Brevet FR2673431A1 — publié le 19920904

Arrière-plan technologique de l'invention La présente invention concerne un support pour la culture des cellules ou des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum et un dispositif du type à colonne rempli dudit support pour la culture en continu de ces cellules. D'une manière conventionnelle, il était bien connu dans une méthode de culture des cellules d'utiliser un milieu dans lequel environ 10 % d'un sérum animal est ajouté à un milieu synthétique auquel des acides aminés, des vitamines, des nutriments essentiels, des sels inorganiques et analogues sont ajoutés ("technologie de culture de tissu" Asakura Shoten, 1988) Toutefois, étant donné que le milieu animal présente des qualités variables selon les lots fabriqués, il est nécessaire de sélectionner un lot approprié lorsque les cellules sont cultivées De plus, étant donné que la fourniture du milieu animal est instable, comme inconvénient, la méthode n'est pas appropriée pour être utilisée à l'échelle industrielle En outre, lutilisation du milieu dans lequel le sérum animal est ajouté présente comme inconvénient le fait que la séparation des substances utiles produites dans les cellules est difficile car des protéines du sérum sont présentes dans le milieu à une concentration élevée. Sommaire de l'invention Un objet de la présente invention est de fournir un support pour la culture efficace des cellules ou des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum. Un autre objet de la présente invention est de fournir un dispositif du type à colonne rempli dudit support pour la culture en continu des cellules, dans lequel les cellules prolifèrent en continu et se différencient et les substances utiles produites dans les cellules sont recueillies efficacement par passage à travers le support dans la colonne. Ces objets et d'autres de la présente invention seront mis en évidence dans la description qui suit. Conformément à la présente invention, on fournit un support pour la culture des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de cellules, comprenant un matériau de support contenant un composé oxyde métallique ayant un intervalle d'absorption d'infrarouge de 1040 à 1 140 cm-1. De plus, conformément à la présente invention, on fournit un dispositif du type à colonne pour la culture en continu des cellules, contenant ledit support mentionné ci-dessus pour faire passer en continu un milieu exempt de sérum à travers le support afin de faire proliférer en continu et de différencier les cellules prolifératives adhérentes de sorte qu'une substance utile produite dans les cellules est recueillie d'un éluat dudit support. Description brève des dessins La figure 1 est un graphique montrant la relation entre la concen- tration de l'acide lactique en mmol Il dans le milieu utilisé pour la culture des cellules et le temps de culture en jours conformément à l'exemple 1; la figure 2 est un spectre d'absorption d'infrarouge pour hydroxyapatite; la figure 3 est un graphique montrant la relation similaire montrée à la figure 1 conformément à l'exemple 2; la figure 4 est un spectre d'absorption d'infrarouge pour le verre silicate; la figure 5 est un graphique montrant la relation similaire montrée à la figure 1 conformément à l'exemple comparatif 1; la figure 6 est un spectre d'absorption d'infrarouge pour lalumine; la figure 7 est un graphique montrant la relation similaire montrée à la figure 1 conformément à l'exemple comparatif 2; la figure 8 est un spectre d'absorption d'infrarouge pour le carbure de silicium; et la figure 9 est un diagramme montrant les résultats de 'électro- phorèse du liquide concentré obtenu conformément à lexemple 3 (a = marqueur de poids moléculaire; b = protéine produite dans la cellule). Mode de réalisation préféré de l'invention Un support pour la culture des cellules ou des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum conformément à la présente invention est composé d'un matériau de support comme ingrédient principal contenant un composé oxyde métallique ayant un intervalle d'absorption d'infrarouge de 1040 à 1 140 cm-1 (désigné ci-après par composé oxyde métallique) Les cellules ou les cellules prolifératives adhérentes peuvent être sélectionnées à partir des suivantes: une cellule ostéoprogénitrice en souche MC 3 T 3-E 1, un fibroblaste, une cellule endothéliale, une cellule musculaire, une cellule nerveuse, des cellules tumorales de ces cellules, les cellules men- tionnées ci-dessus dans lesquelles un gène ecdémique ou extérieur a été incorporé par transduction et des mélanges de celles-ci. Le composé oxyde métallique utilisé comme support pour la culture des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum de la présente invention peut être sélectionné de préférence parmi l'hydroxyapatite, le verre au silicate, la zircone et des mélanges de ceux-ci Le composé oxyde métallique a un intervalle d'absorption d'infrarouge de 1040 à 1 140 cm-l, plus préférablement de 1080 à 1 100 cm-l Lorsque le composé oxyde métal- lique n'a pas cet intervalle d'absorption d'infrarouge mentionné cidessus, les cellules meurent durant leur culture La forme du composé oxyde métallique peut être sélectionnée de façon variée conformément aux types de réacteurs pour la culture des cellules Par exemple, la forme peut être un corps poreux ou des particules granulaires De plus, la taille de particules du composé oxyde métallique peut être de préférence de 0,05 à 20 mm et sa surface spécifique mesurée par la méthode d'absorption des gaz peut être de préférence non supé- rieure à 70 m 2/g. Pour préparer le composé oxyde métallique utilisé comme support pour la culture des cellules dans un milieu exempt de sérum de la présente invention, on peut utiliser une méthode bien connue Par exemple, en utilisant un procédé à presse en caoutchouc à sec, on peut obtenir un produit compact avec une forme prédéterminée et, si nécessaire, le produit compact peut être fritté Ou bien un produit compact fritté ou un bloc de verre ayant une certaine taille ou plus peut être obtenu et broyé et classifié à une taille de particules prédéterminée pour obtenir le composé oxyde métallique. En outre, un dispositif du type à colonne pour la culture en continu des cellules conformément à la présente invention est composé du support mentionné ci-dessus rempli dans le dispositif Le milieu exempt de sérum est passé en continu à travers le support de façon que les cellules prolifératives adhérentes mentionnées prolifèrent en continu et se différencient Par consé- quent, une substance utile produite dans les cellules est recueillie de l'éluat obtenu à partir du support Pour charger le support dans la colonne, par exemple, le composé oxyde métallique peut être chargé en premier dans la colonne puis un milieu pour les cellules prolifératives adhérentes ou un milieu exempt de sérum est ajouté. Pour préparer le milieu exempt de sérum, la prescription d'un milieu de culture de cellules animales ou d'un milieu essentiel minimum de Eagle peut être utilisée Une solution de sels inorganiques, d'aminoacides, de vitamines, de nutriments essentiels ou des mélanges de ceux-ci peut être préparée Après la préparation, la solution peut être stérilisée Si nécessaire, après stérilisation, des facteurs de croissance cellulaire, des hormones, des facteurs d'adhésion cellu- laires ou des mélanges de ceux-ci peuvent être ajoutés à la solution Dans le support pour la culture des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum conformément à la présente invention, on peut employer un milieu exempt de sérum et, ainsi, il est avantageux de pouvoir fournir un milieu ayant une composition prédéterminée, tandis que l'opération de culture est facile sans nécessiter la sélection d'un lot approprié de cellules Lorsque le support pour la culture des cellules dans un milieu exempt de sérum est employé pour préparer un récipient de culture, par exemple un disque de Petri, un ballon, une bouteille à rouleau et analogue, les cellules peuvent être cultivées sans sérum conformément avec les objets. De même, le dispositif du type à colonne pour la culture en continu des cellules, rempli dudit support est extrêmement utile comme un bioréacteur, car les cellules prolifèrent en continu et se différencient, et les substances utiles produites dans les cellules adhérentes au support sont séparées efficacement et purifiées en labsence de protéines superflues. Exemples de linvention La présente invention sera expliquée en référence aux exemples illustratifs qui suivent Toutefois, il est à noter que ces exemples ne doivent en aucun cas limiter la portée de l'invention. Exemple 1 Un tube à colonne ayant une dimension de colonne de 2,0 cm de diamètre et de 3,2 cm de longueur est rempli de particules granulaires d'hydroxyapatite ayant une surface spécifique de 10 m 2/g et une taille de particules de 0,3 à 0,5 mm Ensuite, 1 x 106 cellules de cellules ostéoprogéni- trices MC 3 T 3-E 1 préalablement mises en souches sont ensemencées dans les particules d'hydroxyapatite Trois jours après l'ensemencement les cellules ostéoprogénitrices sont cultivées dans un a-MEM incluant 10 % de sérum bovin foetal Après cela, les cellules sont cultivées dans un a-MEM exempt de sérum, et le milieu est échangé avec un nouveau a-MEM exempt de sérum une fois tous les deux jours La concentration de racide lactique dans le milieu qui a été cultivé et échangé est mesurée par la méthode de réduction NAD utilisant la L-lactate déshydrogénase Les valeurs mesurées sont montrées dans la figure 1. De plus, le spectre d'absorption d'infrarouge pour lhydroxyapatite utilisée comme support est montré à la figure 2. Exemple 2 On conduit les mêmes procédés en suivant lexemple 1, sauf que l'on remplit la colonne avec des particules granulaires de verre au silicate La concentration de l'acide lactique du milieu utilisé est mesurée de façon similaire à celle de l'exemple 1 Le résultat est montré à la figure 3 et le spectre d'absorption d'infrarouge pour le verre au silicate utilisé comme support est montré à la figure 4. Exemples comparatifs 1 et 2 On conduit les mêmes procédés en suivant l'exemple 1 respective- ment, sauf que chaque colonne est remplie de particules granulaires d'alumine dans l'exemple comparatif 1 et de particules granulaires de carbure de silicium dans l'exemple comparatif 2 La concentration en acide lactique dans chacun des milieux utilisés est mesurée de façon similaire à celle de l'exemple 1 respectivement. Le résultat de l'exemple comparatif 1 est montré à la figure 5 et celui de l'exemple comparatif 2 est montré dans la figure 7 respectivement Le spectre d'absorption d'infrarouge pour l'alumine est montré à la figure 6 et celui pour le carbure de silicium est montré à la figure 8 respectivement. Exemple 3 Un tube à colonne ayant un volume de 50 ml et une dimension de colonne de 3,0 cm de diamètre et de 7,5 cm de longueur est rempli de particules granulaires d'hydroxyapatite d'une taille de particules de 0,3 à 0,5 mm pour obtenir un dispositif du type à colonne pour la culture en continu des cellules. Après avoir ensemencé 8,2 x 106 cellules de MC 3 T 3-E 1 sur des particules d'hydroxyapatite, on laisse écouler en continu le milieu exempt de sérum à un débit d'élution de 70 ml/jour pour obtenir 2,41 d'un milieu de culture Ensuite, le milieu obtenu est concentré à 50 ml et le liquide concentré ainsi obtenu est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS Comme résultat, les protéines produites dans les cellules sont détectées Le résultat de lélectro- phorèse est montré à la figure 9. REVENDICATIONS 1 Un support pour la culture des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau de support contenant un composé oxyde métallique ayant un intervalle d'absorption d'infrarouge de 1 040 à 1 140 cm-1. 2 Un dispositif du type à colonne pour la culture en continu des cellules, caractérisé en ce qu'il comprend ledit support selon la revendication 1 chargé dans un tube à colonne pour faire passer en continu un milieu exempt de sérum à travers ledit support afin de faire proliférer en continu et de différencier les cellules prolifératives adhérentes, de sorte qu'une substance utile produite dans lesdites cellules est recueillie de l'éluat provenant dudit support.