Brevet FR2669643A1 — publié le 19920529

PROCEDE DE SYNTHESE ENZYMATIQUE D'ADIPATE D'AMMONIUM La présente invention concerne un procédé de synthèse enzymatique d'adipate d'ammonium. Plus précisement, l'invention concerne un procédé de synthèse d'adipate d'ammonium par hydrolyse d'adipamide et/ou d'adipamate d'ammonium au moyen d'un catalyseur enzymatique spécifique. On sait que l'adipate d'ammonium est un produit particulièrement intéressant car il peut être transformé en acide adipique, un produit lui-même largement utilisé pour la préparation du Nylon. La synthèse de l'adipate d'ammonium par hydrolyse enzymatique de l'adipamide est déja connue dans son principe. Ainsi, parmi les microorganismes chez lesquels on a pu démontrer l'éxistence de cette activité enzymatique, on peut plus particulirement citer les souches appartenant au genre Brévibactérium, et notamment Brévibactérium R 312 (vair à ce sujet ARNAUD et ai, "Etude de l'activité amidasique de quelques bactéries", in Flian Microbilogica, 1976, 21, page 178-185) En outre, l'éxistence au sein de Brévibactérium d'une amidase dite "à activité générale" directement utilisable pour la bioconversion des amides en sels d'acides, et notamment de l'adipamide en adipate d'ammonium, a également déja été mise en évidence (vair à ce sujet MAESTRACCI et al, in Microbillogie Aliments-Nutrition, 1986, Vol 4, page 19-24). Toutefcis, il s'avère que l'activité enzymatique de Brévibactérium R 312, ou de son amidase à activité générale décrite ci-dessus, est insuffisante pour permettre une production élevée, et donc rentable, en adipate d'ammonium à partir de l'adipamide. L'un des buts poursuivis par la présente invention réside donc dans la mise à disposition d'un procédé de synthèse enzymatique d'adipate d'ammonium présentant des rendements améliorés. Or, il a été trouvé par la demanderesse que ce but pouvait être atteint si l'on faisait appel à des enzymes convenablement sélectionnées, utilisées scot telles quelles sait, de préférence, sous la forme de microorganismes recombinés les générant. Plus précisement, il est maintenant proposé un nouveau procédé de synthèse d'adipate d'ammonium par hydrolyse de l'adipamide et/ou de l'adipamate d'ammonium au moyen d'un polypeptide ayant une activité amidase, ou d'un microorganisme recombiné générant ledit polypeptide, ledit procédé étant caractérisé par le fait que l'on utilise: (i) un polypeptide codé par une séquence d'ADN chacisi parmi: la séquence codant pour l'amidase de Brévibactérium R 312 représentée à la figure 9. un analogue de cette séquence résultant de la dégénérescence du code génétique un ADN hybridant avec l'une de ces séquences ou avec un fragment de celles-ci et codant pour un polypeptide ayant une activité amidase. ou (ii) un microorganisme recombiné générant ledit polypeptide. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise un polypeptide (ou un microorganisme recombiné générant ce polypeptide) codé par la séquence telle que représentée à la figure 14, ou par un variant de cette séquence On entend ici par variant toute séquence qui en dépit de quelques altérations résultant par exemple de mutations, délétions ou insertions, ou bien encore de la dégénérescence du code génétique, préserve les propriétés de la séquence initiale. Comme indiqué ci-après, de telles séquences peuvent être trouvées dans des souches du type Rhodococcus. Selon la présente invention, la séquence d'ADN représentée à la figure 14 est considérée comme hybridant avec la séquence d'ADN représentée à la figure 9. Les polypeptides tels que définis ci-dessus, ainsi que les microorganismes recombinés générant ces polypeptides, qui sont utilisés dans le procédé selon la présente invention, ont déja été décrits dans la demande de brevet française déposée sous le numéro 8916332 au nom de RHONE-POULENC SANTE ils ne font donc pas l'objet, en tant que tels, de la présente invention. D'une manière très générale, cette demande de brevet non encore publiée concerne des polypeptides possédant une activité amidase dite éniantiosélective, les séquences d'ADN permettant leur expression, un procédé pour leur préparation, ainsi que leur utilisation comme catalyseurs pour hydrolyser éniantiosélectivement des racémiques d'amides en un acide soit de forme S, sait de forme R Ces polypeptides, ainsi que le matériel génétique permettant leur expression, ont été globalement obtenus conformément aux exemples qui seront donnés ci-aprés. On notera donc que les procédés d'obtention de tels polypeptides, ou du matériel génétique permettant leur expression, ou des microorganismes recombinés les générant, ne constituent pas l'objet de la présente invention. La présente invention est en fait basée sur la découverte que de tels polypeptides à activité amidase éniantoélective présentent également la propriété remarquable de pouvair hydrolyser l'adipamide et/ou l'adipamate d'ammonium en adipate d'ammonium avec des rendements particulièrement élevés La présente invention a donc pour unique objet une utilisation nouvelle de polypeptides particullers. Bien que la demande de brevet FR 8916332 précitée scit ici totalement incluse à titre de référence, son contenu et ses enseignements seront, pour les besoins du présent exposé, au moins en partie redéveloppés, et notamment au niveau des exemples. Les séquences d'ADN qui codent pour les polypeptides utilisés dans le procédé selon l'invention peuvent être obtenues de diverses façons La stratégie générale consiste à cloner, à l'aide de sondes nucléotidiques élaborées à partir du polypeptide purifié, le fragment d'ADN génomique codant pour le polypeptide recherché A l'aide de différentes méthodes, telles que l'élongation d'amorces, la restriction, l'insertion d'adaptateurs ou la ligature avec des ciligonucléotides de raccord, on construit un insert nucléotidique contenant la séquence d'ADN désirée Celle-ci peut alors être cartographiée et séquencée par les techniques connues. D'autres techniques peuvent être également envisagées, comme l'utilisation d'ADN et/ou de la synthèse chimique partielle ou totale. Ces techniques sont connues et les structures décrites aux figures 9 et 14 permettent à l'homme de métier d'isler une séquence équivalente, dans tout microorganisme, avec les moyens connus en la matière. Les polypeptides, dont la structure se déduit des séquences d'ADN cidessus, et qui possèdent une activité amidase, peuvent être obtenus à partir de différents microorganismes, et notamment de Brévibactéries ou de bactéries du genre Rhodococcus Plus précisemment encore, ces polypeptides sont prépares par extraction et purifica Hon à partir de cultures de microorganismes naturels ou recombinants, la purifi-ation étant réalisée par une succession d'étapes consistant à préparer un extrait enzymatique brut à partir de la culture cellulaire, à fractionner cet extrait au sulfate d'ammonium, et à le purifier par différentes chromatographies et filtrations sur gel Les détails de ces étapes sont donnés dans les exemples. Les palypeptides purifiés peuvent ensuite être séquences, leurs gênes clônés et mis à exprimer dans différents microorganismes recombinés (microorganismes hôtes), selon des techniques courantes de biologie moléculaire (technique des ADN recombinants) Plus précisement, les microorganismes transformés contiennent au mains une cassette d'expression des séquences d'ADN tlles que représentées aux figures 9 et 14, ces cassettes étant de préférence constituées par l'une desdites séquences d'ADN sous la dépendance de séquences d'ADN assurant son expression dans l'hôte considéré I 1 peut s'agir d'une cassette intégrée directement dans le génome de l'hôte, ou d'une cassette insérée dans un plasmide qui comporte, en outre, une origine de replication plasmidique active dans l'hôte et un moyen de sélection. Les séquences d'ADN assurant l'expression des séquences d'ADN susmentionnées comportent de préférence une région d'initiation de la transcription et de la traduction. Selon ce procédé, les régions de démarrage de la transcription et de la traduction contiennent un promoteur et un site de fixation des ribosomes Ces régions peuvent être homologues ou hétérologues du polypeptide produit. Le choix de ces régions dépend notamment de l'hôte utilise En particulier, Iorsqu'il s'agit de microorganismes hôtes procaryotes, le promoteur hétérologue peut être chcisi parmi les promoteurs bactériens forts, tels que le promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp, le promoteur de l'opéron lactose Plac, le promoteur droit du phage lambda PR, le promoteur gauche du phage lambda PL, les promoteurs forts de phages de corynébactéries, ou encore les promoteurs homologues de corynébactéries Plus par-f ilirement, dans le cas du promoteur droit du phage lambda, la forme thermosensible pourra être préférée PRC Its. Dans le cas de microorganismes eucaryotes, telles les levures, les promoteurs peuvent être issus de gènes glycolytiques de levure, tels les gènes codant pour la phosphoglycérate kinase (PGK), la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GPD), la lactase (LAC 4), l'énolase (ENO). Concernant les sites de fixation des ribosomes, celui dérivé du gène CII de lambda ainsi que ceux dérivés de gènes homologues de corynébactéries sont utilisés préférentiellement lorsque le microorganisme hôte est procaryote. Une région permettant une terminaison de la traduction et de la transcription fonctionnelle dans l'hôte envisagé peut être positionnée en 3 ' de la séquence codante Le plasmide comprend également un ou plusieurs marqueurs permettant de sélectionner l'hôte recombinant Les marqueurs préférés sont des marqueurs dominants, c'est-à-dire conférant une résistance à des antibiotiques comme l'ampnilline ou la streptomycine ou à d'autres produits toxiques. Parmi les microorganismes hôtes utilisés, on peut citer notamment les entérobactéries telles que E Coli, les bactéries corynéfrmes -telles que celles appartenant aux genres Corynebactérium, Brevibacterium, ou Rhodococcus. Bien entendu, sur le même principe on peut utiliser d'autres types cellulaires. L'adipate d'ammonium est, selon l'invention, préparé simplement en mettant l'adipamide et/ou l'adipamate d'ammonium (réactifs) en présence d'un polypeptide ou d'un microorganisme recombiné tels que décrits précédemment On opère généralement à température ambiante. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le polypeptide ou le microorganisme recombinant contenant le polypeptide, sont immobilisés sur ou dans un support solide. Les exemples qui suivent permettent d'illustrer les caractéristiques et les avantages de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1: Table décrivant les différentes étapes de la purifica Hnon de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312. a à partir de 40 g de cellule humide, après précipitation au sulfate de streptomycine; b une unité (U) est le nombre 1 lm Aole acide HPPA formé par heure dans les conditions décrites ci-après. Figure 2: a Séquences peptidiques (N-terminale et interne) obtenues à partir de la solution purifiée de Brevibacterium R 312 b Sonde oligonucléo:ique réalisée à partir du fragment interne. Figure 3: a Stratégie d'élaboration de la sonde sq 918, à partir du fr agment N-Terminal b Sonde sq 918 obtenue. Figure 4: a Profil d'hybridation de la sonde sq 918 avec l'ADN génomique total de Brevibacterium R 312 digéré par les enzymes Eco RI, Hindl M, Kpn I, Pstl et Sph I b Pro Eil d'hybridation de la sonde sq 762 avec l'ADN génomique total de Brevibacterium R 312 digéré avec les mêmes enzymes que (a). Figure 5 Cartes de restriction des plasmides p XL 1650 et p XL 1651. Figure 6 Carte de restriction du fragment Pst I de 5,4 kb contenant le gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312. Figure 7: S Ltratégie de séquençage du fragment Bam HI-Pst I contenant le gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312. Figure 8: Analyse des phases ouvertes du fragment séquence. Figure 9: Séquences nuclkidique et peptidique de l'amidase énantio- sélective de Brevibacterium R 312. Figure 10: Carte de restriction du plasmide p XL 1724. Figure 1: Carte de restriction du plasmide p XL 1751. Figure 12: Carte de restriction du plasmide p XL 1752. Figure 13: Gel de polyacrylamide-SDS à 12,5 % après clration au bleu de Coomassie démontrant l'expression de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 à partir des couches coli B et E 103 S Chaque piste correspond à une quantité de prtéine équivalente à 60 p 1 de la culture à une densité optique à 610 nm de 2,1 (E 103 S) et 0,7 (coli B) T), fraction soniquée; S), fraction soluhble; C), fraction insoluble Les plasmides témains (p XL 1029 et p XL 906) contiennent respectivement le gène de l'I Llbéta sous le contrôIe du promoteur PRC Its et Ptrp. Figure 14: Séquences nucloidique et peptidique de l'amidase énantiosélective d'un Rhodococcus. Figure 15 Séquences nucléotidique et peptidique de la région -150-200. Figure 16 et 17: Etudes d'homologies de séquences: recherche du site actif. Figure 18 Vecteurs d'expression dans E coli des séquences Amd présentées aux figures 14 et 15. Figure 19: Résultat d'expression avec la souche E coli E 1035 transformée par le plasmide p XL 1894. Figure 20 et 21: Vecteurs d'expression dans les corynébactéries des séquences Amd présentées aux figures 14 et 15. PLASMIDES DE DEPART Le plasmide p XL 534 dérive de p XL 276 (qui contient Ptrp- RB Scl Il At RI-HSA: brevet européen n 86 400617 6) par délétion à l'aide de l'enzyme Ba 131 à partir du site Eco RV, d'un fragment de 2,1 kb, et ligature sur linker Bam Hl. Le plasmide p XL 820 dérive du plasmide p XL 534 par excision du fragment Eco RI-Ndel portant le Ptrp et le RB Sc II At RI, et insertion d'un fragment Eco RI-Ndel contenant le promoteur PRC Its et le site RBS c Il I t RI Ce dernier est issu du plasmide p RK 248 clts (Bernard et al, Gene 5, 59-76) grâce aux étapes suivantes Excision d'un fragment Bgl I-Bg II de p RK 248 clts contenant P Rclts. Insertion de ce fragment au site Bam HI du plasmide p UCI 9. Linéarisation de p UCI 9 ainsi obtenu, par Cla I, et les extrêmités sont remplies avec l'ADN polymérase de Klenow. Digestion supplémentaire par Smal, et ligature. De cette nouvelle construction est excisé un fragment Eco RI-Sal I contenant P Rc Its, qui est inséré dans p XL 534 ouvert par ces deux enzymes. Le fragment Eco RI-Nde I est ensuite excisé de ce plasmide et il contient P Rc Its-RBS cl I à t RI. EXEMPLE I Identification et purification de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312. 1 1 Identification Le R,S-(hydroxy-4 phénoxy)-2 propionamide, dérivé aryloxy- 2 propionamide, est meilleur substrat de l'amidase énantiosélective que les dérivés aryl-2 propionamides, notamment le phényl-2 propionamide et le (benzoyl-3 phényl)-2 propionamide De plus, la sélectivité de l'amidase vis-à-vis de l'énantiomère R de l'HPP Amide est représentative de la sélectivité vis-à-vis de l'énantiomère S des dérivés aryl-2 propionamide. En conséquence, l'activité enzymatique énantiosélective a été détectée en utilisant comme substrat l'(hydroxy-4 phénoxy)-2 propionamide (HPP Amide) La réaction est conduite à 25 C sous agitation dans un tampon phosphate sodium 50 m M, p H 7,0, en présence de Brevibacterium R 312 et est arrêtée par addition d'un mélange acide phosphorique 0,05 M, acétonitrile et HCI IN 55/40/5 (v/v) La culture est ensuite centrifugée et le surnageant est analysé en CLHP en phase inverse (Hibar-Merck RP-18; 5 pmr) L'élution est effectuée avec une solution 85/15 (v/v) d'acide phosphorique 0,005 et d'acétonitrile et les concentrations respectives de HPP Amide et HPP Acide sont mesurées grâce à la position des pics d'élution et comparativement à un standard L'excès énantiomérique, défini comme le rapport (R-S)/(R+S) x 100 dans lequel R et S sont respectivement des concentrations en énantiomère R et S de l'HPP Acide, se déduit soit de mesures polarimétriques (utilisant l'absorption à 589 nm du sodium) soit de l'analyse CLHP sur colone chirale. Les activités obtenues avec les cellules entières et un extrait soluble sont respectivement de 15 U/mg et 24 U/mg de protéine (IU = lpmole d'HPP Acide formée par heure) L'excès énantiomérique de I'HPP Acide R formé est de 95 % Ces résultats montrent que Brevibacterium R 312 possède une activité amidase énantiosélective capable d'hydrolyser les aryl-2 propionamides racémiques en acides S correspondants Cela a été vérifié avec les hydrolyses du phényl-2 propionamide racémique, et du (benzoyl-3 phényl)-2 propionamide racémique qui donnent respectivement les acides S correspondants avec des excès énantiomériques supérieurs 93 %. 1.2 Purification La purification est réalisée à 4 C. Les cellules ( 40 g poids sec de Brevibacterium R 312) sont décongelées et reprises dans 300 ml de tampon A (Phosphate de sodium m M, p H 7, JP -mercaptoéthanoi 5 m M) Les cellules sont ensuite cassées par ultrasons et les débris membranaires sont éliminés par centrifugation à 20000 g pendant 30 minutes 25 ml d'une solution de sulfate de streptomycine 10 % sont ajoutés lentement sous agitation à mi de surnageant Après 45 minutes, la solution est clarifiée comme ci-dessus et le surnageant est traité au sulfate d'ammonium La frac- tion protéique précipitant entre 30,8 % et 56,6 % de saturation au sulfa- te d'ammonium est récupérée par centrifugation et dissoute dans 35 ml du tampon A, avant d'être dialysée plus longuement contre ce même -tampon La solution ainsi obtenue est alors ajustée à 20 % de la satu- ration en sulfate d'ammonium, de nouveau centrifugée et appliquée sur une colonne phényl-Sépharose CL-4 B (Pharmacia) équilibrée avec du tampon A à 20 % de la saturation en sulfate d'ammonium Les fractions protéiques contenant l'activité enzymatique sont ensuite éluées avec le même tampon, puis concentrées par ultrafiltration avec une cellule AMICON DIAFLO PM 10 jusqu'à un volume de 18 ml Du glycérol 10 % est ensuite ajouté à la fraction concentrée et la solution obtenue est chargée sur une colonne Ultrogel Acl 44 (IBF-biotechnics France) préalablement équilibrée en Tris-HCI 50 m M, p H 7,0, Na CI 100 m M. Les fractions protéiques contenant la plus grande activité spécifique (environ 32 % de l'activité totale chargée sur la colonne) sont collec- tées, concentrées et soumises à une étape de filtration supplémentaire sur le même gel De la même façon, les fractions présentant la plus grande activité spécifique (environ 30 % des protéines appliquées sur la colonne) ont été analysées en SDS-PAGE et stockées L'énantiosélectivi- té de la protéine ainsi purifiée a également été déterminée. Ces étapes de purification ont permis d'obtenir une enzyme pure à plus de 80 % avec une activité spécifique de 815 U/mg A ce stade, une bande majoritaire d'un poids moléculaire apparent de 59 + 5 KD, correspondant à au moins 80 % des protéines totales, est visible en SDS- PAGE De plus, l'activité amidase éluée de l'Ultrogel Ac A 44 correspond également à un poids moléculaire de 63 + 5 KD, indiquant que l'enzyme se présente apparemment sous forme mnonomérique. Exemple 2 Clonage de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 2.1 Obtention de séquences protéiques Les séquences peptidiques correspondant respectivement à l'extrémité N-terminale ( 27 résidus) et à un fragment trypsique interne ( 21 résidus) de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 ont été déterminées à partir de l'enzyme ainsi purifiée. Pour cela, 3 nmol de la préparation d'amidase ont été réduites et carboxyméthylées Le composé protéique majoritaire est ensuite déssalé, et purifié jusqu'à homogénéité par chromatographie CLHP en phase inverse La séquence N-terminale est ensuite déterminée selon la méthode de dégradation séquentielle automatique d'Edman, en utilisant un appareil "Applied Biosystems Model 470 A" De cette maniè- re, la séquence présentée figure 2 a est obtenue Afin d'obtenir une séquence supplémentaire interne, la même quantité de protéine est soumise à une digestion trypsique Les fragments réduits et carbo- xyméthylés sont ensuite séparés par chromatographie CLHP en phase inverse ( 2,1 xl Omm; débit: 0,2 ml/min), en utilisant le tampon d'élution suivant: gradient de O à 50 % d'acétonitrile dans 0,07 % d'acide tri- fluoroacétique Un peptide élué dans un pic bien séparé (à 40,8 % d'acétonitrile) est séquencé (Figure 2 a). 2.2 Elaboration des sondes nucléotidiques Deux types de stratégies ont été poursuivies pour la construction des sondes nucléotidiques. Dans la première stratégie, une sonde 29-mer ( 59 % d'ho- mologie minimale) a été construite, tenant compte de l'usage des codons dans l'opéron tryptophane de Brevibacterium lactofermentum (séquence de 7,7 kb contenant 6 cistrons: Matsui et al Mol Gen. Genet 209 p 299, 1987) et d'après la séquence IDGALGSYDV du frag- ment interne (présentant une dégénérescence moyenne moins impor- tante) Le brin non-codant a été synthétisé en considérant la relative neutralité thermodynamique d'appariements G = T et en introduisant quelques dégénérescences pour maximiser la fréquence théorique moyen- ne des codons considérés ( 88 % par rapport à l'usage des codons choisis). Les considérations conduisent à porter le GC % de la sonde à environ 69 % La sonde obtenue-(sq 762) est donnée à la figure 2 b. Dans un deuxième type de stratégie, on a mis en oeuvre la méthode PCR décrite par Girgès et ai (Nucleic Acids Res 16, p.10371, 1988) pour obtenir une sonde nucléotidique exacte à partir d'un peptide correspondant à des codons hautement dégénérés Pour cela, des oligonucléotides synthétiques 25-mer (voir séquence soulignée sur la figure 3) correspondant à toutes les possibilités de clonage des cinq premiers ou cinq derniers codons de la séquence peptidique N-ter- minale et comportant des sites de restriction à leurs extrémités 5 ' (respectivement Eco RI et Hindll) ont été utilisés pour amorcer une amplification enzymatique de I'ADN génomique de Brevibacterium R 312. Après 30 cycles d'amplification le fragment candidat est purifié sur gel puis inséré entre les sites Hind III et Eco RI du bactériophage M 13 mp 19. Un certain nombre de clones, obtenus après clonage du fragment obtenu à deux températures différentes d'hybridation des amorces ( 45 C et 48 C), ont ensuite été séquences et comparés Les résultats sont indi- qués sur la figure 3 Cette figure montre que, à part les dégénérescen- ces introduites par les amorces, on a bien amplifié un fragment d'ADN (unique entre les amorces) codant pour l'extrémité N-terminale de l'amidase Un oligonucléotide synthétique 40-mer correspondant à ce fragment interne a donc été utilisé pour la suite du clonage, comme sonde exacte de l'extrémité N-terminale de l'amidase La séquence de ce fragment sq 918 est indiquée figure 3. Les deux sondes ainsi obtenues ont été marquées au 32 p selon la méthode de phosphorylation en 5 '. 2.3 Clonage du gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 La stratégie suivie a consisté tout d'abord à vérifier la spécificité des sondes synthétisées et à déterminer la nature du frag- ment d'ADN génomique à cloner par Southern Blot Brièvement, de l'ADN génomique de Brevibacterium R 312 a été digéré alternativement par plusieurs enzymes de restriction correspondant à des sites utilisa- bles pour le clonage, en particulier, à des sites présents dans le multi- site de clonage des plasmides de la série p UC Notamment, l'enzyme Pstl a été utilisé Aprè' électrophorèse sur gel d'agarose et transfert sur membrane de nylon, les diverses digestions ont été hydridées aux sondes sq 762 et sq 918 Les résultats présentés figure 4 montrent que les deux sondes sont caractérisées par une spécificité suffisante dans des conditions d'hybridation (au plus un fragment hydridant pour chaque digestion) De plus, dans la mesure o les deux sondes permettent d'obtenir à peu près le même profil d'hybridation, on peut penser que les signaux d'hybridation sont bien spécifiques du gène recherché, et que le peptide interne obtenu après hydrolyse trypsique est très proche de l'extrémité N-terminale Les empreintes d'hybridation montrent en particulier l'existence d'un fragment unique Pst I de 5,4 kpb environ qui hybride très fortement avec les deux sondes Il a alors été décidé de cloner ce fragment Pour cela, tous les fragments de taille comprise entre 4,6 et 5 kpb et 6 à 6,5 kpb environ, résultant d'une digestion génomique totale de Brevibacterium R 312 par Pstl ont été purifiés sur agarose, électroélués, puis ligaturés au vecteur p CUI 9, préalablement digéré par Pst I Après transformation dans la souche d'DH 5 500 colonies blanches, correspondant théoriquement à des microorganis- mes recombinants, ont été obtenus sur milieu X-gal Ces colonies ont été repiquées individuellement, transférées sur membrane de nylon, puis analysées par hydridation avec la sonde sp 918 marquée au 32 p Deux clones ont ainsi été repérés comme hybridant très fortement avec la sonde, et ont été isolés et retenus pour la poursuite du clonage. Les deux plasmides recombinants p XL 1650 et p X L 165 l isolés à partir de ces deux clones ont été analysés par diverses métho- des: cartographie de restriction, séquençage partiel en utilisant les sondes comme amorce de séquençage et Southern Blot Les résultats présentés à la figure 5 montrent que les deux plasmides contiennent le même insert Pst I de 5,4 kpb environ, dans les deux orientations La figure 6 présente une carte de restriction de ce fragment Ces deux plasmides contiennent bien les séquences codant pour les peptides caractérisés, le fragment trypsique jouxtant l'extrémité N-terminale (figure 9) De plus, ces résultats montrent que le gène codant pour l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 est localisé sur un fragment Bam HI-Pst I de 2,4 kpb environ, et orienté dans le sens Bam HI vers Pstl Etant donné la position de l'extrêmité 5 ' de la séquence codante et sachant que l'enzyme est codée par, au maximum, 2 kpb (monomère de 57-63 KD suivant les estimations), il était donc certain que le gène entier était contenu dans le fragment Bam HI-Pst I que l'on a donc entrepris de séquencer. Exemple 3 Séquence du fragment Bam HI-Pstl contenant le gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 La stratégie de séquençage du fragment Bam HI-Pst I est indiquée sur la figure 7 Les diverses séquencesont toutes été obtenues par la méthode de terminaison de chaînes (Kit séquenase en présence de 7-deaza d GTP; ( 535)d ATP) soit sur des matrices simple brin de M 13 recombinant portant des sous-fragments, soit directement sur le plasmi- de p XL 1650 Plusieurs amorces spécifiques ont également été synthéti- sées dans ce but le GC% moyen de la séquence obtenue est de 61,5 %. Une analyse des phases ouvertes obtenues est présentée sur la figure 8. Cette figure montre que la phase ouverte correspondant au N-terminal de l'amidase code pour 521 acides aminés correspondant à un poids moléculaire de 54671 On constate sur cette phase ouverte que le GC% est respectivement de 65,8, 52,5 et 70 % pour la première, deuxième et troisième position de codons, ce qui est une répartition caractéristique dans les séquences codantes de microorganismes riches en GC La séquence complète du fragment Bam HI-Pstl est donnée à la figure 9. Exemple 4 Expression du gène de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 dans E coli 4.1 Construction des plasmides Plusieurs constructions ont été réalisées dans lesquelles le gène structural de l'amidase, contenant un site de fixation des riboso- mes homologue ou dérivé du gène CII du phase lambda, est placé sous contrôle de son propre promoteur, du promoteur de l'opéron tryptopha- ne ou du promoteur droit du phage lambda thermosensible Le plasmide p XL 1650 (figure 5) a été obtenu par insertion dans l'unique site Pstl du plasmide p UCI 9, du fragment de 5,4 kpb résultant de la digestion par Pst I de 1 'ADN génomique total de Brevibacterium R 312 Ce plasmide contient donc le promoteur de l'opéron lactose Plac, suivi du site de fixation des ribosomes et du gène structural de l'amidase énantiosélec- tive de Brevibacterium R 312, ainsi qu'un gène de résistance à l'ampi- cilline. Le plasmide p XL 1724 (figure 10) a été obtenu en insérant dans un vecteur contenant le promoteur de l'opéron tryptophane, le fragment Bam HI-Pstl de 2,26 kpb, excisé par traitement à l'enzyme Bam HI du fragment de 5,4 kpb Ce fragment contient le gène complet de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312, précédé des 58 paires de bases en amont du codon ATG, portant le site de fixation des ribosomes. Deux autres constructions ont été réalisées dans lesquelles le gène structural de l'amidase énantiosélective de Brevibacterium R 312 est placé sous le contrôle de promoteurs hétérologues et de sites de fixation des ribosomes hétérologues. Ces plasmides (p XLI 751 et p XL 1752) ont été obtenus de la manière suivante: Le plasmide p XL 1724 a été mutagénisé par PCR de maniè- re à introduire, à la place du codon ATG situé en amont du gène structural de l'amidase, un site de coupure Ndel: CATATG L'amplifi- cation a été réalisée en utilisant une amorce correspondant au site de coupure Ndel hybridant avec le codon d'initiation ATG et une amorce correspondant au site de coupure Xho I situé quelques paires de bases en aval du codon ATG Le fragment amplifié a ensuite été excisé par coupure avec les deux enzymes Nde I et Xhol. Utilisation du promoteur Ptrp: Un fragment Eco RI-Nde I contenant le promoteur Ptrp et le site de fixation des ribosomes du gène CII de lambda, ne contenant pas la séquence de terminaison t R 1 et la région 5 ' du gène structural de l'amidase a été inséré dans le plasmide p XL 1724 ouvert par Eco RI et Xho I, pour générer le plasmide p XLI 751 (figure 11 >. Utilisation du promoteur PRC Its: La même stratégie a été employée en utilisant cette fois le fragment Eco RI-Nde I du plasmide p XL 820 contenant le promoteur PRC Its et le site de fixation des ribosomes du gène CII de lambda ne contenant pas la séquence t Rl Le plasmide p XLI 752 a ainsi été obtenu (figure 12). 4.2 Expression de l'amidase de Brevibacterium R 312 dans coli B et El 035 Les plasmides p XL 1751 et p XL 1752 ont été utilisés pour transfrmer les souches de co Uli B et E 103 S respectivement selon la méthode du chlorure de calcium La sélection des microorganismes recombinants se fait sur milieu ampicilline. L'expression de l'amidase énaniosélective de Brevibacteium R 312 a été mesurée après sonication des celllbes en gel SDS-PAGE, dans la fraction brute ou, après centrifugation, dans le culot et dans le surnageant Les résultats sont présentés à la figure 13 et montrent un niveau élevé d'expression de l'amidase qui représente jusqu'à 20 % des protéines totales. EXEMPLE 5: Purification de l'amidase énantiosélective d'un Rhodo- coccus. I Dosage de l'activité enzymatique La fraction contenant l'activité est incubée durant 30 min à 30 C dans 500 pi de tampon Tris/H Cl 0 1 p H 7 5 contenant 5 m M DTT et 18 1 m M phényl-2-propionamide Apres incubation, 2 ml de mélange acétonitrile/H Cl 1 N ( 90/10) puis 2 ml de mélange H 3 PO 4 50 m M/CH 3 CN ( 75/25) sont ajoutés au mélange d'incubation Apres centrifugation à 5000 g durant 10 min, une aliquote du surnageant est injectée en CHLP pour doser les produits de la réaction. Colonne: Nucléosil 5-C 18 25 cm Eluant: H 3 PO 4 50 m M/CH 3 CN ( 75/25) Injection: 10 pl Débit: 1 ml/min L'unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour hydrolyser 1 li mole de phényl-2-propionamide par h. Il Protocole de puirifitaion 1 Préparation de l'extrait enzymatique 7 g de cellules sont suspendues dans 15 ml de tampon Tris/HCI 0 1 M p H 7 5-5 m M DTT et cassées par sonication pendant 15 min à 4 C. L'extrait enzymatique brut est récupéré par centrifugation 1 h à 50000 g. 2 Première chromatographie d'échange d'ions A cet extrait brut ( 20 ml) sont ajoutés 20 ml de tampon A: Tzis/H Cl 25 m M p H 7 5-5 m M DTT L'échant Mbon est injecté à un débit de 3 ml/min sur une colonne Mono Q HR 10/10 (Pharmacia) équilibhrée dans le tampon A Apres lavage de la colonne, les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de KC 1 ( O à 1 M) développé en 1 h à 3 ml/min. Des fractions de 6 ml sont recueillie L'amidase est éluée sur 18 ml avec 0 3 M de KC 1 environ. 3 Seconde chromatographie d'échange d'ions Les fractions contenant l'activité sont rassemblées et concentrées à 2 ml à l'aide d'un module d'liltrafi 141 fyrion Centriprep (Amicon) Après dilution avec 6 ml de tampon A, 4 ml de cet échantillon sont injectés à 1 ml/min sur une colonne Mono Q HR 5/5 équilibrée dans le tampon A. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de KC 1 ( O à 0 5 M) dans le tampon A Les fractions sont regroupées, l'échantillon est amené à 15 % de glycérnl (vol/vol) et est finalement concentré à 1 mli comme ci- dessus. 4 Chromatographie hydrophobe 1 ml de tampon Tris/H Cl 0 1 M p H 7 5-0 5 m M DTT-1 7 M (NH 4)2504 (tampon B) est ajouté à l'échantillon qui est ensuite injecté (en deux fais) sur une colonne de phényl-Superose HR 5/5 (Pharmacia) à un débit de 0 25 ml/min Les protéines sont éluées à 0 5 ml/min avec un gradient linéaire croissant de NH 42 SO 4 ( 1 7 M à O M) sur 25 ml. Des fractions de 0 5 ml sont cllectées La fraction active est amenée à % de glycérol puis diluée avec 1 ml de tampon A. Chromatographie sur hydroxyapatite L'échantillon est injecbté à 0 5 ml/min sur une colonne Bio-Gel HPHT (Bio-Rad) équilibrée dans le tampon Tris/C Hl 85 m M p H 7 5-0 5 m M DTT-10 li M Ca C 12-15 % glycérol (tampon C) L'amidase est éluée à un débit de 0 5 ml/min avec un gradient linéaire de O à 100 % de tampon phosphate de potassium 0 35 M p H 7 5-0 5 m M DTT-10 p M Ca C 12-15 % glycérol dans le tampon C en 20 min. Ces différentes étapes permettent d'obtenir une enzyme purifiée à homogénéité avec une activité spécifique de 988 U/mg de protéine. Comme celle de Brévibactium R 312, l'enzyme ainsi obtenue se comporte comme un dimère de sous-unités identiques d'un poids moléculaire apparent de 53 KD +/ 2 KD. EXEMPLE 6 Clonage du gène de l'amidase obtenue à l'exemple 5 Après une nouve 11 e étape de purification sur TSK-G 3000 SW, l'enzyme a fait l'objet d'un travail de séquençage L'extrémité N-terminale étant inaccessibl à la chimie d'Edman, une hydrolyse totale à la trypsine a été effectuée et trais fractions HPLC de l'hydrolysat: 123, 124, et 162 ont donné des peptides permettant d'obtenir une séquence non ambig Uie A partir de ces données, trais sondes nucléotidiques 32-mer, correspondant aux mélanges de 8 à 16 oligonucléotides et contenant chacune 7 inosines dans les positions au mains 3 fcas dégénérées, ont été synthétisées SONDE A (peptide 123) AT VD V P V P D YA ' 3 ' GCIACIGTIGATGTICCIGTICCIGATTATGC C C C SONDE B (peptide 124) E A G E L V P A T D Y ' 3 ' GAAGCIGGIGAACTIGTICCIGCIACIGATTA G GT C *SONDE C (peptide 162) ' 3 ' CAAGATATIGATGTICTIATIGCICCIACIGT G C C T L'fffncarité de ces sondes, marquées en 5 ' au 32 p, a ensuite été testée par transfert de Southern sur de l'ADN génomique de Rhodococcus préalablement digéré par l'une des enzymes de restriction suivantes: Ssti, Sph I, Sma I, Pst I, Kpn I, Ecor I, Sal I et Bam HI Les conditions expérimentales étaient les suivantes: tampon d'hybridation: x SSC, 5 x Denhardt, 0,1 % SDS, 50 m M Na PO 4 p H 6,5, 250)lg/ml ss DNA; températures d'hybridation: 50 ou 55 C ( 2 expériences); conditions de lavages: 1 h, 6 x SSC, Température ambiante et 5 min en 2 x SSC, 0,1 % SDS à 50 C. Dans ces conditions, la sonde A nous a permis d'obtenir des signaux importants et sans ambiguité; en particulir, dans le cas des digestions par Bam HI, Kpn I, Sp HI, Sstl, Sma I, Sali et Pst I, une seule bande génomique a été trouvée hybridant fortement à A correspondant au fragment génomique Pst I de 3,2 kb. Les fragments de 3 à 4 kb d'une digestion Pst I de l'ADN génomique ont été purifiés par électrophorèse préparative sur agarose et électroélution, puis ligaturés au plasmide p UC 19, lui-même digéré par Pstl Apres transformation dans la souche DH 5, 600 clones blancs sur LB Amp X-gal ont été repiqués individuellement et sondés par hybridation sur colonie avec la sonde A, dans des conditions de stringence semblhables à celles utilisées en Southern Neuf clones ayant donné des signaux d'hybridation particulièrement forts ont ensuite fait l'objet d'une analyse par restriction de l'ADN plamidique Parmi six de ces clones ayant manifestement inséré le même fragment de _ 3,2 kb dans les deux orientations, deux clones représentant chacune les deux orientations (p XL 1835 et p XL 1836) ont été analysés plus en détail (carte détaillée, analyse par Southern), confirmant ainsi que le fragment recherché avait bien été obtenu. EXEMPLE 7 Séquence du fragment Pst I de 3,2 kb. La séquence nucléotidique complète du fragment Pstl de 3,2 kb a été déterminée sur les deux brins (voir figure 14) Le pourcentage en G + C de ce fragment s'élève à 62,4 %, sait du même ordre que le pourcentage observé chez R 312 (t 62 %) L'analyse de la séquence obtenue a permis de caractériser une phase ouverte de 1386 nucléotides (position 210 à 1595) codant pour un polypeptide de 462 résidus (mr 48554) contenant les 3 séquences peptidiques obtenues par séquençage de fragments trypsiques. Cette phase ouverte représente le gène structural de l'amidase énantiosàlective recherchée. EXEMPLE 8 Homlogies entre différentes amidases: Idenfiation d'une séquence caractéristique de l'activité amidase. Nous avons tout d'abord comparé les séquences peptidliques des amidases énantiosélectves de R 312 et de celle présentée sur la figure 14. La figure 16 montre que les deux protéines sont particulièrement homologues ( 50 % d'identité stricte) dans le deuxième tiers de la séquence, entre les résidus 150 et 300 de R 312 et 67 % dans la zone 158-215. Nous avons par ailleurs effectué une recherche dans la banque GENPRO de séquences homologues Cette recherche fait apparaître des homologies importantes dans la région 150-200, avec les séquences de l'acétamidase de Aspergillus nidulans, de l'indolacétamide hydrclase de Pseudomonas syringae et de Bradyrhizobium japonicum, de la protéine tms 2 de Agrobactérium tumefaciens, et des 6-amino hexanoate cyclâr dimerhydrobases (ACDH) de Elavobactérium sp K 172 et Pseudomonas sp NK 87 (voir en particulier la figure 17). L'homologie du peptide 137-193 de l'amidase décrite dans la présente demande avec les sites respectifs de ces autres enzymes (en % d'identité stricte des acides aminés) est donnée dans le tableau suivant AMIDASE % HOMOLOGIE R 312 65,5 IAH A tumefaciens 64,3 IAH P syringae 61,8 ACDH (F ou P) 61,4 IAH B japonicum 54,4 Acetamidase (A nidulans) 47,4 Cette région, fortement conservée, est vraisemblahlement responsable de l'activité de ces enzymes. EXEMPLE 9 Expresssion de l'amidase énantiosélective dans E Ccili Afin de confirmer l'identification de la phase codante pour une amidase énantiosélective, un site Ndel (CATATG) a été créé par PCR au niveau de l'ATG présomptif en 210 (figure 14) et le fragment compris entre ce site et le site Sal I (position 1683), contenant uniquement la partie codante pour l'amidase, a été placé sous le contr Ole de signaux efficaces de démarrage de la transcription (promoteurs Ptrp ou PR) et dela traduction (RBS c Il) chez E Coli Les vecteurs ainsi obtenus: p XL 1893 (Ptrp) et p XL 1894 (PR-c It S) sont semblables aux vecteurs p XL 1752 et p XL 1751 décrits précédemment, exprimant l'amidase de R 312. La structure générale de ces vecteurs d'expression est rappelée sur la figure 18 L'expression à partir des plasmides p XL 1893 et p XL 1894 a été étudiée respectivement dans les souches E Coli B et K 12 E 1035 Les résultats obtenus dans le cas de p XL 1894 sont représentés sur la figure 19 Une protéine co-migrant avec l'amidase purifiée est spécifiquement produite à 42 C, en présence du plasmide p XL 1894. EXEMPLE 10 Expression de l'amidase chez les corynébactéries. A) Construction des vecteurs d'expression Ces vecteurs sont élaborés à partir de vecteurs réplicatifs chez les corynébactéries, et comprennent un réplicon d'E Coli un réplicon de corynébactérie un marqueur de sélection, et une séquence Amd. Vecteur p SV 73 (figure 20): Ce plasmide dérive du vecteur p SR 1 de C glutamicum (Yoshihama et co Ull J Bactericl 162, 591 ( 1985)) par insertion d'un fragment du plasmide p UC 8 contenant un réplicon d'E. Coli et du gène de résistance à la kanamycine provenant du transposon Tn 903. Ce plasmide a été utilisé pour construire différents vecteurs d'expression des séquences Amd données aux figures 14 et 15. Notamment: Vecteurs p YG 811 A et B (figure 21): Ces vecteurs dérivent du vecteur p SV 73 par clonage au site Sal I, dans les deux orientations, de la séquence Amd donnée à la figure 14. Vecteurs p YG 817 A et B (figure 21): Ces vecteurs dérivent du vecteur p SV 73 par clonage au site Bgl JI, dans les deux ozientations, de la séquence Amd donnée à la figure 14. Vecteur p YG 822 (figure 20): Ce vecteur dérive de p SV 73 par clonage aux sites Sal I-Bgln d'une cassette d'expression contenant la séquence Amd de la figure 14 et le promoteur Ptrp du bactériophage lambda. D'autres plasmides cryptiques de corynébactérie peuvent également être utilisés pour construire des vecteurs d'expression de séquences Amd dans les corynébactéries Notamment le Plasmide p X 18 is Lé chez B. lactcfermentum (Yoshihama et ca Ull précitée) a permis la construction du vecteur navette p YG 820 A dont la carte de restriction est donnée sur la figure 20. B) Transformation des corynébactéries Toutes les techniques connues de l'homme de l'art peuvent être utilisées, et notamment, la technique de protplstiqa Hon-régénération décrite par Yoshihama et cil précitée Cependant, la demanderesse a montré que la technique d'électroporation est très avantageuse, puisqu'elle permet d'augmenter jusqu'à 1000 fais la fréquence de transformation. L'analyse en polyacrylamide SDS des surnageants de cultures soniquées et centrifugées indique la présence de transformants. EXEMPLE 11 Catalyse enzymatique Cet exemple illustre l'utilisation selon l'invention des polypeptides ou des microorganismes recombinés préparés aux exemples précédents, pour synthétiser de l'adipate d'ammonium par hydrolyse de l'adipamide ou de l'adipamate d'ammonium. A) Milieux de culture des souches ulisées 1 pour les souches naturelles Mleu 1: pour Brévibactérium R 312 glucose 1 Og/l (NH 4)2 SO 4 5 g/1 À KH 2 PO 4 1,01 lg/1 Na 2 HP 04, 12 H 20 1,64 g/1 M-ieu 2: À K 2 HPO 4 Ca C 12, 2 H 20 Zn C 12 Fe SO 4, 7 H 20 Mn SO 4, H 20 Mg 504, 7 H 20 chlorhydrate de tiamine À eau disellée pour Rhodococcus Glycr Cil À Yeast Extract (Difoo) À Beef Extract (Difco) K 2 HP 04 Mg SO 4, 7 H 20 À Fe 504, 7 H 20 Mn 504, H 20 Na Cl Slution minérale * À Na O H isobutyronirile q 0,82 g/1 0,012 g/1 0,0012 g/1 0, 0012 g/1 0,0012 g/1 0,5 g/1 0,002 g/1 g/1 Ig/1 1 g/1 2 g/1 0,5 g/1 mg/1 mg/1 1 Omg/1 1 Omg/1 s.p p H 7,2 g/i * So Uion minérale - Ca C 12, 2 H 20 Na 2 Mo O 4, 2 H 20 Zn 504, 7 H 20 Cu 504, 5 H 20 Co C 12, 4 H 20 H 2 B 03 KI HC 1 10 % 2 Pour les souches recombinantes Mieu 3: Na Cl Bacto-tryptone Extrait de levure mg/1 mg/1 4 mg/1 0,4 mg/1 0, 4 mg/1 mg/1 1 Omg/1 1 Omg/1 g/1 1 Og/1 g/1 Isobutyronitrile Kanamycine Na Cl Bacto-tryptone Extrait de levure Isobutyronitrile Isobutyramide Kanamycine Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Na Cl NH 4 C 1 chlorhydrate de thiamine glucose Mg 504 Ca C 12 Ampiccilline 7 g/1 3 g/1 0,5 g/i 1 g/1 0,01 g/1 4 g/1 lm M 0,1 m M )lg/ml milieu 5 thrytophane mg/1 B) Préparation des culots cellulaires Les cultures des différentes souches sont réalisées en erlens de 2 litres, rempli avec 600 ml de milieu, à 30 C sur table d'agitation ( 150 tr/mn) En fin de culture, les cellules sont récoltées, lavées avec du serum physiologique, réparties en tube Eppendorf et conservées à -18 C jusqu'à utilisation Les milieux et carac isques des cultures des différentes souches testées sont données au tableau I ci-après. C) Mesure de l'activité amidase Le protocole est le suivant: Mlieu 4: g/l 1 g/1 lieu 5: g/1 1 Og/1 g/1 2,5 g/1 2,5 g/1 mg/1 Milieu 6: Dans un flacon muni d'un agitateur, sont introduits l'adipamide ou l'adipamate d'ammonium, la suspension celllaire et le tampon phosphate de potassium 50 m M p H 7,0. Le flacon bouché est placé dans un cri-tal 11 iir thermostats à 25 C sous agitation pendant toute la durée de la réaction. Le mélenge réactionnel est ensuite dilué avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N. Les bactéries et débris cemllulaires sont éliminés par centrifu- gation suivie d'une filtration ( 0,45 im). La composition en acide adipique, adipamide et/ou acide adipamique est déterminée en CLHP. Les résultats obtenus ainsi que les charges utilisées sont donnés dans le tableau Il ci-après. Dans ce tabhleau: E = cellule entière S = cellule soniquée IBN = isobutyronitile IB Am = isobutyramide NMA= N méthylacétamide Thp = Tryptophane néant TABLEAU I Milieux et caractéristiques des cultures des différentes souches testées. Souche milieu DO Extrait sec Proteine 660 g/1 g/l Brévibacterium R 312 1 2,1 1,5 0, 35 E coli (p XL 906) 5 2,3 1,1 0,49 E coli (p XL 1751) 5 1,5 0,8 0,4 E coli (p XL 1751) 6 2,7 1,4 0,4 Rhodococcus 2 3,1 1,1 0,27 Brévibacterium R 312 (p SV 73) 3 2,5 2,1 0,32 Brévibacterium R 312 (p YG 811 A)3 3,2 2,5 0,5 Brévibacterium R 312 (p YG 811 B)3 2 1,3 0,27 Brévibacterium Lactofermentum (p SV 73) 4 3,1 2,0 0,30 Brévibacterium Lactofermentum (p YG 822) 4 3,1 1,9 0,29 L 1 K) m m (D m jII CA TABLEAU II Charges, conditions réactionnelles et résultats de la mesure de l'activité amidase sur adipamide et adipamate MICROORGANISME SUBSTRAT CELLULES VOLUME DUREE ACTIVITE mg de proteine (ml) (h) (pmole/h/mg de proteine) nature Effecteur Etat nature pmole Brevibacterium R 312 NMA E Adipamide 100 0,3 5 15 0,6 idem idem S idem 100 1,6 5 15 2,6 idem idem E Adipamate 100 0,3 5 15 O idem idem S idem 100 1,6 5 15 1,1 E Coli (p XL 906) E Adipamide 100 1,6 5 15 O idem S idem 100 1,6 5 15 O idem E Adipamate 100 1,6 5 15 O idem S idem 100 1,6 5 15 O E Coli (p XL 1751) Thp E Adipamide 90 1,6 5 15 1,5 idem idem S idem 95 1,6 5 15 2,2 idem idem E Adipamate 105 1,6 5 15 0,3 idem idem S idem 105 1,6 5 15 0,6 E Coli (p XL 1751) E Adipamide 95 1,6 5 15 9 idem S idem 85 1,6 5 15 > 2,6 idem E Adipamate 95 1,6 5 15 2 idem S idem 95 1,6 5 15 1,9 Rhodococcus IBN E Adipamide 500 19 25 3 8,4 idem idem S idem 500 19 25 3 15 idem idem E Adipamate 500 8 25 14 O idem idem S idem 500 8 25 15 13,4 Brévibactérium R 312 (p SV 73) IBN E Adipamide 100 1,6 5 15 0,4 Brévibactérium R 312 (p YG 811 A)IBN E Adipamide 100 1,6 5 15 3,6 Brévlbactérium R 312 (p YG 811 B)IBN E Adipamide 100 1,6 5 15 3,5 Brévibactérium IBN E Adipamide 100 1,6 5 15 O lactofermentum (p SV 73) + IB Am Brévibactérium IBN E Adipamide 100 1,6 5 15 2, 3 lactofermentum (p YG 822) + IB Am bi OM KO MD 4 M REVENDICATIONS 1 Procédé de synthèse d'adipate d'ammonium par hydrolyse de l'adipamide et/ou de l'adipamate d'ammonium au moyen d'un polypeptide ayant une activité amidase, ou d'un microorganisme recombiné générant ledit polypeptide, caractérisé par le fait que l'on utilise: (i) un polypeptide codé par une séquence d'ADN choisie parmi: la séquence codant pour l'amidase de Brévibactérium R 312 représentée à la figure 9 un analogue de cette séquence résultant de la dégénérescence du code génétique un ADN hybridant avec l'une de ces séquences ou avec un fragment de celles-ci et codant pour un polypeptide ayant une activité amidase ou (ii) un microorganisme recombiné générant ledit polypeptide. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN hybridant contient la séquence représentée à la figure 14. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le microorganisme hôte est une entérobactérie. 4 Procédé selon la revendication 3, caracbérisé en ce que l'entérobactérie est E Coli. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le microorganisme hôte est une bactérie corynéforme. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que cette bactérie appartient aux genres Corynebactérium, Brévibactérium, ou Rhodococcus. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polypeptide ou le microorganisme recombiné sont immobilisés sur et/ou dans un support scolide.