Brevet FR2680178A1 — publié le 19930212

La présente invention concerne un procédé pour la production d'acide L- glutamique par fermentation L'acide L-glutamique est un aminoacide important comme aliment, médicament, etc. Jusqu'à présent, l'acide glutamique était produit par fermentation en utilisant une bactérie productrice d'acide glutamique appartenant au genre Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium ("Amino Acid Fermentation," pages 195-215, publié par Gakkai Shuppan Center, 1986). Dans d'autres procédés connus pour la production d'acide L-glutamique par fermentation, on utilise des micro-organismes appartenant au genre Bacillus Streptomyces, Penicillium, etc (brevet U S N 3 220 929) ou au genre Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia ou Candida (brevet U S N 3 563 857). L'acide L-glutamique peut être produit par ces procédés avec une productivité assez élevée Il a cependant été nécessaire de mettre au point un procédé plus efficace et moins coûteux pour satisfaire la demande toujours croissante en aminoacide. Avec sa croissance rapide et les progrès dans l'analyse de ses gènes, Escherichia coli a une possibilité d'être utilisé comme un bon microorganisme producteur d'acide L-glutamique Cependant, selon les articles publiés jusqu'à présent, Escherichia coli n'accumule l'acide L- glutamique qu'à une teneur extrêmement faible de pas plus de 2,3 g/l (J Biochem, 50, pages 164-165, 1961). Un objet de la présente invention est d'améliorer la capacité de produc- tion d'acide L-glutamique de micro-organismes appartenant au genre Escherichia et de proposer un procédé pour produire l'acide L-glutamique de manière plus efficace et bon marché. Les inventeurs ont effectué des recherches poussées sur la production de l'acide L-glutamique en utilisant des mutants d'Escherichia coli En consé- quence, on a trouvé que des mutants d'Escherichia coli qui ont une activité faible ou nulle d'ac-cétoglutarate-déshydrogénase (ci-après dénommée ct-CGDH) ont une faible activité de décomposition de l'acide L-glutamique et sont capables de produire l'acide L-glutamique, ainsi que les mutants d'Escherichia coli qui ont les propriétés ci-dessus et dont l'expression de l'opéron de la malate-synthétase (ace B), de l'isocitrate-lyase (ace A) et de l'isocitrate déshydrogénasekinase/phosphatase (ace K) (ci-après dénommé "opéron ace") est constitutive, possède une capacité accrue de produire l'acide Lglutamique. En conséquence, la présente invention propose un procédé pour produire l'acide L-glutamique par fermentation, qui comprend les étapes suivantes: on cultive dans un milieu liquide un mutant qui appartient au genre Escherichia, qui a une activité d'a-CGDH faible ou nulle, qui a une faible activité de gluta- mate-déshydrogénase et qui est capable de produire l'acide L-glutamique; on accumule l'acide L-glutamique dans le milieu de culture; et on récupère le composé du milieu de culture L'invention propose également un procédé pour produire l'acide L-glutamique par fermentation qui comprend les étapes suivantes: on cultive dans un milieu liquide un mutant qui appartient au genre Escherichia, qui a une activité d'a- CGDH faible ou nulle, qui a une faible activité de décomposition de l'acide glutamique et qui est capable de produire l'acide L-glutamique et dont l'expression de l'opéron ace est constitutive; on accumule l'acide L-glutamique dans le milieu de culture; et on récupère le composé du milieu de culture Outre les propriétés ci-dessus, les mutants peuvent avoir d'autres propriétés connues comme efficaces pour améliorer la capacité de production d'acide L-glutamique, telles que besoin de divers nutri- ments, résistance aux médicaments, sensibilité aux médicaments, dépendance des médicaments et ainsi de suite A titre d'exemples de mutants selon l'invention, on peut citer les suivants: Escherichia coli AJ 12628 (FERM P-12380) Escherichia coli AJ 12624 (FERM P-12379) Comme souches mères pour induire un mutant selon l'invention, on peut utiliser des micro-organismes qui appartiennent au genre Escherichia coli et qui ne sont pas pathogènes Comme exemples de ces micro-organismes, on peut citer les souches suivantes: Escherichia coli K-12 (ATCC 10798) Escherichia coli W-3110 (ATCC 27325) Les mutants selon l'invention peuvent être obtenus en appliquant à ces souches mères une technique classique de mutagénèse, par exemple exposition aux rayons X ou aux rayons ultraviolets et mise en contact avec un agent muta- gène tel que la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (ci-après dénommée "NG") Ces mutants peuvent aussi être induits par d'autres techniques génétiques, telles que recombinaison génétique, transduction, fusion cellulaire et ainsi de suite. Plus particulièrement, on peut obtenir des mutants, par exemple de la manière suivante. On peut obtenir des mutants d'activité faible ou nulle d'c L-CGDH, par exemple, sous la forme d'une souche qui est incapable de pousser ou qui pousse extrêmement lentement dans un milieu minimum contenant du glucose dans des conditions de culture aérobies et qui est capable de pousser dans un milieu contenant du glucose additionné d'acide succinique ou de lysine + méthionine, ou sous la forme d'une souche qui est capable de pousser dans un milieu mini- mum contenant du glucose dans des conditions de culture anaérobies (Molec. Gen Genetics, Y 05, pages 182-190, 1969). On peut obtenir des mutants dont l'expression de l'opéron ace est constitutive en utilisant comme souche mère une souche déficiente en phosphoénolpyruvate-synthétase (pps) Les mutants désirés peuvent être obtenus sous la forme d'une souche capable de pousser dans un milieu minimum contenant de l'acide lactique comme source de carbone et incapable de pousser dans un milieu minimum contenant de l'acide pyruvique ou de l'acide acétique + acide pyruvique comme source(s) de carbone Ces mutants peuvent aussi être obtenus sous la forme d'un variant capable d'améliorer la croissance de souches qui ont une activité faible ou nulle d'a-CGDH dans des conditions de culture aérobies (J Bacteriol, 98, pages 2185-2186, 1968). Les mutants qui ont une faible capacité de décomposition de l'acide Lglutamique peuvent être isolés sous la forme d'une souche incapable de pousser ou poussant extrêmement lentement dans un milieu minimum contenant de l'acide L-glutamique (à la place de glucose) comme seule source de carbone ou dans un milieu minimum contenant de l'acide L- glutamique (à la place de sulfate d'ammonium) comme seule source d'azote Cependant, il va de soi que, dans le cas d'un variant qui a besoin de nutriments, la quantité minimale de nutriments nécessaire pour la croissance des mutants doit être ajoutée au milieu. Les mutants de l'invention ainsi obtenus présentent une circulation améliorée de la voie de biosynthèse de l'acide L-glutamique via l'acide a-cétoglutarique dans le cycle tricarboxylique de Krebs Les mutants ont une capacité améliorée de produire l'acide L-glutamique car ils ont une activité extrêmement faible de décomposition de l'acide L-glutamique et en outre leur croissance pourrait être améliorée en raison de l'expression constitutive de leur opéron ace. En utilisant les variants ainsi obtenus, on peut produire l'acide Lglutamique selon une technique classique dans un milieu nutritif classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sels inorganiques et si nécessaire des nutriments organiques mineurs tels qu'aminoacides, vitamines et ainsi de suite On peut utiliser à la fois des milieux synthétiques et naturels. On peut utiliser n'importe quelles sources de carbone et d'azote, pourvu qu'elles soient assimilables par les mutants utilisés Des exemples de sources de carbone utilisables comprennent les saccharides tels que glucose, glycérol, fructose, saccharose, maltose, mannose, galactose, produits d'hydrolyse de l'amidon et mélasses Il est également possible d'utiliser des acides organiques tels qu'acide acétique et acide citrique, soit seuls, soit en combinaison avec d'autres sources de carbone De exemples de sources d'azote utilisables comprennent lammoniac, le sulfate d'ammonium, le carbonate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le phosphate d'ammonium et l'acétate d'ammonium Des exemples de nutriments organiques mineurs comprennent les aminoacides, les vitamines, les acides gras et les acides nucléiques Il est également possible d'utiliser d'autres produits qui contiennent ces nutriments, par exemple, peptone, casaminoacide, extrait de levure et produit d'hydrolyse de protéines de soja Dans le cas o l'on utilise un variant qui a besoin d'aminoacides pour sa croissance, les nutriments nécessaires doivent être ajoutés Des exemples de sels inorganiques utilisables comprennent les phosphates, les sels de magnésium, les sels de calcium, les sels de fer, les sels de manganèse et ainsi de suite. La culture peut être mise en oeuvre avec aération dans des conditions contrôlées à une température de 20 à 45 'C et à un p H de 5 à 9 Si le p H baisse pendant la culture, le milieu de culture peut être neutralisé, par exemple, par le carbonate de calcium ou le gaz ammoniac On peut ainsi accumuler une quantité importante d'acide L- glutamique dans le milieu en environ 10 h à 4 jours. Après la fin de la culture, lacide L-glutamique peut être récupéré du milieu selon une technique connue Par exemple, après séparation des cellules, l'acide glutamique peut être récupéré par concentration et cristallisation Ou bien encore, le composé peut être récupéré par chromatographie d'échange d'ions. L'invention sera encore illustrée par les exemples suivants. Exemple 1 ( 1) Induction d'un variant ayant une faible activité de décomposition de l'acide L-glutamique On a cultivé Escherichia coli W 3110 à 37 C pendant 3 h dans un bouillon L contenant 0,5 % d'extrait de levure, 1 % de polypeptone et 0,5 % de chlorure de sodium (p H 7,0) et les cellules vivantes du micro-organisme ont été traitées par la NG à une concentration de 500 /ug/ml à 35 C pendant 15 min pour induire la mutation En utilisant le milieu minimum de base, le milieu minimum (A) contenant de l'acide L-glutamique comme seule source de carbone et le milieu minimum (B) contenant de l'acide L-glutamique comme seule source d'azote comme indiqué dans le tableau 1, les cellules ainsi traitées ont été étudiées selon la méthode de réplication pour obtenir un mutant, Escherichia coli GH-1, qui était capable de pousser dans le milieu minimum de base indiqué, mais poussait extrêmement lentement dans les deux milieux minimum (A) et (B) ltempérature de culture 37 C; durée de culture 2 joursl. Tableau 1 Milieu mini Milieu mini Milieu mini Milieu mini Milieu mini- mum de base mum (A) mum (B) mum (C) mum (D) Glucose 5 5 5 5 NH 4 CI 1 1 1 1 Na 2 HPO 4, 7 H 20 12,8 12,8 12,8 12,8 12,8 KH 2 PO 4 3 3 3 3 Na Ci 0,5 0,5 0,5 0,5 Mg SO 4, 7 H 20 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Acide L-glutamique 2,0 3,5 Acide succinique 6 L-lysine 0,1 L-méthionine 0,1 (Unité g/l) os K> o,O Oa "Il Oa Pour étudier l'activité de décomposition de l'acide L-glutamique d'Escherichia coli GH-1, on a cultivé le mutant et la souche mère, Escherichia coli W 3110, à 37 C pendant 48 h dans des milieux liquides de composition identique aux milieux ci-dessus Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 2 Escherichia coli GH-1 présentait une croissance extrêmement mauvaise dans les milieux contenant de l'acide L-glutamique comme seule source de carbone et comme seule source d'azote et avait une faible activité de décomposition de l'acide L-glutamique par rapport à la souche mère. Tableau 2 Milieu W 3110 (D 660) GH-1 (D 660) Milieu minimum de base 0,80 0,65 Milieu minimum (A) 0,45 0,07 Milieu minimum (B) 0,80 0,15 (Les valeurs numériques représentent la turbidité à 660 nm) ( 2) Induction d'un variant ayant une activité d'a-CGDH faible ou nulle. Escherichia coli GH-1 obtenu comme ci-dessus a été soumis à la muta- tion de la même manière qu'en ( 1) ci-dessus, pour obtenir un mutant, Escherichia coli AJ 12628, qui poussait extrêmement lentement par la méthode de réplication dans le milieu minimum de base indiqué dans le tableau 1, mais poussait bien à la fois dans le milieu minimum (C) contenant de l'acide succi- nique et dans le milieu minimum (D) contenant de la L-lysine et de la Lméthionine, comme indiqué dans le tableau 1 température de culture 37 C; durée de culture 2 jours). A titre de comparaison, on a déterminé l'activité d'a-CGDH du mutant et celle d'Escherichia coli W 3110 par la méthode de Reed et autres ("Methods in Enzymology", Vol 13, page 55, 1969) Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 3 Escherichia coli AJ 12628 ne présentait pas d'activité d'a-CGDH. Tableau 3 W 3110 AJ 12628 Activité d'ct-CGDH 3,70 Non détecté (Unité:/umoles/mg de protéine min) ( 3) Induction d'un variant dont l'expression de l'opéron ace est constitutive. Escherichia coli AJ 12628 a subi la transduction avec le marqueur icl R par le phage Plvir en utilisant comme donneur Escherichia coli PLK 831 (icl R 7, gal, trp E, pyr F, fnr, rps L, trp R), souche dont l'expression de l'opéron ace est constitutive (la souche était obtenue auprès du E Coli Genetic Stock Center, Université de Yale, U S A) A une culture d'Escherichia coli PLK 831 cultivé jusqu'à la phase de croissance logarithmique, on a ajouté Ca C 12 à une concen- tration de 2,5 10-3 M On y a ensuite ajouté Plvir jusqu'à une multiplicité d'infection (m o i, c'est-à-dire le nombre de phages par cellule) de 5 et la culture a été continuée à 37 C pendant 90 min pour obtenir une solution bacté- riolytique On a ajouté du chloroforme à cette solution pour tuer les bactéries restantes La solution résultante a été centrifugée pour obtenir un liquide sumrnageant, c'est-à-dire une solution de phages On a cultivé séparément Escherichia coli AJ 12628 dans un bouillon L jusqu'à la phase de croissance logarithmique On a ensuite ajouté à cette culture Ca CI 2 jusqu'à la même concentration que ci-dessus Ensuite, on a ajouté la solution de phages jusqu'à une m o i de 0,2 et on a laissé reposer la solution résultante à 37 C pendant min et on l'a ensuite centrifugée pour séparer le liquide surnageant Les cellules obtenues ont été mises en suspension dans une solution saline physio- logique contenant Ca C 12 2,5 10-3 M et inoculées sur une plaque remplie du milieu minimum (D) indiqué dans le tableau 1 Les cellules ont été cultivées à 37 'C pendant 2 jours pour obtenir Escherichia coli AJ 12624 comme souche capable de pousser plus rapidement qu'Escherichia coli AJ 12628. Les deux souches ont été cultivées séparément dans le même milieu liquide en conditions aérobies et on a déterminé leur activité d'isocitrate-lyase selon la méthode de Vanderwinkel et autres (Biochem Biophys Res. Commun,, page 157, 1963) Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 4 Comme on le voit dans le tableau, Escherichia coli AJ 12624 a une activité d'isocitrate-lyase extrêmement accentuée Ceci montre que l'expression de l'opéron ace de la souche est devenu constitutif par suite de la transduction. Tableau 4 AJ 12628 AJ 12624 Activité d'isocitrate-lyase 6 90 (Unité:/moles/mg de protéine min) ( 4) Production d'acide L-glutamique par le mutant obtenu Escherichia coli W 3110, GH-1, AJ 12628 et AJ 12624 ont été inoculés séparément dans des ballons de 500 ml contenant chacun 20 ml de milieu ayant la composition indiquée dans le tableau 5 et les souches ont été cultivées en culture agitée à 37 C jusqu'à ce que le glucose ait été consommé L'acide L-glutamique a été accumulé dans les quantités indiquées dans le tableau 6 Il semblerait d'après les résultats que la quantité d'acide L-glutamique accumulée peut être nettement accrue en cultivant un mutant qui est déficient en activité d'a-CGDH, qui a une faible capacité de décomposition de l'acide L- glutamique et qui est capable de produire l'acide L-glutamique En outre, la durée de fermentation peut être nettement réduite par un mutant ayant les propriétés ci-dessus et dont l'expression de l'opéron ace est constitutive. Tableau 5 Constituant Concentration (g/l) Glucose 40 (NH 4)2 SO 4 20 KH 2 PO 4 1 Mg SO 4,7 H 20 1 Fe SO 4,7 H 20 0,01 Mn SO 4,5 H 20 0,01 Extrait de levure 2 L-méthionine 0,1 L-lysine 0,1 Tableau 6 Souche Quantité d'acide L-glutamique Durée de fermentation (h) (g/l) W 3110 3,0 12 GH-1 5,0 15 AJ 12628 18,5 27 AJ 12624 20,0 16 On peut obtenir selon l'invention un mutant appartenant au genre Escherichia et ayant une capacité améliorée de production d'acide Lglutamique et l'on peut produire l'acide L-glutamique de manière efficace et plus économique. il REVENDICATIONS 1 Procédé pour produire l'acide L-glutamique par fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: on cultive dans un milieu liquide un mutant qui appartient au genre Escherichia, qui a une activité d'a-cétoglutarate-déshydrogénase faible ou nulle, qui a une faible activité de décomposition de racide L- glutamique et qui est capable de produire l'acide L-glutamique; on accumule l'acide L-glutamique dans le milieu de culture; et on récupère le composé du milieu de culture. 2 Procédé pour la production d'acide L-glutamique selon la revendi- catin 1, caractérisé en ce que ledit mutant est un mutant dont l'expression de l'opéron de la malate-synthétase (ace B), de l'isocitrate-lyase (ace A) et de l'isocitrate-déshydrogénase-kinase/phosphatase (ace K) est constitutive.