Brevet FR2673472A1 — publié le 19920904

La présente invention a pour objet un procédé permettant en un seul temps la séparation d'agglutinats érythrocytaires des hématies libres lors d'un test d'agglutination, et la mise en évidence desdits agglutinats. Elle a également pour objet le dispositif permettant la mise en oeuvre de ce procédé On sait que, en immuno-hématologie érythrocytaire, la réaction antigène-anticorps peut être mise en évidence grâce à la présence d'agglutinats. Cette agglutination, spontanée en milieu salin, n'est toutefois pas toujours observable in vitro, notamment dans le cas où les anticorps sont des anticorps dits sensibilisants, les hématies sensibilisées ne donnant pas lieu à une agglutination Afin de provoquer l'agglutination des hématies sensibilisées, diverses techniques ont été mises au point, parmi lesquelles les plus couramment utilisées consistent à ajouter au milieu réactionnel :: - soit des macromolécules comme l'albumine, le dextran ou la polyvinylpyrrolidone - soit, après lavage des hématies sensibilisées, une antiglobuline humaine (test de Coombs) ; - soit une molécule polycationique comme le bromure d'hexadiméthrine, ou "polybrène", le traitement de l'agglutinat ainsi obtenu par une solution citratée provoquant la remise en suspension des hématies non sensibilisées (technique de Lalezari). Une autre technique consiste à traiter préalablement les hématies par une enzyme protéolytique comme la papaïne, la broméline ou la trypsine. Toutes ces techniques d'agglutination peuvent être mises en oeuvre manuellement ou automatiquement, dans les supports les plus variés : tubes à hémolyse, plaques de verre, rhésuscope, microplaques à 96 puits. Toutefois, elles font souvent appel à une centrifugation et tant les phases de lavage (pour le test de Coombs) que les temps et vitesses de centrifugation ainsi que le type d'agitation pour la remise en suspension finale constituent des paramètres critiques qui rendent la maîtrise de ces réactions délicate. D'autre part, les dispositifs mis en oeuvre dans ces techniques de séparation et de mise en évidence des agglutinats érythrocytaires sont peu nombreux. Graham et al. a proposé en 1982 un tube capillaire spécifique que l'on remplit d'une solution d'albumine et de dextran, de densité intermédiaire entre sérum et globules, toutefois cette technique ne s'est pas révélée plus sensible que le test de Coombs classique. Une autre technique dite "en phase solide", , a été présentée en 1984 au symposium de Munich par une équipe française, MULLER A. et al., consistant à centrifuger le mélange sérum-globules à travers un liquide de séparation, après que les puits des microplaques utilisées aient été revêtus d'antiglobuline, la lecture étant faite automatiquement. Le brevet français 2 577 321 décrit une méthode dans laquelle le milieu de séparation est constitué d'un gel à base de dextran, toutefois cette méthode, comme la plupart des méthodes antérieurement proposées, fait appel à une centrifugation, avec l'inconvénient inhérent à la mise en oeuvre de ce type de technique, à savoir de nécessiter un matériel qui ne peut être transporté hors du laboratoire. La présente invention a pour but de remédier à ces divers inconvénients des techniques connues en proposant un procédé et un dispositif qui permettent en un seul temps la séparation et la mise en évidence des agglutinats érythrocytaires, en évitant le recours à une centrifugation. Le procédé selon l'invention se caractérise essentiellement en ce qulil consiste à soumettre le mélange réactionnel à une percolation sur une phase inerte en forçant le flux de la phase mobile par tout moyen approprié. Conformément à l'invention, le mélange réactionnel, qui peut refermer n'importe quel agent d'agglutination connu (macromolécule, antiglobuline ou molécule polycationique), ou des hématies préalablement traitées par une enzyme protéolytique, est introduit dans un tube capillaire ouvert dont l'extrémité inférieure est munie d'un filtre et dans lequel ont été préalablement disposées les microbilles constituant la phase inerte. Après incubation pendant un temps et dans des conditions de température qui sont fonction de la technique utilisée, la vitesse d'écoulement de la phase mobile est augmentée par tout moyen approprié disposé à l'extrémité inférieure du tube. La présence d'agglutinats est visualisée par la formation d'un anneau de couleur à la partie supérieure de la phase inerte. Conformément à l'invention, les microbilles constituant la phase inerte mise en oeuvre peuvent être n'importe quelles microbilles d'un polymère chimiquement inerte vis à vis du milieu réactionnel, et de préférence des billes en copolymère d'oligoéthylèneglycol glycidylméthacrylate et pentaérythritoldiméthacrylate, comme celles commercialisées sous la marque "Fractogel" par la Société MERCK. Le diamètre de ces billes est de préférence compris entre 0,25 et 0,40 um. Toujours conformément à l'invention, le tube capillaire mis en oeuvre présente une hauteur d'environ 60 mm et un diamètre interne d'environ 2 mm, et il est réalisé en un matériau approprié, tel que le verre ou le polystyrène cristal. Le filtre disposé à l'extrémité inférieure du tube capillaire présente une ouverture moyenne de mailles comprise entre 20 et 50 I-im m, et peut être réalisé en n'importe quel polymère convenable, tel qu'un polyamide. Son diamètre peut être sensiblement supérieur à celui du tube, à l'extrémité duquel il peut être maintenu par un manchon semi-rigide qui lui est solidarisé, tel qu'un manchon en chlorure de polyvinyle glissé autour du tube. Il va de soi que le tube capillaire mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peut être remplacé par un dispositif équivalent du type microplaque à 96 puits, à condition que ce dispositif soit muni d'un filtre tel que celui qui vient d'être décrit. Les réactifs nécessaires au test d'agglutination peuvent être disposés préalablement à la surface des billes ou ajoutées extemporanément avec les hématies ou les sérums à tester. Ainsi qu'il a déjà été dit, ces réactifs peuvent être n'importe quel réactif mis en oeuvre à cet effet dans les techniques classiques. Après incubation du mélange réactionnel, on dispose au contact du filtre disposé à la partie inférieure du capillaire un dispositif permettant d'augmenter la vitesse d'écoulement de la phase liquide, ce dispositif pouvant consister soit en un absorbant constitué de matière cellulosique à haut pouvoir de rétention d'eau, soit en un dispositif permettant de créer une dépression dans une chambre mise au contact dudit filtre, ce dernier dispositif étant préférentiellement mis en oeuvre lorsque la technique est automatisée. Pendant la phase d'incubation le tube est obturé à son extrémité supérieure afin d'empêcher l'écoulement de la phase mobile, puis il est ouvert. Le procédé selon l'invention présente l'avantage d'être parfaitement autonome, ne nécessitant aucun matériel annexe tel qu'une centrifugeuse, en sorte qu'il peut être aisément mis en oeuvre hors du laboratoire. Il présente également l'avantage d'offrir un champ d'application large, pouvant être utilisé aussi bien en sérologie (hémagglutination) que pour des groupages sanguins ou des recherches d'agglutinines irrégulières. Il peut en outre être utilisé pour la mise en oeuvre de toutes les techniques connues d'agglutination, et il peut être aisément automatisé. A ces avantages s'ajoute celui inhérent à la stabilité de l'image produite, les réactions restant visibles plusieurs heures. Le procédé selon l'invention permet d'éviter les phases critiques et longues que constituent les lavages et la centrifugation, tout en conservant une grande sensibilité. D'autre part, le tube mis en oeuvre étant ouvert, le procédé selon l'invention permet de cumuler deux techniques connues en associant les deux réactifs correspondants, introduits successivement : on peut ainsi réaliser une technique mixte, par exemple en mettant en oeuvre le polybrène et une antiglobuline humaine. Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration de la présente invention, vis-à-vis de laquelle ils ne présentent aucun caractère limitatif. EXEMPLE 1 Des microbilles de FRACTOGEL TSK HW 50 S sont lavées deux fois au sérum physiologique, un mélange volume à volume de billes et de sérum physiologique étant préparé pour couler les billes. 50 Al de la suspension ainsi préparée sont coulés dans un tube ouvert de 60 mm de hauteur et 2 mm de diamètre interne, dont l'extrémité inférieure est munie d'un filtre en polyamide de lOmm de diamètre fixé à un manchon de PVC glissé sur le tube. On introduit dans le tube ainsi préparé le mélange suivant - hématies-tests : 10 ul - sérum à tester : 10 ul - solution à 1 % de polybrène dans du sérum physiologique : 10 ul. On laisse incuber 10 minutes à température ambiante, en obturant l'extrémité supérieure du tube de manière à éviter l'écoulement de la phase mobile. On dispose alors un absorbant (ouate de cellulose) au contact du filtre disposé à l'extrémité inférieure du tube et on débouche son extrémité supérieure de manière à provoquer l'écoulement de la phase mobile. On lave ensuite avec une solution de citrate hypertonique, et on procède à la lecture. On observe un anneau de couleur rouge à la partie supérieure de la phase inerte, toutes les hématies étant agglutinées. La durée totale de la manipulation est inférieure à 25 minutes. EXEMPLE 2 Cet exemple illustre la cumulation du test au polybrène décrit dans l'exemple 1 avec un test de Coombs à 1' antiglobuline. On procède à la préparation du tube de la manière décrite dans l'exemple 1, puis on prépare le mélange réactionnel suivant - hématies-tests à 3 % - 1 volume - sérum à tester - 1 volume - polybrène à 1 % - 1 volume. On dispose 30 ul de ce mélange à la surface des billes de FRACTOGEL, puis on laisse incuber 10 minutes à température ambiante. Dès que le ménisque du mélange atteint la surface des billes, on dépose 10 ul d'antiglobuline polyvalente, puis 200 ul d'une solution de citrate hypertonique additionné de Tween 20 à 1% (v/v). Après écoulement total de la solution de lavage on procède à la lecture. Les performances du procédé selon l'invention ont été évaluées dans diverses techniques de recherche d'agglutinines irrégulières, en réalisant des dilutions en sérum ÀB de raison 2 d'un anti-D polyclonal. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau ci-après TECHNIQUES TITRES COOMBS MANUEL 128 COOMBS GEL 128 ENZYMATIQUE 65 536 POLYBRENE 32 768 COOMBS POLYBRENE 524 288 On constate que la technique mixte Polybrène-Coombs dont le procédé selon l'invention autorise la mise en oeuvre permet un gain de sensibilité important par rapport aux autres techniques. Ce résultat a été confirmé sur d'autres réactifs dilués, notamment des anti-kell. D'autre part un panel d'hématies-tests présentant des agglutinines irrégulières de spécificités très variées a été testé (Rh 1.2 - Rh 1 - Rh 3 - Rh 3+K1 - K1 - Fya - Lea). Tous ces tests étaient limites dans la technnique de Coombs Manuel et ont tous donné des résultats nettement positifs en technique mixte Coombs-Polybrène, illustrant la supériorité du procédé selon l'invention par rapport aux techniques connues. REVENDICATIONS 1) Procédé pour la mise en évidence d'agglutinats érythrocytaires, permettant en un seul temps la séparation des agglutinats des hématies libres et la mise en évidence desdits agglutinats, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre après incubation le mélange réactionnel, disposé dans un tube ouvert, à une percolation sur une phase inerte en forçant le flux de la phase mobile, la lecture du test s'opérant à la partie supérieure de la phase inerte. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase inerte consiste en des microbilles d'un polymère chimiquement inerte, de diamètre compris entre 0,25 et 0,40 um. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le polymère mis en oeuvre est un copolymère d'oligoethylèneglycol glycidylméthacrylate et pentaérythritoldiméthacrylate. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le tube mis en oeuvre est muni à son extrémité inférieure d'un filtre présentant une ouverture moyenne de mailles de 20 à 50film. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on obture le tube à son extrémité supérieure pendant la phase d'incubation, puis que l'on dispose à son extrémité inférieure, au contact du filtre, un moyen permettant de forcer le flux de la phase mobile, en même temps que l'on débouche son extrémité supérieure. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le moyen pour forcer le flux de la phase mobile consiste en un absorbant constitué d'une matière cellulosique à haut pouvoir de rétention d'eau. 7) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le moyen pour forcer le flux de la phase mobile consiste en un dispositif permettant de créer une dépression dans une chambre mise au contact du filtre. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour réaliser un test d'agglutination avec n importe quelle technique connue. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour réaliser un test d'agglutination associant deux techniques connues 10) Procédé selon la revendication 9, mis en oeuvre pour réaliser un test d'agglutination associant la technique dite "au polybrène" à celle dite "de Coombs", caractérisé en ce qu'on prépare dans un contenant autre que le tube un mélange réactionnel incluant le polybrène, que l'on laisse incuber le temps nécessaire, puis que l'on introduit dans le tube contenant la phase inerte une quantité de ce mélange suffisante pour le recouvrir, après quoi on dépose une quantité suffisante d'antiglobuline puis on lave à l'aide d'une solution appropriée. 11) Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un tube d'une matière transparente inerte comme le verre ou le polystyrène cristal, muni à son extrémité inférieure d'un filtre dont l'ouverture moyenne des mailles est comprise entre 20 et 50 um 12) Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que le filtre est réalisé en un polymère chimiquement inerte vis à vis du milieu réactionnel, comme le polyamide. 13) Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que le filtre est fixé à un manchon d'une matière semi-rigide glissé autour du tube. 14) Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend un tube capillaire dont la hauteur est d'environ 60mm et le diamètre interne d'environ 2 mm. 15) Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une microplaque à 96 puits munie d'filtre dont l'ouverture moyenne des mailles est comprise entre 20 et 50 Film.