Brevet FR2661421A1 — publié le 19911031

- PROCEDE POUR LA TRANSFORMATION D'EMBRYONS SOMATIQUES DE PLANTES UTILES Les plantes dicotylédones sont essentiellement transformables par l'intermédiaire de systèmes vecteurs de plasmides Ti à l'aide d'Agrobacterium tumefaciens Jusqu'à présent, cette voie n'a été adaptée qu'à un petit nombre de plantes monocotylédones Le transfert direct de gènes, sans vecteurs bactériens ou viraux, a donné jusqu'ici de meilleurs résultats avec les plantes monocotylédones En particulier, l'utilisation de protoplastes comme objets à transformer s'est révélée, au moins dans le cas du riz et du maïs, sur le plan cellulaire, comme une voie praticable. Cependant, l'aptitude à la régénération des protoplastes en plantes fertiles est problématique. Dans le WO 88/09374, il est décrit un procédé dans lequel des embryons sexuels de plantes utiles servent de systèmes récepteurs pour des informations génétiques étrangères Les embryons de graines mûres sont en mesure, pendant le gonflement, à l'état isolé ou libérés mécaniquement dans la graine, de recevoir une information génétique étrangère Un à trois jours après la transformation, on a pu mettre en évidence dans les embryons une expression de:gène transitoire Cependant, on n'est pas parvenu jusqu'à présent à trouver des cellules transformées de manière stable dans les plantes produites ou dans leur descendance. On a trouvé à présent d'une manière surprenante que des embryons somatiques immatures peuvent être séchés et -2 - peuvent recevoir par réhydratation dans une solution d'ADN, une information génétique étrangère. L'invention concerne par conséquent 1 Un procédé de transformation d'embryons qui est caractérisé en ce qu'on met à incuber des embryons somatiques immatures à l'état séché avec une solution contenant de l'ADN ou de 1 'ARN. 2 Les embryons monocotylédones somatiques transformés. 3 Les plantes monocotylédones pouvant être obtenues à partir des embryons somatiques transformés. 4 L'utilisation des embryons séchés, monocotylédones, somatiques, le cas échéant transgéniques, pour la préparation de semences artificielles. 5 L'utilisation des embryons somatiques transformés pour la régénération et la culture de plantes utiles fertiles transgéniques. L'invention sera expliquée d'une manière détaillée dans ce qui suit, en particulier, dans ses modes de réalisation préférés. Pour l'exécution de l'invention, on peut utiliser fondamentalement des embryons somatiques immatures de toutes les plantes On utilise de préférence les cellules de plantes utiles telles que des graminées comme le maïs, le blé et l'orge, des plantes ligneuses comme l'épicéa, le mélèze d'Amérique, ou les pins, ou des plantes utiles dicotylédones herbacées comme la luzerne, le colza, le soja, le coton, le céleri, et la carotte On préfère le maïs, le colza et la luzerne En particulier, on travaille de préférence avec des embryons monocotylédones, les graminées, en particulier le mais, étant particulièrement préférés Les embryons somatiques immatures peuvent être obtenus tant à partir de cultures de cals embryogènes que de cultures d'organes. Par "embryons immatures", on entend des embryons à divers stades de développement, qui se différencient à 3 - partir d'associations cellulaires embryogènes dans les cultures de cellules végétales ou les cultures d'organes végétaux et ont atteint au maximum 75 % de la taille d'un embryon mature, issu de graine Les cultures d'organes sont des embryons bien différenciés d'origine zygotique ou somatique, qui forment dans un milieu approprié des embryons adventifs Par "état séché", il faut entendre une teneur en eau de 20 % au maximum La teneur en eau des embryons est de préférence 5 à 15 % en partant d'une cellule à l'état turgescent. Les embryons sont soumis à un séchage ménagé dans des conditons stériles sur une durée de 10 à 18 jours Les cellules sont de préférence cultivées auparavant pendant au moins 7 jours, mieux encore pendant environ 2 à 8 semaines, sur un milieu nutritif à forte teneur en sucre ou en alcool de sucre La concentration du sucre ou de l'alcool de sucre doit être d'environ 8 à 12 % par rapport au poids du milieu nutritif, de préférence de 9 à 10 % On peut utiliser par exemple le glucose, le saccharose, le fructose, ou le sorbitol ou le mannitol en association ou isolément On utilise de préférence le saccharose. Les embryons séchés, qui ont été traités comme il a été décrit, peuvent être conservés pendant plus d'un an à la température ambiante à l'état séché à l'air Ces embryons peuvent aussi être proposés comme semences certifiées artificielles On utilise de préférence alors des embryons monocotylédones, par exemple de graminées, en particulier de maïs. Pour la réhydratation et pour la reprise de croissance, on dépose les embryons séchés sur un milieu de croissance avec ou sans gélose ayant une teneur en sucre, en particulier en saccharose, de 2 à 6 %. Pour la transformation, on baigne les cellules séchées dans une solution aqueuse d'ADN ou d'ARN, qui peut contenir également des constituants du milieu et des sels tampons. On peut faire entrer dans la cellule n'importe quel ADN ou ARN On opère avantageusement avec des gènes 4 - marqueurs sélectionnables, tels que par exemple le gène pour la phosphinothricinacétyltrans férase, l'hygromycinephosphotransférase, l'acétolactatesynthétase, la 5-énolpyruvyl-shikimate-phosphate synthétase (EPSP- synthétase), la glutaminesynthétase ou la transaminase On peut naturellement aussi faire pénétrer des gènes dont l'expression ne peut pas être sélectionnée par la croissance de la plante De tels gènes peuvent par exemple coder pour la 5-endotoxine de Bacillus thuringiensis ou pour la résistance aux virus, comme par exemple les gènes pour les protéines de "coat" des virus, en particulier du virus de la mosaïque du concombre, du virus de la mosaïque de la luzerne ou du virus de la mosaïque de la mûre sauvage On peut en outre utiliser le ou les gènes de la chitinase, qui améliorent la productivité photosynthétique de la plante, par exemple le gène pour la phosphoénolpyruvatecarboxylase ou l'asparaginesynthétase bactérienne (Nakamura, M M et coll; Nucleic Acids Research 9, 4669 ( 1981)) On préfère o p é r e r a v e c 1 e g è N e p o u r 1 a phosphinothricinacétyltransféra S e de Streptomyces viridochromogenes (Wohlleben, W et coll; 80, 25-27 ( 1988)), qui peut être modifié de manière appropriée pour une expression dans les plantes Par l'incorporation de ce gène, les plants de mais et leur descendance deviennent résistants à la phosphinothricine (Glufosinate) et au Bialaphos. Après synthèse ou isolement, on peut multiplier le gène par des procédés classiques, par exemple par transformation de E coli ou par une "réaction en chaîne de polymérase" Le gène fonctionnel isolé peut alors avantageusement être introduit directement ou sur un vecteur de clonage quelconque, de préférence p BR 322, p UC 18 ou p DH 51 (Pietrzak, M et coll NAR 14, 5857 ( 1986)) avec ou sans un promoteur actif dans les plantes, dans les cellules de l'embryon Comme promoteur, on utilise de préférence le promoteur 35 S L'ADN peut aussi être utilisé sous la forme d'un complexe avec des histones, comme cela est décrit par - exemple dans la demande de brevet allemand P 40 05 152 8 Il est avantageux pour la transformation de soumettre les embryons somatiques à un traitement qui provoque des ruptures de brins d'ADN, par exemple à une irradiation par les UV ou les rayons X La sélection ultérieure ne s'effectue pas, comme il est décrit dans le WO 88/09374 sur le plan de la plante entière, mais sur le plan de la cellule unitaire Dans cette mesure, on peut accumuler et découvrir des phénomènes de transformation même extrêmement rares, pour un coût acceptable. A partir des embryons somatiques transformés, de préférence d'embryons monocotylédones, par exemple de graminées, en particulier de mais, on peut régénérer les plantes fertiles par des procédé connus en soi. En outre, les embryons somatiques transformés, en particulier les embryons de monocotylédones, peuvent également être utilisés, comme il a déjà été mentionné ci- dessus pour les embryons non transformés, après une sélection et une multiplication qui sont effctuées par des 7 procédés connus en soi, comme semences artificielles On préfère particulièrement utiliser ici des embryons de graminées appropriées, en particulier de mais. L'invention concerne en outre un procédé pour la protection de plantes monocotylédones par destruction sélective de mauvaises herbes avec de la phosphinothricine, en plantant sur les surfaces cultivées des plantes qui peuvent être obtenues par le procédé conforme à l'invention e t q u i p o r t e N t l e g è N e d e 1 a phosphinothricinacétyltransférase, et leur descendance. Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration supplémentaire de l'invention. Exemples 1 Lancement de cultures de cals de maïs embryogènes et leur préconditionnement pour le séchage. Des embryons immatures propres à la culture de tissus de génotypes de maïs propres à la culture de tissus, par exemple H 99, B 73, A 188, W 64 A, et leurs hybrides, sont préparés avec une taille d'embryons de 1-1,5 mm, à partir de caryopses stérilisés en surface, dans des conditions aseptiques, et sont mis en culture sur un milieu N 6 selon Duncan (Planta 165, 322 ( 1985)) qui contient 9 % de saccharose et 1 mg /l d'acide dichlororthoanisique (Dicamba) Le cal embryogène, qui se forme sur les bords du scutellum, est sous-cultivé sur du milieu N 6 avec 1 mg/l de dicamba et 3 % de saccharose à un intervalle de 3 à 4 semaines Des cultures de cals embryogènes convenant pour le procédé de transformation peuvent être sous-cultivées de la manière décrite ici pendant un à trois ans en conservant leur faculté de régénération La culture s'effectue à 25 C, sur un rythme lumière/obscurité de 12 heures, aux environ de 1000-5000 lux. Avant le séchage, les cals sont cultivés pendant 15 5 jours sur un milieu N 6 à 9 % de saccharose La force osmotique provoquée par la teneur accrue en saccharose augmente la capacité de survie dans le processus de séchage ultérieur. 2 Séchage des cals de maïs embryogènes Le cal préconditionné est transféré dans des boîtes de Petri stériles munies de cames de ventilation, sans milieu de culture Les boîtes de Petri sont placées dans l'obscurité, à la température ambiante, de préférence à 23 c C, 3 C Par boîte de Petri, on sèche au minimum lg et au maximum 2 g de tissu de cal Au bout de deux semaines, les cals embryogènes ont perdu plus de 80 % de leur poids initial. 3 Stockage des cals embryogènes séchés Dès que les cals possèdent encore 15 5 % de leur poids de départ, ils peuvent être stockés pendant une durée illimitée à -70 C ou à -193 c C en conservant leur capacité de survie L'introduction dans de l'azote liquide peut s'effectuer directement ou en passant par un refroidissement 7 - progressif Un refroidissement avec une chute de température définie, par exemple de lc C/minute, n'est pas nécessaire. 4.Réhydratation des embryons Pour la réhydratation et la reprise de la croissance, on place les cals embryogènes sur un milieu gélosé (milieu N 6 à 3 % de saccharose) La réhydratation et la revitallisation s'effectuent également sur d'autres milieux, par exemple sur le milieu de Murashige-Skoog (Physiol Plant 15, 473 ( 1962) et avec des teneurs plus élevées en saccharose A l'exception des cultures de mais autotrophes utilisant l'auxine, une teneur de 0,5-2 mg/l d'acide dichlorphénoxyacétique ou d'acide 3,6-dichlororthoanisique (dicamba) dans le milieu est avantageuse En une demi- heure, les cals reprennent dans le milieu l'eau perdue lors du séchage Les parties de tissu qui se composent d'embryons somatiques à divers stades de développement sont en mesure de se développer à nouveau. Les tissus réhydratés sont d'abord cultivés pendant 7 jours à 25 2 C dans l'obscurité, puis sous 1000-3000 Lux pendant une période d'éclairement de 12 heures A la lumière, les régions des cals embryogènes survivantes verdissent en 7-10 jours Les tissus verdis ou les tissus présentant une croissance visible sont transférés pendant 2 à 3 semaines après la réhumidification sur un milieu frais. 5.Transformation des cals embryogènes Sur le milieu gélosé, (milieu N 6 avec 1 mg/l d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique et 3 % de saccharose) on pipette la solution d'ADN par gouttes de 20-50 gl, suivant la taille des fragments de cal séchés La solution de transformation contient 20 gg d'ADN de plasmide/ml Elle est préparée par mélange d'une solution fondamentale d'ADN à concentration double dans du tampon TE(Tris 10 m M /EDTA 1 m M, p H 7,0) avec du milieu N 6 liquide dans le rapport 1:1 aussitôt avant l'emploi Pour la transformation, on utilise le gène de la phosphinothricine-acétyltransférase synthétique indiqué ci- 8 - dessous sous le contrôle du promoteur du produit de transcription 35 S du virus de la mosaïque du choux-fleur (voir séquence ci-dessous) ou le gène synthétique de la demande de brevet européen CP O 275 957 Ce gène chimérique est intégré dans le site Eco Rl du polylinker du p UC 18. On utilise dans la plupart des expériences un plasmide d'acétyltransférase p UC 18-35 S non coupé Dans les expériences individuelles, le plasmide est coupé avec Eco Rl et le mélange de plasmide puc 18 linéarisé et du segment d'insertion de l'acétyltransférase 35 S à 1,1 Kb est utilisé pour la transformation. Les cals embryogènes séchés sont placés dans les gouttes contenant l'ADN sur le milieu gélosé Le cal embryogène, qui à l'état séché a plus de 3 mm, est séparé à travers un tamis des morceaux plus petits Les petits fragments sont utilisés sans autre prétraitement Les fragments les plus grands sont broyés à l'état séché soit en les pilonnant avec précaution dans un mortier, soit en les prétraitant par immersion dans de l'azote liquide De cette manière, il se forme dans les cals embryogènes séchés des fissures qui favorisent la pénétration de la solution de transformation dans des couches plus profondes du tissu En -30 minutes, les cals absorbent la solution d'ADN Les cals peuvent alors être soumis à une culture ultérieure comme il a été décrit dans l'exemple 4 Il s'est révélé avantageux d'irradier les cals avec une lumière UV de courte longueur d'onde 2 à 24 heures après la réhydratation, pendant 5 à 20 secondes -A cet effet, on place les boîtes de Petri à l'état ouvert sur une source de lumière UV ( 254 nm; 8000 1 g W/cm 2), de telle sorte que les cals soient exposés directement à la lumière UV. 6 Culture des tissus traités par l'ADN La culture s'effectue pendant les premières quatre semaines d'une manière identique à celle des cals embryogènes non transformés (voir exemple 4) Ensuite, les fragments de cals embryogènes survivants sont transformés 9 - sur un milieu N 6 modifié, qui est exempt de glutamine et d'hydrolysat de caséine, mais qui contient 20 mg/1 de L- phosphinothricine Par cette quantité de phosphinotricine, le tissu embryogène non transformé est immédiatement détruit, mais il joue le rôle d'une culture nourricière pour les cellules transformées de manière stable dans l'assemblage tissulaire Dans ce cas, la concentration de la phosphinothricine est suffisamment élevée pour ne permettre qu'une très faible croissance des cellules non transformées. Des cellules de mais transgéniques, qui expriment le gène de la phosphinothricine-acétyltransférase, ont un avantage sélectif et peuvent s'accumuler dans la population cellulaire. Comme la sélection pour l'expression du gène marqueur commence au plus tôt quatre semaines après la transformation, une expression transitoire possible de l'ADN transféré ne joue qu'un rôle secondaire Au bout de 4 à 6 semaines, les cals embryogènes sont transformés sur du milieu N 6 frais avec 20 mg/1 de L-phosphinothricine. Après une durée de culture de 8 à 10 semaines au total en présence de 20 mg/1 (L-phosphinothricine-NH 4 1 10-4 M), le tissu de mais non transgénique ne présente aucune croissance sur un milieu exempt d'aminoacides Quelques cals survivent à cette sélection Ces morceaux sont transférés sur du milieu N 6 frais avec 100 mg/l de L-phosphinothricine- ammonium Deux morceaux de cals sur environ 10000 présentent une croissance comparable au cal témoin sur un milieu exempt de phosphinothricine Ces tissus sont seuls utilisés pour la caractérisation biochimique ultérieure et pour des essais de régénération. 7 Culture de plants de régénérat transgéniques Le tissu de mais embryogène transformé est cultivé sur un milieu N 6 exempt d'hormone en présence de L- phosphinothricine 5 10-4 M Sur ce milieu, il se développe des embryons de mais qui expriment d'une manière suffisamment marquée le gène de la phosphinothricine- - acétyltransférase (gène PAT), pour donner des plantes Les embryons non transformés ou ceux qui n'ont qu'une très faible activité de PAT, meurent Dès que les feuilles des plantes in vitro ont atteint une longueur de 4-6 mm, on peut les faire passer dans de la terre Après élimination par lavage de restes de gélose sur les racines, on plante les plantes dans un mélange de limon, de sable, de vermiculite, et de terre unitaire, et on les adapte pendant les trois premiers jours après la plantation à la culture dans la terre à 90-100 % d'humidité de l'air La culture s'effectue dans une chambre climatisée avec une durée d'éclairement de 14 heures, sous environ 25000 Lux, à une température de jour et de nuit de 23 2/17 10 C Les plantes adaptées sont cultivées à une humidité de l'air de 65 5 %. 8 Mise en évidence de l'expression du gène de la phosphinothricinacétyltransférase transféré a) Aspersion des plantes transgéniques avec de la phosphinothricine 3 à 4 semaines après le transfert dans la terre, les plants de régénérat transgéniques et les plants de régénérat témoins obtenus à partir de cals non traités par l'ADN reçoivent une pulvérisation de la phosphinothricine dans les formules du commerce (Basta R) On utilise une quantité de phosphinothricine qui correspond au traitement par 2,0 kg de substance active/ha L'herbicide est appliqué dans une quantité d'eau de 50 ml/m 2 (= 500 1/ha) Les plants n'ayant pas d'activité de PAT sont tuées par cette quantité de phosphinothricine en 7- 10 jours Par contre, les plants de maïs possédant une activité de PAT ne sont absolument pas endommagés, ou, dans le cas d'une faible activité de PAT, présentent des taches locales sur les feuilles qui n'influent cependant pas de manière mesurable sur la croissance des plantes traitées, suivant le dégré d'expression du gène. b)On congèle à chaque fois des échantillons de 100 mg de cal de mais et de tissu de feuille dans des récipients il - réactionnels de 1,5 ml dans de l'azote liquide et on les homogénéise avec un micro-pilon en acier inoxydable adapté à la forme du récipient On y ajoute 100 il de tampon Tris- EDTA (Tris 50 m M/EDTA 2 m M, p H 7,5) On centrifuge l'homogénéisat à 12000 tours/minute pendant une minute dans une centrifugeuse Eppendorf On prélève à la pipette le liquide surnageant limpide et on jette le culot de centrifugation On détermine la teneur en protéine de l'extrait brut au moyen du dosage des protéine Bio-Rad Pour le dosage de la PAT, on prélève des parties aliquotes des extraits bruts qui contiennent à chaque fois 20 gg de protéine On ajoute aux extraits de l'acétyl-Co-A et de la 14 C-Lphosphinothricine La concentration finale dans le mélange d'incubation est de 1 m M pour l'acétyl-Co-A et de 0,1 m M pour la 14 C-Lphosphinothricine On mélange brièvement les échantillons et on les fait incuber une heure à 370 C On arrête ensuite l'embryo-réaction par addition d'un demi volume d'acide trichloracétique à 12 %, on mélange soigneusement et on place pendant 10 minutes sur de la glace On centrifuge ensuite à 12000 tours/minute pendant 10 minutes et on utilise le liquide surnageant pour la chromatohgraphie sur couche mince Sur une plaque de chromatographie sur couche mince (Cellulose F 254, Société Merck) on applique à chaque fois 6 il des mélanges d'incubation, et aussi les substances de référence 14 C- phosphinothricine et 14 C-acétylphosphinothricine Comme éluant pour la chromatographie sur couche mince, on utilise soit du n-propanol: NH 3 à 25 % ( 3:2), soit de la pyridine:n- butanol:acide acétique glacial:eau ( 3:5:1:4). La plaque de chromatographie sur couche mince séchée est emballée dans une feuille de matière plastique et exposée dans un cassette de film radiographique Sur le film radiographique développé, l'acitivité de la PAT est reconnaissable sur la bande de l'acétylphosphinothricine (qui n'existe que dans le tissu transgénique) La phosphinothricine et l'acétylphosphinothricine sont aisément séparables par chromatographie sur couche mince dans les éluants indiqués ci-dessus. x I VI I À U, I I Drd t t 1 Ji lC) 1 o % I 1-'q I P C"' I -,I D COD A À 'C E-' H 4 ú -' :t-,D ":: C > E- S oo Voc I 1 *C Q 4 l' > a> D 0 C) P C o O{.9 J (.)c, - I UCS, I | é C) I 0.X i C 1 C I I 4:Ev I I Or I I U I- i OPC_ tic) i O r 5 I L t IC-) a If E I c E>c j C 4 C I ICU C l r O f_) I U-C v-C 1 ' E- Ii-1 ID > Ico: J IC) - I OC:_-' I ' I I E -"ó C I -4 PI" I IC E'C " I ' I C 9 t ú I, 1 I CE I ci C I C> J' C.D 1 '> l Es- t O (_> IC>S C> cc> i, E-. I i O<> t o I > t, Oc,- I -'CE- I I I OD i I I I C 4 = I i OC I I DU C') Ie,L> J I U'> I I c 5,I t F-; I Ds C > I tC 5-) t b e) I c: & j E_-f; i I e:Fc I- -co E-. C i BE-' O O O O O O 30 or, I 00 é I E- I O - I I j t) I i O Oc D I'. iI I UC- I 11 c,'E- IC<> O i('C>i I.b i f t II i l-'1 * 'J 1 E 43 'À IC), I t O c 3 l I O 5 I E, Ic O 1 ' IOID I I U I IE-' j Ot i-. 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I 4 o c> r v O C> I 4, Ia Ocl S I ú 4 -tF 'i 41 ú-' I 54VUC 1 a O C l 4 O C O 1 L O l S 4C>C 1511 DO I 4 F jt.3 t CJ 2 l REVENDICATIONS 1 Procédé de transformation d'embryons, caractérisé en ce qu'on fait incuber des embryons somatiques immatures à l'état desséché avec une solution contenant de l'ADN ou de l'ARN. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise des embryons somatiques de cultures de cals embryogènes. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise des embryons somatiques de cultures d'organes. 4 Procédé selon une ou plusieurs des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise des embryons somatiques de plantes monocotylédones. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise des embryons somatiques de graminées. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on utilise des embryons somatiques de maïs. 7 Procédé selon une ou plusieurs des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on cultive les embryons somatiques avant l'incubation avec la solution d'ADN ou d'ARN sur un milieu nutritif contenant un sucre ou un alcool de sucre. 8 Procédé selon une ou plusieurs des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on utilise comme ADN le gène de la phosphinothricinacétyltransféra S e de Streptomyces viridochromogenes, le cas échéant sous forme modifiée. 9 Embryons monocotylédones somatiques transformés. Embryons somatiques de graminées transformés. - 11 Embryons de maïs somatiques transformés. 12 Embryons somatiques selon une ou plusieurs des revendica- tions 9 à 11 contenant le gène de la phosphinothricinacétyl- transtérase. 13 Plantes pouvant être obtenues à partir des embryons somatiques selon les revendications 9 à 12. 14 Utilisation des embryons transformés pouvant être obtenus selon une ou plusieurs des revendications 1 à 8, pour la préparation de semences artificielles. Utilisation d'embryons somatiques desséchés comme semences artificielles. 16 Utilisation des embryons somatiques transformés pouvant être obtenus selon une ou plusieurs des revendications 1 à 8 pour la régénération et la culture de plantes utiles transgéniques fertiles. 17 Procédé de protection de plantes monocotylédones par destruction sélective des mauvaises herbes par la phosphinothricine sur des surfaces cultivées, caractérisé en ce que la surface cultivée est plantée avec des plantes pouvant être obtenues à partir des embryons somatiques selon la revendication 12, ainsi que leur descendance.