Brevet FR2665364A2 — publié le 19920207

FR 2665364 A2 19920207 FR 9009828 A 19900801 I La présente invention concerne un procédé de préparation d'une solution concentrée de facteur VIII de pureté intermédiaire à partir d'un cryoprécipité et vise à constituer un certificat d'addition à la demande de brevet français déposée le 15 Mars 1990 sous le N O 90 03328. Le procédé décrit dans la demande de brevet principal comprend les étapes suivantes: a) on solubilise un cryoprécipité b) on soumet la solution obtenue à une première précipitation, en ajoutant un polysaccharide sulfaté (SPS) en quantité comprise entre 5 et 20 U/ml de solution, en ajustant le p H à une valeur comprise entre 6 7 et 7.3, en abaissant la température à une valeur comprise entre 10 et 16 WC c) on sépare le culot du surnageant; d) on soumet le surnageant à une seconde précipitation en ajoutant un gel d'hydroxyde d'aluminium en quantité comprise entre 100 et 200 g/kg de cryoprécipité de départ, en ajustant le p H à une valeur comprise entre 5 8 et 6 3; e) on sépare le culot du surnageant f) on récupère le surnageant qui est une solution concentrée de Facteur VIII. On a maintenant constaté qu'il est possible d'obtenir une solution concentrée de facteur VIII, en l'absence de précipitation de facteur VIII, dans des conditions opératoires de température et de quantité de SPS lors de l'étape b) qui varient dans un domaine sensiblement plus étendu. C'est pourquoi, le présent certificat d'addition a pour objet un procédé de préparation d'un produit tel qu'obtenu par le procédé selon la revendication 1 du brevet principal, qui comprend les étapes suivantes a) on solubilise un cryoprécipité, b) on soumet la solution obtenue à une première précipitation en ajustant le p H à une valeur comprise entre 6,7 et 7,3, en ajoutant un polysaccharide sulfaté (SPS) dans des conditions de température et de concentration aptes à prévenir la précipitation du facteur VIII, et permettant essentiellement la précipitation du fibrinogène et de la fibronectine tout en laissant le facteur VIII en solution c) on sépare le culot du surnageant; d) on soumet le surnageant à une seconde précipitation en ajoutant un gel d'hydroxyde d'aluminium en quantité comprise entre 100 et g/kg de cryoprécipité de départ, en ajustant le p H à une valeur comprise entre 5 8 et 6 3, de façon à précipiter essentiellement les facteurs vitamine K dépendants et les autres contaminants protéiques tout en laissant le facteur VIII en solution; e) on sépare le culot du surnageant f) on récupère le surnageant qui est une solution concentrée de Facteur VIII. Ainsi, il est possible, en choisissant convenablement les paramètres de l'étape b), de travailler à des températures plus élevées, avec des quantités de SPS supérieures à celles envisagées dans la demande principale, sans pour autant diminuer le rendement en facteur VIII. Suivant un mode de réalisation avantageux de l'invention, à l'étape b), le SPS est ajouté en quantité comprise entre 5 et 40 U/ml de solution et la température est comprise entre 5 et 251 C De façon préférée, le SPS est ajouté en quantité égale à 24 U/ml et la température est de C. Parmi les polysaccharides sulfatés (SPS) utilisables, on peut citer par exemple un mucopolysaccharide polysulfaté, le pentosan polysulfate, le chondroitin sulfate, le dextran sulfate, l'héparine On utilisera de préférence l'héparine. Le cas échéant, le procédé comporte également une étape finale d'inactivation virale. Suivant une caractéristique supplémentaire de l'invention, le procédé est caractérisé par l'obtention d'un facteur VIII dont l'activité spécifique est inférieure à 1,5 UI/mg. L'exemple suivant illustre l'invention. 1) préparation du cryoprécipité On centrifuge du sang humain collecté en présence de citrate de sodium, afin d'éliminer la fraction cellulaire Le plasma obtenu est congelé à -40 'C dans des poches plastiques On procède ensuite en trois étapes successives pour obtenir le cryoprécipité: prédécongélation du plasma: il est réchauffé progressive- ment de manière à ce que sa température passe de -40 C à -1 l C en 8 heures; décongélation du plasma: on élimine les poches plastiques puis on place le plasma congelé dans un broyeur pendant environ 2 minutes. On maintient la température de la solution obtenue entre 0 et 0,5 C; séparation du cryoprécipité: on centrifuge la suspension à une température comprise entre 1 et 4 C. Le cryoprécipité est analysé ci-après les valeurs sont rapportées par rapport à I I de plasma, soit 6.5 g de cryoprécipité Avant précipitation à l'héparine Facteur VIII(c) (U) 346 5 Protéines totales (mg) 840 Activité spécifique du Facteur VIII (U/mg) 0 41 Fibrinogène (mg) 410 Fibronectine (mg) 50 2) Préparation d'une solution concentrée de Facteur VIII g de cryoprécipité sont repris dans quatre fois son volume en poids d'un tampon Tris-H Cl 20 m M à p H 7 0 Le p H est ensuite ajusté à 7.1 avec de l'acide acétique 0 5 N On ajoute ensuite de l'héparine standard commercialisée par la société LEO France à une concentration de 24 U/ml de solution, et on fixe la température du milieu à 20 C Pour récupérer le surnageant, on procède à une centrifugation à 4000 t/mn pendant 15 minutes On ajoute au surnageant une quantité d'AL(OH)3 correspondant à g/kg de cryoprécipité de départ et on ajuste le p H à 6,0 avec de l'acide acétique 0 5 N Comme précédemment, on procède à une centrifugation à 4000 t/mn pendant 15 minutes pour récupérer le surnageant. 3) Inactivation virale de la solution concentrée de Facteur VIII On ajoute 1 m M de Ca CI 2 dans la solution concentrée obtenue puis on ajuste le p H jusqu'à une valeur de 7 avec Na OH 0,1 N Ensuite, on ajoute à la solution un mélange d'inactivation virale de façon à atteindre une concentration finale de 1 % de Tween 80 et 0,3 % de Tn BP (volume/vo- lume) La solution est incubée pendant pendant 6 heures à 24 C. 4) Méthodes d'essais a) détermination de la quantité de Facteur VIII c: par dosage chromogénique après neutralisation de l'héparine en excès; b) détermination de la quantité totale de protéines à l'aide des réactifs commercialisés par Biorad; c) détermination de la quantité de fibrinogène par les réactifs de la société Behring (immunodiffusion radiale simple) d) détermination de la quantité de fibronectine: par les réactifs de la société Behring (immunodiffusion radiale simple) e) détermination de la quantité d'héparine: par dosage chromogénique. On obtient les résultats suivants rapportés dans le tableau ci-après au départ, après après précipitation après la deuxième après inactivation Paramètre solubilisation du à l'héparine précipitation virale cryoprécipité Rendement en 100 91 85 100 facteur VIII ( 96) Concentration en protéines totale 23 13,5 6,7 - (mg/ml) Taux d'élimination 41,4 50,4 - des protéines (%) Activité spécifique du facteur VIII 0, 41 0,61 1,05 1,05 (U/rmng) Ui cn w IX U' REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un produit tel qu'obtenu par le procédé selon la revendication 1 du brevet principal, comprenant les étapes suivantes: a) on solubilise un cryoprécipité, b) on soumet la solution obtenue à une première précipitation en ajustant le p H à une valeur comprise entre 6,7 et 7,3 en ajoutant un polysaccharide sulfate (SPS) dans des conditions de température et de concentration aptes à prévenir la précipitation du facteur VIII, et permettant essentiellement la précipitation du fibrinogène et de la fibronectine tout en laissant le facteur VIII en solution c) on sépare le culot du surnageant; d) on soumet le surnageant à une seconde précipitation en ajoutant un gel d'hydroxyde d'aluminium en quantité comprise entre 100 et 200 g/kg de cryoprécipité de départ, en ajustant le p H à une valeur comprise entre 5 8 et 6 3, de façon à précipiter essentiellement les facteurs vitamine K dépendants et les autres contaminants protéiques tout en laissant le facteur VIII en solution; e) on sépare le culot du surnageant f) on récupère le surnageant qui est une solution concentrée de Facteur VIII. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que à l'étape b), le SPS est ajouté en quantité comprise entre 5 et 40 U/ml de solution et la température est comprise entre 5 et 250 C. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le SPS est ajouté en quantité égale à 24 U/ml et la température est de 20 'C. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le facteur VIII obtenu a une activité spécifique inférieure à 1,5 Ul/mg.