Brevet FR2663646A1 — publié le 19911227

I L'invention a pour objet de nouvelles souches productrices de vitamine B 12 ainsi qu'un procédé de préparation de vitamine B 12 par culture desdites souches. La vitamine B 12 encore appelée cobalamine est essentielle à l'homme et aux animaux non ruminants. Ils la trouvent essentiellement dans une alimentation carnée. C'est pourquoi, dans les élevages industriels d'animaux dont l'alimentation est uniquement à base de protéines végétales, il faut, pour assurer à ces animaux une croissance normale, incorporer la vitamine B 12 à leur nourriture. La vitamine B 12 est actuellement essentiellement préparée par fermentation bactérienne et de nombreux brevets décrivent des souches bactériennes naturellement productrices de vitamine B 12. Bien entendu, il est toujours souhaitable, pour satisfaire aux besoins industriels, tant en alimentation animale qu'en pharmacie, de disposer de systèmes de production toujours plus performants. Ainsi, les recherches actuelles portent d'abord sur l'amélioration de la productivité des souches naturellement productrices, en utilisant les techniques de la mutagénèse et de la recombinaison génétique. La voie de la synthèse de la vitamine B 12 est relativement complexe et maintenant bien connue. Elle correspond, au niveau génétique, à trois régions impliquées dans la synthèse de différents précurseurs de la vitamine B 12. Plus précisément, les gènes impliqués dans la biosynthèse de la vitamine B 12 par les bactéries semblent groupés en trois opérons: l'opéron cob I impliqué dans la biosynthèse de la cobinamide, l'opéron cobl I impliqué dans la biosynthèse du dimethylbenzimidazole (DMB) et l'opéron cobl Il codant pour une fonction permettant la réaction de la cobinamide et du DMB pour former la cobalamine L'opéron cob I joue un rôle particu- lièrement important dans la mesure o une vingtaine de gènes sont impliqués dans la synthèse de la cobinamide. On connaît plusieurs bactéries naturellement productrices, c'est-à-dire qui possèdent tous les gènes de la voie de biosynthèse On peut citer de façon non limitative Bacillus megaterium, Propionobacterium shermanii, Pseudomonas putida et Agrobacterium tumefaciens. En pratique, essentiellement les propionibactéries, c'est-à-dire les bactéries qui synthétisent de l'acide propionique telles que Propiono- bacterium freudenreichii et Propionobacterium shermanii, ainsi que Pseudomonas denitrificans, sont utilisées industriellement. Chez ces bactéries naturellement productrices, certains auteurs ont déjà effectué le clonage et la propagation de certains groupes de gènes afin d'augmenter la quantité de gènes correspondant à des enzymes limitantes. Ainsi Brey et ai, Journal of Bacteriology Août 1986, pages 623-630 ont étudié des groupes de gènes de l'opéron cob I de Bacillus megaterium Cameron et al, Journal of Bacteriology, Janvier 1989, pages 547-557 ont décrit le clonage de groupes de gènes de Pseudomonas denitrificans capables de complémenter, chez les bactéries Pseudomonas putida et Agrobacterium tumefaciens, des mutations cob Un mutant cob est un mutant incapable de synthétiser la cobalamine (vitamine B 12). Toutefois, tous ces travaux ne visent qu'à améliorer la productivité de souches naturellement productrices de vitamine B 12. Or, il est également intéressant de pouvoir faire produire la vitamine B 12 par d'autres bactéries qui ne la produisent pas naturellement. Le déposant a maintenant trouvé qu'il est possible de faire produire de la vitamine B 12 par la bactérie E Coli en la transformant avec un ADN hétérologue comportant tout ou partie de la région cob I et permettant l'expression de ladite région dans E Coli. C'est pourquoi l'invention a pour objet une souche de E Coli productrice de vitamine B 12 transformée par un ADN hétérologue comportant tout ou partie de la région cob I et permettant l'expression de ladite région dans E Coli. La bactérie E Coli a fait l'objet de nombreuses manipulations génétiques car elle présente une bonne aptitude à la transformation, et de nombreux systèmes de production dans E Coli ont été éprouvés pour obtenir des produits d'intérêt industriel Dans le cas de la vitamine B 12, on peut donc penser que la découverte à la base de l'invention ouvre la possibilité de produire la vitamine B 12 à l'échelle industrielle par mise en culture de E.Coli. La région cob I hétérologue peut provenir de toute bactérie chez laquelle cette région a été identifiée On peut citer, de façon non limitative, la région cob I de Citrobacter, de Salmonella typhimurium, et d'une manière générale de toute bactérie naturellement productrice de vitamine B 12. Dans la suite de la description, on s'intéressera plus particuliè- rement à la région cob I de Salmonella typhimurium. L'ADN hétérologue utilisé pour transformer E Coli comporte ou non des éléments assurant l'expression de la région cob I dans E Coli En effet, différentes possibilités sont envisageables La région cob I peut utiliser des éléments propres à E Coli, déjà présents dans la bactérie ou encore être introduite, portée par un vecteur, avec des éléments d'expression hétérologues En tant que vecteur, on peut utiliser différents systèmes tels que les plasmides ou les cosmides. Tout ou partie de la région cob I peut être introduite, dès lors que son expression conduit à la production de vitamine B 12 par E Coli. Ainsi, on a déterminé que la transcription cob I s'effectue à partir d'une portion de gène allant du site Pst I(l) jusqu'au site Pst I ( 8,25) tel qu'identifié à la figure 1 et on constate que le vecteur p AR 3063 qui ne comprend pas les sites Eco RI ( 7,05) et Pst I(l) ( 8,25) ne permet pas la production de vitamine B 12, même s'il complémente cependant des mutations cob désignées par mutation cob-2719 et cob-2720 C'est pourquoi l'invention concerne plus particulièrement une souche de E Coli transfor- mée par un ADN hétérologue comportant la région cob I choisie parmi: a) la région comprise entre les sites de restriction Pst I(l) et Pst I ( 8, 25) telle que représentée sur le diagramme de la figure 1, b) toute séquence d'ADN qui s'hybride à la région définie en a) c) toute séquence d'ADN dégénérée en raison du code génétique par rapport aux séquences d'ADN définies en a) et b). Plus particulièrement, la souche selon l'invention est telle que la région définie en a) présente, à partir suivante: CCTGCAGCAC AGCCGCGATG' GCCAAACAGC CTGGTGGACG GCAAGGCTGT TTCAACGTCG ATTTCAGCAT TCGACCCGAC CCTCAACCTC CGTCACTAGC CGACGCCCAC TATCACTCCT ATTGCTCACT GCCGGTACTG GGGTATGTCC TACCTGCACG CCACTGGGGT TGATTACTGC ATCATGGCAT GATTT et à partir du site de restriction Bam HI Pst I( 1), la séquence suivante: de l'extrémité 5 ', la séquence TTGGTTGCCC CTTGCGGCTA GCGGGCGTGA CAAAAATGCC CTCCTTGCGA CAGAGATCCT GGTCATCCTA CCGTTATGGG TTGTGAATCG ATTGAACATT CGGCGTCGAT CGTCATCAGC ( 4,85), elle présente vers le site GGATCCCTTT CCGCGCCCAG TGCCGTAAAC CGCACGGTCA CATTGCAGCT ATCCCGACGG GCT 3 AATCGT CGCCTGCCAG TCAAATGCCG CT.TAAGCAAT CGGCAATCCA TCGCCGCCA A CGC-ATCGGUCG TCCAGCGGGC CTCGTCGACG M__ _ _ C=_Gw Cfu C m__m 1 _z TGACAACAAC ACGCCGGAZ. TGGTCTATCG CCCATTCCCA GGACGATTAC GCGCCAATAT CTGCGCCA 3 A CTTCCAGCGC CGACCGTTAG TGCC GAGAA m__ S Suivant un mode de réalisation avantageux, la région cob I comprend également le site Pst I ( 1) lui-même Suivant un autre mode de réalisation, la région Cob I, telle que définie en a) comprend également le site Pst ( 8,25) lui-même Plus particulièrement, la région définie en a) comprend également la région comprise entre les sites de restriction Pst I ( 1) et Eco RI ( 0) telle que représentée sur le diagramme de la figure 1, ayant, à partir de site Pst I ( 1) vers le site Eco RI ( 0) la séquence suivante: TAATTGGGGT CGACGCATAG CTGTCATACA ACCCCATGAC CCCTTCAATG ACAGCGATAT CCGCCTGCCG CATTTGTTCG CAAAATAAGG CGTTGAGAAC AGGAGGAGGA AGCATGAAAC TGTCAAGATT ACGGGACGCC ACGCCACAGA TAGCGGTATG CCAGCCGGTA TCAAGGTAAT CTGGCCCAAC TTTAAACGGC TGTACGCGCA et à partir du site Eco RI(O) vers le site Pst I(l) la séquence suivante: CTCATCCTCC 1 ATAGTCTTT Tm CA Am AAA Tmm CACCAG Tm TTT TATTACGCTT TAGATTAACG AAACGTAGCA CGTAACCACA ATCGTTATGA GTATCTTAAT TCATAGCGCA TATTTTTGTG TGTCGATACG TCAGATGAGC CATTATTAAT GGTTGCCACA ATAGCAATAT CATTTCAGAA ACAAAATAAT ATGAAGTACA TTTTATCGTC AACCGCTCAG TGTCGTTATG TTGTGGTAGG TTTGCTATTG AGAAAATTTA AAAATTTAGG GTGTCAGGAA AATATACCGG GCTATTGCTC GGTGTGCCGT GAGGGGTGAA CCGATTTTTG TXTGGTGTAA GCATAAACTG AGATAAGTTT TAAGGATGAG ACAGAAATGT ACAGCCATAA TCCCGCAGCC CGCGCTGTG ATGCTGAC Enfin, l'invention couvre également les formes de réalisation dans lesquelles la région cob I définie en a), lorsqu'elle comprend la région telle que définie précédemment, comprend également les sites Pst I ( 1) et Eco RI ( 0) eux-mêmes Dans tous les modes de réalisation tels que définis précédemment, on peut prévoir que la région cob I définie en a) comporte également la région comprise entre les sites de restriction Eco RI ( 0) et Pst I (-3,5), ainsi que le cas o ladite région cob I comporte toute la région allant du site Pst I (-3,5) au site Cla ( 17,2), toujours selon le mode de représentation adopté dans le diagramme de la figure I. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de vitamine B 12 selon lequel on cultive une souche de E Coli conforme à l'invention dans un milieu de culture approprié et on récupère la vitamine B 12 obtenue. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description détaillée suivante, accompagnée des figures 1 à 5, lesquelles représentent: Figure 1: la carte de restriction d'une partie du génome de Salmonella typhimurium, avec en parallèle les fragments dudit génome contenus dans les plasmides p AR 3062 et p AR 3063 Les sites de restriction les plus courants sont indiqués par leur désignation suivie d'un chiffre entre parenthèses qui visualise pour la commodité de la figure, la position des sites par rapport au site Eco RI( 0) Les flèches accompagnées de signes romains I, II, III, IV correspondent aux régions du génome dont la séquence a été déterminée Les flèches épaisses situées au dessus de la carte de restriction symbolisent le sens de transcription de la région cob I d'une part et d'autre part du gène Col, qui correspond au gène Pdu mentionné dans le document Abstracts of the 90th Annual Meeting Am Soc for Microbiology 1990, 13-17 Mai, Anaheim, Californie Les plasmides p AR 3062 et p AR 3063 sont représentés de façon à montrer leur zone de recouvrement avec les régions du génome de Salmonella typhimurium. Figure 2: une partie de la séquence (séquence I) des plasmides p AR 3062 et p AR 3063 allant du site Pst(I) vers le site Eco RI( 0) tels qu'indiqués à la figure I. Figure 3: une partie de la séquence (séquence II) des plasmides p AR 3062 et p AR 3063, allant du site Eco RI( 0) vers le site Pst I( 1) tels qu'indiqués à la figure 1. Figure 4: une partie de la séquence (séquence III) des plasmides p AR 3062 et p AR 3063 allant du site Pst I(l) vers le site Bam HI ( 4,85) tels qu'indiqués à la figure 1. Figure 5: une partie de la séquence (séquence IV) des plasmides p AR 3062 et p AR 3063, allant du site Bam HI ( 4,85) vers le site Pst I(l) tels qu'indiqués à la figure 1. Les exemples de réalisation décrivent la préparation de deux vecteurs désignés respectivement par p AR 3062 et p AR 3063 dont l'un illustre l'invention et l'autre correspond à un essai comparatif, afin de mettre en évidence la structure minimale que doit avoir la portion de la région cob I pour résoudre le problème posé par l'invention. Exemple: Préparation d'une souche de E Coli productrice de vitamine B 12. Pour rechercher un ensemble de gènes apportant une fonction cob I active chez E coli les expériences ont porté sur 1 'ADN de souches bactériennes dérivées de Salmonella typhimurium LT 2 La souche AR 2155 est un dérivé restriction négatif de la souche LT 2 qui a servi de donatrice d'ADN. Les bactéries ont été cultivées en milieu minimum (par litre Na 2 HP 04 6 g, KH 2 PO 4 3 g, Na CI 0,5 g, NH 4 C 1 lg, Mg SO 4 0,2 g, Ca CI 2 0,01 g, glucose 10 g, Casamino acides I g) puis récupérées par centrifu- gation et traitées en SDS 2 %, protéinase K 10 mg/ml pendant 3 heures à 40 C L'ADN a ensuite été extrait par le phénol et précipité à l'éthanol en présence d'acétate de sodium 0,3 M Les brins d'ADN ont été collectés puis remis sur un tampon Tris p H 7,5 50 m M, EDTA ( 1 m M) pour traitement à la R Nase à 200 mcg/ml L'ADN est extrait ensuite au chlorofome, précipité à l'éthanol, resuspendu et dialysé contre un tampon Tris p H 7,5 l Om M, EDTA 10 m M, Na Cl 10 m M. Cet ADN chromosomique est ensuite digéré partiellement par l'enzyme de restriction Sau 3 A à des concentrations décroissantes allant de 2 unités par mcg d'ADN jusqu'à 0, 015 unités par mcg d'ADN pendant 1 heure à 37 C Les digestions sont arrêtées par l'ajout d'EDTA à la concentration finale de 20 m M et l'ADN ainsi digéré est placé sur un gel d'agarose à 0,4 % dans un champ d'environ I volt par cm jusqu'à migration complète du bleu de bromophénol utilisé comme marqueur de migration. Les bandes de gel correspondant à une taille d'environ 25 kilobases sont découpées, mises dans un sac à dialyse dans un tampon Tris borate EDTA et placées dans une cuve d'électrophorèse L'électroélution est effectuée à 200 volts pendant 1 heure avec inversion de courant pendant 2 minutes pour libérer l'ADN L'ADN est filtré sur colonne de laine de verre puis extrait au phénol et au chloroforme I 1 est ensuite précipité deux fois à l'éthanol et resuspendu sur un tampon Tris EDTA. Cette préparation d'ADN est alors liguée à l'aide de la ligase dans le vecteur p LA 2917 (L N Allen et R S Hanson, Journal of Bacteriology ( 1985) 161 pages 955-962) Ce vecteur est un cosmide portant, en plus d'un marqueur de résistance à la tétracycline, un marqueur de résistance à la kanamycine inactivé lors d'une coupure par l'enzyme Bgl II. Ce vecteur p LA 2917 est préalablement digéré complètement par l'enzyme Bgl II puis déphosphorylé à l'aide d'enzymes commerciales utilisées suivant les protocoles des fournisseurs. Le produit de la ligation est ensuite encapsidé suivant la méthode de Hohn (Methods Enzymol ( 1979) 68 pages 299-309) en utilisant des extraits d'encapsidation commerciaux (Stratagene cloning systems, La Jolla, California). Ce ligat est ensuite amplifié dans la souche restriction négative de E Coli, 517-1 (Simon R,U Priefer, et A P Uhler ( 1982) Biotechnology I pages 784-791) par infection de 5 ml de cette bactérie sensible (suspendue en Mg SO 4 0,01 M) avec 0,5 ml d'encapsidat, suivie d'un étalement sur 25 boîtes de milieu peptonée contenant de la tétracycline à 20 mcg/ml. Environ 12000 colonies sont obtenues et remises en suspension en Mg SO 4 0,01 M Ce mélange sert à préparer un stock de bactériophage lambda virulent qui a pour titre 2 109 pfu/ml. La population de bactériophages ainsi obtenue contient des particules virales de lambda vir qui ne peuvent se développer chez Salmonella typhimurium (Harkki A et Palva E T ( 1984) Mol Gen Genet. pages 256-259) et des particules de cosmides qui peuvent s'y répliquer après infection, à condition d'utiliser une souche de Salmonella typhimurium sensible à l'adsorption du bactériophage lambda. Pour réaliser la transformation, on utilise une souche de Salmonella typhimurium rendue sensible à l'infection par le bactériophage lambda (Palva E T, Liljestrôm P, Harayama S ( 1981) Mol Gen Genet 181 pages 153157) et porteuse de mutations restriction négatives, ci-après dénommée souche TN 2540 Cette souche de Salmonella typhimurium comporte également une mutation cob I (Jeter, R M, B M Olivera et J. Roth ( 1984) J Bacteriol 170 pages 2078-2082) afin de rechercher des clones exprimant la région cob I. Cette souche réceptrice, dénommée TN 2540 cob I-, est infectée par la population de bactériophages obtenue précédemment à une multiplicité d'infection de 0,5 pour rechercher des clones devenus résistants à la tétracycline, puis parmi eux des clones devenus cob I+ De tels clones cob I+ sont trouvés à une fréquence d'environ 1 pour 500 clones résistants à la tétracycline examinés. L'un des plasmides ainsi obtenu est dénommé p AR 3062 et sa carte physique de restriction est déterminée à l'aide d'enzymes de restriction comme indiqué sur la figure I Le plasmide p AR 3062 comprend toute la partie allant du site Pst I (-3,5) au site Pst I ( 17,5). De plus, une portion de la région a été séquencée et les séquences I, II, III, IV correspondantes sont indiquées aux figures 2 à 5. On prépare d'autre part un plasmide contrôle p AR 3063 qui ne contient, du côté 3 ', que le site Cla ( 5,25), mais ne contient pas les sites Eco RI ( 7,05) et Pst I ( 8,25) tels qu'identifiés à la figure 1. De même, une partie de ce plasmide a été séquencée et la partie séquencée se recouvre avec les séquences I, II, III, IV de p AR 3062. Le plasmide p AR 3062 et le plasmide contrôle p AR 3063 sont transférés dans la souche d'E Coli K 12 W 3110 Ces deux souches ainsi que la souche de Salmonella Typhimurium AR 2155 utilisée comme contrôle positif, sont cultivées sous anaérobie, en milieu liquide (par litre: extrait de levure 5 g, chlorure de cobalt 1 mg, dimethyl benzymidazole 50 mg pendant 48 heures à 370 C). Les cultures sont ensuite traitées à 20 minutes à 201 C puis on extrait la vitamine B 12 au phénol et des aliquots sont déposés sur une souche indicatrice E Coli met E sur milieu minimum sans méthionine Les mutants met E peuvent utiliser la vitamine B 12 exogène pour contourner leur besoin en méthionine exogène On détermine la quantité de vitamine B 12 produite en mesurant les halos de croissance de la bactérie indicatrice. La souche de Salmonella typhimurium AR 2155 donne des halos de 22 mm (équivalent à 0,10 mg/g de bactérie), la souche E Coli W 3110 (p AR 3062) des halos de 20 mm (équivalent à 0,08 mg/g de bactérie) et la souche contrôle E Coli W 3110 (p AR 3063) n'a pas donné de halo Par conséquent, la bactérie E Coli naturellement non productrice de vitamine B 12 peut la produire lorsqu'elle est transformée conformément à l'invention. Bien entendu, il est possible, sans sortir du cadre de l'invention de préparer des vecteurs d'expression dans E Coli permettant de surexprimer la vitamine B 12 grâce à la présence de promoteurs réputés forts dans E Coli tels que les promoteurs PGK, Ptac, PL, etc. REVENDICATIONS 1 Souche de E Coli productrice de vitamine B 12 transformée par un ADN hétérologue comportant tout ou partie de la région cob I et permettant l'expression de ladite région dans E Coli. 2 Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit de la région cob I de Salmonella typhimurium. 3 Souche selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'il s'agit de la région cob I choisie parmi: a) la région comprise entre les sites de restriction Pst I( 1) et Pst I ( 8,25) telle que représentée sur le diagramme de la figure 1, b) toute séquence d'ADN qui s'hybride à la région définie en a) c) toute séquence d'ADN dégénérée en raison du code génétique par rapport aux séquences d'ADN définies en a) et b). 4 Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce que, la région définie en a) présente, à partir de l'extrémité 5 ' la séquence suivante: CCTGCAGCAC CTGGTGGACG ATTTCAGCAT CGTCACTAGC ATTGCTCACT TACCTGCACG AGCCGCGATG GCAAGGCTGT TCGACCCGAC CGACGCCCAC GCCGGTACTG CCACTGGGGT GCCAAACAGC TTCAACGTCG CCTCAACCTC TATCACTCCT GGGTATGTCC TGATTACTGC TTGGTTGCCC CTTGCGGCTA GCGGGCGTGA CAAAAATGCC CTCCTTGCGA CAGAGATCCT GGTCATCCTA CCGTTATGGG TTGTGAATCG ATTGAACATT CGGCGTCGAT CGTCATCAGC ATCATGGCAT GATTT et à partir du site de restriction Bam HI ( 4,85), elle présente, vers le site Pst I(l I), la séquence suivante: GGATCC C TT Tm CCGCGCC AG TGCC Gr TAAAC CGCACGG CA CATTGCAGCT ATCCCGACGG GCTAXATC-GT CGCCTGCCAG TCAAAT GCCG CGGCAATCCA TCGCCGCCA P- CGCATCGGCG TCCAGCGUU CCTTAGCAAT CTCGTCGACG TGACAACAAC ACGCCGCGA P TGGTCTATCG CCCATTCCCA GGACGATTAC GCGCCAATAT CTGCGCCA A CTTCCAGCGC CGACCGTTAG TGCCGAGAA I 1 Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite région cob I comprend également le site Pst I ( 1) lui-même. 6 Souche selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que ladite région cob I, définie en a) comprend également le site Pst ( 8, 25) lui-même. 7 Souche selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisée en ce que la région définie en a) comprend également la région comprise entre les sites de restriction Pst I ( 1) et Eco RI( 0) telle que représentée sur le diagramme de la figure 1, ayant, à partir de site Pst I(l) vers le site Eco RI( 0) la séquence suivante: TAATTGGGGT CGACGCATAG CTGTCATACA ACCCCATGAC CCCTTCAATG ACAGCGATAT CCGCCTGCCG CATTTGTTCG CAAAATAAGG CGTTGAGAAC AGGAGGAGGA AGCATGAAAC TGTCAAGATT ACGGGACGCC ACGCCACAGA TAGCGGTATG CCAGCCGGTA TCAAGGTAAT CTGGCCCAAC TTTAAACGGC TGTACGCGCA et à partir du site Eco RI( 0) vers le site Pst I(l) la séquence suivante: CTCATCCTCC ATAGTCTTTT CAATAATTG CACCAGTTTT TATTACGCTT TAGATTAACG AAACGTAGCA CGTAACCACA CG 2 CTG CTGTGT ATCGTTATGA GTATCTTAAT TCATAGCGCA TATTTTTGTG TGTCGATACG TCAGATGAGC CATTATTAAT GGTTGCCACA ATGCTGAC ATAGCAATAT CATTTCAGAA ACAA-ATAAT ATGAAGTACA T Tmm TTATCGTC AACCGCTCAG TGTCGTTATG TTGTGGTAGG TTTGCTATTG AGAAAATTTA AAAATTTAGG GTGTCAGGAA AATATACCGG GCTATTGCTC GGTGTGCCGT GAGGGGTGAA CCGATTTTTG TXTGGTGTAA GCATAAACTG AGATAAGTTT TAAGGATGAG ACAGAAATGT ACAGCCATAA TCCCGCAGCC 8 Souche selon la revendication 7, caractérisée en ce que la région cobi définie en a) comprend également les sites Pstl(l) et Eco RI( 0) euxmêmes. 9 Souche selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisée en ce que la région cob I définie en a) comporte également la région comprise entre les sites de restriction Eco RI( 0) et Pst I(-3,5) telle que représentée sur le diagramme de la figure 1. Souche selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisée en ce que la région cob I définie en a) comporte toute la région allant site Pst I (-3,5) au site Cla ( 17,2) selon les indications données dans le diagramme de la figure 1. Il Procédé de préparation de vitamine B 12 caractérisé en ce qu'on cultive une souche de E Coli selon l'une des revendications précédentes, dans un milieu de culture approprié et on récupère la vitamine B 12 obtenue.