Brevet FR2677252A1 — publié le 19921211

La présente invention est relative à l'utilisation de la jacaline , de ses fragments ou de ses dérivés dans le traitement des maladies liées aux virus HIV. Elle a d'autre part pour objet des compositions pharmaceutiques contenant la jacaline , ses fragments ou ses dérivés . La glycoprotéine de surface CD 4 des cellules T agit comme récepteur cellulaire pour les virus HIV . Son interaction avec la glycoprotéine de l'enveloppe virale gp 120 est probablement une des premières étapes dans l'infection naturelle par le virus HIV Il semble clair in vivo , que le virus HIV échappe aux effets des anticorps neutralisants à cause de la variabilité importante des séquences d'aminoacides de la gp 120 dans les différents isolats du virus HIV . Cependant malgré cette hétérogénéité , pour toutes les variantes caractérisées jusqu'à présent , une interaction entre le CD 4 et le virus semble obligatoire pour maintenir un cycle d'infection . De ce fait , l'inhibition de la fixation du virus sur la cellule cible par le biais d'une protection du récepteur CD 4 a été une des stratégies majeures mise en oeuvre pour bloquer l'infection par le HIV. La jacaline , qui est une protéine composante majoritaire des graines du jaque (Artocarpus Heterophyllus) a été précédemment testée dans un but de diagnostic sur des cellules de patients atteints à différents stades par le virus HIV ( Pineau et al. Aids , 1989, 3: 659-663). Il a été montré in vitro que la jacaline active de manière spécifique des cellules lymphocytaires CD4+ . Les réponses à ces activations sont très différentes en fonction du stade de la maladie des patients étudiés , ce qui laisse supposer selon les auteurs la possibilité de corréler dans un but de diagnostic l'activation des CD4+ avec l'évolution ultérieure du SIDA Cette étude a été suivie par un article de PINEAU et al.( Clin. Exp.Immunol. , 1990, 80: 420-425) qui précise l'activation in vitro de différents types cellulaires des cellules du sang par la jacaline Ces publications , si elles indiquent une utilisation potentielle de la jacaline dans un but de diagnostic, ne mentionnent en aucune façon la possibilité d'utiliser la jacaline dans un but thérapeutique Le demandeur s'est donc attaché à étudier les effets de la jacaline sur les virus HIV Les travaux menés selon l'invention ont montré de manière surprenante que la jacaline inhibe de manière spécifique la fixation des virus HIV sur les récepteurs CD 4 des lymphocytes La présente invention a donc pour objet l'utilisation de la jacaline , de ses fragments ou de ses dérivés dans le traitement des maladies liées au virus HIV Cette utilisation présente l'avantage d'être adaptée à toutes les souches des virus HIV .En effet, comme indiqué précédemment , la liaison du virus au récepteur CD4 est une étape obligatoire dans l'infection des cellules Un autre avantage de cette utilisation réside dans le fait que l'interaction de la jacaline avec le CD4, contrairement à certains anticorps monoclonaux anti-CD4 n'inhibe pas les fonctions normales des lymphocytes et donc ne supprime pas chez les patients séropositifs , la réponse immunitaire normale des cellules CD4+ non infectées par le virus .L'action de la jacaline ne diminue donc en aucune manière les fonctions physiologiques normales des lymphocytes CD4 La présente invention a d'autre part pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une quantité efficace de jacaline , d'un ou plusieurs de ses fragments ou d'un ou plusieurs de ses dérivés en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables . Ces compositions sont destinées au traitement des maladies liées aux virus HIV et peuvent être présentées en vue de l'administration orale , parentérale ou intraveineuse La présente invention est en outre relative à des médicaments contenant la jacaline , un ou plusieurs de ses fragments ou un ou plusieurs de ses dérivés , et en particulier des médicaments pour le traitement des maladies liées aux virus HIV. La jacaline , ses fragments ou ses dérivés peuvent être naturels ou synthétiques , et peuvent notamment être obtenus par recombinaison génétique Il est à noter que la jacaline peut aussi être obtenue par la méthode décrite par Aucouturier et al. (Molec. Immunol. 24, 503, 1987). La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent et les dessins annexés dans lesquels - la figure 1 représente l'autoradiogramme d'une hybridation protéine-protéine (Western Blot) effectuée par passage sur des billes de sépharose-jacaline d'un extrait de cellule solubilisée (puits B) . Un témoin a été effectué par passage sur des billes de sépharose ne portant pas la jacaline (puits A). - La figure 2 illustre l'interaction entre la jacaline et le CD 4 soluble recombinant adsorbé sur de la nitrocellulose - La figure 3 illustre l'effet de la jacaline sur la liaison des anticorps anti-CD4 OKT4 et ORT4A sur des lymphocytes humains du sang périphérique - La figure 4 illustre l'effet de différentes concentrations de la jacaline sur l'infection par le virus HIV de cellules CD4+. La figure 5 illustre comparativement les effets de la jacaline et de la PHA sur le phénotype (CD2, CD4, CD8 d'une population lymphocytaire . Le nombre de jours de culture est indiqué en abscisse , le pourcentage de cellules fluorescentes en ordonnée La figure 6 est un autoradiogramme correspondant à une feuille de nitrocellulose sur laquelle ont été déposées des gouttes de CD4 et gp 120 à diverses concentrations , et qui a été mise en contact d'une solution contenant de la jacaline marquée EXEMPLE 1 Mise en évidence de l'interaction entre la lacaline et le CD4. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été obtenues à partir de donneurs sains . Elles ont été isolées par centrifugation sur gradient de " Ficollhypaque" (milieu de séparation des lymphocytes, Eurobio, Les Ulis, France ). Les PBMC et les CEM (lignée T leucémique) sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum de veau foetal, 1% de mélange d'antibiotiques et 1% de glutamine 107 cellules CEM sont solubilisées dans 100 pl de tampon de lyse (1% de détergent Nonidet P40 , 1% de phényl méthyl sulfonyl fluoride ( PMSF) lOOmM dans tampon Tris 10 mM, pH 8 contenant NaCl et de l'azidure de Na). Le solubilisat obtenu est incubé une nuit à 4"C en présence de jacaline immobilisée sur Sépharose (Pierce) ; le complexe récupéré par centrifugation est dissocié en tampon de Laemmli à l00C. Le surnageant est soumis à une électrophorèse SDS et Western blot sur nitrocellulose . La membrane de nitrocellulose est ensuite plongée dans une solution contenant un mélange de deux anticorps monoclonaux anti-CD4 (ST4 et ST40, fourni par C. Carrière, Sanofi , Montpellier, France) préalablement marqués à 1' 125I en présence de iodogêne . Les bandes CD4 révélées ont été visualisées par autoradiographie L'autoradiogramme de la figure 1 montre qu'il y a interaction entre le CD 4 isolé à partir de cellules , et la jacaline EXEMPLE 2 Fixation de la iacaline sur le CD4 soluble recombinant 3 pg de CD 4 soluble ( dans 2 p1) ,sont déposés sur des bandes de nitrocellulose déshydratée . Ces bandes sont ensuite saturées avec une solution à 1 % de poudre de lait non grasse dans un tampon PBS durant deux heures à température ambiante Les bandes sont ensuite incubées durant 1 h 30 à la température ambiante dans 1 ml d'une solution PBS ( 0,05 % Tween 20) contenant 2 pg de jacaline 125 I (106 cpm ). Après 3 lavages avec du PBS - Tween et séchage ( 1 heure à température ambiante ) , les bandes de nitrocellulose sont exposées L'autoradiogramme de la figure 2 montre que la jacaline iodée se lie au CD 4 soluble déposé sur les bandes de nitrocellulose Ce résultat démontre l'interaction directe entre la jacaline et la molécule de CD 4 soluble EXEMPLE 3: Effet de la jacaline sur la fixation à' anticorps monoclonaux anti-CD 4. Afin de préciser le domaine de la CD4 impliqué dans sa liaison avec la jacaline , l'influence du pré-traitement par la jacaline de lymphocytes humains du sang périphérique sur la liaison de deux anticorps monoclonaux anti-CD4 ( FITC OKT4 et FITC-OKT4A) a été étudiée par cytométrie de flux. Des cellules mononucléaires sanguines de donneurs sains ont été préparées dans un gradient de Ficoll , et ont été incubées ( 106 cellules/ml ) dans un milieu RPMI 1640 avec 200 pg/ml de jacaline ou 2 pg/ml de gp 120 recombinante durant 15 minutes à 37'C Après deux lavages , 106 cellules sont incubées avec 250 ng de FITC OKT4 ou FITC OKT4A dans un volume total de 250cul pendant 30' à 4'C Les cellules témoins ont reçu le même traitement à l'exception de l'incubation avec la jacaline ou la gp 120. Apres deux lavages , les lymphocytes sont analysés par cytométrie de flux Les figures 3A à 3D représentent l'intensité de la fluorescence (en abscisse) en fonction du nombre de cellules (en ordonnée On voit que la fluorescence totale induite par la fixation de FITC OKT4 n'est pas modifiée par le traitement par la jacaline (figure 3A) et que la fixation de FITC OKT4A est diminuée par le traitement par la jacaline (figure 3B). Les mêmes résultats sont obtenus quand les cellules sont prétraitées avec la GP 120 au lieu de la jacaline (figures 3 C et 3 D). Ces résultats montrent que la jacaline inhibe seulement la fixation de l'anticorps FITC- OKT4A. Il est à noter que l'anticorps FITC- OKT4A est dirigé contre une épitope du CD4 identique ou très proche du type de liaison du virus HIV EXEMPLE 4 Inhibition de l'infection par le virus HIV. 5.105 CEM sont incubées 30 minutes à 4 C avec différentes concentrations de jacaline dans un volume de 100 pl dans une plaque de 96 micropuits , puis mises en contact 30 minutes à 4 C avec 100 pl d'une solution diluée au 1/103 d'une suspension de VIH1-BRU correspondant à 100 TCID50 . Les cellules sont ensuite lavées 5 fois avec 200 pl de milieu de culture puis recultivées à la concentration de 5.105 cellules par ml en plaque de 24 puits dans un volume de 1 ml en présence de jacaline . La production virale est évaluée deux fois par semaine par mesure de l'activité transcriptase inverse dans le surnageant de culture .Les infections témoins sont réalisées dans les mêmes conditions mais en absence de jacaline Les différentes concentrations de jacaline utilisées sont 0,01 pg/ml, 0,1 Hg/ml , et 1 Hg/ml. La figure 4 résume les résultats obtenus et montre que la jacaline retarde de façon dose-dépendante la production de virions par les cellules CEM et exerce un effet protecteur à une concentration de 1 pg / ml. EXEMPLE 5 Effets comparatifs de la iacaline et de la phytohémaglutinine ( PHA) sur le phénotype d'une population de lymphocytes humains. Des PBMC ont été cultivées durant lO jours en présence de jacaline ( 50 ;g/ml ) ou de PHA ( 10 Hg/ml ). Les effets de chaque lectine sur le phénotype ( CD2, CD4 , CD8 ) de la population lymphocytaire ont été évalués par cytofluorométrie à t = 0 , à 4 jours et à 10 jours La figure 5 illustre cette étude Cette figure montre que la stimulation par la PHA n'induit pas une variation notable dans le phénotype de la population lymphocytaire après lO jours de culture Par contre , la stimulation par la jacaline modifie clairement le pourcentage de chaque type cellulaire Après 4 jours de culture, la majorité des cellules viables sont des CD+4 .L'addition d'interleukine-2 après 4 jours de culture ne modifie pas les résultats EXEMPLE 6 Etude de la liaison de la iacaline sur le SCD4 recombinant et la sp 120 recombinante Diverses concentrations de sCD4 et de gp 120 ( 1; 0,5 et 0,25 pg/ml) sont déposées en goutte sur une feuille de nitrocellulose Cette feuille est ensuite incubée dans une solution de jacaline marquée par 125I. L'interaction entre la jacaline et les deux protéines est mise en évidence par autoradiographie La figure 6 montre que la jacaline n'interagit pas de manière significative avec la gpl 20 , ce qui suggère que l'inhibition de l'infection par le HIV ne résulte pas d'une interaction entre la jacaline et la gp120. EXEMPLE 7 Effet de la iacaline sur la synthèse d'interleukine 2 L'effet de la jacaline à 50 pg/ml en combinaison avec l'acétate de phorbol myristate sur l'induction de la synthese de l'interleukine-2 dans deux lignées cellulaires JURKAT respectivement de phénotypes CD2+/ CD3 /CD4+ et CD2+/ CD3/CD4 à été étudié. On a trouvé qu'en dépit de l'absence de récepteurs CD3 la jacaline est capable d'induire la synthèse d'interleukine 2 , si le récepteur CD 4 est présent Par contre , dans les cellules CD4 , il n'y a pas de production d'interleukine 2 lors de la stimulation combinée. REVENDICATIONS 1. Utilisation de la jacaline , de ses fragments ou de ses dérivés pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies liées au virus HIV. 2. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace de jacaline , d'un ou plusieurs de ses fragments ou d'un ou plusieurs de ses dérivés en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement des maladies liées aux virus HIV 4. Composition selon l'une des revendications 2 et 3 présentée en vue de l'administration orale , parentérale ou intraveineuse 5. Médicament contenant de la jacaline , un ou plusieurs de ses fragments ou un ou plusieurs de ses dérivés. 6. Médicament selon la revendication 5 pour le traitement des maladies liées aux virus HIV.