Brevet FR2660864A1 — publié le 19911018

La présente invention se rapporte à une composition modifiant le contraste en imagerie aux rayons X, en résonance magnétique nucléaire (IRM) ou aux ultrasons. Elle se rapporte également à un procédé de préparation de cette composition et en son application en angiographie, en imagerie du volume et du débit sanguin d'organes, et en suivi par exemple des ischémies et infarctus sans réinjection. L'imagerie en rayons X repose sur des différences d'atténuations des rayons X d'un tissu à l'autre. Les structures anatomiques ont des opacités radiologiques différentes, qui se traduisent en contrastes radiologiques. Ce contraste est dû à des différences de densité moyenne et de composition anatomique. I1 peut être produit artificiellement. C'est ainsi qu'un organe creux peut être rendu visible en le remplissant d'un produit de contraste, ou en remplaçant son contenu liquide par un produit de contraste, par exemple de l'air pour la ventriculographie cérébrale et des solutions iodées pour la radiographie des vaisseaux. Certains organes peuvent aussi être visualisés par l'introduction dans la circulation d'un produit de contraste qui se concentre dans ces régions. C'est le cas notamment pour l'urographie ou la cholecystographie. Pour la visualisation du système vasculaire en rayonsX, on utilise des produits de contraste iodés hydrosolubles, qui après injection par voie vasculaire, se répartissent dans le système vasculaire et l'espace interstitiel. Ils ne sont pas métabolisés et sont éliminés rapidement par voie urinaire. Ces produits sont caractérisés par une forte diffusion extravasculaire qui nécessite l'injection du produit en bolus et éventuellement des réinjections à intervalles réguliers pour maintenir le contraste à un niveau suffisant. Dans l'imagerie en résonance magnétique, un champ magnétique principal homogène et un champ électromagnétique à haute fréquence perpendiculaire au premier sont appliqués au tissu examiné. Les images formées sont reconstituées à partir de signaux émis par les atomes de l'organisme. Quand le second champ est interrompu, l'énergie absorbée par la matière lors du processus d'excitation est restituée par les noyaux dont le moment magnétique va à nouveau s'aligner avec la direction du champ magnétique principal. La faible énergie émise dite énergie de précession décroît selon un phénomène de relaxation. La relaxation se décompose en deux processus - une relaxation spin-spin, caractérisée par une constante de temps T2, - une relaxation spin-réseau, caractérisée par une constante de temps T1. En IRM les séquences d'acquisition des signaux pondérés en T1 ou en T2 permettent d'obtenir des informations sur la morphologie et la physiologie des organes étudiés mais aussi sur leur composition. Cependant, pour que le phénomène de RMN soit observable, il faut que l'échantillon contienne un nombre important de noyaux ayant un moment magnétique, en particulier l'atome d'hydrogène (1H), phosphore (31P) et carbone (13C). L'IRM se heurte donc à un problème de sensibilité et de contraste. Les agents de contraste paramagnétiques et superparamagnétiques sont particulièrement adaptés pour modifier localement les temps de relaxation T1 et T2. Ils permettent le diagnostic en fonction de leur localisation. La visualisation du système circulatoire et du débit de perfusion des organes peut se révéler particulièrement utile, notamment dans les phénomènes d'hypoperfusion et d'ischémies ou dans les hyperperfusions de certains processus tumoraux. Du fait d'une élimination rénale ou hépatique et d'une diffusion extravasculaire importantes, les agents de contraste classiques paramagnétiques et superparamagnétiques apparaissent inappropriés. Parmi les agents classiques, on peut citer les chélates de métaux comme le DTPA gadolinium (Brevet U.S. 4 647 447) ou des colloldes superparamagnétiques de type dextran oxyde de fer. Ces agents ont un poids moléculaire (590 pour le Gd DTPA) qui entraîne leur passage dans l'espace interstitiel et une élimination rénale rapide. Les colloïdes sont rapidement captés par le système réticulo endothélial et fixés au niveau hépatique et splénique. Une autre voie d'amélioration des paramètres de relaxation du système vasculaire est l'utilisation d'hématies marquées au chrome (Invest. Radiol., 1989, 24, 742-753). Le marquage des hématies au 51Cr est utilisé classiquement en médecine nucléaire. Des hématies sont incubées avec Na2CrO42 à différentes concentrations, CrO42 après pénétration à travers la membrane est réduit en Cor 3+, aux propriétés paramagnétiques, qui se lie à la molécule d'hémoglobine. Les temps de relaxation des culots globulaires sont nettement diminués. Cependant, le chrome est cytotoxique aux doses utiles en RMN, et l'hémolyse des hématies marquées au chrome est plus importante. La demie vie de ces hématies est diminuée d'un facteur 4, par rapport à des hématies canines normales, dont la demi-vie est de 19 jours. L'imagerie par ultra-sons repose sur le fait que les ondes ultra-sonores se propagent dans un milieu donné avec une vitesse dépendant de la nature de ce dernier. A l'interface entre deux milieux de natures différentes, une partie de l'onde est réfléchie et l'autre transmise. En analysant les signaux réfléchis ou transmis, il est ainsi possible d'obtenir soit des images par transmission, soit des images par réflexion qui permettent de visualiser les interfaces entre les différents milieux, cette dernière technique étant utilisée sous le nom d'échographie ultrasonore. Il peut donc être intéressant d'employer un produit de contraste capable de modifier les paramètres de transmission et de réflexion de l'onde ultra-sonore, afin d'obtenir une meilleure visualisation par exemple d'un organe ou du système vasculaire. La présente invention se rapporte donc à une composition de contraste, caractérisée en ce qu'elle comprend un produit de contraste hydrophile ou hydrosoluble ou colloïdal, par exemple un colloïde superparamagnétique ou un gaz sous forme de bulles, encapsulé par une technique de lyse/ rescellement dans des érythrocytes, et en ce qu'elle comporte en outre un support acceptable pour l'administration par voie entérale ou parentérale. Par produit contraste, on entend tout produit capable d'améliorer le contraste en imagerie notamment en imagerie médicale, en particulier en imagerie par RX, en imagerie par résonance magnétique, et en imagerie par ultra-sons. Pour l'imagerie en rayons X, le produit est opaque aux rayons x. il peut s'agir en particulier d'un sel d'acide polyiodé. Parmi les molécules préférées pouvant être encapsulées dans les érythrocytes, on peut citer les sels des acides polyiodés suivants l'acide acétrizolque, l'acide iothalamique, l'acide ioxithalamique, l'acide ioxaglique, - et notamment leurs sels de sodium, lysine, N-méthyl-glucamine ou des composés non ioniques polyiodés - le Iopamidol 1,3-benzenedicarboxamide, N-N'-bis [2-hydroxy-1-(hydroxy- méthyl)éthyl]-5-[(2-hydroxy-1-oxopropyl)amino]2,4,6-triiodo- - le 1,3-benzenedicarboxamide,5-[acétyl(2,3-dihydroxypropyl)amino]-N,N'- bis(2,3 dihydroxypropyl)2,4,6-triiodo - le Ioxilan 1,3-benzenedicarboxamide,5-[acetyl(2,3-dihydroxypropyl) -amino]-N-(2,3-dihydroxypropyl)-N'-(2-hydroxyethyl)2,4,6 -triiodo le Iopromide 1,3-benzenedicarboxamide, N,N'-bis (2,3-dihydroxypropyl)] 2,4,6-triiodo-5-(methoxyacetyl)amino-N-méthyl- le Iopentol 1,3-benzenedicarboxamide,5-[acetyl(2-hydroxy-3-methoxy- propyl) amino-N-N'-bis (2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodo le lotrolan 1,3-benzenedicarboxamide,5,5'-[(1,3-dioxo-1,3-propanediyl) bis(methylimino)]bis[N,N'-bis[2,3-dihydroxy-l-(hydroxymethyl)propyl]-2,4, 6-triiodo le Iodixanol 1,3-benzenedicarboxamide,5,5'-[(2-hydroxy-1,3-propan ediyl)bis (acetylimino)]bis[N,N'-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodo- le Ioversol 1,3 benzenedicarboxamide, N,N'-bis(2,3-dihydroxypropyl)-5 [(hydroxyacetyl) (2-hydroxyethyl)amino]-2,4,6-triiodo-. Pour l'IRM, le produit modifiant le contraste est une substance pouvant influencer localement le champ magnétique appliqué, de manière préférée un complexe paramagnétique ou un collolde superparamagnétique biodégradable tel que des particules d'oxyde de fer enrobées par du dextran. L'effet sur l'accélération de la relaxation protonique est du - soit à une interaction dipolaire classique entre le spin nucléaire des protons des molécules d'eau et les électrons non appariés du métal (dans ce cas les complexes du manganèse Mn2+ et du gadolinium Gd3+ sont préférés) - soit à une différence de susceptibilité magnétique liée à la présence d'un complexe paramagnétique intraérythrocytaire (dans ce cas les complexes de dysprosium sont préférés). Ce complexe peut être choisi parmi les complexes formés à partir d'un ligand cyclique ou acyclique possédant des atomes de coordination choisis parmi l'oxygène, l'azote, le phosphore, le soufre et un métal choisi parmi les lanthanides ou les métaux de transition, notamment le gadolinium, le dysprosium, le manganèse et le fer. Parmi les complexes préférés encapsulables dans les érythrocytes humains, on peut citer - le sel de N-méthyl-glucamine ou de sodium du complexe de gadolinium de l'acide diéthylène-triamine penta-acétique (Gd-DTPA), - le sel de N-méthyl-glucamine ou de sodium du complexe de gadolinium de l'acide 1,4,7,10 tétra-aza-cyclododécane-N-N'-N"-N"'-tétra-acétique (Gd-DOTA), - le sel de N-méthyl-glucamine ou de sodium du complexe de gadolinium de l'acide 2-méthyl-1,4,7,10 tétra-aza-cyclododécane-N-N'-N"-N"' tétra-acétique (Cd-MCTA) - le complexe de gadolinium de l'acide 1,4,7,10 tétra-aza-cyclododécane-N -N'-N" tri-acétique (Gd-DO3A), - le complexe de gadolinium de l'acide 1,4,7, 10 tétra-aza-cyclododécane N-2-hydroxy-propyl, N'-N",N"' triacétique (Gd-HPDO3A), - le complexe de gadolinium du N-N" bis-(méthyl-carbamoyl-méthyl)-dié thylène triamine N,N', N" tri-acétique (Gd-DTPA-BMA). Ces complexes peuvent être neutres ou ioniques, en fonction des charges respectives du ligand et du métal complexe. Cette liste n'est pas limitée aux complexes neutres ni aux complexes salifiés avec le N-méthyl-glucamine et peut être étendue aux sels obtenus avec d'autres bases minérales (sodium, calcium) ou des bases organiques, notamment les amino-acides (lysine, arginine...). Les érythrocytes contenant des agents superparamagnétiques (particules d'oxyde de divers métaux enrobées par du dextran, notamment fer sous forme Fe3 04 et Fe2 03) peuvent être également utilisés comme agents de contraste. Les produits de contraste du type sel d'acide triodé ou complexe paramagnétique pourront également être utilisés en imagerie ultrasonore. Le produit encapsulé dans les érythrocytes pourra également être un gaz sous forme de bulles. De préférence, ce gaz pourra être l'air, l'azote ou le gaz carbonique. Par produits hydrophiles ou hydrosolubles, on entend désigner aussi bien les produits de contraste présentant ces caractéristiques que les produits ayant subi ce traitement les rendant hydrophiles et/ou hydrosolubles. Ce produit est encapsulé dans les érythrocytes par une technique de lyse/ rescellement. Les techniques d'encapsulation érythrocytaires sont de trois types - par chocs osmotiques, - par chocs électriques, - par hémolyse isotonique. En effet, les érythrocytes, comme toutes les cellules, peuvent être lysés dans certaines conditions notamment de pression osmotique. Mais la membrane érythrocytaire peut être reconstituée après la lyse, c'est le rescellement. Il est donc possible d'introduire certains composants exogènes dans les érytrhocytes. La technique qu'on a décrite ci-après est celle de l'encapsulation par "chocs osmotiques". Les différentes étapes de l'hémolyse et du rescellement ont été décrites par Schwoch G. et Passow H. (1973). Des globules rouges soumis à un abaissement de la force ionique, gonflent jusqu'à atteindre un volume critique (150 à 175 % de leur valeur initiale), où la membrane devient perméable aux macromolécules et aux ions. En restaurant l'isotonicité du milieu, les pores se referment et l'imperméabilité de la membrane aux macromolécules est restaurée. Cependant, la membrane reste perméable aux ions principalement alcalins. Une étape d'incubation à 37"C est nécessaire aux globules rouges pour retrouver des caractéristiques de perméabilité identiques aux globules rouges initiaux. Trois techniques différentes d'hémolyse hypotonique ont été proposées Technique de dilution Les globules rouges sont directement dilués dans un milieu hypotonique. Les pores s'ouvrent immédiatement et l'équilibre entre le milieu extra et intracellulaire est obtenu en moins d'une minute. Cependant dans cette technique 60 à 70 % du contenu cytoplasmique des hématies est perdu, réduisant considérablement la viabilité des stromas obtenus. Technique de prégonflement Dans cette technique, proposée par Rechsteiner M. (1975), les globules rouges sont dilués dans un tampon hypotonique à 220 mos/kg et centrifugés. La lyse est alors obtenue par addition d'un faible volume d'eau. Cette procédure est rapide et permet de retenir davantage de petites molécules, comme l'ATP et d'enzymes cytoplasmiques. Technique de dialyse Dans cette technique, proposée indépendamment par Dale G. et coll. (1977) et Deloach J.P. et Coll. (1977), la suspension érythrocytaire à fort hématocrite (70 à 80 O) est maintenue dans un sac de dialyse et dialysée contre un tampon hypotonique. L'hémolyse est alors progressive et peut facilement être contrôlée en modifiant le temps de dialyse. Cette procédure offre plusieurs avantages. En comparant les rendements des diverses techniques d'encapsulation, on note que dans la majorité des cas, la dialyse conduit à un meilleur résultat. Ceci s'explique par une moindre dilution du produit à encapsuler. De plus, dans cette technique, les pertes du contenu cytoplasmique des globules rouges au cours de l'encapsulation, sont considérablement réduites. C'est celle qui est utilisée dans la présente invention. En particulier, une technique de dialyse fournissant d'excellents rendements est celle développée dans le brevet EP 101 341. Cette demande décrit un procédé d'encapsulation dans des érythrocytes humains ou animaux d'une substance présentant une activité biologique, par une technique de dialyse adaptée en flux continu. C'est pourquoi, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une composition caractérisé en ce que -a) les érythrocytes sont placés dans un compartiment de dialyse, l'autre compartiment contenant une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspens ion d'érythrocytes afin de lyser les érythrocytes. -b) les érythrocytes mis en contact avec le produit de contraste sont rescellés par augmentation de la pression osmotique en encapsulant ledit produit de contraste. -c) éventuellement les érythrocytes sont séparés du milieu de réaction. -d) les érythrocytes sont placés dans un support adapté à l'administration entérale ou parentérale pour obtenir une composition de contraste. Pour la technique la plus simple permettant l'encapsulation d'un produit de contraste dans des érythrocytes humains ou animaux, dans le cas de faibles volumes, la dialyse est effectuée dans un sac de dialyse, contre une solution hypotonique. Le lysat est mis en présence du produit actif et on effectue le rescellement par addition d'une solution hypertonique. La méthode d'encapsulation préférée est le procédé par dialyse en flux continu. Pour cela, les érythrocytes sont séparés du plasma et lavés et mis en suspension aqueuse, puis alimentent en continu le compartiment primaire d'un dialyseur. Dans le compartiment secondaire, circule à contre courant un tampon de dialyse, hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes. Le lysat d'érythrocytes est mis en contact avec le produit à encapsuler, cette substance étant introduite avant, pendant ou après la lyse. Le produit pénètre dans l'érythrocyte et on procède au rescellement de la cellule en augmentant la pression osmotique par addition d'une solution hypertonique. Après rescellement, la suspension érythrocytaire est centrifugée pour éliminer les molécules non encapsulées et l'hémoglobine du liquide intercellulaire.Les érythrocytes sont ensuite lavés et remis en sus pension dans du plasma à un hématocrite physiologique. Pour les produits iodés, encapsulés par cette méthode, la concentration intra-érythrocytaire en iode dans la composition pourrait être comprise entre 1 et 300 g d'iode par litre de culot globulaire. Pour les compositions dans lesquelles un complexe paramagnétique est encapsulé par cette méthode, la concentration intraérythrocytaire en métal paramagnétique complexé est comprise entre 0,02 mM et 0,5 M dans le culot globulaire. L'utilisation de produits de contraste encapsulés dans des hématies permet de cibler l'espace de distribution de ces produits, en les confinant strictement dans l'espace vasculaire. C'est pourquoi la présente invention concerne l'application de la composition de contraste définie ci-dessus à l'imagerie du système circulatoire, des organes vascularisés et des petites cavités, caractérisée en ce que l'on injecte la composition par voie entérale ou parentérale, et en ce que l'on visualise ces éléments par un moyen approprié, choisi parmi l'imagerie par RX, par résonance magnétique nucléaire ou par ultrasons. L'administration de la composition peut se faire par voie entérale. La composition peut également être introduite dans une petite cavité de l'organisme, dont on souhaite modifier le contraste en imagerie. De manière préférée, la composition selon l'invention peut être injectée par voie parentérale, en particulier par voie intra veineuse ou intra artérielle. La pharmacocinétique du produit sera celle des érythrocytes. Cette application permettra donc l'imagerie de tous les organes vascularisés et des situations de pathologie vasculaire, rupture ou modifications vasculaires. On observera une amélioration très nette de l'imagerie anatomique des vaisseaux, grâce à la réduction d'une part de la fuite dans l'espace interstitiel et d'autre part de l'élimination urinaire, rencontrées avec les produits actuels, en particulier avec les produits iodés et les chélates de gadolinium. On obtiendra également une amélioration de l'imagerie du volume et du débit sanguin local donc des anomalies de perfusion d'organe. D'une part, on pourra mettre en évidence des phénomènes d'hypofusion ou ischémies, d'autre part des phénomènes d'hyperperfusions intervenant lors de certains processus tumoraux. L'encapsulation de produits de contraste par cette méthode de lyse/rescellement ne modifie pas la durée de demie vie des érythrocytes. Après administration de la composition de contraste par voie parentérale, on observera une rémanence du produit de contraste dans la circulation, sa demie vie pouvant être égale, dans le cas d'érythrocytes humains, à 60 jours. I1 sera donc possible d'effectuer la visualisation à des temps différents, allant jusqu'à 60 jours. On pourra ainsi suivre sans réinjection des processus d'infarctus ou d'ischémies. La composition sera éliminée par destruction des érythrocytes dans la rate. La composition pourra être injectée à des doses allant de 1 à 3 500 cm de culot globulaire traité (avec un hématocrite compris entre 30 et 80 XO). Une application de cette invention est caractérisée en ce qu'on prélève les érythrocytes d'un patient, en ce qu on les traite de manière à encapsuler un produit de contraste et en ce qu'on les réinjecte au patient. Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, les érythrocytes humains sont prélevés sur une solution anticoagulante de citrate phosphate dextrose. Le plasma est décanté et on élimine les leucocytes, les plaquettes et le plasma, par prélavage et centrifugations des érythrocytes. Le culot globulaire est ajusté à la concentration voulue et incubé 30 mn à 4"C. On procède ensuite à l'étape de lyse/rescellement des érythrocytes. Pour cela, on fait circuler dans un dialyseur à plaques la solution erythrocytaire et une solution de lyse, hypotonique, à contre courant. Ces étapes sont menées à 4"C. I1 y a gonflement des érythrocytes et ouverture des pores. A la sortie du dialyseur, on ajoute le DOTA Gd au lysat erythrocytaire, en continu. On doit s'assurer d'un temps de contact permettant la pénétration du principe actif dans les cellules. Les propriétés de l'érythrocyte sont restaurées, par réchauffement de la solution à 37 C et addition d'une solution de rescellement hypertonique. Le rescellement est poursuivi par incubation 30 mn à 370C. La suspension érythrocytaire est ensuite centrifugée pour éliminer les molécules non encapsulées et l'hémoglobine. Après trois lavages successifs par NaCI 150 mM, les érythrocytes sont remis en suspension dans un milieu physiologique. Figure 1 : Stabilité du gadolinium encapsulé à 4 C. Figure 2 : Stabilité du gadolinium encapsulé à 37 C. EXEMPLE 1 Encapsulation de DOTA Gd dans des érythrocytes humains par dialyse en flux continu. a) Préparation des érythrocytes humains Les unités de sang utilisées au cours de cette étude sont - soit des unités prélevées sur solution citrate phosphate dextrose (CPD) à une concentration de 63 ml pour 450 ml de sang prélevé, conservées à 4 C pendant une semaine ou plus, - soit des concentrés globulaires conservés en SAG.M à 4 C pendant une semaine au plus. CPD Acide citrique 1 H2O .......................... 3,27 g Citrate de sodium 2H2O ........................ 26,30 g Phosphate monosodique H2O ...................... 2,22 g Glucose ........................................ 23,20 g Eau ppi qsp .................................... 100 ml On procède à une décantation du plasma et au prélavage des globules rouges afin d'éliminer les leucocytes, les plaquettes et le plasma. Ces étapes sont réalisées au moyen de poches de transfert de 300 et 600 ml (Terumo). Les lavages des culots globulaires sont faits volume à volume , en NaCI 150 mM, avec des centrifugations de 15 mn à 1 000 g. Le culot globulaire est ajusté à la concentration voulue en cellules et on mesure les paramètres hématologiques sur un échantillon. Enfin le culot est incubé 30 mm à 4 C. b) Lyse des érythrocytes La lyse est réalisée dans un dialyseur à plaques Gambro (Lundia 1C) dont la membrane (épaisseur 13,5um et surface efficace 0,41 m2) est un polymère d'acryla-butadiène styrène, de polyéthylène haute et basse densité, cuprophan et de cellulose. On fait circuler à contre-courant la solution érythrocytaire et du tampon de lyse préparé comme suit Solution mère Na2HPO4 ; NaH2PO4, pH 7,4 ...................... 0,2 M CO3H Na ........................................ 0,2 M Glucose ........................................ 0,04 M. Le tampon de lyse est constitué de cette solution diluée au 1/20 en eau distillée, on obtient un tampon à 40 mos/kg et pH 7,4. Le flux du tampon de dialyse est constant : 160 ml/mn. Par contre, les conditions de dialyse varient en fonction du flux sanguin et de l'hématocrite. L'hématocrite du culot globulaire doit être suffisamment élevé pour éviter une perte importante du contenu cytoplasmique des globules rouges ; mais, il doit rester suffisamment faible pour permettre un gonflement important du globule rouge au cours de la dialyse sans induire une pression trop importante dans le dialyseur. c) Introduction du principe actif Dans le cas de molécules dialysables, il est préférable d'ajouter le principe actif directement dans le lysat en continu à la sortie du dialyseur. d) Rescellement et regénération des globules rouges La restauration de l'isotonicité de la suspension globulaire lysée est effectuée après réchauffement à 37 C par addition d'une solution de rescellement hypertonique en raison d'un volume pour dix volumes de lysat. Le rescellement est poursuivi pendant 30 minutes par incubation des globules rouges dans un bain marie à 37 C. La solution de rescellement est constituée d'un mélange NaCI 2 M et de PIGPA. PIGPA C (Laboratoire BRUNEAU) Adenine ................................. 5 mM Inosine ................................. 100 mM Pyruvate de Na .......................... 100 mM Phosphate de Na ......................... 100 mM Glucose ................................. 100 mM e) Lavages post rescellement des globules rouges Après rescellement, la suspension érythrocytaire est centrifugée pour éliminer les molécules non encapsulées et l'hémoglobine du liquide intercellulaire. Les globules rouges sont ensuite lavées selon la même procédure que celle décrite pour les prélavages. Après ces trois lavages en NaCI 150 mM, un lavage en plasma est effectué pour remettre les globules rouges en milieu physiologique. EXEMPLE 2 Encapsulation de DOTA Gd dans des érythrocytes de souris par dialyse en discontinu. a) Préparation de globules rouges de souris Les souris utilisées dans cette étude sont des souris swiss provenant de l'élevage Janvier ou de l'élevage du laboratoire. Le sang total est prélevé sur héparine après anesthésie des animaux à l'éther, par incision dans la partie thoracique latérale, section de l'artère brachiale et prélèvement à la pipette pasteur. Les opérations de lavage sont effectuées en tube. b) Lyse La dialyse est effectuée dans un sac de dialyse en cellulose glycérinée (Poly labo). Le diamètre à plat est de 2,54 cm alors qu'une fois gonflé le diamètre est de 1,59 cm. La membrane de ces sacs de 20 um d'épaisseur a une limite de perméabilité de 12 000 à 14 000. Elle est réalisée sur 5 ml de culot globulaire à 70 % dans un sac de dialyse placé dans un flacon de 250 ml contenant le tampon de lyse. Le flacon est fixé sur un agitateur rotatif à 12 rpm maintenu à 4 . c) Introduction du DOTA Gd et rescellement. Ces étapes sont réalisées en tube. Le tableau 1 donne les paramètres hématologiques et les paramètres d'encapsulation du DOTA. Gd dans les globules rouges humains en fonction du temps de dialyse. Les rendements d'encapsulation sont calculés par rapport à la suspension de globules rouges initiale (Rdt encap/pool) ou par rapport à la concentration obtenue dans le lysat (Rdt encap/lys). Le tableau 2 représente les paramètres hématologiques et les paramètres d'encapsulation du DOTA-Gd dans les globules rouges humains et murins pour un temps de dialyse de 45 mn (moyenne + SD avec N nombre d'expériences). Tableau 1 Encapsulation avec DOTA.Gd Globules rouges humains Temps Témoins 30 min 45 min 60 min N=3 N=8 N=l Paramètres Rdt Cell ( ó) 82,8 + 4,2 73,2 + 3,5 70,3 Rdt encap/pool (%) 28,4 + 6,7 36,4 + 4,1 40,1 Rdt encap/lys (%) 40,9 + 4,7 65,0 + 4,6 76,2 mg/ml* 0,47 + 0,11 0,70 + 0,09 0,73 VGM (fl) 95,9 + 1,7 91,3 + 0,7 86,8 + 2,5 84,8 TGMH (pg) 30,1 + 0,2 27,0 + 0,1 25,7 + 1,0 24,6 CCMH (g/d) 31,3 + 0,3 29,5 + 0,1 29,2 + 0,7 29,1 * mg de DOTA Gd/ml à 100 96 d'hématocrite normalisé pour 1 mg de DOTA Gd/ml dans la suspension érythrocytaire initiale. VGM : volume globulaire moyen (volume moyen d'une hématie) TGMH : quantité globulaire moyenne en hémoglobine CCMH : concentration moyenne globulaire en hémoglobine. Tableau 2 Erythrocytes murins Erythrocytes humains Paramètres Avant Après Avant Après Rdt cell (%) 65,0 + 2,6 73,2 + 3,5 Rdt encap/pool ( ,Ó) 31,6 + 4,0 36,4 + 4,1 Rdt encap/lyse (%) 59,1 + 5,7 65,0 + 4,6 mg/ml* 0,67 + 0,09 0,70 + 0,09 VGM (fl) 50,9 + 0,3 48,3 + 0,9 96,5 + 2,0 86,8 + 2,5 TGMH (pg) 17,5 + 0,9 16,2 + 0,7 30,2 + 0,2 25,7 + 1,0 CCMH (g/dl) 34,4 + 1,7 33,5 + 1,5 31,2 + 0,4 29,2 + 0,7 * mg de DOTA Gd/ml à 100 96 d'hématocrite normalisé pour 1 mg de DOTA Gd/ml dans la sus pension érythrocytaire initiale. EXEMPLE 3 Stabilité du DOTA Gd après encapsulation érythrocytaire Après encapsulation érythrocytaire la suspension de globules rouges à 40 96 d'hématocrite en plasma est maintenu à 40C ou à 370C. Pour différents temps d'incubation un aliquot est prélevé, centrifugé à 1 000 g, dix minutes à 4"C. Le gadolinium est ensuite dosé sur le culot globulaire et sur le surnageant. L'hématocrite du culot est mesuré pour normaliser tous les dosages à un même hématocrite. Les figures 1 et 2 montrent l'évolution, en fonction du temps, de la concentration intraérythrocytaire en gadolinium après encapsulation du Dota-gadolinium pour deux concentrations intraérytrocytaires. GR 1 et GR2 sont les concentrations intraérythrocytaires en DOTA Gd SP1 et SP2 sont les concentrations plasmatiques en DOTA Gd, correspondant respectivement à GR1 et GR2. La température a peu d'impact sur le relargage de DOTA Gd. Cette étude effectuée avec des globules humains montre une légère fuite du gadolinium avec une demi-vie de 9,1 jours à 4"C et 7,5 jours à 37"C. En moyenne, la concentration intraérythrocytaire en gadolinium après 48 heures est égale à 81 96 de la concentration initiale. EXEMPLE 4 Etude de la relaxivité La relaxivité du DOTA Gd a été mesurée dans des culots globulaires (suspension d'hématies à haut hématocrite 80/90 %) lavés après incorporation du DOTA Gd. Le gadolinium a été dosé par spectrophotométrie d'émission atomique (DCP). Le temps de relaxation T1 a été déterminé sur un Minispec BRUKER PC 20 à 20 MHz 0,5 T par séquence d'inversion-récupération à 37 C. Tableau 3 Hématies de souris CONCENTRATION r RELAXIVITE MILIEU (mmol/l) Gd DOTA (mM-1 S-1) Culot globulaire 2,9 8,1* de souris Culot globulaire 0,2 12,3 de souris Plasma de 0,5 3,9 souris eau 0,5 3,9 Ce résultat a été confirmé à différentes dilutions du culot. On observe donc une majoration de la relaxivité du DOTA Gd dans le culot globulaire. Tableau 4 Hématies humaines CONCENTRATION RELAXIVITE MILIEU Gd (mmol/l) (mM-l 5-1) Culot globulaire 0,5 4,7 humain eau 0,5 3,9 EXEMPLE 5: Efficacité en imagerie L'imagerie des tubes contenant les culots globulaires humains après incorporation du DOTA Gd a été réalisée comparativement à des solutions aqueuses de DOTA Gd de concentration équivalente. Imagerie MR MAX 0,5 Tesla, séquences SE 300/20/1, . épaisseur de coupe : 7 mm, . réalisation de profils d'intensité en fonction de la concentration de gadolinium permettant une quantification relative des échantillons les uns par rapport aux autres. Résultats : on constate une efficacité in vitro du même ordre de grandeur entre DOTA Gd et DOTA Gd encapsulé dans les érythrocytes Tableau 5 MILIEU CONCENTRATION INTENSITE HAUTEUR Gd (mmol/l) DE PIC (cm) 9,48 2 4,75 4,3 Culot 0,93 4,6 globulaire 0,37 3,6 0,10 2 0,013 1,4 0 1 8,87 4,7 4,47 6,9 0,85 6,6 Eau 0,41 3,6 0,08 1,6 0 0,8 Le DOTA Gd incorporé dans les globules rouges entraine une modification nette de l'intensité en imagerie (multiplié par 4,6 pour une concentration de 0,93 mM) pour des concentration comprises entre 2.10 3 et 10 4 M comme pour le DOTA Gd. EXEMPLE 6 Durée de vie des hématies La durée de vie des hématies de souris contenant du DOTA Gd a été suivie par marquage au 51 Cr. Le gadolinium a été mesuré par SEA (spectrophotométrie d'émission atomique) parallèlement au comptage gamma du 51 Cr. Résultats : dans les 24 premières heures, on observe la disparition dans la circulation de 18 96 du 51 Cr et 25,5 ,O du Gd. Par la suite, la disparition sanguine est de type monoexponentielle. Tableau 6 Produit incorporé demie vie dans des hématies Espèce des hématies lysées/rescellées (jours) DOTA Gd 3 mM souris 10,6 Néant souris 10,5 Cr 10 mM * chien 4,3 Néant chien 18,9 * Technique d'Eisenberg et coll (1989). On peut constater qu'il n'y a ni relargage de DOTA Gd ni hémolyse importante due à l'incorporation. EXEMPLE 7 Préparation de la composition DTPA-Gd sel de méthylglucamine-érythrocytes. Cette composition a été préparée selon le procédé décrit dans l'exemple 1. REVENDICATIONS 1. Composition de contraste caractérisée en ce qu'elle comprend un produit de contraste hydrophile ou hydrosoluble ou colloïdal par exemple un colloïde superparamagnétique, ou un gaz sous forme de bulles, encapsulé par une technique de lyse/rescellement dans des érythrocytes, et en ce qu'elle comporte en outre un support acceptable pour l'administration entérale ou parentérale. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est un agent de contraste polyiodé. 3. Composition selon les revendications 1 et 2 caractérisée en ce que la concentration intra-érythrocytaire en iode est comprise entre 1 et 300 g d'iode par litre de culot globulaire. 4. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est un gaz sous forme de bulles. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le gaz encapsulé est choisi parmi l'air, l'azote et le gaz carbonique. 6. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est un complexe paramagnétique. 7. Composition selon la revendication 6 caractérisée en ce que le complexe est choisi parmi les complexes formés à partir d'un ligand cyclique ou acyclique possédant des atomes de coordination choisis parmi l'oxygène, l'azote, le phosphore, le soufre et un métal choisi parmi les lanthanides ou les métaux de transition, notamment le gadolinium, le dysprosium, le manganèse, le fer. 8. Composition selon l'une des revendications 6 ou 7 caractérisée en ce que la concentration intra-érythrocytaire en métal paramagnétique complexé est comprise entre 0,02 mM et 0,5 M dans le culot globulaire. 9. Composition selon les revendications 1 et 6 à 8, caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est un sel de N méthylglucamine ou de sodium du complexe de gadolinium de l'acide diéthylènetriamine penta-acétique (Gd-DTPA). 10. Composition selon l'une des revendications 1 et 6 à 8, caractérisée en ce que le produit de contraste est un sel de N méthylglucamine ou de sodium de complexe de gadolinium de l'acide 1, 4, 7, 10 tetra-aza-cyclodécane N-N'-N"-N"' tétra-acétique (Gd-D OTA). 11. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est un colloïde superparamagnétique. 12. Composition selon l'une des revendications 1 et 11 caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est du dextran oxyde de fer. 13. Composition de contraste selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce qu'elle est obtenue par un procédé de lyse/rescellement connu. 14. Composition selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle présente, après injection parentérale, une demie-vie pouvant aller jusqu'à 60 jours. 15. Procédé de préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que -a) les érythrocytes sont placés dans un compartiment de dialyse, l'autre compartiment contenant une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes afin de lyser les érythrocytes. -b) les érythrocytes mis en contact avec le produit de contraste sont rescellés par augmentation de la pression osmotique en encapsulant ledit produit de contraste. -c) éventuellement les érythrocytes sont séparés du milieu de réaction. -d) les érythrocytes sont placés sont placés dans un support adapté à l'administration entérale ou parentérale pour obtenir une composition de contraste. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la dialyse est réalisée en flux continu ou en semi-continu. 17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la dialyse est une dialyse en discontinu, réalisée dans un sac de dialyse. 18. Application de la composition selon l'une des revendications 1 à 14 à l'imagerie du système circulatoire, des organes vascularisés et des petites cavités, caractérisée en ce que l'on injecte la composition par voie entérale ou parentérale, et en ce que l'on visualise ces éléments par un moyen approprié, choisi parmi l'imagerie par RX, par résonance magnétique nucléaire ou par ultrasons. 19. Application selon la revendication 18, caractérisée en ce que l'on effectue la visualisation à des temps différents, allant jusqu'à 120 jours. 20. Application selon les revendications 18 et 19, caractérisée en ce que l'on injecte la composition à des doses allant de 1 à 500cm3 de culot globulaire traité. 21. Application selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisée en ce que l'on prélève les érythrocytes d'un patient, en ce qu'on les traite de manière à encapsuler un produit de contraste, et en ce qu'on les réinjecte. REFERENCES 1. 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