Brevet FR2679919A1 — publié le 19930205

Procédé de conservation de milieux de culture de micro-organismes et conditionnement utilisant ce procédé. La présente invention concerne un nouveau procédé destiné à améliorer la conservation des milieux de culture de microorganismes. Elle concerne également de nouveaux conditionnements destinés à améliorer la conservation desdits milieux. Les laboratoires de microbiologie médicale agroalimentaire ou biotechnologique utilisent actuellement des milieux de culture de plus en plus sophistiqués. C'est le cas en particulier des milieux utilisés comme outils de diagnostic médical ou vétéurinaire. Or, ces milieux, dont la composition est complexe, contiennent des substances très fragiles au contact de l'air ambiant et de la lumière, même lorsqu'ils sont conservés en ambiance réfrigérée, en particulier par exemple des vitamines ou des antibiotiques. En outre, la consommation quotidienne, par ces laboratoires, de chaque type de produit est trop faible pour autoriser la préparation extemporanée de grandes quantités de ces milieux de culture qui sont périmés avant d'être utilisés. Ceci génère des pertes économiques importantes pour ces laboratoires. Du fait de l'augmentation croissante de ces besoins et de la grande variété de ces milieux différents utilisés aujourd'hui, le travail de préparation est trop lourd et fastidieux pour être réalisé quotidiennement convenablement. On connaît déjà différents documents décrivant des procédés destinés à améliorer la conservation de milieux de culture de micro-organismes avant leur incubation, ou de milieux de culture contenant lesdits micro-organismes. Le brevet US 2 874 091 propose de simplifier les opérations de lavage et de stérilisation des boîtes de Petri et décrit en particulier un procédé d'emballage de boites en polymères thermoplastiques dans des poches en polyéthylène transparentes, souples, imperméables aux bactéries et permettant d'éviter L'évaporation de L'eau du milieu de culture présent dans la boîte. Dans ce document, l'ambiance intérieure est constituée d'air atmosphérique, ce qui risque d'être nuisible à la bonne conservation de certains milieux de culture, en particulier les milieux sensibles à la présence d'oxygène. Le brevet US 4 262 091 décrit une méthode et un appareil destinés à la préparation de milieux gélosés contenus dans des boîtes de Petri en atmosphère anaérobie stricte. Les milieux de culture ainsi préparés sont strictement limités aux bactéries anaérobies strictes et non adaptables à d'autres classes de bactéries. Le brevet US 3 532 604 décrit des emballages destinés à améliorer la conservation et le transport de produits biologiques contenus dans des supports de différentes formes en les enveloppant dans des films de différentes natures (papier, aluminium, copolymères, polyéthylène...) adhérant complètement à la forme de l'objet enveloppé après réalisation d'un vide partiel. On a également cherché à améliorer la conservation du contenu de boîtes de Petri ensemencées. Ainsi, le brevet US 4 709 819 révèle un procédé d'emballage de milieux de cultures biologiques où les milieux de culture ensemencés dans des boîtes de Petri en polystyrène sont mis sous sachet individuel stérile où elles se trouvent sous vide partiel. Par ailleurs, la demande internationale WO 89/00189 décrit des poches destinées au stockage sous atmosphère contrôlée de milieux de culture en boîtes ensemencés par des bactéries. L'atmosphère réalisée dans la poche est destinée à améliorer les qualités nutritionnelles du milieu de culture sans que soit recherchée une amélioration de la durée de conservation du milieu lui-même. Le demandeur a, pour sa part, mené des recherches persistantes pour améliorer la conservation du milieu de culture, en particulier du milieu avant son ensemencement. Il a décrit dans la demande de brevet français FR 2 652 060 des procédés de conditionnement de milieux de culture prêts à L'emploi permettant leur conservation prolongée avant utilisation, en cherchant à éviter en particulier leur dessiccation et Leur oxydation. Il a proposé, pour ce faire, d'enfermer ces milieux, contenus par exemple dans des boîtes de Petri, dans des enveloppes étanches en matériaux choisis en fonction de leur propriétés de barrière tant vis-à-vis de l'oxygène atmosphérique que des gaz injectés dans L'enveloppe. Le demandeur a maintenant trouvé qu'il était possible d'améliorer encore très sensiblement la durée de conservation des milieux de culture avant leur ensemencement en les conservant dans des enveloppes étanches à l'intérieur desquelles a été introduit avant scellage au moins un produit (I) connu en biologie cellulaire pour ses propriétés inhibitrices de peroxydes ou de radicaux libres au sein de la cellule. Ainsi, la présente invention concerne un nouveau procédé de conservation de milieux de culture de micro-organismes. Elle concerne également un nouveau conditionnement permettant La conservation des milieux de culture de micro-organismes. Selon une caractéristique essentielle, la présente invention concerne un nouveau procédé de conservation de milieux de culture de micro-organismes caractérisé en ce qu'il consiste à enfermer lesdits milieux de culture dans une enveloppe étanche contenant un produit (I) connu en biologie cellulaire pour son effet inhibiteur de peroxydes ou de radicaux libres au sein de la cellule. Selon une variante de l'invention, elle concerne un procédé tel que défini précédemment utilisant comme produit (I) connu en biologie cellulaire comme inhibiteur de peroxydes ou de radicaux Libres, un produit choisi parmi le mélange acide ascorbique/ tocophérol, la super oxyde-dismutase, les mélanges glutathion/ glutathion peroxydase, la NADPH oxydase, Le cytochrome P450, la xanthine oxydase, les caroténoides, les amido-21-stéroîdes. Selon une autre caractéristique essentielle, la présente invention fournit des conditionnements destinés à la conservation des milieux de culture de micro-organismes constitués d'une enveloppe étanche contenant au moins un récipient contenant lui-même ledit milieu de culture, caractérisés en ce que ladite enveloppe renferme un produit connu en biologie cellulaire pour avoir l'effet d'éliminer les peroxydes ou les radicaux libres au sein de la cellule. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, on introduira en outre dans l'enveloppe au moins un produit (II) dont l'effet est de réguler le taux d'anhydride carbonique. Selon un mode de réalisation de l'invention particulièrement avantageux, les produits inhibiteurs de radicaux libres et/ou de peroxydes et les produits destinés à réguler le taux d'anhydride carbonique sont sous forme liquide et sont introduits dans L'enceinte en en imprégnant un support solide. A titre d'exemple de tels supports solides, on citera des bandes de matériaux de type tissu ou papier ou tout matériau de type cellulosique. On citera également des pastilles solides incorporant les produits (I) et/ou (II). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on réalisera L'imprégnation d'une bande constituée d'un dérivé cellulosique, qui sera collée sur la surface intérieure de l'enveloppe. Une autre façon d'introduire les produits (I) et/ou (II) est de les incorporer dans une pastille qui sera par exemple collée sur la face externe du couvercle de la boîte de Petri. Comme produits (I) inhibiteurs de peroxydes ou de radicaux libres, on pourra utiliser tous ceux classiquement utilisés à cet effet dans le domaine pharmaceutique lorsque L'on recherche un tel effet à l'intérieur des cellules. A titre d'exemples non limitatifs de produits (I), on citera des mélanges acide ascorbique/tocophérol, La super oxydedismutase,des mélanges glutathion/glutathion peroxydase, la NADPH oxydase, le cytochrome P450, la xanthine oxydase, les caroténoides, les ubiquinones, les amido-21-stéroides. A titre de produits (II) permettant de réguler le taux d'anhydride carbonique dans l'atmosphère à L'intérieur de l'enve- loppe, on citera tout particulièrement Les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, par exemple l'acétazolamide. La quantité des produits (I) et/ou (II) à introduire à L'intérieur de l'enveloppe sera déterminée expérimentalement en fonction de la nature du milieu de culture et de la nature de l'atmosphère gazeuse contenue dans l'enveloppe. Ces méthodes expérimentales pourront consister en particulier en des déterminations a posteriori de L'efficacité du milieu pour l'application désirée. L'atmosphère gazeuse à L'intérieur de L'enveloppe est sous une pression de préférence au moins égale à la pression atmos phérique. Elle est constituée d'un gaz ou d'un mélange de gaz ne contenant pas d'oxygène. De façon avantageuse, l'atmosphère gazeuse sera composée d'un mélange d'un gaz inerte, par exemple L'azote ou L'hélium, et de C02. La proportion de gaz inerte sera avantageusement comprise entre 90 et 99 % et le C02 dans la proportion de 1 à 9 %. Le milieu de culture stérile, destiné à être emballé, sera placé dans tout type de récipient classiquement utilisé pour la préparation et/ou la conservation de ces milieux. Il pourra en particulier être contenu dans une boite de Petri, en verre ou en polystyrène, dans un tube de verre, en polystyrène ou en polypro pyrène, ou dans tout autre type de récipient classiquement utilisé à cet usage. Le matériau constituant l'enveloppe sera avantageusement choisi parmi les matériaux associant une bonne résistance mécanique, une bonne isolation vis-å-vis de la pénétration de L'oxygène et de la Lumière, une bonne protection contre la condensation interne de l'eau produite par le milieu gélosé. Il devra avoir également de bonnes propriétés de soudabilité. On utilisera avantageusement, pour réunir toutes ces propriétés, des matériaux complexes multicouches, en particulier des matériaux multicouches connus dans l'emballage alimentaire. A titre d'exemples de tels matériaux multicouches, on citera des matériaux constitués de trois couches : - une couche apportant la résistance mécanique en même temps que la protection vis-à-vis de la lumière et de l'oxygène, par exemple une couche d'aluminium ou de copolymère d'éthylène et d'alcool vinylique (EVOH, par exemple), - une couche protégeant contre la condensation interne de L'eau contenue dans le milieu de culture, avantageusement constituée de polymères dérivés du polyester ayant subi un traitement anti buée, - une couche présentant de bonnes propriétés de soudabilité et de souplesse, par exemple en polyéthylène. Un mode de réalisation particulièrement avantageux du conditionnement selon L'invention est représenté aux figures 1 et 2 qui représentent respectivement une vue en perspective et une vue en coupe longitudinale d'un tel conditionnement. Les figures 2a et 2b représentent les grossissements des parties A et B de la figure 2. En référence à la figure 1, il apparaît que le milieu de culture est contenu dans une boîte de Petri 2 munie d'un couvercle et placée à l'intérieur d'une enveloppe 1 constituée d'un film d'emballage. Cette enveloppe présente deux soudures transversales 4, 4' et une soudure longitudinale inférieure 5. Cette disposition particulière des soudures permet une ouverture aisée sans recourir à un outil spécial au moment de l'utilisation du milieu de culture. Sur la face interne de L'enveLoppe est collée une bande 3 imprégnée du produit (I) inhibiteur de peroxydes ou de radicaux libres et éventuellement d'un produit (II) régulateur du taux de C02 dans l'atmosphère ambiante. La figure 2 présente une coupe longitudinale faite dans la zone centrale du même dispositif et les figures 2a et 2b sont des coupes transversales agrandies faites en A et B dans la partie supérieure et inférieure de l'enveloppe, cette dernière étant dans ce cas formée de trois couches 11, 12, 13 constituées respectivement par exemple d'aluminium, de polyéthylène et de polyester. Le mode de réalisation décrit ci-dessus présente L'avant tage d'offrir une technique de conditionnement facilement automatisable et qui peut être réalisé en utilisant des machines destinées habituellement aux opérations d'emballage de type flow-pack dans l'industrie alimentaire. Le film complexe utilisé pour réaliser L'emballage pourra être préparé en bobines dont la Lèze variera avec le type de machine flow-pack et le nombre et la forme des récipients contenant Le milieu que l'on souhaite emballer simultanément. Lorsque le produit (I) inhibiteur de peroxydes ou de radicaux libres et/ou le produit (11) régulateur du taux d'anhydride carbonique sont supportés comme dans L'exemple représenté aux figures 1 et 2 par une bande collée à l'intérieur de l'enveloppe, on pourra avantageusement prévoir de coller cette bande préalablement sur la face du film complexe destiné à former la face interne de l'enveloppe. On utilisera avantageusement une machine capable de réaliser, selon le mode flow-pack, des emballages en continu à trois soudures, dont deux transversales et une longitudinale. Les deux soudures transversales sont réalisées par un système à mâchoires accompagnantes, de façon à réaliser une qualité optimale de soudure. L'atmosphère interne est obtenue lors de l'opération de formatage de L'enveloppe par la machine grâce à une canule débitant un mélange gazeux à l'intérieur de L'enveloppe en formation et jusqu'au moment du scellage définitif. Le débit du gaz injecté tiendra compte de la cadence de La machine à formater et souder les enveloppes. Il faudra s'assurer que la totalité de l'air interne à L'enveloppe a été remplacée par le mélange gazeux. La présente invention permet d'obtenir une conservation très nettement accrue des milieux de culture, comme cela ressort des exemples donnés à titre non limitatifs. EXEMPLES Exemple 1 On prépare de façon classique un milieu de culture destiné à permettre la croissance de la bactérie Haemophilus influenzae (désignée dans cet exemple par souche X) et référencée sous la référence ATCC9006 à l'American Type of Culture Collection et sous la référence IP54.81 dans la collection de l'Institut Pasteur. Ce milieu de culture contient en particulier 0,05 % en volume d'un facteur de croissance de la souche X constitué de Nicotamide Adénine Diphosphate. On prépare au temps 0, en salle blanche sous flux laminaire stérile, 60 boîtes de Petri contenant le milieu de culture ci-dessus et on sépare ces boîtes en trois lots : - les boîtes du premier lot (1) sont enveloppées dans des poches en polyéthylène soudées et placées à 20 C. - Les boîtes du deuxième lot (2) sont placées dans des enveloppes individuelles scellées constituées d'un matériau barrière multicouche et contenant une atmosphère gazeuse constituée de 98 % d'azote et 2 % de CO2. Ce lot est conservé à 20 C. - Les boîtes du troisième Lot sont placées dans des enveloppes en tout point identiques à celles du lot 2 mais contenant en outre, collée sur la face interne de celle-ci une bande imprégnée d'une solution contenant 2 x d'acide ascorbique, 1 % de tocophérol et 0,5 X de DiamoxX Les boîtes de ce lot sont conservées à 200C. Les essais réalisés ont consisté à tester les milieux de culture des différents lots vis-à-vis de la souche X aux temps : 1 jour, 3 semaines, 3 mois, 4 mois et 6 mois. Pour ces tests, la valeur d'une anse calibrée d'une suspension d'une culture de 18 h à 370C en bouillon approprié de la souche ajustée à 109CFU/ml est ensemencée par la technique d'épuisement en quadrants par recouvrement sur les boîtes des milieux de culture à tester. Après une incubation en atmosphère convenable à 37 C pendant 24 h précises, on dénombre les colonies bactériennes présentes dans le 4e quadrant. Des contrôles de croissance sur milieux complets franchement préparés sont pratiqués en parallèle. Le nombre moyen égal à la moyenne arithmétique du nombre de colonies obtenues sur 5 boîtes est noté et reporté dans le tableau I. Tableau I Dénombrement des colonies de X en fonction du nombre de jours de stockage à 20 C. 1 jour 3 semaines 3 mois 4 mois 6 mois Lot 1 15 0 Lot 3 17 19 17 16 17 Exemple 2 On procède comme précédemment mais avec des boîtes contenant un milieu de culture destiné à inhiber La croissance de la bactérie Lactobacillus Lactis référencée sous la référence ATCC7830 à l'ATCC et sous la référence IP53.61 à l'Institut Pasteur, cidessous désignée par Y et en réalisant cette fois L'ensemencement des boîtes avec un bouillon de culture de la souche Y. Le milieu de culture est un milieu sélectif pour Listéria contenant à titre d'inhibiteur de la souche Y, 0,01 % en volume de Trypaflavine. Les résultats du dénombrement dans le premier quadrant des colonies de la souche Y pour les trois lots de boîtes aux différents temps sont rassemblés dans le tableau Il (chaque chiffre représentant la moyenne obtenue pour 5 boites). Un contrôle de croissance du germe sur milieu sans inhibiteur est pratiqué en parallèle. Tableau II Dénombrement des colonies de Y en fonction du temps de stockage à 20 C. 1 jour 3 semaines 3 mois 4 mois 6 mois Lot 1 12 Lot 2 0 0 0 5 12 Lot 3 0 0 0 0 0 REVENDICATIONS 1. Procédé de conservation des milieux de culture de microorganismes caractérisé en ce qu'il consiste à enfermer lesdits milieux dans une enveloppe étanche contenant un produit (I) connu en biologie cellulaire pour son effet inhibiteur de peroxydes ou de radicaux libres au sein de la cellule. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit produit (I) inhibiteur de peroxydes ou de radicaux Libres est choisi parmi les mélanges acide ascorbique/tocophérol, la super oxydase-dismutase, les mélanges glutathion/glutathion peroxydase, la NADPH oxydase, le cytochrome P450, la xanthine oxydase, les caroténoides, les ubiquinones, les amido-21-stéroides. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caracterisé en ce que ladite enveloppe renferme en outre un produit (II) destiné à réguler le taux d'anhydride carbonique dans L'atmosphère intérieure à ladite enveloppe. 4. Conditionnement destiné à la conservation de milieux de culture de micro-organismes constitué d'une enveloppe scellée (1) contenant au moins un récipient (2) contenant lui-même ledit milieu de culture, caractérisé en ce que ladite enveloppe renferme un produit (I) connu en biologie cellulaire pour avoir l'effet d'éliminer les traces de peroxydes ou de radicaux libres au sein des cellules. 5. Conditionnement selon la revendication 4, caractérisé ce que ledit produit (I) est choisi dans la famille des mélanges acide ascorbique/tocophérol, de la superoxydase-dismutase, des mélanges glutathion/glutathion peroxydase, la NADPH oxydase, le cytochrome P450, la xanthine oxydase, les caroténoides, les ubiquinones, les amido-21-stérodes. 6. Conditionnement selon L'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il renferme en outre un produit (II) permettant deréguler Le taux d'anhydride carbonique, par exemple un Inhibiteur de l'anhydrase carbonique. 7. Conditionnement selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le produit (I) permettant d'éliminer les radicaux libres ou les peroxydes et/ou Le produit (II) permettant de réguler le taux d'anhydride carbonique sont sous forme liquide et introduits dans L'enveloppe par l'intermédiaire d'un support solide (3) qui en est imprégné. 8. Conditionnement selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit support solide (3) est constitué par une bande de tissu, papier ou tout type de dérivé de type cellulosique, collée sur la surface interne de ladite enveloppe. 9. Conditionnement selon L'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que l'atmosphère gazeuse à L'intérieur de l'enve- loppe est constituée d'un gaz ou d'un mélange de gaz à pression au moins égale à la pression atmosphérique et ne contenant pas d'oxygène. 10. Conditionnement selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite atmosphère gazeuse est constituée d'un mélange gazeux contenant 90 à 99 % d'un gaz inerte et 1 à 9 % de C02. 11. Conditionnement selon L'une des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que L'enveloppe (1) est constituée d'un film multi-couche (11, 12, 13). 12. Conditionnement selon L'une des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que L'enveloppe est scellée par un procédé de type flow-pack. 13. Procédé pour améliorer la conservation des milieux de culture de micro-organismes, caractérisé en ce qu'il consiste à enfermer lesdits milieux de culture dans des conditionnements selon L'une des revendications 4 à 12.