Brevet FR2676059A1 — publié le 19921106

i Nouveaux dérivés de peptides utilisables comme inhibiteurs de co L Lagénases bactériennes. La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de peptides, utilisables comme inhibiteurs des col Lagénases bactériennes qui appar- tiennent à la classe des méta L Loprotéases à zinc. De façon plus précise, elle concerne des dérivés de polypeptides possédant un groupement chélatant phosphinique P 02-CH 2 susceptible d'inter- agir fortement avec l'atome de zinc du site actif de ces collagénases. Le collagène est un composant majoritaire de la matrice extracellulaire des organismes eucaryo- tes pluricellulaires Ainsi, il est le constituant principal de la peau, des tendons, des os, des cartilages et des tissus, et représente environ % de toutes les protéines du corps humain. Bien que la molécule de collagène soit très résistante à l'action de la plupart des protéa- ses, elle peut être néanmoins dégradée par des protéases qui lui sont spécifiques, les collagénases. Deux classes distinctes de collagénases ont été identifiées à ce jour et sont caractérisées par la spécificité des coupures qu'elles opèrent dans la molécule de collagène La première classe de collagénases est constituée par les collagénases d'organismes supérieurs qui hydrolysent les liaisons peptidiques contenant le doublé Gly-Ile ou Gly-Leu alors que la deuxième classe est constituée par les collagénases bactériennes qui hydrolysent systématiquement toutes les liaisons peptidiques comportant la séquence X-Gly et dégradent en général toute la molécule de collagène. Les col Lagénases bactériennes appartiennent à La classe des métalloprotéases à zinc et l'existen- ce d'un atome de zinc dans leur site catalytique qui est impliqué directement dans La réaction d'hydrolyse de la liaison peptidique des substrats, rend possible le développement d'inhibiteurs compétitifs de ces enzymes Ces inhibiteurs qui peuvent être des dérivés de peptides, comportent une partie peptidique dont la fonction est d'engager des interactions spécifiques avec les sous-sites de liaison de l'enzyme, et un groupement chélatant susceptible d'interagir fortement avec l'atome de zinc du site actif. Ce modèLe d'interaction enzyme-substrat, propre à la famille des protéases à zinc, a permis récemment la mise au point de puissants inhibiteurs présentant des propriétés pharmacologiques intéres- santes Parmi ceux-ci, on peut citer les inhibiteurs de l'enzyme de conversion et les inhibiteurs des enképhalinases Toutefois, ces composés sont incapa- bles d'inhiber les collagénases bactériennes Ceci s'explique par le fait que chacune de ces trois protéases à zinc (enképhalinase, enzyme de conver- sion, collagénase bactérienne) possède une spécifici- té différente. Dans le cas des collagénases bactériennes, des travaux récents ont montré qu'il était possible, d'après les hypothèses développées ci- dessus, de produire aussi pour cette classe de protéases des inhibiteurs pseudo-peptidiques comportant un groupe- ment chéLatant thiol, cétone ou phosphoramide. Ainsi, Yotakis et al dans Eur J Biochem, vol 160, p 413-418 ( 1986) et dans Eur J Biochem, vol 172, p 761-766, ( 1988), ont montré que les composés HS-CH 2-CH 2-CO-Pro -Arg et HS-CH 2-CH 2-CO- Pro-Har inhibaient les collagénases produites par Achromobacter iophagus et par Clostridium histo Lyti- cum, les constantes d'inhibition Ki obtenues étant de 400 10-9 M et de 210 10-9 M. Galardy et a I dans Biochemistry, vol. 22, n 19, p 4556-4561, ( 1983) et dans US-A- 4 558 034 ont montré que des di et tripeptides comportant un groupement phosphonyle inhibaient la collagénase de c Lostridium histolyticum Dans ce cas, pour le meilleur composé isoamyl-PO 2 Gly- Pro-Ala, la constante d'inhibition Ki est de 20.10-6 M. Mookhtiar et a I dans Biochemistry, vol. 27, p 4299-4304 ( 1988) ont montré que des dérivés de peptides comportant une fonction cétone pouvaient inhiber les collagénases de Clostridium histolyticum. Dans ce cas, la constante d'inhibition Ki est de 1.10-6 M pour le meilleur composé (cinnamoyl Leuk- Gly-Pro-Arg). Ainsi, aucun des inhibiteurs connus ne conduit à des constantes d'inhibition de l'ordre de la nanomole. Aussi, des recherches ont été poursuivies pour trouver d'autres inhibiteurs plus actifs. La présente invention a précisément pour objet de nouveaux dérivés de peptides qui sont des inhibiteurs des collagénases bactériennes plus puissants et plus sélectifs. Selon l'invention, ces dérivés de peptides répondent à la formule O R 6 1-N i -R 4 7 R -NH-CH-P-CH 2-CH 2-CO-R -N-CH-CO-R ( 1) 32 1 3 15 R OR R dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène, un groupe capable de bloquer la terminaison N d'un alpha- aminoacide, ou un radical dérivé d'un alpha-aminoaci- de ou d'un peptide rattaché à NH par sa terminaison CO et comportant sur sa terminaison N un atome d'hydrogène ou un groupe capable de bloquer la terminaison N d'un alpha-aminoacide, R 2 est la chaîne latérale d'un alpha-aminoacide, R 3 est un atome d'hydrogène, un atome de métal, un groupe alkyle en C 1 à C 5 ou un groupe benzyle, -R 4 est un radical bivalent dérivé d'un alpha-aminoa- cide choisi parmi la proline, l'hydroxyproline, la thiazolidine et la déshydroproline, de formule: CH 2 CH S \ CH 2 CH $ CH 2 i I i N-C -CO-C- N CH CO N CH CO - OH CH 2 / \ CH 2 t H 2 C / H 2 C CH 2 H 2 c H 2 I N -CH CO N CH CO - relié à CO par son atome d'azote, R 5 est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C 1 à C 4, R 6 est un groupe alkyle en C 1 à C 5 ou la chaîne latérale d'un alpha-aminoacide, et R 7 représente OR 8 avec R 8 représentant un atome d'hydrogène, un atome de métal, un groupe alkyle en C 1 à C 5 ou un groupe benzyle, ou dans laquelle soit R 1 et R 7, soit R 1 et R 6, forment ensemble un radical bivalent dérivé d'un alpha-amino- acide ou d'un peptide comportant de 2 à 3 résidus d'acides aminés. Dans ces dérivés de peptides, on utilise comme groupement chimique capable d'interagir avec l'atome de zinc du site actif des collagénases, le groupe phosphinique P 02 CH 2 qui présente un fort pouvoir inhibiteur, tout en conférant au dérivé une bonne stabilité chimique. En effet, l'utilisation de cette liaison phosphinique rend ces nouveaux dérivés stables, notamment en milieu acide De plus, ces dérivés sont particulièrement intéressants car, tout en ayant une excellente affinité vis-à-vis des collagé- nases bactériennes, ils possèdent en outre une meilleure sélectivité que les inhibiteurs connus. De plus, les dérivés de peptides de l'invention répondant à la formule (I) dans laquelle R 1 et R 7 forment ensemble un radical bivalent dérivé d'un alpha-aminoacide ou d'un peptide, possèdent une stabilité améliorée vis-à-vis de la dégradation possible par des protéases. En effet, un des problèmes auxquels on doit faire face quand on utilise des peptides dans des milieux physiologiques concerne le fait que ces molécules sont en général très rapidement inacti- vees par des protéases capables de cliver une liaison peptidique présente dans ces molécules. Dans la définition des peptides de l'inven- tion, les termes "alpha-aminoacide" se rapportent aux vingt a- aminoacides communément trouvés dans les protéines qui sont également connus sous le nom d'aminoacides standard et à leurs analogues. Les chaînes latérales de ces aminoacides comprennent des groupes alkyle Linéaires et ramifiés, hydroxyal- kyle, carboxyalkyle, aralkyle, aminoalkyle, carboxa- mide alkyle, mercapto alkyle, phénylalkyle, hydroxyphénylalkyle, guanidinoalkyle, imidazoylalkyle, indolylalkyle, et pyrrolidinyle. A titre d'exemple d'acides aminés gtilisa- bles, on peut citer l'alanine, l'arginine, l'aspara- gine, l'acide aspartique, la cystéine, la glutamine, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, l'isoleucine, la leucine, la norleucine, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la proline, l'hydroxyproline, la sérine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine, La valine, la nitrophényl alanine, l'homo arginine, la thiazolidine et La déshydroproline. Les termes "groupe capable de bloquer La terminaison N d'un a-aminoacide" ou "groupe bloquant" incluent tous les groupes bloquants utili- sables pour bloquer les fonctions amines d'aminoaci- des et de peptides, par exemple les groupes t-butoxy- carbonyle, benzyloxycarbonyle, cinnamoyle, pivaloyle et N-( 9-fluorényl-méthoxycarbonyle). Les métaux utilisables pour R 3 et R 8 sont en particulier des métaux pharmaceutiquement acceptables, par exemple des métaux alcalins tels que le sodium et le lithium. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, R 1 représente un atome d'hydrogène, un groupe capable de bloquer la terminaison N d'un alpha-aminoacide ou un radical dérivé d'un alpha- aminoacide ou d'un peptide éventuellement protégé par un groupe bloquant, et R 7 représente OR 8 avec R 8 représentant un atome d'hydrogène, un atome de métal, un groupe alkyle ou un groupe benzyle. Dans ces dérivés, R 2 est la chaine latérale d'un alpha-aminoacide qui peut être par exemple la phénylalanine, et R 4 est dérivé d'un acide aminé choisi parmi la proline, l'hydroxyproline, la thiazo- lidine et la déshydroproline. On utilise de préférence pour R 4 le dérivé de la proline de formule: _N CO- R 6 Dans ces dérivés, l'extrémité -N-CH-CO- R 5 peut correspondre à différents acides aminés. A titre d'exemple, il peut s'agir de la norleucine et dans ce cas, R 5 est un atome d'hydrogène et R 6 est le groupe n-butyle. Dans ce premier mode de réalisation de l'invention, R 1 peut représenter un groupe bloquant, par exemple Le groupe benzyloxycarbony Le, ou corres- pondre à un résidu d'aminoacide protege, par exemple à La glycine protégée par un groupe bloquant, ou à un résidu de peptide protégé, par exemple -Pro- Gly protégé par un groupe bloquant Ce groupe blo- quant peut être également le groupe benzyloxycarbony- le. Lorsque les dérivés de peptides de l'inven- tion sont destinés à être utilisés comme inhibiteurs des collagènases bactériennes, R 3 est de préférence un métal tel que le sodium, et dans R 7 c'est-à- dire OR 8, R 8 est également de préférence un métal par exemple le sodium. Selon un second mode de réalisation de l'invention, le dérivé de peptide est un cyclopeptide r 4 pondent par exemple à la formule: 0 R 6 Il 4 I -R-NH-CH-P-CH -CH CO R -N -CH -C O (Ia) 12 I 3 2 2 C) R OR RS dans laquelle R 10 représente un radical bivalent dérivé d'un peptide ou d'un alpha-aminoacide. Généra Lement R 10 est dérivé d'un peptide et comprend par exemple deux résidus d'acide aminé. Avec un tel R 10, on obtient un dérivé cyclique plus résistant à la dégradation par des protéases que les dérivés de formule CI) non cyclique, qui conserve par ailleurs intactes ses propriétés inhibi- trices vis-à-vis des collagénases bactériennes. Dans ce second mode de réalisation de l'invention, R 2, R 3, R 4, R 5 et R 6 représentent avantageusement les mêmes groupes que dans le premier mode de réalisation de l'invention. Les dérivés de peptides de l'invention peuvent être préparés par des procédés classiques. Ainsi, les dérivés correspondant au premier mode de réalisation de l'invention dans lesquels R 1 est un groupe bloquant, R 2, R 3, R 4, R 5 et R 6 ont la signification donnée ci-dessus, et R 7 représente OR 8 avec R 8 identique à R 3, peuvent être prépares par un procédé comprenant les étapes suivantes: a) faire réagir un aldéhyde de formule R 2-CHO dans laquelle R 2 a la signification donnée ci-dessus avec du diphényl aminohypophosphite pour obtenir un acide diphénylméthylaminoalkylphosphinique de formule: C 6 H 5 O OH 6 5 CH-NH-CH-P (II) t 2 CH/ 12 \s C 6 H 5 R H b) faire réagir l'acide diphénylméthylami- noa Lkylphosphinique de formule (II) avec un hydracide halogéné de formule HX dans laquelle X est un atome d'halogène, pour obtenir un acide aminoalkylphosphinique de formule: 0 OH NH -CH-P 2 I 2 - R H c) protéger la terminaison N de l'acide aminoalkylphosphinique de formule (III) par le groupe bloquant R 1 pour obtenir l'acide aminoalkyl- phosphinique de formule: 0 OH i 7 Nc il '1 (IV) R -NH-CH-P I 1 2 R H d) faire réagir l'acide de formule (IV) avec un acrylate d'alkyle de formule: CH 2 =CH-COOR 9 dans laquelle R 9 est un radical alkyle pour obtenir le composé de formule: ii R 1-NH-CH-P-CH 2 CH -CH 2-COOR (V) 12 l 2 R OH e) saponifier le composé de formule (V) pour obtenir l'acide de formule (VI) i Il 1 -H R -NH-CH-P-CH 2-CH 2-COOH (VI) 1 O J 2 I R OH f) faire réagir l'acide de formule (VI) avec un peptide de formule R 6 4 _ I R 9 H-R -N-CH-COOR R dans laquelle R 9 est un radical alkyle pour obtenir le peptide de formule (VII) 0 R 6 OI R il4 I R 1 -NH-CH-P-CH -CH 2-CO-R 4-N-CH-COOR (VII) 12 2 2 R 15 R OHR g) faire réagir le peptide de formule (VII) avec un halogénure de formule R 3 X dans laquelle R 3 a la signification donnée ci-dessus et X est un atome, d'halogène pour obtenir le peptide de formule (I). Les dérivés de peptides correspondant au premier mode de réalisation de l'invention, c'est-à-dire répondant à la formule (I) dans laquelle R 1 est un radical dérivé d'un acide aminé ou d'un peptide dont la terminaison N est protégée par un groupe bloquant, R 2, R 3, R 4, R 5 et R 6 ont la signification donnée ci-dessus, et R 7 représente OR 8 avec R 8 identique à R 3, peuvent être préparés *par un procédé comprenant les étapes successives suivantes: a") préparer un peptide de formule (VII) en réalisant les étapes a) à f) du procédé décrit ci-dessus, b') éliminer le groupe protecteur R 1 du peptide de formule (VII) pour obtenir le peptide de formule: O R 6 4 I 4 I 2 NH -CH-P-CH -CH -CO-R 4-N-CH-COOR (VIII) 2121 2 2 15 R OH R c') faire réagir le peptide de formule (VIII) avec un acide aminé ou un peptide dont la terminaison N est protégée par un groupe bloquant et dont la terminaison C est activée par un groupe nitrophényle, et d') faire réagir le peptide obtenu dans l'étape c') avec un halogénure de formule R 3 X dans laquelle X est un atome d'halogène. Les dérivés de cyclopeptides correspondant au second mode de réalisation de l'invention et répondant à la formule: O R 6 Il 4 R 10-NH-CH-P-CH -CH -CO-R -N-CH-CO (Ia) 12 OR3 I 5 ROR 3 2 R CG 1 dans laquelle R 10 représente un radical bivalent dérivé d'un peptide ou d'un aminoacide et R 2, R 3, R 4, R 5 et R 6 ont La signification donnée ci-dessus, peut être préparé par un procédé comprenant les étapes successives suivantes: a") préparer un peptide de formule (VII) en réalisant les étapes a) à f) du procédé décrit ci-dessus, b") éliminer Le groupe protecteur R 1 du peptide de formule (VII) pour obtenir le peptide de formule: 0 R 6 Il 4 f 9 NH 2-CH-P-CH 2-CH 2-CO-R -N-CH-COOR (VIII) R OH R c") faire réagir le peptide de formule (VIII) avec un peptide de formule R 1-R 10-OR 11 dans laquelle R 1 est un groupe b L oquant la terminaison N du peptide et R 11 est un groupe nitrophényle, pour obtenir Le peptide de formule: O R 6 1 10 4 I 9 R-R -NH-CH-P-CH -CH 2-CO-R -N-CH-COOR (IX) 1 2 32 2 15 R OR R d") faire réagir le peptide de formule (IX) avec l'hydrazine pour obtenir l'hydrazide sr de formule: O R 6 1 l 1 O Il 1 ( O c O x) R R NH-CH-P-CH 2-CH 2-CO-R 4-N-CH-CO-NH-NH 2 (X) 2 33 R O R e") déprotéger l'hydrazide de formule (X) pour obtenir l'hydrazide de formule: O R 6 li 4 H-R -NH-CH-P-CH 2 CH 2-CO-R 4-N-CH-CO-NH-NH 2 (XI) R OR R f") cycliser l'hydrazide de formule (XI) pour obtenir le cyclopeptide de formule (Ia) 0 R 6 10 I O R -NH-CH-P-CH 2-CH 2-CO-R -N-CH-CO(Ia) I II 12 1 3,j R OR R Dans les procédés décrits ci-dessus, les différentes étapes sont réalisées par des techni- ques classiques et en utilisant les réactifs et les solvants généralement employés dans la chimie des peptides pour réaliser ces types de réactions. Les dérivés de peptides de l'invention peuvent trouver de nombreuses applications en raison de leur pouvoir inhibiteur vis-à-vis des collagénases bactériennes. Ils peuvent être utilisés en particulier dans des compositions pharmaceutiques destinées au traitement de certaines infections dues à la présence de bactéries capables d'excréter de La collagénase. En effet, la présence de ces bactéries peut entraîner une destruction importante du collagè- ne et porter donc atteinte à l'intégrité du tissu conjonctif de l'organisme infecté C'est le cas en particulier des affections par Clostridium histolyticum ou par Pseudomonas aeruginosa On peut les utiliser en particulier pour le traitement des maladies parodontales associées aux microorganismes collagénolytiques qui sont responsables de la destruction du collagène, entrant par exemple dans la composition de la gencive. En effet, bien que les dérivés de peptides de l'invention n'aient pas d'action directe sur les microorganismes collagénolitiques, ils constituent un moyen thérapeutique intéressant dans certaines pathologies (par exemple gangrène, infections dentaires) car ils sont des inhibiteurs puissants et spécifiques des collagénases bactériennes Dans ces applications pharmaceutiques, on peut aussi utiliser les dérivés de peptides de l'invention pour inhiber d'autres métalloprotèases présentant des spécificités proches de celles des collagénases bactériennes, impliquées dans le métabolisme du collagène. Aussi, l'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant une quanti- * té pharmaceutiquement efficace d'un dérivé de peptide de l'invention répondant à la formule (I) donnée ci-dessus dans laquelle R 3 est un atome d'hydrogène ou de métal. Cette composition peut être sous la forme d'un sel physiologiquement acceptable du dérivé de peptide, dans un véhicule ou un support physiologiquement acceptable appropriée Elle peut par exemple être administrée sous la forme de solutions ou de suspensions par injection. Les doses préférées à administrer se situent dans la gamme allant de lmg/kg/jour à environ mg/kg/jour. Les compositions peuvent être aussi sous la forme de compositions destinées à l'administration orale, telles que des comprimés ou des capsules, obtenus par exemple en combinant les dérivés de peptides de l'invention avec des supports, des excipients et des additifs classiques tels que le carbonate de magnésium, le stearate de magnésium, le talc, le sucre, le lactose, la pectine, la dextri- ne, l'amidon, la gélatine, le tragacanthe, la méthyl- cellulose, la carboxymèthylcellulose de sodium, le beurre de cacao, etc Des diluants, des agents de saveur, des solubilisants, des lubrifiants, des agents de mise en suspension, des liants, des agents de désintégration etc peuvent être ajoutés aux compositions Les ingrédients actifs peuvent être aussi encapsulés avec d'autres supports etc. Les dérivés de peptides de l'invention peuvent également trouver des applications dans d'autres domaines, par exemple pour la protection des peaux dans le domaine de la fabrication du cuir et pour la protection de la gélatine dans différentes activités utilisant la gélatine. En effet, si le substrat naturel des collagénases bactériennes apparait être prioritaire- ment le collagène natif, on sait que cette protéase peut utiliser comme substrat du collagène sous sa forme dénaturée, c'est-à- dire la gélatine La gélatine est utilisée actuellement dans divers contexes et il est intéressant de maintenir l'intégrité parfaite de la gélatine pour ces applications Ceci peut donc être obtenu en utilisant les dérivés de peptides de l'invention comme inhibiteurs compétitifs des collagénases bactériennes susceptibles de détruire la gélatine. On peut encore utiliser les dérivés de peptides de l'invention pour isoler de nouvelles protêases à zinc présentant une spécificité proche de celle que possèdent les collagénases bactériennes, notamment au sein des organismes supérieurs Dans ce cas, on peut utiliser les dérivés de peptides de l'invention comme ligand pour la réalisation de colonnes d'affinité en vue de séparer d'autres protèases à zinc. On peut aussi utiliser les dérivés de peptides de l'invention comme moyen pour contrôler l'activité de la collagénase bactérienne, par exemple dans des procêdés biotechnologiques basés sur l'utilisation de bactéries collagénolytiques, par exemple pour l'attendrissement de la viande et la digestion de sédiments dans les bassins de sédimentation. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront mieux à la lectue des exemples suivants donnés bien entendu à titre illus- tratif et non limitatif. Exemp Le 1: Préparation de Z-D,L Phe*-P 02 CH 2-CH 2-CO Pro-N Le 0,2 Na+ (Composé A). (Z=C 6 H 50 CO, Phe*=-NH-CH(CH 2 C 6 H 5) et Nle =NH-q H-COO) (CH 2)3 CH 3 3 5 a) Synthèse de l'acide diphénnylméthylamino- 1 phényl-2 éthylphosphinique D,L ( 1): (composé n 1). C H O OH 6 5 Il on CH-NH-CH-P (Composé n 1) CH H C 6 H 5 CH 2 H C 6 H 65 Une solution de dioxane ( 12 ml) contenant ( 12 g, 0,1 mol) de phénylacétaldéhyde ( 12 g, 0,1 mol) est ajoutée doucement à une solution de dioxane ( 300 ml) contenant en suspension du diphénylaminohypo- phosphite ( 24,9 g, 0,1 mo L) L'addition de phénylacétaldéhyde est faite à 100 C sous atmosphère d'azote au fur et à mesure de façon à ce que la température ne dépasse pas 100 C Cette addition se fait durant 3 h L'eau formée au cours de la réaction est éliminée par distillation azéotropique. Après avoir ajouté tout l'aldéhyde, la réaction est laissée sous reflux 15 min Ce mélange est refroidi, puis dilué avec 100 ml d'éthanol Le produit cristallisé est filtre, lavé à l'éthanol, puis à l'éther et séché On obtient ainsi 12 g du composé n 1 ( 34 %); (p f= 210 C, Rf( 1)= 0,81). b) Synthèse de l'acide amino-lphényl- 2 éthylphosphinique D,L( 2) de formule O OH NH 2-CH-P (Composé n 2) CH 2 H C 6 H 5 Le composé n 1 ( 3,51 g, 10 mmol) est chauffé à 100 C pendant 1 h dans un mélange H Br/H 20 à 48 % ( 12 ml) Ce mélange est évaporé à sec sous vide très poussé, puis le produit est repris dans l'eau. Le bromure de diphénylméthyl est extrait de cette solution par un traitement à l'éther Après évapora- tion, le produit est repris dans 30 ml d'éthanol. Ce mélange, auquel est ajouté lml d'oxyde de propylè- ne, est refroidi à 4 C jusqu'à précipitation complète du produit Le produit filtré est lavé à l'éthanol, puis à l'éther et séché Le composé n 2 attendu ( 2) est obtenu avec un rendement de 76 % ( 1,42 g), Rf( 1)= 0,37, Rf( 2)= 0,7, p f 226 C. c) Synthèse de l'acide benzyloxycarbonyla- mino-lphényl-2 éthylphosphinique D,L( 3) de formule: 0 OH 1 C HCH 2 -0-CO NH | (Composé n 3) C 6 H-CH-O CO-NH-CH-P CH H CH C 6 H 5 Le composé n 2 ( 1,1 g, 6 mmol) est dissous dans 10 ml d'eau, puis on ajuste le p H de cette solution à 9,5 à l'aide d'une solution de soude 4 N A ce mélange refroidi dans un bain de glace on ajoute doucement du benzyl chloroformate ( 1,2 ml, 7,5 mmol), tout en maintenant le p H de la réaction à 9,5 par additions successives de soude Le méLange réactionnel est laissé sous agitation à O C pendant min, puis pendant 1 h à la température ambiante. Après traitement au diéthyléther, ce mélange est refroidi, puis acidifié par addition d'acide chlorohydrique Le produit qui précipite est filtré, lavé à l'eau froide et séché Le composé n 3 attendu est obtenu avec un rendement de 76 % ( 1,5 g), Rf( 1)= 0,57, Rf( 2)= 0,76, p f 110 C. d) Synthèse du D,L (benzyloxycarbonylamino- 1 'phényl-2 ')hydroxyphosphiny 14thyl-3 propionate d'éthyle( 4) de formule: o C H -CH -O-CO-NH-CH-P-CH 2 CH 2 C (Composé N 4) 6 5 2 1 2-C 2-CO 2 H 5 (ops 04 CH OH 1 2 C 6 H 5 Une suspension du composé n 3 ( 1,27 g, 4 mmol) dans de l'hexam 4thyldisilazane ( 0,968 g, 6 mmol) est chauffée sous agitation à 110 C pendant min sous atmosphère d'argon Après avoir refroidi ce méLange à 90 C, on ajoute goutte à goutte l'acry- late d'éthyle ( 0,48 g, 4,8 mmol) Cette réaction est laissée ensuite pendant 15 min à 90 C sous agita- tion On ajoute 12 ml d'éthanol absolu à ce mélange lorsque sa température atteint 70 C, puis une fois revenu à température ambiante on évapore à sec. Le résidu est dissous dans 10 ml de Na HCO 3 à 10 %, puis lavé au diéthyléther La solution aqueuse, une fois refroidie, est acidifiée à p Hl,5 avec HC 1 1 N Le précipité est filtré, lavé à l'eau froide et séché Le composé n 4 attendu est obtenu avec un rendement de 84 % ( 1,4 g) Rf( 1)= 0,52, Rf( 3)= 0,8. e) Synthèse de l'acide benzyloxycarbonylamino 1 '-phênyl 2 'hydroxyphosphinyléthyl-3 propionique de formule: I C 6 H 5-CH 2-O-CO-NH-CH P CH -H -COOH (Composé no 5) I -2 CH OH C 6 H 5 Le compos 4 n 4 ( 1,26 g, 3 mmol) est dissous dans 6,5 ml de KOH 1 N et laissé sous agitation à température ambiante pendant 45 min Ce mélange est ensuite acidifié à p H 1,5 avec HCL 1 N Le précipité est extrait avec de l'éthylacétate, puis cette phase est lavée avec une solution aqueuse saturée avec Na Cl, séchée avec du sulfate de sodium et concentrée en un faible volume Après une nuit à 4 C, le précipité est filtré, lavé avec un peu d'êthylacêtate et séché Le composé n 5 attendu est obtenu avec un rendement de 88 % (lg). Rf( 1)= 0,51, Rf( 2)= 0,93, Rf( 3)= 0,55, Rf( 5)= 0,41. f) Synthèse du peptide de formule: Z-D, L Phe*PO(OH)-CH 2-CH 2-CO- Pro-Nle o-OCH 3 Il C 6 H 5-CH 2-OCO-NH-CH P -CH 2-CH 2-CO-Pro-Nle-OCH 3 I l CH OH 1 2 C 6 H 5 (Composé n 6) 1 O A une solution froide à 4 C du composé n 5 dissous dans du tètrahydrofurane ( 12 ml), on ajoute du 1-1-carbonyldiimidazole ( 1,78 g, 11 mmol). Après 45 min sous agitation à température ambiante on ajoute à ce m lange le peptide Pro-Nle-OCH 3 ( 5,5 mmol) dilué dans du tètrahydrofurane ( 5 ml). Le mélange, après 24 h sous agitation, est évaporé à sec Ce résidu est dissous dans 20 ml de KOH 0,27 N ( 5,5 mmol), et cette phase est immédiatement Lavée avec du diéthy 14ther, acidifiée à p H 1,5 avec H Cl 1 N Le produit qui précipite est repris dans l'ac 4 ta- te d'ethyle, et cette phase est lavée avec de l'eau, séch 4 e avec dusulfate de sodium et concentrée à sec Ce résidu est dissous dans un faible volume de chloroforme, puis précipité en ajoutant de l'êther de pétrole Le composé n 6 final, après filtration, lavage et séchage, est obtenu avec un rendement de 89 % ( 3 g). Rf( 5)= 0,6, Rf( 6)= 0,33. g) Synthèse du peptide de formule Z-DL Phe*-PO 2 CH 2-CH 2-CO-Pro-Nle,2 Na+ (Composé A). Le composé n 6 ( 0,15 g,0,19 mmol) est dissous dans l'éthanriol 10 % ( 15 ml), puis on ajoute du KOH 2 N( 0,475 ml) sous agitation 3 h à température ambiante La phase aqueuse est acidifiée à p H 1,5 avec H Cl 1 N Le précipité est repris dans de l'4thylacétate et la phase organique est lavée avec une solution aqueuse saturée en Na Cl, séchée avec du sulfate de sodium et concentrée à sec. Le résidu est dilué dans une solution aqueuse contenant du Na HC 03 ( 0,38 mmol), puis lyophilisé. Le produit attendu est obtenu avec un rendement de 93 %. Rf( 1)= 0,27, Rf( 2)= 0,85, Rf( 8)= 0,57. 1 H NMR (H 20): CHú Nle 0,94; CHS,y Nle 1,37 (m, 4); C Hf Nle 1,84 (m, 1); CHP Nle 1,73 (m, 1); CH Ca Ne 4,18 (m, 1); NH Nle 8,08 (d,1); C Hy Pro 2,02 ( m, 2); C Hp Pro 2,02 (m, 1); C Hp Pro 2,28 (m, 1); C Ha Pro 3, 63 (m, 1); CH Pro 3,48 (m, 1); C Ha C Pro 4,41 (q, 1); P-CH 2- CH 2 2, 57 (m,2); P-CH 2-CH 2 1,88 (m,2); CHP Phe 2,73 (m,1); C Hp Phe 3,26 (m, l); C Ha Phe 3,96 (m,l); NH Phe 7,26; (d,1); Z-CH 2 5 (m,2); Ar 7 35 (m, 10). 31 p NMR (H 20): 43,83 Exemple 2: Préparation du peptide Z-Pro-Phe*PO(OH)-CH 2-CH 2-CO-Pro-Nle 2 Na+ (composé B) (Z=C 6 H 50 CO et Phe*=NH-CH(CH 2 C 6 H 5)-) Le groupement protecteur Z du composé n 6 est éliminé par hydrog 4 nolyse catalytique classi- que Le produit obtenu est couplé au Z-Pro-O Nph (nitrophênyl ester) commercial dans le diméthylforma- mide Le produit est saponifié, puis traité dans les mêmes conditions que celles décrites pour l'obtention du composé A. 1 H NMR (H 20): CH Nle 0,89; CH$,y Nle 1,35 (m, 4); CH 3 Nle 1,84 (m, 1); C Hfi Nle 1,73 (m, 1); C Hc L Nle 4,12 (m, 1); NH Nle 7,96 (d,1); C Hy Pro 2,02 ( m, 2); C H 13 Pro 1,98 (m, 1); CH 3 Pro 2,25 (m, 1); CH 3 Pro 3,63 (m, 1); CH Pro 3,52 (m, 1); C Ha Pro 4,28 (q, 1); P-CH 2- CH 2 2,63 (m,2); P-CH 2-CH 2 1,70 (m,2); C Hg 3 Phe 2,73 (m,1); CH 3 Phe 3,31 (m,l); C Hcz Phe 4,42 (m,1); NH Phe 8,16 (d,1); C Hy Pro 1,55 (m, 2); C Hf 3 Pro 1,72 (m, 1); C Hp Pro 2,15 (m, 1); CH Pro 3,42 (m, 1); C Ha O Pro 4,32 (q, 1); Z-CH 2 5 (m,2); Ar 7,35-7,45 (m, 10). 31 p NMR (H 20): 43,2 Exemp Le 3: Préparation du peptide Z-Gly-Pro-Phe*-PO(OH)-CH 2-CH 2-CO-Pro-Nle 2 Na+ (compo- sé C) (Z=C 6 H 50 CO et Phe*=-NH-CH(CH 2 C 6 H 5)-) La synthèse de ce peptide est réalisée par couplage du Z-Gly-Pro-O Nph au composé n 6, ayant subi au préalable une hydrogénolyse catalytique classique, puis traité dans les mêmes conditions que celles décrites pour l'obtention du composé ci-dessus A. IH NMR (H 20): CHE Nle 0 89; CH ,y Nle 1,35 (m, 4); CHI 3 Nle 1,84 (m, 1); C Hp 3 Nle 1,73 (m, 1); C Ha Nle 4,12 (m, 1); NH Nle 7,96 (d,1); C Hy Pro 2,02 ( m, 2); CH 3 Pro 1, 98 (m, 1); C Hp Pro 2,25 (m, 1); C Ha Pro 3,63 (m, 1); CH Pro 3,52 (m, 1); C Ha Pro 4,28 (q 1); P-CH 2- CH 2 2,63 (m,2); P-CH 2-CH 2 1,70 (m,2); C Ha Gly 3,65 (d,1); C Ha Gly 3. 45 (d,1); CHI 3 Phe 2,73 (m,1); CHI Phe 3,31 (m,1); C Hc C Phe 4,37 (m, 1); NH Phe 8,2 (d,1); C Hy Pro 1,55 (m, 2); CH 3 Pro 1,70 (m, 1); CHI 3 Pro 2,15 (m, 1); CHS Pro 3,40 (m, 1); C Ha Pro 4,29 (q, 1); Z-CH 2- (m,2); Ar 7,35-7 45 (m, 10). 3031 p NMR (H 120): 43,35 Exemp Le 4: Préparation du cyc Lopeptide G ly-Pro-Phe*-PO(OH)-CH 2-CH 2-CO-Pro-Nle, Na+ (composé D La synthèse de ce produit est réalisée à partir du composé Z-Gly-Pro-Phe*-PO(OH)-CH 2-CH 2- CO-Pro-Nleo-OCH 3 obtenu dans l'exemple 3 au cours de la synthèse du composé C On prépare l'hydrazide de ce composé par traitement à l'hydrazine dans Le méthanol, puis le groupement protecteur Z est éliminé par hydrogénation catalytique classique. La cyclisation est alors réalisée selon la méthode de Bodanzsky M et Henes G B ( 1975),Bioorg Chem Vol 4, p 212-218. 111 NMR (H 20): CHE Nle 0,92; CHS Nle 1,28 (m, 2); C Hy N Ile 1,28 (m,2); C Hg 3 Nle 1,95 (m, 1); C Hp 3 Nle 1,67 (m, 1); C Hax Nle 4,5 (m, 1); NH Nle 8,31 (d,1); C Hy Pro 2,11 ( m, 2); C Hp 3 Pro 2,02 (m, 1); CHH 5 Pro 2,38 (m, 1); CHâPro 3,63 (m, 1); CHS Pro 3,82 (m, 1); C Ha Pro 4,38 (q, 1); P- CH 2-CH 2 2,68 (m,2); P-CH 2-CH 2 1,62 (m,1); P-CH 2-CH 2 2 29 (m, 1); CHI 3 Phe 2,78 (m,1); CH 3 Phe 3,25 (m,1); C Hax Phe 4,27 (m,l); NH Phe 8,33 (d,1); C Hy Pro 1,88 (m, 2); C Hi 3 Pro 1,18 (m, 1); CH 53 Pro 2,06 (m, 1); CH 6 Pro 3,58 (m, 1); CHâPro 3,41 (m, 1) C Ha Pro 4,28 (q, 1); Ar 7,35- 7,45 (m, 10). 31 p NMR (H O (): 43 83 Exemple 5: Détermination de l'activité des inhibi- teurs. Les activités des différents composés A, B, C et D ont été déterminées d'une part en mesurant la constante de vitesse d'association des inhibiteurs à la colagénase par la méthode Morrison, J, & Walsh, C T ( 1987) Adv Enzymol. Relat Aeras Mol Biol appliquée dans le cas o les inhibiteurs sont du type slow binding; puis d'autre part par la mesure des constantes de vitesse de dissociation des inhibiteurs du complexe enzyme- inhibiteur Dans ce cas, après avoir laissé préincu- ber la collagénase en présence d'un excès d'inhibi- teur, on purifie le complexe enzyme-inhibiteur ainsi formé par gel filtration Puis la solution contenant le complexe purifié est dilute par un facteur 10000 dans un tampon de référence et l'on mesure alors en fonction du temps le retour de L'activité de la collagénase, qui traduit la disso- ciation de l'inhibiteur du complexe enzyme-inhibi- teur Les constantes d'inhibition reportées dans le tableau qui suit correspondent au rapport des constantes de vitesse de dissociation Koff et de vitesse d'association Kon ainsi mesurdes Dans toutes les expériences de mesures d'activité, nous avons utilisé comme substrat synthétique le Fa- Leu-Gly-Pro-Ala dans un tampon Tricine p H 7 La source de collagénase bactérienne utilisée provient de la souche Empedobaterium collagenolyticum. TABLEAU Constantes Composé Formule d'inhibi- tion Ki(n M o A Z, DL-Phe -P-CH 2-CE 2 C-r-l 2 Na+ 1 2 o o B Z-Pro-D,L-Phe -P-CH 2-CH 2-CO-Pro-Nle,2 Na+80 o c Z-Gly- Pro-D,L-Phe -P-CH 2-CH 2-CO-Pro-Nle,2 Na0,4 o D Gly-Pro-D,L-Phe CH 2-CH 2-CO-Pro-Nle o 8 REVENDICATIONS 1 Dérivé de peptide répondant à La formule O R 6 i 4 'CR 7 R -NH-CH-P-CH 2-CH 2-CO-R 4-N-CH-CO-R 7 () R 5 12 1 3 R 2 15 R OR R dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène, un groupe capable de bloquer la terminaison N d'un alpha- aminoacide, ou un radical dérivé d'un alpha-aminoaci- de ou d'un peptide rattaché à NH par sa terminaison CO et comportant sur sa terminaison N un atome d'hydrogène ou un groupe capable de bloquer la terminaison N d'un alpha-aminoacide, R 2 est la chaîne latérale d'un alpha-aminoacide, R 3 est un atome d'hydrogène, un atome de métal, un groupe alkyle en C 1 à C 5 ou un groupe benzyle, -R 4 est un radical bivalent dérivé d'un alpha-amino- acide choisi parmi la proline, l'hydroxyproline, la thiazolidine et la déshydroproline, de formule: CH 2 CH S CH 2 CH 2CH I i i N -CH CO N -CH CO - OH 1 C Hu 2 Xi C H 2 CCH 2 H 2 CCH 2 l I I -N CH -CO N C CO - relié à CO par son atome d'azote, R 5 est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C 1 à C 4, R 6 est un groupe alkyle en C 1 à C 5 ou la chaîne latérale d'un alpha-aminoacide, et R 7 représente OR 8 avec R 8 représentant un atome d'hydrogène, un atome de métal, un groupe alkyle en C 1 à C 5 ou un groupe benzyle, ou dans laque L Le soit R 1 et R 7, soit R 1 et R 6 forment ensemble un radical bivalent dérivé d'un alpha-aminoacide ou d'un peptide comportant de 2 à 3 résidus d'acide aminé. 2 D 4 riv 4 de peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que R 4 représente le radical de formule: f C H CH 2 CH 2 l I -N CH-CO- 3 Dérivé de peptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que R 5 est un atome d'hydrogène et R 6 est le groupe n-butyle. 4 Dérivé de peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que R 2 représente le radical ph 4 nylméthyle. Dérivé de peptide selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce que R 1 représente un groupe capable de bloquer la termi- naison N d'un alpha-aminoacide. 6 Dérivé selon la revendication 5, carac- tèrisé en ce que R 1 est le groupe benzyloxycarbonyle. 7 D 4 rivé de peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractéri S en ce que R 1 représente un radical dérivé de la proline compor- tant un groupe capable de bloquer sa terminaison N. 8 D 4 rivé de peptide selon l'une quelconque des revendi cations 1 à 4, caractérisê en ce que R 1 -représente le radical dérivé du peptide Pro- Gly protégé sur la terminaison N de Gly par un groupe bloquant. 9 Dérivé de peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce que Le groupe bloquant est le groupe benzyloxycarbonyle. Dérivé de peptide selon l'une quelcon- que des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que R 7 représente OR 8 avec R 8 représentant un atome de sodium et R 3 représente un atome de sodium. 11 Dériv 4 de peptides selon l'une quelcon- que des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que R 1 et R 7 forment ensemble le radical bivalent Pro-gly. 12 Proc 4 déde préparation d'un dérivé de peptide répondant à la formule: O R 6 i Il 4 7 R 1 NH-CH-P-CH 2-CH 2-CO-R -N-CH-CO-R (I) 23 R R OR dans laquelle R 1 est un groupe capable de bloquer la terminaison N d'un alpha-aminoacide, R 2, R 3, R 4, R 5 et R 6 ont la signification donnée dans la revendication 1, et R 7 représente OR 8 avec R 8 identique à R 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) faire réagir un aldéhyde de formule R 2-CHO dans laquelle R 2 a la signification donnée ci- dessus avec du diphényl amrinohypophosphite pour obtenir un acide diphénylméthylaminoalkylphosphinique de formule: C 6 H O O OH CH-NH-CH-P (II) C 6 H 5 R H b) faire réagir l'acide diphénylméthylami- noalkylphosphinique de formule (II) avec un hydracide ha Logénè de formule HX dans laquelle X est un atome d'halogène, pour obtenir un acide aminoalkylphosphi- nique de formule: O OH il e-' (III) NH 2-CH-P 2 R 2' H R H c) protéger la terminaison N de l'acide aminoalkylphosphinique de formule (III) par le groupe bloquant R 1 pour obtenir l'acide aminoalkyl- phosphinique de formule: O OH R -NH-CH-P (IV) R H d) faire réagir l'acide de formule (IV) avec un acrylate d'alkyle de formule: CH 2 =CH-COOR 9 dans laquelle R 9 est un radical alkyle pour obtenir le composé de formule: 1 iil 9 R -NH-CH-P-CH 2-CH 2-COOR (V) 1 21 2 2 R OH e) saponifier le composé de formule (V) pour obtenir l'acide de formule (VI) R -NH-CH-P-CH 2-CH 2-COOH (VI) R 2 2 OH R OH f) faire réagir l'acide de formule (VI) avec un peptide de formule R 6 4 _ 9 H-R -N-CH-COOR R dans laquelle R 9 est un radical alkyle pour obtenir le peptide de formule (VII) O R 6 R 1 I 4 t -NH-CH-P-CH -CH -CO-R -N-CH-COOR V I 5 R -NH-C 2 HP 22 2 15 g) faire réagir le peptide de formule (VII) avec un halogénure de formule R 3 X dans laquelle R 3a la signification donnée ci-dessus et X est un atome d'halogène pour obtenir le peptide de formule (I). 13 Procédé de préparation d'un dérivé de peptide répondant à la formule: O R 6 R 1 I 4 I 7 R 1-NH-CH-P-CH 2 CH 2-CO-R -N-CH-CO-R(I) 123 ' 5 R OR R dans laquelle R 1 est un radical dérivé d'un acide aminé ou d'un peptide dont la terminaison N est prot 4 gdepar un groupe bloquant, R 2, R 3,R 4, R 5 et R 6 ont la signification donnée dans la revendication 1, et R 7 représente OR 8 avec R 8 identique à R 3, caractéris 4 en ce qu'il comprend les étapes suivan- tes: a') préparer un peptide de formule (VII) en réalisant les étapes a) à f) du procédé de la revendication 12, b') éliminer le groupe protecteur R 1 du peptide de formule (VII) pour obtenir le peptide de formule: O R 6 I 4 I 9 NH 2-CH-P-CH 2-CH -CO-R -N-CH-COOR (VIII) 212 2 25 R OH R c') faire réagir le peptide de formule (VIII) avec un acide aminé ou un peptide dont La terminaison N est protégée par un groupe bloquant et dont la terminaison C est activée par un groupe nitro- phényle, phênyle d') faire réagir le peptide obtenu dans l'étape c') avec un halog 4 nure de formule R 3 X dans laquelle X est un atome d'halogène. 14 Procédé de préparation d'un dérivé de cyclopeptide répondant à la formule: O R 6 Ril 4 I R 10-NH-CH-P-CH 2-CH 2-CO-R -N-CH-CO (Ia) rR OR 3 R dans laquelle R 10 représente un radical bivalent dérivé d'un aminoacide ou d'un peptide, caractérisé en ce qu'il consiste: a") préparer un peptide de formule (VII) en réalisant les étapes a) à f) du procédé de la revendication 12, b") éliminer le groupe protecteur R 1 du peptide de formule (VII) pour obtenir Le peptide de formule: O R 6 I 4 9 NH -CH-P-CH -CH -CO-R -N-CH-COOR (VIII) 2 12 1 2 2 5 R OH R c") faire réagir le peptide de formule (VIII) avec un peptide de formule R 1-R 10-OR 11 dans laquelle R 1 est un groupe bloquant la terminaison N du peptide et R 11 est groupe nitrophény Le, pour obtenir le peptide de formule: O R 6 1 -10 I 4 _ I 9 R -R -NH-CH-P-CH 2-CH 2-CO-R N-CH-COOR (IX) R OR R d") faire réagir le peptide de formule (IX) avec l'hydrazine pour obtenir l'hydrazide de formule: o R 6 R 1-R 10 NH-CH-P- CH 2-CH 2-CO-R 4-N-CH-CO-NH-NH 2 (x) 1 3 R 5 R OR R e") -déprotéger l'hydrazide de formule (X) pour obtenir l'hydrazide de formule: O R 6 CO 4 _t_CH-C-NH-NH 2 (XI) H-R 1 NH-CH-P-CH-CO-NH-NH 2 (XI) 12 R 5 R OR R f") cycliser l'hydrazide de formule (XI) pour obtenir Le cyc Lopeptide de formu Le: O R 6 I 14 R 10-NH-CH-P-CH -CH -CO-R -N-CH-CO (Ia) I 2 32 2 1 R OR R 5 Composition pharmaceutique, caract 4 ri- s 4 e en ce qu'elle comprend une quantité pharmaceuti- quement efficace d'un dérivé de peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 avec R 3 repré- sentant un atome d'hydrogène ou de mêtal.