Brevet FR2673639A1 — publié le 19920911

La présente demande a pour objet des fractions enrichies en acides gras extraites de fruits du genre Morinda Elle est également relative à l'utilisation de ces fractions et/ou d'acides gras ou de dérivés d'acides gras dans des compositions insecticides Les mouches du genre Drosophila , bien connues des généticiens , peuvent dans certains cas devenir des ravageurs pour les stocks de fruits et légumes et également dans l'industrie viticole . Dans certains cas , jusqu'à 50% de la production est endommagée par les larves des Drosophiles Dans le genre Drosophila, les espèces D. melanogaster sont les plus impliquées dans les dégâts occasionnés aux productions agricoles I1 existe trois espèces proches de D. melanogaster D. simulans , qui est une espèce cosmopolite , et D. mauritiana et D. sechellia qui sont des Drosophiles insulaires de l'Océan Indien. D. sechellia semble ne pouvoir se développer que sur le fruit d'un arbuste: Morinda citrifolia . Ce membre de la famille des caféiers possède une répartition très étendue allant des îles Mascareignes jusqu'à l'Asie du Sud-Est avec des populations récentes décrites à Hawaï , à Moorea et en Guadeloupe . Ces derniers peuplements seraient dus à une importation par des populations originaires de Chine et d'Asie du Sud-Est. Cet arbuste est utilisé pour ses propriétés tinctoriales et en médecine traditionnelle en tant qu'hypotenseur , antiseptique et laxatif Lors de collectes de fruits dans les îles Seychelles, il a été remarqué que les seules Drosophiles émergeant des fruits mûrs étaient de l'espèce D. sechellia, alors que D. melanogaster et surtout D. simulans existent dans l'archipel.Sur les fruits pourris tombés des arbustes , on retrouve par contre un nombre plus important d'espèces dont D.simulans. Des expériences postérieures à cette observation ont encore permis de montrer que la pulpe de Morinda était toxique, la peau et les graines ne semblant pas entraîner de mortalité chez les Drosophiles ( mémoire de DEA de Luc Legal Morinda Citrifolia , Etude comparative de la tolérance et du comportement de trois espèces du sous-groupe melanogaster dont D. sechellia ;Université de Paris VI , Octobre 1988) I1 a en outre été montré que les toxines responsables de la mortalité des Drosophiles sont peu volatiles , rendant le contact entre l'insecte et la pulpe obligatoire afin d'obtenir un maximum de mortalité et que seul le fruit de Morinda mûr pouvait présenter une toxicité , le fruit pourri et le fruit vert n'étant pas toxiques D'autres expériences préliminaires tendent également à indiquer que la toxine est soluble dans un solvant de polarité modérée ( Legal et al., llth European Drosophila Research Conference , Marseille, 5-8 Septembre 1989) Ainsi , il a été montré que les fruits mûrs du Morinda présentent une certaine toxicité vis-à-vis d'espèces spécifiques de Drosophiles , mais la faible activité des préparations de pulpe , ne permet pas une application industrielle de ces observations La demanderesse s'est donc attachée à l'isolement de fractions présentant une toxicité importante et à la mise en évidence des principes actifs Elle a montré d'abord que les principes actifs pouvaient être isolés par un procédé d'extraction simple Elle a montré de manière surprenante que ces fractions et principes actifs sont toxiques pour de nombreuses espèces d'insectes Selon l'invention , on a également trouvé que certains acides gras et leurs dérivés pouvaient être appliqués comme insecticides La présente invention a donc pour objet des fractions enrichies en acides gras pouvant être obtenues à partir de fruits du genre Morinda par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes - extraction par un solvant de polarité moyenne de la pulpe de fruits ou de fruits entiers broyés suivie d'une filtration et d'une évaporation - décantation de l'extrait sec obtenu dans un milieu aqueux comprenant au moins un solvant apolaire , et - séparation des phases organique et aqueuse. Le solvant de polarité moyenne préférentiellement utilisé pour l'extraction est l'acétone , mais d'autres solvants tel que le dioxane , l'acétate d'éthyle , le dichlorométhane , le diméthyl sulfoxide peuvent être utilisés, ainsi que des associations de solvants permettant d'obtenir un mélange de polarité moyenne , bien que les meilleurs résultats aient été obtenus avec l'acétone. L'étape de décantation peut être effectuée dans un milieu aqueux comprenant comme solvant apolaire de l'hexane et plus préférentiellement dans un milieu aqueux comprenant de l'acétone et de l'hexane Les quantités d'eau , d'hexane et d'acétone dans le milieu de décantation peuvent être avantageusement sensiblement égales en volume Sans que cette théorie puisse impliquer une limitation quelconque de la présente invention , on pense que l'acétone a un rôle de désagrégation des tissus du fruit alors que l'hexane serait un solvant des principes actifs responsables de la toxicité du fruit On a trouvé , selon l'invention , que les fractions enrichies en acides gras , telles que décrites ci-dessus sont des produits de valeur comme insecticides ou comme agents actifs d'insecticides On a également trouvé que certains acides gras possèdent des propriétés insecticides L'invention concerne donc aussi une composition insecticide contenant - une quantité efficace d'une fraction , telle que mentionnée ci-dessus et en particulier la fraction organique et/ou - une quantité efficace d'un composé , d'un mélange de composés , de dérivés de ces composés , ou de complexes comprenant ces composés , lesdits composés répondant à la formule R-X dans laquelle * R représente un groupement alkyle ou alkylène en C5 à C9 éventuellement substitué * X représente un groupement alcool éventuel le- ment estérifié , acide ou aldéhyde Le groupement R peut être linéaire ou ramifié. De manière préférentielle R comprend 7 atomes de carbone auquel cas ledit composé peut être l'acide octanoïque ou l'octanol Ledit composé peut aussi être l'acide hexanoïque, l'acide heptanoïque , l'acide nonanoïque ou l'acide décanoïque ou un de leurs dérivés . Les compositions selon l'invention peuvent contenir des additifs usuels dans les compositions insecticides et en particulier des additifs permettant de réaliser des formulations insecticides sous la forme de liquides , pâteS gels , poudres , solides (blocs , plaquettes ....) , aérosols. Les quantités de ces composés seront ajustées par l'homme du métier en fonction de l'utilisation précise qui en sera faite et notamment du mode d'administration, des volumes et/ou surfaces à traiter ainsi que des insectes à détruire ou à neutraliser Préférentiellement , les quantités de ces composés sont comprises dans une gamme allant de 0,1 à 500 g/kg de la composition et en particulier dans une gamme comprise entre 0,1 et 250 g/kg de la composition. Un autre objet de la présente invention est l'utilisation pour la destruction ou la neutralisation des insectes d'une fraction telle que précédemment décrite et en particulier de la fraction organique et/ou d'un ou plusieurs composés répondant à la formule RX tels que précédemment définis . La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples d'application suivants , en référence aux dessins annexés sur lesquels La figure 1 représente le protocole d'extraction des toxines à partir de fruits broyés La figure 2 représente la cinétique de mortalité de mouches en présence de 150 pg d'extrait acétonique , le pourcentage de mortalité étant indiqué en ordonnée , et le temps en abscisse Les figures 3 et 4 représentent les spectres de chromatographie en phase gazeuse respectivement de l'extrait acétonique et de la fraction hexanique Les figures 5a et 5b représentent les spectres de chromatographie en phase gazeuse de fractions hexaniques respectivement de fruits mûrs et de fruits pourris. Les figures 6a et 6b représentent les pics de chromatographie compris entre les graduations 1000 et 2500 les pics ne correspondant pas aux acides gras ayant été éliminés de la figure 6a par traitement informatique , afin d'obtenir la figure 6b. Les figures 7 et 8 sont respectivement des spectres de masse en impact électronique et en ionisation chimique au méthane de l'acide octanoïque Les figures 9 et 10 représentent les cinétiques de mortalité de D. mauritania et de D. melanogaster respectivement en présence d'acide octanoïque et de pulpe de Morinda Les figures 11 et 12 illustrent la mortalité de D. melanogaster respectivement en présence de différentes doses d'acide octanoïque et de pulpe de Morinda La figure 13 représente l'effet comparé des acides décanoïque , octanoïque et hexanoïque sur des mouches mâles et femelles D. melanogaster La figure 14 représente l'effet de dose sur D. sechellia de l'acide octanoïque Les figures 15 et 16 illustrent l'effet de l'acide octanoïque sur différentes espèces de fourmis Dans les figures 9 à 16 , le pourcentage de mortalité est exprimé en ordonnée , le temps étant exprimé en abscisse EXEMPLE 1 - Extraction des agents toxiques Afin d'isoler le ou les principes actifs responsables de la toxicité du fruit du Morinda , des solvants de polarités différentes ont été testés L'extraction a été suivie par estimation directe de la toxicité de chaque fraction Le protocole d'extraction à l'acétone est résumé sur la figure 1 . 100 g de fruit de Morinda entier broyé sont extraits par 100 ml d'acétone durant 18 heures puis sont filtrés et évaporés On obtient 6,1 g d'extrait sec qui sont alors resuspendus dans une solution aqueuse contenant 1/3 d'eau, 1/3 d'acétone et 1/3 d'hexane Après décantation d'une heure , on sépare la fraction hexane (170 mg) et la fraction acétone + eau ( 4,5 g) Ces fractions sont évaporées et les tests de toxicité sont effectués . La cinétique de mortalité de l'extrait acétonique est illustrée sur la figure 2. Des mouches femelles D. mauritania (mau) , D. melanogaster de souches Cs et Ta, ainsi que des mouches issues de croisements entre D. mauritania et D. sechellia ( mause et semau ) ont été mises en présence de 150 pg d'extrait acétonique dans une bote de Pétri. Les résultats indiquent un effet très net de l'extrait acétonique sur la mortalité des D. mauritania et de la souche Cs notamment, mais une quasi absence d'effet sur la souche Ta. Les toxicités respectives des fractions hexaniques et acétone + eau ont été évaluées comparativement . I1 apparat que seule la fraction hexanique présente une toxicité importante Les chiffres exprimés précédemment représentent les moyennes des quantités des produits obtenus en travaillant sur 10 fruits mûrs . Cette extraction peut aussi être faite à partir de pulpe de Morinda. Les extraits obtenus à différents stades du procédé d'extraction sont analysés en chromatographie en phase gazeuse ( azote ) avec un détecteur d'ionisation de flamme ( figures 3 à 6 ). Ces analyses ont été réalisées en utilisant des colonnes apolaires de type OV1 ou DB5 d'une longueur de 50 mètres (S.G.E. , Villeneuve St-Georges ) qui sont des colonnes de silice sur lesquelles sont greffés des groupements méthyle à environ 80% Certains extraits sont de plus analysés en spectrométrie de masse en impact électronique ou en ionisation chimique au méthane ( figures 7 et 8 La figure 3 représente une analyse chromatographique en phase gazeuse d'un extrait total de fruit mûr après extraction à l'acétone .On observe après un début de spectre assez bien résolu un grand nombre de pics massifs et difficiles à séparer Les pics suivants ont été identifiés à la graduation 1100 : acide butanoïque à la graduation 1450 : acide hexanoïque à la graduation 1750 : acide octanoïque à la graduation 1900 environ : acide nonanoïque à la graduation 2000 : acide décanoïque Le pic de l'acide octanoïque représente 30 à 40% en surface des pics totaux d'acides gras La figure 4 représente le profil de la chromatographie en phase gazeuse de la fraction hexanoïque obtenue par traitement de l'extrait analysé dans la figure 3. On note une forte diminution du nombre de produits observables et une disparition de nombreux produits sortant après la graduation 2000. La surface du pic de l'acide octanoïque représente en moyenne 70% de la surface totale des pics d'acides gras Les figures 5a et 5b représentent respectivement des spectres effectués dans les mêmes conditions que précédemment de fractions hexaniques de fruits mûrs et de fruits pourris. Les chiffres mentionnés indiquent les masses moléculaires probables et les espèces correspondantes On observe une très nette diminution de la taille des pics correspondant aux acides hexanoïque , octanoïque et décanoïque notamment , dans le cas du fruit pourri Les figures 6a et 6b correspondent aux pics compris entre les graduations 1000 et 2500 obtenus sur un fruit mûr . Le signal de la figure 6a a été traité par un ordinateur afin d'éliminer les pics ne correspondant pas aux acides gras Ce traitement a été rendu possible grâce au couplage de la chromatographie en phase gazeuse avec la spectrométrie de masse . Chaque pic important obtenu en chromatographie est automatiquement analysé en spectrométrie afin de déterminer sa masse moléculaire et vérifier qu'il possède une fonction acide. En effet , comme le montre la figure 7 , les spectres de masse en impact électronique des acides gras , en l'occurrence du pic chromatographique de l'acide octanoïque, possèdent un pic de dégradation caractéristique de la fonction acide à 60. La figure 8 qui est le spectre de masse en ionisation chimique au méthane du pic de chromatographie de l'acide octanoïque révèle un pic de masse moléculaire 145 correspondant à l'acide octanoïque non dégradé A partir d'une solution d'acide octanoïque pur de concentration connue et d'un extrait préalablement pesé , il est possible d'obtenir une évaluation correcte par comparaison des surfaces des pics de chromatographie en phase gazeuse correspondant aux produits étudiés . L'acide octanoïque qui est l'acide majoritaire est présent en quantité assez reproductible et à une valeur moyenne de 45 Hg par gramme de fruit mûr avant extraction. Les deux autres acides (hexanoïque et décanoïque ) sont en quantités beaucoup plus faibles et variables ( de 10 à 20 fois moins que pour l'acide octanoïque ) . I1 faut aussi noter que, dans certains cas , des quantités non négligeables d'esters méthyliques mais aussi éthyliques de ces acides existent parmi les produits identifiés dans le fruit Des expérimentations préliminaires ont montré que parmi les solvants utilisables , l'acétone à l'état pur est le solvant le mieux adapté pour récupérer le maximum d'activité toxique à partir d'extraits de fruits I1 faut noter que comme l'acétone est partiellement miscible à l'eau , l'extrait réalisé avec l'acétone est en fait un mélange de l'eau venant du fruit et de l'acétone d'extraction D'autres solvants ont été testés ( méthanol éthanol , éther , hexane , eau ) avec une efficacité variable mais dans tous les cas inférieure à celle décrite dans cet exemple . Les extraits réalisés avec des solvants de forte polarité ( méthanol ) ou très apolaire ( hexane ) ont été les moins efficaces EXEMPLE 2 - Action des acides aras sur les Drosophiles . Tous les essais de toxicité décrits dans cet exemple et les exemples suivants sont réalisés en déposant au fond d'une bote de Pétri des échantillons de pulpe ou de solution d'acides gras , et en les recouvrant avec une fine feuille de papier absorbant Les insectes sont ensuite introduits dans chaque boîte de Pétri , et le nombre d'insectes morts est noté en fonction du temps La figure 9 montre la cinétique de mortalité de mouches mâles Drosophila mauritania ( mau ) et D. melanogaster ( me ) en présence de 50 pg d'acide octanoïque La figure 10 quant à elle concerne la cinétique de mortalité de mouches mâles D. melanogaster ( me ), D. simulans ( si) et D. mauritiana ( mau ) en présence de 1,5 g de pulpe La comparaison de ces deux figures montre que l'on obtient avec une quantité de 50 pg d'acide octanoïque , la même cinétique de mortalité pour ces souches sensibles à Morinda qu'avec une quantité de 1,5 g de pulpe La figure 11 représente la cinétique de mortalité de mouches D. melanogaster ( me ) mises en présence de différentes concentrations d'acide octanoïque La figure 12 est une figure comparative montrant l'effet de la quantité de pulpe présente dans la boîte de Pétri sur la mortalité de mouches D.Melanogaster mâles ou femelles , après 20 minutes de traitement La comparaison de ces deux courbes montre que dans les deux cas il existe un effet de dose de la pulpe ou de l'acide octanoïque sur la mortalité des mouches D'autres acides gras ont d'autre part été testés pour leur mortalité vis-à-vis des D. melanogaster A cet effet , 50 ijg d'acide décanoïque ( déca), d'acide octanoïque ( octa) ou d'acide hexanoïque ( hexa ) ont été déposés dans des botes de Pétri .Les cinétiques de mortalité des mouches ont été relevées sur la figure 13 qui montre clairement que les acides décanoïque et hexanoïque ont des effets sur la mortalité des mouches très réduits par rapport à l'acide octanoïque I1 est à noter que les acides hexanoïque et décanoïque induisent néanmoins une perte de la coordination des mouvements des Drosophiles , ce qui suggère qu'ils pourraient participer à une action neurotoxique contribuant à la toxicité globale du Morinda sur les Drosophiles L'effet de l'acide octanoïque a aussi été testé sur la souche D.sechellia , qui n'est pas sensible aux extraits de fruits mûrs . La figure 14 illustre l'effet de dose de l'acide octanoïque sur la mortalité des D. sechellia , les doses étant de 150 pg , 200 ;ig , 250 Hg et 500 Hg par bote de Pétri Par comparaison avec les figures précédentes on remarque qu'il faut une dose 5 à 6 fois plus forte par rapport aux autres souches , pour observer un début de sensibilité à l'acide octanoïque EXEMPLE 3 - Effet de l'acide octanoïque sur d'autres espèces d'insectes Diverses espèces de fourmis ont également été testées ( figures 15 et 16 ) pour leur cinétique de mortalité en présence d'acide octanoïque Les fourmis du genre Lasius , qui sont les fourmis noires habituellement trouvées dans les habitations , sont particulièrement sensibles à l'acide octanoïque comme le montre la figure 15 Les espèces de fourmis Myrmica , Pheidole et M.rubra ont aussi été testées et se sont montrées sensibles à l'acide octanoïque ( figures 15 et 16 ). Un effet dose-réponse net a pu être observé sur d'autres espèces sylvicoles On peut donc parfaitement contrôler la toxicité et la nocivité du produit . Un enregistrement vidéo des symptômes de la mortalité chez ces insectes semble indiquer une action neurotoxique de l'acide octanoïque L'acide octanoïque a été testé sur la blatte germanique ( Blattela germanica ) . Les cinétiques de mortalité ont été effectuées avec des doses d'acide comprises entre 20g et 1000 pg par cm2 , dans des boîtes de Pétri dont la taille est plus importante que celles utilisées dans les tests sur la mouche Drosophile .Ces doses permettent d'obtenir 100% de mortalité en un temps moyen de 15 à 30 minutes Des tests préliminaires sur les blattes américaines suggèrent également une sensibilité à l'acide octanoïque Chez cette espèce , l'effet de dose subléthale du produit entraînant une paralysie spécifique de la partie postérieure de l'insecte a été noté Un autre intérêt de l'acide octanoïque est sa très faible toxicité sur les vertébrés . Chez le rat par ingestion, la mortalité n'intervient que pour des doses voisines de 10 g/kg (Merck Index 11sème édition, n 1765) , ce qui permet d'utiliser ce produit en quantité importante sans danger pour les organismes supérieurs L'octanol a d'autre part été testé à des doses équivalentes à l'acide octanoïque . Une activité toxique quasiment identique a été montrée chez D. melanogaster . Ce résultat est important pour les applications industrielles, l'alcool étant moins réactif que l'acide , par rapport aux surfaces traitées par les compositions insecticides ( par exemple le béton ). Les composés selon l'invention en C8 semblent donc entraîner une mortalité très importante vis-à-vis des insectes, les dérivés en C6 , C7 , Cg et C10 semblant plutôt avoir une activité paralysante La présence de ces deux types de produits dans des compositions insecticides permettrait donc d'obtenir une action synergique de leurs deux activités . On note cependant que l'ester méthylique de l'acide octanoïque utilisé à des doses équivalentes à celles utilisées pour l'acide ne semble pas avoir d'activité significative sur les Drosophiles Les essais rapportés ci-dessus montrent que l'acide octanoïque possède plusieurs avantages , entre autres * Une toxicité spécifique pour les insectes par une action neurotoxique . ( On suppose que la chaîne carbonée de cette molécule permet une pénétration rapide à travers la cuticule lipidique des insectes * Une volatilité relative de la molécule qui permet de l'utiliser selon qu'elle sera couplée ou non avec des composés retenant ou non le produit et qui permet de plus une utilisation variée et contrôlable dans le temps * Une faible toxicité pour les animaux supérieurs et a fortiori pour l'homme REVENDICATIONS 1. Fractions enrichies en acides gras pouvant être obtenues à partir de fruits du genre Morinda par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes - extraction par un solvant de polarité moyenne de la pulpe de fruits ou de fruits entiers broyés, suivie d'une filtration et d'une évaporation - décantation de l'extrait sec obtenu dans un milieu aqueux comprenant au moins un solvant apolaire , et - séparation des phases organique et aqueuse 2. Fractions selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant de polarité moyenne est l'acétone 3. Fractions selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le solvant apolaire est l'hexane 4.Fractions selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 , caractérisé en ce que l'étape de décantation est effectuée dans un milieu aqueux comprenant de l'acétone et de l'hexane 5. Fractions selon la revendication 4 , caractérisé en ce que les quantités d'eau , d'hexane et d'acétone dans le milieu de décantation sont sensiblement égales en volume 6.Composition insecticide contenant - une quantité efficace d'une fraction selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 , et/ou - une quantité efficace d'un composé , d'un mélange de composés , de dérivés de ces composés ou de complexes comprenant ces composés , lesdits composés répondant à la formule R-X dans laquelle * R représente un groupement alkyle ou alkylène en C5-C9 éventuellement substitué * X représente un groupement alcool éventuellement estérifié , acide ou aldéhyde 7. Composition selon la revendication 6 caractérisée en ce que le groupement R est linéaire 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 et 7 , caractérisée en ce que le groupement R est préférentiellement un groupement alkyle en C7. 9. Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce que ledit composé est l'acide octanoïque ou l'octanol 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 et 7 , caractérisée en ce que ledit composé est l'acide hexanoïque , l'acide heptanoïque , l'acide nonanoïque , l'acide décanoïque ou un de leurs dérivés 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 et 7 , caractérisée en ce qu'elle contient de l'acide octanoïque ou de l'octanol et un ou plusieurs composés de formule R-X dans laquelle R est un groupement alkyle en C5, C6 ou C9. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à Il , caractérisée en ce qu'elle contient des additifs usuels des compositions insecticides et en particulier des additifs permettant de réaliser des formulations insecticides sous la forme de liquides, pâtes gels , poudres , solides , aérosols. 13. Composition selon l'une des revendications 6 à 12 , caractérisée en ce qu'elle contient des quantités de composés R-X comprises dans une gamme allant de 0,1 à 500 g/kg et préférentiellement 0,1 à 250 g/kg de la composition 14. Utilisation pour la destruction ou la neutralisation des insectes d'une fraction selon l'une des revendications 1 à 5. 15. Utilisation pour la destruction ou la neutralisation des insectes d'un ou plusieurs composés, de dérivés de ces composés ou de complexes comprenant ces composés, lesdits composés répondant à la formule R-X dans laquelle * R représente un groupement alkyle ou alkylène en C5 à Cg éventuellement substitué * X représente un groupement alcool éventuellement estérifié , acide ou aldéhyde 16. Utilisation selon la revendication 15 , dans laquelle le composé R-X est tel que défini à l'une quelconque des revendications 7 à 11.