Brevet FR2669929A1 — publié le 19920605

- La présente invention concerne une composition d'anti- gènes pouvant déceler la présence d'anticorps spécifiques contre Helicobacter pylori En particulier, elle concerne un mélange d'antigènes isolés par chromatographie, par exclusion due à la taille, d'antigènes de H pylori solubilisés à l'aide de détergents L'invention concerne également un procédé et un nécessaire pour la détection de la présence des anticorps spécifiques de H pylori. Helicobacter pylori (connu précédemment sous le nom de Campylobacter pylori), une bactérie qui colonise l'estomac humain, a été découvert en 1983, comme décrit par B.J Marshall et coll dans Lancet ( 1984), I:1311-1314 L'as- sociation de H pylori avec des troubles gastriques, tels que la gastrite active chronique, les ulcères gastrique et duodé- nal et la dyspepsie non ulcéreuse, a suscité beaucoup d'in- térêt dans le milieu médical spécialisé en gastro- entérologie. Le rôle précis de H pylori dans les ulcères gastro- duodénaux n'a pas encore été élucidé Néanmoins, sa relation avec les troubles gastriques a été la cause d'efforts notables consacrés à la mise au point de procédés pour la détection de l'organisme dans l'estomac humain La détection peut être réalisée de deux façons: ( 1) directement, par examen d'une biopsie de l'estomac par une méthode histolo- gique ou par une méthode d'isolement de cultures cellulaires, 2 - ou les deux; ou ( 2) indirectement, par examen d'un échantil- lon de sérum de sang périphérique pour la détermination d'anticorps circulants dirigés contre H pylori Le faible coût et la simplicité (à la fois pour le patient et pour le praticien) de la seconde méthode sérologique la rend particu- lièrement attrayante. L'exactitude d'un examen sérologique pour la détection d'anticorps dirigés contre H pylori dépend de la nature de la composition antigénique qui se lie aux anticorps Les com- positions utilisées dans les essais actuels vont d'organismes entiers intacts à une substance hautement purifiée consistant en une molécule antigénique essentielle. H Von Wulffen lCampylobacter pylori, p 157-163, Menge et coll éditeurs, Springer-Verlag ( 1988)l a utilisé des lysats de cellules bruts de H pylori pour déceler la pré- sence d'infections chez des patients atteints de gastrite. EP-A-0 329 570 (M J Blaser) révèle que de tels lysats de cellules bruts peuvent être utilisés pour déceler des anti- corps contre H pylori Des extraits de H pylori par la gly- cine acide ont été utilisés en tant que préparations anti- géniques dans des essais immuno-enzymatiques (ELISA), comme décrit par C S Goodwin et coll, J Infectious Diseases ( 1987), 155:488-494 Des compositions d'antigènes de surface et des compositions d'uréase ainsi que des extraits par la glycine acide ont été utilisées pour l'examen de sérums de patients atteints de gastrite, dans F J Bolton et coll, J Clin Pathol ( 1989), 42:723-726. Ces compositions brutes ont de nombreux inconvénients. L'utilisation d'organismes entiers ou de lysats bruts est fréquemment la cause de problèmes de spécificité d'un examen sérologique La présence d'une certaine quantité de substance indésirable dans la composition peut provoquer la fixation "non spécifique" d'autres anticorps, de sorte que des sujets dépourvus d'anticorps spécifiquement dirigés contre H pylori donneront un résultat "faussement positif" de l'essai Des 3 - faux positifs peuvent également apparaître lorsque la compo- sition contient des antigènes également possédés par d'autres organismes apparentés à H pylori Les individus infectés par ces organismes peuvent produire des anticorps à réaction croisée avec la composition de H pylori Ainsi, une composi- tion préférée est enrichie en antigènes spécifiques d'espèce, hautement réactifs, et ne contient pas d'importantes quanti- tés à réaction croisée d'antigènes également possédés par des organismes apparentés. Un autre inconvénient des préparations brutes est que fréquemment elles ne décèlent pas la présence d'anticorps spécifiques de H pylori Ces résultats "faussement négatifs" d'examens peuvent être obtenus lorsque: ( 1) une substance antigénique spécifique de H pylori n'est pas aisément dispo- nible pour la liaison à l'anticorps, en raison d'interactions avec d'autres composants dans la composition; ( 2) le procédé de préparation altère la substance antigénique spécifique de H pylori, de sorte que celle-ci est moins réactive avec des anticorps; ou ( 3) une substance antigénique spécifique de H pylori est trop fortement diluée par la présence de sub- stance indésirable. A l'autre extrémité de l'éventail de compositions d'antigènes, la demande PCT publiée sous le n' WO 89/09407 décrit le diagnostic d'infections provoquées par H pylori, au moyen d'une composition à base d'uréase de H pylori puri- fiée H pylori contient une uréase spécifique d'espèce qui peut être utilisée en sérodiagnostic D'autres compositions utilisant une substance produite à partir d'un gène unique cloné de H pylori peuvent également être utilisées; voir par exemple D Chevrier et coll, J Clin Micro ( 1989), 27:321- 326. L'utilisation de compositions d'antigènes uniques puri- fiésou de produits géniques clonés élimine certaines des causes des résultats erronés indiqués ci-dessus Cependant, l'utilisation d'une composition de gène cloné peut introduire 4 - des molécules de sousproduits de systèmes d'expression qui peuvent encore donner des résultats faussement positifs de l'essai De plus, des compositions de gènes hautement puri- fiés ou clonés peuvent produire l'antigène concerné en une structure altérée, non native, qui est moins réactive avec les anticorps, ce qui donne des résultats faussement négatifs de l'essai. En outre, l'analyse western blot a montré que des indi- vidus infectés produisent caractéristiquement des anticorps dirigés contre H pylori, qui reconnaissent plusieurs anti- gènes Une composition contenant une molécule antigénique unique purifiée ou un seul produit génique purifié limite inutilement la portée de la reconnaissance d'anticorps et peut donner des résultats faussement négatifs pour des indi- vidus infectés ne comportant pas ou comportant peu d'anti- corps dirigés contre l'antigène particulier utilisé. US-A-4 882 271 (Evans et coll) décrit un procédé pour l'obtention d'une composition antigénique qui se situe entre les extrêmes ci-dessus: elle ne contient qu'un petit nombre de composants antigéniques majeurs ayant des masses molécu- laires comprises entre 300 000 et 700 000 daltons On obtient la composition d'Evans en recueillant les fractions d'une séparation chromatographique par exclusion due à la taille, dans une plage définie de masses moléculaires élevées, ayant une nette activité de l'enzyme uréase Evans suggère que bien qu'une purification plus poussée ne soit pas nécessaire, le degré de purification des compositions décrites est néces- saire pour obtenir dans les essais une sensibilité et une spécificité adéquates. Les individus infectés par H pylori répondent en fait à plusieurs antigènes différents Nos propres recherches ont montré que des essais plus sensibles et plus spécifiques pour la détection d'anticorps dirigés contre H pylori peuvent être élaborés à l'aide des techniques d'extraction et de purification telles que décrites ici, pour l'obtention d'une - composition supérieure d'antigènes de H pylori, ayant un plus large spectre d'antigènes réactifs et spécifiques de H pylori, qui étaient inconnus jusqu'à présent. La figure 1 représente la courbe caractéristique de fractionnement d'un extraitparle-n-octyl-v-glucopyrannoside (BOG) d'antigènes de H pylori sur une colonne de Sepharose 6 FF, et l'acitivité d'uréase de fractions réunies. En conséquence, un objet de la présente invention est de fournir une composition antigénique comprenant un mélange d'antigènes provenant de cellules de H pylori solubilisées par un détergent, et qui est capable de déterminer la pré- sence ou l'absence d'une infection par H pylori dans un échantillon biologique avec un plus grand degré d'exactitude et de fiabilité qu'il n'était possible jusqu'à présent. Un autre objet de la présente invention est de fournir une composition antigénique pour la détermination de la pré- sence d'infection par H pylori, cette composition portant au maximum le taux de réponse positive lorsque l'infection est présente, en réduisant au minimum la quantité de résultats faussements négatifs, ce qui améliore la sensibilité de l'es- sai De même, la composition porte au maximum le taux de réponses négatives lorsque l'infection est absente, en rédui- sant au minimum la quantité de résultats faussement positifs, ce qui améliore la spécificité de l'essai. Encore un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé pour la détermination de la présence d'une infection par H pylori dans un échantillon biologique, avec un rapport "signal/bruit" maximum, au moyen d'une composition d'antigènes enrichie ayant un large spectre d'antigènes hau- tement réactifs, spécifiques de H pylori. Encore un autre objet de la présente invention est de fournir un nécessaire à utiliser pour déterminer la présence d'une infection par H pylori dans un échantillon biologique, avec un rapport "signal/bruit" maximum. 6 - La description ci-après fera apparaître d'autres objets, avantages et nouvelles caractéristiques de l'inven- tion, qui apparaîtront également au spécialiste par la mise en pratique de l'invention. Sous un aspect de la présente invention, on fournit une composition comprenant des antigènes purifiés provenant de protéines de Helicobacter pylori associées au cellules, les antigènes ayant des masses moléculaires allant d'environ 16 000 à 120 000 daltons, telles que déterminées par analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide- dodécylsulfate de sodium avec réduction (SDS-PAGE), et ayant une activité dimi- nuée d'uréase. Sous un autre aspect de la présente invention, on four- nit une composition comprenant des antigènes purifiés prove- nant de protéines de Helicobacter pylori associées aux cel- lules, la composition étant obtenue par culture de cellules de Helicobacter pylori dans un bouillon additionné de 10 % de sérum foetal bovin, et récolte des cellules lorsque la crois- sance en phase logarithmique a commencé à décliner; solubili- sation des cellules dans une solution salée tamponnée au phosphate (STP) contenant environ I % de n-octyl-e-D-gluco- pyrannoside, pendant au moins environ 30 minutes, pour l'ob- tention d'une solution de protéines cellulaires; dialyse pen- dant une nuit de la solution de protéines cellulaires contre de la STP, puis centrifugation de la solution à une vitesse moyenne, pour l'obtention d'un surnageant; introduction du surnageant dans une colonne 6 FF (Pharmacia) de chromatogra- phie par exclusion due à la taille; élution de la colonne à l'aide d'un tampon Tris 50 m M contenant 0,025 % d'azoture de sodium, et collecte des fractions éluées; exclusion du pic de protéines à masses moléculaires élevées, contenant la majo- rité de l'activité uréase; et réunion des fractions restantes de protéines à faibles masses moléculaires, privées d'uréase. Sous un autre aspect de la présente invention, on four- nit un procédé pour la détection d'infection par Helicobacter pylori dans un échantillon biologique, le pro- 7 - cédé comprenant: la mise en contact avec l'échantillon d'une composition comprenant des antigènes purifiés provenant de protéines de Helicobacter pylori associées aux cellules, obtenues par les procédés mentionnés plus haut, pour la for- mation d'un complexe d'incubation; et l'essai du complexe d'incubation pour déterminer la présence de complexes anticorps-antigènes indiquant la présence d'infection par Helicobacter pylori. Sous encore un autre aspect de la présente invention, on fournit un nécessaire à utiliser dans la détection d'in- fection par Helicobacter pylori dans un échantillon biolo- gique, le nécessaire comprenant des antigènes purifiés prove- nant de protéines de Helicobacter pylori associées aux cel- lules, obtenues par les procédés mentionnés plus haut. Les "antigènes" de la présente invention sont des "pro- téines associées aux cellules" extraites de cellules de Helicobacter pylori Les "protéines associées aux cellules" comprennent des protéines associées aux membranes externes et des protéines de surface Il est possible d'extraire hors de cellules de H pylori des protéines associées aux cellules, sans détruire les cellules, au moyen de détergents non ioniques tels que le n-octyl-3-D-glucopyrannoside (BOG) et d'autres détergents remplissant la même fonction Ces pro- téines associées aux cellules sont capables de déclencher une réponse immunitaire sous la forme d'anticorps qui recon- naissent des déterminants antigéniques sur ces protéines. Par l'expression "échantillon biologique", telle qu'on l'utilise ici, on entend un échantillon de sang, sérum san- guin, plasma, extrait de lymphe ou autre extrait provenant d'un patient humain, à tester pour déceler la présence d'une infection par H pylori. Telle qu'on l'utilise ici, l'expression "fractions pro- téiques à masses moléculaires élevées contenant de l'activité d'uréase", désigne des fractions chromatographiques ayant une absorbance importante à 280 nm et contenant des protéines à 8 - masses moléculaires généralement supérieures à 300 000 dal- tons (telles que déterminées par chromatographie par perméa- tion de gel) et manifestant une importante activité d'uréase. Telle qu'on l'utilise ici, l'expression "fractions protéiques à faibles masses moléculaires, privées d'uréase" désigne des fractions à faibles masses moléculaires ayant une absorbance marquée à 280 nm et une activité d'uréase diminuée. Telle qu'on l'utilise ici, l'expression "activité d'uréase diminuée" désigne une activité spécifique inférieure à 0,34 unité de DO 550/A 280, telle que mesurée dans l'essai d'hydrolyse d'urée catalysée par l'uréase, décrit dans l'exemple 2. Les compositions d'antigènes de la présente invention sont des protéines associées aux cellules provenant de cel- lules de H pylori Les cellules sont solubilisées à l'aide d'un détergent non ionique, et le surnageant résultant est soumis à une chromatographie sur colonne par exclusion due à la taille, suivie de la réunion des fractions sélectionnées éluées de la colonne Les fractions réunies de la présente invention ne comprennent pas les fractions comportant la majeure partie de l'activité manifeste de l'enzyme uréase. Par contre, un certain nombre de fractions contenant des antigènes à faibles masses moléculaires, privéES d'activité uréase, sont réunies pour donner la composition finale. Les antigènes de la présente invention peuvent être préparés de plusieurs façons Dans un mode de réalisation préféré, on prépare les antigènes par culture d'organismes appartenant à l'espèce H pylori, dans un milieu de crois- sance tel que le bouillon pour culture de Brucella Le bouil- lon contient des compléments nutritifs Un complément préféré est le sérum fatal bovin On met les cellules à incuber dans des flacons secoués sur un agitateur rotatif, dans une atmos- phère composée de CO 2, 02 et N 2 On récolte les cellules par centrifugation à vitesse moyenne, après que la croissance en phase logarithmique a commencé à décliner On peut également 9 - cultiver les cellules de H pylori par étalement, comme par exemple sur des plaques de gélose au sang, suivi de récolte. Une fois les cellules de H pylori récoltées, elles peuvent être lavées, puis mises en suspension dans un tampon pour la solubilisation Dans un mode de réalisation préféré, le tampon de solubilisation est une solution salée tamponnée au phosphate (STP) contenant un détergent non ionique Les détergents non ioniques comprennent des produits de réaction d'oxyde d'éthylène ou d'oxyde de propylène avec: ( 1) des alkyl(C 6-C 22)-phénols ou ( 2) des alcools aliphatiques pri- maires ou secondaires, linéaires ou ramifiés D'autres déter- gents non ioniques comprennent des oxydes d'amines tertiaires à longues chaînes, des oxydes de phosphines tertiaires à longues chaînes et des dialkylsulfoxydes Dans un mode de réalisation préféré, le détergent non ionique est le n-octyl- 3-D-glucopyrannoside ajouté à une concentration de 0,1-3,0 % (p/v), encore mieux de 1,0 %. Les cellules de H pylori lavées sont mises en suspen- sion dans environ 0,1 à 10 ml du tampon de solubilisation, pour 100 mg de poids humide de cellules, encore mieux dans environ 1 ml de tampon de solubilisation pour 100 mg de poids humide de cellules Cette suspension est mise à incuber et agitée pendant au moins environ 30 minutes à la température ambiante La suspension résultante de cellules solubilisées est dialysée contre de-la STP, habituellement pendant une nuit, et le surnageant est recueilli par centrifugation à vitesse moyenne. On soumet ensuite le surnageant résultant à une sépara- tion en fonction de la taille, habituellement une chromato- graphie sur colonne par exclusion due à la taille Dans un mode de réalisation préféré, on injecte le surnageant dans une colonne d'exclusion due à la taille ( 6 FF, Pharmacia) et ensuite on l'élue à l'aide de tampon Tris 50 m M (p H 8,0) con- tenant environ 0,025 % d'azoture de sodium On recueille ensuite les fractions et on contrôle l'absorbance à 280 nm - ainsi que l'activité d'uréase, pour déterminer les profils de fractionnement. On rejette les fractions protéiques à masses molécu- laires élevées, contenant la majeure partie de l'activité d'uréase, et on réunit les fractions restantes à faibles masses moléculaires, privées d'uréase L'ensemble constitue l'extrait d'antigènes de la présente invention L'extrait est constitué d'antigènes ayant des masses moléculaires infé- rieures à 200 000 daltons, plus particulièrement allant d'en- viron 16 000 à environ 120 000 daltons, telles que détermi- nées par SDS-PAGE Dans un mode de réalisation préféré, on prépare cet extrait en réunissant les fractions 34-52 comme indiqué sur la figure 1. Divers essais sérologiques peuvent être utilisés dans la présente invention pour la détection d'anticorps dirigés contre H pylori dans des échantillons biologiques Des essais bien caractérisés tels que les essais immuno- enzymatiques (ELISA), les essais à écoulement rapide, les essais par agglutination de latex, les essais par immuno- blotting et les essais immunologiques à écoulement latéral sont tous envisagés dans la présente invention. Dans un mode de réalisation préféré, on effectue l'es- sai sérologique par la méthode de microtitrage EIA (essai immunoenzymatique) Dans cette méthode, on revêt les puits de plaques de microtitrage avec les compositions de la pré- sente invention, décrites plus haut, et on met à incuber pen- dant une nuit à 40 C On élimine ensuite la solution de la composition et on sèche les puits pendant 2 heures à 370 C On prépare ensuite des échantillons biologiques à tester, à diverses dilutions dans de la STP contenant de l'albumine de sérum bovin (ASB) et on les introduit dans les puits Après minutes d'incubation à 250 C, on élimine l'échantillon bio- logique et on lave les puits avec de la STP contenant le détergent Tween 20 On ajoute ensuite une préparation d'anti- corps de lapin conjugué à une enzyme, qui reconnaît l'immuno- il - globuline G humaine ("anti-Ig G humaine"), et on met de nou- veau les puits à incuber On élimine à nouveau la solution et on effectue un autre lavage avec de la STP et du Tween 20 On ajoute enfin une solution contenant un substrat pour l'enzyme conjuguée. Si des anticorps humains dirigés contre H pylori sont présents dans l'échantillon biologique, les anticorps anti-Ig G humaine de lapin se fixent au puits et l'enzyme conjuguée réagit avec le substrat et produit un changement de coloration qui reflète la quantité d'anticorps présents Dans un mode de réalisation préféré, l'enzyme est la peroxydase de raifort, et le substrat est le 2,2 '-azino-bis(acide 3-éthyl- benzthiazoline-sulfonique) (ABTS). Un autre essai immunologique est l'essai EIA à écoule- ment rapide, qui ressemble à l'essai de microtitrage EIA mais utilise une composition d'antigènes adhérant à une membrane poreuse de Nylon On place ensuite la membrane de Nylon sur un tampon absorbant et on l'insère dans un support en matière plastique exposant la membrane On dilue l'échantillon biolo- gique et on le fait s'écouler à travers la membrane On fait ensuite s'écouler à travers la membrane les anticorps anti-Ig G humaine de lapin conjugués à une enzyme, suivis d'une solution de lavage On ajoute enfin une solution conte- nant le substrat pour l'enzyme conjuguée, et un changement de coloration est produit comme dans la méthode ELISA. Dans l'essai par agglutination de latex, la composition d'antigènes est fixée à des perles de latex On met ensuite l'échantillon biologique à incuber directement avec les par- ticules de latex sur une lame porte-objet Au bout d'une courte durée, on examine le mélange réactionnel pour détermi- ner la présence de particules de latex agglutinées ou réticu- lées, indiquant la présence d'anticorps dirigés contre des antigènes de H pylori. La présente invention englobe également un nécessaire contenant une composition d'antigènes décrite plus haut Le 12 - nécessaire peut alors être utilisé pour mettre en oeuvre les procédés de la présente invention décrits ici. Dans un mode de réalisation préféré, le nécessaire con- tient une composition d'antigènes préparée comme décrit plus haut et fixée ensuite sur un support solide, pour utilisation dans un essai sérologique. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. Exemple 1 Méthodes de culture et d'extraction Culture de H pylori On a utilisé du bouillon pour culture de Brucella (Difco Laboratories) additionné de sérum foetal de veau, en tant que milieu de croissance pour la culture de H pylori à 350 C sous une atmosphère composée de CO 2, 02 et N 2 On a ensemencé un échantillon de 20 ml de milieu de croissance avec 1 ml de culture de base de H pylori congelée, on l'a mis à incuber et on l'a transféré dans une culture de 1 litre mis à incuber pendant 48-72 heures jusqu'à une densité de cellules de 8 à 10 x 107 UFC (unités formant colonies) par ml On a récolté les cellules par centrifugation à vitesse moyenne, on les a lavées avec de l'eau désionisée puis tas- sées par centrifugation à vitesse moyenne, pour obtenir x 1 o 6 cellules par mg de culot de cellules humides. Extrait de cellules de H pylori obtenu par sonication La préparation d'un extrait d'antigènes provenant de H pylori par sonication était similaire à celle décrite par Perez-Perez et coll dans Ann Int Med, 109:11 ( 1988). Après la récolte initiale de cellules par centrifugation à vitesse moyenne, on a lavé trois fois les cellules avec une solution salée isotonique stérile Le culot de cellules final a été mis en suspension à une concentration de 10 mg (poids humide) de cellules par ml d'eau désionisée On a caractéris- tiquement soumis à une sonication une suspension de 10 à 15 ml, en refroidissant en bain de glace, à l'aide d'un appa- 13 - reil de sonication Sonic Dismembrator Model 300 (Fisher Scientific Co, Pittsburgh, PA, USA) avec augmentations brusques d'amplitude de 2 minutes à l'émission maximale de puissance à la micropointe Le produit de sonication résul- tant a été congelé à -70 C, puis décongelé et centrifugé comme décrit plus haut On a recueilli le surnageant et on a évalué la teneur en protéines par lecture de l'absorbance à 280 nm. Extrait de cellules de H pylori par la glycine La préparation d'un extrait d'antigènes par la glycine acide était similaire à celle décrite pour C jejuni dans Blaser et Duncan, Infect Immun, 44:292 ( 1984) Après une récolte initiale par centrifugation à vitesse moyenne, on a lavé les cellules à trois reprises avec une solution salée isotonique stérile, et on les a mises en suspension à 25 C dans un tampon glycine-H Cl 0,2 M (p H 2,2), à une concentra- tion de 10 mg (poids humide) de cellules dans 1 ml de tampon. Au bout de 15 minutes, on a à nouveau centrifugé la suspen- sion de cellules Le surnageant a été conservé et dialysé pendant une nuit contre de l'eau froide, à l'aide d'un tube à seuil de coupure de 12- 14 kilodaltons On a recueilli le rétentat et on a évalué la teneur en protéines par lecture de l'absorbance à 280 nm. Extraction de cellules de H pylori par le n-octyl-C-gluco- pyrannoside (BOG) Dans un essai type, on a récolté une culture de H pylori par centrifugation à vitesse moyenne et on a lavé deux fois les cellules par mise en suspension dans de l'eau désionisée stérile, suivie d'une centrifugation Le culot de cellules final a été mis en suspension à une concentration de mg/ml dans une solution salée tamponnée au phosphate (STP) contenant de l'azoture de sodium et 1 % (p/v) de n-octyl-3-glucopyrannoside (BOG) et mis à incuber pendant minutes à 25 C La suspension a été dialysée pendant une nuit à 4 C à l'aide d'un tube à seuil de coupure de 12- 14 - 14 kilodaltons, contre de la STP contenant de l'azoture de sodium, puis centrifugée à vitesse moyenne On a recueilli le surnageant et on a déterminé la teneur en protéines de l'ex- trait par mesure de l'absorbance à 280 nm. Exemple 2 Préparation et analyse d'extrait d'antigènes de H pylori par BOG On a injecté l'extrait de BOG, décrit ci-dessus, dans une colonne de résine Sepharose 6 FF (Pharmacia) équilibrée dans du tampon tris-H Cl 50 m M (p H 8,0) contenant 0,025 % (p/v) d'azoture de sodium On a recueilli 70 fractions (représentant chacune 2 % du volume de la colonne) et on les a contrôlées par mesure de l'absorbance à 280 nm Un profil de fractionnement type de l'extrait de BOG est représenté sur *la figure 1. Le profil de fractionnement sur la figure 1 révèle cinq composants discernables: ( 1) le groupe A (fractions 17-19 y compris), représentant le premier pic à masse moléculaire élevée et ayant une activité négligeable d'uréase de H pylori; ( 2) le groupe B (fractions 20-33)associé à un "creux de pic" et ayant la majeure partie de l'activité de l'uréase; ( 3) le groupe C (fractions 34-52) contenant des protéines à faibles masses moléculaires, privées d'uréase; ( 4) le groupe D (fractions 53-58) représentant la pente des- cendante du second pic de protéines; et enfin ( 5) le groupe E (fractions 59-63) représentant la traînée du second pic, à faible masse moléculaire. On a analysé les fractions en effectuant une SDS-PAGE avec réduction sur gels de 0,15 x 12 x 15 cm l 12 % p/v d'acrylamide 0,32 % (p/v) de N, N-méthylène-bisacrylamidel en présence de 0,1 % (p/v) de SDS On a injecté en même temps que les échantillons de fractions des étalons de protéines à masses moléculaires élevées et à faibles masses moléculaires (Bio Rad Labs) L'électrophorèse a été effectuée à 25 m A/plaque (gel empilé) ou à 40 m A/plaque (gel coulant), - jusqu'à migration du colorant marqueur bleu de bromophénol jusqu'à l'extrémité inférieure du gel ( 2,5-3 heures) Les gels ont été ensuite colorés pendant 60 minutes dans 0,2 % (p/v) de bleu brillant de Coomassie R 250 dissous dans 50 % (v/v) de méthanol, 10 % (v/v) d'acide acétique, et finale- ment décolorés dans 50 % (v/v) de méthanol, 10 % (v/v) d'acide acétique. L'analyse par SDS-PAGE avec réduction des fractions réunies A-E (définies plus haut), obtenues après fractionne- ment sur Sepharose 6 FF de l'extrait par BOG de cellules de H pylori indique une plage d'enrichissement eu égard aux antigènes communs et aux antigènes spécifiques de H pylori, comme indiqué dans le tableau 1 Sur les gels de PAGE avec réduction, les antigènes à masses moléculaires élevées (PM > 200 000) des groupes A et B apparaissent sous forme de bandes à faibles masses moléculaires (PM de la digestion et de la réduction requises pour la SDS-PAGE. Tableau 1 Groupe PM (kd) de l'antigène A B C D E Spécifique de H pylori * 2 66 1 2 4 62,59 3 0,5 - 52 2 1 - 31 0,5 2 3 1 - Commun 89,73 2 56 2 2 4 3 2 45,42 0,5 2 0,5 0,5 29,25 0,5 3 O 1 21,16 2 2 2 1 Intensité relative sur l'échelle 1-4 (maximum). Le tableau 1 indique que le groupe C est relativement enrichi en antigènes spécifiques de H pylori. 16 - On a déterminé l'activité d'uréase dans chaque frac- tion, en utilisant une modification de la méthode de Mobley et coll, Infect Immun ( 1986), 54:161-169, qui comprend la mesure de la variation de p H provoquée par l'ammoniac engen- dré par l'hydrolyse de l'urée catalysée par l'uréase On a ajouté 50 pi de chaque fraction à 780 pl de tampon pour sub- strat d'uréase lurée 10 m M, tampon phosphate de sodium 4,5 m M (p H 6, 8), 70 lg/ml de rouge de phénoll et on a mis le mélange à incuber pendant 30 minutes à la température ambiante On a ensuite mesuré la densité optique de parties aliquotes de pl à 550 nm au moyen d'un lecteur de plaque de micro- titrage modèle MR 700 (Dynatech Laboratories) L'activité d'uréase spécifique a été exprimée par le rapport DO 550/A 280. La figure 1 représente le profil à 280 nm d'un fractionnement sur Sepharose 6 FF d'une extrait BOG, et l'activité spécifique d'uréase des groupes B et C. Exemple 3 Comparaison du groupe B, du groupe C et d'autres antigènes Dans cet exemple, on a comparé le groupe B, contenant la majeure partie de l'activité de l'uréase (fractions 20-33) et le groupe C privé d'uréase (fractions 34-52), en ce qui concerne l'aptitude à déceler des anticorps Ig G anti- H pylori dans des sérums humains, comme décrit ci-dessous. Echantillons de sérums de patients Dans des cliniques de gastroentérologie, on a recueilli des échantillons de sérum et de plasma sur des sujets qui étaient caractérisés soit comme H pylori- positifs, soit comme H pylori-négatifs, en fonction des résultats culturaux et histologiques de biopsies gastriques. Les échantillons ont été en outre caractérisés par des signes gastro-intestinaux diagnostiqués cliniquement. Essai immuno-enzymatique d'antigènes de H pylori par écoule- ment rapide L'élément en phase solide consistait en un tampon absorbant placé dans une gaine à fond moulé, suivi de 6,45 c 2 17 - de rayonne 8 S et d'une membrane en Nylon Biodyne A de 1,2 gm. On a déposé sur la membrane en Nylon un extrait de H pylori dilué dans une solution de dépôt d'antigènes, suivi d'Ig G humaine dilué dans de la STP contenant de l'azoture de sodium Les membranes ont été bouchées pendant 30 minutes à la température ambiante avec une solution d'ASB alkylée, et ensuite séchées pendant 10-20 minutes à 450 C On a placé une gaine supérieure moulée sur la membrane en Nylon traitée,la zone ayant reçu l'antigène se trouvant au centre de la partie visible, et on l'a soudée aux ultrasons Un assemblage de pré-filtres a été inséré dans les unités soudées, placé dans un sac en feuille métallique contenant un desséchant, puis scellé à chaud. Mode opératoire pour l'essai immuno-enzymatique à écoulement rapide Au moyen d'un dispositif de distribution capillaire de pl, on a placé un échantillon provenant d'un patient (sérum ou plasma) dans une cuvette en matière plastique avec gl de diluant pour échantillon On a introduit l'échan- tillon dilué dans le dispositif d'essai décrit plus haut, et on l'a laissé s'écouler complètement à travers le filtre On a ensuite ajouté de l'anticorps anti-Ig G humaine de lapin conjugué à de la phosphatase alcaline, et on l'a laissé à nouveau s'écouler complètement à travers le filtre Le filtre a été lavé avec 0,5 ml de solution de lavage et on a intro- duit dans la cartouche 210 gl d'une solution de 3-indoxyl- phosphate (un substrat chromogène) Après incubation pendant minutes, on a lavé complètement la membrane pour mettre fin à l'essai Les résultats de l'essai immunologique ont été ensuite interprétés dans les 15 minutes suivantes, à l'aide des critères suivants: UN RESULTAT NEGATIF était indiqué par l'apparition d'une barre négative bleue au centre de la membrane UN RESULTAT POSITIF était indiqué par l'apparition d'un cercle bleu plein superposé sur la barre négative témoin sur la mem- 18 - brane L'absence à la fois de la barre bleue et du cercle bleu plein indiquait que l'essai était ininterprétable, et qu'il fallait le répéter. Qualification du groupe C de l'extrait d'antigènes de H pylori pour la détection d'anticorps dirigés contre H pylori dans des sérums humains On a appliqué l'essai immuno-enzymatique rapide sur différentes compositions d'antigènes, pour déterminer la fré- quence de résultats faussement positifs sr des échantillons de sérum humain Les extraits d'antigènes utilisés étaient: les groupes A et C de l'extrait d'antigènes par BOG; et les extraits par la glycine et obtenus par sonication, préparés comme décrit plus haut Les résultats sont donnés dans le tableau 2. Tableau 2 Echantillons de sérums H pylori-négatifs (confirmnspar examens culturaux et histologiques) Culture/ Echantillon histologie Groupe C Groupe A Glycine Sonication 4 + + + 6 + + 7 + +/ 8 +/ + + +/ 10 +/ + + + 13 +/ +/ 14 + + 16 + 22 +/ +/ +/ 32 + +/ +/ Résultats fausse- ment positifs, %: O 14 77 41 59 19 - Echantillonsde sérurs H pylori-positifs (confirmn par examens culturaux et histologiques) Culture/ Echantillon histologie Groupe C Groupe A Glycine Sonication 3 + + + + + + + + + + 17 + + + + + 23 + + + + + Résultats corrects: 100 % pour tous les extraits testés. On peut voir que le groupe C de l'extrait d'antigènes par BOG a la plus faible fréquence de résultats faussement positifs ( 14 % contre 41 à 77 % pour les autres extraits d'antigènes). Etude de corrélation d'exactitude sur des sérums humains pour des anticorps dirigés contre H pylori, au moyen du groupe C d'extrait d'antigènes par BOG On a recueilli 183 échantillons de sérum et de plasma dans trois cliniques de gastro-entérologie On a utilisé dans l'essai immuno-enzymatique rapide le groupe C de l'extrait d'antigènes par BOG Les résultats de l'essai ont été visuel- lement évalués immédiatement après l'achèvement de l'essai. Les échantillons en désaccord ont été testés par l'essai ELISA sur plaque de microtitrage Biometra, qui détecte les anticorps Ig G dirigés contre H pylori. La corrélation de l'essai aux résultats culturaux et histologiques est donnée dans le tableau 3. Tableau 3 Essai immuno-enzymatique rapide du groupe C par rapport aux résultats d'examens culturaux/histologiques Examens culturaux/histologiques Résultats Résultats positifs négatifs EIA rapide résultat positif 63 15 EIA rapide résultat négatif 3 102 TOTAL: 66 117 - Sensibilité du groupe C (% de résultats positifs réels cor- rectement identifiés) = 95 % Spécificité du groupe C (% de résultats négatifs réels cor- rectement identifiés) = 87 % Exactitude du groupe C (% de résultats corrects) = 90 % Fiabilité des résultats positifs du groupe C (+) = 81 % Fiabilité des résultats négatifs du groupe C (-) = 97 %. Les résultats d'échantillons en désaccord ont été con- firmés comme positifs ou négatifs eu égard à l'infection, au moyen de l'essai ELISA Biometra (tableau 4). Tableau 4 Résultats d'essais d'échantillons en désaccord Résultat des examens Résultat de Résultat de culturaux/histolo l'essai ELISA Echantillon l'EIA rapide giques Biometra 52 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 174 + + Quatorze sur quinze sérums positifs à l'EIA rapide et négatifs aux examens culturaux/histopathologiques ont été 21 - confirmés positifs dans l'essai ELISA Biometra Avec ces ajustements, l'essai immuno- enzymatique rapide s'est révélé avoir une sensibilité et une spécificité de 96 et 99 %, res- pectivement (tableau 5). Tableau 5 Essai immuno-enzymatique rapide du groupe C par rapport aux examens culturaux/histologiques, ajustés pour les résultats de l'essai ELISA Examens culturaux/histologiques Résultats Résultats positifs négatifs EIA rapide résultat positif 77 1 EIA rapide résultat négatif 3 102 TOTAL: 80 103 Sensibilité corrigée du groupe C = 96 % Spécificité corrigée du groupe C = 99 % Exactitude corrigée du groupe C = 98 % PV corrigé du groupe C (+) = 99 % PV corrigé du groupe C (-) = 97 %. Comparaison d'un extrait d'antigènes "enrichis en uréase" avec le groupe C, eu égard à sa qualification dans la détec- tion d'anticorps dirigés contre H pylori dans des sérums humains On a préparé une composition d'antigènes "enrichis en uréase" (groupe B) comme décrit dans US-A-4 882 271 (Evans et coll) et on l'a comparée à l'antigène du groupe C "privé d'uréase" eu égard à leurs aptitudes à déceler des anti- corps Ig G dirigés contre H pylori dans des sérums humains, dans l'essai immuno-enzymatique rapide Le tableau 6 donne les résultats obtenus avec des échantillons de sérum humain. 22 - Tableau 6 Comparaison du groupe B (antigène enrichi en uréase) avec le groupe C au moyen de l'essai immuno-enzymatique rapide Sérums H pylori-négatifs Echantillon Groupe B (uréase) Groupe C 4 + 8 + + 11 + + r A A _ Résultats faussement positifs, % Echantillon 23 Résultats corrects, % Sérums H. Uréase + + + + + + + + pylori-positifs Groupe C + + + + + + + + 23 - Le tableau 6 montre que l'antigène du groupe C, privé d'uréase, a une plus faible fréquence de résultats faussement positifs que la composition d'Evans enrichie en uréase ( 6 % par rapport à 25 %, respectivement). Exemple 4 On a comparé quatre extraits différents d'antigènes de H pylori lgroupe A, groupe C (privés d'uréase), extraits de sonication et de glycinel dans un essai ELISA sur plaque de microtitrage, avec les résultats d'examens culturaux et his- tologiques sur des échantillons de sérums humains. Essai de microtitrage immuno-enzymatique d'antigènes de H pylori On a revêtu pendant une nuit à 4 C, avec des concentra- tions optimisées des quatre antigènes, des plaques de micro- titrage à 96 puits à fond plat Après élimination des solu- tions d'antigènes, les plaques ont été séchées à l'air et enveloppées Pour l'éxécution des essais immunologiques, on a réhydraté les puits, à la température ambiante, avec 300 1 l de solution de lavage pour microtitrage lSTP contenant 0,05 % (p/v) de Tween 20 et 0,01 % (p/v) de Thimerosall On a ensuite éliminé le liquide et on a effectué les étapes sub- séquentes à 25 C On a introduit dans les puits ( 100 pl par puits) des échantillons de sérum dilués par un facteur de 100 avec de la STP contenant de l'ASB, et on les a mis à incuber pendant 30 minutes Les plaques ont été lavées à cinq reprises avec 300 pl chaque fois de solution de lavage, et mises à incuber pendant 30 minutes avec des anticorps anti-Ig G humaine de lapin conjugués à la peroxydase Les plaques ont été lavées à nouveau à cinq reprises avec 300 pl chaque fois de solution de lavage, et mises à incuber pendant minutes avec une solution de substrat fraîchement prépa- rée, constituée de 2,2 '-azino-bis(acide 3-éthylbenz- thiazoline-sulfonique) lsel de diammonium (ABTS)l et de peroxyde d'hydrogène On a mis fin aux réactions par addition de 50 pl d'acide oxalique 0,25 M, et on a mesuré l'absorbance 24 - à 410 nm au moyen d'un lecteur de plaque MR 700 (Dynatech Laboratories). Les résultats donnés dans le tableau 7 montrent que le groupe C, par comparaison avec les autres compositions d'antigènes testées, est supérieur eu égard à sa spécificité et à sa sensibilité dans l'identification de sérums humains H pylori-négatifs et H pylori-positifs. Tableau 7 Comparaison de la spécificité et de la sensibilité d'un essai ELISA par microtitrage pour des anticorps Ig G dans des sérums humains, au moyen de compositions distinctes d'antigènes de H pylori Groupe C Groupe A Glycine Sonication (n= 29) (n= 29) (n= 48) (n= 33) Spécificité: 93 % 72 % 73 % 64 % Sensibilité 100 % 100 % 100 % 100 % Note: 1 N = nombre de sérums H pylori-négatifs testés, déterminés par examen histo-cytologique. 2 la spécificité est l'aptitude à déceler correctement des sérums H pylori-négatifs, comme déterminé par examen histo-cytologique. 3 La sensibilité est l'aptitude à déceler correctement des sérums H pyloripositifs, comme déterminé par examen histo-cytologique. - REVENDICATIONS 1 Composition comprenant des antigènes purifiés, pro- venant de protéines associées aux cellules de Helicobacter pylori, les antigènes: (a) ayant une masse moléculaire inférieure à environ 000 daltons, telle que déterminée par analyse par SDS-PAGE avec réduction; et (b) ayant une activité réduite d'uréase. 2 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les antigènes ont une masse moléculaire allant d'environ 16 000 à environ 120 000 daltons, telle que déter- minée par analyse par SDS-PAGE avec réduction. 3 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les protéines associées aux cellules sont obtenues par solubilisation des cellules par mise en suspension dans une solution salée tamponnée au phosphate (STP) contenant un détergent non ionique. 4 Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que la STP contient 0,1-3,0 % du détergent non ionique n-octyl-0-D-glucopyrannoside. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la STP contient environ 1 % de n-octyl-3-D-gluco- pyrannoside. 6 Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que la solubilisation dure au moins environ 30 minutes. 7 Composition comprenant des antigènes purifiés pro- venant de protéines associées aux cellules de Helicobacter pylori, la compositicn étant obtenue par (a) culture de cellules de Helicobacter pylori dans un bouil- lon additionné de sérum foetal bovin, et récolte des cel- lules lorsque la croissance en phase logarithmique a commencé à décliner; (b) solubilisation des cellules dans une solution salée tam- ponnée au phosphate, contenant environ 1 % de n-octyl-3- D-glucopyrannoside, pendant au moins environ 30 minutes, pour l'obtention d'une solution de protéines cellulaires; (c) dialyse pendant une nuit de la solution de protéines cel- lulaires contre de la STP, puis centrifugation de la solution à vitesse moyenne, pour l'obtention d'un surna- geant; (d) injection du surnageant dans une colonne de chromatogra- phie par exclusion de taille; - (e) élution de la colonne avec du tampon et collecte des fractions éluées; et (f) réunion des fractions protéiques à faibles masses molécu- laires, privées d'uréase, pour l'obtention d'une composi- tion comprenant des antigènes purifiés à partir de pro- téines associées aux cellules de Helicobacter pylori. 8 Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que, dans l'étape (d), la colonne de chromatographie par exclusion due à la taille est une colonne d'exclusion due à la taille 6 FF (Pharmacia). 9 Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que la colonne est éluée avec du tampon Tris 50 m M con- tenant 0,025 % d'azoture de sodium. 10 Procédé pour la détection d'infection par Helicobacter pylori dans un échantillon biologique, le pro- cédé comprenant: (a) la mise en contact de la composition de la revendica- tion 1 avec l'échantillon, pour la formation d'un com- plexe d'incubation; et (b) l'essai du complexe d'incubation pour la détermination de la présence de complexes anticorps-antigènes indiquant la présence d'infection par Helicobacter pylori. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que, dans l'étape (b), le complexe d'incubation est testé par une méthode choisie parmi un essai immuno-enzymatique, un essai radio-immunologique, la fixation de complément, l'hémagglutination indirecte, l'agglutination de latex, l'es- 27 - sai d'écoulement rapide et l'essai d'écoulement latéral. 12 Procédé de détection d'infection par Helicobacter pylori dans une échantillon biologique, le pro- cédé comprenant: (a) la mise en contact de la composition de la revendica- tion 7 avec l'échantillon, pour la formation d'un com- plexe d'incubation; et (b) l'essai du complexe d'incubation pour la détermination de la présence de complexes anticorps-antigènes indiquant la présence d'infection par Helicobacter pylori. 13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que, dans l'étape (b), le complexe d'incubation est testé par une méthode choisie parmi un essai immuno-enzymatique, un essai radio-immunologique, la fixation de complément, l'hémagglutination indirecte, l'agglutination de latex, l'es- sai d'écoulement rapide et l'essai d'écoulement latéral. 14 Procédé pour la détection d'infection par Helicobacter pylori dans un échantillon biologique, le pro- cédé comprenant: (a) l'immobilisation et le séchage de la composition de la revendication 1 sur un support solide, pour l'obtention d'un complexe d'antigènes séchés; (b) l'incubation du complexe d'antigènes séchés avec l'échan- tillon, pour la formation d'un complexe anticorps- antigènes; (c) l'addition au complexe anticorps-antigène d'anticorps anti-Ig G humaine conjugués à une enzyme, et l'incubation pour la formation d'un complexe de marquage; (d) l'addition au complexe de marquage d'un substrat pour l'enzyme conjuguée, pour la formation d'un complexe de développement; et (e) le contrôle du complexe de développement pour déceler un changement dans le substrat, pour la détermination de la quantité d'anticorps dirigés contre Helicobacter pylori, présent dans l'échantillon. 28 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que, dans l'étape (c), les anticorps anti-Ig G humaine sont conjugués à de la peroxydase de raifort. 16 Nécessaire pour la détermination de la présence de Helicobacter pylori dans un échantillon biologique, caracté- risé en ce que le nécessaire comprend la composition de la revendication 1. 17 Nécessaire pour la détermination de la présence de Helicobacter pylori dans un échantillon biologique, caracté- risé en ce que le nécessaire comprend la composition de la revendication 1 immobilisée sur un support solide. 18 Nécessaire pour la détermination de la présence de Helicobacter pylori dans un échantillon biologique, caracté- risé en ce que le nécessaire comprend la composition de la revendication 7. 19 Nécessaire pour la détermination de la présence de Helicobacter pylori dans un échantillon biologique, caracté- risé en ce que le nécessaire comprend la composition de la revendication 7 immobilisée sur un support solide.