Brevet FR2679922A1 — publié le 19930205

La présente invention concerne un système de sécrétion de protéines utilisables chez les corynébactéries, ainsi qu'un procédé mettant en oeuvre ce système, ainsi que de nouvelles protéines antigéniques. Les corynébactéries constituent un groupe de bactéries gram positif, de morphologie irrégulière, représenté par une grande variété de souches. En dépit du fait que les cellules gram positif ont une structure simple facilitant la sécrétion de protéines dans le milieu extérieur, la sécrétion des protéines par les corynébactéries a été très peu étudiée jusqu'ici. Seules la toxine diphtérique secrétée par certaines souches de corynebacterium diphteriae infectées par des phages lysogéniques tox+ (Smith 1980 : J. Bacterial. 141 pp 1142 ; Smith et al. 1980 : 3. Bacteriol. 141 pp 184 ; Creenfield et al. 1983 : PNAS USA 80 pp 6853) et l'étude de la séquence nucléotidique d'un gène impliqué dans la sécrétion d'une DNase par corynebacterium glutamicum (W. Liebl et A.S. Sinskey 1986 : Genetics and Biotechnology of Bacteria, Vol. 2 pp 383-388) ont été rapportées. Le brevet américain US 4 965 197 décrit un système d'expression et de sécrétion utilisable chez corynebacterium sur la base de la DNAse décrite précédemment ; néanmoins il semble que cette protéine ne soit pas majoritaire et que dans ces conditions, le système de sécrétion correspondant soit peu intéressant. C'est pourquoi l'invention concerne un système d'expression et de sécrétion dans une bactérie de type corynébactérie comportant les éléments de sécrétion de deux protéines se trouvant majoritaire ment dans le surnageant de culture de certaines corynébactéries. Plus particulièrement, la présente invention concerne un système d'expression et de sécrétion dans une corynébactérie comprenant - une souche de corynébactérie, - une cassette de sécrétion contenant une première séquence d'ADN fonctionnelle pour l'expression dans ladite souche de corynébactérie, une seconde séquence d'ADN qui code pour un aminoacide, un polypeptide et/ou une protéine, et une troisième séquence d'ADN insérée entre lesdites première et seconde séquences d'ADN qui codent pour des éléments d'une protéine choisie parmi PSI ou PS2, qui assurent la sécrétion desdits amino-acides, polypeptides et/ou protéines de ladite souche de corynébactérie. I1 doit tout d'abord être compris que dans le cadre de la présente invention la terminologie corynébactérie désigne non seulement les souches du genre corynebacterium mais également les souches ayant des propriétés voisines notamment les souches de type brevibacterium. Le système d'expression sur la présente invention comporte outre la souche hôte de corynébactérie une cassette de sécrétion, cette cassette peut se trouver sur un plasmide autoréplicatif dans corynébactérie et dans ce cas, le plasmide comportera une origine de réplication fonctionnelle dans la souche, par exemple dans corynebacterium une origine de réplication PBL 1 ; mais la cassette peut également être portée par un plasmide non réplicatif destiné notamment à l'intégration chromosomique, dans ce cas le plasmide comportera des éléments permettant la recombinaison et l'intégration chromosomique ; dans le cas de l'intégration, la cassette se trouvera finalement sur le chromosome de la bactérie en cause et constituera également une variante du présent système. Parmi les séquences de DNA fonctionnelles pour l'expression dans la souche de corynébactérie il faut citer aussi bien des éléments d'expression homologues que des éléments d'expression hétérologues, c est-à-dire qu'il peut s'agir d'éléments qui existent déjà dans la bactérie hôte ou bien qui au contraire, proviennent d'une bactérie différente. Ces éléments d'expression comporteront essentiellement un promoteur et un site de fixation des ribosomes, mais il est possible également de prévoir d'autres éléments notamment du type éléments de régulation de l'expression. Parmi les promoteurs utilisables chez les corynébactéries il faut citer le promoteur Ptac qui est un promoteur hybride trp/lac également fonctionnel chez E. coli ; mais il est possible également de prévoir d'utiliser par exemple le promoteur de l'une des protéines PS1 et/ou PS2 tels qu'ils sont identifiés dans le cadre de la présente invention. Le système d'expression et de sécrétion de la présente invention est bien entendu destiné plus particulièrement à assurer la production de produits d'intérêt industriel, c'est pourquoi les séquences codantes coderont plus particulièrement pour un peptide, un polypeptide, ou une protéine d'intérêt industriel mais il pourra également s'agir d'une séquence codant non pas directement pour une protéine d'intérêt industriel, mais pour une protéine pouvant intervenir dans la maturation et/ou l'élaboration d'un aminoacide, d'un polypeptide, ou d'une protéine présentant un intérêt industriel. Ainsi, il est possible de prévoir la sécrétion d'un polypeptide comportant des séquences répétées d'un ou de plusieurs amino-acides. Cette seconde séquence de DNA codant pour ces différents produits pourra également comporter certains éléments destinés à assurer la maturation du produit sécrété. Parmi les éléments assurant la sécrétion il faut citer notamment toute ou partie de la séquence signal de l'une des protéines PS1 ou PS2 ainsi que les équivalents de ces séquences, sans modification ou perte de la propriété de sécrétion. En effet, il est certain qu'il est possible d'apporter grâce à des techniques connues telles que des mutations ponctuelles des modifications mineures aux séquences de sécrétion, tout en conservant le même type de propriété de sécrétion, c'est pourquoi la présente invention entend également couvrir ces séquences équivalentes. Le système d'expression de la présente invention peut enfin comporter d'autres éléments d'expression et de sécrétion notamment des éléments tels que des terminateurs, par exemple le terminateur des protéines PS1 et/ou PS2. Dans certains cas, il peut être intéressant d'adjoindre aux séquences d'expression et de sécrétion, toute ou partie de la protéine PSl afin d'obtenir des protéines fusionnées, dont la sécrétion et le taux d'expression pourraient dans ces conditions être améliorés. Les systèmes d'expression selon l'invention, peuvent comporter des éléments hétérologues qui permettent la construction dans des bactéries différentes des corynébactéries par exemple comme cela a été dit précédemment une origine de réplication fonctionnelle dans E. coli mais également d'autres éléments qui peuvent faciliter le transfert dans corynebacteriu m. La présente invention concerne également les souches de corynébactéries comportant un système d'expression et de sécrétion tel qu'il a été décrit précédemment, et plus particulièrement lorsque la souche est une brevibacterium notamment une souche de brevibacterium lactofermentum. Enfin, la présente invention concerne un procédé d'obtention d'aminoacides, de polypeptides, ou de protéines caractérisé en ce que l'on cultive dans un milieu de culture une souche de corynébactérie transformée telle que cela a été décrit précédemment, dans laquelle la seconde séquence de DNA code pour lesdits aminoacides ledit polypeptide, et/ou ladite protéine et en ce que l'on sépare après culture ledit produit du milieu de culture. En effet, grâce à ce procédé, le produit intéressant a été sécrété et se trouve donc dans le milieu de culture duquel il peut être isolé par des procédés connus, qu'il s'agisse de techniques de séparation telles que la chromatographie, la précipitation sélective par exemple, celle-ci devant être adaptée évidemment à la nature de la molécule produite. La présente invention repose sur la mise en évidence de l'existence chez les corynébactéries de deux protéines naturellement secrétées majoritaires du surnageant de culture en milieu riche, PS1 et PS2, la protéine PSI ayant un poids moléculaire d'environ 67000 D, et PS2 d'environ 63000 D. A la différence du système décrit dans le brevet US 4 965 197, ces protéines n'ont pu être associées actuellement avec aucune activité DNase ni d'ailleurs avec aucune activité enzymatique définie. Le séquençage d'un fragment de 2547 paires de base contenant le gène codant pour PS1 et de la région en amont a été réalisé et correspond à la séquence suivante décrite à la figure 1 ainsi qu'à la figure 2 pour la carte de restriction de PS1. Par analyse informatique, une phase ouverte de lecture de 1971 paires de base a été identifiée correspondant à 657 acides aminés. Les signaux putatifs d'initiation de traduction (GAGAAGGAA AACTTCATG) et d'initiation de transcription (TACATA(-35), et TAAGAT(-10), ont été identifiés. En ce qui concerne les signaux de sécrétion, une séquence à l'extrémité NH2 présente les caractéristiques d'une séquence signal comportant un excès de charge positive (7 acides aminés à charge positive dans les 18 premiers acides aminés suivi d'une séquence avec excès d'acides aminés non polaires (18 acides aminés non polaires dans les 23 acides aminés suivants), ainsi que deux séquences d'acides aminés putatives d'un site de clivage de séquence signal apparaissent (pro thr ala ile ala en position 28 à 32) (pro met ala ser ala en position 39 à 43). La taille de la protéine mature est très proche de la taille prédite pour la protéine procéssée (ayant perdue son peptide signal). Un signal putatif de terminateur rho dépendant est trouvé dans l'extrémité COOH à 60 nucléotides des trois codons stop och-amb-opa. Les caractéristiques de la séquence sont rappelées ci-après de 239 à 244 TACATA (signal-35) (S) de 269 à 274 TAAGAT (signal-lO) (S) de 404 à 414 GAGAAGGAAA site de fixation des ribosomes (S) de 420 à 2393 séquence codante (S) de 423 à 548 peptide signal de protéine sécrétée (S) de 2456 à 2505 structure en épingle à cheveux signal de terminateur rho dépendant (S). Le séquençage d'un fragment de 2016 paires de base contenant le gène codant pour PS2 et la région en amont a été réalisé et correspond à la carte de restriction de PS2 décrite dans la figure 2. Une structure équivalente a été observée quant aux signaux d'expression génétique présents dans la séquence. La présente invention concerne également les protéines comportant toute ou partie de la séquence de PS1 ou PS2, en particulier comportant un ou plusieurs sites antigéniques de ces protéines. Lesdites protéines peuvent être utilisées à titre d'élément atypique notamment dans des trousses de diagnostic de même que les anticorps correspondants. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention et ne sont en aucun cas limitatifs. La figure 1 représente la séquence de la protéine PS1 et du gène correspondant. La figure 2 représente la carte de restriction de la région portant le gène codant pour PS1, et de la région portant le gène codant pour PS2. La figure 3 représente le plasmide pCGL612 portant une copie de Cspl (fragment Hind III/Sma 1 de 2,6 kb), et le plasmide pCGL613' correspondant au plasmide pCCL612 interrompu par le gène de résistance à la kanamycine (aph III). La figure 4 représente une construction après intégration substitutive d'un gène csp 1 inactif dans la région d'ADN portant csp 1. Exemple 1 La mise en évidence de deux protéines majoritaires, dénommées PS1 et PS2, dans le surnageant de culture en milieu riche de corynebacterium a permis après purification, d'obtenir des anticorps contre PS1 d'une part, et contre PS2, d'autre part, qui ne présentent pas de réactivité croisée et qui ont servi de crible dans les expériences suivantes. Le clonage des gènes de structure correspondant à ces deux protéines a été entrepris chez E. coli. Une banque de fragments d'ADN partiellement hydrolysés par Sau3Al et compris entre 3 kbp et 7 kbp de la souche de corynebacterium melassecola ATCC 17965 a été construite dans lambda gtll par l'intermédiaire d'adapteurs EcoR1-BamH1. Le criblage de cette banque avec les anticorps spécifiques de PS1 et PS2 a donné un signal immunologique positif pour environ 0,1% des phages. Pour PS1, sur 12 phages analysés, 9 présentent une région d'ADN commune d'environ 2,8 kbp. La plus grande insertion correspond à un fragment d'ADN d'environ 4,2 kbp, qui contient un promoteur fonctionnel chez E. coli ainsi que l'intégralité du gène de structure. Les échantillons d'extraits cellulaires bruts soniqués à partir de souches d'E. coli lysogénisées par ces phages recombinants ont été déposés sur un gel de polyacrylamide 0,1 % SDS et analysés par Western blot avec des anticorps polyclonaux antiPS 1. Ces expériences révèlent la présence d'une protéine de même masse moléculaire que celle obtenue chez C. melassecola. Il est aussi très intéressant de noter qu'une bande protéique mineure de masse moléculaire supérieure (environ 3500 de plus) est observée et qui pourrait correspondre à la forme précurseur chez E. coli. La protéine PS1 est dotée d'une séquence signal comme beaucoup de protéines sécrétées. L'expression du gène codant pour PS 1, csp 1, étant dans l'un des phages recombinants analysés, essentiellement sous le contrôle du promoteur Plac, on a pu définir le sens de transcription du gène ainsi que la localisation approximative de la région codante. Une analyse par Southern blot a montré que le fragment d'ADN cloné chez E. coli correspond bien à de l'ADN de C. melassecola ATCC17965 et ne semble présenter aucun réarrangement majeur ; en conditions d'hybridation stringente, aucune hybridation n'est observée avec de l'ADN d'E. coli. Une carte de restriction détaillée a été effectuée (utilisation plus de 25 enzymes de restriction) (résultats présentés en figure 2). Elle a permis le sous-clonage de la région codante et de la région promotrice de cspl dans un plasmide réplicatif d'E. coli, le pUN121 (nombre de copies moyen). Le gène cspl de C. melassecola ATCC17965 et son promoteur est porté par un fragment HindIII-SmaI d'environ 2,6 kbp. Le plasmide portant ce fragment a été nommé pCGL612 (figure 3), il est hébergé dans la souche d'E. coli TG1 (recA +) ; TG1 (pCGL612) synthétise une protéine PS1 (=réagissant aux anticorps spécifiques de PS1) de même masse moléculaire que PS1 chez C. melassecola ATCC17965, dont elle est issue. Ceci exclut une glycosylation de PS1 chez les corynébactéries et suggère une résistance de cette protéine à la dégradation par les protéases d'E. coli (ce qui est loin d'être la majorité des cas pour les protéines hétérologues synthétisées chez cette bactérie). Exemple 2 On a également réalisé des intégrations de gènes dans la région d'ADN portant csp 1. Pour ces expériences d'intégration, on réalise l'interruption du gène csp 1, par introduction d'une cassette "d'interruption de gène" (gène de résistance à un antibiotique) dans la région codante de csp 1. L'ensemble a été cloné dans un vecteur non réplicatif chez les corynébactéries (pCGL613' présenté en figure 3) et transféré dans la souche Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (B1 15) par électro poration. L'événement d'intégration dans les régions d'homologies par double crossing-over a généré une souche dotée du gène correspondant interrompu (figure 4) l'absence de la protéine PS1 qui en résulte constitue la preuve absolue du clonage de ce gène. Cette expérience montre que la présence d'une protéine PS1 fonctionnelle n'est pas nécessaire à la survie des corynébactéries. REVENDICATIONS 1. Système d'expression et de sécrétion dans une corynébactérie comprenant - une souche de corynébactérie, - une cassette de sécrétion contenant une première séquence d'ADN fonctionnelle pour l'expression dans ladite souche de corynébactérie, une seconde séquence d'ADN qui code pour un aminoacide, un polypeptide et/ou une protéine, et une troisième séquence d'ADN insérée entre lesdites première et seconde séquences d'ADN qui codent pour des éléments d'une protéine choisie parmi PS1 ou PS2, qui assurent la sécrétion desdits amino-acides, polypeptides et/ou protéines de ladite souche de corynébactérie. 2. Système d'expression et de sécrétion selon la revendication 1 caractérisé en ce que la souche de corynébactérie est du genre brevibacterium. 3. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la première séquence d'ADN fonctionnelle pour l'expression comporte un promoteur et un site de fixation des ribosomes. 4. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la cassette de sécrétion est portée par un plasmide autoréplicatif comportant une origine de réplication fonctionnelle dans la souche de corynébactérie. 5. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la cassette de sécrétion comporte des éléments d'ADN assurant son intégration dans le chromosome de la souche. 6. Système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendicatons 1 à 5, caractérisé en ce que la troisième séquence de DNA comporte toute ou partie de la séquence signal de PS1 ou PS2. 7. Souche de corynébactérie comportant un système d'expression et de sécrétion selon l'une des revendications 1 à 6. 8. Souche de corynébactérie selon la revendication 7, carctérisée en ce qu'il s'agit de brevibacterium. 9. Souche de corynébactérie selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Brevibacterium lactofermentum. 10. Procédé d'obtention d'un amino-acide, d'un polypeptide, d'une protéine caractérisé en ce que on cultive en un milieu de culture une souche de corynébactérie selon Itune des revendications 7 à 9, dans laquelle la seconde séquence de DNA code pour ledit amino-acide, ledit polypeptide, ladite protéine et en ce que l'on sépare après culture ledit produit du milieu de culture. 11. Protéine comportant tout ou partie de la séquence de PS1 ou de PS2. 12. Protéine comportant les sites antigéniques de PS1 ou PS2. 13. A titre d'élément antigénique une protéine selon l'une des revendications 11 et 12. 14. Anticorps dirigés contre PS1 ou PS2.