Brevet FR2675694A1 — publié le 19921030

La présente invention concerne un système d'apport pour des facteurs de croissance biologiquement actifs ou morphogénétiques, ainsi qu'un procédé pour préparer un tel système d'apport. Selon l'invention, il est proposé un procédé de préparation d'un système d'apport pour facteurs de croissance biologiquement actifs ou morphogénétiques, en utilisant les techniques de chromatographie, ce procédé comprenant l'étape de l'introduction de tels facteurs biologiquement actifs dans une colonne de chromatographie garnie d'un support adsorbant poreux choisi pour son affinité spécifique pour de tels facteurs biologiquement actifs. Bien entendu, la colonne de chromatographie sera de dimensions appropriées, facilement déterminables par toute personne compétente en la matière. Le facteur biologiquement actif peut être, par exemple, une protéine morphogénétique d'os (PMO) destinée à induire la formation d'un nouvel os, tandis que le support poreux préféré est de l'hydroxyapatite poreuse. L'adsorption des facteurs biologiquement actifs ou morphogénétiques sur le support peut être contrôlée par le procédé selon l'invention, par exemple en contrôlant le taux d'introduction du facteur biologiquement actif à l'intérieur de la colonne de chromotographie Ceci peut être obtenu grâce à un tube capillaire en communication avec une source de facteurs biologiquement actifs dissous ou mis en suspension dans un excipient approprié. Enfin, conformément à la présente invention, il est également proposé un système d'apport pour des protéines morphogénétiques d'os (PMO), comprenant la protéine ostéogénine, ou BMP-3, pour provoquer la formation d'un nouvel os, ledit système d'apport comprenant un support poreux consistant en un adsorbant choisi pour son -2- affinité spécifique pour les protéines et sur lequel les protéines morphogénétiques d'os ont été adsorbées par introduction des protéines dans une colonne remplie d'un support poreux. Un système d'apport ostéogénique préféré selon la présente invention utilise, comme support, de rhydroxyapatite poreuse, sur laquelle les PMO ont été adsorbés. On peut obtenir une hydroxyapatite poreuse convenant en tant que support, par les techniques classiques, après conversion hydrothermique du carbonate de calcium de l'exosquelette corallien. Selon l'invention, il est estimé que le système d'apport en ostéogénine et/ou en autres PMO similaires adsorbées sur hydroxyapatite poreuse, est particulièrement important lorsqu'on cherche à induire la formation d'un nouvel os chez les primates et chez l'homme. L'invention concerne un système d'apport ostéogénique mis en oeuvre dans une méthode d'induction de la formation d'un nouvel os chez les primates, ledit système comprenant un support poreux sur lequel les PMO appropriés ont été adsorbés par introduction desdits PMO dans une colonne chromatographique contenant le support poreux choisi pour son affinité spécifique pour les PMO et ladite méthode comprend l'implantation du système d'apport dans ladite région du corps du primate o l'on cherche à provoquer la formation de l'os. L'invention concerne, également, un procédé pour préparer un système d'apport destiné à être utilisé dans une méthode pour provoquer la formation d'un nouvel os chez le primate On comprendra aisément qu'une telle méthode puisse avoir un intérêt thérapeutique important. L'invention propose, également, une méthode pour provoquer la formation d'un nouvel os chez le primate, comprenant l'implantation dans la région du corps du primate o l'on souhaite générer cet os, d'un système d'apport ostéogénique comprenant un support poreux sur lequel une protéine morphogénétique d'os a été adsorbée par introduction de ladite protéine dans une colonne chromatographique, contenant le support poreux choisi pour son affinité spécifique pour la protéine. Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci concerne un appareil pour préparer un système d'apport en un facteur de croissance biologiquement actif, ou morphogénétique, ledit appareil comprenant une colonne chromatographique destinée à recevoir le support poreux et qui contient un adsorbant ayant une affinité spécifique pour le facteur biologiquement actif; et des moyens de commande sur, ou à proximité immédiate de rorifice d'entrée de la colonne, pour contrôler le taux d'introduction dans ladite colonne du facteur biologiquement actif. Les moyens de commande peuvent comprendre un tube capillaire pour relier une source de facteurs biologiquement actifs dissous ou mis en suspension dans un véhicule approprié, avec la colonne de chromatographie, via l'orifice d'entrée de celle-ci. La matrice extracellulaire de l'os, sous forme d'un support insoluble de nature collagénique, après extraction dissociative par du chlorhydrate de guanidine 4 M ou de l'urée 6 M, s'est révélée appropriée pour optimiser l'induction d'une différenciation locale endochondrale osseuse, lorsque reconstituée avec des PMO, une famille de protéines initiatrices de la formation de l'os (références 1 et 2) Toutefois, un grand nombre de contraintes attachées à un tel apport limite encore l'utilisation des PMO en tant qu'agents pour la formation contrôlée d'un nouvel os chez l'homme La nécessité d'utiliser un support collagénique insoluble limite l'application clinique du phénomène d'induction à la formation de l'os, puisqu'un composant organique préparé à partir d'une matrice osseuse d'origine humaine peut avoir retenu des alloantigènes, ainsi que des virus transmissibles tels que, par exemple, celui du Sida ou de l'hépatite B Il faut donc recourir à un système d'apport ostéogénique non immunogénétique et non organique pour les PMO, si l'on veut les employer en application thérapeutique pour provoquer l'induction de la formation d'os dans la reconstruction du squelette Ceci permettrait de réduire et, peut-être même, d'éviter le recours à un prélèvement chirurgical autogène d'os, avec les risques de morbidité que cela peut comporter. Les différentes références bibliographiques mentionnées dans la description sont rassemblées en fin de celle-ci. L'invention sera maintenant décrite sur la base de l'exemple suivant, donné à titre non limitatif, en regard des dessins annexés; sur ces dessins: la figure 1 est une représentation schématique d'un appareil conforme à la présente invention et comportant une colonne de chromatographie liquide, ainsi qu'un appareil -4- associé, utilisé pour adsorber les PMO sur le support en hydroxyapatite poreuse, conformément à la méthode de la présente invention; les figures 2 à 4 sont des photomicrographies de sections histologiques d'implants, comprenant le système d'apport ostéogénique selon l'invention et collectées 30 jours après l'implantation; la figure 5 est une photomicrographie d'une section histologique d'un implant de contrôle en hydroxyapatite poreuse, sur lequel on n'a fait adsorber aucun PMO; la figure 6 est un profil de chromatographie de fractions de PMO sur disques supports en hydroxyapatite poreuse; et la figure 7 est une représentation schématique du système selon l'invention, sur laquelle sont indiqués, à l'aide de flèches, les niveaux de prélèvements des échantillons pour les trois bioessais, utilisés pour tester l'activité biologique de l'invention. Il reste, bien entendu, que c'est uniquement aux fins de la description que l'invention a été illustrée à l'aide de fractions de PMO isolées de la matrice extracellulaire d'os de babouins et adsorbées sur des disques supports en hydroxyapatite poreuse de mm de diamètre et de 3,5 mm d'épaisseur et, qu'en conséquence, l'invention ne saurait, en aucun cas, être limitée à cette réalisation. Description et spécifications des supports en hydroxyapatite Des supports d'implants consistant en hydroxyapatite poreuse non dégradable ont été obtenus sous la forme de disques de 25 mm de diamètre et de 3,5 mm d'épaisseur. Les composants solides de la trame présentent, en moyenne, un diamètre de 130 lm et leur diamètre d'interconnexion est, en moyenne, de 220 gm La porosité moyenne est de 600 lim et le diamètre moyen d'interconnexion est de 260 plm (Interpore 500, Interpore International, Irvine, CA, Etats-Unis) L'hydroxyapatite est obtenue par échange chimique hydrothermique, avec du phosphate, qui convertit la microstructure de l'exosquelette original de carbonate de calcium des coraux constituant les récifs scléractiniens de la famille des Gonioporas (référence 5), en une réplique non organique de l'hydroxyapatite (références 6 à 8) La conversion en hydroxyapatite est contrôlée par le schéma d'effraction de rayons X, qui montre que la réplique d'hydroxyapatite ainsi obtenue consiste en 90 % d'hydroxyapatite et 10 % de phosphate tricalcique. -5- Purification et préparation des fractions de PMO de babouin Une matrice d'os de diaphyse de babouin déshydratée et tamisée pour retenir la fourchette de taille de particules comprise entre 74 et 420 pum, est déminéralisée par de l'acide chlorhydrique 0,5 N et soumise à une extraction dissociative à l'aide de chlorhydrate de guanidine 4 M, 500 m M de Tris p H 7,4 contenant des inhibiteurs de protéase (référence 1) Les PMO de babouin sont isolées selon la méthode de la référence 1 et conformément à ce qui est décrit pour la purification de l'ostéogénine à partir de matrices d'os de babouin (références 3, 4). Après une chromatographie de filtration de gel, les fractions de PMO ont été testées comme indiqué ci-après, pour en déterminer l'activité biologique, dans l'espace sous- cutané chez le rat. L'activité ostéogénique est testée en reconstituant 25 mg de matrice collagénique d'os insoluble (le support inactif obtenu après extraction dissociative de la matrice d'os de rat), avec 5 à 20 gg de fractions de PMO, comme décrit dans les références 1 et 4 Après implantation dans l'espace sous-cutané du rat, les implants ont été collectés au jour 11 et examinés sur le plan biochimique (activité de phosphatase alcaline) et histologique. Adsorption contrôlée et liaison des fractions de PMO sur le support en hydroxyapatite: création du système d'apport ostéogénique Des aspects de la présente invention sont illustrés dans les deux étapes suivantes: 1 adsorption des PMO sur un support en hydroxyapatite poreuse, utilisant les techniques de chromatographie liquide pour fournir un système d'apport ostéogénique conforme à la présente invention et 2 utilisation de ce système d'apport ostéogénique pour alimenter en PMO et induire la formation d'un nouvel os, après une implantation in vivo chez les primates. 1 Première étape: chromatographie d'adsorption sur des supports en hydroxyapatite Les fractions les plus actives de PMO, ainsi que cela est déterminé par l'activité phosphatase alcaline et par l'étude histologique de la formation naissante d'os dans l'espace sous-cutané du rat, ont été concentrées et traitées par 5 m M d'acide chlorhydrique, en utilisant des membranes ultrafiltrantes de poids moléculaire 10000 6 - (Amicon YM-10) Avant l'adsorption sur les disques d'hydroxyapatite, on a testé les aliquotes de fractions d'ostéogénine dans 5 m M d'acide chlorhydrique, afin de déterminer Factivité biologique dans l'espace sous-cutané chez le rat. Sur la figure 1, on peut voir, dans l'appareil 10 selon la présente invention, une colonne de chromatographie liquide 12, présentant un diamètre interne de 25 mm, chargée de disques poreux d'hydroxyapatite de 25 mm de diamètre, 14. La colonne est équilibrée à l'aide d'un tampon de départ ( 5 m M d'acide chlorhydrique) Après équilibre, on charge les fractions de PMO dissous dans 5 m I du tampon de départ 16 sur les disques supports poreux en hydroxyapatite 14, ce grâce à quoi on obtient le système d'apport ostéogénique conforme à la présente invention, pour la formation de l'implant Le chargement et l'adsorption de fractions ultérieures de PMO ont été rendus plus faciles par une modification de l'orifice d'entrée 18 de la colonne. Cette modification consiste à prévoir la mise en place d'un tube capillaire 20 de 2 mm de diamètre, dans l'orifice 18 (dans la pratique, ce tube, qui est en matière synthétique ou en verre, traverse le bouchon 22 obturant cet orifice) Le niveau 24 du tampon initial est réglé de telle sorte qu'il se trouve environ à 10 mm au dessus de l'extrémité 26 du tube capillaire 20. Après le chargement de la colonne, un capillaire de sortie 28, mis en place à la base de la colonne, est relié à l'orifice d'entrée de la colonne pour amener une recirculation continue du tampon de départ de la matière non fixée La référence numérique 30 désigne l'éluat Après stabilisation des fractions non fixées sur le profil chromatographique à 280 nm de la figure 6 (la flèche indique le chargement des fractions biologiquement actives dans 5 m M de HCI), celles-ci sont recueillies dans 20 ml de tampon de départ (ce qui représente la capacité de la colonne), pour tester leur activité biologique dans l'espace sous-cutané du rat, de la façon qui a été décrite plus haut Après récupération de la matière non fixée dans le tampon de départ, les disques 14 d'hydroxyapatite ayant retenu les PMO ont été mis à sécher dans une chambre à flux laminaire, à température ambiante. Bioessai in vivo du système d'apport ostéogénique (figure 7) Le bioessai in vivo consiste en la succession des trois étapes suivantes: ) bioessai des fractions des PMO avant la charge des disques supports en hydroxyapatite flèche supérieure de la figure 7 -; 2 ) bioessai du système d'apport ostéogénique chez les primates de la race Papio (babouin, Papio ursinus) flèche médiane de la figure 7 -; et ) bioessai des fractions de protéines non fixées, afin de déterminer ractivité biologique résiduelle, si elle existe, du matériau non fixé flèche inférieure de la figure 7-. 1 Les fractions de PMO ont été testées pour déterminer leur activité biologique, ainsi que cela a été décrit plus haut. 2 Des disques supports en hydroxyapatite chargés de PMO ont été implantés en intramusculaire chez des babouins mâles, pour tester lactivité ostéogénique du système d'apport La formation d'os, à rintérieur des disques d'hydroxyapatite, était ensuite vérifiée par voie histologique, après collecte des implants 30 jours après leur mise en place chirurgicale Dans le but de déterminer son potentiel ostéogénique, le système d'apport ostéogénique était implanté dans des sites en dehors des os, afin de fournir une preuve indiscutable que la formation d'os était véritablement induite par le PMO fourni durant la cicatrisation et l'incorporation par le support d'hydroxyapatite. La figure 2 est une photomicrographie de la zone centrale du système d'apport Elle montre une importante formation osseuse dans les espaces poreux des disques en hydroxyapatite, après chromatographie d'adsorption des fractions biologiquement actives des PMO sur des disques, collectés 30 jours après leur implantation intramusculaire chez le babouin mâle Les espaces vides blancs que l'on peut voir sur cette figure 2 représentent la trame d'hydroxyapatite dissoute après le processus histologique impliquant la décalcification de l'échantillon. La figure 3 est une photomicrographie de la zone périphérique du système d'apport. Elle montre l'invasion vasculaire extensive et la différenciation osseuse qui se développe dans la périphérie du disque support en hydroxyapatite, après chromatographie d'adsorption des fractions biologiquement actives de PMO, les diques étant collectés 30 jours après leur implantation intramusculaire chez le 8 - babouin mâle On remarquera en particulier, à gauche de la figure, le tissu musculaire entourant le système d'apport ostéogénique. La figure 4 est une photomicrographie à un grossissement plus important du système d'apport ostéogénique Elle montre des détails de l'os nouvellement formé, à l'intérieur des espaces poreux du disque support en hydroxyapatite, après chromatographie d'adsorption des fractions biologiquement actives de PMO. Comme on peut le voir, une importante formation osseuse s'est développée dans les espaces poreux du disque support La vascularité et la cellularité marquées de l'os nouvellement formé sont très apparentes. La figure 5 est une photomicrographie de la région centrale d'un disque support en hydroxyapatite, implanté sur un babouin mâle, sans lui avoir fait adsorber de PMO par voie chromatographique, afin de constituer un témoin Cette figure montre bien la pénétration limitée des éléments fibrovasculaires et cellulaires dans les espaces poreux et l'absence de différenciation osseuse. 3 L'éventuelle activité biologique résiduelle de la fraction non liée recueillie à la sortie de la colonne, après adsorption chromatographique, a été contrôlée en reconstituant 25 mg de support collagénique insoluble de rat, auxquels on ajoute des concentrations croissantes de fractions de protéines non fixées Aucune différenciation osseuse n'a pu être notée sur des implants reconstitués respectivement avec 50, 200, 500, 1 000 et 2 000 l respectivement de matériel non fixé. Ces résultats prouvent les propriétés ostéogéniques selon l'invention des fractions de PMO, adsorbées par chromatographie sur des supports poreux en hydroxyapatite, implantés dans des sites non osseux chez les primates. Bien entendu, rinvention concerne également toute variante de ce qui a été décrit ci- dessus, qui ne correspond qu'à une illustration d'un mode de réalisation de l'invention et ne constitue, en aucun cas, une base pour en limiter l'esprit et la portée En particulier, la technique de chromatographie ne se limite pas à l'adsorption de PMO (que ce soit un matériel natif ou humain recombinant), mais s'étend à tout autre modulateur cellulaire biologiquement actif, tel que, par exemple, la laminine, le collagène de type IV, les facteurs de croissance transformant beta, le facteur de croissance Il de l'insuline, le -9- facteur de croissance dérivé des plaquettes, le ou les facteur(s) de croissance du fibroblaste, ainsi que l'hormone de croissance. En outre, le matériel poreux que l'on utilise comme support ne se limite pas à des répliques d'hydroxyapatite, mais peut comprendre une large variété d'autres biomatériaux poreux, tels que, par exemple, les hydroxyapatites frittées, les polymères, les implants d'hydroxyapatite poreuse recouverts de titane par projection plasmatique, ainsi que les alliages de reconstruction du squelette et tout autre biomatériel tels que les supports collagéniques, les peaux artificielles et analogues, pour l'adsorption et la fixation contrôlée des facteurs de croissance ou morphogénétiques pour la reconstruction des tissus non osseux. Les références citées dans la description ci-dessus sont les suivantes: 1 Luyten FP, Cunningham NS, Ma S, Muthukumaran N, Hammonds RG, Nevins WB, Wood WI, Reddi AH ( 1989) "Purification and partial amino acid sequence of osteogenin, a protein initiating bone differentiation", J Biol Chem 264: 13377- 13380. 2 Wozney JM et al; "Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities", Science 242: 1528-1534, 1988. 3 Ripamonti U ( 1991), "Bone induction in nonhuman primates An experimental study on the baboon", Clin Orthop Rel Res, 269 col 284-294. 4 Ripamonti U, Ma S, Cunningham N, Yates L, Reddi AH ( 1992), "Initiation of bone regeneration in adult baboons by osteogenin, a bone morphogenetic protein", Matrix, in press. 5 Wells JW ( 1956) Scleratinia, in "Moore RC (ed) Treatise on Invertebrate Paleontology", University of Kansas Press, Kansas City, p 328-444. 6 Weber JN, White EW ( 1973), "Carbonate minerals as precusrsors of new ceramics, metal, and polymer materials for biomedical applications", Miner Sci Engng 5: 151-165. - 7 Roy DM, Linnchan SK ( 1974), "Hydroxyapatite formed from coral skeletal carbonate by hydrothermal exchange", Nature 247: 220-222. 8 White EW, Weber JN, Roy DM, Owen EL ( 1975), "Replamineform porous biomaterials for hard tissue implant applications", J Biomed Mater Res Symposium 6: 23-27. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un système d'apport ostéogénique pour un facteur biologiquement actif de croissance, ou morphogénétique, ledit système comprenant un support poreux, en un matériau adsorbant présentant une affinité pour le facteur biologiquement actif et sur lequel ledit facteur biologiquement actif a été adsorbé, caractérisé en ce que l'on emploie les techniques de chromographie, comprenant l'introduction du facteur biologiquement actif dans une colonne de chromatographie contenant le support poreux. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le facteur biologiquement actif est une protéine morphogénétique d'os, destinée à induire la formation d'un nouvel os. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le support poreux est de l'hydroxyapatite poreuse. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on contrôle le taux d'introduction du facteur biologiquement actif dans la colonne de chromatographie. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on introduit le facteur biologiquement actif dans la colonne de chromatographie via un tube capillaire, qui est en communication avec une source de facteurs biologiquement actifs, dissous ou mis en suspension dans un véhicule approprié. 6 Système d'apport ostéogénique en protéines morphogénétiques d'os, destiné à induire la formation d'un nouvel os, qui comprend un support poreux, en un matériau adsorbant présentant une affinité pour la protéine et sur lequel la protéine a été adsorbée, le système d'apport étant caractérisé en ce que la protéine morphogénétique d'os a été adsorbée sur le support, en introduisant ladite protéine dans une colonne de chromatographie contenant ledit support poreux. 7 Système d'apport selon la revendication 6, caractérisé en ce que le support est de l'hydroxyapatite poreuse et que la protéine morphogénétique d'os est de l'ostéogénine. A 2. 8 Système d'apport selon l'une des revendications 6 ou 7, destiné à induire la formation d'un nouvel os chez un primate. 9 Système d'apport ostéogénique destiné à être mis en oeuvre dans une Procédé pour induire la formation d'un nouvel os chez un primate, ledit système d'apport comprenant un support poreux sur lequel une protéine morphogénétique d'os appropriée a été adsorbée en introduisant ladite protéine dans une colonne de chromatographie contenant le support poreux, choisi en fonction de son affinité spécifique pour la protéine, ladite Procédé comprenant l'implantation du système d'apport dans la région du corps du primate dans laquelle l'os est à créer. Appareil pour la préparation d'un système d'apport en un facteur biologiquement actif de croissance, ou morphogénétique, caractérisé en ce que cet appareil comprend une colonne de chromatographie, recevant un support poreux, en un matériau adsorbant, présentant une affinité spécifique pour ledit facteur biologiquement actif, ainsi que des moyens de commande, prévus sur ou adjacents à l'orifice d'entrée de la colonne, afin de contrôler le débit d'admission dans la colonne du facteur biologiquement actif. 11 Appareil selon la revendication 10, caractérisé en ce que les moyens de contrôle consistent en un tube capillaire connectant une source de facteurs biologiquement actifs, dissous ou mis en suspension dans un véhicule approprié, à la colonne de chromatographie, au niveau de l'orifice d'entrée de celle-ci.