Brevet FR2663638A2 — publié le 19911227

FR 2663638 A2 19911227 FR 9008027 A 19900626 Premier certificat d'addition à la demande principale no 90 04476 déposée le 06 avril 1990. POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE RECEPTEUR DOPAKINERGIQUE, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR CES POLY Pje YMI De S ET UTILISATION DE CES POLYPEPTIDES POUR LE CRIBLAGE DE SUBSTANCES ACTIVES SUR CES POLYPEPTIDES. La présente invention constitue un perfectionnement de l'invention décrite dans la demande de brevet principale N O 90 04476 déposée le 06 avril 1990, et fait l'objet d'un certificat d'addition à cette demande. L'invention décrite dans la demande principale no 9004476 a pour objet des polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique et les gènes codant pour ces polypeptides. En particulier, le polypeptide qui fait l'objet de la demande principale no 9004476 possède une activité de récepteur dopaminergique et: contient la séquence de 446 acides aminés de la Figure 1 ou un fragment de cette séquence, ce fragment étant tel que * soit il contient néanmoins les sites contenus dans cette séquence et dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ce fragment est présent dans une membrane, il soit capable de lier la dopamine à ses agonistes ou antagonistes de manière spécifique et mesurable, par exemple au moyen d'un ligand radioactif selon la technique décrite dans Sokoloff et al. ( 1980)( 13) et dans Martres et al ( 1985)( 11), * soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui reconnaissent également la susdite séquence de 446 acides aminés, mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2 Q * soit il est susceptible de générer des anticorps qui reconnaissent la susdite séquence de 446 acides aminés mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2 ou les polypeptides variants qui correspondent aux polypeptides sus-définis, comportant certaines mutations localisées, sans que les polypeptides ne perdent les propriétés de récepteur dopaminergique. La présente invention a pour objet des polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique et les gènes codant pour ces polypeptides, qui sont des variantes des polypeptides définis dans la demande principale no 9004476. Il était admis jusqu'alors que les divers effets de la dopamine résultaient de son interaction avec deux types de récepteurs communément désignés sous les noms de récepteurs D-1 et D-2 (Kebabian et Calne, ( 1979)( 2)) Parmi ceux-ci, seule la séquence du récepteur D-2 était connue (Bunzow et al, ( 1988)( 19)) et deux isoformes du récepteur D-2 (parfois désignées D-2 A et D-2 B ou encore D-2 ( 415) et D-2 ( 444) résultant de l'épissage alternatif de l'ARN messager du gène dudit récepteur avaient été décrites (Giros et al, ( 1989)( 20); Dal Toso et al, ( 1989)( 22)). Le récepteur D-2 appartient à la famille des récepteurs comportant sept domaines transmembranaires, couplés à une protéine G et présentant un certain degré d'homologie avec les récepteurs de la famille des rhodopsines qui sont exprimés par les photorécepteurs de la rétine. L'existence de récepteurs dopaminergiques distincts des récepteurs D-1 et D-2 avait été suspectée par divers auteurs sur des observations indirectes (voir notamment Schwartz et al, ( 1984)( 14)) mais n'avait jamais été prouvée car lesdits récepteurs n'avaient jamais été isolés, ni identifiés quant à leur structure, ni entièrement définis par leurs propriétés pharmacologiques En particulier, l'existence d'autorécepteurs régulant la synthèse et/ou la libération de dopamine et/ou encore l'activité des neurones dopaminergiques avait été démontrée mais il était couramment admis qu'ils étaient identiques aux récepteurs D-2 en ce qui concerne leur pharmacologie. L'invention a pour objet de donner accès à de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique, ne s'apparentant ni à celle des récepteurs dopaminergiques D-1, ni à celle des récepteurs dopaminergiques D-2. La présente invention a également pour objet: des vecteurs contenant les gènes codant pour des polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique, des cellules transformées pour exprimer les gènes susdits sur lesquelles il est possible d'évaluer l'activité d'agents agonistes ou antagonistes desdits récepteurs, des sondes nucléotidiques suceptibles de s'hybrider avec les gènes codant pour les susdits polypeptides, lesquelles sondes seraient susceptibles d'être utilisées pour le diagnostic in vitro d'affections, notamment neurologiques, psychiatriques, cardiovasculaires ou neuroendocriniennes, des anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre les susdits polypeptides et utilisables dans un but analytique pour purifier lesdits polypeptides, de diagnostic in vitro, ou dans un but thérapeutique, notamment dans les affections impliquant les systèmes dopaminergiques, des trousses (ou kits) pour étudier le degré d'affinité de certaines susbtances pour les susdits polypeptides, des médicaments destinés plus particulièrement au traitement des affections psychiatriques, neurologiques, cardiovasculaires ou neuroendocriniennes et contenant des substances actives sur les susdits polypeptides ayant une activité de récepteur dopaminergique, ou contenant des substances actives sur des cellules transfectées par les gènes ou fragments de gènes codant pour lesdits polypeptides à activité de récepteur dopaminergique, des médicaments actifs sur les récepteurs dopaminergiques déjà identifiés mais dont on voudrait diminuer certains effets secondaires attribuables à leur interaction avec lesdits polypeptides. En particulier, le nouveau polypeptide de l'invention ayant une activité de récepteur dopaminergique: contient la séquence de 446 acides aminés de la Figure 2 ou un fragment de cette séquence, ce fragment étant tel que * soit il contient néanmoins les sites contenus dans cette séquence et dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ce fragment est présent dans une membrane, il soit capable de lier la dopamine à ses agonistes ou antagonistes de manière spécifique et mesurable, par exemple au moyen d'un ligand radioactif selon la technique décrite dans Martres et al. ( 1985) (il), * soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui reconnaissent également la susdite séquence de 446 acides aminés, mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2, * soit il est susceptible de générer des anticorps qui reconnaissent la susdite séquence de 446 acides aminés mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2 les polypeptides variants qui correspondent aux polypeptides sus-définis, comportant certaines mutations localisées, sans que les polypeptides ne perdent les propriétés de récepteur dopaminergique. La reconnaissance de la susdite séquence de 446 acides aminés par les susdits anticorps ou du susdit fragment par les susdits anticorps signifie que la susdite séquence forme un complexe avec l'un des susdits anticorps. La formation du complexe antigène (c'est-à-dire séquence de 446 acides aminés ou susdit fragment)- anticorps et la détection de l'existence d'un complexe formé peuvent se faire par des techniques classiques (telles que celles utilisant un traceur marqué par des isotopes radioactifs ou une enzyme). Pour ce qui est de la définition des "fragments contenant les sites" et répondant à la susdite définition, on se reportera ci-après dans la description. Parmi les fragments ci-dessus définis, on préfère le ou les fragments produits par épissage alternatif de l'ARN messager produit par le gène codant pour la séquence de 446 acides aminés définie ci-dessus. De façon avantageuse, les polypeptides de l'invention correspondent à des fragments de la séquence représentée sur la Figure 2, qui contiennent l'acide aminé correspondant à celui en position 139. Des polypeptides avantageux de l'invention sont tels qu'ils contiennent les sites contenus dans la susdite séquence de 446 acides aminés, dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ces polypeptides sont exposés à la surface d'une cellule en présence d'iodosulpride 1251, et en présence d'un agoniste, l'affinité respective des agonistes suivants: quinpirole, apomorphine, dopamine, vis-à-vis des polypeptides de l'invention est dans l'ordre suivant: l'affinité du quinpirole vis-à-vis des polypeptides de l'invention est supérieure à l'affinité de l'apomorphine vis-à-vis des polypeptides de l'invention, l'affinité de l'apomorphine vis-à-vis des polypeptides de l'invention est sensiblement égale à l'affinité de la dopamine vis-à-vis des polypeptides de l'invention. Des peptides avantageux de l'invention sont tels qu'ils contiennent les sites contenus dans la susdite séquence de 446 acides aminés, dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ces polypeptides sont exposés à la surface d'une cellule en présence d'iodosulpride 1251, et en présence d'un antagoniste l'affinité respective des antagonistes suivants: raclopride, UH 232, halopéridol vis-à-vis des polypeptides de l'invention est dans l'ordre suivant: l'affinité du raclopride vis-à-vis des peptides de l'invention est supérieure à l'affinité de UH 232 vis-à-vis des polypeptides de l'invention, et l'affinité de UH 232 vis-à-vis des polypeptides de l'invention est sensiblement égale à l'affinité de l'halopéridol vis-à-vis des polypeptides de l'invention. UH 232 est défini dans l'article de Svensson K et al "(+) AJ 76 and (+)-UH 232: central stimulants acting as preferential dopamine autoreceptor antagonists" Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 1986, 334, 234-245. Dans ce qui précède et dans ce qui suit, un ligand est considéré comme "agoniste" ou "antagoniste", par référence au comportement connu de ce ligand vis-à-vis du récepteur D-2. La mesure de l'affinité d'un agoniste ou d'un antagoniste vis-à-vis des polypeptides de l'invention se fait par compétition entre l'agoniste ou l'antagoniste (dont on veut mesurer l'affinité) et l'iodosulpride 1251, qui est un ligand à haute affinité des polypeptides de l'invention. En ce qui concerne la mesure de l'affinité des agonistes ou des antagonistes vis-à-vis des polypeptides de l'invention, elle peut avoir lieu dans les conditions suivantes: on utilise une solution (volume final = 400 g 1) de tampon Tris-H Cl 5 Om M, contenant Na Cl 120 m M, KC 1 5 m M, Ca Cl 2 2 m M, Mg C 12 2 m M, 0,1 % d'acide ascorbique, 8- hydroxy quinoléine 1 Og M, 0,1 % d'albumine de sérum bovin et iodosulpride-1251 0,1 à 0,2 n M, 5 jug de protéines de membrane provenant de cellules CH O transfectées, dans lesquelles les polypeptides sont présents à raison d'environ lpmol/mg de protéine membranaire. L'invention concerne également des protéines chimères dans lesquelles le polypeptide tel que défini plus haut ou des fragments de celui-ci sont réunis à un enchaînement d'acides aminés hétérologue par rapport à ce polypeptide. Les polypeptides et protéines chimères de l'invention peuvent être glycosylés et peuvent comporter ou non des ponts disulfure. Dans la suite de la description, et pour simplifier, les polypeptides de l'invention seront désignés par "récepteur D-3 ". L'invention concerne également des acides nucléiques qui comprennent ou qui sont constitués par un enchaînement de nucléotides codant pour l'un quelconque des récepteurs D-3 précédemment définis. Plus particulièrement, l'invention concerne l'acide nucléique qui comprend l'enchaînement de nucléotides représenté sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1 à celle constituée par le nucléotide en position 1863. L'invention concerne particulièrement l'acide nucléique représenté sur la Figure 3 comprenant ou étant constitué par l'enchaînement s'étendant de extrémité constituée par le nucléotide en position 442 à celle constituée par le nucléotide en position 1779. L'acide nucléique sus-défini correspond vraisemblablement à la partie codante du gène correspondant au polypeptide représenté sur la Figure 2. De préférence, les acides nucléiques de l'invention sont tels qu'ils correspondent à des fragments de l'enchaînement de nucléotides représenté sur la Figure 3 et contiennent les nucléotides correspondant respectivement à ceux situés aux positions 856, 857 et 859. Font également partie de l'invention les acides nucléiques variants par rapport à ceux sus-définis et qui comportent certaines mutations localisées dans la mesure o ces acides nucléiques variants s'hybrident avec les acides nucléiques précédemment définis ou avec les sondes nucléiques définies ci-après dans les conditions d'hybridation définies ci-après dans la description. Les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés soit par un procédé chimique, soit par d'autres procédés. Un mode de préparation approprié des acides nucléiques (comportant au maximum 200 nucléotides ou pb, lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) de l'invention par voie chimique comprend les étapes suivantes: la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée de f 3cyanéthyl phosphoramidite décrite dans Bioorganic Chemistry 4; 274-325, 1986, le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur plasmidien approprié et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée. Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques de longueur supérieure à 200 nucléotides ou pb (lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes: l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit dans Proc. Nat Acad Sci USA 80; 7461-7465, 1983, le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur plasmidien approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée. Un autre procédé de préparation des acides nucléiques de l'invention à partir d'AR Nm comprend les étapes suivantes: préparation d'ARN cellulaire à partir de tout tissu exprimant le récepteur dopaminergique D-3 selon les techniques décrites par Maniatis et al, "Molecular cloning", Cold Spring Harbor Laboratory ( 1982), et Ausubel F M et al Current Protocols in Molecular Biology, chapitre 4, Green Publishing Associates et Wiley-Interscience, New York ( 1989), récupération et purification des AR Nm par passage des ARN cellulaires totaux par chromatographie avec un oligod T immobilisé, synthèse d'un brin d'AD Nc à partir des AR Nm purifiés d'après la technique décrite dans Gene 25:263, 1983, clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur plasmidien approprié et récupération de la séquence nucléotidique recherchée en utilisant une sonde d'hybridation appropriée. Pour préparer les acides nucléiques de l'invention, les sondes d'hybridation oligonucléotidiques synthétisées chimiquement sont les suivantes: * celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1, à celle constituée par le nucléotide en position 441, * celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 442, à celle constituée par le nucléotide en position 537, * celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 718, à celle constituée par le nucléotide en position 753, * celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 820, à celle constituée par le nucléotide en position 888, * celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 958, à celle constituée par le nucléotide en position 996, * celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1068, à celle constituée par le nucléotide en position 1240, * celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 1068, à celle constituée par le nucléotide en position 1566, ou leur séquence nucléotidique complémentaire; 1 l ce sont des séquences qui ont été dérivées de celles de la Figure 3 et elles peuvent être utilisées dans les conditions d'hybridation décrites par Maniatis et al. ( 1982) déjà cité. La synthèse du brin d'AD Nc et son amplification subséquente in vitro peut également être effectuée en utilisant la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit par exemple par Goblet et al Nucleic Acid Research, 17, 2144, 1989 "One step amplification of transcripts in total RNA using Polymerase Chain Reaction", en utilisant deux amplimères chimiquement synthétisés définis à partir de la séquence de la Figure 3 Des amplimères appropriés sont par exemple: celui défini sur la Figure 3 du nucléotide 410 au nucléotide 433 et celui défini sur la Figure 3 du nucléotide 1800 au nucléotide 1825. Le fragment d'acides nucléiques amplifié peut être ensuite cloné selon les techniques décrites dans Ausubel F M et al ( 1989) déjà cité. L'invention concerne également les vecteurs recombinants, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmide, cosmide, phage, ou virus, contenant un acide nucléique de l'invention en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication. Un vecteur approprié de l'invention, contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'un polypeptide selon l'invention, dans un hôte cellulaire et éventuellement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence signal et une séquence d'ancrage. L'invention concerne également un hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant défini précédemment comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucléotidique codant pour l'un des polypeptides selon l'invention dans cet hôte. Par hôte cellulaire on entend tout organisme susceptible d'être maintenu en culture. L'un des microorganismes utilisés peut être constitué par une bactérie, notamment Escherichia Coli. Un organisme de choix est constitué par un organisme eucaryote tel que des cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) ou COS-7 (fibroblaste de rein de singe vert africain transformé par le virus SV-40). Mais d'autres organismes peuvent être utilisés tout aussi aisément, naturellement sous réserve que l'on dispose pour chacun d'entre eux des vecteurs, notamment plasmidiques, susceptibles de s'y répliquer et des séquences de nucléotides insérables dans ces vecteurs et capables, lorsqu'elles sont suivies dans ces vecteurs par un insérat codant pour un polypeptide de l'invention, d'assurer l'expression de cet insérat dans les organismes choisis et leur transport dans les membranes de ces hôtes cellulaires. L'invention concerne également les anticorps dirigés de façon spécifique contre l'un des polypeptides de l'invention, ces anticorps étant tels qu'ils ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2 En particulier, ces anticorps reconnaissent les séquences d'acides aminés suivantes: celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 2 s'étendant de l'extrémité constituée par l'acide aminé en position 135 à celle constituée par l'acide aminé en position 147. Pour obtenir les anticorps, on peut injecter chez l'animal l'un de susdits polypeptides. On prépare des anticorps monoclonaux par fusion cellulaire entre des cellules de myélome et des cellules spléniques de souris immunisées, selon les procédés classiques. Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour le diagnostic in vitro du caractère tumoral ou non de certaines cellules ainsi que du caractère bénin ou malin de certaines tumeurs, dans la mesure o ces éléments sont corrélés à l'expression pathologique du récepteur D-3. On a pu constater en effet, que dans certaines tumeurs, notamment tumeurs du poumon, il est possible de détecter l'expression de récepteurs dopaminergiques qui ne devraient pas être normalement présents (Sokoloff et al "Presence of dopamine D-2 receptors in human tumoral cell lines" Biochem Biophys Res. Comm 1989, 162: 575-582). Ce procédé de diagnostic in vitro à partir du prélèvement biologique susceptible de contenir le récepteur dopaminergique D-3 comprend: la mise en contact d'un anticorps de l'invention avec le susdit prélèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe immunologique formé entre le récepteur dopaminergique D-3 ou produit qui en a dérivé et l'anticorps de l'invention, la détection du susdit complexe immunologique formé. L'invention concerne également les sondes nucléotidiques synthétiques ou non, s'hybridant avec l'un des acides nucléiques définis ci-dessus ou leurs séquences complémentaires ou leur ARN correspondant, ces sondes étant telles qu'elles s'hybrident ni avec le gène ni avec les ARN messagers des récepteurs D-1 et D-2 dopaminergiques. Les sondes de l'invention comportent au minimum , avantageusement 15 acides nucléiques et peuvent comporter au maximum la totalité de la séquence nucléotidique représentée sur la Figure 3. Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes: 900 m M de Na Cl, 90 m M de tri-sodium citrate p H 7,0, g/ml d'ADN de sperme de saumon, 0,05 % de pyrophosphate de sodium, 10 à 25 % de formamide déionisée, 0,02 % de Ficoll (Pm de 400 000), 0,02 % d'albumine de sérum bovine, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone, pendant 14 à 16 heures à 42 C. Pour les sondes les plus longues, c'est-à-dire présentant plus d'environ 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes: 600 m M de Na Cl, 60 m M de tri-sodium citrate, 20 gg/ml d'ADN de sperme de saumon, 20 Mg/ml d'AR Nt de levure, 8 m M de Tris-HC 1 p H 7, 4, 40 à 60 % de formamide déionisée, 0,02 % de Ficoll, 0,02 % d'albumine de sérum bovine, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone, 0,2 % de sodium dodécyl sulfate, 10 % de sulfate de dextrane. L'invention concerne en particulier la sonde nucléotidique définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendent de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 820 à celle constituée par le nucléotide en position 888. Les sondes de l'invention peuvent être utilisées comme outils de diagnostic notamment in vitro d'affections neurologiques, psychiatriques, neuroendocriniennes et cardiovasculaires. Les sondes de l'invention peuvent également servir à détailler l'épissage alternatif de l'ARN messager produit par le gène codant pour la séquence de 446 acides aminés définie ci-dessus, l'existence ou non de cet épissage pouvant être liée à des pathologies neurologiques, psychiatriques, cardiovasculaires ou neuroendocriniennes. Plus particulièrement, les sondes de l'invention peuvent être utilisées pour détecter les anomalies génétiques, notamment polymorphismes ou mutations ponctuelles. En ce qui concerne la détection des polymorphismes du gène codant pour le récepteur dopaminergique D-3 chez un individu, elle peut être réalisée à partir d'un échantillon biologique tel que le sang, prélevé chez l'individu selon un procédé comprenant les étapes suivantes: le traitement de l'acide nucléique issu de l'échantillon biologique sus- mentionné réalisé à l'aide d'une enzyme de restriction dans des conditions permettant l'obtention de fragments de restriction issus du clivage dudit acide nucléique au niveau de ces sites de restriction reconnus par ladite enzyme, la mise en contact d'une sonde nucléotidique de l'invention, susceptible de s'hybrider avec les fragments sus- mentionnés dans des conditions permettant la production éventuelle de complexes d'hybridation entre ladite sonde et les fragments de restriction sus-mentionnés, la détection des susdits complexes d'hybridation, la mesure de taille des éventuels fragments de restriction polymorphes engagés dans les complexes d'hybridation sus-mentionnés. En ce qui concerne la méthode de diagnostic in vitro de détection des mutations ponctuelles de l'acide nucléique ou d'un fragment de l'acide nucléique codant pour le récepteur dopaminergique D-3 chez un individu, elle peut être effectuée selon le procédé comprenant les étapes suivantes: la mise en contact d'une sonde nucléotidique de l'invention avec un prélèvement biologique, par exemple du sang, dans des conditions permettant le production éventuelle d'un complexe d'hybridation formé entre la sonde et l'acice nucléique ou un fragment d'acide nucléique susmentionné, la détection du susdit complexe d'hybridation, le séquençage de l'acide nucléique ou du fragment d'acide nucléique intervenant dans le susdit complexe d'hybridation, la comparaison de la séquence de l'acide nucléique ou du fragment d'acide nucléique intervenant dans le susdit complexe d'hybridation avec la séquence de l'acide nucléique (ne présentant pas de mutation) ou du fragment de l'acide nucléique (ne présentant pas de mutation) du récepteur dopaminergique D-3. En ce qui concerne la détection de 1 'épissage alternatif de l'ARN messager produit par le gène codant pour le récepteur D-3, elle peut se faire par quantification de l'ARN messager contenu dans un échantillon de tissu, en utilisant l'une des sondes de l'invention. Les sondes de l'invention peuvent également être utilisées pour détecter l'expression pathologique du récepteur dopaminergique D-3, cette expression étant révélée par la présence d'ARN messager du récepteur dopaminergique D-3 dans des cellules o il ne devrait pas être présent. Cette détection in vitro peut être effectuée à partir d'un échantillon biologique prélevé chez un individu, tel que le sang, selon un procédé qui comprend les étapes suivantes: l'amplification préalable possible des quantités de séquence nucléotidique susceptible d'être contenue dans un échantillon biologique prélevé sur un patient, au moyen d'une amorce d'ADN, la mise en contact de l'échantillon biologique indiqué ci-dessus avec une sonde nucléotidique, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé de ladite sonde et ladite séquence nucléotidique, la détection du complexe d'hybridation ci-dessus qui a pu se former. Cette expression pathologique du récepteur dopaminergique D-3 peut se manifester dans le cas de certaines tumeurs, et peut aussi être corrélée au caractère malin ou bénin de certaines tumeurs. Les polypeptides de l'invention peuvent être préparés par culture dans unmilieu approprié d'un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur recombinant contenant l'un des acides nucléiques définis précédemment et par récupération à partir de la susdite culture du polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé. Un autre procédé de préparation des polypeptides de l'invention est caractérisé en ce que, partant de préférence de l'amino acide C-terminal, l'on condense successivement deux à deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs résidus aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes connues dans la synthèse des peptides et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N- terminal. S'agissant de réaliser l'expression des récepteurs dopaminergiques D-3 dans une bactérie, telle que E. coli ou dans une cellule eucaryote telle qu'une cellule CHO, on effectue les étapes suivantes: la transformation d'un hôte cellulaire compétent avec un vecteur, notamment un plasmide ou un phage, dans lequel a auparavant été insérée une séquence de nucléotides codant pour le récepteur D-3 (insérat) , sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire et permettant l'expression dans l'hôte cellulaire utilisé de ladite séquence de nucléotides, la culture de l'hôte cellulaire transformé dans des conditions permettant l'expression dudit insérat, et le transport du récepteur D-3 exprimé vers la membrane de façon telle que les séquences transmembranaires du récepteur D-3 soient exposées à la surface de l'hôte cellulaire transformé. S'agissant de l'expression en cellules eucaryotes, les éléments de régulation peuvent comporter le promoteur endogène des récepteurs dopaminergiques ou des promoteurs viraux tels que ceux des virus SV 40 ou du virus du sarcome de Rous (RSV). S'agissant de l'expression dans E coli, les éléments de régulation peuvent comporter le promoteur de l'opéron lactose ou de l'opéron tryptophane. L'invention concerne également un procédé de détection de la capacité d'une molécule dopaminergique à se comporter comme ligand vis-à-vis d'un polypeptide de l'invention, lequel procédé comprend: la mise en contact de la molécule dopaminergique avec des membranes d'un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur lui-même modifié par un insérat codant pour le susdit polypeptide, cet hôte portant à sa surface un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide, le cas échéant après induction de l'expression de cet insérat, cette mise en contact étant effectuée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins de ces sites spécifiques et ladite molécule dès lors qu'elle s'avèrerait effectivement posséder une affinité pour ce polypeptide, la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-polypeptide. L'invention concerne également un procédé pour l'étude de l'affinité d'un polypeptide de l'invention pour un ou plusieurs ligands déterminés, lequel procédé comprend: la transformation d'un hôte cellulaire compétent avec un vecteur, notamment un plasmide ou un phage, dans lequel avait auparavant été insérée une séquence de nucléotides codant pour le récepteur D-3 (insérat), sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire et permettant l'expression dans l'hôte cellulaire utilisé de ladite séquence de nucléotides, la culture de l'hôte cellulaire transformé dans des conditions permettant l'expression dudit insérat, et le transport du récepteur D-3 exprimé vers la membrane de façon telle qu'il soit exposé à la surface de l'hôte cellulaire transformé, la mise en contact de cet hôte cellulaire avec ces ligands déterminés, la détection d'une liaison spécifique entre ledit hâte cellulaire transformé et lesdits ligands déterminés. Le procédé décrit ci-dessus permet également l'identification des "fragments contenant les sites" dont question précédemment et qui ne comportent qu'une partie de la séquence de 446 acides aminés de la Figure 2. Cette identification consiste à utiliser des insérats de taille plus réduite que l'acide nucléique codant pour la susdite séquence, à mettre en oeuvre les étapes relatives à l'expression, au transport du produit d'expression et à l'exposition rappelées ci- dessus Lorsqu'on obtient l'expression, le transport du produit d'expression et son exposition sur la membrane, ainsi que la réaction avec les ligands telle que précédemment définie, on peut déterminer ainsi les fragments contenant les sites essentiels Par conséquent, l'absence de réaction avec les ligands, telle que précédemment définie, en utilisant des fragments de taille plus réduite que la séquence complète, tendrait à montrer qu'on a éliminé certains sites essentiels. L'invention concerne également une trousse pour la détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour un polypeptide de l'invention, laquelle trousse comprend: une culture d'hôtes cellulaires transformés par un vecteur modifié tel que défini précédemment ou une culture d'hôtes cellulaires définis précédemment, ou une préparation de membranes desdits hôtes, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression de la séquence nucléotidiques contenue dans le vecteur modifié lorsque le promoteur placé en amont de cette séquence est un promoteur inductible par lesdits moyens physiques ou chimiques, et obtenir une protéine, un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour le susdit polypeptide, des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique de la protéine exprimée. L'invention concerne également un procédé de criblage de médicaments destinés au traitement d'affections neurologiques (telles que la maladie de Parkinson), psychiatriques (telles que les états psychotiques), cardiovasculaires (telles que l'hypertension artérielle) ou neuroendocriniennes (telles que les disfonctionnements de l'axe hypothalamo-hypophysaire). L'invention concerne également des médicaments contenant, comme substance active, une substance active sur l'un au moins des polypeptides selon l'invention, ayant une activité de récepteur dopaminergique ou contenant comme substance active des substances actives sur des cellules transfectées par les gènes ou les fragments de gènes codant l'un au moins des polypeptides à activité de récepteur dopaminergique selon l'invention, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'invention concerne également des médicaments contenant, comme substance active, une substance active sur les récepteurs dopaminergiques D-1 ou D2, mais inactive ou peu active sur les polypeptides à activité de récepteur dopaminergique selon l'invention. L'invention concerne également un procédé de mesure de l'affinité de ligands vis-à-vis d'un polypeptide de l'invention, à l'aide d'un ligand marqué par une méthode radioisotopique et sélectif vis-à-vis du susdit polypeptide de l'invention, comprenant les étapes suivantes: s'il y a lieu, la détermination du susdit ligand sélectif vis-à-vis du susdit polypeptide selon le procédé décrit à propos de l'étude de l'affinité d'un polypeptide de l'invention pour un ou plusieurs ligands déterminés, le marquage du ligand sélectif ainsi déterminé par un procédé radioisotopique, la mise en contact, selon la technique décrite dans Martres et al ( 1985) ( 11), avec des membranes biologiques, notamment de cerveau, contenant le susdit polypeptide de l'invention avec le ligand sélectif marqué et un ligand dont on veut mesurer l'affinité, la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand sélectif marqué-polypeptide. Comme membrane biologique, on peut également travailler sur des membranes de rein. Le ligand marqué et sélectif vis-à-vis d'un polypeptide de 1 ' invention peut également être marqué par une méthode enzymatique. En ce qui concerne la détection du complexe du type ligand sélectif marqué-polypeptide, elle a lieu selon des procédés classiques. L'invention concerne également un procédé de marquage sélectif d'un polypeptide de l'invention à l'aide d'un ligand marqué selon une technique radioisotopique, sur des membranes biologiques contenant d'une part le récepteur D-1 et/ou D-2 et d'autre part le susdit polypeptide, comprenant les étapes suivantes: s'il y a lieu, la détermination d'un ligand sélectif vis-à-vis du récepteur D-1 et/ou D-2 selon le procédé décrit à propos de l'étude de l'affinité d'un polypeptide de l'invention, la mise en contact, selon la technique décrite dans Martres et al ( 1985) ( 11), des susdites membranes biologiques avec le susdit ligand sélectif vis-à-vis du récepteur D-1 et/ou D-2 et avec un ligand marqué selon une technique radioisotopique, notamment 1 ' iodosulpride-125 i, ce qui conduit au marquage sélectif du susdit polypeptide, le récepteur D-1 et/ou D-2 étant occupé par le susdit ligand sélectif, la détection de la formation du complexe du type ligand marqué-polypeptide. La détection du complexe du type ligand marqué- polypeptide peut se faire par des techniques classiques. Le ligand marqué peut également être marqué selon une méthode enzymatique. Ce procédé repose sur l'utilisation d'un ligand marqué (par une technique radioisotopique ou enzymatique), lequel ligand est non sélectif vis-à-vis du récepteur D-3, ce qui implique que si les récepteurs D-1 et/ou D-2 sont également contenus dans les susdites membranes biologiques, ce ligand marqué est susceptible de se lier à la fois aux récepteurs D-1, D-2 et D-3. Afin d'utiliser le ligand marqué dans des conditions telles que le marquage du récepteur D-3 soit sélectif, on a recours à un ligand sélectif vis-à-vis du récepteur D-2 et/ou D-1 Ceci a pour objet d'occuper le récepteur D-2 et/ou D-1 et de le(les) rendre indisponible(s) vis-à-vis du susdit ligand marqué Il en résulte donc que le susdit ligand marqué ne peut plus qu'occuper le récepteur D-3, ce qui entraîne la formation d'un complexe du type ligand marqué-récepteur D-3. Le récepteur D-3 présente une distribution anatomique et des caractéristiques pharmacologiques qui le distinguent des récepteurs D-1 et D-2 Il est exprimé préférentiellement dans les régions limbiques du cerveau impliquées dans les processus cognitifs et émotionnels alors que les récepteurs D-1 et D- 2 sont présents dans la plupart des régions dopaminoceptives, notamment le système extrapyramidal impliqué dans la motricité involontaire. La localisation anatomique très particulière du récepteur D-3 dans le système limbique laisse supposer que des agonistes sélectifs de ce récepteur puissent avoir des effets thérapeutiques sur certains troubles cognitifs et émotionnels associés à la maladie de Parkinson. Les neuroleptiques utilisés en clinique pour traiter les schizophrénies ont tous une affinité pour le récepteur D-3 de l'ordre de 1 à 10 n M qui suggère que le blocage de ce récepteur participe probablement aux effets thérapeutiques des neuroleptiques De plus, le rapport des affinités respectives des neuroleptiques pour les récepteurs D-2 et D-3 est exprimé par le rapport KID-2/K 1 D-3 comme indiqué dans le tableau I ci-après. Tableau 1: Pharmacologie des récepteurs D-2 et D-3 exprimés dans des cellules CHO Valeur K ( i M) Rapport W(n M) Ki D 2 Agentsi D récepteur D2 récepteur D-3 Ki D 3 Agoni stes Bromocriptine 5 3 + 0 6 Apomorphine 24 + 2 SKF 38393 9,560 + 408 Dopamine 474 + 33 Dopamine + Gpp(NH)p 1,705 + 270 TL 99 18 + 1 Pergolide 21 + 3 Quinpirole 576 + 47 7.4 + 1 3 + 3 ,000 + 500 + 3 27 + 3 0.91 + 0 08 0.62 + 0 04 5.1 + 0 3 Antagonistes Domperidone Haloperidol Spiperone Thioproperazine Prochlorperazine (+)Sulpiride Clozapine (-)Sulpiride Thioridazine Amisulpride Chlorpromazine Raclopride Iodosulpride* Pimozide ()AJ 76 (+)'UH 232 0.30 + 0 03 0.45 + 0 03 0.069 + 0 002 0.21 + 0 01 4.7 + 0 4 + 7 56 + 2 9.2 + 0 3 3.3 + 0 2 1.7 + 0 1 2.8 + 0 2 1.8 + 0 1 0.61 + 0 05 * 2.4 + 0 3 270 + 14 + 1 9.5 + 0 5 9.8 + 0 3 0.61 + 0 05 1.7 + 0 1 + 3 422 + 19 + 17 + 1 7.8 + 0 8 3.8 + 0 3 6.1 + 0 3 3.5 + 0 3 1.2 + 0 2 * 3.7 + 0 5 91 + 5 9.2 + 0 1 Les valeurs de Ki sont décrites dans la légende des dérivées d'expériences Figures 5 a et 5 b Les courbes ont été analysées par la méthode de régression non linéaire à l'aide d'un calculateur ( 51) Les valeurs de *KD dérivent de cinétique de saturation à l'équilibre Les moyennes l'écart moyen au standard de valeurs correspondant à 2-3 expériences, avec des résultats similaires. Les termes agonistes antagonistes se réfèrent aux actions des médicaments vis-à-vis des récepteurs D 2 Les composés sont rangés selon leur rapport Ki D-2/Ki-D 3. 0.7 1.2 1.9 0.032 0.046 0.12 0.13 0.20 0.31 0.36 0.42 0.45 0.46 0.51 0.52 0.65 3.0 4.4 et SKF 38393 est décrit dans Pendleton R G et al. "Studies on renal dopamine receptors with SK&F 38393, a new agonist" Eur J Pharmacol, 1978, 51, 19-28, AJ 76 et UH 232 sont décrits dans Svensson K et al. "(+) AJ 76 and (+)-UH 232: central stimulants acting as preferential dopamine autoreceptor antagonists" Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 1986, 334, 234-245. TL 99 est décrit dans Goodale D B et al. Neurochemical and behavioral evidence for a selective presynaptic dopamine receptor agonist Science, 1980, 210, 1141-1143. Ce rapport est corrélé avec certaines propriétés cliniques des neuroleptiques: ceux qui présentent un faible rapport, d'environ 0,05 à environ 0,13 (halopéridol, thiopropérazine, prochlorpérazine) sont des neuroleptiques pour lesquels l'incidence des effets secondaires (parkinsonisme, dystonie et dyskinésies tardives) est la plus forte alors que ceux dont le rapport est le plus élevé, d'environ 0,3 à environ 0,6 (clozapine, amisulpride, thioridazine, sulpiride) sont des neuroleptiques "atypiques" qui provoquent moins d'effets secondaires et/ou ont des propriétés désinhibitrices dans certaines formes déficitaires de schizophrénie. Le criblage de neuroleptiques potentiels par comparaison de leurs affinités respectives pour les récepteurs D-2 et D-3 fournit donc un test prédictif de leurs propriétés "atypiques" ce qui n'existait pas jusqu'alors. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples, notamment en rapport avec les dessins et tableaux dans lesquels: La Figure 1 représente la séquence d'acides nucléiques du récepteur dopaminergique défini dans la demande principale n 9004476 et la séquence d'acides aminés correspondante; La Figure 2 représente les séquences d'acides aminés du récepteur dopaminergique D-2 (deuxième ligne) de rat, alignée avec celle du récepteur dopaminergique D-3 de rat (première ligne) selon la référence 42. Les régions transmembranaires sont encadrées et les positions des introns pour le récepteur D-2 A du rat ( 20, 22, 30, 33) et D-3, déduites de l'analyse de >RGE 12 A et ÀRGS 3, sont indiquées par des flèches Chaque signe "égal" indique une conservation en amino acides et les "tirets" correspondent aux substitutions conservatives o les groupes sont (H,K,R), (I,L,V,M), (A,G,S,T), (Y,F,W), (D,E,P,N,B,Z), (P) et (C). La Figure 3 représente la séquence d'acides nucléiques du récepteur dopaminergique D-3 chez le rat, et la séquence d'acides aminés correspondante. La Figure 4 représente schématiquement l'organisation des clones obtenus après le criblage de l'ADN génomique et l'amplification par technique PCR. La séquence D-3 est schématiquement représentée par sept cases correspondant à Mb I-Mb VII, les lignes ouvertes représentant des séquences codantes et les lignes uniques les séquences non traduites. A RGE 12 A et A RGS 3 sont des clones d'ADN génomique, tandis que RT-PCR A et B représentent des clones d'AD Nc obtenus à partir d'amplification selon la technique PCR d'AD Nc obtenu à partir de poly(A)+ AR Nm et de réverse transcriptase ci-après désignée par RT- PCR Les lignes sombres représentent les régions codantes (exons de clones d'ADN génomiqe) et les lignes fines représentent les introns dans les clones d'ADN génomique Les lignes en pointillés indiquent la continuité de la séquence Les amorces 1, 2 et 3 sont utilisées pour la technique RT- PCR Les sites de restriction indiqués sont tels que: A = Ava I; Ba = Bam HI; Bg = Bgl II; Bs = Bst XI; E = Eco RI; N = Nhe I et S = Sal I A noter que Eco RI, Bgl I et Sal I sont des adaptateurs de l'extrémité 5 ' des amorces de RT-PCR. Les Figures 5 a et 5 b représentent les propriétés comparées des récepteurs D-2 et D-3 exprimés dans les cellules transfectées CHO Plus précisément, la Figure a représente l'inhibition de la liaison à l'iodosulpride-125 I par les agonistes de la dopamine et la Figure 5 b représente l'inhibition de la liaison à l'iodosulpride-125 I par les antagonistes de la dopamine. * La Figure 6 représente la caractérisation des transcripts du gène du récepteur D-3 dans différents tissus. La Figure 7 représente la localisation autoradiographique des sites de liaison à l'iodosulpride-125 I et de l'ARN messager des récepteurs D-2 ou D-3 dans le cerveau de rat. La Figure 8 représente les effets des lésions induites par la 6hydroxydopamine sur les transcripts des gènes des récepteurs D-2 et D-3 dans la substance noire. EXEMPLES 1) Clonage du récepteur dopaminergique D-3: Des oligonucléotides dérivés du récepteur dopaminergique D-2 B (nucléotides 146-233 dans la référence 19) sont marqués radioactivement et utilisés pour cribler une banque d'AD Nc de cerveau de rat ( 20). On montre que l'un des clones s'hybride faiblement avec un fragment de restriction Bam HI-Bgl II du clone du récepteur D-2 A mais pas avec une sonde Accl-Accl (nucléotides 278-571) codant pour les régions transmembranaires Mb II à Mb V représentées sur la Figure 2 Un fragment Aat II-Mscl de ce clone, marqué au phosphore 32 selon la technique de "nick-translation", est utilisé pour cribler une banque génomique de rat, partiellement coupée par Eco RI construite dans le vecteur Charon 4 A Des filtres de nitrocellulose sur lesquels ont été transférés des phages sont soumis à une hybridation 16 h à 42 C dans un milieu contenant % de formamide, 10 % de sulfate de dextran, 4 x SSC, Tris-H Cl 8 m M, p H 7,4, 1 x Denhardt's, 20 pg/ml d'AR Nt de levure, 20 gg/ml d'ADN de sperme de saumon, 0,1 % de SDS, et la sonde à 7,5 105 dpm/ml On lave les filtres deux fois pendant 20 mn à 42 C dans 2 x SSC, 0,1 % de SDS et deux fois pendant 30 mn dans 0,2 x SSC, 0,1 % de SDS à 42 C et 55 C respectivement Trois clones identiques positifs sont obtenus (y compris A RGE 12 A) parmi 800 000 clones et un fragment Nhel-Nhel de 3,5 kb est souscloné dans le site Xbal de M 13 et séquencé ( 43) On synthétise deux amorces dérivées de cette séquence (synthétiseur d'ADN PCR-Mate 391 A, Applied Biosystems) à -32 ( 5 '-ACATTTTGGAGTCGCGTTCCTCTG, amorce 4) et à - 7 (CGAATTCATGGCACCTCTGAGCCAGATAAGCAC, amorce 1) et une amorce dégénérée de la séquence de Mb VII du récepteur D 2 (amorce 2) ( 5 '- CGAATTCGAC(GA)GCACTGTT(GC)AC(GA)TA(GC)CC(GC)AGCCA) à 375 n M. On synthétise un AD Nc monobrin en utilisant de la rêverse transcriptase AMV ( 20 U, Boerhinger), et du poly(A)+ m ARN ( 2 pg) de cerveau de rat Cette matrice est amplifiée ( 29) en utilisant l'amorce 4 et l'amorce 2 ( 75 n M de chacun) pendant 30 cycles ( 92 C, 52 C et 72 C pendant lmn chacun) avec 2,5 U d'ADN polymérase Taq (Perkin Elmer Cetus). Après résolution des produits qui ont été obtenus par la technique PCR par électrophorèse sur gel d'agarose, transfert et hybridation avec la sonde du récepteur D-2 Acc I-Acc I, une bande réactive est excisée à 1,3 kb, et on extrait l'ADN Cet ADN est amplifié à nouveau par technique PCR avec les amorces 1 et 2 Une bande est détectée après coloration au bromure d'éthidium, coupée, l'ADN est extrait et digéré par Eco RI et souscloné dans M 13 (clone RT-PCR A) pour séquençage, et dans le plasmide p GEM-4 Z (Promega) Un fragment de restriction marqué radioactivement Bst XI- Eco RI est utilisé pour cribler une bande génomique de rat, partiellement coupée par Sau 3 A (Clontech) comme décrit ci-dessus Un clone positif RG 53 est obtenu, analysé et un fragment Nhel-Nhel de 3,5 kb hybridant avec la sonde Bst XI-Eco RI est souscloné dans M 13 et séquencé Une amorce est synthétisée 45 nucléotides en aval du premier codon stop TGA dans le cadre (amorce 3: CCACGTCGACAGATCTCGAAGTGGGTAAAGGGAGTG) Les amorces 1 et 3 sont ensuite utilisées dans la technique RT-PCR comme décrit ci-dessus, utilisant le poly(A)' AR Nm de tubercule olfactif comme source d'ARN. Une bande de taille prévue ( 1,4 kb) est extraite après électrophorèse sur gel d'agarose et digérée avec Eco RI-Sal I pour sousclonage directionnel dans M 13 mp 18, M 13 mp 19 et p GEM 4 Z Quatre clones individuels dans M 13 sont entièrement séquences et s'avèrent être identiques. 2) Expression du récepteur D-3 dans des cellules CHO transfectées: On a effectué l'inhibition de la liaison iodosulpride-125 I par les agonistes de la dopamine (Figure 5 a) et les antagonistes (Figure 5 b). METHODE Les vecteurs d'expression dérivent du plasmide p SV p 2-MDH ( 44) Le récepteur adrénergique 62 est excisé de p SV p 2-MDH par digestions avec Hind III et Eco RI et remplacé par un fragment de restriction Sma I-Eco RI du clone du récepteur D-2 A en utilisant un adaptateur de nucléotide franc Hind III conduisant au plasmide p SV D-2 Le vecteur pour exprimer le récepteur D-3 est obtenu en remplaçant le fragment de restriction Hind III-Bgl II de p SV D-2 par un fragment de restriction Eco RI-Bgl II du clone RT-PCR B, en utilisant un adaptateur d'oligonucléotide Hind III-Eco RI conduisant au plasmide p SV D-3 Ces constructions sont cultivées et purifiées sur gradient de chlorure de cesium (Sambrook J et al, Molecular cloning a laboratory manual C Nolan, ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) et transfectées ( 45) à des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO-K 1) déficientes en dihydrofolate réductase Les transfectants stables sont sélectionnés dans un milieu de culture (Dubelcco's Modified Eagle medium) sans hypoxanthine et sans thymidine. L'expression du récepteur D-3 est mise en évidence par la liaison de l'iodosulpride-125 I à des membranes de cellules transfectées selon la technique de Martres et col 1985 Les expériences de liaison sont effectuées ( 11) dans un tampon Tris-H Cl 50 m M (volume total 4001) contenant Na Cl 120 m M, K Cl 5 m M, Ca C 12 2 m M, Mg C 12 2 m M, 0,1 % d'acide ascorbique, 8-hydroxy quinoléine 10 g M, 0,1 % d'albumine de sérum bovin et iodosulpride-125 I 0,1 à 0,2 n M dans les expériences avec des récepteurs D-2 et D-3, respectivement. RESULTATS Les récepteurs D-2 et D-3 ont été exprimés dans des cellules COS-7 ou des cellules CHO, qui normalement n'ont pas de sites de liaison vis-à-vis du d'iodosulpride-125 I, qui est un ligand présentant une haute affinité visà-vis des récepteurs D-2 mais pas du récepteur D-1 dans le cerveau Les récepteurs D-2 et D-3 sont l'un et l'autre marqués au-dessus d'un seuil de liaison non spécifique. Dans des clones transfectés en permanence de cellules CHO, les valeurs de K O sont de 0,6 n M et 1,2 n M respectivement pour D-2 et D-3, et les valeurs B max (Bmax représentant la concentration maximale respectivement en récepteur D-2 et D-3) sont d'environ lpmol/mg de protéine de membrane dans les deux cas. On peut distinguer clairement les deux récepteurs à l'aide de plusieurs agonistes et antagonistes de la dopamine La dopamine elle-même, en l'absence de guanylnucléotide ajouté est d'environ 20 fois plus affine vis-à-vis du récepteur D-3 que vis-à-vis du récepteur D-2 (cf Tableau 1 et Figure 5). En présence de Gpp(NH)p, un guanylnucléotide, la courbe de déplacement de la dopamine vis-à-vis du récepteur D-2 est transférée à droite (Figure 5 a) indiquant la présence d'une protéine G appropriée Au contraire, la courbe de déplacement de la dopamine vis-à-vis du récepteur D-3 n'est pas modifiée de façon significative en présence de guanylnucléotide (Figure b) Ceci peut correspondre à l'absence d'une protéine G appropriée dans la cellule CHO ainsi que dans les cellules COS-7 Cela peut aussi correspondre à une modulation faible de la liaison de la dopamine par les guanylnucléotides vis-à-vis du récepteur D-3. Parmi les agonistes de la dopamine, l'apomorphine et la bromocriptine montrent des affinités similaires vis-à-vis des deux récepteurs, tandis que TL 99 et le pergolide, considérés comme des agents sélectifs autorécepteurs sélectifs présumés ( 9, 17) et le quinpirole sont beaucoup plus affins vis-à-vis du récepteur D-3 que vis-à-vis du récepteur D-2. La plupart des antagonistes de la dopamine appartenant à des classes chimiques variées et cliniquement utilisés comme neuroleptiques montrent des affinités nanomolaires vis-à-vis des deux récepteurs. Par exemple le halopéridol, le spiperone, la thioproperazine, et la prochlorperazine sont approximativement 10 à 20 fois plus affins vis-àvis du récepteur D-2 que vis-à-vis du récepteur D-3 tandis que le sulpiride (-), la clozapine, la thioridazine, l'amisulpride ou le raclopride sont seulement 2 à 3 fois plus affins vis-à-vis du récepteur D-2 que vis-à- vis du récepteur D-3. Les seuls antagonistes qui présentent des affinités limitées mais significativement plus élevées vis-à-vis du récepteur D-3 que vis-à-vis de D-2, sont UH 232 et AJ 76 (défini ci-après), considérés comme des agents présumés sélectifs des autorécepteurs. 3) Caractérisation des transcripts du gène du récepteur D-3 dans plusieurs tissus (cf Figure 6 a et Figure 6 b): Sur la Figure 6 a, on a représenté l'analyse par transfert des ARN messagers du récepteur D-3 à partir de cerveau de rat Pour ce faire, des AR Ns poly(A)+ sont préparés ( 48, 49) Des échantillons ( 8 pg) sont dénaturés, soumis à électrophorèse sur agarose, transférés sur des membranes de nitrocellulose et hybridés ( 20) en utilisant un fragment sélectif de 422 pb de restriction Bam HI-Ava I marqué au 32 p par la technique de "nick- translation", lequel fragment est situé dans la troisième boucle présumée intracytoplasmique, à 5 x 106 dpm/ml Les membranes sont exposées pendant 6 jours à -80 C avec des écrans amplificateurs Les tailles des marqueurs d'ARN (en kb) sont représentées sur la gauche de la Figure 6 a. On a représenté sur la Figure 6 b, les autoradiogrammes d'électrophorèse sur gel d'agarose de produits d'AD Nc marqués au phosphore 32, générés à partir de poly(A)+ AR Nm par technique PCR après amplification de 25cycles (haut) et amplification de 32 cycles (bas) L'AD Nc monobrin est synthétisé en utilisant llg d'ARN, 20 U de transcriptase réverse AMV et l'amorce 3 (Figure 2) L'AD Nc double brin est synthétisé et amplifié en utilisant 2,5 U de polymérase Taq, l'amorce 3 et un oligonucléotide dérivé des amino acides 300-306 (Figure 2): 5 '-AAGCGCTACTACAGCATCTGC (amorce 5) pour 25 ou 32 cycles ( 92 C, 56 C et 72 C, lmn chacun) Une dose traceuse de ( 32 P) d CTP est incorporée pendant l'amplification et l'ADN est soumis à une électrophorèse dans de l'agarose à 1,5 %. 4) Localisation autoradiographique des sites de liaison iodosulpride 125 I et des AR Nm des récepteurs D-2 ou D-3 dans le cerveau de rat: Cette localisation fait l'objet de la Figure 7. Les sections sagittales (A,B,C) ou coronales (D,E,F) (latéralité O 4 mm, niveau interaural 10 7 mm ( 46)) sont incubées avec soit de l'iodosulpride 125 I (A,D), une sonde à la fois pour les récepteurs D-2 ou D 3, soit avec des sondes d'ARN marquées au phosphore 32 sélectives vis-à-vis de l'AR Nm du récepteur D-2 (B,E) ou vis-à-vis de l'AR Nm du récepteur D-3 (C,F). Les abréviations utilisées sur la Figure 7 sont les suivantes: Acb: nucleus accumbens; Cl: claustrum; Cg: cortex cingule; CM: noyau thalamique médian central; C Pu: caude putamen; Fr: cortex frontal; G: noyau thalamique gélatineux; Hip: formation hippocampale; Icj: ilots de Calleja; ICJM: ilot de Calleja majeur; MM: partie médiane du noyau mammillaire médian; MP: partie postérieure du noyau mammillaire médian; MPA: aire préoptique médiane; OB: bulbe olfactif; PF: noyau thalamique parafasciculaire; Tu: tubercule olfactif; TT: tenia tecta; VTA: aire tegmentale ventrale; VI:couche VI du cortex cérébral. La liaison avec l'iodosulpride 125 I est effectuée sur des sections de cryostat non fixées incubées avec 0,3 n M d'iodosulpride 125 I, rincées et apposées pendant 5 jours sur une pellicule désignée sous le nom 3 H- hyperfilm d'Amersham ( 41) Pour les études d'hybridation in situ, on synthétise des sondes d'ARN monobrin marquées au 32 p en utilisant une trousse commercialisée sous le nom Riboprobe (Promega) avec 32 P-UTP et de l'ARN polymérase T 7 Les matrices ( O long) sont des plasmides recombinants de p GEM-4 Z digérés avec Eco RI contenant un fragment Sac IAfl II du clone du récepteur D-2 ou un fragment Bam HI-Ava I du clone B RT- PCR dans l'orientation appropriée Des sections de cryostat ( 10 m) sont montées sur des plaques, fixées dans du formaldéhyde à 4 %, traitées avec la protéinase K et sont soumises à l'hybridation une nuit à 55 C ( 47) avec des sondes marquées au 32 p à 2 106 dpm dans 5041. Les plaques sont rincées, déshydratées ( 47) et apposées sur des pellicules désignées sous le nom " max hyperfilm" (Amersham) pendant 20 jours à -80 C. ) Effets des lésions induites par la 6-hydroxydopamine sur les transcripts des gènes des récepteurs D-2 et D-3 dans la substance noire: Les rats reçoivent une injection unilatérale de 6-hydroxydopamine ( 8 gg/4 g 1 de solution saline) dans le faisceau médian du télencéphale aux coordonnées A 4,7 mm, L 1,5 mm et H 1,0 mm ( 46) Après 10 jours, les rats présentant des rotations controlatérales suite à une administration de 0, 25 mg/kg d'apomorphine sont choisis On les sacrifie 4 à 7 semaines après la lésion et on prépare l'ARN total de la substance noire individuelle ou de l'aire tegmentale ventrale ( 50) On effectue les expériences de PCR comme décrites à propos des Figures 6 a et 6 b, en utilisant des oligonucléotides dérivés des amino acides 43-51: 5 '- GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA et amino acides 243-253: 5 '- GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT pour la M-actine Pour le récepteur D-2, on utilise des oligonucléotides dérivés des amino acides 195-203: 5 '- TCCGAATTCTCATTCTACGTGCCCTTCATC et des amino acides 355-363: 5 'GCTTTCTGCGGCTCATCGTCTTAA Les amorces 3 et (Figure 6) sont utilisées pour le récepteur D-3. Les produits PCR sont obtenus après 16 cycles (rangées 1 et 4), 23 cycles (rangées 2 et 5) et 27 cycles (rangées 3 et 6) pour la M-actine et après 23 cycles (rangées 1 et 4), 27 cycles (rangées 2 et 5) et cycles (rangées 3 et 6) pour les récepteurs D-2 et D-3 avec la substance noire d'un rat (rangées 1-3: côté lésion; rangées 4-6: côté témoin) L'expérience est répétée 4-7 fois avec des tissus individuels et des expériences parallèles sont conduites avec l'aire tegmentale ventrale On procède aux autoradiogrammes de gel, correspondant à 23 et 30 cycles pour la $-actine et les récepteurs respectivement On calcule le rapport des densités optiques correspondant aux récepteurs et à la 6-actine Les rapports obtenus pour le côté de la lésion sont ensuite comparés aux rapports obtenus pour le côté témoin dans chacun des animaux. BIBLIOGRAPHIE 2 Kebabian, J W et Calne, D B Nature 277, 93-96 ( 1979). 9 Clark, D and White, F J Synapse 1, 347-388 ( 1987). 11 Martres, M P, Bouthenet, M L, Salès, N, Sokoloff, P et Schwartz, J C Science 228, 752-755 ( 1985). 13 Sokoloff, P, Martres, M P et Schwartz J C. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 315, 89-102 ( 1980). 14 Schwartz J C, Delandre, M, Martres, M P, Sokoloff, P, Protais, P, Vasse, M, Costentin, J., Laibe, P, Wermuth, C G, Gulat, C et Lafitte, A In: Catecholamines: Neuropharmacology and central nervous system Theoretical aspects. 59-72 (Alan R Liss Inc New-York, 1984). 17 Wolf, M E and Roth, R H In: Dopamine receptors. vol 8 (eds Creese, I and Fraser, C M) 45-96 (Alan R Liss Inc New-York, 1987). 19 Bunzow, J R, Van Tol, H H M, Grandy, D K, Albert, P, Salon, J, Christie, Mc D, Machida, C.A, Neve, K A, and Civelli, O Nature 336. 783-787 ( 1988). 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REVENDICATIONS 1 Polypeptide variant selon la revendication 1 de la demande de brevet ne 9004476 déposée le 06 avril 1990, ayant une activité de récepteur dopaminergique contenant: la séquence de 446 acides aminés de la Figure 2, ou un fragment de cette séquence, ce fragment étant tel que * soit il contient néanmoins les sites contenus dans cette séquence et dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ce fragment est exposé à la surface d'une cellule, il soit capable de lier la dopamine à ses agonistes ou antagonistes de manière spécifique et mesurable, par exemple au moyen d'un ligand radioactif selon la technique décrite dans Martres et al. ( 1985)( 11), * soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui reconnaissent également la susdite séquence de 446 acides aminés, mais ne reconnaissent ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2, * soit il est susceptible de générer des anticorps reconnaissant la susdite séquence de 446 acides aminés mais ne reconnaissant ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2. 2 Polypeptide selon la revendication 1, dans lequel le fragment (de la séquence de 446 acides aminés de la Figure 2) qui y est contenu est tel qu'il comporte l'acide aminé correspondant à celui en position 139. 3 Polypeptide selon la revendication 1, dont l'affinité des agonistes déterminée par compétition avec le ligand iodosulpride-12 I est décroissante dans l'ordre suivant: quinpirole > apomorphine = dopamine. 4 Polypeptide selon la revendication 1 sont l'affinité des antagonistes déterminée par compétition avec le ligand iodosulpride-1251 est décroissante dans l'ordre suivant: raclopride > UH 232 = halopéridol. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par la séquence, représentée sur la Figure 2, s'étendant de l'extrémité constituée par l'acide aminé en position 1 à celle constituée par l'extrémité en position 446. 6 Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par un enchaînement de nucléotides codant pour les polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7 Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par l'enchaînement de nucléotides représenté sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide 1 à celle constituée par le nucléotide 1863, ou est constitué par l'enchaînement de nucléotides représenté sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide 442 à celle constituée par le nucléotide 1779. 8 Vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmide, cosmide, phage ou virus, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique selon l'une des revendications 6 et 7 en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication. 9 Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'une séquences d'acides aminés selon les revendications 1 à , dans un hôte cellulaire et éventuellement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence signal et une séquence d'ancrage. Hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8 et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucléotidique codant pour le polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5 dans cet hôte. 11 Hôte cellulaire transformé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les bactéries, notamment E coli. 12 Hôte cellulaire transformé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les organismes eucaryotes tels que des cellules CHO ou COS-7. 13 Anticorps caractérisé(s) en ce qu'il(s) est (ou sont) dirigé(s) de façon spécifique contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et en ce qu'il(s) ne reconnaît (ou reconnaissent) ni le récepteur dopaminergique D-1, ni le récepteur dopaminergique D-2 et en particulier celui ou ceux reconnaissant les séquences d'acides aminés suivantes: celle définie par la séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 2 s'étendant de l'extrémité constituée par l'acide aminé en position 135 à celle constituée par l'acide aminé en position 147, 14 Sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle s'hybride avec l'un des acides nucléiques selon les revendications 6 et 7 ou leur séquence complémentaire dans les conditions d'hybridation telles qu'elle ne s'hybride pas avec les gènes ou ARN messager des récepteurs dopaminergiques D-1 ou D-2, et en particulier les sondes choisies parmi les sondes nucléotidiques suivantes: celle définie par la séquence d'acides nucléiques représentée sur la Figure 3, s'étendant de l'extrémité constituée par le nucléotide en position 820, à celle constituée par le nucléotide en position 888, ou sa séquence nucléotidique complémentaire. Procédé de détection de la capacité d'une molécule à se comporter comme ligand vis-à-vis d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par: la mise en contact de la molécule avec un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur lui-même modifié par un insérat codant pour le susdit polypeptide, cet hôte portant à sa surface un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide, le cas échéant après induction de l'expression de cet insérat, cette mise en contact étant effectuée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins de ces sites spécifiques et ladite molécule dès lors qu'elle s'avèrerait effectivement posséder une affinité pour ce polypeptide, la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-polypeptide. 16 Procédé pour l'étude de l'affinité d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour un plusieurs ligands déterminés, caractérisé par: la transformation d'un hôte cellulaire compétent avec un vecteur, notamment un plasmide ou un phage, dans lequel avait auparavant été insérée une séquence de nucléotides ou codant pour le récepteur D-3 (insérat), sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire et permettant l'expression dans l'hôte cellulaire utilisé de ladite séquence de nucléotides, la culture de l'hôte cellulaire transformé dans des conditions permettant l'expression dudit insérat, et le transport du récepteur D-3 exprimé vers la membrane de façon telle qu'il soit exposé à la surface de l'hôte cellulaire transformé, la mise en contact de cet hôte cellulaire avec ces ligands déterminés, la détection d'une réaction affine entre ledit hôte cellulaire transformé et lesdits ligands déterminés. 17 Procédé de diagnostic in vitro de l'expression pathologique du récepteur dopaminergique D-3, dans lequel on utilise l'une ou plusieurs quelconques des sondes définies selon la revendication 14, comprenant les étapes suivantes: l'amplification préalable possible des quantités de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7 susceptible d'être contenue dans un échantillon biologique prélevé sur un patient, au moyen d'amorces d'ADN, la mise en contact de l'échantillon biologique indiqué ci-dessus avec une sonde nucléotidique selon la revendication 11, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé de ladite sonde et ladite séquence nucléotidique, la détection du complexe d'hybridation ci-dessus qui a pu se former. 18 Procédé de diagnostic in vitro d'anomalies génétiques, notamment polymorphismes du gène codant pour le récepteur dopaminergique D-3 chez un individu, susceptibles d'être corrélées à des affections psychiatriques, neurologiques, cardiovasculaires ou neuroendocriniennes, à partir d'un échantillon biologique, tel que le sang, prélevé chez un individu, selon un procédé comprenant les étapes suivants: le traitement de l'acide nucléique issu de l'échantillon biologique sus-mentionné réalisé à l'aide d'une enzyme de restriction dans des conditions permettant l'obtention de fragments de restriction issus du clivage dudit acide nucléique au niveau de ces sites de restriction reconnus par ladite enzyme, la mise en contact d'une sonde nucléotidique selon la revendication 14, susceptible de s'hybrider avec les fragments sus- mentionnés dans des conditions permettant la production éventuelle de complexes d'hybridation entre ladite sonde et les fragments de restriction sus-mentionnés, la détection des susdits complexes d'hybridation, la mesure de taille des éventuels fragments de restriction polymorphes engagés dans les complexes d'hybridation sus-mentionnés. 19 Procédé de diagnostic in vitro de détection de mutations ponctuelles de l'acide nucléique ou d'un fragment de l'acide nucléique codant pour le récepteur dopaminergique D-3 selon les revendications 6 ou 7, chez un individu, comprenant les étapes suivantes: la mise en contact d'une sonde nucléotidique selon la revendication 11, avec un prélèvement biologique, par exemple du sang, dans des conditions permettant le production éventuelle d'un complexe d'hybridation formé entre la sonde et l'acice nucléique ou le fragment d'acide nucléique sus-mentionné, la détection du susdit complexe d'hybridation, le séquençage de l'acide nucléique ou du fragment d'acide nucléique intervenant dans le susdit complexe d'hybridation, la comparaison de la séquence de l'acide nucléique ou du fragment d'acide nucléique intervenant dans le susdit complexe d'hybridation avec la séquence de l'acide nucléique (ne présentant pas de mutation) ou du fragment de l'acide nucléique (ne présentant pas de mutation) du récepteur dopaminergique D-3. Procédé de diagnostic in vitro de l'expression pathologique du récepteur dopaminergique D-3, dans lequel on utilise l'anticorps selon la revendication 10 comprenant les étapes suivantes: la mise en contact d'un anticorps selon la revendication 13 avec le susdit prélèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe immunologique formé entre le récepteur dopaminergique D-3 ou produit qui en a dérivé et l'anticorps de l'invention, la détection du susdit complexe immunologique formé. 21 Médicament contenant comme substance active une substance active sur l'un au moins des polypeptides selon l'une des revendications 1 à 5, ayant une activité de récepteur dopaminergique ou contenant comme substance active des substances actives sur des cellules transfectées par les gènes ou les fragments de gènes codant l'un au moins des polypeptides à activité de récepteur dopaminergique selon l'une des revendications 1 à 5 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 22 Médicament contenant comme substance active une substance active sur les récepteurs dopaminergiques D-1 ou D-2, mais inactive sur les polypeptides à activité de récepteur dopaminergique selon l'une des revendications 1 à 5. 23 Procédé de mesure de l'affinité de ligands vis-à-vis d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, à l'aide d'un ligand marqué par une méthode radioisotopique et sélectif vis-à-vis du susdit polypeptide, comprenant les étapes suivantes: s'il y a lieu, la détermination du susdit ligand sélectif vis-à-vis du susdit polypeptide selon le procédé décrit dans la revendication 16, le marquage du ligand sélectif ainsi déterminé par un procédé radioisotopique, la mise en contact, selon la technique décrite dans Martres et al ( 1985) ( 11), avec des membranes biologiques, notamment de cerveau, contenant le susdit polypeptide avec le ligand sélectif marqué et un ligand dont on veut mesurer l'affinité, la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand sélectif marqué-polypeptide. 24 Procédé de marquage sélectif d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, à l'aide d'un ligand marqué selon une technique radioisotopique, sur des membranes biologiques contenant d'une part le récepteur D-l et/ou D-2 et d'autre part un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant les étapes suivantes: s'il y a lieu, la détermination d'un ligand sélectif vis-à-vis du récepteur D-l et/ou D-2 selon le procédé décrit dans la revendication 16, la mise en contact, selon la technique décrite dans Martres et al ( 1985) ( 11), des susdites membranes biologiques avec le susdit ligand sélectif vis-à-vis du récepteur D-l et/ou D-2 et avec un ligand marqué selon une technique radioisotopique, notamment 1 'iodosulpride-125 i, ce qui conduit au marquage sélectif du susdit polypeptide, le récepteur D-l et/ou D-2 étant occupé par le susdit ligand sélectif, la détection de la formation du complexe du type ligand marqué-polypeptide.