Brevet FR2663636A1 — publié le 19911227

La présente invention concerne le procédé de fonctionnalisation d'un oligonucléotide en son extrémité 5'OH par un agent effecteur aminé. La présente invention concerne également un synthon utile dans le procédé consistant en un dérivé phosphoramidite de didesoxynucléoside. La synthèse d'oligonucléotides liés de façon covalente à divers agents effecteurs présente un intérêt considérable de par l'usage massif en biochimie et en biologie moléculaire de ces molécules et leur utilisation en tant qu'agents thérapeutiques potentiels. En particulier, il a été montré que la fixation d'un agent intercalant sur un oligonucléotide accroît la stabilité des duplexes formés avec la séquence complémentaire de ces oligomères (U. Asseline et col., Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 81, 3297-3301, 1984) et améliore la pénétration de ces derniers à travers les membranes cellulaires (P. Verspieren et col., Gene, 61, 307-315, 1987). D'autre part, des oligonucléotides liés à des groupements fluorescents ou à la biotine (S. Agrawal, C. Christodoulou et M. J. Gait, Nucleic Acids Res., 14, 6227-6245, 1986 ; P. Richterich, Nucleic Acids Res., 17, 2181-2185, 1989) peuvent être aisément détectés respectivement par des méthodes fluorométriques ou enzymatiques et colorimétriques très sensibles. Ces composés peuvent être utilisés comme sondes moléculaires froides et remplacer avantageusement les sondes radioactives. Enfin, des oligonucléotides liés à des groupements réactifs pouvant être activés chimiquement (C. B. Chen et D. S. Sigman, Proc. Natl. A cad. Sci. USA, 83, 7147-7151; T. Le Doan et col., Nucleic Acids Res., 15, 8643-8659, 1987 ; J. C. François et col., Biochemistry, 27, 2272-2276, 1988 S. A. Strobel, H. E Moser et P. B. Dervan, J. Am. Chem. Soc, 110, 7927-7929, 1988 ; S.B. Lin et col., Biochemistry, 28, 1054-1061, 1989) ou photochimiquement (T. Le Doan et col., Nucleic Acids Res., 15, 7749-7760, 1987) sont susceptibles de se fixer sur des acides nucléiques au niveau de séquences complémentaires et d'induire localement des dommages irréversibles. Cette famille de composés peut être utilisée pour inhiber sélectivement les fonctions biologiques d'un gène déterminé.La séquence de l'oligomère a pour fonction d'assurer la spécificité de reconnaissance au niveau de la séquence complémentaire portée par le gène ; l'effecteur chimique assurant alors des dommages sur cette cible. Dans la présente demande de brevet, on entend par "oligonucléotide" aussi bien des oligodésoxynucléotides c'est-à-dire en série ADN que des oligoribonucléotides c'est-à-dire en série ARN. D'autre part, on entend également par "oligonucléotide" des oligonucléotides à configuration anomérique bêta ou à configuration anomérique non naturelle alpha. Enfin, les nucléotides constituant l'oligonucléotide peuvent être des nucléotides vrais c'est-à-dire avec un phosphate en 5' du nucléoside correspondant ou des dérivés, entre autres, du type phosphorothiorate, méthylphosphonate, comme il sera vu plus loin. La demanderesse a déjà décrit dans d'autres demandes de brevet des procédés de fonctionnalisation d'un oligonucléotide en son extrémité 5'OH par un agent effecteur aminé. Ainsi pour la meilleure intelligence de la présente invention, on se reportera utilement aux demandes de brevet FR 83 01 223 (2 540 122) et FR 84 117 955 ( 2 568 254) dans lesquelles ont été décrits des composés chimiques constitués par un oligonucléotide comportant un enchaînement de nucléotides naturels, à anomérie béta éventuellement modifiés, sur lequel se trouve fixé par une liaison covalente au moins un groupe intercalant. Dans FR 87 03 366 (2 586 707) on a décrit la synthèse de composés oligonucléotidiques liés à un groupe chimique activable, leur application à titre de nucléases artificielles spécifiques de séquences. Dans la demande de brevet International PCT WO 83/01 451 a été décrite une méthode dans lequel l'oligonucléotide est stabilisé sous forme de phosphotriester. Dans le brevet Américain US 4 469 863 sont décrits des oligonucléotides qui sont stabilisés par remplacement des liaisons phosphodiesters naturelles par des liaisons phophonates. Dans la demande internationale PCT WO 88/04 301, on a décrit la préparation d'oligonucléotides à anomérie alpha ainsi que leur couplage a un agent intercalant ou a un groupement activable chimiquement ou photochimiquement. Dans la présente demande, on entend par "agent effecteur", un radical correspondant à un agent d'intercalation encore appelé agent intercalant, ou un radical chimique ou photoactivable tel qu'un radical porteur d'une fonction réagissant directement ou indirectement avec les chaines de nucléotides ou un radical dont la présence permet une détection facile et sensible. Dans la demande de brevet FR 87 04 339, on a décrit des synthèses par la méthode au phosphoramidite sur support solide pour préparer des composés oligodésoxyribonucléotides alpha et dans la demande de brevet FR 88 12 264, on a décrit des synthèses par la-méthode au phosphoramidite sur support solide, de composés oligoribonucléotides alpha. Jusqu'à présent, dans les procédés de fonctionnalisation d'un oligonucléotide par un agent effecteur, on utilise lors de la dernière étape de l'élongation de l'oligonucléotide, un dérivé par exemple phosphoramidite dans le cas d'une synthèse sur support solide au phosphoramidite dudit agent effecteur fonctionnalisé par un linker. Ainsi, l'article de Stein et al Géne 72 (1988) 333-341 se rapporte à une méthode de fonctionnalisation classique d'un oligonucléotide, il s'agit dans ce cas de l'acridine (ACr). On peut décomposer cette méthode comme suit a) Fonctionnalisation de l'acridine par le linker (m = 3 ou 5) b) Formation du phosphoroamidite correspondant. c) Synthèse sur support solide en utilisant 1 lors de la dernière étape de l'élongation sur machine. d) Décrochage du support solide, et déprotection de l'oligomère avec C6H5SH. On observe, dans ces conditions, une réaction parasite sur l'acridine de l'oligomère final lors de la déprotection (C1 est remplacé par C6H5S). L'approche décrite dans cet article nécessite, à chaque fois que l'on veut introduire un effecteur différent, de synthétiser le phosphoroamidite correspondant O CH Effecteur-linker-O-P1-N3 M Pour pallier à cet inconvénient, on a cherché à coupler de façon covalente un oligodésoxyribonucléotide avec un réactif aminé (R-NH2) à son extrémité 3'OH par une réaction d'amination réductrice entre le dérivé aminé et la fonction aldéhydique d'un site abasique (AP) généré dans l'oligonucléotide (J.-J. Vasseur, C. Gauthier, B. Rayner, J. Paoletti et J. -L. Imbach, Biochem. Biophys. Res. Commun., 152, 56-61, 1988 ; J. -R. Bertrand, J. -J. Vasseur, A. Gouyette, B. Rayner, J.-L. Imbach, C. Paoletti et C. Malvy, J. Biol. Chem., 264, 14172-17178, 1989) selon le schéma suivant 5' oligodésoxyribonucîéotide. création d'un site AP (en milieu de chaîne) ou comme ici à l'extrémité 3' de l'oligomère 5' oligodésoxyribonucléotide O I' 5' oligodésoxyribonucléotide-P-O-CH2(CHOH)2(CH2)2-NH-R I ~~~ O Cette approche très générale, en elle-même puisque de nombreux effecteurs R-NH2 peuvent être considérés, est toutefois limitée par la création du site AP (2' -désoxyribose). En effet, celui-ci est obtenu par hydrolyse acide de la liaison glycosidique d'une désoxyadénosine (dA). La chaîne oligonucléotidique ne peut alors contenir que des nucléosides pyrimidiniques compte tenu du fait que dC et dT sont beaucoup moins sensibles à l'hydrolyse acide que dA ou dG. En d'autre termes, il n'est donc possible par cette méthode de fonctionnaliser par des effecteurs aminés des oligodésoxyribonucléotides constitués uniquement de nucléo sides pyrimidiniques. La présente invention propose un procédé général de formation d'un site abasique à l'extrémité 5'OH d'un oligonucléotide (tant en série ADN qu'en série ARN) synthétisé sur support solide et comprenant cette fois-ci le cas échéant toutes les bases usuelles (A, C, G, T ou U) de l'ADN et de L'ART ainsi que les bases modifiées. Ce procédé original permet ainsi de fonctionnaliser des oligonucléotides de séquences quelconques par des effecteurs aminés. La méthode de fonctionnalisation selon l'invention, a pour caractéristique essentielle l'utilisation de didésoxyribonucléosides et permet via la synthèse automatisée sur support solide de fonctionnaliser des oligonucléotides de séquences quelconques à leur extrémité 5'OH. Le procédé selon l'invention est applicable aux séries ADN ou ARN quelles que soient les modifications structurelles apportées aux oligomères (séries naturelles de configuration béta, séries non naturelles de configuration alpha, phosphorothioates, méthyphosphonates, etc...). Plus précisément la présente invention a pour objet un procédé de fonctionnalisation d'un oligonucléotide en son extrémité 5'OH par un agent effecteur aminé de formule RNH2 caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes a) on synthétise ledit oligonucléotide b) on assemble sur l'extrémité 5'OH dudit oligonucléotide, un didésoxynucléotide via l'extrémité 5' de ce dernier, c) on effectue un couplage covalent dudit oligonucléotide avec ledit réactif aminé RNH2 par une réaction d'amination réductrice entre ledit réactif aminé et une fonction aldéhyde à l'extrémité 5'OH de l'oligonucléotide provenant de l'ouverture par hydrolyse acide du cycle glycosidique du didésoxynucléotide à l'extrémité 5'OH dudit oligonucléotide. La présente invention fournit donc une nouvelle approche de formation d'un site abasique didésoxyribose à l'extrémité 5'OH d'un oligomère pouvant contenir des bases quelconques et ceci quelle que soit la série oligonucléotidique considérée (naturelle ou modifiée). Ces oligonucléotides abasiques ne sont pas isolés car ils conduisent aisément et de façon quantitative à leur forme dérivatisée après amination réductrice avec des effecteurs aminés. Dans un mode de réalisation du procédé selon l'invention aux étapes a) et b), la synthèse de l'oligonucléotide est une synthèse d'assemblage au phosphoramidite sur support solide dans la dernière étape de laquelle, on utilise un dérivé phosphoramidite en 5' du didésoxynucléoside correspondant au didésoxynucléotide que l'on assemble par un cycle de synthèse supplémentaire à l'extrémité 5' dudit oligonucléotide. I1 apparaît que les dérivés phosphoramidites de didésoxynucléosides selon l'invention sont beaucoup plus sensibles à l'hydrolyse acide que les didésoxyribonucléosides ou les ribonucléosides correspondant. Parmi ceux-ci, comme ce sera vu plus loin, les dérivés didésoxynucléosides de la nébularine s'hydrolysent plus aisément. Toutefois, il en va de même d'autres dérivés de didésoxynucléosides, notamment, des dérivés hydrogéno-phosphonates correspondants de formule ce qui ouvre la possibilité d'avoir recours à d'autres types de synthèses que la synthèse au phosphoramidite et en particulier aux synthèses à l'aide de dérivés hydrogéne-phosphonates (Nucleic Acids Researchs Vol. 14 N" 13 1988). Un procédé en phase solide selon la méthode au phosphoramidi te, comporte les étapes essentielles suivantes - On immobilise un dérivé nucléoside protégé en 5', par l'intermédiaire d'une de ses fonctions hydroxyle en 2' ou 3' sur un support solide, - On assemble sur ce support dans un réacteur synthétiseur manuel ou automatique la chaîne d'oligobonucléotide protégée par condensation de monomères constitués de nucléosides protégés en 5' et 2' et substitués par des groupes phosphoramidites en 3', - Les oligonucléotides sont obtenus après décrochage du support de l'oligomère obtenu et élimination des groupes protecteurs. De façon appropriée, l'assemblage de l'oligonucléotide se fait par condensation, en présence dun agent activateur, desdits monomères entre leur fonction en 3' et la fonction hydroxyle-5' du composé nucléoside immobilisé pour le premier monomère ou d'un composé intermédiaire polynucléotide protégé fixé sur ledit composé nucléoside immobilisé pour les monomères suivants. Notamment, l'agent activateur pour la condensation desdits monomères peut être choisi parmi le tétrazole et ses dérivés, tels que le paranitro-phényl tétrazole. Dans le procédé selon l'invention, de préférence après les étapes a) et b) et avant l'étape c) on décroche du support solide le composé constitué par ledit oligonucléotide à l'extrémité 5' duquel est assemblé le dit didésoxynucléotide et on élimine les groupes protecteurs. La réaction d'amination réductrice à l'étape c) peut se faire par exemple par un traitement au cyanoborohyrure de sodium en milieu acide. Dans un mode de réalisation du procédé selon une synthèse de phosphoramidite, utilisera le dérivé phosphoramidite de didésoxynucléoside de formule formule dans laquelle - R1 et R2 représentent un alkyl en C1 à C7 éventuellement substitué, tel que CH3, CH-(CH3)2 ou R1 + R2 forment ensemble un groupe morpholino - R3 représente un alkyl en C1 à C7 éventuellement substitué notamment CH3 ouCH2-CH2CN - B représente une base d'acide nucléique notamment, l'adénine, la guanine ou la nébularine. S'agissant de la base d'acide nucléique B, on choisit en effet de préférence, l'adénine, la guanine ou la nébularine compte tenu de leur facilité d'hydrolyse acide, par rapport aux autres bases d'acides nucléiques. De préférence encore, on utilisera un dérivé phosphoramidite de formule I dans laquelle B représente la nébularine. L'originalité et l'intérêt de l'approche selon l'invention réside en l'utilisation lors de la dernière étape de la synthèse oligonucléotidique sur support solide d'un même dérivé phosphoramidite de didesoxynucléoside quel que soit l'agent effecteur que l'on souhaite introduire. Le dérivé phosphoramidite de didésoxynucléoside, après ouverture du cycle désoxysucre, apporte le "linker" entre l'oligonucléotide proprement dit et l'agent effecte-ur. En outre, la déprotection ne s'effectue plus selon l'invention sur l'oligomère fonctionnalisé avec des risques de réaction parasite, mais l'oligomère est déprotégé avant l'introduction de l'effecteur. La consommation en agent effecteur, substance en général assez chère, est donc moindre dans un procédé selon l'invention car introduit à la dernière étape de la synthèse.Dans les réalisations antérieures telles que l'article de Stein et al, la préparation du phosphoramidite nécessitait l'introduction préalable du linker avec nécessité d'utiliser lors de la synthèse en phase solide un excès (20 fois la stoéchiométrie du dérivé phosphoramidite 1). Dans un mode de réalisation particulier, il est possible selon le procédé selon l'invention de préparer des composés de formule X B i B (") RNH-(CH2)3-CHOH-CH2-O-0p1 À = OH formule dans laquelle : ,i n - RNH est le reste monovalent de l'agent effecteur aminé RNH2, - J = H ou OH - les radicaux B peuvent être identiques ou différents entre eux et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée attachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha ou bêta, - les radicaux X peuvent être identiques ou différents entre eux et représentent un oxoanion O, un thioanion S, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, aminoalcoxy, thioalkyle, - n est compris entre 1 et 50. On citera plus particulièrement les composés de formule II dans laquelle X = O , S, ou CH3. Lorsque X = S, l'étape usuelle d'oxydation après la détritylation, l'addition et le capping peut être remplacée par un cycle de sulfurisation (GENE 72 343-347) (W.J. Stec, G. Zon, W. Egan et B. Stec, J. Amer. Chem. Soc., 106, 6077-6079, 1984 ; R.P. Iyer, W. Egan, J.B. Regan et S.L. Beaucage, J. Amer. Chem. Soc. 112, 1253-1254, 1990). Lorsque X - CH3, un synthon 5'-(dimethoxytrityl) nucléoside 3'-(N,N-diisopropylméthylphosphonamidite) peut être utilisé en lieu et place d'un synthon phosphoramidite, lors de l'étape d'addition (M.A. Dorman, S.A. Noble, L.J. Mc Bride et M.H. Caruthers, Tetrahedron, 40, 95-102, 1984 ; A. Jauger et J. Engels, Tetrahedron Letters, 25, 1437-1440, 1984). Comme on l'a déjà mentionné, les radicaux effecteurs de formule RNH- selon l'invention correspondent à des agents effecteurs qui sont des composés connus dans les techniques touchant aux acides nucléiques. Il s'agit par exemple des composés capables de "s'intercaler" dans la structure des ADN ou des ARN. Ces agents d'intercalation sont, en général, constitués par des composés polycycliques ayant une configuration plane tels que l'acridine, la furocoumarine, la daunomycine, la l,lO-phénanthroline, la phénanthridinium, les prophyrines, les dérivés de la dipyrido (1,2-a : 3', 2'-d) imidazole, Itellipticine ou l'ellipticinium ou leurs dérivés comportant une fonction NH2 Ces agents effecteurs peuvent aussi être des radicaux chimiques réactifs tels que des radicaux chimiques de scission c'est-à-dire que ces radicaux peuvent directement ou indirectement réagir pour scinder une chaîne de nucléotides. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs seront activables, par exemple par voie chimique ou photochimique.Les groupes réactifs de scission activables sont, par exemple, des dérivés de composés tels que l'acide éthylène-diamine-tétracétique, l'acide diéthylène-triamine-pentaacétique, les porphyrines, la l,10-phénanthroline, le psoralène et autres groupes aromatiques absorbant les radiations du proche U.V. et du visible. Ces groupements chimiquement activables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur, induisent des coupures dans des séquences d'acides nucléiques situées dans leur voisinage. Plus précisément selon la présente invention le reste RNH de l'agent effecteur peut représenter - les radicaux dérivés de l'acide éthylène-diamine-tétraacétique de formule - les radicaux dérivés de l'acide d'iéthylène-triamine-pentaacétique, - les radicaux dérivés de la méthylpyrroporphyrine de formule - les radicaux dérivés de la phénanthroliune de formule - les radicaux dérivés de l'acridine - les radicaux dérivés de la proflavine R 1 représentant un groupement amino (NH2) ou azido (N3) - la 9 amino ellipticine = Enfin la présente invention a pour objet un synthon utile dans un procédé selon l'invention caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale formule dans laquelle R1, R2, R3 et B ont les significations données dans la revendication 4. Comme déjà mentionné, de préférence dans le synthon selon l'invention, B représente de préférence l'adénine, la guanine ou la nébularine. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre EXEMPLE 1 : Utilisation de phosphoramidite de didesoxy nucléoside en vue de créer un site abasique (résidu 2', 3' didesoxyribose en 5' d'un oligonu cléotide destiné à être fonctionnalisé). On a préparé le phosphoramidite de formule Après assemblage complet de l'oligonucléotide désiré sur le synthétiseur un cycle supplémentaire est effectué qui permet d'incorporer le phosphoroamidite 1. /wNm9M MÀ I I 3 I t: o o- i' OLIGONUCLEOTIDE3 L'oligomère correspondant 2 est obtenu après déprotection selon les méthodes usuelles puis éventuellement purifié par CLHP. Un traitement en milieu acide (30 mM HCL, 37 , 12 à 15 min) conduit à l'hydrolyse sélective du résidu didésoxynébularine et ains à la formation d'une extrémité didésoxyribose en 5' de l'oligomère soit 3. 0 I I 0=( 0-B-0 ÇÀ 3 on5 OLIGONUCLEOTIDE3 RNH2 BH3CNNa O I I O-P O I/0,B RNH-CH 7 jl HO o-5 OLIGONUCLEOTIDE3 4 Celui-ci est mis en réaction avec l'amine désirée en présence de cyanoborohydrure de sodium en milieu tamponné. Les conditions expérimentales de cette étape dépendent de la nature de l'amine utilisée (solubilité, réactivité, ...) et l'oligomère fonctionnalisé 4 est isolé par CLHP. Selon une variante de réalisation, la réaction d'amination réductrice à l'étape c) du procédé selon l'invention, se fait par un traitement cyanoborohydrure de sodium en milieu acide. I1 apparaît que le dérivé phosphoramidite de didésoxynucléoside de nébularine s'hydrolysent plus aisément que tous les autres nucléosides pirymidiques ou puriniques en particulier que les nucléosides de l'adénine. Les exemples ci-après décrivent la synthèse et la caractérisation des phosphoroamidites 5' de ddA et de ddN de type A = adénine B = nébularine I1 est possible cependant d'utiliser d'autres dérivés phosphoroamidites protégés par divers autres groupements substituant le phosphore CNCH2CH2 à la place de CH3, à la place de etc Est ensuite décrite l'utilisation de ces phosphoroamidites pour dérivatiser différents types d'oligodésoxynucléotides (béta ou alpha). L'amination réductrice par des effecteurs aminés du produit obtenu après dépurination sélective de la ddN S'terminale, est décrite dans la mesure où cette succession d'étapes s'effectue sans isolement de oligomères intermédiaires. EXEMPLE 2 :Synthèse du phosphoroamidite de la ddA 5' -diisopropylaminométhoxyphosphinyl-2', 3' -didésoxyadénosine. A une solution de 2', 3' -didésoxyadénosine (470,5 mg, 2 mmoles) dans du dichlorométhane anhydre (6ml) on ajoute de la N,N,N-diisopropyléthylamine (1,39 ml, 8 mmoles) et de la chloro N,Ndiisopropylaminométhosyphosphine (0,98 ml, 5 mmoles). Le mélange est agité pendant 30 minutes à température ambiante, sous atmosphère d'argon, puis est versé dans une ampoule à décanter contenant de l'acétate d'éthyle (80 ml). La solution résultante est lavée avec de la saumure (4 x 50 ml). La phase organique est séché sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée à sec sous pression réduite. Le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice et l'élution a lieu avec des mélanges de cyclohexane, de dichlorométhane et de triéthylamine (90/9/1 à 30/69/1, v/v/v).Les fractions contenant le produit désiré pur sont rassemblées, évaporées à sec et le résidu redissous dans du dioxanne est soumis à lyophilisation. On obtient une poudre incolore (345,3 mg, 44 % Rdt). - RMN 31P (CD3CN) 149,89 ppm. - RMN 1H (CD3C13)(;8,33, 8,32 8,32 et 8,26 (3s, 2H, H2 et H8); 6,32 (m, 1H, H1,) 4.34 (m, 1H, H4,) 3,83 (m, 2H, H5, et H5") 3,58 (m, 2H, CH (iPr)2) ; 3,44 et 3, 43 (2d, 3H, CH30) ; 2,50 (m, 2H, H2, et H2"); 2,14 (m, 2H, H3, et H3") ; 1,16 (m, 12H, CH3(iPr)2). note : s = singulet, d = doublet, m = multiplet. déplacement chimique exprimé en ppm par rapport au signal du TMS. - Spectre de masse FAB FAB O ; matrice polyéthylèneglycol : (M+H) + = 397 (M+H - HN(iPr)2)+ = 296 ; (M+H) - BH)+ = 262 (M+H - CH30-P(OH)N(iPr)2)+ = 218 ; CH30-P-N(iPr)2 et B-C -0 = 162 (B+H2)+ = 136. EXEMPLE 3 :Synthèse du phosphoroamidite de la ddN : 5' -diisopropylarninométhoxyphosphinyl-2', 3' -didésoxynébularine A une suspension de 2', 3' -didésoxynébularine (211,6 mg, 0,961 mmoles) dans du dichlorométhane anhydre (5 ml) on ajoute de la N, N, N,-diisopropyléthylamine (0,67 ml, 3,844 mmoles) et de la chloro N,N-diisopropylaminométhoxyphosphine (0,35 ml, 1,8 mmoles). Le mélange est agité pendant 30 minutes à température ambiante, sous atmosphère d'argon, puis est versé dans une ampoule à décanter contenant de l'acétate d'éthyle (40 ml). La solution résultante est lavée avec de la saumure ( 4 x 25 ml). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée à sec sous pression réduite.Le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice et dichlorométhane et de thriétylamine (90/9/1 à 50/49/1, v/v/v). Les fractions contenant le produit désiré pur sont rassemblées, évaporées à sec et le résidu redissous dans du benzène est soumis à lyophilisation. On obtient une poudre incolore (165,3 mg, 45 % Rdt). - RMN 31p (CD3CN 150,09 ppm. - RMN H (CD3C13)ss9,03 (s, 1H, H2 ou H6 ou H8; 8,88 (s, 1H, H2 ou H6 ou H8); 8,59 et 8,55 (2s, 1H? H2 ou H6 ou H8); 6,40 (m, 1H, H1,) 4,32 (m, 1H, H4,) ; 3,93-3,67 (m, 2H, H5, et H5"); 3,61-3,51 (m, 2H, CH(iPr)2) ; 3,36 et 3,35 (2d, 3H, CH30, HP = 12,9 et 13,5 Hz) ; 2L,54 (m, 2H, H2' et H2") ; 2,18 (m, 2H, H3' et H3") ; 1,13 (m, 12H, CH3)(iPr)). - Spectre de masse FAB O ; matrice polyéthylèneglycol : (M-H) = 380 B = 119 ; CH3O-P-(O)N(iPr)2 = 178. J FAT O ; matrice polyétylèneglycol : (M+H)+ = 382 (M+H - HN(iPr)2) = 281 ; (M+H - BH)+ = 262 ; + (M+H - CH3O-P(OH)N(iPr)2)+ = 203 ; CH3O-P-N(iPr)2 et B-C=O = 162 ; B-C =0 = 147 ; (B+H2)+ = 121. EXEMPLE 4 :Synthèse d'oligonucléotides comportant la didésoxynébularine à leur extrémité 5' sur support solide par la méthode au phosphorami dite. La didésoxynébularine est incorporée au dernier stade de synthèse des oligonucléotides préparés à l'échelle d'une ,umole de façon classique selon les méthodes décrites dans la littérature (par exemple méthode au cyanoéthylphosphoroamidite pour les oligodésoxyribonucléotides de configuration béta, méthode au méthylphosphoroamidite pour les oligodésoxyribonucléotides de configuration alpha : F. Morvan, B. Rayner, J.P. Leonetti et J.L. Imbach, Nucleic Acids Res., 16, 833-847, 1988). Le cycle de couplage du synthon méthylphosphoroamidite de la ddN est celui utilisé en méthode au méthylphosphoroamidite (référence ci-dessus). la fin de ce cycle, l'étape de détritylation est omise. Déprotection des oligonucléotides Cette déprotection est tout à fait classique et dépend de la nature des groupements protecteurs des phosphates utilisés. Ainsi, pour les oligonuclétotides de configuration Z la déprotection des phosphates est réalisée par une solution de thiophénol/ Et3N/dioxanne (1/1/2v/v/v) pendant 30 minutes à température ambiante, le décrochage de l'oligonucléotide sur le support est réalisé par un traitement avec NH4OH 32 % pendant 3 fois 30 minutes à température ambiante et la déprotection des fonctions protégées par des groupements acyles (résultant du capping) est effectuée par NH4OH 32 % pendant 16 heures à 55 . Pour les oligodésoxyribonucléotides de configuration , seul les traitements avec NH40H sont utilisés. EXEMPLE 5 : Fonctionnalisation par l'amino-9 ellipticine à l'extrémité 5'OH d'un oligonucléotide dirigé contre l'extrémité "cap" du gène de la -globine de lapin. N O e 0-P-O d5,(TGT GAA CGA AAA CT)3 I í HCl 30mM, 37"C, 14 min I' O=CH-(CH2)2-CHOH-CH20-P-0 d5,(TGT GAA CGA AAA CT)3, o pH 5 NaBH3CN, NaBH3CNr pH 5 amino-9 ellipticine L'oligonucléotide (brut réactionnel obtenu après déprotection, 72 unités d'absorbance à 260 nm) comprenant à son extrémité 5' la didésoxynébularine est mis en solution d'acide chlorhydrique 100mM (300 piu). Le mélange est laissé à 37"C pendant 14 minutes. L'évolution de la réaction est suivie par CLHP dans les conditions décrites en annexe. On observe la disparition de l'oligonucléotide de départ (RT = 17,20 min, max = 259,2 nm) et la formation > max = 263,4 nm) et de l'oligonucléotide comportant à son extrémité 5' la chaîne OCH-(CH2)2-CHOH-CH2O-P(O)O2 (RT = 15,03 min, ) max = 259,2 nm). Au bout de ces 14 min de traitement acide, on ajoute successivement une solution de cyanoborohydrure de sodium (6,2-mg, 100 pmoles) dans un tampon acétate de sodium 1M à pH 5 (400 ,ut), de l'eau (500 p1) puis une solution d'amino-9 ellipticine 10 nM dans l'acide chlorhydrique 20 mM. Le mélange réactionnel est laissé à température ambiante pendant 30 minutes. A ce stade, l'analyse CLHP du milieu réactionnel indique la disparition de l'oligonucléotide intermédiaire (RT 15,03 min) et la formation de l'oligonucléotide lié à l'aminoellipticine (RT = 17,80 min,)max = 259,2 nm et 307,2 nm). Ce dernier composé est alors purifié par CLHP. La quantité obtenue d'oligonucléotide fonctionnalisé est de 29 unités d'absorbance à 260 nm. La pureté spectrophotométrique de ce composé est de 99 % à cette même longueur d'ondel. Conditions CLHP utilisées injection : 10 ,ul colonne Beckman XLODS C18 3p gradient linéaire d'une solution à 5 % d'acétonitrile dans un tampon acétate d'ammonium 0,1 M à pH 5,9 vers une solution à 15 % d'acétonitrile dans le même tampon en 30 min à un débit de I ml par min. EXEMPLE 6 : Fonctionnalisation par l'amino-9 ellipticine à l'extrémité 5'OH d'un oligonucléotide ss dirigé contre le site d'épissage du gène tat du virus HIV 1. j NaBH3CN, pH 5 amino-9 ellipticine CH3 O NH-(CH2)3-cHOH-CH2OpO pd5r(ACA CCC AAT TCT)3 o CH3 L'oligonucléotide (brut réactionnel obtenu après déprotection, 80,5 unités d'absorbance à 260 nm) comprenant à son extrémité 5' la didésoxynébularine est mis en solution dans l'eau (700 ul). On ajoute alors une solution d'acide chlorhydrique 100 mM (300 pl). Le mélange est laissé à 370C pendant 12 minutes. L'évolution de la réaction est suivie par CLHP dans les conditions décrites en annexe. On observe la disparition de l'oligonucléotide de départ (RT 16,76 min, ;!1 max = 262,4 nm) et la formation concommitante de la base nébularine (RT = 8,91 min, max = 263,4 nm) et de l'oligonucléotide comportant à son extrémité 5' la chaîne OCH-(CH2)2-CHOH-CH,O-P(O-)O -(RT = 16,16 min, max = 262,4 nm). Au bout de ces 12 min de traitement acide, on ajoute successivement une solution de cyanoborohydrure de sodium (6,2 mg, 100 pmol) dans un tampon acétate de sodium 1M à pH 5 (400 ,ul), de l'eau 500 pl) puis une solution d'amino-9 ellipticine 10 nM dans l'acide chlorhydrique 20 mM. Le mélange réactionnel est laissé à température ambiante pendant 30 minutes. A ce stade, une analyse CLHP du mélange réactionnel indique la disparition de l'oligonucléotide intermédiaire (RT = 16,16 min) et la formation de l'oligonucléotide lié à l'aminoellipticine (RT = 17,86 min, max = 262,4 nm et 307,2 nm). Ce dernier composé est alors purifié par CLHP. La quantité obtenue d'oligonucléotide fonctionnalisé est de 33 unités d'absorbance à 260 nm. La pureté spectrophotométrique de ce composé est de 94 % à cette même longueur d'onde. Conditions CLHP utilisées injection : 10 ,ul colonne Beckman XLODS C18 3p gradient linéaire d'une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1 M à pH 5,9 vers une solution à 20 % d'acétonitrile dans le même tampon en 20 min à un débit de 1 ml par min. REVENDICATIONS 1. Procédé de fonctionnalisation d'un oligonucléotide en son extrémité 5'OH par un agent effecteur aminé de formule RNH2 caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes a) on synthétise ledit oligonucléotide b) on assemble sur l'extrémité 5'OH dudit oligonucléotide, un didésoxynucléotide via l'extrémité 5' de ce dernier, c) on effectue un couplage covalent dudit oligonucléotide avec ledit réactif aminé RNH2 par une réaction d'amination réductrice entre ledit réactif aminé et une fonction aldéhyde à l'extrémité 5'OH de l'oligonucléotide provenant de l'ouverture par hydrolyse acide du cycle glycosidique du didésoxynucléotide à l'extrémité 5'OH dudit oligonucleotide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'aux étapes a) et b), la synthèse de l'oligonucléotide est une synthèse d'assemblage au phosphoramidite sur support solide dans la dernière étape de laquelle, on utilise un dérivé phosphoramidite en 5' du didésoxynucléoside correspondant au didesoxynucleotide que l'on assemble par un cycle de synthèse supplémentaire à l'extrémité 5' dudit oligonucléotide. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé ce que après les étapes a) et b) et avant l'étape c) on décroche du support solide le composé constitué par ledit oligonucléotide à l'extrémité 5' duquel est assemblé le dit didésoxynucléotide et on élimine les groupes protecteurs. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit dérivé phosphoramidite de didesoxynucleotide a pour formule formule dans laquelle - R1 et R2 représentent un alkyl en C1 à C7 éventuellement substitué, tel que CH3, CH-(CH3)2 ou R1 + R2 forment ensemble un groupe morpholino - R3 représente un alkyl en C1 à C7 éventuellement substitué, notamment CH3, ou CH2-CH2CN - B représente une base d'acide nucléique notamment, l'adénine, la guanine ou la nébularine. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'oligonucléotide fonctionnalisé a pour formule formule dans laquelle - RNH est le reste monovalent de l'agent effecteur aminé RNH2. - J = H ou OH - les radicaux B peuvent être identiques ou différents entre eux et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée attachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha ou bêta, - les radicaux X peuvent être identiques ou différents entré eux et représentent un oxoanion O , un thioanion S, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, aminoalcoxy, thioalkyle, - n est compris entre 1 et 50 6. Procédé selon revendication 6 , procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que X = O, S, ou CH3. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le reste RNH de l'agent effecteur représente - les radicaux dérivés de l'acide éthylène-diamine-tétraacétique de formule - les radicaux dérivés de l'acide d'iéthylène-triamine-pentaacétique, - les radicaux dérivés de la méthylpyrroporphyrine de formule - les radicaux dérivés de la phénanthroliune de formule À (I - les radicaux dérivés de l'acridine o - les radicaux dérivés des la proflavine R représentant un groupement amino (NH2) ou azido (N3) - la 9 amino ellipticine = 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la réaction d'amination réductrice à l'étape c) se fait par un traitement au cyanoborohydrure de sodium en milieu acide. 9. Synthon utile dans un procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale formule dans laquelle R1, R2, R3 et B ont les significations données dans la revendication 4. 10. Synthon selon la revendication 9 caractérisé en ce que B représente l'adénine, la guanine ou la nébularine.