Brevet FR2660933A1 — publié le 19911018

MOYENS POUR LA DETECTION DE CELLULES HAUTEMENT PROLIFERATIVEB L'invention a pour objet une méthode pour la détection de cellules fortement prolifératives telles les cellules tumorales et un kit permettant la mise en oeuvre d'une telle méthode. A l'heure actuelle, la détection de tumeurs fait appel le plus souvent à des examens histologiques des cellules transformées qui nécessitent un personnel hautement qualifié pour apprécier les résultats. De plus, peu de marqueurs fiables de cellules tumorales sont actuellement disponibles. L'étude de tumeurs par les inventeurs, notamment de tumeurs du sein, a montré une augmentation importante de l'activité et du taux d'enzymes intervenant dans la synthèse des nucléotides. La mesure de l'activité ou du taux de l'enzyme a pu être corrélée de manière reproductible à l'état tumoral des échantillons biologiques testés. L'invention a donc pour but de fournir une méthode de détection de cellules hautement prolifératives, en particulier, elle vise à fournir une méthode pour mettre en évidence un état tumoral potentiellement évolutif en mesurant l'activité ou le taux d'enzymes particulières. Selon un autre aspect, l'invention vise à fournir un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre de cette méthode. La méthode, selon l'invention, pour la détection de cellules fortement prolifératives, est caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure in vitro de l'activité ou de la quantité de NDP kinases d'un échantillon biologique. On sait que les nucléosides diphosphate kinases (NDP kinases; EC 2.7.4.6.) jouent un rôle majeur dans la synthèse des nucléosides- triphosphates (pour une revue: AGARWAL & PARKS, 1973). Ces enzymes catalysent le transfert du groupement r-phosphate d'un triphosphonucléoside donneur sur un nucléoside diphosphate accepteur par un mécanisme ping-pong comportant un intermédiaire phosphorylé stable comme représenté ci-après N1TP + E = NDP + E J P N2DP + E N P - N2TP + E N1TP + N2DP = N1DP + N2TP (N1 et N2 sont des ribo et déoxyribonucléosides et E P, l'intermédiaire phosphoryle) Leur spécificité vis-à-vis des substrats nucléotidiques est assez large puisqu'elles peuvent utiliser indifféremment les dérivés puriques et pyrimidiques et aussi bien les dérivés riboses que déoxyriboses. Elles forment des polymères constitués d'un seul ou de deux types de monomères associés le plus souvent en hexamères. Les inventeurs ont observé que les variations d'activité ou de taux de NDP kinases traduisent un état tumoral potentiellement évolutif. La mesure de l'activité des NDP kinases est réalisée avantageusement en utilisant comme substrats des nucléotides naturels ou des analogues de synthèse de ces nucléotides et en mettant en évidence les nucléotides produits par des systèmes enzymatiques couplés permettant la formation de produits détectables par colorimétrie et/ou spectrophotométrie. Ainsi, on utilise par exemple un système hexokinase-glucose-6-phosphate déshydrogénase, reliant la formation par la NDP kinase d'ATP à partir d'ITP (inosine triphosphate) et d'ADP, à la formation de la NADPH+H+, produits détectables spectrophotométriquement directement à 340 nm ou dans le spectre visible après la réaction avec la phénazine méthcsulfate et le nitrobleu de tétrazolium (CHENG et al, 1971, Biochemistry 10, 2139). En variante, on mesure la quantité de NDP kinase par marquage de l'intermédiaire phosphorylé résultant de l'interaction du nucléotide triphosphate substrat avec l'enzyme, le marquage de l'intermédiaire phosphorylé étant effectué à l'aide d'analogues tels les dérivés rthiophosphates de 1'ATP ou du GTP qui présentent l'avantage de ne pouvoir être hydrolysés par les phosphatases. L'activité NDP kinase peut également être suivie en utilisant des nucléotides naturels ou des analogues de synthèse radioactifs et des techniques de séparation des produits de la réaction par chromatographie (PARKS & BR AGARWAL, 1973, in The enzymes (BOYER P.D. Ed), 8, 307, Academic Press, NY). Selon un autre mode de réalisation de l'invention, comme l'augmentation d'activité observée correspond à un taux plus important d'enzyme, on mesure la quantité de NDP kinases présentes à l'aide d'anticorps anti-NDP kinases polyclonaux ou monoclonaux et on met en évidence une réaction éventuelle du type antigène-anticorps à l'aide de systèmes révélateurs classiques. Cette détection peut être effectuée sur coupe histologique ou après électrophorèse de ltéchantillon et transfert de WESTERN. Les systèmes révélateurs les plus usuels comprennent des marqueurs chimiques, physiques et/ou enzymatiques et/ou chimioluminescents détectables lorsque la réaction du type antigène-anticorps s'est produite. On citera les systèmes colorimétriques couplés à des enzymes, les systèmes fluorescents ou encore radiomarqués. Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, on utilise des sondes d'ADNc spécifiques de NDP kinases capables de s'hybrider avec les séquences correspondantes des ARN-m codant pour les NDP kinases, une augmentation du taux des ARN-m pouvant être reliée à une augmentation de la quantité de protéines NDP kinases reflétant l'état tumoral de l'échantillon. Avantageusement, l'activité ou la quantité de NDP kinases est mesurée sur un échantillon biologique provenant d'un patient. Pour la mise en evidence d'un état tumoral, on effectue plus spécialement une comparaison d'activité entre un échantillon biologique contenant des cellules hautement prolifératives et un échantillon contenant des cellules correspondantes normales. Par échantillon biologique, on entend tout prélèvement effectué sur le patient qu'il s'agisse d'une tumeur solide, d'un fluide biologique tel que le sang, le sérum, le liquide céphalo-rachidien, le liquide pleural, l'urine, les crachats, des prélèvements obtenus par tubage, aspiration bronchique, ou ponction, ou encore des cellules circulantes. Pour effectuer la mesure, l'échantillon biologique est utilisé sous forme entière, broyée, en coupe, fractionnée, en particulier sous forme de fractions subcellulaires ou, le cas échéant, sous forme de culture cellulaire. Les réactifs nécessaires à la mise en évidence de l'activité ou de la quantité de NDP kinases peuvent être dans un milieu liquide ou incorporés dans un matériau support par exemple des gels ou des filtres-support. L'invention vise également un kit pour la détection in vitro de cellules à fort taux de prolifération. Ce kit est caractérisé en ce qu'il renferme les réactifs nécessaires tels que définis ci-dessus pour la mise en évidence de l'activité ou de la quantité de NDP kinases mises en contact avec un échantillon biologique sous forme appropriée. Le kit de détection de l'invention présente l'avantage de pouvoir être utilisé directement sur des échantillons cliniques et permet d'obtenir des résultats dans un temps très rapide. On rapporte dans les exemples ci-après donnés à titre illustratif une méthode de détection de l'activité NDP kinase mesurée sur des extraits de tissus de différents patients. Les résultats obtenus sont rapportés sur les figures 1 et 2 qui concernent les variations de l'activité de la NDPK en U/mg de protéine selon le tissu étudié pour deux séries de patients. EXEMPLES Préparation des extraits Les fragments de tissus obtenus congelés dans de l'azote liquide sont dégelés rapidement dans du tampon Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 maintenu à 4"C, contenant de 1'EDTA 1 mM, du glycérol 20% et des inhibiteurs de protéases (PMSF (fluorure de phényl méthyl sulfonyl) 1 mM, 1 pg/ml d'antipaïn et 15 pg/ml de benzamidine) à raison 5 ml environ de tampon par gramme de tissus. Les tissus sont coupés finement puis broyés au Poltrons (3 fois 20 secondes à puissance maximale). Le broyat est ensuite centrifugé à 4"C, 10 min. à 20000 g dans une centrifugeuse réfrigérée.Le surnageant est utilisé immédiatement ou conservé par aliquots à -80 C. La concentration en protéines de celui-ci est mesurée par la méthode de BRADFORD (1976, Anal. Biochem., 72, 248). Dosage de l'activité NDP kinase L'activité enzymatique est mesurée par un système enzymatique couplé pyruvate kinase-lactate deshydrogénase (AGARWAL et al, 1978, Meth. Enzymol., 51, 376) qui relie la formation d'ADP par la (ou les) NDP kinase(s) à une consommation de NADH détectée spectrophotométriquement à 340 nm.Les réactions sont les suivantes NDP kinase dDTP + ATP dTTP + ADP PK ADP + PEP ATP + pyruvate LDH Pyruvate + NADH lactate + NAD+ (Abréviations: PEP: phosphoénolpyruvate; PK: pyruvate kinase; LDH: lactate déshydrogénase; dTDP: déoxythymidine diphosphate; dTTP: déoxythymidinetriphosphate) La réaction a lieu à 30 C dans un volume total de 500 p1 de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, contenant du phosphoenolpyruvate 0,5 mM, de 1'ATP 0,5 mM, du MgCl2 6 mM, 100 pg/ml de NADH, du KC1 50 mM, du dTDP 0,2 mi, 1,5 U de pyruvate kinase et de lactate deshydrogénase et la quantité de surnageant d'extrait tissulaire (1 à 10 p1) nécessaire à l'obtention d'une vitesse directement proportionnelle à la quantité d'extrait.Une unité d'enzyme catalyse la formation d'une immole d'ADP par minute. Résultats L'activité NDP kinase d'extraits de plusieurs tumeurs solides du sein a été comparée à celle de différents tissus normaux par la méthode pyruvate kinase-lactate déshydrogéna se. On rapporte sur les figures 1 et 2 l'activité NDP kinase d'extraits de ganglion (GG) de muscle (Mu), de mastose (Ms), de peau (Pe), de sein normal (SN), de thyroïde (Ty) et de tumeur du sein (TS). La lettre précédent les abréviations de chaque extrait correspond au patient sur lequel a été effectué le test. L'examen de ces figures montre que l'activité est augmentée de 5 à 10 fois par rapport à l'activité du tissu normal de référence. L'augmentation de l'activité enzymatique correspond à une augmentation de la quantité de la protéine comme il a été évalué par transfert de WESTERN, en utilisant des anticorps spécifiques de NDP kinase d'érytrocytes humains. Ces résultats sont confirmés sur coupe de tissus par un marquage spécifique des cellules tumorales. La mesure de l'activité NDP kinase constitue donc un critère d'évaluation de l'état tumoral évolutif potentiel d'un prélèvement tissulaire. L'invention fournit ainsi un test simple de dépistage d'états tumoraux potentiellement évolutifs. REVENDICATIONS 1. Méthode de détection in vitro de cellules à fort taux de prolifération, telles les cellules tumorales, caractérisée en ce qu'on mesure l'activité ou la quantité de NDP kinases. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on réalise la mesure de l'activité des NDP kinases en utilisant des nucléotides naturels ou des analogues de synthèse de ces nucléotides, et en mettant en évidence les produits de la réaction par des systèmes enzymatiques couplés permettant la synthèse de produits détectables par colorimétrie et/ou spectrophotométrie. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on mesure la quantité de NDP kinase par marquage de l'intermédiaire phosphorylé résultant de l'interaction du nucléotide triphosphate substrat avec l'enzyme, le marquage de l'intermédiaire phosphorylé étant effectué à l'aide d'analogues tels les dérivés r-thiophosphates de 1'ATP ou du GTP. 4. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on réalise la mesure de l'activité des NDP kinases en utilisant des nucléotides radioactivement marqués, naturels, ou des analogues de synthèse de ces nucléotides et qu'on sépare les produits par chromatographie. 5. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on mesure la quantité de NDP kinases à l'aide d'anticorps anti-NDP kinases polyclonaux ou monoclonaux et qu'on met en évidence une réaction éventuelle du type antigène-anticorps à l'aide de systèmes révélateurs classiques. 6. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on utilise des sondes d'ADNc spécifiques de NDP kinases, capables de s'hybrider avec les séquences correspondantes des ARN-m codant pour les NDP kinases. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'activité ou la quantité de NDP kinase est mesurée sur un échantillon biologique provenant d'un patient. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'échantillon est une tumeur solide ou un fluide biologique, ou des cellules circulantes 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est utilisé sous forme entière, broyée, en coupe, fractionnée, en particulier sous forme de fractions sub-cellulaires ou, le cas échéant, sous forme de culture cellulaire. 10. Kit pour la détection in vitro de cellules à fort taux de prolifération, caractérisé en ce qu'il renferme les réactifs nécessaires à la mise en évidence de l'activité ou de la quantité de NDP kinases, mis en contact avec un échantillon biologique sous forme appropriée.