Brevet FR2662081A1 — publié le 19911122

La présente invention est relative à des préparations pour l'usage cosmétique et/ou dermatologique, contenant des extraits obtenus à partir de cellules germinales et/ou d'embryons d'amphibiens, ainsi qu'à un procédé d'obtention desdits extraits. Les produits destinés à l'entretien et au soin de la peau font actuellement l'objet de nombreuses recherches. Le but de ces préparations peut être le soin de différentes maladies de la peau, l'aide à la cicatrisation, ou plus simplement la protection de la peau, son embellissement, ainsi que la prévention et l'atténuation des effets du vieillissement. Les qualités exigées de ces produits sont multiples efficacité, confort et agrément d'emploi, innocuité, etc... La connaissance des différents constituants de la peau, ainsi que de la structure et de la physiologie du derme et de l'épiderme a progressé ces dernières années. Ceci a amené les fabricants à proposer des formulations cosmétiques de plus en plus élaborées, dans lesquelles sont incorporées des constituants dont l'efficacité sur l'un ou l'autre des facteurs influençant la physiologie cutanée a été suggérée. On peut citer, parmi les substances dont l'emploi a été récemment préconisé - des protéines (telles que le collagène, llélastine, la fibronectine, la kératine, etc...) ; - des lipides d'origine animale ou végétale ; - des acides nucléiques ; - des substances glucidiques, (telles que les glycosaminoglycannes, l'acide hyaluronique, etc...) ; - des facteurs de croissance ; etc... Certaines de ces substances sont obtenues par synthèse chimique, d'autres par génie génétique, d'autres encore sont extraites à partir de sources variées d'origine animale ou végétale. Différentes préparations cosmétiques associant entre elles ces substances ont été proposées ; toutefois, ces associations sont essentiellement empiriques ; en effet, bien que l'on dispose de certaines informations sur l'activité de ces différentes substances prises isolément, on ne sait encore que très peu de choses sur leurs interactions mutuelles. En particulier, on ne connaît absolument pas les proportions dans lesquelles lesdites substances devraient être associées pour que l'efficacité de la préparation cosmétique obtenue soit optimale. La présente invention s'est fixée pour but de pourvoir à des préparations cosmétiques ou dermatologiques, à base d'extraits d'origine biologique contenant différentes substances exerçant une action bénéfique sur la peau, lesdites substances étant présentes dans la préparation dans des proportions telles que l'activité de chacune d'entre elles s'en trouve renforcée. L'Inventeur a constaté que de façon surprenante, des préparations contenant des extraits d'oeufs d'amphibiens répondaient parfaitement aux critères définis ci-dessus. Les oeufs d'amphibiens possèdent des caractéristiques originales, résultant des particularités du développement embryonnaire de ces animaux. En effet, ce développement, qui est extrêmement rapide, se produit dans la plupart de ces espèces à l'extérieur du corps de la femelle, et dans des conditions souvent défavorables, car soumis aux variations de l'environnement, en particulier aux variations hygrométriques. I1 résulte de ces contraintes que les oeufs d'amphibiens contiennent, dès la ponte, et en grande quantité, la majeure partie des composants nécessaires au développement embryonnaire. De plus, ces oeufs sont protégés des agressions du milieu extérieur par des enveloppes diverses. Pour illustrer ce qui précède, il est possible de citer à titre d'exemple, l'oeuf de Xénope, où de nombreux constituants cellulaires sont amplifiés par rapport à une cellule somatique. Les tableaux I et II ci-dessous donnent une liste non exhaustive de ces composants. TABLEAU I Degré Quantité par d'amplifi Macromolicules cation par ovocyte ou rapport à une oeuf cellule somatique DNA total 4,5 ng 100 000 ARN total 5,3 gg 500 000 Ribosomes 1012 500 000 Protéines totales 280 g 1 000 000 Fibronectine 2ng Actine 1,7 à 2,2 g Phospholipides 32 g 700 000 à 1 000 000 Lipides 115 Rg 1 500 000 Polysaccharides 1 000 000 à 2 000 000 Constituants de la gelée 41 g Protéines de la gelée 16,4 Rg Polysaccharides de la gelée 25 gg Acide sialique de la gelée 0,4Rg TABLEAU Il Degré Quantité par d'amplifi Petites molécules cation par ovocyte ou rapport à une oeuf cellule somatique Ribonucléotides triphosphate 4,2 nmoles 320 000 Déoxynucléosides triphosphate 200 pmoles 2 900 000 ATP 1,7 nmoles 600 000 Phosphore total 210 nmoles 3 000 000 6 000 000 Acides aminés 300 pmoles 100 000 Glycogène 45 Ag 5 000 000 Putrescine 0,25 nmoles 1 000 000 Spermine 0,7 nmoles Spermidine 0,7 nmoles 200 000 Glutamate, aspartate 2900 pmoles 600 000 Outre les composants cités de façon non exhaustive cidessus, il convient de signaler la présence d'autres constituants dont le rôle est important , tels que les facteurs de croissance.En outre, les oeufs d'amphibiens sont protégés par des enveloppes, en particulier des enveloppes de gelée dont les propriétés hygroscopiques permettent de maintenir l'oeuf hydraté. La composition des oeufs d'amphibiens est donc au moins en partie connue ; toutefois, l'inventeur a constaté que les effets bénéfiques sur la peau des extraits obtenus à partir de ces oeufs sont bien supérieurs à ceux de leurs différents constituants, que ces derniers soient considérés isolément ou associés dans des compositions connues dans l'art antérieur. La présente invention a pour objet des extraits d'origine biologique pour l'utilisation dans des préparations cosmétiques ou pharmaceutiques, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'oeufs et/ou d'embryons d'amphibiens, et/ou de leurs enveloppes. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdits extraits d'origine biologique sont obtenus à partir de l'enveloppe de gelée entourant les oeufs. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdits extraits d'origine biologique sont constitués par un broyat d'oeufs d'amphibiens dépourvus de leur enveloppe de gelée. Selon encore un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdits extraits d'origine biologique sont constitués par une préparation de vitellus, membranes, et granules diverses d'oeufs d'amphibiens. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdits extraits d'origine biologique sont constitués par une préparation de cytoplasme d'oeufs d'amphibiens. Selon une disposition préférée de l'un quelconque des modes de réalisation qui précèdent, lesdits extraits d'origine biologique sont obtenus à partir d'oeufs ou d'embryons de Xénope. Des oeufs peuvent être obtenus aisément et en grande quantité à partir d'élevages d'amphibiens, et des extraits conformes à l'invention peuvent être obtenus très simplement en mettant en oeuvre des procédés peu coûteux, à partir de ces oeufs. La présente invention a également pour objet des procédés d'obtention des extraits d'oeufs d'amphibiens, ou de leurs enveloppes, tels que définis plus haut. Selon un de ces procédés, un extrait d'oeufs d'amphibiens est obtenu à partir de l'enveloppe gélifiée entourant lesdits oeufs, est caractérisé en ce que, - dans une première étape, l'enveloppe de gelée est retirée par agitation des oeufs dans une solution tamponnée à un pH compris entre 7,5 et 8,5; - dans une deuxième étape, la solution contenant les constituants de l'enveloppe est décantée ; - dans une troisième étape, la solution décantée est dialysée et, optionnellement, dans une quatrième étape, la solution dialysée est concentrée par tous moyens appropriés. Un autre procédé conforme à l'invention est caractérisé en ce que les oeufs d'amphibiens, dépourvus au préalable de leur enveloppe de gelée, sont lavés dans un tampon approprié, puis débarrassés des contaminants extracellulaires par centrifugation, puis broyés. L'extrait obtenu de la sorte peut être utilisé tel quel ou soumis à un traitement tel que la lyophilisation ou la congélation, en vue de le conserver pour une utilisation ultérieure. I1 peut également être fractionné pour obtenir les extraits de vitellus et de cytoplasme définis plus haut. Conformément à l'invention on obtient un extrait de vitellus, en centrifugeant le broyat obtenu précédemment à environ 600 g pendant environ 10 minutes et en recueillant le culot obtenu. Le surnageant résultant de cette centrifugation et qui contient le cytoplasme et les organites cellulaires peut être utilisé tel quel, ou bien subir des étapes de fractionnement supplémentaires, pour séparer le cytoplasme et le cytosol des organites cellulaires. Ces différents types d'extraits sont obtenus à partir de la même préparation d'oeufs, sans addition d'éléments extérieurs. L'Inventeur a constaté que l'absence de toute dilution pendant les différentes étapes de préparation des extraits constitue une garantie de leur efficacité, car ceci permet de maintenir les interactions optimales entre leurs différents constituants. Ils peuvent être lyophilisés, et conservés sous cette forme, et donc peuvent être incorporés à l'état de concentration désiré. Ils sont tout particulièrement adaptés aux préparations cosmétologiques. Selon les autres composants que l'on désirera éventuellement incorporer à la préparation cosmétologique, on pourra choisir un ou plusieurs de ces extraits. On pourra également, si on le désire, fractionner ces extraits et en séparer les différents constituants. La présente invention a également pour objet des préparations à usage cosmétique et/ou dermatologique, caractérisées en ce qu'elles contiennent, en tant que principe actif, au moins un extrait d'oeufs d'amphibiens, ou de leurs enveloppes, tel que défini plus haut. Les extraits d'oeufs d'amphibiens et/ou de leurs enveloppes, conformes à la présente invention constituent une matière première de choix dans l'élaboration de préparations destinées à l'entretien et aux soins de la peau. En effet, outre leur grande efficacité pour l'hydratation, l'assouplissement et l'adoucissement de la peau, la prévention du vieillissement, la cicatrisation, les préparations contenant ces extraits sont parfaitement bien tolérées. Lesdits extraits peuvent être incorporés aussi bien dans des produits de soins, tels que par exemple des émulsions, crèmes, pommades, laits, gels, produits démaquillants, shampooings et après-shampooings, que dans des produits de maquillages tels que, par exemple, des fonds de teint, rouges à lèvres, etc... La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention et d'utilisation des extraits d'oeufs d'amphibiens conformes à l'invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I) PREPARATION DES ANIMAUX Les animaux sont élevés comme décrit par GURDON (1987). 150 à 200 unités d'hormone chorionique gonadotrope sont injectés dans les sacs lymphatiques dorsaux de Xénopes femelles. Six à huit heures plus tard une deuxième injection de 600 à 800 unités d'hormone selon le poids des animaux est réalisée. Les animaux sont alors placés dans des bacs contenant du HSB1X (15mM Tris pH 7,6, NaCl 110mM, KCl 2mM, MgSO4 lmM, Na2HPO4 0,5mM). On peut prétraiter les animaux par une injection d'hormone gonadotropique sérique quelques jours avant les injections d'hormone chorionique. II) PREPARATION DES EXTRAITS CONFORMES A L'INVENTION : Exemple I : Collecte et dégelification des oeufs obtention d'un extrait d'enveloppes d'oeufs d'amphibiens Chaque femelle pond 10 000 à 15 000 oeufs. Ceux-ci sont rincés dans l'eau du robinet, puis dans l'eau distillée où ils sont laissés environ deux à trois minutes. I1 sont alors transférés dans une solution de 2% cystéine dans 0,3X Barth pH 7,95 ou dans de l'eau pH 7,95. Une agitation légère permet de retirer l'enveloppe de gelée entourant les oeufs. La solution contenant les constituants de cette enveloppe est alors décantée. Cette solution est alors dialysée et peut être concentrée sous vide, par lyophilisation, ou précipitation au sulfate d'ammonium, ou de l'éthanol, suivi de dialyse.Elle constitue l'extrait I, riche en mucopolysaccharides, polysaccharides, glycosaminoglycannes, glycoprotéines, composés extrêmement intéressants dans la protection de la peau, en particulier en raison de leur pouvoir hydrophile exceptionnel, et de leur caractère peu occlu sif. Cette gelée peut être déshydratée et réhydratée sans changement d'apparence. Exemple 2 : Obtention d'un extrait total d'oeufs d'amphibiens: Les oeufs sont rincés dans du Barth 0.8X. Puis ils sont rincés dans le tampon qui parait le plus indiqué pour son incorporation dans la préparation cosmétique. On peut aussi simplement rincer les oeufs brièvement dans de l'eau distillée afin de n'apporter aucun élément extérieur à la composition de l'extrait. Une brève centrifugation des oeufs à basse vitesse, par exemple 200g, quarante à soixante secondes, permet d'éliminer tout élément extracellulaire, y compris l'eau. Différents extraits peuvent alors être préparés, de préférence à 0 4 C. L'extrait est broyé dans un homogénéisateur type Dounce ou Potter. On obtient un extrait (extrait II) qui peut être ensuite incorporé à d'autres composants entrant dans la préparation cosmétique choisie. Exemple 3 : Obtention d'un extrait de vitellus, membranes et granules diverses de l'oeuf Si on le désire, on peut fractionner ensuite l'extrait II. Ainsi, une centrifugation de 600g, 10 minutes, permet d'obtenir un culot contenant principalement les composants du vitellus soit les phosphoprotéines phosvitine, la lipoprotéine lipovitelline, des phospholipides, ainsi que certains constituants membranaires et granulaires. Ce culot peut être alors repris en solution et incorporé dans différents types de préparations cosmétiques. Nous l'appelerons extrait III. Exemple 4 : Obtention d'un extrait de cytoplasme Le surnageant de l'exemple 3, riche en composés solubles du cytosol (protéines, acides nucléiques, lipides divers et petites molécules) peut être centrifugé à 14 000 g, pendant 20 minutes pour éliminer les mitochondries et organites cellulaires si nécessaire. Le surnageant ainsi obtenu constitue l'extrait IV. Exemple 5 : Obtention d'un extrait de cytosol Enfin une centrifugation à 100 000g, pendant soixante minutes de l'extrait IV peut permettre d'obtenir un surnageant débarrassé de débris membranaires, précurseurs membranaires, ou microvésicules, ou organites cellulaires comme les ribosomes. Cet extrait est toujours extrêmement riche en protéines et activités enzymatiques diverses et constitue l'extrait V. REVENDICATIONS 1) Extraits d'origine biologique pour l'utilisation dans des préparations cosmétiques ou pharmaceutiques, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'oeufs et/ou d'embryons d'amphibiens, et/ou de leurs enveloppes 2) Extraits d'origine biologique selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir de l'enveloppe entourant les oeufs d'amphibiens. 3) Extraits d'origine biologique selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par un broyat d'oeufs d'amphibiens dépourvus de leur enveloppe de gelée. 4) Extraits d'origine biologique selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par une préparation de vitellus, membranes, et granules diverses d'oeufs d'amphibiens 5) Extraits d'origine biologique selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par une préparation de cytoplasme d'oeufs d'amphibiens. 6) Extraits d'origine biologique, selon une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisés en ce que'ils sont obtenus à partir d'oeufs ou d'embryons de Xénope. 7) Procédé d'obtention d'un extrait biologique selon la Revendication 2, caractérisé en ce que : - dans une première étape, l'enveloppe de gelée est retirée par agitation des oeufs dans une solution tamponnée à un pH compris entre 7,5 et 8,5; - dans une deuxième étape, la solution contenant les constituants de l'enveloppe est décantée ; - dans une troisième étape, la solution décantée est dialysée et, optionnellement, dans une quatrième étape, la solution dialysée est concentrée par tous moyens appropriés. 8)Procédé d'obtention d'un extrait biologique selon la Revendication 3, caractérisé en ce que les oeufs d'amphibiens, dépourvus au préalable de leur enveloppe de gelée, sont lavés dans un tampon approprié, puis débarrassés des contaminants extracellulaires par centrifugation, puis broyés 9) Procédé d'obtention d'un extrait biologique selon la Revendication 4, caractérisé en ce que l'on centrifuge un broyat obtenu par le procédé selon la Revendication 8 à environ 600 g pendant environ 10 mn et l'on recueille le culot obtenu. 10) Procédé d'obtention d'un extrait biologique selon la Revendication 5, caractérisé en ce que dans une première étape, l'on centrifuge un broyat obtenu par le procédé selon la Revendication 8 à environ 600 g pendant environ 10 mn, dans une deuxième étape, l'on centrifuge le surnageant résultant de la première étape à environ 14 000 g pendant environ 20 minutes et l'on recueille le surnageant obtenu. 11) Préparations à usage cosmétique et/ou dermatologique, caractérisées en ce qu'elles contiennent, en tant que principe actif, au moins un extrait d'oeufs d'amphibiens ou de leurs enveloppes, selon une quelconque des Revendications 1 à 6.