Brevet FR2679250A1 — publié le 19930122

La présente invention a pour objet l'utilisation de carbonate de calcium poreux, en particulier de squelette de corail poreux comme matériau support de culture in vitro de cellules eucaryotes. On sait que la plupart des cellules eucaryotes ne peuvent être cultivées in vitro que sur un support solide. De telles cultures sont généralement effectuées dans des conteneurs ou fioles dans lesquelles la multiplication cellulaire s'arrête lorsqu'une couche monocellulaire tapisse entièrement la partie de la paroi en contact avec le milieu nutritif liquide. De tels procédés de culture présentent l'inconvénient de nécessiter la manipulation d'un nombre élevé de conteneurs. Par ailleurs, les cellules eucaryotes ne croissent pas sur certains matériaux, et il n'est pas possible de prédire si un matériau donné conviendra à la culture in vitro de ces cellules. I1 existe actuellement des besoins importants de culture in vitro de cellules eucaryotes dans divers domaines. Par exemple, la culture in vitro de cellules végétales est susceptible de permettre la production et l'isolement de substances naturelles en s'affranchissant des limitations et des aléas de la culture en pleine terre. De même, il est souhaitable de pouvoir cultiver in vitro de nombreuses cellules animales, par exemple dans un but médical. On sait que les cellules de moelle osseuse, qui sont des précurseurs des cellules du système immunitaire, sont très difficiles à cultiver in vitro, bien qu'une telle culture présente un grand intérêt dans le domaine des allogreffes ou des autogreffes. L'intérêt d'une bonne multiplication cellulaire in vitro s'étend aux cellules modifiées par recombinaison génétique. Jusqu a présent de telles cellules ne peuvent être cultivées, en pratique, que si elles sont immortalisées par hybridation avec des cellules cancéreuses ou par transformation à l'aide dtun virus. Un autre intérêt de la culture de cellules in vitro serait, chez un patient souffrant dtune perte de substance osseuse, actuelle ou prévisible, le prélèvement de cellules osseuses chez ce patient, la mise en culture in vitro de ces cellules sur un support convenable, et ultérieurement l'introduction dudit support comprenant les cellules ainsi cultivées afin de combler la perte de substance. On sait en effet que le corail peut constituer une prothèse osseuse biodégradable, dont la réhabitation par l'os à mesure de la dégradation sera favorisée par des cellules cultivées ainsi réintroduites. On a maintenant découvert que le carbonate de calcium poreux, et en particulier le squelette de corail poreux, constitue un matériau support particulièrement intéressant pour la culture in vitro de cellules eucaryotes. Dans la suite de la description on fera référence par commodité au squelette de corail, dont on sait qu'il est constitué de cristaux de carbonate de calcium (aragonite), ou plus simplement au corail, mais il convient de préciser que ces expressions doivent être interprétées ici comme désignant tout matériau calcaire poreux, naturel ou synthétique, notamment sous forme polycristalline. ta présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un matériau poreux, constitué essentiellement de carbonate de calcium, comme support solide tridimensionnel de culture in vitro de cellules eucaryotes. Pour que le corail puisse être utilisé comme véritable support de culture tridimentionnel, il convient de l'utiliser sous la forme de fragments ayant généralement des dimensions supérieures à 0,5 mm et en particulier supérieures à 1 mm. Ce matériau peut se présenter par exemple sous la forme de cylindres, de sphères, de plaques, etc... De tels matériaux peuvent être obtenus par exemple de la façon suivante : les morceaux de corail brut sont abondamment rincés à l'eau courante, séchés et débités en tronçons, puis mis sous la forme et aux dimensions désirées, selon les méthodes connues. Ces tronçons sont plongés dans une solution d'hypochlorite de sodium à 12 g/l pendant 48 heures, puis rincés à l'eau courante pendant 48 heures, et séchés. Finalement, on effectue une stérilisation par rayonnement gamma. L'un des intérêt de l'utilisation du squelette de corail est que, dans ce squelette, les pores sont communiquants, de sorte que toutes les parties du squelette, même sous forme de pièces de dimensions relativement importantes, sont utilisables. Cette communication des pores favorise en outre un envahissement complet du matériau support par les cellules cultivées, et le rendement de la culture, rapporté au volume de matériau support utilisé, est donc optimum. Ce rendement volumique est évidemment élevé, puisque le corail constitue un support tridimensionnel. De préférence, on utilise comme matériau support un matériau ayant des diamètres de pores compris entre 50 et 250 jim, avec une porosité, c'est-à-dire le volume des pores par rapport au volume total du matériau, comprise généralement entre 20 et 80 Z. C'est le cas notamment avec le corail des genres Porites, Acropora, Goniopora, Lobophyllia, Symphyllia, et Millipora. Bien entendu, les milieux et conditions de culture utilises selon l'invention sont ceux qui conviennent à la cellule particulière qui est cultivée. Ces milieux et conditions de cultures sont bien connus ou peuvent être déterminés par de simples expériences de routine. L'invention concerne l'utilisation de squelette de corail comme matériau support dans la culture in vitro de toutes cellules eucaryotes, notamment végétales ou animales, y compris des cellules humaines. I1 peut s'agir par exemple de fibroblastes, de cellules endothéliales, de cellules de moelle osseuse, y compris les cellules souches totipotentes, les ostéoblastes ; ou encore des cellules transformées telles que des hybridomes, etc... L'invention a également pour objet un procédé pour cultiver des cellules eucaryotes in vitro, caractérisé par le fait que l'on ensemence avec lesdites cellules un milieu de culture comprenant un support solide tridimensionnel en carbonate de calcium poreux immergé dans un milieu nutritif liquide approprié. Le matériau support, le milieu de culture et/ou lesdites cellules eucaryotes sont en particulier tels que définis précédemment. La culture est effectuée à un pH convenant à la multiplication de la cellule cultivée. Ce pH est de préférence supérieur à 7, pour éviter une dissolution notable du matériau support. Généralement, la propotion, en volume, du support solide par rapport au volume total (liquide + solide), est supérieure à 5 %, et en particulier supérieure à 10 % ; elle est le plus souvent inférieure ou égale à 50 Z. Pour recueillir les cellules après culture, si désiré, on peut effectuer par exemple une trypsinisation, de façon connue. Dans un mode de réalisation particulier, on peut mettre en oeuvre le procédé de l'invention en cultivant successivement, sur un même support, deux cellules différentes d'une même espèce animale. Un tel procédé est intéressant notamment pour cultiver certaines cellules telles que les cellules de moelle osseuse (cellules souches ou ostéoblastes) qui croissent plus facilement sur une assise de cellules (telles que des cellules endothéliales ou des fibroblastes) que directement sur le support solide. L'invention a également pour objet le produit de culture cellulaire constitué par un support tridimentionnel de carbonate de calcium poreux habité par des cellules eucaryotes, ce produit de culture pouvant notamment être obtenu selon les procédés qui viennent d'être définis. Le produit de culture selon l'invention peut être constitué notamment par le support solide revêtu dtun tapissage de cellules endothéliales ou de fibroblastes. Le produit de culture de l'invention peut également être un support revêtu d'un tel tapissage lui-même revêtu de cellules souches de moelle osseuse et/ou d'ostéoblastes. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 : Culture de cellules de moelle osseuse Il est réalisé un revêtement cellulaire (fibroblastes) d'implants coralliens puis on imprègne ces implants revêtus de fibroblastes de moelle osseuse du patient. 1. REVETEMENT FIBROBEATIQUE 1.1. Matériel Matériau : corail porites (volume de porosité : 50 %) sous forme de pastilles diamètre : 30 nm, épaisseur : 1 mm. Milieu de culture : Moi 99 supplémenté par 10 Z de sérum de veau foetal et 1 Z d'antibiotiques (péniciîline-streptomycine). Type cellulaire : fibroblastes épidermiques de rat. 1.2. Méthodes Obtention d'une culture de fibroblastes épidermiques de rat par la méthode des explants ; Après avoir été rasée, la peau est pincée à l'aide d'une pince courbe, puis avec un scapel on découpe la peau comprise entre les deux mors de la pince et on dépose le lambeau dans une solution saline contenant des antibiotiques à forte concentration (6 Z). Chaque morceau est ensuite redécoupé en petits carrés aux bords nettement tranchés de 2 mm2 environ. On rince les biopales à trois reprises dans le milieu de culture contenant une concentration de pénicilline streptomycine 6, 4 puis 2 fois supérieure à la concentration normale. On découpe les biopsies de morceaux de 2 mm2 par coupures "franches" ; on les dépose dans des boites de culture plastique. On laisse les biopsies adhérer au support avant d'ajouter le milieu de culture, auquel on aura ajouté du sérum de veau foetal à raison de 10 Z minimum. Une bonne adhésion est obtenue en laissant les flacons debout sans milieu, pendant 40 à 60 minutes dans l'incubateur avant de les reposer. Il convient ensuite de conserver les boîtes immobiles, et au bout de deux ou trois jours, les fibroblastes commencent à proliférer autour des explants. Le milieu doit alors être changé tous les deux ou trois jours car les fibroblastes sont éliminés dès que la prolifération a démarré et la première sous-culture peut être réalisée. Si les fibroblastes coexistent dans des cultures primaires avec des cellules plus délicates à cultiver (comme des myoblastes ou des cellules endothéliales), on sélectionne les fibroblastes par la pauvreté du milieu de culture (à laquelle des fibroblastes résistent mais pas les autres types cellulaires). Lorsque les fibroblastes ont atteint la confluence, ctest-à-dire que l'inhibition de contact les empêches de proliférer davantage, on passe, après repiquage, à une culture tridimentionnelle.Dans ce type de culture, les cellules prolifèrent dans les trois dimensions sur un support tridimentionnel. Pour réaliser cette culture, ces solutions cellulaires sont déposée sur des pastilles de corail Porites de 1 mm de diamètre et 1 mm d'épaisseur, le tout dans des boîtes 6 puits ou dans des boîtes de pétri de 35 mm de diamètre. Des quantifications de croissance cellulaire sont faites à intervalles réguliers de façon à évaluer l'augmentation du nombre de cellules contenues dans les pastilles coraliennes. Une fois que le corail est tapissé de fibroblastes, on passe à la deuxième étape : l'imprégnation par des cellules contenues dans de la moelle osseuse fraîche, soit totale, soit épurée des cellules non-nucléées (hématies et adipocytes). 2. CULTURE DE CELLULES DE MOELLE OSSEUSE La moelle osseuse est récupérée par prélèvement chez le rat dans des flacons contenant de la calciparine (3ml/500 ml). Les cellules sont bien dispersées puis mises sur Ficoll à raison de 12 ml de Ficoll pour 20 ml de solution de moelle, à 180C. L'ensemble est centrifugé à 1 600 tours/min pendant 20 min, dans une centrifugeuse stable ne comportant pas de frein. On peut ainsi isoler les cellules souches. On ensemence alors le milieu de culture, contenant le corail tapissé de fibroblastes, avec 107 cellules souches par ml de milieu nutritif liquide. On observe un développement tridimentionnel important des cellules de moelle osseuse. On a obtenu des résultats analogues en cultivant d'abord des fibroblastes de derme humain, puis des cellules de moelle osseuse humaine. EXEMPLE 2 : Culture de fibroblaste embryonnaire de poumon humain. Le matériau support est constitué de sphères ou de cylindres de squelette de corail du genre Porites. Les sphères ont 3 à 4 mm de diamètre, les cylindres ont des dimensions de 3 mm de diamètre et 4 mm de longueur. On a utilisé soit du squelette de corail ayant 20 Z de porosité, soit du squelette ayant 50 Z de porosité. La cellule cultivée est la lignée MRC5, qui est une lignée de fibroblaste embryonnaire de poumon humain. La culture est mise en oeuvre dans des plaques de culture multipuits. t1 inoculation est effectuée à raison de l ml de milieu contenant 50 000 cellules. Le milieu de culture est le milieu Williams supplémenté avec 5 Z de sérum de veau nouveau-né. Les supports sont ensuite recouverts avec le milieu de culture. Les plaques sont mises dans une enceinte thermostatée à 370C sous atmosphère humide (air à 5 Z de C02). Après 24 heures d'incubation, les supports sont repris stérilement et mis en incubation dans d'autres plaques contenant du milieu neuf. à 37"C, et on remet en culture dans les mêmes conditions que precédemment. Ensuite le milieu est changé tous les deux jours, la durée totale de la culture étant de 7 jours. Au bout de 7 jours de culture, on a évalué la biomasse cellulaire par dosage des protéine selon la méthode de Lowry, ainsi que par la coloration de l'ADN par le bleu de méthylène. On a observé une bonne croissance cellulaire aussi bien avec les supports sous forme de sphères que sous forme de cylindres. La croissance est plus forte sur les matériaux à 20 Z de porosité que sur les matériaux à 50 Z de porosité. EXEMPtE 3 : Culture d'un hybridome producteur d'un anticorps monoclonal. L'hybridome sécrète un anticorps monoclonal anti-folate. Il est cultivé en milieu RPMI, supplémenté avec 5 Z de sérum de veau nouveau-né. Les autres conditions de culture sont les memes que celles décrites à l'exemple 2. La croissance cellulaire a été mise en évidence par la détermination, selon la technique ELISA, de la quantité d'anticorps monoclonaux produits. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un matériau poreux, constitué essentiellement de carbonate de calcium, comme support solide tridimentionnel de culture in vitro de cellules de cellules eucaryotes. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ledit matériau est polycristallin 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ledit support est constitué par des fragments de squelette de corail poreux. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que ledit support est constitué de fragments ayant la forme et les dimensions désirées, ces dimensions étant supérieures à 0,5 mm et en particulier supérieures à 1 mm. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que ledit support se présente sous la forme de cylindres, de sphères ou de plaques. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les diamètres des pores sont compris entre 50 et250 pm. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que le volume des pores représente de 20 à 80 Z du volume total du support. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisée par le fait que ledit corail est choisi parmi les genres Pontes, Acropora, Goniopora, Lobophyllia, Symphyllia et Millipora. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que ledit support solide est immergé dans un milieu nutritif liquide. 10. Utilisation selon la revendication précédente, caractérisée par le fait que la proportion en volume du support solide par rapport au volume total (liquide + solide) est supérieure à 5 Z et en particulier supérieure à 10 %. il. Procédé pour cultiver des cellules eucaryotes in vitro, caractérisé par le fait que l'on ensemence avec lesdites cellules un milieu de culture comprenant un support solide tridimentionnel en carbonate de calcium poreux immergé dans un milieu nutritif liquide approprié. 12. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit support et/ou ledit milieu liquide est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 2 à 10. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications Il et 12, caractérisé par le fait que lesdites cellules sont choisies parmi les cellules végétales et animales. 14. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que lesdites cellules sont des cellules humaines. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisé par le fait que lesdites cellules sont choisies parmi les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules de moelle osseuse, y compris les cellules souches totipotentes, et les ostéoblastes. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications Il et 12, caractérisé par le fait que lesdites cellules sont des cellules transformées, en particulier des hybridomes. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications il à 15, caractérisé par le fait que l'on cultive successivement, sur un même support, deux cellules différentes d'un même espèce animale. 18. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on cultive d'abord des fibroblastes, ou des cellules endothéliales, puis que l'on cultive ensuite des cellules de moelle osseuse. 19. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que lesdites cellules de moelle osseuse sont des cellules souches totipotentes ou des ostéoblastes. 20. Produit de culture cellulaire caractérisé par le fait qu'il est constitué par un support de carbonate de calcium tridimentionnel poreux habité par des cellules eucaryotes. 21. Produit selon la revendication 20, caractérisé par le fait qu'il peut être obtenu selon le procédé de l'une quelconque des revendications 11 à 19. 22. Produit selon la revendication 20 ou 21, caractérisé par le fait que ledit support est revêtu d'un tapis sage de cellules endothéliales ou de fibroblastes. 23. Produit selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit tapissage est lui-même revêtu de cellules souches de moelle osseuse et/ou d'ostéoblastes. 24 Produit selon la revendication 22 ou 23, caractérisé par le fait que lesdites cellules sont des cellules humaines.