Brevet FR2678948A1 — publié le 19930115

La présente Invention est relative à de nouveaux vecteurs d'expression et d'intégration dérivés du génome des Densovirus. Les Densovirus sont des petits virus entomopathogènes, non enveloppés; leur génome est constitué par une molécule linéaire d'ADN, dont le poids moléculaire est d'environ 1,7 x 106 Da. Lors de l'encapsidation, des brins + et des brins - complémentaires sont encapsidés séparément dans les particules virales. Un fragment de 4,3 kb correspondant à la région centrale du génome du densovirus du Bombyx a été cloné [BANDO et al. Arch. Virol. 93 : 139-146 (1987)], [BANDO et al. J. Virol. 61 : 553-560 (1987)] . Il a été montré que l'un des brins constituant le génome contient deux cadres de lecture ouverte de 1290 et 2661 nucléotides et que l'autre brin contient un cadre de lecture ouverte de 501 nucléotides. L'emploi des Densovirus dans la lutte contre certains insectes ravageurs a été préconisé. Comme l'obtention en grande quantité de densovirus pose des problèmes de coût d'obtention consécutifs à la nécessité de les reproduire sur leurs hôtes, et donc de mettre en oeuvre des élevages d'insectes, il a été proposé de les produire par génie génétique, en insérant dans un plasmide bactérien une séquence partielle ou complète d'ADN d'un Densovirus. La demande de brevet français 2 624 121 décrit des plasmides recombinants obtenus de la sorte, capables de se répliquer dans E. Coli, et d'induire une densovirose chez un insecte sensible ; elle décrit plus particulièrement la séquence complète du génome du densovirus de Junonia, ainsi que le plasmide pBRJ, obtenu par insertion de ladite séquence dans le plasmide pBR 322 d'E.Coli, ainsi que son utilisation comme bioinsecticide. Le génome du densovirus de Junonia présente les caractéristiques suivantes de ce génome ; un de ses brins contient un seul cadre de lecture ouverte (ORF1) le brin complémentaire contient trois autres cadres de lecture ouverte (ORF2, ORF3, ORF4). En outre ces travaux ont permis d'identifier, aux extrémités du génome, des séquences répétées inversées, de longueur supérieure à 500 pb. Les Inventeurs ont maintenant constaté, d'une part, qu'il est possible d'utiliser le génome des Densovirus pour l'obtention de vecteurs d'expression de gènes exogènes, et d'autre part, que les séquences terminales répétées inversées dudit génome peuvent s'insérer dans 1'ADN génomique d'une cellule hôte, et qu'une séquence d'ADN exogène encadrée par ces séquences répétées inversées est insérée en même temps qu'elles. Les Inventeurs ont ainsi obtenu, à partir du génome de densovirus, des vecteurs permettant l'intégration, dans le génome d'une cellule hôte appropriée, de la séquence d'ADN exogène dont ils sont porteurs, ainsi que la transcription et la traduction de cette séquence exogène dans la cellule hôte. La présente Invention a pour objet des vecteurs d'expression et/ou d'intégration chargés, dérivés du génome d'un Densovirus, et comprenant les séquences terminales répétées inversées dudit génome, lequels vecteurs sont caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre, au moins une séquence d'ADN exogène, insérée entre lesdites séquences terminales répétées inversées. Au sens de la présente Invention, on entend par - "vecteur d'expression", un vecteur permettant la transcription et la traduction d'une séquence codante qui y est insérée - "vecteur d'intégration", un vecteur permettant l'intégration d'au moins une portion de sa séquence dans le génome d'une cellule hôte - "séquence d'ADN exogène", soit une séquence d'ADN qui n'est pas naturellement présente dans le génome des Densovirus, en particulier toute séquence codant pour une protéine qui n'est pas exprimée par les Densovirus à l'état naturel, soit une séquence d'ADN qui est insérée en dehors de sa localisation naturelle. Un vecteur portant une telle séquence d'ADN exogène est dit "chargé", et un vecteur ne portant pas cette séquence est dit "non chargé". Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits vecteurs sont dépourvus d'au moins une partie des séquences centrales du Densovirus. On entend par "séquences centrales" toutes les séquences du génome du Densovirus qui sont localisées entre les séquences terminales répétées inversées. La présente Invention a également pour objet des vecteurs non chargés, permettant, par insertion d'ADN exogène, l'obtention de vecteurs d'expression et/ou d'insertion tels que définis plus haut, et caractérisés en ce qu'ils comprennent le génome d'un Densovirus, dépourvu d'au moins une partie de ses séquences centrales. Pour obtenir la réplication et l'expression de la séquence d'ADN exogène dans la cellule hôte, on cotransfecte ladite cellule avec - d'une part un vecteur chargé conforme à l'invention, et comprenant donc un génome de Densovirus altéré dans au moins l'un des cadres de lecture ouverte, par suite, soit de la délétion des séquences centrales, soit de l'insertion de 1'ADN exogène, - d'autre part un vecteur de complémentation apportant la ou les fonctions manquantes. Le système de complémentation ainsi obtenu permet la reproduction de particules virales capables de propager le génome recombinant. Le vecteur de complémentation pourrait être un vecteur comprenant la séquence génomique du même Densovirus, altérée dans un cadre de lecture resté intact dans le vecteur chargé; ceci risque toutefois d'entrainer des phénomènes de recombinaison qui aboutissent à la production d'ADN viral de type sauvage. I1 est donc préférable d'utiliser un vecteur de complémentation comprenant un génome de Densovirus dépourvu des séquences virales terminales, nécessaires à la réplication, et présentant en outre le moins possible de séquences homologues avec le vecteur comprenant le génome de Densovirus. Les vecteurs conformes à l'invention présentent de nombreux avantages par rapport aux vecteurs dérivés de virus entomopathogènes connus dans l'art antérieur. Tout d'abord, ils permettent l'intégration de gènes étrangers dans le génome des cellules d'insectes. En outre, dans la plupart des vecteurs connus dans l'art antérieur, qui sont principalement des vecteurs dérivés de Baculovirus, il est nécessaire de procéder en plusieurs étapes pour insérer une séquence d'ADN exogène dans le génome viral - il faut d'abord insérer le gène exogène dans un premier vecteur, dit vecteur de transfert, qui est utilisé pour co-transfecter des cellules sensibles avec 1'ADN viral sauvage, - il faut ensuite sélectionner et cloner les virus recombinants ayant intégré le gène exogène dans 1'ADN viral, puis amplifier les clones obtenus ; ce n'est qu'ensuite que les virus peuvent être utilisés pour la transfection de cellules dans le but d'obtenir l'expression du gène exogène. Au contraire, les vecteurs conformes à l'Invention peuvent être chargés directement, in vitro, par le gène que l'on veut faire exprimer, puis utilisés pour la transfection de cellules d'insectes sensibles. Ils ne nécessitent pas l'utilisation de vecteurs de transfert et permettent donc une obtention plus rapide de l'expression du gène exogène inséré. La présente Invention a également pour objet un procédé d'insertion d'une séquence d'ADN dans le génome de cellules d'insectes, lequel procédé est caractérisé en ce que, dans une première étape, l'on transfecte les cellules par un vecteur chargé conforme à l'invention et portant ladite séquence d'ADN, et dans une deuxième étape, on sélectionne les cellules dans le génome desquelles ladite séquence d'ADN a été intégrée. L'Invention englobe également les cellules d'insectes transformées, obtenues par ce procédé. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention et d'utilisation des vecteurs d'expression et ou d'intégration conformes à 1 'Invention. I) PREPARATION DES VECTEURS CONFORMES A L'INVENTION Exemple 1 : Obtention d'un vecteur d1exoression Permettant lexoression du aène de la g-aalactosidase d1 H. coli A) Construction d'un vecteur portant le gène de la 13-galactosidase à partir du plasmide pBRJ Le plasmide pBRJ, obtenu par insertion de 1'ADN génomique du Densovirus de Junonia dans le plasmide pBR 322, est décrit dans la Demande de Brevet Français 2624 121. CONSTRUCTION DU PLASMIDE pBRJ-lacZ 1. Insertion d'un linker Salt de 10 nucléotides 5 g du plasmide pBRJ sont digérés par l'enzyme de restriction NcoI (qui n'a qu'un seul site de coupure dans la séquence virale, dans le cadre de lecture majeur ORF1 en aval du premier codon d'initiation ATG de ce cadre) à raison de 3 U/Ag d'ADN dans un volume final de 30 l pendant 2 heures à 37 C. Les extrémités cohésives générées sont converties en extrémités franches par le grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (fragment de Klenow) à raison de 1,5 U/Rg d'ADN et 40 Rg/ml des 4 dXTP dans 100 l à 20'C durant 30 mn. Les extrémités franches sont ensuite déphosphorylées par l'action de 2 U/g d'ADN de phosphatase alcaline de veau, dans 50 l à 37 C et 56 C pendant 1 heure. Parallèlement, 3 Rg de linkers salol de 10 nucléotides sont phosphorylés par 2 U/g de kinase dans 10 1, pendant 1 heure à 37 C puis ligués à raison de 50 g/ml final, avec le pBRJ, par 2 U/g de T4 DNA ligase dans 20 l à 22 C pendant 12 heures. Des bactéries E. Coli C600 sont rendues compétentes par la méthode au chlorure de calcium [MANIATIS et al, Molecular cloning : A laboratory manual", - Cold Spring Harbor Laboratoy, Cold Spring harbor NY., (1982)] puis 200 F1 de suspension bactérienne sont transformés par 5 l du produit de ligation (pBRJ-Linker SalI). 40 ADN plasmidiques extraits par mini-préparation [BIRNBOIM & DOLY, Nucl. Ac. Res., 7, 1513-1523, (1979)] présentent une taille identique. Deux d'entre eux peuvent être linéarisés par l'endonucléase SalI, ce qui démontre l'insertion des linkers SalI au niveau du site NcoI. Une maxi-préparation de ces plasmides est alors réalisée (HOMES et QUIGLEY, Anal. Biochem, 114, 193-197, 1981). L'insertion de plusieurs linkers, il convient d'éliminer les linkers surnuméraires par digestion exhaustive à raison de deux fois 5 U/Rg d'ADN d'enzyme SalI, pendant 2 H à 37 C. Le passage des plasmides ainsi digérés sur colonne échangeuse d'ions (Minicolonne NACS PREPAC BRL) va permettre d'éliminer les linkers de faible poids moléculaire et de purifier 1'ADN plasmidique. Cet ADN plasmidique ainsi séparé des linkers surnuméraires, est ligué par la T4 ligase à raison d'l U/g d'ADN, 12 H à 22 C 2. Insertion du aène lacZ d'Escherichia coli Le plasmide pMC 1871 [SHAPIRA et al., Gene, 25, 71 (1977)] contient le gène lacZ d'E. coli tronqué d'un "site de liaison ribosomal" et de ses 8 premiers codons N-terminaux non essentiels.Ce gène est flanqué, à chacune de ses deux extrémités, d'un polylinker renfermant le site SalI. Une digestion de 7 ijg de ce plasmide est donc réalisée par 5 U/g de l'endonucléase SalI, 2 H à 37 C dans un volume de 70 1. Le plasmide pBRJ muni d'un linker SalI est également digéré par l'endonucléase a1l dans des conditions similaires, puis déphosphorylé par la phosphatase alcaline de veau. Les produits de digestion de ces deux plasmides sont ligués à raison d'un rapport moléculaire insert (fragment portant le gène lacZ)/plasmide (pBRJ + linker SalI) égal à 5. La ligation est réalisée dans un volume de 100 1 avec 1 U/g de plasmide receveur de ligase T4 pendant 12 H à 22 C, puis 6 H à 4 C. Des bactéries E. Coli C600 compétentes sont ensuite transformées par 50 1 de ce produit de ligation. Sur 250 minipréparations des clones obtenus, 31 possèdent des plasmides recombinants. La nature et l'orientation des inserts est contrôlée par différentes digestions enzymatiques. 4 clones bactériens possèdent des plasmides portant le gène lacZ d'E. coli dans la bonne orientation. Ces plasmides ont été appelés pBRJ-lacZ. B) Expression du gène de la ss-galactosidase dans des cultures cellulaires sensibles 1. Transfection de cellules de Ssodontera littoralis Différentes lignées cellulaires d'insectes ont été testés pour la présence éventuelle d'une activité ss-galatosidasique endogène.Pour cela des cellules saines en cultures sont séparées de leur milieu de culture, puis rincées avec du tampon PBS (3,2 mM Na2H2PO4,H20 3,2 mM Na2HP04,12H20 ; 1,5 mM KH2PO4 ; 13,7 mM NaCl 2,5 mM KC1 ; pH 7,4), fixées par 0,28 de glutaraldéhyde et 2% de formaldéhyde pendant 5 mn, rincées à nouveau avec du PBS, puis incubées pendant 12 H à 37 C avec une solution à 1 mg/ml de Xgal, 4 mM de ferri-ferrocyanure de potassium, 2 mM MgC12 dans du PBS. Le Xgal (5-bromo-4-chloryl-3 -indolyl--D-galatopyranoside) est un des substrats chromogènes de la ss-galactosidase ; une coloration bleue apparait en présence de l'activité ss-gal. Plusieurs lignées se sont avérées présenter une activité ss-gal endogène ou "ss-gal-like" endogène. La lignée Spodoptera littoralis a été retenue pour son absence d'activité "13-gal-like" et pour son taux convenable de transfection par pBRJ. La lignée Spodoptera littoralis est transfectée par le plasmide pBRJ-lacZ, soit selon la méthode au phosphate de calcium [SUMMERS et SMITH, Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin n 1555, (1987)] soit selon une technique faisant intervenir des liposomes (DOTMA : chlorure de N-(1-(2,3-Dioleyloxy) popyl)-N.N.N.tri-méthyl ammonium. Cat N 1202375 BOEHRINGER). Pour ces deux techniques, des cellules saines sont repiquées 48 H avant transfection, à raison de 106 cellules par cupule, dans des boites de culture cellulaires à 6 trous. Pour la méthode au phosphate de calcium, 20 Rg d'ADN pBRJ lacZ sont ajoutés à une solution d'HeBs (137 mM NaCl, 6 mM d(+) glucose ; 5 mM KC1, 0,7 IL Na2HPO4, 7H2O ; 20 mM HEPES ; pH 7,05-7 1), 15 mg/ml de thymus de veau soniqué, 125 mM CaC12 dans un volume final de 500 ml. 30 mm plus tard, le précipité obtenu est mis en contact avec 106 cellules, et 2,5 ml de milieu neuf à 28 C Pour la méthode DOTMA, 2,5 jil de liposomes à 1 mg/ml sont ajoutés à 1 ml de milieu sans sérum de veau foetal, puis vortexés, et 20 Fg de pBRJ-lac Z sont ajoutés à 1 ml de milieu sans sérum, puis vortexés.Ces deux mélanges sont ensuite regroupés puis mis en contact à 28 C avec ds cellules préalablement rincées avec du milieu sans sérum. Après 4 heures de contact, le mélange est éliminé et remplacé par 3 ml de milieu avec sérum. 3 à 5 jours après la transfection, l'expression B-gal est détectée, avec le substrat Xgal, de façon analogue à la technique précédemment décrite pour la recherche d'activité B-gal endogène dans des cellules saines. 2. Dosaae de l'activité ss-aalactosidase Pour permettre une estimation quantitative de l'expression du gène inséré dans le vecteur pBRJ-LacZ, l'activité ss-galactosidasique a été dosée dans les cellules à différents temps suivant la transfection. Des cellules transfectées par différentes concentrations du plasmide pBRJ-lacZ sont prélevées à différents temps post-transfection, séparées du surnageant par centrifugation pendant 5 mn à 1000 rpm, rincées par le tampon PBS sui reprises dans 600 ml d'eau. 300 ml sont ajoutés à 500 ml de tampon Z (0,06 M Na2HPO4 ; 0,04 M Na2H2PO4 ; 0,01 M KC1 0,001 M MgSO4 ; 0,05 M ss-Mercaptoéthanol ; pH 7,0) et 200 ml d'ONPG à 4 mg/ml (substrat chromogène de la 13-galatosidase). La coloration jaune générée par l'activité ss-galactosidase est mesurée par DO (densité optique) à 420 nm. La réaction est stoppée par l'addition de 500 ml de Na2CO3 1 M. Les unités d'activité ss-gal sont exprimées en accord avec MILLER [ Expriment in molecular genetics. Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring harbor N.Y. 432, 352-355, (1972)] Les 300 ml restants sont utilisés pour le dosage de protéines totales selon le procédé BIORAD dérivé de la technique de dosage de BRADFORD [BRADFORD, Anal.Biochem., 72, 248-254, (1975)]. L'activité spécifique est définie comme la quantité d'enzyme produisant 1 nmole de o-nitrophénol/mn/mg de protéines totales à 28 C, PH 7,0. Les résultats sont illustrés dans les figures 1A et 1B. La figure 1A montre l'activité spécifique des cellules transfectées avec 0 10 20 et 40 (A) Fg de plasmide pBRJ LacZ. La figure 1B montre l'activité spécifique des surnageants des mêmes cultures cellulaires. Exemple 2 : Obtention d'un vecteur d'intéoration permettant l'insertion du aène de résistance à la néomycine. I. Construction du plasmide pBRjneo A) Préparation du fragment neoR à insérer 20 g du plasmide pNeo (Pharmacia) ont simultanément été digérés par les deux enzymes de restriction Bglll et BamHI à raison de 5 unités d'enzyme par g d'ADN. Le volume réactionnel est de 80 l et le temps d'incubation de la digestion est de 2 heures à 37 C. L'ADN est ensuite précipité par addition d'acétate de sodium à 0,3 M final, puis de 2 volumes d'éthanol, et incubation pendant 30 mn à -80'C. Les extrémités 5' sortantes des fragments BalII-BamHI sont converties en extrémités franches par le fragment de Klenow de 1'ADN polymérase I d'E.coli ; le culot d'ADN est repris dans 10 1 d'eau distillée et la réaction se réalise à 22 C pendant 30 mn, en présence de 4 unités d'enzyme dans un volume de 50 A1. Un gel d'agarose à 0,7% permet la séparation des fragments ainsi générés. Le fragment d'ADN de 923 pb contenant le gène neoR avec son propre ATG est alors purifié selon la technique du kit Geneclean (BIO 101 Inc. P.O. Box 2284 La Jolla, CA 92038-2284 USA). 1'ADN est repris dans un tampon TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) puis extrait au phénol saturé avec le même tampon. B) Préparation du plasmide receveur Un plasmide dérivé de pBRj est obtenu après élimination du site PVull de la séquence pBR322 par double digestion Aval-Tthlll. Ce plasmide contient la totalité de la séquence virale avec son site Pvull, site unique dans ce plasmide. Ce plasmide pBRJ59DAT10DH15 est digéré par qyyll. La digestion a été réalisée en présence de 4 mg de plasmide et de 5 unités d'enzyme par mg d'ADN, dans un volume final de 10 ml. La linéarisation du plasmide est vérifiée sur gel d'agarose. C) Ligation La ligation est effectué dans un volume de 20 il à laide de 2 unités de T4 DNA ligase dans les conditions proposées par BOEHRINGER, en mettant en présence 1 g d'insert avec 200 ng du plasmide receveur pXXXX. La réaction de ligation est effectuée par incubation pendant 12 H à 16 C. D) Transformation Les bactéries compétentes sont préparées selon le protocole préconisé par SEIDMAN dans "Current Protocols In Molecular Biology", [AUSUBEL et al. - Wiley, Newyork, (1987)]. 100 1 de bactéries compétentes maintenues à 0 C sont mélangées à 10 F1 du produit de ligation et sont placées 10 mn sur glace fondante. Un choc thermique de 5 mn est alors effectué à 37 C. Après addition de 1 ml de milieu LB, les bactéries transformées par le plasmide issu de la ligation sont sélectionnées sur des boîtes de milieu LB gélosées contenant de l'ampicilline à 100 Fg/ml. L'ADN des clones obtenus est ensuite extrait par lyse alcaline. Plusieurs digestions effectuées à l'aide de différentes enzymes de restriction permettent de rechercher et de contrôler la bonne construction. Une maxipréparation de ce clone est réalisée selon la méthode de HOLMES et QUIGLEY, [Anal. Biochem., 11i, 193-197, (1981)]. L'ADN récupéré est purifié sur un gradient de densité de chlorure de césium, dialysé et repris dans du tampon TE. Le plasmide recombinant obtenu, dénommé pBRjneo, renfermant la séquence du gène neoR sous contrôle de son propre ATG (dans un cadre de lecture dif férent de VP4) est prêt à être transfecté. II. TRANSFECTION DES CELLULES A) Transfection des cellules et criblage des cellules résistantes à l'antibiotique G418 La technique de transfection employée consiste à mettre les cellules (Spodoptera littoralis) en présence d'un précipité d'ADN au phosphate de calcium, contenant 1'ADN pBRjneo. L'HEBS (NaCl 0,137M,D(+) glucose 0,006M, KC1 0,005 M, Na2HP047H20 0,0007 M et HEPES 0,02 M) est mélangé à de 1'ADN de thymus de veau, le pH est alors ajusté à 7,05-7,1. Le précipité est obtenu en mélangeant 455 1 d'HEBS-ADN de thymus de veau, 20 1 de TE contenant 1ADN pBRjneo et 25l de CaC12 2,5 M. Ces 500 yl de précipité sont mélangés à 2,5 1 de milieu de Grace, qui recouvrent une cupule de 106 cellules.Deux jours après la transfection, les cellules sont diluées au 1/10e et sont repiquées dans des flacons de 25 cm3, Quatre jours après repiquage, le milieu de Grace est remplacé par du milieu sélectif contenant du G418 (analogue de la généticine) au taux de 400 Wg/ml (la quantité de G418 a préalablement été titrée sur des cellules saines). Ce milieu sélectif est renouvelé tous les trois jours et ceci jusqu'à l'apparition des premiers clones. B) Extraction de 1'ADN cellulaire Les clones cellulaires résistants apparus sont repiqués, toujours sous pression de sélection et ainsi amplifiés. L'ADN total de ces cellules est extrait selon la méthode décrite par SUMMERS (référence précitée). Une quantité d'ADN cellulaire de 20 à 40 tg est digérée dans un volume final de 200 1 en utilisant 5U d'enzyme d'ADN. Le mélange réactionnel est incubé 12 h à 37 C, après quoi, une addition de la même quantité d'enzyme et effectuée, l'incubation devant durer encore 6H. L'ADN est alors précipité puis déposé sur un gel d'agarose 0,7%. L'ADN est alors transféré sur une membrane de nylon (HybondN ; Amersham) selon la technique de SOUTHERN [J. Mol. Biol. , 503-517, (1975)]. Cette membrane est par la suite hybridée avec des sondes préparées à partir de l'ADN neoR et de l'ADN du Densovirus de Junonia, à l'aide d'un kit de marquage fourni par BOEHRINGER. Il permet d'incorporer dans le fragment d'ADN bicaténaire un nucléotide modifié (le DIG-ll-dUTP). Le principe de détection consiste à révéler la liaison de la molécule digoxygénine avec un anticorps spécifique et son conjugué par une réaction enzymatique. L'hybridation effectuée avec des sondes préparées à partir de l'ADN neoR et de l'ADN du Densovirus de Junonia a permis la mise en évidence de l'intégration de la séquence virale chargée du gène neoR dans l'ADN cellulaire. Le profil d'hybridation obtenu est montré dans la figure 2 dans laquelle - les pistes 1, 2 et 3 représentent le profil d'électrophorèse en champs pulsé en gel d'agarose à 1% piste 1 : marqueur de poids moléculaire piste 2 et 3 : digestion Apal de 1'ADN extrait de cellules transfectées par pBRjneo - et les pistes 4, 5 et 6 représentent le résultat de l'hybridation par une sonde neoR du gel précédent après transfert sur membrane nylon. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente Invention. REVENDICATIONS 1) Vecteurs d'expression et/ou d'intégration chargés, dérivés du génome d'un Densovirus, et comprenant les séquences terminales répétées inversées dudit génome, lequels vecteurs sont caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre, au moins une séquence d'ADN exogène, insérée entre lesdites séquences terminales répétées inver sées. 2) Vecteurs recombinants selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus d'au moins une partie des séquences centrales du Densovirus. 3) Vecteurs recombinants non chargés, permettant, par insertion d'ADN exogène, l'obtention de vecteurs d'expression et/ou d'intégration selon la revendication 2, et caractérisés en ce qu'ils comprennent le génome d'un Densovirus, dépourvu d'au moins une partie de ses séquences centrales. 4) Vecteurs recombinants selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils sont dérivés du génome du Densovirus de Junonia. 5) Application de 1'ADN génomique de Densovirus pour l'obtention de vecteurs permettant l'expression dans des cellules d'insectes, de séquences d'ADN exogène insérées dans lesdits vecteurs. 6) Application de 1'ADN génomique de Densovirus pour l'obtention de vecteurs permettant l'intégration dans le génome de cellules d'insectes, de séquences d'ADN exogène insérées dans lesdits vecteurs. 7) Procédé d'insertion d'une séquence d'ADN dans le génome de cellules d'insectes, lequel procédé est caractérisé en ce que, dans une première étape, l'on transfecte les cellules par un vecteur chargé portant ladite séquence d'ADN, selon une quelconque des revendications 1 ou 2, et dans une deuxième étape, on sélectionne les cellules dans le génome desquelles ladite séquence d'ADN a été intégrée. 8) Cellules d'insectes transformées, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par un procédé selon la revendication 7.