Brevet FR2663748A1 — publié le 19911227

La présente Invention est relative à des anticorps spécifiques de la liaison isopeptidique induite par les transglutaminases, à des antigènes constitués par un isopeptide dans lequel une protéine est conjuguée par l'intermédiaire du résidu acide glutamique qu'elle contient à la fonction amine primaire d'une lysine contenue dans une autre protéine. La présente Invention s'étend aux procédés d'obtention desdits anticorps et antigènes et à leurs applications diagnostiques et thérapeutiques. La formation de liaisons transversales entre des chaînes de protéines a généralement lieu par l'intermédiaire des groupes e-NH2 de résidus lysine de peptides, pour donner lieu à la formation de liaisons isopeptidiques N-(glutamyl)lysine en présence de transglutaminases : il se forme ainsi une liaison covalente entre les groupes t-carboxamide des résidus glutamine contenus dans une protéine et les groupes e-amino de résidus lysine contenus dans les mêmes chaînes de protéines ou dans des chaînes différentes.Une telle réticulation a été identifiée aussi bien dans le cas de protéines cellulaires (collagène, kératine), que dans des protéines extra-cellulaires (fibrine insoluble du plasma, utéroglobuline du fluide séminal, protéines du cristallin et pellicules capillaires) et elle a été observée aussi bien entre des protéines homologues qu'entre des protéines hétérologues. I1 a été rapporté récemment que la teneur en isopeptides cellulaires varie en fonction directe de la croissance des cellules et il a été observé que la fonction maximale d'isopeptides coïncide avec une activité transglutaminase dans les cellules concernées. En ce qui concerne les protéines extracellulaires telles que la fibrine, comme on le sait, la forme de la fibrine qui constitue un marqueur pour la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) et pour les infarctus du myocarde, est la forme dimérique "D-Dimer" (Francis et Al., "Circulation", 75, (1987), p. 11701177).Or il est connu que cette dimérisation est réalisée entre deux chaînes monomères du fragment D, par la formation d'une liaison isopeptidique entre le e-NH2 de la lysine d'un monomère D et le -carboxamide d'une glutamine d'un autre monomère D, par action du facteur XIIIa, qui est la transglutaminase plasmatique, conformément à la formule ci-après Ce qui vient d'être dit montre que si une corrélation entre l'activité transglutaminase et la formation de liaisons isopeptidiques est vérifiée, la possibilité de révéler les liaisons isopeptidiques et l'activité transglutaminase pourrait permettre, entre autres, de diagnostiquer de façon très précoce des lésions ou des tumeurs bénignes ou malignes du sein ou du tractus gastro-intestinal, de diagnostiquer des maladies cardiovasculaires, de diagnostiquer des maladies virales accompagnées de séquelles telles que fièvre hémorragique, voire des applications thérapeutiques. L'emploi d'inhibiteurs spécifiques compétitifs (Polylysine, Spermine, Putrescine, CBZ-gln-gly) de TG injectés chez la souris en même temps que des cellules tumorales inhibent la croissance tumorale (Yancey et Laki, 1972). Le même effet est obtenu par l'immunisation de la souris contre la TG cellulaire (Yancey et Laki, 1972). La TG cellulaire semble jouer un rôle dans la métastase puisqu'il a été montré une relation inverse entre l'activité TG et le pouvoir métastasiant de clones cellulaires provenant de rhabdomyosarcome de rat (DELCROS et col., 1986). Chez le rat, l'activité TG dans la tumeur primaire (sarcome de foie) diminue lorsque des métastases sont détectées dans le poumon (Barnes et col., 1985). L'activité TG pourrait donc être un marqueur enzymatique du pouvoir métastasiant. D'autres auteurs ont pu mesurer en même temps que l'activité, la quantité d'enzyme cellulaire par test ELISA avec des anticorps anti-TG (Fesus et Arato, 1986). Ainsi, dans des fibroblastes humains WI38 en culture (isolés d'un tissu pulmonaire embryonnaire), le contenu en TG varie parallèlement à l'activité TG selon l'ordre suivant fibroblaste au repos > prolifératif > transformé. Au niveau cellulaire, les Inventeurs ont pris pour hypothèse que l'utilisation de la TG comme marqueur diagnostique, par marquage de biopsies tumorales à l'aide d'anticorps dirigés contre les isopeptides produits par la réaction TG, pourrait permettre de différencier entre tumeur bénigne et tumeur maligne et éventuellement de classifier les états intermédiaires, qui posent toujours des problèmes aux anatomopathologistes. La TG plasmatique (facteur XIII de coagulation) pourrait également jouer un rôle indirect dans le développement tumoral de nombreuses tumeurs solides sont entourées d'un manchon de fibrine (Chew et Wallace, 1976). Ces molé cules de fibrine réticulées par action du facteur XIII pourraient masquer les antigènes tumoraux et donc la reconnaissance des cellules tumorales par les cellules immunocompétentes. le DFMO ajouté dans l'eau de boisson de souris porteuses de tumeur de Lewis inhibe la croissance de la tumeur primaire à 40-50 % et la formation de métastases pulmonaires à 80 % (Sunkara et col., 1982). Or en plus de son effet direct sur l'ODC, le DFMO est un inhibi teur compétitif de TG (Delcros et al., 1984). Ceci est à prendre en considération en interprétant les résul tats des expériences in vivo. En effet, la TG plasma tique (facteur XIII) pourrait être une cible privilé giée du DFMO, ce qui expliquerait l'augmentation du temps de coagulation observé chez les rats traités par DFMO (Luk et col., 1983). Par ailleurs, des méthodes capables de distinguer in vivo et/ou in vitro le fibrinogène de la fibrine ont été proposées : plusieurs équipes ont fait appel à des moyens immunologiques en développant les anticorps monoclonaux (AcM) spécifiques de la fibrine, qui ne réagissent pas avec le fibrinogène. Pour ce faire, ils ont utilisé le fait que le clivage du fibrinogène par la thrombine fait apparaître sur la molécule de fibrine ainsi formée, des séquences peptidiques N-terminales nouvelles qui sont différentes de celles présentes sur la molécule de fibrinogène intacte. L'immunisation des animaux avec cette fibrine génère des anticorps dirigés contre tous les épitopes sur la fibrine Certains de ces anticorps donnent des réactions croisées avec le fibrinogène natif, d'autres ne réagissent qu'avec la fibrine et plus particulièrement avec la nouvelle séquence N-terminale. La synthèse chimique de ce peptide spécifique de la région N-terminale a permis de sélectionner un AcM 59D8 spécifique (Hui et al. Science, 1983, 222, 1129) et de l'utiliser après marquage à 111In pour visualiser par immuno-scintigraphie les caillots formés expérimentalement chez le chien et le lapin (Knight et al. J. Nuclear Med., 1988, 29, 494). Plusieurs autres AcM, capables de réagir spécifiquement avec la fibrine ont été décrits. Deux des AcM les plus utilisés sont DD-1C3/108 (Elms et al., Thromb Haemostas, 1983, 50, 591-594), DD3B6 disponible commercialement chez American Diagnostica, Greenwich, C.T. Cependant, ces AcM présentent des inconvénients DD-1C3/108 réagit avec le D-Dimer de la fibrine et également avec les produits de dégradation de la fibrine de haut poids moléculaire contenant des chaînes y-7 (Elms et al., 1983), DD3B6 réagit avec un épitope présent sur le fragment D qu'il soit sous forme monomérique ou sous forme dimérique D-Dimer (Devine et Greenberg, A.J.C.P. 1988, 89, p. 663-666). Or la forme e la fibrine qui constitue un marqueur pour la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) et pour les infractus du myocarde, est la forme dimérique, D-Dimer. Il est donc clair que DD3 B6 qui est l'AcM le plus utilisé à l'heure actuelle dans les coffrets de diagnostic pour les déterminations du taux de D-Dimer, par agglutination et par ELISA, n'a pas la spécificité absolue requise pour mesurer le D-Dimer en présence de D-monomère du fait de sa réaction avec la fibrine non-réticulée (Devine et Greenberg, A.J.C.P., 1988, 89, p. 663-666). L'imagerie des thrombi a fait l'objet de recherches en médecine nucléaire depuis de nombreuses années. Toutefois, aucune des techniques proposées (HSA, 99mTc-HSA, sérum-albumine, MBA marqué au 99mTc ; fibrinogène marqué à 123I, 131I-streptokinase, TPA marqué à 1' 1111n, 99mTc-plasmine, 1311-strombospondine, entre autres) n'a eu que des applications étendues du fait de son manque de sensibilité et/ou de spécificité. De même en ce qui concerne les plaquettes autologues marquées à l'1llIn, elles requièrent beaucoup de temps et d'adresse technique pour la séparation et le marquage de plaquettes fonctionnellement actives. Des Anticorps monoclonaux ont été produits contre les plaquettes, mais ils ne peuvent pas être utilisés dans d'autres cas que pour la détection de thrombi récents, en cours de développement. De plus, l'administration d'héparine, en pareils cas, rend inutilisable ce genre d'anticorps. On connait également des anticorps antifibrine qui, toutefois, ne reconnaissent que la fibrine libre et non la fibrine réticulée. La présente Invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des anticorps spécifiques de la liaison isopeptidique induite par des transglutaminases, propres à-permettre la détection in vivo et/ou in vitro de l'isopeptide produit en présence de transglutaminase, qu'il s'agisse de l'isopeptide cellulaire ou extra-cellulaire. La présente Invention s'est également donné pour but de pourvoir à un immunogène protéique contenant ladite liaison isopeptidique et propre à permettre, par immunisation de mammifères appropriés, l'obtention des anticorps susdits dirigés contre l'isopeptide produit en présence de transglutaminase, et également propre à permettre le dosage d'immuncomplexes contenant des anticorps dirigés contre ledit isopeptide. La présente invention a pour objet des anticorps qui reconnaissent de façon spécifique l'isopeptide NE-(y-glutamyl)-lysine formé sous l'action de la transglutaminase, entre le groupe -carboxamide d'un résidu glutamine présent dans une protéine et le groupe -NH2 de la lysine ou entre le groupe e-NH2 d'un résidu lysine libre ou présent dans une protéine et le groupe T-carboxyle de l'acide glutamique libre ou présent dans une protéine, ou des fragments desdits anticorps. Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdits anticorps spécifiques sont des anticorps polyclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, contenus dans le sérum prélevé chez ce dernier et, éventuellement, isolés dudit sérum par des techniques de purification appropriées. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits anticorps spécifiques sont des anticorps monoclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, suivie de la fusion des -cellules spléniques prélevées chez ledit mammifère immunisé, avec les cellules d'un myélome judicieusement choisi, d'un mammifère de même espèce, sélection des hybridomes secrétant les anticorps recherchés, clonage, culture et collecte des anticorps monoclonaux spécifiques. Conformément à la présente invention, celle-ci a également pour objet un immunogène propre à être mis en oeuvre pour l'immunisation de mammifères appropriés en vue de la production d'anticorps spécifiques dirigés contre l'isopeptide N-(Y-glutamyl)-lysine et, de plus, propre à être mis en oeuvre pour le dosage d'anticorps dirigés contre ledit isopeptide, contenus dans des immuncomplexes, lequel immunogène est caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine contenant de l'acide glutamique, conjuguée par l'intermédiaire du groupe y-carboxyle dudit acide au groupe e-NH2 d'un résidu lysine contenu dans une protéine appropriée. Selon une disposition avantageuse de l'invention, les anticorps monoclonaux spécifiques susdits sont sous forme libre. Selon une autre disposition avantageuse de l'invention, lesdits anticorps monoclonaux spécifiques sont immobilisés sur des supports insolubles appropriés. Selon encore une autre disposition avantageuse de l'invention, l'immunogène susdit est immobilisé sur un support insoluble approprié. Conformément à une modalité avantageuse de l'invention, lesdits anticorps monoclonaux sont marqués à l'aide de tous marqueurs appropriés. De façon plus spécifique, lesdits anticorps monoclonaux sont marqués à l'aide de radio-éléments appropriés, notamment lorsqu'ils sont destinés à être mis en oeuvre en imagerie, auquel cas ils sont avantageusement marqués par tous radio-éléments usuels, notamment par 123I, 13lI, 1loin, 99MTc. Lorsqu'ils sont destinés à être mis en- oeuvre dans des tests de diagnostic in vitro, lesdits anticorps monoclonaux sont marqués à l'aide de tous marqueurs convenables tels que radio-éléments, marqueurs enzymatiques, marqueurs fluorescents, luminescents, notamment, entre autres. La présente invention a en outre pour objet un agent de diagnostic in vitro de lésions ou de tumeurs de tissus mammaires ou colorectaux humains, par techniques immunohistochimiques sur des biopsies desdits tissus, caractérisé en ce qu'il est constitué par ledit anticorps spécifique polyclonal ou monoclonal, de préférence sous forme libre, convenablement marqué. La présente invention a, de plus, pour objet un agent de diagnostic in vitro, de maladies cardiovasculaires et de maladies virales accompagnées de séquelles telles que fièvre hémorragique, caractérisé en ce qu'il est constitué par ledit anticorps spécifique monoclonal, de préférence immobilisé sur un support insoluble, convenablement marqué. La présente invention a également pour objet un agent de diagnostic in vivo de tumeurs malignes et de maladies cardiovasculaires, caractérisé en ce qu'il est constitué par ledit anticorps monoclonal spécifique, ou l'un des ses fragments, sous forme libre, convenablement marqué. La présente invention a, par ailleurs, pour objet une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend ledit anticorps monoclonal spécifique, ou l'un de ses fragments, couplé à au moins une enzyme protéolytique appropriée ou à un médicament convenable. Conformément à l'invention, ledit anticorps ou l'un de ses fragments, peut avantageusement servir de vecteur à une enzyme protéolytique choisie dans le groupe qui comprend notamment, mais non limitativement, l'urokinase, la streptokinase, le TPA. La présente invention a encore pour objet un agent de détection d'anticorps dirigés contre un isopeptide formé sous l'action de la transglutaminase, présents dans un tissu ou un fluide corporel, notamment sous la forme d'immuncomplexes, caractérisé en ce qu'il est constitué par un isopeptide formé d'une protéine contenant un résidu glutamine, conjuguée par l'intermédiaire du groupe 7-carboxamide de ce dernier au groupe e-NH2 d'un résidu lysine contenu dans une protéine appropriée, lequel isopeptide est, si on le désire, convenablement marqué. Conformément à l'invention, ledit anticorps peut se présenter soit sous forme d'Immunoglobulines entières, soit sous forme de fragments Fab, Fat'2 etc... chimérisés ou non. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention d'anticorps et d'immunogènes conformes à la présente invention et à la vérification de leur activité. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES EXEMPLE I - Préparation d'AcM 1) Préparation de l'immunogène A 1.36 mg de Keyhole Limpet Hemocyanine (KLH) en solution dans lml de tampon phosphate 10 mM pH6 ont été ajoutés 8,7 mg (20 moles) de N-a-CBZ-lysine-pnitrophenyl ester qui sera désigné ci-après sous le nom de" (Z-lys) " en présence de 3,8 mg (20 moles) de 1 -éthyl3 (3-dimethyl aminopropyl) -carbodiimide (EDC). Le mélange a été laissé à la température de la pièce avec agitation douce pendant 6 h. A la fin de cette période, les produits so- lubles ont été éliminés par dialyse prolongée (4 x 30mn) contre le tampon phosphate IOmM pH6. L'adsorption (W) du CBZ a permis de déterminer que 3,7 Rmoles Z-lys étaient couplées par mg KLH. 2) Préparation de l'antigène pour déterminer le taux d'anticorps dans les sérums de souris, les milieux de culture et les liquides d'ascites de souris. Afin de diminuer les réactions croisées avec la KLH qui a servi comme-immunogène, le (Z-lys) a été couplé à la sérum albumine bovine (BSA) dans les conditions identiques à celles décrites ci-dessus. 3) Immunisation des souris Les souris femelles Balb/C agées de 6 à 8 semaines ont chacune été injectées par voie intraperitonéale (IP) au premier jour (JO) avec 100 pig de KLH-Z-lys emulsifiés avec un volume égal (100F1) de l'adjuvant complet de Freund. A J12 et à J24, les animaux on reçu des rappels de KLH-Z-Lys avec adjuvant incomplet de Freund, à des doses de 100 et 50g respectivement. 4) Détermination du taux d'anticorps des souris immunisées. Les serums prélevés tous les 10 jours par ponction rétro-orbitale ont été éprouvés pour leur taux en anticorps anti Ne(yglu)lys par leur réaction avec la BSA-Z-lys adsorbée sur nitrocellulose (Dot-blot). 5) Fusion de cellules et sélection des clones Les souris présentant les taux d'anticorps les plus élevés ont été sacrifiées, les rates prélevées et les cellules spléniques ont été fusionnées avec les cellules du myélome de souris Sp2/OAgl4 selon le procédé classique de Kohler & Milstein (1975). Les clones sécrétant des Ac ont été sélection- nés par Dot-blot et sub-clonés par la méthode de dillution limite. Sur 720 puits ensemencés, 102 ont donné une réaction positive avec la BSA-Z-lys, un rendement de 14,2 %. 20 des 102 hybridomes ont été sélectionnés selon le critère de l'intensité de la réaction positive de leur milieu avec la BSA-Z-lys en Dot-blot. Elles ont été clonées par la méthode de dilution limite dans les plaques à 96 puits. A partir de ce clonage, 85 clones ont été sélectionnés : 5 d'entre eux (71A3fl, 81AlblO, 81Dlc2,81Dlell et 82D6g7) dont les milieux montraient une forte immunoréactivité avec la BSA-Z-lys ont été retenus. Ils ont été cultivés par la suite dans les fioles de 75 cm2 pour la préparation des AcM en quantité plus grande. 6) Détermination de la sous-classe d'Immunoglobuline (Ig). La sous-classe d'Ig produite par chaque clone a été déterminée par Dot-blot à l'aide de sérums de lapin spécifiques de chaque sous-classe. Le coffret provenant de ZYMED (Laboratories, INC - U.S.A) a été utilisé selon les instructions fournies par le fabricant. EXEMPLE II REACTIVITE A L'AcM de l'EXEMPLE J DE TISSUS FIXES PUIS INCLUS EN PARAFFINE : COMPARAISON BENIN / MALIN / ETATS INTERMEDIAIRES. Les tissus sont fixés dans la solution de Bouin (acide picrique, formol, acide acétique) puis inclus en paraffine. Pour chaque biopsie étudiée, 3 coupes de 5clam sont déparaffinées puis traitées avec l'AcM concentré : 1/8 ou 1/2 et 1 témoin sans AcM. La réaction positive à l'anticorps anti Glu-Lys est révélée sur les coupes par la présence d'un chromogène rouge. Les noyaux sont contre-colorés en bleu. Une coupe adjacente est traitée à l'hématoxyline-safran -éosine pour servir de référence histopathologique. Ont été examinés - 34 carcinomes infiltrants galactophoriques (4 différenciés, 14 moyennement différenciés et 16 indifférenciés) dont 16 étaient associés sur la même coupe avec des zones bénignes, - 11 carcinomes in situ dont 9 associés à du tissu bénin sur la même coupe. Outre ces zones bénignes mitoyennes des carcinomes, 38 mastopathies fibrokystiques ou fibrohyperplasiques typiques dont 11 étaient associées à des métaplasies idrosadénoides, 10 à des hyperplasies atypiques, 11 à du sclerosing adenosis, ont été observées. L'AcM conforme à l'invention ne réagit qu'avec la chromatie cellulaire. Les acini glandulaires encore organisées réagissent avec l'AcM alors que les cellules tumorales toutes proches ne sont pas réactives. A l'intérieur même d'un groupe d'acini les cellules tumorales apparaissent négatives. Afin de comparer la réactivité des différentes cellules sur les coupes, les Inventeurs ont estimé sur chaque coupe le pourcentage de la population cellulaire réagissant avec l'AcM soit 0%, in férieur à 10%, compris entre 10 et 50% ou supérieur à 50%. Comme le montre le tableau I ci-après, tandis que 88 % (soit 30 sur 34) des malins invasifs ne réagissent pas avec l'AcM conforme à l'invention, c'est le cas seulement pour 20 % (soit 13 sur 63) des mastopathies bénignes ; 7 carcinomes in situ sur 10 (cribriforme) se comportent comme la majorité des carcinomes infiltrants ; 7 hyperplasies atypiques Sur 10 et 8 cas de Sclerosing adenosis sur 11 se comportent comme la grande majorité des coupes bénignes. Pour savoir si les différences de réactivité observées étaient significatives, les Inventeurs ont réalisé un test de Chi2 en regroupant les classes pour ne garder que 2 groupes : le négatif (inférieur à 10 %) et le positif (supérieur à 10 %). Le calcul de Chi2 (avec la correction de Yates) montre que la réactivité des cellules de chaque type histologique à l'AcM apparait significative (p 0.001) entre - bénin et carcinome invasif, - hyperplasie atypique et carcinome invasif, - sclerosing adenosis et carcinome invasif, - bénin et carcinome in situ. TABLEAU I N cas observés Fibrokystique Hyperplasie Sclerosing Carcinome Carcinome % de cellules Fibrohyperplasique atypique Adenosis in situ invasif réagissant avec ( n = 63) (n = 10) (n = 11) (n = 10) (n = 34) l'AcM de l'Invention 0 7 1 0 5 23 AcM 0 à 10 6 2 3 3 7 1/2 10 à 50 14 4 3 1 2 50 à 100 36 3 5 2 2 0 15 5 3 13 35 AcM 0 à 10 5 1 1 0 0 1/8 10 à 50 18 4 6 0 0 50 à 100 20 1 1 0 0 Le calcul de Chi2 avec la correction de Yates montre que la différence de réactivité des cellules avec l'AcM de L'Exemple 1 est : Significative entre : . BENIN et CARCINOME INVASIF (AcM 1/2 ou 1/8 : p 0.001) . HYPERPLASIE ATYPIQUE et CARCINOME INVASIF (AcM 1/2 : p 0.001, AcM 1/8 : p 0.01) . SCLEROSING ADENOSIS et CARCINOME INVASIF (AcM 1/2 : p 0.001, AcM 1/8 : p 0.01) . BENIN et CARCINOME IN SITU (AcM 1/2 : p 0.01, A M 1/8 : p 0.001) La présence d'isopeptides Glu-Lys constitue donc un marqueur fiable qui différencie nettement le tissu malin du tissu bénin sur coupes Ristologiques. EXEMPLE III DOSAGE DES PRODUITS DE REACTION TG EN FONCTION DE LA CROISSANCE CELLULAIRE Des cellules HEp2 ou MRC5 sont trypsinées puis ensemencées dans une boîte de Petri contenant du milieu de culture et une lame de verre. La lame couverte de cellules est prélévée à différents temps de culture. Les cellules sont fixées en acétone. Pour tester l'ensemble des produits de réaction TG, en plus du test de réactivité à l'AcM anti Glu - Lys, les Inventeurs ont testé la réactivité des cellules à l'antisérum antiPA. L'AcM conforme à l'invention réagit uniquement avec le noyau aussi bien pour Hep2 que pour MRC5 comme le font les cellules des biopsies. Afin de quantifier la réaction, les Inventeurs ont fait pousser les cellules dans des plaques de microtitration et après traitement avec les anticorps spécifiques le chromogène qui reste soluble donne une réaction colorée lisible à 490 nm sur un lecteur de plaque. L'immunomarquage varie pendant la croissance cellulaire. Ces variations sont corrélées avec celles de l'activité TG, sur les homogénats cellulaires. Cette activité a été dosée en présence d'un excès de substrats exogènes : dimethylcaséine DMC (ler substrat) et 14C Put (2ème substrat). Dans ce cas, le seul facteur limitant de la réaction est la TG. Le témoin en absence de DMC renseigne sur la disponibilité de ler substrats endogènes. EXEMPLE IV Dosage, au niveau plasmatique, d'anticorps anti-isopeptide sous forme d'immuncomplexes. Le dosage d'immuncomplexes par un "Covalent Enzyyme Linked Immuno Assay" (CELIA) a été mis au point. Il permet, contrairement à toutes les autres techniques publiées à ce jour (liaison du Clq ou de la conglutinine, précipitation avec le polyethylène-glycol..) de mesurer le taux de l'anticorps faisant partie de l'immumcomplexe et qui est spécifique d'un antigène particulier. Lorsqu'un sérum humain est dissocié à pH 2,25 puis réassocié in situ sur plaque-Spm à pH 8,1 son contenu en IgG antiSpm est augmenté de 9 fois par rapport au sérum non dissocié. L'augmentation est de 2 fois pour les IgM anti-Spm. Cette observation n'est pas restreinte à un seul sérum : pour 9 autres sérums de malades bronchopulmonaires, leur contenu en IgG antiSpm est accru de 2,7 à 13,5 fois après dissociation et réassociation par rapport à celui des sérums non dissociés. Une différence significative est toutefois notée : pour 5 sur 6 des sérums de malades cancéreux l'augmentation est moins que 8,5 fois tandis que pour les 3 sérums de malades témoins elle est supérieure à 10,6 fois. EXEMPLE V Détermination de la spécificite des AcM vis-à-vis de la fibrine et du D-Dimer a-envers le fibrinogène, la fibrine et la BSA-Z lys. Cette expérience a été effectuée par Dot-blot sur carrés de nitrocellulose sur chacun desquels ont été absorbés 2Rg de fibrinogène, de fibrine (en suspens ion fine obtenue par sonication), et de BSA-Z-lys. Les carrés ont été ensuite incubés avec un tampon (A) contenant 10 % Régilait dans PBS pendant 30 mn à la température am biante. A la fin de cette période, les carrés ont été rincés avec PBS, puis mis à incuber avec le milieu de culture de l'AcM 71 A3fl dilué 1/100 dans un tampon (B) 0,1 % Tween 20 dans PBS. L'ensemble des carrés a été incubé pendant 2h à 37" C. A la fin de la période d'incubation, les carrés de nitrocellulose ont été lavés tout d'abord avec le tampon B, ensuite traités avec les anticorps (mouton) marqués à 125I, dirigés contre les IgG de souris (AMERSHAM) dilués au 1/50 dans une suspension de Régilait dilué à 5 % dans le PBS. Après un temps de contact de 1 h à 37 C, les carrés ont été lavés plusieurs fois avec le tampon B jusqu'à ce que le liquide de lavage ne contienne plus de trace de I'125I. La radioactivité retenue sur chaque carré a ensuite été déterminée dans un compteur 7. b - envers la fibrine humaine formée in situ A 4 tubes contenant chacun 0,5 ml de plasma humain prélevé sur citrate, a été ajouté CaC12 à une concentration finale de 40 mM. A 2 tubes contenant chacun 0,5 ml de plasma prélevé sur citrate a été ajouté du NaCl 0,14 M à la place de CaC12. Tous les tubes ont été incubés une nuit à 37 C. Après cette période, ils ont été centrifugés à 700 g pendant 10 mn. 2 tubes de la série (A) et 2 tubes de la série (C) ont été lavés 3 fois avec le tampon B pour éliminer les traces de protéines plasmatiques. Les tubes de la série (B) n'ont pas été lavés pour déterminer l'influence du lavage. A la fin de cette étape, 1 tube de chaque série a reçu 200 Al du milieu de culture de l'AcM 71A3fl et l'autre 200 Al d'un AcM irrelevant. Après incubation pendant 2 h à la température du laboratoire, tous les tubes ont été lavés par centrifugation avec le Tampon B. Cette étape était suivie par l'addition d'une solution diluée 1/50 ( 5 % Régilait dans PBS) d'anticorps (mouton) marqués à 125I dirigés contre les IgG de souris. Après incubation pendant 2 h, à la température du laboratoire, les étapes de lavage et de mesure de la radioactivité étaient identiques à celles décrites ci-dessus. c - envers le D-Dimer 1) Immobilisation de l'AcM par couplage direct Les sphères paramagnétiques porteuses de groupements NH2 ont été utilisées. Les groupements NH2 ont été convertis en acide-hydrazide : CO-NH-NH2(AH) selon les techniques décrites dans l'Art antérieur Des IgG spécifiques (71 A3 fl) ont été préparés à partir de liquide d'ascite. 50 \g de ces IgG purifiées ont été oxydés à l'aide de périodate de sodium et couplés à la fonction AH des sphères selon la méthode décrite. 2) Immobilisation de l'AcM par immuno-capture Dans ce cas, les IgG (chèvre) anti Fc souris ont été tout d'abord couplées par l'intermédiaire de liaisons hydrazone qui a été formée entre ces IgG oxydées et les groupements AH sur les sphères (Quash et al.,1989) 3,5 mg de ces sphères anti IgG de souris ont été ensuite mises à réagir directement avec 50 Rg d'IgG purifié (71 A3 fl) pendant 1 nuit à 4"C. Le lendemain, les sphères ont été lavées par plusieurs cycles d'aimantation, tout d'abord à l'aide du tampon B et ensuite par un tampon (C) contenant - 0,05 M Tris ajusté à pH 8.1 avec l'acide citrique, - 0,1 % Tween 20 (V/V), - 0,14 M NaCl. 1 mg de ces sphères-AcM ainsi lavées a été resuspendu dans 1 ml de tampon 1 et ajouté à 16 Al de plasma humain étalon contenant le D-Dimer (fourni par STAGO). Après 1 nuit à 4"C, les sphères ont été lavées 3 fois avec le tampon (C) contenant 1 M NaC1 par aimentation pour éliminer toute protéine réagissant non spécifiquement avec les sphères-AcM. Les sphères airrsi récupérées ont été soumises à l'électrophorèse en gel de polyacrylamide à 7,5 % dans des conditions non dénaturantes. d - envers les dipeptides La spécificité fine d'un de ces AcM 71 A3 fl a été recherchée à l'aide du peptide homologue N (7-glu) lys et des peptides hétérologues Na - (&alpha;-glu)lys et Na (aglu)lys. Chaque dipeptide à des concentrations variant de 0,03 Wmol à 1 Rmol, a été ajouté, à O,lml de milieu dilué 1/50 dans tampon (B). Le milieu dilué 1/50 additionné de 100 ptl de PBS servait de contrôle. Après incubation pendant 1 h à 37"C, les milieux ainsi traités ont été mis en contact avec les carrés de nitrocellulose sur lesquels avaient été préalablement déposés 2Rg de BSA-Z-lys et incubés en présence de tampon (A). L'ensemble des carrés et des milieux a été incubé pendant 2 h à 37 C. A la fin de la période d'incubation, les carrés de nitrocellulose ont été lavés tout d'abord avec du tampon A et ensuite traités avec les anticorps (mouton) marqués à 125I dirigés contre les IgG de souris (Amersham Code 1M 131) dilué au 1/50 dans PBS - Régilait 5 %. La suite de l'expérimentation est identique à celle décrite en (a). EXEMPLE VI Détermination de la spécificité de l'AcM conforme à l'invention. La sélection des AcM a été effectuée à l'aide de l'isopeptide Na(7-glu)lys. Néanmoins, il a été vérifié si ces anticorps avaient une spécificité stricte pour le dipeptide homologue ou s'ils donnaient des réactions croisées avec d'autres dipeptides hétérologues contenant glu et lys tels que Na (r-glu)lys qui existe naturellement dans des proteines ou même avec N(a-glu)lys dont l'existence naturelle dans des proteines n'a pas encore été trouvée à ce jour. Détermination de la spécificité fine de l'AcM 71 A3 fl Pour ce faire, ces deux dipeptides ainsi que l'homologue Na(7-glu)lys ont été additionnés (à des concentrations variables) à l'AcM avant son contact avec la BSA-Z-lys. L'expérimentation a été menée comme décrit à l'EXEMPLE V (d). Les résultats obtenus sont représentés sur la Fig. 1 annexée. Il est clair que le taux d'inhibition maximale avec les dipeptides Na (a-glu)lys et Na (a-glu)lys ne dépasse pas 15 %. En revanche, avec le Na (7-glu) lys, cette inhibition atteint 60 %. Dans d'autres expériences d'inhibition utilisant cette fois-ci un dosage immunoenzymatique, l'inhibition par le dipeptide homologue a atteint 72,4 % tandis que celles obtenues avec les dipeptides hétérologues n'ont jamais dépassé 10 %. Détermination de la réactivité de 71 A3 fl avec le fibrinogène et la fibrine. Cette expérience a effectuée par Dot-bloot conformément aux modalités décrites à l'EXEMPLE V (a). Les résultats représentés à la Fig. 2 annexée montrent que cet AcM réagit effectivement avec la fibrine et avec la BSA-Z-lys utilisée comme contrôle mais ne réagit pas avec le fibrinogène. Toutefois, comme cette réaction avec la fibrine ne permettait pas de dire si cet AcM réagirait avec la fibrine native car la sonication subie par la fibrine pour faire une suspension homogène, lors des dot-blots, aurait pu révéler sur la molécule les liaisons N(Y- glu)lys, qui pourraient être à l'état cryptique dans la fibrine native, la réactivité de l'AcM conforme à l'invention sur la fibrine néo-formée, à été testée. Détermination de la réactivité de 71 A3 fl avec la fibrine néoformée. L'expérimentation a été menée comme décrit à l'EXEMPLE V (b) pour déterminer l'influence éventuelle d'autres protéines plasmatiques sur la réaction de l'AcM avec la fibrine. Les résultats qui figurent dans le Tableau II ci-après montrent que cet AcM est capable de réagir avec la fibrine néo-formée. Même en présence d'autres protéines plasmatiques (série non-lavée), l'interaction reste spécifique. TABLEAU II Réactivité de l'AcM avec caillot humain préformé Essais Résultats Corrigés (dpm) (-Témoin conjugué) +Témoin conjugué* 6000 0 (A) Plasma + Ca -Témoin AcM non spécifique 9700 3700 caillot lavé + AcM spécifique 31000 25000 (B) Plasma + Ca +Témoin AcM non spécifique 5700 0 caillot non lavé + AcM spécifique 9500 3500 (C) Plasma - Ca +Témoin AcM non spécifique 1300 0 + Lavage + AcM spécifique 4500 0 * : Anti-IgG de souris marquée à I125. Détermination de la réactivité de l'AcM conforme à l'invention avec le D-DIMER. La procédure expérimentale mise en oeuvre est celle décrite à l'EXEMPLE V (c). Immunocapture Pour faciliter la séparation des produits de cette réaction l'IgG anti isopeptides 71 A3 fl a été tout d'abord purifiée à partir d'un liquide d'ascites et ensuite couplée par liaison covalente (hydrazone) à des sphères paramagnétiques. Les sphères -IgG ont été mises en contact soit avec le D-Dimer purifié, soit avec un sérum contenant le D-Dimer. Après incubation à 4 C, pendant 1 h, les sphères ont été lavées par 4 cycles successifs d'aimantation et ensuite soumises directement à une séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide 7,5 % dans les conditions non-dénaturantes. Les résultats obtenus sont présentés sur les Fig. 3A et 3B annexées. Il est clair que 1) les IgG anti isopeptide ont pu interagir avec le D-Dimer en solution, 2) de toutes les protéines présentes dans un sérum, seul le D-Dimer a été reconnu par les anticorps anti isopeptide. Ces résultats montrent sans équivoque non seulement la spécificité de l'AcM pour une seule protéine plasmatique, le D-Dimer, mais également la possibilité de l'isoler en quantité suffisante afin de servir comme immunogène. Les résultats sont similaires, que l'AcM soit couplé directement par liaison hydrazone sur les sphères ou lié indirectement par l'intermédiaire d'IgG de mouton anti IgG souris fixée elle-même par liaison hydrazone sur les sphères. DETECTION DE CAILLOT CHEZ LE LAPIN Etude d'un anticorps anti-liaison isopeptique marqué à l'Indium 111, chez le lapin Fauve de Bourgogne, sur lequel une thrombose rouge "in situ" a été réalisée. Visualisation par l'utilisation de la Gamma Caméra, après 1 heure, 4 h, 24h et 48 h. Le volume d'injection est de 600 Ciel./ 500 mg anticorps. La concentration radioactive par animal 300ici. Marquage anticorps 71 A3 fl. - couplage au DTPA (acide éthylènediaminetetra-acétique). A 6,5 mg d'anticorps 71 A3 fl dans 2,2 ml de NaHC03 0,1 M on ajouter 0,157 mg d'anhydride de DTPA dans du DMSO anhydre ( rapport molaire DTPA/Anticorps = 10). Après incubation de 20 minutes à température ambiante le DTPA non lié à l'anticorps est éliminé par gel filtration sur HR 200 (30 x 1,5) élué par NaCl 0,15 M. Ensuite l'anticorps est reconcentré par ultrafiltration ( cellule Amicon) à la concentration de 1,7 mg/ml dans NaCl 0,15 M. - Marquage à l'indium 111 A 170 pcg d'anticorps ( 100 Rl) couplés au DTPA on rajoute 100 Rl de tampon acetate 0,2 M pM 5,0 puis 300 Al d'endium 111 Cl3 ( à 100R1/ml) Après incubation de 60 minutes le rendement de marquage est supérieur à 90 %. Réalisation d'une thrombose rouge "in situ" chez le lapin - Chirurgie sur l'animal Une incision parallèle à la trachée-artère est pratiquée. La veine jugulaire est dégagée, un abaisselangue (type médical) est glissé sous la veine, un coton fortement imbibé de formaline (aldéhyde formique pur en solution à 30 %) est appliqué sur celle-ci durant 20 minutes. Passée cette période, le coton est retiré et la plaie nettoyée à l'aide de sérum physiologique puis refermée. L'injection de la solution d'anticorps marqué est effectuée 30 minutes après la fin de l'opération par la voie intra-veineuse. EXPLOITATION La visualisation du thrombus est tentée 1 heure et 4 heures après la-fin de l'injection ; On note une fixation hépatique et une activité circulante importantes. Après 24 heures, on peut observer une petite fixation au niveau de la plaie sur un des 2 lapins. A 48 heures, la fixation est apparente sur les 2 lapins, avec toujours une fixation hépatique et une activité circulante importantes. Pour vérification, le thrombus et lml de sang sont prélevés et comptés sur la chaine de mesure universelle ECT 33 ANTI-CORPS ANTI-LIAISON ISOPEPTIDIQUE In 111 ACTIVITE LAPIN LAPIN N"1 N"2 THROMBUS/g 1053 2733 SANG/ml 2053 2185 THROMBUS/SANG 1,97 1,25 Il est clairement démontré par les exemples que l'AcM conforme à l'invention réagit exclusivement sur la fibrine sous forme de polymère et non pas sous forme de monomère. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Anticorps caractérisés en ce qu'ils reconnaissent de façon spécifique l'isopeptide Ne-(Y-glutamyl)-lysine formé sous l'action de la transglutaminase entre le groupe T-carboxamide d'un résidu glutamine présent dans une protéine et le groupe a-NH2 de la lysine ou entre le groupe a-NH2 d'un résidu lysine soit libre soit présent dans une protéine et le groupe 7-carboxyle de l'acide glutamique, soit libre, soit présent dans une protéine, ou des fragments desdits anticorps. 2. Anticorps selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont des anticorps polyclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, contenus dans le sérum prélevé chez ce dernier et, éventuellement, isolés dudit sérum par des techniques de purification appropriées. 3. Anticorps selon la Revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont des anticorps monoclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, suivie de la fusion des cellules spléniques prélevées chez ledit mammifère immunisé, avec les cellules d'un myélome judicieusement choisi d'un mammifère de même espèce, sélection des hybridomes secrétant les anticorps recherchés, clonage, culture et collecte des anticorps monoclonaux spécifiques. 4. Immunogène propre à être mis en oeuvre pour l'immunisation de mammifères appropriés en vue de la production d'anticorps spécifiques dirigés contre l'isopeptide NE-(y-glutamyl) -lysine et, de plus, propre à être mis en oeuvre pour le dosage d'anticorps dirigés contre ledit isopeptide, contenus dans des immuncomplexes, lequel immunogène est caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine contenant de l'acide glutamique, conjuguée par l'intermédiaire du groupe 7-carboxyle dudit acide au groupe a-NH2 d'un résidu lysine contenu dans une protéine appropriée. 5. Immunogène propre à être mis en oeuvre pour l'immunisation de mammifères appropriés en vue de la production d'anticorps spécifiques dirigés contre l'isopeptide NE-(y-glutamyl) -lysine et, de plus, propre à être mis en oeuvre pour le dosage d'anticorps dirigés contre ledit isopeptide, contenus dans des immuncomplexes, lequel immunogène est caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine contenant de la lysine conjuguée par l'intermédiaire du groupe a-NH2 de ladite lysine, ou groupe 7-carboxyle d'un résidu acide glutamique soit libre, soit contenu dans une protéine appropriée. 6. Anticorps selon la Revendication 3, caractérisés en ce qu'ils sont sous forme libre. 7. Anticorps selon la Revendication 3, caractérisés en ce qu'ils sont immobilisés sur des supports insolubles appropriés. 8. Immunogène selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il est immobilisé sur un support insoluble approprié. 9. Anticorps et Immunogènes selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, caractérisés en ce qu'ils sont marqués à l'aide de tous marqueurs appropriés. 10. Anticorps selon la Revendication 9, caractérisés en ce qu'ils sont marqués à l'aide de radioéléments appropriés, notamment lorsqu'ils sont destinés à être mis en oeuvre dans des tests de diagnostic in vivo auquel cas ils sont avantageusement marqués par tous radio-éléments usuels. 11. Agent de diagnostic in vitro de lésions ou de tumeurs de tissus mammaires ou colorectaux humains, par techniques immunohistochimiques sur des biopsies desdits tissus, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps spécifique polyclonal ou monoclonal, de préférence sous forme libre, convenablement marqué selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, 6, 7, 9 et 10. 12. Agent de diagnostic in vitro, de maladies cardiovasculaires et de maladies virales accompagnées de séquelles telles que fièvre hémorragique, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps spécifique monoclonal, de préférence immobilisé sur un support insoluble, convenablement marqué, selon l'une quelconque des Revendications 3, 6, 7, 9 et 10. 13. Agent de diagnostic in vivo de tumeurs malignes et de maladies cardiovasculaires, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps monoclonal spécifique, ou l'un des ses fragments, convenablement marqué, selon l'une quelconque des Revendications 3, 6, 7, 9 et 10. 14. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal spécifique selon l'une quelconque des Revendications 3, 6, 7, 9 et 10 ou l'un de ses fragments, couplé à au moins une enzyme protéolytique appropriée ou à un médicament convenable. 15. Agent de détection d'anticorps dirigés contre un isopeptide formé sous l'action de la transglutaminase, présents dans un tissu ou un fluide corporel, notamment sous la forme d'immuncomplexes, caractérisé en ce qu'il est constitué par un isopeptide formé d'une protéine contenant un résidu glutamine, conjuguée par l'intermédiaire du groupe -carboxamide de ce dernier au groupe a-NH2 d'un résidu lysine soit libre, soit contenu dans une protéine appropriée, lequel isopeptide, conforme à la Revendication 4 ou à la Revendication 5, est, si on le désire, convenablement marqué.