Brevet FR2668162A1 — publié le 19920424

La présente invention a pour objet un procédé de détection de l'allèle delta- F 508 de la mutation responsable de la mucoviscidose. L' invention a également pour objet des fragments d'ADN constituant des amorces permettant l'amplification de la partie du génome humain portant cette mutation ainsi qu'un coffret de diagnostic contenant ces amorces pour la mise en oeuvre dudit procédé. La mucoviscidose, ou fibrose kystique du pancréas (CF) est une maladie génétique très grave, dont le traitement n'est encore que symptomatique, et très répandue dans les populations de type Caucasien. Il s'agit d'une maladie à déterminisme héréditaire autosomique récessif (dans la descendance d'un couple de porteurs asymptomatiques, la proportion sera d'un individu atteint pour deux porteurs et un individu sain). L'incidence de CF dans la population européenne est de 1/2500 naissances (350 sur 750.000 naissances en France), ce qui donne une fréquence du gène de 1/50, et une proportion des porteurs de 1 sur 25 (2 millions de porteurs potentiels en France pour 50 millions d'habitants). La mutation principale responsable de cette affection est la délétion delta-F 508 (Kerem et al., 1989 Science, 245, 1073-1080), qui est responsable de l'ordre de 70% des cas de mucoviscidose au Canada. En France, les travaux montrent (Lucotte, 1989 Option-Bio, 24, 13-14) que cette mutation est responsable de 79,5% des cas (estimation portant sur des familles originaires du nord de la Loire). En Ecosse, la fréquence rapportée est de 74,4%, alors qu'en Espagne et en Italie elle n'est plus que de 46,2%. La technique classique de détection des porteurs actuellement disponible (Kerem et al., voir Supra) fait intervenir une procédure de détection relativement complexe, incluant: l'hybridation de 1'ADN des sujets avec un couple d'amorces encadrant la mutation, l'amplification de la séquence intermédiaire par réaction en chaîne à la polymérase (PCR) et la révélation de la mutation par hybridation différentielle avec deux oligosondes complémentaires, l'une du chromosome normal et l'autre du chromosome muté; de plus, ces oligosondes sont marquées au 32p, ce qui nécessite, pour la révélation de la réaction, l'utilisation du procédé autoradiographique.Ainsi décrite, une telle procédure, qui de plus n'est pas adaptée à la seule détection des porteurs hétérozygotes, ne peut être utilisée que dans les laboratoires de recherche ayant une autorisation spéciale, et est par conséquent peu propice à une utilisation routinière à des fins d'analyses. Parmi les simplifications du test proposées récemment, une méthode rapide a été décrite (Rommens et al., 1990 Am. J. Hum. Genet., 46, 396-397), qui est basée uniquement sur la différence de taille de trois paires de bases (pb) du fragment amplifié, non spécifique de la mutation delta-F 508, mais commune à toutes les délétions de triplets de paires de bases dans la région. Encore plus récemment, une autre méthode simplifiée a été proposée (Friedman et al., 1990 Clin. Chem. 36, 695-696), spécifique car détectant le site muté, mais faisant intervenir une étape supplémentaire de digestion par une enzyme de restriction. Selon la présente invention, on a montré, de manière surprenante, qu'on pouvait mettre en oeuvre un procédé de détection de la mutation delta- F 508 simple, ne nécessitant l'utilisation ni de molécules radioactives, ni d'enzymes de restriction et permettant une détection spécifique de ladite mutation. L'avantage principal d'un tel procédé par rapport aux autres procédés décrits dans l'art antérieur réside non seulement dans sa spécificité, mais aussi dans le fait qu'il permet, dans un même milieu réactionnel, de déterminer si le patient est porteur de la mutation delta- F 508 et s'il est hétérozygote. La présente invention a pour premier objet des fragments d'ADN présentant les séquences suivantes: SEQUENCE Aml: 5' -CATGCXTTGYTGACGCTTC-3' dans laquelle X représente I ou T et Y représente I ou A SEQUENCE Am2: 5' -CATTAAZGAAZATATCATCTT-3' dans laquelle Z représente I ou A SEQUENCE Am3: 5' -CATTWAAGWAAATATCATTGG-3' dans laquelle W représente I ou A. La présente invention a encore pour objet un procédé de détection de porteurs de l'allèle delta-F 508 de la mutation responsable de la mucoviscidose, comprenant principalement les étapes suivantes: - isolement d'ADN à partir de cellules, de fluides ou de tissus biologiques, - incubation avec de l'ADN-polymerase dans des conditions réactionnelles permettant l'amplification par polymérisation de chaîne (PCR) d'un milieu réactionnel comprenant: * l'ADN isolé, * une amorce alpha présentant une homologie de séquence avec les chromosomes portant l'allèle normal et les chromosomes portant l'allèle muté, et * une amorce bêta présentant spécifiquement une homologie de séquence avec le chromosome portant l'allèle normal ou allèle sauvage, et/ou d'une amorce gamma présentant une homologie de séquence avec le chromosome portant l'allèle muté. * un système tampon adapté aux conditions de réaction. - révélation des produits d'amplification par électrophorèse et coloration par exemple par le bromure d'ethidium. De manière préférentielle, les tissus desquels est isolé l'ADN sont des cellules épithéliales buccales ou des cellules sanguines. Le procédé selon l'invention présente deux modes de mises en oeuvre préférentiels: - un mode de détection, dit monoréactionnel, dans lequel les trois amorces alpha, bêta et gamma sont ajoutées simultanément au milieu d'amplification. Dans ce cas l'électrophorèse est effectuée préférentiellement sur gel d'acrylamide, - un mode de détection, dit biréactionnel dans lequel les amorces bêta et gamma sont ajoutées dans deux milieux réactionnels séparés contenant tous deux l'amorce alpha. Dans ce cas, l'électrophorèse est effectué préférentiellement sur un gel d'agarose. De manière avantageuse, les amorces sont constituées de fragment d'ADN d'environ 20 bases, préférentiellement de 19 bases, auquel cas l'amorce alpha peut présenter la séquence Aml, l'amorce bêta peut présenter la séquence Am2 et/ou l'amorce gamma peut présenter la séquence Am3. L'amplification est généralement poursuivie pendant 30 cycles de réplication et est effectuée, par exemple, par la Taq polymérase. La présente invention est encore relative à un coffret de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé précédemment décrit comprenant notamment: - un milieu permettant l'extraction de 1'ADN des cellules, - des solutions des trois amorces alpha , bêta, gamma dans le tampon adapté à la réaction de polymérisation, - un gel d'acrylamide ou d'agarose, - une solution de coloration, par exemple de Bromure d'Ethidium (BETA) - un échantillon d'ADN marqueur de poids moléculaire de taille adéquat. Le gel peut être sous forme sèche afin d'assurer une meilleure conservation. L'invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples suivants, dans lesquels Les figures 1 et 2 représentent des diagrammes d'électrophorèses obtenus par le procédé dans lequel la détection est effectuée par le mode biréactionnel, les amorces Am2 et Am3 étant ajoutées dans deux milieux réactionnels séparés contenant tous deux l'amorce Aml. Sur la figure 2 les puits pairs correspondent à Ami Am3 les puits impairs à Aml Amz. La figure 3 représente un gel d'électrophorèse dans lequel la détection a été effectuée par le mode monoréactionnel, les trois amorces Aml, Am2 et Am3 étant ajoutées simultanément au milieu réactionnel. Dans la figure 2, H représente les individus hétérozygotes dela-F 508-N, et N représente les individus normaux N/N. EXEMPLE 1 Procédé biréactionnel. L'ADN à tester (au moins 500 ng) est mis dans chacun des deux tubes correspondant à chacune des réactions: ' 1) milieu de détection du chromosome normal, 2) milieu de détection du chromosome muté delta F 508. Les deux couples d'amorces correspondent,d'une part à l'amorce Aml dans laquelle X est T et Y est A dont la séquence est 5' -CATGCTTTGATGACGCTTC-3' ,et d'autre part,soit l'amorce Am2;dans laquelle Z est A dont la séquence est 5' -CATTAAAGAAAATATCATCTT-3' ,pour la détection du chromosome normal,soit l'amorce Am3 dans laquelle W est A;dont la séquence est 5-CATTAAAGAAAATATCATTGG-3' pour le chromosome muté. Dans chacun des deux tubes, le volume réactionnel est de 100 pl et comprend, outre le tampon d'amplification (20 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 100 Frg/ml de Sérum Albumine Bovine, pH = 8,3), 25 pmoles de chaque amorce par couple, 25 HM de chaque dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) et 2,5 unités (u) de Taq polymérase. L'amplification est réalisée de la façon suivante: dénaturation (950C pendant 5 minutes), 20 cycles d'amplification comprenant une dénaturation (950C, 45 secondes), et une extension (600C, 1 minute); le trentième cycle est allongé (extension à 72"C, 7 minutes). La révélation du produit d'amplification est réalisée en déposant 25 pl du produit de la réaction sur un gel d'agarose à 1,5%, coloré ensuite au bromure d'éthidium. Une migration de 30 minutes à 50 mA est suffisante. Les produits d'amplification ont une taille approximative de - 80 paires de bases. Les Figures 1 et 2 donnent des exemples de révélations obtenues: les individus normaux (+) ne présentent une bande qu'avec la révélation Ami Am2. Une bande faible, de taille plus petite (-3 pb) peut être aussi observée avec Aml Am3 quand l'ensemble du produit d'amplification est déposé ce qui permet de juger de l'efficacité de deux réactions. Les individus hétérozygotes H (delta- F 508/N) porteurs présentent en Ami Am2et en Aml Am3 deux bandes d'égale intensité, alors que les homozygotes h delta-F 508/delta- F 508 ne présentent que la bande Aml Am3. Sur ces Figures ED représente la position des dépôts d'échantillons, PA la position du produit d'amplification et MT désigne le puits de l'ADN marqueur de poids moléculaire. EXEMPLE 2 Procédé monoréactionnel De façon à simplifier la présentation et l'utilisation du coffret de diagnostic, un système simplifié de détection de la mutation ne faisant intervenir qu'une seule réaction a été développé. Pour ce faire, les trois amorces sont ajoutées dans le même tube, à des concentrations de 50 Pmoles pour l'amorce Aml et 25 Pmoles pour chacune des amorces Am2 et Am3. Le volume réactionnel est toujours de 100 pl, mais avec 5 mM de MgCl2, 100 pM de chaque dNTP et 3 U de Taq polymérase. Les cycles d'amplification sont les mêmes que dans l'exemple 1. La révélation du produit d'amplification est réalisée en déposant 25 ijl du produit sur un gel d'acrylamide (migration d'au moins 10 cm) à 12%, coloré au bromure d'éthydium. La migration s'effectue en tampon TEB à 150 V pendant 1/2 heure. Un tel gel de 10 puits, préparé et conservé sous vide, peut faire partie d'un coffret prêt à l'emploi, en même temps qu'un échantillon d'ADN marqueur de poids moléculaire avec des fragments ayant des tailles correspondant à la région à résoudre. Dans ces conditions (Figure 3) les produits d'amplification se présentent sous la forme: d'une seule bande pour les individus homozygotes normaux (puits 1) et homozygotes delta- F 508/delta-F 508 (puits 2), de deux bandes pour les hétérozygotes [H] (puits 3). Sur cette figure M représente le puits du marqueur de poids moléculaire et S et I indiquent les positions respectives des bandes supérieures et inférieures (distantes de 3 pb). La technique peut être aménagée pour le dépistage en série. A cet effet, on a mélangé les ADN (+) et H dans les proportions 1/1, 2/1, 4/1 et 24/1; dans tous les cas la bande inférieure apparaît nettement, ce qui permet de détecter un seul ADH H dans un mélange d'ADN de 25 individus (la fréquence des porteurs est justement de l'ordre de 1/25). Lorsqu'une série est positive (la bande de taille inférieure est présente, même à l'état de trace), elle peut alors être décomposée et les individus testés un par un afin d'identifier les positifs. EXEMPLE 3 Méthode simplifiée d'obtention de l'ADN cellulaire à partir de cellules épithéliales de la muqueuse buccale D'une façon générale, les gens ne souhaitent pas (peur des prises de sang, SIDA....) donner leur sang. Une méthode simplifiée d'obtention d'ADN cellulaire à partir des cellules épithéliales de la muqueuse buccale a donc été développée selon le protocole suivant: Les sujets se rincent pendant 10 secondes la bouche avec 15ml d'une solution de prélèvement pouvant être contenue dans le coffret précédemment décrit. Les cellules buccales sont centrifugées à 500g pendant 10 minutes sur une centrifugeuse de paillasse ordinaire. Le culot est resuspendu dans 1 ml de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) à 1% et incubé 1 heure à 550C avec 0,1 mg/ml de protéinase K.Les débris cellulaires sont centrifugés 30 secondes, et chaque prise de 50 pl du surnageant peut constituer le substrat d'une réaction d'amplification PCR. EXEMPLE 4 Validation du test sur des familles CF et dans une population Le procédé de l'exemple 1 a été testé par l'étude d'une collection de 60 familles CF (parents porteurs et cas index atteint). Dans tous les cas les parents porteurs ont été détectés par le test lorsqu'il s'agissait d'hétérozygotes. Le test a aussi été appliqué aux cas de 19 familles où le cas index CF était décédé. A partir de la détection des porteurs de delta-F 508, les prédiction quant à l'état de porteurs des apparentés (oncles, tantes, neveux, nièces, allies....) ont pu être réalisées. Ce test a aussi été appliqué à la détection des hétérozygotes sur une population de 138 ADNs individuels indépendants des deux sexes. Dans cette population, le nombre d'hétérogyzotes détectés est de 4, proportion non significativement différente de celle théorique de 1/25 à 1/30. REVENDICATIONS 1. Fragment d'ADN présentant la séquence Aml suivante: 5' -CATGCXTTGYTGACGCTTC-3' dans laquelle X représente I ou T, et Y représente Y ou A. 2. Fragment d'ADN présentant la séquence Am2 suivante: 5'-CATTAAZGAAZATATCATCTT-3' dans laquelle Z représente I ou A. 3. Fragment d'ADN présentant la séquence Am3 suivante: 5'-CATTWAAGWAAATATCATTGG-3 dans laquelle W représente I ou A. 4. Procédé de détection de porteurs de l'allèle delta F-508 de la mutation responsable de la mucoviscidose comprenant principalement les étapes suivantes: - isolement d'ADN à partir de cellules, de fluides, ou de tissus biologiques, - incubation avec de l'ADN polymérase dans des conditions réactionnelles permettant l'amplification par une DNA polymérase; d'un milieu réactionnel comprenant: * l'ADN isolé, * une amorce alpha présentant une homologie de séquence avec le chromosome portant l'allèle normal et le chromosome portant l'allèle muté, et * une amorce bêta présentant spécifiquement une homologie avec le chromosome portant l'allèle normal et/ou une amorce gamma présentant spécifiquement une homologie avec le chromosome portant l'allèle muté, et * un système tampon adapté aux conditions de réaction, - révélation des produits d'amplification par électrophorèse et coloration. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que les trois amorces alpha, bêta et gamma sont ajoutées simultanément au milieu réactionnel d'amplification. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'électrophorèse est effectuée sur gel d'acrylamide. 7. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que les amorces bêta et gamma sont ajoutées dans deux milieux réactionnels séparés, contenant tous deux l'amorce alpha. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'électrophorèse est effectuée sur un gel d'agarose. 9. Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que les amorces sont constituées de fragments d'ADN d'environ 20 bases et préférentiellement de 19 bases. 10. Procédé selon l'une des revendications 4 à 9, caractérisé en que l'amorce alpha possède la séquence du fragment d'ADN selon la revendication 1. 11. Procédé selon l'une des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que l'amorce bêta possède la séquence du fragment d'ADN selon la revendication 2. 12. Procédé selon l'une des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que l'amorce gamma possède la séquence du fragment d'ADN selon la revendication 3. 13. Procédé selon l'une des revendications 4 à 12, caractérisé en ce que l'ADN est isolé à partir de cellules épithéliales buccales ou de cellules sanguines. 14. Procédé selon l'une des revendications 4 à 14, caractérisé en ce que l'amplification est effectuée pendant environ 30 cycles de réplication. 15. Coffret de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 4 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend notamment: - des préparations des amorces alpha, bêta et gamma préférentiellement dans une solution contenant un système tampon adapté à la réaction de la polymérisation et une DNA polymérase. - un gel d'acrylamide ou d'agarose; - une solution de coloration et - une préparation d'ADN marqueur de poids moléculaire.