Brevet FR2673642A1 — publié le 19920911

La présente invention concerne de nouveaux promoteurs,de nouveaux gènes chimères les contenant et leur utilisation dans les plantes pour leur conférer une tolérance accrue à des herbicides Elle concerne également les cellules végétales transformées à l'aide de ces gènes et les plantes transformées régénérées à partir de ces cellules ainsi que les plantes issues de croisements utilisant ces plantes transformées. Le glyphosate,le sulfosate ou la fosamétine sont des herbicides systémiques à large spectre de la famille des phosphonométhylglycines Ils agissent essentiellement comme inhibiteurs compétitifs de la 5- enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EC 2.5 1 19) ou EPSPS vis à vis du PEP (phosphoenolpyruvate) Après leur application sur la plante,ils sont véhiculés dans la plante o ils s'accumulent dans les parties à croissance rapide, notamment les apex caulinaires et racinaires,provoquant l'altération jusqu'à la destruction des plantes sensibles. L'EPSPS plastidiale, cible principale de ces produits est une enzyme de la voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques,qui est codée par un ou des gènes nucléaires et synthétisée sous forme d'un précurseur cytoplasmique puis importée dans les plastes o elle s'accumule sous sa forme mature. La tolérance des plantes au glyphosate et aux produits de la famille est obtenue par introduction stable dans leur génome d'un gène d'EPSPS d'origine végétale ou bactérienne mutée ou non quant aux caractéristiques d'inhibition par le glyphosate du produit de ce gène Etant donné le mode d'action du glyphosate, il est intéressant de pouvoir exprimer le produit de la traduction de ce gène de façon à permettre son accumulation importante dans les plastes. Il est connu,par exemple d'après le brevet américain 4 535 060,de conférer à une plante une tolérance à un herbicide du type ci-dessus,en particulier la N- phosphonométhylglycine ou glyphosate,par introduction dans le génome des plantes d'un gène codant pour une EPSPS portant au moins une mutation rendant cette enzyme plus résistante à son inhibiteur compétitif(le glyphosate), après localisation de l'enzyme dans le compartiment plastidial Ces techniques demandent cependant à être améliorées pour obtenir une plus grande fiabilité dans l'emploi de ces plantes en conditions agronomiques. Dans la présente description,on entend par "plante" tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse et par "cellule végétale" toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals ou des tissus différenciés tels que des embryons ou des parties de plantes des plantes ou des semences. La présente invention a pour objet la production de plantes transformées ayant une tolérance accrue aux herbicides de la famille des phosphonométhylglycines par régénération de cellules transformées à l'aide de nouveaux gènes chimères comportant un gène de tolérance à ces herbicides L'invention concerne également ces nouveaux gènes chimères ainsi que des plantes transformées plus tolérantes en raison d'une meilleure tolérance des parties à croissance rapide ainsi que les plantes issues de croisements utilisant ces plantes transformées Elle a également pour objet de nouveaux promoteurs pour la construction des gènes chimères ci- dessus. Plus particulièrement l'invention a pour objet un gène chimère pour conférer aux plantes une tolérance accrue vis à vis d'un herbicide ayant pour cible l'EPSPS,comprenant,dans le sens de la transcription, une zone promotrice,une zone peptide de transit,une séquence codant pour une enzyme de tolérance au glyphosate et une zone signal de polyadénylation,caractérisé en ce que la zone promotrice est constituée d'au moins un fragment d'un promoteur d'un gène d'histone végétal permettant l'expression préférentielle de la protéine de tolérance herbicide dans les zones d'accumulation du glyphosate. Le gène d'histone provient d'une plante monodicotylédone telle que par exemple le blé, le maïs ou le riz ou de préférence d'une plante dicotylédone telle que par exemple la luzerne,le tournesol,le soja, le colza ou de préférence Arabidopsis thaliana On utilise de préférence un gène d'histone du type H 3 ou de préférence H 4. La zone promotrice du gène chimère selon l'invention peut comprendre en outre avantageusement au moins un fragment d'un promoteur d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes c'est à dire,par exemple une promoteur d'origine virale tel que le promoteur de l'ARN 35 S du virus de la mosaïque du choux fleur (Ca Mv 35 S) ou d'origine végétale tels que la petite sous unité du gène de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase(Ru Bis CO) d'une culture comme par exemple le maïs ou le tournesol. La zone peptide de transit comprend,dans le sens de la transcription, au moins un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale,puis un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale,de préférence le gène de la Ru Bis CO Les peptides de transit ci-dessus utilisables dans la zone de peptide de transit peuvent être en soi connus,d'origine végétale,par exemple issus de maïs, de tournesol, de pois, de tabac ou autres Le premier et le second peptide de transit peuvent être identiques, analogues ou différents Ils peuvent en outre comprendre chacun une ou plusieurs unités peptide de transit. La partie de séquence de la partie mature N terminale est issue d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, comme par exemple un gène de maïs,de tournesol,de pois ou autres,l'espèce végétale d'origine pouvant être identique,analogue ou différente de celle dont sont issus respectivement le premier et le second peptide de transit Par ailleurs la partie de séquence de la partie mature peut comprendre un nombre variable d'acides aminés,généralement de 15 à ,de préférence de 18 à 33. La construction de l'ensemble de la zone de peptide de transit peut être de manière en soi connue,notamment par fusion ou tout autre moyen convenable Cette zone caractéristique a comme rôle de permettre le relargage d'une protéine mature avec une efficacité maximale,de préférence sous forme native. La séquence codante pour la tolérance herbicide utilisable dans le gène chimère selon l'invention code pour une EPSPS mutée ayant un degré de tolérance au glyphosate Cette séquence obtenue notamment par mutation du gène EPSPS peut être d'origine bactérienne, par exemple issu de Salmonella typhymurium (et nommée dans la suite "gène Aro A"), ou végétale, par exemple de pétunia ou de tomate Cette séquence peut comprendre une ou plusieurs mutations,par exemple la mutation Pro 101 en Ser ou encore les mutations Gly 96 en Ala. La zone signal de polyadénylation,non traduite en 3 ' du gêne chimère selon l'invention peut être d'origine quelconque,par exemple bactérienne telle que celle du gène de nopaline synthase,ou végétale telle que celle de la petite sous unité de la Ru Bis CO du maïs ou du tournesol. Le gène chimère selon l'invention peut comprendre, en plus des parties essentielles ci-dessus, une zone intermédiaire non traduite(linker) entre la zone promotrice et la séquence codante et qui peut etre d'origine quelconque,bactérienne,virale ou végétale. EXEMPLE 1:CONSTRUCTION D'UN GENE CHIMERE: On effectue la construction d'un gène chimère selon l'invention à partir des éléments: l)Promoteur:on isole le promoteur à partir dun clone respectivement d'histone H 4 A 777 et d'histone H 4 A 748 d'Arabidopsis thaliana race Strasbourg décrits par Chaboute(thèse de l'Université de Strasbourg 1987) Ces promoteurs, comprenant environ lkpb entre les sites Xho I utilisés pour l'isoler,sont utilisés tels que ou sous forme dupliquée ou fusionnée avec un promoteur de Ca MV 35 S seul ou double,c'est à dire dont une partie a été dupliquée. 2)Zone de transfert:les deux peptides de transit ainsi que les éléments de protéines matures utilisés proviennent de l'AD Nc cloné de la petite sous unité de la Ru Bis CO de maïs correspondant au gène décrit par Lebrun et al( 1987) et de l'AD Nc cloné de la petite sous unité de la Ru Bis CO de tournesol isolé par Waksman et al( 1987) Plus précisément,la zone de transfert comprend,dans le sens de la traduction: -un peptide de transit de la petite sous unité de la Ru Bis CO de tournesol, -une séquence de 22 acides aminés de la partie mature N terminale de de la petite sous unité de la Ru Bis CO de maïs, -un peptide de transit de la petite sous unité de la Ru Bis CO de maïs. D'autres gènes analogues peuvent contenir respectivement des séquences de 10 à 40 et de préférence de 18 et 33 acides aminés. Afin de fournir un élément comparatif,une autre construction a été effectuée contenant,dans le sens de la transcription "promoteur double Ca MV 355/ peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence N terminale de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos"(p RPA-BL 410). 3)Gène de structure:il provient du gène muté(Pro 101 en Ser) de l'EPSPS de Salmonella typhymurium isolé par Stalker et al( 1985) Le clone p MG 34-2 (fourni par Calgene)a été linéarisé par Xba I puis traité à la nucléase de Vigna radiata Après recoupure par Sma I les deux extrémités franches ont été ligaturées Le clone obtenu possède un site Nco I sur l'ATG initiateur ainsi qu'un site Sal I à 17 pb en aval du codon stop Ce clone a été nommé p RPA-BL 104. 4) Zone signal de polyadénylation:le fragment provient du gène de la nopaline synthase de p Ti 37 (Bevan et al,1983) Ce site est contenu dans un fragment Mbo I de 260 pb(Fraley et al,1983;demande de brevet PCT 84/02913) qui a été traité par la polymérase de Klenow et cloné dans le site Sma I de M 13 mp 18 pour introduire des sites Bam HI et Eco RI respectivement aux extrémités 5 ' et 3. Après coupure par Bam HI et traitement à la nucléase de Vigna radiata puis coupure Eco RI et traitement par la polymérase de Klenow,le fragment résultant a été introduit dans le vecteur p-BL 20 (cf demande de brevet français 88/04130) coupé par Xba I et Bam HI traités à la polymérase de Klenow Après recoupure par Sal I et Sst I,on obtient un fragment d'environ 0,4 kpb contenant la séquence nos 3 ' du côté du site Sal I et la bordure droite de l'ADN-T du côté du site Sst I. L'assemblage de tous ces éléments a été effectué de la façon suivante: Fusion" peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A": Le peptide de transit de la PSU du gène de la Ru Bis CO de maïs provient d'un fragment Eco RI-Sph I de 192 pb issu de l'AD Nc correspondant au gène de la PSU du gène de la Ru Bis CO de maïs, décrit par Lebrun et al( 1987),possédant un site Nco I recouvrant le codon initiateur de la traduction et un site Sph I correspondant au site de clivage du peptide de transit. Par traitement de l'extrémité Sph I avec la polymérase du bactériophage T 4 et en la ligaturant avec l'extrémité Nco I,traitée à la polymérase de Klenow,du gène Aro A de p RPA-BL 104 recoupé Eco RI,on obtient la fusion traductionelle entre le peptide de transit de maïs et le gène de l'EPSPS bactérienne. Fusion peptide de transitde la PSU de la Ru Bis CO de maïs/séquence de 22 acides aminés de la partie mature du gène de maïs/ gène Aro A: De façon similaire un fragment Eco RI-Hind II de 228 bp de l'AD Nc de la PSU du gène de la Ru Bis CO de maïs est ligaturé avec l'extrémité Nco I traitée à la polymérase de Klenow du gène Aro A de p RPA-BL 104 et recoupé par Eco RI On obtient une fusion traductionnelle entre le peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs,les 22 acides aminés de la partie mature de la PSU de la Ru Bis CO de maïs et le gène de 1 'EPSPS bactérienne. Peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol: Le fragment est issu de l'AD Nc isolé par Waksman et Freyssinet( 1987) Un site Sph I a été créé selon la méthode de Zoller et Smith ( 1984) au site de clivage du peptide de transit Le peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol ainsi obtenu est un fragment Eco RI-Sph I de 171 pb. Fusion peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la partie mature de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/ gène Aro A: La construction contenant la fusion peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs a été coupée par Eco RI- Sph I puis mis en ligation avec le fragment Eco RI-Sph I de 171 pb correspondant au peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol Une construction résultante présente une substitution des fragments Eco RI-Sph I et est une fusion traductionnelle "peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A. Le fragment Eco RI- Sal I a été ligaturé avec le fragment Sal I-Sst I contenantla séquence nos 3 ' et la bordure droite de l'ADN-T Le fragment Eco RI-Sst I résultant comprenant"peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos 3 '/Bordure droite ADN-T" est substitué au fragment Eco RI-Sst I contenant la bordure droite de l'ADN-T du plasmide 150 A alpha 2 contenant le promoteur double Ca MV La fusion transcriptionelle "double Ca MV/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos 3 ' dans le vecteur 150 A alpha 2 a été nommé p RPA-BL 294. Fusion"peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A": La construction ci-dessus est coupée par Nco I- Hind III libérant le gène Aro A Puis elle est mise en ligation avec un fragment Nco I-Hind III de 1,Skpb contenant la fusion"peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A" Une construction résultante présente une substitution des fragments Nco I-Hind III et est une fusion traductionelle "peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A". Le fragment Eco RI-Sal I a été ligaturé avec le fragment Sal I-Sst I contenantla séquence nos 3 ' et la bordure droite de l'ADN-T Le fragment Eco RI-Sst I résultant comprenant"peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/peptide de transit de la PSU de Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos 3 '/Bordure droite ADN- T" est substitué au fragment Eco RI-Sst I contenant la bordure droite de l'ADN-T du plasmide 150 A alpha 2 contenant le promoteur double Ca MV La fusion transcriptionelle "double Ca MV/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminésde la PSU de la Ru Bis CO de maïs/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos 3 ' dans le vecteur 150 A alpha 2 a été nommé p RPA-BL 410. Toutes les constructions ont été obtenues par substitution de la zone promotrice double Ca MV de la construction p RPA-BL 410 obtenue ci dessus,coupée en Eco RI-Hind III par un fragment Hind III- Eco RI contenant les différents éléments de promoteurs suivants: A)Promoteur d'histone simple H 4 A 748: Un fragment Xho I-Xho I d'environ 1 kpb contenant le promoteur d'histone H 4 748 d'Arabidopsis thaliana a été ligaturé avec p UC 19 coupé par Sal I Ce clone a ensuite été coupé par Xba I traité à la polymérase de Klénow et Eco RI traité à la polymérase de Klénow puis ligaturé en condition favorisant la recircularisation Le fragment Hind III-Eco RI contenant le promoteur histone a été substitué au fragment Hind III-Eco RI contenant le promoteur double Ca MV de p RPA-BL 410. Le clone résultant contient"promoteur d'histone H 4/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos" et a été nommé p RPA-BL 498. B)Promoteur d'histone simple H 4 777 il Un fragment Xhol de 1 kpb environ contenant l'ensemble des régions 5 ' proximale du gène d'histone H 4 777 d'Arabidopsis thaliana a été cloné au site Sal I du plasmide p UC 19 dans une orientation telle que les sites du polylinker de p UC 19 de Xba I à Eco RI soit situés en aval du site d'initiation de la transcription. Fusion zone de transit de PSU de Ru Bis CO de tournesol/Aro A Un fragment Eco RI Hinc II de l'AD Nc de la PSU de Ru Bis CO de tournesol isolé par Waksman et Freyssinet ( 1987) codant pour le peptide de transit et 30 acides aminés de la proteine mature a été cloné aux sites Eco RI et Sma I de p UC 18. Un fragment Eco RI-Xba I a été isolé et inséré en amont du gène Aro A de p MG 34-2 (fourni par Calgene) aux sites Eco RI et Xba I Afin de mettre en phase les 2 régions codantes, l'insert Eco RI-Hind III de ce clone a été inséré dans M 13 mp 19 aux sites Eco RI et Hind III. La forme réplicative de l'ADN de ce clone a été linéarisé par Xba I puis traité par la nuclease de Vigna radiata Après ligation dans des conditions favorisant la recircularisation et transformation, l'ADN de certains clones a été analysé par sequençage Un des clones obtenu réalise une fusion traductionnelle entre l'élément de PSU de Ru Bis CO et le fragment Aro A, le codon initiateur ATG de ce dernier étant perdu La séquence de la jonction entre ces deux éléments est la suivante: GAC GGGGATCCGGAA PSU Linker Aro A. Cette fusion comporte donc dans le sens de la traduction: peptide de transit de la PSU de Ru Bis CO de tournesol/30 acides aminés de la partie mature de la PSU de Ru Bis CO de tournesol/3 acides aminés correspondant au linker intermédiaire/Aro A. Construction de p RPA BL 240 Le plasmide comprenant le promoteur du gène histone H 4 777 décrit ci-dessus a été coupé par Xba I, traité par la polymerase de Klenow et le fragment résultant de la recoupure par Hind III, isolé Le plasmide contenant la fusion peptide de transit de tournesol/Aro A décrite ci-dessus a été coupé par Eco RI, traité par la polymérase de Klenow et le fragment résultant de la recoupure par Hind III isolé Ces deux fragments ont été mis en ligation en présence de p UC 19 coupé par Hind III Un des clones résultant présente la structure suivante: promoteur histone/zone codant pour le peptide de transit de la PSU de Ru Bis CO de tournesol/zone codant pour 30 acides aminés de la partie mature de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/zone codant pour 3 acides aminés correspondant au linker intermédiaire/zone codant pour Aro A. Ce clone a été coupé par Sal I, traité par la polymérase de Klenow, puis après recoupure par Hind III le fragment isolé a été ligaturé avec le plasmide contenant la zone de polyadénylation coupé par Bam HI, traité par la polymérase de Klenow, puis recoupé par Hind III. Un des clones résultant présente la structure suivante: promoteur histone/zone codant pour le peptide de transit de la PSU de Ru Bis CO de tournesol/zone codant pour 30 acides aminés de la partie mature de Ru Bis CO de tournesol/zone codant pour 3 acides aminés correspondant au linker intermédiaire/zone codant pour Aro A/nos 3 '. Le plasmide ci-dessus a été linéarisé par Hind III et inséré au site unique Hind III du vecteur p RPA-BL 127 construit de la façon suivante: le vecteur p CGN 1152 possédant un gène de résistance à l'hygromycine sous contrôle du gène de la mannopine synthase et du terminateur du gène Tml (fourni par Calgene) a été digéré par Hind III et religaturé sur lui même, conduisant à la création d'un site unique de clonage Hind III. Un des clones résultant comporte la fusion transcriptionnelle suivante en partant de la bordure gauche de l'ADN-T du plasmide p RPA-BL 127: promoteur histone/zone de transit de PSU de Ru Bis CO de tournesol/Aroa/nos 3 ' et a été nommé p RPA-BL-240. C) Duplication du promoteur d'histone (= promoteur double histone). Le promoteur histone H 4 dans p UC 19 décrit ci- dessus a été dirigé par Nde I, traité par la polymérase de Klénow, puis recoupé par Hind III Le fragment éliminé a été substitué par un fragment Hind III - Eco RV purifié par digestion du plasmide portant le promoteur histone H 4 Un des clones obtenu a la structure suivante: zone 5 ' du promoteur H 4 de Hind III à Nde I de 530 pb, zone dupliquée correspondant à deux fragments de 330 pb de Nde I à Eco RV directement répétés, zone 3 ' du promoteur H 4 de Eco RV à Eco RI de pb. Le fragment Hind III-Eco RI contenant le promoteur double histone a été substitué au fragment Hind III- Eco RI contenant le double Ca MV de p RPA-BL 410 Le clone résultant contient"double promoteur histone/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/peptide de transit de maïs/gène Aro A/nos" et a été nommé p RPA-BL 488. D)Promoteur hybride double Ca MV/histone: Le promoteur histone H 4 A 748,dans la cassette Hind III-Eco RI décrite ci-dessus(promoteur histone simple H 4 A 748),est coupé Acc I,traité à la polymérase de Klenow puis coupé Eco RI Le fragment résultant de 580 pb est ligaturé avec le promoteur double Ca MV coupé Eco RV-Eco RI Le clone résultant comprenant la fusion double Ca MV partie 3 ' du promoteur histone est coupé Hind III-Eco RI et substitué au fragment Hind III-Eco RI de p RPA- BL 410 comprenant le double Ca MV La construction résultante comprend"promoteur double Ca MV/partie 3 ' promoteur histone/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de tournesol/séquence de 22 acides aminés de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/peptide de transit de la PSU de la Ru Bis CO de maïs/gène Aro A/nos" et a été nommé p RPA-BL 502. EXEMPLE 2:RESISTANCE DES PLANTES TRANSFORMEES 1 'Transformation: Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101 (Hood et al,1987)porteuse du cosmide p TVK 291 (Komari et al,1986) La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh et al( 1985). 2 'Régénération: La régénération du tabac PBD 6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog(MS) comprenant 30 g/l de saccharose ainsi que 200 ug/ml de kanamycine Les explants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires(Science 1985,Vol 227,p 1229-1231) en trois étapes successives:la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30 g de saccharose contenant 0 05 mg d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de g/l de saccharose mais ne contenant pas d'hormone,pendant 10 jours Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS dilué au demi à teneur moitié en sels, vitamines et sucres et ne contenant pas d'hormone Au bout d'environ 15 jours,les pousses enracinées sont passées en terre. Mesure de la tolérance au glyphosate: les meilleurs plantes issues de la régénération des tabacs transformés sont sélectionnées en serre après traitement des plantes,au stade 5 feuilles par pulvérisation avec une suspension aqueuse de glyphosate à une dose correspondant à 0,6 kg/ha de matière active Les plantes sélectionnées ont été autofécondées et les graines semées sur milieu MS additionné de 30 g/1 de sucrose et 200 microg/ml de kanamycine Les graines issues de plantes présentant un ratio de ségrégation de 3/4 de plantes résistantes-1/4 de plantes sensibles ont été conservées Une analyse par hybridation moléculaire a permis de déterminer les plantes n'ayant intégré qu'une copie de l'ADN-T Par croisement et sélection,ces plantes ont été amenées à l'état hétérozygotes ou homozygotes Ces plantes ont été semées en conditions naturelles de plein champ et pulvérisées au stade 5 feuilles avec une dose de 0,8 kg/ha de glyphosate (Round Up) Les résultats correspondants à l'observation d'indices de phytotoxicité relevés au bout de 30 jours après le traitement Dans ces conditions on constate que les plants transformés par les constructions présentent une tolérance acceptable (p RPA-BL 240 et 410) voire bonne (p RPA-BL 488 et 502) alors que les plants témoins sont complètement détruits; Ces résultats montrent clairement l'amélioration apportéé par utilisation d'un gène chimère selon l'invention pour un même gène codant pour la tolérance au glyphosate. Les plantes transformées selon l'invention peuvent être utilisées comme parents pour l'obtention de lignées et d'hybrides ayant une tolérance accrue au glyphosate. REVENDICATIONS 1)Séquence ADN pouvant servir de zone promotrice dans un gêne chimère utilisable pour la transformation des plantes, caractérisée en ce qu'elle comprend,dans le sens de la transcription,au moins un promoteur d'un gène végétal d'histone permettant l'expression de la protéine de tolérance herbicide dans les zones d'accumulation dudit herbicide. 2)Séquence ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur d'histone provient d'une plante dicotylédone. 3)Séquence ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur d'histone provient d'Arabidopsis thaliana. 4)Séquence ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur d'histone provient d'une plante monocotylédone. )Séquence ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur d'histone est un promoteur H 4. 6)Séquence ADN selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la zone promotrice comprend un promoteur d'histone double. 7)Séquence ADN selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la zone promotrice comprend un promoteur d'histone associé à un promoteur différent issu d'un gène pouvant s'exprimer naturellement dans les plantes. 8)Gène chimère pour conférer aux plantes une tolérance accrue vis à vis d'un herbicide,comprenant, dans le sens de la transcription, une zone promotrice, une zone peptide de transit,une séquence codante pour la tolérance au glyphosate et une zone signal de polyadénylation, caractérisé en ce que la zone promotrice comporte une séquence selon l'une des revendications 1 à 7. 9)Géne chimère selon la revendication 8,caractérisé en ce que l'herbicide a pour cible 1 'EPSP. )Gène chimère selon l'une des revendications 8 et 9,caractérisé en ce que la séquence codante de la tolérance au glyphosate est d'origine bactérienne. 11)Gène chimère selon l'une des revendications 8 et 9,caractérisé en ce que la séquence codante de la tolérance au glyphosate est d'origine végétale. 12)Gène chimère selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que la zone peptide de transit comprend, dans le sens de la transcription, au moins une séquence ADN codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, éventuellement une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis éventuellement une séquence ADN codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. 13)Vecteur pour la transformation des plantes, caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimère selon l'une des revendications 8 à 12. 14)Agrobacterium sp caractérisé en ce qu'elle contient un vecteur selon la revendication 13. )Cellule végétale transformée,caractérisée en ce qu'elle contient un gène chimère selon l'une des revendications 9 à 13. 16)Plante transformée de tolérance herbicide améliorée caractérisée en ce qu'elle a été obtenue à partir d'une cellule selon la revendication 15. 17)Plante selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle est une dicotylédone. 18)Plante selon la revendication 16 caractérisée en ce qu'elle est une monocotylédone. 19)Procédé de construction d'un gène chimère selon l'une des revendications 8 à 12,caractérisé en ce qu'on isole respectivement un promoteur d'histone selon l'une des revendications 1 à 5, au moins une zone de peptide de transit ainsi qu'au moins une séquence codant pour la tolérance herbicide et une zone signal de polyadénylation appropriée et que ensuite on les assemble dans le sens de la transcription du gène de tolérance.