Brevet FR2667324A1 — publié le 19920403

Support pour culture des cellules dans un milieu exempt de sérum et dispositif du type colonne garni dudit support. Arrière-plan technologique de l'invention La présente invention concerne un support pour la culture des cellules ou des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum et un dispositif du type colonne garni dudit support pour la culture en continu de ces cellules. D'une manière conventionnelle, il est bien connu, dans une méthode de culture des cellules d'utiliser un milieu dans lequel environ 10 % d'un sérum animal est ajouté à un milieu synthétique auquel des aminoacides, des vitamines, des matières nutritives essentielles, des sels inorganiques et analogues sont ajoutés ("Tissue Culture Technology" Asakura Shoten, 1988). Toutefois, étant donné que le milieu animal a des qualités variables causées par des lots fabriqués, il est nécessaire qu'un lot approprié soit sélectionné lorsque les cellules sont cultivées. De plus, étant donné que la fourniture d'un milieu animal est instable, il était désavantageux que la méthode ne puisse pas être utilisée sur une échelle industrielle De plus, l'utilisation du milieu dans lequel le sérum animal est ajouté présente l'incon- vénient selon lequel la séparation des substances utiles produites dans les cellules est difficile du fait de la présence des protéines de sérum dans le milieu à une concentration élevée. Sommaire de l'invention Un objet de la présente invention est de fournir un support pour la culture des cellules ou des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum. Un autre objet de la présente invention est de fournir un dispositif du type colonne garni dudit support pour la culture en continu des cellules, dans lequel les cellules prolifèrent en continu et se différencient et les substances utiles produites dans les cellules sont effectivement recueillies par passage à travers le support dans la colonne. Les objets mentionnés ci-dessus et d'autres de la présente invention seront mis en évidence dans la description qui suit. Conformément à la présente invention, on fournit un support pour la culture des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum, comprenant un matériau pour support contenant un composé phosphate de calcium. En outre, conformément à la présente invention, on fournit un dispositif du type colonne pour la culture en continu des cellules, comprenant le support mentionné ci-dessus garnissant ladite colonne, pour faire passer en continu un milieu exempt de sérum à travers le support afin de faire proliférer en continu et différencier les cellules prolifératives adhérentes de sorte qu'une substance utile produite dans les cellules est recueillie d'un éluat à partir du support. Description brève des dessins La figure 1 est un graphique montrant la relation entre la concentration en acide lactique dans le milieu utilisé pour la culture des cellules et le temps de culture conformément à l'exemple 1; la figure 2 est un graphique montrant la relation simi- laire en liaison avec l'exemple comparatif 1; la figure 3 est un graphique montrant la relation simi- Laire en liaison avec l'exemple comparatif 2; la figure 4 est un graphique montrant la relation simi- laire en liaison avec l'exemple comparatif 3; et la figure 5 est un diagramme montrant les résultats de l'éLectrophorèse du liquide concentré obtenu conformément à l'exemple 2. Modes de réalisation préférés de l'invention Un support pour la culture des cellules ou des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum confor- mément à la présente invention est composé d'un matériau de support contenant un composé phosphate de calcium Les cellules ou les cellules prolifératives adhérentes peuvent être sélectionnées à partir d'une souche ostéoparente de cellules MC 3 T 3-E 1, de divers fibroblastes, d'une cellule endothétiale, d'une cellule muscu- laire, d'une cellule nerveuse, des cellules tumorales de ces cellules, des cellules mentionnées ci-dessus dans lesquelles un gène ecdémique ou extérieur a été incorporé par transduction et des méLanges de ceux-ci. Le composé phosphate de calcium utilisé comme support pour la culture des cellules prolifératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum de la présente invention peut être choisi de préférence parmi les suivants: hydroxyapatite, phosphate tricalcique, phosphate tétracalcique, fluoroapatite, carbonate apatite et des méLanges de ceux-ci Plus préférablement, l'hydroxyapatite peut être utilisée car l'hydroxyapatite a de bonnes propriétés d'adhérence avec les cellules et permet aux cellules prolifératives adhérentes d'exhiber une activité supérieure La forme du composé phosphate de calcium peut être sélectionnée de manière variée conformément aux types de réacteurs pour la culture des cellules Par exemple, la forme peut être un corps poreux ou une particule granulaire De plus, la surface spécifique du composé phosphate de calcium mesurée par une méthode d'absorption des gaz peut être de préférence dans l'intervalle de 0,1 à 70 m 2/g. Pour préparer le composé phosphate de calcium utilisé comme support pour la culture des cellules ou des cellules proli- fératives adhérentes dans un milieu exempt de sérum de la présente invention, le procédé de frittage bien connu peut être utilisé Par exemple, le composé phosphate de calcium peut être contrôLé par la température de frittage. De plus, un dispositif du type colonne pour la culture en continu des cellules conformément à la présente invention est composé du support mentionné ci-dessus garnissant ledit dispositif. Le milieu exempt de sérum est envoyé en continu à travers le support de sorte que les cellules prolifératives adhérentes mentionnées ci-dessus prolifèrent en continu et se différencient. En conséquence, une substance utile produite dans les cellules est recueilli d'un éLuat obtenu à partir du support Pour remplir la colonne par le support, par exemple, le composé phosphate de calcium peut être en premier lieu chargé dans la colonne puis un milieu est ajouté pour l'adhérence des cellules prolifératives ou bien un milieu exempt de sérum est ajouté. Pour préparer le milieu exempt de sérum, la prescription d'un milieu de culture cellulaire animal ou du milieu essentiel minimum de Eagle peut être utilisée Une solution de sels inorganiques, d'aminoacides, de vitamines, de nutriments essentiels ou leurs mélanges peut être préparée Après la préparation, la solution peut être stérilisée Si nécessaire, après stérilisation, les facteurs de croissance cellulaire, les hormones, les facteurs d'adhérence cellulaire ou leurs mélanges peuvent être ajoutés à la solution. Dans le support pour la cullure des Icellules prolifé- ratives adhérentes dans un milieu exempt de sérum conformément à la présente invention un milieu exempt de sérum peut être employé et ainsi il est avantageux qu'un milieu ayant une composition prédé- terminée puisse être alimenté, alors que l'opération de culture est facile sans nécessiter la sélection d'un lot approprié pour une cellule. De plus, le dispositif du type colonne pour la culture en continu des cellules, chargée avec le support est extrêmement utile comme bioréacteur car les cellules prolifèrent en continu et se différencient et les substances utiles produites dans les cellules adhérentes au support sont séparées efficacement et purifiées en l'absence des protéines superflues. Exemples de l'invention La présente invention sera expliquée en référence aux exemples illustratifs Il est entendu que ces exemples ne doivent en aucun cas limiter la portée de l'invention. Exemple 1 Une colonne tubulaire ayant une taille de 2,0 cm de diamètre et de 3,2 cm de longueur est remplie par des particules granulaires d'hydroxyapatite ayant une surface spécifique de m 2/g et une taille de particules de 0,3 à 0,5 mm Ensuite, 1 x 106 cellules ostéoparentes MC 3 T 3-E 1 préalablement purifiées en souche sont ensemencées dans les particules d'hydroxyapatite. Pendant 3 jours après l'ensemencement, les cellules ostéoparentes sont cultivées dans un milieu o-MEM incluant 10 % de sérum bovin foetal Ensuite, les cellules sont cultivées dans un milieu "-MEM exempt de sérum et le milieu est échangé avec un nouveau milieu x-MEM exempt de sérum une fois tous les deux jours La concentration de l'acide lactique dans le milieu qui a été cultivé et échangé, est mesurée par la méthode de réducion NAD utilisant la L-lactate déshydrogénase Les valeurs mesurées sont montrées dans la figure 1. Exemples comparatifs 1 à 3 Les mêmes procédés sont conduits d'après l'exemple 1 respectivement sauf que la charge de la colonne est constituée par des particules granulaires d'alumine dans l'exemple comparatif 1, des particules granulaires de zircone dans l'exemple comparatif 2 et des particules granulaires d'oxyde de titane dans l'exemple comparatif 3, chaque taille de particules étant de 0,3 à 0,5 mm. Chaque concentration en acide lactique dans chacun des milieux utilisés est mesurée de façon similaire à celle de l'exemple 1 respectivement. Le résultat de l'exemple comparatif 1 est montré à la figure 2, celui de l'exemple comparatif 2 est montré à la figure 3 et celui de l'exemple comparatif 3 est montré dans la figure 4 respectivement. Exemple 2 Une colonne tubulaire d'un volume de 50 ml et de 3,0 cm de diamètre et de 7,5 cm de longueur est chargée de particules granulaires d'hydroxyapatite d'une taille de particules de 0,3 à 0,5 mm pour constituer un dispositif du type colonne pour la culture en continu des cellules Après ensemencement de 8,2 x 105 cellules MC 3 T 3-EL sur les particules d'hydroxyapatite, le mi Lieu exempt de sérum est envoyé en continu à un taux d'éLution de ml/j pour obtenir 2,4 L d'un mi Lieu de culture Ensuite, Le milieu obtenu est concentré à 50 ml et un liquide concentré ainsi obtenu est soumis à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS Comme résultat, des protéines produites dans les cellules sont détectées Le résultat de l'électrophorèse est montré dans la figure 5. REVENDICATIONS 1 Un support pour la culture des cellules prolifé- ratives adhérentes dans un milieu exempt de sérum caractérisé en ce qu'il comprend un matériau de support contenant un composé phosphate de calcium. 2 Un dispositif du type colonne pour la culture en continu des cellules caractérisé en ce qu'il comprend le support selon la revendication 1 garnissant ledit dispositif pour faire passer en continu un milieu exempt de sérum à travers ledit support pour provoquer la prolifération en continu et la différenciation des cellules prolifératives adhérentes de sorte qu'une substance utile produite dans lesdites cellules est recueillie d'un éLuat provenant dudit support.