Brevet FR2677364A1 — publié le 19921211

Séquences peptidiques de la glycoprotéine externe d'enveloppe du rétrovirus HIV-1 L'invention concerne de nouvelles séquences peptidiques de la glycoprotéine externe d'enveloppe du rétrovir,us HIV-1. Depuis la mise en évidence d'un rétrovirus désigné par HIV-1, capable d'infecter l'homme et de causer chez ce dernier des lymphadénopathies susceptibles de se transformer en SIDA, plusieurs variants de ce rétrovirus ont été isolés et caractérisés. Des différences plus ou moins importantes entre les isolats ont été montrées et l'existence de régions plus ou moins conservées au sein de plusieurs protéines ou glycoprotéines de ces variants a été établie. Dans les pages suivantes, les différents variants de HIV-1 sont regroupés sous la désignation générale HIV-1 et l'on précise si nécessaire, la nature de l'isolat particulier auquel s'applique les définitions ou les résultats. Les séquences nucléotidiques ou les séquences d'acides aminés de l'isolat HIV-1,R, sont données dans la suite du texte par référence à G MYERS et al 1989 Human Retrovirus and AIDS (a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences in Los Alamos) Los Alamos National Laboratory, ce document faisant lui même référence à la publication Cell 1985, 40, 9-14. Plusieurs auteurs ont déjà mis en évidence le fait que l'infection par le virus HIV et le déclenchement de la maladie dont il est responsable, font intervenir plus particulièrement certaines protéines ou glycoprotéines de HIV et notamment de HIV-1. Ils ont également montré que certaines protéines peuvent être utilisées de façon privilégiée pour le diagnostic de la présence d'anticorps formés à la suite de l'infection par le rétrovirus HIV-1 ou pour favoriser ou déclencher la production d'anticorps, le cas échéant d'anticorps neutralisants contre HIV-1. A cet égard le rôle de la glycoprotéine d'enveloppe de HIV-1 a fait l'objet de nombreuses études.Cette glycoprotéine d'enveloppe comprend la glycoprotéine gpl60 ainsi que des dérivés de cette glycoprotéine sous forme d'une glycoprotéine gp120, qui représente la partie extra-membranaire de la gpl60 et d'une protéine gp41 qui correspond à la partie transmembranaire de cette gp160. Ces différentes protéines ont été décrites en particulier pour HIV-lBRU dans l'article de Cell précité. Après l'identification des protéines de HIV-1, divers travaux ont eu pour objet de rechercher des régions spécifiques intéressantes pour la conception de réactifs pour le diagnostic, la prophylaxie ou la thérapie d'une infection par HIV-1. Dans un article de PNAS (Vol 86, pages 6768-6772, Septembre 1989) JAVAHERIAN et al ont décrit à cet égard un domaine peptidique de la protéine d'enveloppe gpl20 de HIV-1 considéré comme neutralisant. Ce domaine, encore appelé boucle de Putney ou boucle V3, est constitué par une séquence de 24 acides aminés comprenant un épitope neutralisant de 8 acides aminés, capable de déclencher la production d'anticorps neutralisants. D'autres auteurs, HO et al ont décrit la mise en évidence d'un autre domaine de neutralisation sur l'enveloppe de HIV-1, et ont décrit à cet égard un peptide compris entre les acides aminés 254 et 274 de la gpl20 de HIV-1 dans un article de Science 1988, 239: 1021-1023. Les tests de production d'anticorps neutralisants par le peptide décrit par HO et al ont été reproduits par une autre équipe RONCO et al rapportent dans un article de Aids Research and Human Retroviruses Vol 1, n" 1, 1991, que ce peptide n'est pas capable de produire des anticorps susceptibles de neutraliser HIV-1. D'autres auteurs (demande de brevet PCT publiée sous le numéro 91/04493) ont localisé deux épitopes de la glycoprotéine gpl20 de HIV-1. Ces épitopes ont été décrits à l'aide de la séquence publiée par Fisher et al, Nature 316: 262-265. Ils correspondent à la séquence comprenant de 67 à 70 acides aminés de l'extrémité C-terminale de la gp120 (épitope appelé 448C) et à la séquence comprenant environ 17% de la gp120 commençant aux acides aminés 40 à 42 à partir de l'extrémité N-terminale (épitope KD). L'épitope 448C commence environ au niveau de l'acide aminé 448 de la gp120, et se termine à l'extrémité C-terminale et l'acide aminé KD commence environ au niveau de l'acide aminé 42 et se termine environ à l'acide aminé 129, par référence à la numérotation donnée dans l'article précité de Nature.Ces épitopes concernent des fragments de la gp120 de HIV-1, différents de ceux qui font l'objet de l'invention. Les inventeurs de la présente demande ont identifié et caractérisé de nouvelles séquences peptidiques de HIV-1 présentant des propriétés intéressantes en vue de détecter, prévenir ou traiter une infection due au rétrovirus humain HIV, plus spécifiquement à HIV-1. L'invention concerne dans ce but des séquences peptidiques antigéniques et des séquences immunogènes ou potentiellement immunogènes chez l'homme. Un groupe préféré de séquences de l'invention est constitué par celui des séquences qui présentent des propriétés immunogènes et peuvent favoriser la protection contre une infection due à HIV-1 voire sa prévention. Les résultats obtenus par les inventeurs permettent d'envisager l'élaboration de compositions immunogènes susceptibles d'entrer dans la formation de vaccins protecteurs vis à vis de HIV-1. Le cas échéant les séquences peptidiques selon l'invention peuvent également être mises en oeuvre pour le traitement de l'infection due à HIV-1. En particulier l'invention permet la préparation d'anticorps anti-idiotypiques, correspondant à l'image interne du ou des épitopes présents dans les séquences peptidiques de l'invention. Ces séquences peptidiques peuvent être obtenues soit par extraction et purification à partir des protéines du virus, soit par synthèse selon les méthodes connues. Ces séquences peuvent également être produites par des techniques mettant en oeuvre la recombinaison de l'ADN. Un premier groupe de séquences peptidiques selon l'invention comprend les séquences antigéniques répondant à l'enchaînement peptidique WIRSANFTDNAKT, soit à tout ou partie d'un enchaînement modifié par substitution, délétion ou addition d'au moins un acide aminé par rapport à l'enchaînement précédent. Un second groupe de séquences comprend toute séquence peptidique caractérisée en ce qu'elle est immunogène et en ce qu'elle répond soit à tout ou partie de l'enchaînement peptidique suivant VVIRSANFTDNAKT, soit à tout ou partie d'un enchaînement modifié par substitution, délétion ou addition d'au moins un acide aminé par rapport à l'enchaînement précédent. Est considérée comme "immunogène" dans le cadre de cette définition, une séquence peptidique satisfaisant au moins l'une des propriétés suivantes - cette séquence peptidique en tant que telle est capable de déclencher in vivo, la production d'anticorps contre le rétrovirus HIV-1. Des séquences particulièrement intéressantes à cet égard sont des séquences capables de déclencher la production d'anticorps protecteurs contre l'infection due à HIV-1. De tels anticorps protecteurs sont en particulier des anticorps neutralisants du virus. Une telle séquence peut être définie comme susceptible de déclencher une réponse primaire ou encore de conférer une immunogénicité active; - cette séquence peptidique est constituée par un haptène capable, lorsqu'il est combiné avec une molécule ou particule jouant le rôle de molécule porteuse, de déclencher la réponse immunitaire protectrice; - cette séquence contient un déterminant antigénique ou épitope, sous une forme non active dans la mesure où cet épitope ne s'avère capable de conduire à une réponse immunitaire protectrice qu'après induction d'une première réaction, déclenchée par exemple par l'administration d'une protéine ou d'un autre peptide de HIV-1. Une telle séquence peptidique est susceptible de déclencher une réponse immunitaire secondaire et peut être encore désignée par séquence immunogène non active. En d'autres termes la séquence immunogène peut soit être suffisante en tant que telle pour déclencher la production d'anticorps, soit nécessiter la contribution d'une autre molécule par exemple sous forme de molécule porteuse ou sous forme de protéine ou de peptide de HIV-1, utilisée pour déclencher la réponse immunitaire ou pour la favoriser lorsqu'elle a été déclenchée par la séquence peptidique de l'invention. Naturellement pour des raisons d'efficacité, il peut être intéressant d'utiliser à la fois une molécule porteuse présentant la séquence peptidique de l'invention et une protéine ou un peptide de HIV-1, ou un analogue fonctionnel du point de vue de l'immunogénicité pour initier et/ou favoriser la réponse immunitaire due à la séquence de l'invention et la production d'anticorps, en particulier d'anticorps protecteurs. On peut donc utiliser les séquences peptidiques de l'invention soit pour initier la réponse immunitaire protectrice, soit sous forme de séquence de rappel. De préférence une séquence peptidique immunogène de l'invention comprend de 3 à 13 acides aminés. Elle comprend avantageusement une majorité d'acides aminés hydrophiles. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, une séquence peptidique est caractérisée en ce qu'elle permet la production d'anticorps protecteurs, par exemple neutralisants, vis à vis de HIV, en particulier vis à vis de HIV-1, et notamment vis à vis des isolats HIVlBRU, HIV-1N et HIV-1RF. Ces isolats sont considérés comme les souches majoritaires de HIV-1 et sont décrits notamment par MYERS dans un catalogue de séquences sous la référence HIV Sequence Database G MYERS et al 1989 Human Retrovirus and AIDS (a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences in Los Alamos, Los Alamos National Laboratory). L'invention concerne également des séquences peptidiques, permettant la production d'anticorps protecteurs contre les isolats IDAV-1 et IDAV-2 de HIV-1. Par l'expression permet la production d'anticorps protecteurs vis à vis de HIV-1" on entend d'une part la possibilité pour la séquence immunogène de déclencher une réponse primaire protectrice selon ce qui a été décrit plus haut et d'autre part la possibilité pour cette séquence de déclencher une reponse secondaire. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention la séquence peptidique est caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement NFTDN. Une séquence préférée est dans ce cas la séquence répondant à cet enchaînement d'acides aminés. Un groupe préféré de séquences peptidiques comprend les enchaînements peptidiques suivants VIRSANFTDNAKT IRSANFTDNAKT RSANFTDNAKT SANFTDNAKT ANFTDNAKT NFTDNAKT NFTDNAK NFTDNA ANFTDN SANFTDN RSANFTDN IRSANFTDN VIRSANFTDN Un autre groupe préféré comprend les enchaînements dont les séquences ci-dessus sont modifiées de telle sorte que le premier acide aminé A est substitué par un acide aminé E. Dans le peptide VIRSANFTDNAKT, la valine correspond à l'acide aminé 276 (base nucléotidique initiale 6591) et la thréonine correspond à l'acide aminé 288 (base nucléotidique terminale 6630), selon la numérotation de MYERS donnée dans la publication précitée et également par rapport à l'article de Cell 1985 précité. A titre de rappel on donne ci-dessous la liste des acides aminés en correspondance avec leur code à une lettre. Acide aminé Code à une lettre Alanine A Arginine R Asparagine N Acide Aspartique D Asparigine ou acide Aspartique B Cystéine C Glutamine Q Acide Glutamique E Glutamine ou acide Glutamique Z Glycine G Histidine H Isoleucine I Leucine L Lysine K Méthionine M Phénylalanine F Prou inde P Sérine S Thréonine T Tryptophane W Tyrosine Y Valine V L'invention comprend aussi, conformément à la définition donnée dans les pages ci-dessus, une séquence peptidique comprenant tout ou partie de l'enchaînement WIRSANFTDNAKT modifié, pourvu que la séquence peptidique formée soit immunogène. Ainsi l'enchaînement modifié peut être délété d'un ou plusieurs acides aminés ou peut comprendre des acides aminés substitués par des acides aminés équivalents sur le plan antigênique et/ou immunogène.On peut également ajouter à l'enchaînement ci-dessus, ou à une partie de cet enchaînement, les acides aminés voisins sur la séquence d'acides aminés de HIV-1. L'invention peut par exemple concerner le polypeptide répondant à la séquence comprenant les acides aminés 270 à 336 ou 276 à 336 (numérotation de MYERS) de la séquence de HIVlBRU décrite dans la publication de MYERS précitée. L'invention concerne par ailleurs une molécule hybride caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'acides aminés hétérologues ou une particule hétérologue, et une séquence peptidique répondant à la définition de l'invention, dans des conditions permettant la production d'anticorps dirigés contre la susdite séquence peptidique. Un enchaînement d'acides aminés hétérologue, une particule hétérologue, sont par exemple des protéines différentes des séquences peptidiques selon l'invention telles qu'elles ont été décrites ci-dessus. Les molécules hybrides sont telles qu'elles permettent la production d'anticorps dirigés contre la séquence peptidique de l'invention et sont donc avantageusement capables de générer des anticorps protecteurs vis à vis de l'infection par HIV-1. A titre d'exemple on peut citer comme protéines porteuses et particules hétérologues, la sérum albumine bovine (BSA), l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg), lam B, mal E, la protéine KLH. De façon générale toute molécule hybride intéressante dans le cadre de l'invention doit permettre l'expression de l'immunogénicité de la séquence peptidique selon l'invention. Cette condition peut par exemple être remplie lorsque la molécule hybride permet l'exposition à sa surface de l'haptène ou de l'épitope de cette séquence peptidique. L'invention vise par ailleurs un oligomère, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 2 motifs, constitués par une ou plusieurs séquences peptidiques décrites précédemment. De tels oligomères peuvent être des holoprotéines ou des hétéroprotéines selon qu'ils comprennent des motifs toujours identiques ou des motifs constitués par différentes séquences peptidiques selon l'invention. De tels oligomères peuvent présenter l'avantage d'augmenter le caractère immunogène des séquences selon l'invention. L'invention concerne par ailleurs des compositions antigéniques et des compositions immunogènes, caractérisées en ce qu'elles comprennent une ou plusieurs séquences peptidiques selon la définition donnée ci-dessus pour ces séquences. De telles compositions peuvent comprendre en outre des oligomères tels que décrits ci-dessus ou être constituées par ces oligomères. Une autre composition immunogène selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend des molécules hybrides, et/ou le cas échéant des séquences peptidiques, et/ou le cas échéant des oligomères correspondant aux définitions données précédemment. Selon un mode de réalisation avantageux, des compositions immunogènes comprennent en outre une séquence immunogène de HIV-1, différente de la séquence peptidique selon l'invention, éventuellement la contenant. Ainsi des compositions préférées sont caractérisées en ce que la séquence immunogène supplémentaire de HIV-1 est sélectionnée parmi les glycoprotéines d'enveloppe gpl60, gp120, la gp41 de HIV-1, ou le peptide correspondant à la boucle V3, ainsi que parmi toutes les protéines immunogènes capables de déclencher ou de participer à la production d'anticorps protecteurs vis à vis de HIV-1. Dans la mesure où la réponse immunitaire protectrice contre HIV-1 peut être soit une réponse primaire, soit une réponse secondaire telle que définie dans les pages précédentes, l'invention a également pour objet une combinaison comprenant à titre de principes actifs, une séquence peptidique selon l'invention et une séquence immunogène spécifique de HIV, en particulier de HIV-lBRU HIV-lN, HIV-lRF, différente de la susdite séquence peptidique, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps dans des conditions permettant la production d'anticorps protecteurs contre HIV et en particulier contre HIV-1, chez une personne à laquelle elle est administrée. Une telle combinaison peut donc être constituée par des principes actifs administrés dans le temps de façon simultanée, séparée ou étalée comme c'est le cas par exemple lorsque la réponse immunitaire est améliorée ou est déclenchée par l'administration sous forme de rappel des séquences peptidiques selon l'invention ou d'une séquence immunogène différente de HIV-1. Dans le cadre de ces combinaisons, les différents principes actifs peuvent être sous forme de constituants individuels séparés ou peuvent être présentés sous forme de mélanges. Une composition préférée comprend à titre de principes actifs, une séquence peptidique répondant à la définition donnée dans les pages précédentes et une glycoprotéine d'enveloppe de HIV-1 notamment la glycoprotéine gp120, par exemple celle de HIV-lBRU. Dans ce cas la gap120 sera administrée en premier lieu, les séquences peptidiques pouvant être utilisées simultanément ou de façon étalée dans le temps, le cas échéant à plusieurs reprises pour déclencher une réponse de type rappel. Les compositions immunogènes décrites ci-dessus peuvent être utilisées comme vaccin pour prévenir une infection par HIV-1. Dans ce cas elles peuvent être administrées par injection, par voie orale, sous forme de solutions, suspensions, comprimes, gélules ... Les principes actifs sont associés dans ce cas avec des excipients habituellement utilisés pour la préparation de vaccins et le cas échéant associés avec un adjuvant. Les séquences peptides et protéines de l'invention peuvent être utilisées dans les vaccins sous leur forme naturelle ou sous forme de sels pharmaceutiques acceptables. De même ces séquences peptides et protéines peuvent être modifiées chimiquement pour améliorer leur stabilité, réduire leur toxicité. Dans ce but on se reportera avantageusement à la description de la demande de brevet EP 0306219. L'invention vise aussi un acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour l'une des séquences peptidiques décrite ci-dessus. Un acide nucléique particulier est caractérisé en ce qu'il répond à l'enchaînement suivant GTAATTAGATCTGCCAATTTCACAGACAATGCTAAAACC Cet enchaînement correspond à la séquence d'acides aminés suivante VIRSANFTDNAKT La séquence nucléotidique peut être utilisée pour transformer un microorganisme intéressant pour préparer un vaccin vivant, par exemple un poxvirus comme celui de la vaccine, l'adénovirus, une bactérie telle que E.coli non pathogène. Le microorganisme ainsi transformé est alors administré à l'homme chez lequel il produit la séquence peptidique codée pour l'acide nucléique ci-dessus ou un équivalent. Le microorganisme porteur de la séquence peptidique de l'invention est alors mis dans des conditions permettant la production d'anticorps protecteurs, par analogie avec ce qui est décrit plus haut pour la séquence de l'invention. La transformation du microorganisme est effectuée selon les techniques classiques et ce avantageusement de façon à permettre l'exposition de la surface cellulaire, de la séquence de HIV-1 produite. L'invention vise par ailleurs des anticorps polyclonaux ou des anticorps monoclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent la séquence peptidique selon l'invention. Un anticorps monoclonal préféré est caractérisé en ce qu'il reconnait un épitope localisé sur la séquence NFTDN. De tels anticorps peuvent être obtenus par la technique des hybridomes, à partir d'animaux préalablement immunisés soit avec une séquence peptidique de l'invention, soit avec une gp120 ou avec une gp160 de HIV-1, les cellules spléniques de l'animal immunisé étant ensuite fusionnées avec des cellules de myélome et les hybrodomes formés étant sélectionnés sur la base de la production d'anticorps capables de reconnaitre les séquences peptidiques de l'invention. A titre préféré un anticorps monoclonal de l'invention est caractérisé en ce qu'il reconnait une séquences d'acides aminés de l'invention et la gap120 des isolats HIV-lBRU, HIV-1RF et HIV-1F. L'invention vise aussi un hybridome tel qu'obtenu par fusion de cellules de myélome avec des cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec la séquence d'acides aminés de la glycoprotéine gp160 de HIV-lBRU comprenant les acides aminés ThrM à Leu & à l'exception du fragment polypeptidique comprenant les acides aminés Ile696 à Val717 delété. Un hybridome particulier sélectionné à partir de ceux précédemment decrits est un hybridome qui produit des anticorps monoclonaux dirigés contre les séquences peptidiques de l'invention. I1 s'agit notamment de l'hybridome 110-E déposé à la CNCM (Collection Nationale des Cultures de Microorganismes Paris-France) le 5 Juin 1991 sous le numéro 1-1108. L'invention concerne en outre des anticorps antiidiotypiques reconnaissant les anticorps polyclonaux ou moclonaux précédemment décrits. Ces anticorps antiidiotypiques peuvent par exemple être obtenus après immunisation d'un animal avec des anticorps tels que décrits ci-dessus, et récupération des anticorps polyclonaux formés, séparation et purification selon les techniques habituellement utilisées, par exemple par chromatographie. Des anticorps monoclonaux antiidiotypiques peuvent aussi être obtenus à partir de l'hôte immunisé avec des anticorps reconnnaissant les séquences peptidiques de l'invention, en particulier par application de la technique des hybridomes. D'autres techniques habituellement utilisées pour la production des anticorps, en particulier des anticorps monoclonaux, peuvent être utilisées. Par ailleurs, ces anticorps peuvent être humanisés selon par exemple la technique de Reichmann L. et al (Nature 332: (6162) 323, 1988). Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour le diagnostic in vitro d'une infection par HIV-1, par exemple pour mettre en évidence des antigènes de HIV-1 ou dans le cas des anticorps anti-idiotypiques, pour la recherche d'anticorps par exemple dans du sérum de patient infecté par HIV-1. Ces anticoprs anti-idiotypiques sont aussi susceptibles d'entrer dans des compositions immunogènes protectrices contre l'infection par HIV-1 et le cas échéant ils peuvent être utilisés pour réaliser une immunothérapie. Les peptides selon l'invention peuvent être avantageusement préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide. Pour préparer les peptides par synthèse on peut avoir recours à la technique de synthèse en solution homogène telle que décrite par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé "Methode der Organischen Chemie" (Méthode de la Chimie Organique) édité par E. Wunsch, Vol 15-I et II, THIEME, Stuggart 1974. Un autre principe de synthèse est par exemple de mettre en présence une phase solide dans laquelle s'assemble la séquence du peptide et une phase liquide contenant solvants et réactifs. A chaque étape la séparation entre le peptide en croissance et les réactifs se fait par simples filtrations et lavages. Le procédé de synthèse d'un peptide conforme à ce qui est décrit plus haut est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a/ mise en contact d'un support solide portant un groupement réactif apte à réagir avec une fonction carboxyle, avec le premier acide aminé C-terminal de la chaîne à synthétiser, protégé au niveau de la fonction amine devant ultérieurement intervenir dans le couplage avec un autre acide aminé, pour éviter l'auto-condensation; b/ déprotection de la fonction amine de l'acide aminé précédemment cité; c/ couplage de la fonction amine déprotégée de l'acie aminé à l'issue de l'étape b/ avec la fonction carboxyle d'un deuxième acide aminé, protégé au niveau de sa fonction amine et qui fournit le deuxième résidu aminoacyle alors couplé au résidu aminoacyle C-terminal du peptide à synthétiser; d/ déprotection de la fonction amine du deuxième acide aminé ajouté et répétition des étapes c/ de couplage et d/ de protection, successivement avec les acides aminés correspondant respectivement aux résidus aminoacyle successifs jusqu'à aboutir au résidu aminoacyle N-terminal dudit peptide; e/ séparation du peptide formé, par traitement de la phase solide portant le peptide synthétisé, notamment au moyen de l'acide fluorhydrique, une fois obtenu 1 'acide-aminé N-terminal; f/ récupération de la séquence peptidique à partir de la solution. Dans un mode de réalisation préféré du procédé précédent, l'étape b/ de déprotection est suivie par une étape de neutralisation destinée à rendre la fonction amine nucléophile. Dans un autre mode de réalisation particulier, on peut encore avoir recours à une seconde étape de couplage réalisée après lavage et neutralisation du peptide obtenu à l'issue de l'étape c/, au moyen d'un agent de couplage, afin de permettre la réaction des fonctions amine qui n'avaient pas réagi lors du premier couplage. I1 est entendu que le procédé de synthèse des peptides selon l'invention n'est pas limité au procédé précédemment décrit mais englobe au contraire toutes les variantes dans la mesure où la séquence peptidique ainsi synthétisée conserve les propriétés immunologiques souhaitées. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent. EXEMPLES 1) Purification de la gp160 à partir du surnageant de cellules BHK Protéines La gp160 est un dérivé (Thr3s-Leussg) de la protéine d'enveloppe de HIV-1 (Cell 1985 vol 40, 9-14) avec une délétion du segment trans-membranaire potentiel Ile696 Val717. .Poids moléculaire calculé 91,5 kDa (809 acides aminés) .IP calculé : 8,54 La protéine contient 32 sites de glycosylation potentiels (Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr) et est fortement glycosylée (environ 42% de la masse). Purification Les échantillons sont dérivés d'un surnageant de cellules BHK infectées avec un culot obtenu par traitement au sulfate d'ammonium du virus de la vaccine 1163. Schéma de purification Précipitation au sulfate d'ammonium (à BV) et récupération du culot de précipitation qui est ensuite resolubilisé. - Précipitation avec HClo4, récupération du surnageant, suivie d'une neutralisation Tris et d'une ultrafiltration, - Dialyse contre l'eau du produit de l'ultrafiltration et récupération du culot par centrifugation, - Précipitation avec le sulfate d'ammonium 80% et sélection du culot resolubilisé dans un petit volume, - Exclusion HPLC par taille (2 fois Zorbax) et sélection des fractions enrichies en gp160. Chromatographie HPLC en phase inverse et récupération des fractions enrichies en gpl60. L'échantillon est conservé congelé dans de la glace sèche et fourni dans du PBS. La pureté de la gp160 est obtenue à 82,1%. Purification de la gap120 à partir du surnageant de culture de cellules de BHK Protéines Le fragment R env.5 désigné ci-après gp120 est le segment comprenant les acides aminés ThrM à Arg5 de la protéine d'enveloppe du virus HIV (Cell 1985 Vol 40, page 9 et suivantes). Son poids moléculaire calculé est 53,9 kDa, son IP calculé est 8,48. La protéine est fortement glycosylée : elle possède 25 sites potentiels de glycosylation (Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr) au niveau des sites asparagine 95, 143, 148, 153, 168, 172, 198, 209, 242, 246, 253, 2i4, 288, 301, 307, 313, 344, 351, 368, 398, 404, 409, 418, 460 et 475. Purification L'échantillon est dérivé de 19 litres de surnageant de culture de cellules BHK infectées avec le virus de la vaccine 1132. Schéma de purification - Précipitation au sulfate d'ammonium (å PV) et récupération du culot qui est ensuite resolubilisé, - Traitement au chlorure de guanidium et dialyse puis récupération du surnageant, - Ultrafiltration et sélection de la phase concentrée puis, chromatographie d'exclusion par taille pour recueillir la fraction riche en gap120. Cette étape est suivie d'une chromatographie HPLC par echange d'anions pour récupérer les fractions enrichies en gp120. On réalise enfin une ultrafiltration avec échange sur tampon pour recueillir le produit final. L'échantillon est conservé dans de la glace et fourni dans du PBS. La gp120 obtenue est pure à 73%. Pour la purification des glycoprotéines gap120 et gpl60 on peut se reporter à la publicationde SCHMITT D. et al dans C.R. Acad. Sci. Paris t308, Série III p269275, 1989. 2) Obtention d'anticorps monoclonaux murins dirigé contre la qp120,,u Des souris de la souche Biozzi (BIOZZI G. et al (Prottides of The Biological Fluids. Proceedings of the 17th Colloquium, Bruges 1969. Editor H. PEETERS PERGAMON PRESS-OXFORD & NEW-YORK, 1970) et J. Immuno logical methods 38, 225-230, 1980) ont été immunisées avec un dérivé recombinant formé par la séquence comprise entre les acides aminés ThrB et Leu de la gp160 de HIV-lBRU, délétée de Ile6 à Val717, produite dans des cellules de BHK et obtenue pure à 82%, selon la technique de Transgene S.A. décrite ci-dessus. La délétion effectuée a pour but de supprimer un fragment transmembranaire hydrophobe. Les séquences décrites ici sont repérées par rapport aux séquences données dans Cell 1985, 40, 9-14. Les souris ont successivement reçu 25g (en ACF) par voie sous cutanée, puis par la même voie 10g (en AIF) 3 fois de suite avec 15 jours d'intervalle entre chaque injection. Apres contrôle des taux sériques d'anticorps dirigés contre la gp160, les cellules spléniques ont été fusionnées selon la technique de Kohler et Milstein (Eur. J . Immunol, 1976, 6, 511-519). Les hybridomes secrétant des anticorps reconnaissant l'immunogene ainsi que l'enchaînement de la gp120 localisé entre les acides aminés ThrB et Art58 de la séquence decrite dans Cell ci-dessus (délétée de son peptide signal hydrophobe correspondant aux acides aminés 1 à 37) produite dans les mêmes conditions que la gp160 par Transgène, ont été sélectionnés en ELISA et RIA.Les hybridomes dont les milieux de culture se sont avérés producteurs d'anticorps reconnaissant gp160 et gp120 ont été sous-clones par dilution limite. Ont été ainsi sélectionnés différents hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifiques de la partie extramembranaire (gp120) de la glycoprotéine d'enveloppe, parmi lesquels l'anticorps appelé 110-E. 3) Mise en évidence des protéines reconnues par l'anticorps 110-E Parmi les anticorps sélectionnes, des dilutions de 5 en 5 du 110-E ont été testées (à partir d'une concentration de 10 g/ml) en ELISA, sur plaques recouvertes avec les protéines gP160BRU et gp120BRU à une concentration de 1 yg/ml. Les 2 proteines étant reconnues de façon identique, la localisation de l'épitoge du 110-E sur la gp120 a été confirme, en Western Blot (LAV Blot I, Diagnostics Pasteur & Dupont HIV-1 Western Blot Kit) après incubation des bandelettes de nitrocellulose avec l'anticorps à une concentration de 5 Ag/ml puis révélation avec les anticorps de mouton anti-IgG de souris couplés à la phosphatase alcaline. Une fixation sur les bandelettes au niveau des protéines gpl60BRu et gp120BRU est observée. Des expériences d'immunoprécipitation ont été réalisées : 2,7 g de virus HIV-1BW inactivé, complété avec 1 g de gp120BRU ont été incubés 1h à 37 C avec 1 g de 110-E; 20 gl de proteine G-Sepharose sont ensuite ajoutes dans le tube et le mélange ainsi obtenu est incubé la nuit, à 4 e C. Après centrifugation le culot est remis en suspension, 4 fois dans du PBS Tween (0,1%) puis traité 5 minutes à 95 C dans un tampon de denaturation (Tris HCl 125 mM pH 6,8, SDS 8%, Glycérol 40%, ss-mercaptoethanol 2%, bleu de bromophénol 0,2%). Le surnageant obtenu après centrifugation est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (10%) puis les proteines séparées sont transférées sur membrane de nitrocellulose.La membrane est saturée en PBS-BSA 3%, puis incubee avec un mélange d'anticorps monoclonaux anti-pl8, p25, gp41, gp120 de HIVlRRU, puis avec des anticorps de mouton anti-IgG de souris couplés à la phosphatase alcaline. L'anticorps 110-E est apte a immunoprécipiter spécifiquement la gp120BRU. 4) Mise en évidence des capacités neutralisantes de l'anticorps 110-E L'anticorps est incubé à des concentrations variables (lh, 37"C) avec 0,1 ml de surnageant de virus produit sur la lignée CEM, à une dilution de virus determinee comme etant la dernière présentant, dans la semaine suivant l'infection, un effet cytogène pour les cellules cibles MT4 infectées par HTLV-l. 3.105 cellules de MT4 sont ajoutées dans chaque cupule contenant virus et anticorps, puis incubees 1 à 2h à 37 C. Le surnageant est remplacé par du milieu frais puis les cellules mortes (coloration au bleu trypan) sont mises en évidence 7 jours après pour évaluer la capacite de l'anticorps à inhiber l'effet cytopathogene du virus. L'anticorps 110-E s'est montré apte à bloquer l'effet cytopathogène de HIV-lBRU à des concentrations supérieures ou egales à 10 pg/ml; aucune toxicité cellulaire n'a été observée. 5) Mise en évidence d'un peptide reconnu par 110-E Des peptides synthetiques dont les séquences recouvrent la majorité des zones immunodominantes de la gp120 de HIV-lBRU ont été déposés sur plaque de microtitration à une concentration de 5 pg/ml. L'anticorps 110-E (1 g/ml), a été rajouté dans les plaques recouvertes avec les différents peptides et sa fixation sur chacun d'entre eux établie grâce à un conjugué peroxydase/anticorps de mouton anti-IgG de souris. La capacité de fixation de l'anticorps sur le peptide correspondant aux acides aminés 252 à 273 du peptide d'enveloppe de HIV (référence MYERS) inclu dans l'antigène de surface du virus de l'hépatite B, HBsAg code par la sequence décrite dans Nature Vol. 281, 25 Octobre 1979 été testée par technique immunoenzymatique. Le seul peptide reconnu est le peptide 270LAE EEVVIRSANTFTDN285, alors que ni le peptide pp047 de l'enveloppe de HIV situé entre les acides aminés 252 et 272 (réference MYERS), ni le peptide ci-dessus décrit inclu dans HBsAG ne le sont. 6) Mise en évidence de la capacité de 110-E à reconnaitre d'autres souches de HIV-1 Restriction de l'épitope par analyse des réactivités croisées de l'anticorps L'anticorps 110-E a été mis en contact, à une concentration de 10 Ag/ml avec des cellules des lignées CEN infectées par HIV-lBRu, H9 infectées par HIVlRF, HUT78 infectées par HIV-lsF2 ou par HIV-1MN, CEM infectées par HIV-lELI et sur des cellules CEM infectées par HIV2RoD, fixées sur lame.La reconnaissance des glycoprotéines de ces virus par l'anticorps murin a été établie par traitement des lames avec des anticorps de mouton anti-IgG de souris couples à la peroxydase, suivie d'une mise en evidence de l'activité de l'enzyme. Un test ELISA de confirmation a été réalisé en testant la capacité de l'anticorps 110-E de se fixer sur une plaque de micro filtration recouverte avec de la gp160MN recombinante (Pasteur Mérieux, Sérums & BR Vaccins). Un western blot de confirmation a été réalisé avec cette même gp160MN recombinante. Parmi les variants viraux testés, HIVlBRU, HIV-1N et HIV-1RF produisent une gpl20 qui est reconnue par 110-E; le résultat a été confirme sur gp160MN. L'analyse des séquences de la région équivalente à 270-285 chez HIVlBRU chez différentes souches virales de HIV-1 est presentée ci-dessous reconnaissance HBsAG ------ LAEE pp047 ------ LAE BRU 270LAEEE VAIRS ANFTD N AKT2ss + SF2 -------- ----- D---N MN -------- ----- E---- - --- + RF -------- ----- E---- - V-- + ELI -------- -I--- E-L-N - --N Le fait que la glycoprotéine de SF2 ne soit pas reconnue indique que l'épitope de l'anticorps inclut au moins une des 2 mutations en 280 (A-- > D) et 284 (D-- > N).La mutation en 280 (A-- > E) par rapport à l'immunogène BRU, n'aboutissant pas à une abolition de la reconnaissance et n'altérant pas l'affinité pour la protéine MN, bien qu'elle ne soit pas supposée conservative (Wang, Nature, 343, 556), l'épitope de l'anticorps 110-E englobe au moins les acides aminés de la séquence NFTDN soulignee ci-dessus. 7) Détermination des constantes d'affinité de 110-E Les constantes d'affinité de 110-E pour les protéines gpl60BRu et gp160MN ainsi que pour le peptide 247 ont été établies suivant la technique de FRIGUET et al (J. Immunol. Methods, 1985, 77, 305). Brièvement, des concentrations variables des 3 antigènes ont été incubées (1 nuit à 4"C) avec l'anticorps 110-E à une concentration de 400 ng/ml. Le mélange est ensuite déposé (15 min à 4 C) sur une plaque de microtitration recouverte avec 1 Zg/ml de gPl6oBRu. La fixation de l'anticorps demeuré libre est établie par adjonction d'un anticorps de mouton anti IgG de souris, couplé à la ss-galactosidase puis de 4méthyl-umbéliféryl ss-Dgalactoside (substrat fluorescent de la p-galactosidase). La transformation des résultats sous forme de droite de Klotz, permet d'établir le 4 de l'anticorps pour les immunogènes. Les affinités de 110-E pour gpl60BRu, gpl60-MN et pour le peptide 247 ont été établies respectivement à 1,3 10-7M, 5,0 107M et 3,0 10-7M, confirmant le fait que l'épitope n'est pas conformationnel. 8) Recherche de séquences proches de celle de ltépitope de l'anticorps 110-E dans les séquences des protéines humaines La séquence de l'épitope potentiel etendu de 1'anticorps 110-E (SANFTDN) a été comparée aux séquences des protéines humaines contenues dans la banque de séquences NBRF (Release 26.0); ont été recherchées les protéines contenant au moins 4 homologies de séquence avec SANFTDN, dans une séquence de 7 acides aminés consécutifs. Aucune protéine humaine autre que virale ne présente d'homologie au seuil de détection fixé. REVENDICATION8 1. Séquence peptidique, caractérisée en ce qu'elle est immunogène et en ce qu'elle correspond à tout ou partie de l'enchaînement peptidique suivant VVIRSANFTDNAKT, ou à tout ou partie d'un enchaînement modifié par substitution, délétion ou addition d'au moins un acide aminé par rapport à cet enchaînement. 2. Séquence peptidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle permet la production d'anticorps neutralisants vis à vis de HIV, en particulier vis à vis de HIV-1, et notamment vis à vis des isolats HIV-1BRU, HIV-1MN et HIV-1RF. 3. Séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchaînement NFTDN. 4. Séquence peptidique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle répond à 1 'enchaînement NFTDN. 5. Séquence peptidique selon la revendication 1, ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle repond à l'un des enchaînements peptidiques suivants VIRSANFTDNAKT IRSANFTDNAKT RSANFTDNAKT SANFTDNAKT AN FT DNAKT NFTDNAKT NFTDNAK NFTDNA ANFTDN SANFTDN RSANFTDN IRSANFTDN VIRSANFTDN ou l'un de ces enchaînements peptidiques dans lequel le premier acide aminé A est substitué par E. 6. Molécule hybride, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'acides aminés hétérologue ou une particule hétérologue et une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 , dans des conditions permettant la production d'anticorps protecteurs diriges contre la susdite sequence peptidique. 7. Molecule hybride selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'enchaînement d'acides amines heterologue ou la particule hétérologue est choisi parmi la sérum albumine bovine (BSA), l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg), lam B, mal E, la KLH. 8. Oligomère, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 2 motifs, constitués par une ou plusieurs séquences peptidiques selon 1'une quelconque des revendications 1 à 5. 9. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une ou plusieurs séquences peptidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 10. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend les oligomères selon la revendication 9 et/ou le cas échéant une ou plusieurs séquences peptidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 11. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend des molécules hybrides selon la revendication 6 ou la revendication 7 et/ou le cas échéant des séquences peptidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et/ou le cas échéant des oligomères selon la revendication 8. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une séquence immunogène de HIV-1 differente de la séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que la séquence immunogène de HIV-1 est sélectionnée parmi les glycoprotéines d'enveloppe gp160, gp120 ou gp41 de HIV-1, la boucle V3, ou toute séquence capable de déclencher ou de participer à la production d'anticorps protecteurs vis à vis de HIV-1. 14. Combinaison comprenant à titre de principes actifs, une séquence peptidique selon 1 'une quelconque des revendications 1 à 5 et une séquence immunogène spécifique de HIV, en particulier de HIV-lBRU, HIV-1N, HIV-1RF, differente de la susdite séquence peptidique, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps dans des conditions permettant la production d'anticorps protecteurs contre HIV et en particulier contre HIV-1, chez une personne à laquelle elle est administree. 15. Combinaison selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principes actifs une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et une glycoprotéine d'enveloppe de HIV-1, notamment la gp120 de HIV~1sRu 16. Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il code pour une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 17. Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il répond à l'enchaînement suivant GTAATTAGATCTGCCAATTTCACAGACAATGCTAAAACC 18. Anticorps polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent la séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 19. Anticorps monoclonal, caractérisé en ce qu'il reconnait la séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 20. Anticorps monoclonal selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il reconnait un épitope localisé sur la séquence NFTDN. 21. Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce qu'il reconnait la glycoprotéine gpl20 des isolats HIV-lBRU, HIV- 1RF, HIVlMN. 22. Hybridome tel qu'obtenu par fusion de cellules de myélome avec des cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec la séquence d'acides aminés de la glycoprotéine gp160 de HIV-1BRU comprenant les acides aminés Thr38 à Leu868 à l'exception du fragment polypeptidique comprenant les acides aminés Il696 à Val717 délété. 23. Hybridome selon la revendication 22, capable de produire des anticorps monoclonaux dirigés contre une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 24. Hybridome selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il est désigné par 110-E et qu'il correspond à la souche déposée le 05 Juin 1991 sous le n" I-1108. 25. Composition pour le diagnostic in vitro de la présence d'antigènes résultant d'une infection par un rétrovirus HIV-1, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps selon l'une quelconque des revendications 18 à 21. 26. Composition pour la détection in vitro d'une infection due à un rétrovirus HIV-1, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.