Brevet FR2682481A1 — publié le 19930416

PROCEDE D'OBTENTION DE CELLULES TROPHOBLASTIQUES D'UN FOETUS La présente invention concerne l'obtention de cellules trophoblastiques du foetus d'un individu mammifère, à partir d'un échantillon de sang prélevé sur la circulation veineuse périphérique de la mère portant ledit foetus, et donc pendant sa gestation. De manière non limitative, la présente invention sera introduite, définie, décrite et discutée par rapport à l'obtention de cellules trophoblastiques du genre humain. Par "cellule trophoblastique", au sens de la présente invention, on entend toute cellule du trophoblaste, syncithiotrophoblaste ou cytotrophoblaste, d'origine villeuse ou extravilleuse, quel que soit son type, anuclée, mononuclée, polynuclée, et quelle que soit l'époque de leur apparition dans le sang maternel par rapport à la durée de la gestation. Différentes publications, parmi lesquelles on citera - COVONE, A.E., MUTTON D., JOHNSON, P.M., ADINOLFI, M. (1984). Trophoblast cells in peripheral blood from pregnant women. Lancet, II, 841-843. - HERZENBERG, L.A., BIANCHI, D.W., SCHRÖDER, J., CANN, H.M., IVERSON, M. (1979). Fetal cells in the blood of pregnant women : detection and enrichment by fluorescence-activated cell sorting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,1453-1455 - HSI, BL-L, YEH, C.-J.G.(1986). Monoclonal antibodies GB25 recognizes human villous trophoblasts, Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol., 10, 1-3 - HSI, BL-L, YEH, C.-J.G., JOHNSON, P.M., BERESFORD, N., STERN, P.L. (1987). Monoclonal antibody GB 17 recognizes human syncytiotrophoblast. J. Reprod. Immunol., 12, 235-244 IKLE, Von-F,A. Dissemination von syncytiotrophoblastze llen im mütterlichen Blut wàhrend der Graviditat. (1964). Bull. Schweiz. Akad. Med. Wiss., 20, 62-72. - KOZMA, R., SPRING, J., JOHNSON, P.M., ADINOLFI, M. (1986). Detection of syncytiotrophoblast in maternal peripheral and uterine veins using a monoclonal antibody and flow-cytometry. Hum. Reprod., 1, 335-336 - KOZMA, R., CHAPMAN, M., LOKE, Y.W., JOHNSON, P.M., ADINOLFI, M. (1986). Detection of trophoblast-like cells in maternal blood using specific monoclonal antibodies. J. Reprod. Immunol., 11, 55-61 - YOUSSEF, M., SHULMAN, P., THARAPEL, A. T., SIMPSON, J.L, ELIAS, E. (1990). Failure to document fetal cells in maternal circulation using the Selypes-Lorencz "air-culture" cytogenetic technique, Hum.Genet., 85, 133-134. ont divulgué et proposé un procédé d'obtention de cellules trophoblastiques ou similaires d'un foetus humain, tel qu'introduit précédemment, selon lequel, successivement - on sépare les érythrocytes d'un échantillon de sang prélevé sur la circulation veineuse périphérique de la mère, pour obtenir par tri négatif une fraction leucocytaire enrichie en leucocytes - on sépare par tri positif une fraction présumément enrichie en cellules trophoblastiques de la fraction leucocytaire (sang maternel moins érythrocytes), en marquant lesdites cellules avec un marqueur biolo gique, à savoir un anticorps substantiellement spéci fique desdites cellules - éventuellement, à partir de la fraction enrichie en cellules trophoblastiques, on trie par cytométrie de flux une fraction présumément encore plus riche en cellules trophoblastiques. De manière générale, en dehors des anticorps retenus ci-après comme marqueurs biologiques, par "marqueur on entend très généralement toute substance, produit, substituant ou composé second, biologique ou non, susceptible de différencier une autre substance ou produit premier, par incorporation ou liaison du produit second au produit premier, et ce pour reconnaître ultérieurement le produit premier, par tout processus d'analyse auquel réagit spécifiquement le produit second. Au sens de la définition précédente, un marqueur peut être une substance lumineuse (par exemple colorant), chromophore (par exemple fluorescente), un enzyme, un haptène, un antigène, un isotope radioactif, etc... Un tel procédé a été proposé ultérieurement par le document WO-A-9006509, selon lequel différents anticorps dits FD 0161 G, FD 066 Q et FD 0338 P ont été isolés comme plus particulièrement spécifiques des cellules syncithiotrophoblastiques et/ou cytotrophoblastiques, pour marquer ces dernières pendant la phase de tri positif sur la fraction leucocytaire. De plus, ces anticorps ont été définis et identifiés par détermination des séquences protéiques des antigènes respectivement reconnus par lesdits anticorps. Plus récemment, le document EP-A-0 412 700 a décrit et proposé un procédé du même type, en ajoutant éventuellement, entre l'étape de séparation des érythrocytes par tri négatif, et l'étape d'obtention par tri positif de la fraction enrichie en cellules trophoblastiques, une étape de séparation d'une partie des leucocytes de la fraction leucocytaire, pour obtenir par tri négatif une fraction pré-enrichie en cellules trophoblastiques. Cette étape intermédiaire d'enrichissement par tri négatif consiste à marquer les monocytes de la fraction leucocytaire avec un anticorps spécifique, par exemple dit HLE-1. Par ailleurs, selon le document EP-A-0 412 700, on a isolé et produit des anticorps monoclonaux, plus particulièrement spécifiques des cellules cytotrophoblastiques du premier trimestre de la gestation, et utilisés pour l'étape de séparation par tri positif de la fraction présumément enrichie en cellules trophoblastiques. Les différents procédés décrits précédemment ont été présentés par leurs auteurs ou inventeurs, comme permettant d'obtenir des cellules foetales, par une méthode "non invasive", c'est-à-dire sans prélèvement de liquide amniotique sur la mère, ou biopsie sur l'embryon. L'obtention de ces cellules foetales permet quant à elle, de manière traditionnelle et connue en soi, la mise en oeuvre de différents tests ou méthodes de diagnostic anté-nétal, par exemple par cytogénétique, tels que détermination du sexe, ou de maladies congénitales comme la trisomie 21 (mongolisme). Jusqu'à présent, les différents procédés décrits précédemment n'ont identifié la présence de cellules trophoblastiques dans la fraction finale obtenue, y compris après cytométrie de flux, qu'en détectant par des tests génétiques biochimiques de l'ADN foetal, en l'occurrence celui du chromosome Y d'un embryon mâle dans ladite fraction finale. Ceci veut dire en particulier qu'à ce jour, d'une part des cellules trophoblastiques n'ont pas été isolées dans la fraction finale du procédé et reconnues en tant que telles, notamment par un examen morphologique, et d'autre part cette fraction finale ne peut être qualifiée de substantiellement pure en cellules trophoblastiques. Or, vis-à-vis des tests à effectuer sur les seules cellules foetales, notamment biochimiques, aux fins d'un diagnostic prénatal, l'obtention d'une fraction finale enrichie en cellules trophoblastiques n'apparaît guère plus utile que l'échantillon initial de sang total de la mère, dont elle est issue. Ce qui apparaît fondamental et essentiel à cet égard, c'est en effet l'obtention d'une fraction substantiellement pure en cellules trophoblas tiques, voire l'obtention d'un nombre suffisant de cellules trophoblastiques, dûment isolées. L'isolement de quelques cellules trophoblastiques ou d'une fraction substantiellement pure en dites cellules autorise en effet toute une série de tests ou vérifications préalables, essentiels pour accomplir différents diagnostics anté-nataux fiables, sensibles, et répétitifs - il est tout d'abord possible de reconnaître et identi fier les cellules trophoblastiques, par toutes les méthodes traditionnelles, telles que morphologie et microscopie électronique - il est ensuite possible de cultiver de manière viable ces cellules trophoblastiques, ce qui ouvre la voie aux tests de cytogénétique traditionnelle, uniquement sur des cellules foetales - pour terminer, et surtout, tous les tests biochimiques traditionnels sur ADN, ou de génétique moléculaire, tels qu'hybridation cytochimique, amplification génomique in vitro (notamment PCR), peuvent être mis en oeuvre directement, c'est-à-dire sans culture, sans risquer une réponse erronée, ou "parasitée" par des cellules maternelles ; à cet égard, si comme indiqué précédemment, on peut envisager une détection du sexe du foetus, par la détection avec un marqueur génétique du chromosome Y dans une fraction finale enrichie en cellules trophoblastiques, il apparaît à ce jour impossible, toujours par la voie génétique biochi mique, de détecter une anomalie chromosomique ou géné tique du foetus, par exemple une anomalie autosomique récessive, sans disposer de cellules foetales quasi ment pures. La présente invention a donc pour objet un procédé tel que précédemment décrit, permettant d'obtenir une fraction substantiellement pure en cellules trophoblastiques, par exemple à 99 %, ayant préservé leur intégrité morphologique et physiologique à l'issue des différentes étapes de tri positif et/ou négatif, ce procédé ouvrant la voie à tous les tests biochimiques traditionnels, appliqués uniquement à l'ADN foetal. La présente invention a pour point de départ la découverte ou observation selon laquelle, lors de l'étape de pré-enrichissement en cellules trophoblastiques par tri positif, le marqueur biologique, par exemple un anticorps spécifique des cellules trophoblastiques, peut aussi bien marquer ces dernières que des leucocytes maternels ayant absorbé, ingéré des cellules trophoblastiques, ou certains de leurs constituants après mort cellulaire, et présentant des épitopes communs avec ces dernières. Pour distinguer aisément, lors de l'étape finale de séparation, par exemple par cytométrie de flux, les cellules trophoblastiques des lymphocytes présentant avec elles une réaction immunologique croisée, la présente invention a identifié différents paramètres opératoires concourrant séparément ou ensemble au résultat recherché. A titre principal, selon la présente invention, il convient tout d'abord, lors de l'étape de pré-enrichissement par tri négatif, de marquer la quasi-totalité des leucocytes, dont lymphocytes, polynucléaires et monocytes, avec un anticorps anti-leucocytaire commun (en abrégé AALC). L'utilisation d'un AALC permet un tri négatif relativement complet sur les leucocytes, présentant l'avantage de ne pas endommager les cellules trophoblastiques présentes dans le sang maternel. Cet avantage apparaît particulièrement significatif vis-à-vis des solutions ayant retenu un tri positif direct des cellules trophoblastiques sur un échantillon de sang maternel, épuisé de ses érythrocytes. Différents autres paramètres concourrent ou complètent le résultat recherché. Ainsi, si l'AALC est fixé sur un support ou phase solide, à l'état divisé, sous formes de particules aimantées par exemple, en suspension dans la fraction leucocytaire, cette dernière est alors mise en contact avec la face dudit support fixant 1'TALC, et les leucocytes marqués avec ce dernier peuvent être aisément et complètement séparés de la fraction leucocytaire, par exemple par l'action d'un champ magnétique. Au surplus, s'agissant d'un support du type particules ou billes magnétiques, on préfèrera opérer avec un excès du nombre d'AALC, par rapport au nombre de cellules dans la fraction leucocytaire, et/ou avec plusieurs AALC fixés sur une même particule aimantée, de manière à obtenir lors de l'étape de pré-enrichissement, un réseau tri-dimensionnel particules/leucocytes, à maille étroite, peu susceptible d'incorporer des cellules trophoblastiques de taille relativement plus importante. Toujours pour des particules aimantées, telles que billes magnétiques, en choisissant entre 0,5 et 1 le nombre de particules aimantées, rapporté au nombre de cellules dans la fraction leucocytaire, on évite un réseau trop dense, susceptible d'endommager les cellules trophoblastiques, lors de l'action du champ magnétique sur les particules et contre la paroi du récipient de traitement. Selon un mode d'execution de l'invention, l'AALC de l'étape de tri négatif et le marqueur de l'étape de tri positif, en l'occurrence un anticorps anti-cellules trophoblastiques (en abrégé AACT), portent des produits chromophores respectivement différents, par exemple et respectivement un groupement chimique fluorescent phycoerythrine, et un anticorps secondaire anti-souris couplé à de l'isothiocyanate de fluorescéine. Un tel choix opératoire permet précisément, par exemple par cytométrie de flux sous fluorescence, de distinguer non seulement les cellules trophoblastiques des lymphocytes maternels résiduels, mais aussi les cellules trophoblastiques des lymphocytes maternels ayant ingéré ces dernières, qui porteront les deux marqueurs. Un procédé représentatif de la présente invention, permettant d'aboutir à des cellules trophoblastiques relativement pures, est décrit ci-après, de manière générale. On prélève tout d'abord un échantillon du sang périphérique veineux de la mère portant le foetus. Il résulte de travaux scientifiques antérieurs que le nombre de cellules trophoblastiques présentes dans cet échantillon est en moyenne et environ d'une cellule pour un million. On sépare les érythrocytes de cet échantillon, par centrifugation sous gradient de densité, par exemple selon la méthode FICOLL, pour obtenir par tri négatif une fraction leucocytaire, c'est-à-dire enrichie en leucocytes. Par exemple, la centrifugation s'effectue dans un liquide de densité égale à 1,077, correspondant à celle des lymphocytes. On obtient ainsi une fraction leucocytaire extraite de l'échantillon centrifugé, contenant des lymphocytes, des monocytes, et des cellules trophoblastiques, alors que le culot de centrifugation contient des globules rouges, des polynucléaires granuleux, des cellules trophoblastiques géantes, ainsi que les plaquettes. A l'issue de cette phase de séparation, la fraction leucocytaire obtenue est déjà enrichie en cellules trophoblastiques, d'un facteur 100 environ, et contient par conséquent environ une cellule trophoblastique pour 10.000. La fraction leucocytaire est ensuite soumise à un nouvel enrichissement en cellules trophoblastiques, par tri négatif, en marquant la quasi-totalité des leucocytes avec un marqueur biologique, en l'occurrence un AALC, pour obtenir deux fractions, à savoir une fraction pré-enrichie en cellules trophoblastiques, ne contenant que quelques leucocytes maternels résiduels, et une fraction contenant pratiquement tous les leucocytes du sang maternel périphé rique, dont lymphocytes, polynucléaires et monocytes. Pour ce faire, et de manière préférentielle, l' AALC retenu, par exemple l'anticorps connu sous la référence CD 45 RO, est fixé sur un support solide à l'état divisé, consistant en des particules aimantées ou billes magnétiques, susceptibles d'être séparées du milieu de suspension par l'action d'un champ magnétique.La fraction leucocytaire est alors mise en contact avec la face du support particulaire ayant fixé 1'AALC. Selon un mode d'exécution préféré, 1'AALC est fixé sur les particules magnétiques, par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire, par exemple un anticorps de chèvre anti-souris, lui-même fixé sur le support solide divisé, par une liaison chimique covalente notamment. Avantageusement, l'anticorps de chèvre anti-souris est fixé sur le support solide par son fragment Fc, en laissant libre un fragment Fab'2, purifié par affinité; cette dernière caractéristique permet d'éviter la fixation des cellules trophoblastiques, qui présentent des récepteurs du fragment Fc. Par ailleurs, toujours pendant l'étape de pré-enrichissement, l'AALC porte un produit chromophore, notamment un groupement chimique fluorescent, par exemple phycoérythrine. Ceci permettra dans les étapes ultérieures du procédé de reconnaître les leucocytes résiduels. Préférentiellement, l'étape de pré-enrichissement en cellules trophoblastiques est effectué avec les choix opératoires suivants - un excès du nombre de molécules d'anticorps, par rapport au nombre de sites cellulaires estimé (soit nombre de cellules x par nombre de sites par cellule) - plusieurs AALC sur chaque particule aimantée ou bille magnétique - un nombre de particules, rapporté au nombre de cellules dans la fraction leucocytaire, compris entre 0,5 et 1. L'ensemble de ces paramètres opératoires permet tout à la fois d'obtenir un réseau particules/globules blancs aux mailles suffisamment étroites pour ne pas piéger les cellules trophoblastiques, tout en évitant de les endommager contre la paroi du récipient d'analyse, lors de l'action du champ magnétique. On procède ensuite à une séparation des cellules trophoblastiques de la fraction pré-enrichie obtenue précédemment, en marquant lesdites cellules avec un marqueur biologique, en l'occurrence un anticorps substantiellement spécifique des cellules trophoblastiques, pour obtenir ainsi par tri positif une fraction substantiellement enrichie en cellules trophoblastiques. Préférentiellement, l'AACT retenu porte un produit chromophore, par exemple un anticorps secondaire anti-souris couplé à de 1' isothiocyanate-fluorescéine. Avantageusement, pendant cette phase de tri positif, l'AACT est un anticorps substantiellement anti-cellules syncythiotrophoblastiques, par exemple les anticorps dénommés GB 17, dans les publications de Monsieur HSI, identifiées dans le préambule de la présente description. Pour terminer, on obtient une fraction substantiellement pure en cellules trophoblastiques, en triant par cytométrie de flux sous fluorescence la fraction enrichie en cellules trophoblastiques précédemment obtenue. Compte tenu des groupements chromophores différents marquant respectivement les cellules trophoblastiques et les leucocytes résiduels, la cytométrie de flux permet de distinguer non seulement les leucocytes résiduels des cellules trophoblastiques, mais aussi les globules blancs maternels ayant absorbé ou ingéré ces dernières, ou certains de leurs constituants après mort cellulaire, de ces mêmes cellules trophoblastiques. Au total, et à la fin d'un tel procédé, on obtient une fraction substantiellement pure en cellules trophoblastiques intactes, permettant ensuite l'application de tous tests génétiques traditionnels, notamment biochimiques sur l'ADN foetal. Par exemple, en partant de 10 cm3 de sang maternel, un tel procédé permet de récupérer jusqu'à 3 x 103 cellules trophoblastiques, ce qui permet ensuite une très grande précision du diagnostic ; en particulier un grand nombre de cellules trophoblastiques permet de détecter les anomalies en mosaïque, c'est-à-dire celles pour lesquelles une partie seulement des cellules foetales est atteinte. De telles anomalies ne sont pas aujourd'hui détectables facilement par la cytogénétique classique, qui ne diagnostique au maximum qu'une vingtaine de cellules. On décrit ci-après un exemple d'obtention de cellules trophoblastiques, selon l'invention. Au bout d'un temps de gestation supérieur ou égal à 6 semaines, on prelèves 10 cm3 de sang maternel dans la veine du pli du coude de la mère par exemple. L'échantillon prélevé contient 5.1010 globules rouges, 5.107 globules blancs (leucocytes, polynucléaires neutrophiles, et eosinophiles, basophiles, lymphocytes, monocytes), 5.103 cellules trophoblastiques (anuclées, mononuclées, géantes plurinuclées), et 4.109 plaquettes. Dans une première étape, avec un gradient discontinu de FICOLL, en centrifugation en milieu de densité 1,077, on élimine environ 99 % des globules rouges, 80 % des polynucléaires, et 80 % des cellules trophoblastiques géantes plurinucléaires. Après centrifugation, on peut prélever simplement l'interface qui contient toutes les cellules mononuclées. On obtient ainsi un autre échantillon contenant environ 5.102 globules rouges, 4.107 globules blancs, et 4.103 cellules trophoblastiques. Dans une deuxième étape, on élimine les globules blancs pour préenrichir l'échantillon en cellules trophoblastiques. A cette fin, on utilise comme décrit précédemment un anticorps anti-leucocytaire commun, par exemple CD45R0 couplé à la phycoerythrine, laquelle est un fluorochrome excitable à 488 nm, et dont l'émission peut être recueillie à 575 nm plus ou moins 20 nm. Les globules blancs marqués comme précédemment sont mis en présence de billes magnétiques recouvertes d'un anticorps de chèvre anti-souris, spécifique des immunoglobulines. Puis on retient les complexes obtenus, à savoir billes/anticorps de chèvre anti-souris/CD45R0/globules blancs, avec un aimant permanent, pour récupérer un surnageant.On obtient ainsi dans ce dernier une population résiduelle de cellules, à savoir environ 5.102 globules rouges, 4.105 globules blancs, et 4.103 cellules trophoblastiques, étant entendu que le facteur d'enrichissement en cellules trophoblastiques peut évoluer entre 10 et 100 environ. Dans une troisième étape, on purifie les cellules trophoblastiques. A cette fin, ces dernières sont couplées avec tout anticorps approprié, spécifique d'un ou plusieurs types de cellules trophoblastiques, et décrit dans les différentes publications et brevets identifiés dans le préambule de la présente description ; on utilise par exemple l'anticorps dit GB 17, tel que décrit par Monsieur Bae-Li HSI, et al, dans un article intitulé "Monoclonal antibody GB 17 recognizes human syncytiotrophoblasts", Journal of Reproductive Immunology, 12 (1987) 235-244. Si l'on utilise l'anticorps GB 17, le complexe cellules trophoblastiques-GB 17 sera marqué avec un anticorps de chèvre anti-souris couplé au FITC (fluoresceine-isothiocyanate), qui est un fluorochrome excitable à 488 nm, émettant à 525 nm plus ou moins 15 nm. On pourra ainsi reconnaître ultérieurement en cytométrie de flux les globules blancs marqués par l'anticorps CD45R0, les globules blancs ayant absorbé ou ingéré des cellules trophoblastiques, et enfin ces dernières. Dans une dernière étape avec un trieur de cellules à laser, c'est-à-dire avec un cytomètre de flux, par exemple un appareil de la marque COULTER et de la référence ELITE, on purifie la fraction obtenue à l'issue de la troisième étape, sur des critères de taille/structure permettant d'éliminer les globules rouges et les débris cellulaires, y compris les cellules trophoblastiques anuclées. A partir des paramètres de fluorescence retenus, on peut discriminer les globules blancs (fluorescence à 575 nm) des cellules trophoblastiques (fluorescence à 525 nm). En moyenne, à l'issue de cette phase de tri, on obtient 3.103 cellules trophoblastiques, à plus ou moins 2.102 cellules, sur 12 prélèvements.Ces cellules purifiées sont recueillies sur lames de microscope, pour hybridation cytochimique ultérieure (100 cellules trophoblastiques par lame), et dans des micro-tubes de 1,5 ml, pour utilisation de l'amplification génomique in vitro (PCR). En final, l'identification des cellules trophoblastiques marquées peut être faîte au microscope en fluorescence et en contraste de phase. Ces cellules peuvent être comptées au microscope à la cellule de MALASSEZ, avec un comptage sur 400 cellules. Ultérieurement, et aux fins d'un diagnostic, différentes sondes d'hybridation in situ, par exemple biotinylées par "nick translation", sont utilisées. Ces sondes peuvent être révélées, après hybridation in situ, par application d'avidine-FITC, et d'un anticorps anti-avidine biotinylé. Ces sondes, à titre d'exemple sont utilisées pour déterminer le nombre de chromosomes "X" ou "Y", pour la détermination du sexe, ou 21, pour la détermination de la trisomie 21. REVENDICATIONS 1.Procédé d'obtention de cellules trophoblastiques d'un foetus d'un individu mammifère, à partir d'un échantillon du sang périphérique prélevé sur la mère portant ledit foetus, selon lequel, successivement (a) on sépare les érythrocytes dudit échantillon, pour obtenir par tri négatif une fraction leucocytaire, enrichie en leucocytes (b) on sépare au moins une partie des leucocytes de la fraction leucocytaire, en marquant les leucocytes à séparer avec un marqueur spécifique, pour obtenir par tri négatif, une fraction pré-enrichie en cellules trophoblastiques (c) on sépare des cellules trophoblastiques de la fraction pré-enrichie, en marquant lesdites cellules, avec un marqueur biologique, par exemple un anticorps substantiellement spécifique desdites cellules, pour obtenir par tri positif une fraction enrichie en cellules trophoblastiques caractérisé en ce sue l'étape de pré-enrichissement est effectuée avec un anticorps anti-leucocytaire commun, marquant la majeure partie des leucocytes de la fraction leucocytaire, dont lymphocytes, polynucléaires et monocytes, pour obtenir une fraction pré-enrichie permettant de distinguer ultérieurement les cellules trophoblastiques des leucocytes maternels résiduels ayant ingéré des cellules trophoblastiques circulant dans le sang maternel. 2.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps anti-leucocytaire commun est fixé sur un support solide, et pendant l'étape de pré-enrichissement la fraction leucocytaire est mise en contact avec la face dudit support ayant fixé ledit anticorps. 3.Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, pendant l'étape de pré-enrichissement, le support solide à l'état divisé, sous forme de particules, est mis en suspension dans la fraction leucocytaire. 4.Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le support solide à l'état divisé consiste en des particules aimantées, susceptibles d'être séparées du milieu de suspension par l'action d'un champ magnétique. 5.Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'anticorps anti-leucocytaire commun est fixé sur le support solide, par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire, notamment un anticorps de chèvre anti-souris, lui-même fixé sur le support solide, notamment par liaison chimique. 6.Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'anticorps de chèvre anti-souris est fixé sur le support solide par son fragment Fc, en laissant libre un fragment Fab'2. 7.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (b) de pré-enrichissement est effectuée avec un excès du nombre de molécules d'anticorps, par rapport au nombre de sites cellulaires estimé dans la fraction leucocytaire. 8.Procédé selon les revendications 4 et 7, caractérisé en ce que sur chaque particule aimantée sont fixés plusieurs anticorps anti-leucocytaires communs. 9.Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le nombre de particules, rapporté au nombre de cellules dans la fraction leucocytaire, est compris entre 0,5 et 1. 10.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps anti-leucocytaire commun porte un produit chromophore, notamment un groupement chimique fluorescent phycoérytrine. 11.Procédé selon la revendication 1, selon lequel le marqueur biologique marquant les cellules trophoblastiques est un anticorps anti-cellules trophoblastiques, caractérisé en ce que ledit anticorps porte un produit chromophore, un anticorps secondaire anti-souris couplé à de l'isothiocyanate de fluorescéine. 12.Procédé selon les revendications 10 et 11, caractérisé en ce que l'anticorps anti-leucocytaire commun et l'anticorps anti-cellules trophoblastiques portent des produits chromophores respectivement différents. 13.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on obtient une fraction substantiellement pure en cellules trophoblastiques, en triant ces dernières par cytométrie de flux dans la fraction enrichie en cellules trophoblastiques. 14.Procédé selon les revendications 12 et 13, caractérisé en ce que la cytométrie de flux est fate sous un flux lumineux permettant de distinguer respectivement les leucocytes marqués avec l'anticorps anti-leucocytaire, et les cellules trophoblastiques marquées avec l'anticorps anti-cellules trophoblastiques. 15.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marqueur biologique marquant les cellules trophoblastiques est un anticorps substantiellement anti-cellules syncythiotrophoblastiques. 16.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon soumis à séparations successives est prélevé sur le sang veineux de la mère. 17.Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fraction leucocytaire est obtenue à partir de l'échantillon du sang, par centrifugation sous gradient de densité. 18.Réactif biologique adapté au procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, comprenant un support solide à l'état divisé, constitué par des particules aimantées, et au moins un marqueur biologique, notamment un anticorps, fixé sur ledit support par l'intermédiaire d'un anticorps anti-souris, caractérisé en ce que l'anticorps anti-souris est fixé sur le support solide par son fragment Fc, laissant libre un fragment Fab'2. 19.Réactif biologique comprenant un anticorps anti-cellules trophoblastiques, caractérisé en ce que ledit anticorps porte un produit chromophore, notamment un anticorps secondaire anti-souris couplé à de l'isothiocyanate de fluorescéine.