Brevet FR2671696A1 — publié le 19920724

PROCEDE DE FABRICATION D'UNE COMPOSITION CONTENANT DES ACIDES SIALIQUES La présente invention a pour objet un procédé de fabrication d'une composition ayant une teneur élevée en acides sialiques, à partir de petit lait. On sait que les acides sialiques contenus dans le petit lait comprennent les oligosaccharides liés à l'acide sialique, tels que le lactose de sialyle (désigné ci-après par "LS") dans lequel l'acide sialique lie des saccharides, le glycomacropeptide de x-caséine (désigné ci-après par "GMP") dans lequel l'acide sialique lie des peptides, les gangliosides dans lesquels l'acide sialique lie des lipides, et autres Le GMP est un peptide lié à l'acide sialique qui se forme lorsque la K-caséine du lait est soumise à l'action de la présure ou de la pepsine et qui est contenue dans le petit lait du fromage ou dans le petit lait de la caséine de présure. Récemment, on a appris que les chaînes de saccharide contenues dans les saccharides complexes tels que les glycoprotéines ou les glycolipides jouent un rôle important dans la reconnaissance intercellulaire dans un corps vivant On a d'abord reconnu que l'acide sialique est particulièrement important comme constituant indispensable d'un récepteur associé à la reconnaissance intercellulaire Les acides sialiques sont contenus dans le lait maternel en une proportion d'environ 3-5 fois celle contenue dans le lait, et sont considérés agir comme un des facteurs évitant l'infection chez les enfants En particulier, il est maintenant connu que le GMP empêche les colonies de bacilles d'adhérer aux cellules du tractus intestinal; empêche l'infection par le virus de la grippe (demande de brevet japonais non examiné publié) (désigné ci-après par "J P Kokai") Sho N O 63-284133); diminue l'appétit (Bulletin of Expérimental Biology and Medicine 96, 889 ( 1983)) En conséquence, il a été fortement souhaité que l'acide sialique soit produit par voie industrielle comme produit de substitution du lait maternel, comme aliment fonctionnel et pour des substances médicales. Jusqu'à ce jour, comme technique de fractionnement des acides sialiques contenus dans le lait, il a été proposé un procédé pour préparer des protéines liées à l'acide sialique, comme décrit 1 O dans la publication de brevet japonais publié pour opposition (désigné ci-après par "J P Kokoku") Sho N O 40-21234, un procédé pour préparer des oligosaccharides liés à l'acide sialique, comme décrit dans J P Kokai Sho N O 59-184197, et un procédé pour préparer des peptides liés à l'acide sialique (GMP), comme décrit 1 5 dans J P Kokai Sho N O 63- 284199 Toutefois, ces procédés sont trop complexes pour être utilisés à l'échelle industrielle, et présentent des défauts au point de vue économique, par exemple en ce qu'ils exigent des installations coûteuses et un fonctionnement coûteux. La présente invention a pour objet de fournir un procédé pour séparer de façon efficace les acides sialiques d'avec le petit lait du fromage ou le petit lait de caséine de présure, à l'échelle industrielle. Les présents inventeurs ont effectué des recherches approfondies afin d'atteindre cet objectif et ont découvert que cet objectif peut être atteint par les étapes consistant à ajuster, à une valeur acide, le p H du petit lait de fromage ou le petit lait de caséine de présure, qui contient des acides sialiques, à mettre en contact le petit lait avec un échangeur cationique pour former une solution qui a été mise en contact avec l'échangeur cationique (désignée ci-après par "solution ayant été soumise à l'échangeur") et à récupérer la solution ayant été soumise à l'échangeur sous forme de composition contenant des acides sialiques Dans le cas o la solution ayant été soumise à l'échangeur contient beaucoup de lactose, il est préférable que la solution ayant été soumise à l'échangeur soit concentrée et cristallisée pour éliminer le lactose. De préférence encore, la solution ayant été soumise à l'échangeur est concentrée et/ou soumise à un dessalement et si nécessaire, séchée et transformée en poudre De plus, il est préférable que le p H de la solution ayant été soumise à l'échangeur, et/ou d'une liqueur mère obtenue après élimination du lactose, soit ajusté à une valeur de 4 ou plus et qu'ensuite, on effectue une ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 2 000 à 50 000 daltons, pour éliminer le lactose et les cendres, tout en élevant la teneur en acides sialiques. Le petit lait contenant des acides sialiques, qui est le produit de départ de la présente invention, est un produit secondaire obtenu lorsque du fromage ou de la caséine de présure est produit à partir de lait tel que le lait de vache, le lait de chèvre ou le lait de brebis Etant donné qu'une faible quantité de caillebotte ou de graisse reste souvent dans le petit lait, il est préférable de les éliminer préalablement à l'aide d'un séparateur de crème ou d'un clarificateur Afin que les protéines du petit lait telles que la P-lactoglobuline soient adsorbées de façon efficace sur l'échangeur cationique, le petit lait peut être préalablement concentré à l'aide d'un dispositif d'ultrafiltration De plus, le petit lait peut être préalablement soumis à un dessalement à l'aide d'un dialyseur électrique et/ou d'une résine échangeuse d'ions. Le p H du petit lait est ajusté à une valeur de 2-5 avant de le soumettre à l'échangeur cationique Comme substance permettant d'ajuster le p H, on peut utiliser n'importe quel type de produit Par exemple, on peut prendre un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide acétique, l'acide lactique et l'acide citrique. Selon une variante, le petit lait acidifié qui a subi un dessalement à l'aide d'une résine, de façon à présenter un p H d'environ 1-4, peut être utilisé pour ajuster le p H afin que le petit lait contienne une teneur élevée en acides sialiques Dans le petit lait dont le p H a été ajusté à 2-5, les acides sialiques sont chargés négativement, alors que la plus grande partie des protéines du petit lait est chargée positivement Lorsque ce petit lait est mis en contact avec l'échangeur cationique, la protéine du petit lait est adsorbée sélectivement sur l'échangeur cationique et il en résulte que les acides sialiques sont récupérés de façon sélective sous forme d'une solution ayant été soumise à l'échangeur Lorsque le p H du petit lait est supérieur à 5, les acides sialiques et la plus grande partie des protéines du petit lait sont chargés négativement En conséquence, la séparation n'est pas efficace, bien que ces deux composés puissent être séparés à l'aide d'un échangeur anionique en utilisant la différence d'adsorption Lorsque le p H du petit lait est inférieur à 2, les acides sialiques se décomposent et en conséquence, le procédé n'est pas pratique à utiliser. Comme techniques permettant l'adsorption des protéines du petit lait sur un échangeur d'ions, on connaît des techniques telles que celles décrites par J N de Wit et al (Neth Milk Dairy J, :41-56 ( 1986)) et J S Ayers et al (New Zealand J Dairy Sci and Tech, 21:21-35 ( 1986)), ainsi que les procédés décrits dans J.P Kokai Sho N O 52-151200 et 63- 39545, et J P Kokai Hei n 2-104246 et 2-138295 Ces techniques utilisent un échangeur cationique comprenant un groupe échangeur d'ions tel qu'un groupe carboxyméthyle ou un groupe sulfonate, et un échangeur anionique comprenant un groupe échangeur d'ions tel que le groupe méthylammonium quaternaire (MAQ) Ces techniques sont simplement utilisées pour préparer la protéine de petit lait isolé (PPI) en provoquant l'adsorption des protéines du petit lait sur l'échangeur d'ions D'autre part, ces techniques ne tiennent pas compte de l'exploitation possible de la solution ayant été soumise à l'échangeur Les présents inventeurs se sont intéressés aux acides sialiques contenus dans le petit lait, et ont découvert un procédé pour la récupération efficace des acides sialiques avec une concentration élevée, à l'aide d'un échangeur cationique La solution ayant été soumise à l'échangeur ainsi obtenue peut être utilisée telle quelle comme composition ayant une teneur élevée en acides sialiques Selon une variante, la solution peut être utilisée après avoir été concentrée et/ou soumise à un dessalement ou, si nécessaire, après séchage et transformation en poudre De plus, une liqueur mère, obtenue après que la solution ayant été soumise à l'échangeur a été concentrée et ensuite cristallisée pour éliminer le lactose, peut être utilisée comme produit ayant une teneur élevée en acides sialiques La concentration peut être réalisée à l'aide d'un évaporateur La cristallisation peut être effectuée par refroidissement ou par addition d'un germe de cristal. Afin d'obtenir une composition ayant une teneur beaucoup plus élevée en acides sialiques, il est préférable que le p H de la solution ayant été soumise à l'échangeur et/ou celui de sa liqueur mère soit ajusté avant la concentration et/ou le dessalement La concentration peut être réalisée par évaporation ou par ultrafiltration Le dessalement peut être réalisé par dialyse électrique, échange d'ions, ultrafiltration ou diafiltration La diafiltration est une technique permettant d'élever encore la 'teneur en protéines, dans laquelle un liquide, qui a été concentré dans une certaine mesure, est soumis à une ultrafiltration, tandis que de l'eau est ajoutée simultanément, et la solution ayant passé est soutirée. Lorsque la solution ayant été soumise à l'échangeur, et/ou sa liqueur mère, sont ajustées à un p H de 4 ou plus, la concentration peut être réalisée par ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 2000 à 50 000 daltons La concentration peut être également réalisée par ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 10 000, à un p H de 4 ou moins En d'autres termes, le glycomacropeptide de K-caséine (GMP), en tant qu'acide sialique, est présent sous forme de monomère à un p H de 4 ou moins, alors qu'il s'associe en un multimonomère à un p H supérieur à 4 Comme produits permettant d'ajuster le p H, on peut utiliser n'importe quel type de substances. Celles-ci comprennent les alcalis telles que l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde de calcium, le carbonate de potassium, le citrate de sodium, etc. Le concentré ainsi obtenu est une composition ayant une teneur élevée en acides sialiques tels que le GMP Notons que l'a-lactalbumine, qui est généralement contenue dans le petit lait conjointement avec les acides sialiques, peut être séparée des acides sialiques par exemple par ultrafiltration de la solution ayant été soumise à l'échangeur, ou de sa liqueur mère, à un p H de 4 ou plus, à l'aide d'un membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 2 000 à 50 000 daltons. Selon la présente invention, il est possible de produire une composition ayant une teneur élevée en acides sialiques, à un faible coût et d'une manière simple et facile, à l'échelle industrielle, par mise en contact du petit lait avec un échangeur cationique, après ajustement du p H du petit lait La composition ainsi obtenue, ayant une teneur élevée en acides sialiques, peut être utilisée à l'échelle industrielle comme produit alimentaire ou comme produit médicinal, et elle est en conséquence très utile. EXEMPLES La présente invention sera mieux comprise en se référant aux exemples non limitatifs ci-après. EXEMPLE DE REFERENCE 1 Cent kilogrammes de petit lait de cheddar, dont le p H a été ajusté à 3, 5 à l'aide d'acide chlorhydrique, sont mélangés avec 3 litres d'Indion 53 (Phoenix Chemicals) comme échangeur cationique, agités lentement pendant 20 heures et ensuite, séparés à l'aide d'un filtre en une solution ayant été soumise à l'échangeur et en l'échangeur cationique La solution ayant été soumise à l'échangeur ainsi obtenue ( 99,2 kg) contient 5,5 g/100 g de substances solides, 0,6 g/100 g de protéine et 20 mg/100 g d'acides sialiques Les acides sialiques sont déterminés quantitativement à l'aide du EYELA CARBOXYLIC ACID ANALYZER S- 14 (TOKYO RIKAKIKAI CO, LTD) (décrit par Naoki Ii du Département Analytique de Snow Brand Company, le 29 Mars 1990 à l'occasion du 37 ème Congrès de la Société Japonaise des Industries Alimentaires (Nihon Shokuhin Kogyo Gakkai)) Les proportions en acides sialiques sont représentées comme l'acide sialique qui est mesuré en débarrassant l'acide sialique des différentes formes d'acide sialique qui sont un mélange de lactose de sialyle et de glycomacropeptide. EXEMPLE DE REFERENCE 2 3 5 On fait passer 100 kg de petit lait de caséine de présure, dont le p H a été ajusté à 4,0 à l'aide d'acide chlorhydrique, à travers une colonne chargée avec 4 litres de CM-Sephadex C-50 (Pharmacia), jouant le rôle d'échangeur cationique, à une SV de 2,5 pendant heures La solution ayant traversé l'échangeur ( 99,0 kg) contient 5,8 g/100 g de substances solides, 0,4/100 g de protéine et 20 mg/100 g d'acides sialiques. EXEMPLE DE REFERENCE 3 La solution ayant été soumise à l'échangeur dans l'exemple de référence 1 est concentrée jusqu'à une teneur en substances solides de 60 % à l'aide d'un évaporateur, et ensuite, cristallisée afin d'éliminer le lactose La liqueur mère ( 6,4 kg), obtenue après lavage à l'eau du lactose cristallisé, contient 34,3 g/100 g de substances solides, 4,6 g/100 g de protéine et 300 mg/100 g d'acides sialiques. EXEMPLE 1 Le p H de la solution ayant été soumise à l'échangeur dans l'exemple de référence 1 est ajusté à 6,4 à l'aide d'hydroxyde de sodium, la solution est soumise à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 20 000 et ensuite, à un dessalement par diafiltration La solution dessalée et concentrée résultante ( 10 kg) contient 3,7 g/100 g de substances solides, 2,8 g/100 g de protéine et 150 mg/100 g d'acides sialiques La solution est encore concentrée et séchée de manière classique pour donner 0,39 kg de poudre. EXEMPLE 2 5,6 kg d'eau sont ajoutés à la liqueur mère obtenue dans l'exemple de référence 3 Le p H de la solution résultante est ajusté à 6,0 à l'aide de carbonate de potassium et ensuite, soumise à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 8 000 daltons La solution 3 5 concentrée obtenue est soumise à un dessalement par diafiltration. La solution dessalée et concentrée résultante ( 12 kg) contient 3,1 g/100 g de substances solides, 2,3 g/100 g de protéine et mg/100 g d'acides sialiques La solution est encore concentrée et séchée de manière classique pour donner 390 g de poudre. EXEMPLE 3 Le p H de la solution ayant été soumise à l'échangeur, obtenue dans l'exemple de référence 2, est ajusté à 5,8 à l'aide d'hydroxyde de sodium et ensuite, la solution est soumise à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse 1 i O moléculaire d'exclusion de 20 000 daltons La solution concentrée résultante est soumise à un dessalement par diafiltration La solution dessalée et concentrée obtenue ( 10 kg) contient 6,2 g/100 g de substances solides, 3,8 g/100 g de protéine et mg/100 g d'acides sialiques La solution est encore concentrée et séchée de manière classique pour donner 0,645 g de poudre. EXEMPLE 4 Le p H de la solution ayant été soumise à l'échangeur, obtenue dans l'exemple de référence 2, est ajusté à 3,5 à l'aide d'acide chlorhydrique et ensuite, soumise à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 8 000 daltons La solution concentrée résultante est soumise à un dessalement par diafiltration La solution concentrée et dessalée résultante ( 10 kg) contient 6,1 g/100 g de substances solides, 3,7 g/100 g de protéine et 182 mg/100 g d'acides sialiques La solution est encore concentrée et séchée de manière classique pour donner 0,640 g de poudre. EXEMPLE 5 Le p H d'un mélange de 5 kg de la solution ayant été soumise à l'échangeur obtenue dans l'exemple de référence 1 et de 5 kg de la liqueur mère obtenue dans l'exemple de référence 3 est ajusté à 3 5 6,0 à l'aide de carbonate de potassium et ensuite, le mélange est soumis à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 8 000 daltons La solution concentrée résultante est soumise à un dessalement par diafiltration La solution dessalée et concentrée résultante ( 2,5 kg) contient 14 g/100 g de substances solides, 9 g/100 g de protéine et 480 mg/100 g d'acides sialiques La solution est encore concentrée et séchée de manière classique pour donner 360 g de poudre. EXEMPLE 6 5,6 g d'eau sont ajoutés à la liqueur mère obtenue dans l'exemple de référence 3 Le p H de la solution résultante est ajusté à 3,6 à l'aide d'H Cl et ensuite, la solution est soumise à une ultrafiltration à l'aide d'un membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 8 000 daltons La solution concentrée résultante est soumise à un dessalement par diafiltration La solution concentrée et dessalée résultante ( 4 kg) contient 10,0 g/100 g de substances solides, 7,3 g/100 g de protéine et 475 mg/100 g d'acides sialiques La solution est encore concentrée et séchée de manière classique pour donner 380 g de poudre. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'une composition contenant des acides sialiques, comprenant les étapes consistant à (a) ajuster à 2-5 le p H du petit lait de fromage ou du petit lait de présure; (b) mettre en contact le petit lait avec un échangeur cationique pour produire une solution ayant été soumise à l'échangeur; (c) ajuster à 4 ou plus le p H de la solution ayant été soumise à l'échangeur; et (d) concentrer et/ou dessaler la solution ayant été soumise à l'échangeur. 2 Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de séchage et de transformation en poudre de la solution ayant été soumise à l'échangeur, après l'étape (d). 3 Procédé selon la revendication 1, dans lequel, dans l'étape (d), la solution ayant été soumise à l'échangeur est déssalée par diafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 2 000-50000 daltons. 4 Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre une étape consistant à concentrer et cristalliser la solution ayant été soumise à l'échangeur après l'étape (b) et avant l'étape (c), pour en éliminer le lactose et produire une liqueur mère. 5 Procédé selon la revendication 4, comprenant en outre une étape consistant à ajouter de l'eau à la liqueur mère pour préparer la solution ayant été soumise à l'échangeur de l'étape (c). 6 Procédé pour la préparation d'une composition 3 5 contenant des acides sialiques, comprenant les étapes consistant à: (a) ajuster à 2-5 le p H du petit lait de fromage ou du petit lait de présure; 1 1 (b) mettre en contact le petit lait avec un échangeur cationique pour produire une solution ayant été soumise à l'échangeur; (c) ajuster à 4 ou moins le p H de la solution ayant été soumise à l'échangeur; et (d) concentrer et/ou dessaler la solution ayant été soumise à l'échangeur. 7 Procédé selon la revendication 6, comprenant en outre une étape consistant à sécher et transformer en poudre la solution ayant été soumise à l'échangeur après l'étape (d). 8 Procédé selon la revendication 6, dans lequel, dans l'étape (d), la solution ayant été soumise à l'échangeur est déssalée par diafiltration à l'aide d'une membrane d'ultrafiltration ayant une masse moléculaire d'exclusion de 10 000 daltons ou moins. 9 Procédé selon la revendication 6, comprenant en outre une étape consistant à concentrer et cristalliser la solution ayant été soumise à l'échangeur, après l'étape (b) et avant l'étape (c), afin d'en éliminer le lactose.