Brevet FR2673951A1 — publié le 19920918

La présente invention concerne un mutant de levure qui est totalement ou partiellement privé d'un gène d'une enzyme spécifique et un procédé pour préparer un peptide ou une protéine utilisant ce mutant. Selon la présente invention, le gène de la levure peut être efficacement exprimé en réduisant ainsi les coûts de production du peptide ou de la protéine produits. Jusqu'à présent, parmi le système d'expression des gènes dans la levure en présence d'un inducteur, on attache une importance spéciale aux gènes provenant des enzymes du système de métabolisme du galactose parce que : (1) le niveau d'expression du gène est élevé, (2) son niveau d'expression de base est faible à l'état non induit et (3) sa manipulation est simple, et ainsi de suite (demande de brevet japonais examinée publiée n 2-49715, demande de brevet japonais non examinée publiée n 63-287486 et Agric. Biol. Chem. 52, p. 2035 (1988)). Maintenant, afin d'exprimer un gène de structure désirée en utilisant des promoteurs de ces gènes d'enzymes du système de métabolisme du galactose, il est nécessaire d'ajouter un supplément de galactose comme inducteur. En général, cependant, une levure contient le système d'enzyme de dégradation du galactose, le galactose est rapidement métabolisé dans un milieu et disparaît. En conséquence, pour maintenir l'expression du gène de structure et maintenir le gène, on doit constamment fournir au milieu du galactose coûteux pour que le galactose soit toujours présent dans le milieu. Cela augmenterait les coûts de production du produit désiré correspondant au gène de structure. Ce point de vue est l'inconvénient dans le cas de l'utililisation du système d'expression du galactose dans la levure. En conséquence, la demanderesse a effectué des recherches poussées pour inactiver la fonction de métabolisme du galactose d'une levure et augmenter l'efficacité du galactose supplémentaire fourni comme inducteur. Comme moyen d'inactivation du système d'enzyme de dégradation du galactose dans une levure, on a étudié un traitement de mutation classique et,dans cet esprit, il est évidemment rapporté qu'un mutant inactivant la galactokinase était recueilli avec le méthanesulfonate d'éthyle (J. Bacteriol, 108, p. 179 (1971)) etc. Cependant, à cause de la mutation inverse ou en retour, son inactivation est inévitablement instable.Afin d'atteindre une inactivation assurée, ctest-à-dire d'en tenir compte pour éviter suffisamment la mutation inverse ou en retour, la demanderesse a adopté un procédé pour la délétion partielle d'un gène comme moyen de destruction d'un gène, et l'on a ainsi trouvé que la fonction de métabolisme du galactose peut être inactivée certainement et en utilisant le mutant ainsi obtenu comme hôte, le système d'expression du gène par le galactose peut être atteint avec un rendement élevé. La présente invention repose sur cette découverte. La présente invention a pour objet un mutant de levure qui est privé totalement ou partiellement d'un gène d'enzyme capable de convertir ou dégrader le galactose. La présente invention a encore pour objet un transformant luimême obtenu en transformant un mutant de levure qui est privé totalement ou partiellement d'un gène d'enzyme capable de convertir ou dégrader le galactose avec un gène codant pour un peptide ou une protéine désirés propres ou étrangers dérivés du gène. En outre, la présente invention a pour objet un procédé pour préparer un peptide ou une protéine, qui consiste à cultiver le transformant dans un milieu contenant du galactose comme inducteur et à récolter les cellules contenant le peptide ou la protéine du bouillon de culture et un procédé pour préparer un peptide ou une protéine, qui consiste à récolter le peptide ou la protéine à partir de ces cellules. En outre, la présente invention a encore pour objet un procédé pour préparer une substance, qui consiste à cultiver le transformant dans un milieu contenant du galactose comme inducteur pour exprimer un gène d'une enzyme du transformant et à préparer la substance par l'action de l'enzyme produite. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, en référence aux dessins annexés, dans lesquels: - la figure 1 représente la construction du plasmide pKO1; - la figure 2 représente la construction du plasmide pKO2; - la figure 3 représente la préparation de la souche S. cerevisiae SK-2; - la figure 4 représente la préparation de la souche S. cerevisiae SK-21; - la figure 5 représente l'expression de l'activité de ss-galactosidase dans la souche S. cerevisiae SK-21/pMT24-271; - la figure 6 représente l'expression de l'activité de ss-galactosidase dans la souche S. cerevisiae SY50-1/pMT24-271. Comme enzyme mentionnée ci-dessus qui convertit ou dégrade le galactose, on peut utiliser l'une quelconque choisie parmi la galactokinase, la galactose- 1-phosphate uridinyl transférase et l'UDP-galactose-4-épimérase, mais on préfère en particulier la galactokinase. Comme gène du peptide ou de la protéine dérivé du peptide ou de la protéine propre ou du peptide étranger ou de la protéine étrangère, on utilise dans les exemples ci-après un gène de la ss-galactosidase de E. coli. En outre, on peut utiliser, par exemple, des gênes de peptides ou protéines tels qu'insuline, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), interféron (a, ss, y), hormone gonadotrope, hormone de croissance, enképhalines, endorphines, hormone adrénocorticotrope, hormone parathyroidienne, facteur de croissance des nerfs (NGF), érythropoïétine, facteur de coagulation du sang, urokinase, sérum albumine, cytokine, facteur de croissance épidermique (EGF), prolactine, rennine, lactogène du placenta, thymopolétine, polypeptide inhibiteur de sécrétion sanguine (GIP), cholécystokine (CCK-39), gastrine (bd), calcitonine, glucagon, sécrétine, motine, somatostatine, collagène, lipase, lactase, invertase, cellulase, amylase, protéase, a-glutamyl cystéine synthétase, glutathione synthétase, alcool déshydrogénase, etc. Comme levure décrite ci-dessus, on préfère Saccharomyces cerevisiae, mais on peut aussi utiliser S. carlsbergensis et ainsi de suite. Comme sources de nutriments du milieu, on peut utiliser sans limitation particulière n'importe lesquelles des sources de carbone, des sources d'azote et d'autres sels inorganiques utilisés de manière classique pour l'incubation d'un micro-organisme, aussi longtemps que l'on ajoute un complément de galactose comme inducteur. Comme sources de carbone, on peut utiliser la dextrine, la glycérine, le glucose, le saccharose, le galactose, le mannitol, l'acide lactique, l'amidon, etc. ; et comme sources d'azote, on peut utiliser la peptone, les poudres de soja, l'extrait de viande, le son de riz, le son, l'urée, la liqueur de trempage du maïs, les sels d'ammonium, les nitrates et d'autres composés azotés organiques ou inorganiques. Comme sels inorganiques, on peut utiliser, par exemple, le chlorure et les phosphates de sodium et, en outre, si nécessaire, des ions magnésium, potassium, calcium, zinc, manganèse ou fer. Les conditions de culture telles que température de culture, durée de culture, etc., peuvent être choisies pour être adaptées à la croissance des bactéries utilisées et pour produire le peptide ou la protéine au degré le plus élevé. Par exemple, on préfère ajuster le pH du milieu dans la gamme d'environ 4 à 8 et la température dans la gamme d'environ 20 à 30in. La présente invention est décrite concrètement ci-après. Le système de métabolisme du galactose par la levure est représenté par les équations chimiques suivantes. Dans diverses substances de ce système de métabolisme, le galactose est considéré comme agissant comme inducteur. Autrement dit, on trouve que la galactokinase est induite par le galactose. galactose + ATP GAL1 galactose-1-phosphate + aDP galactokinase galactose-1 phosphate + GAL7 glucose-1-phosphate galactose uridinyl transférase UDP-glucose + UDP galactose UDP-galactose GAL10 UDP-glucose UDPP-galactose-4-épimérase Afin de stimuler l'efficacité du galactose, il est suffisant d'inactiver soit la galactokinase (gène GAL 1), soit la galactose-1-phosphate uridinyl transférase (gène GAL 7), soit l'UDP-galactose-4-épimérase (gène GAL 10). On considère qu'il est particulièrement efficace d'inactiver la galactokinase (gène GAL-1). Ensuite, comme méthode d'inactivation, le gène GAL 1 est d'abord excisé d'un plasmide composite dans lequel le gène GAL 1 a déjà été cloné. La partie centrale du gène est digérée par une enzyme de restriction convenable et ensuite le fragment de gène de rorotidine-5'-phosphate décarboxylase (URA 3) est intégré dans le gène. Après ce remplacement, le fragment d'ADN recombiné est introduit dans une cellule de levure désirée (qui a été préalablement rendue ura 3, c'est-à-dire auxotrophe pour l'uracile) pour obtenir un transformant à gène GAL 1 inactivé. Le gène GAL 1 contenu dans ce transformant de levure est divisé par le gène URA 3 et partiellement supprimé. C'està-dire que le gène GAL 1 initial et normal a été remplacé par le gène mutant GAL 1 dont le fragment de gène URA 3 a été recombiné par recombinaison homologue en deux points.En conséquence, l'activité de galactokinase de ce transformant de levure a été inactivée. Ce transformant de levure peut être choisi comme mutant inverse ou en retour non auxotrophe pour l'uracile. On s'attend que ce transformant de levure, c'est-à-dire le mutant de levure, sera utilisé avec des vecteurs portant le promoteur GAL 7 (la plupart d'entre eux portent URA 3 comme marqueur de sélection comme indiqué dans la demande de brevet japonais examinée publiée n 2-49715, la demande de brevet japonais non examinée publiée n 63-287486) et ainsi de suite. En conséquence, le fragment de gène URA 3 qui a été inséré est excisé et retourne à l'auxotrophie pour l'uracile dans un état où GAL 1 est encore inactivé. La méthode est un mode de mise en oeuvre de l'inactivation de GAL 1 ; à la place du gène URA 3 décrit ci-dessus, on peut utiliser LEU 2 (ss-IPM déshydrogénase (2-hydroxy-4-méthyl-3-carboxyvalérate NAD oxyde réductase)), ADE 1 (phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthétase), TRP 1 (phosphoribosyl anthranilate isomérase (N-5'- phosphoribosyl anthranilate cétol isomérase)), HIS 1 (ATP phosphoribosyltransférase (l-5'-phosphoribosyl-ATP : pyrophosphate phosphoribosyl transférase)), HIS 2 (histidinol phosphate phosphatase (L-histidinol phosphate phosphate hydrolase)), etc. Ensuite, le mutant de levure ainsi obtenu dont on a supprimé le gène GAL 1 est transformé par un gène de peptide ou protéine propre ou de peptide ou protéine étranger et le transformant est cultivé dans un milieu avec complément de galactose pour produire un peptide ou une protéine désiré. Autrement dit, le gène de la ss-galactosidase de E. coli est choisi comme gène modèle de la protéine désirée ; le gène est inséré entre le promoteur GAL 7 et le terminateur GAL 7 pour construire un plasmide. Le mutant de levure décrit cidessus est transformé par ce plasmide pour obtenir le tranformant. Le transformant est cultivé dans un milieu auquel on ajoute un complément de galactose comme inducteur. L'activité de la ss-galactosidase résultante est comparée avec celle du transformant à gène GAL 1 non inactivé transformé par le même plasmide. Comme indiqué dans les figures 5 et 6, les résultats révèlent qu'il y a une différence significative d'activité de B-galactosidase, indiquant que le mutant de levure à gène GAL 1 inactivé peut être fourni pour l'utilisation efficace du galactose comme inducteur. Le transformant décrit ci-dessus est encore cultivé dans un milieu avec complément de galactose. On prépare une substance en utilisant l'action enzymatique du bouillon de culture contenant le transformant ou ses matières traitées. Des exemples de ces substances comprenent la glutathione, l'alcool, etc. Selon la présente invention, on propose un mutant de levure qui a été privé totalement ou partiellement d'un gène d'enzyme capable de convertir ou de dégrader le galactose. En préparant un peptide ou une protéine par une technique de génie génétique utilisant ce mutant de levure comme hôte, on peut exprimer et préparer efficacement le peptide ou la protéine. La présente invention est décrite plus en détail en référence aux exemples ci-après. Exemple 1 Culture du mutant S. cerevisiae à gène GAL 1 inactivé: (1) Préparation du plasmide pK0î La construction du plasmide pK0î est expliquée en référence à la figure 1. S. cerevisiae dans lequel le gène GAL 1 de S. cerevisiae a été cloné et E. coli HB101/pYK2003 portant le vecteur navette pYK2003 de E. coli ont été cultivées dans 150 ml de milieu L ayant la composition indiquée dans le tableau 1 et contenant un complément de 25Clg/ml d'ampicilline pour préparer environ 200 g d'ADN plasmide pYK2003. TABLEAU 1 Milieu L Extrait de levure Bacto 5 gel Bactotryptone 10 g/l NaCl 5 gel pH 7,5 Ici, pYK2003 est obtenu en prélevant un fragment Sal I/BamH I d'environ 8 kb de l'ADN du phage kgt30Sc491 (J. Mol.Biol., , p. 285-315 (1981 dans lequel le gène GAL 1 de S. cerevisiae a été cloné et en le remplaçant par la région Sal I/BamH I du vecteur navette YRp7 (Proc. Natl. Acad. Sci., X, p. 1035-1039 (1979 de S. cerevisiae/E. coli. Le fragment d'ADN du gène GAL 1 (1911 bp) a été découpé d'environ 50 ug de pYK2003 par traitement par l'enzyme de restriction Eco RI (fabriquée par TAKARA) et isolé des autres fragments par électrophorèse sur gel d'agarose. Lorsque l'on a fait agir l'enzyme de restriction Dra I (fabriquée par TAKARA) sur le fragment d'ADN de 1911 bp pour digérer, ce fragment d'ADN a été divisé en trois parties de 1179 bp, 345 bp et 387 bp. Après avoir lié environ 0,2 g de linker BglII phosphorylé (d pC-A-G-A-T-C-T-G) (fabriqué par TAKARA) avec ces trois fragments d'ADN par la ligase (fabriquée par TAKARA), on y a fait agir les enzymes Bgl II (fabriquée par TAKARA) et Eco RI pour exposer le site Bgl II et le site Eco RI. Les fragments d'ADN ainsi obtenus ont été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose pour les séparer dans l'ordre des poids moléculaires. Sauf pour le fragment d'ADN de 345+4 bp correspondant à la partie centrale du gène parmi les trois fragments d'ADN, le fragment 1179+4bp et le fragment 387+4 bp correspondant aux deux extrémités ont été extraits. Les deux fragments ont été liés l'un avec l'autre par la ligase et le produit de liaison a été traité par Eco RI pour préparer le fragment d'ADN de 1570 bp. Le fragment d'ADN a été lié avec et inséré dans le site Eco RI du vecteur multicopie pUC119 (3162 bp) (fabriqué par TAKARA) de E. coli, qui a été introduit dans E. coli HBIO1 (fabriqué par TAKARA) pour produire un transformant. On a ainsi obtenu le plasmide pKO 1 (4732 bp). (2) Construction du plasmide pKO 2 La construction du plasmide pKO 2 est expliquée en référence à la figure 2. On a traité environ 10,ug de plasmide pNKY51 (Genetics, 116, p. 541 (1987 portant le gène URA 3 de S. cerevisiae avec 10 unités d'enzyme de restriction Bgl II (fabriquée par TAKARA) et 10 unités de Bam H (fabriquée par TAKARA) pour exciser environ 3 jtg de fragment d'ADN URA 3 de 3843 bp du plasmide pNKY5î. D'autre part, on a fait agir 50 unités de l'enzyme de restriction Bgl II sur environ 50,ug du plasmide pKO 1 pour couper le plasmide sur le site de coupure par l'enzyme de restriction Bgl II. Le fragment d'ADN URA 3 décrit ci-dessus a été lié avec et inséré dans le site de coupure par la ligase et E. coli HB101 a été transformé pour obtenir un plasmide de 8575 bp qui a été dénommé pKO 2. (3) Préparation de la souche S. cerevisiae SK-2 Ensuite, on a fait agir l'enzyme de restriction Eco RI sur environ 100,ut du plasmide pKO 2 pour retirer environ 30 ug d'un fragment d'ADN de 5413 bp contenant URA 3 et les deux extrémités d'ADN du gène GAL 1. Le mutant S. cerevisiae YS50-1 auxotrophe à l'uracile (le groupe de gènes de dégradation du galactose est du type sauvage) obtenu par culture dans le milieu YPD ayant la composition représentée dans le tableau 2 a été le milieu YPD ayant la composition représentée dans le tableau 2 a été transformé par environ 15,ug de ce fragment d'ADN et cultivé dans un milieu SD déficient en uracile ayant la composition représentée dans le tableau 3 pour obtenir des transformants. Parmi ces transformants, l'un des transformants devenu certainement non auxotrophe pour l'uracile a été dénommé souche S. cerevisiae SK-2 (voir figure 3). TABLEAU 2 Milieu YPD Extrait de levure 10 g/l Polypeptone 20 g/l Dextrose (glucose) 20 g/l pH non ajusté TABLEAU 3 Composition du milieu SD déficient en uracile Base azotée de levure (Difco) 6,7 g/l Dextrose (glucose) 20 Sulfate d'adénine 20 mg/l L-tryptophane 20 L-histidine,HCl 20 L-arginine,HCl 20 L-méthionine 20 L-tyrosine 30 L-leucine 30 L-isoleucine 30 L-lysine,HCl 30 L-phénylalanine 50 Acide L-glutamique 100 Acide L-aspartique 100 L-valine 150 L-thréonine 200 L-sérine 400 pH 4,8 (par NaOH) On a fait pousser cette souche S. cerevisiae SK-2 à 250C pendant 48 h dans un milieu à la gélose avec un complément de 2 % de galactose au lieu de glucose dans le milieu SD ayant la composition indiquée dans le tableau 4. 1l a été révélé que la croissance de la souche S. cerevisiae SK-2 était beaucoup plus mauvaise que la croissance de la couche S. cerevisiae 50-1. Par contre, les deux souches poussaient de manière équivalente dans le milieu SD ayant la composition indiquée dans le tableau 4 qui contenait une quantité égale de glucose, pas de galactose. Ces résultats révèlent que la souche S. cerevisiae SK-2 altère la capacité de fermentation du galactose. TABLEAU 4 Composition du milieu SD Base azotée de levure (Difco) 6,7 g/I Dextrose (glucose) 20 Uracile 20 ml/l Sulfate d'adénine 20 L-tryptophane 20 L-histidine,HCl 20 L-arginine,HCl 20 L-méthionine 20 L-tyrosine 30 L-leucine 30 L-isoleucine 30 L-lysine,HCl 30 L-phénylalanine 50 Acide L-glutamique 100 Acide L-aspartique 100 L-valine 150 L-thréonine 200 L-sérine 400 pH 4,8 (par NaOH) Ensuite, l'ADN a été extrait de la souche SK-2. En utilisant le fragment d'ADN URA 3 (3843 bp) et le fragment 1179 bp de GAL 1 comme sondes, l'insertion du fragment URA 3 dans le gène GAL 1 sur le chromosome a été confirmée par hydridation de Southern. (4) Préparation de la souche S. cerevisiae SK-21 Ensuite, dans l'hypothèse où il serait nécessaire d'utiliser le gène URA 3 comme marqueur de sélection, on a choisi dans la souche S. cerevisiae SK-2 un mutant dont le gène URA 3 inséré a été perdu par recombinaison homologue. La sélection a été effectuée en cultivant la souche S. cerevisiae SK-2 en présence d'acide 5-fluoro-orotique et en choisissant le mutant résistant à l'acide 5-fluoro-orotique par mutation spontanée (Mol. Gen. Genet., 197, p. 345 (1984 . La souche à gène GAL 1 inactivé qui devenait à nouveau auxotrophe pour l'uracile a été dénommée souche S. cerevisiae SK-21. Exemple 2 Expression du gène utilisant la souche S. cerevisiae SK-21 comme hôte En utilisant la souche S. cerevisiae SK-21, on a utilisé le gène de la ss-galactosidase (lac Z) de E. coli comme gène modèle de la protéine désirée. D'abord, l'ADN du vecteur navette pMT24-271 (Mol. Cell. Biol., 6, p. 246 (1986 de E. coli portant lac Z et de S. cerevisiae a été récolté dans E. coli HB101/pMT24-271. En utilisant l'ADN, la souche S. cerevisiae SK-21 a été transformée. Son marqueur de sélection était URA 3. On a utilisé la souche S. cerevisiae YS50-1 comme groupe témoin de l'hôte. Les transformants obtenus ont été dénommés S. cerevisiae SK-21/pMT24-271 (AJ 14659) et S. cerevisiae YS50-1/pMT24-271 (AJ 14658), respectivement. Ces souches ont été déposées au Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology au Japon sous les numéros FERM P-11982 et FERM p-11981, respectivement. Les deux souches décrites ci-dessus ont été inoculées, respectivement, sur 30 ml de milieu SGlyLac déficient en uracile ayant la composition indiquée dans le tableau 5 et complété par 0,25-5 % de galactose et cultivées à 250C pendant 1 à 19 h pour étudier la production de B-galactosidase. TABLEAU 5 Composition du milieu SGlyLac déficient en uracile Base azotée de levure (Difco) 6,7 g/l Glycérol 20 Acide lactique 20 Sulfate d'adénine 20 mg/l L-tryptophane 20 L-histidine,HCl 20 L-arginine,HCl 20 L-méthionine 20 L-tyrosine 30 L-leucine 30 L-isoleucine 30 L-lysine,HCl 30 L-phénylalanine 50 Acide L-glutamique 100 Acide L-aspartique 100 L-valine 150 L-thréonine 200 L-sérine 400 pH 4,8 (par NaOH) En conséquence, l'activité de ,8-galactosidase dans le cas de la souche S. cerevisiae SK-21/pMT24-271 était d'environ 2,5 fois celle de la souche S. cerevisiae YS50-1/pMT24-271, comme indiqué dans les figures 5 et 6. Les résultats indiquent que la souche S. cerevisiae SK-21 est extrêmement utile dans le système d'expression du gène utilisant le galactose comme inducteur. REVENDICATIONS 1. Mutant de levure, caractérisé en ce qu'il est totalement ou partiellement privé d'un gène d'une enzyme capable de convertir ou dégrader le galactose. 2. Mutant de levure selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite enzyme est la galactokinase. 3. Mutant de levure selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite levure appartient au genre Saccharomyces cerevisiae. 4. Transformant, caractérisé en ce qu'il est obtenu par transformation d'un mutant de levure selon la revendication 1 par un gène codant pour un peptide ou une protéine propre ou un peptide ou une protéine étranger sous le contrôle d'un promoteur dont l'expression est induite par le galactose. 5. Transformant selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite protéine est une enzyme. 6. Procédé pour préparer un peptide ou une protéine,caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un transformant selon la revendication 4 dans un milieu contenant du galactose comme inducteur et à récolter ledit peptide ou ladite protéine du bouillon de culture contenant ledit transformant. 7. Procédé pour préparer une substance, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un transformant selon la revendication 5 dans un milieu contenant du galactose comme inducteur pour exprimer un gène d'une enzyme dudit transformant et à préparer la substance par l'action de l'enzyme produite.