Brevet FR2668889A1 — publié le 19920515

La présente Invention est relative à un procédé de contrôle de la bulbification et/ou de la dormance lors de l'obtention en vitroculture de plantes à bulbe et/ou de plantes appartenant à la famille des Liliacées. Les techniques de vitroculture végétale sont couramment utilisées en agronomie Une de leurs princi- pales applications est la multiplication végétative in vitro, ou micropropagation, qui permet théoriquement l'obtention de milliers de plants identiques à la plante mère, à partir d'une seule plante Cette technique a été utilisée avec succès pour la multiplication de nombreuses espèces végétales, à partir d'explants d'organes, de tissus ou de cellules. Toutefois, s'il est en général relativement aisé de maintenir en culture n'importe quel fragment d'une plante, la régénération de plantes entières pose d'autres problèmes, car elle implique le contrôle de nom- breux facteurs. Différents procédés de culture des plantes à bulbes ont été proposés, à partir de différents types d'explants issus de la plante mère: culture de méristèmes, cultures de fragments d'organes, cultures de cals, cultures d'embryons. De manière générale, les explants issus de la plante mère sont déposés sur un milieu de culture approprié; au bout d'un certain temps, on assiste à l'apparition de bourgeons, puis de pousses qui peuvent être repiquées individuellement; il est possible d'obtenir à partir de la base des pousses individualisées de nouveaux explants qui peuvent théoriquement être mis en culture pour un nouveau cycle de multiplication. De nombreuses recherches, ayant pour but la multiplication in vitro des plantes à bulbe ont été effectuées A titre d'illustration, il est possible de se référer à une revue bibliographique, concernant la culture in vitro de l'ail, de l'oignon et du poireau, qui a été faite par NOVÀK et ai lBiotechnology in Agriculture and Forestry; Vol 2: Crops I; Springer Verlag Eds, ( 1986)l. Il ressort des résultats des travaux réalisés jusqu'à présent, que s'il a été possible, dans certains cas, d'obtenir in vitro, et au bout d'un cycle de multi- plication, des plantules individualisées à partir de fragments d'une plante mère, de nombreux problèmes se sont posés pour effectuer des cycles de multiplication ultérieurs. C'est ainsi, par exemple, que MATSUBARA et HIHARA lJ Jap Soc Hort Sci, 46 ( 4), 479-486, ( 1978)l ont réalisé un premier cycle de multiplication de l'oignon, mais n'ont pas controlé la bulbification observée, ni poursuivi la production de plantules in vitro au cours de cycles ultérieurs FUJIEDA et al lJ. Jap Soc Hort Sci, 48 ( 2), 186-194, ( 1979)l, sont également parvenus à effectuer un premier cycle de multiplication, mais n'ont pas réussi à produire une seconde génération de plantules à partir des pousses axillaires qu'ils ont obtenues. Ultérieurement, HUSSEY lScientia Hortic, 9, 227-236 ( 1978)l, puis HUSSEY et FALAVIGNA lJ Exp Bot. 31: 125 1675-1686 ( 1980)l ont tenté d'effectuer plusieurs cycles de multiplication de l'oignon in vitro: ils ont ainsi constaté que les possibilités de cette technique étaient limitées par une baisse du coefficient de multiplication, et un arrêt de végétation de plus en plus précoce des plantules obtenues, au fil des généra- tions Ces résultats ont été confirmés, un peu plus tard, sur le narcisse lHUSSEY Ann Bot 49 701-719 ( 1982)l. Les phénomènes de blocage de végétation décrits par ces auteurs, bien que pouvant s'accompagner de la formation d'un "pseudo- bulbe" résultant du renflement de la base de la tige, ne sont pas 3 parfaitement similaires à ceux observés lors du processus de bulbification Au cours de la bulbification, la formation d'un organe de réserve à la base de la plante s'accompagne en effet de la sénescence de l'appareil5 aérien, de l'arrêt du fonctionnement racinaire, et de l'entrée en dormance, c'est-à-dire de la non-reprise de végétation des organes bulbifiés, même cultivés dans des conditions favorables Or, dans le processus décrit par HUSSEY et FALAVIGNA, il n'y a pas de sénescence des parties aériennes, pas de vieillissement des racines, et pas de dormance vraie. Le déclenchement trop précoce d'un tel blocage de végétation doit être évité lors de la micropropagation in vitro des plantes à bulbe, car il oblige à une interruption de culture entre chaque cycle, ce qui diminue considérablement le rendement de la micropropagation in vitro, et par là même, l'intérêt de son utilisation. En revanche, en fin de culture, il serait sou- haitable de procéder à l'induction d'une véritable bulbification pour obtenir des bulbes comparables aux bulbes cultivés in vivo et prêts à être repiqués en pleine terre. Il serait donc particulièrement souhaitable de pouvoir contrôler, in vitro, le processus conduisant à la bulbification et à l'entrée en dormance afin de pouvoir soit le prévenir, soit au contraire l'induire au moment opportun. Il est connu que la bulbification chez les plantes à bulbes cultivées en pleine terre est en rapport avec des variables telles que la durée et l'intensité de l'éclairement, et la température. Les observations faites sur des plantes cultivées en pleine terre ne sont pas directement trans- posables in vitro, car il est pratiquement impossible de reproduire expérimentalement l'ensemble des variables 4 complexes qui conditionnent le comportement des plantes cultivées en champ En conséquence, le processus de bulbification in vitro, ainsi que les paramètres susceptibles de l'influencer ont fait l'objet de5 plusieurs études Celles ci n'ont toutefois pas abouti à la mise en évidence du ou des facteurs essentiels dans le déclenchement de ce processus in vitro. Une étude de HEATH et HOLLIES lJ Exp Bot. 16 ( 46), 128-144 ( 1965)l définit la bulbification par des critères morphologiques, qui sont essentiellement: le renflement de la base (quantifié par le rapport de bulbification, qui est égal au rapport du diamètre maximum à la base sur le diamètre au collet), et la présence d'écailles sur le bulbe formé. Ces auteurs indiquent que la bulbification, telle qu'ils la définissent peut être induite, in vitro, par l'utilisation d'un milieu de culture riche en sucres. Il a également été supposé que des substances telles que les auxines, les cytokinines, ou l'acide abscissique pouvaient favoriser la bulbification. Il a d'autre part été proposé, pour tenter de prévenir la bulbification en cultures in vitro, de soumettre lesdites cultures à des photopériodes courtes, d'environ 8 heures, ainsi que d'enrichir le milieu de culture en hormones de croissance, du type auxines, ou cytokinines l BHOJWANI Scientia Hortic 13 47-52 ( 1980)l, lHUSSEY Scientia Hortic, 9, 227-236-( 1978)l, lHUSSEY et FALAVIGNA, J Exp Bot 31 ( 125), 1675-1686 ( 1980)l, HUSSEY lAnn Bot 49 701-719 ( 1982)l Ces tentatives n'ont pas abouti, de façon satisfaisante à l'obtention de bulbes comparables à ceux qui sont formés lors de cultures en pleine terre, à partir de semences. Il apparaît donc que jusqu'à présent, il n'a pas été possible de mettre en évidence le ou les facteurs induisant le processus de bulbification in vitro, et qu'aucun des procédés proposés pour contrôler ce processus, soit qu'il s'agisse de l'éviter pour améliorer le rendement de la micropropagation in vitro, soit qu'il s'agisse de le provoquer pour obtenir des bulbes viables, ne s'est montré réellement efficace.5 La présente Invention s'est fixé pour but la mise au point d'une méthode de culture permettant le contrôle de l'entrée en dormance et/ou de la bulbification, au cours de la micropropagation in vitro des plantes à bulbe.10 La micropropagation in vitro est consituée par une succession de cycles de multiplication Un cycle de multiplication est défini comme la succession des trois étapes suivantes: une première étape, dite de régénération axillaire, dans laquelle des bourgeons sont régénérés à partir d'explants; une deuxième étape, dite de croissance et développement en touffes herbacées, dans laquelle les bourgeons donnent naissance à des plantes qui se développent en touffes; une troisième étape, dite d'individualisation, dans laquelle les touffes sont divisées en plantules qui sont cultivées individuellement jusqu'à enracinement et épaississement basal. Au sens de la présente invention, on entend par bulbification le processus qui provoque chez un vitroplant entier: le renflement de la base, qui peut être évalué par le rapport de bulbification, défini plus haut; la sénescence de l'appareil aérien; l'arrêt du fonctionnement racinaire l'entrée en dormance, c'est à dire la non reprise de la végétation des organes bulbifiés cultivés en conditions favorables (environ 20 'C, 12 à 16 heures de jour, et arrosages réguliers). L'Inventeur est parvenu à agir sur les para- mètres de culture, de façon à obtenir d'une part, la succession de cycles de multiplication, sans bulbifica- tion et sans entrée en dormance ni arrêt de végétation5 des plantules obtenues, et d'autre part, l'induction de la bulbification au moment souhaité; la présente invention résulte en particulier de la constatation, faite par l'Inventeur, que le facteur déclenchant de la bulbification in vitro est le rapport spectral rouge/rouge sombre de la source d'éclairage. L'éclairement des plantules, pendant 14 heures minimum par période de 24 heures, par une lumière contenant une proportion appropriée de radiations dans le rouge sombre suffit à induire le processus de bulbification, sans qu'il soit nécessaire d'agir-sur les autres conditions de culture. La présente Invention a pour objet un procédé permettant la micropropagation in vitro des plantes à bulbe et/ou des Liliacées par une succession de cycles de multiplication, lequel procédé est caractérisé en ce que le contrôle de la dormance et/ou de la bulbification est effectué en modifiant le rapport entre l'énergie émise dans la région rouge (entre 600 et 700 nm), et l'énergie émise dans la région rouge sombre (entre 700 et 800 nm) par la source d'éclairage des cultures in vitro. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention,il comprend au moins l'une des deux phases suivantes: a) une phase de prévention de la bulbification, comprenant au moins un cycle de multipli- cation, dans lequel une photopériode comprenant entre 12 et 16 heures d'éclairement sur 24 heures est établie pendant la deuxième (croissance et développement en touffes herbacées) et la troisième étape (individualisation des plantules), et durant cette photo- période, l'éclairement des plantules est assuré par des sources lumineuses dont le rapport entre l'énergie émise, dans la région rouge et dans la région rouge sombre est supérieur ou égal à 4; b) une phase d'induction de la bulbification, comprenant un cycle de multiplication dans lequel une photopériode d'au moins 16 heures d'éclairement sur 24 heures est établie pendant la deuxième et la troisième étape, et durant cette photopériode, l'éclairement des plantules est assuré par au moins une source lumineuse dont le rapport rouge/rouge sombre est inférieur ou égal à 4. La première phase est mise en oeuvre dès le premier cycle et jusqu'à l'avant dernier cycle de multi- plication; cette phase permet de réaliser, sans bulbifi- cation et sans entrée en dormance, autant de cycles de multiplication qu'on le désire, pour obtenir le nombre de plantules souhaité; à titre d'exemple, si l'on réalise de la sorte 2 à 3 cycles de multiplication, on obtient en un an 6000 à 8000 plantules à partir d'une plante mère. Lorsque l'on souhaite obtenir des bulbes, on réalise un dernier cycle de multiplication en mettant en oeuvre la phase d'induction de la bulbification. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, l'étape de régénération axillaire de chaque cycle de multiplication est effectuée en présence d'au moins une substance de croissance. Les substances de croissance indispensables pour obtenir une bonne régénération des bourgeons sont des cytokinines, par exemple la 6-benzylamino-purine utilisée à une concentration de 0,5 à 10 mg/l; la kiné- tine, utilisée à une concentration de 1 à 20 mg/l, la 2- iso-pentenyl-adénosine, utilisée à une concentration de l'ordre de 1 à 20 mg/l D'autres substances sont égale- ment bénéfiques à la régénération: il s'agit par exemple des auxines, telles que l'acide naphtalène-acétique, utilisé à une concentration de 0, 1 mg/l, ou de la L-tyrosine, à une concentration de 10 à 100 mg/l Des substances à activité comparable aux auxines et aux cytokinines peuvent également être utilisées; il s'agit par exemple du piclorame (analogue des auxines) ou du dithiazuron (analogue des cytokinines); ces substances sont généralement utilisées à des concentrations de l'ordre de O,lmg/ml. D'autres paramètres du milieu de culture ont également une influence favorable sur l'étape de régéné- ration axillaire des bourgeons: la concentration en sucres est de préférence comprise entre 30 et 50 g/i; la concentration en gélifiant est comprise entre 5 et 10 g/i d'agar. Les conditions de lumière et de température n'ont pas une influence déterminante sur l'étape de régé- nération axillaire; la néoformation de bourgeons peut avoir lieu en jours continus ou à l'obscurité, et à des températures variant de + 5 à + 35 C. Si on le souhaite, il est possible à la fin de l'étape de régénération axillaire d'un cycle de multipli- cation, de baisser la température du milieu de culture jusqu'à + 10 C, ce qui a pour effet de stopper la crois- sance, et permet de conserver des plantules viables pendant au moins 6 mois sur le même milieu. De manière avantageuse, au cours de la phase de prévention de la bulbification, la deuxième et la troisième étape du ou des cycle(s) de multiplication sont effectuées sur un milieu dépourvu de facteurs de crois- sance. Préférentiellement, ledit milieu comprend au moins 20 meq de NH 4 +, au moins 20 meq de NO 3-, au moins 3 meq de P 043 et entre 30 g/i et 60 g/i de carbohydrates; De manière avantageuse, au cours de la phase de prévention de la bulbification, la deuxième et la troisième étape du ou des cycle(s) de multiplication sont effectuées à une température diurne comprise entre + 20 et + 30 'C et supérieure d'au moins + 1 i C à la température nocturne. La bulbification peut être accélérée par des facteurs tels que l'augmentation de la teneur en sucres du milieu, la diminution des concentrations en sels minéraux, la présence d'acide abscissique ou d'autres substances de croissance, la culture à température élevée. Avantageusement, au cours de la phase d'induction de la bulbification, la deuxième et la troi- sième étape du cycle de multiplication sont effectuées sur un milieu comprenant entre 30 et 80 g/l de sucres. Si on le souhaite, il est également possible d'ajouter au milieu entre 0 et 5 mg/l d'acide abs- cissique, et/ou entre O et 5 mg/l d'au moins une cytokinine. Lorsque cela est souhaitable, au cours de la phase d'induction de la bulbification, la deuxième et la troisième étape du cycle de multiplication sont effectuées à une température diurne comprise entre + 25 et + 35 C et à une température nocturne comprise entre + 15 et + 30 'C. Une telle association de la thermopériode avec la photopériode est recommandée pour certaines espèces, comme l'oignon; elle pourra être différente pour d'autres espèces Pour chaque espèce, une association thermopériode-photopériode appropriée peut être déterminée à partir des conditions optimales de culture en champ, qui sont connues en elles-mêmes de l'homme de l'art. Les milieux de base utilisables dans le cadre de la présente invention sont, de manière générale, tous les milieux habituellement utilisés pour la vitroculture de plantes, par exemple le milieu de MURASHIGE et SKOOG lPhysiol Plant 15, 473-477, ( 1962)1, le milieu de DUNSTAN et SHORT lActa Hort, 78, 139-148 ( 1977)l, ou des milieux dérivés de ceux-ci. L'intensité de l'éclairement au niveau des plantes peut varier de 1000 à 10 000 lux, soit, en lumière blanche fluorescente, de 5 à 100 J E m-2 s L'éclairage doit comporter un apport de lumière blanche fluorescente du type "cool white" ou "warm white". La présente Invention englobe également les bulbes et plantules obtenus en mettant en oeuvre le procédé conforme à l'invention. Les bulbes obtenus par le procédé conforme à l'invention sont réguliers, dormants et viables à 100 %; ils sont facilement acclimatables en pleine terre, et sont inductibles à fleurir dans l'année suivant leur transplantation en champ; ils se distinguent en outre des bulbes obtenus en pleine terre et issus de semences, par leur homogénéité génotypique, qui se traduit par une homogénéité phénotypique que ne présentent pas ces derniers. Ils se distinguent d'autre part des pseudo- bulbes obtenus par des procédés connus dans l'art antérieur (milieux de culture à forte teneur en sucre et/ou en facteurs de croissance) par les caractéristiques suivantes: les bulbes obtenus conformément à l'invention présentent une période de dormance d'au moins un mois; ils peuvent être facilement stockés et transportés, de la même manière que les bulbes obtenus en champ. comme ils peuvent être obtenus sur des milieux comparativement moins riches en sucre que les milieux préconisés dans l'art antérieur, leur teneur en sucres solubles est généralement inférieure (d'au moins 1 Brix sur l'échelle réfractométrique) à celle des pseudo-bulbes obtenus par culture sur ces derniers; il quelle que soit la teneur en sucre des milieux de culture, les vitrobulbes conformes à l'invention ont une teneur élevée en oligosaccharides de degré de polymérisation supérieur à 6: à maturité, au5 moins 10 % de leur sucres hydrosolubles non-réducteurs sont sous la forme d'oligofructanes Les pseudo-bulbes connus dans l'art antérieur sont pratiquement dépourvus d'oligosaccharides dont le degré de polymérisation est supérieur à 6. le rapport de bulbification des vitrobulbes obtenus conformément à l'invention est supérieur ou égal à 4 ( 0,6), alors qu'il est inférieur à cette valeur chez les pseudo-bulbes de l'art antérieur, obtenus sur des milieux enrichis en substances de croissance. Le procédé de contrôle de la bulbification et de la dormance conforme à l'Invention est applicable à la micropropagation in vitro de toutes les plantes à bulbes, en particulier des Liliacées Il est particulièrement bien adapté à la micropropagation des Alliacées à bulbe, comme l'oignon (Allium cepa), l'ail (Allium sativum), l'échalote (Allium ascalonicum). Il est bien entendu possible de mettre en oeuvre seulement l'une des deux phases du procédé conforme à l'invention Par exemple, lorsque seules les conditions de prévention de la bulbification et/ou de la dormance sont mises en oeuvre, le procédé peut être utilisé dans la micropropagation d'espèces comme le poireau (Allium porrum), pour éviter l'entrée en dormance. Ceci permet de nombreuses applications, parmi lesquelles il est possible de citer à titre d'exemple: la constitution d'une collection de clones à forte valeur génétique (mâles stériles, haploïdes ou polyploïdes, lignées pures d'allogames, etc), les clones obtenus pouvant être soit conservés en culture sans dégénérescence, soit stockés sous forme de bulbes viables induits in vitro l'endomycorhization in vitro des espèces précitées, qui constitue une application particulièrement avantageuse: en effet, les endomycorhizes qui sont des champignons symbiotes des végétaux supérieurs ne peuvent se développer qu'au contact des cellules végétales vivantes du système racinaire, ce qui oblige à entretenir des plantes en serre spécialement pour conserver et multiplier lesdits champignons L'entretien et la multiplication in vitro des Alliacées qui sont très mycotrophes à un stade de leur multiplication offre la possibilité de constituer in vitro un conservatoire actif de souches d'endomycorhizes. Ceci permet un gain d'espace, de main d'oeuvre, assure la pureté de la population d'endomycorhizes, et facilite l'échange de celles-ci directement sous forme de champignons. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de procédés conformes à l'invention Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I CONDITIONS GENERALES DE CULTURE IN VITRO 1) PREPARATION DES EXPLANTS ET TECHNIQUES DE DESINFECTION a) Sur inflorescence Les organes floraux sont prélevés sur des plantes cultivées en plein champ, 12 heures au plus avant leur désinfection Les hampes florales sont éliminées et les spathes fermées immergées dans l'éthanol 95 % pendant une minute Les inflorescences identifiées sont ensuite désinfectées dans une solution à 37 g/1 d'hypochlorite de calcium ( 70 % de chlore actif) pendant 15 minutes puis rincées trois fois à l'eau stérile Les explants tirés de l'inflorescence sont débarrassés de l'enveloppe de la spathe et placés face inférieure sur le milieu de culture. Le milieu de culture se compose des éléments du milieu de MURASHIGE ET SKOOG additionnés des vitamines de MOREL ET MARTIN (cf Tableau I), de 20 g/l de saccharose, 7 g/l d'agar (BACTO) et d'hormones de croissance ( 0,5 g/1 d'acide naphtalène acétique et 2,0 g/l de benzyl-amino-purine) Les cultures sont placées à 22- 260 C sous 16 heures de photopériode (tubes fluorescents General Electric cool white 95 W) et j s E i s. b Sur bulbe d'oignon Les tissus prélevés se réduisent aux dix premières feuilles et ébauches foliaires de chaque apex enfermé dans un bulbe, chaque germe ainsi défini étant relié au plateau basal Les germes à désinfecter sont préparés proprement, mais non stérilement en coupant le bulbe horizontalement en deux, en éliminant les écailles charnues communes à tous les germes, en découpant la base racinaire du bulbe, pour finalement ne conserver que les 3 premiers cm de chaque germe (écailles et feuilles) dont 0,5 cm de plateau basal, et moins de 2,5 cm de diamètre. On prend soin de laver chaque germe dans de l'eau tiède ( 50 'C) savonneuse (Steepo) et de le rincer à l'eau avant de l'immerger 15 minutes dans l'éthanol à 95 % suivi par un bain de 40 minutes dans l'hypochlorite de calcium à 37 g/l (Prolabo). En ambiance stérile, les germes sont rincés trois à quatre fois à l'eau distillée autoclavée Les explants sont préparés en éliminant deux à trois écailles externes, ce qui réduit le diamètre et la taille des germes à 1 cm, et en découpant radialement au scalpel le germe en quatre ou six sections égales, détruisant par le fait l'apex central Chaque section représente un expiant, qui n'excède pas 0,5 cm 3 avec 8 segments de feuilles ou écailles maximum. c Sur vitroplant Les plantes cultivées in vitro sont individua- lisées et l'on ne conserve d'elles que le plateau basai et 0,8 cm de feuilles au-dessus Les racines en particulier seront coupées au niveau du plateau racinaire Le "fût" de 0,8 cm de long mesure entre 0,5 et 1,5 cm de diamètre et comporte huit à dix bases foliaires La préparation des explants consiste à couper le fût en deux suivant l'axe radial, puis de recouper radialement chaque moitié en deux parties égales ce qui achève de détruire le dôme apical. 2 MILIEUX DE CULTURE La composition du milieu de culture de base (MS) est la suivante: macro et micro-éléments de MURASHIGE ET SKOOG, vitamines de MOREL ET MARTIN lC.R Ac Agric Fr, 41, 472-475, ( 1955)l diluées de moitié, agar bacto (DIFCO) ( 6 5 g/l) Quand elle n'est pas précisée, la teneur en sucre est de 40 g/l de saccharose très pur (Merck) Le p H est ajusté à 5,7 avec une solution normale de potasse ou d'acide chlorhydrique. Le milieu est autoclavé à 112 'C ( 1 bar) pendant 20 minutes. Les substances de croissance et autres composants apportés au milieu de base ainsi défini sont incorporés avant d'ajuster le p H et autoclaves. Les récipients de culture sont soit des tubes à essai ( 160 x 24 mm) en verre non hermétiquement clos contenant 13 ml de milieu, soit des bocaux en verre de 500 ml, remplis avec 100 à 150 ml de milieu et clos par un bouchon à vis. 3) CONDITIONS D'ENVIRONNEMENT a) Salles climatisées Trois salles peuvent héberger les vitro- cultures Leurs caractéristiques sont indiquées dans le Tableau I suivant: TABLEAU I NUMERO DE TEMPERATURES ECLAIREMENT SALLE (et hygrométrie) A 15 C la nuit ( 50 % HR) 12 heures de nuit C le jour ( 90 % HR) 12 heures de jour LE s-1 m-2 B 22 C la nuit ( 50 % HR) 8 heures de nuit C le jour ( 70 % HR) 16 heures de jour g E S-1 m-2 C 20 C la nuit ( 50 % HR) 12 heures de nuit C le jour ( 70 % HR) 12 heures de jour g E s-1 m-2 La lumière blanche fluorescente est fournie par des tubes GENERAL ELECTRIC de type Cool White de 2 m de long et 95 W de puissance nominative. b) Enceintes climatisées Ces enceintes sont prévues pour des températures allant de + 5 à + 30 C 1 5 C La thermopé- riode est couplée avec la photopériode, qui est un paramètre à définir L'éclairage est fourni par trois tubes fluorescents Ostram Weiss White (Lumilux) de 40 cm de long et 15 W de puissance nominative A 25 C la quantité de lumière émise par trois tubes fluorescents est de 60 à 70 k E s-l m-2 L'hygrométrie doit être proche de 50 % H R tout au long de l'année. c) Chambre froide La chambre froide est une pièce d'environ m 3 climatisée et éclairée 12 heures sur 24 La tempé- rature y varie de + 1 à + 5 C au niveau des récipients de culture L'éclairage faible ( 10 g E m-2 s-1) peut être amené à 70 g E m-2 s-1 par deux tubes fluorescents General Electric de 95 W L'hygrométrie y est inférieure à 40 % d'H R. d) Eclairement La quantité de lumière active sur la photosyn- thèse (PAR) est mesurée par un radiophotomètre (LI-COR, Inc modèle LI 185 B avec cellule LI 190 SB) au niveau des plantes mais à l'extérieur des récipients de culture; elle s'exprime en g E s-l m-2 II CONTROLE DE LA BULBIFICATION 1 Introduction à partir d'inflorescence et de bulbe Les milieux utilisés sont ceux de base (MS) avec 30 g/l de saccharose auxquels on apporte 0 2 mg/l d'acide naphtalène acétique et 2 0 mg/l de benzyl-amino- purine Les explants sont cultivés dans les conditions de la salle B. 2 Etape de régénération et néoformation axillaire Les substances de croissance ajoutées au milieu de base sont l'acide naphtalène acétique ( 0 20 mg/l à partir d'une solution aqueuse à 10-4 g/l), la kinétine et la 2-iso-pentényl-adénosine ( 2 5 à 5 0 mg/l à partir d'une solution aqueuse à 10-4 g/1) et la benzyl- amino-purine ( 2 0 à 2 5 mg/l à partir d'une solutions aqueuse à 10-4 g/l) Les conditions générales d'environnement sont celles de la salle B. 3 Etapes de croissance et développement herbacés, et d'individualisation des plantules a) En conditions de prévention de la bulbifi- cation: Ces étapes sont effectuées en l'absence de substances de croissance et le milieu MS de base est 17 enrichi avec 300 mg/i d'orthophosphate de sodium et 40 mg/i d'adénine. Les conditions de culture sont celles de la salle B; l'éclairage permet de maintenir un rapport rouge/rouge sombre égal à 6; 8 cycles successifs ont ainsi été effectués à partir d'un bulbe d'oignon; au huitième cycle, à partir de 96 explants issus des plantules obtenues au 7 ème cycle, 80 ont régénéré des bourgeons ( 816 bourgeons),10 soit un taux de régénération de 83 % A titre de comparaison, le bulbe initial avait donné 24 explants dont 11 avaient régénéré des bourgeons ( 43 bourgeons), soit un taux de régénération de 46 %. b) En conditions d'induction de la bulbifica- tion: Le milieu de culture du vitroplant individua- lisé est le milieu MS de base, auquel est ajouté du saccharose, pour une concentration finale de 40 g/l. Les conditions de culture sont les suivantes Photopériode de 16 heures de jour; l'éclairage est fourni par les sources lumineuses de la salle B enrichies en rouge sombre par l'adjonction d'ampoules à incandescence de 25 W, à raison d'une ampoule pour 1,5 m 2, ce qui permet de maintenir un rapport rouge/rouge sombre égal à 1,2; La température est maintenue à 22 C pendant la nuit, et 250 C pendant le jour. III ACCLIMATATION EX-VITRO Les vitrobulbes obtenus au bout d'un cycle de multiplication dans les conditions d'induction de la bulbification décrites ci-dessus sont séchés pendant une semaine à température ambiante, avant d'être placés sur un mélange tourbe/gravier arrosé tous les 3 jours. La durée de la dormance varie selon les condi- tions climatiques; elle est d'environ 65 jours en jours courts (inférieurs à 12 heures), et à une température de 'C constante, ainsi qu'en jours longs, à température constante de 9 C, de 40 jours environ en jours longs, à température nocturne de 20 'C et diurne de 250 C, et de 35 jours environ si les bulbes sont placés en jours longs, à température constante de 90 C pendant 20 jours, puis à température nocturne de 20 'C et diurne de 25 C. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente Invention. REVENDICATIONS 1) Procédé permettant la micropropagation des plantes à bulbe et/ou des Liliacées par une succession de cycles de multiplication in vitro, chacun desdits cycles comprenant trois étapes, lequel procédé est caractérisé en ce que le contrôle de la dormance et/ou de la bulbifi- cation des plantes cultivées in vitro est effectué en modifiant le rapport entre l'énergie émise dans la région rouge, et l'énergie émise dans la région rouge sombre par la source lumineuse assurant l'éclairage desdites plantes. 2) Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'une des deux phases suivantes: a) une phase de prévention de la bulbifica- tion, comprenant au moins un cycle de multiplication, dans lequel une photopériode comprenant entre 12 et 16 heures d'éclairement sur 24 heures est établie pendant la deuxième et la troisième étape, et durant cette photopé- riode, l'éclairement des plantules est assuré par des sources lumineuses dont le rapport entre l'énergie émise, dans la région rouge et dans la région rouge sombre est supérieur ou égal à 4; b) une phase d'induction de la bulbification, comprenant un cycle de multiplication dans lequel une photopériode d'au moins 16 heures d'éclairement sur 24 heures est établie pendant la deuxième et la troisième étape, et durant cette photopériode, l'éclairement des plantules est assuré par au moins une source lumineuse dont le rapport rouge/rouge sombre est inférieur ou égal à 4. 3) Procédé selon la Revendication 2, caracté- risé en ce que pendant la phase d'induction de la bulbification, le rapport rouge/rouge sombre de la source lumineuse assurant l'éclairement des plantules est inférieur ou égal à 2 4) Procédé selon l'une quelconque des Revendi- cations 2 ou 3, caractérisé en ce que la première étape de chaque cycle de multiplication est effectuée en présence d'au moins une substance de croissance. 5) Procédé selon une quelconque des revendications 2 à 4 caractérisé en ce que, au cours de la phase de prévention de la bulbification, la deuxième et la troisième étape du ou des cycle(s) de multiplication sont effectuées sur un milieu dépourvu de facteurs de croissance. 6) Procédé selon la Revendication 5, caracté- risé en ce que le milieu comprend au moins 20 meq de NH 4 +, au moins 20 meq de NO 3-, au moins 3 meq de P 043 et entre 30 g/l et 60 g/l de sucres; 7) Procédé selon l'une quelconque des Revendi- cations 2 à 6, caractérisé en ce que, au cours de la phase de prévention de la bulbification, la deuxième et la troisième étape du ou des cycle(s) de multiplication sont effectuées à une température diurne comprise entre + 20 et + 30 'C et supérieure d'au moins + 1 i C à la tempéra- ture nocturne. 8) Procédé selon l'une quelconque des Revendi- cations 2 à 7, caractérisé en ce que, au cours de la phase d'induction de la bulbification, la deuxième et la troisième étape du cycle de multiplication sont effec- tuées sur un milieu comprenant entre 30 g/l et 80 g/1 de sucres 9) Procédé selon l'une quelconque des Revendi- cations 2 à 8, caractérisé en ce que, au cours de la phase d'induction de la bulbification, la deuxième et la troisième étape du cycle de multiplication sont effec- tuées sur un milieu comprenant entre O et 5 mg/l d'acide abscissique, et/ou entre O et 5 mg/l d'au moins une cytokinine. 10) Procédé selon l'une quelconque des Revendications 2 à 9, caractérisé en ce que, au cours de 21 la phase d'induction de la bulbification, la deuxième et la troisième étape du cycle de multiplication sont effec- tuées à une température diurne comprise entre + 25 et + 35 C et à une température nocturne comprise entre + 15 et + 30 C. 11) Procédé de contrôle de la bulbification, selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il com- prend uniquement la phase de prévention de la bulbification. 12) Procédé de contrôle de la bulbification, selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend uniquement la phase d'induction de la bulbification. 13) Bulbes et plantules caractérisés en ce qu'ils sont obtenus en mettant en oeuvre au moins l'un des procédés selon l'une quelconque des Revendications 1 à 12.