Brevet FR2682875A1 — publié le 19930430

UTILISATION DE L'ACIDE POLYSIALIQUE a2-8 POUR LA REGULATION DE L'ACTION DES PEPTIDES HOMEOBOITES. La présente Invention est relative à la régulation de l'internalisation et du transport intracellulaire de facteurs ayant la propriété de se fixer à 1'ADN, en particulier de peptides homéoboîtes, ou de molécules comprenant lesdits peptides. Plusieurs protéines capables de se fixer sur 1'ADN et de réguler l'expression de différents gènes sont connues : on peut citer par exemple les protéines dites à doigt-zinc (protéines dactyles) incluant en particulier des récepteurs nucléaires des stéroïdes, les protéines à fermeture éclair à leucine, et les protéines à structure hélice-tour-hélice dont font partie les homéoprotéines. Les homéoprotéines interagissent avec 1'ADN par l'intermédiaire d'une région spécifique, dite homéodomaine ou domaine homéoboîte, possédant une structure hélice-tour-hélice, très conservée non seulement d'une homéoprotéine à l'autre, mais également à travers le règne animal, d'une espèce à une autre. La liaison peptide homéoboîte/ADN serait la résultante - d'une liaison à haute affinité (KD 10-9 - l0-1 X), impliquant une séquence consensus ATTA présente dans le promoteur de différents gènes - et d'une liaison à faible affinité (KD 10-6 - 10-7M), impliquant le sillon large de la double hélice d'ADN. Une publication de KISSINGER et al. [Cell, 63, 579 - 590, (1990)] décrit une étude faite par cristallographie sur un complexe "homéodomaine engrailed/ADN". Cette étude montre que la partie C-terminale de l'homéodomaine, comprenant en particulier la structure dénommée hélice 3 (acides aminés 42-58 de l'homéodomaine engrailed), se fixe au niveau du sillon large de 1'ADN. La liaison est essentiellement assurée par des interactions hydrophiles ; cette liaison serait indépendante de la présence de la séquence consensus. Les Inventeurs ont récemment démontré que des peptides possédant la séquence du domaine homéoboîte (de tels peptides sont dénommés dans ce qui suit : "peptides homéoboîte") pénètrent dans les neurones en culture et provoquent une différenciation intense de ces cellules, et en particulier la croissance de leur neurites. La découverte de ces propriétés a permis de proposer l'utilisation de ces peptides comme facteurs de croissance neurotropes, et également comme transporteurs transmembranaires et/ou intracellulaires de différentes macromolécules telles que les polypeptides ou des oligonucléotides (Demande Internationale PCT/FR 91/00444). Toutefois, les Inventeurs ont observé que ce phénomène de pénétration dépendait du type cellulaire l'entrée d'un peptide homéoboîte dans des cellules telles que les fibroblastes est, par exemple, beaucoup moins importante que dans les cellules nerveuses. En poursuivant leurs travaux sur les mécanismes d'entrée du peptide homéoboîte, les Inventeurs ont maintenant mis en évidence différents facteurs conditionnant ce mécanisme d'entrée. Ils ont émis l'hypothèse de l'existence d'une structure cellulaire intervenant dans le transport transmembranaire et intra-cellulaire du peptide homéoboîte, et ont à présent montré l'existence d'une telle structure, impliquant un polysaccharide : l'acide polysialique a2-8, également dénommé acide colominique, qui est présent à la surface de différentes cellules, par exemple les cellules nerveuses jeunes ou en régénération, les myoblastes, certaines populations de lymphocytes T, et qui est porté par une protéine membranaire, la "molécule d'adhésion neuronale" ou NCAM. Les Inventeurs ont constaté que le peptide homéoboîte pénètre dans toutes ces cellules, en quantité 10 fois plus importante que dans les cellules dépourvues de ce récepteur. Ils ont en outre vérifié par des expériences sur la pénétration intra-cellulaire du peptide homéoboîte dans les neurones, que l'entrée dudit peptide, et par voie de conséquence ses effets biologiques, étaient réduits en présence d'acide colominique. Ils ont fait les mêmes observations - lorsque les neurones sont prétraités par une enzyme, l'Endo-N, qui clive spécifiquement les liaisons a2-8 de l'acide polysialique - lorsque les neurones sont préincubés en présence d'un anticorps anti-acide colominique. Ces résultats montrent le rôle essentiel joué par l'acide colominique dans le système de pénétration du peptide homéoboîte, et l'existence d'une interaction spécifique entre la séquence peptidique homéoboîte et 1 'acide colominique. Ils ont en outre établi que l'effet de l'acide colominique sur la pénétration intracellulaire du peptide homéoboîte est comparable à l'inhibition par des frag ments d'ADN précédemment observée (Demande PCT/FR 91/00444). Cette constatation les a conduits à comparer les structures tridimensionnelles respectives de l'acide colominique et de l'ADN double brin (sous la conformation B), établies par RMN et cristallographie. La figure 1 illustre les résultats de cette comparaison : les 4 atomes d'oxygène des groupes carboxyle des molécules situées respectivement aux positions 1, 2, 7 et 8 d'un octamère d'acide polysialique, (figure 1 A, à droite) peuvent être superposés avec les 4 oxygènes des groupes phosphate qui délimitent le sillon large de la double hélice d'ADN (figure 1 A, à gauche). Sur l'un des brins, deux desdits groupes phosphate sont adjacents aux paires de nucléotides 1 et 2 ; sur le brin opposé, deux autres groupes sont adjacents aux paires de nucléotides 7 et 8. Cette superposition, est montrée, vue sous 2 angles différents, aux figures 1B et 1C. Or, il a été montré par ailleurs que cette configuration 1 - 2 / 7 - 8 des groupes phosphate jouait un rôle important dans la liaison de faible affinité (indépendante de la reconnaissance d'une séquence consensus) entre les séquences peptidiques homéoboîte et 1'ADN, en intervenant dans les contacts entre les chaînes latérales des acides aminés de l'hélice 3 du peptide et 1'ADN double brin (KISSINGER et al., publication précitée). On désigne ici par hélice 3 une portion de peptide homéoboîte comprenant des acides aminés 42 à 58 de la séquence peptidique. Les acides aminés sont désignés suivant la numérotation utilisée par QUIAN et al. [Cell, 59, 573-580 (1989]. Certains auteurs dénomment également Hélice 3 + 4 cette même région du peptide homéoboîte. Les observations faites par les Inventeurs permettent d'établir l'existence d'une parenté structurale entre l'acide colominique et 1'ADN double hélice, et il apparaît que le site concerné par cette parenté joue un rôle important dans l'interaction peptide homéoboîte/ADN. En procédant à des expériences de mutagénèse d'un peptide homéoboîte, les Inventeurs ont en outre montré que certaines structures de l'hélice 3 jouaient un rôle essentiel dans la pénétration intracellulaire dudit peptide. La présente Invention résulte de cet ensemble de résultats obtenus par les Inventeurs. La démonstration du rôle de l'acide colominique en tant que récepteur des peptides homéoboîte, la mise en évidence de l'interaction peptide homéoboîte/acide colominique, ainsi que l'identification de structures de l'acide colominique et du peptide homéo boîte susceptibles d'intervenir dans cette interaction, entraînent de nombreuses applications, aussi bien invivo, qu' in-vitro. La présente Invention a pour objet l'acide colominique pour l'utilisation comme médicament. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit acide colominique comprend au moins 8 résidus d'acide sialique. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, l'acide colominique est utilisé comme régulateur de l'activité des peptides homéoboîtes et de leurs dérivés. Au sens de la présente Invention, on entend par dérivés de peptide homéoboîte des macromolécules comprenant des structures similaires à celles identifiées par les Inventeurs comme intervenant dans la liaison de ces peptides avec l'acide colominique, et en particulier - des molécules comprenant une partie peptidique dont la séquence est celle d'un peptide homéoboîte : il s'agit par exemple des homéoprotéines naturelles, ou des produits de fusion entre un peptide homéoboîte ou nucléotidique, tels que ceux qui sont décrits dans la Demande PCT/FR 91/00444 - des molécules comprenant ou constituées par une partie peptidique dont la séquence est celle de l'hélice 3 d'un peptide homéoboîte - des molécules comprenant ou constituées par un peptide homéoboîte mutant à condition, bien entendu, que ladite mutation n'abolise pas la capacité de liaison avec l'acide calominique du peptide : cette définition englobe les peptides mutants ayant perdu partiellement ou totalement leur capacité de reconnaissance de l'ADN au niveau d'une séquence consensus, mais ayant conservé leur capacité de pénétration intracellulaire. De telles applications concernent en particulier la possibilité d'étendre le champ d'utilisation des peptides homéoboîte ou de leurs dérivés à tous les types cellulaires, y compris à ceux qui ne possèdent pas naturellement de récepteur pour ces peptides, ainsi que celle de permettre une régulation positive ou négative de l'activité desdits peptides. Par exemple, des molécules d'acide colominique, conjuguées à une molécule pouvant s'insérer dans la membrane cellulaire (lipide, peptide ou un de leurs dérivés glycosylés), peuvent être greffées à la surface d'une cellule, pour créer des récepteurs artificiels des peptides homéoboîtes ou de leurs dérivés, dans le but de la rendre perméable ou d'augmenter sa perméabilité auxdits peptides ou dérivés. Au contraire, si l'on souhaite prévenir les effets résultant de la liaison entre un peptide homéoboîte et 1'ADN cellulaire, l'acide colominique peut être utilisé soit au niveau extracellulaire, comme inhibiteur compétitif de la liaison récepteur/homéoboîte soit au niveau intracellulaire, comme inhibiteur compétitif de la liaison ADN/homéoboîte. On peut également prévenir l'entrée dans la cellule du peptide homéoboîte à l'aide d'un anticorps anti-acide colominique, ou en bloquant ou détruisant par la neuraminisase endo-N, les molécules d'acide colominique jouant le rôle de récepteur L'Invention englobe également des anticorps anti-acide colominique, pour l'utilisation en tant qu'inhibiteurs de la pénétration intracellulaire de facteurs capables de se fixer à l'ADN. La présente Invention a en outre pour objet l'utilisation de l'acide colominique sur des cellules en culture, dans toutes les applications décrites ci-dessus. Elle englobe dans ce cadre, des cellules dont la membrane est modifiée par insertion de récepteurs artificiels des peptides homéoboîtes ou de leurs dérivés, tels que définis plus haut. L'Invention comprend également des compositions pharmaceutiques comprenant en tant que principe actif, de l'acide colominique, ou un anticorps anti-acide colominique. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples démontrant le rôle joué par l'acide colominique dans le transport intracellulaire des peptides homéoboîtes et de leurs dérivés. Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I - DEMONSTRATION DU ROLE DE L'ACIDE COLOMINIOUE DANS LE SYSTEME DE TRANSPORT TRANSMEMBRANAIRE DU PEPTIDE HOMEO BOITE Des peptides pAntp sont synthétisés, purifiés, et lorsque cela est nécessaire, marqués à la fluorescéine, selon les protocoles décrits dans la Publication de JOLIOT et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 18641866 (1991)] et dans la Demande PCT/FR 91/00444. Les cellules nerveuses sont cultivées dans les conditions décrites dans la Demande PCT et la Publication de JOLIOT et al. précitées. EXEMPLE 1. - Pénétration d'une protéine chimère comprenant un peptide homéoboîte dans des cellules de différents types Une protéine chimère a été construite par recombinaison génétique. Cette protéine a la séquence suivante : pAntp-Ser-Arg-rab3Cter. Rab3Cter est constitué par les 34 acides aminés C-terminaux de la protéine codée par le gène rab3, qui est une petite protéine fixant le GTP (G-protéine) et spécifique des systèmes neuro-endocriniens). pAntp-rab3Cter (nom de la protéine de fusion) a été mis au contact de neurones (poulet, rat) ou de myoblastes (poulet) en culture pendant 12 heures, puis la présence de rab3Cter a été recherchée par immunocytochimie à l'aide d'un anticorps dirigé contre rab3. Dans tous les cas, le complexe pAntp-rab3Cter est retrouvé dans le noyau. Cette expérience démontre que - le système de pénétration et d'adressage nucléaire est lié à la présence de PSA (acide colominique) à la surface de la cellule. - pAntp joue le rôle d'un peptide signal à la fois pour l'entrée dans la cellule, et pour l'adressage nucléaire. EXEMPLE 2. - Effet d'un traitement par l'acide colominique sur la pénétration et les effets morphologiques d'un peptide homéoboîte 5000 cellules sont mises en culture dans 10 Rl de milieu de culture, dans des puits de type TERASAKI recouverts d'un substrat de polyornithine (1,5 Rg/ml). Au bout de 24 heures, 10 Fl de milieu de culture contenant soit du pAntp seul (400 Fg/ml), soit du pAntp préincubé avec 100 Rg/ml ou 1 mg/ml de PSA (acide colominique, SIGMA), soit du PSA seul sont ajoutés. L'aspect morphologique des cultures est analysé 24 heures plus tard. Les résultats de cette expérience sont les suivants Les cellules auxquelles a été ajouté le PSA seul ont une morphologie et une croissance similaire à celles des cellules témoin cultivées sans additif. Les cellules cultivées en présence de pAntp montrent une augmentation de la croissance neuritique, caractéristique de l'action de ce peptide. Les cellules cultivées en présence de PSA (aux deux concentrations testées) et de pAntp ont une morphologie et une croissance similaire à celles des cellules témoin. Il apparaît donc que la présence de PSA seul ne perturbe pas la croissance des neurites, et que le PSA antagonise les effets morphogénétiques de pAntp. EXEMPLE 3. - Effet d'un traitement par l'endo-N sur la pénétration d'un peptide homéoboîte Des cellules de moelle épinière d'embryons de rat (2.104 cellules/20 ,ul de milieu de culture) sont étalées sur des lamelles de verre recouvertes de polyornithine (SIGMA, PM 40.000, 15 llg/ml). 24 heures après, les cellules sont incubées pendant 1 heure en présence d'une solution (107 PFU/ml) de neuraminidase Endo-N du phage PK 1A [FINNE et MAKELA, J. Biol. Chem. 260, 12 1265-1270 (1985)], puis pendant 1 heure en présence de 1Clg de peptide pAntp marqué à la fluorescéine. Un témoin, dans lequel la solution d'Endo-N est remplacée par du milieu de culture, est également réalisé. A la fin de l'incubation, les cellules sont lavées, puis fixées dans une solution éthanol/acide acétique (95/5) (5 minutes, -20 s séchées à l'air, et montées dans du moviol. L'examen au microscope montre que - dans les cellules témoin, une fluorescence importante est observée à l'intérieur de la cellule avec une intensité particulière dans le nucléoplasme, ce qui correspond à la répartition caractéristique du peptide pAntp. - dans les cellules prétraitées à l'Endo-N, la fluorescence intracellulaire est très faible. EXEMPLE 4. - Effet d'un traitement par un anticorps antiacide colominique sur la pénétration d'un peptide homéoboîte Un antisérum anti-ménigocoque B (qui est essentiellement constitué d'anticorps dirigés contre l'acide colominique) est utilisé pour cette expérimentation. Des cultures de 24 heures de neurones de moelle épinière de rat (2.106 cellules) sont préincubées pendant 1 heure en présence d'antisérum anti-méningocoque (dilution 1/10). Ces cellules ainsi que des cellules témoins sont incubées pendant 3 heures en présence de 20 Rg de peptide pAntp. Les cellules sont ensuites lavées 3 fois dans du PBS, puis trypsinisées (15 minutes à 37 C) pour éliminer les peptides pAntp n'ayant pas pénétré. Après 3 lavages dans le PBS, les cellules sont lysées en présence de NP 40 (15 minutes, 4 C) et d'inhibiteurs des protéases. Le lysat est centrifugé (2000 g, 15 minutes, 4 C) et le culot contenant les noyaux est recueilli et solubilisé dans une solution de Nacl 500 mM DTT 1 mM. L'extrait nucléaire ainsi obtenu est analysé sur un gel SDS polyacrylamide (15 96). Les résultats sont illustrés par la Figure 2 - Le profil 1 est celui de l'extrait nucléaire obtenu à partir de cellules préincubées avec l'anti-sérum anti-acide colominique, préalablement à l'incubation avec pAntp. - Le profil 2 est celui de l'extrait obtenu à partir de cellules incubées en présence de pAntp, luimême préincubé avec 150 Rg d'ADN Hoxp (séquence de fixation spécifique du peptide pAntp). - Le profil 3 est celui de Trextrait nucléaire obtenu à partir de cellules directement incubées avec pAntp. La flèche A indique les histones, la flèche B le peptide pAntp. Ces résultats montrent que la pénétration du peptide pAntp est bloquée par un immunsérum anti-acide colominique aussi bien que par la liaison du peptide à sa séquence de fixation spécifique. 11. - DEMONSTRATION DU ROLE DE L'HéLICE 3 DU PEPTIDE HOMEOBOITE DANS LE TRANSPORT TRANSMEMBRANAIRE ET LA LIAISON A L'ADN DUDIT PEPTIDE. EXEMPLE 5. - Obtention de mutants 4 mutants différents ont été obtenus à partir du peptide pAntp. La séquence en acides aminés de ces mutants (code 1 lettre) est représentée à la figure 3. - Mutant 48S : perte des résidus Try 48, Pro 49, Gln 50 et addition d'une Ser 48 - Mutant 50A : remplacement de His 36 par Tyr 36 et remplacement de Gln 50 par Ala 50 - Mutant 39S : remplacement de Cys 39 par Ser 39 - Mutant 40P2 : introduction de 2 Pro en positions 40 et 41, en remplacement de deux résidus Leu et Thr. Les expériences de retard sur gel démontrent que les mutants 48S, 50A et 40P2 ne se fixent plus sur le promoteur de Hox-1.3, alors que le mutant 39S est toujours capable de reconnaître cette séquence. Les expériences de pénétration dans les cellules montrent que les mutants 40P2 et 48S ont perdu leur capacité de pénétration à plus de 80%, alors que la perte n'est que de 60% pour le mutant 50A. Le mutant 39S pénètre dans les cellules nerveuses aussi bien que le sauvage. REVENDICATIONS 1) Utilisation de l'acide colominique pour l'obtention d'un agent régulateur de l'action des peptides homéoboîtes et de leurs dérivés in vitro ou in vi vo. 2) Utilisation selon la Revendication 1, caractérisée en ce que l'acide colominique est utilisé pour l'obtention d'un inhibiteur compétitif de la pénétration intracellulaire et/ou de la liaison à l'ADN des peptides homéoboîtes ou de leurs dérivés. 3) Utilisation selon la Revendication 1, caractérisée en ce que l'acide colominique est utilisé pour l'obtention de récepteurs artificiels de peptides homéoboîtes ou de leurs dérivés. 4) Utilisation selon la Revendication 3, caractérisée en ce que l'acide colominique est conjugué à un polypeptide ou à un lipide ou à un des leurs dérivés glycosylés. 5) Utilisation selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'acide colominique utilisé comprend au moins 8 résidus d'acide sialique. 6) Récepteur artificiel des peptides homéoboîtes ou de leurs dérivés, lequel récepteur comprend au moins une molécule d'acide colominique conjuguée à un polypeptide ou à un lipide. 7) Cellules modifiées, par insertion dans leur membrane cytoplasmique, de récepteurs artificiels selon la Revendication 6. 8) Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent, en tant que principe actif, de l'acide colominique.