Brevet FR2665459A1 — publié le 19920207

i La présente invention concerne un procédé d'obtention de tryptoohane optiquement actif à partir de milieux ou solutions de formation de tryptophane optiquement actif par fermentation. Pour la production de tryptophane optiquement actif, on connaît des procédés qui utilisent des bactéries productrices de tryptophane appartenant au genre Bacillus, au genre Brevibacterium, au genre Corynebacterium, au genre Arthrobacter, etc à partir du glucose comme matière première principale Cependant, les cristaux bruts de tryptophane optiquement actif qui sont obtenus par les procédés conventionnels contiennent des impuretés telles que des protéines, des matières colorantes, etc. En général ces impuretés sont très hydrophobes de sorte que, même lorsque la recristallisation est effectuée de manière conventionnelle, les impuretés sont entraînées sur la surface des cristaux de tryptophane hydrophobe ou dans ces cristaux Même lors- que la quantité d'impuretés est faible il n'est pas facile de les éliminer. Pour éliminer les impuretés, on connaît les procédés sui- vants: ( 1) un procédé qui comprend la mise en contact d'une solution de cristaux bruts de tryptophane avec une résine échan- geuse d'ions pour adsorber les impuretés sur la résine puis la fil- tration à travers une membrane d'ultrafiltration (demande de brevet japonais non examinée publiée n 58-895); ( 2) un procédé qui comprend le chauffage d'une solution de tryptophane obtenue par réaction enzymatique entre 95 et 100 C en présence de carbone activé dans des conditions de p H acide puis la réalisation d'une séparation solide-liquide, la mise en contact du filtrat contenant le tryptophane avec une résine poreuse non polaire pour le concentrer puis l'addition d'un alcool aliphatique inférieur (demande de brevet japonais non examinée publiée n 61-126070); ( 3) un procédé qui comprend le réglage du p H d'une solu- tion de tryptophane dans le domaine alcalin lors de la cristallisa- tion et la réalisation d'une cristallisation avec neutralisation en présence d'un alcool inférieur ou d'une cétone (demande de brevet japonais non examinée publiée no 59-39857, 60-30694 et 61-12607); etc. Cependant, les procédés de purification mentionnés ci- dessus présentent les problèmes suivants dans la pratique: ( 1) le tryptophane présente une forte adsorption molécu- laire vis-à-vis des résines par suite d'une affinité spécifique qui peut être attribuée à sa structure moléculaire de sorte que le tryptophane à tendance à être adsorbé et désorbé en même temps que les impuretés telles que les matières colorantes, etc qui sont présentes Pour séparer ces impuretés, les opérations qui impli- quent l'utilisation d'une résine sont compliquées de sorte que les opérations d'adsorption et d'éLution s'accompagnent de pertes. ( 2) Le tryptophane comporte un noyau indole qui est ins- table du point de vue structural de sorte que dans le cas d'un traitement thermique de la solution riche en impuretés qui contient le tryptophane obtenu par fermentation entre 95 et 100 C, l'aug- mentation de la quantité de produits de dégradation colorés est inévitable. ( 3) La cristallisation du tryptophane avec un solvant s'accompagne d'une médiocre efficacité d'élimination des impu- retés ainsi que d'une manipulation compliquée du solvant et d'une récupération compliquée de celui-ci. Pour remédier à ces inconvénients, la présente invention a pour objet de proposer un procédé simple d'obtention de trypto- phane optiquement actif avec un rendement élevé en tryptophane optiquement actif de grande pureté, en partant des enseignements de l'art antérieur. A La suite de recherches appronfondies pour résoudre les problèmes évoqués ci-dessus, les présents inventeurs ont constaté qu'il est possible d'obtenir du tryptophane optiquement actif de grande pureté avec un rendement élevé à partir d'un milieu d'obten- tion de tryptophane par fermentation, par cristallisation du chlo- rhydrate de tryptophane optiquement actif combinée à une cristalli- sation avec neutralisation simultanée Ainsi, la présente invention concerne un procédé d'obtention de tryptophane optiquement actif à partir d'un milieu d'obtention de tryptophane par fermentation, qui comprend l'élimination des cellules du milieu de fermentation, l'addition d'acide chlorhydrique ou d'acide chlorhydrique et d'un sel minéral contenant des ions chlore au liquide exempt de cellules pour cristalliser et séparer le chlorhydrate de tryptophane opti- quement actif, la dissolution du chlorhydrate de tryptophane opti- quement actif et le fait de soumettre la solution obtenue et une solution alcaline à une cristallisation avec neutralisation simul- tanée afin de maintenir le p H de la solution de cristallisation entre 3 et 8. Pour éliminer les cellules, on peut utiliser la centrifu- gation, la filtration sous pression, la filtration sous pression réduite, la filtration à travers une membrane, par exemple la fil- tration de précision, l'ultrafiltration ou d'autres procédés connus, mais il est préférable d'utiliser l'ultrafiltration dans laquelle les cellules et les protéines sont éliminées simultané- ment Le p H de la solution de laquelle les cellules sont retirées n'est pas limité de manière particulière mais il peut être situé dans le domaine acide, de préférence entre 3 et 5, si l'on tient compte de l'élimination des cellules, des protéines etc par flocu- lation. Il est préférable que la concentration du tryptophane optiquement actif dans la solution exempte de cellules soit supé- rieure ou égale à 50 g/l Lorsque la concentration du tryptophane est inférieure à 50 g/l on concentre en général la solution en utilisant un procédé qui n'est pas limité de manière particulière. Par exemple, on peut effectuer la concentration par chauffage sous pression réduite, par congélation, en utilisant une membrane d'osmose inverse, isolément ou en combinaison, dans un système dis- continu ou continu Cependant, il est souhaitable que la concen- tration soit effectuée à une température inférieure ou égale à C, de préférence inférieure ou égale à 60 C, du fait que le chauffage à haute température provoque une décomposition du tryp- tophane et entraîne la formation de matières colorées. Puis, on ajoute de l'acide chlorhydrique seul ou de l'acide chlorhydrique et un sel minéral contenant des ions chlore lors de la cristallisatio du tryptophane optiquement actif à partir de la solution contenant au moins 50 g/l de tryptophane optiquement actif Lorsque l'on ajoute de l'acide chlorhydrique seul, il est préférable de l'ajouter en une quantité d'au moins deux équivalents par rapport à la quantité de tryptophane optiquement actif Lorsque l'on ajoute de l'acide chlorhydrique et le sel minéral contenant des ions chlore, il est préférable d'utiliser l'acide chlorhydrique en une quantité d'au moins un équivalent et le sel minéral conte- nant des ions chlore en une quantité d'au moins un équivalent par rapport à la quantité de tryptophane optiquement actif Comme sel minéral contenant des ions chlore on peut utiliser tout sel soluble tel que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, etc. On peut réaliser la cristallisation du chlorhydrate de tryptophane optiquement actif par exemple par concentration, refroidissement, etc, isolément ou en combinaison, dans un système discontinu ou continu On peut déterminer les conditions opéra- toires telles que le degré de concentration, la température de refroidissement, la vitesse de refroidissement, etc, de manière à otenir des cristaux présentant une séparation solide-liquide aussi satisfaisante que possible et une efficacité de cristallisation aussi élevée que possible. Après la cristallisation, on sépare les cristaux avec une centrifugeuse Les cristaux obtenus sont des prismes. Le chlorhydrate de tryptophane optiquement actif est en général dissous dans l'eau Dans ce cas, on règle de préférence la concentration du chlorhydrate de tryptophane optiquement actif à une valeur supérieure ou égale à 50 g/L La solution est soumise à une cristallisation avec neutralisation simultanée (décrite dans la suite) de manière à maintenir le p H de la solution alcaline et de la solution de cristallisation (suspension de cristallisation) entre 3 et 8, pour pouvoir obtenir des cristaux de tryptophane op- tiquement actifs Pour des raisons économiques, la solution alca- line utilisée est de préférence de type minéral Cette solution alcaline peut être par exemple une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium, de l'ammoniaque, etc La concentration de la solution alcaline n'est pas limitée de manière particulière Le mélange de la solution de chlorhydrate de tryptophane optiquement actif et de la solution alcaline de manière que le p H après la cristallisation soit maintenu entre 3 et 8 peut être effectué en introduisant pro- gressivement par petites portions et simultanément la solution de chlorhydrate de tryptophane optiquement actif et la solution alca- Line dans un réservoir de cristallisation (cristallisation avec neutralisation simultanée) Lorsque la cristallisation avec neutra- lisation simultanée commence, on peut ajouter si nécessaire des germes cristallins ou bien on peut provoquer la cristallisation en réglant la vitesse de neutralisation (vitesse d'introduction simul- tanée de la solution de chlorhydrate de tryptophane et de la solution alcaline) En général il est avantageux que la vitesse de cristallisation avec neutralisation soit faible mais ceci dépend de l'échelle à laquelle on effectue la cristallisation Pour une échelle d'environ 0,1 à 105 l, il est judicieux de réaliser l'introduction pendant une durée de I à 4 h Pour empêcher la dé- composition du tryptophane, on règle de préférence la température de cristallisation entre 20 et 60 C, de préférence encore entre 30 et 50 C. Après avoir introduit la solution de chlorhydrate de tryptophane optiquement actif et la solution alcaline dans le réservoir de cristallisation dans des conditions permettant une cristallisation avec neutralisation simultanée, il est bien entendu préférable de refroidir encore la suspension de cristallisation afin d'augmenter le rendement en les cristaux de tryptophane opti- quement actif. Les cristaux de tryptophane optiquement actif précipités sont isolés par séparation solide-liquide conventionnelle Il est particulièrement préférable d'utiliser une centrifugeuse. Le tryptophane optiquement actif est obtenu selon le pro- cédé de la présente invention avec une pureté élevée et un rende- ment important En général, pour obtenir un tryptophane optiquement actif présentant une pureté d'au moins 90 % à partir du milieu de fermentation, il est nécessaire d'effectuer des opérations compli- quées telles que l'utilisation d'une résine etc; lorsque des cristaux de tryptophane optiquement actif sont directement obtenus par cristallisation, ces cristaux sont de faible pureté et le ren- dement est d'environ 50 à 70 % Cependant, selon le procédé de la présente invention il est possible d'obtenir avec un rendement supérieur à 70 % du tryptophane optiquement actif de pureté supé- rieure ou égale à 90 %. D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront mieux dans la description détaillée qui suit d'un exemple de mise en oeu- vre. Exemp Le En utilisant de l'acide chlorhydrique à 35 % on a réglé à 3,5 le p H de 30 I de milieu d'obtention de L-tryptophane par fer- mentation Après avoir éliminé les cellules par centrifugation, on a concentré la solution à 60 C sous pression réduite jusqu'à ce que la concentration en L-tryptophane atteigne 180 g/l Puis on a ajouté à la suspension de l'acide chlorhydrique à 35 % et du chlo- rure de sodium en des quantités de 3,5 équivalents et 3 équiva- lents, respectivement, tout en maintenant à 50 C la suspension concentrée Après l'avoir refroidie de 50 C à 15 C pendant une nuit, on a séparé les cristaux à l'aide d'une centrifugeuse et on les a lavés à l'eau On a séché les cristaux à 60 C pendant 2 h sous pression réduite pour obtenir 156 g de cristaux de chlorhy- drate de L-tryptophane Dans ces cristaux de chlorhydrate de L-tryptophane la pureté du L-tryptophane était de 95,7 %. On a introduit simultanément dans un réservoir de cris- tallisation à 30 C une solution dans l'eau de 130 g du chlorhydrate de L-tryptophane obtenu en une concentration de 150 g/l et une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 27 % tout en contrôlant la vitesse d'introduction pour que le p H de la suspension atteigne 6,5 On a isolé à l'aide d'une centrifugeuse le L-tryptophane ainsi cristallisé On a lavé à l'eau les cristaux puis on les a séchés à 60 C pendant 2 h sous pression réduite pour obtenir 92 g de cristaux de L-tryptophane Ces cristaux présentaient une teneur en Ltryptophane de 96,4 % avec un rendement correspondant à 75 % de L-tryptophane dans le milieu de fermentation. Exempte comparatif 1 En utilisant de l'acide chlorhydrique à 35 % on a réglé à 3,5 le p H de 30 l de milieu d'obtention de L-tryptophane par fer- mentation Après avoir éliminé les cellules par centrifugation, on a concentré la solution à 60 C sous pression réduite jusqu'à ce que la concentration du L-tryptophane atteigne 180 g/L Puis, on a ajouté de l'acide chlorhydrique à 35 % à la suspension en une quan- tité correspondant à 5 équivalents de L-tryptophane tout en main- tenant à 50 C la suspension concentrée Après avoir refroidi de 50 C à 15 C pendant une nuit, on a séparé les cristaux à l'aide d'une centrifugeuse et on les a lavés à l'eau On a séché les cris- taux à 60 C pendant 2 h sous pression réduite pour obtenir 161 g de cristaux de chlorhydrate de L-tryptophane Dans ces cristaux de chlorhydrate de L-tryptophane la pureté du L-tryptophane était de 95,7 %. Après avoir introduit au préalable dans un réservoir de cristallisation une solution dans l'eau de 130 g du chlorhydrate de L- tryptophane ainsi obtenu en une concentration de 150 g/l, on a effectué une cristallisation avec neutralisation simultanée en maintenant le p H à 6,5 en ajoutant goutte à goutte une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 27 % sous agitation à 30 C Les cristaux étaient finement divisés si bien que les opérations d'agi- tation, de séparation, etc sont devenues impossibles. Exemple comparatif 2 Avec de l'acide chlorhydrique à 35 % on a réglé à 3, 5 le p H d'un milieu de production de L-tryptophane par fermentation. Après avoir éliminé les cellules par centrifugation, on a concentré la solution à 60 C sous pression réduite jusqu'à ce que la con- centration du L-tryptophane atteigne 150 g/l Après avoir refroidi la suspension concentrée de 50 C à 15 C pendant une nuit, on a séparé les cristaux à l'aide d'une centrifugeuse et on les a lavés à l'eau On a séché les cristaux à 60 C pendant 2 h sous pression réduite pour obtenir 106 g de cristaux de L-tryptophane Dans les cristaux de L-tryptophane, la pureté du L-tryptophane était de 71,8 % et le rendement en L-tryptophane était de 60 %. Comme indiqué ci-dessus, selon la présente invention, grâce au traitement de cristal Lisation il est possible de précipi- ter avec un rendement élevé des cristaux de tryptophane optique- ment actif de grande pureté sans qu'il soit nécessaire d'effectuer un traitement avec une résine ou un traitement nécessitant des grandes quantités de solvant organique Ainsi, du fait de l'absence de liquides usés qui apparaissent au cours du traitement avec des résines, la présente invention permet également de préserver l'en- vironnement. Or REVENDICATIONS 1 Procédé d'obtention de tryptophane optiquement actif à partir d'un milieu de production de tryptophane par fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend l'élimination des cellules dudit milieu de fermentation, l'addition d'acide chlorhydrique ou d'acide chlorhydrique et d'un sel minéral contenant des ions chlore audit liquide exempt de cellules pour cristalliser et séparer du chlorhy- drate de tryptophane optiquement actif, la dissolution dudit chlorhydrate de tryptophane optiquement actif et le fait de sou- mettre la solution résultante et une solution alcaline à une cris- tallisation avec neutralisation simultanée de manière à maintenir entre 3 et 8 le p H de la solution de cristallisation. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide chlorhydrique ou l'acide chlorhydrique et le sel miné- ral contenant des ions chlore sont ajoutés après que le liquide exempt de cellules a été porté à une concentration de tryptophane optiquement actif d'au moins 50 g/l. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité d'acide chlorhydrique ajoutée est d'au moins 2 équivalents par rapport au tryptophane optiquement actif. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les quantités d'acide chlorhydrique et de sel minéral contenant des ions chlore ajoutées sont d'au moins 1 équivalent d'acide chlo- rhydrique et d'au moins 1 équivalent d'ion chlore dans le sel minéral contenant des ions chlore par rapport au tryptophane optiquement actif. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite solution de chlorhydrate de tryptophane optiquement actif a une concentration d'au moins 50 g/l.