Brevet FR2668496A1 — publié le 19920430

La présente invention concerne un procédé pour la produc- tion de L-lysine par fermentation. La L-lysine est l'un des aminoacides essentiels C'est le premier aminoacide limitatif des céréales et un aminoacide impor- tant utilisé dans l'alimentation des poulets à rôtir ou des porcs. Dans les procédés classiques pour produire la L-lysine, on a utilisé des variantes artificielles de micro-organismes isolées et dérivées du monde naturel On sait que la plupart de ces variantes artificielles dérivent de micro-organismes appartenant au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium On sait également que le système de biosynthèse de la L-lysine a été potentialisé en conférant aux micro-organismes des propriétés telles qu'auxo- trophie, résistance ainsi que sensibilité aux aminoacides analogues, médicaments chimiques et ainsi de suite en combinaison ou en ajoutant successivement ces propriétés ("AMINO SAN HAKKO (Amino Acid Fermentation)" édité par H Aida, K Takinami, I. Chibata, K Nakayama et H Yamada; Gakkai Shuppan Center, 1986, page 273. Cependant, les procédés classiques sont assez coûteux et relativement inefficaces On a donc besoin d'un procédé pour produire la L-lysine qui soit moins coûteux et qui ait une effica- cité améliorée. En conséquence, un objet de la présente invention est de proposer un procédé pour produire la L-lysine qui soit moins coûteux que les procédés classiques. L'invention a également pour objet de proposer un procédé pour produire la L-lysine qui soit plus efficace que les procédés classiques. Les objets ci-dessus et d'autres sont atteints par un procédé pour produire la L-lysine, qui consiste à cultiver dans un milieu nutritif une couche mutante productrice de L-lysine appar- tenant au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium et résistante à la sélénalysine, à produire et accumuler la L-lysine dans le bouillon de culture et à recueillir la L-lysine du bouillon de culture. Selon la présente invention, on propose un procédé pour produire la L-lysine par fermentation qui est à la fois relati- vement peu coûteux et efficace en comparaison avec les procédés classiques pour produire la L-lysine. La demanderesse a effectué des études poussées pour obtenir des variantes ou mutants ayant une productivité de L- lysine améliorée à partir de micro-organismes appartenant au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium En conséquence, on a découvert de manière surprenante que des souches mutantes ayant une productivité de L-lysine améliorée peuvent être obtenues avec une fréquence éLevée dans les variantes auxquelles on a conféré la résistance à la séLénalysine La présente invention a été réalisée à partir de cette découverte Donc, la présente invention propose un procédé pour produire la L-lysine qui consiste à cultiver dans un milieu nutritif une souche mutante productrice de L-lysine appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium et résistante à la séLénalysine, à produire et accumuler la L-lysine dans le bouillon de culture et à recueillir la L-lysine du bouillon de culture. La séLénalysine (ci-après en abrégé SéLys) mentionnée dans la présente invention a une structure chimique semblable à celle de la lysine, dans laquelle le groupe méthylène en position y de la lysine est remplacé par un atome de séLénium (Se). On peut utiliser comme souches mères des variantes dérivées utilisées dans la présente invention (ci-après en abrégé souches mères) n'importe quelles bactéries quelles que soient l'espèce et la souche aussi longtemps qu'elles appartiennent au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium. Par exemple, on peut utiliser les micro-organismes suivants connus comme bactéries corynéformes dites productrices d'acide L- glutamique: Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 En outre, on peut aussi utiliser des souches productrices de L-lysine qui sont obtenues en conférant aux micro-organismes décrits ci-dessus des propriétés telles qu'auxotrophie à la L- alanine et sensibilité au fluoropyruvate, par exemple, qui sont déjà connues comme efficaces pour améliorer la productivité de L- lysine. La résistance à la Sélys mentionnée dans la présente invention s'entend pour désigner la propriété d'une telle variante qui peut pousser dans un milieu contenant de la Sélys à une concen- tration qui inhibe la croissance de la souche mère. Les variantes utilisées dans la présente invention peuvent être facilement obtenues en soumettant les souches mères décrites ci- dessus à un traitement mutagène tel que, par exemple, l'exposition aux UV ou un traitement par des agents chimiques tels que Nméthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (ci-après NG) ou acide nitrique et ensuite en recueillant les variantes qui peuvent pousser dans un milieu contenant de la Sélys à une concen- tration, par exemple 500 pg/ml, qui inhibe la croissance de la souche mère. Des exemples spécifiques des variantes qui peuvent être utilisées dans la présente invention comprennent les souches suivantes: Brevibacterium lactofermentum AJ 12564, FERM BP-3554 (Sélysr) Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12565, FERM BP-3555 (Sélys) Brevibacterium lactofermentum AJ 12566, FERM BP-3556 (AEC, Ala, Sélysr) Brevibacterium flavum AJ 12568, FERM BP-3557 (AEC r, PK W Sélysr) Corynebacterium glutamicum AJ 12579, FERM BP-3559 (AEC r Sélysr) Les symboles utilisés entre parenthèses ont les significations suvantes: Selysr: résistance à la sélénalysine AEC: résistance à la S-( 2-aminoéthyl)-cystéine Ala: auxotrophie à l'alanine P Kw: activité réduite de pyruvate kinase. Les variantes décrites ci-dessus ont été déposées Le octobre 1990 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japon et ensuite transformées le 10 septembre 1991 en un dépôt selon le traité de Budapest. Comme sources de carbone dans le milieu nutritif qui est utilisé pour cultiver la présente souche mutante, on peut utiliser des sucres tels que le glucose et la mélasse, par exemple; des acides organiques tels que, par exemple, acide acétique et acide citrique; et des alcools tels que, par exemple, l'éthanol. Comme sources d'azote, on peut utiliser le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le phosphate d'ammonium, l'urée, l'ammoniaque aqueuse et le gaz ammoniac et d'autres sources d'azote classiques. Comme substances nutritives organiques, on peut utiliser, par exemple, l'hydrolysat acide de protéine de soja et l'extrait de levure. Les conditions pour la culture de la souche mutante selon l'invention sont de préférence des conditions aérobies à une tempé- rature de fermentation d'environ 30 à 35 O C pendant une durée de fermentation d'environ 40 à 100 h On préfère maintenir le p H dans l'intervalle d'environ 6,5 à 7,0 dans l'étape initiale et pendant la fermentation Pour ajuster le p H, on peut utiliser des agents classiques tels que des substances acides ou alcalines inorganiques ou organiques et en outre l'urée, le carbonate de calcium ou le gaz d'ammoniac. On peut recueillir la L-lysine du bouillon de fermenta- tion en général par le procédé à la résine échangeuse d'ions et d'autres techniques connues en combinaison. La présente invention sera illustrée ci-après par quelques exemples non limitatifs. Exemple 1 On a cultivé Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 dans un milieu contenant 1 % de peptone, 1 % d'extrait de levure, 0,5 % de Na Cl et 0,5 % de glucose, le p H étant ajusté à 7,0 Après avoir recueilli les cellules, on a effectué un traitement par le tampon au phosphate 0,1 M (p H 7,0) contenant 250 pg/ml de NG à 30 C pendant 30 min Ensuite les cellules ayant un taux de survie de 1,0 % ont été inoculées sur un milieu minimum sur plaque de gélose contenant 500 pg/ml de Sélys (tableau 1) et cultivées à 30 C pendant 7 j On a obtenu à partir des colonies qui ont poussé Brevibacterium lactofermentum AJ 12564 (FERM BP-3554). Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 qui est la souche mère ne peut pas pousser (sensible à la Sélys) sur le milieu mini- mum sur plaque de gélose ci-dessus contenant 500 pg/ml de Sélys, tandis que la variante obtenue, Brevibacterium lactofermentum AJ 12564, peut pousser sur le milieu (résistante à la Sélys) La variante uti Lisée dans la présente invention peut être nettement distinguée de la souche mère ou d'autres variantes par cette diffé- rence. Tableau 1 Composition du milieu minimum Composant Concentration Glucose 20 g/l Sulfate d'ammonium 10 g/l KH 2 PO 4 1 g/l Mg SO 4,7 H 20 0,4 g/l Fe SO 4,7 H 20 10 mg/l Mn SO 4,4 H 20 10 mg/l Biotine 50 pg/l Chlorhydrate de thiamine 100 pg/l Urée 2 g/l (p H 7,0) Tableau 2 Milieu de production de L-lysine Composant Concentration Glucose 100 g/l Sulfate d'ammonium 45 g/l KH 2 PO 4 1 g/l Mg SO 4,7 H 20 0,4 g/L Fe SO 4,7 H 20 10 mg/L Mn SO 4,4 H 20 10 mg/l Biotine 50 pg/l Chlorhydrate de thiamine 200 pg/l Concentré d'hydrolysat de protéine de soja (azote total 7 %) 15 pg/l (p H 7,0) Ensuite, pour la production de L-lysine par fermentation, on a préparé le milieu de production de L-lysine indiqué dans le tableau 2 et on a chargé séparément deux échantillons de 20 ml du milieu chacun dans un flacon agité d'un volume de 500 ml Après stérilisation par chauffage à 115 C pendant 10 min, on a ajouté au milieu 1 g de carbonate de calcium préalablement stérilisé à l'air sec On a inoculé Brevibacterium lactofermetum ATCC 13869 et AJ 12564, respectivement, sur le milieu, puis on a cultivé à 31,5 C pendant 72 h sur une secoueuse La quantité de L-lysine (calculée en monochlorhydrate de L-lysine) accumulée dans le bouillon de fermentation a été déterminée quantitativement et elle est indiquée dans le tableau 3 Avec la souche mutante résistante à la Sélys, on observe une nette augmentation de la production de L-lysine en comparaison avec la souche mère. Tab 7 eau 3 Tableau 3 Souche Sensibilité L-lysine, HCL à la Sélys accumulé (g/dl) ATCC 13869 sensible 0,01 AJ 12564 résistante 2,32 Exemple 2 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 a été soumis à une mutation par traitement par la NG de manière semblable à l'exemple 1 pour donner Corynebacterium acetoacidophilum AJ 12565 (FERM BP-3555) comme souche résistante à la Sélys Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 et AJ 12565 ont été cultivés de la même manière qu'à l'exemple 1 et on a étudié la production de L-lysine. Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. Tableau 4 Souche Sensibilité L-lysine, HCL à la Sélys accumu Lé (g/dl) ATCC 13870 sensible 0,01 AJ 12565 résistante 2,21 Exemple 3 Brevibacterium lactofermentum AJ 3424 (FERM P-1711) résistant à la S-( 2-aminoéthyl)-L-cystéine et auxotrophe vis-à-vis de l'alanine a été soumis à un traitement mutagène par la NG de manière semblable à l'exemple 1 pour donner Brevibacterium lactofermentum AJ 12566 (FERM BP-3556) comme souche résistante à la Sélys Brevibacterium lactofermentum AJ 3424 et AJ 12566 ont été cultivés de la même manière qu'à l'exemple 1 et on a étudié la production de L-lysine Les résultats sont indiqués dans le tableau La quantité produite était améliorée de 20,3 % avec Brevibacterium lactofermentum AJ 12566 en comparaison avec AJ 3445. Tableau 5 Souche Sensibilité L-lysine, HCL à la SéLys accumulé (g/dl) ATCC 3424 sensible 2,32 AJ 12566 résistante 2,79 Exemple 4 Corynebacterium glutamicum AJ 3463 (FERM P-1987) produc- teur de lysine, résistant à S-( 2-aminoéthyl)-L-cyctéine a été soumis à un traitement mutagène de manière semblable à l'exemple 1 pour donner Corynebacterium glutamicum AJ 12579 (FERM BP-3559) comme souche résistante à la Sélys Corynebacterium glutamicum AJ 3463 et AJ 12579 ont été cultivés de la même manière qu'à l'exemple 1 et on a étudié la production de L-lysine Les résultats sont indiqués dans le tableau 6. Tableau 6 Souche Sensibilité L-lysine, HCI à la Sélys accumulé (g/dl) ATCC 3463 sensible 2,21 AJ 12579 résistante 2,64 Exemple 5 Brevibacterium flavum ATCC 11841 (FERM P-6463) résistant à la S-( 2-aminoéthyl)-L-cystéine, dont l'activité de pyruvate kinase avait été réduite en comparaison avec la souche sauvage, a été soumis à un traitement mutagène de manière semblable à l'exemple 1 pour donner Brevibacterium flavum AJ 12568 (FERM BP-3559) comme souche résistante à la Sélys Brevibacterium flavum AJ 11841 et ATCC 12568 ont été cultivés de la même manière qu'à l'exemple 1 et on a étudier la production de L-lysine Les résultats sont indiqués dans le tableau 7. Tableau 7 Souche Sensibilité L-lysine, H Cl à la Sélys accumu Lé (g/dl) ATCC 11841 sensible 4,00 AJ 12568 résistante 4,50 Exemple 6 On a prélevé chaque fois avec une boucle de platine Brevibacterium flavum AJ 11841 et ATCC 12568 d'une culture sur gélose déclinée et on a inoculé sur 50 ml de milieu de culture d'ensemencement indiqué dans le tableau 8, respectivement On a préparé le bouillon de culture d'ensemencement en effectuant la culture aérienne agitée à 31,5 C pendant 18 h. D'autre part, on a chargé séparément 300 ml du milieu de culture principal indiqué dans le tableau 9 dans un fermenteur en verre de 1 l et on a inoculé chaque fois avec 15 ml du bouillon de culture d'ensemencement On a mis en oeuvre la culture aérienne agitée à 31,5 C avec aération à une vitesse spatiale horaire de -1 1 min 1 Tout en maintenant le p H du milieu dans l'intervalle de 7,0 à 8,0, on a ajouté en continu ou par intermittence au bouillon de culture un mélange de glucose et de sulfate d'ammonium (rapport de mélange glucose/sulfate d'ammonium 10:1; concentration de glucose dans le mélange 40 %) pour effectuer la fermentation à 31,5 C pendant 72 h Les résultats sont indiqués dans le tableau 10. Tableau 8 Composition du milieu de culture d'ensemencement Composant Concentration Glucose 15 g/l Sulfate d'ammonium 3 g/l Urée 1 g/l KH 2 PO 4 1 g/l Mg SOL',7 H 20 0,4 g/l Mn 2 mg/l ++ Fe 2 mg/L Biotine 50 pg/L Chlorhydrate de thiamine 200 pg/l Concentré d'hydrolysat de protéine de soja (azote total 7 %) 30,pg/l (p H 7,0) Tableau 9 Composition du milieu de culture principal Composant Concentration Glucose 10 g/l Sulfate Ammonium 30 g/l KH 2 PO 4 1 g/l Mg SO 4, 7 H 20 0,4 g/l ++ Fe 2 mg/L ++ Mn 2 mg/l Biotine 50 pg/l Chlorhydrate de thiamine 60 pg/l Concentré d'hydrolysat de protéine de soja (azote total 7 %) 30 pg/l (p H 7,5) Tableau 10 Souche Sensibilité L-lysine, HCI à la Sélys accumulé (g/dl) ATCC 11841 sensible 8,60 AJ 12568 résistante 9,50 En cultivant ainsi la souche résistante à la Sélys dans un milieu nutritif, la L-lysine accumulée dans le bouillon de culture augmente nettement en comparaison avec celle accumulée par la souche mère En conséquence, le coût de production de la L-lysine par fermentation est fortement réduit, en particulier à l'échelle industrielle. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra- tion et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 Procédé pour la production de L-lysine, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver dans un milieu nutritif une souche mutante productrice de L-lysine appartenant au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium et résistante à la sélénalysine, à produire et accumuler la L-lysine dans le bouillon de culture et à recueillir la L-lysine du bouillon de culture. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en outre en ce qu'on cultive ladite souche dans le milieu de culture à une température de fermentation d'environ 30 à 35 C pendant environ 40 à 100 h. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en outre en ce que l'on maintient le p H à environ 6,5 à 7,0 dans l'étape initiale et pendant la fermentation. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche appartenant au genre Corynebacterium ou au genre Brevibacterium et résistante à la sélénalysine est choisie parmi Brevibacterium lactofermentum AJ 12564, Corynebacterium acetoacido- philum AJ 12565, Brevibacterium lactofermentum AJ 12566, Brevibac- terium flavum AJ 12568 et Corynebacterium glutamicum AJ 12579. Procédé selon que la L-lysine est produite 6 Procédé selon que la L-lysine est produite 7 Procédé selon que la L-lysine est produite 8 Procédé selon que la L-lysine est produite 9 Procédé selon que la L-lysine est produite Procédé pour la revendication en quantité d'au la revendication en quantité d'au la revendication en quantité d'au la revendication en quantité d'au la revendication en quantité d'au 1, caractérisé en moins 2,21 g/dl. 1, caractérisé en moins 2,31 g/dl. 1, caractérisé en moins 2,64 g/dl. 1, caractérisé en moins 2,79 g/dl. 1, caractérisé en moins 9,50 g/dl. produire une souche mutante productrice de L-lysine d'un micro-organisme appartenant au genre bacterium ou au genre Corynebacterium et résistante à la nalysine, caractérisé en ce que l'on soumet une souche mère tenant au genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium ce ce ce ce ce Brevi- sélé- appar- à un traitement mutagène et on recueille les variantes qui sont capables de pousser dans un milieu contenant de la sélénalysine à une concentration suffisante pour inhiber la croissance de la souche mère. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit traitement mutagène comprend l'exposition aux ultra- violets ou le traitement par un composé chimique mutagène. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit composé chimique mutagène comprend la N-méthyl-N-nitro-N- nitrosoguanidine ou l'acide nitrique. 13 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite souche mère est choisie parmi Brevibacterium divari- catum ATCC 14020, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 et Brevibacterium roseum ATCC 13825, Corynebacterium lilium ATCC 15990 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. 14 Souche mutante de micro-organisme producteur de L-lysine caractérisée en ce qu'elle appartient au genre Brevi- bacterium ou au genre Corynebacterium, et en ce qu'elle est résistante à la sélénalysine. Souche mutante de micro-organisme producteur de L-lysine selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi Brevibacterium lactofermentum AJ 12564, Corynebacte- rium acetoacidophilum AJ 12565, Brevibacterium lactofermentum AJ 12566, Brevibacterium flavum AJ 12568 et Corynebacterium glutamicum AJ 12579. 16 Souche mutante de micro-organisme producteur de L- lysine selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle produit la L-lysine en quantité d'au moins 2,21 g/dl. 17 Souche mutante de micro-organisme producteur de L- lysine selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle produit la L-lysine en quantité d'au moins 2,31 g/dl. 18 Souche mutante de micro-organisme producteur de L- lysine selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle produit la L-lysine en quantité d'au moins 2,64 g/dl. lysine produit lysine produit 19 Souche mutante de micro-organisme producteur de L- selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle la L-lysine en quantité d'au moins 2,79 g/dl. Souche mutante de micro-organisme producteur de L- selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle la L-lysine en quantité d'au moins 9,50 g/dl.