Brevet FR2662356A1 — publié le 19911129

De tout temps la cosmétologie s'est attachée à ralentir le vieillissement cutané. Les deux facteurs exogènes majeurs à l'origine du vieillissement cutané sont les radiations UV émises par le soleil et les radicaux libres oxygénés (RL0) (essentiellement OH' et o2-), Au niveau de la peau, le principal facteur responsable de la production de RLO à partir de l'oxygène moléculaire est le rayonnement W. Mais il existe également un certain nombre de fonctions physiologiques courantes qui s'accompagnent d'une accumulation de RLO. Il en est ainsi dans le cas de la respiration mitochondriale, de la biosynthèse des prostaglandines ou au cours d'une réaction inflammatoire. Pour faire face à cet afflux externe et interne de RLO l'organisme humain dispose d'un certain nombre de moyens de défense. Ce sont des composés hydro ou liposolubles antiradicalaires. Sans être exhaustif on peut citer certains enzymes (SOD, catalase, glutathion-peroxydase), des vitamines A, E, C). Concernant le déterminisme du vieillissement, il semblerait que les réactions mettant en jeu l'effet destructeur des RLO augmentent avec l'âge. Par ailleurs, il est certain que l'accumulation de produits de dégradation issus d'attaques radicalaires répétées et la diminution voire l'inactivation de certains systèmes de défense participent également au vieillissement. Si on considère maintenant l'action des RLO au niveau moléculaire, il est important de connaitre les structures chimiques les plus vulnérables à cette action. On peut citer les molécules ou types de molécules suivants - Les acides gras polyinsaturés Ils rentrent dans la composition de toutes les membranes biologiques et sont particulièrement sensibles à l'action délétère des radicaux libres. Leur détérioration conduit à l'apparition de lipoperoxydes. I1 en résulte une désorganisation complète de l'agencement des lipides membranaires et une profonde altération des propriétés fonctionnelles des protéines (récepteurs, enzymes, transporteurs) qui les entourent. Sous l'effet répété, cumulatif et irréversible de ces modifications structurales, les membranes perdent peu à peu leurs caractéristiques de fluidité et de perméabilité. - L'acide hyaluronique (AH) Il est connu que le contenu en acide hyaluronique du derme diminue avec l'âge. I1 existe donc une corrélation entre l'aspect d'une peau et sa teneur en acide hyaluronique. Or, on sait depuis longtemps que l'acide hyaluronique peut être dépolymérisé par des mécanismes qui mettent en jeu les RLO (GREENWALD & MOY - Arthrites and Rheumatism, 1980, 23(4) 455 463). On perçoit ainsi mieux la nécessité de préserver l'acide hyaluronique contre les RLO pour garder une peau jeune. - Le Collagène D'une façon générale, les protéines peuvent être aussi dénaturées par une attaque radicalaire et par l'action des W. Ainsi, au niveau cutané, la désorganisation des fibres de collagène, sous l'influence des UVA est fortement impliquée dans le vieillissement. Par ailleurs, un certain nombre de changements dans les propriétés du collagène sont associés au vieillissement. I1 s'agit de la diminution de sa solubilité et de l'augmentation de sa stabilité thermique et mécanique. On attribue en général ces modifications à l'augmentation du nombre de liaisons intracaténaires qui pourrait être due à une action des RLO. En résumé, on peut affirmer que l'intégrité de l'acide hyaluronique et du collagène sont en grande partie responsable des propriétés biomécaniques du derme. Leur altération a des conséquences néfastes pour la fermeté et l'élasticité de la peau. Dans la lutte contre les effets du vieillissement cutané, il est possible d'adopter différentes stratégies. Les plus courantes sont l'emploi de filtres solaires ou de composés susceptibles de neutraliser les cations métalliques et les RLO. Une autre stratégie, plus originale, consiste à protéger les molécules vulnérables contre l'action des RLO. Précisément, il existe au sein des organismes de vertébrés une catégorie de protéines, dont le rôle supposé est la protection des structures biologiques. Ces protéines sont présentes au niveau du cristallin de l'oeil. On les appelle protéines du cristallin, elles sont relativement spécifiques de ce tissu, solubles dans l'eau et présentes en quantité abondante dans le cytoplasme des cellules du cristallin. Deux données chiffrées traduisent bien cette abondance ; elles représentent 90 % des protéines totales du tissu et entre 20 et 60 % de son poids humide. Ces protéines du fait des conditions particulières du cristallin (absence de biosynthèse des protéines et maintien nécessaire de la transparence) sont très stables. Elles ont une durée de vie importante et possèdent une grande résistance vis à vis des rayonnements lumineux, de la chaleur et des radicaux libres. Au sein du cristallin elles sont fortement liées entre elles pour former un gel transparent compact. Chez les vertébrés, il en existe trois groupes : Y, B et t. On les distingue en fonction de leur taille, de leur charge, de leurs propriétés immunologiques et physico-chimiques, de la composition en acides aminés de leurs sous-unités et de leur degré d'agrégation. a) i -cristallin Ce groupe est prédominant chez les mammifères (35 % des protéines totales). Les t-cristallins se présentent sous la forme d' agrégats de 800 Kilodaltons construits à partir de seulement deux sous-unités i A et dB de chacune environ 20 Kilodaltons. Les agrégats ont la forme de particules sphériques de 14 à 15 nm de diamètre et contiennent des pourcentages variables degA et &alpha; B. La sous-unité XA possède 173 acides aminés et un caractère acide alors que, la sous-unité YB contient 175 acides aminés et un caractère basique. Malgré cette différence, les deux sous-unités présentent 57 % de similitude dans leur composition en acides aminés. Il est important de noter que la sous-unité iB est exprimée dans d'autres tissus que le tissu cristallin. En effet, elle a été mise en évidence dans des tissus de coeur, de cerveau de moelle épinière, de poumon, de peau et de rein, ainsi que dans des lignées cellulaires épithéliales cultivées "in vitro". En revanche elle n'a été détectée dans aucune lignée cellulaire fibroblastique. Ces observations suggèrent un rôle possible en dehors du cristallin pour la sous-unitédqB. A l'opposé, la sous unité ZA n'est exprimée qu'au niveau oculaire et serait donc spécifique du cristallin. b) ss et t-cristallin Dans les cristallins de vertébrés, les autres groupes importants de protéines hydrosolubles sont les B et les #, que l'on distingue entre elles sur la base de critères physico-chimiques et immunologiques. Les B comme les o, sont présentes dans les cristallins de tous les vertébrés et sont souvent majoritaires. I1 existe des sousunités acides (BA) et basiques (ssB) de 20 à 30 KD assemblées en agrégats de 50 à 100 KD (BL) ou de 100 à 200 KD (BH). Les t'-cristallins, présentes dans beaucoup d'espèces, sont majoritaires chez les poissons, mais absentes chez les oiseaux. Elles sont exclusivement monomériques, de masse moléculaire environ 21 KD. Toutes ont un résidu glycine non modifié à l'extrémité N-terminal. En dépit d'une distinction formelle entre ces deux classes de protéines, leur séquence en acides aminés et les données obtenues par cristallographie (rayons X) montrent qu'elles sont proches au niveau structural. Elles appartiennent à une super famille de protéines : les B et W~ cristallins. De nombreux auteurs, BHAT et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 1989, 158 (1), 319-325 et de JONG et al., J. Biol. Chem., 1988, 263 (11) 5141-5149, pensent que les protéines du cristallin pourrait avoir un rôle majeur dans la protection des composants cellulaires de ce tissu. Une étude récente, (CARMICHAEL et al., Biochemical Society transaction, 629th Meeting, London, 1989, 17, 494-495), vient d'ailleurs d'étayer cette hypothèse. Elle montre, de façon indiscutable, que les trois catégories de cristallins (, B et #) protègent certaines protéines (albumine bovine, hémoglobine, ovalbumine, lysozyme) contre une agression radicalaire. Ces protéines sont hydrolysées en l'absence de cristallins (' Protocole : Une solution d'acide hyaluronique à 0,5 % dans l'eau (100 ml) est placée dans des conditions oxydantes en présence et en l'absence des protéines de cristallin (extrait brut). Le système oxydant est le suivant H2 02 110 volumes : 200 p1 CuSO4 à 0,1 % : 2 ml Résultats : Ils sont exprimés en pourcentage de la viscosité initiale de la solution après 3 heures à 37 C. Quantité de protéines du cristallin dans les 100 ml % de la viscosité initiale (en t) 0 4 0.05 66 0.1 76 Nous avons également cherché à savoir, si les protéines du cristallin étaient capables de s'opposer à l'oxydation d'acides gras polyinsaturés (AGPI) présents dans des membranes phospholipidiques. L'oxydation a été réalisée par un système producteur de RLO classique (H202 Fe2+). L'apparition de diènes conjugués absorbant fortement à 233 nm dans les AGPI traduit l'importance de l'oxydation Protocole : 100 ml d'une solution de phospholipides à 0.12 % dans l'eau sont placés dans des conditions oxydantes, en présence et en l'absence des protéines du cristallin (extrait brut).Le système oxydant est le suivant H2 2 110 volumes : 20 pl FeCl2 à 0,2 % : 50 p1 KSCN à 0,3 % : 5 ml L'incubation se fait à 37 C pendant 24 heures. On procède ensuite à une extraction volume à volume des solutions oxydées contre de l'heptane avant d'enregistrer la Densité Optique à 233 nm des solutions heptaniques. Résultats Quantité de protéines du cristallin dans les 100 ml DO à 233 nm (en *) O 2,2 0,05 0,45 0,1 0,20 Au vue des résultats, il apparaît donc que les protéines du cristallin protègent efficacement les AGPI de l'oxydation. Certains auteurs, CHARMA et al., Biochem. Biophys. Acta, 1987, 915, 284-291) ont, par ailleurs, mis en évidence une activité anti-élastasique dans la fraction &alpha; O(-cristallin. Cette propriété présente un intérêt en cosmétique, car la dégradation de l'élastine est responsable en partie de la perte d'élasticité du derme au cours du vieillissement cutané. En résumé, les protéines du cristallin exercent une action stabilisante sur les autres protéines, sur l'acide hyaluronique et sur des contre-types de membranes biologiques. Elles possèdent en outre une activité anti-élastasique. Toutes ces propriétés permettent de penser qu'elles constituent un outil performant de lutte contre le vieillissement cutané. La présente invention a donc pour objet l'utilisation dans des compositions cosmétiques d'extraits obtenus à partir de cristallins de vertébrés. Pour optimiser l'activité "in mitron décrite précédemment il est préférable de procéder à une purification partielle d'un extrait aqueux de cristallin. Cependant, l'extrait brut total présente aussi une activité satisfaisante. En outre, cette activité n'est que peu influencée par le degré d'agrégation des sous-unités. Les protéines pourront être extraites et purifiées à partir de cristallins de vertébrés au moyen des techniques décrites par LEENEN et de JONG (Exp. Eye Res., 1981, 32, 467-474) et SIEZEN et al. (Eur. J. Biochem., 1978, 91, 387-396). Ces techniques font appel au prélèvement de cristallins frais, à leur broyage et homogénéisation en solution aqueuse et à l'élimination des débris par centrifugation ou filtration.La purification par chromatographies pourra permettre de décomposer l'extrait brut en fractions plus ou moins riches en chacune des trois catégories de protéines du cristallin (d, B et & Les extraits (bruts ou purifiés) pourront être utilisés, soit sous la forme native, soit à l'état de sous-unités monomériques isolées après action d'un agent dissociant. Cet agent dissociant sera choisi parmi ceux connus de l'homme de l'art. On peut citer, sans être limitatif, le sodium dodécyl sulfate, l'urée et le mercaptoéthanol. Les différents extraits pourront être également utilisés sous une forme hydrolysée après une hydrolyse enzymatique ou chimique. Enfin, on pourra envisager de coupler chimiquement les fonctions réactives libres de ces protéines avec toutes les molécules connues de l'homme de l'art pour ce type de couplage. Même dans le cas des extraits obtenus après purification, il pourra être utilisé un ou plusieurs inhibiteur des protéases. On peut citer, sans être limitatif, 1'EDTA et le phényl méthyl sulfonyl fluoride. Concernant la dose d'utilisation des extraits de cristallin on se situera avantageusement dans une gamme de concentrations protéiques allant de 0.01 % à 50 % et préférentiellement entre 0,05 et 20 %. Les compositions cosmétiques à base de protéines du cristallin peuvent être présentées sous n'importe quelle forme telles que, crèmes, laits, gels, lotions, shampooings. L'extrait protéique peut être introduit dans ces formulations directement en solution dans la phase aqueuse, ou encapsulée dans des vecteurs permettant d'obtenir un relargage lent et progressif des protéines et leur pénétration, au moins partielle, à l'intérieur du stratum corneum. De tels vecteurs peuvent être constitués, de façon non limitative, par des vésicules lipidiques de type liposomes ou par des particules ou des vésicules de polymères naturels ou synthétiques d'un diamètre compris entre 10 nm et 2 mm connus sous les noms de nanoparticules, nanocapsules, microparticules, microcapsules. Les produits réalisés selon le présent brevet peuvent être utilisés à titre préventif, dans le cadre général de la lutte contre le vieillissement de la peau et l'apparition des rides.De tels produits peuvent également être préconisés dans tous les cas où des radicaux libres sont produits en quantité importante. On peut citer par exemple, et de façon non limitative, le soin des peaux inflammées ou irritées, des peaux soumises à un rayonnement W trop prolongé (érythème solaire), ainsi que le soin des peaux soumises aux effets nocifs, producteurs de radicaux libres, de la pollution atmosphérique. Des exemples non limitatifs de compositions cosmétiques selon l'invention sont présentées, ci-dessous : 1) Crème antirides Stéarate de sorbitan .................... 3,00 Polysorbate 60 .................. 4,00 Alcool cétylique ..................... 1,50 Huile de silicone .................... 6,00 Huile minérale .......................... 3,00 p-hydroxybenzoate de méthyle ................... 0,30 Eau .......................................... 68,00 Extrait de cristallin brut ................... 1,00 Parfum ........................................ 0,20 2) Crème contre le stress Stéarate de triéthanolamine ....................... 3,00 Stéarate de glycérol ....................... 3,00 Alcool cétylique .................. 2,00 Decyl oléate ........................... 1,00 Huile minérale ................................ 8,00 Myristate d'isopropyle ...................... 2,00 Purcellin liquide .................... 3,00 p-hydroxybenzoate de méthyle ........... 0,30 Eau............................................. 88,64 Sorbitol........................................ 1,00 Extrait de cristallin purifié ( & ristallin) 0,50 Parfum......................................... 0.15 3) Lait après solaire Polysorbate 60 ........................ 1,50 Alcool oléique ........................ 0,50 Cire d'abeille ........................ 1,50 Ruile de vaseline.............................. 3,00 Huile de lanoline ............................ 4,00 Huile de silicone ................... 3,00 p-hydroxybenzoate de méthyle .................. 0,30 Eau....................................... 87,55 Carbopol 940 ........................ 0,20 Triéthanolamine............................ 0,20 Glycérine.................................. 4,00 Extrait de cristallin hydrolysée ................ 2,00 Parfum.................................... 0,20 REVENDICATIONS 1. Compositions cosmétiques caractérisées en ce qu'elles contiennent un extrait obtenu à partir de cristallins de vertébrés. 2. Compositions cosmétiques selon la revendication 1 caractérisées en ce que l'extrait est en solution aqueuse. 3. Compositions cosmétiques selon les revendications 1 et 2, caractérisées en ce que l'extrait est purifié. 4. Compositions cosmétiques selon les revendications 1, 2 et 3, cactérisées en ce que l'extrait est enrichi eno(-cristallin 5. Compositions cosmétiques selon les revendications 1, 2 et 3, cactérisées en ce que l'extrait est enrichi en B-cristallin 6. Compositions cosmétiques selon les revendications 1, 2 et 3, cactérisées en ce que l'extrait est enrichi en > -cristallin 7. Compositions cosmétiques selon les revendications de 1 à 6, caractérisées en ce que les protéines de l'extrait sont sous leur forme native. 8. Compositions cosmétiques selon les revendications de 1 à 6, caractérisées en ce que les protéines de l'extrait sont sous la forme de sous-unités monomériques isolées 9. Compositions cosmétiques selon les revendications de 1 à 6, caractérisées en ce que les protéines de l'extrait sont hydrolysées. 10. Compositions cosmétiques selon les revendications de 1 à 6, caractérisées en ce que les protéines de l'extrait sont modifiées chimiquement. 11. Compositions cosmétiques selon les revendications de 1 à 10, caractérisées en ce que l'extrait contient un ou plusieurs inhibiteurs de protéases. 12. Compositions cosmétiques selon les revendications de 1 à 11, caractérisées en ce que les protéines de l'extrait sont à une concentration comprises entre 0,01 et 50 %. 13. Compositions cosmétiques selon l'une quelconque des revendications de 1 à 12, caractérisées en ce que l'extrait de cristallin possède la propriété de contrecarrer la dépolymérisation oxydative de l'acide hyaluronique. 14. Compositions cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisées en ce que l'extrait de cristallin possède la propriété de ralentir la peroxydation des acides gras polyinsaturés. 15. Compositions cosmétiques selon l'une quelconque des revendications de 1 à 4 et de 7 à 12, caractérisées en ce que l'extrait de cristallin possède une activité anti élastasique. 16. Compositions cosmétiques selon l'une quelconque des revendications de 1 à 15, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous la forme d'une crème, d'un lait, d'un gel d'une lotion ou d'un shampooing. 17. Compositions cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisées en ce que les protéines de l'extrait sont encapsulées dans des vésicules lipidiques de type liposomes. 18. Compositions cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisées en ce que les protéines de l'extrait sont encapsulées dans des particules ou des vésicules de polymères synthétiques ou naturels de diamètre compris entre 10 nm et 2 mm, connus sous le nom de nanoparticules, nanocapsules, microparticules, microcapsules. 19. Compositions cosmétiques selon l'une quelconque des revendications de 1 à 18 caractérisées en ce qu'elles sont destinées à la lutte contre le vieillissement cutané et l'apparition des rides. 20. Compositions cosmétiques selon l'une quelconque des revendications de 1 à 18 caractérisées en ce qu'elles sont destinées au soin des peaux inflammées et irritées. 21. Compositions cosmétiques selon l'une quelconque des revendications de 1 à 18, caractérisées en ce qu'elles sont destinées à traiter les effets nocifs de la pollution atmosphérique.