Brevet FR2681874A1 — publié le 19930402

La présente invention a pour objet un matériel prêt à l'emploi permettant la réalisation d'études de pharmacologie sur des cellules en culture Le matériel selon l'invention comporte un nombre limité de chambres de culture permettant la présentation des cellules sur une membrane microporeuse qui assure le contact des cellules avec les substances à tester Le matériel peut être stocké et transporté à basse température puis remis à incuber pour être utilisé, sans autre manipulation, dans des tests de toxicité vis à vis des cellules. De nombreux efforts sont entrepris par les laboratoires pharmaceutiques et cosmétiques pour développer des systèmes alternatifs afin de limiter le nombre de tests de toxicité sur animaux Plusieurs tests s'effectuent déjà sur des "équivalents de tissus", sur des fragments d'organes en culture ou des monocouches cellulaires. Plusieurs laboratoires proposent déjà à la vente différents types de cellules, à l'état congelé, pour la mise en culture et l'application en toxicologie Toutefois ces cultures ne peuvent être réalisées que dans des laboratoires équipés en matériel sophistiqué et en personnel bien entraîné aux cultures de cellules. La mise à disposition de matériel prêt à l'emploi représenterait donc un avantage pour de nombreux laboratoires qui ne peuvent s'équiper pour réaliser eux mêmes des cultures cellulaires. Le matériel selon l'invention comprend un support de culture en deux parties: une partie a) constituée d'un monobloc de matière plastique non toxique pour les cellules supérieures, de forme quelconque, cylindrique ou parallélipipédique par exemple, dans lequel sont creusés des puits cylindriques, servant de "chambre de cultures" pour des cellules supérieures en monocouches; la partie inférieure des puits est constituée d'une membrane microporeuse en matière compatible avec l'attachement et la multiplication des cellules, ladite membrane étant thermosoudée au bloc de plastique; la partie supérieure des puits est obturée, à l'exception d'un orifice de remplissage; le bloc comprend aussi un évent central, en communication avec la partie inférieure et, ainsi, commun à tous les puits. une partie b) de préférence moulée dans la même matière que le bloc a) et fomant un support inférieur adapté pour fermer hermétiquement le bloc a) tout en ménageant un espace libre entre les membranes microporeuse et le fond du support; cet espace libre sera rempli de milieu de culture ou du milieu de maintenance des cellules; il pourra être commun à tous les puits ou être compartimenté pour permettre ultérieurement le test de différents produits ou de différentes doses de produit. Les deux parties a et b du support selon l'invention sont réalisés de préférence en polystyrène ou en polycabonate et la membrane microporeuse, en nylon, en polypropylène ou en polycarbonate, présentant une porosité de 0,3 à 0,5 pm. Les puits de culture auront par exemple une auteur de 2 à 4 cm et un diamètre de 1 à 2 cm. Après ensemencement des puits avec les cellules choisies et incubation à 370 C en milieu approprié jusqu'à obtention d'un tapis confluent sur les membranes microsporeuses, le milieu de culture est vidé et remplacé par des milieu de maintenance, de manière à remplir la totalité du volume des puits et de l'espace libre de la partie b), après expulsion de toute, bulle d'air par l'évent, puis les orifices supérieurs sont hermétiquement fermés par un film de plastique adhésif. Le milieu de maintenance est additionné d'une substance gélifiante comme l'agarose (d'un degré de pureté compatible avec la survie des cellules supérieures Il est ainsi capable de se solidifier dans les conditions de stockage et de transport du matériel, c'est-à-dire de + 40 C à + 100 C, et de redevenir liquide dans les conditions de mise en oeuvre du test ( 37 C). Différents types de cellules peuvent être mis en culture et conservés dans le support selon l'invention; plus particulièrement, pour des tests de toxicité de produits cosmétiques, on utilise des fibroblastes humains (fibroblastes dérivés de prépuces ou lignées cellulaires établies) ou des fibroblastes de cornée de lapin (pour se rapprocher du modèle animal du test d'irritation de l'oeil de lapin connu sous le nom de test de Draize). Le matériel selon l'invention, comprenant le support et les tapis cellulaires établis sur ses membranes et protégés par le milieu de maintenance gélifié, peut être stocké pendant quelques jours à basse température, de préférence entre 40 C et 100 C, et expédié aux utilisateurs dans les mêmes conditions peu contraignantes. L'utilisation du matériel pour la mise en oeuvre de tests de toxicité ne nécessite aucune manipulation préalable; une incubation de quelques heures à 370 C reliquéfie le milieu de maintenance et rétablit les cellules dans des conditions physiologiques - Le matériel selon l'invention est ainsi particulièrement adapté à la mise en oeuvre du procédé décrit dans la demande de brevet FR 2 656 331 qui consiste à cultiver des cellules dans des chambres de culture traditionnelles présentant une membrane microporeuse permettant d'étudier la toxicité de préparations sur les cellules, par diffusion au travers de la membrane, quelle que soit la forme galénique de la préparation (c'est-à-dire hydrosoluble ou liposolubles), les cellules restant dans leur milieu de culture physiologique par leur partie apicale Le procédé était mis en oeuvre par manipulation des chambres de culture et transfert de celles-ci dans des cupules contenant les produits à tester. L'avantage du matériel selon la présente invention est de permettre la mise en oeuvre des tests de toxicité sans aucune manipulation préalable En effet, après incubation à 370 C jusqu'à ce que le milieu de maintenance soit redevenu liquide, il suffit de retirer la partie inférieure b) du support, de vider le milieu de maintenance et de le remplacer par la substance ou la composition à tester, soit en une dose unique, soit en plusieurs doses si le fond du support est compartimenté, et de le replacer en contact avec les cellules par simple réajustement avec la partie a) L'incubation est ensuite poursuivie à 370 C. Après le temps de contact choisi, on récupère les cellules des membranes microporeuses et on mesure leur viabilité par un test calorimétrique classique. Le matériel selon l'invention permet également de réaliser des tests plus sophistiqués et d'évaluer le métabolisme cellulaire en réaction aux produits testés. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE 1: Mise en culture des cellules et étude de leur suivie au cours du stockage et dans des conditions de test. Des blocs cylindriques percés de trois puits ont été utilisés La partie a) a un diamètre de 50 mm, une hauteur de 22 mm; les puits ont un diamètre de 15 mm et l'évent, de 3 mm La partie b) a un diamètre intérieur de mm et extérieur de 60 mm et une hauteur de 12 mm Avec ce modèle de bloc à 3 puits, chacune des trois chambres de culture est soumise aux mêmes conditions, pour donner une évaluation statistiquement valable des pourcentages de survie Chacun des blocs est soumis aux conditions expérimentales choisies Les cellules choisies sont des fibroblastes de cornée de lapin, en lignée établie. Chaque chambre de culture est inoculée avec 500 000 cellules dans 1 ml de milieu (milieu MEM additionné de bicarbonate et de 10 % de serum de veau foetal) L'espace libre de la partie inférieure (b) est rempli du même milieu. Les cultures sont incubées à 370 C en atmosophère de C 02 pendant 48 heures ce qui assure la formation d'une monocouche confluente sur la membrane microporeuse. Après remplacement du milieu de croissance par du milieu de maintenance contenant 1 % (P/V) d'agarose, les blocs sont placés en chambre froide à 40 C pendant différents temps, avec un minimum de 24 heures A la sortie de la chambre froide, les blocs sont immédiatement incubés à 370 C pendant 48 heures et la viabilité des cellules est évaluée par un test calorimétrique au MTT, décrit par Mossman (J Immunol Methods, 1983, 55- 63), et exprimée en pourcentage de cellules vivantes par rapport aux cultures parallèles maintenues à 370 C pendant le même temps. On n'observe aucune perte de viabilité dans ces conditions. Dans les mêmes conditions, après conservation à 40 C pendant 24 heures et incubation à 370 C pendant 48 heures, on étudie l'aptitude des cellules à subir un test de toxicité Le compartiment inférieur est vidé du milieu à l'agarose et remplacé par un milieu à tester Le produit à tester est de l'octocynol en solution dans du milieu de culture, à trois concentration 10, 50 et 100 gg/ml. La viabilité cellulaire est mesurée comme décrit plus haut On obtient les résultats suivants Concentration % de cellules % de cellules d'octocynol survivantes après survivantes sur cultures en gg/ml conservation à 40 C fraîchement établies 0 100 100 10 100 92 67,7 65 il 12 Les résultats ainsi obtenus sont les mêmes que ceux déterminés sur des cellules fraîchement établies et non conservées à 40 C en agarose. EXEMPLE 2: Etude de cytotoxicité et détermination de la CL 50 du laurysulfate de sodium. Des chambres de culture conformes au modèle décrit (une chambre témoin et 5 chambres destinées à recevoir des concentrations différentes du produit à étudier) sont ensemencées avec des fibroblastes humains préparés à partir de prépuces, à raison de 20 000 cellules par puits Les chambres de cultures sont maintenues dans une étuve à 370 C. 24 heures plus tard, les cellules étant arrivés à confluence, le contenu de la partie b de chacune des chambres de culture est remplacé par de l'huile de paraffine, dans laquelle est dissous du laurysulfate de sodium, aux concentrations de 200 gg/ml, 100 Jg/ml et Jg/ml; de l'huile de paraffine seule est utilisée pour la chambre de culture servant de témoin (des essais préliminaires ont permis de s'assurer que l'huile de paraffine n'entraîne pas de mortalité de ce type cellulaire). Après 24 heures de contact, la viabilité des cellules est estimée par le test calorimétrique au MTT et le pourcentage de cellules survivantes est calculé par rapport au témoin. Les résultats suivants ont été obtenus Concentration de SLS % de cellules survivantes 50 Jg/ml 100 gg/ml 74,5 gg/ml 6,0 gg/ml 5,0 soit une CL 50 (concentration létale 50 %) calculée de 104,2 + 13,6 lig/ml (moyenne + écart type). EXEMPLE 3: Evaluation de la toxicité parallèlement au pouvoir irritant oculaire d'un produit cosmétique. L'essai est réalisé sur des fibroblastes humains, avec un lait démaquillant. Dans les conditions d'utilisation décrites plus haut, les cellules étant arrivées à confluence sur les membranes microporeuses, une quantité choisie du produit cosmétique à étudier est mise dans le compartiment inférieur de 3 chambres de culture et recouverte par de l'huile de paraffine. Les cultures sont replacées à l'étuve, respectivement pendant 30 minutes, 1 heure et 4 heures Une chambre de culture témoin, ne contenant que de l'huile de paraffine, est laissée à l'étuve pendant 4 heures. La viabilité des cellules est ensuite appréciée par le test calorimétrique au MTT. Les résultats suivants ont été obtenus Temps de contact % de cellules avec le produit survivantes minutes 72 1 heure 57 4 heures Un indice de cytotoxicité a été calculé à partir de ces résultats, soit 2,25. Des résultats semblables ont été obtenus avec 100 produits cosmétiques Pour cet ensemble de résultats, l'indice de cytotoxicité et l'indice d'irritation oculaire maximum (méthode de DRAIZE) ont été déterminés, et ont permis de montrer qu'il existait une bonne corrélation (r = 0,85) entre ces deux paramètres. Il est donc possible, à partir de l'indice de cytotoxicité, de déterminer un indice d'irritation oculaire théorique. Dans le cas du produit cosmétique cité plus haut, cet indice est de 15,5, ce qui permet de considérer le produit comme légèrement irritant pour l'oeil. La validité de ce résultat a été confirmée par la détermination de l'indice d'irritation oculaire maximum sur 1 Q le lapin, par la méthode de DRAIZE L'indice trouvé est de 13,3. REVENDICATIONS 1 Support de cultures cellulaires pour matériel prêt à l'emploi caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'un bloc de matière plastique en deux parties ajustées: une partie a) constituée d'un monobloc dans lequel sont creusés des puits cylindriques destinés à servir de chambres de cultures, leur partie inférieure étant constituée d'une membrane microporeuse apte à supporter la multiplication et le maintien de cultures cellulaires et leur partie supérieure étant obturée à l'exception des orifices de remplissage et d'un évent commun qui seront fermés ultérieurement par un film de plastique adhésif; une partie b) adaptée sous la partie a) pour la fermer hermétiquement tout en maintenant un espace libre destiné à mettre les membranes miroporeuses en contact avec du milieu de culture ou de maintenance et, ultérieurement, avec la substance à tester, ledit espace libre pouvant être commun à quelques puits de culture ou compartimenté pour isoler chaque puits de culture. 2 Support de cultures cellulaires selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est fabriqué dans une matière choisie parmi le polystyrène, le polycarbonate ou toute matière plastique compatible avec la survie de cellules supérieures. 3 Support de cultures cellulaires selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les puits cylindriques ont une hauteur d'environ 2 à 4 cm et un diamètre d'environ 1 à 2 cm. 4 Support de cultures cellulaires selon l'une quelconque des revendiations 1 à 3, caractérisé en ce que les membranes microporeuses sont fabriquées en une matière choisie parmi le nylon, le polycarbonate, le polypropylène ou toute matière compatible avec l'attachement et la multiplication d'une monocouche de cellules supérieures. Support de cultures cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les membranes microporeuses ont une porosité de 0,3 à 0,5 Pm. 6 Matériel prêt à l'emploi pour la réalisation d'études de cytotoxicité, caractérisé en ce qu'il comprend un support de cultures cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, un tapis cellulaire confluent établi sur les membranes microporeuses de chaque puits et, dans les espaces supérieur et inférieur entourant les membranes et les tapis cellulaires, du milieu de maintenance additionné d'une substance gélifiante qui permet au milieu de se présenter à l'état gélifié à basse température et à l'état liquide à température physiologique. 7 Matériel prêt à l'emploi selon la revendication 6, caratérisé en ce que le tapis cellulaire confluent est établi à partir d'une suspension de cellules supérieures choisies parmi les divers types de fibroblastes, en cultures primaires ou en lignées, appropriés pour des études de cytotoxicité. 8 Matériel selon la revendication 6 caractérisé en ce que la substance gélifiante est l'agarose, de qualité purifiée pour cellules supérieures. 9 Matériel prêt à l'emploi selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il supporte le stockage et le transport à une température comprise entre 40 C et 100 C. Méthode de détermination de la cytotoxicité d'une substance ou d'une composition, caractérisée en ce qu'elle comprend l'incubation du matériel selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, à 370 C pendant 48 heures sans autres manipulation, puis la mise en place de la substance ou de la composition dans la partie b) du support selon la revendication 1, en contact avec les cultures cellulaires au travers des membranes microporeuses et, après un temps de contact choisi, la détermination du pourcentage de cellules survivantes.