Brevet FR2667789A1 — publié le 19920417

La présente invention concerne un procédé de préparation d'une composition à activité cicatrisante. La cicatrisation des plaies endothéliales chez l'homme et/ou l'animal met en oeuvre un processus complexe impliquant des interactions entre de nombreuses substances de type enzymes de sérum, facteurs de croissance, plaquettes, monocytes et macrophages notamment. I1 est aujourd'hui reconnu que ce sont les plaquettes et les macrophages qui sont les cellules les plus impliquées dans ce processus de cicatrisation. Les plaquettes initient la cicatrisation en libérant au niveau de la plaie des facteurs angiogénique et de croissance qui agissent sur l'angiogénèse et stimulent la synthèse en collagène. Ces facteurs, et plus particulièrement le facteur de croissance PDGF, ont déjà fait l'objet de nombreuses études compte tenu de leur importance dans ce processus de cicatrisation. (Journal of Cellular Physiology, vol. 113, p. 261; Blood, vol.64, N" 2, 1984, p.458). On sait aujourd'hui qu'ils sont présents au sein des alphagranules plaquettaires, et qu'ils circulent sous cette forme jusqu'à ce que les plaquettes soient induites, par une activation extérieure, à se dégranuler. Ainsi, il a été démontré, in vitro (Stakenow et al., Exp. Cell. Res., 1981, 136, 321-25; Burke JM et al., Exp. Cell. Res., 1977, 107-387) et in vivo (Knighton D. et al., Annal of Surgery 1982, vol. 196, n"4, p. 379) que l'activation des plaquettes par de la thrombine libérait un mitogène ou encore facteur de croissance pour les fibroblastes, et stimulait la synthèse du collagène par ces cellules. Le rendement de cicatrisation est par conséquent limité par la biodisponibilité de ces facteurs de croissance qui contrôlent la migration et la prolifération cellulaires. Aujourd'hui il est intéressant de disposer de compositions à base de facteurs de croissance qui puissent être administrées à des patients souffrant d'une carence en ce type de composés, ou simplement présentant des difficultés de cicatrisation, tels les diabétiques et les personnes âgées. Le brevet WO 86 03122 décrit l'utilisation d'un surnageant total de plaquettes activées à la thrombine pour améliorer le processus de cicatrisation. La présente invention concerne notamment un procédé de préparation d'une composition cicatrisante améliorée obtenue à partir d'un surnageant de plaquettes d'origine humain ou animal, activé in vitro, caractérisé en ce que ledit surnageant subit au moins une étape de traitement acide à pH inférieur à 5 pendant un temps suffisant pour obtenir le TGFPw, puis en ce que l'on récupère le surnageant traité et on élimine le précipité obtenu après neutralisation. Dans ce procédé, l'activation des plaquettes libère le contenu des *-granules, c'est-à-dire des protéines plasmatiques et des peptides à caractère hormonal ou de facteur de croissance. On a ainsi pu mettre en évidence - de l'albumine, - du fibrinogène - du facteur v.W, - de la sérotonine, - de l'histamine, - du Connective Tissu Activating Peptide III (CTAP III), - de la 3 thromboglobine (P.T.G.), - du Platelet Factor IV (P.F.IV), - du Platelet Derived Growth Factor (P.D.G.F.), - de l'Epidermal Growth Factor (E.G.F.), - de l'Insuline like Growth Factor I et II (I.G.F.I et II), - du Transforming Growth Factor et (T.G.F. (ss). C'est donc tout un cocktail de produits biologiquement actifs qui est ainsi libéré. Cependant, certains facteurs de croissance, liés à une protéine porteuse, sont inactifs (Furlanetto et Marino, Meth in Enz, Vol. 146, P. 216-226). C'est le cas notamment du T.G.F, qui est présent sous une forme latente dans l'extrait des ? -granules (Pircher et al. B.B.R.C., Vol 136, P. 36-37 (1986)). Grâce au procédé selon l'invention qui comporte une étape de traitement acide, le surnageant obtenu contient notamment le TGF à l'état actif et conduit à des résultats de cicatrisation très supérieurs à ceux obtenus pour les extraits non traités. Cette amélioration de l'activité est due en grande partie à l'activation du TGFA . De préférence, ce traitement acide est conduit à un pH inférieur à 3, par exemple 2,5, pendant une durée de quelques minutes, notamment une dizaine de minutes. Bien entendu, ce traitement peut être optimisé en fonction du surnageant utilisé. Le surnageant à traiter sera de préférence obtenu de la façon suivante - séparation des plaquettes de la fraction plasmatique et déleucocytation, - activation dans une solution tampon, en présence d'un activateur, - homogénéisation du mélange, et - récupération du surnageant. Certaines opérations mises en oeuvre dans les différentes étapes de ce procédé font appel à des techniques familières de l'homme du métier, notamment la séparation des plaquettes et la déleucocytation; elles ne seront pas rappelées ici en détail, mais apparaîtront plus clairement à la lecture des exemples ci-après. L'activation est conduite de préférence sur une suspension de plaquette mise en présence d'un activateur. Parmi les activateurs on préfère utiliser la thrombine, mais l'ADP calcique est un activateur qui présente certains avantages. En effet, les activateurs du type thrombine, collagène inactivé sont d'origine humaine ou animale, et peuvent présenter des inconvénients liés à ces origines. Au contraire, 1'ADP calcique est un produit qui peut être synthétisé chimiquement, ce qui garantit son inocuité. Après l'activation, le surnageant obtenu subit une inactivation virale, de préférence par pasteurisation. Cette étape de pasteurisation permet de se débarrasser de toute trace de contamination bactérienne ou virale éventuellement présente dans le surnageant. Elle permet en outre d'inactiver l'activateur contenant la thrombine éventuellement présente. La pasteurisation est conduite de préférence par chauffage du surnageant pendant environ 10 heures à une température de l'ordre de 60"C. Le pH est un pH neutre ou légèrement acide. C'est ce surnageant obtenu après l'inactivation virale, éventuellement sans avoir été séparé du précipité formé par l'étape de chauffage, qui est soumis au traitement acide. Le surnageant traité obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention présente l'avantage, compte-tenu de sa pureté protéique, d'être stable et de pouvoir être stocké dans de bonnes conditions. Il est également possible de prévoir que la composition cicatrisante est préparée extemporanément à partir des plaquettes du sujet qui doit être traité, ce qui écarte tout risque biologique, réaction ou contamination. La présente invention se rapporte également aux compositions cicatrisantes obtenues à partir de ce surnageant. Il s'agit notamment de telles compositions contenant plus de 1 ug/ml de TGF activé, de préférence 3 ,ug/ml. Compte-tenu de sa bonne stabilité, le surnageant peut être conservé sous forme lyophilisée par exemple, disponible pour un mélange extemporané au moment de son application sur la plaie avec un agent support, ou encore pour l'élaboration de compositions cicatrisantes. Les compositons selon l'invention peuvent bien entendu contenir d'autres principes thérapeutiquement actifs, qui pourront être choisis parmi des composés antiseptiques, antibiotiques, et/ou anesthésiques par exemple, ou bien d'autres substances actives connues pour leur activité dans la cicatrisation des plaies. Il est également possible de prévoir des compositions contenant des colles biologiques à base d'un mélange extemporané de fibrinogène/fibronectine et thrombine, notamment la colle biologique décrite dans les demandes de brevet français 90 07505 et 89 10355. Ces compositions peuvent comporter également des excipients pharmaceutiques acceptables, choisis parmi des composés présentant une bonne compatibilité avec les principes actifs et le surnageant, contenus dans ladite composition. Ces excipients pharmaceutiquement acceptables pourront ainsi être choisi parmi des polymères hydrosolubles de type polymère naturel, tels les polysaccharides (gomme xanthane, gomme de caroube, peptine...) ou polypeptides, des dérivés cellulosiques type méthylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylméthylcellulose ou encore des polymères synthétiques, polaxamère, carbomère, PVA ou PVP. Bien entendu, de telles compositions devront posséder un pH de même qu'une osmolarité dans les limites de la physiologie. Enfin, il est à la portée de tout homme de l'art d'ajouter dans ces compositions divers excipients type cosolvant comme l'éthanol, le glycérol, l'alcool benzylique, des humectants (glycérol), des agents facilitant la diffusion (transcurol, urée), ou encore des conservateurs anti-bactériens. Ces compositions pourront se présenter sous une forme de liquide, de lait, de poudre, de spray, et de façon préférée sous forme d'hydrogel. Les exemples présentés ci-après à titre non limitatif permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques de la présente invention. EXEMPLE 1 Les plaquettes sont extraites du plasma par double centrifugation. Elles sont déleucocytées par filtration sur filtre PALL et lavées en tampon Tris 0,04 M pH 7.4. On récupère ainsi environ 3 x 1010 plaquettes par don standard de sang total, en suspension dans 5 à 10 ml de tampon. On ajoute à cette suspension de la thrombine à raison de 5 U/ml et on laisse agir 10 min.; le surnageant obtenu est ajusté à pH 7,0 et chauffé pendant 10 h à 60"C au bain-marie. On obtient ainsi un produit qui peut être traité par le procédé de l'invention. EXEMPLE 2: ACIDIFICATION L'extrait suivant l'exemple 1 est porté à pH 2,5 par addition d'HCl, maintenu 10 min. avec une agitation douce, puis il est neutralisé à pH 7,0 par addition de NaOH. Le précipité, formé pendant la pasteurisation et l'étape de traitement à pH acide sont centrifugés et le surnageant est filtré si nécessaire. EXEMPLE 3 Les plaquettes sont extraites du plasma par double centrifugation. Les plaquettes sont déleucocytées par filtration sur filtre PALL et lavées en tampon TRISS 0.02 M pH 7.4. On récupère ainsi environ 3.10 exp 10 plaquettes par don standard de sang total, en suspension dans 5 à 10 ml de tampon. On ajoute à cette suspension de l'ADP à hauteur de 2.5 micromole par litre et 19 millimole/litre de calcium. La suspension est homogénéisée, puis laissée au repos pendant 20 mn. L'agrégat plaquettaire est alors centrifugé. L'extrait plaquettaire est chauffé à pH 7.0 pendant 10 heures à 60"C, au bain-marie. Le précipité important qui se produit pendant le chauffage est centrifugé et le surnageant récupéré. Ce surnageant peut être traité comme dans l'exemple 2. EXEMPLE 4 L'extrait selon l'exemple 2 est dilué au 1/5ème dans une solution d'hydroxyméthylcellulose à 2 g/l ou dans une solution de collagène à 20 g/l. On réalise sur un rat Wistar femelle de 200 g une série de 6 punchs dorsaux circulaires de diamètre 6 mm et profondeur 2 mm environ symétriques par rapport à la colonne vertébrale. Une série de 3 puits est remplie par 10 ul d'extrait dilué, l'autre série par 3 puits de placébo. Trois lots de rats sont ainsi réalisés - 1 lot utilisant de l'extrait selon l'exemple 1, - 1 lot utilisant de l'extrait selon l'exemple 2, - 1 lot comparant l'extrait acidifié versus l'extrait non acidifié (2 VS 3). Les orifices sont ensuite recouverts par un film plastique, lui-même recouvert de tulle gras, le tout maintenu en place par une bande auto-adhésive. Les rats sont sacrifiés à j4 et j7 après le traitement, la plaie est ensuite prélevée et fixée pendant 48 h dans du paraformaldéhyde à 4% contenant du saccharin (0,4M), du CaCl2 1% et du Nacl (0,15M), puis lavée à l'eau courante. Pour l'histologie, les pièces fixées sont enrobées dans du tissu Teck, coupées ou cryotome et colorées au trichome de Masson. RESULTATS Voici les résultats obtenus à partir d'une suspension à 5 x plaquettes/ml. Extrait Suivant Extrait Suivant Extrait Suivant Exemple 1 * Exemple 1 Exemple 2 P.D.G.F. 350 ng/ml 300 ng/ml 280 ng/ml T.G.F.ssactif 30 ng/ml 50 ng/ml 2,8 g/ml T.G.F.sstotal 3,0 g/ml 3,0 g/ml 3,0 g/ml * avant pasteurisation Le dosage du T.G.F.ssest fait suivant la technique du clonage en agar de Pircher et al. (BBRC, Vol 136, P. 30-37) Le T.G.F.ss actif est la quantité mesurée spontanément dans l'échantillon. Le T.G.F. ss total est la quantité mesurée après activation complète de l'échantillon. La différence entre les deux correspond au T.G.F.ss latent. On constate donc que l'activation obtenue persiste malgré la neutralisation suivant l'exemple 2. Résultats sur l'animal: effets observés après 7 jours Le tissu cicatriciel du témoin placebo s'organise en une trame fibrillaire, lâche, faiblement cellularisée. En présence d'extraits selon l'exemple 2 ou 3, le tissu de régénération se différencie à plusieurs fibres - la densité cellulaire extérieure beaucoup plus élevée, - la matrice collagénique est mieux définie, son organisation générale est dense. Elle s'exprime sous forme de dépôts fibrillaires annonçant l'organisation classique du derme, - la couche cornée est mieux différenciée pour l'extrait suivant l'exemple 3 que pour l'extrait suivant l'exemple 1 et la maturation est entamée comme en atteste la différenciation de follicule pileux. On constate donc que les fractions acidifiées sont plus efficaces que les fractions non acidifiées, notamment par une différenciation cellulaire plus précoce. Les effets à j4 sont similaires, mais moins accentués. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une composition cicatrisante obtenue à partir du surnageant de plaquettes d'origine humaine ou animale, activé in vitro, caractérisé en ce que ledit surnageant subit au moins une étape de traitement acide à pH inférieur à 5 pendant un temps suffisant pour activer le TGF, puis récupération du surnageant traité et élimination du précipité obtenu après neutralisation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le traitement acide est effectué à un pH inférieur à 3. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le traitement acide dure environ 10 min. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que avant le traitement acide le surnageant est pasteurisé. 5. Procédé de préparation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le surnageant qui doit être traité est obtenu à partir de plaquettes isolées mises en suspension et soumises à une activation. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'activation est effectuée à l'aide de thrombine ou d'ADP calcique. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la composition cicatrisante est préparée extemporanément à partir des plaquettes du sujet qui doit être traité. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la concentration de plaquettes activées de 109 à 101 plaquettes/ml. 9. Composition pharmaceutique destinée notamment à la cicatrisation, caractérisée en ce qu'elle comporte une composition cicatrisante pouvant être obtenue par le procédé de l'une des revendications 1 à 8. 10. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comporte un surnageant de plaquettes activées débarrassé de ses plaquettes et contenant au moins 1 ,ug/ml de TGFO actif.