Brevet FR2663421A1 — publié le 19911220

La présente invention concerne un procédé permettant, dans des prélèvements biologiques, la mise en évidence d'une forme cryptique d'infection par HIV et le suivi d'un traitement anti-SIDA. I1 est inutile de rappeler le développement considérable du SIDA dans le monde et le fait qu'une issue fatale est, malheureusement, à prévoir dans la très grande majorité des cas. Actuellement, les traitements préventifs de type vaccination sont encore à l'étude, quant aux traitements curatifs type AZT, ils ne font au mieux que reculer l'issue fatale. Le SIDA a son origine dans l'infection par un virus dit HIV dont on connaît différents types et sous-types, HIV1, HIV2, variants BRU, NDK, par exemple. La mise en évidence de l'infection par HIV s'effectue par un dosage immunologique du sang qui permet de savoir si le patient a été en contact avec le virus. Si la réaction immunologique est positive, le patient est dit séro-positif, séro-négatif dans le cas contraire. La séro-positivité ne constitue pas en elle-même un élément suffisant pour dire que le patient développe un SIDA, en effet, un patient séro-positif peut rester asymptomatique pendant un certain temps avant de basculer dans le SIDA, c'est-à-dire présenter l'ensemble des symptomes correspondant, effondrement du système immuntaire et apparition d'infections opportunistes (sarcome de Kaposi). Ainsi, un patient séro-positif présente dans la plupart des cas une infection dans laquelle le virus est latent et ne se multipliera qu'au bout d'un certain temps. L'intérêt de détecter les séro-positifs asymptomatiques est, certes, important, mais, compte tenu des traitements existants qui sont encore essentiellement préventifs, il y a probablement un intérêt plus grand encore à pouvoir éventuellement détecter un état plus précoce de l'infection ou même des états plus sensibles à cette infection. En effet, dans ce cas il est sans doute possible de prendre des dispositions pour limiter les risques de contagion, le développement d'une séro-positivité et, par lâ même, du SIDA. Actuellement, les recherches ont surtout porté sur les différentes protéines du virus et les anticorps correspondants dans le but de mettre en évidence un état pré-séropositif ou état à risque que l'on a nommé parfois "infection cryptique" par la voie immunologique. Une autre possibilité de mise en évidence d'une infection cryptique est la mise en évidence directe des séquences du virus et non plus des produits d'expression de ces séquences, par amplification génique. Ce type de détection par amplification génique présente, toutefois, l'inconvénient d'être délicat de mise en oeuvre. Il est donc intéressant de disposer de "marqueurs" précoces, c est-à-dire de molécules dont la concentration ou les rapports de concentration peuvent être mesurés facilement et être reliés à l'existence d'une infection cryptique ou à l'évolution d'un traitement. La présente invention repose sur la mise en évidence de nouveaux marqueurs de l'infection cryptique par HIV qui sont liés au processus immunitaire mais ne dépendent pas directement de la réaction antigène-anticorps. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour la mise en évidence d'échantillon biologique provenant d'un individu séro-négatif à risque d'infection par le virus HIV, caractérisé en ce que dans l'échantillon biologique on mesure au moins deux des rapports - le rapport ACTH/endorphine qui est inférieur à 0,45, - le rapport ACTH/cortisol total est supérieur à 0,4 x - le rapport cortisol libre/cortisol total est supérieur à 2,5 %, pour déterminer que l'échantillon provient d'un individu à risque d'infection par le virus HIV. Ce procédé peut également être adapté pour suivre l'évolution d'une thérapie anti-virale et/ou de type vaccination. En effet, dans ce dernier cas, le fait que les rapports évoluent en sens inverse, c'est-à-dire que le rapport - ACTH/endorphine devient supérieur à 0,45, - ACTH/cortisol total devient inférieur à 0,4 x - cortisol libre/cortisol total devient inférieur à 2,5 %, peut démontrer le retour à la normale en l'absence de symptome du SIDA. Le taux de cortisol libre mentionné précédemment est le taux de cortisol libre mesuré le matin. Les rapports sont en poids. En effet, les études qui sont à la base de la présente invention ont montré que si le taux d'ACTH et de béta-endorphine ne diffère pas significativement dans les quatre groupes, par contre les groupes SERO+ et SERO- présentent des rapports ACTH/béta-endorphine, ACTH/cortisol total et cortisol libre/cortisol total très similaires et présentent des différences significatives avec les témoins. Les mesures de 1'ACTE, endorphine, cortisol peuvent être effectuées par des procédés connus. En particulier des dosages immunologiques, par exemple des "radio-immuno-assay" (RIA) ou des ELISA. Pour chacun de ces dosages, il conviendra de choisir la sensibilité en fonction des résultats souhaités. Ce type de marqueurs présentent l'avantage considérable de pouvoir être mesuré sur des échantillons sanguins et avec du matériel et des manipulateurs n'ayant pas de technicités particulières à la différence des techniques de type PCR. D'autres caractéristiques du procédé selon l'invention apparaîtront à la lecture de Itexemple ci-après. EXEMPLE L'étude a porté sur trois groupes d'homosexuels de sexe masculin. 1 - des patients séro-positifs symptomatiques SIDA 2 - des patients séro-positifs asymptomatiques 3 - des partenaires séro-négatifs du groupe 2. Un groupe témoin d'hétérosexuels séro-négatif sert de référence. Les groupes se répartissent comme suit 1 - 13 témoins séro-négatifs hétérosexuels 2 - 19 SIDAS avérés homosexuels 3 - 15 séro-positifs partenaires homosexuels 4 - 15 séro-négatifs partenaires homosexuels Deux prélèvements sont pratiqués le même jour sur chaque sujet à 8 heures et à 16 heures pour doser 1 - ACTH 2 - cortisol 3 - béta-endorphines La méthodologie par radio-immuno-essai a été chosie pour le dosage du taux de béta-endorphines, ACTH et cortisol. Les techniques pour ces dosages neuro-hormonaux sont des immuno-analyses utilisant un anticorps spécifique, un antigène marqué (I125,H3) et un système de séparation de l'Ag lié à l'Ac et de l'Ag libre. Les éléments permettant ces dosages sont largement disponibles et il existe également des trousses permettant ce type de dosage qui sont utilisées couramment pour la mise en évidence des désordres endocriniens. Les variations des taux physiologiques normaux sont importants dans le groupe témoins et dans les trois autres groupes considérés. I1 y a un écart-type important. Néanmoins, le test paramétrique de l'analyse de la variance à un facteur (Lest-Significant-difference), autorise à considérer les valeurs observées comme significatives et à poursuivre par le test Wilson et le test de Wilcocson. En parallèle, ces résultats ont été soumis à une autre analyse statistique, à savoir les tests non-paramétriques de Mann et Whitney. Les résultats mesurés sont rassemblés dans le tableau 1. Ces résultats ont été également analysés en terme de droites de régression TABLEAU 1 Temoins SIDAS SERO + SERO n = 13 n = 19 n = 15 n = 15 ACTH (pg/ml) 16,9#14 19,7#8 17,5#5 14,7#6 Béta-endorphine (pg/ml) 35,2#30 48,4#21 42,0#17 40,0#15 Cortisol total matin (ng/ml) 68,0#23 67,6#35 34,0#22 32,5#12 Cortisol libre (ng/ml) 0,65#0,5 1,13#1 1,35#1 1,83#1,6 ACTH/béta-endorphine 0,69#0,41 0,44#0,16 0,42#0,3 0,41#0,26 ACTH/cortisol total 10-3 0,25# 0,29# 0,52# 0,54# Les concentrations plasmatiques moyennes (matin et soir) de 1'ACTE, de la béta-endorphine ne diffèrent pas significativement dans les quatre groupes. Le cortisol total des SERO+ et SERO- présente des concentrations significativement inférieures à celles des SIDAS et témoins, tant le matin que le soir. Les sécrétions hypophysaires de béta-endorphines et surrénaliennes de cortisol étant toutes deux en relation avec 1'ACTE, les résultats ont été analysés en termes de droites de régression et de rapports ACTH/béta-endorphine et ACTH/cortisol total journalier, et sur la base des corrélations inter-individuelles des deux couples de valeurs. a - Le rapport ACTH/béta-endorphine Le rapport ACTH/béta-endorphine montre pour les témoins comme pour les SIDAS une corrélation positive significative (R = 0,57 et R = 0,68 respectivement). Mais le rapport moléculaire ACTH/béta-endorphine passe de 1/2 chez les témoins à 1/10 chez les SIDAS. Pour les deux groupes SERO+ et SERO- le couplage entre ACTH et béta-endorphine est indiqué par l'existence d'une corrélation inter-individuelle positive entre ces deux valeurs, mais ce couplage est absent par rapport aux témoins. Les rapports moyens ACTH/béta-endorphine montrent dans les trois groupes SERO+ et SERO- et SIDAS une élévation moyenne relative de la béta-endorphine par rapport à 1'ACTE. Les droites de régression objectivent pour les SIDAS l'élévation de la béta-endorphine et pour les homosexuels SERO+ et SEROla chute de 1'ACTH. Chez la majorité des SERO - la valeur ACTH/béta-endorphine est inférieure à 0,45, si l'on compare les valeurs journalières. b - Le rapport ACTH/cortisol total Le couplage ACTH/cortisol total s'exprime chez les témoins par une corrélation inter-individuelle positive (R = 0,55) qui n'est pas retrouvée chez les SIDAS, SERO+ et SERO-. En termes de rapports, les rapports moyens ACTH/cortisol total des témoins (0,00035) et des SIDAS (0,00040) ne sont pas significativement différents. I1 faut rappeler que les SIDAS sont en stress chronique, avec un taux élevé de cortisol. En revanche, ces rapports sont augmentés chez les SERO+ et SERO- (0,00073 et 0,00071 respectivement) par une chute du cortisol relatif à 1'ACTE. Cette chute est objectivée par les droites de régression. Chez la majorité des SERO - la valeur ACTH/cortisol total est supérieure à 0,4 x 10 3, le cortisol total qui est utilisé pour ce rapport est le cortisol du matin. Ceci est important car le cortisol varie notablement entre le matin et le soir. c - Sur le taux de cortisol libre La proportion du cortisol libre par rapport au cortisol total est augmentée chez les SERO+ et les SERO-, elle ne l'est pas chez les SIDAS et témoins. Pour SIDAS et témoins cette proportion est de 1,46 et de 2,5 %. Pour les SERO+ et les SERO- la proportion passe à 4,54 et 7,03 XO, c'est-à-dire, en général, très supérieure à 2,5 %. REVENDICATIONS 1) Procédé pour la mise en évidence d'échantillon biologique provenant d'un individu séro-négatif à risque d'infection par le virus HIV, caractérisé en ce que dans l'échantillon biologique on mesure au moins l'un des rapports - le rapport ACTH/endorphine qui est inférieur à 0,45 - le rapport ACTH/cortisol total est supérieur à 0,4 x 10 3 - le rapport cortisol libre/cortisol total est supérieur à 2,5 %. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mesure des taux d'ACTH, d'endorphine et de cortisol est effectuée par radio-immuno-essais. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le taux de cortisol total est le taux de cortisol total mesuré le matin.