Brevet FR2678636A1 — publié le 19930108

La présente invention concerne de nouvelles souches de levure modifiées par génie génétique, leur préparation, et leur utilisation pour la production de protéines recombinantes Plus particulièrement, l'invention concerne de nouvelles souches de levures du genre Kluyveromvces. Il existe un grand choix d'organismes hôtes, tels que les cellules mammifères ou les microorganismes, qui peuvent potentiellement être utilisés en vue de la production de protéines recombinantes. L'utilisation de cellules mammifères modifiées par les techniques de 1 ADN recombinant présente l'avantage de conduire à des produits très proches de ceux d'origine naturelle Cependant la culture de ces cellules est délicate, onéreuse, et ne peut être conduite que dans des volumes limités. L'emploi de microorganismes, tels que les bactéries, permet une fabrication à une échelle plus importante mais présente l'inconvénient de conduire à des produits qui, dans certains cas, diffèrent sensiblement des produits d'origine naturelle Ainsi les protéines normalement glycosylées chez l'homme ne sont pas, en général, glycosylées par les bactéries lP Berman et L A Laskey, Trends Biochem Sci, ( 1985) 10, p 51 et suivantesl Par ailleurs, les protéines humaines exprimées à haut niveau dans des bactéries telles que E coli acquièrent souvent une conformation non native qui s'accompagne d'une précipitation intracellulaire lR G. Schoner et coli, Bio Technol ( 1985), 3, p 151 et suivantes; J M Schoemaker et coll, EMBO J ( 1985), 4, p 775 et suivantesl Enfin, pour qu'un gène puisse s'ex- primer dans une bactérie, telle que E coli il est indispensable de positionner un codon initiateur ATG, générant une méthionine devant la séquence codante de la protéine mature Souvent, ce résidu n'est pas excisé par la méthionyl aminopep- tidase de E&cli lP H Seeburg et coll, 1985, 2, p 37 et suivantes; J M Schoner et coll, Proc Natl Acad Sci USA ( 1981), 81,p 5403 l La protéine obtenue présente donc un acide aminé anormal comme premier résidu, qui peut provoquer l'inhibition stérique d'une activité biologique si le début de la protéine est impliqué dans cette activité Le résidu peut également présenter un caractère immunogène néfaste à l'administration ultérieure de la protéine. L'utilisation de systèmes microbiens eucaryotes tels que les levures ou les champignons représente une alternative interessante à l'utilisation d'hôtes bactériens pour la préparation de protéines recombinantes En effet, ces organismes possèdent toutes les caractéristiques de structure et d'organisation cellulaire des organismes eucaryotes plus complexes, tels que les cellules de mammifères En particulier, les levures sont capables de réaliser les modifications post-transcriptionnelles et posttraductionnelles importantes pour l'activité de nombreuses protéines En outre, les levures sont bien connues à l'echelle industrielle: elles peuvent être cultivées à haute densité cellulaire, elles ne sont pas pathogènes, ne produisent pas d'endotoxines et sont utilisées dans lindustrie alimentaire depuis très longtemps. Les levures sont déjà utilisées comme organismes hôtes pour la production de protéines recombinantes (Cf "Yeast Genetic Engineering" Barr et al. (Eds), Butterworths, Stoneham, 1989). En particulier, les levures du genre Saccharomyces cerevisiae ont fait l'objet de nombreuses études (voir notamment EP 60057), et les systèmes employant cette levure permettent d'exprimer à des niveaux assez élevés des gènes hétérologues Toutefois, la capacité sécrétoire de S cerevisiae constitue un facteur limitant dans l'exploitation de cette levure. D'autres systèmes de production ont été développés avec les levures Pichia pastoris (EP 402 847) ou Schizosaccharomyces pombe (EP 385 391), et des études sont également effectuées sur la levure Schwanniomvces (EP 394 538). Récemment, les levures du genre Kluyveromvces ont été utilisées comme organismes hôtes pour la production de protéines recombinantes Les protéines produites par cette levure sont notamment la chymosine (EP 96 430), la thaumatine (EP 96 910), l'albumine, l'interleukine-18, le t PA et le TIMP (EP 361 991), et des dérivés de l'albumine à fonction thérapeutique (EP 413 622). Cependant, si des vecteurs d'expression relativement performants ont été développés pour l'utilisation de cette levure, aucune recherche n'a été effectuée dans le but d'améliorer les performances intrinsèques de la cellule utilisée En particulier, il existe de nombreuses espèces de levures du genre Kluyveromyces, et, au sein de ces espèces, de nombreuses souches différentes La Demanderesse a maintenant montré que ces différentes souches se comportaient de manière très hétérogène pour la production de protéines recombinantes, certaines d'entre-elles étant totalement inutilisables. La présente invention résulte de l'identification d'une souche de levure taxonomiquement apparentée à l'espèce Kluyveromvces lactis possédant des propriétés particulièrement avantageuses pour la production de protéines recombinantes. La présente invention décrit ainsi lobtention de souches de levures modifiées par génie génétique, pouvant être cultivées en masse, et capables de produire efficacement, et éventuellement de sécréter dans le milieu de culture, des protéines recombinantes biologiquement actives. Un aspect de linvention concerne donc de nouvelles souches de levure pour la production de protéines recombinantes Plus précisément, un objet de l'invention concerne une cellule hôte pour la production de protéines recombinantes caractérisée en ce qu'il s'agit de la levure K lactis CBS 293 91 ou d'un dérivé ou mutant de celle-ci, contenant un fragment d'ADN hétérologue comprenant un gêne de structure et des signaux permettant son expression. Au sens de la présente invention, on entend par dérivé ou mutant, toute souche obtenue à partir de K lactis CBS 293 91 capable d'être utilisée pour la production de protéines recombinantes En particulier, de tels dérivés ou mutants peuvent être obtenus par modifications génétiques (altérations au niveau de l'ADN) ou biochimiques A cet effet, différents outils de mutagénèse peuvent être utilisés, comme par exemple des outils non-spécifiques: agents physiques (rayons X, rayons ultra-violet) ou, agents chimiques (agents alkylants ou bialkylants, agents intercalants ou des outils spécifiques tels que les systèmes d'insertions mutationnelles dirigées sur l'ADN (transposons, rétrotransposons, plasmides intégratifs, etc). Un exemple de tels dérivés est constitué par la souche Klactis Y 616, obtenue à partir de la souche CBS 293 91 par délétion au niveau du gène URA 3. D'autres mutants peuvent être obtenus par mutation au niveau de gènes codant pour des protéases, et notamment de protéases transitant par le réticulum endoplasmique telles que les protéases A, B, la carboxypeptidase Y, ou les convertases (Kex 1 en particulier). Le fragment d'ADN hétérologue peut être introduit dans la cellule par différentes techniques Généralement, la transformation ou l'electroporation conviennent, mais il est entendu que l'invention n'est pas limitée à une technique particulière. Plus préférentiellement, le fragment d'ADN hétérologue comprend en outre des signaux permettant la sécrétion de la protéine recombinante Ces signaux peuvent correspondre aux signaux naturels de sécrétion de la protéine considérée, mais ils peuvent également être d'une origine différente En particulier des signaux de sécrétion dérivés de gènes de levure peuvent être utilisés, tels que ceux des gènes de la toxine killer (Stark et Boyd, EMBO J 1 ( 1986) 1995) ou de la pheromone alpha (Kurjan et Herskowitz, Cell Q 30 ( 1982) 933; Brake et al, Yeast 4 ( 1988) 5436). Toujours dans un mode particulier de l'invention, le fragment d'ADN hétérologue comprend en outre un marqueur de sélection Un tel marqueur permet en effet d'identifier facilement les cellules de l'invention Il peut s'agir en particulier de marqueurs conférant la résistance à des antibiotiques (tel que par exemple le gène Upl (Jimenez et Davies, Nature 287 ( 1980) 869)) ou à d'autres composés toxiques pour la cellule (ions cuivre notamment), ou de marqueurs complémentant des auxotrophies de la cellule hôte (tel que par exemple le gène URA 3 (De Louvencourt et al, J Bacteriol 154 ( 1983) 737). Généralement, les signaux permettant l'expression du gène de structure sont choisis parmi les promoteurs et les terminateurs de transcription Il est entendu que ces signaux sont choisis en fonction du gène de structure et du résultat recherché En particulier, il peut être préférable dans certains cas d'utiliser un promoteur régulable de manière à pouvoir découpler les phases de croissance de l'hôte et celle d'expression du gène De même, pour des raisons de force et de compatibilité, il peut être préférable d'utiliser dans certains cas les promoteurs naturels des gènes de structure, et dans d'autres cas, des promoteurs d'origine différente. Préférentiellement, les promoteurs utilisés sont dérivés de gènes de levure, et encore plus préférentiellement, de gènes glycolytiques de levure D'un intérêt tout particulier sont les promoteurs dérivés de gènes glycolytiques des levures du genre Saccharomyces ou Kluyveromyces Notamment, on peut citer les promoteurs des gènes codant pour la phosphoglycerate kinase (PGK), la glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase (GPD), les énolases (ENO), ou les alcool-deshydrogenases (ADH) On peut également citer des promoteurs dérivés de gènes fortement exprimés tels que le gène de la lactase (LAC 4), de la phosphatase acide (PHOS), ou des facteurs d'élongation de la traduction (TEF). Par ailleurs, ces régions promotrices peuvent être modifiées par mutagénèse, par exemple pour ajouter des éléments supplémentaires de contrôle de la transcription, tels que notamment des régions UAS ("Upstream Activating Sequence") A titre d'exemple, un promoteur hybride entre les promoteurs des gènes PGK et GAL 1/GAL 10 de S cerevisiae donne de bons résultats. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le fragment d'ADN hétérologue fait partie d'un plasmide d'expression, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. S'agissant de vecteurs à réplication autonome, ils peuvent être obtenus en utilisant des séquences à réplication autonome chez K lactis CBS 293 91 ou ses dérivés ou mutants En particulier, il peut s'agir de séquences chromosomiques (ARS) provenant par exemple de S cerevisiae (Stinchcomb et al, Nature 282 ( 1979) 39) ou de K latis (Das et Hollenberg, Curr Genet 6 ( 1982) 123) Il peut également s'agir d'origines de réplication dérivées de plasmides et par exemple du plasmide p KD 1 de K drosophilarum (EP 361991) ou du plasmide 2 t de S.cerevisiae (pour revue voir Futcher, Yeast 4 ( 1988) 27). S'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci sont généralement obtenus en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de la cellule hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du plasmide. Avantageusement, selon la présente invention, le gène de structure code pour une protéine d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire A titre d'exemple, on peut citer les enzymes (tels que notamment la superoxide dismutase, la catalase, les amylases, les lipases, les amidases, la chymosine etc), les dérivés sanguins (tels que la sérum- albumine ou des variants moléculaires de celle-ci, l'alpha ou la bêta- globine, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur von Willebrand ou certains domaines de celui-ci, la fibronectine, l'alpha-1 antitrypsine etc), l'insuline et ses variants, les lymphokines ltelles que les interleukines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF), le TNF, le TRF, les MIP, etc l, les facteurs de croissance (tels que l'hormone de croissance, l'érythropoiétine, le FGF, l'EGF, le PDGF, le TGF etc), les apolipoprotéines, des polypeptides antigéniques pour la réalisation de vaccins (hépatite, cytomégalovirus, Eppstein-Barr, herpes etc), des récepteurs viraux, ou encore des fusions de polypeptides telles que notamment des fusions comportant une partie active fusionnée à une partie stabilisatrice (par exemple des fusions entre l'albumine ou des fragments d'albumine et le récepteur ou une partie d'un récepteur de virus (CD 4, etc)). Préférentiellement, le gène de structure code pour la sérum-albumine humaine, un précurseur de celle-ci, ou un de ses variants moléculaires On entend par variant moléculaire de l'albumine les variants naturels résultant du polymorphisme de l'albumine, les dérivés structuraux possédant une activité de type albumine, les formes tronquées, ou toute protéine hybride à base d'albumine. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production de protéines recombinantes, selon lequel on cultive une cellule recombinée telle que définie ci-avant et on récupère la protéine produite. Comme montré dans les exemples, ce procédé permet, de manière surprenante, d'obtenir des niveaux de production de protéines recombinantes très élevés. Avantageusement, le procédé de l'invention permet également la sécrétion de la protéine recombinante dans le milieu de culture. Le procédé de l'invention permet la production à des taux élevés de protéines recombinantes d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire Il est particulièrement adapté, bien que non limité, à la production de sérum-albumine humaine, ou ses variants moléculaires. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemple qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: Construction du promoteur hybride PGK/GAL. P = promoteur; UAS = "Upstream Activating Sequence". Figure 2 Stratégie de construction et représentation du vecteur p YG 401 P = promoteur; T = Terminateur de transcription; bla = gène conférant la résistance à l'ampicilline; ph = gène conférant la résistance à la généticine (G 418). Figure 3: Représentation du vecteur p YG 107 La légende est identique à celle de la figure 2. Figure 4: Expression et sécrétion d'albumine dans différentes souches de K lactis transformées par le vecteur p YG 401 Analyse en SDS-PAGE ( 8,5 % d'acrylamide) après coloration au bleu de Coomassie, de surnageants de culture ( 25 pl) obtenus dans les conditions décrites dans les exemples Les lignes a et b correspondent à 0,5 et 1,0 pg d'albumine standard. Figure 5: Expression et sécrétion d'albumine dans différentes souches de K lactis transformées par le vecteur p YG 107 Analyse en SDS-PAGE ( 8,5 % d'acrylamide) après coloration au bleu de Coomassie, de surnageants de culture ( 25 p 1) obtenus dans les conditions décrites dans les exemples Les cellules transformées ont été cultivées en milieu M 9 EL 10 (Cf exemple), en présence de 2 % de glucose (Glu) ou 2 % de lactose (Lac) Les lignes a et b correspondent à 0,5 et 1,0 pg d'albumine standard. Figure 6: Stratégie de clonage, et modification du gêne URA 3 de K.lactis CB 52359. TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium bromure d'éthidium, la digestion par les enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, rélectroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E coli, etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y, 1986; Ausubel et al, (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York 1987). La mutagénèse dirigée in vitro par oligodésoxynucléotides est effectuée selon la méthode développée par Taylor et ai (Nucleic Acids Res 13 ( 1985) 8749-8764) en utilisant le kit distribué par Amersham Le séquençage de nucléotides est réalisé selon la technique des didéoxy décrite par Sanger et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 74 ( 1977) 5463- 5467) L'amplification enzymatique de fragments d'ADN spécifiques est effectuée par réaction de PCR ("Polymerase- catalyzed Chain Reaction") dans les conditions décrites par Mullis et Faloona (Meth Enzym, 155 i ( 1987) 335-350) et Saiki et al (Science 230 ( 1985) 1350- 1354), en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) en suivant les recommandations du fabricant. EXEMPLES Exemple 1: Construction de cassettes et/ou de vecteurs d'expression de protéines recombinantes. 1.1 Construction de vecteurs d'expression d'albumine humaine. 1.1 1 Construction d'un vecteur d'expression d'albumine sous contrôle d'un promoteur hybride PGK/GAL. Un vecteur d'expression de la sérum-albumine humaine a été préparé à partir du plasmide p YG 19 (EP 361 991) Ce dernier comprend les éléments suivants: la séquence du plasmide p KD 1, qui fait de p YG 19 un plasmide à copies multiples, stable, et capable de se répliquer chez les levures du genre Kluyveromyces (EP 361 991), une cassette d'expression de la sérum-albumine humaine comportant le gène de structure codant pour la forme prépro sous contrôle du promoteur du gène PGK de S cerevisiae; un réplicon et un marqueur de sélection (gène b} conférant la résistance à l'ampicilline) bactériens; et, le gène nph conférant la résistance au G 418 à la levure. Le vecteur p YG 401 a été construit à partir du plasmide p YG 19 par modification au niveau de la cassette d'expression de la sérum-albumine humaine. Dans p YG 401, le gène de l'albumine n'est plus sous contrôle du promoteur du gène PGK de S cerevisiae, mais sous contrôle d'un promoteur hybride entre les promoteurs des gènes PGK et GA Ll/GAL 10 de S cerevisiae Ce promoteur hybride a été obtenu en remplaçant la région UAS ("Upstream Activating Sequence") du promoteur PGK (Stanway et al, Nucl Acid Res 15 ( 1987) 6855) par la région UAS du promoteur GA Ll/GAL 10 (Johnston et Davies, Mol Cell Biol 4 ( 1984) 1440; West et al, Mol Cell Biol 4 ( 1984) 2467). Ce promoteur hybride a été construit de la manière suivante (Cf figure 1): L'obtention du plasmide p YG 29 a été décrite en détail dans la demande EP 361 991 Ce plasmide comporte le promoteur du gène PGK de S cerevisiae isolé à partir du plasmide p YG 19 sous forme d'un fragment Sal I-Hind IH, et cloné dans le bactériophage M 13 mp 18 I 1 a ensuite été modifié par mutagénèse dirigée pour introduire les sites de restriction suivants: 1 site Hind HI supplémentaire en position -25 par rapport à l'ATG. L'introduction de ce site permet de restaurer après les différentes étapes de clonage, une région nueléotidique proche de l'ATG identique à la région native du promoteur PGK L'environnement du codon ATG est en effet connu pour influencer de manière sensible l'efficacité de l'initiation de la traduction des gènes eucaryotes (Kozak, M, Microbiol Rev 47 ( 1983) 1-45; Hamilton, R, Nucl Acid Res 15 ( 1987) 3581-3593). -2 sites Not I de part et d'autre de la région UAS. L'UAS du promoteur GA Ll/GAL 10 a été isolée à partir du plasmide p G 1 décrit par Miyajima et al (Nuel Acid Res 12 ( 1984) 6397-6414; Cloning Vectors, Pouwels et al, Elsevier ( 1985) VI-B-ii-2) Ce plasmide est déposé à l'ATCC sous le numéro 37305. Le plasmide p Gl comporte un fragment de 0,8 kb contenant le promoteur GA Ll/GAL 10 de S cerevisiae, inséré dans le site Hind II du plasmide p UC 8, duquel il peut être excisé sous forme d'un fragment Bam HI-Pst I (figure 1). Ce fragment a été excisé de p G 1, purifié, puis digéré avec les enzymes Rsa I et Alu I, dont les sites de coupure respectifs sont localisés de part et d'autre de la région UAS Un fragment de 143 pb a ainsi été isolé par electroélution, puis mis sous forme d'un fragment Not I en ajoutant un linker 5 '-GCGGCCGC-3 ' Ce fragment a ensuite été cloné dans le plasmide p YG 29, préalablement digéré par Not I. Le plasmide résultant est appelé p YG 32 (figure 1). Pour obtenir le vecteur d'expression portant ce promoteur hybride, le fragment Sal I-Hindl II portant le promoteur hybride a été isolé de p YG 32 et ligaturé avec un adaptateur synthétique Hind Il I-Bst EII composé des 2 brins complémentaires suivants: 5 '-AGC TIT ACA ACA AAT ATA AAA ACA ATG AAG TGG-3 ' et 5 '-GT TAC CCA CTT CAT TGT TIT TAT ATT TGT TGT AA-3 ' (le codon d'initiation de la transcription est représenté en caractères gras). Cet adaptateur reconstitue les 22 pb situées immédiatement en amont du gène de structure PGK de S cerevisiae, et comprend les premiers codons du gène codant pour la prépro HSA, jusqu'à un site Bst EII présent dans le gène natif (figure 1). La cassette d'expression de l'albumine humaine a ensuite été reconstituée en ligaturant le fragment Sal I-Bst EII ainsi obtenu portant le promoteur hybride et l'extrêminté 5 ' du gène de structure de l'albumine, avec le fragment Bst EII-Sac I isolé du plasmide p YG 19, portant le reste du gène de l'albumine, et le terminateur du gène PGK de S cerevisiae (figure 2). La cassette ainsi obtenue a été utilisée pour remplacer ia cassette d'expression Sal I-Sac I portée par le plasmide p YG 19. Le vecteur résultant est appelé p YG 401 (figure 2). 1 1 2 Construction d'un vecteur d'expression d'albumine sous contrôle du promoteur LAC 4 de K lactis. Pour tester l'efficacité du promoteur inductible LAC 4 dans le système de production de la présente invention, le vecteur d'expression p YG 107 a été construit Ce vecteur est identique au vecteur p YG 401 dans lequel: (i) Le site Eco RI situé à la jonction entre la partie p KD 1 et le réplicon bactérien est détruit Cette destruction a été obtenue par coupure du plasmide p YG 401 par Eco RI, remplissage des extrémités cohésives au moyen du fragment Klenow de l'ADN polymerase de E coli, et religature. (ii) Le site Hindl I présent dans le gène Uh conférant la résistance au G 418 est détruit: Cette modification a été obtenue, après sous-clonage du gène ah dans le bactériophage M 13 mp 7, par mutagénèse dirigée selon la méthode décrite par Taylor et al (Nueleic Acid Res 13 ( 1985) 8749), en utilisant l'oligodéoxynucléotide suivant: 5 '-GAA ATG CAT AAG CTC TTG CCA TTC TCA CCG-3 ' Cet oligodéoxynucléotide transforme le codon C Tr codant pour la leucine 185 en CTC Ce changement ne modifie pas la séquence protéique résultante. Les modifications (i) et (ii) apportent des changement mineurs, destinés uniquement à faciliter des étapes ultérieures de clonage, mais qui n'interviennent pas dans l'efficacité d'expression des vecteurs. (iii) La cassette d'expression de l'albumine (fragment Sal I-Sac I) a été remplacée par la cassette Sal I-Sac I provenant du plasmide p YG 404 (EP 361 991), dans laquelle le gène codant pour l'albumine humaine (forme prépro) est sous contrôle du promoteur LAC 4 de K lactis. La structure du vecteur p YG 107 est représentée sur la figure 3. Exemple 2: Transformation de Kluyveromvces par des vecteurs d'expression de protéines recombinantes. Différentes techniques permettant l'introduction d'un fragment d'ADN dans la levure peuvent être utilisées. Avantageusement, les différentes souches de Kluyveromyces utilisées ont été transformées en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol, selon la technique décrite par Ito et al (J. Bacteriol 153 ( 1983) 163-168). Un protocole alternatif a également été décrit en détail dans la demande EP 361991. Exemple 3: Expression et sécrétion de protéines recombinantes dans différentes levures du genre Kluyveromyces. Cet exemple démontre que l'utilisation des nouvelles levures de 1 1 l'invention modifiées génétiquement, permet d'obtenir des niveaux de production et de sécrétion de protéines recombinantes particulièrement élevés. 3.1 Sérum-albumine humaine 3.1 1 Les souches de Kluyveromyces lactis suivantes ont été transformées par le vecteur p YG 401, selon le protocole décrit dans l'exemple 2: K lactis CBS 293 91 K lactis CB 5739 K lactis CB 5762 K lactis CB 51067 -K lactis CB 51797 K lactis CB 52619 K Ilactis CB 52621 K lactis CB 56315 K lactis CB 58043 K lactis CB 5683 K lactis CB 5579 88 La production d'albumine recombinante a été déterminée selon la méthode décrite dans la demande EP 361 991 après 120 heures de culture à 28 C sous agitation constante, en milieu YPD (Extrait de levure 10 g/l; peptone 20 g/l; glucose 20 g/l), en présence de généticine 2 % Les surnageants de culture ont été obtenus après 2 centrifugations successives ( 5 minutes à 4000 t/mrin, puis 10 minutes à 12000 t/min) permettant d'éliminer toute contamination cellulaire Un échantillon de 0,5 ml a ensuite été chauffé à 95 C pendant 15 minutes en présence d'un volume égal de tampon Tris-Hcl 0,125 M, glycérol 20 %, 2-mercaptoéthanol 10 %, sodium dodécyl sulfate (SDS) 4,6 % et 0,4 % de bleu de bromophénol (tampon Laemli 2 X, Laemli, Nature 227 ( 1970) 680)); et 50 tl de la solution obtenue ont été déposés sur gel SDS-polyacrylamide 8,5 % Après migration, le gel a été révélé au bleu de Coomassie. La figure 4 montre une augmentation de 200 % environ de la quantité d'albumine produite dans le système de l'invention, par rapport aux meilleurs systèmes antérieurement décrits (EP 361 991). 3.1 2 Les souches de Kluyveromyces lactis suivantes ont été transformées par le vecteur p YG 107, selon le protocole décrit dans l'exemple 2: K lactis CB 54574 K lactis CB 5683 Klactis CB 52359 K lactis CBS 293 91 K lactis CB 5579 88 La production d'albumine recombinante a été déterminée selon la méthode décrite dans la demande EP 361 991 et dans l'exemple 3 1 1 après 120 heures de culture à 28 C sous agitation constante, en milieu M 9 EL 10 en présence de glucose 20 g/1 ou de lactose 20 g/l Le milieu M 9 EL 10 est composé du milieu M 9 (Maniatis et al précitée) supplémenté d'extrait de levure 10 g/l. La figure 5 montre que la quantité d'albumine produite est toujours supérieure dans le système de l'invention Elle montre également que la production est 2 à 3 fois supérieure dans un milieu contenant du lactose (inducteur du promoteur LAC 4) que dans un milieu glucose Par ailleurs, elle montre enfin que, de manière surprenante, la souche CBS 293 91 est semi-constitutive pour la production de protéines recombinantes sous contrôle du promoteur LAC 4. 3.2 Interleukine-l B Les souches de Kluyveromvces lactis suivantes ont été transformées par le vecteur p SPHO-IL 35 (Cf EP 361 991), selon le protocole décrit dans rexemple 2: K lactis CB 5683 K lactis CBS 293 91 K lactis CB 5579 88 Exemple 4: Construction d'un mutant ura 3 de K lactis CBS 293 91. Un dérivé ura 3 a été préparé à partir de K lactis CBS 293 91 Un tel dérivé conserve les propriétés de la souche initiale, avec en plus une auxotrophie pour l'uracile qui peut être utilisée comme marqueur de sélection Pour éviter tout événement de réversion, ce mutant a été préparé par délétion d'une partie de l'allèle URA 3 chromosomique de CBS 293 91 Cette technique de mutagénèse permet également d'éviter l'emploi d'agents mutagéniques non spécifiques, pouvant altérer d'autres régions génomiques de la cellule. 4.1 Clonage et modification du gène URA 3 de K lactis CB 52359 (figure 6). Le gène URA 3 de K lactis codant pour l'orotidine-5-phosphate decarboxylase (Shuster et al, Nucl Acid Res 15 ( 1987) 8573) a été cloné sous forme d'un fragment Bam HI-Pst I de 1,2 kb en utilisant la technique de PCR (Cf techniques générales de clonage), à partir d'un extrait d'ADN génomique (Rose et al., "Methods in Yeast Genetics" Cold Spring Harbor Laboratory Press, N Y, 1990) de K lacftis CB 52359 au moyen des oligodéoxynucléotides suivants: '-GGAAGCTTGGCTGCAGGAA Tr GTCGTTCATGGTGACAC-3 ' et 5 '- CCGAATTCCCGGATCCCATAATGAAAGAGAGAGAGAGAAGCAAAC-3 '. Le fragment obtenu a ensuite été sous-cloné dans les sites Bam HI et Pst I du plasmide p IC-20 H (Marsh et al, Gene 32 ( 1984) 481) pour donner le plasmide p YG 1007 (figure 6) Ce fragment a ensuite été modifié par délétion d'un fragment interne au gène URA 3 comprenant 286 pb, localisées entre les sites Sty I, puis religature en présence de ligase Ce nouveau plasmide est appelé p YG 1010 (figure 6). 4.2 Tranformation de K lactis CBS 293 91 par le gène URA 3 délété. La souche CBS 293 91 a été transformée par 10 tg du fragment Pst I- Bam HI isolé du plasmide p YG 1010 par électroélution, et comportant le gène URA 3 délété Après un saut de température à 42 C ("heat shock") et 2 lavages successifs à l'eau, 600,ul de milieu YPD ont été ajoutés et les cellules ont été incubées une nuit Les cellules ont ensuite été étalées sur milieu synthétique minimal SD ("bacto-yeast nitrogen base" sans acides aminés (Difco) 6,7 g; glucose 20 g; Bacto-agar 20 g, eau distillée 1000 ml) en présence d'uracile ( 100 ug/ml), d'uridine ( 100 g/ml) et de 5-fluoro orotate ( 5 FO) 15 m M. Des clones sont apparus au bout de 4 à 5 jours Ils ont été repiqués sur milieu YPD de manière à obtenir des colonies isolées. A partir du ler repiquage, 3 clones issus de la colonie initialement apparue sur milieu SD+ 5 FO ont été réisolés sur milieu YPD (repiquage secondaire). Les clones issus du repiquage secondaire ont ensuite été testés pour le phénotype Ura 3 en utilisant le test en goutte sur milieu SD et SD+uracile (Jund et Lacroute, J of Bact 102 ( 1970) 607-615; Bach et Lacroute, Mol Gen Genet. ( 1972) 126-130) Le génotype ura 3 des clones ainsi obtenus a été contrôlé par: réaction de PCR en utilisant les oligodéoxynucléotides décrits pour le clonage en 4 1, ce qui permet d'identifier les clones ne portant que le gène URA 3 délété; complémentation au moyen du plasmide p Kan 707 (EP 361 991) portant le gène URA 3 intact de S cerevisiae, connu pour sa capacité à complémenter l'auxotrophie ura 3 chez K lactis (De Louvencourt précitée); et Southern blot sur l'ADN génomique des clones identifés, en utilisant comme sonde le gène URA 3 de K lactis isolé dans l'exemple 4 1 marqué au 32 p selon la technique décrite par Feinberg et Vogelstein (Anal Biochem 132 ( 1983) 6). Le mutant Ura 3 sélectionné est appelé Klactis Y 616. Un échantillon de la souche K lactis Y 616 a été déposé le 11 juin 1991 auprès du Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à Baarn aux Pays- Bas dans les conditions du Traité de Budapest, sous le numéro CBS 294 91 La souche K.lactis CBS 293 91 correspond à la souche CB 51065 redéposée le 11 juin 1991 selon les conditions du Traité de Budapest. 1 5 REVENDICATIONS 1 Cellule hôte pour la production de protéines recombinantes caractérisée en ce qu'il s'agit de la levure K lactis CBS 293 91 ou d'un dérivé ou mutant de celle-ci, contenant un fragment d'ADN hétérologue comprenant un gène de structure et des signaux permettant son expression. 2 Cellule hôte selon la revendication 1 caractérisée en ce que le fragment d'ADN hétérologue comprend en outre des signaux permettant la sécrétion de la protéine recombinante. 3 Cellule hôte selon la revendication 1 caractérisée en ce que le fragment d'ADN hétérologue comprend en outre un marqueur de sélection. 4 Cellule hôte selon la revendication 1 caractérisée en ce que les signaux permettant l'expression du gène de structure sont choisis parmi les promoteurs et les terminateurs transcriptionnels. Cellule hôte selon la revendication 4 caractérisée en ce que les promoteurs transcriptionnels sont choisis parmi les promoteurs de gènes de levure, et préférentiellement de gènes glycolitiques de levure ou de gènes de levure fortement exprimés. 6 Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le fragment d'ADN hétérologue fait partie d'un plasmide d'expression, à réplication autonome ou intégratif. 7 Cellule hôte selon la revendication 6 caractérisée en ce que le fragment d'ADN hétérologue fait partie d'un plasmide d'expression à réplication autonome comprenant des séquences chromosomiques de type ARS ou une origine de réplication dérivée du plasmide p KD 1 de K drosophilarum ou du plasmide 24-t de Scerevisiae. 8 Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le gène de structure code pour une protéine d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire. 9 Cellule hôte selon la revendication 8 caractérisée en ce que la protéine est choisie parmi les enzymes (telles que notamment la superoxide dismutase, la catalase, les amylases, les lipases, les amidases, et la chymosine), les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine ou des variants de celle-ci, l'alpha- ou la bêta-globine, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur von Willebrand ou des domaines de celui-ci, la fibronectine, l'alpha-1 antitrypsine), l'insuline et ses variants, les lymphokines ltelles que les interleukines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF), le TNF, le TRF,et les MIP), les facteurs de croissance (tels que l'hormone de croissance, l'rérythropoiétine, le FGF, l'EGF, le PDGF, le TGF), les apolipoprotéines, des polypeptides antigéniques pour la réalisation de vaccins (hépatite, cytomégalo- virus, Eppstein-Barr, herpes etc), les récepteurs viraux, ou encore des fusions de polypeptides telles que notamment des fusions comportant une partie active fusionnée à une partie stabilisatrice. Cellule hôte selon la revendication 9 caractérisée en ce que la protéine est choisie parmi la sérum-albumine humaine et ses variants moléculaires. 11 Procédé de production de protéines recombinantes caractérisé en ce que l'on cultive une cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et on récupère la protéine produite. 12 Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que la protéine est sécrétée dans le milieu de culture. 13 Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12 pour la production d'une protéine telle que définie dans la revendication 9. 14 Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que la protéine est choisie parmi la sérum-albumine humaine et ses variants moléculaires. La levure K:lactis Y 616 n CBS 294 91.