Brevet FR2677666A1 — publié le 19921218

Peptides ou polypeptides immunoqènes du virus BVD et virus apparentés, vaccins les incorporant ou les exprimant, procédés et moyens de production y relatifs. La présente invention a trait à de nouveaux Debtides ou Dolypeptides immunoqènes du virus de la diarrhée bovine et virus apparentés, en particulier virus de la maladie de Border, à des vaccins les incorporant ou les ex Drimant. ainsi qu'à des procédés et moyens de production y relatifs. Le virus de la diarrhée bovine (BVD) est un virus enveloppé à ARN monocaténaire infectieux, qui est apparenté au virus de la peste porcine classique et à celui de la maladie de Border les trois virus formant le genre Pestivirus qui appartient à la famille des Toqaviridae Le virus BVD est universellement répandu dans les populations bovines et se manifeste par un très large éventail de symptômes cliniques associés à des maladies congénitales, respiratoires ou entériques (diarrhée virale bovine. maladie des muqueuses). Les isolats des virus BVD peuvent être classés en deux catéqories ou biotypes distincts d'après leurs effets en culture de cellules: cytopathoqène et non cytopathogène. L'infection aiquë d'animaux séronéqatifs est ordinairement bénigne ou subclinique Par contre, une infection intra-utérine du foetus, dans les quatre premiers mois environ après le début de la gestation, par une souche non cytopathogène, peut non seulement produire des avortements, des mortinatalités ou la naissance de veaux faibles, mais aussi la naissance de veaux présentant une virémie persistante Cette période correspond à une absence d'immunité chez le foetus Lorsque le système immunitaire devient ensuite compétent, celui-ci reconnaît le virus comme sien et il s'établit une situation d'immunotolérance. Ces animaux ne pourront pas survivre à une infection ultérieure par une souche cytopathoaène de virus BVD homoloaue. Le maintien du virus non cytopathoaène au sein de la population bovine est assuré par sa lente dissémination faisant suite à l'infection aiquë d'animaux séronégatifs et, surtout, par son excrétion continuelle par les animaux présentant une virémie persistante Voir J Brownlie et al., Ann Rech Vét ( 1987) 18:157-166. Des vaccins à virus atténués et à virus tués ont été développés dans le passé, sans résultats satisfaisants. Voir P Saurat et al "La Maladie des Muqueuses" ( 1972): 229-251, l'Expansion scientifique française, Paris, et A L. Fernelius et al, Am J Vet Res ( 1971) 32:1963-1979 Les vaccins à virus atténués Deuvent être responsables de la mort de certains des animaux inoculés, notamment des animaux à virémie persistante Les vaccins à virus tués quant à eux demandent de multiples inoculations et ne procurent qu'une immunité relativement faible et peu durable. La recherche semble donc s'orienter vers d'autres types de vaccins, vaccins synthétiques et vaccins vivants recombinants Pour ce faire, il faut avant tout rechercher des déterminants antigéniques. Le génome de la souche virale Osloss de biotvpe cytopathogène a été cloné et entièrement séquencé par Renard et al (demande de brevet EP-A- 0 208 672 du 8 juillet 1985). La demanderesse a trouvé que la phase de lecture ouverte (ORF), de la séquence génomique de BVD Osloss longue de 12408 nucléotides, a une capacité codante de 3951 acides aminés (aas). Les protéines structurales sont codées par la partie 5 ' du aénome et sont notamment une protéine non glycosylée de 270 acides aminés, appelée p 20 suivant la nomenclature proposée par Collett et al (Viroloay 165:200-208, 1988), et deux protéines glycosylées appelées gp 62 et gp 53 suivant cette même nomenclature On utilise dans ce qui suit une autre nomenclature pour ces trois protéines structurales, qui sera C pour p 20, g El pour gp 62 et g E 2 pour gp 53. R.O Donis et al (Neutralizina Monoclonal Antibodies to Bovine Viral Diarrhoea Virus Bind to the 56 K to 58 K Glycoprotein J Gen Virol ( 1988), 69:77-86) ont montré la présence d'épitopes de neutralisation dans une protéine qlycosylée d'enveloppe de 56-58 k D. D'après la demande de brevet EP-A-0 236 977, on connaît également un épitope peptidique neutralisant qui s'avère être situé au niveau du site d'épissage entre les glycoprotéines g El et g E 2. La présente invention a pour objectif de mettre en évidence d'autres épitopes neutralisants et d'obtenir les peptides ou polypeptides les incluant et de réaliser des compositions vaccinales, y compris vaccins synthétiques et vaccins vivants recombinants, contre le virus de la diarrhée bovine et virus apparentés. Un autre objectif de l'invention est de fournir de tels vaccins qui soient efficaces contre les deux biotypes du virus BVD. Conformément à l'invention, on a localisé des épitopes neutralisants dans une région codée par la partie ' du génome du virus BVD/Osloss et, à partir des informations de localisation, on a réalisé des constructions d'ADN qui comprennent une fraction du aénome BVDF laquelle contient au moins une séquence de nucléotides correspondant à l'un au moins de ces épitopes Plus précisément, les séquences relatives à ces épitopes ont été notamment localisées dans la première moitié de la partie du aénome viral (transcrit en ADN) qui code pour g E 2 On a aussi localisé des épitopes dans la séquence codant pour g El. L'invention a donc pour objet une séquence de nucléotides correspondant sensiblement à la fraction du génome des virus BVD codant pour g E 2 ou séquence contenue à son intérieur, et de préférence la première moitié de g E 2, et à une séquence de nucléotides correspondant à la fraction des virus BVD codant pour q El ou séquence contenue à son intérieur, ainsi que toute nouvelle séquence nucléotidique qui les contient, séparément ou en combinaison, et qui comporte des moyens permettant leur expression ou qui soit associée à de tels moyens. Une séquence de nucléotides correspondant sensiblement à la première moitié de la partie du génome, de la souche Osloss (B Liess, 1967, Dtsch Tieràrtztl. Wochenschr, 74:46-49), codant pour g E 2 est représentée, à titre d'exemple, dans la liste de séquences annexée, sous la référence SEQ ID NO:1 Pour cette même souche, une séquence codant pour g El est représentée sous la référence SEQ ID NO:3. A titre d'exemple, de telles séquences peuvent être les suivantes: codon d'initiation de traduction séquence codant pour q El séquence codant pour q E 2 signal de fin de copie (une séquence complète est représentée à titre d'exemple dans la liste de séquences sous la référence SEQ ID NO:2); codon d'initiation de traduction séquence codant pour g El + les 273 premiers codons de q E 2 signal de fin de copie (par exemple SEQ ID No:4); codon d'initiation de traduction séquence codant pour la fin de q El + les 273 premiers codons de q E 2 signal de fin de copie codon d'initiation de traduction séquence codant pour les 273 premiers codons de q E 2 signal de fin de copie; codon d'initiation de traduction séquence codant pour q E 2 signal de fin de copie; codon d'initiation de traduction séquence codant pour la première moitié de q E 2 signal de fin de copie; codon d'initiation de traduction séquence codant pour C séquence codant pour q El séquence codant pour g E 2 - signal de fin de copie. L'invention a également pour objet les fragments nucléotidiques appartenant à cette première moitié de ladite partie du génome codant pour g E 2, ou à la partie codant pour g El, et dont les produits de traduction sont reconnus par des anticorps neutralisants, lesdits fragments étant associés à des moyens permettant leur expression. Bien entendu, les séquences de nucléotides précitées incluent toutes les séquences équivalentes, c'est-à-dire qui reprennent les propriétés essentielles de la séquence. A titre d'exemple, ce serait le cas d'une séquence qui code pour une séquence identique d'acides aminés, mais qui utiliserait d'autres codons spécifiques par dégénérescence du code. Ce serait également le cas pour une séquence codant pour une séquence d'acides aminés non plus identique mais similaire, compte tenu des ressemblances entre acides aminés. Bien entendu, les séquences peuvent être issues de différentes souches de Pestivirus ou être constituées de séquences hybrides résultant de l'assemblage de fragments génomiques issus de souches différentes Les séquences précitées incluent donc toute séquence différente conservant la reconnaissance par les mêmes anticorps neutralisants. Ces séquences peuvent être des séquences d'ARN ou d'ADN, orientées positivement dans le sens 5 ', 3 '. L'invention a également pour objet les peptides ou polypeptides correspondant à la traduction de ces séquences de nucléotides. Ces peptides ou polypeptides peuvent être préparés par différents procédés qui font également partie de l'invention. Ainsi, dans un premier mode de mise en oeuvre, les séquences de nucléotides pertinentes selon l'invention peuvent être introduites dans des vecteurs d'expression viraux ou eucaryotes. Différentes techniques connues de construction de ces vecteurs sont décrites dans la demande de brevet EP-A-0 208 672. Comme vecteurs d'expression viraux, on peut notamment utiliser le système Baculovirus (US-A-4 745 051) en intéarant la séquence nucléotidique concernée dans le génome de Baculovirus Un exemple de construction dans ce système sera décrit plus loin. Les hôtes eucaryotes peuvent être des cultures cellulaires animales ou des levures, notamment Saccharomyces cerevisiae Les vecteurs de transfert pour les levures comportent avantageusement des marqueurs permettant la sélection des recombinants utiles, par exemple par résistance aux antibiotiques ou autres moyens de sélection connus (Broach J et al, Meth Enz ( 1983) 101: 307) Pour les promoteurs, voir également Hess et al, J Adv Enz Req ( 1968) 7:149, et Holland et al Biochemistry ( 1968) 17:4900 ou Itzeman et al, J Biol. Chem ( 1980) 255:2073. Les cellules animales sont, de préférence, des lignées cellulaires de mammifères connues telles que He La, CHO ou BHK, des cellules d'insectes, par exemple Spodoptera frugiperda (dépôt ATCC CRL 1711, Sf 9) (notamment pour le système Baculovirus) et, d'une façon générale, on préférera des lignées dont l'utilisation pour l'expression de substances à administrer à l'animal a été reconnue par les autorités sanitaires On utilisera comme promoteur, dans ces constructions cellulaires des promoteurs viraux tels que ceux du virus SV 40 (Fiers et al, Nature ( 1978) 273:113) et du virus CMV ou cytomeqalovirus humain (McGreqor et Caskey, Nucleic Acids Res 17:2365, 1989), ou encore celui du gène polyhédrine du Baculovirus Ac NPV ou Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (Hooft van Iddekinge et al, 1983, Virology 131: 561-565). L'invention a donc également pour objet les hôtes eucaryotes permettant l'expression de ces peptides ou polypeptides, de préférence dans un état qlycosylé. Les peptides ou polypeptides selon l'invention peuvent également être fabriqués par synthèse peptidique usuelle (voir par exemple Stewart et ai, Solid-Phase Peptide Synthesis W H Freeman Co, San Francisco ( 1969) ou Merrifield, J Am Chem Soc 85:2149-2154 ( 1963) ou les brevets US-A-3 862 925, 3 842 047, 3 972 859 et 4 105 602). Pour fabriquer rapidement de faibles quantités de peptides destinés par exemple à la recherche de réactions immunoloqiques avec des anticorps, monoclonaux ou non, on peut également utiliser une synthèse in vitro par traduction en système acellulaire (lysat de réticulocytes de lapin) additionné ou non de membranes microsomiales selon aue l'on souhaite obtenir un be Ptide glycosylé ou non. L'invention a également pour objet les vaccins incluant, dans une composition vaccinante efficace, ou exprimant, de tels peptides ou polypeptides, notamment les peptides issus d'une séquence codant pour g El et g E 2 ou g El et la première moitié de g E 2 Les peptides ou polypeptides peuvent être ou non conjugués à des supports et les vaccins peuvent présenter des adjuvants usuels. Ces virus recombinants peuvent aussi être utilisés pour l'expression de peptides ou polypeptides selon l'invention dans des cultures de virus sur cellules. Brève description du dessin. La figure 1 montre, sur la carte du génome de BVD Osloss, la position des clones d'AD Nc 63 36 et 183 couvrant la région codant pour les protéines structurales de BVD, les sites de restriction utilisés ci-après pour le clonage du fragment g El, la phase de lecture ouverte et les protéines structurales El et E 2: la figure 2 montre le profil d'hydrophobicité de la phase de lecture ouverte du génome de BVD Osloss codant pour les protéines structurales et la localisation des sites potentiels de glycosylation et des résidus cystéine sur la phase de lecture ouverte; la figure 3 montre la position de l'ensemble des sites de restriction utilisés ci- après ainsi que la stratégie suivie pour la préparation du fragment E 1/830; la figure 4 montre la localisation des trois principaux fragments, El, El/830 et El/E 2 dont le clonaqe est décrit ci-après, dans la partie du génome de BVD Osloss codant pour les protéines structurales; la figure 5 montre la carte de restriction du vecteur de transfert p JVP 10 Z; les promoteurs du gène P 10 et du qgène de la polyhédrine (PH) ainsi que le sens de la transcription qu'ils initient sont indiqués par des flèches S indique le site de clonage; et la fiqure 6 montre la cinétique d'expression des gqlycoprotéines dans les cellules Sf 9 infectées par Ac NPV-E 1/E 2. 1 Localisation des régions codant pour les glycoprotéines. A Localisation de la région codant pour q El. On a représenté sur la figure 1 la partie du génome viral relative aux protéines membranaires La protéine g El (protéine glycosylée de 56-58 k D; non glycosylée de 48 k D) est une protéine membranaire du virus BVD Les données suivantes ont permis sa localisation: a) Une partie de la phase de lecture ouverte est très riche en sites de qlycosylation potentiels et en cystéine, ce qui est typique de protéines membranaires glycosylées (voir figure 2). b) Un sérum de lapin dirigé contre la protéine fusion e-gal-C 63 diminue la taille des plages de lyse en reconnaissant vraisemblablement des épitopes à la surface du virus. c) Le début de la Drotéine a El a été déterminé par la présence d'une séquence signal caractéristique (von Heijne G, N A R 14:4683-4690, 1986) débutant au niveau de l'acide aminé 250 et précédée d'un tripeptide Arg-Lys-Lys pouvant être le signal d'épissaae de la première protéine (voir figure 2). d) La fin de la protéine a été déterminée d'après la taille attendue pour la protéine non alycosylée Elle coïncide avec la localisation d'une hélice potentiellement membranaire. En résumé, la taille de la protéine q El non glycosylée sera: avec la séquence signal (non clivée): 453 acides aminés; sans la séquence signal: 425 acides aminés. B Localisation de la réaion codant Dour g E 2. Cette région contient 4 sites de glycosylation potentiels (voir figure 2); la fin de la protéine a été déterminée d'une part d'après la taille attendue pour la protéine non glycosylée et d'autre part sur la base de l'analyse du profil d'hydrophobicité, la séquence codant pour g E 2 étant suivie d'une région fortement hydrophobe, hautement conservée parmi les Pestivirus connus et dont le rôle est encore mal identifié. 2 Préparation du fragment E 1/830. A Clonage de la séquence codant pour g El. La séquence codant pour g El a été isolée à partir du clone 63 (C 63) de la bibliothèque d'AD Nc décrite dans la demande de brevet EP-A-0 208 672 (le clone y est désigné par p CT 63) dans le plasmide p SP 65 (vecteur décrit par Melton D A et al, 1984, dans Nucleic Acids Res. 12:7035-7056) Des clones de ce genre peuvent facilement être obtenus soit lors de la constitution d'une bibliothèque d'AD Nc à partir de l'ARN viral comme cela est décrit dans la demande de brevet EP-A-0 208 672 soit par synthèse, soit encore par amplification (Polymerase Chain Reaction) à partir d'amplimères choisis dans la séquence donnée dans la susdite demande de brevet Cette étape a été réalisée comme suit: a) A partir du clone 63 on a isolé un fragment lBgl I Ban I Il contenant la quasi-totalité de la séquence codant pour g El (voir figure 1). b) On a synthétisé un oligonucléotide synthétique dont la séquence comprend: une extrémité 5 ' Eco RI; un codon ATG d'initiation de la traduction les 5 premiers codons de la séquence de g El; un site de restriction Bql I un site de restriction Ban II les 6 derniers codons de la séquence de g El; un codon TAG de terminaison de la traduction; une extrémité 3 ' Bam HI. c) Cet oligonucléotide synthétique a été cloné entre les sites Eco RI et Bam HI du plasmide DBR 322 (Bolivar et al. 1977 Gene 2: 95-113) préalablement délété de ses sites Bal I et Ban II internes; ensuite, le fragment lBql I - Ban IIl isolé en a) a été inséré entre les sites correspondants de l'oligonucléotide cloné dans p BR 322 Le fragment résultant suit le schéma suivant: lEco RI ATG Séquence codant pour g E 1 codon STOP-Bam HIl Sa taille est de 1376 paires de bases (pb) Sa séquence nucléotidique est référencée SEQ ID NO:3 dans la liste de séquences annexée. d) Ce fragment lEco RI Bam HIl a ensuite été transféré dans le plasmide p SP 65 qui contient le promoteur pour l'ARN polymérase du bactériophage SP 6, pour donner le plasmide p SP 65-g E 1 et permet ainsi la transcription in vitro de la séquence insérée. B Clonage d'une séquence codant pour une partie de g E 2 dans le plasmide p SP 65-g E 1. On a utilisé le clone 36 (C 36), de la susdite bibliothèque (p CT 36), dont la position sur la carte est représentée sur la figure 1. A partir de ce clone 36, on a isolé, par les enzymes de restriction, un fragment Pvu II-Nde I comprenant la fin de la séquence codant pour g El et 273 codons de la séquence codant pour g E 2 La position des sites de restriction ainsi aue la stratégie suivie sont illustrées à la fiaure 3. On a synthétisé un oliqonucléotide comprenant: une extrémité 5 ' Nde I, un codon TAG de terminaison de la traduction, une extrémité 3 ' Bam HI. Cet oliqonucléotide a été ajouté au fraament Pvu II-Nde I. Le fragment résultant a ensuite été diaéré par Bal II et Bam HI et inséré dans le plasmide DSP 65-a E 1 décrit en A. Le fragment final suit donc le schéma suivant: lEco RI ATG séquence codant pour a El 830 nucléotides de q E 2 STOP Bam HIl Sa taille est de 2200 pb Sa séquence nucléotidique est donnée dans la liste de séquences sous la référence SEQ ID NO:4. 3 Transcription/traduction in vitro. Le fragment obtenu en 2 B-, cloné dans le Dlasmide p SP 65, a été transcrit in vitro, puis traduit dans un système acellulaire (lysat de réticulocytes de lapin) En fait, deux traductions ont été faites, l'une en présence de membranes microsomiales de pancréas de chien, l'autre en l'absence de membranes microsomiales. L'analyse du produit de traduction montre, en l'absence de membranes microsomiales, un poids moléculaire estimé à 80 000 daltons. Lorsque la traduction est faite en présence des membranes microsomiales qui conduisent à la maturation et à la glycosylation de la protéine, on obtient une première protéine glycosylée de 62 k D et une deuxième protéine de 40 k D environ La protéine de 62 k D est la protéine g El comme le montrent des expériences similaires réalisées à partir du clone 63 de la bibliothèque d'AD Nc La protéine de 40 k D environ correspond au début de la protéine g E 2. 4 Immunoprécipitation des produits de traduction. Les différentes protéines synthétisées ont été immunoprécipitées à l'aide de deux types d'anticorps monoclonaux neutralisants: la protéine glycosylée de 62 k D est reconnue par le premier groupe, tandis que la protéine de 40 k D correspondant à g E 2 contient au moins un épitope reconnu par le deuxième groupe de monoclonaux. Tous les anticorps immunoprécipitent également la protéine de 80 k D observée en l'absence de membranes microsomiales, ce qui montre que la qlycosylation n'est pas indispensable à la reconnaissance par ces anticorps. Les vérifications effectuées avec les constructions aboutissant à g El ne conduisent à une immunoprécipitation qu'en présence du premier groupe d'anticorps, de même que les expériences conduites avec une construction incorporant g El prolongée des 32 premiers codons de g E 2 et présentant donc l'épitope décrit dans la demande de brevet EP-A-0 236 977. Préparation du fragment El/E 2. Les sites de restriction Stu I et Ava I utilisés pour prolonger le fragment E 1/830 et construire le fragment complet E 1/E 2 sont indiqués sur la figure 3 La stratégie suivie a été la suivante: a) Isolement du fragment lStu I-Ava Il à partir du clone 183 issu de la bibliothèque d'AD Nc (o il est désigné par p CT 183) identifiée ci-dessus (C 183 à la figure 3). b) Synthèse d'un oligonucléotide dont la séquence comprend une extrémité 5 ' Stu I, un site de restriction Ava I, un codon TGA de terminaison de la traduction et une extrémité 3 ' Bam HI. c) Clonaqe de l'oligonucléotide entre les sites de restriction Stu I et Bam HI du plasmide p SP 65 contenant le fragment E 1/830 Le site Stu I de ce plasmide est situé dans le fragment E 1/830 361 nucléotides en amont du site Nde I utilisé dans la prepéDaration de El/830, et le site Bam HI correspond à l'extrémité 3 ' du fragment cloné dans p SP 65 (voir figure 3). d) Digcrestion du Dlasmide résultant par Stu I et Ava I. e) Clonage du fragment isolé en a) dans le plasmide obtenu en d). Suivant cette procédure, le fragment E 1/830 a été prolongé d'une longueur de 277 nucléotides; le fragment résultant est long de 2487 nucléotides et comprend les séquences complètes codant pour les deux glycoprotéines El et E 2 Ce fragment El/E 2 suit le schéma suivant: lEco RI ATG séquence codant pour El séquence codant pour E 2 TGA Bam HIl Sa localisation est illustrée à la figure 4, par comparaison aux deux fragments El et E 1/830. Sa séquence est annexée ci-après: SEQ ID NO:2. 6 Expression dans le système Baculovirus. L'intégration du fragment E 1/E 2 dans le génome du Baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (Ac NPV) a été réalisée par l'intermédiaire du vecteur de transfert p JVP 10 Z (J Vialard et al 1990, Journal of Virology 64: 37-50) dont la carte de restriction est illustrée à la figure 5. Le vecteur p JVP 10 Z contient: * un site de clonage Nhe I placé entre le promoteur et le site de polyadénylation du gène de la polyhédrine de Ac NPV; * le gène de résistance à l'ampicilline et l'origine de réplication du plasmide p UC 8 (J Messing, 1983, Meth. Enzymol 101: 20); * le gène lac Z codant pour la P-galactosidase, placé sous le contrôle du promoteur P 10 de Ac NPV et suivi du signal de polyadénylation du virus SV 40 Le repérage des recombinants peut se faire plus facilement en ajoutant dans l'agarose de recouvrement un substrat indicateur pour la P-galactosidase, aboutissant à la coloration bleue des plaaes recombinantes. Le fragment E 1/E 2a été cloné dans le site de restriction Nhe I du plasmide p JVP 10 Z et le plasmide recombinant p JV Pl OZ-E 1/E 2 a été utilisé pour cotransfecter des cellules d'insectes (Sf 9, cellules de Spodoptera fruqiperda, voir J Vialard et al cité ci- dessus) en même temps que de l'ADN purifié de Ac NPV sauvage La purification d'un virus recombinant Ac NPV-E 1/E 2 a ensuite été réalisée par étalement du surnageant de cotransfection en boîtes de Petri et isolement des plages virales par recouvrement d'agarose; deux critères permettent de distinguer les plages recombinantes de celles provoquées par du virus sauvage: l'expression de la P-galactosidase (voir ci-dessus) et l'absence de polyhédrine nettement visible par contre dans les cellules infectées par le virus sauvage. 7 Mise en évidence des épitopes de neutralisation. Les glycoprotéines exprimées dans le système Baculovirus peuvent être mises en évidence dans un ELISA sandwich faisant intervenir un mélange de deux anticorps monoclonaux neutralisants comme anticorps capteurs ( 12 B 1 et 204 Bll), et le monoclonal 23 Gll non neutralisant, comme anticorps révélateur. 12 B 1: anti-g El 204 Bll: anti-g E 2 Les deux anticorps capteurs étant dirigés contre des épitopes distincts, leur réactivité a été testée individuellement en réalisant un ELISA répondant au schéma suivant: Capteur Echantillon Révélateur 12 81 ou Sf 9/Ac NPV-E 1/E 2 23 G 11 * 204 B 11 Les résultats de ce test sont rassemblés dans le tableau 1. Tableau 1: Réactivité en ELISA des deux monoclonaux neutralisants 12 81 et 204 811 sur les protéines exprimées par le virus recombinant Ac NPV-E 1/E 2. ELISA sandwich: capteurs = 12 81 ou 204 B 11; révélateur = 23 G 11 * (dilution anticorps: 4000 x). Sf 9/Ac NPV-E 1/E 2: cellules Sf 9 (Spodoptera fruqiperda) infectées par le recombinant Ac NPV-E 1/E 2 et récoltées à 72 heures post-infection; Sf 9: cellules non infectées. Les valeurs sont exprimées en DO X 1000 (OVER = DO > 2). Capteur Dilution des Sf 9/Ac NPV-E 1/E 2 Sf 9 cellules ___________________________________________________________ 12 B 1 3 x OVER 72 9 x 1558 49 27 x 1078 44 81 x 259 48 204311 3 x OVER 46 9 x OVER 36 27 x 1915 32 81 x 602 35 Ces résultats montrent que les protéines exprimées sont captées par les deux types d'anticorps neutralisants testés; il est important de rappeler que ces deux monoclonaux diffèrent sous deux aspects: a des expériences de transcriptionsl traductionsl immunoprécipitations ont déterminé qu'ils étaient dirigés contre des épitopes distincts situés l'un dans la qlycoprotéine g El, l'autre dans g E 2; leur capacité à capter les protéines produites en Baculovirus montre par conséquent que non seulement les deux protéines sont exprimées, mais qu'elles le sont en outre dans une conformation permettant leur reconnaissance par les anticorps monoclonaux neutralisants. b les deux anticorps neutralisants ont été développés à partir d'antigènes d'immunisation différents: le 204 B 11 (ou BD 204 B 11) est issu de la souche BD/Moredun, le 12 Bl (ou NY 12 B 1) de la souche New York; le 216 E 7 (ou AV 216 E 7 anti-q E 2), issu de la souche Aveyron, reconnaît également de manière spécifique les protéines exprimées en Baculovirus qui proviennent de la souche Osloss. 8 Cinétique d'expression des glycoprotéines. Le niveau d'expression des glycoprotéines dans les cellules Sf 9 infectées par le recombinant Ac NPV-El/E 2 était encore en phase ascendante 72 heures après l'infection; on a donc réalisé une cinétique d'infection s'étendant sur une période plus lonaue (Il jours), et le taux en glycoprotéines exprimées a été estimé au cours du temps d'après les valeurs obtenues en ELISA Il s'agit d'un ELISA sandwich réalisé suivant le même schéma que celui décrit en 7, dans lequel les anticorps neutralisants 12 B 1 et 204 B 11 sont utilisés individuellement comme capteurs et le 23G 11 * comme révélateur Les résultats sont illustrés sur la figure 6: 204 B 11:A, B, C = courbes obtenues avec le monoclonal 204 B 11 utilisé comme capteur, et pour trois dilutions de cellules Sf 9 infectées ( 4 x, 12 x et 36 x). 12 Bl:B, C = courbes obtenues avec le monoclonal 12 B 1 utilisé comme capteur, pour deux dilutions de cellules infectées ( 12 x et 36 x). Le niveau d'expression des protéines reconnues en ELISA, quel que soit l'anticorps utilisé comme capteur, atteint un plateau 4 jours après l'infection ( 99 heures), plateau qui persiste pratiquement jusqu'au septième jour post-infection ( 167 heures) Le parallélisme observé entre les courbes obtenues avec les deux types de capteurs confirme la présence des deux épitopes dans les protéines exprimées, épitopes qui sont maintenus avec la même stabilité tout au long de la cinétique d'infection. 9 Localisation des protéines exprimées Les anticorps monoclonaux neutralisants 204 B 11, 12 B 1 et 216 E 7 ont été utilisés pour mettre en évidence les glycoprotéines par la technique d'immunofluorescence indirecte Pour ce faire, les cellules Sf 9 infectées par le recombinant Ac NPV-El/E 2 ont été soumises à différentes conditions de fixation: dans de l'acétone 95 %, 20 minutes à -200 C dans du formol 4 %, 10 minutes à température ambiante; minutes dans du formol 4 %, suivi de 5 minutes dans du Triton X-100 0,1 %. Les conditions de fixation à l'acétone sont trop drastiques pour permettre une localisation précise des protéines exprimées: les membranes sont perméabilisées et la fluorescence est intense mais répartie dans tout le cytoplasme Par contre, lorsque les cellules sont fixées au formol, la fluorescence est visible sous forme de granules localisés sur toute la surface des cellules infectées. Le fait d'ajouter à la fixation au formol une étape de traitement au Triton X-100 fragilise la membrane cytoplasmique sans perméabiliser les noyaux, ce qui amène une fluorescence plus intense que précédemment, granuleuse, entrant par endroits dans le cytoplasme. Il est important de souligner que les deux anticorps 12 Bl (NY; anti-g El) et 204 B 11 (BD; anti-g E 2) donnent des images tout à fait comparables, et qu'il en est de même pour le 216 E 7 (AV; anti-g E 2) Ces résultats confirment par conséquent la présence des deux glycoprotéines, qui sont exprimées à la surface des cellules infectées et qui pourraient être associées l'une à l'autre. Les glycoprotéines exprimées sont reconnues par des anticorps monoclonaux neutralisants, qui diffèrent à deux niveaux D'une part, ils sont dirigés contre des épitopes distincts situés l'un dans la première glycoprotéine, l'autre dans la deuxième; les résultats montrent par conséquent que les deux protéines sont toutes deux présentes dans les cellules infectées par le recombinant et suivent une courbe d'expression tout à fait comparable. D'autre part, ils diffèrent au niveau des souches virales utilisées comme antigènes d'immunisation: 12 B 1 souche BVD/New-York (Rhône Mérieux. France); 204 B 11 souche BD/Moredun (Rhône Mérieux, France); 216 E 7 souche Aveyron (Rhône Mérieux, France). Cette constatation surprenante est intéressante dans le cadre de l'utilisation des glycoprotéines exprimées (issues de la souche Osloss) à des fins de vaccination, étant donné la reconnaissance comparable de ces protéines par des anticorps issus de souches virales séroloqiquement aussi éloignées que Aveyron et New-York Il est à noter par exemple que l'anticorps 216 E 7 non seulement ne neutralise pas le virus New-York, mais ne le reconnaît pas en immunofluorescence. Enfin, les images observées en immunofluorescence dans différentes conditions de fixation des cellules montrent clairement que les glycoprotéines, révélées par les anticorps monoclonaux neutralisants, sont exprimées à la surface des cellules infectées. Il est à noter que les glycoprotéines g El et q E 2 sont exprimées à un niveau suffisant pour être observables en gel d'électrophorèse après coloration au bleu de Coomassie Leurs positions sur gel correspondent aux poids moléculaires attendus après clivage et glycosylation ce qui laisse supposer une maturation correcte des protéines exprimées dans ce système. El/E 2: Immunisation de lapins et analyse des anticorps induits. Un lysat de cellules d'insectes Sf 9 (Spodoptera frugiperda) infectées par le recombinant Ac NPV-E 1/E 2 a été utilisé dans des essais d'immunisation de lapins réalisés suivant le protocole suivant: Matériel: antigène d'immunisation: cellules Sf 9 infectées par Ac NPV-E 1 IE 2; antigène témoin: cellules Sf 9 non infectées, 6 lapins: 3 doses d'antigène, 1 témoin pour chaque dose: Lapins n 1, 2, 3: inoculation de cellules infectées, à raison, respectivement, de 20 106, 4 106 et 0,8 106 cellules par inoculation. Lapins n 4, 5, 6: inoculation de cellules témoins, à raison, respectivement, de 20 106 4 106 et 0,8 106 cellules par inoculation. Immunisation: jour O: lère inoculation; jour 28: 2 ème inoculation; jour 56: 3 ème inoculation; jour 85: 4 ème inoculation; jour 110: 5 ème inoculation. Analyse séroloqique: Les sérums ont été prélevés avant la première inoculation, puis aux jours 38, 66, 99 et 120 Les anticorps BVDspécifiques sont ensuite analysés en ELISA compétition vis-à-vis d'anticorps monoclonaux neutralisants, ainsi que par séroneutralisation contre trois souches virales: Aveyron, New-York et Osloss non cytopathogène. Nomenclature utilisée pour les prélèvements successifs: N Dose Prélèvements lapin inoculée Jour 38 Jour 66 Jour 99 Jour 120 ___________________________________________________________ 1 20 106 CI 51/P 38 51/P 66 Si/P 99 Sl/P 120 2 4 106 CI 52/P 38 52/P 66 52/P 99 52/P 120 3 0,8 106 CI 53/P 38 53/P 66 53/P 99 53/P 120 4 20 106 C Te 54/P 38 54/P 66 54/P 99 54/P 120 4 106 C Te 55/P 38 55/P 66 55/P 99 55/P 120 6 0,8 106 C Te 56/P 38 56/P 66 56/P 99 56/P 120 ___________________________________________________________ CI = cellules Sf 9 infectées par Ac NPV-E 1/E 2 C Te = cellules Sf 9 non infectées. a) Résultats obtenus en ELISA compétition. Les sérums prélevés après les 2 ème et 3 ème inoculations de lysats cellulaires bruts (P 38 et P 66) ont été analysés pour leur capacité à entrer en compétition avec un anticorps monoclonal neutralisant, en l'occurrence BD 204 B 11, dans sa liaison avec l'antigène E 1/E 2 produit dans les cellules d'insectes Les résultats sont rassemblés dans le tableau 2. A partir de ces valeurs, on a calculé le pourcentage de compétition des sérums 1 à 3 (antigène CI) par rapport à la DO de base (témoin sans sérum), après correction en fonction de leurs contrôles respectifs par les lapins 4 à 6 (antigène C Te), autrement dit: %age compétition = (DO C Te DO CI) x 100 (I) DO TSS o CI = cellules Sf 9 infectées par Ac NPV-E 1/E 2: C Te = cellules Sf 9 non infectées TSS = témoin sans sérum. Les valeurs calculées sont reprises dans le tableau 3. Tableau 2: Réactivité en ELISA des sérums prélevés sur les 6 lapins aux jours 38 et 66. Fixation de l'antigène El/E 2 par l'intermédiaire de l'anticorps NY 12 B 1 (anti-g El) utilisé comme capteur (ascite dilué 4000 x) Anticorps compétiteur: BD 204 B 11 (anti-q E 2; monoclonal purifié et marqué, utilisé à la dilution 1000 x). Les valeurs sont exprimées en D Ox 1 0000 La nomenclature des échantillons est celle décrite ci-dessus. _________________________________________________________ Dilution des prélèvements 375 x 75 x 15 x lère série de prélèvements (P 38): Dose: 20 106 cel /inj. Si (CI) 1076 936 727 54 (C Te) 965 903 780 Dose: 4 106 cel /inj. 52 (CI) 971 812 555 (C Te) 993 847 597 Dose: 0,8 106 cel /inj. 53 (CI) 1006 822 608 56 (C Te) 929 809 571 __________________________________________________ 2 ème série de prélèvements (P 66): Dose: 20 106 cel /inj. 51 (CI) 1001 957 912 54 (C Te) 1064 1014 897 Dose: 4 106 cel /inj. 52 (CI) 973 773 406 (C Te) 1083 957 800 Dose: 0,8 106 cel /inj. 53 (CI) 1012 889 765 56 (C Te) 1052 983 939 _______________________________________________________ TSS (témoin sans sérum): 1103 Tableau 3: Taux de compétition des sérums prélevés aux jours 38 et 66, vis-à-vis du monoclonal BD 204 B 1 (exprimés en % et calculés d'après les valeurs du tableau 2, suivant la formule (I). _____________________________________________________ Dilution des prélèvements 375 x 75 x 15 x ______________________________________________________ P 38 51 0 O 4,8 52 2 3,2 3,8 53 O O O P 66 51 5,7 5,2 O 52 10 16,7 35,7 53 O 8,5 15,7 ______________________________________________________ b) Séroneutralisations. * On a testé la présence d'anticorps neutralisants dans les quatre séries de prélèvements P 38, P 66, P 99 et P 120, et ce vis-à-vis de trois souches de Pestivirus cultivées sur cellules OCK: Osloss non cytopathoqène; New York; Aveyron. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4. Tableau 4: Titres séroneutralisants de sérums prélevés aux jours 38, 66, 99 et 120, vis-à-vis des souches Osloss NC (Os NC), New York (NY) et Aveyron (AV) ( 100 ufp/cupule). Les valeurs sont exprimées en dilution de sérum pour laquelle on obtient 50 % de neutralisation des virus testés. 0: pas d'effet observable; ___________________________________________________________ n lapin 1 2 3 4 5 6 Souche Os NC: P 38 4 16 16 O O P 66 32 256 64 O O O P 99 4096 4096 4096 O O O P 120 16384 4096 16384 0 O O Souche NY: P 38 P 66 P 99 P 120 o o O o O O O Souche AV: P 38 O 8 4 O O O P 66 O 32 4 O O O P 99 1024 512 256 O O O P 120 256 1024 1024 O O O ___________________________________________________________ c) Conclusions. Les protéines virales exprimées en cellules d'insectes par le Baculovirus recombinant Ac NPV-E 1/E 2 induisent chez le lapin l'apparition d'anticorps neutralisants: vis-à-vis des trois souches de Pestivirus testées, soit Osloss non cytopathogène, New York et Aveyron; chez les trois lapins immunisés par des doses différentes d'antigène; dès le premier prélèvement, soit après deux injections d'antigène, avec un titre séroneutralisant faible mais significatif par comparaison aux lapins témoins; le titre augmente aux prélèvements suivants et devient très significatif à partir du troisième prélèvement, et ce vis-à-vis des trois souches virales. Les anticorps induits chez le lapin par l'inoculation d'extraits de cellules exprimant les antigènes recombinants E 1/E 2 neutralisent par conséquent au moins trois souches très différentes de Pestivirus qui sont Osloss NC (BVD), New York (BVD) et Aveyron (maladie de Border). ANNEXE: LISTE DES SEQUENCES. SEQ ID NO: 1 TYPE DE SEQUENCE: séquence nucléotidique LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 894 paires de bases NOMBRE DE BRINS: simple CONFIGURATION: linéaire TYPE DE MOLECULE: AD Nc pour ARN génomique ORIGINE: BVD Osloss REGION TRADUITE: 1-894 PROPRIETES: code pour la première moitié de la structurale g E 2 Leu TTG Pro CCA Ile ATC Ser TCG Gly GGT Leu CTG Lys AAA Asn AAC Gly GGA Cys TGC Lys AAG Pro CCT Asp GAC Gln CAA Val GTT Gly GGC Asp GAT Gly GGA Ala GCC Ile ATC Phe TTT Lys AAA Pro CCT Asp GAT Phe TTC Leu CTC Gly GGC Cys TGC Pro CCT Gly GGG Glu GAG Ile ATT Ile ATA Glu GAA Phe TTT Ile ATA Thr ACG Pro CCC Tyr TAC Ile Leu ATA CTG Lys Pro AAA CCC Leu Gly CTT GGG Met Arg ATG CGG Ile Lys ATC AAA Leu His CTA CAC Asp Gly GAT GGA Leu Gly CTC GGT Asn Thr AAT ACA Gly Trp GGA TGG Leu Ala TTA GCC Phe Arg TTT AGG Asp Cys GAC TGT Trp Leu TGG TTG Gly Phe GGC TTT Ala Thr GCT ACG Leu Gln CTG CAG Tyr Leu TAT CTA Thr Ara ACG AGA Lys Glu AAA GAA Leu Cys CTT TGC Thr Leu ACA CTT Thr Gly ACA GGA Met Thr ATG ACC Gln Gly CAA GGC Ala Leu GCC TTG Ile Leu ATA CTC Tyr Tyr TAC TAC Gly Leu GGC CTC Asp Thr GAC ACG Ile Thr ATT ACA Ala Leu GCC CTG Gln Glu CAA GAG Pro Cys CCG TGT Leu Asn CTG AAT Thr Val ACT GTG Val Val GTT GTA Cys Ile TGC ATT Gly Gly GGA GGG Ile ATA Ala GCC Thr ACC Gly GGA Cys TGT Pro CCG Asp GAC Asp GAT G 1 y GGG Ser AGT Arg CGA Thr ACC Asn AAC Thr ACA Ile ATA Thr ACT Val GTT Glu GAG Thr ACG Val GTA Ala GCT Pro CCA Leu CTG Thr ACA Gln CAG Trp TGG glycoprotéine Gly GGG Ala GCC Gln CAG Val GTA Arg AGG Ser TCT Val GTG Lys AAA Ala GCC Cys TGT Tyr TAC Lys AAA Thr ACT Ala GCA Lys AAA Trp TGG Val GTG Glu GAA Val GTA Glu GAA Pro CCC Phe TTC His CAC Lys AAG Val GTC Cys TGT Gln CAA Asn AAT Tyr TAT Trp TGG Ala GCC Val GTA Met ATG Leu TTG Gln CAG Trp TGG Arg AGG Ile ATC Val GTA Gln CAA Gly GGG Asn AAT Glu GAA Cys TGT Arg AGG Phe TTT Asp GAT Val GTA Met ATG Ser TCC His CAC Gly GGG Val GTG Leu CTC Glu GAG Tyr TAC Lys AAA Tyr TAT Glu GAA Asp GAT Arg AGG Val GTT Asn AAT Argc AGG Gly GGA Pro Gly Asp Ile Leu Arg T Yr Val Asp Gly Pro Val Glu Ser Cys Lys 224 CCG GGG GAC ATA CTA CGA TAT GTA GAT GGG CCT GTC GAG TCT TGC AAG 672 Trp Cys Gly Tyr Lys Phe His Lys Ser Glu Gly Leu Pro His Phe Pro 240 TGG TGT GGT TAC AAG TTT CAT AAA AGT GAG GGT CTG CCA CAC TTC CCA 720 Ile Gly Lys Cys Lys Leu Lys Asn Glu Ser Gly Tyr Arg Gln Val Asp 256 ATT GGC AAG TGC AAG CTG AAG AAT GAA AGT GGC TAC AGA CAA GTA GAT 768 Glu Thr Ser Cys Asn Arg Asp Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Gly Ser Z 72 GAG ACC TCT TGC AAC AGA GAC GGT GTG GCT ATA GTA CCA ACT GGT TCG 816 Val Lys Cys Lys Ile Gly Asp Thr Val Val Gln Val Ile Ala Met Asp 288 GTG AAA TGC AAG ATA GGG GAC ACA GTG GTG CAA GTC ATA GCA ATG GAT 864 Asp Lys Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro 23 GAT AAG CTA GGG CCT ATG CCT TGC AGA CCA 894 SEQ ID NO: 2 TYPE DE SEQUENCE: séquence nucléotidique LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 2487 paires de bases NOMBRE DE BRINS: simple CONFIGURATION: linéaire TYPE DE MOLECULE: AD Nc pour ARN génomique ORIGINE: BVD Osloss REGION TRADUITE: 10-2479 PROPRIETES: code pour les glycoprotéines structurales g El et g E 2. Met Gly Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 13 GAA TTC ACC ATG GGC AAA CTA GAG AAA GCC CTG TTG GCA TGG GCA GTA 48 Eco RI Nco I Ile Ala Leu Val Leu Phe Gln Val Ala Val Gly Glu Asn Ile Thr Gln 29 ATA GCC TTG GTT TTG TTT CAA GTC GCA GTG GGA GAG AAC ATA ACA CAA 96 Tr P Asn Leu Gln Asp Asn Gly Thr Glu Gly Ile Gln Arg Ala Met Phe 45 TGG AAC TTA CAA GAC AAT GGG ACG GAA GGA ATA CAA CGG GCC ATG TTC 144 Gln Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 61 CAA AGA GGC GTA AAT AGA AGT CTG CAT GGG ATC TGG CCA GAG AAA ATC 192 Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Ala 77 TGT ACA GGT GTC CCC TCC CAC TTG GCC ACT GAT ACA GAA CTG AAG GCA 240 Ile His Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr Thr Cys Cys 93 ATT CAT GGT ATG ATG GAT GCT AGC GAG AAG ACA AAT TAC ACA TGC TGC 288 Arg Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr 109 AGG CTC CAA CGC CAT GAG TGG AAC AAG CAT GGT TGG TGC AAT TGG TAC 336 Asn Ile Glu Pro Trp Ile Val reu Met Asn Lys Thr Gln Ala Asn Leu 125 AAT ATT GAA CCT TGG ATT GTT CTC ATG AAT AAA ACC CAA GCC AAC CTT 384 Ala Glu Gly Gln Pro Pro Arg Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 141 GCT GAG GGT CAG -CA CCA AGG GAG TGT GCC GTT ACA TGC CGG TAT GAC 432 Arg Asp Ser Asp Leu Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Ser Pro Thr 157 CGA GAT AGT GAC CTA AAT GTA GTA ACA CAA GCT AGG AAC AGC CCC ACA 480 Pro Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Val 173 CCA TTG ACA GGC TGC AAG AAA GGC AAG AAC TTC TCC TTT GCA GGT GTG 528 Leu Val Gln Gly Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Val Ser Asp Val Leu 189 TTG GTA CAA GGG CCT TGC AAC TTT GAA ATA GCT GTA AGT GAT GTG CTG 576 Phe Arg Glu His Asp Cys Thr Ser Val Ile Gln Gly Thr Ala His Tyr 205 TTT AGA GAG CAC GAT TGC ACA AGT GTG ATT CAA GGC ACG GCT CAC TAT 624 Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Ser Leu Glu Ser Ala Arg Gln Gly Thr 221 CTG GTA GAC GGG ATG ACC AAT TCT CTA GAA AGT GCC AGG CAA GGG ACC 672 Ala Lys Leu Thr Thr Trp Leu Gly Arg Gln Leu Lys Lys Leu Gly Lys 237 GCA AAG TTA ACT ACT TGG TTG GGT AGG CAG CTT AAG AAA CTA GGG AAG 720 Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Ala Ser 253 AAA CTG GAA AAC AAG AGT AAG ACA TGG TTT GGG GCA TAT GCA GCC TCT 768 Pro Tyr Cys Glu Val Glu Arg Arg Leu Gly Tyr Ile Trp Tyr Thr Lys 269 CCC TAC TGC GAG GTA GAA CGG AGG CTT GGT TAC ATC TGG TAT ACA AAG 816 Asn Cys Thr Pro Ala Cys Leu Pro Lys Asn Thr Lys Ile Val Gly Pro 285 AAT TGC ACC CCT GCC TGT TTA CCA AAA AAT ACA AAG ATC GTT GGC CCC 864 Gly Arg Phe Asp Thr Asn Ala Glu Asp Gly Lys Ile Leu His Glu Met 301 GGT AGG TTC GAC ACC AAT GCG GAG GAT GGT AAA ATA CTG CAT GAG ATG 912 Gly Gly His Leu Ser Glu Val Leu Leu Leu Ser Val Val Val Leu Ser 317 GGG GGC CAC TTG TCA GAG GTG CTA CTA CTC TCA GTG GTA GTG CTT TCC 960 Asp Phe Ala Pro Glu Thr Ala Ser Val Val Tyr Leu Ile Leu His Phe 333 GAT TTC GCT CCA GAG ACA GCC AGT GTG GTA TAT TTA ATT CTA CAT TTC 1008 Ser Ile Pro Gln Gly His Thr Asp Ile Hls Asp Cys Asp Lys Asn Gln 349 TCC ATC CCA CAA GGA CAC ACT GAC ATA CAT GAC TGT GAT AAA AAC CAA 1056 Leu Asn Leu Thr Val Gly Leu Thr Thr Ala Glu Val Ile Pro Gly Ser 365 CTA AAC CTC ACC GTA GGA CTC ACA ACA GCT GAA GTA ATA CCT GGG TCA 1104 Val Trp Asn Leu Gly Lys Tyr Val Cys Ile Arg Pro Asp Trp Trp Pro 381 GTT TGG AAT TTG GGC AAA TAT GTT TGT ATA AGA CCA GAT TGG TGG CCT 1152 Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Leu Val Phlie Glu Glu Val Gly Gln Val Ile 397 TAT GAG ACA GCC ACG TTC CTA GTG TTT GAA GAG GTG GGT CAA GTG ATC 1200 Arg Ile Val Leu Arg Ala Leu Arg Asp Leu Thr Arg Ile Trp Thr Ala 413 AGG ATA GTC TTG AGG GCT TTA AGA GAT CTA ACG CGC ATT TGG ACC GCT 1248 Ala Thr Thr Thr Ala Phe Leu Val Cys Leu Val Lys Val Val Arg Gly 429 GCT ACG ACT ACT GCA TTC CTG GTA TGT CTG GTG AAG GTG GTG AGA GGC 1296 Gln Val Leu Gln Gly Ile Leu Trp Leu Ile Leu Ile Thr Gly Ala Gln 445 CAA GTG TTG CAA GGC ATA CTG TGG TTG ATA CTC ATA ACA GGG GCA CAA 1344 Gly Leu Pro Val Cys Lys Pro Gly Phe Tyr Tyr Ala Ile Ala Lys Asn 461 GGG CTC CCA GTT TGC AAA CCC GGC TTT TAC TAC GCC ATA GCC AAA AAT 1392 Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Thr Gly Leu Thr Thr Gln Trp Tyr 477 AAT GAG ATC GGC CCT CTT GGG GCT ACG GGC CTC ACC ACT CAG TGG TAT 1440 Glu Tyr Ser Asp Gly Met Arg Leu Gln Asp Thr Gly Val Val Val Trp 493 GAA TAC TCG GAT GGG ATG CGG CTG CAG GAC ACG GGA GTT GTA GTG TGG 1488 Cys Lys Gly Gly Glu Ile Lys Tyr Leu Ile Thr Cys Glu Arg Glu Ala 509 TGT AAA GGT GGA GAG ATC AAA TAT CTA ATT ACA TGT GAG AGG GAA GCC 1536 IH W D DXX Y 3 D VDI DDD VDV DYD n I 9 DII 1 e I" eîi VDD VD Vf ÈJ Vf ogd VDD hidv VDO -9 Y 9 n ID 99 D DYD UTS YO% n ID VIS) O Jd Ie A DI Ll ILT A Im A DIS IPA VID ne' I Yi J AI DYV usy UVD nlo DIS IPA VIS I'A O Yl DVI nel DI 9 ICA DYY usy D Dli SJV IDV SDD AID dsf SV DIS dsy 9 DD Io JS O Jd O 99 DD VS SDI DD DIV VVD VVS VDI VYID *e o Jd AID AID Jls d 015 9 D Vil SDI DI D 9 D 9 nes nel d Jl ne' IîA DID VID ODI DYVD DD nae nae Jas niî pt V DYS Ili 99 S l Vi Vvo dsy qa 8 dai JAI u Il I Vl l YD 99 V IDD D 9 VD us V dsj b Jv oid nl D Dil DOV 191 VDD DDV G 14 a Ma J SLAD p Iv t I l'VI VDD V Dv D Di DD a K o -1 a 1 OJ 1 s XO oj VVD DID Dis DV DVS Ul S IA Ie A Jil dsy i V %DD DIS 199 DYS el I ?IV IPA AID dsv D 9 D 19 V V 9 i VV DVI AID Jas nhi Us V s A' 99 D DSV 1 D 9 V Vi D AID n Id Jles SA STH ID DD D V 9 VID l ZI o Ja AID ds V IPA JAZ 999 DDD VDS Dil DD 9 D D 9 AID AID neq p IV SAD liv DDI D 9 OD VD 99 V el I AD A Is D Ul 5 Ji VIZD ZD DDV 01 V DDD Ie A Ip A Jq I q GN w I DID 1 OY VOD VOV DDI I'A Jq I AID t 1 Z dxl i Vv DID 113 VOY VDV usy nea nesl 1 i Z Jlti I 9 D DDD DD 9 UID 9 DD s AD oaa s AD nel AID DVD VVZ VI 9 VVV VDD n ID U 11 n ID s Al AID D 9 D DDD V 9 DI DVD naq t I DJ I Pl S 5 H Z 8 Z úT 8 L 6 L Zgez T 8 L 59 L 99 ZZ 6 IL ZZ úúL 09 TZ LTL ZTTZ TOL Â'90 Z 9 TOZ 896 T ú 59 OUZ 6 T Lú 9 ZL 8 T TZ 9 VZ 8 T 9 LLT 8 ZLT ú LS 089 T L 55 Zú 9 T T 9 Z SZS DIV e II VDS DVS dsv D Vi JTAI YDV al I I 9 V -lsy IYV CISV dsf SDI le S YDD o Jad asx DIY SA 'l VIS I PA DIV DSV ds JV SDO d.I YVZ UI 9 nse DIV 99 Y 99 V VIS I 1 A DIZV I Zi qew JAZ 119 D 99 IPA Im A IDY DIVZ JIU el I VVD VYD UTS Ul S YYV VODV s A' J 141 ODD Iz oid 9 II DIV VD 9 ew p TV 199 IDY AID JMI VIS Il:) IPA UTS DII DV:) aid STH DDI IDI SAD la S 151 IDV s AD JMI 019 YYY IPA SA' DVV DVI SA'l JAI D Vsq IA DYD IDI STH SAD DII DDS elwa 'T Vy 3:): VIIV o Id SA' VVD D 99 n 19 IPA IPA jas -114, DVI JTAI DII 1 a 4 d IAI l Til DDD IAI DVV 9 DV 9, TD naq d DDD VD 9 V j 1 v ds ID qaa ne' III 19 D us V D,-T,Dj naq DV 9 dsv In I eqa Vi I VSD AID DID JIVD d VI ne'l UID 99 DD *A 9 ID IVD DDS dsy AIYZD DDV VIS D A 99 DD 9 AID DVI SA'1 ODI SAD DDI SAD Dvl JAI l IV eîi ne' sqa IVD a Lla dsf 0-I Od Vvv s A' Il I ala DIV DDD -IV n ID DOD AIS DDD 2 D Jy 1 Vv s Xq Dus V 93 V SDO o Id IVID ne' SAD 13 L jas DVY SA' l D 99 AID D Vo ds V DD dsf DIV s A SAD VDD AID DIVV us V S A'l s ID SID nsq qo V 99 le DVI D.T, 1 nlg -KT, DVD niî o Jd s II usw s Aq s Xq nsq Y 95 IDD 0 ala ogd DVV DIV Vl I usq DVI S A'I nl D SD'V J'II s III VID VIVV aîi 1 VV VIIV Ja S ne' SID DID ne' nal DVD DVD STH s TH Vi I DIV ne'q e N DVV Vil SA' n D' DDD 99 DD AIS n I 9 9 DV IVS s Al dsy vv V 959 SXAl IA DDV SVD J 14 ni D DDS d O 1 059 ld AID o 19 15 SDI SD 9 DDI AID aild bl Y SSD AID AID DDV DOVD Giv STIH I"VI DDI us V -les j'D DIV IPA SW 99 V VID D Jy I'A 995 V YISV dsy dsy VIS) Ili nl D BU VI DDV JAI LXV 999 z Z 9 Z SEQ ID NO: 3 TYPE DE SEQUENCE: séquence nucléotidique LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 1376 paires de bases NOMBRE DE BRINS: simple CONFIGURATION: linéaire TYPE DE MOLECULE: AD Nc pour ARN génomique ORIGINE: BVD Osloss REGION TRADUITE: 10-1371 PROPRIETES: code pour la glycoprotéine structurale g El Met Gly Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 13 GAA TTC ACC ATG GGC AAA CTA GAG AAA GCC CTG TTG GCA TGG GCA GTA 48 Eco RI Nco Z Ile Ala Leu Val Leu Phe Gln Val Ala Val Gly Glu Asn Ile Thr Gln 29 ATA GCC TTG GTT TTG TTT CAA GTC GCA GTG GGA GAG AAC ATA ACA CAA 96 Trp Asn Leu Gln Asp Asn Gly Thr Glu Gly Ile Gln Arg Ala Met Phe 45 TGG AAC TTA CAA GAC AAT GGG ACG GAA GGA ATA CAA CGG GCC ATG TTC 144 Gln Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 61 CAA AGA GGC GTA AAT AGA AGT CTG CAT GGG ATC TGG CCA GAG AAA ATC 192 Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Ala 77 TGT ACA GGT GTC CCC TCC CAC TTG GCC ACT GAT ACA GAA CTG AAG GCA 240 Ile His Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr Thr Cys Cys 93 ATT CAT GGT ATG ATG GAT GCT AGC GAG AAG ACA AAT TAC ACA TGC TGC 288 Arg Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr 109 AGG CTC CAA CGC CAT GAG TGG AAC AAG CAT GGT TGG TGC AAT TGG TAC 336 Asn Ile Glu Pro Trp Ile Val Leu Met Asn Lys Thr Gln Ala Asn Leu 125 AAT ATT GAA CCT TGG ATT GTT CTC ATG AAT AAA ACC CAA GCC AAC CTT 384 Ala Glu Gly Gln Pro Pro Arg Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 141 GCT GAG GGT CAG CCA CCA AGG GAG TGT GCC GTT ACA TGC CGG TAT GAC 432 Arg Asp Ser Asp Leu Asn Val Val Thr Gln Ala Arg Asn Ser Pro Thr 157 CGA GAT AGT GAC CTA AAT GTA GTA ACA CAA GCT AGG AAC AGC CCC ACA 480 Pro Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Val 173 CCA TTG ACA GGC TGC AAG AAA GGC AAG AAC TTC TCC TTT GCA GGT GTG 528 Leu Val Gln Gly Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Val Ser Asp Val Leu 189 TTG GTA CAA GGG CCT TGC AAC TTT GAA ATA GCT GTA AGT GAT GTG CTG 576 Phe Arg Glu His Asp Cys Thr Ser Val ile Gln Gly Thr Ala His Tyr 205 TTT AGA GAG CAC GAT TGC ACA AGT GTG ATT CAA GGC ACG GCT CAC TAT 624 Asp Gly Met Thr Asn Ser Leu GAC GGG ATG ACC AAT TCT CTA Leu Thr Thr Trp Leu Gly Arg TTA ACT ACT TGG TTG GGT AGG Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp GAA AAC AAG AGT AAG ACA TGG Cys Glu Val Glu Arg Arg Leu TGC GAG GTA GAA CGG AGG CTT Thr Pro Ala Cys Leu Pro Lys ACC CCT GCC TGT TTA CCA AAA Phe Asp Thr Asn Ala Glu Asp TTC GAC ACC AAT GCG GAG GAT His Leu Ser Glu Val Leu Leu CAC TTG TCA GAG GTG CTA CTA Ala Pro Glu Thr Ala Ser Val GCT CCA GAG ACA GCC AGT GTG Pro Gln Gly His Thr Asp Ile CCA CAA GGA CAC ACT GAC ATA Leu Thr Val Gly Leu Thr Thr CTC ACC GTA GGA CTC ACA ACA Asn Leu Gly Lys Tyr Val Cys AAT TTG GGC AAA TAT GTT TGT Thr Ala Thr Phe Leu Val Phe ACA GCC ACG TTC CTA GTG TTT Val Leu Arg Ala Leu Arg Asp GTC 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Trp GTT TGG Tyr Glu TAT GAG Arg Ile AGG ATA Ala Thr GCT ACG Gly Thr GGG ACC Gly Lys GGG AAG Ala Ser GCC TCT Thr Lys ACA AAG Gly Pro GGC CCC Glu Met GAG ATG Leu Ser CTT TCC His Phe CAT TTC Asn Gln AAC CAA Gly Ser GGG TCA Trp Pro TGG CCT Val Ile GTG ATC Thr Ala ACC GCT Arg Gly AGA GGC Ala Gln Gly Leu GGG CTC SEQ ID NO: 4 TYPE DE SEQUENCE: séquence nucléotidique LONGUEUR DE LA SEQUENCE: 2210 paires de bases NOMBRE DE BRINS: simple CONFIGURATION: linéaire TYPE DE MOLECULE: AD Nc pour ARN génomique ORIGINE: BVD Osloss REGION TRADUITE: 10-2206 PROPRIETES: code pour la glycoprotéine structurale g El et la première partie de la glycoprotéine structurale g E 2 GAA TTC ACC Ile Ala Leu ATA GCC TTG Trp Asn Leu TGG AAC TTA Gln Arg Gly CAA AGA GGC Cys Thr Gly TGT ACA GGT Ile Hls Gly ATT CAT GGT Arg Leu GAGG CTC CAA Asn Ile Glu AAT ATT GAA Ala Glu Gly GCT GAG GGT Arg Asp Ser CGA GAT AGT Pro-Leu Thr CCA TTG ACA Leu Val Gln TTG GTA CAA Met Gly Lys ATG GGC AAA Val Leu Phe GTT TTG TTT Gln Asp Asn CAA GAC AAT Val Asn Arg GTA AAT AGA Val Pro Ser GTC CCC TCC Met Met Asp ATG ATG GAT Arg His Glu CGC CAT GAG Pro Trp Ile CCT TGG ATT Gln Pro Pro CAG CCA CCA Asp Leu Asn GAC CTA AAT Gly Cys Lys GGC TGC AAG Gly Pro Cys GGG CCT TGC Leu Glu Lys Ala Leu CTA GAG AAA GCC CTG Gln Val Ala Val Gly CAA GTC GCA GTG GGA Gly Thr Glu Gly Ile GGG ACG GAA GGA ATA Ser Leu His Gly Ile AGT CTG CAT GGG ATC His Leu Ala Thr Asp CAC TTG GCC ACT GAT Ala Ser Glu Lys Thr GCT AGC GAG AAG ACA Trp Asn Lys His Gly TGG AAC AAG CAT GGT Val Leu Met Asn Lys GTT CTC ATG AAT AAA Arg Glu Cys Ala Val AGG GAG TGT GCC GTT Val Val Thr Gln Ala *GTA GTA ACA CAA GCT Lys Gly Lys Asn Phe AAA GGC AAG AAC TTC Asn Phe Glu Ile Ala AAC TTT GAA ATA GCT Leu TTG Glu GAG Gln CAA Trp TGG Thr ACA Asn AAT Trp TGG Thr ACC Thr ACA Arg AGG Ser TCC Val GTA Ala GCA Asn AAC Arg CGG Pro CCA Glu GAA Tyr TAC Cys TGC Gin CAA Cys TGC Asn AAC Phe TTT Ser AGT Trp TGG Ile ATA Ala GCC Glu GAG Leu CTG Thr ACA Asn AAT Ala GCC Arg CGG Ser AGC Ala GCA Asp GAT Ala Val GCA GTA Thr Gln ACA CAA Met Phe ATG TTC Lys Ile AAA ATC Lys Ala AAG GCA Cys Cys TGC TGC Trp Tyr TGG TAC Asn Leu AAC CTT Tyr Asp TAT GAC Pro Thr CCC ACA Gly Val GGT GTG Val Leu GTG CTG Phe Arg Glu His Asp Cys Thr Ser Val Ile Gln Gly Thr Ala His Tyr TTT AGA GAG CAC GAT TGC ACA AGT GTG ATT CAA GGC ACG GCT CAC TAT Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Ser Leu Glu Ser Ala Arg Gln Gly Thr 221 CTG GTA GAC GGG ATG ACC AAT TCT CTA GAA AGT GCC AGG CAA GGG ACC 672 Ala Lys Leu Thr Thr Trp Leu Gly Arg Gln Leu Lys Lys Leu Gly Lys 237 GCA AAG TTA ACT ACT TGG TTG GGT AGG CAG CTT AAG AAA CTA GGG AAG 720 Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Ala Ser 253 AAA CTG GAA AAC AAG AGT AAG ACA TGG TTT GGG GCA TAT GCA GCC TCT 768 Pro Tyr Cys Glu Val Glu Arg Arg Leu Gly Tyr Ile Trp Tyr Thr Lys 269 CCC TAC TGC GAG GTA GAA CGG AGG CTT GGT TAC ATC TGG TAT ACA AAG 816 Asn Cys Thr Pro Ala Cys Leu Pro Lys Asn Thr Lys Ile Val Gly Pro 285 AAT TGC ACC CCT GCC TGT TTA CCA AAA AAT ACA AAG ATC GTT GGC CCC 864 Gly Arg Phe Asp Thr Asn Ala Glu Asp Gly Lys Ile Leu His Glu Met 301 GGT AGG TTC GAC ACC AAT GCG GAG GAT GGT AAA ATA CTG CAT GAG ATG 912 Gly Gly His Leu Ser Glu Val Leu Leu Leu Ser Val Val Val Leu Ser 317 GGG GGC CAC TTG TCA GAG GTG CTA CTA CTC TCA GTG GTA GTG CTT TCC 960 As D Phe Ala Pro Glu Thr Ala Ser Val Val Tyr Leu Ile Leu His Phe 333 GAT TTC GCT CCA GAG ACA GCC AGT GTG GTA TAT TTA ATT CTA CAT TTC 1008 Ser Ile Pro Gln Gly His Thr Asp Ile His Asp Cys Asp Lys Asn Gin 349 TCC ATC CCA CAA GGA CAC ACT GAC ATA CAT GAC TGT GAT AAA AAC CAA 1056 Leu Asn Leu Thr Val Gly Leu Thr Thr Ala Glu Val Ile Pro Gly Ser 365 CTA AAC CTC ACC GTA GGA CTC ACA ACA GCT GAA GTA ATA CCT GGG TCA 1104 Val Trp Asn Leu Gly Lys Tyr Val Cys Ile Arg Pro Asp Trp Trp Pro 381 GTT TGG AAT TTG GGC AAA TAT GTT TGT ATA AGA CCA GAT TGG TGG CCT 1152 Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Leu Val Phe Glu Glu Val Gly Gln Val Ile 397 TAT GAG ACA GCC ACG TTC CTA GTG TTT GAA GAG GTG GGT CAA GTG ATC 1200 Ara Ile Val Leu Arg Ala Leu Arg Asp Leu Thr Arg Ile Trp Thr Ala 413 AGG ATA GTC TTG AGG GCT TTA AGA GAT CTA ACG CGC ATT TGG ACC GCT 1248 Ala Thr Thr Thr Ala Phe Leu Val Cys Leu Val Lys Val Val Arg Gly 429 GCT ACG ACT ACT GCA TTC CTG GTA TGT CTG GTG AAG GTG GTG AGA GGC 1296 Gln Val Leu Gln Gly Ile Leu Trp Leu Ile Leu Ile Thr Gly Ala Gln 445 CAA GTG TTG CAA GGC ATA CTG TGG TTG ATA CTC ATA ACA GGG GCA CAA 1344 Gly Leu Pro Val Cys Lys Pro Gly Phe Tyr Tyr Ala Ile Ala Lys Asn 461 GGG CTC CCA GTT TGC AAA CCC GGC TTT TAC TAC GCC ATA GCC AAA AAT 1392 Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Thr Gly Leu Thr Thr Gln Trp Tyr 477 AAT GAG ATC GGC CCT CTT GGG GCT ACG GGC CTC ACC ACT CAG TGG TAT 1440 Glu Tyr Ser Asp Gly Met Arg Leu Gln Asp Thr Gly Vai Val Val Tr D 493 GAA TAC TCG GAT GGG ATG CGG CTG CAG GAC ACG GGA GTT GTA GTG TGG 1488 Cys Lys Gly Gly Glu Ile Lys Tyr Leu Ile Thr Cys Glu Arg Glu Ala' 509 TGT AAA GGT GGA GAG ATC AAA TAT CTA ATT ACA TGT GAG AGG GAA GCC 1536 Arg Tyr Leu Ala Ile Leu His Thr Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Val 525 AGG TAT CTG GCC ATT CTA CAC ACG AGA GCC CTG CCG ACG TCT GTA GTA 1584 Phe Glu Lys Ile Ile Asp Gly Lys Glu Gln Glu Asp Val Val Glu Met 541 TTT GAA AAA ATC ATA GAT GGA AAA GAA CAA GAG GAC GTA GTG GAA ATG 1632 Asp Asp Asn Phe Glu Leu Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Lys Pro Leu 557 GAT GAT AAC TTT GAA CTC GGT CTT TGC CCG TGT GAT GCT AAA CCC TTG 1680 Val Arg Gly Lys Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln 573 GTA AGG GGA AAA TTT AAT ACA ACA CTT CTG AAT GGG CCA GCC TTC CAG 1728 Met Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val Ser Leu Cys Hls Trp 589 ATG GTT TGC CCT ATA GGA TGG ACA GGA ACT GTG AGT CTG TGT CAC-TGG 1776 Ser Asn Lys Asp Thr Leu Ala Met Thr Val Val Arg Thr Tyr Lys Arg 605 TCC AAT AAG GAT ACG TTA GCC ATG ACC GTT GTA CGA ACA TAC AAG AGG 1824 His Arg Pro Phe Pro Phe Arg Gln Gly Cys Ile Thr Gln Lys Val Ile 621 CAC AGG CCT TTC CCC TTT AGG CAA GGC TGC ATT ACC GAG AAA GTC ATC 1872 Gly Gly Asp Leu Tyr Asp Cys Ala Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val 637 GGG GGA GAC CTC TAC GAC TGT GCC TTG GGA GGG AAC TGG ACT TGT GTA 1920 Pro Gly Asp Ile Leu Arg Tyr Val Asp Gly Pro Val Glu Ser Cys Lys 653 CCG GGG GAC ATA CTA CGA TAT GTA GAT GGG CCT GTC GAG TCT TGC AAG 1968 Trp Cys Gly Tyr Lys Phe His Lys Ser Glu Gly Leu Pro Hls Phe Pro 669 TGG TGT GGT TAC AAG TTT CAT AAA AGT GAG GGT CTG CCA CAC TTC CCA 2016 Ile Gly Lys Cys Lys Leu Lys Asn Glu Ser Gly Tyr Arg Gln Val Asp 685 ATT GGC AAG TGC AAG CTG AAG AAT GAA AGT GGC TAC AGA CAA GTA GAT 2064 Glu Thr Ser Cys Asn Arg Asp Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Gly Ser 701 GAG ACC TCT TGC AAC AGA GAC GGT GTG GCT ATA GTA CCA ACT GGT TCG 2112 Val Lys Cys Lys Ile Gly Asp Thr Val Val Gln Val Ile Ala Met Asp 717 GTG AAA TGC AAG ATA GGG GAC ACA GTG GTG CAA GTC ATA GCA ATG GAT 2160 Asp Lys Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Tyr Gly Met Pro *** GAT AAG CTA GGG CCT ATG CCT TGC AGA CCA TAT GGC ATG CCA TAG GAT 2208 CC Z 210 REVENDICATIONS 1 Séauence nucléotidique correspondant sensiblement à tout ou partie de la fraction du qénome du virus BVD codant pour la qlycoprotéine q E 2. 2 Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle correspond sensiblement à la première moitié de la fraction du génome du virus BVD codant pour la glycoprotéine g E 2. 3 Séquence nucléotidique correspondant sensiblement à tout ou partie de la fraction du génome du virus BVD codant pour la glycoprotéine g El. 4 Séquence nucléotidique contenant la séquence selon la revendication 1 ou 2 et/ou la séquence selon la revendication 3. 5 Séquence nucléotidique comprenant une fraction du génome BVD, caractérisée en ce qu'elle contient: codon d'initiation de traduction séquence codant pour g El séquence codant pour q E 2 siqnal de fin de copie. 6 Séquence nucléotidique comprenant une fraction du génome BVD, caractérisée en ce qu'elle contient: codon d'initiation de traduction séquence codant pour g El + les 273 premiers codons de g E 2 siqnal de fin de copie. 7 Séquence nucléotidique comprenant une fraction du génome BVD, caractérisée en ce qu'elle contient: codon d'initiation de traduction séquence codant pour la fin de g El + les 273 premiers codons de g E 2 - signal de fin de copie. 8 Séquence nucléotidique comprenant une fraction du génome BVD, caractérisée en ce qu'elle contient: codon d'initiation de traduction séquence codant pour les 273 premiers codons de g E 2 signal de fin de copie. 9 Séquence nucléotidique comprenant une fraction du génome BVD, caractérisée en ce qu'elle contient: codon d'initiation de traduction séquence codant pour g E 2 signal de fin de copie. Séquence nucléotidique comprenant une fraction du génome BVD, caractérisée en ce qu'elle contient: codon d'initiation de traduction séquence codant pour la première moitié de g E 2 signal de fin de copie. 11 Séquence nucléotidique comprenant une fraction du génome BVD, caractérisée en ce qu'elle contient: codon d'initiation de traduction séquence codant pour C séquence codant pour g El séquence codant pour g E 2 signal de fin de copie. 12 Fragments de la séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 4 et dont les produits de traduction sont reconnus par au moins un anticorps monoclonal neutralisant du virus BVD. 13 Peptide correspondant à la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14 Peptide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est glycosylé. Virus recombinant incorporant et exprimant la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 16 Virus selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un Baculovirus. 17 Vecteur d'expression de levure incorporant et exprimant la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 18 Cellule hôte eucaryote comprenant le virus selon la revendication 15 ou 16. 19 Cellule hôte eucaryote selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle est choisie Darmi les cellules de mammifères et les cellules d'insectes. Cellule hôte eucaryote selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'il s'agit de Spodoptera fruqiperda. 21 Levure comprenant le vecteur selon la revendication 17. 22 Levure selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'il s'agit de Saccharomyces cerevisiae. 23 Vaccin contenant, dans un véhicule approprié, ou exprimant, des Deptides correspondant à une séquence codant pour g El et a E 2. 24 Vaccin contenant, dans un véhicule approprié, ou exprimant, des peptides correspondant à une séquence codant pour g El et la première moitié de g E 2. Vaccin contenant, dans un véhicule approprié, ou exprimant, l'un au moins des peptides selon l'une des revendications 13 et 14.