Brevet FR2665703A1 — publié le 19920214

La présente demande concerne de nouvelles microprotéines, le procédé de préparation et l'application à titre de médicament de ces nouvelles microprotéines. La présente demande a ainsi pour objet de nouvelles microprotéines répondant à la formule générale (I) R1 -8- X1 -E- X2 X3 -D- -G- X4 -R- -P- -Q- -A- X5 -P- R2 (I) dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, un résidu de formule E-V-E-K- ou de formule :E-A-E-K X1 représente un résidu d'acide aspartique ou de glycine, X2 représente un résidu d'acide aspartique ou d'alanine, X3 représente un résidu de sérine ou de thréonine, X4 représente un résidu d'acide aspartique ou d'alanine, X5 représente un résidu de sérine ou de leucine, R2 représente un résidu de formule -G-L-G-P-G-P ou de formule :: -E-P-M-Q-E-S, Parmi les microprotéines telles que définies ci-dessus, on retient notamment celles, caractérisées en ce que, R1 représente un atome d'hydrogène, un résidu de formule E-V-E-K X1 et X2 représentent un résidu d'acide aspartique, représente un résidu de sérine, X4 représente un résidu d'acide aspartique, X5 représente un résidu de sérine, R2 représente un résidu de formule -G-L-G-P-G-P Parmi ces dernières, on retient de préférence la microprotéine de formule 8-D-E-D-B-D-G-D-R-P-Q-A-8-P-G-L-G-P-G-P On peut également retenir la microprotéine de formule E-V-E-K-S-D-E-D-S-D-G-D-R-P-Q-A-S-P-G-L-G-P-G-P Parmi les microprotéines telles que définies ci-dessus, on retient également celle, caractérisée en ce que, R1 représente un résidu de formule : E-A-E-K X1 représente un résidu de glycine, X2 représente un résidu d'alanine, X3 représente un résidu de thréonine, X4 représente un résidu d'alanine, X5 représente un résidu de leucine, R2 représente un résidu de formule : -E-P-N-Q-E-S. Cette dernière microprotéine a donc pour formule E-A-E-K-8-G-E-A-T-D-G-A-R-P-Q-A-L-P-E-P-N-Q-U-E-8 L'invention a également pour objet un procédé de préparation des microprotéines telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquentiellement sur un support de type polystyrène réticulé les amino-acides dûment protégés à l'aide d'un agent de couplage, déprotège les amino-acides, et libère de la résine la chaîne peptidique ainsi formée pour obtenir la microprotéine ainsi recherchée. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, le procédé ci-dessus décrit est caractérisé en ce que - le support de type polystyrène réticule est une résine de type "Boc-AA-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, AA est le premier amino-acide et CM désigne le support de polystyrène réticulé, - l'agent de couplage est le (benzotriazol-l-yloxy) tris(diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate ou BOP, - la libération du support de la chaîne peptidique ainsi que la déprotection des amino-acides est effectuée au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température de préference vers 0 C. Les microprotéines, objet de la présente invention présentent de très intéressantes propriétés pharmacologiques ; on note en particulier des propriétés anticatécholamines. Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale. Ces propriétés justifient l'utilisation des nouvelles microprotéines répondant à la formule (I) ci-dessus à titre de médicaments. La présente invention a ainsi également pour objet l'application à titre de médicaments des nouvelles microprotéines telles que définies par la formule générale (I) cidessus. Parmi les médicaments, objet de l'invention, on retient notamment les médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les produits de formule (I) dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, un résidu de formule E-V-E-K X1 et X2 représentent un résidu d'acide aspartique, X3 représente un résidu de sérine, X4 représente un résidu d'acide aspartique, X5 représente un résidu de sérine, R2 représente un résidu de formule -G-L-G-P-G-P Parmi ces derniers on retient de préférence les médicaments renfermant la microprotéine telle que définie ci-dessus de formule S-D-E-D-S-D-G-D-R-P-Q-A-S-P-G-L-G-P-G-P Parmi les médicaments de l'invention on retient enfin les microprotéines répondant à la formule I ci-dessus dans laquelle R1 représente un résidu de formule :E-A-E-K X1 représente un résidu de glycine, X2 représente un résidu d'alanine, X3 représente un résidu de thréonine, X4 représente un résidu d'alanine, X5 représente un résidu de leucine, R2 représente un résidu de formule : -E-P-M-Q-E-S et donc une microprotéine de formule E-A-E-K-S-G-E-A-T-D-G-A-R-P-Q-A-L-P-E-P-X-Q-U-E-S Ces médicaments trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement des pathologies se situant dans le cadre d'une hypersecrétion des catécholamines et des corticoides, notamment dans les situations de stress, dans l'ulcère gastrique, dans l'hypertension artérielle et lors de poussées hypertensives chez les malades porteurs de tumeurs de type phéochromocytome secrétant. Ces médicaments peuvent aussi être utilisés pour lutter contre les effets secondaires des glucocorticoides ; ils permettent de lutter également contre les troubles dus à une hypersécrétion de glucocorticoides et notamment contre le vieillissement en général et plus particulièrement contre l'hypertension, le glaucome, l'athérosclérose, l'ostéoporose, le diabète, l'obésité ainsi que la dépression de l'immunité et l'insomnie. La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause peut être par exemple de 0,1 à 10 mg par jour par voie intraveineuse chez l'homme. L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques qui renferment au moins un dérivé précité à titre de principe actif. A titre de principe actif, les microprotéines répondant à la formule générale (I), peuvent être incorporées dans des compositions pharmaceutiques destinées à la voie digestive ou parentérale. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple, les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les capsules, les granulés, les suppositoires, les préparations injectables, les aérosols ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. I1 va être donné maintenant à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE 1 : Nicroprotéine de formule E-V-E-R-8-D-E-D-8-D-G-D-R-P-Q-A-8-P-G-L-G-P-G-P STADE A : Assemblage de la chaîne neptidique On utilise un support de type "Boc-Pro-CM-support" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, Pro représente un groupement proline et CM-support désigne le support de polystyrène réticulé. Le support renfermant 0,6 mmol Trp/g a été préparée selon la technique décrite par Plaue S. et Heissler D. (1987) Tetrahedron Letter 18, 1401. Tous les aminoacides sont N-protégés par le groupement tertiobutylcarbonyl,les groupements protecteurs des chaînes latérales ont été les suivants - ester de cyclohexyl pour l'acide aspartique, - benzyl pour la sérine, - o-chlorobenzyloxycarbonyl pour la lysine, - tosyl pour l'arginine. Les réactions de couplage ont été effectuées en utilisant le BOP ou (benzotriazol-l-yloxy tris (diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate. Un cycle de couplage peut être résumé comme suit Déprotection : 1 - Traitement avec une solution d'acide trifluoroacétique (50 %) dans le dichlorométhane contenant 3 % d'ethane dithiol pendant 1 minute. 2 - Vidange puis traitement avec une solution d'acide tri fluoroacétique à 50 % dans le dichlorométhane contenant 3 % d'ethanedithiol pendant 30 minutes. 3 - Vidange puis lavage avec de l'isopropanol contenant 5 % d'éthanedithiol. 4 - Lavage au dichlorométhane, 2 fois. Couplage : 1 - Addition de BOP et de Boc-acide aminé. 2 - Addition de diisopropyléthylamine (6 équivalents) puis de solvant (dichlorométhane ou diméthylformamide) sous agitation. 3 - Après réaction négative à la ninhydrine lavage 2 fois au dichlorométhane. Les tests de controle utilisant la ninhydrine ont été effectués suivant le procédé décrit par Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D. & Cook, P.I. (1970) Anal. Biochem. 24, 595-598. Avant le traitement par l'acide fluorhydrique le dernier groupement Boc est éliminé par l'acide trifluoroacétique. Au départ de 2 g de résine " Boc-Lys-CM-résine" on a ainsi obtenu en opérant manuellement 5,25 g de complexe chaîne peptidique protégée, résine que l'on utilise directement au stade suivant. STADE B : Libération du complexe chaîne peptidiaue protéaée- résine On fait réagir 1,5 g de complexe chaîne peptidique protégée-résine pendant 60 minutes avec 15 ml d'acide fluorhydrique à 0 C en présence d'anisole (1 ml) et diméthylsulfide (0,5 ml). La résine est lavée à l'éther ; le peptide brut est extrait par une solution aqueuse d'acide acétique à 20 %. Après lyophilisation, on obtient 660 mg de produit brut non cyclisé que l'on utilise directement au stade suivant STADE C : Cyclisation et purification On dissout 500 mg du peptide brut obtenu ci-dessus, dans 250 ml d'eau, agite vigoureusement, ajoute de la diisopropyléthylamine jusqu'à obtention de pH 8 (une goutte de mélange est recueillie toutes les heures et ajoutée à une goutte d'une solution contenant de l'acide dithiobis (2-nitrobenzoique) dans un tampon molaire de K2HPO4 (pH 8) pour suivre la réaction d'oxidation). Pendant toute la réaction on maintient le pH à 8 par addition de diisopropyl-éthylamine. La réaction est suivie par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Après 28 heures, on constate l'absence de coloration jaune dans le test à l'acide dithiobis (2-nitrobenzoique). Le produit obtenu est purifié par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur colonne Whatman M20 ODS3 et élué par un mélange eau-acétonitrile renfermant 0,1 % d'acide trifluoroacétique. On lyophilise la fraction obtenue et recueille finalement 30 mg de produit attendu. EXEMPLES 2 et 3 En opérant de la même manière qu'à l'exemple 1 mais avec d'autres amino-acides, on a préparé les 2 autres microprotéines qui figurent ci-après EXEMPLE 2 : Microprotéine de formule S-D-E-D-S-D-G-D-R-P-Q-A-S-P-G-L-G-P-G-P EXEMPLE 3 : Microprotéine de formule E-A-E-R-8-G-E-A-T-D-G-A-R-P-Q-A-L-P-E-P-N-Q-U-E-S EXEMPLE 4 On a préparé un soluté injectable répondant à la formulation suivante - Produit de l'exemple 1 1 mg - excipient aqueux stérile 2 ml EXEMPLE 5 On a préparé des comprimés répondant à la formule suivante - Produit de l'exemple 1 2 mg - excipient q.s.p. un comprimé terminé à 150 mg (composition de l'excipient : lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium). ETUDE DE L'ACTIVISTE BIOLOGIE DE8 PRODUITS A) Des cellules chromaffines en culture ont été préincubées 10 minutes avec les produits étudiés. Les cellules ont alors été stimulées par la carbamylcholine (analogue de l'acétylcholine) 0,5 mM ou dépolarisées directement par du potassium 59 mM. Les résultats obtenus avec les produits des exemples figurent dans la tableau I ci-après TABLEAU I PRODUITS ETUDIES % de Noradrénaline libérée cellulaire I Carbamyl-choline K + 59 mM Contrôle 1 25 + 0,8 ( 0 %) 20,2 + 0,7 ( 0 %) Chromogranine A 10-6M 6,3 1,0 (75 %) 11,6 + 0,9 (43 %) Exemple 2 l06M 1 3,8 + 0,8 (85 %) 9,3 + 0,9 (54 %) Exemple 1 10-6M 4,4 + 1,0 (83 %) 7,7 + 0,2 (62 t) (Chromogranine A = protéine purifiée de médullo-surrénale de bovidés). Entre parenthèses, sont portés les pourcentages d'inhibition. Le composé de l'exemple 2 produit une inhibition dosedépendante de la libération des catécholamines dans la zone de concentration comprise en 10 9 et 10 6M. La valeur ID50 a été pratiquement déterminée à 5 x 10 8M. Le composé de l'exemple 1 produit une courbe similaire à l'exemple 2 avec un ID50 également voisin. B) Par ailleurs, ces expériences ont été complétées par la mesure des entrées de calcium extracellulaire dans l'espace intracellulaire, en mesurant après 30 secondes de stimulation avec 0,5 mM de carbamyl-choline ou 59 mM de potassium, l'accumulation de 45Ca++. PRODUITS ETUDIES I Accumulation de 45CA++ I (pmol/30 sec/l06 cellules) I Carbamyl-choline K+ 59 mM Contrôle 1 3,34 ( 0 %) 4,20 ( 0 %) Exemple 2 l06M g 0,19 (94,4 %) 0,85 (80 %) Entre parenthèse, sont portés les pourcentages d'inhibition. Ces résultats montrent que le composé de l'exemple 2 bloque l'entrée de calcium évoquée soit par la carbamylcholine soit par une concentration dépolarisante de potassium, l'inhibition atteignant par 86 ou 77 % respectivement, suggérant ainsi la possibilité que l'inhibition de la libération des catécholamines est la conséquence d'une réduction des flux de calcium au travers des canaux voltanes sensibles à calcium de ces cellules excitables. C) Dans ces expériences, la libération des catécholamines est suivie en temps réel en mesurant les catécholamines par technique électrochimique en continu à partir d'une suspension cellulaire incubée dans une chambre de perfusion. Les cellules sont stimulées par des pulses successifs de 1, l-diméthyl-4-phényl-piperazinium-iodure, en présence de 1 micromolle de composé de l'exemple 2. Les pulses répétés induisent une désensibilisation progressive des réponses cellulaires. En présence de composé de l'exemple 2, on assiste à une inhibition de 40 % du premier pic de sécrétion obtenu en stimulant les cellules avec le piperazinium, puis on observe une inhibition complète des réponses sécrétoires successives. L'élimination de la microprotéine permet un retour à la normale, mais qui prend un temps très long, puisque après 10 mn, nous n'avons que 31 % des valeurs contrôle. Ces résultats indiquent que ces microprotéines excercent une inhibition prolongée dans le temps de l'activité sécrétrice des cellules chromaffines et qu'ils accentuent aussi de façon spectaculaire le processus de désensibilisation de la réponse sécrétoire. REVENDICATIONS 1) Nouvelles microprotéines répondant à la formule générale (I) R1 -S- X1 -E- X2 X3 -D- -G- Xo -R- -P- -Q- -A- X5 -P- R2 (I) dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, un résidu de formule E-V-E-K- ou de formule : E-A-E-K X1 représente un résidu d'acide aspartique ou de glycine, X2 représente un résidu d'acide aspartique ou d'alanine, X3 représente un résidu de sérine ou de thréonine, X4 représente un résidu d'acide aspartique ou d'alanine, X5 représente un résidu de sérine ou de leucine, R2 représente un résidu de formule -G-L-G-P-G-P ou de formule . -E-P-M-Q-E-8 2) Microprotéines selon la revendication 1, caractérisées en ce que, R1 représente un atome d'hydrogène, un résidu de formule E-V-E-K X1 et X2 représentent un résidu d'acide aspartique, représente un résidu de sérine, X4 représente un résidu d'acide aspartique, X5 représente un résidu de sérine, R2 représente un résidu de formule -G-L-G-P-G-P 3) Microprotéine selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle a pour formule S-D-E-D-S-D-G-D-R-P-Q-A-S-P-G-L-G-P-G-P 4) Microprotéines selon la revendications 1, caractérisées en ce que R1 représente un résidu de formule :E-A-E-K xl représente un résidu de glycine, X2 représente un résidu d'alanine, X3 représente un résidu de thréonine, X4 représente un résidu d'alanine, x5 représente un résidu de leucine, R2 représente un résidu de formule : -E-P-M-Q-E-S 5) Procédé de préparation des nouvelles microprotéines telles que définies à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquentiellement sur une résine polystyrène réticulée les aminoacides dûment protégés en utilisant un agent de couplage, libère de la résine la chaîne peptidique ainsi formée et déprotège les amino-acides, pour obtenir la microprotéine recherchée. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que - la résine polystyrène réticulé est une resine de type "Boc AA-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, AA est le premier amino-acide et CM désigne la résine polystyrène réticulée, - l'agent de couplage est le BOP ou (benzotriazol-l-yloxy) tris (diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate, - la libération de la résine de la chaîne peptidique ainsi que la déprotection des amino-acides est effectuee au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température. 7) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles microprotéines telles que définies par la formule générale (I) de la revendication 1. 8) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles microprotéines telles que définies à l'une quelconque des revendications 2, 3, 4 ou 5. 9) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif, l'un au moins des médicaments tels que définis à l'une quelconque des revendications 8 ou 9.