Brevet FR2671086A1 — publié le 19920703

PEPTIDES OPIOIDES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION, ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE CONTENANT CES PEPTIDES La présente invention concerne de nouveaux peptides présentant une activité opioïde et dérivés de protéines de blé, en particulier du gluten de blé, ainsi que des procédés pour la préparation de ces nouveaux peptides et des compositions pharmaceutiques contenant ceux- ci comme ingrédients actifs. On sait que des peptides dérivés de protéines alimentaires (caséine, gluten) possèdent des activités opioïdes, comme des activités analgésiques ou narcotiques, semblables à celles de la morphine, et peuvent présenter une importance physiologique. C Zioudrou et coll rapportent que l'on trouve des peptides présentant une activité opioïde dans les produits de l'hydrolyse du gluten de blé et de l'a-caséine à l'aide de pepsine, et cette activité est également démontrée grâce à des essais biologiques, comprenant l'inhibition, réversible par le naloxone, de l'adénylate cyclase dans des homogénats de cellules hybrides de neuroblastome et de gliome, et des contractions, stimulées électriquement, du canal déférent de souris (J Biol Chem, vol 254, N O 7, p 2446-2449, 1979). F R Huebner et coll ont reconnu les activités opioïdes de fragments dérivés d'une fraction de la gliadine, par dosages des radio-récepteurs (Peptides, vol. , p 1139-1147, 1984). J E Morley et coll ont rapporté que du gluten hydrolysé prolonge le temps de transit intestinal et que cet effet est contrarié par l'administration conjointe de naloxone, et aussi que du gluten hydrolysé produit une augmentation, réversible par le naloxone, de l'activité du type de celle de la somatostatine plasmatique, qui peut être responsable des retards de transit (Gastroenterology, vol 84, N O 6, p 1517-1523). Ces rapports suggèrent que des peptides opioïdes ont été détectés dans des hydrolysats de gluten, mais il n'a pas encore été possible d'élucider la structure et les propriétés de ces peptides. La Demanderesse a montré qu'en raison de leur très faible activité, on ne peut pas isoler des peptides actifs à partir des produits d'hydrolyse du gluten de blé par la pepsine La présente invention résulte de nos efforts continus pour isoler de nouveaux peptides opioïdes, présentant les structures indiquées, à partir des produits d'hydrolyse du gluten. C'est donc un objet de la présente invention que de fournir de nouveaux peptides opioïdes, présentant la séquence indiquée d'acides aminés et isolés à partir des produits d'hydrolyse des protéines de blé. Un autre objet de la présente invention est de fournir des procédés de préparation de peptides opioïdes par hydrolyse enzymatique ou par synthèse chimique. Un autre objet de la présente invention est de fournir des compositions pharmaceutiques comprenant ces peptides opioïdes comme ingrédients actifs. La figure 1 représente la séparation des fractions à activité d'opioïde I, II, III et IV, dans une colonne d'octadécylsilane (ODS) La figure 2 représente la séparation de la fraction à activité d'opioïde V dans une colonne d'ODS. La présente invention fournit des peptides présentant une activité opioïde (peptides opioïdes), préparés par hydrolyse de protéines de blé à l'aide de protéases Les peptides opioïdes de l'invention englobent certains peptides de structure déterminée et certains de structure indéterminée, les deux groupes étant compris dans le cadre de l'invention Parmi les peptides de l'invention, ceux présentant une structure déterminée peuvent englober des peptides opioïdes présentant respectivement les séquences suivantes d'acides aminés: Gly-Tyr-Tyr-Pro (SEQ ID n l) ( 1) GlyTyr-Tyr-Pro-Thr (SEQ ID n 2) ( 2) Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser (SEQ ID n 3) ( 3) Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (SEQ ID n 4) ( 4) Les quatre peptides opioïdes présentant les séquences ( 1), ( 2), ( 3) et ( 4), respectivement (SEQ ID n l), (SEQ ID n 2), (SEQ ID n 3) et SEQ ID n 4), sont nouveaux et appelés ici, pour des raisons de commodité, respectivement "Peptide A", "Peptide B", "Peptide C" et "Peptide D" A notre connaissance, il n'existe pas de rapport relatant la préparation et l'isolement de ces quatre peptides, par hydrolyse enzymatique à partir des protéines de blé ou par synthèse chimique. Parmi les peptides de cette invention, on connait, d'après J Med Chem 1978, vol 21 n 11, p 1110-1115, les peptides opioïdes présentant respectivement les séquences suivantes d'acides aminés: Tyr-Gly-Gly-TrpLeu (SEQ ID n 5) ( 5) Tyr-Gly-Gly-Trp (SEQ ID n 6) ( 6) Mais il n'existe pas de rapport relatant la préparation et l'isolement de ces deux peptides par hydrolyse enzymatique à partir des protéines de blé Les deux peptides opioïdes présentant les séquences ( 5) et ( 6), respectivement (SEQ ID n 5) et (SEQ ID n 6), sont respectivement appelés ici "Peptide E" et "Peptide F", pour des raisons de commodité. Les acides aminés constituant les peptides opioïdes de l'invention peuvent présenter n'importe laquelle des configurations D, L et DL. On peut préparer les peptides de la présente invention par un nouveau procédé enzymatique qui comporte l'hydrolyse des protéines de blé à l'aide d'une protéase fonctionnant en milieu acide (appelée dans ce qui suit, pour des raisons de commodité, "protéase acide") puis l'hydrolyse des produits de cette première hydrolyse à l'aide d'une protéase fonctionnant en milieu neutre ou d'une protéase fonctionnant en milieu alcalin, et éventuellement, le fractionnement, l'isolement et la purification du mélange de peptides obtenu par des moyens classiques La séquence d'acides aminés des peptides ainsi isolés peut être déterminée par exemple à l'aide d'un dispositif de séquençage de protéines. En se basant sur la séquence d'acides aminés déterminée, on peut également synthétiser les peptides de la présente invention selon un procédé classique, par exemple une synthèse en phase solide selon la méthode au t- butoxycarbonyle (t-BOC). Les protéines de blé que l'on peut utiliser dans la présente invention peuvent englober du gluten seul, ou un mélange de gluten avec d'autres protéines du blé, comme l'albumine, la gliadine et la globuline. Les protéases acides que l'on peut utiliser dans la présente invention peuvent englober une pepsine et des protéinases aspartiques dérivées de Pycnoporus coccineus, Aspergillus et Penicillium On peut les utiliser seules, ou bien en combinaison les unes avec les autres, pourvu qu'elles ne se contrarient pas les unes les autres Si l'on utilise plusieurs protéases acides, on peut réaliser l'hydrolyse en utilisant simultanément les diverses protéases ou en utilisant successivement chaque protéase. Les protéases neutres que l'on peut utiliser dans la présente invention peuvent englober des métalloprotéinases, dérivées de microorganismes, y compris les protéases résistant à la chaleur et provenant de Bacillus, comme la thermolysine, celles dérivées d'Aspergillus, de Streptomyces ou de Rhizopus, celles provenant de plantes, telles que la papaïne et la bromélaïne, et celles existant in vivo chez les animaux, telles que la trypsine, la chymotrypsine, la plasmine et la thrombine. Les protéases alcalines que l'on peut utiliser dans la présente invention peuvent englober des cérino- protéinases, dérivées de Bacillus, et similaires Les protéases neutres ou alcalines peuvent être utilisées seules, ou en combinaisons les unes avec les autres, pourvu qu'elles ne se contrarient pas les unes les autres Si on utilise plusieurs protéases neutres, on peut effectuer l'hydrolyse en utilisant simultanément ces diverses protéases ou en utilisant successivement chacune de ces protéases. On peut effectuer le fractionnement, l'isolement et la purification selon des procédés connus, comme une séparation sur membrane ou un procédé de chromatographie. Dans la mise en oeuvre de cette invention, on préfère la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), y compris la chromatographie à polarité de phases inversée (RPC) sur une colonne d'octadécyl-silane (ODS), une colonne à groupes phényle, une colonne à groupes cyanopropyle ou une colonne à groupes phénétyle. Les peptides de la présente invention possèdent des activités opioïdes, qui sont impliquées dans les effets analgésiques et narcotiques, dans certaines maladies, dans la respiration, la pulsation, l'établissement de la température corporelle, les fonctions gastro-intestinales, l'athrocytose, l'immunité, la régulation de la sécrétion d'hormones telles que l'insuline et la somatostatine, l'exaltation de l'absorption d'électrolytes et la régulation des contractions du myocarde, et ils peuvent donc être utiles comme agents analgésiques et narcotiques, comme agents hypnotiques, comme agents augmentant la sécrétion d'hormones gastro- intestinales, comme agents augmentant l'absorption des électrolytes, etc C'est pourquoi la présente invention fournit également des compositions pharmaceutiques comprenant, comme ingrédients actifs, les peptides opioïdes comportant les séquences d'acides aminés indiquées dans les formules ( 1) à ( 6), ou des sels physiologiquement acceptables de ces peptides Les peptides opioïdes de l'invention ou leurs sels, du fait qu'ils se présentent sous forme d'une poudre blanche soluble dans l'eau, peuvent être administrés par voie orale ou parentérale, tels quels ou à l'état dissous dans l'eau. En fonction de la voie d'administration, on peut formuler ces peptides opioïdes avec une grande variété de véhicules physiologiquement acceptables Les formes posologiques peuvent englober comprimés, capsules, suppositoires, pastilles, sirops, granulés, poudres, solutions injectables ou suspensions On peut choisir une dose appropriée en fonction de la forme posologique, de l'âge et du sexe des patients, du degré de gravité des symptômes, etc Les peptides opio des de l'invention peuvent être ajoutés aux aliments. On va maintenant décrire des modes préférés de réalisation de la présente invention. Hydrolyse du gluten de blé on hydrolyse le gluten de blé, à l'aide de protéases, pour préparer un mélange de peptides hydrosolubles On hydrolyse initialement le gluten de blé à l'aide d'une protéase acide, à l'état dispersé ou dissous dans une solution acide comme de l'acide chlorhydrique dilué Ensuite, on neutralise les produits d'hydrolyse ou on les rend alcalins, puis on poursuit l'hydrolyse à l'aide d'une protéase neutre ou alcaline, afin de préparer un mélange de peptides Dans ce cas, en utilisant une protéase neutre ou alcaline, on peut obtenir un mélange de peptides contenant des peptides A (SEQ ID N O l), B (SEQ ID N 02), E (SEQ ID n 5) et F (SEQ ID n 6) On peut obtenir un mélange de peptides contenant le peptide D (SEQ ID n 4) en utilisant, comme protéase neutre, celles existant in vivo chez les animaux, telles que la trypsine, la chymotrypsine ou similaire Dans ce cas, on peut utiliser la trypsine et la chymotrypsine simultanément ou successivement. Dans la préparation des peptides, on utilise de preférence la pepsine comme protéase acide, puisque l'on peut alors obtenir le produit souhaité avec un rendement élevé. Pour préparer les peptides A (SEQ ID n l), B (SEQ ID n 2), E (SEQ ID n 5) et F (SEQ ID n 6), on utilise de préférence de la thermolysine dérivée de Bacillus ou dérivée d'Aspergillus (en particulier Aspergillus oryzae), en tant que protéases neutres, puisque l'on peut alors obtenir le produit souhaité avec un rendement élevé. Les protéases acides, neutres ou alcalines peuvent être utilisées à l'état libre ou à l'état immobilisé La quantité de protéase utilisée peut être située dans l'intervalle allant d'environ 5 000 à 100 000 unités pour g de gluten sec On détermine l'activité (en unités) de la protéase utilisée, selon le procédé de réaction colorée (A), faisant appel à la caséine et au réactif de Folin et décrit par S Akabori, dans "Method of Studying Enzymes", vol 2, p 238, 1961, en utilisant comme substrat une solution de caséine Hamerstein à 1 %, fournie par American Merk Co On effectue la réaction à 30 C pendant 30 minutes. La quantité d'enzyme nécessaire pour la libération de 1 Mg de tyrosine pendant une minute représente 1 unité d'activité enzymatique. Il est avantageux de réaliser les traitements par les protéases dans des conditions optimales de p H, température, quantité de protéase, vitesse et durée du traitement, conditions qui sont choisies en fonction de facteurs tels que le type et la forme d'utilisation des protéases, etc Quand on réalise l'hydrolyse de gluten à l'aide de pepsine, puis de thermolysine, ou bien à l'aide de pepsine, puis de trypsine et de chymotrypsine, par exemple, on ajuste le p H d'une solution ou d'une dispersion aqueuse de gluten à une valeur située entre environ 1,5 et ,0, et on effectue l'hydrolyse à l'aide de pepsine à une température d'environ 30 à 500 C Puis on ajuste le p H de la solution à une valeur située entre environ 6,0 et 8,0, et on poursuit l'hydrolyse à l'aide de thermolysine ou de trypsine-chymotrypsine, à une température d'environ 30 à 500 C, jusqu'à ce que la valeur de la solubilité dans de l'acide trichloroacétique 0,75 M se trouve dans l'intervalle allant d'environ 40 à 80 %. Quand l'hydrolyse a atteint le degré souhaité, on désactive les protéases par chauffage et/ou réajustement du p H On sépare et on élimine l'enzyme désactivée et toutes les matières solides insolubles, comme le gluten non- hydrolysé, par des procédés convenables tels que la centrifugation, pour récupérer un mélange de peptides à partir de la solution résiduelle, par dessication ou similaire. On soumet ensuite le mélange de peptides, dissous dans de l'eau, à une HPLC, par exemple une HPLC sur colonne à polarité de phases inversée, pour isoler les peptides souhaités à l'état pur. On peut opérer de la façon suivante l'isolement des peptides opioïdes à partir du mélange de peptides. Isolement des peptides A, B, E et F (a 1) Le mélange de peptides préparé par hydrolyse du gluten de blé à l'aide de pepsine, puis à l'aide de thermolysine, est soumis à une HPLC sur une colonne d'octadécyl-silane (ODS) (par exemple Cosmosil 5 C 18-AR, Nacalai Tesque Inc) et élué à l'aide d'une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,05 % (solution A) et d'une solution d'acétonitrile (ACN) contenant 0,05 % de TFA (solution B), avec un gradient linéaire de O à 40 % de solution B On sépare une fraction I éluée pour une concentration d'ACN située entre 22,5 % et 23,5 % environ, une fraction II éluée entre 24 % et 25 % environ, une fraction III éluée entre 28 % et 29 % environ, et une fraction IV éluée entre 34 % et 35 % environ, et on détermine les activités opioïdes de ces fractions. (b 1) Les fractions présentant une activité opioïde, préparées dans l'étape (a 1), sont soumises à une chromatographie à polarité de phases inversée (RPC) sur une colonne présentant des caractéristiques différentes de celles de la colonne utilisée en (al) (par exemple Cosmosil Ph, Nacalai Tesque Inc) et éluées d'une façon semblable à celle de l'étape (al) Une fraction I-1 éluée pour une concentration d'ACN située entre 24 % et 25 % environ se sépare de la fraction I, une fraction II-1 éluée entre 33 % et 34 % environ se sépare de la fraction II, une fraction III-1 éluée entre 30 % et 31 % environ se sépare de la fraction III et une fraction IV-1 éluée entre 36 % et 37 % environ se sépare de la fraction IV On détermine les activités opioïdes de ces fractions. (cl) Les fractions présentant une activité opioïde, préparées dans l'étape (bl), sont soumises à une chromatographie à polarité de phases inversée (RPC) sur une colonne présentant des caractéristiques différentes de celles de la colonne utilisée en (b 1) (par exemple Cosmosil CN-R, Nacalai Tesque Inc) et éluées d'une façon semblable à celle des étapes (al) et (b 1) Une fraction I-2 éluée pour une concentration d'ACN située entre 18 % et 19 % environ se sépare de la fraction I-1, une fraction II-2 éluée pour une concentration d'ACN de 27 % environ se sépare de la fraction II-1, une fraction III-2 éluée entre 26 % et 27 % environ se sépare de la fraction III-1 et une fraction IV-2 éluée entre 32 % et 33 % environ se sépare de la fraction IV-1 On détermine les activités opioïdes de ces fractions. (d 1) Parmi les fractions à activité opioïde préparées dans l'étape (cl), on soumet les fractions I-2, III-2 et IV-2 à une chromatographie sur la colonne utilisée en (al), et on les élue avec une solution tampon 10 m M de KH 2 PO 4-Na 2 HPO 4 (p H 7) (solution C) et une solution tampon m M de KH 2 PO 4-Na 2 HPO 4 (p H 7) contenant 50 % d'ACN (solution D), avec un gradient linéaire de 0 % à 100 % de solution D Une fraction I-3 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 18 % se sépare de la fraction I-2, une fraction III-3 éluée pour environ 21 % d'ACN se sépare de la fraction III-2, et une fraction IV-3 éluée pour environ 28 % d'ACN se sépare de la fraction IV-2 On détermine les activités opioïdes de ces fractions. (e 1) Parmi les fractions présentant une activité opioïde, préparées dans l'étape (d 1), on soumet la fraction IV-3 à une chromatographie sur la colonne utilisée dans l'étape (al), et on effectue l'élution selon un protocole semblable à celui des étapes (a 1), (b 1) et (c 1) Une fraction IV-4, éluée pour une concentration d'ACN d'environ 31 %, se sépare de la fraction IV-3, et on détermine l'activité opioïde de cette fraction-là. (f 1) La fraction IV-4, présentant une activité opioïde et préparée dans l'étape (el), est soumise à une chromatographie à polarité de phases inversée sur une colonne présentant des caractéristiques différentes de celles des colonnes utilisées dans les étapes (al), (b 1) et (cl) (par exemple Develosil Ph A-5, Nomura Chemical Inc), puis on effectue l'élution comme dans l'étape (d 1) Une fraction IV-5 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 29 % se sépare de la fraction IV- 4, et on détermine l'activité opioïde de cette fraction-là. (gl) Par dessication, on chasse les solvants de la fraction II-2 obtenue dans l'étape (cl), qui présente une activité opioïde, des fractions I- 3 et III-3 obtenues dans l'étape (dl), qui présentent une activité opioïde, et de la fraction IV-5 obtenue dans l'étape (fli), qui présente une activité opioïde. (hl) Les séquences d'acides aminés des substances desséchées obtenues dans l'étape (gl) sont analysées à l'aide d'un appareil de séquençage de protéines (par exemple séquenceur de protéines 477 A, Applied Biosystems Inc) On identifie la fraction I-3 au Peptide B (SEQ ID n 2), Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr, la fraction II-2 au Peptide A (SEQ ID n l), Gly-Tyr-Tyr-Pro, la fraction III-3 au Peptide F (SEQ ID n 6), TyrGly-Gly-Trp et la fraction IV-5 au Peptide E (SEQ ID n 5), Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu. Isolement du Peptide D (a 2) On soumet le mélange de peptides, préparé par hydrolyse de gluten de blé avec de la pepsine, puis avec un mélange de trypsine et de chymotrypsine, à une HPLC sur une colonne d'octadécyl-silane (ODS) (par exemple Cosmosil 5 C 18-AR, Nacalai Tesque Inc), et l'on effectue l'élution à l'aide d'une solution aqueuse à 0,05 % d'acide trifluoro- acétique (TFA) (solution A) et d'une solution d'acétonitrile (ACN) contenant 0,05 % de TFA (solution B), avec un gradient linéaire de O à 40 % de solution B On sépare la fraction (fraction V) éluée pour une concentration d'ACN située entre environ 31 % et 32 %, et on constate qu'elle possède une activité opioïde. (b 2) On soumet la fraction présentant une activité opioïde (fraction V), préparée dans l'étape (a 2), à une chromatographie à polarité de phases inversée (RPC) sur une colonne présentant des caractéristiques différentes de celles de la colonne utilisée en (a 2) (par exemple Cosmosil Ph, Nacalai Tesque Inc), et on effectue l'élution comme dans l'étape (a 2) On sépare la fraction (fraction V-1) éluée pour une concentration d'ACN d'environ 33 %, et on constate qu'elle possède une activité opioïde. (c 2) On soumet la fraction (fraction V-1) présentant une activité opioïde, préparée dans l'étape (b 2), à une chromatographie à polarité de phases inversée (RPC) sur une colonne présentant des caractéristiques différentes de celles des colonnes utilisées dans les étapes (a 2) et (b 2) (par exemple Cosmosil 5 CN-R, Nacalai Tesque Inc), et l'on effectue l'élution comme dans les étapes (a 2) et (b 2) On sépare la fraction (fraction V-2) éluée pour une concentration d'ACN située entre environ 27 % et 28 %, et on constate qu'elle possède une activité opioïde. (d 2) On introduit la fraction (fraction V-2) présentant une activité opioïde, préparée dans l'étape (c 2), dans la colonne utilisée dans l'étape (a 2), puis on l'élue à l'aide d'un tampon 10 m M de KH 2 PO 4-Na 2 HPO 4 (p H 7) (solution C) et d'un tampon à 10 m M de KH 2 PO 4-Na 2 HPO 4 (p H 7) contenant 50 % d'ACN (solution D), avec un gradient linéaire de 0 % à 100 % de solution D On sépare la fraction (fraction V-3) éluée pour une concentration d'ACN d'environ 24 %, et on constate qu'elle présente une activité opioïde. (e 2) On évapore le solvant de la fraction presentant une activité opioïde (fraction V-3), et l'on obtient un produit solide séché. (f 2) A l'aide d'un appareil de séquençage de protéines (par exemple séquenceur de protéines 477 A, Applied Biosystems Inc), on analyse la séquence d'acides aminés du produit séché obtenu dans l'étape (e 2) On identifie la fraction V-3 au Peptide D (SEQ ID n 4). On peut également préparer les peptides A à F (SEQ ID n l à 6) de la présente invention par synthèse chimique, par exemple selon le procédé suivant. Synthèse chimique des peptides On synthétise les peptides à l'aide d'un appareil de synthèse de peptides Sam 2 (Biosearch Inc), selon un protocole standard de synthèse On traite un conjugué Boc(butoxycarbonyl)-Pro-résine avec une solution de déblocage, contenant 45 % d'acide trifluoroacétique, puis on couple le produit obtenu avec du Boc-Tyr(C 12-Bzl), en presence de diisopropylcarbodiimide Après déblocage effectué de façon semblable à celle mentionnée ci-dessus, on couple la résine avec, successivement, Boc-Tyr(C 12-Bzl) et Boc-Gly, pour obtenir un conjugué Boc-Gly-Tyr(C 12-Bzl)- Tyr(Cl 2-Bzl)-Pro-résine On place ce conjugué peptide- résine dans du fluorure d'hydrogène contenant 10 % d'anisole, et on agite le tout à 00 C pendant 1 heure Après avoir chassé le fluorure d'hydrogène par distillation, on lave le résidu avec de l'éther et on extrait le peptide avec de l'acide acétique à 30 % La purification du peptide brut par HPLC sur une colonne d'ODS fournit le peptide A (SEQ ID N O l) On peut également synthétiser les peptides B à F (SEQ ID n Os 2 à 6) selon un mode opératoire semblable à celui mentionné ci-dessus. Les exemples non limitatifs suivants illustrent davantage l'invention. EXEMPLE 1 Préparation des Peptides A, B, E et F à partir d'hydrolysats de gluten de blé ( 1) On disperse et dissout 5 g de gluten de blé dans 100 ml d'H Cl 0,02 N, puis on soumet la solution à une centrifugation à 3500 x g pendant 20 minutes pour éliminer les substances insolubles, et on ajuste le p H de la solution à 2,0 à l'aide d'H Cl 1 N On ajoute à cette solution de gluten 5000 unités de pepsine (disponible chez Sigma Chemical Co, U S A) et on chauffe la solution à 370 C pendant 15 heures Après la fin de la réaction, on ajuste le p H de la solution à 7,0 avec de la Na OH 1 N, puis on y ajoute 5000 unités de thermolysine (disponible chez Peptide Research Institute Inc) et on chauffe le mélange à 370 C pendant 4 heures Après la fin de la réaction, on chauffe la solution à 90 C pendant 20 minutes, pour désactiver la pepsine et la thermolysine On soumet l'hydrolysat à une centrifugation à 3500 x g pendant 20 minutes, pour éliminer les matières insolubles, et on lyophilise le surnageant obtenu, ce qui donne environ 3,5 g d'un hydrolysat de gluten de blé. ( 2) On soumet 80 mg de cet hydrolysat de gluten de blé à une chromatographie à polarité de phases inversée (RPC) sur une colonne d'octadécyl-silane (Cosmosil 5 C 18- AR, 20 mm de diamètre interne, 250 mm de long, Nacalai Tesque Inc), puis on effectue l'élution à l'aide d'une solution aqueuse à 0,05 % d'acide trifluoroacétique (TFA) (solution A) et d'une solution d'acétonitrile (ACN) contenant 0,05 % de TFA (solution B), à un débit de 10 ml/min, avec un gradient linéaire de 0 % à 40 % de solution B sur une période de 40 minutes La figure 1 représente le chromatogramme que l'on obtient en mesurant l'absorbance de l'éluat à la longueur d'onde de 230 nm. On détermine l'activité opioïde des fractions indiquées sur la figure 1 On trouve une activité opioïde pour la fraction I, éluée pour une concentration d'ACN située entre environ 22,5 et 23,5 %, pour la fraction II, éluée pour une concentration d'ACN située entre environ 24 et 25 %, pour la fraction III, éluée pour une concentration d'ACN située entre environ 28 et 29 %, et pour la fraction IV, éluée pour une concentration d'ACN située entre environ 34 et 35 %. ( 3) On répète le mode opératoire de l'étape ( 2), en utilisant 2000 mg de l'hydrolysat de gluten de blé préparé au cours de l'étape ( 1), pour obtenir, à partir des fractions I, II, III et IV, des fractions présentant une activité opioïde On soumet les fractions actives I, II, III et IV à une RPC, en utilisant une colonne à groupes phényle (Cosmosil 5 Ph, 4,6 mm de diamètre interne, 250 mm de long, Nacalai Tesque Inc), et on effectue l'élution à l'aide des solutions A et B, à un débit de 1 ml/min, avec un gradient linéaire de 0 % à 40 % de solution B sur une période de 40 minutes. On détermine l'activité opioïde de chacune des fractions éluées On trouve une activité opioïde, dans le cas de la fraction I, dans la fraction I-1 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 24 à 25 %; dans le cas de la fraction II, dans la fraction II-1 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 33 à 34 %; dans le cas de la fraction III, dans la fraction III-1 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 30 à 31 %; et dans le cas de la fraction IV, dans la fraction IV-1 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 36 à 37 %. ( 4) On soumet les fractions I-1, II-1, III-1 et IV- 1, préparées au cours de l'étape ( 3) et présentant une activité opioïde, à une RPC, en utilisant une colonne à groupes cyanopropyle (Cosmosil 5 CN-R, 4,6 mm de diamètre interne, 250 mm de long, Nacalai Tesque Inc), et on effectue l'élution dans les mêmes conditions qu'au cours de l'étape ( 3). On recueille chacune des fractions éluées, et on détermine si elles ont une activité opioïde On trouve une activité opioïde, dans le cas de la fraction I-1, dans la fraction I-2 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 18 à 19 %; dans le cas de la fraction II-1, dans la fraction II-2 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 27 %; dans le cas de la fraction III-1, dans la fraction III-2 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 26 à 27 %; et dans le cas de la fraction IV-1, dans la fraction IV-2 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 32 à 33 %. ( 5) On soumet les fractions présentant une activité opioïde I-2, III-2 et IV-2, préparées dans l'étape ( 4) relatée ci-dessus, à une chromatographie à polarité de phases inversée (RPC) sur une colonne d'octadécyl-silane (Cosmosil 5 C 18-AR, 20 mm de diamètre interne, 250 mm de long, Nacalai Tesque Inc), et on effectue l'élution à l'aide d'une solution tampon de KH 2 P 04-Na 2 HPO 4 10 m M (p H 7) (solution C) et d'une solution constituée de 50 % d'ACN et de 50 % de solution tampon de KH 2 P 04-Na 2 HPO 4 10 m M (p H 7) (solution D), avec un gradient linéaire de O à 100 % de solution D On recueille chaque fraction éluée et on en détermine l'activité opioïde On trouve une activité opioïde, dans le cas de la fraction I-2, dans la fraction I-3 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 18 %; dans le cas de la fraction III-2, dans la fraction III-3 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 21 %; et dans le cas de la fraction IV-2, dans la fraction IV-3 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 28 % ( 6) Parmi les fractions présentant une activité opioïde préparées au cours de l'étape ( 5), on soumet à nouveau la fraction IV-3 à une RPC, en utilisant la même colonne que dans l'étape ( 5) et en effectuant l'élution dans les mêmes conditions que dans l'étape ( 4) On recueille chaque fraction éluée et on en détermine l'activité opioïde On trouve une activité opioïde dans la fraction IV-4 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 31 %. ( 7) On introduit encore la fraction IV-4 présentant une activité opioïde, préparée au cours de l'étape ( 6), dans une colonne à groupes phénétyle (Develosil Ph A-T-5, 4,6 mm de diamètre interne, 250 mm de long, Nomura Chemical Inc), et on effectue l' élution dans les mêmes conditions que dans l'étape ( 5) On détermine l'activité opioïde de chaque fraction éluée, et l'on trouve une activité opioïde dans la fraction IV-5 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 29 %. ( 8) On récupère, concentre et dessèche la fraction II-2 obtenue au cours de l'étape ( 4), les fractions I-3 et III-3 obtenues au cours de l'étape ( 5) et la fraction IV-5 obtenue au cours de l'étape ( 7). On analyse les séquences d'acides aminés des substances séchées préparées ci-dessus, à l'aide d'un appareil de séquençage de protéines 477 A (Applied Biosystems Inc). Dans le cas de la substance sèche de la fraction I- 3, on observe la libération successive de L-Gly, L-Tyr, L- Tyr, L-Pro et L-Thr à partir de l'extrémité N-terminale, et l'on identifie cette substance comme étant le "Peptide B" dont la séquence d'acides aminés est la suivante: Gly-Tyr- Tyr-Pro-Thr Tous les acides aminés constituant ce peptide présentent la configuration L. Dans le cas de la substance sèche de la fraction II- 2, on observe la libération successive de L-Gly, L-Tyr, L-Tyr et L-Pro à partir de l'extrémité N-terminale, et l'on identifie cette substance comme étant le Peptide A (SEQ ID n l) dont la séquence d'acides aminés est la suivante: Gly-Tyr-Tyr-Pro Tous les acides aminés constituant ce peptide présentent la configuration L. Pour la substance sèche de la fraction III-3, on observe la libération successive de L-Tyr, L-Gly, L- Gly et L-Trp à partir de l'extrémité N-terminale, et l'on identifie cette substance comme étant le Peptide F (SEQ ID n 6) dont la séquence d'acides aminés est la suivante: Tyr-Gly-Gly-Trp Tous les acides aminés constituant ce peptide présentent la configuration L. Pour la substance sèche de la fraction IV-5, on observe la libération successive de L-Tyr, L-Gly, L-Gly, L- Trp et L-Leu à partir de l'extrémité N-terminale, et l'on identifie cette substance comme étant le Peptide E (SEQ ID n 5) dont la séquence d'acides aminés est la suivante: Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu Tous les acides aminés constituant ce peptide présentent la configuration L. On détermine les rendements en Peptides A, B, E et F à partir des masses moléculaires et des coefficients d'extinction molaire à la longueur d'onde d'absorption de 280 nm, et l'on trouve respectivement environ 4 10-2 %, 4.10-3 %, 1 10-5 % et 3 10-4 % On détermine les valeurs de Rf des Peptides A, B, E et F par chromatographie en couche mince sur des plaques de gel de silice, en utilisant comme solvant de développement un mélange butanol/acide acétique/pyridine/eau ( 15/3/10/12), et l'on trouve respectivement les valeurs de 0,58, 0,54, 0,77 et 0,61. EXEMPLE 2 Préparation d'un mélange de peptides contenant les Peptides A, B, E et F, à partir d'un hydrolysat de gluten de blé On effectue l'hydrolyse d'un gluten de blé selon le même mode opératoire que dans l'exemple 1, sauf que l'on utilise, comme protéase acide, en le même nombre d'unités, une protéinase aspertique dérivée d'Aspergillus niger (disponible chez Yakult Co sous la désignation commerciale "Protéase YP-SS"), à la place de la pepsine, et que l'on fait incuber à 37 C pendant 15 heures la solution de gluten de blé, ajustée à p H 3,0 On soumet l'hydrolysat obtenu à une chromatographie à polarité de phases inversée, de façon semblable à celle indiquée dans l'exemple 1 ( 2) On trouve une activité opioïde dans les fractions I, II, III et IV indiquées dans la figure 1, avec les mêmes intensités que dans l'exemple 1 Ainsi, on obtient dans cet exemple un mélange de peptides à activité opioïde, contenant les Peptides A, B, E et F (SEQ ID n l, 2, 5 et 6). EXEMPLE 3 Préparation d'un mélange de peptides contenant les Peptides A, B, E et F à partir d'un hydrolysat de gluten de blé On effectue l'hydrolyse d'un gluten de blé, selon le même mode opératoire que dans l'exemple 1, excepté que l'on utilise, comme protéase neutre, en le même nombre d'unités, une protéase neutre dérivée d'Aspergillus oryzae (disponible chez Yamato Chemical Co sous la désignation commerciale "Protin FN"), à la place de thermolysine On soumet l'hydrolysat obtenu à une chromatographie à polarité de phases inversée, de façon semblable à celle indiquée dans l'exemple 1 ( 2) On trouve une activité opioïde dans les fractions I, II, III et IV indiquées sur la figure 1, avec les mêmes intensités que dans l'exemple 1 Ainsi, on obtient dans cet exemple un mélange de peptides à activité opioïde contenant les Peptides A, B, E et F (SEQ ID n l, 2, 5 et 6). EXEMPLE 4 Préparation d'un mélange de peptides contenant les Peptides A, B, E et F à partir d'un hydrolysat de gluten de blé On effectue l'hydrolyse d'un gluten de blé, selon le même mode opératoire que dans l'exemple 1, excepté que l'on utilise, comme protéase neutre, en le même nombre d'unités, une protéase cérique dérivée de Bacillus (disponible chez Nagase Sangyo Co sous la désignation commerciale "Bioprase SP-4 "), à la place de thermolysine. On soumet l'hydrolysat obtenu à une chromatographie à polarité de phases inversée, de façon semblable à celle indiquée dans l'exemple 1 ( 2) On trouve une activité opioïde dans les fractions I, II, III et IV indiquées sur la figure 1, avec les mêmes intensités que dans l'exemple 1 Ainsi, on obtient dans cet exemple un mélange de peptides à activité opioïde contenant les Peptides A, B, E et F (SEQ ID N O l, 2, 5 et 6). EXEMPLE 5 Préparation du Peptide D à partir d'un hydrolysat de gluten de blé ( 1) On disperse et dissout 5 g de gluten de blé dans 100 ml d'H Cl 0,02 N, et on soumet cette solution à une centrifugation à 3500 x g pendant 20 minutes, pour éliminer les matières insolubles, puis on ajuste le p H de cette solution à 2,0, à l'aide d'H Cl 1 N A cette solution de gluten de blé, on ajoute 5000 unités de pepsine (disponible chez Sigma Chemical Co, U S A) et on fait incuber la solution à 370 C pendant 15 heures Après la fin de la réaction, on ajuste le p H de la solution à 7,0 à l'aide d'une solution aqueuse de Na OH 1 N, et on y ajoute 5000 unités de trypsine (disponible chez Sigma Chemical Co) et 5000 unités de chymotrypsine (disponible chez Sigma Chemical Co), et on fait incuber le mélange à 370 C pendant 4 heures Après la fin de la réaction, on chauffe la solution à 90 C pendant 20 minutes pour inactiver les enzymes On soumet l'hydrolysat à une centrifugation à 3500 x g pendant 20 minutes pour éliminer les matières insolubles, et on lyophilise le surnageant obtenu, ce qui donne environ 3,0 g d'un hydrolysat de gluten de blé. ( 2) On soumet l'hydrolysat de gluten de blé, préparé au cours de l'étape ( 1), à une chromatographie à polarité de phases inversée (RPC) en utilisant une colonne d'octadécyl-silane, (Cosmosil 5 C 18-AR ( 20 mm de diamètre interne, 250 mm de long, Nacalai Tesque Inc), puis on effectue l'élution à l'aide d'une solution aqueuse à 0,05 % d'acide trifluoroacétique (TFA) (solution A) et d'une solution d'acétonitrile (ACN) contenant 0,05 % de TFA (solution B), à un débit de 10 ml/min, avec un gradient linéaire de 0 % à 40 % de solution B en 40 minutes La figure 2 représente le chromatogramme obtenu à ce moment, pour une longueur d'onde de détection de 230 nm. On détermine l'activité opioïde des fractions représentées sur la figure 2 On trouve une activité opioïde pour la fraction V, éluée pour une concentration d'ACN située entre environ 31 et 32 %. ( 3) On répète le mode opératoire de l'étape ( 2), en utilisant 2000 mg de l'hydrolysat de gluten de blé préparé au cours de l'étape ( 1), pour obtenir une fraction V présentant une activité opioïde On soumet cette fractionà une RPC sur une colonne à groupes phényle, Cosmosil 5 Ph ( 4,5 mm de diamètre interne, 250 mm de long, Nacalai Tesque Inc), en effectuant l'élution à l'aide des solutions A et B, à un débit de 1 ml/min, avec un gradient linéaire de 0 % à 40 % de solution B en 40 minutes. On détermine l'activité opioïde de chacune des fractions éluées On trouve une activité opioïde pour la fraction V-1, éluée pour une concentration d'ACN d'environ 33 %. ( 4) On soumet la fraction V-1 présentant une activité opioïde, préparée au cours de l'étape ( 3), à une RPC sur une colonne à groupes cyanopropyle, Cosmosil 5 CN-R ( 4,6 mm de diamètre interne, 250 mm de long, Nacalai Tesque Inc), et l'on effectue l'élution dans les mêmes conditions que dans l'étape ( 3). On recueille chacune des fractions éluées et on en détermine l'activité opioïde On trouve une activité opioïde dans la fraction V-2 éluée pour une concentration d'ACN d'environ 27-28 %. ( 5) On soumet la fraction V-2 présentant une activité opioïde, préparée dans l'étape ( 4) ci-dessus, à une chromatographie à polarité de phases inversée (RPC) sur une colonne d'octadécyl-silane (ODS), Cosmosil 5 C 18-AR ( 4,6 mm de diamètre interne, 150 mm de long, Nacalai Tesque Inc), et l'on effectue l'élution à l'aide d'une solution tampon de KH 2 PO 4-Na 2 HPO 4 10 m M (p H 7) (solution C) et d'une solution tampon à 10 m M de KH 2 PO 4-Na 2 HPO 4 (p H 7) contenant % d'ACN (solution D), avec un gradient linéaire de O à % de solution D On recueille chaque fraction éluée et on en détermine l'activité opioïde On trouve une activité opioïde dans la fraction V-3, correspondant à un pic d'absorption intense, éluée pour une concentration d'ACN d'environ 24 %. ( 6) La fraction V-3, préparée dans l'étape ( 5), est récupérée, concentrée et séchée. En utilisant le même appareil de séquençage de protéines, modèle 477-A, que celui utilisé dans l'exemple 1, on détermine la séquence d'acides aminés de la substance sèche préparée comme indiqué ci-dessus On observe la libération successive de L-Tyr, L-Pro, L-Ile, L-Ser et L- Leu à partir de l'extrémité N-terminale, et l'on identifie cette substance au Peptide D (SEQ ID N 04), présentant la séquence d'acides aminés Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu Tous les acides aminés constituant ce peptide présentent la configuration L. A partir de la masse moléculaire et du coefficient d'extinction molaire observé pour une longueur d'onde d'absorption de 280 nm, on calcule le rendement en Peptide D à partir du gluten de blé, et l'on trouve une valeur d'environ 4 10-4 % On détermine la valeur de Rf du Peptide D, par chromatographie en couche mince sur une plaque de gel de silice, de la même façon que dans l'exemple 1, et on trouve une valeur de 0,73. EXEMPLE 6 Préparation des Peptides A à F par synthèse chimique ( 1) Synthèse du Peptide A Dans le récipient réactionnel d'un appareil de synthèse de peptides Sam 2 (fabriqué par Biosearch Inc), on fait réagir, à température ambiante et pendant 25 minutes, un mélange de 0,75 g d'un conjugué Boc (butoxycarbonyl)-Pro-résine (taux de substitution de 0,4 meq/g), disponible dans le commerce, et de 20 ml de chlorure de méthylène contenant 45 % d'acide trifluoroacétique et 2,5 % d'anisole, dans le but d'éliminer le groupe Boc. Le conjugué dont on a éliminé le groupe Boc, Pro- résine, est ensuite lavé avec du chlorure de méthylène, neutralisé avec du chlorure de méthylène contenant 10 % de diisopropyl-éthyl-amine, et lavé à nouveau avec du chlorure de méthylène. On mélange cette résine avec 5 ml d'une solution 0,4 M de Boc-Tyr(C 12Bzl) dans du diméthylformamide et 5 ml d'une solution 0,4 M de diisopropylcarbodiimide dans du chlorure de méthylène, on place ce mélange dans le récipient réactionnel et on le fait réagir à la température ambiante pendant 2 heures, sous agitation. On lave la résine résultante avec, dans l'ordre, du diméthylformamide, du chlorure de méthylène, du chlorure de méthylène contenant 10 % de diisopropyléthylamine, du chlorure de méthylène et un mélange de chlorure de méthylène et de diméthylformamide, pour obtenir un conjugué Boc-Tyr(C 12-Bzl)-Pro-résine. On répète ce cycle de réaction, élimination d'un groupe Boc et couplage d'un composé Boc-acide aminé, de la façon indiquée ci-dessus, et l'on obtient un conjugué Boc- Gly-Tyr(C 12-Bzl)-Tyr(C 12-Bzl)-Pro-résine. On introduit ce conjugué résine-peptide dans 20 ml de fluorure d'hydrogène contenant 10 % d'anisole, et on agite le tout à O C pendant 2 heures pour séparer le peptide d'avec la résine. On élimine ensuite le fluorure d'hydrogène par distillation sous pression réduite, et on extrait le résidu avec de l'acide acétique à 30 %, puis on le lyophilise, ce qui donne 150 mg d'un peptide brut On purifie ce peptide brut par chromatographie à polarité de phases inversée (RPC), en utilisant une colonne d'octadécyl-silane (ODS) Cosmosil 5 C 18-AR, Nacalai Tesque Inc), et l'on obtient 40 mg d'un produit final dont la composition en acides aminés (rapport molaire) est la suivante: Gly:Tyr:Tyr:Pro = 1:1:1:1. Une analyse de ce peptide à l'aide du même appareil de séquençage de protéines que celui utilisé dans l'exemple 1 permet d'identifier le peptide synthétisé comme étant le Peptide A (SEQ ID n l), dont la séquence d'acides aminés est Gly-Tyr-Tyr-Pro Par chromatographie en couche mince (CCM), on trouve que le Rf de ce peptide vaut 0,58, comme celui du produit de l'exemple 1. ( 2) Synthèse du Peptide B De la même manière que celle indiquée pour le Peptide A, on synthétise 30 mg d'un produit final, à partir de 1 g d'un conjugué Boc(butoxycarbonyl)-Thr(Bzl)-résine (taux de substitution 0,3 meq/g), disponible dans le commerce La composition du produit en acides aminés (rapport molaire) est Gly:Tyr:Tyr:Pro:Thr = 1:1:1:1:1 Une analyse réalisée à l'aide de l'appareil de séquençage de protéines utilisé dans l'exemple 1 permet d'identifier le peptide synthétisé comme étant le Peptide B (SEQ ID n 2), présentant la séquence d'acides aminés Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr. Par CCM, on trouve que le Rf de ce produit vaut 0,54, comme celui du produit de l'exemple 1. ( 3) Synthèse du Peptide C De la même manière que celle indiquée pour le Peptide A, on synthétise 30 mg d'un produit final, à partir de 0,77 g d'un conjugué Boc-Ser(Bzl)-résine (taux de substitution 0,39 meq/g), disponible dans le commerce La composition du produit en acides aminés (rapport molaire) est Gly:Tyr:Tyr:Pro:Thr:Ser = 1:1:1:1:1:1 Une analyse réalisée à l'aide de l'appareil de séquençage de protéines utilisé dans l'exemple 1 permet d'identifier le peptide synthétisé comme étant le Peptide C (SEQ ID n 3), présentant la séquence d'acides aminés Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr- Ser Par CCM, on trouve que le Rf de ce produit vaut 0,53. ( 4) Synthèse du Peptide E De la même manière que celle indiquée pour le Peptide A, on synthétise 40 mg d'un produit final, à partir de 0,6 g d'un conjugué Boc-Leu-résine (taux de substitution 0,5 meq/g), disponible dans le commerce La composition du produit en acides aminés (rapport molaire) est Tyr:Gly:Gly:Trp:Leu = 1:1:1:1:1 Une analyse réalisée à l'aide de l'appareil de séquençage de protéines utilisé dans l'exemple 1 permet d'identifier le peptide synthétisé comme étant le Peptide E (SEQ ID n 5), présentant la séquence d'acides aminés Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu Par CCM, on trouve que le Rf de ce produit vaut 0,77, comme celui du produit de l'exemple 1. ( 5) Synthèse du Peptide F De la même manière que celle indiquée pour le Peptide A, on synthétise 30 mg d'un produit final, à partir de 1 g d'un conjugué Boc-Trp-résine (taux de substitution 0,3 meq/g), disponible dans le commerce La composition du produit en acides aminés (rapport molaire) est Tyr:Gly:Gly:Trp = 1:1:1:1 Une analyse réalisée à l'aide de l'appareil de séquençage de protéines utilisé dans l'exemple 1 permet d'identifier le peptide synthétisé comme étant le Peptide F (SEQ ID n 6), présentant la séquence d'acides aminés Tyr-Gly-Gly-Trp Par CCM, on trouve que le Rf de ce produit vaut 0,61, comme celui du produit de l'exemple 1. ( 6) Synthèse du Peptide D De la même manière que celle indiquée pour le Peptide A, on synthétise 40 mg d'un produit final, à partir de 0,6 g d'un conjugué Boc-Leu-résine (taux de substitution 0,5 meq/g), disponible dans le commerce La composition du produit en acides aminés (rapport molaire) est Tyr:Pro:Ile: Ser:Leu = 1:1:1:1:1 Une analyse réalisée à l'aide de l'appareil de séquençage de protéines utilisé dans l'exemple 1 permet d'identifier le peptide synthétisé comme étant le Peptide D (SEQ ID n 4), présentant la séquence d'acides aminés Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu Par CCM, on trouve que le Rf de ce produit vaut 0,73, comme celui du produit de l'exemple 5. Test de détermination de l'activité opioïde On isole par excision les canaux déférents de deux souris mâles ICR pesant 30-35 g, et on les raccorde à un capteur de traction (TB 612-T, Nippon Koden Kogyo Inc, Japon) sous une tension de 0,4 g On plonge chacun de ces canaux déférents dans un tube de 2 ml, maintenu à 36 C et rempli d'une solution de Krebs contenant 118 m M de Na Cl, 4,75 m M de K Cl, 2,54 m M de Ca C 12, 25 m M de Na HCO 3, 1,19 m M de KH 2 PO 4 et 11 m M de glucose et on ventile ces canaux déférents à l'aide d'un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de gaz carbonique, qui provient d'une bouteille Après avoir laissé l'ensemble se stabiliser pendant environ 2 heures de cette façon, on applique une stimulation électrique ( 30 V, 1 ms) aux canaux déférents de souris, pour provoquer des contractions Une fois stabilisées ces contractions électro-induites, on ajoute 50 Ml d'un inhibiteur (contenant un inhibiteur d'amino-peptidase, etc) aux contenus des tubes Puis on ajoute dans les tubes chacune des fractions séparées, à partir des hydrolysats de gluten de blé, par chromatographie en phase liquide haute performance, et l'on enregistre les variations des contractions électro-induites des canaux déférents de souris On estime l'activité opioïde de ces fractions d'après l'inhibition des contractions, après addition de chaque fraction et inversion de l'inhibition par addition de 20 Ml d'une solution de naloxone 1 004 M On détermine pour chaque fraction la concentration (IC 50) qui inhibe de % les contractions électro-induites des canaux déférents de souris. Les valeurs d'IC 50 obtenues pour les Peptides A à D sont indiquées dans le tableau 1. Tableau 1 Peptide I Cso(m) Peptide A 70 Peptide B 40 Peptide C 75 Peptide D 15 On a rassemblé ci-dessous, sous forme schématique, les informations obtenues au cours des opérations de séquençage réalisées pour les exemples ci-dessus. ( 1) INFORMATION CONCERNANT SEQ ID N 01: (i) CARACTERISTIQUES DE SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 4 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 1 Gly Tyr Tyr Pro ( 2) INFORMATION CONCERNANT SEQ ID N 2: (i) CARACTERISTIQUES DE SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 5 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 2 Gly Tyr Tyr Pro Thr 1 5 ( 3) INFORMATION CONCERNANT SEQ ID N 3: (i) CARACTERISTIQUES DE SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 3 Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser 1 5 ( 4) INFORMATION CONCERNANT SEQ ID N 4: (i) CARACTERISTIQUES DE SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 5 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 4 Tyr Pro Ile Ser Leu 1 5 ( 5) INFORMATION CONCERNANT SEQ ID N 5: (i) CARACTERISTIQUES DE SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 5 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 5 Tyr Gly Gly Trp Leu 1 5 ( 6) INFORMATION CONCERNANT SEQ ID N 6: (i) CARACTERISTIQUES DE SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 4 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N 6 Tyr Gly Gly Trp REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un peptide opio'de, caractérisé en ce qu'il comporte l'hydrolyse d'une protéine de blé avec une protéase fonctionnant en milieu acide, puis l'hydrolyse du produit de cette première hydrolyse, à l'aide d'une protéase fonctionnant en milieu neutre ou d'une protéase fonctionnant en milieu alcalin, et la récupération, à partir du produit de cette seconde hydrolyse, d'un peptide voulu, présentant une activité opioide. 2 Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une séparation et une purification du produit d'hydrolyse de protéines de blé. 3 Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase fonctionnant en milieu neutre dérive de Bacillus ou d'Asperzillus, la protéase fonctionnant en milieu alcalin dérive de Bacillus, et le peptide opiolde présente l'une des séquences d'acides aminés suivantes: Gly-Tyr-Tyr-Pro (SEQ ID n 1), Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr (SEQ ID n 2), Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu (SEQ ID n 5), ou Tyr-Gly-Gly-Trp (SEQ ID n 6). 4 Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase fonctionnant en milieu neutre est de la trypsine- chymotrypsine, et en ce que le peptide opioide présente la séquence d'acides aminés suivante: Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (SEQ ID n 4). Peptide opioïde ou mélange de peptides opioldes, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir du procédé selon la revendication 1 ou 2. 6 Peptide opioide ou mélange de peptides opioïdes selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il présente l'une des séquences suivantes d'acides aminés: Gly-Tyr-Tyr-Pro (SEQ ID n l 1), Gly-Tyr-Tyr- Pro-Thr (SEQ ID n 2), Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser (SEQ ID n 3), Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (SEQ ID n 4), Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu (SEQ ID n 5), ou Tyr-Gly-Gly-Trp (SEQ ID n 6). 7 Peptide opioïde, caractérisé en ce qu'il présente l'une des séquences suivantes d'acides aminés Gly-Tyr-Tyr-Pro (SEQ ID n 1), GlyTyr-Tyr-Pro-Thr (SEQ ID n 2), Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser (SEQ ID n 3), ou Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (SEQ ID n 4). 8 Composition pharmaceutique comprenant un peptide opiolde conforme à la revendication 7 ou un sel physiologiquement acceptable d'un tel peptide, dans un véhicule pharmaceutique acceptable.