Brevet FR2671097A1 — publié le 19920703

ú i La présente invention a pour objet une souche mutante de Xanthomonas campestris, un procédé de fermentation de ce microorganisme pour l'obtention de xanthane, un xanthane non visqueux susceptible d'être produit par ledit procédé. La viscosité des solutions aqueuses de xanthane a conduit à utiliser ce polysaccharide comme épaississant et stabilisant de suspensions dans les industries alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques, dans les peintures et les encres ainsi que pour la récupération assistée du pétrole. Le xanthane est un polymère dont la chaîne principale, qui a la même structure que celle de la cellulose, porte des motifs latéraux trisaccharidiques substitués par des groupes acétates ou pyruvates On sait que selon les souches productrices et les conditions de culture, le polysaccharide produit peut avoir des motifs latéraux plus ou moins modifiés et une masse moléculaire moyenne variable, quoique toujours très élevée Ceci peut entraîner des variations de ses propriétés physiques, notamment de sa viscosité; néanmoins, il n'a jamais été isolé de polysaccharide ayant La structure du xanthane et dont la viscosité des solutions aqueuses soit pratiquement nulle. On a maintenant trouvé qu'une souche de Xanthomonas campestris donnait dans de bonnes conditions de productivité, un xanthane de très faible viscosité. Selon un premier aspect, l'invention concerne la souche de Xanthomonas campestris déposée, selon le traité de Budapest, à la Collection Nationale de Cutture de Microorganismes (CNCM) France le 15 Juin 1990, sous le No 1-956. Cette souche mutante a été sélectionnée sur un milieu Liquide contenant de l'azote minéral comme seule source d'azote ainsi que du glycérol comme seule source de carbone Elle peut être cultivée en milieu liquide synthétique ainsi que sur milieu solide. Le microorganisme se présente sous forme de bâtonnets, et ses colonies jaunes et muqueuses, sur milieu solide, en présence de glucose, ne se distinguent pas de celes de la souche d'origine NRRL B-1459. La souche mutante se distingue par sa croissance rapide sur glycérol comme seule source de carbone, par comparaison à la souche d'origine NRRL B-1459 et à la souche ATCC 31600 qui est capable de croître sur milieu synthétique; elle est résistante à La streptomycine et à l'acide nalidixique et n'assimile pas le lactose. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne un procédé de fermentation de ce microorganisme pour la production de xanthane classique ou non visqueux. Ce procédé d'obtention de xanthane comprend une phase de production qui doit se dérouler en présence de calcium et d'hexamétaphosphate alcalin, de préférence de sodium. Le milieu destiné à la phase de croissance de la souche mutante phase de multiplication du microorganisme comporte de préférence du glycérol comme seule source de carbone; les autres composants dudit milieu sont ceux habituellement rencontrés dans les fermentations de Xanthomonas, que l'homme du métier choisira, à l'aide de quelques essais préalables, pour obtenir une croissance optimale Ainsi à une source d'azote qui peut être minérale, comme un sel d'ammonium, ou plus complexe, on ajoutera des sels fournissant le phosphate, le magnésium, le potassium, le soufre, ainsi que le fer, le calcium et des oligo-éléments. On pourra aussi mettre dans le milieu, un mélange tampon qui fixera le p H vers 7, par exemple à base d'acide 3-morpho Linopropanesulfonique. Le glycérol est assimilé rapidement par la souche mutante, y compris en présence d'un mélange d'acides aminés En l'absence d'autre source de carbone, La production inutile et gênante de xanthane est supprimée, au cours de cette première phase. Une source d'azote convenable sera constituée d'un mélange d'hydrolysat de caséine, d'acide glutamique et d'extrait de levure Par ailleurs, la présence de bore, parmi les oligo-éléments, favorise la croissance du microorganisme Le diluant du milieu de croissance est de l'eau, désionisée pour qu'il n'y ait pas d'interférence avec les ions introduits. Le milieu destiné à La phase de production du xanthane, classique ou non visqueux, par La souche de l'invention, comporte: une source de carbone classique qui conduirait, avec une souche ordinaire, à la production de xanthane visqueux, comme un sucre; une ou plusieurs sources d'azote; des sels fournissant les ions habituels dans les fermentations de ce type, tel que phosphate, magnésium, potassium, soufre ainsi que fer et calcium et une solution d'oligo-éléments. En outre, et c'est une caractéristique de l'invention, le milieu de production contient un hexamétaphosphate alcalin, à une concentration initiale comprise entre 50 et 500 mg/l et de préférence entre 200 et 300 mg/l, ce qui nécessite la présence de 1 mg à 15 mg de Ca++ /1. L'hexamétaphosphate alcalin est avantageusement de l'hexamétaphosphate de sodium. Le diluant du milieu de production est de l'eau désionisée. On préfère comme source de carbone, le fructose, et mieux le glucose; et comme source d'azote, la lysine, seule ou en mélange avec un hydrolysat de caséine. Pour la préparation, selon l'invention, d'un xanthane non visqueux, le milieu doit, pendant toute la fermentation, rester non visqueux, facile à agiter et à aérer, et la fermentation doit être arrêtée dès que la viscosité du milieu commence à croître; en effet, si celle-ci est continuée, du xanthane de viscosité normale apparaît peu à peu dans le milieu, et on peut n'obtenir, après une fermentation prolongée, que du xanthane de viscosité normale. Toutefois, l'addition, dès que la viscosité commence à croître, d'hexamétaphosphate alcalin, à raison de 50 à 200 mg/L de milieu, et de préférence autour de 100 mg/l, permet de suspendre t'augmentation de la viscosité et de prolonger la production du xanthane non visqueux. Ledit hexamétaphosphate intervenant ici est, aussi avantageusement, de l'hexamétaphosphate de sodium. En général, la durée de la fermentation est en moyenne de heures avant de constater l'apparition d'une viscosité dans Le moût de fermentation, cependant, elle peut être continuée pendant 10 heures, et davantage, en faisant une addition d'hexamétha- phosphate dans le milieu. La fermentation peut être arrêtée à tout moment avant l'apparition de viscosité, mais on attend de préférence que la totalité de la source de carbone soit pratiquement consommée. Le milieu en fin de fermentation, n'étant pas visqueux, La séparation des corps cellulaires et des insolubles éventuels est effectuée facilement, par centrifugation, par microfiltration ou par ultrafiltration; dans ce dernier cas, les cellules peuvent être recyclées et la fermentation reprise, après simple addition, dans le milieu o elles sont restées en suspension, des constituants nécessaires du milieu de production. Les solutions de polysaccharide ainsi obtenues sont limpides et peuvent, pour certaines applications, être utilisées telles que. Le polysaccharide peut aussi être isolé, avant ou après séparation des insolubles, par précipitation selon une méthode connue: on ajoute dans le milieu un solvant miscible à l'eau dans lequel le polysaccharide est insoluble tel que l'acétone, l'éthanol ou de préférence l'isopropanol; comme pour une fermentation classique, la présence de faibles concentrations d'ions alcalins ou alcalino-terreux, et notamment de calcium, dans le milieu, entre 50 et 100 m M, améliore la précipitation. Pour certaines applications, par exemple en cosmétique, il peut être souhaitable d'isoler un xanthane non contaminé par des lipopolysaccharides, dont l'activité pyrogène est bien connue Or, on sait que les Xanthomonas étant des bactéries Gram -, des quantités importantes de lipopolysaccharides sont libérées dans le milieu de fermentation; elles pourront être éliminées par précipitation avant celle du polysaccharide par des techniques connues,tel Les que l'addition d'ions alcalinoterreux dans un milieu basique. Pour la préparation, selon l'invention, de xanthane visqueux classique -, on fait produire la souche de Xanthomonas de l'invention dans un milieu contenant un hexamétaphosphate alcalin à une concentration comprise entre 50 mg/l et 500 mg/l, de préférence entre 200 et 300 mg/l, et des ions calcium à raison de 1 à 15 mg de Ca++ /L, et on prolonge la fermentation jusqu'à ce que la viscosité du milieu soit comparable à celle d'un milieu de production usuel, avant d'isoler le xanthane selon les procédés classiques. Un tel procédé est avantageux dans la mesure o le milieu de production est visqueux pendant une durée nettement plus courte que dans une fermentation classique, de même productivité. Le milieu de production, pour l'obtention de xanthane visqueux ou non visqueux, présente les mêmes caractéristiques, à savoir, la présence d'un hexamétaphosphate alcalin de préférence l'hexamétaphosphate de sodium et d'ions calcium. Selon un dernier aspect, l'invention concerne un nouveau xanthane, non visqueux. Par xanthane non visqueux, on entend un produit dont les solutions aqueuses à la concentration de 10 g/L, contenant environ 1 % (p/v) de KCL, ont une viscosité inférieure à 250 m Pa s, mesurée avec un viscosimètre Brookfield, avec un mobile LVT, équipé d'une aiguille 1 ou 2 tournant à 60 tours/minute à 25 C, alors que pour les xanthanes connus, elle est comprise entre 1200 et 1500 m Pa S; la présence de KCL est classique dans les mesures de viscosité du xanthane; elle assure que le résultat est indépendant de la quantité d'ions qui peuvent être introduits avec le xanthane à étudier. Ce xanthane non visqueux est de composition chimique identique aux xanthanes connus en particulier en ce qui concerne les groupes acétates et pyruvates; par contre, la masse moléculaire moyenne du polymère est inférieure à celle des xanthanes visqueux. Par une technique couplant la chromatographie d'exclusion et la diffusion de la lumière laser à faible angle, décrite par exemple dans Carbohydrate Polymers 6, p 477-492 ( 1986), on a déterminé que les masses moléculaires des xanthanes du commerce étaient de 2 x 106 ou plus, tandis que la masse moléculaire moyenne du polysaccharide selon l'invention est de l'ordre de 6 à 7 x 105. Les solutions de concentration 1 à 20 g/l du xanthane non visqueux, selon l'invention, ne deviennent pas visqueuses par chauffage, entre 80 et 120 C et pendant 5 à 30 minutes. Un xanthane non visqueux présentant ces caractéristiques structurelles, n'a jamais été décrit, et l'invention n'est pas limitée au polysaccharide produit par la souche CNCM I-956; elle concerne aussi les polysaccharides non visqueux, ayant la structure chimique du xanthane et qui pourraient être produits par une autre souche mutante de Xanthomonas campestris ou par un microorganisme d'espèce ou de genre différent, éventuellement obtenu par génie génétique, ou encore qui serait préparé par synthèse chimique ou hémisynthèse. Le xanthane non visqueux selon l'invention, ne peut être utilisé seul, dans les applications classiques du xanthane usuel, qui font appel à ses propriétés rhéologiques Toutefois, il peut être mélangé en proportions variables à un xanthane visqueux usuel pour obtenir des compositions de xanthane de viscosités intermédiaires, reproductibles et présentant néanmoins les caractéristiques rhéologiques intéressantes du xanthane, c'est-à-dire, l'indépendance de la viscosité de ses solutions pour une large gamme de température et de p H et sa pseudoplasticité; ces mélanges auront les mêmes applications comme agent épaississant et suspensoide que le xanthane classique, puisque le xanthane non visqueux conserve ses caractéritiques de solubilité. Ces compositions de xanthanes, comme le xanthane non visqueux selon l'invention, pourront être associées aux autres hydrocolloides, tels que carraghénanes, pectines, gélatines, alginates et caroubes, dans leurs applications habituelles, notamment dans l'industrie alimentaire. En outre, le xanthane non visqueux pourra être utilisé pour son pouvoir filmogène, notamment en boulangerie. Enfin, le xanthane non visqueux, selon l'invention, pourra être soumis à des réactions chimiques plus facilement qu'un xanthane visqueux pour donner par greffage ou réticulation des produits utiles. On décrit dans ce qui suit, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. Exemple 1 Obtention du xanthane non visqueux en fermenteur de laboratoire. La souche Xanthomonas campestris mutante CNCM I-956 peut être conservée de façon classique lyophilisée ou en tube congelé à C en milieu aqueux glycérolé à 20 %. a) Phase de croissance. Le milieu de croissance est préparé préalablement: On dissout dans 800 m L d'eau désionisée: Fe SO 4, 7 H 20 ( 0,125 g); Ca CL 2, 2 H 20 ( 0,015 g); Mg SO 4, 7 H 20 ( 0,300 g); K 2504 ( 0,040 g); Na Cl( 0,125 g); acide glutamique ( 3,0 g); extrait de levure ( 1,0 g); hydrolysat de caséine ( 7,5 g), et on ajoute une solution d'oligo-éLéments ( 1 ml). L'hydrolysat de caséine est, par exemple, celui commercialisé par HUMKO SHEFFIELD (USA) sous le nom "Hy-Case, salt free"; la solution d'oligo-éléments est préparée par dissolution dans 900 ml d'eau désionisée de: 10 g de Mn CL 2, 2 g de Zn 504, 7 H 20, 25 mg de Cu 504, 5 H 20, 2 g de Co CL 2, 6 H 20, 0,5 g de H 3 B 03; 180 mg de KI, 1,9 g de Na 2 Mo O 4, 2 H 20, 2,4 g d'AICL 3, 6 H 20, 50 mg de K Cr( 504)2, 12 H 20 et 26 mg de Ni 504, 6 H 20; on ajoute 100 ml d'acide chlorhydrique concentré et on met à l'autoclave à 120 C pendant 30 minutes. Le p H de la solution est amené à 7,4 par addition d'une solution aqueuse de KOH (d = 1,38) avant maintien à 120 C pendant minutes On ajoute ensuite 100 ml d'une solution aqueuse filtrée de glycérol ( 18,4 g) et de K 2 HP 04 ( 1,5 g). Une préculture des souches lyophilisées est effectuée en fiole, agitée à 30 C, dans ce milieu, puis 150 ml de préculture sont introduits dans 1,35 I de milieu dans un fermenteur maintenu entre 280 C et 320 C; le p H est maintenu à 7,4 par addition de Na OH ou H Cl, et Le milieu est aéré par introduction d'air frais sous une légère pression. On poursuit la culture jusqu'à obtention d'environ 8 g de biomasse par litre. b) Phase de production. Le milieu de production est constitué d'une solution dans 800 ml d'eau désionisée d'hydrolysat de caséine ( 1,13 g); Mg 504, 7 H 20 ( 50 mg); Mg CL 2, 6 H 20 ( 85 mg); Ca CL 2, 2 H 20 ( 27 mg); lysine 1 g, dont Le p H a été amené à 7 par addition de KOH avant stérilisation mélangée à une solution dans 100 ml d'eau désionisée de K 2 HP 04 ( 4 g) d'hexamétaphosphate de sodium ( 250 mg) et de glucose ( 45 g). On introduit 150 ml du moût obtenu en fin de phase de croissance dans 1,35 I de milieu de production; durant la fermentation, la température est maintenue entre 28 C et 32 C, le p H à 7; la concentration en glucose a une valeur supérieure à g/l, et le milieu est aéré par introduction d'air frais, sous légère pression. c) Isolement du xanthane non visqueux. On mélange, à 80 C, 4 g du moût de fermentation avec ml d'eau, puis on ajoute 90 ml d'isopropanol; après repos du mélange, on filtre et sèche le solide à 55 C pendant 15 heures. Dans le Tableau I, on a porté le poids de xanthane ainsi isolé par kilo de milieu, ainsi que la viscosité du milieu de fermentation dont il est extrait. Les mesures de viscosité ont été effectuées à 25 C avec un viscosimètre Brookfield, équipé d'un mobile LVT, avec une aiguille 2 ou 3 tournant à 30 tours/minute. TABLEAU I durée de la production Viscosité du moût (m Pa s) 21 h 30 24 h 26 h 30 29 h 31 h 46 h h : Poids de xanthane: : (g/kg): : 10,6: : 11,8: : 14,25: : 14,8: : 15,7: : 26,3: : 27,1: d) Séparation des cellules. 2 g de solide obtenu selon c) sont mis en suspension dans ml d'eau, et le mélange est centrifugé à 12000 g pendant minutes Le culot de centrifugation est séparé, et on précipite Le xanthane par addition d'isopropano L dans La solution Limpide. Exempte 2 Dans une autre fermentation, après 24 heures de production, La viscosité du moût est de 10 m Pa s, et le poids du xanthane de 13,75 g/kg de moût; on ajoute alors 100 mg/I d'hexa- méthaphosphate de sodium dans le moût Dans ces conditions, après heures, la viscosité est de 20 m Pa S et le poids de xanthane de 20,40 g/kg. : : : REVENDICATIONS 1 Souche de Xanthomonas campestris déposée à la CNCM sous le No 1-956. 2 Procédé d'obtention de xanthane caractérisé en ce que l'on cultive la souche de Xanthomonas campestris CNCM I-956 dans un milieu nutritif contenant 50 à 500 mg/L d'un hexamétaphosphate alcalin et 1 à 15 mg/l d'ions calcium. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la phase de croissance du microorganisme a lieu dans un milieu contenant du glycérol comme seule source de carbone. 4 Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on utilise de l'hexamétaphosphate de sodium. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, pour l'obtention d'un xanthane dont la viscosité des solutions aqueuses à 10 g/l, à 25 C, est inférieure à 250 m Pa s, caractérisé en ce que la fermentation est arrêtée lorsque la viscosité du milieu augmente. 6 Procédé selon L'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'on introduit dans le moût de fermentation de à 100 mg d'hexamétaphosphate alcalin par litre de milieu lorsque la viscosité du milieu de fermentation s'accroît. 7 Xanthane dont La viscosité des solutions aqueuses à g/l, à 25 C, est inférieure à 250 m Pa s. t