Brevet FR2675384A1 — publié le 19921023

L'invention concerne des compositions pharmaceutiques contenant les complexes de l'acide polyadenylique avec l'acide polyuridylique associés avec un agent anti-sida (Syndrome de l'rmmuno Déficience Acquise), destinées au traitement du Sida. Le brevet français N 2 622 586 décrit un procédé de préparation d'homopolymères et copolymères de polynucléotides et de leurs complexes Bien que ces composés ne soient pas nouveaux, les procédés antérieurs n'étaient pas capables de fournir de tels complexes à un coût économiquement acceptable et sans impuretés toxiques ce qui les rendaient inappropriés pour un usage pharmacologique Le procédé, décrit dans le brevet français ci-dessus, conduit à des produits d'une pureté suffisante pour un usage pharmacologique et nommément décrits pour le traitement des tumeurs. Le complexe du Poly(A) Poly(U) a été décrit comme un agent anti-viral peu actif sur des souches de virus différentes de celles des rétrovirus responsables du Sida (cf "Effects of polynucleotides on monkeys and man", CLINICAL ASPECTS OF INTERFERONS, 1988, pages 319-331); par conséquent, il n'était pas évident que le Poly(A) Poly(U) puisse être un agent anti-rétroviral, les virus et rétrovirus étant considérés comme des espèces distinctes. Selon l'invention, il a été prouvé que le complexe Poly(A) Poly(U) est aussi un agent inhibiteur puissant des différents Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIII) dans les cultures cellulaires, en bloquant l'entrée du virus Il a été aussi prouvé que le complexe Poly(A) Poly(U) est efficace lorsqu'il est administré avec d'autres agents anti- Sida, tels que la 3 '-azido-3 '-déoxythymidine (AZT), la Didéoxyinosine (DDI) ou la Didéoxycytidine (DDC), car il accroît de façon synergique l'effet de ces derniers En conséquence, l'invention concerne une composition thérapeutique dont le principe actif contient du Poly(A) Poly(U) associé avec un autre agent anti-Sida De préférence, le Poly(A) Poly(U) est préparé selon le procédé décrit dans le brevet français N 2 622 586. -2- En conséquence, cette invention concerne une composition thérapeutique pour le traitement du Syndrome de l'Immuno Déficience Acquise (Sida) et les affections similaires, ladite composition comportant un principe actif associé à des diluants ou excipients pharmacologiquement acceptables, caractérisée en ce que la composition du principe actif comprend de 90 à 99,99 % du complexe Poly(A) Poly(U) et de 10 à 0,01 % d'un autre agent anti-Sida agissant sur le virus VIH selon un mécanisme différent de celui du complexe Poly(A) Poly(U) De préférence, la composition du principe actif comprend de 99, 00 à 99,99 % du complexe Poly(A) Poly(U) et de 1,00 à 0,01 % d'un autre agent anti-Sida. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'autre agent anti-Sida agissant sur le virus VIH, est choisi parmi l'AZT, la DDI ou la DDC. L'intérêt du Poly(A) Poly(U) dans le traitement du Sida, ressort clairement des différentes expériences décrites ci-dessous. CYTOPATHOLOGIE Deux lots de cellules CEM (cellules T riches en récepteurs CD 4), infectées par le virus de l'Immuno Déficience Humaine VIH-1 Bru (Lai) sont traitées avec du Poly(A) Poly(U), 24 heures après l'infection Deux lots similaires de cellules CEM infectées par le VIIHI, sont utilisées comme contrôle et non traitées Les cultures cellulaires sont régulièrement inspectées sous microscope, afin d'observer l'évolution des effets cytopathiques (fusion de cellules et formation de Syncitia), résultant de l'action du VIH. Le protocole expérimental est le suivant: 5 x 106 cellules CEM sont incubées avec 1 ml de surnageant contenant du VIH, avec une reverse transcriptase d'une activité de 1,0 x 106 cpm Une heure plus tard, les cellules sont centrifugées et le résidu cellulaire ( 0,5 x 106 cellules) est mis en suspension dans un milieu RM Pl contenant 10 % de sérum foetal et 2 ltg/ml de polybrène 24 heures plus tard, le Poly(A) Poly(U) est ajouté à une concentration de 200 p g/ml Les cultures cellulaires sont ainsi maintenues sans ajout de Poly(A) Poly(U). Les résultats sont les suivants: Jour 6 Jour 7 Jour 8 Jour 11 Contrôles ++ ++++ ++++ cellules mortes Cellules traitées + + ++ Le symbole "+ " indique l'apparition des effets cytopathiques; le nombre de ces symboles utilisés est une quantification approximative Ces résultats montrent que les effets cytopathiques sont réduits de façon significative par le traitement. Les cultures sont préparées comme décrit ci-dessus et, pendant la nuit du jour 7 à 8, elles sont incubées avec de la 35 S-méthionine, pour une analyse électrophorétique du SDS des protéines virales synthétisées à la fois dans la masse cellulaire et dans le surnageant Ces résultats sont présentés sur le dessin annexé Sur ce dessin, "-" indique un échantillon de contrôle non traité et "+" un échantillon de culture traitée avec du Poly(A) Poly(U) Les identificateurs sur la droite des taches sont les suivants: gp 120 la protéine de l'enveloppe p 68 la reverse transcriptase p 55 le précurseur de la protéine du noyau p 40 le précurseur de la protéine du noyau, partiellement clivée p 32 l'endonucléase p 25 la protéine principale du noyau Les résultats montrent une réduction presque totale de la présence de protéines virales dans les cellules et les surnageants de cultures traitées avec le Poly(A) Poly(U). La quantité d'antigènes p 24/p 25 dans le surnageant, est mesurée 8 jours après l'infection, au moyen du test ELISA. Cellules traitées Contrôles 1,01 4 g/ml 0,03 gtg/ml 1, 27 gg/ml 0,07 gg/ml -4- Ceci montre une suppression de 96,5 % de la production de VIH dans les cultures traitées avec le Poly(A) Poly(U). L'action du Poly(A) Poly(U) sur l'inhibition de la production de VIH dans des cellules en culture, a été confirmée par les expériences ci-après. 1 Effets de la variation de la dose de Poly(A) Poly(U): Les cellules CEM sont infectées par le VIH 24 heures plus tard, différentes concentrations de Poly(A) Poly(U) sont ajoutées La production de virus dans le surnageant de cultures, est déterminée au jour 5 après l'infection, en quantifiant la quantité d'antigènes p 24/p 25 présents Les cellules utilisées comme contrôles et qui ont été infectées mais non traitées par le Poly(A) Poly(U), éclatent. Les résultats obtenus sont les suivants: Poly(A) Poly(U) p 24/p 25 (g/ml) ( 9 g/m D) O 1,10 0,53 0,14 0,10 0,07 2 Effets de traitement répété: Le mode opératoire est identique à celui décrit dans la première expérience, mais l'addition de Poly(A) Poly(U) se fait à une concentration de 200 lg/ml, 24 heures et 96 heures après l'infection Un contrôle, non traité, est également conservé; comme précédemment, les cellules du contrôle se détruisent au jour 5. La concentration (lxg/ml) de p 24/p 25, aux jours 4, 5, 6 et 7 après infection, est mesurée sur le contrôle non traité et sur les cellules traitées aux jours 1 et 4. Les résultats obtenus sont les suivants: -5- p 24/p 25 (gg/ml) Jour 4 Jour 5 Jour 6 Jour 7 Contrôles 0,72 1,25 Cellules traitées0,05 0,10 0,20 0,26 3 L' effet du Poly(A) Poly(U) se fait lors de la première étape de l'infection virale: Les cellules, infectées par le VIH, sont traitées avec 200 lxg/ml de Poly(A) Poly(U) à différents moments, avant, pendant, et après l'infection du VIH Au jour 6 après l'infection, le nombre de Syncitia est compté Au jour 7, le niveau de p 25 dans le milieu de culture, est mesuré. Poly(A) Po Iy(U) Syncitia (%) p 25 (ng/ml) Témoin (non traité) 90 1320 Cellules traitées: 3 jours avant 85 1215 2 jours avant 72 965 1 jour avant 45 280 1 heure avant ETUDE DE L'EMPLOI DU POLY(A) POLY(U) AVEC L'AZT: Les cellules sont infectées par le VIH, 24 heures avant un unique traitement: (a) de Poly(A) Poly(U) seul, à une concentration de 100 gg/ml; (b) d'AZT seul, aux différentes concentrations de 100, 250, 1000, 5000 et 10 000 ng/ml ( 5 échantillons); (c) d'AZT aux différentes concentrations de 100, 250, 1000, 5000 et 10 000 ng/ml, chacune avec une concentration de Poly(A) Poly(U) de 100 gg/ml ( 5 échantillons). -6- De plus, un témoin, non traité, sert de référence; la culture cellulaire du contrôle meurt progressivement après le jour 7 ce qui explique qu'aucune valeur n'apparaisse dans les colonnes des jours 12 et 14. Le niveau de l'antigène p 25 dans les surnageants, est mesuré aux jours 7, 12 et 14 après infection Les résultats, exprimés en gg/ml, sont les suivants: Jour 7 p 25 Jour 12 Jour 14 Témoin 1250 Poly(A) Poly(U) 135 980 1200 AZT 100 38 380 1200 AZT 100 16 75 900 Poly(A) Poly(U) AZT 250 18 170 1200 AZT 250 5 40 840 Poly(A) Poly(U) 100 AZT 1000 AZT 1000 Poly(A) Poly(U) 100 AZT 5000 AZT 5000 Poly(A) Poly(UJ) 100 AZT 10 000 AZT 10 000 Poly(A) Poly(UJ) 100 Les résultats montrent que l'association AZT/Poly(A) Poly(U) est plus efficace que l'un d'eux pris séparément En effet, le Poly(A) Poly(U) présente un effet inhibiteur sur le VIH Ceci a été montré par les tests ci-dessous: A: la synthèse métabolique des protéines virales dans les cellules infectées B: l'activité de la reverse transcriptase dans le milieu de culture des cellules infectées C: la quantité de la protéine principale du noyau p 25 du VIH dans le milieu de culture des cellules infectées D: la fusion de cellules -7- L'action inhibitrice du Poly(A) Poly(U) sur différents types et isolats du VIH: Dans toutes les expériences présentées ci-dessus, on a utilisé l'isolat VIH-1 Bru Lai Afinm de prouver que l'action inhibitrice du Poly(A) Poly(U) ne se limite pas à la seule espèce VIH-1 utilisée ci- dessus, d'autres espèces de VIH-1 telles que ELI ( 31) et deux espèces différentes du VIH-2, ROD et EHO, ont été testées Le Poly(A) Poly(UJ), ajouté 6 heures avant l'infestation de cellules CEM avec ces virus, conduit à plus de 90 % d'inhibition de la production virale, ce qui prouve que l'action démontrée s'applique à toutes les espèces de VIH actuellement connues. Ces expérimentations démontrent une puissante action anti-rétrovirale Il apparaît que le Poly(A) Poly(U) semble agir au niveau de la pénétration du virus dans la cellule, alors que l'AZT agit au niveau de la transcription intra-cellulaire Utiliser le traitement combinant le Poly(A) Poly(U) avec un autre agent anti-retroviral donne de bien meilleurs résultats que chacun d'eux seul et même que l'addition des activités de chacun d'eux aux mêmes doses. Présentation Posologie: Dans tous ces tests, le Poly(A) Poly(U), à la dose de 200 gg/ml, exerce une action inhibitrice qui peut être estimée entre 85 et 90 % Pour une injection unique chez l'homme, une quantité de 100 à 4000 mg de Poly(A) Poly(U) associé de 0,01 à 40 mg d'un autre agent anti-Sida tel que l'AZT, la DDI et la DDC, est souhaitable; des doses, injectées chez l'homme, peuvent être efficaces entre 150 et 1000 mg L'effet maximal est obtenu par un traitement administré le plus proche possible de l'infestation, mais un traitement avant ou après l'infestation est également efficace Le traitement peut être répété à des intervalles de 3 à 5 jours L'administration se fait par injection I V des principes actifs dissous en milieu aqueux. Pour la préparation de la solution à injecter, il est prévu, de préférence, de dissoudre de 0,2 à 1,0 g de principe actif dans 100 ml de milieu aqueux La composition d'une solution aqueuse prête à l'emploi, pourrait être conforme à ce qui est décrit ci- après. -8- Na H 2 PO 4-H 20 0,100 g Na Ci 0, 068 g Na OH pour neutraliser (p H 7) H 20 q s ppour 100 ml Dans 100 ml de solution aqueuse, les constituants suivants sont dissous: Poly(A) Poly(U) 0,400 g + AZT + 0,004 g Mannitol 1,84 g Na Ci 0, 48 g Pour administrer 150 mg de Poly(A) Poly(U) associé à 1,5 mg d'AZT, il suffira d'injecter 37,5 ml de solution aqueuse telle que décrite ci-dessus. REVENDICATIONS 1 Composition thérapeutique pour le traitement du Syndrome de l'Immuno Déficience Acquise (Sida) et les affections similaires, ladite composition comportant un principe actif associé à des diluants ou excipients pharmacologiquement acceptables, caractérisée en ce que la composition du principe actif comprend de 90 à 99,99 % du complexe Poly(A) Poly(U) et de 10 à 0,01 % d'un autre agent anti-Sida agissant sur le virus VIH selon un mécanisme différent de celui du complexe Poly(A) Poly(U). 2 Composition thérapeutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition du principe actif comprend de 99,00 à 99,99 % du complexe Poly(A) Poly(U) et de 1,00 à 0,01 % d'un autre agent anti-Sida. 3 Composition thérapeutique selon les revendications let 2, dans laquelle l'agent anti- Sida agissant sur le virus VIH selon un mécanisme différent de celui du complexe Poly(A) Poly(U), est choisi parmi la 3 '-azido-3 'déoxythymidine (AZT), la Didéoxyinosine (DDI) ou la Didéoxycytidine (DDC).