Brevet FR2673359A1 — publié le 19920904

PROCEDE DE FABRICATION D'UNE COMPOSITION A TENEUR ELEVEE EN a-LACTALBUMINE, CONTENANT DES ACIDES SIALIQUES DOMAINE TECHNIQUE La présente invention a pour objet un procédé de fabrication, à partir du petit lait, d'une composition à teneur élevée en a-lactalbumine contenant des acides sialiques. ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION On sait que les acides sialiques contenus dans le petit lait comprennent des oligosaccharides liés à l'acide sialique tels que le sialyl lactose (désigné ci-après par "SL") dans lequel l'acide sialique lie des saccharides, le glycomacropeptide de K-caséine (désigné ci-après par "GMP") dans lequel l'acide sialique lie des peptides, les gangliosides dans lesquels l'acide sialique lie des lipides, et autres. Le GMP est un peptide lié à l'acide sialique qui se forme lorsque la K-caséine du lait est soumise à l'action de la présure ou de la pepsine, et qui est contenu dans le petit lait du fromage ou dans le petit lait de la caséine de présure. Récemment, on a appris que les chaînes de saccharides contenues dans les saccharides complexes tels que les glycoprotéines ou les glycolipides jouent un rôle important dans la reconnaissance intercellulaire dans un corps vivant. On a d'abord reconnu que des acides sialiques sont particulièrement importants comme constituant indispensable d'un récepteur associé à la reconnaissance intercellulaire. Chez les humains, les acides sialiques sont contenus dans le lait maternel en une proportion d'environ 3-5 fois celle contenue dans le lait de vache, et sont considérés comme un des facteurs évitant l'infection chez les enfants. En particulier, il est maintenant connu que le GMP empêche les bacilles coliques d'adhérer aux cellules du tractus intestinal; empêche l'infection par le virus de la grippe (demande de brevet japonais non examinée publiée (désigné ci-après par "J.P.Kokai") Sho n" 63-284133); diminue l'appétit (Bulletin of Experimental Biology and Medicine 96, 889 (1983)). En conséquence, il a été fortement recommandé que les acides sialiques soient produits par voie industrielle comme substituts du lait maternel, comme aliments fonctionnels et comme substances médicinales. Jusqu'à ce jour, comme technique de fractionnement des acides sialiques contenus dans le lait, il a été proposé un procédé pour préparer des protéines liées à l'acide sialique, comme décrit dans le brevet japonais publié pour opposition (désigné ci-après par "J.P. Kokoku") Sho n" 40-21234, un procédé pour préparer des oligosaccharides liés à I'acide sialique, comme décrit dans J.P. Kokai Sho n0 59-184197, et un procédé pour préparer des peptides liés à l'acide sialique (GMP), comme décrit dans J.P. Kokai Sho n" 63-284199. Etant donné que la protéine du petit lait présente une valeur nutritive et une aptitude d'utilisation élevées, par comparaison avec la caséine et les protéines du soja, on sait que la protéine du petit lait est utilisée comme produit de substitution pour le lait maternel ou comme source de protéine dans des compositions nutritives. En particulier, la ss-lactoglobuline (désignée ci-après par "ss-Lg"), qui est un des principaux constituants protéiques du petit lait, n'est pas présente dans le lait maternel et agit comme allergène dans les allergies infantiles. En conséquence, lorsqu'une protéine du petit lait est utilisée pour remplacer le lait maternel, il est recommandé de réduire la ss-Lg et d'utiliser un produit ayant une teneur élevée en a-lactalbumine (désignée ci-après par "a-La"). Jusqu'à ce jour, comme procédé pour la séparation et la récupération d'une fraction à teneur élevée en a -La, à partir du petit lait, il a été proposé des procédés tels que ceux décrits par Kuwata et al. (J. Food, Sci., 50 (1985)), R.J. Pearce (Aust. Dairy Technol., 42 (1987)), et J.L. Maubois et al. (J.P. Kokai Sho n" 56-36494). Toutefois, ces procédés fractionnent séparément les acides sialiques et l'a -La à partir du petit lait, et ne récupèrent pas ces constituants de façon simultanée et efficace. De plus, ces procédés sont complexes pour une application industrielle et présentent des défauts au point de vue économique, par exemple en ce qu'ils exigent des installations techniques et un fonctionnement ayant des coûts élevés. L'objet de la présente invention est de fournir un procédé pour la séparation et la récupération simultanées et efficaces des acides sialiques et de l'a-La, à partir de petit lait tel que le petit lait de fromage et le petit lait de présure. Les présents inventeurs ont mené des recherches approfondies dans ce but et ont découvert que celui-ci peut être atteint par refroidissement du petit lait; ajustement de sa teneur en Ca et Mg; ajustement de son pH à une valeur de 6-9; chauffage du petit lait à une température de 40-60"C pour former un précipité ; et élimination du précipité pour préparer une composition contenant des acides sialiques, à teneur élevée en a-La. Les teneurs en Ca ou Mg sont bien entendu ici des teneurs en ions calcium ou magnésium. Le petit lait, qui est le produit de départ de la présente invention, est un sous-produit obtenu lors de la fabrication du fromage ou de la caséine de présure à partir de laits tels que le lait de vache, le lait de chèvre et le lait de brebis. Etant donné qu'une faible quantité de caillé ou de graisse reste souvent dans le petit lait, il est en général préférable de les éliminer préalablement à l'aide d'un séparateur de crème ou d'un clarificateur. Toutefois, selon la présente invention, en utilisant un procédé de microfiltration ou un procédé d'ultrafiltration, la graisse et la 13 - L g peuvent être éliminées simultanément sans utiliser un séparateur de crème ou un clarificateur, de façon à augmenter la teneur en a-La des protéines recueillies. Le filtrat obtenu contient des acides sialiques et présente une teneur élevée en a-La. Le procédé de l'invention peut comprendre les étapes indiquées ci-après. Le petit lait est refroidi, de préférence à 0-10"C environ. La teneur en Ca et/ou Mg du petit lait est ensuite ajustée. La teneur en Ca et/ou Mg peut être ajustée par addition au petit lait de Ca et/ou Mg. Le Ca et/ou Mg peuvent être ajoutés au petit lait par exemple sous la forme d'un sel hydrosoluble tel que CaC12 ou MgC12. La teneur en Ca et/ou Mg du petit lait est de préférence de 0,6-2,0 g/kg. Cette teneur en Ca et/ou Mg est ajustée afin d'obtenir l'association/agrégation de la ss-Lg dans l'étape de chauffage subséquente. Lorsque cette teneur en Ca et/ou Mg est inférieure à 0,6 g/kg, la force ionique des ions libres Ca et/ou Mg est faible et en conséquence, l'association/agrégation de la ss-Lg ne s'effectue pas dans une mesure suffisante. Lorsque la teneur en Ca et/ou Mg est supérieure à 2,0 g/kg, l'association/agrégation de la ss-Lg devient faible même avec une force ionique élevée. Le petit lait, dont la teneur en Ca et/ou Mg a été ajustée, est ensuite ajusté à un pH de 6-9 puis chauffé à 40-60 C, de préférence pendant 5-20 min, pour former un précipité. Comme substances permettant d'ajuster le pH du petit lait, on peut utiliser des acides ou des alcalis. Les acides comprennent l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide acétique. Les alcalis comprennent l'hydroxyde de sodium, lthydroxyde de potassium, l'hydroxyde de calcium et le carbonate de potassium. Lorsque le pH du petit lait est inférieur à 6 ou supérieur à 9, l'association/agrégation de la ss-Lg est difficile à obtenir dans une mesure suffisante. Lorsque le petit lait, dont le pH a été ajusté, est soumis à un chauffage à une température supérieure à 600C environ et d'une durée supérieure à 20 min, l'a-La est facilement dénaturée. La dénaturation de l'a-La provoque sa précipitation conjointement avec celle de la 13 -Lg. En conséquence, il est difficile d'obtenir dans ces conditions une composition contenant des acides sialiques, ayant une teneur élevée en a-La. Le précipité obtenu après chauffage selon le procédé de l'invention est ensuite séparé du petit lait, pour donner une composition, par exemple sous la forme d'un filtrat, qui contient essentiellement de l'a-La comme protéine du petit lait, et contient également du lactose, des minéraux, et des acides sialiques, y compris le GMP. Le précipité est séparé de préférence par microfiltration et/ou ultrafiltration. La microfiltration peut être réalisée par exemple à l'aide d'une membrane ayant un diamètre de pores de 1 ptm ou moins. La microfiltration est de façon générale une technique de filtration utilisant une membrane ayant un diamètre de pores d'environ 0,1-10 llm, pour séparer des particules telles que des bactéries, des particules de graisse, des micelles de caséine, des aggrégats et des précipités.Les types des membranes sont désignés par leur diamètre de pores. L'ultrafiltration est réalisée à l'aide d'un dispositif d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure de 50000 daltons ou plus. L'ultrafiltration est de façon générale une technique de filtration utilisant une membrane ayant une taille de pore d'environ lnm à 1 Rm, pour séparer les particules les plus grosses, telles que les protéines, des particules plus petites telles que le lactose et les substances minérales. Les types de membranes utilisés dans la technique d'ultrafiltration sont généralement désignés par la masse moléculaire limite des molécules retenues. Les types des membranes ne sont généralement pas désignés par leur diamètre de pores. A ce jour, toutefois, la frontière entre les techniques de microfiltration et d'ultrafiltration n'a pas été clairement établie en ce qui concerne le diamètre des pores. Bien que la stabilité thermique des protéines du petit lait, basée sur la teneur en Ca et/ou Mg, soit mentionnée par Sunisa Varunsatian et al. (J. Food Science, 48 (1983)) et J.N. deWit (J. Dairy Science, 67 (1984)), ces auteurs fractionnent un surnageant et un précipité par centrifugation, n'indiquent que les compositions des produits fractionnés, et ne se réfèrent pas à une technique de séparation/fractionnement utilisant une membrane industrielle. Bien que J.L. Maubois et al. décrivent l'élimination des lipoprotéines à l'aide d'un dispositif de microfiltration (Bulletin of the IDF212, (1987)), ils ne décrivent pas la modification de la teneur en ss-Lg provoquée par ce procédé. La composition ainsi produite, telle qu'un filtrat, peut être condensée et/ou dessalée, ajustée à un pH de 4 ou plus et ensuite, soumise à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure de 50000 daltons ou moins. Ceci permet de réduire la teneur en lactose de la composition. De plus, des acides sialiques tels que le GMP peuvent être récupérés dans une solution condensée. Le GMP (masse moléculaire: 9000), un constituant principal des acides sialiques, est présent sous la forme d'un polymère (masse moléculaire 50000) à un pH de 4 ou plus, alors qu'il est présent sous la forme d'un monomère à un pH inférieur à 4. La concentration peut être effectuée dans un évaporateur. Le dessalement peut être réalisé à l'aide d'un échangeur d'ions ou d'un électro-dialyseur.Selon une variante, on peut effectuer une concentration et un des salement simultanés par ultrafiltration. Dans l'ultrafiltration, le lactose et les substances minérales sont éliminés du petit lait de façon efficace, par addition d'eau au petit lait. Afin d'élever la teneur en a-La, il est préférable que la solution concentrée et/ou dessalée (y compris le rétentat obtenu après ultrafiltration) soit ajustée à un pH de 3,0-5,0, et ensuite, chauffée à 40-700C, de préférence pendant 5-60 min, pour former simultanément un précipité. Dans ces conditions, les acides sialiques et l'a -La peuvent former simultanément des précipités d'une manière efficace. De plus, il est préférable que le précipité soit dissous dans l'eau, par addition d'eau au précipité, dispersion sous agitation et ajustement du pH par addition d'un alcali tel que NaOH.Etant donné que les conditions de chauffage sont douces, le précipité est apte à une agrégation réversible en fonction du pH. En conséquence, le précipité va se dissoudre à nouveau lorsque le pH revient à une valeur de 6-8. A cet égard, il est préférable que la dissolution du précipité soit réalisée à une température inférieure à 40"C. Si nécessaire, la solution peut être concentrée, dessalée ou séchée pour former une poudre. L'étape de précipitation est décrite par R.J. Pearce et al. (demande publiée de brevet japonais non examinée (désignée ci-après par "J.P. Kohyo" Hei nO 2-503425) et par Chihara et al. (J.P. Kokai n" Sho 63-268138). Toutefois, l'objet du procédé de cette demande est de séparer et de récupérer seulement l'a -La. De plus, ces procédés différent du présent procédé en ce que le présent procédé contient les étapes précédentes aussi bien que l'étape de précipitation, qui permet une récupération simultanée et efficace des acides sialiques et de l'a-La. Selon la présente invention, il est possible de produire une composition contenant des acides sialiques et ayant une teneur élevée en a-La, à un coût faible et d'une manière simple et facile, à l'échelle industrielle. La composition ainsi obtenue peut être utilisée comme produit alimentaire ou comme produit pharmaceutique et en conséquence, elle a une grande utilité industrielle. La présente invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples non limitatifs décrits ci-après. EXEMPLE 1 100 kg de petit lait de cheddar sont stérilisés et refroidis à 2"C. A ce petit lait, on ajoute du CaC12 de façon que sa teneur en Ca soit de 1,2 g/kg. Le pH du petit lait est ensuite ajusté à 7,3 à l'aide de NaOH, le petit lait est chauffé à 50"C pendant 10 min pour former un précipité.Le précipité est séparé du petit lait par microfiltration à l'aide d'une membrane de microfiltration (TECH-SEP CARBOSEP) ayant un diamètre de pores de 0,2 clam, dans des conditions telles que le petit lait est concentré à 1/20ème de son poids initial (facteur de concentration (FC): 20) et que de l'eau est ajoutée au petit lait concentré en un volume identique à celui du petit lait concentré (facteur de dilution (FD) :1), pour donner un 1,perméat" (100 kg). Le perméat contient 5,1 g/100 g de substances solides, 0,4 g/100 g de protéine, 0,08g/100 g d'a-La, 0,07 g/100 g de ss-Lg et 12 mg/100 g d'acides sialiques. La quantité d'acides sialiques est exprimée en acide sialique mesuré en libérant l'acide sialique des acides sialiques qui sont un mélange de sialyl lactose et de glycomacropeptide. EXEMPLE 2 100 kg du perméat obtenu dans l'exemple 1 sont ajustés à un pH de 5,5 à l'aide d'HCl et concentrés à 1/1 Sème du poids initial par ultrafiltration (facteur de concentration (FC): 15) à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration (DDS GR61PP) ayant un seuil de coupure de 20000 daltons, pour donner une solution concentrée et dessalée de 6,7 kg. La solution concentrée et dessalée contient 12,1 g/100 g de substances solides, 5,0 g/100 g de protéine, 1,2 g/100 g d'a-La, 1,0 g/100 g de ss-Lg et 175 mg/100 g d'acides sialiques. EXEMPLE 3 6,7 kg de la solution concentrée et dessalée, obtenue dans l'exemple2, sont ajustés à un pH de 3,7 à l'aide d'HCl et chauffés à 55"C pendant 30 min, pour former un précipité. Le précipité est séparé par centrifugation et récupéré. Le précipité est dissous par dispersion dans l'eau sous agitation, et le pH de la dispersion est ajusté à 7 par addition de NaOH pour préparer une composition de 7,0 kg. La composition contient 2,6 g/100 g de substances solides, 2,0 g/100 g de protéine, 1,0 g/100 g d'a-La, 0,3 g/100 g de ss-Lg et 70 mg/100 g d'acides sialiques. La composition est évaporée et séchée de manière classique pour donner 200 g de poudre. EXEMPLE 4 100 kg de petit lait de caséine de présure sont stérilisés et refroidis à 2"C. A ce petit lait, on ajoute du MgC12 pour ajuster la teneur en Mg à 0,8 g/kg. Le petit lait est ensuite ajusté à un pH de 7,3 à l'aide de KOH, il est chauffé à 50"C pendant 10 min pour former un précipité. Le précipité est séparé du petit lait à l'aide d'une membrane de microfiltration (NGN CEFILT-MF) ayant un diamètre de pores de 0,5 m, dans des conditions telles que le petit lait soit concentré à 1/25ème de son poids initial (facteur de concentration (FC) : 25) et de l'eau est ajoutée au petit lait concentré en une quantité trois fois supérieure à celle du petit lait concentré (facteur de dilution (FD): 3), pour donner un perméat.Le perméat (108 kg) contient 6,0 g/100 g de substances solides, 0,5 g/100 g de protéine, 0,10 g/100 g d'a-La, 0,09 g/100 g de ss-Lg et 16 mg/100 g d'acides sialiques. EXEMPLE 5 108 kg du perméat obtenu dans l'exemple 4 sont ajustés à un pH de 5,5 à l'aide d'HCl, et concentrés à l/lOème du poids initial (facteur de concentration (FC) : 10) à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration (KOCH ABCOR HFK131) ayant un seuil de coupure de 8000 daltons, pour donner une solution concentrée et dessalée de 10,8 kg. La solution concentrée et dessalée contient 12,1 g/100 g de substances solides, 5,0 g/100 g de protéine, 1,0 g/100 g d'a La, 0,9 g/100 g de ss-Lg et 150 mg/100 g d'acides sialiques. EXEMPLE 6 10,8 kg de la solution concentrée et dessalée obtenue dans l'exemple S sont ajustés à un pH de 4,0 à l'aide d'HCl, et chauffés à 55"C pendant 30 min, pour former un précipité. Le précipité est séparé par centrifugation, et récupéré. Le précipité est dissous dans l'eau par dispersion dans l'eau sous agitation, et le pH de la dispersion est ajusté à l'aide de NaOH, pour préparer une composition de 10,0 kg. La composition contient 2,4 g/100 g de substances solides, 1,8 g/100 g de protéine, 1,0 g/100 g d'a-La, 0,25 g/100 g de ss-Lg et 60 mg/100 g d'acides sialique. La composition est évaporée et séchée de manière classique pour donner 250 g de poudre. EXEMPLE 7 100 kg de petit lait de gouda sont refroidis à 70C. La teneur en Ca du petit lait est ajustée à 0,5 g/kg à l'aide de CaC12 et la teneur en Mg du petit lait est ajustée à 0,5 g/kg à l'aide de MgC12. Le petit lait est ensuite ajusté à un pH de 7,8 à l'aide de KOH, il est chauffé à 55"C pendant 5 min pour former un précipité. Afin d'éliminer le précipité, le petit lait est soumis à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration (NGK CEFILT:UF) ayant un seuil de coupure de 150000 daltons, de façon que 100 kg de petit lait soient concentrés à 5 kg (facteur de concentration (FC): 20) et de l'eau est ajoutée en une quantité qui est deux fois celle du petit lait concentré (10 kg) (facteur de dilution (FD) : 2), pour donner un perméat (105 kg). Le perméat contient 4,5 g/100 g de substances solides, 0,4 g/100 g de protéine, 0,09 g/100 g d'a-La, 0,5 g/100 g de ss-Lg et 14 mg/100 g d'acides sialiques. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une composition contenant des acides sialiques, à teneur élevée en a-lactalbumine, comprenant les étapes consistant à (a) refroidir le petit lait; (b) ajuster la teneur en Ca et/ou Mg du petit lait; (c) ajuster le pH du petit lait à une valeur de 6-9; (d) chauffer le petit lait à 40-60"C pour former un précipité ; et ensuite (e) éliminer le précipité. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le petit lait est refroidi à 0-10 C. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la teneur en Ca et/ou Mg est de 0,6-2,0 g/kg. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la teneur en Ca et/ou Mg est ajustée par addition de Ca et/ou Mg au petit lait. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, dans étape (e), le précipité est éliminé par microfiltration ou ultrafiltration. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la microfiltration est réalisée à l'aide d'une membrane de filtration ayant un diamètre de pores de leur ou moins. 7. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'ultrafiltration est réalisée à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure de 50.000 daltons ou plus. 8. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre une étape (f) consistant à concentrer et/ou dessaler la composition après l'étape (e). 9. Procédé selon la revendication 8, comprenant en outre une étape de séchage et de transformation de la composition en poudre, après l'étape (f). 10. Procédé selon la revendication 9, comprenant en outre, après l'étape (f), les étapes consistant à: (g) ajuster le pH de la composition à 4,0 ou plus ; et (h) concentrer et/ou dessaler la composition. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel la concentration et le dessalement sont réalisés par ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure de 50000 daltons ou moins. 12. Procédé selon la revendication 10, comprenant en outre, après l'étape (h), les étapes consistant à: (i) ajuster le pH de la composition à 3,0-5,0; (j) chauffer la composition à 40-700C pendant 5-60 min, pour former un précipité; et (k) récupérer le précipité. 13. Procédé selon la revendication 12, comprenant en outre, après l'étape (k), les étapes consistant à: (1) disperser le précipité dans l'eau pour obtenir une dispersion (m) ajuster le pH de la dispersion à 6-8, pour dissoudre le précipité dans l'eau, de façon à obtenir une solution. 14. Procédé selon la revendication 13, comprenant en outre, après l'étape (m), une étape consistant à sécher la solution et à la transformer en poudre.