Brevet FR2665177A1 — publié le 19920131

Gène recombinant codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou Lysozyme. L'invention concerne un nouveau gène recombinant codant pour une nouvelle protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme, une bactérie contenant ce gène recombinant, une cellule végétale, une plante, ou une partie de plante, en particulier une semence végétale, transformées par un gène recombinant de ce type, un procédé pour rendre les plantes résistantes aux agents pathogènes, tels que les champignons, les bactéries, ainsi que les arthropodes notamment les insectes, et les nématodes, qui comprend une étape de transformation par ce gène, ainsi que cette nouvelle protéine et un procédé pour la préparer. Les plantes cultivées sont soumises à des attaques par des agents pathogènes, tels que Les champignons et les bactéries, lesquelles sont responsables de pertes importantes de récoltes. Le principal moyen actuel de Lutte contre ces agents réside dans l'utilisation de substances chimiques à activité fongicide ou bactéricide. On sait aujourd'hui que les plantes réagissent natu tellement à ces attaques par divers mécanismes de défense, malheureusement en général à déclenchement trop tardif et d'intensité trop faible pour être suffisamment efficaces. L'un de ces mécanismes comprend L'induction d'une enzyme appelée chitinase EC 3.2.1.14. (A. Toppan et aL, 1982, Agronomie, 2, 829-834).Cette induction peut être artificiellement stimulée par des substances, telles que l'éthylène avec comme conséquence l'augmentation de la résistance aux agents pathogènes de La pLante traitée (Boller T., 1988, Oxford Surveys of Plant Molecular and CeLL Biology, 5, 145174). La chitine est un polymère Linéaire polysaccharidique, constitué d'unités N-acetylglucosamine associées par des Liaisons 8-1,4. Cetui-ci est un composé structural présent dans la paroi de la plupart des champignons pathogènes, dans l'exosquelette des arthropodes, en particulier des insectes, et dans L'enveLoppe externe des oeufs et des cystes de nématodes. Les enzymes appelées chitinases sont capables de dégrader la chitine.On distingue parmi celles-ci deux groupes différents définis selon leur mode d'attaque de la chitine : les exochitinases capables de liberer L'unité Nacétylglucosamine située aux extrémités non réductrices des chaînes et les endochitinases capables de fragmenter les chaînes, qui sont les seules chitinases capables d'inhiber in vitro la croissance des hyphes mycéliennes (Roberts W.K et aL., 1988, Gen. Microbiol, 134, 169-176). Les chitinases végétales connues sont en grande majorité de type endo, contrairement aux chitinases bactériennes connues qui sont de type exo (Roberts W.K et aU, 1988, Gen. Microbiol, 134, 169-176). Un grand nombre d'endochitinases végétales, notamment celles de tomate et de tabac (P. AUDY et al., 1990, Phytochem, 29, 4, 1143-1159), présentent également une activité Lysozyme, capacité de cliver les liaisons ss-1,4 entre L'acide N-acétylglucosamique et L'acide N-acétylmuranique du peptidoglycane des parois bactériennes. On peut donc admettre que les activités lysozyme et endochitinase sont assez proches (Roberts W.K et a , 1988, Gen. Microbiol., 134, 169-176) et qu'une nouvelle protéine à activité endochitinase, en particulier de structure intermédiaire entre L'endochitinase de tomate et L'endochitinase de tabac, présente probablement une activité lysozyme. Des séquences d'ADN codant pour des exochitinases bactériennes ont déjà été isolées et clonées (Jones J.D.G. et al., 1986 EMBO J., 5, 467-473 et Sundheim L. et al., 1988, Physiol Moles Plant Pathol., 33, 483-491). Le brevet US-A-4751081 décrit L'isolement et le clonage du gène complet codant pour La chitinase de Serratia marcescens ainsi que la transformation par ce gène des bactéries Pseudomonas fLuorescens NZ130 et Pseudomonas putida MK280. Ces bactéries transformées sont capables de dégrader legère- ment une chitine colloïdale dispersée dans le milieu de culture bactérien Les travaux de Harpster M.H. et al, 1989, Nucl. Ac. Res., 17, 5395 ont montré que ce gène code pour une exochitinase, ce qui explique la faible efficacité de dégradation observée (Cf. tableau 2, col. 13 et 14 de ce document). La publication de Jones J.D.G. et al. (1988), Mol Gen. Genet., 212, 536-542, mentionne la transformation de plantes de tabac par Agrobacterium tumefaciens contenant un gène chimérique comprenant la partie codante de l'exochitinase de Serratia marcescens, sous contrôle de différents promoteurs végétaux. Ce document ne donne aucune indication sur l'éventueLle augmentation de la résistance aux pathogènes conférée par l'expression de cette exochitinase. Des séquences d'ADN génomique et/ou d'ADN complémentaire codant pour certaines endochitinases végéta les ont d'autre part été isolées et clonées (Broglie K.E., 1986, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 83, 6820-6824 et Hedrick S-A., 1988, Plant Physiol., 86, 182-186). Personne n'a réussi jusqu a présent à utiliser un gène recombinant codant pour une endochitinase végéta le pour transformer des cellules végéta les de façon à permettre son expression et L'obtenu tion après régénération de plantes transformées et de descendances de celles-ci qui expriment une endochitinase recombinante. Les demanderesses ont construit un gène chimérique dont La partie codante, précédée d'un promoteur viraL fort et d'un terminateur bactérien, comprend le fragment codant, incomplet dans sa partie 31, d'un clone de L'ADN genomique de L'endochitinase de tomate (Thèse de Doctorat ès Sciences de M. DURAND-TARDIF, 1986, Universite de Paris Sud) associé à un segment synthétique identique à un fragment 3' de La partie codante de l'ADNc de L'endochitinase de tabac (Hideaki Shinshi et al., 1987, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 84, 89-93). Ce gène a été cloné dans un vecteur appelé Vecteur binaire ; il s'agit d'un vecteur capable de se répliquer dans E. coli ainsi que dans Les bactéries du genre Agrobacterium et d'être transféré entre E. coli et une bactérie du genre Agrobacterium (voir GELVIN et al., Kluwer Academic press 1988). Ce vecteur binaire a été transféré dans des agrobactéries qui ont servi à transformer in vitro des cellules de tabac et de colza. Les plantes transformées, obtenues après régénération à partir de celLes-ci et leurs descendances, expriment le gène chimérique à un niveau élevé sous la forme d'une protéine de masse moléculaire voisine de 26 kDa présentant une activité endochitinase. La protéine recombinante présente dans les cellules de colza a été isolée, purifiée et caractérisée.Le nombre de loci d'insertion du gène chimérique a d'autre part été déterminé par l'analyse génétique statistique des descendances de plantes de tabac transformées par le gène chimérique et exprimant un marqueur de sélection lié au gène chimérique. Ce nombre est généralement égal à 1, parfois 2 rarement supérieur à 2, ce qui montre la possibilité d'insertions multiples du gène au cours de la transformation.Les descendances des plantes transformées exprimant L'endochitinase recombinante présentent une résistance aux agents pathogènes plus importante que celle des plantes non transformées et proche de, voire supérieure à, celle de plantes connues pour être génétiquement résistantes L'invention concerne donc un nouveau gène recombinant caractérisé en ce qu'iL code pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme qui comprend la séquence (1) ciaprès :: GLy GLy Asp Leu Gly Ser Val Ile Ser Asn Ser Met Phe Asp Gtn Met Leu Lys His Arg Asn Glu Asn Ser Cys Gln Gly Lys Asn Asn Phe Tyr Ser Tyr Asn Ala Phe Ile Thr Ala Ala Arg Ser Phe Pro Gly Phe Gly Thr Ser Gly Asp Ile Asn Ala Arg Lys Arg Glu Ile Ala Ata Phe Phe Ala Gtn Thr Ser His GLu Thr Thr GLy GLy Leu Pro His Leu Met Asp His Ser His GLy Val Thr Val Ser Leu GLu Asn Glu VaL Thr Pro Val Thr Thr VaL His Gln Val Val Asn Gly Leu Val His Leu GLu Gly Asn Ile Ser Asp Glu Ala Gln Ser Lys Phe Asn Tyr Asn Tyr GLy Pro Cys GLy Arg ALa Ile Gly Val Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asp Leu Val Ala Thr Asp Pro Val Ile Ser Phe Lys Thr ALa ILe Trp Phe Trp Met Thr Pro Gln Ser Pro Lys Pro Ser Cys His Asp Val Ile Ile Gly Arg Trp Asn Pro Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ala Asn Arg Leu Pro Gly Phe Gly Val Ile Thr Asn Ile Ile Asn Gly Gly Leu Glu Cys Gly Arg Gly Asn Asp Asn Arg Val Gln Asp Arg Ile Gly Phe Tyr Arg Arg Tyr Cys GLy ILe Leu GLy Val Ser Pro Gly Asp Asn Leu Asp Cys GLy Asn Gln Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met Ce gène recombinant code de préférence pour une protéine qui comprend, immédiatement en amont de la séquence (1), la séquence (2) ci-après :: Gtn Asn Cys GLy Ser Gln Gly Gly Gly Lys Val Cys Ala Ser Gly Gln Cys Cys Ser Lys Phe Gly Trp Cys Gly Asn Thr Asn Asp His Cys Gly Ser Gly Asn Cys Gln Ser Gln Cys Pro Gly Gly Gly Pro Gly Pro Gly Pro Val Thr destinée à être clivée lors de la maturation de la protéine, ou une séquence présentant un degré d'homologie substantiel avec la séquence (2). De préférence, ce gène recombinant code pour une protéine dont la séquence comprend, en amont de la séquence (1) et de préférence séparée de la séquence (1) par une séquence destinée à être clivée, une séquence codant pour un peptide-signal. Un gène de ce type particuLièrement intéressant est celui qui code pour une protéine dont La sequence comprend, immédiatement en amont de la séquence (2) ou d'une séquence présentant un degré d'homologie substantieL avec la séquence (2), la séquence (3) ci-après Met Arg Arg Thr Ser Lys Leu Thr Thr Phe Ser Leu Leu Phe Ser Leu Val Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ala ou une séquence présentant un degré d'homologie substantieL avec la séquence (3). L'invention concerne aussi un gène chimérique, tomatetabac caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité Lysozyme qui comprend une séquence présentant un degré d'homoLogie substantiel avec la séquence (1). La partie codante de ce gène chimérique comprend au moins une partie de L'ADN génomique ou de L'ADN complémentaire de L'endochitinase de tomate et au moins une partie de L'ADN génomique ou de L'ADN compLémentaire de L'endochitinase de tabac, ces différentes parties étant choisies et agencées de façon que la séquence chimérique obtenue code pour une protéine comprenant une séquence qui présente un degré d'homologie substantiel avec la séquence (1) De préférence, La partie codante du gène chimérique présente au moins un intron. En effet, it est connu que la présence d'introns dans la partie codante d'un gène augmente L'expression de celui-ci (voir par exemple les travaux de J. CALLIS et al., (1987, Genes and development, 1, 1183-1200). Un exemple de tel gène chimérique est le gène recombinant dont la partie codante est la séquence ci-après ATGAGGCGAA CTTCTAAATT GACTACTTTT TCTTTGCTGT TTTCTCTGGT TTTGCTGAGT GCTGCCTTGG CACAGAATTG TGGTTCACAG GGCGGAGGCA AAGTTTGTGC GTCGGGACAA TGTTGCAGCA AATTCGGGTG GTGCGGTAAC ACTAATGACC ATTGTGGTTC TGGCAATTGT CAAAGTCAGT GTCCAGGTGG CGGCCCTGGT CCTGGTCCTG TTACTGGTGG GGACCTCGGA AGCGTCATCT CAAATTCTAT GTTTGATCAA ATGCTTAAGC ATCGTAACGA AAATTCTTGT CAAGGAAAGA ATAATTTCTA CAGTTACAAT GCCTTTATTA CTGCTGCTAG GTCTTTTCCT GGCTTTGGTA CAAGTGGTGA TATCAATGCC CGTAAAAGGG AAATTGCTGC TTTCTTTGCC CAAACCTCCC ATGAAACTAC TGGTATGTGT ATAACCATTC ACATCGAACC ATTAAAATAT AATTTCATTT TATTTTATTT AGTAATTGAT TATATATGTA GGAGGATGGC CTTCCGCACC TGATGGACCA TTCGCATGGG GTTACTGTTT CCTTAGAGAA CGAGGTAACC CCGGTGACTA CTGTTCACCA AGTAGTCAAT GGCCTTGTGC ACCTGGAAGG AAATATTTCG GACGAGGCCC AATCCAAATT TCACAGTAAG CTACATAAAT CTATATATGG TAAAATTTGA TGAACTTGTA GTGTCTAATT ACGTGTATTT TGACATTTCA AAACAGCAAC TACAACTATG GGCCATGTGG AAGAGCCATC GGAGTGGACC TTTTAAACAA TCCTGATTTA GTAGCCACAG ACCCAGTCAT CTCATTCAAG ACTGCTATCT GGTTCTGGAT GACCCCTCAA TCACCAAAGC CTTCTTGCCA CGATGTCATC ATTGGAAGAT GGAACCCATC TGCCGGTGAC CGATCAGCCA ATCGTCTTCC TGGATTTGGT GTCATCACAA ACATCATCAA TGGGGGCCTG GAATGTGGTC GTGGCAATGA CAATAGGGTC CAGGATCGCA TTGGGTTTTA CAGGAGGTAT TGCGGTATTC TTGGTGTTAG TCCTGGTGAC AATCTTGATT GCGGAAACCA GAGATCTTTT GGAAACGGAC TTTTAGTCGA TACTATGTAA TGA Cette séquence codante est, de préférence, précédée d'une séquence promotrice comportant un promoteur viraL fort, tel que Le promoteur 35S du virus de la mosaïque de chou-fleur Revoir ODELL J.T. et al., 1985, NATURE, 313, 81O-812 et suivie d'une séquence terminatrice comportant le terminateur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens avoir BEVAN M. et aL., 1983, Nucal Ac. Res., 11, 369. L'invention a également trait à une bactérie, par exemple de L'espèce E. coli, qui contient le gène recombinant défini cidessus dans un contexte ou environnement nucLéotidique permettant sa réplication et donc peut servir au clonage de ce gène, ainsi qu'à une bactérie susceptibLe d'infecter une pLante avec transfert de matériel génétique, par exempLe de L'une des espèces Agrobacterium rhizogenes et Agrobacterium tumefaciens, qui contient ce gène dans un contexte permettant sa réplication et donc peut servir à transformer des cellules végétales. La transformation des cel Lules végétales par le gène ci-dessus peut également être effectuée par une autre méthode biologique teile que la voie du tube pollinique (Zhong-xun Luo et al., Plant Molec. Biol.Rep., 1988, 6, 165176) et la transformation directe de graines en germination (Toepfer R. et al., 1989, The Plant Cell., 1, 133-139), ou par une méthode physique telle que L'utilisation de polyéthylènegLycol, l'électroporation (Chistou P. et al., 1987, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 84, 3662-3699) et le bombardement à L'aide de microprojectiLes (KLein T.M. et al., 1988, Proc. NtL. Acad. Sci. USA, 85, 85028505). L'invention concerne également une cellule végétale caractérisée en ce qu'elle est transformée par un gène recombinant codant une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme, inséré dans un contexte susceptible de permettre son expression. Cette cellule végétale peut provenir d'une espèce de grande cuLture, telle que par exemple Le maïs, le soja, La betterave, Le blé, l'orge, le pavot, le colza, le tournesol, la luzerne et le sorgho, d'une espèce floraLe telle que le rosier, L'oeiLlet, le gerbera ou d'une espèce potagère telle que la carotte, la tomate, la salade, la chicorée, le poivron, le melon et le chou. Des espèces particulièrement appréciées sont le colza Brassica napus, le tournesol Helianthus annuus et le tabac Nicotiana tabac. L'étape de transformation qui concerne une ou quelques cellules est suivie d'une étape de multiplication de ces cellules transformées de façon à obtenir des cals, lesquels peuvent donner naissance à des plantes transformées, par des processus d'organogenèse ou d'embryogenèse. L'invention concerne donc aussi une plante ou une partie de plante, caractérisée en ce qu'elle contient, dans un contexte susceptible de permettre son expression, un gène recombinant codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité Lysozyme. Une partie de plante particulièrement appréciée est la semence : graine ou autre partie d'un végétal apte à former une nouvelle pLante compLète, notamment après semis ou enfouissement. Ces plantes peuvent être L'une quelconque des espèces ci-dessus et plus particulièrement des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus. L'invention a égaLement trait à un procédé pour obtenir des plantes résistantes aux agents pathogènes, tels que les champignons, les bactéries ainsi que les arthropodes en particuLier les insectes, et les nématodes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de transformation de cellules végéta les par un gène codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité Lysozyme, suivie d'une étape de muLtipLication des cellules transformées et d'une étape de régénération des pLantes. De préférence, L'étape de transformation des cellules végétales est effectuée in vitro à L'aide d'une agrobactérie (c'est-à-dire d'une bactérie du genre Agrobacterium) ayant intégré Le gène codant pour une protéine présentant une activité endochitinase et/ou activité lysozyme. L'invention concerne aussi Les plantes résistantes aux agents pathogènes susceptibles d'être obtenues à L'aide du procédé défini ci-dessus. L'invention a également trait à l'utilisation d'une plante faisant partie des plantes définies au paragraphe précédent ou d'une plante contenant, dans un contexte susceptible de permettre son expression, un gène recombinant codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme, comme géniteur dans un programme de sélection pour créer de nouveLLes variétés végétales. L'invention concerne aussi une nouveLLe protéine à activité endochitinase et/ou lysozyme qui comprend la séquence (1) ainsi qu'un procédé pour L'obtenir qui comprend la mise en culture de cellules ou de cals végétaux transformés par le gène recombinant, la lyse de ceux-ci, l'isoLement et la purification de la protéine recombinante. Cette protéine peut présenter un intérêt comme principe actif d'un nouveau médicament destiné à soigner des affections, telles que par exemple les mycoses. L'invention sera mieux comprise à L'aide des exemples ci après une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de L'homme de l'art, est exposée en détail dans L'ouvrage de Maniatis et al. : Molecular cloning : a laboratory manual" publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York (2 édition). Le matériel biologique (souches, phages, plasmides ou plantes) utilisé dans les exempies ci-après est disponible dans le commerce et décrit respectivement dans les documents ci-après - phage Lambda CHARON 4A : MANIATIS et al., Op. Cit. ; - vecteur binaire pBIN19 : BEVAN et al., 1984, Nucal. Ac. Res., 12, 8711-8721 ; - plasmide pBI121 : JEFFERSON R.A. et al., 1987, E.N.B.O.J, 6, 3901 ; - souche E. coli MC1061 : MEISSNER P.S. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 4171 ; - souche E. coli HB101 : MANIATIS et al., Op. Cit. ; - souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 HOEKEMA et al., 1983, NATURE, 303, 179-180 ; - plante Nicotiana tabac var Wisconsin Havana 38 SCHNEIDER M., 1990, Plant Molec. Biol., 14, 935-947 ; - champignon Chalara elegans : RAWLINGS R.E., 1940, Ann Mo Bot. Gdn., 27, 561-598 ; - plante Nicotiana tabacum var Paraguay 49 obtenue auprès de L'institut du tabac, Bergerac, France Les abréviations suivantes sont utilisées dans les exemples ci-après &alpha;32-dCTP : déoxycytidine 5'-floc32-P]-triphosphate commercialisé par AMERSHAM sous La référence 10205 ; 0,2 x SSC : NaCl 30 mM, citrate trisomique 3 mM ; pH 7,0 (décrit par MANIATIS et al., op cit.) ; SDS : dodécyisuLfate de sodium ; FPLC : fast protein liquid chromatography ; PVDF : difLuorure de polyvinylidène. EXEMPLE 1 : Construction du vecteur binaire pBR1 contenant un gène chimérique tomate-tabac de L'endochitinase 1) Préparation de la séquence codante du gène chimérique a) Préparation de la partie 5' de la séquence codante du gène chimérique à partir de l'ADNg (ADN génomique) de L'endochitinase de tomate Un clone contenant l'ADNg de L'endochitinase de tomate a été obtenu de la façon suivante (Cf. Thèse de Doctorat ès Sciences spécialité : biologie moLécuLaire végétale, 1986, de M. DURANT TARDIF - Université de Paris Sud) Une banque d'ADN génomique de tomate a été construite dans le phage Lambda Charon 4A par clonage de fragments issus de la digestion partielle par l'endonucléase EcoRI de L'ADN génomique de tomate Lycopersicon esculentum.La banque génomique ayant été amplifiée, 6,6 x 105 clones ont été criblés après transfert de L'ADN phagique sur nitrocellulose par les techniques bien connues de L'homme de l'art (Maniatis et ail., Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984), à L'aide d'une sonde d'ADNc codant pour une endochitinase de haricot (BrogL;e et al-, 1986, PNAS, 83, 6820-6824). Le clone, appelé clone 10.2 s'hybridant avec cette sonde, contient un fragment d'ADN génomique de tomate de 3,5 kb contenant une partie du gène de L'endochitinase de tomate. Ce fragment a ensuite été inséré dans le plasmide pEMBL8 (Dente et al. (1983) Nucl. Ac. Res., 11, 1645-1655) entre les sites EcoRI et HindIII. Le plasmide obtenu appelé pCH3.5 a été cloné dans E. coli. Ce plasmide a ensuite été extrait et purifié par la méthode de la lyse alcaline (BIRNBOIM et DOLY dans Maniatis et al., op. cit.). L'utilisation de plusieurs endonucléases de restriction a permis d'établir La carte de restriction du fragment d'ADN génomique d'environ 3,5 kb inséré dans le plasmide pCH3.5, représentée sur La figure 1. Les différents fragments EcoRI-HincII, HincII-PvuII, PvuII-EcoRV, EcoRV-HindIII ont été préparés par digestion par Les endonucLéases correspondantes, purifiés par éLectrophorèse sur gel d'agarose et isoLés par électroétution (Maniatis et al., op. cit.). Chacun de ces fragments a été cloné dans L'ADN de la forme répLicative du phage simple brin M13mp19 (Pharmacia) entre les sites de restriction compatibles. Ces fragments ont ensuite été séquencés selon la méthode des didéoxyribonucléotides (Sanger et al., PNAS-USA, 14, 5463-5467, 1977). La séquence, telle que déduite des expériences ci-dessus, est représentée sur la figure 2, laquelle indique également les sites de restriction utilisés pour le clonage dans pEMBL8 et les sites de restriction importants pour la suite de La construction. La séquence d'acides aminés traduite est aussi représentée sur cette figure sur La Ligne inférieure par rapport à la séquence codante, les introns étant hachurés Cette séquence possède une partie promotrice de 1940 nucléotides suivie d'une partie codante, codant pour 302 acides aminés, dans laquelle sont insérés deux introns. Cette partie codante est incompLète dans sa région 3' (pas de codon stop). Par utilisation des sites de restriction StyI (position 2006) et HindIII (position 3007), un fragment de 1001 pb a été obtenu ; il a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose a bas point de fusion. La synthèse chimique d'un oligonucléotide de 71 pb, appelé fragment 1, dont la séquence est donnée ci-dessous, a permis de reconstituer La partie 5' éLiminée en amont du site StyI et d'insérer en amont du codon ATG d'initiation de la traduction un site de restriction BamHI Le fragment BamHI-HindIII de 1071 pb a été sous-cloné dans le vecteur pUC 19 (Pharmacia) dans Les sites correspondants à L'aide de la T4 DNA ligase Le plasmide obtenu est appeLé pCH1 Séquence du fragment 1 : b) Préparation de la partie 3' manquante de la séquence codante du gène chimérique :: Une comparaison de séquences à L'aide d'un logiciel approprié (logiciel UWGCG de L'université de Wisconsin : Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721 - Option GAP : alignement optimal des séquences d'après la méthode de Needleman et Wunsch, 1970 J mol. Biol., 48, 443-453) entre La partie codante, incomplète dans sa région 3' du clone pCH3.5 et la séquence publiée de l'ADNc de L'endochitinase de tabac comprenant 329 acides aminés (Hideaki Shinshi et al (1987), Proc. Ntl. Acad.Sci USA, 84, 89-93 et (1990) Plant Mol Biol., 14, 357-368) montre une homologie importante entre les séquences, en particulier dans la partie 3' de celles-ci (Cf. figure 3 qui représente un alignement effectué par ce logiciel, d'après l'homologie maximale de ces deux séquences, celle de l'ADNg de L'endochitinase de tomate dépourvue de ses introns étant située sur la ligne inférieure). On a assemblé des oLigonucléotides synthétisés sur un synthétiseur d'ADN Applied Biosystems 4600, de façon à obtenir un fragment, appelé fragment 2, dont La séquence reprend pour 71 nucLéotides la séquence de l'ADNg de L'endochitinase de tomate, située en aval du site DRAIN (2) et pour 92 nucléotides, une séquence proche de la partie 3' de la séquence publiée de l'ADNc d'endochitinase de tabac, à laquelle on a rajouté un second codon stop et la séquence du site de restriction SacI.Cette séquence est représentée ci-après : la séquence proche de la partie 3' de la séquence de l'ADNc d'endochitinase de tabac étant soulignée et Le site SacI étant indiqué GGCCTGGAA TGTGGTCGTG GCAATGACAA TAGGGTCCAG GATCGCATTG GGTTTTACAG GAGGTATTGC GGTATTCTTG GTGTTAGTCC TGGTGACAAT CTTGATTGCG GAAACCAGAG ATCTTTTGGA AACGGACTTT TAGTCGATAC TATGTAATGA On a soumis à une hydroLyse partieLLe par les enzymes de restriction BamHI et DraII le plasmide pCH1, puis isolé et purifié après éLectrophorèse sur gel d'agarose un fragment de 999 pb, appelé fragment 3, dont les extrémités sont constituées par le site BamHI en 5' et par Le site DraII (2) en 3' (Cf. figure 2), les fragments 2 et 3 ont été liqués à L'aide de la T4 DNA ligase dans le plasmide pUC 19, ouvert aux sites de restriction BamHI et SacI. Le plasmide obtenu est appelé pCHî.2. On a vérifié par séquençage que la partie BamHI - SacI de ce plasmide comportait La séquence attendue. Celle-ci, ainsi que la séquence d'acides aminés déduite, est représentée sur la figure 4. Cette séquence comprend la séquence codante du gène chimérique encadrée par les sites de restriction BamHI et SacI. Celle-ci code pour une protéine de 326 acides aminés comprenant un peptide signal supposé de 24 acides aminés (déterminé à L'aide d'un logiciel qui utilise la méthode décrite par G. von Heijne, 1986, Nucal Ac. Res., 14, 483-490). La masse moléculaire attendue d'après la séquence de cette protéine cLivée de son peptide signal supposé est d'environ 32 kDa. 2) Préparation du gène chimérique complet et clonage de celui-ci dans le vecteur binaire pBIN 19. La séquence codante obtenue précédemment a été insérée entre une séquence promotrice comprenant Le promoteur dit 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (35S CaMV) et une séquence terminatrice comprenant Le terminateur de la opaline synthase (NOS) d'Agrobacterium tumefaciens. a) Préparation de La séquence promotrice comprenant le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur A partir du plasmide pBI121 (Clontech) par coupure à L'aide des endonucléases HindIII et BamHI, puis éLectrophorèse, le fragment HindIII-BamHI d'environ 900 pb contenant le promoteur 35S est isolé. Ce fragment est recoupé par HindII. Le fragment d'environ 410 pb, portant le site BamHI, est traité par la T4 DNA Ligase en présence d'un Linker HindIII (séquence synthétique contenant un site HindîlI). Après coupure par l'endonucléase HindIII et éLectrophorèse, le fragment HindIII-BamHI résultant (d'environ 420 pb) est isolé et purifié. b) Préparation de la séquence terminatrice comprenant le terminateur de la opaline synthase (NOS) d'Agrobacterium tumefaciens. A partir du plasmide pBI121 (Clontech) par coupure à L'aide des enzymes de restriction SacI et EcoRI, puis électrophorèse sur gel d'agarose, un fragment de 250 pb environ, renfermant le terminateur de la nopaline synthase, a été isolé. On a ligué à l'aide de la T4 DNA Ligase la séquence promotrice, la séquence codante du gène chimérique de la chitinase et la séquence terminatrice dans Le vecteur binaire pBINî9 ouvert à L'aide des endonucléases HindIII et EcoRI. La partie de ce vecteur qui pourra être transféré aux végétaux comprend un gène de résis -tance à la kanamycine immédiatement en amont du gène chimérique complet (Cf. BEVAN (1984), Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721). Le gène de résistance à la kanamycine servira de marqueur de sélection au cours des étapes de transformation et d'analyse de La descendance des plantes transformées. Le vecteur obtenu est appelé pBR1. La séquence du gène chimérique complet, vérifiée par séquençage, est représentée sur la figure 5. Le plasmide est cloné dans la souche E. coLi MC1061 (Clontech). EXEMPLE 2 : Transfert dans Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes du plasmide pBR1 contenant Le gène chimérique tomate-tabac de L'endochitinase. a) Transfert dans Agrobacterium tumefaciens Ce transfert est réalisé comme décrit ci-après par conjugaison triparentale entre la souche E. coli MC1061 contenant le vecteur pBRî et la souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech) à L'aide de la souche E. coLi HB101 contenant le plasmide mobilisateur pRK20î3. La souche E. coli MC1061 contenant le plasmide pBRî et une souche E.coli HB101 (Clontech) contenant le plasmide mobilisateur pRK2013 sont cultivées à 37 C dans du milieu Luris (Gibco) en présence de 25 mg/l de kanamycine. La souche Agrobacterium tumefaciens LBA4404 est cultivée à 280C dans du milieu Luria en présence de 100 mg/l de rifampicine (elle est résistante à cet antibiotique) ; 200 ,ul de chacune des trois cultures sont mélangés, étaLés sur du milieu Luria gélosé (Gibco) et incubés toute la nuit à 280C. Les bactéries sont ensuite remises en suspension dans 5 ml de milieu Luria et des parties ali- quotes sont étaLées sur des boites de Pétri contenant un mi Lieu minimum gélosé (décrit dans "Plant molecular biology manual" GELVIN et al., Kluwer Academic Press, 1988) en présence de 100 mg/l de rifampicine, 25 mg/l de kanamycine. Dans ces conditions, seules poussent les colonies d'Agrobacterium tumefaciens ayant intégré le plasmide pBR1.Celles-ci contiennent le gène chimérique dans un contexte permettant sa réplication. La résistance aux deux antibiotiques des colonies sélectionnées est vérifiée en repiquant celles-ci sur le même milieu de sélection deux fois de suite. La présence du gène chimérique de L'endochitinase dans Agrobacterium tumefaciens est vérifiée par La méthode de Southern sur une préparation d'ADN total. (Lyse des ceLLuLes, purification de L'ADN par extraction à L'aide du mélange phénol/chloroforme, selon le protocole décrit par GELVIN dans L'ouvrage cité ci-dessus, coupure de L'ADN purifié à L'aide d'enzymes de restriction, électrophorèse sur gel d'agarose, transfert sur membrane et hybridation selon Les techniques bien connues de L'homme de l'art) b) Transfert dans Agrobacterium rhizogenes Ce transfert est réalisé de La meme façon que Le transfert dans Agrobacterium tumefaciens décrit en a), avec la souche Agrobacterium rhizogenes A4 décrite par GUERCHE et al. (1987) Mol. gen. genet. 206, 382. EXEMPLE 3 : Obtention de plantes de tabac transformées Le tabac Nicotiana tabacum cultivé in vitro a été infecté par Agrobacterium tumefaciens contenant le plasmide pBR1 selon la procédure de Horsch et al., bien connue de L'homme du métier (HORSH R.B et al 1985, Science 227, 1229-1231), dont les principales étapes sont exposées ci-après. Des disques de feuilles de plantes axéniques de tabac N. tabacum (variété Wisconsin Havana 38 sensible aux champignons pathogènes) sont incubés dans une cuLture d'A. tumefaciens hébergeant le plasmide pBRî. Les disques égouttés sur papier Whatman ont été transférés sur des mi lieux de culture en boites de Pétri afin de multiplier Les cellules transformées de façon à obtenir des cals, puis produire des pousses en présence de céfotaxime (500 ,ug/ml) et de kanamycine (100 ,ug/ml). Les pousses résistantes à la kanamycine ont été ensuite transférées sur un milieu permettant L'induction des racines en présence de céfotaxime et de kanamycine. Les plantules sont ensuite repiquées en terrines dans un substrat composé de tourbe et de terreau et mises à croître en serre. Toutes Les plantes transforémes (génération Ro) ayant survécu aux étapes de régénération et d'acclimatation en serre se sont révéLées morphologiquement normales et fertiLes. Elles ont été autofécondées et ont donné des graines (génération R1). EXEMPLE 4 : Ana lyse de L'ADN génomique des pLantes de tabac transformées (génération Ro) selon la technique de SOUTHERN Blot. L'ADN génomique de haut poids molécuLaire a été isolé à partir de feuilles matures de plantes transgéniques de la génération Ro selon La méthode d'extraction à L'aide de bromure de cétyLtriméthylammonium et de purification par précipitation, décrite dans L'ouvrage 'Plant MolecuLar Biology Manual" déjà cité. 10 g de cet ADN génomique ont été digérés toute la nuit à 37 C avec 20 unités des enzymes de restriction HindIII et EcoRI. Les fragments de restriction obtenus ont été séparés par électro phorése sur gel d'agarose (1 %). L'ADN a été transféré selon la méthode de SOUTHERN Blot sur un filtre de nitrocellulose et hybridé avec une sonde nucléotidique comprenant la séquence du gène chimérique recombinant marquée à l'a32-dCTP par marquage au hasard (random priming). Le lavage à haute stringence a été réalisé en présence de 0,2 x SSC, 0,1 % SDS à 680C avant l'autoradiographie. L'analyse de L'autoradiogramme permet de tirer les conclusions suivantes - certaines plantes ne possèdent pas de copies du gène transféré (absence de signaL). - La plupart des plantes testées contiennent au moins une copie sans réarrangement de la construction : promoteur 35S CaMV - gène chimérique de L'endochitinase - terminateur NOS. - Certains profils suggèrent qu'il existe des réarrangements internes dans la construction, mais ces évènements sont rares. EXEMPLE 5 : Détermination pour les plantes de tabac transformées (générations Ro, R1 et R2) de L'expression de L'endo chitinase recombinante. 1) Ana lyse de L'ARN messager selon la technique de Northern Blot. L'ARN total des plantes transformées de La génération Ro a été isolé selon Le protocole de VERWOERD et aL., NAR, 17, 2362, 1989. Des portions de feuilles sont prélevées et broyées, puis traitées par un mélange de phénol/Tris-HCl pH 8,0/LiCL 0,1M. Les ARN sont purifiés par traitement au chloroforme, puis au Licol 2M et précipités. 15 g d'ARN de chaque plante sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose (1,2 %) en conditions dénaturantes (Maniatis op. cit.) puis transférés sur une membrane de nitroceLLulose (Hybond C-extra Amersham). Les ARN messagers (ARNm) correspondant au gène introduit sont repérés à L'aide d'une sonde oligonuléotidique de séquence 5' AGGGCCGCCACCTGGACACTGA 3' préalablement marquée au moyen d'a32-dCTP et de la terminal transférase (Boehringer Mannheim) selon le protocole décrit dans Maniatis et aL. (op. cit.). Cette analyse a permis de mettre en évidence pour Les plantes transformées la présence d'un signal d'hybridation correspondant à un ARN messager d'environ 1500 nucléotides, absent des plantes non transformées. 2) Détermination de L'expression de L'endochitinase. La méthode utiLisée fait appel à la visualisation par des techniques immunologiques de L'endochitinase recombinante. a) Préparation des anticorps : une endochitinase de tomate a été purifiée jusqu'à homogénéité à partir de cals de tomate comme décrit ci-après : des cals de tomate ont été cultivés in vitro sur un milieu de Murashige et Skoog (Murashige T. et Skoog F., 1962, Physiol. PLant , 15, 473-497) contenant 0,1 mg/t d'ANA (acide naphtaLène acétique) et 1 mg/l de BAP (benzylamino purine). Des extraits cellulaires sont obtenus par broyage du matériel végétal dans une solution tampon Tris-HCt 50 mM pH 8,4 contenant 15 mM de p mercaptoéthanol et 5 % de polyvinylpolypyrrolidone. La protéine est purifiée à partir de cet extrait par précipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie en phase liquide seLon la technique FPLC de PHARMACIA sur la coLonne échangeuse de cations à base de polymère synthétique (Mono S de Pharmacia), et chromatographie d'exclusion (tamisage moléculaire) sur un agarose réticulé selon le protocole décrit ci-après Protocole de purification de L'endochitinase de tomate ETAPE 1 : L'extrait protéique est précipité par le sulfate d'ammonium (60 % de saturation). Les protéines ayant précipité sont récupérées par centrifugation (15 000 g pendant 30 min), solu biLisées dans une soLution tampon (acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2) et dialysées une nuit à 40C contre une solution tampon acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2. Extemporanément, La concentration de la solution tampon de L'extrait protéique est ramenée à 10 mM par passage sur des mini-colonnes prêtes à L'emploi (PD10. Pharmacia). ETAPE 2 : L'extrait protéique est ensuite purifié par chromatographie d'échange d'ions à base de poLymère synthétique (colonne Mono-S de Pharmacia) à L'aide d'une technique FPLC (Pharmacia). L'extrait est déposé sur la colonne Mono-S équiLibrée avec un tampon acétate d'ammonium 10 mM pH 5,2. Les protéines retenues sur la colonne sont éLuées par un gradient linéaire de 10 à 500 mM d'acétate d'ammonium. ETAPE 3 : Les fractions contenant L'endochitinase de tomate sont concentrées par ultrafiltration sur membrane Centricon 10 (Amicon). La purification de la protéine est poursuivie par chromatographie (tamisage moLéculaire) sur un agarose réticulé (colonne SUPEROSE 12 Pharmacia), L'éluvion est réalisée par une soLution tampon acétate d'ammonium 500 mM pH 5,2. A chaque étape, L'endochitinase de tomate est identifiée par son poids moLéculaire (Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS - révélation à L'argent) et son activité endochitinase, mesurée par une méthode radiochimique (Cf. exemple 9 ciaprès) utilisant la chitine marquée comme substrat (MOLANO et al (1977) Anal. Biochem 83, 648-656). On a ensuite injecté à des Lapins 25 ug d'endochitinase de tomate dans 500 l d'adjuvant complet de Freund. Trois injections de rappel de. 25 pg dans L'adjuvant incomplet de Freund (500 pl) ont été réalisées à 3 semaines d'intervaLLe. L'immunsérum a été pré levé après La dernière injection. b) Préparation des extraits bruts de protéines de plantes de tabac transformées (génération Ro) Les extraits bruts de protéines ont été préparés à partir de différents tissus de la plante (racine, tige, feuille, etc...). Les fragments de tissus ont été congelés dans l'azote liquide, réduits en poudre et stockés à -20 C. La poudre a été extraite à 40C en présence d'un tampon acétate d'ammonium 0,1 M pH 5,2 et soumise à une centrifugation à 10 000 g. La concentration des protéines totales a été déterminée sur les surnageants, appelés ci-après les extraits bruts de protéines en suivant La technique de Bradford (Bradford, M.M., (1976) Anal. Biochem., 72, 248-254). c) Mise en évidence par immuno-empreinte (Western Blot) On soumet les extraits bruts de protéines de différentes plantes transformées et des plantes non transformées (témoins) à un Western Blot, technique bien connue de L'homme de l'art et décrite notamment par H. TOWBIN et al. : Proc. Ntl. Acad. Sci.USA, 76, 1972, 4350-4354, qui comprend les étapes suivantes - dénaturation par ébuLLition pendant 10 min dans un tampon dénommé tampon de charge constitué de Tris HCI 0,125 M pH 6,8, SDS 4 %, bleu de bromophénol 0,002 %, glycérol 20 %, p- mercaptoéthanol 10 % (selon Le protocole décrit par LAEMMLI (U.K LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685) - séparation électrophorétique des différentes protéines contenues dans le solubilisat seLon le protocole décrit par LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685) ; - eLectrotransfert desdites protéines contenues dans le gel sur une membrane en PVDF (selon la technique de H. TOWBIN et al. Proc. Natal. Acad. Sci.USA 76 (1979) 4350-4354). L'immunodétection est réalisée selon un protocole qui comprend les étapes suivantes : - saturation de la membrane PVDF sur laquelle les protéines ont été transférées par incubation au minimum 2 heures à 37 C dans une solution de gélatine à 3% - 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % du détergent Tween 20 - incubation (1 heure à 370C) en présence de l'immunsérum préparé précédemment (contenant les anticorps polyclonaux reconnaissant la protéine recombinante) dilué au 1/10 000 dans du tampon phosphate salin - 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % du détergent Tween 20. Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé à L'aide d'un système streptavidine-biotine conjugué à la phosphatase alcaline avec te kit RPN 23 d'AMERSHAM (Blotting-détection kit) utilisé selon les indications du fabricant. L'empreinte obtenue montre la présence d'une protéine d'environ 26 kDa pour les plantes transformées, absente des plantes témoins. (La protéine déduite de la séquence du gène chimérique, clivée de son peptide signal supposé, a une masse moléculaire d'environ 32 kDa). L'analyse selon la technique de Northern Blot et selon celle de Western Blot a été effectuée sur 30 plantes transformées (répondant positivement au Southern Blot). 28 plantes ont montré une expression de L'ARN messager du gène chimérique en Northern Blot et une expression de l'endochitinase recombinante en Western Blot. La non-expression pour 2 plantes résulte probablement de l'insertion du gène chimérique dans un contexte non transcrit. L'analyse, selon la technique de Northern Blot et selon celle de Western Blot, a été également effectuée sur les plantes de la génération R1 issues de plantes transformées de la génération Ro exprimant la protéine recombinante et sur des plantes de La génération R2 issues de plantes de la génération R1 exprimant la protéine recombinante. En accord avec la ségrégation Mendelienne (Cf. exemple 6 ci-après), la plupart, mais non la totalité, des plantes de la génération R1 et de la génération R2 expriment la protéine recombinante. Ces résuLtats montrent donc la stabilité de l'insertion du gène dans Les plantes de tabac et de son expression au cours des générations successives. EXEMPLE 6 : Analyse génétique des plantes de tabac transformées (génération R1). Les tabacs régénérés (génération Ro) en présence de kanamycine ont été autopollinisés. Les graines matures (génération R1) sont récoltées et stockées en tubes Eppendorf à 4 C. Les graines sont stérilisées en surface à L'aide d'une solution aqueuse d'hypochlorite de calcium à 2 %. Les graines sont ensuite rincées à l'eau stérile, séchées pendant 24 h dans une hotte à flux laminaire sur du papier filtre et mises à germer sur du milieu Murashige et Skoog gélosé, complémenté par 100 ,ug/ml de kanamycine (le gène de résistance à la kanamycine lié au gène chimérique complet et transféré au tabac en même temps que celui-ci sert ici de marqueur de sélection). L'analyse génétique a été effectuée sur les descendances de 16 plantes transformées (de la génération Ro) choisies parmi les 28 plantes exprimant l'endochitinase recombinante (Cf. exemple 4), abrégées Tn (n étant le n attribué à la plante) et d'une plante témoin Nicotiana tabacum var Wisconsin Havana 38 non transformée, abrégée WH 38. Le nombre d'individus observés (effectif total) varie selon les descendances de 27 à 139. Le taux de germination est élevé (de l'ordre de 95 %) et comparable pour toutes Les plantes étudiées. Deux types de phénotypes sont observés au moment de la germination des graines : - des plantules résistantes à la kanamycine qui poussent bien en présence de 100 ,ug/ml de kanamycine et possèdent un système racinaire développé et des feuilles vertes, - des plantules sensibles à la kanamycine, correspondant soit à des plantes qui ne développent pas de racines et qui produisent des feuilles blanches, soit à des plantes pour lesquelles le système racinaire est réduit et qui produisent des feuilles avec des zones blanches. On définit la ségrégation génétique comme le rapport du nombre de plantes résistantes sur le nombre de plantes sensibles à la kanamycine. Le tableau 1 ci-après rassemble les résultats obtenus : Tableau 1 SEGREGATIONS OBSERVEES CHEZ LES DESCENDANCES DE PLANTES DE TABAC TRANSFORMEES ET INTERPRETATION PLANTE Kmr Kms Effectifs Segrégation théoretique Kmr Kms Conclusion : effectifs totaux testée effectifs théoretiques khi-2 ségrégation observés effective Plantes transformées T1 62 27 89 3 : 1 66,75 22,25 1,35 3 : 1 T2 66 14 80 3 : 1 60 20 2,40 3 : 1 T4 66 25 91 3 : 1 68,25 22,75 0,30 3 : 1 T6 86 5 91 15 : 1 85,31 5,69 0,09 15 : 1 T11 48 11 59 3 : 1 44,25 14,75 1,27 3 : 1 T12 61 31 92 3 : 1 69 23 3,71 3 : 1 T14 85 3 88 15 : 1 82,5 5,5 1,21 15 : 1 T16 73 21 94 3 : 1 70,5 23,5 0,35 3 : 1 T19 74 19 93 3 : 1 69,75 23,25 1,04 3 : 1 T27 35 13 48 3 : 1 36 12 0,11 3 : 1 T28 51 19 70 3 : 1 52,5 17,5 0,17 3 : 1 T29 59 26 85 3 : 1 63,75 21,25 1,42 3 : 1 T30 17 10 27 3 : 1 20,25 6,75 1,59 3 : 1 T31 139 0 139 - - - - > 2loci T36 65 25 90 3 : 1 67,50 22,50 0,37 3 : 1 T37 71 25 96 3 : 1 72 24 0,06 3 : 1 Plante témoin WH38 0 89 89 - - - - WH38: plante Nicotiana tabacum var. Wisconsin Havana 38 non transformèe In : descendence de la plante transformée exprimant l'endochitinase recombinante Kmr : nombre de plantes résistantes à la kanamycine. khi-2 au seuil de 5%=3.48 Kms : nombre de plantes sensibles à la kanamycine Lorsque le khi-2 observé est inférieur à 3.84. Les ségrégations observées et supposées coïncident. L'analyse statistique des résultats rassemblés dans le tableau 1 ci-dessus montre que le caractère : résistance à la kanamycine, génétiquement lié au caractère conféré par le gène chimérique de l'endochitinase se comporte comme un caractère Mendélien dominant simple (ségrégation Mendélienne 3/1 ou 15/1) présent en un seul locus (une copie ou plusieurs copies du gène proches : 311), en deux loci (deux ensembles distants génétiquement comprenant chacun une copie ou plusieurs copies du gène proches génétiquement : 1511) ou en plus de deux loci (cas de la plante T31). Le nombre de loci dans chaque plante a été confirmé par l'analyse des descendances de la génération R2 EXEMPLE 7 : Mesure de la résistance aux champignons pathogènes des plantes transformées (génération R1) Les plantules de la génération R1 résistantes à la kanamycine issues des 16 plantes transformées choisies, d'une plante Nicotiana tabac var. Wisconsin Havana 38 sensible à Chalara elegans (également appelé Thielaviopsis basicola), abrégée WH38, et d'une plante Nicotiana tabacum var. Paraguay 49, abrégée P49, génétiquement tolérante à ce champignon, ont été transférées en serre pour évaluation de leur résistance à ce champignon. Ce dernier a été choisi car il est représentatif des champignons pathogènes du tabac possédant de la chitine dans leur paroi.L'étude a porté sur des effectifs de plantules variant de 15 à 36 selon les plantes. Le protocole choisi dans cette étude est décrit ci-après Les plantules sont cultivées en godets (3 x 3 cm). A l'apparition de la 5éme feuille, les plantes sont inoculées en déposant au niveau du collet une suspension d'endoconidies 5 x spores/ml). Les endoconidies sont prélevées sur des cultures mycéliennes de ce champignon entretenues sur le milieu "potato dextrose agar" (Difco) à 220C et à l'obscurité. On évalue la résistance à Chalara elegans en attribuant une note 45 jours après l'inoculation.Les plantes sont notées selon les symptômes d'infection et selon leur niveau de développement végétatif par rapport à un témoin non inoculé (ce témoin est une plante WH38 non inoculée pour les plantes issues des 16 plantes transformées choisies et de la plante WH38 et une plante P49 non inoculée pour les plantes issues de La plante P49). Les classes sont définies selon les critères suivants : Note O : plante morte ; note 1 : bourgeon terminal encore vert, système racinaire détruit ; note 2 : développement des plantes ne dépassant pas 25 % de celui du témoin, système racinaire entièrement nécrosé ; note 3 : développement de plantes atteignant 50 % du développement du témoin, système racinaire présentant des parties saines ; note 4 : développement des plantes identiques au témoin. L'indice de résistance de la descendance d'une plante transformée représente La moyenne des notes effectuées sur les plantules issues de cette plante. Le tableau 2 ci-après rassemble les résultats obtenus : Tableau 2 MESURE DE LA RESISTANCE AUX CHAMPIGNONS PATHOGENES DE DESCENDANCES DE PLANTES DE TABAC TRANSFORMEES Indice de résistance de Plante Effectif testé La descendance Plantes transformées T1 32 2,030 T2 31 0,065 T4 36 1,200 T6 34 0,743 T11 35 2,514 T12 33 1,632 T14 26 1,769 T16 36 1,750 T19 36 1,416 T27 20 0,050 T28 27 1,444 T29 36 1,750 T30 15 2,666 T31 36 2,888 T36 36 1,686 Plantes WH38 34 0,044 témoins P49 34 2,823 WH38: plante Nicotiana tabacum var. Wisconsin Havana 38 non trans formée P39 : plante Nicotiana tabacum var Paraguay 49 Tn : descendance de la plante transformée exprimant L'endochiti nase recombinante. On constate à la lecture du tableau ci-dessus que toutes Les descendances des plantes transformées Tn présentent un indice de résistance supérieur à celui de la descendance de la plante témoin WH38 (plante non transformée) et parfois proche de, voire supérieur à, celui de la descendance de la plante témoin P49 génétiquement résistante. EXEMPLE 8 : Obtention de plantes de colza transformées La transformation est réalisée selon le protocole de P GUERCHE et al. (P. GUERCHE et al. 1987, Mol. Gen. Genet., 206, 382). Les différents milieux de culture sont ceux décrits par Pelletier et al. (Pelletier et al., 1983, Mol. gen. genet., 191, 244). Leur composition sera explicitée par la suite (tableau 3). a) Obtention de racines transformées Des segments de tige sont prélevés sur l'extrémité apicale de plantes de colza (Brassica napus : variétés de printemps Brutor et Westar et variété d'hiver) de 1 m de haut environ. Ces segments sont stérilisés en surface, rincés dans de l'eau stérile, découpés en segments de 1,5 cm de long environ et placés dans un tube contenant le milieu A. L'inoculation de L'extrémité de ce segment est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d'Agrobacterium rhizogenes contenant le plasmide pBRî. Des racines transformées apparaissent sur le segment de tige au bout de 1 à 2 semaines, elles sont prélevées et placées sur le milieu B gélosé (15 g/l) et complémentées par 500 pg de cefo- taxime/ml. b) Obtention des cals transformés Des fragments de racines sont incubés pendant 15 jours sur le milieu D contenant 3 mg/l d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, puis transférés sur le meme milieu gélosé (15 g/l) en vue de la multiplication des cellules transformées de façon à obtenir des cals et à fournir des extraits bruts destinés à La purification de la protéine recombinante (Cf. exemple 10 ci-après). c) Régénération de plantes transformées Des fragments de racines sont incubés pendant 15 jours sur le milieu D contenant 3 mg/t d'acide 2,4-dichlorophenoxyace- tique, puis placés sur le milieu RCC d'induction de bourgeons. Des plantes racinées sont ensuite obtenues par passage des bourgeons sur les milieux F et G Tableau 5 Composition des diffèrents milieux utilisés pour l'obtention de plantes de colza transformées Milieu Composition A B D RCC F G (mg/L) NH4NO3 1650 200 1650 1650 825 KNO3 1900 2500 1250 1900 1900 950 (NH4)2SO4 134 67 NaH2PO4 150 75 KH2PO4 170 35 170 170 85 CaCl2 2H2O 440 750 525 440 440 220 MgSO4 7H2O 370 250 250 370 370 185 H3BO3 12.4 3 12.4 12.4 6.2 6.2 MnSO4 4H2O 33.6 10 33.6 33.6 22.3 22.3 ZnSO4 7H2O 21 2 21 21 8.6 8.6 KI 1.66 0.75 1.66 1.66 0.83 0.83 Na2MoO4 2H2O 0.5 0.25 0.5 0.5 0.25 0.25 CuSO4 5H2O 0.05 0.025 0.05 0.05 0.025 0.025 CoCl2 6H2O 0.05 0.025 0.05 0.05 0.025 0.025 FeSO4 7H2O 22.24 27.8 27.8 27.8 27.8 22.24 Tableau 3 (suite 1) Milieu Composition A B D RCC F G (mg/L) Na2EDTA 29.84 37.3 37.3 37.3 37.3 29.84 Inositol 100 100 100 100 100 100 Acide nicotinique 0.5 1 2 0.5 1 0.5 Pyridoxine HCL 0.5 1 2 0.5 1 0.5 Thiamine 10 10 10 Glycine 2 2 2 Glucose 10000 20000 10000 10000 10000 Saccharose 10000 20000 10000 D-mannitol 70000 1 0.1 0.01 N.A.A. 1 0.5 0.5 B.A. 1 2,4D .25 1 Adénine sulfate 30 I.P.A. 0.5 GA 0.02 Tween 80 10 Tableau 3 (suite 2) Milieu Compositions A B D RCC F G (mg/L) 8000 8000 8000 8000 Agar 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 pH 10 Gentamicine (sulfate) NAA = acide naphthalène acétique BA = acide benzyl-6-aminopurine 2,4D = acide dichloro-2,4-phénoxyacétique IPA = N6-(#Ȋso-pentényl)adénine GA3 = acide gibbérellique EDTA = acide éthylènediaminetétraacétique. EXEMPLE 9 : Analyse de C'ADN génomique des plantes de colza trans formées (génération Ro) et détermination pour ces dernières et de leurs descendances de L'expression de I'endochitinase recombinante. 1) Analyse de l'ADN génomique selon la technique de Southern Blot L'analyse de I'ADN génomique selon la technique de Southern Blot, effectuée dans les conditions décrites dans l'exemple 4, a permis de constater que la plupart des plantes testées contiennent au moins une copie sans réarrangement de La construction promoteur 35S CaMV - gène chimérique de l'endochitinase - terminateur NOS. 2) Analyse de I'ARN messager selon la technique de Northern Blot L'analyse de I'ARN messager selon la technique de Northern Blot, effectuée dans les conditions décrites dans L'exemple 5, n'a été mise en oeuvre que pour quelques plantes, l'ana lyse selon la technique de Western Blot étant plus rapide pour fournir l'information attendue. Elle a permis de mettre en évidence pour les plantes transformées analysées la présence d'un ARN messager d'environ 1 500 nucléotides, absent des plantes non transformees. 3) Détermination de L'expression de I'endochitinase recombinante par Western Blot L'analyse en Western Blot, effectuée dans les conditions et à l'aide des anticorps décrits dans l'exemple 5 sur les extraits bruts de protéines de plantes de colza transformées (préparés comme décrit dans l'exemple 5 pour les extraits bruts de protéines de plantes de tabac transformées) a permis de visualiser la protéine recombinante. L'empreinte obtenue montre la présence d'une protéine d'environ 26 kDa pour les plantes transformées, absente des plantes témoins (la protéine déduite de la séquence du gène chimérique, clivée de son peptide signal a une masse moléculaire d'environ 32 kDa) et également la présence d'une protéine d'environ 38 kDa reconnue par les anticorps, présente également dans les plantes non transformées. Cette dernière est une endochitinase endogène (Atta K.K. et al., 1988, Abstracts du Second International Congress of Plant Molecular Biology, Jerusalem) qui présente des caractéristiques sérologiques communes avec celles de l'endochitinase recombinante. L'analyse selon la technique de Western Blot a été effectuée sur 42 plantes transformées (répondant positivement au Southern Blot). 38 plantes ont montré une expression de L'endochi- tinase recombinante. La non-expression observée pour 4 plantes résulte probablement de l'insertion du gène chimérique dans un contexte non transcrit. L'analyse selon la technique de Western Blot a également été effectuée sur des plantes de la génération R1 issues de plantes transformées de la génération Ro exprimant l'endochitinase recombinante. En accord avec les lois de la génétique pour l'hérédité des diploïdes, la plupart mais non la totalité de celles-ci expriment la protéine recombinante. Ces résultats montrent la stabilité de l'insertion du gène dans les plantes de colza et de son expression au cours des générations. EXEMPLE 10 : Purification de l'endochitinase recombinante des cals de colza transformés (génération Ro), mesure de son activité enzymatique et détermination de sa séquence ami notermina le. 1) Purification de L'endochitinase recombinante : La protéine recombinante a été purifiée à partir des extraits bruts de protéines de cals de colza transformés, par précipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie en phase liquide FPLC sur une colonne échangeuse de cations à base de polymère synthétique et chromatographie d'exclusion (tamisage moléculaire) sur un agarose réticulé, selon le protocole décrit ciaprès : Protocole de purification de I'endochitinase recombinante ETAPE 1 :L'extrait protéique est précipité par le sulfate d'ammonium (60 x de saturation) Les protéines ayant précipité sont récupérées par centrifugation (15 000 g pendant 30 min), solubilisées dans une solution tampon (acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2) et dialysées une nuit à 40C contre une solution tampon acétate d'ammonium 100 mM pH 5,2. Extemporanément, la concentration de la solution tampon de L'extrait protéique est ramenée à 10 mM par passage sur des mini-colonnes prêtes à L'emploi (PDîO. Pharmacia). ETAPE 2 : L'extrait protéique est ensuite purifié par chromatographie d'échange d'ions à base de polymère synthétique (colonne Mono-S de Pharmacia) à L'aide d'une technique FPLC (Pharmacia). L'extrait est déposé sur la colonne Mono-S équilibrée avec un tampon acétate d'ammonium 10 mM pH 5,2. Les protéines retenues sur la colonne sont éluées par un gradient linéaire de 10 à 500 mM d'acétate d'ammonium. ETAPE 3 : Les fractions contenant I'endochitinase recombinante sont concentrées par ultrafiltration sur membrane Centricon 10 (Amicon). La purification de la protéine est poursuivie par chromatographie d'exclusion (tamisage moléculaire) sur un agarose réticulé (colonne SUPEROSE 12 PHARMACIA), L'éluvion étant réalisée par une solution tampon acétate d'ammonium 500 mM pH 5,2. A chaque étape, I'endochitinase de tomate est identifiée par son poids moléculaire (Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS-révélation à l'argent), par son immuno-empreinte (Cf. exemple 5 c)) et son activité endochitinase, mesurée par une méthode radiochimique décrite ci-après utilisant la chitine marquée comme substrat (MOLANO et al. (1977) Anal. Biochem 83, 648-656). 2) Mesure de l'activité enzymatique de I'endochitinase recombi nante. a) Méthode L'activité endochitinase est mesurée par une méthode radiochimique utilisant la chitine marquée au tritium comme substrat selon un protocole décrit par MOLANO et al., 1977, Anal. Biochem 83, 648-656, résumé ci-après. A 50 PI de chitine tritiée (50 kBq/ml), lavés préalablement par 4 centrifugations successives et renouvellement du solvant, on ajoute 50 PI de fraction contenant I'endochitinase recombinante puis 250 ul de solution tampon acétate de sodium 0,2 M pH 4,5. Après 45 min d'incubation à 200C, la réaction est arrêtée par addition de 100 PI d'acide trichloroacétique 20 %. Après centrifugation (10 000 g pendant 10 min), la quantité de radioactivité solubilisée dans 100 ,ut de surnageant est mesurée en scintit- lation Liquide. A chaque étape de purification selon la méthode décrite ci-dessus, la protéine recombinante (identifiée grâce à son poids moléculaire et sa réaction positive avec les anticorps polyclonaux contre I'endochitinase de tomate) montre une activité endochitinase. b) Résultats Les activités spécifiques mesurées à l'issue de l'étape 1, de L'étape 2 et de L'étape 3 sont respectivement de 135, 7 416 et 32 193 cpm/pg de protéine. 3) Détermination de la séquence aminoterminale de I'endochitinase recombinante mature. Après purification de L'endochitinase recombinante selon le protocole décrit ci-dessus, le séquençage de l'extrémité aminoterminale a été réalisé. Les échantillons à traiter sont portés à La surface d'un filtre PVDF (polyvinylidenedifluoride) par électrotransfert selon La méthode décrite par H. TOWBIN et al. Proc. Ntl. Acad. Sci. USA (1979), 4350-4354, après électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Le filtre est introduit dans un séquenceur de protéines (modèLe 470 A commercialisé par la Société Applied Biosystems (E.U.A.)) équipé d'un chromatographe (modèle 430 d'Applied Biosystems) qui analyse en continu les dérivés phényl thiohydantoiques formés, après chaque cycle de dégradation. La séquence aminoterminale déterminée est représentée ciaprès, le symbole X représentant un acide aminé non déterminé : Gly-Gly-X-Leu-Gly-Ser-Val-Ile-Ser-Asn-X-Met-Phe-X-Gln-Met-Leu-Lys-- X-Arg On constate que le début de la séquence de la protéine mature (figure 6) correspond au 76ème acide aminé à partir de la méthionine aminoterminale déduite de la séquence du gène chimérique (Cf. figure 4). La protéine traduite à partir de L'ART messager codé par le gène chimérique subit un clivage de son peptide signal, supposé de 24 acides aminés (G. von Heijne, 1986, Nucl. Ac. Res., 14, 483490), puis une maturation provoquant le clivage d'un peptide aminoterminal de 51 acides aminés. La séquence du gène chimérique contient donc les informations nécessaires à la synthèse d'une protéine de type preproenzyme, qui est maturée en endochitinase active. REVENDICATIONS 1. Gène recombinant, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme qui comprend la séquence (1) ci-après : Gly Gly Asp Leu Gly Ser Val Ile Ser Asn Ser Met Phe Asp Gln Met Leu Lys His Arg Asn Glu Asn Ser Cys Gln Gly Lys Asn Asn Phe tyr Ser Tyr Asn Ala Phe Ile Thr Ala Ala Arg Ser Phe Pro Gly Phe Gly Thr Ser Gly Asp Ile Asn Ala Arg Lys Arg Glu Ile Ala Ala Phe Phe Ala Gln Thr Ser His Glu Thr Thr Gly Gly Leu Pro His Leu Met Asp His Ser His Gly Val Thr Val Ser Leu Glu Asn Glu Val Thr Pro Val Thr Thr Val His Gln Val Val Asn Gly Leu Val His Leu Glu Gly Asn Ile Ser Asp Glu Ala Gtn Ser Lys Phe Asn Tyr Asn Tyr Gly Pro Cys Gly Arg Ala Ile Gly Val Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asp Leu Val Ala Thr Asp Pro Val Ile Ser Phe Lys Thr Ala Ile Trp Phe Trp Met Thr Pro Gln Ser Pro Lys Pro Ser Cys His Asp Val Ile Ile Gly Arg Trp Asn Pro Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ala Asn Arg Leu Pro Gly Phe Gly Val Ile Thr Asn Ile Ile Asn Gly Gly Leu Glu Cys Gly Arg Gly Asn Asp Asn Arg Val Gln Asp Arg Ile Gly Phe Tyr Arg Arg Tyr Cys Gly Ile Leu Gly Val Ser Pro Gly Asp Asn Leu Asp Cys Gly Asn Gln Arg Ser Phe Gly Asn Gly Leu Leu Val Asp Thr Met. 2. Gène recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine qui comprend, immédiatement en amont de la séquence (1), la séquence (2) ci-après Gln Asn Cys Gly Ser Gtn Gly Gly Gly Lys Val Cys Ala Ser Gly Gln Cys Cys Ser Lys Phe Gly Trp Cys Gly Asn Thr Asn Asp His Cys Gly Ser Gly Asn Cys Gln Ser Gln Cys Pro GLy Gly Gly Pro Gly Pro Gly Pro Val Thr ou une séquence présentant un degré d'homologie substantiel avec la séquence (2). 3. Gène recombinant selon L'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine dont la séquence comprend, en amont de la séquence (1), une séquence codant pour un peptide-signat. 4. Gène recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine dont la séquence comprend, immédiatement en amont de la séquence (2) ou de la séquence présentant un degré d'homologie substantiel avec la séquence (2), la séquence (3) ci-après : Met Arg Arg Thr Ser Lys Leu Thr Thr Phe Ser Leu Leu Phe Ser Leu Val Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ala ou une séquence présentant un degré d'homologie substantiel avec la séquence (3). 5. Gène chimérique tomate-tabac, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme qui comprend un degré d'homologie substantiel avec la séquence (1). 6. Gène chimérique selon la revendication 5, caractérisé en ce que la partie codante comprend au moins un intron. 7. Gène recombinant selon L'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que sa partie codante est la séquence ciaprès : ATGAGGCGAA CTTCTAAATT GACTACTTTT TCTTTGCTGT TTTCTCTGGT TTTGCTGAGT GCTGCCTTGG CACAGAATTG TGGTTCACAG GGCGGAGGCA AAGTTTGTGC GTCGGGACAA TGTTGCAGCA AATTCGGGTG GTGCGGTAAC ACTAATGACC ATTGTGGTTC TGGCAATTGT CAAAGTCAGT GTCCAGGTGG CGGCCCTGGT CCTGGTCCTG TTACTGGTGG GGACCTCGGA AGCGTCATCT CAAATTCTAT GTTTGATCAA ATGCTTAAGC ATCGTAACGA AAÂTTCTTGT CAAGGAAAGA ATAATTTCTA CAGTTACAAT GCCTTTATTA CTGCTGCTAG GTCTTTTCCT GGCTTTGGTA CAAGTGGTGA TATCAATGCC CGTAAAAGGG AAATTGCTGC TTTCTTTGCC CAAACCTCCC ATGAAACTAC TGGTATGTGT ATAACCATTC ACATCGAACC ATTAAAATAT AATTTCATTT TATTTTATTT AGTAATTGAT TATATATGTA GGAGGATGGC CTTCCGCACC TGATGGACCA TTCGCATGGG GTTACTGTTT CCTTAGAGAA CGAGGTAACC CCGGTGACTA CTGTTCACCA ACTAGTCAAT GGCCTTGTGC ACCTGGAAGG AAATATTTCG GACGAGGCCC AATCCAAATT TCACAGTAAG CTACATAAAT CTATATATGG TAAAATTTGA TGAACTTGTA GTGTCTAATT ACGTGTATTT TGACATTTCA AAACAGCAAC TACAACTATG GGCCATGTGG AAGAGCCATC GGAGTGGACC TTTTAAACAA TCCTGATTTA GTAGCCACAG ACCCAGTCAT CTCATTCAAG ACTGCTATCT GGTTCTGGAT GACCCCTCAA TCACCAAAGC CTTCTTGCCA CGATGTCATC ATTGGAAGAT GGAACCCATC TGCCGGTGAC CGATCAGCCA ATCvTCTTCC TGGATTTGGT GTCATCACAA ACATCATCAA TGGGGGCCTG GAATGTGGTC GTGGCAATGA CAATAGGGTC CAGGTCGCA TTGGGTTTTA CAGGAGGTAT TGCGGTATTC TTGGTGTTAG TCCTGGTGAC AATCTTGATT GCGCAAACCA GAGATCTTTT GGAAACGGAC TTTTAGTCGA TACTATGTAA TGA 8. Gène recombinant selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence promotrice comportant le promoteur 35S du virus de la mosaique de chou-fleur. 9. Gène recombinant selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence terminatrice comportant le terminateur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens. 10. Bactérie caractérisée en ce qu'elle contient, dans un contexte permettant sa réplication, un gène recombinant selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Bactérie susceptible d'infecter une plante avec transfert de matériel génétique, caractérisée en ce qu'elle contient, dans un contexte permettant sa réplication, un gène recombinant selon l'une des revendications 1 à 9. 12. Bactérie selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Agrobacterium rhizogenes et Agrobacterium tumefaciens. 13. Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un gène recombinant codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme, inséré dans un contexte susceptible de permettre son expression. 14. Cellule végétale selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus. 15. Cellule végétale selon L'une des revendications 13 et 14, caractérisée en ce que le gène codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme est un gène recombinant selon l'une des revendications 1 à 9. 16. Plante ou partie de plante, caractérisée en ce qu'elle contient, dans un contexte susceptible de permettre son expression, un gène recombinant codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme. 17. Plante ou partie de plante selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus. 18. Plante ou partie de plante selon L'une des revendications 16 et 17, caractérisée en ce que le gène recombinant codant pour une protéine à activité chitinase et/ou activité lysozyme est un gène recombinant selon L'une des revendications 1 à 9. 19. Semence végétale, caractérisée en ce qu'elle contient, dans un contexte susceptible de permettre son expression, un gène recombinant codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme. 20 Semence végétale selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus. 21. Semence végétale selon l'une des revendications 19 et 20, caractérisée en ce que le gène recombinant codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme est un gène recombinant selon l'une des revendications 1 à 9. 22. Procédé pour obtenir des plantes résistantes aux agents pathogènes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de transformation de cellules végétales par un gène codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme, suivie d'une étape de multiplication des cellules transformées et d'une étape de régénération des plantes. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'étape de transformation des cellules végétales est effectuée in vitro à l'ai de d'une agrobactérie ayant intégré le gène codant pour une protéine présentant une activité endochitinase et/ou une activité lysozyme. 24. Procédé selon l'une des revendications 22 et 23, caractérisé en ce qu'il est appliqué à l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus. 25. Procédé selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que le gène codant pour une protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme est un gène recombinant selon l'une des revendications 1 à 9 26. Plante résistante aux agents pathogènes, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à l'aide d'un procédé selon l'une des revendications 22 à 25. 27. Utilisation d'une plante selon l'une des revendications 16 et 26 dans un programme de sélection pour créer de nouvelles variétés végétales. 28. Protéine à activité endochitinase et/ou activité lysozyme, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence (1). 29. Procédé pour obtenir La protéine selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules ou de cals végétaux contenant, dans un contexte susceptible de permettre son expression, un gène recombinant selon l'une des revendications I à 9, la lyse de ceux-ci, l'isolement et la purification de cette protéine. 30. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que les cellules ou les cals végétaux sont choisis dans l'une des espèces Nicotiana tabacum, Helianthus annuus et Brassica napus.