Brevet FR2680374A1 — publié le 19930219

Procédé de coloration d'acides nucléiques détectés par marqua- ge non-radioactif et ensemble de réactifs pour la mise en oeuvre de ce procédé. L'invention concerne la coloration d'acides nucléiques, préa- lablement fixés sur un support solide et détectés par un procédé de marquage de type non-radioactif. On a décrit dans le Brevet français n' 88 03982 un procédé de coloration d'une séquence d'acide nucléique fixée sur un support solide, ainsi qu'un ensemble de réactifs, ou "kit", pour la mise en oeuvre du procédé. Conformément au procédé du Brevet français précité, on utilise un système enzymatique propre à se fixer directement ou indirectement sur la séquence d'acide nucléique pour la détecter par un marquage de type non-radioactif, et on fait réagir ce système enzymatique sur un substrat chromogénique pour former un produit coloré qui précipite in situ, ce qui permet de révéler la séquence détectée, et on utilise une solution de révélation comprenant un composé organique soufré, possédant une liaison avec un atome de soufre, formant substrat pour le système enzymatique, et propre à être hydrolysé par ce système enzymatique pour former un composé organique à fonction thiol. Dans le procédé du Brevet français précité, la solution de révélation comprend, outre le composé organique soufré, un composé de l'or, soluble et stable en solution aqueuse, propre à réagir avec le composé organique à fonction thiol pour former un complexe or-produit organique, de coloration jaune, qui précipite in situ et qui peut être ensuite décoloré. L'avantage essentiel du procédé ci-dessus est que la coloration du précipité obtenu peut être éliminée par traitement avec une solution de décoloration, ce qui permet de conduire plu- sieurs analyses sur un même échantillon. Il a maintenant été découvert que l'on pouvait faire réagir le composé organique soufré avec d'autres composés, différents des composés de l'or, tout en permettant d'obtenir une colora- tion susceptible d'être ensuite décolorée. L'invention concerne, selon un premier aspect, un procédé de coloration d'une séquence d'acide nucléique fixée sur un sup- port solide, du type défini précédemment, dans lequel la solu- tion de révélation comprend, outre le composé organique soufré, un composé d'un métal, autre que l'or, soluble et stable en solution aqueuse, propre à réagir avec le composé organique à fonction thiol pour former un complexe métal-composé soufré, qui présente une coloration spécifique dudit complexe, qui précipite in situ et qui peut être ensuite décoloré. Il s'agit par conséquent d'une solution de révélation à deux constituants: le composé organique soufré et le composé d'un métal autre que l'or. Le métal faisant partie de ce second constituant peut être choisi, en particulier, parmi le mercure, l'argent, le platine, et le plomb. Le composé métallique en question doit être soluble et stable en solution aqueuse et doit être propre à réagir avec le compo- sé organique à fonction thiol pour former un complexe métal- composé soufré. Le complexe ainsi obtenu et qui précipite in situ présente une coloration caractéristique du complexe métallo-soufré considéré et il peut être ensuite décoloré. Si désiré, on peut faire ensuite réagir le complexe métal- composé soufré ainsi obtenu, avec un composé renforçateur propre à accentuer la coloration dudit complexe Ce composé renforçateur est avantageusement un sel d'argent, par exemple du nitrate d'argent, propre à réagir sur le complexe métal-composé soufré pour donner une coloration brun-noir. Le complexe métal-composé soufré ainsi obtenu, dont la co- loration peut être éventuellement renforcée, est traité ensuite par une solution de décoloration, ce qui permet de réutiliser le support sur lequel a été fixé au préalable, et de façon irréversible, l'acide nucléique à analyser Cet acide nucléi- que peut être ainsi soumis à plusieurs analyses successives. Conformément à l'invention, l'acide nucléique transféré sur le support solide, qui peut être une membrane, est fixé de façon irréversible sur ce support par tout traitement appro- prié. Le support solide sur lequel est fixé l'acide nucléique est ensuite traité par un système enzymatique approprié qui peut comporter ou non une séquence d'acide nucléique "sonde" com- plémentaire de 3 A séquence d'acide nucléique "cible" fixée sur le support solide Cette enzyme doit donc être capable de se fixer directement sur l'acide nucléique "sonde" ou sur l'acide nucléique "cible", ou encore indirectement par le biais d'un anticorps conjugué, d'une protéine ou de tout autre com- posé chimique. Dans une forme de réalisation de l'invention, le système en- zymatique comprend une enzyme à activité phosphatasique, par exemple la phosphatase alcaline, et la solution de révélation comprend un substrat phosphatasique, par exemple la cystéamine- S-phosphate ou l'adénine mononucléotide phosphate, ainsi qu'un composé organique du métal ou un sel du métal considéré. Dans une autre variante, le système enzymatique comprend l'en- zyme glutathion réductase et la solution de révélation comprend un substrat de la glutathion réductase et un composé organique du métal ou un sel du métal considéré. La solution de révélation utilisée pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, comprenant le composé organique soufré et le composé de métal, est avantageusement mélangée à un tam- pon approprié à p H neutre ou légèrement basique, par exemple un tampon à base de Tris-acétate et d'acétate de magnésium La coloration caractéristique du complexe métal-composé soufré peut être accentuée par traitement avec un composé renforçateur comme indiqué précédemment. La coloration du précipité obtenu, avec ou sans addition du composé renforçateur, peut être éliminée par traitement avec une solution de décoloration Cette dernière peut être consti- tuée notamment par un mélange de thiosulfate de sodium et de thiosulfate d'ammonium à forte molarité en milieu acide. Après traitement par la solution de décoloration, le support peut être traité par un mélange d'urée et de SDS (sodium dodé- cyl sulfate) à chaud pour éliminer toute trace de protéine et d'acide nucléique, autre que la séquence d'acide nucléique restant fixée sur le support solide. Selon un autre aspect, l'invention concerne un ensemble de réactifs, ou "kit", comprenant un flacon d'un composé organique soufré, possédant une liai- son avec un atome de soufre, formant substrat pour le système enzymatique, et propre à être hydrolysé par ce système enzy- matique pour former un composé organique à fonction thiol, un flacon d'un composé d'un métal, autre que l'or, soluble et stable en solution aqueuse, propre à réagir avec le composé organique à fonction thiol pour former un complexe métal-composé soufré, de coloration spécifique du complexe considéré et précipitant in situ, un flacon d'une solution tampon propre à être mélangée au substrat et au composé de métal pour former une solution de révélation, et un flacon d'une solution de décoloration. De préférence, cet ensemble de réactifs comprend en outre: un flacon d'une solution d'un composé renforçateur de colo- ration; et un flacon d'une solution d'urée et de SDS. Le procédé et l'ensemble de réactifs de l'invention sont utili- sables pour détecter l'acide nucléique d'un échantillon, lequel acide peut être un ADN ou un ARN, naturel ou synthétique. Revendications 1 Procédé de coloration d'une séquence d'acide nucléique fixée sur un support solide, dans lequel on utilise un système enzy- matique propre à se fixer directement ou indirectement sur cette séquence pour la détecter par un marquage de type non radioactif, et on fait réagir ce système enzymatique sur un substrat chromogénique pour former un produit coloré qui précipite in situ, ce qui permet de révéler la séquence détectée, et dans lequel on utilise, conformément à la revendication 1 du Brevet principal, une solution de révélation qui comprend: un composé organique soufré, possédant une liaison avec un atome de soufre, formant substrat pour le système enzymatique, et propre à être hydrolysé par le système enzymatique pour former un composé organique à fonction thiol, caractérisé en ce que cette solution de révélation comprend en outre: un composé d'un métal autre que l'or, soluble et stable en solution aqueuse, propre à réagir avec le composé organique à fonction thiol pour former un complexe métal-composé soufré, qui présente une coloration spécifique dudit complexe, qui précipite in situ et qui peut être ensuite décoloré. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le métal est choisi parmi le mercure, l'argent, le platine et le plomb. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on fait ensuite réagir le complexe métal-composé soufré avec un composé renforçateur propre à accentuer la coloration dudit complexe. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on traite le complexe métal-composé soufré par une solution de décoloration. 5 Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le système enzymatique comprend une enzyme à acti- vité phosphatasique, par exemple la phosphatase alcaline, et en ce que la solution de révélation comprend un substrat phos- phatasique, par exemple la cystéamine-S-phosphate ou l'adénine mononucléotide phosphate, ainsi qu'un composé organique du métal ou un sel du métal considéré. 6 Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le système enzymatique comprend l'enzyme glutathion réductase et en ce que la solution de révélation comprend un substrat de la glutathion réductase et un composé organique du métal ou un sel du métal considéré. 7 Procédé selon l'une des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que l'on fait ensuite réagir le complexe métal-composé soufré avec un composé renforçateur propre à accentuer la coloration dudit complexe. 8 Ensemble de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il com- prend: un flacon d'un composé organique soufré, possédant une liai- son avec un atome de soufre, formant substrat pour le système enzymatique, et propre à être hydrolysé par ce système enzy- matique pour former un composé organique à fonction thiol, un flacon d'un composé d'un métal, autre que l'or, soluble et stable en solution aqueuse, propre à réagir avec le compo- se organique à fonction thiol pour former un complexe métal- composé soufré, de coloration spécifique du complexe considéré et précipitant in situ, un flacon d'une solution tampon propre à être mélangée au substrat,t au composé de métal pour former une solution de révélation, et un flacon d'une solution de décoloration. 9 Ensemble de réactifs selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre: un flacon d'une solution d'un composé renforçateur de colo- ration, et un flacon d'une solution d'urée et de SDS.