Brevet FR2677664A1 — publié le 19921218

La présente invention concerne un dispositif et un procédé de contrôle microbiologique des liquides sous pression qui permettent de dénombrer les microorganismes vivants contenus dans ces liquides. Dans de nombreuses industries, notamment les industries alimentaires, pharmaceutiques et électroniques, il est important de pouvoir contrôler la qualité micro- biologique des fluides sous pression, qu'ils soient en cours de transfert à travers des canalisations ou en attente dans des cuves de stockage. Jusqu'à présent, la méthode couramment utilisée consistait à prélever, dans des conditions aseptiques, un certain volume de liquide dans un récipient à l'aide d'une petite prise d'échantillon (petit robinet) et ensuite à contrôler cet échantillon par la méthode habituelle de filtration ou celle indiquée dans le brevet FR-B-2 558 847 déposé le 31 janvier 1984 par la Société MILLIPORE S A. On imagine dès maintenant les risques le "faux positifs" encourus du fait de ces prélèvements, transvase- ments et transferts d'échantillons De plus, ces diverses manipulations entraînent des pertes de temps et donc des retards dans le résultat des analyses L'invention qui va être décrite ci-après supprime ces risques puisque la filtration, nécessaire à l'analyse, ainsi que la mise en contact du filtre avec le milieu nutritif, nécessaire au développement des microorganismes éventuellement retenus sur la membrane, peuvent être faites sur place Elle simplifie de ce fait les opérations jusque là nécessaires au contrôle microbiologique de ces liquides. Le dispositif de contrôle microbiologique d'un échantillon liquide selon la présente invention est un dispositif, de préférence préstérilisé et à usage unique, qui fait appel à une membrane filtrante. Ce dispositif se caractérisé par un réservoir entièrement clos en matière plastique transparente à la base duquel est scellée une membrane filtrante, ledit réservoir étant muni, en amont de la membrane, d'une fenêtre de lecture intégrée et, en aval de la membrane, d'une collerette comportant une lèvre d'étanchéité et une partie filetée femelle.5 Sur la partie filetée femelle du réservoir, on peut adapter soit un support de filtration soit une cassette d'incubation, l'un et l'autre en matière plas- tique. Le support de filtration comporte un boîtier muni extérieurement d'une partie filetée mâle coopérant avec la partie filetée femelle du réservoir et un plateau supérieur muni d'un système de canaux de drainage aboutis- sant à un orifice d'évacuation axial, ledit support de filtration comportant également un cône d'étanchéité coopérant avec la lèvre d'étanchéité du réservoir pour éviter toute infiltration ou contamination en provenance de l'extérieur sur le pourtour du support, lors de la filtration de l'échantillon de liquide à analyser. La cassette d'incubation comporte un boîtier contenant un milieu approprié, liquide ou solide, de culture de microorganismes et muni extérieurement d'une partie filetée mâle coopérant avec la partie filetée femelle du réservoir, ladite cassette pouvant présenter à son extrémité supérieure, une partie conique destinée à coopérer avec la lèvre d'étanchéité du réservoir, pour assurer l'étanchéité sur le pourtour aval de la membrane filtrante et éviter ainsi toute déshydratation du milieu de culture lors de l'incubation. Le dispositif selon l'invention présente l'avantage de maintenir la membrane filtrante dans un réservoir parfaitement clos, donc à l'abri de toute contamination exogène pouvant fausser les résultats de l'analyse microbiologique à effectuer. Il permet également de prélever l'échantillon de liquide à analyser, sous des pressions pouvant aller jusqu'à 6 105 Pa, ce qui n'était le cas d'aucun dispositif antérieurement connu. Et il permet enfin d'effectuer directement et rapidement l'incubation des microorganismes éventuellement recueillis sur la membrane de filtration, sans aucune manipulation de cette dernière. La présente invention a également pour objet un procédé de contrôle microbiologique d'un échantillon liquide à l'aide d'une membrane filtrante qui comprend10 successivement l'introduction de l'échantillon à analyser dans un dispositif comprenant le réservoir ci-dessus défini vissé sur un support de filtration, la mise en pression ou en dépression du réservoir pour terminer la filtration, le remplacement du support de filtration par une cassette d'incubation vissée dans le réservoir et une incubation de l'ensemble constitué par le réservoir et la cassette, en position inversée, dans un incubateur. Il convient de noter qu'un tel procédé, indépendamment de sa simplicité et de sa rapidité, permet de contrôler la qualité microbiologique d'un liquide sous pression dans des conditions maximales de fiabilité, car il évite toute manipulation tant de l'échantillon de liquide prélevé que de la membrane recueillant les germes éventuel- lement présents et à détecter. L'invention va maintenant être décrite à l'aide des dessins ci-joints o: la figure 1 représente une coupe en élévation du réservoir du dispositif selon l'invention; la figure 2 est une vue de dessus du réservoir représenté sur la figure 1; la figure 3 est une coupe en élévation du support de filtration destinée à coopérer avec le réservoir des figures 1 et 2; la figure 4 est une de dessus du support de filtration représenté sur la figure 3; la figure 5 est une coupe en élévation d'une cassette d'incubation, pour milieu de culture liquide, destinée à coopérer avec le réservoir des figures 1 et 2; la figure 6 est une coupe en élévation d'une autre cassette d'incubation, pour milieu de culture solide, destinée à coopérer avec le réservoir des figures 1 et 2; la figure 7 est une coupe d'une première forme de réalisation de la lèvre d'étanchéité du dispositif selon l'invention; la figure 8 est une coupe d'une deuxième forme de réalisation de la lèvre d'étanchéité du dispositif selon l'invention; la figure 9 est une vue d'une prise d'échan- tillon de liquide à contrôler avec le dispositif selon l'invention, en cours de filtration. la figure 10 est une vue montrant la fin de la filtration d'une prise d'échantillon par mise sous pression aseptiquement du dispositif selon l'invention à l'aide d'une seringue; la figure il est une vue montrant la fin de la filtration d'une prise d'échantillon par pompage du reliquat de liquide à l'aide d'une seringue; les figures 12 et 13 sont des vues, partiel- lement en coupe, du dispositif selon l'invention en position inversée dans un incubateur et comportant une cassette d'incubation pour milieu en culture respectivement liquide ou solide; les figures 14 et 15 sont des vues montrant comment on peut perforer le réservoir du dispositif selon l'invention pour accéder aux colonies en vue de leur prélèvement et de leur identification; la figure 16 est une vue montrant le prélèvement d'une colonie sur la membrane du dispositif selon l'invention;35 enfin la figure 17 est une vue montrant comment on peut poursuivre l'incubation du dispositif selon l'invention, après prélèvement d'une colonie. Le réservoir ( 1), représenté sur les figures 1 et 2, comporte un corps ( 2), généralement cylindrique, fermé, à sa partie supérieure, par une fenêtre de lecture ( 3) et, à sa partie inférieure, par une membrane filtrante ( 4), situé dans un plan parallèle à celui de la fenêtre de lecture. Le corps cylindrique ( 2), est muni d'un orifice d'entrée ( 5) latérale, de type Luer femelle, pouvant être fermé par un bouchon Luer mâle ( 6) et dont l'axe est parallèle au plan de la membrane ( 4). Une collerette tubulaire ( 7), de diamètre supérieur à celui du corps cylindrique ( 2), prolonge ce dernier en aval de la membrane filtrante et est muni intérieurement d'une partie filetée femelle ( 8), pouvant consister notamment en trois départs de filets femelles pour assurer un serrage rapide sur un élément amovible muni de filets mâles correspondants. La partie de raccordement entre le corps cylindrique ( 2) et la collerette tubulaire ( 7) comprend successivement d'amont vers l'aval un épaulement ( 9), une lèvre d'étanchéité ( 10) et une butée de serrage ( 11). L'épaulement ( 9), en forme de couronne circulaire de même axe que celui du corps ( 2), délimite la base du réservoir ( 1) sur laquelle est scellée la membrane filtrante ( 4), dans un plan perpendiculaire à l'axe commun du corps ( 2) et de la collerette ( 7). La lèvre d'étanchéité ( 10) se présente, dans la réalisation représentée sur la figure 1, sous forme d'une languette circulaire, de diamètre intermédiaire entre ceux du corps ( 2) et de la collerette ( 7) et de même axe que ces derniers, s'étendant axialement avec des faces interne et externe. Enfin la butée de serrage ( 11), également en forme de couronne circulaire de même axe que le corps cylindrique ( 2), a pour but d'éviter l'écrasement de l'extrémité circulaire de la membrane filtrante, lors du vissage d'un élément amovible sur la partie filetée ( 8) de la collerette. Comme le montre la figure 1, la fenêtre de lecture ( 3) est dégagée de toute obstruction afin de ne pas masquer la vision de la membrane filtrante ( 4). Le réservoir ( 1) est constitué en une matière plastique qui doit être transparente, résister à la pression et pouvoir être perforé sans rupture de préférence10 latéralement, au cas o on souhaiterait prélever une colonie microbienne, qui s'est développée, après incuba- tion, sur la membrane filtrante. La demanderesse à trouvé qu'une matière plastique convenant pour le réservoir était un copolymère de méthacrylate de méthyle, de butadiène et de styrène. La membrane filtrante ( 4) est connue et en général en matière plastique de type ester de cellulose ayant un diamètre de pore qui varie selon la taille des microorganismes à retenir Pour les microorganismes couramment recherchés, le diamètre des pores généralement utilisé est de 0,45 micromètre D'autres matériaux filtrants, hydrophiles ou hydrophobes, peuvent être utilisés pour la rétention d'autres microorganismes. Le support de filtration ( 12), qui vient compléter le dispositf selon l'invention, est représenté sur les figures 3 et 4. Il comporte un boîtier ( 13), généralement cylindrique, muni extérieurement d'une partie filetée mâle ( 14), pouvant consister par exemple en trois filets mâles, coopérant avec la partie filetée femelle ( 8) de la collerette ( 7) du réservoir ( 1), et éventuellement d'organes de préhension ( 30). Le boîtier ( 13) est fermé à sa partie supé- rieure par un plateau ( 15), comprenant un rebord périphé- rique circulaire ( 16) et un système de canaux de drainage circulaires ( 17) et axiaux ( 18) aboutissant à un orifice d'évacuation axial ( 19). Le rebord périphérique ( 16) se prolonge axiallement légèrement au-delà de la face supérieure du plateau ( 15) comme le montre plus particulièrement la fig. 3, de façon à former une cavité circulaire centrale servant à la réception d'un intercalaire aseptique poreux amovible ( 20) en forme de disque qui repose sur le sommet des canaux de drainage. La face supérieure de cet intercalaire ( 20), destiné à entrer en contact avec la totalité de la surface inférieure filtrante de la membrane ( 4) pour la supporter, lorsque le support ( 12) est vissé dans le réservoir ( 1), se trouve au même niveau que la face supérieure du rebord périphérique ( 16), qui comporte quelques fines entailles radiales ( 21), pour faciliter l'évacuation éventuelle de liquide infiltré entre le pourtour aval de la membrane et la surface ( 16), par l'intercalaire aseptique poreux ( 20). La partie de raccordement entre le boîtier fileté ( 13) et le plateau ( 15) du support de filtration ( 12), comporte dans la forme de réalisation représentée sur le figure 1 et comme le montre plus précisément la figure 7, un épaulement extérieur ( 22), une rigole circulaire ( 23) et un cône d'étanchéité ( 24) délimitant le rebord périphé- rique ( 16). Lors du vissage du support de filtration ( 12) à l'intérieur de la collerette du réservoir ( 1), l'épaule- ment ( 22) vient en contact avec la butée ( 11) pour éviter l'écrasement de la membrane circulaire (non représentée sur la figure 7), et le cône d'étanchéité ( 24) vient déformer la face interne de la lèvre d'étanchéité ( 10) pour assurer une étanchéité parfaite entre support ( 12) et réservoir ( 1) Dans une autre forme de réalisation représentée sur la figure 8, l'épaulement extérieur ( 22) du support de filtration ( 12), non seulement vient en contact avec la butée ( 11) du réservoir ( 1) mais il comporte également un cône d'étanchéité ( 24) qui vient déformer la face externe, et non plus interne, de la lèvre d'étanchéité ( 10) pour assurer une étanchéité parfaite, lors du vissage du support5 ( 12) dans le réservoir ( 1). Le mode de réalisation représenté sur la figure 8 permet de réaliser des prélèvements d'échantillons de liquides à analyser à des pressions supérieures à celles pouvant être utilisées avec la mode de réalisation de la figure 7 et qui peuvent aller jusqu'à 6 105 Pa, étant donné que toute augmentation de la pression du liquide à filtrer a tendance à augmenter l'étanchéité du réservoir sur le cône d'étanchéité du support de filtration. La matière plastique du support de filtration ( 12) peut être par exemple un polymère styrénique comme une résine acrylonitrile-butadiène- styrène et l'intercalaire ( 20) peut être par exemple en polyéthylène fritté. La cassette d'incubation ( 25) destinée à compléter le dispositif selon l'invention peut être une cassette en matière plastique pour milieu de culture liquide (Fig 5) ou solide (Fig 6). Cette cassette ( 25) comporte un boîtier ( 26), généralement cylindrique, contenant un milieu de culture ( 27) approprié au microorganisme à détecter et qui est muni extérieurement d'une partie filetée mâle ( 28), pouvant coopérer avec la partie filetée femelle ( 8) de la colle- rette ( 7) du réservoir, et constituée, par exemple, par trois départs de filets mâles pour l'un et femelles pour l'autre, afin d'assurer un serrage rapide. Le boîtier ( 26) peut également comporter des organes de préhension ( 29) et à sa partie supérieure, un épaulement ( 37) destiné à entrer en contact avec la butée ( 11), lors du vissage de la cassette ( 25) dans le réservoir ( 1) Dans la cassette pour milieu de culture liquide représentée sur la fig 5, le boîtier ( 26) comporte à sa partie supérieure un support convexe vers l'extérieur ( 31) et d'une seule pièce avec le boîtier. Ce support convexe ( 31) est muni d'un système de canaux d'alimentation reliés à un orifice d'alimentation axial ( 32), clos par un bouchon amovible ( 36). Le support convexe ( 31) est légèrement en retrait par rapport à son rebord périphérique pour former une cavité circulaire centrale, o repose un tampon absorbant ( 33) imbibé du milieu liquide de culture approprié, et qui peut être protégé par un papier de protection pelable ( 34) collé sur ledit rebord périphé- rique. Le support convexe ( 31) est relié à l'extrémité supérieure du boîtier ( 26) par une partie conique ( 35), destinée à coopérer avec la lèvre d'étanchéité ( 10) du réservoir ( 1), afin d'éviter un assèchement de la péri- phérie du milieu liquide de culture de la cassette, vissée dans le réservoir, lors de d'incubation. La cassette d'incubation pour milieu de culture solide, représentée sur la figure 6 ne comporte pas de partie conique d'étanchéité, mais son boîtier ( 26) est fermée à chacune de ses extrémités par un couvercle amovible ( 38 et 39). Le couvercle ( 38), situé à l'opposé de l'épaulement ( 37), sert au remplissage de la cassette et le couvercle ( 39), de forme convexe vers l'extérieur, est retiré lors du vissage de la cassette ( 25) dans le réservoir ( 1). La matière plastique constituant les corps des cassettes peut être du polystyrène et celle des couvercles du polypropylène. Le procédé selon l'invention consiste, après remplissage des cassettes avec le milieu de culture convenable, à effectuer les opérations nécessaires au contrôle microbiologique directement à l'emplacement du prélèvement de l'échantillon liquide à contrôler. On commence par visser un réservoir ( 1) sur un support de filtration ( 12) jusqu'à la butée d'étanchéité; le réservoir peut alors supporter une pression de filtra- tion du liquide à analyser supérieure à 3 105 Pa, dans la5 mode de réalisation représenté sur les figures 1, 3 et 7 et à 6 105 Pa, dans la mode de réalisation de la figure 8. On retire alors le petit bouchon Luer mâle ( 6) et on connecte le réservoir ( 1) à la prise d'échantillon. On ouvre la valve de la prise d'échantillon et on laisse filtrer le volume désiré de liquide à contrôler, en recueillant le volume de l'échantillon dans un bécher situé en aval du support de filtration (voir fig 9). On ferme la valve de prise d'échantillon en fin de prélèvement et on retire l'unité de filtration. On termine la filtration soit en pressurisant aseptiquement le réservoir à l'aide d'un seringue ( 40) munie d'un filtre d'air, comme indiqué sur la fig 10, ce qui a l'avantage de chasser tout le liquide présent en amont, en aval et dans les pores de la membrane et ce qui évite tout risque de dilution du milieu de culture en aval de la membrane filtrante, soit en effectuant une dépression par pompage du reliquat de liquide à l'aide d'un seringue ( 40), comme indiqué sur la figure 11. Le prélèvement de l'échantillon étant terminé, on dévisse le support de filtration ( 12) et on visse à sa place l'une des cassettes ( 25) contenant le milieu de culture désiré. Il suffit alors de placer l'ensemble de l'unité constituée par le réservoir ( 1) et la cassette ( 25), en position inversée, dans un incubateur à la température et pendant le temps nécessaires au développement des colonies provenant des éventuels microorganismes recueillis sur la membrane filtrante ( 4), comme montré sur les figures 12 et 13. Il convient de noter que le dispositif selon la présente invention permet également de prélever un il échantillon de produit à analyser à l'aide d'une source de vide connectée au support de filtration ( 12), telle que seringue ou fiole à vide; cette alternative n'existait pas avec les dispositifs antérieurement connus. 5 Après développement des colonies, on peut procéder soit à leur comptage, comme dans une boite de Pétri, étant donné que la fenêtre de lecture ( 3) est parfaitement dégagée soit procéder à l'identification de l'une d'entre elles par prélèvement, en perforant le10 réservoir à l'aide d'un appareil ( 41) adapté à cet effet afin de pouvoir prélever la colonie souhaitée avec une anse de platine ( 42) Le réservoir étant placé dans un support, une pointe coupante de section triangulaire pénètre parallèlement à la membrane filtrante dans les parois du corps cylindrique ( 2) du réservoir ( 1) en créant ainsi un trou sans enlèvement de plastique et très proprement (voir les figures 14 et 15). On peut, si on le désire, créer plusieurs trous pour rendre plus accessibles les colonies situées sur la surface de la membrane filtrante Il suffit alors d'intro- duire l'anse de platine ( 42) à travers le trou le mieux placé pour effectuer le prélèvement (figure 16) Enfin, si l'on souhaite poursuivre l'incubation, il suffira d'en- velopper l'unité de contrôle constituée par le réservoir et la cassette d'incubation dans un film approprié ( 43) afin d'isoler le réservoir de l'air extérieur (voir figure 17). REVENDICATIONS 1 Dispositif de contrôle microbiologique d'un échantillon liquide à l'aide d'une membrane filtrante, de préférence préstérilisé et à usage unique, caractérisé en ce qu'il comprend un réservoir ( 1) entièrement clos en matière plastique transparente à la base duquel est scellée une membrane filtrante ( 4), ledit réservoir étant muni, en amont de la membrane, d'une fenêtre de lecture intégrée ( 3) et, en aval de la membrane, d'une collerette ( 7) comportant10 une lèvre d'étanchéité ( 10) et une partie filetée femelle ( 8). 2 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réservoir ( 1) comporte, en amont de la membrane filtrante ( 4) une entrée de liquide se présentant sous forme d'un orifice ( 5) d'axe parallèle au plan de cette membrane ( 4) et pouvant être obturé par un bouchon amovible ( 6). 3 Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le réservoir ( 1) comporte une butée de serrage ( 11) située entre la lèvre d'étanchéité ( 10) et la partie filetée femelle ( 8). 4 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la lèvre d'étanchéité ( 10) consiste en une languette circulaire dont la face interne assure l'étanchéité par coopération avec une partie conique d'un élément amovible pouvant se visser dans la partie filetée femelle du réservoir. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la lèvre d'étanchéité ( 10) consiste en une languette circulaire dont la face externe assure l'étanchéité par coopération avec une partie conique d'un élément amovible pouvant se visser dans la partie filetée femelle du réservoir.35 6 Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la partie filetée ( 8) de la collerette ( 7) du réservoir ( 1) comporte trois départs de filets femelles pour assurer un serrage rapide. 7 Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le réservoir ( 1), dont la fenêtre de lecture intégrée ( 3) constituant la face supérieure et située dans un plan parallèle à celui de la membrane filtrante ( 4), est dégagée de toute obstruction afin de ne pas masquer la vision de la membrane, peut être perforé, de préférence latéralement, par enfoncement et rendre ainsi accessible le dessus de la membrane filtrante pour prélèvement éventuel de colonies microbiennes à l'aide d'une anse ( 42). 8 Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matière plastique transparente du réservoir ( 1) est un copolymère de méthacrylate de méthyle, de butadiène et de styrène. 9 Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un support de filtration ( 12) en matière plastique comportant un boîtier ( 13) muni extérieurement d'une partie filetée mâle ( 14) coopérant avec la partie filetée femelle ( 8) du réservoir ( 1) et un plateau supérieur ( 15) muni d'un système de canaux de drainage ( 17, 18) aboutissant à un orifice d'évacuation axial ( 19), ledit support de filtra- tion ( 12) comportant également un cône d'étanchéité ( 24) coopérant avec la lèvre d'étanchéité ( 10) du réservoir ( 1) pour éviter toute infiltration ou contamination en provenance de l'extérieur sur le pourtour du support lors de la filtration d'un échantillon de liquide à analyser. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que le rebord périphérique ( 16) du plateau supérieur ( 15) du support de filtration ( 12) se prolonge axialement au-delà de la face supérieure du plateau ( 15) pour former une cavité circulaire centrale servant à l'insertion d'un intercalaire aseptique poreux amovible ( 20), reposant sur le sommet des canaux de drainage ( 17, 18) et destiné à entrer en contact avec la totalité de la surface filtrante de la membrane ( 4) de5 réservoir ( 1). 11 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, prise en combinaison avec la revendication 6, caractérisé en ce que la partie filetée ( 14) du support de filtration ( 12) comporte trois départs de filets mâles pour assurer un serrage rapide sur trois filets femelles ( 8) correspondants du réservoir ( 1). 12 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que la matière plastique du support de filtration ( 12) est un polymère styrénique et notamment une résine acrylonitrile-butadiène- styrène. 13 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'incubation en matière plastique ( 25) comportant un boîtier ( 26) contenant un milieu approprié de culture de microorganismes ( 27) et muni extérieurement d'une partie filetée mâle ( 28) coopérant avec la partie filetée femelle ( 8) du réservoir ( 1). 14 Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que la cassette d'incubation ( 25) comporte un support convexe vers l'extérieur ( 31) recevant un tampon absorbant ( 33) imprégné de milieu de culture liquide, pouvant être protégé par un papier de protection pelable ( 34) et en ce que l'extrémité supérieure du boîtier ( 26) de la cassette présente une partie conique ( 35) destinée à coopérer avec la lèvre d'étanchéité ( 10) du réservoir ( 1) pour assurer l'étanchéité sur le pourtour aval de la membrane filtrante ( 4) et éviter ainsi toute déshydratation du milieu de culture ( 27) lors de l'incuba- tion. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 14, caractérisé en ce que la matière plastique de la cassette d'incubation est du polystyrène. 16 Procédé de contrôle microbiologique d'un échantillon de liquide à l'aide d'une membrane filtrante ( 4), caractérisé en ce qu'il comprend successivement l'introduction de l'échantillon à analyser dans un dispositif faisant l'objet de l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans lequel le réservoir ( 1) est vissé à étanchéité sur un support de filtration ( 12), la mise en pression ou en dépression du réservoir ( 1) pour terminer la filtration, le remplacement du support de filtration ( 12) par une cassette d'incubation ( 25) vissé à étanchéité dans le réservoir ( 1) et une incubation de l'ensemble constitué15 par le réservoir et la cassette, en position inversée, dans un incubateur.