Brevet FR2682396A1 — publié le 19930416

La présente invention a pour objet une séquence nucléique du gène associé au syndrome de Kallmann lié au chromosome X, les applications de cette séquence ou de fragments de cette séquence comme sondes nucléiques ou amorces nucléiques pour l'amplification spécifique du gène ou de fragments du gène associé au syndrome de Kallmann lié au chromosome X, ainsi que tout ou partie des séquences peptidiques dérivées de la séquence nucléique et leurs applications. Le syndrome de Kallmann est caractérisé par l'association d'un hypogonadisme hypogonadotropique avec une anosmie. Ce syndrome est également appelé dysplasie olfactogénitale en raison de l'existence de cas où il existe une agénèsie des bulbes olfactifs. Il existe plusieurs modes de transmission du syndrome : un mode de transmission liée au chromosome X, un mode autosomal récessif et un mode autosomal dominant. L'incidence du syndrome de Kallmann a été estimé à un mâle sur 10.000. L'excès d'un facteur 6 à 7 du nombre de représentants du sexe masculin porteurs du syndrome par rapport au nombre de représentants du sexe féminin suggère que la forme liée au chromosome X est la plus fréquente. Sous cette forme, les individus du sexe féminin peuvent être affectés d'hyposmie. L'association des deux symptomes est longtemps restée énigmatique. Cependant, des études récentes ont fait état d'une voie de développement commune des neurones olfactifs et des neurones synthétisant l'hormone de libération de la gonadotropine (GnRH). Les deux types de neurones ont leur origine dans la placode olfactive. Les prolongements centraux des neurones olfactifs traversent l'ethmoïde pour atteindre la zone embryonnaire du cerveau antérieur. Un contact entre les nerfs olfactifs croissant en profondeur et le cerveau antérieur est nécessaire au développement des bulbes olfactifs. Les neurones synthétisant la GnRH migrent également vers le cerveau, traversent l'os ethmoïde avec les branches du nerf terminal. Enfin, ils atteignent l'aire préoptique septale et l'hypothalamus. Ceci suggère une implication probable du gène associé au syndrome de Kallmann (KAL) dans ce développement embryologique commun. La découverte par Schwanzel-Fukuda et al., 1989 (23) que les neurones synthétisant la GnRH étaient présents uniquement en dehors du tissu cérébral chez un foetus humain présentant un syndrome de Kallmann associé au chromosome X renforce cette hypothèse. Des analyses de liaison génétique et des études de délétions ont permis la localisation du gène KAL associé au chromosome X à proximité du locus STS (stéroïde sulfatase) dans la région Xp 22,3 (Ballabio et al. (6) et (7)). Des analyses d'ADN provenant de deux individus présentant des délétions Xp terminales, l'un présentant un syndrome de Kallmann et l'autre non, ont permis aux auteurs de la presente invention de situer au moins une partie du gène dans un intervalle s'étendant sur moins de 350 kb (intervalle KAL) (Petit et al. (20)). Cet intervalle est situé entre 8,6 et 8,95 Mb à partir du télomère de Xp. Les présents inventeurs ont a présent isolé et séquencé le gène associé au syndrome de Kallmann lié au chromosome X. A partir d'un patient LIL 155 présentant une délétion terminale sur le bras court du chromosome X (Petit et al. (20)) et d'un patient AM présentant une translocation Xp 22,3, Yq 11 (Tiepolo et al., (26)), une détermination précise de la taille de la région KAL a pu être réalisée, et la région entière sequencée. Les exons codants ont été mis en évidence. Parmi 19 exons potentiels, deux se sont révélés conservés chez différentes espèces animales. L'un des deux a été utilisé pour isoler des clones d'ADNc provenant de banques foetales. A partir de la séquence d'ADNc, les inventeurs ont pu déduire une protéine extracellulaire de 679 aminoacides, contenant un motif de type protéine acide du petit-lait (whey acidic protein (WAP)) alors qu'une autre région de la protéine présente des homologies significatives avec des molécules d'adhésion. En raison de l'homologie avec des molécules d'adhésion, les inventeurs ont dénomme le gène associé au syndrome de Kallmann lié au chromosome X, gène ADMLX. La présente invention a ainsi pour objet un fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique choisie parmi (A) la séquence SEQ ID N" 1, (B) les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, (C) des fragments desdites séquences (A) et (B), (D) les séquences complémentaires desdites séquences (A), (B) et (C), et (E) les séquences qui hybrident avec l'une des séquences (A), (B), (C) ou (D). La présente invention a également pour objet un vecteur de clonage comportant un fragment d'acide nucléique tel que défini précédemment. Un vecteur de clonage préféré est le plasmide p85B contenant un ADNc ayant la séquence SEQ ID N" 1 telle que définie précédemment, déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) le 26 septembre 1991 sous le n" In1146. La présente invention a également pour objet un couple d'oîigonucléotides aptes à jouer le rôle d'amorces nucléiques dans l'amplification spécifique du gène ou de fragments du gène associé au syndrome de Kallmann lié au chromosome X dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il est constitué de deux séquences nucléotidiques choisies parmi (A), (B), (C) et (D), sous réserve que l'un des membres du couple est constitué par une séquence appartenant à (D). Les amorces ont de préférence une longueur de 18 à 30 nucléotides et, de préférence, de 18 à 22 nucléotides. L'une des deux amorces est complémentaire du brin (+) de la matrice et l'autre amorce est complémentaire du brin (-). Il est important que ces amorces ne possèdent pas de structure secondaire ou de séquence complémentaire l'une de l'autre. D'autre part, la longueur et la séquence de chaque amorce doivent être choisies de manière à ce que les amorces ne s'hybrident avec d'autres acides nucléiques présents dans 1 'échantillon biologique. Les amplimères sélectionnés comme amorces spécifiques pour l'amplification de séquences nucléiques peuvent être choisis par exemple en suivant la méthode décrite par Griffai et coll (30). Les fragments amplifiés peuvent être identifiés après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide ou après une électrophorèse capillaire ou encore après une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou sur échangeurs d'ions). La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes des séquences (A), (B), (C), (D) ou (E), des plasmides contenant ces séquences ou des produits d'amplification. Ces sondes peuvent être marquées ou non par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. La présente invention a également pour objet une sonde nucléique spécifique du gène associé au syndrome de Kallmann lié au chromosome X, caractérisé en ce qu'elle comporte au moins 20 nucléotides consécutifs choisis parmi les séquences nucléiques (A), (B), (C), (D) et (E) telles que définies précédemment. Ces sondes comprennent avantageusement au moins 20 nucléotides consécutifs parmi les séquences mentionnées ci-dessus. Les séquences non marquées peuvent être utilisées directement comme sondes, cependant les séquences d'acide nucléique sont généralement marquées par un élément radio-actif (32P, 35S 3HI 125I) ou par une molécule non-radioactive (biotine, acétylaminofluo-rène, digoxigénine, 5-bromo-désoxyuridine) pour obtenir des sondes utilisables pour de nombreuses applications. Dans ce dernier cas, on pourra utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans FR 2 422 956 et FR 2 518 755. La technique d'hybridation peut être réalisée de diverses manières (Matthews et al. (28)). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'ADN de l'échantillon biologique sur un support (nitrocellulose, nylon, polystyrène, ...) et à incuber, dans des conditions bien définies, 1'ADN cible immobilisé avec 1'ADN sonde. Après l'hybridation l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde ...). Lorsqu'une quantité suffisante d'ADN peut être extraite à partir des prélèvements à analyser, les séquences décrites ci-dessus sont utilisables pour détecter et identifier le gène ou un fragment de gène associé au syndrome de Kallmann directement dans ces prélèvements. Dans le cas contraire, une culture rapide en milieu liquide peut être réalisée avant l'extraction de l'ADN, ou bien, la petite quantité d'ADN extrait du prélèvement peut être soumise à la technique PCR. La présente invention a également pour objet une méthode de détection d'une anomalie génétique liée au syndrome de Kallmann dans un échantillon biologique contenant de l'ADN humain comportant les étapes suivantes a) mise en contact de l'échantillon biologique contenant l'ADN avec un couple d'amorces spécifiques telles que définies précédemment, 1'ADN humain contenu dans l'échantillon ayant été éventuellement rendu accessible à l'hybridation et dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN humain contenu dans l'échantillon biologique b) amplification de l'ADN humain ; c) révélation des produits d'amplification par les techniques appropriées d) mise en évidence éventuelle d'une mutation ou d'une délétion par les techniques appropriées. Les mutations peuvent être détectées par la technique d'analyse de polymorphisme conformationnel de simples brins (SINGLE-STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM (SSCP)) telle que décrite par Masato Orita et al. (29). Les délétions peuvent être mises en évidence par détermination de la longueur des fragments amplifiés par exemple par une electrophorèse sur gel de polyacrylamide ou encore par détermination de la séquence du fragment amplifié. La méthode de détection d'une anomalie génétique liée au syndrome de Kallmann peut être réalisée par exemple sur un échantillon contenant des cellules de foetus humain, après culture desdites cellules. La présente invention a également pour objet un nécessaire pour la détection d'une anomalie génétique liée au syndrome de Kallmann dans un échantillon biologique, comprenant les éléments suivants - un couple d'amorces spécifiques telles que définies précédemment, - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'ADN, - un composant permettant de déterminer la longueur des fragments amplifiés ou de mettre en évidence une mutation. La présente invention a également pour objet une séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle est codée par l'une des séquences nucléotidiques (A), (B), (C), (D) ou (E). Elle a plus particulièrement pour objet une séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence choisie parmi (A) la sequence peptidique SEQ ID N" 1, (B) la séquence peptidique comprise entre S22 et Y679 de la séquence SEQ ID N" 1, (C) des fragments des séquences (A) ou (B), (D) les séquences peptidiques qui diffèrent des séquences (A), (B) ou (C) par insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs aminoacides et qui possèdent la même activité. La présente invention a également pour objet des anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine ou un peptide ayant une séquence peptidique telle que définie précédemment. La présente invention a enfin pour objet un procédé de dosage d'une protéine ou d'un peptide présentant une séquence peptidique telle que définie précédemment mettant en oeuvre les anticorps monoclonaux selon l'invention. La séquence d'ADNc (SEQ ID N" 1) a été obtenue par les étapes suivantes (I) - Isolement d'un clone à partir d'une banque YAC (Yeast artificial chromosome) comprenant la région KAL, (clone YAC 376 B4), (II) - Caractérisation de la région KAL en réalisant un sous-clonage du clone YAC 376 B4 suivie d'une analyse par hybridations différentielles, (III) - Recherche de phases de lecture ouverte dans la région KAL qui a permis de mettre en évidence deux exons appartenant au gène ADMLX, (IV) - Criblage de banques d'ADNc humain et de macaque avec une sonde (485 S1) issue de l'un des exons et isolement d'un clone contenant le gène ADMLX. La protéine a été caractérisée à partir de la séquence d'ADNc obtenue. Son expression a été étudiée dans différents tissus. Par comparaison avec le gène natif, des anomalies génétiques ont pu être caractérisées chez différents patients présentant un syndrome de Kallmann. Pour la compréhension de l'invention, on se reportera aux figures annexées sur lesquelles - la Fig. 1 représente schématiquement l'intervalle KAL tel que défini antérieurement à l'invention (a) et l'intervalle KAL tel que défini selon la présente invention (b) - la Fig. 2 représente les résultats d'analyse en Southern blot d'hybridation avec des sondes obtenues à partir du clone YAC 376 B4, les ADN de patients FL(ligne 1), LIL 155(ligne 2) et AM(ligne 3) présentant tous des délétions terminales dans la région Xp 22,3; - la Fig. 3 représente la carte de l'intervalle KAL; - la Fig. 4 représente les résultats de "zooblots" montrant les séquences conservées parmi différentes espèces animales; - la Fig. 5 représente la localisation du gène ADMLX ;; - les Fig. 6 (A) et (B) représentent l'ADNc du gène ADMLX et la séquence d'aminoacides déduite à partir de la séquence nucléotidique - la Fig. 7 représente la caractérisation du pont de cassure du patient AM - la Fig 8 represente la délétion de l'extrémité 5' du gène ADMLX chez le patient RM 254. Les techniques générales de clonage utilisées dans le cadre de la présente invention sont décrites ci après A - Lignées cellulaires Des cellules lymphoplastiques transformées par le virus d'Epstein-Barr du patient LIL 155 et des fibroblastes provenant des patients AM et FL ont été cultivées sur un milieu RMPI 1640 (Flow Laboratories) additionné de 10 % de sérum foetal de veau (Jacques Boy, Reims, France). B - Amplification par PCR en utilisant des sondes Alu PCR L'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) a été réalisée avec 50 ng du clone d'ADN de YAC, 250 mM d'amorces dans 10 mM de tampon tris-HCl (pH 8,3 à 200 C) contenant 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,01 % de gélatine, des dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) à une concentration chacun de 100 pM (Pharmacia) et 2,5 unités de Taq ADN polymérase (Cétus) (volume total 50 pl). On a effectué une dénaturation initiale pendant 40 mn à 94" C, suivie de 30 cycles de dénaturation à 94" C (1 mn), d'hybridation à 60 C (1 mn) et d'extension à 72" C (4 mn).Les amorces spécifiques ont été obtenues à partir de la séquence consensus Alu : amorces 278 et TC65, Nelson et al., 1989 (17) et à partir des bras droit et gauche du vecteur pYAC4 : amorces 4R et 4L ; Nelson et al., 1991 (18). C - PCR sur l'ADNc De l'ADNc a été synthétisé par extension à partir d'amorces en utilisant des hexamères aléatoires à une concentration de 5 pM (Pharmacia) et 200 unités de transcriptase inverse du virus de la leucémie murine Moloney (BRL) pour un pg d'ARN total. 1 pg d'ARN total a été incubé à 42" C pendant 30 mn dans 20 pl de (NH4)2 SO4, 16,6 mM, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de p-mercaptoéthanol, 6,7 pM d' EDTA, 67 mM de Tris-HCl (pH 8,8 à 20 C) contenant 20 unités de RNasin (Promega) et des dNTP, à une concentration 100 pM chacun. Les tubes ont été chauffés à 95" C pendant 5 mn et refroidis sur de la glace. Une PCR a été réalisée sur le brin simple d'ADNc dans le mélange pour transcription inverse additionné de 10 % de DMSO (v/v) et de dNTP, à une concentration 100 pM chacun, dans un volume final de 100 pl. Les deux amorces de 21 nucléotides ont été utilisées à une concentration 0,3 pM. Après 10 mn à 80" C, deux unités de Taq ADN polymérase (Cétus) ont été ajoutées, et de l'huile minérale a été déposée à la surface de la solution. Une dénaturation initiale à 94" C (2 mn) a été suivie par 30 à 40 cycles de dénaturation à 94" C (45 secondes) d'hybridation à 55" C (1 mn) et d'extension à 72" C (45 secondes). D - Analyses de Southern Des digestions par les enzymes de restriction (EcoRI, Hind III, Taq I, Pst I) ont été réalisées avec 10 à 15 unités enzymatiques par ug d'ADN génomique. Les digestions des ADN, les migrations et les transferts ont été réalisés comme décrit par Petit et al., 1988 (19). Afin de minimiser le bruit de fond, les sondes obtenues par Alu-PCR ont été hybridées à 65" C pendant 6 heures avec 1,5 mg par ml d'ADN de placenta humain soniqué avant l' hydribation par blot. Les membranes ont été lavées à 65" C dans 0,1 % SDS, SSC deux fois à 0,1 fois en fonction de la nature de la sonde. Des "zoos-blot" ont été préhybridés et hybridés selon la technique décrite par Howley et al., 1979 (12). Les lavages ont été effectués à 42" C avec une solution contenant du formamide (25 à 35 %), SDS à 1 %, 1 M NaCl, 5 mM EDTA et 50 mM de tampon phosphate (pH 7,2). E - Analyses par électrophorèse en champ électrique pulsé (PFGE) Les analyses d'ADN de poids moléculaire élevé ont été réalisées sur des appareils TAFE (Beckman) et OFAGE (LKB Pharmacia). On a également utilisé un champ inversé pour le programme pulsé DNAstar. Les conditions de digestion et d'électrophorèse sont celles décrites par Petit et al., 1988 (19). F - Sous-clonage du clone YAC 376 B4 Une digestion partielle avec MboI a été effectuée sur 1'ADN de poids moléculaire élevé provenant du clone YAC 376 B4. Les fragments de restriction ont été ligaturés dans un vecteur X EMBL3, après détermination de la taille (20-40 kb) sur un gel d'agarose à 0,5 %. Le criblage pour caractériser les clones contenant l'ADN humain a été réalisé avec une sonde Alu. Les ADN de 150 clones positifs ont été extraits, (Manfioletti et Schneider, 1988; Coulson et Sulston, 1988), et digérés par Taq I. Les fragments de restriction ont été séparés sur gel d'agarose, transférés et hybridés avec l'ADN total du clone YAC 376 B4 et avec diverses autres sondes (Alu, Kpn, polyAC, polyAG, CRI-S232 et des sondes provenant d'Alu-PCR).Les clones se recouvrant ont été alignés par analyse par scanner (scanner laser, Molecular Dynamics, Visage 4,3, Bioimage) et par comparaison des motifs de restriction à l'aide d'un programme d'ordinateur (Bellanné-Chantelot et al., 1991(8). G - Réaction de séquençage et alignement Le séquençage des clones d'ADNc et de l'ADN génomique a été réalisé sur des matrices M13 monocaténaires. L'ADN a été soniqué, fractionné (600 à 1200 bp) sur gel d'agarose et les extrémités franches ont été ligaturées à un vecteur mpl8M13. Les matrices à simple brin ont été séquencées avec des amorces de M13, marquées par fluorescence, en utilisant la TAQ ADN polymérase (NBL) sur un séquenceur Applied Biosystems 310 A. Les données de séquences brutes ont été traitées en utilisant le programme informatique de Staden (Staden, 1987(25) modifié de manière à pouvoir traiter ce programme génomique (750 000 nucléotides séquencés). H - Banques d'ADNc Deux banques d'ADNc de cerveau foetal humain ont été achetées chez Stratagene. L'une dans un vecteur k Zap Il, amorcée par de l'oligo (dT) et de manière aléatoire, provenait d'une femme normale ayant subi un avortement tardif à 17-18 semaines, l'autre, dans Uni-Zap XR, amorcée par de l'oligo (dT), et de manière aléatoire provenait de donneuses multiples enceintes de 15 à 20 semaines. En outre, une banque X a été réalisée à partir d'un foetus de Macaccus fascicularis de 36 jours. De 1'ARN total a été préparé en modifiant la méthode d'extraction au phénol chaud (Sambrook et al., 1989 (21). Les tissus broyés ont été lysés dans de l'acétate de sodium 10 mM, (pH 5,2), SDS 0,5 %, puis extrait par du phénol à 55 C. Des ARN poly A (+) ont été purifiées et la synthèse d'ADNc a été réalisée en utilisant des hexamères aléatoires conformément aux recommandations du fabricant (Pharmacia). Les ADNc ont été clonés dans un vecteur X gtlO. Un million de clones indépendants ont été étalés sur plaque et transférés sur des membranes de nitrocel-lulose (Hybond C-super, Amersham). Les hybridations et les lavages ont été réalisés comme décrit précédemment pour les analyses de Southern. I - Criblage des exons par un procédé automatisé à critères multiples La séquence d'ADN génomique a été criblée pour les exons candidats avant la fin du procédé qui conduit à l'assemblage des différents fragments en une séquence unique (procédé Contig). Les deux orientations de l'ADN de 67 kb ont été fusionnées en une séquence unique et soumises à un procédé automatisé à critères multiples conçu pour la détection d'exons codant internes. Ce procédé est basé sur des considérations concernant les cadres de lecture ouverte (ORF), les jonctions d'épissage potentielles, les différences entre les compositions en nucléotides d'hexamères et les similarités de segments avec des protéines connues. Toutes les phases de lecture ouverte (définies entre deux codons d'arrêt successifs) d'une longueur minimum de 50 nucléotides ont été sélectionnées.Tous les exons potentiels (même chevauchant) à l'inté-rieur de ces phases de lecture ouverte ont en outre été délimités à partir de tous les couples de jonction d'épissage possibles. Tous les segments ayant un "indice d'exons possibles positif (Claverie et al., 1990 (10)) ont été traduits en aminoacides, et testés pour leur similarité significative avec des protéines connues en utilisant le programme BLAST p (Altschul et al., 1990 (3)) et la matrice de calcul optimal PAM 120 (Altschul et al., 1991(2)). Les meilleurs candidats (et les sondes d'ADNc ont été choisis à partir de considérations à la fois sur les similarités de scores et l'indice d'exons possibles. Le meilleur candidat (CS1) correspondait à l'exon 1840 à 1980 représenté à la figure 6 avec une similarité N-CAM L1. J - Analyse de la séquence protéique L'analyse de la structure primaire du cadre de lecture ouverte du gène Kallmann a été réalisé en utilisant des outils et programmes informatiques connus tels que PC gene, BLAST p et FASTA (Bairoch, 1991 (5), Lipman et Pearson, 1985 (15), Schuler et al., 1991 (22) et Altschul et Lipman, 1990 (4)), et la collection de séquences de protéines (Boguski et al., 1991 (9)). Des analyses des études de similarité ont en outre été réalisées à l'aide de programmes informatiques conventionnels et à partir des séquences protéiques connues. I) Isolement d'un clone (clone 376 B4) comportant la région KAL à partir d'une banque YAC En utilisant la sonde CRI-S232 (Knowlton et al. (13)) décrite pour détecter un locus à l'intérieur de la région KAL telle que définie antérieurement à l'invention, les inventeurs ont isolé 13 clones YAC à partir de la banque YAC CEPH Mark I (Albertsen et al., 1990 (1)). Différentes sondes ont été obtenues à partir de ces YAC, en utilisant l'amplification par PCR avec des amorces Alu (voir point B). Les produits d'amplification par PCR dérivant de YAC 376 B4 ont été obtenus en utilisant les amorces 278 (int 2), TC 65 (int 1) et 4R et 278 (4 R376 B4). Ces sondes ont été hybridées aux ADN préalablement digérés pat Taq 1 d'un panel de patients présentant tous des délétions terminales dans la région Xp 22,3. Les résultats en analyse Southern sont représentés à la fig. 2.Parmi ces patients, LIL 155 avait une délétion sur le bras court du chromosome X; AM présentait une translocation Xp 22,3; Yq 11, seul AM présentait un syndrome de Kallmann. Sur la Fig. 2, les points de cassures des patients 2 et 3 définissent l'intervalle KAL délimité antérieurement à l'invention. 4X et X4Y se rapportent respectivement à un patient de sexe féminin ayant 48 chromosomes dont XXXX et un patient de sexe masculin ayant 49 chromosomes dont xYYYY. La sonde B (int 1) est localisée dans l'intervalle KAL tandis que les sondes A (int 2) et C (4 R 376 B4) sont localisées respectivement aux extrémités distale et proximale. Ceci a permis de définir 20 intervalles de délétion dans le segment terminal de 10 Mb. Les sondes ont également été hybridées à un panel de Yq, qui a permis de définir 7 intervalles de délétion. 12 clones YAC se sont avérés provenir du chromosome X et 1 (YAC 218 F9) du chromosome Y. Seule une sonde (int 1) provenant d'un seul clone YAC de 352 kb, a montré une hybridation à l'intérieur de l'intervalle KAL. Ce clone a été dénommé 376 B4. Deux autres sondes provenant du même clone YAC (int 2, int 3) se sont hybridées dans l'intervalle de délétion situé immédiatement à l'extrémité distale de l'intervalle KAL, tandis qu'une sonde provenant de l'extrémité droite (4R-376 B4) s'hybridait dans l'intervalle de délétion situé immédiatement à l'extrémité proximale (Fig. 2). le clone YAC 376 B4 englobe ainsi l'intervalle KAL.Dans la mesure où une délétion comprenant tous les loci X détectés par la sonde CRI-S232 a été décrite comme n'étant pas associée au syndrome de Kallmann (Ballabio et al., 1990), 1' interval- le peut-être réduit à la distance comprise entre le locus détecté par la sonde CRI-S232 et le point de cassure du patient AM (Fig. 1). A partir de la distance comprise entre les loci détectés par les sondes CRI-S232 et 4R376B4 (déterminées à partir de la carte physique du clone YAC 376 B4), les présents inventeurs ont conclu que l'intervalle KAL ainsi redéfini n'excédait pas 125 kb. II) Caractérisation de la région KAL 1 - Sous-clonage du clone YAC 376B4 Le clone YAC 376 B4 a été sous-cloné dans un vecteur k EMBL3. Une carte de fragments assemblés en une séquence unique (carte contig) de 180 kb des inserts du phage X couvrant l'intervalle KAL a été établie. 2 - Hybridations différentielles L'hybridation avec les fragments EcoRI obtenus à partir de sous-clones de YAC 376 B4 dans X avec les ADN d'hommes et de femmes normaux et à partir des individus 48, XXXX et 49, XYYYY (de façon à identifier les bandes X spécifiques et Y spécifiques par dosage) ont montré une colinéarité des ADN des clones de YAC et génomique. Elle a également révélé des fragments homologues X-Y. Sur la Fig. 3, A) représente la carte contig des sous-clones X recombinants obtenus à partir de YAC 376 B4 qui ont été séquencés, seul le fragment EcoRI proximal de 9 kb du clone 2-7 a été séquencé. B) représente les sites de restriction pour EcoRI et Hind III. Le point de cassure du patient AM et le locus détecté par la sonde CRI-5232 sont indiqués par des astérisques. C) représente les régions homologues entre Xp 22,3 et Xq ll (bandes hachurées). Ces homologies ont été définies par hybridation de fragments EcoRI obtenus à partir des clones X avec les ADN d'individus 46, XX, 46, XY, 48, XXXX et 49, XYYYY. La plus forte homologie est détectée dans la partie du centromère de l'intervalle KAL (apprécié par l'intensité des signaux d'hybridation). Tous ces fragments homologues X-Y se sont hybridés avec le clone YAC 218 F9 (provenant du chromosome Y, fourni par le CEPH (Centre d'Etudes du Polymorphisme Humain)). Cette homologie persistante Xp 22,3; Yq 11 était connue antérieurement. De manière à déterminer la taille exacte de la région KAL, des produits de digestion d'ADN génomique par EcoRI et Hind III provenant des patients LIL 155 et AM ont été également sondés avec les fragments EcoRI des inserts dans le phage X. La sonde la plus distale détectant le point de cassure du patient LIL 155 a été localisée à environ 10 kb à l'extrémité distale du locus CRI-S232. Les fragments de restriction les plus petits détectables compris dans la translocation Xp 22,3 ; Yq 11 du patient AM se sont révélés être un fragment Hind III spécifique du chromosome X de 2,3 kb et son fragment homologue spécifique du chromosome Y de 2,8 kb. A partir de la distance entre ce fragment spécifique de X et le locus détecté par la sonde CRI- S232, les inventeurs ont déduit que l'intervalle KAL avait une longueur d'environ 67 kb. Ils ont en outre obtenu une carte plus précise du point de cassure du chromosome X à l'intérieur de ce fragment Hind III de 2,3 kb. lll) Recherge de phases de lecture ouverte dans la région KAL Les ADN provenant de 7 phages X recombinants se chevauchant (1-35, 2-38, 2-20, 2-33, 2-35, 1-16, fragment EcoRI proximal de 2-7), qui recouvraient entièrement la région KAL ont été séquencés. Une carte contig unique de 67 kb a été obtenue et la séquence complète a été analysée par des méthodes informatiques pour distinguer entre les introns et les exons. Le programme informatique utilisé était respectivement basé sur les codons préférés (Staden et MacLachlan, 1982 (24)) et sur un procédé à critères multiples. Ces analyses ont révélé un total de 19 exons potentiels, avec différentes probabilités associées. Des exons codants potentiels ont été recherchés en utilisant des programmes informatiques connus. Les séquences correspondant à chacun de ces exons potentiels ont été amplifiées en utilisant la technique PCR et utilisées comme sondes sur des "zooblots". Les résultats d'hybridation sont représentés sur la Fig. 4, où M représente 1'ADN d'un représentant mâle; F celui d'un représentant femelle, pour chaque espèce, le sexe du chien étant indéterminé). Seules deux sondes (485 S1 et CS1) ont permis de détecter des fragments d'ADN unique chez d'autres espèces mammifères. La séquence 485 S1 a montré une bande nette chez le cheval et le cochon. La séquence CS1 a revélé un profil d'hybridation plus complexe, comportant des bandes très importantes chez certaines espèces dont certaines probablement polymorphes. Les sondes 485 S1 et CS1 ont donné les meilleurs scores de probabilité en utilisant les programmes informatiques précédemment mentionnés. La séquence CSl a été retenue en outre en partie en raison d'une similitude avec N-CAM L1 (Cunningham et al., 1987 (11), Moss et al. 1988 (16)). Les deux séquences avaient la même orientation transcriptionnelle. IV) Criblage de banques d'ADNc humain et de macaque avec lasonde 485 S1 et isolenent d#une clone contenant legéne ADMLX Une banque d'ADNc a été réalisée à partir d'un foetus de macaccus fascicularis au 36eme jour de gestation, correspondant au premier jour pour lequel on a observé l'expression de cellules GnRH dans cette espèce. Cette banque ainsi que les deux banques d'ADNc de cerveau foetal humain (point H) ont été criblées avec la sonde 485 S1. Sept clones indépendants sur un million ont été isolés à partir de la banque de macaque non amplifiée et 5 à 7 clones à partir des autres banques. Les premières séquences obtenues à partir des clones humains avaient suggéré que certains ADNc étaient soit incomplètement épissés dans la mesure où ils étaient interrompus par des séquences non codantes ou chimériques car une extrémité hybridait avec des autosomes. Le séquençage d'au moins 3 clones cohérents indépendants a été réalisé pour la partie codante du produit de transcription tandis que la partie 3' non codante était définie à partir du séquençage du génome. La Fig. 5 représente la localisation du gène ADMLX. Sept clones (22, 109, 85, 121, 114, 9, 37 et 29) ont été utilisés pour l'assemblage de l'ADNc complet. Les clones 22 et 85 contiennent l'intégralité de la région codante. Le fragment terminal de 4715b de l'extrémité 3 de l'ADNc est contenu dans le fragment proximal de 8,1 kb de l'intervalle de l'ADN génomique KAL. La Fig. 6 (A) et (B) représente la séquence complète de 6313 kb de l'ADNc, obtenue à partir des clones d'ADNc se chevauchant partiellement. (A) représente l'extrémité 5' et la phase de lecture ouverte. L'ADNc contient une phase de lecture ouverte unique longue (ADMLX) de 679 aminoacides, débutant au premier codon ATG, 153 nucléotides en aval de l'extrémité 5' de l'ADNc. Ce codon d'initiation ATG suit la séquence consensus eucaryote Cc (A/G) CC ATG G (Kozak, 1986 (14)). La région 3' non traduite (B) est d'une taille inhabituelle (4123 nucléotides) et est située à une distance de 2,8 kb d'un motif dinucléotidique répété ayant un polymorphisme élevé; elle contient 8 signaux de polyadenylation potentiels (AAUAAA). A partir de l'alignement avec la séquence génomique disponible, les présents inventeurs ont défini les quatre derniers exons. Les trois derniers exons (4715 nucléotides) ont été cartographiés sur une région d'ADN génomique de 8,1 kb. Le dernier exon de 4180 pb ne code que pour 19 aminoacides. L'exon correspond à la sonde 485 S1 et l'exon est identique à l'exon prédit pour CS1. Ainsi, le gène ADMLX contient les deux exons qui ont été révélés par exploration par analyseur de l'intervalle KAL. L'extrémité 5' de l'ADNc et le début de la région codante contiennent un groupe de dinucléotides CpG : un site NotI (position 431), un site Bss HII (position 135) et 13 sites HpaII sont comptés dans les 431 premiers nucléotides. Ces sites sont encadrés sur la Fig. 6. Ceci suggère la présence d'un îlot de CpG identique à l'îlot de CpG proche du point de cassure du patient LIL 155. La séquence d'aminoacides (en code IUPAC à 1 lettre) qui est obtenue par traduction à partir de la séquence des bases débute par un peptide leader supposé (encadré). Les autres parties encadrées définissent le domaine riche en résidus cystéine , le domaine de type protéine de petit lait (whey acidic protein (WAP) , le centre du motif 1 de type twitchine , le centre de la région similaire à N-CAM L1 . N+ représente les sites de glycosylation potentiels liés à l'asparagine Les régions de localisation des liaisons des exons sont indiquées par un T. Les signaux consensuels de polyadénylation sont représentés en lettres majuscules (Fig. 6B), un site pour Hpa II est souligné (2145). V) Caractérisation de la protéine ADMLX a) Analyse de la séquence La séquence peptidique prédite commence par une bande de résidus non chargés hydrophobes, caractéristiques d'un peptide signal. Le clivage de celui-ci (selon la méthode de Von Heijne, 1986 (27)) découvre la sérine-22 à l'extrémité N-terminale de la protéine mature comportant 658 aminoacides et ayant un poids moléculaire déterminé par calcul de 74280. La liaison de chaînes latérales osidiques aux sites de glycosylation potentiels associés aux restes asparagine pourrait conférer une masse moléculaire plus élevée à la protéine. Le reste de la séquence d'aminoacides correspond à un polypeptide basique relativement hydrophobe (pI = 9,72), ne manifestant pas de domaine transmembranaire. La tendance moyenne à former des hélices a est faible, le repliement de la protéine étant majoritairement de type ss. La distribution des résidus cystéine dans la séquence suggère l'organisation générale de la protéine ADMLX. Les 175 aminoacides N-terminaux du polypeptide mature contiennent 20 cystéines tandis que seuls 5 autres résidus cystéine sont retrouvés dans les 483 résidus suivants. La région riche en cystéines peut en outre être divisée en deux groupes séparés : un motif central nettement consensuel de type WAP s'étendant sur le segment et un groupe différent comportant 12 résidus cystéine s'étendant sur la région . Une derniere caractéristique de la phase de lecture ouverte du gène ADMLX consiste en une région Cterminale hydrophobe comportant 10 résidus basiques histidine, lysine et arginine regroupés dans les 19 résidus codés par le dernier exon. b) Recherche d'homologies La chaîne polypeptidique comprise entre les résidus 176 et 660 présente des similitudes nombreuses et significatives avec le motif répété de type III de la fibronectine et avec des séquences correlées à ce motif répété. En utilisant le programme BLAST P (Altschul, 1991 (2)) on a mis en évidence que les molécules présentant le plus de similitudes avec cette région étaient la fibronectine de rat, la twitchine de C. elegans, la protéine associée à l'antigène commun des leucocytes humains, et la contactine/F11 de la poule. Dans la région cependant, le segment ne présente aucune similitude nette avec une protéine connue. Cette région codée par les trois derniers exons et contenant 4 résidus cystéine constitue un domaine original. VI) Expression du gène ADMLX Une hybridation de Northern blots d'ARN poly A(+) de foetus de Macaccus fascicularis (utilisé pour la banque d'ADNc), de cellules de cerveau humain adulte et de tératome NT2/D1 avec une sonde d'ADNc codant de 2 kb n'a permis de détecter aucun produit de transcription. L'expression du gène ADMLX a été étudiée alors par transcription inverse à partir d'ARN provenant de types cellulaires et tissulaires variés suivie par une amplification par PCR à l'aide d'amorces provenant de la séquence d'ADNc. On a utilisé trois jeux d'amorces placées le long de la région codante de la séquence d'ADNc (entre les positions 100 et 394, 1060 et 1380 et 1560 et 1850) pour analyser l'expression du gène. Ces amorces appartenaient à six exons différents. On a mis en évidence des produits d'amplification dans tous les tissus étudiés : cerveau adulte, foie, rein, muscle squelettique, cellules lymphoblastiques et cellules de tératome NT2/DA, rein foetal et muscle foetal. Les produits d'amplification ont la taille attendue et s'hybrident avec les sondes oligonucléotidiques de l'invention. VII) Caractérisation d'une anomalie génétique chez des patients présentant un syndrome de Kallmann Une cartographie des exons à l'intérieur de la région KAL réalisée chez le patient AM a permis de révéler que le fragment HindIII de 2,3 kb spécifique du chromosome X impliqué dans ce réarrangement contenait l'avant-dernier exon et la totalité de la partie codante du dernier exon (Fig. 7). Ceci impliquait l'éventualité d'une interruption du gène ADMLX dans la région 3' non codante. Les inventeurs ont alors sélectionné le long de la région KAL différents jeux d'amorces (de la position 1014 à la position 3275) qui ont permis d'amplifier des fragments sur le chromosome X mais non sur le chromosome Y. L'absence d'amplification de séquences appartenant au chromosome Y a été établie en réalisant une amplification par PCR sur de l'ADN provenant de cellules hybrides 3E7 (ne contenant que le chromosome humain Y) et sur des ADN de trois patients présentant une délétion de la région KAL. En partant de la présence du produit d'amplification spécifique en utilisant l'amorce A4 (en position 1014) avec les amorces 6B, 7B ou 8B (respectivement aux positions 1514, 2018 et 2866), les inventeurs ont abouti à la conclusion que le point de cassure du patient AM était situé à moins de 481 pb du site HindIII en position 3347. Les séquences des amorces sont reproduites pour information dans le tableau ci-dessous. En partant en revanche de l'absence de produit d'amplification par PCR en utilisant l'amorce 10A (complémentaire de l'amorce 8B) avec l'amorce 9B ou 12B, se situant à l'intérieur des 57 derniers nucléotides codants (positions 3271, 3306), les inventeurs en ont déduit que le point de cassure du patient AM était localisé au moins 31 bases en amont du codon stop. Sur la Fig. 7, les jeux d'amorces 4A-6B ; 4A-8B et 10A-9A sont représentés respectivement par (A), (B) et (C). Le patient AM est représenté par le chiffre (1), un individu de sexe féminin normal 46,XX (2) et un individu de sexe masculin 46,XY comprenant une délétion interstitielle comprenant la région KAL (3) (PAR 252) ont été utilisés respectivement comme témoins positif et négatif. La délétion dans PAR 252, qui n'est affecté que par le syndrome de Kallmann, a été détectée au cours d'une hybridation systématique avec des sondes provenant de la région KAL. Le côté droit de la figure correspond à la direction du centromère. La Fig. 8 représente la délétion de l'extrémité 5' du gène ADMLX chez le patient RM 254. Les sondes PCR obtenues à partir de l'ADNc, entre les positions 306 et 505 (a) et entre les positions 389 et 965 (b) ont été hybridées à l'ADN génomique de patients présentant un syndrome de Kallmann, digéré par Pst I (a) et Hind III (b). Les lignes 1 et 3 représentent des individus de sexe féminin normaux. La ligne 2 et les lignes 4 à 8 correspondent à des individus de sexe masculin présentant un syndrome de Kallmann. La sonde (a) révele des bandes spécifiques de X et Y. La bande spécifique du chromosome X est polymorphe (ligne 6) et présente une délétion pour le patient RM 254 (ligne 7). La sonde (b) révèle plusieurs bandes spécifiques pour X et Y. Seul le fragment spécifique de la partie supérieure de X présente une délétion chez le patient RM 254. SEQUENCE DES AMORCES KAL 1B 5' : TTC AAC AAG CTT ACA CAT CTG KAL 2B 5' : GTG TCT GTC TTC ACC AAT CT KAL 3A 5' : GAA TTG GGG AGG GCA GGA ATA KAL 4A 5' : CTG GTC CAA GTG AAC ATG CCC KAL 5B 5' : AGT GGC CTG GAA GAC AGG CCA KAL 6B 5' : TAA AGT CTT CAG CTG CAC ATC KAL 7B 5' : TGA CAG GAT GGC TTA ATG CCC KAL 8B 5' : GGC TAT CAA GCT CTC CCA TTG KAL 9B 5' : GAT GAC GAT GCT TAA GAT GAG KAL 13B 5' : AAT GAT GTG GAT GAC GAT GC KAL 12B 5' : TTA GTA TCT TTC TGG AGA AGG KAL llA 5' : TGT CTG ATG ACT AGT GTG TGG KAL 10A 5' : CAA TGG GAG AGC TTG ATA GCC LISTE DES SEQUENCES I - INFORMATION GENERALE (1) DEMANDEUR : INSTITUT PASTEUR (2) TITRE DE L'INVENTION Séquence nucléique du gène associé au syndrome de Kallmann lié au chromosome X, séquences pepti diques correspondantes; applications diagnosti ques. (3) NOMBRE DE SEQUENCES : 1 Il - INFORMATION POUR SEQ ID NO 1 CARACTERISATION DES SEQUENCES TYPE : nucléotide et sa protéine correspondante LONGUEUR : 6161 paires de bases (séquence nucléotidique) 679 aminoacides (séquence peptidique) NOMBRE DE BRINS : simple CONFIGURATION : linéaire TYPE DE MOLECULE :ADNc pour ARNm ORIGINE ORGANISME : humain LIGNEE CELLULAIRE : cellules de cerveau foetal CARACTERISTIQUE -152gggtcggcga ggagggtccg gccggagttg aaggattgaa ctttccggct cagtcgcggc gtctgcctgg tcctcagcag tgcaggcccg ccgcggagca gggagccctc ggcccgcgcc cggcgccctc gccctcgccc tcgacccgca gcc 1 atggtgcccggggtg cccggcgcggtcctg accctctgcctctgg ctggcggcctccagc ggctcctggcggccg gccccggcgcggctc 1 m v p g v p g a v l t l a l w l a a s s g s w r p a p a r l 91 tgcgcggcggctgga cgagtcgctgtctgc cgggagcgtccagcg cgctcctgcgcctcc aggcgcctgagcctg cagatcactcgcatc 31 c a a a g r v a v c r c r p a r a c a a r c l s l q i t r i 181 tccgccttcttccag cacttccagaacaat ggttccctggtttgg tgccagaatcacaag caatgttctaagtgc 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SYMBOLES DES ACIDES AMINES A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I île isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser serine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine REVENDICATIONS 1. Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique choisie parmi (A) la séquence SEQ ID N" 1, (B) les séquences qui en diffèrent par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, (C) des fragments desdites séquences (A) et (B), (D) les séquences complémentaires desdites séquences (A), (B) et (C), et (E) les séquences qui hybrident avec les séquences (A), (B) et (C). 2. Vecteur de clonage, caractérisé en ce qu'il contient un fragment d'acide nucléique selon la revendication 1. 3. Plasmide p 85 B déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes le 26 septembre 1991 sous le n" I-1146. 4. Couple d'oligonucléotides aptes à jouer le rôle d'amorces nucléiques dans l'amplification spécifique du gène ou de fragments du gène associé au syndrome de Kallmann lié au chromosome X dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il est constitué de deux séquences nucléotidiques choisies parmi (A), (B), (C) et (D) selon la revendication 1, un des membres du couple étant constitué par une séquence appartenant à (D). 5. Couple d'oligonucléotides selon la revendication 4, caractérisé en ce que les séquences ont une longueur de 18 à 30 nucléotides et, de préférence, de 18 à 22 nucléotides. 6. Sonde nucléique spécifique du gène associé au syndrome de Kallmann lié au chromosome X, caractérisé en ce qu'elle comporte au moins 20 nucléotides consécutifs choisis parmi les séquences nucléiques (A), (B), (C), (D) et (E) selon la revendication 1. 7. Méthode de détection d'une anomalie génétique liée au syndrome de Kallmann dans un échantillon biologique contenant de l'ADN humain comportant les étapes suivantes a) mise en contact de l'échantillon biologique contenant l'ADN avec un couple d'amorces spécifiques selon l'une des revendications 4 ou 5, l'ADN humain contenu dans l'échantillon ayant été éventuellement rendu accessible à l'hybridation et dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN humain contenu dans l'échantillon biologique ; b) amplification de l'ADN humain ; c) révélation des produits d'amplification d) mise en évidence éventuelle d'une mutation ou d'une délétion par les techniques appropriées. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que dans l'étape d), on met en évidence une mutation par la technique d'analyse de polymorphisme conformationnel de simples brins (singlestrand conformation polymorphism (SSCP)). 9. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que dans l'étape d), on met en évidence une délétion par détermination de la longueur des fragments amplifiés. 10. Nécessaire pour la détection d'une anomalie génétique liée au syndrome dé Kallmann dans un échantillon biologique, comprenant les éléments suivants - un couple d'amorces spécifiques selon l'une des revendications 4 ou 5, - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'ADN, amplification d'ADN, - un composant permettant de déterminer la longueur des fragments amplifiés ou de mettre en évidence une mutation. 11. Séquence peptidique, caractérisée en ce qu'elle est codée par l'une des séquences nucléotidiques choisies parmi A, B, C, D et E selon la revendication 1. 12. Séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence choisie parmi (A) la séquence peptidique SEQ ID N" 1, (B) la séquence peptidique comprise entre S22 et Y679 de la séquence SEQ ID N" 1, (C) des fragments des séquences (A) ou (B), (D) les séquences peptidiques qui diffèrent des séquences (A), (B) ou (C) par insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs aminoacides et qui possèdent la même activité. 13. Anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine ou un peptide ayant une séquence peptidique selon la revendication 12. 14. Procédé de dosage d'une protéine ayant une séquence peptidique selon la revendication 12, comprenant l'utilisation d'anticorps monoclonaux selon la revendication 13.