Brevet FR2675815A1 — publié le 19921030

NOUVELLES SOUCHES DE LEVURE DE PANIFICATION ET LEUR PROCEDE D'OBTENTION, NOUVELLES LEVURES FRAICHE ET SECHE CORRESPONDANTES L'invention a pour objet de nouvelles souches de levure de panification à large spectre, c'est-à-dire performantes à la fois sur pâtes sans sucre et sur pâtes fortement sucrées ainsi qu'un procédé d'obtention de ces nouvelles souches; elle vise également, en tant que pro- duits industriels nouveaux, les levures *de panification fraîche ou sèche obtenues à partir de ces souches. On connaît déjà des souches adaptées à la fermenta- tion du maltose et relativement osmotolérantes, c'est-à- dire présentant un assez large spectre d'application. A cet égard, on rappelle le brevet français NI 7739149, le brevet européen No 79 400555 3 demandé le 03.08 1979 et accordé sous le N O O 008 554 et le brevet américain No 4 396 632 du 02 08 1983, tous trois au nom de la Société Demanderesse. Ces trois brevets correspondent à des aspects différents de l'exploitation d'un procédé reproductible d'obtention par hybridation de nouvelles souches à large spectre, ledit procédé reposant sur le choix judicieux des souches parentes et l'emploi de tests performants de sélection des nouvelles souches à large spectre ainsi construites. Il a également été proposé de préparer des souches à large spectre en transformant une souche de départ par intégration de gènes qui codent pour des enzymes permet- tant la fermentation du maltose (demande de brevet euro- péen N O 88 201870 8 du 01 09 1988 publié sous le N O 0 306 107) Les résultats industriels obtenus tels qu'ils apparaissent à la lecture de la description sont médio- cres Ainsi, le gain obtenu sur pâte normale selon le tableau 6, page 20, par intégration dans une souche os- motolérante d'un vecteur intégratif dépourvu de DNA hété- rologue codant et contenant des gènes MAL est de 18 %, ce qui est largement insuffisant pour pouvoir qualifier la souche obtenue comme étant à large spectre En effet, l'écart d'activité sur pâte normale (pâte sans sucre) entre une souche osmotolérante très active sur pâte sucrée, et une souche très bien adaptée à la fermentation du maltose peut atteindre des rapports de l'ordre de 1 à 2 Or, il apparaît à la lecture du brevet que cette construction est la seule pouvant être considérée comme stable et susceptible de conduire à des levures de panifi- cation pouvant être commercialisées Toujours à la même page 20, il est indiqué que les autres constructions décrites qui ne semblent pas pouvoir conduire à des levures de panification commercialisables mais qui ont conduit à des gains théoriques de l'ordre de 30 %, ce qui est encore insuffisant, permettent de penser que des progrès du même ordre pourront être obtenus en augmentant le nombre de copies des gènes intégrés sans DNA hétérolo- gue codant; c'est une hypothèse qui reste toutefois à vérifier A cet égard, il est rappelé que, selon certains auteurs, il y a des possibilités de modifications non contrôlées du génôme des levures, dues à la transformation même (Heritage damage to yeast caused by transformation, Danhash, Garner, Oliver, Biotechnology, 1991, vol 9, 179). Ceci étant, les souches de levures rapides, adap- tées au maltose utilisées industriellement depuis une vingtaine d'années, sont des souches pour lesquelles, comme leur nom l'indique, la fermentation du maltose n'est guère réprimée par la présence de glucose et est peu dépendante de l'induction par le maltose Ces souches ont été construites par hybridation L'hybridation, quand elle résulte uniquement de croisements menés au hasard, est une méthode dont les résultats sont souvent considérés comme non prévisibles et non reproductibles Cela n'est plus vrai dès lors que les croisements ne sont pas menés au hasard et que des tests de sélection efficace existent. L'expérience montre que l'obtention de souches très bien adaptées au maltose a une fréquence certaine L' avancée des connaissances en biologie moléculaire sur la régula- tion des gènes d'un système donné permet d'expliquer comment, par recombinaison méïotique, les souches ayant les propriétés recherchées peuvent être construites avec une fréquence certaine Par exemple, des travaux de biolo- gie moléculaire ont montré que des mutations intervenant sur les gènes de régulation du système maltose MAL 13, MAL 23, MAL 43, MAL 64 conduisent à des souches ayant une expression constitutive des enzymes dégradant le maltose. Ces gènes mutés sont appelés MAL 13 c, MAL 23 c, MAL 43 c, MAL 64 c Ces gènes de régulation ont en général un carac- tère dit "trans" qui donne à la mutation un caractère dominant et leur présence est souvent associée à une certaine dérépression par rapport au glucose Si un évène- ment peut être prévu avec une fréquence certaine, le phénomène devient prévisible et reproductible. L'invention a notamment pour but de fournir de nouvelles souches à large spectre et un procédé reproduc- tible par hybridation pour les construire, lesdites nou- velles souches et ledit procédé présentant des progrès importants par rapport à ceux de l'art antérieur. Et la Société Demanderesse a eu le mérite de trouver, à l'issue de recherches approfondies, que ce but était atteint, en d'autres termes que de nouvelles souches de levure de panification à large spectre et caractérisées par les activités enzymatiques suivantes déterminées à l'aide des tests T 1, T 2 et T 3 décrits plus loin: activité maltose perméase après croissance de la levure sur milieu glucose, en l'absence de maltose (Test T 1): au moins 9 unités, activité maltase après croissance de la levure sur milieu glucose, en l'absence de maltose (Test T 2): au moins 80 unités et, de préférence, au moins 90 unités, activité invertase (Test T 3): moins de 10 unités et, de préférence, plus de 2 unités, pouvaient être construites par mise en oeuvre d'un procédé consistant: à sélectionner des souches parentes présentant de manière générale de bonnes propriétés de multiplication sur mélasses, d'assimilation de l'azote minéral, de préférence de résistance au séchage; présentant sur pâtes normales ou, de préférence, sur pâtes sucrées des propriétés particulièrement remar- quables; à faire sporuler les souches ainsi sélectionnées; à rechercher par des tests de sélection simples parmi les haploïdes (ségrégeants) ainsi obtenus, ceux qui auront de plus un potentiel élevé pour avoir des pro- priétés maximales sur les types de pâtes boulangères pour lesquels la souche parente n'est pas performante; à croiser ensemble les haploïdes à fort potentiel ainsi sélectionnés; à sélectionner les hybrides issus de ces croisements par les mêmes tests, puis par des tests de sélection plus complets. Les tests utilisés pour mesurer les susdites unités enzymatiques et les définitions de ces unités sont indi- qués ci-après. L'unité maltose-perméase est exprimée en nanomoles de maltose entrant par minute dans 1 mg de matières sèches cellulaires levure. Le dosage de la maltose-perméase, après culture sur milieu glucose, en l'absence de maltose (Test T 1), est dérivé du protocole de Serrano R, Eur J Biochem, 1977, , 97-102, et réalisé de la manière indiquée ci-après. Les levures sont cultivées pendant 24 heures sur milieu YEG (Yeast extract 0,5 %, glucose 2 %, agar 3 %) Les levures sont alors récoltées et lavées de manière à ob- tenir une suspension de levures contenant 4 à 5 mg de matières sèches levure par ml de tampon phosphate de Na 0,05 M ( 50 millimolaire), p H 6, suspension qui est mise à incuber au bain-marie à 200 C On prépare par ailleurs une solution contenant d'une part, du maltose non radioactif et du maltose radioactif U C 14 pour une concentration finale 1 M (molaire) et de 22 microcuries/ml ( 814 kilobecquerels/ml), et d'autre part du glucose 0,01 M ( 10 millimolaire) L'essai d'incorporation (entrée du maltose dans la cellule) est réalisé à 20 'C pour limiter le méta- bolisme du maltose, en mélangeant 230 microlitres de la suspension de levure à 30 microlitres du mélange de sucres La vitesse d'incorporation est estimée d'après la radioactivité intracellulaire pour des durées inférieures ou égales à 30 secondes L'activité malto-perméase est exprimée en nanomoles de maltose entrant dans la cellule par minute et par mg de matières sèches. Le dosage de la maltose-perméase après culture sur milieu maltose (Test T'l) est réalisé, comme indiqué ci- dessus, si ce n'est que les levures sont cultivées pendant 24 heures sur milieu YEM o les 2 % de glucose sont rempla- cés par 4 % de maltose. L'unité maltase est exprimée en nanomoles de PNP (paranitrophénol) libérées par minute et par mg de matiè- res sèches levure. Le dosage de la maltase après culture sur milieu glucose, en l'absence de maltose (Test T 2), est réalisé de la manière indiquée ci-après. Les levures sont cultivées sur milieu YEG pendant 24 heures comme pour le dosage de la maltose-perméase Les levures sont récoltées et lavées de manière à obtenir une suspension contenant 10 à 20 milligrammes de matières sèches levure par millilitre, les levures sont perméabili- sées par le chloroforme et, pour ce faire, on ajoute 0,3 ml de chloroforme à 2 ml de suspension; on agite l'ensem- ble pendant 30 minutes à 300 C, puis on dilue à 20 ml avec de l'eau à 4 C Ensuite, la maltase est dosée par la méthode de Halvorson H et Elias E L Biochim Biophys. Acta, 1958, 30, 28. Le dosage de la maltase après culture sur milieu maltose (Test T' 2) est réalisé comme indiqué ci-dessus si ce n' est que les levures sont cultivées pendant 24 heures sur milieu YEM o les 2 % de glucose sont remplacés par 4 % de maltose. L'unité invertase est définie comme étant la production d'une micromole de sucres réducteurs, cor- respondant en l'occurrence à une demi-micromole de sac- charose inverti, en 5 minutes par mg de matières sèches de levures, à 300 C et à p H 4,7, sans plasmolyse de la levure; pour la doser (Test T 3), on met en présence une quantité connue, de l'ordre de quelques dizièmes de mg, de matières sèches levure et du saccharose à concentration 0,1 molaire dans un tube à essais en milieu tamponné (tampon acétate à p H 4,7) placé dans un bain-marie à 300 C Au bout de 5 minutes, la réaction d'inversion du saccharose est bloquée par ajout du réactif au dinitrosalycilate de soude qui sert à doser les sucres réducteurs formés par réaction calorimétrique. Les valeurs indiquées plus haut des susdites activités enzymatiques caractéristiques des souches selon l'invention montrent que les souches en question: sont parfaitement adaptées au maltose, c'est-à- dire ont des activités constitutives maltose-perméase et maltase en milieu glucose qui ne sont pas limitantes, ont une activité invertase suffisamment importante pour ne pas être limitante et suffisamment faible pour ne pas créer rapidement une augmentation de la pression osmotique due à l'hydrolyse du saccharose. Les susdites activités enzymatiques sont, dans le cas des nouvelles souches conformes à l'invention, des conditions nécessaires mais non suffisantes à elles seules. Il faut que les souches en question aient de plus un bon rendement de multiplication, une bonne assimilation de l'azote, une bonne activité fermentative du glucose, étant entendu que le maltose ou le saccharose sont toujours fermentés sous forme de glucose ou de fructose, une bonne résistance au séchage, propriétés qui sont obtenues grâce à la sélection conforme à l'invention des souches parentes. Le nouveau produit industriel constitué par la levure de panification préparée sous forme fraîche à l'aide des susdites nouvelles souches pouvant être ob- tenues par le procédé conforme à l'invention, est caracté- risé par le fait que, simultanément dans les tests A décrits ci-après, elle présente les caractéristiques suivantes: dans le test A 1 sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 170 et 230 ml, dans le test A 5 sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 140 et 180 ml. dans le test A 6 sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 180 et 250 ml. Le nouveau produit industriel constitué par la levure sèche de panification préparée à l'aide des sus- dites nouvelles souches pouvant être obtenues par le procédé conforme à l'invention, est caractérisé par le fait que, simultanément dans les tests A' décrits ci- après, elle présente les caractéristiques suivantes: dans le test A'1 sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 120 et 145 ml, dans le test A'5 sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 100 et 130 ml, dans le test A' 6 sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 140 et 190 ml. Ces valeurs caractéristiques tant pour la levure fraîche comprimée selon l'invention que pour la levure sèche active selon l'invention, montrent qu'il s'agit d'une levure qui est aussi rapide sur pâte boulangère sans sucre ou avec peu de sucre que les meilleures levures produites pour fermenter des pâtes sans sucre ou peu sucrées, et qui est également sur pâte à plus de 15 % de sucre au moins aussi performante que les levures spécia- lisées pour la fermentation de ces pâtes sucrées, alors que ces propriétés ne se retrouvent jamais simultanément dans les souches actuellement connues. Les tests A et A' utilisés par la Demanderesse pour caractériser les susdites levures sont réalisés à l'aide du fermentomètre de Burrows et Harrison décrit dans le "Journal of the Institute of Brewing", vol LXV, No 1, January-February 1959 et sont exactement définis de la manière suivante: Test A, (levures comprimées fraîches). A 20 g de farine incubée à 30 C, on ajoute un poids de levure comprimée correspondant à 160 mg de matières sèches, cette levure étant délayée dans 15 ml d'eau contenant 27 g de Na Cl par litre et 4 g de 504 (NH 4)2 par litre; on malaxe à l'aide d'une spatule pendant 40 secondes, de manière à obtenir une pâte que l'on place au bain-marie réglé à 30 'C; treize minutes après le début du malaxage, le récipient contenant la pâte est fermé hermétiquement; la quantité totale de gaz pro- duit est mesurée après 60, puis 120 minutes; cette quantité est exprimée en ml à 300 C et sous 760 mm de Hg. Test A'1 (levures sèches). Identique à l'essai A 1, mais préalablement au malaxage, on réhydrate en 15 minutes les 160 mg de matières sèches levure qui se présentent sous forme de levure sèche active dans de l'eau distillée, à 380 C; on utilise à cet effet 40 % du volume d'eau d'hydratation mis en oeuvre; le complément en eau, additionné de 405 mg de Na Cl, est ajouté à l'issue des 15 minutes de réhydratation. Test A 2 (levures comprimées fraîches). Essai identique à l'essai Al, mais on ajoute à la farine 100 mg de saccharose; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes. Test A'2 (levures sèches). Essai identique à l'essai A'1, mais on ajoute à la farine 100 mg de saccharose; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes. Test A 3 (levures comprimées fraîches). Essai identique à l'essai A'1, mais on ajoute à la farine 2 g de saccharose; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes. Test A'3 (levures sèches). Essai identique à l'essai A'1, mais on ajoute à la farine 2 g de saccharose; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes. Test A 4 (levures comprimées fraîches). Essai identique à l'essai Al, mais on ajoute à la farine 5,5 g de saccharose; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes. Test A'4 (levures sèches). Essai identique à l'essai A'1, mais on ajoute à la farine 5,5 g de saccharose; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes. Test A 5 (levures comprimées fraîches). Essai identique à l'essai A 1, mais on ajoute à la farine 4 g de saccharose; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes et 120 minutes. Test A'5 (levures sèches). Essai identique à l'essai A'1, mais on ajoute à la farine 4 g de saccharose; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes et 120 minutes. Test A 6 (levures comprimées fraîches). A 25 g de farine incubée à 30 'C, on ajoute 6,5 g de sucre glace et un poids de levure comprimée correspon- dant à 320 mg de matières sèches, ensuite on procède comme pour l'essai A 1 et la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 et 120 minutes. Test A'6 (levures sèches). Essai identique à l'essai A 6, en procédant pour réhy- drater les 320 mg de matières sèches levure sous forme levure sèche active comme dans l'essai A'1. Ceci étant, pour construire les nouvelles souches, conformément à l'invention on procède comme suit. Dans une première étape, on sélectionne les souches parentes De préférence, on utilise pour cette sélection les meilleures souches déjà connues comme levures de panification, ces souches ayant déjà un certain nombre de propriétés de base indispensables; la plupart de ces souches peuvent être obtenues auprès des centres de col- lection internationaux et notamment à 1 'ATCC (American Type Culture Collection), o elles sont déposées. Elles peuvent être classées en deux grands groupes, à savoir: les souches très rapides sur pâte sans sucre, qui donnent dans le test A 1 en 2 heures des levures fraîches pouvant avoir une activité de 200 ml de C 02 ou plus, mais qui parallèlement donnent des activités en général infé- rieures à 70 ml de CO 2 dans le test A 6 en 2 heures; ces souches très rapides, très bien adaptées au maltose ont des activités maltose- perméase constitutive et maltase constitutive élevées; elles se caractérisent par ailleurs par une activité invertase élevée; les souches très bien adaptées aux pâtes sucrées qui ont une activité dépassant nettement 150 ml dans le test A 6 en 2 heures mais dont les activités dans le test A 1 en 2 heures ne sont que de l'ordre de 100 ml de C 02; ces souches très bien adaptées aux pâtes sucrées ont des activités maltose-perméase constitutive, maltase constitu- tive et invertase faibles, voire très faibles. De préférence, on utilise des souches parentes du deuxième groupe, et on sélectionne celles il qui sont performantes dans le test A 6, c'est-à- dire qui donnent lieu à un dégagement gazeux d'au moins ml en 2 heures dans ce test, qui donnent un rendement acceptable sur mélasses y compris à des taux de multiplication horaire élevés de l'ordre de 1,20, qui assimilent aisément l'azote et sont suscep- tibles de donner des levures de panification, dans des conditions courantes de culture, avec des teneurs en azote sur matières sèches de l'ordre de 9. De préférence, ces souches parentes ainsi sélec- tionnées sont, de plus, stables au séchage. On a constaté qu'une proportion significative des souches osmotolérantes utilisées industriellement présen- tent ces propriétés, ce grâce à quoi il n'y a aucune difficulté à sélectionner des souches parentes con- venables. Dans le cas des souches parentes du premier groupe, on sélectionne celles qui, d'une part, donnent au moins 180 ml en 2 heures dans le test A,, qui donnent un rendement acceptable sur mélasses y compris à des taux de multiplication horai- re élevés de l'ordre de 1,20, et qui assimilent aisément l'azote, qui, d'autre part, ne sont pas trop osmosensibles, point qui est étudié en remplaçant dans les tests A 5 et A 6 le saccharose par une même quantité de glucose, étant entendu qu'on retient les souches donnant au moins 80 ml de C 02 et, de préférence, au moins 90 ml en 2 heures dans le test A 5 o le saccharose a été remplacé par une même quantité de glucose. Dans une deuxième étape, on fait sporuler les souches parentes ainsi sélectionnées. Conformément à l'invention, on sélectionne parmi les haploïdes obtenus, ceux qui simultanément: se colorent en bleu lorsqu'ils sont cultivés sur un milieu à base de glucose comme le milieu YEG (Yeast Extract 0,5 %, glucose 2 %, agar 3 %) en présence de 5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-alpha-D-glucopyranoside appelé ci- après X alpha-glu, qui est un analogue du maltose; ont un taux dl'invertase inférieur à 10 unités et, de préférence, supérieur à 2 unités. Le susdit test de coloration bleue réalisé sur boîte de Pétri est de mise en oeuvre très simple Les souches à tester sont repiquées en quadrillage sur un milieu à base de glucose comme, par exemple, le milieu YEG contenant le X alpha-glu ( 40 microlitres par boîte de Pétri d'une solution à 2 % de X alpha-glu dans le diméthyl- formamide) Si le X alpha-glu a pu pénétrer dans la cel- lule, et si la maltase interne à la levure est présente sous forme constitutive et est non réprimée par le glu- cose, la maltase coupe la liaison alpha-glucoside de ce composé et libère un radical de couleur bleue intense, qui précipite. Après croissance, les colonies correspondant aux souches déréprimées pour le système maltose présentent ladite coloration bleue intense dans le test en question. Ce test de coloration bleue sur boîte de Pétri est très rapide et permet de tester rapidement d'une façon simple de très nombreux haploïdes Il est particulièrement inté- ressant pour la recherche des haploïdes déréprimés pour le système maltose parmi les ségrégeants obtenus à partir de souches sélectionnées pour les performances dans le test A 6, mais peu actifs sur pâte sans sucre en raison de leur non adaptation au maltose Il permet de sélectionner d'une manière étonnamment simple et sûre parmi les haploïdes issus de souches parentes qui ne sont pas du tout adaptées au maltose, la proportion de ségrégeants (haploïdes) en l'occurrence quelques pour cent qui ont des activités maltose-perméase et maltase constitutives se situant à des niveaux nécessaires et suffisants pour pouvoir conduire par hybridation à des souches très bien adaptées au mal- tose et donc très rapides sur pâte sans sucre. La mesure du taux d'invertase est d'une mise en oeuvre un peu plus lourde Dans le cas, notamment o l'on cherche à sélectionner des ségrégeants pauvres en inver- tase issus de souches parentes sélectionnées en raison de leurs performances dans le test A, (dégagement d'au moins ml sur 2 heures), on peut avoir recours à un test calorimétrique semi-quantitatif, dérivé du test mis au point par TRUMBLY, Journal of Bacteriology, 1986, 166, p. 1123. Pour ce faire, on peut utiliser une plaque de microtitration Dans chaque cupule de ladite plaque, on introduit 20 microlitres d'eau, puis on introduit une quantité de la colonie à tester correspondant au volume d'une tête d'épingle, c'est-à-dire environ 0,05 mg de matières sèches levure (exemptes du milieu de culture) et enfin on ajoute 50 microlitres d'une solution de sac- charose à 6 % dans du tampon acétate de sodium 0,01 M ( 10 millimolaire), à p H 4,6. On met ensuite la plaque de microtitration à incuber pendant 5 minutes à 300 C au bain-marie On ajoute alors 50 microlitres de chlorure de triphényl-tétrazolium à 0,1 % dans Na OH 0,5 molaire On incube à nouveau pendant 2 minutes à 500 C au bain-marie. Il se développe une coloration rouge d'autant plus intense que le taux d'invertase du ségrégeant (haploïde) est élevé Expérimentalement, on peut de manière simple, par ce test de coloration, sélectionner les haploïdes ayant moins de 20 unités invertase. La sélection ainsi effectuée des haploïdes doit être confirmée par la mesure de leur activité enzymatique. Lesdits haploïdes devront présenter simultanément les activités suivantes: maltose-perméase après croissance sur glucose: au moins 3 unités et, de préférence, au moins 7 unités, maltase après croissance sur glucose: au moins 40 unités et, de préférence, au moins 80 unités, invertase: moins de 10 unités et, de préférence, entre 2 et 10 unités. De préférence, ces haploïdes présenteront également les activités suivantes: maltose-perméase après culture sur maltose: au moins 12 unités, maltase après culture sur maltose: au moins 200 unités. Dans l'étape suivante, on procède à l'hybridation de l'ensemble des haploïdes sélectionnés, c'est-à-dire des haploïdes qui répondent à l'ensemble des critères définis ci-dessus. On signale que la sporulation des souches de départ, l'obtention des haploïdes et la conjugaison de ces haploïdes sont effectuées par mise en oeuvre des techni- ques décrites dans le chapitre 7 H Sporulation and Hybridi- zation of Yeast" par R R Fowell, de l'ouvrage "The Yeasts", volume 1, édité par A H Rose and J S Harrison, 1969 Academic Press La technique d'hybridation retenue est la technique de la conjugaison en masse (mass-mating). On sélectionne ensuite, à partir de tous les hybrides ainsi obtenus, les souches conformes à l'inven- tion en ayant recours aux mêmes tests que pour la sélec- tion des haploïdes, à savoir: développement d'une culture bleue après étalement sur boîte de Pétri YEG en présence de X alpha-glu, non développement d'une coloration rose dans le test pour déterminer le taux d'invertase d'après Trumbly, maltose-perméase après culture de la levure sur milieu glucose, en l'absence de maltose, au moins 9 uni- tés, maltose-perméase après culture de la levure sur milieu maltose, au moins 12 unités, maltase après culture de la levure sur milieu glu- cose, en l'absence de maltose, au moins 50 unités, de préférence au moins 80 unités et, encore de préférence, au moins 90 unités, maltase après culture de la levure sur milieu mal- tose, au moins 200 unités, invertase: moins de 10 unités, de préférence plus de 2 unités, et on affine la sélection en ayant recours à des tests de culture selon des méthodes usuelles, par un tri supplémen- taire: en fonction du rendement, en fonction de l'assimilation d'azote, en fonction des activités dans les tests Ai et A 6, en fonction de la résistance au séchage. De manière à augmenter les croisements possibles et leurs performances, il est intéressant de rechercher expérimentalement parmi les haploïdes sélectionnés comme indiqué plus haut et objet des croisements définis ci- dessus: ceux qui, de manière dominante, même après croisement avec des haploïdes ayant une invertase supérieure à , donneront des souches ayant une invertase infé- rieure à 10; ceux qui, de manière dominante, apporteront après culture sur glucose en l'absence de maltose, des activités maltose-perméase et maltase élevées. Pour préparer la levure fraîche de panification conforme à l'invention, on cultive les susdites souches selon les méthodes habituelles mais avec un taux de multi- plication horaire moyen de l'ordre de 1,18 à 1,20 de manière à obtenir des levures comprimées à environ 30 % de matières sèches ayant moins de 5 % de bourgeons, des te- neurs en azote sur matières sèches de l'ordre de 8,7 à 9 et des teneurs en P 205 sur matières sèches de l'ordre de 3 %. La levure fraîche comprimée ainsi obtenue est caractérisée par le fait que: dans le test Ai sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 170 et 230 ml, de préférence entre et 230 ml, dans le test A 5 sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 140 et 180 ml, de préférence entre et 180 ml, dans le test A 6 sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 180 et 250 ml, de préférence entre et 250 ml. Pour préparer la levure active sèche conforme à l'invention, les nouvelles souches obtenues sont cultivées selon les méthodes habituelles, en milieu concentré, c'est-à-dire dans un milieu o le poids total du moût en fin de culture par rapport à la quantité de mélasses coulée est de l'ordre de 4,5 à 5, avec un taux de multi- plication horaire moyen de l'ordre de 1,18 à 1,20, de manière à obtenir de nouvelles levures comprimées à 30- % de matières sèches: ayant une quantité de bourgeons inférieure à 5 %, une teneur en protéines sur matières sèches de l'or- * dre de 7,9 à 8,3, une teneur en P 205 sur matières sèches de 1 'ordre de 2,7 à 2,8, une teneur en tréhalose sur matières sèches de l'or- dre de 10 à 13 %, de préférence de l'ordre de 12 à 13 %. Cette levure fraîche est séchée par un séchage rapide ménageant en présence d'un émulsifiant, par exemple en présence de 1,5 % de monostéarate de sorbitan. La nouvelle levure sèche ainsi obtenue est caracté- risée par le fait que: dans le test A'1 sur 2 heures, elle donne un dégage- ment gazeux compris entre 120 et 145 ml, de préférence entre 130 et 145 ml et, plus préférentiellent encore, entre 135 et 145 ml, dans le test A'5 sur 2 heures, elle donne un dégage- ment gazeux compris entre 100 et 130 ml, de préférence entre 110 et 130 ml, et dans le test A' 6 sur 2 heures, elle donne un dégage- ment gazeux compris entre 140 et 190 ml, de préférence entre 150 et 190 ml et, plus préférentiellement encore, entre 160 et 190 ml. Ceci étant, l'invention est illustrée par les exemples suivants. EXEMPLE 1 On isole les souches de levures fraîches et de levures sèches osmotolérantes commercialisées en Europe, aux Etats-Unis d'Amérique et au Japon. On les teste dans le cadre d'une culture reprodui- sant des conditions industrielles, en milieu concentré, à un taux de multiplication moyen de l'ordre de 1,18 con- duisant: à des levures pressées à 8,8-9 % en poids d'azote sur matières sèches, à des levures sèches à 8 % en poids d'azote sur matiè- res sèches. On retient les souches qui simultanément donnent un rendement en matières sèches levures sur mélasse de betteraves à 50 degrés Clerget (mesure du saccharose par double polarisation) d'au moins 25 %, donnent des levures pressées conduisant, dans le test A 6, à au moins 160 ml de gaz carbonique, donnent des levures sèches conduisant, dans le test A' 6, à au moins 120 ml, ont un taux d'invertase inférieur à 10 unités. On fait sporuler les souches retenues, qui ne sont pas adaptées au maltose Aucune souche connue répondant aux critères énumérés ci-dessus, ne permet d'obtenir des levures fraîches comprimées donnant significativement plus de 100 ml en 2 heures dans le test Ai On recherche les haploïdes donnant des colonies bleues dans le test sur boîte de Pétri avec milieu YEG (Yeast Extract Glucose) et X alpha-glu. On vérifie que les haploïdes donnant des colonies bleues répondent simultanément à tous les critères sui- vants: activité maltose-perméase après culture sur milieu glucose, au moins 3 unités et, de préférence, au moins 7 unités, activité maltose-perméase après culture sur milieu maltose, au moins 12 unités, activité maltase après culture sur milieu glucose, au moins 40 unités et, de préférence, au moins 80 unités, activité maltase après culture sur milieu maltose, au moins 200 unités, activité invertase, moins de 10 unités. On a ainsi obtenu une vingtaine d'haploïdes répon- dant simultanément à l'ensemble de ces critères. A titre d'exemple, on signale que trois haploïdes ont été déposés dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) à l'Institut Pasteur à Paris, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cédex 15 Ces haploïdes sont désignés dans les cahiers de laboratoire de la Deman- deresse sous les numéros: HO 37 de signe de conjugaison a déposé dans la CNCM sous le numéro I-1076 HCT 14 de signe de conjugaison alpha déposé dans la CNCM sous le numéro I-1075 HCT 44 de signe de conjugaison alpha déposé dans la CNCM sous le numéro I-1074. Ces haploïdes présentent les activités enzymati- ques suivantes: maltose maltose-perméase maltase maltase perméase inver après culture sur milieu tase glucose maltose glucose maltose HO 37 3,5 26 115 230 7 HCT 14 8,0 22 45 240 6 HCT 44 12,0 15 135 340 2 EXEMPLE 2 On croise ensemble les haploïdes sélectionnés selon l'exemple 1 On sélectionne les souches répondant aux critères suivants. Dans un premier temps, on sélectionne les souches ayant simultanément les activités enzymatiques suivantes: maltose-perméase après culture sur milieu glucose, au moins 9 unités, maltose-perméase après culture sur milieu maltose, au moins 12 unités, maltase après culture sur milieu glucose, au moins unités, maltase après culture sur milieu maltose, au moins unités et, de préférence, au moins 230 unités, invertase: moins de 10 unités et, de préférence, plus de 2 unités. Dans un second temps, on vérifie par des tests de culture les performances des souches ainsi sélectionnées. On peut faire des tests semi-anaérobies de laboratoire donnant une récolte suffisante pour permettre des mesures d'activité fermentative; on peut également faire des cultures aérobies en volumes réduits Ces tests ont le mérite de pouvoir être effectués rapidement sur un grand nombre de souches Ils permettent le classement des sou- ches obtenues, la vérification qu'elles ont bien les performances recherchées, par rapport à des souches témoins. Dans un dernier temps, on vérifie que les souches ayant passé le deuxième crible donnent une nouvelle levure de panification selon l'invention dans le cadre d'essais pilotes reproduisant aussi exactement que possible les conditions de la production industrielle, c'est-à-dire: les cycles de fabrication successifs, la concentration du milieu de culture illustré par exemple par le ratio poids final du moût levuré dans le cuve de fermentation mélasse totale à 50 % de saccharose qui a été choisi dans le cadre des essais comme étant de l'ordre de 4,7, les conditions d'aération, le taux d'alcool en cuve. Dans le cadre de cet exemple, trois souches ont été sélectionnées comme donnant des produits nouveaux par- ticulièrement intéressants, c'est-à-dire la nouvelle levure fraîche comprimée et la nouvelle levure sèche selon l'invention Ces trois souches ne sont que des exemples, d'autres souches équivalentes ont et pourront être obtenues. Les trois souches sont désignées dans les cahiers de laboratoire de la Demanderesse et déposées à la Collec- tion Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cédex 15, sous les numéros: n O 3493 déposée dans la CNCM sous le no I-1073 n O 3603 déposée dans la CNCM sous le N O I-1072 n O 3608 déposée dans la CNCM sous le N O I-1071. Ces trois souches ont les activités enzymatiques suivantes, qui sont comparées avec les activités enzymati- ques de quelques souches-types. 3603 Souche isolée d'une levure très rapide sur pàte normale commercialisée en Grande-Bretagne Souche isolée d'une levure très osmotolérante commercialisée au Japon NCYC 995 NCYC 996 Les tr trois souches suivants par é. NCYC NCYC 955 996 - maltose-perméase maltose-perméase maltase maltase invertase après culture sur milieu glucose maltose glucosemaltose 14 21 130 240 5 16 27 230 330 4 16 36 90 250 8 9 12 90 230 100 130 1,5 290 40 24 20 rois haploïdes HO 37, HCT 14, HCT 44, les 3493, 3603, 3608 présentent les caryotypes lectrophorèse à champs pulsés: L 43 H 037 HCTI 4 HCT 44 3603 3608 YPH 80 - Sur ce schéma, ont été ajoutées à titre de témoins les souches de levures de boulangerie NCYC 995 et NCYC 996, objet du brevet U S n 4 396 632 ainsi que deux souches témoins de laboratoires: La 3: souche haploïde témoin de laboratoire, YPH 80: Yeast Chromosome PFG Marker, vendu par New England BIOLABS, 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915/USA. EXEMPLE 3 Les trois nouvelles souches 3493, 3603, 3608 dépo- sées dans la CNCM sous les n' I-1073, 1-1072, I-1071, la souche isolée à partir de la meilleure levure fraîche pour ses performances sur pâte normale, trouvée sur le marché britannique en 1990, désignée ci- après comme souche rapide britannique, la souche isolée à partir de la meilleure levure pour ses performances sur pâtes très sucrées, trouvée sur le marché japonais en 1990, désignée ci-après comme souche osmotolérante japonaise, ont été cultivées de la manière suivante. A l'exception de l'emploi de procédés et matériels spécifiés ci-après, les souches ont été propagées en plu- sieurs stades de multiplication aérobie, la levure fraîche a été récoltée, lavée, filtrée à l'aide de matériels classiques employés en levurerie et selon les procédés de fabrication habituels comme les matériels et les procédés décrits dans l'ouvrage "Yeast Technology" de Gerald Reed and Henry J Peppler ( 1973), The Avi Publishing Company Inc ou dans le chapitre "Production of Baker's Yeast", Gerald Reed, publié par Prescott and Dunn's Industrial Microbiology, 4 ème Edition, édité par Gerald Reed, The Avi Publishing Co Inc, second printing 1983. Il est particulièrement veillé à ce que tous les nutriments nécessaires en petites quantités à la levure, minéraux (macroéléments et oligoéléments), vitamines (bio- tine, vitamines de groupe B) soient présents au moins dans les quantités les plus grandes recommandées dans les ou- vrages de référence cités ci-dessus De manière générale, ces essais sont menés comme indiqué dans les précédents brevets de la Demanderesse, cités ci-dessus Il est notam- ment veillé à obtenir des levures bien lavées et à refroi- dir rapidement la crème et les levures filtrées à 20 C. Le dernier stade de multiplication de la levure conduisant à une levure fraîche comprimée très active est mené plus spécifiquement de la manière suivante: dilution du milieu de culture en fin de multiplica- tion commerciale: Poids du moût levuré dans la cuve = 4,7 Quantité de mélasse à 50 % de sucres totaux exprimés en saccharose De préférence, ces essais sont menés avec un mélange de 90 % de mélasses de betterave, 10 % de mélasses de canne de bonne qualité Le sucre des mélasses de bet- terave est mesuré par la méthode Clerget (détermination du saccharose par double polarisation), le sucre des mélasses de canne est déterminé par mesure enzymatique du sac- charose, glucose et fructose réellement présents et l'en- semble des ces sucres est calculé en équivalent sac- charose; taux de multiplication horaire moyen sur le dernier cycle de multiplication de 14 heures: 1,18 à 1,20. taux maximum de bourgeons de la levure récoltée: 5 %. taux azote/matières sèches levure récoltée: 9 % ( 8,6 à 9,2). taux P 205/matières sèches levure récoltée: 3 %. Ces essais ont donné les résultats suivants: Test Al Test A 5 Test A 6 2 heures 2 heures 2 heures Souche 3493 198 154 215 Souche 3603 193 150 223 Souche 3608 210 165 235 Souche NCYC 995 180 110 135 Souche rapide britannique 210 90 55 Souche osmotolérante japonaise 110 135 198 La souche NCYC 995 était la meilleure souche connue jusqu'alors pour combiner des propriétés de rapidité sur pâte normale (sans sucre) et sur pâtes sucrées Dans le tableau ci- dessus, elle est à 8,6 d'azote sur matières sèches, ce qui est proche du maximum pour sa production industrielle. EXEMPLE 4 On procède comme dans l'exemple précédent avec les mêmes souches dans le but d'obtenir des levures sèches actives Les conditions générales de culture restent substantiellement les mêmes Le taux de multiplication horaire moyen est de l'ordre de 1,18 Les conditions particulières de la culture, notamment les coulées d'in- grédients sont adaptées de manière à viser la composition suivante pour la levure récoltée destinée au séchage: azote sur matières sèches valeur optimum ( 8 %) P 205 sur matières sèches 2,7 à 2,8 * tréhalose sur matières sèches 12 %. Pour la production des levures fraîches et sèches, il existe pour chaque souche une teneur optimum en azote sur matière sèche, en fonction des autres propriétés désirées pour la levure A partir d'une certaine teneur en protéines, les gains d'activité fermentative deviennent faibles, voire très faibles ou même nuls Cette notion est très importante pour les levures sèches A partir d'une certaine teneur en protéines, les gains d'activité fermen- tative deviennent inférieurs à l'augmentation des pertes au séchage liées à cette teneur en protéines Pour les nouvelles souches, l'optimum de composition en azote sur matières sèches pour la production de levures sèches est de l'ordre de 8 à 8,2 %. A cette levure, on ajoute une fine émulsion à base d'un émulsifiant comme le monostéarate de sorbitan, celui- ci étant ajouté à raison de 1,5 % de matières sèches levure L'émulsion peut également contenir un agent épaississant On extrude la composition obtenue à travers une grille de largeur de maille 0,5 à 1 mm et on sèche ladite levure à au moins 92 %, de préférence au moins 94 % de matières sèches par un séchage rapide particulièrement ménageant, c'est- à-dire un séchage de moins d'une heure o la température de la levure ne dépasse pas 300 C en début du séchage et 40 QC en fin de séchage De préférence, on a ajouté une fine émulsion constituée de monostéarate de sorbitan à raison de 1,5 % de la matière sèche levure et de carboxyméthylcellulose à raison de 0,5 % de la matière sèche levure et on a séché rapidement la levure par flui- disation dans un courant d'air sec et chaud, comme indiqué page 6 du brevet européen O 008 554 La levure sèche à la sortie du fluidiseur est rapidement refroidie et emballée dans des emballages hermétiques sous atmosphère inerte, c'est-à-dire sous un gaz neutre (azote, gaz carbonique) contenant moins de 1 % d'oxygène On a ainsi obtenu des levures sèches à environ 95 % de matières sèches. N/MS Levures fraîches Levures sèches à 30-35 % matières sèches à 95 % matières sèches Souche A 1 A 5 A 6 A 1 A 5 A'6 2 heures 2 heures 2 heures 2 heures 2 heures 2 heures Souche 3493 8-8,2 172 140 200 137 113 160 Souche 3603 8 182 147 220 122 105 150 Souche 3608 8 193 151 226 135 115 170 Souche NCYC 995 7,5-7,8 154 100 125 131 82 100 Souche NCYC 996 7,2-7,5 105 125 165 91 100 130 Souche rapide 8,2 185 90 70 125 60 40 britannique Souche osmotolérante 8 95 120 180 70 95 145 japonaise EXEMPLE 5 Signification des tests d'activité fermentative Les différents tests utilisés pour mesurer l'acti- vité des levures de panification sont discutés dans le chapitre VII 1 B intitulé "Appréciation du pouvoir fer- mentaire", pages 449 à 464 du Guide Pratique d'Analyses dans les Industries des Céréales, coordonné par B GODON et W LOISEL, éditions Techniques et Documentation Lavoisier/ Apria 1984 La méthode de Burrows et Harrison y est décrite comme la méthode de choix pour les levureries. Les tests retenus dans la présente demande de brevet sont: les tests A 1 et A'1 qui correspondent à la méthode décrite en détail pages 455 à 458 de cet ouvrage, et qui sont la reprise à quelques variantes près de la méthode originale telle que décrite par ses auteurs en 1959 Ils correspondent à une pâte sans sucre; les tests A 5 et A'5, A 6 et A'6 qui correspondent à la mise en oeuvre de pâtes sucrées. Ces derniers tests ont été préférés aux tests A 2, A'f 2 A 3, A'3, A 4, A'4 qui sont apparus à l'expérience moins instructifs Quelques essais ont été faits en reprenant les tests A 3, A'3 et A 4 et A'4 Leurs résultats sont décrits dans le tableau ci-dessous, dans lequel on rappelle les résultats obtenus dans ces tests avec les souches NCYC 890, NCYC 995 et NCYC 996 à titre de comparaison. OS 8 Z It T El 09 SEú 1 ZS Oi IS Z Zi 6 Et 1 LS LET 591 SZI SZI 001 9 z 151 EúZ 091 OZZ Lbl T 861 tbl 861 O 01 Eú 89 Sbl lb SOI ZE b SI OS 8 L E 61 t S Z 8 80 Z 8 b EL Z 81 SL LLT OL Oz I samaaq f slaioq; onaqi amoq I samaq Z samaqzl samoq Z omaql amaqj l siamanq Z 9.V S V sw % 56 s Qq:>s soin Ag"l sw % SE O C saq:>ei son 1 a' SN/N oqono S Ln t O Co N o c'N S'LZ Ec'9 Z 8 E úú Sú Oú OLI I OSI LSI SLI Z 8 Sll ZOI SO It Sll t II 8 'L Z'L S'L 06 'L 09 '8 b 6 'L '8 00 '8 068 DODN 966 DADN 566 DODN 809 E 809 E Eú 09 E 6 t E E 6 tbú Par ailleurs, dans la demande de brevet européen n' 88 201870 8 publiée sous le N O O 306 107, qui vise par des moyens différents, l'obtention de souches à large spectre, ce sont des tests, spécifiques à la Demanderesse de ce brevet européen, intitulés B, C et B', C' qui sont utili- sés La levure de panification obtenue avec une souche transformée par intégration de vecteurs homologues n'est toujours pas proposée à la vente, selon les déclarations les plus récentes d'un porte-parole de la Demanderesse dudit brevet Aucune souche transformée n'est déposée dans un centre de collections Les tests B et C correspondent à des tests sur pâte normale sans sucre, et les tests B' et C' correspondent à des tests sur pâte à 30 % de sucre. Faute de pouvoir se procurer des échantillons, un essai de corrélation entre les résultats donnés: par lesdits tests B et C d'une part, et les tests A 1 et A'1 d'autre part, par lesdits tests B' et C' d'une part, et les tests A 6 et A'6 d'autre part, a été fait Compte tenu des résultats de cet essai de corrélation, on peut établir le tableau suivant: Levure fraîche comprimée à environ % de matières sèches B Al B' A 6 Souche A de la demande 306 107;w 311 155 q 190 122 Souche Ap Gb p 2 RBRR 01 = 1 367 184 i% 190 122 Souche 3493 396 198 333 215 Souche 3608 420 210 364 235 On notera que très peu de valeurs absolues sont données et qu'aucun essai de séchage n'est décrit dans la demande de brevet européen 306 107 Quoiqu'il en soit, il apparaît que la nouvelle levure fraîche comprimée, objet de la présente invention, par rapport à la levure fraîche comprimée obtenue avec la souche Ap Gb-p 2 RBRR 01 = 01: est au moins aussi active sur pâte normale, est beaucoup plus active sur pâte sucrée. Ces conclusions peuvent être extrapolées aux levures sèches Ces conclusions sont normales, si on prend en compte que les meilleures levures sur pâtes très su- crées ont une activité sur pâte sans sucre inférieure à la moitié de celles des meilleures levures spécialisées pour pâte sans sucre Le gain maximum sur pâtes sans sucre espéré par la méthode de transformation employée dans la demande de brevet européen publiée sous le no 306 107 est de quelques dizaines de pour cent Cette méthode de trans- formation ne peut conduire sur la base des résultats décrits qu'à des levures ayant des performances inférieu- res à celles de la présente invention. REVENDICATIONS 1 Nouvelles souches de levure de panification à large spectre ayant un bon rendement de multiplication, une bonne assimilation de l'azote, une bonne activité fermentative du glucose, de préférence une bonne résistance au séchage, caractérisées par le fait qu'elles présentent simul- tanément les activités enzymatiques suivantes: activité maltose- perméase après croissance de la levure sur milieu glucose, en l'absence de maltose (Test T 1): au moins 9 unités, activité maltase après croissance de la levure sur milieu glucose, en l'absence de maltose (Test T 2): au moins 80 unités et, de préférence, au moins 90 unités, activité invertase (Test T 3): moins de 10 unités et, de préférence, plus de 2 unités. 2 Nouvelles souches de levure de panification à large spectre selon la revendication 1, caractérisées par le fait qu'elles présentent simultanément les activités enzymatiques suivantes: activité maltoseperméase après croissance de la levure sur milieu maltose (Test T'1), au moins 12 unités, activité maltase après croissance de la levure sur milieu maltose (Test T'2), au moins 200 unités. 3 Procédé de construction des nouvelles souches de levure de panification à large spectre selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'on sélectionne des souches parentes présentant de manière générale de bonnes propriétés de multiplication sur mélasses, d'assimilation de l'azote minéral, de préférence de résistance au séchage, présentant sur pâtes normales ou, de préférence, sur pâtes sucrées des propriétés particulièrement remar- quables, fait sporuler les souches ainsi sélectionnées, recherche par des tests de sélection parmi les haploïdes (ségrégeants) ainsi obtenus, ceux qui auront de plus un potentiel élevé pour avoir des propriétés maximales sur les types de pâtes boulangères pour lesquels la souche parente n'est pas performante, croise ensemble les haploïdes à fort potentiel ainsi sélectionnés, sélectionne les hybrides issus de ces croisements par les mêmes tests, puis par des tests de sélection plus complets. 4 Nouvelle levure fraîche de panification suscep- tible d'être obtenue à l'aide des nouvelles souches de levure de manification selon les revendications 1 ou 2, caractérisée par le fait que: dans le test Ai sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 170 et 230 ml, de préférence entre et 230 ml, dans le test A sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 140 et 180 ml, de préférence entre et 180 ml, dans le test A 6 sur 2 heures, elle donne un dégagement gazeux compris entre 180 et 250 ml, de préférence entre et 250 ml. 5 Nouvelle levure sèche de panification suscep- tible d'être obtenue à l'aide des nouvelles souches de levure de panification selon les revendications 1 ou 2, caractérisée par le fait que: dans le test A'1 sur 2 heures, elle donne un dégage- ment gazeux compris entre 120 et 145 ml, de préférence entre 130 et 145 ml et, plus préférentiellent encore, entre 135 et 145 ml, dans le test A'5 sur 2 heures, elle donne un dégage- ment gazeux compris entre 100 et 130 ml, de préférence entre 110 et 130 ml, et dans le test A' 6 sur 2 heures, elle donne un dégage- ment gazeux compris entre 140 et 190 ml, de préférence entre 150 et 190 ml et, plus préférentiellement encore, entre 160 et 190 ml. 6 Haploïde déposé dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) à l'Institut Pasteur sous le no I-1076. 7 Haploïde déposé dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) à l'Institut Pasteur sous le no I-1075. 8 Haploïde déposé dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) à l'Institut Pasteur sous le N O 1-1074. 9 Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on sélectionne les souches parentes parmi celles: qui, de préférence, donnent lieu à un dégagement gazeux d'au moins 160 ml en 2 heures dans le test A 6 ou qui donnent lieu à la fois à un dégagement gazeux d'au moins ml en 2 heures dans le test A 1 et à un dégagement gazeux d'au moins 80 ml et, de préférence, d'au moins 90 ml en 2 heures dans le test A o le saccharose a été remplacé par une quantité égale de glucose, qui donnent un rendement acceptable sur mélasses y compris à des taux de multiplication horaire élevés de l'ordre de 1,20, et qui assimilent aisément l'azote et sont suscep- tibles de donner des levures de panification, dans des conditions courantes de culture avec des teneurs en azote sur matières sèches de l'ordre de 9. 10 Procédé selon l'une des revendications 3 et 9, caractérisé par le fait que l'on sélectionne parmi les haploïdes obtenus par sporulation des souches parentes, ceux qui simultanément: se colorent en bleu lorsqu'ils sont cultivés sur un milieu à base de glucose comme le milieu YEG (Yeast Extract 0,5 %, glucose 2 %, agar 3 %) en présence de 5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-alpha-D-glucopyranoside ou X alpha- glu, ont un taux d'invertase inférieur à 10 unités et, de préférence, supérieur à 2 unités, et qui présentent les activités enzymatiques suivantes: maltose-perméase après culture sur glucose: au moins 3 unités et, de préférence, au moins 7 unités, maltase après culture sur glucose: au moins 40 unités et, de préférence, au moins 80 unités. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'on sélectionne les haploïdes ayant en plus simultanément les activités enzymatiques suivantes: maltose-perméase après culture sur maltose: au moins 12 unités, maltase après culture sur maltose: au moins 200 unités. 12 Procédé selon l'une des revendications 3, 9 à 11, caractérisé par le fait que l'on sélectionne parmi les hybrides obtenus, ceux: qui donnent lieu au développement d'une culture bleue après étalement sur boîte de Pétri YEG en présence de X alpha-glu, qui ne donnent pas lieu au développement d'une coloration rose dans le test pour déterminer le taux d'invertase d'après Trumbly, et qui présentent les activités enzymatiques suivantes: maltose- perméase après culture sur milieu glucose, en l'absence de maltose, au moins 9 unités, maltose-perméase après culture sur milieu maltose, au moins 12 unités, maltase sur milieu glucose, en l'absence de maltose, au moins 50 unités, de préférence au moins 80 unités et, encore de préférence, au moins 90 unités, maltase sur milieu maltose, au moins 200 unités, invertase: moins de 10 unités, de préférence plus de 2 unités, étant entendu que, parmi les hybrides ainsi sélectionnés, on opère une sélection supplémentaire par des méthodes usuelles: en fonction du rendement, en fonction de l'assimilation d'azote, en fonction des activités dans les tests A 1 et A 6, en fonction de la résistance au séchage. 13 Procédé de construction de nouvelles souches de levure de panification à large spectre selon la revendica- tion 1, caractérisé par le fait que l'on croise ensemble au moins deux des haploïdes conformes aux revendications 6 à 8 et que l'on sélectionne, parmi les hybrides issus de ces croisements, ceux qui donnent lieu au développement d'une culture bleue après étalement sur boite de Pétri YEG en présence de X alpha-glu, qui ne donnent pas lieu au développement d'une coloration rose dans le test pour déterminer le taux d'invertase d'après Trumbly, et qui présentent les activités enzymatiques suivantes: maltose-perméase après culture sur milieu glucose, en l'absence de maltose, au moins 9 unités, maltose-perméase après culture sur milieu maltose, au moins 12 unités, maltase sur milieu glucose, en l'absence de maltose, au moins 50 unités, de préférence au moins 80 unités et, encore de préférence, au moins 90 unités, maltase sur milieu maltose, au moins 200 unités, invertase: moins de 10 unités, de préférence plus de 2 unités, étant entendu que, parmi les hybrides ainsi sélectionnés, on opère une sélection supplémentaire par des méthodes usuelles: en fonction du rendement, en fonction de l'assimilation d'azote, en fonction des activités dans les tests A 1 et A 6, en fonction de la résistance au séchage. 14 Nouvelle souche de levure de panification déposée dans la Collection Nationale de Cultures de Micro- organismes à l'Institut Pasteur sous le N O I-1073. 15 Nouvelle souche de levure de panification déposée dans la Collection Nationale de Cultures de Micro- organismes à l'Institut Pasteur sous le no I-1072. 16 Nouvelle souche de levure de panification déposée dans la Collection Nationale de Cultures de Micro- organismes à l'Institut Pasteur sous le no 1-1071.