Brevet FR2673429A1 — publié le 19920904

INHIBITEUR LYMPHOCYTAIRE DES FONCTIONS DU SYSTEME IMMUNITAIRE L'invention est relative à un principe hydrosoluble capable d'inhiber les fonctions du système immunitaire, en particulier chez l'homme. Elle concerne aussi les applications de ce principe hydrosoluble à la constitution de compositions pharmaceutiques, notamment à visée thérapeutique immunosuppressive ou antitumorale ou encore pour l'inhibition de réplications de virus ayant un tropisme pour les cellules appropriées correspondantes de l'hôte, notamment de virus lymphotropes. L'invention concerne encore la production d'anticorps spécifiques de ce principe hydrosoluble et leurs applications, notamment au diagnostic ou à l'inhibition de la surproduction chez l'hôte d'un principe hydrosoluble du même type ou des cellules qui les produisent, notamment des lymphocytes T CD8+CD57+. Des études antérieures ont en effet montré que les cellules CD8+CD57+ inhibent les réponses prolifératives B et T induites par des mitogènes, ainsi que la différenciation in vitro de cellules B et leur capacité à sécréter des immunoglobulines in vitro. En particulier, il a été constaté une augmentation tardive de ces cellules dans le sang périphérique et les poumons de patients infectés par le VIH (virus d'immuno-déficience humaine). Leur capacité à inhiber l'activité de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques du VIH ou d'alloantigènes a été démontrée. Les abbréviations suivantes seront utilisées dans la suite du teste NK : Natural Killer (cellules tueuses naturelles) LAK : Lymphokin Activated Killer (cellules tueuses activées de lymphokines) CTL : Cytotoxic T lymphocytes (lymphocytes T cytotoxiques) CMNS : Cellules mononucléées sanguines FITC : Fluoroisothiocyanate PE : Phycoerythrine AcMo : Anticorps monoclonal Plus généralement il a maintenant été observé que l'on pouvait observer une augmentation importante des lymphocytes CD8+CD57+ au cours de certains états pathologiques tels que les transplantations d'organes et les infections virales persistantes à (cytomegalovirus), EBV (virus d'Epstein-Barr) ou VIH. Cette sous-population de lymphocytes, normalement faiblement représentée, peut ainsi devenir majoritaire au sein des cellules CD8. I1 a en outre maintenant été montré qu'aucune activité cytotoxique des lymphocytes alvéolaires ne pouvait être mise en évidence sur des tests standard de relargage de chrome, chez la majorité des patients parvenus au stade d'ARC ou de SIDA. Mais il a été constaté que les lymphocytes alvéolaires CD8+CD57+ inhibaient l'activité cytotoxique anti-VIH de façon non spécifique d'antigène (s'exerçant aussi bien sur des CTL spécifiques du VIH que sur des CTL allospécifiques) et non restreinte par des antigènes HLA. L'effet inhibiteur des cellules CD8+CD57+ a été démontré sur trois types d'effecteurs cytotoxiques provenant de donneurs sains : des CTL alloréactifs, des cellules NK) et LAK. L'addition de cellules CD8+CD57+ sélectionnées positivement à ces effecteurs cytotoxiques induit une inhibition dose-dépendante des trois types de cytotoxicité. Cet effet inhibiteur n'est pas restreint par les antigènes du CMH et diffèrent d'un effet lytique puisque les cellules CD8+CD57+ n'exercent aucun effet cytotoxique spontané sur diverses cibles cellulaires dans un délai de 4 à 72 heures. Les mêmes résultats ont été obtenus à partir de cellules CD8+CD57+ amplifiées après transplantation médullaire, rénale ou cardiaque. Dans l'ensemble, ces résultats suggèraient que les cellules CD8+CD57+ exercent un contrôle sur divers types de réponses immunitaires. Une étude phénotypique a été effectuée par immunofluorescence en triple couleur chez les patients VIH et transplantés avec des résultats identiques, montrant que ces cellules expriment les antigènes CD2, CD7, CD5 et sont des cellules T matures différenciées puisqu'elles portent le complexe CD3-Récepteur de type alpha, bêta. Contrairement aux cellules NK, elles sont CD16- et CD56-. L'analyse des marqueurs d'activation montrent l'absence d'expression des récepteurs de l'iL2 (CD25) et de la transferrine (CD71). 5 à 10% seulement expriment l'antigène HLk-Dr à leur surface. L'invention concerne plus particulièrement le facteur hydrosoluble, suppresseur non spécifique de l'immunité, tel que celui qui peut être obtenu à partir de lymphocytes T CD8+CD57+. I1 a été découvert que le surnageant (SN) de cellules CD8+CD57+ mais non des cellules CD8+CD57-, produit spontanément en 4 à 24 heures, à 37"C, en l'absence de stimulation préalable, était à même d'exercer une inhibition identique au nombre correspondant de cellules productrices sur les différents effecteurs cytotoxiques préalablement définis. Le surnageant est actif sur des cellules effectrices mais non sur leur cibles et n'est pas cytolytique.Ces surnageants de cellules CD8+CD57+ inhibent également la prolifération de cellules mononucléées sanguines B et T induite par des mitogènes tels que PHA ou PWM ou par une stimulation du complexe CD3/récepteur spécifique à l'antigène. De même la prolifération de lignées cellulaires tumorales lymphoblastoïdes T( CEM, JURKAT), B, transformées par 1'EBV, myélo-monocytaires ou granuleuses ( U937, K562) est inhibée spécifiquement par des surnageants de cellules CD8+CD57+ purifiées. L'activité suppressive de ces surnageants n'est pas inhibée par des anticorps neutralisants du TNFa, B, TGFB1 et B2 ou IFNz, ni par pré-incubation des cellules productrices en présence d'inhibiteurs de synthèse des prostaglandines (indomethacine, ETYA). Enfin, ces SN ne contiennent pas d'IFN, IL2, IL4 ou IL6, ni de PGE2 à des taux détectables. Par contre, l'inhibition de l'activité cytotoxique induite par ces SN est bloquée par addition secondaire d'IL4 ou d'IFNz. De façon plus générale, l'invention concerne donc un principe actif hydrosoluble capable d'inhiber des fonctions du système immunitaire, ce principe actif étant - susceptible d'être obtenu à partir de lymphocytes T qui sont eux-mêmes reconnus par des anticorps respectivement dirigés contre des antigènes CD8 et CD57 et - apte à inhiber l'activité cytolytique de cellules CTL. I1 est susceptible d'être obtenu à partir de lymphocytes T eux-mêmes reconnus par des anticorps monoclonaux reconnaissant les antigènes CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD57, mais non reconnus par des anticorps monoclonaux reconnaissant les antigènes CD16, CD25, CD56, CD71. I1 peut encore s'agir d'un facteur hydrosoluble, caractérisé en ce - qu'il inhibe l'activité cytolytique de cellules allospécifiques CTL, LAK et NK - qu'il inhibe la prolifération de cellules mononucléées sanguines B et T induites par des mitogènes tels que PIU (phytohémagglutinine) ou PWM (pokeweed mitogen) ou par une stimulation du complexe CD3/récepteur spécifique à l'antigène - qu'il inhibe spécifiquement la prolifération de lignées cellulaires tumorales lymphoblastoïdes ou granuleuses (U937, K562). L'invention concerne donc encore plus particulièrement un principe actif hydrosoluble du type sus-indiqué, lequel est en outre caractérisé en ce que son activité inhibitrice n'est perturbée ni par des anticorps neutralisants du TNF, ni par des anticorps neutralisants des facteurs TGFB1 et B2 ou des anticorps neutralisants de IFN-a, ni par préincubation en présence d'indométhacine ou d'ETYA ; en revanche en ce que cette activité est bloquée par l'addition secondaire d'IL4 (interleukine 4) ou d'IFNIFN-a (interféron). Un principe actif préféré de l'invention est en outre caractérisé en ce - qu'il est complexé par la concanavaline, le complexe étant dissociable par le a-méthyl-D-mannoside - que ses activités ne sont pas abolies par la trypsine, par l'exposition à une température de 80 à 100"C pendant une heure et à pH acide, 2 à 4. L'activité inhibitrice du SN CD8+CD57+ n'est abolie ni par la trypsine, ni par exposition à la chaleur (80"C ou 100"C) ou à pH acide. Elle est spécifiquement retenue sur colonne de Concanavaline A et éluée après addition de méthyl-mannoside, permettant un enrichissement de 5 fois en activité inhibitrice. Une étape de fractionnement sur gradient de glycérol a indiqué une constante de sédimentation faible inférieur à 1 S. Par ailleurs le poids moléculaire apparent (PM) estimé par gel filtration du facteur présent dans le SN CD8+CD57+ est de l'ordre de 20 à 30 kD.Une détermination plus précise des PM, réalisée par électrophorèse en SDS-PAGE, indique l'existence de 2 bandes colorables par la technique de coloration à l'argent dans les régions correspondant aux PM suivants : l'une de 34 à 37 kD pour l'une, 45-53 kD pour l'autre. I1 a été possible d'éluer de ces bandes l'activité inhibitrice de la cytotoxicité. L'invention concerne donc plus particulièrement des principes actifs de ce type qui s'assimileraient à des glycoprotéines (compte-tenu de la rétention observée de l'activité sur la colonne de concanavaline A) ayant des poids moléculaires de 20 à 55 kD, la cas échéant sous forme dimérique. Ces valeurs de poids moléculaires ne sont pas exclusives de valeurs différentes de poids moléculaires d'un principe actif davantage purifié, tel qu'il doit être obtenu à partir du surnageant susdit ou de solution comprenant les contenus dans les bandes de poids moléculaires sus-mentionnés, notamment sur des colonnes sur lesquelles auront été fixées des anticorps préalablement formés contre l'un des principes actifs sus-définis.A cet égard, l'invention concerne encore tout principe actif hydrosoluble capable d'inhiber des fonctions du système immunitaire et susceptible d'être obtenu à partir d'autres sources, dès lors qu'il possèderait une activité cytolytique de la même nature, voire les autres propriétés d'inhibition qui ont été constatées chez les principes actifs contenus dans les surnageants de lymphocytes CD8+CD57+, et que ces activités et propriétés seraient inhibées par les anticorps du genre en question. L'invention concerne encore un procédé de fabrication d'un principe actif conforme à l'invention, caractérisé par la mise en incubation d'une culture d'une population de lymphocytes T enrichie en des cellules de la sous-population CD8+CD57+, à la température, notamment à 37 C et pendant la durée de production, notamment 24 heures, au sein d'un milieu compatible avec ces lymphocytes et la récupération de ce principe actif à partir de ce milieu. Dans un mode de réalisation préféré de procédé selon l'invention, les cellules productrices ont auparavant été "immortalisées", notamment par l'intermédiaire d'une infection virale, par exemple avec un virus du type HTLV. L'invention concerne également les anticorps euxmêmes, plus particulièrement ceux qui inhibent les différentes activités du susdit principe hydrosoluble. Ces anticorps peuvent être obtenus par tout procédé classique, notamment par administration du principe actif hydrosoluble dans un état de pureté aussi avancé que possible à un hôte animal, notamment lapin ou souris, apte à réagir sur le plan immunitaire à ces principes actifs et à produire de tels anticorps. L'invention concerne aussi les anticorps monoclonaux présentant les caractéristiques rappelées plus haut, ainsi que les hybridomes obtenus par fusion entre des cellules spléniques d'un animal, notamment rat ou souris, et des cellules de myèlomes dans des conditions classiques (notamment selon la technique de Kohler et Milstein, Vol. 256, 7 août 1975) et par la sélection de ceux des hybridomes formés qui secrètent des anticorps monoclonaux dans des essais d'inhibition des différentes activités manifestées par le principe actif hydrosoluble selon l'invention, lorsque ceux-là sont amenés et maintenus au contact de celui-ci. De préférence on sélectionne ceux des anticorps monoclonaux qui seraient aptes à neutraliser les effets d'inhibition exercés par le principe actif hydrosoluble de l'invention, notamment l'inhibition que celui-ci exerce - sur l'activité cytolytique de cellules allospécifiques CTL - sur l'activité cytolytique de cellules allospécifiques CTL, LAK et NK et de préférence aussi - sur l'expression de lignées cellulaires tumorales lymphoblastoïdes ou granuleuses (U937, K562). L'invention concerne donc aussi les anticorps de ce type, immobilisés, notamment par fixation sur une colonne d'affinité, les anticorps ainsi immobilisés permettant la purification de solutions concernant les principes actifs hydrosolubles immunologiquement complémentaires. Un tel procédé de purification comprend - la mise en contact de ces solutions avec les anticorps immobilisés sur la colonne d'affinité, - la récupération du principe actif par dissociation du complexe anticorps-antigène formé, notamment en mettant le complexe au contact d'une solution ionique appropriée, par exemple HC1. L'invention concerne donc également les compositions à visée pharmaceutique dans lesquelles le principe hydrosoluble selon l'invention se trouve associé à des véhicules physiologiquement acceptables, choisis selon le mode d'administration envisagé, notamment par voie parentérale, perfusion comprise. L'utilisation de ces compositions à visée pharmaceutique doit être envisagée pour des thérapeutiques immuno-suppressives, anti-tumorales ou anti-virales et tout particulièrement dans tout désordre organique s'accompagnant d'une modification d'activité au sein de l'organisme des cellules NK, LK et CTL. De même l'invention concerne la composition à visée pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, les anticorps sus-définis aux fins de permettre de contrôler la production in vivo de l'inhibiteur produit par les cellules CD8+CD57+' lorsque celles-ci tendent à proliférer au-delà d'un seuil pré-déterminé, voire même à inhiber leur propre développement. L'invention concerne enfin également les compositions à base de ces anticorps utilisables pour le diagnostic et le dosage dans un échantillon biologique, notamment à base de lymphocytes du principe actif du type de celui produit par les cellules CD8+CD57+, les procédés alors mis en oeuvre consistant à mettre les anticorps du genre en question en contact avec l'échantillon biologique contenant le principe à détecter dans des conditions permettant la production d'un complexe immunologique entre ces anticorps et le principe actif recherché et la détection du complexe formé. I1 n'est pas nécessaire d'insister sur les techniques analytiques susceptibles d'être mises en oeuvre (méthodes ELISA, RIA ...). Des caractères supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit, d'exemples particuliers illustrant les conditions dans lesquelles le principe de l'invention peut être obtenu à partir de CD8+CD57+ et comment son activité peut être testée. Les légendes des figures 1 à 4 apparaissent à la fin de la description. MATERIELS ET METHODES Patients Deux groupes de patients ont été étudiés : 1) une cohorte de 100 patients infectés par le VIH dont la séropositivité a été affirmée par technique ELISA et de Western-Blot ; 2) une cohorte de 25 patients ayant reçu pour hémopathie maligne une allogreffe de moelle osseuse provenant de donneurs HLA identiques de la fratrie. Lymphocytes Les cellules mononucléées sanguines (CMNS) ont été isolées par gradient de centrifugation sur Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Suède). Analyse en immunofluorescence Une première étude en immunofluorescence (IF) directe des sous-populations lymphocytaires a été réalisée en double couleur sur sang total, en utilisant des anticorps monoclonaux (AcMo) couplés au FITC ou à la PE. Une analyse a été réalisée sur lymphocytes isolés, en triple couleur, en utilisant de plus l'AcMo anti-CD57 couplé à la biotine (Immunotech, France) révélé par addition de streptavidine couplée au Rouge Texas et à la PE (Duochrom, Becton Dickinson, France). Des combinaisons des AcMo suivants, couplés au FITC ou à la PE ont été utilisées : anti-CD4,8,25,71 (Immunotech) ; anti-CD2, 5, 7, w29,45RA (Coultronics, France) ; anti-CD3, - TcRaB, HLA-Dr (Becton-Dickinson).L'IF a été analysée sur 10.000 cellules par cytofluorométrie (FACSCAN, Becton-Dickinson, USA) Tri cellulaire Les cellules CD8+CD57+ ont été purifiées par 2 méthodes : 1) par fluorescence (FACS) sur un cytofluoromètre(FACSTAR, Becton-Dickinson, USA), triant les cellules CD8+CD57+ et CD8+CD57- (avec plus de 95% de pureté) ; 2) par billes magnétiques, en utilisant des billes magnétiques recouvertes d'avidine (Immunotech, France) et couplées à l'AcMo anti-CD57 biotinylé, permettant d'isoler les cellules CD57+ (enrichies à plus de 75 %) et CD57- (moins de 5 % de cellules résiduelles). Cellules cytotoxiques effectrices Les cellules cytotoxiques ont été obtenues à partir de donneurs volontaires sains. Des CTL spécifiques d'antigènes HLA ont été générés en culture mixte lymphocytaire (7) et testés contre des lignées lymphoblastoïdes B allogéniques. Les cellules LAK ont été obtenues après culture de 3 jours de CMNS, en présence de 100 u/ml d'I12 recombinante (Roussel, France) et testées contre les lignées lymphoblastoïdes Raji et Daudi. Les cellules NK ont été testées sur la lignée cellulaire K562 à partir de CMNS fraichement isolées. Tests de cytotoxicité Les tests de cytotoxicité ont été réalisés par étude du relargage de 51Cr, préalablement incorporé dans les cellules cibles, après un contact de 4 heures à 37 C de cellules effectrices (E) et cibles (C) à des rapports E/C décroissants. La lyse est appréciée par le pourcentage de relargage spécifique de 51 Cr dans le surnageant ; le relargage spontané (RS) variant entre 12 et 25 % de la radioactivité totale incorporée. Les tests d'inhibition de cytotoxicité ont été effectués en ajoutant au début du test de relargage de Cr, des concentrations décroissantes soit de lymphocytes totaux ou purifiés soit des surnageants correspondants, à des taux constants de cellules tueuses. L'inhibition a été calculée selon la formule suivante 5 relarcage expérimental (avec cellules suppresslves) - % RS 1 t relzrçage contrôle (sans cellules suppressives} - S RS PréDaration des surnaqeants (SN) Des SN ont été préparés à partir de cellulesl purifiées CD8+CD57+ et CD8+CD57- par FACS (fluorescence mesurée par cytofluorométril), ou CD57+ et CD57 par billes magnétiques.Les cellules ont été incubées 4 heures à 37"C, 5 x 106/ml, en RPMI 1640 supplémenté comme décrit précédemment mais ne contenant pas de sérum. Les SN ont été recueillis après centrifugation à 500 g des suspensions cellulaires et filtrés sur filtres de 0,22 um puis congelés à -80 C. Les traitements par inhibiteurs ont été réalisés par addition aux SN de : 1) Trypsine (Sigma, USA) aux concentrations de 2,5 à 0,25 mg/ml pendant 1 heure à 37"C, puis de l'inhibiteur spécifique, avant les tests de cytotoxicité ; 2) de sérums de lapins neutralisants anti TNFa et ss (200 u/ml (don du Dr J. Witzerbin, France) et d'AcMo neutralisants anti-TGFB1 et B2 (don du Dr G. Chaouat, France). Pour l'inhibition de synthèse des prostaglandines, des cellules CD8+CD57+ ont été préincubées 18 h dans un milieu de culture enrichi en indomethacine (10-4M, Sigma) ou ETYA (5 x 10-5, Sigma). Chromatographie d'affinité et filtration sur gel La chromatographie sur colonne de sépharose couplée à la concanavaline A (ConA) (Pharmacia, Suède) a été réalisée après saturation par albumine bovine, sur billes équilibrées à pH,6. Les SN cellules CD8+CD57+ purifiées, concentrés 4 fois, ont été déposés sur la colonne. Après lavage des fractions non liées, l'élution spécifique a été faite par addition de méthyl-a-D-mannoside (Sigma). Les diverses fractions ont été dialysées contre H2O, lyophylisées et reconcentrées en milieu de culture sans sérum avant d'être testées en inhibition de cytotoxicité. La filtration sur gel a été réalisée sur colonne supérose 12-FPLC (Pharmacia). Des SN CD8+CD57+ concentrés 10 fois ont été déposés sur la colonne puis élués à 0.3 ml/mm. La colonne a été calibrée grâce à des protéines standards (Bio-Rad, USA). Les fractions recueillies ont été traitées comme précédemment. RESULTATS 1) Les lymphocytes CD8+CD57+ inhibent les activités cytotoxiques spécifiques et non-spécifiques d' antigène Afin de tester l'activité fonctionnelle des cellules CD8+CD57+, les lymphocytes sanguins ont été étudiés dans des cohortes de patients présentant un pourcentage significativement accru ( > 25 %) de ces cellules (taux normaux 7 + 5 %, p 0.01) au cours de l'infection par le VIH (patients aux stades IV, avec un taux de lymphocytes circulants CD4+ en moyenne de 155 + 122/mm3), et après transplantation médullaire chez 13/25 patients, parmi lesquels a été retrouvée une infection active à CMV dans 12 cas. L'effet de ces cellules a été testé sur trois types d'effecteurs cytotoxiques provenant de donneurs sains volontaires : des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) alloréactifs, des cellules Natural-Killer (NK) et des cellules tueuses activées par des lectines (LAK). Comme le montre la figure 1, des cellules CD8+CD57+ sélectionnées positivement (par tri sur cytofluoromètre ou billes magnétiques) ont été ajoutées à ces effecteurs cytotoxiques testés à un rapport effecteur cible constant assurant une lyse significative de 15 à 30 %. Cette addition induit une inhibition dose dépendante des trois types ce cytotoxicité. L'effet inhibiteur n'est pas restreint par les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité, puisque des cellules CD8+CD57+ pouvaient être actives sur des effecteurs cytotoxiques histoincompatibles (résultats non présentés).Des cellules CD8+CD57- utilisées comme contrôles, n'ont aucun effet suppresseur. A noter que les cellules CD8+CD57+ n'exercent aucune action cytotoxique sur diverses cibles cellulaires (K562, Raji) (Figure 1). Ces résultats démontrent que les lymphocytes CD8+CD57+ dont le taux s'accroît dans diverses conditions pathologiques peuvent exercer un effet inhibiteur non spécifique sur divers types de cytotoxicité à médiation cellulaire T et NK. 2) Caractérisation phénotypique des lymphocytes CD8+CD57+ Pour tenter de mieux cartactériser les marqueurs de surface exprimés par ces cellules, une étude phénotypique a été effectuée par immunofluorescence en triple couleur. Les résultats en sont identiques chez les patients VIH et transplantés et montrent (Figure 2) que 100 % de ces cellules expriment les antigènes CD2, CD7, CD5 et sont des cellules T matures différenciées puisqu'elles portent le complexe CD3-Récepteur T. Contrairement aux cellules NK, elles sont CD16- et CD56-. L'analyse des marqueurs d'activation montre l'absence d'expression des récepteurs de l'iL2 (CD25) et de la transferrine (CD71). 5 à 10 % seulement expriment l'antigène HLA-DR à leur surface. 3) Les cellules CD8+CD57+ libèrent un facteur suppresseur non spécifique Pour analyser le mécanisme d'action de ces cellules, nous avons testé l'activité inhibitrice d'un surnageant lymphocytaire produit par incubation pendant 4 heures de lymphocytes CD8+CD57+ ou CD8+CD57- purifiés, dans un milieu de culture sans sérum. Le surnageant obtenu à partir des cellules CD8+CD57+, mais non des cellules CD8+CD57-, exerce une inhibition identique au nombre correspondant de cellules productrices sur les différents effecteurs cytotoxiques préalablement décrits (Figure 1B). Pour définir la cible de cette activité inhibitrice les effecteurs cytotoxiques ou leurs cibles ont été incubés séparément avec le surnageant suppresseur, lavés puis testés fonctionnellement.Comme montré sur la Figure 3, le surnageant est actif sur les cellules effectrices mains non sur leur cible. De plus, il n'est pas cytolytique puisque les divers types de cellules incubés dans ces surnageants conservent une bonne viabilité (résultats non présentés). L'activité suppressive de ces surnageants n'est pas inhibée par des anticorps neutralisants du TNF et, TGFB1 et B2 ni par pré-incubation des cellules productrices en présence d'inhibiteurs de synthèse des prostaglandines (indomethacine, ETYA). Enfin, ces SN ne contiennent pas d'IFN, IL2, IL4 ou IL6 (résultats non présentés). L'ensemble de ces données indique que les cellules CD8+CD57+ produisent sans réactivation in-vitro, un facteur suppresseur actif sur des effecteurs cytotoxiques spécifiques et non spécifiques d'antigène. 4) Caractérisation physico-chimique préliminaire du facteur suppresseur CD8+CD57+ Afin de préciser les caractères biochimiques de l'inhibiteur produit par les cellules CD8+CD57+, nous avons testé sa résistance à la chaleur et à la trypsine. Nos résultats (non présentés) indiquent que l'activité inhibitrice n'était pas abolie par la trypsine (testée à des concentrations allant de 0.25 mg/ml à 2,5 mg/ml ni par exposition à la chaleur (1 h à 80 C). Ces données compatibles avec la présence de radicaux glycosylés, nous ont conduits à rechercher la capacité du SN CD8+CD57+ à se lier à une colonne de concanavaline A (ConA). L'activité inhibitrice est spécifiquement retenue sur la colonne et peut être éluée par addition de méthyl-Dmannoside (Figure 4). Une étape de fractionnement sur gradient de glycerol a indiqué une constante de sédimentation faible inférieure à 1 S (Résultats non présentés). Par ailleurs, le poids moléculaire (PM) du facteur présent dans le SN CD8+CD57+ a été estimé par gel filtration : le pic d'activité inhibitrice éluée, correspond à une molécule de 20 à 30 kD (Figure 4). Ce résultat suggère que le facteur suppresseur est une molécule de 20 à 30 kD dans sa forme native mais n'exclut pas la possibilité qu'il s'agisse d'un facteur suppresseur de plus faible PM adsorbé sur une molécule porteuse de PM apparent 20-30kD. A notre connaissance, il s'agit de la première observation d'un facteur soluble libéré par des lymphocytes T humains CD8+CD57+, médiant une activité inhibitrice sur des effecteurs cytotoxiques. Par ses caractéristiques physico-chimiques et fonctionnelles, celle molécule diffère des PGE2 et des cytokines connues, telles les TNF et TGF, pouvant exercer des activités immunosuppressives (8-10). De plus, cette molécule diffère d'un facteur d'origine placentaire capable d'inhiber également des activités cytotoxiques à médiation lymphocytaires (11). De fait, les autres facteurs immunosuppresseurs décrits en physiologie ou pathologie chez l'homme se distinguent de notre observation par leur origine cellulaire, PM, résistance à la chaleur et aux protéases, capacité de se lier aux lectines, et activités sur les effecteurs cytotoxiques (8-12). Bien que la fonction exercée in-vivo par les cellules CD8+CD57+ reste inconnue, leur augmentation au cours de certaines pathologies (états d'immunodéficience acquise, ou stimulations antigéniques prolongées) suggère qu'elles puissent exercer un rôle fonctionnel au cours de ces affections. Dans le cadre des tests in-vitro rapportés ici, l'identification d'une molécule de 20 kD libérée par les lymphocytes CD8+CD57+, et sa caractérisation, en progrès dans notre laboratoire, devraient permettre de mieux définir la place de ces cellules dans le contrôle des fonctions immunitaires et particulièrement des réactions de cytotoxicité. REFERENCES 1 - Leroy E, Calvo CF, Divine M, Gourdin MF, Baujean F, Ben Aribia MH, Mishal Z, Vernant JP, Farcet JF, Senik A. J. Immunol. 137/2180-89, 1986. 2 - Legendre CM, Guttmann RD, Hou SK, Jean R. J. Immunol. 135:1061-66, 1985. 3 - Gratama JW, Loon AM, Oosteveer MAP, Naipal Amih, D'Amaro J, Witte TJM. Exp. Hematol. 15:803-8, 1987. 4 - Gupta S. J. Clin. Immunol. 6:502-09, 1986 5 - Landay A, Gartland L, Clement T. J. Immunol. 131:2757-61, 1983 6 - Clement LT, Grossi E, Garland GL. J. Immunol. 133:2460-65, 1984 7 - Joly P, Guillon JM, Mayaud C, Plata F, Theodorou I, Denis M, Debre P, Austran B. J. Immunol. 143:2193-2202, 1989 8 - Garcia-Penarrubia P, Bankhurst AD, Koster FT. J. Exp. Med. 8:601, 1989 9 - Rook AH, Kehrl JH, Wakefield L, Roberts AB, Sporn MB. Burlington B, Lane H, Fauci A. J. Immunol. 136:3916, 1986 10 - Ruggerio V, Baglioni C. J. Biol. Chem. 138:661, 1987 11 - Menu E, David V, Bensussan A, Chaouat G. J. Reprod. Immunol. 16:137, 1989 12 - Tsicomoulos A, Tonnel AB, Vorng H, Joseph M, Wallaert B, Kusnierz JP, Pestel J, Capron A. Eur. J. Immunol. 6:1201-08, 1990. Figure 1 - INHIBITION DE L'ACTIVITE CYTOLYTIQUE DES CTL ALLOSPECIFIQUES, CELLULS LAK Ew NK PAR LES LYMPHOCYTES CD8+CD57+. Les effecteurs cytotoxiques ont été testés & BR EBV et aux LAK (e) testés sur la lignée Raji ; soit de (B) :CMNS de sujets HIV+, triées par FACS, CD8+CD57+ (C), CD8+CD57 20 et leurs surnageants CD8+CD57+ ( ), CD8+CD57 (A) ajoutées dans les mêmes conditions à des cellules NK testées sur K562. Les CMNS ont été testées pour contrôle directement sur les cellules cibles Raji (+) et K562 () (A). Figure 2 - ANALYSE PAR IF EN TRIPLE COULEUR DES LYMPHOCYTES CD8+CD57+. Les CMNS de 3 receveurs de greffes de moelle osseuse ont été incubées avec diverses combinaisons d'AcMo. L'analyse a été faite sur un FACSCAN en utilisant le logiciel Paint-a-gate (Becton Dickinson). En abscisse et en ordonnée figurent respectivement les intensités de fluorescence des AcMo CD8-FITC/ou PE et CD57 Ducchrom. Les cellules triple positives sont représentées en points colorés en noir. Figure 3 - LE FACTEUR SOLUBLE CD8+CD57+ INHIBE LES EFFECTEUR CYTOTOXIQUES MAIS NON SIEURS CIBLES. L'activité cytolytique des cellules LAK contrôles (O) ou préincubées 2 heures dans un surnageant CD8+CD57+ provenant de sujets transplantés, puis lavees (u), a été testée sur la lignée Daudi contrôle (A) ou préalablement incubée dans le SN CD8+CD57+ (B). Figure 4 - LIAISON A LA ConA ET ESTIMATION DU PM DE LA MOLECULE INHIBITRICE PRESENTE DANS LE SURNAGEANT CD8+CD57+. A,B : un surnageant concentré de CMNS triées CD8+CD57+ de sujet HIV+ a été déposé sur une colonne de (A), ConA-sépharose. La fraction liée a été éluée par addition d' methyl mannoside (1M) (1 ). Chaque fraction a été testée pour son activité inhibitrice de la cytolyse LAK ; (B) : Superose 12 pour gel filtration; Le PM a été estimé d'après la courbe décrite par les protéines standard : aldolase (158 kD), albumine bovine sérique (67 kD), ribonuclease (13,7 kD). Les fractions ont été testées comme précédemment. REVENDICATIONS 1. Principe actif hydrosoluble capable d'inhiber des fonctions du système immunitaire, ce principe actif étant - susceptible d'être obtenu à partir de lymphocytes T qui sont eux-mêmes reconnus par des anticorps respectivement dirigés contre des antigènes CD8 et CD57 - apte à inhiber l'activité cytolytique de cellules CTL. 2. Principe actif hydrosoluble selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu à partir de lymphocytes T eux-mêmes reconnus par des anticorps monoclonaux reconnaissant les antigènes CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD57, mais non reconnus par des anticorps monoclonaux reconnaissant les antigènes CD16, CD25, CD56, CD71. 3. Principe actif hydrosoluble selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce - qu'il inhibe l'activité cytolytique de cellules allospécifiques CTL, LAK et NK - qu'il inhibe la prolifération de cellules mononucléées sanguines B et T induites par des mitogenes tels que PHA (phytohémagglutinine) ou PWM (pokeweed mitogen) ou par une stimulation du complexe CD3/récepteur spécifique à 1' antigène - qu'il inhibe spécifiquement la prolifération de lignées cellulaires tumorales lymphoblastoïdes ou granuleuses (U937, K562). 4. Principe actif hydrosoluble selon l'une quelconque des revendication 1 à 3, caractérisé en outre en ce que son activité inhibitrice n'est perturbée ni par des anticorps neutralisants du TNF, ni par des anticorps neutralisants des facteurs TGFB1 et B2 ou des anticorps neutralisants de IFN-7, ni par préincubation en présence d'indométhacine ou d'ETYA ; en revanche en ce que cette activité est bloquée par l'addition secondaire d'IL4 (interleukine 4) ou d'IFN-T (interféron). 5. Principe actif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce - qu'il est complexé par la concanavaline, le complexe étant dissociable par le a-méthyl-D-mannoside - que ses activités ne sont pas abolies par la trypsine, par l'exposition à une température de 80 à 100"C pendant une heure et à pH acide, 2 à 4. 6. Principe actif hydrosoluble capable d'inhiber des fonctions du système immunitaire et susceptible d'être obtenu à partir de lymphocytes T qui sont eux-mêmes reconnus par des anticorps dirigés contre respectivement des antigènes CD8 et CD57 et aptes à inhiber l'activité cytolytique de cellules CTL, caractérisé en ce que la susdite capacité d'inhibition est neutralisée par des anticorps formés contre un principe actif obtenu à partir de lymphocytes T CD8+CD57+ ayant les propriétés inhibitrices du principe actif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et ces anticorps étant capables de neutraliser au moins l'une des propriétés inhibitrices selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Anticorps, notamment monoclonaux, formés contre le principe actif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Hybridomes secréteurs des anticorps monoclonaux selon la revendication 7. 9. Composition à visée pharmaceutique dans laquelle le principe hydrosoluble selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 est associé à un véhicule physiologiquement acceptable, choisi selon le mode d'administration envisagé, notamment par voie parentérale, perfusion comprise. 10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, applicable dans des thérapeutiques immuno-suppressives, anti-tumorales ou anti-virales et tout particulièrement dans tout désordre organique s'accompagnant d'une réduction d'activité au sein de l'organisme des cellules NK, LK et CTL. 11. Procédé de purification d'un principe actif, conformément à l'une quelconque des revendications 1 à 6, notamment à partir d'un surnageant d'une population de lymphocytes T CD8+CD57+, caractérisé par - la mise en contact de ces solutions avec des anticorps conformes à la revendication 8 ou 9 immobilisés sur la colonne d'affinité, - la récupération du principe actif par dissociation du complexe anticorps-antigène formé. 12. Composition à visée pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, les anticorps sus-définis aux fins de permettre de contrôler la production in vivo de l'inhibiteur produit par les cellules CD8+CD57+ lorsque celles-ci tendent à proliférer au-delà d'un seuil prédéterminé, voire même à inhiber leur propre développement. 13. Utilisation des anticorps selon la revendication 8 ou 9 pour le diagnostic et le dosage dans un échantillon biologique, notamment à base de lymphocytes du principe actif du type de celui produit par les cellules CD8+CD57+, le procédé alors mis en oeuvre consistant à mettre les anticorps du genre en question en contact avec l'échantillon biologique contenant le principe à détecter dans des conditions permettant la production d'un complexe immunologique entre ces anticorps et le principe actif recherché, et la détection du complexe formé.