Brevet FR2667944A1 — publié le 19920417

La présente invention concerne un nouveau test de diagnostic en une étape sous forme d'une trousse en plaque ou panneau qui est utilisé pour fournir un diagnostic précis, simple et rapide pour déterminer si la douleur thoracique d'un patient est d'origine cardiaque et pour distinguer entre l'angor instable et l'infarctus du myocarde au stade précoce de la douleur thoracique du patient En particulier, ce test permet de déterminer simultané- ment les niveaux dans le sérum ou le plasma de trois substances ou marqueurs différentes que l'on trouve dans le sérum ou le plasma pendant ou après une affection cardiaque, à l'aide d'un format chimique sec de type sandwich d'immunodosage enzymatique Dans le mode de réalisation préféré de l'invention, les trois marqueurs sont la créatine kinase (CK), la myoglobine et les chaînes légères de myosine (MLC). La présente invention concerne également un procédé de diagnostic qui est mis en oeuvre au moyen de cette trousse. Le diagnostic d'urgence de l'infarctus du myocarde dépend du discernement du médecin et de la détermination des symptômes du patient tels que douleur ou pression thoracique qui s'étend éven- tuellement dans le bras et dans le cou, fatigue, sensation de mort imminente, respiration courte, pâleur, peau froide et moite, cyanose périphérique ou pouls filiforme rapide. La plupart des patients d'Amérique du nord qui souffrent d'une douleur thoracique consultent un médecin ou le service des urgences dans les 6 h qui suivent l'apparition de la douleur thoracique IL est donc essentiel qu'un test de diagnostic soit efficace au stade précoce d'un infarctus du myocarde. Pour détecter un infarctus du myocarde, on utilise plusieurs tests cardiaques qui comprennent: électrocardiogramme (ECG), transaminase glutamique oxaloacétique cérique/aspartate transférase (SGOT/AST), lactate déshydrogénase (LDH), immunodosage de créatine kinase-MB (CK-MB) et dosage amélioré à particules de latex NA-myoglobine Cependant, il n'existe pas de test cardiaque enzymatique unique permettant au médecin du service des urgences d'identifier l'origine cardiaque ou non cardiaque d'une douleur thoracique De plus, une thérapie thrombolytique ne peut être envi- sagée qu'après confirmation d'un infarctus du myocarde La probabi- lité de guérison totale du patient ou au moins de réduction au minimum des Lésions cardiaques augmente Lorsqu'une telle thérapie est amorcée précocement Il est donc essentiel que le médecin détermine si la douleur est cardiaque ou non cardiaque. L'électrocardiogramme peut être utilisé pour détecter un infarctus du myocarde Cependant, l'électrocardiogramme ne cons- titue pas un diagnostic, sauf si le coeur a subi des lésions impor- tantes La spécificité diagnostique de l'électrocardiogramme est seulement de 51 % pendant les phases initiales de la douleur thoracique De ce fait, l'électrocardiogramme n'est pas approprié pour la détection précoce d'un infarctus du myocarde. La transaminase glutamique oxalo-acétique/aspartate transférase (SGOT/AST) est une enzyme prédominante que l'on rencontre à concentration éLevée dans le muscle cardiaque On utilise des tests sériques pour déterminer les niveaux de SGOT dans le diagnostic d'un infarctus du myocarde Cependant, SGOT ne commence à croître qu'environ 8 à 10 h après le début de la douleur thoracique, atteint sa valeur maximale en 24 à 36 h et revient à la normale au bout de 5 à 7 jours SGOT n'est pas particulièrement utile pour diagnostiquer d'urgence un infarctus du myocarde à un stade précoce de la douleur thoracique d'un patient Egalement, SGOT n'est pas spécifique du muscle cardiaque On la trouve dans de nombreux tissus y compris les muscles squelettiques, le foie et les reins, et elle est libérée par suite d'injections intramusculaires, de chocs, au cours de maladies du foie et de la congestion hépatique, de sorte qu'elle est de peu d'intérêt pour détecter des Lésions spécifiques du tissu cardiaque. La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme que l'on rencontre à concentration élevée dans de nombreux tissus y compris le coeur, les muscles squelettiques et le foie On utilise des tests de détection de la présence de LDH dans le sérum pour le diagnostic d'un infarctus du myocarde Il existe cinq isotypes habituels parmi lesquels le coeur contient principalement LDH 1 et LDH 2 Les niveaux de LDH commencent à croître 24 à 36 h après le déclenchement de la douleur thoracique et atteignent leur valeur maximale au bout de 48 à 72 h pour revenir à la normale au bout de 4 à 8 jours De ce fait, LDH n'est pas utilisable comme indice d'un infarctus du myocarde à un stade précoce de la douleur thoracique d'un patient De plus, LDH n'est pas spécifique des lésions cardiaques mais apparaît au cours des embolies pulmonaires, des hémolyses, des congestions hépatiques, des maladies rénales et des lésions des muscles squelettiques Ce manque de spécificité réduit aussi l'utilité de LDH comme aide au diagnostic. La créatine kinase (CK) est une enzyme que l'on rencontre dans le tissu musculaire La créatine kinase catalyse la conversion de la créatine et de l'adénosine triphosphate (ATP) en phospho- créatine et adénosine diphosphate (ADP) On rencontre dans le tissu cardiaque CK-MB qui est l'une des différentes isoenzymes de CK. CK-MB est un marqueur sensible pour la détection d'un infarctus du myocarde du fait qu'elle est libérée par le tissu lésé du myocarde. CK-MB est donc présente dans le sérum d'un patient atteint La figure 1 représente la concentration de CK dans le sérum d'un patient en fonction du temps (ref Lee T H et al ( 1986) Ann. Intern Med 105, 221-233). L'immunodosage de CK-MB est le test de diagnostic standard pour l'infarctus du myocarde Le brevet US-A-4 900 662 intitulé "CK-MM Myocardial Infarction Immunoassay" décrit un procédé d'utilisation de CK-MB. Dans le brevet US-A-4 900 662, Shah décrit un procédé pour déterminer le niveau de concentration élevé initial de CK-MM-a, qui est une isoforme de CK-MM, et de CK-MM-a et CK-MM-b simultanément dans le sérum d'un patient à la suite d'un infarctus du myocarde L'utilisation de ce procédé fournit une estimation précise de l'époque de l'infarctus Ce procédé comprend la déter- mination de la concentration combinée de CK-MM-a et de CK-MM-b et de la concentration de CK-MM-a dans le sérum, pour déterminer l'époque de la phase aiguë de l'infarctus du myocarde Les réactifs décrits comprennent de nouveaux anticorps polyclonaux et monoclo- naux pour CK-MM-a qui ne se lient pas de manière significative avec CK-MB, CK-MM-b ou CK-MM-c, un anticorps anti-CK-MM-b qui ne se lie pas de manière significative avec CK-MB, CK-MM-a ou CK-MM-c, un anticorps anti-CK-MM-a+b qui se lie avec CK-MM-a et CK-MM-b mais qui ne se lie pas de manière significative avec CK-MB ou CK-MM-c, des dérivés marqués de ces anticorps, des supports insolubles sur lesquels sont fixes ces anticorps, et des trousses contenant un ou plusieurs de ces réactifs Les réactifs de CK marqués par enzyme et radiomarqués sont particulièrement utiles. On rencontre des difficultés lors de l'utilisation de CK-MB seule comme marqueur de diagnostic Tout d'abord, les niveaux sériques de CK-MB ne sont pas élevés jusqu'à 6 à 8 h après le déclenchement de l'infarctus du myocarde, et n'atteignent pas leur valeur maximale avant 12 h, ce qui rend difficile un diagnostic précoce et un traitement d'urgence. Deuxièmement, le test de CK-MB doit être conduit dans un laboratoire par des techniciens de laboratoire entraînés Dans les zones rurales, il peut être impossible de réaliser le test et d'interpréter les résultats rapidement, ce qui retarde le diagnos- tic et augmente les coûts du système sanitaire en termes de coûts d'hospitalisation d'un patient attendant le diagnostic. Troisièmement, CK-MB a été localisée dans les tissus musculaires squelettiques normaux de sorte que le test est moins spécifique du coeur et que le diagnostic est moins certain. La myoglobine est une autre protéine située à proximité de la membrane cellulaire squelettique ou myocardique Elle est sécrétée par la cellule dès que la membrane cellulaire devient anormalement perméable, par exemple au cours d'une ischémie myocar- dique, ce qui constitue un état réversible La myoglobine est détectable dans le sérum dans les 90 min qui suivent le déclenche- ment de la douleur thoracique Selon la communauté des chercheurs dans le domaine médical la myoglobine est libérée par nécrose myocardique et constitue de ce fait un marqueur précoce utile pour les lésions myocardiques La figure 2 représente la concentration de myoglobine dans le sérum en fonction du temps (ref Grenadier E et al ( 1981) Am Heart J 105, 408-416; Seguin J et al. ( 1988) J Thorac Cardiovasc Surg 95, 294-297). Lorsque l'on détermine l'origine d'une douleur thora- cique, il est possible d'exclure un infarctus du myocarde aigu en l'absence de détection d'une élévation du niveau de myoglobine sérique dans les 2 à 3 h qui suivent le déclenchement de la douleur. Un dosage amélioré à particules de latex NA-myoglobine est une trousse de dosage du commerce pour la détection de la myo- globine Le dosage est basé sur la réaction entre l'antigène présent dans les fluides corporels humains et les anticorps anti- myoglobine couplés de manière covalente à des particules de polys- tyrène L'échantillon, le réactif myoglobine N (N Myoglobin Reagent), une solution pour l'élimination des réactions non spécifiques et le tampon de réaction N (N Reaction Buffer) seront pipetés automatiquement dans une cuvette La dispersion de la lumière est mesurée par une méthode néphélométrique au bout de 12 min d'incubation et la concentration de la myoglobine est calculée à partir d'une courbe d'étalonnage. La myoglobine peut également être dosée au moyen d'un radioimmunodosage mais aucun format de test ELISA n'est dispo- nible actuellement. On rencontre des difficultés avec l'utilisation de la myoglobine seule comme marqueur de diagnostic La myoglobine n'indique aucun type particulier de lésion myocardique telle qu'un infarctus du myocarde La myoglobine peut être présente également au cours de différents états tels que choc, maladie rénale, rhabdomyolyse et myopathie De plus, les concentrations de la myoglobine dans le sérum et le plasma dépendent en général de l'âge et du sexe et varient dans un large domaine chez les êtres humains sains normaux En général, on considère que des concentrations sériques atteignant 90 pg/l constituent la limite supérieure de la gamme de référence pour les personnes saines De ce fait, ce qui peut constituer un niveau normal pour un individu peut être une indication d'un problème sérieux chez un autre individu de sorte que le diagnostic est un peu moins précis que ce qui serait souhai- table. Les chaînes légères de myosine (MLC) font partie de la myofibrille de myosine mais leur rôle fonctionnel n'est pas clair. Les MLC sont présentes dans les muscles à contraction lente, à contraction rapide, auriculaires et ventriculaires On sait que les MLC sont très sensibles pour l'ischémie myocardique Les MLC apparaissent rapidement dans le sérum et Leur niveau reste éLevé pendant les 10 jours suivant une nécrose myocardique La figure 3 représente la concentration de MLC dans le sérum d'un patient en fonction du temps (ref Wang J et al ( 1989) Clin Chimica Acta 181, 325-336; Jackowski G, Symmes J C et al ( 1989) Circulation Suppl 11 80, 355) Les MLC ont également une valeur de pronostic pour déterminer le succès d'une thérapie thrombolytique Des niveaux élevés de MLC indiquent un pronostic sombre et correspon- dent aussi à un infarctus important Des niveaux décroissants pendant plusieurs jours indiquent une tendance vers la guérison du patient tandis que des maximas ou des niveaux stationnaires indiquent une tendance à l'infarctus et la nécessité d'une inter- vention. Il existe deux types principaux de MLC connus comme étant MLC 1 et MLC 2 qui existent sous forme d'un groupe soluble dans le cytoplasme des cellules myocardiques et aussi dans la myofibrille de myosine Dans le muscle ventriculaire, le type MLC 2, et peut être MLC 1, est identique à l'isotype exprimé dans les muscles squelettiques à contraction lente MLC 1 est élevé chez 80 à 85 % des patients qui souffrent de douleurs cardiaques MLC 1 est un indicateur très sensible de l'angor instable et de la cardiopathie ischémique. D'autres marqueurs cardiaques tels que les protéines cardiaques de faible poids moléculaire (LMWCP) peuvent être utilisés Des exemples de marqueurs cardiaques de ce type com- prennent les composants de l'appareil contractile, à savoir la troponine, la troponine-T, la troponine-I et la troponine-C, les enzymes mitochondriales, telles que la triose P isomérase, les polypeptides de faible poids moléculaire qui sont facilement libé- rés par le coeur, et les protéines ou fragments de protéines de la membrane sarcolemmique qui peuvent être libérées précocement après le déclenchement d'une ischémie, en particulier une protéine sarcolemmique de 15 kd et une glycoprotéine complexe de 100 kd qui sont spécifiques du coeur. L'isotype cardiaque de la troponine-I inhibe L'inter- action entre les mo Lécules d'actine et de myosine au cours des périodes de repos entre les contractions du muscle cardiaque La troponine-I apparaît dans le sérum d'un patient dans les 4 à 6 h qui suivent un infarctus du myocarde et reste à un niveau éLevé pendant 7 à 8 jours La figure 4 représente la concentration de la troponine-I en fonction du temps (ref Cummins B, Auckland M L. et Cummins P ( 1987) Am Heart J 113, 1333-1344) Elle est spé- cifique du coeur et a une sensibilité supérieure à celle des autres marqueurs pour détecter les Lésions cardiaques par rapport aux Lésions des muscles squelettiques. La troponine-T fait partie du complexe troponine- tropomyosine du filament fin et sert de liaison entre le squelette de la tropomyosine et le complexe troponine-I-troponine C La tro- ponine-T est une protéine de base qui comporte des isotypes dans le muscle cardiaque et les muscles squelettiques à contraction rapide et à contraction lente Elle apparaît dans le sérum en 3 h et reste à un niveau éLevé pendant au moins 10 jours après un infarctus du myocarde La figure 5 représente la concentration de la troponine-T en fonction du temps (ref Katus H A et al ( 1989) J Mol Cell Cardiol 21, 1349-1353) La troponine-T présente une configuration de libération à deux phases Elle est spécifique du coeur et très sensible pour l'infarctus du myocarde. Les chaînes lourdes de myosine (MHC) et la tropomyosine sont des protéines de poids mo Léculaire plus éLevé qui peuvent être utilisées également comme marqueurs cardiaques Les MHC font partie de la protéine contractile majeure du muscle Des fragments de MHC peuvent être libérés du ventricule dans le sérum à la suite d'une nécrose des ce L Lu Les myocardiques et d'une Lésion subséquente irréversible des membranes Bien que les fragments de MHC n'appa- raissent pas rapidement dans le sérum après une nécrose des cellules myocardiques, les MHC demeurent à un niveau éLevé pendant au moins 10 jours après un infarctus du myocarde et on observe des niveaux maximas de MHC 4 jours après un infarctus du myocarde La figure 6 représente La concentration des MHC en fonction du temps. (ref Leger J O C et al ( 1985) Eur J of Clin Invet 15, 422- 429, Seguin J R et al ( 1989) J Thorac Cardiovasc Surg 18, 397- 401) L'aire comprise sous la courbe de libération des MHC présente une très bonne corrélation avec l'ampleur des lésions des cellules myocardiques Cependant, les niveaux de MHC ont une faible valeur clinique pendant la phase aiguë d'un infarctus du myocarde. La tropomyosine est un dimère formé à partir de deux polypeptides qui font partie du système régulateur de la contrac- tion musculaire La tropomyosine est détectable dans le sérum envi- ron 7 à 8 h après un infarctus du myocarde, et de même que CK-MB, elle est très sensible pour l'infarctus du myocarde La figure 7 représente la concentration de la tropomyosine en fonction du temps (ref Cummins P et al ( 1981) Clin Sci 60, 251-259) Cependant, la tropomyosine n'est pas spécifique du coeur puisqu'elle est présente à des niveaux élevés lors de traumatismes des muscles squelettiques. Chacun des procédés standards actuels pour le diagnostic d'un infarctus du myocarde présente des limites Aucun d'eux ne fournit un test de diagnostic très sensible, spécifique, rapide et simple pouvant être mis en oeuvre peu après le déclenchement de la douleur thoracique, par exemple dans une ambulance ou dans le cabinet d'un médecin. Selon la présente invention, on combine et on mesure au moins trois marqueurs différents des lésions cardiaques présents dans le sang ou le sérum d'un patient au stade précoce de la dou- leur thoracique pour fournir un procédé amélioré de diagnostic d'un infarctus du myocarde utilisable dans les stades précoces de l'angor instable ou de l'infarctus du myocarde. Les inconvénients de l'état de la technique peuvent être surmontés grâce à un test de diagnostic en une étape, précis, rapide au moyen d'un panneau ou plaque portable qui peut être uti- lisé en cas d'urgence pour détecter la présence d'au moins trois marqueurs de lésions cardiaques dans le sérum d'un patient Les résultats du test permettent de déterminer si le patient souffre d'angor instable ou d'un infarctus du myocarde La détection précoce d'un infarctus du myocarde permet d'amorcer une thérapie thrombolytique à un stade précoce Ceci permet de réduire au mini- mum Les Lésions cardiaques et d'augmenter Les chances de survie du patient Les résultats du test permettent de faire La distinction entre L'angor instab Le et L'infarctus du myocarde et ceci même plusieurs jours après Le début de La dou Leur Le test se Lon L'invention uti Lise un format chimique sec de type sandwich d'immu- nodosage enzymatique Les mesures en série dans Le temps au moyen du panneau ou p Laque fournissent au médecin des informations con- cernant L'amp Leur des Lésions musculaires et Le succès d'une inter- vention thrombo Lytique Dans Le mode de réalisation préféré de L'invention, Les trois marqueurs sont La créatine kinase (CK), La myoglobine et Les chaînes Légères de myosine (MLC). Ainsi, La présente invention fournit une trousse de test de diagnostic pour détecter un infarctus du myocarde au stade précoce de La dou Leur thoracique du patient La trousse de test comprend un réceptacle destiné à recevoir et à contenir un échan- ti L Lon de sang ou de sérum du patient et un moyen de détection destiné à communiquer avec L'échanti L Lon Le moyen de détection comprend au moins trois anticorps monoclonaux ou po Lyc Lonaux mis en suspension sur un support, chaque anticorps étant complémentaire d'une protéine différente Libérée par Le musc Le cardiaque au cours du stade précoce d'un infarctus du myocarde, et des réactifs correspondants qui sont sensibles de manière indépendante à chaque anticorps qui réagit avec La protéine complémentaire La réponse combinée des réactifs constitue une indication du diagnostic du patient. La présente invention concerne également un procédé de diagnostic qui uti Lise La trousse de test ci-dessus. D'autres avantages et caractéristiques de L'invention apparaîtront mieux dans La description détai LLée qui suit et se réfère aux dessins annexés, donnés uniquement à titre d'exemp Le, et dans Lesque Ls: La figure 1 est un graphique représentant Le niveau de CK dans Le sérum en fonction du temps; La figure 2 est un graphique représentant Le niveau de myoglobine dans Le sérum en fonction du temps; La figure 3 est un graphique représentant Le niveau de MLC dans Le sérum en fonction du temps; La figure 4 est un graphique représentant Le niveau de troponine-I dans Le sérum en fonction du temps; La figure 5 est un graphique représentant Le niveau de troponine-T dans Le sérum en fonction du temps; La figure 6 est un graphique représentant Le niveau de MHC dans Le sérum en fonction du temps; La figure 7 est un graphique représentant Le niveau de tropomyosine dans Le sérum en fonction du temps; La figure 8 est une vue de dessus du mode de réalisation préféré de L'invention; La figure 9 est une vue en perspective éc Latée du mode de réalisation de La figure 8; La figure 10 est une vue en perspective de La membrane du mode de réalisation de La figure 8; et La figure 11 est une vue en perspective d'un second mode de réalisation de La membrane. La trousse de test se Lon L'invention est représentée sur La figure 8 sous forme d'un panneau ou p Laque 1. Le format de panneau uti Lisé est connu et est disponible dans Le commerce Ce format est semb Lab Le à un format uti Lisé actue L Lement en association avec Les tests de grossesse et i L est disponible dans Le commerce sous La marque déposée BIOSIGN. Ce panneau consiste en une carte de po Lypropy Lène qui comporte un panneau fronta L 10 et un panneau dorsa L 12 Le panneau fronta L 10 présente une fenêtre d'affichage 14 et une fenêtre d'échanti L Lon 16 comme Le montre La figure 8 Sous Le panneau fronta L 10 se trouve une membrane chimique sèche 18 (figure 9) qui est fixée au dos du panneau fronta L 10 par des moyens appropriés. Le panneau dorsa L 12 est muni d'une Lèvre 20 qui s'étend sur Le périmètre du panneau pour recevoir Le panneau fronta L 10 par assem- b Lage instantané ou par tout autre moyen pour que La membrane 18 soit enserrée hermétiquement entre Le panneau fronta L et Le panneau dorsa L. Dans une variante, le réceptacle est un récipient trans- parent susceptible d'être fermé hermétiquement et le support cons- titue le côté du récipient. Le panneau frontal 10 peut être muni également d'une zone 13 sur laquelle peut être inscrit le nom ou l'identification du patient On peut prévoir également un espace pour inscrire les résultats du test. La figure 10 représente la membrane 18 qui constitue le support des anticorps monoclonaux ou polyc Lonaux Dans le mode de réalisation préféré, le sang ou le sérum progresse d'une extrémité à l'autre de la membrane comme le montre la flèche L'extrémité 22 est en alignement avec la fenêtre d'échantillon 16 Un anticorps capturé immobilisé 24 est appliqué contre un conjugué anticorps- enzyme 26 ou lié à celui-ci, ce conjugué étant dirigé contre un épitope de l'antigène qui est différent de celui qui est reconnu par l'anticorps 24 L'anticorps 24 est complémentaire de la protéine myosine De même, l'anticorps 28 est appliqué contre un réactif correspondant 30 L'anticorps 28 est complémentaire de CK-MB De même, l'anticorps 32 est appliqué contre un réactif 34. L'anticorps 32 est complémentaire des chaînes légères de myosine. L'anticorps 36 est un anticorps qui est complémentaire d'une protéine quelconque que l'on rencontre dans le sérum ou le sang normal L'anticorps 36 est appliqué contre le réactif 38 Cet anti- corps 36, qui est le plus éloigné de la fenêtre d'échantillon, est un anticorps témoin destiné à indiquer la fin du test. Les anticorps monoclonaux et polyclonaux peuvent être préparés par des protocoles conventionnels avec des mammifères quelconques utilisés pour la production d'anticorps polyclonaux. Dans le mode de réalisation préféré, on utilise un réactif marqué Le réactif est marqué ou lié chimiquement à une fraction distincte qui peut être observée ou mesurée pour vérifier ou quantifier la présence d'un anticorps dans le sérum ou le sang ou sur la membrane chimique sèche Les ligands et groupes qui peuvent être conjugués aux anticorps de cette invention pour être utilisés comme outil de diagnostic comprennent les éléments, composés ou matériaux biologiques qui présentent des caractéris- tiques physiques ou chimiques qui peuvent être utilisées pour distinguer les anticorps auxquels ils sont liés. Il est nécessaire d'avoir par marqueur cardiaque au moins deux anticorps du type mono/poly ou lapin/poly, chêvre/poly Les anticorps sont purifiés en ce qui concerne l'affinité contre leur immunogène cardiaque spécifique puis purifiés encore par adsorption croisée contre une espèce non apparentée pour éLiminer les immuno- globulines non spécifiques. Pour utiliser la trousse, la personne qui établit le diagnostic, par exemple un médecin, un ambulancier ou une infirmière, applique trois gouttes ou moins de 100 pl de sérum ou sang du patient sur la fenêtre d'échantillon 16 L'échantillon migre par capillarité le long de la membrane 18 et vient successi- vement en contact avec les paires anticorps-réactif 24 et 26, 28 et 30, 32 et 34 et 36 et 38. S'il est présent dans l'échantillon, le marqueur cardiaque spécifique se lie à l'anticorps immobilisé sur la mem- brane Le réactif correspondant réagit aussi et il est visualisé par un changement de couleur du réactif Le changement de couleur est proportionnel à la concentration du marqueur dans l'échan- tillon De ce fait, si l'on utilise la trousse de test de manière répétée dans le temps, il est possible de déterminer aussi l'augmentation ou la diminution de la concentration du marqueur et de l'utiliser comme outil de diagnostic Les résultats du test peuvent être obtenus en 3 à 5 min. Dans le mode de réalisation préféré, le panneau frontal est marqué pour identifier la position de la réaction protéine- anticorps Une bande bleue permet de visualiser chaque marqueur cardiaque qui est présent dans l'échantillon L'intensité de la bande peut être quantifiée à l'aide d'un réflectomètre disposé sur le panneau frontal qui relie l'intensité de couleur au niveau de concentration d'un marqueur particulier Le réflectomètre peut contenir un microprocesseur de sorte que le résultat quantifié correspondant à chaque marqueur cardiaque testé sur le panneau peut être produit et imprimé sous forme de concentration de chaque marqueur en même temps que le nom ou identification du patient. De préférence, le test est sensible à des concentrations de marqueur de 0,5 ng/ml à 25 ng/ml en utilisant 3 gouttes ou moins de 100 pl de sérum ou de plasma avec un coefficient de variation de précision pendant le test et entre les tests inférieur à 15 %. Le choix des marqueurs cardiaques utilisés dans le test dépend des propriétés de ces marqueurs Dans le mode de réalisation préféré, ce sont la myoglobine, MLC et CK-MB comme le montre la figure 8. La myoglobine est libérée très tôt par les cellules myocardiques, elle n'est pas spécifique du coeur, elle est très sensible pour l'infarctus du myocarde et la nécrose et elle n'est pas libérée par des lésions anoxiques en l'absence de nécrose Les MLC sont spécifiques du coeur et permettent de faire la distinction entre les douleurs cardiaques et les douleurs non cardiaques, et elle sont libérées précocement mais moins précocement que la myo- globine CK-MB permet de faire la distinction entre l'angor et l'infarctus du myocarde mais elle n'est pas détectable jusqu'à environ 6 h après le déclenchement de la douleur thoracique de sorte qu'elle n'est pas utilisée seule comme test de diagnostic d'urgence. D'après les figures 1, 2 et 3, et dans le cas o les trois marqueurs cardiaques utilisés sont CK-MB, myoglobine et MLC, l'interprétation suivante des résultats fournirait un diagnostic. Si le panneau est positif pour les MLC et négatif pour la myoglobine et CK-MB, ceci indique que la douleur thoracique du patient est cardiaque et que son origine est l'angor instable. Si la myoglobine et les MLC sont positives et si CK-MB est négative, ceci indique un infarctus du myocarde au stade précoce; une thérapie d'intervention peut être amorcée. Si les trois marqueurs sont positifs, ceci indique un infarctus du myocarde. Si MLC et CK-MB sont positives, tandis que la myoglobine est négative, ceci indique un infarctus du myocarde. Si la myoglobine et CK-MB sont positives tandis que les MLC sont négatives, le patient pourrait souffrir d'un traumatisme des muscles squelettiques (faux positif) ou être en plein infarctus du myocarde. Le test peut ne pas permettre de distinguer un faux positif d'un "petit" infarctus du myocarde dans ce cas, du fait que la courbe de libération des MLC présente de légères baisses à plusieurs intervalles et que le patient peut souffrir d'un petit infarctus sous- endocardique et subir le test au moment d'une baisse Lorsque l'infarctus est peu important, la baisse atteint sensiblement le niveau normal de sorte que le patient réagirait négativement au test concernant les MLC Un diagnostic positif reposerait sur la présence de CK-MB. Au cas o le patient souffre d'un infarctus du myocarde important, la baisse des niveaux de MLC n'est pas assez impor- tante pour atteindre le niveau normal de sorte que les MLC demeurent détectables. Dans d'autres modes de réalisation, le panneau de test peut utiliser des combinaisons d'anticorps différentes dans le même format afin de déterminer des marqueurs cardiaques différents Pour faire en sorte que le panneau détecte des lésions du tissu cardiaque à un stade précoce de la douleur thoracique du patient, il est nécessaire d'utiliser au moins un anticorps correspondant à un marqueur qui est présent en quantité importante à un stade précoce de la lésion cardiaque, tel que CK, les chaînes Légères de myosine ou La myoglobine On peut utiliser également dans la trousse des protéines cardiaques de faible poids moléculaire qui présentent les caractéristiques et les propriétés de CK, des chaînes légères de la myosine ou de la myoglobine. Il est possible de choisir les protéines et enzymes appropriées parmi les suivantes: troponine, troponine-I, troponine-C, troponine- T et protéines de la membrane sarcolemmique, triose P isomérase ou toute protéine cardiaque de poids molé- culaire élevé présentant les caractéristiques et les propriétés de la créatine kinase, de la myoglobine ou des chaînes légères de myosine. D'autres protéines telles que la tropomyosine et les chaînes lourdes de myosine peuvent également être ajoutées à la trousse La trousse permet alors de détecter un infarctus du myocarde si le patient se présente en vue de l'établissement du diagnostic de nombreuses heures après le déclenchement de la douleur thoracique, le patient étant alors au stade tardif de l'infarctus du myocarde. Il est préférable que la trousse contienne au moins deux protéines ou enzymes choisies parmi la créatine kinase, la myoglo- bine, les chaînes légères de myosine et la troponine-T. Dans un second mode de réalisation représenté sur la figure 11, la membrane 118 peut comporter une couche d'anticorps capturé 124 et un réactif correspondant 126, et de même pour chaque autre marqueur à détecter, une paire correspondante d'anticorps et de réactif, c'està-dire 128 et 130, 132 et 134 et une paire témoin 136 et 138 Dans ce mode de réalisation, l'échantillon est versé goutte à goutte sur chaque paire et les résultats sont lus de la même manière que ci-dessus. La membrane chimique sèche 118 peut être supportée par un matériau absorbant 120 Le matériau absorbant 120 favorise l'aspi- ration du sérum à travers la membrane. Dans un autre mode de réalisation, on utilise un tube de prélèvement de sang qui est utilisé habituellement pour prélever des échantillons de sang sur les patients La paroi interne du tube peut jouer le rôle de support pour les anticorps monoclonaux et polyclonaux et les réactifs L'échantillon ayant été prélevé sur le patient, l'utilisateur agite simplement le tube pour que l'anti- corps réagisse avec le sang Des changements de couleur tels que décrits ci-dessus se produisent si la protéine cardiaque est présente dans le sang. REVENDICATIONS 1 Trousse de test de diagnostic pour détecter un infar- ctus du myocarde au stade précoce de la douleur thoracique d'un patient, caractérisée en ce qu'elle comprend un réceptacle ( 1) destiné à recevoir et à contenir un échanti L Lon de sang ou de sérum du patient, et un moyen de détection destiné à communiquer avec l'échantillon, le moyen de détection comprenant au moins trois anticorps monoclonaux ou polyclonaux ( 24, 28, 32; 124, 128, 132) mis en suspension sur un support, chaque anticorps étant complé- mentaire d'une protéine différente libérée par le muscle cardiaque au cours des stades précoces d'un infarctus du myocarde, et des réactifs correspondants ( 26, 30, 34; 126, 130, 134) qui sont indé- pendamment sensibles à chaque anticorps qui réagit avec la protéine complémentaire, de sorte que la réponse combinée des réactifs constitue une indication de l'état cardiaque du patient. 2 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 1, caractérisée en ce que les anticorps monoclonaux et poly- clonaux sont complémentaires d'au moins trois des protéines ou enzymes suivantes: créatine kinase, myoglobine, chaines légères de myosine, troponine, troponine-I, troponine-C, troponine-T et protéines de la membrane sarcolemmique, triose P isomérase ou toute protéine cardiaque de faible poids mo Léculaire présentant les caractéristiques et les propriétés de la créatine kinase, de la myoglobine ou des chaînes Légères de myosine, tropomyosine ou toute protéine cardiaque de poids mo Léculaire éLevé présentant les caractéristiques et les propriétés de la créatine kinase, de la myoglobine ou des chaînes Légères de myosine, au moins deux des protéines ou enzymes étant choisies parmi la créatine kinase, la myoglobine, les chaînes Légères de myosine et la troponine-T. 3 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 2, caractérisée en ce que lesdits anticorps monoclonaux et polyclonaux comprennent un anticorps capturé immobilisé appliqué contre le réactif correspondant comprenant un conjugué anticorps- enzyme dirigé contre un épitope différent de celui qui est reconnu par l'anticorps. 4 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 3, caractérisée en ce que lesdits réactifs changent de couleur par suite de la réaction de chaque anticorps avec la protéine complémentaire. 5 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 4, caractérisée en ce que ledit changement de couleur est proportionnel à la concentration de la protéine complémentaire dans l'échantillon. 6 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 5, caractérisée en ce que ledit réceptacle ( 1) comprend un panneau frontal ( 10) présentant une fenêtre d'échantillon ( 16) destinée à recevoir l'échantillon et une fenêtre d'affichage ( 14) destinée à afficher les réactifs, un panneau dorsal ( 12) et un moyen de fermeture ( 20) pour fixer le panneau frontal sur le panneau dorsal en enserrant entre eux le support ( 18) pour former ainsi une unité. 7 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 6, caractérisée en ce que ledit support est une membrane chimique sèche ( 18; 118). 8 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 7, caractérisée en ce que ladite membrane ( 118) est supportée par un matériau absorbant ( 120) pour favoriser la progression de l'échantillon vers le moyen de détection. 9 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 8, caractérisée en ce que ladite membrane s'étend sur la fenêtre d'échantillon et sur la fenêtre d'affichage, les anticorps et les réactifs correspondants étant répartis dans la fenêtre d'affichage à partir de la fenêtre d'échantillon. Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 9, caractérisée en ce que ledit panneau frontal est marqué pour identifier la position de la réaction protéine-anticorps. 11 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 10, caractérisée en ce que ledit panneau frontal est muni en outre d'un réflectomètre pour quantifier la concentration des protéines dans l'échantillon. 12 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 11, caractérisée en ce que ledit moyen de détection comprend un anticorps témoin ( 36; 136) qui est complémentaire d'une protéine existant normalement dans le sérum, et un réactif corres- pondant ( 38; 138) sensible à l'anticorps témoin qui réagit avec la protéine complémentaire pour indiquer que le test est en fonction- nement. 13 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 12, caractérisée en ce que ledit anticorps témoin et la protéine correspondante sont situés sur le support à la plus grande distance de la fenêtre d'échantillon pour indiquer l'achèvement du test. 14 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 5, caractérisée en ce que ledit réceptacle est un récipient transparent susceptible d'être fermé et ledit support constitue le côté du récipient. Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 13 ou 14, caractérisée en ce que les anticorps monoclonaux et polyc Lonaux sont complémentaires de la créatine kinase et de la myoglobine. 16 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 15, caractérisée en ce que lesdits anticorps sont comp Lémen- taires de la créatine kinase, de la myoglobine et des chaînes légères de myosine. 17 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 15, caractérisée en ce que lesdits anticorps sont comp Lémen- taires de la créatine kinase, de la myoglobine et de la troponine-T. 18 Trousse de test de diagnostic selon la revendica- tion 15, caractérisée en ce que le test est sensible à des concen- trations de marqueurs de 0,5 ng/ml à 25 ng/ml en utilisant moins de pl d'échantillon avec un coefficient de variation de précision pendant le test et entre deux tests inférieur à 15 %. 19 Procédé de diagnostic de l'infarctus du myocarde, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à déposer un échantillon de sang ou de sérum préLevé sur un patient sur une trousse de test de diagnostic comprenant un réceptacle ( 1) destiné à recevoir et à contenir un échantillon de sang ou de sérum du patient, et un moyen de détection destiné à communiquer avec l'échantillon, le moyen de détection comprenant au moins trois anticorps monoclonaux ou polyclonaux ( 24, 28, 32; 124, 128, 132) mis en suspension sur un support ( 18; 118), chaque anticorps étant complémentaire d'une protéine différente libérée par le muscle cardiaque au cours des stades précoces d'un infarctus du myocarde, et des réactifs correspondants ( 26, 30, 34; 126, 130, 134) qui sont indépendamment sensibles à chaque anticorps qui réagit avec la protéine complémentaire, la réponse combinée des réactifs consti- tuant une indication de l'état du patient, et à visualiser et ana- lyser le résultat fourni par la trousse de test de diagnostic. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que ladite pluralité d'anticorps monoclonaux et polyclonaux est complémentaire de trois des protéines ou enzymes suivantes: créatine kinase, myoglobine, chaînes légères de myosine, troponine, troponine-I, troponine-C, troponine-T et protéines de la membrane sarcolemmique, tropomyosine, triose P isomérase ou toute protéine cardiaque de faible poids moléculaire présentant les caractéristiques et les propriétés de la créatine kinase, de la myoglobine ou des chaînes légères de myosine, au moins deux des protéines ou enzymes étant choisies parmi la créatine kinase, la myoglobine, les chaînes légères de myosine et la troponine-T. 21 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont complémentaires de la créatine kinase, de la myoglobine et des chaînes légères de myosine. 22 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont complémentaires de la créatine kinase, de la myoglobine et de la troponine-T.