Brevet FR2661190A1 — publié le 19911025

L'invention concerne un procédé microbiologique de préparation de dérivés trans-3-hydroxy de l'&alpha; -lonone. Les produits obtenus par le procédé conforme à l'invention sont d'utiles matériaux de départ pour la préparation de produits organiques les plus divers, tels que les carotenoides (par exemple la lutéine, la tunaxanthine, la zéaxanthine, la cryptoxanthine), de produits conférant de l'odeur ou de la saveur (par exemple les arômes du vin et du tabac), de substances actives pharmaceutiques, d'insecticides et d'agents induisant la chute des fruits. L'invention a pour objet un procédé microbiologique de préparation de dérivés trans-3-hydroxy de 1' E( -ionone, à savoir la trans-3-hydroxy-&alpha; -ionone et/ou le trans-3-hydroxy-(-ionol, caractérisé en ce que l'on fait fermenter l' -ionone avec un champignon filamenteux du genre Mucor. Le procédé conforme à l'invention permet d'introduire un groupe hydroxy dans la position 3 de 1' - ionone avec une sélectivité et un rendement élevés. I1 se forme, de façon surprenante, exclusivement ou presque ex clusivement les dérivés trans-3-hydroxy, le groupe oxo dans la chaîne latérale de 1' -ionone pouvant être réduit simultanément en groupe hydroxy. Les dérivés 3-oxo qui peuvent se former en faibles quantités lors de la réaction ultérieure des dérivés 3-hydroxy, peuvent être facilement séparés. Mais, on peut, en général, totalement ou en grande partie éviter leur formation par un choix approprié des conditions de fermentation.Le procédé conforme à l'invention offre ainsi une méthode simple et sélective pour la préparation de la trans-3-hydroxy & -ionone et/ou du trans-3-hydroxy-i-ionol avec un rendement élevé et en évitant le plus possible les sousproduits cis-3-hydroxy. En adaptant les conditions de fermentation, en particulier la durée de la fermentation, le procédé peut être en outre conduit de telle façon qu'il se forme principalement l'un des deux produits principaux. L'expression "trans-3-hydroxy-d -ionone" comprend dans le cadre de la présente invention la (3S,6S)3-hydroxy- -ionone et la (3R, 6R) -3-hydroxy-oC -ionone. L'expression "trans-3-hydroxy A-ionol" comprend le (3S,6S,9RS)-3-hydroxy-&alpha;-ionol et le (3R,6R,9RS)-3 hydroxy-&alpha;-ionol. L'expression "cis-3-hydroxy-&alpha;-ionone" comprend la (3S,6R)-3-hydroxy-o(-ionone et la (3R,6S) 3-hydroxy- -ionone. L'expression "cis-3-hydroxy-&alpha; -ionol" comprend la (3S,6R,9RS)-3-hydroxy-&alpha; -ionol et le (3R,6S, 9RS)-3-hydroxy-E -ionol. Le procédé conforme à l'invention peut être réalisé avec l'&alpha; -ionone racémique ou optiquement active. Les dérivés trans-3-hydroxy sont généralement obtenus sous une forme optiquement active, même lorsque l'on fait réagir l'd -ionone racémique. Pour l'obtention de l'isomère présentant une configuration 3S,6S ou 3R,6R avec une pureté optique qui soit la plus élevée possible, on peut cependant avantageusement faire réagir l' -ionone optiquement active. On peut, conformément à l'invention, utiliser toutes les souches du genre Mucor plumbeus, en particulier les souches Mucor plumbeus CBS 110.16 Mucor plumbeus ATCC 4740 Mucor plumbeus DSr4 5613 Mucor plumbeus DSM 5614 Les microorganismes du genre Mucor sont facilement accessibles à l'homme de l'art. Pour assurer la bonne exécution du procédé conforme à l'invention, on a néanmoins récemment déposé les souches de Mucor plumbeus CBS 110.16 et ATCC 4740 auprès de la Collection allemande des microorganismes et cultures cellulaires S.a.r.l. sous les numéros DSM 5613 et DSM 5614. Les microorganismes peuvent être utilisés en tant que culture (par quoi, on entend le mycélium et la solution nutritive correspondante)) sous la forme du mycélium ou sous une forme ayant subi un traitement de préparation. L'exécution du procédé conforme a l'invention peut être réalisée, de préférence, de telle mmanière que a) I'on cultive un microorganisme approprié en présence de l'd -ionone ou b) que l'on ajoute après culture d'un microorganisme approprié l'd -ionone et que l'on poursuit l'incubation ou c) que l'on sépare après culture du microorganisme la biomasse (par exemple par filtration) et qu'on l'incube dans une solution appropriée (par exemple une solution tampon) en présence de l' -ionone. La suspens ion de culture peut être préparée en inoculant un milieu approprié avec le microorganisme. Comme milieux conviennent des milieux aqueux contenant des substances nutritives usuelles, c'est-à-dire une source de carbone telle que le glucose, le fructose, le saccharose, le maltose et analogues, une source d'azote telle que l'urée, la peptone, un extrait de levure, un extrait de viande, des acides aminés, des sels d'ammonium et analogues, des sels minéraux tels que des sels de magnésium, de sodium, de potassium, de calcium et/ou de fer, et éventuellement d'autres substances nutritives convenant pour la croissance du microorganisme et des pro duits ant-moussants. La culture du microorganisme peut être effectuée sous la forme d'une culture submergée, sous la forme d'une culture agitée ou sous la forme d'une culture stationnaire (par exemple dans les fermenteurs). Le microorganisme est, de préférence, cultivé dans des conditions aérobies. La culture du microorganisme peut être effectuée en particulier sous forte aération (ce qui peut être obtenu par exemple avec une table à agitation rotative ou par aération supplémentaire), car on peut de cette manière, en général, améliorer l'activité du microorganisme. La culture du microorganisme peut être effectuée en outre, de préférence, en présence de substances qui conviennent pour stimuler la biosynthèse des systèmes d'hydroxylation chez les mammifères, telles que le 3méthylcholanthrène, le phénobarbital, le clofibrate et analogues. Les substances présentant cette propriété sont désignées, dans ce qui suit, par "inducteurs d'enzymes d'hydroxylation" ou simplement par "inducteurs". La culture en présence de telles substances conduit dans la plupart des cas à une activité du microorganisme beaucoup plus élevée et donc à des durées de réaction plus courtes et à des rendements plus élevés dans le procédé conforme à l'invention. La concentration en inducteur n'est pas critique et peut être par exemple d'environ 10-100 mg/l. Par une aération active lors de l'étape de culture, on peut encore notablement augmenter l'activité du microorganisme. La fermentation conforme à l'invention peut, ainsi qu'il a déjà été indiqué ci-dessus, par exemple être réalisée, en ajoutant directement l' -ionone au milieu de culture. L'addition de l' -ionone est effectuée, de préférence, pendant ou à la fin de la période de culture. Selon une autre méthode, la biomasse lavée peut être séparée, après la culture par exemple par filtration, lavée et mise en suspension dans une solution aqueuse d' oc-ionone, par exemple dans une solution tampon contenant de l' S -ionone. Cette méthode est habituellement préférée, car on peut plus facilement faire varier et contrôler les conditions pour une optimalisation du procédé, par exemple ajustage d'une valeur de pH déterminée, utilisation d'un tampon etc.. Comme dans cette méthode, le milieu d'incubation ne contient pas de substances nutritives, on ne doit pas, en outre, effectuer la biotransformation dans des conditions stériles de sorte que l'isolement et la purification des produits sont notablement facilitées. Il est, en général, avantageux d'exécuter le procédé conforme à l'invention sous une bonne aération. Ceci peut être par exemple obtenu en effectuant la transformation avec une table à agitation rotative ou dans un réacteur fortement aéré. La température de la fermentation conforme à l'invention peut varier dans des limites relativement larges et être comprises par exemple entre environ 15 et environ 550C. On préfère généralement une température située entre environ 23 et 280C. La concentration du substrat n'est pas critique et est en général de l'ordre de 0,5-5 g/l. La durée optimale de la fermentation dépend du microorganisme utilisé, des conditions de la fermentation et de la concentration en i-ionone. La durée optimale de la fermentation dépend, en outre, du produit que l'on désire obtenir, la trans-3-hydroxy-d -ionone ou le trans-3 hydroxy- o(-ionol. Elle peut être facilement déterminée cas par cas et est située, en général, entre environ 1 et environ 20 jours. Pour des concentrations en substrat d'environ 0,5 à environ 2 g/l, la durée optimale de la fermentation est généralement comprise entre environ 2 et 7 jours. Le procédé conforme à l'invention est, de préférence, exécuté avec un microorganisme que lton a fait croître en présence d'un inducteur d'enzyme d'hydroxylation. Ainsi que déjà indiqué ci-dessus, la transformation peut être, de cette façon, généralement accélérée et le rendement augmenté. Le procédé conforme à l'invention peut, de préférence, être réalisé dans une solution tampon. Ceci peut, par exemple, être effectué en ce qu'on sépare la biomasse obtenue par culture et en ce qu'on la met en suspension dans une solution tampon contenant de l' -ionone. Le substrat peut être également ajouté de façon répétée ou de façon continue. L'utilisation d'un tampon permet un meilleur contrôle des conditions, une optimalisation du produit désiré, des transformations plus rapides et des rendements plus élevés. On préfère des tampons avec une valeur de pH d'environ 5,5-8,5. Les tampons phosphate sont, en général, préférés. Ceux-ci peuvent être préparés, de façon connue, à partir de phosphates, de préférence à partir de leurs sels de sodium, de potassium et/ou d'ammonium, tels que le phosphate de sodium, l'hydrogénophosphate de sodium, le dihydrogénophosphate de sodium et analogues, et éventuellement ajustage de la valeur du pH désirée avec des acides ou des bases usuels, tels que l'acide chlorhydrique, l'acide phosphorique, la soude caustique et analogues. La concentration du tampon n'est pas critique; on utilise cependant, en général, des solutions d' environ 0,05-0,5 M. Particulièrement préférés sont les tampons phosphate avec une valeur de pH d'environ 7. Le procédé conforme à l'invention est à un certain degré énantiosélectif. Ceci résulte par exemple du fait que partant de l'-ionone racémique sont formés gé néralementvdes produits optiquement actifs et que l' ionone non encore totalement transformée se trouve généralement dans le mélange de fermentation sous une forme optiquement active. Le procédé conforme à l'invention fournit des dérivés 3-hydroxy exclusivement ou principalement sous forme trans, c'est-à-dire sous forme de trans-3-hydroxy -ionone ou sous forme de trans-3-hydroxy-d -ionol. Conviennent particulièrement pour la préparation des composés trans les souches Mucor plumbeus DSM 5614 et ATCC 4740. Mais, la formation de cis-3-hydroxy-E -ionone et de cis-3-hydroxy-&alpha; -ionol peut être également pratiquement totalement évitée en utilisant d'autres souches du genre Mucor, par exemple Mucor plumbeus DSM 5613 ou CBS 110.16, en particulier lorsque les temps d'incubation sont choisis de façon correspondante. Le procédé conforme à l'invention peut, en outre, être conduit de telle manière qu'il se forme principalement la trans-3-hydroxy-d -ionone ou le trans-3-hydroxy -ionol. Des temps d'incubation relativement courts favorisent la formation de la trans-3-hydroxy-ol -ionone, tandis que des temps d'incubation relativement longs favorisent la formation du trans-3-hydroxy-o(-ionol. La configuration des produits dépend essentiellement de la configuration du substrat et du microorganisme utilisé. Lorsque l'on utilise de l' -ionone racémique, les souches Mucor plumbeus DSM 5613, DSM 5614, CBS 110.16 et ATCC 4740 fournissent la trans-3-hydroxy-E -ionone majoritairement dans la configuration (3S,6S) et le trans 3-hydroxy-&alpha;-ionol majoritairement dans la configuration (3R,6R,9RS). Après achèvement du procédé conforme à l'invention, les produits peuvent être isolés, d'une façon connue en soi, du bouillon de fermentation ou du milieu d'incubation. L'isolement est effectuée, de préférence, par extraction avec un solvant organique insoluble dans l'eau, par exemple avec un hydrocarbure aliphatique ou cycloaliphatique, éventuellement chloré ou avec un ester ou un éther aliphatique, tel que l'hexane, le chlorure de méthylène, l'acétate d'éthyle, le diéthyléther et analogues. L'acétate d'éthyle est en général préféré. L'extraction peut être généralement facilitée par saturation de la phase organique avec du chlorure de sodium. Le produit brut peut être purifié de façon classique, par exemple par distillation, cristallisation et/ou par des méthodes chromatographiques. L'utilisation ultérieure des produits obtenus peut être effectuée de façon connue. Des méthodes appropriées pour la transformation en caroténoîdes sont par exemple décrites dans Pure and Appl. Chem. 51, 535 (1979) et dans les références bibliographiques qui y sont citées. L'invention est encore illustrée par les exemples suivants. Les produits ont été identifiés par des méthodes spectroscopiques et par comparaison avec les données de la littérature. Les configurationsabsolues ont été déduites des valeurs de / 7D et de leur comparaison avec les données tirées de Acta Chem. Scand. 27, 2107 (1973), de Acta Chem. Scand. B32, 391 (1978) et de Helv. Chem. Acta 63, 1451 (1980). Les composants obtenus à partir du mélange de produits sont généralement des mélanges non racémiques des antipodes optiques concernés; la configuration absolue indiquée désigne dans ces cas les antipodes obtenus de façon prépondérante. Pour la conservation ou pour la culture des microorganismes, on a utilisé les milieux suivants milieu A (pour la conservation des souches et des col lections de spores) en g/l dans de l'eau désio nisée peptone pancréatique 5 g extrait de levure 5g 'extrait de malt 5 g D-(+)-glucose monohydraté 20 g bacto-agar 20 g milieu B : (milieu de croissance) en g/l dans de l'eau dés ionisée cornsteep liquor (eau de trempage du mais) 10 g D-(+)-glucose monohydraté 30 g KH2PO4 îg K2HPO4 2g MgSO4. H2O 0,5 g NaNO3 2g Fe2(SO4)3.7 H2 Q,02 g KCl 0,5 g La culture du microorganisme a été effectuée sur une culture inclinée avec du milieu A à 250C pendant 4 jours. Exemple 1 Biotransformation de 1' 4-ionone avec de la biomasse lavée de Mucor plumbeus DSM 5613 Un fermenteur de 7,5 1 contenant 6 l de milieu B a été inoculé avec une suspension de spores (environ 5.107 spores) de Mucor plumbeus DSM 5613. Après culture à 270C sous aération pendant 72 heures, une partie de la biomasse a été filtrée, plusieurs fois lavée avec une solution saline à 0,9 % et mise en suspension dans 6 ballons agités contenant chacun 50 ml d'un tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,2 et 25 mg d' -ionone racémique (120 g de biomasse humide/l). Après incubation à 270C avec une table à agitation rotative (300 rpm) pendant 4 jours, les mélanges d'incubation ont été réunis et extraits trois fois avec chaque fois 150 ml d'acétate d'éthyle.La phase organique a été séchée sur du sulfate de sodium, filtrée et évaporée sous vide. L'huile restante (170 mg) a été séparée chromatographiquement sur du gel de silice avec diéthyléther/cyclohexane (1:1), les composants suivants ayant été obtenus a) 4,5 mg d' -ionone non transformée; b) 22,5 mg de (6S)-3-oxo-t -ionone; 21 21 = 66,60 (c=1,45, CHCl3); RMN 1H (ppm, CDCl3) : 6,68 (dd, J1-9,5Hz, J2=16Hz, 1H), 6,15 (d,J=16Hz, 1H), 5,98 (s, 1H), 2,72 (d,J=9Hz, 1H), 2,25 (s, 3H), 2,22 (système AB ,2H), 1,58 (s, 3H), 1,08 (s, 3H), 0,98 (s, 3H); RMN 13C (ppm, CDCl3) : 198,0, 197,3, 158,9, 143,4, 133,7, 126,9, 55,4, 47,4, 36,6, 27,9, 27,5, 27,3, 23,4; c) 78 mg de (3S,6S)-3-hydroxy-&alpha;-ionone); [&alpha;]D21 = -40,5 (c=1,05, CHCl3);RMN H (ppm, CDCl3) : 6,50 (dd, J1= 10Hz, J2=î6Hz, 1H), 6,05 (d,J=16Hz, 1H), 5,60 (s, 1H), 4,21 (s, large), 2,46 (d,J=10Hz, 1H), 2,22 (s, 3H), 1,58 (système AB, 2H), 1,58 (s, 3H), 0,98 (s,3H), 0,85 (s, 3H); R4N 13C (ppm, CDCl3) : 197,3, 147,0, 135,1, 133,5, 125,9, 65,3, 54,3, 43,8, 33,8, 29,3, 27,1, 24,7, 22,5; d) 7,5 mg de (3R,6R,9RS)-3-hydroxy-M -ionol; [&alpha;]D21 +162,80, c=0,78, CHCl3);RMN 1H (ppm, CDCl3) : 5,50 (dd, J1=6,5Hz, J2=15,5Hz, 1H), 5,45 (s, 1H), 5,30 (dd, J1=9,5Hz, J2=15,5Hz, 1H), 4,25 (m, J=6Hz, 1H), 4,15 (s, 1H), 2,25 (d, J=10Hz, 1H), 1,75 (système AB, 2H), 1,58 (s, 3H), 1,22 (d, J=6,5Hz, 3H), 0,92 (s, 3H), 0,76 (s, 3H) ; e) 10,5 mg de (6R,9RS)-3-oxo-&alpha;-ionol; [&alpha;]D21=+177,3 c=0,82, CHCl3); RMN 1H (ppm, CDCl3) : 5,85 (s, 1H), 5,65 (dd, J1=6Hz, J2=15Hz, 1H), 5,50 (dd, J=8,5Hz, J2=15Hz, 1H), 4,30 (m, J=6Hz, 1H), 2,48 (d, J=9 Hz, 1H), 2,17 (système AB,2H), 1,90 (s, 1H), 1,25 (d, J=6Hz, 3H), 0,98 (s, 3H), 0,90 (s, 3H). Exemple 2 3(Lotransformation de l'M -ionone avec de la biomasse lavée de Mucor plumbeus DSM 5614 25 flacons de 250 ml contenant chacun 100 ml du milieu B ont été inoculés avec des spores de Mucor plumbeus DSM 5614 fraîchement récoltées et incubés à 270C avec une table à agitation rotative (270 rpm). Après 72 heures, le mycélium a été filtré (215 g de biomasse humide), lavé plusieurs fois avec une solution saline à 0,9 % et incubé dans 15 ballons de 250 ml contenant chacun 0,6 % (poids/vol.) de Tween 80 R (polyoxyéthylène sorbitanemonooléate) dans 100 ml d'un tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,2 et 0,2 g d' -ionone racémique (quantité totale 3 g) 7 jours à 270C avec une table à agitation rotative (270 rpm). Les mélanges d'incubation ont été réunis et extraits trois fois avec de l'acétate d'éthyle.La phase organique a été séchée sur du sulfate de sodium, filtrée et évaporée sous vide, d'où l'on a obtenu 4,9 g d'une huile brune. 1,7 g de l'huile obtenue a été séparée chromatographiquement sur du gel de silice avec acétone/chlorure de méthylène (5:95), les composants suivants ayant été obtenus a) 0,135 g de (R)-&alpha;-ionone, [&alpha;]D20=+4,1, CHCl3); b) 0,120 g d'un mélange de produits; c) 0,245 g de (6R)-3-oxo-&alpha;-ionone, 7&num;D20=+î3,30 (c=3,4, CHCl3); d) 0,460 g de (3S,6S)-3-hydroxy-&alpha; -ionone, pt7D20= -17,10 (c=4,2, CHC13), environ 6 % e.e.; e) 0,086 g de 3-oxo-&alpha;-ionol. Exemple 3 Influence de la concentration en substrat et du temps d'in- cubation Le Mucor plumbeus DSM 5614 a été cultivé dans des flacons agités puis le mycélium lavé a été incubé de fa çon analogue à l'exemple 1 dans un tampon phosphate de potassium b,1 M pH 7,2 en présence d'&alpha;-ionone. On a fait varier la concentration en substrat (&alpha;-ionone) et les temps d'incubation et on a étudié leur influence sur la formation du trans-3-hydroxy-t -ionol, du cis-3-hydroxy &alpha;;-ionol et du 3-oxo-s -ionol. Après extraction des mélanges d'incubation avec l'acétate d'éthyle, on a analysé les produits obtenus par chromatographie gazeuse sur une colonne capillaire DBWAX R (30 m x 0,2 mm) à 200 C (gaz entraîneur : hélium). Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1. Tableau 1 Concentration temps d'in- &alpha;-ionone (3R,6R,9RS)- (3S,6R,9RS)- 3-Oxoen éducte cubation 3-Hydroxy-&alpha;- 3-Hydroxy-&alpha;- &alpha;;-ionol ionol ionol 0,5 g/1 24 h 30,3% 60,6% - 48 h 7,5% 67,2% 16,1% 1,0% 72 h - 58,0% 20,7% 13,1% 96 h - 57,0% 20,2% 17,3% 1,0 g/1 24 h 26,2% 49,5% 7,0% 48 h 12,1% 57,5% 10,1% 72 h 6,0% 63,9% 12,1% 6,0% 96 h 2,5% 63,9% 13,1% 9,1% 1,5 g/1 24 h 71,2% 20,2% - 48 h 54,5% 30,3% - 72 h 51,5% 31,3% 8,5% 96 h 51,4% 32,3% 9,0% 120 h 44,4% 39,8% 6,0% 144 h 27,2% 53,0% - 168 h - 77,7% - 4 - REVENDICATIONS - 1 - Procédé pour la préparation de trans-3-hydroxy -ionone et/ou de trans-3-hydroxy- -ionol, caractérisé en ce que l'on fait fermenter l'OC -ionone avec un champignon filamenteux du genre Mucor. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la fermentation avec une souche de Mucor plumbeus, de préférence avec Mucor plumbeus DSM 5613, DSM 5614, CBS 110.16 ou ATCC 4740. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on effectue la fermentation avec un microorganisme, celui-ci ayant été cultivé en présence d'une substance appropriée pour la stimulation de la biosynthèse des systèmes d'hydroxylation chez les mammifères. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on effectue la fermentation dans une solution tampon ayant un pH 5,5-8,5. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on effectue la fermentation dans une solution tampon phosphate. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on effectue la fermentation dans une solution tampon phosphate a un pH d'environ 7.