Brevet FR2677249A1 — publié le 19921211

La présente invention concerne un vecteur particulaire, biodégradable, utile pour le transport de molécules à activité biologique. Elle concerne également un procédé de synthèse de ce vecteur, et d'encapsulation de principes actifs dans ce vecteur. De tels vecteurs constituent l'un des procédés utilisés pour faire pénétrer ou réagir un composé actif à l'intérieur d'un système biologique ou biochimique. En effet, ils doivent permettrent en encapsulant un tel composé, de la protéger vis-à-vis des agents normaux de son catabolisme, et de l'amener jusqu'à son lieu d'action, où le vecteur le libérera. On a utilisé dans ce but des liposomes, qui sont constitués d'une vacuole aqueuse entourée d'une bicouche phospholipidique. Un tel système de transport présente cependant un certain nombre de limitations dues à la fragilité des liposomes, leur hétérogénéité et la complexité de leur production à l'échelle industrielle. En outre, leur capacité de transport est réduite. Une autre solution consiste à utiliser des biovecteurs supra-moléculaires (ou BVSM), tels qu'ils sont décrits dans la demande PCT FR/8900229. De tels vecteurs comprennent un noyau central de polysaccharides réticulés, entouré d'une première couche lipidique liée au noyau par des liaisons covalentes, et d'une seconde couche ou feuillet externe de composés amphiphiles. Ces biovecteurs sont très stables, lyophilisables, stérilisables, et leur structure présente de fortes analogies avec les vecteurs naturels. Ces biovecteurs peuvent encapsuler des principes actifs de natures chimiques différentes, en accord avec les caractéristiques des trois zones : un noyau polaire, une couronne lipidique et un feuillet externe amphiphile. Toutefois, ces vecteurs présentent certaines imperfections. En effet, le taux de principe actif pouvant être encapsulé reste relativement faible. En outre, le principe actif doit etre encapsule au moment de la synthèse de la zone du biovecteur correspondante, et, pour les principes actifs encapsulés notamment dans le noyau, il y a un risque d'altération lors de la synthèse des couches suivantes. Il est donc souhaitable de disposer de vecteurs particulaires permettant le chargement de principes actifs avec des rendements quantitatifs, selon un protocole permettant la conservation de l'intégrité structurale des principes actifs, ces vecteurs restant cependant parfaitement biodégradables et biocompatibles avec l'organisme. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un vecteur particulaire biodégradable, caractérisé en ce qu'il comporte - un noyau constitué d'une matrice polysaccharidique ou oligosaccha ridique réticulée, sur laquelle sont gréffés des ligands ioniques, - une première couche lipidique semi-perméable, liée au noyau par des liaisons covalentes, - une seconde couche de composés amphiphiles, liée à la première couche lipidique par des interactions hydrophobes. Un tel vecteur permet l'encapsulation optimisée de principes actifs à l'intérieur du noyau polysaccharidique. Ces propriétés sont obtenues par le greffage d'un grand nombre de ligands ioniques, hydrolysables enzymatiquement, sur la matrice réticulée. Le noyau, auquel est ainsi conféré un caractère ionique important, est doté alors de propriétés d'encapsulation très supérieures à celles observées pour les vecteurs particulaires de l'art antérieur, et il est complètement biocompatible par le choix adapté de ces ligands et des constituants de la matrice. Le greffage ionique ne doit pas être préjudiciable à la stabilité ni à la taille de la matrice polysaccharidique. Ces ligands seront donc choisis de préférence parmi des molécules biologiques naturellement présentes dans l'organisme, et couplés à la matrice par des liaisons hydrolysables enzymatiquement. Selon un des aspects de l'invention, les ligands greffés sur la matrice sont des composés acides. Ces ligands acides peuvent notamment être choisis parmi l'acide succinique, l'acide phosphorique, l'acide citrique, la glycine, l'alanine, l'acide glutamique, l'acide aspartique. L'acide succinique est un constituant naturel de l'organisme et intervient dans le cycle de Krebs. C'est un diacide carboxylique qui peut former avec les hydroxyles de la matrice polysaccharidique une liaison ester facilement biodégradable grâce à la présence ubiquitaire dans l'organisme de succinylestérase. La fonction acide qui n'est pas engagée dans la fontion ester avec la matrice polysaccharidique reste donc disponible pour assurer les propriétés d'échange d'ions. Les phosphates sont également des fonctions extrêmement fréquentes dans l'organisme. On les retrouve principalement associés à des lipides, des sucres et à des nucléotides. On peut également greffer sur la matrice des mono hydroxy ou des monoaminoacides, par exemple l'acide citrique, les acides aminés à chaîne courte et les acides aminés acides. I1 est intéressant de disposer de noyaux ayant un taux de greffage de ligands suffisant pour permettre un niveau d'encapsulation ultérieur satisfaisant. Ce taux doit se rapprocher d'une charge par sucre élémentaire. On obtient par exemple des vecteurs particulaires dans lesquels l'acide succinique est greffé à un taux correspondant environ à une charge pour 1,5 résidus de glucose ; ou bien l'acide phosphorique est greffé à un taux correspondant environ à une charge pour 1,5 résidus de glucose. Selon un autre aspect de l'invention, les vecteurs particulaires sont caractérisés en ce que les ligands greffés sur la matrice sont des composés basiques, fixés à la matrice par l'intermédiaire d'un composé acide. Afin d'obtenir le greffage biodégradable de ligands basiques, la Demanderesse a trouvé qu'il était possible d'utiliser notamment l'acide succinique entre la matrice polysaccharidique et un composé basique. L'une des fonctions acides de l'acide succinique est utilisée pour réaliser une fonction ester biodégradable avec la matrice polysaccharidique et l'autre fonction acide est utilisée pour réaliser une fonction ester ou amide avec le composé basique. De préférence, les ligands basiques greffés sur la matrice sont des composés bifonctionnels comportant une fonction acylable formant une liaison amide ou ester avec un composé acide fixé sur la matrice. La fonction acylable est par exemple une fonction hydroxyle, amine primaire ou secondaire. L'autre fonction, basique, non acylable, est par exemple une fonction amine tertiaire ou quaternaire. Le ligand basique peut notamment être choisi parmi, le 2-(diméthylamino) éthanol et la 2-(diméthylamino)éthylamine. Des taux de greffage ionique correspondant à une charge pour trois résidus glucose peuvent être observés. La matrice polysacchar idique, elle-même biodégradable, peut être constituée d'un polysaccharide réticulé chimiquement choisi parmi le dextrane, l'amidon, la cellulose, les oligosaccharides et leurs dérivés. Elle peut être notamment réalisée en réticulant un polysac cl aride biodégradable comme l'amidon avec un agent bifonctionnel, comme l'épichlorhydrine. Dans le cas où le rapport épichlorhydrine/glucose est maintenu en dessous de 1/10, le gel obtenu conserve la propriété d'être hydrolysé par les amylases. La cinétique d'hydrolyse est toutefois ralentie lorsque ce rapport augmente et se rapproche de 1/10. L'analyse des produits d'hydrolyse enzymatique des matrices d'amidon réticulé ne permet pas de mettre en évidence des oligomères de glucose non hydrolysable de taille supérieure à 10. L'administration de telles matrices d'amidon réticulé à l'intérieur de l'organisme ne doit donc pas conduire à la formation de polymères de glucose non éliminables par l'organisme. Les noyaux des vecteurs particulaires selon l'invention possèdent une certaine porosité, qui dépend des conditions de réticulation, de la nature du ligand ionique et de son taux de greffage. La première couche lipidique, semi-perméable, des vecteurs particulaires selon l'invention est de préférence constituée d'acides gras naturels, fixés à un taux variable. En effet, la densité de cette couche lipidique peut être modulée par une acylation ménagée. Le contrôle de la réaction d'acylation peut être réalisé soit par le contrôle de la stoéchiométrie des réactifs, soit par le contrôle de la cinétique réactionnelle. Les couches lipidiques peu denses rendent les particules seulement partiellement hydrophobes. I1 en résulte que les particules possèdent notamment la capacité de s'hydrater partiellement. La présence des acides gras placés en périphérie ne permet cependant pas aux particules de se disperser librement dans les milieux aqueux et les noyaux faiblement acylés sont observés sous forme d'agrégats dont la cohésion est due à des liaisons de type hydrophobe. Dans un mode de réalisation préférée, le vecteur particulaire selon l'invention peut être caractérisé en ce que la seconde couche lipidique est constituée de phospholipides. Les particules sont alors à nouveau complètement dispersées. Toutefois, le rapport optimal pour atteindre une dispersion maximale entre le poids de noyau acylé et le poids de phospholipides est plus important dans le cas de noyaux ayant une première couche semi-perméable que dans le cas de noyaux complètement hydrophobes. I1 est possible qu'il se forme autour du noyau acylé un double feuillet de phospholipides, le feuillet interne étant interdigité par les acides gras de la première couche lipidique. Un vecteur particulaire selon l'invention peut être caractérisé en ce qu'une molécule à activité biologique est incluse dans le noyau. En effet, un vecteur selon l'invention peut encapsuler un principe actif, en mettant à profit la porosité du noyau. Ce noyau a de préférence une taille comprise entre 10 nm et 10 um. Les principes actifs peuvent pénétrer à l'intérieur du noyau polysaccharidique ionique au travers de la couche semi-perméable. Ils sont ensuite stabilisés et maintenus à l'intérieur du noyau par l'établissement de liaisons coulombiennes entre leurs charges et les charges de la matrice p olysaccharidique. De manière préférée, la molécule à activité biologique incluse dans le vecteur particulaire selon l'invention à un poids moléculaire compris entre 100 daltons et 500 kilodaltons. La présente invention a également pour objet un procédé de synthèse d'un vecteur particulaire possédant une ou plusieurs des caractéristiques précédentes, ce procédé étant caractérisé en ce que a) on prépare une matrice par réticulation d'un polymère ou oligomère hydrophile biodégradable, b) on fixe sur la matrice, des ligands ioniques par des liaisons hydroly sables enzymatiquement, afin d'obtenir le noyau du vecteur, c) on soumet les noyaux à ultrabroyage pour les amener à une taille comprise entre 10 nm et 10 pm, d) on sèche les noyaux, e) on couple chimiquement sur les fonctions réactives à la surface du noyau des composés lipidiques pour former la première couche, f) on introduit des composés amphiphiles en contact hydrophobe avec la première couche afin de former la seconde couche. La réticulation de polymère hydrophile, notamment de polysaccharide, est un procédé connu de l'homme du métier. Toutefois, les conditions doivent être fixées pour obtenir une matrice qui reste biodégradable et, de préférence, ne donne pas naissance à des produits d'hydrolyse enzymatique constitué par des oligomères de glucose non hydrolysables de taille supérieure à 10. Le greffage des ligands ioniques doit permettre d'obtenir un taux suffisant pour conférer un caractère ionique au noyau obtenu. Dans le cas de l'acide succinique, les meilleurs résultats pour le greffage de l'acide succinique sont obtenus en utilisant le monochlorure de l'acide succinique. Une méthode originale de synthèse de ce réactif a été mise au point, utilisant une réaction de transchloration entre le dichlorure de l'acide succinique et l'acide succinique libre selon l'équation suivante 2 C1CO-CH2-CH2-COOH Cette réaction est simple à effectuer et conduit avec un bon rendement au monochlorure pur et cristallisé. L'intérêt de ce réactif par rapport aux autres réactifs déjà décrits est 1) sa grande facilité de préparation 2) sa très grande réactivité chimique notamment vis-à-vis des hydroxyles 3) sa solubilité dans l'eau 4) l'absence de résidus ou de sous produits de réaction toxiques La Demanderesse a trouvé que l'utilisation de ce réactif permettait le greffage d'acide succinique sur des matrices polysaccharidiques (PS) avec de bons rendements et dans des conditions réactionnelles très douces (0 C, pH 6,5). Des taux de greffage ionique correspondant à une charge pour 1,5 résidus de glucose peuvent notamment être atteints. 0 C,pH6,5 Cette réaction permet l'obtention d'une répartition régulière des ligands greffés sur la matrice polysaccharidique, contrairement à ce qui est observé par les techniques classiques, avec l'emploi d'anhydride succinique par exemple. Le couplage de phosphates sur les matrices PS fait intervenir classiquement la réaction de l'oxychlorure de phosphore (POCI3) sur la matrice polysaccharidique en présence de NaOH 2N. Avec les conditions réactionnelles décrites, il n'est cependant pas possible d'obtenir des taux de greffage ionique supérieurs à une charge négative pour six résidus glucoses. La Demanderesse a montré que l'efficacité de cette réaction pouvait être améliorée de façon importante en travaillant à basse température et en maintenant le pH à 13,5 au cours de la réaction. On obtient ainsi des taux de greffage correspondant à une charge pour 1,5 résidus de glucose. Lorsque l'on souhaite greffer des ligands basiques sur la matrice, un mode de préparation optimal des ligands basiques est décrit ci-après. Afin d'obtenir le greffage biodégradable de ligands basiques, il est possible d'utiliser l'acide succinique comme composé intermédiaire entre la matrice polysaccharidique et un ligand basique. La réaction est réalisée en faisant réagir stoéchiométriquement le dichlorure de l'acide succinique avec le composé bifonctionnel. I1 se forme un produit de couplage possédant une fonction chlorure d'acide réactive et une fonction basique, amine tertiaire ou quaternaire. (CH2)2-N(CH3)2 La fonction basique permet au réactif d'être soluble dans l'eau et apporte les propriétés d'échange d'ions. La fonction chlorure d'acide permet de réaliser le greffage sur les hydroxyles de la matrice osidique. Des taux de greffage ionique correspondant à une charge positive pour 1,5 résidus glucose ont pu être obtenus avec ces réactifs, ou bien par exemple une charge pour 3 résidus glucose. La réaction décrite plus haut peut être utilisée également pour greffer sur la matrice osidique des mono hydroxy ou des mono amino acides sur la matrice osidique. Dans tous les cas, le taux de greffage ionique de la matrice polysaccharidique est variable, et sera modulé notamment en fonction du type de composé à encapsuler ; on pourra utiliser des vecteurs pour lesquels les taux de greffage sont inférieurs à ceux indiqués ci-dessus comme pouvant être obtenus par les procédés décrits. On utilisera en particulier des taux de greffage ionique de l'ordre de 1 charge pour 3 résidus glucose. Les noyaux ioniques peuvent être ultrabroyés par des techniques analogues à celles utilisées pour les matrices polysaccharidiques neutres, comme l'extrusion à haute pression ou les ultra sons. La taille des particules peut être ajustée en réglant les conditions d'ultrabroyage et l'état de dureté du gel, qui dépend du caractère réticulé et de l'état ionique du noyau. Le séchage des noyaux doit éviter au maximum leur agrégation. Ceci peut être obtenu notamment en réalisant l'étape d) en présence de bicarbonate d'ammonium. En effet, il est possible de diminuer le degré d'agrégation lors des opérations de séchage par lyophilisation ou atomisation en ajoutant aux suspensions à déshydrater du bicarbonate d'ammonium (NH4HCO3). Ce composé très soluble dans l'eau maintient en effet entre les particules une certaine force ionique qui prévient leur rapprochement et donc leur agrégation éventuelle. Le bicarbonate d'ammonium, étant volatil, est ensuite éliminé lors du séchage et n'interfère pas avec les opérations suivantes. L'utilisation de bicarbonate d'ammonium permet d'obtenir des poudres de particules caractérisées par une densité beaucoup plus faible qu'en l'absence de bicarbonate. La Demanderesse a trouvé que la diminution des phénomènes d'agrégation se traduisait par une augmentation du taux d'acylation des particules et par une plus grande hydrophobie de ces dernières. La synthèse de la couche lipidique semiperméable est une synthèse régiosélective qui est réalisée par une acylation des noyaux polysaccharidiques en milieu aprotique non solvant des polysaccharides. Parmi les solvants utiles pour cette réaction, la Demanderesse a trouvé qu'il était possible d'utiliser le CO2 à l'état super critique pour effectuer l'étape e). L'emploi de CO2 à l'état super critique représente une amélioration importante puisque ce composé est non toxique et parfaitement éliminable à l'issue de la réaction, par détente de l'atmosphère réactionnelle. D'autre part, la Demanderesse a trouvé qu'il est possible de diminuer la densité de la couche lipidique par une acylation ménagée. Le contrôle de la réaction d'acylation peut être réalisé soit par le contrôle de la stoéchiométrie des réactifs, soit par le contrôle de la cinétique réactionnelle. Dans un des aspects préférés de la présente invention, le procédé de synthèse de vecteur particulaire est caractérisé en ce qu'après l'étape e) et avant l'étape f), on inclut dans le noyau des substances à activité biologique. Un des inconvénients des BVSM décrits dans le brevet original était la possibilité de dériver le produit encapsulé par des acides gras lorsque la réaction d'acylation était réalisée après l'encapsulation. La Demanderesse a trouvé qu'il est possible de faire pénétrer les principes actifs à l'intérieur du noyau polysaccharidique ionique au travers de la couche semi perméable et d'éviter ainsi la dérivatisation des principes actifs. Une fois que les principes actifs ont franchi la couche lipidique semi perméable, ils sont stabilisés et maintenus à l'intérieur du noyau par l'établissement de liaisons coulombiennes entre leurs charges et les charges de la matrice polysaccharidique. De plus, des rendements d'encapsulation pratiquement quantitatifs peuvent être obtenus en utilisant une méthode qui consiste à hydrater progressivement un mélange principe actif, avec les noyaux acylés obtenus à l'issue de l'étape e). L'hydratation étant soit par de l'eau, soit par un tampon, soit par un mélange eau/alcool inférieur. I1 est possible que l'encapsulation soit favorisée par les concentrations saturantes en principes actifs ainsi obtenues et par le flux du liquide vers la partie interne des particules induit par leur hydratation. Dans le cas où la substance à activité biologique est un composé non ionique, le procédé selon l'invention peut être caractérisé en ce qu'on greffe, de façon réversible, une charge ionique sur ladite substance avant son inclusion dans le noyau. En effet, la Demanderesse a trouvé qu'il est possible d'encapsuler des principes actifs polaires non ioniques à l'intérieur de noyaux ioniques en leur greffant de façon réversible une charge ionique. Nous avons trouvé que ce greffage réversible pouvait être réalisé notamment par la réaction des hydroxyles des principes actifs avec le monochlorure de l'acide succinique. I1 se forme ainsi un monosuccinate du principe actif présentant une charge négative. Le principe actif original est ensuite retrouvé par l'action de la succinylestérase. Dans un des modes de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, celui-ci peut être caractérisé en ce que l'étape f) est effectuée par dispersion des noyaux acylés obtenus à l'issue de l'étape e), dans lesquels est éventuellement inclus un principe actif, dans un milieu lipidique renfermant des triglycérides et des phospholipides, puis traitement par une lipase. Le caractère hydrophobe des noyaux à couche lipidique semi perméable est suffisant pour leur permettre de se disperser dans des environnements lipidiques comme des triglycérides. Ces dispersions peuvent être comparées à des émulsions eau/hulle stabilisées. La Demanderesse a montré que les noyaux acylés pouvaient de plus être incorporés aux formulations des composés huileux et notamment aux émulsions. Le système obtenu est ainsi l'équivalent d'une émulsion triple eau/huile/eau. La Demanderesse a, de plus, trouvé que le traitement d'une émulsion huile/eau, dont la partie huileuse est composée d'un mélange de triglycérides à courte chaîne, de phospholipides et de noyaux acylés, par une lipase conduisait après hydrolyse enzymatique des triglycérides et dialyse à l'obtention de BVSM composés de noyaux acylés entourés de phospholipides. Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée EXEMPLE 1: PREPARATION DE MATRICES POLYSACCHARIDIQUES BIODEGRADABLES Dans un réacteur de 5 1, on solubilise 500 g d'amylopectine (Roquette, Lille, France) dans un litre de NaOH 2N. Lorsque la solution est bien homogène, on introduit 28 g d'épichlorydrine (Fluka, Suisse) correspondant à 0,1 équivalent/résidu glucose. Après la fin de l'addition, la préparation est encore homogénéisée 1 h puis laissée reposée 8 h. La préparation d'amidon polymérisé est ensuite amenée à pH 7 par addition d'acide acétique 2 N puis dispersée grossièrement à l'aide d'un broyeur à hélice. Le gel obtenu est ensuite filtré sur Büchner et lavé plusieurs fois avec de l'eau distillée jusqu'à l'élimination de tous les sels et des sous produits de la réaction. On obtient après lyophilisation 450 gr (90 %) de gel réticulé. EXEMPLE 2 : DEGRADATION ENZYMATIQUE DU GEL D'AMIDON RETICULE 1 g d'amidon réticulé selon l'exemple 1 est dispersé dans 50 ml de tampon phosphate pH6,9 et mis en présence de 200 unités d'amylase de Bacillus (Sigma). La réaction est agitée pendant une heure à 20"C puis la réaction est stoppée par un chauffage à 90"C pendant 2 min. Le mélange réactionnel est devenu limpide et les produits de réaction sont analysés par HPLC sur une colonne C18 avec une phase mobile entièrement acqueuse et une détection par indice de réfraction. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus avec de l'amidon non réticulé et montrent qu'il n'y a pas apparition d'oligomères de taille supérieure à 10. EXEMPLE 3 : PREPARATION DE MATRICE POLYSACCHARIDIQUE IONIQUE GREFFEE PAR DE L'ACIDE SUCCINIQUE a) Préparation du monochlorure de l'acide succinique C l-CO-(CH2)2-COOH 50 g d'acide succinique sont dispersés dans 50 ml d'une solution anhydre de THF et de DMF (90/10) maintenue à 0 C. On ajoute progressivement, sous agitation, la quantité stoechiométrique de dichlorure de l'acide succinique (66 g). La réaction s'accompagne d'un dégagement de chaleur et le mélange réactionnel est refroidit énergiquement pour maintenir la température en dessous de 0 C. La réaction est poursuivie jusqu'à la dissolution totale de l'acide succinique en suspension. Simulta nément à la dissolution de l'acide succinique, on observe la précipitation progressive du monochlorure de l'acide succinique. Après la fin de la réaction, le monochlorure est précipité complètement par addition d'éther de pétrole anhydre (100 ml) et séparé du mélange réactionnel par filtration sur Büchner. Après lavage du précipité par 100 ml d'éther de pétrole anhydre et séchage au dessicateur sous pression réduite, on obtient 80 g de monochlorure pur (rdt 70 %). b) Caractérisation du monochlorure de l'acide succinique Analyse élémentaire Valeurs calculées expérimentales C 35 % 36 % H 3,6 % 3,4 % O 35 % 36,5 % C1 26 % 24,1 % Spectre Infra rouge : bandes à 3200 cm-l(s) (OH), 1800 (s) (COC1) Caractérisation du monochlorure de l'acide succinique par la formation de l'acide N-(phényl) succinamylolque: (C6H5)-NH-CO-(CH2)2-COOH 100 mg de monochlorure de l'acide succinique sont dissous dans 2 ml d'acétonitrile anhydre. On ajoute, à température ambiante, 1,5 équivalents d'aniline (102 mg) et la réaction est maintenue agitée pendant 30 minutes.On ajoute alors 10 ml d'acide sulfurique 0,005 M et on extrait la solution par de l'éther éthylique (3X 3 ml). Les phases étherées sont rassemblées et lavées par de l'eau jusqu'à neutralité puis séchées sur MgS04 anhydre. L'éther est ensuite filtré, évaporé sous pression réduite pour donner 90 mg d'acide N-(phényl) succinamyloîque. L'analyse chromatographique est réalisée sur une colonne 5 um C8, 3,6 cm X 4,6 mmID avec une détection UV à 254 nm. La colonne est développée par un gradient linéaire entre une phase mobile TFA 5 mM et une phase mobile TFA 5 mM/acétonitrile (30/70). Le chromatogramme indique la présence d'un seul pic caractérisé par un K' de 13,5. On n'observe pas de pics correspondant à l'élution de l'aniline ni du dérivé dianilide de l'acide succinique. Spectre Infra rouge : bandes à 3300 cm-l (s) (OH), 1770 cm-l (s) (COOH), 1650 cm-l (s) (CON). Analyse élémentaire Valeurs calculées expérimentales C 62,5 % 64 % N 7,3 % 6,9 % H 5,2 % 5,7 % c) Greffage de l'acide succinique sur la matrice d'amidon réticulé 100 g d'amidon réticulé préparés selon l'exemple 1, sont dispersés dans 1 litre d'une solution NaCI 2 M et refroidit à 0 C. Le monochlorure de l'acide succinique (85,3 g) est alors ajouté, sous forme de poudre, progressivement à la dispersion agitée doucement et maintenue à pH 6,5 et en dessous de 0 C. Après la fin de l'addition, la réaction est encore agitée une heure à 0 C puis 2 H à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite acidifié à pH2 par addition d'HCl 2 N et agité une heure.Le gel ionique obtenu est séparé du milieu réactionnel par filtration sur Büchner et lavé plusieurs fois par de l'eau distillée jusqu'à neutralité. On obtient après lyophilisation 110 gr (rdt 78 %) de gel ionique. Le taux de greffage ionique est mesuré par titration du gel par une solution NaOH 0,1 M avec la phénophtaléine comme indicateur. On obtient une charge négative pour 2,5 résidus glucoses. EXEMPLE 4 : PREPARATION DE MATRICES POLYSACCHARIDIQUES GREFFEES PAR DE L'ACIDE PHOSPHORIQUE 100 g d'amidon réticulé obtenu selon l'exemple 1 sont dispersés dans une solution de NaCI 2 M ; pH 13,5 et refroidit à 0 C. On ajoute progressivement l'oxychlorure de phosphore (114 ml, 104 g) en maintenant le pH à 13,5 et la température en dessous de 0 C. Après la fin de l'addition, le mélange réactionnel est agité encore deux heures en le laissant revenir à température ambiante. Le mélange est ensuite acidifié à pH2 par ajout d'HCl 2 N, agité une heure, filtré sur Büchner et lavé avec de l'eau distillée jusqu'à neutralité. On obtient après lyophilisation, 110 gr (rdt 90 %) de gel ionique.Le taux de greffage obtenu est déterminé par titration par de la soude 0,1 N avec la phénolphtaléine comme indicateur. On trouve une charge négative pour 1,5 résidus glucoses. EXEMPLE 5 : PREPARATION DE MATRICE POLYSACCHARIDIQUE GREFFEE PAR LE N-(2-(DIMETHYLAMINO)ETHYL) SUCCINAMYLATE. a) Préparation du chlorure de l'acide N-(2-(diméthylamino)éthyl) succinamylolque : C1 -CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)2-N(CH3)2) 15,4 g de dichlorure de l'acide succinique sont dissous dans 100 ml d'acétonitrile anhydre et la solution est maintenue sous agitation à OOC. On ajoute goutte à goutte une solution de 10 g de 2-diméthylaminoéthylamine dans 100 ml d'acétonitrile anhydre. Le milieu réactionnel est encore agité 30 min après la fin de l'addition en maintenant la température à 0 C. Le produit de couplage est alors précipité dans le ballon réactionnel. Lorsque tout le produit est précipité, il est séparé du milieu réactionnel par filtration sur Büchner, lavé plusieurs fois par de l'acétonitrile froid puis séché au dessicateur sous pression réduite pour donner 18 g de produit pur (rdt 84 %). Analyse élémentaire Valeurs calculées expérimentales C 46,7 % 48 % N 13,6 % 12,5 % H 6,8 % 7,6 % b) Greffage de l'acide N-(2-(diméthylamino)éthyl)suoeinamyloïque sur une matrice osidique 100 g d'amidon réticulé selon l'exemple 1 sont dispersés dans un litre de NaCI 2 M maintenue sous agitation à pH 6,5 et à OOC. On ajoute alors progressivement 63,4 g de chlorure de l'acide N6(2-(diméthylamino) éthyl)succinamylique. Lorsque tout le chlorure d'acide est ajouté, on laisse agiter encore 2 h à 0 C. Le gel ionique obtenu est ensuite filtré sur Büchner, lavé à l'eau distillé et lyophilisé pour donner 105 g de matrice basique (rdt 83 %). Le taux de greffage obtenu est déterminé par l'analyse du taux d'azote présent dans le gel (3,6 %).Ce taux de greffage correspond à une charge positive pour 4 résidus glucoses. EXEMPLE 6 : OBTENTION DE PARTICULES POLYSACCHARIDIQUES IONIQUES, GREFFEES PAR L'ACIDE SUCCINIQUE, DE PETITE TAILLE 100 gr de gel ionique obtenu selon l'exemple 3 sont dispersés dans 4 litres d'eau distillée et homogénéisés pendant 1 H par un homogénéisateur Rannie (type industrie 12,S1) à une pression de 1000 Bars et un débit de 40 I/h. L'analyse de la taille des particules obtenues est effectuée au moyen d'un nanosizer Coulter N4 et indique que 90 % des particules ont un diamètre inférieur à 50 nm. Les particules de très petite taille sont ensuite séchées par lyophilisation ou par atomisation en présence de bicarbonate d'ammonium (50 gr/l). Après séchage, la taille des particules est contrôlée à nouveau au nanosizer après dispersion des particules dans l'eau. Les résultats obtenus sont identiques aux valeurs obtenues avant le séchage. Le taux de greffage ionique est également identique. EXEMPLE 7 : REALISATION DE LA COUCHE LIPIDIQUE SEMIPER MEABLE 10 gr de particules de 50 nm obtenues selon l'exemple 6 sont dispersés dans 30 ml de dichlorométhane. On ajoute 0,8 gr de chlorure d'acide palmitique. Un réfrigérant muni d'une garde au carbonate de potassium est adapté sur le flacon réactionnel et la réaction est agitée énergiquement à reflux pendant une nuit. Le dichlorométhane est ensuite évaporé avec un evaporateur rotatif et le résidu est lavé plusieurs fois par de ltéthanol puis séché sous vide. On obtient 10,3 gr de particules acylées (rdt 100 ,ó). Le taux d'acides gras greffés mesuré après saponification des particules est de 5 %. Avec les mêmes conditions d'acylation, le taux d'acides gras greffés sur des particules identiques mais séchées sans bicarbonate d'ammonium est de 3 %. EXEMPLE 8 CHARGEMENT DE LA BUTIROSINE DANS LES BVSM A NOYAUX IONIQUE ET A COUCHE LIPIDIQUE SEMI PERMEABLE La butirosine est un antibiotique de la famille des aminoglycosides. C'est une molécule constituée d'un aminocyclitol lié par des liaisons glycosidiques à des sucres aminés. Il s'agit donc d'un produit très polaire et basique soluble uniquement dans l'eau. Son poids moléculaire est de 556. On prépare d'abord des noyaux acylés acides de 50 nm selon l'exemple 7. On mélange à l'état sec 1 g de noyaux acylés avec 1 g de butirosine base (Park-Davis). Le mélange est en suite hydraté très progressivement par ajout d'eau distillée. Le mélange est maintenu constamment agité et à 500C. On ajoute ainsi 10 ml d'eau en laissant le mélange revenir à température ambiante et on laisse agiter encore 2 h. La suspension obtenue est ensuite lyophilisée. Le résidu sec est dispersé dans 5 ml d'éthanol et ajouté goutte à goutte à une suspension de liposomes unilammellaires (1,5 g de lécithines de jaune d'oeuf purifiées dans 50 ml d'eau distillée). Après sonication au bain pendant 1/2 h, la suspension est ultrafiltrée (point de coupure 7500 Daltons) et la butirosine libre présente dans l'uîtrafiltrat est dosée par HPLC. Les résultats indiquent la présence de 50 mg de butirosine dans l'ultrafiîtrat, ce qui correspond à un rendement d'incorporation de 95 % et un taux d'incorporation de 95 % en poids de butirosine par rapport au poids du coeur acylé. EXEMPLE 9 : CHARGEMENT DE LA PEROXYDASE DE RAIFORT DANS LES BVSM A NOYAUX ACIDES ET A COUCHE LIPIDIQUE SEMIPERMEABLE La peroxydase de raifort est une enzyme basique possédant un poids moléculaire de 40.000 Daltons. On utilise les noyaux acylés acides préparés selon l'exemple 7. Un g de noyaux acylés est mélangé à l'état sec avec 1,5 g de peroxydase (Fluka). Le mélange est agité et hydraté très progressivement par ajout d'eau distillée.La température est maintenue à 40"C. On ajoute ainsi 10 ml d'eau distillée et on laisse agiter encore 2h à 40"C. On ajoute alors 10 ml d'une suspension de 400 mg d'octyl glucoside et de 1,5 g de lécithine de jaune d'oeuf purifiée et le mélange résultant est soniqué pendant 1/2 h au bain en maintenant la température en dessous de 30"C. La suspension obtenue est ensuite dialysée pendant 24 h à 4"C contre de l'eau distillé de façon à éliminer I'octyl glucoside. La préparation est ensuite ultrafiltrée avec une membrane possédant un point de coupure à 100.000 Daltons. La peroxydase libre est dosée dans l'ultrafiltrat par la méthode de Bradford et par dosage enzymatique.Les résultats par les deux méthodes indiquent la présence de 45 mg de péroxydase libre soit un rendement d'encapsulation de 97 % et un taux de chargement de 145 % par rapport au poids de noyaux acylés. EXEMPLE 10 PREPARATION DE NOYAUX ACYLES BASIQUES DE 50 nm Les noyaux basiques sont préparés par le greffage de l'acide N-(2-(diméthylamino)éthyl)succinam yloïque selon l'exemple 5. 200 g de matrice PS basique sont dispersées dans 2 1 d'eau distillée et ultrabroyés à haute pression (800 bars) avec un homogénéisateur Rannie pour donner des particules de 50 nm. Ces particules sont atomisées en présence de bicarbonate d'ammonium (50 g/l) pour donner 130 g de poudre sèche qui sont suspendus dans 400 ml de dichlorométhane. On ajoute alors 16 g de chlorure d'acide oléique et on laisse sous agitation pendant 24 h à température ambiante.Les particules acylées obtenues sont alors séparées du milieu réactionnel par centrifugation et lavées avec du dichlorométhane puis avec de l'éthanol. La suspens ion éthanolique finale est évaporée sous vide à froid pour donner 125 g de noyaux basiques acylés. Le taux de greffage d'acides gras est mesuré par dosage de l'acide oléique libre après saponification des particules. On trouve un taux de 4,5 %. EXEMPLE Il : CHARGEMENT D'UN NUCLEOTIDE : L'ADENOSINE 5' MONOPHOSPHATE (AMP) 1'AMP est une molécule acide d'un poids moléculaire de 347. Le chargement est donc effectué sur des noyaux basiques. 1 g de noyaux basiques préparés selon l'exemple 10 est mélangé intimement à l'état sec avec 0,75 g d'AMP (Fluka). Le mélange est ensuite hydraté progressivement avec de l'eau distillée sous agitation constante et avec une température maintenue à 40"C. On ajoute ainsi 10 ml d'eau distillée et on laisse agiter encore 2 h à 40"C. La suspension résultante est ensuite lyophilisée, le résidu est repris dans 3 ml d'éthanol et la suspension alcoolique est ajouté goutte à goutte à une préparation de liposomes unilamelaires (1,5 g de lécithine de jaune d'oeuf purifiée dans 50 ml d'eau). Après sonication pendant 1/2 h au bain, la préparation est ultrafiltrée de 1'AMP libre est dosée par spectrophotométrie dans l'ultrafiltrat. Les résultats obtenus indiquent une valeur de 50 mg d'AMP soit un rendement d'encapsulation de 97,3 % et un taux de charge de 70 % par rapport au poids de noyaux acylés. EXEMPLE 12 : CHARGEMENT D'UNE MOLECULE NON IONIQUE, LE STACHYOSE Le stachyose est un tétrasaccharide de structure Gal 1--) 6 Gal 1-- > 6Glc 1-- > 2 Fru. C'est un composé dépourvu de charge électrique et très polaire. La structure du stachyose ne lui permet donc pas d'être encapsulé dans un des compartiments polaires ou lipophiles des BVSM. Nous avons réalisé l'encapsulation en greffant à la molécule de stachyose une fonction ionique acide couplée à un des hydroxyles du stachyose par une fonction ester hydrolysable enzymatiquement. a) Préparation du dérivé acide du stachyose 1 g de stachyose est dissous dans 5 ml d'une solution aqueuse maintenue sous agitation à 0 C et à pH 6,5 par un pHstat... On ajoute progressivement à cette solution 135 mg de monochlorure d'acide succinique préparé selon l'exemple 3. Après la fin de l'addition, on laisse encore agiter pendant 2 h en laissant revenir à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite appliqué au sommet d'une colonne de perméation de gel G25 et élué par de l'eau distillée. Les fractions contenant l'oligosaccharide (testé par la méthode de Dubois) sont rassemblées et lyophilisées pour donner 0,85 g de stachyose modifié. Le taux de greffage ionque est mesuré par titration avec de la soude 0,1 N et correspond à une charge ionique pour 4,2 sucres donc environ une charge par molécule de stachyose. b) Chargement du stachyose modifié 1 g de noyau basiques acylés préparés selon l'exemple 10 est mélangé intimement à l'état sec avec Ig de stachyose modifié. Le mélange est ensuite hydraté très progressivement avec de l'eau distillée sous agitation constante et avec une température maintenue à 40"C. On ajoute ainsi 10 ml d'eau distillée et on laisse agiter encore 2 h à 40"C. La suspension résultante est ensuite lyophilisée, le résidu est repris dans trois ml d'éthanol et la suspension alcoolique est ajoutée goutte à goutte à une préparation de liposomes unilammellaires (1,5 g de lécithines de jaune d'oeuf purifiée dans 50 ml d'eau distillée).Après sonication pendant 1/2 h au bain, la préparation est ultrafiltrée et le stachyose libre est dosé par la méthode de Dubois. Les résultats indiquent une valeur de 75 mg de stachyose soit un rendement d'encapsulation de 92,5 % et un taux de charge de 92,5 % par rapport au poids de noyaux acylés. EXEMPLE 13 : PREPARATION DE BVSM A PARTIR D'UNE DISPERSION DE NOYAUX ACYLES DANS UNE SOLUTION DE TRIGLYCERIDES 15 mg de noyaux polysaccharidiques (50 nm), préparés selon l'exemple 7, sont dispersés dans un mélange de 30 mg de lécithines de jaune d'oeuf purifiée et de 250 mg de tributyrine. Le mélange est repris dans 10 ml de tampon Tris-maléate 0,1 pH 7,2 et la suspension est homogénéisée au Vortex et par agitation magnétique. L'ensemble est placé au bain marie à 37"C et 25 mg de lipase (Type VII, C. Cylindrae, Sigma) sont ajoutés. L'acide butyrique libéré est neutralisé par addition de NaOH 0,01 M au moyen d'un pHstat maintenant le pH à 7,2. Après 30 mn d'incubation, la suspension s'est éclaircie et la mesure des tailles (Coulter N4SD, Coultronics) indique une population de taille centrée autour de 50 nm.La sus pension est ensuite transférée dans un boudin de dialyse (Cut-off 12.000-14.000, Spectrapor), placée dans un litre de tampon tris-maléate 0,01 M, pH 7,2 et laissée une nuit à dialyser. L'analyse, par chromatographie en phase gazeuse, de la solution contenue dans le boudin de dialyse indique l'absence de tributyrine et d'acide butyrique. EXEMPLE 14 : PREPARATION DES NOYAUX ACYLES DANS LE CO2 SUPERCRITIQUE 3 g de noyaux polysaccharidiques ioniques, préparés selon l'exemple 6, sont placés dans un réacteur en saphire de 10 ml éprouvé à 150 bars. On ajoute 240 mg de chlorure d'acide oléique et on pressurise le réacteur à 100 bars avec du CO2 anhydre. La réaction est ensuite maintenue sous agitation 12 h à 400C. Le CO2 est ensuite détendu, le résidu est lavé plusieurs fois par de l'éthanol puis séché sous vide à basse température. On obtient 2,5 g de particules acylées. Le taux d'acides gras greffés, mesuré après saponification des particules est de 5,5 %. EXEMPLE 15 : PREPARATION DES MATRICES HYDROPHILES PAR RETICULATION D'OLIGOSACCHARIDES PAR L'OXY CHLORURE DE PHOSPHORE Dans un ballon de 500 ml, on introduit 50 g de dextrine 10 (Fluka) (poids moléculaire 1620) que l'on dissout dans 45 ml d'eau contenant 1 g de borohydrure de sodium. La réaction est agitée pendant deux heures à température ambiante jusqu'à la réduction totale des sucres réducteurs terminaux afin d'éviter les réactions indésirables d'énolisation-crotonisation de polysaccharides en milieu basique. Après ce temps, on ajoute à la solution 5 ml d'hydroxyde de sodium 10 N afin d'obtenir une solution de 50 ml de NaOH 2N et on place le ballon dans un bain réfrigéré à O"C sous agitation mécanique. Une fois la température stabilisée à O"C, on ajoute 1,19 g d'oxychlorure de phosphore (POCI3, 7,8 mM) goutte à goutte, sous agitation énergique. Après la fin de l'addition du POCI3, le mélange réactionnel est encore agité doucement pendant 1 heure et puis neutralisé à pH 7 par addition d'acide acétique. Le gel ainsi obtenu est ensuite dispersé grossièrement à l'aide d'un broyeur à hélice, filtré sur un buchner et lavé plusieurs fois à l'eau distillée jusqu'à élimination des sels et des sous-produits de la réaction. Le gel est finalement précipité à l'éthanol et séché sous pression réduite pour obtenir 40 g de dextrine réticulée (80 % rendement). REVENDICATIONS 1. Vecteur particulaire biodégradable, caractérisé en ce qu'il comporte - un noyau constitué d'une matrice polysaccharidique ou oligosaccharidique réticulée, sur laquelle sont greffés des ligands ioniques, - une première couche lipidique semi-perméable, liée au noyau par des liaisons covalentes, - une seconde couche de composés amphi phi les, liée à la première couche lipidique par des interactions hydrophobes. 2. Vecteur particulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ligands greffés sur la matrice sont des composés acides. 3. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les ligands acides greffés sur la matrice sont choisis parmi l'acide succinique, l'acide phosphorique, l'acide citrique, la glycine, l'alanine, l'acide glutamique, l'acide aspartique. 4. Vecteur particulaire selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'acide succinique est greffé à un taux allant jusqu'à une charge pour 1,5 résidus de glucose. 5. Vecteur particulaire selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'acide phosphorique est greffé à un taux allant jusqu'à une charge pour 1,5 résidus de glucose. 6. Vecteur particulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ligands greffés sur la matrice sont des composés basiques, fixés à la matrice par l'intermédiaire d'un composé acide. 7. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 et 6, caractérisé en ce que les ligands greffés sur la matrice sont des composés bifonctionnels comportant une fonction acylable formant une liaison amide ou ester avec un composé acide fixé sur la matrice. 8. Vecteur particulaire selon la revendication 7, caractérisé en ce que le ligand basique est choisi parmi la choline, le 2-(diméthylamino) éthanol et la 2-(diméthylamino)éthylamine. 9. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le ligand basique est greffé à un taux allant jusqu'à une charge pour 1,5 résidus de glucose. 10. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la matrice est constituée d'un polysaccharide réticulé choisi parmi le dextrane, l'amidon, la cellulose et leurs dérivés. 11. Vecteur particulaire selon l'une des revendications I à 10, caractérisé en ce que la première couche lipidique semi-perméable est constituée d'acides gras naturels fixés à un taux variable. 12. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la seconde couche lipidique est constituée de phospholipides. 13. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la seconde couche est formée d'un double feuillet de phospholipides, le feuillet interne étant interdigité par les acides gras de la première couche lipidique. 14. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'une molécule à activité biologique est incluse dans le noyau. 15. Vecteur particulaire selon la revendication 14, caractérisé en ce que la molécule à activité biologique a un poids moléculaire compris entre 100 daltons et 500 kilodaltons. 16. Vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le noyau à une taille comprise entre 10 nm et 10 pm. 17. Procédé de synthèse d'un vecteur particulaire selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que a)on prépare une matrice par réticulation d'un polymère ou d'un oligomère hydrophile biodégradable, b)on fixe sur la matrice, des ligands ioniques par des liaisons hydrolysables enzymatiquement, afin d'obtenir le noyau du vecteur, c) on soumet les noyaux à ultrabroyage pour les amener à une taille comprise entre 10 nm et 10 tjm, d)on sèche les noyaux, e)on couple chimiquement sur les fonctions réactives à la surface du noyau, des composés lipidiques pour former la première couche, f) on introduit des composés amphiphiles en contact hydrophobe avec la première couche afin de former la seconde couche. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu a l'étape b) on fixe sur la matrice de l'acide succinique en utilisant le monochlorure d'acide succinique selon la réaction suivante dans laquelle PS-OH représente la matrice réticulée porteuse d'une fonction OH. 19. Procédé selon l'une des revendications 17 et 18, caractérisé en ce que les composés lipidiques introduits à l'étape e) sont des acides gras. 20. Procédé selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce qu'après l'étape e) et avant l'étape f), on inclut dans le noyau des substances à activité biologique. 21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que l'étape d) est effectuée en présence de bicarbonate d'ammonium. 22. Procédé selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que l'étape e) est effectuée dans du CO2 à l'état supercritique. 23. Procédé selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que l'inclusion de la substance à activité biologique est effectuée par mélange de ladite substance avec les noyaux obtenus à l'issue de l'étape e), et hydratation progressive. 24. Procédé selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que la substance à activité biologique est un composé non ionique et en ce qu'on greffe, de façon réversible, une charge ionique sur ladite substance avant son inclusion dans le noyau. 25. Procédé selon l'une des revendications 17 à 24, caractérisé en ce que l'étape f) est effectuée par dispersion des noyaux acylés obtenus à l'issue de l'étape e), dans lesquels est éventuellement inclus un principe actif, dans un milieu lipidique renfermant des triglycérides et des phospholipides, puis traitement par une lipase.