Brevet FR2670215A1 — publié le 19920612

La présente invention est relative à des lignées de cellules immortalisées conservant les mêmes propriétés que les cellules différenciées ou précurseurs primaires du donneur d'origine, à leurs applications en tant que système de production de cellules différenciées en grand nombre et en tant que modèle d'étude de la physiopathologie des cellules différenciées obtenues. La présente invention est également relative à l'application desdites cellules différenciées et/ou précurseurs comme agent à visée préventive et/ou thérapeutique, notamment dans le traitement des maladies génétiques, et plus particulièrement dans les myopathies. Les lignées cellulaires immortalisées de l'Art antérieur ne permettent pas d'obtenir des cellules différenciées ayant les mêmes propriétés que les cellules qui se différencient normalement dans l'organisme vivant, pour former notamment un organe ; de plus, les lignées cellulaires immortalisées décrites dans l'Art antérieur sont spécifiques d'un organe ou d'un type cellulaire. La Demande Internationale PCT WO 89/09816, au nom de MASSACHUSSETS INSTITUTE OF TECHNOLOGY décrit, par exemple, une lignée cellulaire immortalisée produite par incorporation dans des cellules précurseurs appropriées, d'un gène stimulateur de multiplication, qui est capable de permettre auxdites cellules de se multiplier, lequel gène est contrôlé par un facteur externe. Plus spécifiquement, cette Demande PCT décrit une lignée cellulaire immortalisée produite par incorporation, dans des cellules du système nerveux embryonnaire, d'un vecteur rétroviral comprenant un gène de multiplication, qui correspond au domaine sensible à la température de la souche tsA58 du virus SV4O et un gène résistant à un médicament, notamment à un antibiotique. Toutefois, le modèle proposé dans cette Demande internationale PCT est spécifique des cellules nerveuses ; de plus, il comprend un vecteur rétroviral, comprenant un promoteur viral, qui comporte un certain nombre d'inconvénients, notamment les risques liés à la présence d'un fragment d'origine virale. Les Inventeurs se sont, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des lignées de cellules immortalisées, permettant l'obtention de cellules différenciées présentant les caractéristiques des cellules différenciées obtenues normalement à partir de cellules primaires, quelle que soit la cellule d'origine. La présente invention a pour objet des lignées cellulaires immortalisées, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par transformation appropriée de cellules primaires convenables, -issues d'un organe d'animal approprié, notamment un mammifère ou un oiseau,- par un fragment d'acide nucléique comprenant un oncogène viral immortalisant approprié, au moins un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine et éventuellement un gène dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique, lequel gène permet la sélection des transformants. Selon un mode de réalisation avantageux desdites lignées cellulaires, l'oncogène viral immortalisant est choisi dans le groupe qui comprend l'oncogène T/t de SV40, l'oncogène tST/At de SV40, l'oncogène T/At de SV40 et la région du gène immortalisant de l'adénovirus, du virus Epstein-Barr ou du virus herpétique. Conformément à l'invention, le fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine est, de préférence, le promoteur de la vimentine et plus particulièrement le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine, compris entre les bases -830 et +93 de la séquence régulatrice de la vimentine. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine comprend les bases -830 à -529 et/ou le fragment -540 à -140, situés en amont du site cap. Un tel fragment d'acide nucléique hybride (oncogène grand T de SV 40 associé au promoteur de la vimentine) a notamment été décrit dans la Demande de Brevet européen n 90402009.6 et est notamment incorporé dans un plasmide dénommé pHuVim830-T/t. Dans la présente invention, on entend par gène grand T, le gène qui exprime à la fois la protéine T et la protéine t (symbolisé T/t), alors que le gène T/At n'exprime que la protéine grand T (At correspond à la délétion du gène petit t). Les Inventeurs ont mis au point une séquence qui contient le gène grand T thermosensible (ts) tST/At et le promoteur de la vimentine, laquelle séquence a l'avantage de n'exprimer conditionnellement que la protéine grand T et d'être activée par le promoteur de la vimentine ; de plus, ce gène grand T est modifié de manière à être thermosensible. Cette séquence peut notamment être insérée dans un plasmide, dénommé par les Inventeurs pHuVim830-tST/Bt. Les lignées cellulaires conformes à l'invention, en raison de l'association fragment d'ADN codant pour'l'antigène T du virus SV40 et promoteur de la vimentine, -qui constitue l'activateur du gène immortalisant associé-, présentent un certain nombre d'avantages, notamment liés à la présence du promoteur de la vimentine. La vimentine est un polypeptide que l'on retrouve dans les cellules dérivées du mésenchyme. Il s'agit d'une protéine de structure des cellules ; le gène de la vimentine joue notamment un rôle dans la croissance cellulaire, la différenciation et le développement cellulaire. La combinaison gène d'expression de l'antigène T du SV40 et promoteur de la vimentine a notamment l'avantage de permettre un contrôle spécifique de la différenciation cellulaire - l'activation du gène de l'antigène T est réalisée par le promoteur de la vimentine, en présence d'un agent mitogène approprié, éventuellement associé à des protéines qui se fixent sur un site du promoteur de la vimentine ; il en ressort qu'en l'absence d'agent mitogène, le promoteur de la vimentine est réprimé, - l'antigène T lui-même, lorsqu'il est produit, active le promoteur de la vimentine, par action sur certains sites du promoteur de la vimentine sur lesquels peuvent se fixer des protéines activatrices (AP1, c-fos, NK-KB) et l'antigène T lui-même. Une telle combinaison a également l'avantage de ne pas être spécifique vis-à-vis d'une cellule ou d'un organe, mais au contraire de permettre l'immortalisation de n'importe quelle cellule, tout en gardant les potentialités de différenciation de la cellule immortalisée. La combinaison gène d'expression de l'antigène T sensible à la chaleur et promoteur de la vimentine, a de plus l'avantage de permettre un double contrôle, tant au niveau de l'antigène T lui-même (température d'activation, 34 C par exemple) que du promoteur de la vimentine (répression lorsque l'antigène T n'est plus fonctionnel), cette combinaison ayant de plus l'avantage de ne pas contenir le gène t, évitant ainsi des perturbations au niveau de la membrane cellulaire. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites lignées, les cellules primaires sont avantageusement choisies dans le groupe qui comprend les cellules musculaires précurseurs de mammifère et plus particulièrement les myoblastes, les cellules épithéliales de mammifère et les cellules endothéliales de mammifère. Conformément à l'invention, les cellules musculaires précurseurs sont, de préférence, choisies dans le groupe qui comprend les myoblastes normaux de souris, les myoblastes mutants de souris et les myoblastes mutants humains. Les myoblastes mutants de souris sont avanta geusement choisis dans le groupe qui comprend des myoblastes de dysgénésie musculaire, notamment dénommés myoblastes mdg et mdx et les myoblastes mutants humains sont notamment choisis dans le groupe qui comprend les cellules DMD et les cellules STEINERT. La lignée de cellules immortalisées conforme à l'invention est avantageusement obtenue par transfection des cellules primaires appropriées par un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tST/At, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-T/t. Conformément à l'invention - la lignée, dénommée HVM, est obtenue par transfection de myoblastes normaux de souris par un plasmide pHuVim830-tST/At et a été déposée sous le n I-1019 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT PASTEUR. - la lignée dénommée HVMd est obtenue par transfection de myoblastes mutants mdg de souris par un plasmide pHuVim830-tST/At et a été déposée sous le n I-1020 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT PASTEUR. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la lignée cellulaire est obtenue par microinjection d'une séquence linéaire d'acide nucléique appropriée, obtenue à partir d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tST/At, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-T/t, dans des cellules primaires convenables. Conformément à l'invention, la lignée dénommée HVE est obtenue par microinjection d'un plasmide pHuVim830-T/t linéarisé dans des cellules endothéliales humaines du cordon ombilical et a été déposée sous le n I-1016 en date du 3 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR. On obtient ainsi des lignées cellulaires présentant un taux de multiplication élevé. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (a) culture d'une lignée cellulaire musculaire immortalisée, conforme à l'invention, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant thermosensible, notamment le plasmide pHuVim830-tST/At, sur un milieu approprié, contenant une quantité appropriée de sérum d'un animal convenable, à une température comprise entre 34 C et 36 C, permettant l'expression conditionnelle d'une protéine virale, et notamment de l'antigène tsT et une multiplication cellulaire importante (b) modification de la température des cellules en culture à une température comprise entre 38 C et 40 C, associée, éventuellement, à une modification du milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu et/ou utilisation d'un sérum d'un animal différent de celui de l'étape (a) ; et (c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b). Dans les cellules différenciées ainsi obtenues (stade myotubes), le promoteur de la vimentine est réprimé et la protéine T n'est pas fonctionnelle. En variante, le procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées comprend les étapes suivantes (a) culture d'une lignée cellulaire musculaire immortalisée, conforme à l'invention, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant, notamment un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t et le plasmide pHuVim830-T/At, sur un milieu approprié, contenant une quantité convenable de sérum d'un animal convenable, à une température appropriée notamment 37C (b) modification du milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu (c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b) La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de cellules épithéliales ou endothéliales différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (a) culture d'une lignée cellulaire épithéliale ou endothéliale, conforme à l'invention en présence d'un agent d'activation approprié, qui conditionne l'expression d'une protéine virale appropriée et notamment de l'antigène T en présence du promoteur de la vimentine et permet une multiplication cellulaire importante (b) transfert de ladite lignée immortalisée dans un milieu dépourvu en agent d'activation et/ou à une température comprise entre 37 C et 40 C ; et (c) obtention de cellules différenciées en grand nombre. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'agent d'activation est notamment choisi dans le groupe qui comprend l'antigène T lui-même et des agents mitogènes appropriés. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'agent mitogène est notamment choisi dans le groupe qui comprend les sérums, les facteurs de croissance tels que le PDGF, 1'EGF ou le FGF, l'interleukine II, les interférons et la phytohémaglutinine (PHA). Lorsque l'agent d'activation consiste en l'antigène T lui-même, il agit sur certains sites du promoteur de la vimentine et active ainsi le promoteur puis, le promoteur activé active ensuite l'antigène T. Lorsque l'agent d'activation consiste en du sérum, ce dernier agit plus particulièrement sur les protéines AP1, c-fos et NF-KB, qui se fixent sur l'acide nucléique du promoteur de la vimentine au niveau notamment des bases -707, -693, -197, -195 et -227, permettant au gène codant pour l'antigène T, d'exprimer ledit antigène. La présente invention a également pour objet les cellules différenciées obtenues par l'un quelconque des procédés d'obtention de cellules différenciées décrits ci-dessus. Les cellules différenciées ou précurseurs conformes à l'invention trouvent notamment application comme agent à visée préventive, vaccin par exemple, notamment par adjonction d'un fragment d'acide nucléique d'un virus approprié et/ou comme agent à visée thérapeutique, notamment par adjonction d'un fragment d'acide nucléique dit "correcteur", plus spécifiquement dans le traitement de maladies génétiques, par exemple les myopathies. En effet, dans de telles cellules, le promoteur de la vimentine est réprimé ; de plus, elles n'expriment plus l'antigène T. La présente invention a également pour objet un agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule différenciée conforme à l'invention, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement~associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié. La présente invention a également pour objet un agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire conforme à l'invention, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié. La présente invention a, de plus, pour objet un modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire des cellules musculaires, épithéliales, endothéliales ou nerveuses, caractérisé en ce qu'il est constitué par une lignée cellulaire conforme à 1' invention. La présente invention a, en outre, pour objet une séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend successivement - une séquence codant pour l'antigène grand T de SV40, ne comportant pas le fragment codant pour l'antigène petit t, laquelle séquence est thermosensible, ou un fragment de celle-ci - une séquence comprenant au moins un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine et notamment au moins un fragment du promoteur de la vimentine humaine, d'une longueur de 830 paires de bases à partir du site cap ou un fragment de celle-ci, notamment le fragment -830 à -529 et/ou le fragment -540 à -140, en amont dudit site cap ; et, éventuellement - un gène, dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique. Une telle séquence peut notamment être insérée dans un vecteur approprié, notamment un plasmide, lequel vecteur est apte à immortaliser une lignée cellulaire appropriée ; un tel plasmide a été dénommé, comme précisé plus haut, pHuvim830-tsT/At par les Inventeurs. La présente invention a, de plus, pour objet une méthode de production d'un mammifère transgénique non humain, caractérisée en ce qu'elle comprend l'introduction d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-tST/At dans un mammifère non humain à un stade embryonnaire précoce. La présente invention a également pour objet un mammifère transgénique non humain, caractérisé en ce qu'il est obtenu par la méthode ci-dessus décrite, et en ce que les cellules comprenant le plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/t et le plasmide pHuVim830 tST/t, peuvent se différencier normalement in vivo, tout en pouvant produire des cellules immortalisées in vitro. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Préparation des plasmides. 1) Plasmide pHuVim830-T/t Ce plasmide est décrit dans la Demande de Brevet européen 90402009.6 ; il exprime l'antigène grand T et l'antigène petit t. Le fragment -830 - +93 du promoteur de la vimentine est cloné dans un plasmide pUC 18 les clones sont obtenus par digestion de la séquence 5' du gène de la vimentine au niveau du site de l'enzyme de restriction Pvu II. Le plasmide pUC 18 contenant le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine est linéarisé par l'enzyme de restriction Xba I ; on obtient une extrémité 3' cohésive, qui est ajustée de manière à obtenir une extrémité franche, puis on lie le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine ainsi obtenu avec le fragment d'ADN de l'antigène T, par ligation de l'extrémité 3' Xba I du promoteur avec l'extrémité Sfi I du fragment SV40. Les extrémités BamH I 5' et 3' sont liées en présence de T4 ligase. Les séquences codant pour l'antigène T sont ainsi sous le contrôle de la région régulatrice de la vimentine de 830 paires de bases. 2) Plasmide pHuVim830-tST/At : Ce plasmide contient la séquence codant pour l'antigène grand T dans laquelle les nucléotides 4630 à 4900 ont été retirés. Ce plasmide n'exprime plus la protéine t et l'expression de la protéine T est thermosensible. Cette thermosensibilité est obtenue à l'aide d'une mutation au niveau du nucléotide 3505. Le plasmide qui n'exprime que la protéine T, est activé par le gène de la vimentine humaine. La séquence codant pour l'antigène T commence en position 5234 et s'arrête en position 2533 ; ce fragment est généré par digestion de 1'ADN de SV40 par les enzymes de restriction suivantes : Sfi I, (position 5234) et BamH I (position 2533). La figure 1 décrit plus précisément ce plasmide, qui comprend successivement un fragment de 830 paires de bases du promoteur humain de la vimentine, la séquence codant pour l'antigène T et le plasmide pUC18. Exemple 2 : Production de lignées cellulaires musculaires précurseurs conformes à l'invention et cellules musculaires différenciées, obtenues à partir de ces lignées. a- Lignées cellulaires musculaires précurseurs Les myoblastes immortalisés sont obtenus par transfection avec le plasmide pHuVim-tST/At décrit cidessus, à 34 C dans un milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal à 20 t. Dans ces conditions, toutes les cellules expriment l'antigène T (figures 2A et 2B), indiquant qu'elles ont toutes intégrées le plasmide ; en effet, à 34 C la protéine grand T fonctionnelle induit la multiplication et l'immortalisation de la cellule.Ces figures 2A et 2B représentent l'immunofluorescence indirecte obtenue, lorsqu'une lignée cellulaire immortalisée, réalisée à partir de myoblastes normaux (figure 2A) ou de myoblastes mdg (figure 2B), est mise en contact avec des anticorps monoclonaux anti-protéine T ; à 34 C, tous les noyaux cellulaires expriment l'antigène T. La synthèse de la protéine grand T est caractérisée après électrophorèse d'extraits myoblastiques après couplage avec des anticorps spécifiques dirigés contre ladite protéine T. La quantité de protéine T est similaire dans les myoblastes normaux et dans les myoblastes mdg. L'analyse de 1'ADN génomique révèle que le gène recombinant est intégré (figures 3A et 3B). Ces figures représentent l'intégration du plasmide pHuVim830tST/At dans les cellules musculaires. L'ADN des cellules immortalisées est traité par l'enzyme de restriction Hinc II, puis est soumis à une électrophorèse sur gel, suivie d'un transfert sur bande de nitrocellulose ; on procède ensuite à une incubation avec une sonde d'ADN marquée au 32P (32p dCTP), correspondant au fragment codant pour l'antigène T (les 632 derniers nucléotides du gène SV40 T (Amersham Multiprime kit) ; si le fragment est effectivement intégré, on observe une bande d'environ 1 kb (figure 3A : muscle normal, souche sauvage ; figure 3B : muscle mdg, dysgénésie musculaire g). Le temps de doublement de ces cellules immortalisées est d'environ 24 heures. b- obtention de cellules musculaires différenciées Les lignées cellulaires obtenues ci-dessus, sont mises dans des conditions de différenciation appropriées à savoir à 39 C, dans un milieu DMEM contenant du sérum de cheval à 10 %. La thermosensibilité de l'expression de l'antigène T conduit à une augmentation de la différenciation terminale, lorsque l'antigène T est réprimé. Dans ces conditions de différenciation (39'C, milieu DMEM contenant du sérum de cheval à 10 %), les cellules mononucléées (myoblastes) non fusionnées expriment la protéine T alors que les myoblastes fusionnés (myotubes multinucléés) n'expriment pas la protéine T, indiquant la répression du promoteur de la vimentine au stade myotubes. Les souris normales et les souris présentant une dysgénésie musculaire (souris dites mdg), sont capables de former des myotubes. Deux clones ont plus particulièrement été étudiés HMV pour les myoblastes normaux et HMVd pour la dysgénésie musculaire. 2. Caractéristiques des cellules différenciées obtenues L'apparition de sarcomères normaux, de triades et du couplage excitation-contraction sont des marqueurs de la différenciation terminale des cellules musculaires en culture. Les cellules différenciées obtenues à partir de la lignée immortalisée de souris normales se contrac tent spontanément en culture et leur organisation sarcomérique peut être visualisée, alors que dans les myotubes mdg immortalisés obtenus conformément à l'invention, l'organisation sarcomérique est peu développée. Contrairement aux myotubes immortalisés normaux conformes à l'invention, le courant calcique de type L n'est pas retrouvé dans les cellules différenciées mdg. Exemple 3 : Production de lignées cellulaires endothéliales conformes à l'invention et cellules différenciées, obtenues à partir de ces lignées. a. Immortalisation de cellules endothéliales Les cellules endothéliales de porc et de lapin sont recueillies, à partir d'échantillons de sang, par ponction veineuse dans des tubes héparinisés suivie d'une centrifugation sur Ficoll (d=1,09). Les cellules endothéliales humaines sont recueillies, après une digestion limitée à la collagénase, des veines du cordon ombilical ou des vaisseaux du cerveau ; ces cellules sont mises en culture dans des récipients de culture recouverts de gélatine, avec un milieu DMEM supplémenté avec du sérum de veau foetal à 10 %, de la glutamine à 2 mM et des antibiotiques, incubées à 37 C en atmosphère humidifiée contenant 10 % de CO2. Entre 500 et 2000 cellules sont individuellement microinjectées dans leurs noyaux, avec un plasmide pHuVim830-T/t linéarisé (environ 3,5 kb), tel que décrit dans la Demande de Brevet européen n 90402009.6, à savoir comprenant le gène codant pour l'antigène T complet de SV40 (grand T et petit t) et la séquence comprise entre les nucléotides -830 et +93 du promoteur de la vimentine, linéarisé par digestion Sph I/BamH I dudit plasmide à une concentration de 2 ng/l dans un tampon Tris-EDTA. La microinjection de ce plasmide dans le noyau desdites cellules est suivie de l'intégration et de l'expression de l'antigène grand T dans les cellules dérivées. La quantité injectée est d'environ deux fois supérieure à la taille du noyau. 2. Caractéristiques de la multiplication cellulaire L'efficacité du clonage est testée sur des plaques contenant 50 puits de~ culture de 10 mm de diamètre, lesquels puits sont inoculés avec 1-10 cellules. Les courbes de croissance sont établies à partir de trois plaques, en utilisant des cellules COS comme référence. La croissance dans un milieu semi-solide est réalisée comme décrit par GIMBRONE et al. (Cell, 1976, e, 685693), avec du DMEM supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %. Trois semaines après la microinjection, des foyers multicouches de cellules apparaissent dans toutes les cultures primaires, envahissant les cellules résiduelles. De tels foyers n'apparaissent jamais dans les cultures contrôle, dans lesquelles la monocouche confluente de cellules subit une dégénération spontanée en 3 à 5 semaines. Les caractéristiques des lignées cellulaires obtenues sont résumées dans le tableau I ci-après COMPORTEMENT ENDOTHELIUM ENDOTHELIUR ENDOTHELIUM CELLULAIRE LAPIN PORC HUMAIN Clone Clone 1 CEH Nombre de passages 60 20 15 15 Temps de double- 20h 36h 66h 32h ment (SVF 10 %) Temps de double- 34h 40h - 35h ment (SVF 5 %) Temps de double- 41h - - ment (SVF 0,1 %) Capacité de + + + + clonage Présence de + - - foyers Croissance dans + - - milieu semi solide L'antigène T intranucléaire est identifié à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris et un anticorps de lapin anti-souris conjugué avec un de la fluorescéine, après fixation à l'éthanol-acétone (7/3), pendant 6 minutes à 20'C ; les filaments intermédiaires sont détectés par immunofluorescence indirecte en présence d'un anticorps monoclonal de souris anti-vimentine (Amersham) ; la mise en évidence du facteur VIII est réalisée comme décrit dans Little et al.(J. Pathol., 1986, 149, 89-95), en utilisant un anticorps de lapin anti-facteur VIII (Zymed Laboratories) La figure 4 représente l'immunofluorescence indirecte obtenue, lorsqu'une lignée cellulaire immortalisée, réalisée à partir de cellules endothéliales immortalisées, est mise en contact avec des anticorps monoclonaux anti-protéine T. L'analyse de 1'ADN génomique révèle que le gène recombinant est intégré (figure 5). Cette figure représente l'intégration du plasmide pHuVim830T/t dans les cellules : l'ADN des cellules immortalisées est traité par l'enzyme de restriction Hinc II, puis est soumis à une électrophorèse sur gel, suivie d'un transfert sur bande de nitrocellulose ; on procède ensuite à une incubation avec une sonde d'ADN marquée au 32P (32p dCTP), correspondant au fragment codant pour l'antigène T (les 632 derniers nucléotides du gène SV40 T (Amersham Multiprime kit) ; si le fragment est effectivement intégré, on observe une bande d'environ 1 kb. b. Arrêt de la multiplication desdites lignées immortalisées Dès que l'on transfert les cellules immortalisées telles que préparées ci-dessus, sur un milieu dépourvu en sérum ou contenant moins de 1 % de sérum, lesdites cellules gardent les propriétés caractéristiques des cellules endothéliales, notamment la production de facteur VIII. Exemple 4 : Production de lignées cellulaires épithéliales conformes à l'invention et cellules différenciées, obtenues à partir de ces lignées. a. Immortalisation de cellules les cellules épithéliales de glande mammaire de lapin sont obtenues après digestion de ces tissus par la collagénase les cellules épithéliales d'oviductes bovins sont récoltées après lavage des oviductes avec un milieu DMEM. Les cellules sont microinjectées comme décrit à l'exemple 3, ci-dessus. Les caractéristiques des lignées cellulaires obtenues sont résumées dans le tableau II ci-après COMPORTEMENT EPITHELIUM EPITHELIUM CELLULAIRE MAMMAIRE D'OVIDUCTE LAPIN BOVIN Nombre de 55 30 passages Temps de double- 22h 20h ment (SVF 10 %) Temps de double- 22h 22h ment (SVF 5 %) Temps de double- 35h ment (SVF 0,1 %) Capacité de + + clonage Présence de foyers Croissance dans + milieu semi-solide b.Arrêt de la multiplication desdites lignées immortalisées :: Dès que l'on transfert les cellules immortalisées telles que préparées ci-dessus, sur un milieu dépourvu en sérum ou contenant moins de 1 % de sérum, lesdites cellules gardent les propriétés caractéristiques des cellules épithéliales, notamment la détection des filaments intermédiaires, par immunofluorescence indirecte en présence d'un anticorps monoclonal de souris anti-kératine. De telles cellules immortalisées trouvent notamment application pour servir de cellules nourricières aux embryons de bovins lors du sexage des embryons. Exemple 5 : Souris transgénique. On microinjecte 70 oeufs au stade une cellule avec un fragment linéarisé du plasmide pHuVim830-tST/At puis on transfert lesdits oeufs dans les oviductes de 35 souris. L'analyse en ADN des cellules de la queue par la méthode de Southern montre que 3 jeunes souris sont transgéniques. Les souris transgéniques obtenues expriment le gène T de SV40 et trouvent notamment application dans l'étude dans la tumorigénécité in vivo et comme source de cellules immortalisées, dans la mesure où le promoteur HuVim830 est inductible en culture in vitro. Le croisement d'une souris transgéniques "VimT" avec un mutant mdg ou un mutant mdx conduit à un animal dont les cellules mises en culture sont à la fois immortelles et portent la mutation précitée. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Lignées cellulaires immortalisées, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par transformation appropriée de cellules primaires convenables, -issues d'un organe d'animal approprié, notamment un mammifère ou un oiseau,- par un fragment d'acide nucléique comprenant un oncogène viral immortalisant approprié, au moins un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine et éventuellement un gène dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique. 2. Lignées cellulaires selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'oncogène viral immortalisant est choisi dans le groupe qui comprend l'oncogène T/t de SV40, l'oncogène tST/At de SV40, l'oncogène T/At de SV40 et la région du gène immortalisant de l'adénovirus, du virus Epstein-Barr ou du virus herpétique. 3. Lignées cellulaires selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce que le fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine est, de préférence, le promoteur de la vimentine et plus particulièrement le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine, compris entre les bases -830 et +93 de la séquence régulatrice de la vimentine. 4. Lignées cellulaires selon la revendication 3, caractérisées en ce que le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine comprend les bases -830 à 529 et/ou le fragment -540 à -140, situés en amont du site cap. 5. Lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que les cellules primaires sont avantageusement choisies dans le groupe qui comprend les cellules musculaires précurseurs de mammifère et plus particulièrement les myoblastes, les cellules épithéliales de mammifère et les cellules endothéliales de mammifère. 6. Lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que les cellules musculaires précurseurs sont choisies dans le groupe qui comprend les myoblastes normaux de souris, les myoblastes mutants de souris et les myoblastes mutants humains. 7. Lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par transfection de cellules primaires appropriées par un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tST/At, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-T/t 8. Lignée cellulaire selon la revendication 7, dénommée HVM, caractérisée en ce qu'elle a été obtenue par transfection de myoblastes normaux de souris par un plasmide pHuVim830-tST/At et a été déposée sous le n I1019 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR. 9. Lignée cellulaire selon la revendication 7, dénommée HVMd, caractérisée en ce qu'elle a été obtenue par transfection de myoblastes mutants mdg de souris par un plasmide pHuVim830-tST/At et a été déposée sous le n I-1020 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR. 10. Lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par microinjection d'une séquence linéaire dun acide nucléique appropriée, obtenue à partir d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tST/At, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-T/t, dans des cellules primaires convenables. 11. Lignée cellulaire selon la revendication 10, dénommée HVE, caractérisée en ce qu'elle a été obtenue par microinjection d'un plasmide pHuVim830-T/t linéarisé dans des cellules endothéliales humaines du cordon ombilical et a été déposée sous le n I-1016 en date du 3 décembre 1990 ~auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR. 12. Procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (a) culture d'une lignée de cellules musculaires selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant thermosensible, sur un milieu approprié contenant une quantité appropriée de sérum d'un animal convenable, à une température comprise entre 34 C et 36 C, permettant l'expression conditionnelle d'une protéine virale, et notamment de l'antigène tST et une multiplication cellulaire importante (b) modification de la température des cellules en culture à une température comprise entre 38 C et 40 C, associée, éventuellement, à une modification du milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu et/ou utilisation d'un sérum d'un animal différent de celui de l'étape (a) ; et (c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b). 13. Procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (a) culture d'une lignée cellulaire musculaire immortalisée selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant, notamment un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t et le plasmide pHuVim830-T/At, sur un milieu approprié, contenant une quantité convenable de sérum d'un animal convenable, à une température appropriée notamment 37C (b) modification du milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu (c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b). 14. Procédé d'obtention de cellules épithéliales ou endothéliales différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (a) culture d'une lignée cellulaire épithéliale ou endothéliale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, 7, 10 ou 11, en présence d'un agent d'activation approprié qui conditionne l'expression d'une protéine virale appropriée et notamment de l'antigène T en présence du promoteur de la vimentine et permet une multiplication cellulaire importante (b) transfert de ladite lignée immortalisée dans un milieu dépourvu en agent d'activation et/ou à une température comprise entre 37 C et 40 C ; et (c) obtention de cellules différenciées en grand nombre. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent d'activation est notamment choisi dans le groupe qui comprend l'antigène T lui-même et des agents mitogènes appropriés. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent mitogène est notamment choisi dans le groupe qui comprend les sérums, les facteurs de croissance tels que le PDGF, l'EGF ou le FGF, l'interleukine II, les interférons et la phytohémaglutinine (PHA). 17. Cellules différenciées, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par l'un quelconque des procédés d'obtention de cellules différenciées selon l'une quelconque des revendications 12 à 16. 18. Agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule différenciée selon la revendication 17, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié. 19. Agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié. 20. Modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire des cellules musculaires, épithéliales, endothéliales ou nerveuses, caractérisé en ce qu'il est constitué par une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 21. Séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend successivement - une séquence codant pour l'antigène grand T de SV40, ne comportant pas le fragment codant pour l'antigène petit t, laquelle séquence est thermosensible, ou un fragment de celle-ci ; et - une séquence comprenant au moins un fragment du promoteur de la vimentine humaine, d'une longueur de 830 paires de bases à partir du site cap ou un fragment de celle-ci, notamment le fragment -830 à -529 et/ou le fragment -540 à -140, en amont du site cap ; et, éventuellement - un gène, dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique. 22. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique selon la revendication 19, lequel vecteur est apte à immortaliser une lignée cellulaire appropriée. 23. Méthode de production d'un mammifère transgénique non humain, caractérisée en ce qu'elle comprend l'introduction d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-tST/At dans un mammifère non humain à un stade embryonnaire précoce. 24. Mammifère transgénique non humain, caractérisé en ce qu'il est obtenu par la méthode selon la revendication 23, et en ce que les cellules comprenant le plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-tsT/At, peuvent se différencier normalement in vivo, tout en pouvant produire des cellules précurseurs immortalisées in vitro.