Brevet FR2670129A1 — publié le 19920612

La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une membrane garnie d'une couche d'un gel et un cadre de support d'une telle membrane conçu pour la mise en oeuvre de ce procédé Plus particulièrement, l'invention est relative à la confection d'un ensemble gel/membrane utilisable dans une technique de séparation de macromolécules par électrophorèse. Dans cette application, on utilise une couche d'un gel, tel que l'agarose ou un polyacrylamide, et un champ électrique établi entre deux bords opposés de la couche. Des échantillons de macromolécules, par exemple d'acide nucléique, à séparer sont déposés dans des puits formés dans le gel, le long d'un de ces deux bords de la couche. L'ensemble est ensuite immergé dans un liquide approprié d'électrophorèse Sous l'effet du champ électrique, les macromolécules des échantillons logés dans les puits se déplacent vers le bord opposé de la couche, à travers le gel, à des vitesses qui sont fonction notamment de leur masse moléculaire, de sorte qu'au bout d'un temps donné, des macromolécules de masses moléculaires différentes ont parcouru dans le gel des distances différentes. Les macromolécules ainsi séparées sont ensuite transférées, soit par entraînement fluide, soit au moyen d'un champ électrique perpendiculaire à la couche de gel, sur une membrane placée contre une face de cette couche, en vue de leur hybridation et de leur détection ultérieures On décrit dans la demande de brevet européen No 358 556 déposée au nom de la demanderesse, un procédé et un dispositif d'électrophorèse conçus pour assurer une telle migration contrôlée de macromolécules, dans une pile de plaques rectangulaires de gel. Lorsqu'on utilise une membrane pour supporter la couche de gel, la confection de l'ensemble gel/membrane est particulièrement délicate en raison de la finesse et du manque de raideur de la membrane utilisée, couramment une feuille mince de nitrocellulose éventuellement chargée de nylon pour accroître sa résistance mécanique. Les cadres connus pour supporter une telle membrane ont pour défaut de ne pas permettre un maintien de cette membrane dans un plan sous tension uniforme Des plis résultant de défauts de tension se forment alors dans la membrane La couche de gel que l'on coule sur une membrane ainsi plissée présente des déformations qui s'opposent à une progression régulière des macromolécules dans la couche et rendent le résultat de la migration inexploitable La suppression de ces plis exige des manipulations longues et fastidieuses incompatibles avec les exigences d'une fabrication automatisée voire industrielle. La présente invention a donc pour but de fournir un procédé de préparation d'une telle membrane garnie de gel et un cadre pour la mise en oeuvre de ce procédé, qui permettent d'empêcher la formation de plis dans la membrane. La présente invention a aussi pour but de fournir un tel procédé et un tel cadre qui soient compatibles avec des moyens industriels de confection des membranes garnies de gel et de manipulation des cadres de support de ces membranes. On atteint ces buts de l'invention, ainsi que d'autres qui apparaîtront à la lecture de la présente description, avec un procédé de préparation d'une membrane garnie d'une couche d'un gel, suivant lequel on met d'abord la membrane à plat dans un plan horizontal et on coule ensuite un gel sur cette membrane, ce procédé étant remarquable en ce qu'on met la membrane sous tension par une traction exercée entre au moins deux bords opposés sensiblement parallèles de cette membrane. Grâce à cette mise sous tension de la membrane, les plis sont supprimés et le gel s'étale en une couche d 'épaisseur uniforme sur la membrane.35 Pour la mise en oeuvre de ce procédé, l'invention fournit un cadre de support de la membrane, qui comprend au moins deux barrettes et des moyens pour fixer une membrane à ces barrettes, suivant deux bords parallèles de cette membrane Le cadre est remarquable en ce qu'il comprend des moyens pour faire varier progressivement la position relative des deux barrettes entre une position o la membrane est détendue et une position o cette membrane est tendue entre ses deux barrettes. Les moyens pour faire varier la position relative des barrettes comprennent au moins deux lames élastiques identiques ancrée chacune par ses extrémités dans deux extrémités correspondantes des barrettes fixées à la membrane, ces lames pouvant être fléchies pour rapprocher les barrettes l'une de l'autre en vue de la fixation de la membrane aux barrettes Les lames sont prévues pour coopérer avec des moyens de commande de leur flexion. Suivant un mode de réalisation préféré du cadre selon l'invention, celuici comprend deux paires de lames élastiques parallèles ancrées chacune entre deux extrémités correspondantes des barrettes et des moyens de commande de la flexion des lames de chaque paire pour les rapprocher ou les écarter symétriquement Ces moyens peuvent avantageusement être constitués par une came rotative insérée entre les deux lames d'une paire. D'autres caractéristiques et avantages du procédé et du cadre suivant la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre et à l'examen du dessin annexé dans lequel: la figure 1 est une vue perspective du cadre de support suivant l'invention, dans la configuration qui lui est donnée pour le préparer à la coulée d'une couche de gel sur une membrane fixée sur ce cadre, la figure 2 est une vue perspective du même cadre, dans la configuration qui est la sienne après la mise sous tension de la membrane qu'il porte, conformément aux enseignements de la présente invention, la figure 3 est une vue partielle en coupe du cadre des figures 1 et 2 prises suivant le trait de coupe III-III de la figure 2, et la figure 4 est une vue en coupe analogue à celle de la figure 3 d'un autre mode de réalisation du cadre suivant la présente invention. Comme représenté aux figures 1 et 2 du dessin annexé, le cadre de support selon l'invention comprend deux barrettes symétriques 1 et 2 entretoisées par des paires de lames élastiques 3, 4 et 5, 6 Ces lames sont de mêmes longueurs et ancrées perpendiculairement en 7, 8, 9, dans des extrémités correspondantes des deux barrettes 1 et 2, de manière à définir avec ces barrettes un cadre rectangulaire sur deux bords opposés duquel elles sont agencées par paire de lames parallèles légèrement écartées l'une de l'autre. Ces lames sont constituées en un matériau ni métallique ni conducteur, flexible mais non extensible tel qu'un matériau composite, par exemple en verre époxy pultrudé Ainsi, si on déforme ces lames comme illustré à la figure 1, la longueur de la projection de la lame sur un axe perpendiculaire aux deux barrettes 1, 2 diminue ce qui a pour effet de rapprocher les barrettes l'une de l'autre Si les déformations appliquées aux quatre barrettes sont identiques, les barrettes restent en outre parallèles à elles-mêmes. Suivant l'invention, on utilise cette structure mécanique pour tendre une membrane qui doit recevoir une couche d'un gel Pour ce faire, on fixe un morceau rectangulaire de cette membrane sous le cadre des figures 1 et 2, alors que des moyens de commande 11, 12 de la flexion des lames sont insérés entre les lames 3, 4 et 5, 6 respectivement Ces moyens 11, 12 peuvent, par exemple, prendre la forme de coins ou, comme représenté à la figure 1, de cames oblongues solidaires de parties cylindriques moletées 13, 14 respectivement, permettant de les faire tourner commodément entre une position o la came ne charge pas les lames (figure 2) et une position o elle charge ces lames en les déformant (figure 1) de manière à rapprocher les barrettes 1, 2 l'une de l'autre, en parallèle. Suivant l'invention, on fixe une membrane 15 par deux bords opposés aux barrettes 1 et 2 alors que le cadre est dans la position représentée à la figure 1 Le moyen de fixation utilisé peut être un produit adhésif tel qu'un ruban adhésif double face 16 (voir la coupe partielle de la figure 3) préalablement rapporté sur la membrane avec protection temporaire En variante, les deux bords de la membrane 15 peuvent être pincés entre une barrette 1, 2 et une contre-barrette 1 ', 2 ' (voir la coupe partielle de la figure 4), un profilé de clipage en U 17 étant passé sur l'ensemble pour presser ces deux éléments l'un vers l'autre. Après la fixation d'une membrane 15 sur le cadre ( 1, 2, 3, 4, 5, 6) le procédé de préparation d'une membrane garnie d'une couche de gel suivant l'invention se développe de la manière suivante. Le cadre portant la membrane détendue est posé sur un support parfaitement plat et horizontal contre lequel la membrane s'applique L'horizontalité est vérifiée avec un niveau d'eau Des barrettes supplémentaires 18, 19 sont montées sur le cadre au voisinage des lames élastiques, de manière à délimiter sur la membrane sous-jacente, avec les barrettes 1, 2, une surface qui doit recevoir une couche de gel. On remarquera que l'une 18 des barrettes 18, 19 présente, en regard de la surface délimitée, une surface portant de multiples indentations alignées 20 formant un peigne. On coule ensuite une quantité prédéterminée d'un gel liquide, mais faisant prise progressivement à la température ambiante, par exemple, sur la membrane 15, à l'intérieur du cadre suivant l'invention Ce gel s'étale alors par gravité sur la membrane en une couche 23 d'épaisseur parfaitement uniforme (voir figures 3 et 4). Pour éviter, conformément à un objectif essentiel de l'invention, la présence de plis sur la membrane, celle-ci peut être tendue juste avant la coulée du gel, par une rotation des cames 11, 12 propre à détendre les lames élastiques 3, 4, 5, 6 (voir figure 2) et donc à écarter les barrettes 1, 2 l'une de l'autre contre la résistance de la membrane 15 ainsi mise en tension. On remarquera que lors de la coulée du gel, celui- ci s'insinue entre les indentations 20 de la barrette 18 ce qui a pour effet de former une rangée de puits 21 sur un bord de la couche, puits destinés à recevoir des échantillons de macromolécules à étudier, comme indiqué en préambule de la présente description, lorsque l'application visée est la migration contrôlée de ces macromolécules par électrophorèse. Les barrettes 18, 19 sont amovibles et retirées du cadre après la prise du gel (voir figure 2) Le cadre ainsi dépouillé porte une couche de gel dont les puits 21 sont alors dégagés et prêts à recevoir les macromolécules à étudier. On remarquera que les barrettes 1, 2 portent, sur leur surface latérale intérieure au cadre, des rangées de dents arrondies 22 Il s'agit là d'une disposition qui contribue à l'accrochage de la couche de gel sur les barrettes pendant la prise de celui-ci On remarquera en outre sur les figures 3 et 4 que les bords de la couche ou plaque de gel restent au contact des faces internes des barrettes 1 et 2. Le cadre ainsi garni d'une membrane portant une couche d'un gel approprié et d'épaisseur calibrée peut ensuite être introduit, après remplissage des puits 21, dans un dispositif tel que celui décrit à la demande de brevet européen précitée et conçu pour recevoir une pluralité de tels cadres et assurer simultanément dans ceux-ci les migrations électrophorétiques nécessaires. Il apparaît maintenant que le procédé suivant l'invention apporte bien l'avantage essentiel annoncé, a savoir la possibilité de préparer une couche de gel, de quelques millimètres d'épaisseur par exemple, sur une membrane parfaitement tendue, sans pli. Il apparaît aussi immédiatement à l'homme de métier, que les diverses opérations de fixation de la membrane sur son cadre de support, de coulée du gel et de mise sous tension de la membrane sont automatisables sans difficultés particulières et se prêtent donc à une industrialisation de la fabrication de tels ensembles de gel/membrane Il s'agit là d'un avantage important de l'invention sur les techniques actuelles de préparation de tels ensembles qui exigent à la fois du temps et de l'habileté sans que l'écueil de la formation de plis puisse toujours être évité En outre, dans le cadre d'une fabrication industrielle, il devient possible de contrôler la tension de la membrane ce qui contribue à la reproductibilité des spectres de migration de macromolécules transférés sur la membrane. On observera en outre que la membrane peut être détachée du cadre suivant l'invention, que cette membrane soit fixée à ce cadre par les moyens illustrés à la figure 3 ou à la figure 4 Le cadre est alors réutilisable ce qui abaisse encore le coût du procédé de préparation suivant l'invention, notamment dans le cadre d'une industrialisation de ce procédé. Bien entendu l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple Ainsi, le cadre décrit est entretoise par deux paires de lames élastiques 3, 4 et 5, 6 On pourrait concevoir un cadre comprenant une seule lame élastique là o il y en a deux dans le mode de réalisation décrit Cependant, l'utilisation de paires de lames écartées, parallèles et encastrées est avantageuse en ce que chaque paire constitue elle-même un rectangle qui se déforme facilement symétriquement et qui est difficilement déformable asymétriquement, qui s'oppose à toute déformation du cadre dans son plan et qui s'oppose en outre à tout voilage de ce cadre grâce au fait que les lames sont disposées dans des plans perpendiculaires au plan du cadre. On observera aussi que les moyens utilisés suivant 1 ' invention pour tendre une membrane entre deux de ses bords pourraient être duplicatés entre les deux autres bords pour assurer une mise en tension bidirectionnelle de la membrane, plus propre encore, en principe, à favoriser la parfaite planeité de la membrane On pourrait encore10 tendre la membrane dans une direction parallèle à la direction de migration des macromolécules plutôt que dans une direction perpendiculaire à celle-ci. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'une membrane garnie d'une couche d'un gel, suivant lequel on met d'abord la membrane à plat dans un plan horizontal et on coule ensuite un gel sur cette membrane, caractérisé en ce qu'on met la membrane sous tension par une traction exercée entre au moins deux bords opposés sensiblement parallèles de cette membrane. 2 Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que, pour mettre la membrane sous tension, on fixe d'abord deux bords parallèles de celle-ci à des barrettes ( 1, 2) et on écarte ensuite ces barrettes l'une de l'autre, dans une direction transversale à leur direction. 3 Procédé conforme à la revendication 2, caractérisé en ce qu'on délimite une surface sensiblement rectangulaire sur la membrane non tendue à l'aide desdites barrettes ( 1, 2) et de deux autres barrettes transversales ( 18, 19) et on coule le gel sur la surface ainsi délimitée. 4 Cadre de support de membrane conçu pour la mise en oeuvre du procédé conforme à la revendication 1, comprenant au moins deux barrettes ( 1, 2) parallèles et des moyens ( 2 ', 17; 16) pour fixer une membrane ( 15) à ces barrettes, suivant deux bords parallèles de cette membrane, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens ( 3, 4, 5, 6, 11, 12) pour faire varier la position relative des deux barrettes entre une position o la membrane ( 15) est détendue et une position o cette membrane ( 15) est tendue entre ces barrettes. Cadre conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que lesdits moyens pour faire varier la position relative desdites barrettes comprennent au moins deux lames élastiques identiques ancrées chacune par ses extrémités dans deux extrémités correspondantes des barrettes ( 1, 2) fixées à la membrane ( 15), ces lames pouvant être fléchies pour rapprocher les barrettes l'une de l'autre en vue de la fixation de la membrane aux barrettes. 6 Cadre conforme à la revendication 5, caractérisé en ce que la membrane ( 15) supporte une couche d'un gel coulé sur la membrane alors que celle-ci est portée à l'horizontale par les barrettes ( 1, 2) en position rapprochée. 7 Cadre conforme à la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est conçu pour coopérer avec des moyens de commande ( 11, 12) de la flexion des lames élastiques. 8 Cadre conforme à la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend deux paires de lames élastiques parallèles ( 3, 4) et ( 5, 6) ancrées chacune entre deux extrémités correspondantes des barrettes, les moyens de commande ( 11, 12) de la flexion des lames de chaque paire étant constitués par une came rotative insérée entre deux lames d'une paire. 9 Cadre conforme à l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce qu'il est conçu pour coopérer avec deux barrettes supplémentaires ( 18, 19) dimensionnées pour être installées entre les deux barrettes de support de la membrane de manière à délimiter avec cellesci, sur la membrane, une surface sur laquelle le gel à couler sur la membrane doit être retenu jusqu'à25 sa prise. Cadre conforme à la revendication 9, caractérisé en ce qu'une au moins ( 18) des barrettes supplémentaires est amovible et présente des indentations ( 20) permettant de ménager des puits ( 21) sur un bord de la surface de la membrane réservée à la coulée du gel. 11 Cadre conforme à l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que les barrettes ( 1, 2) de support de la membrane ( 15) sont munies de dents ( 22) sur leurs surfaces destinées à35 contenir le gel sur la surface de la membrane réservée à ce gel. 12 Cadre conforme à l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que la membrane est fixée sur les barrettes de support par un ruban adhésif ( 16) double face. 13 Cadre conforme à l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que la membrane ( 15) est fixée sur chaque barrette de support ( 1, 2) par pincement entre une surface de cette barrette et une surface d'une contre-barrette ( 2 '), le pincement étant assuré par un profilé ( 17) enserrant la barrette et la contre-barrette.