Brevet FR2677126A1 — publié le 19921204

Réactif pour mesurer l'activité peroxydasique de la glaire cervicale, dispositif de mise en oeuvre de ce réactif et procédé de réalisation La présente invention a pour objet un réactif pour mesurer l'activité peroxydasique de la glaire cervicale. Elle concerne également un dispositif de détection de l'activité peroxydasique comprenant ce réactif ainsi qu'un procédé permettant de réaliser ce dispositif. Le réactif selon l'invention est plus spécialement destiné à permettre de déterminer, chez la femme, la date de période ovulatoire dans un but d'aide à la maîtrise de la fécondité, qu'il s'agisse d'éviter ou de profiter de la période fertile. Selon le document FR-A-2 652 092 au nom de la Demanderesse, il est décrit un procédé pour effectuer une telle mesure consistant après prélèvement de la glaire, à la diluer puis à y ajouter un peroxyde et le système chromogène MBTH (3-méthyl-2-benzothiazolinone hydrazone)/DMAB(acide diméthylaminobenzoïque) pour conduire à une coloration variable selon l'activité de l'enzyme et appréciable à l'oeil nu, cette coloration étant comparée à un nuancier. Ce procédé est avantageux, en ce que - il permet de prédire l'ovulation et non de la confirmer - il est fiable - sa mise en oeuvre est simple. Ce procédé repose sur l'évaluation de l'activité peroxydasique de la glaire cervicale, cette activité diminuant à partir du cinquième jour précédant l'ovulation pour passer par un minimum à la date de l'ovulation et remonter ensuite. En comparaison avec les méthodes existantes pour détecter l'ovulation, basées sur des variations de concentrations hormonales ou de température, ce procédé permet une détermination anticipée et certaine de la date d'ovulation. Le document FR-A-2 652 092 décrit aussi un réactif constitué par de la ficine, un peroxyde et le système chromogène MBTH/DMAB. Cependant à température ambiante, la conservation de ce réactif est limitée à quinze jours environ, et il doit de ce fait être maintenu au réfrigérateur pour que sa conservation soit prolongée. La présente invention propose un réactif pour mesurer l'activité peroxydasique, présentant les mêmes avantages que le réactif selon le document précité, mais possédant en outre, une plus grande stabilité à température ambiante. Le réactif selon l'invention comprend un peroxyde, une substance chromogène susceptible d'être oxydée, un agent de fluidification de la glaire cervicale, la substance chromogène étant 1'ABTS, acide-2,2'-azino-bis-(3- éthylbenzothiazoline-6-sulfonique). Le choix de 1'ABTS permet de prolonger la conservation du réactif jusqu'à trois mois à température ambiante sans altération. Le peroxyde est de préférence choisi dans le groupe des peroxydes liquides tels que le peroxyde d'hydrogène et des peroxydes solides tels que le peroxyde d'urée. L'agent de fluidification peut être un enzyme choisi parmi la ficine, 1' d -mannosidase et la # -N-acétyl-glucosaminidase ou bien du chlorure de calcium. Le réactif selon l'invention peut être mis en oeuvre sous une forme liquide et son pH est ajusté entre 4 et 6. La présente invention vise également un dispositif pour détecter l'activité peroxydasique de la glaire cervicale, comprenant un support, sur lequel sont superposées plusieurs couches, chacune d'elles étant constituée par au moins un composant du réactif selon la présente invention et un liant. Selon un mode de réalisation préférentiel du dispositif, le dispositif comprend trois couches, une couche inférieure, déposée sur le support, comprenant 1'ABTS, une couche intermédiaire comprenant le peroxyde, et une couche supérieure comprenant l'agent de fluidification de la glaire cervicale. Selon ce mode, l'ordre de disposition des couches est celui du déroulement de la réaction de détection. Le liant est préférentiellement choisi parmi les liants à base de colloides hydrophiles tels que la polyvinylpyrrolidone, les alginates, l'agarose, la gélatine,les acrylamides. Il peut être identique ou différent pour chaque couche. Ce dispositif est avantageux en ce que, de sa conception à son utilisation, chacun des composants du réactif est maintenu individuellement dans un milieu inerte, cet agencement confèrant une durée de conservation du réactif beaucoup plus longue. Un autre objet de la présente invention est un procédé pour réaliser ce dispositif. Il consiste à incorporer chacun des composants du réactif dans un milieu colloïdal gélifiant et à appliquer en couches successives superposées à partir du support, chacune des couches obtenues, chaque dépôt d'une couche s'effectuant après gélification de la couche sur laquelle elle sera déposée, par exemple, en respectant entre chaque dépôt un temps d'attente suffisant à la prise en masse de la dernière couche déposée, avant le dépôt de la suivante. La gélification peut aussi être obtenue sous l'action d'un ou plusieurs facteurs physiques tels que la diminution de la température. A titre d'exemple non limitatif, la préparation d'un dispositif selon l'invention est à présent décrite. Selon cet exemple le réactif choisi comprend l'o( -mannosidase pour 5 unités/dm2, le peroxyde d'urée pour 15 mg/dm2, et 1'ABTS pour 2 24 mg-/dm , chaque concentration étant donnée par rapport à une unité de surface de la couche correspondante. Les solutions de composants du réactif sont préparées comme suit 1) on dissout de la gélatine dans de l'eau pour obtenir une solution A, 2) on dilue chacun des composants respectivement o(-mannosidase, peroxyde d'urée et ABTS dans une partie de la solution A. Sur un support, la solution d'ABTS est coulée à l'état liquide pour former la couche inférieure. Après le respect d'un temps d'attente correspondant au temps de gélification de la couche inférieure, sont appliquées la couche intermédiaire correspondant à la solution de peroxyde d'urée, puis après un nouveau temps d'attente, la couche supérieure correspondant à la solution de 1' ol-mannosidase. Le dispositif obtenu se présente sous forme d'un support horizontal constitué ou recouvert par un matériau inerte tel que plastique, papier rigide, sur lequel sont superposées trois couches qui ont une épaisseur chacune de 0,1 à 2 mm. L'utilisation de ce dispositif se fait par le dépôt d'une goutte de glaire cervicale sur la couche supérieure. Au bout d'une dizaine de minutes, une coloration de bleu à vert est obtenue et est comparée à un nuancier fourni avec le dispositif d'analyse. En pratique, une femme désireuse de connaître la date de sa prochaine ovulation doit effectuer une analyse tous les deux jours, après le sixième jour de la menstruation, ces analyses devant être répétées jusqu'à ce qu'elle observe une remontée de l'activité peroxydasique. Le résultat de chaque analyse sera reporté sur un graphique comportant en abscisse une échelle des temps et en ordonnée un certain nombre de repères correspondant à un certain nombre de couleurs appartenant au nuancier. Les différents points reportés sur le graphique permettront de tracer une courbe ayant la forme suivante : cette courbe présentera tout d'abord une zone à peu près horizontale, puis une rupture correspondant à une baisse de l'activité peroxydasique, la courbe passant par un minimum le jour de l'ovulation, puis remontant pour atteindre sa valeur initiale sensiblement deux jours après l'ovulation. Le premier point d'inflexion se situant sensiblement quatre jours avant l'ovulation, permettra à la femme de déceler de manière certaine et de façon anticipée la date de sa prochaine ovulation. REVENDICATIONS 1. Réactif pour mesurer l'activité peroxydasique de la glaire cervicale comprenant un peroxyde, une substance chromogène susceptible d'être oxydée, un agent de fluidification de la glaire cervicale caractérisé en ce que la substance chromogène est 1'ABTS, acide 5 2'-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline6-sulfonique), produisant en présence de peroxydase, une gamme de colorations appréciables à ltoeil nu et stables dans le temps pendant plus de 15 minutes. 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peroxyde est choisi dans le groupe des peroxydes liquides tels que le peroxyde d'hydrogène et des peroxydes solides tels que le peroxyde d'urée. 3. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de fluidication est un enzyme choisi parmi la ficine, 1 e(-mannosidase et la 13 -N-acétyl-glucosaminidase ou bien du chlorure de calcium. 4. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est sous forme liquide et son pH est ajusté entre 4 et 6. 5. Dispositif pour détecter l'activité peroxydasique de la glaire cervicale, comprenant un support caractérisé en ce que sur le support sont superposées plusieurs couches, chacune d'elles étant constituée par au moins un composant du réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et un liant. 6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend trois couches, une couche inférieure, déposée sur le support comprenant 1'ABTS, une couche intermédiaire comprenant le peroxyde et une couche supérieure comprenant l'agent de fluidification de la glaire cervicale. 7. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que le liant est choisi parmi les liants à base de colloides hydrophiles. 8. Procédé pour réaliser un dispositif selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que - on incorpore chacun des composants du réactif dans un liant colloïdal gélifiant - on applique successivement chacune des solutions obtenues, en couches superposées, chaque dépôt d'une couche s'effectuant après gélification de la couche sur laquelle elle sera déposée.