Brevet FR2669824A1 — publié le 19920605

L'Invention est relative à l'utilisation de variants des interférons a, notamment des interférons a de classe II, tels que la trophoblastine, lesquels variants sont obtenus par génie génétique dans un système d'expression eucaryote, pour l'obtention de médicaments, et plus particulièrement pour l'obtention de produits thérapeutiques et de diagnostic destinés à améliorer la fertilité des animaux d'élevage. La trophoblastine ou oTP, a été mise en évidence respectivement par MARTAL et al. [J. Reprod. Fert., 56, 63-73 (1979) ; Pro. 10th intern. Congress on Anim. Reprod. and A.l., Urbana-Champaign (USA), 11, 509 (short communication) (1984)] et GODKIN et al. [J. Reprod. Fert., 65, 141-150 (1982)] chez les ovins où elle est produite en abondance par l'embryon, entre le 12e et le 21e jour de gestation ; chez les bovins, elle est produite entre le 16ème et le 24ème jour. Elle existe sous au moins 5 isoformes correspondant à des variants génétiques. Ces isoformes sont décrites dans la Demande Internationale PCT 89/08706, au nom de l'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE. Le poids moléculaire de la trophoblastine est de 20 KDa et son point isoélectrique est compris entre 5,3 et 5,5, suivant l'isoforme considérée. Il a été proposé de classer la trophoblastine parmi les interférons a de classe II. La trophoblastine produite par les embryons possède, comme les autres interférons, des activités biologiques variées. La trophoblastine intervient dans le mécanisme de reconnaissance de l'embryon par l'organisme maternel. GODKIN et al [J. Reprod. Fert., 71, 57-64 (1984)] ont montré que l'injection intra-utérine d'oTP purifiée prolonge pendant quelques jours la sécrétion de progestérone lutéale chez des brebis cycliques receveuses. FINCHER et al.[J. Reprod. Fert., 76, 425-433 (1986)] ont constaté que l'injection d'oTP naturelle dans l'utérus retarde de quelques jours la lutéolyse induite par l'ocytocine ou ltoestradiol et s'accompagne d'une réduction de la sécrétion de prostaglandine F2a. Des observations similaires ont été faites avec des interférons a de classe I [PLANTE et al., Endocrinology 122, 2342-2344, (1988) ; STEWART et al., (1989) J. Repr. Fert. Supp. p. 127-138]. Une activité antivirale de cette protéine a également été mise en évidence. Cette activité a été décrite par MARTAL et al. [J.Reprod.Fert.Abs.series, 2, 3, (1988)] et POUTZER et al., [Biochem.Biophys.Res.Com., 152, 801-807, (1988)l , ainsi que dans la Demande PCT 89/08706 précitée. Cette Demande propose également l'utilisation de la trophoblastine pour la prévention du rejet des greffes d'organes. Ces propriétés permettent d'envisager de nombreuses utilisations thérapeutiques de la trophoblastine. Le développement de telles applications s'est heurté toutefois au fait que la trophoblastine ne pouvait être obtenue qu'à partir des conceptus, ce qui ne permettait pas sa production en quantité suffisante pour un usage industriel. Cependant, le clonage chez E. Coli de l'ADN complémentaire (ADNc) des ARN messagers (ARNm) codant pour la trophoblastine ovine a été décrit dans la Demande PCT 89/08706 citée plus haut. Il pouvait donc être envisagé de construire, à partir de cet ADNc, des gènes chimériques permettant la production de trophoblastine dans des microorganismes. Les constructions réalisées dans un premier temps chez E. Coli n'ont pas permis la production de trophoblastine en quantité suffisante. Des essais de clonage dans d'autres hôtes ont donc été effectués. Un système d'expression permettant la sécrétion de trophoblastine à partir de levures a ainsi été recherché, et une construction permettant un haut niveau d'expression du gène de la trophoblastine a été élaborée. Dans cette construction, la région correspondant à la séquence signal de l'ADNc de la trophoblastine a été délétée et remplacée par la séquence signal de la préprophéromone de levure, puis l'ensemble a été cloné dans le vecteur d'expression PTG 7908. La trophoblastine recombinante qui résulte de l'expression du gène chimérique ainsi construit contient 2 acides aminés supplémentaires (alanineproline) précédant la cystéine N-terminale de la trophoblastine naturelle. Cette trophoblastine recombinante est dénommée ci-après APrT. Le système d'expression ainsi obtenu, ainsi que la trophoblastine recombinante synthétisée font l'objet d'une Demande de Brevet, au nom de la Société TRANSGENE, déposée en même temps que la présente Demande. Une expression quantitativement suffisante du gène de la trophoblastine après clonage dans la levure n'a donc pu être obtenue qu'au prix de l'addition de deux acides aminés à l'extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique. Il était à craindre que cette modification de la structure primaire ait des conséquences sur la structure tertiaire telles que l'activité physiologique de la protéine recombinante obtenue soit différente de celle de la protéine naturelle. En effet, chez les interférons a, le résidu cystéine à l'extrémité N-terminale intervient dans la structure tertiaire de la molécule, par formation d'un pont disulfure cysl-cys99, et il est généralement considéré que la position dudit résidu est essentielle pour le maintien d'une conformation active.Jusqu'à présent, la possibilité d'utiliser dans les applications des interférons a naturels, des interférons a dont l'extrémité N-terminale ait été modifiée, n'avait donc absolument pas été envisagée. Or, les Inventeurs ont procédé à l'étude des propriétés physiologiques de l'APrT, et au cours de cette étude, ont constaté que de façon surprenante, et malgré les deux acides aminés N-terminaux supplémentaires qui étaient susceptibles de modifier la structure tertiaire et d'entraîner une gène conformationnelle perturbant l'activité de la molécule, les propriétés immunologiques et biologiques (antivirales, antilutéolytiques, et immunosuppressives) de cet interféron a recombinant étaient équivalentes à celles de la molécule naturelle. Il apparaît donc, au vu des constatations faites par les Inventeurs, que des variants d'interférons a modifiés par adjonction à leur extrémité N-terminale, d'un ou plusieurs acides aminés, par exemple un di- ou un tripeptide, conservent les propriétés des interférons a naturels, notamment s'il s'agit d'acides aminés à chaîne latérale non polaire ou neutre, tels que l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, le tryptophane, la glycine, la sérine et la thréonine, La présente Invention a pour objet les applications de variants d' interféron a, de formule générale X1-Ro (I) ou bien X1-X2-RO (Il) ou bien X1-X2-X3-Ro (III) dans laquelle X1, X2 et X3 sont identiques ou différents, et représentent chacun un acide aminé à chaîne latérale non polaire ou neutre, et Ro représente la séquence en acides aminés de la forme mature d'un interférona, pour l'obtention de médicaments ou de réactifs de diagnostic. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, X1, X2 et X3 représentent chacun un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, le tryptophane, la glycine, la sérine et la thréonine Par interférona (IFN-a), on entend notamment un IFN-a de classe I (IFN-aI) ou de classe II (IFN-aII). Un IFN-aI est caractérisé par une séquence de 166 acides aminés tandis qu'un IFN-aII possède une extension C-terminale de 6 acides aminés par rapport à un IFN-aI. Cette définition englobe, bien évidemment les variants alléliques naturels des interférons a. Par exemple, en ce qui concerne les interférons a d'origine humaine, on connaît au moins une quinzaine de gènes dont les séquences codantes présentent entre elles plus de 85 d'homologie. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, un variant d'interférona, de formule générale Ala-Pro-RO' (IV) dans laquelle R0, est un interféron aII, est utilisé dans les applications définies ci-dessus. De préférence, ce variant répond à la formule Ala-Pro-Ro" (V) dans laquelle Roi' est un IFN aII d'origine bovine ou ovine. Selon une modalité particulièrement avantageuse de ce mode de réalisation, un variant d'interférona dénommé APrT, de formule générale Ala-Pro-Ro"' (VI) dans laquelle Ro"' représente la séquence en acides aminés de la forme mature d'une quelconque des isoformes de la trophoblastine, est utilisé dans lesdites applications. Conformément à l'Invention, les variants d'interférona tels que définis plus haut sont utilisables dans toutes les applications des interférons a naturels telles que par exemple l'obtention de médicaments antiviraux, immunomodulateurs, anti-inflammatoires, antitumoraux. De manière avantageuse, l'APrT est, outre les applications générales des interférons a définies plus haut, plus spécifiquement utilisée pour l'obtention de médicaments antilutéolytiques, ainsi que de produits destinés à améliorer la survie des embryons lors de leur transplantation, et pour l'obtention de réactifs permettant le diagnostic de la viabilité des embryons à un stade précoce de leur développement. Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, l'APrT est utilisée pour le traitement des troupeaux, afin d'améliorer leur fertilité. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention, l'APrT est utilisée pour le traitement des embryons lors de leur transplantation dans les différentes techniques de reproduction d'animaux d'élevage impliquant un transfert d'embryons, en particulier celles associées à la cryoconservation, à la fécondation in-vitro, au clonage embryonnaire, à la transgénèse embryonnaire. Selon encore un autre mode de réalisation préféré de la présente Invention, l'APrT est utilisée pour l'obtention de réactifs et de kits permettant le diagnostic de viabilité des embryons à un stade précoce de leur développement. Un tel diagnostic est basé sur le dosage de la trophoblastine produite par les embryons. Ce dosage peut par exemple, être effectué par des méthodes immunologiques ; dans ce cas, l'APrT peut être utilisé comme immunogène pour la production d'anticorps, ou comme antigène, dans des méthodes de type compétitif. La trophoblastine produite par les embryons peut également être quantifiée par son activité antivirale ; l'APrT peut être utilisée comme standard d'activité antivirale dans un tel dosage. La présente Invention a également pour objet un procédé de purification de l'APrT à partir de milieu de culture de levures la produisant, lequel procédé est caractérisé en ce que 1'APrT est purifiée par chromatographie de type DEAE sur une colonne échangeuse d'ions cationique, par une élution en 3 étapes - un gradient de KCl de 0 à 0,135 M - une phase isocratique à 0,135 M environ de KCl - un gradient de KCl de 0,135 M à 0,5 M, l'APrT étant recueilli à la fin de la phase isocratique. L'APrT peut également être purifié par chromatographie en phase inverse, ou par chromatographie d'affinité, à l'aide d'anticorps anti-trophoblastine. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et d'utilisation de l'APrT, et de démonstration de ses propriétés. Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : PRODUCTION ET PURIFICATION DE LA TROPHOBLASTINE RECOMBINANTE (APrT) a) Production de l'APrT dans la levure. La séquence d'ADN codant pour le précurseur de la trophoblastine ovine, telle que décrite dans la Demande PCT 89/08706 est clonée sous forme d'un fragment EcoRI dans le vecteur M13TG131 décrit dans l'article de M.P. KIENY et al., [Gene, 26:91 (1983)]. On obtient ainsi le vecteur M13TG771. Pour pouvoir isoler le fragment codant pour la protéine mature, c'est-à-dire, le fragment d'ADN sans la séquence signal, on crée, en 5' de la séquence mature de la protéine (Figure 1), un site HindîlI par mutagénèse dirigée en utilisant la trousse Amersham et ltoligonucléotide OTG2102 dont la séquence est la suivante : GAGGATCTCAAGCTTGTTACCTAT. Le brin antisens de la trophoblastine, porté par le vecteur M13TG771 simple brin, est représenté cidessous ligne I et l'oligonucléotide OTG2102 est représenté ligne II ; les étoiles * représentent les mésappariements qui vont provoquer les mutations recherchées. Ligne I : CT CCT AGA GAC CCA ACA ATG GAT A Ligne II : GA GGA TCT CAA GCT TGT TAC CTA T. ** * On obtient ainsi le vecteur M13TG7720. Les mutations ponctuelles qui ont été introduites dans la séquence codante induisent le remplacement des acides aminés Leucine en position -2 et Glycine en position -1 du précurseur de la trophoblastine respectivement par la glutamine et la Alanine. M13TG7720 est ensuite digéré par EcoRI et le fragment d'ADN EcoRI codant pour le précurseur muté de la trophoblastine est inséré dans le vecteur pTG769 (décrit dans la Demande de Brevet EP0258118 au nom de TRANSGENE) préalablement digéré par EcoRI. On obtient ainsi le vecteur pTG7901. D'autre part, pour produire la trophoblastine dans la levure, le fragment d'ADN codant pour la tropho blastine doit être mis sous le contrôle d'un promoteur de levure. Pour cela on utilise le vecteur M13TG3841, décrit dans la Demande de Brevet PCT déposée le 28 Avril 1990, dont le numéro de dépôt est FR90/00306, et qui contient en particulier - le promoteur du gène codant pour le facteur alpha 1 (MFalphal) ; - la séquence pré de MFalphal codant pour le peptide signal du précurseur du facteur alpha 1 ; et - la séquence pro de MFalphal. Un site de restriction SmaI est créé entre le deuxième et le troisième codon de la séquence pro de MFalphal par mutagénèse dirigée en utilisant la trousse Amersham et l'oligonucléotide OTG2072 dont la séquence est la suivante : TCCGCATTAGCTGCTCCCGGGAACACTACAACAGAA. Le brin antisens des séquences pré-pro de MFalphal, porté par le vecteur M13TG3841, est représenté ci-dessus ligne I et l'oligonucléotide OTG2072 est représenté ligne II ; les étoiles * indiquent les mésappariements qui vont provoquer les mutations recherchées. Ligne I AGG CGT AAT CGA CGA GGT CAG TTG TGA TGT TGT CTT Ligne II TCC GCA TTA GCT GCT CCC GGG AAC ACT ACA ACA GAA * ** SmaI On obtient ainsi le vecteur M13TG3869. Les mutations ponctuelles qui ont été introduites dans la séquence codante induisent le remplacement de l'acide aminé Glycine par la valine. Le vecteur pTG7901 est digéré par HindIII pour libérer le fragment d'ADN HindIII, codant pour la trophoblastine mature qui est ensuite traité à la nucléase Mung Bean. Ce fragment est inséré dans le vecteur M13TG3869 préalablement digéré par SmaI. On obtient ainsi le vecteur M13TG7740 qui comporte en séquence et en phase - le promoteur de MFalphal, - la séquence pré de MFalphal suivie des deux premiers codons de la séquence pro, soit ceux codant pour les acides aminés alanine et proline et, - le fragment d'ADN codant pour la trophoblastine ovine. Le fragment d'ADN SphI, issu du vecteur M13TG7740, comportant le promoteur de MFalphal, la séquence pré suivie des codons de l'alanine et de la proline et la séquence d'ADN codant pour la trophoblastine mature est inséré dans le vecteur de levure pTG3828 (décrit dans la Demande de Brevet PCT dont le numéro de dépôt est FR90/00306) préalablement digéré par SphI. On obtient ainsi le plasmide pTG7908. Une souche de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae de génotype MATalpha, ura3-251, -373, -328, leu2-3,-112,his3,pep4-3 est transformée par le plasmide pTG7908 par la méthode à l'acétate de lithium [H. ITO et al., J. Bacteriol. (1983) 153] et les prototrophes pour l'uracile (Ura+) sont sélectionnées sur un milieu YNBG (14 g/l de bases azotées pour levure (Yeast Nitrogen Base), 10 g/l de glucose) additionné avec 10 g/l de casaminoacides. Le variant Al-Pro-trophoblastine est produit par "Fed-Batch" dans un fermenteur de 20 L BIOLAFFITE. 12 l de milieu D kàppeli [A. FICCHTER et al., Adv. Microbial. Physiol. (1981), 22, 123-183] concentré 1,5 fois qui contienne 10 g/l de glucose et de HY Case SF (vendu par SHEFFIELD) sont ensemencés avec 400 ml d'une préculture d'un clone de levure transformé par pTG9708. Cette préculture est effectuée en erlenmeyer à 30"C sur un milieu sélectif YNBG. Avant la mise en route de la fermentation la DO600 du milieu ainsi ensemencé est de 0,2. La fermentation se fait à 30"C, à un pH de 4,5 contrôlé par adjonction d'une solution d'ammoniaque à 10% et à une pression partielle d'oxygène correspondant à 30% de la pression de saturation, maintenue constante par une régulation de l'agitation. Lorsque tout le glucose est consommé, la DO600 est mesurée (DO de départ de l'alimentation) et on commence l'alimentation en glucose par paliers exponentiels de 3 heures, sachant que le taux de croissance spécifique (F) est de 0,1 heurte~1 et que la quantité de glucose rajoutée (QS) est de 0,045 g/h/DO.La fermentation est arrêtée lorsque DO600 = 100, et la récolte se fait par centrifugation à 5000g. On obtient ainsi 13 l de surnageant de culture contenant le variant Ala-trophoblastine. b) Purification de l'APrT: Les surnageants de culture de levures sont centrifugés puis concentrés et dialysés contre 0,05M de tampon Tris-HCl, (pH 8,2) dans une cellule d'ultrafiltration(AMICON), sur membrane FILTRON retenant les molécules supérieures à 10 KDa. L'isolement de 1'APrT a été effectué à l'échelle semi-préparative par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), sur une colonne d'échangeurs d'anions TSK DEAE 5PW semi-préparative (150 x 21,5) équilibrée par du tampon Tris-HCl, 0,05M, pH 8,2. Le débit est de 4ml/mn. Après injection de l'échantillon, on procède à l'élution par un gradient de KCl de 0 à 0,135 M (tampon Tris-HC1, 0,05M, pH 8,2) pendant 90mn, suivi d'une phase de plateau isocratique à 0,135 M de KCl pendant 30 mn, puis d'un second gradient, jusqu'à 0,5M de KC1 pendant 80mn. L'élution est suivie par mesure de l'absorption à 280nm. Le pic correspondant à l'APrT est identifié à l'aide d'un immunsérum anti-trophoblastine naturelle (la similitude des propriétés antigéniques de l'APrT et de la trophoblastine naturelle est démontrée ci-dessous, à l'exemple 2), puis les fractions correspondantes sont recueillies. L'APrT sort à la fin de la phase de plateau isocratique à 0,135 M de KC1 La figure 1 illustre le profil d'élution obtenu ; le pic correspondant à l'APrT est hachuré. Le poids moléculaire apparent de l'APrT en électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS est d'environ 21 KDa. La figure 2 montre le profil électrophorétique obtenu (puits a : APrT ; puits b marqueurs de poids moléculaire). Exemple 2 : COMPARAISON DES PROPRIETES IMMUNOLOGIQUES DE L'APrT AVEC CELLES DE LA TROPHOBLASTINE NATURETLv L'existence de réactions croisées antigéniques entre l'APrT et la trophoblastine est évaluée par radioimmunoessai (RIA), en utilisant un antisérum polyclonal anti-trophoblastine, et une préparation de trophoblastine marquée à l'iode 125, selon le protocole décrit dans la Demande PCT 89/08706 Les courbes RIA d'inhibition obtenues dans ces conditions sont représentées à la figure 3 ; en abscisse est porté le Log de la dilution, et en ordonnée le Logit = Log (Bo/1-Bo) correspondant (Bo représente la concentration maximale de trophoblastine liée, pour une concentration constante d'antisérum anti-trophoblastine) - (g) témoin : préparation purifiée de trophoblastine ; ; Y= - 0,9572X - 0,2341 coefficient de régression linéaire = O, 9957 - (x) milieu de culture des levures sécrétant l'APrT (dilutions de 1 à 1/100) Y= - 0,9372X - 0,921 coefficient de régression linéaire = O, 9996 - (X) préparation d'APrT (dilutions de 1 à 1/4000) obtenue comme décrit à l'exemple 1, Y= - 0,9341X - 2,41 coefficient de régression linéaire = O, 9955 Ces courbes sont parallèles entre elles, ce qui démontre que les propriétés antigéniques de l'APrT sont similaires à celles de la trophoblastine naturelle. Exemple 3 : TEST D'ACTIVITE ANTIVIRALE L'activité antivirale de l'APrT est mesurée selon le protocole décrit par LA BONNARDIERE et LAUDE, [Infection and Immunity, 32, 28-31, (1981)], sur des cellules MDBK (Madin Darby Bovine Kidney), une lignée de cellules de rein de veau, en présence du virus de la stomatite vésiculaire. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus à partir d'un interféron de référence, qui est un interféron a porcin de classe I, d'un titre de 1 000 UI, lui-même étalonné par rapport au standard humain de référence Les résultats de ce test d'activité antivirale font apparaître une activité équivalente, pour les surnageant s de milieu de culture de levures (0,8 x 108 UI/mg), l'APrT purifiée (0,55 x 108 UI/mg), et la trophoblastine naturelle (0,7 x 108 UI/mg). Exemple 4: DEMONSTRATION IN VIVO DE L ACT L'ACTIVITE ANTILUTEOLYTIQUE DE L'APrT Animaux et traitement hormonal L'expérimentation a été menée chez 30 brebis de race Préalpes-du-Sud. Les cycles oestriens sont synchronisés au moyen d'éponges vaginales imprégnées de 300 mg de 17&alpha;-acétoxy-9&alpha;-fluoro-11ss-hydroxyprogestérone (SEARLE, INTERVET). Ces éponges sont laissées en place pendant 14 jours et le jour du retrait (J14), on injecte aux brebis, par voie intramusculaire, 500 UI de PMSG (pregnant mare serum gonadotrophin) ; 48h après, les brebis commencent un nouveau cycle (JO). Mise en place de cathéters intra-utérins Les brebis sont anesthésiées, puis, par laparotomie au niveau de la ligne blanche, l'opérateur accède à l'utérus et procède au marquage des corps jaunes à l'encre de Chine. Un cathéter stérile (SILASTIC, DOW CORNING) de 0,076 mm de diamètre interne, 0,165 mm de diamètre externe et de 70 cm de long est équipé d'un court manchon à l'une de ses extrémités, qui permet de maintenir en place le cathéter dans la corne utérine, sensiblement au niveau de la jonction utéro-tubaire. L'ouverture est refermée avec une aiguille sertie à un fil "catgut" (laboratoire BRUNEAU). Une suture en bourse est effectuée autour de l'orifice d'insertion du cathéter assurant le positionnement durable du dispositif. Un point de sécurité réalisé avec une aiguille sertie à de la soie (Laboratoire BRUNEAU) fixe le cathéter au ligament large. L'autre extrémité est fermée avec un fil de lin et une boucle est pratiquée, afin que l'opérateur, après avoir percé la paroi abdominale au niveau du flanc droit, puisse ressortir le cathéter en tirant sur la boucle. Un frein de SILASTIC a été placé à 30 cm de l'extrémité intra-utérine pour limiter la sortie du cathéter et servir de butée à l'intérieur de la paroi abdominale. Une longueur d'environ 40 cm est à la disposition de l'opérateur qui procède aux injections intrautérines.Un point effectué autour de l'orifice abdominale d'émergence du cathéter, renforce la solidité du dispositif. Les poses de cathéters sont pratiquées entre les 9e et île jours du cycle. Injections intra-utérines Trois lots de brebis ont été constitués : les injections intra-utérines commencent entre le 10ème et le 12ème jour du cycle, et sont effectuées 2 fois par jour, pendant 8 jours. L'APrT est en solution dans du sérum physiologique contenant 50 000 UI/ml de pénicilline G et de la BSA à 2'/.. Le volume de solution injecté est de îml. Lot A : C'est un lot témoin composé de 10 brebis qui reçoivent 2 fois par jour 1 ml de solution de BSA (fraction V, SIGMA) à 2ç/oo dans un sérum physiologique (NaCl 0,9%) contenant 50 000 UI/ml de pénicilline G. Lot B : Ce groupe est composé de 8 brebis auxquelles on a administré bi-quotidiennement 170 Ag d'APrT. Lot C : Ce groupe est composé de 4 brebis qui reçoivent 2 fois par jour 80 Rg d'APrT Lot D : 5 brebis reçoivent 2 fois par jour 340 Rg d'APrT. En fin d'expérimentation, toutes les brebis subissent une laparotomie exploratrice afin, d'une part, de vérifier que les cathéters sont restés bien en place et, d'autre part, de contrôler dans chaque lot la présence ou non de corps jaune(s) marqué(s) à ltencre de Chine. Dosage radioimmunologique de la progestérone Le sang des animaux est prélevé dans la veine jugulaire à l'aide de tubes Vacutainer (BECTON-DICKINSON) sans anticoagulant. La concentration de progestérone sérique est déterminée par dosage radioimmunologique direct sans extraction, selon le protocole décrit par HEYMAN et al.[J.Reprod.Fert., 70, 533-540, (1984)1. De la progestérone marquée au tritium et un immunsérum antiprogestérone spécifique (INSTITUT PASTEUR) sont utilisés pour ce dosage. Dans le lot A témoin, la concentration de progestérone dans le sang périphérique diminue brutalement chez l'ensemble des brebis à partir du 14è jour, pour atteindre des taux inférieurs à 0,5 ng/ml entre le 15e et le 17e jour post-oestrus. La durée moyenne du cycle est, dans ce lot, de 15,2 + 0,3 jours. L'administration de 80 Rg d'APrT par jour (lot C) ne prolonge pas cette durée. Dans le lot B, (170 Rg/jour) on constate au 14e jour du cycle un ralentissement de la chute de la progestéronémie par rapport au lot A : 7 brebis sur 8 présentent à ce stade des taux de progestéronémie supérieurs à l ng/ml (contre 4 sur 10 dans le lot A) ; au 15e jour du cycle, 5 brebis sur 8 présentent encore des taux de progestéronémie supérieurs à 1 ng/ml (contre 2 sur 10 dans le lot A). Dans ce lot, la lutéolyse est retardée en moyenne de 2 jours par rapport au lot A. Dans le lot D, l'administration intra-utérine d'APrT à la dose de 340 Ag/jour maintient la fonction lutéale bien au-delà de la durée du cycle normal chez quatre brebis sur 5 (25, 32, 45, et 64 jours respectivement, chez les brebis ne9037, 9431, 9458, et 9053)- Le profil moyen comparatif de sécrétion de progestérone entre les différents lots, représenté par la Figure 4 montre bien qu'il existe une persistance nette de l'activité lutéale dans le lot D. (W) Lot A (O) Lot B (X) Lot C (O) Lot D En outre, lors du contrôle chirurgical par laparotomie, aucun corps jaune néoformé n'a été constaté chez aucune des 4 brebis du lot D mentionnées ci-dessus, ce qui montre que la progestéronémie mesurée correspond à la persistance des corps jaunes cycliques antérieurs aux injections d'APrT. Des expériences précédemment réalisées montraient l'activité antilutéolytique de la trophoblastine naturelle, mais elles ne permettaient pas d'affirmer que la trophoblastine suffisait à elle seule pour prévenir la lutéolyse, et n'avaient pas permis de déterminer quel était le rôle des différentes isoformes de la trophoblastine.Or, les expériences décrites cidessus montrent que l'APrT obtenue à partir d'une seule isoforme suffit, à des doses appropriées, à inhiber la lutéolyse, et ce, en dépit des deux aminoacides supplémentaires de l'extrémité N-terminale Exemple 5 : DEMONSTRATION DES PROPRIETES IMMUNOSUPPRES SIVES DE L'APrT Ces propriétés ont été démontrées par trois types de tests permettant la mise en évidence de trois modes d'action immunologique différents - l'activité antimitotique, évaluée par l'action sur la prolifération des lymphocytes murins ou humains ; - l'activité d'inhibition de la réaction cytologique de rejet de greffe, évaluée grâce au test in vitro de la réaction lymphocytaire mixte (RLM); - l'activité immunorégulatrice sur la population des lymphocytes tueurs NK, indépendants des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC). 1) Action de 1'APrT sur la prolifération des lymphocytes murins activés par la phytohémagglutinine Des lymphocytes murins sont obtenus à partir de rate de souris C3H/He ou Balb/c après broyage au Potter et lavage deux fois dans du milieu de culture RPMI 1640 à 1500 t/mn pendant 10 mn. Enfin, les lymphocytes isolés sont mélangés dans le même milieu de culture, additionné de 10 % de sérum de veau foetal (SVF), à une concentration finale de 5 106 cellules/ml. Le milieu de culture est composé de 500 ml de RPMI 1640 (GIBCO) + 5 ml de pénicilline G/strep (GIBCO) + 5 ml de bicarbonate de sodium 7,5 % (GIBCO) + 5 ml de glutamine. 100 A1 par puits de milieu de culture contenant 6 X 105 lymphocytes à raison de 5 fg/ml PHA (WELLCOME) sont incubés avec 100 Rl d'une solution d'APrT à 3pLg/ml (108 UI/mg) ou 100 Rl de milieu de culture (contrôle) dans des plaques microtest de 96 puits à 37 C, dans une atmosphère d'air-CO2 (95 %-5 %), pendant 48h. La prolifération lymphocytaire est évaluée par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée. 25 F1 de thymidine 3H (0,04 mCi/ml) sont ajoutés à chaque puits et les cellules sont récoltées, 24 h après et déposées sur filtre (Glass Micro fibre Filters-GFM-WHATMAN). Après séchage, les filtres sont déposés dans des tubes auxquels on ajoute 1 ml de liquide de scintillation (ECONOFLUOR). La radioactivité est mesurée dans un compteur à rayonnement ss (BECKMAN). Les résultats sont illustrés par la Figure 5, qui montre que l'APrT inhibe de façon très marquée (55 %) la prolifération des lymphocytes murins traités à la PHA. A : Témoin B : APrT. La radioactivité en c.p.m. est portée en ordonnée 2) Action de l'APrT sur. une réaction lymphocytaire mixte Les réactions lymphocytaires mixtes sont réalisées en incubant par puits 150 1 de milieu de culture contenant 5.108 cellules réactives C3H/He par ml avec 5.106 cellules stimulatrices, isogéniques ou allogéniques, irradiées à 1 800 Rads/ml. On utilise des cellules de souris C3H/He pour la réaction isogénique et des cellules de souris Balb/c pour la réaction allogénique. On ajoute par puits 100 A1 d'APrT à 3pLg/mi (108 UI/mg) ou de milieu de culture (contrôle) dans des plaques microtest de 96 puits (FALCON 3072) à 37 C, et on laisse les cultures sous atmosphère gazeuse d'air-CO2 (95 % - 5 %) pendant 4 jours. La lyse lymphocytaire par les lymphocytes cytotoxiques produits au cours de la réaction lymphocytaire mixte est évaluée en mesurant l'incorporation de thymidine tritiée. 25 A1 de thymidine 3H sont ajoutés 24 h avant le prélèvement des lymphocytes et leur dépôt sur filtre. La mesure de la radioactivité des filtres est effectuée dans un compteur à scintillation Les résultats sont représentés Figure 6 A : Contrôle B : Trophoblastine naturelle C : APrT La radioactivité en c.p.m. est portée en ordonnée. En culture bidirectionnelle de lymphocytes provenant de deux souches de Souris (Balb/c et C3H/He), l'APrT inhibe à 90% la lyse des lymphocytes marins par les cellules cytotoxiques (CTL) produites. 3) Action de l'APrT sur la lyse cellulaire par les cellules NK Des cellules K562 (lignée érythroleucémique humaine) sont centrifugées 10 mn à 1800 t/mn et 0,5 ml de 51Cr sont déposés sur le culot. Après 1 h d'incubation à 37 C dans 5 % de C02-95 % d'air, les cellules sont lavées trois fois dans du milieu de culture RPMI et resuspendues dans le même milieu de culture, à la concentration de 2 X 105 cellules/ml. Trois types d'incubation en plaque de microtitration à 37 C,, dans une atmosphère air-CO2 (95 % - 5 %) sont réalisées en parallèle: - 100 A1 de cellules K562 marquées + 100 l de lymphocytes humains 50 à 100 fois plus concentrés + 100 Fl d'APrT à 3pLg/mi (108 UI/mg) ou de milieu de culture (témoin) permettent de déterminer les protéines radioactives du milieu expérimental (prot. rad. exp.) ; - 100 fl de cellules K562 marquées + 200 Fl d'HCl 4N permettent d'évaluer les protéines radioactives du milieu total (prot. rad. tot.) ;; - 100 1 de K562 marquées + 200 Fl de milieu de culture permettent de déterminer les protéines radioactives du milieu spontané (prot. rad. spont.). Après 4 h d'incubation, 100 fl de surnageant sont prélevés dans chaque puits et la radioactivité due à la libération de protéines marquées au 51Cr dans le milieu est comptée en cpm dans un compteur à rayonnement gamma. Les résultats sont exprimés en moyenne de pourcentage de lyse cellulaire d'échantillons et calculés selon la formule suivante cpm prot. rad. exp. - cpm prot. rad. spont. % de lyse = cpm prot. rad. tot. - cpm prot. rad. spont. La figure 7 montre les résultats obtenus A : Contrôle B : APrT C : IFN alpha D : IFN gamma Il apparaît donc nettement que l'APrT active la lyse cellulaire des cellules cible K562 par les cellules NK. Cette activation de la lyse cellulaire par les cellules NK est analogue à celle observée à partir d'interféron a humain de classe 1 et inférieure à celle de l'interféron r humain de référence Les exemples qui précèdent montrent que l'APrT présente des propriétés immunologiques et biologiques comparables à celles qui avaient été précédemment montrées pour la trophoblastine naturelle, ce qui permet son utilisation dans toutes les applications préconisées pour cette dernière. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente Invention. REVENDICATIONS 1") Applications de variants d' interféron a, de formule générale X1-Ro (I) ou bien X1-X2-RO (II) ou bien X1-X2-X3-R (III) dans laquelle X1, X2 et X3 sont identiques ou différents, et représentent chacun un acide aminé à chaîne latérale non polaire ou neutre, et Ro représente la séquence en acides aminés de la forme mature d'un interférona, pour l'obtention de médicaments ou de réactifs de diagnostic. 2") Applications selon la Revendication 1, caractérisées en ce qu'un variant dans lequel X1, X2 et X3 choisi dans le groupe constitué par l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, le tryptophane, la glycine, la sérine et la thréonine et Ro représente la séquence en acides aminés de la forme mature d'un interféron a, pour l'obtention de médicaments ou de réactifs de diagnostic. 3 ) Applications selon l'une quelconque des Revendications 1 ou 2, caractérisées en ce qu'un variant d'interféron a, de formule générale Ala-Pro-RO' (IV) dans laquelle Ro' est un interféron aII, est utilisé. 4 ) Application selon la Revendication 3, caractérisé en ce qu'un variant de formule générale Ai-Pro-R0, ' (V) dans laquelle Roi' représente un interféron aII d'origine ovine ou bovine, est utilisé. 5 ) Applications selon la Revendication 4 caractérisée en ce qu'un variant, dénommé APrT, de formule générale Ala-Pro-R,"' (VI) dans laquelle Ro"' représente la séquence en acides aminés de la forme mature de la trophoblastine, est utilisé. 6 ) Applications selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisées en ce qu'un variant d'interféron a, de formule générale I, II, III, IV, V ou VI est utilisé pour l'obtention de médicaments antiinflammatoires, antiviraux, antitumoraux, immunomodulateurs ou antilutéolytiques. 7 ) Applications selon la Revendication 6 caractérisées en ce que le variant d'interféron a utilisé est l'APrT de formule VI. 8 ) Application de l'APrT pour le traitement des embryons lors de leur transplantation. 9 ) Application de l'APrT pour l'obtention de réactifs permettant un diagnostic de viabilité des embryons à un stade précoce de leur développement. 10 ) Procédé de purification de l'APrT à partir de milieu de culture de levures, caractérisé en ce que l'APrT est purifié sur une colonne chromatographie, par une élution en 3 étapes - un gradient de KCl de 0 à 0,135 M - une phase isocratique à 0,135 M environ de KCl - un gradient de KCl de 0,135 M à 0,5 M, l'APrT étant recueilli à la fin de la phase isocratique.