Brevet FR2669930A1 — publié le 19920605

i Protéine présentant une activité de type cytokine, ADN recombinant, vecteur d'expression et hôtes permettant son obtention. La présente invention a pour objet une nouvelle protéine présentant une activité de type cytokine, les outils de génie génétique pour la produire, à savoir un ADN recombinant, un vecteur d'expression portant cet ADN recombinant, les micro-organismes procaryotes et les cellules eucaryotes contenant cet ADN recombinant ainsi qu'un médicament, utile notamment comme anti- cancéreux ou immunomodulateur, contenant à titre de principe actif cette protéine. Il est bien connu que le système immunitaire comprend des éléments cellulaires et des substances solubles sécrétées par ces derniers, appelées cytokines Celles-ci sont des protéines qui assurent la communication entre une cellule émettrice et une cellule cible appartenant soit au système immunitaire, soit à un autre système biologique de l'organisme Les cytokines ont en général une activité biologique dite pléitropique: elles peuvent avoir de multiples actions sur la cellule cible: prolifération, différenciation, cytolyse, activation, chimiotactisme, etc Plu- sieurs de ces molécules ont déjà trouvé des applications en théra- peutique: par exemple, l'interleukine-2 ou l'interféron-o utili- sés pour le traitement de certaines tumeurs par immunothérapie et les facteurs myélopoëtiques, tels que le GCSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) ou le GMCSF (Granulocyte Monocyte Colony Stimulating Factor) qui stimulent la croissance et la différen- ciation des cellules sanguines et permettent ainsi l'enrichis- sement en ces dernières du sang apprauvi en celles-ci suite à une chimiothérapie. Une des premières cytokines découvertes est l'inter- leukine-1, à laquelle on a d'abord attribué une activité centrale dans l'inflammation: le chimiotactisme des neutrophiles, suite à des expériences montrant une activité de ce type in vivo après injection (T YOSHIMURA et al 1987, J Imm, 139, 788-793) On sait aujourd'hui que l'interleukine-1 stimule in vivo l'expression d'une autre cytokine chimiotactique vis-à-vis de neutrophiles, l'interleukine-8 (initialement appelée Neutrophil Chemotactic Factor NCF) Cette cytokine, dont la séquence d'acides aminés a été déterminée en 1987 après isolement et purification ainsi que par clonage et séquençage de son ADN complémentaire (K Matsushima et al 1988 J Exp Med, 1883-1893), est homologue à d'autres cytokines déjà connues à la date de sa découverte: les cytokines produites par les granules oc des plaquettes telles que le PF 4 (Platelet Factor 4) et le PBP (Platelet Basic Protein) La famille des protéines connues homologues à l'interleukine-8, appelée habituellement famille SIS (pour Small Induced Secreted proteins), s'est considérablement agrandie depuis 1987 Elle compte aujour- d'hui notamment les cytokines suivantes: gro (également appelé MGSA: Melanoma Growth Stimulatory Activity) décrite par A Anisowicz et a I, 1987, Proc Ntl Acad Sci USA, 84, 7188-7192 et A Richmond et al 1988, EMBO J, 7, 2025-2033, RANTES (Regulated upon Activation Normal T Expressed and presumably Secreted) décrite par Schall et ai, 1988, J Imm, 141, 1018-1025, MIP-1 (Macrophage Inflammatory Protein 1) décrite par S D Wolpe et a I, 1988, J Exp Med, 167, 570-581, MIP 2 (Macrophage Inflammatory Protein 2) décrite par S D Wolpe et a I, 1989, Proc. Ntl Acad Sci USA, 86, 612-616 et MCP-1 (Monocyte Chemoat- tractant Protein 1 également appelée MCAF: Monocyte chemotactic and Activating Factor) décrite par T Yoshimura et a I, 1989, Proc. Ntl Acad Sci USA, 84, 9233-9237 et K Matsushima et al, 1989, J Expr Med, 169, 1485-1489. La cytokine MCP-1, isolée d'une lignée de gliome par T Yoshimura, référence ci-dessus, ainsi que d'une lignée monocy- taire par K Matsushima et a I, référence ci-dessus, existe sous deux formes de masses moléculaires apparentes 13 et 15 k Da, appelées MCP-loc et MCP-1 p qui semblent correspondre à des modifi- cations post-traductionnelles MCP-1 a une activité chimiotactique pour les monocytes et les basophiles mais pas pour les neutrophiles (E.J Leonard, 1990, Immunology Today, 11, 3, 97-101) et un effet stimulateur de l'activité cytostatique des monocytes sur certaines lignées tumorales (K Matsushima et ai, 1989, J Exp Med, 169, 1485-1490). Les études de structures tridimensionnelles par spec- troscopie de résonance magnétique nucléaire ou diffraction des rayons X de l'interleukine-8 et de PF 4 ont montré que ces deux cytokines ont la même conformation, avec un peptide carboxy- terminal de 12 à 15 acides aminés en forme d'héLice (x (R St. Charles et a L, 1988, J Biol Chem, 264, 4, 2092-2099 et G M. Clore, 1990, Biochem, 29, 1689-1696) Selon G M Clore, la plupart des cytokines de la famille SIS ont une telle partie carboxy-terminale en forme d'hélice a. On a montré récemment que le peptide carboxy-terminal de 13 acides aminés est responsable de l'activité antiangiogénique (inhibition de la prolifération des vaisseaux sanguins) de la cytokine PF 4 (T MAIONE et al, 1990, Science, 247, 77-79) Selon D.G Osterman, 1982, Biochem Biophys, Res Commun, 107, 130-135, ce peptide a une activité chimiotactique vis-à-vis des monocytes trente fois supérieure à celle de PF 4. La protéine de la présente invention est une protéine sécrétée dont la séquence d'acides aminés correspond à celle d'un ADN complémentaire obtenu à partir de l'ARN messager extrait de cellules mononucléaires humaines du sang périphérique cultivées dans des conditions stimulant l'expression de cytokines Cette protéine présente, en ce qui concerne sa séquence d'acides aminés, une certaine homologie avec celle de la cytokine MCP-1, et, comme cette dernière, elle possède une activité de type cytokine Elle constitue un nouveau membre de la famille SIS Elle peut être utile notamment en cancérologie et dans le traitement par immuno- modulation de certains états infectieux. La présente invention a plus particulièrement pour objet une protéine présentant une activité de type cytokine, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés (al) suivante: X-Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu dans laquelle X représente le résidu glutamine, le résidu gluta- mine précédé du résidu méthionine, un résidu glutamine dont le groupe amino-terminal est bloqué, un résidu acide glutamique amino- bloqué, ou le résidu acide pyroglutamique, ou une séquence qui diffère de la séquence (al), par un ou plusieurs acides aminés, et confère à la protéine la même activité. Cette protéine est de préférence sous une forme qui présente une masse moléculaire apparente, déterminée par électro- phorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS de 11 + 1, 13 + 1, 17 + 2 ou 18 + 2 k Da Lorsqu'elle est sous une forme de masse moléculaire de 17 + 2 ou 18 + 2 k Da, elle est avantageu- sement N-glycosylée. Cette protéine a de préférence, dans le cas o elle a une masse moléculaire apparente de 11 + 1 k Da ou 17 + 2 k Da, un degré de pureté, déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et révélation au nitrate d'argent, supérieur à %. L'invention concerne également le peptide présentant une activité de type cytokine qui comprend une partie de 13 à 20 acides aminés de la séquence (a 2) suivante: Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu correspondant à la partie carboxy-terminale de la séquence (al). L'invention a aussi pour objet un ADN recombinant carac- térisé en ce qu'il code pour la protéine précédente, laquelle peut être alors obtenue à partir du lysat cellulaire ou, avantageu- sement, pour un précurseur de la protéine précédente Ce précurseur comprend alors de préférence la séquence d'acides aminés (a 3) suivante: Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr G Ln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu précédée d'une séquence signal. La séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a 3) est par exemp Le la séquence (Na 3) suivante: CAGCCAGTTGGGATTAATACTTCAACTACCTGCTGCTAC AGATTTATCAATAAGAAAATCCCTAAGCAGAGGCTGGAGAGCTACAGAAGGACCACCAGT AGCCACTGTCCCCGGGAAGCTGTAATCTTCAAGACCAAACTGGACAAGGAGATCTGTGCT GACCCCACACAGAAGTGGGTCCAGGACTTTATGAAGCACCTGGACAAGAAAACCCAAACT CCAAAGCTT Cette séquence signal, choisie en fonction de la cellule hôte, a pour fonction de permettre l'exportation de la protéine recombinante en dehors du cytoplasme, ce qui permet à la protéine recombinante de prendre une conformation proche de celle de la protéine naturelle et facilite considérablement sa purification. Cette séquence signal peut être clivée soit en une seule étape par une signal-peptidase que libère la protéine mature, la séquence éliminée étant habituellement appelée séquence pré ou peptide- signal, soit en plusieurs étapes lorsque cette séquence signal comprend en plus de la séquence éliminée par la signal-peptidase, appelée séquence pré, une séquence éliminée plus tardivement au cours d'un ou plusieurs évènements protéolytiques, appelée séquence pro. Pour une expression dans les micro-organismes proca- ryotes, tels que par exemple Escherichia coli, cette séquence signal peut être soit une séquence dérivée d'un précurseur naturel d'une protéine exportée par un micro-organisme procaryote (par exemple le peptide signal Omp A lGhrayeb et al 1984, EMBO Journal, 3, 2437-2442 l ou celui de la phosphatase alcaline EJ Bact 1983, 154, 366-374 l, soit une séquence non endogène provenant d'un précurseur eucaryote (par exemple le peptide signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine), soit un peptide signal synthétique (par exemple celui décrit dans la demande de brevet française n 2 636 643, de séquence: Met Ala Pro Ser Gly Lys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Pro Ser Trp Asn Ala Gly Ala). Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que les ascomycètes, par exemple la Levure Saccharomyces cerevisiae ou le champignon filamenteux Cryphonectria parasitica, cette séquence signal est de préférence une séquence dérivée d'un précurseur naturel d'une protéine sécrétée par ces cellules, par exemple pour la levure celui de l'invertase (demande de brevet EP 0 123 289) ou celui de la séquence prépro de la phéromone alpha (demande de brevet DK 2484/84), ou pour Cryphonectria parasitica, celui de la séquence prépro de l'endothiapepsine, de séquence: Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Val Thr Ala Met Leu Ala Gly Gly Ala Leu Ser Ser Pro Thr Lys Gln His Val Gly Ile Pro Val Asn Ala Ser Pro Glu Val Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gln Val Arg Asn Pro Asn Tyr Lys Phe Asn Gly Pro Leu Ser Val Lys Lys Thr Tyr Leu Lys Tyr Gly Val Pro Ile Pro Ala Trp Leu Glu Asp Ala Val Gln Asn Ser Thr Ser Gly Leu Ala Glu Arg Pour une expression dans les cellules animales, on utilise comme séquence signal soit une séquence signal d'une protéine de cellule animale connue pour être exportée par exemple le peptide signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine, déjà connu pour permettre la sécrétion de l'interleukine-2 (cf la demande de brevet française 2 619 711) -, soit l'une des trois séquences signal explicitées ci-dessous. Une séquence signal appréciée pour une expression dans les cellules animales est celle qui a la séquence d'acides aminés (bl) suivante: Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala A La Ala Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Cette séquence signal est par exemple codée par la séquence nucléotidique (Nbl) suivante: ATGAAAGCCTCTGCAGCACTTCTGTGTCTGCTGCTCACAGCAGCTGCT TTCAGCCCCCAGGGGCTTGCT Une autre séquence signal appréciée pour une expression dans les cellules animales est celle qui a la séquence (b 2) suivante. Met Pro Ser Pro Ser Asn Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala par exemple codée par la séquence nucléotidique (Nb 2) suivante: ATGCCC TCACCCTCCAACATGAAAGCCTCTGCAGCACTTCTGTGTCTGCTGCTCACAGCAGCTGCT TTCAGCCCCCAGGGGCTTGCT Une autre séquence signal appréciée pour une expression dans les cellules animales est celle qui a la séquence (b 3) suivante: Met Trp Lys Pro Met Pro Ser Pro Ser Asn Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala par exemple codée par la séquence nucléotidique (Nb 3) suivante: ATGTGGAAGCCCATGCCC TCACCCTCCAACATGAAAGCCTCTGCAGCACTTCTGTGTCTGCTGCTCACAGCAGCTGCT TTCAGCCCCCAGGGGCTTGCT L'invention concerne également un vecteur d'expression qui porte, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment. Pour une expression dans les micro-organismes proca- ryotes, en particulier dans Escherichia coli, l'ADN recombinant doit être inséré dans un vecteur d'expression comportant notamment un promoteur efficace, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gène à exprimer, ainsi qu'une séquence d'arrêt de trans- cription efficace en aval du gène à exprimer Ce vecteur doit également comporter une origine de réplication et un marqueur de sélection Toutes ces séquences doivent être choisies en fonction de la cellule hôte. Pour une expression dans les cellules eucaryotes, le vecteur d'expression selon l'invention porte l'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression, à sa réplication dans les cellules eucaryotes et à la sélection des cellules transformées De préférence, ce vecteur porte un marqueur de sélection, choisi par exemple pour complémenter une mutation des cellules eucaryotes réceptrices, qui permet la sélection des cellules qui ont intégré l'ADN recombinant en un nombre de copies élevé soit dans leur génome, soit dans un vecteur multicopie. Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que la levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae, il convient d'insérer l'ADN recombinant entre, d'une part, des séquences reconnues comme promoteur efficace, d'autre part, un terminateur de transcription L'ensemble promoteur-séquence codante-terminateur, appelé cassette d'expression, est cloné soit dans un vecteur plasmidique monocopie ou polycopie pour la levure, soit intégré en multicopie dans le génome de la levure. Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que celles des champignons filamenteux, du groupe des ascomycètes, par exemple ceux des genres Aspergillus, Neurospora, Podospora, Trichoderma ou Cryphonectria, le vecteur d'expression selon l'invention porte l'ADN recombinant défini précédemment avec les moyens nécessaires à son expression, et éventuellement un marqueur de sélection et/ou des séquences télomériques Il est en effet possible de sélectionner les transformants ayant intégré un ADN d'intérêt à l'aide d'un marqueur de sélection situé soit sur le même vecteur que l'ADN d'intérêt, soit sur un autre vecteur, ces deux vecteurs étant alors introduits par cotransformation L'ADN recombinant de l'invention peut être soit intégré au génome des champignons filamenteux, soit conservé sous forme extrachromo- somique grâce à des séquences permettant la réplication et la partition de cet ADN. Pour une expression dans les cellules animales, notamment dans les cellules d'ovaires de hamster chinois CHO, l'ADN recombinant est inséré dans un plasmide (par exemple dérivé du p BR 322) comportant deux unités d'expression, une première unité dans laquelle est inséré l'ADN recombinant devant un promoteur efficace (par exemple le promoteur précoce de SV 40) La séquence autour de l'ATG d'initiation est de préférence choisie en fonction de la séquence consensus décrite par KOZAK (M KOZAK ( 1978) Cell, , 1109-1123) Une séquence intronique, par exemple de l'intron de l'o-globine de souris, peut être insérée en amont de l'ADN recom- binant ainsi qu'une séquence comportant un site de polyadénylation, par exemple une séquence de polyadénylation du SV 40, en aval du gène recombinant La deuxième unité d'expression comporte un marqueur de sélection, par exemple une séquence d'ADN codant pour la dihydrofolate réductase (enzyme ci-après abrégée DHFR) Le plasmide est transfecté dans les cellules animales, par exemple les cellules CHO DHFR (incapables d'exprimer la DHFR) Une lignée est sélectionnée pour sa résistance au méthotréxate: elle a intégré dans son génome un nombre élevé de copies de l'ADN recombinant et exprime ce dernier à un niveau élevé. L'invention a également trait aux micro-organismes procaryotes qui sont transformés par le vecteur d'expression défini précédemment et aux cellules eucaryotes qui contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, l'ADN recombinant défini précédemment Celui-ci peut avoir été introduit par transformation par le vecteur d'expression défini précédemment ou par l'ADN recom- binant de l'invention lui-même, lequel peut parfois être intégré directement au génome en un locus qui permet son expression. Des cellules eucaryotes préférées sont les cellules animales. L'ADN recombinant peut, par exemple, avoir été introduit dans les cellules par transfection par le vecteur d'expression ci- dessus, par infection au moyen d'un virus ou d'un rétro-virus le portant, ou par micro-injection. L'invention concerne aussi un procédé de préparation de la protéine définie précédemment qui comprend une étape de culture des cellules animales ci-dessus, suivie de l'isolement et de la purification de la protéine recombinante. L'invention se rapporte également à la protéine recom- binante susceptible d'être obtenue par un procédé qui comprend une étape de culture de ces cellules animales, suivie de l'isolement et de la purification de la protéine recombinante. La protéine de l'invention a une activité chimiotactique vis-à-vis des monocytes mise en évidence à l'aide du test de chimiotactisme décrit par W FALK et al, 1980, J Imm meth, 33, 239-247 et un effet stimulateur de l'activité des monocytes sur certaines lignées tumorales, constatée sur le test d'inhibition de la croissance des tumeurs décrits par K Matsushima et al, 1989, J Exp Med, 169, 1485-1480. L'invention a donc également pour objet le médicament, utile notamment en cancérologie et dans le traitement de certains états infectieux, au cours desquels les défenses immunitaires sont affaiblies, suite par exemple à la présence de certains parasites (par exemple la leishmaniose, la lèpre ou la maladie de Chagas), qui contient comme principe actif la protéine ou le peptide définis précédemment dans un excipient pharmaceutiquement acceptable. Ceux-ci peuvent être utilisés seuls ou en association avec d'autres agents actifs: par exemple une ou plusieurs autres cytokines. L'invention est illustrée à l'aide des exemples non limitatifs ci-après: Une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Maniatis et al: "Molecular cloning: a Laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York ( 2 e édition). EXEMPLE 1: Culture et stimulation des cellules mononucléaires du sang périphérique. Préparation de l'ARN messager 1) Culture et stimulation des cellules mononucléaires du sang périphérique: A partir de poches de sang périphérique (prélevées sur trois volontaires sains dans un centre de transfusion sanguine), ayant préalablement subi une cytaphérèse et un gradient de Ficoll (Gauchat et a I, 1989, Eur J Imm 19, 1079), on prélève une fraction de cellules enrichie en cellules mononucléaires du sang périphérique PBMNC (peripheral blood mononuclear cells) de compo- sition approximative suivante: 70 % de lymphocytes, 25 % de mono- cytes et 5 % de granulocytes (comptage des cellules à l'aide du compteur de cellules Coulter-Modèle S-Plus IV). Les cellules sont recueillies dans un flacon de 250 ml, puis centrifugées à 1500 tr/min pendant 10 min à 37 C Le surnageant est éliminé et le culot de cellules est rincé avec 50 ml d'un milieu à base de glucose, sels minéraux, acides aminés et vitamines, appelé milieu RPMI (milieu RPMI 1640 de Gibco BRL), puis de nouveau centrifugé dans les mêmes conditions. Le culot de cellules est alors repris avec 500 ml du milieu RPMI complété avec 10 % de sérum de veau foetal (Gibco BRL- réf 013-06290 H), additionné de 10 unités de pénicilline et de 10 pg de streptomycine (solution de pénicilline/streptomycine de Gibco réf 043-05140 D) par ml de milieu ainsi que de L-glutamine (Gibco BRL- réf 043-05030 D) jusqu'à 2 m M final Une partie de la suspension cellulaire est répartie en vue de la séparation des cellules adhérentes et des cellules non adhérentes, à raison d'environ 100 ml par boîte, dans quatre grandes boites de culture carrées ( 245 x 245 x 20 mm-Nunc réf 166508) et incubée pendant 1 h à 37 C On sait en effet que la plupart des cellules monocy- taires adhèrent à la boîte de culture, tandis que la plupart des cellules lymphocytaires restent en suspension. Les cellules non adhérentes sont aspirées à l'aide d'une pipette et cultivées dans des flacons de culture du type Falcon de surface 175 cm 2 en présence de milieu RPMI complété comme décrit ci-dessus, additionné de 10 ng/ml de phorbol myristate-2 acétate-3 (PMA) (Sigma-réf P 8139) et de 5 pg/ml de phytohémaglutinine (PHA-P) (Sigma-réf L 8754), à 370 C en présence de 5 % de C 02 pendant 24 h. Sur les cellules adhérentes, on rajoute 100 ml de milieu RPMI complété comme décrit ci- dessus additionné de 10 ng/ml de PMA et de 5 pg/ml de PHA-P Les cellules sont incubées à 37 C en présence de 5 % (v/v) de CO 2 pendant 5 h. Le reste de la suspension cellulaire, appelé ci-après les cellules totales, est réparti dans 4 grandes boîtes de culture carrées et incubé en présence de milieu RPMI complété comme décrit ci-dessus, additionné de 10 ng/ml de PMA et 5 pg/ml de PHA-P à 37 C en présence de 5 % (v/v) de C 02 pendant 5 h pour les deux premières boites et 24 h pour les deux autres. 2 h avant la fin de l'incubation on ajoute dans le milieu de culture de ces différentes cellules 10 pig/ml de cycloheximide (Sigma-réf C 6255) (inhibiteur de traduction qui augmente la stabilité des ARN des cytokines: cf T Lindsten et al, 1989, Science 244, 339-344) et l'incubation est poursuivie pendant 2 h à 37 C. 2) Préparation de l'ARN messager: a) Extraction de l'ARN messager Les cellules sont récupérées da la façon suivante: les cellules adhérentes sont lavées 2 fois avec du tampon PBS (Phosphate buffered saline) puis grattées avec un grattoir en caoutchouc et centrifugées On obtient ainsi un culot cellulaire appelé culot A. pour les cellules non adhérentes, après agitation du flacon contenant la suspension des cellules, la suspension cellulaire est prélevée et centrifugée On obtient ainsi un culot cellulaire appelé culot cellulaire NA. pour les cellules totales, la fraction adhérente est lavée 2 fois avec du tampon PBS et grattée comme précédemment puis centrifugée. La fraction non adhérente est centrifugée Les deux culots cellu- laires obtenus seront réunis par la suite Leur réunion est appelée culot cellulaire T( 5 h) pour les cellules totales incubées pendant h et T( 24 h) pour les cellules totales incubées pendant 24 h. Les culots cellulaires A, NA, T( 5 h) et T( 24 h) sont congelés et conservés à -80 C. Chaque culot cellulaire congelé est mis en suspension dans le tampon de lyse de composition suivante: guanidine- thiocyanate SM; Tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane 50 m M p H 7,5 EDTA m M La suspension est traitée par ultrasons à l'aide d'un sonicateur Ultra Turax n 231 256 (Janke et Kunkel) à puissance maximale pendant 4 cycles de 20 s On ajoute du p-mercaptoéthanol jusqu'à 0,2 M et on refait un cycle de sonication de 30 s On ajoute du chlorure de lithium jusqu'à 3 M On refroidit la suspension à 4 C et on la laisse reposer à cette température pendant 48 h L'ARN est ensuite isolé par centrifugation à 9000 tr/min pendant 60 min Le culot d'ARN est lavé une fois avec une solution de chlorure de lithium 3 M, recentrifugé, puis repris dans un tampon de composition suivante: SDS 1 %, EDTA 5 m M et Tris H Cl 10 m M p H 7,5, additionné de 1 mg/ml de protéinase K (Boehringer Mannheim, Gmb H) Après incu- bation à 40 C pendant 1 h la solution d'ARN est extraite avec un mélange phénol/chloroforme On précipite à -20 C l'ARN contenu dans la phase aqueuse à l'aide d'une solution d'acétate d'ammonium 0,3 M final et 2,5 volumes d'éthanol On centrifuge à 15 000 g pendant 30 min et on garde le culot. b) Purification de la fraction poly A de l'ARN Le culot est repris dans 1 ml de tampon de composition Tris 10 m M p H 7,5 EDTA lm M, appelé tampon TE et mis en suspension par agitation au vortex L'oligo d T- cellulose type 3 (commercialisé par Collaborative Research Inc, Biomedicals Product Division) est préparé suivant les recommandations du fabricant L'ARN est déposé sur l'oligo d T-cellulose, agité doucement pour mettre en suspension Les billes, puis chauffé pendant 1 min à 65 C. La suspension est ajustée à 0,5 M Na Cl puis mise à agiter doucement pendant 10 min La suspension est alors centrifugée pendant 1 min à 1000 g, le surnageant est éliminé, le culot est lavé 2 fois avec 1 ml de tampon TE contenant 0,5 M Na Cl Les surnageants sont éliminés L'élution de la fraction polyadénylée des ARN (constituée des ARN messagers) est obtenue par suspension des billes dans 1 m L de tampon TE, puis chauffage de cette suspension à 60 C pendant 1 min, suivie d'une agitation pendant min sur plaque basculante On centrifuge ensuite pendant 1 min à 1000 g, ce qui permet de récupérer le surnageant contenant des ARN messagers libres en solution L'ensemble des opérations ci-dessus (à partir de l'élution) est répété 2 fois Les surnageants ainsi obtenus sont rassemblés, on éLimine les billes résiduelles par centrifugation et on précipite le surnageant avec 3 volumes d'éthanol et une solution de Na Cl à 0,3 M final. On obtient ainsi à partir des culots cellulaires A, NA, T( 5 h) et ( 24 h) quatre échantillons d'ARN-poly A, nommés par la suite ARN-poly A -A, ARN-poly A -NA; ARN-poly A -T( 5 h) et ARN- poly A±T( 24 h). EXEMPLE 2: Préparation d'une banque d'ADN complémentaire enrichie en séquences spécifiques des cellules mononucléaires du sang périphérique 1) Construction du vecteur de clonage p SE 1: La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées Les techniques declonage employées sont celles décrites par T MANIATIS, EF FRITSCH et J SAMBROOK dans "Molecular Cloning, a Laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) La synthèse des oligonucléotides est réalisée à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 8700. La description ci-après sera mieux comprise en référence à la figure 1, qui représente une carte d'assemblage du plasmide p SE 1, les sites ayant disparu par ligation étant notés entre parenthèses Les symboles utilisés dans cette figure seront précisés dans l'exposé ci-après. Ce plasmide a été construit par ligations successives des éléments ciaprès: a) un fragment Pvu II-Pvu II symbolisé par +++++++ sur la fi- gure 1 de 2525 pb, obtenu par digestion complète du plasmide p TZ 18 R (Pharmacia) à l'aide de l'enzyme de restriction Pvu II Ce fragment contient l'origine de réplication du phage fl (notée ORI R fl sur la figure 1), un gène (noté Amp sur la figure 1) portant la résistance à l'ampicilline et l'origine de réplication (notée ORI p B 322 sur la figure 1) permettant la réplication de ce plasmide dans E Coli Le premier site franc Pvu II disparaît par ligation avec le site franc Eco RV (qui disparaît également) du fragment décrit en g). b) un fragment Pvu II-Hpa I symbolisé par sur la figure 1 - de 1060 pb de l'ADN d'adénovirus type 5 entre les positions 11299 (site de restriction Pvu II) et 10239 (site de restriction Hpa I (B DEKKER et H VAN ORMONDT, Gene 27, 1984, 115-120) contenant l'information pour les ARN VA-I et VA-II Le site franc Hpa I disparaît par ligation avec le site franc Pvu II (qui disparaît également) du fragment décrit en c) Le site Apa I en position 11 218 a été enlevé par clivage à l'aide de l'enzyme Apa I, traitement à l'aide de l'exonucléase: ADN polymérase du phage T 4 et religation. c) un fragment Pvu II-Hind III symbolé par / I / / I / I / sur la figure 1 de 344 pb, issu de l'ADN du virus SV 40 obtenu par diges- tion complète à l'aide des enzymes de restriction Pvu II et Hind III. Ce fragment comporte l'origine de réplication et le promoteur précoce de l'ADN du virus SV 40 (réf B J BYRNE et al Proc Ntl. Acad Sci USA ( 1983), 80, 721-725). Le site Hind III disparaît par ligation avec le site liant à Hind III du fragment décrit en d). d) un fragment synthétique "site liant à Hind III"-Hind III symbo- lisé par sur la figure 1 de 419 pb dont la séquence donnée ci- après contient une séquence proche de la séquence 5 ' non traduite du virus HTLV 1 (R WEISS et ai, "Molecular Biology of Tumor Viruses part 2-2 e ed 1985 Cold Spring Harbor Laboratory p 1057) et L'intron distal du gène de l'l-globine de souris (Y Nishioka et ai, 1979, Cel L, 18, 875-882). site liant à Hind III TAGCTGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCC 1 + + + + + + 60 CCGAGCGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCGGCGGGATGGACTCCGGCGGTAGGTGCGG GGTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTA 61 + + + + + + 120 CCACTCAGCGCAAGACGGCGGAGGGCGGACACCACGGAGGACTTGACGCAGGCGGCAGAT GGTAGGCTCCAAGGGAGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTCTAAACTTACCTA 121 + + + + + + 180 CCATCCGAGGTTCCCTCGGCCTGTTTCCGGGCCAGAGCTGGACTCGAGATTTGAATGGAT GACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTT 181 + + + + + + 240 CTGAGTCGGCCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGACGAACGAGTTGAGATGCAGAAACAAA CGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAACTTCAAGGTATGCGCTGGGACCTGGCAGGCGGCAT 241 + + + + + + 300 GCAAAAGACAAGACGCGGCAATGTTGAAGTTCCATACGCGACCCTGGACCGTCCGCCGTA CTGGGACCCCTAGGAAGGGCTTGGGGGTCCTCGTGCCCAAGGCAGGGAACATAGTGGTCC 301 + + + + + + 360 GACCCTGGGGATCCTTCCCGAACCCCCAGGAGCACGGGTTCCGTCCCTTGTATCACCAGG CAGGAAGGGGAGCAGAGGCATCAGGGTGTCCACTTTGTCTCCGCAGCTCCTGAGCCTGCA 361 + + + + + + 420 GTCCTTCCCCTCGTCTCCGTAGTCCCACAGGTGAAACAGAGGCGTCGAGGACTCGGACGT GA CTTCGAA Hind III e) un fragment synthétique Hind III-"site liant à Bam HI" symbo- lisé par XXXXXXX sur la figure 1 contenant le promoteur de l'ARNpolymérase du phage T 7 ainsi qu'un polylinker contenant les sites de clonage Apa I et Bam HI. f) un fragment Bam HI-Bcl I de 240 pb représenté par sur la figure 1 -, petit fragment obtenu par digestion complète à l'aide des enzymes Bcl I et Bam HI du virus SV 40 qui contient le site de polyadénylation tardif de ce dernier (M FITZGERALD et al. Cell, 24, 1981, 251-260) Les sites Bam HI et Bcl I disparaissent par ligations avec respectivement le site liant à Bam HI du fragment décrit en e) et le site Bam HI (qui disparaît également du fragment décrit en g). g) un fragment Bam HI-Eco RV symbolisé par 000000 sur la fi- gure 1 de 190 pb, petit fragment issu du plasmide p BR 322 après digestion complète à l'aide des enzymes Eco RV et Bam HI. Le plasmide p SE 1 comporte donc les éléments nécessaires pour son utilisation comme vecteur de clonage dans E coli (origine de réplication dans E coli et gène de résistance à l'ampicilline, provenant du plasmide p TZ 18 R) ainsi que comme vecteur d'expression dans les cellules animales (promoteur, intron, site de polyadénylation, origine de réplication du virus SV 40), et pour sa copie en simple brin dans un but de séquençage (origine de réplication du phage f M). 2) Constitution d'une banque d'ADN complémentaire enrichie en séquences spécifiques des cellules mononucléaires du sang périphérique: La technique de clonage utilisée est celle décrite par D Caput et al, (technique de l'amorce-adaptateur (Primer- adapter): (D Caput et al, Proc Natl Acad Sci (U S A) ( 1986) 83, 1670-1674)). Elle consiste d'une part à digérer le vecteur p SE 1 par Apa I, ajouter une queue de polyd C sur L'extrémité 3 ' protubérante, puis à digérer les plasmides ainsi obtenus par l'endonucléase Bam HI Le fragment correspondant au vecteur est purifié sur colonne de Sépharose CL 4 B (Pharmacia) Il comprend donc une queue polyd C à une extrémité, l'autre extrémité étant cohésive, du type Bam HI. D'autre part, les ARN-poly A obtenus à l'issue de l'exemple 1 sont soumis à la transcription inverse à partir d'une amorce dont la séquence est la suivante: ' GATCCGGGCCCTTTTTTTTTTTT 3 ' Ainsi, les AD Nc présentent à leur extrémité 5 ' la séquence GATCC complémentaire de l'extrémité cohésive Bam HI. Les hybrides ARN-ADN obtenus par action de la transcriptase inverse sont soumis à une hydrolyse alcaline qui permet de se débarrasser de l'ARN Les AD Nc simple brin sont alors soumis à un traitement à la terminale transférase de façon à ajouter des polyd G en 3 ' et purifiés par 2 cyles sur colonne de Sépharose CL 4 B. Ces AD Nc sont hybridés avec de L'ARN-poly A provenant de cellules de la lignée CO 53 (lignée de cellules de reins de singe exprimant l'antigène T du virus SV 40: cf Y Gluzman, 1981, Cell, 23, 175-182). Les AD Nc non hybridés sont isolés (fraction enrichie en ADN complémentaire aux ARN messagers spécifiques des cellules mono- nucléaires du sang périphérique). Ces AD Nc sont insérés sous forme simple brin dans le vecteur p SE 1 Un second oligonucléotide (l'adaptateur) complémen- taire de l'amorce est nécessaire pour générer un site Bam HI à l'extrémité 5 ' des AD Nc Après hybridation du vecteur, de l'AD Nc et de l'adaptateur, les molécules recombinantes sont circularisées par l'action de la ligase du phage T 4 Les régions simple brin sont alors réparées grâce à l'ADN polymérase du phage T 4 Le pool de plasmides ainsi obtenu sert à transformer la souche MC 1061 (M Casabadan et S Cohen, J Bact ( 1980) 143, 971-980) par éLectroporation. Protocole de préparation de la banque d'ADN complémentaire a) Préparation de I'ADN complémentaire A partir de 5 pg des ARN-poly A de cellules mono- nucléaires de sang périphérique obtenus à l'issue de l'exemple 1 de composition suivante: ARN-po Ly A A: 0,5 pg, ARN-poly A NA: 2 pg, ARN-poly A T( 5 h): 2 pg et ARN-poly A T( 24 h): 0,5 pg, on prépare l'ADN complémentaire simple brin marqué au 32 P-d CTP (l'ADN complémentaire obtenu présente une activité spécifique de 3000 dpm/ng) avec l'amorce synthétique de séquence suivante: ' GATCCGGGCCCTTTTTTTTTTTT 3 ' dans un volume de 100 pl Après 30 min d'incubation à 46 C avec 100 unités de l'enzyme transcriptase inverse (Genofit-E 1 022) on ajoute 4 pl d'EDTA 0,5 M On extrait une première fois avec du * phénol (saturé en tampon TE) puis une seconde fois avec du chloro- forme On ajoute 10 pg d'ARN de transfert de foie de veau, 1/10 de volume d'eau solution d'acétate d'ammonium 10 M et 2,5 volumes d'éthanol pour précipiter l'ADN complémentaire On centrifuge, on dissout le culot dans 30 pl de tampon TE puis on retire les petites molécules telles que sels, phénol et chloroforme par chromato- graphie d'exclusion sur une colonne de polyacrylamide P 10 (Biogel P 10-200-400 mesh, réf 1501050-Biorad). b) Hydrolyse alcaline de la matrice ARN On ajoute 4,6 pl d'une solution de Na OH 2 N, on incube min à 68 C, puis on ajoute 4,6 pl d'acide acétique 2 N et on fait passer la solution obtenue sur une colonne de polyacrylamide P 10. c) Addition homopolymérique de d G On allonge l'ADN complémentaire en 3 ' avec une "queue" de d G avec 66 unités de l'enzyme terminale transférase (Pharmacia-27073001) On incube 30 min à 37 C, puis on ajoute 4 pl d'EDTA 0,5 M. d) Purification sur colonne de Sépharose CLB Afin d'éliminer l'amorce synthétique, on purifie l'ADN complémentaire sur deux colonnes successives de 1 ml de sépharose CL 4 B équilibrée en Na OH 30 m M/EDTA 2 m M. Les trois premières fractions radioactives (d'environ pl chacune) sont regroupées et précipitées avec 1/10 de volume d'une solution d'acétate d'ammonium et 2,5 volumes d'éthanol La quantité d'ADN complémentaire est de 1 pg. e) Hybridation Le culot d'ADN complémentaire est mis en suspension dans pl de tampon TE, on ajoute 15 pg d'ARN-poly A+ extrait de cellules de la lignée COS, puis 1/10 de volume d'une solution de Na Cl 3 M, 5 volumes d'éthanol et on laisse précipiter à -20 C. On centrifuge, on lave à l'éthanol 70 %, on sèche, on dissout le culot dans 5 pl de tampon de composition suivante: Tris 0,1 M p H 7,5; Na Cl 0,3 M, EDTA lm M, on met la solution obtenue dans un tube capillaire que l'on scelle puis on incube à 65 C pendant h. On dilue le contenu du capillaire dans 100 pl de tampon TE auquel on ajoute 300 pl de tampon phosphate de sodium 50 m M p H 6,8 On fait passer la solution obtenue sur une colonne d'hydroxyapatite (BIORAD réf 130 0520) à 60 C, équilibrée avec ce tampon phosphate On sépare le simple brin (l'ADN complémentaire non hybridé) et le double brin (ARN messager de COS hybridé à l'ADN complémentaire) par un gradient de tampon phosphate de 0,1 M à 0,2 M à travers la colonne d'hyhdroxyapatite On regroupe les fractions correspondant à l'ADN complémentaire simple brin ( 25 % en poids de l'AD Nc élué), on ajoute 20 pg d'ARN de transfert, on précipite le volume total avec 1/10 de volume d'une solution d'acétate d'ammonium 10 M et 2,5 volumes d'éthanol On centrifuge, le culot est dissous dans 200 pl de TE, on retire le phosphate résiduel sur polyacrylamide P 10, on précipite de nouveau avec 1/10 de volume d'une solution d'acétate d'ammonium 10 M et 2,5 volumes d'éthanol. Le culot est dissous dans 30 p L d'une so Lution de Na OH m M; EDTA 2 m M On charge l'ADN complémentaire sur une colonne de Sépharose CL 4 B (Pharmacia) de 1 ml, équilibrée avec une solution de Na OH 30 m M; EDTA 2 m Mafin d'éliminer le reste d'amorce synthétique On regroupe les 3 premières fractions radio- actives d'environ 80 pl chacune On précipite l'AD Nc contenu dans ces fractions avec 1/10 de volume d'une solution d'ammonium 10 M et 2,5 volumes d'éthanol La quantité d'ADN complémentaire ainsi récupérée est de 20 ng. f) Appariement du vecteur de clonage p SE 1 et de l'ADN complémentaire en présence de l'adaptateur On centrifuge, le culot est dissous dans 33 p L de tampon TE, on ajoute 5 p L ( 125 ng) de vecteur de clonage p SE 1, 1 pl ( 120 ng) de l'adaptateur de séquence suivante: ' AAAAAAAAAAAAAGGGCCCG 3 ' pi L d'une solution de Na CL 200 m M, on incube 5 min à 65 C puis on laisse refroidir le mélange réactionnel jusqu'à température ambiante. g) Ligation On ligue le vecteur de clonage et l'AD Nc simple brin dans un volume de 100 p IL avec 32,5 unités de l'enzyme ADN ligase du phage T 4 (Pharmacia réf: 270 87002) pendant une nuit à 15 C. h) Synthèse du deuxième brin de l'AD Nc On élimine les protéines par extraction au phénol suivie d'une extraction au chloroforme, puis on ajoute 1/10 de volume d'une solution d'ammonium 10 m M puis 2, 5 volumes d'éthanol On centrifuge, le culot est dissous, le deuxième brin d'ADN complé- mentaire est synthétisé dans un volume de 30 p L avec 30 unités de l'enzyme ADN polymérase du phage T 4 (Pharmacia) pendant 1 h à 37 C. On extrait au phénol et on retire les traces de phénol par une colonne de polyacrylamide P 10. i) Transformation par électroporation On transforme des cellules E coli MC 1061 (Clontech) avec l'ADN recombinant obtenu précédemment par électroporation à l'aide de l'appareil Biorad Gene Pulser (Biorad) utilisé à 2,5 k V dans les conditions prescrites par le fabricant, puis on fait pousser les bactéries pendant 6 h 30 dans du milieu dit milieu LB (Maniatis, op cité) de composition: bactrotryptone 10 g/l; extrait de levure g/l; Na Cl 10 g/l, additionné de 100 pg/ml d'ampicilline. On détermine le nombre de clones indépendants en étalant une dilution au 1/1000 de la transformation avant l'amplifi- cation sur une boîte de milieu LB additionné de 1,5 % d'agar (p/v) et de 100 pg/ml d'ampicilline appelé par la suite milieu gélosé. Le nombre de clones indépendants est de 500 000. EXEMPLE 3: Criblage de la banque d'ADN complémentaire soustraite et sélection du clone A 1) Réalisation des répliques des colonies bactériennes de la banque d'AD Nc sur filtre de Nylon: On distribue environ 40 000 bactéries recombinantes de la banque d'AD Nc sur des boîtes de Pétri de 245 x 245 mm contenant du milieu gélosé (environ 2 000 colonies/boite). A partir de chacune de ces boîtes, on réalise un transfert des colonies sur une membrane de Nylon (Hybond N- Amersham) par dépôt de la membrane sur la surface de la boite et mise de repères par perçage de la membrane à l'aide d'une aiguille La membrane est ensuite retirée et déposée sur la surface d'une nouvelle boîte de Pétri contenant du milieu gélosé. On laisse pendant quelques heures à 37 C pour obtenir la repousse des colonies A partir de cette première membrane, on réalise deux répliques sur de nouvelles membranes (préalablement déposées sur du milieu gélosé pour les humidifier) par contacts successifs avec la première membrane Les répliques sur membrane obtenues sont finalement déposées sur des boites de milieu gélosé et mises à incuber pendant une nuit à 30 C. Les répliques sur membrane sont déposées avec les colonies vers le haut, sur une feuille de Whatman 3 MM saturée avec une solution de composition: Na OH 0,5 M; Na Cl 1,5 M, pendant min, ce qui permet de lyser les bactéries et de fixer l'ADN Les répliques sur membrane sont ensuite posées sur une deuxième feuille de Whatman 3 MM saturée cette fois avec une solution neutralisante de composition: Na Cl 1,5 M; Tris-H Cl p H 8 0,5 M, pendant 5 min. Les répliques sur membrane sont ensuite plongées dans une solution de 2 x SSC (composition de la solution SSC: Na Cl 0,15 M; citrate de sodium 0,015 M) et les débris bactériens sont partiellement éliminés en frottant doucement à l'aide d'ouate de nettoyage. On traite ensuite les répliques sur membrane avec de la protéinase K (Boehringer Mannheim Gmb H) à 100 pg/ml dans une solution de composition: Tris-HCL 10 m M p H 8; EDTA 10 m M; Na Cl 50 m M; SDS 0,1 % à raison de 20 ml par membrane On incube min à 37 C avec agitation Les répliques sur membrane sont de nouveau plongées dans une solution de 2 x SSC pour éliminer défini- tivement toute trace de débris bactériens Elles sont finalement mises à sécher sur du papier-filtre pendant quelques minutes puis pendant 30 min sous vide à + 80 C On obtient ainsi, pour chaque boite, deux répliques sur membrane, appelées par la suite réplique 1 et réplique 2. 2) Préparation de l'ARN utilisé pour la fabrication des sondes AD Nc: a) Culture et stimulation de la lignée monocytaire U 937 La lignée monocytaire U 937 ATCC 1593 est cultivée dans du milieu RPMI complété avec 10 % de sérum de veau foetal (Gibco BRL-réf 013-06290 H), additionné de 10 unités de pénicilline et de 10 pg de streptomycine par ml ainsi que de 2 m M final de L-glutamine Pour l'activation de ces cellules, on les met dans le milieu RPMI additionné de pénicilline, streptomycine et L-glutamine et de 20 ng/ml de phorbol myristate-2 acétate-3 (PMA) (Sigma- réf P 8139) pendant 24 h Les cellules ainsi activées sont grattées et centrifugées Le culot cellulaire obtenu est appelé culot cellu- laire U 937 P. La moitié des cellules sont induites de surcroit avec du cycloheximide ( 10 pg/m L) pendant les deux dernières heures de culture Cet inhibiteur de la synthèse protéique rend plus stables les ARN messagers instables (dont les cytokines) (cf T Lindsten et al, 1989, Science, 244, 339-343) Les cellules ainsi activées sont grattées et centrifugées Le culot cellulaire obtenu est appelé culot cellulaire U 937 PC. b) Préparation de l'ARN-poly A A partir des culots cellulaires U 937 P et U 937 PC, l'ARN est extrait et la fraction poly A+ est purifiée comme décrit dans l'exemple 1-2)a) et b) On obtient ainsi deux fractions ARN-poly A+, appelées respectivement fraction poly A 1 et fraction poly A 2. 3) Préparation des sondes AD Nc radiomarquées: Les sondes AD Nc radiomarquées, appe Lées respectivement sonde 1 et sonde 2, sont synthétisées à partir des deux fractions A+ ARN-poly A ci-dessus préparées comme décrit ci-après. 1 pjg d'ARN poly A est hybridé avec 200 ng d'oligo d T 12 _ 18 (Pharmacia) dans 2 à 3 pl par incubation pendant 2 min à C et refroidissement jusqu'à température ambiante La synthèse de l'AD Nc radiomarqué est réalisée dans un volume réactionnel de pl en tampon de composition: Tris-HCL 50 m M p H 8,3; Mg CL 2 5 m M; dithiotréitol 10 m M, contenant 10 p M de chacun des 4 désoxy- nucléotides (Pharmacia), 150 p Ci de d CTP 32 P ( 3000 Ci/mmol Amersham) et 40 unités de R Nasine (inhibiteur de RN Ase-Genofit) La réaction s'effectue à 46 C pendant 30 min en présence de 10 à unités de transcriptase inverse (Genofit) Cette synthèse est suivie de l'hydrolyse alcaline de l'ARN par une solution de Na OH 0,3 M dans un volume final de 20 pl pendant 30 min à 65 C On neutralise par ajout d'acide acétique 3 M On ajuste le volume à pl avec du milieu TE On fait une extraction avec un même volume de phénol suivie d'une deuxième extraction avec un même volume d'un mélange chloroforme/isoamylalcool (dans les proportions respectives 24/1) On élimine le d CTP 032 P non incorporé lors de la synthèse du brin AD Nc par chromatographie d'exclusion sur une colonne de polyacrylamide P 10 (Biogel-200-400 mesh-Biorad). La quantité d'AD Nc est de 60 à 100 ng possédant une activité spécifique de I x 109 dpm/pg. 4) Hybridation des répliques des colonies bactériennes avec les sondes AD Nc: Les répliques sur membrane sont préhybridées pendant 2 h à 42 C dans un tampon de composition: 50 % formamide; 6 x SSC; 5 x solution de Denhardt; 0,1 % SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué, rajouté après dénaturation 10 min à 100 C Les répliques sur membrane sont hybridées pendant deux jours: la réplique 1 avec la sonde 1 et la réplique 2 avec la sonde 2, ces sondes étant utilisées à une concentration de 4 ng/ml dans le tampon ci- dessus La 5 x solution de Denhardt (cf Maniatis, op cité) a la composition: Ficoll (type 400-Pharmacia) 1 g/l, polyvinylpyrrolidone 1 g/l et la sérumalbumine bovine (BSA) 1 g/l. Les préhybridation et hybridation s'effectuent en tubes dans un four à hybrider (Hybaid) avec respectivement 25 ml et 10 ml de tampon par membrane. Ensuite les répliques sur membrane sont successivement lavées plusieurs fois pendant 15 min à 20 C dans le tampon de composition 2 x SSC; 0,1 % SDS, puis deux fois pendant 15 min dans une solution 0,1 x SSC, 0, 1 % SDS à 55 C séchées sur papier Whatman 3 MM et autoradiographiées sur films Kodak XAR 5. ) Hybridation avec un mélange d'oligonucléotides corres- pondant à la plupart des cytokines connues: Pour identifier les clones qui contiennent les ADN complémentaires aux ARN messagers des cytokines connes, une autre série de répliques sur membrane est préparée comme décrit ci-dessus, avec un mélange appelé mélange C de 28 oligonucléotides comportant chacun 20 nucléotides, correspondant aux ADN complémen- taires des cytokines suivantes: Interleukine-1 x(Furutani Y et al, 1985, Nucl Ac Res, 13, 5869- 5882), Interleukine-1 p (Auron P et al, 1984, Proc Ntl Acad. Sci USA, 81, 7907-7911), Interleukine-2 (Degrave W et al, 1983, EMBO J, 2, 3249- 3253), Interleukine-3 (Yang Y C et al 1986, 47, 3-10), Interleukine-4 (Yokoto T et a L, 1986, Proc Nt L Acad. Sci, USA, 83, 5894- 5898), Inter Leukine-5 (Hirano T et al, 1986, Nature, 324, 73-75), Interleukine-6 (May L et a L, 1986, Proc Ntl. Acad Sci USA, 83, 8957-8961), interleukine-7 (Namen A et al, 1988, Nature, 333, 571-573), Interleukine-8 (Matsushima K et al, 1988, J Exp Med, 167, 1883-1893), Interleukine-9 (Yang Y C et al, 1989, Blood, 74, 1880-1884), TN Fo(Pennica D et al, 1984, Nature, 312, 724- 729), TNF 3 (Gray P et al, 1984, Nature, 312, 721-724), G-CSF (Nagata S et al, 1986, 319, 415-418), M-CSF (Kawasaki E et al, 1985, Science, 230, 291-296), GM-CSF (Wong G. et a L, 1985, Science, 228, 810- 815), LIF (Grough N et al, 1988, Proc Ntl Acad Sci USA, 85, 2623- 2627), Interféron o (Goeddel D et al, 1981, Nature, 290, 20-26), Interféron Pl (Taniguchi T. et al, 1980, Gene, 10, 11-15), Interféron y (Gray P et al, 1982, Nature, 295, 503-508), TG Fo (Derynck R et al, 1984, Cell, 38, 287-297), TGF 31 (Derynck R et al, 1985, Nature, 316, 701-705), b FGF (Prats H et al, 1989, Proc Ntl Acad Sci USA, 86, 1836-1840), Erythropoiétine (Jacobs K et al, 1985, Nature, 313, 806-810), BCGF (Sharma S et al, 1987, Science, 235, 1489-1492), MIF (Weiser W et al, 1989, Proc Ntl Acad Sci USA, 86, 7522-7526), MCP-1 (Yoshimura T et al, FEBS Lett, 244, 487-493), Oncostatine-M (Malik N et al, 1989, Mol Cell Biol, 9, 2847-2853) et EDF (Murata M et al, 1988, Proc Ntl Acad Sci. USA, 85, 2434-2438). Ces oligonucléotides, fabriqués à l'aide du synthétiseur d'ADN Biosearch 8700, sont couplés avec de la peroxydase de raifort EC 1 11 17 (Boehringer Mannheim-Réf 814-407) selon le protocole suivant: on fait réagir sur la colonne de synthèse les oligo- nucléotides avec du carbonyl-diimidazole (Aldrich 11, 553-3) et du diamino-1,6-hexane (Aldrich H 1 169-6) selon la méthode de Wachter et al, 1986, Nucl Ac Res, 14, 7985-7994. après déprotection des bases et clivage du support par traitement ammoniacal, les oligonucléotides sont purifiés sur une résine d'échange d'ions (Quiagen Diagen-500051) avec changement du contre-ion ammonium en ion lithium. les 5 '-amino-oligonucléotides sont couples à la peroxydase de raifort (Boehringer Mannheim-814407) selon la méthode de M Urdea et a L, Nucl Ac Res, 1988, 16, 4937-4956. Les clones donnant un signal autoradiographique plus fort avec la sonde 2 qu'avec la sonde 1 et ne s'hybridant pas avec le mélange C ont été partiellement séquences comme décrit dans l'exemple 4 ci-après Un de ces clones, appelé par la suite clone A, a été retenu. EXEMPLE 4: Séquençage et analyse de la séquence de l'AD Nc du clone A 1) Séquençage de l'AD Nc du clone A: a) préparation de l'ADN simple brin Le clone A contient le vecteur p SE 1, lequel porte un AD Nc entre les sites Apa I et Bam HI, appelé par la suite AD Nc A. Le vecteur p SE 1, qui contient l'origine de réplication du phage fl, permet de produire de l'ADN simple brin par culture du clone A en présence du bactériophage M 13 K 07 (Pharmacia réf: 27- 1524) de la manière suivante: Le clone A est cultivé, dans un tube de 15 ml, sous agi- tation à 37 C dans 2 ml de milieu 2 x YT de composition: bacto- tryptone 16 g/l, extrait de levure 10 g/l, Na CL 5 g/l (décrit dans Maniatis et a I, op cité), complémenté avec 0,001 % de thiamine et pg/ml d'ampicilline, jusqu'à une densité optique à 660 nm d'environ 0,60. pl de cette culture sont infectés avec du bactériophage M 13 K 07 (Pharmacia réf: 27-1524) à une multiplicité d'infection de l'ordre de 10 dans un tube de 15 ml La culture est mise à agiter à 37 C. Au bout de 1 h, 2 ml de milieu sont ajoutés La culture est alors mise à incuber pendant environ 16 h à 37 C sous agitation. 1,5 ml de la culture est centrifugé, dans un microtube, à 000 g pendant 2 min. 1 ml de surnageant est transféré dans un microtube et additionné de 250 pl d'une solution de polyéthylène glycol de masse molécu- laire 6 000 20 % contenant 2,5 M de Na Cl Le mélange est incubé pendant 5 min à 4 C pour faciliter la précipitation du phage puis centrifugé 5 min à 15 000 g Le surnageant est éliminé et le culot phagique est resuspendu dans 500 pl de tampon de composition Tris l Om M p H 8, EDTA lm M. La suspension est extraite une fois au phénol saturé avec du Tris m M p H 8, puis deux fois au chloroforme. La préparation est ensuite précipitée par adjonction de 1/10 de volume d'une solution d'acétate de sodium 3 M p H 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol La précipitation est réalisée à -20 C pendant un minimum de 20 min L'ADN est centifugé 10 min à 15 000 g, le culot est lavé avec une solution d'éthanol à 70 % puis remis en suspension dans pl de tampon de composition: Tris 10 m M p H 8, EDTA lm M. b) séquençage Les réactions de séquençage sont réalisées à l'aide du kit de séquençage United States Biochemical (réf: 70770), qui utilise la méthode de Sanger et ai, Proc Ntl Acad Sci USA, 1977, 14, 5463-5467 Les amorces utilisées sont des oligo- nucléotides de 18 nucléotides, complémentaires soit au vecteur p SE 1 dans la région immédiatement en 5 ' de l'AD Nc A, soit à la séquence de l'AD Nc A. 2) Analyse de la séquence de l'AD Nc A: La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 2, 3 et 4. La figure 2 représente la séquence nucléotidique de l'AD Nc A et en visà-vis la séquence d'acides aminés déduite, les trois Met susceptibles d'initier la traduction étant soulignés et le site de clivage probable du peptide signal étant indiqué par une flèche verticale. La figure 3 et la figure 4 représentent respectivement l'alignement d'après l'homologie maximale selon la méthode de Needieman et Wunsch, 1970, J Mol Biol, 48, 443-453 de la séquence d'acides aminés déduite de l'AD Nc A (ligne supérieure) et de la séquence d'acides aminés déduite de l'AD Nc de la cytokine MCP-1 (ligne inférieure) et l'alignement selon cette méthode de l'AD Nc A (ligne supérieure) et de l'AD Nc de la cytokine MCP-1 (ligne inférieure). Analyse de la séquence de l'AD Nc A ( 1) L'AD Nc A comporte 802 nucLéotides et se termine par une séquence poly A. ( 2) Ce nombre de nucléotides est en accord avec la taille de l'ARN messager correspondant (environ 0,8 kb), mesurée par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % en présence de formaldéhyde (Maniatis, op cité), suivie d'un transfert sur membrane de Nylon (Hybond N± Amersham) et hybridation selon le protocole décrit ci-après. Cette membrane est hybridée avec une sonde radiomarquée avec du 32 P-d CTP fabriquée à partir de l'AD Nc A (Amersham) par coupure partielle de ce dernier à l'aide de la DN Ase I, suivie d'une polymérisation à l'aide de l'enzyme ADN polymérase I (technique dite de "nick-translation"), comme décrit par Maniatis et a I, op cité L'hybridation se fait à 42 C pendant 16 h en milieu aqueux contenant 50 % de formamide, 1 M de Na Cl, une solution de x Denhardt et 0,1 % de SDS Les membranes sont lavées plusieurs fois à température ambiante avec une solution 2 x SSC contenant 0,1 % de SDS, puis lavées deux fois à 50 C pendant 15 min avec une solution 0,1 x SSC contenant 0,1 % de SDS La solution de 5 x Denhardt a la composition suivante: Ficoll (type 400 Pharmacia) 1 g/l, polyvinylpyrrolidone 1 g/l et BSA 1 g/L La solution 1 x SSC contient 0,15 M de Na Cl et 0,015 M de citrate de sodium. ( 3) A la position 787-792, la séquence CATAAA, qui ressemble à la séquence consensus AATAAA décrite par M Birnstiel et al, 1985, Cell, 41, 349, est probablement un signal de poly- adénylation A la position 534-554, une région riche en A et T: TTATTAATATTTTAATTTAAT contient le motif consensus d'instabilité ATTTA décrit par G Shaw et ai, 1986, Cell, 46, 659-667 La plupart des cytokines connues possèdent une telle région riche en A et T, qui contient ce motif consensus d'instabilité. ( 4) La séquence d'ADN comporte une phase de lecture ouverte pour la traduction d'une protéine à partir de l'ATG en position 41-43 jusqu'au TGA à la position 368-370 qui correspond à un codon d'arrêt de la traduction Dans cette phase de lecture, il y a trois codons ATG aux positions 41-43, 53-55 et 71-73, susceptibles d'initier la traduction Parmi ceux-ci, l'environnement nucléoti- dique de l'ATG aux positions 71-73 est celui qui se rapproche le plus de la séquence consensus décrite par Kozak M, 1978, CELL, 15, 1109- 1123, pour l'initiation de la traduction dans les cellules eucaryotes. ( 5) Un logiciel de recherche de peptide signal, appelé par la suite logiciel PS, a été développé par la demanderesse d'après la méthode et les informations décrites par Von Heijne, 1986, Nucl Ac Res. 14, 483- 490 Ce logiciel prévoit dans cette phase de lecture une région hydrophobe ressemblant à un peptide signal et un site probable de clivage protéique à la position 139-140 (entre Ala et Gln) Le peptide signal prévu est compris entre l'une des trois Met susceptibles d'initier la traduction et ce site de clivage La protéine mature (protéine traduite clivée de son peptide signal) comprend donc 76 acides aminés (cf figure 2) ( 6) La séquence d'acides aminés de la protéine déduite de l'AD Nc A et celle de l'AD Nc A ont été comparées respectivement à la séquence de la protéine déduite de l'AD Nc de la cytokine MCP-1, et à la séquence de l'AD Nc de la cytokine MCP-1, à l'aide d'un logiciel approprié, à savoir le logiciel UWGCG de L'université de Wisconsin: Devereux et al, 1984, Nucl Ac Res, 12, 8711-8721 - Option GAP: alignement optimal des séquences d'après la méthode de Need Leman et Wunsch, 1970, J Mol Biol, 48, 443-453 Cette compa- raison a montré environ 74 % d'identité entre la séquence d'acides aminés de la protéine déduite de l'AD Nc A et celle de la cytokine MCP-1 ( 73 acides aminés identiques sur les 99 acides aminés) et environ 79 % d'identité entre la partie de l'AD Nc A codant pour la protéine déduite et l'AD Nc de la cytokine MCP-1 ( 235 nucléotides identiques sur Les 297 nucléotides). Le site de clivage prédit par le logiciel PS, à la position 139-140 (entre Ala et Gln), correspond à celui constaté expérimentalement pour la cytokine MCP-1 par E Robinson et ai, 1989, Proc Ntl Acad Sci USA, 86, 1850-1854 L'ATG en position 71-73 de l'AD Nc A correspond à l'ATG inititateur de la traduction de la cytokine MCP-1. L'homologie entre la séquence d'acides aminés de la protéine traduite de l'AD Nc A et celle de la cytokine MCP-1 indique que la protéine traduite de l'AD Nc A est une protéine sécrétée, de type cytokine. EXEMPLE 5: Analyse de la sécrétion dans les cellules COS de la protéine codée par l'AD Nc A Les cellules COS sont des cellules de reins de singe exprimant l'antigène T du virus SV 40 (Gluzman, Y Cell 23, 1981, -182) Ces cellules, qui permettent la réplication des vecteurs contenant l'origine de réplication de l'ADN du virus SV 40 (cas du vecteur p SE 1), constituent des hôtes de choix pour l'étude de l'expression transitoire de gènes dans les cellules animales. 1) Transfection des cellules COS et expression transi- toire de la protéine codée par l'AD Nc A: 5 x 105 cellules COS sont ensemencées dans une boîte de Pétri de 6 cm de diamètre (Corning) dans 5 ml de milieu modifié d'Eagle selon Dulbecco ci- après appelé DMEM (le Dulbecco's Modified Eagle medium de Gibco réf 041- 01965), lequel contient 0,6 g/l glutamine, 3,7 g/l Na HCO 3 et est complémenté avec du sérum de veau foetal (Gibco) à raison de 5 % Après environ 16 h de culture à 37 C dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone, le milieu de culture est enlevé par aspiration et les cellules sont lavées avec 3 ml de tampon PBS (le Phosphate Buffered Saline de GIBCO) On y ajoute alors le mélange suivant: 1 000 pl de (DMEM + % sérum de veau foetal (Gibco)), 110 pl de diéthylaminoéthyl- dextrane de poids mo Léculaire moyen 500 000 (Pharmacia), à une concentration de 2 mg/ml, 1,1 p L de chloroquine 100 m M (Sigma) et 6 pg d'ADN plasmidique du clone A, préparé selon la technique de lyse alcaline suivie de la purification de l'ADN plasmidique sur un gradient de chlorure de césium (Maniatis et al, op cité) Après 5 h d'incubation à 37 C dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone, le mélange est retiré des cellules On y ajoute alors 2 ml de tampon PBS contenant 10 % de diméthylsulfoxyde (qualité Spec- troscopie, Merck) Après 1 min d'incubation à la température ambiante, le mélange est retiré et les cellules sont lavées deux fois avec du PBS et sont incubées dans du milieu DMEM contenant 2 % de sérum de veau foetal L'incubation est poursuivie pendant h à 37 C sous atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone. D'autre part, on a préparé des cellules COS témoins en effectuant les opérations décrites ci-dessus avec l'ADN du plasmide p SE 1. 2) Marquage des protéines: L'ensemble des opérations décrites ci- dessous est effectué avec les cellules COS transfectées par l'ADN plasmidique du clone A et les cellules COS témoins. Le milieu de culture est enlevé par aspiration et les cellutes sont lavées deux fois avec 3 ml de tampon PBS On ajoute ml de milieu MEN (Minimal Eagle's Medium) sans méthionine (Gibco réf 041-01900 H), complété avec 3 g/ml de glucose et 4 m M de glutamine On incube pendant 2 h à 37 C On enlève le milieu de culture et on rajoute 2 ml de même milieu additionné de 200 p Ci de méthionine 35 S (réf SJ 1015 Amersham) On incube pendant 6 h à 37 C On prélève le milieu de culture, on le centrifuge pendant min pour éliminer les débris cellulaires et les cellules en suspension, et on garde le surnageant Les cellules adhérentes sont rincées deux fois avec du PBS, grattées avec un grattoir en caout- chouc et centrifugées. 3) Analyse des protéines radiomarquées des cellules COS transfectées par électrophorèse sur gel de polyacry- lamide: On précipite I ml du surnageant des cellules COS trans- fectées et 9 ml d'acétone à -20 C On centrifuge et on récupère les culots de protéines On les reprend dans un tampon de composition: Tris 0,125 M p H 6,8, SDS 4 %, glycérol 20 % Une partie aliquote de la suspension obtenue correspondant à une radioactivité de 000 cpm est analysée par électrophorèse sur un gel de poly- acrylamide 15 % en présence de SDS selon la technique décrite par U.K Laemmli, Anal Biochem, 1977, 78, 459 Le gel est séché sous vide Les protéines radiomarquées sont révélées par autoradio- graphie. On constate sur l'autoradiogramme la présence de quatre bandes surnuméraires pour les cellules transfectées par l'ADN plasmidique du clone A par rapport aux cellules témoins: deux bandes de forte intensité correspondant à des masses moléculaires apparentes de 11 + 1 et 17 + 2 k Da et deux bandes de faible inten- sité correspondant à des masses moléculaires apparentes de 13 + 1 et 18 + 2 k Da La masse moléculaire calculée pour la protéine mature de 76 acides aminés est de 8 956 k Da, donc inférieure aux masses moléculaires apparentes correspondant aux bandes observées. Cette migration, apparemment aberrante de la protéine de l'invention, peut être provoquée par son caractère basique très prononcé (présence de nombreux résidus lysine et arginine dans sa séquence; p K théorique de 10,46) On sait en effet que les protéines ayant un caractère basique important, telles que la cytokine MCP-1 (Yoshimura et al, 1989, ainsi que Furutani et a I, 1989, références citées ci-dessus et Rollins, 1989, Mol Cell. Biol, 9, 4687-4695) ont, dans ces conditions (électrophorèse en gel de polyacrylamide 15 % en présence de SDS), une migration différente de celle attendue (T TUNG et al, 1981, Biochem. Biophys Res Comm 42, 1117-1121) Pour la cytokine MCP-1 de masse moléculaire calculée à partir de La séquence d'acides aminés déter- minée expérimentalement d'environ 8,7 k Da, on observe, par analyse électrophorétique sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, deux bandes de forte intensité correspondant à des masses molécu- laires apparentes de 13 et 15 k Da. Les différentes bandes observées ou certaines d'entre elles peuvent aussi correspondre à des degrés de glycosylation divers de la protéine de l'invention Celle-ci présente en effet (cf fig 2) un résidu asparagine susceptible d'être N-glycosylé et plusieurs résidus sérine et thréonine susceptibles d'être o-glycosylés. 4) Mise en évidence de la N-glycosylation probable des formes de masse moléculaire apparente 17 + 2 et 18 + 2 k Da: Le marquage des protéines est effectué comme en 2) ci- dessus mais en présence de 10 pg/ml de tunicanycine (Sigma-réf T 7765), agent inhibiteur de la N-glycosylation des protéines. L'analyse des protéines sur gel de polyacrylamide est effectuée comme en 3). On constate sur l'autoradiogramme la présence de deux bandes surnuméraires pour les cellules transfectées par l'ADN plasmidique du clone A, par rapport aux cellules témoins: une bande de forte intensité correspondant à une masse moléculaire apparente de 11 + 1 k Da et une bande de faible intensité corres- pondant à une masse moléculaire apparente de 13 + 1 k Da Ces résultats montrent que les deux formes de la protéine recombinante observées en 3) correspondant à une masse moléculaire de 17 + 2 et 18 + 2 k Da sont N-glycosylées. EXEMPLE 6: Purification de la protéine recombinante sécrétée codée par l'AD Nc A 1) Production de la protéine recombinante: 4 x 107 cellules COS sont ensemencées dans un flacon de culture cylindrique, dénommé habituellement "roller", de surface 850 cm 2 dans 150 ml de milieu modifié d'Eagle selon Dulbecco ci- après appelé DMEM (le Dulbecco's Modified Eagle medium de Gibco), lequel contient 0,6 g/l glutamine, 3,7 g/l Na HCO 3 et est complé- menté avec du sérum de veau foetal (Gibco) à raison de 5 % puis tamponné avec du dioxyde de carbone Après environ 16 h de culture à 37 C avec une vitesse de rotation d'environ 0,2 tr/min, le milieu de culture est enlevé par aspiration et les cellules sont lavées avec du tampon PBS (le Phosphate Buffered Saline de Gibco) On y ajoute alors le mélange suivant: 36 ml de (DMEM + 10 % sérum de veau foetal (Gibco)), 4 ml de diéthylaminoéthyl-dextrane de poids moléculaire moyen 500 000, à une concentration de 2 mg/ml (Pharmacia), 40 pl de chloroquine 100 m M (Sigma) et 128 pg d'ADN de plasmidique du clone A, préparé selon la technique de lyse alcaline suivie de la purification de l'ADN plasmidique sur un gradient de chlorure de césium (Maniatis et al, op cité) Après 5 h d'incu- bation à 37 C dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone, le mélange est retiré des cellules On y ajoute alors ml de tampon PBS contenant 7 % de diméthylsulfoxyde (qualité Spectroscopie, Merck) Après 1 min et 30 S de rotation à la tempé- rature ambiante, le mélange est retiré et les cellules sont lavées deux fois avec du PBS et sont incubées 5 jours à 37 C en rotation dans du milieu DMEM (Sigma) sans rouge de phénol On prélève le surnageant, de volume environ 130 ml. 2) Isolement et purification des deux formes majoritaires de la protéine recombinante: Les deux formes majoritaires de la protéine recombinante, celles des bandes de forte intensité correspondant à des masses moléculaires apparentes de 11 + 1 et 17 + 2 k Da (cf exemple 5 3)), ont été isolées et purifiées à partir des 130 ml de surnageant obtenus ci-dessus, selon la méthode décrite par T Yoshimura et al, 1989, Journal of Immunology, 89, 1956-1962, avec les étapes succes- sives suivantes: chromatographie d'affinité sur une colonne d'Orange A-Sépharose (Amicon), préalablement équilibrée avec une solution Tris-H Cl 20 m M p H 8, avec comme éluant un gradient linéaire de Na Cl de O à 0,6 M dans une solution Tris-H Cl 20 m M p H 8 dialyse des fractions contenant la protéine recombi- nante (déterminées par analyse électrophorétique sur gel de poly- acrylamide en présence de SDS) contre une solution appelée solution 1, de tampon MOPS 20 m M p H 6,5 contenant 0,1 M de Na CL chromatographie HPLC d'échange anionique de ces fractions sur un support comprenant des groupes carboxyméthyle, la colonne CM-3 SW de Toyo Soda, préalablement équilibrée avec la solution 1, avec comme éluant un gradient linéaire de 0,1 à 0,4 M de Na Cl dans la solution 1, et une détection à 280 nm La protéine recombinante se trouve dans les fractions correspondant à deux pics qui donnent, par analyse électrophorétique en présence de SDS, pour l'un, une bande de masse moléculaire apparente de 11 + 1 k Da, pour l'autre, une bande de masse moléculaire apparente de 17 + 2 k Da. chromatographie HPLC en phase inverse des fractions réunies correspondant à chacun des deux pics, sur colonne Hi-pore RP de Biorad, préalablement équilibrée avec une solution contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique, avec comme éluant un gradient linéaire de O à 70 % d'acétonitrile dans une solution contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique et une détection à 280 nm Pour les fractions réunies de chacun des deux pics la protéine recombi- nante sort avec un gradient de 30 % d'acétonitrile. La pureté de chacune des deux formes majoritaires de la protéine recombinante de masses moléculaires apparentes de 11 + 1 et 17 + 2 k Da ainsi isolées et purifiées, estimée sur gel de poly- acrylamide en présence de SDS et révélation au nitrate d'argent, est supérieure à 85 %. 3) Analyse de la séquence amino-terminale de chacune des deux formes majoritaires de la protéine recombinante isolées et purifiées: Pour chacune des deux formes majoritaires de la protéine recombinante isolées et purifiées la séquence amino-terminale a été analysée à l'aide d'un séquenceur Applied Biosystem modèle 470 a, couplé à un analyseur de dérivés phény Lthiohydantoïques Applied Biosystem modèLe 120 A La protéine purifiée ( 200 pmoles contrôlées par analyse d'acides aminés) a été déposée sur le séquenceur en présence de 20 pmoles de p-lactoglobuline, protéine témoin. Aucune séquence amino-terminale correspondant à la séquence d'acides aminés codée par l'AD Nc A n'a été détectée (par contre la séquence amino-terminale de la protéine témoin a été détectée, donc le séquenceur fonctionne). Il y a donc probablement un blocage amino-terminal de chacune des deux formes majoritaires de la protéine recombinante. REVENDICATIONS 1 Protéine présentant une activité de type cytokine, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés (al) suivante: X-Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu dans laquelle X représente le résidu glutamine, le résidu glutamine précédé du résidu méthionine, un résidu glutamine dont le groupe amino-terminal est bloqué, un résidu acide glutamique amino-bloqué, ou le résidu acide pyroglutamique, ou une séquence qui diffère de la séquence (al) par un ou plusieurs acides aminés et confère à la protéine la même activité. 2 Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a une masse moléculaire apparente de 11 + 1 k Da. 3 Protéine selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle présente un degré de pureté supérieur à 85 %. 4 Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a une masse moléculaire apparente de 17 + 2 k Da. Protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est N-glycosylée. 6 Protéine selon l'une des revendications 4 et 5, carac- térisée en ce qu'elle présente un degré de pureté supérieur à 85 %. 7 Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a une masse moléculaire apparente de 13 + 1 k Da. 8 Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a une masse moléculaire apparente de 18 + 2 k Da. 9 Protéine selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est N-glycosy Lée. Peptide présentant une activité de type cytokine, caractérisé en ce qu'il comprend une partie de 13 à 20 acides aminés de la séquence (a 2) suivante: Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu 11 ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine selon la revendication 1 ou pour un précurseur de la protéine selon la revendication 1. 12 ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour un précurseur d'une protéine selon la revendication 1. 13 ADN recombinant selon la revendication 12, carac- térisé en ce que le précurseur de la protéine selon la revendi- cation 1 comprend la séquence (a 3) suivante: Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu précédée d'une séquence signal 14 ADN recombinant selon la revendication 13, carac- térisé en ce que la séquence signal a la séquence d'acides aminés (bl) suivante: Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ale ADN recombinant selon la revendication 13, caracté- risé en ce que la séquence signal a la séquence d'acides aminés (b 2) suivante: Met Pro Ser Pro Ser Asn Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala 16 ADN recombinant selon la revendication 13, caracté- risé en ce que la séquence signal a la séquence d'acides aminés (b 3) suivante: Met Trp Lys Pro Met Pro Ser Pro Ser Asn Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala 17 ADN recombinant selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (a 3) est la séquence (Na 3) suivante: CAGCCAGTTGGGATTAATACTTCAACTACCTGCTGCTAC AGATTTATCAATAAGAAAATCCCTAAGCAGAGGCTGGAGAGCTACAGAAGGACCACCAGT AGCCACTGTCCCCGGGAAGCTGTAATCTTCAAGACCAAACTGGACAAGGAGATCTGTGCT GACCCCACACAGAAGTGGGTCCAGGACTTTATGAAGCACCTGGACAAGAAAACCCAAACT CCAAAGCTT 18 ADN recombinant selon La revendication 14, caracté- risé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (bl) est la séquence (Nbl) suivante: ATGAAAGCCTCTGCAGCACTTCTGTGTCTGCTGCTCACAGCAGCTGCT TTCAGCCCCCAGGGGCTTGCT 19 ADN recombinant selon la revendication 15, caractérisé en ce que la séquence nuc Léotidique codant pour la séquence d'acides aminés (b 2) est la séquence (Nb 2) suivante: ATGCCC TCACCCTCCAACATGAAAGCCTCTGCAGCACTTCTGTGTCTGCTGCTCACAGCAGCTGCT TTCAGCCCCCAGGGGCTTGCT 20 ADN recombinant selon la revendication 16, caracté- risé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés (b 3) est la séquence (Nb 3) suivante: ATGTGGAAGCCCATGCCC TCACCCTCCAACATGAAAGCCTCTGCAGCACTTCTGTGTCTGCTGCTCACAGCAGCTGCT TTCAGCCCCCAGGGGCTTGCT 21 Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il contient, avec les moyens nécessaires à son expression, un ADN recombinant selon l'une des revendications 11 à 20. 22 Cellules animales, caractérisées en ce qu'elles contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, un ADN recombinant selon l'une des revendications 11 à 20. 23 Cellules animales selon la revendication 22, caracté- risées en ce qu'elles contiennent un vecteur d'expression selon la revendication 21. 24 Procédé de préparation d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture de cellules animales selon l'une des revendications 22 et 23, suivie de l'isolement et de la purification de la protéine recombinante. 25 Protéine recombinante susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant une étape de culture de cellules animales selon l'une des revendications 22 et 23, suivie de l'isolement et de la purification de la protéine recombinante. 26 Médicament, caractérisé en ce qu'il contient une protéine selon l'une des revendications 1 à 9 et 25. 27 Médicament, caractérisé en ce qu'il contient un peptide selon la revendication 10.