Brevet FR2677996A1 — publié le 19921224

La présente invention concerne un nouveau plasmide de levure, ainsi que de nouveaux vecteurs de clonage et/ou d'expression dérivés de celui-ci, leur préparation et leur utilisation, notamment pour la production de protéines recombinantes L'invention concerne aussi les cellules hôtes recombinées contenant de tels vecteurs. Plus particulièrement, la présente invention concerne tout ou partie d'un nouveau plasmide isolé à partir de la levure Kluyveromyces waltii ou d'un dérivé de celui-ci, et les vecteurs de clonage et/ou d'expression construits à partir de celui-ci. Au cours des dix dernières années, la levure est apparue comme un microorganisme hôte très prometteur pour la production de protéines hétérologues. En particulier, la mise en évidence par Beggs et al (Nature z ( 1978) 104) du plasmide 21 t et de vecteurs dérivés de celui- ci a été l'une des clés du développement actuel de l'étude génétique et moléculaire de la levure Saccharomyces cerevisiae Depuis, le système 2 p a permis d'introduire et d'exprimer des gènes hétérologues dans la levure afin d'obtenir des protéines d'intérêt pharmaceutique ou agro- alimentaire Cependant, le plasmide 21 i et ses dérivés ne peuvent se répliquer efficacement que dans les levures appartenant à l'espèce S cerevisiae et à quelques espèces proches de celle-ci Ce système ne peut donc pas être utilisé pour la manipulation génétique dans la plupart des espèces de levure Notamment, il n'est pas utilisable dans les levures dont les propriétés physiologiques, distinctes de celles de S cerevisiae, permettraient des applications nouvelles et/ou des exploitations industrielles plus performantes. Différents laboratoires ont donc recherché d'autres plasmides dans des espèces variées de levure Ainsi, plusieurs plasmides circulaires ont été trouvés chez la levure du genre Zygosaccharomvces, et notamment les plasmides p SR 1 et p SR 2 (Toh-é et al, J Bacteriol 15 j ( 1982) 1380); p SB 1, p SB 2, p SB 3 et p SB 4 (Toh-é et al, J Gen Microbiol, LQ ( 1984) 2527); et p SM 1 (Utatsu et al, J Bacteriol 1 2 ( 1987) 5537) Un plasmide circulaire a également été trouvé chez Kluyveromyces drosophilarum: p KD 1 (Falcone et al, Plasmid là ( 1986) 248). Tous ces plasmides présentent des caractéristiques communes avec le plasmide 2 k, et notamment des séquences répétées inversées, et l'existence sous deux formes isomériques possibles due à un système de recombinaison site- spécifique. Cependant, ces plasmides présentent toujours l'inconvénient d'avoir un spectre d'hôte étroit Ainsi, en raison de leur spécificité vis-à-vis des espèces hôtes de levure, ces plasmides ne peuvent être utilisés que dans un nombre limité de souches. La présente invention résulte de la mise en évidence d'un plasmide naturel de la levure Kluyveromvces waltii Ce plasmide, nommé p KW 1, est le premier plasmide naturel connu de cette espèce de levure Purifié à partir de la souche K waltii CBS 6430, ce plasmide a été cartographié au moyen d'enzymes de restrictions, et la carte résultante est présentée sur la figure 1. Un objet de l'invention réside donc dans le plasmide p KW 1 isolé à partir de la souche K waltii CB 56430, ou tout fragment ou dérivé de celui-ci. Par dérivé, on entend au sens de l'invention les plasmides qui, en dépit de quelques modifications, conservent les propriétés du plasmide de départ. Notamment, les modifications peuvent prendre la forme de mutations ou de délétions portant sur des régions d'une importance relative Il peut s'agir également d'insertions ou de suppressions, comme par exemple de sites de clonage. Par fragment de p KW 1, on entend notamment les différents éléments génétiques de ce plasmide Plus préférentiellement, comme éléments génétiques de p KW 1, on peut citer notamment les gènes de structure ou des parties de ceux- ci, des séquences promotrices fonctionnelles, les séquences répétées inversées (IR), ou encore les séquences permettant la réplication (origine de réplication) ou conférant la stabilité au plasmide (locus de stabilité). En effet, l'étude structurale du plasmide p KW 1 a permis de mettre en évidence des analogies avec le plasmide 2,u de S cerevisiae Ainsi, 4 gènes de structure ont été mis en évidence (voir figure 2), ainsi qu'une origine de réplication Par ailleurs, le clonage de p KW 1 dans E coli a permis d'isoler 4 types de plasmides recombinés, correspondant à 2 formes isomériques du plasmide p KW 1 (les formes A et B) clonées dans le vecteur p Kan 2 l dans les deux orientations possibles (le vecteur p Kan 2 l est décrit dans l'exemple 3 1) Ces deux formes sont représentées sur la figure 1 L'existence de deux formes isomériques indique la présence de séquences répétées inversées L'étude a ainsi montré que le plasmide p KW 1 contient une paire de séquences répétées inversées de 0,3 kb chacune, et deux séquences uniques de 2,5 et 2,3 kb, dont lorientation distingue les 2 formes isomériques A et B La taille moléculaire du plasmide p KW 1 est donc de 5,5 kb environ Différents sites de restriction ont été mis en évidence et, à titre d'exemple, les sites uniques suivants: Eco RI, Sph I, Sal I, Cla I, Nhe I et Bgl I. La séquence nucléotidique complète du plasmide p KW 1 a également été déterminée (figure 3) L'absence d'homologie entre cette séquence et celle de plasmides connus a été démontrée, notamment par des expériences d'hybridation (voir exemple 2) L'absence d'hybridation en conditions de stringence modérée est caractéristique de cette différence de séquence. Dans un mode préféré, l'invention a pour objet un plasmide comprenant tout ou partie de la séquence présentée à la figure 3 ou d'un dérivé de celle-ci. Par ailleurs, la Demanderesse a également montré qu'il est possible d'utiliser le plasmide p KW 1 ou des fragments de celui-ci pour construire des vecteurs de clonage et/ou d'expression particulièrement stables. Un autre objet de la présente invention réside donc dans des vecteurs de clonage et/ou d'expression caractérisés en ce qu'ils comprennent tout ou partie du plasmide p KW 1 de K waltii CBS 6430 représenté à la figure 1, ou d'un dérivé de celui-ci. Un objet plus particulier de l'invention consiste en un vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il comprend un élément génétique au moins du plasmide p KW 1. En raison du spectre d'hôte du plasmide p KW 1, les vecteurs de l'invention peuvent être utilisés dans des espèces autres que l'hôte naturel S, waltii. Ils peuvent notamment être utilisés pour la transformation d'espèces très variées, notamment d'espèces de levures. Différents types de vecteurs ont été construits à partir de p KW 1, différant au niveau de la taille du fragment provenant de p KW 1, et donc des éléments fonctionnels issus de p KW 1. Un objet encore plus particulier de l'invention consiste en un vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en oe qu'il comprend lorigine de réplication du plasmide p KW 1. D'autres constructions peuvent être préparées, contenant des frag- ments plus ou moins importants, permettant d'étudier l'influence des différents éléments de p KW 1 sur la stabilité des vecteurs, leur spécificité d'hôte, et leur effi- cacité pour l'expression de gènes hétérologues En particulier, des vecteurs d'expression peuvent être élaborés à partir des différents éléments génétiques du plasmide p KW 1 (origine de réplication, séquences répétées inversées, gènes de structure, régions promotrices), que l'on peut introduire dans des plasmides connus pour améliorer leurs performances ou leur conférer de nouvelles proprié- tés De la même façon, des vecteurs peuvent être obtenus en ajoutant des éléments au plasmide p KW 1, ou en remplaçant certains éléments génétiques de p KW 1 par des éléments provenant d'autres plasmides Ainsi, des vecteurs peuvent être obte- nus en substituant par exemple rorigine de réplication de p KW 1 par l'origine de réplication du plasmide 2,u de S cerevisiae ou du plasmide p KD 1 de Kluyvero- mvces, ou par un réplicon chromosomique (ARS) d'une levure (exemple KARS de K lactis De la même façon, des vecteurs peuvent être obtenus en substituant le locus de stabilité de p KW 1 par celui du plasmide 21 t de S cerevisiae ou du plasmide p KD 1 de Kluvveromyces Il peut être particulièrement interessant de réaliser des vecteurs hybrides comprenant des éléments des plasmides p KD 1 et p KW 1. Avantageusement, les vecteurs de l'invention comprennent l'intégra- lité du plasmide p KW 1 tel que représenté à la figure 1. Préférentiellement, les vecteurs de l'invention comprennent le plas- mide p KW 1 linéarisé à un site de restriction fonctionellement neutre. Par site de restriction fonctionellement neutre, on entend au sens de la présente invention un site de restriction au niveau duquel il est possible d'inter- rompre la structure du plasmide sans altérer ses propriétés de réplication et de stabilité. En particulier, il peut s'agir de sites présents sur le plasmide p KW 1 A titre d'exemple, on peut citer notamment les sites Cla I( 1); Pst I( 4608); ou Eco RV( 3072) tels que représentés sur la figure 1. Il peut également s'agir de sites introduits artificiellement sur le plasmide p KW 1, ou rendus uniques Dans ce cas, les sites sont préférentiellement introduits dans des régions intergéniques du plasmide, et notamment dans la région située entre les gènes B et D ou dans celle située entre le gène D et l'IR 2. Avantageusement, selon la présente invention, le plasmide p KW 1 est linéarisé au niveau d'un site de restriction unique. Un site particulièrement intéressant à cet égard est le site unique Cla I localisé en position 1 sur la figure 1 La Demanderesse a en effet montré que ce site permettait d'utiliser le plasmide p KW 1 pour construire les vecteurs de clonage et/ou d'expression, en introduisant à ce niveau, par exemple, des fragments d'ADN hétérologue, tout en maintenant la réplication stable du vecteur obtenu Ce résultat est surprenant dans la mesure o le site Cla I est localisé dans le gène de structure B. L'utilisation de tels sites de clonage neutres permet donc d'obtenir des vecteurs très stables, capables de se maintenir dans les cellules transformées, même en l'absence de toute pression de sélection. Avantageusement, les vecteurs de l'invention contiennent en outre une séquence d'ADN hétérologue comprenant un gène de structure au moins, sous le contrôle de signaux permettant son expression. Les signaux permettant l'expression du ou des gènes de structure peuvent être constitués par un ou plusieurs éléments choisis parmi les promoteurs, les terminateurs ou les signaux de sécrétion Il est entendu que ces signaux sont choisis en fonction de l'hôte utilisé, du gène de structure et du résultat recherché. En particulier il peut être préférable dans certains cas d'utiliser un promoteur régulable, permettant le découplage entre les phases de croissance de l'hôte et d'expression du ou desdits gènes de structure De même, l'utilisation d'un peptide signal (signal de sécrétion) peut permettre d'augmenter les taux de production de la protéine recherchée, et faciliter l'étape de purification. Préférentiellement, les promoteurs utilisés sont dérivés de gènes de levure D'un intérêt tout particulier sont les promoteurs dérivés de gènes glycoly- tiques des levures du genre Saccharomyces ou Kluyveromyces Notamment, on peut citer les promoteurs des gènes codant pour la phosphoglycerate kinase de S.cerevisiae (PGK), la Glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase (Qrn), les énolases (EN_), ou les alcool- deshydrogenases (ADH) On peut également citer des promoteurs dérivés de gènes fortement exprimés tels que le gène de la lactase (LAC 4) ou de la phosphatase acide (PH 05). Par ailleurs, ces régions peuvent être modifiées par mutagénèse, par exemple pour ajouter des éléments supplémentaires de contrôle de la transcription, tels que notamment des régions UAS ("Upstream Activating Sequence"). Le gène de structure qui peut être introduit dans les vecteurs de l'invention code préférentiellement pour un polypeptide d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire A titre d'exemple, on peut citer les enzymes (tels que notam- ment la superoxide dismutase, la catalase, les amylases, les lipases, les amidases, la chymosine etc), les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine, l'alpha ou la béta-globine, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur van Willebrand, la fibronec- tine, l'alpha-i antitrypsine etc), l'insuline et ses variants, les lymphokines ltelles que les interleukines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF), le TNF, le TRF etc l, les facteurs de croissance (tels que l'hormone de croissance, l'érythropoiétine, le FGF, l'EGF, le PDGF, le TGF etc), les apolipoprotéines, ou encore des polypeptides antigéniques pour la réalisation de vaccins (hépatite, cytomégalovirus, Eppstein-Barr, herpes etc). Dans un mode particulier de réalisation de l'invention le gène de structure peut être un gène résultant de la fusion de plusieurs séquences d'ADN Il peut s'agir notamment d'un gène codant pour un polypeptide hybride, contenant par exemple une partie active associée à une partie stabilisatrice A titre d'exemple, on peut citer les fusions entre l'albumine ou des fragments d'albumine et un récepteur ou une partie d'un récepteur de virus (CD 4, etc). Dans un autre mode de réalisation, la séquence d'ADN hétérologue peut comprendre plusieurs gènes de structure, et notamment des gènes interve- nant, au niveau génétique ou biochimique, dans la biosynthèse d'un métabolite Le métabolite peut en particulier être un antibiotique, un acide aminé ou une vitamine. Dans un mode particulier de réalisation, les vecteurs de l'invention contiennent en outre: un réplicon E c 1 i et/ou au moins un marqueur de sélection. Ces éléments permettent de manipuler de manière beaucoup plus aisée les vecteurs de l'invention. Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinées contenant un vecteur tel que défini ci-avant. Les cellules recombinées sont préférentiellement choisies parmi les levures. La Demanderesse a montré que les vecteurs de l'invention pouvaient en effet être utilisés aussi bien dans Kwaltii (l'hôte naturel de p KW 1) que dans des levures d'espèces ou même de genres différents Notamment, ils peuvent être utilisés dans d'autres Klyuveromyces ou dans Saccharomyce 5 Par ailleurs, lorsque la souche K waltii CB 56430 est utilisée comme cellule hôte, des recom- binaisons homologues entre les vecteurs de l'invention et le plasmide p KW 1 rési- dent peuvent affecter la stabilité des vecteurs, et ainsi diminuer les performances du couple hôte/vecteur Afin d'améliorer encore la stabilité des vecteurs de l'invention dans un tel couple hôte/vecteur, la demanderesse a préparé une souche K waltii p KW 1 (KW 18) Cette souche permet d'optimiser l'utilisation indus- trielle des vecteurs de l'invention (voir exemple 4). Différentes techniques peuvent être utilisées pour introduire les vec- teurs de l'invention dans les cellules hôtes En particulier, la transformation (Bianchi et al, Curr Genet 12 ( 1978) 185) et l'électroporation (Delorme, Appl Environ Microbiol 155 ( 1989) 2242) donnent de bons résultats Il est clair toutefois que l'invention n'est pas limitée à une technique particulière. Un objet de l'invention réside également dans un procédé de prépara- tion d'un polypeptide selon lequel on cultive une cellule recombinée telle que définie plus haut et on récupère le polypeptide produit Plus particulièrement, le procédé de l'invention permet la production de protéines d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire, telles que celles indiquées ci-avant Plus spécifiquement, le procédé de l'invention est adapté à la production d'albumine humaine et de ses variants ou précurseurs. Dans le cas o les gènes de structure interviennent dans la biosyn- thèse d'un métabolite, les cellules recombinées peuvent également être utilisées directement dans un procédé de bioconversion. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: Carte de restriction du plasmide p KW 1 Les séquences répétées inver- sées ainsi que les gènes de structure A-D sont indiqués Les positions indiquées pour les sites de restriction correspondent au premier nucléotide reconnu par l'enzyme. Figure 2: Etude des phases ouvertes du plasmide p KW 1 Les éléments génétiques indiqués sont localisés aux positions suivantes par rapport à la séquence présentée figure 3 Gène A: nucléotides 1454 à 2755; Gène B: nucléotides 4948 à 54; Gène C nucléotides 389 à 1309 sur le brin complémentaire; Gène D nucléotides 3444 à 4313 sur le brin complémentaire; IR 1: nucléotides 53 à 368; IR 2: nucléotides 2713 à 3028. Figure 3: Séquence nucléotidique du plasmide p KW 1 La séquence représentée correspond à la forme B du plasmide La position 1 correspond au premier nucléotide de la séquence reconnue par l'enzyme Cla I Le plasmide p KW 1 a été fragmenté par des enzymes de restriction et les fragments ont été clonés dans p TZ 18 R (Pharmacia) Les séquences des segments clonés ont été déterminées par la méthode de Sanger sur les 2 brins. Figure 4: Cartes de restriction des plasmides navettes YIP 5 et p Kan 21 Ap: Gène de résistance à l'ampicilline; Tc: Gène de résistance à la tétracycline; Km: Gène de résistance à la kanamycine (G 418); Lac Z: Gène de structure de la Bgalactosi- dase. Figure 5: Stratégie de construction des vecteurs p BNA 1, p NEA 2, p BNB 1/A 3, p NEB 1, p XXY 2 et p XXK 3 Voir aussi tableau 1. Figure 6: Carte de restriction du vecteur p XXK 3. Figure 7: Stratégie de construction des vecteurs p KWC 11, p KW 51 et p KW 514. Figure 8: Etude de la stabilité des vecteurs p KWC 11 et p XXK 3 dans la souche Kwaltii KW 18 Dans chaque cas, un clone transformé a été cultivé en milieu YPG non sélectif pendant le nombre de générations indiqué, puis des aliquots de culture ont été étalés sur boites de milieu YPG gélosé avec et sans G 418, afin de déterminer le nombre total des cellules et le nombre de cellules résistant à G 418. La stabilité correspond au % de cellules résistantes. Figure 9: Stratégie de construction du vecteur d'expression p XPHO 5 Abbrévia- tions: P=promoteur, T=terminateur, ss=signal de sécrétion, CIP=Calf Intestinal Phosphatase, Km=kanamycine, E=Eco RI, H=Hind IH, S=Sa II, B= Bam HI, Sm-=Sma L. Figure 10: Cartes de restriction des vecteurs p XKN 18 et p XPHO 5 Légende: voir figure 9. Figure 11: Détection immunologique de l'IL 1 B produite par Kwaltii Les mar- queurs de poids moléculaire (K Da) sont indiqués à gauche Puits 1: IL-1 B de référence ( 100 ng); Puits 2: Surnageant de culture du transformant p XKN 18 (sans cassette IL-1 B); Puits 3: Surnageant de culture du transformant p XPHO 5 traité par l'endo-N acetylglucosamidase H; Puits 4 et 5: Surnageants des cultures des transformants p XPHO 5 en milieu L Pl et H Pl respectivement. Figure 12: Stratégie de construction du plasmide p YG 65. Figure 13: Stratégie de construction du plasmide p YG 70. Figure 14: Stratégie de construction du plasmide p YG 141 Xph: gène codant pour l'aminoglycoside 3 '-phosphotransférase, conférant la résistance à la kana- mycine; bla: gène codant pour la B-lactamase conférant la résistance à l'ampicil- line. Figure 15: Stratégie de construction du plasmide p YG 142. Tableaux 1 et 2: Composition de vecteurs dérivés de p KW 1 selon l'invention (*) Sites de clonage. Tableaux 3, 4 et 5: Transformation par des vecteurs de l'invention respectivement de S cerevisiae, K waltii et de différentes souches de Kluyveromvces La stabilité des transformants est exprimée par le pourcentage de cellules Ura+ après 10 géné- rations de croissance dans le milieu non-sélectif YPD Les souches isonucléaires K.waltii p KW 1 + et p KW 1 sont CBS 6430 et KW 18 respectivement. TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centri- fugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium bromure d'éthi- dium, la digestion par les enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, l'élec- troélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E coli, etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y, 1986; Ausubel et al, (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York 1987). La mutagénèse dirigée in vitro par oligodésoxynucléotides est effec- tuée selon la méthode développée par Taylor et al (Nucleic Acids Res 13 ( 1985) 8749-8764) en utilisant le kit distribué par Amersham Le séquençage de nucléo- tides est réalisé selon la technique des didéoxy décrite par Sanger et al (Proc. Natl Acad Sci USA, 74 ( 1977) 5463-5467) L'amplification enzymatique de fragments d'ADN spécifiques est effectuée par réaction de PCR ("Polymerase- catalyzed Chain Reaction") dans les conditions décrites par Mullis et Faloona (Meth Enzym, 155 ( 1987) 335-350) et Saiki et al (Science 23 ( 1985) 1350- 1354), en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) en suivant les recommandations du fabricant. EXEMPLES 1) Isolement et purification de p KW 1 La souche CBS 6430 est cultivée dans 2 litres de milieu YPG (Yeast extract 1 %, Bactopeptone 1 %, Glucose 2 %) avec agitation à 26 C pendant envi- ron 18 heures Les cellules en phase stationnaire précoce sont récoltées par centri- fugation On obtient habituellement 13 à 15 grammes de masse cellulaire par litre. Les cellules sont lavées avec 150 ml de sorbitol 1 M contenant 30 mg de Zymo- lyase 20 T (Kirin Breweries Co, Tokyo) Après incubation à 30 C pendant 1 heure, on ajoute à la suspension de protoplastes 5 ml de sodium dodecylsulfate à %o et 5 ml de EDTA à 0,SM, p H 7,0 Le mélange est immédiatement agité vi- goureusement, et incubé à 50 C pendant 1 à 2 heures On ajoute au lysat l'acétate de potassium à la concentration finale de 1 M et le mélange est maintenu dans la glace pendant 2 heures Les précipités formés sont éliminés par centrifugation (Sorvall S 534, 15 000 tpm, 30 minutes) Le surnageant auquel 2 volumes d'étha- nol à 95 % sont ajoutés est refroidi dans la glace afin de précipiter les acides nucléiques Les précipités sont collectés par centrifugation, lavés avec l'éthanol à %, séchés sous vide, et enfin dissouts dans 40 ml de 5 x TE (lx TE est Tris- H Cl 10 m M, EDTA lm M, p H 8) Après addition de 40 g de Cs CI et 5 ml de bromure d'éthidium (solution stock de 10 mg/ml), le mélange est centrifugé à 000 tpm pendant 6 heures (Beckman, rotor 60 Ti) La bande fluorescente de r ADN plasmidique se trouve au-dessous de la bande majeure d'ADN chromosomique L'ADN du plasmide est collecté et soumis au second cycle de centrifugation dans Cs CI/bromure d'éthidium L'ADN plasmidique collecté est mélangé avec un volume d'isopropanol préalablement équilibré avec Cs Cl 4 M pour éliminer le bromure d'éthidium Après plusieurs extractions par l'isopropanol, la solution d'ADN est dialysée contre 1 x TE Le volume de la solution peut être réduit par dialyse contre le polyéthylène-glycol 6 000 en paillettes. 2) Séquençage et études d'homologies Le plasmide p KW 1 a été séquence en utilisant la méthode décrite par Sanger et al (Proc Natl Acad Sci USA 74 ( 1977) 5463-5467) La séquence complète est indiquée sur la figure 3. L'absence d'homologie entre cette séquence et celle de plasmides connus a été déterminée par des expériences d'hybridations moléculaires: p KW 1 est marqué au 32 p, et hybridé avec les plasmides suivants, préalablement immo- bilisés sur un filtre de nitrocellulose: plasmide 2 de S cerevisiae, p SR 1, p SB 3 et p SB 4 de Z rouxii, p SB 1 et p SB 2 de Z bailii, et p KD 1 de K drosophilarum. L'hybridation a été réalisée dans des conditions de stringence modé- rée ( 0,6 M Na+, 65 C, 18 heures); aucun des plasmides n'a donné un signal positif d'hybridation. Les autres plasmides circulaires (p SB 1, p SB 4) dont les séquences n'ont pas encore été décrites, sont également différents de p KW 1, par la taille moléculaire, par la longueur des répétitions inverses et par leurs espèces hôtes. 3) Construction de vecteurs de clonage dérivés de p KW 1. Deux types de molécules recombinées ont été construits à partir de p KW 1. 3.1 Dans le premier type, différents fragments de p KW 1 (correspondant par exemple aux éléments génétiques de p KW 1) ont été introduits dans des vecteurs navette, et notamment dans les vecteurs Y Ip 5 (Struhl et al, Proc Nat Acad Sci USA 76 ( 1979) 1035) et p Kan 2 11, représentés sur la figure 4. Le plasmide p Kan 21 a été construit par insertion du gène aph (Genblock, Pharmacia) conférant la résistance à la kanamycine (G 418) sous forme d'un fragment Acc I de 1,25 kpb, dans le site Nar I du plasmide p UC 19 (Viera et Messing, Gene 19 ( 1982) 259) p Kan 21 contient donc, en plus de ph, le gène bla conférant la résistance à l'ampicilline et l'origine de réplication de Col E 1 permettant la réplication dans E Coli Les levures transformées par les vecteurs dérivés de p Kan 21 peuvent être détectées par leur croissance sur milieu contenant t Lg/ml de généticine (G 418). Le plasmide Y Ip 5 est un dérivé du plasmide p BR 322 dans lequel le gène URA 3 de S cerevisiae a été inséré comme marqueur de sélection La levure transformée par les dérivés de Y Ip 5 est détectée par sa croissance sur un milieu sans uracile Dans ce dernier cas, la levure hôte est une auxotrophe déficiente en orotidine-monophosphate carboxylase de la voie de synthèse de l'uracile. Les vecteurs de ce premier type sont p BNA 1, p NEA 2, p BNB 1/A 3, p NEB 1, p XXY 2 et p XXK 3 (tableau 1 et figure 4). Vecteur p BNA 1 p KW 1 a été digéré par Bgl II et Nhe I (Cf figure 5) et les fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse Le fragment de 2,4 kpb est récupéré et inséré par ligation entre les sites uniques Bam HI et Nhe I dans le gène de résis- tance à la tétracycline du plasmide Y Ip 5 (Yanish-Peron et al, Gene 33, 1985, 103-119), celui-ci étant préalablement digéré par Bam HI et Nhe I et repurifié Les extrémités Bgl II et Bam HI sont compatibles pour ligation spécifique E coli transformé par le mélange de ligation est sélectionné sur le milieu LB gélosé contenant l'ampicilline L'insertion est vérifiée par la réplique des transformants sur le milieu LB gélosé contenant la tétracycline, ceux-ci étant sensibles à cet antibiotique La structure duplasmide est vérifiée par extraction de l'ADN à partir de transformants individuels et son analyse par les enzymes de restriction A titre d'exemple, le plasmide p BNA 1 digéré par Pst I produit 3 fragments de 3,28, 3,15 et 1,36 kpb: la double digestion Pst I/Nhe I donne 4 fragments de 3,15, 2,3, 1,36 et 1,0 kpb. Vecteur p NEA 2 Le fragment Nhe I-Eco RI de 2,0 de p KW 1 (Cf figure 5) est isolé et inséré entre les deux sites uniques Nhe I et Eco RI dans le gène de résistance à la tétracycline de Y Ip 5, celui-ci étant préalablement digéré par ces deux enzymes. Le produit de ligation est introduit dans E coli, et les transformants résistants à ampicilline et sensibles à la tétracycline sont isolés Le plasmide est isolé comme dans le cas de p BNA 1 à partir de l'un de ces transformants La structure du plasmide recombiné obtenu est vérifiée par restriction A titre d'exemple, la digestion par Pst I produit 2 fragments de 4,35 et 3,15 kpb; la double digestion par Pst I/Xho I produit 4 fragments de 3,15, 1,8, 1,75 et 0,7 kpb. Vecteur p XXY 2 Le fragment Xho I-Xba I de 545 pb de p KW 1 (Cf figure 5) est isolé et inséré entre les sites uniques Sal I-Nhe I dans le gène de résistance à la tétracycline du plasmide Y Ip 5 Les extrémités Xho I et Sal I, d'une part, et Xba I et Nhe I, d'autre part, sont compatibles pour ligation spécifique Le produit de ligation est introduit dans E coli, et le plasmide recombiné est isolé comme dans le cas de p BNA 1 La structure du plasmide obtenu est vérifiée par restriction A titre d'exemple, la digestion par Eco RI + Nru I produit deux fragments de 4,5 et 0,96 kpb. Vecteur p XXK 3 Le fragment Xho I-Xba I de 545 pb de p KW 1 (Cf figure 5) est isolé et inséré entre les sites uniques Sal I-Xba I (polylinker au N-terminal de Lac Z) du plasmide p Kan 21 Le mélange de ligation est introduit dans E coli, et les trans- formants, étalés sur le milieu LB contenant X-gal et IPTG, sont isolés comme colonies blanches parmi les bleues Répliquées sur le milieu LB contenant la kanamycine, elles croissent bien Ces colonies sont individuellement analysées pour leur contenu en plasmide Le plasmide obtenu à partir de l'un des transfor- mants présente la structure montrée dans la figure 6, vérifiée par restriction A titre d'exemple, la digestion par Bam HI + Pst I produit quatre fragments 2,5, 1,3, 0,55 et 0,19 kpb. Vecteur p BNB 1/A 3 Le fragment Bgl II-Nhe I de 1,9 kpb de p KW 1 (Cf figure 5) est isolé et inséré entre les sites Bam HI-Nhe I de Y Ip 5 Le plasmide recombiné est isolé comme dans le cas de p BNA 1 La structure du plasmide est vérifiée par restric- tion A titre d'exemple, la digestion par Pst I produit 3 fragments de 3, 15, 2,8 et 1,36 kpb; la double digestion par Pst I/Nhe I produit 4 fragments de 3,15, 1,8, 1,36 et 1,0 kpb. Vecteur p NEB 1 Le fragment Nhe I-Eco RI de 2,5 kpb de p KW 1 (Cf figure 5) est isolé et inséré entre les sites Nhe I-Eco RI de Y Ip 5 Le plasmide recombiné est isolé comme dans le cas de p BNA 1 La structure du plasmide est vérifiée par restric- tion A titre d'exemple, la digestion par Pst I produit 2 fragments de 4, 65 et 3,15 kpb; la double digestion par Pst/Xho I produit 3 fragments de 3,15, 2,9 et 1,75 kpb. 3 2 Le deuxième type de molécules recombinées contient la totalité de la séquence de p KW 1 Pour obtenir ces vecteurs, p KW 1 est linéalisé par cou- pure unique à un site de restriction, permettant d'introduire des segments d'ADN hétérologue De tels segments peuvent contenir des gènes de structure, inclus par exemple dans des cassettes d'expression, et/ou des vecteurs navettes entiers, tels que notamment p Kan 21 ou Y Ip 5 (figure 4). Les exemples de ce type de vecteurs sont p KWC 11, p KW 51 et p KW 514 (tableau 2 et figure 7). vecteur p KW 514 L'ADN de p KW 1 a été digéré par l'enzyme de restriction Sal I Le plasmide p Kan 2 11, décrit plus haut, est digéré aussi par Sal I (le site unique Sal I est localisé dans le multisite de clonage présent dans le gène Lac Z) Les deux plas- mides sont ligaturés par l'ADN-ligase Le mélange de ligation est utilisé pour la transformation de E col JM 83 comme dans le cas précédent La suspension des cellules transformées est étalée sur LB gélosé contenant X-gal et IPTG Les colonies blanches, parmi les bleues, sont récupérées individuellement Elles sont résistantes à l'ampicilline et à la kanamycine Leur contenu en plasmide est ana- lysé sur les mini-préparations d'ADN comme précédemment Le plasmide, p KW 514, isolé à partir de Pun des transformnants, contient la forme A du plasmide p KW 1 et possède la structure montrée dans la Figure 7 Elle est vérifiée par restriction A titre d'exemple, la digestion par Bam HI produit 3 fragments de 5,6, 2,6 et 1,2 kpb. Vecteurp KW Cll Le plasmide p KW 1 est digéré par Cla I Le plasmide p Kan 21 est digéré par Acc I Ils sont repurifiés par traitement au phénol et précipitation par éthanol Les ADN des deux plasmides sont mélangés en quantités approximati- vement égales et soumis à la réaction de ligation par l'ADN-ligase pendant une nuit Le produit de ligation est amplifié dans E coli Les colonies des transfor- mants sont blanches sur le milieu LB contenant Xga I et IPTG Elles sont résis- tantes à la kanamycine et l'ampicilline sur le milieu contenant l'un ou l'autre de ces antibiotiques Le plasmide, p KWC 11, isolé à partir de l'un des transformants, contient la forme A du plasmide p KW 1 et possède la structure montrée dans la Figure 7 Elle est vérifiée par restriction A titre d'exemple, la digestion du plas- mide par Bam HI produit 3 fragments de 5,6, 2,9 et 0,9 kpb. Vecteur p KW 51 Le plasmide p KW 1 et le plasmide Y Ip 5 sont digérés par Sal I Le mélange est repurifié et soumis à la réaction de ligation Le produit de ligation est introduit dans E coli Des transformants résistants à l'ampicilline et sensibles à la tétracycline, sont obtenus Le plasmide, p KW 51, isolé à partir de l'un d'entre eux, contient la forme A du plasmide p KW 1 et possède la structure montrée dans la Figure 7 A titre d'exemple, la digestion du plasmide par Eco RI donne deux frag- ments de 8,3 et 2,7 kpb. 4) Construction d'une souche CBS 6430 p K Wl- Kwaltii CBS 6430 a d'abord été transformée par le plasmide recom- binant p KW 514 (tableau 2 et figure 7) La méthode de transformation utilisée est essentiellement celle décrite par Chen et Fukuhara (Gene 69, 181 ( 1988)) utilisant les protoplastes Les transformants obtenus sont maintenus pendant 75 générations sur milieu YPD-agar 1 mg/ml G 418 (Milieu YPD: extrait de levure 10 g/l; peptone 20 g/l; glucose 20 g/l) Ils sont ensuite transférés sur milieu YPD liquide sans antibiotique et maintenus pendant 10 générations. Dans ces conditions (sans pression sélective), le plasmide p KW 514 est progressivement perdu Les colonies sensibles à G 418 qui apparaissent sont prélevées et testées individuellement pour la présence des plasmides Le test consiste en extraction de l'ADN cellulaire, suivie d'une électrophorèse de ces AD Ns sur un gel d'agarose La présence de plasmides est révélée par coloration au bromure d'éthidium Parmi les colonies qui sont devenues sensibles à G 418, 25 % se sont révélées démunies de tout plasmide Une de ces colonies a été gardée comme souche de K waltii dépourvue de plasmide p KW 1 et désignée KW 18. 5) Transformation de différentes levures 5.1 Transformation de S cerevisiae Parmi les différents vecteurs décrits dans les tableaux 1 et 2 et aux figures 4 et 5, certains de ceux contenant le marqueur LIRA 3 ont été utilisés pour transformer une souche auxotrophe jja 3 de S cerevisiae (la souche 5150 2 B: Mat a, m M 3, 1 Qu 2, Ir 1, hà 3, 2 p). La méthode de transformation est essentiellement celle décrite par Sherman et al (Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, NY, 1986). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 3 Ils montrent que les vecteurs de l'invention sont capables de transformer les levures du genre Saccharomyces. 5.2 Transformation de K waltii La transformation de Kwaltii a été réalisée avec des vecteurs portant le marqueur de résistance à la kanamycine. La méthode de transformation utilisée est essentiellement celle décrite par Chen et Fukuhara (Gene 69 ( 1988) 181) utilisant les protoplastes Il est clair que toute autre technique permettant d'introduire un fragment d'ADN dans un microorganisme peut être utilisée. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 4. * Ils montrent que les vecteurs de l'invention sont capables de trans- former avec une fréquence élevée la levure Kwaltii. Par ailleurs, l'étude de stabilité décrite dans la figure 8 montre que des vecteurs peuvent être obtenus à partir de p KW 1, présentant une stabilité de % après 50 générations de croissance dans un milieu non sélectif Ceci est parfaitement illustré par le vecteur p KWC 11 Cette étude montre également qu'il est préférable, pour obtenir une stabilité relativement élevée, d'utiliser les vecteurs ne comportant que l'origine de réplication du plasmide p KW 1 dans des cellules hôtes possédant un plasmide p KW 1 résident. 5.3 Transformation d'autres levures Le vecteur p KWC 11, hautement stable et autonome dans K waltii, a été utilisé pour tester la transformabilité de différentes expèces de levures, et notamment celles appartenant au genre Kluyveromyces. Les résultats sont présentés dans le tableau 5. La présence du vecteur p KWC 11 dans les transformants a été vérifiée par électrophorèse. L'ensemble de ces résultats montrent que l'étendue des espèces hôtes des vecteurs de l'invention peut être très grande, dépassant le genre Kluvvero- myvces. 6) Utilisation des vecteurs de l'invention pour la production de protéines hétérologues 6 1 Interleukine-1 B: 6.1 1 Construction d'un vecteur d'expression et de sécrétion de l'IL-1 B dérivé de p KW 1 (figures 9 et 10). Le vecteur p XXK 3 (tableau 1, figure 6) est linéarisé par Eco RI et les extrémités sont comblées avec le fragment Klenow de l'ADN polymerase I de E coli Un "linker" synthétique ( 5 '-GCGGCCGC-3 ') formant un site de restriction reconnu par l'enzyme Not I est ajouté au moyen de la ligase T 4, et le vecteur ainsi obtenu (p XKN 18) est purifié après son amplification chez E coli (figure 10). Une cassette d'expression de l'IL-1 B est réalisée, composée (a) du promoteur régulé PHO 5 provenant de S cerevisiae (Bajwa et al, Nucl Acid Res. 12, ( 1984) 7721-7739), (b) du gène de l'IL-1 B humaine (Jung et a I, Ann. Inst Pasteur/Microbiol 139 ( 1988) 129-146) précédé (c) d'une séquence synthétique correspondant à la séquence signal de la toxine killer de p GKL 1 de K.lactis (région pré du gène de la sous-unité alpha) (Stark et Boyd, EMBO J 5, ( 1986) 1995-2002), et (d) du terminateur PHO 5 La cassette d'expression a été isolée à partir du vecteur p SPHO 5-IL 14 dont la construction est décrite dans le brevet EP 361991 La cassette a été réalisée de la manière suivante: A l'extrémité ' du gène codant pour la partie mature de 'I'L-l B est insérée Ia séquence synthétique suivante, sous forme d'un fragment Eco RI: Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly Lys Arg 5 '-TTCATTT T GCTGTCATCGTCAAGGTAAAAG-3 ' 3 '-TAC Tr ATATAAAATGTATAAAAACAAAAACGACAGTAAGCAAGTTCCATITC Tr AA-5 ' Les derniers codons ajoutés (Lys et Arg) forment un site de coupure potentiel reconnu par l'endopeptidase Kexl de K 1 lactis (Tanguy-Rougeau et al; FEBS Lett 234 ( 1988) 464) Cette séquence a été fusionnée au gène de l'IL-1 B par le site Eco RI, formant la jonction suivante: Gly Lys Arg Ile His Met Ala 'GGT AAA AGA AT CAT ATG GCA 3 ' L'alanine (GCA) correspond au premier acide aminé de r'IL-1 B mature. Arg-Ile-His-Met correspond à un "linker" Eco RI-Nde I introduit pour faciliter le clonage (Cf EP 361 991). L'ensemble de la cassette est mis sous forme d'un fragment Not I par addition d'un linker correspondant ( 5 '-GCGGCCGC-3 '). La cassette de secrétion de l'IL-1 B est insérée, au site Not I, dans p XKN 18 Le vecteur résultant est appelé p XPHO 5 (figure 10). 6 1 2 La souche K waltii CBS 6430 est transformée par le vecteur p XPHO 5, dans les conditions décrites dans l'exemple 5 2. 6.1 3 Expression de l'IL-1 B: Les cellules transformées sont cultivées à 28 C, en absence de G 418, dans le mi Iieu liquide L Pl (à faible teneur en phosphate minéral) et le milieu H Pl (à haute teneur en phosphate), préparés selon Chen et Fukuhara (Gene 69 ( 1988) 181-192), pendant 4 jours 50 ml de culture sont centrifugés et les surnageants filtrés sur membrane Millipore ( 0,22 apm) Les protéines sont précipitées par addition d'éthanol à la concentration finale de 60 % Les précipités sont dissouts dans 2 ml de tampon de Laemmli (Nature AZ ( 1970) 680-685) et 20 p 1 d'échan- tillons sont utilisés pour l'analyse SDS-PAGE selon Laemmli (document précité). Après électrophorèse, les protéines sont transférées sur une feuille de nitrocellu- lose, et traitées par un antisérum polyclonal de lapin anti IL-18 humaine Le Blot est ensuite traité avec un 2 ème anticorps polyclonal anti-lapin biotinylé (Vectastain ABC Immuno Peroxydase Kit, Vector Laboratories) Le complexe antigène-anticorps est révélé selon le protocole du fournisseur. La figure 11 montre qu'une protéine de poids moléculaire apparent de 21 k Da est sécrétée par la levure transformée par p XPHO 5 La protéine est spéci- fiquement reconnue par l'antisérum anti-IL-l B Cette protéine n'est pas synthétisée par la levure transformée par le vecteur de contrôle p XKN 18 (sans cassette IL-1 B) La protéine sécrétée correspond à la forme glycosylé de l'IL-l B, ce qui est démontré par la réduction du PM apparent après traitement par l'enzyme endo-N-acétylglucosamidase H (figure 11 piste 3) Ce couple hôte/vecteur K.waltii/p XPHO 5, encore non-optimisé, sécrète approximativement 5 mg d'IL-l Bpar litre de culture Le niveau de la sécrétion d'IL-18 par K waltii est plus élevé dans le milieu L Pl que dans le milieu H Pi, ce qui suggère que l'activité du promoteur PHO 5 est régulée par le phosphate dans K waltii comme dans S.cerevisiae. 6.2 Sérum-albumine humaine: 6.2 1 Construction du plasmide p YG 140 (figures 12-14). Un plasmide a été construit comprenant: un réplicon E co&i, le gène I sous contrôle du promoteur kl de la toxine killer de K.lactis (EP 361911) dans lequel le site Hind Il a été éliminé par mutagénèse diri- gée, et le gène b I, conférant la résistance à l'ampicilline. Le gène aph sous contrôle du promoteur kl est isolé à partir du plasmide p Kan 707 (EP 361991) sous forme d'un fragment Pst I, qui est cloné dans le site équivalent du phage M 13 mp 7 Le plasmide résultant est appelé p YG 64 (figure 12) Le site Hindn I présent dans ce gène a été détruit par mutagénèse diri- gée selon la méthode décrite par Taylor et al (Nucl Acid Res 13 ( 1985) 8749). Le plasmide résultant est appelé p YG 65 L'oligodéoxynucléotide ayant servi pour la mutagénèse a la séquence suivante: 5 '- GAAATGCATAAGCTCTTGCCATTCTCACCG-3 ', et a permis de transformer le triplet CTT codant pour la leucine 185 en CTC Pour construire le plasmide p YG 70, la partie contenant le réplicon bactérien du vecteur p Kan 707 a été isolée par digestion avec l'enzyme Eco RI et recircularisation avec la T 4 DNA ligase pour obtenir p YG 69 Le frag- ment Pst I présent dans ce dernier vecteur contenant le gène ph a ensuite été remplacé par le fragment équivalent muté provenant de p YG 65 Le plasmide résultant est appelé p YG 70 (figure 13). Ce plasmide est ensuite digéré par Eco RI et religué en présence d'un adaptateur Eco RI-Nar I-Eco RI contenant la séquence suivante: 5 '-AATTCGGCGCCG-3 '. La plasmide obtenu est appelé p YG 140 (figure 14). 6.2 2 Introduction d'une cassette d'expression de l'albumine (figure 14). Le gène codant pour la prépro SAH sous contrôle du promoteur et du terminateur du gène PGK de S cerevisiae a été isolé sous forme d'un fragment Sal I-Sac I à partir du vecteur d'expression p YG 19 (EP 361991) Ce fragment a été introduit dans les sites correspondant du plasmide p YG 140 pour générer le plas- mide p YG 141. 6.2 3 Construction du vecteur d'expression p YG 142 (figure 15). Les plasmides p YG 141 et p KW 1 sont digérés respectivement par les enzymes Nar I et Cla I Après ligation, 4 plasmides recombinants sont obtenus, en raison de l'existence des 2 formes A et B de p KW 1, et de l'orientation de la partie p KW 1 par rapport à la partie p YG 141. La figure 15 décrit la carte de restriction d'un de ces 4 plasmides: p YG 142, contenant la forme B de p KW 1. Les autres plasmides sont appelés p YG 143, p YG 144 et p YG 145. Un échantillon de la souche K lactis CBS 6430 a été déposé au CBS à Baarn (Pays-Bas) selon les conditions du Traité de Budapest le 4 juin 1991 sous le numéro CBS 290 91. REVENDICATIONS 1 Plasmide p K Wl isolé à partir de la souche Kwaltii CB 56430, ou tout fragment ou dérivé de celui-ci. 2 Fragment selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un élément génétique. 3 Plasmide caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence présentée à la figure 3 ou d'un dérivé de celle-ci. 4 Vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il com- prend tout ou partie du plasmide p KW 1 de Kwaltii CBS 6430 représenté à la figure 1 ou d'un dérivé de celui-ci. Vecteur selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il comprend un élément génétique au moins du plasmide p KW 1. 6 Vecteur selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend lorigine de réplication du plasmide p KW 1. 7 Vecteur selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il comprend l'intégralité du plasmide p KW 1. 8 Vecteur selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence présentée à la figure 3 ou d'un dérivé de celle-ci. 9 Vecteur selon l'une des revendications 4, 7 ou 8 caractérisé en ce que le plasmide p KW 1 est linéarisé au niveau d'un site de restriction fonctionel- lement neutre. Vecteur selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un site de restriction présent sur le plasmide p KW 1, ou introduit artificiellement sur celui-ci. 11 Vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un site de restriction introduit artificiellement dans une région intergénique, et de préférence dans la région située entre les gênes B et D ou dans la région située entre le gène D et 11 IR 2. 12 Vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce que le plas- mide p KW 1 est linéarisé au niveau des sites Cla I( 1), Pst I( 4608) ou Eco RV( 3072), les positions étant données par rapport à la figure 3. 13 Vecteur selon l'une quelconque des revendications 4 à 12 carac- térisé en ce qu'il contient en outre une séquence d'ADN hétérologue comprenant un gène de structure au moins sous le contrôle de signaux permettant son expres- sion. 14 Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont constitués par un ou plusieurs éléments choisis parmi les promoteurs, les terminateurs, et les signaux de sécrétion. Vecteur selon la revendication 14 caractérisé en ce que les promoteurs sont régulables. 16 Vecteur selon la revendication 14 caractérisé en ce que les promoteurs dérivent de gènes de levure, et préférentiellement de gènes glycoly- tiques de levure. 17 Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce que le gène de structure code pour un polypeptide d'intérêt pharmaceutique ou agroalimen- taire. 18 Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce que le gène de structure code pour une protéine hybride. 19 Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce que le ou les gènes de structure sont des gènes intervenant, au niveau génétique ou biochi- mique, dans la biosynthèse d'un métabolite. Vecteur selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il contient en outre un réplicon E coli. 21 Vecteur selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il contient en outre un marqueur de sélection au moins. 22 Cellule recombinée contenant un vecteur selon l'une quelconque des revendications 4 à 21. 23 Cellule selon la revendication 22 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure. 24 Cellule selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure du genre Kluyveromvces ou Saccharomyces. Procédé de préparation d'un polypeptide caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinée selon l'une des revendications 22 à 24 et on récupère le polypeptide produit. 26 Procédé selon la revendication 25 caractérisé en ce que le poly- peptide est choisi parmi les enzymes (telles que notamment la superoxide dismu- tase, la catalase, Ies amylases, les lipases, les amidases, la chymosine etc), les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine, l'alpha ou la béta- globine, le fac- teur VIII, le facteur IX, le facteur van Willebrand, la fibronectine, l'alpha-1 anti- trypsine etc), l'insuline et ses variants, les lymphokines ltelles que les interleu- kines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF), le TNF, le TRF etc l, les facteurs de croissance (tels que l'hormone de croissance, l'érythropoiétine, le FGF, I'EGF, le PDGF, le TGF etc), les apolipo- protéines, ou encore des polypeptides antigéniques pour la réalisation de vaccins (hépatite, cytomégalovirus, Eppstein-Barr, herpes etc). 27 Procédé selon la revendication 26 caractérisé en ce que le poly- peptide est l'albumine humaine ou un de ses variants ou précurseurs. 28 Utilisation d'une cellule recombinée selon l'une des revendica- tions 22 à 24 comme catalyseur dans une réaction de bioconversion. TABLEAU 1 VECTEURS FRAGMENT VECTEUR MARQUEUR DE PKW 1 NAVETTE p BNA 1 Bgl II-Nhe I Y Ip 5 URA 3 2,4 Kb *Bam HI-Nhe I p NEA 2 Nhe I-Eco RI Y Ip 5 URA 3 2,0 kb Nhe I-Eco RI p XXY 2 Xho I-Xba I Y Ip 5 URA 3 0,55 kb Sal I-Nhe I p XXK 3 Xho I-Xba I p Kan 21 0,55 kb Sal I-Xba I p BNB 1/A 3 Bgll II-Nhe I Y Ip 5 URA 3 1,9 kb Bam HI-Nhe I p NEB 1 Nhe I-Eco RI Y Ip 5 URA 3 2,5 kb Nhe I-Eco RI TABLEAU 2 VECTEURS SITE DE VECTEUR MARQUEURS LINEARISATION NAVET E DE PKW 1 p KW 514 Sal I p Kan 2 *(Sa I) Kan R pa 1 *(Sal I) Kn p KW Cll Cla I p Kan 21 (Acc I Kan R p KW 51 Sal I Y Ip 5 (Sal I) URA 3 Transformation de Saccharomyces cerevisiae par des vecteurs dérivés de p KW 1. VECTEURS Transformants Ura+ par pg d'ADN p KW 51 4400 p BNA 1 1200 p BNB 1/A 3 7 600 p XXY 2 4 000 p SK 1 4500 TABLEAU 4 Transformation de Kluyveromyces waltii par des vecteurs dérivés de p KW 1. VECTEURS Support de Transformants G 418-résistants réplication par pg d'ADN p KW 1 + p KW 1- p KWC 11 p KW 1 total 36 000 8 000 ( 98 %) ( 100 % p XXK 3 Xba I-Xho I 35 000 10 000 540 bp de p KW 1 ( 49 %) ( 2,8 %) p KW 514 p KW 1 total 10 000 8 000 ( 92 % 7) ( 29 %) TABLEAU 5 Transformation de levures du genre Kluyveromyces. avec le vecteur p KW Cll Espece Souche GC% Fréquence de Stabilité des transformation transformants par pg d'ADN (%) K. waltii CB 56430 45,6 2400 100 K.thermnotole CB 56340 46,2 4000 25 rans