Brevet FR2679252A1 — publié le 19930122

La présente invention a pour objet un procédé pour déterminer le génotype HLA de classe II d'un individu et se rapporte plus particulièrement à la détection des gènes polymorphes HLA DR. Ce procédé est applicable notamment au typage HLA en transplantation, au diagnostic médical, à la médecine légale, etc. Le système HLA (antigène des lymphocytes humains) est codé par le complexe d'histocompatibilité majeur chez l'homme. Il constitue une contrainte très importante au cours des transplantations d'organes entre les individus en effectuant une distinction entre le soi et le non-soi. De plus, les -facteurs du HLA sont impliqués dans la prédisposition à un grand nombre de maladies. Les antigènes du système HLA ont donc été utilisés dans des procédés de typage pour déterminer les caractéristiques entre donneurs et receveurs lors de transplantations d'organes (F. H. BACH et J.J. VAN ROOD, N. Engl. J. Med., 295, pages 806-13 (1976)), ainsi que la prédisposition d'un individu à certaines maladies. D'un point de vue génétique, le système HLA est bien caractérisé et consiste en un ensemble de loci plus ou moins polymorphes situés dans un intervalle d'environ 2 centimorgans (cM) sur le bras court du chromosome 6. Trois loci dans ce système (HLA A, B et C) codent pour une classe d'alloantigènes exprimés de façon codominante (classe I). Une autre région (HLA-D) qui contient en fait plusieurs gènes code pour une seconde classe d'alloantigènes exprimés de façon codominante avec un degré important de polymorphisme (classe II). Plusieurs autres loci qui contrôlent notamment les composants C2, C4 et le facteur Bf de la cascade du complément appartiennent également au système HLA (classe III). Le succès des greffes d'organes dépend dans une grande mesure de l'identité HLA (classes I et II) entre receveur et donneur.En conséquence, le typage HLA doit être le plus exact possible. Ce besoin concerne principalement les transplantations de reins (P.J. Morris et A. Ting (1982) Immunol. Rev 66, 103 - G. Opelz (1989) Transpl. Proc. 21,609 - E.L. LAGAAIJ, P.H. Hennemann, M. Ruigrok et al. (1985) New Engl. J. Med 321,701) et les greffes de moelle osseuse (P.G. Beatty, R.A. Clift, E.M. Mickelson et al. (1985) New Engl. J. Med 313,765 - J.M. Hows et B.A. Bradley (1990) British J. Hematol. 76,1). Dans le cadre de la greffe de moelle osseuse, l'identité parfaite au niveau des antigènes HLA classe II représente un facteur déterminant pour le succès de la greffe, ctest-à-dire pour éviter un rejet du greffon ou le développement d'une maladie greffon-contre-hôte (P.G. Beatty, J. Hansen, G.M. Longton et al. (1991) Transplantation 51, 443 - R.C. Ash, J.T. Casper, C.R. Chitambar et al. (1990) New Engl. J. Med. 322, 485 - C. Anasetti, D. Amos, P.G. Beatty et al. (1989) New Engl. J. Med. 320,197). Le polymorphisme des produits d'expression des gènes de la région HLA D est défini habituellement par des techniques sérologiques basées sur l'analyse par des alloantisera des produits des gènes HLA exprimés à la surface des cellules (J.J. Van Rood et A. Van Leeuwen (1963) J. Clin. Invest. 42,1382 - J.J. Van Rood, A. Van Leeuwen, J.J. Koning, A.B. Van Oud Ablas (1975) Tissue Antigens 5, 73). La précision et la reproductibilité dépendent des lots de sera disponibles. Cependant, même dans les meilleures conditions, un très grand nombre des allèles existants ne sont pas détectables par ces techniques sérologiques. Les limites de l'analyse sérologique résultent essentiellement de l'absence d'alloantiséra monospécifiques, d'une discrimination incomplète avec des réactivités croisées entre des spécificités très proches, par exemple DR3 et DRw13 ou encore d'une expression altérée des molécules HLA classe II à la surface des cellules, par exemple de cellules leucémiques. Grâce à la biologie moléculaire, on sait maintenant qu'il existe un plus grand nombre de gènes HLA qu'on ne le supposait auparavant et, surtout, beaucoup plus d'allèles différents. Cette diversité est maintenant caractérisée au niveau des séquences d'ADN des différents gènes et allèles. Selon le dernier rapport du comité de nomenclature HLA (voir The WHO Nomenclature Committee for factors of the HLA system (1990) Immunogenetics 31, 131 - and - J.G. Bodmer, S.G.E. Marsh, E.D. Albert, W.F. Bodmer, B. Dupont, H.A. Erlich, B. Mach, W.R. Mayr, P. Parham, T. Sasazuki, G.M.T. Schreuder, J.L. Strominger, A. Svejgaard et P.I. Terasaki (1991) Tissue Antigens 37, 97), le polymorphisme HLA classe II se répartit comme suit : locus DRB1 : 47 allèles, locus DRB3 : 4 allèles, locus DRB4 : 1 allèle, locus DRB5 : 4 allèles, locus DQB1 : 17 allèles, locus DQA1 : 13 allèles, locus DPB1 : 21 allèles, locus DPA1 : 4 allèles. Beaucoup de ces allèles échappent à l'analyse sérologique et ne sont identifiables qu'au niveau de l'ADN. On peut illustrer les limites du typage sérologique par la spécificité sérologique DR4, maintenant subdivisée en Il sous-types (DRB1*0401-0411) (voir J.G. Bodmer, S.G.E. Marsh, E.D. Albert, W.F. Bodmer, B. Dupont, H.A. Erlich, B. Mach, W.R. Mayr, P. Parham, T. Sasazuki, G.M.T. Schreuder, J.L. Strominger, A. Svejgaard et P.I. Terasaki (1991) Tissue Antigens 37, 97), identifiables seulement au niveau de la séquence d'ADN. De même, la spécificité DRw6, qui peut être subdivisée en DRw13 et DRwl4 par quelques alloantisera, contient en réalité 10 séquences alléliques (DRB1*1301-1305 et DRB1*1401-1405 (voir la publication de Bodmer JG citée ci-dessus) qui, là aussi, ne peuvent être discriminées que par l'analyse génotypique au niveau de la séquence d'ADN. L'analyse génotypique est une nouvelle approche permettant d'analyser la diversité du système HLA classe II directement au niveau des gènes. L'analyse génotypique est basée sur le principe de l'hybridation moléculaire et la première approche qui fut proposée est la technique dite "RFLP" qui consiste à fragmenter l'ADN par utilisation d'enzymes de restriction et à analyser la taille des fragments d'ADN spécifiques générés par ces enzymes (voir C.T. Wake, E.O. Long et B. Mach (1982) Nature 300, 372 - J. Blhme, M; Andersson, G. Andersson, E. Miller, P.A. Peterson et L. Rask (1985) J. Immunol. 135, 2149 - J.L. Bidwell, E.A. Bidwell, D.A. Savage, D. Middleton, P.T. Klouda et B.A. Bradley (1988) Transplantation 45, 640). L'analyse par RFLP ne permet de reconnaltre que certaines des différences alléliques indétectables par la sérologie, et cette technique présente encore des limitations. En effet, un allèle portant une séquence différente est identifiable seulement si le nucléotide différent est dans le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction utilisée dans l'analyse et donc un grand nombre d'allèles HLA classe II ne seront pas reconnus par cette analyse. De plus, l'analyse RFLP met rarement en évidence une modification dans une séquence codante, et ne fournit pas d'informations sur la nature exacte de la modification. Enfin, cette technique est longue et lourde car elle implique d'utiliser des quantités relativement importantes d'acides nucléiques qui doivent être digérées avec plusieurs enzymes de restriction, des électrophorèses et des transferts sur filtres. Pour illustrer les limites de la technique RFLP, on peut mentionner que les sous-types des spécificités DRI, DR4, DRw8, DRwll ou DRw13, ne sont pas détectables par RFLP. Une nouvelle technique d'analyse génotypique de HLA classe II a été proposée, qui est la méthode dite "de typage par oligonucléotides". Grâce à la connaissance des séquences d'ADN des gènes de HLA classe II et en particulier des gènes DRB, qui sont de loin les plus polymorphes, on peut utiliser des oligonucléotides qui sont spécifiques d'un endroit donné de la séquence du gène comme traceurs pour l'analyse du polymorphisme par hybridation. Ces oligonucléotides sont choisis de façon à être les plus informatifs possibles et à permettre l'identification des différents allèles, sur la base de leurs différences de séquences. Dans la pratique, n'importe quelle différence de séquence, même d'un seul nucléotide, peut être détectée. La technique de typage par oligonucléotides peut être appliquée aussi bien à l'ADN, comme décrit dans la publication d'Angelini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 83, pages 4489 4493 (1986), qu'à l'ARN (voir C. Ucla, J.J. Van Rood, J. Gorski et B. Mach (1987) J. Clin. Invest. 80, 1155). Cette nouvelle approche est basée sur le principe de l'hybridation moléculaire en utilisant les propriétés caractéristiques des acides nucléiques qui sont les possibilités d'interagir avec une séquence complémentaire par l'intermédiaire de liaisons hydrogènes et de former ainsi un hybride stable, selon les lois d'appariement connues, c'est-à-dire A-T, G-C, pour l'ADN et A U, G-C pour l'ARN. Ainsi, des oligonucléotides de synthèse correspondant à des séquences d'ADN ou dtARN des allèles connus peuvent être utilisés comme sondes pour identifier, dans un échantillon, une séquence nucléique appelée cible, contenant une séquence complémentaire de celle de la sonde. Le marquage de l'hybride formé entre la cible et la sonde permet la détection et la quantification de la cible dans l'échantillon.Ce marquage est effectué par tout marqueur connu, tel que marqueur enzymatique, chimique ou radioactif. Sur la base de ces principes la première application de typage par oligonucléotide pour le HLA classe II a été présentée par Angelini et al. dans la publication précédemment citée, avec utilisation de la technique dite "SOUTHERN" selon laquelle l'ADN cible est déposé sur une membrane de nylon et la détection est effectuée à l'aide d'une sonde oligonucléoditique marquée. La technique a ensuite été appliquée à la détection d'allèles HLA classe II non identifiables par la sérologie de routine (voir J.M. Tiercy, J. Gorski, M. Jeannet et B. Mach (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 198 - J.M. Tiercy, J. Gorski, H. Bétuel, A.C. Freidel, L. Geb hrer, M. Jeannet et B. Mach (1989) Human Immunol. 24, 1). Une autre application directe au typage HLA classe II est celle décrite dans la demande de brevet PCT WO 89/11547 utilisant la technique dite "Dot-Blot". Une modification à ces techniques est représentée par la méthode dite "Reverse Dot Blot" qui consiste à fixer sur une membrane de papier, nitrocellulose ou un mélange des deux, une sonde nucléotidique et à effectuer la détection d'une hybridation avec une cible marquée. Cette technique a été appliquée au typage HLA-DQA et à la détection des mutations de la ss -thalassémie méditerranéenne (R.K. Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 86, pages 6230-6234 (1989)). Comme décrit précédemment et expliqué dans les publications et la demande de brevet citées ci-dessus, le typage cellulaire nécessite la détection de mutations ponctuelles dans le génôme et implique la mise au point de sondes suffisamment sensibles pour détecter et différencier des séquences homologues à un nucléotide près, et on a trouvé qu'il fallait utiliser des sondes de courte taille, généralement de moins de 30 nucléotides, qui confèrent au test une grande spécificité, tout en conservant une bonne sensibilité. L'utilisation d'oligonucléotides de courte taille permet de disposer d'un grand éventail de sélectivité. Dans le cas où l'on utilise un test comprenant la fixation d'une sonde sur un support solide reste posé le problème lié à l'immobilisation d'une sonde courte, inférieure à 30 nucléotides, sur un tel support solide. R.K. SAIKI et al., dans la publication précédemment citée, ont proposé une méthode qui consiste à coupler à l'extrémité 3' d'une sonde comprenant entre 15 et 20 bases, une queue poly(dT) de 400 bases et à immobiliser la sonde par l'intermédiaire de cette queue sur un filtre de nylon par exposition à des rayons ultraviolets, de façon à coupler par covalence les bases thymines aux amines primaires présentes dans le nylon. Cependant, cette méthode n'est pas entièrement satisfaisante, car elle présente des problèmes de spécificité. En effet, les bases thymines de la sonde peuvent également réagir, sous rayonnement U.V., avec le support, ce qui implique une diminution de l'efficacité d'hybridation. Par ailleurs, pour des raisons d'industrialisation, il est souhaitable de mettre au point un procédé de typage qui présente une grande spécificité et une bonne sensibilité, mais qui de plus soit simple à mettre en oeuvre, d'exécution rapide, peu onéreux, automatisable et utilisable pour le typage individuel. On a maintenant trouvé un nouveau procédé pour déterminer le génotype HLA DR d'un individu, qui pallie les inconvénients décrits ci-dessus en permettant de détecter et de différencier des séquences homologues à un nucléotide près. Le procédé de l'invention est mis en oeuvre à l'aide d'un ensemble de sondes nucléotidiques choisies de façon à permettre un typage avec un nombre minimum de sondes. Cet ensemble de sondes présente notamment l'avantage de permettre d'opérer à une température unique, notamment à 370 C. (bien qu'il soit possible d'opérer à une autre température, comme on le verra dans la partie expérimentale ci-après). Un tel ensemble de sondes fait également partie de l'invention. L'ensemble des sondes de l'invention qui sera défini ci-après, peut être utilisée sous la forme de sondes de détection (marquées avec un agent traceur usuel) dans les techniques du type Southern, ou, de préférence, sous la forme de sondes de capture (technique sandwich ou reverse dot blot) immobilisées sur un support solide, soit par fixation passive (adsorption) directement ou par l'intermédiaire d'un ligand), tel qu'un ligand hydrophobe (voir par exemple la demande de brevet européen NO 0 405 913), soit par l'établissement d'au moins une liaison covalente qui peut être faite ici encore directement ou par l'intermédiaire d'un ligand capable de se fixer par covalence sur le support (voir par exemple la demande de brevet PCT NO wo 88/01302). L'immobilisation des sondes peut être réalisée soit à l'aide de procédés connus, soit à l'aide d'autres procédés qui seront décrits ci-après. Les sondes de l'invention vont être décrites principalement sous la forme de séquences nucléotidiques. Il est évident pour l'homme du métier que, même pour le cas de sondes destinées à détecter des mutations ponctuelles, à une température donnée, il est possible d'envisager l'utilisation de sondes de longueur (nombre de nucléotides) variable, dans une certaine mesure, grâce notamment à l'emploi de solutions, tampons favorisant plus ou moins la stabilité des complexes d'hybridation. Les sondes de l'invention sont donc définies par une séquence qui pourra être généralement considérée comme maximum (en particulier si on souhaite travailler à température relativement basse, par exemple à 370 C), avec en outre l'indication d'une séquence minimum qui sera encore utilisable à ladite température et qui sera sensible à une mutation même ponctuelle. Il est évident pour les spécialistes qu'à chaque sonde nucléotidique particulière correspond une sonde complémentaire, qui est bien entendu capable de jouer le même rôle en tant que sonde de capture ou de détection. L'invention s'étend donc à de telles sondes ayant une séquence complémentaire de celles qui seront décrites ciaprès. il est également évident pour les spécialistes qu'il est généralement possible de remplacer, dans un ensemble de sondes, l'une des sondes reconnaissant une spécificité quelconque X par un système de deux sondes reconnaissant l'une des spécificités X et et l'autre des spécificités X et Z, auquel cas des réponses positives à la fois avec la sonde XY et avec la sonde XZ permettent de conclure à la présence de la spécificité x. L'invention s'détend donc à un système de sondes, tel qu'il sera défini ci-après, dans lequel une ou plusieurs sondes sont remplacées par un tel système équivalent de deux sondes ou plusieurs sondes. Bien entendu, un tel système associatif peut être appliqué à un nombre de spécificités supérieur à 2. L'invention a donc pour objet un ensemble de sondes permettant de déterminer selon les techniques de typage par oligonucléotides, les types HLA DRss et/ou les sous-types associés, ledit ensemble de sondes comprenant au moins les sondes nucléotidiques suivantes (la partie soulignée correspondant à la séquence optimum). -(G)CTGGASAGATGCA(T) - CAGCAG & TAAGTATG(A) - (G)TGGACAACTACT(G) GATACTTCTATCACC(AA) - (G) - (G)GGCCCTGGTGGA(CA) - (T)GCGGTATCTGCACA (C) TGGAAGACGAGC(G) - (T)GGAAGACAAGCG(G) - (T)GCGGAGCACTGG(A) - (A)CCAGTAGGAGAACTG(G) - (A)CCAGGAGGAGAACGT(G) - (A)CTCTACGGGTGAGT(G) - (G)ACACCTATTGCAGA(C) lesdites sondes pouvant être sous forme marquée ou couplées de façon covalente à un ligand facilitant la fixation sur un support solide ou fixées directement ou indirectement sur un support solide. L'invention concerne notamment un ensemble de sondes tel que défini ci-dessous, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre les sondes suivantes (la partie soulignée correspondant à la séquence optimum) : séquences 42 et 57 , et/ou les suivantes : 52, 37, 55. (G)AGGAGGACTTGCGC(T) - (G)GAGAGACACTTCC(A) - (G)GAG & GCGTAAG(T) - TTCCTGGAGAGACAC - (G)GGAGAGATACTTC(C) L'invention a également pour objet un procédé pour déterminer le typage HLA DRp d'un individu, selon les techniques usuelles de typage par oligonucléotides, caractérisé par le fait que l'on utilise comme sondes de capture ou de détection, soit séquentiellement, soit simultanément, au moins une partie des sondes de l'ensemble de sondes tel que défini ci--dessus Dans un procédé automatisé, on utilisera l'ensemble des sondes. Dans d'autres cas, il est évidemment possible de les utiliser l'une après l'autre, et d'arrêter le procédé lorsque les renseignements recueillis suffisent à déterminer le typage. Le procédé de l'invention comprend donc essentiellement les étapes consistant - à mettre en contact selon une technique particulière choisie, des échantillons d'acides nucléiques cibles contenant les régions polymorphes du gène HLA DR d'un individu, avec au moins une partie de l'ensemble des sondes tel que défini ci-dessus, - à faire incuber, selon les méthodes connues, dans des conditions prédéterminées telles que l'hybridation avec chaque sonde ne se produit que Si la cible contient une séquence parfaitement complémentaire de celle de ladite sonde, et - à déterminer, selon les techniques de détection usuelles, l'hybridation ou l'absence d'hybridation avec chacune des sondes utilisées. Les informations recueillies sont ensuite utilisées pour déterminer le typage en fonction d'un plan de typage préétabli, tenant compte des sondes utilisées et de la connaissance des types HLA DR et/ou sous types associés répertoriés. Ce travail est simplifié par l'utilisation d'un plan de typage, c'est à dire en pratique un tableau donnant directement les types et/ou sous types en fonction des réponses positives (hybridation(s)) observées. Pour l'ensemble des sondes de la présente invention, un tel tableau est donné ci-après dans la partie expérimentale (voir tableau 6). L'invention concerne en particulier un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel on utilise lesdites sondes comme sondes de capture, ce procédé pouvant être caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à a) immobiliser chaque sonde de capture sur un support solide, b) mettre en contact chaque sonde de capture immobilisée avec un milieu liquide contenant au moins un fragment d'acide nucléique cible, dans des conditions prédéterminées permettant l'hybridation si la séquence complémentaire de celle de la sonde est présente dans la cible et c) détecter la présence d'hybrides éventuellement formés. Bien entendu, les sondes de l'invention permettent de détecter aussi bien des fragments cibles d'ARN que d'ADN. Lorsque la sonde de capture est très courte, c'est-à-dire inférieure à 20 nucléotides et en particulier inférieure à 17 nucléotides, il devient nécessaire de mettre en oeuvre des moyens permettant d'améliorer la fixation de la sonde sur un support solide. La fixation de la sonde sur le support est effectuée alors sous la forme d'un dérivé résultant du couplage covalent de la sonde avec un ligand facilitant la fixation sur le support solide. Le ligand, qui peut comprendre une partie hydrophobe est notamment un ligand comprenant au moins un groupement fonctionnel polaire, par exemple un groupement aminé. Le groupement fonctionnel peut servir à fixer la sonde sur le suppport solide par établissement d'une liaison covalente. Lorsque le groupement fonctionnel polaire ne réagit pas avec le support, il améliore la fixation par adsorption sur le support, même si le support est hydrophobe. Le ligand est par exemple choisi parmi les protéines et les composés tels que représentés respectivement par les formules I et II ci-dessous dans laquelle Z représente un radical alkyle ou alcényle de 2 à 12 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué par un ou plusieurs groupements choisis parmi les groupements hydroxy et/ou amino, et M représente notamment un ion alcalin ou ammonium. Ce ligand est couplé préférentiellement à l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique de la sonde de capture dans laquelle n est un nombre entier pouvant varier de 1 à 4 et de préférence n = 1 ou 4. Ce ligand est couplé préférentiellement à l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique de la sonde de capture. Lorsque le ligand est une protéine, on choisit par exemple une albumine, de préférence l'albumine de sérum de bovin, qui peut être couplée à l'extrémité 5' ou 3' de la séquence nucléotidique de la sonde de capture. Le support de la présente invention peut être tout support permettant d'immobiliser une séquence nucléotidique ou un dérivé selon l'invention, soit par adsorption passive soit par covalence. Les supports peuvent être réalisés en tout matériau habituellement utilisé tel que nitrocellulose, nylon, papier, ou de préférence, en un matériau hydrophobe tel qu'un polymère de styrène ou un copolymère à base de styrène comprenant au moins 10 % en poids de motifs styrène. Le support solide selon l'invention peut être sans limitation sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un tube, d'un cône, de puits ou analogues. Selon le procédé de la présente invention, un échantillon contenant un acide nucléique est obtenu à partir d'un individu dont le génotype HLA DR doit être déterminé. Tout type de tissu contenant de l'acide nucléique HLA DR peut être utilisé dans le cadre de la présente invention. Il est ainsi possible d'utiliser des fragments d'acide nucléique (ADN ou ARN) obtenus après coupure par voie chimique, enzymatique ou analogue de l'acide nucléique présent dans l'échantillon de l'individu. Cependant l'incorporation d'une étape préalable d'amplification de l'ADN ou de l'ARN cible peut faciliter le procédé de typage par oligonucléotide de la présente invention. Le principe de l'analyse du polymorphisme HLA par hybridation d'oligonucléotides spécifiques de séquences reste le même, mais une étape d'amplification sélective permet un enrichissement en séquences de la cible, ce qui simplifie la technique (R.K. Saiki, T.L. Bugawan, G.T. Horn, K.B. Mullis et H.A. Erlich (1986) Nature 324, 163 - J.M. Tiercy, M. Jeannet et B. Mach (1990) Eur. J. Immunol. 20, 237). L'amplification peut être obtenue soit à partir d'ADN, soit à partir d'ARN. Il est évident pour un homme du métier que l'amplification des séquences de la cible HLA DR dans un échantillon peut être accomplie par toute méthode connue qui permet d'obtenir une amplification suffisante pour que la séquence de la cible puisse être détectée par hybridation d'un acide nucléique à une sonde. En général, l'acide nucléique dans l'échantillon sera de l'ADN, le plus souvent de l'ADN génomique. Cependant, la présente invention peut également être mise en oeuvre avec d'autres acides nucléiques tels que de l'ARN messager ou de l'ADN cloné, et l'acide nucléique dans l'échantillon de l'individu pourra être sous la forme d'un simple brin ou d'un double brin. Bien entendu, lorsque l'acide nucléique est sous la forme double brin, il est nécessaire de pratiquer une étape de dénaturation pour obtenir un acide nucléique simple brin. Les sondes utilisées dans la présente invention sont des oligonucléotides spécifiques d'une séquence (OSS) qui, dans des conditions appropriées, peuvent se lier spécifiquement à leurs séquences complémentaires. Si une sonde particulière peut être utilisée pour identifier uniquement un allèle, la sonde est alors appelée OSA, ctest-à-dire oligonucléotide spécifique d'un allèle. Il est possible qu'une seule sonde ne soit pas capable d'identifier à elle seule un allèle spécifique DRss en raison de la nature différente entre divers allèles DRP. Selon le procédé de l'invention, l'identité d'un allèle est déduite à partir d'un modèle de liaison d'un ensemble de sondes, chaque sonde individuelle de l'ensemble étant spécifique de différentes parties du gènes HLA DR. Grâce au choix de multiples sondes correspondant aux séquences d'ADN des allèles connus, la spécificité du procédé de typage par oligonucléotides de la présente invention permet d'identifier tous les allèles des loci DRB1, DRB3 et DRB5. Bien entendu, le procédé de la présente invention pourrait être utilisé pour identifier les allèles d'autres loci extrêmement polymorphes tels que DQB1 et DPB1. Comme les différences alléliques sont essentiellement localisées dans l'exon codant pour le premier domaine des molécules HLA (aa 5-94), les sondes sont choisies pour être complémentaires de séquences spécifiques localisées dans cette région.Au cas ou de nouveaux allèles seraient découverts, ceux-ci sont immédiatement répertoriés dans un registre de séquences HLA classe II, qui permet d'actualiser la collection de traceurs informatifs et donc d'adapter la méthodologie à la détection de tout nouvel allèle. Pour rationaliser le typage HLA classe II complet, on a proposé d'introduire tout d'abord une première étape du typage DR générique, lequel peut, avec un nombre limité de sondes reconnaître les principales spécificités HLA-DR, c'est-à-dire HLA DRl-DRw18. Cette étape est suffisante pour un grand nombre d'applications cliniques (voir B. Mach et J.M. Tiercy (1991) Human Immunol. 30, 278). Sur la base des résultats de cette première étape, il est possible de choisir les sondes spécifiques nécessaires pour réaliser, dans un deuxième temps, un micropolymorphisme DRp, pour détecter le polymorphisme DQB1 et si nécessaire pour caractériser les allèles DPB1. L'analyse des spécificités HLA-DR1-DRw18 par la technique de typage par oligonucléotides peut être appliquée dans les laboratoires d'histocompatibilité pour le typage DR de routine, en remplacement de la sérologie DR, notamment pour effectuer le typage DR de patients en liste d'attente pour une greffe rénale ou le typage de donneurs de reins potentiels, le typage DR de patients leucémiques pour lesquels une greffe de moelle osseuse est envisagée, ainsi que des membres de leur famille ou des donneurs potentiels non apparentés, le typage DR à grande échelle pour la constitution de registres de donneurs de moelle volontaires, pour déterminer des associations entre des maladies et le système HLA, par exemple dans le cas de diabètes insulinodépendants, pour des applications en médecine prédictive ou encore pour des recherches de paternité et autres identifications judiciaires. On donne ci-après quelques définitions de termes utilisés dans la présente demande "génotype" fait référence à l'ensemble des caractéristiques génotypiques d'un individu par opposition au "phénotype" qui sont les caractérisations d'un individu telles qu'elles ressortent de l'analyse des produits d'expression du gène et notamment des protéines. "allèles" sont les différentes formes alternatives d'un même gène qui présentent des différences au niveau de la séquence nucléique. Ces différences se manifestent au niveau de 1'ADN, de 1'ARN et des protéines. "polymorphisme" caractérise la diversité introduite dans une population par l'existence d'allèles différents pour un même gène. "oligonucléotide" tel qu'utilisé ici désigne les amorces, les sondes, les fragments d'acides nucléiques devant être détectés, etc... Les oligonucléotides peuvent être préparés par toute méthode appropriée connue. Par ailleurs, dans la présente demande lorsque les séquences des sondes de capture sont soulignées, ceci réprésente la séquence optimale pour un typage selon l'invention. Bien entendu, ces séquences optimales peuvent être ralongées à l'extrémité 3' et/ou 5' par au moins une base. Dans ce cas, les base pouvant être ajoutées sont indiquées entre parenthèses. Enfin, il est possible pour un homme du métier de modifier la longueur des séquences utilisées en fonction des conditions opératoires (telles que : les températures d'hybridation, de lavage, la nature du tampon d'hybridation et/ou de lavage) et du plan de typage L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faite en référence à des exemples non limitatifs illustrant des modes de réalisation préférés du procédé de l'invention. EXEMPLE 1 : Les ligands utilisés dans la présente invention et donnés ici à titre d'exemple, peuvent être des composés disponibles dans le commerce tels que dans le tableau 1 ci-après TABLEAU 1 ligand Formule Fournisseur ref o ll oct5 CF3C-NH-(CH6OP a N(isoPr)2 Applied Biosystems 400808 O (CH2)fCN MMTrNH-(CH,2O-P/ b N (isoPr)2 Clontech Lab Inc 5206-1 (CH2)2CN Fs MMTr-NH-(CH2)3t P/ c N (isoPr)2 GlenResearch 10-1903 Fmoc-NH-CH2-CH-CH20DMTr O-(CH2)2CN N(isoPr), d N(isoPr)2 Clontech Lab Inc 5203-3 CH2-NH-Fmoc e CPGiCMOCH2-CH-CH2ODMTr Clontech Lab Inc 5221-1 (CH2)4-NH-Fmoc CPGLCAAOCI-,-r;H-CH,-ODMTr Clontech Lab Inc 5222-1 f MMTr = monomethoxytrityl DMTr = dimethoxytrityl Fmoc= fluorenyl- 9-methoxycarbonyl CPG = billes de verre à porosité contrôlée LCAA = longue chaîne alkyle amine (bras espaceur) Le couplage d'un ligand phosphoramidite à un oligonucléotide est effectué selon le protocole général suivant Un oligonucléotide est synthétisé sur un appareil automatique 381 A de la société APPLIED BIOSYSTEMS en utilisant la chimie des phosphoramidites selon le protocole du constructeur.Le ligand phosphoramidite dissout dans de l'acétonitrile anhydre à une concentration de 0,2 M, est placé en position X du synthétiseur et l'addition du ligand se fait à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide selon le protocole standard de la synthèse automatique lorsque la synthèse de l'oligonucléotide est achevée. Dans le cas où le ligand est porteur d'un groupement protecteur dimethoxytrityle, tel que pour le composé d, il est nécessaire d'effectuer une étape supplémentaire de déprotection du groupement trityle par l'acide trichloroacétique en fin de synthèse. Après déprotection une nuit à 550 C dans NH40H 33 %, suivie d'une précipitation dans de l'éthanol à - 200C, l'oligonucléotide est séché sous vide et repris dans 1 ml d'H2O. Pour les composés référencés b et c, une étape supplémentaire de clivage du groupement monomethoxytrityle est effectuée selon le protocole du fabricant (CLONTECH et GLEN RESEARCH respectivement) après déprotection. Dans le cas des composés portant la référence e et f, la synthèse automatique démarre par la silice greffée par le ligand selon le protocole standard. Le couplage ligand et oligonucléotide s'effectue par l'extrémité 3' de ce dernier. Dans tous les cas, les oligonucléotides modifiés à leurs extrémités 5' ou 3' sont purifiés par chromatographie liquide haute pression (CLHP) en phase inverse sur une colonne Brownlee RP18 (10 mm - 25 cm). Conditions : débit 4,6 ml/min Gradient 10 % à 35 % de tampon B en 30 min. 35 % à 100 % de tampon B en 3 min. Les caractéristiques des tampons A et B sont les suivantes. Tampon A : 0.1 molaire Triethylammoniumacétate (TEAA) pH = 7,00 Tampon B : 50 % Tampon A + 50 % CH3CN. EXEMPLE 2 Couplage d'un oligonucléotide à l'Albumine de Sérum de boeuf (ASB). Un oligonucléotide portant le bras aminolink 2 référencé a dans le tableau 1 est synthétisé tel que décrit dans l'exemple 1 3. 10 8 mole d'oligonucléotide sont séchés sous vide et repris dans 25 pl de tampon borate de sodium 0.1 M, pH 9.3. On additionne 500 l d'une solution à 30 mg/ml de DITC (phénylène-1,4-diisothiocyanate Fluka 78480) dans le DMF. Le mélange est agité 1,5 h à température ambiante avant l'addition de 3 ml d'H2O. Après extraction de la solution par le butanol (3 x 3 ml), la phase aqueuse restante (500 fl) est séchée sous vide puis reprise par 1.10 7 mole (6,6 mg) d'ASB (Pierce 30444) dans 400 Rl de tampon borate (0,1 molaire pH 9.3). Après une nuit sous agitation à température ambiante, le conjugué est purifié par échange d'ions en CLHP sur une colonne AX300 (BROWNLEE 4.6 x 100 mm) par un gradient de NaCl (Tableau 1). Le pic du conjugué est dialysé contre de l'eau (2 x 1 litre) concentré sous vide, repris par 1 ml H2O et stocké à - 200 C. Conditions chromatographiques Gradient de : 10 % B'à 56 % B' en 25 min. 56 % B' à 100 % B' en 2 min. Les caractéristiques des tampons A' et B' sont les suivantes A' = 20 mM phosphate de sodium, pH 7,00; 20 % CH3 CN. B' = Tampon A' + 1 M NaCl ou 2M NaCl. EXEMPLE 3 On a représenté dans le tableau 2 les alignements d'acides aminés des différents allèles du gène DR Beta dans le but de définir les positions des acides aminés mutés par rapport à la séquence consensus choisie (appelée "DR CONS"). Ces mutations correspondent à des mutations non silencieuses au niveau de l'ADN c'est à dire des mutations qui induiront un changement d'acide aminé. On sait en effet que les acides aminés sont codés au niveau de l'ADN par des triplets de bases Une mutation sur la troisième position n'entrainera généralement pas de changement d'acide aminé. Par contre le changement de la seconde base induira assez souvent un changement d'acide aminé. Enfin, une mutation sur la première base entraînera toujours une modification de l'acide aminé. Dans le cas du typage des différents allèles, on utilise donc le plus souvent les mutations sur l'ADN correspondant aux mutations non silencieuses. Mais il est possible de détecter une mutation de type silencieuse, par exemple dans le but de différencier 2 allèles très proches. Dans le tableau 3, on a représenté les alignements des nucléotides du gène DRBeta pour tous les allèles connus et publiés dans la littérature à ce jour, par rapport à la même séquence consensus que dans le tableau 2. La nomenclature utilisée pour désigner les différents allèles et celle proposée lors de la cinquième conférence d'histocompatibilité (Leiden, Hollande, 1991). Les indications entre parenthèses dans le tableau 2 représente la nomenclature précédente. TABLEAU 2 10 20 30 40 50 60 70 80 90 * * * * * * * * * * * * * * * * * DR CONS PRFLEQxKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRR DRB1*0101 (Dw1) W L F L E CI S DRB1*0102 (Dw20) W L F L E CI S AV DRB1*0103 (DwBON) W L F L E CI S I DE DRB1*0501 (Dw2) W P R S F I A V DRB1*0502 (Dw12) W P R S F I A DRB1*0601 (Dw21) W P R S F D DRB1*0602 (Dw22) W P R S L D DRB1*0301 (DRw17) YST Y H N F K GR N V DRB1*0302 (DRw18) YST E H N K GR N DRB1*0401 (Dw4) V H H K DRB1*0402 (Dw10) V H H I DE V DRB1*0403 (Dw13TAS V H H E V DRB1*0404 (Dw14) V H H V DRB1*0405 (Dw15) V H H S DRB1*0406 (ET2) V H H S E V DRB1*0407 (Dw13JHA V H H E DRB1*0408 V H H DRB1*0409 V H H S K V DRB1*0410 H S V DRB1*0411 H S E V DRB1*0701 (Dw17) W G YK Q E L F V S I D GQ V DRB1*0702 (DB1) W G YK Q E L F V S I D GQ V DRB1*0801 (MADURA) YSTG Y S F D L DRB1*0802 (SPL) YSTG Y F D L DRB1*0803 (TAB) YSTG Y S F D L DRB1*0804 YSTG Y F D L V DRB1*0901 (Dw23) Y H GI N V S F R E V DRB1*1001 EV F L E RVE A Y R DRB1*1101 (SVEIG) YST F E F D DRB1*1102 (JVM) YST F E I DE V TABLEAU 2 10 20 30 40 50 60 70 80 90 * * * * * * * * * * * * * * * * * DR CONB PRFLEQXKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRR DRB1*1103 (UA-S2) -----YST----------------------------------F----------E--------F--DE---------------V------- DRB1*1104 (TURBO) -----YST----------------------------------F----------E--------F--D----------------V------- DRB1*1201 (HERLUF) -----YSTG--Y-------------H-H----LL--------F---------V--S------I--D---------------AV------- DRB1*1202 -----YSTG--Y-------------H-H----LL--------F---------V--S------F--D---------------AV------- DRB1*1301 (EHK) -YST-------------------H----N---------F-------------------I--DE---------------V------- DRB1*1302 (WT46) -----YST-------------------H----N---------F-------------------I--DE----------------------- DRB1*1303 (HAG) -----YST--------------------------------------------S---------I--DE----------------------- DRB1*1304 -----YST----------------------------------F---------S---------I--DE---------------V------- DRB1*1305 (DES.DI) -----YST-------------------H----N---------F-------------------F--D------------------- DRB1*1401 (TEM) -----YST-------------------H----F-------------------A--E---------R---E------------V------- DRB1*1402 (AMALA) -----YST---------------E---H----N--------------------------------------------------------- DRB1*1403 (JX6) -----YST---------------E---H----N--------------------------------D---L-------------------- DRB1*1404 -----YST-------------------H----F-------------------A--E---------R---E------------V------- DRB1*1405 ---YST---Q---------------H----F--------------------------------R---E------------V DRB3*0101 (52a) -----LR--------------Y-----H----FL------------------V--S----------K-GR--N----------------- DRB3*0201 (52b1) -----LL----------------E-H-H-----A------------R-------------------K-GQ--N---------V------- DRB3*0202 (52b2) -----LL----------------E-H-H-----A------------R-------------------K-GQ--N----------------- DRB3*0301 (52c) -----LL----------------E---H----F-------------------V--S----------K-GQ--N---------V------- DRB4*0101 ------A-C----L------NN-I--I------A-YN--L---Q---------------------R---E-------Y----V------- DRB5*0101 (Dw2) ----Q-D-Y--------------H-DI-----DL----------------------------F--D------------------------ DRB5*0102 (Dw12) ----Q-D-Y--------------H-GI-----N-----------------------------F--D------------------------ DRB5*0201 (Dw21) ----Q-D-Y--------------H-GI-----N-----------------------------I---A--------------AV------- DRB5*0202 (Dw22) ----Q-D-Y--------------H-GI-----N-----------------------------I---A--------------AV-------- TABLEAU 3 10 15 20 25 30 35 40 45 R F L E Q X X S E C H F F N G T E R V R F L D R Y F Y N Q E E Y V R F D S D V G E Y R A DR cons CACGTTTCTTGGAGCAGXXTAAGTCTGAGTGTCATTTCTTCAATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTCTATAACCAGGAGGAGTACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTACCGGGCG DRB3*0101 ---------------T-CG--------------------------------------------A----------------C---------------T-C---------------------------------- DRB3*0201 ---------------T-CT---------------------------------------------------G---C-----C------------------C--------------------------------- DRB3*0202 ---------------T-CT---------------------------------------------------G---C-----C------------------C--------------------------------- DRB3*0301 ---------------T-CT---------------------------------------------------G---------C---------------T------------------------------------ DRB1*0301 --------------T-CTC--C-----------------------------------------A----------------C--------------A------------------------------T------ DRB1*0302 --------------T-CTC--C------------------------------------------------G---------C--------------A------------------------------------- DRB1*1101 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A--------------------------------------T------ DRB1*1102 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A--------------------------------------T------ DRB1*1103 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A--------------------------------------T------ DRB1*1104 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A--------------------------------------T------ DRB1*1201 --------------T-CTC--C-GG-------T------------------------------A------G---C--------------------CT-C---------------------------T------ DRB1*1202 --------------T-CTC--C-GG-------T------------------------------A------G---C--------------------CT-C---------------------------T------ DRB1*1301 ----T-CTC--C----------------------------------------------------------C--------------A------------------------------T------ DRB1*1302 --------------T-CTC--C----------------------------------------------------------C--------------A------------------------------T------ DRB1*1303 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A--------------------------------------------- DRB1*1304 --------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A--------------------------------------------- DRB1*1305 --------------T-CTC--C----------------------------------------------------------C--------------A------------------------------T------ DRB1*1401 --------------T-CTC--C----------------------------------------------------------C---------------T------------------------------------ DRB1*1402 --------------T-CTC--C------------------------------------------------G---------C--------------A------------------------------------- DRB1*1403 --------------T-CTC--C------------------------------------------------G---------C--------------A------------------------------------- DRB1*1404 --------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------C---------------T------------------------------------ DRB1*1405 --------------T-CTC--C------------A---------------------------------------------C---------------T------------------------------------ DRB1*0801 --------------T-CTC--C-GG-------T------------------------------------------------------A--------------------------------------------- DRB1*0802 --------------T-CTC--C-GG-------T------------------------------------------------------A--------------------------------------------- DRB1*0803 --------------T-CTC--C-GG-------T------------------------------------------------------A------A-------------------------------------- DRB1*0804 --------------T-CTC--C-GG-------T------------------------------------------------------A--------------------------------------------- DRB1*04 -----------------GT---ACA------------------C---------------------------------------C---A--------------------------------------------- DRB1*0406 -----------------GT---ACA------------------C---------------------------------------C---A--------C------------------------------------ DRB4*0101 -----------------GC-----G-------------C-----------------A---T--AA----AT-------A--------A-----------C-----A-A----T---C--------------A- DRB1*07 --------C--TG----GG-----A-A----------------C-----------------A---------A---CT-------------------T------------------------------------ DRB1*0901 -----C--------------------AT---C-----GG-A--------A-------A------------------------------------- DRB1*1001 --------------G--GT-----T------------------C---------------------G-----A---CG-G--C-----A-----------C-----A--------------------------- DRB1*0101 -----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A--------A--------C------------------------------------ DRB1*0102 -----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A--------A--------C------------------------------------ DRB1*0103 -----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A--------A--------C------------------------------------ DRB5*0101 -----------C-----GA-----A------------------C-------------------------C-----G--A--------A-------G--T---------------------------------- DRB5*0102 -----------C-----GA-----A------------------C-------------------------------GG-A--------A-------A------------------------------------- DRB5*0201/02 -----------C-----GA-----A------------------C-------------------------C-----GG-A--------A-------A------------------------------------- DRB1*1501 --------C--TG----CC----AGG----------------------------------------------------------------------C-------------------------------T---- DRB1*1502 --------C--TG----CC----AGG----------------------------------------------------------------------C-------------------------------T---- DRB1*1601 --------C--TG----CC----AGG----------------------------------------------------------------------C------------------------------------ DRB1*1602 --------C--TG----CC----AGG----------------------------------------------------------------------C------------------------------------- TABLEAU 3 (suite) 50 55 60 65 70 75 80 85 90 V T E L G R P D A E Y W N S Q K D L L E Q X R A X V D T Y C R H N Y G V G E S F T V Q R R DR cons GTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACCTCCTGGAGCAGAXGCGGGCCGYGGTGGACACCGACTGCAGACACAACTACGGGGTTGGTGAGAGCTTCACAGTGCAGCGGCGA DRB3*0101 ----------------------TC----------------------------------------A-----G-CG--------AT----------------------------------------------- DRB3*0201 ----G-----------------------------------------------------------A-----G-CA--------AT-------------------------TG-------------------- DRB3*0202 ----G-----------------------------------------------------------A-----G-CA--------AT----------------------------------------------- DRB3*0301 ----------------------TC----------------------------------------A-----G-CA--------AT-------------------------TG-------------------- DRB1*0301 ----------------------------------------------------------------A-----G-CG--------A--------------------------TG-------------------- DRB1*0302 ----------------------------------------------------------------A-----G-CG--------A------------------------------------------------ DRB1*1101 -------------------------AG------------------------T-------AG-C-G--------C--------------------------------------------------------- DRB1*1102 -------------------------AG------------------------A-------AG-CGA--------C-----------------------------------TG-------------------- DRB1*1103 -------------------------AG------------------------T-------AG-CGA--------C-----------------------------------TG-------------------- DRB1*1104 -------------------------AG------------------------T-------AG-C-G--------C-----------------------------------TG-------------------- DRB1*1201 ----------------------TC-------C-------------------A-------AG-C-G---C----C------------T-------------------C--TG-------------------- DRB1*1202 ----------------------TC-------C-------------------T-------AG-C-G---C----C------------T-------------------C--TG-------------------- DRB1*1301 ---------------------------------------------------A-------AG-CGA--------C-----------------------------------TG-------------------- DRB1*1302 ---------------------------------------------------A-------AG-CGA--------C--------------------------------------------------------- DRB1*1303 ---------------------AGC---------------------------A-------AG-C-A--------C------------------------------------------------G-------- DRB1*1304 ---------------------AGC---------------------------A-------AG-CGA--------C-----------------------------------TG-------------------- DRB1*1305 ---------------------------------------------------T-------AG-C-G--------C--------------------------------------------------------- DRB1*1401 ----------------------C---G---C------------------------------G--G--------A------------T----------------------TG-------------------- DRB1*1402 ----------------------------------------------------------------G--------C--------------------------------------------------------- DRB1*1403 ---------------------AGC-----------------------------------AG-C-G-------CT--------------------------------------------------------- DRB1*1404 ----------------------C---G---C------------------------------G--G--------A------------T----------------------TG-------------------- DRB1*1405 --------------------------T----------------------------------G--G--------A------------T----------------------TG-------------------- DRB1*0801 ---------------------AGC---------------------------T-------AG-C-G-------CT--------------------------------------------------------- DRB1*0802 ---------------------------------------------------T-------AG-C-G-------CT------------------------------------------------G-------- DRB1*0803 ---------------------AGC---------------------------A-------AG-C-G-------CT--------------------------------------------------------- DRB1*0804 ---------------------------------------------------T-------AG-C-G-------CT-----------------------------------TG-------------------- DRB1*0401 ----------------------------------------------------------------A--------C--------------------------------------------------------- 0402 ---------------------------------------------------A-------AG-C-G--------C-----------------------------------TG-------------------- 0403 ----------------------------------------------------------------G--------A-----------------------------------TG-------------------- 0404 ----------------------------------------------------------------G--------C-----------------------------------TG-------------------- 0405 ---------------------AGC----------------------------------------G--------C--------------------------------------------------------- 0406 ----------------------------------------------------------------G--------A-----------------------------------TG-------------------- 0407 ----------------------------------------------------------------G--------A--------------------------------------------------------- 0408 ----------------------------------------------------------------G--------C--------------------------------------------------------- DRB4*0101 -----------------------C--T----------------------------------G--G--------A-------------------T---------------TG-------------------- DRB1*07 -----------A----------TC-------C-------------------A--------G-C-G-----G-CA----------GTG-------------------------------------------- DRB1*0901 ----------------------T--------C-------------------T---------G--G--------A----------GTG------------------------------------------A- DRB1*1001 -------------------------------------------------------------G--G---T----C--------------------------------------------------------- DRB1*0101 ----------------------------------------------------------------G--------C--------------------------------------------------------- DRB1*0102 ----------------------------------------------------------------G--------C--------------------------------C--TG-------------------- DRB1*0103 ---------------------------------------------------A-------AG-C-G--------C--------------------------------------------------------- DRB5*0101 -----------------------C--T------------------------T-------AG-C-G---C----C------------------------------------------------------------ DRB5*0102 -----------------------C--T------------------------T-------AG-C-G---C----C------------------------------------------------------------ DRB5*0201/02 -----------------------C--T------------------------A-----------GC--------C--------------------------------C--TG----------------------- DRB1*1501 -----------------------C--T------------------------A-----------GC--------C-----------------------------------TG------------------------q DRB1*1502 -----------------------C--T------------------------A-----------GC--------C------------------------------------------------------------ DRB1*1601 -----------------------C--T------------------------T-------AG-C-G---C----C------------------------------------------------------------ DRB1*1602 -----------------------C--T--------------------------------AG-C-G---C----C------------------------------------------------------------- EXEMPLE 4 : En utilisant les 2 protocoles décrits précédemment on a synthétisé des oligonucléotides portant soit un ligand, tel que décrit dans l'exemple 1 et qui sont résumés dans le tableau 4, soit couplé à l'ASB, tel que décrit dans l'exemple 2 et qui sont résumés dans le tableau 5 TABLEAU 4 Ref. N sequence 5'-3' ligand X *tr ** (mn) 1 563 CTGGAAAGATGCA a 17,11 2 562 TGGAAAGATGCAT a 17,63 3 561 CAGGATAAGTATGA a 17,52 4 579 GCAGGATAAGTATGA a 16,7 5 603 CAGCAGGATAAGTATG b 17,44 6 1094 CAGCAGGATAAGTATG a 16,25 7 546 TGGACAACTACTG a 18,61 7 bis 570 GGACAACTACTG a 16,09 8 596 GGACAACTACTG b 17,29 9 545 GATACTTCTATCACC a 19,2 10 398 CCTGATGAGGAGTA a 14,6 11 573 CAGGGTAAGTATAAG a 16,18 12 580 GCAGGGTAAGTATAAG a 16,99 13 1064 TGGCAGGGTAAGTAT a 17,55 14 591 GGCAGGGTAAGTATAAG b 18,18 15 1095 GGCAGGGTAAGTATAAG a 17,13 16 400 GGOOCTGGTGGA a 13,79 17 595 GGOOCTGGTGGA b 17,43 18 574 GOGGTATCTGCACA a 16,62 19 556 GGAGGAGGTTAAG a 17,94 20 555 TGGAAGAOGAGC a 16,1 21 755 TGOGGAGCACTGGA a 16,86 22 867 GGAAGACAAGOG a 13,36 23 915 CTCTAOGGGTGAG a 19,04 24 1066 CTCTAOGGGTGAGT a 17,14 25 990 CAOCTATTGCAGA a 17,47 26 1067 CACCTATTGCAGAC a 17,08 27 1068 ACACCTATTGCAGA a 17,81 28 802 OCAGGAGGAGAACGT a 15,88 29 1096 OCAGGAGGAGAACGT c 15,77 30 1097 OCAGGAGGAGAACGT d 13,74 31 1098 OCAGGAGGAGAACGT e 14,03 32 1099 OCAGGAGGAGAACGT f 14,81 33 1100 OCAGAGGAGAAOGT a 14,97 34 1107 ACCAGAGGAGAACGT a 16,05 35 935 ACCAGGAGGAGAACGTG - 19,29 36 997 GAGCTGOGTAAG a 16,55 37 1033 TTCCTGGAGAGACAC a 18,4 38 1030 TTCCTGGAGAGACAC a 18,39 39 1065 TCCTGGAGAGATACT a 18,01 40 1058 GGAGGACTTGOGC a 17,9 41 1059 GGAGGACTTGOGC a 18,35 42 1060 AGGAGGACTTGOGC a 17,05 * X représente le ligand selon la nomenclature utilisée précédemment dans le tableau 1 ** Tr représente le temps de rétention en minutes (min) de l'oligonucléotide en CLHP dans les conditions décrites dans l'exemple 1 (colonne BROWNLEE RP 18(4,6 mm-25 cm) débit 1 ml/min). TABLEAU 5 REFERENCE NUMERO SEQUENCE 5'-3' TR * (mn) RATIO ** OLIGO/ASB 43 571B TGGACAACTACT 7,85 (2M) 1 44 574B GCGGTATCTGGACA 8,69 (2M) 0,8 45 556B GGAGGAGGTTAAG 7,76 (2M) 1 46 555B TGGAAGACGAGC 16,85 (1M) 0,8 47 756B GCGGAGCACTGG 17,78 (1M) 1,5 48 867B GGAAGACAAGCG 16,65 (1M) 1,1 49 868B TGGAAGACAAGC 8,56 (2M) 1,3 50 856B GAGGAGCTCCTGCGCT 19,96 (1M) 1,2 51 966B AGGAGAACGTGC 19,66 (1M) 1,5 52 997B GAGCTGCGTAAG 18,88 (1M) 0,9 53 998B AGCTGCGTAAGT 16,32 (1M) 1 54 1026B GAGAGACACTTCC 13,98 (1M) 0,5 55 986B GGAGAGATACTTC 15,81 (1M) 0,6 56 1049B GAGAGATACTTCC 15,86 (1M) 1,2 57 1089B ACGGGGCTGTG 17,72 (1M) 1,1 58 1090B TACGGGGCTGT 17,24 (1M) 1 59 1091B CGGGGCTGTGG 17,42 (1M) 1,1 * Tr représente le temps de rétention en minutes (min) de l'oligonucléotide couplé à l'ASB en CLHP dans les conditions décrites dans l'exemple 2. (1M) signifie que le tampon B contient lM NaCl. (2M) signifie que le tampon B contient 2M NaCl. ** L'oligonucléotide est quantifié en picomoles par spectrométrie U.V. en mesurant l'absorbance à 260 nm selon le protocole APPLIED BIOSYSTEMS. L'ASB est dosé par la méthode de BRADFORD (BRADFORD M.M., Anal.Biochem., 72,248 (1976)) en picomoles.Le ratio oligo/ASB est le rapport de ces 2 valeurs. On a défini dans cet exemple des oligonucléotides de capture que l'on peut synthétiser, sans ligand, avec un ligand ou bien coupler par exemple à l'ASB. Le choix des séquences des oligonucléotides synthétisés tient compte de l'alignement des séquences d'ADN des différents allèles décrits dans le tableau 3 de l'exemple 3. Les sondes oligonucléotidiques sélectionnées, utilisées par exemple comme sondes de capture, permettent d'effectuer un plan de typage comme décrit dans le tableau 6. I1 est bien évident pour l'homme de l'art que d'autres plans de typage peuvent être définis avec d'autres oligonucléotides. TABLEAU 6 SONDE 1 6 43 9 14 17 44 45 10 24 27 46 48 26 47 12 37 55 42 57 TYPE DRB1*0101 + DRB1*0102 + + DRB1*0103 + + DRB1*0101(1501) + + DRB1*0102(1502) + DRB1*0201/0202 + + (1601/1602) DRB1*0301 + + + ou + DRB1*0302 + + + + DRB1*0401-0411 + DRB1*0402 + + DRB1*1101-1104 + + DRB1*1102-1103 + + + DRB1*1201-1202 + + + + DRB1*1301 + + + ou + DRB1*1302 + + + DRB1*1303 + + DRB1*1304 + + DRB1*1305 + + DRB1*1401 + + + DRB1*1402 + + + DRB1*1403 + + + DRB1*1404 + + + + DRB1*1405 + + DRB1*0701-0702 + DRB1*0801-0804 + + DRB1*0901 + DRB1*1001 + Dans le tableau 6, les indications entre parenthèses représentent la nomenclature utilisée avant la conférence d'histocompatibilité (1991) des sous types de l'allèle DRB5. Le signe + signifie que le sous type de la ligne considérée du tableau 6 donne une hybridation avec la sonde de la colonne correspondante. A l'aide du tableau 6, il est possible d'interpréter facilement les résultats obtenus (hybridation ou absence d'hybridation) avec diverses sondes par exemple une cible donnant une réponse positive avec les sondes 43, 14, 28 et 37 correspond aux types DRB1*0301/DRB1*07. EXEMPLE 5 préparation des sondes de détection Selon l'exemple 2 l'oligonucléotide activé et séché sous vide est repris par 1,25 10 7 mole (5 mg) de peroxydase de raifort (BOEHRINGER MANHEIM 413470) dans 200 pl de tampon borate de sodium 0,1M, pH 9,3. Le protocole de purification est identique : le conjugué est stocké à -200C dans un tampon 50 mM tris HCl , pH 7,0 ,40% glycérol. Le tableau 7 résume les différents conjugués utilisés pour la détection HLA DR. TABLEAU 7 REFERENCE # SEQUENCE 5'-3' TR * (mn) # RATIO ** OLIGO/HRP D1 CCGGGCGGTGAC(GT)GAGCTGGGGC 11.88 (2M) 1,4 D2 CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC 18,09 (2M) I 1,8 DS GAACAGCCAGAAGGAC 9,32 (2M * Tr représente le temps de rétention en minutes (min) de l'oligonucléotide couplé à la peroxydase de raifort (HRP) en CLHP dans les conditions décrites dans l'exemple 2. (2M) signifie que le tampon B contient 2M NaCl. ** L'oligonucléotide est quantifié en picomoles par spectrométrie U.V. en mesurant l'absorbance à 260 nm selon le protocole APPLIED BIOSYSTEMS. La peroxydase de raifort (HRP) est dosée par U.V. à 402 nm en picomoles selon ATOR M.A., J.Biol. Chem.,31,14954 (1987). Le ratio oligo/HRP est le rapport de ces 2 valeurs. EXEMPLE 6 : préparation du matériel génétique L'extraction d'acides nucléiques à partir de sang total est effectuée dans un appareil Applied Biosystems d'après le protocole suivant : 2 à 6 ml de sang total sont repris dans du tampon TE (10 mM Tris-HCl pH 8,00, 1 mM EDTA) (quantité suffisante pour 6 ml) et sont déposés dans une ampoule d'extraction de 30 ml. Une solution de protéinase K (840 unités dans 20 mM Tris-HCl pH 8,5) est ajoutée. L'ensemble est incubé sous agitation 1 heure à 550C. L'excès de protéines présentes est éliminé par 2 extractions simultanées (8,5 ml) par un mélange de phénol chloroforme. L'ensemble est agité pendant 20 minutes à 600C. Après élimination de la phase organique une nouvelle extraction phénolique est effectuée. L'excès de phénol est éliminé par une extraction au chloroforme (9,5 ml), 10 minutes à 370C. L'ADN contenu dans la phase aqueuse est précipité par addition de 0,5 ml d'acétate de sodium 3 M pH 5,5 et 13,5 ml dtisopropanol puis récupéré sur un filtre. L'ADN est ensuite repris dans 1 ml d'eau distillée, puis dosé en spectrophotométrie à 260 nm. EXEMPLE 7 : amplification de l'ADN L'Amplification enzymatique est effectuée par la technique de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) (MULLIS et FALOONA, Meth. in Enzymol. vol. 155, pp 335-350) d'après le protocole suivant Dans un tube de type Eppendorf sont ajoutés 0,1 à 2 g d'ADN purifié ou non dans un volume total de 100'Ll du tampon suivant - 10 ul de tampon de PCR 10 fois concentré (500 mM KCl, 100 mM Tris HCl pH 8,3 (200c), 15 mM MgCl2, 0,1% gélatine) - 2 Fl dNTP (dATP, dCTP, dGTP, TTP) 0,5cil - 2 pl de chaque amorce correspondant à 25 pmoles - 1,5 unités de Taq polymerase (Perkin Elmer Cétus) - eau distillée (quantité suffisante pour 100 Rl) - 50 Fl d'huile de paraffine Le tube est déposé dans un Thermocycler (Perkin Elmer Cétus) dans lequel seront effectués les 35 cycles de températures suivants:: - 0,5 minute de dénaturation à 950C - 0,5 minute d'hybridation à 550C - 0,5 minute d'élongation à 720C Les amorces utilisées ont la séquence suivante amorce 1 = 5'-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3' amorce 2 = 5'-TCoeCGCTGCACTGTGAAG-3' EXEMPLE 8: Dans un puits d'une plaque de microtitration en polystyrène (Nunc 439454) sont déposés 100 l d'une solution d'un oligonucléotide de capture d'une spécificité DR donnée à une concentration de 0,15 pM dans du PBS 3 x (0,45 M NaCl, 0,15 M phosphate de sodium pH 7.0). Il y a autant de puits remplis que nécessaires pour le typage. Dans tous les cas un contrôle positif doit être ajouté dans le but de vérifier l'efficacité de l'étape d'amplification ainsi que l'étape de détection. La sonde de capture qui est utilisée comme contrôle positif est présente sur tous les allèles connus à ce jour et a la séquence suivante 5'-GGGGAGTACCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCT- 3' La plaque est lavée 3 fois avec 300 Jil de PBS Tween (0,15 M NaCl, 0,05 M phosphate de sodium, pH 7,0 ; 0,5 % Tween 20 (Merck 822184)).Le produit d'amplification (100 fl) tel que décrit dans l'exemple 7 est dénaturé par 10 l de NaOH 2 N pendant 5 minutes sous agitation à température ambiante. 10 l d'acide acétique 2N puis un volume de tampon PEG (Phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,0 NaCl 0,5 M, Tween 20 0,65 %, ADN de sperme de saumon (Sigma D 9156) 0,14 mg/ml, PEG 4 000 (Merck 807490) 2 %) équivalent à n x 50 gl (n étant le nombre de sondes de capture nécessaires au typage) sont additionnées successivement à cette solution. 50 111 de cette solution sont répartis par puits suivis de 50 Ijl de la sonde de détection (conjugué oligonucléotide péroxydase) à une concentration de 15 nM dans le tampon PEG. La plaque est incubée 1 h à 370 C et lavée par 3 x 300 l de PBS Tween. 100 pl de substrat OPD (orthophenylenediamine Cambridge Medical Biotechnology ref/456) dans un tampon OPD (0,05 M acide citrique, 0,1 M Na2HPO4, pH 4,93) à la concentration de 4 mg/ml auquel on ajoute extemporanément H202 à 30 volumes au 1/1000, sont ajoutés par puits. Après 20 min de réaction, l'activité enzymatique est bloquée par 100 gl d'H2SO4 1N et la lecture est effectué sur Axia Microreader (bioMérieux) à 492 nm. EXEMPLE 9 6 ADN, préparés selon la méthode décrite dans l'exemple 6, sont amplifiés selon la méthode décrite dans l'exemple 7. Le protocole de typage comporte les sondes de capture suivantes: 5 a-GATACTTCTATCACC 3 = oligonucléotide de spécificité DR 3 portant le ligand a en 5' (référencé 545 5 GATACTTCTATCACC 3' = oligonucléotide de séquence identique mais sans ligand (référencé 545 nu) 5 a-TGGACAACTACTG 3'~ oligonucléotide de spécificité DR 4 portant le ligand a en 5' (référencé 546 5' TGGACAACTACTG 3' = oligonucléotide de séquence identique mais sans ligand (référencé 546 nu) Le protocole de typage est conforme au protocole général décrit dans l'exemple 8. Les sondes D1 et D2 (tableau 7) sont utilisées en mélange 50%50% comme sondes de détection. Les résultats sont présentés dans le tableau 8 ci-après TABLEAU 8 ADN TYPAGE # DR3 DR3 DR4 DR4 545 NU 545 546 NU 546 1 DR11/DR11 0,019 0,025 0,021 0,025 2 DR4/DR4 0,018 0,021 0,021 0,138 3 DR8/DR7 0,017 0,022 0,019 0,019 4 DR3/DR11 0,026 0,423 0,021 0,027 5 DR3/DR4 0,023 0,176 0,026 0,296 6 DR3/DR3 0,023 0,387 0;023 0;;018 Les 2 sondes de capture sans ligand ne différencient pas les spécificités des ADN alors que les mêmes séquences avec le ligand a permettent d'identifier les spécificités DR2 et DR4 des ADN. EXEMPLE 10: 24 ADN, préparés selon la méthode décrite dans l'exemple 6, sont amplifiés selon la méthode décrite dans l'exemple 7. Le protocole de typage est conforme au protocole général décrit dans l'exemple 8. Les sondes D1 et D2 (tableau 7) sont utilisées en mélange 50%50% comme sondes de détection. Le protocole de typage comporte les sondes de capture récapitulées dans le tableau 9 ci-après: TABLEAU9 reference numéro sequence 5'-3' 1 563 CTGGAAAGATGCA 5 603 CAGCAGGATAAGTATG 43 571B TGGACAACTACT 9 545 GATACTTCTATCACC 10 398 CCTGATGAGGAGTA 14 591 GGCAGGGTAAGTATAAG 17 595 GGCCCTGGTGGA 44 574B GCGGTATCTGCACA 45 556B GGAGGAGGTTAAG 46 555B TGGAAGACGAGC 48 867B GGAAGACAAGCG 47 756B GCGGAGCACTGG 28 802 CCAGGAGGAGAACGT 24 1066 CTCTACGGGTGAGT 27 1068 ACACCTATTGCAGA 52 997B GAGCTGCGTAAG 37 1033 TTCCTGGAGAGACAC 55 986B GGAGAGATACUO 42 1060 AGGAGGACTTGCGC Les résultats du typage sont donnés dans la tableau 10: TABLEAU 10 SONDE 1 5 43 9 10 14 17 44 45 46 48 47 OLIGON N 563 603 571-ASB 545 398 591 595 574-ASB 556-ASB 555-ASB 367-ASB 756-ASB ADN N 58 0,017 0,025 0,718 0,013 0,029 1,006 0,072 0,033 0,022 0,018 0,015 0,016 59 0,509 0,024 0,036 0,016 0,029 0,929 0,072 0,031 0,025 0,018 0,037 0,018 60 0,014 0,021 0,030 0,011 0,024 0,050 0,030 0,033 0,023 > 2,500 0,016 0,024 66 0,012 0,027 0,066 0,015 0,023 0,992 0,098 0,031 0,024 0,022 0,060 0,016 67 0,468 0,089 0,035 0,042 > 2,500 0,054 0,030 0,032 0,028 > 2,500 0,042 0,015 68 0,017 0,049 0,037 0,025 0,017 0,826 0,068 0,031 0,024 > 2,500 0,120 0,016 70 0,504 0,018 0,027 0,020 0,076 0,016 0,017 0,033 0,031 0,017 0,070 1,674 71 0,011 0,017 0,031 0,025 > 2,500 0,019 0,030 0,032 0,030 > 2,500 0,020 0,021 72 0,459 1,373 0,046 0,025 0,031 0,085 0,015 0,044 0,037 0,017 0,017 0,019 73 0,353 0,890 0,034 0,018 0,016 0,048 0,021 0,044 0,034 0,019 0,015 0,017 75 0,019 0,052 0,625 1,113 0,044 0,043 0,023 0,033 0,038 0,019 0,018 0,017 78 0,015 0,037 0,625 0,015 0,032 0,589 0,046 0,034 0,031 0,015 0,048 0,019 79 0,014 0,012 0,425 0,013 0,030 0,010 0,015 0,033 0,028 > 2,500 0,039 0,017 80 0,018 0,752 0,041 0,025 0,016 0,448 0,040 0,045 0,030 0,021 0,036 0,016 83 0,014 0,959 0,030 0,022 0,017 0,042 0,536 0,050 0,028 0,073 0,023 0,021 84 0,007 0,013 0,023 0,399 0,015 0,013 0,014 0,031 0,028 1,210 0,042 0,016 85 0,015 0,013 0,468 0,014 0,010 0,018 0,016 0,076 0,034 > 2,500 0,012 0,019 86 0,019 0,747 0,035 0,939 0,023 0,056 0,018 0,041 0,029 0,021 0,070 0,021 87 0,016 1,190 0,035 0,016 0,013 0,046 0,014 0,043 0,029 > 2,500 0,025 0,019 89 0,012 0,032 0,026 0,956 0,015 0,021 0,018 0,032 0,028 0,017 0,014 0,019 90 0,355 0,035 0,031 1,028 0,042 0,038 0,023 0,035 0,036 0,017 0,016 0,022 91 0,866 0,008 0,016 0,014 0,040 0,036 0,015 0,014 0,032 0,020 0,018 0,019 92 0,401 0,015 0,019 0,013 0,010 0,012 0,026 0,021 0,019 0,018 0,014 0,025 95 0,010 0,011 0,048 0,037 0,010 0,017 0,023 0,042 0,016 1,931 1,973 0,024 TABLEAU 10 SONDE 28 24 27 32 37 55 42 OLIGO N 302 1066 1068 997-ASR 1033 986-ASB 1060 controle+ ADN N ADN N TYPAGE 58 0,083 0,026 0,026 0,050 0,759 0,028 0,024 > 2,500 58 DRB1*0301/DRB1*07 59 0,020 0,022 0,039 0,048 0,035 0,023 0,019 > 2,500 59 DRB1*0101-0102/DRB1*07 63 0,083 0,881 0,584 0,777 1,194 0,026 0,030 > 2,500 63 DRB1*12/DRB1*1301 66 0,024 0,023 0,015 0,036 0,030 0,025 0,022 > 2,500 66 DRB1*07/ 67 0,028 0,028 0,032 0,041 0,893 0,026 0,026 > 2,500 67 DRB1*01/DRB1*11 68 0,107 0,015 0,039 0,050 0,105 0,214 0,025 > 2,500 68 DRB1*07/DRB1*1302 70 0,024 0,028 0,846 0,058 0,952 0,028 0,024 > 2,500 70 DRB1*1401/DRB1*0101-0102 71 0,088 0,022 0,046 0,058 2,363 0,048 0,023 > 2,500 71 DRB1*11/DRB1*1301 72 0,028 0,024 0,042 0,074 0,070 0,017 0,446 > 2,500 72 DRB1*0101/DRB5*0101 73 0,024 0,023 0,030 0,135 0,045 0,018 0,424 > 2,500 76 DRB1*0101/DRB5*0101 75 0,099 0,029 0,025 0,729 0,031 0,017 0,021 > 2,500 75 DRB1*0301/DRB1*04 78 0,095 0,013 0,026 0,060 0,813 0,015 0,020 > 2,500 78 DRB1*0301/DRB1*07 79 0,117 0,028 0,034 0,744 0,912 0,019 0,019 > 2,500 79 DRB1*0301/DRB1*1301 80 0,030 0,021 0,066 0,040 0,045 0,014 0,412 > 2,500 80 DRB1*07/DRB5*0101 83 0,040 2,096 0,060 0,038 0,058 0,023 0,501 > 2,500 83 DRB1*08/DRB5*0101 84 0,152 0,021 0,049 0,041 0,011 0,210 0,019 > 2,500 84 DRB1*04/DRB1*1302 85 0,219 0,070 0,040 0,612 0,038 0,168 0,024 > 2,500 85 DRB1*03/DRB1*13 86 0,030 0,024 0,055 0,100 0,036 0,034 0,022 > 2,500 86 DRB1*04/DRB5*0201-0202 87 0,183 0,048 0,096 0,595 0,047 0,015 0,024 > 2,500 87 DRB1*1301/DRB5*0201-0202 89 0,026 0,617 0,301 0,042 0,567 0,019 0,024 > 2,500 89 DRB1*04/DRB1*12 90 0,026 0,024 0,032 0,042 0,016 0,018 0,026 > 2,500 90 DRB1*0101/DRB1*04 91 0,028 0,026 0,042 0,048 0,032 0,014 0,025 > 2,500 91 DRB1*0101/ 92 0,156 0,039 0,028 1,157 0,021 0,312 0,023 > 2,500 92 DRB1*0101/DRB1*1402 95 0,154 0,079 0,028 1,224 0,023 0,302 0,022 > 2,500 95 DRB1*1302/DRB1*1303 La méthode décrite nous permet de typer sans ambiguïté les 24 ADN testés. EXEMPLE 11: La température préférentielle d' hybridation pour le typage HLA DR décrit dans la présente invention est 37 OC. I1 est cependant possible de modifier cette température d'hybridation L'exemple suivant est identique à l'exemple 10 à l'exception de la température d'hybridation qui a été modifiée de 370C à 450C. Le typage est réalisé sur 11 ADN. Les sondes de capture utilisées sont données dans le tableau 11 ci-après: TABLEAU 11 reference numéro sequence 5'-3' 1 563 CTGGAAAGATGCA 5 603 CAGACAGGATAAGTATG 43 571B TGGACAACTACT 9 545 GATACTTCTATCACC 10 398 CCTGATGAGGAGTA 14 591 GGCAGGGTAAGTATAAG 17 595 GGCCCTGGTGGA 44 574B GCGGTATCTGCACA 45 556B GGAGGAGGTTAAG 46 555B TGGAAGACGAGC 48 867B GGAAGACAAGCG 47 756B GCGGGAACATGG 28 802 CGAGGAGGAGAACGT Les résultats du typage sont donnés dans le tableau 12 ci-après:: TABLEAU 12 SONDE 1 5 43 9 10 14 17 44 45 OLIGO N 563 603 571-ASB 545 398 591 595 574-ASB 556-ASB ADN N 71 0,003 0,003 0,025 0,006 0,805 0,004 0,008 0,003 0,033 71 0,099 1,200 0,035 0,002 0,005 0,012 0,007 0,008 0,039 73 0,099 1,035 0,023 0,001 0,007 0,012 0,007 0,009 0,036 75 0,005 0,022 0,114 0,171 0,009 0,013 0,009 0,004 0,040 78 0,005 0,014 0,126 0,001 0,006 0,704 0,008 0,003 0,037 79 0,007 0,005 0,148 0,006 0,007 0,007 0,009 0,005 0,036 80 0,007 1,135 0,025 0,003 0,008 0,525 0,008 0,009 0,044 83 0,008 1,012 0,020 0,008 0,011 0,029 0,060 0,022 0,058 84 0,009 0,011 0,022 0,194 0,010 0,020 0,019 0,015 0,053 SONDE OLIGO N 555-ASB 867-ASB 756-ASB 802 controle + TYPAGE ADN N 71 0,583 0,016 0,009 0,039 > 2,500 DRB1*11/DRB1*1301 72 0,012 0,010 0,009 0,013 > 2,500 DRB1*0101/DRB5*1101 73 0,005 0,011 0,013 0,017 > 2,500 DRB1*0101/DRB5*1101 75 0,011 0,007 0,010 0,045 > 2,500 DRB1*0301/DRB1*04 78 0,005 0,005 0,006 0,062 > 2,500 DRB1*0301/DRB1*07 79 0,790 0,013 0,009 0,122 > 2,500 DRB1*0301/DRB1*1301 80 0,010 0,012 0,008 0,016 > 2,500 DRB1*07/DRB5*0101 83 0,029 0,021 0,021 0,040 > 2,500 DRB1*08/DRB5*0101 84 0,452 0,020 0,019 0,166 > 2,500 DRB1*04/DRB1*1302 85 0,564 0,023 0,021 0,244 > 2,500 DRB1*03/DRB1*13 86 0,017 0,017 0,020 0,038 > 2,500 DRB1*04/DRB5*0201-0202 EXEMPLE 12:: Le tampon d'hybridation préférentiel nommé tampon PEG utilisé pour le typage HLA DR comme décrit dans l'exemple 8 a la composition suivante : Phosphate de sodium 0,1 M, pH 7, NaCl 0,5 M, Tween 20 0,65 %, ADN de sperme de saumon (Sigma D 9156) 0,14 mg/ml, PEG 4000 (Merck 807490) 2 %). On a utilisé le même tampon contenant de la formamide (10% final). I1 est connu que la formamide permet de diminuer la température d'hybridation. Si l'on effectue toujours l'hybridation à 370C en présence de formamide, on doit donc augmenter la spécificité de la détection. Le typage est réalisé sur 24 ADN qui sont ceux qui ont été utilisés dans l'exemple 10. Les sondes de capture utilisées et les valeurs obtenues sont données dans le tableau 13 ci-après: TABLEAU 13 SONDE 1 5 43 9 10 14 17 44 45 46 48 47 OLIGO N 563 603 571-ASB 545 398 591 595 574-ASB 556-ASB 555-ASB 867-ASB 756-ASB ADN N 58 0,004 0,015 0,075 0,005 0,005 0,467 0,005 0,005 0,008 0,008 0,020 0,008 59 0,084 0,015 0,016 0,004 0,005 0,426 0,007 0,006 0,007 0,008 0,018 0,007 63 0,009 0,008 0,019 0,008 0,010 0,007 0,006 0,008 0,009 0,351 0,020 0,009 66 0,007 0,022 0,017 0,009 0,008 0,684 0,005 0,006 0,005 0,009 0,018 0,008 67 0,118 0,039 0,017 0,015 0,356 0,027 0,008 0,004 0,004 0,343 0,016 0,004 68 0,010 0,015 0,020 0,010 0,009 0,445 0,004 0,002 0,008 0,332 0,012 0,007 70 0,105 0,009 0,016 0,010 0,010 0,011 0,009 0,008 0,009 0,008 0,014 0,340 71 0,007 0,007 0,018 0,011 0,393 0,010 0,006 0,007 0,012 0,344 0,015 0,005 72 0,085 0,395 0,018 0,008 0,008 0,007 0,007 0,009 0,015 0,007 0,018 0,004 73 0,094 0,353 0,017 0,010 0,009 0,012 0,006 0,008 0,005 0,007 0,019 0,008 75 0,009 0,014 0,062 0,132 0,010 0,011 0,005 0,004 0,008 0,008 0,020 0,009 78 0,006 0,009 0,074 0,011 0,008 0,415 0,006 0,012 0,006 0,004 0,012 0,006 79 0,005 0,006 0,043 0,005 0,004 0,005 0,007 0,005 0,009 0,388 0,014 0,005 80 0,003 0,213 0,013 0,003 0,002 0,211 0,008 0,006 0,010 0,011 0,012 0,008 83 0,007 0,391 0,015 0,005 0,005 0,005 0,023 0,008 0,012 0,015 0,010 0,004 84 0,004 0,008 0,013 0,110 0,005 0,007 0,003 0,006 0,005 0,410 0,018 0,002 85 0,007 0,007 0,033 0,007 0,006 0,006 0,006 0,003 0,008 0,371 0,018 0,005 86 0,009 0,203 0,020 0,081 0,007 0,005 0,005 0,005 0,009 0,048 0,016 0,005 87 0,008 0,289 0,015 0,009 0,008 0,008 0,006 0,004 0,004 0,323 0,014 0,006 89 0,008 0,010 0,015 0,091 0,002 0,004 0,007 0,005 0,012 0,009 0,013 0,007 90 0,033 0,007 0,015 0,075 0,003 0,009 0,007 0,004 0,001 0,008 0,014 0,008 91 0,077 0,006 0,013 0,006 0,005 0,006 0,009 0,006 0,013 0,009 0,015 0,002 92 0,042 0,009 0,013 0,009 0,006 0,007 0,008 0,009 0,005 0,012 0,017 0,003 93 0,005 0,004 0,015 0,006 0,006 0,006 0,008 0,002 0,008 0,319 0,308 0,005 TABLEAU 13 SONDE 28 24 27 82 37 42 OLIGON N 802 1066 1068 997-ASB 1033 1060 controle + ADN N ADN N TYPAGE 58 0,036 0,005 0,001 0,004 0,207 0,009 > 2,500 58 DRB1*0301/DRB1*07 59 0,002 0,006 0,008 0,004 0,009 0,010 > 2,500 59 DRB1*0101-0102/DRB1*07 63 0,026 0,015 0,058 0,029 0,261 0,011 > 2,500 63 DRB1*12/DRB1*1301 66 0,007 0,005 0,007 0,008 0,012 0,010 > 2,500 66 DRB1*07/ 67 0,009 0,005 0,008 0,009 0,251 0,024 > 2,500 67 DRB1*01/DRB1*11 68 0,036 0,006 0,009 0,010 0,016 0,011 > 2,500 68 DRB1*07/DRB1*1302 70 0,008 0,004 0,055 0,008 0,199 0,009 > 2,500 70 DRB1*1401/DRB1*0101-0102 71 0,034 0,003 0,005 0,009 0,539 0,008 > 2,500 71 DRB1*11/DRB1*1301 72 0,010 0,009 0,006 0,004 0,009 0,130 > 2,500 72 DRB1*0101/DRB5*0101 73 0,010 0,009 0,005 0,005 0,010 0,150 > 2,500 73 DRB1*0101/DRB5*0101 75 0,038 0,008 0,008 0,021 0,014 0,010 > 2,500 75 DRB1*0301/DRB1*04 78 0,041 0,007 0,004 0,007 0,254 0,015 > 2,500 78 DRB1*0301/DRB1*07 79 0,064 0,007 0,006 0,028 0,315 0,012 > 2,500 79 DRB1*0301/DRB1*1301 80 0,007 0,008 0,009 0,008 0,011 0,142 > 2,500 80 DRB1*07/DRB5*0101 83 0,010 0,166 0,007 0,009 0,017 0,159 > 2,500 83 DRB1*08/DRB5*0101 84 0,050 0,006 0,008 0,010 0,014 0,009 > 2,500 84 DRB1*04/DRB1*1302 85 0,063 0,009 0,007 0,036 0,009 0,011 > 2,500 85 DRB1*03/DRB1*13 86 0,014 0,008 0,004 0,011 0,010 0,010 > 2,500 86 DRB1*04/DRB5*0201-0202 87 0,042 0,007 0,005 0,028 0,007 0,004 > 2,500 87 DRB1*0301/DRB5*0201-0202 89 0,008 0,068 0,039 0,005 0,201 0,006 > 2,500 89 DRB1*04/DRB1*12 90 0,008 0,011 0,009 0,006 0,010 0,009 > 2,500 90 DRB1*0101/DRB1*04 91 0,010 0,010 0,006 0,008 0,009 0,011 > 2,500 91 DRB1*0101/ 92 0,040 0,007 0,012 0,028 0,018 0,012 > 2,500 92 DRB1*0101/DRB1*1402 95 0,035 0,008 0,009 0,030 0,017 0,009 > 2,500 95 DRB1*0302/DRB1*1303 La température préférentielle d'hybridation est 370C et le tampon d'hybridation préférentiel est le tampon PEG, mais comme le montrent les résultats de l'exemple 11 et 12, on voit qu'il est possible de faire varier à la fois la température d'hybridation et le tampon d'hybridation. Comme cela ressort de la description ci-avant, le procédé de la présente invention combine les avantages pratiques suivants : une spécificité optimale avec discrimination possible de tous les allèles, une simplicité d'exécution et un coût réduit par rapport à l'analyse sérologique, une rapidité d'exécution- avec obtention des résultats 90 minutes environ après amplification, soit une durée totale inférieure à 12 heures, ce qui est essentiel pour les donneurs de reins, une compatibilité au typage individuel essentielle pour les typages d'urgence et l'utilisation en petits laboratoires, un signal quantifiable par mesure de Densité Optique et un traitement éventuel des résultats par un système informatique simple, et une adaptabilité à des systèmes automatiques. REVENDICATIONS 1. Ensemble de sondes nucléotidiques permettant de déterminer selon les techniques usuelles de typage par oligonucléotides, les types HLA DR et/ou sous types associés, ledit ensemble de sondes comprenant au moins les sondes nucléotidiques suivantes (la partie soulignée correspondant à la séquence optimum) (G)CTGGAAAGATGCA(T) , CAGCAGGATAAGTATG(A) , (G)TGGACAACTACT(G), GATACTTCTATCACC(AA) , (G)CCTGATGAGGAGTA(C) , (T)GGCAGGGTAAGTATAAG, (G)GGCCCTGGTGGA(CA) , (C)TGGAAGACGAGC(G) , (T)GGAAGACAAGCG(G) , (A)CCAGTAGGAGAACGT(G) , (A)CCAGGAGGAGGACGT(G) , (A)CTCTACGGGTGAGT(G) -(G)ACACCTATTGCAGA(C) lesdites sondes pouvant être sous forme marquée, ou couplées de façon covalente à un ligand facilitant leur fixation sur un support solide ou fixées directement sur un support solide. 2. Ensemble de sondes selon la revendication 1 comprenant en outre les sondes suivantes (la partie soulignée correspondant à la séquence optimum) - (G)GAGCTGCGTAAG(T) , TTCCTGGAGAGACAC , (G)GGAGAGATACTTC(C) et/ou les sondes suivantes (G)AGGAGGACTTGCGC(T) , 3. Ensemble de sondes selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdites sondes sont couplées de façon covalente avec un ligand. 4. Ensemble de sondes selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ledit ligand comprend au moins un groupement fonctionnel polaire. 5. Ensemble de sondes selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ledit groupement fonctionnel polaire est un groupement aminé 6. Ensemble de sondes selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait que ledit ligand comprend une partie hydrophobe 7. Ensemble de sondes selon l'une quelconques des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que ledit ligand comprend un groupement de formule générale (I) dans laquelle Z représente un radical alkyle ou alcényle de 2 à 12 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué par un ou plusieurs groupements hydroxy et/ou amino, et représente notamment un cation alcalin ou ammonium 8.Ensemble de sondes selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que ledit ligand comprend un groupement de formule générale (II) dans laquelle n est un nombre entier pouvant varier de 1 à 4, 9. Ensemble de sondes selon l'une quelconques des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que ledit ligand comprend un peptide ou une protéine. 10. Ensemble de sondes selon la revendications 9, caractérisé par le fait que ladite protéine est une albumine. 11. Ensemble de sondes selon la revendications 10, caractérisé par le fait que ladite albumine est une albumine de sérum de bovin. 12. Ensemble de sondes selon l'une quelconques des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lesdites sondes sont fixées par adsorption passive sur ledit support solide 13. Procédé pour déterminer le typage HLA DR d'un individu à partir d'un échantillon de l'individu selon les techniques usuelles de typage par oligonucléotides caractérisé par le fait qu'on utilise comme sondes de capture ou de détection au moins une partie des sondes de l'ensemble des sondes défini dans l'une quelconque des revendications précédentes. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant - à faire incuber, selon les méthodes connues, dans des conditions prédéterminées telles que l'hybridation avec chaque sonde ne se produit que si la cible contient une séquence parfaitement complémentaire de celle de ladite sonde, et - à déterminer, selon les techniques de détection usuelles, l'hybridation ou l'absence d'hybridation avec chacune des sondes utilisées. 15. Procédé selon les revendications 13 et 14, caractérisé par le fait que l'on utilise lesdites sondes comme sondes de capture. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à - immobiliser chaque sonde de capture sur un support solide, - mettre en contact chaque sonde de capture immobilisée avec un milieu liquide contenant au moins un fragment d'acide nucléique cible, dans des conditions prédéterminées permettant l'hybridation si la séquence complémentaire de celle de la sonde est présente dans la cible, et - détecter la présence d'hybrides éventuellement formés. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que ladite sonde de capture est telle que définie dans l'une quelconque des revendications 3 à 12 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé par le fait que le fragment d'acides nucléiques cible est un fragment d'ADN ou d'ARN 19. Procédé selon l'une des revendications 14 à 16s caractérisé par le fait que la détection des hybrides formés est effectué à l'aide d'au moins l'une des sondes de détection suivantes: CCGGGCGGTGAC(GT)GAGCTGGGGC ; CCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC GAACAGCCAGAAGGAC.