Brevet FR2679253A1 — publié le 19930122

Protéines de résistance a la cycloheximide. Utilisation comme marqueur de sélection par exemple pour contrôler le transfert d'acides nucléiques. L'invention concerne des protéines de résistance à la cycloheximide et leur utilisation comme marqueur de sélection, par exemple pour contrôler le transfert d'acides nucléiques. Les inventeurs ont en effet recherché des marqueurs de sélection adaptés pour contrôler le transfert d'acides nucléiques chez les eucaryotes, marqueurs qui seraient plus efficaces que les marqueurs habituellement utilisés provenant d'organismes procaryotes. On sait par exemple que les marqueurs habituellement utilisés (généticine G-418, hygromycine et bléomycine) proviennent de gènes de résistance isolés chez des procaryotes et sont généralement peu efficaces, notamment chez les champignons. Ces problèmes obligent les expérimentateurs à utiliser de très fortes concentrations en antibiotique, provoquant des problèmes de toxicité et de coût de production. Dès lors d'autres moyens de sélection ont été utilisés, par exemple la sélection par le méthotrexate, la sélection par l'auxotrophie, etc.Cependant ces moyens de sélection ne sont pas applicables de façon générale. Il existe donc un besoin pour la réalisation de systemes adaptés à la mise en oeuvre d'un marqueur plus efficace et/ou plus puissant que les marqueurs connus jusqu'à présent et d'un coût de production moins onéreux. La cycloheximide constituerait un marqueur potentiellement intéressant par exemple pour mettre en évidence le transfert d'acide nucléique hétérologue chez des eucaryotes. Dans ce but, les eucaryotes que l'on cherche à modifier de façon contrôlable grâce à un test de détection de la résistance à la cycloheximide, doivent être rendus résistants à cet antibiotique dans des conditions satisfaisantes pour assurer un contrôle fiable du transfert d'acide nucléique hétérologue réalisé soit à des fins de recherche soit dans un but d'exploitation industrielle. La cycloheximide est un antibiotique qui inhibe la synthèse protéique en se fixant sur la sous-unité 60S ribosomale comme l'ont décrit STOCKLEIN et al (1980, Curr. Genetics 1, 177-183). Les organismes naturellement résistants à la cycloheximide sont rares; à ce jour des observations relatives aux mécanismes de résistance ont été décrites chez un mutant d'un organisme naturellement sensible à la cycloheximide, le mutant cyh2 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Dans ce contexte, le phénomène de résistance est engendré par une modification de la protéine ribosomale L29 (STOCKLEIN et al, 1980). Ces organismes cellulaires mutants sont généralement résistants à de faibles concentrations en cycloheximide (de l'ordre de 5-10 pg/ml). D'autres auteurs (TAKAGI et al dans le brevet US 4.857.460) ont rapporté des résultats relatifs à l'étude de la résistance à la cycloheximide chez une autre levure, Candida Maltosa. Ils presentent une séquence d'ADN procurant la résistance à la cycloheximide chez C. maltosa. Cependant aucun gène, aucune phase ouverte de lecture, n'a été identifié dans cette séquence. En d'autres termes le brevet US 4.857.460 ne donne pas les éléments de caractérisation d'un gène, éléments qui auraient pu conduire à définir des modalités pour son utilisation, par exemple pour transformer de façon reproductible des eucaryotes différents de Candida Maltosa, en souches résistantes à la cycloheximide. Les inventeurs se sont intéressés à la levure Kluvveromyces lactis (K lactis) et ont mis en évidence le fait que la résistance à la cycloheximide chez K lactis dépend de l'expression d'un gène particulier. Ils ont aussi identifié le fait que le niveau de résistance de la bacterie à cet antibiotique fait intervenir d'autres éléments liés à la présence d'ADN particulier ayant un rôle de cofacteur (ou séquence (s) cofactrice (s)). Les inventeurs ont donc obtenu chez K lactis une séquence d'acide nucléique d'une taille d'environ 5,2 kb, susceptible de conférer un niveau de résistance à un hôte cellulaire transformé par cette séquence, suffisamment élevé pour la réalisation d'un système de sélection par la resistance à cet antibiotique, cette résistance pouvant se manifester pour une concentration en cycloheximide supérieure à 1 mg/ml. A l'intérieur de cette séquence d'acide nucléique, les inventeurs ont identifié et caractérisé un gène particulier codant pour une protéine dont la présence s'avère nécessaire pour induire le phénomène de résistance chez K lactis. Ce gène particulier code pour une protéine ribosomale qui est responsable de la résistance à une concentration en cycloheximide de l'ordre de 100 pg/ml. La résistance totale à cet antibiotique chez K Lactis nécessite non seulement la présence de cette séquence inductrice de résistance, mais encore la présence d'éléments d'ADN supplémentaires contenus dans la séquence d'acide nucléique de 5,2 kb déterminée par les inventeurs et décrite ci-après. Ces éléments additionnels jouent le rôle de cofacteurs. La présente demande a donc pour objet une protéine capable de conférer la résistance à la cycloheximide à un hôte cellulaire eucaryote naturellewent sensible à cet antibiotique ou resistant à un bas niveau de concentration (encore désigné par organisme résistant à bas niveau) de cet antibiotique. Ce premier type de protéine pourra être désigne dans la suite par l'expression "protéine de résistance". L'invention vise aussi une séquence d'acide nucléique comprenant un gène codant pour la protéine de résistance ci-dessus décrite, chez K lactis, ainsi que des séquences déterminant la présence de cofacteurs impliqués dans le niveau de la résistance conférée par la susdite protéine. Elle concerne également le gène codant pour la protéine de résistance et les différents fragments d'acide nucléique déterminant la présence des cofacteurs. Elle vise aussi des vecteurs de clonage et/ou d'expression de ces séquences nucléotiques ainsi que des hôtes cellulaires eucaryotes transformés par ces vecteurs. Une première proteine selon l'invention ou proteine de résistance à la cycloheximide est une protéine dont la présence est nécessaire et suffisante pour conférer à un hôte naturellement sensible à la cycloheximide, la résistance à cet antibiotique. Elle est caractérisée en ce qu'elle répond à l'enchaînement d'acides amines A suivant, ou en ce qu'elle comprend tout ou partie de cet enchaînement A éventuellement modifié, dès lors que la protéine formée confère la résistance à la cycloheximide, à un hôte eucaryote recombinant transformé par la séquence nucléotidique codant pour cette protéine, dans des conditions permettant sa production. SEQUENCE A: 1/1 31/11 Met val asn val pro lys thr arg lys thr tyr cys lys gly lys glu cys arg lys his 61/21 91/31 ala gln his lys val thr gln tyr lys ala gly lys ala ser leu tyr ala gln gly lys 121/41 151/51 arg arg tyr asp arg lys gln ser gly phe gly gly gln thr lys gln ile phe his lys 181/61 211/71 lys ala lys thr thr lys lys val val leu arg leu glu cys met ser cys lys thr lys 241/81 271/91 thr gln leu ala leu lys arg cys lys his phe glu leu gly gly glu lys lys gln lys 301/101 gly gln ala leu gln phe OPA La propriété de cette protéine de conférer la résistance à la cycloheximide peut être évaluée lorsqu'elle est produite dans un hote cellulaire eucaryote déterminé, naturellement sensible à la cycloheximide à une concentration supérieure à un seuil déterminé en fonction de la nature de l'hôte, et qu'elle permet dans cet hôte d'obtenir une résistance à une concentration supérieure de 5 à 15 fois environ, de préférence de 10 fois environ, par rapport à la concentration de cycloheximide conférant la sensibilité naturelle chez cet hôte. En particulier chez les levures l'augmentation du niveau de résistance est d'environ 10 fois. A titre d'exemple on donne ci-dessous un ordre de grandeur de la sensibilité naturelle à la cycloheximide de différents organismes levures S cerevisiae : 1 pg/ml cellules eucaryotes supérieures : 1 Sg/ml plants de tabac : 10 pg/ml De façon générale, la sensibilité naturelle d'un organisme déterminé se manifeste dès lors que la présence de cycloheximide dans le milieu de culture inhibe la croissance et la multiplication de l'organisme. Lorsqu'il est fait référence dans ce texte à un hôte eucaryote sensible à la cycloheximide, cette référence doit être interprétée comme désignant tout organisme eucaryote répondant à la définition ci-dessus s'agissant de la résistance à la cycloheximide. Une protéine de résistance à la cycloheximide selon l'invention peut encore être caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence nucléotidique I suivante, par une partie de la séquence I ou par une séquence modifiée par rapport à I, dès lors que la protéine codée par cette partie de séquence ou cette séquence modifiée est capable de conférer la résistance à une concentration au moins égale à 100 g/ml de cycloheximide lorsqu'elle est introduite chez un hôte eucaryote par exemple chez la levure Saccharomyces Cerevisiae, dans des conditions permettant son expression. GTTAACGTT CCAAAGACCA GAAAGACTTA CTGTAAGGGT AAGGAGTGCC GTAAGCACGC CCAACACAAG GTTACCCAAT ACAAGGCTGG TAAGGCTTCC TTGTACGCTC AAGGTAAGAG AAGATATGAC CGTAAACAAT CTCGTTTCGG TGGTCAAACC AAGCAAATTT TCCACAAGAA AGCTAAGACT ACCAAGAAGG TCGTTTTCAG ATTGGAATGT ATGTCCTGTA AGACCAAGAC CCAATTGGCT TTGAAGAGAT GTAAGCACTT CGAATTGGGT GGTGAAAAGA AGCAAAAGGG TCAAGCTTTG CAATTCTGA L'invention concerne également une séquence d'acide nucléique comprenant la séquence codant pour la protéine de résistance à la cycloheximide chez K lactis, cette séquence étant caractérisée en ce qu'elle répond à lune des définitions suivantes (a) il s'agit d'une séquence d'acide nucléique de K lactis d'environ 5,2 kb, capable de conférer une résistance à la cycloheximide à une concentration supérieure à 1 mg/ml chez K lactis, et comprenant les sites de restriction définis à la figure 3; Les divers sites sont situés respectivement aux positions suivantes Sau3A : 0, StuI : +300 bp, PvuII : +600 bp, BglII +900 bp, BstXI : +1200 bp, PvuII : +2300 bp, Pst I +2400 bp, PstI : +3000 bp, EcoRI : +3200 bp, HindIII : +3300 bp, EcoRI : +3700 bp, HindIII : +4500 bp, HindIII : +4540 bp, SalI : +5100 bp. (b) il s'agit d'une séquence d'acide nucléique d'environ 5,2 kb, comprenant l'enchaînement nucléotidique I ou hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement I, dans des conditions de forte stringence (0,1 X SSC, 0,1% SDS à 650C), et capable de conférer une résistance à une concentration de cycloheximide supérieure à 100 pg/ml, de préférence supérieure à 1 mg/ml, chez K lactis; (c) il s'agit d'une séquence d'acide nucléique d'environ 5,2 kb comprenant l'enchaînement nucléotidique II suivant ou hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement II, dans des conditions de forte stringence, et capable de conférer une résistance à une concentration de cycloheximide supérieure à 100 pg/ml, de préférence supérieure à 1 mg/ml, chez K lactis. SEQUENCE Il 10 20 30 40 50 60 1 CCTCGAGGTC GACATTCAAG GGTTTAGTAT CCTGAAAACA AAGCTTGTAT AGACAGCCGA 60 61 CGGTTCTTGG TGACTGTTTG CATCCGTGCA CCATAAAATC TCTCTTAACC ACCCACACAT 120 121 TGATTTTCGT GTTCAATTGA AATGTGAAAA ATAAAATTGT TTCCCAATTA GGACTATATT 180 181 CGTCTGTGGG AAAATAACAT TGCCTAGTGG CATTGGTGTG GCCTAACCAG GCCGAATCAC 240 241 TCACTTTCCA CTAACAGACC TTCCTCCTGG TCGGTCTGGT CTGGGCTACC GGCAGTGTAG 300 301 TCTCTCTTGC CAACACATTA CGCATTCATG CTTGCTTCTG CCTACTGCTT CCCCGCCCAG 360 361 GCTAAGCTTG GACGTGCGTA GTCGGGGGGC CAGTAACGCC TGCTCGTCTG GACTTGTTCG 420 421 CCTTCACTCT TGCTGCCGTC TCTGCTTCGA TGGCTGCCAT TCGGCAATTC TCATCTGGAA 480 481 GGATTGAACC ACCTTGAATT TTTCAACATT AAAATATTAC ACAAGGAAAG TTCATCATAG 540 541 TAGATATATC GTATAGTTGA TTGTTATAGC ACCTATTTGT TTCAGTACAT TCAGAAAGCG 600 601 TAACTCAACA GAGATCAAAT CAGTCACAAT GGGTATGTGA ACAAGATTTA AAATATACCG 660 661 TGGAGATTGT CAGTGGTTTA TTCGATTTTT GGTATCCTGA GGGAAGAATG GAACGTTTGA 720 721 AGTTTAGTAC CAAGTGAACA TGAAATGAGC TATGGTTATT TAACAGAATA CAGCATTTCA 780 781 GAGTGAATCA ATGAGAAAAC ACCAACCGTA TTGGAAATTC AGATATTGCA TCGACAAGGG 840 841 GGGAGAGTTC ATTTGAGTTG GTGAACTATA TCAAAAGATC AGTATTTTGG TCGAAGTATG 900 901 GACGATTCAC TAGCATAAAA CCCTGTTCAC GCTGGAGGAA GTAATTTGGG TTATTTGTTG 960 961 TCCCTATGTT TCTTAATTCG GTGTAGTCGA GACAACCTCA GAGAATTGTA TATCAGTGAA 1020 1021 GTCAACGCTA CACTGACTGA ACATAATTAA CAGGAACTCA GTCGTATTAA ACAACTGGGG 1080 1081 TTCAGATAGC CTGGACCTCC CTATACAATA AGAAGAAGAG AATAGAATTC CTGCAATCAA 1140 1141 AATAAGCTGG ATGAAGCTAA AGAATATTTT TTTACTAACA TCGACATGTA TCACTATCTT 1200 1201 ATGATATGTT AATTTCTAAC AGTTAACGTT CCAAAGACCA GAAAGACTTA CTGTAAGGGT 1260 1261 AAGGAGTGCC GTAAGCACGC CCAACACAAG GTTACCCAAT ACAAGGCTGG TAAGGCTTCC 1320 1321 TTGTACGCTC CCGGTAAGAG AAGATATGAC CGTAAACAAT CTGGTTTCGG TGGTCAAACC 1380 1381 AAGCAAATTT TCCACAAGAA AGCTAAGACT ACCAAGAAGG TCGTTTTGAG ATTGGAATGT 1440 1441 ATGTCCTGTA AGACCAAGAC CCAATTGGCT TTGAAGAGAT GTAAGCACTT CGAATTGGGT 1500 SEQUENCE II (suite) 1501 GGTGAAAAGA AGCAAAAGGG TCAAGCTTTG CAATTCTGAG ATTATCTTTT GGAAGACCAT 1560 1561 TTGTTACCAA TTTGTCAATT TTTTAACTTT TCTATAAGTA TTACGAATTC ACATATACTC 1620 1621 TTTCATCACA TTTATAATCT CATATCTGTC ATTTGTATAG TTTAGTCTCC ACTGGGTACT 1680 1681 TCTTCACTTT GCGATTTGTA TTATACGTAT TCTAAGTATA ATTTTCAGCA GAACGCATAA 1740 1741 GAGTTTATTA ACAAGAATTG TTTACAAAGA ATAGCGTAGG ACTCAGGCTA CATTATTGAT 1800 1801 CCTGCAGGCA GTAAAGCTTA CATATGACCT TAGCTAATAT AACATGTACA TACTCACCAT 1860 1861 GTATACCACT TTTTTCATTC CATTGTCTAA AATATGTTTT CAATATTTGC CAAAATCGCC 1920 1921 AATTTCATTG GAAAAACAAA AACATCHAAT CAAACTTGTT TTAGAAAACA ACGAACATGA 1980 1981 AACTATACTG TTAACGTTTA GAGACATATT TCACGTCAAC AAGGCCGTTT GGACGTCGCT 2040 2041 ACTTCAGCAA CAACACGTAA TGTACGGTGG ATATTCGAAT CAGAACTACT ATCAACAGCC 2100 2101 TTCTGGTCGT CCGAAACGAT TTTCAGCAAC AGGGAAACAT GCCCTTTTCG GAACCTTCTC 2160 2161 AGCCCATGTT CAGCACCAAT TATATGAAAC AACAAGGATC ACAGCCGTCT TACAAGACCG 2220 2221 TCTGACCCAA CAGCAATCGC AACCTCAGTC GCATAATAAT CAATATTATC CGAATGGAGG 2280 2281 GTTTACTGAT GTGCCCAACT TGAATTATCC AGCGACTCCA CCACCAACTC AAAGCATTTA 2340 2341 TTCACATAAC ACCAACTCTA ATTCGAAGGT ATATCAATCC GCTCAGCATA CATCTCCCGG 2400 2401 TCAATATTCT GTTGCCAGTG AGTCCGGTTT GTACATCCCG CCACCACTGC AGCAACAGCA 2460 2461 GAATGGTCAA CAGAGTCCTG TGAGATCGGT ACATCAACAG ACACAGCAAA CACCGCCAAC 2520 2521 ATTTACTCAG CAACAAAGCT CTTCCCAACC TCAGTCACCT CAACACAATA CGTTATCATG 2580 2581 CACAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AACAACAAAC TCAACAGGCC CAGCAGCAAG 2640 2641 GACAACGACA AACTCAGCAA CAGTCTCAGC AGCAAGCTCA ACAACAGAAT GGATCGGCGA 2700 2701 ATAATTACAT GTATTTTGAG AGAAGACCTG ACCTATTGAC CAAAACTACC CAAGACAAAG 2760 2761 CAGATCGAAT TCCTGCAGCC CGGGGGATCC ACTAGTTCTA GAGCGGCCGC CACCGCGGTG 2820 2821 GAGCTCCAAT TCGCCCTATA GT 2842 10 20 30 40 50 60 Selon un mode de realisation préfére de l'invention, les deux séquences d'ADN définies aux points (b) et (c) ci-dessus, répondent en outre à la carte de restriction donnée à la figure 3. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'acide nucléique ci-dessus décrite est extraite de la souche E.coli DHSa recombinée avec le plasmide Ye23/31, déposée à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes à Paris, France) le 2 Juillet 1991 sous le numéro I-1121. On appele ici "séquence complémentaire" d'une séquence d'acide nucléique donnée, une séquence inverse et complémentaire par rapport à une séquence donnée. Le terme "inverse" rend compte de la restauration de l'orientation 5' - 3' de l'acide nucléique qui est aussi complémentaire par la nature des nucléotides qu'elle contient, à une séquence donnée. La séquence d'acide nucléique de 5,2 kb comprend, outre la séquence codant pour la protéine dite de résistance, ci-dessus décrite, l'ADN que l'on peut désigner par le terme "cofacteur", qui determine le niveau de résistance à la cycloheximide chez K lactis et chez un hôte cellulaire transformé par cette séquence. Cet ADN cofacteur est compris dans la sequence II. L'invention concerne donc également les fragments d'ADN suivants, inclus dans la séquence de 5,2 kb cidessus décrite le fragment BamHI (5') - PvuII (3') d'environ 2,3 kb le fragment PvuII (5') - SalI (3') d'environ 3 kb L'obtention d'une résistance à la cycloheximide chez un hôte cellulaire donné, à un niveau déterminé peut être réalisée en transformant cet hôte avec un acide nucléique codant pour la protéine de résistance à la cycloheximidee et avec un fragment d'ADN cofacteur present dans la séquence de 5,2 kb adjacent ou non à l'acide nucléique ci-dessus, l'introduction de ce fragment chez l'hôte étant directement corrélée à l'importance de la résistance constatée. Un mode de réalisation de la transformation d'un hôte cellulaire est décrit dans les pages suivantes. La proteine de résistance peut être isolée par lyse des cellules de K. lactis suivie des étapes décrites dans "The Yeasts" (seconde édition par A.H. Rose et J.S. Harrison, vol 4: 504-505). La purification peut aussi être faite par affinité au moyen d'anticorps digérés contre la séquence A. Dans ce cas on réalise une surexpression de la protéine ribosomale qui est ensuite purifiée selon les techniques classiques, sur gel de polyacrylamide. La bande de poids moléculaire correspondant à la proteine de sequence A est prélévée. Cette bande est la bande majoritaire pusiqu'elle résulte de la surexpression de la protéine. Elle est soumise à une réaction avec les anticorps ci-dessus décrits, produits selon les techniques classiques, s'agissant notamment d'anticorps monoclonaux. L'invention vise aussi la séquence ORF A contenant l'acide nucléique I, ORF A étant elle même comprise entre les nucléotides en positions 1 et 1560 de l'enchaînement II étant entendu que la séquence comprise entre les nucléotides 633 et 1222 correspond à un intron V. D'autres séquences nucléotidiques particulièrement interessantes dans le cadre de l'invention sont les séquences suivantes - l'enchaînement nucléotidique ORF A en tant que tel ou tout enchaînement nucléotidique hybridant avec la séquence complémentaire de ORF A dans les conditions suivantes : 60 C, 2 x SSC, 5 x Denhart, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon, - la séquence codante I (ou phase exonique) contenue dans l'acide nucléique ORF A codant pour la protéine de résistance chez Kluyveromyces lactis, et comprise entre les nucléotides 1223 et 1239, - la séquence IV, comprise entre les nucléotides 1561 et 2740 appelée cofacteur et capable d'augmenter la résistance à la cycloheximide conférée par la protéine de résistance, - la phase intronique V de ORF A, - l'enchaînement nucléotidique III délimite par les nucléotides 1 et 628, qui contient les éléments de régulation de l'expression de ORF A et en particulier la region promotrice de la transcription de la séquence ORF A; ce promoteur contient en particulier des régions régulatrices des promoteurs de protéines caractéristiques des ribosomes, régions de type "UASRpG" telles que décrites par W.H. Mager (Biochem. Biophys. Acta (1988) 949: 1-15). Ces protéines dites ribosomales sont importées dans le noyau de la cellule qui les produit, où elles sont assembles en ribosome, - la séquence IV comprise entre les nucléotides 1561 et 2740 appelée cofacteur et capable d'augmenter la résistance à la cycloheximide conféree par la protéine de résistance. L'invention a aussi pour objet des vecteurs recombinants en particulier pour le clonage et/ou l'expression des protéines dont on a précédemment donné les caractéristiques. Ces vecteurs d'expression sont caractérisés par l'incorporation en un de leurs sites non essentiels pour leur réplication, d'une séquence nucléotidique choisie parmi les precedentes, sous le contrôle des éléments de régulation nécessaires à son expression dans un hôte cellulaire eucaryote choisi, ces éléments de régulation comportant notamment un promoteur, le cas écheant inductible et une séquence de terminaison de transcription. Un tel vecteur peut comprendre une séquence nucleotidique codant pour une protéine dite protéine de résistance à la cycloheximide, seule ou en association avec une séquence nucléotidique cofactrice répondant à la définition donnée précédemment. L'invention vise en outre des vecteurs répondant aux définitions ci-dessus caractérisés en ce qu'ils contiennent en outre un acide nucléique hétérologue déterminé, par exemple un acide nucléique codant pour une protéine d'intérêt pharmaceutique ou industriel, cet acide nucléique étant sous le contrôle d'éléments de régulation nécessaires à son expression dans l'hôte, ces éléments pouvant être confondus avec les séquences contrôlant la transcription des séquences nucléotidiques intervenant dans la résistance à la cycloheximide. Le système de résistance selon l'invention permet de façon avantageuse de contrôler l'insertion de sequences hétérologues telles celle de la Serum Albumine Humaine, de l'antigène de surface de l'hépatite B, en vue de leur expression dans un hôte eucaryote. A titre d'exemple on peut utiliser des vecteurs du type plasmide replicatif, des vecteurs intégratifs tels que pSVL (Pharmacia). Un tel vecteur peut par exemple contenir la protéine répondant à la séquence A, dépourvue de son intron. De façon générale, il est intéressant pour la mise en oeuvre de l'invention, d'utiliser des vecteurs à multiples copies en particulier quand les cellules transformées sont des cellules eucaryotes. Des vecteurs préférés selon l'invention sont des vecteurs adaptés à l'expression dans des levures notamment d'intérêt industriel que l'on souhaite marquer avec un marqueur d'auxotrophie, une levure particulière étant Pichia pastoris, ou des vecteurs adaptés à l'expression dans une cellule animale d'eucaryote supérieur, par exemple le baculovirus, ou encore des vecteurs adaptés à l'expression dans une cellule vegétale telle que les plants de tabac. L'invention vise par ailleurs une cellule eucaryote caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur répondant aux caractéristiques ci-dessus et en particulier en ce qu'il s'agit d'une cellule de levure, par exemple Pichia pastoris, d'une cellule animale d'eucaryote supérieur, par exemple une cellule d'insecte ou une cellule de mammifère notamment murine ou simienne, d'une cellule humaine ou encore d'une cellule végétale. Une cellule particulièrement avantageuse dans le cadre de l'invention est la souche E.coli DH5a transformée avec le plasmide Ye23/31 déposée à la CNCM le 2 Juillet 1991 sous le numéro I-1121. Une telle cellule recombinante peut être obtenue par tous les procédés d'insertion de séquences hétérologues couramment utilisés pour la préparation d'hôtes cellulaires recombinants. On peut notamment appliquer la technique d'électroporation décrite par M. Becker, L. Garente dans Method in Enzymology (1991 Vol. 194: 182-187). A titre d'application, les protéines de résistance décrites précédemment peuvent être utilisées dans un système de sélection répondant spécifiquement à un marqueur de type cycloheximide, pour contrôler l'introduction chez un hôte eucaryote d'une séquence hétérologue que l'on souhaite exprimer dans cet hôte. La sélection sera d'autant plus aisée que la résistance peut être verifiee avec une forte concentration d'antibiotique cette résistance résultant alors de l'association à la protéine de résistance ci-dessus à un cofacteur défini précédemment. Il est particulièrement intéressant dans le cadre de l'invention de préparer des protéines permettant d'obtenir une résistance à une concentration d'environ 100 pg/ml, voire 1 mg/ml de cycloheximide. Il est en outre dans certains cas très avantageux d'obtenir des proteines de résistance eventuellement en association avec un cofacteur conduisant à une résistance à une concentration d'environ 1 mg/ml de cycloheximide. L'invention vise par ailleurs un procédé pour le contrôle de la présence d'un acide nucléique hétérologue dans un hôte cellulaire, caractérise en ce qu'il comprend - la transformation de l'hôte cellulaire par un vecteur d'expression comportant en des sites non essentiels pour sa replication, l'acide nucléique hétérologue d'une part, une séquence nucléotidique codant pour une protéine de résistance d'autre part et le cas échéant une séquence nucleotidique cofactrice sous le contrôle des éléments de régulation nécessaires à l'expression de ces séquences dans l'hôte cellulaire choisi, - la culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, - la mise en contact de l'hôte avec une concentration déterminée de cycloheximide et la détection de la résistance de l'hôte vis à vis de cet antibiotique. L'invention a aussi pour objet une méthode pour l'obtention de cellules exprimant la résistance à la cycloheximide telle que décrite dans les pages précédentes caractérisée par les etapes suivantes - transformation d'un hôte cellulaire donné, par une séquence d'acide nucléique de l'invention préalablement insérée dans un plasmide de l'hôte, dans des conditions permettant l'expression de le susdite séquence d'acide nucléique; - culture des cellules transformées (transformants) dans un milieu complet contenant une concentration de cycloheximide très faible, de préférence inférieure à 2 pg/ml; - récupération des souches résistantes à une concentration supérieure à 1 à 10 pg/ml en cycloheximide. A titre d'exemple, s'agissant des levures, les étapes décrites ci-dessus sont effectuées dans les conditions suivantes - la culture des transformants est réalisée à une température comprise entre environ 29 C et environ 30"C, de préférence 30 e C, en présence d'une concentration en cycloheximide inférieure à 2 Ag/ml, pendant 12 à 36 heures, - les souches sélectionnées à partir de cette culture sont celles qui résistent en culture en présence de 100 pg/ml de cycloheximide, - le milieu complet de culture contient 10 g/l d'extrait de levure (yeast extract), 20 g/l de Bacto peptone et 20 g/l de glucose. Pour des cellules eucaryotes, comme par exemple les cellules LTK- (souris) le milieu de culture peut être un milieu Dulbeco modifié par 10% de sérum de veau nouveau né et par un antibiotique fongicide. Les clones recombinants sont sélectionnés selon la technique décrite par Delpeyroux F. et al dans Journal of Virology (Dec 1990 Vol. 64 (12): 6090-6100). En résumé, les cellules sont cotransfectées avec 10 fois plus de plasmide recombinant que de vecteur contenant le gène de résistance à l'antibiotique G418 (Colbère - Garapin F. et al 1981, J. Mol. Biol 150: 1-14). Après trois semaines, les clones résistants au G418 sont mis en milieu de culture additionné de cycloheximide à une concentration de 1 à 10 pg/ml. Lorsque l'hôte cellulaire est S cerevisiae, le plasmide contenant la séquence nucléotidique de l'invention peut être le plasmide multicopie épisomal (Ye) de S cerevisiae. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention ressortent des exemples et des figures qui suivent. Figure 1 : vecteur de clonage contenant le fragment d'ADN de K lactis d'environ 5,2 kb procurant la résistance à la cycloheximide Une banque génomique de la souche de K lactis 2359-152 résistante à plusieurs mg/ml de cycloheximide a été construite. Cette banque est réalisée dans un vecteur navette E.coli/S. cerevisiae :pEMBL Ye 23 (Baldari et al 1985 Gene 35: 27-32, figure 1). L'ADN chromosomique de K lactis a été digéré partiellement par l'enzyme Sau3A puis fractionné sur un gradient de sucrose.Les fractions contenant un ADN de taille comprise entre 4 et 9 kb ont été rassemblée et l'ADN ligaturé au vecteur Ye 23 préalablement coupé et déphosphorylé au site BamHI situé dans le gène de la 8-galactosidase. Ce mélange de ligation a permis de transformer la souche de E.coli XL1 et les transformants recombinants ont été sélectionnés sur un milieu permettant de visualiser une insertion dans le gène de p-galactosidase. 23000 clones de E.coli recombinants ont été ainsi sélectionnés. L'analyse par restriction des plasmides de cinquante clones a permis d'estimer la taille moyenne de l'insertion d'ADN de K lactis à 5 kb, ce qui donne une probablité de 99,5% d'obtenir un gene spécifique. Souche de E.coli XL1 (souche mise au point par la société Stratagène : endAl, hsdR17 (rk, mk+), supE44, thi, #-, recAl, gyrA96, relAl, # (lac), F', proAB, laciq Z#M15, TnlO (ter) Souche de S.cerevisiae OL1: a, leu2-3, leu2-112, his3-ll, his3-15, ura3-251, ura3-273 Figure 2 : Fragment séquence de l'ADN de K lactis procurant la résistance à la cycloheximide (séquence II) Figure 3 : carte de restriction du fragment d'ADN de 5,2 kb de K lactis qui a été inséré au site BamHI du vecteur Ye 23 (C. Baldari et al, Gene (1985) 35: 27) Le fragment SalI-PvuII (2,8 kb) séquence contient la protéine ribosomale.Les divers sites sont situés respectivement aux positions suivantes Sau3A : O, StuI : +300 bp, PvuII : +600 bp, BglII +900 bp, BstXI : +1200 bp, PvuII : +2300 bp, Pst I : +2400 bp, PstI : +3000 bp, EcoRI : +3200 bp, HindIII : +3300 bp, EcoRI : +3700 bp, HindIII : +4500 bp, HindIII : +4540 bp, SalI : +5100 bp. EXEMPLES I - Clonage du fragment d'ADN de K. lactis procurant la résistance à la cycloheximide I.1) Construction d'une banque de K.lactis chez S.cerevisiae Une banque génomique de la souche de K. lactis 2359-152 (WESOLOWSKI et al, 1982, Curr. Genetics. 5: 191-197) résistante à des concentrations de plusieurs mg/ml de cycloheximide a été construite. Cette banque a été réalisée dans un vecteur navette E.coli/S.cerevisiae : pEMBL Ye 23 (BALDARI et al, 1985, Gene 35: 27-32), (figure 1). L'ADN chromosomique de K. lactis a été digéré partiellement par l'enzyme Sau3A puis fractionné sur un gradient de sucrose.Les fractions contenant un ADN de taille comprise entre 4 et 9 kb ont été rassemblées et ligaturées au vecteur Ye 23 préalablement coupé et déphosphorylé au site BamHI situé dans le gène 8-galactosidase. Ce mélange de ligation a permis de transformer la souche de E.coli XL1 (BULLOCK et al, 1987, Biotechniques 5, 376-379) et les transformants recombinants ont été sélectionnés sur un milieu permettant de visualiser une insertion dans le gène de la p-galactosidase. 23000 clones de E.coli recombinants ont été sélectionne. L'analyse par restriction des plasmides de cinquante clones a permis d'estimer la taille moyenne de l'insertion d'ADN de K. lactis à 5,2 kb, ce qui donne une probabilité de 99,5% d'obtenir un gène spécifique. I.2) Transformation de S.cerevisiae et obtention de résistants à la cycloheximide La souche OL1 de S.cerevisiae (BOY-MARCOTTE et al, 1982, Gene 20: 433-440), sensible à des concentrations inférieures à 1 Ag/ml de cycloheximide a été transformée avec 1 'ADN extrait de la banque. Dans un premier temps les transformants ont été criblés pour la prototrophie uracil ce qui a permis d'évaluer la quantité totale de transformants. Dans un deuxième temps nous avons répliqué ces transformants sur un milieu contenant de la cycloheximide respectivement à deux concentrations : 10 et 100 g/ml. 35000 transformants URA+ ont été obtenus dont 7 sont résistants à des concentrations supérieures à 100 Mg/ml de cycloheximide.Après analyse, il s'est avéré que 6 parmi les 7 clones retenus avaient intégré 1'ADN provenant de K. lactis dans leur génome. Cependant, chez le septième transformant, le caractère de résistance a été maintenu sur un plasmide Ye 23. Ce transformant est resistant à de très fortes concentrations de cycloheximide dépassant 1 mg/ml. Le fragment d'ADN procurant la résistance à la cycloheximide est d'environ 5,2 kb. D'autre part, pour les transformants ayant intégré dans leur génome le fragment d'ADN de K. lactis, le phénomène de résistance est maintenu chez un diploïde hétérozygote pour ce marqueur. Le caractère "cycloheximide résistant" est donc dominant. I.3) Protéine responsable de la résistance à la cycloheximide La totalité de ce fragment a eté insérée dans des vecteurs phagemides pBluescript (Stratagene). Différentes délétions unidirectionnelles ont été réalisées à laide du couple d'enzymes ExoIII/Sl. Le séquençage de l'ADN simple brin a été effectué à l'aide la technique de Sanger en utilisant des amorces universelles ou des amorces synthétisées au laboratoire à partir de la séquence elle même. Un fragment de la séquence ainsi obtenue est présenté figure 2. Elle contient notamment une phase ouverte de lecturee ORF A. Phase ORF A Cette phase de lecture est longue de 320 bp (figure 2) et elle est dotée d'un intron de 590 bp. Cet intron est localisé à l'extrémité 5' du gène, après la première base après l'ATG. La protéine codée par l'exon est de 150 acides aminés (figure 3). La recherche d'homologies à l'aide des banques de données EMBL et GENEBANK montre que 1'ORF A est homologue à 75% au niveau des acides amines à la protéine ribosomale L36a du rat (GALLAGHER et al, 1988, DNA7: 269-273) et à 74% à une proteine ribosomale humaine (DAVIES et al, 1986, Gene 45: 183-191) qui est elle même homologue à la protéine ribosomale rp44 (aussi dénomée L41) de S.cerevisiae (ITOH, 1978 FEBS Lett. 96: 399-402).L Cette séquence est suffisante pour procurer un niveau de resistance élevé vis à vis de la cycloheximide, cependant ce niveau est plus faible que celui observe chez les transformants possédant le fragment initial de 5,2 kb. I.4) Expression de la phase de lecture A Afin de déterminer dans quelle mesure la protéine dite de résistance est responsable du phénomène de résistance à la cycloheximide, la blême souche de S.cerevisiae a été transformée avec un vecteur contenant uniquement l'ORF A. Les transformants qui possèdent l'ORF A sont résistants à la cycloheximide. Cependant le niveau de résistance observé (100 pg/ml) est environ dix fois inférieur à celui obtenu lorsque ORF A est associée avec l'ADN cofacteur contenu dans le fragment total de 5,2 kb (1000 pg/ml). Par contre la délétion de la séquence ORF A entraîne l'abolition de la résistance. Conclusions Un gène responsable du phénomène de résistance à la cycloheximide a été isolé sur un fragment d'ADN de K. lactis. Ce système est composé d'une protéine ribosomale (ORF A) très fortement analogue aux protéines ribosomales L36a humaine et de rat ainsi que la rp44 (ou L4l) de S. cerevisiae. Cette protéine est nécessaire pour provoquer le phénomène de résistance mais non suffisante pour avoir une résistance totale vis à vis de l'antibiotique. La présence d'un cofacteur localisé sur le fragment cloné de 5,2 kb de K lactis est nécessaire pour obtenir une résistance à un niveau de 1 mg/ml environ chez K lactis. REVBNDICATIONS 1. Séquence d'acide nucléique de K lactis d'environ 5,2 kb, capable de conférer une résistance à la cycloheximide à une concentration supérieure a 1 mg/ml chez K lactis et comprenant les sites de restriction : Sau3A : 0, StuI : +300 bp, PvuII : +600 bp, BglII : +900 bp, BstXI : +1200 bp, PvuII : +2300 bp, Pst I : +2400 bp, PstI : +3000 bp, EcoRI : +3200 bp, HindIII : +3300 bp, EcoRI : +3700 bp, HindIII +4500 bp, HindIII : +4540 bp, SalI : +5100 bp. 2. Séquence d'acide nucléique d'environ 5,2 kb selon la revendication 1, comprenant l'enchaînement nucléotidique I ou hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement I, dans des conditions de forte stringence (0,1 x SSC, 0,18 SDS à 65C), et capable de conférer une résistance à la cycloheximide à une concentration supérieure à 100 pg/ml, de préférence supérieure à 1 mg/ml, chez K lactis. 3. Séquence d'acide nucléique d'environ 5,2 kb selon la revendication 1 ou 2, comprenant l'enchaînement nucléotidique II ou hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement II dans des conditions des forte stringence, et capable de conférer une résistance à une concentration de cycloheximide supérieure à 100 Ag/ml, de préférence supérieure à 1 mg/ml, chez K lactis. 4. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir de la souche Ecoli DH5a transformée par le plasmide Ye 23/31 déposée à la CNCM le 2 Juillet 1991, sous le numéro I-1121. 5. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle contient tout ou partie de la séquence II, ou ce qu'elle correspond à la séquence II ou en ce qu'elle hybride dans des conditions de forte stringence avec la séquence complémentaire de II dès lors que la séquence nucléotidique ainsi formée possède au moins l'une des propriétés suivantes - elle code pour une protéine de résistance à la cycloheximide et/ou, - elle code pour un enchaînement d'acides aminés susceptible d'être reconnu par des anticorps dirigés contre une protéine de résistance à la cycloheximide et/ou, - elle régule l'expression de la séquence codant pour une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans Kluyveromyces lactis. 6. Séquence nucléotidique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement Ez encha înement nucléotidique ORF A ou en ce qu'elle hybride avec la séquence complémentaire de ORF A dans des conditions de forte stringence. 7. Séquence nucléotidique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence codante I de ORF A. 8. Séquence nucléotidique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle répond à l'enchaînement nucléotidique III ou à la région promotrice de la transcription de la séquence ORF A. 9. Cofacteur susceptible d'augmenter la résistance à la cycloheximide conférée par une proteine codée par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caracterise en ce qu'il est compris dans la séquence d'acide nucléique suivante entre les nucléotides 1561 à 2740 dès lors qu'il permet d'obtenir un niveau de resistance à la cycloheximide supérieur à 100 Ug/ml chez un hôte eucaryote modifié par insertion de cette séquence d'acide nucléique et de la séquence nucléotidique codant pour une protéine de résistance, dans des conditions permettant la production de ces protéines. 10. Protéine de résistance à la cycloheximide, caractérisée en ce qu'elle répond à l'enchaînement d'acides aminés A, ou en ce qu'elle comprend tout ou partie de cet enchaînement A éventuellement modifié, dès lors que la protéine formée confère une résistance à une concentration supérieure ou égale à 100 pg/ml à la cycloheximide à un hôte eucaryote recombinant transformé par la séquence nucléotidique codant pour cette protéine, dans des conditions permettant sa production. 11. Protéine de résistance à la cycloheximide, caractérisée en ce qu'elle est codée par la séquence nucléotidique I, par une partie de la séquence I ou par une séquence modifiée par rapport à I, dès lors que la protéine codée par cette partie de séquence ou cette sequence modifiée est capable de conférer une résistance à une concentration superieure ou égale à 100 Ag/ml à la cycloheximide lorsqu'elle est introduite chez un hôte eucaryote, dans des conditions permettant son expression. 12. Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, telle qu'obtenue à partir de Kluyveromyces lactis. 13. Vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, sous le contrôle des éléments de régulation nécessaires à son expression dans un hôte eucaryote choisi, ces éléments de régulation comportant un promoteur, le cas échéant inductible et une séquence de terminaison de transcription. 14. Vecteur selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur adapté à l'expression dans les levures telles que Pichia Pastoris, ou d'un vecteur adapté à l'expression dans une cellule animale, par exemple le baculovirus, ou d'un vecteur adapté à l'expression dans une cellule végétale. 15. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il contient en outre un acide nucléique déterminé dont on recherche l'expression dans un hôte eucaryote choisi, cet acide nucléique étant sous le contrôle d'éléments de régulation nécessaires à son expression dans l'hôte. 16. Vecteur selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'acide nucléique est sous le contrôle des éléments de régulation contrôlant la transcription des séquences nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 17. Cellule eucaryote caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 13 à 16 et en particulier en ce qu'il s'agit d'une cellule de levure, par exemple Pichia pastoris, d'une cellule animale, par exemple d'une cellule d'insecte ou d'une cellule de mammifère notamment murine ou simienne, d'une cellule humaine ou encore d'une cellule végétale. 18. Cellule eucaryote selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée à la CNCM le 2 Juillet 1991, sous le numéro 1-1121. 19. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, dans un système de sélection repondant spécifiquement à un marqueur de type cycloheximide, chez un hôte eucaryote, notamment pour contrôler chez cet hôte l'incorporation d'un acide nucléique hétérologue déterminé. 20. Procédé pour le contrôle de la présence d'un acide nucléique hétérologue dans un hôte cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend - la transformation de l'hôte cellulaire par un vecteur d'expression comportant en des sites non essentiels pour sa replication, l'acide nucléique hétérologue, une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, sous le contrôle des éléments de régulation nécessaires à l'expression de ces séquences dans l'hôte cellulaire choisi, - la culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, - la mise en contact de l'hôte avec une concentration déterminée de cycloheximide et la detection de la résistance de l'hôte vis à vis de cet antibiotique.