Brevet FR2666086A1 — publié le 19920228

Fluorures d'acides aminés et leur utilisation pour la préparation des peptides L'invention concerne des fluorures d'acides aminés et leur utilisation pour la préparation des peptides. On sait que pour préparer des peptides, il faut coupler un acide aminé avec un autre acide ou un autre peptide. Pendant le couplage une seule fonction acide et une seule fonction amine devant réagir il est par conséquent nécessaire d'une part d'activer ces deux fonctions et d'autre part de protéger les fonctions qui ne doivent pas réagir. Parmi les solutions proposées pour obtenir la réaction de couplage l'une d'elles consiste à remplacer l'acide aminé par un de ses dérivés actifs. Comme dérivés actifs d'acides aminés qui ont été utilisés on peut citer des azides, des chlorures, des anhydrides mixtes ou symétriques et des esters. La difficulté pour trouver un bon dérivé actif réside dans le fait qu'il doit être à la fois suffisamment réactif et suffisamment stable. Les azides, les anhydrides mixtes ou symétriques ont des durées de vie limitée. Les esters actifs sont stables mais ont une réactivité modérée. Ce sont le plus souvent des esters aromatiques et les phénols qui se forment pendant la réaction de couplage sont généralement difficiles à éliminer. Les chlorures d'acides aminés sont très difficiles à préparer au moyen de réactifs peu courants ou non sélectifs et des réactions secondaires peuvent se produire. De plus ils sont très instables car ils s'hydrolysent et se cyclisent facilement. I1 est par conséquent nécessaire la plupart du temps de les utiliser en milieu anhydre comme indiqué dans la publication principes of Peptide Synthesis par M. Bodansky, pages 10 et 11. Certains tels que les chlorures de N-tertio-butyloxycarbonyl-acides aminés n'ont jamais pu être obtenus. I1 existait donc un besoin de nouveaux dérivés actifs d'acides aminés qui ne présentent pas les inconvénients des dérivés connus. On a maintenant trouvé de nouveaux dérivés actifs d'acides aminés qui sont des fluorures d'acides aminés N:-protégés de formule dans laquelle R1 représente le groupe benzyloxycarbonyle ("Z") ou 9fluorénylméthoxycarbonyle ("Fmoc"), R2 représente un atome d'hydrogène ou le reste d'un acide aminé et R3 représente un atome hydrogène , le radical méthyle ou forme avec R2 le reste d'un acide aminé. Les fluorures de formule (I) sont des composés inconnus jusqu'ici. Ils présentent une bonne stabilité. Aucune dégradation n'a été constatée après six mois de stockage à la température ambiante. Si une dégradation partielle intervient par exemple sous de mauvaises conditions, il se forme de l'acide-aminé et de l'acide fluorhydrique qui ne sont pas gênants dans la préparation des peptides. Le reste de l'acide aminé représenté par R2 éventuellement lié avec R3 est le reste des acides aminés connus naturels ou synthétiques sous forme L, D ou DL notamment tels que ceux décrits dans Houben-Weyl vol. XV, 1974, Syntheses von Peptiden. Dans les acides aminés les plus courants, ce reste est généralement constitué d'un radical aliphatique comportant de 1 à 10 atomes de carbone ramifié ou non qui peut porter comme substituants des radicaux aryles substitués ou non, hétérocycliques saturés ou non, aromatiques ou non, des groupes fonctionnels OH, SH, - NH2, =NH,-COOH, -S-S- qui généralement doivent être protégés comme il est habituel dans la chimie des peptides comme indiqué par exemple dans les publications précédemment citées. Les fonctions OH, SH peuvent par exemple être protégées sous forme d'éthers ou de thioéthers en particulier d'alkyle ou de benzyle, les fonctions amines sous forme de carbamates, en particulier de benzyle ou de 9-fluorénylméthyle, les fonctions acide sous forme d'esters d'alkyle. Comme fluorures d'acides Na-protégés on peut en particulier citer les fluorures des acides aminés tels que la glycine, valine, alanine, leucine, isoleucine, phénylalanine, sérine, thréonine, lysine, 6-hydroxylysine, arginine, acide aspartique, asparagine, acide glutamique, glutamine, cystéine, cystine, méthionine, tyrosine, thyroxine, proline, hydroxyproline, tryptophan, histidine qui sont Na-protégés par le groupe Z ou "Fmoc". Les fluorures de formule (I) peuvent être préparés simplement par réaction de l'acide aminé Na-protégé sur le fluorure de cyanuryle selon le schéma réactionnel suivant La réaction a lieu à la température ambiante en présence de pyridine généralement dans un solvant tel que le dichlorométhane ou l'acétonitrile. Le fluorure de cyanuryle est généralement utilisé en quantité comprise entre 1 et 3 équivalent par rapport à l'acide aminé. L'acide cyanurique qui se forme est insoluble dans le milieu et est éliminé aisément par filtration. Les fluorures d'acides aminés sont ainsi obtenus et isolés facilement avec de bons rendements et une excellente pureté. En plus de leur bonne stabilité, on a trouvé que ces fluorures d'acides aminés Na-protégés pouvaient réagir très facilement sur la fonction amine d'un autre acide aminé ou d'un peptide en formation sans qu'il soit nécessaire d'activer la fonction amine. L'invention concerne par conséquent également un nouveau procédé de préparation des peptides caractérisé en ce que l'on fait réagir un fluorure d'acide aminé N:-protégé de formule (I) dans laquelle R1, R2 et R3 sont tels que définis précédemment, sur un acide aminé ou un peptide dans un solvant en présence d'un agent de fixation de l'acide fluorhydrique. Les acides aminés ou les peptides qui sont mis à réagir avec le fluorure sont choisis parmi les acides aminés naturels ou synthétiques sous forme L, D ou DL et les peptides préparés à partir de ces acides aminés. En particulier ce sont les acides aminés cités précédemment ou les peptides qui ont la fonction amine libre et la fonction acide protégée par un des groupes protecteurs habituels ou par fixation sur une résine insoluble comme il est connu (notamment par Principle of Peptide Synthesis par M. Bodansky). La réaction peut avoir lieu par conséquent en phase homogène ou hétérogène liquide-liquide ou liquide-solide. Comme solvants qui conviennent pour effectuer la réaction, on peut citer les nitriles tels que par exemple l'acétonitrile, le benzonitrile, les cétones comme par exemple l'acétone, la méthyléthylcétone, la méthylisobutylcétone, les éthers cycliques ou non tels que par exemple le tétrahydrofuranne, le dioxanne, l'éther de tertiobutyle et de méthyle, les hydrocarbures chlorés tels que par exemple le dichlorométhane, le dichloroéthane, le chloroforme, les amides comme par exemple la diméthylformamide, la diméthylaacétamide. On préfère généralement que les solvants soient anhydres. Cependant il est possible d'utiliser une phase aqueuse dans un système biphasique, par exemple pour dissoudre une base. La présence d'un agent de fixation de l'acide fluorhydrique est nécessaire pour éliminer l'acide qui se forme au cours de la réaction. Tous les moyens habituels peuvent être employés. L'accepteur d'acide peut par exemple être une base organique comme une amine tertiaire telle que la triéthylamine, la diisopropyléthylamine ou la N-méthylmorpholine ou une base minérale telle que le carbonate ou bicarbonate de sodium, la potasse ou la soude, en solution aqueuse. En général on utilise de un à deux équivalents de la base par équivalent d'acide. Le fluorure d'acide aminé et l'acide aminé ou le peptide sont généralement mis à réagir dans des proportions stoechiométriques. Un excès de l'un ou l'autre de ces composés de départ peut également être utilisé.En particulier lorsque l'acide aminé est fixé sur un support solide, on peut ajouter jusqu'à 10 équivalents du fluorure d'acide aminé NQ-protégé par équivalent d'acide aminé, généralement la quantité de fluorure est voisine de 5 équivalents. La température de la réaction est en général comprise entre 10' et 50"C, de préférence entre 20' et 30ex. Le temps de réaction quant à lui varie le plus souvent entre 10 minutes et 5 heures. Les peptides sont récupérés après les traitements habituels. Grâce au nouveau procédé selon l'invention des dipeptides ou des peptides supérieurs très utiles notamment dans l'industrie pharmaceutique sont préparés aisément et rapidement en phase liquide ou solide avec de bons rendements et au moyen de réactifs faciles à obtenir et stables. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois la limiter. ExemPle 1 Préparation du fluorure de N-(9-fluorénvlméthoxvcarbo- nyl )qlvcine. Dans un ballon de 500 ml, on place 2,75 g (0,02 mole) de fluorure de cyanuryle dissous dans 50 ml de dichlorométhane anhydre et on ajoute goutte à goutte une solution de 6,0 g (0,02 mole) de N-(9-fluorénylméthoxycarbonyl)glycine et 1,59 g de pyridine dans 250 ml de dichlorométhane. On agite 4 à 5 heures à 25ex, puis on filtre le précipité, on ajoute 5 ml d'eau glacée au filtrat et on agite 5 minutes. On filtre de nouveau et on sèche le filtrat sur du sulfate de magnésium. On évapore le solvant et on obtient 5,0859 (rendement : R=85 %) du fluorure attendu sous forme d'une poudre blanche. Point de fusion : F=133-134"'C, IR V(C=0) : 1860 cm-t. Exemple 2 Préparation du fluorure de N-benzyloxycarbonvlglycine. On ajoute goutte à goutte une solution de 4,0 g (0,019 mole) de N-benzyloxycarbonylglycine et de 1,5 g de pyridine dans 20 ml d'acétonitrile à une solution de 2,1 g (0,015 mole) de fluorure de cyanuryle dans 24 ml d'acétonitrile. On agite 4 heures à 25"C. On filtre. On reprend avec 100 ml de chloroforme et on lave avec 25 ml d'eau glacée. On sèche la phase organique sur du sulfate de magnésium et on évapore les solvants pour obtenir 3,55 g (R=88 %) du fluorure attendu sous forme d'un solide blanc, F = 50-51"C, I.R. f(C=0) : 1860 cm-t. Exemple 3 On prépare divers fluorures d'acides aminés selon les méthodes décrites dans les exemples 1 ou 2. Les résultats sont indiqués ci-dessous Acide Méthode Rdt % F C IR utilisé Z-Ala 2 80 liq 1850 - 4,8 (3 AcOEt) Z-Leu 2 80 liq 1850 -12,2 (1,6 AcOEt) Z-Phe 1 70 80-83 1845 -30,5 (1,3 AcOEt) Z-Phe 2 80 80-83 1845 -30,5 (1,3 AcOEt) Z-Val 2 75 liq 1850 + 7,8 (3 AcOEt) Fmoc-Ala 1 85 108 1850 - 1,07 (2 AcOEt) Fmoc-Ala 2 85 108 1850 - 1,07 (2 AcOEt) Fmoc-Gly 2 91 134-135 1850 Fmoc-Ile 2 81 113-114 1845 +13,1 (0,6 AcOEt) Fmoc-Leu 2 92 95-96 1850 - 6,3 (1 AcOEt) Fmoc-Lys (Boc) 2 80 - - Fmoc-Met 2 80 122-123 1850 Fmoc-Phe 2 75 110-111 1850 -22,8 (0,6 AcOEt) Fmoc-Pro 2 91 75-77 1850 -26,2 (0,9 AcOEt) Fmoc-Val 2 85 112-113 1845 + 8,5 (1,85 AcOEt) Fmoc-Tyr (OBzl) 2 80 128-130 1850 +24,61 (1 AcOEt) Exemple 4 SYnthèses de peptides On prépare divers dipeptides selon les méthodes A ou B suivantes Méthode A On dissout (et/ou suspend) 4,5 mmoles de fluorure d'acide aminé Na-protégé, 4,9 mmoles de chlorhydrate de l'ester de l'aciaminé dans 13 ml d'acétonitrile. On ajoute à ce mélange 10 mmoles de N-méthylmorpholine diluée dans 14 ml d'acétonitrile. On agite 4 h à 25"C. On reprend à l'acétate d'éthyle et lave la phase organique successivement avec HCl dilué, du bicarbonate de potassium et de l'eau. On sèche sur du sulfate de magnésium et on évapore à sec puis on cristallise. Méthode B Dans un tricol contenant l'acide aminé estérifié (1 mmole) en solution dans le dichlorométhane, le fluorure d'acide aminé (1,2 mmole) en solution dans CH2C12 et une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 10 % (10 ml) sont additionnés goutte à goutte, simultanément à l'aide de 2 ampoules de coulée. La solution est maintenue sous agitation magnétique et à température ambiante. La réaction est suivie par 0CM sur plaque de silice (éluant CHCl3/ MeOH :9/1 ou 7/3). Cela permet de constater la disparition de l'ester qui est en défaut. L'acide aminé bloqué par le groupement Fmoc est visible en UV (256 nm) alors que l'ester est révélé grâce à la ninhydrine. La réaction est arrêtée quand il n'y a plus d'ester ce qui demande entre 1 h et 2 h. Alors le mélange réactionnel est traité. Tout d'abord on sépare les phases aqueuses et organiques.Ensuite la phase organique est lavée avec de l'acide chlorhydrique 1 N (2 fois) afin d'éliminer la base restante. Des lavages à l'eau permettent de revenir à un pH neutre (6,5). Enfin un traitement en milieu basique (carbonate de potassium 1M) permet d'éliminer l'excès de fluorure d'acide aminé (qui est sous forme hydrolysé : Fmoc-R3N CHR2-COO-). La phase organique est finalement séchée sur du sulfate de magnésium et évaporée avec un évaporateur rotatif. Le produit obtenu est alors séché à l'étuve (50") pendant 5 h. Les résultats sont indiqués ci-dessous Dipeptide Méthode Rdt % F "C préparé Z-Gly-Phe-OMe A 82 huile + 34,2 (1 AcOEt) Z-Gly-Ala-OMe A 60 huile - 5,6 (1 AcOEt) Z-Ala-Gly-OEt A 50 95-96 Z-Val-Phe-OEt A 84 128-130 Z-Val-Ala-OEt A 74 159-160 - 47,3 (1,6 MeOH) Z-Leu-Phe-OMe A 95 79-80 - 26,1 (1,3 MeOH) Z-Phe-Ala-OMe A 91 128-130 - 22,3 (1,25 EtOH) Fmoc-Ala-Ala-OMe B 87 195-196 - 3,07 (0,63 AcOH) Fmoc-Phe-Phe-OEt B 86 171-173 + 18,5 (0,97 CH2C12) Fmoc-Ile-Pro-OMe B 77 63-65 - 59,1 (0,28 CH2C12) Exemple 5 Synthèse en phase solide de Leu-Ala-Val-Gly On place dans un réacteur muni d'un verre fritté 4,0 g de résine 4-(hydroxyméthyl) phénoxyméthyl-copoly(styrène-1S-divinylben- zène) contenant 0,78 mmole/g de sites actifs.On lave cette résine 2 fois 1 min. avec CH2Cl2 (10 mil), 1 min. avec une solution à 5 % de diisopropyléthylamine dans CH2C12, puis 4 fois 1 min. avec CH2C12(10 ml). On traite par une solution de 2,80 g (9,36 mmoles) de Fmoc-Gly-F, 1,2 g (9,36 mmoles) de diisopropyléthylamine et 0,114 g (0,936 mmoles) de diméthylaminopyridine (DMAP) dans 25 ml de dichlorométhane pendant 2 heures. On lave la résine 5 fois 1 min. avec CH2C12 (10 ml) et on traite la résine par une solution de 1,5 g (15,6 mmoles) d'anhydride acétique et 189 mg de DMAP dans 25 ml de dichlorométhane pendant 30 min. On lave la résine 3 fois i min. avec CH2C12 (10 ml), 5 fois i min. avec de la diméthylformamide (DMF) (10 ml), 1 fois 3 min. puis 1 fois 7 min. avec une solution à 20 % de pipéridine dans la DMF (10 ml), 3 fois 1 min. avec la DMF et enfin 7 fois 1 min. avec CH2C12 (10 ml). On fait réagir la résine 20 min. avec une solution de 3,17 g (9,36 mmoles) de Fmoc Val-F et 1,2 g (9,36 mmoles) de diisopropyléthylamine dans 25 ml de dichlorométhane puis on lave 5 fois 1 min. avec CH2Cl2 (10 ml), 5 fois 1 min. avec de la DMF (10 ml), 1 fois 3 min. puis 1 fois 7 min. avec une solution à 20 % de pipéridine dans la DMF (10 ml), 3 fois 1 min. avec la DMF et enfin 7 fois 1 min. avec CH2C12 (10 ml). On recommence alors les opérations avec Fmoc-Ala-F puis Fmoc-Leu-F. Après le dernier lavage, on traite la résine 1 heure avec 20 ml d'acide trifluoroacétique à 55 % dans le dichlorométhane. On filtre, on évapore le solvant, on reprend à l'eau, on évapore à nouveau et on obtient 1,2 g (R=95 %) de Leu-Ala-Val-Gly à 99 % de pureté par HPLC. REVENDICATIONS 1) Fluorures d'acides aminés de formule dans laquelle R1 représente le groupe benzyloxycarbonyle ou 9-fluo rényl méthoxycarbonyl e, R2 représente un atome d'hydrogène ou le reste d'un acide aminé et R3 représente un atome d'hydrogène, le radical méthyle ou forme avec R2 le reste d'un acide aminé. 2) Fluorures d'acides aminés selon la revendication 1 caractérisés en ce que R2 seul ou lié à R3 représente le reste d'un acide aminé choisi parmi la glycine, valine, alanine, leucine, isoleucine, phénylalanine, sérine, thréonine, lysine, o-hydroxylysine, arginine, acide aspartique, asparagine, acide glutamique, glutamine, cystéine, cystine, méthionine, tyrosine, thyroxine, proline, hydroxyproline, tryptophan, histidine. 3) Procédé de préparation des peptides caractérisé en ce que l'on fait réagir un fluorure d'acide aminé Na-protégé de formule (I) dans laquelle Rt, R2 et R3 sont tels que définis dans les revendications 1 ou 2, sur un acide aminé ou un peptide, dans un solvant en présence d'un agent de fixation de l'acide fluorhydrique. 4) Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la fonction acide de l'acide aminé ou du peptide est protégée par un groupe protecteur habituel ou par fixation sur une résine insoluble. 5) Procédé selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce que la réaction a lieu en présence d'un solvant choisi parmi les nitriles, les cétones, les éthers cycliques ou non, les hydrocarbures chlorés et les amides. 6) Procédé selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce que l'agent de fixation de l'acide fluorhydrique est une base organique telle qu'une amine tertiaire ou une base minérale telle qu'une solution aqueuse de carbonate ou bicarbonate de sodium, de potasse ou de soude. 7) Procédé selon la revendication 4, 5 ou 6 caractérisé en ce que la température de la réaction est comprise entre 10'C et 50 C, de préférence entre 200C et 30 C.