Brevet FR2665176A1 — publié le 19920131

La présente invention concerne un nouveau complexe génique utile notamment pour la modification des végétaux, notamment des Cucumis melo. Dans le domaine des fruits, l'étape clé pour les produits qui doivent être commercialisés est celle de la maturation. La maturation est une séquence d'évènements qui commence généralement à la fin de la croissance du fruit et qui doit aboutir à des qualités d'ensemble optimales pour la consommation, notamment pour ce qui est des qualités organoleptiques. Si le fruit dépasse cette maturité, il se produit une désorganisation cellulaire qui correspond à ce qu'on appelle la surmaturation. Cette surmaturation correspond pour certains fruits à la fin d'un paroxysme de production d'éthylène. C'est pourquoi les fruits sont répartis en deux groupes qui tiennent compte de leur comportement avec l'éthylène * Les fruits climatériques qui dégagent de l'éthylène de façon autocatalytique au début de la phase de maturation. Chez ces fruits, l'éthylène semble initier, coordonner et accélérer l'ensemble des processus physiologiques de maturation. * Les fruits non climatériques, qui ne présentent pas cette crise éthylénique autocatalytique au début de leur phase de murissement, et chez lesquels il n'est pas possible de modifier la maturation par application d'éthylène. Les fruits non climatériques sont notamment les agrumes, les raisins et les fraises. Les fruits climatériques sont notamment les pommes, les poires, les tomates, les melons et les bananes. Les fruits climatériques présentent la propriété sur le plan de la conservation de passer très rapidement de l'état mature à l'état surmature après l'apparition du paroxysme de la crise éthylénique. Comme cela peut être observé dans la figure 2 (courbe A) relative à Cucumis melo, la crise éthylénique est très importante et peu de temps après le fruit commence à se désorganiser et sa valeur marchande diminue. La présente invention concerne donc la mise en évidence d'un complexe génique isolable à partir d'un système cellulaire végétal, caractérisé en ce que, lorsqu'on le transfère dans un système cellulaire compatible appartenant à une plante portant des fruits de type climatérique, il s'exprime en conférant aux fruits des caractéristiques de type non climatérique. Ce complexe génique est plus particulièrement intéressant lorsqu'il s'exprime dans Cucumis melo. Toutefois, il est bien évident que ce complexe génique peut également être utilisé pour transformer d'autres fruits climatériques en fruits non climatériques, ceci en utilisant plus particulièrement les techniques de génie génétique développées dans le domaine de la molécule végétale. De façon encore plus spécifique, la présente invention concerne un complexe génique isolable à partir d'un système cellulaire végétal du type Cucumis melo, caractérisé en ce que, lorsqu'il est introduit dans un système végétal appartenant à une plante portant des fruits de type climatérique, il fait s'exprimer dans ledit système cellulaire les phénotypes suivants, détectables au cours du temps et définis par comparaison avec ledit système cellulaire non modifié a) une émission d'éthylène présentant un plateau stable pendant environ 5 jours, b) une diminution de la teneur en fructose, c) une stabilité de la teneur en glucose dans le temps, d) une diminution de la teneur en acide malique, e) une augmentation sensible de la teneur en acide propionique dès l'introduction du complexe génique dans ledit système cellulaire, suivie d'une inversion de son processus d'évolution. La mise en évidence et la mesure de ces différents paramètres seront explicitées plus en détail dans les exemples. Ce complexe génique est d'origine naturelle, il a été obtenu par mutation dirigée, il est stable et autoreproductible dans les systèmes cellulaires, notamment les systèmes cellulaires du type Cucumis melo. Actuellement, il peut être reproduit en suivant le même processus mais à l'aide de systèmes qui permettent rapidement de tester les produits les plus prometteurs. En particulier, ce complexe peut être obtenu à partir de systèmes cellulaires de type climatérique en utilisant des procédés de mutation physiques ou chimiques et en sélectionnant les produits obtenus par leur teneur en acide propionique. En effet, le complexe selon la présente invention confère aux produits qui l'incorporent la propriété de présenter une teneur forte en acide propionique qui peut être mise en évidence par divers moyens, notamment une mesure HPLC. Les exemples donneront d'autres informations sur ce type de procédé. Lorsque l'on a pu mettre en évidence un système cellulaire exprimant ce complexe génique, il suffit de reproduire le système cellulaire porteur du complexe génique objet du brevet avec n'importe quel système cellulaire compatible ou rendu compatible. Ceci permet d'obtenir un nouveau système cellulaire dans lequel le complexe génique s'exprime. En outre, le complexe génique selon la présente invention a été introduit dans la lignée 95LS444 de Cucumis melo dont les semences ont été déposées conformément au Traité de Budapest dans la Collection NCIMB (National Collection of Industrial and Marine Bacteria - ABERDEEN AB2 1RY (Ecosse - GB) 23 St. Machar Drive) le 19 juillet 1990 sous le n" 40310. A partir de ces semences, l'homme de métier peut aisément reproduire l'invention en utilisant des techniques connues. Si l'on reproduit le système cellulaire porteur du complexe génique selon l'invention avec n'importe quel système cellulaire compatible ou rendu compatible, on obtient un système cellulaire exprimant le complexe génique. Les descendances de ce croisement donnent une ségrégation dans lequel il est toujours possible de récupérer le complexe génique en utilisant comme crible les analyses biochimiques caractéristiques décrites précédemment et ainsi de suite. On peut ainsi ré obtenir de nouveaux systèmes cellulaires stables et auto-reproductibles dans lesquels le complexe génique de l'invention s'exprime. En outre, il est possible, comme cela a été réalisé à de nombreuses reprises dans les végétaux, de transférer ce complexe génique dans d'autres systèmes cellulaires, notamment par des techniques de fusion cellulaire et de fusion de protoplaste, comme cela a été réalisé déjà, par exemple, pour l'obtention de stérilités mâles cytoplasmiques, lesquelles ont été transférées du choux au colza. Les techniques de fusion cellulaire ou de protoplaste ne seront pas rappelées ici en détail, elles sont connues de l'homme de métier. C'est pourquoi, la présente invention concerne également les complexes géniques obtenus à partir de la lignée 95LS444 de Cucumis melo déposée à la Collection NCIMB sous le n" 40310. La présente invention concerne également les cellules, notamment les cellules végétales, modifiées par introduction dudit complexe génique. La présente invention concerne également un Cucumis melo caractérisé en ce que - il présente un dégagement de C2H4 de l'ordre d'au moins 10 l kg-1.h-1 7, de préférence 12, jours après le maximum de dégagement de C2H4, - sa teneur en acide propionique diminue du premier au septième jour. Le melon selon la présente invention comporte également un taux de fructose croissant beaucoup, notamment doublant du premier au septième jour suivant la maturation. Les exemples ci-après vont permettre de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. La figure 1 représente l'intensité respiratoire de C. melo témoin et C. melo modifié selon l'invention en fonction du nombre de jours après la récolte. La figure 2 représente la quantité de C2H4 dégagée pour le témoin et le produit selon l'invention en fonction du nombre de jours après la récolte. EXEMPLE 1 Le complexe génique objet de la présente invention a été obtenu à partir de systèmes cellulaires constitués par du pollen de Cucumis melo. Ces systèmes cellulaires ont été soumis à différents rayonnements suivant le protocole suivant 1) Détermination de la dose de rayonnement après laquelle 50 % des cellules étaient encore vivantes. Ce rayonnement est communément appelé dose léthale 50 (DL 50). 2) Expositions des systèmes cellulaires à la DL 50. Les systèmes cellulaires, ainsi irradiés ont été ensuite reproduits avec des systèmes cellulaires compatibles (issus de Cucumis melo). Les nouveaux systèmes cellulaires obtenus ont été cultivés puis criblés de façon à mettre en évidence la présente du complexe génique recherché. Le complexe a été criblé en utilisant la décroissance du taux d'acide propionique avec le temps. En effet, sur les cellules d'origine ce taux d'acide croît avec le temps. I1 est bien connu que l'éthylène (C2H4) est un des facteurs qui initialise, coordonne et accélère l'ensemble des processus physiologiques de la maturation des systèmes cellulaires climatériques. Or, selon les études antérieures (De Pooter H.L., 1981 ; De Pooter H.L., 1982 ; De Pooter H.L., 1984) l'acide propionique interviendrait comme précurseur et régulateur de la synthèse de C2H4. La décroissance du taux d'acide propionique en fonction du temps a donc été choisi comme confirmation de la création du complexe génique dans le système cellulaire. Parallèlement, pour accélérer les processus de criblage, les mesures suivantes ont été effectuées 1) Appréciation de la texture interne et du ramollissement du fruit en fonction du temps par mesure de la flexion totale sous un poids de 3 kg. 2) Pénétrométrie à maturation (indice réfractométrique supérieur à 11) pour mesurer la texture interne (norme AFNOR) avec élimination des mesures moyennes inférieures à 1,5 kgf. Ainsi, on obtient des systèmes cellulaires non climatériques à partir de Cucumis melo qui peuvent être transférés par croisement, notamment dans des systèmes voisins compatibles ou bien dans d'autres systèmes par des méthodes de biologie moléculaire. EXEMPLE 2 Cet exemple a pour objet de comparer les caractéristiques d'un Cucumis melo modifié par un complexe génique selon l'invention (produit B) avec le Cucumis melo non modifié (produit A). a) Activité respiratoire et production de C H C. melo est un fruit climatérique : lors de sa maturation, on peut observer une brusque augmentation de l'activité respiratoire et de l'émission de C2H Les mesures d'activité respiratoire et d'émission de C H sont effectuées à partir de la veraison jusqu'à la sénescence du fruit. Le C H est dosé par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats représentés aux figures 1 et 2 correspondent à la moyenne de 6 échantillons. C. melo selon l'invention a une activité respiratoire beaucoup moins importante que le témoin (figure 1). Quelques jours après la récolte, comme cela est visible sur la figure 2, l'émission d'éthylène est plus faible chez le produit modifié. La quantité maximale d'éthylène dégagé est la même pour les deux produits. Cette émission maximale est observée 10 jours plus tard chez le produit de l'invention. L'introduction du complexe génique transforme le pic éthylénique observé chez le témoin en un plateau stable pendant 8 jours pour le produit selon l'invention. On a donc une inactivation des gènes codant les enzymes impliqués dans la production d'éthylène autocatalytique. Le complexe génique supprime la crise éthylénique du système cellulaire qui conserve alors ses fonctions physiologiques beaucoup plus longtemps. Le système cellulaire a réaction climatérique est transformé en un système cellulaire non climatérique. A 20"C, la crise de maturation suivie de l'arrêt des fonctions physiologiques et catabolisme du système cellulaire initial peut être caractérisée par l'arrêt de production de C2H4. L'introduction du complexe génique permet une continuation des fonctions physiologiques pendant une quinzaine de jours à 20"C après la montée du dégagement de C2H4. b) Evolution des glucides Les teneurs en sucres réducteurs et sucres totaux ont été étudiées au début et à la fin de la phase de maturité de consommation. Cette phase s'étend sur 3 jours pour le produit A (les dosages ont été faits le premier et le troisième jour). Chez le produit de l'invention (produit B), la durée de conservation est plus importante (les dosages sont effectués le premier et le septième jour). Les sucres réducteurs sont principalement représentés par le fructose. Une quantité de glucose relativement importante est présente chez le témoin à la fin de la période de maturité de consommation. Les résultats présentés dans le tableau I montrent que la teneur en sucres totaux est supérieure chez le produit de l'invention. I1 faut noter que la teneur en sucres réducteurs est très faible chez le produit de l'invention. Le tableau II montre le comportement des systèmes cellulaires avant (A) et après (B) l'introduction du complexe génique. L'introduction du complexe génique diminue considérablement la teneur en fructose à l'origine et permet une stabilité dans le temps de la teneur en glucose. Tableau I Teneur en sucres des deux produits Sucres réducteurs Sucres totaux g. 100 g 1 MF g. 100 g 1 MF 1 er jour 0,95 5,6 A 3ème jour 1,5 6,4 1er jour 0,15 8,0 B 7ème jour 0,65 7,8 Tableau II Fructose Glucose g. 100 g-1 MF g. 100 g-1 MF A 1 er jour 0,9 0,05 A 3ème jour 0,95 0,6 1er jour 0,1 0,05 B 7ème jour 0,65 0,05 c) Evolution des acides organiques Les dosages des acides organiques par HPLC ont été effectués parallèlement aux dosages des sucres. Le tableau III montre le comportement des systèmes cellulaires avant (A) et après (B) l'introduction du complexe génique. L'introduction du complexe génique diminue considérablement la teneur initiale en acide malique et inverse le processus de l'acide propionique au cours du temps. Tableau III Acide malique Acide propionique mg. 100 g-1 MF mg. 100 g-1 MF 1er jour 18,5 190 A 3ème jour 11,1 370 1er jour trace 410 7ème jour 13,9 270 Bibliographie De Pooter H.L., Dirinck P.J., Willaert G.A., Schamp N.M., 1981, Phytochemistry 20, 9, 2135-2138. De Pooter H.L., Montens J.P., Dirinck P.J., Willaert G.A., Schamp S.M., 1982, Phytochemistry 21, 5, 1015-1016. De Pooter H.L., D'Ydewalle Y.E., Willaert G.A., Dirinck P.J., Schamp N.M. 1984, Phytochemistry 23, 1, 23-26. REVENDICATIONS I) Complexe génique isolable à partir d'un système cellulaire végétal, caractérisé en ce que, lorsqu'on le transfère dans un système cellulaire compatible appartenant à une plante portant des fruits de type climatérique, il s'exprime en conférant aux fruits des caractéristiques de type non climatérique. 2) Complexe génique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'exprime dans Cucumis melo. 3) Complexe génique isolable à partir d'un système cellulaire végétal du type Cucumis melo, caractérisé en ce que, lorsqu'il est introduit dans un système végétal appartenant à une plante portant des fruits de type climatérique, il fait s'exprimer dans ledit système cellulaire les phénotypes suivants, détectables au cours du temps et définis par comparaison avec ledit système cellulaire non modifié :: a) une émission d'éthylène présentant un plateau stable pendant environ 5 jours, b) une diminution de la teneur en fructose, c) une stabilité de la teneur en glucose dans le temps, d) une diminution de la teneur en acide malique, e) une augmentation sensible de la teneur en acide propionique dès l'introduction du complexe génique dans ledit système cellulaire, suivie d'une inversion de son processus d'évolution. 4) Complexe génique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il peut être obtenu à partir de la lignée 95LS444 de Cucumis melo déposée à la Collection NCIMB sous le n" 40310. 5) Cellules végétales modifiées par l'introduction d'un complexe génique selon l'une des revendications 1 à 4. 6) Cucumis melo caractérisé en ce qu'il comporte un complexe génique selon l'une des revendications 1 à 5. 7) Cucumis melo selon la revendication 6, caractérisé en ce que - il présente un dégagement de C H de l'ordre d'au moins 10 pl kg l.h 1 7 jours après le maximum de dégagement de C2H4, - sa teneur en acide propionique diminue du premier au septième jour suivant la maturation. 8) Cucumis melo selon la revendication 7, caractérisé en ce que la teneur en fructose double au moins du premier au septième jour suivant la maturation. 9) Cucumis melo selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé par la continuation de ses fonctions physiologiques, donc sa conservation 15 jours à 20"C après le maximum de dégagement de C2H4. 10) Cucumis melo selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il est un descendant de la lignée 95LS444 de Cucumis melo déposée à la Collection NCIMB sous le n" 40310.