Brevet FR2665711A1 — publié le 19920214

La présente invention concerne l'intégration de séquences d'ADN prédéterminées dans le génome des corynébactéries. Cette intégration peut avoir deux grandes finalités. I1 peut, d'une part, s'agir de faire produire par une souche de corynébactérie une protéine particulière, soit que cette protéine ne soit pas normalement exprimée par la souche en cause, ou bien de lui faire surproduire une protéine homologue. Mais, d'autre part, il peut s'agir de bloquer l'expression d'un gène en effectuant une interruption de celui-ci, ce qui conduira à l'annulation de l'activité enzymatique correspondante et à l'accumulation du substrat de la réaction dans la cellule. Les corynébactéries qui regroupent, outre Corynebacterium, Brevibacterium, sont des bactéries dont la manipulation s'est révélée jusqu'à présent assez délicate - tout d'abord car il n'existait que peu ou pas de méthode permettant leur transformation, et - des barrières de restriction très importantes existent qui font que les transformations mettant en oeuvre de l'ADN provenant d'autres sources bactériennes sont la plupart du temps inefficaces. Récemment, on a pu mettre en évidence la possibilité de transformer des corynébactéries par des méthodes d'électroporation. Toutefois, si les techniques de transformation par vecteur autoréplicatif sont intéressantes, il est préférable la plupart du temps, et au niveau industriel, de disposer de bactéries qui ont été transformées par intégration dans le chromosome, c'est-à-dire des souches qui sont stables dans le temps, tant quant au nombre de copies de l'élément intégré que quant à sa localisation. C'est l'objet de la présente invention de proposer des systèmes d'intégration dans le génome des corynébactéries. La présente invention concerne des intégrons de corynébactéries caractérisés en ce qu'ils comportent - un gène assurant une sélection, appelé ci-après "gène de sélection", efficace dans ladite corynébactérie, - une séquence homologue du génome de ladite corynébactérie, lesdites séquences ayant été adaptées à ladite bactérie. Par "intégron", on entend désigner un vecteur non réplicatif ayant la propriété de s'intégrer dans le génome d'une corynébactérie, cet intégron pouvant être sous forme linéaire ou circulaire. Toutefois, l'intégron provient, en général, d'un plasmide autoréplicatif qui permet la synthèse dans un hôte différent, Escherichia coli par exemple. Mais avant l'étape d'intégration, on supprimera, de préférence, toute trace d'ADN d'origine non corynébactérienne, sauf le gène de sélection, et en particulier toutes les séquences impliquées dans la réplication. Les gènes de sélection efficaces dans lesdites corynébactéries sont - soit des gènes de résistance à une substance particulière, antibiotique notamment, - soit des gènes conférant un phénotype clairement identifiable, coloration et/ou complémentation par exemple. Dans le cas présent, la sélection par résistance à un antibiotique est plus particulièrement intéressante. Ainsi, on pourra utiliser - les gènes AphlII conférant la résistance à la kanamycine, noté Km R, - les gènes Cat conférant la résistance au chloramphénicol, noté CmR Mais, d'autres gènes peuvent être utilisés, notamment la résistance à l'érythromycine. Par "séquence homologue", on entend désigner des séquences qui correspondent à celles présentes dans la corynébactérie transformée ou qui présentent un taux d'homologie supérieur à 80 ,G, il peut s'agir de séquences de la même espèce ou non, ces séquences peuvent d'ailleurs être synthétiques. Les séquences devront être adaptées ou non, c'est-à-dire tenir compte des problèmes de barrières de restriction existant chez les corynébactéries, par des procédés dont certains sont décrits ci-après. De préférence, cet intégron provient d'un plasmide qui comporte, outre l'intégron, une partie réplicative, l'intégron étant flanqué de sites de restriction permettant son excision, et de préférence de séquences répétées inverses correspondant à un site de restriction non présent dans l'intégron, par exemple Note, BstXI ou SacI. Ainsi, par digestion à l'aide de l'enzyme qui reconnaît ledit site de restriction, on peut obtenir directement l'intégron, lequel peut, si besoin est, être circularisé, puisque les extrémités obtenues sont complémentaires, avant d'être utilisé pour la transformation de la corynébactérie. Dans le système selon la présente invention, l'intégron fait donc, de préférence, partie d'un vecteur plasmidique qui est susceptible de se répliquer à l'aide d'origines de réplication, ou réplicon, placées dans la partie réplicative. Selon la nature du réplicon présent dans cette cassette réplicative, le plasmide composite peut se répliquer soit uniquement dans les corynébactéries, s'il est constitué d'un seul réplicon endogène, soit à la fois dans les corynébactéries et dans un hôte étranger, Escherichia coli par exemple, lorsqu'on l'associe au plasmide deux réplicons différents, chacun permettant la réplication dans son hôte propre. Dans ce cas, la construction du plasmide pourra être effectuée dans des systèmes différents des corynébactéries, ce qui peut parfois présenter des intérêts compte tenu des difficultés de construction dans Corynebacterium et Brevibacterium. Grâce à la présence de séquences homologues présentes simultanément dans l'intégron et dans le génome, l'intégron va s'insérer par recombinaison dans le chromosome. Ainsi, dans le transformant primaire, le gène cloné initialement au site multiple de clonage de l'intégron se retrouve dupliqué dans le chromosome bactérien (voir schéma Figure 2a). Une telle duplication peut présenter un intérêt technologique dans la mesure où le doublement du gène peut entraîner un accroissement de l'activité codée par ce gène, notamment l'activité enzymatique correspondante. Comme la structure de l'intégrant primaire correspond à une duplication en tandem directe des séquences homologues encadrant le gène de sélection, il est possible de prévoir une amplification de cette structure par sélection de la croissance de l'intégrant primaire sur un milieu permettant de détecter les souches surexprimant le gène de sélection. Ainsi, lorsque le gène de sélection est le gène de résistance à un antibiotique, on peut sélectionner les souches les plus résistantes, sur milieux avec une teneur croissante en antibiotique, lesquelles souches devront correspondre à une surexpression des gènes correspondant aux séquences homologues, mais également à tout gène ou séquence d'ADN qui aurait été inséré dans l'intégron. Bien entendu, l'intégron comportera, de préférence, outre la ou les séquences homologues, une séquence codant pour une séquence d'intérêt, notamment pour un peptide ou une protéine d'intérêt qui pourra être homologue, c'est-à-dire provenir d'une corynébactérie, ou bien hétérologue, c'est-à-dire provenir d'autres espèces bactériennes, mais également être d'origine eucaryote ou synthétique. Ces séquences comporteront, de préférence, les éléments assurant leur expression dans les corynébactéries ou bien seront insérées en phase pour pouvoir être exprimées par les éléments d'expression de la bactérie hôte. Dans le cas de Corynebacterium, il peut être intéressant par exemple d'obtenir une surexpression de certaines enzymes, notamment gltA ou gdhA. Comme cela a été indiqué précédemment, il est possible d'utiliser ce système pour assurer l'interruption d'un gène en utilisant un intégron selon l'invention. Par interruption ou par substitution, comme cela est décrit à la figure 2b, le gène correspondant est inactivé, ceci conduit à une surproduction du substrat de l'enzyme codée par le gène correspondant. En général, l'intégron sera conçu sous forme d'une cassette d'intégration, c'est-à-dire qu'en plus du gène de sélection et de la séquence homologue, qui dans certains cas peuvent être confondus, on prévoira une séquence comportant plusieurs sites de clonage qui permettra d'insérer des séquences d'ADN et/ou des gènes à volonté. Dans tous les cas, à des fins de confinement génétique, on essaiera de prévoir un intégron dépourvu d'ADN réplicatif d'une autre espece. I1 est également possible de prévoir des systèmes d'intégration plus complexes, en particulier des systèmes d'intégration qui comportent en outre les séquences d'un élément transposable. Les séquences d'éléments transposables peuvent être l'ensemble des séquences qui assurent la transposition, à l'exception des protéines codées par la corynébactérie, mais il peut également s'agir d'éléments transposables qui sont dépourvus des séquences codant pour les transposases. Parmi les éléments transposables, il faut citer le phage Mu, en particulier sous la forme d'un phage miniMu. Dans le cas des éléments transposables comme le phage miniMu, comme on le verra ci-après, on a utilisé des marqueurs qui peuvent faire partie du phage ou d'origine différente, par exemple des marqueurs colorés. Ce type de structure d'intégration comportant un fragment de phage miniMu, une séquence d'ADN homologue et un gène de sélection peut permettre, comme à l'aide des structures décrites précédemment, d'obtenir soit une surexpression d'un gène particulier, soit l'interruption d'un gène lorsque cela se révèle nécessaire. Ces dernières structures, bien que différentes des structures précédentes seront néanmoins appelées par simplification "intégron". La présente invention concerne également des souches de corynébactérie obtenues par transformation intégrative à l'aide des intégrons décrits précédemment, notamment lorsque l'intégron a été introduit par électrotransformation. Parmi les souches de corynébactéries utilisables, il faut citer plus particulièrement: - B. lactofermentum, - B. flavum, - C glutamicum, - C. melassecola, pour leur intérêt industriel. Dans le cas où le clonage est réalisé chez un hôte différent de la corynébactérie hôte final de l'intégron, le transfert de l'intégron peut mettre à profit les propriétés réplicatives éventuelles de la construction dans la corynébactérie afin d'adapter l'intégron à la corynébactérie. Ainsi on commencera par introduire le plasmide comportant, outre l'intégron, une partie réplicative, dans la souche même ou s'effectuera l'intégration, puis cet intégron ainsi adapté sera récupéré par extraction du plasmide puis digestion par la ou les enzymes qui libèrent l'intégron, le fragment purifié étant alors autoligué ou non et le produit de ligation utilisé pour la transformation intégrative ; dans ce cas les barrières de restriction ne constituent plus une difficulté. Dans certains cas il peut être utile de passer par une corynébactérie intermédiaire, notamment dans le cas où l'ADN est d'origine E. coli, il peut être intéressant d'adapter l'intégron à Brevibacterium lactofermentum avant de l'adapter à Corynebacterium melassecola. Enfin, l'invention concerne l'utilisation des Corynébactéries selon l'invention dans le cadre de procédés industriels, notamment pour la préparation de protéines ou de métabolites mettant en jeu l'intégron selon l'invention. Les exemples ci-après permettront de mieux mettre en évidence les avantages de la présente invention. Sur les figures annexées - la figure I schématise la préparation d'un intégron en partant d'un plasmide réplicatif, - la figure 2 schématise l'insertion d'un intégron, par simple recombinaison (a) par double recombinaison ((b), - la figure 3 schématise la structure de pCGL519, - la figure 4 schématise le pourcentage de résistance à la kanamycine en fonction du temps pour deux souches transformées, - la figure 5 schématise la structure des miniMu, MudII1681, MudII 16 81 -Cat, - la figure 6 schématise les plasmides . pCGL107 et . pCGL107::Mud+, - la figure 7 schématise l'intégration des intégrons désirés contenant ou non le miniMu. EXEMPLE 1 Construction d'une banque d'ADN chromosomique de Corynebacterium melassecola ATCC17965 et clonage du gène gltA L'ADN chromosomique de la souche de C. melassecola ATCC 17965 a été préparé suivant la méthode adaptée de Ausubel et al. (1987). Une digestion ménagée par l'endonucléase de restriction MboI (Boehringer) a été réalisée sur 10 llg de cet ADN en suivant le protocole décrit dans Maniatis et al. (1982). Les fragments d'ADN ont été séparés en fonction de leur taille sur gradient de sucrose comme décrit par Ausubel et al. (1987). Les fragments d'une taille comprise entre 6 et 15 kb ont été retenus pour la construction de la banque. Le plasmide de clonage pUN121 (Nilsson et al., 1983) a été préparé par la méthode de Birnboim and Doly, (1979) à partir de la souche de E. coli GM2199 disponible librement. Le plasmide a été linéarisé par l'endonucléase de restriction BclI (Boehringer). La banque a été construite par ligation avec la T4 DNA ligase (Boehringer) dans les conditions décrites par Ausubel et al. (1987), de 1 pg de plasmide pUN121 linéarisé par BclI et de 2 pg des fragments d'ADN de 6 à 15 kb décrits ci-dessus. Le mélange de ligation a été introduit dans la souche de E. coli DHSalpha par électroporation en suivant le protocole décrit par Dower et al. (1988). Les clones de E. coli portant les plasmides recombinants ont été sélectionnés directement par leur capacité à croître sur milieu LB contenant 10 pg/ml de tétracycline. Les plasmides de la totalité des clones résistants à la tétracycline ont été préparés par la méthode de Birnboim et Doly (1979). L'ensemble de ces plasmides correspond à la banque d'ADN. La souche de E. coli W620 déficiente pour l'activité citrate synthase a été transformée avec la banque d'ADN de C. melassecola ATCC17965. Un clone transformant de E. coli W620 capable de croître sur milieu minimum de sélection contenant de la tétracycline a été sélectionné. Ce clone est porteur drun plasmide recombinant pCGL508. Différents sous-clonages ont permis de raccourcir le fragment d'ADN de C. melassecola portant le gène gltA complet à un fragment d'ADN de 3,5 kb délimité par deux sites de restriction Hindîli. EXEMPLE 2 Intégron pCGL519 Le schéma de préparation de 1'intégron est représenté à la Figure 1. Le gène aphIII a été choisi comme gène de sélection ; il confère la résistance jusqu'à 600 ,ug/ml de kanamycine lorsqu'il est intégré à une copie dans le chromosome. On travaille habituellement à 25 tjg/ml. Le fragment HindIII de 3,5 kb portant le gène de structure gltA codant pour la citrate synthase de C. melassecola obtenu à l'exemple 1 a été choisi au départ comme fragment d'ADN homologue du génome des Corynébactéries et inséré dans l'un des sites uniques du site multiple de clonage (le site HindIII). Les sites de restriction bordant l'intégron prévus pour être les plus utilisés dans la stratégie d'intégration sont les sites NotI qui correspondent à une séquence à 8 nucléotides, et les sites BstXI. L'enzyme BstXI reconnaît la séquence (CCAN5NTGG) ce fait elle coupe aussi fréquemment qu'une enzyme à 6 nucléotides et on peut s'attendre à générer plusieurs fragments. Mais les fragments libérés se réassocient en fonction de la nature des séquences internes des différents sites BstXI, ce qui doit conduire finalement à la seule reconstitution du fragment de départ. Le plasmide pCGL519 (Figure 3) est un exemple de plasmide versatile susceptible de générer un intégron. On a testé l'intégration dans C. melassecola de sa cassette intégrative à partir d'un plasmide issu au départ de E. coli. pCGL519 est constitué des deux fragments réplicatifs et intégratifs bordés par les sites NotI. Le premier fragment correspondant à l'intégron qui comprend un site multiple de clonage, le gène de sélection aphIII et un fragment HindIII homologue du chromosome portant le gène gltA qui code pour la citrate synthase. Le second fragment comprend la partie réplicative du plasmide pBLI (fragment SspI-HpaI de 3 kb) qui se réplique chez les corynébactéries, la partie réplicative du plasmide pACY184 qui se réplique chez E. coli, ori pI SA, et l'origine de réplication du phage M13 complémentable en trans. Le plasmide pCGL519 a été construit dans E. coli par insertion d'un fragment HindIII de 3,5 kb contenant le gène gltA dans un vecteur pCGL243. Comme représenté dans la Figure 1, après clonage pCGL519 est utilisé pour transformer B. lactofermentum. Au moment du transfert de pCGL519 dans Brevibacterium lactofermentum CGL2002, le fragment NotI contenant les origines de réplication a été substitué car la partie réplicative de pBLI s'était inactivée dans E. coli. Ceci montre un avantage supplémentaire de la structure en cassette. EXEMPLE 3 Intégration Le transfert de pCGL519 dans Corynebacterium melassecola ATCC17965 très restrictive vis-à-vis de E. coli a été réalisé à partir du même plasmide extrait de B. lactofermentum. Le système proposé permet d'isoler le plasmide pCGL519 de la souche de C. melassecola ATCC17965 qui est totalement restrictive vis-à-vis de E. coli mais seulement partiellement vis-à-vis de B. lactofermentum. Ainsi, une cassette intégrative possédant la modification de la souche réceptrice a été préparée. Après digestion du plasmide pCGL519 issu de C. melassecola ATCC17965 par l'endonucléase de restriction NotI (Boehringer), l'intégron contenant le gène gltA et le gène de sélection AphIII a été isolé et purifié à partir d'un gel d'agarose à bas point de fusion. L'intégron ainsi purifié a ensuite été soumis à une autorecircularisation par ligation. Le mélange de ligation a ensuite été introduit dans la souche de C. melassecola ATCC17965 par électroporation (Bonamy et al., 1990). Les clones de C. melassecola résistant à 25 pg/ml de kanamycine ont été soumis à l'analyse. 500 transformants ont été obtenus. 31 parmi les 50 analysés ne possédaient pas le plasmide pCGL519 et 20 d'entre eux ont été analysés par southern blot après digestion XbaI. Tous correspondent à un même évènement d'intégration s'effectuant par recombinaison homologue dans la région gltA. Selon la nature du produit de ligation (molécule monomérique circulaire ou molécule polymérique linéaire ou circulaire), les intégrants primaires peuvent être interprétés comme issus d'un "crossing-over" simple ou double. Une analyse en champ pulsé après digestion NotI suivi d'une hyridation par une sonde correspondant au fragment HindITI de 3,5 kb contenant gltA a été réalisée. L'intégration d'une seule copie de l'intégron est confirmée par cette analyse. Le modèle implique la duplication de la copie sauvage du gène gltA: l'activité enzymatique a été mesurée, elle est multipliée d'un facteur 1,82 en accord avec l'interprétation des blots et montre que la copie intégrée n'est pas inactivée. Les résultats sont rassemblés au tableau 1 par rapport à la souche sauvage et à la souche transformée par un plasmide réplicatif. La stabilité de la structure intégrée a été mesurée quant au pourcentage de cellules Kanamycine résistantes après une trentaine de génération (Figure 4) et quant à l'activité enzymatique de la citrate synthase qui restent stables. L'amplification de la structure intégrée a été réalisée par sélection de croissance sur boîte contenant une excès de kanamycine, sélection à 800 llg/ml puis 1 000 llg/ml puis 1 000 ,ug/ml de kanamycine et de néomycine. Une amplification en tandem direct a été obtenue. Malgré la stabilité de la structure amplifiée et de la résistance à la kanamycine, le haut niveau d'activité enzymatique obtenu au départ dans le cas de la citrate synthase ne s'est pas maintenu ultérieurement. Il est possible qu'une inactivation spécifique du gène gitA se soit produite. EXEMPLE 4 Construction à base de miniMu Les dérivés de Mu choisis dans cet exemple sont Mudil 1681 et MudII 1681-Cat (respectivement Km R et CmR) qui ont une taille de 14,8 kb et 16,6 kb respectivement (Figure 5). Le miniMu MudII 1681-Cat est un dérivatif du transposon MudII 1681 (Castilho et al., 1984). Ils possèdent les éléments nécessaires à la transposition énoncés précédemment (excepté HU) ainsi que le gène du répresseur thermosensible C (régulateur de l'expression des transposases A et B), un gène de résistance aux antibiotiques (respectivement aphII et cat) et les gènes lacA lacY et lacZ'. Ce dernier commence au 8ème codon et permet de détecter des fusions traductionnelles de protéines lorsque Mud s'insère dans un cadre de lecture. On a transféré ces transposons dans les Corynébactéries. Après intégration des transposons dans le chromosome, une méthode, décrite à l'exemple 8, a permis d'amplifier la copie intégrée. Associée à cette amplification, le gène cible de l'évènement d'intégration (le gène de structure de la glutamate déshydrogénase) a dans de nombreux cas été également amplifié avec une augmentation jusqu'à un facteur 25 de l'activité enzymatique correspondante. EXEMPLE 5 Construction de vecteurs pour le transfert des miniMu Le vecteur intégratif (pCGL107 - Figure 6) contient le gène gdhA (Gdh') interrompu par le marqueur de résistance à la kanamycine KmR (aphIII), le réplicon (ori) de pUN121 (Nilsson et al., 1983) et les gènes conférant la résistance à la tétracycline (TetR) et à l'ampicilline (Amp R) Ce vecteur n'étant pas réplicatif dans Brevibacterium lactofermentum s' intègre par simple "crossing-over" au site d'homologie du gène gdhA (Leblon et al., 1990). MudII 1681-Cat a été introduit dans le vecteur intégratif pCGL107 par minimuduction à partir de E. coli OR1836 dans la souche MC4100. Parmi les diverses insertions obtenues, une d'entre elles a été retenue donnant un phénotype lac- en E. coli (pCGL107::Mud+, Figure 6). A partir de ce même plasmide, a été préparé un Mud désarmé pCGL107::Mud-, Figure 6) chez lesquels les gènes des transposases A et B ont été délétés par digestion HindIII. D'autres stratégies de transfert ont été testées ; MudII 1681 a été introduit chez les Corynébactéries en plaçant le transposon sur deux autres types de vecteurs: - Vecteur suicide (non réplicatif, non intégratif) pEVl l::Mud, il s'agit d'un dérivé de pUC18 dépourvu des gènes lac dans lequel MudII 1681 a été introduit. - Vecteur navette (pCGL229) possédant le réplicon de pBL1 (fragment HindIII-HpaI), le réplicon p15A et le gène cat de Tn9. MudII 1681 a été introduit sur le vecteur navette par minimuduction chez E. coli Rec+. Parmi les diverses insertions obtenues, une d'entre elles a été retenue donnant un phénotype Lac- (pCGL229::Mud+). A partir de ce vecteur, a été préparé un Mud désarmé pCGL229::Mud chez lequel les gènes des transposases A et B ont été délétés par digestion PstI. EXEMPLE 6 Efficacité d'électrotransformation des constructions et leur transfert dans Brevibacterium lactofermentum Avec les vecteurs précédemment décrits, on électrotransforme une souche d'E. coli (DHSalpha) et deux souches de Brevibacterium lactofermentum CGL2002 et CGL2005. Ces deux souches sont partiellement permissives vis à vis de 1'ADN issu de E. coli. Ces expériences ont apporté les résultats présentés dans le tableau 2. On peut faire les observations suivantes - Dans E. coli, que ce soit dans le cas du vecteur navette pCGL229 ou dans le cas du vecteur pCGL107 (qui peut s'y répliquer), l'efficacité de transformation est nettement diminuée lorsque Mud+ est présent sur le vecteur ce qui n'est pas le cas lorsque les gènes de transposition ont été délétés.Ce phénomène typique des plasmides réplicatifs portant des dérivés de Mu actifs peut être attribué à une très forte expression de la transposase de Mu dans son hôte naturel. Ceci montre que dans les constructions présentées ci-dessus, les Mud+ utilisés (MudII 1681 et MudII 1681-Cat) sont bien actifs. - Dans aucune des souches de Corynébactérie testées il n'est possible d'obtenir de transformants avec les vecteurs navettes pCGL229::Mud+ ou - (ni avec le vecteur suicide pEVI 1::Mud). Dans le cas des dérivés de pCGL229, il est possible que lors de la minimuduction dans E. coli Rec+ le réplicon pBL1 ait été inactivé expliquant l'incapacité du vecteur à se multiplier dans B. lactofermentum. - Des transformants ont été obtenus dans B. lactofermentum CGL2005 avec le vecteur intégratif pCGL107 et ses dérivés. L'efficacité de transformation obtenue avec pCGL107::Mud+ et pCGL107::Mud- est semblable, ce qui indique que le MiniMu MudII 1681-Cat A+B+ ne se transpose pas à haute efficacité lorsqu'il est introduit dans B. lactofermentum à l'aide d'un vecteur intégratif. La diminution observée (facteur 20) dans l'efficacité de transformation des deux dérivés de pCGL107 comparés à pCGL107 lui-même est vraisemblablement due à l'augmentation de taille du plasmide transformant (10 kb dans le cas de pCGL107, 26,7 kb dans le cas de pCGL107::Mud+ et 22,1 kb dans le cas de pCGL107::Mud-). EXEMPLE 7 Etude des évènements d'intégration de pCGL107::Mud dans B. lactofermentum CGL2005 La transformation de la souche 2005 par pCGL107::Mud+ a permis d'obtenir 147 clones résistant à la kanamycine (25 pg/ml) mais aucun transformant en sélectionnant pour la résistance au chloramphénicol (5 ug/ml). Cependant, après réplique sur chloramphénicol, 103 de ces clones sont résistants au chloramphénicol. I1 s'avère donc que le gène cat de Tn9 ne s' exprime pas suffisamment à une seule copie pour permettre une sélection primaire en colonies ; par contre, cette expression est suffisante pour déterminer un phénotype résistant par des tests ultérieurs en strie. Tous les clones obtenus sont de phénotype lac-, ce qui correspond au phénotype observé chez E. coli. Les deux types d'intégrants obtenus (les transformants de type 1, KmRCmS et de type 2, Km R Cm R) peuvent correspondre respectivement à la substitution du gène gdhA par évènement de double "crossing-over" et à l'intégration du plasmide complet au site gdhA par évènement de simple "crossing-over" (Figure 7). Les données en faveur de cette interprétation sont les suivantes - Le dosage de la glutamate déhydrogénase (selon la technique de Meers et al., 1970) chez les transformants de type 1 et 2 (Tableau 3): 5 sur 7 transformants de type 1 (pour exemple K2 et K3, Tableau 3) ont une activité gdh nulle, ce qui est en accord avec la substitution du gène gdhA par le gène interrompu. 4 des 5 transformants de type 2 ont une activité gdh semblable au témoin (KC2 et KC4 par exemple, Tableau 3). - Les analyses moléculaires en Southern Blot correspondant à la digestion BamHI des transformants de type 1 (K2) et de type 2 (KC2 et KC4) et révélation des bandes caractéristiques (visualisées sur la Figure 7) par la sonde plasmidique pCGL107 (résultats non présentés). Celles-ci indiquent que la structure moléculaire des transformants gdh (K2) est conforme à une substitution de gène. Elle confirme aussi que les transformants gdh+ (évènements de type 2 (KC2 et KC4) et quelques uns de type 1 (Kl) sont obtenus par intégration du plasmide au site gdhA. EXEMPLE 8 Sélection des éventuelles transpositions Les transformants de type 2 (KmR et CmR) n'expriment pas suffisamment le gène de résistance au chloramphénicol pour obtenir la croissance de colonies isolées en présence de chloramphénicol 5 ug/ml. R Nous avons donc recherché chez ces transformants des sous-clones Cm en espérant sélectionner des transpositions de Mud (qui porte le gène cat). Ces sous-clones ont été obtenus à une fréquence voisine de 1 pour 105 cellules. Après réplique sur Xgal, ces clones présentent toute une graduation de couleurs du blanc au bleu (30 % sont nettement bleus). Ce résultat est confirmé par la mesure des activités béta-galactosidase (Tableau 4). Ceci pourrait indiquer une transposition de Mud, amplifiant la résistance au chloramphénicol et faisant apparaître des activités béta-galactosidase par fusion de protéine au site d'insertion. En fait, les mêmes expériences réalisées avec le pCGL107::Mud- ont abouti au même résultat indiquant que ces evènements ne sont pas dus à des évènements de transposition. EXEMPLE 9 Mise en évidence de l'amplification en tandem sur le chromosome du plasmide pCGL107::Mud+ Il s'avère que la quasi totalité de ces clones Lac+ isolés précédemment (à l'exception de KC3T4) ont aussi une activité gdh amplifiée (Tableau 4). De plus, sauf une exception (KC3T4), les activités béta-galactosidase (dosée selon Miller, 1972) et gdh sont quasi proportionnelles. La même observation peut être faite concernant le dosage de la chloramphénicol acétyl transférase (selon la méthode de Shaw, 1975, Tableau 5). Ce résultat est contradictoire avec la transposition de Mud qui n'emporte jamais de séquences adjacentes lors de sa transposition. I1 indique plutôt une amplification en tandem sur le chromosome de l'unité de répetition pUN-Mud-gdh qui est bordée par des homologies de séquence. Ce point a été confirmé par digestion de l'ADN génomique des souches KC3, KC3T1 et KC3T3 par BamHI, NotI et XbaI. Non seulement la bande BamHI interne à Mud (et égale à 7 kb) est amplifiée mais aussi les bandes contenant les bords de Mud (11 kb et 2,4 kb) ce qui est conforme à une amplification en tandem et ce qui s'oppose à un évènement de transposition. De plus, les digestions NotI (qui coupe une seule fois dans MudII 1681-Cat) et XbaI (qui coupe une seule fois dans gdh') amplifient nettement la bande de 24 kb de l'unité de répétition. Cette amplification semble relativement stable dans la mesure où l'activité béta-galactosidase reste à un niveau de 70 % de l'activité de départ après 15 générations sans pression de sélection. Les activités Cat et Gdh présentent également une perte de 30 % après 25 générations. Cette amplification en tandem rappelle des résultats d'Albertini et al. (1985) et de Jannière et al. (1985) chez Bacillus subtilis. On attribue l'activité béta-galactosidase des clones amplifiés à une traduction parasite amplifiée (hors du cadre de lecture du gène de résistance à l'ampicilline où l'opéron lac est fusionné) présente chez B. lactofermentum et indétectable chez E. coli. Les souches citées ont les origines suivantes Escherichia coli DH5alpha : Gibco BRL MC4100 : Casadaban (1976) . OR1836 : Reyes Brevibacterium lactofermentum CGL2002 : Bonamy et al. (1990) CGL2005 (B115) : Bonnassie et al. (1990) Corynebacterium melassecola ATCC17965 : ORSAN TABLEAU 1 ACTIVITE SPECIFIQUE CITRATE SYNTHASE SOUCHES ACTIVITE ACTIVITE SPECIFIQUE RELATIVE ATCC17965 1,041 1 ATCC17965::gltA 1,893 1,82 ATCC17965 (pCGL519) 5,340 5,13 Activite specifique Citrate synthase en mole CoASH/min/mg de proteines Tableau 2:Efficacité de transformation des vecteurs portant les MiniMu Souches bactériennes E.coli DH5&alpha; B.lactofermentum B.lactofermentum CGL2002 CGL2005 pCGL229 5x107 105 106 4 pCGL229::Mud+ 2x10 0 n.d. pCGL229::Mud- 4x106 0 n.d. 5 3 4 pCGL107 10 3x10 10 pCGL107::Mud+ 5x10 0 4x10 pCGL107::Mud- 105 n.d. 5x10 TABLEAU 3: DOSAGE DE LA GLUTAMATE DESHYDROGENASE DANS LES TRANSFORMANTS PRIMAIRES Activité spécifique Gdh en mole de souche bactérienne NADPH consommé/min/mg protéine 2 souche de départ Km Cm CGL2005 2,18 transformant KmRCmS K1 2,1 K2 #0,06 K3 #0,06 K4 50,06 K5 #0,06 K6 2,18 K7 #0,06 RR transformant Km Cm KC2 2,24 KC3 2,12 KC4 2,18 KC5 3,45 KC7 2,06 TABLEAU 4:DOSAGE DES ACTIVITES ssGALACTOSIDASE ET GLUTAMATE DESHYDROGENASE DANS LES INTEGRANTS AMPLIFIES Souche bactérienne Activité Activité spécifique ssgalactosidase glutamate deshydrogénase souche de départ CGL2005 3,7 2,48 intégrants prima ires KC2 6,2 2,24 KC3 4,5 2,06 intégrants amplifiés KC3T1 27,9 18,2 KC3T2 20,7 16,0 KC3T3 48,2 49,6 KC3T4 32,2 2,24 KC3T5 19,7 8,55 KC3T6 19,0 11,9 KC3T7 34,5 28,0 KC2T1 7,4 2,73 TABLEAU 5:DOSAGE DES ACTIVITES CAT, ssGAI et GDH DANS LES SOUCHES AMPLIFIEES Souche bactérienne Activité ssgal Activité Activité spécifique Cat spécifique Gdh souche de départ Km Cm CGL2005 3,7 #0,07 2,18 intégrant primaire Km Cm K2 #0,07 #0,006 K3 #0,07 #0,006 intégrant primaire Km Cm KC3 4,5 2,72 2,06 KC7 3,4 1,82 intégrants amplifiés KC3T1 27,9 19,7 18,2 KC3T3 48,2 33,3 49,6 KC3T4 32,2 18,4 2,24 KC3T5 19,7 13,6 8,55 REFERENCES Albertini A.M. and Galizzi A. (1985). Amplification of a chromosomal region in Bacillus subtilis; J. Bacteriol., 162:1203-1211) Ausubel M.A., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and Struhl K. (1987) in "Current protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates and Wiley - Interscience Birnboim H.C. and Doly J., (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acid Res. 7:1513-1523 Bonamy C., Guyonvarch A., Reyes O., David F. and Leblon G. (1990) Interspecies electro-transformation in Corynebacteria. FEMS Microbiology Letters 66:263-270 Bonnassie S. Oreglia J. Trautwetter A. and Sicard A.M. (1990) Isolation and characterization of a restriction and modification deficient mutant of Brevibacterium lactofermentum, Soumis Casadaban M.J. Transposition and fusion of the lac gènes to selected promoters in E. coli using bacteriophages lambda and Mu. J. Mol.Biol. 104 (1976) 541-555 Castilho B.A., Olfson P. and Casabadan M.J. 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Metho. in Enz. 43: 737-755 REVENDICATIONS 1) Intégron de Corynébactérie caractérisé en ce qu'il comporte: - un gène assurant une sélection efficace dans ladite corynébactérie, - une séquence homologue du génome de ladite corynébactérie, lesdites séquences ayant été adaptées à ladite bactérie. 2) Intégron selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il provient d'un plasmide qui comporte, outre l'intégron, une partie réplicative, l'intégron étant flanqué de séquences répétées inverses correspondant à un site de restriction non présent dans l'intégron. 3) Intégron selon la revendication 2, caractérisé en ce que la partie réplicative comprend une origine de réplication efficace dans une bactérie non Corynéforme. 4) Intégron selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'origine de réplication est efficace dans E. coli. 5) Intégron selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la partie réplicative comprend une origine de réplication efficace dans les bactéries Corynéformes. 6) Intégron selon la revendication 1, caractérisé en ce qu il comporte en outre les séquences d'un élément transposable. 7) Intégron selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les séquences d'un élément transposable assurant la transposition à l'exception des protéines codées par la bactérie Corynéforme. 8) Intégron selon la revendication 6, caractérisé en ce que les séquences de l'élément transposable sont dépourvues des séquences codant pour les transposases. 9) Intégron selon l'une des revendications I à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'intérêt. 10) Intégron selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence d'intérêt code pour un peptide ou une protéine d'intérêt. 11) Intégron selon la revendication 10, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une protéine homologue. 12) Intégron selon la revendication 11, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une protéine hétérologue. 13) Intégron selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une enzyme. 14) Intégron selon la revendication 13, caractérisé en ce que la séquence codant pour une protéine d'intérêt est choisie parmi les genet - gltA - gdhA. 15) Intégron selon l'une des revendications 2 à 14, caractérisé en ce que le site de restriction non présent dans l'intégron est choisi parmi - NotI - BstXI. 16) Intégron selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que lesdites séquences ont été adaptées pour une souche de Corynébactérie. 17) Intégron selon la revendication 16, caractérisé en ce que lesdites séquences ont été transférées dans une souche de Brevibacterium avant d'être adapté chez Corynebacterium. 18) Intégron selon la revendication 17, caractérisé en ce que lesdites séquences ont été amplifiées. 19) Intégron amplifié selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'amplification a donné des séquences amplifiées stables. 20) Intégron selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence homologue de Corynebacterium melassecola qui s'intègre dans le chromosome de Brevibacterium lactofermentum. 21) Procédé de transformation d'une souche de bactérie Corynéforme par un intégron selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que l'intégron est introduit dans ladite souche par électroporation. 22) Corynébactérie susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 21. 23) Corynébactérie selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de - B. lactofermentum - B. flavum - C. glutamicum - C. melassecola.