Brevet FR2679776A1 — publié le 19930205

MELANGE DE CONSTITUANTS PEPTIDIQUE8 AYANT DES PROPRIETES VACCINANTES CONTRE LE PALUDISHZ, NOTAMMENT DU A PLASMODIUM FALCIPARUN L'invention concerne un mélange de 3 constituants peptidiques ayant des propriétés vaccinantes contre le paludisme, notamment du A Plasmodium Falciparum, plus particulièrement la capacité d'induire in vivo une réponse immunitaire protectrice, y compris la production d'anticorps immunoprotecteurs aptes à détruire les parasites du stade sanguin, responsables de la maladie chez l'homme, dans un modèle de primate représenté par le singe écureuil SAIMIRI SCIUREUS. Ces trois constituants sont définis dans ce qui suit comme "premier constituant, "deuxième constituant" et "troisième constituant". Le "premier constituant" est constitué par un polypeptide dérivé d'un antigène majeur de P falciparum, ayant un poids moléculaire de l'ordre de 72 kDA, d'où l'appellation "Antigène 72 kDA" utilisée dans ce qui suit pour le désigner, particulièrement d'un polypeptide issu de cet antigène 72 kDA ayant la capacité, comme celui-ci - d'être reconnu par des anticorps protecteurs contenus dans des sérums ou des fractions immunoglobuliniques provenant d'animaux, notamment de singes SAIMIRI SCIUREUS, devenus résistants aux parasites après les infections répétées contrôlées par chimiothérapie, les dits sérums ou fractions étant susceptibles de rendre résistants des singes initialement sensibles - d'être lui-même inducteur, notamment chez le singe, et plus particulièrement chez le singe SAIMIRI SCIUREUS, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de P falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. Ce premier constituant est lui-même souvent reconnu par des sérums de patients humains habitant des régions où le paludisme sévit de façon endémique. La séquence nucléotidique codant pour la séquence peptidique antigène 72 kDA a été identifiée par L.S. MATTEI et al European Journal of Immunology (1989) 19 1823 - 1828. Le premier constituant est avantageusement constitué par un polypeptide ci-après désigné "i72" comprenant les 153 acides amines de la région C terminale de l'antigène 72 kDA, dont la séquence en acides aminés, de même qu'une séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide i72 sont présentées ci-après 1/1 31/11 GAT CGT ATO GTT AAT GAT GCT GAA AAA TAC AAA GCA GAA CAT OAA GAA AAC AGA AAA AGA asp arg met val asn asp ala glu lys tyr lys ala glu Asp glu glu asn arg lys arg 61/21 91/31 ATC GAA GCA AGA AAC AGC CTT GAA AAT TAC TGC TAT GGA CTT AAA AGC TCA TTA GAA GAC ile glu ala arg asn ser leu glu asn tyr cys tyr gly val lys ser ser leu glu asp 121/41 151/51 CAA AAA ATT AAA GAA AAA TTA CAA CCA GCT GAA ATT GM ACA TGT ATG AAA ACT ATT ACA gin lys ile lys glu lys leu gln pro ala glu lla glu thr cys met lys thr ile thr 181/61 211/71 ACC ATA CTT GAA TGG TTA GAA AAA AAC CAA CTT GCT GGA AAA OAT GAA TAT GAA GCC AAA thr ile glu trp leu glu lys asn gln leu ala gly lys asp glu tyr glu ala lys 241/81 271/91 CAA AAA GAA GCA GAA TCG GTT TGT OCT CCA ATT ATG TCT AAA ATC TAT CAA OAT GCT OCT gln lys glu ala glu ser val cys ala pro ile met ser lys il. tyr gln asp ala ale 301/101 GGT GCA GCC GGT GGT ATG CCA GGA GGT ATG CCC GGT GGA ATG CCA GGT GGA ATG CCA GGT gly ala ala gly gly met pro gly gly met pro gly gly met pro gly gly met pro gly 361/121 391/131 GGT ATG CCA GGT GGT ATO AAT TTC CCA CGA GGT ATG CCC GGA GCA GGA ATG CCA CGA AAT gly met pro gly gly met asn phe pro gly gly set pro gly ala gly met pro gly asn 421/141 451/151 GCC CCA OCT GGA AGT CGA CuA ACA GTT GAA OAA GTT GAT TAA ACT AAT AAA AAA AAA AAA ala pro ala giy ser gly pro thr val glu glu val asp OCH thr ain lys lys lys lys 481/161 511/171 CAT TAA ACA CGA CAA ATA TAA AAA TAT ATA TAT TAT AAA AAT ATA TAT ATA TAT ATT TTT his OCH thr gly gln ile OCH lys tyr ile tyr tyr lys asn ile tyr ile tyr ile phe 541/181 571/191 TTT TTT TTT TTA CAT TTT TOT AAA TTA ATA TOA ATT phe phe phe leu his phe cys lys leu ile CPA ile PREMIER CONSTITUANT ou par un polypeptide recombinant contenant la séquence du précédent, par exemple celui obtenu sous forme de molécule de fusion avec la glutatione transférase de Schistosoma japonicum, selon la technique décrite par D.B. Smith and K.S. Johnson (1988) Gene 67, 41-48, par transformation de E.Coli avec le plasmide pGEX préalablement modifié par la séquence nucléotidique d'insertion appropriée. Une culture de E. Coli (Escherichia coli DH5&alpha;) transformé par le susdit plasmide modifié par une séquence nucléotidique codant pour le peptide i72 qui a été déposée le 24 Juillet 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur de Paris (CNCM) sous le numéro I - 1129. C'est le produit d'expression de ce plasmide qui consiste en le "constituant 1" de l'exemple fourni plus loin. Le deuxième constituant est constitué par un peptide ou oligopeptide codé tel qu'il est défini ciaprès. Le deuxième constituant, ainsi qu'un fragment d'acide nucléique qui code pour ce deuxième constituant, sont caractérisés en ce qu'ils contiennent les élements de séquence respectifs suivants GAG GAA TGT CAA GGG GAA GTT TAT TTA TTT GTT AAA AAG ATA CCT ATA Glu GL Cys Gln Gly Glu Val Tyr Leu Phe Val Lys Lys Ile Pro Ile GAC- GTA T-sG ATA AGA CAG TAC AAC TTG ATG AAT GAT AAT GAT GGA GAA Glu Val rp Ile Arg Gln Tyr Asn Leu Met Asn Asp Asn Asp Gly Glu TAT TTA TTA GAT GGG GAA AAT TTT ATT ATG GAA GCA GTA GCC TGC GCT Tyr Leu Leu Asp Gly Glu Asn Phe Ile Met Glu Ala Val Ala Cys Ala TAT TTA AGC GAG CAT TAT CCT GGA CTC ACA CCT AAA TTG TAC AAG GTA Tyr Leu Ser Glu His Tyr Pro Gly Leu Thr Pro Lys Leu Tyr Lys Val TTA TAT GAG CCT GAA TGT GCT AAC TGT AAT GAA GAG GAT AAG AAT ATG Tyr Glu Pro Glu Cys Ala Asn Cys Asn Glu Glu Asp Lys Asn Met AGT GAA GAT AAT CAT AAG AAG GAT AGT AAA CAT AAG GGG GAT AGT AAT Ser Glu Asp Asn His Lys Lys Asp Ser Lys His Lys Gly Asp Ser Asn CAC AAA AGT GAT AGT AAT CAC AAA AGT GAT AGT AAT CAC AAA AGT GAT His Lys Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Asp AGT AAT CAT AAA AGT GAT AGT AAT CAT AAA AGT GGT AGT AAT CAC AAA Ser Asn His Lys Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Gly Ser Asn His Lys AGT GAT TGT AAT CAC AAG AGT GGT AGT AAT CAC AAG AGT GGT AGT AAT Ser Asp Cys Asn His Lys Ser Gly Ser Asn His Lys Ser Gly Ser Asn CAC AAG AGT GAT AGT AAT CAT CAA AGT GAT TGT AAT .. His Lys Ser Asp Ser Asn His Gln Ser Asp Cys Asn ... .. ... .. ... GAT CAT AAT CAC AAA AGC GAT . ... .. Asp His Asn His Lys Ser Asp CAT AAC CAC AAG AGC GAT AAT AAC CAC AAG AGT GAT CAT AAT CAC AAA His Asn His Lys Ser Asp Asn Asn His Lys Ser Asp His Asn His Lys AGT GAT CAT AAA AAA AAT AAT AAC AAT AAT AAG GAT AAT AAA AAT GAC Ser Asp His Lys Lys Asn Asn Asn Asn Asn Lys Asp Asn Lys Asn Asp GAT AAT GAT GAC AGT GAT GCA AGC GAT GCA GTT GAT GAA GAT ATT GAG Asp Asn Asp Asp Ser Asp Ala Ser Asp Ala Val Asp Glu Asp Ile Glu ATA CTT GAG TCT TAT AGT GAT TTG AAT AAA TTT AAT GAG ATG TTA ACA Ile Leu Glu Ser Tyr Ser Asp Leu Asn Lys Phe Asn Glu Met Leu Thr GAA CAA TTA AAT AAA AAT AAG GAT GGA TAT GTT GTT TTG GTT ACT GAA Glu Gln Leu Asn Lys Asn Lys Asp Gly Tyr Val Val Leu Val Thr Glu TTA TTT GGT GAA GAT CTT TTT CAA TAT ATT AAT AAA AGG AAT GAA AAT Leu Phe Gly Glu Asp Leu Phe Gln Tyr Ile Asn Lys Arg Asn Glu Asn DEUXIEME CONSTITUANT GAA GAT ACG CGT GTA AGA GAT GAA GAT AAA AAA ATA ATT ATG TTT GAA Glu Asp Thr Arg Val Arg Asp Glu Asp Lys Lys Ile lie Met Phe Glu TTT TTA AAG TTA TTA ATA AAA TTA CAT AAT GCA GGA TTG GTA CAT CTT Phe Leu Lys Leu Leu Ile Lys Leu His Asn Ala Gly Leu Val His Leu GAT ATA TCT CCT GAA AAT ATA TTG ATA GAA AAT AAT GGT GAG TTA CGC Asp Ile Ser Pro Glu Asn Ile Leu Ile Glu Asn Asn Gly Glu Leu Arg TTA TGT GAT CTA GCT AAA TGT GCT CCA ATG TAT ACA CAC AAT TTA AGA Leu Cys Asp Leu Ala Lys Cys Ala Pro Met Tyr Thr His Asn Leu Arg CAT ATT AAA GGA AAT GGA AAC GAT TTG TAT TCA TTT CAA TCT TGT CAA His Ile Lys Gly Asn Gly Asn Asp Leu Tyr Ser Phe Gln Ser Cys Gln CCT TGT GTT GGA AAA ATC CCA TGT ATT CCA AAA GAG TGT TGG GAT ATT Pro Cys Val Gly Lys Ile Pro Cys Ile Pro Lys Glu Cys Trp Asp Ile ATT AGA GAA CAT ATA AAA TTA AAA ATA GAT AAT CCT TTT GAA CAT TTA Ile Arg Glu His Ile Lys Leu Lys Ile Asp Asn Pro Phe Glu His Leu TCA ACT ATT ACT GAT CAA GAA GAA AGA AAA AAA TAT TAT TTT GAT GTA Ser Thr Ile Thr Asp Gln Glu Glu Arg Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Val CAT TGT GTA GAT AAA TAT ATG CTT GGT ATA TTT TAT ATA TGG ATA TGG His Cys Val Asp Lys Tyr Met Leu Gly Ile Phe Tyr Ile Trp Ile Trp AAT TTA AAT TAT ATA TGG AAA CGA GCT GAC CCA CCA AAT GAT AGA ACA Asn Leu Asn Tyr Ile Trp Lys Arg Ala Asp Pro Pro Asn Asp Arg Thr TTT AAT AAT TTC TTA AAA TAT AAT TTA AAT ATA AAT GTA TTT CAG TTA Phe Asn Asn Phe Leu Lys Tyr Asn Leu Asn Ile Asn Val Phe Gln Leu GCC CAA CAA TGG CCA AAA GGT CTC AAA GAT ATA ATT AAC GTA AGA TAT Ala Gln Gln Trp Pro Lys Gly Leu Lys Asp Ile Ile Asn Val Arg Tyr ATA AGA AAA AAA AAA AAA ARA AAA AAA ATA ATA ATA ATA ATA ATG ATG Ile Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Ile Ile Ile Ile Met Met TTT TAT ATA GTA TGT GCA TAG TGAATGTTTT TTTTTTATAT TTTAATACAT Phe Tyr Ile Val Cys Ala *** GAAATGATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATTTTCTC TTTATAGAAA TTATTAAGCC TAGAAAGTAG AATGAAGACA GACTTAAATG AATTAACTGA ACATCCATGG TGGATTAATG AAGATTAATT TTAATTTTTT AAGTATTATA TGAATATTTA TTATTAGTAG ACTTTATATA TAACAATAAA TATTGACACG TGCAATATTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGA ATTAAAAAGG AATGTTTTAT TGTTTAGGAC TATATGGAAA AATAATAATA TATATATGTT TCCACATTAA AAA DEUXIEME CONSTITUANT (Suite) ce deuxième constituant" a été décrit dans la demande de brevet français n 90 10039 déposée le 6 Août 1990. Cet oligopeptide étant reconnu par des anticorps contre P.falciparum ou capable d'induire la production d'anticorps cytophiles, de préférence d'isotype IgGl et IgG3, et présentant en outre un caractère protecteur comme cela a été indiqué plus haut à propos du premier constituant lit. Une souche de E. Coli, transformée par un tel acide nucléique, a été déposée à la CNCM sous le n I-987 le 27 Juillet 1990. Un "deuxième constituant préféré est le peptide recombinant contenant la séquence du peptide "R 23" de formule LysSerAspSerAsnHisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspSerAsn HisMetSerAspHisAsnHisMetserAspHisAsnHistysserAspHisAsnHisLys SerAspAsnAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAsp SerAsnHisLysSerAspHisAsn Une souche de E. Coli contenant la séquence d'ADN correspondante a été déposée le 27 Juillet année 1990 sous le n I - 986 à la CNCM. Le peptide R23 (le "constituant 2") utilisé dans l'exemple qui suit, a pareillement été produit sous forme d'une protéine recombinante du fusion avec la glutatione transférase de Schistosoma japonicum, selon la technique déjà mentionnée de D. B. Smith et K.S. Johnson. Enfin le troisième constituant est constitué par un polypeptide EB 200 contenant la séquence polypeptidique ci-dessous définie par sa séquence en acides aminés S VTGNI LVEG SVTEEVVGEEK LVSEEIVTEEG SVAQEIVEEDA P A T E E I D E I E SVTEEVVEEEG PVDEEIVQEEG TVTEEIIQGE S K V E E V V E E Q G S E N E E I F V E E V SASQEIVQNE SGTEEILELV SASQEIVQDG S V T E Q I I E E L F P V T E E V V N E E E ou une partie de cette séquence dès lors que celle-ci est apte, le cas échéant lorsqu'elle est incorporée à une protéine de fusion, oligomérisée ou conjuguée à une protéine porteuse, à induire in vivo une réponse immunitaire protectrice chez le singe écureuil Saimiri sciureus, notamment à induire in vivo des anticorps eux-mêmes capables d'inhiber l'invasion de globules rouges par des mérozoïtes. Ce polypeptide étant également apte à induire in vivo des anticorps protecteurs, tels que définis plus haut. Un polypeptide préféré est le polypeptide "EB200", dont la séquence en aminoacides ainsi qu'une séquence de nucléotides codant pour ce polypeptide, apparaissent ci-après 1/1 31/11 GGA TCC GTA ACT GAA GAA GTT GTA GGA GAA GAA AAA TTA GTT AGT GAA GAA ATA GTA ACG gly ser val thr glu glu val val gly glu glu lys leu val ser glu glu ilQ val thr 61/21 91/31 GAA GGA TCT GTT GCT CAA GAA ATA GTA GAA GAA GAT GCA CCA GCT ACT GAA GAA glu glu gly sQr val ala gln glu ile val glu glu asp ala pro ala thr glu glu il. 121/41 151/51 GAA ATA GAA TCA GTT ACT GAA GAA GTT GTC GAA GAA GAA GGA CCT GTT GAT GAA GAA asp glu île glu ser val thr glu glu val val glu glu glu gly pro val asp glu glu 181/61 211/71 ATT GTA CAA GAA GAA GGT ACA GTT ACT GAA GAA ATA ATA CAA CGA GAA TCT AAA GTT GAT GAA il. val gin glu glu gly thr val thr glu glu il. il. gln gly glu sQr lys val glu 241/81 271/91 GAG GTC GTA GAA GAA CAA GGA TCT GAA AAT GAA GAA ATA TTC GTA GAA GAA GTA TCA OCT glu val val glu glu glu gly ser glu asn glu glu il. phQ val glu glu val ser ala 301/101 331/111 TCT CAA GAA ATA GTA CAA AAT GAA TCA GGT ACC GAA GAA ATA TTC GAA AAA GTA TCA OCT "r gln glu ile val gln asn glu ser gly thr glu glu ile leu glu lys val ser ala 361/121 391/131 TCT CAA GAA ATA GTA CAA GAT GGA TCA GTT ACT GAA CAA ATA ATA CGA ATT "r gln glu ile val gln asp gly ser val thr glu gin ile ile gly ils TROISIEME CONSTITUANT constitue l'un des "troisièmes constituants" qui peuvent être utilisés de façon avantageuse dans le mélange vaccinant selon l'invention. Un peptide recombinant de fusion contenant cette séquence ("constituant 3" dans l'exemple qui suit) a, comme les "constituant 1" et "constituant 2", été produit en mettant en oeuvre la technique décrite par D.B. Smith et K.S. Johnson. Une culture de E. Coli (Escherichia coli DH 5 ) contenant le plasmide d'expression correspondant a été déposée le 24 Juillet 1991 à la CNCM sous le n I - 1128. La capacité qu'a le singe écureuil SAIMIRI SCIUREUS de produire des anticorps actifs contre des P falciparum conduit à la solide présumption que tous les antigènes dont il est question dans la présente de brevet sont également inducteurs d'anticorps immunoprotecteurs chez l'homme, dès lors qu'ils lui seraient administrés, par analogie avec des travaux antérieurs faisant état de la similitude entre les anticorps contre les antigènes du parasite P falciparum présents dans les sérums de populations vivant dans des régions où le paludisme sévit de façon endémique d'une part, et les anticorps induits par les mêmes antigènes chez le singe écureuil Saimini Sciureus. D'une façon générale, le mélange vaccinant de l'invention contient des proportions de ces trois constituants qui peuvent être ajustées par le spécialiste, selon leurs activités individuelles, mesurables par exemple dans un test du type de celui dont la description sera donnée dans l'exemple. A titre purement indicatif ces proportions pourront, pour chacun des trois constituants correspondre à une valeur comprise entre 20 et 80 t en moles du mélange, étant naturellement entendu que le total des trois proportions choisies ne saurait excéder 100 % en moles. Les polypeptides responsables des activités relatives des trois constituants peuvent être utilisés soit seuls, en particulier lorsqu'ils présentent euxmêmes une activité immunogene suffisante, le cas échéant en présence d'un adjuvant immunologique approprié, par exemple du type muramylpeptide ou analogue, soit sous formes oligomérisées, dans le cas où une telle oligomérisation renforcerait l'induction d'une réponse immunitaire, soit encore au sein de protéines de fusion (comme dans l'exemple qui suit), soit enfin à l'état conjugué à des protéines porteuses. Des techniques pour produire de tels conjugés sont décrites, par exemple, dans la demande de brevet français 89 04847/2 645 877 déposée le 12 Octobre 1989. L'invention concerne également des protélnes de fusion dans lesquelles des séquences peptidiques respectivement issues des "premier", "deuxième" et "troisième" constituants seraient incluses dans une seule et même protéïne, ces séquences peptidiques étant liées les unes aux autres, soit bout å bout, soit par l'intermédiaire d'éléments peptidiques de pontage. Chacune de ces séquences peptidiques est réduite å la taille nécessaire lui permettant de contribuer å l'induction d'anticorps reconnaissant le constituant auquel elle correspond, lorsque cette protéine de fusion est administrée a un hôte approprié. Par exemple, la protéine de fusion comprendrait des séquences liées bout à bout respectivement issues du polypeptide "i72", du polypeptide EB 200 et du polypeptide R23. Les séquences des deux derniers peptides mentionnés sont le cas échéant limitées à des fragments contenant chacun 3 à 4 motifs des séquences répétitives dégénérés que possèdent respectivement EB200 et R 23. De telles protélnes fusionnant les 3 constituants peuvent être produites par des techniques de génie génétique, notamment par transformation d'un hôte cellulaire compétent par un vecteur modifié par un acide nucléique contenant lui-même des séquences nucléotidiques successives codant pour les séquences polypeptidiques correspondantes dans une phase de lecture commune, sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire. L'invention concerne naturellement toutes compositions de vaccins dans lesquelles le susdit mélange de polypeptides se trouverait associé à des véhicules pharmaceutiquement acceptables facilitant leur administration à lwhomme. Les résultats qui suivent, obtenus chez le singe, n'en sont pas moins hautement significatifs du caractère vaccinant potentiel du mélange concerné chez l'homme. Ce mélange contenait les "constituant 1", "constituant 2" et "constituant 3" dans les proportions molaires suivantes "Constituant 1" : 46% "Constituant 2n : 13 t nConstituant 3" : 41 t Les expériences d'immunisation de singes Saimiri avec ce mélange d'antigènes recombinants de Plasmodium falciparum ont été conduites comme suit Animaux : 16 singes Saimiri sciureus d'élevage (F1 nés en captivité), phénotype Guyana K14-7, de 1 a 2 années d'âge : 1 animal donneur de parasites et 15 animaux répartis en 5 groupes expérimentaux.Les méthodes expérimentales de manipulation et d'infection des singes Saimiri ont été ceux décrits par Gysin et al (J. Parasitol., 66 : 1003-1009, 1980) et Gysin & Fandeur (Amer. J. Trop. Med. & Hyg. 32 : 461-467, 1983). Souche de Plasmodium falciparum : la souche de parasites utilisés a été la souche Palo Alto (FUP-1) adaptée au singe Saimiri en 1979 (Gysin et al J. Parasitol. 66: 1003-1009, 1980). Identification des groupes d'animaux d'expérience : les animaux utilisés dans l'expérience proviennent de l'élevage de Saimiri sciureus de l'institut Pasteur de la Guyane française, appartenant au phénotype Guyana de karyotype K14-7. Tous sont nés en captivite (génération F1) et avaient entre 1 et 2 ans d'âge en mars 1991. La distribution des animaux dans les groupes a été faite par tirageau-sort å partir d'un groupe pool initial de 15 singes. Les numéros d'identification de chaque singe ont été ceux affectés à la naissance et correspondent aux fiches individuelles dans le fichier établi dans le programme informatisé de l'unité de primatologie de l'institut Pasteur de la Guyane Française. Groupe I - Immunisation avec le mélange de la série d'antigènes de Pasteur : i72pGEx, EB200, R23, dorénavant appelés molécules recombinantes Pasteur. Singes 89053, 89023, 89080. Groupe II - Contrôles non immunisés. Singes n 89126, 89043, 90001. Immunisations : les animaux ont été immunisés à l'état intact (non splénectomisés). Tous les antigènes ont été utilisés dans la dose de 100 yg de protéine fusion par injection émulsionnée dans 1 ml d'adjuvant PAO (polyalofine) de Behringwerke, injecté dans plusieurs points par voie sous-cutanée dans la région dorsale de l'animal. Nombre d'injections : chaque animal a reçu 4 doses vaccinantes aux jours : 0 (zéro), 21, 42 et 75 de l'expérience. Evaluation de la protection immune. Tous les animaux ont été splénectomisés le jour 85 de l'expérience, soit 10 jours après la dernière dose immunisante. Au jour 90, les animaux ont été soumis & une inoculation d'épreuve avec une dose de 100,000 globules rouges parasités par Plasmodium falciparum, souche Palo-Alto, provenant dtun anima 1 donneur (Saimiri splénoctomisé 10 jours avant l'infection) infecté avec l'échantillon d'un stabilat congelé de parasites (P. faciparum, souche Palo-Alto, FUP-1), une semaine auparavant. La figure s illustre les résultats obtenus concernant l'évolution des parasitémies (P sur l'axe des ordonnées) en fonction du nombre de jours (J) suivant les inoculations d'épreuve chez les singes vaccinés et chez les singes contrôle. Les courbes (a) relatives aux animaux du groupe II témoignent d'un développement rapide de la parasitémie dans les 4 à 6 jours suivant l'inoculation des animaux avec les globules rouges parasités obligeant l'expérimentateur à introduire un traitement chimiothérapique au 7ème jour après l'infection Au contraire les courbes (b) relatives aux animaux du groupe I font apparaître une guérison complète de 2 des animaux vaccinés, et pour le troisième un retard à la parasitémie qui ne se développe qu'à compter du 10ème jour. Il est intéressant de remarquer que les trois courbes (b) y compris celle relative à l'animal chez lequel la parasitémie a tout de même fini par se développer, témoignent toutes d'un accroissement puis même d'une réduction de la parasitémie entre les jours 4 et 6. Compte tenu de la nature virulente des parasites utilisés dans les innoculations d'épreuve et des résultats moins favorables obtenus à ce jour avec d'autres peptides immunogènes, la guérison totale chez deux singes vaccinés et le retard dans le développement de la parasitémie chez le troisième doivent être dans tous les cas interprétés comme le résultat d'un effet vaccinant réel de la composition selon 1' invention. L'invention concerne également les compositions qui ne mettraient en oeuvre que 2 des constituants définis plus haut sur les 3, par exemple des compositions contenant les antigènes i72 et EB 200 i72 et R 23 ; EB200 et R 23 respectivement. étant entendu que ces peptides peuvent être remplacés par des fragments ou protéines de fusion répondant aux conditions qui ont également été définies plus haut, les proportions de ces deux constituants devant alors être ajustés en fonction du résultat souhaité. L'invention concerne naturellement aussi les mélanges d'anticorps spécifiques qui peuvent être obtenus à partir des constituants respectifs des mélanges susdits de polypeptides. Ces mélanges d'anticorps peuvent être administrés in vivo, notamment dans le but d'interférer avec une parasitémie due à une infection par un parasite humain, notamment du type P. falciparum. Enfin, l'invention étend de même ses effets a des mélanges des séquences nucléiques dans lesquelles les différentes séquences nucléiques correspondantes auront été recombinées entre elles, dans des conditions autorisant leur expression sous la forme d'une protéine de fusion comprenant des séquences peptidiques correspondant aux séquences des trois constituants (entiers ou partiels) précédemment pris en considération. REVENDICATIONS 1. Mélange vaccinant contre la paludisme comprenant trois constituants définis dans ce qui suit comme "premier constituant", "deuxième constituant" et "troisième constituant", respectivement caractérisés en ce que - le "premier constituant" est constitué par un polypeptide dérivé d'un antigène majeur de P falciparum, ayant un poids moléculaire de l'ordre de 72 kDA, d'où l'appellation "Antigène 72 kDA" utilisée dans ce qui suit pour le désigner, particulièrement d'un polypeptide issu de cet antigène 72 kDA ayant la capacité, comme celui-ci * d'être reconnu par des anticorps protecteurs contenus dans des sérums ou des fractions immunoglobuliniques provenant d'animaux, notamment de singes SAIMIRI SCIUREUS, devenus résistants aux parasites après les infections répétées contrôlées par chimiothérapie, les dits sérums ou fractions étant susceptibles de rendre résistants des singes initialement sensibles ; * d'être lui-même inducteur, notamment chez le singe, et plus particulièrement chez le singe SAIMIRI SCIUREUS, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de P falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. ou par une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique. - le "deuxième constituant" correspond à au moins une partie de la séquence peptidique qui suit CT GAG GAA TGT CAA GGG GAA GTT TAT TTA TTT GTT AAA AAG ATA CCT ATA Glu Glu Cys Gln Gly Glu Val Tyr Leu Phe Val Lys Lys Ile Pro Ile GAG GTA TGG ATA AGA CAG TAC AAC TTG ATG AAT GAT AAT GAT GGA GAA Glu Val Trp Ile Arg Gln Tyr Asn Leu Met Asn Asp Asn Asp Gly Glu TAT TTA TTA GAT GGG GAA AAT TTT ATT ATG GAA GCA GTA GCC TGC GCT Tyr Leu Leu Asp Gly Glu Asn Phe Ile Met Glu Ala Val Ala Cys Ala TAT TTA AGC GAG CAT TAT CCT GGA CTC ACA CCT AAA TTG TAC AAG GTA Tyr Leu Ser Glu His Tyr Pro Gly Leu Thr Pro Lys Leu Tyr Lys Val TTA TAT GAG CCT GAA TGT GCT AAC TGT AAT GAA GAG GAT AAG AAT ATG Leu Tyr Glu Pro Glu Cys Ala Asn Cys Asn Glu Glu Asp Lys Asn Met AGT GAA GAT AAT CAT AAG AAG GAT AGT AAA CAT AAG GGG GAT AGT AAT Ser Glu Asp Asn His Lys Lys Asp Ser Lys His Lys Gly Asp Ser Asn CAC AAA AGT GAT AGT AAT CAC AAA AGT GAT AGT AAT CAC AAA AGT GAT His Lys Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Asp AGT AAT CAT AAA AGT GAT AGT AAT CAT AAA AGT GGT AGT AAT CAC AAA Ser Asn His Lys Ser Asp Ser Asn His Lys Ser Gly Ser Asn His Lys AGT GAT TGT AAT CAC AAG AGT GGT AGT AAT CAC AAG AGT GGT AGT AAT Ser Asp Cys Asn His Lys Ser Gly Ser Asn His Lys Ser Gly Ser Asn CAC AAG AGT GAT AGT AAT CAT CAA AGT GAT TGT AAT .. His Lys Ser Asp Ser Asn His Gln Ser Asp Cys Asn ... .. ... .. ... GAT CAT AAT CAC AAA AGC GAT . ... .. Asp His Asn His Lys Ser Asp CAT AAC CAC AAG AGC GAT AAT AAC CAC AAG AGT GAT CAT AAT CAC AAA His Asn His Lys Ser Asp Asn Asn His Lys Ser Asp His Asn His Lys AGT GAT CAT AAA AAA AAT AAT AAC AAT AAT AAG GAT AAT AAA AAT GAC Ser Asp His Lys Lys Asn Asn Asn Asn Asn Lys Asp Asn Lys Asn Asp GAT AAT GAT GAC AGT GAT GCA AGC GAT GCA GTT GAT GAA GAT ATT GAG Asp Asn Asp Asp Ser Asp Ala Ser Asp Ala Val Asp Glu Asp Ile Glu ATA CTT GAG TCT TAT AGT GAT TTG AAT AAA TTT AAT GAG ATG TTA ACA Ile Leu Glu Ser Tyr Ser Asp Leu Asn Lys Phe Asn Glu Met Leu Thr GAA CAA TTA AAT AAA MT AAG GAT GGA TAT GTT GTT TTG GTT ACT GAA Glu Gln Leu Asn Lys Asn Lys Asp Gly Tyr Val Val Leu Val Thr Glu TTA TTT GGT GAA GAT CTT TTT CAA TAT ATT AAT AAA AGG AAT GAA AAT Leu Phe Gly Glu Asp Leu Phe Gln Tyr Ile Asn Lys Arg Asn Glu Asn GAA GAT ACG CGT GTA AGA GAT GAA GAT AAA AAA ATA ATT ATG TTT GAA Glu Asp Thr Arg Val Arg Asp Glu Asp Lys Lys Ile Ile Met Phe Glu TTT TTA AAG TTA TTA ATA AAA TTA CAT AAT GCA GGA TTG GTA CAT CTT Phe Leu Lys Leu Leu Ile Lys Leu His Asn Ala Gly Leu Val His Leu GAT ATA TCT CCT GAA AAT ATA TTG ATA GAA AAT AAT GGT GAG TTA CGC Asp Ile Ser Pro Glu Asn Ile Leu Ile Glu Asn Asn Gly Glu Leu Arg TTA TGT GAT CTA GCT AAA TGT GCT CCA ATG TAT ACA CAC AAT TTA AGA Leu Cys Asp Leu Ala Lys Cys Ala Pro Met Tyr Thr His Asn Leu Arg CAT ATT AAA GGA AAT GGA AAC GAT TTG TAT TCA TTT CAA TCT TGT CAA His Ile Lys Gly Asn Gly Asn Asp Leu Tyr Ser Phe Gln Ser Cys Gln CCT TGT GTT GGA AAA ATC CCA TGT ATT CCA AAA GAG TGT TGG GAT ATT Pro Cys Val Gly Lys Ile Pro Cys Ile Pro Lys Glu Cys Trp Asp Ile ATT AGA GAA CAT ATA AAA TTA AAA ATA GAT AAT CCT TTT GAA CAT TTA Ile Arg Glu His Ile Lys Leu Lys Ile Asp Asn Pro Phe Glu His Leu TCA ACT ATT ACT GAT CAA GAA GAA AGA AAA AAA TAT TAT TTT GAT GTA Ser Thr Ile Thr Asp Gln Glu Glu Arg Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Val CAT TGT GTA GAT AAA TAT ATG CTT GGT ATA TTT TAT ATA TGG ATA TGG His Cys Val Asp Lys Tyr Met Leu Gly Ile Phe Tyr Ile Trp Ile Trp AAT TTA AAT TAT ATA TGG AAA CGA GCT GAC CCA CCA AAT GAT AGA ACA Asn Leu Asn Tyr Ile Trp Lys Arg Ala Asp Pro Pro Asn Asp Arg Thr TTT AAT AAT TTC TTA AAA TAT AAT TTA AAT ATA AAT GTA TTT CAG TTA Phe Asn Asn Phe Leu Lys Tyr Asn Leu Asn île Asn Val Phe Gin Leu GCC CAA CAA TGG CCA AAA GGT CTC AAA GAT ATA ATT AAC GTA AGA TAT Ala Gln Gln Trp Pro Lys Gly Leu Lys Asp Ile Ile Asn Val Arg Tyr ATA AGA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ATA ATA ATA ATA ATA ATG ATG Ile Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Ile Ile Ile Ile et Met TTT TAT ATA GTA TGT GCA TAG TGAATGTTTT TTTTTTATAT TTTAATACAT Phe Tyr lie Val Cys Ala *** GAAATGATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATTTTCTC TTTATAGAAA TTATTAAGCC TAGAAAGTAG AATGAAGACA GACTTAAATG AATTAACTGA ACATCCATGG TGGATTAATG AAGATTAATT TTAATTTTTT AAGTATTATA TGAATATTTA TTATTAGTAG AC TTTATATA TAACAATAAA TATTGACACG TGCAATATTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGA ATTAAAAAGG AATGTTTTAT TGTTTAGGAC TATATGGAAA AATAATAATA TAT ATATGTT TCCACATTAA AAA ou à une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique. - le troisième constituant est constitué par un polypeptide EB 200 contenant la séquence polypeptidique ci-dessous définie par sa séquence en acides aminés SVTGNILVEG SVTEEVVGEEK LVSEEIVTEEG SVAQEIVEEDA P A T E E I D E I E S V T E E V V E E E G P V D E E I V Q E E G TVTEEIIQGE S K V E E V V E E Q G S E N E E I F V E E V SASQEIVQNE SGTEEILELV SASQEIVQDG S V T E Q I I E E L F P V T E E V V N E E E ou une partie de cette séquence dès lors que celle-ci est apte, le cas échéant lorsqu'elle est incorporée à une protéine de fusion, oligomérisée ou conjuguée à une protéine porteuse, à induire in vivo une réponse immunitaire protectrice chez le singe écureuil Saimiri sciureus, notamment à induire in vivo des anticorps eux-mêmes capables d'inhiber l'invasion de globules rouges par des mérozoïtes. ou par une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique. 2. Mélange vaccinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que - le premier constituant est un polypeptide dont la séquence peptidique est représentée ci-dessous 1/1 31/11 CAT CGT ATG GTT AAT GAT GCT GAA AAA TAC AAA GCA GAA GAT GAA GAA AAC AGA AAA AGA asp arg met val asn asp ala glu lys tyr lys ala glu aso glu glu asn arg lys arg 61/21 91/31 ATC GAA GCA ACA AAC AGC CTT GAA AAT TAC TGC TAT GGA GTT AAA AGC TCA TTA GAA GAC ile glu ala arg asn ser leu glu asn tyr cys tyr gly val lys ser ser leu glu asp 121/41 151/51 CAA AAA ATT AAA GAA AAA TTA CAA CCA GCT GAA ATT GAA ACA TGT ATG AAA ACT ATT ACA gln lys 11. lys glu lys leu gln pro ala glu ile glu thr cys set lys thr Il. thr 181/61 211/71 ACC ATA CTT GAA TGG TTA GAA AAA AAC CAA CTT GCT GGA AAA GAT GAA TAT GAA GCC AAA thr ile leu glu trp leu glu lys asn gln leu ala gly lys asp glu tyr glu ala lys 241/81 271/91 CAA AAA GAA GCA GAA TCG GTT TGT GCT CCA ATT ATG TCT AAA ATC TAT CAA GAT GCT GCT gln lys glu ala glu ser val cys ala pro ile met ser lys ile tyr gln asp ala ala 301/101 331/111 GGT GCA GCC GGT GGT ATG CCA GGA GGT ATG CCC GGT GGA ATG CCA GGT GGA ATG CCA GGT gly ala ala gly gly met pro gly gly met pro gly gly met pro gly gly met pro gly 361/121 391/131 GGT ATG CCA GGT GGT ATG AAT TTC CCA GGA GGT ATG CCC GGA GCA GGA ATG CCA GGA AAT gly lot pro gly gly set asn phe pro gly gly set pro gly ala gly set pro gly asn 421/141 451/151 GCC CCA GCT GGA AGT GGA CCA ACA GTT GAA GAA GTT GAT TAA ACT AAT AAA AAA AAA AAA ala pro ala gly ser gly pro thr val glu glu val asp OCH thr asn lys lys lys lys 481/161 511/171 CAT TAA ACA GGA CAA ATA TAA AAA TAT ATA TAT TAT AAA AAT ATA TAT ATA TAT ATT TTT his OCH thr gly gln ile OCH lys tyr ile tyr tyr lys asn ile tyr ile tyr ile phe 541/181 571/191 TTT TTT TTT TTA CAT TTT TGT AAA TTA ATA TGA ATT phe phe phe leu his phe cys lys leu ile OPA ile ou par une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique. - le deuxième constituant est le peptide de formule LysSerAspSerAsnHisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspSerAsn HisMetSerAspHisAsnHisMetSerAspHisAsnHisLysSerAspHisAsnHisLys SerAspAsnAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAsp SerAsnHisLysSerAspHisAsn ou une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique. - le troisième constituant est un polypeptide dont la séquence peptidique est représentée ci-dessous 1/1 31/11 GGA TCC GTA ACT GAA GAA GTT GTA GGA GAA GAA AAA TTA GTT AGT GAA GAA ATA GTA ACG gly ser val thr glu glu val val gly glu glu lys leu val ser glu glu ile val thr 41/21 91/31 GAA GAA GGA TCT GTT GCT CAA GAA ATA GTA GAA GAA GAT GCA CCA GCT ACT GAA GAA ATT glu glu gly ser val ala gln glu ile val glu glu asp ala pro ala thr glu glu ile 121/41 151/51 GAT GAA ATA GAA TCA GTT ACT GAA GAA GTT GTC GAA GAA GAA GGA CCT GTT GAT GAA GAA asp glu ile glu ser val thr glu glu val val glu glu glu gly pro val asp glu glu 181/61 211/71 ATT GTA CAA GAA GAA GGT ACA GTT ACT GAA GAA ATA ATA CAA GGA GAA TCT AAA GTT GAA ile val gln glu glu gly thr val thr glu glu ile ile gln gly glu ser lys val glu 241/81 271/91 GAG GTC GTA GAA GAA CAA GGA TCT GAA AAT GAA GAA ATA TTC GTA GAA GAA GTA TCA GCT glu val val glu glu gln gly ser glu asn glu glu ile phe val glu glu val "r ala 301/101 331/111 TCT CAA GAA ATA GTA CAA AAT GAA TCA GGT ACC GAA GAA ATA TTG GAA AAA GTA TCA GCT ser gln glu ile val gln asn glu ser gly thr glu glu ile leu glu lys val ser ala 361/121 391/131 TCT CAA GAA ATA GTA CAA GAT GGA TCA GTT ACT GAA CAA ATA ATA GGA ATT ser gln glu ile val gln asp gly ser val thr glu gln ile ile gly ile ou par une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique. 3. Mélange selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la proportion de chacun des constituants est en une proportion comprise entre 20 et 80 % en moles du mélange, étant naturellement entendu que le total des trois proportions choisies ne saurait excéder 100 % en moles. 4. Polypeptide de fusion incluant en une seule molécule des séquences correspondant à celles des trois constituants du mélange selon la revendication 1 ou la revendication 2. 5. Mélanges d'anticorps spécifiques qui peuvent être obtenus à partir des constituants respectifs des mélanges de polypeptides selon la revendication 1 ou la revendication 2. 6. Composition immunogène contenant les constituants des compositions des revendications 1 à 4, associées à un véhicule pharmaceutiquement acceptable facilitant leur administration in vivo sous forme de vaccin. 7. Fragments d'acides nucléiques recombinés ou non avec des séquences d'ADN hétérologues, caractérisés en ce qu'ils codent pour les polypeptides des constituants des mélanges selon la revendication 1 ou la revendication 2 ou pour le polypeptide de fusion de la revendication 4.