Brevet FR2666095A1 — publié le 19920228

Arriere-plan technologique de l'invention Domaine de L'invention La présente invention concerne un procédé de production de la L-lysine par fermentation. La L-lysine est l'un des 20 amino acides essentiels naturels. En plus des autres utilisations, la L lysine est utilisée dans la production des aminaux sur pied. Etant donné que les céréales, qui sont des produits alimentaires courants pour animaux sur pied (par exemple bétail, et cochons) ne contiennent pas des niveaux suffisants d'aminoacides pour les conditions nutritionnelles requises pour Les animaux sur pied, il est nécessaire de les supplémenter par la L-lysine. Ainsi, il est nécessaire de développer une méthode efficace pour La production de La L-lysine. Description de l'art antérieur Dans Les procédés décrits antérieurement pour la production microbienne de la L-lysine par fermentation, les micro organismes producteurs spécifiques de la lysine ont été isolés ou dérivés des producteurs naturels de la lysine. La plupart de ces mutants choisis artificiellement sont dérivés des micro-organismes appartenant au genre Brevibacterium ou alternativement au genre Corynebacterium.Dans ces deux genres, la production de la L-lysine est obtenue par potentialisation du système de biosynthèse de La L-lysine par une combinaison ou par une réunion séquentielle des propriétés telles que le caractère auxotrophe, la sensibilité, la résistance analogue, etc. (Tosaka, Takinami dans "Fe-rmentation des Amino Acides", édité par Aida, Takinami, Chibata, Nakayama et Yamada, Gakkai Publisching Center, 1986, page 273). Ces méthodes ont une capacité limitée pour sélectionner les organismes qui produisent la L-lysine à des niveaux accrus. L'objet de la présente invention est donc de développer une méthode de pro duction des micro-organismes capables de produire des niveaux accrus de L-lysine par fermentation. Sommaire de L'invention L'un des objets de la présente invention est d'améliorer le rendement de fermentation de la L-lysine pour obtenir des coûts de production inférieurs. Un autre objet de la présente invention est de fournir des méthodes de création des micro-organismes du genre Brevibacterium ou du genre Corynebacterium qui ont une productivité de L-lysine améliorée et des méthodes de production de la lysine par culture et fermentation de ces nouveaux micro-organismes. Comme résultat de diverses recherches pour obtenir des mutants ayant une productivité améliorée de la lysine parmi les micro-organismes appartenant au genre Brevibacterium ou alternativement du genre Corynebacterium, Les inventeurs ont découvert une corrélation directe entre la capacité d'un micro-organisme à produire la L-lysine et la résistance du micro-organisme au 4-N (D-alanyl)-Z,4-diamino-2,4-didésoxy-L-arabinose (désigné ci-après par "pulmycine"). La corrélation entre la production de la L-lysine et la résistance à la pulmycine par le micro-organisme était inconnue dans l'art biologique. La pulmycine est un antibiotique connu produit par une bactérie appartenant au genre Bacilles. La pulmycine antibiotique et ses dérivés utiles dans la présente invention incluent ceux ayant une structure chimique similaire à la pulmycine et ayant une activité biologique similaire à ta pulmycine, tels que les dérivés suivants Dérivés de la pulmycine (Code No. ) (Structure) NK-25574 SK-25575 NK-25573 NK-25572 NK-25576 (* indique la forme D) Ces objets et d'autres seront mis en évidence au cours de la description qui suit des modes de réalisation donnés en exemple pour illustrer L'invention sans en limiter la portée. Description détaillée des modes de réalisation préférés Le mutant producteur de la L-lysine de la présente invention peut être dérivé d'une souche parentale quelles que soient l'espèce et ta souche pourvu que Le micro-organisme appartienne au genre Brevibacterium ou alternativement au genre Corynebacterium et que la souche soit celle désignée ci-apres par "souche parentale". Selon un mode de réalisation préféré, la souche parentale doit en outre être caractérisée par le fait qu'elle a une productivité accrue de L-lysine en plus d'au moins une des propriétés -telles que la résistance à la S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine en présence de la L-thréonine, le caractère auxotrophe de la L-homosérine, etc.Les souches parentales connues comme étant des bactéries productrices du L-glutamate du type Coryne sont préférées, ces souches parentales incluant sans y être limitées les micro-organismes suivants Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Corynebacterium acetacidophyllum ATCC 13870 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 De plus, les souches ayant une productivité améliorée de L-lysine obtenues par communication additionnelle des propriétés de caractère auxotrophe de la L-alanine, de sensibilité vis-à-vis de L'acide fluoropyruvique etc, aux souches ayant la productivité de la L-lysine décrite ci-dessus, peuvent également être utilisées comme souche parentale. Le terme "résistance à la pulmycine" utilisé dans la présente invention se réfère à une propriété d'un micro-organisme qui permet à ce micro-organisme de croître dans un mi lieu contenant des concentrations élevées de pulmycine, ces concentrations normalement empêchent ou gênent la croissance de la souchce parentale. En plus de l'obtention des mutants de la présente invention à partir des souches parentales qui sont déjà connues comme étant mutants producteurs de la L-lysine, les mutants peuvent également être obtenus en communiquant la résistance à la pulmycine à une souche sauvage de bactéries du type Coryne et ensuite en communiquant séquentiellement la résistance chimique ou le caractère auxotrophe du nutriment pour améliorer La productivité de la lysine. En vue de communiquer cette résistance à la pulmycine au micro-organisme de la souche parentale, la souche parentale est soumise à un traitement mutationnel conventionnel incluant sans y être limité L'irradiation ultraviolette ou un traitement chimique par exemple par la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (désignée ci-après par "NTG"), L'acide nitrique etc,. Des exemples non limitatifs spécifiques sont donnés. Le micro-organisme producteur de la L-Lysine, Brevibacterium lactofer mentum (AJ 12435, FERM BP-2294), est traité par 250 pg/ml de NTG à 300C pendant 30 min. Le mi lieu minimum en plaque de nutriment (tableau 1) contenant 3 mg/L de pulmycine est inoculé par les cellules traitées qui exihent un taux de survie de 1 %. Après incubation à 300C pendant 7 jours, les colonies sont recueillies pour une caractérisation supplémentaire. Tableau 1 Composition du mi lieu minimum Composant Concentration Glucose 20 g/l Sulfate d'ammonium 10 g/l KH2PO4 1 g/l MgS04,7H20 0,4 g/l FeS04,7H20 10 mg/l MnS04,4H20 10 mg/l Biotine 50 pg/l Chlorhydrate de thiamine 100 ,ug/l Urée 2 g/l pH 7,0 Les colonies résultantes sont testées pour la résistance à la pulmycine en vue de déterminer les concentrations inhibitrices minimales. Le degré de croissance est déterminé comme suit. Un mi lieu contenant de L'extrait de levure (10 g/l), du peptone (10 girl), du chlorure de sodium (5 g/l) et de l'agar-agar (20 g/l) à pH 7,0 est stérilisé par chauffage à 1200C pendant 20 min.Les plaques d'agar-agar sont inoculées par une suspension saline physiologique stérile de la souche mutante sélectionnée qui a été préalablement cultivée dans un bouillon incliné pendant 24 h. Les plaques sont inoculées par un comptage de bactéries d'environ 106. Des disques de papier contenant diverses concentrations de pulmycine sont placées sur la plaque inoculée et incubées à 300C pendant 48 h. La présence des cercles dtinhibition de croissance est observée et enregistrée. Une souche mutante représentative est sélectionnée et dénommée Brevibacterium Lactofermentum AJ 12529, FERM-P-11579 et est également sélectionnée une souche de Corynebacterium qui est exposée aux mêmes conditions de mutagenèse que l'espèce Brevibacterbium. Le Corynebacterium acetacidophyllum (AJ 12425, FERM-BP-2295) est utilisé comme souche parentale et la souche résistante à la pulmycine résultante AJ 12530, FERM-P-11580 est sélectionnée pour L'incubation et le test de résistance à la pulmycine comme décrit ci-dessus. La résistance à La pulmycine du mutant ainsi obtenue est montrée dans le tableau 2. Tableau 2. Degré de croissance Concentration de Pulmycine (chlorhydrate) (mg/ml) Souche 0 1 2 3,5 5 AJ 12435 (parentale) ++ ++ + - AJ 12529 ++ ++ ++ + + AJ 12415 (parentale) ++ ++ + - - AJ 12620 ++ ++ + + Le degré de croissance du mutant mentionné dans le tableau 2 est indiqué par L'aptitude du micro-organisme à croître en présence des concentrations montrées de pulmycine. Les niveaux de croissance de la souche parentale sont mentionnés et suivis par les niveaux de croissance des mutants sélectionnés. Les symboles ++ et + indiquent une croissance excellente et bonne, respectivement, tandis que Le symbole - indique L'absence de croissance. En vue d'effectuer La production de La L-lysine avec les mutants de la présente invention, les mutants peuvent être cultivés par fermentation dans un mi lieu nutritif conventionnel contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des sels inorganiques, et si nécessaire contenant également des nutriments organiques à L'état de trace. Aucune difficulté particulière n'est observée dans la culture des mutants de la présente invention par la technologie standard de fermentation. Les sources de carbone utilisées dans la présente invention peuvent inclure les sources de carbone standards incluant les hydrates de carbone tels que glucose, mélasse, etc ; tes acides organiques tels que L'acide pyruvique, L'acide citrique, etc ; et les alcools tels que l'éthanol, etc. Les sources d'azote peuvent inclure le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le phosphate d'ammonium, L'hydroxyde d'ammonium, le gaz ammoniac et d'autres sources d'azote conventionnelles. Les nutriments organiques à L'état de trace incluent l'hydrolysat de protéines de soja, L'extrait de levure etc et d'autres sources de nutriments organiques conventionnelles. L'incubation des mutants producteurs de L-lysine de la présente invention est conduite de préférence dans des conditions aérobies à une température de fermentation de 30 à 35 C pendant une période de fermentation de 40 à 100 h. Il est préférable que le pH de la fermentation soit maintenu dans un intervalle de 6,5 à 7,0 au cours de L'incubation. Le pH de la fermentation peut être ajusté en utilisant des méthodes standards incluant L'addition des substances acides ou alcalines inorganiques ou organiques, l'urée, le carbonate de calcium, L'hydroxyde d'ammonium etc. La L-lysine produite durant la fermentation peut être recueillie à partir du bouillon de fermentation par des méthodes standards qui incluent sans y être Limitées les méthodes à résines échangeuses d'ions ou d'autres méthodes connues. Par culture des souches résistantes à la pulmycine comme décrit précédemment, le niveau de production de la L-lysine et l'accumulation sont remarquablement accrus comparativement à la souche parentale. Les fermentations comparatives entre la souche parentale et les mutants dérivés de cette souche sont décrites dans les exemples qui suivent et les données sont mentionnées dans les tableaux 3 et 4. La quantité de L-lysine accumulée est déterminée par conversion de l'aminoacide en son chlorhydrate qui est ensuite soumis à la détermination quantitative par colorimétrie à la ninhydrine au cuivre acide. Exemples Exemple 1 Un mi lieu contenant du glucose (36 g/l), du chlorure d'ammonium (20 g/l), du KH2P04 (1 g/l), du MgS04,7H20 (400 mg/l), du FeS04,7H20 (10 mg/l), du MnS02,4H20 (8 mg/l), de l'hydrolysat acide de protéine de soja (1 mg/L calculé en azote), du chlorhydrate de triamine (0,1 mg/l) et de la biotine (0,3 mg/l) est préparé. Des ballons (500 ml) sont chargés de 20 ml chacun du mi lieu décrit ci-dessus et soumis à la stérilisation par chauffage à 120 C pendant 10 min, après quoi du carbonate de calcium (1 g) qui a été préalablement soumis à ta stérilisation par La chaleur sèche est ajouté au milieu.Le ballon de culture est inoculé par la souche microbienne désirée et incubé à 31,5 C pendant 48 h dans une secoueuse alternative. La quantité de L-lysine accumulée dans le mi lieu de fermentation est déterminée quantitativement (calculée en chlorhydrate) par colorimétrie à la ninhydrine au cuivre acide, et Les résultats sont mentionnés dans le tableau 3. Pour toutes les souches résistantes à la pulmycine, un accroissement remarquable de l'accumulation de la L-lysine est observé, comparativement à la souche parentale. Tableau 3. Quantité de chlorhydrate de L-lysine accumulée Rendement basé Souche Quantité accumulée sur le sucre (%) AJ 12453 (parentale) 9,3 25,8 AJ 12529 11,3 31,5 AJ 12415 (parentale) 7,3 29,5 AJ 12530 10,3 28,7 Exemple 2 Un mi lieu utilisant la mélasse noire comme source de sucre- et contenant du KH2P04 (80 g/l), du MgS04,7H20 (1 g/l) et du chlorure d'ammonium (5 girl, pH 7,0) est préparé. Des ballons (500 ml) sont chargés de 20 ml chacun du mi lieu décrit précédemment et soumis à la stérilisastion par chauffage à 1150C pendant 10 min, après quoi, le carbonate de calcium (1 g) préalablement soumis à une stérilisation par la chaleur sèche est ajouté au mi lieu aqueux. Les ballons sont inoculés par la souche microbienne désirée et incubés à 31,50C pendant 72 h dans une secoueuse alternative. La quantité de L-lysine qui s'accumule dans le mi lieu de fermentation est déterminée quantitativement (calculée sous forme de chlorhydrate) par colorimétrie à la ninhydrine au cuivre acide dont les résultats sont mentionnés dans le tableau 4. Pour toutes les souches résistantes à la pulmycine, un accroissement remarquable de l'accumulation de la L-lysine est observé comparativement à ta souche parentale TabLeau 4. Quantité de chlorhydrate de L-lysine accumulée Souche Quantité accumulée Rendement basé sur (gel) le sucre (%) AJ 12435 (parentale) 10,4 25,5 AJ 12529 23,8 29,8 AJ 12415 (parentale) 17,3 21,7 AJ 12530 21,3 26,6 Les résultats expérimentaux mentionnés ci-dessus démontrent clairement l'utilité de la présente invention. Par la mise en oeuvre de la présente invention, on peut s'attendre à ce que Le coût de production de la L-lysine soit fortement réduit. Bien entendu, de nombreuses modifications et variations de la présente invention sont possibles à la lumière des enseignements décrits ci-dessus. Il est entendu que ces modifications et variations sont envisagées dans le cadre de La présente invention. REVENDICATIONS 1. Une méthode de préparation des micro-organismes capables de produire la L-lysine caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes (a) mutagenèse d'un micro-organisme d'une souche parentale appartenant à un genre choisi dans le groupe comprenant le Brevibacterium et le Corynebacterium, par exposition à un mutagène ; (b) culture de ce micro-organisme après muta genèse en présence du 4-N-(D-alanyl)-2,4-diamino-2,4 - didésoxy-L-arabinose ou un dérivé de celui-ci. 2. La méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que le micro-organisme de la souche parentale est un micro-organisme producteur de la L-lysine connu. 3. La méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit micro-organisme parental exhibe la résistance à la S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine en présence de la L-thréonine. 4. La méthode selon La revendication 1, caractérisée en ce que ledit organisme de la souche parentale exhibe un caractère auxotrophe de la L-homosérine. 5. La méthode selon La revendication 1, caractérisée en ce que ledit organisme de la souche parentale est une bactérie productrice de L-glutamate. 6. La méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit micro-organisme est choisi dans le groupe comprenant les suivants : Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium Lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Corynebacterium acetacidophyllum ATCC 13870, Corynebacterium lilium ATCC 15990 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. 7. La méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit mutagène est choisi dans le groupe comprenant le rayonnement ultraviolet et les mutagènes chimiques. 8. La méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit mutagène chimique est choisi dans le groupe comprenant la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine et L'acide nitrique. 9. Un procédé de production de la L-lysine par fermentation caractérisé en ce qulil comprend (a) la culture d'un micro-organisme dérivé d'une souche parentale appartenant à un genre choisi dans le groupe comprenant le Brevibacterium et le Corynebacterium, ledit micro-organisme ayant une résistance au 4-N-(D-alanyl)-2,4-diamino-2,4-didésoxy-L- arabinose ou un dérivé de ce dernier ; et (b) la récupération de la L-lysine du mi lieu de culture. 10. Le procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit micro-organisme de la souche parentale est un microorganisme producteur de la L-Lysine connu. 11. Le procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit micro-organisme de la souche parentale exhibe une résistance à la S-(2-aminoéthyl > -L-cystéine en présence de la L-thréonine. 12. Le procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit micro-organisme de La souche parentale exhibe un caractère auxotrophe de la L-homosérine. 13. Le procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit micro-organisme de la souche parentale est une bactérie productrice de L-glutamate. 14. Le procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit micro-organisme de La souche parentale est choisi dans le groupe comprenant les suivants : Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium Flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterjum roseum ATCC 13825, Corynebacterium acetacidophyllum ATCC 13870, Corynebacterium lilium ATCC 15990 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. 15. Le procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est résistant au 4-N-(D-alanyl)-2,4- diamino-2,4-didésoxy-L-arabinose ou un dérivé de ce dernier à des concentrations supérieures à 2 mg/ml. 16. Un micro-organisme appartenant au genre choisi dans le groupe comprenant le Brevibacterium et le Corynebacterium, caractérisé en ce que ledit micro-organisme exhibe une résistance au 4-N-(D-alanyl)-2,4-diamino-2,4-didésoxy-L-arabinose ou un dérivé de ce dernier. 17. Le micro-organisme selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est le Brevivacterium Lactofermentum AJ 12529, FERM-P 11579. 18. Le micro-organisme selon La revendication 16, caractérisé en ce que Ledit micro-organisme est Le Corynebacterium acetacidophyllum AJ 12530, FERM-P 11580.