Brevet FR2681075A1 — publié le 19930312

La présente invention est relative à une pré- paration enzymatique purifiée issue de Chromobacterium violaceum, présentant une activité déshydrogénasique, à son procédé d'obtention et à son application à la produc-5 tion d',idéhydrotryptophanyl-peptides. Une activité déshydrogénasique, agissant sur la chaîne latérale du tryptophane a été décrite dans Methods in Enzymology ( 1987, 142, 195217; K TAKAI et O HAYAISHI) La tryptophan side chain oxidase (TSO), isolée de Pseudomonas XA (ATCC 29574), est un système multienzymatique qui catalyse la déshydrogénation en Ca et Cg de résidus tryptophanyles Cependant, le composé insaturé (-A Trp-) n'est qu'un produit secondaire dans le catabolisme du tryptophane, formé en équilibre avec les produits de dégradation ( 5-hydroxy et 5-céto), à partir d'un intermédiaire unique indolyloxazoline et ne permet pas de maîtriser convenablement la production des compo- sés déhydro du fait de la variation du rendement de syn- thèse de ces composés, notamment en fonction de la nature du substrat et des conditions expérimentales (le p H, en particulier) De plus, cette enzyme est faiblement spéci- fique et transforme le L-tryptophane (L-Trp), le D-tryp- tophane (D-Trp), les résidus dont le noyau indole est mo- difié ou substitué ( 5 OH-Trp) et les résidus décarboxylés (tryptamine). P.J DAVIS et al ont mis en évidence l'existence d'une biotransformation du N-benzyloxy- carbonyle-L-tryptophane dans une culture de bactérie à Gram négatif, Chromobacterium violaceum (ATCC 12472), se traduisant également par la formation d'une double liai- son entre les carbones Ca et Co du L-tryptophane (BBA, 1975, 385, 133-144); ils ont également étudié la trans- formation de l'acide indole-3 propionique en acide indole-3 acrylique (J Bacteriol, 1976, 126, 1, 544-546) et la stéréochimie de la déshydrogénation de la chaîne latérale du N-benzyloxycarbonyle-(S)tryptophane (J C S. Chem Comm, 1977, 821, 842-843). Toutefois, cette réaction n'a été mise en évi- dence que sur des substrats particuliers dont la seule caractéristique commune est la présence d'un noyau in- dole, et ce uniquement lors de l'incubation de cellules au repos et dans des cultures de bactéries. Il résulte de ce qui précède qu'aussi bien les réactions décrites dans TAKAI et al que celles décrites dans DAVIS et al ne permettent pas leur application à la production de déhydropeptides et de déhydroprotéines purs. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une préparation enzymatique purifiée, présentant une activité déshydrogénasique spé- cifique du résidu L-tryptophane, à partir de Chromobacte- rium violaceum qui répond mieux aux besoins de la pra- tique que les préparations de l'Art antérieur, notamment en ce qu'elle permet d'obtenir des déhydropeptides ou des déhydroprotéines purs, dans des conditions opératoires faciles à mettre en oeuvre industriellement. La présente invention a pour objet une prépa- ration enzymatique purifiée ayant une activité de déshy- drogénase, caractérisée: en ce qu'elle présente: une activité spécifique comprise entre 35 et 45 uni- tés secondes-1 par mole d'hème pour le N-acétyle-L- tryptophanamide (NATA), un poids moléculaire apparent de l'ordre de 680 k Da, un point isoélectrique de l'ordre de 4, une température optimale d'activité supérieure à 80 'C; en ce qu'elle est thermostable; et en ce qu'elle catalyse la conversion de résidus tryptophanyles en résidus déhydrotryptophanyles à un p H compris entre 3 et 8. Les Inventeurs ont appelé cette préparation enzymatique purifiée Ltryptophane 2 ',3 '-oxydase (L-tryp- tophane:oxygène 2 ',3 '-oxydoréductase, EC 1 3 3 ?), compte- tenu de ses propriétés fonctionnelles Elle pré-5 sente une structure protomérique de 88 k Da comprenant deux sous-unités, respectivement de 14 k Da et de 74 k Da. Selon un mode de réalisation avantageux de la- dite préparation, elle est susceptible d'être obtenue par extraction convenable à partir de Chromobacterium viola-10 ceum, laquelle extraction comprend une étape d'incubation dans un milieu dénaturant, de la fraction enzymatique isolée. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite préparation, elle est susceptible d'être obte- nue par expression de l'information génétique, obtenue par clonage du gène ou de 1 'AD Nc, dans un microorganisme approprié. La préparation enzymatique purifiée conforme à l'invention présente des caractéristiques qui permettent son utilisation industrielle: 1 la formation d'la,g-déhydrotryptophanyl-pep- tides et d'la,f-déhydrotryptophanyl-protéines résulte directement de la catalyse; 2 ces déhydropeptides et ces déhydroprotéines sont les produits uniques de la réaction enzymatique, quelles que soient les conditions opératoires entre p H 3 et p H 8, à condition que le groupement a-aminé du résidu A Trp soit impliqué dans une liaison peptidique ou protégé de manière convenable; 3 l'enzyme possède une haute spécificité pour les résidus tryptophanyles: (i) au niveau du cycle indo- lique, qui ne doit être ni substitué ni modifié, (ii) au niveau de la fonction a-carbonyle, dont la présence est indispensable à la catalyse, et enfin (iii) une stéréo- spécificité au niveau du carbone asymétrique (Ca): la réaction nécessite l'énantiomère L du tryptophane. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de ladite préparation enzymatique purifiée, caractérisé en ce qu'il comprend: I une étape de préparation de la fraction enzymatique brute Q 1 qui comprend: a l'extraction des protéines totales par broyage des cellules de Chromobacterium violaceum, en présence d'un inhibiteur de l'activité protéolytique in- trinsèque, ultracentrifugation et séparation des pro-10 téines par précipitation fractionnée dans un tampon approprié, et b l'obtention de la fraction enzymatique Q 1, par une succession d'étapes chromatographiques appro- priées, et II une étape de préparation de la fraction enzymatique purifiée Zl par c une incubation de la fraction enzymatique Q 1 en milieu dénaturant, et d perméation de gel de la fraction active Q 1 incubée. Parmi les principaux inhibiteurs de l'activité protéolytique endogène, on peut citer le PMSF (fluorure de phényl méthane sulfonyle), 1 'EDTA (acide éthylène di- amine tétracétique), la benzamidine, la pepstatine A, la leupeptine etc Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du- dit procédé, l'inhibiteur de l'activité protéolytique in- trinsèque est de préférence un mélange de PMSF et d'EDTA. De manière connue, la précipitation fraction- née est mise en oeuvre avec du sulfate d'ammonium ou d'autres agents précipitants. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le milieu dénaturant comprend un agent dénaturant choisi dans le groupe qui comprend l'urée ( 3-4 M) et le SDS (dodécylsulfate de sodium) ( 0,1 à 2 % p/v), associé à un agent réducteur choisi dans le groupe qui comprend le dithiothréitol (DTT, > 50 m M) et le 2-mercapto-éthanol ( 1 à 5 % v/v). On définit, au sens de la présente invention, le milieu dénaturant comme un milieu qui détruit les in- teractions de forte ou faible énergie au sein des pro- téines, à l'exception de l'enzyme L-Trp-2 ',3 '-oxydase; ceci a pour effet une diminution du poids moléculaire ap- parent des protéines contaminantes, et une meilleure sé- paration en chromatographie de perméation de gel, l'activité enzymatique étant stable dans ces conditions. La présente invention a également pour objet, un procédé de préparation de déhydropeptides et de déhy- droprotéines, caractérisé en ce que l'on met en contact un peptide ou une protéine à transformer, et la prépara- tion enzymatique purifiée de L-Trp-2 ',3 '-oxydase de Chromobacterium violaceum conforme à l'invention, à un p H compris entre 3 et 8 et à une température comprise entre 'et 60 'C. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la transformation est effectuée en pré- sence de catalase (EC 1 11 1 6), à une concentration finale de 50 à 100 pg/ml. De manière avantageuse et surprenante, le dé- hydrotryptophane est le produit unique de la réaction en- zymatique catalysée par la L-Trp-2 ',3 '-oxydase de Chromo- bacterium violaceum, quelles que soient les conditions de la réaction entre p H 3 et p H 8; de plus, le composé dé- hydro obtenu est stable lorsque groupe a-aminé est impli- qué dans une liaison peptidique ou protégé de manière convenable. Egalement de manière inattendue, dans les conditions du procédé conforme à l'invention, on obtient des déhydropeptides et des déhydroprotéines dont tous les résidus tryptophanyles accessibles ont été transformés et ce avec un rendement de l'ordre de 100 %; de plus, les composés déhydro n'entraînent pas nécessairement un changement drastique de leur activité biologique. La création d'une double liaison en position CE-C 5 i des résidus tryptophanyles introduit une contrainte conformationnelle qui confère à la molécule les autres propriétés suivantes: inhibition de la protéolyse par les princi- pales endo et exoprotéases: x-chytmotrypsine, carboxy- peptidases A et Y, aminopeptidase M;10 modification du spectre de fluorescence, qui permet notamment d'étudier spécifiquement les interac- tions portant sur un résidu tryptophanyle particulier de la molécule. Les déhydropeptides et les déhydroprotéines obtenus par le procédé conforme à l'invention sont parti- culièrement stables et trouvent notamment application: dans la préparation de traceurs, grâce à l'introduction d'atomes stables ou radioactifs ( 2 D, 3 H, I), en un site spécifique de la molécule, tels que des sondes de photoaffinité, des sondes de fluorescence ou des sondes pour la résonance magnétique nucléaire (RMN), comme réactifs pour l'étude des interactions entre protéines ou l'étude topologique d'un récepteur ou d'un site actif, comme réactifs de diagnostic, y compris en imagerie médicale, comme nouvelles molécules (agonistes, antagonistes, inhibiteurs d'enzymes de conversion ou tout autre médicament), particulièrement intéressantes notam- ment du fait de leur stabilité plus grande (inhibition de la dégradation protéolytique, permettant une action prolongée et une meilleure réabsorption du peptide modi- fié), ou comme produits cosmétologiques. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se ré- fère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de5 la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.10 EXEMPLE 1: Préparation de la L-Trp-2 ',3 '-oxydase de Chromobacterium violaceum (préparation enzymatique puri- fiée). 1) Purification: La L-tryptophane déshydrogénase (L-Trp DH) ou LTrp-2 ',3 '-oxydase est préparée à partir de cellules de Chromobacterium violaceum (ATCC 12472), cultivées en milieu de Mitoma, supplémenté en Ltryptophane à 0,5 g/l (DAVIS et al, BBA, 1975, 385, 133-144) en fermenteur de litres, puis stockées après congélation à -80 'C. La purification, dont le protocole est dé- taillé ci-après et sur le schéma 1, comprend une sépa- ration des protéines par broyage, suivie d'une ultra- centrifugation et d'une précipitation fractionnée au sul- fate d'ammonium, l'obtention de la fraction enzymatique brute Q 1 par une succession d'étapes chro- matographiques et l'obtention de la fraction enzymatique purifiée Z 1 par incubation de la fraction enzymatique Q 1 en milieu dénaturant et perméation de gel de ladite frac- tion.30 De manière plus précise: les bactéries Chromobacterium violaceum sto- ckées à -80 'C sont décongelées dans un tampon A (Tris- H Cl 0,1 M p H 7,0, EDTA 5 m M, PMSF 100 mg/1, CHAPS 1 %, DTT 10 m M) à une concentration de 1 ml/g et maintenues à une température de 4 'C, puis on les centrifuge pendant minutes à 5 000 g et à 4 'C. le culot bactérien est repris dans du tampon A tel que défini ci- dessus, additionné de 5 % de glycérol (environ 0,4 ml/g) et le broyage des bactéries est réa- lisé sur ce culot en presse d'Eaton, à -60 'C. lorsque le broyage est réalisé, on décongèle à nouveau, puis on centrifuge 20 minutes à 39 000 g ( 4 'C). le surnageant de cette centrifugation (surnageant Sl) est ultracentrifugé 1 heure à 100 000 g et à 4 'C. le surnageant de cette ultracentrifugation (surnageant 52) est incubé pendant 1 heure à 30 'C, en présence de Benzonase (MERCK) 25 U/ml et de Mg C 12 10 m M, afin de lyser le matériel nucléaire (ADN, ARN). une précipitation au sulfate d'ammonium à % de saturation est réalisée sur le lysat obtenu, puis les fractions sont séparées par centrifugation à 39 000 g et à 4 'C pendant 20 minutes. le surnageant de cette dernière centrifuga- tion (surnageant 53) est précipité au sulfate d'ammonium à 45 % de saturation et centrifugé à 39 000 g et à 4 'C pendant 20 minutes. on récupère le culot (C 45 %), qui est solu- bilisé dans un tampon B (L-His HC 1 20 m M p H 5,6), filtré sur cartouche Sep-pak ACCELL CM (Waters) et rincé dans ce tampon B. la solution obtenue est soumise à une chro- matographie d'adsorption sur colonne échangeuse d'anions Protein Pak DEAE 8 HR (Waters) et élution en tampon B (gradient 0,2 à 1 M Na Cl). l'éluat comprend la fraction enzymatique ac- tive Q 1, qui est incubée avec de l'urée 3 M et du DTT m M, pendant 30 min à 25 'C. après incubation, la solution est soumise à une perméation de gel sur une colonne ZORBAX GF 450 (Du y 9 Pont de Nemours) suivie d'une élution en tampon C (K 2 HPO 4 0,2 M p H 7), débit 1 ml/min. la colonne est équilibrée grâce à un mélange standard de protéines dont le poids moléculaire est connu: immunoglobuline M ( 900 000), thyroglobuline ( 670 000), y globuline ( 158 000), ovalbumine ( 44 000), myoglobine ( 17 000), cyanocobalamine ( 1 350); l'activité enzymatique se trouve alors éluée sous forme d'un pic unique de protéine (Z 1), dont le poids moléculaire appa- rent est estimé à 680 k Da et qui peut être stocké à -80 'C ( 20 % glycérol). 2) Pureté de la préparation: Une électrophorèse en milieu dénaturant (SDS-PAGE) montre que la fraction Zl est constituée de deux bandes majoritaires: 74 et 14 k Da (figure 1). Cette figure 1 représente le suivi de la puri- fication de la L-Trp 2 ',3 '-oxydase par électrophorèse en gel de polyacrylamide (gradient 8-18 %), contenant du dodécylsulfate de sodium ( 1 g/l), p H 6,4 et révélation au bleu de Coomassie; les profils T sont des témoins de migration: phosphorylase b ( 94 k Da), sérumalbumine bovine ( 67 k Da), ovalbumine ( 43 k Da), anhydrase carbo- nique ( 30 k Da), inhibiteur de la trypsine ( 20,1 k Da) et alactalbumine ( 14,4 k Da); le puits 1 correspond à la fraction C 45 % (= 50 jg); le puits 2 correspond à la fraction Q 1 (= 50 gg) et le puits 3 correspond à la frac- tion Z 1 (= 20 gg) pure. Le spectre de la fraction enzymatique Z 1 met en évidence la présence d'un cofacteur hémique (figure 2) La pureté de la préparation peut être estimée à par- tir du rapport UV/y des absorbances à 275 nm (région des aromatiques) et à 427 nm (raie Soret (y) de l'hème oxydé). En effet, ce rapport diminue au cours de la purification et passe d'environ 3 après chromatographie d'échange d'ions (Q 1) à 0,7 après perméation de gel (Zl, pureté > 95 %) De cette valeur, on peut déduire par approxima- tion le coefficient d'extinction molaire de l'hème oxydé à 427 rn, soit 8427 = 120 m M-l cm-i, qui permet de calcu- ler la concentration d'enzyme dans la préparation. Le rendement global de purification s'élève à environ 6,5 mg de L-Trp-2 ',3 '-oxydase pour 100 grammes de cellules humides. Les figures 2 A et 2 B illustrent les spectres de la L-Trp-2 ',3 'oxydase; la figure 2 A correspond à la fraction Q 1, l'enzyme (= 2,7 p M) étant en solution dans un tampon L-histidine 20 m M, Na Cl 0,2 M, p H 5,6; la figure 2 B correspond à la fraction pure Z 1, l'enzyme (= 0,18 1 M) étant en solution dans un tampon K 2 HPO 4 0,2 M, p H 7 Ces figures présentent en abscisse la longueur d'onde et en ordonnée l'absorbance. 3) Stockage: Les conditions optimales de stabilité sont ob- tenues en tampon Bis-tris 0,1 M, p H 7 Les fractions Q 1 et Z 1 sont conservées congelées à -80 'C. 4) Mesure de l'activité enzymatique: Les mesures d'activité spécifique de l'enzyme ainsi que l'ensemble des expériences de cinétique à l'état stationnaire, ont été réalisées dans les condi- tions standard définies comme suit: Température: 30 'C Substrat: Nacétyle-L-tryptophanamide (NATA) 1 m M Tampon: succinate 50 m M, p H 5,5 en suivant directement l'apparition du produit déhydro à 330 nm (figure 3) L'activité spécifique (As) de la frac- tion Q 1 est calculée sur la base d'un coefficient d'extinction molaire à 330 nm de 18,8 m M-l cm-l déterminé au laboratoire (contre 8330 = 19,89 m M-l cm-1 dans la lit- térature (TAKAI et al précité) Le NATA, qui représente le plus petit enchaînement peptidique possible, est uti- lisé comme substrat modèle de la réaction enzymatique. L'activité spécifique de la préparation (As) est estimée à 39,5 3,1 unités pour le NATA (une unité enzymatique représentant une mole de produit formé par seconde par mole d'hème). Cette figure 3, qui comporte en abscisse les longueurs d'onde et en ordonnée l'absorbance, illustre la cinétique de formation de la double liaison en Ccx-C (déshydrogénation du N-acétyle-L-tryptophanamide), dans les conditions opératoires précisées ci-dessus (NATA 0,1 ma M). ) Caractérisation de l'enzyme: Structure: la L- tryptophane-2 ',3 '-oxydase est une hémoprotéine dont le poids moléculaire apparent avoisine 680 k Da, comme précisé ci-dessus Elle est glo- balement acide: son point isoélectrique (p I) est d'environ 4 C'est un hétéropolymère, constitué de deux sous-unités en quantités stoechiométriques, 74 et 14 kilodaltons, assemblées sous forme d'un protomère de 88 k Da Les protomères sont vraisemblablement les sous- unités fonctionnelles de l'enzyme, constituant à eux seuls une véritable chaîne de transfert d'électrons, et assemblés sous forme "holo-octamérique". Fonction: la L-tryptophane 2 ',3 '-oxydase catalyse la conversion du N-acétyle-L-tryptophanamide (NATA) en a,o-déhydro NATA aux dépens de l'oxygène, avec formation d'un équivalent de peroxyde d'hydrogène (H 202). La réaction enzymatique s'exprime à un p H op- timum de 5 + 0,5, tandis que la zone de stabilité opti- male de l'enzyme est à p H 7 + 0,5. La température optimale de la cinétique se si- tue au dessus de 80 'C (figure 4); cette figure 4, qui comporte en abscisse la température et en ordonnée l'activité spécifique, illustre l'effet de la température sur la cinétique; l'enzyme est thermostable, caractéri- sée par une demi-vie évoluant de 90 minutes à 50 'C à quelques secondes seulement au-delà de 80 'C La figure 5 montre que l'inactivation suit une cinétique du premier ordre, ce qui suggère que la dénaturation thermique de l'enzyme est bien le seul facteur responsable: l'enzyme "activée" ( 0,27 g M dans du bis-Tris 0,1 M, p H 7 conservée 3 h à température ambiante) est incubée à 50 ( Aucune transformation n'a pu être mise en évi- dence pour les aminoacides aromatiques: la N-acétyle-L- phénylalaninamide et la N-acétyle-L-tyrosinamide Il en est de même lorsque le noyau indole est substitué: 5-hy- droxyle L-Trp, N-formyle L-Trp et pour les isomères de la série D: Dtryptophane et N-acétyle D-tryptophane Ces résultats montrent que l'enzyme possède une forte spéci- ficité pour le noyau indole et pour l'énantiomère L (stéréospécificité). De même, aucune réaction ne peut être mise en évidence sur la tryptamine, alors que l'acide indole-3 propionique est oxydé en acide indole-3 acrylique; ces résultats démontrent que la fonction a-aminée n'est pas impliquée dans la catalyse tandis que le groupement a-carbonyle est absolument nécessaire. 7) Caractérisation et stabilité des produits de la réaction: La déshydrogénation du NATA a été suivie en fonction du p H (p H 3 5, 6 8), à une température de 'C en tampon succinate 50 m M p H 5,6 Les produits de réaction sont analysés et purifiés en CLHP en phase in- verse, puis lyophilisés et analysés en spectrométrie de masse (Désorption par Ionisation Chimique: DCI) Le ANATA est le seul produit de la réaction enzymatique, ca- ractérisé en CLHP (pic unique, Xmax 333 nm) et en spectrophotométrie de masse (MH+= 244). La conversion du L-tryptophane et du L-trypto- phanamide, dont les fonctions E-aminées respectives sont libres, se traduit par une augmentation de l'absorbance à 320 nm suivie après quelques minutes d'une phase de dé- croissance qui s'accompagne de l'inhibition totale de l'enzyme L'analyse par spectrométrie de masse des pro- duits de la réaction du L-Trp NH 2 met en évidence un pic moléculaire (MI+ = 203) correspondant vraisemblablement au dérivé cx-céto acide indole-3 pyruvique amide Ce phénomène, est beaucoup plus rapide lorsque la fonction a-carboxylique n'est pas substituée (L-Trp, comp I), et se traduit par la formation d'une imine instable (Il) qui s'hydrolyse pour donner naissance aux composés a-céto (respectivement l'acide indole-3 pyruvique (III) et son homologue amide) -figure 6- Il est donc préférable que la fonction a-aminée soit bloquée, afin d'empêcher tout phénomène d'isomérisation et d'assurer une meilleure sta- bilité du composé déhydro. EXEMPLE 2: Procédé de préparation des déhydropeptides et déhydroprotéines. a) Peptides On procède comme à l'exemple 1 7). Toutes les réactions ont été réalisées en pré- sence de catalase Dans chaque cas, les constantes ciné- tiques (Kcat et Km) sont calculées pour évaluer l'efficacité de l'enzyme pour chaque type de substrat. Les résultats sont présentés dans le Tableau I ci-après. TABLEAU I SUBSTRATS Nombre SEQUENCE Km Kca Kcît/KÂ de ré (PM) (s) (M s-) sidus Penta-5 Boc PAWMDF 26 32 106 gastrine LHRH 10 p EHWSYGLRPG 71 20 3 105 K Kaco R 15 17 KKKHWVYYTCCPDTPY 272 2 7 103 ACTH 24 SYSMEHFRWGKP 930 17 2 104 VGKKRRPVKVYP -lacto 162 Trp 19-Trp 51 2 % de*transforma- globuline tion () Catalase 506 Trp 14-Trp 142 12 % dg transforma- Trp 182-Trp 185 tion Trp 276-Trp 302 BSA 582 Trp 133-Trp 212 24 % de transforma- tion () ): Valeurs données à titre indicatif, donnant une idée de la transformation du Trp dans les protéines en 24 heures, dans les conditions standard définies à l'exemple 1 7 pour le NATA (E/S = 1/1000). D'une façon générale l'efficacité de l'enzyme diminue avec la taille du peptide Le Kcat reste cepen- dant du même ordre de grandeur, sauf dans le cas du pep- tide K Kaco R 15 (peptide synthétique de la sous-unité a du récepteur nicotinique de l'acétylcholine) o elle est di- minuée d'un facteur 10; ce résultat peut s'expliquer par la nature très hydrophobe, compacte, de ce peptide et la présence d'un pont disulfure Le Km subit une varia- * tion plus importante pouvant atteindre un facteur 50 pour un peptide de 24 aminoacides Dans tous les cas, quelle que soit la position du résidu tryptophanyle dans la sé- quence, les peptides testés jusqu'à 25 résidus ont été transformés avec succès (knax 332 à 336 nm) Les rende-35 ments atteignent quasiment 100 %. b) Protéines Comme précisé ci-dessus, l'accessibilité des résidus tryptophanyles, tant au niveau du noyau indolyle qu'au niveau des protons Ca et C 5, joue un rôle prépondé-5 rant La transformation est très lente, cependant les rendements obtenus, dans les conditions standard, en 24 heures sur des protéines de grosse taille ( 5-lactoglo- buline: 32 k Da, BSA: 67 k Da, catalase: 232 k Da) mon- trent que, dans des conditions adaptées (température, p H,10 milieu partiellement dénaturant), la transformation des résidus tryptophanyles accessibles peut atteindre %. c) Propriétés particulières des déhydropeptides: La création d'une double liaison en position CO-C 5 des résidus tryptophanyles introduit une contrainte conformationnelle qui confère à la molécule de nouvelles propriétés:. Résistance à la protéolyse: La présence de résidus a,p-déhydrotrypto- phanyle au sein de chaînes polypeptidiques inhibe totale- ment la protéolyse par les principales endo et exo- protéases: achytmotrypsine, carboxypeptidases A et Y, aminopeptidase M Les composés déhydro constituent donc25 un maillon de résistance dans la molécule, et pourraient permettre de prolonger l'action et de favoriser la réab- sorption d'un peptide-médicament.. Modification du spectre de fluorescence: Les spectres de fluorescence du NATA et du ANATA ainsi que des principaux déhydro-peptides synthéti- sés ont été enregistrés La présence de la double liaison provoque un déplacement de la longueur d'onde maximale d'émission qui passe de 372 nm (Xexc: 280 nm) à 427 nm (lexc: 330 nm) Cette modification du spectre d'émission est donc particulièrement intéressante puisqu'elle permet d'étudier spécifiquement les interac- tions portant sur un résidu tryptophanyle particulier de la molécule. Activité biologique Les contraintes conformationnelles induites dans un peptide -ou une protéine par la formation dla,p- déhydrotryptophane, peuvent se traduire par des modifica- tions structurales locales, susceptibles d'entraîner l'abolition ou au contraire l'exaltation de son activité biologique. La lA Trp 3 l pentagastrine a été testée in vivo et les résultats montrent que ce peptide possède la même activité biologique que le peptide natif. Il en ressort que la formation de déhydrotryptophane n'entraîne pas nécessairement un chan- gement drastique de l'activité biologique des produits testés. Utilisation de la double liaison pour l'introduction de sondes spécifiques: Les résidus déhydrotryptophanyles générés in situ au sein de peptides et de protéines constituent un site privilégié de marquage. La réduction de la double liaison par le tri- tium gaz ( 3 H 2), en présence de catalyseur stéréospéci- fique a déjà été réalisée sur le modèle ANATA (PINTO ALPHANDARY H et al, J Label Comp & Radiopharmaceuti- cals, 1988, 25, 1273-1279) Cette méthode présente de nombreux avantages du fait de sa spécificité, de la forte ressemblance de l'atome de tritium avec l'atome d'hydrogène -absence de modification de la structure pri- maire-, de la forte radioactivité spécifique de cet iso- tope ( 29 Ci/mat) et de sa demi-vie élevée ( 12,6 ans). L'addition d'iode froid ou radioactif (I Cl, p H 7) sur la double liaison est une seconde possibilité (MAELICKE et al., FEBS Lett, 1978, 85, 296-300). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven- tion. REVENDICATIONS 1 ') Procédé de préparation d'a,p-déhydro- tryptophanyl-peptides et d' a, 5-déhydrotryptophanyl-pro- téines, caractérisé en ce que l'on met en contact un pep- tide ou une protéine à transformer et une préparation enzymatique purifiée ayant une activité de L-tryptophane déshydrogénase, à un p H compris entre 3 et 8 et à une température comprise entre 20 'et 60 'C. 2 ') Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la transformation est effectuée en pré- sence de catalase (EC 1 11 1 6), à une concentration fi- nale de 50 à 100 gg/ml. 3 ') Préparation enzymatique purifiée ayant une activité de L- tryptophane déshydrogénase, susceptible d'être mise en oeuvre dans un procédé selon la revendica- tion 1 ou la revendication 2, caractérisée: en ce qu'elle présente: une activité spécifique comprise entre 35 et 45 uni- tés secondes-1 par mole d'hème pour le N-acétyle-L-tryp- tophanamide (NATA), un poids moléculaire apparent de l'ordre de 680 k Da, un point isoélectrique de l'ordre de 4, une température optimale d'activité supérieure à 80 'C; en ce qu'elle est thermostable; et en ce qu'elle catalyse la conversion de ré- sidus tryptophanyles en résidus déhydrotryptophanyles à un p H compris entre 3 et 8. 4 ') Préparation enzymatique purifiée selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est suscep- tible d'être obtenue par extraction convenable à partir de Chromobacterium violaceum, laquelle extraction com- prend une étape d'incubation dans un milieu dénaturant, de la fraction enzymatique isolée. ') Préparation enzymatique purifiée selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est suscep- tible d'être obtenue par expression de l'information gé- nétique, obtenue par clonage du gène ou de l'AD Nc, dans un microorganisme approprié. 6 ') Procédé d'obtention de la préparation en- zymatique purifiée selon l'une quelconque des revendica- tions 3 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend: I une étape de préparation de la fraction enzymatique brute Q 1 qui comprend: a l'extraction des protéines totales par broyage des cellules de Chromobacterium violaceum, en présence d'un inhibiteur de l'activité protéolytique in- trinsèque, ultracentrifugation et séparation des pro- téines par précipitation fractionnée dans un tampon approprié, et b l'obtention de la fraction enzymatique Q 1, par une succession d'étapes chromatographiques appro- priées, et II une étape de préparation de la fraction enzymatique purifiée Z 1 par c une incubation de la fraction enzymatique Q 1 en milieu dénaturant, et d perméation de gel de la fraction active Q 1 incubée. 7) Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce que l'inhibiteur de l'activité protéolytique intrinsèque est de préférence un mélange de PMSF et d'EDTA. 8 ') Procédé selon la revendication 6 ou la re- vendication 7, caractérisé en ce que le milieu dénaturant comprend un agent dénaturant choisi dans le groupe qui comprend l'urée ( 3-4 M) et le SDS (dodécylsulfate de so- dium) ( 0,1 à 2 % p/v), associé à un agent réducteur choisi dans le groupe qui comprend le dithiothréitol (DTT, > 50 m M) et le 2-mercapto-éthanol ( 1 à 5 % v/v). 9 ') a,5-déhydrotryptophanyl-peptides et d' a,- déhydrotryptophanyl-protéines, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2. ') Application des déhydropeptides selon la revendication 9, à la préparation de sondes froides et de traceurs radioactifs. 11 ') Réactif, caractérisé en ce qu'il comprend un déhydropeptide ou une déhydroprotéine selon la reven- dication 9. 12 ') Médicament, caractérisé en ce qu'il com- prend un déhydropeptide ou une déhydroprotéine selon la revendication 9. 13 ') Produit cosmétologique, caractérisé en ce qu'il comprend un déhydropeptide ou une déhydroprotéine selon la revendication 9.