Brevet FR2667079A1 — publié le 19920327

L'invention décrite ici concerne une procédure complète de détection de bactéries pathogènes dans la cavité buccale humaine, et plus particulièrement celles associées aux parodontopathies. Le parodonte est constitué des tissus de soutien de la dent. Le terme de maladie parodontale destructrice englobe un ensemble de formes cliniques de gingivites et parodontites, maladies inflammatoires ayant pour facteur étiologique des micro-organismes. Ces maladies parodontales se traduisent par une inflammation gingivale, une lyse osseuse, la formation de poche parodontale par migration apicale de la jonction gingivo-dentaire et aboutissent à terme à la perte de la dent après destruction des tissus de soutien de cette dent. Les études épidémiologiques montrent que l'incidence et la sévérité des parodontopathies sont variables suivant les pays et les groupes d'âge, mais des études récentes portant sur 147 millions d'Américains de 19 ans et plus évaluent à environ 20% les dents perdues à cause de la maladie parodontale. L'incidence la plus importante d'extraction dentaire pour cause de maladie parodontale survient entre 20 et 50 ans. Après 35 ans, la majorité des dents perdues le sont pour cause de maladie parodontale plutôt que pour cause de carie dentaire. D'autre part, l'incidence de la carie dentaire est actuellement en nette régression dans les pays développés. De ce fait, davantage de gens gardent leurs dents au cours de leur vie, et la proportion de gens âgés augmentant, il est raisonnable de prévoir que la fréquence de la maladie parodontale augmentera dans le futur. De nombreuses études ont étayé le fait que les micro-organismes de la plaque dentaire sont les agents étiologiques de la quasi-totalité des parodontopathies. On sait actuellement que des groupes spécifiques de bactéries sont associés avec des formes cliniques précises : 300 espèces bactériennes sont recensées dans la cavité buccale humaine, mais seulement 15 à 20 d'entre elles sont associées à la maladie parodontale. I1 est donc probable que la plupart des micro-organismes de la plaque dentaire représentent des bactéries opportunistes dépourvues de pouvoir pathogène réel, un petit nombre seulement d'entre elles étant réellement impliqué dans l'étiopathogénie des parodontites. Parmi celles-ci, deux ont été particulièrement reconnues comme les espèces majeures dans la plupart des maladies parodontales très évolutives ce sont Bacteroides gingivalis et Actinobacillus actinomycetemcomitans. On sait actuellement que la maladie parodontale n'est pas un processus lent, continu progressant de la gingivite à la parodontie terminale et à la perte des dents. I1 existe au contraire des épisodes courts d'activité alternant avec de longues périodes de rémission : certains sites en particulier présentent des périodes d'activité de durée et d'amplitude variables aboutissant à des pertes d'ancrage et à des destructions osseuses importantes. Ces périodes d'activité ne peuvent, à l'heure actuelle, être reconnues qu'à posteriori, par la constatation d'une aggravation de la profondeur de poche par comparaison avec des mesures antérieures. I1 n'existe, en effet, aucun critère diagnostique capable de détecter un site en phase d'activité.Cependant, les corrélations établies entre la présence de certains organismes spécifiques et l'aggravation des lésions permet de penser qu'un diagnostic microbiologique est essentiel pour : 1- évaluer les agents pathogènes, 2- déterminer les individus et les sites à risques, 3déterminer le choix des méthodes thérapeutiques, 4- évaluer les effets du traitement, 5- détecter de façon précoce les sites réfractaires ou récidivants, 6- préciser les intervalles entre les visites. Les techniques classiques permettant de détecter et de caractériser ces bactéries pathogènes font appel à des cultures bactériologiques qui, de par la nature particulière des anaérobies ou micro aérophiles concernées, ne sont réalisables que dans des environnements spécialisés. Mais le problème majeur de ces analyses est celui du prélèvement et de la conservation des bactéries vivantes: à partir d'un prélèvement effectué au cabinet du praticien, il est particulièrement délicat de conserver et de transporter dans de bonnes conditions des bactéries anaérobies pouvant être détruites par suite d'une simple exposition à l'oxygène de l'air. Des systèmes de confinement spéciaux et des procédures particulières doivent être utilisées lors de ces prélèvements.Ces lourds problèmes de manipulation limitent considérablement les possibilités d'utilisation de ces techniques microbiologiques et, en tout état de cause, condamnent leur usage en routine. D'autres méthodes de diagnostic faisant appel à des réactions immunologiques et utilisant des anticorps poly ou monoclonaux reconnaissant certaines de ces bactéries ont été proposés et pourraient constituer des approches intéressantes. Alternativement aux méthodes microbiologiques et immunologiques, il est possible, pour rechercher la présence de tel ou tel micro-organisme, d'utiliser des sondes nucléotidiques spécifiques. Ces techniques ont déjà été appliquées avec succès aux pathogènes de la cavité buccale et plusieurs sondes ont déjà été décrites par plusieurs laboratoires. Les tests consistent alors en une hybridation directe entre 1'ADN provenant d'un prélèvement et une sonde marquée caractéristique d'un des micro-organismes concernés. Si ces tests donnent des résultats satisfaisants sur des échantillons contenant une concentration élevée de bactéries, ils rencontrent les limites techniques inhérentes à l'activité spécifique de la sonde marquée et au nombre de molécules cibles présentes dans l'échantillon à analyser, et ne permettent pas de détecter de faibles quantités de bactéries. Or, il semble bien que le plus souvent l'évolutivité à long terme d'une poche de parodontie soit directement liée à la présence résiduelle de micro-organismes pathogènes dont le traitement ne serait pas venu à bout. Les traitements mécaniques ou chimiothérapeutiques utilisés dans les parodonties visent en effet à éradiquer totalement ces bactéries afin d'arrêter le processus infectieux responsable des lésions du parodonte. I1 est donc fondamental de pouvoir évaluer avec précision si cet objectif a été atteint et si des bactéries restent présentes dans les poches. Qu'un foyer de bactéries demeure, et la lésion peut poursuivre son évolution à bas bruit. Un e analyse par simple hybridation directe peut ne pas être en mesure de déceler de faibles populations bactériennes. Préalablement à cette hybridation, une étape d'amplification de la cible s'avère donc nécessaire afin de se trouver dans des zones de sensibilité optimale. OBJET ET PRINCIPE DE L'INVENTION L'objet de la présente invention est de décrire les procédures permettant une amplification et une détection optimale de l'ADN de ces pathogènes. Cette invention fait appel, pour l'étape d'amplification des séquences cibles, à l'utilisation de la technique PCR (Polymerase Chain Reaction). Cette réaction est basée sur le principe de la réplication de l'ADN par duplication et sur l'utilisation d'amorces spécifiques, encadrant la séquence cible à amplifier, ces amorces étant utilisées comme point de démarrage pour des enzymes de réplication de l'ADN, en particulier pour des ADN polymérases thermostables utilisées pour ces réactions. Le schéma de principe de cette technique est rappelé figure 1. L'amplification de la séquence cible procède par cycles successifs comportant une étape de dénaturation de l'ADN, puis une hybridation des amorces sur les séquences qui leur sont complémentaires, et enfin par l'élongation effectuée par 1'ADN polymérase à partir de ces amorces. Après un tel cycle, une séquence cible présente en x exemplaire(s) dans l'échantillon à amplifier se retrouvera dupliquée, c'est-à-dire présente en 2x exemplaires. Après n cycles d'amplification, le nombre de séquences cibles sera de x.2n. Les procédures de PCR couramment utilisées font état de 20 ou 30 cycles d'amplification, ce qui correspond à des facteurs d'amplification de plusieurs dizaines de millions de fois. L'utilisation d'une telle technique permet donc de diminuer considérablement le seuil de sensibilité pour la détection de microorganismes et, théoriquement, permet de le descendre jusqu'au niveau de la cellule unique. Les techniques d'amplification fondées sur la PCR sont tellement puissantes qu'elles permettent même de visualiser directement, par des artifices de coloration, le fragment d'ADN produit par l'amplification. Cependant, au cours des cycles des réactions de polymérisation artéfactuelles peuvent produire des produits d'amplification ne correspondant pas toujours à la région d'ADN ciblée. Afin d'assurer une spécificité absolue dans la caractérisation des produits d'amplification, on procède, sur ces produits, à une hybridation avec une sonde nucléotidique reconnaissant spécifiquement une région d'ADN située entre les amorces utilisées dans l'amplification. Cette hybridation, effectuée sur des produits homogènes présents en concentration élevée, ne rencontre évidemment pas les mêmes problèmes de sensibilité qu'une hybridation conduite directement sur les prélèvements et permet, si on le souhaite, d'utiliser pour le marquage de la sonde toutes sortes de marquages froids à faible activité spécifique et bruits de fond faibles ou nuls. De plus, les amorces et les sondes oligonucléotidiques utilisées pour ce système sont des fragments d'ADN synthétique fabriqués par synthèse chimique. L'utilisation d'ADN de synthèse est un facteur de garantie des séquences utilisées et permet une meilleure maîtrise des conditions expérimentales. Ce système exploite donc deux niveaux de spécificité: d'une part, on utilise des amorces oligonucléotidiques spécifiques de la famille bactérienne et des conditions d'hybridation strictes et spécifiques et d'autre part, on repère le produit amplifié avec une sonde oligonucléotidique spécifique de la bactérie recherchée. Cette double réaction d'hybridation, sur trois séquences cibles non directement contigües, garantit la haute spécificité de cette approche. C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé pour la mise en évidence d'une bactérie de la cavité buccale, caractérisé en ce que: - on prélève un échantillon dans la cavité buccale, - après préparation de l'échantillon, on amplifie un ADN cible, situé entre deux amorces de ladite bactérie, par le procédé PCR, mettant en oeuvre lesdites amorces, - après amplification, on hybride les produits d'amplification de l'ADN cible avec une sonde spécifique de 1'ADN cible, et - on révèle l'hybridation. Ltinvention concerne également des amorces pour la mise en oeuvre de la méthode PCR de même que des sondes utilisables dans la méthode PCR, mais également dans les procédés d'hybridation classiques. Plus particulièrement, il s'agit d'amorces pour la détection de 1'ADN cible de Bacteroides gingivalis, caractérisées en ce qu'il s'agit des séquences suivantes Bgl : 5'CTC TTG CTA TGA CAG CTT GT3' Position 174 à 193 (Dickinson et al.) Bg2 : S'AGIT CAG TTC AGT TGT CAA TG3' Position 499 à 480 (Dickinson et al.) ou d'une séquence similaire efficace utilisable pour l'amplification d'un ADN cible spécifique; et/ou d'amorces pour la détection de l'ADN cible de Actinobacillus actinomycetemcomitans, caractérisées en ce qu'il s'agit des séquences suivantes Aal : 5'GGG TCT GGA GTA CTT TAG GG3' Position 106 à 125 (Chuba et al.) Aa2 : 5'CCC AGG CCC TCA GAT TTA3' Position 352 à 345 (Chuba et al.) ou d'une séquence similaire efficace utilisable pour l'amplification d'un ADN cible spécifique. Egalement, l'invention concerne - la sonde spécifique de 1'ADN cible de Bacteroides gingivalis, caractérisée en ce qu'il s'agit de la sonde Bg : GTT GAA GAC ATC AAA TGT AGT GCA CCC CAA ou une séquence équivalente efficace; et/ou - la sonde spécifique de 1'ADN cible de Actinobacillus actinomycetemcomitans, caractérisée en ce qu'il s'agit de la sonde AAC18 : CCC CAA ATC CCC ACC ACG ou une séquence équivalente efficace. Enfin, l'invention concerne des trousses pour la mise en oeuvre dudit procédé. Les terminologies "sondes" et "amorces" ("primer") sont connues dans cette technique et ne sont pas redéfinies. On appelle ADN cible, l'ADN qui doit être amplifié par amplification d'un ADN spécifique d'une souche qui sera la cible de l'amplification. Pour les amorces, celles-ci sont identifiées spécifiquement, mais il est possible, compte tenu de la connaissance des génomes bactériens d'utiliser des amorces voisines qui conduisent au même produit d'amplification de 1'ADN cible, elles sont dites séquences similaires efficaces. De même, une séquence équivalente efficace pour la sonde spécifique est une séquence qui permet d'identifier le même produit d'amplification. PROCEDURES UTILISEES Les procédures décrites ici sont applicables à la recherche et à la caractérisation de toutes sortes de micro-organismes pouvant être présents dans la cavité buccale humaine et associés par exemple, soit à des caries soit à des parodonties. Ces procédures ont cependant été mises au point en vue de la caractérisation spécifique de deux agents anaérobies, Actinobacillus actinomycetemcomitans et Bacteroides gingivalis, qui semblent être des contaminants majeurs des proches de parodontie en activité et en évolution. Ces deux cas seront donnés en exemple pour illustrer l'utilisation de cette technique. CHOIX ET PREPARATION DES AMORCES OLIGONUCLEOTIDIQUES Les amorces oligonucléotidiques doivent répondre à plusieurs exigences - les amorces d'amplification doivent reconnaître tous les sous-types de la souche cible et encadrer une région hautement spécifique qui sert de cible à la sonde; - les sondes doivent aussi reconnaître tous les sous-types et eux seuls. Ceci pour respecter les exigences de spécificité et de sensibilité maxima. De plus, ces séquences doivent remplir certaines conditions exigées pour une amplification optimale, ne pas présenter de réactions d'hybridation intra- ou inter-moléculaire l'une par rapport à l'autre et avoir un rapport G+C/A+T satisfaisant. Afin de rechercher de telles séquences spécifiques, de nombreux essais ont été réalisés sur des séquences connues de Bacteroides gingivalis et d'Actinobacillus actinomycetemcomitans. Dans le cas de Bacteroides gingivalis nous nous sommes adressés à la séquence d'un gène codant pour une protéine fibrilaire caractéristique de Bacteroides gingivalis (Dickinson et al., J. Bact., 170, 4, pp 1658-1665, 1988). En analysant plusieurs couples d'amorces et différentes sondes, nous avons déterminé deux amorces appelées BG1 et BG2 et une sonde appelée BG. La spécificité de ce système a été vérifiée en effectuant des essais d'amplification et d'hybridation de ces produits sur les bactéries suivantes B. gingivalis, B. melanogenus, B. corporis, B. oris, B. oralis, B. asacchararolytus, B. ondodontalis, B. intermedius, B. denticola, B. loeschei. Dans les conditions définies ci-après seules les B. gingivalis donnent des résultats positifs. Dans le cas d'Actinobacillus actinomycetemcomitans, on a fait appel pour sélectionner les séquences adéquates, à l'ADN ribosomal 16S. Il est connu que 1'ADN ribosomal comporte des régions qui sont hautement conservées de façon inter- et intra-spécifique et des régions spécifiques d'espèces, de genre, de type et sous-type. Dans ce système deux amorces spécifiques ont été synthétisées correspondant à une séquence conservée d'ARN ribosomal 16S (Chuba et al., Journal of Microbiology, 134, pp 1923-1930, 1988). Les fragments amplifiés correspondant aux bactéries suivantes de la famille des Pasteurellaceae ont été séquences - Actinobacillus lignieresi - Hemophilus aphrophilus - Hemophilus influenzae - Actinobacillus equuli - Actinobacillus actinomycetemcomitans 6330 - Actinobacillus actinomycetemcomitans 52106 - Actinobacillus hominis - Actinobacillus multocida - Actinobacillus actinomycetemcomitans 101032 - Actinobacillus actinomycetemcomitans 101033. Plusieurs divergences majeures ont été trouvées par rapport aux séquences publiées. Ce travail nous a permis de déterminer une sonde spécifique du genre Actinobacillus actinomycetemcomitans qui ne reconnaît que cette bactérie à l'exclusion de toutes les autres citées ci-dessus. Ces résultats ont été validés sur 20 sujets sains qui étaient tous négatifs pour Bacteroides gingivalis comme pour Actinobacillus actinomycetemcomitans. En revanche, chez des patients atteints de diverses formes de parodontites, nous avons pu mettre en évidence la présence indépendante ou simultanée des deux bactéries. PROTOCOLES UTILISES I - TECHNIQUE DE PRELEVEMENT DES ECHANTILONS A TESTER 1) Elimination en douceur sur le site à prélever de la plaque supra-gingivale. Rinçage au spray. 2) Isolation à l'aide d'un rouleau de coton et séchage. 3) Insertion d'une pointe de papier absorbante pour endodontie, taille moyenne jusqu'au fond de la poche, en évitant de faire saigner, la pointe reste en place 15 secondes et est déposée dans un tube stérile. Il - TRANSPORT Les échantillons sont transportés en tube stérile à température ambiante. III - PREPARATION DES ECHANTILLONS AVANT LA MISE EN OEUVRE DE LA PROCEDURE D'AMPLIFICATION Les pointes de prélèvement sont transvasées dans des tubes contenant 50 1ll de tampon d'amplification et chauffés 10 min à 100 C. IV - AMPLIFICATION Pour Bacteroides gingivalis les oligonucléotides employés sont Bgl : 5'CTC TTG CTA TGA CAG CTT GT3' Position 174 à 193 (Dickinson et al.) Bg2 : 5'AGT CAG TTC AGT TGT CAA TG3' Position 499 à 480 (Dickinson et al.) Pour Actinobacillus actinomycetemcomitans Aal : 5'GGG TCT GGA GTA CTT TAG GG3' Position 106 à 125 (Chuba et al.) Aa2 : 5'CCC AGG CCC TCA GAT TTA3' Position 352 à 345 (Chuba et al.) Les cycles d'amplification comprenaient - 1ère dénaturation 92 C 5 min - 1ère hybridation 50 C 1 min - 1ère élongation 72 C 1 min puis 35 cycles - dénaturation 92 C 1 min - hybridation 50 C 1 min - élongation 72 C 1 min Pour rendre la mise en pratique de la détection de ces deux pathogènes plus rapide, nous réalisons les deux amplifications dans le même tube, le volume final étant de 100 ul. 250 ng de chaque oligonucléotide sont utilisés ainsi que 2,5 U de Taq polymérase. V - HYBRIDATION ET REVELATION Les produits d'amplification précipités et resuspendus en lSSC sont hybridés en tube à 60 C pendant une heure puis migrés en gel de polyacrylamide 6%. Les deux sondes spécifiques respectivement de Aa : AaCl8 et Bg : BG marquées au 32P, sont hybridées simultanément dans le même tube. Sonde AaC18 : CCC CAA ATC CCC ACC ACG Sonde Bg : GTT GAA GAC ATC AAA TGT AGT GCA CCC CAA Une autoradiographie de 12 heures permet la révélation des résultats. Tout autre système de marquage pourrait être utilisé. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la mise en évidence d'une bactérie de la cavité buccale, caractérisé en ce que - on prélève un échantillon dans la cavité buccale, - après préparation de l'échantillon, on amplifie un ADN cible situé entre deux séquences amorces de ladite bactérie par le procédé PCR, mettant en oeuvre lesdites amorces, - après amplification on hybride les produits d'amplification de l'ADN cible avec une sonde spécifique de l'ADN cible, et - on révèle l'hybridation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on détecte des bactéries impliquées dans les parodontopathies. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on détecte Bacteroides gingivalis et Actinobacillus actinomycetemcomitans. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que pour mettre en évidence plusieurs bactéries on effectue l'amplification à l'aide des amorces compatibles aux dites bacteries dans le même récipient. 5. Amorce pour la détection de l'ADN cible de Bacteroides gingivalis, caractérisée en ce qu'il s'agit des séquences suivantes BgI : 5'CTC TTG CTA TGA CAG CTT GT3' Bg2 : S'AGIT CAG TTC AGT TGT CAA TG3' ou d'une séquence similaire efficace utilisable pour l'amplification d'un ADN cible spécifique. 6. Amorce pour la détection de l'ADN cible de Actinobacillus actinomycetemcomitans, caractérisée en ce qu'il s'agit des séquences suivantes Aal : 5'GGG TCT GGA GTA CTT TAG GG3' Aa2 : 5'CCC AGG CCC TCA GAT TTA3' ou d'une séquence similaire efficace utilisable pour l'amplification d'un ADN cible spécifique. 7. Sonde spécifique de l'ADN cible de Bacteroides gingivalis, caractérisée en ce qu'il s'agit de la sonde Bg : GTT GAA GAC ATC AAA TGT AGT GCA CCC CAA ou une séquence équivalent efficace. 8. Sonde spécifique de l'ADN cible de Actinobacillus actinomycetemcomitans, caractérisée en ce qu'il s'agit de la sonde AaC18 : CCC CAA ATC CCC ACC ACG ou une séquence équivalente efficace. 9. Trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 4. 10. Trousse selon la revendication 9, caractérisée en ce que les amorces et/ou les sondes sont celles des revendications 5 à 8.