9 Essais sur rats LHRH-a-globuLine humaine LHRH--globuline équine fraction IV-1 fraction IV-1 par carbodiimide par carbodiimide Suppression de la testostérone plasmatique 12/12 12/12 E. Plus grande activité adjuvante de l'émulsion eaudans-l'huile de l'invention sur d'autres émulsions (tableau 10). Essais sur le porc en utilisant le même conjugué composé de la LHRH et de 1' &alpha;-globuline humaine par le carbodiimide et administré à la même dose sous un même volume par la voie transcutanée en 5 points. Les émulsions examinées sont : une émulsion fluide huile-dans-l'eau (B), l'émulsion de l'invention (formule C du tableau), une émulsion du commerce à diluer avec l'antigène (E), une phase huileuse à émulsionner avec le conjugué (F). Pour toutes ces formules, la quantité finale d'antigène par dose est la même. Les émulsions sont réalisées dans les conditions habituelles pour ceux experts en formulation de ce type. Tableau 10 Mulsions B C E F Suppression de la testostérone 2/5 4/4 1/5 3/5 plasmatique Nombre d'animaux présentant une concentration de 2/5 4/4 3/5 3/5 1' androsténone tissulaire au-dessous de 0,5 pg/g F. Efficacité de l'immunisation passive anti-LHRH pour l'amélioration des qualités organoleptiques de la viande, mesurée par l'abaissement de l'androstênone tissulaire. Tableau 11 Teneur en adrosténone du tissu adipeux chez les animaux témoins et chez ceux qui ont été soumis à l'immunoneutralisation anti-LHRH passive par un plasma hyperimmun équin anti-(D-Lys6)-LHRH administré sous un volume de 300 ml aux jours 16, 13, 9 et 5 avant abattage. Témoins Traités Nombre d'animaux présentant une concentration d'androsténone inférieure 2/5 5/5 à 0,50 yg/g de tissu adipeux (différence significative au risque a = 0,2) G. Efficacité et tolérance des formulations renfermant la LHRH conjuguée à l'o Deux essais ont été effectués en deux temps, respectivement les groupes 1, 3 et 5 pour le premier et les groupes 2 et 4 pour le second (tableaux 12 et 13). G.1 L'efficacité de l'immunoneutralisation anti-LHRH est augmentée pour un volume égal de vaccin par la multiplication des points d'administration transcutanée. Tableau 12 Groupes i 2 3 4 5 ler vaccin 1 ml 1 ml 1 ml 0,4 ml 0,4 ml (5 points) (5 points) (5 points) (10 points) (2 points) 2e vaccin 1 ml 1 ml 0,4 ml 0,4 ml 0,4 ml (5 points) (5 points) (2 points) (10 points) (2 points) Suppression ou diminution marquée | 10/12 | 10/11 | 9/12 | 11/11 | 8/11 de la testostérone (nbre d'animaux) Concentration de l'androsténone tissulaire 11/12 ND 10/23 ND ND au-dessous de 0,5 g/g (nbre d'animaux) ND : non déterminé G.2 La tolérance aux vaccins utilisés est jugée par l'évolution de la réaction inflammatoire cutanée, notée de 0 à 4 chez un animal en fonction de l'importance des papules apparaissant après l'administration ; une papule apparaît à chaque point d'administration. La sommation des notes dans chacun des groupes est résumée comme suit : note moyenne à l'issue de la première semaine qui suit l'administration (Ad. 1) et note moyenne au moment de l'abattage pour chacun des vaccins (Ab) (tableau 13). La meilleure tolérance est observée avec l'emploi des vaccins dans le groupe 4. Tableau 13 Tolérance par administration par voie transcutanée observée au cours des 2 essais effectués (essai 1 groupes 1, 3 et 5, essai 2 groupes 2 et 4). Groupes 2 3 4 5 Vaccins 1 ou 2 le vac. 2e vac. le vac. 2e vac. le vac. 2e vac le vac. 2e vac. le vac. 2e vac. Nombre de points d'administration 5 5 5 5 5 2 10 10 2 2 Al 42 11 31 11 41 16 33 11 30 10 Ab 2 4 0 0 5 3 0 0 2 0 Nombre d'animaux 12 11 12 11 11 REVENDICATIONS 1. Procédé pour améliorer les qualités organoleptiques, en particulier l'odeur, la sapidité et la tendreté, de la viande des animaux domestiques mâles non castrés, dans lequel, peu avant l'abattage de l'animal concerné, on supprime sensiblement l'action des stéroldes androgènes et non androgènes, par immunoneutralisation active ou passive anti-LHRH, tout en maintenant pratiquement jusqu a l'abattage les avantages liés au caractère mâle de l'animal. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on administre en premier lieu un vaccin anti-LHRH, puis, peu avant l'abattage de l'animal, on administre à nouveau un vaccin anti-LHRH. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on administre en premier lieu un vaccin conçu pour induire une première réponse immunitaire de faible intensité, sans effet notable, ou même mesurable, sur la sécrétion des stéroïdes gonadiques et en ce que, avant l'abattage, on administre un vaccin formulé pour produire la suppression ou l'abaissement significatif de la sécrétion des stéroldes sans réaction locale ou générale adverse, susceptible de nuire à l'apparence ou à la qualité de la viande. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le vaccin anti-LHRH administré en premier lieu l'est avant la phase d'engraissement de l'animal. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le vaccin anti LHRH administré en premier lieu est un vaccin en émulsion. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que, pour le porc, on administre, avant l'abattage, le vaccin anti-LHRH avec un adjuvant de type aqueux. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, comme adjuvant de type aqueux, on utilise du gel d'hydroxyde d'aluminium et/ou saponine. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on administre le vaccin en adjuvant aqueux de 15 à 21 jours avant l'abattage. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que, pour les bovins et les ovins, on administre, avant l'abattage, un vaccin anti-LHRH avec un adjuvant en émulsion. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on administre le vaccin en émulsion de un à deux mois avant l'abattage. 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'on administre le vaccin en émulsion de quatre semaines à plusieurs mois après l'administration faite en premier lieu. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 9 à 11, caractérisé en ce que, pour le porc, le vaccin en émulsion est un vaccin en émulsion eaudans-l'huile. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'émulsion eau-dans-l'huile est faite d'un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensioactifs non ioniques. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que l'on administre un conjugué immunogène anti-LHRH comprenant - la LHRH totale ou modifiée, - un fragment peptidique de LHRH de 5 à 7 acides aminés modifiés ou non, ou - un agonis te de la LHRH, couplé à une protéine porteuse immunogène choisie parmi - sérum albumine bovine ou humaine, - thyroglobuline, - ovalbumine, - globulines humaines ou équines. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le conjugué comprend la LHRH couplée à l'alphaglobuline équine, notamment fractions IV-1 et IV-4. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la LHRH et l'alpha-globuline sont couplées par un carbodiimide. 17. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu on administre à 11 animal, quelques jours avant l'abattage, du sérum ou du plasma hyperimmun anti-LHRH. 18. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en qu'on administre à l'animal, quelques jours avant l'abattage, des anticorps monoclonaux anti-LHRH. 19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que l'administration est faite de cinq à quinze jours avant l'abattage, par voie sous-cutanée ou intramusculaire. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 16, caractérisé en ce qu'on administre par voie transcutanée, de préférence en plusieurs points, à l'aide d'un appareil d'injection sans aiguille par jet sous pression. 21. Vaccin anti-LHRH conçu pour induire une réponse immunitaire de faible intensité, sans effet notable, ou même mesurable, sur la sécrétion des stéroïdes gonadiques et comprenant comme principe actif un conjugué alpha-globuline-LHRH. 22. Vaccin anti-LHRH conçu pour produire la suppression ou l'abaissement significatif de la sécrétion des stéroides sans réaction locale ou générale adverse, susceptible de nuire à l'apparence ou à la qualité de la viande, et comprenant comme principe actif un conjugué alpha-globuline-LHRH. 23. Vaccin anti-LHRH selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce qu'il est en émulsion eau-dans l'huile. 24. Vaccin anti-LHRH selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'émulsion comprend un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensioactifs non ioniques. 25. Vaccin anti-LHRH selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce qutil est en adjuvant aqueux. 26. Vaccin anti-LHRH selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comprend un gel d'hydroxyde d'aluminium et/ou saponine. 27. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 21 à 26, caractérisé en ce que le conjugué est obtenu par addition sur 1 volume de mélange alphaglobuline équine, notamment fractions IV-1 et IV-4, et LHRH totale en solution de 2 à 20 mg/ml dans NaCl 0,9 % de 0,5 à 2 volumes de solution de chlorhydrate de N-éthyl-N' (diméthylamino-3 propyl) carbodiimide en solution à 2,5 % dans NaCI 0,9 %. 28. Ensemble de vaccination anti-LHRH comprenant dans un même emballage un nombre égal de doses d'un vaccin à administrer en première injection et d'un vaccin à administrer avant l'abattage, selon l'une quelconque des revendications 21 à 27.