Brevet FR2677767A1 — publié le 19921218

Procédé de détection de l'infection par le virus de la diarrhée bovine, séquence nucléotidique codant pour une protéine induite par l'infection Dar ce virus et protéines et antigènes recombinants s'y rapportant. La présente invention concerne un procédé de détection de l'infection par le virus de la diarrhée bovine, une séquence nucléotidique codant pour une protéine associée à l'infection Dar ce virus et des protéines et antigènes recombinants s'y rapportant. Le virus de la diarrhée bovine (BVD) est un virus enveloppé à ARN monocaténaire infectieux, qui est apparenté au virus de la peste porcine classique et à celui de la maladie de Border, les trois virus formant le genre Pestivirus qui appartient à la famille des Togaviridae Le virus BVD est universellement répandu dans les populations bovines et se manifeste par un très large éventail de symptômes cliniques associés à des maladies congénitales, respiratoires ou entériques (diarrhée virale bovine, maladie des muqueuses). Les isolats des virus BVD peuvent être classés en deux catégories ou biotypes distincts d'après leurs effets en culture de cellules: cytopathogène et non cytopathogène. L'infection aiguë d'animaux séronéqatifs est ordinairement bénigne ou subclinique Par contre, une infection intra-utérine du foetus, dans les quatre premiers mois environ après le début de la gestation, par une souche non cytopathogène, peut non seulement produire des avortements, des mortinatalités ou la naissance de veaux faibles, mais aussi la naissance de veaux présentant une virémie persistante, c'est-à-dire excrétant le virus de manière permanente Cette Dériode de quatre mois correspond à une absence d'immunité chez le foetus Lorsque le système immunitaire devient ensuite compétent, celui-ci reconnaît le virus comme sien et il s'établit une situation d'immunotolérance (absence d'anticorps) Ces animaux ne pourront pas survivre à une infection ultérieure par une souche cytopathoqène de virus BVD homologue. Le maintien du virus non cytopathogène au sein de la population bovine est assuré par sa lente dissémination faisant suite à l'infection aiguë d'animaux séronégatifs et, surtout, par son excrétion continuelle par les animaux présentant une virémie persistante (Voir J Brownlie et al, Ann Rech Vét ( 1987) 18:157-166). A Fenton et al (Journal of Virological Methods, 27 ( 1990), 253-260) détectent les antigènes de Pestivirus dans le sang de moutons virémiques infectés de manière persistante par le virus de la maladie de Border, par un ELISA conduit de façon à détecter un antigène spécifique dans les leucocytes de ces animaux Cette technique nécessite au préalable une purification des leucocytes qui s'avère lonque et complexe à réaliser. Le génome de la souche virale Osloss de biotype cytopathogène a été cloné et entièrement séquencé par Renard et al (demande de brevet EP-A- 0 208 672 du 8 juillet 1985) La demanderesse a trouvé que la phase de lecture ouverte (ORF), de la séquence qgénomique de BVD Osloss lonque de 12408 nucleotides a une capacité codante de 3951 acides aminés (aas). Dans un résumé distribué au cours du Symposium sur les infections des ruminants par les Pestivirus qui s'est tenu à Hanovre les 8 et 9 juin 1990, C Lecomte et al. indiquent l'identification d'un produit de traduction d'AD Nc du virus BVD immunoprécipité par des anticorps monoclonaux reconnaissant la protéine non structurale p 80 d'un certain nombre de souches de Pestivirus Le même AD Nc est exprimé dans E coli et l'antigène produit est utilisé en ELISA de compétition pour détecter des anticorps anti-BVD dans le sérum bovin. La préparation et la caractérisation d'une série d'anticorps monoclonaux ont été décrites par C Lecomte et ai (Veterinary Microbiology, 23 ( 1990), 193-201), de même que l'utilisation d'une protéine fusion produite dans E. coli, comme antigène recombinant permettant la détection d'anticorps sériques anti-BVD dans un ELISA de compétition avec les anticorps monoclonaux choisis. Dans un résumé distribué au VIIIème Conqrès international de virologie qui s'est tenu à Berlin du 26 au 31 août 1990, C Lecomte et al proposent de recourir à deux tests ELISA pour détecter d'une part les anticorps anti-BVD et d'autre part les antigènes viraux Les anticorps anti-BVD dans le sérum seraient détectés par un ELISA de compétition mettant en oeuvre un antigène recombinant p 80 de BVD Osloss produit dans E coli et des anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre la protéine p 80 d'un certain nombre de souches de Pestivirus. Le deuxième ELISA serait un ELISA de type "sandwich" utilisant deux anticorps monoclonaux et permettrait la détection d'antigènes chez les animaux virémiques persistants. La déposante a cependant trouvé que la protéine p 80 produite dans E coli n'est pas reconnue par tous les anticorps monoclonaux anti-p 80 et notamment par certains d'entre eux qui présentent une polyspécificité. c'est-à-dire réagissent vis-à-vis de plusieurs ou de toutes les souches de Pestivirus, ce qui compromet les chances de pouvoir détecter en une fois toute infection par une souche quelconque de BVD, d'autant plus que le deuxième ELISA, basé sur l'utilisation de deux anticorps monoclonaux, pourrait aussi ne pas être suffisamment polyspécifique. L'invention a pour objectif de fournir un procédé de détection très sensible permettant un contrôle complet et efficace de l'infection éventuelle d'un élevage par un virus BVD quel qu'il soit, et portant à la fois sur la détection des virémies persistantes et des infections aiaues. L'invention a donc pour objet un procédé de détection de l'infection d'un prélèvement de sang par le virus BVD, comprenant un premier test pour la détection des anticorps anti-BVD et un deuxième test pour la détection des particules virales, caractérisé en ce que l'on détecte les anticorps anti-p 80 à l'aide d'un antigène recombinant comprenant la protéine non structurale p 80 du virus BVD, produite en hôte eucaryote, et de préférence d'un anticorps monoclonal anti-p 80 utilisé comme anticorps compétiteur, et que l'on détecte la présence de particules virales à l'aide d'anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, dirigés contre la protéine p 80 du virus BVD, et de préférence d'un sérum dirigé contre l'antigène p 80 recombinant produit en hôte eucaryote ou procaryote, pour la détection des virémies persistantes et des infections aiquës par n'importe quelle souche de BVD. La protéine p 80 est de préférence issue de BVD Osloss et la séquence nucléotidique codant pour cette protéine a été entièrement séquencée La séquence est donnée dans la liste de séquences annexée, sous la référence SEQ ID NO:1 La demanderesse a ainsi avantageusement localisé deux sites potentiels de clivage de la p 80 (KVR: Lysine Valine Arqinine) correspondant au début et à la fin de p 80. La protéine p 80 est exprimée dans des vecteurs viraux ou eucaryotes et notamment dans le système Baculovirus, lequel est avantageusement le baculovirus Ac NPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus). La séquence nucléotidique codant pour p 80 est introduite dans un vecteur d'expression approprié selon les techniques connues de construction de ces vecteurs, notamment celles décrites dans la demande de brevet EP-A-0 208 672. Bien entendu, la séquence de nucléotides précitée inclut toutes les séquences équivalentes, c'est-à-dire qui reprennent les propriétés essentielles de la séquence A titre d'exemple, ce serait le cas d'une séquence qui code pour une séquence identique d'acides aminés, mais qui utiliserait d'autres codons spécifiques par dégénérescence du code Ce serait également le cas pour une séquence codant pour une séquence d'acides aminés non plus identique mais similaire com Dte tenu des ressemblances entre acides aminés. On entend aussi Dar séquence équivalente une séquence, codant Dour la p 80, issue d'une autre souche de BVD et conservant la reconnaissance par les anticor Ds anti-D 80. L'antiaène recombinant lui-même provient de cultures de cellules hôtes eucaryotes qui ont été transfectées par le vecteur exprimant D 80, et est constitué de préférence d'extraits de ces cellules Les hôtes eucaryotes peuvent être des cultures cellulaires animales ou des levures, notamment Saccharomyces cerevisiae Les vecteurs de transfert pour les levures comportent avantageusement des marqueurs permettant la sélection des recombinants utiles, par exemple par résistance aux antibiotiques ou autres moyens de sélection connus (Broach J et al, Meth Enz. ( 1983) 101: 307) Pour les promoteurs, voir également Hess et al, J Adv Enz Reg ( 1968) 7 / 149, et Holland et al., Biochemistry ( 1968) 17: 4900 ou Itzeman et al, J. Biol Chem ( 1980) 255: 2073. Les cellules animales sont, de préférence, des lignées cellulaires de mammifères connues telles que He La, CHO, ou BHK des cellules d'insectes, par exemple Spodoptera frugiperda (dépôt ATCC CRL 1711, Sf 9) (notamment pour le système Baculovirus) et, d'une façon générale, on préférera des lignées dont l'utilisation pour l'expression de substances à administrer à l'animal a été reconnue par les autorités sanitaires On utilisera comme promoteur, dans ces constructions cellulaires, des promoteurs viraux tels que ceux du virus SV 40 (Fiers et al, Nature, ( 1978) 273: 113) et du virus CMV ou cytomegalovirus humain (McGregor et Caskey, Nucleic Acids Res 17: 2365, 1989), ou encore celui du aène polyhédrine du Baculovirus Ac NPV ou Autoqrapha californica nuclear polyhedrosis virus (Hooft van Iddekinge et al, 1983, Virology 131: 561-565). L'antigène recombinant est de préférence immobilisé sur un support solide (plaques de microtitrage par exemple), notamment par l'intermédiaire d'un anticorps monoclonal anti-p 80 utilisé comme capteur Des dilutions de sérums bovins sont mises en contact avec l'antigène immobilisé ou non et les anticorps anti-BVD sont soit directement révélés par un anti-sérum anti-Iq G bovines couplé par exemple à la peroxydase ou à la biotine (ELISA indirect), soit révélés par un ELISA de compétition avec un deuxième anticorps monoclonal anti-p 80 couplé par exemple à la peroxydase ou à la biotine En fait, cette détection peut être faite sur toute fraction de sang bovin, notamment sérum et plasma. De préférence, on révèle les particules virales dans le sanq complet, brut ou enrichi en globules blancs par une simple centrifugation, notamment pendant 30 minutes à 2500 g. Pour assurer une détection complète de la présence de particules virales de tous les types de BVD, on utilise de préférence comme capteur un mélange de trois anticorps monoclonaux p 80-spécifiques plutôt qu'un seul anticorps monoclonal. On effectue de préférence un ELISA de type "sandwich" avec, comme capteur, le mélange de trois anticorps monoclonaux spécifiques de la p 80 virale et, comme révélateur, le sérum dirigé contre la protéine p 80 recombinante Le sérum provient notamment de l'immunisation d'animaux, notamment de lapins ou de chèvres, par inoculations répétées de p 80 recombinante, laquelle peut être produite aussi bien en cellules procaryotes qu'eucaryotes. On peut ainsi détecter comme positifs des échantillons correspondant à un titre viral inférieur par exemple à 103 ufp/ml (ufp = unités formatrices de plaques). L'invention permet en fait de détecter comme positifs des échantillons qui, par la méthode usuelle d'immunofluorescence sur cellules infectées, peuvent nécessiter trois passages successifs du virus et le choix des cellules hôtes adéquates, ce qui oblige à propager le virus sur plusieurs types cellulaires. La protéine p 80 ne contenant pas d'épitopes de neutralisation, ce procédé permettra avantageusement de faire la distinction entre les animaux infectés naturellement et les animaux vaccinés par un vaccin recombinant basé sur les protéines structurales du virus. L'invention a aussi pour objet la séquence de nucléotides référencée SEQ ID NO:1 correspondant à la séquence de BVD Osloss codant cour la protéine non structurale p 80, ou une séquence équivalente selon la définition donnée Plus haut, ainsi que toute nouvelle séquence nucléotidique qui la contient et qui comporte des moyens permettant son expression ou qui soit associée à de tels moyens. L'invention a encore pour objet la protéine p 80 recombinante correspondant à la traduction de cette séquence, notamment en hôte eucaryote, dans les systèmes d'expression sus-indiqués et tout antigène recombinant contenant cette séquence, notamment constitué d'extraits de cellules hôtes en particulier eucaryotes comme cela a été exposé ci-dessus. BREVE DESCRIPTION DU DESSIN. La fiaure 1 montre la position des clones d'AD Nc couvrant l'ensemble du qénome du virus BVD (souche Osloss). La fiqure 2 montre l'analyse in vitro de la région du qgénome de BVD Osloss correspondant au clone d'AD Nc 174. Les chiffres y indiquent la taille (paires de bases = pb) des différents fragments obtenus par digestion de l'insert 174 par chacune des enzymes de restriction utilisées. La figure 3 montre la localisation, sur le qénome de BVD Osloss de la région immunoréactive de 80 acides aminés et des limites de la protéine p 80. La figure 4 montre le criblaqe d'épitopes dans la réaion immunoréactive, longue de 80 acides aminés, située au sein de la protéine p 80. La figure 5 montre le schéma du vecteur de transfert p Ac YM 1 décrit par Matsuura et al dans J Gen Virol. ( 1987), 68: 1233 à 1250. I LOCALISATION ET SEQUENCAGE DE LA SEQUENCE CODANT POUR p 80. 1 On a cloné de l'AD Nc C 174 (clone p CP 174 de la bibliothèque d'AD Nc décrite dans la demande de brevet européen EP-A-0 208 672) (figure 1) dans le plasmide p SP 65, en aval du promoteur pour l'ARN polymérase du bactériophage SP 6, entre les sites Eco RI et Bam HI (vecteur décrit par Melton D A et al, 1984, Nucleic Acids Res 12:7035-7056). 2 Après digestion par différentes enzymes de restriction dont la position des sites successifs est indiquée à la figure 2, chaque fragment obtenu a été transcrit in vitro, puis traduit dans un système acellulaire (lysat de réticulocytes de lapin) Les produits de traduction de poids moléculaire croissant ont été immunoprécipités par des anticorps monoclonaux anti-p 80; cela a permis de localiser une réqion immunoréactive lonaue de 80 acides aminés, localisée sur la figure 3 et dont la séquence est donnée dans la liste de séquences sous la référence SEQ ID NO:2. 3 La présence d'épitopes reconnus dans cette région de 80 acides aminés a été confirmée par criblage d'épitopes ("epitope scanninq") c'est-à-dire que 75 hexamères peptidiques recouvrant cette région ont été synthétisés sur support solide et testés en ELISA en présence d'anticorps monoclonaux anti-p 80 et de sérums bovins positifs ou néaatifs en anticorps Le résultat est illustré sur la fiqure 4. 4 Suite à la localisation des épitopes anti-p 80 on a reconstitué la séquence codant pour la protéine p 80 afin de se rapprocher le plus possible de la protéine naturelle. Par analyse de la séquence génomique du virus BVD/Osloss et comparaison avec celle des Flaviviridae connus on a déterminé la présence de deux sites potentiels de clivage (KVR: Lysine Valine Arginine) correspondant au début et à la fin de la p 80; le poids moléculaire théorique de la protéine comprise entre ces deux sites est de 80430 daltons Le premier des deux triplets se retrouve exactement au même endroit dans le aénome du virus BVD/NADL, et le génome entier de BVD/Osloss ne contient que triplets KVR, tous situés dans la partie codant pour les protéines non structurales du virus (le génome NADL en contient seulement trois). Le fragment p 80 de 2200 pb (paires de bases) correspondant à la séquence codant pour la p 80 a été amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction) et cloné; sa localisation est illustrée sur la figure 3; sa séquence nucléotidique est référencée SEQ ID NO:1. II -EXPRESSION DE L'ANTIGENE RECOMBINANT. L'intégration du fragment p 80 dans le génome du Baculovirus Autographa Californica nuclear Dolyhedrosis virus (Ac NPV) a été réalisée par l'intermédiaire du vecteur de transfert p Ac YM 1 décrit par Matsuura et al (J Gen. Virol 68: 1233-1250, 1987; carte de restriction à la figure 5), en aval du promoteur du gène de la polyhédrine de Ac NPV Ce vecteur contient le site de Dolyadénylation du gène polyhédrine ainsi que le gène de résistance à l'ampicilline et l'origine de réplication du plasmide p UC 8 (J Messinq, 1983, Meth Enzymol 101:20). A cet effet, le fragment amplifié de séquence SEQ ID NO:1 est digéré par les enzymes de restriction Nco I et Bam HI, puis traité à l'ADNpolymérase (fragment de Klenow), de manière à rendre franches les extrémités 5 ' et 3 ' du fragment On le clone ensuite dans le vecteur p Ac YM 1 digéré par Bam HI et traité à l'ADN-polymérase (fragment de Klenow) pour rendre les extrémités franches On obtient le plasmide recombinant p Ac Y Ml-p 80, la p 80 étant exprimée sous la dépendance du promoteur du gène de la polyhédrine. Le plasmide obtenu est utilisé pour cotransfecter les cellules d'insectes Sf 9 en même temps que l'ADN purifié de l'Ac NPV type sauvage Un virus recombinant Ac NPV-p 80 a été purifié par étalement du surnageant de cotransfection et isolement des plages virales par recouvrement d'agarose. III TEST ELISA DE DETECTION D'ANTICORPS ANTI-p 80. Principe: Le test est basé sur la détection des anticorps anti-p 80, autrement dit des anticorps dirigés contre une protéine non structurale de 80 000 daltons associée à l'infection par le virus BVD. Un antigène recombinant comprenant la protéine p 80 issue du virus Osloss est fixé sur support solide par l'intermédiaire d'un anticorps monoclonal utilisé comme capteur L'échantillon de sang ou de sérum bovin est mis en contact avec l'antigène fixé et est ensuite soit directement révélé par un antisérum anti-Iq G bovines couplé, soit mis en compétition avec un deuxième anticorps monoclonal anti-p 80 couplé. Matériel, réactifs et échantillons: 1 Matériel et tampons: plaques pour ELISA à 96 puits (NUNC MAXISORP); tampon carbonate p H 9,6: Na 2 CO 3 15 m M, Na HCO 3 m M, Na N 3 3 m M; tampons de lavage: ( 1) PBS, ( 2) PBS, Tween 20 0,1 %; tampon de dilution: PBS, Tween 20 0,1 %, sérum de cheval 10 % (contrôlé exempt de virus BVD); tampon de saturation: PBS, sérum de cheval 10 % (contrôlé exempt de virus BVD). chromoqène et tampon adéquat. 2 Réactifs: 1 anticorps monoclonal anti-p 80 utilisé comme capteur de l'antigène p 80 (liquide d'ascite dilué); antigène p 80 recombinant; a) ELISA compétition: 1 anticorps monoclonal anti-p 80 dilué et couplé à la peroxydase ou à la biotine; b) ELISA indirect: sérum (lapin ou chèvre) 13 2677767 anti-Ig G bovines couplé à la oeroxydase ou à la biotine). 3 Préparation des échantillons: échantillons sériques: prélèvement du sang en tubes sans anti-coagulant; coagulation minimum 4 heures à température ambiante; centrifugation 2500 g, 30 minutes; prélever le surnageant = sérum. le test peut être réalisé sur n'importe quelle fraction sanguine, notamment le plasma ou même le sang complet prélevé en tubes avec anti-coagulant. Méthode: 1 Fixation du capteur: L'anticorps monoclonal anti-p 80 dilué est réparti à raison de 100 il par cupule: contact une nuit à 4 C; 3 lavages avec le tampon ( 1). 2 Saturation (facultative): pl/cupule de tampon de saturation: 1 heure à 37 C. 3 Fixation de l'antigène: antigène p 80 recombinant ( 100 Pl/cupule) contact une nuit à 4 C. 4 Contact avec les échantillons: 100 pl/cupule; sérums dilués 10 x: contact 2 heures à 37 C. 3 lavages avec le tampon ( 1). Contact avec l'anticorps révélateur: a) ELISA compétition: contact avec l'anticorps monoclonal dilué et couplé: lh 30 à 37 C; 3 lavages avec le tampon ( 2); 3 lavages à l'eau. b) ELISA indirect: contact avec le sérum anti-Iq G bovines dilué et couplé: lh 30 à 37 C; 3 lavages avec le tampon ( 2); 3 lavaaes à l'eau. 6 Révélation par le chromogène: La procédure varie suivant le chromogène et est détaillée par le fournisseur de celui-ci. IV TEST ELISA DE DETECTION DE PARTICULES VIRALES. Principe: Le test est basé sur la détection de la protéine p 80, protéine non structurale du virus BVD présente en grande quantité dans le sang des animaux infectés Un mélange de trois anticorps monoclonaux spécifiques de cette protéine p 80 est utilisé comme capteur et fixé sur support solide (plaques de microtitraqe) Le sang complet ou la fraction de sang enrichie en alobules blancs ou "buffy coat" est mise en contact avec le mélange capteur fixé Un sérum (lapin ou chèvre) dirigé contre la protéine p 80 recombinante est utilisé comme anticorps révélateur, soit directement couplé (à la peroxydase ou à la biotine), soit révélé lui-même par un deuxième anticorps (anti-Iq G de lapin ou de chèvre) couplé à la peroxydase ou à la biotine. La présence d'antigène viral dans les échantillons testés se traduit par l'élévation de la densité optique de base en présence de chromogène. Matériel, réactifs et échantillons: 1 Matériel et tampons: plaques pour ELISA à 96 puits: NUNC MAXISORP. tampon carbonate p H 9,6: Na 2 CO 3 15 m M, Na HCO 3 m M, Na N 3 3 m M. tampon de lavage: PBS, Tween 20 0,1 %. tampon de saturation/dilution: PBS, Tween 20 0,1 %, sérum de cheval 10 % (contrôlé exempt de virus BVD). chromoqène et tampon adéquat. 2 Réactifs: mélange de 3 anticorps monoclonaux anti-p 80, liquides d'ascite dilués. sérum (lapin ou chèvre) dirigé contre la protéine p 80 recombinante, soit directement couplé (à la peroxydase ou à la biotine), soit révélé lui-même par un deuxième anticorps (anti-Iq G de lapin ou de chèvre) couplé à la peroxydase ou à la biotine. 3 Préparation des échantillons: Prélèvement du sang en tubes héparinés; les échantillons sont testés soit tels quels, soit après enrichissement en globules blancs suivant la procédure suivante: centrifugation à 2500 g; 30 minutes; après centrifugation, éliminer par pipettage la couche supérieure constituée par le plasma et prélever le "buffy coat", zone blanchâtre située entre le plasma et les globules rouges- Méthode: 1 Fixation du capteur: Mélange d'anticorps monoclonaux dilués et répartis à raison de 100 pl par cupule. Contact une nuit à 4 C. 3 lavages en PBS/Tween. 2 Saturation: pl/cupule de tampon de saturation contenant 10 % de sérum de cheval. 1 heure à 37 C. 3 Contact avec les échantillons: pl de sang complet ou de "buffy coat" par cupule. Contact 2 heures à 37 C. 3 lavages en PBS/Tween. 4 Contact avec l'anticorps révélateur: Sérum anti-p 80 dilué, couplé ou non (peroxydase ou biotine): contact 1 h à 37 C ( 100 pl/cupule); 3 lavages en PBS/Tween; 3 lavages à l'eau; En cas d'utilisation de sérum non couplé, à nouveau contact avec antisérum couplé ( 1 heure à 37 C). 5 Révélation par le chromogène: La procédure varie suivant le chromogène choisi et est détaillée par le fournisseur de celui-ci. LISTE DES SEQUENCES. SEQ ID NO: 1 TYPE DE SEQUENCE: séquence nucléotidique LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 2236 paires de bases NOMBRE DE BRINS: simple CONFIGURATION: linéaire TYPE DE MOLECULE: AD Nc pour ARN génomique ORIGINE: BVD Osloss REGION TRADUITE: 40 2229 PROPRIETES: code pour la protéine p 80 TCT AGA AAT TTT GTT TAA CTT TAA xba I Glu Thr Gly Trp Ala Tyr Thr His GAA ACC GGA TGG GCC TAC ACA CAC His Val Thr Ala Gly Lys Asp Leu CAT GTG ACC GCA GGC AAA GAC CTA Thr Arg Val Val Cys Gln Ser Asn ACA AGA GTG GTT TGC CAA AGT AAC Tyr Gly Val Lys Thr Asp Ser Gly TAT GGT GTC AAG ACG GAC TCC GGA Val Leu Asn Pro Glu Ala Val Asn GTA TTA AAT CCA GAG GCA GTA AAT Val His Leu Gln Lys Thr Gly Gly GTA CAC CTC CAA AAA ACA GGT GGG Gly Thr Pro Ala Phe Phe Asp Leu GGA ACT CCA GCC TTC TTT GAC CTG GAA GGA GAT Gln Gly Gly CAA GGC GGC Leu Val Cys CTG GTT TGT Asn Lys Leu AAC AAG TTA Cys Pro Asp TGT CCA GAT Ile Ser Gly ATA TCA GGG Glu Phe Thr GAA TTC ACA Lys Asn Leu AAA AAT TTG Leu Pro Ile Phe Glu Ala Ser Ser Gly Arg Val CTA CCC ATA TTT GAG GCT TCT AGT GGC AGG GTG Val Gly Lys Asn Glu Glu Ser Lys Pro Thr Lys GTA GGA AAG AAT GAG GAA TCC AAG CCC ACA AAA Met Gly Leu ATA CCC ATG GGA CTG Nco 1 ? Ile Ser Ser Val Asp ATA AGC TCA GTA GAC Asp Ser Met Gly Arg GAT AGT ATG GGT AGG Thr Asp Glu Thr Glu ACT GAT GAG ACA GAA Gly Ala Arg Cys Tyr GGT GCC AGG TGC TAC Ser Lys Gly Ala Ala TCC AAG GGA GCT GCT Cys Val Thr Ala Ser TGT GTT ACT GCA TCG Lys Gly Trp Ser Gly AAG GGA TGG TCA GGT Val Gly Arg Val Lys GTC GGC AGA GTT AAA Leu Met Ser Gly Ile TTA ATG AGT GGT ATC Gln Thr Val Ser Lys Ser Thr Ala Asp Leu Thr Glu Met Val Lys Lys CAA ACC GTC TCA AAA AGC ACA GCC GAT TTA ACA GAG ATG GTC AAG AAG Ile Thr Ser Met Asn Arg Gly Asp Phe Lys Gln Ile Thr Leu Ala Thr ATA ACC AGC ATG AAC AGG GGA GAC TTT AAG CAG ATA ACC CTT GCA ACA Gly Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu Pro Lys Ala Val Ile Glu Glu Ile GGG GCA GGA AAA ACT ACA GAA CTC CCA AAG GCA GTG ATA GAG GAG ATA Gly Arg Hls Lys GGA AGA CAC AAG Glu Ser Val Tyr GAG TCA GTC TAT Asn Leu Arg Ile AAC TTA AGA ATA Arg CGG Gln CAA Gly GGG Val Leu GTG CTA Tyr Met TAC ATG Asp Met GAC ATG Thr Tyr Ala Ser Tyr Gly Tyr ACC TAC GCC TCA TAT GGA TAT Arg Ala Ala Met Val Glu Tyr AGG 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Ala Met Thr Ala GCT ATG ACC GCC His Pro Ile Glu CAC CCA ATA GAA Leu Gly Ser Gln CTT GGA AGC CAG Glu Met Lys Gly GAG ATG AAG GGT Val Asp Val Ala GTT GAT GTA GCC Tyr Tyr Ser Gly TAC TAC AGT GGG Ser Pro Tyr Val TCC CCA TAC GTC Leu Pro Asp LeuCTG CCA GAT TTA Arg Val Arg Val AGG GTG AGG GTG Arg Met Ala Val AGA ATG GCT GTC Gly Arg Val Lys GGT AGA GTG AAG Gly Ser Lys Asp GGG TCA AAG GAC Ile Glu Asp Gly ATA GAA GAT GGA Leu Arg Ala TTG AGA GCA Pro Ser Ile CCC AGT ATC Met Ala Thr ATG GCA ACT Pro Gin Pro CCG CAG CCG Leu Asp Glu CTG GAT GAG Lys Ile His AAA ATT CAC Thr Pro Ala ACC CCA GCA Glu Phe Ile GAA TTC ATA Phe Leu Asp TTC CTT GAC Asn Met Leu AAC ATG CTG Lys Lys Leu AAG AAA CTA Glu Asp Pro GAA GAC CCG Val Val Ala GTA GTA GCC Asp Thr Val GAT ACA GTT Ser Ser Lys TCA TCA AAA Thr Val Gly ACT GTG GGC Pro Gly Arg CCC GGT AGG Tyr His Tyr TAC CAC TAT Ile Asn Val ATC AAC GTG Ala Ala GCA GCT Ser Phe TCC TTC Gly Ile GGG ATC Lys Leu AAG CTC Tyr His TAT CAC Arg Phe AGA TTT Gly Ser GGG TCA Ala Pro GCT CCT Ile Ala ATA GCG Val Phe GTC TTC Lys Ala AAA GCC Ala Asn GCT AAC Thr Asn ACC AAT Val Asp GTT GAC Ile Pro ATA CCT Glu Gln GAA CAG Tyr Tyr TAC TAT Asp Leu GAC CTG Thr Lys ACA AAG Ser Phe Arg Glu Met Asn Tyr Asp Trp Ser Leu Tyr Glu Glu Asp Ser 515 TCC TTT AGG GAA ATG AAT TAC GAT TGG AGC CTG TAC GAG GAG GAC AGC 1584 Leu Leu Ile Thr Gln Leu Glu Ile Leu Asn Asn Leu Leu Ile Ser Glu 531 TTG CTG ATA ACG CAG CTG GAG ATA CTG AAC AAT CTA CTC ATC TCT GAA 1632 Asp Leu Pro Ala Ala Val Lys Asn Ile Met Ala Arg Thr Asp His Pro 547 GAC CTA CCA GCA GCA GTA AAA AAC ATC ATG GCA AGG ACT GAT CAC CCA 1680 Glu Pro Ile Gln Leu Ala Tyr Asn Ser Tyr Glu Val Gln Val Pro Val 563 GAA CCA ATC CAG CTT GCA TAC AAC AGT TAT GAG GTC CAG GTC CCT GTA 1728 Leu Phe Pro Lys-Ile Arg Asn Gly Glu Val Thr Asp Thr Tyr Glu Asn 579 CTG TTT CCA AAA ATA AGG AAT GGG GAG GTT ACA GAT ACT TAC GAG AAC 1776 Tyr Ser Phe Leu Asn Ala Arg Lys Leu Gly Glu Asp Val Pro Val Tyr 595 TAC TCA TTC CTA AAT GCA AGA AAA CTA GGG GAA GAT GTA CCT GTG TAC 1824 Ile Tyr Ala Thr Glu Asp Glu Asp Leu Ala Val Asp Leu Leu Gly Leu 611 ATT TAT GCC ACC GAA GAT GAA GAC CTG GCA GTA GAC CTT CTA GGC TTG 1872 Asp Trp Pro Asp Pro Gly Asn Gln Gln Val Val Glu Thr Gly Lys Ala 627 GAC TGG CCC GAC CCA GGG AAC CAG CAA GTA GTG GAG ACT GGG AAA GCA 1920 Leu Lys Gln Val Val Gly Leu Ser Ser Ala Glu Asn Ala Leu Leu Ile 643 CTG AAG CAA GTG GTA GGA CTG TCC TCT GCT GAG AAT GCC CTG CTC ATA 1968 Ala Leu Phe Gly Tyr Val Gly Tyr Gln Ala Leu Ser Lys Arg His Val 659 GCC CTG TTT GGG TAT GTA GGA TAT CAA GCT TTG TCA AAA AGA CAC GTC 2016 Pro Met Ile Thr Asp Ile Tyr Thr Ile Glu Asp Gln Arg Leu Glu Asp 675 CCA ATG ATC ACA GAC ATA TAC ACC ATA GAA GAT CAA AGA CTA GAG GAC 2064 Thr Thr His Leu Gln Tyr Ala Pro Asn Ala Ile Arg Thr Glu Gly Lys 691 ACA ACC CAC CTC CAA TAT GCA CCT AAT GCT ATA AGA ACT GAG GGG AAG 2112 Glu Thr Glu Leu Lys Glu Leu Ala Val Gly Asp Met Asp Arg Ile Met 707 GAG ACT GAA CTA AAG GAA TTA GCA GTG GGT GAC ATG GAC AGA ATC ATG 2160 Glu Ser Ile Ser Asp Tyr Ala Ser Gly Gly Leu Thr Phe Ile Arg Ser 723 GAA TCC ATC TCA GAT TAT GCA TCA GGA GGG TTG ACA TTC ATA AGA TCT 2208 STOP Gln Ala Glu Lys Val Arg *** 7 Z 9 CAG GCA GAG AAA GTA CGC TAG CGG ATC C 2236 Ba, r HI 2677767 SEQ ID NO: 2 TYPE DE SEQUENCE: séquence nucléotidique LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 240 paires de bases NOMBRE DE BRINS: simple CONFIGURATION: linéaire TYPE DE MOLECULE: AD Nc pour ARN qénomique ORIGINE: BVD Osloss REGION TRADUITE: 1 240 PROPRIETES: code pour une réqion de 80 acides aminés de la D 80, comprenant des épitopes recon- nus par des anticorps monoclonaux anti-p 80. Gly Tyr Gln Ala Leu Ser Lys Arg His Val Pro Met Ile Thr Asp Ile 16 GGA TAT CAA GCT TTG TCA AAA AGA CAC GTC CCA ATG ATC ACA GAC ATA 48 Tyr Thr Ile Glu Asp Gln Arg Leu Glu Asp Thr Thr His Leu Gln Tyr 32 TAC ACC ATA GAA GAT CAA AGA CTA GAG GAC ACA ACC CAC CTC CAA TAT 96 Ala Pro Asn Ala Ile Arg Thr Glu Gly Lys Glu Thr Glu Leu Lys Glu 48 GCA CCT AAT GCT ATA AGA ACT GAG GGG AAG GAG ACT GAA CTA AAG GAA 144 Leu Ala Val Gl Y Asp Met Asp Arg Ile Met Glu Ser Ile Ser Asp Tyr 64 TTA GCA GTG GGT GAC ATG GAC AGA ATC ATG GAA TCC ATC TCA GAT TAT 192 Ala Ser Gl Y Gly Leu Thr Phe Ile Arg Ser Gln Ala Glu Lys Val Arg 80 GCA TCA GGA GGG TTG ACA TTC ATA AGA TCT CAG GCA GAG AAA GTA AGA 240 21 2677767 REVENDICATIONS. 1 Procédé de détection de l'infection d'un prélèvement de sang par un virus de la diarrhée bovine (BVD), comprenant un premier test pour la détection des anticorps anti-BVD et un deuxième test pour la détection des particules virales, caractérisé en ce que l'on détecte les anticorps anti-p 80 à l'aide d'un antigène recombinant comprenant la protéine p 80 du virus BVD produite en hôte eucaryote et que l'on détecte la présence de particules virales à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine p 80 du virus BVD, pour la détection des virémies persistantes et des infections aiguës par n'importe quelle souche de BVD. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine p 80 recombinante est codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1 ou une séquence équivalente. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'antigène p 80 recombinant provient de cultures cellulaires animales transfectées par un vecteur convenable exprimant la protéine p 80. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'antigène p 80 recombinant provient de cultures de cellules d'insectes, telles que Spodoptera frugiperda. 5 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'antigène p 80 recombinant provient de cultures de cellules de mammifères, telles que Hela, CHO ou BHK. 6 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'antigène p 8 o recombinant provient de cultures de cellules de levure, telles que Saccharomyces cerevisiae, transfectées par un vecteur convenable exprimant la protéine p 80. 7 Procédé selon l'une auelconaue des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'antiaène p 80 recombinant comprend des extraits de cellules hôtes eucaryotes transfectées par un vecteur convenable exprimant la protéine p 80. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine D 80 est obtenue par expression dans un vecteur viral ou eucaryote. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la protéine p 80 est exprimée dans le système Baculovirus, tel que le baculovirus Ac NPV. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on détecte les anticorps anti-p 80 dans toute fraction de sang bovin, telle que sérum ou plasma. 11 Procédé selon l'une auelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'antiaène p 80 recombinant permettant la détection d'anticorps est immobilisé sur un support solide. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on révèle la présence d'anticorps anti-p 80 par un anti-sérum anti-Ia G bovines couplé à un révélateur. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on révèle la présence d'anticorps par un ELISA de compétition, en présence d'un anticorps monoclonal anti-p 80 couplé à un révélateur. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'on détecte la présence de particules virales dans le sang complet, brut ou enrichi en globules blancs par simple centrifugation. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'on détecte la présence de particules virales à l'aide d'un sérum dirigé contre l'antigène p 80 recombinant produit en hôte eucaryote ou procaryote. 16 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que, pour la détection des particules virales, on utilise un mélange de trois anticorps monoclonaux spécifiques de la p 80 virale. 17 Procédé selon l'ensemble des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'on effectue un ELISA de type "sandwich" avec le mélange d'anticorps monoclonaux comme capteur et le sérum comme révélateur. 18 Séquence nucléotidique référencée SEQ ID NO:1 et correspondant à la séquence de BVD Osloss codant pour la protéine non structurale p 80. 19 Séquence nucléotidique contenant la séquence selon la revendication 18. 20 Protéine recombinante correspondant à la traduction de la séquence nucléotidique selon la revendication 18 ou 19. 21 Protéine recombinante selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle est produite en hôte eucaryote transfecté par un vecteur convenable exprimant ladite séquence nucléotidique. 22 Protéine recombinante selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle est produite dans des cellules d'insectes Spodoptera frugiperda transfectées par un vecteur Baculovirus, tel que le baculovirus Ac NPV. 23 Antigène recombinant contenant la protéine recombinante selon l'une des revendications 20 à 22. 24 Antiqène recombinant selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il comprend des extraits de cellules hôtes transfectées par un vecteur exprimant ladite protéine recombinante.