Brevet FR2681330A1 — publié le 19930319

NOUVEAU PLASMIDE RECOMBINANT REPLICABLE POUR LA PRODUCTION DE PHENYLALANINE La présente invention a pour objet un procédé de pro- duction de L-phénylalanine par Escherichia coli recombinant (ci-après "E coli") Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un nouvel E coli contenant un plas- mide pour la production de L-phénylalanine et un procédé pour la production de L-phénylalanine par emploi de ce nouveau microbe. La L-phénylalanine est un amino-acide essentiel et peut être utilisée pour la production par synthèse d'ASPARTAME , un agent édulcorant Il existe beaucoup de méthodes connues faisant emploi de microbes pour la production de L-phényl- alanine Par exemple, JP-A-37-6 345 et 60-160 890 décrivent un procédé de production de L-phénylalanine par emploi de Brevibacterium ou Corynebacterium sp qui nécessite de la tyrosine JP-A-55-165 797 décrit une méthode similaire par emploi d'E coli qui requiert de la tyrosine et qui est ré- sistant vis-à-vis des analogues de la tryptophane KR-A-88- 11 331 et 88-11 332 décrivent une méthode similaire par em- ploi d'E coli qui est revertant d'auxotrophe de tryptophane et de tyrosine et qui est résistant aux analogues de phényl- alanine, tyrosine et tryptophane KR-A-89-3 682 et 89-3 714 décrivent des procédés de production de phénylalanine par E coli recombinant qui amplifie le nombre de copies d'un gène qui code pour une enzyme limitatrice de la vitesse. La présente invention a par conséquent pour objet un nouvel E coli (KCCM 10 013) qui peut produire de grands rendements en L-phénylalanine. Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de production de L-phénylalanine par E coli re- combinant qui peut être transformée avec un nouveau plasmide p MW 26 contenant deux promoteurs et un répresseur sensible à la température pour manifester le gène phe A et un gène aro F. La chorismate mutase ppréphénate déhydratase est codée par le gène phe A et la 3-déoxy-Darabino-heptulosonate 7-phosphate synthase est codée par l'aro F. Un autre objet de la présente invention est de fournir un plasmide recombinant replicable p MW 16 qui est capable de transformer un E coli pour produire un E coli transformé donnant lieu à une production de phénylalanine très élevée. Un autre objet de la présente invention encore est de fournir un procédé de production de phénylalanine en un ren- dement élevé, qui comprend la culture d'E col Ai selon la présente invention dans un milieu de culture. D'autres buts et objets de la présente invention de- viendront apparents à la lecture de la description détaillée qui suit Il doit être compris cependant que cette descrip- tion détaillée et les exemples spécifiques, bien qu'indiquant des modes de réalisation préférés de la présente invention, ne sont donnés qu'à titre illustratif, bien que de nombreux changements et de modifications entrant dans le cadre de la présente invention seront apparents à l'homme de l'art à partir de cette description détaillée. La présente invention sera mieux comprise et de façon plus détaillée à partir de la description détaillée ci- dessous et des figures accompagnantes qui sont donnés à titre d'illustration, et non limitatifs de la présente invention, et dans lesquels: la figure 1 illustre le cheminement métabolique de la biosynthèse des amino-acide aromatiques dans E col Ai; et la figure 2 illustre les étapes de préparation d'un plasmide recombinant p MW 16 et sa carte de restriction. Les gènes aro F et phe A destinés à être employés pour la production de L-phénylalanine sont dérivés d'E coli MWPWJ 304 (KCCM 10 013). En se référant maintenant en détail aux figures données à des fins d'illustration de la présente invention, tel que décrite dans la figure 1, le procédé de préparation de L- phénylalanine à l'aide de plasmide recombinant est contrôlé par action enzymatique dans les cellules d'E coli Une des enzymes qui contrôle la réaction est la chorismate mutase P-préphénate déhydratase Une des autres enzymes qui contrôle la réaction est l'enzyme 3-déoxy-D-arabino-heptulosonate 7- phosphate synthase (ci-après appelée "DAHP synthase") La DAHP synthase existe sous forme de trois isoenzymes qui sont codés par les gènes aro F, aro G et aro H, respectivement Dans la présente invention, afin d'augmenter sensiblement la pro- duction de phe A et aro F, un promoteur PL de phase X est connecté à chacun des gènes et un répresseur sensible à la température est utilisé pour contrôler la production du gène. Tel que décrit dans la figure 2, le procédé de prépa- ration du plasmide p MW 16 est décrit dans Recombinant DNA Methodology and Molecular Cloning Le procédé recombinant pour la préparation du plasmide p MW 16 est décrit dans Mole- cular Cloning, A Laboratory Manual (T Mariatis et al) et Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M Ausubel et al). Ainsi, une nouvelle souche MWPWJ 304 destinée à être employée pour la fabrication de L-phénylalanine est obtenue. La nouvelle souche MWPWJ 304 a été déposée à la Korean Fermentation Culture Collection le 30 août 1991 selon les conditions du Traité de Budapest et sous le numéro de dépôt KCCM 10 013. La présente invention est maintenant décrite plus en détail grâce aux exemples suivants qui doivent être considé- rés comme illustratifs et non limitatifs de la présente in- vention. EXEMPLE 1 Préparation de plasmide p MW 16 ( 1) Isolement de l'ADN du p MW 12 Le p MW 12 (US-A-5 008 190 et 5 030 567), un plasmide recombinant contenant le gène phe A et le gène aro F, est digéré avec Eco RV dans un milieu salin tampon pour enzyme de restriction l 50 m M de chlorure de sodium, m M de tris-HC 1 (p H 7,5), 10 m M de chlorure de ma- gnésium et 1 m M de dithiothréitoll à 37 C pendant 16 heures L'ADN digéré est traité avec un mélange phé- nol/chloroforme et précipité par de l'éthanol pour produire un plasmide ADN linéarisé Ce plasmide ADN est traité avec de la phosphatase alcaline d'intestin de veau (ci-après "CIP") pour empêcher que l'ADN de plas- mide linéarisé ne s'auto-ligature. ( 2) Obtention du fragment de promoteur PL Le plasmide p P Lc 2833 est digéré par l'enzyme de res- triction Hae II et Bam HI et un fragment PL de 0,26 Kb est récupéré sur un gel d'agarose ayant un point de fusion bas puis purifié Le fragment de PL de 0,26 Kb ayant une extrémité cohesive est traité par du poly- mérase ADN T 4 dans un milieu tampon de réaction l 50 m M de tris-H Cl (p H 8,0), 5 m M de chlorure de magnésium, 5 m M de dithiothréitol, 50 pg/ml d'albumine de sérum bovin (BSA), 100 p M de d ATP, 100 p M de d GTP, 100 p M d CTP et 100 p M d TTP) à une température de 11 C pendant minutes pour former des extrémités franches. ( 3) Préparation de plasmide p MW 14 Le plasmide p MW 12 linéarisé traité à la phosphatase de l'étape ci-dessus ( 1) est mélangé avec le fragment de promoteur PL ayant des extrémités franches aux deux extrémités obtenu dans l'étape mentionnée ( 2) ci-dessus en une proportion de 1/3 est traité par de la ligase ADN T 4 à une température de 16 C pendant 16 heures de façon à ligaturer les fragments Le plasmide recombi- nant combiné est transformé par la méthode convention- nelle au chlorure de calcium en un E coli MWEC 203-7 qui nécessite pour sa croissance de la phénylalanine. La souche transformée est cultivée dans un milieu de culture MM contenant 50 pg/ml d'antibiotique Kanamycine ( 10 g de glucose, 4 g de sulfate d'ammonium, 2 g de phosphate de potassium monobasique, 1 mg de thiamine- H Cl, 0,5 g d'acide fumarique, 20 g d'agar, 1 litre d'eau distillée à p H 7,4) Le plasmide recombinant p MW 14 est séparé de la souche cultivée qui se développe dans le milieu de culture MM contenant 50 pg/ml de Kanamycine. ( 4) Préparation de p MW 15 Le plasmide p MK 5 contenant un gène CI 857 d'un répres- seur sensible à la température est traité par l'enzyme de restriction Bgl II et le fragment d'ADN de 0,8 Kb est récupéré sur un gel d'agarose 0,9 % puis ensuite traité avec la polymérase ADN T 4 pour former les extré- mités franches Le plasmide p MW 14 de l'étape mentionnée ci-dessus ( 3), qui est combiné avec le promoteur PL au début du gène aro F est digéré par l'enzyme Dra III et traité avec du CIP de façon à retirer les groupes 5 '- phosphate Ensuite, le plasmide p MW 14 traité est mé- langé avec le fragment CI 857 ayant des extrémités fran- ches aux deux extrémités et qui sont jointes par la ligase ADN T 4 Le plasmide recombinant est transformé en E coli HB 101 pour produire p MW 15. ( 5) Préparation de p MW 16 Le plasmide recombinant p MW 15 isolé est digéré avec l'enzyme Bam HI et Bgl II et traité avec la ligase ADN T 4 pour produire p MW 16 Le plasmide p MW 15 contient le gène tyr A entier Dans p MW 16, un fragment 0,7 Kb du gène Tyr A en est retiré Le plasmide recombinant p MW 16 est transformé en une souche laissant s'échapper la tyrosine et sensible à la température, E coli MWWJ 304 (KFCC 10737, qui a fait l'objet d'un dépôt à la Korean Fermentation Culture Collection, 30 août 1991) puis est cultivé dans un milieu de culture contenant 50 pg/ml de Kanamycine à 37 C pendant 24 heures Parmi les souches transformées par p MW 16, la meilleure souche pour pro- duire la L-phénylalanine, MWPWJ 304 (KCCM 10 013, dépo- sée à la Korean Culture of Microorganisms, 28 janvier 1992) est isolée Les propriétés biochimiques de la nouvelle souche MWPWJ 304 (KCCM 10 013) sont les mêmes que celles de la souche hôte MWWJ 304 (KFCC 10 737). Cependant, la nouvelle souche MWPWJ 304 nécessite plus de tyrosine pour se développer et produire de la L-phénylalanine par comparaison à la souche hôte MWWJ 304 Le rendement en L-phénylalanine et l'activité de la DAHP synthase de la nouvelle souche MWPWJ 304 sont augmentés. EXEMPLE EXPERIMENTAL 1 L'activité enzymatique et le rendement en L-phényl- alanine de la nouvelle souche MWPWJ 304 sont augmentés par comparaison à la présente souche comme suit (tableau I, ta- bleau II): TABLEAU I Activité enzymatique de la DAHP synthase Température Activité enzymatique Souche de culture Unités MWPEC 13-60 (KCTC 8337 P) 32 C 1,0 MWWJ 304 (KFCC 10 737) 37 C 0,9 MWPWJ 304 (KCCM 10 013) 37 C 3,1 Les données ci-dessus sont obtenues par la méthode de I Shiio et al (Journal of Biochemistry, 75, 987-997, 1974). L'activité enzymatique de la MWPWJ 304 (KCCM 10 013) est basée sur celle de la MWPEC 13-60 (KCTC 8337 P) Le milieu de culture de la MWWJ 304 (KFCC 10 737) et MWPWJ 304 (KCCM 013) contient 100 mg/l supplémentaires de L-tyrosine comparé à la MWPEC 13-60. EXEMPLE 2 Préparation de L-phénylalanine (A) Souche MWPWJ 304 (KCCM 10 013) (B) Milieu de culture Glucose 3 % Tryptone 1 % Extrait de Bacto levure 1 % Chlorure de sodium 0,1 % Kanamycine 10 mg/l p H 7,0 (C) Milieu de fermentation Glucose 6 % Sulfate de potassium 0,04 % Sulfate d'ammonium 2 % Citrate de sodium 0,05 % Acide fumarique 0,05 % Chlorure de magnésium 0,08 % Phosphate de potassium monobasique 0,1 % Phosphate de potassium dibasique 0,1 % Extrait de Bacto levure 0,1 % Glutamate de monosodium 0,05 % Chlorure de cobalt 0,1 mg/l Sulfate de zinc 1 mg/l Chlorure de manganese 2 mg/l Chlorure de calcium 5 mg/l Chlorure ferrique 20 mg/l L-tyrosine 300 mg/l Chlorhydrate de thiamine 10 mg/l Acide nicotinique 10 mg/1 p H 7,0 (D) Méthode de fermentation ml du milieu de culture sont chargés dans un réci- pient test de 500 ml et autoclaves à 120 C pendant minutes Après stérilisation, la nouvelle souche E coli MWPWJ 304 (KCCM 10 013) est inoculée dans le récipient et mis en culture à 37 C pendant 16 heures sous agitation Le milieu de fermentation est préparé à partir de la formulation ci-dessus Apres que 3,5 % du carbonate de calcium autoclavé séparément ont été ajou- tés au milieu de fermentation et que 2 ml d'un bouillon de germe y ont été ajoutés, le milieu de fermentation est agité et fermenté à 37 C pendant 36 heures A l'is- sue de la fermentation, la quantité de L-phénylalanine accumulée est de 16,2 g/1. EXEMPLE 3 Préparation de L-phénylalanine La souche (A), le milieu de culture (B) et de milieu de fermentation (C), à l'exception des 400 mg/1 de L- tyrosine, sont les mêmes que dans les exemples 1 et 2. (D) Méthode de fermentation i litre du milieu de fermentation est chargé dans un fermenteur de 2 litres et autoclavé à 120 C pendant 15 minutes La nouvelle souche MWPWJ 304 (KCCM 10 013) est ajoutée à 50 ml du milieu de culture dans un ré- cipient de 500 ml et mis en culture à 37 C pendant 16 heures avec agitation 50 ml du bouillon de culture sont chargés dans le fermenteur avec une agitation de i 000 tr/min et un débit de 1,0 vvm (débit d'oxygène) à 37 C pendant 48 heures Pendant la fermentation, un p H de 7,0 est maintenu par addition d'hydroxyde d'ammonium puis une solution de glucose à 60 % est ajoutée au fer- menteur à trois reprises lorsque le niveau de glucose chute en-dessous de 1 %. La quantité totale de glucose qui est utilisée dans la fermentation est de 185 g/1 La L-phénylalanine est obtenue avec une concentration de 50, 8 g/l 1 litre de la solution de fermentation est purifié par une méthode conventionnelle, telle que l'absorption avec une résine échangeuse d'ions, et isolement avec de l'hydroxyde d'ammonium pour produire 45,7 g/1 de L-phénylalanine sous forme de cristaux bruts. TABLEAU II Rendement en L-phénylalanine (g/l) Souche T O C de \MWWJ 304 MWPWJ 304 la culture (KFCC 10 737) (KCCM 10 013) 31 14,9 13,7 34 20,6 21,2 37 31,5 50,8 39 15,5 22,8 * 200 mg/l de L-tyrosine sont ajoutés au milieu de fer- mentation de MWWJ 304 (KFCC 10 737). EXEMPLE 4 L'exemple 3 est répété à l'exception que 27 litres de culture sont chargés dans un fermenteur de 50 litres et 1,3 litres du bouillon de culture sont chargés dans le fermenteur sous agitation à raison de 450 tr/min et avec un débit de 1,0 vvm La quantité de L-phénylalanine produite est de 49,1 g/l. L'invention ayant été ainsi décrite, il est évident qu'elle donne lieu à de nombreuses variantes Ces variantes ne doivent pas être considérées comme limitant la portée de la présente invention, et toutes ces variantes telles qu'évi- dentes à l'homme de l'art sont comprises dans la portée des revendications suivantes. REVENDICATIONS 1. Un plasmide recombinant replicable comprenant de l'ADN de plasmide contenant deux promoteurs et un répresseur sensible à la température pour manifester un gène phe A qui code la chorismate mutase p- préphénate déhydratase et un gène aro F qui code la 3-déoxy-D-arabino- heptulosonate 7-phosphate synthase, ledit plasmide recombinant étant identifié comme le plasmide p MW 16 contenu dans E coli MWPWJ 304 (KCCM 10 013), qui est capable de transformer un E coli et produire un E coli transformé ayant une capacité de production de phénylalanine optimale. 2. Le plasmide recombinant replicable selon la reven- dication 1, dans lequel lesdits promoteurs sont des promo- teurs k PL' 3 Le plasmide recombinant replicable selon la reven- dication 1, dans lequel ledit répresseur sensible à la tem- pérature est un répresseur CI 857. 4. Un E coli MWPWJ 304 (KCCM 10 013) qui a une capa- cité de production de phénylalanine optimale en vertu du fait qu'il contient les gènes phe A et aro F. 5. Un procédé de production de phénylalanine qui comprend la mise en culture d'une souche d'E coli qui contient le plasmide du KFCC 10 738 dans un milieu de cul- ture. 6 Le procédé de production de phénylalanine selon la revendication 5, dans lequel ladite culture est mise en oeu- vre en présence de sucre. 7. Le procédé de production de phénylalanine selon la revendication 6, dans lequel ledit sucre est le glucose. 8 Le procédé de production de phénylalanine selon la revendication 6, dans lequel ladite culture est mise en oeu- vre à une température de 37 C.