Brevet FR2673195A1 — publié le 19920828

CULTURES DE LIGNEES PERMANENTES DE CELLULES PROMYELOCYTAIRES HUMAINES, ET LEURS UTILISATIONS POUR LE CRIBLAGE DE NOLECULES UTILISABLES NOTAMMENT DANS LE TRAITEMENT DES LEUCEMIES La leucémie aigüe promyélocytaire (ou LAP pour Leucémie Aigle à Promyélocytes, ou encore leucémie de type M3) est une pathologie bien définie dans le domaine des leucémies, et est cytogénétiquement caractérisée par une translocation t(15 ; 17) (q22 qll-12) (Rowley J.D. et al, lancet 1 : 549, 1977). Cette translocation pourrait jouer un rôle dans la prolifération cellulaire incontrôlée avec blocage de la maturation cellulaire qui se produit dans les LAP. Des études in vitro et in vivo ont permis de démontrer que l'acide rétinoïque (ou encore désigné ci-après par RA) arrête le processus de prolifération cellulaire des LAP et induit la maturation morphologique et fonctionnelle des promyélocytes vers le stade des granulocytes. Cet effet de l'acide rétinoique sur les promyélocytes suggère que l'expression de certains gènes étroitement impliqués dans la transduction du signal RA, ou dans le processus de maturation des cellules, soit altérée par la translocation susmentionnée. Des études in vitro menées sur des promyélocytes provenant de patients atteints de LAP, ont permis de démontrer que le gène codant pour le récepteur a de l'acide rétinoïque (récepteur RARa) normalement situé sur le chromosome 17 est remanié par translocation avec le locus myl normalement situé sur le chromosome 15 (de Thé et al, Nature, 347, pp 558-561, 1990). En utilisant des sondes correspondant à des segments d'ADN localisés au voisinage des points de cassure de la translocation, des réarrangements génomiques de l'un ou de l'autre locus ont pu être déterminés chez les patients atteints de LAP sus-mentionnés. Par conséquent les gènes RARa et myl sont fréquemment réarrangés dans les LAP.Ces expériences soutiennent fortement l'implication du récepteur a de l'acide rétinoïque dans les leucémies aigus à promyélocytes. Compte tenu de l'importance du rôle joué par le RARa dans la pathologie des LAP, il serait particulièrement intéressant de pouvoir disposer de lignées cellulaires constituées de promyélocytes d'origine humaine comportant cette translocation t(15 ; 17) caractéristique des LAP, afin notamment de cribler des molécules dérivées de l'acide rétinoïque, ou autres molécules, susceptibles de restaurer la maturation cellulaire sans pour autant présenter les effets toxiques de l'acide rétinoïque. Cependant, aucune lignée de cellules promyélocytaires humaines n'a pu être maintenue en culture jusqu'à maintenant et n'a pu par conséquent permettre ce type d'étude. Bien que la lignée HL60 ait été appelée "promyélocytaire" (Gallagher R. et al, Blood 54 713, 1979), il est désormais reconnu d'une part qu'elle provient d'une leucémie myéloblastique caractérisée par des cellules à un certain stade de maturation (M2) (Dalton WT et al, Blood 71 ; 242, 1988), et d'autre part qu'elle ne contient pas la tranlocation t(15 ; 17) sus-mentionnée. Un des buts de la présente invention est précisément de disposer d'une culture cellulaire permettant de cribler des molécules susceptibles de restaurer la maturation cellulaire. La présente invention a pour objet une lignée cellulaire permanente, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée de cellules promyélocytaires caractéristiques des leucémies aigües promyélocytaires humaines, ces cellules étant cytogénétiquement caractérisées par une translocation t(15 ; 17), et susceptibles de proliférer indéfiniment dans un milieu de culture. Le milieu de culture dans lequel sont susceptibles de proliférer les cellules susmentionnées, est avantageusement constitué d'un milieu nutritif synthétique (RPMI 1640) et de sérum de veau foetal. La lignée cellulaire de 1 l'invention et ses variantes sont particulièrement caractérisées en ce qu'elles présentent des empreintes génétiques sur gel d'electrophorèse identiques, en totalité ou en partie, à l'empreinte génétique représentée sur la Figure 1. A titre illustratif, les empreintes génétiques des cellules constituant les lignées cellulaires de l'invention, sont obtenues selon le mode opératoire défini dans Nucleic Acids Research (1988) vol. 16, n"9, p. 4161. L'invention concerne plus particulièrement une lignée cellulaire telle que décrite ci-dessus, et qui a fait l'objet d'un dépôt à la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes de l'INSTITUT PASTEUR (CNCM) le 25 février 1991 sous le numéro I-1045. Cette lignée cellulaire a été obtenue à partir d'un patient atteint d'une LAP, traité par chimiothérapie et en phase de rechute. Des cellules de la moëlle osseuse ont été prélevées chez ce patient, et ont été mises en culture sur une couche de cellules du stroma de moelle osseuse (Lanotte et al J. Cell. Sci. 50 : 281, 1981) jusqu'à l'obtention d'une lignée cellulaire autonome (ci-après désignée par l'expression NB4). Cette lignée cellulaire NB4 est particulièrement caractérisée par l'empreinte génétique représentée sur la Figure 1, et fait l'objet d'une étude plus approfondie dans la description détaillée qui suit de l'invention. L'invention concerne également un procédé de criblage de molécules susceptibles de restaurer la maturation cellulaire, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'une quantité déterminée de la molécule étudiée avec une lignée cellulaire de l'invention suivie de la mise en évidence d'une éventuelle différenciation des cellules de ladite lignée. La détection de la différenciation des promyélocytes des lignées cellulaires de l'invention vers le stade des granulocytes est avantageusement réalisée par application de l'une ou plusieurs des méthodes suivantes. Cette différenciation se traduisant notamment par l'activation de l'expression de certains gènes spécifiques, les produits d'expression de ces gènes sont détectés à l'aide d'anticorps susceptibles de reconnaître spécifiquement les polypeptides produits, ces anticorps étant le cas échéant marqués notamment de manière radioactive ou enzymatique. Lorsque ces produits d'expression présentent une activité enzymatique ou lorsque cette maturation se traduit par une disparition d'une activité enzymatique, telle que l'activité myélopéroxydase, la détection de la différenciation est avantageusement réalisée à l'aide de substrats, le cas échéant marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique, et sur lesquels les produits enzymatiquement actifs exprimés, ou qui ne sont plus exprimés, sont susceptibles d'agir. La détection de cette différenciation cellulaire peut également être réalisée par une étude morphologique des cellules, notamment après coloration de ces dernières. A titre d'exemple de méthode de coloration des cellules, on peut citer la coloration de May-Grünwald-Giemsa. La différenciation cellulaire peut également s'apprécier selon un critère fonctionnel, c'est à dire que l'on étudie si les cellules différenciées sont fonctionnelles au même titre que des granulocytes normaux. A titre d'exemples de test susceptible de permettre la détection de critères fonctionnels de granulocytes normaux, on citera : le test NBT (Nitro Blue Tetrazolium) (Pick E., Methods Enzymol. 133:407, 1986). Le temps de réponse aux molécules étudiées des lignées cellulaires de l'invention lors de la mise en oeuvre du procédé de criblage décrit ci-dessus, varie de quelques heures à quelques jours en fonction de la méthode de détection de la différenciation cellulaire choisie. A titre illustratif, le temps d'incubation nécessaire avant détection de l'activation de l'expression de gènes est de l'ordre de 30 minutes à 24 heures, celui nécessaire avant détection de la modification de l'aspect morphologique des cellules est de 15 heures à 5 jours, et celui nécessaire avant détection de l'aspect fonctionnel des cellules est de 3 jours à 7 jours. De manière avantageuse, cette méthode de criblage permet de sélectionner des molécules susceptibles d'être utilisées dans le domaine de la prévention ou du traitement de pathologies causées par une prolifération anormale des cellules, notamment des tumeurs malignes en général, et plus particulièrement des leucémies, notamment les leucémies aigües promyélocytaires. L'invention vise également les cultures ellesmêmes constitutées par des cellules des lignées cellulaires de l'invention, notamment des cellules NB4 sus-mentionnées, et d'un support nutritif permettant la prolifération des cellules, notamment le milieu RPMI 1640 additionné de sérum de veau foetal indiqué plus haut. A ce titre l'invention a pour objet des kits pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage tel que décrit ci-dessus, ces kits comprenant - une culture telle que décrite ci-dessus comprenant une lignée cellulaire selon l'invention, - des réactifs appropriés pour permettre la détection de l'éventuelle différenciation des cellules, notamment * des anticorps susceptibles de reconnaître spécifiquement les polypeptides produits par l'activation de l'expression de certains gènes, ces anticorps étant le cas échéant marqués notamment de manière radioactive ou enzymatique, * des substrats, le cas échéant marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique, et sur lesquels les produits enzymatiquement actifs exprimés, ou qui ne sont plus exprimés, sont susceptibles d'agir, * des enzymes, le cas échéant marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique, et susceptibles d'agir sur les substrats produits lors de la différenciation cellulaire, * des colorants cellulaires. Les lignées cellulaires de l'invention sont également caractérisées en ce que les surfaces membranaires des cellules les constituant sont notamment reconnues par la totalité des anticorps respectivement spécifiquement dirigés contre des antigènes de membranes de leucocytes humains de classe I (HLA class I), les marqueurs CD13 et CD33 des cellules myéloides, les marqueurs CD15 et CDllb des granulocytes, les marqueurs CD9 et CDllb des monocytes, le marqueur CDllb de l'a-intégrine, le marqueur CD38 des cellules T activées, le marqueur CD2 des cellules T, le marqueur CD4 du récepteur HIV des cellules T helper, ou sont reconnues par certains d'entre eux seulement, mais ne sont pas reconnues par les anticorps dirigés contre les antigènes de membranes de leucocytes humains de classe II (HLA class II), le marqueur CD10 des antigènes de membrane de la surface des leucocytes des leucémies aigres lymphocytaires (CALLA), les marqueurs CDllc, CD14, CD36 des monocytes, le marqueur CDllc de l'a-intégrine et des granulocytes, le marqueur CD36 des plaquettes, le marqueur CD7 des cellules T immatures, le marqueur CD3 des cellules T, le récepteur cellulaire de 1'IL-2 chaîne p, le marqueur CD19 des cellules B Pan, le marqueur CD23 des cellules B matures, le marqueur CD34 des cellules précurseurs des lymphocytes et des myélocytes, le marqueur CD41 des plaquettes du groupe II/IIIa, le marqueur CD42 des plaquettes du groupe IX, les érythrocytes, la glycophorine, ou ne sont pas reconnues par certains d'entre eux seulement. La présence du marqueur CD4 a la surface des cellules de l'invention confère à ces dernières la propriété d'être un modèle de choix pour l'étude du processus de l'infection des cellules par les virus du type HIV. La présente invention a également pour objet des polypeptides secrétés par les lignées cellulaires de l'invention, et impliqués dans le mécanisme de prolifération autonome des cellules de ces lignées. Ces polypeptides, par exemple des facteurs de croissance, sont obtenus à partir des lignées cellulaires de l'invention, notamment selon la méthode comprenant les étapes suivantes - incubation des cellules des lignées de l'invention dans un milieu de culture, - prélèvement du milieu de sécrétion de ces cellules et détection de la présence éventuelle d'un ou plusieurs polypeptides tels que définis ci-dessus à l'aide d'un test de prolifération et de différenciation réalisé sur des cellules hématopoïétiques de référence, ou sur la lignée NB4 elle-même ou ses variantes, - séparation biochimique (chromatographie, électrophorèse etc...) du ou des polypeptides sus-mentionnés. Ces étapes décrites ci-dessus permettent d'obtenir la ou les molécule(s) naturelle(e). L'obtention de la (ou des) molécule(s) recombinante(s) peut être réalisée par criblage d'une banque d'expression de la lignée NB4 ou d'une variante de cette lignée productrice de l'activité biologique recherchée, suivie du clonage génétique et de la production de la (ou des) molécule(s) recombinante(s) sus-mentionnée(s). L'invention a plus particulièrement pour objet le ou les facteurs de croissance issus de la lignée cellulaire NB4, et susceptibles d'être obtenus selon le mode opératoire indiqué ci-dessus. L'invention sera plus particulièrement illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention de la lignée cellulaire NB4. I NATERIELS ET MéTHODES a) Culture cellulaire et établissement de la lignée cellulaire NB4 Un échantillon de moelle a été obtenu à partir d'un patient atteint de LAP après que ce patient ait reçu un traitement par l'acide rétinoïque. Les leucocytes ont été séparés par centrifugation sur Ficoll-Hypaque et cultivés à une concentration de 104 cellules/ml sur un support nutritif constitué de cellules du stroma de moëlle osseuse humaine (Lanotte et al, J. Cell Sci 50:281, 1981), avec un milieu RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY) complété avec 12,5 % de sérum de veau foetal (SVF), 7,5 % de sérum de cheval (Flow Lab, Scotland), dans un flacon en plastique à 37"C dans un air humidifié plus 5 % de C02.Les cultures ont été entretenues chaque semaine en remplaçant une moitié du milieu de croissance avec du milieu frais. Après 4 à 5 semaines, la couche adhérente contenant des régions de cellules leucémiques proliférantes a été détachée mécaniquement et la population cellulaire entière a été transférée sans dissociation dans un flacon contenant un support nutritif frais constitué de cellules de stroma de moëlle osseuse. De cette manière un enrichissement progressif de cellules LAP proliférantes a été obtenu. Un développement dépendant du microenvironnement a été observé pendant quatorze semaines. Une croissance autonome a alors été détectée et une population cellulaire se développant rapidement a envahi la culture et est devenue une lignée cellulaire. Les cellules LAP ainsi obtenues sont désignées NB4.Les conditions de croissance NB4 ont été améliorées en cultivant les cellules a une concentration de 2x105 cellules/ml dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de SVF seul (le temps de doublement est de 36 à 40 heures). Des quantités aliquotes de cellules ont été congelées à -80 C. b) Analyse cytogénétique Les chromosomes ont été étudiés lorsque la lignée cellulaire a été établie et après 40 semaines de culture avec 2 passages par semaine. La technique de bandes R (RHG) a été utilisée et les chromosomes ont été classés selon la nomenclature internationale (ISCN (1985]: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature) (Harnden DG, Klinger HP (eds] Published in collaboration with Cytogenet Cell Genet. Basel, Switzerland, Karger, 1985). c) Induction de la différenciation Les cellules NB4 (105 cellules/ml), dans du milieu RPMI contenant 10 % de SVF et des concentrations variées d'acides tout-trans rétinoïques (Sigma) en tant qu'agent inducteur, ont été incubées pendant 1 à 5 jours dans des microplaques de culture. La maturation a été évaluée par examen microscopique de la coloration enzymatique sur des plaques cytologiques et aussi par l'adhésion à la matrice extracellulaire des cellules du stroma, à la fibronectine. Les cellules ont été colorées à l'aide de May-Grünwald-Giemsa. Les réactions de la myélopéroxydase, de l'a-naphtyl butyrate estérase, de la naphtol-ASD chîoroacétate estérase, de la phosphatase alcaline et au NBT ont été effectuées. d) Marqueurs de surface cellulaire La coloration pour l'immunofluorescence indirecte sur les suspensions cellulaires a été réalisée selon les méthodes décrites dans (Chen Z. et al. : Immunological typing of ALL: Concurrent analysis by flow cytometry and immunocytology. Leuk Res 10:1411, 1986 ). L'analyse cytofluométrique a été réalisée sur un profil EPICS (Coultronics, Margency, France). Un grand nombre d'anticorps monoclonaux (cf. supra) a été utilisé. II RESULTATS a) Etablissement, morphologie et cytométrie de la lignée cellulaire Les cellules LAP ont été cultivées sur une couche de cellules du stroma de moëlle. Au début de la culture, une sous-population de cellules ayant réalisé une certaine "coopération" avec le microenvironnement hématopoïétique a été sélectionnée. La population globale, avec des pertes d'interaction avec les cellules du stroma était constituée de promyélocytes hypergranulaires en phase G0/G1, tandis que quelques cellules leucémiques fortement associées aux cellules du stroma, avaient une activité mitotique, étaient beaucoup moins granulaires, avec la morphologie des cellules blastiques trouvées dans les LAP. Au moment de l'isolement de la lignée cellulaire NB4, seules les cellules blastiques prolifèrent.Après 9 mois de culture (soit environ 155 doublements de cellules) aucun changement significatif n'a été constaté. b) Etude cytogénétique Les analyses cytogénétiques ont été réalisées au stade initial de la culture au moment de l'isolement de la lignée cellulaire NB4, et après neuf mois de culture. Au stade initial de la culture, les 23 métaphases examinées étaient anormales avec des variations caryotypiques d'une cellule à l'autre. Leur nombre de chromosomes variait entre 68 et 90, la plupart d'entre eux se situant dans le domaine hypotétraploide, avec des pertes au hasard. Toutes les métaphases ont la translocation t(15 ; 17) (q22 ; qll-12) associée avec d'autres remaniements variables d'une cellule à l'autre. Toutefois, une perte du chromosome 19 et un remplacement par 19 q+ d'une part, et un der (12 ?) (p12 ; ?) était présent sur toutes les métaphases examinées. La translocation t(15 ; 17) présente dans le premier caryotype réalisé à partir du patient susmentionné atteint de LAP et au stade de sa seconde rechute, a été observée dans toutes les métaphases de la lignée cellulaire établie. La complexité caryotypique qui a été observée dans la culture de moelle osseuse à court terme a été retrouvée dans la lignée cellulaire avec une large variation d'une cellule à une autre. Le caryotype était hypotétraploide avec perte au moins d'une copie des chromosomes 8, 11 et 14. Un caryotype repésentatif peut être résumé de la manière suivante 80-87, XXX, -X, -3, -8, -9, -10, -12, -14, -14, -18, -19, -19, der(12), t(12;?)(p12;), t(15;17) (q22;qll-12), t(15;17), der(19)t(19;?), + marqueurs variables. En raison de cette variation, il est difficile d'établir les différences mineures entre les caryotypes des cellules "fraîches" et les caryotypes des cellules de la lignée NB4. Toutefois, un nouveau marqueur der(l2) a pu être détecté dans la lignée cellulaire alors qu'il n'était pas présent dans les cellules "fraiches". Le remaniement du chromosome 19, ressemblant à HSR(19)(q13), que l'on trouve dans certaines métaphases des cellules "fraîches", a apparemment été selectionné durant l'établissement de la lignée cellulaire car il était présent dans toutes les métaphases, la plupart du temps dupliqué. Le caryotype de la lignée NB4 est représenté sur la Figure 2. c) Analyse immunocytologique Les marqueurs de surface cellulaire de NB4 ont été analysés (cf. supra) et suivis pendant 9 mois, mais aucun changement significatif n'a été détecté. I1 a ainsi été déterminé que NB4 exprime des marqueurs spécifiques du stade granulocytaire, mais également des marqueurs de cellules lymphoïdes telles que CD2, CD4, et un marqueur des monocytes CD9. Les pourcentages des cellules positives vis-àvis des marqueurs myéloïdes (73 % à 89 %) et des marqueurs des cellules T (73 % pour CD4) suggèrent que les caractéristiques des deux lignées sont simultanément exprimées. CD9 est exprimée par 73 % des cellules, tandis que les cellules sont clairement négatives pour ce qui concerne les autres marqueurs liés au monocyte tels que CD14 ou CD36. L'expression de ces antigènes pourrait être reliée à des activations de gènes liés aux altérations de caryotypes multiples qui ont été trouvées. d) L'acide rétinoique induit la maturation Des cellules NB4 ont été traitées avec de l'acide rétinoïque trans (lpmol/l) pendant six jours. L'arrêt de la prolifération cellulaire est survenu après 48 heures ; des maturations morphologiques accompagnées de modifications des antigènes de surface et des marqueurs fonctionnels peuvent être détectées.Une forte augmentation du marqueur corrélé à l'v-intégrine, CDllb (Arnaout MA: Structure and function of the leucocyte adhesion molecules CD11 CD18. Blood 75:1037, 1990) a été remarquée ; CDllc, qui est absent des cellules blastiques est fortement exprimé sur 75 % des cellules différenciées ; ces changements sont associés avec une augmentation marquée de l'adhésion des cellules aux matrices extracellulaires. La production de superoxyde et peroxyde d'hydrogène, et la réduction du NBT ont été quantitativement analysées par ELISA et par des méthodes cytochimiques ; une forte augmentation de la positivité du test NBT indique une capacité potentielle antimicrobienne corroborant la maturation morphologique induite par l'acide rétinoïque. III ANALYSE DES RESULTATS La lignée cellulaire NB4 est la seule lignée permanente présentant une translocation t(15;17) établie à partir de cellules leucémiques d'un patient atteint de LAP. Les cellules provenant de LAP humaines (M3) présentent une manière singulière de proliférer in vitro qui est la cause probable des échecs réalisés jusqu'à ce jour afin d'obtenir une lignée cellulaire permanente. Il peut être conclu de ces échecs : (1) que les cellules LAP ont un potentiel de prolifération in vitro très faible. L'analyse du cycle cellulaire par cytométrie démontre un arrêt de la prolifération en phase G1 (ou éventuellement en phase GO) durant plusieurs semaines et pendant lesquelles les cellules deviennent hypergranulaires et présentent une réaction myélopéroxydase intense. Toutefois, les cellules de LAP survivent en culture, alors que beaucoup de types cellulaires de leucémies meurent ; cela suggère que ces cellules ne requièrent pas de facteur de survie, à la différence des promyélocytes normaux ou des lignées cellulaires dépendantes de facteurs. (2) aucun des facteurs de croissance hématopolétique testés jusqu'à maintenant (y compris G-CSF) ne permet la prolifération in vitro sur plus de 3 à 4 cycles cellulaires. (3) les cellules de LAP réalisent des interactions cellules-cellules ou cellules-matrices avec les cellules du stroma de la moelle osseuse. Quelques cellules de LAP associées au microenvironnement (1 à 10 pour 105 cellules) prolifèrent. Compte tenu de ce qui précède on pourrait s'attendre à ce que des cellules de LAP de stroma de moëlle cocultivée pendant plusieurs mois pourraient permettre la selection de cellules capables de proliférer. Les auteurs de la présente demande ont émis l'hypothèse que l'isolement d'une lignée cellulaire de LAP permanente dépend d'un second évènement responsable de l'autonomie de prolifération et que sa probabilité devrait considérablement augmentée dans une population en cycle par comparaison avec une population arrêtée au stade G1. Cette stratégie a été adoptée pour isoler la lignée cellulaire NB4. La culture primaire de cellules leucémiques sur une couche de cellules de stroma fournit un environnement favorable pour la prolifération cellulaire.Il ne peut être affirmé qu'une mutation additionnelle est responsable de l'apparition de cellules leucémiques autonomes qui se développent dans la culture de cellules de LAP dépendant du microenvironnement. Il faut souligner qu'un marqueur additionnel der(l2) est présent dans la lignée cellulaire mais ne peut être détecté dans les cellules "fraîches". Par contre une population cellulaire s'autorenouvelant pourrait être déjà présente dans la moëlle du patient et aurait pu être sélectionnée in vitro.Plusieurs observations jouent en faveur de cette dernière hypothèse : (1) Parmi les multiples changements de chromosomes dans les cellules blastiques du patient, qui sont peut-être partiellement reliés à des traitements antérieurs, quelques remaniements favorisant la prolifération in vitro peuvent avoir été selectionnés (2) Les cellules NB4 ont conservé des caractéristiques morphologiques d'une population minoritaire de cellules blastiques qui a été également trouvée chez le patient au moment de sa rechute. L'acide rétinoique induit une maturation rapide des cellules NB4 du point de vue morphologique et fonctionnelle ; la prolifération cellulaire n'est plus détectable après 3 jours d'un traitement continu à l'acide rétinoïque. La maturation des cellules NB4 avec d'autres inducteurs tels que les esters de phorbol, le diméthyl-sulfoxide, les nucléotides cycliques, et les corticostéroïdes, n'égale jamais tant en intensité qu'en rapidité la maturation induite par l'acide rétinoique. La figure 1 représente l'empreinte génétique de la lignée cellulaire NB4, et qui est obtenue par digestion du génome des cellules avec Hinf I, suivie d'une migration des fragments d'ADN obtenus sur gel d'électrophorèse et détection de fragments à l'aide de la sonde M13 (cf. Nucleic Acids Research susmentionné). La Figure 2 représente le caryotype de la lignée cellulaire NB4, les flèches indiquent les chromosomes remaniés. REVENDICATIONS 1. Lignée cellulaire permanente, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée de cellules promyélocytaires humaines caractéristiques des leucémies aigües promyélocytaires, ces cellules étant cytogénétiquement caractérisées par une translocation t(15 ; 17), susceptibles de proliférer indéfiniment dans un milieu de culture. 2. Lignée cellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules la constituant présentent des empreintes génétiques sur gel d'electrophorèse identiques, en totalité ou en partie, à l'empreinte génétique représentée sur la Figure 1. 3. Lignée cellulaire selon la revendication 1 ou la revendication 2, déposée à la CNCM le 25 février 1991 sous le numéro I-1045. 4. Culture cellulaire essentiellement constituée de cellules appartenant à une lignée cellulaire telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3, en association avec des éléments nutritifs permettant la prolifération des cellules. 5. Procédé de criblage de molécules susceptibles de restaurer la maturation cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'une quantité déterminée de la molécule étudiée avec une lignée cellulaire selon l'une des revendications 1 à 4, suivie de la mise en évidence d'une éventuelle différenciation des cellules de ladite lignée. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la mise en évidence de la différenciation des cellules est réalisée - par détection des produits d'expression de gènes spécifiquement exprimés au cours de la différenciation, à l'aide d'anticorps susceptibles de reconnaître spécifiquement les polypeptides produits, ces anticorps étant le cas échéant marqués notamment de manière radioactive ou enzymatique, ou à l'aide de substrats, le cas échéant marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique lorsque ces produits d'expression sont enzymatiquement actifs, - ou par étude morphologique des cellules, - ou encore par étude fonctionnelle des cellules. 7. Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend - une lignée cellulaire selon l'une des revendications 1 à 4, - des réactifs appropriés pour permettre la détection de l'éventuelle différenciation des cellules, notamment * des anticorps susceptibles de reconnaître spécifiquement les polypeptides produits par l'activation de l'expression de certains gènes, ces anticorps étant le cas échéant marqués notamment de manière radioactive ou enzymatique, * des substrats, le cas échéant marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique, et sur lesquels les produits enzymatiquement actifs exprimés, ou qui ne sont plus exprimés, sont susceptibles d'agir, * des enzymes, le cas échéant marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique, et susceptibles d'agir sur les substrats produits lors de la différenciation cellulaire, * des colorants cellulaires. 8. Facteur de croissance secrété par la cellule d'une lignée selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il assure la prolifération de ces cellules dans un milieu de culture approprié, notamment dans un milieu tel que défini dans la revendication 1.