Brevet FR2678638A1 — publié le 19930108

Anticorps polyclonaux et monoclonaux contre la protéine tau pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer La maladie d'Alzheimer est caractérisée du point de vue clinique par des troubles progressifs des capacités cérébrales qui vont jusqu'à la démence. Du fait des symptômes non spécifiques, le diagnostic différentiel clinique des stades précoces est extrêmement difficile. Jusqu'à maintenant, on n'a pu étabir un diagnostic sans ambiguité qu'après la mort. Du point de vue microscopique, il apparat une atrophie marquée du cortex dans Le domaine fronto-temporal et occipital. Du point de vue histologique, on peut confirmer le diagnostic par la mise en évidence des différents dépôts spécifiques de la maladie d'Alzheimer. - plaques - NFT (Neurofibrillary Tangles : enchevêtrements neurofibrillaires) Il est possible d'isoler les NFT à partir du tissu cérébral de patients atteints par la maladie d'Alzheimer. Ils contiennent comme constituant protéique principal la protéine tau. La protéine tau humaine (1, 2) et la protéine tau murine (3) ont été entre-temps séquencées et les séquences ont été publiées. On a induit des anticorps monoclonaux et polyclonaux contre la séquence AS 29 à AS 46 de la protéine tau murine et contre la séquence AS 40 à AS 57 des protéines tau humaines. Ces anticorps reconnaissent immunohistologiquement dans le tissu cérébral les NFT spécifiques de la maladie d'Alzheimer. Dans la technique de transfert de Western, les anticorps reconnaissent deux variantes de la protéine tau CPM 69 000 et PM 130 000) (4). On ne peut mettre en évidence ces deux variantes de protéine tau que dans le cerveau de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Elles ne sont pas présentes dans le tissu cérébral de patients sains de même âge. Ainsi, L'anticorps reconnaît spécifiquement une variante de protéine tau qui n'existe que dans le tissu cérébral des patients atteints de la maladie d'Alzheimer, de sorte qu'il convient au diagnostic précoce de la maladie d'Alzheimer. Du fait d'une forte antigénicité du peptide utilisé pour l'immunisation, l'anticorps a un titre élevé et présente de ce fait un faible bruit de fond ce qui améliore la sensibilité et la spécificité du diagnostic. Il est spécifique de la bande de 120 000 kD et aussi de la bande de 69 000 kD qui n'apparaissent que dans le cas de la maladie d'Alzheimer. L'anticorps permet un diagnostic dans le liquide céphalorachidien, éventuellement dans d'autres liquides corporels ou dans des cellules périphériques (fibroplastes principaux, épithélium). Il permet en particulier un diagnostic sûr avant La mort même au stade précoce de la maLadie. Obtention des antisérums polyclonaux On a préparé par synthèse en phase solide (Multiple Peptide Systems, San Diego, Ca) un oligopeptide de séquence Tyr--Va L-Arg-Se r-Lys-I Le--G Ly-Se r-Th r-G Lu-Asn-Leu-Lys-Hi - Gly-Gly-Gly que l'on a couplé à la protéine vecteur KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin : hémocyanine de patelle) (Pierce, Rockford, Illinois). A cet effet, on a dissous la KLH (20 mg/ml) dans PBS et on a ajouté un excès 10 fois molaire d'oligopeptide. On a ajouté goutte à goutte du glutaraldéhyde jusqu'à obtenir une concentration finale de 0,25 %. On a incubé le mélange pendant 2 h à la température ambiante, on l'a dialysé contre PBS et congelé par portions aliquotes à -200C. On a immunisé des lapins Chinchilla mâles (4-5 kg) avec 250 ug d'antigène en présence du glycolipide synthétique M66 selon le document DE-OS-3 521 994 en tant qu'adjuvant. On a fait toutes les trois semaines des injections de rappel de 250 ;jg d'antigène également en présence de 1 mg/kg de glycolipide. Après la septième injection de rappel on a saigné les lapins et on a recueilli le sérum que l'on a stocké à -200C en vue d'examens immunologiques. Préparation de NFT à partir du tissu cérébral On a congelé à -700C, en L'espace de 7 à 24 h après la mort, du tissu cérébral provenant de patients souffrant de la maladie d'Alzheimer et de patients non atteints de cette maladie qui sont morts pour des raisons non neurologiques. On a confirmé le diagnostic clinique de la maladie d'Alzheimer sur les cerveaux ainsi obtenus, au moyen de procédés histologiques habituels, par la mise en évidence de plaques et de NFT dans le cortex temporal et l'hippocampe. On a homogénéisé du tissu cérébral (hippocampe) dans du tampon A (0,1 M de MES pH 6,4, 0,5 mM de chlorure de magnésium, 1 mM de EGTA, 0,1 mM de EDTA, 0,1 mM de GTP, 0,4 mM de PMSF et 5 pM de leupeptine, 10 mM de benzamidine, 3 mM de mercaptoéthanol, 0,25 mg/ml d'inhibiteur de trypsine et 0,34 M de saccharose) (5 ml/g de tissu cérébral).On a réglé à 1 M la concentration en saccharose de l'homogénat et on l'a centrifugé pendant 90 min à 190 000 g. On a remis en suspension le culot dans du saccharose 0,34 M, on l'a déposé au-dessus d'un gradient discontinu de 1,2 M et 1,8 M de saccharose et on l'a centrifugé pendant 2 h à 190 000 g. On a transformé en culot la phase intermédiaire 1,2 M/ 1,8 M de la manière décrite ci-dessus. On a repris le culot dans du tampon A (1 ml), on l'a incubé pendant 5 min à 200C avec 100 ,ul de SDS à 2 % et on a séparé les PHF par centrifugation pendant 10 min à 11 000 g. On a fait bouillir le culot pendant 5 min dans 2,3 % de SDS, 10 % de glycérine, 5 % de mercaptoéthanol. Electrophorèse sur gel et transfert de Western Les surnageants traités thermiquement en présence de SDS de cerveaux de patients atteints de la maladie d'Alzheimer ou de cerveaux témoins ou d'homogénats de cerveaux de patients atteints de la maladie d'Alzheimer et de cerveaux témoins ainsi que les PHFpurifiés provenant de cerveaux de patients atteints de la maladie d'Alzheimer ont été analysés sur des gels de polyacrylamideSDS à 10 %, transférés sur nitrocellulose et mis en évidence avec de l'antisérum 819 (1:5 000). Immunohi stochimie Des coupes fixées au formol d'hippocampe de patients atteints de la maladie d'Alzheimer ont été incluses dans la paraffine, coupées et incubées avec des anticorps B19 (1:5 000). On a réalisé la détection avec des anticorps anti-lapin biotinylés et la streptavidineperoxydase. On prépare les anticorps monoclonaux selon des méthodes habituelles, telles que celles décrites par exemple dans le document EP 195 331. Littérature: 1) M. Goedert, G.G. Spillantier, M.C. Potier, J. Ulrich, et R.A. Crowther Cloning and Sequencing of the C-DNK encoding an isoform of microtubule enso ciatea protein tau containing four tandem repeats EMBO Journal 8, 393-399 (1989) 2) G. Lee, L. Neve, et K.S. Kosik The microtubule binding domain of tau protein Neuren 2, 1615 1624 (1989) 3) G. Lee, N. Cowan et M. Kirschner The primary Structure and Heterogeneity of tun Protein from Monar Brai n Science 239, 285-288 (1988) 4) Y. Gache, F. Ricothi, J. Guilleminot, G. Thetss et J. Nunez Proteine tau variants present in paired helical filament (PHT's) of Alzheimer brains. FEBS Lett. 272, 65-68 (1990). REVENDICATIONS 1. Agent pour la mise en évidence de la maladie d'Alzheimer, contenant un anticorps qui réagit avec la séquence AS 29 à 46 de la protéine tau murine et/ou avec La séquence 40 à 57 de la protéine tau humaine. 2. Agent selon la revendication 1 pour la mise en évidence de la maladie d'Alzheimer à partir d'un liquide corporel. 3. Agent selon la revendication 1 pour la mise en évidence immunohistologique de La maladie d'Alzheimer.