Brevet FR2676847A1 — publié le 19921127

La présente invention concerne un procédé d'énumération des réticulocytes et les kits destinés à cette énumération. L'hématopoïèse des cellules sanguines, cellules précurseurs connues comme cellules souches pluripotentes, se déroule dans la moelle osseuse. Les cellules souches pluripotentes se différencient entre autres en cellules CFUE (Erythrocyte Colony Forming Units), puis en érythroblastes, ensuite en réticulocytes et enfin en érythrocytes, transporteurs de l'oxygène. Ces dernières cellules vivent environ 100 jours dans le système sanguin périphérique ou dans la rate avant d'être détruites dans le foie. Bien que le système de différenciation de la lignée érythrocytaire, jusqu'au stade réticulocytaire, se trouve dans la moelle osseuse, quelques réticulocytes se sont régulièrement trouvés dans le sang périphérique. Le nombre des réticulocytes du sang périphérique est une mesure de l'activité biologique de la moelle osseuse, indicateur important dans le diagnostic différentiel des anémies. Les réticulocytes et les érythrocytes sont des cellules anucléées : le principe, sur lequel reposent les méthodes d'énumération actuelles, est basé sur le repérage de l'appareil biosynthétique de réticulocytes. Cet appareil biosynthétique inclut la présence de ribosomes et de d'ARNm qui sont impliqués dans la synthèse de l'hémoglobine. On opère donc une coloration des ribosomes dans les réticulocytes, puis procède à une énumération des réticulocytes par microscopie. Une autre méthode d'énumération des réticulocytes utilise un marqueur fluorescent d'ARN, le "Thiazole orange" et une analyse cytométrique. Cette méthode présente notamment l'inconvénient d'être peu fiable pour des échantillons renfermant un pourcentage de réticulocytes inférieur à 2% ; cet inconvénient est majeur car les valeurs normales de réticulocytes se situent à environ 1t. De plus, cette méthode ne permet pas d'énumérer les réticulocytes dans certaines situations pathologiques ou les globules rouges sont parasités. I1 serait souhaitable de disposer d'un procédé excluant une fausse énumération due à la présence dans le sang d'éléments qui ne soient pas d'origine érythrocytaire ou réticulocytaire. Un tel procédé, de plus, devrait de même pouvoir permettre une énumération des réticulocytes fiable et précise même si les réticulocytes sont faiblement représentés dans l'échantillon. C'est pourquoi la présente demande a également pour objet un procédé d'énumération des réticulocytes caractérisé en ce que l'on fait réagir un échantillon sanguin humain avec - un composé caractérisé par une longueur d'onde LO1 à affinité spécifique pour l'ensemble des cellules anucléées de la lignée érythocytaire, et avec - un composé caractérisé par une longueur d'onde L02 à affinité spécifique restreinte aux seuls réticulocytes, puis soumet ledit échantillon à une détection desdites longueurs d'ondes. Le composé à affinité spécifique pour l'ensemble des cellules anucléées de la lignée érythocytaire peut être, par exemple, un anticorps, notamment un composé ayant une relation spécifique avec un élément présent chez les seules cellules anucléées de la lignée érythrocytaire, plus particulièrement avec la glycophorine A. On retient tout particulièrement les anticorps anti-glycophorine A, et tout particulièrement, l'anticorps monoclonal de souris anti-glycophorine A humaine commercialisé par la société IMMUNOTECH (France) produit par l'hybridome D 2.10. On peut citer aussi les anticorps antiglyphorine A humaine commercialisés par Sigma Diagnostics, P.O. Box 14508 St Louis MO 63178 US, sous la référence Anti Glycophorin, MC-27 ou par DAKOPATTS A/S Productionsveg 42 P.O. Box 1359 DK-2600 Glostrup, Danemark, sous la référence MO Anti-Hu Glycophorin A, M819. Le composé ci-dessus peut être par lui-même doué d'une capacité d'absorption et/ou d'émission de la longueur d'onde Lol, éventuellement après avoir reçu un rayonnement d'excitation. Toutefois, il s'agira de préférence d'un dérivé ayant une affinité spécifique pour l'ensemble des cellules anucléées de la lignée érythocytaire modifié, par exemple par couplage avec un fluorochrome, pour le rendre capable d'une telle émission ou d'une telle absorption. Comme fluorochromes on peut citer par exemple des colorants pour laser (laser dyes), notamment la phycoérythrine et la Fluoroscéine isothiocyanate (FITC) ou les couples de fluorochromes capables d'utiliser le même rayonnement excitateur. Par "fluorochrome" l'on entend un dérivé capable d'absorber spécifiquement un rayonnement excitateur de longueur d'onde spécifique en reémettant un rayonnnement de moindre énergie. On retient en particulier les dérivés de la fluorescéine, notamment leurs isocyanates ou isothiocyanates, capables de réagir avec les fonctions amino libres, par exemple d'un anticorps. Le couplage du fluorochrome peut être réalisé selon les méthodes connues en elle-mêmes et notamment par le brevet US N 4.520.110, pour la phycoérythrine par exemple. Le composé caractérisé par une longueur d'onde LO2 à affinité spécifique aux seuls réticulocytes, répondra à des caractéristiques analogues au composé ci-dessus décrit. I1 en diffèrera par sa spécificité qui sera dirigée vers les seuls réticulocytes, notamment vis-à-vis du récepteur de la transferrine, absent chez les érythrocytes. Il en diffèrera encore par sa longueur d'onde LO2 différente de la longueur d'onde Loi ci-dessus. Dans la présente demande, par "affinité spécifique restreinte aux seuls réticulocytes" l'on entend que ledit composé a une affinité pour les seuls réticulocytes vis-à-vis des érythrocytes, étant entendu qu'il peut avoir une affinité pour d'autres composants de l'organisme humain. Comme tels composés, on peut citer en particulier les anticorps anti-récepteur de la transferrine, notamment les anticorps IgG1 de souris anti-récepteur de la transferrine humaine, comme l'anticorps commercialisé par Immunotech, référence 0482, ou celui commercialisé par DAKOPATTS A/S, référence Mo Anti-Hu transferrin receptor CD71, M734. Les longueurs d'onde LO1 et LO2 utilisées pourront se trouver tant dans le spectre visible que dans le spectre invisible. Elles seront de préférence capables d'être mesurées à l'aide de cytomètre de flux, permettant l'analyse différentielle d'une grande quantité de cellules dans un temps très court. Le procédé selon l'invention permet ainsi de déterminer d'une part la quantité de cellules anucléées et d'autre part parmi celles-ci les seuls réticulocytes. Dans le cas où l'on met en oeuvre des anticorps à titre de composés à affinité spécifique, ceux-ci peuvent être l'objet d'une fixation non-spécifique. C'est pourquoi, l'on fait réagir de préférence en outre un second échantillon sanguin identique au précédent, avec une immunoglobuline ne reconnaissant aucun élément humain, de préférence une IgG1, d'une sous-classe identique à celle des anticorps avec spécificité pour les réticulocytes, comme l'anticorps de contrôle IgG1 commercialisé par Immunotech, référence 0571, ou par Becton Dickinson, P.O. Box 7375 Mountain View, CA 34039 US, sous la référence Control Mouse IgGl Catalog No 9040. L'utilisation d'un tel réactif de contrôle, doté de la longueur d'onde LO2 ci-dessus, par exemple par conjugaison avec le même fluorochrome que celui utilisé pour l'anticorps caractéristique des réticulocytes, par exemple un anticorps anti-récepteur de la transferrine, permet l'énumération différentielle des cellules ayant une fluorescence non-spécifique, vis-à-vis des cellules ayant une fluorescence spécifique pour les réticulocytes et donc de corriger les mesures pour obtenir le nombre exacte de réticulocytes. C'est pourquoi la présente demande a également pour objet le procédé défini ci-dessus, dans lequel l'on met en oeuvre des anticorps spécifiques de l'ensemble des cellules anucléées de la lignée érythocytaire d'une part, et spécifiques des seuls érythrocytes d'autre part, caractérisé en ce qu'en outre, l'on fait réagir un échantillon sanguin identique à celui ci-dessus avec une immunoglobuline ne reconnaissant aucun élément humain de manière spécifique, de préférence une IgG1 appartenant notamment à la même sous-classe que l'anticorps antirécepteur de la transferrine, particulièrement de souris. La présente demande a enfin pour objet les kits destinés à l'énumération ci-dessus caractérisés en ce qu'ils renferment - un composé caractérisé par une longueur d'onde LOI à affinité spécifique pour l'ensemble des cellules anucléées de la lignée érythocytaire, et - un composé caractérisé par une longueur d'onde LO2 à affinité spécifique pour les seuls réticulocytes. Le composé, caractérisé par une longueur d'onde LO1 à affinité spécifique pour l'ensemble des cellules anucléées de la lignée érythrocytaire, comprend de préférence un anticorps anti-glycophorine A humaine. La longueur d'onde LO1 est de préférence fournie par couplage avec la phycoérythrine ou le FITC. Le composé caractérisé par une longueur d'onde LO2 à affinité spécifique pour les seuls réticulocytes comprend de préférence un anticorps anti-récepteur de la transferrine humaine, de préférence un anticorps de souris. La longueur d'onde LO2 sera de préférence procurée par le FITC (Fluoresceine isothiocyanate) ou la phycoérythrine. Les kits ci-dessus renfermeront de préférence en outre un anticorps de contrôle IgGl incapable de reconnaître des éléments humains de manière spécifique, avantageusement un anticorps IgGl de souris. L'anticorps de contrôle se verra avantageusement conférer la longueur d'onde LO2 par le même fluorochrome que celui ci-dessus, notamment par le FITC ou la phycoérythrine. tes kits renfermeront de préférence l'anticorps de contrôle à la même concentration en immunoglobuline, notamment de souris, que la préparation d'anticorps à affinité spécifique pour les seuls réticulocytes, notamment anti-récepteurs de la transferrine. Les anticorps éventuellement mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention seront de préférence monoclonaux. Ils seront de plus avantageusement d'origine murine. Les exemples qui suivent illustrent la présente sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 A titre d'exemple, on a effectué des énumérations de réticulocytes avec un anticorps monoclonal de souris anti-glycophorine A humaine (Immunotech, clone D2.10) couplé à la phycoérythrine et un anticorps monoclonal IgG1 de souris anti-récepteur de la transferrine humaine (Immunotech, clone YDJ.122) ainsi qu'un anticorps de contrôle IgGl couplé au FITC. Le couplage de l'anticorps antiglycophorine A à la phycoérythrine a été effectué selon la technique décrite par Stryer et al, US Patent 4.520.110. Après la procédure de couplage telle que décrite, le produit couplé a été purifié par filtration sur gel. Une quantité de 20% de l'anticorps a été retrouvée sous la forme de conjugué. Une préparation standard (réf. IOT 0773) de 1' anticorps anti-glycophorine A a été calibrée par cytométrie de flux avec des globules rouges du sang normal. On a dilué la préparation de telle sorte que la quantité de 0,0025 ml de préparation a été suffisante pour saturer les molécules de glycophorine de surface des érythrocytes d'une quantité de 0,1 ml de sang dilué ou 1/100ème (environ 5.106 érythrocytes). Le produit a été stabilisé par 0,2 mg/ml d'albumine de serum de veau. Un couplage au FITC de l'anticorps antirécepteur de la transferrine a été effectué selon les méthodes classiques (voir par exemple L. Hudson and F.C. Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications). Une préparation standard (réf. IOT 0483) d'anticorps anti-récepteur de la transferrine a été calibrée par cytométrie de flux avec la quantité de 0,1 ml d'une suspension de cellules d d'une lignée T leucémique humaine HPB ALL. 0,01 ml de préparation a été suffisant pour saturer les sites du récepteur de la transferrine sur la surface de 5.105 cellules HPB ALL. L'anticorps de contrôle IgGl de souris a été dilué de manière à se trouver en isoconcentration d'IgGl de souris avec la préparation d'anticorps antirécepteur de la transferrine. Des prises de sang ont été effectuées à l'aide d'un dispositif contenant de 1'EDTA comme anticoagulant pour prélever le sang (seringue standard pour comptage de sang total). Dans un délai de 0 à 6 heures, une quantité de 0,01 ml de sang en EDTA a été diluée au 1/100 dans un tube Balcon 2063 par adjonction de 1 ml de PBS-Dulbecco. Des aliquots de 0,1 ml de sang dilué ont été redistribués dans des tubes Falcon 2063 et mis à 4 C. Une quantité de 0,005 ml de la "préparation standard" de l'anti-glycophorine A conjuguée à la phycoérythrine et une quantité de 0,015 ml de la "préparation standard" de l'anti-récepteur de la transferrine ont été pipettés dans un tube marqué "cl71". Une quantité de 0,005 ml de la préparation standard de l'anti-glycophorine A conjuguée à la phycoérythrine et de 0,015 ml de la "préparation standard" de l'anticorps de contrôle IgGl couplé au FITC ont été pipettés dans un deuxième tube marqué "contrôle". Les deux tubes ont été agités par vortex et gardés à 4" C pendant 21 minutes pour effectuer le marquage des cellules. Les tubes ont été agités toutes les 7 minutes. A la fin de la réaction, 4 ml de PBS-Dulbecco ont été rajoutés à chaque tube et les tubes centrifugés à 200 G pendant 3 minutes. Le surnageant limpide a été aspiré et les cellules resuspendues dans 300 ,ul de PBS-Dulbecco. Ensuite les cellules sont conservées à 4" C et analysées par cytomêtrie de flux dans un délai de 6 heures. L'analyse cytométrique a été effectuée sur un appareil Facscan (Becton Dickinson, Mountain View). Side Scatter et Forward Scatter Gains sont en échelle logarithmique avec un détecteur de E00 pour Forward Scatter et un détecteur de 360 pour Side Scatter. Les fluorescences 1 et 2 sont en échelle logarithmique avec un détecteur FL1 à 660 V et un détecteur FL2 à 555 V. Le "Scatter Live Gate" a été placé de telle façon que les débris cellulaires et les plaquettes sont exclus de l'analyse, 20 000 évènements ont été analysés et les données accumulées en "list mode". Les données ont été évaluées à l'aide d'une fenêtre d'analyse orthogonale sur FL1 et FL2 dot plot. Le réglage de la fenêtre à l'aide du tube contrôle est fait de telle sorte que 0,2t des évènements de la préparation contrôle montrent un marquage simultané en double couleur (voir fig. 1). La figure 1 représente l'analyse cytométrique des réticulocytes dans une population de 20 000 évènements érythrocytes de quatre individus différents (A, B, C et D) après marquage par un mélange d'anticorps anti-glycophorine A couplé à la phycoérythrine et un anticorps IgG1 contrôle couplé à la FITC (I) ou un anticorps anti-récepteur de la transferrine (II). Dans les fenêtres rectangulaires R1 se trouvent les évènements correspondant aux réticulocytes : la valeur indiquée sous la fenêtre indique pour chaque individu A, B, C et D le pourcentage de réticulocytes par rapport à la population totale de cellules anucléées de la série érythrocytaire, à savoir réticulocytes et érythrocytes. Dans la colonne de gauche (I) on trouve pour chaque individu sur la même ligne la valeur de la fixation non spécifique qui permet donc la correction précise de la valeur obtenue dans la colonne (II). REVENDICATIONS 1. Procédé d'énumération des réticulocytes caractérisé en ce que l'on fait réagir un échantillon sanguin humain avec - un composé caractérisé par une longueur d'onde LO1 à affinité spécifique pour l'ensemble des cellules anucléées de la lignée érythocytaire, avec - un composé caractérisé par une longueur d'onde LO2 à affinité spécifique restreinte aux seuls réticulocytes, puis soumet ledit échantillon à une détection desdites longueurs d'ondes. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le composé caractérisé par une longueur d'onde LO2 à affinité spécifique pour les seuls réticulocytes a une affinité pour les récepteurs de la transferrine. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le composé caractérisé par une longueur d'onde LO1 à affinité spécifique pour l'ensemble des cellules anucléées de la lignée érythocytaire a une affinité pour la glycophorine A. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que les composés sont des anticorps couplés à un fluorochrome. 5. Procédé selon la revendication 4 carac térisé en ce que les deux fluorochromes sont capables d'utiliser le même rayonnement excitateur. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5 caractérisé en ce que les fluorochromes sont choisis parmi la phycoérythrine et les dérivés cyanés ou thiocyanés de la fluorescéine. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'en outre l'on fait réagir un second échantillon humain identique au précédent avec une immunoglobuline ne reconnaissant aucun élément humain de mnaière spécifique et caractérisée par la longueur d'onde LO2. 8. Kits d'énumération de réticulocytes caractérisés en ce qu'il renferment - un composé caractérisé par une longueur d'onde LO1 à affinité spécifique pour l'ensemble des cellules anucléées de la lignée érythocytaire, et - un composé caractérisé par une longueur d'onde LO2 à affinité spécifique pour les seuls réticulocytes. 9. Kits selon la revendication 8 caractérisés en ce qu'ils renferment en outre un anticorps de contrôle, incapable de reconnaître des éléments humains de manière spécifique, et caractérisé par la longueur d'onde LO2.