Brevet FR2678950A1 — publié le 19930115

CARTOUCHE, DISPOSITIF ET PROCEDE D'EXTRACTION D'ACIDES NUCLEIOUES, TELS OUE L'ADN A PARTIR D'UN ECHANTILLON DE SANG OU DE CELLULES DE TISSUS. L'invention concerne une cartouche pour l'extraction d'acides nucléiques, notamment d'ADN génomique à partir d'un échantillon de sang ou de cellules de tissus, ainsi qu'un dispositif et un procédé d'extraction utilisant cette cartouche. Les procédés classiques d'extraction d'ADN à partir de sang ou de cellules de tissus comprennent en général une lyse des cellules, une séparation des noyaux des cellules par centrifugation, une lyse des noyaux avec une dégradation des protéines, une agglomération de 1'ADN génomique au moyen de phénol et de chloroforme et une précipitation de 1'ADN au moyen d'éthanol, puis une remise en suspension de 1'ADN extrait. Ces opérations sont longues et fastidieuses et se prêtent mal à l'extraction d'ADN génomique à partir d'un grand nombre d'échantillons de sang ou de cellules de tissus. On a déjà proposé des procédés plus simples (voir par exemple "Nucleic Acids Research" volume 17, n 20, de 1989, page 8390), consistant pour l'essentiel à lyser les cellules, à isoler les noyaux par centrifugation, à lyser les noyaux et dégrader les protéines par un mélange de PLB et de protéase K, en évitant l'utilisation de réactifs tels que le phénol et le chloroforme. La présente invention a essentiellement pour objet une cartouche d'extraction d'acides nucléiques, tels que 1'ADN génomique à partir d'un échantillon de sang ou de cellules de tissus, permettant de simplifier encore l'extraction de 1'ADN en supprimant les opérations de séparation par centrifugation utilisées dans la technique antérieure, ainsi qu'en outre les réactions d'agglomération, de précipitation et de remise en suspension de 1'ADN. Elle a également pour objet un dispositif et un procédé d'extraction d'acides nucléiques, tels que 1'ADN génomique, utilisant cette cartouche. Elle propose, à cet effet, une cartouche comprenant une enceinte de dialyse destinée à la collecte et à la purification de 1'ADN, et des moyens d'entrée et de sortie de produits dans l'enceinte de dialyse, caractérisée en ce qu'elle comprend un support plan allongé de faible épaisseur, à lumière centrale, sur les deux faces duquel sont fixées des membranes de dialyse définissant entre elles l'enceinte de dialyse, et deux bagues d'extrémité, qui sont montées aux extrémités longitudinales opposées dudit support et qui comprennent chacune un conduit traversant débouchant dans l'enceinte de dialyse. Une telle cartouche est réalisable avec des dimensions permettant de la monter dans un tube standard d'un dispositif classique de traitement d'échantillons biologiques, par exemple du type à carrousel utilisé de façon très répandue dans les laboratoires de biologie. Avantageusement, la cartouche selon l'invention comprend un filtre de rétention des noyaux des cellules, porté par le support et partageant l'enceinte de dialyse en deux compartiments séparés, dans lesquels les conduits traversants desdites bagues d'extrémité débouchent respectivement d'un côté et de l'autre du filtre. Le filtre précité est par exemple un film de polyester à pores ou mailles très fines ayant des dimensions de l'ordre du micromètre. La présence de ce filtre dans l'enceinte de dialyse de la cartouche permet d'éviter les opérations classiques de séparation des noyaux par centrifugation, grâce au fait que les noyaux des cellules se fixent et s'accrochent sélectivement sur le filtre lorsqu'on fait circuler les cellules lysées dans l'enceinte de dialyse à travers le filtre. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le support précité est formé de deux cadres rectangulaires superposés, chaque cadre comportant, sur la face interne d'un de ses petits côtés, une rainure sensiblement axiale débouchant à ses extrémités dans l'enceinte de dialyse et dans le conduit traversant de la bague d'extrémité correspondante. Le filtre précité est fixé entre ces deux cadres superposés, de sorte que les conduits traversants des bagues d'extrémité débouchent l'un d'un côté du filtre, et l'autre de l'autre côté du filtre. Selon une autre caractéristique de l'invention, chaque bague comprend, sur une de ses faces d'extrémité, une rainure transversale destinée à recevoir un petit côté d'un cadre précité et dans laquelle le conduit traversant de la bague débouche en regard de la rainure axiale formée dans ce petit côté du cadre. L'autre face d'extrémité de la bague comprend un septum ou une cavité cylindrique de réception d'un disque de matière élastomère à perçage axial de faible diamètre auto-obturant. Le conduit traversant de la bague est formé à travers le fond de cette cavité. L'invention propose également un dispositif pour l'extraction d'acides nucléiques tels que 1'ADN à partir d'un échantillon de sang ou de cellules de tissus, comprenant une cartouche d'extraction du type précité, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un tube dans lequel ladite cartouche est montée à étanchéité par ses bagues d'extrémité, des moyens d'amenée ou de circulation d'un liquide de dialyse dans le tube à l'extérieur de la cartouche, des moyens de liaison reliant les conduits traversants des bagues d'extrémité sélectivement à des moyens d'extraction par soufflage et/ou aspiration et à des moyens d'amenée d'échantillon à traiter, de réactifs et de produits de rinçage. L'extraction d'ADN peut, dans un tel disposi tif, être réalisée entièrement dans la cartouche d'extraction placée dans un tube du dispositif, sans qu'il soit nécessaire de retirer ce tube ou cette cartouche du dispositif pour des opérations de séparation par centrifugation. Avantageusement, ladite cartouche est disposée dans le tube entre deux pièces semi-cylindriques permettant de réduire le volume interne libre du tube et comportant des conduits de passage de liquide de dialyse. De par sa structure, la cartouche d'extraction a un coût faible et peut donc être jetée après usage, ce qui évite tout risque de contamination ou de pollution d'un échantillon à l'autre. L'invention propose également un procédé d'extraction d'acides nucléiques tels que 1'ADN à partir d'un échantillon de sang ou de cellules de tissus, au moyen d'un dispositif du type précité comprenant une cartouche munie d'un filtre de fixation des noyaux des cellules, ce procédé consistant à effectuer une lyse des cellules pour en extraire les noyaux, une lyse des noyaux pour en extraire 1'ADN et une dégradation des protéines présentes pour les séparer de 1'ADN par dialyse, caractérisé en ce qu'il consiste à faire passer le mélange échantillon-produit de lyse des cellules dans la cartouche pour retenir les noyaux des cellules sur le filtre précité et extraire le reste du mélange par le conduit traversant d'une bague de la cartouche, puis, après rin çage par un tampon approprié, à effectuer la lyse des noyaux et la dégradation des protéines dans l'enceinte de dialyse de la cartouche, à purifier 1'ADN par dialyse dans ladite enceinte et à l'extraire de la cartouche par le conduit traversant d'une bague de celle-ci. Ce procédé évite toute manipulation des cartouches d'extraction d'ADN. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci appa raitront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 illustre schématiquement le principe de l'invention; - la figure 2 est une vue éclatée des différents constituants d'une cartouche d'extraction selon l'invention; - la figure 3 est une vue en élévation d'un cadre de support de membrane et de filtre, - la figure 4 est une vue de dessus d'une pièce semi-cylindrique de réduction de volume; - la figure 5 est une vue schématique partielle à plus grande échelle, en coupe axiale, d'une cartouche d'extraction; - la figure 6 illustre schématiquement les opérations essentielles du procédé d'extraction d'ADN selon l'invention. On se réfère d'abord à la figure 1, qui illustre schématiquement le principe de l'invention. Dans cette figure, la référence 10 désigne un tube cylindrique ouvert à ses deux extrémités, dans lequel est montée à étanchéité une cartouche 12 selon l'invention, comprenant deux bagues d'extrémité 14 entre lesquelles sont prévues deux membranes de dialyse 16 délimitant entre elles une enceinte de dialyse 18 fermée, et un filtre 20 qui partage l'enceinte de dialyse 18 en deux compartiments séparés 22 et 24. La bague supérieure 14 comprend un conduit 26 d'amenée d'échantillon et de produits à l'intérieur de l'enceinte de dialyse, dans le compartiment 22, et la bague inférieure 14 comprend un conduit 26 de sortie de produits qui débouche dans l'autre compartiment 24 de l'enceinte de dialyse. Enfin, le tube 10 comprend des conduits 28, 30 d'amenée et de sortie respectivement d'un liquide de dialyse, qui débouchent dans le tube à l'extérieur de l'enceinte de dialyse 18 délimitée par les membranes 16. Le principe est le suivant un échantillon à traiter, par exemple de sang, est amené avec un produit classique de lyse des cellules dans l'enceinte de dialyse 18 par le conduit 24 de la bague supérieure 14, et sort ensuite de cette enceinte de dialyse 18 par le conduit 26 de la bague inférieure 14, après avoir traversé le filtre 20. Celui-ci est constitué par exemple d'un film de polyester de faible épaisseur, de l'ordre de quelques micromètres par exemple, présentant des mailles très fines ayant des dimensions de l'ordre du micromètre, qui retiennent et fixent les noyaux des cellules lysées. Après rinçage par circulation d'un tampon approprié dans l'enceinte 18, on réalise dans cette enceinte la lyse des noyaux fixés sur le filtre 20, on dégrade les protéines présentes, par exemple au moyen de la protéase K, on purifie 1'ADN présent dans l'enceinte 18 par dialyse dans le tube 10, et on extrait ensuite 1'ADN de l'enceinte 18 par exemple par soufflage d'air par le conduit 24 et/ou aspiration par le conduit 26. Les étapes essentielles de ce procédé sont illustrées schématiquement en figure 6. On se réfère maintenant aux figures 2 à 5, qui représentent un mode de réalisation préféré de la cartouche d'extraction selon l'invention. Cette cartouche comprend, comme déjà indiqué, deux bagues d'extrémité 14, et deux membranes de dialyse 16 fixées sur un support-plan de faible épaisseur qui porte également le filtre 20. Le support des membranes 16 et du filtre 20 est constitué de deux cadres rectangulaires 32 identiques superposés, dont l'un est représenté à plus grande échelle et en élévation en figure 3. Chaque cadre 32 est réalisé en une matière synthétique ou une matière composite à base de fibre de verre et comprend deux grands côtés longitudinaux 34 reliés entre eux par deux petits côtés transversaux 36, de façon à délimiter une lumière centrale 38 de forme allongée. L'un des petits côtés 36 du cadre 32 comprend, sur sa face interne ou face sur laquelle est appliqué l'autre cadre 32, une rainure sensiblement axiale 40 dont les extrémités débouchent à l'extérieur du cadre et dans la lumière 38, respectivement. Sur l'autre face du cadre 32, ou face destinée à recevoir une membrane 16, les bords de la lumière 38 sont chanfreinés comme indiqué en 42 en pointillé sur la figure 3. Les deux cadres 32 sont superposés en étant disposés tête-bêche, le filtre 20 étant fixé par collage à sa périphérie sur la face interne d'un des cadres, l'autre cadre étant ensuite collé sur le premier de telle sorte que leurs lumières 38 soient alignées, tout en étant séparées l'une de l'autre par le filtre 20. Les membranes de dialyse 16 sont ensuite collées à leur périphérie sur les faces externes des cadres 32. Le petit côté transversal 36 des cadres 32, qui comporte la rainure précitée 40, a une largeur supérieure à celle de l'autre petit côté 36 de ces cadres, de sorte que, dans la configuration obtenue par assemblage des deux cadres, le petit côté 36 d'une cadre comportant la rainure 40 déborde vers l'extérieur au delà de l'autre petit côté 36 de l'autre cadre. Chaque bague 14 est de forme générale cylindrique et comprend, à son extrémité tournée vers les cadres 32, une rainure diamétrale 44 de réception du petit côté 36 d'un cadre dans lequel est formée la rainure 40. A son autre extrémité, chaque bague 14 comprend une cavité cylindrique 46 dont le fond est à distance du fond de la rainure 44, et qui communique avec cette rainure par un perçage 48 de faible diamètre (par exemple 2mm). La cavité 46 de chaque bague 14 est destinée à recevoir un "septum" ou disque 50 de matière élas tomère comprenant un perçage axial très fin 52 auto-obturant, qui débouche dans le perçage 48 précité (figure 5). Chaque bague 14 comprend également une rainure périphérique 54 de montage d'un joint torique d'étanchéité. On notera que la bague supérieure 14 est prolongée vers le haut par une jupe cylindrique 56 permettant de recueillir quelques gouttes de liquide lors de la connexion et de la déconnexion de la cartouche d'extraction à des moyens d'amenée de produit ou de réactif, ce qui évite la pollution ou la contamination des surfaces environnantes. Enfin, on peut prévoir deux pièces complémentaires 58 de forme semi-cylindrique, qui peuvent être des pièces pleines réalisées en une matière plastique appropriée et qui comprennent des passages traversants 60. Ces pièces 58 sont destinées à être disposées de part et d'autre des cadres 32 de la cartouche d'extraction à l'intérieur d'un tube 10, pour réduire le volume interne libre de ce tube et réduire en conséquence le volume de liquide de dialyse qu'il faut amener à l'intérieur du tube pour le remplir. La cartouche d'extraction représentée dans les figures 2 à 5 est utilisée de la façon suivante lorsqu'elle est montée à étanchéité dans un tube cylindrique 10, comme représenté schématiquement en figure 1, une aiguille d'injection est enfoncée dans le perçage 52 du disque 50 ou "septum" de la bague supérieure, pour l'amenée d'un échantillon, d'un réactif ou d'un liquide de rinçage dans l'enceinte formée par les membranes 16 fixées sur les cadres 32. Le produit injecté par cette aiguille passe par le perçage 48 de la bague supérieure 14, par la rainure 40 du côté transversal supérieur d'un cadre 42, et remplit l'enceinte de dialyse en traversant le filtre 20. Pour extraire ce produit, il suffit d'enfoncer une aiguille d'injection dans le per çage 52 du disque 50 ou septum de la bague inférieure 14 et d'aspirer le produit contenu dans l'enceinte de dialyse. Pour l'extraction d'ADN génomique à partir d'un échantillon de sang, on procède de la façon suivante: - on réalise tout d'abord un rinçage de la cartouche par injection puis extraction de 10ml de PBS. On introduit ensuite dans la cartouche un échantillon de 10ml de sang mélangé à 10ml d'un produit de lyse des cellules, par exemple un mélange de sucrose et de triton comme décrit dans l'article précité de la Revue "Nucleic Acids Research" et on laisse incuber pendant lh30 à 4 C. On extrait ensuite ce mélange de la cartouche, les noyaux des cellules restant accrochés sur le filtre 20. On effectue ensuite un double rinçage par du PBS (deux fois 10ml) puis on injecte dans la cartouche 1,5 ml d'un produit de lyse des noyaux et 0,5 ml de protéase K. L'incubation dans la cartouche est d'une heure à 55 C. On effectue ensuite une dialyse pendant quelques heures à 60'C environ par amenée d'un liquide de dialyse dans le tube 10 à l'extérieur de l'enceinte de dialyse délimitée par les membranes 16 de la cartouche, afin de purifier 1'ADN présent dans cette enceinte et d'éliminer tous les déchets, puis on extrait 1'ADN par soufflage et/ou aspiration dans l'enceinte de dialyse. On procède de façon analogue pour extraire 1ADN de cellules de tissus. Eventuellement, dans ce dernier cas, les cellules peuvent être lysées et les noyaux séparés de façon préalable. Dans ce cas, le filtre 20 n'a plus d'utilité, et la cartouche d'extraction est utilisée uniquement comme enceinte de dialyse. REVENDICATIONS 1. Cartouche pour l'extraction d'acides nucléiques tels que 1'ADN à partir du sang ou de cellules de tissus, comprenant une enceinte de dialyse (18) destinée à la collecte et à la purification de 1'ADN et des moyens (24, 26) d'entrée et de sortie de produits dans l'enceinte de dialyse, caractérisée en ce qu'elle comprend un support plan allongé (32) de faible épaisseur, à lumière centrale (38), sur les deux faces duquel sont fixées des membranes de dialyse (16) définissant entre elles l'enceinte de dialyse (18), et deux bagues d'extrémité (14) qui sont montées aux extrémités longitudinales opposées dudit support et comprennent chacune un conduit traversant (48) qui débouche dans l'enceinte de dialyse. 2. Cartouche selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend un filtre (20) de rétention des noyaux des cellules, porté par le support et partageant l'enceinte de dialyse (18) en deux compartiments (22, 24) séparés dans lesquels les conduits traversants (48) desdites bagues débouchent d'un côté et de l'autre du filtre (20) respectivement. 3. Cartouche selon la revendication 2, caractérisée en ce que le filtre (20) est un film de polyester à mailles très fines ayant des dimensions de l'ordre du micromètre. 4. Cartouche selon l'un des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit support est formé de deux cadres rectangulaires (32) superposés, chaque cadre comportant sur la face interne d'un de ses petits côtés (36) une rainure (40) sensiblement axiale débouchant à ses extrémités dans l'enceinte de dialyse (18) et dans le conduit traversant (48) de la bague correspondante. 5. Cartouche selon la revendication 4, caractérisée en ce que les cadres rectangulaires (32) et les bagues d'extrémité (14) sont en une matière synthétique ou composite à base de fibre de verre. 6. Cartouche selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que les bords internes de chaque cadre (32) sont chanfreinés du côté de la face extérieure du cadre sur laquelle est fixée une membrane de dialyse (16). 7. Cartouche selon l'ensemble de la revendication 2 et de l'une des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que le filtre (20) est fixé entre les deux cadres (32) superposés. 8. Cartouche selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisée en ce que chaque bague (14) comprend, sur une de ses faces d'extrémité, une rainure transversale (44) destinée à recevoir un petit côté d'un cadre précité (32) et dans laquelle le conduit traversant (48) de la bague débouche en regard de la rainure axiale (40) formée dans ce petit côté du cadre. 9. Cartouche selon la revendication 8, caractérisée en ce que chaque bague (14) comprend à son extrémité opposée une cavité cylindrique (46) de réception d'un disque de matière élastomère à perçage axial de faible diamètre auto-obturant, et en ce que le conduit traversant (48) de la bague est formé à travers le fond de cette cavité. 10. Cartouche selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que chaque bague (14) comporte un joint annulaire périphérique d'étanchéité. 11. Dispositif pour l'extraction d'acides nucléiques tel que 1'ADN à partir d'un échantillon de sang ou de cellules de tissus, comprenant une cartouche d'extraction (12) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un tube (10) dans lequel ladite cartouche est montée à étanchéité par ses bagues d'extrémité, des moyens (28, 30) d'amenée ou de circulation d'un liquide de dialyse dans le tube à l'extérieur de la cartouche, des moyens de liaison reliant les conduits traversants des bagues d'extrémité sélectivement à des moyens d'extraction par soufflage et/ou aspiration et à des moyens d'amenée d'échantillon à traiter, de réactifs et de produits de rinçage. 12. Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite cartouche est disposée dans le tube entre deux pièces (58) semi-cylindriques permettant de réduire le volume interne libre du tube et comportant des conduits (60) de passage de liquide de dialyse. 13. Procédé d'extraction d'acides nucléiques tel que 1'ADN à partir d'un échantillon de sang ou de cellules de tissus au moyen d'un dispositif selon la revendication 11 ou 12 et comprenant une cartouche munie d'un filtre de rétention des noyaux de cellules, ce procédé consistant à effectuer une lyse des cellules pour en extraire les noyaux, une lyse des noyaux pour en extraire l'ADN, et une dégradation des protéines présentes pour les séparer de 1ADN par dialyse, caractérisé en ce qu'il consiste à faire passer le mélange échantillon-produit de lyse des cellules dans la cartouche pour fixer et accrocher les noyaux des cellules sur le filtre (20) précité, à extraire le reste du mélange par le conduit traversant d'une bague de la cartouche, puis après rinçage par un tampon approprié, à effectuer la lyse des noyaux et la dégradation des protéines dans l'enceinte de dialyse de la cartouche, à purifier 1'ADN par dialyse dans ladite enveloppe, et à l'extraire de la cartouche par le conduit traversant d'une bague de celle-ci.