Brevet FR2675508A1 — publié le 19921023

La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence peptidique de la # 2 microglobuline (P2m) humaine ou un oligopeptide compris dans cette séquence, ou une molécule incluant tout ou partie de cette séquence, capable de neutraliser l'infection par le HCMV. Le HCMV est un Herpès-virus incriminé dans différents syndromes allant de la classique "maladie des inclusions cytomégaliques" du nouveau-né, aux complications infectieuses et immunopathologiques des transfusions sanguines et greffes tissulaires, ou de différents syndromes immunodéficitaires iatrogènes ou acquis, dont le SIDA (Merigan, TC, and Resta, S 1990, Rev. infect. Dis, 12 : s 693). Le portage latent chez l'adulte cliniquement sain varierait de 40 à 100 ,Ó selon les contrées (Ho, M, 1990, Rev. Infect. Dis, 12 : S 701). Les mécanismes pathogéniques qui régissent la décompensation de l'infection latente lors de l'immunosuppression, ainsi que les complications immunopathologiques, après greffe allogénique, sont méconnus. Leur identification est entravée par l'absence de modèle expérimental chez l'animal de laboratoire, du fait de la stricte spécificité du HCMV pour l'homme. Des modèles murins, utilisant le MCMV, ont permis de conforter les hypothèses résultant de l'observation de la pathologie humaine : la décomposition de l'infection latente serait secondaire au déficit immunitaire iatrogène, altérant de manière prédominante l'immunité à médiation cellulaire (lymphocytes T et monocytes - macrophages), mais le déclenchement secondaire de lésions tissulaires (notamment la pneumonie interstitielle) résulterait d'une réaction immunopathologique (probablement l'action des lymphocytes cytotoxiques contre les cellules infectées exprimant des "néoantigènes" viraux) (Shanley et coll, 1982, J. Infect. Dis. 146 : 388). Cependant les différences génomiques et phénotypiques entre le MCMV et le HCMV ne permettent pas de validation imunothérapeutique directement transposable à l'homme, à partir des données du modèle murin. La compréhension des mécanismes d'interaction entre le HCMV et la cellule-hôte a bénéficié de deux découvertes récentes qui suggèrent que le virus pourrait se fixer à la membrane cellulaire sur le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHCI) : le fait que le HCMV lie la 2 microglobuline, chaîne légère du MHCI, tant dans les produits pathologiques, qu'expérimentalement (Grundy, JE et coll, 1987, J. Gen. Virol. 68 : 793) et, corrélativement, l'identification d'une séquence génomique virale codant potentiellement pour une protéine analogue du MHCI (Beck, S, and Barrel G., 1988, Nature, 331 : 269). Ces données ont conduit à évaluer, et à démontrer, le rôle de la p2m humaine en tant que récepteur pour le HCMV en utilisant des fibroblastes murins, normalement non permissifs au HCMV, transfectés avec le gène de la p2m humaine, comme cellules-cibles. A partir de ces résultats et dans un des aspects de la présente invention, les inventeurs ont évalué différents peptides synthétiques, dont la séquence reproduit des portions de lap2m, pour leur capacité, une fois associés au HCMV, à inhiber l'infection des cellules humaines et des transfectants murins exprimant la p2m humaine. Le pouvoir inhibiteur de l'infection des cellules par le HCMV a été démontré pour l'un de ces peptides. La présente invention concerne un composé doté notamment d'une activité inhibitrice de l'infection de cellules humaines par le cytomégalovirus, caractérisé en ce qu'il contient au moins la séquence Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-Lys-Asp- Glu-Tyr-Ala-Cys-Arg-Val (S22V) ou un fragment de ladite séquence présentant des activités inhibitrices. Le composé selon la présente invention peut comporter d'autres séquences peptidiques et/ou des séquences de nature non peptidique comme cela sera décrit ci-après. I1 doit être compris que la séquence en amino-acides ainsi décrite peut comporter d'autres fonctionnalités, des glycosylations notamment, qui sont couvertes par la définition précédente. Le composé selon la présente invention peut être obtenu par différentes techniques, notamment par synthèse chimique ou obtenu sous forme de molécule recombinante exprimée par un hôte procaryote ou eucaryote. Un peptide contenant la séquence neutralisante peut être également obtenu par coupures chimiques ou enzymatiques de la p 2m native, en utilisant des agents tels que : l'hydrolyse acide ménagée, l'hydroxylamine, le CNBr, le BNPS ou le NCS/urée, le NBS, le NZB, la protéase d'Armillaria Mellea, la chymotrypsine, la clostripaîne, l'endopeptidase Lys C, l'élastase pancréatique, l'enzyme de clivage post-proline, la trypsine, la protéase V8 du staphylocoque par exemple. Ces composés selon l'invention présentent une approche thérapeutique originale de la lutte contre le HCMV. En effet l'approche thérapeutique actuelle en matière de prévention et de traitement des infections à HCMV implique l'utilisation de molécules antivirales et/ou immunothérapeutiques (Mérigan, TC, and Resta, S., 1990, Rev. Infect. Dis, 12 : S 693). Parmi les agents antiviraux administrés dans un but curatif à des patients immunodéprimés souffrant d'une infection à HCMV, le Ganciclovir et le Foscarnet seraient les plus actifs. L'Acyclovir n'a pas d'efficacité démontrée. Le Ganciclovir présente l'inconvénient d'entraîner des effets toxiques pour les granulocytes et le Foscarnet est néphrotoxique. Des protocoles associant des immunoglobines polyclonales anti-HCMV au Ganciclovir et permettant de diminuer la posologie de l'antiviral auraient permis de limiter le taux de mortalité par infection à HCMV. Les immunoglobulines anti-HCMV auraient un effet bénéfique en retardant et limitant la survenue de l'infection après greffe rénale. Cet effet n'est pas évident dans le cas de greffe allogénique de moelle osseuse. Des vaccins atténués, injectés à des transplantés rénaux, auraient un effet bénéfique en diminuant la gravité de l'infection. Ces différents produits thérapeutiques nécessitent d'être évalués dans des essais cliniques complets, pour leur intérêt en traitement et/ou prévention incluant leurs effets sur la suppression du portage asymptomatique, qui semble être la source et le réservoir unique de l'infectlon. Les bilans des essais cliniques ne permettent pas d'attribuer d'effet satisfaisant aux molécules thérapeutiques administrées aux patients immmunodéficients ou transplantés. La quête de nouveaux produits efficaces et dénués d'effets secondaires est essentielle. L'une des approches thérapeutiques qui est proposée dans la présente invention est l'utilisation du mécanisme de neutralisation de l'infection virale par inhibition de l'attachement du HCMV à son récepteur présumé, la ," 2m, en saturant le virus par un "leurre" peptidique correspondant à un des domaines de la 2m native. Une telle approche, par "détournement" de récepteur a déjà été tentée avec succès dans d'autres modèles d'infection virale : le CD4 pour HIVI et l'lCAMl pour le Rhinovirus (White, JM, and Littman, D., 1989, Cell, 56 : 725). C'est précisément l'un des buts de la présente invention que de détourner le virus de son récepteur en utilisant l'un des composés définis précédemment. Le composé selon l'invention peut être utilisé sous forme de la séquence peptidique ou bien sous une forme plus élaborée. Ainsi, afin d'augmenter la durée de vie du composé selon l'invention, lors de son administration, on peut prévoir de le coupler chimiquement ou physiquement avec des éléments protecteurs et/ou des molécules porteuses, il pourra s'agir d'éléments d'extrêmités résistants aux peptidases : hydroxy, acide et/ou amino acide non naturel par exemple, ou bien des éléments protecteurs du type PEG, immunoglobuline et/ou albumine ou bien des fragments dérivés de ces produits. Ces technologies de protection sont également connues et ont déjà été appliquées à différents peptides. Ce composé peut également être associé sous des formes de particules, nanoparticules, liposomes ou autres, en Darticulier inertes et biodégradables. La présente invention concerne également les anti-idiotypes des anticorps dirigés contre la séquence décrite précédemment. En effet, un anticorps dirigé contre ce peptide peut mimer dans sa structure et conformation son site de liaison au HCMV. Un anti-idiotype contre cet anticorps peut avoir les mêmes fonctions inhibitrices de l'infection par le HCMV que le peptide neutralisant et donc être employé comme substitut de celui-ci. Outre son pouvoir inhibiteur, ce peptide peut être utilisé comme agent de vectorisation de molécules actives contre le HCMV (agents antiviraux, interféron par exemple). Ainsi, l'invention a pour objet des médicaments pilotes c'est-à-dire comportant tout ou partie de molécules à activité anti-virale couplées avec les composés et/ou les peptides selon l'invention. Les anti-viraux utilisables sont plus particulièrement des analogues de nucléosides anti-viraux type Acyclovir ou Ganciclovir. Les méthodes de couplage sont connues et dépendent des produits en cause. Il est maintenant possible d'effectuer des couplages sur les fractions NH2 et/ou COOH des peptides selon l'invention. La présente invention concerne également la composition pharmaceutique comportant au moins un composé selon l'invention, soit à titre de principe actif soit comme agent de vectorisation de molécules actives contre le HCMV. Les composés selon la présente invention peuvent se présenter sous une forme galénique quelconque appropriée au mode d'administration. Les dosages utilisés dépendent évidemment du type d'infection et de son stade et doivent être adaptés à l'état du patient. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en valeur d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention sans pour autant être limitatifs. Les figures 1 et 2 suivantes illustrent l'invention. Figure 1: effet inhibiteur de S22V, sur les fibroblastes humains MRC5 et murins J27, exprimant la P 2 microglobuline humaine. Figure 2 : dose-dépendance de l'effet neutralisant de S22V sur les fibroblastes humains MRC5 exposés au HCMV. Exemple 1: Infections virales La souche de HCMV AD 169 nous a été fournie par S. Michelson (Institut Pasteur, Paris). L'inoculum viral est obtenu à partir de surnageants de cellules MRC5 (ATCC CCL 171) cultivées en milieu MEM (Gibco) additionné de sérum de veau fétal (SVF) à la concentration de 10 % final, et infectées pour une période qui provoque 90 % d'effet cytopathique. Le stock de HCMV est conservé à -800C. Outre les cellules fibroblastiques humaines MRC5, nous avons éprouvé le pouvoir infectieux du HCMV, seul ou pré-incubé avec divers produits, pour des fibroblastes murins (L) transfectés soit avec le gène de la thymidine-kinase (témoin) ou soit avec le gène de la F'2m humaine (cellules J27). Ces transfectants nous ont été fournis par M. Pla (INSERM U93, Hôpital St Louis, Paris). Les cellules sont d'abord cultivées en plaque à 24 puits (Falcon) en MEM, 10 % SVF, jusqu'à formation d'un tapis cellulaire monocouche. Ving quatre heures avant l'infection le milieu de culture est remplacé par du MEM sans additif. Au moment de l'infection le milieu est remplacé par la suspension virale et la plaque est centrifugée à 2 000 x g pendant 45 minutes. L'excès de virus est ensuite éliminé et les cellules sont mises en culture en MEM sans additif. Les plaques sont incubées à 37"C en air/C02 à 5 % pendant 18 heures. Exemple 2 : Essais de neutralisation 1. Matériel et méthodes Pour évaluer le pouvoir neutralisant des différentes préparations contre le HCMV, l'inoculum viral est mélangé v/v à chaque produit et incubé pendant 1 h à 37"C avant d'être mis en présence des cellules cibles. Les produits éprouvés sont La 2m humaine (SEROTEC) Un peptide synthétique (NEOSYSTEM) témoin (D 20K) ne présentant aucune homologie de séquence avec la S2m et dont la séquence en acides aminés est AspProArg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser-Gly-Thr- Val-Lys-. Trois peptides synthétiques (NEOSYSTEM) représentant une partie de la séquence peptidique de la 32m humaine (Cunningham, BA., Wang, JL., Berggard, I., and Peterson, PA, 1973, Biochemistry, 12 : 4811): le peptide E23M : Glu-Tyr-Ala-C ys-Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro- Lys-Ile-Val-Cys-Trp-Asp-Arg-Met, le peptide C22S : Cys-Ile-Glu-Val-Asp -Leu-Leu-Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Glu-L ys-Val-Glu-His-S er-As p-Leu-S er et le peptide S22 : Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu -Lys-Asp-Glu-Tyr-Ala-Cys-Arg-Val. Une IgG2 monoclonale humaine anti-HCMV (JM Seigneurin, CHRU de Grenoble) a également été éprouvée dans nos essais. Le milieu de culture est éliminé après les 18 heures d'incubation des cellules infectées. Les cellules sont lavées deux fois avec du NaCI 0,15 M en tampon phosphate (PBS). Les cellules sont ensuite fixées en 90 % d'acétone pendant 15 minutes à +4"C. L'infection par le HCMV est détectée par révélation des antigènes immédiatement précoces (IEA) avec un anticorps monoclonal murin IgGl, (Réf : E 13 Biosoft) lui-même révélé par immunoconjugué anti IgG murine (H+L) marqué à la péroxydase (Diagnostic Pasteur). Deux séries d'expériences ont été réalisées. Les résultats présentés expriment la moyenne du nombre d'unités infectieuses détectées d'après le nombre de noyaux cellulaires colorés par l'immunopéroxydase révélée par adjonction de diaminobenzidine tetrahydrochlorure puis H202. 2. Résultats Comme le montre le figure 1, les fibroblastes humains MRC5 et les fibroblastes murins J27 exprimant la #2m humaine sont sensibles à l'infection par HCMV AD 169, alors que les fibroblastes murins témoins transfectés avec le gène TK sont insensibles. Ces résultats confirment le rôle de récepteur de la 2m pour le HCMV. La pré-incubation avec les différentes préparations à la concentration de 200 ug/ml montre que le peptide S22V inhibe l'infection des MRC5 et des J27. Le peptide C22S ne semble inhiber dans cet essai que l'infection des MRC5. Dans cette expérience le peptide D20K a été omis de l'essai d'infection des MRC5. La figure 2 montre les résultats obtenus avec trois concentrations des produits éprouvés contre le HCMV sur cellules MRC5. Il se confirme que le peptide S22V mis en présence du HCMV est neutralisant et que cet effet est dose-dépendant. REVENDICATIONS 1. Composé doté notamment d'une activité inhibitrice de l'infection de cellules humaines par le cytomégalovirus humain, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la séquence Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-Lys Asp-Glu-Tyr-Ala-C ys-Arg-Val ou un fragment de ladite séquence présentant des propriétés inhibitrices. 2. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que il est couplé avec un élément protecteur et/ou des molécules porteuses. 3. Composé selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce qu'il comporte un fragment destiné à améliorer sa résistance aux peptidases. 4. Composé selon I et 3 caractérisé en ce que la séquence est associée à une molécule naturelle, telle que l'albumine, ou une immunoglobuline. 5. Composé selon 1 à 4 caractérisé en ce que la séquence est associée à un liposome ou à une nanoparticule inerte et biodégradable. 6. Composé selon I à 5 caractérisé en ce qu'il est obtenu par fractionnement chimique ou enzymatique de la i3 microglobuline ou par synthèse chimique. 7. Composé selon 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est exprimé sous forme d'une molécule recombinante chez un hôte procaryote ou eucaryote. 8. Composé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que il comporte en plus de la séquence, tout ou partie d'une molécule à activité anti-virale. 9. Composition comportant au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications I à 8. 10. Composition pharmaceutique selon 9 comportant au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications I à 8. Il. Composition pharmaceutique selon 10 utilisée à titre de thérapeutique ou de prophylaxie contre une affection à cytomégalovirus. 12. Anti-idiotype contre l'anticorps d'un composé selon l'une des revendications 1 à Il, utilisable à titre de vaccin.