Brevet FR2668489A1 — publié le 19920430

Polypeptides impliqués dans l'expression de la résistance aux glycopeptides, notamment chez les bactéries à Gram-positif. Séquence nucléotidique codant pour ces polYpeptides et utilisation pour le diagnostic L'invention concerne les polypeptides associés à l'expression de la résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment chez des bactéries à Gram-positif, en particulier de la famille des cocci à Gram-positif. L'invention vise également une séquence nucléotidique codant pour ces polypeptides. Elle concerne aussi l'utilisation de ces polypeptides et de leur séquence nucléotidique en tant que moyens de détection in vitro d'une résistance à des glycopeptides. Parmi les cocci à Gram-positif, l'invention vise tout particulièrement les entérocoques, les streptocoques et les staphylocoques qui présentent un intérêt particulier pour la mise en oeuvre de l'invention. Les glycopeptides, parmi lesquels la vancomycine et la teicoplanine, sont des antibiotiques inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne. Ces antibiotiques sont très utilisés pour le traitement des infections sévères dues à des cocci à Gram-positif (enterocoques, streptocoques et staphylocoques), en particulier dans les cas d'allergie et de résistance aux pénicillines. Malgré un long usage clinique de la vancomycine, cet antibiotique est resté actif sur la quasi totalité des souches jusqu'en 1986, date à laquelle ont été isolées les premières souches résistantes. Depuis, la résistance aux glycopeptides a eté détectée par de nombreux microbiologistes en Europe et aux Etats Unis, notamment chez des souches isolées de malades immunodéprimés, rendant nécessaire une évaluation systématique de la sensibilité des germes en milieu hospitalier. L'activité des glycopeptides dépend de la formation d'un complexe entre l'antibiotique et les précurseurs du peptidoglycane, plus que de l'interaction directe avec des enzymes du métabolisme de la paroi cellulaire. En particulier on a constaté que les glycopeptides se fixent aux résidus terminaux D-alanyl-D-alanine (D-ala-D-ala) des précurseurs du peptidoglycane. L'émergence récente d'une résistance aux glycopeptides notamment chez des entérocoques et des staphylocoques, a conduit à l'obtention de certains résultats au niveau de la connaissance des facteurs conférant cette résistance. On a par exemple constaté dans une souche d'entérocoque particulière, Enteroccus faecium BM4147, que le déterminant de la résistance aux glycopeptides était localisé sur un plasmide de 34 kb, le plasmide pIP816 qui a été cloné dans E.coli (Brisson Noël et al, 1990, Antimicrob Agents Chemother 34, 924-927). D'après les résultats obtenus jusqu'à présent, la résistance aux glycopeptides était associée avec la production d'une protéine de poids moléculaire d'environ 40 kDa, la synthèse de cette protéine étant induite par des concentrations sous-inhibitrices de certains glycopeptides comme la vancomycine. En réalisant une étude plus approfondie de la résistance de certaines souches de cocci à Gram-positif vis à vis de glycopeptides notamment de la vancomycine ou de la teicoplanine, les inventeurs ont constaté que cette résistance serait liée à l'expression de plusieurs protéines ou polypeptides codés par des séquences généralement portées par des plasmides chez les souches résistantes. Les nouveaux résultats obtenus par les inventeurs permettent en outre de distinguer les gènes codant pour deux phénotypes de résistance, d'une part les souches hautement résistantes aux glycopeptides, d'autre part des souches résistantes à un bas niveau. Par souche résistante à un haut niveau, on entend une souche de bactérie en particulier une souche de cocci à Gram-positif pour laquelle les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de vancomycine et de teicoplanine sont respectivement supérieures à 32 et 8 pg/ml. Les CMI de la vancomycine vis à vis des souches résistantes à bas niveau sont comprises entre 16 et 32 pg/ml. Ces souches sont apparemment sensibles à la teicoplanine. Les inventeurs ont isolé et purifié, parmi les composants nécessaires à l'expression de la résistance aux glycopeptides, une protéine particulière dénommée VANA présentant une certaine homologie avec des Dalanine-D-alanine ligases. VANA est néanmoins fonctionnellement distincte des ligases. L'invention concerne des polypeptides ou protéines impliqués dans l'expression d'une résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides et notamment à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ainsi que les séquences nucléotidiques codant pour de tels complexes. L'invention vise également des sondes nucléotidiques utilisables pour la détection d'une résistance aux glycopeptides, notamment par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), ou par des tests faisant intervenir des anticorps. Les polypeptides impliqués dans l'expression de la résistance aux glycopeptides selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins 3 protéines ou toute partie de l'une ou plusieurs de ces protéines nécessaires pour conférer à des bactéries à Gram-positif, la résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ou de favoriser cette résistance, en particulier dans des souches de la famille des cocci à Gram-positif, ces protéines ou parties de protéines étant reconnues par des anticorps dirigés contre l'une des séquences identifiées dans la liste des séquences par SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3. Ces séquences sont encore désignées respectivement par ORFI, VANA (ou ORF2 ), ORF3; elles caractérisent les protéines de résistance telles qu'obtenues à partir de la souche Enterococcus faecium BM4147 décrite par Leclerq et al (N Engl J Med 319:157-161). Par l'expression "polypeptides" on entend tout enchaînement d'acides aminés pouvant contenir des protéines, ou d'une taille inférieure à celle d'une protéine. L'expression d'une résistance à des glycopeptides peut se traduire par la persistance d'une infection due à des germes habituellement sensibles aux glycopeptides. Un polypeptide ou une protéine est nécessaire à l'expression d'une résistance aux glycopeptides, dès lors que son absence rend la souche qui la contient plus sensible aux glycopeptides et que ce polypeptide n'est pas présent chez les souches sensibles. Différents niveaux de résistance aux glycopeptides existent parmi les souches de cocci à Gram-positif notamment. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les polypeptides entrant dans les définitions ci-dessus, correspondent à l'association des protéines indentifiées dans la liste des séquences par SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3. Les inventeurs ont donc constaté que l'expression d'une résistance aux glycopeptides chez des bactéries à Gram-positif, nécessite l'expression d'au moins trois protéines ou de polypeptides issus de ces protéines. Selon un premier mode de réalisation particulier de l'invention, les polypeptides sont encore caractérisés en ce que les séquences d'acides aminés nécessaires à l'expression de la résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides sont sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment des protéines correspondant aux séquences désignées par SEQ ID NO 4 ou SEQ ID NO 5 dans la liste des séquences,et qui correspondent respectivement à une séquence R de régulation, et à une séquence S senseur. Ces séquences de régulation sont notamment capables d'augmenter le niveau de résistance, dans la mesure où elles favorisent l'expression des protéines de résistance comprises dans les polypeptìes de l'invention. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les polypeptides ci-dessus sont codés par la séquence SEQ ID NO 6 identifiée dans la liste des séquences, qui représente la séquence codante des 5 protéines décrites précédemment. L'invention vise également les protéines purifié appartenant aus polypeptid g décritS précédemment. En particulier l'invention vise la protéine purifiée VANA, caractérisée en ce qu'elle correspond à la séquence d'acides aminés SEQ ID NO 2 dans la liste des séquences. La protéine VANA comporte 343 acides aminés et a un poids moléculaire calculé de 37400 Da. D'autres protéines intéressantes dans le cadre de l'invention correspondent aux séquences identifiées par SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 dans la liste des séquences. L'invention vise aussi toute combinaison de ces différentes protéines dans un complexe de résistance, ainsi que des protéines hybrides comprenant une ou plusieurs des protéines ci-dessus, ou partie de ces protéines, en association avec une séquence d'acides aminés déterminée. Entrent également dans le cadre de l'invention, les séquences nucléotidiques codant pour l'une des séquences d'acides aminés décrites ci-dessus. Une séquence particulière est la séquence nucléotidique de 7,3 kb environ, correspondant au fragment de restriction HindIII-EcoRI, tel qu'obtenu à partir du plasmide pIP816 décrit dans la publication de Leclercq et al - 1988, précitée. Cette séquence de 7,3 kb comprend l'enchaînement nucléotidique codant pour les 3 protéines de résistance et les 2 protéines de régulation dont il est question ci-dessus. Cette séquence codante est inclue dans un fragment interne BglII-XbaI. L'invention vise aussi tout fragment nucléotidique comprenant le susdit fragment de restriction ainsi que toute partie du fragment HindIII-EcoRI, en particulier le fragment de 3,4 kb environ EcoRI-XbaI codant pour les 3 protéines de résistance ou le fragment de 1,7 kb environ EcoRV-SacII codant pour VANA ou encore le fragment de 3,3 kb environ HindîlI-EcoRI codant pour les 2 protéines de régulation. Une autre définition d'une séquence nucléotidique de l'invention correspond à un fragment nucléotidique comportant dans l'ordre les sites de restriction suivants tel qu'obtenu à partir de pIP816 précité HindIII, BqlII, BqlII, EcoRI, BamHI, XbaI, EcoRI Une autre séquence nucléotidique selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement identifié par SEQ ID NO 7, ou en ce qu'elle comprend cet enchainement ou toute partie de cet enchaînement susceptible, - soit de constituer une sonde d'hybridation pour la détection d'une résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, en particulier dans des souches de la famille des cocci à Gram-positif, - soit de coder pour une séquence nécessaire à l'expression de la résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la vancomycine et/ou la teicoplanine, en particulier dans des souches de la famille des cocci à Gram-positif. La séquence SEQ ID NO 7 code pour les 3 protéines de résistance dont question ci-dessus. D'autres enchaînements nucléotidiques préférés sont les enchaînements SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, ou d'une variante de l'un de ces enchaînements dès lors qu'elle code pour une protéine ayant des propriétés immunologiques et/ou fonctionnelles similaires à celles des protéines codées par les enchaînements SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10. Ces séquences codent pour les 3 protéines de résistance. La séquence nucléotidique désignée par SEQ ID NO 8 correspond à un fragment d'ADN de 1029 pb situé entre le codon ATG en position 377 et le codon TGA en position 1406 sur le plasmide pAT214 (Fig. 6). L'invention vise également une séquence nucléotidique correspondant à l'enchaînement SEQ ID NO 6 correspondant à la séquence codante des 5 protéines (2 protéines de régulation et 3 protéines de résistance) ,et comprenant également les séquences flanquantes associées à ces séquences codantes, ou comprenant cet enchaînement. Entre aussi dans le cadre de l'invention une séquence modifiée par rapport à SEQ ID NO 6, caractérisée en ce qu'elle est dépourvue des séquences flanquantes. Ces séquences flanquantes sont les enchainements représentés dans les pages suivantes et délimitées comme suit: enchainement en amont de la séquence codant pour R: entre les bases 1 et 1476, enchainement entre la séquence codant pour la protéine senseur S et ORF1: entre les bases 3347 et 3500, enchainement en aval de la séquence codante ORF3:entre les bases 6168 et 7227. La séquence désignée par SEQ ID NO 6 est encore caractérisée par le fragment comportant les sites de restriction dans l'ordre suivant BqlIII - EcoRI - BamHI - EcoRI La localisation des protéines de régulation et de résistance est illustrée figure 3. Font également partie de l'invention, des séquences recombinantes caractérisées en ce qu'elles comprennent l'une des séquences nucléotidiques cidessus. L'invention concerne aussi un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques ci-dessus, en un site non essentiel pour sa réplication, sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression, de la résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la vancomycine ou la teicoplanine, chez un hôte déterminé. Des vecteurs recombinants particulièrement avantageux pour la mise en oeuvre de l'invention sont les vecteurs suivants : pAT214 contenant le fragment EcoRV - SacII de 1761 bp contenant une séquence nucléotidique codant pour la protéine VANA ; dans ces vecteurs les séquences de l'invention sont avantageusement placées sous le contrôle de promoteurs tels que le promoteur lac. L'invention vise aussi un hôte cellulaire recombinant comprenant une séquence nucléotidique telle que décrite précédemment ou un vecteur décrit cidessus, dans des conditions permettant l'expression de la résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la résistance à la vancomycine ou/et à la teicoplanine, cet hôte étant par exemple choisi parmi les bactéries, notamment les cocci à Gram-positif. Pour certaines applications on peut aussi utiliser les levures, les champignons, les cellules d'insectes ou de mammifères. L'invention vise également une sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est capable d'hybrider avec une séquence décrite précédemment, cette sonde étant le cas échéant marquée. Ces sondes peuvent être ou non, spécifiques des protéines de résistance aux glycopeptides. Des marqueurs utilisables pour les besoins de l'invention sont les marqueurs radioactifs connus ainsi que d'autres marqueurs tels que les marqueurs enzymatiques ou des marqueurs chémoluminescents. Des sondes ainsi marquées peuvent être utilisées dans des tests d'hybridation pour détecter une résistance aux glycopeptides chez des bactéries à Gram-positif. Dans ce cas, on pourra mettre en oeuvre des conditions de faible stingence. Des sondes nucléotidiques selon l'invention peuvent être caractérisées en ce qu'elles sont spécifiques chez des bactéries à Gram-positif des séquences codant pour une protéine de résistance à des glycopeptides notamment à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces sondes pouvant en outre être universelles parmi ces séquences. Par ces sondes spécifiques, on entend tout oligonucléotide hybridant avec une séquence nucléotidique codant pour l'une des protéines selon l'invention, telle que décrite dans les pages précédentes, et ne présentant pas de réaction d'hybridation croisée ou d'amplification (PCR) avec des séquences présentes chez l'ensemble des souches sensibles. Le caractère universel des oligonucléotides utilisables en PCR, est déterminé par leur capacité de promouvoir spécifiquement l'amplification d'une séquence nucléotidique impliquée dans la résistance chez une souche quelconque de bactérie à Gram-positif, résistante aux antibiotiques de la famille des glycopeptides. La taille des sondes nucléotidiques selon l'invention peut varier en fonction de l'utilisation recherchée. Pour les oligonucléotides utilisables en PCR on aura recours à des fragments de longueur usuelle dans cette technique. Pour réaliser des sondes, on peut prendre toute partie des séquences de l'invention, par exemple des sondes fragments de 200 nucléotides. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, une sonde nucléotidique est choisie pour sa spécificité vis à vis d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine nécessaire à l'expression chez des bactéries à Gram-positif d'un haut niveau de résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, en particulier à la vancomycine et à la teicoplanine. A titre d'exemple des sondes intéressantes pourront être choisies dans la partie intragénique du gène van A. D'autres sondes particulières de l'invention sont le caractère spécifique d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine nécessaire à l'expression chez des bactéries à Gram-positif d'un bas niveau de résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, en particulier à la vancomycine chez des bactéries à Gram-positif. On mentionne également que des sondes oligonucléotides qui seraient issues de la séquence du gène van A codant pour la protéine VANA peuvent être utilisées pour rechercher indifféremment une résistance de haut niveau ou de bas niveau. D'une façon particulièrement préférée, on caractérise une sonde de 1'invention en ce qu'elle hybride, avec une séquence nucléotidique non chromosomique d'une souche à Gram-positif résistante à des glycopeptides, notamment la vancomycine et/ou la teicoplanine, en particulier en ce qu'elle hybride avec une séquence nucléotidique non chromosomique d'une souche de cocci à Gram-positif, par exemple une souche d'entérocoque et de préférence E faecium 4147. Pour différencier des souches à haut niveau de résistance, de souches à bas niveau de résistance on pourra réaliser un test d'hybridation en mettant en oeuvre des conditions de forte stringence. Les oligonucléotides de l'invention peuvent être obtenus à partir des séquences de l'invention, par coupure avec des enzymes de restriction, ou par synthèse chimique selon les méthodes classiques. L'invention vise par ailleurs des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent le ou les polypeptides décrits ci-dessus ou une séquence d'acides aminés décrite ci-dessus. Ces Ces anticorps peuvent être obtenus selon les méthodes classiques de production d'anticorps. En particulier pour la préparation des anticorps monoclonaux on aura recours à la méthode de Kolher et Milstein selon laquelle on prépare des anticorps monoclonaux par fusion cellulaire entre des cellules de myélome et des cellules spléniques de souris préalablement immunisées avec un polypeptide selon l'invention, conformément au procédé classique. Les anticorps de l'invention sont avantageusement utilisables pour la détection de la présence de protéines caractéristiques d'une résistance aux glycopeptides, en particulier à la vancomycine et à la teicoplanine. Des anticorps particulièrement intéressants sont les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre la protéine VANA. De tels anticorps permettent avantageusement de détecter des souches de bactéries, en particulier des cocci à Gram-positif présentant une résistance à haut niveau vis à vis des antibiotiques de la famille des glycopeptides. Pour réaliser cette détection, on aura avantageusement recours à des anticorps marqués par exemple par une substance radioactive ou autre. Entrent donc dans le cadre de l'invention, des tests pour la détection chez les bactéries à Grampositif, d'une résistance aux glycopeptides, notamment des tests mettant en oeuvre les techniques ELISA. Un kit pour le diagnostic in vitro de la présence de souches à Gram-positif, résistantes aux glycopeptides, en particulier à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier aux cocci à Gram-positif par exemple des entérocoques, par exemple E faecium, caractérisé en ce qu'il comprend - des anticorps répondant à la définition ci-dessus, le cas échéant marqués, - un réactif pour la détection d'une réaction immunologique du type anticorps-antigène. Les moyens mis au point par les inventeurs présentent par ailleurs l'avantage tout à fait intéressant d'être adaptés pour la réalisation d'un test ou d'un kit rapide et fiable de détection de souches à Gram-positif, résistantes aux glycopeptides par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Un tel test permet d'améliorer la sensibilité des tests existants qui restent peu fiables et peut permettre dans certains cas la détection de l'ensemble des représentants de la famille des gènes codant pour des protéines de résistance aux glycopeptides chez des bactéries à Gram-positif. La réalisation d'un test par la méthode d'amplification des gènes de ces protéines est faite par la technique PCR ou par la technique IPCR (IPCR abréviation de réaction de polymérisation en chaîne inverse). La technique IPCR permet l'amplification des régions NHz et COOH terminales des gènes que l'on souhaite détecter. Certaines amorces particulières permettent d'amplifier les gènes des souches résistantes à bas niveau. Ces amorces sont par exemple choisies dans la séquence codant pour la protéine de résistance VANA. A titre d'exemple les séquences suivantes sont utilisables comme amorces ou comme sondes pour la détection d'une amplification pour la méthode PCR ou IPCR. P1 : GGX GAA GAT GGX TCX TTX CAA GGX G C AG C G A P2 : AAT ACX ATX CCX GGX TTT AC C T C C X représente l'une des bases A,T,C ou G ou encore correspond dans tous les cas à l'inosine. L'invention vise naturellement les sondes complémentaires des oligonucléotides précédemment décrits ainsi que éventuellement les sondes ARN qui leur correspondent. Un kit pour le diagnostic in vitro de la présence de souches à Gram-positif, résistantes aux glycopeptides, en particulier résistantes à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier aux cocci à Gram-positif, notamment en ce qu'il s'agit de souches d'entérocoques, par exemple E faecium, est caractérisé en ce qu'il comprend - une sonde nucléotidique répondant aux définitions ci-dessus et le cas échéant, - des oligonucléosides triphosphates en quantité suffisante pour permettre l'amplification de la séquence recherchée, - un tampon d'hybridation, - un agent de polymérisation d'ADN. L'invention vise aussi un procédé de détection in vitro de la présence de souches à Gram-positif, résistantes aux glycopeptides, en particulier à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier à la famille des cocci à Gram-positif, notamment en ce qu'il s'agit de souches d'entérocoques, par exemple E faecium, caractérisé en ce qu'il comprend a) la mise en contact d'un échantillon biologique susceptible de contenir les souches résistantes, avec une amorce constituée par une sonde ci-dessus décrite, ou toute partie d'une séquence précédemment décrite, capable d'hybrider, avec une séquence nucléotidique recherchée nécessaire à l'expression de la résistance aux glycopeptides, cette séquence étant utilisée comme matrice, en présence des 4 différents nucléosides triphosphates, et d'un agent de polymérisation, dans des conditions d'hybridation telles que pour chaque séquence nucléotidique ayant hybridé avec une amorce, un produit d'élongation de chaque amorce complémentaire de la matrice est synthétisé, b) la séparation de la matrice et du produit d'élongation obtenu, ce dernier pouvant alors également se comporter comme une matrice, c) la répétition de l'étape a) de façon à obtenir une quantité détectable des séquences nucléotidiques recherchées, d) la détection du produit d'amplification des séquences nucléotidiques. La détection des produits d'élongation de la séquence recherchée peut être réalisée par une sonde identique aux amorces mises en oeuvre pour effectuer la technique PCR ou IPCR, ou encore par une sonde différente de ces amorces, cette sonde étant le cas échéant marquée. Des détails concernant la mise en oeuvre des techniques PCR, peuvent être obtenus à partir des demandes de brevets EP 0229701 et EP 0200362. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent et dans les figures. Légende des figures - figure 1 : électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) des protéines des fractions membranaires lignes 1 et 4, poids moléculaires standards; ligne 2, E faecium BM4147 mis en culture en l'absence de vancomycine; ligne 3, BM4147 mis en culture avec 10 p g/ml de vancomycine. La tête de flèche indique la position de la protéine VANA. - figure 2 : A : Cartes de restriction des insérats des plasmides pAT213 et pAT214. Le vecteur et l'insérat d'ADN sont distingués par des segments clairs et sombres respectivement. La flèche ouverte représente le gène van A. B : Stratégie pour le séquençage nucléotidique pour 1'insérat de 1761 bp dans le plasmide pAT214. Les flèches indiquent la direction et l'étendue des réactions de séquençage par la méthode didéoxy. L'amorce synthétique d 'oligonucléotides (5' ATGCTCCTGTCTCCTTTC 3' OH) est complémentaire de la séquence entre les positions 361 et 378. Seuls les sites de restriction pertinents sont donnés. - figure 3 : position des séquences R,S,ORF1,ORF2,0RF3. figure 4 : représentation de SEQ ID NO 6 - figure 5 : représentation de SEQ ID NO 6 et de la protéine correspondante. figure 6 : séquence du gène VANA et la protéine correspondante. Matériels et méthodes pour l'indentification et la caractérisation du gène van A Souches bactériennes et plasmides L'origine des plasmides utilisés est donnée dans le tableau ci-après. Souche ou plasmide Source ou Référence Escherichia Coli JM83 Messing (1979) AR1062 Rambach et Hogness (1977) JM103 Hannshan (1983) ST640 Lugtenberg et van Schijndel van-Dam (1973) Enterococcus faecium BM4147 Leclercq et al (1988) Plasmide pUC18 Norrander et al (1983) pAT213 Brisson-Noêl et al (1990) pAT214 This work Préparation des membranes d'enterococcus Enterococcus faecium BM4147 a été cultivé jusqu'à l'obtention d'une densité optique (DO600) de 0,7 dans 500ml de milieu broth BHI. L'induction a été réalisée avec 10 pg/ml de vancomycine (Eli Lilly Indianapolis Ind). Les étapes ultérieures ont été réalisées à 4 C. Les cellules ont été récupérées par centrifugation pendant 10 minutes à 6000g, lavées dans un tampon TE (0,01 M TRIS-HC1, 0,002 M EDTA, pH 7,0) et fragmentées avec des billes de verre (100 zm de diamètre) dans un appareil Braun pendant 2 minutes. Les débris cellulaires ont été séparés par centrifugation pendant 10 minutes à 6000g. Les membranes ont été collectées par centrifugation pendant 1 heure à 65000g et resuspendues dans 0,5ml de tampon TE. Préparation des extraits protéiques Des plasmides ont été introduits par transformation dans la souche E.coli AR1062 préparée sous forme de sac bactérien. Les sacs bactériens ont été récupérés à partir de gradients de sucrose et les protéines ont été marquées avec 50 pCi de (35S)L- methionine (Amersham, Grande-Bretagne) selon la méthode de Rambach et Hogness (1977, P.N.A.S. USA, 74; 5041-5045). Préparation des fractions membranaires et des fractions cytoplasmiques de E.coli E.coli JM83 et des souches dérivées ont été mises en culture dans un milieu BHI jusqu'à l'obtention d'une densité optique (DO600) de 0,7, lavées et suspendues dans un tampon TE. La suspension cellulaire a été traitée par ultrasons pendant 20 secondes avec des doses de 50 W dans un appareil de fragmentation de cellules dans un appareil à ultrasons Branson B7 et les cellules intactes ont été récupérées par centrifugation pendant 10 minutes à 6000g. Le surnageant a été fractionné en fractions membranaire et cytoplasmique par centrifugation pendant 1 heure à 100000g. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) Les protéines des fractions bactériennes ont été séparées par SDS-PAGE dans des gels à gradient linéaire de polyacrylamide (7,5% - 15%) (Laemmli 1970, Nature 227 : 680-685). L'electrophorèse a été réalisée pendant 1 heure à 200 V puis 3 heures à 350 V. Les gels ont été colorés avec du bleu de Coomassie. Les protéines des extraits des sacs bactériens ont été séparées dans des gels de 10% de polyacrylamide et visualisées par autoradiographie. Purification de la bande protéique et détermination de la séquence N-terminale Les protéines des fractions membranaires d'une culture induite de E.faecium BM4147 ont été séparées par SDS-PAGE. Le gel a été electrotransféré pendant 1 heure à 200 mA sur une membrane de polyvinylidène difluorure (Immobilon Transfer, Millipore) en utilisant un appareil de blott (Electrophoresis Unit LKB 2117 Multiphor II) selon les recommandations du fabricant. Les protéines transférées ont été colorées avec le rouge de Ponceau. La portion de membrane portant la protéine intéressante a été coupée, centrée sur un filtre en teflon et placée dans la cartouche du bloc d'un séquenceur (Séquenceur Applied Biosystems modèle 470A). La protéine a été séquencée par la dégradation automatisée de Edman (1967, Eur. J.Biochem 1; 80-81). Construction de plasmides Le plasmide pAT213 (Brisson-Noël et al, 1990, Antimicrob Agents chemother, 34; 924-927) consiste en un fragment d'ADN EcoRI de 4,0 kb du plasmide pIP816 d'entérocoque cloné au site EcoRI d'un vecteur navette gram-positif-gram-négatif pAT187 (Trieu-Cuot et al, 1987, FEMS Microbiol Lett 48; 289-294). Pour construire pAT214, le fragment d'ADN de 1761 bp EcoRV-SacII de pAT213 a été purifié, traité avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I de E.coli et ligué à l'ADN de pUC18 préalablement digéré avec SmaI et déphosphorylé (figure 2).Le clonage (Maniatis et al, 1982 Cold Spring Harbor Laboratory Press) a été réalisé avec des endonucléases de restriction (Boehringer Mannheim et Pharmacia) avec la ligase ADN T4 (Pharmacia) et la phosphatase alcaline (Pharmacia) selon les recommandations du fabricant. Sous-clonage dans M13 et séquence nucléotidique Les fragments d'ADN de restriction ont été sousclonés dans le polylinker des formes de réplication des dérivés mpl8 et mpl9 du bactériophage M13 (Norrander et al, 1983, Gene 26; 101-106), obtenus auprès de Pharmacia P-L Biochemicals. E.coli JM103 a été transfecté avec des phages recombinants et de 1 l'ADN simple brin a été préparé. Le séquençage nucléotidique a été réalisé par la méthode didéoxy de terminaison de chaîne (Sanger et al, 1977, P.N.A.S USA 74; 5463-5467) en utilisant une ADN T7 polymérase ( Sequenase, United States Biochemical Corporation, Cleveland Ohio) et de l'(a35S]dATP (Amersham, Grande-Bretagne).Les produits des réactions ont été révélés dans des gels de polyacrylamide contenant un tampon dénaturant à 6%. Analyse informatique et données sur la séquence La séquence d'ADN complète a été assemblée en utilisant les programmes d'ordinateur DBCOMP et DBUTIL (Staden, 1980, Nucleic Acids Res 8; 3673-3694). La banque de données de protéines, PSEQIP de l'Institut Pasteur a été criblée en utilisant un alogorythme développé par Claverie (1984, Nucleic Acids Res 12; 397-407). Les alignements entre des paires de séquences d'acides aminés ont été construits en utilisant l'algorythme de Wilbur et al (1983, P.N.A.S USA 80; 726-730). La signification statistique de l'homologie a été évaluée avec l'algorythme de Lipman et Pearson (1985, Science 227; 1435-1440). Pour chaque comparaison 20 séquences d'acides aminés ont été utilisées pour calculer les moyennes et les déviations standard des résultats aléatoires. Tests de complémentation génétique Les plasmides ont été introduits par transformation dans E.coli ST640, un mutant sensible à la température avec une ligase non modifiée D-ala-D-ala (Lugtenberg et al 1973, J. Bacteriol 110; 26-34). Les transformants ont été sélectionnés à 300C sur des plaques contenant 100 pg/ml d'ampicilline et la présence de l'ADN plasmidique de la taille recherchée et les cartes de restriction ont été vérifiés.Des colonies uniques poussées à 300C dans un milieu BHI broth contenant de l'ampicilline ont été placées à la fois sur un milieu agar BHI contenant 100 pg/ml d'ampicilline et dans 50 pM d'isopropyle-1-thio-ss-D- glacto-pyranoside (IPTG) et les plaques ont été incubées à une température permissive de 30"C ou non permissive de 42"C. Le test de complémentation était considéré comme positif si les colonies étaient présentes après 18 heures d'incubation à 40 C. Résultats Identification de la protéine VANA et séquence Nterminale Les fractions membranaires des E faecium BM4147 mis en culture d'une part dans des conditions d'induction, et d'autre part en l'absence d'induction, ont été analysées par SDS-PAGE. La seule différence détectable associée avec l'exposition à des concentrations sous-inhibitrices de vancomycine a été l'intensification marquée d'une bande qui correspondait à une protéine de poids moléculaire estimé d'environ 40 kDa. Dans les cellules induites et dans les cellules non induites, la bande protéique représente la même protéine puisque cette bande est absente des membranes d'un dérivé de BM4147 qui a perdu le plasmide pIP816. La protéine inductible, désignée par VANA a été purifiée après SDS-PAGE et une dégradation automatisée de Edman a été réalisée sur un échantillon de 50 pmol. Neuf acides aminés de la séquence N-terminale de VANA ont été identifiés : Met Asn Arg Ile Lys Val Ala Ile Leu. Sous-clonage du gène vanA L'insérat de 4,0 kb du plasmide pAT213 porte le déterminant de la résistance aux glycopeptides de E faecium BM4147. Divers fragments de restriction de cet insérat ont été sous-clonés dans pUC18 et les plasmides recombinants spécifiques de VANA dans E.coli ont été identifiés par analyse SDS-PAGE des protéines des fractions cytoplasmique et membranaire ou des extraits de sacs batériens. Cette approche a été utilisée car E.coli qui est intrinsèquement résistant au glycopeptide. L'insérat EcoRV-SacII du plasmide pAT214 (figure 2) code pour un polypeptide unique de 40 kDa qui migre conjointement avec VANA, issu des préparations membranaires de E faecium BM4147. Séquence nucléotidique de l'insérant dans pAT214 et identification de la séquence codante vanA La séquence nucléotidique de l'insérat EcoRV-SacII de 1761 bp dans pAT214 a été déterminée sur les deux brins de 1'ADN selon la stratégie décrite à la figure 2. La localisation des codons de terminaison (TGA, TAA, TAG) dans trois cadres de lecture sur chaque brin d'ADN a montré la présence d'un unique cadre de lecture ouvert (ORF) ayant une taille suffisante pour coder pour la protéine VANA. Ce cadre de lecture ORF est localisé entre le codon TAA en position 281 et le codon TAG en position 1406. La séquence d'acides aminés déduite de ORF a été comparée avec celle de l'extrémité N-terminale de VANA.Les neufs acides aminés identifiés par le séquencage protéique sont codés par la séquence nucléotidique débutant avec le codon ATG (méthionine) en position 377 (figure 3). Ce codon d'initation de traduction est précédé par une séquence (TGAAAGGAGA), caractéristique d'un site de liaison au ribosome (RBS) de bactéries à Gram-positif qui est complémentaire pour les 8 bases de l'ARNr de la sous-unité 16S de Bacillus subtilis dans sa partie (3'OH UCUUUCCUCC 5') (Moran et al, 1982, Mol. Gen. Genet. 186; 339-346). Dans ce cadre ORF, il n'y a pas d'autre codon d'initiation ATG ou GTG entre les positions 281 et 377. La séquence de 1029 bp qui s'étend du codon ATG en position 377 au codon TGA en position 1406 code pour une protéine contenant 343 résidus d'acides aminés.Le poids moléculaire calculé de cette protéine est 37400 Da ce qui est en accord avec l'estimation de 40 kDa obtenue par l'analyse SDS PAGE. Homologie des séquences d'acides aminés de VANA et des enzymes ligases D-ala-D-ala Le screening de la banque de données de protéines, PSEQIP a montré l'existence d'une homologie de séquences entre VANA et les ligases D-ala-D-ala de E.coli (ECOALA, Robinson et al, 1986, J. Bacteriol 167; 809-817) et de Salomella typhimurium (DALIG, Daub et al, 1988, Biochemistry 27; 3701-3708). Le pourcentage de similarité calculé par paires de protéines était entre 28% et 36% pour les acides aminés identiques et entre 48% et 55% en tenant compte des acides aminés homologues. VANA et DALIG sont plus étroitement liées. La signification statistique de ces similarités a été évaluée en alignant VANA et des séquences contenant la même composition en acides aminés que DALIG ou ECOALA (Lipman et Pearson, 1985, Science 227; 1435-1440). Test de complémentation génétique pour l'activité de ligase D-ala-D-ala La souche E.coli ST640 est un mutant thermosensible présentant une activité ligase D-ala-Dala déficiente (Lugtenberg et al, 1973, J. Bacteriol 113 : 96-104). Les plasmides pUC18 et pAT214 ont été introduits par transformation dans E.coli ST640. Les souches ST640 et ST640 (pUC18) ont poussé normalement uniquement à la température permissive (30"C) alors que E.coli ST640 (pAT214) a poussé à la fois à la température permissive et à la température non permissive (42"C). Ce test montre que VANA est biologiquement active dans E.coli et est probablement capable de catalyser la même réaction de ligation que DALIG. Les séquences qui font l'objet de l'invention sont données dans les pages suivantes après la liste des séquences contenant la description de ces séquences. Dans la liste des séquences, les protéines sont repérées par rapport à la position des bases nucléotidiques correspondant aux acides aminés des extrémités des protéines. Liste des séquences ( contenues dans la séquence présentée ci-après) - Séquences d'acides aminés SEQ ID NO 1 : séquence de la première protéine de résistance, correspondant à la séquence d'acides aminés de la phase de lecture ouverte n"3 , commençant à la base 3501 et se terminant à la base 4529, SEQ ID NO 2 : séquence de la protéine VANA, correspondant à la séquence d'acides aminés de la phase de lecture ouverte n"l, commençant à la base 4429 et se terminant à la base 5553, SEQ ID NO 3 : séquence de la troisième protéine de résistance, correspondant à la séquence d'acides aminés de la phase de lecture ouverte n"3, commençant à la base 5526 et se terminant à la base 6167, SEQ ID NO 4 : séquence de la protéine de régulation R, correspondant à la séquence d'acides aminés de la phase de lecture n"l, commençant à la base 1477 et se terminant à la base 2214, SEQ ID NO 5 : séquence de la protéine senseur S, correspondant à la séquence d'acides aminés de la phase de lecture ouverte n 2,commençant à la base 2180 et se terminant à la base 3346. - Séquences nucléotidiques SEQ ID NO 6 : séquence nucléotidique contenant la séquence codant pour les 5 protéines, ainsi que les séquences flanquantes SEQ ID NO 7 : séquence contenant la séquence codant pour les 3 protéines de résistance, ainsi que les séquences flanquantes et commençant à la base 3501 et se terminant à la base 6167, SEQ ID NO 8 : séquence du gène van A, commençant à la base 4429 et se terminant à la base 5553, SEQ ID NO 9 : séquence codant pour la première protéine de résistance, commençant à la base 3501 et se terminant à la base 4529, SEQ ID NO 10 : séquence codant pour la troisieme protéine de résistance, commençant à la base 5526 et se terminant à la base 6167. LysLeuPhePheLeuLeuIleCys***ArgPheThrAsnArgIleLys***LeuLeuPhe SerPheSerPheCysSerPheValArgAspLeuLeuThrValLeuAsnSerPhePheSer AlaPheLeuPheAlaHisLeuLeuGlulleTyr* **ProTyr** * IleAlaSerPheGln AAGCTTTTCTTTTTGCTGATTTGTTAGAGATTTACTAACCGTATTAAATAGCTTATTTTC SerHisCysProCysPheProHisHisSerPheLysCysSerAspSerArgGlnTyrAsn AlaIleAlaLeuAlaSerHisThrIleLeuSerSerValValIleAlaGlySerIleIle ProLeuProLeuLeuProThrProPhePheGlnVal*********GlnAlaVal***Phe AGCCATTGCCCTTGCTTCCCACACCATTCTTTCAAGTGTAGTGATAGCAGGCAGTATAAT 100 PheValPheSer***LysIleTyrAlaPheMetGln***MetAsnGlyIleThrIlePhe LeuPhePheLeuArgLysSerMetHisSerCysSerArg***MetAlaSerProPheSer CysPhePheLeuGluAsnLeuCysIleHisAlaValAspGluTrpHisHisHisPhePro TTTGTTTTTTCTTAGAAAATCTATGCATTCÂTGCAGTAGATOAATGGCATCACCATTTTC GlnSer***LeuMetLysValLeuLysCysHisSerIlePheThrGlnGlyGlnSerTyr LysAlaAsn* *****ArgTyrteuAsnVallleArgTyrSerteuArgvalLysValThr lysteulleAspGluGlyThr***MetSerPheAsplleRisSerGly***LysteuGln CAAAGCTAATT GATGAAGGTACTTAAATG TCATTCGATATTCACTCAGGGTAAAAGTTAC . 200 . - LysvalValPheThrserAsnPhePheGlnMetlleProtysCyslle?heProLeuArg LysSerTyrSerLeuArgIleSerPheLys***SerGlnSerValPheSerLeu***Gly SerrgIleHisPheG1uPhe1euSerAsnAspProLysValTyrPheProPheG1uAsp AAAGTCGTATTCACTTCGAATTTCTTTCAAATGATCCCAAASTGTATTTTCCCTTTGAGG 300 IleMetIleLysArgGlyTrpThrAsnThrAsnLeuPheArgTyrIleLeuTyrAspArg ******SerSerGluAspGlyLeuThrProIleCysPheAspIleTyrCysMetThrGlu AsnAspGlnAlaArgMetAsp***HisGlnSerValSerIleTyrIleVal***ProAsn ATAATGATCAAGCGAGGATGGACTAACACCAATCTGTTTCGATATATATTGTATGACCGA IleTrpAspAlaPheAspMertSerValTrpProThrGlyIleProLysAsnSer***Leu SerGlyMetLeuLeuIle***ValTyrGlyGlnProGlyTyrArgArgThrAlaAsn*** LeuGlyCysPhe***TyrGluCysMetAlaAsnArgAspT:arGluGluGlnLeuIleGlu ATCTGGGATGVTTTTGATATGAGTGTATGGCCAACCGGGATACCGAAGAACAGCTAATTG 400 AsnSerLysSer***Thrva1PhePheProProSerLeuI1enTyrPhe***I1e?ro ThrA1aAsnProLysArgPheSerSerLeuLeuArgLeuLeThrI1eSerLysSerArg GlnGlnIleLeuAsnGlyPheLeuProSerPheAlaTyr***LeuPheLeuAsnProVal AACAGCAAATCCTAAACGGTTTCTTCCCTCCTTCGCTTATTAACTATTTCTAAATCCCG PheGlyLysSerGluValGlyProGlnTyrProPheIlePheArgAspLeuHisLysSer LeuGluLysValLys* **ValProSerlleHisserserSerGlylleCyslletysAla TrpLysLys***SerArgSerProValSerIleHisLeuGlnGlyPheAla***LysPro TTTGGAAAAAGTGAAGGTAGGTCCCCAGTATCCATTCATCTTCAGGGATTTGCATAAAAGC 500 . . 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XbaI,le fragment d'environ 1,7 kb EcoRV - SacII et le fragment de 3,3 kb HindIII - EcoRI. 9/ Séquence nucléotidique selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comporte dans l'ordre les sites de restriction suivants tel qu'obtenus à partir du plasmide pIP816 HindIII, BqlII, BqlII, EcoRI, BamHI, XbaI, EcoRI 10/ Séquence nucléotidique selon 1 'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement identifié par SEQ ID NO 7, ou en ce qu'elle comprend cet enchainement ou toute partie de cet enchaînement susceptible, - soit de constituer une sonde d'hybridation pour la détection d'une résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, en particulier dans des souches de la famille des cocci à Gram-positif, - soit de coder pour une séquence nécessaire à l'expression de la résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la vancomycine et/ou la teicoplanine, en particulier dans des souches de la famille des cocci à Gram-positif. 11/ Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu'il s'agit de l'un des enchaînements SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, ou d'une variante de l'un de ces enchaînements dès lors qu'elle code pour une protéine ayant des propriétés immunologiques et/ou fonctionnelles similaires à celles des protéines codées par les enchaînements SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10 12/ Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'enchaînement SEQ ID NO 6 ou en ce qu'elle comprend cet enchaînement. 13/ Séquence recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 7 à 12. 14/ Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, en un site non essentiel pour sa réplication, sous le contrôle d'eléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression, de la résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la vancomycine ou la teicoplanine, chez un hôte déterminé. 15/ Vecteur recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pAT214. 16/ Hôte cellulaire recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 7 à 13 ou un vecteur selon la revendication 14 ou la revendication 15, dans des conditions permettant l'expression de la résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, notamment la vancomycine ou la teicoplanine, cet hôte étant par exemple choisi parmi les bactéries, notamment les cocci à Gram-positif. 17/ Sonde nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est capable d'hybrider avec une séquence selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, cette sonde étant le cas échéant marquée. 18/ Sonde nucleotidique selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est spécifique chez des bactéries à Gram-positif, des séquences codant pour une protéine de resistance à des glycopeptides notamment à la vancomycine et/ou à la teicoplanine et universelle parmi ces séquences. 19/ Sonde nucléotidique selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est spécifique d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine nécessaire à l'expession d'un haut niveau de résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, en particulier à la vancomycine et à la teicoplanine, chez des bactéries à Gram-positif. 20/ Sonde nucléotidique selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle est spécifique d'une séquence nucléotidique codant pour une protéine nécessaire à l'expression d'un bas niveau de résistance à des antibiotiques de la famille des glycopeptides, en particulier à la vancomycine, chez des bactéries à Gram-positif. 21/ Sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisée en ce qu'elle hybride avec une sequence nucléotidique non chromosomique d'une souche résistante à des glycopeptides, notamment la vancomycine et/ou la teicoplanine, en particulier en ce qu'elle hybride avec une séquence nucléotidique non chromosomique d'une souche de cocci Gram-positif, par exemple une souche d'entérocoque et de préférence E faecium 4147. 22/ Anticorps polyclonaux ou monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent le complexe polypeptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou une séquence d'acides aminés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 23/ Kit pour le diagnostic in vitro de la présence de souches résistantes aux glycopeptides, en particulier à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier aux cocci à Gram-positif, notamment en ce qu'il s'agit des souches d'entérocoques, par exemple E faecium, caractérisé en ce qu'il comprend - des anticorps selon la revendication 22, le cas échéant marqués, - un réactif pour la détection d'une réaction immunologique du type anticorps-antigène. 24/ Kit pour le diagnostic in vitro de la présence de souches résistantes aux glycopeptides, en particulier résistantes à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier aux cocci à Gram-positif notamment en ce qu'il s'agit de souches d'entérocoques, par exemple E faecium, caractérisé en ce qu'il comprend - une sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, et le cas échéant, - des oligonucléosides triphosphates dATP, dCTP, dTTP, dGTP, - un agent de polymérisation d'ADN. 25/ Procédé de détection in vitro de la présence de souches résistantes aux glycopeptides, en particulier à la vancomycine et/ou à la teicoplanine, ces souches appartenant en particulier à la famille des cocci Gram-positif, notamment en ce qu'il s'agit de souches d'entérocoques, par exemple E faecium, caractérisé en ce qu'il comprend a) la mise en contact d'un échantillon biologique susceptible de contenir les souches résistantes, avec une amorce constituée par une sonde selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, capable d'hybrider avec une séquence nucléotidique recherchée, nécessaire à l'expression de la résistance, cette séquence étant utilisée comme matrice, en présence des 4 différents nucléosides triphosphates, et d'un agent de polymérisation, dans des conditions d'hybridation telles que pour chaque séquence nucléotidique ayant hybridé avec une amorce, un produit d'élongation de chaque amorce complémentaire de la matrice est synthétisé, b) la séparation de la matrice et du produit d'élongation obtenu, ce dernier pouvant alors également se comporter comme une matrice, c) la répétition de l'étape a) de façon à obtenir une quantité détectable des séquences nucléotidiques recherchées, d) la détection du produit d'amplification des sequences nucléotidiques.