Brevet FR2676123A1 — publié le 19921106

La présente invention concerne un complexe agglutinant, et les réactifs qui le contiennent, pour l'identification d'antigènes présents sur les parois cellulaires dans un procédé mettant en jeu une réaction immunologique spécifique, et un procédé d' identification et de groupage des cellules, notamment des cellules sanguines, à l'aide de ce réactif. Un réactif ou sérum test est dit agglutinant quand il est capable de produire une agglutination des cellules qui portent l'antigène reconnu par l'anticorps présent dans le réactif en suspension en soluté salin; c'est le comportement le plus fréquemment observé des réactifs composés d'anticorps de type Ig M. Un réactif ou sérum test est dit non agglutinant quand la fixation du ou des anticorps qui le composent sur les cellules, qui portent l'antigène reconnu par l'anticorps présent dans le réactif, en suspension en soluté salin ne suffit pas à provoquer l'agglutination C'est le comportement le plus fréquemment observé des réactifs composés d'anticorps de type Ig G Dans ce cas et, en particulier, pour des antigènes caractéristiques qui sont soit en faible nombre sur chaque cellule, soit peu accessibles aux anticorps, l'agglutination est provoquée au moyen d'artifices comme l'addition d'enzymes protéolytiques ou le test à l'antiglobuline. Les exemples d'antigènes difficiles à mettre en évidence sont nombreux sur les cellules sanguines Sur les globules rouges, on peut citer les antigènes des systèmes Rh, Lutheran, Kell, Duffy, Kidd, Diego et autres; sur les leucocytes ou les plaquettes, ce sont les antigènes HLA, c'est-à-dire ceux du complexe majeur d'histocompatibilité. Il est souhaitable d'identifier ces antigènes, parfois même en urgence, préalablement à toute transfusion sanguine, au moins chez les polytransfusés, et préalablement à toute -transplantation d'organe, ou encore lorsqu'il existe un risque d'alloimmunisation foeto-maternelle Aussi, une technique rapide, simple de mise en oeuvre et peu coûteuse, comme celles permettant de visualiser directement la réaction immunologique grâce à une agglutination qui utilisent un réactif agglutinant, spécifique et stable, de prix de revient faible, est d'un grand intérêt. On sait qu'un groupage érythrocytaire peut être effectué par divers procédés simples et rapides, pouvant être automatisés, lorsque le réactif est agglutinant On peut pour la description de ces procédés se référer à l'ouvrage de Rouger P et Salmon C Techniques de Laboratoire fi p 25- 26 Ed Masson ( 1981), qui décrit notamment les réactions sur plaque d'opaline, en tube ou microplaque. Mais, pratiquement seuls, les anticorps de type Ig M sont agglutinants dans ces conditions, contrairement à ceux de type Ig G et les réactifs commercialisés ainsi utilisables concernent uniquement les groupages ABO ou Rhésus, systèmes pour lesquels les anticorps polyclonaux de type Ig M sont naturellement abondants chez l'homme et, surtout, pour lesquels on peut obtenir des anticorps monoclonaux par culture d'hybridomes. Par contre, l'obtention en quantité suffisante d'anticorps polyclonaux de type Ig M, pour certains antigènes difficiles à mettre en évidence, supposerait l'immunisation volontaire d'un grand nombre de sujets pour permettre la récolte, dans les prélèvements sanguins, des Ig M spécifiques de l'antigène, qui devront être séparés de toutes les autres Ig M présentes avant utilisation; ces opérations coûteuses devraient être répétées indéfiniment, puisque, pour la plupart de ces antigènes, on ne sait pas actuellement préparer des anticorps monoclonaux de type Ig M. Un groupage érythrocytaire prenant en compte les antigènes difficiles à mettre en évidence, auxquels correspondent uniquement des Ig G et donc des réactifs non agglutinants, ne peut être réalisé qu'avec des techniques plus complexes, décrites dans l'ouvrage précédent p 33- 34 et 49 à 65, comme la réaction sur plaque d'opaline, à 40 C, en présence d'albumine, les réactions en présence d'enzymes protéolytiques dont la papaine ou la réaction à l'antiglobuline (test de Coombs) et ses analogues. Ces techniques sont plus longues et impliquent, pour avoir une sensibilité acceptable, la présence de concentrations non négligeables, de l'ordre de 15 à 20 %, de macromolécules dans le milieu d'agglutination; ceci peut entraîner un certain nombre de réactions faussement positives, notamment si l'échantillon a une anomalie protéique ou s'il donne un test de Coombs direct positif. On a aussi proposé des moyens pour obtenir un réactif agglutinant à partir d'anticorps de type Ig G. Ainsi des anticorps dirigés contre certains des antigènes difficiles à mettre en évidence des hématies seraient transformés en anticorps agglutinants par réduction par le 2-mercaptoéthanol, comme décrit dans Proc Natl Acad Scien USA 74 ( 6) p 2531 2535 ( 1977); mais ce procédé n'est pas applicable aux antigènes peu flexibles ou présents sur un faible nombre de sites par cellule, comme l'antigène K; en outre, le procédé mis en oeuvre en tube implique une lecture au microscope et cela seulement après 2 heures d'incubation. L'obtention d'un réactif agglutinant à partir d'anticorps de type Ig G est aussi décrite dans GB-A- 2103360, lorsque les anticorps sont fixés, au niveau de leur région Fc, sur la protéine A isolée, ou non, de la bactérie Staphylococcus aureus qui la contient; mais l'agglutination n'est, là encore, pas immédiate; elle n'est observable, en tube, qu'après une incubation de 45 minutes à 370 C; en outre, l'aspect non homogène du réactif, préparé avec la bactérie entière, ne permet pas une utilisation aisée, notamment dans des appareils automatiques. La présente invention, selon un premier aspect, concerne un complexe agglutinant et les réactifs le contenant, qui peuvent être utilisés dans toutes sortes de réactions d'agglutination et, notamment, dans les techniques simples d'identification et de dosage, couramment utilisées pour les réactifs à base d'anticorps de type Ig M; mais ils peuvent être aussi utilisés dans des techniques plus complexes, mais plus sensibles, dont l'emploi est parfois nécessaire pour confirmer un résultat douteux. Le complexe agglutinant selon l'invention est le résultat de couplages d'affinité entre un anticorps de type Ig G, non agglutinant spécifique de l'antigène à identifier, une protéine capable de se lier en au moins deux points à la partie Fc des anticorps et un anticorps anti- immunoglobuline. Les anticorps de type Ig G peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. Lorsque l'on utilise des anticorps mono- clonaux, ils sont obtenus de façon classique, à partir des surnageants, de préférence clarifiés, des cultures cellulaires convenables; on trouve sur le marché des anticorps monoclonaux, spécifiques des groupes sanguins difficiles à identifier ou dirigés contre les antigènes du système HLA; d'autres sont décrits dans la littérature ou peuvent être préparés par des méthodes connues en soi. Les anticorps polyclonaux, plus rares et plus coûteux, peuvent être extraits des sérums ou plasmas de sujets humains immunisés, par exemple par le procédé d'adsorption-élution décrit dans Vox Sang 33 p 280 ( 1977). Le réactif selon l'invention est particuliè- rement bien adapté à l'identification des antigènes érythrocytaires difficiles à mettre en évidence et notamment ceux du type Kell pour lesquels sont rares les sujets spontanément immunisés, porteurs d'Ig M et pour lesquels on ne connaît pas d'anticorps monoclonaux de type Ig M de qualité suffisante pour permettre le groupage des cellules sanguines. Parmi les protéines capables de se fixer sur la partie Fc des anticorps et qui portent au moins deux sites de fixation, ce qui permet, par liaison des anticorps, la formation d'un réseau macromoléculaire, on peut citer celles d'origine microbiologique et notamment la protéine A de Staphylococcus aureus bien connue, ou celle de Staphylococcus epidermidis, de Staphylococcus pyogenes et la protéine G de Streptococcus species. Ces protéines ou leurs fragments pourront être d'origine naturelle, extraites des bactéries et plus ou moins purifiées, mais elles peuvent aussi être d'origine recombinante; un certain nombre sont commercialisées notamment par les Sociétés SIGMA ou PIERCE, en général sous forme lyophilisée. L' anticorps antiglobuline, autre constituant du complexe, peut être choisi parmi tous les types d'anticorps anti-immunoglobuline polyvalents ou ceux spécifiques des Ig G; il pourra être d'origine monoclonale ou polyclonale, plus ou moins purifié; des fragments pourront aussi être utilisés Lorsque l'anticorps dirigé contre l'antigène à identifier est d'origine humaine, l'anticorps antiglobuline sera dirigé contre les immunoglobulines d'origine humaine; il importe en effet, d'avoir la même spécificité pour les deux anticorps, à moins que les réactions croisées entre espèces soient possibles. Le complexe agglutinant peut être préparé par addition de la protéine capable de se lier à la partie Fc des anticorps à une solution de l'un des deux anticorps, en milieu de préférence tamponné à un p H compris entre 5 et 9, mieux entre 6,5 et 7,5, ou en milieu salin sensiblement isotonique éventuellement tamponné; la fixation est terminée après un temps qui dépend de la température d'incubation, qui est généralement comprise entre 40 C et 500 C, de préférence entre 20 C et 40 C; dans ces conditions, le temps nécessaire est compris entre 5 mn et 1 heure. La quantité de protéine ajoutée à la solution d'anticorps dépend de la concentration de ce dernier, mais aussi de la densité sur la protéine des sites de fixation de l'anticorps; il est préférable que les anticorps saturent sensiblement tous les sites A titre d'exemple, on peut indiquer que le rapport de poids d'anticorps au poids de protéine A ou G pure sera en général compris entre 3 et 30, de préférence entre 5 et 20, et que la concentration initiale en anticorps sera de préférence supérieure à 50 pg/ml. L'addition de l'autre anticorps peut avoir lieu dès la fin de l'incubation, ou ultérieurement si le milieu est conservé à + 4 C, ou mieux congelé Comme précédemment, le volume et la concentration de la solution d'anticorps ajoutés dépendent notamment de la spécificité de l'anticorps et de la sensibilité recherchée Par exemple, pour un groupage Kell ou Rhésus, on peut utiliser des quantités d'anticorps de type Ig G et d'antiglobuline, polyvalente ou spécifique anti-Ig G, sensiblement identiques, pour former le complexe. La température et la durée de la seconde d'incubation pour fixer le second anticorps ne sont pas critiques; elles pourront évoluer dans les mêmes limites que celles indiquées pour la fixation du premier anticorps L'homme du métier sera à même de déterminer tous les paramètres de la préparation du complexe par des essais préalables. On peut aussi faire incuber un mélange des deux anticorps et de la protéine, en proportions convenables, pour obtenir le complexe agglutinant, mais mais on préfère faire réagir, dans une première étape, l'anticorps de type Ig G dirigé contre l'antigène à identifier et la protéine avant de faire réagir l'anticorps antiglobuline. La solution de complexe agglutinant obtenue à la fin des couplages d'affinité peut être plus concentrée que celle qui sera utilisée dans les procédés d'identification de routine pour lesquels la concentration en Ig G complexée sera de l'ordre de 1 à 50 pg/ml Aussi en fin de préparation elle peut être conservée telle qu'à température inférieure à 10 C ou congelée pour une dilution ultérieure extemporanée, mais elle peut être aussi conservée diluée, prête à l'emploi, à ces températures, après son conditionnement en multiples de doses unitaires La dilution convenable est en général effectuée par addition d'une solution tampon de p H compris entre 5 et 9, à base de TRIS ou de phosphate, auxquels peuvent être ajoutés des sels, des amino-acides ainsi que des macromolécules connues pour leur pouvoir de stabilisation des solutions d'anticorps et de renforcement des réactions d'agglutination, à faible concentration, c'est-à-dire en général à concentration inférieure à 5 %; parmi ces macromolécules, on peut citer la polyvinylpyrrolidone, les polysaccharides neutres, comme le Dextran R les protéines, comme l'albumine. Polar une conservation prolongée, le réactif contiendra aussi de préférence un agent bactériosta- tique, tel que l'azoture de sodium Ce réactif et le complexe peuvent aussi être conservés lyophilisés, et sont alors introduits au moment de l'emploi dans de l'eau distillée ou dans un tampon de type phosphate salin. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne un procédé d'identification des antigènes des parois cellulaires; qui consiste à mettre en présence une suspension des cellules à étudier dans un milieu convenable avec un complexe d'affinité formé entre un anticorps de type Ig G non agglutinant, une protéine capable de se fixer par au moins deux de ses sites sur la partie Fc des anticorps, et un anticorps antiimmu- noglobuline et à observer l'apparition d'une éventuelle agglutination. La composition du milieu d'agglutination n'est pas critique; néanmoins, les cellules doivent y rester intactes, ce qui implique en général la présence de sels minéraux; par ailleurs, on a constaté que la présence de macromolécules, en quantité faible, inférieure à 5 %, améliorait la vitesse de la réaction; la nature de ces macromolécules et leur concentration dépend de la nature de l'anticorps, du complexe, de sa concentration et des conditions opératoires, mais l'homme du métier sera à même de les choisir après des essais préalables. Ce procédé est avantageusement mis en oeuvre pour le groupage érythrocytaire et notamment pour 1 'étude des systèmes Rh, Duffy, Kidd, ou Kell, pour lesquels ce procédé, simple et rapide, donne des résultats équivalents à la plupart des procédés utilisés actuellement en routine. On peut employer l'une quelconque des techniques connues pour effectuer la réaction immunologique et visualiser l'agglutination, que ce soit sur plaque d'opaline, en tube ou en microplaque On peut opérer à une température comprise entre 10 C et 370 C, mais on préfère la température ambiante, plus simple de mise en oeuvre; l'agglutination est observée alors rapidement, en une minute à quelques minutes suivant les conditions opératoires, l'affinité de l'anticorps, la nature de l'antigène et sa concentration dans l'échantillon. Dans ce qui suit, on décrit des exemples de complexes et de réactifs de l'invention et les résultats de la mise en oeuvre du procédé d'identification cellulaire de l'invention comparés à ceux obtenus avec des réactifs polyclonaux agglutinants riches en anticorps de type Ig M. Les différentes réactions d'agglutination uti- lisées dans les exemples ont été effectuées comme suit: 1 ) Réaction sur plaque d'opaline à température ambiante: Une goutte de réactif et une goutte de culot globulaire à tester, lavé ou non, sont déposées sur la plaque et mélangées avec une baguette de verre pour former un cercle de 2 cm de diamètre; l'agglutination éventuelle est constatée après 2 minutes. ) Réaction en tube: Une goutte de suspension d'hématies à 2 % et une goutte de réactif sont mélangées, et on observe les éventuels agglutinats formés après 1 ou 2 heures de sédimentation. 3 ) Réaction à l'antiglobuline (ou test de Coombs): On ajoute une goutte de suspension des hématies à tester, lavées ou non, dans du sérum physiologique dans un tube de Kahn contenant une goutte de réactif et on laisse incuber 15 minutes à 370 C avant de laver trois fois avec du sérum physiologique Au culot de décantation, on ajoute 1 goutte d'antiglobuline et centrifuge durant 1 minute après remise en suspension du culot; on observe ensuite l'agglutination éventuelle en agitant doucement le tube. Les titres et scores des réactions ont été calculés de façon classique, comme il est décrit notamment dans l'ouvrage de Rouger P et Salmon C, précédemment cité, p 31-32. EXEMPLE 1 Réactif anti-Kell agglutinant: On dilue par addition de tampon phosphate salin (p H 7,4) le surnageant clarifié d'une culture cellulaire contenant 150 pg/ml d'un anticorps anti-Kell monoclonal d'origine humaine de type Ig G dirigé contre l'antigène K, jusqu'à une concentration de 100 pg/ml A cette solution, on ajoute un volume d'une solution à 10 pg/ml de protéine A dans le même tampon, commercialisée par Sigma sous la référence P 6031; le mélange est maintenu durant 60 minutes, sous agitation, à 370 C, puis on y ajoute 1 volume d'une solution d'antiglobuline polyvalente et on maintient le mélange durant 30 minutes, sous agitation, à 370 C avant de le ramener à température ambiante, vers 200 C. L'antiglobuline polyvalente est un réactif préparé à partir de sérum de chèvre, hyperimmunisée avec des immunoglobulines et du complément humains, dilué dans un solvant salin isotonique contenant de l'albumine Les caractéristiques de ce réactif répondent aux définitions du Journal Officiel de la République Française du 17 mars 1984, rubrique Ministère des Affaires Sociales - caractéristiques et normes des réactifs utilisés en immunohématologie érythrocytaire (Annexe 2 p 2596); ce réactif est commercialisé par Diagnostics Transfusion (FR) sous la référence 21120. Pour les essais dont les résultats figurent dans ce qui suit, le mélange ainsi obtenu a été dilué avant utilisation avec le même volume de tampon phosphate salin (p H 7,4) contenant du glycocolle ( 2 %) et du Dextran ( 1 %) Le réactif de référence, préparé à partir de sérums humains hyperimmuns, et enrichi en macromolécules, est commercialisé par Diagnostics Transfusion sous la référence 21083. 1 ) Réaction sur plaque d' opaline à température ambiante: sur 200 échantillons de sang de donneurs, dont 8 % sont connus pour être du phénotype K, on a identifié 100 % des phénotypes positifs sans aucun faux positif ou négatif avec le réactif selon l'invention et le réactif de référence Au cours de cette étude, on a constaté que 45 * des images d'agglutination obtenues avec le réactif selon l'invention étaient plus fortes et 50 % équivalentes. La durée de formation des premiers agglutinats avec les deux réactifs était courte: 5 secondes pour le produit de l'exemple, 6 secondes pour la référence. Les titres étaient respectivement de 8 et 4 et les scores de 20 et 14 pour le produit de l'exemple et pour la référence. 2 ) Réaction en tube et lecture au microscope optique: Les résultats obtenus sont: Titre Score réactif de l'exemple 1 256 66 réactif de référence 128 56 ) Réaction à l'antiglobuline: Titre Score réactif de l'exemple 1 128 57 réactif de référence 256 71 EXEMPLE 2 Réactif anti-Kell agglutinant: On prépare un réactif selon le procédé décrit à l'exemple 1 mais en remplaçant la protéine A par la protéine G, pure, commerciale. Dans la réaction sur plaque d'opaline, le réactif a un titre de 8 et un score de 20, tandis qu'en tube son titre est de 128 et son score de 52; dans la réaction à l'antiglobuline, le titre est de 128 et le score de 56. EXEMPLE 3 Réactif anti-Kell agglutinant: On prépare un réactif selon le procédé décrit à l'exemple 1 avec la protéine A et une antiimmunoglo- buline anti-Ig G (H'L, c'est-à-dire dirigée contre les chaînes lourde et légère d'origine humaine), commercia- lisée par Biosys France sous la référence BI 2015. Sur plaque d'opaline, le titre est de 8 et le score de 20; en tube, le titre est de 128 et le score de 49; dans la réaction à l'antiglobuline, le titre est de 64 et le score de 46. EXEMPLE 4 Réactif pour rechercher le phénotype D (Rh') Le réactif a été préparé avec un anticorps monoclonal de type Ig G, dirigé contre l'antigène D, une antiimmunoglobuline polyvalente et de la protéine A en appliquant le procédé décrit à l'exemple 1. Un réactif préparé dans les mêmes conditions avec uniquement l'anticorps monoclonal de départ dans la -réaction sur plaque d'opaline ne donne pas d'agglutination, alors que le réactif du présent exemple a un titre de 16 et un score de 30; dans la réaction à l'antiglobuline, l'anticorps monoclonal de départ a un score légèrement supérieur à celui du réactif du présent exemple. REVENDICATIONS 1 Complexe agglutinant pour l'identification d'antigènes sur les parois cellulaires, caractérisé en ce qu'il résulte de couplages d'affinité entre un anticorps de type Ig G non agglutinant spécifique de l'antigène à identifier, une protéine capable de se lier en au moins deux sites à la partie Fc d'anticorps et un anticorps antiimmunoglobuline ou ses fragments. 2 Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine est choisie parmi les protéines bactériennes A et G. 3 Complexe selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'anticorps anti-immunoglobuline est spécifique des Ig G. 4 Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour l'identification d'antigènes erythrocytaires. Complexe selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'anticorps non agglutinant est un anticorps dirigé contre l'antigène K. 6 Complexe selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'anticorps non agglutinant est un anticorps dirigé contre l'antigène D. 7 Réactif agglutinant caractérisé en ce qu'il comprend un complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, correspondant à 1 à 50 pg/ml d'Ig G complexée, dans une solution saline, tamponnée à un p H compris entre 5 et 9, et contenant de O à 5 % de macromolécules utilisées dans les réactifs d'agglutination. 8 Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient des macromolécules choisies parmi la polyvinylpyrrolidone, les polysaccharides neutres et les protéines. 9 Procédé d'obtention d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on met en présence, dans les conditions de formation d'un couplage d'affinité, un anticorps spécifique de l'antigène à identifier et la protéine, et que l'on met ensuite le produit couplé obtenu en présence d'un anticorps antiimmunoglobuline dans les conditions de formation d'un nouveau couplage d'affinité. Procédé d'identification des antigènes sur les parois cellulaires, caractérisé en ce qu'on met en présence un complexe ou un réactif agglutinant selon l'une des revendications 1 à 8 avec une suspension des cellules et que l'on observe l'éventuelle agglutination. 11 Procédé d'identification d'antigène K dans un échantillon de sang, caractérisé en ce que l'on met cet échantillon en contact avec un complexe agglutinant selon la revendication 5 et l'on observe l'éventuelle agglutination. 12 Procédé d'identification d'antigène D dans un échantillon de sang, caractérisé en ce que l'on met cet échantillon en contact avec un complexe agglutinant selon la revendication 6 et l'on observe l'éventuelle agglutination.