Brevet FR2681327A1 — publié le 19930319

PROTEINES CAPABLES NOTAMMENT DE CONSTITUER DES FACTEURS DE REGULATION FONCTIONNELLE DE LA CELLULE ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES. L'invention a pour objet des protéines capables notamment, de constituer des facteurs de régulation fonctionnelle de la cellule, et leurs applications biologiques. On connaît le rôle fondamental des interactions et des communications entre les cellules. Les interactions cellule-cellule revêtent une importance majeure dans le développement et ltorganisation des organismes multicellulaires, ainsi que dans leur physiologie et leur pathologie. Il est généralement admis que ces interactions s'effectuent par l'effet de facteurs solubles circulants, mais aussi par l'intermédiaire de molécules d'adhésion cellulaire (CAM), de molécules d'adhésion au support matriciel et de molécules constituant des structures fonctionnelles entre les cellules. Ces molécules assurent toutes à la fois, une régulation de la genèse durant les stades précoces du développement, incluant en outre les processus primaires tels que la prolifération et les migrations cellulaires. Elles donnent naissance à des signaux qui conduisent à une expression différentielle des gènes et par là, à une induction embryonnaire (voir notamment Gallin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83 : 8235-8239, 1986 ; Edelman, Immunol. Rev. 100:11-45, 1987 ; Jessel, Neuron. 1:3-13, 1988). Si le rôle de ces molécules a bien été établi, les mécanismes moléculaires impliqués dans ces régulations coordonnées sont toutefois peu élucidés à ce jour. Les communications entre cellules jouent également un rôle important dans le maintien de l'expression différentielle des gènes des cellules matures des tissus adultes, comme l'ont montré notamment des travaux réalisés sur les systèmes nerveux périphérique et central (voir notamment Rathjen et al., J. Cell. Biol. 104 : 343 - 353, 1987 et Seilheimer et al., J. Cell. Biol. 109:3095 - 3103, 1989). Un autre exemple de grand intérêt à cet égard est fourni par le foie adulte. On constate en effet que la dissociation du tissu hépatique pour isoler des hépatocytes conduit à une forte diminution de la transcription des gènes codant pour les fonctions spécifiques du foie (voir Clayton et al. Mol. Cell Biol. 5:2623 - 2632, 1985).De plus, il a été constaté que l'établissement en culture d'interactions homotypiques, c'est-à-dire des hépatocytes entre eux, ne permet pas de préserver leur phénotype adulte, alors que les protéoglycanes induisent la formation de structures jonctionnelles fonctionnelles et restaurent la transcription d'ARNm spécifiques en cultures primaires. L'ensemble de ces résultats tend à démontrer le rôle majeur des cellules non parenchymateuses sur la transcription différentielle des gènes spécifiques du foie dans les hépatocytes adultes. Certains des co-inventeurs de la présente demande ont décrit dans le brevet FR 8307148 du 29 avril 1983, au nom de l'INSERM, un procédé de co-culture dthépatocytes humains adultes avec une population cellulaire hétérologue, mais d'origine hépatique. Durant la co-culture, on constate l'établissement de contacts entre les deux populations cellulaires. Il s'ensuit un maintien des activités fonctionnelles des hépatocytes sur plusieurs semaines. Durant la co-culture, on observe la sécrétion et le dépôt de divers composants d'une matrice donnant un réseau matriciel extracellulaire complexe qui entoure et recouvre les colonies d'hépatocytes et, en parallèle et de manière coordonnée, une activation de l'expression de gènes spécifiques du foie. Les inventeurs ont utilisé ce système de coculture d'hépatocytes pour étudier les relations causales entre les différents événements biologiques qui conduisent à une différenciation stable des hépatocytes dans le foie adulte. Une approche immunologique de ce problème leur a permis, en utilisant un anticorps monoclonal déterminé, de mettre en évidence le rôle critique joué à cet égard par une protéine de membrane. En poursuivant ces travaux, les inventeurs ont constaté que d'autres cellules que les hépatocytes, dans d'autres tissus que dans les tissus du foie, comportaient dans leur membrane des protéines de ce type reconnues également par l'anticorps monoclonal en question. L'invention a donc pour but de fournir des protéines impliquées de façon majeure dans les interactions et les communications de cellule à cellule. Elle vise plus spécialement à fournir des protéines de régulation de cellules différenciées, ou de cellules en cours de différenciation. L'invention vise en outre les applications biologiques de ces protéines, en particulier comme facteurs de régulations fonctionnelles et comme marqueurs de différenciation cellulaire. Les protéines de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent ou sont constituées par une séquence d' acides aminés capable de réagir spécifiquement avec un anticorps monoclonal tel qu'obtenu par immunisation d'un animal avec des cellules épithéliales de rat d'origine hépatique, suivie des étapes de fusion et de clonage effectuées selon les techniques classiques, en particulier l'anticorps monoclonal secrété par la souche d'hybridome déposée à la D.S.M (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 19 juin 1991 sous le n" DSM ACC 2011. D'une manière inattendue, il apparaît que de telles protéines sont capables de jouer un rôle critique dans la communication cellulaire, et notamment dans la reconnaissance spécifique et 1' interaction de populations cellulaires différentes et conduisent à la transcription active de certains gènes et 1' expression de fonctions caractéristiques d'un tissu donné. Elles constituent des protéines de communication entre les cellules dvun type donné et les cellules hétérologues contigües ou jointives. Elles s'avèrent en effet capables d'assurer la transmission d'un signal ou de signaux d' un type cellulaire à un autre type cellulaire qui peut être contigü ou proximal. Concernant la distribution tissulaire, à l'état adulte, les protéines de l'invention sont exprimées notamment au niveau du foie, du pancréas exocrine, des testicules et des ovaires. Au niveau cellulaire dans le foie, elles sont caractérisées en ce qu'elles sont membranaires et polarisées au pôle sinusoïdal des hépatocytes adultes normaux. Cette polarité peut disparaître dans les cellules d'hépatomes, le foie foetal et le foie en régénération. Les protéines selon l'invention sont encore caractérisées en ce qu'elles sont exprimées notamment par les hépatocytes, les cellules épithéliales des ductules biliaires, les cellules endothéliales et les cellules de Ito. Elles sont également caractérisées en ce que, dans les testicules, elles sont exprimées au niveau des tubes séminifères par les cellules de Sertoli (cellules dites nourricières) et les spermatocytes à un stade précis de maturation, fin leptotène et zygotène. Elles sont en outre caractérisées en ce que, dans l'ovaire, elle sont exprimées par les ovocytes et les cellules folliculaires (cellules nourricières), qui les entourent, uniquement à un stade de maturation très précis, tout comme les spermatocytes dans les testicules. Les études effectuées sur des co-cultures d'hépatocytes et de cellules épithéliales de foie de rat (en abrégé CEFR), selon le procédé du brevet FR mentionné plus haut, ont montré l'implication de protéines spécifiques, du type de celles définies plus haut, dans les interactions entre ces deux populations cellulaires. Ces protéines spécifiques sont également impliquées dans 1' activité fonctionnelle des cellules germinales. Elles constituent dans ces cas des glycoprotéines intégrales de la membrane. Ces protéines sont plus spécialement caractérisées en ce qu'elles sont formées d'une séquence d'acides aminés ayant un poids moléculaire (PM) d'environ 85000 daltons, tel que mesuré par électrophorèse en gel dénaturant de polyacrylamide. On notera que le PM des séquences protéiques peut varier sensiblement d' une espèce à 1' autre, voire d' un type cellulaire à 1' autre. Selon un autre aspect, les protéines de l'invention mises en évidence dans les co-cultures d'hépatocytes sont des protéines membranaires présentant un pI de 4,9 à 5,1 environ par analyse sur gel bidimensionnel. Dans une variante, ces protéines se présentent sous une forme ayant un PM de 73 000 daltons environ, possédant l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal (ou en abrégé AcM) défini plus haut, correspondant à des protéines de membrane tronquées. Ces protéines présentent notamment un pI de l'ordre de 5,2. Sous l'un des divers aspects évoqués ci-dessus, ces protéines de l'invention sont encore caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une seule chaîne protéique. L'implication de ces protéines peut être appréciée au regard de l'altération de l'activité fonctionnelle des hépatocytes matures lorsqu'on ajoute à la co-culture un anticorps monoclonal les reconnaissant spécifiquement, comparée à l'activité fonctionnelle de co-cultures non traitées par 1' AcM. Cette altération est observée au regard de paramètres significatifs d'un bon maintien d'un stade de différenciation en co-culture, à savoir la survie de lthépatocyte pendant plusieurs semaines, la production d'albumine, la présence de niveaux élevés d'ARN-m spécifiques du foie, l'organisation caractéristique des composants du cytosquelette et le dépôt de fibres de matrice extracellulaire.Comme montré dans les exemples rapportés ci-après, l'immunoréaction des protéines de l'invention avec l'anticorps monoclonal se traduit par une perte du phénotype adulte des hépatocytes, et comme dans les cultures pures, par une survie réduite à 5 à 6 jours environ, une diminution rapide de la sécrétion de sérum albumine avec un taux inférieur à environ 50 * de la production normale, accompagnée d'une diminution du niveau des ARN-m correspondants et des ARN-m d'autres gènes spécifiques du foie. On constate que, comme dans les cultures pures, les hépatocytes de co-cultures traitées par l'anticorps monoclonal en question synthétisent du procollagène Ial qui ne polymérise pas. Ces changements correspondent à une perte pratiquement complète de dépôt de matrice extracellulaire. Ils coïncident également avec une incapacité des hépatocytes à développer une architecture du cytosquelette caractéristique du phénotype différencié. Les résultats obtenus sur les hêpatocytes mettent en évidence le rôle des protéines de l'invention dans la régulation fonctionnelle des cellules. On mesurera en particulier les effets coordonnés, induits ou médiés, par ces protéines, l'expression de gènes spécifiques de tissus, l'organisation de protéines du cytosquelette et le dépôt d'une matrice extracellulaire. Selon un autre aspect de l'invention, les protéines en question sont caractérisées en ce qu'il s'agit de glycoprotéines. Selon encore un autre aspect, les protéines de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont constituées en tant que telles, par la partie active des protéines définies plus haut, c'est-à-dire la partie responsable de la communication entre les cellules d'un type donné et les cellules hétérologues contigües ou proximales. L'invention vise notamment la partie glycosylée des protéines définies dans ce qui précède. Selon encore un autre aspect de l'invention, les protéines actives vis-à-vis de la régulation cellulecellule sont des protéines recombinantes et renferment au moins la partie active évoquée plus haut. Dans une autre variante de 1' invention, les protéines de 1' invention sont des analogues des protéines définies ci-dessus, c'est-à-dire que leur séquence d' acides aminés peut différer de celle de la séquence protéique active de référence par un ou plusieurs acides aminés délétés et/ou remplacés et/ou substitués, dès lors que ces changements n' altèrent pas les propriétés définies ci-dessus. On notera à cet égard que le terme protéine tel qu' utilisé dans la description et les revendications désigne aussi bien les protéines telles qu' obtenues par voie de synthèse, que les protéines sous forme native ou sous forme recombinante, les parties actives de ces protéines, et leurs analogues comme défini plus haut. L'invention vise également un procédé d'obtention des protéines définies ci-dessus. Ce procédé comprend la mise en contact d'un extrait de membranes de foie avec un anticorps monoclonal capable de reconnaître spécifiquement une protéine de surface de cellules épithéliales de foie de rat, ou un fragment Fab ayant une telle propriété. Les membranes de foie sont avantageusement solubilisées avec un agent ayant pour effet de les lyser, notamment un agent détergent tel que le Triton X100. Pour l'étape de mise en contact, l'anticorps monoclonal, ou les fragments Fab, est avantageusement couplé à un support, plus spécialement un support utilisable dans une colonne comme le Sépharose 4B. Les protéines recherchées se fixent sélectivement sur l'anticorps par immunoréaction et sont ensuite éluées. A cet effet, on procède avec avantage à une augmentation du pH du tampon. Comme tampon approprié, on citera la diéthylamine de pH 11,5 renfermant 0,05 % de Triton X100. Aux fins de purification, l'éluat recueilli renfermant une protéine donnée est mis en contact avec un adsorbant sélectif permettant d'éliminer des protéines de poids moléculaires identiques à celui de la protéine recherchée mais de points isoélectriques différents, puis on désorbe la protéine à l'aide d'un tampon approprié et on la récupère à partir de l'éluat. Les protéines de l'invention peuvent être également purifiées à l'aide d'un anticorps polyclonal induit de manière classique par immunisation d'un animal. D'une manière générale, les anticorps polyclonaux dirigés contre les protéines de l'invention sous forme native ou recombinante, ou leur partie active, ou leurs analogues tels que définis plus haut, entrent également dans le cadre de l'invention. Naturellement, tout tissu, autre que les membranes de foie, donnant lieu à une réaction immunologique avec des anticorps tels que définis ci-dessus peut être utilisé pour obtenir les protéines de l'invention. On notera que la reconnaissance par l'anticorps n'est pas spécifique d'espèce. L'anticorps monoclonal utilisé comme outil d'identification des protéines est tel qu'obtenu par sécrétion à partir de souches d'hybridomes résultant de la fusion d'une cellule immortelle de myélome non sécréteur avec une cellule productrice d'anticorps dirigés contre une protéine de surface de cellules épithéliales de foie de rat. L'étape de fusion des deux types cellulaires est notamment réalisée selon la technique la plus couramment utilisée, à savoir celle de Kôhler et Milstein, Nature, vol. 256, p. 495, 1975. Les cellules productrices d'anticorps sont des splénocytes. Ces cellules sont récupérées après immunisation in vivo de l'animal avec une suspension cellulaire de CEFR vivantes. Les cellules immortelles sont des cellules de myélome non sécréteur, ce qui permet d'obtenir des hybridomes ne sécrétant que l'immunoglobuline de la spécificité de la cellule productrice. On utilise de manière classique des cellules de myélome SP2/0-Ag. Conformément à la technique usuelle, les hybridomes obtenus sont mis en culture et clonés selon le procédé de dilution limite. On sélectionne avantageusement les hybridomes dont les surnageants de culture produisent des immunoglobulines, en utilisant un test classique d'immunofluorescence. Un deuxième niveau de sélection est opéré parmi les clones positifs retenus à l'issue de l'étape précédente, en ne retenant que les clones capables de reconnaître une protéine de la membrane plasmatique en donnant lieu à une réaction du type antigène-anticorps mais ne réagissant pas avec deux types de cellules non hépatiques, à savoir les cellules endothéliales de cornée et les fibroblastes de peau humaine. Les anticorps monoclonaux récupérés peuvent être utilisés tels quels ou sont purifiés, par exemple sur colonne d'affinité, et conservés par congélation, ou éventuellement lyophilisés. L'invention vise tout spécialement l'anticorps monoclonal L8 dont le mode de production est rapporté dans les exemples. Les souches d'hybridomes productrices d'anticorps monoclonaux définies ci-dessus, ainsi que leur procédé d'obtention, comprenant les étapes de fusion et de sélection définies plus haut en rapport avec les anticorps monoclonaux, entrent également dans le cadre de 1' invention. Dans une variante de l'invention, les protéines reconnues par les anticorps monoclonaux dans le procédé de l'invention correspondent à des protéines recombinantes comportant ou formées par la partie active vis-à-vis de la régulation cellule-cellule. En opérant selon les techniques classiques de transfert de gènes du génie génétique, ces protéines sont produites dans des hôtes cellulaires, notamment dans des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant les fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées. Ces fragments sont introduits par ligation dans un site approprié du vecteur choisi. Les protéines exprimées sont récupérées du milieu de culture, après lyse des bactéries, et purifiées. Dans encore une autre variante, les protéines de l'invention sont formées par la partie active comme déjà défini, ou sont des analogues de ces protéines ou de leur partie active. Ces protéines sont obtenues par recombinaison génétique ou synthèse peptidique selon les techniques classiques. La mise en oeuvre de ces techniques conduit à l'élaboration d'outils qui constituent des produits nouveaux. Ainsi, les hôtes cellulaires transformés, les vecteurs d'expression tels que plasmides, et fragments d'ADN tels qu'évoqués ci-dessus entrent dans le cadre de l'invention. Compte tenu de leur rôle dans la communication et dans les interactions entre cellules, les protéines de l'invention présentent un grand intérêt comme facteur de régulation fonctionnelle des cellules cibles dans un tissu donné. L'invention vise en particulier leur utilisation dans les cultures cellulaires en vue d'assurer le maintien de l'activité fonctionnelle d'un type donné de cellules. Les cultures sont réalisées avantageusement dans les conditions habituelles et la protéine est ajoutée au milieu. Comme rapporté dans les exemples, les protéines de l'invention jouent un rôle majeur dans le fonctionnement hêpatocytaire en culture. L'invention vise donc plus spécialement un procédé de culture d'hépatocytes, en particulier d'hépatocytes humains, comportant la mise en oeuvre d'une protéine telle que définie ci-dessus en remplacement des CEFR utilisées dans le procédé du brevet déjà mentionné. L'invention vise en outre un kit comportant la protéine telle que définie ci-dessus et les réactifs ou une partie des réactifs nécessaires pour réaliser une culture cellulaire donnée. Le kit renferme également avantageusement les cellules concernées. Les protéines de l'invention sont également utilisables comme marqueurs de différenciation cellulaire, de polarité cellulaire ou encore de distribution cellulaire. Ces marqueurs permettent d'effectuer des études de mécanismes fondamentaux. Ils sont en particulier utilisables en pharmacopée constituant des modèles cellulaires pour l'étude de la toxicité de molécules médicamenteuses et/ou 1' analyse des produits de métabolisation. Ils permettent également la mise en évidence d'un stade donné de différenciation. Ainsi, selon un aspect présentant un intérêt majeur, les protéines de l'invention constituent des marqueurs des cellules germinales à un stade précis de différenciation au stade adulte, mais aussi au cours du développement. Des essais réalisés sur des cultures de cellules de testicules ont montré que les protéines de l'invention sont exprimées au niveau des tubes séminifères par les cellules nourricières de Sertoli et les spermatocytes à un stade bien précis de la maturation (voir article R.A. Hess dans Biology of reproduction 43,525 - 542 (1990). Les anticorps dirigés contre ces protéines, avantageusement formés, selon les techniques classiques, contre une protéine purifiée d'origine humaine, constituent des outils particulièrement précieux pour effectuer des diagnostics de grande précision, ou des sélections cellulaires. Ils sont ainsi utilisables pour la caractérisation de spermogrammes. Les protéines de l'invention sont également présentes dans les ovocytes et les cellules folliculaires qui les entourent uniquement dans les follicules matures reconnaissables par la formation de l'atrium. L'utilisation d'anticorps dirigés contre ces protéines permet la reconnaissance des ovocytes matures qui sont les seuls fécondables. L'invention vise donc l'application de ces anticorps en tant que bioréactifs pour le diagnostic in vitro dans un échantillon biologique de la présence de cellules germinales mâles ou de cellules germinales femelles à des stades précis de maturation comme indiqué plus haut, en vue de leur caractérisation et/ou de leur sélection. Dans cette application, les anticorps sont libres. En variante, ils sont fixés sur un support solide non immunogène. La méthode selon 1 invention de diagnostic In vitro de la présence de protéines telles que définies cidessus est caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes - on met en contact l'échantillon à analyser avec une préparation d'un anticorps, ou d'un fragment Fab, comme défini ci-dessus, immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec ladite protéine, lorsqu'elle est présente dans l'échantillon, puis on met en évidence la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps en opérant avantageusement selon les techniques habituelles. Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité et rapidement la présence de la protéine membranaire constituant un marqueur de différenciation d'une part des cellules de Sertoli et des spermatocytes à un stade donné, d'autre part, des ovocytes également à un stade précis de maturation, de les localiser, voire de les collecter selectivement et de les quantifier. On mesurera l'intérêt de cette méthode dans le cadre des fécondations in vitre pour la sélection des ovocytes matures ou pour la culture d'ovocytes à des fins de conservation et/ou de maturation invitro. Ces applications immunohistologiques basées sur le rôle précoce joué par les protéines de l'invention dans les différenciations cellulaires, s'étendent à tous les tissus susceptibles de les exprimer au stade embryonnaire précoce ou à des stades plus tardifs du développement. Elles permettent d'étudier la spécificité d'expression à l'état adulte des cellules d'un tissu donné. La méthode ci-dessus est également applicable pour effectuer une sélection parmi des populations cellulaires de celles des cellules qui expriment les protéines de 1' invention. L'invention vise également un kit pour la mise en évidence desdites protéines aux fins de diagnostic in vitre de leur présence dans un échantillon biologique ou pour effectuer une sélection cellulaire. Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation d'anticorps ou de fragment Fab libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection. Selon un autre aspect de l'invention, la reconnaissance des protéines natives par des anticorps contre ces protéines, autorise l'utilisation de ces anticorps comme vaccin contraceptif. L'administration de ces anticorps à des souris peut conduire à une inhibition de la fertilité pendant le traitement. L'invention vise donc également un vaccin contraceptif caractérisé en ce qu'il renferme un anticorps dirigé contre les protéines, ou parties des protéines des ovocytes matures ou des spermatocytes comme défini plus haut, en association avec un véhicule inerte. La suite de la description comprend des exemples dans lesquels sont rapportés les résultats obtenus avec, comme type cellulaire les hépatocytes. Il est clair toutefois que ces exemples ne sont donnés que pour illustrer l'invention, d'autres types cellulaires pouvant être utilisés dès lors qu'ils répondent aux définitions de l'invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 7, qui représentent - la figure 1 des micrographies de co-cultures (B,C), ou de cultures pures (A), d'hépatocytes traités (A,C) ou non (B) avec l'AcM L8, - la figure 2 représente la production d'albumine en fonction de la durée d'une co-culture (en jours), en présence de concentrations croissantes d'AcM L8, - la figure 3A est une immunolocalisation sur coupe de foie de rat adulte et les figures 3B et 3C sont des micrographies montrant l'immunolocalisation du complexe AcM L8-protéine dans des cultures d'hépatocytes, - la figure 4 donne les résultats d'hybridation d'ARN-m d'hépatocytes avec différentes sondes. - la figure 5 représente des micrographies de cocultures avec dépôt de fibres matricielles, traitées (B,D) ou non (A,C) par l'AcM L8, puis colorées à la réticuline (imprégnation à 1' argent), - la figure 6A représente des immunoprécipités de protéines de l'invention avec l'AcM L8 à partir de cellules endothéliales de cornée (1), de cellules épithéliales hépatiques (2) et d'hépatocytes (3), en conditions non réductrices ; la figure 6B les mêmes immunoprécipités en conditions réductrices; la figure 6C représente une électrophorèse bidimensionnelle révélant le pHI des protéines et la figure 6D montre une immunoprécipitation après extraction des protéines avec le Triton X114, et - la figure 7 montre des coupes de tissus de rat adulte, après réaction avec l'AcM L8, A/ et B/ de follicule ovarien, C/ d' intestin grêle D de tubes séminifères. I. REACTIFS ET PRODUITS UTILISES Complexe laminine-entactine, laminine, héparanesulfate et collagène IV : extraits de la tumeur, de sarcome de souris (Engelbreth-Holm-Swarm) (1) en opérant selon (2) avec les modifications données dans (3). Fibronectine et collagénase : Boehringer Mannheim France S.A. Meylan. . Milieu minimum essentiel : Gibco Milieu 199 : Gibco . Milieu E de Williams : (14) Sondes d'hybridation pour l'analyse d'ARN-m pRSA8 pour le gène de l'albumine (4), A4C9 pour le gène de l'aldolase B (5) et du procollagène Ial (6). Anticorps anti-cytokératine 18 (anti CK 49) de spécificité connue (7). . Fibroblastes de souris 3T3 (8). . Cellules endothéliales de cornée de boeuf (9). . Cellules épithéliales de cristallin de boeuf (10). Anticorps anti-IgM de souris marqué à la peroxydase: Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Pays-Bas. . asti Ig de souris marquée avec de l'isothiocyanate de fluorescéine : Diagnostic Pasteur, Marnes-la-Coquette, France. . [35S] - méthionine et [12S1]Na : Amersham France S.A., Les Ulis. . IgM de chèvre anti-souris (Nordic Immunological Laboratories). Protéine A-Sépharose et Ampholines (Pharmacia France SA, Saint-Quentin-en-Yvelines). II Isolement des cellules et culture isolement des hépatocytes ; préparation de cultures pures ou de co-cultures. - hépatocytes. Les hépatocytes normaux adultes sont obtenus par perfusion de foie de rat (Sprague-Dawley ; 150-200 grammes) avec une solution de collagénase à 0,025 % tamponnée avec de l'Hepes 0,lM (acide 4-(21 - hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) (pH 7,4). On opère selon la méthode de Seglen décrite dans (11) en utilisant les modifications rapportées par Guguen et al., dans (12). - Cultures pures. Dans le cas d'une culture pure, les hépatocytes sont ensemencés dans des flacons de culture dans un mélange formé de 75 t de milieu MEM et de 25 t de milieu 199, supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal et contenant par ml : pénicilline (100 Ut), sulfate de streptomycine (100 ug), insuline de boeuf (5 pg) et albumine de sérum de boeuf ou BSA (1 mg). Le milieu, auquel on ajoute 7 x 10-5 M d'hémisuccinate d'hydrocortisone, est renouvelé 4 h plus tard, puis chaque jour. - Co-cultures. Les co-cultures sont préparées selon les conditions décrites dans (13). Brièvement, 4 h après l'ensemencement des hépatocytes, on enlève le milieu et on ajoute les CEFR non transformées, ou d'autres types cellulaires, mis en suspension dans un milieu frais. 24 h plus tard, le milieu est supplémenté avec 7 x 10-5M d'hémisuccinate d'hydrocortisone et renouvelé ensuite chaque jour. Pour analyser l'ARN, les hépatocytes des cocultures sont sélectivement séparés à partir des CEFR par incubation 10 min avec une solution de collagénase dépourvue de calcium (0,05 *, pH 7,6) tamponnée avec de l'Hepes 0,1 M. Cultures de fibroblastes, myofibroblastes et cellules endothéliales. Les fibroblastes de souris 3T3, les cellules endothéliales de cornée de boeuf, les fibroblastes de peau humaine et les myofibroblastes de foie de rat sont maintenus dans le milieu supplémenté avec du sérum évoqué ci-dessus, sans insuline, corticostéroïdes, ni albumine. Culture de cellules épithéliales. Les cellules CEFR sont isolées en traitant des foies de rats normaux de 10 jours, avec de la trypsine (14) et (15). Des cellules épithéliales de foie de marmotte (CEFM) sont préparées à partir de marmottes importées des E.U.A. Les CEFR, CEFM et les cellules épithéliales de cristallin de boeuf sont mises en culture dans un milieu E de William supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal. III Production et sélection des anticorps monoclonaux Des souris Balb/c sont immunisées avec une suspension cellulaire de 107 CEFR vivantes. Les splénocytes sont récupérés. Cinq fusions différentes sont réalisées avec des cellules de myélome SP2/0-Ag. On sélectionne les surnageants de culture produisant des immunoglobulines au regard de la réponse positive donnée au test d'immunofluorescence indirecte avec les cellules CEFR et les hépatocytes. Sur 400 cultures d'hybridomes positives, 95 % environ sont positives avec les CEFR et les hépatocytes et 5 * environ sont positives seulement avec les CEFR.Les clones positifs sont ensuite sélectionnés selon leur aptitude à reconnaître à la fois une protéine membranaire plasmatique du foie et leur inaptitude à réagir avec des cellules non hépatiques, telles que les fibroblastes de peau humaine et les cellules endothéliales de cornée de boeuf. Finalement, 24 hybridomes sécrétant activement des anticorps dirigés contre des protéines de membranes plasmatiques de foie sont sélectivement clonés et mis en culture. IV Sélection d'AcM au regard de l'effet sur l'activité fonctionnelle des hépatocytes. L'aptitude des anticorps monoclonaux à modifier les capacités fonctionnelles des hépatocytes en co-culture est contrôlée en ajoutant des quantités croissantes de surnageants de cultures des hybridomes sélectionnés, à des cultures pures d'hépatocytes et à des co-cultures. On ajoute ainsi 100, 200, et 500 p1 de surnageant. On isole la souche produisant des AcM capables de réduire significativement, la survie des hépatocytes en coculture, mais n' exerçant aucun effet sur la viabilité des cellules en culture pure. Ces AcM sont appelés L8. Comme indiqué plus haut, cette souche d'hybridome a été déposée à la D.S.M. le 19 juin 1991 sous le n" DSM ACC 2011. Ils sont caractérisés comme étant de classe IgM selon la technique d'Ouchterlony. . Effet sur la viabilité des hépatocytes et sur la sécrétion d'albumine. On ajoute à des co-cultures d'hépatocytes le surnageant de cultures d'hybridomes secrétant AcML8 et, dans quelques expériences, on utilise des IgM L8 concentrées par traitement à l'euglobuline, puis dialyse du fluide d'ascite contre de l'eau distillée à pH 5 (voir (16) et (17)). La figure 1 représente les photos de A : cultures pures d'hépatocytes de 2 jours traitées avec un surnageant d'hybridomes produisant L8 ; B : de co-culture d'hépatocytes de 5 jours C : de co-cultures d'hépatocytes de 5 jours, traitées avec un surnageant d'hybridomes produisant L8. 500 p1 d'AcML8 sont ajoutés au milieu de culture au démarrage de la culture, puis tous les jours à chaque renouvellement du milieu. Au troisième jour, la forme typique polygonale des hépatocytes maintenus en co-culture est perdue en présence de l'AcM L8 et la plupart des hépatocytes sont morts au 5ème ou 6ème jour, tandis que les CEFR ne sont pas affectées. La capacité des cellules à sécréter de l'albumine est étudiée dans les cultures traitées chaque jour avec l'AcM L8. Le taux de sécrétion d'albumine est quantifié dans les milieux de culture durant 5 ou 6 jours par immunonéphélométrie par laser en opérant selon (18). L'AcM est ajouté à différentes concentrations. Le taux de sérum albumine est mesuré dans le milieu prélevé chaque jour. Sur la figure 2, on a représenté les résultats obtenus avec les cultures pures les co-cultures témoins maintenues sans addition d'AcM L8, et des co-cultures auxquelles on a ajouté 2,5 5 10 et 20 pg/ml d'AcM partiellement purifié. L'anticorps est ajoute lors de l'ensemencement de CEFR et tous les jours à chaque renouvellement de milieu. On constate que la sécrétion d'albumine est maintenue à un niveau élevé dans les co-cultures non traitées et chute dans celles auxquelles on a ajouté 10 ou 20 pg d'anticorps partiellement purifié par ml de milieu (figure 2a). Classe de l'AcM L8 L'AcM L8 est caractérisé comme étant de classe IgM selon la technique d'Ouchterlony. On rapporte ci-après deux expériences réalisées pour déterminer à quel moment l'AcM L8 exerce un effet sur des hépatocytes en co-culture. Dans une première expérience, on ajoute l'AcM L8 au début de l'ensemencement cellulaire, puis on arrête le traitement 1, 2, 3, ou 4 jours après. Dans une deuxième série d'expériences, la coculture est initiée sans anticorps et le traitement est commencé seulement 1, 2, ou 3 jours après. L'effet de l'AcM L8 est evalué en mesurant la capacité des hépatocytes à survivre et à sécréter l'albumine dans le milieu. On constate que la suppression du traitement avec l'AcM L8 au premier jour ainsi que l'addition tardive de l'anticorps au troisième jour, n'a pas d'incidence significative sur la viabilité cellulaire et la production d'albumine. On met en évidence un effet inhibiteur seulement lorsque l'anticorps est présent entre les premiers et deuxièmes jours après l'ensemencement des CEFR correspondant à l'établissement de contacts entre les deux populations cellulaires. Le premier jour de décalage de phase représente le temps nécessaire pour l'attachement des CEFR, leur croissance et l'obtention d'une confluence avec les colonies d'hépatocytes. L'étude par microcinématographie des cellules épithéliales de foie établissant des contacts avec des hépatocytes montre l'apparition d'une zone claire et plate au site de contact au bout de 20 min et une réorientation des organelles intracytoplasmiques de manière radiale en direction de ce site. V Immunolocalisation de la protéine réagissant avec l'AcM L8 Les cultures pures d'hépatocytes et les cocultures sont fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 4 * tamponnée avec du cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,4) pendant 30 min à 4"C. Les AcM sont localisés en utilisant une coloration indirecte avec de l'immunoperoxydase ou la technique d'immunofluorescence indirecte. Les incubations sont réalisées en présence de 0,1 ou de 0,2 % de saponine. Un deuxième anticorps est constitué par un anticorps anti IgM de souris marqué par de la peroxydase ou par une immunoglobuline anti-souris marquée avec de l'isothiocyanate de fluorescéine. La réaction immunopositive avec l'AcM L8 est uniformément localisée au niveau de la membrane plasmatique d'hépatocytes fraichement isolés et de cultures pures d'hépatocytes et ce, seulement dans les 4 premiers jours puis disparaît. En revanche, l'AcM L8 immunoréagit avec les membranes plasmatiques des hépatocytes en co-culture pendant deux semaines. La réaction diminue lentement ensuite avec le temps. On rapporte sur la figure 3B) une photo sur une co-culture de 3 jours montrant, en utilisant la technique d'immunofluorescence, la localisation de la protéine sur la membrane plasmatique et sa distribution uniforme autour des cellules. Elle apparaît fortement exprimée par les hépatocytes et faiblement par les CEFR. Pour l'étude par microscopie électronique, les cellules sont ensuite fixées avec 2,5 * de glutaraldéhyde, puis incubées 30 min avec une solution renfermant 1 * d'osmium dans un tampon 0,1 M de cacodylate. Les cellules sont ensuite déshydratées dans de l'éthanol pur et incluses dans de l'EponR. La figure 3C montre une micrographie au microscope électronique d'une co-culture de 3 jours. La molécule de protéine est détectée par réaction d'immunopéroxydase. On observe des dépôts denses d'électrons, uniformément distribués à la surface cellulaire des hépatocytes et des CEFR. Aucune coloration intracellulaire n'est visible. La figure 3A montre la distribution de la protéine sur une coupe de foie de rat adulte. Elle apparat uniformément distribuée dans le lobule et localisée essentiellement au pôle sinusoïdal des cellules. VI Réaction de différents types cellulaires avec des hépatocytes de rat en co-culture et immunoréactivité avec l'AcM L8. On rapporte ci-après les résultats obtenus avec des co-cultures de différents types cellulaires avec des hépatocytes de rat. On considère que les cellules qui sont capables d'améliorer à la fois la survie des cellules et la sécrétion d'albumine, sont capables d'établir des interactions cellulaires avec les hépatocytes. L'immunoréactivité avec l'AcM L8 est mise en évidence par localisation indirecte avec l'immunoperoxydase. Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau Cellules Espèce Inter- Réactivité action avec cellulaire l'AcM L8 Cellules épithéliales de foie CEFR (SDIII) Rat + + - foie (SDVI) Rat + + - foie CEFM Marmotte + + - cristallin Boeuf - ND* Autres types cellulaires - Myofibroblastes de foie Rat - ND - Fibroblastes de peau Homme - ND - Cellules endothéliales Boeuf - ND de cornée - Fibroblastes 3T3 Souris + ND *ND signifie qu'aucune réactivité n'a été décelée. L'examen de ce tableau montre que deux lignées cellulaires différentes de CEFR et une lignée cellulaire épithéliale de foie de marmotte (CEFM), sont capables de favoriser la survie d'hépatocytes de rat et la sécrétion d'albumine. Toutes ces cellules sont immunoréactives avec l'AcM L8. En revanche les cellules épithéliales de cristallin de boeuf et les myofibroblastes de foie de rat ne réagissent pas avec les hépatocytes en co-culture. En outre, des essais ont été effectués combinant des hépatocytes de différentes espèces avec les CEFR. Les hépatocytes de souris, de marmotte, de chien, de babouin et d'homme sont tous capables de réagir avec les CEFR et de maintenir une stabilité fonctionnelle élevée en co-culture. L'ensemble de ces résultats montrent que les cellules qui donnent lieu à une réaction du type antigène anticorps avec 1' AcM L8 sont capables de réagir avec les hépatocytes en co-culture, donnant lieu à l'établissement de communications intercellulaires permettant le maintien de l'état différencié des hépatocytes. VII Etude de l'action de l'AcM L8 sur l'expression de gènes spécifiques du foie d'hépatocytes en co-culture. On analyse les niveaux d'ARNm de l'albumine (a), de procollagène I al (b) et d'aldolase B (c) d'hépatocytes fraîchement isolés (0) et d'hépatocytes maintenus en cocultures 2 ou 5 jours avec (+) ou sans (-) 20 pg/ml d'AcM L8 partiellement purifié. A titre de comparaison les cultures pures ont été analysées à 2,4 et 6 jours. A correspond aux co-cultures, B aux cultures pures d' hépatocytes, 2, 4 et 6 jours après ensemencement. Des quantités égales d'ARN total (20 ,ug) de ces différentes sources sont utilisées. L'ARN total est obtenu en suivant la technique de Chirgwin et al. (19) avec 5 M de thiocyanate de guanidium/CsCl. L'ARN total (20 pg) est résolu par électrophorèse et transféré sur un filtre de nitrocellulose. Le filtre est préhybridé de manière classique et hybridé avec une sonde d'ADN nick-translaté 3 x 106 cpm/ml de 32P pendant 18 h à 65" C. On réalise l'hybridation avec un excès de sondes d'ADNc correspondant à (A), (B) et (C). Les résultats sont rapportés sur la figure 4. Les niveaux d'ARNm de l'albumine et de l'aldolase B augmentent fortement du deuxième au cinquième jour dans les co-cultures non traitées alors que ces niveaux diminuent fortement en présence de l'AcM L8 au cinquième jour. En revanche, des quantités croissances de procollagène I a1 sont observées en présence de l'AcM L8. Pour démontrer que l'AcM L8 altère spécifiquement la régulation des gènes spécifiques du foie, médiée par le contact cellule-cellule, des cultures pures d'hépatocytes sont prolongées jusqu'à huit jours en présence de 25 mM de nicotinamide et exposées en continu à l'AcM L8. Ni la morphologie, ni la sécrétion d'albumine n'est modifiée dans ces cellules quand l'AcM L8 est présent. En revanche, les co-cultures avec ou sans nicotinamide perdent leur capacité à sécréter des niveaux élevés d'albumine en présence de 1' AcM L8. Pour vérifier que l'AcM L8 n'a pas d'effet direct sur les cultures d'hépatocytes pures, on a analysé les produits de traduction in vitre des hépatocytes non traités ou traités tous les jours avec l'AcM L8 et maintenus en culture pure ou en co-culture. A cet effet, 5 pg d'ARN total de cultures pures et de co-cultures, non traitées ou traitées chaque jour avec 10 pg/ml d'AcM L8 partiellement purifié (1, 3 et 5 jours) sont traduits in vitre en utilisant des lysats de réticulocytes de lapin (20) contenant 50 pCi de [35S]-méthionine. La traduction est réalisée pendant 2 h à 30"C. Le matériau précipitable avec de l'acide trichloracétique (4 x 105 cpm) est développé sur SDS-PAGE et autoradiographié.On constate que le profil des protéines synthétisées par les cultures pures est semblable durant la période de culture, qu'il y ait ou non présence de l'AcM L8. En revanche, le traitement des co-cultures avec l'AcM L8 pendant 3 jours induit spécifiquement des changements importants dans le niveau de synthèse des différentes protéines VIII Etude de l'effet de l'AcM L8 sur l'organisation du cytosquelette des hépatocytes et sur le dépôt des composants de la matrice extracellulaire. Cytosquelette Il a déjà été établi que la forme cellulaire et le cytosquelette sont étroitement associés avec le phénotype différencié des hépatocytes. L'examen effectué a porté sur les contacts cellules-cellules avec les CEFR pour vérifier s'ils induisent des changements précoces ou tardifs du cytosquelette. Des cytokératines CK8 et CK18, qui forment les filaments de taille intermédiaire du cytosquelette des hépatocytes, ont été analysés. L'immunolocalisation de la protéine CK18 est réalisée dans les cultures pures et dans les co-cultures en présence ou en l'absence de l'AcM L8. Les filaments de cytokératine forment un réseau complexe uniformément distribué dans le cytoplasme des hépatocytes en cultures pures tandis qu'ils sont principalement localisés à la périphérie cellulaire juste en dessous de la membrane plasmatique en co-culture. On a constaté que l'addition journalière de l'AcM L8 à partir du démarrage de la co-culture perturbe fortement la réorganisation de ces composants du cytosquelette. Dépôt de la matrice extracellulaire La coloration de la réticuline par imprégnation d'argent de la matrice extracellulaire est réalisée suivant la méthode de Gordon et al. décrite dans (20) dans des cocultures fixées avec un mélange de paraformaldéhyde à 4 % et de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon cacodylate (pH 7,4) pendant 15 min à 4"C. Il a déjà été démontré que la présence de la matrice extracellulaire est associée au maintien des fonctions hépatocytaires en co-culture. Le rôle de l'AcM L8 sur le dépôt de la matrice extracellulaire a été étudié en co-culture en utilisant la coloration de la réticuline. On rapporte, sur les figures 5A et 5B, les micrographies obtenues avec des co-cultures établies en ajoutant les CEFR 4 heures après avoir ensemencé les hépatocytes pour obtenir une monocouche de cellules. La coloration est effectuée sur des co-cultures de 3 jours, traitées tous les jours avec 2 pl/ml de fluide d'ascites de cellules de myélome SP2/0-Ag servant de témoin (A) et de fluide d'ascites obtenus avec des hybridomes secrétant l'AcM L8 (B). Dans les cellules en co-culture non traitées, la matrice extracellulaire est tout d'abord localisée entre les deux populations cellulaires. Cette trame ou réseau couvre graduellement les colonies d'hépatocytes en une semaine. L'addition précoce et journalière de 5 pg et 10 pg par ml de l'AcM L8 aux co-cultures inhibe fortement le dépôt de la matrice extracellulaire dans les deux conditions de co-culture mise en oeuvre. Les résultats donnés ci-dessus ayant montré que l'activité de la protéine de l'invention est inhibée par l'anticorps monoclonal la reconnaissant spécifiquement durant l'établissement des contacts entre les deux populations cellulaires, des expériences ont été réalisées pour étudier l'effet de cet anticorps sur l'attachement des hépatocytes aux CEFR. On rapporte sur les figures 5C et 5D les micrographies obtenues avec ces co-cultures. Des boîtes de 3,5 cm de diamètre couvertes par une monocouche confluente de CEFR sont préincubées avec 2 p1 de fluide ascitique de SP2/O-Ag (C) ou de L8 (D) par ml de milieu dépourvu de sérum pendant 1 heure. Les hépatocytes fraîchement isolés (106 cellules) sont alors ensemencés et maintenus à 37"C dans le même milieu contenant SP2/0-Ag ou l'AcM L8. Les milieux des fioles sont récoltés en double au bout de 2, 3, 4, 7 et 22 h et le nombre d'hépatocytes non attachés est estimé en mesurant l'activité lactate déshydrogénase après lyse des cellules avec PBS contenant 0,2 % de Triton X-100. On n'observe aucune différence significative dans l'attachement des hépatocytes aux CEFR en présence de l'AcM L8. Les différences entre les cellules traitées ou non traitées sont observées seulement après trois jours et consistent en un retard à l'étalement de l'hépatocyte dans la co-culture avec l'AcM L8, tandis que les cellules non traitées ne s'étalent pas bien. De plus, le dépôt de matrice extracellulaire est fortement réduit et la viabilité des hépatocytes est limitée à quelques jours comme indiqué ci-dessus. On a également vérifié si l'AcM L8 est capable d'altérer l'adhésion des hépatocytes à différents composants de la matrice extracellulaire. On rapporte les résultats obtenus avec les substrats suivants : gel de EHS, fibronectine, collagène IV, laminine, complexe laminine-entactine, héparanesulfate, sont examinés. On recouvre avec 2 pg de protéines les fonds des flacons de culture de tissus renfermant des puits de 0,32 cm2 contenant 100 pl de milieu dépourvu de sérum. Après 2 h, on ajoute 3 % de BSA à une (concentration finale de 1,5 %) pendant encore 30 min. Le milieu est éliminé et les hépatocytes préalablement incubés pendant 30 min dans un milieu dépourvu de sérum contenant des quantités croissantes d'AcM L8 ou de fluide ascitique SP2/0-Ag et 0,02 % de BSA sont ensemencés. Au bout d'une heure, les cultures sont lavées deux fois avec PBS. Le nombre d'hépatocytes attachés et non attachés est mesuré comme décrit ci-dessus. L'ensemencement d'hépatocytes dans un milieu contenant des concentrations croissantes en AcM L8 ou en fluide ascitique SP2/0-Ag n'empêche pas ou ne retarde pas l'attachement à des substrats de plastique, fibronectine, laminine, complexe laminine-antactine-collagène IV, héparane-sulfate-protéoglycane. La préincubation des cellules avec l'AcM L8 n'affecte pas ces résultats. I1 a de plus été vérifié que les hépatocytes ensemencés avec l'AcM L8 sur des boîtes recouvertes de gel ESH ne montrent aucun changement dans leur survie et leur capacité fonctionnelle. Ces données suggèrent que l'épitope reconnu par l'AcM L8 n'est vraisemblablement pas impliqué dans la réactivité avec la matrice extracellulaire. IX Caractérisation des polypeptides reconnus par l'AcM L8. On effectue l'immunoprécipitation sur des lysats cellulaires après iodination de la surface cellulaire des hépatocytes et des CEFR (21). Les cellules sont marquées avec Na [1251] par réaction catalysée à la lactoperoxydase. Les lysats des différentes sources sont précipités avec le fluide d'ascites obtenus avec les hybridomes secrétant l'AcM L8. On réalise une incubation 90 min avec 3 ul de fluide ascitique. Afin d'éliminer les fixations non spécifiques, le fluide ascitique est traité par de la protéine A-Sépharose avant utilisation. Les échantillons sont ensuite incubés avec des IgM faits chez la chèvre anti-souris, puis de la protéine A-Sépharose. Les billes d'affinité sont lavées avec le tampon de lyse et le matériau fixé est élué avec 100 p1 d'échantillon tampon selon Laemmli (22) pour déterminer le poids moléculaire, ou avec 100 p1 de tampon de lyse selon O'Farell (23) pour déterminer le pI.L'électrophorèse SDS-PAGE est effectuée en gel de polyacrylamide formant un gradient linéaire de 4 à 15 % ou de 7,5 à 15 % dans le système tampon de Laemmli évoqué ci-dessus. La mesure de l'isoélectrofocus est effectuée avec des Ampholines de pH 3 à 10 dans le système tampon O'Farell mentionné plus haut. détermination du poids moléculaire. La figure 6A donne les résultats obtenus par analyse SDS-PAGE dans des conditions réductrices avec des immunoprécipités de lysats de cellules endothéliales de cornée de boeuf (piste 1), des hépatocytes (piste 2) et de CEFR (piste 3). L'analyse SDS-PAGE des immunoprécipités de l'AcM L8 montre deux chaînes peptidiques ayant des poids moléculaires apparents de 85 kD et 73 kD à la fois pour les hépatocytes et les CEFR. Ces deux bandes ne sont jamais détectées après immunoprécipitation avec le fluide ascitique des cellules de myélome SP2/0-Ag utilisées pour la fusion et servant de témoin, ni lorsqu'on prépare des lysats détergents iodés à partir de cellules endothéliales de cornée de boeuf (piste 1). Sur la figure 6B, on a représenté les résultats de l'analyse SDS-PAGE dans des conditions non réductrices des immunoprécipités obtenus avec les hépatocytes (piste 1) et les CEFR (piste 2). On constate que les deux polypeptides sont constamment présents aussi bien dans des conditions réductrices que non réductrices, ce qui suggère que les deux chaînes ne sont pas liées par des ponts disulfure. La chaîne la plus lourde (85 kD) paraît migrer légèrement plus vite dans des conditions non réductrices avec un poids moléculaire apparent de 80 kD. mesure du pI (figure 6C) Le pI est de 4,9 - 5,1 environ pour le polypeptide de 85 kD et de 5,2 pour celui de 73 kD. Les hépatocytes sont soumis à une extraction avec du Triton X-114 et à un fonctionnement de phase à 30"C comme décrit dans (24). Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 6D. Les deux polypeptides sont essentiellement récupérés à partir de la phase hydrophobe (piste 1), ce qui est à relier à leur nature membranaire. Ils ne peuvent être extraits de la membrane du plasma après traitement avec PBS ou EDTA. La phase aqueuse (piste 2), la phase hydrophobe (piste 3) et la phase aqueuse (piste 4) sont immunoprécipitées avec 1' AcM L8. X Etude de l'immunoréactivité de différents tissus avec l'AcM L8. follicule ovarien de rat On a représenté sur les figures 7A et 7B de photos de follicule ovarien de rat respectivement à faible (A) et fort (B) après réaction avec l'AcM L8. On observe sur ces figures le follicule mature comportant des cellules folliculaires et l'ovocyte avec formation d'un atrium. On observe également un petit follicule immature sans atrium. On constate un marquage tout autour des cellules folliculaires proches de l'ovocyte et autour de l'ovocyte lui-même, indiquant une immunoréaction avec l'AcM L8. Intestin grêle Sur la figure 7C, on a représenté une photo d'une coupe d'intestin grêle montrant des villosités intestinales. Aucune réaction avec l'AcM L8 n'est observée. Seules les hématies apparaissent colorées. Testicule de rat. La figure 7D représente une photo d'une coupe de testicule de rat montrant plusieurs tubes séminifères. On reconnaît à la périphérie les spermatocytes marqués par l'AcM L8, mettant en évidence l'expression de protéines de l'invention par ces cellules. XI Extraction de la protéine membranaire du plasma Les cultures sont lavées 3 fois avec du PBS, puis les cellules sont détachées de la boîte de Pétri, centrifugées à 6 500 t/min pendant 10 secondes et solubilisées soit dans du Triton X-100 à 1 %, du SDS à 0,01 %, 2 mM d'EDTA, 130 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) ou dans du Triton X-114 à 1 %, 130 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4), en passant cinq fois au travers d'une aiguille G26 avec une seringue et maintenue 30 min à 4" C. On ajoute dans tous les tampons deux inhibiteurs de protéases, à savoir l'aprotinine (100 UI/ml) et du phénylméthylsulfoxyde (2mM). Les lysats cellulaires sont centrifugés 10 min à 13 000 t/min. Lorsque le matériau soluble est extrait dans du Triton X-114, on le soumet à une séparation de phase, puis on ajuste les deux phases en ajoutant soit du Triton X-114 ou le tampon afin d'obtenir les mêmes teneurs en sels et en agents tensioactifs dans les différents échantillons. Références bibliographiques 1/ Kleinman H.K. et al. Biochemistry 21:6188-6193, 1982 2/ Timpl R. et al. J. Biol. Chem. 254:9933-9937, 1979 3/ Hassel J.R., et al. J. Biol. Chem. 260:8098 - 8105, 1985 4/ Sargent T.D., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:3256-3260, 1979 5/ Simon M.P. et al. J. Biol. Chem. 258:14567-14584, 1983 6/ Clavel C. et al. Int. J. Cancer. 44:548-553, 1989 7/ Leroux-Nicollet I. et al. Biochem. Res. Commun. 114:556-563, 1983 8/ Rheinwald J.G. et al. Cell. 6:317-330, 1975 9/ Gospodarowicz D. G. et al. Exp. Eye Res. 29:485-509, 1979 10/ Arruti C. et al. Exp. Cell. Res. 117:283-292, 1978 11/ Seglen P.O. Exp. Cell. Res. 76:25-30, 1973 12/ Guguen C. et al. Biochimie 57:1065-1071, 1975 13/ Guguen-Guillouzo C. et al. Exp. Cell Res. 143:47-54, 1983 14/ Williams G.M. et al. Exp. Cell Res. 69: 106-112, 1971 15/ Morel-Chany E. et al Eur. J. Cancer. 14:1341-1352, 1978 16/ Goding J.W. 1986. Academic Press Inc. London. 104-141, 1986, Godin J.W. editor. 17/ Garcia Gonzalez M. S. et al. J. Immunol. Meth. 111:17 23, 1988. 18/ Lescoat G. N., Cell Differ. 16:259-268, 1985. Guillouzo, A. et al. C. Biol. Cell. 43:163-172, 1982. 19/ Chirgwin J.M. et al. Biochemistry. 18:5294-5299, 1979. Andrews G. K. et al., J. Biol. Chem., 257:5148-5153, 1982. Eur. J. Biochem. 67:247-256, 1976. 20/ Gordon H. et al., Am. J. Pathol. 12:545-551, 1936. Rubin K. et al, Exp. Cell Res. 163:127-138, 1986. 21/ Clément,B., et al. J. Biol. Chem. 264:12467-12471, 1989. 22/ Laemmli U.K., Nature (Lond.) 227:680-685, 1970. 23/ O'Farell P., J. Biol. Chem. 250:4007-4021, 1975. 24/ Bordier, C., J. Biol. Chem. 256:1604-1607, 1981. REVENDICATIONS 1/ Protéines capables notamment de constituer des facteurs de régulation fonctionnelle de la cellule, caractérisées en ce qu'elles comprennent ou sont constituées par une séquence d' acides aminés capable de réagir spécifiquement avec un anticorps monoclonal tel qu'obtenu par immunisation d'un animal avec des cellules épithéliales de rat d'origine hépatique vivantes, suivie des étapes de fusion et de clonage effectuées selon les techniques classiques, en particulier avec l'anticorps monoclonal secrété par le clone déposé à la D.S.M. le 19 juin 1991 sous le n" DSM ACC 2011. 2/ Protéines selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles constituent des protéines de communication entre les cellules d'un type donné et les cellules hétérologues contigües ou proximales. 3/ Protéines selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que, dans les tissus adultes, elles sont exprimées au niveau du foie, du pancréas exocrine, des testicules et des ovaires. 4/ Protéines selon la revendication 3, caractérisées en ce que, au niveau cellulaire dans le foie adulte normal, leur localisation est membranaire et polarisée au pôle sinusoïdal des hépatocytes. 5/ Protéines selon la revendication 3, caractérisées en ce que, dans les tissus du foie, elles sont exprimées par les hépatocytes, et d' autres cellules non parenchymenteuses, notamment les cellules épithéliales des ductules biliaires, les cellules endothéliales et les cellules de Ito. 6/ Protéines selon la revendication 3, caractérisées en ce que, dans les testicules, elles sont exprimées au niveau des tubes séminifères par les cellules de Sertoli et les spermatocytes à un stade précis de maturation, fin leptotène et zygotène. 7/ Protéines selon la revendication 3, caractérisées en ce que, dans l'ovaire, elles sont exprimées par les ovocytes matures et les cellules folliculaires qui les entourent. 8/ Protéines selon l'une des revendications 5, 6, ou 7, caractérisées en qu'elles correspondent à une séquence d'acides aminés ayant un poids moléculaire apparent de 85 000 daltons environ, avec un pI de 4,9 à 5,1 environ. 9/ Protéines selon l'une des revendications 5, 6, ou 7, caractérisées en ce que leur séquence d'acides aminés possède un poids moléculaire de 73 000 daltons environ, avec un pI de 5,2 environ. 10/ Protéines selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une seule chaîne protéique. 11/ Protéines selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce qu'il s'agit de glycoprotéines. 12/ La partie active des protéines selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, capables d' assurer la régulation cellule-cellule, en particulier la partie glycosylée de ces protéines. 13/ Protéines recombinantes, ou telles qu'obtenues par voie de synthèse, caractérisées en ce qu'elles renferment la partie active des protéines selon la revendication 12. 14/ Analogues des protéines selon 1' une quelconque des revendications 1 à 13, dont la séquence comporte un ou plusieurs acides aminés différents par rapport aux séquences desdites protéines ou parties actives, et/ou délétés, et/ou substitués, dès lors que ces changements n' altèrent pas leurs propriétés dans la communication cellulaire. 15/ Procédé d'obtention de protéines selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact d'un extrait de membranes de foie avec un anticorps monoclonal capable de reconnaître spécifiquement une protéine de surface de cellules épithéliales de foie de rat, ou un fragment Fab ayant une telle propriété. 16/ Anticorps polyclonaux capables de reconnaître une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, en donnant lieu à un complexe du type antigèneanticorps, et anticorps monoclonaux capables de réagir spécifiquement avec un épitope d'une telle protéine, ou leurs fragments Fab, en particulier ceux sécrétés par le clone déposé à la D.S.M. sous le n" DSM ACC 2011 le 19 juin 1991. 17/ Application d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 comme facteur de régulation cellulaire, en particulier à la culture cellulaire notamment d'hépatocytes, et en particulier d'hépatocytes humains. 18/ Kit pour culture cellulaire, caractérisé en ce qu il comporte une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 et les réactifs ou une partie des réactifs nécessaires pour réaliser une culture cellulaire donnée, ainsi qu'avantageusement les cellules concernées. 19/ Application d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 comme marqueur de différenciation cellulaire, de polarité cellulaire ou encore de distribution cellulaire, et en particulier comme marqueur des cellules germinales à un stade donné de leur différentiation. 20/ Méthode pour mettre en évidence dans un échantillon biologique ou des cellules la présence de protéines selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes - on met en contact l'échantillon à analyser avec une préparation d'un anticorps monoclonal selon la revendication 15, ou d'un fragment Fab, immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec ladite protéine, lorsqu'elle est présente dans l'échantillon, puis, - on met en évidence la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps en opérant avantageusement selon les techniques habituelles. 21/ Kit pour la mise en évidence de la présence dans un échantillon biologique ou des populations cellulaires, de protéines selon 1' une quelconque des revendications 1 à 14, en particulier aux fins de diagnostic ou de sélection cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend - une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration, - une préparation d'anticorps ou de fragement Fab libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus, - des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.