Brevet FR2676732A1 — publié le 19921127

Les azotures de pyridyle perhalogénés tels que l'azido-4 tétrafluoro 2,3,5,6 pyridine (PAF) (A) où l'azido-4 dichloro-3,5 difluoro-2,6 pyridine (B) (PAC) possèdent deux propriétés essentielles. En position 2, on trouve un atome de fluor nucléofuge qui peut etre remplacé par une fonction nucléophile (azote-soufre, par exemple). Ils possèdent sur le carbone-4 une fonction azoture qui, sous irradiation ultraviolette, par exemple, conduit à un nitrène intermédiaire qui s'insère dans une liaison C-N, C-O, C-H ou C-C ou toute autre liaison se trouvant à son voisinage. Ces deux propriétés ont conduit l'un de nous à les utiliser a) comme agents de réticulation pour étudier la topologie des composants du ribosome bactérien (R. Millon et al, Biochim. Biophys. Res. Comm. 1981, 101, 784-791) b) comme agents susceptibles de réagir en position 2 avec la fonction aminée du chitosane, un homopolymère de glucosamine en vue de produire une résine photoactivable (S. Sicsic et al, Brevet Français nO 80-190-31) c) comme agents susceptibles de réagir avec la fonction aminée de la glycine conduisant ainsi à une glycine N-substituée photoactivable (C. Bouthier de la Tour et al, Eur. J. Med. Chem. 1983, 18, 315-318) d) comme agents susceptibles de réagir avec une fonction aminée greffée au préalable sur une base purique, ce qui conduit à un cofacteur (ATP ou NAD+) immobilisé (S. Sicsic et al, Eur. J. Biochem. 1989, 179, 435-440). Si l'on fait réagir l'une de ces substances A ou B avec une molécule inerte ou fonctionalisée, petite ou grosse, soluble ou non dans le milieu utilisé, ces deux molécules soumises à une irradiation appropriée, en général de 260 nm à 320 nm, conduisent à des nitrènes de très courte durée de vie qui s'insèrent immédiatement dans une liaison C-C, C-H, C-N, C-O, C-S, se trouvant à leur voisinage. Une telle réaction, présentée dans la figure I (page 1/7), conduit aux deux structures C et D dans lesquelles représente une molécule petite ou grosse sur laquelle la pyridine tétrahalogénée A ou B est maintenant greffée par l'atome d'azote se trouvant en position 4 de la pyridine halogénée. D'une manière générale, et sans que cela soit limitatif représente une macromolécule naturelle ou synthétique telle que - du polyéthylène - du polypropylène - des latex diversement fonctionnalisés - du polyéthylène glycol - des polysaccharides (cellulose ou dérivé de cellulose, dextranes), chitosane, chitine - du PVDF - des polyamides ou des polyesters - des protéines tcollagène, enzymes, anticorps) - des acides nucléiques - des lipides - ou une combinaison des systèmes précédents - des cellules procaryotes ou eucaryotes. Ces nouvelles structures acquièrent ainsi une nouvelle fonctionalité puisque, comme indiqué dans la figure II (page 1/7), elles peuvent réagir avec des molécules possédant des fonctions nucléophiles représentées par HNuX pour conduire aux systèmes E et F trihalogénés disubstitués en 2 et 4 de la pyridine dans lesquels Nu est un atome d'azote primaire ou secondaire, un résidu S- et X peut être - une chaîne hydrocarbonée - une chaine hydrocarbonée possédant des fonctions diverses monovalentes, divalentes ou trivalentes - une chaine hydrocarbonée ayant dans sa structure des hétéroatomes (O, S, N) et possédant éventuellement des fonctions monovalentes, divalentes ou trivalentes - un colorant, un résidu fluorescent - un cofacteur tel que la biotine ou l'imminobiotine, l'adénosine mono, di ou triphosphate, le NAD+ ou le NADH - un monosaccharide, un oligosaccharide, un polysaccharide - un a-aminoacide, un peptide, une protéine - un acide gras, un lipide - un nucléoside, un mononucléotide - une base purique ou pyrimidique, un oligonucléotide, un acide nucléique (ribo ou déoxyribonucléique) - une combinaison des structures précédentes. Bien entendu, les systèmes précédents ne possédant pas une fonction nucléophile devront être modifiés structuralement au préalable. A l'évidence, les systèmes C et D peuvent ainsi être exploités pour préparer une large variété de structures présentant des avantages très significatifs par rapport à la résine photoactivable décrite dans le brevet français 80-190-31. En effet - les systèmes C et D ne sont pas photoactivables et peuvent par conséquent être stockés et manipulés à la lumière sans altérer leur réactivité chimique donc leur potentialité de réaction avec des molécules possédant des fonctions nucléophiles - les macromolécules supportant les pyridines halogénées peuvent posséder des structures très diverses et par conséquent répondre à un grand nombre de besoins et satisfaire de nombreuses exigences dans les domaines de la chimie et des biotechnologies - elles possèdent une capacité très grande puisque la quantité de pyridine fixée va essentiellement dépendre des rapports de concentration molécule molécules A ou 3 présentes dans le milieu et que le nombre de résidus -NuX fixés dépendra bien sûr du nombre de pyridines tétrahalogénées accessibles. Les molécules E et F serviront, par exemple, et sans que ceci soit limitatif à - la fabrication de supports, solubles ou insolubles, basiques (NH2) ou acides (COOH, S03H, PO3H2, B(-OH)2 utilisables dans des procédés de purification par échangeurs d'ions ou par complexation, pour réaliser de la synthèse en phase solide (peptides, oligonucléotides), pour fixer des macromolécules - la fixation de fonctions aminées ou acides sur des protéines, des lipides, des acides nucléiques ou des polysaccharides, de manière à modifier leurs propriétés physicochimiques et éventuellement biologiques ainsi qu'à améliorer leurs propriétés de fixation sur des supports : fixation covalente d'une enzyme sur un support (billes ou membranes) de cellulose activée préalablement par du bromure de cyanogène, par exemple - la passivation ae supports chromatographiques hydrophiles ou hydrophobes - la fabrication de supports biotînylés utilisables, par exemple, pour purifier de l'avidine cu de la streptavidine - la fabrication de protéines biotinylées (enzymes-anticorps) utilisables en immunologie et, plus précisément, en immunodiagnostic - la fabrication d'oligonucléotides ou d'acides nucléiques biotinylés dans lesquels la biotine joue un rôle de sonde froide en dosage immunologique l'immobilisation d'oligo ou de polysaccharides et, plus précisément, de cyclodextrines (a, ss - la fabrication de supports colorés ou fluorescents utilisables dans plusieurs domaines de la biologie et de l'immunologie (latex, par exemple) l'immobilisation particulièrement efficace d'enzymes, telles que, par exemple, la papaïne, la protéinase K, les ribonucléases, les déoxyribonucléases, les enzymes de restriction, les phosphodiésterases, les ADN ligases, les enzymes de dégradation du lipide A. Ces différentes enzymes trouvent, en effet, des applications tout à fait pertinentes en biologie et en biotechnologie - l'immobilisation de protéines ne possédant pas de propriétés catalytiques : sérum albumines bovine et humaine, anticorps, récepteurs divers. A titre d'exemple, et sans que cela soit limitatif, nous décrivons ci-dessous quelques uns des produits ainsi obtenus, ainsi que leur mode de préparation. EXEMPLE I : PAF fixé sur la Serum Albumine Bovine (BISA) 1. Préparation de la solution de BSA (Serum Albumine Bovine) La BSA est solubilisée dans un tampon phosphate pH 7,5. On prépare une solution de aépart à 7,6 mg/ml. 2. PréDaration des solutions de PAF On prépare une gamme de concentrations du PAF en solution dans méthanol. Concentrations utilisées en pmoles/litre : 12,5 - 2t - 37,5 - 50 - 100 - 150 - 200 - 300 - 400 - 700 - 900. 3. Fixation du PAF sur la BSA Dans des tubes à essai de 30 ml, on verse 10 ml de la solution de BSA (76 mg) et 10 ml des différentes concentrations du PAF. Chaque mélange est agité pour obtenir une solution homogène puis les tubes sont irradiés sous UV pendant 15 minutes. Le contenu de chaque tube est ensuite dialysé contre l'eau. Puis le volume de chaque tube est ajusté à 10 ml par lyophilisation. A chacun des tubes, on ajoute 10 ml d'une solution 200 pmolaire de aminoéthyle dabsyl sulfonamide puis agite à température ambiante pendant 24 h. On lyophilise les solutions obtenues puis lave le résidu par du chlorure de méthylène (3 x 10 ml). Le résidu est alors dissous dans 30 ml de sérum physiologique puis la densité optique de chacune des préparations est mesurée à 434 nm. Cette mesure permet de déterminer la quantité de PAF fixé sur la BSA en fonction de concentrations croissantes de PAF utilisé (figure III, page 2/7). EXEMPLE II : PAF fixé sur le dextrane 60 1. Préparation de la solution de dextrane 60 Le dextrane 60, qui est un polymère de glucose, est solubilisé dans l'eau à une concentration de 14 mg/ml. 2. Préparation des solutions de PAF Pour le PAF, on a utilisé une gamme de quatre concentrations en le solubilisant dans l'méthanol : 25 pM - 37,5 uM - 50 pM - 100 uM. 3. Fixation du PAF sur le dextrane 60 Dans des tubes à essai, on mélange 10 ml de la solution de départ de dextrane 60 (140 mg) et 10 mi des 4 concentrations en PAF. Après agitation, les tubes sont irradiés sous UV pendant environ 15 minutes. L'éthanol contenu dans les tubes est ensuite éliminé au rotavapor. Puis chaque fraction est lavée plusieurs fois avec de l'acétate d'éthyle (40 ml à chaque lavage) jusqu'à disparition du PAF en excès. Chaque solution de PAF dextrane est alors traitée comme dans l'exemple I, ce qui permet de mesurer la quantité de PAF fixée en fonction de concentrations croissantes de PAF utilisé. Les résultats de ces expériences sont indiqués figure IV, page 2/7). EXEMPLE III : PAC fixé sur membrane de PVDF (Difluorure de polyvinylidène) 1. Préparation des solutions de PAC On prépare une gamme de concentrations de PAC en solution dans le méthanol : 0,1 ; 0,25 ; 0,5 ; 0,75 et 1 M. 2. Fixation de PAC sur les membranes de PVDF Chaque filtre de PVDF (5 cm2) est trempé dans la solution méthanolique de PAC et séché dans l'obscurité. Dès que le filtre est sec, il est irradié à 254 nm pendant 15 minutes. Il est ensuite lavé par du méthanol jusqu a ce que l'absorption à 254 nT. de la solution de lavage soit nulle. Les filtres sont alors séchés puis stockés à température ambiante sans prendre de précaution particulière. EXEMPLE IV : PAC fixé sur membrane de cellulose 1. Préparation des solutions de PAC On prépare une gamme de concentrations de PAC en solution dans le méthanol : 0,1 ; 0,25 ; 015 ; 0,75 et 1 M. 2. Fixation de PAC sur membrane de cellulose Chaque filtre de cellulose (5 cm2) est trempé dans la solution méthanolique de PAC puis séché dans l'obscurité. Dès que le filtre est sec, il est irradié pendant 15 minutes. Il est ensuite lavé par du méthanol jusqu'à ce que l'absorption à 254 nm de la solution de lavage soit nulle. Les filtres sont alors séchés puis stockés à température ambiante sans prendre de précaution particulière. EXEMPLE V : PAF fixé sur membrane de cellulose 1. Préparation des solutions de PAF On prépare une gamme de concentrations de PAF en solution dans le méthanol : 0,1 ; 0,25 ; 0,5 ; 0,75 et 1 M. 2. Fixation de PAF sur membrane de cellulose Chaque filtre de cellulose (5 cm2) est trempé dans la solution méthanolique de PAF puis séché dans l'obscurité. Dès que le filtre est sec, il est irradié pendant 15 minutes. I1 est ensuite lavé par du méthanol jusqu'à ce que l'absorption à 25 nm de la solution de lavage soit nulle. Les filtres sont alors séchés puis stockés à température ambiante sans prendre de précaution particulière. EXEMPLE VI . Déoxyribonucléase I E.C.3.1.2.1.1. (DNase-I) immobilisée sur membrane de PVDF-PAC 1. Marquage radioactif de la DNase-I 10 .g de DNase-I sont dissous dans 3 mi de tampon borate 0,2 M pH 9,5 auxquels on ajoute 250 uCi de formaldéhyde 14C et 10 mg de CNBHNa. Ce mélange est agité à température ambiante pendant 2 heures, puis l'enzyme marquée au 14C est dialysée extensivement contre 3 1 d'une solution de ClNa 0,8 %. Le volume de la solution enzymaticue est ensuite ajusté à 10 ml par addition de CiNa à 0,8 % 2. DNase-I immobilisée sur membrane de PVDF-PAC Les filtres activés par PAC de l'exemple III sont incubés pendant 12 h à 250C en présence d'une solution de DNase-I à 2 mg/ml à laquelle on a ajouté une petite quantité de DNase 14C comme traceur. Les filtres sont ensuite lavés avec une solution de NaCl 0,8 %. Le lavage est arrêté lorsque la radioactivité des solutions de lavage atteint une valeur quasi-nulle. La radioactivité fixée sur les filtres est alors mesurée par scintillation liquide. Les résultats de la fixation de DNase-I sur les filtres sont indiqués dans la figure V, page 3/7. 3. Activité catalytique de la membrane de PVDF-PAC-DNase-I Le pouvoir catalytique de la DNase-I est déterminé par la mesure de la densité optique d'une solution de DNA, selon J. Kunitz, J. Gen. Physiol. 1950, 33, 349, en présence de la membrane de PVDF-PAC-DNase-I à 260 nm en fonction du temps. La figure VI, page 3/7, rend compte du résultat ainsi obtenu. EXEMPLE VII : DNase-I immobilisée sur membrane de cellulose-PAC Les filtres de cellulose activés par PAC de l'exemple IV sont incubés pendant 12 h à 250C en présence d'une solution de DNase-I à 2 mg/ml à laquelle on a ajouté une petite quantité de DNase 14C comme traceur radioactif. Les filtres sont ensuite lavés avec une solution de NaCl 0,8 %. Le lavage est arrêté lorsque la radioactivité des solutions de lavage atteint une valeur quasinulle. La radioactivité fixée sur les filtres est alors mesurée par scintillation liquide. Les résultats de la fixation de la DNase-I sur les filtres sont indiqués dans la figure VII. Activité catalytique de la membrane de cellulose PAC-DNaseI Le pouvoir catalytique de la DNase-I est déterminé par la mesure de la densité optique d'une solution de DNA en présence de la membrane de cellulose PAC-DNase-I à 260 nm en fonction du temps, selon J. Kunitz, J Gen. Physiol. 1950, 33, 349. La figure VIII, page 4/7) rend compte des résultats obtenus. Le tableau 1 compare le présent résultat avec celui obtenu par condensation de la DNase I sur une membrane de cellulose activée par le bromure de cyanogène. méthode d'activation DNase4 g) AImn. PAC 34 5,66. CNBr 290 6,28.10-3 Tableau I Comparaison de l'immobilisation de la DNasé-I par le PAC ou le CNBr EXEMPLE VIII : RNase-A immobilisée sur membrane de cellulose PAC 1. Marquaae radioactif de la RNase-A 10 mg de RNase-A (pancréas de boeuf) sont dissous dans 3 ml de tampon borate 0,2 M, pH 9,5. Sont ajoutés ensuite 250 uCi de formaldéhyde 14C et 10 mg de CNBH3Na. Le mélange est agité à température ambiante pendant 2 heures. La RNase-A 14C est dialysée extensivement contre 3 litres d'une solution tIaCl 0,8 %. 2. Immobilisation de la RNase-A Les filtres activés par le PAC de l'exemple IV sont incubés pendant 12 heures à 250C en présence d'une solution de RNase-A à 2 mg/ml à laquelle on a ajouté la RNase-A 14C comme traceur radioactif. Les filtres sont ensuite lavés avec une solution de NaCl 0,8 3. Le lavage est arrêté lorsque la radioactivité des solutions de lavage atteint une valeur quasi-nulle. La radioactivité sur les filtres est alors mesurée par scintillation liquide. Les résultats de la fixation de la RITase-A sur les filtres sont indiqués dans la figure IX, page 5/7. 3. Activité catalytique ae la membrane de cellulose PAC RNase-A L'activité catalytique de la RNase-A immobilisée est déterminée par la mesure de l'absorbance d'une solution d'ARN de levure en présence de la membrane de cellulose PAC-RNase-A à 260 nm en fonction du temps (Kalnitsky et al J. Biol. Chem. 1959, 234, 1512). La membrane de cellulose PAC-R > Jase-A est trempée dans 25 ml d'ARN 0,01 % dans un tampon acétate 0,1 M pH 5,0 dans un réacteur thermostaté à 15 C. L'absorbance est mesurée à 260 nm toutes les 5 minutes. Les résultats obtenus sont montrés dans la figure X, page 5/7. EXEMPLE IX : DNase-I immobilisée sur membrane de cellulose-PAF Les filtres de cellulose activés par le PAF, de l'exemple IV, sont incubés pendant 12 h à 250C en présence d'une solution de DNase-I à 2 mg/ml à laquelle on a ajouté une petite quantité de DNase 14C comme traceur radioactif. Les filtres sont ensuite lavés avec une solution de NaC1 0,8 %. Le lavage est arrêté lorsque la radioactivité des solutions de lavage atteint une valeur quasinulle. La radioactivité fixée sur les filtres est alors mesurée par scintillation liquide. EXEMPLE X : RNase-A immobilisée sur membrane de cellulose PAF Les filtres activés par le PAF de l'exemple IV sont incubés pendant 12 heures à 250C en présence d'une solution de RNase-A à 2 mg/ml à laquelle on a ajouté la RNase-A 14C comme traceur radioactif. Les filtres sont ensuite lavés avec une solution de NaCl 0,8 %. Le lavage est arrêté lorsque la radioactivité des solutions de lavage atteint une valeur quasi-nulle. La radioactivité sur les filtres est alors mesurée par scintillation liquide. Les résultats de la fixation des exemples IX et X sont indiqués dans la figure XI, page 6/7. EXEMPLE XI : Fixation de la biotine hexaméthylène diamine sur des filtres PVDF-PAF 1. Synthèse de la biotine-héxaméthylène diamine Dans un ballon de 500 ml rodé, 5,86 mmoles (2 g) de biotine-hydroxysuccinimide sont dissous dans 150 ml de DMF. 5,86 mmoles (1,36 mg) d'hexaméthylène diamine dissous dans 50 ml de DMF sont ajoutées. Le mélange est agité à température ambiante pendant 24 heures. A la fin de la réaction, le solvant est évaporé et le résidu est lavé avec du dichlorométhane. Le résidu est ensuite déposé sur une colonne appropriée de silice équilibrée au méthanol. L'élution est faite avec un gradient croissant en ammoniaque 28 %. La biotine hexaméthylène diamine est éluée à 25 % de NH3 . Les fractions sont collectées et le solvant est évaporé. Le produit est obtenu sous forme de poudre blanche. Le rendement de la réaction est de 76 %. Caractéristiques - C.C.M. : méthanol : NH3 28 % 4:1 Rf = 0,52 ; révélateurs ninhydrine ; p.DACA (p.diméthylamino cinnamaldéhyde). - Masse (DCI/NHs) m/e : MH MH+ = 343. 2. Fixation de PAF sur des membranes PVDF Chaque filtre de PVDF (5 cm2) est trempé dans une solution méthalonique de PAF à des concentrations différentes (0,1 ; 0,2 0,3 ; 0,4 et 0,5 M) puis séché dans l'obscurité. Dès que le filtre est sec7 il est irradié pendant 15 minutes. Il est ensuite lavé par du méthanol jusqu'à ce que l'absorption à 254 nm de la solution de lavage soit nulle. Les filtres sont alors séchés et stockés à température ambiante. 3. Fixation de la biotine-hexaméthylène diamine sur des filtres PVDF-PAF Chacun des filtres PVDF-PAF est incubé pendant 12 heures à 250C en présence de 2 ml d'une solution de biotine hexaméthylène diamine 0,1 M dans un tampon DJaHCO3 0,1 M pH 9,5 Les filtres sont ensuite lavés avec le même tampon et la quantité de biotine hexaméthylène diamine est mesurée dans les solutions de lavage par la méthode décrite par McCormick et al, Anal. Biochem. 1970, 34, 226-236 Les résultats de fixation sont indiqués dans la figure XII, page 7/7. EXEMPLE XII : Fixation et relargage de la streptavidine sur membrane de PVDF PAF-Biotine (Chromatographie d'affinité Une solution de streptavidine (20 ml) est préparée dans NaHCO3 0,2 M ; pH 8,7 à une concentration de 0,5 mg/ml. La membrane est ensuite trempée dans cette solution et mise à agiter. La d.o. à 282 nm est prise toutes les 5 minutes. Après 1 heure et demie, la d.o. atteint un maximum et la membrane est trempée dans le tampon de lavage : guanidine-HC1 3 M ; pH 5,5, puis la streptavidine est éluée dans 20 ml de tampon guanidine HC1 6 M ; pH 1,5. Les résultats sont montrés sur les figures XIII et XIV, page 7/7. Cette membrane a montré avoir une capacité de 3 mg environ. REVENDICATIONS 1. Molécules de pyridines tétrahalogénées fixées par un atome d'azote se trouvant en position 4 de la pyridine tétrahalogénée sur des molécules inertes ou fonctionalisées, petites ou grosses, solubles ou non. 2. Molécules de pyridines tétrahalogénées substituées en 4 selon la revendication 1. obtenues par irradiation à une longueur d'onde appropriée, en général de 260 à 320 nm de pyridines tétra halogénées possédant en position 4 une fonction azoture qui génère ainsi un nitrène extrêmement réactif. 3. Molécules de pyridines tétrahalogénées fixées par un atome d'azote se trouvant en position 4 selon les revendications 1. et 2. dans lesquelles la molécule fixée sur la pyridine peut être - du polyéthylène - du polypropylène - des latex diversement fonctionalisés - du polyéthylène glycol - des polysaccharides (cellulose ou dérivé de cellulose, dextrane, chitosane, chitine) - du PVDF - des polyamides ou des polyesters - des protéines - des acides nucléiques - des lipides - des combinaisons des systèmes précédents - des cellules procaryotes et eucaryotes obtenues par insertion des nitrènes selon la revendication 2. dans une liaison C-C, C-H, C-N, C-O, C-S se trouvant à leur voisinage. 4. Molécules de pyridines tétrahalogénées fixées par un atome d'azote se trouvant en position 4 selon les revendications 1. à 3. obtenues par condensation photochimique de la tétrafluoro-2,3,5,6 azido-4 pyridine (PAF) et de la difluoro-2,6 dichloro-3,5 azido-4 (PAC) pyridine sur des molécules très variées. 5. Molécules de pyridines trihalogénées fixées par un atome d'azote se trouvant en position 4 de la pyridine trihalogénée sur des molécules inertes ou fonctionnalisées, petites ou grosses, solubles ou non dans lesquelles on trouve en position 2 une fonction NuX. 6. Procédé de préparation de molécules de pyridine trihalogénées fixées par un atome d'azote se trouvant en position 4 de la pyridine trihalogénée sur des molécules inertes ou fonctionnalisées, petites ou grosses, solubles ou non, et obtenues en faisant réagir des pyridines tétrahalogénées des révendications 1. à 4. avec des molécules de formule générale HNuX dans un solvant tel que l'eau, le tampon phosphate, borate ou acétate, le DMF ou le méthanol. 7. Molécules de pyridines trihalogénées obtenues selon le procédé de préparation de la revendication 6. où X peut être - une chaîne hydrocarbonée - une chaine hydrocarbonée possédant des fonctions diverses monovalentes, divalentes ou trivalentes - une chaine hydrocarbonée ayant dans sa structure des hétéroatomes (O, S, N) et possédant éventuellement des fonctions monovalentes, divalentes ou trivalentes - un colorant, un résidu fluorescent - un cofacteur tel que la biotine ou l'imminobiotine, l'adénosine mono, di ou triphosphate, le NAD+ ou le NADH - un monosaccharide, un oligosaccharide, un polysaccharide - un -aminoacide, un peptide, une protéine - un acide gras, un lipide - un nucléoside, un mononucléotide - une base purique ou pyrimidique, un oligonucléotide, un acide nucléique (ribo ou déoxyribonucléique) - une combinaison des structures précédentes 8. Molécules de pyridines trihalogénées selon les revendications 5. et 7. utilisables dans : - la fabrication de supports, solubles ou insolubles, basiques (NH2) ou acides (COOH, SO3H, PO3H2, B(-OH)2 utilisables dans des procédés de purification par échangeurs d'ions ou par complexation pour réaliser de la synthèse en phase solide (peptides, oligonucléotides), pour fixer des macromolécules - la fixation de fonctions aminées ou acides sur des protéines, des lipides, des acides nucléiques ou des polysaccharides, de manière à modifier leurs propriétés physicochimiques et éventuellement biologiques ainsi qu'à améliorer leurs propriétés de fixation sur des supports : fixation covalente d'une enzyme sur un support (billes ou membranes) de cellulose activée préalablement par au bromure de cyanogène, par exemple - la passivation de supports chromatographiques hydrophiles ou hydrophobes - la fabrication de supports biotinylés utilisables, par exemple, pour purifier de l'avidine ou de la streptavidine - la fabrication de protéines biotinylées (enzymes-anticorps) utilisables en immunologie et, plus précisément, en immunodiagnostic - la fabrication d'oligonucléotides ou d'acides nucléiques biotinylés dans lesquels la biotine joue un rôle de sonde froide en dosage immunologique l'immobilisation d'oligo ou de polysaccharides et, plus précisément, de cyclodextrines (a, ss, Y - la fabrication de supports colorés ou fluorescents utilisables dans plusieurs domaines de la biologie et de l'immunologie (latex, par exemple) l'immobilisation particulièrement efficace d'enzymes, telles que, par exemple, la papaïne, la protéinase K, les ribonucléases, les déoxyribonucléases, les enzymes de restriction, les phosphodiestérases, les ADN ligases, les enzymes de dégradation du lipide A. Ces différentes enzymes trouvent, en effet, des applications tout à fait pertinentes en biologie et en biotechnologie l'immobilisation de protéines ne possédant pas de propriétés catalytiques : sérum albumines bovine et humaine, anticorps, récepteurs divers.