Brevet FR2679254A1 — publié le 19930122

SONDES OLIGONUCLEOTIDIQUES POUR LE TYPAGE ET LA DETECTION DES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS La présente invention concerne des sondes oligonucléotidiques constituées par des séquences d'acides nucléiques dérivant de l'Acide Désoxyribonucléique (ADN) d'au moins un papillomavirus humain (PVH), utiles pour le typage et la détection desdits PVH. Les papillomavirus sont associés à un grand nombre d'infections virales plus ou moins graves; certains PVH infectent spécifiquement l'épiderme, d'autres infectent les muqueuses génitales, orales ou laryngées. Si la plupart des PVH provoquent des lésions bénignes telles que les verrues cutanées, d'autres sont responsables de lésions précancéreuses, telles que les néoplasies cutanées se développant chez des patients atteints d'épidermodysplasie verruciforme, telles que les néoplasies intra-épithéliales. En ce qui concerne les infections génitales, les papillomavirus de types 16 (PVH 16) et 18 (PVH 18) sont généralement associés à des dysplasies sévères, des cancers cervicaux et des carcinomes; de même, mais moins communément, pour les papillomavirus de types 31, 33, 35 ou 51.Par contre, les papillomavirus de types 6 et 11 sont le plus souvent associés à des lésions de type condylome acuminé ou des dysplasies légères. Plus de 60 types de PVH ont été décrits. Ils s'agit dans tout les cas de virus de petite taille, dont la capside contient une molécule d'ADN double brin constituée d'environ 8 000 paires de bases. Leur classification est basée sur la comparaison des ADN viraux par hybridation moléculaire dans des conditions stringentes; par convention, un PVH constitue un nouveau type si son ADN montre une homologie inférieure à 50 % avec 1'ADN des autres PVH. Les techniques de clonage d'ADN recombinant ont permis d'isoler et de purifier 1'ADN de plusieurs types de PVH, notamment ceux de PVH 6, 11, 16 et 18 (DURST M. et al., Proc. Natl. Acad., USA (1983), 80 : 312; BOSHART M. et al., EMBO J. (1984), 3 : 1151; DE VILLIERS E.-M. et al., J. Virol. (1981), 40 : 932; GISSMANN L. et al., J. Virol. (1982), 44 : 393; LORINCZ A. T. et al., J. Virol. (1986), 58 : 225; BEAUDEMON S. et al., Nature. (1986), 321 : 246). Les connaissances actuelles sur les PVH résultent en grande partie de l'étude de la séquence nucléique de ces ADN, ainsi que de leur utilisation pour préparer des sondes nucléiques pour le typage et la détection des papillomavirus dans des échantillons par hybridation. La détection des PVH par des méthodes immunologiques n'est pas adaptée car les antigènes de capsides ne sont pas spécifiques du type de PVH et ces antigènes sont peu ou pas exprimés dans certains stades de l'infection. En outre, les papillomavirus ne peuvent être cultivés in vitro. Ce sont les raisons pour lesquelles la détection par hybridation moléculaire est le meilleur moyen de détecter et typer les papillomavirus. Cette détection et ce typage peuvent être réalisés soit par hybridation sur plaque ou membrane en dot lot ou par la méthode de Southern à partir de grattages des cellules cervicales ou de biopsies (PAO CC et al., Journal of Clinical Microbiology. (1989), 27 :168-173; INOUE M. et al., Journal of Virologicals Methods. (1989), 26 : 159-170; WEBB DH. et al., Journal of Infectious diseases. (1987), 156 n06 : 912-919; HALLAM N. et al., Journal of Medical Virology (1989), 27 : 317-321; MELCHERS W. J.G. et al., Journal of Medical Virology. (1988), 25 : 11-16), soit par hybridation in situ sur des lames réalisées partir de biopsies ou de cellules provenant de frottis (SYRJANEN S. et al., Journal of Virology Methods. (1988), 19:225-238; LEWIS FA. et al., Journal Of Clinical Pathol. (1987), 40 : 163-166; BURNS J. et al., Journal of Clinical Pathol. (1987), 40 : 858-864). Des tests de dépistage et/ou de typage en hybridation in situ ont été décrits notamment dans les demandes de brevets européens NO 294 659, 192 001 et 370 625. La plupart de ces tests repose sur l'utilisation de sondes correspondant au génome entier ou à une grande part du génome du virus, d'autres font appel à l'utilisation d'oligonucléotides comme amorces dans un processus d'amplification d'une séquence nucléique in vitro connu sous le nom de PCR ("Polymerase Chain Reaction" décrit par la Société CETUS CORPORATION) (MORRIS B. J. et al., Journal of Medical Virology. (1990), 32 : 22-30; RAKOCZY P. et al., Journal of Medical Virology. (1990), 32 : 10-17; MELCHERS W. J. M. et al., Journal of Medical Virology. (1989), 27 : 329335; DALLAS P. et al., Journal of Medical Virology. (1989), 27 : 105-111). La demande de brevet européen NO 301 968 au nom de IRE-CELLTARG S.A. décrit des sondes d'acides nucléiques utiles pour détecter indifféremment les différents types de papillomavirus humain. Les travaux menés par la Demanderesse sur les génomes de plusieurs types de PVH ont permis de déterminer des séquences oligonucléotidiques comprenant entre 20 et 30 bases et présentant des caractéristiques qui ont permis de préparer des sondes oligonucléotidiques utiles pour la détection et le typage, selon des procédés d'hybridation, des PVH, plus particulièrement des PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33, avec ou sans recours à une amplification de type PCR. Les sondes de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent tout ou partie d'au moins une des séquences de formules suivantes (5') CGGTGGACCGGTCGATGTATGT (3') (I) (5') CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG (3') (Il) (5') ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC (3') (III) (5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (1V) (5') GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3') (V) (5') CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (3') (VI) (5') TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') (VII) (5') TATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGA (3') (VIII) Dans ces formules les lettres représentent les nucléotides suivants : A pour la base adénine, C pour la base cytosine, G pour la base guanine et T pour la base thymine; (5') et (3') indiquent les extrémités 5' et 3' de l'oligonucléotide. Chacune des séquences des oligonucléotides de formules (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII) et (VIII) correspond à un fragment de l'ADN d'au moins un PVH, notamment de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33. En conséquence, l'invention a plus particulièrement pour objet des sondes oligonucléotidiques permettant dans des conditions d'hybridation adaptées, soit le dépistage en général des PVH impliqués dans les lésions génitales, soit la détection spécifique de PVH 6, PVH 11, PVH 16 et PVH 18 qui sont les plus fréquemment rencontrés et PVH 31 et PVH 33 qui sont moins fréquents. I1 sera fait référence dans ce qui suit aux figures annexées dans lesquelles - la figure 1 représente la séquence nucléotidique de 1'ADN de PVH6, - la figure 2 représente la séquence nucléotidique de 1'ADN de PVH11, - la figure 3 représente la séquence nucléotidique de 1'ADN de PVH16, - la figure 4 représente la séquence nucléotidique de 1'ADN de PVH18, - la figure 5 représente la séquence nucléotidique de 1'ADN de PVH31, - la figure 6 représente la séquence nucléotidique de 1'ADN de PVH33. Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante 5' CGGTGGACCGGTCGATGTATGT 3 t (I) L'oligonucléotide de formule (I) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 16 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 494 à 515. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (I), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (I) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16. Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16 dans un échantillon biologique, est constituée de la séquence de formule suivante 5' CGGTGGACCGGTCGATGTATGT 3' (I) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16, PVH 31 et PVH 33 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante 5' CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG 3' (Il) L'oligonucléotide de formule (II) est issu de la séquence de 1'ADN de PVH 16 et de la séquence de l'ADN de PVH 33. Il présente une homologie de 100 % avec le fragment de 1'ADN de PVH 16 délimité par les nucléotides situés aux positions 1273 à 1295, et une homologie de 100 % avec le fragment de 1'ADN de PVH 33 délimité par les nucléotides situés aux positions 1285 et 1307.En outre l'oligonucléotide de formule (II) ne diffère que d'une base avec le fragment de 1'ADN de PVH 31 délimité par les nucléotides situés aux positions 1268 à 1290. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (Il), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (II) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16, PVH 31 et PVH 33. Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16, PVH 31 et PVH 33 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante 5' CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG 3' (Il) Une sondes selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16 et PVH 18 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante 5' ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC 3' (III) L'oligonucléotide de formule (III) est issu de la séquence de 1'ADN de PVH 18 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de 1'ADN de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 1009 à 1032. En outre l'oligonucléotide de formule (III) ne diffère que de 2 bases avec le fragment de l'ADN de PVH 16 délimité par les nucléotides situés aux positions 963 à 986.Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (III), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (III) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16 et PVH 18. Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16 et PVH 18 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante 5' ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC 3' (III) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 18 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante (5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (IV) L'oligonucléotide de formule (IV) est issu de la séquence de 1'ADN de PVH 18 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de l'ADN de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 673 à 694. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (IV), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (IV) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 18. Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 18 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante (5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (IV) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 6 et PVH 11 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante (5') GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3') (V) L'oligonucléotide de formule (V) est issu de la séquence de 1'ADN de PVH 6 et de la séquence de l1ADN de PVH 11. I1 présente une homologie de 100 % avec les fragments de 1'ADN de PVH 6 et PVH 11 délimités par les nucléotides situés aux positions 584 à 605.Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (V), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (V) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 6 et PVH 11. Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 6 et PVH 11 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante (5 t ) GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3') (V) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 6 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante (5') CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (3') (VI) L'oligonucléotide de formule (VI) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 6 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 1250 à 1272. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (VI), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (VI) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 6. Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection de PVH 6 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante (5') CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (3') (VI) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33, comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante (5') TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') (VII) L'oligonucléotide de formule (VII) est issu de la séquence de 1'ADN de PVH 16 et présente une homologie de 100 * avec le fragment de 1'ADN de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 7012 à 7036. En outre l'oligonucléotide de formule (VII) présente plus de 80 % d'homologie avec un fragment de l'ADN de PVH 6, PVH 11, PVH 31 et PVH 33, et 76 % d'homologie avec un fragment de 1'ADN de PVH 18.Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (VII), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (VII) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16. Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33 dans un échantillon biologique, est constituée de la séquence de formule suivante (5') TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') (VII) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33, comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante (5') TATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGA (3') (VIII) L'oligonucléotide de formule (VIII) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 16 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 634 à 659.En outre, ltoligonucléotide de formule (VIII) présente plus de 88 % d'homologie avec un fragment de 1'ADN de PVH 6, PVH 11, PVH 31 et PVH 33, et 60 % d'homologie avec un fragment de 1'ADN de PVH 18. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (VIII), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (VIII) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16. Les sondes constituées par les séquences oligonucléotidiques de formules I, II, III, IV, V et VI permettent respectivement, dans des conditions d'hybridation appropriées, la détection spécifique de PVH 16, PVH 16/31/33, PVH 18/16, PVH 18, PVH 6/11 et PVH 6. Les sondes constituées par les séquences oligonucléotidiques de formules VII et VIII permettent dans les mêmes conditions d'hybridation le dépistage de l'un de ces PVH L'invention concerne naturellement aussi les sondes oligonucléotidiques complémentaires des précédentes et donc capables de s'apparier avec la même portion d'ADN de PVH en raison de sa nature bicaténaire. Font aussi partie de l'invention les sondes oligonucléotidiques précédentes dans la séquence desquelles les thymines sont remplacées par des uraciles ou dans lesquelles une des quatre bases est remplacée par une inosine. L'invention concerne également toute sonde ne se distinguant des précédentes au niveau de la séquence oligonucléotidique que par additions et/ou suppressions et/ou substitutions d'un ou plusieurs nucléotides, dès lors que celles-ci n'entraînent pas de modification des propriétés d'hybridation desdites sondes. L'invention a aussi pour objet toute association des sondes oligonucléotidiques précédentes entre elles ou avec des sondes déjà connues, pour un dépistage ou un typage spécifique des PVH; de tels mélanges permettent d'améliorer la sensibilité et la spécificité de détection afin d'obtenir une meilleure discrimination des infections à papillomavirus. L'invention vise en outre tout acide nucléique recombinant contenant tout ou partie d'au moins une des séquences oligonucléotidiques des sondes de l'invention, ainsi que les sondes préparées à partir de ces acides nucléiques recombinants. Les sondes de 1 t invention sont utilisées avec des milieux d'hybridation et selon des conditions d'hybridation adaptés au dépistage ou au typage des PVH. Des milieux et conditions d'hybridation préférés seront décrits dans les exemples ci-après et peuvent être modifiés sans affecter les propriétés d'appariement des sondes et des ADN des PVH; notamment les conditions de température et de lavage peuvent être modifiées entre 180C, 25 OC et 37 OC, ainsi que le pourcentage de formamide, en liaison ou non avec la température d'hybridation. Les sondes de l'invention sont utilisées dans des procédés d'hybridation pour le typage et la détection de PVH contenus dans dans un échantillon biologique. De tels procédés comprennent la mise en contact dtune sonde de l'invention ou d'un mélange de ces sondes avec l'échantillon biologique traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzymes de restriction, puis hybridés dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et ltADN cible de PVH contenu dans I é l'échantillon. La détection est réalisée à l'aide de tout moyen approprié pour mettre en évidence ledit hybride.Ces procédés peuvent être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration. L'ADN extrait peut également, préalablement à l'hybridation avec les sondes de l'invention, être amplifié selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase et d'amorces spécifiques des PVH à typer, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN cible, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Un aliquot du produit d'amplification est prélevé et traité dans les conditions décrites ci-après. Selon un protocole préféré, les produits d'amplification sont placés dans les puits des plaques de microtitration pendant une nuit à température ambiante, avant d'être mis en contact avec une sonde de l'invention, spécifique du fragment à amplifier. Selon un autre mode de réalisation d'un procédé d'hybridation selon l'invention, des coupes histologiques sont réalisées à partir du prélèvement biologique et la sonde ou le mélange de sondes de l'invention sont mis en contact directement avec lesdites coupes histologiques pour la détection de 1'ADN de PVH par hybridation in situ. Avantageusement, les sondes oligonucléotidiques de l'invention sont marquées par tout marqueur classiquement utilisé. Les sondes peuvent être marquées à l'aide d'un traceur radioactif comme 32p, 3sus, 125I, 3H, 14C. Le marquage radioactif peut être réalisé selon une méthode quelconque connue de l'homme du métier. Les sondes peuvent être marquées en (3') par addition d'un ou plusieurs déoxyribonucléotides ou ribonucléotides ou d'un analogue de nucléotide tel qu'un didéoxynucléotide, marqués en position alpha par le 32p, en présence de la Déoxynucléotidyl Terminal Transférase; les sondes peuvent également être marquées en (5') à l'aide d'une kinase, par exemple la T4 Polynucléotide Kinase; il s'agit dans ce cas du transfert sur la sonde du phosphate radioactif d'un nucléotide marqué en position gamma. Les sondes peuvent encore être marquées à chaque extrémité par adjonction d'une séquence quelconque radiomarquée en présence d'une ligase. Les sondes peuvent aussi être marquées par "Random Priming" ou également lors de leur synthèse chimique en y incorporant un ou plusieurs ribonucléotides ou déoxyribonucléotides radioactifs. La méthode de détection de l'hybridation dépendra du marqueur radioactif utilisé et pourra reposer sur l'autoradiographie, la scintillation liquide, le comptage de rayonnement gamma ou tout autre technique permettant de détecter le rayonnement émis par le marqueur radioactif. Un marquage non radioactif peut également être utilisé, en associant aux sondes de l'invention des groupements présentant des propriétés immunologiques, comme un antigène ou un haptène, une affinité spécifique pour certains réactifs comme un ligand, des propriétés permettant la complétion de réactions enzymatiques comme une enzyme ou un substrat d'enzyme. les sondes peuvent être marquées par "Random Priming" ou lors de la synthèse chimique en incorporant un ou plusieurs ribonucléotides ou déoxyribonucléotides marqués non radioactivement. Le marquage non radioactif peut encore être réalisé par incorporation à l'extrémité 3' d'un ou plusieurs déoxyribonucléotides ou ribonucléotides ou d'un analogue de nucléotide tel qu'un didéoxynucléotide comportant l'un de ces groupements.Le marquage peut aussi être fait directement par modification chimique de l'oligonucléotide, comme la photobiotinylation ou la sulfonation. Il peut également être réalisé par addition en 3' ou 5' de molécules traceuses par réaction chimique après synthèse; les sondes peuvent encore être marquées à chaque extrémité par adjonction d'une séquence quelconque portant des molécules traceuses, en présence d'une ligase. La méthode de détection et de révélation de l'hybridation dépendra du marqueur non radioactif utilisé. L'invention a également pour objet des kits pour la mise en oeuvre des procédés de détection et de typage des PVH in vitro définis ci-dessus. A titre d'exemple, de tels kits comprennent notamment - un milieu permettant le traitement de l'échantillon à tester, - une quantité déterminée d'une sonde ou d'un mélange de sondes conformes à l'invention, - un milieu approprié à la réalisation d'une réaction d'hybridation entre 1'ADN de PVH et lesdites sondes, - des réactifs permettant la détection des hybrides formés entre ltADN de PVH et ladite sonde lors de la réaction d'hybridation. Outre les caractéristiques qui précèdent, l'invention comporte d'autres caractéristiques qui apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfèrent à des exemples de réalisation et de mise en oeuvre de la présente invention, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications. I - PréParation des cellules Les différentes études réalisées pour contrôler la sensibilité et la spécificité de détection des sondes oligonucléotidiques sélectionnées ont été réalisées sur les lignées cellulaires CaSki et HeLa ou SiHa contenant respectivement 1000-500 copies de PVH 16, 50-10 copies de PVH 18 et 10-1 copies de PVH 16 par cellule. Les cellules sont cultivées sur monocouche en milieu DMEM (Dulbecco - modified Eagle minimum essential medium) contenant 10 % de sérum de veau foetal. Les cellules sont comptées, centrifugées et resuspendues dans 100 Wl de tampon 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl. Elles sont traitées pendant 1 heure à 60 OC en présence de protéinase K, 1 % SDS. Après arrêt de la réaction, 1'ADN est précipité à l'alcool, puis resuspendu dans 20 Fl de tampon Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Na4EDTA. II - PréParation et marquage des sondes Les oligonucléotides de formules I, II, III, IV, V, VI, VII et VIII sont préparés par synthèse chimique. Ils sont marqués en 5' avec une molécule traceuse, en ajoutant un cycle lors de la synthèse chimique afin d'introduire un bras aminolinker en 5'. Dans le protocole préféré, la molécule incorporée est une biotine. Elle est ajoutée par traitement de l'oligonucléotide aminolinker avec du N-hydroxysuccinimide biotine pendant une nuit à température ambiante. La purification de l'oligonucléotide marqué est réalisée par précipitation à l'ethanol. Lorsque la sonde est marquée en 3', le marquage est réalisé par incubation en présence de désoxynucléotidyl terminal transférase, selon le protocole décrit par RILEY et al.(DNA. (1986), 5 : 333337) et KUMAR et al. (Anal. Biochem.(1988), 169 : 376382). III - PréParation des échantillons pour hybridation en dot. en Southern e n .filtration sur membrane ou sur plaque d e microtitration Les cellules prélevées sur les patients sont diluées dans un tampon de transport contenant 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl puis centrifugées. Le culot est repris dans 100 1 du tampon Tris décrit ci-dessus et traité pendant 1 heure en présence de 500 fg/ml de protéinase K, 1 % SDS, à 60 OC. La composition du tampon et la température de digestion protéolytique sont données à titre d'exemple. Selon le type de support utilisé pour l'hybridation, les cellules lysées sont utilisées dans le test de dépistage ou de typage après arrêt de la réaction ou 1'ADN est précipité à l'ethanol, puis resuspendu dans 20 1 de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Na4EDTA. IV - Rybridation en dot ou en Southern 1) Préparation de la membrane pour le dot L'ADN est déposé sur une membrane de nitrocellulose ou sur une membrane de Nylon chargée ou non. Dans le protocole préféré, une membrane Nylon est utilisée. Après séchage, 1'ADN est traité afin d'être dénaturé par une solution telle que 0,4 M NaOH, 0,6 M NaCl pendant 10 minutes, puis neutralisé à l'aide d'une solution telle que 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl pendant 10 minutes. Après séchage, la membrane est traitée aux W afin de fixer 1'ADN. 2) Préparation des échantillons et de la membrane pour le Southern L'ADN est déposé sur un gel d'agarose après digestion enzymatique à l'aide d'enzymes de restriction. Après électrophorèse et coloration du gel au bromure d'éthidium afin de visualiser les fragments de restriction obtenus, le gel est traité pendant 30 minutes dans une solution de 0,4 M NaOH, 0,6 M NaCl, puis pendant 30 minutes dans une solution de 0,5 M Tris HC1 pH 7,5, 1,5 M NaCl. L'ADN est transféré du gel sur une membrane de nitrocellulose ou sur une membrane de Nylon chargée ou non, par transfert actif de type Southern ou par transfert passif. Dans le protocole préféré la membrane Nylon utilisée est fixée aux UV pendant 10 minutes après séchage. 3) Hybridation La membrane est préhybridée pendant 15 minutes à température ambiante en présence du milieu d'hybridation contenant par exemple 45 % formamide, 6 x SSC, 0,1 % SDS, 1 x Denhart et 100 Ag/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. Le tampon SSC est défini comme suit : 1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3citrate, pH 7. La solution de Denhart est définie comme suit : 50 x Denhart = 1 % Ficoll, 1 % polyvinylpyrrolidone, 1 % BSA. Le Denhart peut également être associé à ou remplacé par du PEG ou du Dextran Sulfate. La ou les sondes oligonucléotidiques marquées sont ajoutées à une concentration comprise entre 10 et 1000 ng/ml selon la molécule traceuse utilisée. Dans l'exemple cité précédemment la concentration est de 100 ng/ml. L'hybridation est réalisée à 18 OC pendant une heure. Après rinçage rapide dans un tampon contenant SSC et SDS, par exemple 1 x SSC, 0,1 % SDS, trois lavages de 10 minutes sont réalisés avec cette même solution à température ambiante sous agitation. La membrane, rincée en tampon TEN (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl) est prête pour l'étape de détection. 4) Détection La membrane est bloquée avec une solution contenant du lait écrémé, par exemple 0,3 g/ml et de l'héparine. La concentration de celle-ci peut être de 100 Rg/ml dans le tampon TEN. L'incubation est réalisée préférentiellement pendant 15 minutes. Un conjugué reconnaissant la molécule traceuse fixée à la sonde, ou un substrat si la molécule en question est une enzyme, est ajouté. Dans le protocole préféré, la molécule traceuse est la biotine. Le conjugué utilisé est donc composé d'une molécule de streptavidine, d'avidine ou encore d'un anticorps anti-biotine, couplé à une enzyme, par exemple la peroxydase ou avec des molécules fluorescentes, telles que le FITC ou l'or colloïdal. Dans le protocole préféré, la streptavidine est utilisée conjuguée à la phosphatase alcaline. Le conjugué streptavidine phosphatase alcaline est incubé pendant 7 minutes 30 à température ambiante à une concentration de 40 fg/ml. Après rinçage rapide dans une solution contenant 0,1 M Na sulfate et 0,3 % d'une solution 30 % de BRIJ 35, trois lavages de 15 minutes sont effectués avec cette même solution à température ambiante. 5) Révélation Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine phosphatase alcaline, différents substrats de la phosphatase alcaline peuvent être utilisés tels que le 4-bromo-5-chloro-indolylphosphate (BCIP) associé ou non avec du nitro bleu de tétrazolium (NBT) ou du naphtol phosphate et du fast red ou encore d'autres molécules présentant une liaison pouvant être hydrolysée par la phosphatase alcaline. Si le substrat est NBT/BCIP, la membrane est recouverte du tampon de révélation, 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgC12 en présence de 0,33 mg/ml de NBT et de 0,17 mg/ml de BCIP. Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine peroxydase, différentes associations de substrats peuvent être utilisées, telles que l'eau oxygénée et la tétraméthylbenzidine ou encore l'eau oxygénée et l'aminoéthylcarbazole. V - Hybridation en filtration sur membrane 1) Préparation de la membrane L'ADN est traité afin d'être dénaturé, par une solution concentrée de NaOH pour obtenir une concentration finale de 0,4 M. Après 10 minutes de traitement à température ambiante, 1'ADN est déposé sur une membrane de nitrocellulose ou de Nylon, chargée ou non. Cette membrane est elle-même adaptée sur un absorbant de type POREX ou autre, le tout étant disposé dans un support plastique du type de ceux utilisés en immunofiltration. 2) Hybridation en filtration Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante. Chaque réactif est pipeté, déposé sur la membrane jusqu'à son absorption, et incubé comme suit. La membrane est préhybridée pendant 30 secondes en présence de 100 Al du milieu d'hybridation contenant par exemple 45 % formamide, 6 x SSC, 0,1 % SDS et 1 x Denhart. Le Denhart peut également être associé à ou remplacé par du PEG ou du Dextran Sulfate. L'hybridation est effectuée pendant 15 minutes en présence de 100 F1 du milieu d'hybridation contenant la ou les sondes oligonucléotidiques marquées à une concentration comprise entre 10 et 100 ng/ml selon la molécule traceuse utilisée. Dans l'exemple cité la concentration est de 50 ng/ml. Puis la membrane est lavée avec 300 pl d'une solution contenant par exemple 1 x SSC et 0,1 % SDS jusqu a complète absorption. 3) Détection en filtration La membrane est bloquée pendant 30 secondes avec 100 Al d'une solution contenant du lait écrémé, par exemple 1 g pour 100 ml d'un tampon Tris 100 mM, 150 mM NaCl, et de l'héparine à une concentration de 100 Ag/ml. Un conjugué reconnaissant la molécule traceuse fixée à la sonde, ou un substrat si ladite molécule est une enzyme, est ajouté. Selon le protocole préféré, la molécule traceuse est la biotine. Le conjugué utilisé est donc composé d'une molécule de streptavidine, avidine ou encore anticorps anti-biotine, couplée à une enzyme, par exemple la peroxydase, ou à des molécules fluorescentes comme FITC ou à l'or colloïdal. Selon le protocole préféré, la streptavidine est utilisée conjuguée à la phosphatase alcaline. Le conjugué streptavidine phosphatase alcaline peut être dilué dans la solution de blocage et incubé 30 secondes à une concentration de 6 fg/ml. La membrane est ensuite lavée avec 300 Fl d'une solution contenant 0,1 M de Na sulfate et 0,3 % d'une solution de BRIJ 35 à 30 % jusqu a complète absorption. 4) Révélation en filtration Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine phosphatase alcaline, différents substrats de la phosphatase alcaline peuvent être utilisés tels que le 4-bromo-5-chloro-indolylphosphate (BCIP) associé ou non avec du nitro bleu de tétrazolium (NBT) ou du naphtol phosphate et du fast red ou encore d'autres molécules présentant une liaison pouvant être hydrolysée par la phosphatase alcaline. Si le substrat est le NBT/BCIP, 200 Al du tampon de révélation 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 contenant 0,33 mg/ml de NBT et 0,17 mg/ml de BCIP est ajouté jusqu'à complète absorption. Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine peroxydase, différentes associations de substrats peuvent être utilisées, telles que l'eau oxygénée et la tétraméthylbenzidine ou encore l'eau oxygénée et l'aminoéthylcarbazole. VI - Hybridation in situ Ce protocole est utilisable sur des coupes congelées, des coupes en paraffine contenant des cellules épithéliales ainsi que sur des frottis cytologiques. 1) Préparation des prélèvements Les tissus sont placés dans 10 % formaline et préparés dans les 4 à 18 heures qui suivent. Ils peuvent également être fixés à l'aide des autres fixateurs classiquement utilisés en immunohistochimie, tels que PFA 4 % ou Carnoy. Les cellules lorsqu'il s'agit de frottis sont fixées préférentiellement sur les lames à l'acétone ou au Carnoy. Quand les coupes sont en paraffine, une à trois sections (de 4 à 6 Fm d'épaisseur) de spécimen sont déposées sur des lames. Qu'il s'agisse de cellules ou de coupes, les lames sont prétraitées afin de favoriser leur adhérence sur la lame. Le paraffinage des coupes est réalisé selon un protocole classique par traitement au xylène. I1 s'agit de deux bains de 5 minutes dans le xylène suivis de deux bains de 5 minutes en ethanol 100 % puis d'un séchage à température ambiante. Quand les coupes sont congelées, on applique une a trois sections (6 à 8 Fm d'épaisseur) de tissu fixé et congelé sur les lames prétraitées; puis l'on cuit les lames pendant une heure à 60 OC, on les fixe dans un bain d'acétone et on les sèche à température ambiante. 2) Traitement à la protéinase K Les lames préparées à partir de biopsies en paraffine ou congelées sont incubées en présence de protéinase K ou de pronase pendant 15 minutes à 37 OC, à une concentration dépendant du type et du temps de fixation. Une concentration de 1 Ag/ml a été utilisée dans les exemples cités ci-après pour les coupes en paraffine. L'arrêt de la réaction est effectué par trois rinçages successifs de 5 minutes dans de l'eau distillée. 3) Déshydratation des lames Les lames sont déshydratées par incubation dans deux bains successifs d'ethanol 95 et 100 %. Les lames sont séchées à température ambiante. 4) Hybridation Chaque coupe est recouverte de 25 à 30 W1 de milieu d'hybridation contenant par exemple 45 % formamide, 1 x Denhart, 6 x SSC, 100 Rg/ml d'ADN de sperme de saumon et 1 Rg/ml de sonde oligonucléotidique marquée. Le Denhart peut être associé à ou remplacé par du PEG ou du Dextran Sulfate. Les coupes sont recouvertes de lamelles et sont dénaturées par incubation pendant 10 minutes à 95 OC . Elles sont ensuite hybridées pendant 1 à 2 heures à température ambiante. Les lamelles sont enlevées et les lames sont lavées en présence de tampon SSC à une concentration pouvant varier entre 4 et 0,1 x SSC. Les lames sont rincées en 0,1 M Tris-HCl pH 7,4, 0,1 M NaCl, 10 mM MgCl2, trois fois 5 minutes à température ambiante. 5) Détection Un conjugué reconnaissant la molécule traceuse fixée sur la sonde, ou un substrat si la molécule en question est une enzyme, est ajouté. Dans le protocole préféré, la molécule traceuse est la biotine. Le conjugué utilisé est donc composé d'une molécule de streptavidine, d'avidine ou encore d'un anticorps antibiotine; couplé à une enzyme, par exemple la peroxydase ou avec des molécules fluorescentes, telles que le FITC ou ltor colloïdal. Dans le protocole préféré, la streptavidine est utilisée conjuguée à la phosphatase alcaline. Les lames sont incubées en présence de streptavidine phosphatase alcaline à 1 Fg/ml pendant 30 minutes à température ambiante puis lavées dans le tampon de révélation, 0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2. 6) Révélation Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine phosphatase alcaline, différents substrats de la phosphatase alcaline peuvent être utilisés tels que le 4-Bromo-5-chloro-indolylphosphate (BCIP) associé ou non avec du Nitro bleu de tétrazolium (NBT) ou du Naphtol phosphate et du Fast Red ou encore d'autres molécules présentant une liaison pouvant être hydrolysée par la phosphatase alcaline. Si le substrat est NBT/BCIP, la révélation est réalisée dans le tampon de révélation en présence de 0,33 mg/ml de NBT et de 0,17 mg/ml de BCIP pendant 1 à 2 heures 30 à température ambiante et à l'abri de la lumière. Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine peroxydase, différentes associations de substrats peuvent être utilisées, telles que l'eau oxygénée et la tétraméthylbenzidine ou encore l'eau oxygénée et l'aminoéthylcarbazole. VII - Hybridation sur plaque d e microtitration 1) FréParation des échantillons L'ADN extrait à partir des cellules selon le protocole décrit ci-avant est dénaturé pendant 10 minutes en présence de soude à une concentration finale 0,4 M, puis dilué en présence d'acétate d'ammonium afin d'obtenir une concentration finale de 1 M. L'ADN est ensuite déposé directement dans les plaques de microtitration à raison de 50 W1 par puits. L'ADN extrait peut également, préalablement à l'hybridation avec les sondes de l'invention, être amplifié selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase et d'amorces spécifiques des PVH à typer, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter le cycle de dénaturation de 1'ADN cible, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Un aliquot du produit d'amplification est prélevé et traité dans les conditions décrites ci-avant. Selon un protocole préféré les plaques sont incubées pendant la nuit à température ambiante. Un tel procédé d'amplification peut notamment être mis en oeuvre selon les conditions standards de PCR, avec les amorces spécifiques de PVH 16 suivantes - ACCGAAACCGGTTAGTATAAAAGC - TCATTTAATTGCTCATAACAGTAG 2) Hybridation Les puits sont vidés et 100 Fl de milieu d'hybridation sont ajoutés. Le milieu d'hybridation préféré contient 30 % formamide, 6 x SSC, 0,1 % SDS, 1 x Denhart et 100 fg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. Le Denhart peut également être associé à ou remplacé par du PEG ou du Dextran Sulfate. La sonde oligonucléotidique marquée est ajoutée à une concentration comprise entre 10 et 1000 ng/ml selon la molécule traceuse utilisée. Dans l'exemple cité, la sonde est marquée à la biotine et utilisée à une concentration de 100 ng/ml. L'hybridation est réalisée à 18 OC pendant une heure. Les puits sont vidés, rincés deux fois puis lavés une fois 15 minutes en présence d'un tampon contenant SSC et SDS, par exemple 1 x SSC et 0,1 % SDS. 3) Détection Les puits sont bloqués avec une solution contenant du lait écrémé par exemple 100 mg/ml et de l'héparine. La concentration de celle-ci peut être de 100 fg/ml dans le tampon TEN (50 mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl). L'incubation est réalisée préférentiellement pendant 15 minutes. Les puits sont vidés et 100 fl de tampon TEN contenant un conjugué reconnaissant la molécule traceuse fixée à la sonde, ou un substrat si la molécule en question est une enzyme, sont ajoutés. Dans le protocole préféré, la molécule traceuse est la biotine. Le conjugué utilisé est donc composé d'une molécule de streptavidine, d'avidine ou encore d'anticorps anti-biotine, couplé à une enzyme, par exemple la phosphatase alcaline ou la peroxydase. Dans le protocole préféré, la streptavidine est utilisée couplée à la phosphatase alcaline. Le conjugué streptavidine phophatase alcaline est incubé pendant 10 minutes à température ambiante à une concentration de 20 Rg/ml. Les puits sont vidés, rincés deux fois, puis lavés 15 minutes à température ambiante dans une solution contenant 0,1 M Na sulfate et 0,3 % d'une solution 30 % de BRIJ 35. 4) Révélation Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine phosphatase alcaline, différents substrats de la phosphatase alcaline peuvent être utilisés, tels que du p-Nitrophényl Phosphate (PNPP) ou d'autres molécules présentant une liaison pouvant être hydrolysée par la phosphatase alcaline. Si le substrat est le PNPP, une solution à 2 mg/ml de PNPP en tampon diéthanolamine (1 M diéthanolamine, pH 9,8, 0,5 mM MgC12) est ajoutée à raison de 100 A1 par puits. Cette solution est préparée extemporanément. La révélation est réalisée en 3 heures à 37 OC, à l'abri de la lumière. Lorsque le conjugue utilisé est un conjugué streptavidine peroxydase, différentes associations de substrats peuvent être utilisées tels que l'eau oxygénée et la tétraméthylbenzidine ou encore l'eau oxygénée et la O-phénylène diamine. REVENDICATIONS 1) Sonde oligonucléotidique pour le typage et la détection des papillomavirus humains, notamment de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie d'au moins une des séquences oligonucléotidiques suivantes (5') CGGTGGACCGGTCGATGTATGT (3') (I) (5') CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG (3') (II) (5') ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC (3') (III) (5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (IV) (5') GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3') (V) (5') CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (3') (VI) (5') TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') (VII) (5') TATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGA (3') (VIII) ou de leurs séquences complémentaires. 2) Sonde oligonucléotidique pour le typage et la détection de PVH 16, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonucléotidique suivante (5') CGGTGGACCGGTCGATGTATGT (3') (I) ou de sa séquence complémentaire. 3) Sonde oligonucléotidique pour le typage et la détection de PVH 16, PVH 31 et PVH 33, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonucléotidique suivante (5') CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG (3') (II) ou de sa séquence complémentaire. 4) Sonde oligonucléotidique pour le typage et la détection de PVH 16 et PVH 18, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonucléotidique de formule suivante (5') ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC (3') (III) ou de sa séquence complémentaire. 5) Sonde oligonucléotidique pour le typage et la détection de PVH 18, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonucléotidique de formule suivante (5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (IV) ou de sa séquence complémentaire. 6) Sonde nucléotidique pour le typage et la détection de PVH 6 et PVH 11, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonucléotidique de formule suivante (5') GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3') (V) ou de sa séquence complémentaire. 7) Sonde oligonucléotidique pour le typage et la détection de PVH 6, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonucléotidique de formule suivante (5') CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (3') (VI) ou de sa séquence complémentaire. 8) Sonde oligonucléotidique pour la détection des PVH, notamment PVH 6 PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonucléotidique de formule suivante (5') TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') (VII) ou de sa séquence complémentaire. 9) Sonde oligonucléotidique pour la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonucléotidique de formule suivante (5') TATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGA (3') (VIII) ou de sa séquence complémentaire. 10) Sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle est marquée radioactivement ou par un marqueur du type enzymatique, antigénique, ligand, luminescent ou fluorescent. 11) Composition pour la détection et/ou le typage des PVH, notamment de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisée en ce quelle comporte plusieurs sondes distinctes selon les revendications 1 à 10. 12) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec l'échantillon biologique préalablement traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzymes de restriction, - la réalisation d'une hybridation en dot ou Southern sur membrane entre la sonde ou le mélange de sondes et 1'ADN de PVH contenu dans l'échantillon, - la détection à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé. 13) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec l'échantillon biologique préalablement traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, - la réalisation d'une hybridation sur membrane en filtration entre la sonde ou le mélange de sondes et l'ADN de PVH contenu dans l'échantillon, - la détection en filtration à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé. 14) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec des coupes histologiques ou avec des prélèvements cytologiques réalisés à partir de l'échantillon biologique, - la réalisation in situ d'une hybridation entre la sonde ou le mélange de sondes et l'ADN de PVH contenu dans l'échantillon, - la détection à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé. 15) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec l'échantillon biologique préalablement traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, - la réalisation d'une hybridation sur plaque de microtitration entre la sonde ou le mélange de sondes et 1'ADN de PVH contenu dans l'échantillon, - la détection à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé. 16) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - l'extraction de l'ADN de PVH contenu dans les cellules de l'échantillon biologique, - l'amplification génétique dudit ADN au moyen d'amorces adaptées, - la mise en contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec 1'ADN de PVH amplifié, - la réalisation d'une hybridation sur plaque de microtitration entre la sonde ou le mélange de sondes et 1'ADN de PVH amplifié, - la détection à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé. 17) Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de typage et de détection in vitro des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33, selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend - un milieu permettant le traitement de l'échantillon à tester; - une quantité déterminée d'une sonde selon lune quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, - un milieu approprié à la réalisation d'une réaction d'hybridation entre 1'ADN de PVH et la sonde ou le mélange de sondes, - des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés lors de la réaction d 'hybridation.