Brevet FR2678946A1 — publié le 19930115

PHOTOREACTEUR POUR LA CULTURE EN MASSE DE MICROORGANISMES EN CONDITIONS PHOTOCONTROLEES L'invention a pour objet un photoréacteur pour la culture en masse de microorganismes en conditions photocontrôlées. De manière classique, la production de microorganismes par photosynthèse s'opère dans un récipient de culture, ou photoréacteur, contenant un milieu liquide nutritif apportant les éléments nécessaires à la multiplication des microorganismes, comme l'azote, le phosphore et le potassium, en présence de dioxyde de carbone et de rayonnements lumineux. La production en photoautotrophie de microorganismes tel que les algues ou les Cyanobactéries microscopiques, unies ou pluricellulaires, se mesure en gramme de biomasse (en matière sèche), par mètre carré de surface éclairée naturellement ou artificiellement, et par jour ; on considère un cycle de 24 heures en éclairement continu ou discontinu.Elle obéit à l'équation établie par Myers lumière C 2 + H20 + N, P, K (et autres éléments minéraux) biomasse + 02 Dans les expériences réalisées jusqu a ce jour dans les productions de masse en éclairement naturel dans des systèmes à ciel ouvert ou des systèmes clos, la production de biomasse exprimée en g/m2/jour est linéairement proportionnelle à la quantité totale d'énergie lumineuse incidente exprimée en kcal/m2/jour, du moins dans la partie du rayonnement visible (ou autre unité, celle-ci étant toutefois d'un intérêt pratique pour les calculs de rendement : 1 gramme de biomasse = 6 kcal). Ceci s'explique par le fait que la concentration en biomasse croissant avec la quantité d'énergie lumineuse apportée, les effets nocifs d'un excès d'intensité lumineuse (surexposition) sont compensés par l'augmentation du nombre de cellules (effet Tyndall) d'un point de vue physique, et par la mise en oeuvre des stratégies physiologiques des microorganismes qui s'adaptent à des intensités lumineuses croissantes en augmentant leur taux de synthèse de caroténoïdes (surtout chez les Chlorophycées).Il en va de même pour les radicaux libres provenant d'une suraccumulation de dioxygène de la photosynthèse (dont l'émission est proportionnelle à l'énergie lumineuse) car, dans ces conditions, les microorganismes mettent en jeu des stratégies physiologiques conduisant à décupler leur aptitude à produire des agents antioxydants (SOD, tocophérols, vitamine C). Ce qui se passe dans les situations de surexposition lumineuse se passe aussi tout du moins pour un grand nombre d'espèces de microalgues et de Cyanobactéries dans les cas de sous-exposition lumineuse. C'est ainsi que chez les Cyanobactéries, les Rhodophycées, les Cryptophycées, des pigments complémentaires (les phycobiliprotéines) permettent de collecter une quantité totale de lumière plus grande que ne leur permettrait la seule présence de chlorophylles. D'autres dispositifs membranaires existent notamment chez les Dinophycées ou c'est la synthèse d'un caroténoide, la péridinine, qui, associée au complexe chlorophyllien, permettra une collecte plus large de la lumière. Divers facteurs limitants interviennent sur le taux de production de biomasse. Ainsi, le rendement de la photosynthèse au niveau cellulaire ne peut dépasser 6,7 % de l'énergie photonique incidente totale, sur les bases théoriques de la photosynthèse en 1990. Les rendements actuellement obtenus dans les productions de microalgues et de Cyanobactéries selon les procédés mis en oeuvre oscillent entre 1 et 4 %. La température, le pH, le taux de C02 et des éléments minéraux présents peuvent également constituer des facteurs limitant la production photosynthétique de biomasse. Cette dernière peut être en outre affectée par des effets corrosifs de type chimique, par exemple une concentration excessive en oxygène photosynthétique, ou de type mécanique résultant d'une turbulence dans le milieu de culture, créée par une agitation mécanique, le pompage de la culture ou le bullage d'un gaz. Si la production quantitative de biomasse dépend en premier lieu de la quantité totale d'énergie lumineuse, la composition qualitative de la biomasse dépend du programme selon lequel est appliqué cette quantité totale d'énergie lumineuse, c'est-à-dire de la photopériode. C'est le système phytochrome, souvent appelé horloge biologique, qui est le récepteur des signaux lumineux à bas niveau d'énergie de cette horlogerie cellulaire qui induit ou réprime telle ou telle voie de synthèse. La qualité spectrale de la lumière intervient ici. On connaît au moins deux séries de photorécepteurs, l'un dans le bleu, l'autre dans le rouge. Ainsi, l'alternance en éclairement naturel d'une photopériode et d'une nyctipériode entraîne-t-elle, en culture continue de microorganismes, tels que les microalgues, une synchronisation de son développement, à savoir : division cellulaire de nuit (augmentation du nombre de cellules avec protéosynthèse active), croissance cellulaire de jour (augmentation de la taille et du volume cellulaire avec synthèse cellulaire de lipides, de caroténoides ou d'hydrocarbures et de produits antioxydants liés à l'émission d'oxygène par photosynthèse). On notera que chez les tallophytes non photosynthétiques comme les champignons, la synthèse des caroténoïdes est sous le contrôle du système photochrome fusarium, neurospora, cephalospora, rhodotorula et autres. Le fait que les tallophytes photosynthétiques, comme les microalgues et les Cyanobactéries utilisent la lumière comme seule source d'énergie ne doit pas faire oublier ces processus "bas niveau d'énergie". En cas de baisse de l'intensité lumineuse pendant la photopériode, la synthèse de pigments protéiques comme les phycobiliprotéines augmente considérablement, tout du moins chez les espèces capables d'en fabriquer comme les Cyanobactéries, les Rhodophycées ou les Cryptophycées. La qualité spectrale de la lumière influe aussi sur ces synthèses comme démontré dans le cas des Cyanobactéries avec des filtres verts ou des filtres rouges appliqués entre la source lumineuse et le photoréacteur de culture. Les dispositifs de production de biomasse photosynthétique décrits dans les brevets FR 85 00655, 87 13647 et 84 08320 sont constitués de tubulures dans lesquelles circule une suspension de microalgues. Ces tubulures sont disposées dans un plan horizontal ou incliné et exposé à la lumière naturelle. Les variations périodiques, journalières et saisonnières, les incidents climatiques (nuages) entraînent des variations biochimiques de la biomasse par un mauvais contrôle de la lumière en qualité, quantité et durée. En outre, la disposition horizontale, ou inclinée, de ces réacteurs ne permet la capture de la lumière que sur une faible épaisseur de culture (de 3 à 6 cm au maximum). L'invention a pour but de remédier au moins en partie aux inconvénients des dispositifs connus à ce jour. Elle vise en particulier un photoréacteur autorisant le contrôle de la lumière avec une grande maîtrise. L'invention a plus spécialement pour objet un photoréacteur permettant de jouer à la fois sur la quantité totale de lumière apportée au milieu de culture, son programme par photopériode et sur la qualité spectrale de façon à effectuer un photocontrôle de la production métabolique de microorganismes tels que microalgues ou Cyanobactéries, principalement de la voie lévulinique conduisant aux chlorophylles et aux phycobiliprotéines et de la voie mévalonique conduisant aux caroténoides. Le photoréacteur selon l'invention qui comprend, des moyens d'amenée du milieu de culture et de récupération de la culture, et des moyens d'amenée de dioxyde de carbone, est caractérisé en ce qu'il comprend une enceinte fermée (1), dont au moins les parois destinées à être exposées à la lumière sont en un matériau transparent à la lumière naturelle ou artificielle, cette enceinte comportant une ou plusieurs cavités intérieures, également en un matériau transparent à la lumière naturelle ou artificielle, cette ou ces cavités étant pourvues de moyens d'éclairage (7), de telle sorte que de la lumière naturelle ou artificielle pénètre également par l'intérieur dans la culture introduite dans le photoréacteur. Selon une disposition préférée, le photoréacteur de l'invention comprend en outre des fibres optiques disposées de manière à plonger dans le milieu de culture introduit. La présence de ces fibres optiques permet d'assurer pendant le jour en lumière naturelle, un complément de lumière naturelle ou artificielle au sein de la culture. Selon une autre disposition préférée, le photoréacteur comporte des moyens de contrôle de la qualité de la lumière émise sur ses parois extérieures et sur les parois des cavités intérieures et/ou dans les fibres optiques. A cet effet la ou les cavités intérieure(s) et/ou les parois extérieures comportent des filtres permettant de sélectionner les longueurs d'ondes souhaitées. En variante la ou les cavité(s) intérieure(s) sont pouvues de moyens d'éclairage avec des lumières monochromatiques. D'une manière générale, le photoréacteur du dispositif de l'invention permet une très grande souplesse de l'utilisation de la lumière naturelle, que ce soit de la lumière solaire directe ou de la lumière diffuse, et de la lumière artificielle en quantité, c'est-à-dire en intensité et durée d'application, et en qualité, c'est-à-dire par rapport à sa composition spectrale. L'application d'un programme approprié permet ainsi d'optimiser la production de biomasse, un rendement de pratiquement 6% étant obtenu. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'ensemble de l'enceinte formant le photoréacteur est élaboré en un matériau transparent, ce qui permet d'effectuer les cultures de microorganismes en lumière naturelle ou artificielle. Comme exemples de matériau transparent, on citera le verre ou une matière plastique souple ou rigide, telle que le polyéthylène, le polychlorure de vinyle, le polymétracrylate de méthyle ou des polycarbonates. Afin d'assurer une température appropriée pour une culture donnée, pendant une période contrôlée, le photoréacteur est avantageusement pourvu de moyens de contrôle thermique. Ce contrôle thermique est assuré avantageusement par une double enveloppe transparente entourant au moins une partie de l'enceinte exposée à la lumière et dans laquelle circule un fluide. I1 s'agit d'un fluide caloporteur, notamment de l'eau ou de l'huile, ou d'un fluide frigoporteur tel qu'un glycol. Les microorganismes en culture sont maintenus en suspension grâce à un système d'agitation par exemple de type air lift ou une agitation quelconque. Le photoréacteur est éclairé par de la lumière naturelle ou artificielle, selon un programme continu ou discontinu, sur sa face externe, sur sa face interne et le cas échéant par l'intérieur grâce à des fibres optiques plongeant directement dans la culture. D'une manière avantageuse, un tel photoréacteur permet, en un lieu donné, d'utiliser au maximum la lumière naturelle sans en subir les inconvénients saisonniers ou météorologiques tout en l'optimisant pour obtenir un contrôle de la composition biochimique de la cellule. Une lumière artificielle peut être utilisée comme un complément destiné à augmenter la quantité de lumière totale du volume de liquide pour augmenter la concentration cellulaire, donc dépasser la production que donnerait la seule lumière solaire. Cette lumière artificielle peut avoir la même composition spectrale que la lumière naturelle ou être enrichie à volonté dans le bleu ou le rouge (zone du photorécepteur bleu et du photochrome). Elle permet de prolonger la photopériode naturelle lors des jours courts d'hiver, de printemps et d'automne. Elle peut aussi servir de complément en quantité d'énergie distribuée sur 24 heures. La lumière artificielle apportée par ces fibres optiques peut être une lumière discontinue très forte en intensité distribuée par flashes programmés. L'invention vise également un procédé de culture de microorganismes caractérisé en ce que le milieu de culture est introduit dans un photoréacteur tel que défini plus haut et qu'il est soumis à l'action de lumière artificielle et/ou naturelle venant de l'extérieur du photoréacteur, et/ou de l'intérieur par des cavités intérieures du photoréacteur et le cas échéant, de fibres optiques plongeant dans le milieu de culture, l'intensité et la qualité de l'éclairement, ainsi que la longueur de la photopériode étant contrôlés de manière à optimiser la production de biomasse et sa qualité biochimique. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la suite de la description en référence aux figures 1 et 2 qui représentent schématiquement - la figure 1 une coupe longitudinale d'un photoréacteur selon l'invention, raccordé à un dispositif d'apport de milieu de culture carbonaté, et - la figure 2 une coupe vue de dessus du même photoréacteur, Le photoréacteur représenté sur les figures 1 et 2, comprend une enceinte de culture (I) fermée s' emboîtant sur un support constituant un socle de maintien (2). L'enceinte (1) présente une forme générale annulaire avec une partie cylindrique, entourée d'une double paroi (3), et une partie inférieure (4) formant le fond, effilée pour éviter les sédimentations cellulaires. La double paroi, dans laquelle circule un fluide destiné à maintenir la température de la culture proche de la température optimale, peut être recouverte de filtres sélectifs (5). Il s'agit par exemple de filtres de gélatine de type Chromoid permettant à partir de la source lumineuse interne de ne retenir que certaines longueurs d'ondes. On citera par exemple les filtres ChromoWid (R) n" 101 (jaune), 419 (bleu foncé), 112 (rose foncé), 114 (rubis), les filtres à fibres n" 461 (bleu ardoise) et 464 (rouge moyen). Un renfort métallique (6), gainé de matière plastique et soudé permet d'asseoir cette enceinte sur le support (2) s'emboîtant dans l'enceinte de culture (1) et disposé sous le dispositif d'éclairage interne (7). Le fond de l'enceinte comprend une arrivée d'air (8) et un conduit d'amenée du milieu de culture (9) pourvu de moyens d'injection (10) du milieu de culture carbonaté sous pression. L'un des côtés de l'enceinte (1) comporte dans sa partie supérieure une surverse latérale (11), ainsi que des sondes de mesure (13) du pH et de la température. L'air est évacué par la sortie (12). Le centre de l'anneau formé par 1 'enceinte comprend un dispositif d'éclairage interne (7) solidaire d'un support (14) comportant une ou, selon le volume de l'enceinte, plusieurs lampes fluorescentes. Ces lampes peuvent être - du type COOL-WHITE ou lumière du jour, - du type GRO-LUX (enrichi en lumière bleue et rouge), - du type GERMICIDE (ut), pour stérilisation de la partie culture. Ce dispositif se glisse dans l'enceinte de culture. De ce fait, les tubes fluorescents peuvent être très facilement interchangés. Le fonctionnement de ces lampes est commandé par une horloge réglée en fonction de la longueur de photopériode choisie. La plupart de ces lampes sont à ce jour disponibles jusqu'en 2,4 mètres de longueur, ce qui permet de concevoir le photostat sous forme d'une colone et ainsi de retenir une agitation type air lift. Entre ce dispositif d'éclairage et la paroi interne de l'enceinte annulaire de culture, il est possible d'intercaler des filtres comme indiqué plus haut. Un ventilateur hélicoïdal (15), disposé à la base du dispositif d'éclairage, permet d'évacuer une grande partie des calories émises par les lampes fluorescentes. Des fibres optiques (16) plongent dans l'enceinte au sein du milieu de culture. Le conduit d'amenée (9) est raccordé à un dispositif d'apport de milieu de culture carbonaté. Ce dispositif représenté sur la figure 3, comprend un réservoir de carbonatation (17) contenant le milieu de culture et le gaz à dissoudre sous pression. Ce réservoir est alimenté en milieu de culture à partir de l'enceinte (18) à l'aide d'une pompe (19) commandée par des sondes de niveau (20). Un système d'apport en C02 (21) régulé par une sonde de pH (22) sous pression variable est relié au réservoir (17). Une pompe (23) permet l'alimentation du photoréacteur (1) en milieu de culture carbonaté à un débit constant déterminant le taux de dilution de la culture, le milieu carbonaté étant introduit à l'aide d'aiguilles d'injection (10). Un pH-mètre (24) et un régulateur de pH (25) assurent le contrôle du pH. La pression d'utilisation du C02 est commandée par l'évolution du pH de la culture. Une fixation de C02 par les microorganismes se traduit par une augmentation du pH et entraînera donc une augmentation de la pression du C02 dans le réservoir de carbonatation pour augmenter ainsi la quantité de ce gaz dissous dans le milieu de culture. Une autre possibilité de carbonater la culture consiste à injecter C02 en mélange avec l'air ou tout autre atmosphère contrôlée (1 à 10 * de C02). La proportion de ce mélange peut être commandée par l'évolution du pH (électrovanne ou vanne motorisée). Dans le cas de grosses installations, à la sortie du cultivateur, l'air peut être recyclé et la teneur en C02 complétée. Ce système présente l'avantage de permettre un enrichissement progressif du dispositif en oxygène provenant de la photosynthèse et libéré dans la culture, condition particulièrement intéressante dans le cas où l'on recherche la production d'antioxydants. Le milieu de culture sursaturé est injecté sous pression pour assurer la carbonatation. L'injection du C02 est asservie au pH de la culture mesurée en permanence. Le milieu de culture se trouve à la température optimale requise grâce au fluide de la double paroi. Pour assurer le maintien en suspens ion des microorganismes et un bon transfert de masse entre les phases liquide, gaz, solide (milieu minéral de culture, C02/02, microorganismes) on soumet la culture à agitation à l'aide d'une rampe de distribution d'air assurant une agitation par air lift ou on utilise une pompe de circulation du milieu liquide. Le soutirage de la culture est effectué en continu par la surverse, qui permet de compenser l'apport continu de milieu de culture dans l'enceinte (non représenté) et de récolter ainsi un volume équivalent de suspension cellulaire. Dans une variante le circuit de distribution du milieu liquide, du gaz et de la culture comporte un système d'ultrafiltration permettant une surconcentration de la biomasse par extraction d'une partie du milieu de culture contenant les métabolites extracellulaires. Le dispositif de l'invention est particulièrement approprié pour la culture des microorganismes par photosynthèse, tout spécialement la culture de microalgues, de Cyanobactéries, de bactéries photosynthétiques et certaines espèces hétérotrophes nécessitant de la lumière pour exprimer un métabolite particulier, par exemple des caroténoides chez les champignons. Parmi les microalgues utilisables dans le photoréacteur de l'invention, on citera Spirulina, Anaboena, Dunaliella, Pormidium, Chlorella, Rhodella, Scenedesmus, Isochrysis, Chlamydomonas et Pavlova. A titre d'exemples, on indiquera ci-après le dimensionnement d'un dispositif selon l'invention. La culture étant éclairée sur deux faces, et par des fibres optiques, une épaisseur de culture de l'ordre de 14 cm s'avère satisfaisante. Pour une même hauteur de culture, le volume de culture dépendra du diamètre intérieur donc de l'importance de la source lumineuse interne. Nombre de Diamètre Diamètre Volume de lampes intérieur extérieur culture pour internes du cultivateur du cultivateur une hauteur (cm) (cm) de 1 m (litres) (litres) 1 7 21 30 3 14 28 50 5 20 34 90 5 20 34 90 Nombre de Volume de Surface totale Rapport lampes culture pour exposée Surface/ internes H = 1 m à la lumière Volume internes H = 1 m à la lumière Volume 1 0,03 m3 0,9 m2 30 3 0,05 m3 1,3 m2 26 5 0,90 m3 1,7 m2 19 5 0,90 m3 1,7 m2 19 Les unités tubulaires telles que décrites notamment dans le brevet FR 87 13 647 du 2 octobre 1987 au nom du C.E.A. ont un rapport surface/volume compris entre 15 et 40. REVENDICATIONS 1/ Photoréacteur pour la culture de microorganismes par photosynthèse comprenant des moyens d'amenée du milieu de culture et de récupération de la culture et des moyens d'amenée de dioxyde de carbone, caractérisé en ce qu'il comprend une enceinte fermée (1), dont au moins les parois destinées à être exposées à la lumière sont en un matériau transparent à la lumière naturelle ou artificielle, cette enceinte comportant une ou plusieurs cavités intérieures, également en un matériau transparent à la lumière naturelle ou artificielle, cette ou ces cavités étant pourvues de moyens d'éclairage (7), de telle sorte que de la lumière naturelle ou artificielle pénètre également par l'intérieur dans la culture introduite dans le photoréacteur. 2/ Photoréacteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte des fibres optiques (15) disposées de manière à plonger dans le milieu de culture introduit. 3/ Photoréacteur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de contrôle de la qualité de la lumière émise sur ses parois extérieures et sur les parois des cavités intérieures et/ou dans les fibres optiques. 4/ Photoréacteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que la ou les cavités intérieure(s) et/ou les parois extérieures comportent des filtres permettant de sélectionner les longueurs d'ondes souhaitées 5/ Photoréacteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que la ou les cavité(s) intérieure(s) sont pourvues de moyens d'éclairage avec des lumières monochromatiques. 6/ Photoréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la photopériode et l'intensité de l'éclairement auquel il est soumis sont contrôlés suivant un programme permettant d'optimiser la production de biomasse et sa qualité biochimique. 7/ Photoréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est élaboré en un matériau transparent choisi parmi le verre, ou une matière plastique souple ou rigide comme le polyméthracrylate de méthyle, le polyéthylène, le polychlorure de vinyle, ou des polycarbonates. 8/ Photoréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est pourvu de moyens de contrôle thermique (3), de manière à assurer une température appropriée sur une durée contrôlée pour une culture donnée. 9/ Photoréacteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que les moyens de contrôle thermique sont constitués par une double enveloppe transparente autour d'au moins une partie de l'enceinte, dans laquelle circule un fluide caloporteur tel que l'eau ou l'huile, ou un fluide frigoporteur tel qu'un glycol. 10/ Photoréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte un système d'agitation (8) pour maintenir les microorganismes en suspension, par exemple de type airlift ou une agitation mécanique. 11/ Dispositif pur la culture de microorganismes par photosynthèse, caractérisé en ce qu'il comporte un photoréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 relié à un dispositif d'apport de milieu de culture carbonaté. 12/ Procédé de culture de microorganismes, caractérisé en ce que le milieu de culture est introduit dans un photoréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et qu'il est soumis à l'action de lumière artificielle et/ou naturelle venant de l'extérieur du photoréacteur, et/ou de l'intérieur par des cavités intérieures du photoréacteur et le cas échéant, de fibres optiques plongeant dans le milieu de culture, l'intensité et la qualité de l'éclairement, ainsi que la longueur de la photopériode étant contrôlés de manière à optimiser la production de biomasse.