Brevet FR2665175A1 — publié le 19920131

ETAT DE LA TECHNIQUE: LES PEAUX RECONSTITUEES IN VITRO Afin de pouvoir reproduire in vitro toutes les caractéristiques et étapes de la différenciation épidermique terminale, les conditions de culture doivent se rapprocher le plus possible de ltenvironnement naturel de ltépiderme. Par conséquent, après confluence, les cultures doivent être exposées à l'air et le milieu nutritif doit traverser le substrat pour parvenir aux cellules prolifératives de la première couche. Plusieurs systèmes de culture comprennent l'utilisation de substrats dermiques ou pseudodermiques, tandis que d'autres se contentent de substrat constitués par des filtres chimiquement inertes, recouverts ou non d'une matrice extracellulaire pouvant favoriser l'attachement cellulaire. Dans ces systèmes, on obtient la formation d'un vrai stratum corneum, c'est à dire une différenciation épidermique apparemment complète avec présence de toutes les couches cellulaires successives caractéristiques, et l'expression des marqueurs biochimiques essentiels. a)Les cultures de kératinocytes normaux sur un derme désepidermise Le système de culture sur derme désépidermisé présente l'avantage de garder une membrane basale intacte comme surface d'attachement des kératinocytes tout en éliminant les interférences dues aux fibroblastes du derme, puisque ces derniers sont "tués" par congélations successives (Régnier et coll., 1981; Pruniéras et coll., 1983). Après exposition à l'air, l'expression de la kératine de 67 kD dans ce système démontre que la présence de fibroblastes vivants n'est pas nécessaire pour induire la différenciation terminale.Ceci n'exclut pas une influence des composants acellulaires du derme: l'action filtrante de ce substrat, c'est à dire la rétention de molécules à activité inhibitrice du type vitamine A du milieu de culture contenant du sérum, est évoquée (Régnier et coll., 1986). La différenciation terminale des kératinocytes humains normaux et transformés dans ce système a été décrite de façon plus détaillée (Régnier et coll., 1988; 1989), cependant ces résultats ne peuvent être imputés à une action stimulante de la différenciation du substrat dermique, puisque les cultures de contrôle non differenciées étaient des cultures immergées classiques: en effet, il est possible que l'exposition à l'air permette une différenciation épidermique complète; le vrai contrôle pour estimer l'influence du substrat aurait donc du être une culture sur substrat inerte, mais également exposée à l'air. b)Les cultures de kératinocytes normaux sur un équivalent de derme: "le système de Bell'1 L'équivalent de derme est préparé en incluant des fibroblastes vivants dans une matrice de collagène qui est modifiée et contractée par ces cellules résidentes (Bell et coll., 1979). Des kératinocytes de rat ou humains normaux sont cultivés à la surface de ces substrats qui sont alors exposés à l'air au moyen de grilles en acier inoxydable. Ces peaux reconstituées ont été greffées avec succès sur des rats (Bell et coll., 1983). Ces peaux reconstruites, en présence de sérum dans le milieu, expriment tous les principaux marqueurs de la différenciation épidermique, mais leur localisation précise dans les différentes couches cellulaires ne correspond pas tout à fait à celle observée dans l'épiderme in vivo (Asselineau et coll., 1985).De plus, certains antigènes des cellules basales ne sont pas polarisés comme in vivo (Asselineau et coll., 1986a). Récemment le système a été perfectionné en ajustant la concentration en acide rétinoïque à 10 ' M, grâce à l'utilisation d'un sérum délipidisé: l'expression des différents marqueurs ressemble alors fortement à la situation normale in vivo = orthokeratose (Asselineau et coll., 1989). Le même substrat de derme-équivalent a servi pour l'obtention, à partir de follicules de cheveux humains exposé à l'interface air-liquide, d'un épiderme in vitro présentant tous les aspects de la différenciation épidermique (Lenoir et coll., 1988). Ce travail est en accord avec l'observation courante que les racines des poils qui subsistent dans une plaie après un traumatisme sont capables de régénérer un épiderme interfolliculaire normalement différencié. D'autres chercheurs cultivent des kératinocytes sur ces memes lattices de Bell, mais en incorporant une biopsie de peau humaine (Coulomb et coll., 1986; 1989). c)Autres systèmes Ils consistent à inoculer des cellules épidermiques de souris ou de rat sur des films ou gels de collagène, des filtres de nylon ou de nitrocellulose couverts de collagène ou d'équivalent de membrane basale déposé par des cellules endothéliales de cornée de boeuf, puis d'exposer ces cultures à l'air pour 14 à 21, ou même 65 jours (Fusenig et coll., 1983; Bernstam et coll., 1986; Vaughan et coll., 1986; Lillie et colt., 1980; 1988). Un des points communs de tous ces systèmes de culture épidermique tridimensionnelle est ltexposition à l'air, qui semble essentielle pour la formation d'une couche cornée in vitro; mais surtout toutes ces expériences ont été réalisées en présence de sérum dans le milieu de culture, estimé nécessaire pour la croissance et la différenciation complète. Or, pour pouvoir significativement évaluer si et comment les composants du derme influencent la prolifération et la différenciation épidermiques, le système de culture nécessaire comprend un substrat:ïnerte chimiquement sans fibroblastes ni collagène; de même pour cerner l'influence de facteurs sériques (qui, in vivo, migreraient à travers la membrane basale), l'emploi d'un milieu de culture chimiquement défini devient un outil de recherche indispensable.Dans de telles conditions de culture minimales (ni facteurs dermiques, ni sériques), l'obtention d'un épiderme viable et de surcroit bien différencié était considérée comme improbable, les kératinocytes étant supposés ne pas se suffire à eux-mêmes, ni pour la synthèse d'une membrane basale (Bohnert et coll., 1986), ni pour leur différenciation terminale complète (Fusenig et coll., 1983; Lillie et coll., 1980;1988). La plupart des systèmes de peaux reconstitués ont été développés soit pour produire des greffons de peau totale, soit pour établir des modèles de la différenciation épidermique terminale complète. Naturellement le derme avait été préssenti comme substrat in vitro idéal (Pruniéras et coll., 1983). Les matrices dermiques ou pseudo-dermiques permettaient en plus d'exposer facilement les cultures épidermiques à l'air (Bell et coll., 1983; Régnier et coll., 1984). Le milieu de culture arrivait à travers le substrat perméable. De toutes ces expériences, les chercheurs ont cru pouvoir déduire la nécessité d'un substrat mésenchymateux et de sérum pour pouvoir obtenir une différenciation épidermique complète in vitro (Bernfield & Banerjee, 1982; Holbrook & Hennings, 1983; Bohnert et coll., 1986). L'INVENTION: Différenciation épidermique terminale complète en culture en absence de facteurs dermiques et sériques Différenciation épidermique terminale de kératinocytes humains cultivés en milieu chimiquement défini sur des substrats constitués par des filtres inertes à l'interface air-liquide Un épithélium totalement différencié ayant les caractéristiques de l'épiderme a été obtenu in vitro en cultivant des kératinocytes humains normaux (KHN) dans un milieu chimiquement défini sur des substrats de filtres inertes à l'interface air-liquide pendant 14 jours.Des coupes verticales doublement colorées et des études d'immunofluorescence indirecte ont montré la stratification et ltexpression correctes de marqueurs protéiques de la différenciation; l'analyse par microscopie électronique montre la présence de desmosomes, de granules de kératohyaline, de corps lamellaires extrudant leur contenu lipidique et la formation d'un stratum corneum de dix couches. De plus, tous les lipides typiques de l'épiderme humain stratifié étaient présents dans ces cultures, notamment les céramides, qui sont probablement responsables de la relative imperméabilité du stratum corneum. Dans nos conditions de milieu l'utilisation de dermes désépidermisés comme substrat ne permit pas d'obtenir une différenciation des kératinocytes meilleure que celle obtenue sur des filtres d'acetate de cellulose ou de polycarbonate. L'obtention d'un épiderme bien différencié in vitro, cultivé dans des conditions simples et définies, devrait permettre la mise au point d'un système standard pour. l'étude de la différenciation, de la réépidermisation, de la cytotoxicité kératinocytaire, de la perméation épidermique ainsi que du passage transépidermique de drogues. Les cultures décrites ici montrent clairement que les kératinocytes humains normaux sont capables de produire un épiderme complètement différencié en absence totale de facteurs mésenchymateux. De plus, l'absence de membrane basale sur le substrat n'a aucune influence sur la qualité de l'expression des différents marqueurs de la membrane basale. Le fait que de telles cultures soient réalisables ne permet pas de déduire que l'épiderme humain n'a besoin ni de facteurs plasmatiques, ni d'apport dermique pour vivre et s'organiser. Mais l'influence de tels facteurs, actifs à des concentration très basses (pM ou nM), ne pourra être clairement déterminée qu'à l'aide de l'utilisation d'un tel système chimiquement défini. (1) Pour élucider les mécanismes de régulation de la différenciation épidermique, (2) pour développer un modele expérimental de l'épiderme, utilisable pour des tests de cytotoxicité, de cytocompatibilité et (3) de perméabilité aux produits pharmaceutiques ou cosmétiques, il semble clair qu'un système défini et "minimum" de peau reconstruite capable d'évoluer vers la différenciation terminale est très utile sinon indispensable. De plus, ce système pourra aider comprendre la régulation de la différenciation et de l'homéostasie épidermiques humaines. De plus, l'élimination du sérum permet de concevoir et d'interprèter des expériences difficiles ou impossibles à mettre en oeuvre en sa présence. Dans un milieu défini il est possible d'étudier l'effet d'hormones ou d'agents pharmacologiques ou cosmétiques en absence de composants non identifiés qui peuvent lier, inactiver, antagoniser ou mimer l'action de l'agent étudié. De même des expériences concernant le relargage de produits cellulaires, tels les facteurs sécrétés par des lignées de cellules différenciées, sont beaucoup plus faciles à réaliser et à interprèter en absence de protéines sériques. METHODE 1: Les méthodes de culture des cellules épidermiques en milieu défini sur filtres inertes Des suspensions cellulaires contenant majoritairement des kératinocytes humains normaux sont obtenues par la méthode de séparation derme/épiderme dans 0.25 % de trypsine (Green et coll.,1979) à partir d'échantillons de peau humaine. Les cultures primaires préliminaires facultatives peuvent être effectuées selon la méthode de Green (Rheinwald & Green, 1975,1977), oubien directement dans un milieu défini, tel que le MCDB 153 (Boyce,1983; Tsao,1982) par exemple. Avant d'atteindre la confluence, les cellules de ces cultures sont récoltées grâce à une trypsination douce et comptées. Plusieurs cycles de subculture peuvent ainsi être réalisés afin d'augmenter le nombre total de cellules disponibles pour la culture finale qui est exposée à l'air. A partir d'une suspension cellulaire obtenue directement d'un échantillon de peau, ou provenant de subcultures, l'ensemencement des substrats choisis se fait à une densité cellulaire variant de 104 à 106 cellules par cm2. Les substrats utilisés peuvent être des filtres classiques en acetate de cellulose (Millipore PIHA), en polycarbonate (Nucleopore Nucell ou Costar Transwell), en nylon, en silicone ou des polymères naturels tels le collagène, l'élastine, l'agarose etc.. Ces substrats peuvent être recouverts, avant l'ensemencement par les cellules par des solutions comprenant des molécules ou facteurs favorisant ou non l'attachement et /ou la croissance cellulaire.Le substrat utilisé doit surtout être perméable aux molécules nutritives du milieu défini, pour qu'elles puissent le traverser pour atteindre les cellules de la première couche cellulaire lors de l'exposition à l'air des cultures. L'inoculum se fait dans du milieu défini (DMEM, Ham F-12, MCDB 153, autres milieux de synthese) susceptible de favoriser la croissance cellulaire par rapport à la différenciation. Lorsque les cultures atteignent la confluence (après 1 à 5 jours, selon la densité de l'inoculum et la prolifération des cellules), leur substrat respectif est hissé, à l'aide de pinces fines et stériles, sur un support stérile permettant l'accès du milieu de culture à toute la face inférieure du substrat, de façon à ce que les cultures soient nourries, par en dessous et à travers le substrat, par le milieu de culture défini qui est choisi pour favoriser la différenciation épidermique et pour limiter la proliferation des cellules à celle observée pendant la régénérescence d'un épiderme humain in vivo. Ainsi le milieu défini MCDB 153 est alors à haute concentration de calcium (environ 1.2 mM), le milieu F-12 de Ham ne contient alors plus aucun facteur de croissance, tandis que les additifs nécessaires pour permettre la formation correcte d'une couche cornée compacte sont ajoutés au milieu choisi (lipides, stéroïdes, vitamines). Le couverclé de chaque boite de culture doit être pose de façon à éviter que les gouttes provenant de la condensation du milieu de culture ne retombent sur les couches cornées en formation, ce qui induirait une hydratation excessive des lipides extracellulaires, dont certains sont responsable de la relative imperméabilité de l'épiderme (Madison, 1988). Après incubation dans une atmosphère non saturée d'humidité, entre 40 et 95 % d'humidité relative, de préférence autour de 60 %, pendant au moins une semaine, avec des changements du milieu défini tous les trois jours, les coupes transversales de cultures fixées dans la paraffine ou simplement congelées révèlent une architecture ressemblant fortement à celle d'un épiderme humain in vivo, avec expression de tous les marqueurs de différenciation épidermique classiques, formation d'une couche cornée compacte (au moins dix couches cellulaires), synthese des lipides typiques du stratum corneum, mais avec la particularité d'avoir une assise basale suivant les contours du substrat, c'est à dire rectiligne. voir figures 1, 2 et 3. METHODE 2: Analyse de la morphologie et des compositions lipidique et protéique des épithéliums formés en culture: Tests de cytocompatibilité Les cultures décrites plus haut sont utilisées pour tester les effets d'une exposition d'un produit médical, pharmaceutique ou cosmétique à leur surface sur l'étant des couches cornées, de l'architecture globale des cultures et de la morphologie des cellules. Pour cela des techniques classiques de histologie et de microscopie électronique sont mises en oeuvre (Rosdy, 1990a; Asselineau, 1989; Madison,1988; Régnier, 1988). De même pour la préparation d'extraits protéiques ou lipidiques, des techniques classiques sont employées (Rosdy, 1986,1988; Asselineau, 1989; Ponec,1989; Lampe, 1983).Les protéines sont ensuite visualisées par immunoélectrophorese ou simplement par coloration de gels d'électrophorèse, tandis que les lipides typiques des épidermes bien différenciés sont détectés par chromatographie semi-quantitative bidimensionelle sur couche mince (Brod, 1987; Ponec, 1989). Les résultats sont bien entendu comparés avec ceux obtenus avec des cultures témoins (positifs et négatifs) parallèles et au moins deux cultures indépendantes sont effectuées par échantillon à tester. METHODE 3: Analyse des molécules relarguées dans le milieu défini par les cellules des équivalents d'épiderme: tests de cytocompatibilité Le fait d'utiliser un milieu chimiquement défini pour obtenir les équivalents d'épiderme décrits plus haut permet de mesurer un paramètre supplémentaire de grande importance: le relargage de molécules (en quantités faibles) synthétisées par les cellules de l'équivalent d'épiderme; en effet, la présence de sérum dans les systèmes de culture de peaux reconstruites empêchait de mesurer ce type de paramètre. Les cellules épidermiques et plus précisément les kératinocytes synthétisent in vivo et in vitro une large gamme de molécules et facteurs ayant des fonctions de régulation biologique importantes (Akhurst, 1988; Bikle,1986; Coffey, 1987; Miyazaki,1989; Nickoloff,1989). Les techniques analytiques utilisées sont très variées, car elles dépendent étroitement du type de molécules que l'on veut détecter, ou que l'on pense pouvoir détecter: la présence (dans le milieu défini) de facteurs peut être mise en évidence par les techniques maintenant classiques de HPLC, de chromatographie sur couche mince, d'électrophorèse rapide, d'immunoélectrophorese (Westernblot), d'immunofluorescence indirecte, par des tests indirects d'une fonction biologique connue de la molécule (test de croissance sur culture de fibroblastes par exemple). Ces tests de relargage de molécules par un équivalent d'épiderme sont relativement complexes à effectuer, mais les renseignements obtenus sur les mécanismes de toxicité cellulaire sont très précieux et intéressant.Leur obtention n' est possible uniquement grâce à l'utilisation d'un milieu chimiquement défini pendant toute la durée des cultures. LEGENDE DES FIGURES: Figure 1: Culture de cellules épidermiques exposées à l'air et en milieu défini sur filtre en acetate de cellulose (Millipore PIHA)(A) et sur filtre en polycarbonate (B) apres 14 jours d' incubation à 37"C à 60 * d'humidité. Figure 2: idem, mais plus en détail. Noter la différenciation épidermique complète et normale. Figure 3: Culture de cellules épidermiques exposées à l'air et en milieu défini sur filtre en acetate de cellulose (Millipore PIHA) après 14 jours d' incubation à 37"C à 60 % d'humidité. Marquage de coupes verticales de cultures congelées à l'aide d'anticorps monoclonaux reconnaissant les marqueurs essentiels de la différenciation épidermique: kératines K1 et K10 (A), filaggrine (B), transglutaminase membranaire (C), et involucrine, précurseur principal de l'enveloppe cornée (D). BIBLIOGRAPHIE Akhurst RJ, Fee F, Balmain A. Localized production of TGF-beta mRNA in tumour promoter-stimulated mouse epidermis. 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In,Vitro Cell. & Develop.Biology 22:141-149; 1986 REVENDICATIONS: 1- Procédé d'obtention d'un équivalent d'épiderme humain, dans lequel: a)on prépare une suspension de cellules provenant, directement ou après au moins une subculture, d'un échantillon d'épiderme humain, b)on ensemence ces cellules épidermiques humaines sur un substrat perméable et chimiquement inerte, recouvert ou non d'un dépot de molécules favorisant l'attachement cellulaire, après la confluence, on soulève le substrat à l'interface air/milieu de culture, de façon à ce que le milieu parvienne aux cellules de la couche inférieure uniquement à travers le substrat, d)on utilise du milieu de culture chimiquement défini (sans aucune composante inconnue), et e)on incube les cultures ainsi exposées à l'air-pendant au moins 5 jours. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise un milieu défini dont la concentration en calcium est supérieure à 1.15 mM. 3- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise un milieu défini ne contenant aucun facteur de croissance peptidique. 4- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise comme substrat des filtres en acetate de cellulose, en polycarbonate, en silicone, en nylon, en collagène ou en agarose. 5- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on place les cultures de cellules épidermiques dans un incubateur qui a une atmosphère contrôlée de 40 à 95 % d'humidité. 6- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on place les cultures de cellules épidermiques dans un incubateur qui a une atmosphère contrôlée de 60 % (+/- 5 %) d'humidité. 7- Equivalent d'épiderme, caractérisé par le fait qu'il est obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6. 8- Utilisation de l'équivalent d'épiderme selon la revendication 7 pour des tests de cytotoxicité sur culture cellulaire. 9- Utilisation de l'équivalent d'épiderme selon la revendication 7 pour tester la toxicité ou la qualité de produits pharmaceutiques ou cosmétiques, ou d'un ou plusieurs de leurs ingrédients. 10- Utilisation de l'équivalent d'épiderme selon la revendication 7 pour mesurer la vitesse et/ou la qualité de la pénétration à travers l'épiderme de produits pharmaceutiques ou cosmétiques, ou d'un ou plusieurs de leurs ingrédients.