Brevet FR2676331A1 — publié le 19921120

MILIEU DE CONSERVATION D'ORGANES, DE TISSUS OU DE CELLULES L'invention concerne un nouveau milieu de conservation d'organes vivants, de tissus biologiques ou de cellules Elle s'applique en particulier pour réaliser un milieu de conservation de cornée, apte à maintenir de façon remarquable la densité cellulaire endothéliale et à favoriser la prise ultérieure du greffon. La greffe d'organe est aujourd'hui la seule voie maîtrisée pour remplacer des organes vitaux ou non Un des problèmes est de réunir le receveur et l'organe en un même endroit tout en conservant la plus grande vitalité à l'organe pour une bonne prise du greffon Cela passe par une bonne vitalité cellulaire des tissus qui composent le greffon. Il existe de nombreux milieux de conservation ou milieux de culture possédant une base nutritive, qui ont une certaine action proliférative Toutefois, cette action proliférative des milieux connus est généralement insuffisante pour assurer le développement cellulaire souhaité De plus, ces milieux ne semblent pas présenter une action anticollagénasique (qui consiste en une inhibition de l'activité des collagénases, destructrices des collagènes) et ces milieux sont inaptes à s'opposer à la destruction au moins partielle des collagènes des tissus par les collagénases; par exemple les milieux de conservation d'organes, actuellement utilisés, assurent le plus souvent une vitalité médiocre du greffon et n'autorisent qu'une durée de conservation limitée.30 L'invention se propose d'améliorer les performances des milieux de conservation d'organes (humains ou non), de tissus ou de cellules. A cet effet, le milieu de conservation visé par l'invention comprend une base nutritive biologique liquide, notamment milieu de culture cellulaire, et se caractérise en ce qu'il comporte une proportion minoritaire de protéines enzymatiques péroxydase, en particulier lactopéroxydase, et/ou protéines enzymatiques à hème ferrique, en particulier lactoferrine Dans le cas de la lactoferrine,40 la proportion préférentielle est comprise entre 0,01 et grammes de lactoferrine par litre de milieu Dans le cas de la lactoperoxydase, cette proportion est comprise entre 0,01 et 5 grammes de milieu. La lactoferrine et la lactopéroxydase sont deux protéines existant dans diverses sécrétions des mammifères (lait, salive, larmes), dont on a décrit les effets antibactériens et effet prolifératif sur les cellules sanguines libres ("Hashizume, Identification of lactoferrin as an essential growth factor for human lymphocytic cell lines in serum free medium, Biochimica et Biophysica Acta, 763-1983 p 377-382 ") Cependant, l'effet prolifératif sur des cellules liées est un phénomène fondamentalement différent et les auteurs de la publication sus-évoquée ont écarté l'existence de cet effet sur les cellules liées et ont même été conduits à conclure à un effet inhibiteur sur la croissance des cellules. Contrairement aux conclusions de cette publication, les inventeurs ont mis en évidence un effet facteur de croissance de ces protéines Cet effet a été mis en évidence en travaillant in vitro sur des fibroblastes de cornée de lapin (lignée établie "no CCI 60 " nomenclature "ATCC"), cultivés dans du sérum de veau foetal à 3 % enrichi de la protéine testée, par comparaison à un témoin cultivé dans du sérum de veau foetal à 3 % en l'absence de ladite protéine. De plus, afin d'évaluer les performances du milieu conforme à l'invention sur la conservation d'un organe, a été apprécié l'état de cornées humaines destinées à une kératoplastie transfixiante, conservées, d'une part, dans le30 milieu enrichi précité, d'autre part, dans le milieu témoin. La conclusion montre une bien meilleure conservation des greffons dans les milieux conformes à l'invention en comparaison avec les milieux similaires non enrichis des protéines précitées. Enfin, ces expérimentations ont montré que la lactoferrine, la transferrine et, de façon plus générale, les protéines enzymatiques à hème ferrique avaient une action anticollagénasique, limitant la dégradation tissulaire par inhibition de l'activité des métalloenzymes. 40 Il peut être affirmé dans ces conditions qu'un milieu de conservation enrichi de lactoferrine et/ou lactopéroxydase augmente sensiblement et de façon reproductible la viabilité des greffons et par là, donne une meilleure chance de prise entre le greffon et l'hôte Le milieu conforme à l'invention peut en particulier être utilisé pour la conservation de cornées, celle-ci s'effectuant de préférence à 4 ' C. L'invention s'étend à l'application des protéines enzymatiques péroxydases ou des protéines enzymatiques à hème ferrique, pour engendrer ou accroître une action proliférative dans un milieu de culture ou de conservation biologique Elle s'étend également à l'application des protéines enzymatiques à hème ferrique pour engendrer ou accroître une action anticollagénasique dans un tel milieu. ETUDE DE L'EFFET DE LA LACTOFERRINE SUR UNE CULTURE CELLULAIRE TYPE CELLULES LIEES La lactoferrine (de même que la lactopéroxydase dans les essais suivants) a été associée à un milieu de culture cellulaire minimal ("MEM") additionné de 3 % de sérum de veau foetal. 1/ Détermination de la dose non cytotoxique maximale ou DNC: 50 g/l A 100 g/l, on trouve 13 % de mortalité cellulaire. 2/ Effet prolifératif en fonction de la dose en lactoferrine. INDICE DE CROISSANCE TEMOIN 0,1 g/l 5 g/l 25 g/l 50 g/l + 3 jours 100 149 142 103 49 + 6 jours 100 137 121 107 48 La lactoferrine stimule très efficacement la croissance de fibroblastes entre 0,1 g/l et 25 g/l; compte- tenu des résultats obtenus, l'on peut considérer que la proportion à prévoir est comprise entre 0,01 g/l et 30 g/l pour assurer une stimulation satisfaisante. EFFET DE LA LACTOPEROXYDASE SUR UNE CULTURE CELLULAIRE TYPE CELLULES LIEES 1/ Détermination de la dose non cytotoxique maximale ou DNC = 10 % poids/volume A 50 g/l, on trouve 7 % de mortalité cellulaire. 2/ Effet prolifératif en fonction de la dose en lactopéroxydase. INDICE DE CROISSANCE TEMOIN 0,2 g/l 1 g/l 5 g/l 10 g/l + 3 jours 100 119 114 98 75 + 6 jours 100 116 120 108 85 La lactopéroxydase stimule très efficacement la croissance des fibroblastes entre 0,2 g/l et 1 g/l; l'on peut considérer que la proportion à prévoir est comprise entre 0,01 g/l et 5 g/l pour obtenir une stimulation satisfaisante. La lactopéroxydase et la lactoferrine ont donc un effet facteur de croissance "like". EFFET DE L'ASSOCIATION DE LACTOFERRINE ET LACTOPEROXYDASE SUR LA CONSERVATION DE LA CORNEE HUMAINE25 Le milieu de conservation qui a été réalisé pour ces essais présente la composition suivante: Glucose: 4 g/l Acides aminés: 1,74 g/l Vitamines: 31 mg/l30 Electrolytes Antibiotiques: 300 mg/l Sulfate de chondroitine: 20 g/l Lactoferrine: 5 g/l Lactoperoxydase: 3 g/l35 Tampon stabilisateur de p H: 9 g/l Excipient: eau qsp p H: 7,4 Osmolarité: 320 m Osm/kg H 20 PROTOCOLE L'étude est réalisée sur 20 cornées humaines, excisées avec un anneau cornéo-scléral de 2 mm sous hotte à flux laminaire, sans effondrement de la chambre antérieure, afin d'éviter tout traumastime de l'endothélium. L'age moyen des donneurs est de 73,1 ans (minimum 57 ans, maximum 86 ans) Le délai moyen entre le décès et le prélèvement est de 8,4 heures (minimum 4 heures, maximum 12 heures) Le délai moyen entre le prélèvement et la mise en conservation à 40 C est de 8,2 heures (minimum 4 heures, maximum 12 heures). Les 20 cornées humaines sont séparées en deux groupes de 10 Pour chaque paire, une cornée est conservée pendant 7 jours, l'autre cornée est conservée pendant 14 jours dans le milieu. Avant mise en conservation, une coloration vitale au bleu trypan 0,3 % ( 1 minute) et une dilatation osmotique des espaces inter-cellulaires dans du sérum physiologique ( 4 minutes) sont réalisées La densité endothéliale et le pourcentage de cellules mortes sont calculés à l'aide d'une grille micrométrique montée sur un microscope optique La mesure de l'épaisseur cornéenne est réalisée au microscope à l'aide d'une vis micrométrique après25 mise au point sur l'épithélium, puis sur l'endothélium. Les mêmes opérations sont réalisées à la fin de la période de conservation ( 7 ème jour ou 14 ème jour). MORTALITE CELLULAIRE Après 7 jours de conservation, le taux de mortalité cellulaire moyen est de 0,9 % pour un taux de mortalité cellulaire initial de 0,6 %. Après 14 jours de conservation, le taux de mortalité cellulaire moyen est de 1,5 % pour un taux de mortalité cellulaire initial de 0,7 %. Les différences entre les deux groupes ( 7 ème et 14 ème jour) et les différences de chacun des groupes par rapport à JO (jour d'origine) ne sont pas significatives: le taux de mortalité est négligeable.40 DENSITE ENDOTHELIALE Dans le cas de la conservation à 7 jours, la densité cellulaire moyenne à JO des cornées est de 2710 cellules/mm 2 (minimum 2200, maximum 3400) Après 7 jours de conservation, elle atteint 2690 cellules/mm 2 (minimum 2200, maximum 3300) La perte cellulaire endothéliale moyenne est faible: 20 cellules/mm 2 Sur les 10 cornées observées, 8 ne présentent aucune perte cellulaire endothéliale, les 2 cornées restantes ayant subi une perte de 100 cellules/mm 2. Dans le cas de la conservation à 14 jours, la densité cellulaire moyenne à JO des cornées est de 2660 cellules/mm 2 (minimum 2000, maximum 3400) Après 14 jours de conservation, elle atteint 2490 cellules/mm 2 (minimum 2000, maximum 3000) La perte cellulaire endothéliale moyenne est modérée: 170 cellules/mm 2 Sur les 10 cornées observées, 3 ne présentent aucune perte cellulaire endothéliale, 3 ont perdu 100 cellules/mm 2, 4 ont perdu plus de 100 cellules/mm 2. Le maintien de la densité cellulaire endothéliale des cornées conservées dans le milieu de l'invention s'avère satisfaisant après 7 jours et après 14 jours de conservation; dans les milieux de conservation équivalents mais dépourvus de lactoferrine et lactopéroxydase, la densité endothéliale chute fortement dès le 7 ème jour. EPAISSEUR DU GREFFON CORNEEN L'épaisseur moyenne des cornées avant conservation est de 0,48 mm; elle est identique pour les deux groupes de cornées.30 Après 7 jours de conservation, elle atteint 0,52 mm (+ 0,04 mm) et après 14 jours de conservation 0,55 mm (+ 0,07 mm). Le taux d'épaississement du greffon cornéen après 7 jours et après 14 jours de conservation dans le milieu de l'invention reste tout à fait modéré lorsqu'on le compare aux études publiées sur d'autres solutions de conservation. (Il est inférieur à 15 % à 14 jours alors que les plus performants des milieux existants provoquent un taux d'épaississement supérieur à 30 %). 40 REVENDICATIONS 1/ Milieu de conservation d'organes, de tissus ou de cellules, comprenant une base nutritive biologique liquide, caractérisé en ce qu'il comporte une proportion minoritaire de protéines enzymatiques péroxydases et/ou protéines enzymatiques à hème ferrique. 2/ Milieu de conservation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une proportion minoritaire de protéines lactopéroxydases et/ou de protéines lactoferrines. 3/ Milieu de conservation selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en association de la lactoferrine et de la lactopéroxydase. 4/ Milieu de conservation selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend entre 0,01 et 30 grammes de lactoferrine par litre de milieu. / Milieu de conservation selon l'une des revendications 2, 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend entre 0,01 et 5 grammes de lactopéroxydase par litre de milieu. 6/ Milieu de conservation selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la base nutritive est un milieu de culture cellulaire.25 7/ Milieu de conservation selon l'une des revendications précédentes, comprenant en milieu aqueux du glucose, des acides aminés, des vitamines, des électrolytes, des antibiotiques, du sulfate de chondroitine, un tampon stabilisateur de p H, de la lactoferrine et de la30 lactopéroxydase. 8/ Milieu selon l'une des revendications 1 à 7 destiné à la conservation de cornée. 9/ Application des protéines enzymatiques péroxydases telles que lactopéroxydases ou des protéines enzymatiques à hème ferrique telles que lactoferrine, pour engendrer ou accroître une action proliférative dans un milieu de conservation d'organes, de tissus ou de cellules. 10/ Application des protéines enzymatiques à hème ferrique telles que lactoferrine pour engendrer ou accroître une action anticollagénasique dans un milieu de conservation d'organes, de tissus ou de cellules.