Brevet FR2681601A1 — publié le 19930326

La présente invention concerne un nouveau polysaccharide, son procédé d'obtention par culture d'un microorganisme du genre Pseudomonas ainsi que ce microor- ganisme, et les applications de ce polysaccharide comme agent de viscosité, épaississant, gélifiant ou stabili- sant de suspensions. On connaît différentes espèces de microor- ganismes producteurs de polysaccharides dont les pro- priétés rhéologiques particulières permettent leur utilisation comme agents de suspension ou comme agents épaississants ou gélifiants des milieux aqueux; le xanthane entre, par exemple, dans la composition d'en- cres, de peintures, de produits alimentaires ou de médicaments; le scléroglucane est utilisé dans les forages pétroliers. On a maintenant isolé une souche de micro- organismes du genre Pseudomonas, dans un prélèvement de terre de Normandie qui, par culture sur un milieu nutritif classique contenant des sources de carbone et d'azote organique et des sels minéraux, secrète un nouveau polysaccharide dont les propriétés rhéologiques en milieu aqueux sont particulièrement intéressantes, du même type que celles du xanthane mais se manifestant à plus faible concentration. Selon un premier aspect, l'invention concerne donc une souche bactérienne dénommée PS-5 T 1, dont un échantillon a été déposé en application du traité de Budapest, le 24 09 91 sous le numéro I-1145 à la Collec- tion Nationale de Cultures de Microorganismes Paris, France (CNCM). Les bactéries PS-5 T 1 sont Gram négatif; elles ont une forme de bâtonnet de dimension moyenne 0,7 à 8,0 pum sur 1,1 à 1,45 pum. Sur milieu nutritif gélosé Plate Count Agar, commercialisé par DIFCO, la souche forme des colonies rondes, bombées, jaunes, brillantes, atteignant 2 mm de diamètre après 48 heures à 28 C Sur milieu MY gélosé (DIFCO), l'aspect des colonies est identique, et leur diamètre augmente si l'incubation se prolonge. Les propriétés physiologiques et biochimiques des bactéries P 55 T 1, déterminées selon les méthodes décrites dans Bergey's Manual, Noel R KRIEG and al, 1974 et The Prokaryotes, Mortimer P STARR, 1981, figurent dans le tableau I. Tableau I Cytochrome oxydase + Catalase + Test oxydation-fermentation oxydation Culture en anaérobie - Croissance à différentes concentrations en Na Cl: 0,5 % + 1,0 % + 2,0 % + 2,5 6,0 % - Survivantes à 60 C 30 min: + 102 cellules/ml à partir de 109 cellules Croissance à différentes températures: 4 C - C + C + 32 C - 37 40 50 C - Croissance en présence de triphényl tétrazolium à 0,01 % + 0,02 % + 0,05 % 0,1 % Croissance à différents p H 4; 5; 5,5 - 6,5; 7; 7,5 + 8-9 + à 12 Croissance sur du Triple sugar iron agar Pente (du tube incliné) Changement couleur Culot Production de gaz - Production H 2 S - Pigment sur milieu de King A - Pigment sur milieu de King B - Croissance sur le milieu de Burk's - Utilisation du malonate - Hydrolyse de la cellulose - Hydrolyse de la pectine - Test de dénitrification - Dans le tableau II sont mentionnés les résultats d'essais enzymatiques classiques effectués en utilisant les ensembles de réactifs commercialisés par la Société A Pl System, la Balme-les-Grottes 38390 - Montalieu Vercieu (FR). Tableau II Indole - Voges Proskauer (VP) + Simmon's citrate + Réduction du nitrate + Arginine dihydrolase - Lysine décarboxylase - Ornithine décarboxylase Production H 2 S Test uréase Egg Yolk réaction (lécithinase) - Hydrolyse de l'amidon + Hydrolyse de la gélatine + Protéase + Le polysaccharide selon 1 ' invention peut être obtenu par fermentation de ces bactéries dans un milieu de culture convenable, agité et aéré de façon classique. Les bactéries PS-5 T 1 ne se développent pas sur un milieu contenant comme seule source d'azote un sel d'ammonium, mais la source d'azote présente dans le milieu de fermentation peut être de diverses origines protéiques, telles que, par exemple, des extraits de levure, des farines de soja, des eaux de trempage de maïs, de la gélatine, des drèches de distillerie, des peptones Ces protéines sont introduites à raison de 0,1 % à 1 % (p/v) du milieu liquide aqueux, ce qui correspond à un poids équivalent en azote total de 0,16 à 1,6 g/l environ. Les bactéries peuvent utiliser un grand nombre d'hydrates de carbone comme source de carbone et par exemple le galactose, le glucose, le mannose, l'amygdaline, la cellobiose, le maltose, l'amidon, le glycogène et le lactose et le milieu nutritif peut contenir un seul de ces composés ou un mélange de ceux- ci En général, on en introduit de 2 % à 6 % (g/l) dans le milieu aqueux de fermentation. Parmi les sels minéraux facteurs de crois- sance utilisables pour la culture des bactéries PS-5 TI, on choisira les sels apportant des ions Na, K, NH 4, Ca, Mg, P 04, 504, Cl, C 03 On introduit aussi de façon classique dans le milieu nutritif, de préférence, des oligo-éléments tels que Cu, Mn, Fe, Zn, à raison de quelques ppm. La fermentation qui permet de produire le polymère de l'invention, peut être réalisée en milieu agité et aéré à une température comprise entre 200 C et 320 C, et de préférence à 280 C; le p H du milieu est compris entre 6,5 et 9,0 et de préférence vers 7,0 et il est ajusté si nécessaire en cours de fermentation Une fermentation dure de 30 heures à 80 heures avant que le milieu ne devienne trop épais. Le polysaccharide est isolé du milieu de fermentation en fin de culture, de préférence, par précipitation; pour cela, on introduit dans le milieu, après sa stérilisation, un solvant miscible à l'eau, dans lequel le polymère est insoluble, tel qu'un alcool comme l'éthanol, le méthanol et de préférence l'isopropanol, ou une cétone, telle que l'acétone; de cette façon, on isole le polysaccharide brut, co-précipité avec des corps cellulaires et des sels; on dit que le polysaccharide est sous forme native. Il peut être utilisé tel quel ou après puri- fication notamment par dialyse pour éliminer les sels et par reprécipitation à partir d'une solution aqueuse à faible concentration, 1 à 5 g/l ou de préférence 2 à 3 g/l, par addition de l'un des solvants précédemment cités, en général par addition d'isopropanol. Pour améliorer sa dispersibilité en milieu aqueux on pourra, comme on le fait pour d'autres poly- saccharides dont le xanthane, traiter le polymère de l'invention par un dialdéhyde aliphatique, comme le glutaraldéhyde. Un autre objet de l'invention est le poly- saccharide, dénommé 5 T 1, dans ses différentes formes, qui peut être obtenu par culture des bactéries PS-5 T 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'unités répétiti- ves dont le squelette de chacune comporte 2 radicaux de d-mannose, 2 de d-glucose, 1 de d-galactose, 1 d'acide d-glucuronique, 1 de d-xylose, 1 de 1-lyxose et 1 de 1-fucose, et dont certains hydroxyles saccharidiques sont éventuellement estérifiés, notamment sous forme d'acéta- te. Selon les conditions de culture et d'isole- ment, le polysaccharide peut présenter différentes formes, c'est-à-dire porter plus ou moins de groupes acétate et pyruvate sur le squelette. La structure et l'enchainement de chaque unité du polysaccharide ont été déterminés sur un échantillon de masse sensiblement homogène par des techniques classiques d'analyse, et plus particulière- ment, une forme du polysaccharide 5 T 1 est constituée d'une succession d'unités nonasaccharidiques dont le squelette de base, sur lequel est greffé un groupe pyruvique, est représenté par la formule développée I suivante dans lequelle R éventuellement présent sur le lyxose représente un groupe en C 1 à C 6: H 3 C COOH > 4) Glc P( 1 3)Glc P( 1 -3) Glc UA a( 1 3) Fuc a(l> Xyl p( 1-> 4)Man p( 1 -2)Man al, R-Lyx P 1 l Dans une forme particulière, le polysaccha- ride 5 T 1, est constitué du produit de formule I sur laquelle sont fixés trois groupes acétate. Les propriétés rhéologiques du nouveau polymère selon l'invention sont particulièrement avan- tageuses: en solution le polymère selon l'invention a une viscosité supérieure à celle du xanthane La viscosité d'une solution à 1 % est stable même en milieu acide, tel que dans l'acide acétique à 20 %, ou en présence d'un sel tel que Na Cl, Na 2504, Ca C 12, et n'évolue pas lorsqu'on élève la température de la solution de 20 C à 90 C mais disparaît à p H > 10, en présence d'un cation trivalent, tel que A 13 ', Fe 3 ", Cr 3 +, en milieu aqueux le polysaccharide 5 T 1 gélifie; ainsi, on obtient un gel cohérent avec une solution aqueuse à 0,5 % du polymère contenant 50 ppm d'A 13 %, ppm de Fe 3 + ou 200 ppm de Cr 3 +. Dans ce qui suit, on décrit un exemple de préparation du polysaccharide selon l'invention, les méthodes de détermination de sa structure et ses pro- priétés rhéologiques. EXEMPLE Des bactéries Pseudomonas de la souche 1-1145 ont été ensemencées sur un milieu gélosé MY Après 48 heures d'incubation à 28 C, la culture obtenue a été utilisée pour ensemencer 100 ml de bouillon MY dans une fiole et après 24 heures d'incubation à 28 C, on a ensemencé 1000 ml du même bouillon; enfin après 12 heures de culture les bactéries finalement obtenues ont été introduites dans 10 litres d'un milieu nutritif convenant pour la production du polysaccharide 5 T 1 composé de: glucose ( 35 g/l), farine de soja ( 5 g/l), K 2 HPO 4 ( 3 g/l), Mg SO 4 ( 1 g/l), Mn SO 4 ( 50 pg/l), Fe SO 4 ( 50 pg/l), Zn SO 4 ( 50 Pg/l), Cu SO 4 ( 50 pg/l), la fermentation a été effectuée à 28 C en milieu agité et aéré tandis que le p H du milieu était maintenu à 7 Après heures environ, le milieu a été porté à 80 C pendant 15 min, pour l'opération dite de stérilisation Après retour à température ambiante, on a introduit dans le milieu 2,5 volumes d'isopropanol pour précipiter le polysaccharide 5 T 1. Après séchage vers 55 C, on a isolé 20 g du polymère natif recherché. Le polysaccharide ainsi obtenu peut être introduit dans environ 10 litres d'eau distillée, et la suspension filtrée à travers une couche de terre de diatomées; en introduisant dans le filtrat 3 à 5 volumes d'isopropanol, on précipite le polysaccharide dit pur. Propriétés du polysaccharide 5 T 1 On a effectué des mesures viscosimétriques à C pour un xanthane courant et pour le polysaccharide pur obtenu selon l'exemple ci-dessus, en solution aqueuse en présence de chlorure de potassium ( 10 g/l), avec un viscosimètre Rhéomat LS 30, commercialisé par la société Contraves (FR), soit à différentes vitesses de cisaille- ment avec des solutions à 10 g/l, soit à la vitesse de cisaillement 0,01 seconde-1 pour de faibles concentra- tions Les courbes obtenues sont représentées figures 1 et 2 en annexe. Les résultats d'autres mesures effectuées avec un viscosimètre Brookfield, modèle LVF, comportant un mobile référence 2 ou 3 et tournant à 30 tours par minute, pour des solutions de différentes concentrations, contenant éventuellement 10 g/l de chlorure de potassium, figurent tableau III: TABLEAU III concentration KC 1 référence viscosité (m Pa) du polymère mobile produit produit (g/100 ml) natif purifié ______________________________________________________ 0,5 3 760 1200 0,5 + 3 1240 1640 0,2 2 190 280 0,2 + 2 240 350 0,075 2 44 62 0,075 + 2 46 70 __-________ Etude structurale Des fragments saccharidiques ont été obtenus soit par fragmentation avec CH 30 H/H Cl à 80 C du polymère éventuellement prétraité et acétylé, soit après hydrolyse par l'acide trifluoroacétique à 100 C, suivie d'une réduction puis d'une acétylation; ils ont été étudiés,en général, par une méthode couplant la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse. Le polysaccharide 5 T 1 purifié obtenu dans les conditions de l'exemple précédent a été prétraité: par le lithium dans l'éthylènediamine pour dégrader les acides uroniques, par le métaperiodate de sodium avant et après saponifi- cation, ce qui ne décompose que xylose, lyxose et man- nose, par Cr O 3 dans l'acide acétique, ce qui détruit les saccharides peracétylés en configuration anomérique équatoriale, par une base forte en milieu anhydre (Li CH 3 SC dans le diméthylsulfoxyde) qui dégrade, par p-élimination, les acides uroniques des polysaccharides perméthylés. La présence de substituants acétiques a été mise en évidence par chromatographie liquide sur colonne d'exclusion d'ions après l'hydrolyse du polysaccharide 5 T 1 Le groupe pyruvique, vraisemblablement lié au galactose par une liaison acétal sur les hydroxyles 4 et 6, a été mis en évidence après méthanolyse du polysac- charide et de son dérivé perméthylé Le groupe R présent sur le lyxose n'a pas été caractérisé. REVENDICATIONS 1 Polysaccharide caractérisé en ce qu'il est constitué d'unités répétitives saccharidiques qui ont un squelette comportant 2 radicaux de d-mannose, 2 de d- glucose, 1 de d-galactose, 1 d'acide d-glucuronique, 1 de d-xylose, 1 de 1-lyxose et 1 de 1-fucose. 2 Polysaccharide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un radical d'acide pyruvique greffé par unité nonasaccharidique. 3 Polysaccharide selon l'une des revendica- tions 1 et 2, caractérisé en ce que certains hydroxyles saccharidiques sont estérifiés, sous forme d'acétate. 4 Polysaccharide selon l'une des revendica- tions 2 et 3, caractérisé en ce qu'il est constitué par une succession d'unités répétitives dont le squelette sur lequel est greffé un groupe pyruvique répond à la for- mule I H 3 C COOH 4 6 Gal 1 -+ 4) Glc p( 1 -> 3)Glc p( 1-43)Glc UA a( 1 -> 3)4 Fuc a(l- Xyl p( 1-)4)Man p( 1-)2)Man al/ R-Lyx 1 dans laquelle R éventuellement présent est un groupe en C 1 à C 6. Polysaccharide selon la revendication 4, caractérisé en ce que 3 des hydroxyles saccharidiques, par unité, sont sous forme acétate. 6 Procédé d'obtention d'un polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 5, qui consiste à cultiver des bactéries de la souche CNCM N 1-1145 dans un milieu nutritif aqueux et à isoler le polysaccharide produit lors de la fermentation. 7 Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce que le milieu de fermentation aéré est à une il température comprise entre 200 C et 320 C, un p H compris entre 6,5 et 9 et qu'il contient une source de carbone, une source d'azote organique et des facteurs de croissan- ce. 8 Polysaccharide obtenu selon le procédé de l'une des revendications 6 et 7, à l'état natif. 9 Souche de bactérie Pseudomonas déposée à la CNCM sous le No I-1145. Utilisation d'un polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 5 et 8 pour l'obtention de gels aqueux en présence de cations trivalents. 11 Utilisation d'un polysaccharide selon l'une des revendications 1 à 5 et 8 comme agent de viscosité.