Brevet FR2674537A1 — publié le 19921002

Protéine à activité de type cytokine, ADN recombinant codant pour cette protéine, cellules animales transformées. La présente invention a pour objet une nouvelle protéine, les outils de génie génétique pour la produire, à savoir un ADN recombinant, un vecteur d'expression portant cet ADN recombinant, les micro-organismes procaryotes et les cellules eucaryotes contenant cet ADN recombinant ainsi qu'un médicament, utile notamment comme anticancéreux ou immunomodulateur, contenant à titre de principe actif cette protéine Il est bien connu que le système immunitaire comprend des éléments cellulaires et des protéines solubles sécrétées par ces derniers, appelées cytokines. Celles-ci sont des protéines qui assurent la communication entre une cellule émettrice et une cellule cible appartenant soit au système immunitaire, soit à un autre système biologique de l'organisme.Les cytokines ont en général une activité biologique dite pléitropique : elles peuvent avoir de multiples actions sur la cellule cible : prolifération, différenciation, cytolyse, activation, chimiotactisme, etc... Plusieurs de ces molécules ont déjà trouvé des applications en thérapeutique : par exemple, l'interleukine-2 ou l'interféron- utilisés pour le traitement de certaines tumeurs par immunothérapie et les facteurs myélopoëtiques tels que le GCSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) ou le GMCSF (Granulocyte Monocyte Colony Stimulating Factor) qui stimulent la croissance et la différenciation des cellules sanguines et permettent ainsi L'enrichissement en ces dernières du sang appauvri en celles-ci, suite, par exemple, à une chimiothérapie. On a notamment les connaissances suivantes à propos des cytokines : 1) Celles-ci correspondent à des protéines sécrétées. La sécrétion d'une protéine, donc en particulier d'une cytokine, s'effectue le plus souvent par un mécanisme qui comprend le clivage d'une région aminoterminale hydrophobe de la protéine traduite, appelée séquence peptidique pré ou peptide signal, lors de l'excré- tion de la protéine mature dans le milieu (Von Heijne G. 1986, Nucl. Ac. Res., 14, 4683-4690). La plupart des séquences peptidiques des cytokines connues comprennent effectivement un peptide signal. 2) Les cytokines correspondent en général à des protéines inductibles, soit par d'autres cytokines (K. Matsushima et al., 1988, J. Exp. Med., 167, 1883-1893 - Shimizu H. et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 561-568), soit par des agents chimiques activateurs de la prolifération et de la différenciation cellulaire teLs que les lipopolysaccharides, les ionophores calciques par exemple la calimicine, le dibutyryl AMP cyclique, Le diméthylsulfoxyde, L'acide rétino7que, la concanavaline A, la phytohémaglutidine (PHA-P) et les esters de phorbol, par exemple le phorbol myristate2 acétate-3 (PMA) (Muegge K. et Durun S.K. 1990 Cytokine 2, 1-8 C.B. Thompson et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 1333-1337), soit par des anticorps contre Les molécules de surface, tels que les antigènes de surface CD2, CD3, CD28 et CD40 (Thomson C.B. et al., référence ci-dessus et Rousset F. et al., 1991, J. Exp. Med., 173, 703-710). 3) L'induction des cyokines étant transitoire, les ARN messagers des cytokines sont instables. Ils possèdent pour la plu- part des cytokines la séquence AUUUA, séquence d'instabilité consensus mise en évidence par D. Caput et al., 1986, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 83, 1670-1670 ; G. Shaw et al., 1986, Cell, 46 659-667 ainsi que K. Peppel et al., 1991, J. Exp. Med., 173, 349-355. 4) La grande majorité des cytokines connues sont synthétisées par les cellules du système immunitaire, notamment par les monocytes et les lymphocytes T auxiliaires du sang périphérique (Ullman K.S. et al., 1989, Ann. Rev. Imm., 8, 421-452 et L'ouvrage "Macrophage derived cell regulatory factors" de C. Sorg, pub lié en 1989 par Karger-Bâle-Suisse). Leur synthèse est induite par les agents inducteurs mentionnés en 2). IL est connu par ailleurs qu'on est capable de construire à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique, constituées principalement de lymphocytes et de monocytes, cultivées et stimulées à L'aide de différents agents inducteurs tels que la phytohémaglutinine, le phorbol myristate-2 acétate-3 et L'anticorps monoclonal anti-CD2, une banque d'ADN complémentaire soustraite des séquences d'ADN complémentaire ubiquitaires dans les cellules animales, et donc enrichie en ADN complémentaire codant pour des cytokines (H.C. Chang et al., 1989, 19, 1045-1051, P.F. Zipfel et al., 1989, Mol. Cell. Biol, 9, 1041-1048). On sait d'autre part que la production de cytokines (appelées lymphokines) par Les lymphocytes T est plus importante, donc correspond à des quantités d'ARN messagers plus grands, avec une stimulation à L'aide de la combinaison binaire : phorbol myristate-2 acétate-3 et phytohémaglutinine ou phorbol myristate-2 acétate-3 et l'anticorps anti-CD28 qu'avec le phorbol myristate-2 acétate-3 uniquement et avec la combinaison binaire : phorbol myristate-2 acétate-3 et phytohémaglutinine qu'avec la combinaison tertiaire : phorbol myristate-2 acétate-3, phytohémaglutinine et cyclosporine A, la cyclosporine A ayant apparemment un effet inhibiteur sur la transcription des ARN messagers des cytokines (Thompson et al., 1989, Proc. Ntl. Acad. Sci., 86, 1333-1337 et Lindsten T. et al., 1989, Science, 244, 339 et Mattila et al., 1990, EMBO J., 9, 4425-4433). Cette expression différentielle des ARN messagers des cytokines dans différentes conditions de stimulation peut servir à un criblage, appelé criblage différentiel, d'une banque d'ADN com plémentaire contenant des séquences codant pour des cytokines dans Le but de sélectionner ces dernières séquences (cf. notamment Dworkin et al., 1980, Dev. Biol., 76, 449-464, Cochran B.M. et al., 1983, Cell, 33, 939-947 et Zipfel P.F. et al., 1989, Mol. Cell. Biol.,9, 1041-1048). Il est en effet possible de construire à pa-rtir de deux ARN messagers correspondant à deux états de stimulation des ceLLuLes, appelés ici état de stimulation 1 et état de stimulation 2, L'état de stimulation 2 étant supposé plus riche en ARN messagers codant pour une cytokine que L'état 1, deux sondes radioactives appelées respectivement sonde 1 et sonde 2, qui sont des transcripts obtenus à L'aide de la transcriptase inverse de ces deux ARN messagers.On hybride ces deux sondes avec des colonies bactériennes contenant des séquences d'ADN complémentaire de labanque. Les colonies bactériennes contenant un ADN complémentaire dont L'ARN messager change d'abondance entre Les deux états d'activation vont donner des signaux différentiels avec les deux sondes, L'hybridation étant plus importante pour les clones retenus (qui correspondent à des protéines inductibles) pour la sonde 2 que pous la sonde 1. IL est connu par ailleurs que tes cellules COS, cellules de reins de singe exprimant l'antigène T du virus SV40 (Gluzman, Y. Cell, 23, 1981, 175-182), qui permettent la réplication des vecteurs contenant L'origine de réplication de L'ADN du virus SV40, constituent des hotes de choix pour L'étude de L'expression de gènes dans les cellules animales et de la sécrétion des protéines exprimées. La sécrétion d'une protéine dans ces cellules indique que celle-ci est sécrétée par la cellule qui la produit naturellement (H.C. Chang et al., 1989, 19, 1045-1051 et W.Y. Weiser et al., 1989, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 86, 7522-7526). La présente invention a pour objet une protéine à activité de type cytokine, caractérisée en ce qu'elle comprend une sous-séquence d'au moins 69 acides aminés de L'une des séquences d'acides aminés (a1), (a2) ou (a3) ci-après : (al) Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Asp Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn (a2) Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Asp Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly GLn Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn (a3) :: Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn GLn Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Asp Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn ou d'une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec les séquences (a1), (a2) ou (a3). Cette sous-séquence d'au moins 69 acides aminés peut provenir d'un clivage carboxy - et/ou amino - terminal de L'une des séquences (a1), (a2) ou (a3) ou d'une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec L'une des séquences (a1), (a2) ou (a3). Elle peut aussi être L'une des séquences (a1), (a2) ou (a3) ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec L'une des séquences (a1), (a2) ou (a3). Un degré d'homologie élevé signifie ici une homologie d'identité (rapport entre les acides aminés identiques et le nombre total d'acides aminés) d'au moins 80%, et de préférence d'au moins 90%, des séquences d'acides aminés, lorsqu'elles sont alignées d'-apres l'homologie maximale, selon La méthode d'alignement optimal des séquences de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443-453. Cette méthode algorithmique, qui considère tous Les ali- gnements possibles et crée un alignement dans lequel le plus possi ble d'acides aminés identiques sont appariés et le nombre de trous dans les séquences alignées est minimal, est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université de Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8722 - option GAP. La séquence peptidique déjà connue la plus proche de celle de la séquence (a3) de 114 acides aminés est celle de 132 acides aminés déduite de L'ADNc de la protéine P600 de souris, exprimée dans une sous-classe de lymphocytes T de souris : Les cellules Th2 activées à L'aide de la concanavaline A (K.D. Brown et ail., 1989, J. Imm., 142, 679-687). Une comparaison de ces séquences peptidiques à L'aide de la méthode de Needleman et Wunsch, (cf. figure 3) montre que 64 acides aminés sont identiques sur 114, soit une homologie d'identité d'environ 56%. La protéine de la présente invention est une protéine sécrétée notamment par les lymphocytes T et inductible dans ces derniers par le phorbol myristate-2 acétate-3, cette induction étant - comme attendu pour une cytokine (v. texte ci-dessus) amplifiée par la phytohémaglutinine ou l'anticorps monoclonal CD28 avec un effet inhibiteur de cette augmentation dans le cas de la stimulation par la phytohémaglutanine en présence suppLémentaire de cyclosporine A. Elle possède une activité de type cytokine et peut être utile notamment en cancérologie ainsi que dans le traitement par immunomodulation de certains états infectieux. Cette protéine est de préférence sous une forme qui a une masse moléculaire apparente, déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS de 9,0 + 1,5 ou 17,0 + 1,5 kDa. Lorsqu'elle est sous une forme de masse moléculaire de 17,0 + 1,5 kDa, elle est avantageusement n-glycosylée. L'invention a aussi pour objet un ADN recombinant caractérisé en ce qu'il code pour La protéine à activité de type cytokine définie précédemment. L'ADN complémentaire correspondant à cette protéine a été isolé à partir d'une banque d'ADN complémentaire construite à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique humain stimulées à L'aide de phytohémaglutinine et de phorbolmyristate-2 acétate-3, soustraite des séquences d'ADN complémentaire des cellules COS non stimulées, cette banque d'ADN complémentaire ayant une richesse d'au moins 10% en clones qui renferment un ADN complémentaire codant pour une cytokine déjà connue, par criblage différentiel à L'aide de quatre sondes construites à partir des ARN messagers correspondant aux états suivants de stimulation des cellules mononucléaires du sang périphérique : a) en présence de phorbol myristate-2 acétate-3, b) en présence de phorbol myristate2 acétate-3 et de l'anticorps monoclonal CD28, c) en présence de phorbol myristate-2 acétate-3 et de phytohémaglutinine, d) en présence de phorbol myristate-2 acétate-3, de phytohémaglutinine et de cyclosporine A. L'ADN complémentaire isolé comprend une séquence codant pour un peptide signal et la séquence ATTTA correspondant à la séquence d'instabilité consensus des cytokines AUUUA mentionnée ci-dessus. Cet ADN recombinant comporte de préférence, en amont de la séquence codant pour la sous-séquence d'au moins 69 acides aminés de L'une des séquences (a1), (a2) ou (a3) ou d'une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec L'une des séquences (a1), (a2) ou (a3), une séquence signal, choisie en fonction de la cellule hôte, qui a pour fonction de permettre l'exportation de la protéine recombinante en dehors du cytoplasme, ce qui permet à la protéine recombinante de prendre une conformation proche de celle de la protéine naturelle et facilite considérablement sa purification. Cette séquence signal code pour une séquence peptidique qui peut être clivée, soit en une seule étape par une signal-peptidase que Libère la protéine mature, la séquence éLiminée étant habituellement appelée séquence pré ou peptide-signal, soit en plusieurs étapes lorsque cette séquence peptidique comprend en plus de la séquence éliminée par La signal-peptidase, appelée séquence pre, une séquence éliminée plus tardivement au cours d'un ou plusieurs évènements protéolytiques, appelée séquence pro. Dans le cas ou la sous-séquence d'au moins 69 acides aminés est la séquence (a3) ou la séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a3), le peptide signal codé par la séquence signal peut être, soit immédiatement en amont de la séquence (a3) ou de la séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a3), soit en être séparé par un ou plu- sieurs acides aminés, en particulier par la séquence d'acides aminés (C1) suivante Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Pour une expression dans les micro-organismes procaryotes, tels que par exemple Escherichia coli, cette séquence signal peut être, soit une séquence dérivée de la séquence codant pour un précurseur naturel d'une protéine exportée par un microorganisme procaryote (par exemple le peptide signal OmPA CGhrayeb et al. 1984, EMBO Journal, 3, 2437-24427 ou le peptide signal de la phosphatase alcaline EMichaeLis et al., J. Bact., 1983, 154, 366 374), soit une séquence non endogène provenant d'une séquence codant pour un précurseur eucaryote (par exemple le peptide signal de l'un des précurseurs naturels de L'hormone de croissance humaine), soit une séquence codant pour un peptide signal synthétique (par exemple celui décrit dans le demande de brevet français n 2 636 643, de séquence : Met Ala Pro Ser Gly Lys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Pro Ser Trp Asn Ala Gly Ala). Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que les ascomycètes, par exemple La Levure Saccharomyces cerevisiae ou le champignon filamenteux Cryphonectria parasitica, cette séquence signal est de préférence une séquence dérivée d'une séquence codant pour un précurseur naturel d'une protéine sécrétée par ces ceLLuLes, par exemple pour La levure, le précurseur de l'invertase (demande de brevet EP 0 123 289) ou le précurseur de la séquence prépro de la phéromone alpha (demande de brevet DK 2484/84), ou pour Cryphonectria parasitica, le précurseur de la séquence prépro de L'endothiapepsine, de séquence :: Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Val Thr Ala Met Leu Ala Gly Gly Ala Leu Ser Ser Pro Thr Lys Gln His Val Gly Ile Pro Val Asn Ala Ser Pro Glu Val Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gln Val Arg Asn Pro Asn Tyr Lys Phe Asn Gly Pro Leu Ser Val Lys Lys Thr Tyr Leu Lys Tyr Gly Val Pro ILe Pro Ala Trp Leu Glu Asp Ala Val Gln Asn Ser Thr Ser Gly Leu Ala Glu Arg Pour une expression dans les cellules anima Les, on utilise comme séquence signal, soit une séquence signal d'une protéine de cellule anima le connue pour être exportée - par exemple une séquence codant pour le peptide signal de l'un des précurseurs naturels de L'hormone de croissance humaine, déjà connu pour permettre la sécrétion de l'interleukine-2 (cf. la demande de brevet français 2 619 711) -; soit L'une des trois séquences signal explicitées ci-dessous. Une séquence signal appréciée pour une expression dans les cellules anima les est celle qui code pour la séquence d'acides aminés (b1) suivante : Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Cette séquence signal est par exemple la séquence nucléotidique (Nb1) suivante : ATGGCGCTTT TGTTGACCAC GGTCATTGCT CTCACTTGCC TTGGCGGCTT TGCC Une autre séquence signal appréciée pour une expression dans les cellules animales est celle qui code pour la séquence (b2) suivante. Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala par exemple la séquence nucléotidique (Nb2) suivante ATGCATCCGC TCCTCAATCC TCTCCTGTTG GCACTGGGCC TCATGGCGCT TTTGTTGACC ACGGTCATTG CTCTCACTTG CCTTGGCGGC TTTGCC Une autre séquence signal appréciée pour une expression dans tes cellules animales est celle qui code pour la séquence (b3) suivante : Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala par exemple la séquence (Nb3) suivante : ATGCATCCGC TCCTCAATCC TCTCCTGTTG GCACTGGGCC TCATGGCGCT TTTGTTGACC ACGGTCATTG CT La séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a3) est par exemple la séquence (Na1) suivante :: TCCCCAGGCC CTGTGCCTCC CTCTACAGCC CTCAGGGAGC TCATTGAGGA.GCTGGTCAAC ATCACCCAGA ACCAGAAGGC TCCGCTCTGC AATGGCAGCA TGGTATGGAG CATCAACCTG ACAGCTGACA TGTACTGTGC AGCCCTGGAA TCCCTGATCA ACGTGTCAGG CTGCAGTGCC ATCGAGAAGA CCCAGAGGAT GCTGAGCGGA TTCTGCCCGC ACAAGGTCTC AGCTGGGCAG TTTTCCAGCT TGCATGTCCG AGACACCAAA ATCGAGGTGG CCCAGTTTGT AAAGGACCTG CTCTTACATT TAAAGAAACT TTTTCGCGAG GGACGGTTCA AC L'invention concerne également un vecteur d'expression qui porte, avec les moyens nécessaires à son expression, L'ADN recombinant défini précédemment. Pour une expression dans les micro-organismes procaryotes, en particulier dans Escherichia coli, L'ADN recombinant doit être inséré dans un vecteur d'expression comportant notamment un promoteur efficace, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gène à exprimer, ainsi qu'une séquence d'arrêt de transcription efficace en aval du gène à exprimer. Ce plasmide doit également comporter une origine de réplication et un marqueur de sélection. Toutes ces séquences doivent être choisies en fonction de la cellule hôte. Pour une expression dans les cellules eucaryotes, le vecteur d'expression selon l'invention porte L'ADN recombinant défini précédemment avec Les moyens nécessaires à son expression, à sa réplication dans les cellules eucaryotes et à la sélection des cellules transformées. De préférence, ce vecteur porte un marqueur de sélection, choisi par exemple pour complémenter une mutation des cellules eucaryotes réceptrices, qui permet la sélection des cellules qui ont intégré L'ADN recombinant en un nombre de copies élevé soit dans leur génome, soit dans un vecteur multicopie. Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que la levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae, il convient d'insérer L'ADN recombinant entre, d'une part, des séquences reconnues comme promoteur efficace, d'autre part, un terminateur de transcription. L'ensemble promoteur-séquence codante-terminateur, appelé cassette d'expression, est cloné soit dans un vecteur plasmidique monocopie ou polycopie pour la levure, soit intégré en multicopie dans le génome de la levure. Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que celles des champignons filamenteux, du groupe des ascomycètes, par exemple ceux des genres Aspergillus, Neurospora, Podospora, Trichoderma ou Cryphonectria, le vecteur d'expression selon l'in- vention porte L'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression, et éventuellement un marqueur de sélection et/ou des séquences télomériques. Il est en effet possible de sélectionner les transformants ayant intégré un ADN d'intéret à L'aide d'un marqueur de sélection situé soit sur le même vecteur que L'ADN d'intéret, soit sur un autre vecteur, ces deux vecteurs étant alors introduits par cotransformation.L'ADN recombinant de L'invention peut être soit intégré au génome des champignons filamenteux, soit conservé sous forme extrachromosomique grâce àdes séquences permettant La réplication et la partition de cet ADN. Pour une expression dans les cellules anima Les, notamment dans les cellules d'ovaires de hamster chinois CHO, L'ADN recombinant est inséré dans un plasmide (par exemple dérivé du pBR322) comportant deux unités d'expression, une première unité dans laquelle est inséré L'ADN recombinant devant un promoteur efficace (par exemple le promoteur précoce de SV40). La séquence autour de l'ATG d'initiation est de préférence choisie en fonction de la séquence consensus décrite par KOZAK (M. KOZAK (1978) Cell., 15, 1109-1123).Une séquence intronique, par exemple de l'intron de l' -globine de souris, peut etre insérée en amont de L'ADN recombi nant ainsi qu'une séquence comportant un site de polyadénylation, par exemple une séquence de polyadénylation du SV40, en aval du gène recombinant. La deuxième unité d'expression comporte un marqueur de sélection, par exemple une séquence d'ADN codant pour la dihydrofolate réductase (enzyme ci-après abrégée DHFR). Le plasmide est transfecté dans les cellules anima Les, par exemple les cellules CHO DHFR (incapables d'exprimer la DHFR).Une lignée est sélectionnée pour sa résistance au méthotréxate : elle a intégré dans son génome un nombre élevé de copies de L'ADN recombinant et exprime ce dernier à un niveau élevé. L'invention a également trait aux micro-organismes procaryotes qui sont transformés par le vecteur d'expression défini précédemment et aux cellules eucaryotes qui contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, L'ADN recombinant défini précédemment. Celui-ci peut avoir été introduit par transformation par le vecteur d'expression précédemment ou par L'ADN recombinant de L'invention lui-même, lequel peut parfois etre intégré directement au génome en un locus qui permet son expression. Des cellules eucaryotes avantageuses sont les cellules anima Les. L'ADN recombinant peut, par exemple, avoir été introduit dans les cellules par transfection par Le vecteur d'expression cidessus, par infection au moyen d'un virus ou d'un rétro-virus Le portant, ou par micro-injection. L'invention se rapporte également à la protéine recombinante à activite de type cytokine susceptible d'être obtenue par un procédé qui comprend une étape de culture de ces cellules anima Les, suivie de l'isolement et de la purification de la protéine recombinante. L'invention a donc également pour objet le médicament, utile notamment en cancérologie et dans le traitement de certains états infectieux, au cours desquels les défenses immunitaires sont affaiblies, suite par exemple à la présence de certains parasites (par exemple la leishmaniose, la lèpre ou la maladie de Chagas), qui contient comme principe actif la protéine définie précédemment dans un excipient pharmaceutiquement acceptable. Ceux-ci peuvent être utilisés seuls ou en association avec d'autre agents actifs : par exemple une ou plusieurs autres cytokines. L'invention sera mieux comprise à L'aide de L'exposé ciaprès, divisé en sections, qui comprend des résultats expérimentaux et une discussion de ceux-ci. Certaines de ces sections concernent des expériences effectuées dans le but de réaliser l'invention, d'autres des exemples de réalisation de L'invention donnés bien sûr à titre purement illustratif. Une grande partie de l'ensemble des techniques décrites dans ces sections, bien connues de L'homme de l'art, est exposée en détail dans L'ouvrage de Sambrook Fritsch et Maniatis : "Molecular cloning : a Laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York (2ème édition). La description ci-après sera mieux comprise à L'aide des figures 1 à 4. La figure 1 représente une carte d'assemblage du plasmide pSE1, plasmide de clonage dans E. coli et d'expression dans Les cellules animales, les sites ayant disparu par ligation étant notés entre parenthèses. Les symboles utilisés dans cette figure seront précisés lors de la description de ce plasmide (section 2). La figure 2 représente la séquence nucléotidique de L'ADNc NC30 et en vis-à-vis la séquence d'acides aminés déduite, les deux Met susceptibles d'initier la traduction étant soulignés, les deux sites de clivage probables du peptide signal étant indiqués par deux flèches verticales et les quatre sites possibles de N-glycosylation étant soulignés en pointillé. La figure 3 et la figure 4 représentent respectivement l'alignement d'après l'homologie maxima le selon la méthode de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443-453 de la séquence d'acides aminés déduite de L'ADNc NC30 (ligne supérieure) et de la séquence déduite de L'ADNc de la protéine P600 de souris (ligne inférieure) et l'alignement selon cette méthode de la partie codant de L'ADNc NC30 (Ligne supérieure) et de L'ADNc de la protéine P600 (ligne inférieure). SECTION 1 : CuLture et stimulation à L'aide de PMA et PHA-P des celLuLes mononucléaires du sang périphérique. Prépa ration de C'ARN messager utilisé pour faire La banque d'ADN complémentaire 1) Culture et stimulation des cellules mononucléaires du sang périphérique : A partir de poches de sang périphérique (prélevées sur trois volontaires sains dans un centre de transfusion sanguine), ayant préalablement subi une cytaphérèse et un gradient de Ficoll (Gauchat et al., 1989, Eur. J.Imm. 19, 1079) on prélève une fraction de cellules enrichie en cellules mononucléaires du sang périphérique PBMNC (peripheral blood mononuclear cells) de composition approximative suivante : 70% de lymphocytes, 25% de monocytes et 5% de granulocytes (comptage des cellules à L'aide du compteur de cellules Coulter-Modèle S-Plus IV). les cellules sont recueillies dans un flacon de 250 ml, puis centrifugées à 1 500 tr/min pendant 10 min à 37 C. Le surnageant est éliminé et le culot de cellules est rincé avec 50 ml de milieu à base de glucose, sels minéraux, acides aminés et vitamines, appelé milieu RPMI (milieu RPMI 1640 de Gibco BRL), puis de nouveau centrifugé dans les mêmes conditions. Le culot de cellules est alors repris avec 500 ml du milieu RPMI complété avec 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRLréf. 013-06290H), additionné de 10 unités de pénicilline et de 10 jjg de streptomycine (solution de pénicilline/streptomycine de Gibco réf. 043-05140D) par ml de milieu ainsi que de L-glutamine (Gibco BRL-réf. 043-05030D) jusqu'à 2 mM final. Une partie de la suspension cellulaire est répartie en vue de la séparation des cellules adhérentes et des cellules non adhérentes, à raison d'environ 100 ml par boute, dans quatre grandes boutes de culture carrées (245 x 245 x 20 mm-Nunc - réf. 166508) et incubée pendant 1 h à 370C. On sait en effet que la plupart des cellules monocytaires adhèrent à la boite de culture tandis que La plupart des cellules lymphocytaires restent en suspension. Les cellules non adhérentes sont aspirées à t'aide d'une pipette et cultivées dans des flacons de culture du type Falcon de 2 surface 175 cm en présence de milieu RPMI complété comme décrit ci-dessus, additionné de 10 ng/ml de phorbol myristate-2 acétate-3 (PMA) (Sigma-réf. P8139) et de 5 ,ug/ml de phytohemaglutinine (PHA-P) (Sigma-réf. L8754), à 370C en présence de 5% de C02 pendant 24 h. Sur les cellules adhérentes on rajoute 100 ml de milieu RPMI complété comme décrit ci-dessus additionné de 10 ng/ml de PMA et de 5 ,ug/ml de PHA-P. Les cellules sont incubées à 370C en présence de 5% (v/v) de C02 pendant 5 h. Le reste de la suspension cellulaire, appelé ci-après les cellules totales, est réparti dans quatre bottes de culture carrées et incubé en présence de milieu RPMI complété comme décrit cidessus, additionné de 10 ng/ml de PMA et 5 g/ml de PHA-P à 37 C en présence de 5% (v/v) de C02 pendant 5 h pour les deux premières boites et 24 h pour les deux autres. 2 h avant la fin de L'incubation on ajoute dans le milieu de culture de ces différentes cellules 10 ,ug/ml de cycloheximide (Sigma-réf. C6255) (inhibiteur de traduction qui augmente la stabilité des ARN des cytokines : cf. Lindsten et al., 1989, Science 244, 339) et L'incubation est poursuivie pendant 2 h à 370C. 2) Préparation de L'ARN messager : a) Extraction de l'ARN messager Les cellules sont récupérées de la façon suivante : - les cellules adhérentes sont lavées 2 fois avec du tampon PBS (Phosphate buffered saline) puis grattées avec un grattoir en caoutchouc et centrifugées. On obtient ainsi un culot cellulaire appelé culot A ; - pour les cellules non adhérentes, après agitation du flacon contenant la suspension des ceLLuLes, la suspension cellu Laire est prélevée et centrifugée. On obtient ainsi un culot cellulaire appelé culot cellulaire NA ; - pour les cellules totales, La fraction adhérente est lavée deux fois avec du tampon PBS et grattée comme précédemment puis centrifugée. La fraction non adhérente est centrifugée.Les deux culots cellulaires obtenus seront réunis par la suite. Leur réunion est appelée culot cellulaire T (5 h) pour les cellules totales incubées pendant 5 h et T (24 h) pour les cellules totales incubées pendant 24 h. Les culots cellulaires A, NA, T (5 h) et T (24 h) sont congelés et conservés à -800C. Chaque culot cellulaire congelé est mis en suspension dans Le tampon de lyse de composition suivante : guanidine-thiocyanate 5 M ; tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane 50 mM pH 7,5 EDTA 10 mM. La suspension est soniquée à L'aide d'un sonicateur Ultra o Turax n 231 256 (Janke et Kunkel) à puissance maxima le pendant quatre cycles de 20 s. On ajoute du -mercaptoéthanol jusqu'à 0,2 M et on refait un cycle de sonication de 30 s. On ajoute du chlorure de lithium jusqu'à 3 M. On refroidit la suspension à 4 C et on la laisse reposer à cette température pendant 48 h. L'ARN est ensuite isolé par centrifugation à 9 000 tr/min pendant 60 min.Le culot d'ARN est Lavé une fois avec une solution de chlorure de lithium 3 M, recentrifugé, puis repris dans un tampon de composition suivante : SDS 1%, EDTA 5 mM et Tris HCL 10 mM pH 7,5, additionné de 1 mg/ml de protéinase K (Boehringer Mannheim, GmbH). Après incubation à 40 C pendant 1 h la solution d'ARN est extraite avec un mélange phénol/chloroforme. On précipite à -200C L'ARN contenu dans la phase aqueuse à L'aide d'une solution d'acétate d'ammonium 0,3 M final et 2,5 volumes d'éthanol. On centrifuge à 15 000 g pendant 30 min et on garde le culot. b) Purification de la fraction poly A de L'ARN Le culot est repris dans 1 ml de tampon de composition Tris 10 mM pH 7,5 EDTA 1 mM, appelé tampon TE et mis en suspension par agitation au vortex. L'oligo dT-cellulose type 3 (commercialisé par Collaborative Research Inc, Biomedicals Product Division) est préparé suivant les recommandations du fabricant. L'ARN est déposé sur L'oligo dT-cellulose, agité doucement pour mettre en suspension les billes, puis chauffé pendant 1 min à 650C. La suspension est ajustée à 0,5 M NaCl puis mise à agiter doucement pendant 10 min. La suspension est alors centrifugée pendant 1 min à 1 000 g, le surnageant est éliminé, le culot est lavé deux fois avec 1 ml de tampon TE contenant 0,5 M NaCl. Les surnageants sont éliminés. L'élution de la fraction polyaldénylée des ARN (constituée des ARN messagers) est obtenue par suspension des billes dans 1 ml de tampon TE, puis chauffage de cette suspension à 60 0C pendant 1 min, suivie d'une agitation pendant 10 min sur plaque basculante. On centrifuge ensuite pendant 1 min à 1 000 g, ce qui permet de récupérer Le surnageant contenant des ARN messagers libres en solution. L'ensemble des opérations ci-dessus (à partir de l'elution) est répété deux fois.Les surnageants ainsi obtenus sont rassemblés, on élimine les billes résiduelles par centrifugation et on précipite le surnageant avec 3 volumes d'éthanol et une solution de NaCL à 0,3 M final. On obtient ainsi, à partir des culots cellulaires A, NA, T (5 h) et (24 h), quatre échantillons d'ARN-poly A , nommés par la suite ARN-poly A±A, ARN-poly A±NA; ARN-poly A±T 85 h) et ARNpoly A -T (24 h). SECTION 2 : Préparation d'une banque d'ADN complémentaire enrichie en séquences spécifiques des cellules mononucléaires du sang périphérique 1) Construction du vecteur de clonage pSEI : La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées. Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T. Maniatis, EF. Fritsch et J. Sambrook dans "Molecular Cloning, a Laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984). La synthèse des oligonucléotides est réalisée à L'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 8700. La description ci-après sera mieux comprise en référence à la figure 1. Ce plasmide a été construit par ligations successives des éléments ci-après : b) - un fragment PvuII-HpaI - symbolisé par sur la figure 1 de 1060 pb de L'ADN d'adénovirus type 5 entre les positions 11299 (site de restriction PvuII) et 10239 (site de restriction HpaI) (DEKKER et VAN ORMONDT, Gene 27, 1984, 115-120) contenant L'information pour les ARN VA-I et VA-II. Le site franc HpaI disparaît par ligation avec le site franc PvuII (qui disparaît également) du fragment décrit en c). Le site ApaI en position 11 218 a été enlevé par clivage à L'aide de L'enzyme ApaI, traitement à L'aide de ltexonucléase : ADN polymérase T4 et religation. c) - un fragment PvuII-HindIII - symbolisé par sur La figure 1 - de 344 pb, issu de L'ADN du virus SV40 obtenu par digestion complète à L'aide des enzymes de restriction PvuII et HindIII. Ce fragment comporte L'origine de réplication et le promoteur précoce de L'ADN du virus SV40 (réf. B.J. BYRNE et al. Proc. Ntl. Acad. Sci. USA (1983), 80, 721-725). Le site HindIII disparait par ligation avec le site liant à HindIII du fragment décrit en d). d) - un fragment synthétique 'site liant à HindIII"-HindIII symbolisé par sur la figure 1 - de 419 pb dont la séquence donnée ci-après contient une séquence proche de La séquence 5' non traduite du virus HTLVI (R. WEISS et al., "Molecular Biology of Tumor Vireuses - part 2-2eme ed - 1985 - Cold Spring Harbor Laboraa) - un fragment PvuII-PvuII - symbolisé par +++++++ sur La figure 1 - de 2525 pb, obtenu par digestion complète du plasmide pTZ18R (Pharmacia) à L'aide de l'enzyme de restriction PvuII. Ce fragment contient l'origine de réplication du phage f1 (notée ORI f1 sur la figure 1), un gène (noté AmpR sur la figure 1) portant la résistance à l'ampicilline et L'origine de réplication (notée ORI pBR322 sur la figure 1) permettant la réplication de ce plasmide dans E. coli.Le premier site franc PvuII disparaît par Ligation avec le site franc EcoRV (qui disparaît également) du fragment décrit en g). tory - p. 1057) et l'intron distal du gène de l'oc-globine de souris (U. Nishioka et al., 1979, Cell, 18, 875-882). Site liant à HindIII VAGCTGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCC 1 60 CCGAGCGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCGGCGGGATGGACTCCGGCGGTAGGTGCGG GGTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTA 61 120 CCACTCAGCGCAAGACGGCGGAGGGCGGACACCACGGAGGACTTGACGCAGGCGGCAGAT GGTAGGCTCCAAGGGAGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTCTAAACTTACCTA 121 180 CCATCCGAGGTTCCCTCGGCCTGTTTCCGGGCCAGAGCTGGACTCGAGATTTGAATGGAT GACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTT 181 240 CTGAGTCGGCCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGACGAACGAGTTGAGATGCAGAAACAAA CGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAACTTCAAGGTATGCGCTGGGACCTGGCAGGCGGCAT 241 300 GCAAAAGACAAGACGCGGCAATGTTGAAGTTCCATACGCGACCCTGGACCGTCCGCCGTA CTGGGACCCCTAGGAAGGGCTTGGGGGTCCTCGTGCCCAAGGCAGGGAACATAGTGGTCC 301 360 GACCCTGGGGATCCTTCCCGAACCCCCAGGAGCACGGGTTCCGTCCCTTGTATCACCAGG CAGGCCGGGGAGCAGAGGCATCAGGGTGTCCACTTTGTCTCCGCAGCTCCTGAGCCTGCA 361 420 GTCCTTCCCCTCGTCTCCGTAGTCCCACAGGTGAAACAGAGGCGTCGAGGACTCGGACGT GA CTTCGAÂ HindIII e) - un fragment synthétique HindIII - "site liant à BamHI" - symbolisé par XXXXXXX sur la figure 1 - contenant le promoteur de L'ARN - polymérase du phage T7 ainsi qu'un polylinker contenant notamment les sites de clonage ApaI et BamHI. f) - un fragment BamHI-BclI de 240 pb - représenté par sur la figure 1 -, petit fragment obtenu par digestion complète à L'aide des enzymes BclI et BamHI du virus SV40 qui contient le site de polyadénylation tardif de ce dernier. (M. FITZGERALD et al., Cell, 24, 1981, 251-260). Les sites BamHI et BclI disparaissent par liga- tion avec respectivement le site liant à BamHI du fragment décrit en e) et le site BamHI (qui disparait égaLement du fragment décrit en g). g) - un fragment BamHI-EcoRV - symbolisé par 000000 sur la figure 1 - de 190 pb, petit fragment issu du plasmide pBR322 après digestion complète à L'aide des enzymes EcoRV et BamHI. Les sites EcoRV et BamHI disparaissent par ligation avec respectivement le site PvuII du fragment décrit en a) et le site BclI du fragment décrit en f). Le plasmide pSEI comporte donc les éléments nécessaires pour son utilisation comme vecteur de clonage dans E. coli (origine de réplication dans E. coli et gène de résistance à l'ampicilline, provenant du plasmide pTZ18R) ainsi que comme vecteur d'expression dans les cellules animales (promoteur, intron, site de polyadénylation, origine de réplication du virus SV40), et pour sa copie en simple brin dans un but de séquençage (origine de réplication du phage f1). 2) Constitution d'une banque d'ADN complémentaire enrichie en séquences spécifiques des cellules mononucléaires du sang périphérique La technique de clonage utilisée est celle décrite par Caput et al., (technique de L'amorce-adaptateur (Primer-adapter) : (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) (1986) 83, 1670-1674)). Elle consiste d'une part à digérer le vecteur pSEI par ApaI, ajouter une queue de polydC sur L'extrémité 3' protubérante, puis à digérer les plasmides ainsi obtenus par l'endonucléase BamHI. Le fragment correspondant au vecteur est purifié sur colonne de Sépharose CL4B (Pharmacia). Il comprend donc une queue polydC à une extrémité, L'autre extrémité étant cohésive, du type BamHI. D'autre part, les ARN-poly A obtenus à L'issue de l'exemple 1 sont soumis à la transcription inverse à partir d'une amorce dont la séquence est la suivante : 5' Ainsi, les ADNc présentent à leur extrémité 5' la séquence GATCC complémentaire de L'extrémité cohésive BamHI. Les hybrides ARN-ADN obtenus par action de la transcriptase inverse sont soumis à une hydrolyse alcaline qui permet de se débarrasser de L'ARN. Les ADNc simple brin sont alors soumis à un traitement à la termina le transférase de façon à ajouter des polydG en 3' et purifiés par deux cycles sur colonne de Sépharose CL4B. Ces ADNc sont hydridés avec de l'ARN-poly A provenant de cellules de la lignée COS3 (lignée de cellules de reins de singe exprimant l'antigène T du virus SV40 : cf. Y. Gluzman, 1981, Cell, 23, 175-182). Les ADNc non hydridés sont isolés (fraction enrichie en ADN complémentaire aux ARN messagers spécifiques des cellules mononucléaires du sang périphérique). Ces ADNc sont insérés sous forme simple brin dans le vecteur pSEI. Un second oligonucléotide (l'adaptateur) complémentaire de L'amorce est nécessaire pour générer un site BamHI à L'extrémité 5' des ADNc. Après hydridation du vecteur, de L'ADNc et de l'adaptateur, les molécules recombinantes sont circularisées par L'action de la ligase du phage T4. Les régions simple brin sont alors réparées grâce à L'ADN polymérase du phage T4. Le pool de plasmides ainsi obtenu sert à transformer la souche MC 1061 (Casabadan et S. Cohen, J. Bact. (1980) 143, 971-980) par électroporation. Protocole de préparation de la banque d'ADN complémentaire a) Préparation de L'ADN complémentaire A partir de 5 g des ARN-poly A de cellules mononucléaires de sang périphérique obtenus à L'issue de l'exemple 1 de composition suivante : ARN-poly A+A :0,5 g, ARN-poly A+ NA : 2 g, ARN-poly A+T (5h) : 2 g et ARN-poly A+T (24h) : 0,5 g, on prépare L'ADN complémentaire simple brin marqué au 32p-dCTP (l'ADN complémentaire obtenu présente une activité spécifique de 3 000 dpm/ng) avec L'amorce synthétique de séquence suivante (comprenant un site BamHI) : GATCCGGGCC CTTTTTTTTT TTT dans un volume de 100 pl. Après 30 min d'incubation à 460C avec 100 unités de l'enzyme transcriptase inverse (Genofit-El 022) on ajoute 4 ,ul d'EDTA 0,5 M.On extrait une première fois avec du phénol (saturé en tampon TE) puis une seconde fois avec du chloroforme. On ajoute 10 pg d'ARN de transfert de foie de veau, 1/10 de volume d'une solution d'acétate d'ammonium 10 M et 2,5 volume d'éthanol pour précipiter L'ADN complémentaire. On centrifuge, on dissout le culot dans 30 pl de tampon TE puis on retire les petites molécules telles que sels, phénol et chloroforme par chromatographie d'exclusion sur une colonne de polyacrylamide P10 (Biogel P10-200-400 mesh, réf. 1501050-Biorad). b) Hydrolyse alcaline de la matrice ARN On ajoute 4,6 g d'une solution de NaOH 2 N, on incube 30 min à 68 C, puis on ajoute 4,6 g d'acide acétique 2 N et on fait passer la solution obtenue sur une colonne de polyacrylamide P10. c) Addition homopolymérique de dG On allonge L'ADN complémentaire en 3' avec une "queue" de dG avec 66 unités de l'enzyme termina le transférase (Pharmacia 27073001). On incube 30 min à 37 C, puis on ajoute 4 g d'EDTA 0,5 M. d) Purification sur colonne de Sépharose CL4B Afin d'éliminer L'amorce synthétique, on purifie L'ADN complémentaire sur deux colonnes successives de 1 ml de Sépharose CL4B (Pharmacia) équilibrée en NaOH 30 mM/EDTA 2 mM Les trois premières fractions radioactives (d'environ 80 ,ul chacune) sont regroupées et précipitées avec 1/10 de volume d'une solution d'acétate d'ammonium et 2,5 volumes d'éthanol. La quantité d'ADN complémentaire est de 1 pg. e) Hybridation Le culot d'ADN complémentaire est mis en suspension dans 25 ,ul de tampon TE, on ajoute 15 pg d'ARN-poly A extrait de cellules de la lignée COS, puis 1/10 de volume d'une solution de NaCl 3 M, 5 volume d'éthanol et on laisse précipiter à -20 C. On centrifuge, on lave à L'éthanol 70%, on sèche, on dissout le culot dans 5 l de tampon de composition suivante : Tris 0,1 N pH 7,5 , NaCl 0,3 M, EDTA 1 mM, on met la solution obtenue dans une tube calillaire que l'on scelle puis on incube à 65 C pendant 40 h. On dilue le contenu du capillaire dans 100 pl de tampon TE auquel on ajoute 300 p1 de tampon phosphate de sodium 50 mM pH 6,8. On fait passer la solution obtenue sur une colonne d'hydroxyapatite (BIOARD réf. 130.0520) à 60 C, équilibrée avec ce tampon phosphate. On sépare Le simple brin (l'ADN complémentaire non hydridé) et le double brin (ARN messager de COS hydridé à L'ADN complémentaire) par un gradient de tampon phosphate de 0,1 M à 0,2 M à travers La colonne d'hydroxyapatite.On regroupe les fractions correspondant à L'ADN complémentaire simple brin (25% en poids de l'ADNc élué, ce qui correspond à un enrichissement d'environ quatre fois en séquence spécifiques de cellules mononucléaires du sang périphérique), on ajoute 20 pg d'ARN de transfert, on précipite le volume total avec 1/10 de volume d'une solution d'acétate d'-ammonium 10 M et 2,5 volumes d'éthanol. On centrifuge, le culot est dissous dans 200 p1 de TE, on retire le phosphate résiduel sur polyacrylamide P10, on précipite de nouveau 1/10 de volume d'une solution d'acétate d'ammonium 10 M et 2,5 volumes d'éthanol. Le culot est dissous dans 30 l d'une solution de NaOH 30 mM ; EDTA 2 mM. On charge L'ADN complémentaire sur une colonne de Sépharose CL4B (Pharmacia) de 1 ml, équilibrée avec une solution de NaOH 30 mM ; EDTA 2 mM afin d'éliminer le reste d'amorce synthétique. On regroupe les trois premières fractions radioactives d'environ 80 pl chacune. On précipite l'ADNc contenu dans ces fractions avec 1/10 de volume d'une solution d'ammonium 10 M et 2,5 volumes d'éthanol. La quantité d'ADN complémentaire ainsi récu pérée est de 20 ng. f) Appariement du vecteur de clonage pSEI et de L'ADN complémentaire en présence de l'adaptateur On centrifuge, le culot est dissous dans 33 ,ul de tampon TE, on ajoute 5 pL (125 ng) de vecteur de clonage pSEI, 1 p1 (120 ng) de l'adaptateur de séquence suivante (comprenant un site ApaI), 5'AAAAAAAAAA AAAGGGCCCG3' 10 l d'une solution de NaCl 200mM, on incube 5 min à 65 C puis on laisse refroidir le mélange réactionnel jusqu'à température ambiante. g) Ligation On ligue le vecteur de clonage et l'ADNc simple brin dans un volume de 100 ,ul avec 32,5 unités de L'enzyme ADN ligase du phage T4 (Pharmacia réf. : 270 87002) pendant une nuit à 150C. h) Synthèse du deuxième brin de l'ADNc On élimine Les protéines par extraction au phénol suivie d'une extraction au chloroforme, puis on ajoute 1/10 de volume d'une solution d'ammonium 10 mM puis 2,5 volumes d'éthanol. On centrifuge, le culot est dissous, le deuxième brin d'ADN complémentaire est synthétisé dans un volume de 30 l avec 30 unités de l'enzyme ADN polymérase du phage T4 (Pharmacia) pendant 1 h à 370C. On extrait au phénol et on retire les traces de phénol par une coLonne de polyacrylamide P10. i) Transformation par électroporation On transforme des cellules E. coli MC1061 (Clontech) avec L'ADN recombinant obtenu précédemment par électroporation à L'aide de l'appareil Biorad Gen Pulser (Biorad) utilisé à 2,5 kV dans les conditions prescrites par le fabricant, puis on fait pousser les bactéries pendant 6 h 30 dans du milieu dit milieu LB (Maniatis, op cité) de composition : bactrotryptone 10 g/l ; extrait de levure 5 g/l; NaCI 10 g/l, additionné de 100 ,ug/ml d'ampicilline. On détermine le nombre de clones indépendants en étalant une dilution au 1/1000 de La transformation avant l'amplification sur une boîte de milieu LB additionné de 1,5% d'agar (p/v) et de 100 pg/ml d'ampicilline, appelé par la suite milieu gélosé. Le nombre de clones indépendants est de 500 000. SECTION 3 : Criblage de La banque d'ADN compLémentaire soustraite et sélection du clone NC30 1) Réalisation des répliques des colonies bactériennes de la banque d'ADNc sur filtre de Nylon On distribue environ 40 000 bactéries recombinantes de la banque d'ADNc sur des boîtes de Pétri de (245 x 245 mm) contenant du milieu gélosé (environ 2 000 colonies/boFte). A partir de chacune de ces boîtes, on réalise un transfert des colonies sur une membrane de Nylon CHybond N-Amersham) par dépôt de la membrane sur la surface de la botte et mise en repères par perçage de la membrane à L'aide d'une aiguille. La membrane est ensuite retirée et déposée sur la surface d'une nouvelle boîte de Pétri contenant du milieu gélosé. On laisse pendant quelques heures à 370C pour obtenir la repousse des colonies. A partir de cette première membrane on réalise quatre répliques sur de nouvelles membranes (préalablement déposées sur du milieu gélosé pour les humidifier) par contacts successifs avec la première membrane. Les répliques sur membrane obtenues sont finalement déposées sur des boîtes de milieu gélosé et mises à incuber pendant une nuit à 300C. Les répliques sur membrane sont déposées avec les colonies vers le haut, sur une feuille de Whatman 3 MM saturée avec une solution de composition : NaOH 0,5 M ; NaCl 1,5 M, pendant 5 min, ce qui permet de lyser Les bactéries et de fixer L'ADN. Les répliques sur membrane sont ensuite posées sur une deuxième feuille de Whatman 3 MM saturée cette fois avec une solution neutralisante de composition : NaCl 1,5 M ; Tris-HCl pH 8 0,5 M, pendant 5 min. Les répliques sur membrane sont ensuite plongées dans une solution de 2 x SSC (composition de la solution SSC : NaCI 0,15 M ; citrate de sodium 0,015 M) et les débris bactériens sont partiellement éliminés en frottant doucement à l'aide d'ouate de nettoyage. On traite ensuite les répliques sur membrane avec de la protéinase K (Boehringer Mannheim GmbH) à 100 ,ug/ml dans une solution de composition : Tris-HCL 10 mM pH 8 ; EDTA 10 mM ; NaCI 50mM ; SDS 0,1% à raison de 20ml par membrane. On incube 30 min à 37 C avec agitation. Les répliques sur membrane sont de nouveau plongées dans une solution de 2 x SSC pour éliminer définitivement toute trace de debris bactériens. Elles sont finalement mises à sécher sur du papier-filtre pendant quelques minutes puis pendant 30 min sous vide à +800C. On obtient ainsi, pour chaque boîte, quatre répliques sur membrane, appelées par la suite réplique 1, réplique 2, réplique 3 et réplique 4. 2) Préparation de L'ARN utilisé pour la fabrication des sondes ADNc a) Culture et stimulation des cellules mononucléaires du sang péri phérique à l'aide de PMA, (PMA et anti-CD28), (PMA, PHA-P et cyclosporine A) ou (PMA et PHA-P) Les cellules non adhérentes sont préparées comme décrit précédemment (section 1,1). Elles sont cultivées pendant 5 h en 2 flacons de type Falcon de surface 175 cm en présence du milieu RPMI complété avec 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL-réf. 01306290H), additionné de 10 unités de pénicilline et de 10 pg de streptomycine (solution de pénicilline/streptomycine de Gibco-réf. 043-05140D) par ml de milieu ainsi que de L-glutamine (Gibco BRLréf. 043-05030D) jusqu a 2 mM final. Les cellules sont stimulées pendant 5 h dans L'une des conditions de stimulation 1), 2), 3) et 4) suivantes : 1) en présence de 10 ng/ml de phorbol myristate-2 acétate-3 (PMA) (Sigma, réf. P8139) 2) en présence de 10 ng/ml de PMA et de 1 g/ml de l'anticorps monoclonal anti-CD28 (Réactifs et Systèmes S.A. réf. ACM0280NC050) 3) en présence de 10 ng/ml de PMA, de 5 pg/ml de phytohémaglutinine (PHA-P) (Sigma, réf.L8754) et de 1 pg/ml de cyclosporine-A (Sandoz) 4) en présence de 10 ng/ml de PMA et de 5 ,ug/ml de PHA-P Il est en effet connu que t'addition de l'anticorps anti CD28 augmente la quantité des ARN messagers de plusieurs cytokines, notamment l'IL2, llIFNy, le TNFa et le GMCSF par une augmentation de la stabilité de leurs ARN messagers (Lindsten T. et al. (1989) Science, 244, 339) dans les lymphocytes T, et que l'immunosuppres- seur cyclosporine-A inhibe L'augmentation des ARN messagers des cytokines induites par L'activation avec PMA et PHA-P dans les lymphocytes T (Thompson C.B. et al. (1989) PNAS 86, 1333-1337). On centrifuge ensuite les milieux de culture (conditionnés par les cellules non adhérentes) dans les conditions de stimulation ci-dessus et on retient les culots cellulaires, appelés respectivement, culot cellulaire 1, culot cellulaire 2, culot cellulaire 3 et culot cellulaire 4. b) Préparation de I'ARN-poly A A partir des culots cellulaires ci-dessus, L'ARN est extrait et la fraction poly A est purifiée comme décrit dans la section 1-2 a) et b). On obtient ainsi quatre fractions ARN-poly A+, appelées respectivemment fraction poly A+1, fraction poly A+2, + + fraction poly A 3 et fraction poly A 4. 3) Préparation des sondes ADNc radiomarquées : Les sondes ADNc radiomarquées, appelées respectivement sonde 1, sonde 2, sonde 3 et sonde 4, sont synthétisées à partir des quatre fractions ARN-poly A+ ci-dessus préparées comme décrit ci-après. 1 pg d'ARN-poly A+ est hybridé avec 200 ng d'oligo dT (Pharmacia) dans 2 à 3 yl par incubation pendant 2 min à 650C et refroidissement jusqu'à température ambiante. La synthèse de l'ADNc radiomarqué est réalisée dans un volume réactionnel de 10 g en tampon de composition : Tris-HCl 50 mM pH 8,3 ; MgCl2 5 mM ; dithiotréitol 10 mM, contenant 10 yM de chacun des quatre désoxynucléotide-triphosphates (Pharmacia), 15 pCi de dCTP x32P (3000 Ci/mmol Amersham) et 40 unités de RNasine (inhibiteur de RNAse-Genofit). La réaction s'effectue à 46 C pendant 30 min en présence de 10 à 20 unités de transcriptase inverse (Genofit). Cette synthèse est suivie de l'hydrolyse alcaline de L'ARN par une solution de NaOH 0,3 M dans un volume final de 20 ,ul pendant 30 min à 65 0C. On neutralise par ajout d'acide acétique 3 M. On ajuste le volume à 50 pl avec du milieu TE. On fait une extraction avec un même volume de phénol suivie d'une deuxième extraction avec un même volume d'un mélange chloroforme/isoamylalcool (dans les proportions respectives 24/1). On élimine le dCTP a non incorporé lors de la synthèse du brin ADNc par chromatographie d'exclusion sur une colonne de polyacrylamide P10 (Biogel-200-400 mesh-Biorad). La quantité d'ADNc est de 60 à 100 ng possédant une activité spécifique de 1 x 109 dpm/ug. 4) Hybridation des répliques des colonies bactériennes avec les sondes ADNc Les répliques sur membrane sont préhybridées pendant 2 h à 420C dans un tampon de composition : 50% formamide ; 6 x SSC ; 5 x solution de Denhardt ; 0,12 SDS et 100 yg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué, rajouté après dénaturation 10 min à 1000C. Les répliques sur membrane sont hybridées pendant deux jours : la réplique 1 avec la sonde 1 et la réplique 2 avec la sonde 2, la réplique 3 avec la sonde 3, la réplique 4 avec la sonde 4 ces sondes étant utilisées à une concentration de 4 ng/ml dans le tampon ci-dessus. La 5 x solution de Denhardt (cf. Maniatis, op. cité) a la composition : Ficoll (type 400-Pharmacia) 1 g/l, polyvinylpyrrolidone 1 g/l et la sérumalbumine bovine (BSA) 1 g/l. Les préhybridation et hybridation s'effectuent en tubes dans un four à hybrider (Hybaid) avec respectivement 25 ml et 10 ml de tampon par membrane. Ensuite les répliques sur membrane sont successivement lavées plusieurs fois pendant 15 min à 20 C dans le tampon de composition 2 x SSC ; 0,1% SDS, puis deux fois pendant 15 min dans une solution 0,1 x SSC, 0,1% SDS à 550C séchées sur papier Whatman 3 MM et autoradiographiées sur films Kodak XAR5. 5) Hybridation avec un mélange d'oligonucléotides correspondant à la plupart des cytokines connues Pour identifier les clones qui contiennent les ADN complémentaires aux ARN messagers des cytokines connues, une autre série de répliques sur membrane, préparées comme décrit ci-dessus, avec un mélange - appelé mélange C - de 28 oligonucléotides comportant chacun 20 nucléotides, correspondant aux ADN complémentaires des cytokines suivantes : Interleukine-1 cx(Furutani Y. et al., 1985, Nucl. Ac. Res., 13, 5869-5882), Interleukine-1 D (Auron P. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7907-7911), Interleukine-2 (Degrave W. et al., 1983, EMBO J., 2, 3249-3253), Interleukine-3 (Yang Y.C. et al., 1986, 47, 3-10), Interleukine-4 (Yokoto T. et al., 1986, Proc. Ntl. Acad.Sci., 83, 5894-5898), Interleukine-5 (Hirano T. et al., 1986, Nature, 324, 73-75), Interleukine-6 (May L. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8957-8961), Interleukine-7 (Namen A. et al., 1988, Nature, 333, 571-573), Interleukine-8 (Matsushima K. et al., 1988, J. Exp. Med., 167, 1883-1893), Interleukine-9 (Yang Y.C. et al., 1989, Blood, 74, 1880-1884), TNFa(Pennica D. et al., 1984, Nature, 312, 724-729), TNFss (Gray P. et al., 1984, Nature, 312, 721-724), G-CSF (Nagata S. et al., 1986, 319, 415-418), M-CSF (Kawasaki E. et al., 1985, Science, 230, 291-296), GM-CSF (Wong G. et al., 1985, Science, 228, 810-815), LIF (Gough N. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2623-2627), Interféron oc (Goeddel D. et al., 1981, Nature, 290, 20-26), Interféron p1 (Taniguchi T. et al., 1980, Gene, 10, 11-15), Interféron y (Gray P. et al., 1982, Nature, 295, 503-508), TGFx (Derynck R. et al., 1984, Cell., 38, 287-297), TGFp1 (Derynck R. et al., 1985, Nature, 316, 701-705), bFGF (Prats H. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1836-1840), Erythropoiétine (Jacobs K. et al., 1985, Nature, 313, 806-810), BCGF (Sharma S. et al., 1987, Science, 235, 1489-1492), MIF (Weiser W. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7522-7526), MCP-1 (Yoshimura T. et al., FEBS Lett., 244, 487-493), Oncostatine-M (Malik N. et al., 1989, Mol. Cell. Biol., 9, 2847-2853) et EDF (Murata M. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2434-2438). Ces oligonucléotides, fabriqués à l'aide du synthétiseur d'ADN Biosearch 8700, sont couplés avec de la peroxydase de raifort EC 1.11.17 (Boehringer Mannheim-réf. 814-407) selon le protocole suivant : * on fait réagir sur la colonne de synthèse les oligonu cléotides avec du carbonyl-diimidazole (Aldrich - 11, 553-3) et du diamino-1,6-hexane (Aldrich - H1.169.6) selon la méthode de Wachter et al., 1986, Nucl. Ac.Res., 14, 7985-7994 ; après déprotection des bases et clivage du support par traitement ammoniacal, les oligonucléotides sont purifiés sur une résine d'échange d'ions (Quiagen - Diagen 500051) avec changement du contre-ion ammonium en ion lithium ; * les 5' -amino-oligonucléotides sont couplés à la peroxydase de raifort (Boehringer Mannheim-814407) selon la méthode de M. Urdea et al., Nucl. Ac. Res., 1988, 16, 4937-4956. Le mélange d'oligonucléotides s'hybride avec environ 10% des clones de la banque. Les clones donnant un signal autoradiographique plus fort avec la sonde 2 qu'avec la sonde 1, plus fort avec la sonde 4 qu'avec la sonde 1 et plus fort avec la sonde 4 qu'avec la sonde 3 et- ne s'hybridant pas avec le mélange C ont été partiellement séquencés comme décrit dans la section 4 ci-après. Un de ces clones, appelé par la suite clone NC30, a été retenu. SECTION 4 : Expression de LIARN messager du cLone NC30 dans les ceLLuLes mononuctéaires du sang périphérique Les cellules non adhérentes (constituées principalement de lymphocytes) sont préparées comme décrit dans la section 1-1) et stimulées comme décrit dans la section 3-2)-a) avec en plus des cellules temoins non stimulées (conditions de stimulation 0)). Les ARN messagers de ces cellules dans cinq conditions de stimulation sont préparés comme décrit dans l'exemple 1-2)-a) et analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% en présence de formaldéhyde (Sambrook, op. cité), suivie d'un transfert sur membrane de Nylon (Hybond N± Amersham) et hybridation selon le protocole décrit ciapyres. Cette membrane est hybridée avec une sonde radiomarquée avec du dCTPa32P fabriquée à partir de l'ADNc NC30 (Amersham) par coupure partielle de ce dernier à l'aide de la DNAse I, suivie d'une polymérisation à l'aide de l'enzyme ADN polymérase I (technique dite de "nick-translation" ou déplacement de césure), comme décrit par Sambrook et al., op. cité. L'hybridation se fait à 420C pendant 16 h en milieu aqueux contenant 50% de formamide, 1 M de NaCl, une solution de 5 x Denhardt et 0,1% de SDS. Les membranes sont lavées plusieurs fois à température ambiante avec une solution 2 x SSC contenant 0,1% de SDS, puis lavées deux fois à 50 C pendant 15 min avec une solution 0,1 x SSC contenant 0,1% de SDS. La solution de 5 x Denhardt a la composition suivante : Ficoll (type 400 Pharmacia) 1 g/l, polyvinylpyrrolidone 1 g/l et BSA 1 g/l. La solution 1 x SSC contient 0,15 M de NaCI et 0,015 M de citrate de sodium. On constate pour les cellules non stimulées et pour les cellules stimulées dans les conditions 1), 2), 3) et 4) une bande autoradiographique correspondant à un ARN d'environ 1,4 kb. L'expression de cet ARN est augmentée en présence de PMA (bande d'intensité plus forte pour la condition de stimulation 1) que pour la condition de stimulation 0)), cette augmentation étant amplifiée avec la présence supplémentaire de PHA-P ou d'anti-CD28 (bandes d'intensité plus forte pour les conditions de stimulation 2) et 4) que pour la condition de stimulation 1)) et non changée avec la présence supplémentaire de PHA-P et de cyclosporine (bandes d'intensité semblable pour les conditions de stimulation 1) et 3)). SECTION 5 : Séquençage et analyse de La séquence de L'ADNc du clone NC30 1) Séquençage de I'ADNc du clone NC30 a) préparation de l'ADN simple brin Le clone NC30 contient le vecteur pSE1, lequel porte un ADNc entre les sites ApaI et BamHI, appelé par la suite ADNc NC30. Le vecteur pSE1, qui contient l'origine de réplication du phase f1 permet de produire de I'ADN simple brin par culture du clone NC30 en présence du bactériophage M13K07 (Pharmacia - réf. 27-1524) de la manière suivante Le clone NC30 est cultivé, dans un tube de 15 ml, sous agitation à 370C dans 2 ml de milieu 2 x YT de composition : bactotryptone 16 g/l, extrait de levure 10 g/l, NaCI 5 g/l (décrit dans Maniatis et al., op. cité), complémenté avec 0,001% de thiamine et 100 pg/ml d'ampicilline jusqu'à une densité optique à 660 nm d'environ 0,60. - 100 p1 de cette culture sont infectés avec du bactériophage M13K07 (Pharmacia - réf. 27-1524) à une multiplicité d'infections de l'ordre de 10 dans un tube de 15 ml. La culture est mise à agiter à 370C. - Au bout de 1 h, 2 ml de milieu sont ajoutés. La culture est alors mise à incuber pendant environ 16 h à 370C sous agitation. - 1,5 ml de la culture est centrifugé, dans un microtube, à 15 000 g pendant 2 min. - 1 ml de surnageant est transféré dans un microtube et additionné de 250 PI d'une solution de polyéthyîèneglycol de masse moléculaire 6 000, 20% contenant 2,5 M de NaCI. Le mélange est incubé pendant 5 min à 40C pour faciliter la précipitation du phage, puis centrifugé 5 min à 15 000 g. Le surnageant est éliminé et le culot phagique est resuspendu dans 500 pl de tampon de composition Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM. - La suspension est extraite une fois au phénol saturé avec du Tris 100 mM pH 8, puis deux fois au chloroforme. - La préparation est ensuite précipitée par adjonction de 1/10 de volume d'une solution d'acétate de sodium 3 M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol. La précipitation est réalisée à -200C pendant un minimum de 20 min. L'ADN est centrifuge 10 min à 15 000 g, le culot est lavé avec une solution d'éthanol à 70% puis remis en suspension dans 30 ,ul de tampon de composition : Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM. b) Séquençage Les réactions de séquençage sont réalisées à l'aide du kit de séquençage United States Biochemical (réf : 70770), qui utilise la méthode de Sanger et al., Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 1977, 14, 5463-5467. Les amorces utilisées sont des oligonucléotides de 18 nucléotides, complémentaires soit au vecteur pSE1 dans la région immédiatement en 5' de l'ADNc NC30, soit à la séquence de I'ADNc NC30. 2) Analyse de la séquence de l'ADNc NC30 La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 2, 3 et 4. Analyse de la séquence de l'ADNc NC30 (1) L'ADNc NC30 comporte 1297 nucléotides et se termine par une séquence poly A. (2) Ce nombre de nucléotides est en accord avec la taille de I'ARN messager correspondant (environ 1,4 kb) (cf. section 4). (3) A la position 1264-1269 la séquence AATAAA, qui correspond à la séquence consensus décrite par M. Birnstiel et al., 1985, Cell., 41, 349 est un signal de polyadénylation. Aux positions 855-861, 872-878, 1133-1139 et 1152-1158 on trouve des séquences de 7 nucléotides : TATTTAT, TATTTAA, AATTTAT et TATTTAA, contenant le motif consensus d'instabilité ATTTA décrit par G. Shaw et al., 1986, Cell, 46, 659-667. La plupart des cytokines connues possèdent ce motif consensus d'instabilité. (4) La séquence d'ADN comporte une phase de lecture ouverte pour la traduction d'une protéine à partir de l'ATG en position 15-17 jusqu'au TGA à la position 453-455 qui correspond à un codon d'arrêt de la traduction. Dans cette phase de lecture il y a deux codons ATG aux positions 15-17 et 57-59, susceptibles d'initier la traduction, correspondant respectivement à des protéines traduites de 146 et 132 acides aminés. Parmi ceux-ci l'environnement nucléotidique de l'ATG aux positions 57-59 est celui qui se rapproche le plus de la séquence consensus décrite par Kozak M., 1978, Cell, 15, 11091123, pour l'initiation de la traduction dans les cellules eucaryotes. (5) Un logiciel de recherche de peptide signal a été développé par la Demanderesse d'après la méthode et les informations décrites par Von Heijne, 1986, Nucl. Ac. Res. 14, 483-490. Ce logiciel prévoit dans cette phase de lecture une région hydrophobe ressemblant à un peptide signal et trois sites probables de clivage protéique, aux positions 74-75 (entre Thr et Thr), aux positions 86-87 (entre Ala et Leu) et 110-111 (entre Ala et Ser). Le peptide signal prévu est compris entre l'une des deux Met susceptibles d'initier la traduction et l'un de ces trois sites de clivage. Il comprend donc (cf. figure 2) 32, 24, 21, 18, 10 ou 6 acides aminés. Les peptides signal de 10 ou de 6 acides aminés, trop courts pour un peptide signal eucaryote (cf. "Protein targeting" de P. Pugsley, 1989, Academic, Press, San Diego-Californie-Etats-Unis), ne seront pas pris en considération. La proteine mature prévue (protéine traduite clivée de son peptide signal) comprend donc une séquence de 126, 122 ou 114 acides aminés. Comparaison aux autres séquences connues La séquence peptidique déjà connue la plus proche de celle de la séquence de 114 acides aminés de la protéine mature est celle de la protéine de 131 acides aminés déduite de l'ADNc de la protéine P600 de souris décrite par K.D. Brown et al., 1989, J. Imm. 142, 679-687. Cette protéine est exprimée dans une sous-classe de lymphocytes T de souris : les cellules Th2, activées à l'aide de la concanavaline A. Une comparaison de ces séquences peptidiques à l'aide de la méthode de Neediman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443-453, mise en oeuvre dans le logiciel UWGCG de ltuniversité de Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res. 12, 8711-8721, option GAP, montre que 64 acides aminés sont identiques sur 114, soit une homologie d'identité d'environ 56%. Cette méthode algorithmique considère tous les alignements possibles et crée un alignement, représenté sur la figure 3, dans lequel le plus possible d'acides aminés identiques sont appariés et le nombre de trous dans les séquences alignées est minimal. Une comparaison des séquences nucléotidiques par cette méthode montre une homologie d'identité d'environ 70% entre la séquence codante de l'ADNc NC30 et I'ADNc de la protéine P600 de souris (cf. figure 4). SECTION 6 : Analyse de La sécrétion dans Les cellules COS de La protéine codée par l'ADNc NC30 Les cellules COS sont des cellules de reins de singe exprimant l'antigène T du virus SV40 (Gluzman, Y. Cell, 23, 1981, 175-182). Ces cellules, qui permettent la réplication des vecteurs contenant l'origine de réplication de l'ADN du virus SV40 (cas du vecteur PSE1), constituent des hôtes de choix pour l'étude de l'expression de gènes dans les cellules animales. 1) Transfection des cellules COS et expression transitoire de la protéine codée par l'ADNc NC30 5 x 105 cellules COS sont ensemencées dans une boîte de Pétri de 6 cm de diamètre (Corning) dans 5 ml de milieu modifié d'-Eagle selon Dubelcco ci-après appelé DMEM (le Dulbecco's Modified Eagle medium de Gibco réf. 041-01965), lequel contient 0,6 g/l glutamine, 3,7 g/l NaHC03 et est complémenté avec du sérum de veau foetal (Gibco) à raison de 5%. Après environ 16 h de culture à 370C dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone, le milieu de culture est enlevé par aspiration et les cellules sont lavées avec 3 ml de tampon PBS (le Phosphate Buffered Saline de GIBCO).On y ajoute alors le mélange suivant : I 000 p1 de (DMEM + 10% sérum de veau foetal (Gibco)), 110 pI de diéthylaminoéthyl-dextrane de poids moléculaire moyen 500 000 (Pharmacia), à une concentration de 2 mg/ml, 1,1 ,ul de chloroquine 100 mM (Sigma) et 6 pg d'ADN plasmidi que du clone NC30, préparé selon la technique de lyse alcaline suivie de la purification de l'ADN plasmidique sur un gradient de chlorure de césium (Sambrook et al., op. cité). Après 5 h d'incubation à 37 C dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone, le mélange est retiré des cellules. On y ajoute alors 2 ml de tampon PBS contenant 10% de diméthylsulfoxyde (qualité Spectroscopie, Merck).Après 1 min d'incubation à la température ambiante, le mélange est retiré et les cellules sont lavées deux fois avec du PBS et sont incubées dans du milieu DMEM contenant 2% sérum de veau foetal. L'incubation est poursuivie pendant 40 à 37 C sous atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone. D'autre part, on a préparé des cellules COS témoins en effectuant les opérations décrites ci-dessus avec l'ADN du plasmide pSE1. 2) Marquage des protéines L'ensemble des opérations décrites ci-dessous est effectué avec les cellules COS transfectées par l'ADN plasmidique du clone NC30 et les cellules COS témoins. Le milieu de culture est enlevé par aspiration et les cellules sont lavées deux fois avec 3 ml de tampon PBS. On ajoute 5 ml de milieu MEM (Minimal Eagle's Medium) sans méthionine (Gibco - réf. 041-01900H), complété avec 3 g/ml de glucose et 4 mM de glutamine. On incube pendant 2 h à 370C. On enlève le milieu de culture et on rajoute 2 ml de même milieu additionné de 200 pCi de méthionine 35S (réf. SJ1015 Amersham). On incube pendant 6 h à 370C. On prélève le milieu de culture, on le centrifuge pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires et les cellules en suspension, et on garde le surnageant. 3) Analyse des protéines radiomarquées des cellules COS transfectées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide On précipite 1 ml du surnageant des cellules COS transfectées et 9 ml d'acétone à -200C. On centrifuge et on récupère les culots de protéines. On les reprend dans un tampon de composition : Tris 0,125 M pH 6,8, SDS 4%, glycérol 20%. Une partie aliquote de la suspension obtenue correspondant à une radioactivité de 200 000 cpm est analysée par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 15% en présence de SDS selon la technique décrite par U.K. Laemmli, Anal. Biochem., 1977, 78, 459. Le gel est séché sous vide. Les protéines radiomarquées sont révélées par autoradiographie. On constate sur l'autoradiogramme la présence de deux bandes surnuméraires pour les cellules transfectées par l'ADN plasmidique du clone NC30 par rapport aux cellules témoins : une bande nette de forte intensité correspondant à une masse moléculaire apparente de 9,0 + 1,5 kDa et une bande diffuse de faible intensité correspondant à une masse moléculaire apparente de 17,0 + 1,5 kDa. Le clone NC30 code donc pour une protéine sécrétée. La masse moléculaire apparente pour la forme de la protéine de l'invention correspondant à la bande de 9 + 1,5 kDa est inférieure à la masse moléculaire calculée pour la protéine mature de 114 acides aminés de 12 586 Da. Cette différence, d'au plus environ 5 kDa peut être provoquée, soit par une mobilité électrophorétique inattendue de cette forme de la protéine de l'invention, soit par un clivage carboxyet/ou aminoterminal d'au plus 45 acides aminés de la séquence (a1), la protéine clivée comprenant alors une sous-séquence d'au moins 69 acides aminés de la séquence de la protéine mature de 114 acides aminés. La bande de masse moléculaire apparente 17,0 + 1,5 kDa peut correspondre à une forme N-glycosylée de la protéine de l'invention. Celle-ci présente en effet (cf. figure 2) quatre sites possibles de N-glycosylation. REVENDICATIONS 1. Protéine à activité de type cytokine, caractérisée en ce qu'elle comprend une sous-séquence d'au moins 69 acides aminés de la séquence d'acides aminés (a1) suivante (a1 ) Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Asp Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn ou d'une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a 2.Protéine à activité de type cyokine, caractérisée en ce qu'elle comprend une sous-séquence d'au moins 69 acides aminés de la séquence d'acides aminés (a2) suivante (a2) Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Asp Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu île Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn ou d'une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a2). 3. Protéine à activité de type cytokine, caractérisée en ce qu'elle comprend une sous-séquence d'au moins 69 acides aminés de la séquence d'acides aminés (a3) suivante : Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Asp Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys île Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn ou d'une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a 3). 4. Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend l'une des séquences (a1), (a2) ou (a3) ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec l'une des séquences (a1), (a2) ou (a3). 5. Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle a une masse moléculaire apparente de 9 + 1,5 kDa. 6. Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle a une masse moléculaire apparente de 17 + 1,5 kDa. 7. Protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est N-glycosylée. 8. ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. ADN recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte, en amont de la sous-séquence d'au moins 69 acides aminés de la séquence codant pour l'une des séquences (a1), (a2) ou (a3) ou d'une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec l'une des séquences (a1), (a2) ou (a3), une séquence signal. 10. ADN recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte, en amont de la séquence codant pour l'une des séquences (a1), (a2) ou (a3) ou d'une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec l'une des séquences (a1), (a2) ou (a3), une séquence signal. 11. ADN recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que le peptide signal codé par la séquence signal est séparé de la séquence (a3) ou de la séquence présentant un degré d'homologie élevé avec la séquence (a3) Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala 12. ADN recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence signal code pour la séquence d'acides aminés (b1) suivante = Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala 13. ADN recombinant selon la revendications 11, caractérisé en ce que la séquence signal code pour la séquence d'acides aminés (b2) suivante : Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala 14.ADN recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce que la séquence signal code pour la séquence d'acides aminés (b3) suivante : Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val île Ala 15. ADN recombinant selon l'une des revendications 9 à 14, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a3) est la séquence (Nal) suivante : TCCCCAGGCC CTGTGCCTCC CTCTACAGCC CTCAGGGAGC TCATTGAGGA GCTGGTCAAC ATCACCCAGA ACCAGAAGGC TCCGCTCTGC AATGGCAGCA TGGTATGGAG CATCAACCTG ACAGCTGACA TGTACTGTGC AGCCCTGGAA TCCCTGATCA ACGTGTCAGG CTGCAGTGCC ATCGAGAAGA CCCAGAGGAT GCTGAGCGGA TTCTGCCCGC ACAAGGTCTC AGCTGGGCAG TTTTCCAGCT TGCATGTCCG AGACACCAAA ATCGAGGTGG CCCAGTTTGT AAAGGACCTG CTCTTACATT TAAAGAAACT TTTTCGCGAG GGACGGTTCA AC 16.ADN recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence signal est la séquence (nabi) suivante : ATGGCGCTTT TGTTGACCAC GGTCATTGCT CTCACTTGCC TTGGCGGCTT TGCC 17. ADN recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence est la séquence nucléotidique (Nb2) suivante ATGCATCCGC TCCTCAATCC TCTCCTGTTG GCACTGGGCC TCATGGCGCT TTTGTTGACC ACGGTCATTG CTCTCACTTG CCTTGGCGGC TTTGCC 18. ADN recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence signal est la séquence cob3) suivante : ATGCATCCGC TCCTCAATCC TCTCCTGTTG GCACTGGGCC TCATGGCGCT TTTGTTGACC ACGGTCATTG CT 19. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il contient, avec les moyens nécessaires à son expression, un ADN recombinant selon l'une des revendications 8 à 18. 20. Cellules animales, caractérisées en ce qu'elles contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, un ADN recombinant selon l'une des revendications 8 à 18. 21. Cellules animales selon la revendication 20, caractérisées en ce qu'elles contiennent un vecteur d'expression selon la revendication 19. 22. Procédé de préparation d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture de cellules animales selon l'une des revendications 19 et 20, suivie de l'isolement et de la purification de la protéine recombinante. 23. Protéine recombinante à activité de type cytokine, susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant une étape de culture de cellules animales selon l'une des revendications 20 et 21, suivie de l'isolement et de la purification de la protéine recombinante. 24. Médicament, caractérisé en ce qu'il contient une protéine selon l'une des revendications 1 à 7. 25. Médicament, caractérisé en ce qu'il contient une protéine selon la revendication 23.