Brevet FR2675805A1 — publié le 19921030

La présente Invention a pour objet-des anti ozènes extraits d'épithélium malpighien de mammifère et reconnus spécifiquement par les autoanticorps présents -hez les patients atteints de polyarthrite rhumatoide :?R). L'invention est plus précisément relative dune ' uns part à un antigène extrait d'épiderme humain et vautre part à un antigène extrait d'épithéliums oeso phagiens de rat, ainsi qu'aux protéines antigéniques les constituant. L'invention concerne également les anticorps reconnaissant ces antigènes, ainsi que les compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence dautoanticorps et les compositions i=tunogènes pour la laréparation de vaccin, comprenant lesdits antigènes ou protéines. L'invention concerne aussi un procédé de diagnostic de la polyarthrite rhumatoide mettant en oeuvre lesdits antigènes ou protéines. La polyarthrite rhumatoide (PR) est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques. Elle atteint environ 2 % de la population des pays développés. La PR est évolutive, invalidante et pose des problèmes de diagnostic difficiles dans ses formes de dé Dut, alors même quelle appelle des traitements spéci tiques. En dehors des signes cliniques et radiologiques, le rhumatologue ne dispose actuellement que de tests biologiques peu spécifiques pour son diagnostic. Les plus utilisés d'entre eux sont les tests de Waaler-Rose, qui détectent le facteur rhumatoide dans 7 PR sur 10. Cependant, la spécificité de ces tests est très mauvaise puisque ces facteurs sont détectés dans la plupart des autres pathologies autoimmunes et même chez des individus sains. La présence d'autoanticorps dirigés contre les composants cellulaires est la caractéristique générale des maladies autoimmunes telles que la polyarthrite rhu matoise (PR), le lupus érythémateux disséminé (LED), la sclérodermie (SCL), la polymyosite ou ia maladie du tissu connectif (MTCD). Parmi les nombreux types d'autoanticorps identifiés dans ces maladies, ceux spéci fi-ement présents chez les malades atteints de PR et réagissant avec un antigène épithélial oesophagien ont été décrits pour la première fois par B.J.J. Young et al. dans Br.Med.J. 2:97-99, 1979. Ces autoanticorps ont été improprement dénommés anticorps antikératines. Ces autoanticorps spécifiques de la PR ont été jusqu'à présent détectés et titrés par immunofluorescence indirecte sur cryocoupes transversales d'oesophage de rat. -.Serre et al. dans Rev.Rhum. 53(11):604-614 (1986) ont montré que l'antigène défini par ces autoanticorps est malpighien et cornifié et présent uniquement dans le Stratum corneum ; ils ont aussi montré que l'antigène reconnu par les sérums de patients atteints de PR est également présent dans l'épiderme humain (G.Serre et al. Revue du Rhumatisme, 1986, 53(11), 607-614). Les travaux effectués par la Demanderesse dans le domaine de la différenciation épidermique et malpighienne et ltétude d'anticorps monoclonaux pour la définition de nouveaux antigènes de différenciation mais aussi d'autoanticorps humains contre ces mêmes antigènes, lui ont permis de montrer que les anticorps anti-Stratum corneum d'oesophage de rat sont dauchentiques autoanticorps, qui ne reconnaissent pas les kératines humaines ou murines, mais d'autres antigènes exprimés dans ces tissus. Des travaux plus poussés ont permis à la Demanderesse d'extraire, de purifier et de caractériser biochimiquement ces antigènes ainsi que les protéines les constituant, spécifiquement reconnues par les autoanticorps sériques présents chez les malades atteints de PR. L'Invention concerne en conséquence un antigène de différenciation terminale présent dans les épithéliums malpighiens de mammifères, spécifiquement reconnu par les autoanticorps présents chez un patient atteint de polyarthrite rhumatoide, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes - il est de nature protéique, - un traitement par une nucléase ne modifie pas son immunoréactivité, - un traitement par l'éthanol ne modifie pas son immunoréactivité, - un traitement par l'acide trichloroacétique ne modifie pas son immunoréactivité, - il est hydrosoluble. Parmi les épithéliums malpighiens de mammifère, on peut citer les épithéliums qui tapissent la cavité buccale, tels que les muqueuses jugales, gingivales, linguales ou palatines ; ainsi que les muqueuses génitales, anales et aérodigestives supérieures. Les travaux ayant mené à la présente Invention ont plus particulièrement concerné l'épithélium oesophagien de rat et l'épiderme humain. Un premier antigène spécifiquement reconnu par les autoanticorps présents chez les malades atteints de PR a été extrait de l'épiderme humain. Cet antigène présente les propriétés suivantes - après électrophorèse en conditions natives, il se dissocie en plusieurs protéines antigéniques dont le poids moléculaire correspondant est compris entre environ 80 et 400 kD, les protéines les plus immunoréactives ayant un poids moléculaire apparent compris entre 80 et 120 kD, - après isoélectrofocalisation, il se dissocie en plusieurs protéines antigéniquesdont les pHi varient de 5,8 à 7,4. Cet antigène est caractérisé par les propriétés suivantes - après électrophorèse bidimensionnelle du type isoélectrofocalisation, suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, il apparaît comme une protéine antigénique de poids moléculaire apparent moyen d'environ 40 kD dont les pHi varient de 5,8 à 7,4. Cet antigène est encore caractérisé par la propriété suivante - il présente des propriétés immunologiques en commun avec la filaggrine humaine ou un fragment de protéolyse du précurseur de la filaggrine. En outre, cet antigène extrait d'épiaerme .-.amain présente des propriétés immunologiques en commun avec la filaggrine humaine ou un fragment de protéolyse précurseur de la filaggrine. La Demanderesse a également extrait épithéliums oesophagiens de rat un second antigène spé citiquement reconnu par les autoanticorps présents chez les patients atteints de PR. Cet antigène présente les propriétés suivantes - après électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS, il se sépare en les trois protéines antigéniques suivantes une première protéine de poids moléculaire moyen d'environ 210 kD, * une deuxième protéine de poids moléculaire moyen compris entre environ 90 et 130 kD, * une troisième protéine de poids moléculaire moyen compris entre environ 67 et 90 kD, - après électrophorèse en gel de polyacrylamide en condition native, il se sépare en les trois protéines antigéniques suivantes * une première protéine dont le poids moléculaire moyen apparent correspondant est d'environ 440 kD, * une deuxième protéine dont le poids moléculaire moyen apparent correspondant est d'environ 220 kD, * une troisième protéine dont le poids moléculaire moyen apparent correspondant est d'environ 120 kD. Cet antigène est encore caractérisé par les propriétés suivantes - après électrophorèse bidimensionnelle du type isoélectrofocalisation, suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, il se dissocie en les trois pro téines antigéniques suivantes une première protéine de poids moléculaire moyen d'en viron 210 kD dont les pHi varient d'environ 5,85 à 6,85, * une deuxième protéine de poids moléculaire compris en tre environ 90 et 130 kD dont les pHi varient d'environ 5,85 à 7,35, * une troisième protéine dont le poids moléculaire dimi nue d'environ 120 à 67 kD pendant que son pHi varie d'environ 5 à 7,5. - après chromatographie de gel-filtration et interaction hydrophobe puis électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, cet antigène se sépare en les deux fractions protéiques antigéniques suivantes * une première fraction très hydrophobe contenant la pro téine de poids moléculaire moyen d'environ 210 kD et la protéine de poids moléculaire moyen compris entre envi ron 90 et 130 kD, * une deuxième fraction moins hydrophobe que la première contenant la protéine de poids moléculaire moyen com pris entre environ 120 et 67 kD. Les protéines constitutives de ces antigènes ont été purifiées et testées avec les autoanticorps présents chez les patients atteints de PR. il apparaît que ces protéines présentent des propriétés immunologiques au moins équivalentes à celles des antigènes dont elles sont issues. L'Invention concerne en conséquence également les trois protéines mises en évidence après électrophorèse bidimensionnelle du type électrofocalisation, suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, de l'antigène extrait de l'épithélium oesophagien de rat. Ces trois protéines ont également été mises en évidence dans les fractions protéiques obtenues après chromatographie séquentielle de gel-filtration et interaction hydrophobe de l'antigène extrait d'épithélium oesophagien de rat, puis électrophorèse en conditions dénaturantes. La première de ces trois protéines présente un poids moléculaire moyen d'environ 210 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 7,35 ; la deuxième présente un poids moléculaire moyen compris entre 90 et 130 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 7,35 ; la troisième présente un poids moléculaire moyen compris entre 67 et 120 kD et des pHi variant d'environ 5,8 à 7,4. L'Invention concerne aussi la protéine mise en évidence après électrophorèse bidimensionnelle du type électrofocalisation suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, de l'antigène extrait d'épiderme humain. Cette protéine a un poids moléculaire d'environ 40 kD et des pHi variant d'environ 5,8 à 7,4. Les antigènes et les protéines précédemment décrits sont particulièrement utiles pour la préparation de compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence d'autoanticorps dans un échantillon biologique d'un patient atteint de polyarthrite rhumatoide. Ces compositions permettent la formation d'un complexe antigène-anticorps entre les protéines ou antigènes de l'invention et les autoanticorps présents dans un échantillon biologique, tel que du sérum, d'un sujet atteint de PR ; ces compositions et les antigènes qu'elles contiennent sont donc particulièrement intéressants pour le diagnostic in vitro de la PR. Un test par immunotransfert pour la détection des autoanticorps anti-Stratum corneum de classe G, spécifique de la polyarthrite rhumatoide a été mis au point. Ces autoanticorps étaient antérieurement détectés par IIF sur cryocoupe d'oesophage de rat. Un protocole d'immunotransfert, réalisé à partir d'un extrait antigénique épithélial oesophagien murin, a été optimisé pour obtenir une meilleure définition des bandes immunoréactives et une meilleure sensibilité, puis trois configurations, différentes, soit par la méthode de séparation des protéines antigéniques (électrophorèse en conditions natives ou dénaturantes), soit par la dilution des sérums analysés, ont été validées sur le plan diagnostic avec une large série de sérums représentatifs de la pathologie rhumatologique. Il est apparu que dans ces trois conditions, la sensibilité diagnostique du test oscillait autour de 50% pour une spécificité voisine de 95%, lorsque seule la présence ou l'absence d'immunoréactivité était prise en compte. Par contre, la protéine antigénique de 120 kD de l'antigène séparé en conditions natives, reconnue beaucoup plus spécifiquement par les sérums de patients atteints de PR, a permis la détection des sérums avec une sensibilité de 68% pour une spécificité de 99%, performance très supérieure à celle de 1'IIF qui présente une sensibilité de 43% pour une spécificité de 99%. L'approche parallèle conduite avec l'antigène extrait d'épiderme humain a permis de montrer que la protéine de 40 kD, seule forme immunoréactive dans ce tissu, permettait d'obtenir des performances diagnostiques équivalentes à celles de la protéine antigénique murine de 120 kD. L'invention a également trait à des anticorps formés contre les antigènes et protéines de l'invention, anticorps qui peuvent être polyclonaux ou monoclonaux et produits alors par tout hybridome préparé selon les méthodes classiques de fusion cellulaire entre des cellules spléniques activées in vitro par l'antigène ou provenant d'un animal immunisé contre l'une des protéines ou glycoprotéines antigéniques de l'invention et des cellules d'une lignée de cellules myélomateuses. L'invention est aussi relative à un procédé de purification des autoanticorps spécifiquement présents chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoide, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes - la mise en contact d'un fluide biologique d'un patient atteint de polyarthrite rhumatoide avec au moins un antigène ou au moins une protéine, tels que définis nans ce qui précède, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques avec lesdits anticorps, - l'isolement desdits complexes du milieu réactionnel, - la séparation des autoanticorps des complexes immuno logiques. L'invention concerne enfin un procédé de diagnostic in vitro de la polyarthrite r;aumatolde dans un fluide biologique, comprenant au moins les étapes suivantes - la mise en contact de ce fluide biologique avec au moins un antigène ou une protéine selon l'invention, éventuellement marqué, ou un conjugué de cet antigène ou protéine avec une molécule porteuse, dans des condi tions permettant la formation d'un complexe immunolo gique avec les autoanticorps éventuellement présents - la détection dans le fluide biologique de la présence du complexe immunologique, par des méthode physiques ou chimiques. Le procédé de diagnostic précédent peut être mis en oeuvre grâce à un nécessaire ou kit comprenant - au moins un antigène ou une protéine selon l'invention, éventuellement marqué, ou un conjugué de cet antigène avec une molécule porteuse - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique avec les autoanticorps éven tuellement présents dans un échantillon biologique - un ou plusieurs réactifs pour la détection du complexe immunologique formé - le cas échéant, un échantillon de référence, tel qu'un sérum négatif. D'autres caractéristiques et avantages de 1'Invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui sont illustrés par les figures en annexe étant entendu que ces exemples ne sauraient être interprétés comme tendant à réduire la portée des Revendications. EXEMPLE 1 - CARACTERISATION DE L'ANTIGENE EXTRAIT D'EPITHELIUMS OESOPHAGIENS DE RAT I - MATERIEL ET METHODE A - EXTRACTIONS DES PROTEINES EPITHRLMÈS 1) Préparation de l'épithélium oesophagien par clivaae chorioétithélial L'oesophage de rat est composé de trois tuniques principales qui sont, de 'extérieur vers l'intérieur : une couche conjonctive (l'adventice), une couche musculaire (la musculeuse), une couche composée d'un chorion recouvert par un épithélium malpighien cor nifie. Après élimination, par dissection, de l'adventice et de la musculeuse, l'épithélium est séparé mécaniquement du chorion (clivage chorio-épithélial) après un choc athermique en milieu liquide (KH2/K2H-PO4 8,5 mM; NaCl 150 mM; EDTA 5 mM; PMSF 0,4 mM; pH 7,2). Les épithéliums clivés sont conservés hydratés par un volume minimal de PBS (KH2-/K2H-P04 8,5 mM; NaCl 150 mM; pH 7,2) avant de subir un contrôle histologique permettant de vé- rifier l'absence de chorion contaminant 2) Extraction des protéines épithéliales a) Tampons et séouences d'extraction L'antigène de l'invention étant exclusivement épithélial, c'est à partir du seul épithélium qu'ont été réalisées les extractions. A partir d'épithéliums clivés, l'extraction des protéines épithéliales est réalisée successivement par broyage au potter puis agitation à 4 Celsius en milieu tamponné. Après centrifugation, le surnageant est récupéré et le culot est soumis aux étapes d'extraction afin d'améliorer les rendements. Des protocoles classiques (W.W. Franke et al., J. Mol. Biol., 153:933-959, 1981 - Sun and Green, J. Biol. Chem. 253(6):2053-2060, 1978) adaptés à l'extraction séquentielle des protéines à partir de tissus épithéliaux et notamment de l'épiderme, ont été tout d'abord utilisés. Puis des extractions en une seule étape ont ensuite été testées. Différents milieux d'extraction correspondant à des tampons Tris-HCl additionnés ou non de sels (KCl, NaCl), de détergents (Triton, NP40), d'agents dénaturants (urée, SDS) et d'agents réducteurs (bêta-mercaptoéthanol) ont ainsi été testés. Au cours des extractions fractionnées, l'antigène a été retrouvé exclusivement dans la fraction correspondant soit à un tampon Tris de faible force ionique, soit à un tampon TBS-EDTA-Triton. Ceci a permis de confirmer que l'antigène n'est pas une cytokératine, de montrer qu'il est extractible en absence d'urée et d'agents réducteurs et qu'il est hydrosoluble. Cependant, en comparant les diverses techniques d'extraction, l'intensité de l'immunoréactivité est apparue légèrement supérieure en présence de NP40. Un milieu d'extraction constitué de TBS + inhibiteurs + NP40 0,5 * apparaît donc comme le plus efficace. La grande hydrosolubilité de l'antigène a été confirmée, lorsque le PBS destiné à empêcher la dessiccation des épithéliums lors des clivages chorio-épithéliaux et donc inhibant ceux-ci sous un très faible volume, a été analysé. Il est apparu que ce tampon PBS était riche en protéines et contenait des traces détectables d'antigènes. L'antigène n'était que partiellement extrait en PBS puisqu'on le retrouvait en quantité importante après broyage des oesophages en tampon TBS-NPQO. Cette étape de broyage n'a donc pas été supprimée. Lors de la purification de l'antigène, l'intense absorption de NP40 à 280 nm interférant avec celle des protéines, notamment en chromatographie de gelfiltration, a conduit à comparer les immunoréactivités d'extractions réalisées avec et sans NP40. Les culots restants ont été dans les deux cas réextraits en tampon additionné de NP40. Très peu d'antigène a été détectable dans ces culots, qui ont été extraits au départ avec ou sans détergent.En outre, les profils en gel PAGE-SDS ont été identiques et la quantité de protéines extraites a été très voisine (5,62 mg/ml sans NP40 contre 5,76 mg/ml avec NP40). Ce dernier tampon (TBS + inhibiteur sans toP40) est donc celui qui doit être adopté pour I'extraction de l'antigène en préalable à tous les travaux de purification et de caractérisation. b) Ostlmlsatlon des conditions thvsiaues d'extraction Afin d'optimiser la procédure d'extraction, certains paramètres physiques ont été explorés de manière systématique. Il s'agit de la température, de la durée, du type de broyage, du type d'agitation et de l'action d' inhibiteurs enzymatiques. - Broyage : Il a été effectué soit au potter électrique à haute vitesse, soit de façon plus douce, au potter manuel. L'efficacité de l'extraction a été dans les deux cas à peu près équivalente. Le potter électrique est cependant préféré car il permet le broyage d'un plus grand nombre d'oesophages. - Sonification L'optimisation de l'extraction par des sonifications de durée variable, après potterisation a été testée. Elle s'est avérée très faible et la sonification n'est donc pas nécessaire. - Agitation : Agitation douce et agitation rapide ont été comparées. Une agitation rapide en présence d'un détergent entraînant la formation de mousse et provoquant une suroxygénation du milieu est en effet susceptible d'altérer l'antigène. En fait, la qualité de l'extraction a été identique dans les deux cas. Une agitation douce a cependant été retenue pour préserver au maximum 1 antigène. - Terrtoérature Température ambiante et température de 4-Celsius ont été comparées. De meilleurs résultats ont t obtenus avec des extractions conduites à 4-Celsius. - Durée : Des extractions sous agitation de 15 minutes, 2 heures et 17 heures ont été comparées. Bien que 1' augmentation du temps d'extraction augmente faiblement la quantité d'antigène extrait, une durée de 15 minutes a été retenue pour la minimisation du risque d'altération de l'antigène. - Inhibit.eurs L'effet protecteur pour antigène des inhibiteurs suivants a été testé - Inhibiteur de la prolifération bactérienne Azide de sodium, - Inhibiteur d'enzymes lytiques protéases (aprotinine, PMSF), phosphatases (NaF, PCMB), glycosidases (déoxymannojirimycine, déoxyJirimycine). Des extractions sans inhibiteurs ont été réalisées notamment lorsque l'extrait était destiné à la caractérisation biochimique de l'antigène par action de différentes enzymes ; aucune modification de l'antigène nta été constatée en l'absence d'inhibiteur. - Protocole d'extraction optimisé L'étude des paramètres précédents a permis de déterminer le protocole d'extraction optimisé ci-après - Substrat : épithélium d'oesophage ae rat obtenu par clivage chorio-épithélialX - Tampon : Tris HC1 40 mM NaCl 150 mM EDTA 10 mM pH 7,4 - Inhibiteurs :Azide de sodium 0,1 8 PMSF 1 mM Aprotinine 2 mg/ml - Rapport substrat/tampon 500 tjl de tampon par épithélium oesophagien - Conditions Broyage : potter électrique 15 minutes Température de broyage : 4-Celsius Agitation après broyage : 15 minutes à 4-Celsius - Concentration protéique totale de l'extrait 5 à 8 mg/ml - Conservation de l'extrait brut -20 ou -40'C - PréDaratlon à partir de muqueuse oesoshaaienne totale Dans un but de simplification de la procédure d'extraction, l'extraction de l'antigène à partir de muqueuse oesophagienne totale a été étudiée. I1 s'agit alors d'une dissection de la muqueuse mais sans- clivage chorio-épithélial. La contamination protéique ainsi induite a été étudiée. Des extractions parallèles, soit à partir de muqueuses, soit à partir d'épithéliums clivés. L' analyse en PAGE-SDS des protéines extraites (fraction "PBS" et extraction par broyage selon la méthode de Sun and Green) montre que la présence du chorion n'entraîne pas de contamination protéique dans la zone de masse molaire de l'antigène. Après immunotransfert de la fraction épithélio-choriale extraite par broyage, l'antigène est parfaitement détectable. c) Concentration de l'extrait brut L'antigène étant faiblement représenté dans l'extrait brut (environ moins de 1 % des protéines totales), une étape de concentration des extraits s'avère nécessaire, surtout lorsque ceux-ci doivent être analysés par électrophorèse sur système FPLC (dépôts de l'ordre du microlitre). Parmi les diverses techniques de concentration testées, celle consistant à concentrer les extraits par précipitation au TCA 10 % a été retenue. Cette technique facile à mettre en oeuvre ne produit aucune altération de l'antigène puisque la réponse immunologique est parfaitement conservée en immunotransfert. De la même façon, des précipitations par l'méthanol ou le sulfate d'ammonium ainsi que la lyophilisation contrôlée n'induisent aucune altération sensible de l'antigène et sont donc parfaitement utilisables. B - ELECTROPHORESES Pour tous les milieux d'extraction étudiés ciaprès, les protéines solubles sont séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS (PAGE-SDS) puis électro-transférées sur nitrocellulose. 1) Séparation tar isoélectrofocallsatlon (IEF) horizontale . Gel : 9 X 15 cm, 4% acrylamide contenant des ampholines formant un gradient de pH de 3,5 à 9,5. Echantillon déposé : extrait brut préparé selon le pro tocole précédent, concentré par purification à l'acide trifluoroacétique (TCA) à 10% et repris dans l'eau. 2) Electrothorèses monodimensionnelles - Electrophorèse verticale classique selon la méthode décrite par Laemmli (Nature, 227 : 680-685, 1970) . Gel : 10 X 10 cm, 7% acrylamide . Tampon de migration : Tris 25 mM, glycine 192 mM, Sodium Dodécyl Sulfate (SDS),1%, pH 8,3. échantillon déposé : extrait brut lyophylisé et repris en Tris-HCl 10 mM pH 7.~4, SDS 2%, 2-Mercaptoéthanol (2ME) 1%, bleu de bromophénol 0,1%, glycérol 10%. - Electrophorèse horizontale miniaturisée" en conditions dénaturantes. Gel : 4 X 4 cm, 7,5% acrylamide Tampon 200 mM, Tricine 200 mM, SDS 0,55%, pH 8,1. Echantillon déposé : extrait brut concentré par préci pitation au TCA 10% et repris en Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, SDS 2%, 2-ME 1%, Bleu de bromophénol 0,1%. Electrophorèse horizontale "miniaturisée" en conditions natives. Gel : 4 X 4 cm, gradient de 8 à 25% en acrylamide Tampon de migration : Tris 250 mM, L-Alanine 880 mM, pH 8,8. Echantillon déposé : extrait brut concentré par préci pitation au TCA 10% et repris soit dans l'eau, soit en tampon Tris-HCl 200 mM à différents pH. 3 Electroohorèses bidimensionnelles IEF/PAGE-SDS première dimension : IEF horizontale. Gel : 4 X 4 cm, 4% acrylamide, gradient de pH 3,5 à 9,5 Echantillon déposé : extrait brut concentré par préci pitation à l'éthanol (4 volumes) et repris dans l'eau. deuxième dimension : électrophorèse dénaturante comme décrite précédemment. . Echantillon déposé : piste gel IEF incubé en Tris 112 mM, acide acétique 112 mM, SDS 2,5%, 2-ME 1%. C - IMMMNODETECTION L'immunodétection de l'antigène est réalisée à l'aide de sérums humains provenant de patients atteints de PR dans lesquels les autoanticorps anti-Stratum corneum d'oesophage de rat avait été préalablement titrés par immunofluorescence indirecte semiguantitative et affectés d'une valeur-titre de 0 à 8 : paramètre GIFOR (G-Immunofluorescence-Oesophage de Rat) La valeur-seuil, GIFOR = 2, qui correspond à une spécificité diagnostique pour la PR supérieure à 99 % permet de classer les sérums de malades en deux groupes : GIFOR+ et GIFOR- (C.Vincent et al., Ann. Rheum. Dis. 48:712-722, 1989). Dans les sérums choisis, on a également pris en compte le paramètre immunologique suivant : le titre des autoanticorps anticytokératines épidermiques de classe G déterminé en ELISA (GELISA) (G.Serre et al, J. Invest. Dermatol. 88:21-27, 1987). Ces autoanticorps réagissent en immunotransfert avec les cytokératines humaines contaminantes éventuellement présentes dans l'extrait et dues à la desquamation naturelle des manipulateurs. Les sérums utilisés ont été choisis pour consti cuver également deux groupes, GELISA+ et GELISA-, en fonction du titre élevé (DO > 0,6) ou faible (DO - GIFOR+/GELISAs - GIFOR+/GELISA - GIFOR-/GELISA+ - GIFOR-/GELISA Enfin, des sérums témoins provenant d'individus normaux ou de patients atteints d'infections rhumatologiques non rhumatoides ainsi que des anticorps monoclonaux murins spécifiques des cytokératines humaines ont été inclus dans les tests (G.Serre et al., Colloque INSERM, Vol. 171:524, 1988). Dans ces conditions expérimentales, l'antigène extrait d'épithéliums oesophagiens de rat est repérable en immunotransfert par une immunoréactivité spécifique des sérums de PR GIFOR+ correspondant à une large bande située entre 90 et 120 Kd. Les autoanticorps naturels antikératines se traduisent par la présence de bandes immunoréactives situées autour de 65-67 Kd, présentes dans les seuls sérums GELISA+, plus ou moins intenses en fonction de leur titre et totalement indépendantes de la valeur de GIFOR D - CHROMATOGRAPHIE Les molécules antigéniques ont été séparées dans différentes fractions après chromatographie séquentielle gel-filtration/interaction hydrophobe. Puis ces fractions ont été analysées par PAGE-SDS et PAGE en conditions natives. E - DIGESTION ENZYMATIQUR 1) Protéínase K Deux extraits d'épithélium d'oesophage de rat en tampon TBS/NP40 sont précipités au TCA 10% et les protéines reprises dans un tampon Tris-HCl 50 mM PH 7,5 CaC1î 10 mM. Un des extraits est additionné de protéinase K (préincubée pendant 1 heure à 37'C pour éliminer d'autres hydrolases éventuellement présentes dans la préparation commerciale) à la concentration finale de 50 Rg/ml. Les deux échantillons sont ensuite incubés pendant 1 heure à 37'C puis analysés comparativement en immunotransfert après migration en PAGE en conditions natives ou en PAGE-SDS. 2) Nucléase Deux extraits d'épithélium d'oesophage de rat en tampon TBS/NP40 sont précipités au TCA 10%. L'un d'eux est hydrolysé par 2 U/ L de nucléase de microcoque (hydrolyse de l'ADN et de 1'ARN) en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, CaC12 5 mM. Le deuxième échantillon, non traité, sert de témoin. Les deux préparations sont incubées pendant 1 heure à 37-C puis analysées comparativement en immunotransfert après migration en PAGE en conditions natives ou en PAGE-SDS F - DEGLYCOSYLATION 1) OxYdatlon~àà l'acide rerlodloue Le protocole de WOODWARD et COLL. (J. IMM. METH. 78:143-153, 1985) a été utilisé ; ce protocole permet l'oxydation periodique d'un échantillon préalablement transféré sur une membrane de nitrocellulose, 1 l'oxydation periodique pouvant être suivie d'une immunodétection. Un extrait d'épithélium d'oesophage de rat est transféré après migration en PAGE-SDS, La membrane de nitrocellulose est découpée en plusieurs pistes qui sont soumises à une oxydation periodique (incubation en tampon acétate de sodium 50 mM pH 4,4, periodate de sodium 20 mM, pendant 1 heure à l'obscurité et à température ambiante) suivie d'une réduction au borohydrure de sodium (NaBH4 50 mM en PBS pH 7,4 pendant 30 mn à température ambiante). Des échantillons témoins ne subissant aucun traitement chimique ou subissant uniquement la réduction ont été inclus. L'ensemble des échantillons est ensuite immunodétecté. 2) Traitement tar l'acide trifluoromethanesulfoniaue (TFMS) L'utilisation du TFMS, selon la méthode de EDGE et COLL. (ANAL. BIOCHEM. 118:131-137, 1981), permet une déglycosylation quasi-totale des glycoprotéines tout en conservant leur axe peptidique. Cette méthode a été appliquée à une glycoprotéine témoin, la fétuine bovine et à des extraits d'épithélium d'oesophage de rat contenant l'antigène. Des extraits sont dialysés contre de l'eau puis lyophilisés; Leur traitement est réalisé par addition d'un mélange (66/33-V/V) de TFMS et d'amisol (agent protecteur de l'axe peptidique) et incubation sous agitation après saturation en azote de l'atmosphère des tubes.Le protocole de référence a été optimisé en faisant varier différents paramètres - proportion de mélange TFMS/Anisol par rapport à la masse de protéines traitée : 33 à 266 Rl de mélange par mg de protéine totale de l'extrait oesophagien. - température : O'C, 4-C ou température ambiante. - Durée de l'incubation : 1, 3 ou 24 heures. Dans tous les cas, après incubation, l'arrêt de la réaction est effectué par addition de 2 volumes d'éther glacial et de 3 volumes d'un mélange py'idine/eau (50/50-V/V). Le précipité de trifluorométhanesulfonate de pyridinium, soluble dans la phase éthérée, a été éliminé avec elle. Après une nouvelle extraction par l'éther glacial, la phase aqueuse a été dialysée contre de l'eau. Les échantillons ont ensuite été lyophylisés, séparés par PAGE, transférés, puis immunodétectés. 3) Traltement ar la tettide N-alvcosldase F (PNGase F) La PNGase, également commercialisée sous le nom de Glycopeptidase F ou de N-Glycanase, hydrolyse la liaison amide existant entre le résidu asparaginyl d'une glycoprotéine et le N, N' diacétyl-chitobiose de la structure commune à tous les oligosaccharides N-liés. La fétuine contient trois chaînes oligosaccharidiques N-liées dont l'élimination par la PNGase F entraîne une diminution de masse molaire facilement visualisable en PAGE-SDS (S. HIRANI et al., ANAL. BIOCHEM. 162:485-492, 1987). La fétuine bovine (2 mg/ml) et un extrait lyophilisé d'épithélium oesophagien de rat (8 mg/ml de protéine) sont dénaturés pendant 5 mn à 90'C avec du SDS à 28 et du 2ME 0,05 M. Puis les protéines sont placées dans un milieu réactionnel de composition suivante - Nonidet P40 (NP40) 1,25% (protection de l'enzyme vis-à vis de l'action dénaturante du SDS), - phosphate de potassium 166 mM pH 8 (conservation du pH optimale de l'enzyme), - 1,10-orthophénentroLine 10 mM (inhibiteur de protéase) solubilisés dans du méthanol à la concentration finale de 10%, - PNGase F 0,3 U/Al. Dans ce milieu réactionnel, les concentrations finales respectives du SDS et du 2ME sont de 0,166 % et 16 mM. L'incubation est de 24 heures à 37'C. Des témoins "fétuines" ec " extraits antigéniques" incubés sans enzymes sont inclus dans le proto zone. Après hydrolyse et concentration par précipitation au TCA, les échantillons sont séparés par PAGE, transfé es et immunodétectés. G - REACTIVITE AVEC DIFFERENTES LECTINES Les Inventeurs ont cherché à confirmer la na =Üre glycoprotéique de l'antigène en détectant spécifiquement certains sucres par des lectines couplées à la peroxydase. Deux lectines végétales : les lectines de germes de blé (WGA) et la concanavaline A (ConA) ont été choisies pour leur spécificité différente tI.J. GOLSTEIN ez R.D. PORETZ, The Lectins : properties, function and application in biology and medicine) - la WGA reconnaît des résidus de ssD-N acétylglycosamine avec les affinités croissantes suivantes (1) GlcNAc - La Con A s'associe aux sucres suivant classés par affi nité croissante (2) aGlcNAc ANAL. BIOCHEM 127:389-394, 1982 et W.F. GLASS et al., ANAL. BIOCHEM. 115:219-224, 1981). L'incubation est réalisée dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 200 mM, CaC12 lmM, MnC12 1 mM et Tween 0,18 pendant 1 heure à 37'C et 1 nuit à 4 C. Celle-ci est précédée et suivie d'étapes de lavages dans le même tampon. Différents agents de saturation supplémentaires comme la gélatine ou la sérum-albumine bovine oxydée par un traitement à l'acide periodique ne permettent pas d'ampSifier la réponse obtenue lors de l'utilisation du seul Tween. Après le dernier lavage, l'association lectine-antigène est révélée par mise en évidence de l'activité peroxydasique par H202 et 4-chloro-1-naphtol comme lors des immunodétections. II - CARACTERISATION PYSICOCHIMIQOE DE~'ANTLGENPI La caractérisation physico-chimique de l'antigène a été effectuée à partir d'extraits bruts d'épithélium d'oesophage de rat, puis à partir de fractions antigéniques purifiées Dans les deux cas, après séparation électrophorétique, les protéines ont été transférées puis immunodétectées par des sérums de patients atteints de PR. A - MASSE MOLAIRE L'analyse en immunotransfert d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat séparé par PAGE-SDS et immunodétecté avec des sérums de PR GIFOR + et GIFOR montre que l'antigène se présente sous la forme d'une zone immunoréactive large et étalée correspondant à une protéine de masse molaire moyenne comprise entre 90 et 130 kD, d'une bande immunoréactive étroite correspondant à une protéine de masse molaire moyenne d'environ 210 kD et d'une zone immunoréactive correspondant à une protéine de masse molaire moyenne comprise entre 67 et 90 kD. B - POINTS ISOELECTRIQUES L'extrait brut est concentré cinq fois par précipitation TCA 10%, repris dans veau, séparé par IEF (pHi 3,5 à 9,5), transféré puis immunodétecté avec des sérums de patients atteints de PR GIFOR + et GIFOR -. Les molécules antigéniques présentent une aistribution très hétérogène, les protéines de l'extrait brut reconnues spécifiquement par la plupart des sérums GIFOR + se répartissent en un faisceau de bandes fines dont les points isoélectriques varient de 5,2 à 7,5. C - CARACTERTSTIQUE DE MIGRATION EN CONDITIONS NATIVES La figure 1 représente 1'immunotransfert d'un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat repris en milieu acide et séparé par PAGE en conditions natives. L'extrait brut concentré dix fois par précipitation au TCA, est repris dans l'eau (pH inférieur à 4), séparé par PAGE en conditions natives (8-25%), transféré puis immunodétecté avec des sérums de PR GIFOR + (pistes 74, 52, 5, 11) dilué au 1/100 ; la piste Tg représente un témoin négatif.Dans ces conditions de reprise à pH acide l'immunotransfert effectué avec quatre sérums de patients atteints de PR fait apparaître trois zones immunoréactives correspondant à des protéines de poids moléculaire moyen apparent d'environ 440 kD, 220 kD et 120 kD, lesquelles sont reconnues avec une affinité variable selon les sérums. D - ELECTROPHORESE BIDINENSIONNELLE IHP'/PAGE-SDS Cette technique qui combine IEF dans la premi ère dimension et PAGE-SDS dans la deuxième permet de déterminer simultanément les points isoélectriques et les masses molaires des diverses molécules antigéniques, de confirmer leur grande hétérogénéité de charge et de montrer leur grande hétérogénéité de masse. La figure 2 représente l'immunotransfert d'un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat séparé par électrophorèse bidimensionnelle (lEF/PAGE-SDS). L'extrait brut concentré 20 fois par précipitation à l'éthanol puis repris dans l'eau, est séparé par IEF (pHi 5 à 8) puis par PAGE-SDS (7,5*), transféré puis immunodétecté avec deux sérums de patients atteints de PR GIFOR +, dilués au 1/100. La zone immunoréactive de 90 à 130 kD présente des pHi variant de 5,85 à 7,35, ceux de la bande de 210 kD varient de 5,85 à 6,85. Une troisième population immunoréactive, en forme de "virgule" a migré de 120 à 67 kD tandis que ces pHi se répartissent de manière continue entre 5 et 7,5.Les molécules antigéniques de masse molaire inférieures à 90 kD, clairement détectées après électrophorèse bidimensionnelle n'apparaissent en élec t rohorès e monodimensionnelle qu'avec des sérums de titre élevé, sous la forme d'une extension de 1timmunoréactivité vers les zones de faible poids molécu iaire. La plus grande quantité d'antigène déposée en IEF/PAGE-SDS, permettant une meilleure sensibilité d'immunodétection, explique cette apparente discordance. E - CARACTERISTIQUES DE SEPARATION C}IROMATOGRAPHIQW3 La figure 3 représente la séparation en chro matographie d'interaction hydrophobe d'une solution antigénique prépurifiée par gel-filtration (profil d'élution suivi par mesure de la DO à 280 nit). Des fractions immunoréactives purifiées par chromatographie de gelfiltration (Superose 12) à partir d'un extrait brut sont séparés sur Phényl-Superose (Tampon d'équilibre phosphate 50 mM, NH2S04 1,7 M, pH 7 ; Tampon d'élution phosphate 50 mM, pH 7 ; volume injecté : 30 mm ; Débit 0,5 ml/mn ; DO 280 nm pleine échelle : 0,05 ; Collecte 1 ml/tube). Les profils- d'élution et l'étude par immunotransfert des différentes fractions antigéniques se sont avérés très reproductibles au cours de multiples purif i- cations. La répartition des molécules antigéniques dans les différentes fractions a donc pu être modelisée. La figure 4 représente la modélisation des profils d'immunoréactivité des fractions antigéniques purifiées par chromatographie séquentielle gelfiltration/interaction hydrophobe, obtenue après PAGE-SDS (1) ou PAGE en conditions natives (2) , Les différences d'intensité des bandes ou zones immunoréactives reflètent, pour une même bande ou zone, la richesse relative en protéines antigéniques de chaque fraction. En électrophorèse dénaturante, la- bande à 210 kD (fractions F, G et H), la large bande mal limitée de 90 à 130 kD (D, E, F, G et H) et une bande de 67 à 90 kD (C, D et E) ont été visualisées. En électrophorèse native, la bande fine à 440 kD (F, G et H), la bande à 232 kD (C, D, E, F, G et H) et la large bande au niveau de 120 kD (B, C, D et E) ont été retrouvées. La comparaison des molécules antigéniques analysées en PAGE-SDS dans les différentes fractions purifiées et des molécules identifiées après électrophorèse bidimensionnelle (IEF/PAGE-SDS) dans un extrait brut, comme indiqué à la figure 7, renseigne sur l'ampleur d'hydrophobicité respective - La bande à 210 kD dont les pHi varient de 5,85 à 6,85, est retrouvée dans les fractions obtenues en fin d'élution (F, G et H), elle est donc très hydrophobe. - La zone diffuse de 90 à 130 k, dont les pHi se situent de 5,85 à 7,35, présente le même profil d'élution que la bande à 210 kD (fraction E, F, G et H) et donc la même hydrophobicité. - Par contre, la population en forme de virgule qui présente des pHi plus étalés de 5 à 7,5, est retrouvée majoritairement en début d'élution (fractions B, C, D et E) et présente donc un caractère moins hydrophobe que les deux molécules précédentes. III - CARACTERISATION BIOCHIMIOUE DE L'ANTIGèNE A - LES MOLECCLES ANTIGENIQUES SONT DE NATURE PROTEIQUE La figure 5 représente 1 'analyse en immunotransfert des protéines d'un extrait antigénique digéré (B) ou non (A) par la protéinase K, séparé par PAGE en conditions natives (8-25z), transférés puis immunodétectés avec trois sérums de patients atteints de PR GIFOR + (pistes I à 3) et un sérum de patient atteint de PR GIFOR - (piste 4) ; la piste Tg représente des témoins négatifs. Les colorations au Rouge Ponceau des bandes de nitrocellulose correspondant aux échantillons traités montrent la digestion totale des protéines de l'extrait. L'immunodétection après PAGE en conditions non natives montre que l'iinmunoréactivité spécifique des sérums GIFOR + disparaît Lorsque l'échantillon est préalablement digéré par la protéinase K. L'iinmunodétection après transfert des échantillons séparés en PAGE-SDS a confirmé ce résultat. La nature protéique des molécules porteuses de l'antigéniclté étant affirmée, les Inventeurs ont déterminé s'il s'agissait d'homo- ou d'hétéroprotéines, quelles associations et/ou substitutions de l'antigène étaient susceptibles de rendre compte de la diversité de poids isoélectrique et de masse molaire apparente et quelle était la nature biochimique du ou des épitopes reconnus. B - LES PROTEINES ANTIGENIQUES NE SONT PAS ASSOCIEES A DES ACIDES NUrtwIQZES L'association éventuelle de l'antigène avec des acides nucléiques a été étudiée. Un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat a été traité ou non par la nucléase de microcoque puis analysé par électrophorèse en gel d'agarose 1%, suivie d'une coloration au bromure d'éthidium. Après séparation des échantillons par électrophorèse en gel d'agarose 1%, l'absence d'acides nucléiques dans l'échantillon traité prouve l'efficacité de la digestion enzymatique. La figure 6 représente l'analyse par immunotransfert après PAGE en conditions natives (8-25%) d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat traité (b) ou non (a) par la nucléase de microcoque. L'analyse a été réalisée avec trois sérums de patients atteints de PR GIFOR + (pistes 1 à 3) et un sérum de PR GIFOR - (piste 4) ; la piste Tg représente des témoins négatifs. L'immunodétection après PAGE en conditions natives montre l'insensibilité des protéines antigéniques au traitement par les nucléases tant du point de vue de leur immunoréactivité avec les sérums de patients de PR que de celui de leur masse molaire apparente, prouvant qu'elles ne sont pas associées à des acides nucléiques. C - LES PROTEINES ANTIGENIQUES SONT-RT.'T.KS DES GLYCOPROTEINES ? Les glycoprotéines présentent souvent une forte hétérogénéité de points isoélectriques et un taux inconstant de fixation du SDS qui rend médiocre leur résolution en PAGE-SDS. Les protéines antigéniques présentant également ces caractéristiques, les Inventeurs ont cherché leur éventuelle substitution par des résidus glucidiques. Dans ce but, des techniques visant soit à altérer les molécules de sucres éventuellement portées par l'axe peptidique, soit à débarrasser la partie protéique de ses résidus glycaniques, ont été utilisées. 1) Destruction d'éventuels étitotes alucidioues car 1 'acide teriodiatie La figure 7 représente l'immunodétection d'un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat qui, après séparation par PAGE-SDS (7,5%) et transfert a été - incubé pendant lh30 en tampon TBS (témoins "incubation" : piste a), - incubé pendant 1h en tampon acétate de sodium, puis ré duit pendant 30 mn au borohydrure de sodium (témoins "réduction" : piste b), - oxydé par l'acide periodique en tampon acétate de so- dium pendant 1h puis réduit pendant 30 mn au boro hydrure de sodium ("essai" : piste c), trois sérums de PR GIFOR + (pistes 1 à 3), deux sérums de PR GIFOR - (pistes 4 et 5) et deux sérums de contrôle (pistes 6 et 7) ont été utilisés ; la piste Tg représente des témoins négatifs. Le traitement par l'acide periodique n'a en rien modifié les protéines spécifiquement reconnues par les sérums de patients atteints de PR. Trois interprétations de ce résultat sont possibles - les protéines antigéniques sont des glycoprotéines mais les sucres sensibles à une oxydation periodique qu'elles portent ne sont pas impliqués dans le ou les épitopes majoritairement reconnus par les autoanticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoide. - les protéines antigéniques sont des glycoprotéines mais les sucres qu'elles portent de par leur nature et/ou leur type d'enchaînement sont insensibles à une oxyda tion periodique (1'acide periodique clive la liaison entre deux carbones vicinaux portant initialement soit chacun une fonction alcool, soit 1un une fonction alcool et l'autre une fonction acide ou cétone ou amide primaire ou secondaire). - les protéines antigéniques ne sont pas des glyco protéines. Afin de trancher entre ces trois possibilités, les Inventeurs ont utilisé une méthode ae déglycosylation totale puis cherché des modifications de la masse ou de I'immunoréactivité des protéines antigéniques. 2) Déalocosvlatlon Deux types principaux de lien permettent l'association d'un oligosaccharide à un axe peptidique la liaison O-glycosidique qui permet l'association a'un oligosaccharide à un résidu Serine ou Thréonine (et rarement hydroxylysine) par l'intermédiaire d'une galactosamine N-acétylée et la liaison N-glycosidique qui rattache un oligosaccharide à un résidu asparagine par l'intermédiaire d'une glucosamine N-acétylée. Pour déglycosyler les glycoprotéines, deux types de traitement peuvent être appliqués - des traitements aspécifiques permettant d'éliminer tous les types de radicaux glucidiques, qu'ils soient liés à la protéine par une liaison N- ou une liaison O-glycosidique. C'est le cas par exemple du traitement chimique par l'acide trifluorométhanesulfonique (TFMS); - des traitements spécifiques de l'un ou llautre de ces types de liaison. C'est le cas de la ss-élimination par la soude pour les liaisons O-glycosiaique et un certain nombre d'hydrolyse enzymatique plus ou moins spécifique de la nature chimique du sucre N-lié pour les liaisons N-glycosidiques. a) Traltement assécifioue tar le TFMS L'analyse par immunotransfert après PAGE-SDS (7,5%) d'un extrait antigénique traité par le TFMS et d'un extrait incubé dans l'eau montre que les protéines antigéniques présentent une légère diminution de masse molaire apparente par rapport à l'échantillon témoin. Bien que faible cette différence d'environ 10 à 20 kD est observée pour toutes les conditions de traitement et retrouvée dans deux expériences distinctes. L'analyse en immunotransfert après IEF des protéines d'un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat traité par le TFMS montre que l'immunoréactivité spécifique des sérums de patients atteints de -PR sur les échantillons témoins s'étale dans une zone de pHi d'environ 5,2 à 7,3. Après traitement des TFMS, les protéines immunodétectées par les sérums de patients atteints de PR ont présenté des pHi plus basiques compris entre 6 et 8. Ce changement de pHi et de masse molaire apparente des protéines antigéniques est en faveur d'une substitution glycanique des molécules. Cependant la persistance d'une mauvaise définition en PAGE-SDS et d'une large gamme de pHi en IEF suggère que les protéines anti génioues pourraient être substituées aussi par d'autres radicaux non glucidiques et/ou que les effets observés pourraient être dus au clivage d'une liaison peptidique particulièrement fragile. Toutefois, la conservation de l'immuno-réactivité après traitement par le TFMS est un argument fort en faveur de la nature non glucidique du ou des épitopes reconnus par les autoanticorps spécifiques de la PR. b) Traitement spécifique tar la PNGase F Afin de confirmer les résultats obtenus avec le TFMS, les Inventeurs ont entrepris des expériences de déglycosylation par l'enzyme PNGase F qui élimine spécifiquement les sucres N-liés. La déglycosylation par la PGNase F a été effectuée sur un extrait antigénique brut après dialyse contre de l'eau et lyophilisation. L'analyse de cet extrait par immunodétection en PAGE-SDS et transfert ne fait apparaître aucune différence entre l'antigène témoin et l'antigène traité par la PNGase F. Deux interprétations de ce résultat sont possibles - l'antigène n'est pas substitué par des N-oligosaccharides, - les oligosaccharides branchés à des résidus asparagine de la protéine ont une structure chimique originale qui les empêche d'être clivés par la PNGase F. Cependant, une seule analyse monodimensionnelle ne permet pas d'affirmer clairement l'insensibilité à la PNGase F des protéines antigéniques puisque cellesci se superposent partiellement, comme le montre l'analyse en électrophorèse bidimensionnelle. 3) Détection des sucres tar des lectines La réactivité éventuelle de l'antigène avec la lectine de germe de blé (W.G.A.) ou la concanavaline (conA) a été testée par "affinodétection" sur nitrocellulose antigénique et comparée aux profils d'immunodétection spécifiques des sérums de PR. Les protéines de 1extrait antigénique brut, reconnues après PAGE-SDS ou PAGE en conditions natives, par un sérum de patients atteints de PR, ont été différentes des protéines reconnues par les lectines. Cependant, des zones communes de réactivité, en particulier au niveau de la protéine de 210 kD en PAGE-SDS, suggère que la WGA et la ConA reconnaissent une partie de l'antigène. Des fractions antigéniques purifiées par chromatographie de filtration sur gel ont été analysées dans les mêmes conditions. Cette expérience a confirmé que des glycoprotéines de même poids moléculaire que certaines protéines antigéniques étaient reconnues par la ConA et que le profil de réactivité de la WGA semblait se rapprocher de celui d'un sérum de patients atteints de PR. La preuve dune affinité des lectines vis-àvis des protéines antigéniques a été obtenue après tEF/PAGE-SDS de l'extrait antigénique brut. La figure 8 représente la détection des protéines d'un extrait antigénique brut, après électrophorèse bidimensionnelle (IEF pHi 5 à 8/PAGE-SDS 7,5%) et transfert sur nitrocellulose, avec - en (2) : un sérum de patients atteints de PR GIFOR +, - en (4) : la ConA, - en (5) : la WGA, afin d'amplifier la réactivité, trois dépôts d'extraits antigéniques ont été effectués sur le gel d'IEF. Une fraction de l'antigène (bande à 200 kD et zone immunoréactive entre 90 et 130 kD) déposée côté anode y a précipité, produisant une réactivité artéfactuelle dans la zone des pHi acides. Cette étude a permis de montrer que les molécules reconnues par la ConA étaient différentes de l'antigène, mais que la WGA s'associait spécifiquement aux protéines antigéniques de 90-130 kD et 210 kD. Les protéines immunoréactives en forme de "virgule" s'étalant de 120 kD à 67 kD avec des pHi de 5 à 7,5 ne présentent, par contre, aucune réactivité vis-à-vis de la WGA. EXEMPLE 2 - CARACTERISATION DE L 'ANTIGENH EXTIT DE L'EPIDERME HUMAIN SPECIFIQUE DE LA POLYARTHRITE RHDDATO IDE I - MATERIEL ET METHODE A - PATIENTS ET SERUMS La présente étude a été réalisée à partir de 64 sérums de patients atteints de diverses maladies rhu matologiques parfaitement caractérisées sur les plans clinique et biologique. Parmi ces 64 sérums, 45 proviennent de patients atteints d'une polyarthrite rhumatoïde défile selon les critères de lAmerican Rhumatism Asso- ciation. 32 sérums provenant de sujets sains, hommes et femmes, ont été utilisés à titre de contrôle. L'immunodétection a été réalisée à l'aide de deux anticorps monoclonaux, l'un spécifique des cytokératintes humaines dénommé F 12-19 (réf. iblio. ou ou rét Biosoft-Clonatec), l'autre spécifique de la filaggrine humaine dénommé AKH-1 (réf. Blblio. ou réf. Biomédical Technologies Inc.). B - EXTRACTION EXTRACTION DES PROTEINES EPIDERMIQUES Des fragments de peau recueillis après chirurgie plastique mammaire et abdominale ou après circoncision ont été conservés à -80'C. L'épiaerme a été séparé mécaniquement du derme, selon la méthode décrite par Kassis et Sondergaard (Arch. Dermatol. Res. 273 301-306, 1982), par un traitement thermique à 57'C en tampon PBS (KH2-/K2H-PO4 8,5 mM ; NaCI 150 mM) contenant de i'EDTA 5 mM et du Phénylméthylsulfonylfluoride (PMSF) 0,5 mM puis broyé mécaniquement en tampon Tris-HCl 40 mM pH 7,* ; NaCl 150 mM ; EDTA 10 mM ; NP40 0,5 mM, ci-après dénommé tampon A. Après centrifugation à 12 000 g pendant 15 minutes, le surnageant a été séparé du culot contenant les cytokératines épidermiques. En outre, d'autres extractions ont été réalisées selon le même protocole mais dans un tampon Tris-HOl 20 mM pH 7,4 ; PMSF 0,5 mM, ci-après dénommé tampon B. Les différentes fractions ont été conservées à -20'C. C - ELECTROPHORESES Les protéines des diverses fractions ont été analysées par focalisation isoélectrique à l'équilibre ou avant ltéquilibre, ou par électrophorèse en gel d'acrylamide (PAGE) en présence de sodium dodécyl sulfate (conditions dénaturantes ; PAGE-SDS) ou en absence de sodium dodécyl sulfate (conditions natives ; PAGE-native). Des électrophorèses bidimensionnelles ont également été réalisées. Les protéines ont parfois été précipitées par 4 volumes d'éthanol ou par l'acide trichloroacétique (TCA) 15% final, afin d'en augmenter la concentration. D - INODETECTION Les protéines ont été transférées sur membrane de nitrocellulose selon la technique décrite par TOWBIN et al. (PNAS 76 : 4350-4354, 1979). Les sérums ont été utilisés dilués du 1/10 au 1/100 après incubation des bandelettes de nitrocellulose en PBS, Tween-20 0,05%. L'incubation en présence des sérums a été poursuivie pendant 1 heure à 37'C puis 12 heures à 4 C. Les anticorps monoclonaux AKH-1 dilué au 1/100 ou F12-19 dilué au 1/500 ont été incubés pendant 2 heures à 37 C. Après lavages, les bandelettes de nitrocellulose ont été révélées par des anticorps secondaires, anti-IgG humaines ou murines marquées à la peroxydas e. E - TRAITEMENTS ENZYMATIQUES L'extrait épidermique concentré (80 Rg/l) a été traité par la protéinase K (1 mg/ml, 30 minutes, 37 C en présence de SDS 1%) ou par la nucléase microccocale (100 U/ml, 30 minutes, 37 C dans un tampon Tris-CaC12 5mM, Tris-HOl 30 mM pH8). F - IMMUNOPRECIPITATION - L'extrait épidermique préadsorbé sur Protéine A-Sepharose a été incubé à 37'C pendant 2h en présence de l'anticorps AKH-1 ou F12-19 et de NaCl, 1 M final. Les complexes anticorps-antigène formés ont été ensuite recueillis par la protéine A-Sepharose puis analysés par immunotransfert après PAGE-SDS. G - PURIFICATION DES CYTOKERATINES Les cytokératines uréosolubles ont été purifiées à partir d'épiderme mammaire selon la méthode dé crite par SUN et GREEN (J. Biol. Chem. 252 : 2053-2060, 1978). H - PURIFICATION DE LA FILAGGRINE HUMAINE La filaggrine a été extraite à partir de peau mammaire selon la technique décrite par LIMLEY et DALE (BBA 774 : 28-35, 1983) avec les modifications sui vantes : extrait épidermique en urée 6M, préparé en absence d'agent réducteur, a été purifié sur chromatographie FPLC avec une résine échangeuse d'anions. Les protéines cationiques non retenues ont été précipitées par 4 volumes d'acétone, redissoutes dans un petit volume de tampon contenant 1,5% de SDS et 2,5% de 2-mercaptoéthanol et déposées au sommet d'un gel préparatif SDS de 10 cm de hauteur. Ce gel a ensuite été transféré sur une membrane du type Immobilan-PVDF commercialisée par la Société MILLIPORE.La zone correspondant à la filaggrine a été repérée par immunodétection avec l'anticorps AKE-1 et découpée ; la filaggrine a alors été éluée par 0,3 ml/cm2 de tampon d'élution (Tris-HCl 50 mM pH 8,8 SDS 2% Triton X-100 1t) et concentrée par précipitation. I - PURIFICATION DE L'ANTIGENE 20 cm2 d'épiderme mammaire ont été broyés au potter électrique dans le tampon A. L'homogénat a été centrifugé pendant 15 minutes à 10 000 g et le surnageant précipité par le TCA (15% final). Le précipité a été resolubilisé dans un petit volume de Tris-HCl 30 mM pH8, CaC12 5mM ; la fraction soluble a été clarifiée par centrifugation, additionnée de SDS 1,5 et 2ME 2,5* et déposée au sommet d'un gel préparatif SDS de 10 cm de hauteur. L'antigène a alors été purifié comme décrit cidessus pour la filaggrine, la zone correspondant à l'antigène étant référée par immunodétection avec un sérum de polyarthrite rhumatoide. II - RESULTATS A - CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE ET BIOCHIMIQUE DE L 'ANTIGENE Afin de caractériser l'antigène reconnu par les sérums de polyarthrite rhumatoide, un extrait épidermique mammaire a été préparé par homogénéisation d'épiderme mammaire dans le tampon A, en présence d'un détergent non ionique (NP40). Cet extrait soluble a été analysé par immunodétection après PAGE et transfert des protéines sur nitrocellulose. La figure 9 représente l'analyse en immunotransfert de l'extrait NP40 précédent avec des sérums de polyarthrite rhumatoide et des sérums de contrôle. L'extrait NP40 (8 mg/ml) a été précipité par TCA, repris en tampon Tris-CaC12 en le concentrant 7 fois puis analysé par immunotransfert après PAGE-SDS (gradient 8-25%). Les sérums ont été dilués au 1/10 en PBS-Tween 20 0,05%. les sérums 1 et 3 proviennent de patients atteints de myolane malui, le sérum 2 provient d'un patient atteint de la maladie de SHARP, le sérum 4 provient d'un patient atteint d'arthrose, le sérum 5 provient d'un patient atteint de polymyosite, le sérum 6 provient d'un patient atteint de la maladie de BIAGET, les sérums 7 à 21 proviennent de patients atteints de polyarthrite rhumatoide et les sérums 22 à 38 proviennent de sujets normaux ; t0 est un témoin incubé seulement avec l'anticorps anti-IgG humaine marquée. La plupart des sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoide (80%) ont reconnu une protéine présentant en gel SDS (conditions dénaturantes)-un poids moléculaire d'environ 40 kD. Sa migration n'a pas été mo difiée par l'omission de l'agent réducteur (2ME) dans le tampon d'échantillon, ce qui indique que cette molécule ne contient probablement pas de pont disulfure. Au concraire, 89% des sérums de patients atteints d'une ma laaie rhumatologique autre que la polyarthrite rhumatoide et aucun des sérums de contrôle n'ont reconnu cet antigène. Une protéine de 68 kD a été détectée non spécifiquement par une large portion de sérums appartenant à tous les groupes testés et donc vraisemblablement par des autoanticorps naturels. La figure 10 représente l'analyse en immunotransfert de l'extrait antigénique NP40 précédent, traité ou non par une nucléase (1) ou une protéase (2). En (1), l'extrait NP40 d'épiderme mammaire a été précipité par le TCA, repris en tampon Tris-CaC12 puis traité avec (+) ou sans (-) nucléase microccocale (100 U/ml) pendant 30 minutes à 37'C. En (2), l'extrait NP40 d'épiderme humain identique au précédent a été précipité par le TCA puis repris dans SDS 1% et traité sans (-) ou avec (+) 10 mg/ml de protéinase K pendant 30 minutes à 37'C. Dans tous les cas, les protéines ont été séparées en PAGE-SDS (8-25%), transférées puis immunodétectées avec des sérums de contrôle (a) et des sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoide (b) dilués au 1,'100. La disparition de la région immunoréactive après un traitement de l'extrait par la protéinase K confirme la nature pro téioue de la molécule porteuse du ou des épitopes reconnus car les autoanticorps, alors que cette région n'a pas été modifiée après une digestion des acides nucléiques par la nucléase de Micrococcus, les molécules reconnues spécifiquement par les sérums de patients atteints de PR après transfert et immunodétection des protéines épidermiques analysées par PAGE en conditions natives, sont hétérogènes. La figure 11 représente l'analyse de l'antigène par cette électrophor..èse en conditions natives cette analyse a consisté à précipiter l'extrait NP40 d'épiderme humain par l'éthanol, puis à effectuer une immunodétection après PAGE en conditions natives (8-25%) et transfert sur nitrocellulose avec des sérums de patients atteints de PR (sérums 1 à 4 et 8 à 8) et de sérums témoins (sérums 5 à 7), dilués au 1/100. La figure 12 représente l'analyse de l'antigène par isoélectrofocalisation (IEF). Les protéines de l'extrait NP40 d'épiderme mammaire ont été précipitées par l'éthanol, séparées par IEF (pHi 3 à 9), transférées sur nitrocellulose avec des sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoide (sérums S à 12) et des sérums témoins (sérums 1 à 4) dilués au 1/100, puis immunodétectées. L'antigène présente aussi une distribution très hétérogène de pHi, ceux-ci variant de 5,8 à 7,4. Cette hétérogénéité de pHi a été vérifiée en électrophorèse 2D (IEF/PAGE-SDS). La protéine reconnue spécifiquement par les sérums de patient atteints de PR, après transfert d'un tel geL 2D montre une image caractéristique en forme de virgule, le poids moléculaire apparent diminuant au fur et à mesure que le pHi devient plus basique. La figure 13 représente l'analyse de l'antigène en gel bidimensionnel IEF/PAGE-SDS ; les protéines de l'extrait NP40 d'épiderme mammaire ont été précipitées par l'éthanol, séparées par IEF (pHi 5 à 8) suivi de PAGE-SDS (12,5%), transférées sur nitrocellulose et immunodétectées par un sérum de patient atteint de polyarthrite rhumatoide (PR) et un sérum de contrôle. L'hétérogénéité marquée de l'antigène, aussi bien en masse qu'en pHi, indique probablement la présence d'isoformes modifiées ; elle suggère qu'il pourrait être glycosylé et/ou phosphorylé. Cependant un traitement par la N-peptide N-glycosidase-F n'a modifié ni sa -migration ni son immunoréactivité après PAGE-SDS. 3 - HROSOLUILITE DE L 'ANTIGENE 5 cm2 d'épiderme mammaire ont été broyés mécaniquement dans le tampon A ou dans le tampon B. Les homogénats ont ensuite été centrifugés 10 minutes à 10 000 g et une quantité égale des protéines solubles des deux surnageants a été précipitée par l'éthanol puis séparée par PAGE en conditions natives (8-25e), transférée sur nitrocellulose puis immunodétectée des sérums de patients atteints de PR et des sérums de contrôle. Cette étude indilue que l'antigène est extrait non seulement en présence d'un détergent (tampon A) mais également en son absence (tampon B). En outre, l'antigène est toujours retrouvé majoritairement dans les fractions solubles et présents dans les culots en très faible quantité.Ces résultats indiquent que 1antigène humain, comme celui d'oesophage de rat est une molécule très hydrosoluble. C - EXPRESSION DE L'ANTIGANG DANS DIFFERENTS TERRITOIRES ANATOMIQUES EPIDERMIQUES L'analyse par immunotransfert des protéines d'un extrait NP40 d'épiderme abdominal et d'épiderme préputial indique que l'antigène associé à la PR est présent dans l'épiderme humain indépendamment du sexe et du territoire anatomique (sein, abdomen ou prépuce), ainsi que de l'âge (enfants et adultes). L'antigène étant histologiquement localisé dans le Stratum corneum, il est légitime de penser que son abondance dépendra de L'épaisseur de celui-ci qui varie suivant le territoire anatomique. D - IDENTIFICATION DE L'ANTIGèNE L'antigène reconnu par les sérums de malades atteints de PR n'est pas une cytokératine épidermique humaine. La figure 14 représente - en (a) : un extrait NP40 d'épiderme mammaire immuno détecté, après PAGE-SDS (8-25*) et transfert sur nitro cellulose, avec un sérum de patient atteint de PR, pré incubé dune part avec le tampon d'extraction (1), avec l'extrait lui-même (2) et avec une fraction insoluble enrichie en cytokératine épidermique (3). - en (b) : les cytokératines uréosolubles immuno détectées, après PAGE-SDS (8-25%) et transfert, avec l'anticorps monoclonal anti-cytokératine F12-19 pré incubé soit avec le tampon d'extraction (1), soit avec l'extrait épidermique (2), soit avec une fraction enri chie en cytokératine (3), soit avec les cytokératines uréosolubles (4). - en (c) : les protéines de l'extrait d'épiderme (5), une fraction enrichie en cytokératine z) et les cyto kératines uréosolubles pures (7) séparées par PAGE-SDS (8-25%), transférées et immunodétectées avec lAcM anti-cytokératines F12-19. L'immunoréactivité des sérums de patients atteints de PR na pas été inhibée par une préincubation de ceux-ci sur des cytokératines épidermiques (enrichie ou purifiée) alors quelle a disparu en présence d'extrait hydrosoluble de peau. De même, l'anticorps monocLonal F12-19 na reconnu en immunotransfert, aucune protéine de l'extrait antigénique La forme caractéristique en virgule de l'antigène en gel 2D et son poids moléculaire apparent en gel SDS sont voisins de ceux de la filaggrine, protéine qui apparaît dans le Stratum granulosum au cours de la différenciation épidermique (SARRET et ai., Path. Biol. 37:297-303, 1989). Les Inventeurs ont donc cherché à déterminer si la filaggrine et l'antigène de l'invention étaient identiques et si les sérums de malades atteints de PR contenaient des autoanticorps anti-f ilaggrine. La figure 15 représente analyse d'un immunotransfert des protéines d'un extrait d'épiderme mammaire séparées en (A) par PAGE-SDS (12,5%), en (B) par PAGE en conditions natives et en (C) par IEF (pHi 3 à- 9), puis transférées sur nitrocellulqse et immunodétectées par des sérums de patients atteints de PR (sérums 1, 3, 6, 7 et 8), l'anticorps monoclonal anti-filaggrine AKH-1 (2), un anticorps monoclonal de contrôle (4) et un sérum de contrôle (5). Ces protéines ont été séparées en triplica (D) par NEpHGE suivi de PAGE-SDS (8-25%) puis transférées sur nitrocellulose et colorées au Rouge Ponceau (a) ou immunodétectées par l'anticorps monoclonal AKH-1 (b), et par un sérum de patient atteint de PR (c). L'antigène est reconnaissable à sa forme caractéristique en virgule. L'anticorps monoclonal antifilaggrine humaine AKH-1 reconnaît spécifiquement en immunotransfert une protéine épidermique humaine soluble en présence de NP40, présentant les mêmes caractéristiques de migration en conditions d'électrophorèse dénaturante ou native que l'antigène de la PR. Après IEF et gel 2D, l'antigène et la protéine reconnus en immunotransfert par AKH-1 présentent une image identique. Les Inventeurs ont alors cherché à déterminer si l'anticorps monoclonal AKH-1 pouvait immunoprécipiter l'antigène à partir de l'extrait épidermique en NP40. La figure 16 présente l'analyse comparative des protéines d'un extrait épidermique NP40, préabsorbées sur protéine A-Sepharose, séparées par PAGE-SDS (12,5%) - avant immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal AKH-1 (totale), - après immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal AKH-1 (IP KAH-l), - immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal de contrôle G36 (IP G36), puis, après transfert sur nitrocellulose, immuno détectée avec AKH-1, G36, un sérum de patient atteint de PR, un sérum de contrôle (CO) ou avec les seuls anticorps secondaires anti-IG de souris (Tg S) et anti-IG humaines (Tg h); les surnageants des fractions immunoprécipitées avec G36 (Surn G36) et AKH-1 (Surn AKH-1) ont été analysées de la même façon après précipitation avec le TCA. Ces résultats montrent que AKE-1 a effectivement immunoprécipité une protéine épidermique de même poids moléculaire que l'antigène de la PR, cette molécule étant d'ailleurs reconnue spécifiquement en immunotransfert par les sérums de patients atteints de PR. Cette immunoprécipitation a été réalisée en présence de NaCl 1 M, ce qui rend peu probable une co-immunoprécipitation due à une association entre les deux protéines (filaggrine et antigène). Afin de vérifier que les protéines de l'extrait reconnu par AKH-1 et par les sérums de patients atteints de PR étaient les mêmes, les surnageants d'une immunoprécipitation par 1'anticorps monoclonal anti-filaggrine ont été subséquemment analysés par immunotransfert avec un sérum de patients atteints de PR. La figure 16 montre que l'extrait a été épuisé (partiellement ou totalement) en antigène et en filaggrine par l'anticorps monoclonal antifilaggrine. A l'inverse, les sérums de patients atteints de PR n'ont pas immunoprécipité l'antigène. Ce résultat négatif peut être dû à une faible affinité des autoanticorps pour l'antigène, à une trop faible quantité d'autoanticorps dans le sérum ou à une non reconnaissance par ceux-ci de l'antigène sous sa forme native. Cette dernière hypothèse est peu probable puisque l'antigène est immunodétectable sur nitrocellulose après électrophorèse en gel natif. Afin de confirmer que la filaggrine et l'antigène de la PR ont au moins en commun l'épitoge détecté par 1anticorps monoclonal AKH-1, 1antigène a été purifié par élution à partir d'une membrane de transfert. La figure 17 représente l'analyse par PAGE-SDS et immunotransfert des protéines des diverses fractions au cours de la purification. Les protéines totales d'un extrait d'épiderme humain (1), les protéines solubles après pré cipitation de l'extrait par le TCA (2) et celies de la fraction antigénique purifiée finale (3) ont été séparées par PAGE-SDS (12,5%), transférées sur nitrocellulose et colorées à l'amldo-plaque (Amido) ou immunodétectées avec un sérum de patients atteints de PR (PR), un sérum de contrôle (cl), un anticorps monoclonal anti-filaggrine (AKH-1) et un anticorps monoclonal de contrôle (G36). Les protéines majeures, solubles après précipitation au TCA apparaissent sous la forme d'un doublet de poids moléculaire (PM) apparent d'environ 40 kD. Ce doublet est la principale bande immunoréactive reconnue par un sérum de patients atteints de PR. Cette protéine a alors été purifiée à partir d'un gel PAGE-SDS préparatif par transfert puis élution. L'antigène de la PR a été spécifiquement immunodétecté après PAGE-SDS, par l'anticorps monoclonal antifilaggrine AKH-1. De façon à vérifier que les sérums de patients atteints de PR reconnaissaient également la filaggrine humaine et donc que celle-ci était étroitement apparentée à l'antigène, les Inventeurs ont purifié la filaggrine selon la méthode décrite par LINNEY et DALE (BBA 744:28-35, 1983). La figure 18 représente l'analyse de la filaggrine humaine purifiée, analysée par PAGE-SDS (12,5%) transférée sur- nitrocellulose et immunodétectée avec des sérums de patients atteints de PR (sérums 1 à 4), un sérum de contrôle (sérum 5), un AcM de contrôle (6) et 1'AcM AKH-1 (7) ou colorée par le Rouge Ponceau (8). La figure 18 montre que les sérums de patients atteints de PR reconnaissent spécifiquement la filaggrine humaine. REVENDICATIONS - 1. Antigène de différenciation terminale présent dans des épithéliums malpighiens de mammifères, spécifiquement reconnu par les autoanticorps présents chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoide, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes - il est de nature protéique, - un traitement par une nucléase ne modifie pas son immunoréactivité, - un traitement par l'éthanol ne modifie pas son immunoréactivité, - un traitement par l'acide trichloroacétique ne modifie pas son immunoréactivité, - il est hydrosoluble. 2. Antigène selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est extrait d'épiderme humain. 3. Antigène selon la Revendication 2, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes - après électrophorèse en conditions natives, il se dissocie en plusieurs protéines antigéniques dont le poids moléculaire correspondant est compris entre environ 80 et 400 kD, les protéines les plus l;mmuno- réactives ayant un poids moléculaire apparent compris entre environ 80 et 120 kD, - après isoélectrofocalisation, il se dissocie en plu sieurs protéines antigéniques dont les pHi varient de 5,8 à 7,4. 4. Antigène selon l'une des Revendications 2 à 3, caractérisé en ce qu'après électrophorèse bidimensionnelle du type isoélectrofocalisation suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, il apparaît comme une protéine antigénique de poids moléculaire apparent moyen d'environ 40 kD dont les pHi varient de 5,8 à 7,4. 5. Antigène selon l'une des Revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il présente des propriétés immunologiques en commun avec la filaggrine humaine ou un fragment de protéolyse du précurseur de la filaggrine. 6. Antigène selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est extrait d'épithéliums oesophagiens de rat. 7. Antigène selon la Revendication 6, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes - après électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS, il se sépare en les trois protéines antigéniques suivantes * une première protéine de poids moléculaire moyen d'environ 210 kD, * une deuxième protéine de poids moléculaire moyen compris entre environ 90 et 130 kD, * une troisième protéine de poids moléculaire moyen compris entre environ 67 et 90 kD, - après électrophorèse en gel de polyacrylamide en condi tion native, il se sépare en les trois protéines anti géniques suivantes * une première protéine dont le poids moléculaire moyen apparent correspondant est d'environ 440 kD, * une deuxième protéine dont le poids moléculaire moyen apparent correspondant est d'environ 220 kD, * une troisième protéine dont le poids moléculaire moyen apparent correspondant est d'environ 120 kD. 8. Antigène selon l'une des Revendications 6 à 7, caractérisé en ce qu'après électrophorèse bidimensionnelle du type isoélectrofocalisation suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, il se dissocie en les trois protéines antigéniques suivantes - une première protéine de poids moléculaire moyen d'en viron 210 kD dont les pHi varient d'environ 5,85 à 6,85, - une deuxième protéine de poids moléculaire compris en tre environ 90 et 130 kD dont les pHi varient d'environ 5,85 à 7,35, - une troisième protéine dont le poids moléculaire dimi nue d'environ 120 à 67 kD pendant que son pHi varie d'environ 5 à 7,5. 9. Antigène selon l'une des Revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'après chromatographie de gel f tration et interaction hydrophobe puis électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, il se sépare en les deux fractions protéiques antigéniques suivantes - une première fraction très hydrophobe contenant la pro téine de poids moléculaire moyen d'environ 210 kD et la protéine de poids moléculaire moyen compris entre environ 90 et 130 kD, - une deuxième fraction moins hydrophobe que la première contenant la protéine de poids moléculaire moyen compris entre environ 120 et 67 kD. 10. Protéine de l'antigène extrait d'épithélium d'oesophage de rat selon la Revendication 8, caractérisé en ce qu'elle présente un poids moléculaire moyen d'environ 210 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 6,85. 11. Protéine- de l'antigène extrait d'épithé lium d'oesophage de rat selon la Revendication 8, caractérisé en ce qu'elle présente un poids moléculaire moyen compris entre 90 et 130 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 7,35. 12. Protéine de l'antigène extrait d'épithélium d'oesophage de rat selon la Revendication 8, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire moyen compris entre 67 et 120 kD et des pHi variant d'environ 5 à 7,5. 13.- Protéine de l'antigène extrait d'épiderme humain selon la Revendication 4, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire d'environ 40 kD et des pHi variant d'environ 5,8 à 7,4. 14. Composition antigénique pour le diagnostic de la présence d'autoanticorps dans un échantillon biolo gique d'un patient atteint de polyarthrite rhumatoide, caractérisée en ce qu'elle =comprend au moins un antigène selon l'une des Revendications 1 à 9 ou une protéine selon l'une des Revendications 10 à 13. 15. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il reconnaît un antigène selon l'une des Revendications 1 à 9 ou une protéine selon l'une des Revendications 10 à 13. 16. Procédé de purification des autoanticorps spécifiquement présents chez les patients atteints de la polyarthrite rhumatoide caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes - la mise en contact d'un fluide biologique d'un patient atteint de polyarthrite rhumatoide avec au moins un antigène selon l'une des Revendications 1 à 9 ou au moins une protéine selon l'une des Revendications 10 à 13, dans des conditions permettant la formation de com plexes immunologiques avec lesdits anticorps, - l'isolement desdits complexes du milieu réactionnel, - la séparation des autoanticorps des complexes immunologiques. 17. Procédé de diagnostic in vitro de la polyarthrite rhumatoide dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes - la mise en contact de cet échantillon biologique avec au moins un antigène selon l'une des Revendications 1 à 9, ou au moins une protéine selon l'une des Revendica tions 10 à 13, éventuellement marqué, ou encore un conjugué de cet antigène ou de cette protéine avec une molécule porteuse, dans des conditions permettant la formation d'un complexe immunologique avec les auto anticorps éventuellement présents; - la détection dans cet échantillon biologique de la pré sence du complexe immunologique, par des méthodes phy siques ou chimiques. 18. Nécessaire pour le diagnostic in vitro de la polyarthrite rhumatoide dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend - au moins un antigène selon l'une des Revendications 1 à 9 ou au moins une protéine selon l'une des Revendica tions 10 à 13, éventuellement marqué, ou un conjugué de cette protéine avec une molécule porteuse - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique avec les autoanticorps éven tuellement présents dans ledit échantillon biologique - un ou plusieurs réactifs pour la détection du complexe immunologique formé - le cas échéant, un échantillon de référence, tel qu'un sérum négatif.