Brevet FR2664289A1 — publié le 19920110

Procédé icrobioLosique de détection de produits toxiques minéraux ou organiques utiLisant des souches de Levures du genre Saccharomyces La présente invention concerne un procédé microbiologique de détection de produits toxiques, minéraux ou organiques, et les souches utilisables pour la mise en oeuvre de ce procédé. Elle s'applique en particulier au contrôle des eaux de distribution, des effluents et autres déchets industriels, agricoles ou urbains, destinés à être traités par voie biologique. Les rejets de substances toxiques, permanents ou accidentels par certaines industries, entreprises agricoles, centres hospitaliers etc. constituent une source de contamination susceptible de perturber plus ou moins gravement des écosystèmes naturels ou des procédés industriels de traitement biologique des déchets. En effet, les substances toxiques telles que les métaux lourds (plomb, mercure, sélénium, cadmium, cuivre, zinc, chrome, nickel, etc.), et les composés organiques tels que cyanures, composés organohalogénés, etc., se révèlent très nocifs pour l'environnement et représentent des produits particulièrement dangereux, soit par toxicité directe, soit par bioaccumulation dans des organismes maillons des chaînes alimentaires. Aussi, la présence de ces produits toxiques dans des liquides tels que les eaux de distribution, Les effluents et autres, doit être détectée le plus rapidement possible. De même, la présence de ces substances toxiques doit être détectée dans les déchets indus triels qui vont être soumis à des procédés de traitement par voie biologique, par exemple fermentation microbienne aérobie ou anaérobie, car la plupart des microorganismes sont sensibles à ces produits toxiques, qui nuisent au bon déroulement du traitement par voie biologique. On connaît certains procédés de détection de produits toxiques dans un milieu liquide ; en particulier, on peut mesurer les phénomènes d'inhibition engendrés par ces produits toxiques, par exemple par l'intermédiaire des variations de l'activité d'une enzyme spécifique ou sur la quantité de métabolite produite par un organisme vivant, comme il est décrit par Walker dans Fate and Effects of Pollutants, June 1989, p. 1077-1097, et par Munawar dans Hydrobiologia 149:87-105 (1987). Ces procédés connus ne sont toutefois pas utilisables dans tous les cas et ne permettent pas forcément l'obtention d'une réponse rapide. La présente invention a précisément pour objet un procédé microbiologique de détection de produits toxiques qui permet, d'une part, une détection rapide des produits toxiques présents dans un milieu plus ou moins complexe et, d'autre part, l'estimation de leur forme biologiquement active. Selon L'invention, le procédé de détection d'un produit toxique présent dans un milieu consiste à cultiver des microorganismes sensibles à ce produit toxique et capables de réaliser une fermentation éthanolique, dans un milieu de culture convenant pour cette fermentation et contenant un échantillon dudit milieu, et à déterminer le taux d'inhibition de fermentation éthanolique provoqué par la présence du produit toxique dans cet échantillon. Selon l'invention, on peut utiliser comme microorganisme une levure appartenant au genre Saccharomyces ou tout autre microorganisme bactérien ou fongique capable de réaliser une fermentation éthanolique. De préférence, on utilise la souche Saccharomyces LYA1 déposée sous le numéro 1-964 le 27/6/90 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de L'institut Pasteur, que l'on désignera ci-après sous la référence LyA1, ou la souche Saccha romyces LyBI déposée sous le numéro 1-965 le 27/6/90. à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de L'institut Pasteur, que l'on désignera ci-après sous la référence LYB1. Les caractéristiques des souches Loyal et LYBI sont données dans Les tableaux 1 et 2 annexés. On peut toutefois utiliser dans le procédé de l'invention d'autres microorganismes capables de réaliser une fermentation éthanolique à condition qu'ils aient une bonne sensibilité à des doses minimes du produit toxique à détecter, c'est-à-dire qu'une dose minime de produit toxique entrane une inhibition détectable de la fermentation éthano lique. Selon l'invention, le taux d'inhibition de fermentation éthanolique peut être déterminé en mesurant, soit la quantité de gaz carbonique produite par fermentation, soit la quantité de métabolite produite, par exemple d'éthanol. Ainsi, on peut déterminer le taux d'inhibi tion de fermentation éthanolique à partir des mesures des quantités de C02 ou d'éthanol produites par fermentation dans les mêmes conditions, en présence et en L'absence du produit toxique à détecter. Les conditions de fermentation sont choisies en fonction du microorganisme utilisé. Dans le cas ou ce microorganisme est une levure du genre Saccharomyces, on réalise de préférence la fermentation éthanolique dans un milieu de culture ayant un pH compris entre 2,5 et 7, avantageusement à pH 4, en atmosphère exempte d'oxygène. De préférence, encore on réalise la fermentation à une température de 18 à 360 C, avantageusement à 280C. L'échantillon de milieu à analyser qui contient le produit toxique à détecter peut être soumis préalablement à un prétraitement de nature physique ou physicochimique, avant d'être utilisé dans le milieu de culture pour la fermentation. Ce prétraitement peut consister en une dilution, une concentration, une précipitation, ou une minéralisation. On peut utiliser aussi d'autres techniques séparatives telles que la chromatographie, les séparations sur résines, gels filtrants, et la centrifugation. Ce prétraitement peut être effectué pour éliminer certains éléments gênants pour le procédé de détection par fermentation ou pour la détection et la mise en évidence de produits toxiques susceptibles d'être présents simultanément dans l'échantillon. Ainsi, dans le cas où les produits toxiques à détecter sont constitués par des métaux lourds, on peut effectuer une séparation préalable de certains métaux présents dans l'échantillon, effectuer des mesures sur un échantillon non soumis au prétraitement et sur l'échantillon prétraité pour déterminer chacun des métaux lourds présents dans l'échantillon. On peut réaliser également une détermination différentielle des différents produits toxiques en effectuant une première mesure à un premier pH du milieu, puis une seconde mesure après avoir modifié le pH car les profils d'inhibition peuvent être différents en fonction du pH et des produits toxiques à détecter. Dans ce cas, on détermine les variations du taux d'inhibition en fonction du temps pour identifier le produit toxique présent dans l'échantillon. Ainsi, le procédé de l'invention permet d'effectuer un diagnostic différentiel puis d'identifier certains toxiques métalliques, par exemple par l'examen du profil de cinétique d'inhibition. Le procédé de l'invention est très avantageux car il est facile à mettre en oeuvre et permet d'évaluer avec précision le degré de toxicité des produits toxiques biologiquement actifs présents. Par rapport aux procédés connus, il se révèle très fiable et facile à utiliser en routine, même dans le cas de milieux liquides très colorés ou très chargés en particules, tels que des boues de stations d'épuration. Il peut d'ailleurs être utilisé pour la détection de produits toxiques dans des milieux plus ou moins complexes (opaques, liquides, pâteux ou hétérogènes). Les produits toxiques susceptibles d'être détectés par le procédé de l'invention sont en particulier les métaux lourds tels que le plomb, le mercure, le cadmium, le sélénium, le cuivre, le zinc, le chrome, le nickel, etc. et leurs composés inorganiques ou organométalliques et les composés organiques et organohalogénés tels que le phénol, Le naphtalène, les dérivés chlorés du benzène comme le phényl chlorobenzène, etc. L'invention a également pour objet les microorganismes utilisés dans ce procédé de détection. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparatront mieux à la lecture de la description qui suit, donnée bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence au dessin annexé sur Lequel - la figure 1 est une représentation schématique d'un appareil utilisable pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, - la figure 2 est un diagramme représentant l'inhibition (exprimée en pourcentage de l'activité fermentaire éthanolique) de la souche LyB1 en fonction de la concentration en mercure d'un échantillon, - la figure 3 est un diagramme représentant l'inhibition (exprimée pl de C02/hxmg de biomasse et en pourcentage de l'activité fermentaire éthanolique) de la levure Ly A1 en fonction de la concentration en plomb d'un échantillon, et - la figure 4 est un diagramme illustrant l'inhibition (exprimée en pourcentage de l'activité de fermentation) de la souche LYB1 en fonction du temps, soit en présence de plomb, (courbe en trait plein), soit en présence de mercure, (courbe en pointillés) après un changement de pH du milieu de fermentation de 6,0 à 4,0. Sur la figure 1, on a représenté une installation pouvant être utilisée pour déterminer- le taux d'inhibition de fermentation éthanolique par mesure de la quantité de gaz carbonique dégagé. Ce dispositif comprend une fiole (1) conte nant le milieu de culture et le microorganisme utilisé. On peut introduire dans cette fiole (1) par la vanne (3) l'échantillon du liquide à analyser. La fiole (1) est en communication par sa partie supérieure avec un tube en U (5) servant de manomètre par l'intermédiaire d'une conduite (7). Le gaz dégagé dans la fiole (1) peut être mesuré par le microvolumètre (9) étalonné en microlitres et muni d'une molette de réglage (11) pour maintenir une pression constante dans la fiole (1) L'autre branche du manomètre est reliée à une fiole (13) destinée à compenser des microvariations de pression extérieures au système. Les deux branches du manomètres peuvent être reliées entre elles par une conduite munie d'une vanne (19). La fiole (13) et la conduite (15) débouchent dans une conduite générale (21)munie d'une vanne (23). Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, on introduit dans la fiole (1) dont le volume peut être d'environ 15ml, 2ml de milieu de culture qui renferme environ 106 cellules du microorganisme utilisé et qui contient un volume variable de l'échantillon à analyser. On purge tout d'abord le microréacteur de son air par balayage sous flux de gaz inerte tel que l'azote, en ouvrant les vannes (17, 19 et 3) pendant 3 min et en introduisant ce gaz par la vanne (23) à un débit de 3l/min. On ferme ensuite successivement les vannes (23, 3 et 19), puis on détermine la variation de pression dans la conduite (7) due au dégagement de gaz carbonique en la compensant par une variation de la capacité du microvolumètre (9) en déplaçant la molette de réglage (11). Les exemples suivants illustrent le dosage du mercure et du plomb par le procédé de détection de l'invention. Exemple 1: Dosage du mercure utilisant la souche de levure Saccharomyces LOB1. On utilise l'appareillage représenté sur la figure 1 et on introduit dans la fiole (1) 2ml du milieu de culture MFL et environ 2.108 cellules de levure Saccharomyces LyB1. Le milieu de culture MFL contient 20g/l de sucre fermentescible, 5g/l d'extrait de levure, et de l'eau distillée ou l'échantillon aqueux à analyser ou un mélange des deux. On réalise plusieurs dosages en utilisant des milieux de culture MFL contaminés par 1 à 10ppm de mercure sous forme de HgCl2. Après avoir purgé l'ensemble de l'appareillage de son air par balayage d'azote pendant 3min à un débit de 31/min, on réalise la fermentation à une température de 280C et un pH de 4,0, en soumettant le milieu de culture à une agitation à raison de 60 translations par minute. Après 10min de fermentation, on mesure le volume de gaz carbonique dégagé dans le microvolumètre (9). La mesure de référence pour déterminer le taux d'inhibition est effectuée dans les mêmes conditions sans adjonction de HgCl2, et elle correspond ici à 1100l de C02 par heure et par milligramme de biomasse poids sec de levure. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 2 qui représente l'inhibition (en % de l'activité fermentaire) par rapport à la quantité de mercure (en ppm) présente dans, l'échantillon. Sur cette figure, on voit que le seuil significatif de toxicité qui correspond au taux d'inhibition détectable, c'est-à-dire plus de 5% d'inhibition, est obtenu avec une concentration en mercure totale de l'échantillon de 3ppm, ce qui correspond à 40ppb (parties par billion) de mercure sous forme soluble. Le procédé de détection de l'invention est donc très intéressant puisqu'il permet de détecter rapidement des quantités biologiquement actives très faibles de mercure. ExeipLe 2 : Dosage du plomb dans un milieu filtré de digestat au moyen de la souche de levure Saccharomyces LYS1. On suit le même mode opératoire que dans l'exemple 1 pour déterminer l'inhibition de fermentation éthanolique, mais dans ce cas on utilise la souche LYA1 et on réalise la culture à une température de 360C et à un pH de 4, après avoir soumis au préalable l'échantillon à analyser à une filtration sur une membrane poreuse de 0,45pm. On détermine comme précédemment le taux d'inhibition en mesurant les quantités de C02 dégagées dans le microvolumètre (9). Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 3 qui représente le volume de C02 dégagé par h par mg de poids sec de biomasse (levure) en fonction de la concentration totale en plomb (en mg/l). On a également précisé sur cette figure les taux d'inhibition correspondants (en %). Ainsi, on voit qu'une concentration totale en plomb de 23mg/l correspond à un taux d'inhibition de 48%. ExeipLe 3 : Dosage du plomb et du mercure utilisant la souche Lys1. On suit le même mode opératoire que dans t'exemple 1, pour réaliser les dosages sur des milieux de culture contenant respectivement 50mg/l de Pb et 8mg/l de Hg, sauf que l'on réalise la fermentation à un pH de 6 et que l'on modifie le pH pour l'ajuster à 4 après 30min de fermentation, sans modifier les autres conditions opératoires. On observe alors des cinétiques dtinhibi- tion différentes pour le plomb et le mercure. Sur la figure 4, on a représenté l'inhibition (en % de l'activité fermentaire) en fonction du temps (en minutes), la courbe en trait plein se rapporte au milieu contenant 50mg/l de plomb et La courbe en pointillés se rapporte au milieu contenant 8mg/l de mercure. Ainsi, en effectuant des mesures sur un milieu contenant du Pb ou du Hg avant et après le changement de pH, on peut suivant le profil d'inhibition obtenu, identifier le toxique présent dans le milieu. Le procédé de l'invention est donc très intéressant puisqu'il permet d'établir un diagnostic différentiel des produits toxiques tels que les métaux lourds. On peut aussi obtenir ce diagnostic différentiel en effectuant un prétraitement de séparation des métaux, par exemple sur résines échangeuses d'ions. De plus, il peut être mis en oeuvre de façon automatique pour effectuer la surveillance séquentielle ou continue d'un milieu tel qu'un cours d'eau, un affluent ou un effluent d'installation industrielle telle qu'une station d'épuration, en utilisant par exemple une batterie de réacteurs alimentés en milieu de culture, en microorganismes et en échantillons à analyser. TABLEAU 1 Souche : Sacharomyces LyB1 ASSIMILATION FERMENTATION Substrat 3 jours 3 semaines Glucose + + + Galaclose + + + Saccharuse - - Maltose - - Cellobiose - - Trehalose - - Laclose - - Raffinose - - Amidon sol. - - Xylose - - IEST COMPLEMENTS L-Arabinose - Ribose - + Croissance à 37 C + Rhamnose - Erythritol - - Ethylomine HCl : Ribitol Cadaver ine: Mannitol - Ac succinique Croissanca 50% glucose: + Ac citrique Croissance-60% glucose: Inositol Ethanol 0,1% cyclcheximide: Glycerol 0,01% cyclcheximide: Nitrate Nitrite SPORULATION Sans vilamine - - Fowel : + Sorbose - Melibiose - - LAMES GELOSEES Melezitose - - Pseudomycélium: + Inuline vrai mycàlium: D-Arabninose - Glucosemine - Sorbitol - -methyl glucosidde- Salicine Ac lactique - Arbutine - Dulcitol - Xylitol - TABLEAU 2 Souche :Saccharomyces LyB1 ASSIMILATION FERMENTATION Substrat 3 jours 3 semaines Glucose + + + Galactose + + + Saocharose - - Maltose - - Cellobiose - - Trehalose - - Lactose - - Raffinose - - Amidon sol. - - Xylose - - TEST COMPLEMENTS L-Arabinose - Ribose - + Croissance à 37 C + Rhamonse - Erythritol - - Ethylamlne HCl: Rlbitol - - Caoavér ine Mannitol Acsuccinique - - Croissance 50% glucose Ac Citrique Croissance 60% glucose: Inositol - Ethanol +/- + 0,1% cyclocheximfde Glycerol - - 0,01% cyclocheximide:+ Nitrate Nitrite - - SPORULATION Sensvitamine - - Fowel: + Sorbose - Melibiose - - LAMES OELOSEES Melezitose - - Pseuchomycélium: Inuline - - vrsi mycélium:- D-Arabinose - Glucosamine - Sorbitol - -methyl qucosidde - Salicine - Ac lactique - Arbutine - Dulcitol - Xylitol - REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'un produit toxique présent dans un milieu, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver des microorganismes sensibles à ce produit toxique et capables de réaliser une fermentation éthanolique, dans un milieu de culture convenant pour cette fermentation et contenant un échantillon dudit milieu, et à déterminer le taux d'inhibition de fermentation éthanolique provoqué par la présence du produit toxique dans cet échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les microorganismes sont des levures appartenant au genre Saccharomyces. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le microorganisme est obtenu à partir de la souche Saccharomyces LyA1 déposée sous le n0 1-964 le 27/6/90 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'institut Pasteur. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le microorganisme est obtenu à partir de la souche Saccharomyces LYB1 déposée sous le n0 1-965 le 27/6/90 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'institut Pasteur. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on détermine le taux d'inhibition de fermentation éthanolique en mesurant les quantités de C02 produites par fermentation dans les mêmes conditions, en présence et en l'absence de l'échantillon contenant le produit toxique à détecter. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on détermine le taux d'inhibition de fermentation éthanolique en mesurant les quantités d'éthanol produites par fermentation dans les mêmes conditions, en présence et en l'absence dudit produit toxique. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le produit toxique est un métal lourd, un composé de métal lourd ou une molécule appartenant au groupe des toxiques organiques ou organohalogénés. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on détermine Les variations du taux d'inhibition en fonction du temps pour identifier le produit toxique présent dans l'échantillon. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le métal lourd est le plomb, le mercure, le cadmium, le sélénium, le cuivre, Le zinc, le chrome, ou le nickel. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on réalise la fermentation éthanolique dans un milieu de culture ayant un pH entre 2,5 et 7. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 10, caractérisé en ce que l'on réalise la fermentation éthanolique à une température de 18 à 360C. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on réalise préalablement un prétraitement de l'échantil- lon contenant le toxique. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le liquide est un effluent aqueux ou un déchet indus triel, agricole ou urbain. 14. Souche de Saccharomyces LyA1 déposée sous le n0 I-964 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur. 15. Souche de Saccharomyces LyB1 déposée sous le n I-965 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de L'institut Pasteur.