Brevet FR2684383A1 — publié le 19930604

La présente invention concerne une nouvelle cytokine, antagoniste spécifique de l'induction de l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II à la surface des cellules, par l'interféron gamma. Toutes les cellules de l'organisme expriment à leur surface des glycoprotéines appelées antigènes d'histocompatibilité de classe I. I1 existe également une catégorie de glycoprotéines exprimées uniquement par les cellules immunocompétentes, les antigènes d'histocompatibilité de classe II. Ces antigènes sont codés par une famille de gènes situés chez l'homme sur le chromosome 6, et appelée complexe majeur d'histocompatibilité (C.M.H.), ou (H.L.A.) chez l'homme. Les antigènes d'histocompatibilité de classe II jouent un rôle important au cours de la réponse immunitaire, en particulier dans le cadre des interactions entre cellules B et T ou entre cellules présentatrices d'antigènes et cellules T. L'interféron gamma favorise les fonctions des cellules immunocompétentes en induisant l'expression des antigènes du complexe majeur d'histo-compatibilité (C.M.H.) par de nombreux types cellulaires (Becker, 1985). La capacité à présenter l'antigène est proportionnelle à la quantité de molécules (H.L.A.) classe II présentes sur la surface des cellules accessoires. L'interféron gamma permet donc à ces cellules d'exprimer suffisamment de molécules (H.L.A.) classe II pour présenter l'antigène. Le mécanisme de régulation, interféron gamma dépendante, n'a pas encore été élucidé. Les antigènes (H.L.A.) classe II sont également considérés comme des marqueurs de différenciation : ceci a été démontré pour les cellules des lignées myéloïdes (Radka et Coll., 1986) ou du foie foetal (Natali et Coll., 1984), mais leur fonction au cours de la différenciation cellulaire n'est pas encore établie. En outre, la présence des antigènes de classe II pourrait jouer un rôle au cours du phénomène de tumorigénèse (Festenstein et Garrido, 1986). L'expression des antigènes de classe II est constitutive sur les cellules B. Accolla et Coll. (1985) et De Préval et Coll. (1985) ont montré que cette expression est sous le contrôle d'un facteur qui agit en trans au niveau génique. Un modèle de régulation des antigènes de classe II a été proposé par Boss et Strominger (1986). Dans ce modèle il existe au niveau génomique dans la région 5' flanquante du gène, 4 régions successives contrôlant l'expression des antigènes d'histocompatibilité : un élément de régulation négative, 2 régions de contrôle positif, et une autre région de contrôle négatif. Des travaux plus récents sur la régulation au niveau génomique des antigènes H.L.A. classe II ont abouti à la mise en évidence d'un promoteur, appelé E dans la région 5' des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité, et de 2 protéines capables de se fixer sur le promoteur Ed(Dorn et Coll., 1988 Dorn et Coll., 1989 ; Koch et Coll., 1989). L'efficacité d'induction est différente suivant le système cellulaire concerné. En effet, certaines lignées cellulaires (lignée leucémique K562, fibroblastes embryonnaires...) sont difficilement inductibles, voire non inductibles, alors que d'autres lignées (fibroblastes adultes, cellules de carcinomes coliques...) expriment les antigènes H.L.A. classe II après induction par des doses faibles d'interféron gamma. I1 a été montré dans le cadre de la présente invention que la difficulté à obtenir l'induction des antigènes H.L.A. classe II par l'interféron gamma sur des cellules dites réfractaires, était dûe à la production spontanée d'un inhibiteur endogène soluble. C'est pourquoi la présente invention concerne une cytokine, qui est un antagoniste spécifique de l'induction de l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II à la surface des cellules par l'interféron gamma, et qui - comporte tout ou partie de la séquence peptidique telle que décrite dans la figure 1, ainsi que les variants conservant l'activité biologique précédemment décrite, et - est naturellement secrétée par les cellules, ou - est le produit d'expression d'une séquence d'ADN exogène, chez les cellules procaryotes ou eucaryotes. Bien que le composé préféré selon la présente invention corresponde à la formule de la figure 1, la présente invention concerne également les variants de cette cytokine notamment les variants obtenus par délétion notamment des extrémités N ou C terminales, les variants obtenus par substitution d'un ou plusieurs acides aminés et les variants d'addition obtenus en ajoutant un ou plusieurs acide(s) aminé(s) par exemple l'acide aminé méthionine à l'extrémité N-terminale lorsque la cytokine est exprimée dans une bactérie. La présente invention concerne également les composés comportant les épitopes actifs de la cytokine reliés ou non entre eux par des séquences différentes, et qui sont également dénommés ci-après variants. Selon la nature des cellules hôtes utilisées, la cytokine peut être glycosylée, de façon à pouvoir subir les modifications post-traductionnelles, intéressantes pour son activité biologique dans les cellules de mammifères, ou non glycosylée. La protéine naturelle présente outre les caractéristiques décrites précédemment un poids moléculaire de l'ordre de 19 000 sur gel de polyacrylamide SDS, et son activité inhibitrice est sensible à la chaleur et à la trypsine. La protéine est précipitable dans une solution de sulfate d'ammonium à 50%. La protéine peut être obtenue naturellement, comme produit de sécrétion dans le surnageant de culture de cellules. Elle peut également résulter de l'expression d'une séquence d'ADN exogène chez les cellules procaryotes ou plus avantageusement eucaryotes. Dans ce cas, la séquence d'ADN exogène peut être notamment une séquence d'ADN complémentaire ou bien une séquence d'ADN génomique. Les séquences d'ADN selon l'invention comprennent les séquences qui permettent l'expression des nouvelles cytokines dans les cellules hôtes procaryotes et eucaryotes. Les séquences selon l'invention concernent plus précisément celles choisies parmi a) la séquence d'ADN de la figure 1 ou ses brins complémentaires b) une séquence d'ADN qui s'hybride avec les séquences d'ADN de a) ou une partie de celles-ci ; et c) une séquence qui, compte-tenu de la dégénérescence du code génétique code pour une cytokine ayant la même séquence d'acides aminés que a) ou b). d) une séquence qui code pour un variant de ladite cytokine et qui conserve l'activité biologique précédemment décrite. Ainsi la présente invention concerne également des séquences d'ADN codant pour l'expression de variants tels que décrits précédemment. L'invention concerne également les séquences d'ADN s'hybridant aux séquences d'ADN précédemment décrites, ou à l'un ou plusieurs de leurs fragments. Les séquences selon l'invention peuvent être associées de façon covalente ou non à une molécule marquée, notamment par un marquage isotopique (I125, etc.) ou par un marquage non isotopique (biotine, etc.) de façon à être facilement détectées. La présente invention concerne également les cellules hôtes, eucaryotes ou procaryotes, ayant subi une transformation ou une transfection avec une séquence d'ADN telle que précédemment décrite, de façon à assurer l'expression dans la cellule hôte de ladite cytokine. L'invention concerne également un vecteur de clonage, biologiquement fonctionnel, comprenant une séquence d'ADN telle que précédemment décrite, ainsi que les cellules hôtes eucaryotes ou procaryotes, transformées ou transfectées, de façon stable, par un tel vecteur de clonage. Par vecteur de clonage biologiquement fonctionnel on entend désigner tout vecteur susceptible de permettre l'expression de la séquence en cause dans l'hôte transformé ou transfecté, ou bien susceptible de permettre l'intégration chromosomique de ladite séquence, et son expression sous le contrôle d'un promoteur homologue ou hétérologue. Ce type de vecteur est connu dans le domaine des ADN recombinants. I1 peut s'agir d'un plasmide auto-réplicatif ou non, comportant une origine de réplication efficace dans l'hôte, par exemple l'origine de réplication de pBR322 pour E. coli ainsi que les éléments assurant l'expression de la séquence - promoteur, - site de fixation des ribosomes, - terminateur éventuel pour les levures par exemple, ainsi que divers éléments de contrôle. Ces plasmides peuvent également comporter des gènes marqueurs assurant la sélection notamment, ou des séquences d'intégration comportant des séquences homologues assurant l'intégration par recombinaison. I1 peut également s'agir de virus recombinés, par exemple des virus vecteurs du type vaccine. Les méthodes de transformation et de transfection sont connues et doivent être adaptées à l'hôte. Les cellules hôtes peuvent également avoir été modifiées par le biais de vecteurs afin d'excréter la protéine sous forme mature et/ou sous forme fusionnée. La présente invention concerne également un procédé de préparation de la nouvelle protéine, caractérisé en ce que l'on purifie ladite cytokine à partir du surnageant de culture de cellules ou on fait exprimer la cytokine par des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes décrites précédemment, puis on isole la cytokine souhaitée. Dans le cas où la cytokine est sécrétée naturellement par des cellules en culture, les cellules sont cultivées de préférence dans un milieu nutritif approprié dépourvu des protéines contaminatrices du sérum, ce dernier étant contenu dans un sac à dialyse perméable aux poids moléculaires inférieurs à 50 kD. Ce procédé est également utilisable lorsque la cellule hôte est une cellule ayant été traitée par un vecteur tel que décrit précédemment, et dont la culture nécessite l'emploi de sérum, bien que l'on préfère utiliser des hôtes qui poussent sur un milieu simple. Les cellules susceptibles de produire une cytokine selon l'invention sont assez nombreuses ; parmi celles-ci il faut citer la lignée K562 disponible auprès du National Institute of General Medical Sciences sous le n" GMO5372D. Mais il est possible d'utiliser d'autres cellules notamment des carcinomes, ou des cellules d'hépatomes. L'invention concerne également les anticorps, en particulier les anticorps monoclonaux, dirigés contre les cytokines selon l'invention. Ces anticorps peuvent être notamment utilisés dans le cadre d'un diagnostic de présence desdites protéines. L'invention concerne également un immuno-serum dirigé contre les cytokines précédemment décrites. Les cytokines selon la présente invention, peuvent être utilisées à titre de principe actif dans une composition thérapeutique, dans le cas où l'on voudra augmenter l'effet antagoniste de ces protéines vis-à-vis de l'interféron gamma. Ces compositions thérapeutiques sont surtout utilisables dans tous les états nécessitant une modulation de l'activité de l'interféron gamma. En particulier les compositions selon la présente invention sont utilisables dans le traitement et/ou la prévention de certains types de maladies auto-immunes, mais également lors de certains actes chirurgicaux tels que certaines transplantations. Les compositions selon l'invention pourront comporter également d'autres monokynes et/ou cytokines. L'invention concerne également une composition thérapeutique contenant à titre de principe actif un anticorps ou un immuno-serum, dirigé contre ladite cytokine ou même des anti-sens correspondant aux séquences codantes, ceci notamment afin de limiter les quantités de cytokine circulantes. L'invention concerne également un kit de diagnostic permettant de détecter la protéine, et comportant au moins un anticorps dirigé contre celle-ci. Les exemples et figures ci-après sont destinés à mettre en lumière d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention, sans pour autant en limiter la portée. Sur les figures ci-annexees La figure 1 représente : la séquence nucléotidique de l'ADN complémentaire correspondant à l'inhibiteur, et la séquence peptidique déduite. La figure 2 représente : 1) à droite : les histogrammes obtenus sur un cytomètre de flux (E.C. Coulter) d'expression des antigènes HLA DR (b) et HLA classe I (c) sur les cellules K562 après induction par l'interféron gamma glycosylé, à 1000 UI/ml. En (a) les contrôles négatifs sans interféron gamma, avec ou sans les anticorps spécifiques (les courbes se superposant). 2) à gauche : l'immunoprécipitation des chaînes -alpha (32kD) et beta (28kD) des antigènes HLA DR induits par l'interféron gamma sur les cellules K562 (A), le contrôle négatif (B). La figure 3 représente: les histogrammes obtenus sur un cytomètre de flux (E.C. Coulter), d'expression des antigènes HLA DR (b) et HLA classe I (d) sur les cellules ICIG-7 après induction par l'interféron gamma glycosylé, à 100U1/ml. En (a) les contrôles négatifs sans interféron gamma avec ou sans les anticorps spécifiques (les courbes se superposent). Expression des antigènes HLA DR (c) et HLA classe I (e) sur les cellules ICIG-7 après induction par l'interféron gamma glycosylé, à l00U1/ml et en présence du milieu conditionné des cellules K562. La figure 4 représente les étapes de purification : en (A) culture des cellules, en (B) la courbe obtenue après colonne MonoQ, et en (C) la courbe obtenue après Superose 12. Les fractions actives se situent dans les parties hachurées. Exemple 1: Mise en évidence de la cytokine 1. Culture cellulaire Les cellules K562, provenant de l'épanchement pleural d'un malade atteint d'une leucémie myéloîde chronique en crise blastique, sont cultivées dans du milieu RPMI-1640 complet. Les cellules sont placées dans une étuve à 37"C et 5% de CC2. Elles sont ensemencées à la concentration de 250 000 cellules/ml toutes les 72h. Les cellules ICIG-7, cellules fibroblastiques embryonnaires humaines normales, (ces cellules ont été mises en culture dans notre laboratoire à partir de poumon embyronnaire humain normal), sont cultivées dans une étuve humide à 37"C et 5% en C02, dans du milieu MEM complet. Les cellules adhérentes parvenues à confluence (à 72h) sont détachées de leur support par l'action de la trypsine (0,25% dans du MEM) 2 à 3 minutes et remises en culture à une densité de 80000 cellules/cm2. 2. Milieu conditionné Les cellules K562 sont cultivées dans les conditions décrites plus haut ; le milieu de culture est prélevé après 72h, centrifugé, filtré sur filtre 0,22 um et supplémenté par 10% de SVF et 2mM de glutamine. 3. Interféron gamma (IFN-Gamma) L'interféron gamma recombinant non glycosylé, produit à partir de bactéries d'E. Coli, est obtenu auprès de la société Biogen (GENEVE, SUISSE) et son activité spécifique est de 2.107 UI/mg. L'interféron gamma recombinant glycosylé (DEVOS et Colt, 1984), produit dans les cellules CHO de Hamster possède une activité spécifique de 1,3.108 UI/ml. 4. Induction par l'interféron gamma Les cellules (K562 ou ICIG-7) sont cultivées dans des macroplaques de culture à 6 puits (9cm2/puits) à une densité cellulaire de 5.104 cellules/puits/2ml, pendant 72h en présence de 1000UI/ml d'IFN -gamma recombinant glycosylé (CHO) ou 10000UI/ml d'IFN-gamma recombinant non glycosylé (E. Coli). 5. Test de l'activité biologique Les cellules ICIG-7 sont induites dans les conditions décrites au paragraphe précédent mais, en présence de milieu conditionné ou des fractions de purification qui sont diluées dans du milieu MEM complet (voir purification). L'expression des antigènes d'histocomptabilité à la surface cellulaire a été déterminée par la technique d'immunofluorescence indirecte. Les cellules sont lavées 3 fois en milieu de Hanks, puis resuspendues à la densité cellulaire de 5.105 cellules/ml. 200 ul de cette suspens ion sont distribués dans des puits d'une microplaque à fond rond (96 puits). La plaque est centrifugée 5 minutes à 800g, le surnageant est éliminé. Les cellules sont ensuite incubées, 30 minutes à 4"C en chambre humide avec 20 ul d'anticorps à 10 ug/ml: D1-12 (Carrel et Coll, 1981), pour les antigènes HLA classe II et IOT2 (Immunotech, France) pour les antigènes HLA classe I. Après trois lavages en milieu de Hanks par centrifugation 5 minutes à 800g et élimination du surnangeant, les cellules sont incubées 30 minutes à 4"C en chambre humide avec 20 pi d'anticorps de chèvre anti immunoglobulines de souris couplés à la fluorescéine (FITC) (Immunotech, France) à la dilution prescrite par le fabriquant. Les cellules sont lavées 3 fois en milieu de Hanks et analysées en cytométrie de flux (ATC Odam Brucker France). L'analyse est réalisée sur 5000 ou 10000 cellules à la longueur d'onde de 488nm. Les résultats sont représentés sous forme d'histogrammes de distribution des cellules avec, en abscisse, l'intensité de fluorescence (échelle logarithmique) et, en ordonnée, le nombre de cellules. Exemple Il : Purification de la cytokine 1. Culture cellulaire Les cellules K562 sont lavées 3 fois en RPMI-1640 (sans rouge de phénol) afin d'éliminer les traces de SVF, puis remises en suspension dans du RPMI-1640 (sans rouge de phénol) additionné de 2mM de glutamine. Un sac de dialyse de porosité 50Kd (Spectrapor 7 Spectrum) contenant lOml de sérum de veau foetal pur est introduit dans un flacon de culture contenant 90ml de RPMI-1640 (sans rouge de phénol ni SVF) et 2,5.107 cellules. Pour la purification, 2 litres de culture ont été nécessaires. Les cellules sont cultivées 72h à 370 C, le milieu est centrifugé à 800g 15 minutes ; le culot est éliminé et le surnageant est à nouveau centrifugé à 800g 15 minutes, puis filtré sur filtre 0,22 pm. Du PMSF est rajouté au surnageant à la concentration finale de lmM. 2. Première étape de purification Le surnageant est concentré 100 fois sur une membrane AMICON YM10, puis dialysé contre un grand volume de tampon Phosphate 10mM/pH 7,4 contenant du PMSF lmM. Une colonne échangeur d'anions (Mono Q Pharmacia SUEDE) est équilibrée par 10 ml de tampon Phosphate 10 mM/pH 7,4. L'échantillon est déposé sur la colonne puis élué grâce à 20 ml d'un gradient de NaCl de 0 à 0,25 M en Tampon 10 mM/pH 7,4. Des fractions de 0,5 ml sont collectées en sortie de colonne et analysées sur gel de polyacrylamide (gradient de 8 à 25%) en présence de SDS. Le gel est ensuite coloré au nitrate d'argent comme prescrit par le fabricant (Phast System, Pharmacia SUEDE). L'activité biologique de chaque fraction est ensuite testée, à plusieurs dilutions dans du milieu RPMI-1640 complet, selon le protocole décrit précédemment. 3. Deuxième étape de purification Les fractions contenant l'activité biologique sont réunies et concentrées 10 fois sur membrane AMICON YM10, l'échantillon est déposé sur une colonne de filtration sur gel (Superose 12, Pharmacia SUEDE), puis la filtration est effectué à l'aide d'un tampon phosphate 10 mM/NaCl 0,15 M/pH 7,4. La colonne avait prélalablement été calibrée avec un ensemble de protéines de poids moléculaires connus (Kit Pharmacia) et équilibrée avec le tampon phosphate 10 mM/NaCl 0,15 M/pH 7,4. Des fractions de 0,25 ml sont collectées en sortie de colonnes et analysées selon le protocole décrit précédemment. Exemple ICI : Production d'anticorps monoclonaux 1. Immunisation Une souris Balb/C est immunisée selon le protocole suivant - une injection sous-cutanée de 0,5 ml d'une solution contenant 10 Ug de la protéine purifiée dans 0,250 ml de PBS et 0,250 ml d'adjuvant de Freund complet. - 8 jours et 21 jours plus tard une deuxième et une troisième injection sous cutanée d'une solution contenant 10 ,ug de la protéine purifiée dans 0,5 ml de PBS sans adjuvant de Freund. - une dernière injection sous-cutanée est effectuée 5 jours avant la fusion cellulaire avec une solution contenant 10 pg de la protéine purifiée dans 0,5 ml de PBS sans adjuvant de Freund. 2. Fusion a) le jour précédant la fusion - Le milieu HAT et la solution de fusion sont préparés. - Les cellules de myélome de souris NUS 1 sont remises en suspension dans du milieu RPMI-1640 complet, à la concentration de 250000 cellules/ml. - Les macrophages péritonéaux d'une souris Balb/C sont prélevés en lavant la cavité péritonéale à l'aide de 5 ml de NaCI 0,15 M froid. Les macrophages sont centrifugés 10 minutes à 800g, puis remis en suspension dans du milieu HAT à la concentration de 5.105 cellules/ml et distribués dans 5 microplaques de culture (96 puits), à raison de 100 ul par puits. Les microplaques sont ensuite placées dans un incubateur à C02 (37"C, 7% de CO2) b) le jour de la fusion - Les cellules NS1 sont lavées 4 fois dans du RPMI-1640 par centrifugation à 800g 10 minutes, puis le dernier culot est repris dans du RPMI-1640 à la concentration de 107 cellules/ml. - La rate de la souris immunisée est prélevée, dilacérée dans du RPMI-1640, les cellules obtenues sont centrifugées 10 minutes à 800g et le culot repris dans du RPMI-1640 à la concentration de 107 cellules/ml. - Hybridation : la fusion cellulaire est réalisée en mélangeant, dans un tube de 50 ml, 5 ml de cellules de rate (5.107 cellules), 3 mi de cellules NS1 (3.107 cellules) et 42 ml de RPMI-1640. Le tube est centrifugé 10 minutes à 800g, et le culot est repris dans 1 ml de solution de fusion, ajoutée en 1 minute, en maintenant l'agitation constante. Puis le tube est immergé, 90 secondes, dans un bain-marie à 37"C en maintenant l'agitation. La fusion est stoppée en introduisant 50 ml de milieu RPMI-1640 complet selon le protocole suivant 1 ml en 30 secondes 3 ml en 30 secondes 16 ml en 1 minute 30 ml ensuite. Le tube est laissé 5 minutes à température ambiante, centrifugé 10 minutes à 200g et le culot obtenu est lavé deux fois dans du milieu RPMI-1640 complet, par centrifugation 10 minutes à 200 g. Après chaque centrifugation les cellules sont reprises le plus doucement possible. Les cellules sont resus pendues dans 50 ml de milieu HAT et distribuées, à raison de 100 ul/puits, dans les microplaques contenant les macrophages. Celles-ci sont replacées dans l'incubateur à CO2 - Préservation des clones : le milieu est renouvelé après 6 jours de culture, en aspirant le surnageant et en le remplaçant par du milieu frais. Au cours des deuxième et troisième semaines de culture, des colonies, constituées de cellules hybrides sélectionnées par le milieu, apparaissent dans certains puits. Les surnageants de culture sont prélevés pour tester la présence d'anticorps et la réactivité de ceux-ci ; les clones intéressants sont prélevés et transférés dans des macro plaques de culture 24 puits contenant 2 ml de milieu RPMI-1640 complet et 2.106 cellules spléniques provenant d'une souris Balb/C normale. I1 est nécessaire de sous-cloner pour s'assurer du maintien, au cours de la culture, d'un clone secréteur. Le sous-clonage se fait par dilution limite ; pour cela, 200 cellules sont remises en suspension dans 10 ml de milieu RPMI-1640 complet, et la suspension est distribuée dans une microplaque de culture 96 puits, le milieu est renouvelé après 6 jours de culture, en aspirant le surnageant et en le remplaçant par du milieu frais. Au cours des deuxième et troisième semaines de culture, des colonies apparaissent dans certains puits et les surnageants de culture des clones sont testés. 3. Criblage des anticorps a) ELISA La fixation de la protéine purifiée, sur des microplaques microELISA, est réalisée par incubation 1h à 37"C, avec 100 ul par puits, d'une solution de la protéine à 0,1 ug/ml dans un tampon carbonate/bicar bonate 0,5 M pH 9,6. L'excès de protéines est éliminé par 5 lavages en tampon NaCl/Tween. Puis la plaque est saturée 1h à 37"C à l'aide d'une solution de PBS/SAB (Sérum Albumine Bovine) 3%. Après 5 lavages en tampon NaCl/Tween, 100 ul/puits de surnageants de culture, des différents clones, préalablement dilués au 1/2 dans du PBS/0,1% Tween 20 sont ajoutés et incubés pendant 1 h30 à 37"C. Après 5 lavages en tampon NaCl/Tween, la révélation des immunoglobulines de souris fixées à la plaque, est effectuée par incubation avec 100 Ill/puits d'anticorps de chèvre anti immunoglobulines de souris marqués à la peroxydase et dilués (à la dilution prescrite par le fabriquant) dans du PBS/0,05% Tween 20/3% SAB. Les plaques sont incubées lh30 à 37"C puis lavées 5 fois en tampon NaCl/Tween. Le taux d'anticorps marqués à la peroxydase fixés à la plaque est évalué par détermination de l'activité peroxydase à l'aide d'une solution d'orthophénylène Diamine (OPD) dans un tampon OPD en présence d'eau oxygénée (H2O2) (40 mg d'OPD pour 100 ml de Tampon et 20 pi d'H2O2 110 volumes sont ajoutés extemporanément). 200 ul de cette solution d'OPD sont introduits dans chaque puits, la coloration apparaît après quelques minutes à l'obscurité, la réaction est alors stoppée en ajoutant 50 Ill/puits d'H2S04 0,1N. La densité optique est mesurée à 492 nm sur un spectrophotomètre automatique pour lecture de plaques. b) Blocage de l'activité inhibitrice Les cellules ICIG-7 sont cultivées dans des macro plaques de culture à 6 puits (9 cm2/puits) à une densité cellulaire de cellules/puits/2 ml, pendant 72h en présence de 1000 UI/ml d'IFN-gamma recombinant (CHO), de la protéine purifiée et de surnageants d'hybridomes dilués au 1/2, dans du milieu MEM complet, contenant les anticorps. c) immunoblot Le surnageant des cellules K562 est concentré 100 fois sur une membrane AMICON YM10, puis dialysé contre un grand volume de tampon Phosphate 10mM/pH 7,4. 10 p1 de cette solution sont dilués dans 40 p1 de tampon d'échantillon Laemmli. L'échantillon est porté à 1000C pour 2 minutes, puis déposé sur un gel de polyacrylamide en gradient de 8 à 25% (Pharmacia), après migration et transfert sur une membrane de Nitrocellulose 0,45 pm (selon le protocole prescrit par le frabriquant, PhastSystem et PhastTransfer Pharmacia), la membrane est incubée 30 minutes à température ambiante dans une solution de PBS/SAB 3%. La nitrocellulose est découpée en bandes pour tester la réactivité des différents anticorps monoclonaux vis-à-vis de la molécule. Chaque bande est incubée toute la nuit à 40C avec 2 ml de chaque surnageant de culture d'hybridome dilué au 1/2 dans une solution de PBS/0,l% Tween 20. Après 3 lavages de 5 minutes en tampon NaCl/Tween, les bandes sont incubées lh30, à température ambiante, avec des anticorps de lapin anti imunoglobulines de souris (Rabbit anti Mouse DAKO 2412) dilués au 1/500 en tampon NaCl/Tween. Après 4 lavages en tampon NaCl/Tween, les bandes sont incubées avec le Complexe APAAP (Sera Lab) dilué au 1/400 en tampon NaCl/Tween, lh30 à température ambiante. Les bandes sont à nouveau lavées 4 fois en tampon NaCl/Tween. Les anticorps fixés sont révélés selon le protocole suivant : 400 ul de NBT (50 mg/ml) sont ajoutés à 60 ml de tampon NBT, après dissolution, 200 ,ul de BCIP (50 mg/ml) sont ajoutés à la solution. Les bandes sont laissées dans cette solution environ 5 minutes puis lavées à l'eau et séchées sur un papier Whatman 3MM Chr. Exemple 4 : Clonage d'un ADN complémentaire 1. Criblage d'une banque d'expression en lambda gtll a) Préparation des bactéries Y1090 Une colonie isolée est prélevée et incubée à 37"C sous agitation 3 à 4h dans 1 ml de LB, puis les bactéries sont transférées dans 50 ml de LB et incubées toute la nuit à 370C sous agitation. Les bactéries sont centrifugées 20 minutes à 1200g et le culot est repris dans 20 ml de tampon SM. b) Titrage de la banque K562 Lambda gtl 1 (Clontech) 300 ,ul de bactéries Y1090 sont ajoutés à 100 gul de phages dilués au 1/500000, en tampon SM ; le mélange phages bactéries est incubé 25 minutes à 37"C. 7,5 ml de gélose molle (Top Agar) sont ajoutés et immédiatement étalés sur une boîte de 150 mm contenant du LB/agar/Ampicilline. La boîte est incubée à 42"C pour 4h, puis les plages de lyse sont comptées pour déterminer le titre de la banque. c) Premier tour de criblage 6 tubes sont préparés pour le test ; 100 1ll de suspension contenant 3.104 phages, provenant de la banque, dans du tampon SM/MgSO4 10 mM, sont ajoutés à 300 ,ul de bactéries Y1090 en SM fraîchement préparées ; le mélange est incubé 25 minutes à 37"C. 7,5 ml de Top Agar sont ajoutés dans chaque tube et immédiatement étalés sur une boîte de 150 mm contenant du LB/Agar/Ampicilline. Les boites sont incubées à 42"C pendant 4h. 6 filtres de Nitrocellulose 0,45 pm sont trempés dans une solution d'IPTG 10mM et séchés quelques minutes avant d'être déposés sur les boîtes. Les boîtes sont alors incubées à 37"C pendant 2h.Les filtres sont prélevés puis incubés 30 minutes à température du laboratoire dans du tampon PBS/BSA 3%, (les boîtes sont conservées à 4"C pendant le reste du test). Les filtres sont transférés dans un mélange de 4 anticorps, choisis parmi ceux produits, sous forme d'ascites et diluées au 1/500 dans du tampon NaCl/Tween. Les filtres sont incubés toute la nuit à 40C, lavés 4 fois 5 minutes en tampon NaCl/Tween, puis incubés lh30 à la température du laboratoire, avec des anticorps de lapin anti immunoglobulines de souris (Rabbit anti Mouse DAKO Z412) dilués au 1/500 en tampon NaCl/Tween. Après 4 lavages de 5 minutes en tampon NaCl/Tween, les filtres incubés avec le Complexe APAAP (Sera Lab) dilué au 1/400 en tampon NaCl/Tween, lh30 à température ambiante. Les filtres sont à nouveau lavés 4 fois en tampon NaCl/Tween. Les plages de lyse positives sont révélées selon la protocole suivant : 450 pi de NBT (50 mg/ml) sont ajoutés à 60 ml de tampon NBT, après dissolution, 200 pi de BCIP (50 mg/ml) sont ajoutés à la solution. Les filtres sont laissés dans cette solution dans l'obscurité jusqu'à l'apparition d'une plage de lyse positive (environ 5 minutes) ; les filtres sont alors lavés à l'eau et séchés sur un papier whatman 3 MM Chr quelques minutes. d) Deuxième tour de purification Les plages de lyse positives au premier tour sont prélevées à l'aide d'une pipette Pasteur retournée, chaque carotte ainsi prélevée est mise à diffuser toute la nuit dans 1 mi de tampon SM/MgSO4 10 mM. Les phages sont titrés come décrit pour le titrage de la banque. Pour chaque plage de lyse, une sus pension de 200 phages dans 100 p1 de tampon SM/MgSO4 10 mM sont ajoutés à 100 ,ul de bactéries Y1090 fraichement préparées en SM. Le mélange est incubé 25 minutes à 37"C. 3,5 mi de Top Agar sont ajoutés dans chaque tube et immédiatement étalés sur une boîte de 90 mm contenant du LB/Agar/Ampicilline. Les boîtes sont incubées à 42"C et traitées comme au premier tour. e) Troisième tour de purification Les plages de lyse positives au deuxième tour sont prélevées à l'aide d'une pipette Pasteur, chaque carotte ainsi prélevée est mise à diffuser toute la nuit dans 1 ml de tampon SM/MgS04 10 mM. Les phages sont titrés comme décrit pour le titrage de la banque. Pour chaque plage de lyse, une suspension de 50 phages dans 100 ,ul de tampon SM/MgSO4 l0mM est ajoutée à 100 ,ul de bactéries Y1090 fraîchement préparées en SM. Le mélange est incubé 25 minutes à 37"C. 3,5 ml de Top Agar sont ajoutés dans chaque tube et immmédiatement étalés sur une boîte de 90 mm contenant du LB/Agar/Ampicilline.Les boîtes sont incubées à 42"C et traitées comme au premier tour. f) Amplification des phages sur boîte Une suspension de 5.104 phages à amplifier dans 100 pi de tampon SM/MgSO4 10 mM est ajoutée à 300 pi de bactéries Y1090 fraîchement préparées en SM, le mélange est incubé 25 minutes à 37"C. 7,5 ml de Top Agar sont ajoutés dans chaque tube et immédiatement étalés sur une boîte de 150 mm contenant du LB/Agar/Ampicilline. Les boîtes sont incubées à 42"C pour 4h, puis toute la nuit à 40C dans 10 ml de SM. Le produit de la diffusion est récupéré, et la boîte rincée avec 5 ml de tampon SM. Les phages sont titrés comme décrit pour le titrage de la banque. g) Préparation de phages purifiés Une colonie isolée de bactéries Y1090 est prélevée et incubée à 37"C sous agitation 3 à 4h dans 1 ml de LB, puis tranférées dans 50 ml de LB et incubées toute la nuit à 370C sous agitation. Les bactéries sont centrifugées 20 minutes à 1200g et le culot est repris dans 20 ml de tampon SM. La concentration des bactéries est estimée (une unité de D.O. à 600 mm correspond à 8.108 bactéries/ml). Les bactéries et les phages sont mis en présence à la multiciplicité 20 : 12.109 bactéries dans 100 pi de SM/MgSO4 10 mM sont incubés 25 minutes à 37"C, puis 400 ml de LB/MgSO4 10 mM ajoutés au mélange. La préparation est incubée 3 à 4h à 37"C sous agitation, la densité optique à 600 nm est mesurée toutes les heures ; elle doit atteindre 1,5 et redescendre à 0,5. Du chloroforme est ajouté (2 ml pour 400 mi). Le mélange est incubé 20 minutes à 37"C sous agitation. Après une centrifugation de 30 minutes à 10000 RPM à 4"C, le surnageant est récupéré, de la DNAse et de la RNAse à la concentration finale de 2,5 pg/ml sont ajoutées. La préparation est incubée 45 minutes à 37"C sous agitation, 24 g de NaCl (pour 400 ml) et 40 g de PEG 6000 (pour 400 ml) sont successivement ajoutés. Après précipitation 1h (ou toute la nuit) à OOC, le mélange est centrifugé à 10000 RPM 30 minutes à 4"C. Le surnageant est éliminé, et le tube est égoutté sur un papier absorbant. Le culot est repris dans 1 ml de tampon SM, puis 10 pi de SDS 10% et 10 pi d'EDTA 0,5 M pH8 sont ajoutés. Le tube est incubé 15 minutes à 68"C. Des extractions successives sont effectuées : 1) Chloroforme, 2) 2 extractions Phénol, 3) 2 extractions Phénol/Chloroforme, 4) Chloroforme, 5) 4 extractions à l'Ether. La dernière phase aqueuse est incubée 40 minutes à 65"C, puis précipitée par 1 volume d'Isopropanol froid et centrifugée 15 minutes à 4"C à 12000g. Le surnageant est éliminé et le culot lavé dans 500 pi d'Ethanol à 80% puis centrifugé 15 minutes à 4"C et à 12000g. Le culot est repris dans 50 pi de tampon TE pH8 et après mesure de la DO à 260 nm, la concentration ajustée à 100 pg/ml. h) Purification de l'insert à partir du phage L'insert est récupéré après digestion par l'enzyme de restriction EcoRI 25 pi de phages purifiés (2,5 pg) 50 pi de tampon d'enzyme 10X (fourni par le fabriquant) 415 pi d'eau distillée MilliQ (Millipore) 10 pi d'enzyme EcoRI (9UI/pi) Le mélange est incubé lh30 à 37"C, puis 30 minutes à 37"C après addition de 10 pi de RNAse (10 ,ug/ml). (La RNAse est portée à 100"C 20 minutes puis refroidie dans la glace avant utilisation). La digestion est contrôlée sur gel d'agarose 1% dans un tampon TAE IX ; pour cela 8 pi de la solution sont prélevés et 2 pi de tampon de charge sont ajoutés. La migration s'effectue à 80 Volts dans une mini cuve d'électrophorèse en présence de tampon TAE 1X et de BET à 0,5 ug/ml. 500 pi de la solution de digestion sont transférés dans un tube Eppendorf et 500 pi de Phénol/Chloroforme V/V sont ajoutés. Après agitation du tube et centrifugation 5 minutes à 12000g la phase aqueuse supérieure est transférée dans 2 nouveaux tubes pour être précipitée. 250 pi d'acétate d'Ammonium 4 M et 1 ml d'éthanol absolu froid sont ajoutés. Les tubes sont laissés 15 minutes dans la carboglace, réchauffés quelques secondes et centrifugés 15 minutes à 12000g à 4"C. Le surnageant est éliminé soigneusement et le culot lavé dans 500 pi d'éthanol 80 96 et centrifugé 15 minutes à 12000g à 4"C, puis séché. Le culot est repris dans 10 pi d'eau distillée. 2. Sous clonage de l'insert purifié dans le plasmide pBLSCR a) Préparation du plasmide pBLSCR KS (Stratagene) Le plasmide est digéré par EcoRI 20 pi de plasmide (1 llg/ 10 pi de tampon d'enzyme 10X (fourni par le fabriquant) 60 pi d'eau distillée 10 pi d'EcoRI (9UI/,ul) Le mélange est incubé 1h à 37"C, la digestion est vérifiée sur gel d'agarose 1% comme décrit précédemment. 100 pi de la solution de digestion sont transférés dans un tube Eppendorf et 100 pi de Phénol/Chloroforme V/V sont ajoutés. Après agitation du tube et centrifugation de 5 minutes à 12000g et à 4"C, la phase aqueuse supérieure est transférée dans un nouveau tube. 100 pi d'acétate d'Ammonium 4 M et 500 pi d'éthanol absolu froid sont ajoutés et le tube laissé 15 minutes dans la carbo glace, réchauffé quelques secondes et centrifugé 15 minutes à 12000g à 4"C. Le surnageant est éliminé soigneusement et le culot lavé dans 500 pi d'éthanol 80% et centrifugé 15 minutes à 12000g à 4"C, puis séché. Le culot est repris dans 10 pi d'eau distillée. Le plasmide est traité à la phosphatase 10 pi plasmide 10 pi Tampon 10X 5 pi phosphatase (1UI) 75 pi d'eau distillée Le tube est incubé 1h30 à 37"C puis le plasmide précipité commme décrit précédemment le culot est repris dans 10 pi de tampon TE pH8. b) Purification du plasmide et de l'insert sur gel Un gel d'agarose SeaPlaque GTG (FMC BioProducts) à 0,8% est réalisé dans un tampon TAE 1X. 2 pi de tampon de charge sont ajoutés dans, soit 10 pi de plasmide, soit 10 pi d'ADN phagique. Les échantillons sont déposés sur le gel et la migration s'effectue à 20 volts dans un tampon TAE 1X en présence de BET à 0,5 pg/mi final ; jusqu'à ce que le front de migration atteigne 10 cm. Les bandes d'agarose correspondant au plasmide et à l'insert sont découpées sous UV et récupérées dans des tubes Eppendorf, les tubes sont chauffés à 65"C et le volume d'agarose fondu mesuré. c) Ligation Pour la ligation, un tube contenant 2 ,ul de vecteur purifié (200 ng), 2 pi d'insert purifié (200 ng), 2 pi de tampon de ligase 10X (fourni par le fabriquant), 12 pi d'eau distillée, et 2 lul de T4 DNA ligase est incubé toute la nuit à 150C. Un tube est également préparé en omettant l'insert. d) Transformation calcique 1) Préparation des bactéries compétentes Une colonie isolée de bactéries HBlOl est prélevée et mise ne culture dans 50 ml de LB sous agitation à 37 C toute la nuit. La densité est mesurée à 600 nm et les bactéries diluées dans du LB pour obtenir 500 ml de bactéries à 0,1 de densité optique.Les bactéries sont remises en culture à 37 C sous agitation jusqu'à obtenir une densité optique de 0,6 ; puis refroidies le plus vite possible à 0 C et centrifugées, à 0 C, à 1500g 5 minutes ; le surnageant est éliminé et le culot repris dans 500 ml de CaC12 50 mM froid et incubé 1h à 0 C. Après centrifugation 5 minutes à 1200g à 0 C, le surnageant est éliminé et les bactéries resus pendues dans 50 ml de Caca, 50 mM/20 Ó glycérol. Les bactéries sont soit utilisées immédiatement, soit congelées à -80 C, en aliquotes. 2) Transformation Dans un tube stérile de 5 ml, pour chaque ligation, maintenu dans de la glace 20 1ll Tris HCl 10 mM pH8 5 pi du produit de la ligation 10 pi de tampon TMC lOX 65 pi de bactéries compétentes (fraîchement préparées ou congelées). Les tubes sont incubés 15 minutes à 4 C, puis 2 minutes à 42 C et enfin 10 minutes à température ambiante. Dans chaque tube I ml de LB est ajouté et ceux-ci sont incubés 1h à 37 C, 300 pi de cette suspension sont étalés sur une boîte de 90 nm contenant du LB/Agar/Ampicilline. Les boites sont incubées toute la nuit à 370C. e) Mini préparation de plasmide Des colonies sont prélevées dans les boîtes à l'aide de cure-dents et déposées dans des tubes contenant 3 ml de LB, puis incubées toute la nuit à 370C sous agitation. 1,2 ml de chaque suspension sont transférés dans des tubes Eppendorf, les bactéries sont récupérées par centrifugation de 15 minutes à 12000g (4 C). Le surnageant est éliminé, le culot repris dans 100 pi de tampon TELT et 10 pi de lysozyme. Les tubes sont placés I minute à 100"C et 5 minutes dans la glace, puis centrifugés 1û minutes à température ambiante. Le culot est éliminé à l'aide d'un cure-dent, puis 220 ul/tube d'éthanol absolu froid sont ajoutés et les tubes mis dans la carboglace pour 15 minutes. Les tubes sont réchauffés puis centrifugés 15 minutes à 4"C et à 1200g, les surnageants éliminés et les culots lavés avec 500 pi/tube d'éthanol 80% froid, centrifugés 10 minutes à 12000g à 4"C. Les culots sont séchés puis chaque culot est repris dans 30 pi de Tris HC1 10 mM pH 7,5. f) Vérification de la présence de l'insert 10 pi de mini préparation 2 pi de tampon d'enzyme EcoRI 6 pi d'eau distillée 2 pi d'EcoRI 50UI/p1. Les tubes sont incubés 1h à 37"C. 10 pi de chaque préparation digérée ou non sont déposés sur gel d'agarose, 1% du tampon TAE 1X, et la migration s'effectueà 80 Volts, dans du tampon TAE IX contenant du BET à 0,5 pg/mi final. 3. Séquençage de l'ADNc obtenu a) Amplification et purification du plasmide Un des plasmides contenant l'insert est amplifié ; pour cela 50 pi de bactéries contenant le plasmide intéressant sont incubées toute la nuit à 37"C et sous agitation dans 10 ml de LB contenant de l'Ampicilline. La densité optique est mesurée à 600 nm et les bactéries sont diluées dans du LB, contenant de l'Ampicilline, pour obtenir 500 ml de culture ayant une densité optique de 0,1. Les bactéries sont incubées toute la nuit à 37"C et sous agitation dans un Erlen Meyer de 2 litres. Les bactéries sont centrifugées 20 minutes à 4"C et à 12000g, et la purification du plasmide s'effectue, selon la notice du fabriquant, sur colonne Quiagen. b) Synthèse d'oligonucléotides La synthèse d'oligonucléotides est réalisée à l'aide d'un synthétiseur automatique (Applied biosystem), l'oligonucléotide obtenu est fixé sur une colonne. I1 est élué de cette colonne par 3 passages d'ammoniaque 25%, (300 pi, 300 pi et 400 pi) à l'aide d'une seringue de I ml et récupéré à l'autre extrémité à l'aide d'une autre seringue. Chaque introduction d'ammoniaque est accompagnée d'une incubation de 15 minutes à température ambiante. L'oligonucléotide est récupéré dans un tube qui est placé à 65"C pour toute la nuit. L'oligonucléotide est précipité dans 1 volume de sulfate d'ammonium 4 M et deux volumes et demi d'éthanol absolu froid, le tube est placé dans la carboglace pour 15 minutes, réchauffé, centrifugé 15 minutes à 12000g à 4"C. Le surnageant éliminé et le culot lavé dans 500 pi d'éthanol 80% froid. Le culot est séché et repris dans 500 pi d'eau distillée. Une mesure de la densité optique est réalisée à 260 nm et la concentration d'oligonucléotide est ajustée à 0,8 pM utilisable pour la séquence. c) Séquençage Le séquençage a été réalisé à l'aide du kit de séquençage T7 de Pharmacia, selon la technique décrite par le fabriquant. Le produit de la réaction subit une électrophorèse sur gel de polyacrylamide 8% et 0,4 mm d'épaisseur, en présence d'urée 46% et dans du tampon TBE IX. Deux dépôts de chaque réaction de séquence sont réalisés à 2h d'intervalle. La séquence a été déterminée par plusieurs réactions. Les deux premières réactions de séquence ont été réalisées en utilisant deux oligonucléotides correspondant au site d'insertion de l'insert dans le plasmide. Les deux réactions de séquences suivantes, ont été réalisées en utilisant 2 oligonucléotides de 15mer correspondant aux dernières bases pouvant être lues sur l'insert. Les réactions de séquences suivantes ont été réalisées de la même façon, c'est-à-dire que 2 nouveaux oligonucléotides ont été choisis et synthétisés. Des réactions successives ont été réalisées jusqu'à obtention de la séquence complète. 4. Amplification de l'insert phagique par P.C.R. L'amplification de l'insert par PCR a été réalisée sur un appareil Perkin Elmer Cetus. De la solution stock contenant 3.107 phages/ml, 10 pi sont prélevés et 40 pi d'eau distillée ajoutés. L'échantillon est porté 2 minutes à 100"C et centrifugé à 12000g 10 minutes ; le surnageant est récupéré (= ADN pour PCR). Réaction de PCR 10 pi ADN pour PCR 10 pi de tampon d'enzyme lOX 2 pi de dNTP's 124 pM 1 pi Oligonucléotides 1 (50pM) 1 pi Oligonucléotides 2 (50pM) 1 pi Oligonucléotides 1 (ou 2) marqués à 1'ATP P32 (3pM) 0,5 pi d'enzyme Taq (0,5UI/pi) 75,5 pi d'eau distillée. 30 cycles Dénaturation : 30 secondes à 94"C Fixation des oligonucléotides : 40 secondes à 55"C Extension : 40 secondes à 72"C. L'extension du dernier cycle dure 10 minutes. 5. Séquençage après P.C.R. Le produit de la PCR est utilisé pour le séquençage selon la technique de Maxam et Gilbert sur des morceaux de papier (pour séquence Maxam et Gilbert Amersham RPN 1500). Réaction A + G : le papier est incubé 10 minutes à température ambiante dans 1 ml d'acide formique aqueux 66%. Réaction C : le papier est incubé 10 minutes à température ambiante dans 1 ml d'hydroxylamine/hydrochloryde 275 mg/ml pH 6. Réaction G: le papier est incubé 5 minutes à température ambiante dans 1 mi d'ammonium formate 50 mM pH 3,5 contenant 7 pi de DMS. Réaction T + C: le papier est incubé deux fois 10 minutes à température ambiante dans deux fois I ml de permanganate de potassium 2 mg/ml. Chaque fragment est lavé 3 fois 30 secondes dans l'eau distillée et une fois 30 secondes dans I'éthanol 96%, le papier est séché à l'air 2 minutes entre chaque lavage. Les fragments sont ensuite transférés dans des tubes Eppendorf contenant 300 pi de pipéridine ; après 30 minutes à 90"C les fragments sont éliminés et les tubes mis à sécher. Les culots sont repris dans 40 pi d'eau distillée par tube puis séchés. Cette opération est renouvelée 3 fois. Chaque culot est repris dans 15 pi de tampon de charge pour arrêt de séquence (kit Pharmacia) et les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide 8% comme décrit précédemment. 6. Sous clonage dans le vecteur CDM8 de l'insert purifié L'insert purifié à partir du phage est traité par l'enzyme de Kieenow 20 pi dtinsert (200 ng) 2 p1 de dATP (0,5 mM) 2 pI de dCTP (0,5 mM) 2 ,ul de dGTP (0,5 mM) 2 pi de dTTP (0,5 mM) 4 pi de tampon d'enzyme 10X 6 pi d'eau distillée 2 Eul d'enzyme de Kleenow (2U1/pi) Le tube est incubé 30 minutes à 37"C, puis l'ADN est précipité en ajoutant un volume d'acétate d'ammonium 4 M et 2,5 volumes d'éthanol absolu froid ; le tube est placé 15 minutes dans la carboglace, réchauffé, centrifugé à 12000g 15 minutes à 4"C. Après élimination du surnageant, le culot est lavé dans 500 pi d'éthanol 80% froid, centrifugé 15 minutes à 12000g à 4"C, séché et repris dans 10 pi d'eau distillée. Ligation 5 pi de cette solution 3 pi d'adaptateurs BstX1 (3 pg) I pi de tampon d'enzyme 10X 1 pi de T4 DNA ligase (2,5UI/p1). Le tube est incubé à 15"C toute la nuit, les adaptateurs non liés sont éliminés sur une colonne de sephadex S400 de Pharmacia selon le protocole décrit par le fabriquant. L'ADN récupéré est précipité comme décrit précédemment et le culot est repris dans 21 pi d'eau distillée. Puis 4 pi de vecteur CDM8 coupé par BstXl (In vitrogen 0,2 pg/pi), 3 pi de tampon de ligation (fourni par le fabriquant), 2 pi de T4 DNA ligase (2,5 Ul/pi) sont ajoutés et le tube incubé à 15"C toute la nuit. Le tube peut-être conservé à -20 C. 7. Vérification du sens d'insertion de l'insert a) Préparation de bactéries compétentes Une colonie isolée de bactéries est prélevée et mise en culture dans 50 ml de LB sous agitation à 37"C toute la nuit. La densité est mesurée à 600 nm diluées dans du LB pour obtenir 500 ml de bactéries à 0,1 densité optique. Les bactéries sont remises en culture à 37"C sous agitation jusqu'à obtenir une densité optique de 0,4 à 0,5 à 600 nm ; les bactéries sont refroidies le plus vite possible à 0 C et laissées 15 minutes à O"C. Les bactéries sont centrifugées à 0 C à 1200g 20 minutes, le surnageant est éliminé et le culot repris dans 1/2 volume initial d'eau distillée froide, l'opération est renouvelée 4 fois. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 1 volume de glycérol 30% ; les bactéries sont soit utilisées immédiatement soit congelées à -80 C, en aliquotes. b) Electroporation 2 pi du produit de ligation et 50 pi de bactéries compétentes sont mélangés dans une cuvette d'électroporation 0,2 cm, l'appareil est réglé sur 2470 mV, 400 Ohms, 25 pF. Immédiatement après électroporation les bactéries sont reprises dans 1 ml de milieu SOC puis incubées 1h sous agitation à 37"C. Les bactéries sont étalées à raison de 10 pi, 100 pi ou 500 pi sur 3 boîtes de LB/Agar/Ampicilline/Tétracycline. Les boîtes sont incubées toute la nuit à 37"C. Des mini préparations sont réalisées pour vérifier l'insertion comme décrit précédemment. A partir de colonies possédant l'insert, des préparations de plasmides plus importantes sont réalisées comme décrit précédemment. Puis un séquençage est effectué pour déterminer le sens d'insertion. 8. Transformation de cellules COS Un des plasmides, ayant le sens d'insertion permettant la synthèse de la protéine, est utilisé pour l'électrophorèse des cellules COS. Les cellules COS sont ensemencées dans du milieu DMEM complet et sont recueillies au bout de 24h (50 à 70% de confluence). Les cellules sont lavées deux fois en PBS froid par centrifugation à 800g 5 minutes et resuspendues à 107 cellules/ml dans du tampon d'électroporation. 0,8 ml de suspens ion cellulaire et 60 llg de plasmide/insert sont mélangés dans une cuvette d'électroporation 0,4 cm. La cuvette est placée dans la glace 10 minutes, l'appareil est réglé sur 380 mV, 25 pF. Immédiatement après électroporation, la cuvette est placée dans la glace 10 minutes, puis les cellules remises en culture dans un flacon de 75cm2. Le surnageant est prélevé 48h plus tard pour être testé. 9. Vérification de l'activité de la protéine recombinante Le surnageant des cellules COS, électroporées, est utilisé dans un test d'induction des cellules ICIG7, le surnageant est utilisé à différentes dilutions dans du milieu MEM complet, et le test est réalisé comme décrit précédemment. REFERENCES ACCOLLA R.S., CARRA G., GUARDIOLA J. ; P.N.A.S., 1985, 82 : 5145-5149. BECKER S. ; Surv. Immunol. Res., 1985, 4 : 135-145. BOSS J.M., STROMINGER J.L.; P.N.A.S., 1986, 83 : 9139-9143. DE PREVAL C., LISOWSKA-GROSPIERRE B., LOCHE M., GRISCELLI C., MACH B. ; Nature, 1985, 318 : 291-293. DORN A., FEHLING H.J. , KOCH, W., LE SIEUR M., GERLINGER P., BENOIST C., MATHIS D. ; Molecular and Cellular Biology, 1988, 8 3875-3987. 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REVENDICATIONS 1/ Cytokine qui est un antagoniste spécifique de l'induction de l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II à la surface des cellules par l'interféron gamma, et qui - comporte tout ou partie de la séquence peptidique telle que décrite dans la figure 1, ainsi que ses variants conservant l'activité biologique précédemment décrite, et - est naturellement secrétée par les cellules, ou - est le produit d'expression d'une séquence d'ADN exogène dans des cellules procaryotes ou eucaryotes. 2/ Cytokine slon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire déterminé en gel de polyacrylamide SDS, d'environ 19 000. 3/ Cytokine selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que elle est obtenue par expression d'une séquence d'ADN exogène dans une cellule eucaryote. 4/ Séquence d'ADN qui code lors de l'expression dans une cellule hôte, pour une cytokine, qui est un antagoniste spécifique de l'induction de l'expression des antigènes d'histocompatibilité de classe II à la surface des cellules par l'interféron gamma, ladite séquence étant choisie parmi: a) la séquence d'ADN de la figure 1 ou ses brins complémentaires b) une séquence d'ADN qui s'hybride avec les séquences d'ADN de a) ou une partie de celles-ci ; et c) une séquence qui, compte-tenu de la dégénérescence du code génétique code pour une cytokine ayant la même séquence d'acides aminés que a) ou b). d) une séquence qui code pour un variant de ladite cytokine et qui conserve l'activité biologique précédemment décrite. 5/ Séquence d'ADN selon la revendication 4, codant pour l'expression de tout ou partie de la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3 ainsi que ses analogues et/ou dérivés, qui conservent l'activité précédemment décrite de ladite cytokine. 6/ Séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 à 5, caractérisée en ce qu'elle est associée de façon covalente à une molécule marquée détectable. 7/ Séquence d'ADN selon la revendication 6, caractérisée en ce que le marquage est un marquage isotopique. 8/ Séquence d'ADN selon la revendication 6, caractérisée en ce que le marquage est un marquage non isotopique. 9/ Cellule hôte eucaryote ou procaryote transformée ou ayant subi une transformation ou une transfection avec une séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 à 5, de façon à assurer l'expression dans la cellule hôte de ladite cytokine. 10/ Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote. 11/ Vecteur de clonage biologiquement fonctionnel comprenant une séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 à 5. 12/ Cellules hôtes transformées ou transfectées de façon stable par un vecteur de clonage selon la revendication 11. 13/ Procédé de préparation de la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on purifie ladite cytokine à partir du sur nageant de culture de cellules. 14/ Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les cellules sont cultivées dans un milieu nutritif approprié, dépourvu des protéines contaminatrices du sérum. 15/ Procédé selon l'une des revendications 13 et 14, caractérisé en ce que le sérum est contenu dans un sac à dialyse perméable aux poids moléculaires inférieurs à 50 kD. 16/ Procédé de préparation d'une cytokine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on met en culture dans un milieu approprié une cellule hôte selon l'une des revendications 9 et 10 ou 12 de façon à ce qu'elle exprime ladite cytokine et en ce que l'on isole la cytokine souhaitée. 17/ Anticorps monoclonaux dirigés contre la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3. 18/ Immuno-sérum dirigé contre la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3 ou obtenue par le procédé selon l'une des revendications 13 à 16. 19/ Composition thérapeutique comportant à titre de principe actif une cytokine selon l'une des revendications 1 à 3 ou obtenue par le procédé selon l'une des revendications 13 à 16. 20/ Composition thérapeutique comportant à titre de principe actif une séquence d'ADN selon l'une des revendications 4 à 8. 21/ Composition thérapeutique comportant à titre de principe actif un anticorps selon la revendication 17, ou un immuno-serum selon la revendication 18. 22/ Kit de diagnostic de présence de la cytokine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un anticorps selon la revendication 17.