Brevet FR2673645A1 — publié le 19920911

La L-lysine est un aminoacide important utilisé comme additif alimentaire pour les poulets, les porcs, etc, car la L- lysine est insuffisante dans les cultures alimentaires comme le mais La présente invention concerne un procédé pour la production de L-lysine par fermentation. Les procédés classiques connus pour la production de L- lysine par fermentation consistent à conférer des propriétés néces- saires pour acquérir la productivité de L-lysine comme l'auxotro- phie pour l'homosérine, la résistance à la S-( 2-aminoéthyl)L- cystéine, la résistance à l'o-chlorocaprolactame, etc à des micro- organismes appartenant au genre Brevibacterium ou au genre Coryne- bacterium qui ont été isolés du monde naturel (ci-après dénommés souches sauvages), à cultiver les micro-organismes dans un milieu contenant des sources de carbone et des sources d'azote, etc, et à recueillir la L-lysine produite et accumulée dans le bouillon de culture par adsorption sur résine, etc En outre, un procédé utili- sant des souches améliorées de ces micro-organismes producteurs de Llysine, par exemple, des souches auxotrophes pour la L-alanine, des souches sensibles au fluoropyruvate, des souches résistantes aux analogues de la L-leucine, etc, a également été étudié, mais le rendement en L-lysine par fermentation n'est pas encore satis- faisant On souhaite donc mettre au point un procédé plus efficace pour produire la L-lysine à des coûts plus faibles que dans les procédés classiques, en utilisant des micro-organismes producteurs de L- lysine ou leurs mutants ayant une productivité de L-lysine encore améliorée et un rendement de fermentation amélioré. Un objet de la présente invention est de proposer un pro- cédé efficace pour produire la L-lysine à des coûts plus faibles que dans les procédés classiques en améliorant en outre la produc- tivité de L-lysine de micro-organismes producteurs de L-lysine ou de leurs mutants améliorés et en améliorant le rendement de fermen- tation. La demanderesse a effectué des recherches poussées en vue d'améliorer encore la productivité de L-lysine des micro-organismes producteurs de L-lysine ou de leurs mutants améliorés et d'augmen- ter le rendement de fermentation, et en conséquence elle a trouvé que des mutants producteurs de L-lysine qui ont acquis la résis- tance à une acyl-lysine et/ou à une acyl-lysine méthy Lée sont appropriés à cet effet La présente invention repose sur cette découverte. Autrement dit, la présente invention propose un procédé pour produire la L-lysine par fermentation qui consiste à cultiver un micro-organisme appartenant au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium doué de résistance à une acyl-lysine et/ou à une acyl-lysine méthylée et capable de produire la L-lysine et à recueillir la L-lysine produite et accumulée dans le bouillon de culture. Le terme "acyl-lysine" utilisé dans la présente invention désigne les composés contenant un résidu d'acide gras en C 5-C 20 lié au groupe amino en position " et/ou au groupe amino en position ú de la L ou DL-lysine par une liaison acyle Des exemples de ces composés comprennent les suivants: N _-stéaroyl L-lysine, N - décanoyl-L-lysine, NW-myristoyl-L-lysine, N -palmitoyl-L-lysine, N, N -dioctanoyl-L-lysine, N,N -dilauroyl-L-lysine, etc Le terme "acyl- lysine méthy Lée" désigne les acyl-lysines qui sont méthylées sur le groupe amino en position a Des exemples de ces composés comprennent les suivants: N -méthyl-N -stéaroyl-L-lysine, N,N - diméthyl-N décanoyl-DL-lysine, N',N'-diméthyl-N -palmitoyl-DL- lysine, N,N,N -triméthyl-N -myristoyl-DL-lysine, N,N,N -tri- méthyl-Ng-palmitoyl-DL-lysine, etc. Les mutants utilisés dans la présente invention appar- tiennent au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium et sont résistants à une acyl-lysine et/ou à une acyl-lysine méthylée, c'est-àdire qu'ils peuvent pousser bien en présence d'acyl-lysine même à une concentration de 25 mg/l et/ou en présence d'acyl-lysine méthylée même à une concentration de 25 mg/l et ils ont des pro- priétés connues nécessaires pour acquérir la productivité de L- lysine comme l'auxotrophie pour l'homosérine, la résistance à la S- ( 2-aminoéthyl)-L-cystéine, la résistance à l'c-chlorocaprolactame, etc ou leurs combinaisons La propriété de pousser bien signifie ici que le degré de croissance relative est d'au moins 50 lorsque la croissance est prise égale à 100 en l'absence d'acyl-lysine et d'acyl-lysine méthylée. Des exemples spécifiques de mutants comprennent les sui- vants: Brevibacterium lactofermentum AJ 12592 (FERM BP-3239) Brevibacterium lactofermentum AJ 12593 (FERM BP-3240) Corynebacterium glutamicum AJ 12596 (FERM BP-3242) Les souches décrites ci-dessus ont été déposées conformé- ment au traité de Budapest le 24 Janvier 1991, au Fermentation Research Institute, (FRI), ministère du commerce international et de l'industrie, situé au 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japon. Comme souches mères utilisées pour obtenir ces mutants, on utilise des micro-organismes appartenant au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium qui sont déjà connus pour produire la L-lysine En outre, on peut utiliser comme souches mères les souches sauvages suivantes: Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Après avoir conféré à ces souches sauvages la produc- tivité de L-lysine, la résistance à l'acyl-lysine et/ou à l'acyl- lysine méthylée peut leur être conférée Ou bien encore, la résis- tance à l'acyl-lysine et/ou à l'acyl-lysine méthylée peut être préalablement conférée à ces souches sauvages, et ensuite la pro- ductivité de L-lysine. Pour soumettre ces souches mères à un traitement de muta- tion, on peut appliquer des procédés classiques tels que la mise en contact avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (ci-après en abrégé NG) Afin de sélectionner parmi ces mutants les souches résistantes à l'acy L-lysine et/ou résistantes à l'acy L-lysine méthylée, on peut utiliser un procédé qui comprend la récolte des mutants qui poussent bien dans un milieu contenant l'acyl-lysine ou l'acyl-lysine méthylée à une concentration qui inhibe nettement la croissance des souches mères Un exemple plus spécifique de récolte des souches résistantes est indiqué ci-dessous. Des cellules viables de Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 (FERM BP-2294), qui est un micro-organisme producteur de L- lysine résistant à la S-( 2-aminoéthyl)-lysine, ont été traitées par 250 pg/ml de NG à 300 C pendant 30 min Les cellules ayant un taux de survie de 1,0 % ont été inoculées sur une plaque de gélose du milieu minimum indiqué dans le tableau 1 avec addition de 50 mg/l de N,N -dioctanoyl-L- lysine comme acyl-lysine Après culture à 30 C pendant 1 semaine, la colonie qui a poussé a été récoltée La concentration de l'acyl-lysine ou de l'acyl-lysine méthylée ajoutée au milieu est choisie convenablement en fonction de la concentra- tion inhibitrice minimale de croissance de la souche mère utilisée et est réglée pour récolter efficacement les souches résistantes désirées L'une des souches résistantes est Brevibacterium lacto- fermentum AJ 12592 (FERM BP-3239) qui a encore été utilisée pour l'expérience suivante De manière semblable, on a obtenu Brevibac- terium lactofermentum AJ 12593 (FERM BP-3240) comme souche résis- tante à la N,N,N -triméthyl-N -palmitoyl-DL-lysine. Tableau 1 Constituant Concentration glucose 20 g/l sulfate d'ammonium 10 g/L KH 2 PO 4 1 g/L Mg SO 4,7 H 20 0,4 g/L Fe SO 4,7 H 20 10 mg/l Mn SO 4,4 H 20 10 mg/l biotine 50 pg/l s Tab Leau 1 (suite) Constituant Concentration chlorhydrate de thiamine 100 pg/l urée 2 g/l gélose 20 g/L En outre, en utilisant Corynebacterium glutamicum AJ 3463 (FERM BP-1987) comme souche mère, on a obtenu Corynebacterium glu- tamicum AJ 12596 (FERM BP-3242) comme souche résistante à la N,N,N-trimethyl-N -palmitoyl-DL-lysine. La résistance de chacune des souches résistantes ainsi obtenues à l'acyl-lysine ou à l'acyl-lysine méthylée a été déter- minée comme indiqué ci-dessous et comparée à celle de la souche mère L'acyl-lysine ou l'acyl-lysine méthylée était ajoutée au milieu indiqué dans le tableau 2 à chaque concentration et on a chargé séparément 4 ml du milieu dans un petit tube à essais Après stérilisation, la souche testée était inoculée dans le milieu. Après culture agitée à 30 C pendant 24 h, on a mesuré la turbidité à la longueur d'onde de 562 nm et on a calculé le degré de crois- sance relative à partir de celle obtenue dans le milieu sans addi- tion d'acyl-lysine ni d'acyl-lysine méthy Lée Les résultats sont indiqués dans le tableau 3 Les mutants de la présente invention présentent un degré de croissance relative aussi bon que plus de 50 en présence d'acyl-lysine ou d'acyl-lysine méthylée à une concen- tration de 25 mg/l, tandis que les souches mères ont un degré de croissance relative très mauvais de moins de 10 Comme indiqué ci- dessus, les mutants de la présente invention se distinguent nette- ment des souches mères puisque les mutants sont résistants à l'acyl-lysine ou à l'acyl-lysine méthylée. Tableau 2 Constituant Concentration saccharose 20 g/l sulfate d'ammonium 5 g/l KH 2 P 04 1 g/l Mg SO 4,7 H 20 0,4 g/l Tab Leau 2 (suite) Constituant Fe SO 4,7 H 20 Mn SO 4, 4 H 20 biotine chlorhydrate de thiamine nicotinamide hydrolysat de protéine (calculé en azote) urée Concentration mg/l mg/l pg/l pg/l mg/l 1 g/l 3 g/l Souche testée Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 Composé Tab Leau 3 Concentration N ,NE-dioctanoyl- L-lysine 0 mg/l Degré de croissance relative Brevibacterium lactofermentum AJ 12592 Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 N,NE-dioctanoyl- L-lysine Nf,N,Ne-triméthyl- N Epalmitoyl-DL- lysine 0 mg/l 0 mg/l Souche testée Brevibacterium lactofermentum AJ 12593 Tableau 3 (suite) Composé Concentration Ne,Ne,N-triméthyl O mg/l N -palmitoyl-DL 10 lysine 25 Degré de croissance relative Corynebacterium glutamicum AJ 3463 Corynebacterium glutamicum AJ 12596 Na,NJ-dioctanoyl-L- lysine N,N -dioctanoyl-L- lysine En utilisant ces souches résistantes, la L-lysine peut être produite par fermentation dans un milieu nutritif ordinaire contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sources inorganiques, des facteurs de croissance et des nutriments néces- saires pour le micro-organisme utilisés de manière classique Comme sources de carbone, on peut utiliser des sucres tels que glucose, saccharose, mélasse, hydrolysats d'amidon, etc; des acides orga- niques tels qu'acide acétique, acide propionique, etc; des alcools tels qu'éthanol, propanol, etc Comme sources d'azote on peut utiliser le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, l'urée, l'ammoniac, etc. Comme conditions de culture des souches, la culture aérienne a été effectuée à une température de fermentation de 24 à 37 C, de préférence 30 à 34 C La durée nécessaire à la fermenta- tion est en général de 2 à 7 j Le p H au début ou pendant la fer- 0 mg/l 0 mg/l mentation est dans la gamme de 5,0 à 8,5, de préférence 6,0 à 7,5. Pour ajuster le p H, on peut utiliser des substances acides ou alca- lines inorganiques ou organiques et en outre l'urée, le carbonate de calcium, le gaz ammoniac et ainsi de suite. Après la fermentation, la L-lysine est récoltée du bouil- lon de culture par des méthodes connues utilisant une résine échan- geuse d'ions, la cristallisation, etc et leurs combinaisons. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute- fois en limiter la portée. Exemp Le 1 Un milieu contenant 36 g/l de glucose, 20 g/l de chlorure d'ammonium, 1 g/l de KH 2 P 04, 400 mg/l de Mg SO 4,7 H 20, 10 mg/L de Fe SO 4,7 H 20, 8 mg/l de Mn SO 4,4 H 20, 3 mg/l d'hydrolysat de protéines de soja (calculé en azote), 0,1 mg/L de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/L de biotine (p H 7,0) a été chargé séparément à raison de ml chaque fois dans un flacon agité de 500 ml Après stérilisa- tion par chauffage à 115 C pendant 10 min, on a ajouté dans le bal- lon 1 g de carbonate de calcium préalablement stérilisé par la cha- leur sèche Chaque souche a été inoculée sur le milieu puis culti- vée à 31,5 C pendant 48 h en agitant La quantité de L-lysine accu- mulée dans le bouillon de culture a été déterminée quantitativement par colorimétrie à l'acide-ninhydrine de cuivre Les résultats sont indiqués dans le tableau 4 Pour chacune des souches résistantes, la quantité de L-lysine accumulée était nettement augmentée par rapport aux souches mères correspondantes. Souche Tableau 4 L-Lysine accumu- lée (g/l) B lactofermentum AJ 12435 (souche mère) B lactofermentum AJ 12592 (souche résistante) C glutamicum AJ 3463 (souche mère) C glutamicum AJ 12596 (souche résistante) 9,5 11,8 Rendement rap- porté au sucre (z) 26,4 32,8 7,0 ,7 19,5 29,7 Exemple 2 On a chargé séparément chaque fois 20 ml d'un milieu con- tenant 80 g/L de mélasse finale calculée en sucre, 50 g/L de sul- fate d'ammonium, 1 g/l de KH 2 P 04, 1 g/l de Mg SO 4,7 H 20, 10 mg/l d'hydrolysat de protéines de soja (calculé en azote), 0,1 mg/l de chlorhydrate de thiamine et 0,3 mg/L de biotine (p H 7,0) dans des flacons agités de 500 ml Après stérilisation par chauffage à 120 C pendant 10 min, on a ajouté au ballon 1 g de carbonate de calcium préalablement stérilisé par chauffage à sec à 180 C pendant 2 h. Chaque souche a été inoculée sur le milieu puis cultivée à 31,5 C pendant 72 h en agitant La quantité de L-lysine accumulée dans le bouillon de culture a été déterminée Les résultats sont indiqués dans le tableau 5 Avec la souche résistante, l'accumulation de L- lysine était nettement augmentée par rapport à la souche mère. Souche Tab Leau 5 L-Lysine accumu- Lée (g/l) B lactofermentum AJ 12435 (souche mère) B lactofermentum AJ 12593 (souche résistante) ,4 Rendement rap- porté au sucre (%) ,5 24,8 31,0 Selon le procédé de la présente invention, en utilisant le micro-organisme producteur de L-lysine résistant à l'acyl-lysine et/ou à l'acyl-lysine méthylée, on peut produire la L-lysine par fermentation avec un rendement et une quantité accumulée élevés et l'on peut réduire les coûts de la production industrielle de la L- lysine. REVENDICATION Procédé pour La production de L-Lysine par fermentation, caractérisé en ce que L'on cu Ltive un micro-organisme (appartenant au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium) résistant aux acyl- lysines et/ou acyl-lysines méthylées et capable de produire la L-lysine et on récolte la L-lysine produite et accumulée dans le bouillon de culture.