Brevet FR2676456A1 — publié le 19921120

L'invention a pour objet de nouvelles alpha-amylases thermostables, leur procédé de préparation ainsi que leur utilisation dans les industries textile, papetière et en brasserie. Sous le terme générique d'amylase, on désigne toute activité enzymatique capable d'hydrolyser tout ou partie des liaisons alpha 1-4 ou alpha 1-6 de l'amidon. Dans la pratique industrielle, on utilise une alpha-amylase dite enzyme liquéfiante, afin d'hydrolyser l'amidon après l'avoir transformé en empois par chauffage à une température supérieure à 95"C. Ce type d'activité enzymatique hydrolyse les liaisons alpha-amylase 1,4 glucosidiques, caractéristiques de l'amylose et du l'amylopectine. L'usage d'une alpha-amylase thermostable présente un intérêt immédiat dans la mesure où il évite d'avoir à refroidir l'empois avant de l'y ajouter. D'autre part, l'opération de liquéfaction ne peut s'effectuer qu'après l'empesage ou gélification de l'amidon natif, après qu'il ait été débarassé de ses constituants solubles par trempage.La gélification s'effectue à des températures de l'ordre de 100 à 115"C. I1 est donc souhaitable de pouvoir disposer d'une amylase qui possède des caractéristiques de thermorésistance accrue, afin notamment de pouvoir effectuer simultanément ou à des température proches les deux opérations d'empesage et de liquéfaction. En outre, un acroissement de la température réactionnelle permet d'augmenter la cinétique enzymatique et de diminuer la viscosité du mélange. La société danoise Novo commercialise, sous l'appellation Termamyl, une alpha-amylase thermostable produite par fermentation d'une souche de Bacillus licheniformis. Cette enzyme est sécrétée dans le milieu de culture. En l'absence de tout protecteur (ion Ca ++ et amidon), elle conserve 90 % de son activité après 10 minutes à 80"C. En présence d'ions Ca 0,1 M, elle est stable à 100 % à 90"C pendant 15 minutes (Rosendal P., Nielsen B.H., Lange NK (1972) Stability of bacterial alpha-amylase in the starch liquefaction process. Die Starie 31, 368-372). D'autre part, les publications françaises de brevet FR-A-2 533 583 et FR-A-2 537 602 décrivent le clonage du gène de Bacillus licheniformis codant pour l'alpha-amylase thermostable et son expression par Escherichia coli et Bacillus subtilis, le gène étant localisé sur un plasmide multicopies. Synthétisée par ces deux microorganismes, l'aphaamylase conserve toutes ses propriétés inchangées : poids moléculaire, thermostabilité, activité spécifique en fonction du pH, propriétés immunologiques. Le gène a été séquencé et sa séquence, ainsi que la séquence d'acides aminés correspondante, sont indiquées à la figure 1. Les inventeurs ont maintenant mis au point des variants de l'alpha-amylase dont la séquence est représentée à la figure 1, pour lesquels les propriétés intéressantes de l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis sont maintenues et qui en outre présentent, par rapport à la forme naturelle, des caractéristiques de thermostabilité accrues. L'invention a donc tout d'abord pour objet un variant thermostable de l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis caractérisé en ce que, par rapport à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1, sa séquence comporte au voisinage de l'histidine (His) en position 133 au moins une substitution par un acide aminé plus hydrophobe que His, et/ou au voisinage de l'Alanine (Ala) en position 209 au moins une substitution par un acide aminé plus hydrophobe que Ala. Le terme "au voisinage de" désigne aussi bien les positions His ou Ala elles-mêmes que quelques acides aminés situés de part et d'autre de ces positions. La séquence présentée à la figure 1 correspond à la séquence mature de l'alpha-amylase, c'est-à-dire après clivage post-traductionnel du peptide signal. En ce qui concerne la substitution au voisinage de la position 133, le variant 133 133 His - > Tyr est tout particulièrement préféré. I1 faut également citer les variants pour lesquels His est remplacé par un acide aminé choisi parmi Phe, Leu, Tyr, Glu, Lys, Gln. L'invention repose sur la découverte que la région située notamment autour de l'acide aminé 133 est une région importante, sinon essentielle pour la thermostabilité de la protéine. Une autre région importante pour la stabilité de l'alpha-amylase se trouve située au voisinage de la position 209 de la protéine mature. En particulier, un ou plusieurs acides aminés naturellement présent en position 209 ou dans son voisinage peut être substitué par un acide aminé choisi notamment parmi Val, Leu, Ile, pour obtenir un variant alpha-amylase thermostable. Pour cette position, une mutation tout particulièrement préférée 209 est celle pour laquelle Ala est substituée par Val209. Les variants de l'alpha-amylase selon l'invention peuvent contenir une mutation dans une seule des deux régions mentionnées, ou bien dans les deux régions à la fois. De tels variants doublement mutés possèdent une stabilité accrue à la chaleur par rapport à chacune des amylases variants et une demie vie à 90"C augmentée d'un facteur 9 à 10 par rapport à la forme naturelle. Les variants selon l'invention peuvent être préparés par les techniques de génie génétique, à partir d'un gène de structure modifié par rapport au gène naturel. On utilise à cette fin les techniques courantes de mutagénèse et on prépare un oligonucléotide susceptible de s'hybrider à l'ADNc au voisinage de la position 133. La Demanderesse a également mis au point une stratégie de mutagénèse au hasard, à partir d'un variant thermosensible appelé p841ts (possédant une double mutation en position 164 et 165). L'invention a donc également pour objet un gène codant pour un variant thermostable de l'alpha-amylase conforme à l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un gène qui comprend la séquence d'ADN telle que représentée à la figure 1, sauf que le codon codant pour His est remplacé par un codon codant pour Tyr et/ou le codon codant pour Ala209 est remplacé par un codon codant pour Val209 La séquence de la figure 1 n'est pas reprise dans le corps de la description pour ne pas l'alourdir, mais elle en fait partie intégrante. L'invention a également pour objet un vecteur d'expression d'un variant thermostable de l'apha-amylase selon l'invention dans une cellule hôte c'est-à-dire un vecteur qui contient un gène codant pour l'alphaamylase tel que décrit précédemment ainsi que les éléments assurant son expression dans ladite cellule hôte. Différentes cellules hôtes peuvent être envisagées dans le cadre de l'invention et les éléments assurant l'expression sont choisis en relation avec la cellule hôte. On peut citer plus particulièrement des bactéries, des préférence les bactéries telles que Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis ou E.coli. Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, pour l'expression dans Bacillus subtilis les éléments assurant l'expression du gène codant pour le variant de l'alpha-amylase contiennent la région régulatrice promoteur-SacR située en amont du gène de la lévane saccharase de Bacillus subtilis. Une telle construction est décrite dans la publication de brevet FR-A-2 582 316. Grâce à ce type de construction, l'aîpha-amylase est sécrétée dans le milieu extérieur dans des conditions où elle ne l'est pas naturellement, c'est-à-dire durant la phase exponentielle de croissance. Plus généralement, on peut utiliser la région régulatrice du gène codant pour l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis pour exprimer le gène codant pour le variant selon l'invention dans n'importe quel système hôte. L'invention a également pour objet les cellules hôtes transformées par un vecteur d'expression selon l'invention ainsi qu'un procédé de préparation des variants conformes à l'invention, selon lequel on cultive des cellules hôtes telles que définies précédemment dans des conditions de culture appropriées et on récupère le variant obtenu. Enfin, l'invention a pour objet l'utilisation des variants selon l'invention dans différentes industries textile, papetière, en brasserie, notamment pour l'empesage et la liquéfaction de l'amidon. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront à la lecture de la description détaillée suivante, en relation avec les figures 1 à 6 qui montrent - figure 1 : la séquence d'ADN d'un gène de structure de l'apha-amylase thermostable de Bacillus licheniformis ainsi que la séquence d'acides aminés correspondante. - figure 2 : la structure du plasmide pINA90l. - figure 3 : sous forme d'un courbe, l'évolution comparée de la thermostabilité de l'alpha-amylase His133 et du variant Tyr133 en fonction du temps d'incubation à 90"C en présence de 0,1 mM de Cas12. - figure 4 : la meme courbe que la figure 3 avec 1 mM de Caca,. - figure 5 : la meme courbe que la figure 3 avec 10 mM de Caca,. - figure 6 : un diagramme représentant la thermostabilité de différents variants en position 133 à des températures variables. - figure 7 : diagramme d'inactivation thermique de l'alphaamylase de B. licheniformis par rapport aux variants p841ts et p841ts Val209, à 90"C, pH6, 1 mM CaC12. - figure 8 : diagramme d'inactivation thermique de l'alphaamylase de B. licheniformis et des variants d'alpha-amylase à 90"C et pH6, 1 mM CaCI2. 133 Exemple 1 : Préparation du variant Tyr de l'alpha-amylase thermostable de Bacillus licheniformis. 1) préparation du gène On synthétise un oligonucléotide de 25 nucléotides de séquence : 5' TCA GGA GAA TAC CTA ATT AAA GCC CT 3', susceptible de s'hybrider à l'ADN du gène de structure dont la séquence est représentée à la figure 1, et d'y introduire après usage des techniques classiques de mutagénèse dirigée, le codon TAC correspondant à l'acide aminé Tyr à la place du codon CAC correspondant à l'acide aminé His en position 133. Afin de s'assurer qu'aucune modification autre que la mutation désirée n'est intervenue, on isole un fragment du gène de structure généré par les enzymes de restriction Sst II et Cla I encadrant le codon correspondant à l'acide aminé 133, on détermine sa séquence nucléotidique puis on l'introduit dans un gène naturel traité par les mêmes enzymes Sst II et Cla I, afin de reconstituer un gène entier. Grâce au gène ainsi reconstitué, il est certain que seule la modification effectuée sur la position 133 est présente et confére à la nouvelle enzyme ses propriétés. 2) Préparation du vecteur d'expression On prépare le plasmide PINTA901 dont la structure est représentée à la figure 2. I1 s'agit d'un vecteur à faible nombre de copies (10 à 40) possédant plusieurs sites de restriction uniques dans le gène de l'alpha-amylase pour faciliter le sous-clonage des fragments mutés. Ce plasmide pINA90î permet l'expression des gènes d'alpha-amylase à un niveau modéré, non toxique pour les cellules, mais suffisamment élevé pour la caractérisation des variants. Il porte l'origine de réplication (ORI) de type ColEl d'un plasmide à faible nombre de copies dérivé de pJRD158 (Davison et al., 1984). Contrairement à pBR322, le gène de résistance à l'ampicilline (Ap) ne contient pas de site PstI.La délétion d'un fragment Xhol-SalI a permis aussi d'éliminer le site SalI de pJRD158. On introduit un fragment EcoRI-HindIII de 2,9 kb portant le gène codant pour l'alphaamylase sauvage (Amy). Ainsi construit, ce vecteur possède 8 sites de restriction uniques qui partagent le gène amylase en segments de 120 à 600 kb et facilitent ainsi le sous-clonage de fragments mutés. On remplace ensuite le gène codant pour I'alpha-amylase par le gène préparé précédemment. 3) Expression du gène dans une souche de E.Coli On transforme une souche de E.Coli avec le plasmide préparé précédemment. Les cellules sont mises en culture en milieu liquide LB (Luria Broth) avec 100 mg/l d'ampicilline, puis elles sont reprises dans 1/2 volume de saccharose 25 % et agitées pendant 15 minutes à 20"C, puis de nouveau 15 minutes à 20"C en présence de saccharose 25 %, EDTA 10 mM. Après centrifugation, les cellules sont reprises dans l'eau glacée et centrifugée après 20 minutes à 0 C. 4) Détermination des caractéristiques du variant obtenu. La thermostabilité se définit comme étant l'activité amylolytique résiduelle après chauffage. L'activité amylolytique est mesurée par l'action dextrinifiante de l'enzyme. On utilise la méthode à l'iode en mesurant la densité optique à 620 nm d'une solution d'amidon à I % (pH = 5.8), en présence d'une solution iodo-iodurée. Les unités sont exprimées en DO par rapport à un témoin sans incubation. Un aliquot de surnageant de culture est soumis à l'action de la température pendant un temps donné et on mesure l'activité enzymatique résiduelle. L'activité amylolytique résiduelle est exprimée en pourcentage de l'activité par rapport à l'activité d'un aliquot non traité. La détermination de la demi-vie de la protéine obtenue est effectuée à 90"C, dans un tampon acétate de sodium 50 mM, pH 6. Elle dépend de la concentration en Ca ++ dans le milieu. L'ion Calf n'intervient pas dans la réaction catalytique mais joue un rôle structurel pour le maintien d'une structure biologiquemernt active. Les résultats obtenus pour dlfférentes concentrations d'ions Ca ++ sont illustrés par les figures 3 à 5 - pour une concentration de 0,1 mM Cas12, les demi-vies sont 133 respectivement de 8 et 5 minutes pour le variant Tyr et la forme naturelle. - pour une concentration de 1 mM CaC12 les demi-vies sont respectivement de 200 et 55 minutes. - pour une concentration de 10 mM CaC12, le variant Tyr133 conserve 95 % de son activité après 5 heures à 90"C, contre 50 % pour la forme naturelle. Exemple 2 : Préparation d'autres variants en position 133. On procède comme indiqué à l'exemple 1, sauf que la mutagénèse est est effectuée de façon à remplacer le codon codant pour His par un codon codant respectivement pour Ala(A), Glu(E), Pro(P), Lys(K), Leu(L), Ser(S), Gln(Q), Gly(G), Phe(F). La figure 6 indique les résultats de thermostabilité (activité résiduelle après chauffage) obtenus pour ces différents variants. Elle permet en outre de constater une relation entre le degré d'hydrophobicité de l'acide aminé substitué et la thermostabilité du variant de l'alpha-amylase obtenu. Il apparaît que les variants comportant à la position 133 une substitution par un acide aminé plus hydrophobe que His présentent effectivement une thermostabilité accrue par rapport à la forme naturelle. Les variants Pro, Ser, Gly, Ala sont donc indiqués uniquement à titre d'exemples comparatifs. Exemple 3 : Obtention d'un gène muté de l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis exprimant une protéine plus thermostable que la protéine sauvage. La nature même de l'enzyme rend difficile l'obtention de variants affectés dans la thermostabilité, en effet une activité amylolytique thermostable ne confère pas un avantage sélectif aux bactéries qui l'expriment, ce qui rend difficile l'usage de cribles génétiques simples, ou l'utilisation de cribles biologiques, comme il en a été décrit pour l'obtention de variants thermostables de la Kanamicine Nucléotidyltransférase (J. Biol. Chem., 1985, 260, 15298-15303), par l'utilisation de souches bactériennes thermophiles. Une stratégie de mutagénèse au hasard à partir d'une forme thermosensible de la protéine a donc été développée, afin d'isoler des mutations intragéniques capables de restaurer tout ou partie de la thermostabilité de la forme sauvage. Un tel variant thermosensible a été obtenu par mutagénèse dirigée, il s'agit de la double substitution Asp 164tAla et Trp 1653goy. La cinétique de dénaturation thermique à 90"C de ce variant thermosensible, appelé p841ts, est montrée dans la figure 7. A 90"C en présence de tampon acétate 50 mM contenant CaCl2 1 mM , plus de 90% de l'activité amylolytique est perdue après 8 minutes d'incubation alors que la protéine sauvage en conserve près de 100 %. I1 fallait choisir un système biologique peu sensible à la chaleur et de manipulation aisée pour la mutagénèse, le séquençage des mutants et la production d'amylase. Le système du phage simple brin M13 remplit toutes ces conditions: après un chauffage de 45 minutes à 800C la quasi totalité des particules phagiques reste infectieuse; le gène de l'alphaamylase s'y exprime dans les deux orientations à partir de son propre promoteur ; l'activité amylolytique est facilement repérable sur milieu amidon par la production de halos autour des plages, après coloration à l'iode; les facilités de manipulation tant pour la séquence nucléotidique que pour la mutagénèse sont évidentes. La totalité du gène de structure, codant pour le variant thermosensible de l'alpha-amylase p841ts, ainsi que la région promotrice, est cloné, sous forme d'un fragment EcoRI-HindIII de 2,8 Kb dans le phage M13mp18. Le phage recombinant obtenu est appelé M 13 mpl8 p841ts. La transcription du gène clone est sous le contrôle de son propre promoteur. Les particules phagiques sont mutagénisées à l'hydroxylamine (250 mM, tampon acétate pH6) et utilisées pour infecter E. coli TG1. Les cellules sont étalées sur milieu Luria broth, EDTA 1 mM et incubées une nuit à 37"C. Des aliquotes correspondants à 1-10% de particules phagiques survivantes sont utilisés pour l'expérience. Pour augmenter la sensibilité du test, de 1'EDTA lmM est ajouté au milieu afin de chélater les ions Calcium stabilisateurs de l'amylase. Les boites sont ensuite placées à haute température (80"C pendant 45 mn) et recouvertes d'une seconde couche de milieu LB gélosé, EDTA lmM, contenant 1 % d'amidon soluble. Après 45 minutes d'incubation à 50"C, les boites sont colorées par des vapeurs d'iode.Les phages produisant des amylases thermorésistantes sont détectées par l'apparition d'un halo ; dans ces conditions, I'amylase thermosensible ne produit pas de halo. Parmi 104 phages testés, on a pu isoler un phage produisant une amylase de thermostabilité nettement supérieure à la forme thermosensible. Le séquençage des gènes a révélé une mutation suppressive située en dehors du site de mutation d'origine. La substitution Ala209- > Val a été trouvée chez 3 variants indépendants, il est donc probable que seul un petit nombre de positions est susceptible de produire des variants de thermostabilité accrue. Introduite dans la protéine sauvage, la substitution Ala209- > Val augmente par un facteur deux la demie vie de la protéine à 90 C, ce qui constitue un gain appréciable pour cette protéine déjà extrêmement therm ostable. Cette même stratégie appliquée sur le gène cloné dans l'autre orientation dans le phage M13mp19, ainsi que l'utilisation d'un autre mutagène devrait permettre l'isolement d'autres mutations suppressives, de même que l'utilisation d'un autre variant thermosensible. Exemple 4 Par recombinaison in vitro, des gènes codant pour les protéines variantes Val209 et Tyr133, on a obtenu le variant protéique doublement Val 133 substitué -Tyr . Les effets de ces deux substitutions sur la thermostabilité de la protéine s'additionnent, la demie vie de l'amylase Val209 133 -Tyr , testée à 90 C en présence de tampon acétate 50 mM et de CaCl2 ImM, est de plus de 10 Heures, alors que celles de la protéine sauvage, et de chacun des variants Val209 et Tyr sont respectivement de 1h 30, 3h 30 et 4 heures (figure n 8). REVENDICATIONS 1. Variant thermostable de l'apha-amylase de Bacillus licheniformis caractérisé en ce que, par rapport à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1, sa séquence comporte au voisinage de 1' histidine (His) en position 133 au moins une substitution par un acide aminé plus hydrophobe que His, et/ou au voisinage de l'Alanine (Ala) en position 209 au moins une substitution par un acide aminé plus hydrophobe que Ala. 2. Variant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substitution au voisinage de la position 133 est effectuée par des acides aminés choisis parmi Phe, Leu, Tyr, Glu, Lys, Gln. 3. Variant de l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis His133 133 Tyr 4. Variant selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la substitution au voisinage de la position 209 est effectuéee par des acides aminés choisis parmi Val, Leu, Ile. 5. Variant de l'alpha-amylase selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'Alanine en position 209 est substituée par une Valine en position 209 6. Gène codant pour un variant selon l'une des revendications 1 à 5. 7. Gène codant pour un variant selon l'une des revendications 1 à 5, contenant la séquence d'ADN telle que représentée à la figure 1, sauf 133 que le codon codant pour His est remplacé par un codon codant pour Tyr133 et/ou le codon codant pour Ala209 est remplacé par un codon 209 codant pour Val 8. Vecteur d'expression d'un variant selon l'une des revendications 1 à 3, dans une cellule hôte, caractérisé en ce qu'il contient un gène selon la revendication 6 ou 7, ainsi que les éléments assurant son expression dans ladite cellule hôte. 9. Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce que les éléments assurant l'expression comprennent la région régulatrice du gène codant pour l'alpha-amylase de Bacillus licheniformis. 10. Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce que les éléments assurant l'expression comprennent la région régulatrice promoteur SacR localisée en amont du gène codant pour la lévane saccharase de Bacillus subtilis. 11. Cellule hôte transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 8 à 10. 12. Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce qu elle est choisie parmi Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis et E.coli. 13. Procédé de préparation des varlants selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on cultive les cellules hôtes selon l'une des revendications 11 ou 12, dans des conditions de culture appropriées et on récupère le variant obtenu. 14. Utilisation des variants selon l'une des revendications 1 à 5, dans l'industrie textile, papetière, en brasserie, notamment pour l'empesage et la liquéfaction de l'amidon.