Brevet FR2672902A1 — publié le 19920821

NOUVELLE METHODE D'OBTENTION DES SULFATES DE STEROIDES La présente invention concerne une méthode pour l'obtention des sulfates de stéroïdes en utilisant une sulfotransférase présente dans une lignée cellulaire de cancer mammaire humain. Les hormones stéroïdes circulent sous forme libre et sous forme conjuguée. Les stéroïdes conjugués sont principalement les sulfates et les glucuronides.La forme glucuronide est l'étape finale du métabolisme et est excrétée par voie urinaire ou intestinale. Par contre, la forme sulfate est une étape qui peut conduire à des précurseurs de l'hormone, du fait, qu'il existe un équilibre réversible entre la forme libre et la forme sulfate. Les sulfates d'oestrogènes sont présents en quantité très importante dans le plasma pendant le cycle menstruel et pendant la ménopause. Ils sont significativement augmentés pendant la période de l'ovulation (HAWKINS R.A. et OAKEY, J. Endocr. 60 (1974) 3-17;ROBERTS K.D. et al.,Steroids 35 (1980) 179-187)et se trouvent en quantité très importante pendant la grossesse particulièrement à la fin (BELISLE S.et al.,J Clin. Endocrin. Metab., 46 (1978) 721-728; YOUNG B.K. et al.,J. Clin. Endocrin. Metab. 39 (1974) 842-849.) ainsi que dans les différents liquides et organes du compartiment foetal (LAATIKAINEN T. et PELTONEN J.,Acta Endocr., 79 (1975) 577-588; KLOPPER A.In: Recent Progress in Obstetrics and Gynecology, (1974) pp,162-169).Les sulfates sont aussi présents à des concentrations élevées dans des cancers dépendant des hormones (cancer du sein et cancer de la prostate) (PASQUALINI J.R.et al., J. Steroid Biochem.34 (1988) 155-163.; REED M.J.et al. Cancer Res.435 (1983) 3940-3943.). Après avoir essayé une série de lignées cellulaires de cancer mammaire: MCF-7, R-27,T-47D, MDA-MB 468, MDA-MB 436, MDA-MB 231, nous avons eu la surprise de voir que la lignée cellulaire MDA-MB 468 produit des quantités très importantes de sulfates des différents stéroïdes. Par contre, dans les autres lignées cellulaires, on n'observe pas de formation de sulfates ou en quantité négligeable. La méthode consiste à incuber cette lignée dans un milieu de culture appelé "EAGLE" (milieu essentiel minimum) qui contient 10mM de l'Hepes additionné de 2mM L-glutamine, 100 U/ml de peniciline-steptomycine et 5% de sérum de veau. Les cellules sont maintenues dans une atmosphère humide contenant 5% d'anhydride carbonique. Juste avant le maximum de croissance les cellules sont incubées pendant 24 heures à 370C avec différents stéroïdes marqués au tritium (oestrone, oestradiol, oestriol, déhydroépiandrostérone, testostérone, prégnénolone) à des concentrations de 5 x 10-9M.Le milieu de culture est prélevé et le matériel radioactif analysé par chromatographie sur couche mince sur gel de silice dans les systèmes suivants: chloroforme/acétate d'éthyle (4:1, v/v) ou acétate d'éthyle/méthanol:ammoniaque (75:25:2, v/v/v). Avec le premier système, on peut caractériser les stéroïdes libres et avec le 2ème système les sulfates de stéroïdes formés. Le pourcentage de chaque fraction est calculé sur la totalité de la radioactivité incubée. Les sulfates obtenus sont analysés après solvolyse dans une solution de 0,9% de C1Na contenant de l'acide sulfurique 2 N Les sulfates de stéroides synthétisés dans la cellule sont secrétés dans le milieu de culture, ce qui permet une production continue. On observe sur le tableau 1 que le pourcentage des sulfates synthétisés avec les différents stéroïdes est très élevé de l'ordre de 65 à 90% de la totalité de la radioactivité incubée. Le maximum de formation du sulfate est atteint au bout de 2 heures de culture. Des exemples de formation des sulfates d'oestrone et de sulfate d'oestradiol sont indiqués dans les figures 1 et 2. Comme le montre le tableau 2, l'analyse de la fraction sulfate des stéroïdes obtenus montre que les sulfates formés sont de 62 à 91% du stéroïde incubé ce qui facilite énormement leur production et leur purification. Cette nouvelle méthode qui utilise la lignée cellulaire MDA MB 468 du cancer mammaire humain présente un double intérêt: 1. Les différents sulfates de stéroïdes peuvent être largement utilisés comme marqueur pour des méthodes radioimmunologiques et autoradiographiques et pour toute technique faisant intervenir la radioactivité comme moyen de détection ou de localisation. 2.La synthèse de ces sulfates particulièrement ceux des oestrogènes peut avoir des applications thérapeutiques pour toute pathologie ayant pour cause une déficience oestrogénique en particulier:la déficience ovarienne, la ménopause naturelle chez des femmes de plus de 50 ans ou artificielle chez toute femme qui a dû subir une ovariectomie pour des raisons médicales, l'ostéoporose, les tumeurs bénignes et malignes du sein, le cancer et lthyper- trophie bénigne de la prostate TABLEAU 1 CONVERSION DE DIFFERENTS STEROIDES EN LEURS SULFATES APRES INCUBATION AVEC LA LIGNEE CELLULAIRE MDA MB 468 DU CANCER MAMMAIRE HUMAIN. (En pourcentage de la radioactivité totale) FORMATIONTION DES STEROIDES INCUBES SULFATES DE STEROIDES dans le milieu après 2 heures d'incubation [ H] - OESTRONE 62+ 10 [3S - OESTRADIOL 649 [ H] - OESTRIOL 91+ 4 [3H] -DEHYDROEPIANDROSTERONE 75 f 5 [3H1 -TESTOSTERONE 65 L3H1 -PREGNENOLONE 72+7 Les cellules avant leur maximum de leur croissance sont incubées pendant 24h. à 37 avec 5 x 10-9 M des différents stéroïdes. Les valeurs représentent la moyenne + (SD) de 8 déterminations. TABLEAU 2 ANALYSE DE LA FRACTION SULFATE APRES INCUBATION DE DIFFERENTS STEROIDES AVEC LA LIGNEE CELLULAIRE MDA MB 468 DU CANCER MAMMAIRE HUMAIN. (En pourcentage de la radioactivité totale) STEROIDES INCUBES SULFATES FORMES [3H] - OESTRONE SULFATE D' OESTRONE 75 i 5 [3H] - OESTRADIOL SULFATE D' OESTRADIOL 73 + 5 [3H] - OESTRIOL SULFATE D' OESTRIOL 90 + 4 [3H] -DEHYDROEPIANDROS- SULFATE DE DEHYDRO- 90 2 TERONE EPIANDROSTERONE [3H] -TESTOSTERONE SULFATE DE TESTOSTERONE 83 t 5 [3H] -PREGNENOLONE SULFATE DE 75 + 7 PREGNENOLONE Les cellules avant leur maximum de leur croissance sont incubées pendant 24h. à 37 avec 5 x 10-9 M des différents stéroides. Les valeurs représentent la moyenne + (SD) de 8 déterminations. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de sulfates de stéroïdes ayant les structures de l'oestrane, du prégnane, de l'androstane et de leurs dérivés correspondants, caractérisé en ce qu'il consiste à incuber la lignée cellulaire MDA MB 468 de cancer mammaire humain. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée avec des stéroides facultativement radioactifs dans un milieu de culture appelé "EAGLE" (milieu essentiel minimum) qui contient 10mM de 1'Hepes additionné de 2mM L-glutamine, 100 U/ml de penicilinesteptomycine et 5% de sérum de veau, les cellules étant maintenues dans une atmosphère humide contenant 5% d'anhydride carbonique. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les sulfates des stéroïdes secrétés sont isolés et purifiés par chromatographie en couche mince sur gel de silice. 4. Sulfates de stéroïdes obtenus selon le procédé décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils ont une pureté correspondant à 75 à 90% du stéroïde incubé.