Brevet FR2671561A1 — publié le 19920717

Procédé et milieu d'identification de bactéries du genre Listeria La présente invention a pour objet un procédé et un milieu d'identi- fication bactériologique, permettant de différencier et/ou identifier les dif- férentes espèces du genre Listeria Plus précisément, l'invention a pour objet principal la différenciation de l'espèce monocytogenes, pathogène, des autres espèces non pathogènes du genre Listeria. Le genre Listeria comprend aujourd'hui sept espèces, dont seule Listeria monocytogenes est pathogène pour l'homme Des germes sont à l'origine d'épidémies sévères chez l'homme, à la suite de contaminations à l'origine alimentaires Dans les aliments (lait et produits laitiers essentiel- lement), deux espèces de Listeria sont principalement isolées: Listeria innocua non pathogène et Listeria monocytogenes pathogène. Ces deux espèces ont de nombreux caractères biochimiques communs, il est en conséquence difficile de les différencier Les tests actuellement utilisés sont les suivants. 1) Le test de la p-hémolyse: ce test repose sur la détermination d'une activité -hémolytique liée à la production par la bactérie d'une substance qui provoque la lyse des hématies (listériolysine) Ce test est exercé sur gélose de sang de mouton ou de cheval, mais la réponse est souvent discrète Ce test est donc peu fiable et s'il permet de différencier les deux espèces princi- palement rencontrées, à savoir L monocytogenes (réponse positive) de L. innocua (réponse négative), il n'est pas spécifique de l'espèce pathogène. 2) Le CAMP-test: ce test est associé au test de la P-hémolyse précédemment décrit Le test est réalisé sur gélose trypticase soja, contenant % d'hématies lavées de mouton La souche r-hémolytique de S aureus CIP 5710 est ensemencée en une strie perpendiculaire aux stries formées par la culture de la souche de Listeria à tester Le renforcement de l'hémolyse du staphylocoque au contact des deux zones indique une réaction positive En pratique, le CAMP-test est une technique lourde à mettre en oeuvre, et, comme l'hémolyse, n'est pas toujours très fiable. La présente invention a donc pour objet principal un mode de diffé- renciation de l'espèce monocytogenes du genre Listeria, particulièrement discriminant, sensible, et relativement peu subjectif. A titre secondaire, la présente invention a pour objet un système complet d'identification des différentes espèces du genre Listeria. Après avoir soumis les sept espèces du genre Listeria à l'épreuve de plus de 500 tests biochimiques différents, se décomposant en 142 tests enzymatiques (peptidases, osidases, phosphatases, estérases, etc) 82 tests de fermentation 278 tests d'auxonogrammes la Demanderesse a abouti à la découverte fondamentale selon laquelle toutes les espèces de Listeria possédaient une activité enzymatique glycine aminopeptidase, à l'exception de l'espèce pathogène L monocytogenes. A partir de cette découverte, la présente invention propose donc un procédé d'analyse bactériologique particulièrement discriminant pour les espèces du genre Listeria et consistant à mettre en contact, sous incubation, l'échantillon à analyser avec un milieu d'identification comprenant un substrat de la glycine aminopeptidase, chromogène ou fluorigène, et susceptible d'être hydrolysé en présence de l'enzyme précité. Toujours à partir de la même découverte, l'invention propose un milieu d'identification bactériologique des espèces du genre Listeria, par exemple conditionné sous forme déshydratée, comprenant un substrat de la glycine aminopeptidase, chromogène ou fluorigène, et susceptible d'être hydrolysé au contact ou en présence de l'échantillon à analyser, pouvant contenir l'espèce L monocytogenes. Aux fins de caractérisation des espèces Listeria autres que monocytogenes, un tel milieu peut aussi comprendre un ou plusieurs substrats de transformation permettant de caractériser l'espèce présente dans l'échan- tillon à analyser Ils sont de préférence choisis parmi les substrats suivants: substrats fermentescibles par les bactéries, c'est-à-dire hydrates de carbone (D-xylose, ribose, rhamnose, tagatose, e -méthyl-D-mannoside, " -méthyl-D-glucoside, mannitol) substrats réductibles par les bactéries tels que nitrates, et de préférence le nitrate de potassium substrats hydrolysables par voie enzymatique tels que substrats de 11 O a -mannosidase. Par substrat chromogène ou fluorigène, on entend tout marqueur dont la molécule, en présence d'au moins un enzyme spécifique, est susceptible d'être hydrolysée ou coupée en deux parties, à savoir une partie inerte, non chromogène ou fluorigène, et une partie chromogène ou fluorigène, pouvant développer une couleur visible à l'oeil nu, ou sous éclairement UV, directement, ou indirectement, c'est-à-dire par action d'un composé chimique complémentaire, dit révélateur. Ainsi le substrat chromogène ou fluorigène peut être choisi parmi les substrats hydrolysables en un produit: directement fluorigène, à savoir le glycine-4-nitroanilide, la glycine- 7-amido-4-méthylcoumarine, la glycine-7-amido-4-trifluorométhylcoumarine, le glycine-2-naphtylamide et le glycine-4-méthoxy-2-naphtylamide directement chromogène, à savoir le glycine-4-nitroanilide, la glycine-7amido-4-méthylcoumarine et la glycine-7-amido-4-trifluorométhylcoumarine, et indirectement chromogène, à savoir le glycine-2- naphtylamide et le glycine-4-méthoxy-2-naphtylamide, auxquels est additionné un révélateur choisi parmi les sels de diazonium du type Fast Blue BB, et le para- diméthylaminocinnam aldéhyde. On obtient ainsi un complexe coloré en présence d'une réaction positive Bien entendu, les substrats ci-dessus ne sont donnés qu'à titre d'exemple, et ne constituent pas une limitation à la présente invention. La concentration du substrat de la glycine aminopeptidase introduit dans le milieu, varie de préférence entre 0,01 m M et 10 m M. Le milieu selon l'invention comprend un système tampon choisi parmi les tampons Tris, phosphatés et milieux peptonés Il permet d'ajuster le p H du milieu à une valeur comprise entre 6 et 9. Selon une formulation particulière du milieu de l'invention, le milieu contient du chlorure de sodium, pour une teneur de préférence comprise entre 0 et 10 g Il peut également contenir au moins un activateur de la glycine aminopeptidase, en quantité préférentiellement comprise entre 0 et 100 mg pour 1 litre de milieu et choisi de préférence parmi les cations bivalents Mg 2 +, Ca 2 +, Mn 2 +, Selon cette formulation particulière, le milieu peut contenir une solution de Mn C 12 ou Mn SO 4, de préférence à raison de 30 mg/l de milieu. La préparation du milieu selon l'invention, la mise en oeuvre du procédé et les avantages sont à présent illustrés par les exemples suivants. EXEMPLE 1 Préparation d'un milieu selon l'invention Une formulation préférentielle du milieu est la suivante glycine-2- naphtylamide 0,65 g trizma base 6,06 g Na Cl 5, 00 g eau distillée 1 1 HCI qsp p H 8 La formulation précédente est déshydratée dans des puits de plaque de microtitration par séchage ventilé à 371 C pendant 24 heures Le volume de milieu à évaporer est de 100 microlitres par puits Les milieux ainsi préparés sont conservés sous déshydratant, à l'obscurité à + 41 C jusqu'à leur utilisation. EXEMPLE 2 Mise en oeuvre du procédé selon l'invention La mise en oeuvre ci-dessous est donnée à titre d'exemple Il est évident qu'elle peut subir de nombreuses variantes. A partir d'un isolement sur gélose Columbia au sang de mouton ( 5 %), on réalise une suspension de la souche de Listeria à étudier, dans de l'eau distillée stérile Cette suspension est ajustée au point NI 4 de l'échelle de McFarland Cent microlitres de cette suspension sont introduits dans un puits de la plaque de microtitration contenant la formulation déshydratée décrite selon Exemple 1 Après une incubation de 4 heures à 371 C, une goutte de réactif Fast Blue BB est ajoutée au milieu réactionnel pour détecter la présence de 2-naphtylamine libre Le développement d'une coloration orange indique une réaction positive. EXEMPLE 3 Utilisation du milieu selon l'invention pour différencier les deux espèces Listeria, L monocytogenes et L innocua La mise en oeuvre du procédé selon Exemple 2, est appliquée à la différenciation des souches suivantes 41 souches de L monocytogenes 33 souches de L innocua. Les résultats obtenus ont été les suivants, exprimés en nombre de souches positives: L monocytogenes: 0/41, soit 0 % L innocua: 33/33, soit 100 % Cet exemple met en évidence la spécificité du milieu et sa fiabilité résultant d'une observation qui ne prête à aucune confusion. EXEMPLE 4 Utilisation d'un milieu selon l'invention en combinaison avec d'autres milieux de détection pour identifier les espèces du genre Listeria Les milieux de détection choisis, associés au milieu selon l'invention, qui ne sont qu'une illustration des possibilités offertes, sont les milieux suivants: milieu de détection des bactéries qui fermentent le D-xylose milieu de détection des bactéries qui fermentent le ribose milieu de détection des bactéries qui fermentent l'0 -méthyl-D-mannoside milieu de détection des bactéries qui réduisent les nitrates. La formulation de chacun des milieux est la suivante: milieu selon l'invention soit A, formulation selon Exemple 1 milieu comprenant l'hydrate de carbone fermentescible, soit B eau distillée 1000 ml hydrate de carbone: D-xylose, ribose,d-Me-D-mannoside 10 g À bacto-peptone Difco 5 g À rouge de phénol 60 mg p H ajusté à 8,5 milieu comprenant les nitrates, soit C eau distillée 1000 ml nitrate de potassium 1 g bacto-peptone Difco 10 g p H ajusté à 7,0 Les différentes formulations ont été stérilisées par filtration sur filtre 0,22 micron, et réparties dans des puits de plaque de microtitration aux côtés du test glycine aminopeptidase précédemment décrit, à raison de 100 micro- litres par puits Les milieux réactionnels ont ensuite été déshydratés par séchage ventilé à 37 C pendant 24 heures. Les batteries de tests ainsi préparées ont été conservées sous déshy- dratant à l'obscurité et à + 4 C jusqu'à leur utilisation. 104 souches de Listeria ont été étudiées, réparties ainsi 41 L monocytogenes 33 L innocua 8 L ivanovii 3 L welshimeri 14 L seeligeri 3 L grayi 2 L murrayi. Ces différentes souches ont été testées de la façon suivante pour chaque souche isolée sur gélose Columbia au sang de mouton ( 5 %), une suspension bactérienne a été réalisée dans de l'eau distillée stérile cette suspension a été ajustée au point n 4 de l'échelle de McFarland microlitres ont été répartis dans les puits correspondant aux 5 milieux décrits ci-dessus après une incubation de 4 heures à 37 C, les différentes réactions ont été interprétées de la façon suivante: milieu A (voir Exemple 3) milieu B coloration jaune: réaction positive coloration rouge: réaction négative milieu C: après addition d'une goutte de chacun des réactifs NI Tl et NIT 2, commercialisés par BIO MERIEUX et consistant en une solution dans de l'acide acétique, respectivement d'acide sulfanilique et de N,Ndiméthyl- 1 -naphtylamine coloration rouge réaction positive pas de coloration réactive négative Les résultats obtenus ont été les suivants A 3 B C Sustat Substrat de la, glycine D-xylose Ribose alpha-mthyl nitrate am.inopeptidase cnocyrogenes innocu oa I + _ L ivanovti + + L welshiireri + L seeligeri + I + I L grayi + | _ _ _rra y l + | + | -: O % de réaction positive +: 100 % de réaction positive Ce tableau montre que les sept espèces composant le genre Listeria sont toutes séparées deux à deux par au moins l'un des cinq milieux sélectionnés. Cette combinaison de milieu permet d'identifier simplement et préci- sément, toute souche de Listeria, quelle que soit l'espèce à laquelle elle appartient. REVENDICATIONS 1 Procédé d'analyse bactériologique, selon lequel on met l'échantillon à analyser au contact d'un milieu d'identification comprenant un substrat chromogène ou fluorigène, susceptible d'être hydrolysé en présence d'au moins un enzyme associé au métabolisme d'au moins une espèce bactérienne, caractérisé en ce que, afin de différencier l'espèce monocytogenes dans un échantillon pouvant contenir des bactéries du genre Listeria, on introduit dans le milieu d'identification un substrat de la glycine aminopeptidase. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concen- tration du substrat de la glycine aminopeptidase varie entre 0,01 m M et m M. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on introduit un système tampon avec le substrat pour ajuster le p H à une valeur comprise entre 6 et 9. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu d'identification au moins un activateur de la glycine aminopeptidase. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'activateur est un cation bivalent choisi dans le groupe consistant en Mn++, Mg++ et Ca++. 6 Milieu d'identification bactériologique, comprenant un substrat chromogène ou fluorigène, susceptible d'être hydrolysé en présence d'au moins un enzyme associé au métabolisme d'au moins une espèce bactérienne, caractérisé en ce que, afin de différencier l'espèce monocytogenes dans un échantillon à analyser mis au contact dudit milieu et pouvant contenir des bactéries du genre Listeria, le milieu d'identification comprend un substrat de la glycine aminopeptidase. 7 Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le substrat est fluorigène directement, et est choisi parmi les composés suivants: glycine-4- nitroanilide, glycine-7-amido-4-méthylcoumarine, glycine-7-amido-4trifluorométhyl- coumarine, glycine-2-naphtylamide, glycine-4-méthoxy-2-naphtylamide. 8 Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le substrat est chromogène directement et est choisi parmi les composés suivants: glycine- 4-nitroanilide, glycine-7-amido-4-méthylcoumarine, glycine-7-amido-4- trifluométhylcoumarine. 9 Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le substrat est chromogène indirectement par addition d'un révélateur, et est choisi parmi les composés suivants: glycine-2-naphtylamide, glycine-4-méthoxy-2naphtylamine. Milieu selon la revendication 9, caractérisé en ce que le révélateur est un sel de diazonium tel que le "Fast Blue BB" ou le para-diméthyl- aminocinnamaldéhyde. 11 Milieu selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend un système tampon pour maintenir son p H entre 6 et 9. 12 Milieu selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que la concentration molaire du substrat est comprise entre 0,01 m M et m M. 13 Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre du chlorure de sodium, au moins un activateur de la glycine aminopeptidase. 14 Milieu selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'activateur est un cation bivalent choisi dans le groupe consistant en Mn++, Mg++ et Ca++. Milieu selon la revendication 14, caractérisé en ce que la quantité de l'activateur est comprise entre O et 100 mg pour I litre. 16 Milieu selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est déshydraté. 17 Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un substrat de fermentation et/ou un substrat réductible et/ou un substrat enzymatique, dont la transformation chimique permet de carac- tériser l'espèce Listeria présente dans l'échantillon à analyser. 18 Milieu selon la revendication 17, caractérisé en ce que le substrat de fermentation est choisi dans le groupe consistant en D-xylose, ribose, 0 (-méthyl-mannoside, rhamnose, tagatose, O (-méthyl-D-glucoside et mannitol. 19 Milieu selon la revendication 17, caractérisé en ce que le substrat réductible est choisi parmi les nitrates, de préférence le nitrate de potassium. Milieu selon la revendication 17, caractérisé en ce que le substrat enzymatique synthétique est un substrat de l'0 d-mannosidase. 21 Dispositif d'identification des Listeria monocytogenes comprenant un conditionnement d'un milieu selon l'une quelconque des revendications 6 à 20.