Brevet FR2662697A1 — publié le 19911206

tTOUVEAU GMiGLIOSIDE PROVENANT DU LAIT ET SON PROCEDE D' OBTEtTTIOI La présente invention concerne un nouveau ganglioside, le 9-0-acètyl-GD3, provenant du lait de vache et d'autres produits laitiers, ainsi qu'un procédé d'obtention de ce gangiioside. Le 9-0-acétyl-GD3 est un dérivé particulier du ganglioside GD3, dans lequel le groupe hydroxyle sur le carbone If. 9 du résidu d'acide sialique est converti en ester acétique. On sait que les gangliosides existent dans les mélanomes, les cellules cancéreuses humaines de mélanome cutané, le tissu nerveux du rat et analogues et on prévoit différentes recherches concernant leurs fonctions et leur métabolisme. Les sphingoglycolipides comprenant les gangliosides consistent en une partie formée par une chaîne saccharidique et en une partie lipidique appelée céramide. Cette partie appelée céramide consiste en une base à longue chaîne et en un acide gras. En général, les sphingoglycolipides sont classés selon la partie formée par la chaîne saccharidique; cependant, on sait que l'on rencontre des variations dans la partie céramide chez les sphingoglycolipides bien qu'ils soient classés dans le même groupe et qu'ils comportent la même chaîne saccharidique. En effet, les glycolipides provenant du même tissu comportent la même chaîne saccharidique mais des bases à longues chaînes et des acides gras différents. On sait que cette variation est caractéristique des organes et tissus qui contiennent des gangliosides. De plus, on sait que la partie formée par la chaîne saccharidique participe aux fonctions physiologiques des sphingoglycolipides; par ailleurs, on sait aussi que la structure de la partie céramide participe largement à la manifestation des fonctions physiologiques comme le montre le cas des cérébrosides à activité anti-ulcère et antistress. Ainsi, la manifestation des fonctions physiologiques est influencée non seulement par la structure de la chaîne saccharidique mais aussi par la structure de la partie céramide. On sait en particulier que le 9-0-acétyl-GD3 est un antigène spécifique du cancer qui a suscité beaucoup d'intérêt. Cependant, concernant le poids moléculaire et la structure du 9-0-acétyl-GD3 provenant des cellules de mélanome humain, on sait seulement que les constituants principaux sont la base à longue chaîne, la sphingosine (d 18:1) et les acides gras, l'acide palmitique (C 16:0) et l'acide tétracosénoïque (C 24:1) (J. Biol. Chem. 260 (1985), 14556-14563). Par ailleurs, on a trouvé récemment que le 90-acétyl-GD3 est présent dans le babeurre préparé à partir de lait de vache et qu'il s'agit d'un constituant normal de l'organisme (Lipids, li (1989), 680-684).On identifie ce 90-acétyl-GD3 à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique du 9-0-acétyl-GD3 mais on n'a pas déterminé sa structure par analyse spectrométrique ou par analyse chimique. Ainsi, on ne peut pas considérer que l'analyse de la structure du 9-0acétyl-GD3 provenant des cellules de mélanome humain est satisfaisante et en outre, jusqu'à maintenant, on n'a pas fait l'analyse de la structure du 9-0-acétyl-GD3 provenant du babeurre préparé à partir du lait de vache. Ceci est dû au fait que le 9-0-acétyl-GD3 existe dans les tissus ou les fluides corporels en des quantités extrêmement faibles et que par conséquent la quantité de ganglioside isolé et purifié est très faible. Pour étudier le 9-0-acétyl-GD3 du point de vue chimique et pour mettre en évidence ses fonctions physiologiques, il est nécessaire d'isoler et de purifier le 9-0-acétyl-GD3 en grandes quantités. Les présents inventeurs sont parvenus à isoler et purifier de grandes quantités de 9-0-acétyl-GD3 provenant du lait de vache en utilisant comme produit de départ le lait de vache ou un produit laitier, et ils ont pu confirmer que le 9-0-acétyl-GD3 obtenu est sensiblement différent de celui qui provient des cellules de mélanome humain, en analysant la chaîne saccharidique, la base à longue chaîne et les acides gras pour révéler la structure du ganglioside, et parvenir ainsi à la présente invention. Ainsi, un objet de la présente invention consiste à proposer un nouveau ganglioside 9-0-acétyl-GD3 qui provient du lait de vache ou d'un produit laitier. Un autre objet de la présente invention consiste à proposer un nouveau ganglioside 9-0-acétyl-GD3 qui provient du lait de vache ou d'un produit laitier et qui est utile dans différentes recherches en médecine; biochimie et analogues, en particulier pour la recherche concernant les mélanomes humains. Un autre objet de l'invention consiste à proposer un nouveau ganglioside 9-0-acétyl-GD3 provenant du lait de vache ou d'un produit laitier, qui soit utile comme réactif dans le domaine de la biochimie. Un autre objet de la présente invention consiste à proposer un procédé de production d'un nouveau ganglioside 9-0-acétyl-GD3 intéressant, utilisant comme produit de départ le lait de vache ou un produit laitier. Ainsi, la présente invention concerne un ganglioside, le 9-0-acétyl-GD3, représenté par la formule générale suivante: NeuS, 9Ac2 a 2 v 8Neu 5Ac a 2 3 3Gal 8 1 4Glc (3 1 > lCer (I) dans laquelle Neu représente un résidu d'acide neuraminique, Ac représente un groupe acétyle, Gal représente un résidu de galactose, Glc représente un résidu de glucose et Cer représente un résidu de céramide. On obtient ce ganglioside à partir du lait ou d'autres produits laitiers. En outre, la présente invention concerne un procédé de production du ganglioside 9-0-acétyl-GD3 de formule (I) dans lequel du lait de vache ou un autre produit laitier est traité avec un mélange chloroforme-méthanol ou chlorof ormeméthanol-eau pour extraire le ganglioside, et la solution d'extraction du ganglioside obtenue est lavée à l'acétone puis est soumise à une chromatographie d'échange d'ions et à une chromatographie sur gel de silice pour obtenir le ganglioside 9-0-acétyl-GD3. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels: la figure 1 représente des spectrogrammes de résonance magnétique nucléaire du proton du ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention obtenu à partir du lait de vache et d'autres produits laitiers; la figure 2 représente des spectrogrammes de résonance magnétique nucléaire du proton du ganglioside 9-0-acétyl-GD3 obtenu à partir de cellules de mélanome humain; la figure 3 représente un spectrogramme de masse du méthylester du N-méthyl-N-acétyl-9-0-méthyl-4,7, 8-tri-0-TMS- neuraminylméthylcétoside selon la présente invention; la figure 4 représente un spectrogramme de masse du méthylester du 8-0-TMS-N-méthyl-4,7,9-tri-0-méthyl-N-acétyl- neuraminylméthyl cétos ide; la figure 5 représente un spectrogramme de masse du méthylester du N-méthyl-4,7 , 8, 9-tétra-0-méthyl-N-acétyl- neuraminylméthyl cétos ide. Le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention peut être représenté par la formule (II) suivante: dans laquelle R1 représente un groupe CH3- (CH2)1- ou un groupe CH3-(CH2)m-CH=CH-, et R2 représente un groupe CH3(CH2)n- ou un groupe CH3(CH2)p-CH=CH-(CH2)7-, 1 représentant un nombre entier compris entre 13 et 15, m représentant un nombre entier compris entre 11 et 13, n représentant un nombre entier compris entre 16 et 22 et p représentant un nombre entier compris entre 7 et 13. De plus, selon l'invention, les résidus -COOH de la formule (II) mentionnée ci-dessus peuvent être sous forme de sels. Des exemples de sels comprennent les sels de métaux alcalins tels que le sodium, le potassium etc. et les sels d'ammonium. En outre, les sels peuvent être des sels d'addition d'acides aminés basiques tels que l'arginine et la lysine ou de substances basiques telles que des amines. Le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention comprend aussi les sels mentionnés ci-dessus. Des exemples de gangliosides sont les composés suivants: Composé R1 R2 (III) CU3-(CH2)1- CH3-(CH2)n 1 = 13-15 n = 16, 20, 21 ou 22 (IV) CH3-(CH2)1- CH3(CH2)p-CH=CH-(CH2)7 1 = 13-15 p = 7, 11, 12 ou 13 (V) CH3-(CH2)m-CH=cH- CH3-(CH2)n m = 11-13 n = 16, 20, 21 ou 22 (VI) CH3(CH)m-cH=cH- CH3(CH2)p-CH=CH-(CH2)7 m = 11-13 p = 7, 11, 12 ou 13 Ainsi, le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 a une céramide comprenant principalement de l'hexadécasphinganine, (d 16:0), de l'hexadécasphingénine, (d 16:1) ou de la sphinganine (d 18:0) (ou de la sphingénine d 18:1) comme base à longue chaîne et de l'acide octadécanoïque (C 18:0), de l'acide octadécénoique (C 18:1), de l'acide docosanoïque (C 22:0), de l'acide tricosanoique (C 23::0) ou de l'acide tétracosanoïque (C 24:0) comme acide gras, comme le montrent les formules (III), (IV), (V) et (VI). De plus, la présente invention comprend les composés qui comprennent deux ou plus de deux des substances mentionnées ci-dessus en combinaison. m=16, 20, 21, 22 n=13, 15 (III) chaîne saccharidique comme ci-dessus m=7, 11, 12, 13 n=13, 15 (IV) chaîne saccharidique corne ci-dessus m=16, 20, 21, 22 n=ll, 13 (v) chaîne saccharidique comme ci-dessus m=7,11,12,13 n=11,13 (VI) De plus, le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention est produit généralement de la manière suivante: On utilise comme matière première du lait de vache ou d'autres produits laitiers provenant du lait de vache, tels que le babeurre, le petit lait et le lait écrémé. Ces matières premières contiennent différents constituants tels que des protéines, du lactose, des graisses, des glycolipides neutres et des gangliosides y compris le 9-0acétyl-GD3.Les présents inventeurs ont présenté antérieurement un procédé pour concentrer efficacement les gangliosides du lait de vache (brevet japonais mis à la disposition du public N . 269992/1988). Le concentré obtenu selon ce procédé contient du 9-0-acétyl-GD3 sous une forme très concentrée. Selon la présente invention, on applique un tel procédé et on concentre encore par séchage le concentré obtenu; on le traite avec un mélange chloroforme-méthanol pour extraire une fraction lipidique contenant les gangliosides et on sèche l'extrait. Puis, on retire les graisses et les cholestérols par lavage à l'acétone de l'extrait sec obtenu. On peut utiliser aussi un mélange chloroforme-méthanol-eau pour l'extraction de la fraction lipidique qui contient les gangliosides.On soumet ensuite cet extrait, qui est une fraction lipidique complexe contenant principalement des glycolipides et des phospholipides, à une chromatographie d'échange d'ions puis à une chromatographie sur gel de silice; on obtient ainsi le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention, sous forme d'une poudre blanche, comportant un constituant du composé (III) ou (VI), avec une pureté supérieure à 90%. De plus, il est possible également d'isoler ces composés par chromatographie de partage en phase inverse. Les analyses de la structure des gangliosides obtenus par le procédé selon la présente invention de la manière décrite ci-dessus sont les suivantes: (1) Hydrolyse alcaline douce: A la fraction de 9-0-acétyl-GD3 isolée on a ajouté de l'hydroxyde de sodium 0,2N dans le méthanol et on a fait réagir le mélange à la température ambiante pendant 2 heures puis on l'a concentré et déminéralisé pour le soumettre à une chromatographie en couche mince. La mobilité du 9-0acétyl-GD3 non hydrolysé en chromatographie en couche mince était supérieure à celle du GD3 dépourvu de groupe acétyle; cependant, lorsque le 9-0-acétyl-GD3 était hydrolysé, la mobilité était totalement identique à celle du GD3. Ceci signifie que le ganglioside purifié était instable en milieu alcalin et était un dérivé du GD3. (2) Spectrophotométrie RMN H Selon un procédé connu, on a traité environ 3 mg de 90-acétyl-GD3 provenant du lait de vache pour effectuer une substitution par de l'eau lourde puis on l'a dissous dans un mélange diméthylsulfoxyde-eau lourde (98:2 en volume) pour le soumettre à une mesure au spectromètre de résonance magnétique nucléaire à 900C. Les résultats sont représentés sur la figure 1. La partie correspondant à la chaîne saccharidique de ce spectrogramme était sensiblement identique à celle du 9-0-acétyl- & 3 purifié provenant de cellules de mélanome humain (figure 2) et l'on a confirmé par spectrométrie que la structure de la chaîne saccharidique du ganglioside de la présente invention correspond à la formule générale (I). (3) Détermination du site de liaison du groupe acétyle de GD3 acétvlé On a réalisé ensuite une acétalisation avec le méthylvinyléther, une méthylation, une méthanolyse et une triméthylsilylation (TMS) du ganglioside selon la méthode de Gasa et al. (Method in Research on Complex Glycolipids II, page 87) pour introduire un groupe méthyle au niveau d'un groupe hydroxyle ayant un groupe acétyle de liaison et un groupe triméthyle au niveau d'un groupe hydroxyle libre, puis l'on a analysé le ganglioside obtenu par chromatographie gaz-liquide (CGL) /spectrométrie de masse (colonne de CGL: DB-1; tension d'ionisation pour la spectrométrie de masse: 70 eV). Comme le montre la figure 3, le spectre de masse du méthylester du N-méthyl-N-acétyl-9-0méthyl-4, 7,8 -tri-0-TMS-neuraminylméthylcétoside a été confirmé. En plus de ce résultat, l'hydrolyse partielle du ganglioside avec la sialidase a produit du GD3 mais pas de 9-0-acétyl-GD3. Ces résultats indiquent qu'un groupe acétyle est lié au groupe hydroxyle au niveau du neuvième atome de carbone de l'acide sialique terminal de GD3. (4) Détermination du site de liaison de l'acide sialique par analyse par méthylation On a méthylé totalement environ 1 mg de 9-0-acétyl-GD3 par la méthode de Hakomori (J. Bio. Chem., iS, 205 (1964)) et on a soumis le produit obtenu à une méthanolyse avec 0,5 ml d'un mélange HC1 0,3IT-méthanol à 750C pendant 18 heures. Après avoir retiré le solvant, on a soumis le résidu à une triméthylsilylation à 600C pendant 20 minutes. On a analysé le dérivé TMS ainsi obtenu par chromatographie gaz-liquide (CGL)/spectrométrie de masse (colonne de CGL: DB-1; tension d'ionisation pour la spectrométrie de masse: 70 eV). Comme le montrent les figures 4 et 5, les spectres de masse du méthylester du 8-0-TMS 8-0-TMS-0:T-méthyl-4,7 ,9-tri-0-méthyl-N-acétyl- neuraminylméthylcétoside et du méthylester du N-méthyl 4,7,8,9-tétra-0-méthyl-t1-acétyl-neuraminylméthylcétoside ont été confirmés. (5) Détermination du site de liaison de la chaîne saccharidique par analyse par méthylation En utilisant le 9-0-acétyl-GD3 totalement méthylé préparé en (4) ci-dessus, on a préparé un dérivé d'acétate d'alditol partiellement méthylé selon un procédé connu. L'analyse par chromatographie gaz-liquide/spectrométrie de masse (colonne de CGL: DB-1; tension d'ionisation pour la spectrométrie de masse: 70 eV) a confirmé les spectres de masse du l,3,5-triacétyl-2,4,6-triméthylgalactitol et du 1,4,5-triacétyl-2,3,6-triméthylglucitol. (6) Comoosition des acides gras On a introduit environ 1 mg de ganglioside dans un tube à essai à sommet fileté et bouchon en Teflon Q et on a ajouté 1 ml de mélange méthanol aqueux-HCl 1N. On a chauffé le mélange à 750C pendant 18 heures. Après refroidissement à l'air, on a extrait trois fois avec 2 ml d'hexane à chaque fois pour obtenir des méthylesters d'acides gras. En outre, pour acétyler les résidus hydroxyle des esters, on a retiré le solvant avec un évaporateur à azote et on a séché suffisamment la substance obtenue, on lui a ajouté 0,1 ml de mélange pyridine-acide acétique anhydre (1:1 en volume) et on l'a chauffée à 800C pendant 30 minutes. On a analysé le dérivé ainsi obtenu par chromatographie gaz-liquide (colonne DB-1) et par chromatographie gaz-liquide/spectrométrie de masse (colonne DB-1).Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 acide gras teneur acide gras teneur % % C 14:0 0,2 C 22:1 1,1 C 16:0 1,2 C 22:0 31,0 C 18:0 8,8 C 23:1 1,5 C 18:1 4,1 C 23:0 23,0 C 20:0 2,4 C 24:1 4,3 C 21:0 1,7 C 24:0 16,5 C 22:2 3,9 (7) Composition de la base à longue chaîne Après l'extraction à l'hexane, on a séché la solution méthanolîque préparée en (6) ci-dessus à l'aide d'un évaporateur à azote et on a ajouté au résidu obtenu un réactif de triméthylsilylation, puis on a chauffé le mélange formé à 600C pendant 20 minutes. On a analysé le dérivé ainsi obtenu par chromatographie gaz-liquide et chromatographie gaz-liquide (CGL)/spectrométrie de masse (colonne de CGL: DB-1; tension d'ionisation pour la spectrométrie de masse: 70 eV). Les résultats sont présentés dans le tableau 2. D'après les caractéristiques présentées en (1) ou (7), on a identifié le ganglioside selon l'invention comme étant un ganglioside de formule générale (III), (IV), (V) ou (VI), ce qui est représenté de la manière suivante: IJeu5, 9 kc 2 a 2 v 8 Neu 5 Ac a 2 9 3 Gal ss 1 + 4 Glc ss 1 + 1 Cer Tableau 2 base à longue chaîne teneur d 16:1 13,9 d 16:0 35,3 d 17:1 4,1 d 17:0 1,8 d 18:1 38,7 d 18::0 6,2 En général, étant donné que les gangliosides ont une grande importance du point de vue physiologique, le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 de la présente invention est aussi très important et peut être utilisé efficacement comme réactif en recherche médicale ou biologique, en particulier dans la recherche sur les mélanomes. Le ganglioside selon la présente invention est le 9-0acétyl-GD3 provenant du lait de vache et il s'agit d'un nouveau ganglioside dont la structure de la partie céramide est différente de celle du 9-0-acétyl-GD3 provenant des mélanomes humains. Grâce à la présente invention, on dispose d'un réactif utile pour la recherche en médecine et en biochimie, en particulier pour la recherche concernant les mélanomes et on peut développer des produits pharmaceutiques ou diagnostiques. Les exemples non limitatifs suivants sont destinés à illustrer la présente invention. Exemple 1 On a dissous trois kilogrammes de petit lait dans 30 litres d'eau chaude et on a ajouté à cette solution 80 litres de méthanol. On a agité le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes et on a ajouté au mélange 40 litres de chloroforme. On a agité de nouveau le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes pour extraire les gangliosides. Puis, après avoir filtré la solution extraite et l'avoir concentrée par séchage, on a ajouté au concentré 500 ml de mélange chloroforme-méthanol (2:1 en volume). On a agité le mélange résultant à la température ambiante pendant 30 minutes puis on l'a filtré. Au filtrat ainsi obtenu on a ajouté 20 litres d'acétone puis on l'a laissé au repos pendant une nuit à 40C. Après l'avoir filtré, on a obtenu un précipité blanc. On a dissous le précipité blanc dans un mélange chloroforme-méthanol-eau (30:60:8 en volume) et on a appliqué le mélange résultant sur une colonne (3,0 x 40 cm) de résine échangeuse d'ions (DEAE-Sephadexe A-25) pour permettre l'adsorption des gangliosides. Ensuite, on a élué les glycolipides neutres avec 1500 ml d'un mélange chloroforme-méthanol-eau (30:60:8 en volume) et 300 ml de méthanol, puis on a élué les gangliosides avec 300 ml d'une solution d'acétate de sodium 0,2M dans le méthanol. On a dialysé la solution d'extraction des gangliosides pour éliminer l'acétate de sodium puis on l'a séchée par évaporation au moyen d'un évaporateur pour obtenir 1,2 g de gangliosides sous forme d'une poudre blanche. Cette poudre blanche était un composé du 9-0-acétyl-GD3 contenant 24 mg de 9-0-acétyl-GD3 pour un total de 1,2 g. On a dissous cette poudre dans un mélange chloroformeméthanol-eau (70:30:3 en volume) et on a appliqué le mélange obtenu sur une colonne de gel de silice (3,0 x 100 cm) pour permettre l'adsorption des gangliosides. Ensuite, on a élué les fractions dépourvues de gangliosides avec 1,5 litre d'un mélange chloroforme-methanol-eau (70:30:3 en volume). Puis, on a élué le 9-0-acétyl-GD3 par fractionnement avec 5 litres de mélange chloroforme-méthanol-eau (65:35:35 en volume). On a confirmé la fraction contenant le 9-0-acétyl-GD3 par chromatographie en couche mince et on a recueilli le 9-0acétyl-GD3 que l'on a séché par évaporation à l'aide d'un évaporateur. On a ainsi obtenu 7,5 mg de 9-0-acétyl-GD3 présentant une pureté supérieure à 95% confirmée par chromatographie en couche mince. Exemple2 On a dissous 40 kilogrammes de babeurre en poudre dans 400 litres d'eau puis on a ajouté à la solution 1 kg de protéase de Bacillus subtilis. On a fait réagir la solution obtenue à pH 7,0, 400C pendant 15 heures en vue de la protéolyse puis on la chauffée à 900C pendant 10 minutes pour inactiver l'enzyme. Ensuite, on a filtré à 400C la solution ainsi obtenue à un débit de 15 litres/heure et sous une pression moyenne de 0,6 MPa à laide d'un dispositif d'ultrafiltration (module de type LAB-20, produit par la société DDS) muni d'une membrane d'ultrafiltration d'une surface de 0,36 m2 pour concentrer les gangliosides. Après l'avoir concentrée, on a recueilli la solution à partir du bain de concentration et on l'a lyophilisée; on a ainsi obtenu 3000 g de poudre. Ensuite, on a ajouté à la poudre 5 litres de mélange chloroforme-méthanol (2:1 en volume) et on a agité le mélange obtenu à la température ambiante pendant 30 minutes puis on l'a filtré. Au filtrat ainsi obtenu on a ajouté 40 litres d'acétone et on l'a laissé au repos pendant une nuit à 40C. Après filtration on a obtenu un précipité blanc. On a dissous le précipité blanc dans un mélange chloroforme-méthanol-eau (30:60:8 en volume) et on a appliqué le mélange résultant sur une colonne (100 x 60 cm) de résine échangeuse d'ions (DEAE-Sephadexe A-25) pour permettre l'adsorption des gangliosides. Puis on a élué les glycolipides neutres avec 15 litres d'un mélange chloroforme-méthanol-eau (30:60:8 en volume) et 5 litres de méthanol, après quoi on a élué les gangliosides avec 25 litres d'une solution d'acétate de sodium 0,2 M dans le méthanol. On a dialysé l'éluat de gangliosides pour éliminer l'acétate de sodium puis on l'a séché par évaporation à l'aide d'un évaporateur; on a ainsi obtenu 5,4 g de gangliosides sous forme d'une poudre blanche. Cette poudre était un composé du 9-0-acétyl-GD3 contenant 100 mg de 9-0acétyl-GD3 pour un total de 5,4 g. On a dissous cette poudre dans un mélange chloroformeméthanol-eau (70:30:3 en volume) et on a appliqué le mélange résultant sur une colonne de gel de silice (3,3 x 120 cm) pour permettre l'adsorption des gangliosides. Ensuite, on a élué les fractions dépourvues de gangliosides avec 2,5 litres d'un mélange chloroforme-méthanol-eau (70:30:3 en volume). Puis, on a élué le 9-0-acétyl-GD3 par fractionnement avec 5 litres d'un mélange chloroformeméthanol-eau (65:35:3,5 en volume). On a confirmé par chromatographie en couche mince la fraction contenant le 90-acétyl-GD3 et on a recueilli le 9-0-acétyl-GD3 que l'on a séché par évaporation à l'aide d'un évaporateur. On a ainsi obtenu 100 mg de 9-0-acétyl-GD3 d'une pureté supérieure à 95% confirmée par chromatographie en couche mince. Exemple 3 Pour séparer les types moléculaires du 9-0-acétyl-GD3 provenant du lait de vache ou d'un produit laitier, on a utilisé 100 mg de 9-0-acétyl-GD3 obtenu selon l'exemple 2. On a dissous le 9-0-acétyl-GD3 dans un mélange méthanol-eau (85:15 en volume) et on a appliqué le mélange obtenu sur une colonne en phase inverse C18 (3,3 x 120 cm, YMC ODS). Ensuite, on a elué les gangliosides avec 1,5 litre d'un mélange méthanol-eau (85:15 en volume) pour fractionner les types moléculaires de 9-0-acétyl-GD3 en surveillant l'absorbance à 205 nm. On a obtenu six fractions correspondant à six pics d'absorption principaux. On a confirmé que chaque fraction était constituée par un type d'acide gras et un type de base à longue chaîne de la manière suivante: hexadécasphinganine (d 16:0) et acide docosanoique (C 22:0), hexadécasphinganine (d 16:0) et acide tricosanoique (C 23:0), hexadécasphinganine (d 16:0) et acide tétracosanoïque (C 24:0), sphingénine (d 16:0) et acide docosanoique (C 22:0), sphingénine (d 16:0) et acide tricosanoique (C 23:0), et sphingénine (d 16:0) et acide tétracosanoïque (C 24:0). Ainsi, on a séparé six types moléculaires différents de 9-0acétyl-GD3. REVENDICATION 1. Ganglioside 9-0-acétyl-GD3 caractérisé par la formule générale (I) NeuS, 9Ac2 a 2 + 8Neu 5Ac a 2 - > 3Gal (3 1 # 4Glc ss 1 > lCer (I) dans laquelle Neu représente un résidu d'acide neuraminique, Ac représente un groupe acétyle, Gal représente un résidu de galactose, Glc représente un résidu de glucose et Cer représente un résidu de céramide. 2. Ganglioside 9-0-acétyl-5D3 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un composé de formule générale (II) dans laquelle R1 représente un groupe CH3-(CH2)1- ou un groupe CH3-(CH2)m-CH=CH-, et R2 représente un groupe CH3(CH2)n- ou un groupe CH3(CH2)pCH=CH (CH2)7-, 1 représentant un nombre entier compris entre 13 et 15, m représentant un nombre entier compris entre 11 et 13, n représentant un nombre entier compris entre 16 et 22 et p représentant un nombre entier compris entre 7 et 13. 3. Ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il provient du lait ou d'autres produits laitiers. 4. Procédé de préparation du ganglioside 9-0-acétyl GD3 selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que du lait de vache ou d'autres produits laitiers sont traités avec un mélange chloroforme-méthanol ou avec un mélange chloroforme-méthanol-eau pour l'extraction des gangliosides et l'extrait de gangliosides obtenu est soumis à une chromatographie d'échange d'ions et à une chromatographie sur gel de silice pour obtenir le ganglioside 9-0-acétyl GD3. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on prépare l'extrait de gangliosides en dissolvant du petit lait en poudre dans de l'eau chaude puis en extrayant les gangliosides par addition de méthanol puis de chloroforme. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'extrait de gangliosides est un filtrat concentré obtenu par ultrafiltration d'un lysat de protéase de babeurre en poudre. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on réalise la chromatographie d'échange d'ions en appliquant l'extrait de gangliosides obtenu à l'aide d'un mélange chloroforme-méthanol-eau sur une résine échangeuse d'ions (DEAE-Sephadexe A-25) pour permettre l'adsorption des gangliosides puis en éluant en vue du fractionnement à laide d'une solution d'acétate de sodium dans le méthanol pour obtenir le ganglioside 9-0-acétyl-GD3. 8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on réalise la chromatographie sur gel de silice en appliquant l'extrait de gangliosides obtenu à l'aide d'un mélange chloroforme-méthanol-eau (70:30:3 en volume) sur une colonne de gel de silice pour permettre l'adsorption des gangliosides puis en éluant en vue du fractionnement à l'aide d'un mélange chloroforme-méthanol-eau (65:35:3,5 en volume) pour obtenir le ganglioside 9-0-acétyl-GD3.