Brevet FR2662097A1 — publié le 19911122

i La présente invention concerne le domaine de l'élec- trophorèse sur plaque verticale de gel Elle concerne en particulier les problèmes posés par le chargement d'échan- tillons sur une plaque de gel et par le refroidissement du gel pendant l'électrophorèse. Certaines des nombreuses considérations concernant la réalisation d'un appareil d'électrophorèse sur plaque verticale de gel sont le refroidissement réalisé de manière que la température reste uniforme et constante, l'entretien d'un champ électrique uniforme et permanent, la réduction au minimum du volume de solution tampon nécessaire, et le chargement des échantillons de manière fiable et repro- ductible. Les plaques de gel sont habituellement formées par raccordement de deux plaques de verre avec des entretoises placées aux deux bords verticaux de manière qu'un espace soit établi entre elles, cet espace ayant une largeur comprise entre 0,25 et 3 mm Les plaques sont serrées l'une sur l'autre le long des bords verticaux et un joint étanche est placé le long du bord inférieur ouvert L'espace est alors rempli d'une solution de formation d'un gel, et un élément rapporté formant des cellules, appelé dans l'indus- trie "peigne" ou "gabarit", est placé le long du bord supérieur ouvert avec ses dents qui pénètrent dans l'espace compris entre les plaques te gel peut durcir alors que cet élément rapporté reste en position, et l'élément rapporté est ensuite retiré afin qu'il laisse une rangée de cavités le long du bord supérieur du gel Des échantillons sont placés dans ces cavités après enlèvement du joint du bord inférieur du gel et le "sandwich de gel" résultant est placé dans une cellule Les bords supérieur et inférieur exposés sont alors mis au contact de solutions tampons conductrices dans lesquelles des électrodes sont aussi immergées. De minces couches de gel sont souhaitables pour de nombreuses séparations Malheureusement, les couches minces de gel ont des cavités d'échantillons qui sont minces et qui limitent le volume d'échantillon qui peut être chargé et rendent en outre difficile la disposition de l'échantil- lon dans la cavité. Un autre problème que concerne l'invention est celui qui se, pose avec tous les types de chauffage par effet Joule en cours d'électrophorèse Comme dans d'autres systèmes d'électrophorèse, les systèmes à plaque de gel sont sujets à cet effet de chauffage, surtout lors de l'utilisation d'un champ électrique d'intensité élevée De manière bien connue des hommes du métier, un chauffage non contrôlé par effet Joule peut provoquer une détérioration des échantillons et le défaut d'uniformité de la tempéra- ture provoque la migration de protéines qui se trouvent à des emplacements différents du gel avec des vitesses différentes. L'appareil décrit dans le présent mémoire comporte des propriétés permettant la solution de ces problèmes. Dans un premier aspect, une première plaque d'un ensemble à deux plaques qui forme l'enceinte du gel contient une série de rigoles inclinées le long du bord de chargement d'échan- tillons, chaque rigole débouchant dans l'espace formé entre les plaques L'espacement des rigoles correspond à l'espa- cement des dents de l'élément rapporté en forme de peigne utilisé pour la réalisation des cavités des échantillons dans le gel, et les rigoles ont pour rôle d'élargir les cavités de logement d'échantillons et d'augmenter ainsi leur capacité Dans des modes de réalisation préférés, les dents de l'élément rapporté en forme de peigne sont à la fois plus longues et plus larges que les rigoles si bien que les dents recouvrent les ouvertures des rigoles et, dans d'autres modes de réalisation préférés, une saillie dépasse de chaque dent afin que les saillies pénètrent dans les rigoles lorsque l'élément rapporté est en position Ces saillies peuvent être utilisées pour le support de l'élé- ment rapporté à une hauteur convenable ou pour le 'remplis- sage de l'espace interne d'une rigole afin qu'il reste, dans la rigole, un espace dépourvu de gel pendant la coulée du gel ou elles peuvent être utilisées dans ces deux buts. Lorsque le gel est coulé et que l'élément rapporté a été retiré, les rigoles permettent une augmentation de la dimension de l'échantillon que peut traiter le système si bien qu'il est beaucoup plus facile pour l'opérateur de placer les échantillons dans les cavités sans risquer de détériorer le gel lui-même. Dans un second aspect de l'invention, l'enceinte comprenant la plaque de gel est placée dans un réservoir tampon de manière qu'une électrode soit placée au contact électrique du bord inférieur exposé du gel, par l'intermé- diaire de la solution tampon Le réservoir a une construc- tion telle qu'une paroi plate est refroidie depuis l'exté- rieur par un dispositif de refroidissement thermoélectrique alors que la surface interne de la paroi est au contact de la première plaque de l'enceinte délimitant le gel Le bord inférieur de l'enceinte est au-dessus de la partie infé- rieure du réservoir et laisse un tronçon de paroi refroidie au-dessous de l'enceinte du gel L'électrode est placée en face de cette partie exposée de la paroi refroidie de manière que les bulles de gaz dégagées au niveau de l'élec- trode attirent la solution tampon refroidie de l'espace qui se trouve sous l'enceinte du gel le long de la paroi opposée, si bien que l'effet- de refroidissement est étendu aux deux côtés de l'enceinte d'une manière uniforme. Certaines de ces caractéristiques sont décrites dans la suite du présent mémoire dans des modes de réalisation préférés de l'invention, et d'autres modes de réalisation préférés comprennent des caractéristiques telles qu'une plaque d'un matériau de dispersion de chaleur fixée à l'extérieur de la paroi refroidie de réservoir tampon, entre la paroi et le dispositif de refroidissement, l'uti- lisation de matériaux différents pour les deux parois plates de l'enceinte, et la sélection de surfaces de paroi de l'enceinte et de paroi du réservoir prenant en compte la différence de conductibilité thermique des deux matériaux. Ces deux aspects de l'invention peuvent être utili- sés séparément ou en combinaison. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels: la figure 1 est une vue en perspective, partielle- ment éclatée, d'une enceinte destinée à contenir un gel selon l'invention, comprenant un élément rapporté en forme de peigne destiné à constituer des cavités de logement d'échantillons dans le gel; la figure 2 est une vue en perspective de l'élément rapporté en forme de peigne de la figure 1, et elle repré- sente l'autre côté; la figure 3 est une vue en élévation frontale d'un réservoir tampon selon l'invention, destiné à loger et retenir l'enceinte de la figure 1; la figure 4 est une vue éclatée en plan du réservoir tampon de la figure 3, contenant l'enceinte de la figure 1; et la figure 5 est une vue en élévation latérale avec des parties arrachées du réservoir et de l'enceinte de la figure 4, suivant la ligne 5-5 de cette figure. L'enceinte 11 contenant le gel, représentée sur la figure 1, est considérée comme exemple représentatif du premier aspect de l'invention L'enceinte est formée d'un premier et d'un second organe 12, 13 qui entourent le gel le long de ses deux faces plates et de ses deux bords latéraux, et laissant les bords supérieur et inférieur exposés Le premier organe 12 de cette représentation est une plaque plate alors que le second organe 13 est une structure moulée dont une partie est une plaque plate 14 tournée vers l'autre plaque plate 12 Les matériaux dont sont formés ces organes ne doivent pas conduire l'électri- cité mais, par ailleurs, leurs autres propriétés ne sont pas primordiales, les considérations principales étant leur transparence afin que la formation du gel et le déroulement des opérations d'électrophorèse puissent être contrôlés visuellement, et leurs caractéristiques de transfert de chaleur permettant le refroidissement par les parois de ces organes Pour des raisons de commodité de fabrication, le premier organe 12 est de préférence constitué d'une plaque de verre qui est rigide alors que le second organe 13 est de préférence formé d'une matière plastique transparente, par exemple acrylique. Dans cette représentation, le second organe 13 comporte des bandes plates 15, 16 placées de part et d'autre de la partie plate 14 Ces bandes constituent les zones de contact entre les deux organes Les deux bandes ont aussi pour rôle de délimiter un plan en avant du plan de la partie de plaque plate 14, avec formation d'épaule- ments étroits 17 dont la largeur est égale à l'épaisseur du gel L'espacement des plaques peut aussi être obtenu par d'autres dispositifs classiques, par exemple par disposi- tion d'entretoises d'épaisseur convenable entre les deux organes La structure représentée sur le dessin comporte des entretoises dans le second organe 13 et présente l'avantage de faciliter l'alignement des différentes parties et de nécessiter un nombre réduit d'éléments dans la totalité de l'ensemble L'espace forme un volume qui est utilisé à la fois comme cavité de moulage pour le gel et comme cavité occupée par le gel pendant l'électrophorèse. Cet espace est délimité par la plaque plate (premier organe 12 de l'enceinte), la partie 14 de plaque plate du second organe 13 de l'enceinte et les deux épaulements étroits 17 formés le long des bandes plates, de part et d'autre. Les deux organes 12 et 13 sont maintenus en coopéra- tion par un dispositif classique qui comporte de façon générale des pinces ou agrafes de divers types, le long des bords latéraux Les pinces représentées sur la figure 1 sont des pinces 18, 19 de matière plastique ayant une forme en U, qui glissent sur les bords latéraux qui sont en contact et dont la résistance mécanique et l'élasticité sont suffisantes pour que les deux organes restent en coopération pendant l'électrophorèse Des forces supplémen- taires de serrage peuvent être appliquées à ces pinces pendant la coulée du gel. L'élément rapporté 24 en forme de peigne se loge dans l'espace compris entre la première plaque plate 12 et la partie 14 de plaque plate du second organe 13 Les dents de l'élément rapporté sont tournées vers le bas afin qu'elles forment des cavités dans le gel Comme le montrent les autres figures, l'élément rapporté 24 est destiné à être en appui contre le bord supérieur de l'espace destiné à contenir le gel, seules les dents 25 pénétrant dans cet espace. La construction du second organe 13 de l'enceinte comporte un prolongement 26 muni de parois, le long de la partie supérieure du tronçon 14 de plaque plane Ce prolon- gement 26 forme une chambre supérieure de solution tampon destinée à assurer le contact électrique avec le bord supérieur du gel à l'aide d'une solution tampon Le prolon- gement a un fond 27 et trois parois 28, 29, 30 La plaque plate 12 qui forme l'autre organe de l'enceinte joue le rôle de la quatrième paroi. Le bord du fond 27 qui est adjacent au volume contenant le gel comporte une série de rigoles 31 placées aux endroits o les cavités-doivent être formées par les dents 25 de l'élément rapporté 24 Chaque rigole recoupe le bord supérieur de la partie de plaque plate et forme une ouverture 32 le long de cette partie 14 Ces ouvertures 32 débouchent dans chacune des diverses cavités de logement d'échantillon formées dans le gel par les dents 25 de l'élément rapporté Les rigoles sont inclinées et font un angle obtus avec la partie 14 de plaque plate Dans des modes de réalisation préférés, cet angle est compris entre environ 110 et 1600 Lorsque le gel est coulé et lorsque l'élément rapporté 24 est retiré, des échantillons peuvent être ajoutés avec un volume suffisant pour qu'ils rem- plissent non seulement les cavités formées dans le gel mais aussi l'intérieur de chaque rigole, les rigoles augmentant ainsi considérablement la capacité volumique de chaque cavité. La figure 2 représente la face opposée de l'élément rapporté 24 en forme de peigne Chacune des dents 25 a une saillie 33 Ces saillies pénètrent dans les rigoles 31 lorsque l'élément rapporté est en place Les saillies ont des surfaces inférieures inclinées, analogues aux rigoles et ont de manière générale une forme complémentaire de celle des rigoles, et laissent un vide dans chaque rigole après coulée du gel et enlèvement de l'élément rapporté. Chaque vide fait ainsi partie du volume de la cavité Il faut noter que chaque dent 25 a une largeur et une longueur qui sont toutes deux supérieures à celles de chaque saillie , de la même manière que les dents sont plus larges et plus profondes que les rigoles. Des poignées 34 qui facilitent l'extraction par l'opérateur de l'élément rapporté lorsque le gel a été coulé, sont aussi incorporées à cet élément rapporté. La figure 3 est une vue en élévation frontale d'un réservoir 40 de solution tampon, réalisé sous forme d'un réceptacle de la solution tampon inférieure et d'un boîtier de l'électrode inférieure, et destiné aussi à loger la totalité de l'enceinte comprenant le gel Un couvercle 41 est représenté au-dessus du réservoir de solution tampon et comporte une électrode 59 qui est utilisée comme électrode supérieure lorsque le couvercle est en position La cavité 42 du réservoir tampon a un fond 43 en V et un orifice 44 d'évacuation proche du sommet du V afin qu'il facilite l'extraction de la solution tampon du réservoir Comme représenté sur les figures suivantes, le réservoir tampon de ce mode de réalisation est réalisé en deux moitiés qui coopèrent de façon étanche le long du fond et des deux côtés, grâce à des boulons et des écrous ou d'autres dispositifs classiques La figure 3 représente neuf pas- sages 45 destinés à des boulons. On se réfère maintenant à la figure 4 qui représente le réservoir tampon en vue de dessus et sous forme éclatée, avec l'enceinte 11 qui contient le gel Sur cette vue, les deux moitiés 46, 47 du réservoir tampon sont visibles, de même que les boulons 48 qui maintiennent les deux moitiés en coopération La figure 5 est une vue verticale avec des parties arrachées. On se réfère aux figures 4 et 5; l'intérieur de la moitié avant 47 du réservoir tampon a un profil 49 à gradin des deux côtés La moitié arrière 46 du réservoir tampon a des cavités correspondantes 50 Lorsque les deux moitiés sont fixées l'une à l'autre, le profil à gradin et les cavités forment une gorge le long de chaque bord de la cavité du réservoir, chaque gorge ayant une dimension telle qu'elle peut loger l'un des deux bords latéraux de l'en- ceinte 11, et étant suffisamment large pour qu'elle puisse contenir les pinces d'extrémité 18, 19 Les gorges sont placées de manière qu'elles retiennent l'enceinte 11 en position voulue dans le réservoir, la surface externe de la partie de paroi plate 14 de la plaque moulée de l'enceinte étant au contact d'une paroi plate 51 de la moitié arrière 46 du réservoir tampon Cette paroi plate 51 est refroidie par un dispositif thermoélectrique 52, par l'intermédiaire d'une plaque d'un matériau 53 qui conduit très bien la chaleur et qui répartit l'effet de refroidissement sur toute la surface de la paroi plate 51 Le dispositif thermoélectrique 52 de refroidissement peut être constitué par divers ensembles disponibles dans le commerce Un exemple particulièrement utile dans le cas d'une paroi 51 de matière plastique ayant une épaisseur de 0, 63 mm et pour une électrophorèse à puissance constante de 15 W, utilise deux éléments de refroidissement fournis par Melcor Materials Electronic Products Corporation, Trenton, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique, sous le nom de module thermoélectrique de pompage de chaleur du catalogue CP 1 4- 127-045 L Les éléments sont montés en série et reliés à une source de courant continu de 15 V. Le matériau 53 qui conduit la chaleur est en général un matériau ayant une conductibilité thermique d'au moins W/m K environ à 20 OC et de préférence d'au moins 229 W/m K environ à 20 OC Ce matériau peut être par exemple une plaque métallique, par exemple de cuivre ou d'aluminium (de qualité 2024 et 1100) Un dissipateur de chaleur 54 à ailettes et un ventilateur 60 sont aussi représentés et complètent l'appareil de refroidissement Les flèches placées à gauche du ventilateur indiquent le sens du courant d'air créé par le ventilateur. Le profil 49 à gradin de la moitié avant 47 du réservoir tampon laisse aussi un espace 55 entre la plaque plate avant 12 de l'enceinte et la paroi avant 56 du réservoir tampon Pendant le fonctionnement, cet espace est occupé par la solution tampon inférieure, placée sur la hauteur du gel dans l'enceinte 11 Une électrode 57 est placée près de la partie inférieure de cet espace et près de la surface de la plaque 12 et joue le rôle d'une anode. Les bulles dégagées par l'anode pendant l'électrophorèse remontent verticalement dans cet espace et agitent la solution tampon Bien que la largeur de cet espace 55 ne soit pas primordiale, elle doit être suffisante pour permettre aux bulles d'agiter la solution tampon Un espace de largeur uniforme qui n'est pas inférieur à 0,1 cm environ est préférable On a utilisé de manière satisfai- sante en réalité un espace compris entre 0,3 et 0,6 cm. La hauteur de l'enceinte 11 contenant le gel dans le réservoir tampon est établie par deux nervures 58 de support sur lesquelles repose la face inférieure de la chambre tampon supérieure 26 Ces nervures 58 ont une hauteur telle que l'enceinte il n'est pas placée sur toute la longueur de la surface refroidie 51, vers le bas, mais laisse au contraire une bande 61 placée le long de la partie inférieure de la surface refroidie, audessous du bord inférieur de l'enceinte 11, qui est exposée à la solution tampon inférieure La solution tampon inférieure qui est au contact de cette bande 61 est directement refroidie par cette bande, et les bulles créées au niveau de l'électrode 57 mélangent ce liquide refroidi avec le liquide restant occupant l'espace 55 placé au-dessus, si bien que l'effet de refroidissement est étendu à toute la plaque avant 12 de l'enceinte Pour que l'effet soit maximal, le rapport de la partie 62 de la surface de la paroi refroidie 51 qui est au contact de la plaque arrière 14 de l'enceinte à la surface de la bande exposée 61 est à peu près égal au rapport de la conductibilité thermique de la plaque avant 12 de l'enceinte à celle de la plaque arrière 14 Comme la plaque plate arrière 14 a en général une conductibilité thermique inférieure à celle de la plaque plate avant 12, la surface de la partie 62 de contact de la paroi refroidie 51 est supérieure de façon générale à celle de sa bande exposée 61. Il faut noter que le couvercle 41 contient une électrode supérieure 59 jouant le rôle d'une cathode, placée de manière que l'électrode supérieure pénètre dans la chambre tampon supérieure de l'enceinte qui est remplie de solution tampon supérieure pendant l'électrophorèse. il REVENDICATIONS 1 Appareil pour électrophorèse sur une plaque verticale de gel, caractérisé en ce qu'il comprend une enceinte ( 11) destinée à une plaque de gel et délimitant des première et seconde parois plates opposées ( 14, 12) délimitant un espace rectangulaire destiné à une plaque de gel, cet espace étant ouvert le long d'un bord, le bord ouvert déterminant la largeur de l'espace rectangu- laire destiné à contenir la plaque de gel, un réservoir tampon ( 40) ayant des dimensions lui permettant de loger l'enceinte ( 11) et comprenant des troisième et quatrième parois plates ( 51, 56) qui sont opposées et un fond intermédiaire, la troisième paroi plate ayant au moins la même étendue que l'espace rectangulaire destiné à contenir la plaque de gel, en largeur et en hauteur, un dispositif de fixation de l'enceinte ( 11) dans le réservoir tampon ( 40) afin que la première et la troisième paroi plate soient en contact et qu'un premier espace soit délimité entre le bord ouvert de l'enceinte et le fond et un second espace entre la seconde et la quatrième paroi, une électrode ( 57) placée dans le réservoir tampon de manière que, lorsque l'enceinte lui est fixée, l'élec- trode se trouve dans le premier espace, et un dispositif de refroidissement ( 52-54) destiné à extraire de la chaleur de la troisième paroi plate. 2 Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que la troisième paroi plate ( 51) a une hauteur supé- rieure à celle de l'espace rectangulaire destiné à contenir le gel, le dispositif de fixation forme une bande ( 61) de la troisième paroi plate ( 51) qui est placée le long du fond près du premier espace, et l'appareil comporte en outre une plaque ( 53) d'une matière solide qui est au contact de la troisième paroi plate et qui a pratiquement la même étendue que celle-ci et dont la conductibilité thermique est au moins d'environ 120 W/m K à 20 OC. 3 Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réservoir tampon ( 40) comporte en outre deux parois latérales opposées reliant la troisième et la quatrième paroi, et le dispositif de fixation comprend des gorges ( 49) formées dans les parois latérales et destinées à loger des bords latéraux de l'enceinte ( 11). 4 Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enceinte ( 11) destinée à contenir la plaque de gel comporte une chambre tampon supérieure placée le long d'un bord supérieur opposé au bord ouvert, et un dispositif ( 41) de support d'une électrode ( 59) dans la chambre tampon supérieure. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que la première et la seconde paroi plate ( 14, 12) de l'enceinte ( 11) sont formées de matériaux ayant des conduc- tibilités thermiques différentes, le matériau de la pre- mière paroi plate ayant une conductibilité thermique inférieure à celle du matériau de la seconde paroi plate. 6 Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que la troisième paroi plate a une hauteur supérieure à celle de l'espace rectangulaire destiné à contenir le gel de manière qu'une partie seulement ( 62) de la surface de la troisième paroi plate ( 51) soit au contact de la première paroi plate ( 14), le dispositif de fixation forme une bande ( 61) de la troisième paroi plate le long du fond, près du premier espace, la première et la seconde paroi plate de l'enceinte ( 11) contenant la plaque de gel sont formées de matériaux ayant des conductibilités thermiques différentes, le matériau de la première paroi plate ayant une conductibi- lité thermique inférieure à celle de la seconde paroi plate, et le rapport de la surface de la partie de la troi- sième paroi plate qui est au contact de la première paroi plate à la surface de la bande ( 61) de la troisième paroi plate qui est adjacente au premier espace est à peu près égal au rapport des conductibilités thermiques des maté- riaux de la seconde paroi plate et de la première paroi plate. 7 Appareil de coulée et de retenue d'une plaque de gel destinée à être utilisée dans un appareil pour électro- phorèse, sur une plaque verticale de gel selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, l'appareil de coulée et de retenue étant caractérisé en ce qu'il comprend: un premier organe ( 12) comprenant une première plaque plate de largeur et de longueur choisies, un second organe ( 13) qui comprend une seconde plaque plate ( 14) de longueur infé- rieure à celle de la première plaque plate et dont un bord forme un bord supérieur, et une série de rigoles ( 31) rejoignant un premier côté de la seconde plaque plate en faisant un angle obtus avec la seconde plaque plate, les rigoles recoupant le bord supérieur et délimitant des ouvertures dans la plaque plate le long du bord supérieur, un dispositif ( 19) de fixation du premier et du second organe ( 12, 13) de manière qu'une partie de la première plaque plate dépasse du bord supérieur, si bien qu'un espace destiné à contenir une plaque de gel est déli- mité entre la première et la seconde plaque plate et près du bord supérieur, et un élément rapporté ( 24) en forme de peigne, ayant des dents ( 25) dont le nombre et l'espacement sont égaux, et ayant des longueurs et des largeurs égales au moins à celles des rigoles, et destiné à être en appui sur le bord supérieur lorsque le premier et le second organe sont fixés l'un à l'autre, les dents pénétrant dans l'espace destiné à contenir la plaque de gel. 8 Appareil selon la revendication 7, caractérisé en ce que le second organe ( 13) a en outre une saillie ( 27) placée le long de son bord supérieur et disposée transver- salement à la seconde plaque plate, la saillie, en coopéra- tion avec la partie de première plaque qui dépasse du bord à supérieur lorsque le premier et le second organe sont fixés l'un à l'autre, formant un réceptacle tampon ( 26) le long du bord supérieur, les rigoles formant des cavités dans la saillie ( 27). 9 Appareil selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'élément rapporté ( 24) en forme de peigne a des saillies ( 33) formées sur les dents, les saillies ayant une forme pratiquement complémentaire de celle des rigoles et étant placées sur les dents afin qu'elles se logent dans les rigoles et remplissent pratiquement l'espace interne de celles-ci lorsque l'élément rapporté en forme de peigne est en appui sur le bord supérieur. Appareil selon la revendication 7, caractérisé en ce que le second organe ( 13) comporte en outre une paire de surfaces plates placées sur la longueur du second organe le long des côtés opposés de la seconde face plate et déli- mitant un plan parallèle à la seconde plaque plate et décalé par rapport à celle-ci d'une distance choisie qui est égale à l'épaisseur voulue pour la plaque de gel.