Brevet FR2684381A1 — publié le 19930604

i Composés présentant une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol pour leur application en tant que substance thérapeutiquement active La présente invention concerne, pour leur première application, en tant que substance thérapeutiquement active, les composés présentant une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol. Dans le cadre de la présente description, on entend par composé présentant une liaison amide phosphorique, tout composé dont la structure chimique comporte un groupement: OH -NH-P=O OH Un exemple préféré de tels composés est la créatine phosphate, encore dénommée phosphocréatine, qui est une substance largement répandue chez les vertébrés notamment présente dans le muscle strié, mais absente du sang et des liquides extracellulaires Un autre exemple est l'arginine-phosphate, que l'on trouve dans les muscles des intervertébrés. De même, on entend par composé présentant une liaison phosphate d'énol, tout composé présentant dans sa structure chimique le groupement: OH -C-O-P=O Il I CH 2 OH Un exemple préféré de tels composés est l'acide phospho-énol-pyruvique qui est un métabolite endogène intermédiaire intervenant dans la glycolyse, et qui est donc dans les conditions physiologiques, localisée dans les cellules et absente du sang. Les liaisons amide phosphorique ou phosphate d'énol des composés précités sont des liaisons riches en énergie. Il a été découvert, et ceci constitue le fondement de la présente invention, que les composés présentant une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol présentent des propriétés pharmacologiques particulièrement intéressantes, et notamment, une activité antitumorale particulièrement remarquable. Ces composés trouveront donc notamment application dans le traitement des tumeurs humaines, et plus particulièrement des tumeurs d'emblée ou devenues résistantes à la chimiothérapie, telles que par exemple les adénocarcinomes (colon, pancréas, estomac, bronches, reins, seins, utérus, ovaires); les carcinomes épidermoides (voies aéro- digestives supérieures, bronches, voies urinaires, anus, peau); le mélanome malin, les sarcomes des tissus mous; les leucémies, les lymphomes, le myélome multiple. Ainsi, la présente invention s'étend aux compositions pharmaceutiques, notamment à activité antitumorale, contenant à titre d'ingrédient actif, au moins un composé présentant une liaison amide phosphorique, ou une liaison phosphate d'énol, en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions pharmaceutiques seront généralement préparées selon des procédés classiques et administrées par voie veineuse, sous forme de bolus ou de perfusion intermittente ou continue, ou par voie intra- artérielle, ou par voie intra-péritonéale, ou par voie intramusculaire, à des doses pouvant varier de 50 mg à 5 g par kilo de poids corporel et par 24 heures. L'invention vise également à couvrir un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique, notamment à activité antitumorale, caractérisé en ce qu'il consiste à incorporer une quantité pharmaceutiquement efficace d'au moins un composé présentant une liaison amide phosphorique, ou une liaison phosphate d'énol, dans un excipient pharmaceutiquement acceptable. Selon une caractéristique particulière de ce procédé, la composition pharmaceutique est formulée en préparation injectable dosée de 0 1 à 50 g. Enfin, la présente invention vise encore à couvrir un procédé de traitement des tumeurs humaines, caractérisé en ce qu'il comprend l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un composé présentant une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol. Les propriétés pharmacologiques des composés présentant une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol ont été mises en évidence en évaluant par différentes études les effets de la créatine phosphate sur des cellules tumorales. Les effets observés sont indiscutablement dûs à la présence dans cette molécule d'une liaison amide phosphorique. Des essais complémentaires sur l'acide phospho-énol-pyruvique laissent supposer que des propriétés pharmacologiques analogues peuvent être obtenues à partir de composés présentant une liaison phosphate d'énol. 1 * Méthode 1.1 Principe Le développement d'un adénocarcinome d'origine humaine chez les souris nude est réalisé par inoculation de cellules cancéreuses Ca CO 2 Les effets de la créatine phosphate sur la croissance tumorale et la différenciation cellulaire sont étudiés après l'administration du produit par voie intraveineuse ou intrapéritonéale L'évaluation de ces effets est effectuée par la mesure de la taille et du poids de la tumeur puis par l'examen histologique en comparant les données du groupe des témoins avec celles du groupe traité. 1.2 Mode opératoire 1.2 1 Préparation de l'animal Les souris nude, souche Swiss, âgées de 4 semaines sont maintenues dans l'isolateur pendant une semaine avant l'implantation des cellules tumorales dans des conditions stériles. 1.2 2 Culture cellulaire Les cellules Ca CO 2 sont cultivées dans le milieu DMEM contenant 20 % de sérum de veau foetal, de la glutamine à 2 m M et 1 % d'acides aminés non-essentiels, dans un incubateur avec 10 % de C 02 Le milieu de culture est renouvelé 3 fois par semaine Le repiquage est réalisé en utilisant de la trypsine et de l'EDTA. 1.2 3 Développement de l'adénocarcinome d'origine humaine chez la souris nude Après la trypsinisation, une quantité d'environ 10 x 106 cellules Ca CO 2 (soit dans 0 2 mi de tampon PBS, soit dans 0 2 ml de milieu de culture) sont inoculés par voie sous cutanée au niveau du flanc droit de chaque souris-hôte, dans des conditions stériles. Les animaux sont alors maintenus dans l'isolateur. Les animaux sont pesés et la tumeur est mesurée avec un pied à coulisse chaque jour afin d'établir une courbe de croissance tumorale Le volume de la tumeur ainsi établie (hémi-ellipso Ydale) est calculé selon la formule suivante: volume = 0 5236 x largeur x longueur x hauteur (Dethlefsen et ai, 1968) Lorsque l'animal est sacrifié, la tumeur est prélevée en totalité et pesée, puis fixée dans le formol à 10 % ou le Bouin pour examen anatomopathologique. 1.2 4 Etude concernant leffet de la créatine phosphate sur la croissance et la différenciation tumorale Deux séries d'études ont été réalisées avec la créatine phosphate. Chaque série comporte de 7 à 8 souris nude réparties entre groupes témoins et traités Au début de l'étude, toutes les souris ont eu une implantation sous cutanée, au niveau du flanc droit, de cellules tumorales Ca CO 2; Le traitement a été commencé 7 jours après l'implantation pour l'expérience 1 et s'est prolongé pendant 6 semaines Le groupe d'animaux témoins a reçu le véhicule dans les mêmes conditions. 1 i O Pour l'expérience 2, les animaux ont été traités pendant la phase exponentielle de croissance tumorale, à savoir 6 semaines après l'injection des cellules tumorales et pendant 3 semaines et demie. La posologie a été la suivante: 0 5 M de créatine phosphate dissous dans Na CI à 0 9 % injectées sous un volume de 1 mi, à raison de 6 injections intrapéritonéales par semaine (groupe traité), 1 ml de sérum physiologique (Na CI à 0 9 %) par injection, à raison de 6 injections par semaine (groupe des témoins). Pour la première série, les animaux ont été sacrifiés une semaine après l'arrêt du traitement, et les tumeurs prélevées ont été fixées dans le formol à 10 % Pour la deuxième série, les animaux ont été sacrifiés à l'arrêt du traitement, et les tumeurs prélevées fixées dans le Bouin. 2 * Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau ci-après et indiquent le poids de la tumeur en mg, animal par animal. ANIMAUX TEMOINS ANIMAUX TRAITES PAR UP 999-247 Poids corporel Poids de la tumeur Poids corporel Poids de la tumeur (g) (mg) (g) (mg) Début essaiFin essai Début essai Fin essai 17 22 577 2 18 5 23 5 88 9 16.5 23 812 6 20 24 334 ) 16 5 21 5 20 5 18 21 84 2 WL 16 22 47 2 27.5 33 2274 24 5 26 287 N 8 D 25 31 5 2240 24 5 29 818 c _ 23 27 103 26 28 5 184 23 28 97 LU 21.5 24 10 (' la prise de poids moyenne pendant le traitement est de 3 2 g pour les traités, 5.0 g pour les témoins. Les résultats obtenus montrent qu'il n'existe pas de différence au point de vue du comportement et de l'état général entre le groupe témoin et le groupe traité Une différence importante est observée en ce qui concerne le poids de la tumeur prélevée entre les deux groupes, dans les deux séries testées. Sur le plan de l'examen histologique, les prélèvements sont identifiés comme des adénocarcinomes peu différenciés Par rapport aux néoplasmes prélevés chez les animaux témoins, les tumeurs observées chez les animaux traités présentent une taille très nettement inférieure Aucune différence notable concernant l'architecture et la cytologie des néoplasmes observées n'est visible. 3 * Conclusion Les résultats montrent selon la série considérée une inhibition de la croissance tumorale ou une régression tumorale après l'administration de créatine phosphate chez les souris nude porteuses de tumeurs établies. TOLERANCE La créatine phosphate a été administrée par voie intraveineuse 1 fois par jour pendant 5 jours, aux doses 600, 1200, 1800 et 2400 mg/kg, chez le rat L'évolution pondérale et le comportement alimentaire des animaux ont été suivis durant la période expérimentale Un bilan biochimique et hématologique a été réalisé sur le plasma et le sang recueillis après sacrifice des animaux. Dans les conditions expérimentales décrites, la créatine phosphate n'a pas induit de mortalité. Les variations observées concernent les groupes d'animaux traités par les plus fortes doses étudiées qui entraînent une augmentation modeste des transaminases ainsi que du sodium, et une diminution des phosphatases alcalines et des éléments figurés du sang. Les autres modifications s'inscrivent dans les fluctuations habituellement rencontrées chez le rat. La créatine phosphate a révélé une excellente tolérance biologique pour des doses pouvant aller jusqu'à 2400 mg par administration intraveineuse. De même, l'acide phospho-énol-pyruvique a révélé une bonne tolérance biologique et a été administré chez le rat jusqu'à une dose de 500 mg/kg sans induire de mortalité. On trouvera, ci-après, des exemples non limitatifs de compositions pharmaceutiques à base de composé présentant une liaison amine phosphorique ou une liaison phosphate d'énol. La créatine phosphate peut se présenter, soit sous forme d'une solution stérile prête à l'emploi, soit sous forme d'une poudre ou d'un lyophilisat stérile Il pourra alors être avantageux de faire appel à un ballaste sans activité pharmacologique, parmi lesquels on retiendra le lactose, le mannitol. Le solvant de reconstitution pourra être, soit choisi parmi les solvants d'injection classiquement utilisés (Na CI 9 c, sérum glucosé à 5 % ou à 15 %, sorbitol), soit tout autre solvant de perfusion généralement disponible. De manière préférentielle, la préparation pharmaceutique se présentera sous forme d'un lyophilisat stérile contenant 25 g de créatine phosphate à reconstituer avec 100 ml d'une solution à 9 O/ o de chlorure de sodium. REVENDICATIONS 1 Composés présentant une liaison riche en énergie choisie parmi une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol pour leur application en tant que substance thérapeutiquement active. 2 Créatine phosphate pour son application en tant que substance thérapeutiquement active. 3 Acide phospho-énol-pyruvique pour son application en tant que substance thérapeutiquement active. 4 Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent, à titre d'ingrédient actif, au moins un composé présentant une liaison riche en énergie choisie parmi une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Compositions pharmaceutiques à activité anti-tumorale, caractérisées en ce qu'elles contiennent à titre d'ingrédient actif, au moins un composé présentant une liaison riche en énergie choisie parmi une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol, en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. 6 Compositions pharmaceutiques selon la revendication 4 ou 5 caractérisées en ce qu'elles contiennent, à titre d'ingrédient actif, un composé choisi parmi la créatine phosphate et l'acide phospho-énol-pyruvique. 7 Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique, notamment à activité anti-tumorale, caractérisé en ce qu'il consiste à incorporer une quantité pharmaceutiquement efficace d'au moins un composé présentant une liaison riche en énergie choisie parmi une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol, dans un excipient pharmaceutiquement acceptable. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la composition pharmaceutique est formulée en préparation injectable dosée de 0 1 à 50 g. 9 Utilisation d'au moins un composé présentant une liaison riche en énergie choisie parmi une liaison amide phosphorique ou une liaison phosphate d'énol pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des tumeurs.