Brevet FR2685327A1 — publié le 19930625

Procédés spectrophotométriques de dosage des mercaptans totaux, du glutathion réduit (GSH) et des mercaptans autres que le GSH dans un milieu aqueux, réactifs et nécessaires pour leur mise en oeuvre. L'invention concerne le dosage des mercaptans et du glutathion réduit, notamment dans les milieux biologiques. Elle a plus particulièrement pour objet un procédé spectrophotométrique de dosage des mercaptans totaux, du glutathion réduit (en abrégé GSH) et, par différence, des mercaptans autres que le GSH, dans un milieu aqueux, notamment biologique, des réactifs et des nécessaires ou kits pour la mise en oeuvre de ce procédé. Le glutathion, composé ubiquitaire, est une molécule-clef sur le plan physiologique en raison de ses nombreuses fonctions biochimiques (référence 1) , En conséquence, les variations de sa concentration, en particulier une diminution de son taux intracellulaire normal (1-10 mM), peuvent entraîner des désordres importants. Il est donc nécessaire de pouvoir disposer d'une méthode de dosage du GSH qui soit fiable, simple, sensible et spécifique de ce paramètre biochimique. L'existence de nombreuses méthodes de dosage du GSH suggère que ces dernières ne sont pas satisfaisantes (référence 2). Les techniques de mesure connues des mercaptans, en général, et du GSH en particulier, exploitent l'une ou l'autre des deux principales propriétés chimiques des mercaptans : pouvoir réducteur et pouvoir nucléophile, d'où leur classification en - Méthodes utilisant le pouvoir réducteur des mercaptans Ces méthodes ne sont pas spécifiques du GSH, elles nécessitent donc une étape de purification chromatographique pour doser le GSH et, dans certains cas, la présence d'une enzyme de couplage comme par exemple la glutathion-réductase (référence 3) ; et - Méthodes utilisant le pouvoir nucléophile des mercaptans Ces méthodes reposent sur la substitution de dérivés halogénés (de type dinitrohalogénobenzène ou monohalogénobimane, par exemple) avec ou sans glutathiontransférase.Ces méthodes également, ne sont pas spécifiques du GSH en absence d'enzyme et nécessitent une étape de séparation chromatographique pour doser le GSH. Selon les cas, la détection peut être de type spectrophotométrique, spectrofluorimêtrique (référence 4), ou électrochimique (référence 5). Dans l'exposé qui suit, on se limitera aux méthodes utilisant la spectrophotométrie d'absorption UV/visible ou la spectrofluorimétrie comme technique de détection. Les méthodes utilisant le pouvoir réducteur des mercaptans sont basées sur un échange thiol-disulfure, selon le mécanisme réactionnel suivant (dans le cas du glutathion) 2 GS- + RSSR GSSG + 2 RS- La plus connue utilise le réactif d'ELLMAN (références 6 et 7). Cette méthode basée sur la formation d'un chromophore à 412 nm est peu complexe, mais l'instabilité du réactif d'ELLMAN vis-à-vis de la lumière et du pH (hydrolyse) et l'autoxydation du chromophore libéré nécessitent la réalisation d'une mesure de référence qui alourdit le test. Tout ceci en fait un réactif non utilisable en Biologie Clinique sur de grandes séries d'échantillons. L'analogue sélénié du réactif d'ELLMAN a été synthétisé et utilisé pour le dosage de mercaptans (référence 8). Il est plus résistant que le réactif d'ELLMAN vis-à-vis de l'hydrolyse alcaline mais présente, par ailleurs, les mêmes inconvénients que ce dernier. Enfin, il convient de mentionner l'utilisation de disulfures pyridiniques (référence 9). D'une façon générale, les réactifs d'échange thiol-disulfure ne peuvent pas être utilisés pour un dosage spécifique du GSH. Les méthodes basées sur le pouvoir nucléophile des mercaptans exploitent leur capacité d d'addition sur des réactifs électrophiles, à savoir 10 Les réactifs halogénoaromatiques activés Ces réactifs du type l-chloro-2,4-dinitrobenzène (CDNB) ou 2,4-dinitro-1-fluoro-benzène (DNFB) ne sont pas spécifiques des groupements thiols à pH alcalin. Ils nécessitent la présence d'une enzyme telle que la GSHtransférase, dont ils servent par ailleurs à mesurer l'activité. La faible sensibilité de ces réactifs est l'un des inconvénients majeurs de ces méthodes. De plus, leur réactivité non enzymatique ntest pas nulle, ce qui exclut un dosage totalement spécifique du GSH.Pour pallier cet inconvénient, de nombreuses méthodes sont basées sur la séparation chromatographique des produits réactionnels comme, par exemple, la méthode de chromatographie liquide haute performance (HPLC) de REED (références 10 et 11) qui couple une formation de dérivés, ou dérivatisation, des amines (à l'aide du DNFB : réactif de Sanger) à une Scarboxyméthylation, mais qui est longue et lourde à mettre en oeuvre. 20 Les monohalogénobimanes (référence 12) Ces composés peuvent réagir avec des groupements nucléophiles autres que les groupements thiols, tels que par exemple les amines. Ils ne sont pas, non plus, spécifiques du GSH en présence d'autres mercaptans : il est donc, ici encore, nécessaire d'intégrer dans le protocole une étape de séparation chromatographique. Ce procédé permet néanmoins d'obtenir un profil exhaustif des mercaptans présents. Toutefois, la photosensibilité des réactifs et des produits de réaction implique des précautions d'emploi qui alourdissent la méthode de dosage. Par ailleurs, la cinétique lente du monochlorobimane, à pH inférieur ou égal à 8, permet d'exploiter la spécificité biochimique des glutathion-S-transférases au voisinage de la neutralité. Ce réactif pénètre lentement les cellules intactes, à l'intérieur desquelles il réagit avec l'enzyme et son substrat le GSH, ce qui permet un dosage en cytométrie de flux (référence 13). Le dérivé monobromotri méthylammoniobimane (référence 14) présente, quant à lui, l'avantage d'une plus grande solubilité dans l'eau et permet une détection conductimétrique, mais cette dernière est difficile à standardiser. Quels que soient leurs avantages particuliers, d'une façon générale, la plupart de ces méthodes requièrent une séparation chromatographique sophistiquée, et leur mise en oeuvre est trop longue pour permettre l'analyse rapide d'une grande série d'échantillons. 30 Les dérivés de l'acide iodoacétique Ces composés ont une spécificité inférieure à celle des réactifs cités ci-dessus, leur sensibilité est plutôt moyenne, voire médiocre dans certains cas. Ils sont généralement instables à la lumière et nécessitent une séparation chromatographique en raison de leurs caractéristiques d'absorption similaires à celles du produit d'addition. 40 Les dérivés du maléimide La spécificité de ces composés n'est pas meilleure que celle des réactifs précédents. Leur sensibilité n'est bonne que dans le cas où le produit d'addition est fluorescent. L'un des inconvénients majeurs de cette dernière méthode est que l'on suit une diminution d'absorption préexistante, ce qui est moins sûr et plus délicat que de suivre l'augmentation d'une nouvelle absorption. 50 Les réactifs possédant une double liaison électrophile activée (accepteurs de Michaël) Ces réactifs incluent - les énones (référence 15) qui réagissent très lentement avec les composés nucléophiles azotés ou oxygénés, mais plus rapidement avec les composés nucléophiles soufrés; leur spécificité n'est jamais totale vis-à-vis des groupements thiols; leur sensibilité, quant à elle, est variable selon le réactif considéré; elles présentent généralement les mêmes inconvénients majeurs que les réactifs précédents; - les vinylpyridines qui sont des réactifs lents, peu solubles en milieu aqueux, utilisés pour bloquer le groupement SH des mercaptans, en général, et du glutathion (référence 16), en particulier, mais non pour le doser. Il convient enfin de citer deux types de réactifs fluorescents qui sont inadaptés à un dosage de routine pour des raisons de complexité méthodologique et de spécificité limitée vis-à-vis des groupements thiols en général et inexistante vis-à-vis du glutathion, ce sont - l'aldéhyde orthophtalique qui requiert la présence d'un groupement thiol et d'une amine primaire pour fournir un dérivé isoindolique fluorescent (références 17 et 18) ; et - les dérivés du benzoxa-1, 3-diazole, en particulier le 7-chloro-2-benzoxa-l, 3-diazole-4-sulfonate (SBD-Cl) et le 7-fluoro-2-benzoxa-l, 3-diazole-4-sulfonate (SBD-F), qui requièrent un temps de réaction important et un pH alcalin de 9,5 (références 19 et 20). L t invention a pour but de remédier aux inconvénients des méthodes connues de dosage des mercaptans en général et du GSH en particulier en fournissant - des réactifs colorimétriques spécifiques des mercaptans dans des échantillons, notamment biologiques, bruts et susceptibles de permettre un dosage spécifique du GSH en présence de mercaptans contaminants, et rapides, c ' est-à-dire dont le temps de réaction totale avec les mercaptans du milieu soit inférieur à 15 minutes dans les conditions opératoires;; - un procédé d'utilisation de tels réactifs permettant de doser, sur une seule prise d'échantillon, les mercaptans totaux dans une première étape et le GSH réduit dans une seconde étape, ce qui aboutirait à la détermination de trois paramètres physiologiques * la quantité de mercaptans totaux * la quantité de GSH * la quantité de mercaptans distincts du GSH, par différence. L'invention a, en particulier, pour but de mettre au point un procédé simple et rapide de mesure du GSH réduit, adapté à un dosage de routine sur de grandes séries d'échantillons, ce qui implique * la formation d'un chromophore absorbant le plus souvent dans le visible, dont la mesure de l'absorbance ne nécessite pas de spectrophotomètre spécifique * un dosage en point final et non en cinétique * un temps d'incubation court : par exemple inférieur à 30 minutes * des conditions opératoires permettant d'annuler le risque d'autoxydation des groupements thiols pendant la durée du dosage. Ces buts sont atteints grâce à 11 invention qui, selon l'un de ses modes de réalisation, fournit un procédé de dosage des mercaptans dans un échantillon aqueux, notamment biologique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement la formation d'un produit de substitution chromophorique entre tous les mercaptans présents dans l'échantillon et un réactif choisi parmi les composés de type halogénopyridinium répondant à la formule générale I dans laquelle R1 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle, p-nitrobenzyle, phényle ou o,p-dinitrophényle R3 = hydrogène, CF3, NO2, OR5, CH2OR5, COOR5, CoNHR5, CN, p-nitrostyryle, p-nitrophényldiazo, p-N(CH3)2-phényldiazo ou o-nitrobenzamide Y = halogénure, méthylsulfate, fluorosulfonate, phosphate, tétrafluoroborate ou tosylate ; et soit R2 = F, C1, Br, I ou SCN, et R4 = hydrogène, N02 ou p-R6-phényldiazo; soit R2 = hydrogène ou p-R6-phényldiazo, et R4 = F, Cl, Br, I ou SCN avec R5 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle ou phényle, et R6 = OR5 ou N(R5)2, ou parmi les composés de type quinoléinium répondant à la formule générale Il dans laquelle R1 et Y sont définis comme précédemment R7 = hydrogène ou méthyle ; R8 = hydrogène, F, Cl, Br, I ou SCN R9 = hydrogène, F, Cl, NO2 ou CF3 R10 = hydrogène, N02 ou Cl ; R11 = hydrogène, F, Cl, CF3 ou N02 ; et R12 = hydrogène, OH, benzyloxy ou NO2; étant entendu que R8, R9, R10 et R11 ne peuvent représenter simultanément l'hydrogène. Les composés de formules générales I et II cidessus peuvent être préparés par analogie à des procédés connus et notamment comme suit. Les dérivés de la série diazopyridinium peuvent être préparés par diazotation à l'aide d'acide nitreux sur les dérivés aminohalogénopyridiniques correspondants, conduisant aux sels de diazonium correspondants. Ces derniers, instables, se couplent rapidement avec des dérivés aromatiques nucléophiles, tels que par exemple la N,Ndiméthylaniline ou le phénol, conduisant aux dérivés azoïques, qui sont ensuite alkylés selon la procédure générale décrite ci-dessous. Les dérivés de la série halogénopyridinium où R3=CH20R5 sont obtenus par réduction, à l'aide d'hydrure d'aluminium et de lithium, des composés pyridine-3carboxylate de méthyle correspondants, eux-mêmes obtenus par estérification du chlorure d'acide nicotinique substitué correspondant. Comme précédemment, l'alkylation est effectuée selon la procédure générale décrite ci-dessous. Les dérivés de la série halogénopyridinium où R3 = p-nitro-styryle sont obtenus par réaction de Wittig sur le dérivé pyridine-3-carboxaldéhyde correspondant, à l'aide de sels d'halogénotriphénylaryle phosphonium en milieu biphasique, en présence d'agents de transfert de phase. Comme précédemment, l'alkylation est effectuée selon la procédure générale décrite ci-dessous. Les dérivés de la série fluoroquinoléinium sont obtenus par réaction de Schiemann sur les sels de diazonium correspondants. N-alkylation Une procédure générale de la dernière étape de synthèse des composés de formules générales I et II est réalisée comme suit. Au dérivé pyridinique ou quinoléinique (1 mmole) dissous dans 10 volumes d'un solvant organique, comme par exemple l'acétonitrile, est ajouté à 100C l'agent alkylant soit pur, comme par exemple l'iodure de méthyle, soit en solution dans un solvant organique, comme par exemple le tétrafluoroborate de triméthyloxonium (2 mmoles) dans 1 volume d'acétonitrile. Le milieu réactionnel est agité pendant 30 minutes à 2 heures. Le solvant est évaporé sous pression réduite, le résidu est repris par 1 volume d'éther terbutylméthylique, puis essoré, lavé et séché sous vide. Lorsque cela s'avère nécessaire, les produits sont purifiés par chromatographie liquide haute performance (HPLC) préparative sur colonne de silice (C8, 5ru), en éluant par un mélange eau/acétonitrile. Une lyophilisation finale permet d'aboutir aux produits désirés avec des rendements non optimisés compris entre 20 et 97 %. Lorsque cela s'avère approprié, l'alkylation est réalisée dans l'iodure de méthyle au reflux, ou à l'aide de sulfate de méthyle dans l'acétone au reflux ou de fluorosulfonate de méthyle dans un solvant organique, tel que par exemple le glyme, selon le produit final désiré. Les composés de formule générale I dans laquelle R1 à R4 et Y sont définis comme précédemment, étant entendu que - lorsque R3 = hydrogène ou OH et R4 = hydrogène, R2 ne représente pas F, Cl, Br ou I, et - lorsque R2 = hydrogène et R3 = hydrogène ou OH, R4 ne représente pas F, Cl, Br ou I sont nouveaux et constituent l'un des objets de la présente invention. Les composés de formule générale II dans laquelle R1, R7 à R12 et Y sont définis comme précédemment, étant entendu que - lorsque R8 = F, Cl, Br ou I, alors R7, R9, R10, R11 et R12 ne peuvent représenter simultanément H - lorsque R9 = F ou Cl, alors R7, R8r R10, R11 et R12 ne peuvent représenter simultanément H ; - lorsque R10 = Cl, alors R7, R8, R9, R11 et R12 ne peuvent représenter simultanément H ; - lorsque R11 = F ou C1, alors R7, R8, R9, R10 et R12 ne peuvent représenter simultanément H ; et - lorsque R8 = R11 = Cl, alors R7, R9, R10 et R12 ne peuvent représenter simultanément H, sont nouveaux et constituent l'un des objets de la présente invention. Selon un autre mode de réalisation, l'invention fournit un procédé de dosage du glutathion réduit (GSH) dans un échantillon aqueux, notamment biologique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1. former un produit de substitution chromophorique entre tous les mercaptans présents dans l'échantillon et un réactif choisi parmi les composés de formule générale I ou de formule générale II définies ci-dessus ; et 2. amener le pH du milieu réactionnel à une valeur comprise entre 12,8 et 13,8, pour former spécifiquement une thione chromophorique à partir du produit de substitution chromophorique formé à l'étape 1. entre le GSH et ledit réactif. Le principe du dosage du glutathion réduit selon l'invention repose donc sur une stratégie comprenant deux étapes chimiques consécutives - tout d'abord, formation d'un produit de substitution, appelé ci-après "adduit", entre tous les mercaptans (RSH) présents dans l'échantillon, dont notamment le glutathion réduit (GSH), et l'un des réactifs définis cidessus, appelé "réactif BXT", selon la réaction RSH + réactif BXT RS-BXT (chromophore 1) - puis, après alcalinisation du milieu, à pH compris entre 12,8 et 13,8, selon le réactif BXT utilisé, formation, par réaction de ss-élimination, d'une thione chromophorique, spécifique de l'adduit GS-BXT, formé à partir du GSH et du réactif BXT, selon la réaction GS-BXT 13H alcalin3~ thione (chromophore 2). Cette méthode permet de déterminer, au moyen de mesures spectrophotométriques * dans un premier temps, la quantité de mercaptans totaux (RSH) présents dans l'échantillon ; * dans un deuxième temps, la quantité de glutathion réduit (GSH) dans ce même échantillon ; et * par différence, la quantité de mercaptans distincts du glutathion. Cette méthode permet donc d'avoir accès à trois paramètres à l'aide d'une seule prise d'échantillon. L'originalité du procédé de dosage selon l'invention est basée sur une stratégie comprenant une première étape de formation d'un adduit chromophorique entre le réactif BXT et tous les mercaptans présents dans l'échantillon et une seconde étape, après alcalinisation, de formation d'une thione chromophorique, spécifiquement avec l'adduit GSH/réactif BXT. L'utilisation des réactifs et du procédé décrits permet donc de mesurer, sur une seule prise d'échantillon, la quantité globale de mercaptans, en général, et celle du GSH, en particulier, en milieu aqueux, à l'aide d'une double mesure colorimétrique. La simplicité de mise en oeuvre de cette méthode originale est très supérieure à celle des méthodes spectrophotométriques préalablement décrites. La méthode de dosage colorimétrique du GSH qui est décrite ici, est la première qui soit totalement spécifique, en l'absence de tout réactif enzymatique. Cette nouvelle méthode de dosage constitue donc un nouvel outil pour les recherches biologiques en général ainsi qu'en Chimie Clinique, en particulier pour l'élaboration de kits de dosage ou de diagnostic, les physiopathologies potentielles étant par exemple la cataracte, le diabète, la polyarthrite rhumatoïde, l'ischémie. Les échantillons visés sont notamment les érythrocytes, le plasma, les plaquettes sanguines, et d'une façon générale tout échantillon, notamment biologique, contenant des mercaptans et en particulier du GSH. Selon un mode avantageux de mise en oeuvre, l'invention a pour objet un procédé de dosage des mercaptans totaux dans un échantillon aqueux, notamment biologique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1. ajouter à l'échantillon à doser, tamponné dans la gamme de pH 7,0 à 7,5, un aliquot d'une solution-mère, dans l'eau ou dans un solvant miscible à l'eau, d'un réactif BXT de formule générale I ou II en excès, 2. homogénéiser le milieu réactionnel ainsi obtenu, 3. laisser incuber pendant au moins 5 minutes, 4. mesurer, à l'aide d'un spectrophotomètre, l'absorbance du ou des produit(s) de substitution ou adduit(s) formé(s) entre le réactif BXT et le ou les mercaptan(s) présent(s) dans l'échantillon et 5. déterminer la concentration en moles/litre des mer captans totaux présents dans l'échantillon, selon la formule [mercaptans totaux] = (A/m x d) x D dans laquelle - A représente l'absorbance mesurée, - em représente le coefficient d'extinction molaire spécifique du réactif BXT utilisé, exprimé en l.mole-1.cm-l, - d représente la longueur de la cuve, exprimée en cm, et - D représente le coefficient de dilution. Selon un autre mode avantageux de mise en oeuvre, l'invention a pour objet un procédé de dosage du glutathion réduit GSH dans un échantillon aqueux, notamment biologique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1. ajouter à l'échantillon à doser, tamponné dans la gamme de pH 7,0 à 7,5, un aliquot d'une solution-mère, dans l'eau ou dans un solvant miscible à l'eau, d'un réactif BXT de formule générale I ou II en excès, 2. homogénéiser le milieu réactionnel ainsi obtenu, 3. laisser incuber pendant au moins 5 minutes, 4. ajuster le pH du mélange à une valeur comprise entre 12,8 et 13,8, selon le réactif BXT choisi, 5. laisser incuber pendant au moins 15 minutes, 6. mesurer, à l'aide d'un spectrophotomètre, l'absorbance de la thione chromophorique produite par ss-élimination, spécifiquement avec l'adduit GSH-réactif BXT et 7. déterminer la concentration en moles/litre du GSH dans l'échantillon, selon la formule [GSH] = (A'/Em x d) x D dans laquelle - A' représente l'absorbance mesurée, - em représente le coefficient d'extinction molaire spécifique du réactif BXT utilisé, exprimé en 1 mole-1. cm-1, - d représente la longueur de la cuve, exprimée en cm, et - D représente le coefficient de dilution. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, on détermine la concentration des mercaptans distincts du glutathion réduit présents dans l'échantillon, au moyen de la différence des concentrations mesurées selon les deux procédés définis ci-dessus, c'est-àdire en utilisant la formule [mercaptans distincts du GSH] = [mercaptans totaux] - [GSH]. Le dosage des mercaptans totaux, du glutathion réduit et des mercaptans autres que le GSH dans un échantillon aqueux, notamment biologique, à l'aide des nouveaux réactifs de formules générales I et II, repose donc sur la mesure spectrophotomètrique de la formation des nouveaux chromophores 1 et 2, produits respectivement au cours de chacune des deux réactions constituant cette méthode originale. Des méthodes générales qui peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre de ces déterminations sont expliquées plus en détail ci-après. Dosage des mercaptans totaux Le milieu réactionnel est constitué par un tampon de pH = 7,0 à 7,5, comme, par exemple, un tampon phosphate 50 mM, contenant de l'acide diéthylènetriaminepentacétique (DTPA) 1 mM. Selon la nature du tampon considéré, une addition de soude ou d'acide chlorhydrique, à température ambiante, permet d'ajuster le pH à la valeur désirée. La température de travail choisie, par exemple 250C, doit être maintenue constante (+10C) durant les temps d'incubations et de mesures. Les solutions tampons et de réactifs doivent être préparées extemporanément et peuvent être conservées entre 0 et 40C, au moins pendant 8 heures. Le rapport concentration en réactif BXT/concentration en mercaptans estimée doit être supérieur à 10 et ne dépasse en général pas 1000, pour garantir des temps réactionnels courts. La réaction est déclenchée par l'ajout, par exemple dans une cuve pour spectrophotomètre contenant l'échantillon à doser, d'un aliquot d'une solution-mère du réactif BXT dans l'eau ou dans un solvant organique miscible à l'eau, tel que par exemple l'éthanol, l'acétonitrile, le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde. Le volume réactionnel final, par exemple 1 ml, ne doit pas varier d'une mesure à l'autre. Après homogénéisation de la solution et incubation pendant 5 à 10 minutes à la température de travail choisie, l'absorbance à la longueur d'onde de l'adduit ou des adduits est mesurée: par exemple à 356 nm pour l'adduit entre le composé BXT 03015 selon l'invention, décrit dans la partie expérimentale qui suit, et le GSH. Le tableau I qui suit contient, à titre d'exemples, les données spectrophotométriques obtenues avec le réactif BXT 03015 et un certain nombre de mercaptans physiologiques ou susceptibles d'être utilisés en biochimie ou en Chimie Clinique. TABLEAU I Données spectrales des chromophores obtenus par réaction entre le réactif BXT 03015 et quelques mercaptans, avant et après alcalinisation AVANT APRES alcalinisation Mercaptans Adduit de BXT 03015 hmax (nm) , hmax (nm) m(1.mole-1.cm-l) m(1.mole-1.cm-l) Glutathion 356,16000 thione : 400,14700 DL-Pénicillamine 354,16000 adduit : 358,15000 N-Acétyl-L-cystéine 358,15000 hydrolyse:329,10500 Mercaptosuccinate 362,15000 hydrolyse:329,10800 Cystéine 352,18500 adduit : 356,18400 Homocystéine 352,15000 adduit : 356,14000 2-Mercaptopyridine 345,14500 hydrolyse:327,13000 Diéthyldithio- 279,13000 hydrolyse:329,10400 carbamate Captopril 359,14000 hydrolyse:329,10300 Thio--D-glucose 341,14000 hydrolyse:329,10700 Cystéinylglycine 350,16000 adduit:355,13000 Coenzyme A 359,16000 hydrolyse:329,8000 Sérum Albumine (*) 345,12500 (**) bovine (*) Il ne se forme que 0,50 équivalent d'adduit (voir référence 23). (**) Le spectre d'absorption est similaire à celui obtenu avant alcalinisation. La quantification des mercaptans totaux est réalisée comme indiqué plus haut. La sensibilité du dosage a été déterminée à partir d'une gamme étalon en certains mercaptans physiologiquement importants. Elle est, par exemple pour le GSH, égale à 0,017 UA.l.Rmole-1 avec le réactif BXT 03015, comme cela ressort de l'examen de la figure 1 des dessins annexés (UA = unités d'absorbance). La figure 1 représente les variations de l'absorbance à 356 nm de l'adduit formé entre le réactif BXT 03015 et le GSH, la N-acétylcystéine, la cystéine et la cystéinyl-glycine, respectivement, en fonction de la concentration micromolaire en mercaptans. On constate que l'absorbance varie de façon linéaire en fonction de cette concentration et que la sensibilité du dosage est égale à 0,017 UA.l.Amole-1, pour le GSH. Dosage du alutathion réduit Le même mélange réactionnel, utilisé précédemment pour le dosage des mercaptans totaux, est réutilisé pour le dosage du glutathion réduit. Ce mélange est ajusté à une valeur de pH = 13,5 par l'addition d'une solution alcaline concentrée, comme par exemple une solution de soude à 30 %, à la température de travail choisie, par exemple 250C. Après 15-20 minutes d'incubation dans ces mêmes conditions, l'absorbance de l'unique produit de ss-élimination de l'adduit entre le GSH et le réactif BXT, est mesurée à la longueur d'onde définie pour le réactif BXT considéré, par exemple 400 nm pour le réactif BXT 03015. Le tableau II qui suit contient les données spectrophotométriques obtenues avec quelques réactifs selon l'invention et le GSH. TABLEAU II Données spectrales des chromophores obtenus par réaction entre le GSH et quelques réactifs BXT dont la préparation est décrite dans la partie expérimentale qui suit, avant et après alcalinisation AVANT APRES alcalinisation REACTIF BXT Adduit Thione NO Xmax(nm) Xmax(nm) Xmax(nm) m(1.mole-1.cm-l) m(l.mole-1.cm-l) m(l.mole-1.cm-l) BXT 03012 232-259 300 328 (ex.1) 12000-4000 20000 18000 BXT 03015 315 356 400 (ex.7) 8000 16000 14700 BXT 03016 321 339 381 (ex.8) 12000 15000 16000 BXT 03034 319 346 388 (ex.9) 9000 15000 18000 BXT 03065 326 343 393 (ex.l1) 9000 17000 20000 BXT 03069 312 414 520 (ex.15) 5400 6000 2500 La sensibilité du dosage est déterminée à partir d'une gamme standard de concentrations en GSH, et est égale par exemple à 0,010 UA.l.Rmole-1 avec le réactif BXT 03015, comme cela résulte de la figure 3 des dessins annexés. La figure 2 représente les variations de l'absorbance ou densité optique (D.O.) à 356 nm de l'adduit formé entre le GSH et le réactif BXT 03015, avant alcalinisation, en fonction de la concentration (micromolaire) en GSH. On constate que l'absorbance varie de façon linéaire en fonction de la concentration en GSH. Cette figure montre en outre la sensibilité du dosage. La figure 3 représente les variations de l'absorbance ou densité optique (D.O.) à 400 nm de la thione formée à partir de l'adduit GSH/réactif BXT 03015, après alcalinisation, en fonction de la concentration (micromolaire) en GSH. On constate que l'absorbance varie de façon linéaire en fonction de la concentration en GSH. Cette figure montre en outre la sensibilité du dosage. L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre des procédés selon l'invention définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement, en tant que réactif, un composé de formule générale I ou II. L'invention sera expliquée plus en détail à l'aide des exemples non limitatifs donnés dans la partie expérimentale qui suit. PARTIE EXPERIMENTALE I. Synthèse de réactifs de type halogénopyridinium Exemple 1 : Tétrafluoroborate de 4-chloro-1 methylpyridinium (BXT 03012). Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation à 200C, 6,66 mmoles de chlorhydrate de 4chloropyridine (JANSSEN) dans 5 ml d'eau et 10 ml d'éther éthylique. Une solution molaire d'hydrogénocarbonate de sodium (7 mmoles) est ajoutée en 10 minutes. Le milieu biphasique est décanté, la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et filtrée. Au filtrat à 100C, sont additionnés 5 ml d'acétonitrile puis, lentement en 10 minutes, une solution de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (7,0 mmoles; LANCASTER). L'agitation est maintenue pendant 30 minutes dans ces conditions. Le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est agité dans 20 ml de 2-propanol pendant 1 heure, essoré et séché sous vide pendant 2 heures. 3,66 mmoles d'un produit cristallisé blanc sont obtenues; rendement 55 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3-N+ : 4,50 ppm (s, 3H); H3 et H5 : 8,25 ppm (d, 2H, J = 7,5 Hz); H2 et H6 : 9,00 ppm (d, 2H, J = 10 Hz). *SM : FAB, glycérol-NOBA ion positif : M+ : 128 ion négatif : M- : 87 FAB = bombardement par atomes rapides (Fast Atom Bombardment) NOBA : alcool méta-nitrobenzylique *Microanalyse Calculé (%) : C = 33,4; H = 3,2; N = 6,5; Cl = 16,5. Trouvé (%) : C = 33,5; H = 3,0; N = 6,6; Cl = 16,7. Exemple 2 : Tétrafluoroborate de 2-bromo-4-r4'-(N N- diméthylamino)phénylazo]-1-méthylpyridinium (BXT 03044). 2-Bromo-4-[4l-(N,N-dimAthylamino)phinylazo]-pyri- dine: Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout, sous agitation à OOC, 7,75 mmoles de 2-bromo-4-aminopyridine (références 21 et 22) dans 4 ml d'acide tétrafluoroborique à 34 %. 8 mmoles de nitrite de sodium dans 3 ml d'eau sont ajoutées en 10 minutes à 0 C. L'agitation est maintenue pendant 1 heure. Une solution de 7,75 mmoles de N,Ndiméthylaniline dans 2 ml d'acide tétrafluoroborique à 34 % est additionnée en 30 minutes, en maintenant la température du milieu réactionnel entre 0 C et 50C. A la fin de l'addition, le pH est amené à 8,0 par adjonction de carbonate de sodium solide. La solution est extraite à l'acétate d'éthyle (5x10 ml).La phase organique est lavée par une solution d'eau saturée en chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium et évaporée sous vide. Le résidu brut est purifié par chromatographie rapide (flashchromatographie) préparative sous moyenne pression (1 à 2 bars) sur 200 g de silice GeduranX [MERCK, 40-63 Zm (230-400 mesh)], en éluant par un mélange chlorure de méthylèneacétate d'éthyle (95/5). Après évaporation du solvant sous pression réduite, le produit désiré, de couleur rouge vif, est obtenu avec un rendement de 20 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) N-(CH3)2 : 3,20 ppm (s,6H); H3 et H5r : 6,85-6,95 ppm (d, 2H, J = 10 Hz); H5 : 7,65 ppm (d, 1H, J = 5 Hz); H3 : 7,80 ppm (s, 1H); H2 et H6' : 7,85-7,95 ppm (d, 2H, J = 10 Hz); H6 : 8,50 ppm (d, 1H, J = 5 Hz). Tétrafluoroborate de 2-bromo-4-(4 T- (N,N-diméthyl- amino)phénylazo]-1-méthylpyridinium (BXT 03044) Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre et sous courant d'azote, on dissout sous agitation à 100C, 1,47 mmoles de 2-bromo-4[4'-(N,N diméthylamino)phénylazo]pyridine dans 5 ml d'acétonitrile. Une solution de 1,47 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 1 heure et le solvant est évaporé sous vide. Le produit brut est purifié par HPLC préparative sur colonne [C8, 5 m, L = 250 mm, diamètre intérieur (DI) = 10,5 mm], en éluant par un mélange acétonitrile-eau (40/60). Après lyophilisation, le produit désiré (1,17 mmoles) est obtenu avec un rendement de 75 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) N-(CH3)2 : 3,35 ppm (s, 6H); CH3-N+ : 4,55 ppm (s, 3H); H3 et Hg' : 7,00-7,10 ppm (d, 2H, J = 10 Hz); H2 et H6 : 7,97-8,05 ppm (d, 2H, J = 10 Hz); H5 : 8,12 ppm (d, 1H, J = 7,5 Hz); H3 : 8,40 ppm (s, 1H); H6 9,10 ppm (d, 1H, J = 7,5 Hz). *SM (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 321 ion négatif : M- : 87. Exemple 3 : Têtrafluoroborate de 2-brozno-4- droxyphénylazo)-1-méthylpyridinium (BXT 03057). 2-Bromo-4-(4'-hydroxyphénylazo)pyridine : Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, d'une barrière d'azote, on dissout sous agitation à OOC, 5,78 mmoles de 2-bromo-4-aminopyridine dans 4 ml d'acide sulfurique (d = 1,84). Une solution de 6 mmoles de nitrite de sodium (ALDRICH) dans 3 ml d'eau est ajoutée en 10 minutes à 0 C et l'agitation est maintenue 1 heure dans ces conditions. Une solution de 5,8 mmoles de phénol (JANSSEN) dans 5 ml d'eau est ajoutée en 30 minutes à OOC. Après 1 heure d'agitation de 0 C à 200C, le pH de la solution est amené à 6 par du carbonate de sodium solide. Le milieu réactionnel est extrait par 5 fois 10 ml d'acétate d'éthyle, la phase organique est lavée par une solution d'eau saturée en chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium, et le solvant est évaporé sous vide à l'évaporateur rotatif. Le produit brut est cristallisé dans 10 ml d'éther éthylique, essoré, lavé par 3 fois 2 ml d'éther éthylique et séché sous vide pendant 1 heure. Le produit cristallisé, de couleur marron, est obtenu avec un rendement de 32 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) H3 et Hst : 7,0 ppm (d, 2H, J = 4,5 Hz); Hs : 7,85 ppm. (d, 1H, J = 2 Hz); H3 : 7,95 ppm (s, 1H); H2 et H6 : 8,05 ppm (d, 2H, J = 4,5 Hz); H6 : 8,20 ppm (d, 1H, J = 2 Hz). Tétrafluoroborate de 2-bromo-4- (4 '-hydroxyphényl- azo)-1-mAthylpyridinium (BXT 03057) Le produit désiré est obtenu par méthylation de la 2-bromo-4- (4' -hydroxyphénylazo) pyridine selon la procédure générale de N-alkylation décrite plus haut et purifié par HPLC préparative sur colonne de silice greffée C8 avec un éluant acétonitrile-eau (60/40). Le produit désiré est obtenu, après lyophilisation, avec un rendement de 75 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3N+ : 4,60 ppm (s, 1H); H3 et H5T : 7,10 ppm (d, 2H, J = 10 Hz); H2 et H6 : 8,00 ppm (d, 2H, J = 10 Hz); H5 : 8,30 ppm (m, 1H); H3 : 8,70 ppm (s, 1H); H6 9,30 ppm (m, 1H); H mobile : 10,1 ppm (s large, 1H). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 292 ion négatif : M- : 87. Exemple 4 : Tétrafluoroborate de 2-chloro-3-tri zluorométhyl-1-méthylpyridinium (BXT 03019). Le produit désiré est obtenu par méthylation de la 2-chloro-3-trifluorométhylpyridine selon la procédure générale de N-alkylation décrite plus haut et recristallisé dans du 2-propanol. Rendement 85 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3N+ : 4,70 ppm (s, 3H); H5 : 8,40 ppm (dd, 1H, J = 10-7,5 Hz); H4 : 9,10 ppm (d, 1H, J = 10 Hz); H6 9,45 ppm (d, 1H, J = 7,5 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 196 ion négatif : M- : 87. *Microanalyse Calculé (%) : C = 29,6 ; H = 2,1 ; N = 4,9 Trouvé (%) : C = 29,8 ; H = 2,2 ; N = 5,1. Exemple 5 : Iodure de 2-chloro-3-hydroxyméthyl-N- méthylpyridinium (BXT 030488. 2-Chloropyridine-3-carboxylate de méthyle Dans un tricol de 250 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, d'une barrière d'azote, on dissout à 200C, 56 mmoles de triéthylamine (OSI) dans 20 ml d'alcool méthylique séché sur siliporite NK 30. En 15 minutes à OOC, on ajoute 56 mmoles de chlorure d'acide 2-chloronicotinique (LANCASTER). L'agitation est maintenue à OOC pendant 2 heures et le mélange réactionnel est amené à sec à l'évaporateur rotatif. Le produit brut est repris par 100 ml d'acétate d'éthyle et 50 ml d'eau. La phase organique est décantée, lavée par une solution d'eau saturée en chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium, et le solvant est évaporé à 1 'évaporateur rotatif. On obtient le produit désiré avec 87 % de rendement, sous forme d'une huile orangée qui est utilisée sans traitement supplémentaire pour la réaction suivante. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CDCl3) OCH3 : 4,0 ppm (s, 3H); Hg : 7,40 ppm (dd, 1H, J = 3-6 Hz); H4 : 8,20 ppm (d, 1H, J = 6 Hz); H6 : 8,55 ppm (d, 1H, J= 3 Hz). 2-Chloro-3-hydroxyméthylpyridine : Dans un tricol de 250 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, d'une barrière d'azote, on met en suspension à 200C, 49 mmoles d'hydrure d'aluminium et de lithium dans 20 ml de tétrahydrofuranne fraîchement distillé. En 15 minutes à 200C, on ajoute 49 mmoles de 2chloropyridine-3-carboxylate de méthyle, sous agitation. L'agitation est maintenue à 200C pendant 2 heures, 10 ml d'acétate d'éthyle sont ajoutés très lentement et le mélange réactionnel est filtré sur célite et lavé par 100 ml d'eau. Le filtrat est extrait par 2 fois 20 ml d'acétate d'éthyle, la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et le solvant est évaporé à l'évaporateur rotatif. Le produit brut est purifié par "flashchromatographie" préparative sous moyenne pression (1 à 2 bars) sur 600 g de silice Gedurans tMERCK, 40-63 m (230-400 mesh)], en éluant par un mélange de chlorure de méthylène/acétate d'éthyle (80/20). L'évaporation des fractions intéressantes donne le produit désiré, solide blanc, avec un rendement de 36 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CDC13) OCH2 : 4,80 ppm (s, 2H); H5 : 7,30 ppm (dd, 1H, J = 4-7 Hz); H4 : 7,90 ppm (d, 1H, J = 7 Hz); H6 : 8,20 ppm (d, 1H, J = 4 Hz). *SM : (IE, 70eV) M+ : 143 (55); 108 (72); 78 (100); 51 (86) IE = impact électronique. Iodure de 2-chloro-3-hydroxyméthyl-N-méthylpyri- minium (BXT 03048) Dans un ballon en forme de poire de 50 ml, muni d'une agitation magnétique, d'un thermomètre et d'un réfrigérant à carboglace surmonté d'une barrière d'azote, on dissout 3,5 mmoles de 2-chloro-3-hydroxyméthylpyridine dans 5 ml d'acétonitrile contenant 20 ml d'iodure de méthyle (LANCASTER), sous agitation. L'agitation est maintenue 4 heures au reflux et 18 heures à 200C. Le mélange réactionnel est concentré sous vide, le produit est essoré, lavé à l'éther éthylique et séché sous vide. On obtient le produit désiré sous forme de cristaux beiges, avec 70 % de rendement. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, D2O) CH2 : 4,45 ppm (s, 2H); CH3-N+ : 4,85 ppm (s, 3H); 7,86-8,00 ppm (dd, 1H, J = 9,6-7,2 Hz); H4 8,60 ppm (d, 1H, J = 9,60 Hz); H6 : 8,76 ppm (d, 1H, J = 7,2 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 158 ion négatif : M- : 127. Exemple 6 : Méthylsulfate de 2-chloro-3-hydroxy-1 méthylRyridinium (BXT 03049). Dans un ballon en forme de poire de 50 ml, muni d'une agitation magnétique, d'un thermomètre et d'une barrière d'azote, on dissout 7,72 mmoles de 2-chloro-3hydroxypyridine (LANCASTER) dans 5 ml d'acétone contenant 3 ml de sulfate diméthylique (JANSSEN), sous agitation. L'agitation est maintenue 2 heures au reflux. Le mélange réactionnel est amené à sec sous vide à l'évaporateur rotatif, le produit brut est repris par 30 ml d'éther terbutylméthylique, essoré, lavé à l'éther terbutylméthylique et séché sous vide. On obtient le produit désiré, sous forme de cristaux blancs, avec 77 % de rendement. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3 du méthylsulfate : 3,40 ppm (s, 3H); CH3-N+ : 4,30 ppm (s, 3H); H5 : 7,90 ppm (m, 1H); H4 : 8,10 ppm (d, 1H, J = 8 Hz); H6 : 8,70 ppm (d, 1H, J = 3 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 144 ion négatif : M- : 111. *Microanalyse Calculé (%) : C = 32,8 ; H = 3,9; N = 5,4; S = 12,0; Cl = 13,8 Trouvé (%) : C = 29,8; H = 2,2; N = 5,1; S = 13,3; Cl = 14,2. II. Synthèse de réactifs de type halogénoquinoléinium Exemple 7 Tétrafluoroborate de 4-chloro-7-tri fluoromethyl-1-méthy1auinolinium (BXT 03015). Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 2,15 mmoles de 4-chloro-7-trifluorométhylquinoléine (ALDRICH) dans 5 ml d'acétonitrile. A 100C, une solution de 4,30 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 1 heure et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est repris par 50 ml d'éther terbutylméthylique, essoré et séché sous vide pendant 2 heures. Le produit brut est purifié par HPLC préparative sur colonne (Cg, 5 llm, L = 250 mm, DI = 10,5 mm), en éluant par un mélange acétonitrile-eau (20/80) . Après lyophilisation, le produit désiré (1,7 moles) est obtenu. Rendement 77 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3-N+ : 5,00 ppm (s, 3H); H6 : 8,45 ppm (dd, 1H, J = 1,9-9,5 Hz) ; H3 : 8,60 ppm (d, 1H, J = 7,14 Hz); H5 8,95 ppm (d, 1H, J = 9,50 Hz); H8 : 9,10 ppm (s, 1H); H2 : 9,70 ppm (d, 1H, J = 7,14 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 246 ion négatif : M- : 87. *Microanalyse Calculé (%) : C = 39,6 ; H = 2,4 ; N = 4,2 ; Cl = 10,6 Trouvé (%) : C = 39,4 ; H = 2,2 ; N = 4,0 ; Cl = 10,2. Exemple 8 : l'étrafluoroborate de 4-chloro-1 2- diméthyîauinoléinium (BXT 03016). Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 2,0 mmoles de 4-chloro-2-méthylquinoléine (ALDRICH) dans 5 ml d'acétonitrile. A 100C, une solution de 4,0 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 1 heure et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est repris par 50 ml d'éther terbutylméthylique, essoré et séché sous vide pendant 2 heures. Le produit brut est purifié par HPLC préparative sur colonne (C8, 5 Wm, L = 250 mm, DI = 10,5 mm), en éluant par un mélange acétonitrile-eau (20/80). Après lyophilisation, le produit désiré (0,8 mmole) est obtenu. Rendement : 38 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3 : 3,2 ppm (s, 3H); CH3-N+ : 4,70 ppm (s, 3H); H7 8,10 ppm (dd, 1H, J = 8-6,5 Hz); H6 : 8,30 ppm (dd, 1H, J = 8-6,5 Hz); H3 : 8,40 ppm (s, 1H); Hs : 8,60 ppm (d, 1H, J = 8 Hz); H8 : 8,70 ppm (d, 1H, J = 8 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 192 ion négatif : M- : 87. *Microanalyse Calculé (%) : C = 47,2 ; H = 3,9 ; N = 5,0 ; Cl = 12,7 Trouvé (%) : C = 47,3 ; H = 3,9 ; N = 4,9 ; Cl = 13,0. Exemple 9 : Tetrafluoroborate de 4-chloro-1-méthyl quinoléinium (BXT 03034). Dans un ballon de 100 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 3,17 mmoles de 4-chloroquinoléine (ALDRICH) dans 10 ml d'acétonitrile. A température ambiante, une solution de 6,30 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 30 minutes et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est repris par 10 ml de 2-propanol et agité 10 minutes. Le précipité est filtré, lavé par 50 ml d'éther terbutylméthylique, essoré et séché sous vide pendant 2 heures. Après recristallisation dans un mélange éther terbutylméthylique/2-propanol (1/1), le produit désiré (1,5 mmoles) est obtenu. Rendement 84 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3-N+ : 4,45 ppm (s, 3H); H3 : 8,20 ppm (d, 1H, J = 7,5 Hz); H6 et H7 : 8,40 ppm (m, 2H); H5 et H8 : 8,70 ppm (dd, 2H, J = 8-1,8 Hz); H2 : 9,5 ppm (d, 1H, J = 7,5 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 178 ion négatif : M- : 87. Exemple 10 : Tetrafluoroborate de 7-chloro-1.2 diméthylauinoléinium (BXT 03064). Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 2,0 mmoles de 7-chloro-2-méthylquinoléine (ALDRICH) dans 5 ml d'acétonitrile. A 100C, une solution de 2,60 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 1 heure 30 et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est repris par 50 ml d'éther terbutylméthylique, essoré et séché sous vide pendant 2 heures. Après recristallisation dans un mélange éther terbutylméthylique/2-propanol (1/1), le produit désiré (1,5 mmoles) est obtenu. Rendement : 76 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3 : 3,20 ppm (s, 3H); CH3-N+ : 4,65 ppm (s, 3H); H6 8,00 ppm (dd, 1H, J = 8,8-1,6 Hz); H3 : 8,12 ppm (d, 1H, J = 8 Hz); Hs : 8,45 ppm (d, 1H, J = 8,8 Hz) ; H8 8,72 ppm (d, 1H, J = 1,8 Hz); H4 : 9,12 ppm (d, 1H, J = 8 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 192 ion négatif : M- : 87. *Microanalyse : Calculé (%) : C = 47,2 ; H = 3,9 ; N = 5,0 ; Cl = 12,7 Trouvé (%) : C = 47,0 ; H = 3,8 ; N = 5,1 ; Cl = 12,5. Exemple 11 TQt : Tétrafluoroborate de 4.7-dichloro-1- méthylguinoléinium (BXT 03065). Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 2,0 mmoles de 4,7-dichloroquinoléine (ALDRICH) dans 5 ml d'acétonitrile. A 100C, une solution de 2,60 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 1 heure et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est repris par 50 ml d'éther terbutylméthylique, essoré et séché sous vide pendant 2 heures. Après recristallisation dans un mélange éther terbutylméthylique/2-propanol (1/1), le produit désiré (1,4 mmoles) est obtenu. Rendement : 70 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, D2O) CH3-N+ : 7 ppm (s, 3H); H6 : 10,49 ppm (dd, 1H, J = 9 2,2 Hz); H3 : 10,58 ppm (d, 1H, J = 6,7 Hz); H8 : 10,94 ppm (d, 1H, J = 2,1 Hz); H5 : 11,2 ppm (d, 1H, J = 9 Hz); H2 : 11,56 ppm (d, 1H, J = 6,5 Hz). *SM : (FAB, glycéro-NOBA) ion positif : M+ : 212 ion négatif : M- : 87. *Microanalyse Calculé (%) : C = 40,0 ; H = 2,6 ; N = 4,6 ; Cl = 23,6 Trouvé (%) : C = 41,1 ; H = 2,4 ; N = 4,8 ; Cl = 23,6. Exemple 12 : Tetrafluoroborate de 5-chloro-8 hydroxy-1-mAthylquinoléinium (BXT 03066). Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 2,0 mmoles de 5-chloro-8-hydroxyquinoléine (ALDRICH) dans 5 ml d'acétonitrile. A 100C, une solution de 2,40 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 30 minutes et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est repris par 50 ml d'éther Hz éther terbutylméthylique, essoré et séché sous vide pendant 2 heures. Après recristallisation dans un mélange éther terbutylméthylique/2-propanol (1/1), le produit désiré (1,4 mmoles) est obtenu. Rendement 70 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3-N+ : 5,05 ppm (s, 3H); H7 : 7,65 ppm (d, 1H, J = 8,6 Hz); H6 : 7,95 ppm (d, 1H, J = 8,6 Hz); H3 : 8,20 ppm (dd, 1H, J = 5,7-2,3 Hz); H4 : 9,35 ppm (d, 1H, J = 5,7 Hz); H2 : 9,40 ppm (d, 1H, J = 2,3 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 194 ion négatif : M- : 87. Exemple 13 : Trétrafluoroborate de 5-chloro-8- benzyloxy-1-méthylquinoléinium (BXT 03063). 5-Chloro-8-benzyloxyquinoléine Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation et d'un thermomètre, on dissout sous agitation 10,0 mmoles de 5-chloro-8-hydroxyquinoléine (ALDRICH) dans 20 ml de DMF- sec. Puis on ajoute 11 mmoles de carbonate de potassium et 10 % en poids d'iodure de potassium. Une solution de 11 mmoles de chlorure de benzyle (JANSSEN) dans 5 ml de DMF est additionnée goutte à goutte en 5 minutes à température ambiante et sous agitation. Après 18 heures de réaction à 500C, le mélange réactionnel, additionné de 100 ml d'eau, est extrait par 4x50 ml d'éther terbutylméthylique. Les phases organiques sont rassemblées, puis lavées par 3x50 ml d'HCl 1N. Les phases aqueuses sont rassemblées, alcalinisées à pH = 9 et extraites par 2x50 ml d'acétate d'éthyle. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré est obtenu après recristallisation dans de ltéthanol. Rendement:79,5 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH2O : 5,35 ppm (s, 2H); 7,22-7,45 ppm (m, 4H); 7,55-7,70 ppm (m, 4H); H4 : 8,53 ppm (d, 1H, J = 5,2 Hz); H2 : 8,95 ppm (d, 1H, J = 2,1 Hz). Tétrafluoroborate de 5-chloro-8-benzyloxy-l-méthyl- quinoléinium (BXT 03063) Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 10,0 mmoles de 5-chloro-8-benzyloxyquinoléine dans 5 ml d'acétonitrile. A 100C, une solution de 23,0 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 1 heure et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est repris par 50 ml d'éther terbutylméthylique, essoré et séché sous vide pendant 2 heures. Le produit brut est purifié par HPLC préparative sur colonne (C8, 5 Clam, L = 250 mm, DI = 10,5 mm), en éluant par un mélange acétonitrile-eau (20/80) . Après lyophilisation, le produit désiré (2,0 mmoles) est obtenu. Rendement : 21 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3-N+ : 5,00 ppm (s, 3H); CH20 : 5,55 ppm (s, 2H); H2, H4' et H6t : 7,45 ppm (m, 3H); H3 et H5r : 7,75 ppm (m, 2H); H7 : 7,95 ppm (d, 1H, J = 10 Hz); H6 8,15 ppm (d, 1H, J = 10 Hz), H3 : 8,35 ppm (t, 1H, J = 11,2 Hz); H2 et H4 : 9,5 ppm (d, 2H, J = 11,4 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 284 ion négatif : M- : 87. Exemple 14 : Tétrafluoroborate de 5-fluoro-1-mAthyl- guinoléinium (BXT 03068). 5-Fluoroquinoléine Dans un tricol de 100 ml muni d'une agitation et d'un thermomètre, on dissout à température ambiante 13,7 mmoles de 5-aminoquinoléine (ALDRICH) dans 20 ml d'éthanol. Une solution d'acide tétrafluoroborique à 34 % est ajoutée en 5 minutes. Le mélange réactionnel est refroidi à -50C et 36,0 mmoles de nitrite d'isoamyle (JANSSEN) sont ajoutées en 10 minutes à cette température. A la fin de l'addition, le milieu réactionnel est maintenu à OOC sous agitation pendant 1 heure. La suspension obtenue est filtrée, le solide est lavé par 3x20 ml d'éthanol absolu et 3x20 ml d'éther éthylique, puis séché sous vide pendant 18 heures. Le sel de diazonium ainsi obtenu avec un rendement de 85,7 % est utilisé tel quel pour l'étape suivante. Dans un tricol de 250 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre et d'un réfrigérant ascendant, lui-même équipé d'un bulleur à huile, le sel de diazonium obtenu précédemment est mis en suspension dans 100 ml d'heptane anhydre et chauffé au reflux pendant 3 heures, sous agitation. Le mélange réactionnel est refroidi et additionné d'une solution de soude 1N (100 ml). La phase organique est décantée, lavée par 2x100 ml de cette même solution de soude, puis par 2x100 ml d'eau saturée en NaCl et séchée sur MgSO4. Le solvant est évaporé sous vide à l'évaporateur rotatif. Le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice GeduranB: éluant CH2Cl2. Rendement 35 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CDC13) H6 : 7,26-7,40 ppm (ddd, 1H, J = 1-6,8-9,7 Hz); H3 7,54-7,64 ppm (dd, 1H, J = 4,8-10 Hz); H7 : 7,67-7,79 ppm (ddd, 1H, J = 4-6,8-8 Hz); H8 : 7,88 ppm (dd, 1H, J = 1-8 Hz); H4 : 8,45 ppm (dd, 1H, J = 2-10 Hz); H2 8,95 ppm (dd, 1H, J = 2-4,8 Hz). *SM : (IE, 70eV) M+ : 147(100); 120(21); 99(10); 74(14). Tétrafluoroborate de 5 -f luo ro -1 -méthylquinoléinium (BXT 03068) Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 10,0 mmoles de 5-fluoroquinoléine dans 5 ml d'acétonitrile. A 100C, une solution de 23,0 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 1 heure et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est repris par 50 ml d'éther terbutylméthylique, essoré et séché sous vide pendant 2 heures. Le produit désiré est recristallisé dans un mélange éther terbutylméthylique/2-propanol (1/1). Rendement : 50 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3-N+ : 4,90 ppm (s, 3H); H3 : 7,85 ppm (dd, 1H, J = 9,5-12 Hz); H6 et H7 : 8,25-8,40 ppm (m, 2H); H8 : 8,48 ppm (d, 1H, J = 12,3 Hz); H4 : 9,45 ppm (d, 1H, J = 12 Hz); H2 : 9,65 ppm (d, 1H, J = 9,5 Hz). *SM : (IE, 70eV) M+ : 162(80); 147(100); 120(48); 99(21); 74(20). Exemple 15 Fluorosulfonate de 5-fluoro-8-nitro-1- méthylquinoléinium (BXT 03069). 5-Fluoro-8-nitroquinol8ine Dans un tricol de 100 ml, muni d'une agitation et d'un thermomètre, on introduit une solution de 20,0 mmoles de 5-fluoroquinoléine dans 10 ml d'acide sulfurique concentré (d = 1,84). En maintenant la température à OOC, 5 ml d'acide nitrique fumant sont additionnés goutte à goutte, sous agitation. Le mélange réactionnel est maintenu à 200C pendant 10 minutes, puis versé lentement sur de la glace (100 g). Le mélange réactionnel est amené à pH = 8 par addition lente de soude concentrée. Le précipité ainsi obtenu est extrait par 100 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par 2x50 ml d'eau et séchée sur MgSO4. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice Geduran: éluant CH2Cl2. Rendement 67 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CDCl3) H6 : 7,27 ppm (dd, 1H, J = 8,58-8,64 Hz); H3 : 7,62 ppm (dd, 1H, J = 8,60-4,20 Hz); H7 : 8,10 ppm (dd, 1H, J = 8,56-5,22 Hz), H4 : 8,48 ppm (dd, 1H, J = 2,5-8,6 Hz); H2 : 9,12 ppm (dd, 1H, J = 2,5-4,2 Hz). *SM : (IE, 70eV) M+ : 192(100), 176(16), 162(47), 146(33), 134(98), 126(43), 119(21), 107(36), 99(44). Fluorosulfonate de 5-fluoro-8-nitro-l-méthylquino- 18indium (BXT 03069) Dans un tricol de 100 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 2,5 mmoles de 5-fluoro-8-nitroquinoléine dans 10 ml de glyme sec. A température ambiante, est additionné en 3 minutes 1 ml de fluorosulfonate de méthyle (10,0 mmoles; ALFA VENTRON). Le mélange réactionnel est agité 1 heure à 600C. Après retour à température ambiante, le précipité obtenu est essoré et lavé par 3x10 ml d'éther terbutylméthylique puis séché sous vide. Le produit désiré est obtenu avec un rendement de 46 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3) CH3-N+ : 4,70 ppm (s, 3H); H6 : 8,10 ppm (dd, 1H, J = 8,58-8,64 Hz); H3 : 8,58 ppm (dd, 1H, J = 8,60-4,20 Hz; H7 : 8,90 ppm (dd, 1H, J = 8,56-5,22 Hz); H4 9,66 ppm (dd, 1H, J = 2,5-8,6 Hz); H2 : 9,88 ppm (dd, 1H, J = 2,5-4,2 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 207 ion négatif : M- : 404 (2 M-/1 M+) M- : 99. Exemple 16 : Tétrafluoroborate de 5-nitro-l-méthyl- quinoléinium (BXT 03070). Dans un ballon de 50 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation 5,74 mmoles de 5-nitroquinoléine (ALDRICH) dans 10 ml d'acétonitrile. A 250C, une solution de 6,4 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) dans 4 ml d'acétonitrile est ajoutée en 10 minutes. L'agitation est maintenue 1/2 heure et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu brut est repris par un mélange d'éther terbutylméthylique/2-propanol (1/1), essoré et séché sous vide pendant 2 heures. Le produit désiré est recristallisé dans un mélange éther terbutylméthylique/2-propanol (1/1). Rendement : 89 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, D20) CH3-N+ : 4,70 ppm (s, 3H); H3 : 8,20 ppm (dd, 1H, J = 9,6-5,6 Hz); H7 : 8,33 ppm (t, 1H, J = 8,6 Hz); H6 et Hg : 8,74 ppm (t, 2H, J = 8,6 Hz); H4 :9,37 ppm (d, 1H, J = 5,6 Hz); H2 : 9,64 ppm (d, 1H, J = 9,6 Hz). *SM : (FAB, glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 189 ion négatif : M- : 87. Exemple 17 : Fluorosulfonate de 6-chloro-7 trifluorométhyl-1-méthylguinoléinium et fluorosulfonate de 6-chloro-5-trifluoro méthyl-1-méthylquinoléinium 6-Chloro-7-trifluorométhylquinoléine et 6-chloro-5 trifluorométhylquinoléine Dans un tricol de 100 ml, muni d'une agitation et d'un thermomètre, on introduit 20 mmoles de 5-amino-2 chloro-1-trifluorométhylbenzène (ALDRICH) et 14 mmoles d'oxyde d'arsenic (ALDRICH) dans 80 ml de glycérol anhydre (SIGMA). 2,15 ml d'acide sulfurique concentré (d = 1,84) sont additionnés goutte à goutte, à température ambiante. Le mélange réactionnel est placé sous vide [2666 Pa (20 mm de Hg)], tandis que la température est amenée progressivement à 1100C.L'agitation est maintenue à cette température pendant 4 heures. Puis le mélange réactionnel est ramené à la pression atmosphérique, et une seconde addition d'acide sulfurique concentré (d = 1,84; 1 ml) est effectuée. L'élimination de l'eau est alors reprise sous agitation vigoureuse pendant 4 heures sous vide [2666 Pa (20 mm de Hg)] à une température ne dépassant jamais 12 OOC . Après retour du milieu réactionnel à une température de 1000C, 50 ml d'eau sont ajoutés lentement. La solution résultante, revenue à température ambiante et dont le pH est rendu basique par addition d'une solution concentrée d'ammoniaque (d = 0,89; 5 ml; PROLABO), est extraite par de l'acétate d'éthyle (2x100 ml). Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de magnésium puis le solvant est évaporé sous vide.Le résidu solide est finalement chromatographié sur colonne de silice GeduranX [MERCK; 40-63 Fm (200-400 mesh)] à l'aide d'un mélange éluant : chlorure de méthylène/pentane (4/1). 6-chloro-7-trifluorométhylquinoléine : rendement = 24 %. Caractéristiques physiques *pF = 137-1390C. *RMN 1H (200 MHz, CDCl3) H3 : 7,53 ppm (dd, 1H, J = 4,18-8,40 Hz); Hs : 7,96 ppm (s, 1H); H4 : 8,12 ppm (d, 1H, J = 7,40 Hz); H8 : 8,48 ppm (s, 1H); H2 : 8,99 ppm (dd, 1H, J = 1,38-2,78 Hz). *SM (IE, 70eV) : 233(30); 231(100); 212(10); 196(20). 6-chloro-5-trifluorométhylquinoléine : rendement = 8 %. Caractéristiques physiques *RMN 1H (200 MHz, CDC13) : H3 : 7,40 ppm (dd, 1H, J = 4,20-8,96 Hz); H7 : 7,58 ppm (d, 1H, J = 9,16 Hz); H8 : 8,03 ppm (d, 1H, J = 8,94 Hz); H4 : 8,45 ppm (d, 1H, J = 9,00 Hz); H2 : 8,85 ppm (d, 1H, J = 2,94 Hz). *SM (IE, 70eV) : 233(30); 231(100); 212(10); 196(20); 179(15). Fluorosulfonate de 6-chloro-5-trifluorométhyl-1méthylquinoléinium (BXT 03071) Dans un ballon de 50 ml, muni d'une agitation et sous courant d'azote, on introduit 0,6 mmole de 6-chloro-5trifluorométhylquinoléine dans 5 ml d'éther diméthylique de l'éthylène glycol puis goutte à goutte, sous agitation, 0,2 ml (2,4 mmoles) de fluorosulfonate de méthyle (ALFA). Après 1 heure de chauffage à 5 OOC puis retour à température ambiante, la solution résultante est additionnée de 10 ml d'éther éthylique. Le précipité formé est filtré, lavé à l'éther éthylique (2x5 ml) puis séché à l'étuve sous vide, à 400C, sur anhydride phosphorique. Le produit désiré (poudre blanche) est isolé avec un rendement de 72 %. Caractéristiques physiques *pF = 149-1510C. *RMN 1H (200 MHz), CD3SOCD3) CH3-N+ : 4,70 ppm (s, 3H); H3 : 8,35 ppm (dd, 1H, J = 5,78-9,12 Hz); H7 : 8,51 ppm (d, 1H, J = 9,8 Hz); H8 8,86 ppm (d, 1H, J = 9,9 Hz), H4 : 9,38 ppm (d, 1H, J = 9,06 Hz); H2 : 9,64 ppm (d, 1H, J = 5,48 Hz). *SM (FAB ; glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 345 ion négatif : M- : 99. Fluorosulfonate de 6-chloro-7-trifluorométhyl-1 mAthylquinoléinium (BXT 03072) Le mode opératoire mis en oeuvre pour l'obtention de ce composé est identique à celui du composé précédent en remplaçant la 6-chloro-5-trifluorométhylquinoléine par la 6chloro-7-trifluorométhylquinoléine. Le produit désiré est obtenu avec un rendement de 80 %. Caractéristiques physiques *pF = 187-1890C. *RMN 1H (200 MHz, CD3SOCD3) CH3-N+ : 4,78 ppm (s, 3H); H3 : 8,38 ppm (dd, 1H, J = 6,0-9,3 Hz); H5 : 8,90 ppm (d, 1H); H8 : 8,98 ppm (s, 1H); H4 : 9,25 ppm (d, 1H, J = 7,5 Hz); H2 : 9,64 ppm (d, 1H, J = 7,0 Hz). *SM (FAB ; glycérol-NOBA) ion positif : M+ : 345 ion négatif : M- : 99. III. Exemples d'applications Les protocoles opératoires décrits ci-après sont des exemples d'applications du procédé selon l'invention au dosage des mercaptans non protéiques et du glutathion sur un lysat érythrocytaire, à l'aide du réactif BXT 03015. Un exemple de coffret de réactifs est décrit cidessous. Ce coffret ou kit de réactifs selon l'invention doit être stocké à une température comprise entre 0 et 40C. Description des réactifs T : Tampon phosphate 50 mM, pH = 7,3, contenant du DTPA 1 mM. (On le laisse s'équilibrer à l'air et à 250C avant utilisation). S1 : Solution d'acide métaphosphorique à 5 %. (Doit être maintenue entre 0 et 40C pour la préparation de l'échantillon). S2 : Solution de soude à 30 %. (On la laisse s'équilibrer à l'air et à 250C). RI : Réactif BXT sous forme solide. (On prépare extemporanément une solution-mère 10-2 M dans le tampon T). E : GSH sous forme solide. Préparation de l'échantillon - on centrifuge 2 ml de sang total à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes ; - on élimine le surnageant - on reprend le culot érythrocytaire avec 4 fois son volume de solution S1 refroidie entre 0 et 40C - on mélange ; - on centrifuge à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant ainsi obtenu correspondant à un lysat érythrocytaire, dont les protéines ont été précipitées, dilué au 1/5e, constituera l'échantillon à doser (il doit être maintenu entre 0 et 40C pour les mesures) 1. Dosage des mercaptans totaux Protocole du dosage Les mesures sont effectuées à 250C dans un spectrophotomètre dont les cuves de mesure sont thermostatées. Le mélange réactionnel correspondant à chaque dosage est préparé extemporanément selon le protocole suivant, pour des cuves de 1 ml - on mélange : 100 fl de l'échantillon à doser et 800 Al de solution T ; - on laisse incuber pendant 1 minute à 250C ; - on déclenche la réaction en ajoutant 100 pl de solutionmère de R1 10-2 M dans le tampon T ; et - on laisse incuber pendant 5 minutes à 250C. La mesure d'absorbance (A) est effectuée à 356 nm dans le cas où R1 est le composé BXT 03015, dans des cuves de 1 cm de trajet optique, contre de l'air. Le GSH présent dans le coffret de réactifs (E) peut être utilisé pour définir une courbe d'étalonnage, si nécessaire. Expression des résultats Dans les conditions de ce dosage, la concentration en mercaptans totaux est déterminée selon la formule [mercaptans totaux] = (A/16200) x 50 dans laquelle A est l'absorbance mesurée. Remarque : Le coefficient d'extinction molaire utilisé ici (16200 l.mole-lcm-1) est une moyenne des coefficients d'extinction molaire à 356 nm obtenus pour les adduits formés entre le BXT 03015 et les principaux mercaptans physiologiquement importants décrits dans le Tableau I qui précède. L'erreur relative est égale, dans ces conditions, à + 9 %. Dans ce cas, on obtient une mesure de la concentration en mercaptans totaux dans l'échantillon exprimée en moles/l. 2. Dosage du glutathion réduit Protocole du dosage Les mesures sont effectuées à 250C dans un spectrophotomètre dont les cuves de mesure sont thermostatées. Le mélange réactionnel correspondant à chaque dosage est préparé extemporanément selon le protocole suivant, pour des cuves de 1 ml - à la solution ayant servi à doser les mercaptans totaux, on ajoute 50 Fl de solution S2 ; et - on laisse incuber pendant 15 minutes à 250C. La mesure d'absorbance est effectuée à 400 nm dans le cas où R1 est le composé BXT 03015, dans des cuves de 1 cm de trajet optique, contre de l'air. Expression des résultats Dans les conditions de ce dosage, la concentration en GSH est déterminée selon la formule [GSHj = (A'/14700) x 50 dans laquelle A' représente l'absorbance mesurée. Dans ce cas, on obtient une mesure de la concentration en glutathion réduit (GSH) exprimée en moles/l. Une solution de GSH (réactif E) à 10-2 mole/l dans de l'acide métaphosphorique à 5 % (solution S1) peut être préparée extemporanément et servir pour une courbe d'étalonnage, si nécessaire. BIBLIOGRAPHIE 1 - DOLPHIN D., POULSON R. et AVRAMOVIC O. Eds. (1989) Glutathione : chemical, biochemical and medical aspects, Vol. I & I,0 J.WILEY and Sons 2 - ANDERSON M.E. (1989) dans DOLPHIN D., POULSON R. et AVRAMOVIC O.Eds., Glutathione : chemical, biochemical and medical aspects, Vol. I & I, J.WILEY and Sons, pp. 339-365 3 - TIETZE F.(1969) Anal. Biochem., 27, 502-522 4 - LING. B. LIN, DEWAELE C., BAEYENS W.R.G. (1991) J. Chromatogr., 553(1-2), 433-9 5 - SOFIC E., RIEDERER P., BURGER R., GSELL W., HEUSCHNEIDER G. (1991) Fresenius. J. Anal. Chem., 339, 258260 6 - ELLMAN G.L. (1959) Arch. Biochem. Biophys., 82, 70 77 7 - SEDLAK J. et LINDSAY R.H. (1968) Anal. Biochem., 25, 192-205 8 - LUTHRA N.P., DUNLAP B. et ODOM J.D. (1981) Anal. Biochem., 117, 94-102 9 - TORSHINSKI Y.M. (1981) Sulfur in Proteins, Pergamon Press, pp. 124-125 10 - FARISS M.W. et REED D.J. (1987) Meth. in Enzymol., 143, 101-109 11 - REED D.J. et BEATTY P.W. (1980) Reviews in Biochemical Toxicology - Elsevier, 2, 213-24 12 - KOSOWER E. M., KOSOWER N.S. et RADKOWSKY A. (1983), dans LARSSON A. et al. Eds., Raven press, New York, pp. 243250 13 - RICE G.C., BUMP E. A., SHRIEVE D.C., LEE W. et KOVACS M. (1986) Cancer Rez., 46, 6105-5110 14 - HOLLOWAY C.J. (1987) J. of Chromatogr., 390, 101110 15 - MUTUS B., WAGNER J.D., TALPAS C.J., DIMMOCK J.R., PHILLIPS O.A., REID R.S. (1989) Anal. Biochem., 177, 237-243 16 - GRIFFITH O. W. (1980) Anal. Biochem., 106, 207-212 17 - HISSIN P., HILF R. (1976) Anal. Biochem., 74, 214226 18 - MARTENSSON J. (1987) J. of Chromatogr., 420, 152157 19 - FAHEY R.C. (1989), dans "Glutathione : chemical, biochemical and medical aspects", DOLPHIN D., POULSON R., AVRAMOVIC O. Eds., John Wiley and Sons, pp. 303-337 20 - BIN LING B., BAEYENS F.R.G., MARYSAEL H. (1989) Anal. Chim. Acta, 227, 203-209 21 - BROWN E., (1957) J. Am. Chem. Soc., 29, 3563 22 - HERTOG D., (1951) Rec. Trav. Chim. Pays-Bas, 70, 591 23 - INOUE M., SAITO Y., HIRATA E., MORINO Y., NAGASE S., (1987) J. Prot. Chem., 6, 207-225 REVEND ICAT IONS 1.- Procédé de dosage des mercaptans dans un échantillon aqueux, notamment biologique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement la formation d'un produit de substitution chromophorique entre tous les mercaptans présents dans l'échantillon et un réactif choisi parmi les composés de type quinoléinium répondant à la formule générale Il dans laquelle R1 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle, p-nitrobenzyle, phényle ou o,p-dinitrophényle; R7 = hydrogène ou méthyle; R8 = hydrogène, F, C1, Br, I ou SCN; R9 = hydrogène, F, Cl, NO2 ou CF3; R10 = hydrogène, NO2 ou ClJ R11 = hydrogène, F, Cl, CF3 ou NO2; R12 = hydrogène, OH, benzyloxy ou NO2; étant entendu que R8, R9, R10 et R11 ne peuvent représenter simultanément l'hydrogène; et Y = halogénure, méthylsulfate, fluorosulfonate, phosphate, tétrafluoroborate ou tosylate. 2.- Procédé de dosage du glutathion réduit (GSH) dans un échantillon aqueux, notamment biologique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1. former un produit de substitution chromophorique entre tous les mercaptans présents dans l'échantillon et un réactif choisi parmi les composés de formule générale II définie à la revendication 1 ; et 2. amener le pH du milieu réactionnel à une valeur comprise entre 12,8 et 13,8, pour former spécifiquement une thione chromophorique à partir du produit de substitution chromophorique formé à l'étape 1. entre le GSH et ledit réactif. 3.- Procédé de dosage des mercaptans totaux dans un échantillon aqueux, notamment biologique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1. ajouter à l'échantillon à doser, tamponné dans la gamme de pH 7,0 à 7,5, un aliquot d'une solution-mère, dans l'eau ou dans un solvant miscible à l'eau, d'un réactif BXT de formule générale II en excès, 2. homogénéiser le milieu réactionnel ainsi obtenu, 3. laisser incuber pendant au moins 5 minutes, 4. mesurer, à l'aide d'un spectrophotomètre, l'absorbance du ou des produit(s) de substitution ou adduit(s) formé(s) entre le réactif BXT et le ou les mercaptan(s) présent(s) dans l'échantillon et 5. déterminer la concentration en moles/litre des mer captans totaux présents dans.l'échantillon, selon la formule [mercaptans totaux] = (A/em x d) x D dans laquelle - A représente l'absorbance mesurée, - m représente le coefficient d'extinction molaire spécifique du réactif BXT utilisé, exprimé en l.mole-1.cm-1, - d représente la longueur de la cuve, exprimée en cm, et - D représente le coefficient de dilution. 4.- Procédé de dosage du glutathion réduit GSH dans un échantillon aqueux, notamment biologique, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 1. ajouter à l'échantillon à doser, tamponné dans la gamme de pH 7,0 à 7,5, un aliquot d'une solution-mère, dans l'eau ou dans un solvant miscible à l'eau, d'un réactif BXT de formule générale II en excès, 2. homogénéiser le milieu réactionnel ainsi obtenu, 3. laisser incuber pendant au moins 5 minutes, 4. ajuster le pH du mélange à une valeur comprise entre 12,8 et 13,8, selon le réactif BXT choisi, 5. laisser incuber pendant au moins 15 minutes, 6. mesurer, à l'aide d'un spectrophotomètre, l'absorbance de la thione chromophorique produite par ss-élimination, spécifiquement avec l'adduit GSH-réactif BXT et 7. déterminer la concentration en moles/litre du GSH dans l'échantillon, selon la formule [GSH] = (A'/m x d) x D dans laquelle - A' représente l'absorbance mesurée, - m représente le coefficient d'extinction molaire spécifique du réactif BXT utilisé, exprimé en I.mole-l.cm-l, - d représente la longueur de la cuve, exprimée en cm, et - D représente le coefficient de dilution. 5.- Procédé de dosage de la concentration des mercaptans distincts du glutathion dans un échantillon aqueux, notamment biologique, au moyen de la différence des concentrations mesurées respectivement selon les procédés des revendications 3 et 4, en utilisant la formule [mercaptans distincts du GSH] = [mercaptans totaux] - [GSH]. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le réactif utilisé est le réactif BXT 03015 ou tétrafluoroborate de 4-chloro-7trifluorométhyl-1-méthylquinoléinium. 7.- Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement, en tant que réaction, un composé de formule générale II telle que définie à la revendication 1. 8.- Composé de formule générale II telle que définie à la revendication 1, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 9.- Composés de formule générale II, dans laquelle R1, R7 à R12 et Y sont définis comme à la revendication 1, étant entendu que - lorsque R8 = F, Cl, Br ou I, alors R7, R9, R10, R11 et R12 ne peuvent représenter simultanément H - lorsque R9 = F ou Cl, alors R7, R8, R10, R11 et R12 ne peuvent représenter simultanément H ; - lorsque R10 = Cl, alors R7, R8, R9, R11 et R12 ne peuvent représenter simultanément H ; - lorsque R11 = F ou Cl, alors R7, R8, R9, R10 et R12 ne peuvent représenter simultanément H ; et - lorsque R8 = Roll, Cl, alors R7, R9, R10 et R12 ne peuvent représenter simultanément H.