Brevet FR2661920A1 — publié le 19911115

-f PROCEDE DE DETERMINATION D'UN ACTIVATEUR DU PLASMINOGENE ET DE SON INHIBITEUR DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une nouvelle solu- tion technique pour la détermination ou le dosage d'un activateur du plasminogène choisi parmi l'ensemble cons- titué par les activateurs du plasminogène de type tissu- laire et de type urokinase, d'une part, et d'un inhibi- teur dudi-t activateur du plasminogène, d'autre part. Elle vise le procédé pour la détermination d'un activateur du plasminogène et de son inhibiteur, qui com- prend selon ladite nouvelle solution l'inhibition de deux protéines plasmatiques: les 62-antiplasmine (i 2-AP) et ART ANTERIEUR Les activités des activateurs du plasminogène de type tissulaire (t PA) et de type urokinase (u PA) sont régulées par une substance inhibitrice dénommée inhibiteur d'activateur du plasminogène (PAI) On sait en particulier que les t PA et PAI jouent un rôle très impor- tant dans la régulation de la fibrinolyse et que les méthodes antérieurement connues pour leur dosage reposent sur le principe de la mesure de la plasmine, qui a été générée dans le système à partir du plasminogène, au moyen d'un substrat peptidique (fluorogène ou mieux chro- mogène) spécifique de la plasmine. La fibrinolyse a pour but de restaurer la perméa- bilité vasculaire en dégradant les dépôts de fibrine sus- ceptibles de se former sur les parois vasculaires La fibrinolyse est assurée par la plasmine qui est un enzyme très puissant circulant dans le plasma sous sa forme inactive: le plasminogène. L'activation du plasminogène en plasmine peut se dérouler selon deux voies: une voie dite intrinsèque (ou endogène) et une voie dite extrinsèque (ou exogène) In vivo la fibrinolyse est perpétuellement régulée par un système d'inhibiteurs de telle façon que la fluidité san- guine soit toujours maintenue Pour information, les mé- canismes de la fibrinolyse ont été schématisés dans la figure 1 ci-après avec les interventions des activateurs et des inhibiteurs Dans la figure 1, chaque flèche en trait épais continu désigne une activation, et chaque flèche en trait épais discontinu désigne une inhibition. L'urokinase légalement dénommée activateur du plasminogène de type urokinase (en abrégé: u PA)l inter- vient dans les mécanismes (voie intrinsèque) de la fibrinolyse d'abord sous la forme prourokinase ldénommée activateur du plasminogène de type urokinase de structure monocaténaire (en abrégé: scu PA)l puis sous la forme d'urokinase dite de haut poids moléculaire légalement dénommée activateur du plasminogène de type urokinase de structure bicaténaire (en abrégé: tcu PA ou HMW-UK)l Le t PA intervient dans les mécanismes (voie extrinsèque) de la fibrinolyse sous la forme dite sct PA ldénommée activateur du plasminogène de type tissulaire de structu- re monocaténaire (autre abréviation donnée dans la litté- rature: t PA-I)l et sous la forme dite tct PA ldénommée activateur du plasminogène de type tissulaire de structu- re bicaténaire (autre abréviation donnée dans la litté- rature: t PA-II)l. Il convient cependant de remarquer que, à l'état physiologique, le scu PA (voie intrinsèque) semble respon- sable, en grande partie, de l'activité fibrinolytique, et le t PA (voie extrinsèque) n'intervient que faiblement l 95 % environ du t PA sont rapidement complexés par le PAI-1 dès sa libération; seuls restent 5 % environ du t PA sous forme libre et donc active dans le plasmal En revanche, dès que l'organisme subit une agression quelconque, la voie extrinsèque joue alors un rôle prépondérant et essentiel pour pallier la formation excessive de plasmine. Le t PA est principalement libéré des cellules endothéliales Il peut être extrait de différents tissus d'origine animale (ovaire et coeur de porc) ou humaine (utérus) Toutefois, comme la quantité de t PA purifié extraite de ces tissus est infime, la source principale de t PA purifié que l'on préfère provient de la culture cellulaire de mélanomes humains (BOWES) Grâce à cette culture cellulaire qui sécrète beaucoup de t PA, on a pu obtenir le t PA purifié, estimer son poids moléculaire, déterminer sa structure biochimique et caractériser ses activités physiologiques Le t PA est une sérine protéase ayant un poids moléculaire moyen d'environ 70 000 dal- tons, capable de transformer le plasminogène en plasmine. La présence de fibrine permet une activation optimale du plasminogène par le t PA. L'inhibiteur d'activateur du plasminogène len abrégé:PAIl intervient dans la régulation des activa- teurs du plasminogène On connaît essentiellement quatre formes de PAI, à savoir le PAI-1 (inhibiteur 1 des activateurs du plasminogène), le PAI-2 (inhibiteur 2 des activateurs du plasminogène), le PAI-3 (inhibiteur 3 des activateurs du plasminogène) et la protéase nexine lvoir Thrombosis and Haemostasis 56 (No 3), pages 415-416, ( 1986)l. Les inhibiteurs du t PA, qui sont également désignés sous le nom d'anti-activateurs, sont principale- ment de deux types: le PAI-1 qui est présent dans le plasma et les granules alpha des plaquettes, et qui réagit aussi bien avec le t PA que l'uroki- nase pour donner des complexes inactifs: (t PA-PAI-l) et (u PA-PAI-l); comme la vi- tesse de complexation est très élevée, le fait qu'il existe du PAI-1 libre dans un plasma, implique qu'il ne peut pas il y avoir dans ce plasma de t PA libre actif; et le PAI-2 qui est d'origine probablement ma-crophagique, qui est à sa concentration maximale chez la femme enceinte au 3 è tri- mestre de la grossesse, et qui, s'il forme des complexes inactifs avec le t PA, pos- sède une affinité plus grande vis-à-vis de l'u PA; lvoir E D SPRENGERS et al, Blood 69, (No 2), pages 381-387 ( 1987)l. En d'autres termes, on sait que les activités des activateurs du plasminogène de type tissulaire et uroki- nase sont régulées par au moins deux inhibiteurs spécifi- ques de type endothélial (PAI-1) et placentaire (PAI-2) et que les couples t PA/PAI et u PA/PAI ont un rôle essen- tiel dans la régulation de la fibrinolyse. On sait par ailleurs que l'activité antiplasmini- que du plasma, qui est très importante, est principale- ment localisée au niveau des Cl-globulines et O 2- globulines On connaît six protéines plasmatiques capables d'inhiber la plasmine en système purifié; ce sont: 1 ' l-antitrypsine, l'inter "antitrypsine, l'inhibiteur de la C 1 estérase (en abré- gé Cl-Inh), l'antithrombine III (en abrégé AT III), l'È 2-macroglobuline (en abrégé d 2-M), et 1 'o 2-antiplasmine (en abrégé Ot 2-AP). En présence de concentrations plasmatiques normales en " 2-AP et " 2-M, les autres inhibiteurs de la plasmine interviennent peu dans l'inactivation de la plasmine Le rôle de 1 ' ( 2-M est d'inhiber la plasmine en excès quand il n'y a plus d' & 2-AP libre Ces inhibiteurs, principalement O ( 2-AP et O( 2-M interfèrent de façon significative dans les dosages de PAI lvoir l'article de G CONTANT et al Thrombosis Research 56, pages 377-386, ( 1989) et l'exposé de W KAUSEL et al. présenté lors du Congrès de la Ligue Méditerranéenne de Lutte contre la Thrombose de 1988 à Athènes et intitulé: "Relative -Contribution of Known Plasminogen Activator Inhibitors (PA Is) to the t PA and u PA Inhibitory Capacity of Plasma"l. Les méthodes qui ont déjà été préconisées, pour le dosage de t PA et PAI sont schématisées par les diagrammes A et B qui suivent Elle reposent sur la mesu- re de la plasmine générée dans le système au moyen d'un substrat spécifique de la plasmine. Diagramme A dosage du t PA - substrat t PA chromogène Plasminogène) plasmine stimulateur p NA -6Diagramme B dosage du PAI (PAI-1) PAI (plasma) t PA Méthode M 3 -> Méthode M 4 (t PA-PAI) + t PA résiduel > Méthode M 5 -> Méthode M 6 On sait en particulier que les méthodes de dosage de l'activité biologique du t PA ont été préconisées dans le passé en phase solide et en phase liquide. En phase solide (méthode Ml), on connaît une technique fondée sur la fixation d'un réseau de fibrine à la surface de cupules d'une microplaque; après fixation de la source de t PA, des lavages sont effectuées afin d'éliminer la plupart des facteurs gênant la génération de plasmine Cette technique présente des avantages: utilisation de toute source de t PA, comme le plasma, l'activité mesurée est spécifique du t PA et in- dépendante de la prourokinase len abrégé: scu PAl et de l'urokinase len abrégé: tcu PAl. Voir à cet effet les modalités de la méthode M 1 décrite par E ANGLES-CANO et al, "A Spectrophotometric Solid- Phase Fibrin-Tissue Plasminogen Activator Activity Assay (SOFIA-t PA) for High Fibrin Affinity Tissue Plasminogen Activators" Anal Biochem, 153, pages 201-210, ( 1986). En phase liquide (méthode M 2), on connait une technique selon laquelle, à la source de t PA à doser, on ajoute du plasminogène en excès et des fragments de fibrinogène solubles comme stimulateur La plasmine en excès générée coupe le substrat spécifique de la plasmine lpar exemple l'un des substrats CBS 30 41 (H-D-Abu-L-CHA-L-Lys-p NA) ou CBS 33 08 (H-D-Nle-LCHA-L-Arg-p NA) commercialisés par la -7- société DIAGNOSTICA STAGOl et libère p NA détectable (notamment à 405 nm) La source de t PA peut être soit du t PA purifié (extrait de mélanome comme indiqué ci-dessus) que l'on utilise pour l'étalonnage, soit des euglobulines plasmatiques (dilution 1/10 et à p H 5,9), c'est-à-dire une source de t PA dépourvue d'inhibiteurs de la plasmine (surtout 1 ' O (référence No 0822 du catalogue de cette société). L'activité mesurée est particulièrement liée au t PA grâce aux fragments de fibrinogène, mais elle est amplifiée par les autres voies d'activation (Facteur XII, prourokinase, urokinase) Pour que la mesure de l'activi- té soit spécifique du t PA, il est nécessaire d'ajouter des anticorps anti-t PA. On connait également une autre méthode (méthode M 7) qui consiste à séparer le t PA libre par adsorption sur colonne de lysine-sépharose et qui a été décrite par E.GYZANDER et al, Thromb Res, 35, pages 547-548, ( 1984). Les méthodes applicables au dosage du PAI sont également applicables au dosage du t PA, dès lors qu'elles reposent sur la détermination du t PA résiduel après complexation du PAI contenu dans le plasma à tester. Elles comprennent notamment la méthode M 3 décrite par C.KORNINGER et al, Thromb Haem, 46, pages 622-665, ( 1981) et 52, pages 127-130, ( 1984) qui met en oeuvre des euglobulines; la méthode M 4 décrite par J CHMIELEWSKA et al., Thromb Res, 31, pages 427-436, ( 1983) qui fait appel à du plasma acidifié; la méthode M 5 décrite par J.H VERHEIJEN et al, Thromb Haem, 48, pages 266-269, ( 1982) qui fait appel à la précipitation des euglobulines sur plasma pur ou dilué; et la méthode M 6 décrite dans l'article de G CONTANT et al précité et utilisée dans la trousse de dosage commercialisée sous la nomenclature "STACHROM PAI" (référence No 0824) par la société DIAGNOSTICA STAGO Pour que la technique de G CONTANT et al, précitée soit spécifique, il est important de diluer l'échantillon à tester dans du plasma déplété (i e. appauvri ou épuisé) en PAI, l'interférence des inhibiteurs de la plasmine (autres que Q( 2-AP et $ apportés par le plasma devient alors négligeable. Le principal inconvénient des méthodes précitées pour doser le t PA et/ou le PAI réside dans la nécessité de séparer le t PA libre des complexes t PA-PAI et u PA-PAI et d'empêcher l'action des inhibiteurs de la plasmine (plus particulièrement i 2-AP et È 2-M) par -acidification du plasma (voir méthode M 4), -précipitation des euglobulines (voir méthode M 5), ou -adsorption sur colonne (voir méthode M 7). En bref, les méthodes antérieurement connues M 1- M 7 sont longues et délicates à mettre en oeuvre et sont susceptibles d'être déficientes en ce qui concerne la re- productibilité et/ou la sensibilité des dosages. Par ailleurs, comme on connaft l'inactivation des O(-antiplasmines par oxydation notamment de l'article de D JOHNSON et al, J Biol Chem, 254, pages 4022-4026, ( 1979), du résumé No 01358 de la communication de D. LAWRENCE et al,(congrès "Thrombosis and Haemostasis" de 1985 à San Diego) et de l'article de D LAWRENCE et al, Biochem, 25, pages 6351-6355, ( 1986) au moyen de chlora- mine T, on sait que l'on a proposé une nouvelle méthode (méthode M 8) qui consiste à ajouter un oxydant spécifique des groupements méthionine, tel que la chloramine T, pour inhiber l'action de 1 '0 2-AP lVoir à cet effet les articles de T W STIEF et al, Thromb Res, 49, pages -9- 581-589, ( 1988), 50, pages 559-573 ( 1988), 56, pages 213- 220, ( 1989), la demande de brevet européen publiée EP-A-O 297 597, et la notice de la trousse de dosage commercialisée par la société BEHRING DIAGNOSTIKA sous la nomenclature "PAI-TEST" intitulée "FUNKTIONELLE BESTIM- MUNG DES PLASMINOGEN-AKTIVATOR-INHIBITORS" (novembre 1988)l Comme la chloramine T et les autres moyens oxydants sont des produits de manipulation délicate, il est apparu un besoin d'une nouvelle solution technique pour la détermination des activateurs du plasminogène de type tissulaire et de type urokinase, d'une part, et de leurs inhibiteurs, d'autre part, faisant appel à des moyens différents de ceux préconisés auparavant. BUT DE L'INVENTION La nouvelle solution technique que l'on préconise selon l'invention pour la détermination d'un activateur du plasminogène choisi parmi l'ensemble constitué par les activateurs du plasminogène de type tissulaire et de type urokinase, d'une part, et d'un inhibiteur dudit activa- teur du plasminogène, d'autre part, repose sur l'utilisa- tion d'un nouveau moyen inhibant ou annihilant les inhi- biteurs de la plasmine, X 2-AP et/ou o( Plus précisément, la présente invention repose sur la découverte surprenante que des venins de serpent contenant un matériau métalloprotéinasique inhibant les inhibiteurs PAI, d'autre part. La nouvelle solution technique selon l'invention permet de pallier les inconvénients précités des méthodes de dosage antérieures sus-visées. Selon un premier aspect de l'invention, on propose une nouvelle solution technique pour la détermi- nation des activateurs du plasminogène et de leurs inhibiteurs qui met en oeuvre au moins un matériau métalloprotéinasique. Selon un second aspect de l'invention, on préco- nise un procédé pour la détermination d'activateurs du plasminogène de type tissulaire (t PA) et de leurs inhibi- teurs (PAI) dans lequel on utilise un matériau métallo- protéinasique. Selon un autre aspect de l'invention, on préconi- se un nécessaire, trousse ou kit de dosage comprenant en tant que réactif au moins un matériau métalloprotéinasi- que. OBJET DE L' INVENTION On propose selon l'invention une nouvelle utili- sation d'une substance inhibant les protéines plasmati- ques O parmi l'ensemble constitué par les matériaux métallopro- téinasiques. On propose également selon l'invention un nouveau procédé pour la détermination (i) d'un activateur du plasminogène choisi parmi l'ensemble constitué par les activateurs du plasminogène de type tissulaire (t PA) et les activateurs du plasminogène de type urokinase (u PA), et (ii) d'un inhibiteur (PAI) dudit activateur du plasminogène, ledit procédé, qui comporte la transforma- tion du plasminogène en plasmine puis le dosage de la il plasmine résultante de ladite transformation, étant caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition des protéines plasmatiques o 2-antiplasmine et/ou O globuline au moyen d'une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les matériaux métalloprotéinasi- ques. ABREVIATIONS Par commodité, les abréviations suivantes ont été utilisées dans la présente description, à savoir: a) en ce qui concerne la fibrinolyse: tissulaire de structure monocaté- naire (en anglais: "single-chain tissue plasminogen activator"); autre nomenclature: t PA-I tct PA = activateur du plasminogène de type tissulaire de structure bicaténaire (en anglais: "two-chain tissue plasminogen activator); autre nomenclature: t PA-II u PA = activateur du plasminogène de type urokinase (en anglais: "urokinase plasminogen activator"); autres nomenclatures: urokinase ou acti- vateur du plasminogène de type urinaire scu PA = activateur du plasminogène de type urokinase de structure monocaténaire (en anglais: "single-chain urokinase tcu PA PAI PAI-1 PAI-2 PAI-3 UK Arg Abu CHA CHT Glu Gly Hyp 3 Hyp 4 Hyp Leu Lys Nle -12- plasminogen activator"); autre nomencla- ture: prourokinase = activateur du plasminogène de type urokinase de structure bicaténaire (en anglais: "two-chain urokinase plasminogen activator"); autres nomenclatures: urokinase de haut poids moléculaire ou HMW-UK = inhibiteur d'activateur du plasminogène = inhibiteur 1 des activateurs du plasmi- nogène, substance formant des complexes (t PA-PAI-1) et (u PA-PAI-1) avec t PA et respectivement u PA = inhibiteur 2 des activateurs du plasmi- nogène, substance formant des complexes avec t PA et u PA = inhibiteur 3 des activateurs du plasminogène, substance susceptible de former des complexes avec u PA = urokinase (autre nomenclature de u PA). b) en ce qui concerne les substrats peptidiques: = arginyle = 2aminobutyryle = 3-cyclohexylalanyle = 3-( 4-hydroxycyclohexyl)alanyle = glutaminyle = glycyle = hydroxyprolyle ( 3 Hyp ou 4 Hyp) = 3-hydroxyprolyle (ou 3-hydroxy-2- pyrrolidinecarbonyle) = 4-hydroxyprolyle (ou 4-hydroxy-2- pyrrolidinecarbonyle) = leucyle = lysyle = norleucyle -13- Nva Phe Phg Pip Pro Pyr Tyr Val AMCHA BSA Bzl EACA EM Et Me MM OD Ot Bu PEG= PM p NA RT = norvalyle = phénylalanyle = phénylglycyle = pipécolinoyle = prolyle = pyroglutaminyle (ou 2-pyrrolidone-5- carbonyle) = tyrosyle = valyle c) en ce qui concerne les autres abréviations: = acide tranexamique, de nomenclature systématique: acide 4-(aminométhyl)- cyclohexane-carboxylique = albumine bovine sérique = benzyle = acide E aminocaproique = éthyloxymalonyle (Et O-CO-CH 2-Co) = éthyle = méthyle = méthyloxymalonyle (Me O-CO-CH 2-CO) = densité optique = t-butyloxy = reste de polyéthylèneglycol de PM = n = poids moléculaire = p- nitroanilino lou ( 4-N 02)CGH 4 NHl = température ambiante ( 15-20 C) DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Par l'expression "matériau métalloprotéinasique" on entend selon l'invention une substance constituée par une ou plusieurs métalloprotéinases ou une substance renfermant au moins une métalloprotéinase Le matériau métalloprotéinasique qui intervient selon l'invention a pour objet d'annihiler, d'inhiber ou détruire les pro- téases plasmatiques que sont les O 2-AP et/ou c" 2-M. Parmi les matériaux métalloprotéinasiques qui conviennent selon l'invention, on peut notamment citer les venins Les venins contenant au moins une métallo- protéinase peuvent être utilisés soit tels que recueillis notamment de serpents ou d'insectes, soit purifiés Parmi les venins de serpent que l'on peut utiliser, on peut notamment citer ceux obtenus d'animaux appartenant aux familles des vipéridés et des crotalidés. Le matériau métalloprotéinasique préféré selon l'invention est choisi parmi les produits qui clivent 1 ' 68 000 daltons pour donner un peptide qui est essentiel- lement dépourvu d'activité O de 53 000 daltons. Les matériaux métalloprotéinasiques que l'on préconise de préférence selon l'invention sont constitués par les venins de Bitis arietans, Crotalus basiliscus et Lachesis muta (ou Lachesis mutus). On sait que les &'-aminoacides tels que l'AMCHA et 1 'EACA favorisent la transformation du plasminogène en plasmine selon deux mécanismes: induction d'un change- ment de conformation du Glu-plasminogène en Lys-plasmino- gène plus activable en plasmine, et interférence sur l'interaction de la plasmine avec l'P( 2-AP permettant de diminuer l'effet inhibiteur de la plasmine par 1 ' " 2-AP d'au moins 10 fois. On vient de trouver de façon surprenante que lesdits CO-aminoacides potentialisent l'effet recherché du matériau métalloprotéinasique sur l' o 2-AP et l' 2-M, lorsque l'on fait appel à un plasma non épuisé en d 2- AP, en présence ou en absence de PAI En revanche, il n'y a pas de potentialisation de l'effet dudit matériau métalloprotéinasique lorsque l'on fait appel à un plasma épuisé en O suffisamment importante avec ledit matériau métallo- protéinasique. Dans le cas de la détermination ou du dosage de t PA, l'on recommande selon l'invention d'incorporer un stimulateur Le stimulateur utilisable est ici un moyen classique de l'art antérieur, par exemple des monomères de fibrine commercialisés notamment sous le nom commer- cial de DESASIF ldes-AA-fibrinogènel par la société BIOPOOL, des fragments de fibrinogène (voir l'article de VERHEIJEN précité) et commercialisés notamment par la société DIAGNOSTICA STAGO dans sa trousse de dosage STACHROM PA, ou une polylysine décrite notamment dans l'article de GYZANDER précité. De façon avantageuse selon l'invention, l'on pré- conise pour la détermination ou le dosage de t PA d'utiliser une concentration de venin dans un tampon approprié supérieure ou égale à 0,025 mg/ml (correspon- dant à une teneur supérieure ou égale à 0,0125 mg/ml finale dans le mélange de l'essai) En pratique, la con- centration maximale du venin dans le tampon sera infé- rieure ou égale à 1 mg/ml De préférence, l'on utilisera plus avantageusement une concentration de venin dans le tampon de l'ordre de 0, 05 mg/ml Le tampon préféré sera un tampon phosphate de p H 7,0 à 9,0 et mieux un tampon phosphate de p H 7,5 Ledit tampon peut contenir de l'albumine bovine (BSA) pour favoriser la lyophilisation des réactifs devant être incorporés dans les trousses de dosage. Pour le dosage ou la détermination de PAI, on préconise avantageusement d'utiliser une concentration de venin dans le plasma de 0,1 à 1 mg/ml, et de préférence une concentration de 0,24 mg/ml Selon le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention, pour la détermination ou le dosage du t PA, (a) l'on incorpore du venin dans le -16- plasma à étudier dilué dans le tampon approprié, (b) incube à 37 C pendant 2 minutes, (c) ajoute le moyen stimulant (notamment le produit commercialisé sous le nom de STIMUGEN par la société DIAGNOSTICA STAGO), (d) incube à 37 C pendant 150 minutes, (e) ajoute le substrat chromogène, puis (f) incube à 37 C pendant 5 minutes On effectue ensuite la lecture de la libération du moyen chromogène, notamment à 405 nm en cinétique selon la méthode statique dite à deux points (en ajoutant dans ce cas de l'acide acétique) La lecture de OD (notamment par transmission) est contrôlée par un essai à blanc dans lequel le plasma à étudier additionné de venin est remplacé par le tampon additionné de venin. En variante, le venin peut être incorporé dans le système au stade (c) avec le moyen stimulant. Toujours selon le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention, pour la détermination ou le dosage du PAI, (a) l'on incorpore t PA ou u PA dans le plasma à étudier, (b) incube à 37 C pendant 5 minutes, (c) ajoute un mélange constitué par du plasminogène, un W-aminoaci- de (notamment AMCHA ou EACA) et du venin, (d) incube à 37 C pendant 3 minutes, (e) ajoute le substrat chromogène, puis (f) incube à 37 C pendant 3 minutes On effectue ensuite la lecture de la libération du moyen chromogène, comme indiqué ci-dessus, notamment à 405 nm en cinétique selon la méthode dite à deux points (en ajoutant dans ce cas de l'acide acétique) La lecture de OD (notamment par transmission) est également contrôlée par un essai à blanc dans lequel le t PA ou l'u PA est remplacé par un tampon. Parmi les substrats chromogènes synthétiques spécifiques de la plasmine, l'on peut utiliser notamment l'un des composés suivants: H-D-Nva-L-CHA-LLys-p NA, H-D-Abu-L-CHT-L-Lys-p NA, H-D-Nle-L-CHA-L-Arg-p NA, H-D-Phe-LPip-L-Arg-p NA, H-D-Val-Leu-Lys-p NA, MM-L-Phe-L-Arg-p NA, MM-L-4 Hyp-LArg-p NA, MM-L-3 Hyp-L-Arg-p NA, MM-L-Tyr-L-Arg-p NA, MM-L-Phg-L-Arg-p NA, MM-L-Hyp-L-Lys-p NA, MM-L-Pro-L-Lys-p NA, MM-L-Tyr-L-Lys-p NA, MM-LHyp(Ot Bu)-L-Arg-p NA, EM-L-Pro-L-Arg-p NA, EM-L-Tyr-L-Arg-p NA, EM-L-PheL-Arg-p NA, EM-L-Phg-L-Arg-p NA, PEG 200 lCO-D-Glu(O Bzl)-L-Pro-L-Arg-p NAl 2, PEG 400 lCO-D-Leu-Gly-L-Arg-p NAl 2, (les deux derniers substrats de cette liste étant décrits dans la demande de brevet français No 90 01964 de la Demanderesse) ou un de leurs sels d'addition d'acide, notamment avec H Cl, l'acide acétique ou l'acidetrifluoro- acétique comme acide salifiant. Le nécessaire, trousse ou kit de dosage selon l'invention, comprendra au moins un matériau métallopro- téinasique de préférence choisi parmi les venins de Bitis arietans, Crotalus basiliscus, Lachesis muta et leurs mé- langes, et le cas échéant, des échantillons t PA, u PA et/ou PAI purs. La solution selon l'invention, qui met en oeuvre un matériau métalloprotéinasique pour inhiber les protéa- ses plasmatiques ( 2-AP et/ou le PAI. EXEMPLE 1 Protocole de dosage de t PA - On procède selon le diagramme A ci-dessus dans un tube à hémolyse en matière plastique maintenu à la tempé- rature de 37 C, selon les modalités données dans le tableau I ci-après. TABLEAU I DOSAGE DU t PA Ingrédients Essai Blanc Plasma dilué dans un tampon avec matériau métallopro- téinasique (a) 200 Tampon plus maté- riau métallopro- téinasique (a) 200 g 1 Incubation 2 minutes 2 minutes Stimulant (b) 200 200 1 Incubation 150 minutes 150 minutes Substrat (c) 200 2i 200 Notes (a) venin de B arietans, C basiliscus ou L mut (b) produit commercialisé sous le nom de STIMU, par la société DIAGNOSTICA STAGO (c) substrat chromogène spécifique de la plasm Remarque La lecture est faite avec un spectrophotomètre pour apprécier la libération du groupement chromogène à 405 nm. a GES ine EXEMPLE 2 Dosage de PAI - On procède selon le diagramme B ci-dessus dans un tube à hémolyse en matière plastique maintenu à la tempé- * rature de 37 C, selon les modalités données dans le tableau II ci-après. TABLEAU II DOSAGE DU PAI Ingrédients Essai Blanc Plasma 50 p 50 u PA ou t PA 200 p 1 - Tampon 200 Incubation 5 minutes 5 minutes Plasminogène plus (a) plus (b) 200 l 20 l Incubation 3 minutes 3 minutes Substrat (c) 2001 2001 Incubation 3 minutes 3 minutes Notes (a) venin de B arietans, C basiliscus ou L muta (b) w-aminoacide (AMCHA ou EACA) (c) substrat chromogène spécifique de la plasmin E Remarque La lecture est faite avec un spectrophotomètre pour apprécier la libération du groupement chromogène à 405 nm. EXEMPLE 3 Effet du matériau métalloprotéinasique sur t X 2-AP - On a mesuré la teneur en Q L.muta, la teneur en venin étant à une concentration su- périeure ou égale à 0,50 mg/ml de plasma en tampon de di- lution (soit une teneur supérieure ou égale à 0,0125 mg/ml du mélange contenant de la plasmine). L'inhibition de l'à 2-AP mesurée avec quatre lots différents de venin de B arietans, quatre lots dif- férents de C basiliscus et quatre lots différents de L. muta est obtenue pour des concentrations allant de 0,5 à 1 g/ml de plasma (soit 0,025 à 0, 050 g/l de tampon) de B.arietans, d'une part, et pour la concentration de 0,5 mg/ml de plasma (soit 0,025 mg/ml de tampon) de C basi- liscus ou de L muta, d'autre part. Quand on dose 1 ' o neur en O 2-AP dite de 100 %) en présence d'un desdits venins, on trouve une teneur (relative) en 62-AP d'envi- ron 25 % ( 20 à 30 %), ce qui démontre une inhibition de l' ( 2-AP par le matériau métalloprotéinasique contenu dans le venin de B arietans, C basiliscus ou L muta. Les résultats consignés dans la figure 2 ci-après dans le système OD en ordonnées (à 405 nm)/V (venin de B.arietans) en mg/ml en abscisses confirment l'inhibition de 1 'o échantillon contenant le tampon sans plasmine. EXEMPLE 4 Effet du matériau métalloprotéinasique sur le plasminogène et la plasmine - On a observé que le matériau métalloprotéinasique (notamment le venin de B arietans, C basiliscus ou L. muta) n'a pas d'effet sur le plasminogène et qu'il n'a pas d'effet statistiquement significatif sur la plasmine. En particulier lorsque l'on ajoute le matériau métallo- protéinasique à de la plasmine puis incube à 37 C, on constate que le matériau métalloprotéinasique est capable d'hydrolyser les substrats synthétiques spécifiques de la plasmine lnotamment les substrats CBS 30 41 et CBS 10 65, qui sont respectivement les H-D-Abu-L-CHA-L-Lys-p NA,Ac OH et MM-Hyp-Arg-p NA,Ac OHl Cette hydrolyse est fonction de la concentration en venin; quand on utilise une concen- tration en venin relativement faible ( 0,0125 mg/ml de milieu), 95 % de la plasmine est active sur le substrat: l'effet du venin sur la plasmine est alors statistique- ment non significatif. EXEMPLE 5 Effet du matériau métalloprotéinasique sur u PA et t PA - On a observé que l'activité de u PA (urokinase) directement mesurée sur un substrat spécifique n'est pas modifiée en présence de venin (voir figure 3). On a également observé que l'activité du t PA me- surée par STACHROM PA n'est pas modifiée en présence de venin (voir figure 4). Dans la figure 3, selon le système OD en ordon- nées (à 405 nm)/V (venin de B arietans) en mg/ml en abscisses, les courbes 3 A (u PA à 100 UI/ml), 3 B (u PA à 40 UI/ml) et 3 C (tampon seul) sont approximativement des droites. Dans la figure 4, selon le système OD en ordon- nées (à 405 nm)/t PA (dans le tampon) en UI/ml en abscis- ses, les courbes 4 A (tampon contenant 0,24 mg/ml de -22- venin de B arietans), 4 B (tampon contenant 0,50 mg/ml de venin de B arietans) et 4 C (tampon sans venin) sont des droites pratiquement confondues. EXEMPLE 6 Effet du matériau métalloprotéinasique sur PAI - On a observé que, lorsqu'un plasma riche en PAI est incubé en présence d'un matériau métalloprotéinasique (venin de B arietans, C basiliscus ou L muta), l'activité du PAI telle que dosée est identique à celle trouvée dans ledit plasma en l'absence dudit matériau métallopro- téinasique (voir figure 5). On a également observé que, lorsque l'on ajoute du t PA purifié au mélange plasma-matériau métalloprotéi- nasique (venin de B arietans, C basiliscus ou L muta), le t PA ajouté est totalement inhibé par le PAI du plasma en l'absence et en présence dudit matériau métalloprotéina- sique (voir figure 6). L'ensemble de ces résultats met clairement en évidence que, selon l'invention, le matériau métallopro- téinasique n'inhibe pas le PAI. Dans la figure 5, selon le système OD en ordon- nées (à 405 nm)/PAI en UI/ml en abscisses, les courbes 5 A (PAI en l'absence de venin de B arietans) et 5 B (PAI en présence de venin de B arietans) sont des droites paral- lèles. Dans la figure 6, selon le système OD en ordon- nées (à 405 nm)/venin (de B arietans) en mg/ml en abscis- ses, le t PA a été ajouté à un plasma PO (teneur en PAI de O UI/ml) déplété en PAI ou à un plasma Pl (teneur en PAI de 7,7 UI/ml) riche en PAI, en présence de concentra- tions croissantes en venin de O à 0,50 mg/ml La courbe 6 A (plasma PO sans t PA) est une droite qui est approximativement parallèle à la droite 6 B (tampon PO plus t PA 5,2 UI/ml) Les droites 6 C (plasma Pl sans t PA) et 6 D (plasma Pl plus t PA 5,2 UI/ml) sont identiques; ce- ci indique que le t PA ajouté au plasma (P 1) riche en PAI est inhibé en l'absence ou en présence de venin. EXEMPLE 7 Effet du matériau métalloprotéinasique sur les complexes u PA-PAI - On a apprécié l'éventuelle interaction du maté- riau métalloprotéinasique (venin de B arietans brut, tel que recueilli et fourni par les fermes d'élevage) sur les complexes u PA-PAI formés par incubation avec l'u PA (urokinase) à 37 C pendant 0,25 h d'un plasma riche en PAI (plasma P 2 contenant du PAI à la concentration de 10 UI/ml) par comparaison avec le plasma PO épuisé en PAI utilisé à l'exemple 6. Les résultats obtenus avec le venin de B arietans ont été consignés dans les tableaux III et IV ci-après. Lesdits résultats montrent qu'il n'y a pas de formation de complexe dans le plasma PO car il n'y a pas de PAI: on retrouve donc tout l'u PA résiduel; comme le plasma P 2 contient 10 UI/ml de PAI, il y a formation de complexes avec l'u PA et l'on ne retrouve qu'une partie de l'u PA ajouté Ces résultats montrent également que le venin n'a pas d'effet sur la dissociation des complexes u PA-PAI et t PA-PAI. EXEMPLE 8 Effet du matériau métalloprotéinasique et de l'AMCHA sur la transformation du plasminogène en plasmine par l'u PA ou le t PA - En premier lieu, on a vérifié que 1 'AMCHA, oméga- aminoacide de référence, augmente la génération de plas- mine dans le dosage de PAI en présence d'urokinase (voir les résultats donnés dans la figure 7). Dans la figure 7, selon le système OD en ordon- nées (à 405 nm)/PAI en UI/ml en abscisses, les courbes obtenues: 7 A (sans AMCHA), 7 B (AMCHA à 1,3 mmoles/l dans le réactif) et 7 C (AMCHA à 2,6 mmoles/l dans le réactif), -24- sont des droites et montrent que l'AMCHA augmente effec- tivement la transformation du plasminogène en plasmine. En deuxième lieu, on a voulu vérifier que 1 'AMCHA diminue l'effet de l' O( 2-AP d'un plasma normal (c'est-à- dire un plasma ayant une teneur en c une concentration de 0,88 mmole/l de tampon de dilution. En troisième lieu, comme le venin brut (venin de B arietans) est capable d'inhiber 1 ' potentialisé par 1 'AMCHA selon les modalités suivantes. Dans le dosage d' trouve une teneur d'O ma incubé en présence de venin et d'AMCHA ajoutés simul- tanément Cette observation permet de conclure que l'AMCHA potentialise l'effet du venin sur l'inhibition de 11 Dans le dosage de PAI, on trouve que le venin a un effet très important sur l'augmentation de la généra- tion de plasmine et que cet effet est supérieur à celui de l'AMCHA (voir tableaux V,VI et VII ci-après) On cons- tate que l'effet du venin est potentialisé par l'AMCHA en présence ou en l'absence de PAI (voir lesdits tableaux V, VI et VII). Lorsque l'on utilise un plasma déficient en o AP, la génération de plasmine est importante avec le venin, et elle l'est encore plus avec l'AMCHA Ce résul- tat est lié à la transformation du Glu-plasminogène en Lys-plasminogène, et on constate que 1 'AMCHA dans ce cas ne potentialise pas le venin (voir tableau VIII ci- après). -25- EXEMPLE 9 Effet du matériau métalloprotéinasique sur 1 ' On sait que les substances telles que l'EACA stimulent in vitro la génération de thrombine dans un plasma alors que l'effet de 1 ' " 2-M est inhibé lcf. I.G SLOAN et al, Thromb Res, 44, pages 761-769, ( 1986)l Ce phénomène peut être expliqué par le fait que les oméga-aminoacides tels que l'EACA et l'AMCHA possè- dent un groupe amine terminal et sont capables d'inhiber 1 ' cette façon. On sait, d'autre part, qu'il a été signalé que certains venins perdent leur activité protéolytique quand ils sont incubés avec 1 ' telles que l'92-M lvoir l'article de L F KRESS précitél. Compte tenu de ces circonstances, on a voulu vé- rifier si oui ou non un matériau métalloprotéinasique tel qu'un venin (venin brut de B arietans) en association le cas échéant avec un oméga-aminoacide (AMCHA) pouvait in- tervenir favorablement dans le dosage de PAI Dans cette optique, on a mesuré la plasmine résiduelle après inhibi- tion par l'aprotinine On a observé que: l'aprotinine ( 0,1 TIU/ml) inhibe la plasmine purifiée mais pas le venin, la plasmine générée en présence d'aprotinine est environ de 3 % dans un système tamponné, la teneur en plasmine générée en milieu plas- matique et liée à 1 ' O donc négligeable, même en l'absence d'1 ç 2-AP. -26- Les résultats qui ont été obtenus sont consignés dans les tableaux IX et X ci-après Le tableau IX est relatif à la mesure de la plasmine générée en présence d'urokinase (u PA), d'une part, en présence ou en l'absen- ce d'aprotinine, d'autre part, dans un plasma normal en Oc 2-AP mais déplété en PAI Le tableau X est relatif à la mesure de la plasmine générée en présence d'urokinase, d'une part, en présence ou en l'absence d'aprotinine, d'autre part, dans un plasma déplété en o EXEMPLE 10 Conditions optimales du dosage de t PA - Les conditions optimales pour le dosage de t PA sont obtenues avec des concentrations de venin (de préfé- rence venin brut de B arietans tel que recueilli et fourni par les fermes d'élevage): supérieures à 0,0125 mg/ml dans le mélange réactionnel (c'est-à-dire à des concentrations supérieu- res à 0,025 mg/ml dans le tampon), et plus préférentiellement, de l'ordre de 0,025 mg/ml dans le mélange réactionnel (i e 0,050 mg/ml dans le tampon), quel que soit le lot de venin. La génération de plasmine optimale est obtenue en 2,50 h pour une gamme de t PA allant de O à 4 UI/ml, en tubes de verre ou de plastique La courbe d'étalonnage obtenue est linéaire (voir courbe 8 A de la figure 8) La courbe obtenue avec un plasma riche en t PA et dilué en plasma déplété en t PA et PAI est également linéaire (voir courbe 8 B de la figure 8). La figure 8 a été obtenue selon le système OD en ordonnées (à 405 nm)/t PA en UI/ml en abscisses. Les résultats observés sur des plasmas obtenus après stase veineuse sont similaires, en présence de ve- nin, à ceux observés sur des euglobulines en l'absence de venin (voir tableau XII ci-après). -27- Avant stase veineuse, les résultats sont plus élevés sur les euglobulines car la mesure du t PA est évaluée avec les autres activateurs du plasminogène, surtout ceux de la voie dépendante du Facteur XII Ces autres activateurs sont activés pendant la fabrication des euglobulines. EXEMPLE Il Conditions optimales du dosage de PAI - Les conditions optimales de dosage du PAI sont obtenues avec des concentrations: d'u PA de 10 à 50 UI/ml (de préférence 10 UI/ml), ou de t PA (selon le dosage au moyen de "STACHROM PAI"), de plasminogène de 1 à 4 U/ml (de préférence 3 U/ml) de mélange réactionnel, quel que soit le lot de plasminogè- ne, d'AMCHA de 0,4 à 4 mmoles/l (de préférence 0,8 mmole/l) de mélange réactionnel, ou de tout autre oméga- aminoacide, de venin (de préférence venin brut de B arietans) de 0,1 à 1 mg/ml de plasma et mieux 0,24 mg/ml de plasma, de substrat (spécifique de la plasmine) de 1 à 5 micromoles/ml de plasma et mieux de 3,5 micromoles/ml de plasma. Dans ces conditions, la génération de plasmine optimale est obtenue en 3 minutes et l'hydrolyse du substrat est réalisée en 3 minutes La courbe d'étalon- nage réalisée avec un plasma déplété en PAI lplasma dans lequel la teneur en PAI est nulle (PAI = O UI/ml)l et un plasma riche en PAI (PAI = 7,7 UI/ml) est linéaire Voir à cet effet la figure 9 Dans la figure 9, selon le système OD en ordonnées (à 405 nm)/PAI en UI/ml en abscisses, les droites 9 A, 9 B, 9 C et 9 D ont été obtenues avec respectivement quatre lots différents de venin de B. arietans. -28- Les résultats observés sur des plasmas normaux et des plasmas pathologiques (femmes enceintes et patients post-opératoires) sont similaires à ceux trouvés par la technique "STACHROM PAI" Les unités sont exprimées en UI/ml d'urokinase pour le PAI en présence de venin et en UI/ml de t PA pour le PAI par la technique "STACHROM PAI" (voir tableau XI) On constate toutefois une petite différence chez les femmes enceintes car le PAI-2 a une activité anti-u PA supérieure à l'activité anti-t PA (voir plasma F). UTILISATION DES REACTIFS Pour la mise en oeuvre de l'invention, l'on recommande d'utiliser les réactifs selon les modalités suivantes: Dosage de t PA On utilisera: les réactifs de la trousse de dosage "STACHROM PA" de la société DIAGNOSTICA STAGO, un matériau métalloprotéinasique (constitué par du ve- nin de serpent) lyophilisé seul ou lyophilisé avec le "STIMUGEN". La reconstitution du flacon est donc identique à celle décrite dans la notice "STACHROM PA" Les exci- pients de lyophilisation du matériau métalloprotéinasique sont ceux décrits pour le "STIMUGEN". Dosage de PAI On utilisera: t PA: réactif de la trousse de dosage "STACHROM PAI" de la société DIAGNOSTICA STAGO, u PA (urokinase): 20 UI/flacon, à reprendre par 2 ml d'eau distillée, excipients de lyophilisation: tampon phosphate ( 100 m M; p H 9,0) et BSA à 5 g/l, conservateur: gentamicine 50 mg/l, -29- réactif, à reprendre par 2 ml d'eau distillée: 1 volume de plasminogène purifié en tampon phosphate à p H 7,5, 3 volumes de matériau métalloprotéinasique (venin de serpent) à la concentration de 0,15 mg/ml dans de l'eau distillée, 2 volumes d'AMCHA à 4 mmoles/l dans un diluant contenant un tampon phosphate ( 50 m M; p H 7, 5), 3 % de glycine et 0,9 % de Na Cl (conservateur: gentamicine à 50 mg/1) , substrat: 16,5 micromoles/flacon à reprendre par 2 ml d'eau distillée, en excipient glycine classique, plasma étalon ou contrôle lyophilisé dans un milieu comprenant 3 % de glycine, 1 % de lactose, 1 % de saccharose et 50 mg/l de gentamicine. TABLEAU III Dosage de u PA u PA Sur Plasma PO Sur plasma P 2 ajouté u PA résiduel u PA résiduel (UI/ml) (UI/ml) (UI/ml) Théorique Trouvé Théorique Trouvé 20 20 10 10 28 28 27 18 16,2 35 32 25 23,2 I CO) I t' t' TABLEAU IV Dosage de PAI u PA PAI PAI ajouté (UI/ml) (UI/ml) (UI/ml) Sur plasma PO Sur plasma P 2 Théorique Trouvé Théorique Trouvé O O 10 10 28 O 1 2 1,8 O 3 O 1,8 H Co K) M M F w K) G TABLEAU V Dosage de PAI (AOD) sur plasma PO (PAI = O UI/ml) Sans AMCHA AMCHA AMCHA ( 4 mmoles /1) ( 8 mmoles/1) Sans venin 57 709 724 Venin ( 0,25 mg/ml) 776 1012 944 Venin ( 0,50 mg/ml) 625 1030 931 TABLEAU VI Dosage de PAI (AOD) sur plasma P 3 (PAI = 8 UI/ml) Sans AMCHA AMCHA AMCHA ( 4 mmoles /1) ( 8 mmoles/1) Sans venin 33 473 538 Venin ( 0,25 mg/ml) 452 663 614 a) PO 0 % 0 % M O TABLEAU VII Dosage de PAI ( O Dp 3 O Dpo) Pente obtenue Sans AMCHA AMCHA AMCHA ( 4 mmoles /1) ( 8 mmoles/1) Sans venin 24 236 186 Venin ( 0,25 mg/ml) 324 349 330 CO CO K) M M F w K) G TABLEAU VIII Dosage de PAI (XOD) sur plasma déficient en O 2-AP Sans AMCHA AMCHA ( 8 mmoles /1) Sans venin 433 1 505 Avec Venin ( 0,25 mg/ml) 1 345 1 468 K) M M F w K) G TABLEAU IX AOD TAMPON PLASMA PO (PAI = O UI/ml) sans avec sans avec aprotinine aprotinine aprotinine aprotinine Avec venin 852 23 ( 2,7 %) 257 O (O %) (n K) m m F w K) G TABLEAU X 4 OD TAMPON PLASMA DEFICIENT en o Avec venin 1 774 231 ( 13 %) > 2 0 279 - I Co 0) I co TABLEAU XI Plasmas PAI (UI/ml) STACHROM PAI Urokinase et venin A O O B O 0,2 C 18,3 6,0 D 18,7 6,5 E 23,2 8,5 F 16,6 7,9 KO TABLEAU XII Echantillon Pool normal Plasma G avant stase veineuse Plasma G après stase veineuse t PA (UI/ml) euglobulines en absence de venin 3,6 Plasma en de venin présence 3,7 Ko Mo bo REVENDICATIONS 1 Utilisation d'une substance inhibant les protéi- nes plasmatiques È( 2-antiplasmine et/ou Oi 2-macroglobu- line dans le domaine du dosage des activateurs du plasminogène et des inhibiteurs desdits activateurs du plasminogène, ladite utilisation étant caractérisée en ce que ladite substance inhibant lesdites protéines plasmatiques est choisie parmi l'ensemble constitué par les matériaux métalloprotéinasiques. 2 Utilisation suivant la revendication 1, caracté- risée en ce que ledit matériau métalloprotéinasique est associé à au moins un Co-aminoacide. 3 Procédé pour la détermination (i) d'un activateur du plasminogène choisi parmi l'ensemble constitué-par les activateurs du plasminogène de type tissulaire (t PA) et les activateurs du plasminogène de type urokinase (u PA), et (ii) d'un inhibiteur (PAI) dudit activateur du plasminogène, ledit procédé, qui comporte la transforma- tion du plasminogène en plasmine puis le dosage de la plasmine résultante de ladite transformation, étant caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition des protéines plasmatiques i 2-antiplasmine et/ou X 2-macro- globuline au moyen d'une substance choisie parmi l'ensemble constitué par les matériaux métalloprotéina- siques. 4 Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le matériau métalloprotéinasique est choisi parmi les produits qui clivent 1 ' b 2-antiplasmine de poids moléculaire de l'ordre de 68 000 daltons pour don- ner un peptide qui est essentiellement dépourvu d'activi- té È parmi les venins. 6 Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le matériau métalloprotéinasique est choisi parmi les venins de serpent appartenant à la famille des vipéridés et des crotalidés. lo 7 Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le matériau métalloprotéinasique est choisi parmi les venins de Bitis arietans, Crotalus basiliscus et Lachesis muta. 8 Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que pour la détermination du t PA, (a) l'on incorpore le matériau métalloprotéinasique dans le plasma à étudier dilué dans le tampon approprié, (b) incube à 37 C pendant 2 minutes, (c) ajoute un moyen stimulant la transformation du plasminogène en plasmine, (d) incube à 37 C pendant 150 minutes, (e) ajoute le substrat chromogène spécifique de la plasmine, puis (f) incube à 37 C pendant 5 minutes, la lecture de la densité optique correspondante à la libération du moyen chromogène étant ensuite effectuée notamment par comparaison avec un essai à blanc dans lequel le plasma à étudier additionné de matériau métalloprotéinasique du stade (a) est remplacé par un tampon additionné de matériau métalloprotéinasi- que. 9 Procédé suivant la revendication 8, dans lequel le matériau métalloprotéinasique est incorporé au stade (c) au lieu du stade (a). Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que pour la détermination du PAI, (a) l'on incorpore t PA ou u PA dans le plasma à étudier, (b) incube à 37 C pendant 5 minutes, (c) ajoute un mélange constitué par du plasminogène, un WO-aminoacide et ledit matériau métalloprotéinasique, (d) incube à 37 C pendant 3 minutes, (e) ajoute le substrat chromogène spécifique de la plasmine, puis (f) incube à 37 C pendant 3 minutes, la lecture de la densité optique correspondante à la libération du moyen chromogène étant ensuite effectuée notamment par comparaison avec un essai à blanc dans lequel au stade (c) l'activateur du plasminogène (t PA ou u PA) est remplacé par un tampon. 11 Nécessaire pour la détermination d'un activateur du plasminogène de type tissulaire ou de type urokinase, d'une part, ou d'un inhibiteur d'activateur du plasmino- gène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un matériau métalloprotéinasique.