Brevet FR2670292A1 — publié le 19920612

Procédé de dosage quantitatif de protéines ou glycoprotéines, notamment immunoglobulines et en particulier IgE, dans les larmes et applications de ce procédé. L'invention concerne le dosage quantitatif de protéines ou glycoprotéines, notamment immunoglobulines et en particulier IgE, dans les larmes. On a déjà détecté la presence d'IaE dans les larmes (E. BLOC ICffEL et L. HELLEBOID. Revue française des Laboratoires n 207, mai i 1990, pages 43 à 46). Les larmes sont prélevées avec une bandelette de papier du type Schirmer, dont une extrémité a té placée dans le cul-de-sac conjonctival. Après migration des larmes sur 2 cm au minimum, la bandelette est séchée.La détection des IaE fait appel à une technique dite "sandwich" : la bandelette est placée dans une solution d'anticorps anti-IgE marqués les IgE du prélèvement lacrymal passent dans la solution et se lient aux anticorps anti-IgE ; les complexes marqués obtenus vont à leur tour se fixer sur d'autres anticorps anti-IgE en phase solide, également piacés dans la solution (les IgE forment un pont entre les deux types d'anticorps, chaque complexe étant marqué et fixé sur la phase solide). La mesure est faite après élimination par lavage de l'excédent de marqueur. Le seuil de détection au-delà duquel on considère qu'il existe bien une allergie a été fixé par référence à des solutions standard d'IgE utilisées pour les dosages plasmatiques et titrant 2 UI d'IgE/ml. Dans la thèse de L. HELLEBOID (Académie de Paris, Université René Descartes, Faculté de médecine Necker-Enfants-Malades, 1987) traitant du meme sujet, il est précisé, en conclusion, quten cas de positivité, c'est-à-dire de taux d'IgE supérieur au seuil précité, on doit recourir à des dosages quantitatifs, par les techniques usuelles, des IgE sériques et lacrymales, ce qui pose les problèmes habituels de volume de larme pouvant être prélevé, notamment chez les sujets présentant une insuffisance des sécrétions lacrymales, et de prélèvement par pipette chez les sujets craintifs et chez les enfants agités. Ces techniques usuelles recourent notamment aux prises de sang pour les dosages des IgE sériques et au prélèvement par pipette pour les IgE lacrymales. Si le dosage quantitatif dans les larmes du lysozyme1 de la lactoferrine, de l'albumine, de la transferrine et des IgG (P. N. Stuchell et al., Investigative Ophthalmology & BR Visual Science, vol. 25, mars 1984, pages 374 à 377) ou de médiateurs de l'inflammation (D. Proud et al., J. Allergy Clin. Immunol., i990, vol. 85, pages 896 à 905) a déjà été réalisé à partir de prélèvements par bandelettes, ces dosages nécessitent cependant une élut ion pour récupérer les substances et la pesée des bandelettes avant et après le prélèvement ou encore la détermination exacte du volume de larmes recueilli. L'invention a pour objectif de remédier à ces inconvénients en fournissant une nouvelle méthode de dosage quantitatif des IgE lacrymales, qui nécessite un faible volume de larmes et qui soit extrêmement simple et rapide à réaliser La demanderesse a trouvé de facon tres surprenante qu'il était possible d'effectuer un dosage quantitatif des IgE lacrymales directement à partir d'un prélèvement sur bandelette du type décrit ci-dessus. A posteriori, la demanderesse a trouvé que non seulement les IgE s'adsorbent lors du prélèvement sur la bandelette de papier ou analogue en fonction quantitative de la concentration lacrymale en IgE, mais encore, qu en présence d'anticorps et/ou d'antigènes réagissant spécifiquement avec elles, elle se désorbent rapidement et en fonction quantitativement définie de la concentration lacrymale en IgE. De façon très avantageuse, il est apparu que cette méthode permettait de quantifier les IgE dans toute la plage des concentrations rencontrées chez les sujets malades et ceci en une seule étape, facilement accessible à tout laboratoire. L'invention a donc pour objet un procédé de dosage quantitatif de protéines ou glycoprotéines, notamment immunoglobulines et en particulier IgE, dans les larmes, comprenant les étapes de - placer une extrémité d'une bandelette ou analogue hydrophile appropriée dans le cul-de-sac conjonctival, les caractéristiques de la bandelette ou analogue permettant l'adsorption des protéinesiglycoprotéines sur la partie de la bandelette ou analogue en contact avec les larmes jusqu'à ce qu'un équilibre soit atteint entre la quantité adsorbée de protéines/glycoprotéines et leur concentration lacrymale réelle - déterminer directement la quantité de la protéine/glycoprotéine concernée qui est adsorbée sur ladite partie de bandelette ou analogue, par une méthode immunochimique appropriée ; et - rapporter cette quantité à une courbe étalon établie parallèlement, donnant la concentration lacrymale réelle pour cette protéine/glycoprotéine, cette courbe ayant été établie à partir de solutions de référence de concentrations connues prélevées par bandelette ou analogue et dosées de préférence selon le même protocole. Des bandelettes appropriées sont notamment des bandelettes de papier cellulosique de faible densité, a fibres couchées ou non, par exemple les bandelettes pour test de Schirmer des Laboratoires Faure (Annonay, FRANCE) (papier type Whatman n 1) ou des bandelettes réalises avec du papier référence n 2312 des Laboratoirs Schleicher & Schuell (Dassel, Allemagne). Les reférences n 566 et n 1573 de même provenance conviennent également. Malgré une moins bonne sensibilité, on peut encore citer, du même fournisseur, les références n 1577, 1575, 1506, 1507. 903, 589/2, 589/3, 589/5, 589/6, 572 et 512. Par bandelette ou analogue, on entend dans ie sens de l'invention tout support, de préférence mince pouvant être mis au contact de l'oeil sans l'agresser, et pouvant avoir des formes différentes, par exemple filiformes, en forme de pastille ou de disque, d'éponge chirurgicale, d'embout de bâtonnet, etc. Les bandelettes peuvent avantageusement avoir des dimensions de l'ordre de 55 mm x 5 mm. Lors du prélèvement, on laisse imbiber les 15 premiers millimètres environ de la bandelette, quelques minutes suffisant à cette opération. Elles peuvent, ou non, être prévues pour une séparation de l'extrémité mise au contact de l'oeil d'avec le reste de la bandelette. Mais, en fait, on peut, après prélèvement, garder la bandelette entière, y compris pendant les étapes ultérieures. La bandelette peut ensuite être conservée, après le prélèvement, pendant plusieurs semaines avant la mise en oeuvre de la méthode immunochimique. Les équivalents de la matière cellulosique, non agressifs ou toxiques pour l'oeil, peuvent être utilisés, notamment des polymères et complexes macromoléculaires d'origine naturelle ou synthétique. La méthode immunochimique peut mettre en oeuvre des anticorps dirigés contre la protéine/glycoprotéine concernée pour capter celle-ci, puis assurer la détermination quantitative des complexes antigène-anticorps ainsi formés Cette méthode est de préférence une méthode "sandwich" du type décrit dans l'article de E. BLOCH-MICHEL et al. cité au début. La partie de bandelette ou analogue ayant été au contact des larmes est placée dans une solution, contenue dans un tube ou analogue, comprenant deux séries d'anticorps, dirigés contre la protéine/glcoprotéine concernée, des anticorps marqués libres et des anticorps en phase solide. Les protéines passent dans la solution et se fixent sur les anticorps maraués. Chaque complexe ainsi obtenu se trouve fixé sur un anticorps en phase solide. Les anticorps peuvent être mono- ou polyclonaux. Les anticorps en phase solide peuvent être des anticorps immobilisés sur une phase solide telle que notamment disque de papier, tube en matière plastique (anticorps fixés à la paroi intérieure) servant de récipient pour ltensemble de la réaction, etc. La méthode immunochimique peut aussi mettre en oeuvre, dans les conditions décrites plus haut pour les anticorps, des réactions d'antigènes, tels que des allergènes, avec les anticorps, notamment dans une réaction de type "sandwich" telle que citée ci-dessus, auquel cas on utilise avantageusement un anticorps et un antigène. l'un étant marqué et libre, l'autre immobilisé en phase solide. On comprend qu'en dehors de ces réactions de type "sandwich", on peut utiliser toute autre méthode de dosage quantitatif. Pour la révélation, la méthode immunochimique peut notamment faire appel à une technique immuno-enzymatique, par exemple ELISA, ou à une technique radio-immunologique. De préférence, les tubes de réaction sont agités afin d'augmenter la sensibilité, c'est-à-dire de permettre la mesure de très faibles quantités, notamment inférieure-s à 2 kulil. La sensibilité peut être avantageusement de l'ordre de 0,025 UI/ml. Le procédé de dosage selon l'invention peut s appliquer par exemple aux immunoglobulines, notamment IgE et IgG, aux protéines de l'inflammation et à tous les autres paramètres utiles en diagnostic clinique. Le procédé peut donc non seulement s'appliquer au dosage des IgE lacrymales totales, mais aussi au dosage des IgE spécifiques, et on constate, de façon surprenante, que des concentrations faibles de ces IgE spécifiques peuvent etre dosées. A fortiori, on peut procéder à un dosage semi-quantitatif des IgE spécifiques. Pour les IgE spécifiques, on utilise avantageusement des allergènes ou réactogènes qui peuvent être insolubilisés, de la façon décrite pour les anticorps, ou non, ou marques ou non. De manière surprenante, il a été trouvé que le procédé selon l'invention pouvait conduire à établir non seulement des diagnostics dans les cas d'allergies ophtalmiques (conjonctivites allergiques), mais aussi dans le cas des allergies générales. Dans ce dernier cas, la sensibilité du procédé permet la quantification des IgE transsudées. Enfin, l'invention est également applicable au dosage lacrymal de substances reflétant un état inflammatoire ou pathologique et notamment des substances susceptibles de se trouver dans les larmes dans des plages de concentrations faibles et de préférence assez peu étendues. L'invention va être maintenant décrite plus en détail avec, d'abord, la réalisation d'une courbe étalon pour le dosage d'IgE lacrymales, puis le dosage des IgE lacrymales totales chez un certain nombre de sujets. I - Courbe d'étaionnaae. La courbe d'étalonnage a été réalisée par mise en contact des bandelettes (Whatman n" 1) avec des solutions étalons d'IgE, migration iusau'au 2/3 de leur longueur environ, puis mise en contact en une seule étape des 15 premiers millimètres de bandelette, du disque de papier porteur d'anticorps anti-IgE en phase solide et de 100 microlitres de solution d'anticorps anti-IgE marqués à l'iode 125. On a laissé incuber 24 h sous agitation, procédé ensuite au lavage du disque de papier, puis au comptage de la radioactivité portée par celui-ci. On a ainsi traité des solutions d'IgE ayant c les concentrations suivantes : 0, 0,5, 1, 2,5, 7,5! 20, 50 et 100 kUI IgEIl. La courbe étalon obtenue fait l'objet de la figure jointe. II - Dosage des IaE totales. Le dosage a été fait dans la plupart des cas au cours du bilan initial, et pour certains patients secondairement, pour essayer de lever le doute dans une situation d'incertitude. A/ Matériel et méthodes. 184 patients, âgés de 13 mois à 76 ans, ont été recrutés ; ils présentaient tous une conjonctivite bilatérale chronique, évoluant depuis une période variant entre 4 mois et une quinzaine d' années ; parfois, une kératite récidivante d'étiologie inconnue ou suspectée allergique y était associée. Aucun d'entre eux n avait d'antécédent d'uvéite. Ces sujets ont été classés préalablement (en l'absence de tout dosage d'IgE) en six groupes, correspondant chacun à un tableau particulier - Groupe 1 (70 cas) . conjonctivites dues aux pneumallergènes courants (poussière de maison, acariens, plumes, poils de chat ou de chien), répondant aux critères suivants : histoire et aspect clinique évocateurs ; tests intradermiques franchement positifs (avec ou sans reaction syndromique oculaire) et, parfois, test de provocation par voie sous-cutanée positif ; au moins 2 des 3 critères suivants : antécédents personnels et/ou familiaux d'allergie immédiate, IgE sériques totales élevées, éosinophilie sanguine ou conjonctivale. A noter qu'aucun de ces sujets n'avait une conjonctivite pollinique saisonnière pure. - Groupe 2 (10 cas) : kératoconjonctitites printanières, où aspect clinique et contexte évocateurs ont suffi pour affirmer le diagnostic. - Groupe 3 (9 cas) : conjonctivites à papilles géantes des porteurs de lentille souple, que nous appellerons GPC ("giant papillary conjunctivitis"), caractérisées là encore par l'aspect clinique et le contexte. - Groupe 4 (40 cas) : conjonctivites a allergie possible" correspondant à 2 situations différentes : - sujets chez lesquels l'examen a été fait en "première intention" et où l'on n'avait pas encore d'autre élément (tests cutanés en particulier) - sujets ayant une conjonctivite atypique, où le diagnostic d'allergie ne peut être écarté avec certitude (tests modérement positifs ou sujets remplissant incomplètement les conditions du groupe 1). - Groupe 5 (16 cas) : hypersensibilité retardée, donc sans médiation par les IgE ; les critères sont les suivants : aspects cliniques particuliers, tests cutanés positifs aux antigènes microbiens ou fongiques, amélioration par un traitement spécifique (antimycosique par exemple). - Groupe 6 (39 cas) : conjonctivites chroniques non allergiques : soit les critères du groupe 1 sont tous négatifs soit la cause de la conjonctivite a été déterminée par la suite. On trouve ici en particulier des syndromes secs non allergiques. Le prélèvement de larmes a été fait aux deux yeux à l'aide d'une bandelette de parier filtre (type Schirmer) (une extrémité. placée dans le cul-de-sac conjonctival pendant quelques minutes) et, en cas de syndrome sec sévère, a pu nécessiter une stimulation du larmoiement par vapeur de formol. Le dosage des IgE a ëté fait par le procédé selon l'invention, dont la sensibilité était de 0,025 UI/ml. B/ Résultats. Les résultats obtenus figurent sur le tableau 1, où chaque colonne correspond à l'un des groupes définis plus haut. L'un des sujets presentait une GPC strictement unilatérale l'oeil atteint a été classé dans "GPC" (taux Tableau 1 Le calcul des moyennes respectives de chaque groupe donne les résultats suivants (à chaque valeur inférieure ou supérieure au seuil quantitatif a été assignée la valeur de celui-ci) Groupe nombre de moyenne intervalle de con prélèvements (UI/ml) fiance (risque de 5) pneumallergènes 140 4,0733 2,977 - 5,150 printanières 20 15,860 1,284 - 30,436 GPC 17 5,3647 -1,533 - 12,262 allergie possible 80 21470 1,149 - 3.803 HS retardée 32 0,725 0,513 - 0,937 non allergique 76 0,7342 0.630 - 0,838 Il y a une différence significative (au risque de 1 %) entre chacun des 3 premiers groupes (pneumallergènes, printanières, GPC) et les 2 derniers, dans lesquels l'allergie immédiate ne joue pas de rôle. Les critères usuels suivants sont retenus pour l'interprétation des. résultats : - - > 2 UI/ml pour au moins l'un des deux yeux : positif. Tableau 2 positifs douteux negatifs pneumallergènes (n=70) 54 % 10 % 36 % printanières (n=10) 70 % 10 % 20 % GPC (n=9) 45 % 22 % 33 % allergie possible (n=40) 23 % 17 % 60 % HS retardée (n=16) 6 % 12 % 82 % non allergique (n=39) 8 % 20 % 72 % n = nombre de sujets dans la classe. REVENDICATIONS 1.Procédé de dosage quantitatif de protéines ou glycoproteines, notamment immunoglobulines et en particulier IgE, dans les larmes, comprenant les etapes de - placer une extrémité d'une bandelette ou analogue hydrophile appropriée dans le cul-de-sac conjonctival. les caractéristiques de la bandelette ou analogue permettant l'adsorption des protéines/glycoprotéines sur la partie de la bandelette ou analogue en contact avec les larmes jusqu'à ce qu'un équilibre soit atteint entre la quantité adsorbée de protêines/glycoprotéines et leur concentration lacrymale réelle - déterminer directement la quantité de la protéine/glycoprotéine concernée qui est adsorbée sur ladite partie de bandelette ou analogue, par une méthode immunochimique appropriée ; et - rapporter cette quantité à une courbe talon établie parallèlement, donnant la concentration lacrymale réelle pour cette crotéine/glycoprotéine, cette courbe ayant été établie à partir de solutions de reférence de concentrations connues prPlevée6 par bandelette ou analogue et dosées de préférence selon le même protocole. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bandelettes ou analogues sont réalisées en papier cellulosique de faible densité. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les bandelettes ou analogues sont réalisées en papier type Whatman n 1 ou papiers références n" 2312, 566 et 1573 des Laboratoires Schleicher et Schull. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, pour la méthode immunochimique, on utilise des anticorps et/ou des antigènes, tels que des allergenes ou autres réactogènes, dirigés contre la protéine/glycoprotéine, pour capter celle-ci, puis on détermine la quantité de complexes antigène-anticorps ainsi formés. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise deux séries d'anticorps, des anticorps marqués libres et des anticorps immobilisés en phase solide. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise des anticorps et des antigènes, les uns marqués et libres, les autres immobilisés en phase solide. 7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'on place au moins la partie de bandelette ayant été au contact des larmes dans une solution, contenue dans un tube ou analogue, comprenant les deux séries d'anticorps, ou les anticorps et antigènes. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications o à 7, caractérisé en ce que les anticorps sont mono- ou po lyc lonaux. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que les anticorps ou antigènes immobilisés sont fixés sur la paroi interieure du tube servant à la réaction. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que, pour la révélation, la méthode immunochimique fait appel à une technique immuno-enzymatique, par exemple ELISA. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que la méthode immunochimique fait appel à une technique radio-immuoiogique. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que l'on agite les tubes de réaction pendant l'incubation avec les anticorps et/ou antigènes. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il présente une sensibilité inferieure à 2 kUI/l, notamment de l'ordre de 0,025 UIZml. 14. Application du procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 au dosage des immunoglobulines, notamment IgE et IgG. 15. Application du procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 au dosage des IgE totales ou spécifiques. 16. Application du procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 au dosage des protéines de l'inflammation.