Brevet FR2667875A1 — publié le 19920417

La présente invention concerne un plasmide thermosensible utilisé pour modifier un gène chromosomique de micro-organisme de type Corynebacterium utilisé pour la production par fermentation de substances intéressantes telles que les acides aminés afin d'en modifier le caractère génétique. On a fait de nombreuses tentatives pour modifier le caractère génétique de Corynebacterium par des techniques de génie génétique et pour utiliser ce micro-organisme en vue de produire par fermentation des substances intéressantes telles que les acides aminés. Cependant, tous ces procédés utilisent comme vecteur un plasmide capable de réplication autonome (demandes de brevets japonais mises à disposition du public n0 58-192900 et 58-21699). Les plasmides se répliquent et fonctionnent à l'extérieur du chromosome. De ce fait, lorsque le caractère génétique d'une bactérie est modifié au moyen de L'ADN plasmidique, cette modification ne peut pas être étendue au chromosome de la bactérie hôte. En particulier, lorsqu'il s'agit des propriétés de L'ADN de la bactérie hôte, telles que les délétions, les mutations, etc., il est impossible d'apporter une modification appropriée. Il existe actuellement un procédé qui comprend le traitement d'une bactérie hôte avec un mutagène, puis la sélection d'une souche modifiée de manière aléatoire et qui présente les propriétés souhaitées. Cependant, ce procédé entraîne beaucoup de travail et de nombreuses difficultés.De même, lorsque l'on utilise L'ADN plasmidique, le plasmide est souvent instable et est expulsé de La cellule si bien qu'il est impossible d'obtenir une expression suffisante ou bien encore il apparaît de nombreuses copies du plasmide qui porte le gène souhaité, de sorte que l'expression devient excessive et a une influence néfaste sur la croissance des bactéries ou sur la production d'une substance souhaitée. La présente invention a pour objet de modifier un gène spécifique sur Le chromosome de manière ciblée et de fixer de manière stable un nombre défini de copies du gène sur le chromosome pour résoudre ces problèmes. La présente invention a pour objet de fournir un procédé par lequel l'origine de réplication de L'ADN plasmidique capable de réplication autonome dans Corynebacterium est transformée par élé- vation de la température de culture en une origine de réplication incapable de répLication autonome ce qui permet de modifier volontairement un gène spécifique sur le chromosome et de fixer de manière stable sur le chromosome un nombre déterminé de copies du gène. Ainsi, la présente invention a pour objet un plasmide ayant une origine de réplication thermosensible qui présente les propriétés suivantes : (a) il est capable de réplication autonome dans Corynebacterium et d'être maintenu dans Corynebacterium, (b) lorsqu'une cellule contenant le plasmide est cultivée entre 31 et 370C, la réplication du plasmide est inhibée et en meme temps le plasmide est expulsé de la cellule. La figure 1 représente la variation de la propriété de rétention de plasmide de la souche Brevibacterium lactofermentum AJ12036 (FERM-P7559) (FERM = Fermentation Research Institute, Japon) contenant le plasmide pHSC4 d'un type mutant dont l'origine de réplication est thermosensible, dans le cas d'une culture à température élevée (340C). La propriété de rétention de plasmide a été déterminée en diluant la culture Liquide, en étalant la solution sur une boite de M-CM2G contenant du chloramphénicol et sur une boite de M-CM2G ne contenant pas de chloramphénicol, et en cultivant à basse température (200C), en comptant le nombre de colonies portant le plasmide et le nombre de colonies qui se sont développées sur la boite de M-CM2G dépourvue de chloramphénicol, et en comparant ces deux nombres. La figure 2 représente la variation de la propriété de rétention du plasmide pHSC22. La figure 3 représente la variation de la propriété de rétention du plasmide pHSC23. Les trois plasmides ci-dessus ont une origine de réplication thermosensible. La figure 4 représente la variation de la propriété de rétention de plasmide de La souche AJ12036 portant le plasmide pHC4 (plasmide ayant une origine de réplication de type sauvage). A la suite de recherches poussées pour résoudre les pro blèmes précédents, les présents inventeurs ont réussi à modifier L'origine de réplication de L'ADN plasmidique capable de réplication autonome dans Corynebacterium pour obtenir une origine de réplication d'un type mutant thermosensible incapable de réplication à haute température. Le gène souhaité est ligaturé avec un plasmide comportant cette origine de réplication thermosensible et une souche content ce plasmide est cultivitée tout d'abord entre 10 et 27 C, de préféference entre 20 et 25 C, puis entre 31 et 37 C, de préférence entre 33 et 36 C pour éliminer le plasmide. Une soche contenant le gène intégré dans le chromosome est sélectionnée. Dans ce cas, un gène marqueur tel qu'un gène du plasmide qui confère une résistance à un médicament est intégré dans le chromosome. Bien que le plasmide ne soit pas contenu dans le micro-organisme, la souche dans laquelle l'intégration s'est produite présente le caractère du gène marqueur et peut être sélectionnée par détection de ce caractère, qui peut être la résistance à un médicament. A ce stade, L'ADN du plasmide vecteur et le gène souhaité sont intégrés l'un et L'autre dans le chromosome. Cependant, il est possible de sélectionner les souches dont le chromosome a perdu la partie vecteur par recombinaison homologue en utiLisant comme critère la disparition du caractère du gène marqueur. Dans ce cas, il est possible d'effectuer un remplacement de gène par lequel le gène chromosomique de L'hôte correspondant au gène souhaité est éliminé et remplacé par le gène introduit avec le plasmide. Pour intégrer un gène dans le chromosome, on dispose d'un procédé, différent du procédé décrit ci-dessus, qui comprend la transfection d'un ADN incapable de réplication et la sélection d'une souche qui présente une recombinaison. Cependant, Le procédé qui utilise un plasmide thermosensible permet de dupliquer intracellulairement Le gène souhaité à L'état plasmidique et de dupliquer la souche porteuse du plasmide pour obtenir une recombinaison avec une fréquence bien plus grande que celle qui est obtenue par le procécé entraînant une recombinaison par transfection d'ADN incapable de réplication.De ce fait, la présente invention est caractérisée en ce que la fréquence de transformation de L'hôte ou la dégradation de L'ADN infecté influe à peine sur la fréquence des recombinants qui apparaissent, de sorte que ce procédé peut être tout à fait généralisé. On donne dans la suite des exemples de souches sauvages de bactéries productrices d'acide glutamique, mais il est possible d'utiliser d'autres bactéries en tant qu'hôte si l'origine de réplication thermosensible est active dans la bactérie et si le plasmide est capable de réplication. Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium flavum ATCC 13826 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Corynebacterium acetoacidophitum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, 13060 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 (ATCC = American Type Culture Collection). Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'inven- tion de manière plus précise sans en Limiter la portée. Exemple 1 Obtention d'une origine de réplication thermosensible et construction d'un vecteur plasmidique en vue d'une intégration dans le chromosome. Construction de pHK4 Tout d'abord, on a préparé en tant que matériel pour obtenir L'origine de réplication thermosensible, un vecteur plasmi dique pHK4 capable de réplication autonome dans les cellules de Escherichia coli et de Corynebacterium. On a décrit dans La littérature certains vecteurs plasmidiques qui sont capables de réplication automone dans les cellules d'Escherichia coli et de Corynebacterium. A cet effet, on a construit le nouveau vecteur navette pHK4 à partir de pAJ1844 (voir la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n0 58-216199) et de pHSG298 (voir S. Takeshita et al., : Gene, 61, 63-74 (1987)). pAJ1844 a été digéré partiellement avec l'enzyme de restriction Sau3AI et ligaturé avec pHSG298 totalement digéré avec L'enzyme de restriction BamHI. La souche Brevibacterium lactofermentum AJ12O36 (FERM-P7559) a été transformée avec L'ADN après ligature. La transformation a été accomplie selon La technique d'électroporation (voir demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 2-207791). La sélection des transformants a été opérée à L'aide d'une boîte de M-CM2G contenant 5 g de glucose, 10 g de polypeptone, 10 g d'extrait de levure, 15 g de NaCl, 0,2 g de DL-méthionine et 15 g de gélose par litre d'eau pure, pH 7,2 ainsi que 25 yg/ml de kanamycine.L'ADN plasmidique a été préparé à partir des transformants. Le plasmide de plus petite taille a été sélectionné et appelé pHK4. Ce plasmide est capable de réplication autonome dans Escherichia coli et Corynebacterium et communique à l'hôte une résistance à la kanamycine. L'origine de réplication du plasmide pHK4 est dérivée du plasmide pHM1519 présent natucellement dans Corynebacterium glutamicum . Obtention d'une origine de réplication thermosensible et construction d'un vecteur plasmidique en vue d'une intégration dans le chromosome pHK4 a été traité avec L'hydroxyLamine in vitro. Le traitement à l'hydroxylamine a été réalisé par un procédé connu (G.O. Humpherys et al. : Molec. Gen. Genet., 145, 101-108 (1976)). Après le traitement, L'ADN a été recueilli et la souche Brevibacterium lactofementum AJ12036 a été transforme avec cet ADN. Les transformants ont été sélectionnés à basse température (20 C) sur une boite de M-CM1G contenant 25 g/ml de kanamycine. Les transformants qui sont apparus ont été répliqués sur une nouvelle boîte de même contenu et cultivés à haute température (340C). On a obtenu trois transformants qui étaient incapables de se développer à haute température sur la boite sélective contenant la kanamycine. A partir des transformants, on a recueilli des plasmides que l'on a appelés pHS4, pHS22 et pHS23.Les plasmides ont été recueillis à partir de la souche Escherichia coli AJ12570 (FERM BP-3523) portant le plasmide pHS4 et d'Escherichia coli portant chacun des plasmides pHS22 et pHS23. Le fragment d'ADN dérivé de pAJ1844, qui est La'origine de réplication dans Corynebacterium, a été excisé avec les enzymes de restriction BamHI et KpnI et ligaturé avec pHSG398 (voir S. Takeshita et al. : Gene, 61, 63-74 (1987)) qui est un vecteur pour Escherichia coli. Ces plasmides qui ont des origines de réplication dérivées de pHS4, pHS22 et pHS23, ont été appelés pHSC4, pHSC22 et pHSC23, respectivement. De même, l'origine de réplication dans Corynebacterium dérivée de pHK4 a été transférée dans pHSG398 pour préparer pHC4. pHC4, pHSC4, pHSC22 et pHSC23 sont capables de réplication automone dans Corynebacterium et Escherichia coli et communiquent à L'hôte une resistance au chloramphénicol. Il se confirme également que les origines de réplication de pHSC4, pHSC22 et pHSC23 qui fonctionnent dans Corynebacterium sont de type thermosensible. A partir d'Escherichia coli AJ12571 (FERM BP-3524) contenant le plasmide pHSC4, d'Escherichia coli AJ12615 (FERM BP-3530) contenant le plasmide pHSC22, d'Escherichia coliAJ12616 (FERM BP3531) contenant le plasmide pHSC23 et d'Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) contenant le plasmide pHC4, on a préparé Les plasmides que l'on a transfectés dans la souche Brevibacterium Lactofermentum AJ12036.On a observé une modification de L'aptitude à la rétention des plasmides par culture à haute température (340C) dans un mi lieu non sélectif. La réplication de pHSC4, pHSC22 et pHSC23 dans AJ12036 était sensiblement complètement inhibée par la culture à haute température (figures 1, 2, 3 et 4). Détermination de la séquence nucléotidique des origines de réplication thermosensibles : On a déterminé Les séquences nucléotidiques des origines de réplication, qui fonctionnent dans Corynebacterium, du plasmide pHC4 ayant une origine de réplication du type sauvage, et des plasmi des pHSC4, pHSC22 et pHSC23 ayant des origines de réplication de type thermosensible. Le procédé de détermination de la séquence nucléotidique était celui de Sanger et al. (F. Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)). IL est apparu qu'il y avait une substitution de 2 à 4 nucléotides entre l'origine de réplication de type sauvage et les origines de réplication des types mutants thermosensibles. La séquence nucléotidique de ta région de l'origine de réplication thermosensible contenue dans pHSC4 et fonctionnant dans Corynebacterium est la suivante (1) Caractéristiques de La séquence : (A) longueur : 2 958 paires de bases (B) type : acide nucléique (C) double brin (D) topologie : linéaire. (2) Type moléculaire : ADN (génomique) (3) Origine (A) organisme : Corynebacterium glutamicum (B) souche : ATCC 13058. GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAC CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGCAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGGCCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ACCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATTGTTGCCT TGACGCACGC GCAGCACGCA 1500 GCCGTGCTTG TCCTGGACAT TGATGTGCCG AGCCACCAGG CCAGCAGGAA AATCGAGCAC 1560 GTAAACCCCG AGGTCTACGC GATTTTGGAG CGCTGGGCAC GCCTGGAAAA AGCGCCAGCT 1620 TGGATCGGCG TGAATCCACT GAGCGGGAAA TGCCAGCTCA TCTGGCTCAT TGATCCGGTG 1680 TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC GACCGAGGAA 1740 ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG GTGGCCACTG 1800 CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG CGTGGATCGC 1860 CTAGCTGATC TTATGGAGGT TGCTCGCATG ATCTCAGGCA CAGAAAAACC TAAAAAACGC 1920 TATGAGCAGG AGTTTTCTAG CGGACGGGCA CGTATCGAAG CGGCAAGAAA AGCCACTGCG 1980 GAAGCAAAAG CACTTGCCAC GCTTGAAGCA AGCCTGCCGA GCGCCGCTGA AGCGTCTGGA 2040 GAGCTGATCG ACGGCGTCCG TGTCCTCTGG ACTGCTCCAG GGCGTGCCGC CCGTGATGAG 2100 ACGGCTTTTC GCCACGCTTT GACTGTGGGA TACCAGTTAA AAGCGGATGG TGAGCGCCTA 2160 AAAGACACCA AGATCATCGA CGCCTACGAG CGTGCCTACA CCGTCGCTCA GGCGGTCGGA 2220 GCAGACGGCC GTGAGCCTGA TCTGCCGCCG ATGCGTGACC GCCAGACGAT GGCGCGACGT 2280 GTGCGCGGCT ACGTCGCTAA AGGCCAGCCA GTCGTCCCTG CTCGTCAGAC AGAGACGCAG 2340 AGCAGCCGAG GGCGAAAAGC TCTGGCCACT ATGGGAAGAC GTGGCGGTAA AAAGGCCGCA 2400 GAACGCTGGA AAGACCCAAA CAGTGAGTAC GCCCGAGCAC AGCGAGAAAA ACTAGCTAAG 2460 TCCAGTCAAC GACAAGCTAG GAAAGCTAAA CCAAATCGCT TGACCATTGC AGGTTGGTTT 2520 ATGACTGTTG AGGGTGAGAC TGGCTCGTGG CCGACAATCA ATGAAGCTAT GTCTGAATTT 2580 AGCGTGTCAC GTCAGACCGT GAATAGAGCA CTTAAGTCTG CGCGCATTGA ACTTCCACGA 2640 GGACGCCGTA AAGCTTCCCA GTAAATGTGC CATCTCGTAG GCAGAAAACG GTTCCCCCCG 2700 TAGGTCTCTC TCTTGGCCTC CTTTCTAGGT CGGGCTGATT GCTCTTGAAG CTCTCTAGGG 2760 GGGCTCACAC CATAGGCAGA TAACGGTTCC CCACCGGCTC ACCTCGTAAC GCGACAAGGA 2820 CTGCTCCCAA AGATCGCCTA GCTGATCTTA TGGAGGTTGC TCGCATGATC CTTTTTGATA 2880 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 2940 AAAAGATCCC CGGGTACC 2958 La séquence nucléotidique de la région de l'origine de réplication thermosensible contenue dans pHSC22 et qui fonctionne dans Corynebacterium est la suivante (1) Caractéristiques de La séquence (A) longueur : 2 958 paires de bases (B) type : acide nucléique (C) double brin (D) topologie : linéaire. (2) Type moléculaire : ADN (génomique) (3) Origine (A) organisme : Corynebacterium glutamicum (B) souche : ATCC 13058. GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGACAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGTAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGGCCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA- 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGCGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ATCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATTGTTGCCT TGACGCACGC GCAGCACGCA 1500 GCCGTGCTTG TCCTGGACAT TGATGTGCCG AGCCACCAGG CCGGCGGGAA AATCGAGCAC 1560 GTAAACCCCG AGGTCTACGC GATTTTGGAG CGCTGGGCAC GCCTGGAAAA AGCGTCAGCT 1620 TGGATCGGCG TGAATCCACT GAGCGGGAAA TGCCAGCTCA TCTGGCTCAT TGATCCGGTG 1680 TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC GACCGAGGAA 1740 ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG GTGGCCACTG 1800 CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG CGTGGATCGC 1860 CTAGCTGATC TTATGGAGGT TGCTCGCATG ATCTCAGGCA CAGAAAAACC TAAAAAACGC 1920 TATGAGCAGG AGTTTTCTAG CGGACGGGCA CGTATCGAAG CGGCAAGAAA AGCCACTGCG 1980 GAAGCAAAAG CACTTGCCAC GCTTGAAGCA AGCCTGCCGA GCGCCGCTGA AGCGTCTGGA 2040 GAGCTGATCG ACGGCGTCCG TGTCCTCTGG ACTGCTCCAG GGCGTGCCGC CCGTGATGAG 2100 ACGGCTTTTC GCCACGCTTT GACTGTGGGA TACCAGTTAA AAGCGGCTGG TGAGCGCCTA 2160 AAAGACACCA AGATCAGCGA CGCCTACGAG CGTGCCTACA CCGTCGCTCA GGCGGTCGGA 2220 GCAGACGGCC GTGAGCCTGA TCTGCCGCCG ATGCGTGACC GCCAGACGAT GGCGCGACGT 2280 GTGCGCGGCT ACGTCGCTAA AGGCCAGCCA GTCGTCCCTG CTCGTCAGAC AGAGACGCAG 2340 AGCAGCCGAG GGCGAAAAGC TCTGGCCACT ATGGGAAGAC GTGGCGGTAA AAAGGCCGCA 2400 GAACGCTGGA AAGACCCAAA CAGTGAGTAC GCCCGAGCAC AGCGAGAAAA ACTAGCTAAG 2460 TCCAGTCAAC GACAAGCTAG GAAAGCTAAA CCAAATCGCT TGACCATTGC AGGTTGGTTT 2520 ATGACTGTTG AGGGAGAGAC TGGCTCGTGG CCGACAATCA ATGAAGCTAT GTCTGAATTT 2580 AGCGTGTCAC GTCAGACCGT GAATAGAGCA CTTAAGTCTG CGGGCATTGA ACTTCCACGA 2640 GGACGCCGTA AAGCTTCCCA GTAAATGTGC CATCTCGTAG GCAGAAAACG GTTCCCCCCG 2700 TAGGTCTCTC TCTTGGCCTC CTTTCTAGGT CGGGCTGATT GCTCTTGAAG CTCTCTAGGG 2760 GGGCTCACAC CATAGGCAGA TAACGGTTCC CCACCGGCTC ACCTCGTAAC GCGACAAGGA 2820 CTGCTCCCAA AGATCGCCTA GCTGATCTTA TGGAGGTTGC TCGCATGATC CTTTTTGATA 2880 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 2940 AAAAGATCCC CGGGTACC 2958 La séquence nucléotidique de la région de l'origine de réplication thermosensible contenue dans pHSC23 et qui fonctionne dans Corynebacterium est la suivante (1) Caractéristiques de la séquence (A) longueur : 2 958 paires de bases (B) type : acide nucléique (C) double brin (D) topologie : Linéaire. (2) Type moléculaire : ADN (génomique) (3) Origine (A) organisme : Corynebacterium glutamicum (B) souche : ATCC 13058. GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGCAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGACCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATGGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ACCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA CGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATTGTTGCCT TGACGCACGC GCAGCACGCA 1500 GCCGTGCTTG TCCTGGACAT TGATGTGCCG AGCCACCAGG CCGGCGGGAA AATCGAGCAC 1560 ATAAACCCCG AGGTCTACGC GATTTTGGAG CGCTGGGCAC GCCTGGAAAA AGCGCCAGCT 1620 TGGATCGGCG TGAATCCACT GAGCGGGAAA TGCCAGCTCA TCTGGCTTAT TGATTCGGTG 1580 TATGTCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC GACCGAGGAA 1740 ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG GTGGCCACTG 1800 CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG CGTGGATCGC 1860 CTAGCTGATC TTATGGAGGT TGCTCGCATG ATCTCAGGCA CAGAAAAACC TAAAAAACGC 1920 TATGAGCAGG AGTTTTCTAG CGGACGGGCA CGTATCGAAG CGGCAAGAAA AGCCACTGCG 1980 GAAGCAAAAG CACTTGCCAC GCTTGAAGCA AGCCTGCCGA GCGCCGCTGA AGCGTCTGGA 2040 GAGCTGATCG ACGGCGTCCG TGTCCTCTGG ACTGCTCCAG GGCGTGCCGC CCGTGATGAG 2100 ACGGCTTTTC GCCACGCTTT GACTGTGGGA TACCAGTTAA AAGCGGCTGG TGAGCGCCTA 2160 AAAGACACCA AGATCATCGA CGCCTACGAG CGTGCCTACA CCGTCGCTCA GGCGGTCGGA 2220 GCAGACGGCC GTGAGCCTGA TCTGCCGCCG ATGCGTGACC GCCAGACGAT GGCGCGACGT 2280 GTGCGCGGCT ACGTCGCTAA AGGCCAGCCA GTCGTCCCTG CTCGTCAGAC AGAGACGCAG 2340 AGCAGCCGAG GGCGAAAAGC TCTGGCCACT ATGGGAAGAC GTGGCGGTAA AAAGGCCGCA 2400 GAACGCTGGA AAGACCCAAA CAGTGAGTAC GCCCGAGCAC AGCGAGAAAA ACTAGCTAAG 2460 TCCAGTCAAC GACAAGCTAG GAAAGCTAAA CCAAATCGCT TGACCATTGC AGGTTGGTTT 2520 ATGACTGTTG AGGGTGAGAC TGGCTCGTGG CCGACAATCA ATGAAGCTAT GTCTGAATTT 2580 AGCGTGTCAC GTCAGACCGT GAATAGAGCA CTTAAGTCTG CGGGCATTGA ACTTCCACGA 2640 GGACGCCGTA AAGCTTCCCA GTAAATGTGC CATCTCGTAG GCAGAAAACG GTTCCCCCCG 2700 TAGGTCTCTC TCTTGGCCTC CTTTCTAGGT CGGGCTGATT GCTCTTGAAG CTCTCTAGGG 2760 GGGCTCACAC CATAGGCAGA TAACGCTTCC CCACCGGCTC ACCTCGTAAC GCGACAAGGA 2820 CTGCTCCCAA AGATCGCCTA GCTGATCTTA TGGAGGTTGC TCGCATGATC CTTTTTGATA 2880 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 2940 AAAAGATCCC CGGGTACC 2958 La séquence nucléotidique de la région de l'origine de réplication de type sauvage contenue dans pHC4 et qui fonctionne dans Corynebacterium est la suivante (1) Caractéristiques de la séquence (A) longueur : 2 958 paires de bases (B) type : acide nucléique (C) double brin (D) topologie : linéaire. (2) Type moléculaire : ADN (génomique) (3) Origine (A) organisme : Corynebacterium glutamicum (B) souche : ATCC 13058. GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGCAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGGCCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ACCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATTGTTGCCT TGACGCACGC GCAGCACGCA 1500 GCCGTGCTTG TCCTGGACAT TGATGTGCCG AGCCACCAGG CCGGCGGGAA AATCGAGCAC 1560 GTAAACCCCG AGGTCTACGC GATTTTGGAG CGCTGGGCAC GCCTGGAAAA AGCGCCAGCT 1620 TGGATCGGCG TGAATCCACT GAGCGGGAAA TGCCAGCTCA TCTGGCTCAT TGATCCGGTG 1680 TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC GACCGAGGAA 1740 ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG GTGGCCACTG 1800 CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG CGTGGATCGC 1860 CTAGCTGATC TTATGGAGGT TGCTCGCATG ATCTCAGGCA CAGAAAAACC TAAAAAACGC 1920 TATGAGCAGG AGTTTTCTAG CGGACGGGCA CGTATCGAAG CGGCAAGAAA AGCCACTGCG 1980 GAAGCAAAAG CACTTGCCAC GCTTGAAGCA AGCCTGCCGA GCGCCGCTGA AGCGTCTGGA 2040 GAGCTGATCG ACGGCGTCCG TGTCCTCTGG ACTGCTCCAG GGCGTGCCGC CCGTGATGAG 2100 ACGGCTTTTC GCCACGCTTT GACTGTGGGA TACCAGTTAA AAGCGGCTGG TGAGCGCCTA 2160 AAAGACACCA AGATCATCGA CGCCTACGAG CGTGCCTACA CCGTCGCTCA GGCGGTCGGA 2220 GCAGACGGCC GTGAGCCTGA TCTGCCGCCG ATGCGTGACC GCCAGACGAT GGCGCGACGT 2280 GTGCGCGGCT ACGTCGCTAA AGGCCAGCCA GTCGTCCCTG CTCGTCAGAC AGAGACGCAG 2340 AGCAGCCGAG GGCGAAAAGC TCTGGCCACT ATGGGAAGAC GTGGCGGTAA AAAGGCCGCA 2400 GAACGCTGGA AAGACCCAAA CAGTGAGTAC GCCCGAGCAC AGCGAGAAAA ACTAGCTAAG 2460 TCCAGTCAAC GACAAGCTAG GAAAGCTAAA CCAAATCGCT TGACCATTGC AGGTTGGTTT 2520 ATGACTGTTG AGGGAGAGAC TGGCTCGTGG CCGACAATCA ATGAAGCTAT GTCTGAATTT 2580 AGCGTGTCAC GTCAGACCGT GAATAGAGCA CTTAAGTCTG CGGGCATTGA ACTTCCACGA 2640 GGACGCCGTA AAGCTTCCCA GTAAATGTGC CATCTCGTAG GCAGAAAACG GTTCCCCCCG 2700 TAGGTCTCTC TCTTGGCCTC CTTTCTAGGT CGGGCTGATT GCTCTTGAAG CTCTCTAGGG 2760 GGGCTCACAC CATAGGCAGA TAACGCTTCC CCACCGGCTC ACCTCGTAAC GCGACAAGGA 2820 CTGCTCCCAA AGATCGCCTA GCTGATCTTA TGGAGGTTGC TCGCATGATC CTTTTTGATA 2880 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 2940 AAAAGATCCC CGGGTACÇ 2958 Les sites de mutation des origines de réplication thermosensibles sont Les suivants. Pour pHSC4, G en position 1543 est muté en A et G en position 1546 est muté en A sur la séquence. Pour pHSC22, C en position 683 est muté en T, C en position 1172 est muté en T et C en position 1615 est muté en T sur La séquence.Pour pHSC23, G en position 756 est muté en A, G en position 1561 est muté en A, C en position 1668 est muté en T et C en position 1685 est muté en T sur la séquence. Exemple 2 Intégration de L'ADN porté par le plasmide dans le gène chromosomique de Brevibacterium lactofermentum à l'aide d'un vecteur plasmidique pour l'intégration dans le chromosome. On sait que le gène de la 3-désoxy-D-arabinoheptuloso- nate-7-phosphate synthétase (abrégé dans la suite en "gène DS"), dans lequel la rétro-inhibition par la tyrosine et la phénylalanine a été sensiblement abolie, communique à la souche de Brevibacterium lactofermentum à la fois une résistance contre la m-fluorophénylalanine, qui est analogue à la phénylalanine, et une aptitude à produire la phénylalanine et la tyrosine (voir demande de brevet japonais mise à la disposition du public n0 61-124375). En utilisant cette propriété comme critère, le gène DS a été intégré dans le chromosome de La souche sauvage de Brevibacterium lactofermentum par recombinaison homologue. Préparation du plasmide pour l'intégration dans Le chromosome pAR-1, qui est le plasmide porteur du gène DS dans lequel la rétro-inhibition par la tyrosine et La phénylalanine a été sensiblement abolie (voir demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 61-124375), ayant été partiellement digéré avec Sau3AI, Le produit de digestion a été ligaturé avec pHK4 totalement digéré avec L'enzyme de restriction BamHI. Le produit de ligature a été transfecté dans la souche Brevibacterium iactofermentum A512036 par électroporation. Les transformants ont été sélectionnés sur une boite de mi lieu minimum contenant 20 g de glucose, 5 g de (NH4) 2S04, 2 g durée, 1 g de KH2PO4, 5 g de MgSO4,7H2O, 10 mg de FeS04,7H20, 10 mg de MnS04,4H2o, 50 ug de biotine, 2 000 g de chlorhydrate de thiamine, 15 g de gélose par litre d'eau, pH 6,6 et 500 ,ug/ml de mfluorophénylalanine. Des plasmides ont été préparés à partir des transformants et le plasmide de plus petite taille a été sélectionné. Ce plasmide a été digéré avec les enzymes de restriction BamHI et SalI pour récupérer un fragment de 1,9 kilobase contenant le gène DS. Ce fragment a été ligaturé avec pHSC4 digéré avec BamHI et SalI. Ce plasmide a été appelé pHSC4D. Transfection du plasmide pour l'intégration dans Brevibacterium lactofermentum et sélection de la souche dans laquelle L'intégra- tion dans le chromosome est effective Le plasmide pHSC4D a été préparé à partir de la souche Escherichia coli AJ12572 (FERM BP-3525) contenant le plasmide pHSC4D et transfecté dans ta souche Brevibacterium lactofermentum AJ12036 par électroporation. Les transformants ont été sélectionnés à ZOOC sur une boite de M-CM2G contenant 5 ,ug/ml de chlor- amphénicol. Après la transfection, la souche obtenue a été cultivée sur une boite de M-CM2G.Puis, le bouillon de culture a été dilué jusqu'à 103 à 106 colonies formées sur boite de gélose (= cfu colony forming unit) et le liquide dilué a été appliqué à une boite de M-CM2G contenant 5 ug/ml de chloramphénicol. La boite a été cultivée à 340C. La- souche porteuse du plasmide thermosensible est devenue sensible au chloramphénicol puisque la réplication du plasmide était inhibée à cette température, de sorte qu'aucune colonie n'a pu se former. Cependant, il a été possible de sélectionner la souche dont le chromosome a intégré L'ADN plasmidique puisqu'elle est résistante au chloramphénicol et forme des colonies.On a confirmé par hybridation de Southern et par la résistance des bactéries à la m-fluorophénylalanine que le gène DS de type mutant dérivé du vecteur plasmidique a été intégré au voisinage du gène DS du chromosone hôte par recombinaison homologue. Exemple 3 Obtention d'une souche dans laquelle le gène a été remplacé à partir de la souche dans laquelle a eu lieu l'intégration dans le chromosome Tout d'abord, des souches sensibles au chloramphénicol ont été recueillies à partir de la souche AJ12573 (FERM BP-3526) dont le chromosome a intégré le gène DS par recombinaison homologue. Les souches dans lesquelles l'intégration a eu lieu ont été diluées et le produit dilué a été appliqué à une boite de M-CM2G cultivée ensuite à 340C. Des colonies s'étant développées, la réplication a été effectuée sur une boîte de M-CM2G contenant 5 g/ml de chloramphénicol et elle a été suivie par une culture à 34 C. Les souches qui sont devenues sensibles au chloramphénicol ont été recueillies. Parmi Les souches qui sont devenues sensibles au chloramphénicol, on a sélectionné la souche qui était sensible au chlor amphénicol et résistante à la m-fluorophénylalanine. La sensibilité au chloramphénicol signifie que Le vecteur plasmidique a quitté le chromosome par recombinaison et ta résistance à la m-fluorophénylalanine signifie que le gène DS de type mutant transfecté à partir du plasmide demeure sur le chromosome. En d'autres termes, lors du départ du gène du chromosome par recombinaison homologue, le gène de type mutant transfecté à partir du plasmide reste associé au chromosome, et Le gène de type sauvage qui est présent de manière inhérente sur Le chromosome s'est recombiné avec le vecteur plasmidisque et s'est séparé du chromosome avec le vecteur ce qui a eu pour résultat un remplacement de gène. Exemple 4 Production de tyrosine et de phénylalanine par La souche dans le chromosome de laquelle a été intégré le gène DS de type mutant La tyrosine et la phénylalanine ont été produites à L'aide de La souche AJ12573 (FERM BP-3526) dans le chromosome de laquelle le gène DS de type mutant avait été intégré au moyen du vecteur thermosensible, et à L'aide de la souche AJ12574 (FERM BP3527) sur le chromosome de laquelle le gène DS de type mutant est fixé par remplacement de gène. Chaque souche ayant été cultivée sur une boite de M-CM2G, elle a été inoculée sur un mi lieu producteur de phénylalanine (130 g de glucose, 10 g de (NH4)2S04, 1 g de KH2PO4, 1 g de MgS04,7H20, 12 g d'acide fuma ri que, 3 ml d'acide acétique, 50 ml d'hydrolysat acide de soja "AJI-EKI", 10 mg de FeS04,7H20, 10 mg de MnS04,4H20, 50 pg de biotine, 2 000 ,ug de chlorhydrate de thiamine et 50 g de CaCO3 par litre d'eau, pH 7,0), puis cultivée à 31,50C pendant 48 h. Le tableau 1 ci-dessous indique les quantités de tyrosine et de phénylalanine présentes dans le bouillon de culture après la culture. TABLEAU 1 Souche AJ12036 AJ12573 AJ12574 quantité de tyrosine produite (g/l) 0,37 2,02 2,73 quantité de phénylalanine produite (girl) 0 3,46 2,07 Exemple 5 Intégration du gène de l'aspartate kinase de type à rétroinhibition abolie dans le chromosome de la souche sauvage de Brevibacterium lactofermentum et production de lysine à L'aide de la souche dans laquelle l'intégration s' est produite. Préparation du plasmide pour l'intégration du gène Le gène de l'aspartate kinase (appelé dans la suite "gène AK"), dans lequel la rétro-inhibition par la lysine et la thréonine a été sensiblement abolie, a été obtenu à partir de La souche productrice de lysine Corynebacterium glutamicum AJ3463 (FERM-P 1987) de la manière suivante : L'ADN chromosomique de AJ3463 a été partiellement digéré avec l'enzyme de restriction Sau3AI et le produit de digestion a été ligaturé avec pHSC4 totalement digéré avec BamHI.Cet ADN a été transformé dans la souche AJ12036. Les transformants ont été sélectionnés à 200C dans un mi lieu minimum contenant 5 ug/ml de chloramphénicol, 100 mg/dl de L-thréonine et 3 000 ug/ml de S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine (appelée dans la suite "AEC"). A partir du transformant, on a préparé un plasmide que L'on a appelé pHSC4AE. Intégration du gène AK de type à inhibition abolie dans le chromosome de Brevibacterium lactofermentum et obtention de la souche qui a subi le remplacement de gène La souche Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a été transformée par le plasmide pHSC4AE. Le transformant a été sélectionné à 200C. Le transformant a été dilué dans L'eau stérile à raison de 103 à 105 colonies par boite (cfu) et le produit dilué a été étalé sur une boite de M-CM2G. Après culture à 340C, les souches qui ont formé des colonies ont été sélectionnées en tant que souches qui ont intégré le gène. A partir des souches qui ont intégré le gène, on a obtenu de nouveau les souches sensibles au chloramphénicol et on a sélectionné comme souche qui a subi un remplacement de gène une souche sensible au chloramphénicol et résistante à AEC. Production de lysine à t'aide de la souche qui a subi un remplacement de gène La souche Brevibacterium Lactofermentum AJ12575 (FERM BP-3528) dans le chromosome de laquelle le gène AK de type à inhibition abolie a été intégré par remplacement de gène, et sa souche apparentée ATCC13869, ont été inoculées sur un mi lieu producteur de lysine (100 g de glucose, 55 g de (NH4)2S04, 1 g de KH2P04, 1 g de MgSO4,7H2O, 50 ml d'hydrolysat acide de soja "MAMENO", 10 mg de FeSO4,7H2O, 10 mg de MnS04,4H20, 5 mg de nicotinamide et 50 g de CaC03 par litre d'eau, pH 8,0) puis cultivées à 31,50C pendant 48 h. Le tableau 2 ci-dessous indique la quantité de lysine présente dans le bouillon de culture après la culture. TABLEAU 2 Souche ATCC13869 AJ12575 quantité de lysine produite (g/l) 0,1 17,5 REVENDICATIONS 1. Plasmide ayant une origine de réplication thermosensible, caractérisé par les propriétés suivantes : a) il est capable de réplication autonome dans Corynebacterium et d'être maintenu dans Corynebacterium, et b) sa réplication est inhibée et il est expulsé d'une cellule qui le contien lorsque celle-ci est cultivée entre 31 et 37 C. 2. Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu par modification du vecteur navette pHK4, dont l'origine de réplication est dérivée du plasmide pHM1519 présent naturellement dans Corynebacterium glutamicum, en vue de lui communiquer une thermosensibilité. 3. Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente la séquence nucléotidique suivante GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGCAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGGCCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGGCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ACCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATTGTTGCCT TGACGCACGC GCAGCACGCA 1500 GCCGTGCTTG TCCTGGACAT TGATGTGCCG AGCCACCAGG CCAGCAGGAA AATCGAGCAC 1560 GTAAACCCCG AGGTCTACGC GATTTTGGAG CGCTGGGCAC GCCTGGAAAA AGCGCCAGCT 1620 TGGATCGGCG TGAATCCACT GAGCGGGAAA TGCCAGCTCA TCTGGCTCAT TGATCCGGTG 1680 TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC GACCGAGGAA 1740 ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG GTGGCCACTG 1800 CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG CGTGGATCGC 1860 CTAGCTGATC TTATGGAGGT TGCTCGCATG ATCTCAGGCA CAGAAAAACC TAAAAAAACGC 1920 TATGAGCAGG AGTTTTCTAG CGGACGGGCA CGTATCGAAG CGGCAAGAAA AGCCACTGCG 1980 GAAGCAAAAG CACTTGCCAC GCTTGAAGCA AGCCTGCCGA GCGCCGCTGA AGCGTCTGGA 2040 GAGCTGATCG ACGGCGTCCG TGTCCTCTGG ACTGCTCCAG GGCGTGCCGC CCGTGATGAG 2100 ACGGCTTTTC GCCACGCTTT GACTGTGGGA TACCAGTTAA AAGCGGCTGG TGAGCGCCTA 2160 AAAGACACCA AGATCATCGA CGCCTACGAG CGTGCCTACA CCGTCGCTCA GGCGGTCGGA 2220 GCAGACGGCC GTGAGCCTGA TCTGCCGCCG ATGCGTGACC GCCAGACGAT GGCGCGACGT 2280 GTGCGCGGCT ACGTCGCTAA AGGCCAGCCA GTCGTCCCTG CTCGTCAGAC AGAGACGCAG 2340 AGCAGCCGAG GGCGAAAAGC TCTGGCCACT ATGGGAAGAC GTGGCGGTAA AAAGGCCGCA 2400 GAACGCTGGA AAGACCCAAA CAGTGAGTAC GCCCGAGCAC AGCGAGAAAA ACTAGCTAAG 2460 TCCAGTCAAC GACAAGCTAG GAAAGCTAAA CCAAATCGCT TGACCATTGC AGGTTGGTTT 2520 ATGACTGTTG AGGGTGAGAC TGGCTCGTGG CCGACAATCA ATGAAGCTAT GTCTGAATTT 2580 AGCGTGTCAC GTCAGACCGT GAATAGAGCA CTTAAGTCTG CGGGCATTGA ACTTCCACGA 2640 GGACGCCGTA AAGCTTCCCA GTAAATGTGC CATCTCGTAG GCAGAAAACG GTTCCCCCCG 2700 TAGGTCTCTC TCTTGGCCTC CTTTCTAGGT CGGGCTGATT GCTCTTGAAG CTCTCTAGGG 2760 GGGCTCACAC CATAGGCAGA TAACGGTTCC CCACCGGCTC ACCTCGTAAC GCGACAAGGA 2820 CTGCTCCCAA AGATCGCCTA GCTGATCTTA TGGAGGTTGC TCGCATGATC CTTTTTGATA 2880 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 2940 AAAAGATCCC CGGGTACC 2958 4.Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente la séquence nucléotidique suivante GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGTAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCGAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGGCCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGACTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCCAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ATCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAC ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATTGTTGCCT TGACGCACGC GCAGCACGCA 1500 GCCGTGCTTG TCCTGGACAT TGATGTGCCG AGCCACCAGG CCGGCGGGAA AATCGAGCAC 1560 GTAAACCCCG AGGTCTACGC GATTTTGGAG CGCTGGGCAC GCCTFGAAAA AGCGTCAGCT 1620 TGGATCGGCG TGAATCCACT GAGCGGGAAA TGCCAGCTCA TCTGGCTCAT TGATCCGGTG 1680 TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC GACCGAGGAA 1740 ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG GTGGCCACTG 1800 CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG CGTGGATCGC 1860 CTAGCTGATC TTATGGAGGT TGCTCGCATG ATCTCAGGCA CAGAAAAACC TAAAAAACGC 1920 TATGAGCAGG AGTTTTCTAG CGGACGGGCA CGTATCGAAG CGGCAAGAAA AGCCACTGCG 1980 GAAGCAAAAG CACTTGCCAC GCTTGAAGCA AGCCTGCCGA GCGCCGCTGA AGCGTCTGGA 2040 GAGCTGATCG ACGGCGTCCG TGTCCTCTGG ACTGCTCCAG GGCGTGCCGC CCGTGATGAG 2100 ACGGCTTTTC GCCACGCTTT GACTGTGGGA TACCAGTTAA AAGCGGCTGG TGAGCGCCTA 2160 AAAGACACCA AGATCATCGA CGCCTACGAG CGTGCCTACA CCGTCGCTCA GGCGGTCGGA 2220 GCAGACGGCC GTGAGCCTGA TCTGCCGCCG ATGCGTGACC GCCAGACGAT GGCGCGACGT 2280 GTGCGCGGCT ACGTCGCTAA AGGCCAGCCA GTCGTCCCTG CTCGTCAGAC AGAGACGCAG 2340 AGCAGCCGAG GGCGAAAAGC TCTGGCCACT ATGGGAAGAC GTGGCGGTAA AAAGGCCGCA 2400 GAACGCTGGA AAGACCCAAA CAGTGAGTAC GCCCGAGCAC AGCGAGAAAA ACTAGCTAAG 2460 TCCAGTCAAC GACAAGCTAG GAAAGCTAAA CCAAATCGCT TGACCATTGC AGGTTGGTTT 2520 ATGACTGTTG AGGGAGAGAC TGGCTCGTGG CCGACAATCA ATGAAGCTAT GTCTGAATTT 2580 AGCGTGTCAC GTCAGACCGT GAATAGAGCA CTTAAGTCTG CGGGCATTGA ACTTCCACGA 2640 GGACGCCGTA AAGCTTCCCA GTAAATGTGC CATCTCGTAG GCAGAAAACG GTTCCCCCCG 2700 TAGGTCTCTC TCTTGGCCTC CTTTCTAGGT CGGGCTGATT GCTCTTGAAG CTCTCTAGGG 2760 GGGCTCACAC CATAGGCAGA TAACGGTTCC CCACCGGCTC ACCTCGTAAC GCGACAAGGA 2820 CTGCTCCCAA AGATCGCCTA GCTGATCTTA TGGAGGTTGC TCGCATGATC CTTTTTGATA 2880 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 2940 AAAAGATCCC CGGGTACC 2958 5.Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente la séquence nucléotidique suivante : GGATCCGGTG TATGCCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC 60 GACCGAGGAA ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG 120 GTGGCCACTG CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG 180 CGTGGATCGC CTAGCTGATC CCGAAAAAGT TTTTGCCTTT TGTAAAAAAC TTCTCGGTCG 240 CCCCGCAAAT TTTCGATTCC AGATTTTTTA AAAACCAAGC CAGAAATACG ACACACCGTT 300 TGCAGATAAT CTGTCTTTCG GAAAAATCAA GTGCGATACA AAATTTTTAG CACCCCTGAC 360 GTGCGCAAAG TCCCGCTTCG TGAAAATTTT CGTGCCGCGT GATTTTCCGC CAAAAACTTT 420 AACGAACGTT CGTTATAATG GTGTCATGAC CTTCACGACG AAGTACCAAA ATTGGCCCGA 480 ATCATCAGCT ATGGATCTCT CTGATGTCGC GCTGGAGTCC GACGCGCTCG ATGCTGCCGT 540 CGATTTAAAA ACGGTGATCG GATTTTTCCG AGCTCTCGAT ACGACGGACG CGCCAGCATC 600 ACGAGACTGG GCCAGTGCCG CGAGCGACCT AGAAACTCTC GTGGCGGATC TTGAGGAGCT 660 GGCTGACGAG CTGCGTGCTC GGCAGCGCCA GGAGGACGCA CAGTAGTGGA GGATCCAATC 720 AGTTGCGCCT ACTGCGGTGG CCTGATTCCT CCCCGACCTG ACCCGCGAGG ACGGCGCGCA 780 AAATATTGCT CAGATGCGTG TCGTGCCGCA GCCAGCCGCG AGCGCGCCAA CAAACGCCAC 840 GCCGAGGAGC TGGAGGCGGC TAGGTCGCAA ATGGCGCTGG AAGTGCGTCC CCCGAGCGAA 900 ATTTTGGCCA TGGTCGTCAC AGAGCTGGAA GCGGCAGCGA GAATTATCCG CGATCGTGGC 960 GCGGTGCCCG CAGGCATGAC AAACATCGTA AATGCCGCGT TTCGTGTGGC CGTGGCCGCC 1020 CAGGACGTGT CAGCGCCGCC ACCACCTGCA CCGAATCGGC AGCAGCGTCG CGCGTCGAAA 1080 AAGCGCACAG GCGGCAAGAA GCGATAAGCT GCACGAATAC CTGAAAAATG TTGAACGCCC 1140 CGTGAGCGGT AACTCACAGG GCGTCGGCTA ACCCCCAGTC CAAACCTGGG AGAAAGCGCT 1200 CAAAAATGAC TCTAGCGGAT TCACGAGACA TTGACACACC GGCCTGGAAA TTTTCCGCTG 1260 ATCTGTTCGA CACCCATCCC GAGCTCGCGC TGCGATCACG TGGCTGGACG AGCGAAGACC 1320 GCCGCGAATT CCTCGCTCAC CTGGGCAGAG AAAATTTCCA GGGCAGCAAG ACCCGCGACT 1380 TCGCCAGCGC TTGGATCAAA GACCCGGACA CGGGAGAAAC ACAGCCGAAG TTATACCGAG 1440 TTGGTTCAAA ATCGCTTGCC CGGTGCCAGT ATTGTTGCCT TGACGCACGC GCAGCACGCA 1500 GCCGTGCTTG TCCTGGACAT TGATGTGCCG AGCCACCAGG CCGGCGGGAA AATCGAGCAC 1560 ATAAACCCCG AGGTCTACGC GATTTTGGAG CGCTGGGCAC GCCTGGAAAA AGCGCCAGCT 1620 TGGATCGGCG TGAATCCACT GAGCGGGAAA TGCCAGCTCA TCTGGCTTAT TGATTCGGTG 1680 TATGTCGCAG CAGGCATGAG CAGCCCGAAT ATGCGCCTGC TGGCTGCAAC GACCGAGGAA 1740 ATGACCCGCG TTTTCGGCGC TGACCAGGCT TTTTCACATA GGCTGAGCCG GTGGCCACTG 1800 CACGTCTCCG ACGATCCCAC CGCGTACCGC TGGCATGCCC AGCACAATCG CGTGGATCGC 1860 CTAGCTGATC TTATGGAGGT TGCTCGCATG ATCTCAGGCA CAGAAAAACC TAAAAAACGC 1920 TATGAGCAGG AGTTTTCTAG CGGACGGGCA CGTATCGAAG CGGCAAGAAA AGCCACTGCG 1980 GAAGCAAAAG CACTTGCCAC GCTTGAAGCA AGCCTGCCGA GCGCCGCTGA AGCGTCTGGA 2040 GAGCTGATCG ACGGCGTCCG TGTCCTCTGG ACTGCTCCAG GGCGTGCCGC CCGTGATGAG 2100 ACGGCTTTTC GCCACGCTTT GACTGTGGGA TACCAGTTAA AAGCGGCTGG TGAGCGCCTA 2160 AAAGACACCA AGATCATCGA CGCCTACGAG CGTGCCTACA CCGTCGCTCA GGCGGTCGGA 2220 GCAGACGGCC GTGAGCCTGA TCTGCCGCCG ATGCGTGACC GCCAGACGAT GGCGCGACGT 2280 GTGCGCGGCT ACGTCGCTAA AGGCCAGCCA GTCGTCCCTG CTCGTCAGAC AGAGACGCAG 2340 AGCAGCCGAG GGCGAAAAGC TCTGGCCACT ATGGGAAGAC GTGGCGGTAA AAAGGCCGCA 2400 GAACGCTGGA AAGACCCAAA CAGTGAGTAC GCCCGAGCAC AGCGAGAAAA ACTAGCTAAG 2460 TCCAGTCAAC GACAAGCTAG GAAAGCTAAA CCAAATCGCT TGACCATTGC AGGTTGGTTT 2520 ATGACTGTTG AGGGTGAGAC TGGCTCGTGG CCGACAATCA ATGAAGCTAT GTCTGAATTT 2580 AGCGTGTCAC GTCAGACCGT GAATAGAGCA CTTAAGTCTG CGGGCATTGA ACTTCCACGA 2640 GGACGCCGTA AAGCTTCCCA GTAAATGTGC CATCTCGTAG GCAGAAAACG GTTCCCCCCG 2700 TAGGTCTCTC TCTTGGCCTC CTTTCTAGGT CGGGCTGATT GCTCTTGAAG CTCTCTAGGG 2760 GGGCTCACAC CATAGGCAGA TAACGGTTCC CCACCGGCTC ACCTCGTAAC GCGACAAGGA 2820 CTGCTCCCAA AGATCGCCTA GCTGATCTTA TGGAGGTTGC TCGCATGATC CTTTTTGATA 2880 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 2940 AAAAGATCCC CGGGTACC 2958 6. Plasmide selon la revendication 1, destiné à une recombinaison homologue dans un chromosome, caractérisé en ce qu'il présente un fragment homologue d'une séquence présente sur Le chromosome de Corynebacterium. 7. Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit fragment est ligaturé dans pHSC4 et ledit fragment est le gène de la 3-désoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthétase dérivé de Brevibacterium lactofermentum dans lequel la rétroinhibition par la tyrosine et la phénylalanine a été abolie. 8. Procédé pour réaliser une recombinaison homologue dans Corynebacterium, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de Corynebacterium avec un plasmide selon la revendication 6 dans des conditions permettant audit plasmide d'hêtre maintenu dans Corynebacterium, la culture entre 31 et 370C, la sélection d'une souche de laquelle ledit plasmide a été éliminé par ladite culture et l'intégration dans le chromosome d'un fragment homologue d'une séquence présente sur le chromosome de Corynebacterium. 9. Transformant, caractérisé en ce qu'il est préparé par le procédé selon la revendication 8. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend le retrait sur le transformant d'un fragment présent de manière inhérente dans le chromosome et ayant une séquence homologue du fragment intégré par le procédé de la revendication 8, dans des conditions permettant Le maintien du fragment intégré. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit transformant est Brevibacterium lactofermentum et le gène intégré est le gène de la 3-désoxy-D-arabinoheptulosonate-7- phosphate synthétase dans lequel la rétro-inhibition par la tyrosine et la phénylalanine a été abolie. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit transformant est Brevibacterium lactofermentum et le gène intégré est le gène de l'aspartate kinase dans lequel la rétroinhibition par La lysine et La thréonine a été abolie. 13. Corynebacterium, caractérisé en ce qu'il est préparé par le procédé selon la revendication 10. 14. Corynebacterium, caractérisé en ce qu'il est préparé par le procédé selon la revendication 11. 15. Corynebacterium, caractérisé en ce qu'il est préparé par le procédé selon la revendication 12. 16. Procédé de préparation d'un acide aminé, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une bactérie selon la revendication 13 pour produire L'acide aminé souhaité dans un mi lieu et la récupération de L'acide aminé. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit acide aminé est la tyrosine, la phényLaLanine ou la lysine.