Brevet FR2678949A1 — publié le 19930115

"Procédé d'obtention d'un complexe protéique d'action stabilisatrice de la dégénérescence" L'invention concerne un procédé d'obtention d'un complexe protéique possédant une activité stabilisatrice de la dégénérescence et plus particulièrement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge et de la rétinite diabétique. L'invention concerne également le complexe protéique obtenu par le procédé. Dans le brevet FR-A-1532489 et le BSM 7226M, il est décrit un procédé d'obtention d'un complexe d'enzymes et d'acides nucléiques, utilisé notamment pour combattre les manifestations du vieillissement, par exemple dans le traitement de la cataracte. Le procédé consiste à broyer des tissus cellulaires frais, à les malaxer dans une solution isotonique, à soumettre le mélange obtenu à un traitement dit d'activation comprenant un ou plusieurs cycles formés chacun d'une phase de sensibilisation (par exemple congélation puis réchauffage) puis d'une phase d'irradiation par des rayons ultraviolets. La phase de sensibilisation a pour effet une diffusion des enzymes dans la solution et la phase d'irradiation a pour effet d'augmenter l'activité spécifique des enzymes libérés. Le complexe obtenu contient une quantité importante d'agents actifs. Il s'agit donc essentiellement dTun procédé d'activation d'un broyat cellulaire. Lorsque l'on soumet des cellules à des chocs physicochimiques, par exemple une élévation brusque de température, une privation temporaire d'oxygène ou la présence de substances toxiques, il se déclenche à l'intérieur des cellules une série de synthèses de protéines dites de protection, de défense ou de réparation, ainsi que la synthèse d'un type particulier de protéines dites de chocs. Ces protéines de chocs ont la propriété de réactiver des protéines dénaturées en leur redonnant leur conformation spatiale. Cependant, ces agressions, notamment par chocs thermiques, endommagent fortement les cellules et les éventuelles protéines de chocs. La présente invention a pour but de pallier ces insuffisances, en proposant un procédé d'obtention d'un complexe protéique en soumettant des tissus cellulaires à des chocs agressifs tout en évitant d'endommager les cellules. A cet effet, elle propose un procédé pour l'obtention d'un complexe protéique du genre résultant de l'application à une matière cellulaire d'un traitement d'agression, caractérisé en ce que la matière tissulaire est une culture de cellules vivantes. Le procédé comprend une première étape au cours de laquelle la culture de cellules vivantes est lavee et mise en suspension dans une solution isotonique, une seconde étape au cours de laquelle on soumet la culture de cellules vivantes en suspens ion dans la solution isotonique à une succession de traitements d'agressions par actions mécanique, thermiques et photoniques, une dernière étape au cours de laquelle on procède à une opération de séparation physique pour recueillir le complexe protéique. Un tel procédé permet d'obtenir un complexe comportant d'une part des protéines dites essentielles et d'autre part des protéines de chocs. L'invention sera mieux comprise et les avantages apparaîtront plus clairement à la lumière de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple. La matière tissulaire de base est constituée par une culture de cellules vivantes, provenant d'organismes appartenant au règne animal, de préférence embryonnaire ou placentaire. La culture peut avoir également une origine végétale ou bactérienne. Dans un premier temps la culture de cellules vivantes est lavée et mise en suspension dans liquide isotonique. La préparation ainsi obtenue est placée dans un récipient à fond plat de manière à avoir une couche mince de solution de l'ordre de quelques millimètres d'épaisseur. Dans un deuxième temps on fait subir à la pre'paration étalée en couche mince les traitements d'agressions. La première phase est une phase d'agression par action mécanique. On utilise un laser pulsé à régime non thermique, par exemple un laser du type dit Nd-YAG, (Grenat d'aluminium et d'yttrium dopé au néodyme). On procède à un balayage monotrace en s'attachant à "décrire" par impacts un réseau de points équidistants sur tout le volume à traiter, en veillant à ne pas atteindre un seuil qui détruirait l'activité biologique. Le but est d'avoir une densité de points suffisante pour obtenir une séparation des cellules. Pour conserver l'activité biologique et procéder aux phases suivantes d'agressions, la préparation issue de cette première phase est placée dans un flacon étanche. Les flacons sont ensuite immergés dans de l'azote liquide (à -194 C) pendant 48 heures. Dans une deuxième phase on réalise les agressions thermiques et photoniques. La préparation subit un réchauffement rapide par impulsions longues micro-ondes jusqu'à l'obtention d'une température proche de 30"C. Le contenu du flacon est alors placé dans un récipient à fond plat pour être etendu en couche mince. On procède alors à l'aide de lasers actifs à différentes longueurs d'onde (laser à argon ou à krypton) à une agression par impacts de photocoagulation en "damier large". On réalise immédiatement après une irradiation par rayons ultra-violets A, en alternant pendant 30 minutes des cycles d'action maximale de 5 minutes et d'action minimale de 5 minutes. La préparation est ensuite immédiatement transvasée dans un flacon étanche et congelée dans l'azote liquide.Cette succession d'opérations à savoir, réchauffement rapide, photocoagulations par laser et irradiations UV est renouvelée toutes les 12 heures. Pour la dernière irradiation la source UVA est remplacée par une source d'UVB germicides de manière à stériliser le produit. On procède enfin à une séparation physique pour recueillir le complexe protéique. Celui-ci est alors placé dans une solution isotonique. On obtient une solution colloïdale isotonique dans laquelle les composants du complexe se trouvent en suspension homogène et stable. Le produit est conditionné en ampoules stériles scellées. Entre les différentes étapes du procédé les préparations de cultures cellulaires peuvent être conservées dans des flacons étanches à basse température. Le traitement d'agression a pour but d'induire les synthèses d'une part d'un grand nombre de protéines de protections et de réparations et d'autre part la synthèse de protéines de chocs. Ceci est l'effet de processus biologiques généraux consécutifs à l'organisation des moyens de défense au niveau cellulaire et extra-cellulaire. Par le procédé de l'invention on crée ces conditions hostiles et voire on les "exagère". La réponse provoquée est répétitive et ubiquitaire. le produit est administrable par toutes les voies d'accès d'un liquide. Le produit obtenu présente un pH neutre. I1 contient une quantité importante d'éléments essentiels et notamment - des protéines essentielles - des enzymes antiradicaux oxydants, dont les superoxydes dismutases, des catalases et des glutathionperoxydases; - des enzymes réparatrices d'ADN dont 1'ADN polymérase; - des molécules complexes de structures ambivalentes pouvant permettre des actions activatrice et inhibitrice. Cette fonction a typiquement l'allure des modulateurs de facteurs de croissance. - des protéines de chocs dont l'une d'elles a été isolée et possède une formule proche de l'arginine, NH2 - C(=NH) - NH(CH2)3 - CH(NH2)3 - CH(NH2) - CO2H Le produit possède surtout la propriété de stabiliser la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et la rétinite diabétique (RD), cette dernière à ses débuts. Le complexe agit, d'une part en rééquilibrant la régulation d'une stimulation de l'angiogenèse par l'utilisation de modulateurs de facteurs de croissance présents dans le complexe, d'autre part en utilisant une des propriétés des protéines de chocs qui est de réactiver les protéines dénaturées en leur redonnant une structure spatiale correcte dont dépend essentiellement l'activité de la protéine. La stabilisation de la DMLA est obtenue dans les formes atrophiques ou "sèches" et cela sur une durée de dix ans.Dans le cas d'un traitement de la RD, on observe une résolution des hémorragies anévrismales punctiformes. Le produit présente d'autres propriétés - la stabilisation des opacités cristalliniennes dans la cataracte, voire résolution des opacités légères en début d'affection; - la stabilisation de l'état du cartilage dans les arthrose dégénératives, voire résolution dans leur tout début; - la stabilisation de l'involution du parodonte, avant la chute des dents, voire résolution d'un faible ébranlement des dents; - la stabilisation de l'état de la peau, en particulier du derme et arrêt dans l'épiderme de la diminution du nombre de kératinocytes. Ces types de stabilisation sont réalisées par des mécanismes similaires, en sachant qu'au niveau des composants de la matrice extra-cellulaire se trouvent des récepteurs spécifiques de facteurs de croissance et que le cristallin, le cartilage, le parodonte et le derme sont constitués par de la matrice extra-cellulaire. Pour la stabilisation de l'angiogenèse, les cellules sont également dotées de récepteurs spécifiques aux facteurs de croissance. Le produit permet aussi d'augmenter la rapidité d'élimination et de neutralisation des radicaux libres. Il agit également sur les dégénérescences myopigènes, les localisations dermique et oculaire de l'herpès et les vascularites. L'expérimentation animale a confirmé pour les critères toxicologiques et tératologiques, une absence d'effet à court et à long terme. REVENDICATIONS 1. Procédé pour l'obtention d'un complexe protéique du genre résultant de l'application à une matière tissulaire d'un traitement d'agression, caractérisé en ce que la matière tissulaire est une culture de cellules vivantes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une première étape au cours de laquelle la culture de cellules vivantes est lavée et mise en suspension dans une solution isotonique, une seconde étape au cours de laquelle on soumet la culture de cellules vivantes en suspension dans la solution isotonique à une succession de traitements d'agressions par actions mécanique, thermiques et photoniques, une dernière étape au cours de laquelle on procède à une opération de séparation physique pour recueillir le complexe protéique. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape de traitement d'agression comprend une première phase d'agression par action mécanique et une seconde phase d'agressions successives par actions thermiques et photoniques. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'agression par action mécanique est réalisée par impacts de laser pulsé. 5. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la phase d'agressions par actions thermiques et photoniques comprend au moins deux cycles avec la succession d'une phase d'agression par une variation brusque de température, de grande amplitude, puis d'une phase d'agression par impacts de photo-coagulation laserienne et d'une phase d'agression par irradiations par rayons ultraviolets. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les irradiations du dernier cycle sont réalisées avec des rayons ultraviolets germicides (wu). 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'entre les différentes étapes du procédé, les préparations de cultures cellulaires sont conservées à basse température.