Brevet FR2677023A1 — publié le 19921204

i Dérivés de coumarine hydrosolub Les, Leur préparation et Leur utilisation comme substrat d'enzyme. La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de coumarine hydrosolub Les et leur procédé de préparation à partir de nouveaux esters A-cétoniques à groupement hydrophile. Les coumarines sont une importante famille de mo Lécules présentant des applications très va- riées. En effet, en dehors de domaines comme la pharmacologie o elles peuvent jouer le rôLe d'anticoagulant, les coumarines sont très utilisées pour leurs propriétés optiques (fluorescence et chimi Luminescence), par exemple en tant que colorants pour lasers, produits fluorescents pour l'optique, produits pour la synthèse de substrats d'enzymes utilisés dans des dosages pour le diagnostic médical, et marqueurs de molécules biologiques, utiles égale- ment dans le domaine du diagnostic médical. Or, pour ces diverses applications, les coumarines ont l'inconvénient d'avoir une solubilité dans l'eau ou, dans des solvants hydrophiles comme les alcools et même dans des solvants mixtes (mélange eau-solvant organique) médiocre ou mauvaise, ce qui diminue leurs performances et leurs possibilités d'emploi. Dans le cas de la préparation d'un substrat d'enzyme, on réalise le plus souvent une combinaison chimique entre a) un colorant ou un produit fluores- cent et b) une molécule biochimique telle qu'un acide aminé, un peptide, un sucre ou une molécule d'acide phosphorique Le substrat ainsi formé doit présenter Les propriétés suivantes: ) Les caractéristiques de coloration ou de fluorescence de a) doivent être annulées ou très fortement diminuées dans le substrat, 2 ) le substrat doit être capable de réagir avec des enzymes spécifiques pour subir un clivage, 3 ) le clivage doit régénérer le produit colorant ou fluorescent a) et restaurer ainsi la couleur ou la fluorescence, et 4 ) cette restauration doit être proportionnelle à la quantité d'enzyme mise en oeuvre pour que les substrats puissent servir au dosage d'enzyme. Parmi les dérivés de coumarine connus, on a utilisé jusqu'à présent, pour la préparation de substrats d'enzymes; la 7-amino-4-méthyl coumarine et l'acide 7-amino-coumarine-4-méthane sulfonique, comme il est décrit dans Chem Pharm Bull, vol. , 1977, p 362-363 et dans Chem Pharm Bull, vol 36, 1988, p 3496-3502. Couplée à la leucine, La 7-amino-4-méthyl coumarine peut être utilisée par exemple comme substrat pour la L-leucine amino peptidase Cette coumarine est très intéressante car elle est très fluorescente avec un maximum d'intensité de fluorescence, environ 14 fois plus élevé que celui des amines utilisées habituellement comme substrat, telles que la -naphtylamine Par ailleurs, il y a une différence d'intensité de fluorescence importante entre l'aminocoumarine et le substrat correspondant amide. Cependant, comme il est indiqué dans Chem Pharm Bull vol 36, p 3496-3502 ( 1988), on doit utiliser avec cette aminocoumarine un mélange d'eau et de solvant organique tel que le sulfoxyde de diméthyle en raison de sa solubilité trop faible dans l'eau, ce qui constitue un inconvénient car de nombreuses enzymes comme l'encéphalinase sont sensibles aux solvants organiques; de plus la présence de solvant organique complique la procédure de dosage. Aussi, pour améliorer la solubilité dans l'eau de cette coumarine, on a remplacé le groupement méthyle en position 4 par le groupement méthane sulfonique plus hydrophile. Cependant, la synthèse de cette dernière aminocoumarine est assez compliquée; de plus, elle ne convient pas pour de nombreuses enzymes. La présente invention a précisément pour objet de nouveaux dérivés de coumarines hydrosolubles qui pallient ces inconvénients, grâce à la présence en position 4 du noyau coumarine d'une chaîne polyé- ther leur conférant une solubilité dans l'eau amélio- rée, sans modifier pour autant leurs propriétés fluorescentes ou colorantes. Ces dérivés de coumarine répondent à la formule: R 2 CH 2 R 1 R R 6 () R 3 R 4 O R 4 dans laquelle 1) R 1 représente un radical répondant aux formules (OCH 2 CH 2)m OCH 2 R 7, ou (OCH(CH 3)CH 2)m OCH 2 R 7, dans lesque Lles m est un nombre entier de 1 à 30, et R 7 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, OH, OR 8, SH, SR 8, COOH, COOR 9 CONHR , CONR 8 R 10, CONHNH 2, COON NH 2, NHR 8, NR 8 R 10, -503 H, 503 R 9, ou un radical alkyle, alcoxy ou aryle, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'halogène, le radical phényle, CF 3, OH, OR 8, SH, SR 8, COOH, COOR 9, NH 2, NHR 8, NR 8 R 10, 503 H et 503 R 9, o R 8 est un radical alkyle ou aryle, R 9 est un radical alkyle ou aryle, NH 4 ou Ml/v avec M étant un métal de valence v, et R 10 est un radical alkyle ou aryle, ou R 8 et R 10 peuvent former ensemble un cycle hydrocarboné, saturé ou insaturé comportant éventuellement un hétéroatome choisi parmi O, S et N, 2) R 2, R 3, R 4 et R 5 qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, NH 2, NHR 8, NR 8 R 1 0, NHR 11, NR 8 R 11, SH SR 8 SR 11 OH OR 8 OR 11 avec R 8 et R 10 ayant la signification donnée ci-dessus, et R 11 représentant un radical acyle dérivé d'un composé choisi parmi les acides aminés, les peptides, les acides carboxyliques et les acides gras, le radical P 03 R 2avec R étant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, ou un radical dérivé d'un sucre, ou un radical alkyle ou alcoxy, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'halogène, OH, OR 8, SH, SR 8, COOH, COOR 9, NH 2, NHR 8, NR 8 R 10, 503 H, 503 R 9, SR 11, OR 11, CF 3, NHR 11 et NR 8 R 11 avec R 8, R 9, R 10 et R 11 ayant la signification donnée ci-dessus, ou 3) R 2 et R 3, R 3 et R 4 ou R 4 et R 5 forment ensemble un noyau cyclique saturé ou insaturé de 5 à 8 atomes de carbone, ou un noyau hétérocyclique comportant au moins un hëtéroatome choisi parmi N, O et S, ou 4) R 3, R 4 et R 5 forment avec Le noyau phényle auquel ils sont liés un noyau polycyclique, à trois cycles condensés comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, ou ) R 2, R 3 et R 4 forment avec le noyau phényle auquel ils sont liés un noyau polycyclique, à trois cycles condensés, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, et 6) R 6 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, COOH, COOR 9 avec R 9 ayant la signification donnée ci-dessus, ou un radical alkyle, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'halogène, OH, SH, COOH, COOR 9, OR 8, SR 8, 503 H et 503 R 9avec R 8 et R 9 ayant la signification donnée ci-dessus. Dans la formule donnée ci-dessus, les termes radical alkyle ou alcoxy désignent des radi- caux linéaires ou ramifiés ayant généralement de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence 1 à 5 atomes de carbone. Les termes radical aryle désignent les radicaux dérivés d'hydrocarbures aromatiques comme le benzène, le naphtalène A titre d'exemple de tels radicaux, on peut citer les radicaux phényle, naphtyle Les termes de cycle hydrocarboné désignent des hydrocarbures cycliques saturés ou insaturés ayant de 3 à 10 atomes de carbone. Lorsqu'ils comportent un ou plusieurs hétéroatomes, il peut s'agir par exemple de la pipéridine, de la pyridine, de la pipérazine, du pyrrole, du furanne, du pyranne, de la morpholine. Les acides aminés utilisés pour R 11 peuvent être les acides aminés naturels, en particulier ceux servant de substrats pour des enzymes. Les peptides utilisés sont ceux formés de plusieurs acides aminés, en particulier les acides aminés naturels. Les sucres utilisés pour R 11 peuvent être des oses tels que le glucose, le mannose, le galactose. Lorsque R 2 et R 3, R 3 et R 4 ou R 4 et R 5 forment un cycle, il peut s'agir des cycles hydrocar- bonés et des hétérocycles mentionnés ci-dessus. Lorsque R 2, R 3 et R 4 ou R 3, R 4 et R 5 forment avec le noyau phényle, un noyau polycyclique comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroa- tomes, il peut s'agir par exemple du noyau suivant: Les métaux M représentant R 9 peuvent être par exemple des métaux alcalins comme le sodium. Dans la formule (I) ci-dessus, la présence du radical R 1 qui comporte une chaîne polyether, permet de conférer aux dérivés de coumarine Les propriétés d'hydroso Lubilité, tandis que la présence d'au moins un substituant R 2, R 3, R 4 ou R 5 permet de conférer aux dérivés, d'autres propriétés, par exemple, renforcer les propriétés fluorescentes et chimiluminescentes de la coumarine, constituer un substrat d'enzyme, ou permettre la synthèse de substrats d'enzymes utilisables pour des dosages d'enzymes. Aussi, selon un premier mode de réalisation de l'invention, au moins l'un des R 2, R 3, R 4 et R 5 représente NH 2, NHR 8, NHR 11, NR 8 R 11, SH, OH, SR 11 ou OR 11 avec R 8 et R 11 ayant la signification donnée ci-dessus. De préférence, dans ce premier mode de réalisation de l'invention, un seul des R 2, R 3, R 4 et R 5 représente NH 2, NHR 8, NHR 11, NR 8 R 11, SH, OH, SR 11 ou OR 11 Dans ce cas, les autres représen- tent généralement un atome d'hydrogène. De préférence encore, R 2, R 3 et R 5 repré- sentent un atome d'hydrogène et R 4 représente l'un des substituants précités. Ce premier mode de réalisation est particu- lièrement adapté à l'utilisation des dérivés de coumarine comme substrats d'enzymes pour des dosages d'enzyme. En effet, lorsque R 2, R 3, R 4 ou R 5 représente un groupe choisi parmi NH 2, NHR 8, SH et OH, par exemple NH 2 ou OH, on peut facilement coupler le dérivé de coumarine à un composé approprié pour la réalisation d'un substrat d'enzyme par réaction du composé avec ce groupe substituant. Ces dérivés constituent des produits intermédiaires très intéressants car, à partir d'un seul dérivé, on peut réaliser toute une gamme de substrats d'enzymes en faisant réagir ce produit avec des composés appropriés. Lorsque R 2, R 3, R 4 ou R 5 représente NHR 11, NR 8 R 11,SR 11ou OR 11, R 11 est choisi de façon à conférer au dérivé de coumarine la propriété d'être un substrat d'enzyme. A titre d'exemple de te Ls substrats, on peut citer le dérivé de coumarine de formule (I) dans lequel R 4 représente NHR 11 avec R 11 étant le radical dérivé de La L-leucine de formule: (CH 3)2 CH-CH 2-C(NH 2)-C(O)-, qui constitue un substrat de La L-leucine aminopeptidase. Généralement, dans ce premier mode de réalisation de l'invention R 6 représente un atome d'hydrogène, mais il pourrait aussi représenter un substituant permettant d'améliorer encore l'hydrosolubilité ou la fluorescence. Selon un second mode de réalisation de l'invention, plus particulièrement destiné aux dér ivés de coumarine utilisés comme produit fluores- cent ou comme colorant, au moins l'un des R 2, R 3, R 4 et R 5 représente NH 2, NHR 8, NR 8 R 10, OH, OR 8 SH, SR 8 ou un radical alkyle substitué ou non, afin de renforcer les propriétés fluorescentes, ou colorantes, ou l'hydrosolubilités de la coumarine. Dans une variante de ce second mode de réalisation, R 2, R 3 et R 4 ou R 3, R 4 et R 5 forment avec le noyau phènyle auquel ils sont liés, un noyau polycyclique comportant trois cycles condensés et un atome d'azote, ce qui permet également de renforcer les propriétés fluorescentes ou colorantes. Dans les deux modes de réalisation de l'invention, R 1 représente avantageusement -(OCH 2 CH 2)m OCH 2 R 7. A titre d'exemple R 7 peut représenter un atome d'hydrogène, COOR 9 ou COOH. Les dérivés de coumarines de l'invention peuvent être préparés par un procède classique mettant en oeuvre la réaction de Pechman, à partir de nouveaux esters P-cétoniques comportant le groupe- ment hydrophile R 1. Aussi, l'invention a également pour objet ces nouveaux esters Pcétoniques, qui répondent à la formule: R 1-CH 2-CO-CH(R 6)-COOR 12 (II) dans laquelle R 1 et R 6 ont la signification donnée ci-dessus, et R 12 représente un radical alkyle, un radical aryle ou un radical cycloalkyle. De préférence, R 6 est un atome d'hydrogène. Les radicaux alkyle ou aryle représentant R 12 peuvent être du même type que ceux décrits précédemment en relation avec la formule (I) Les radicaux cycloalkyle ont généralement de 5 à 7 atomes de carbone. De préférence, on utilise pour R 12 un radical alkyle ayant de I à 4 atomes de carbone, par exemple le radical méthyle ou éthyle. Ces esters A-cétoniques peuvent être préparés par un procédé classique à partir des acides de formule R 1-CH 2-COOH. Le procédé de préparation de ces esters 1-cétoniques comprend, par exemple les étapes suivan- tes: ) transformer un acide de formule R 1- CH 2-COOH dans laquelle R 1 a la signification donnée ci-dessus, en l'imidazolide ou le chlorure d'acide correspondant, 2 ) faire réagir l'imidazolide ou Le chlorure d'acide aveç un ester de formule: R 6 CH' C( CH 32 (III) C O / pour former un dérivé acylé, et 3 ) faire réagir le dérivé acylé avec un alcool de formule R 120 Hpour obtenir l'ester P 3-cétonique de formule (II). Les acides de départ R 1-CH 2-COOH sont des produits du commerce ou peuvent être préparés par des procédés classiques. L'ester de formule (III) existe dans le commerce (acide de Meldrum) ou peut être préparé par un procédé classique en partant de l'acide de Meldrum ou d'un malonate de diéthyle et en pratiquant deux substitutions successives sur le CH 2 malonique. Pour préparer les dérivés de coumarines de formule (I) de l'invention, on fait réagir l'ester P-cétonique de formule (II) décrit ci- dessus avec un phénol de formule: R 2 R 3 O (IV) R 4 OH R 5 dans Laquelle R 2 ' R 3, R 4 et R 5 ont la signification donnée ci-dessus. Cette réaction de condensation (réaction de Pechmann) peut être effectuée dans l'éthanol en présence d'un catalyseur acide tel que H 2504, H Cl, CF 3 COOH ou leurs sels, par exemple le chlorure d'aluminium, le chlorure de zinc, le chlorure d'étain. Lorsque l'un des R 2, R 3, R 4, R 5 est un substituant du type NHR 11, NR 8 R 11, SR 11 ou OR 11 on préfère généralement préparer tout d'abord le dérivé de coumarine dans lequel ce substituant est NH 2, NHR 8, SH ou OH et le transformer en le substituant voulu par réaction avec un composé capable d'apporter R 11. Ainsi, lorsque R 11 est un radical dérivé d'un acide aminé, on peut faire réagir l'acide aminé avec le dérivé de coumarine comportant un substituant NH 2 ou NHR 8, SH ou OH pour former une liaison du type peptide ou du type ester. Les phénols utilisés pour la réaction peuvent être prépares par des procédés classiques ou sont des produits du commerce. L'utilisatio Qn des esters /P-cétoniques de formule (II) décrits ci-dessus est intéressante car elle permet d'inclure directement sur le noyau de la coumarine une chaîne du type polyéther sans l'intermédiaire d'un groupe labile, par exemple du type CO-NH, susceptible d'être clivé par certaines enzymes. Comme on l'a vu plus haut, les dérivés de coumarines correspondant au premier mode de réalisation de l'invention qui comportent un groupe- ment R 11 sur l'un des R 2, R 3, R 4, et R 5, peuvent être utilisés comme substrats d'enzymes dans un procédé de dosage d'enzymes. Pour ces dosages, on peut utiliser le dérivé tel quel, ou sous la forme d'un sel d'addition aux acides, par exemple sous la forme de chlorhydra- te. Pour effectuer un tel dosage, on prépare tout d'abord une solution d'un dérivé de coumarine de formule (I) dans laquelle R 2, R 3, R 4 ou R 5 repré- sente NHR 11, NR 8 R 11, SR 11 ou OR 11 avec R 11 pouvant jouer le rôle de substrat pour l'enzyme à doser, on détermine l'intensité de fluorescence de la solution du dérivé de coumarine ainsi prépare, puis on ajoute à cette solution un échantillon de la solution d'enzyme à doser et on détermine après une durée déterminée, par exemple après 6 min, l'intensité de fluorescence de la solution On détermine ensuite La concentration en enzyme de la solution à doser à partir d'une courbe étalon donnant les variations de l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration en enzyme, qui a été élaborée à partir d'échantillons ayant des concentrations connues en enzyme en réalisant les dosages dans Les mêmes conditions. Lors de ce dosage, l'enzyme présente dans l'échantillon à doser hydrolyse le substrat d'enzyme en régénérant le dérivé de coumarine par exemple le dérivé de formule (I) avec R 4 représentant NH 2, NHR 8, OH ou SH qui présente une, fluorescence beaucoup plus importante que le dérivé dans lequel R 4 représente NHR 11, SR 11, NR 8 R 11 ou OR 11 La restauration de l'activité fluorescente est proportionnelle à la quantité d'enzyme de l'échantillon. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif en référence au dessin annexé sur lequel Les figures 1, 2, 4, 7, 10, 12, 15, 16, 18, 20 et 23 sont les spectres RMN de composés de l'invention, Les figures 3, 5, 6, 8, 9, 11, 13, 14, 17, 19, 21 et 22 sont les spectres de masse des composés de l'invention, la figure 24 est une courbe représentant la vitesse initiale (en p M/min) de la réaction enzymatique dans le cas d'un substrat enzymatique de l'invention en fonction de la concentration en substrat (en FM), la figure 25 est une courbe d'étalonnage représentant l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration en enzyme (Cg/ml). Exemp Le 1: Préparation du 3,6 9-trioxadécanoyle acétate d'éthyle (composé n O 1). Ce composé est un ester P-cétonique de formule (II) avec R 1 =(OCH 2 CH 2)20 CH 3 R 12 =C 2 H 5 R 6 =H Dans un premier récipient, on prépare une solution anhydre de 29 g d'acide 3,6,9-trioxadéca- no;que ( 0,16 mol) dans 400 ml de dichlorométhane, puis on introduit dans cette solution, sous agita- tion, 28,3 g ( 0,174 mol) de carbonyldiimidazole et on poursuit l'agitation pendant 2 h. Dans un second récipient, on introduit 24,65 g d'acide de Meldrum dans 400 ml de dichlorométhane anhydre, puis on refroidit à -5 C et on ajoute 12,9 g de pyridine dans 24 ml de dichlorométhane. En maintenant le second récipient à -5 C, on introduit sur une durée de 30 min, à l'abri de la lumière, la solution du premier récipient, puis on porte à 40 C pendant 15 min. On ajoute ensuite 165 ml d'eau glacée en refroidissant, puis on Laisse décanter On Lave alors la phase organique avec 120 ml de H Cl 2,5 N, puis avec 120 ml de solution saline saturée, et on évapore jusqu'à siccité. On reprend alors le résidu dans 500 ml d'éthanol anhydre et on porte au reflux pendant 2 h 30 On évapore sous vide et on obtient ainsi 12,1 g de composé n 1-, ce qui correspond à un rende- ment de 30 %. Les caractéristiques de ce composé sont les suivantes: 1 ) point d'ébul Lition sous 54 Pa: 140-145 C. 2 ) Chromatographie sur couche mince (CCM) de silice fluorescente, en utilisant comme éluant un mélange butanol/acide acétique/eau ( 60:20:20): Rf = 0,7, révélé sous ultraviolet à 254 nm, aux vapeurs d'iode, et à la 2,4 DNPH, 3 ) Spectre RNM (résonance magnétique nucléaire) Les figures 1 et 2 représentent respective- ment le spectre (RMN) du proton et du carbone 13. Ces spectres confirment bien la structure du produit. Exemple 2: Préparation du 10-carboxybenzyl-3,6,9- décanoyl acétate d'éthyle (composé n 2). Ce composé est un ester A-cétonique répon- dant à la formule (II) avec R 1 =(OCH 2 CH 2)20 CH 2-COO-CH 2-C 6 H 5, R 12 =éthyle. R 6 =H. Pour cette préparation, on part de l'acide 3,6,9-trioxaundécane-1,11 dioique que l'on transforme en ester monobenzylique par couplage en présence de dicyclohexyl carbodiimide On transforme ensuite cet ester monobenzylique en l'ester P-cétonique en utilisant le même mode opératoire que dans l'exem- ple 1. a) Preparation de l'ester monobenzylique de l'acide 3,6,9-trioxa-undécane-1,11-dioique. (composé n 3) de formule: HOOC-CH 2-(OCH 2 CH 2)2-OCH 2-COO-CH 2-C 6 H 5 On introduit 10,8 g d'alcool benzylique et 0,7 g de aminopyridine (DMAP) sur une solution anhydre de 88,9 g d'acide 3,6,9-trioxa-undécane- 1,11-dioique dans 700 ml de CH 2 CL 2 En refroidissant à 5 C, on introduit 20,6 g de dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) dans 40 ml de dichlorométhane anhydre On agite pendant 2 h à la température ambiante, puis on filtre le précipité formé On lave le filtrat avec 150 ml d'acide chlorhydrique 1 N, 15 Orl d'eau, puis 2 fois 200 ml de bicarbonate de sodium 0,8 N. On acidifie la solution de bicarbonate par addition de l'acide chlorhydrique 3 N pour ajuster son p H à 2, puis on l'extrait par 3 fois 150 ml de dichlorométhane On évapore les extraits organiques jusqu'à siccité et on obtient ainsi 11,7 g d'ester monobenzylique (composé n 3), ce qui correspond à un rendement de 38 %. Les caractéristiques du produit sont les suivantes: 1 ) La chromatographie sur couche mince de silice fluorescente en utilisant comme èluant un méLange de butanol, d'acide acétique et d'eau ( 60:20:20) donne un Rf de 0,5, révélé sous ultravio- Let à 254 nm et aux vapeurs d'iode. 2 ) Spectrométrie de masse (ionisation à l'ammoniac). La figure 3 représente le spectre de masse de ce produit Le pic à 313 (M+ 1) et 330 (M+ 18) confirme la masse du produit qui est de 312. 3 ) Spectre RMN ( 200 M Hz). La figure 4 représente le spectre du proton et confirme la structure du produit. b) Préparation du 10-carboxybenzy L-3,6,9- décanoyl acétate d'éthyle (composé n 2). Dans un premier récipient, on prépare une solution de 10 g de l'ester monobenzylique préparé en a) (composé n 3) dans 16 ml de dichlorométhane, puis on introduit sous agitation 5,71 g ( 0, 035 mol) de carbonyl diimidazo Le et on poursuit l'agitation pendant 2 h. Dans un second récipient, on introduit ,04 g d'acide de Meldrum dans 16 ml de dichlorométhane anhydre, puis on refroidit à -5 C et on ajoute 2,5 g de pyridine dans 6 ml de dichlorométhane. On introduit ensuite dans ce second réci- pient, toujours à -5 C, sur une durée de 30 min et à l'abri de l'air, la solution d'imidazolide du premier récipient, puis on porte à 40 C pendant min. Sous refroidissement, on ajoute 24 ml d'eau glacée, on décante et on lave La phase organi- que avec 15 ml de H Cl 2,5 N et 15 ml de solution saline saturée, puis on évapore la phase organique jusqu'à siccit 4. On reprend le résidu dans 100 ml d'éthanol anhydre, on porte au reflux pendant 2 h 30, et on évapore sous vide On purifie sur une colonne de silice en utilisant comme éluant un mélange CH 2 C 12/tétrahydrofurane THF ( 90:10). On obtient ainsi 4,7 g du composé n 2 (fractions 22 à 43), ce qui correspond à un rendement de 39 %. Les caractéristiques du produit sont les suivantes. -1 ) Chromatographie sur couche mince. En utilisant la silice fluorescente K 6 F et un mélange butanol acide acétique eau ( 60:20:20) comme solvant, on obtient un Rf de 0,55 révélé à 254 nm, 365 nm, et à l'iode. ) Spectrométrie de masse (ionisation chimique à l'ammoniac). La figure 5 représente le spectre de masse du composé n 2. Le pic à M+ 1 = 383 confirme la masse moléculaire du produit ( 382). Exemple 3: Preparation de la 7-amino-4-( 2 ',5 ',8 '- trioxanonyl)coumarine (composé n 4) de formule CH 2 (OCH 2 CH 2)20 CH , H 2 N Ce composé répond à la formule (I) avec R 1 =(OCH 2 CH 2)20 CH 3 R 2 =R 3 =R 5 =R 6 =H, et R 4 =NH 2. Dans un ballon de 100 ml, on introduit g ( 0,06 mol) de composé n 1, 6,6 g ( 0,06 mol) de 3-aminophénol, 45 ml d'éthanol absolu et 9,5 g de ch Lorure de zinc On porte le méLange réactionnel à L'ébul Lition sous agitation pendant 24 h, puis on Le verse dans un mélange de 800 m L de dich Loromé- thane et de 600 ml d'eau On laisse décanter, on extrait La phase aqueuse avec deux fois 200 m L de dichlorométhane et on Lave Les phases organiques réunies avec 120 m L d'eau On évapore jusqu'à siccité. On fait crista L Liser dans 50 m L d'acétate d'éthy Le, on purifie Le produit brut obtenu sur une colonne de si Lice en utilisant l'acétate d'éthyle comme éluant et on recrista L Lise dans L'acétate d'éthyle. On obtient ainsi 2,67 g du composé n 4, ce qui correspond à un rendement de 15 %. Les caractéristiques du produit sont Les suivantes. 1 ) CCM (si Lice fluorescente K 6 F, acétate d'éthyle) Rf= 0,5 (révéLation à 254 nm, 356 nm, I 2). 2 ) Spectrométrie de masse (ionisation chimique à L'ammoniac). * La figure 6 représente Le spectre de masse Le pic à M+ 1 = 294confirme bien La masse mo Léculaire de 293. 3 ) RMN ( 200 M Hz). La figure 7 représente Le spectre du proton obtenu et confirme La structure du produit. 4 ) So Lubi Lité dans l'eau: lg/l. Exemple 4: Preparation de La 7-diméthy Lamino-4- ( 2 ',5 ',8 '-trioxanony L)coumarine (composé n 5) de formule: CH 2 (OCH 2 CH 2) 20 CH 3 CH ' R 35 O JJ Dans un erlenmeyer de 25 ml, on introduit 2,06 g ( 15 mmol) de 3-diméthylaminophénol, 3,72 g ( 15 mmol) de composé n 1, 7 ml d'éthanol absolu et 2,35 g de chlorure de zinc. On porte à l'ébullition sous agitation pendant 24 h et on verse la solution dans un méLange de 200 ml de dichlorométhane et de 150 ml d'eau. On extrait la phase aqueuse avec deux fois 50 ml de dichlorométhane et on lave les phases organiques réunies avec 50 ml d'eau On évapore ensuite jusqu'à siccité. On purifie le produit obtenu sur colonne de silice en utilisant l'acétate d'éthyle comme é luant. On obtient ainsi 3,36 g du composé n 5, ce qui correspond à un rendement de 70 %. Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 1 ) CCM (silice fluorescente K 6 F, acetate d'éthyle). Rf= 0,55 révélé à 254 nm, 365 nm et à l'iode. 2 ) Spectre de masse (ionisation chimique à l'ammoniac). La figure 8 représente le spectre obtenu. Le pic à M+ 1 = 322confirme la masse moléculaire de 321. Exempte 5: Preparation de la 7-diéthylamino-4- ( 2 ',5 ',8 '-trioxanonyl) coumarine (composé n 6) de formule CH 2 (OCH 2 CH 2)20 CH 3 C 2 H S N 7 zc C 2 H 5 J j On suit le même mode opératoire que dans l'exemple 4 pour préparer ce composé en partant du composé n 1, mais en utilisant 2,48 g ( 15 mmol) de 3-diéthylaminophénol au lieu des 2,06 g de 3-dimé- thylaminophénol, en purifiant le produit brut sur une colonne de silice, mais en utilisant comme éluant CH 2 CL 2 puis deux mélanges CH 2 C 12-THF ( 95:5 et 90:10). On obtient ainsi 3,1 g du composé n 6, ce qui correspond à un rendement de 60 %. Les caractéristiques du produit sont Les suivantes. 1 ) CCM (silice fluorescente K 6 F, butanol- acide acétique, 60:20:20). Rf= 0,68 révé 14 à 254 nm, 356 nm et à l'iode. 2 ) Spectre de masse (ionisation chimique à l'ammoniac) La figure 9 représente ce spectre Le pic à M+ 1 = 350 confirme la masse moléculaire de 349. 3 ) RMN ( 200 M Hz) La figure 10 représente le spectre du proton qui confirme la structure du,composé. Exemple 6: Préparation de 2,3,6,7-tétrahydro- 9-( 2 ' 5 ',8 '-trioxanonyl)-1 H, 5 H 11 H-( 1)-benzopyrano- ( 6,7,8-ij)-quinolizinone-11 (composé no 7) de formu- le: H 2 (OCH 2 CH 2) 20 CH 3 o o Dans un ballon de 100 ml, on introduit 3 g de 8-hydroxyjulolidine, 3,93 g de 3,6,9-trioxadéca- noate d'éthyle, 12 ml d'éthanol absolu et 2,49 g de chlorure de zinc On porte à l'ébullition sous agitation pendant 24 h, puis on verse le contenu du ballon dans un mélange de 200 ml de dichlorométhane et de 150 ml d'eau On extrait la phase aqueuse avec deux fois 50 m L de dichlorométhane et on lave les phases organiques réunies avec 50 ml d'eau, puis on évapore jusqu'à siccité. On purifie le produit brut sur une colonne de silice en utilisant comme éluant CH 2 CL 2 puis le mélange CH 2 CL 2-THF ( 90:10) et on fait cristalliser l'huile obtenue dans de l'eau. On obtient ainsi 3,09 g du composé n 7, ce qui correspond à un rendement de 52 %. Les caractéristiques du produit sont les suivantes: ) CCM (silice fluorescente K 6 F, CH 2 CL 2- THF, 90:10). Rf= 0,6 révélé à 254 nm, 356 nm et à l'iode. 2 ) Spectre de masse (ionisation chimique à l'ammoniac). La figure 11 représente le spectre obtenu. Le pic à M+ 1 = 374 confirme bien la masse moléculaire de 373. 3 ) RMN ( 200 M Hz) 4 ) Solubilité dans l'eau: 0,2 g/l. ) Solubilité dans le mélange éthanol- eau ( 30:70):3 g/1. La figure 12 représente le spectre du proton qui confirme bien la structure attendue. Exemple 7: Préparation de la 2,3,6,7-tétrahydro- 9-( 9 '-carboxyéthyl-2 ',5 ',8 ' trioxanonyl)-1 H,5 H,11 H- ( 1)-benzopyrano-( 6,7,8-ij)-quinolizinone-11 (composé n 8) de formule: CH 2 (OCH 2 CH 2)20 CH 2 COOC 2 H 5 O O Dans un ballon de 100 ml, on introduit 2,23 g de 8- hydroxyjulolidine, 4,6 g du composé n 2, 13,5 ml d'éthanol absolu et 1,85 g de chlorure de zinc On porte à l'ébullition sous agitation pendant 24 h, puis on verse le -contenu du ballon dans un mélange de 450 ml de dichlorométhane et de 170 ml d'eau On extrait la phase aqueuse avec deux fois m L de dichlorométhane, et on lave les phases organiques avec 50 ml d'eau, puis on évapore jusqu'à siccité. On purifie le produit brut sur une colonne de silice en utilisant comme éluant CH 2 CL 2puis CH 2 CL 2: THF ( 95:5). On obtient ainsi 5,25 g du composé n 8, ce qui correspond à un rendement de 60 %. Les caractéristiques du produit sont les suivantes: 1. ) CCM (silice fluorescente K 6 F, CH 2 CL 2- THF, 95:5) Rf= 0,42 révélé à 254 nm, 356 nm et à l'iode. 2 ) Spectre de masse (impact électronique). La figure 13 représente le spectre obtenu. Le pic moléculaire à M= 445 confirme bien la masse du produit. Exemple 8: Préparation de la 2,3,6,7-tétrahydro- 9-( 9 '-carboxy-2 ',5 ',8 '-trioxanonyl)-l H,5 H,11 H-( 1)- benzopyrano-( 6,7,8-ij)-quinolizinone-11 (composé n 9) de formule CH 2 (OCH 2 CH 2)20 CH 2 COOH O O On dissout 3,17 g ( 7,11 mmol) du composé n 8 dans 63 ml de méthanol et on introduit 95 m L d'eau contenant 626 mg ( 15 mmol) de soude On chauffe à 50 C sous agitation pendant 1 h à l'abri de la lumière, puis on ramène à 20 C On acidifie à p H 1,5 avec H Cl 3 N et on agite durant 30 min On ramène le p H à 6,4 avec de La soude 3 N et on agite pendant 30 min On évapore partiellement le méthanol sous vide et on extrait les impuretés avec 200 ml de dichlorométhane, puis on évapore à sec sous vide et on reprend le résidu dans 50 ml d'éthanol On filtre les sels minéraux et on met à sec. On obtient ainsi 2,5 g du composé n 9 sous la forme d'une huile se solidifiant lentement, ce qui correspond à un rendement de 84 %. Les caractéristiques de ce produit sont les suivantes. 10) CCM (silice fluorescente K 6 F, butanol acide acétique eau 60:20:20). Rf= 0,45 révélé à 254 nm, 356 nm et à l'iode. 2 ) Spectre de masse (ionisation chimique à l'ammoniac). La figure 14 représente le spectre obtenu. Le pic à M= 256 révèle une fragmentation entre le carbone et le premier oxygène de la chaîne latérale correspondant au substituant R 1. 3 ) Spectre RMN La figure 15 représente le spectre du proton qui confirme la structure du composé. La figure 16 représente le spectre du carbone 13 de ce composé. Exemp Le 9: Préparation de la 7-hydroxy-4-( 2 ',5 ',8 '- trioxanonyl)-coumarine (composé n 10) de formule: CH 2 (OCH 2 CH 2)20 CH 3 HO O O Dans un ballon de 25 ml, on introduit 3,3 g (O,03 mol) de résorcinol, 7,4 g ( 0,03 mol) de composé n 1 et 7,5 ml d'acide trifluoroacètique. On agite à 75 C pendant 5 h, puis on verse le contenu du ballon dans un mélange de 300 g d'eau et de glace. On extrait par deux fois 150 m L de butanol et on lave les phases butanoliques par deux fois 50 ml d'eau, puis on évapore jusqu'à siccité. On purifie le produit b Cut par chromatogra- phie sur colonne de silice en utilisant l'acétate d'éthyle comme éluant et on recristallise les frac- tions les plus pures dans un mélange éthanol-eau ( 30:70). On obtient ainsi 2 g du composé n 10, ce qui correspond à un rendement de 23 %. Les caractéristiques du produit sont les suivantes: 1 ) CCM (silice fluorescente K 6 F, acétate d'éthyle). Rf= 0,48 révélé à 254 nm, 356 nm et à l'iode. 2 ) Spectre de masse (ionisation chimique à l'ammoniac) La figure 17 représente le spectre obtenu. Les pics à 295 (M+ 1) et à 312 (M+ 18) confirment la masse mo Léculaire de 294. ) Spectre RMN du proton ( 200 Mhz). La figure 18 représente Le spectre obtenu qui confirme la structure du composé. 4 ) Solubilité dans l'eau: lg/l. 5 ) Solubilité dans le méLange eau-éthanol ( 90:10): 7 g/L. Exemp Le 10: Préparation de la 4-( 2 ',5 ',8 '-trioxano- nyl)-escu Létine (composé n 11) de formule: CH 2 (OCH 2 CH 2)2 CH 3 HO 2 2 20 OCH 3 HO O Dans un ballon de 100 ml, on introduit 3,05 g ( 12 mmol), de triacétoxybenzène ( 12 mmol), 3 g ( 12 mmol) du composé n 11, puis 14 ml d'acide sulfu- rique On porte à 80 C pendant 30 min, puis on refroi- dit et on verse sur un mélange de 50 ml d'eau et ml de n- butanol On sépare la phase organique et on la rince avec 4 fois 50 ml d'eau, puis on évapore sous vide. On purifie le produit sur colonne de silice en utilisant comme éluant le mélange dichloro- méthane-méthanol ( 75:25) On évapore les fractions purifiées, on les reprend dans le dichlorométhane, puis on élimine un insoluble et on concentre à sec. On obtient ainsi 270 mg de composé n 11, ce qui correspond à un rendement de 8 %. Les caractéristiques du produit sont les suivantes: 10) CCM (silice fluorescente K 6 F, CH 2 CL 2- Me OH, 75:25). Rf= 0,85 révélé à 254 nm, 356 nm et au chlorure ferrique. 2 ) Spectre de masse (ionisation chimique à l'ammoniac). La figure 19 représente le spectre obtenu. Les pics à 311 ( 310 + 1) et 328 ( 311 + 17) confirment la masse moléculaire du produit. ) Spectre RMN du proton ( 200 M Hz). La figure 20 représente le spectre obtenu qui confirme la structure du composé. Exemple 11: Préparation du N-carbobenzyloxy-L- leucine-4-( 2 ',5 ',$'-trioxanonyl)-7-coumarinylamide (composé n 12) de formule: CH 2 (OCH 2 CH 2)20 CH 3 CH 3 CH-CH-CH-CO-NH O J 2 CH i CH 3 NH-COOCH 2-C 6 H 5 Dans cet exemple, on couple le composé n 4 avec la N-carbobenzyloxy-Lleucine pour préparer un substrat d'enzyme en utilisant le dicyclohexylcar- bodiimide (DCCI). Dans un erlen de 25 ml, on dissout 1,06 g ( 4 mmol) de Ncarbobenzyloxy-L-leucine et 1,17 g ( 4 mmol) du composé n 4 dans 10 ml de dimèthylformami- de On introduit sous agitation 989 mg ( 4,8 mmo L) de DCCI et on agite pendant 2 h,puis on filtre le précipité formé On verse sur un mélange de ml d'eau et 50 ml de dichlorométhane, on lave la phase organique avec 20 ml de HCL 1 N, 20 ml de bicarbonate de sodium à 0,5 % et 20 ml d'eau On sèche ensuite la solution et on la concentre à sec. On obtient ainsi 2 g du composé n 12, ce qui correspond à un rendement de 92,6 %. Les caractéristiques du produit sont les suivantes. 1 ) CCM (silice fluorescente K 6 F, butanol acide acétique eau, 60:20:20). Rf= 0,72 révelé à 254 nm et 356 nm. 2 ) Spectre de masse (ionisation chimique à l'ammoniac). La figure 21 représente le spectre obtenu. Les pics à 541 (M+ 1) et à 558 (M+ 18) confirment bien la masse moléculaire de 540. Exemple 12: Preparation du N-carbobenzyloxy-L- leucine-4-( 2 ',5 ',8 '-trioxanonyl)-7-coumarinylamide (composé n 12). Dans cet exemple, on utilise un autre procédé pour préparer le composé n 12 de l'exemple 11 Dans ce cas, on réalise le couplage du composé n 4 avec la N-carbobenzyloxy-L-leucine après forma- tion intermédiaire d'un anhydride mixte de la N- carbobenzyloxy-L-leucine. Dans un ballon de 250 ml, on introduit à l'abri de l'humidité, 72 ml de THF anhydre, 3,62 g ( 13,7 mmol) de N-carbobenzyloxy-L-leucine et 1,45 g ( 14,3 mmol) de N- méthylmorpholine On refroidit à -15 C et on introduit 1,96 g ( 14,3 mmol) de chloro- formiate d'isobutyle et on laisse réagir pendant min. A cette température, on introduit en min, 4 g ( 13,7 mmol) du composé n 4 dissous dans 144 ml de THF On agite pendant 1 h supplémentaire à -15 C, puis à 20 C jusqu'au lendemain On filtre le produit insoluble et on évapore à sec On reprend le résidu avec 50 ml de dichlorométhane et on le lave avec 20 ml de HCL 1 N, 20 ml de bicarbonate de sodium à 0,5 % et 20 ml d'eau Puis on sèche et on concentre à sec. On obtient ainsi 7,8 g du composé n 12, ce qui correspond à un rendement de 91,5 %. Les caractéristiques de ce produit sont les mêmes que celles de l'exemple 11. Exemp Le 13: Préparation du chlorhydrate de L-Leuci- I ne-4-( 2 ',5 ',8 ', trioxanonyl)-7-coumarinylamide (composé n 13) de formule: CH 2 (OCH 2 CH 2)20 CH 3 CH 3 o C- CH-CH 2-CHCON H o O x I 2 CH 3 NH 2,HCL On prépare ce composé à partir du composé n 12 en éliminant tout d'abord le groupement N- carbobenzyloxy de la leucine par hydrogénation catalytique. Dans une fiole à hydrogéner, on introduit 48 ml d'éthanol, 8,5 g du composé n 12 et 2,55 g de palladium sur charbon à 5 % On purge à l'azote et on introduit de l'hydrogène sous agitation pendant h à la pression atmosphérique et à la température ambiante On filtre le catalyseur et on évapore à sec On purifie le produit obtenu par chromatogra- phie sur colonne de silice en utilisant comme éluant le THF. On obtient ainsi 2,7 g du composé n 13, ce qui correspond à un rendement de 42 %. On forme ensuite le chlorhydrate correspon- dant en dissolvant les 2,7 g de composé n 13 dans ,5 ml de méthanol et en ajoutant 730 Pl de H Cl concen- tre On évapore ensuite sous vide jusqu'à siccité, on ajoute 6 ml d'isopropanol et on maintient au froid pendant 24 h On filtre le précipité forme, on recueille encore du produit en diluant le filtrat à l'éther éthylique et on obtient ainsi en tout 2 g de chlorhydrate du composé n 13, ce qui correspond à un rendement de 68 %. Les caractéristiques de ce produit sont les suivantes: ) CCM a) silice fluorescente K 6 F, butanol - acide acétique eau, 60:20:20 Rf= 0,46 révélé à 254 nm, 356 nm et à la ninhydrine. b) silice fluorescente K 6 F, THF. Rf= 0,25 révélè à 254 nm, 356 nm et à la ninhydrine. 2 ) Spectre de masse (ionisation chimique à l'ammoniac). La figure 22 représente le spectre obtenu. Les pics à 407 (M+ 1) et 424 (M+ 18) confirment bien la masse mo Léculaire de 406. 3 ) Spectre RMN. La figure 23 représente le spectre du proton qui confirme bien la structure du produit obtenu. Exemp Le 14. Dans cet exemple, on étudie les propriétés du composé n 13 et son utilisation comme substrat hydrosoluble de la leucine aminopeptidase. 1 Etudes en cuve de L'activité enzymati- que. Du fait de La présence possible dans Le substrat Leu ATC (composé n 13) d'une trace d'ATC ( 7-amino-4-( 2 ',5 ',8 '-trioxanonyl)- coumarine qui est le produit d'hydrolyse, on a retenu une méthode cinétique pour la détermination de l'activité enzymatique de la leucine aminopeptidase, c'est- à-dire que le signal est constitué par la différence d'intensité de fluorescence au temps 2 minutes et au temps 12 minutes De cette manière, l'interfé- rence -de l'ATC présent avant l'hydrolyse est élimi- née. a) Détermination des longueurs d'onde optimales. Les spectres d'excitation et d'émission de l'ATC et de la leucine- ATC (composé n 13) ont été tracés à partir de solutions 10-7 M dans le tampon Tris p H 7,8. Les maxima obtenus sont consignés dans le tableau 1 avec les maxima correspondants de * substrats commerciaux dérivés de la 7-amino-4-méthyl- coumarine (Leu-AMC) ou de l'acide 7-amino-4-coumari- nyl-méthanesulfonique (Gly Gly Arg AMCS). TABLEAU 1 Longueurs d'onde maximales d'excitation/fluorescence et de mesure (en nm) pour Les dérivés de L'ATC, l'AMC et l'AMCS. Substrat Produit Mesure d'hydrolyse (nm) (nm) (nm) Composé n 13 (Leu ATC) 330/405 350/465 370/480 Leu AMC 327/390 345/440 380/440 Gly Gly Arg AMCS 336/409 362/462 380/462 La position des spectres d'excitation et de fluorescence du composé n 13 (Leu-ATC) et du produit d'hydrolyse correspondant (ATC) est intermédiaire entre celle des dérivés de l'AMC et de l'AMCS, tandis que son déplacement de Stokes est le plus large. Aux longueurs d'onde utilisées pour la mesure, le rapport des intensités de fluorescence du produit d'hydrolyse et du substrat à concentration équimolaire est de l'ordre de 400 pour l'ATC, 300 pour l'AMC et 250 pour l'AMCS Ainsi, la fluorescence du substrat n'in-terfère aucunement avec celle du produit d'hydrolyse. b) Détermination des caractéristiques de la réaction enzymatique. La vitesse initiale de la réaction a été étudiée pour une concentration en substrat constitué par le composé n 13 (Leu- ATC) allant de 2 x 10-5 mol/L à 2 x 10-3 mo L/l en utilisant les réactif suivants. Chlorhydrate de Leu-ATC cristallisé de l'exemple 13: solutions aqueuses 4 x 10-5 à 4 x 10-3 mol/L, Leucine aminopeptidase (Sigma, réf N 5006): solu- tion aqueuse à 7,53 pg/ml dans le tampon Tris 0,2 M p H 7,8, Tampon Tris: solution A: Tris 0,2 M soit 24,23 g/1 L solution B: H Cl 0,1 M Ce tampon est préparé en mélangeant 25 ml de solution A et 33,7 ml de solution B et en complé- tant à 100 ml avec de l'eau Le p H doit être à 7,8, Solution d'acide perchlorique 1,17 N (dilution de L'acide pur au 1/10). Pour cette détermination, on prépare tout d'abord dans des tubes la gamme suivante de concentrations en substrat (composé n 13, Leu-ATC): 0 2 4 10 20 50 100 200 x 10-5 M (concen- tration finale). On ajoute à chaque tube une concentration de 1,51 pg/ml en leucine aminopeptidase, l'ensemble étant en solution dans le tampon Tris à p H 7,8 préchauffé à 37 C et les tubes étant dans un bain mmarie thermostaté à 37 C Après 2 min, 250 u L sont prélevés dans chaque tube et versés dans des tubes contenant 250 il de solution perchlorique et 75 Opl d'eau La même opération est répétée à 6 min. L'ensemble des tubes est dilué au millième. L'intensité de fluorescence IF est mesurée à 370/480 nm La différence des intensités à 6 et 2 min: IF( 6)-IF( 2), constitue le signal. La concentration en ATC correspondante est calculée par rapport à une gamme d'étalonnage allant de 10-9 à 10-8 M Les résultats sont donnés dans Le tableau 2 qui suit: TABLEAU 2 Concentration en Leu-ATC O 2 4 10 20 50 100 200 (en 10-5 M) IF( 6)-IF( 2) O 5,5 11,5 21 38,5 45 47 48 Concentration en ATC dans O 1,38 2,88 5,25 9,63 11,25 11, 7 10 solution de lecture (en n M) Concentration en ATC dans solution d'hy O 1,7 3,6 6,6 12,0 14,1 14,7 15,0 drolyse (en u M/min) La constante de vitesse kcat est calculée par le rapport Vm/Ez o Vm est la vitesse maximale en jumol/s / mg Ez et Ez est la quantité d'enzyme contenue dans un mg, exprimée en pmol La masse molaire de la Leucine aminopeptidase est prise égale à 300 000. La figure 24 est une courbe illustrant l'évolution de la vitesse initiale (en PM/min)en fonction de la concentration en substrat (Leu- ATC) exprimé en p M. Cette courbe présente une allure hyperboli- que caractéristique d'une cinétique michaelienne. Les points expérimentaux ont été ajustés à l'équation correspondante par régression non linéaire (logiciel Graphpad) et ont permis de déterminer la constante d'affinité, Km, la vitesse maximale Vm et la constan- te de vitesse kcat (rapport de la vitesse maximale à la concentration en enzyme) Les résultats, compa- res à ceux des substrats connus, sont rapportés dans le tableau 3. TABLEAU 3 Km Vm kcat (m M) (pmol/mg Ez/ (s-1) min) Composé n O 13 Leu ATC 0,11 10,3 572 Leu AMC 0,16 4,0 Leu-Pnaphty- lamide 0,15 5,5 Il apparaît que l'affinité de la Leu ATC pour la leucine aminopeptidase est meilleure que celle des deux autres substrats tandis que la vitesse maximale est plus élevée Ceci est peut-être à rapporter au fait que le milieu réactionnel ne contient aucun solvant organique, contrairement aux autres substrats De plus, la comparaison de la Leu ATC et de la Leu AMC montre que la présence de la chaîne latérale hydrosoluble R 1 ne pénalise pas la réaction enzymatique, ce qui est un avantage par rapport aux substrats concurrents dérivés de l'acide 7-amino-4-coumarinyl-méthanesulfonique. Dans ceux-ci, le groupement sulfonique hydrosoluble diminue fortement la vitesse maximale et l'affinité. c) Détermination des caractéristiques analytiques de la réaction. Les conditions de réaction ont été détermi- nées d'après l'étape précédente La concentration en substrat Leu- ATC a été choisie pour donner une vitesse maximale (lm M) Le temps de réaction a été porté à 12 minutes, en mesurant la différence des intensités de fluorescence aux temps 12 et 2 minutes Pour évaluer la limite de quantification, mesurer la répétabilité et tester la linéarité, 6 gammes d'enzymes ont été réalisées, contenant des concentrations de O 0,05 0,10 0,25 - 0,50 1 lg/ml, en utilisant les mêmes réactifs que précédemment On obtient ainsi la gamme suivante: Ez (mg/ml) O 0,05 0,10 0,25 0,50 1 Leu-ATC ( 4 x 10- 3 M) 250 250 250 250 250 250 Tampon Tris 750 740 730 700 650 550 2 Enzyme 5 ug/ml O 10 20 50 100 200 Pour effectuer l'évaluation, on prépare une série de tubes contenant 7501 l d'eau + 250 Yl de solution perchlorique 1, 17 N et au temps 2 min, on y tranfère 250 ul de chaque échantillon de la gamme d'enzymes On fait de même au temps 12 min. On dilue ensuite tous les tubes au 1/200 dans l'eau et on lit la fluorescence ( 370/480 nm) avec un gain de 2 sur le fluorimètre Perkin Elmer L 53 B. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 25 qui représente la courbe d'étalonnage moyenne illustrant la variation de l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration en enzyme (pg/m L). Cette courbe d'étalonnage a été déterminée par régression Linéaire La moyenne + écart-type est de 153 + 7,36 pour la pente, et de -3,10 + 1,16 pour l'intercept. Le test de linéarité est significatif au seuil de 5 % (F= 0,554). La limite de quantification, calcu Lée par le rapport-3 b/à, est de O,02 pg/ml. La répétabilité, évaluée par le coefficient de variation, est de 17 % à 0,05 pg/ml, 8 % à 0,25 pg/ml, et 4 % à 1 lg/ml. La limite de détection est donc plus favorable que celle obtenue avec la Leu AMC qui est de 0,03 pg/ml. REVENDICATIONS 1.Dérivé de R 3 R 4 coumarine R 6 répondant ( 1) dans laquelle 1) dan et R 1 représente un radical répondant aux formules (OCH 2 CH 2)m OCH 2 R 7, ou (OCH(CH 3)CH 2)m OCH 2 R 7, s lesquel Les m est un nombre entier de 1 à 30, R 7 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, OH, OR 8, SH, SR 8, COOH, 8 1 O C 8 R 9, NHR, CONR 8 Rlo, CONHNH 2, COON _ NH 2, NHR 8, O NR 8 R 10, -503 H, 503 R 9, ou un radical alkyle, alcoxy ou aryle, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'ha 16 gè- ne, le radical phényle, CF 3, OH, OR 8, SH, formule: à la R. SR 8, COOH, COOR 9, NH 2, NHR 8, NR 8 R 10, 503 H et 503 R 9, o R 8est un radical a Lky Leou aryle, R 9 est un radical alkyle ou aryle, NH 4 ou M 1/v avec M étant un métal de valence v, et R 10 est un radical alkyle ou aryle, ou R 8 et R 10 peuvent former ensemble un cycle hydrocarboné, saturé ou insaturé comportant éventuellement un hétérpatome choisi parmi O, S et N, 2) R 2, R 3, R 4 et R 5 qui peuvent être identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, NH 2, NHR 8, NR 8 R 10, NHR 11, NR 8 R 11, SH SR 8 SR 11 OH OR 8 OR 11 avec R 8 et R 10 ayant la signification donnée ci-dessus, et R 11 représentant un radical acyle dérivé d'un composé choisi parmi les acides aminés, les peptides, les acides carboxyliques et les acides gras, le radical PO 3 R 2 avec R étant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, ou un radical dérivé d'un sucre, ou un radical alkyle ou alcoxy, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d'halogène, OH, OR 8, SH, SR 8, COOH, COOR 9, NH 2, NHR 8, NR 8 R 10, 503 H, 503 R 9, SR 11, OR 11, CF 3, NHR 11 et NR 8 R 11 avec R 8, R 9, R 10 et R 11 ayant la signification donnée ci-dessus, ou 3) R 2 et R 3, R 3 et R 4 ou R 4 et R 5 forment ensemble un noyau cyclique saturé ou insaturé de 5 à 8 atomes de carbone, ou un noyau hétérocyclique comportant au moins un hétéroatome choisi parmi N, O et S, ou 4) R 3, R 4 et R 5 forment avec le noyau phényle auquel ils sont liés un noyau polycyclique, à trois cycles condensés comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, ou ) R 2, R 3 et R 4 forment avec le noyau phényle auquel ils sont liés un noyau polycyclique, à trois cycles condenses, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S, et 6) R 6 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, COOH, COOR 9 avec R 9 ayant la signification donnée ci-dessus, ou un radical alkyle, non substitué ou substitué par au moins un substituant choisi parmi les atomes d;halogène, OH, SH, COOH, COOR 9, OR 8, SR 8, 503 H et 503 R 9avec R 8 et R 9ayant la signification donnée ci-dessus. 2 Dérivé de coumarine selon la revendica- tion 1, caractérisé en ce que au moins l'un des R 2, R 3, R 4 et R 5 représente NH 2, NHR 11, NHR 8, NR 8 R 11, SH, OH, SR 11 ou OR 11 avec R 8 et R 11 ayant La signifi- cation donnée dans la revendication 1. 3 Dérivé de coumarine selon la revendica- tion 2, caractérisé en ce que R 4 représente NH 2, NHR 8, SH ou OH, et en ce que R 2, R 3 et R 5 représen- tent un atome d'hydrogène. 4 Dérivé se Lon La revendication 3, carac- térisé en ce que R 4 représente NH 2 ou OH. Dérivé se Lon la revendication 2, carac- téri S en ce que R 4 représente NHR 11, NR 8 R 11, SR 11 ou OR 11. 6 Dérivé se Lon La revendication 5, carac- térisé en ce que R 4 représente NHR 11 avec R 11 étant le radical de formule: (CH 3)2 CH-CH 2-C(NH 2)-C(O)- 7 Dérivé de coumarine selon L'une quelcon- que des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que R 6 représente un atome d'hydrogène. 8 Dérivé de coumarine selon l'une que Lcon- que des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que R 1 représente (OCH 2 CH 2)m OCH 3. 9 Dérivé de coumarine selon revendication 8, caractérisé en ce que m est éga L à 2. Dérivé de coumarine selon la revendica- tion 1, caractérisé en ce que au moins L'un des R 2, R 3, R 4 et R 5 représente NH 2, NHR 8, NR 8 R 10, OH, OR 8, SH, SR 8 ou un radica L alkyle substitué ou non substitué. 11 Dérivé de coumarine selon la revendica- tion 1, caractérisé en ce que, soit R 2, R 3 et R 4, soit R 3, R 4 et R 5 forment avec le noyau phény Le auque L ils sont liés un noyau polycyclique comportant trois cycles condenses et un atome d'azote. 12 Ester P-cétonique répondant à La formule: R 1-CH 2-CO-CH-COOR 12 (II) dans laquelle R 1 et R 6 ont la signification donnée dans la revendication 1 et R 12 est un radical alkyle, aryle ou cycloalkyle. 13 Ester cétonique selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que R 6 est un atome d'hydrogène. 14 Ester P-cétonique selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que R 12 est un radical alkyle de 1 à 4 atomes de carbone. Ester 1-cétonique selon la revendica- tion 14, caractériseé en ce que R 12 est le radical éthyle. 16 Ester P-cétonique selon l'une quelcon- que des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que R 1 représente le radical de formule -(OCH 2 CH 2)m OCH 2 R 7 dans laquelle R 7 est un atome d'hydrogène ou COOR 9 avec R 9 étant le radical benzyle. 17 Procédé de préparation d'un ester P-cétonique de formule (II) selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1 ) transformer un acide de formule R 1CH 2-COOH dans laquelle R 1 a la signification donnée dans la revendication 1, en l'imidazolide ou le chlorure d'acide correspondant, 2 ) faire réagir l'imidazolide ou le chlorure d'acide avec un ester cyclique de formule: R 6 CH' C C(CH 3)2 (III) *C 00/ pour former un dérivé acylé, et 3 ) faire réagir le dérivé acylé avec un alcool de formule R 120 H pour obtenir l'ester -cétonique de formule (II). 18 Procédé de préparation d'un dérivé de coumarine de formule (I), selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un ester r -cétonique de formule: R 1-CH 2-CO-CH-COOR 12 (II) avec un phénol de formule: R 3 )ot (IV) R 4 OH R 5 dans lesquelles R 1, R 2, R 3, R 4, et R 5, ont la signi- fication donnée ci-dessus et R 12 représente un radical alkyle, aryle ou cycloalkyle. 19 Utilisation des dérivés de coumarine selon l'une quelconque des revendications 3 et 4 pour la synthèse d'un substrat d'enzyme destiné au dosage de cette enzyme. Utilisation des dérivés de coumarine selon l'une quelconque des revendications 5 et 6 comme substrat d'enzyme dans un procédé de dosage de cette enzyme.