Brevet FR2672605A1 — publié le 19920814

La présente invention est du domaine des biotechnologies et a pour objet un procédé d'obtention d'un produit biologique à partir de la larve du ver à soie (BOMBYX MORI), le produit obtenu suivant le procédé et des applications de ce produit aux domaines de la deimacosmétique, de la pharmaceutique et de la diététique. Actuellement, il existe sur le marché de nombreuses matières premières visant ces domaines, d'origine végétale ou animale (organique, placentaire, embryonnaire...) ainsi que des extraits de chrysalide ou nymphes, notamment de BOMBYX MORI et meme des extraits de soie. Par ailleurs, la chenille de BOMBYX est connue pour ses qualités nutritionnelles, en particulier dans les pays tropicaux et équatoriaux où elle permet de limiter les carences nutritionnelles multiples à ceux qui en consomment ; en effet, cet aliment comporte des vitamines, oligoéléments, protéines (dont acides aminés essentiels), lipides (dont acides gras essentiels) en quantités très intéressantes. De très nombreuses publications ont décrit les techniques de traitement des larves, de BOMBYX MORI notamment, et ont fourni des analyses des produits extraits de ces larves. Depuis 1935, grâce aux travaux de l'Américain WILLIAMS et de l'Allemand WEGGLEWORTH, on sait que la chrysalide de BOMBYX MORI contient de nombreux acides gras essentiels et une hormone naturelle, l'ecdysone, que les deux scientifiques nommèrent "hormone juvénile" pour son pouvoir rajeunissant. Les expériences de laboratoires ont montré que l'ecdysone était capable de régénérer des cellules à partir de concentration très faible, et qu'elle agissait aussi sur la multiplication cellulaire. On pourra encore, pour cerner de manière plus précise l'arrière plan de l'invention, se reporter aux deux publications suivantes. En premier lieu, un Brevet FR1503586 (BORDAS) décrit la manière d'obtenir des produits cosmétiques à partir d'extraits lipidiques de larves (entre autres larves de BOMBYX) ; il y a lieu d'observer toutefois que cette publication préconise le traitement de "l'insecte" (dans le cas présent la chenille des lépidoptères) pris dans la phase de croissance de la chrysalide. Sans doute cette même publication, dont on a reproduit en fig.2 des courbes d'activité des corps adipeux (lipides), fait-elle état de l'intérêt pharmaco-dynamique de la larve ; mais la plage des stades d'évolution (huit de part et d'autre du stade de la métamorphose) est si large que suivant l'é- poque où l'on effectue le traitement de l'insecte, on obtient des compositions inversées d'une époque par rapport à une autre. Or, c'est précisément l'un des aspects de l'invention que d'avoir montré qu'il ne faut pas attendre le stade de la métamorphose (chenille/chrysalide), ni limiter l'extraction aux seuls corps adipeux, si l'on veut obtenir les meilleures propriétés pharmacodynamiques de l'extrait. En second lieu, KODONDI, LECLERCQ, BOURGEAY-CAUSSE et al (1987) ont publié dans la revue "ALIMENTS" sous le titre "Intérêt nutritionnel de chenilles et attacidés du Zaïre : composition et valeur nutritionnelle", un article fournissant des analyses de larves, et leurs modes opératoires ; cet article ne précise pas toutefois, à quel stade de développement précis doivent être prises ces chenilles qui au demeurant ne sont pas les larves BOMBYX MORI. La démarche inventive du Demandeur a consisté dans un premier temps à mettre en doute le fait que la seule teneur en lipides des chenilles pouvait expliquer les vertus nutritionnelles et curatives des extraits dans la période prépupale, puis dans un deuxième temps à procéder à des analyses nombreuses et précises mettant en lumière l'évolution de divers composants bio chimiques de la chenille dans cette période jusqu'à déterminer la plage optimale sus-visée dans laquelle les propriétés pharmacodynamiques liées à la présence éphémère d'hormones et de vitamines, présentent un maximum très aigu. Dans cette plage se situe le stade où la larve a emmagasiné tous les éléments nécessaires à la fabrication du cocon (énergie, protéines, lipides, glucides, vitamines, enzymes, hormones...). L'invention, tant dans les conditions chiffrées du procédé que dans les résultats quantitatifs obtenus, est strictement limitée au BOMBYX MORI élevé classiquement dans une magnanerie et nourri avec des feuilles de mûrier. Le procédé 2 de l'invention consiste tout d'abord à sélectionner les chenilles atteignant le stade dit de la "montée", soit sept à neuf jours après leur quatrième mue ; la sélection sera de préférence opérée après un temps de jeûnesuffisant (quelques heures) des chenilles, à l'issue duquel le tube digestif se sera vidé de son contenu. Les chenilles sont ensuite, de préférence, prélevées et congelées dans l'azote liquide après cette opération de surgélation, les chenilles peuvent être conservées pendant plusieurs mois au congélateur à -250 C, de préférence sous atmosphère d'azote ; les chenilles sont ensuite broyées, de préférence cryobroyées, et enfin séchées, de préférence par lyophilisation pour une meilleure conservation ultérieure. Un autre broyage suivi d'un tamisage fin, est conseillé pour obtenir une poudre la plus fine possible. Cette dernière opération réduit la dégradation des molécules thermosensibles. On obtient une poudre homogène fine, d'odeur végétale, de couleur vert-jaune et pouvant tirer sur le gris-vert si elle vieillit en pleine lumière. Les composants sont notés dans le tableau. Les figures de la planche annexée permettront de mieux comprendre l'intérêt de l'invention et de mieux la situer par rapport à son arrière plan technologique, planche dans laquelle - La fig.l est un graphe illustrant l'évolution du poids de BOMBYX MORI depuis son stade d'oeuf jusqu'à son stade de papillon, - La fig.2 est un graphe tiré du Brevet français cité plus haut, représentant l'activité des corps adipeux en fonction du temps, et - La fig.3 illustre à travers plusieurs graphes, l'évolution de certains composants dans la période d'évolution concernée par la présente invention. Sur la fig.l, il apparaît que le poids P de la larve, ou chenille, de BOMBYX MORI évolue depuis l'éclosion de l'oeuf initial (O) suivant sept âges bien différenciés ; l'évolution du poids au cours des quatre premiers âges est progressive avec des discontinuités lors de quatre mues successives ; la quatrième mue (M) survenant vers le 18ème jour, marque le début du 5ème âge au cours duquel la chenille atteint un poids maximum voisin de 4 à 5 grammes ; ayant atteint son poids maximum, la chenille va, après une période d'errance et d'agitation au cours de laquelle son poids va diminuer, commencer à filer son cocon et vider ses viscères ; dès cette période d'errance et durant tout le filage (coconage), l'insecte va consommer ses réserves et son poids va diminuer rapidement jusqu'à environ 0,7 grammes. Environ six jours après le passage par le maximum de poids, son cocon ayant été complètement élaboré, la chenille se transforme (C) en chrysalide avec une production bien connue d'hormones (notamment ecdysone) ; environ trois jours après cette transformation elle donnera naissance (E) à un papillon qui quittera le cocon et se vouera pendant quelques jours seulement à la seule fonction de reproduction. La fig.2 indique, selon FR1503586 que "l'activite" maximale du tissu adipeux se situe, pour la chenille, entre l'avant dernière mue et la dernière mue (5ème âge) et pour la chrysalide quelques jours avant l'éclosion de l'insecte parfait, avec cependant une plus grande "activité" pour le tissu adipeux des nymphes de lépidoptères (BOMBYX). Les courbes de la fig.3 ont été établies par le Demandeur, à partir de prélèvements et d'analyses à 24 heures d'intervalles. Les valeurs d'ordonnées n'ont pas été précisées car les échelles varient considérablement suivant que l'on considère le poids de l'insecte, les quantités relatives (%) de lipides, de protides ou, encore, les quantités relatives faibles (mg/lOOgn d'hormones ou de vitamines. La comparaison de ces courbes avec les indications de la fig.2 montre tout d'abord que dans le cas du BOMBYX, et si l'on remplace le concept vague "d'activité" par celui plus objectif des quantités de composants, notamment de protides, le meilleur stade de prélèvement n'est pas celui de la chrysalide mais celui de la chenille, et que ce n'est pas toute la période de croissance qui permet l'extraction de quantités convenables de composants intéressants (protides, vitamines, hormones) mais seulement la courte période comprise entre les 7ème et 9ème jours consécutifs à la quatrième mue (M). Le tableau suivant, établi à partir d'analyses de l'extrait (lyophilisat) de chenilles de BOMBYX MORI prélevées, conformément à l'invention, au huitième jour, fournit les concentrations quantités relatives Qr) de certains composants - HUMIDITE (g/lOOg de matière lyophilisée) 5,5 - CENDRES (g/lOOg MS) 4,6 - GLUCIDES (g/lOOg MS) 9,8 - LIPIDES (g/lOOg MS) 14,0 - PROTIDES (g/lOOg MS) 66,1 VITAMINES - VITAMINE B5 (mg/lOOg MS) 7,71 (3,73) (chrysalide) - VITAMINE PP (mg/lOOg MS) 7,75 (3,33) ( - BIOTINE (mg/lOOg MS) 57,2 10-3 (24,4 10-3)( " ELEMENTS MINERAUX Na (mg/lOOg MS) 62 Fe (mg/lOOg MS) 2,2 K (mg/lOOg MS) 1615 Mn (mg/lOOg MS) 1,1 Ca (mg/lOOg MS) 286 Cu (mg/100g MS) 0,5 Mg (mg/lOOg MS) 188 Zn (mg/lOOg MS) 5,6 Phosphate 482 On tira du tableau ci-dessus, à titre de proportions caractéristiques de l'extrait, ou substance, relevant de l'invention - la proportion protides/lipides, de 66,1/14,0 = 4,73, toujours supérieure à 4,5 dans la période comprise entre le 7ème et le 9ème jours, et - un poids cumulé, pour lOOg. de matière sèche (M.S.) des vitamines B5 et PP, de 15 mg pouvant descendre jusqu'à 10 mg, valeur bien supérieure au poids cumulé de 7,06 mg/l00 g. M.S. (B5 : 3,73 et PP : 3,33) obtenu pour la chrysalide après le 10ème jour. On comprendra que seuls les moyens modernes d'analyse ont permis d'optimiser le moment du prélèvement et il est permis d'espérer que des moyens encore plus performants permettront d'affiner encore davantage une ou plusieurs périodes à l'intérieur de celle ci-dessus définie, afin de pouvoir même sélectionner le stade optimal de production d'une vitamine ou d'un hormone particulière ; bien évidemment les conditions d'élevage devront, parallèlement, permettre une homogénéité concomitante de la population des chenilles. A titre de variantes moins performantes, mais moins onéreuses que la cryogénation, le cryobroyage ou la lyophilisation - le broyage peut être fait avant la congélation, - il peut être remplacé par un pressage suivi ou non d'une filtration, - on peut ajouter au broyat ou au filtrat des additifs : conservateurs, antiseptiques, bactéricides, antifongiques, antioxydants, huiles essentielles, parfums...), - le broyat ou le filtrat peut ne pas être congelé et alors, utilisé cru ou mélangé avec d'autres principes actif s, un excipient et des additifs, - la congélation peut être effectuée dans un congélateur familial dont la température dépasse rarement -200 C, - le séchage peut être effectué par atomisation (procédé SPRAY), mais aussi par séchage sur surface raclée (procédé HATMAKER), - à partir du lyophilisat, il est possible d'extraire les protéines ou les lipides avec les vitamines liposolubles, A titre de variante d'extraction, il est possible d'enlever les glandes séricigènes juste avant le broyage et on obtiendra alors deux sous-produits d'une part, les glandes séricigènes très riches en acides aminés suivants (glycine, sérine, alanine, tyrosine) et d'autre part, les chenilles amputées de cet organe, avec une teneur en protéines moindre ; l'enlèvement de la glande séricigène peut avantageusement être réalisé par simple centrifugation (centrifugeuse ménagère à 3.000 t/mn) il est suivi du séchage et du broyage des deux sous-produits obtenus. La substance obtenue selon le procédé de l'invention, ou ses variantes, pourra bien sûr être purifiée si nécessaire à des fins médico-chirurgicales pour un usage parentéral ou pour des plaies traumatiques ou chirurgicales profondes. Des tests de toxicité ont été effectués, sur recommandation de 1'INSTITUT PASTEUR, par le Laboratoire HAZELTON sur un lot de rats et se sont avérés négatifs. Aucune toxicité par voie orale n'est apparue. même--aux doses les plus élevées. Un essai clinique a été réalisé sur une femme d'une cinquantaine d'années qui présentait sur l'avant bras gauche, face postérieure, une cicatrice de brûlure 2ème degré profond ancienne de 8 mois, à ses dires douloureuse au frottement des vêtements, rouge-violacée, boursoufflée, dyspigmentée.En quelques jours, l'hyperesthésie avait disparu ; au bout de deux mois, il reste une cicatrice étoilée complètement indolore, dépigmentée, plane, très souple et ne présentant aucun aspect chéloldique. Cette femme a, de son propre chef, passé sur sa brûlure le broyat pur de ver à soie, préparé un an auparavant et conservé au frigidaire sans aucun additif, l'utilisatrice a seulement noté l'apparition d'un halo plus foncé à la surface du produit et qui correspondrait probablement à l'oxydation des lipides en contact avec l'air. Elle n'a noté aucun changement ni dans l'odeur, ni dans la couleur du produit et encore moins l'apparition de moisissures. Le Demandeur propose pour l'extrait sus-décrit de la chenille de BOMBYX MORI - des applications dermocosmétiques par son effet tenseur immédiat et prolonge, par action hydratante prononcée, donc "anti-rides", l'amélioration à effacement complet de certaines tâches hyperpigmentaire, l'amélioration de la coloration de la peau, diminution de la couperose, action au niveau des vergetures et des petites cicatrices ainsi qu'un usage capillaire de par sa richesse en acide pantothénique en particulier - un usage pharmaceutique accélérant les cicatrisations cutanées ou muqueuses traumatiques ou chirurgicales pour améliorer probablement par augmentation de la multiplication cellulaire les anciennes cicatrices et en particulier, pour traiter les brûlures profondes ou superficielles, anciennes ou récentes (cette invention paraît intéressante pour traiter les chéloïdes, les hyperesthésies résiduelles) - un usage nutritionnel, à la vue des analyses biochimiques effectuées à la demande de l'inventeur par l'INSTITUT PASTEUR de Lyon en ce qui concerne les glucides, lipides, protides, vitamines, oligoéléments, éléments minéraux et par llI.N.R.A. de Theix près de Clermont-Ferrand en ce qui concerne les acides aminés et les acides gras tant pour l'animal que pour l'homme, soit comme complément alimentaire en particulier dans des situations extrèmes comme les dénutritions de toute nature, les régimes demandant une supplémentation en éléments essentiels, lors de la pratique de sports de façon intensive, voire pour les cosmonautes. I1 doit être enfin compris que les applications de la substance de l'invention sont données à titre illustratif et non limitatif. REVENDICATIONS 1.- Procédé d'extraction d'une substance biologique à partir de la larve de lepidoptères de l'espèce BOMBYX MORI, caractérisé en ce qu'auprès avoir élevé clas siquement en magnanerie les larves (chenilles) de BOMBYX MORI et les avoir nourri avec des feuilles de mûrier jusqu'après leur quatrième mue, on prèlève les chenilles dans la plage comprise entre le 7ème et le 9ème jours consécutifs à cette quatrième mue 2.- Procédé d'extraction selon la revendication 1, carac terse : * en ce qu'immédiatement après le prélèvement, le traitement comprend les étapes sui vantes consistant à - congeler les chenilles dans l'azote liquide, puis - cryobroyer les chenilles sur gelées, - lyophiliser le broyat 3.- Procédé d'extraction selon la revendication 2, térisé : en ce qu'il comprend en outre, les étapes ultérieures consistant à - effectuer un broyage fin, - tamiser le broyat au tamis ; 4.- Substance biologique obtenue selon un procédé conforme à la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend des proté ines et des lipides dans une proportion protides/lipides supérieure à 3,5 ; 5.- Substance biologique selon la revendication 4, térisée : en ce que la dite proportion protides/lipides est supérieure à 4,5 ; 6.- Substance bilogique selon la revendication 5, carac térisée : en ce qu'elle comprend en outre, pour 100 gr. de matière sèche, un poids de vitamines B5 et PP cumulé d'au moins 10 mg. 7.- Procédé d'extraction selon la revendication 2, carac térisé : en ce qu'au lieu du séchage du broyat par lyophilisation, ce broyat est séché par atomisation (procédé SPRAY) 8.- Procédé d'extraction selon la revendication 1, carac térisé : en ce qu'immédiatement après le prélèvement, le traitement comprend les étapes sui vantes consistant a - broyer les chenilles, - presser le broyat, - filtrer, - sécher par atomisation 9.- Procédé d'extraction selon la revendication 8, carac térisé : en ce que l'étape de séchage par atomisation est remplacée par le séchage sur surface raclée (procédé HATMAKER) 10.- Procédé d'extraction selon la revendication 1, carac térisé : : en ce qu'immédiatement après le prélèvement, le traitement comprend les étapes suivantes consistant à -enlever par centrifugation de la chenille, les glandes séricigènes, puis - sécher et broyer les deux sous-produits obtenus.