Brevet FR2665365A1 — publié le 19920207

Antigène de Plasmodium falciparum susceptible d'induire des anticorps protecteurs - Application à la vaccination. L'invention a pour objet de nouveaux antigènes de Plasmodium falciparum et leur application notamment en vue de la protection contre le paludisme. Les parasites responsables du paludisme chez l'homme, dont notamment Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax pour ne citer que les principaux d'entre eux, présentent chez l'hôte humain des morphologies différentes et expriment des antigènes différents en fonction de leur localisation dans l'organisme de l'hôte infecté. Les différences morphologiques et antigéniques de ces parasites au cours de leur cycle de vie chez l'homme, permettent de définir au moins quatre stades de développement distincts. Le tout premier stade de développement du parasite chez l'homme correspond à la forme sporozoïte introduite dans le sang de l'hôte, par piqures d'insectes porteurs du parasite. Le second stade correspond au passage du parasite dans le foie et à 1'infection des cellules hépatiques dans lesquelles les parasites se développent pour former les schizontes hépatiques qui lorsqu'ils sont matures (par exemple pour P falciparum le 6è jour après pénétration des sporozoïtes) libèrent par éclatement des mérozoites hépatiques. Le troisième stade est caractérisé par l'infection des érythrocytes sanguins par les formes asexuées (mérozoïtes) du parasite; ce stade érythrocytaire de développement correspond à la phase pathogène de la maladie.Le quatrième stade correspond à la formation des formes à potentiel sexué (ou gamétocytes) qui deviendront des formes sexuées ou gamètes extra-cellulaires chez le moustique. On sait que de nombreuses études ont été entreprises pour isoler à partir des souches de parasites infectantes pour un hôte humain des fractions polypeptidiques, d'une part pour assurer le diagnostic in vitro du paludisme par détection des anticorps correspondants, et d'autre part, pour tenter de vacciner contre le paludisme. Plusieurs études ont été réalisées sur les antigènes de Plasmodium falciparum et en particulier sur différents antigènes ayant un poids moléculaire (PM) proche de 100kDa (fraction 100kDa). Des résultats ont montré que la fraction 100kDa est constituée de plusieurs antigènes distincts, migrant dans la même zone de poids moléculaire mais formant des taches (spots) différentes après séparation selon le point isoélectrique. Des résultats obtenus en 1982 ont montré que les singes Saimiri immuns et protégés après infection par P. falciparum ont des anticorps reconnaissant des antigènes migrant en gel de polyacrylamide-SDS avec un PM apparent de 96-lOOkDa. La présence de cette spécificité est liée à l'activité protectrice du sérum. Les singes immunisés par infection mais non protégés ne possèdent pas de tels anticorps (Gysin et al 1982 Parasite immunol 4/421). On a aussi constaté que la fraction d'antigènes parasitaires obtenue par élution de la bande de P.H. d'environ 100kDa de gels de polyacrylamide-SDS préparatifs conférait par immunisation à des singes Saimiri une protection appréciable contre une infection à P. falciparum (Dubois et al 1984 Proc Natl Acad Sci 81229). Trois taches distinctes (pI 5,15; 5,25 et 5,35) ont été mises en évidence par Jovin et al (1987, Infec Immun, 55, 1387); l'une d'elles correspond à l'antigène 96 TR, antigène thermostable reconnu préférentiellement par des sérums d'adultes immuns mais non par des enfants vivant en zone d'endémie. Tous les antigènes décrits jusqu'à présent dans la fraction 100kDa sont différents par leur séquence primaire. C'est le cas de l'antigène GBP 130 de Ravetch (Ravetch et al 1985, Science 227, 1593; Kochan et al 1986 Cell 44, 689) qui correspond à l'antigène 96 TR cité plus haut, de l'antigène 44 (Cooper et al 1988, Molec Biochem Parasitol 29, 251) isolé à partir des rhoptries et reconnu par les anticoprs d'individus exposés à P. falciparum en zone d'endémie palustre. Un autre antigène de cette catégorie est ABRA/Ag 101 (Weber et al, 1988, J Biol Chem 263, 11421). La présente invention concerne un antigène de P falciparum, appartenant à la fraction 100kDa mais qui se distingue des précédents notamment par sa séquence primaire. L'antigène selon l'invention est en outre susceptible d'induire des anticorps et en particulier des anticorps protecteurs vis à vis de P falciparum . L'invention vise par ailleurs l'utilisation de ces antigènes dans des compositions vaccinantes contre P falciparum ainsi que pour la détection in vitro d'une infection due à P falciparum. Font également partie de l'invention les séquences nucléotidiques codant pour l'antigène cidessus, en particulier les séquences d'ADN simple et double brins ainsi que les ARN correspondant. Les antigènes de l'invention peuvent être isolés et purifiés à partir de P falciparum ou peuvent être produits par synthèse chimique en utilisant les méthodes classiques de production. L'invention concerne donc une séquence nucléotidique de P falciparum, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchainement de nucléotides comportant n répétitions successives de fragments nucléotidiques identiques ou non de 18 paires de bases (bp) codant pour des peptides, identiques ou non, de 6 acides aminés répondant au motif de base suivant Asp b Asn His Lys Ser dans lequel b est un acide aminé quelconque, ou codant pour une variante de ce motif de base obtenue par substitution d'un ou plusieurs acides aminés dès lors que les propriétés antigèniques et/ou immunogènes de l'oligopeptide formé ne sont pas modifiées, n étant suffisant pour que l'enchainement nucléotidique formé code pour un oligopeptide capable d'induire in vivo des anticorps qui reconnaissent l'antigène codé par la séquence nucléotidique de P falciparum répondant à la carte de restriction donnée ci-après GENE R45 De préférence, la séquence nucléotidique cidessus code pour un oligopeptide capable d'induire in vivo des anticorps susceptibles d'être protecteurs ou impliqués dans le mécanisme de protection contre P falciparum chez l'homme. De tels anticorps dits "anticorps protecteurs" sont efficaces dans un test d'inhibition cellulaire dépendante d'anticorps (ADCI). Dans ce test la cellule effectrice (monocyte de sujet sain), en présence d'anticorps spécifiques, inhibe la culture de P falciparum. Une étroite corrélation a été établie entre l'effet inhibiteur des anticorps en ADCI et leur pouvoir protecteur in vivo chez les sujets infectés. Le test de 1'ADCI peut par exemple être effectué dans les conditions suivantes des cellules mononuclées du sang de donneurs français sains ont été séparées sur un gradient de densité Ficoll-Hypaque (Pharmacia) selon la technique de BOYUM (1968 Scand J Clean Lab. Invest 21 Suppl. 97 : 77). Le nombre de monocytes dans la suspension cellulaire obtenue a été estimé par une souche non spécifique de l'estérase (NSE) (TUCKER et al J Immunol Meth 14 : 267). La suspension cellulaire mononuclée (dans un milieu RPMI) a ensuite été distribuée dans des plaques de 96 trous suivant un taux de 2.105 monocytes (cellule NSE+) par puits. Après 90 minutes d'incubation à 370C dans de l'air contenant 5% de CO2 les cellules non adhésives ont été retirées des puits en lavant avec du RPMI. Cette méthode a permis de récupérer environ 105 cellules adhésives par puits parmi lesquelles plus de 90% étaient des monocytes. Dans les puits contenant les monocytes adhésifs, des cultures asynchrones de P falciparum ont été ajoutées suivant un taux de 200 RBC/1 monocyte. Le mileu de culture (RPMI + 10% de sérum humain) a été complété avec chacune des IgG purifiées à tester à 10% de leur concentration initiale dans le sérum du donneur (ou 5,10,20 et 40% pour certaines expériences). Les puits de contrôle consistent en 1) une culture seule, 2) une culture et des IgG test sans monocyte, 3) une culture et des IgG de contrôle, 4) une culture et des IgG de contrôle et des monocytes. Le test a en principe duré 48 heures. La parasitémie commençant à environ 0,2% à 0,5% a généralement atteint 1% à 3%. L'index d'inhibition de la croissance spécifique (SGI) qui prend en compte l'inhibition possible induite soit par les cellules soit par les anticorps (IgG) seuls, utilisé comme contrôle dans chaque expérience a été calculé comme suit SGI = 1 - ((pourcentage de parasites calculés avec monocytes et IgG divisé par le pourcentage de parasitémie avec IgG) divisé par le (pourcentage de parasitémie avec monocytes et IgG contrôle/pourcentage de parasites avec que IgG contrôle X 100 L'invention vise aussi le gène de P falciparum codant pour un antigène ayant un poids moléculaire d'environ 100kDa, contenant la séquence ci-dessus, tel qu'isolé à partir de P falciparum, par exemple par mise en contact avec la séquence ci-dessus pour permettre une réaction d'hybridation dans des conditions suffisamment stringentes. Les acides aminés variables du motif de base décrit ci-dessus,sont choisis parmi les suivants, représentés par leur code Ala : alanine, A Cys : cystéine, C Asp : acide aspartique, D Glu : acide glutamique, E Phe : phénylalanine, F Gly : glycine, G His : histidine, H Ile : isoleucine, I Lys : lysine, K Leu : leucine, L Met : méthionine, M Asn : asparagine, N Pro : proline, P Gln : glutamine, Q Arg : arginine, R Ser : serine, S Thr : thréonine, T Val :Valine, V Trp : tryptophane, W Tyr : tyrosine, Y Dans le cadre de la définition précédente, des séquences nucléotidiques préférées sont caractérisées en ce que les variantes du motif de base sont des séquences codant pour des peptides choisis indépendemment les uns des autres parmi les suivants Asp Ser Asn His Met Ser Asp Ser Asn His Met Ser His Asn His Met Ser Glu Ser Asn His Lys Ser Asp Ser Asn His Glu Ser D'autres variantes sont naturellement admises dès lors que l'oligopeptide résultant conserve les propriétés structurales et/ou fonctionnelles de l'oîigopeptide codé par la séquence ci-dessus. De préférence b est choisi parmi Ser, His, Asn, Cys. Les antigènes de l'invention peuvent être isolés et purifiés à partir de P falciparum ou peuvent être produits par synthèse chimique en utilisant les méthodes classiques de production. Une séquence nucléotidique préférée selon l'invention et répondant aux caractéristiques précédentes est la suivante Dde I CTGAGGARTGTCAAGGGGAAGTTTATTTATrTGTTAAAAAGATACCTATAGA -GGTATGGATAAGACAGTACAACTTGATGAATGATAATGATGGAGAATATTTATTAGATGG -GGAAAATTTTATTATGGAAGCAGTAGCCTGCGCTTATTTAAGCGAGCATTATCCTGGACT -CACACCTAAATTGTACAAGGTATTATATGAGCCTGAATGTGCTAACTGTAATGAAGAGGA -TAAGAATATGAGTGAAGATAATCATAAGAAGGATAGTAAACATAAGGGGGATAGTAATCA -CAAAAGTGATAGTAATCACAAAAGTGATAGTAATCACAAAAGTGATAGTAATCATAAAAG -TGATAGTAATCATAAAAGTGGTAGTAATCACAAAAGTGATTGTAATCACAAGAGTGGTAG -TAATCACAAGAGTGGTAGTAATCACAAGAGTGATAGTAATCATCAAAGTGATTGTAATCA # 80 REPETITIONS 18 bp -CGATCATAATCACAAAAGCGATCATAACCACAAGAGCGATAATAACCACAAGAGTGATCA -TAATCACAAAAGTGATCATAAAAAAAATAATAACAATAATAAGGATAATAAAAATGACGA -TAATGATGACAGTGATGCAAGCGATGCAGTTGATGAAGATATTGAGATACTTGAGTCTTA -TAGTGATTTGAATAAATTTAATGAGATGTTAACAGAACAATTAAATAAAAATAAGGATGG -ATATGTTGTTTTGGTTACTGAATTATTTGGTGAAGATCTTTTTCAATATATTAATAAAAG -GAATGAAAATGAAGATACGCGTGTAAGAGATGAAGATAAAAAAATAATTATGTTTGAATT -TTTAAAGTTATTAATAAAATTACATAATGCAGGATTGGTACATCTTGATATATCTCCTGA -AAATATATTGATAGAAAATAATGGTGAGTTACGCTTATGTGATCTAGCTAAATGTGCTCC -AATGTATACACACAATTTAAGACATATTAAAGGAAATGGAAACGATTTGTATTCATTTCA -ATCTTGTCAACCTTGTGTTGGAAAAATCCCATGTATTCCAAAAGAGTGTTGGGATATTAT -TAGACAACATATAAAATTAAAAATAGATAATCCTTTTGAACATTTATCAACTATTACTGA -TCAAGAAGAAAGAAAAAAATATTATTTTGATGTACATTGTGTAGATAAATATATGCTTGG -TATATTTTATATATGGATATGGAATTTAAATTATATATGGAAACGAGCTGACCCACCAAA -TGATAGAACATTTAATAATTTCTTAAAATATAATTTAAATATAAATGTATTTCAGTTAGC -CCAACAATGGCCAAAAGGTCTCAAAGATATAATTAACGTAAGATATATAAGAAAAAAAAA -AAAAAAAAAAAAAAATAATAATAATAATAATGATGTTTTATATAGTATGTGCATAGTGAAT -GTTTTTTTTTTTTATTTTAATACATGAAATGATATATATATATATATATATATATATATT -TTCTCTTTATAGAAATTATTAAGCCTAGAAAAGTAGAATGAGACAGACTTAAATGAATTA -ACTGAACATCCATGGTGGATTAATGAAGATTAATTTTAATTTTTTAAGTATTATATGAAT -ATTTATTATTAGTAGACTTTATATATAACAATAAATATTGACACTGTGCAATATTAAAAA -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATTAAAAAGGAATGTTTTATTGTTTAGGACTAT -ATGGAAAAATAATAATATATATATGTTTCCACATTAAAA...... *codons stop (3 phases) Dans la séquence ci-dessus définie, les répétitions remplissent les conditions énoncées dans pages précédentes. Entrent également dans le cadre de l'invention, toute partie ou fragment de la séquence ci-dessus codant pour un peptide, un oligopeptide ou une protéine ayant des propriétés antigéniques, voire immunogènes, seule ou en association avec une molécule porteuse dans une composition ou sous forme d'une molécule hybride, lesdits fragments ayant de préférence la capacité d'induire la production d'anticorps en particulier protecteurs contre P falciparum. Ces fragments sont obtenus par exemple par coupure enzymatique à partir de la séquence totale ou par synthèse chimique. A cet égard, l'invention porte notamment sur toute partie de la séquence nucléoditique codant pour un nombre de motifs de base répétés suffisant pour induire in vivo la formation d'anticorps de préférence d'anticorps protecteurs contre P falciparum et de façon préférée cette partie est constituée par 1'enchainement d'environ 80 répétitions répondant à la définition ci-dessus. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la séquence nucléoditique est caractérisée en ce qu'elle comprend 1'enchainement nucléoditiaue R23 rénondant à la formule suivante 10 20 30 40 50 R23 ù ci ù ù ù ù ACAAAAGTGATAGTAACCACAAGAGCGATCATMTCACMGAGTGATAGTAA 70 80 90 100 110 120 ci ci ci ci ci ci CCACATGAGCGATCATAACCACATGAGCGATCATAACCACMGAGCGA TCATMCCACAA 130 140 150 160 170 180 ci ù ù ù ù ù GAGCGATAATAACCACMAAGTGATAGTAACCACMAAGTGATAGTAACCACmAAGTGA 190 200 210 220 230 240 ù ù ù ci L'enchainement R23 qui appartient en tant que fragment individualisé à l'invention présente la propriété tout à fait avantageuse d'exprimer un polypeptide capable de fixer des anticorps cytophiles et de préférence d'induire des anticorps en particulier des anticorps protecteurs contre P falciparum lorsqu'il est administré de façon à ce que les anticorps produits aient des propriétés cytophiles. Des anticorps cytophiles sont aptes à se fixer par leur fragment Fc à des cellules en particulier des macrophages. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléoditique est caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchainement nucléotidique R45 répondant à la formule suivante R45 10 20 30 40 50 60 ù ci ù ci e CACAAGAGCGATAATAACCACAAAAGTGATAGTAACCACAAAAGTGATAGTA 7 80 90 100 110 120 ù ci ci ù ci ci ACCACAAAAGTGATAGTAACCACAAGAGCGATCATMTCACMGAGCGATCATMGCACA 130 140 150 160 170 180 ci ci Ù ci ci TGAGCGATAATAACCACAAGAGCGATAATAATCACAAGAGCGATAATAATCACAAGAGCG 90 200 210 220 230 240 Ü ci ci ci ci ATCATAATCACAAGAGCGATAATAATCACAAGAGCGATCACAATCACAAGAGTGATAGTA 250 260 270 280 290 300 ù ù ù ù ù ù ATCACAAGAGTGATAGTAACCACAAGAGTGATAGTAACCACAAGAGTGATAGTAACCACA 310 320 330 340 350 360 ù ù ù ù ù ù AGAGTGATAATAACCATAAGAGCGATCATAATCAC[AACAGT] I1 est naturellement entendu que l'enchainement R45 en tant que tel est inclu dans cette définition. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléoditique est caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchainement nucléotidique R51 répondant à la formule suivante 10 20 30 40 50 60 R51 ù ù ù ù ù ù [AATTC]CACAATCACATGAGCGATCATAATCACAAGAGTGATAATAACCATAAGAGTGATC 70 80 90 100 110 120 ci ci ci ci ù ci ATAATCACAAAGTGATAGTAACCACATCAGCGATCATAACCACATGAGCGATCATAACC 130 140 150 160 170 180 ci ci o ci ù ci ACAACACCGATCATMTCACAAGAGCGATCATAACCACAAGACCATAATAACCACAAAA 190 200 210 220 230 240 ci b~ ci ci ci GTGATAGTAACCACAAAGT[GAGGAATTCC On remarquera que les séquences R23 et R45 se chevauchent. L'invention vise aussi les séquences ci-dessus auxquelles on aurait ajouté à une extrémité ou aux 2 extrémités des "linkers" (oligonucléotides synthétiques) tels que GGAATTCC. L'invention vise aussi toutes les combinaisons des enchainements R23, R45 et R51, notamment la séquence formée des enchainements correspondant à R23 et R45. De façon tout à fait avantageuse, la séquence de l'invention est caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide capable d'induire la production d'anticorps cytophiles, de préférence d'isotype IgG1 ou IgG3. Elle concerne aussi la séquence nucléoditique qui comprend l'enchaînement I en amont des 80 répétitions, et l'enchaînement II en aval des 80 répétitions, correspondant respectivement aux séquences suivantes I: Dde I CTGAGGAATGTCAAGGGGAAGTTTATTTATTTGTTAAAAAGATACCTATAGA -GGTATGGATAAGACAGTACAACTTGATGAATGATAATGATGGAGAATATTTATTAGATGG -GGAAAATTTTATTATGGAAGCAGTAGCCTGCGCTTATTTAAGCGAGCATTATCCTGGACT -CACACCTAAATTGTACAAGGTATTATATGAGCCTGAATGTGCTAACTGTAATGAAGAGGA -TAAGAATATGAGTGAAGATAAT II 'AAAAATAATAACAATAATAAGGATAATAAAAATGACGA -TAATTGATGACAGTGATGCAAGCGATGCAGTTGATGAGATATTGAGATACTTGAGTCTTA -TAGTGATTTGAATAAATTTAATGAGATGTTAACAGAACAATTAAATAAAAATAAGGATGG -ATATGAAAATGAAGATACGCGTGTAAGAGATGAAGATAAAAAAATAATTATGTTTGAATT -GAATGAAAATGAAGATACGCGTGTAAGAGATGAAGATAAAAAAATAATTATGTTTGAATT -TTTAAAGTTATTAATAAAATAATGGTGAGTTACGCTTATGTGTCTAGCTAAATGTGCTCC -AAATATATTGATAGAAAATAATGGTGAGTTACGCTTATGTGATCTAGCTAATGTGCTCCC -AATGTATACACACAATTTAAGACATATTAAAGGAAATGGAAACGATTTGTATTCATTTCA -ATCTTGTCAACCTTGTGTTGGAAAAATCCCATGTATTCCAAAAGAGTGTTGGGATATTAT -TAGACAACATATAAAATTAAAAATAGATAATCCTTTTGAACATTTATCAACTATTACTGA -TCAAGAAGAAAGAAAAAAATATTATTTTGATGTACATTGTGTAGATAAATATATGCTTGG -TATATTTTATATATGGATATGGAATTTAAATTATATATGGAAACGAGCTGACCCACCAAA -TGATAGAACATTTAATAATTTCTTAAAATATAATTTAAATATAAATGTATTTCAGTTAGC -CCAACAATGGCCAAAGGTCTCAAAGATATAATTAACGTAAGATATATAAGAAAAAAAAAA -AAAAAAAAAAAAAATAATAATAATAATAATGATGTTTTATATAGTATGTGCATAGTGAAT -GTTTTTTTTTTTTATTTTAATACATGAAATGATATATATATATATATATATATATATATT -TTCTCTTTATAGAAATTATTAAGCCTAGAAAGTAGAATGAAGACAGACTTAAATGAATTA -ACTGAACATCCATGGTGGATTAATGAAGATTAATTTTAATTTTTTAAGTATTATATGAAT -ATTTATTATTAGTAGACTTTATATATAACAATAAATATTGACACTGTGCAATATTAAAAA -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATTAAAAAGGAATGTTTTATTGTTTAGGACTAT -ATGGAAAAATAATAATAATATATATATGTTTCCATTAAAA........ 'codons stop (3phases) L'invention vise aussi toute partie de ces enchaînements, codant pour un antigène reconnu par des anticorps contre P falciparum ou susceptible d'induire ou de contribuer à la production in vivo de tels anticorps. Entrent également dans le cadre de l'invention, les séquences nucléoditiques complémentaires des séquences précédentes ainsi que les séquences ayant subi des mutations ponctuelles, par exemple par substitution, délétion, insertion ou inversion de nucléotides, dès lors que les propriétés antigéniques, le cas échéant immunogènes des séquences correspondantes non modifiées sont conservées. L'antigène de P falciparum conforme à l'invention, susceptible d'induire la formation d'anticorps, en particulier d'anticorps protecteurs contre P falciparum, est caractérisé en ce qu'il s'agit du produit de traduction de l'une des séquences nucléotidiques ci-dessus. L'antigène de P falciparum ci-dessus est encore caractérisé en ce qu'il est susceptible d'induire des anticorps et en particulier des anticorps protecteurs contre P falciparum, et en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés comportant un oligopeptide constitué de n répétitions de peptides, identiques ou non, répondant au motif de base Asp b Asn His Lys Ser dans laquelle b représente un acide aminé quelconque ou à une variante de ce motif de base obtenue par substitution d'un ou plusieurs acides aminés dès lors que les propriétés antigèniques et/ou immunogènes de l'oligopeptide formé sont conservées, n étant tel que l'oligopeptide formé vérifie les propriétés énoncées ci-dessus par référence à la séquence nucléoditique. Des variantes du motif de base peuvent être choisies parmi les peptides ci-dessus définis en rapport avec les séquences nucléotidiques de l'invention. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'antigène répondant aux définitions cidessus répond à la séquence en acides aminés représentée ci-après 5 10 15 20 25 30 S E C Q S E V Y L F V E K I P I E V W I R Q T N L E N 35 40 45 50 55 60 D N D G E Y L L D G S N F I N E A V A C A Y L E S N I P S L 65 70 75 80 89 90 T P K I T E V L Y E P S C A N C H E E D K N N S N D N N E K 95 100 105 110 115 120 D S K/K K G U S N/N K S D S N /N K S N E N/N K S D S N/K K S 125 130 135 140 145 150 D S N/N L S C E N/N K S D N C /N K S G E N/N C S G S N/K K S 155 D S N/N Q S D C N .... # 80 REPETITIONS 6as D N N/L K S D E N/N K S D N N /N K S D N N/N K S D N K K E S N N K J D N K N D D N D D E D A S D A V D E D I E I L E S T S O L N K F N E K L T E Q L N K N K D G Y V V L V T E L F G E D L F Q Y I N K R N E N E D T R V R D E D E K I I N F E F L E L L I K L N N A G L V E L D I S P E N I L I E N N C E L A L C D L A K C A P M Y T E N L R N I K C N G E D L Y S F Q S C Q P C V G K I P C I P K E N W D I I R E N I E L K I D M P P E N L S T I T D Q E E R K K Y Y F D V E C V D E V E L S I F Y I W I W E L N Y I V K R A D F F N D R T F N N F L K Y N L S I N V F Q L A Q Q W P K G L K D I I N V Z Y I K K K K G G K K I I I I I N N F Y I V C A. L'invention concerne également les parties de la séquence antigénique présentée précédemment; en particulier entrent dans le cadre de l'invention, les fragments antigéniques A et B situés en amont de l'enchainement comportant les 80 répétitions et en aval de cet enchainement. A 5 10 15 20 25 30 S E C Q G E V Y L F V E E I P I E V W I R Q Y N L N E 35 40 45 50 55 60 S N D G E Y L L D G S N F I N Z A V A C A Y L E E N T P G L 65 70 75 80 85 Y P K I T K V L Y E P E C A N C N E E D K K N S E D W B K N N N N K J D N K N D D N D D E D A S D A V D E D I E I L E S T S O L N K F N E K L T E Q L N K N K D G Y V V L V T E L F G E D L F Q Y I N K R N E N E D T R V R D E D E K I I N F E F L E L L I K L N N A G L V E L D I S P E N I L I E N N C E L A L C D L A K C A P M Y T E N L R N I K C N G E D L Y S F Q S C Q P C V G K I P C I P K E N W D I I R E N I E L K I D M P P E N L S T I T D Q E E R K K Y Y F D V E C V D E V E L S I F Y I W I W E L N Y I V K R A D F F N D R T F N N F L K Y N L S I N V F Q L A Q Q W P K G L K D I I N V Z Y I K K K K G G K K I I I I I N N F Y I V C A. D'autres fragments également intéressants dans le cadre de l'invention sont les fragments constitués par tout ou partie des répétitions des peptides dont la définition a été donnée précédemment. Des antigènes particuliers de P falciparum s'inscrivant dans les définitions ci-dessus, sont les antigènes comprenant ou correspondant aux séquences d'acides aminés R23, R45 ou R51 et répondant respectivement aux enchainements d'acides aminés suivants R23 isLysSerAspSerAsnHisLysSerAspHisAsnisLysSerAspSerAsn HlsMetserAspHlsAsnHisMetSerAspHlsAsnHlsLysberAsDHlsAsnHlsLys oerAsDAsnAsnHisLysSerAsDSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAsp SerAsnistysSerAspHisAsn R51 HisAsnHisMetSerAspHisAsnHisLysSerAspAsnAsnHisLysSerAspHis AsnHisLysSerAspSerAsnHisMetSerAspHisAsnHisMetSerAspHis LysSerAspHisAsnFIisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspAsnAsnHisLysSer Asp5erAsnHistysSer R45 HisLysSerAspAsnAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsn HisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspHisLysHisMet SerAspAsnAsnHisLysSerAspAsnAsnHisLysSerAspAsnAsnHisLysSerAsp HisAsnHisLysSerAspAsnAsnHisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspSerAsn HisysSersp5erAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLys SerAsoAsnAsnHisLysSerAspHisAsnHis. Selon un autre aspect de l'invention, les séquences nucléotidiques dont la description figure dans les pages précédentes, peuvent se présenter sous la forme d'un ADN recombinant. Dans ce cas la séquence nucléotidique caractéristique de P falciparum selon l'invention, est de préférence classée sous le contrôle d'un promoteur de préférence un promoteur fort, éventuellement inductible tel que celui de l'opéron lactose ou le promoteur pl ou pR du bactériophage lambda et d'éléments de régulation adaptés à son expression dans un hôte cellulaire choisi, tels que des signaux de terminaison, de transcription, d'excrétion ou de secrétion. L'invention concerne donc également un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique telle que décrite précédemment, le cas échéant sous le contrôle d'un promoteur et des éléments de régulation pour l'expression dans un hôte cellulaire déterminé. Des vecteurs particulièrement adaptés pour la réalisation de l'invention sont par exemple des plasmides, des cosmides ou des phages et en particulier le Baculovirus Àgtll, pMS notamment pMS23, pGEX. L'invention vise aussi un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence antigénique répondant aux définitions cidessus, en association avec un polypeptide hétérologue, notamment un polypeptide caractéristique d'un stade sanguin ou hépatique de l'infection par P falciparum, par exemple l'antigène LSA ou encore un polypeptide ou une protéine porteuse. Par l'expression "polypeptide" il faut entendre tout peptide, polypeptide, protéine ou fragment protéique utilisable pour la réalisation de l'invention, en particulier tout polypeptide physiologiquement acceptable. A titre d'exemple de protéine porteuse, on pourra citer la p-Galactosidase, l'anatoxine tétanique, l'ovalbumine, le sérum albumine, l'hémocyanine, le PPD de la tuberculine (Purified Protein Derivative). Des molécules porteuses synthétiques telles que les polylysines, les poly (D-L-alanine) - poly (L-lysine) sont également compatibles avec la réalisation de l'invention. Un tel polypeptide recombinant, peut être utilisé pour la réalisation d'une composition vaccinante, par exemple lorsque la séquence antigénique de P falciparum qu'il contient ne permet pas en tant que tel de déclencher la production d'anticorps. La séquence hétérologue peut être choisie de façon telle qu'elle stimule la formation des anticorps recherchés. Par ailleurs la séquence polypeptidique hétérologue peut être choisie de façon telle qu'elle permet elle-même d'obtenir une réaction immunogène et qu'elle permet dans ce cas de déclencher la production d'anticorps. La séquence polypeptidique hétérologue peut par exemple être caractéristique d'un antigène de P falciparum par exemple d'un antigène de stade sanguin ou hépatique. On peut ainsi obtenir un effet conjugué et une réponse vis à vis d'antigènes différents. Entre également dans le cadre de l'invention, un hôte cellulaire recombinant, caractérisé en ce qu'il est tranformé par un acide nucléique recombinant ou un vecteur recombinant tel que décrit dans les pages précédentes, dans des conditions permettant l'expression d'une séquence de P falciparum selon l'invention. Avantageusement le vecteur ou l'acide nucléique recombinant introduit est choisi pour sa compatibilité avec l'hôte cellulaire recombinant et est tel que la séquence de P falciparum est sous le contrôle d'un promoteur et le cas échéant des séquences codant pour les signaux de terminaison de la transcription, compatibles avec l'expression dans l'hôte choisi.A titre d'exemple d'hôte cellulaire utilisable pour réaliser l'invention, on peut citer les bactéries telles que E.coli, Bacillus subtilis ou des Streptomyces, les levures telles que Saccharomyces cerevisiae, des champignons, les cellules d'insectes ou encore les cellules de mammifères telles que les cellules CHO. Des hôtes cellulaires particulièrement intéressants pour la réalisation de l'invention sont d'une part la souche SB275 comprenant la séquence R23,déposée à la CNCM (Collection Nationale des Cultures de Microorganismes à Paris) sous le numéro I-986 le 27 Juillet 1990 et d'autre part la souche SG363 comprenant la séquence comprise entre les sites de restriction DdeI figurant sur la carte de restriction, déposée à la CNCM sous le numéro I-987 le 27 Juillet 1990. L'invention vise naturellement les séquences nucleotidiques de P falciparum contenues dans les vecteurs recombinants insérés dans les souches SB275 et SG363. L'invention concerne aussi la souche SB95 contenant la séquence nucléotidique R45 décrite dans les pages précédentes, ainsi que cette séquence telle qu'issue du clone SB95. L'invention permet aussi de réaliser une composition vaccinante, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un antigène répondant aux définitions ci-dessus. Cette composition peut être obtenue par le mélange dudit principe actif, avec un véhicule pharmaceutique acceptable, choisi en fonction du mode d'administration souhaité. Les résultats obtenus in vivo et in vitro par les inventeurs ont permis de déterminer qu'une utilisation de la composition vaccinante ci-dessus pour la production d'anticorps protecteurs contre P falciparum, doit tenir compte du mécanisme de coopération entre macrophages, monocytes et anticorps (processus de 1'ADCI) (Antibody-Dependant-Cellular Inhibitory effect) tel que decrit dans les exemples) mis en evidence au cours des expériences. Ainsi pour obtenir des anticorps protecteurs contre P falciparum, l'immunisation avec un antigène selon l'invention doit être réalisée de façon à induire préférentiellement des anticorps cytophiles (anticorps ayant une affinité pour diverses cellules en particulier de la lignée macrophagique) du type IgG1 et IgG3. Au contraire 1'immunisation doit induire peu d'anticorps non cytophiles du type IgG2, IgG4 et IGM. Les inventeurs ont donc mis en évidence que le mécanisme d'action protectrice est fonctionnel lorsque l'anticorps produit a une spécificité donnée, en particulier vis à vis des antigènes de l'invention, et lorsque cet anticorps appartient à un isotype susceptible de coopérer avec les monocytes. Une autre composition vaccinante selon l'invention peut, outre le principe actif constitué par l'antigène de P falciparum défini précédemment, comporte un autre antigène caractéristique par exemple des stades sanguins ou hépatiques de P falciparum. L'invention a aussi pour objet des amorces d'ADN ou d'ARN utilisables par exemple dans le cadre de la synthèse de séquences nucléotidiques éventuellement suivie de la synthèse polypeptidique selon l'invention par la technique de la PCR (Polymerase Chain Reaction) telle que décrite dans les brevets américains numéros 4.683.202 et 4.683.195 et dans la demande de brevet européen numéro 200.362 (PCR = amplification en chaine de 1'ADN). De telles amorces d'ADN ou d'ARN sont constituées d'environ 8 à 25 nucléotides identiques à une séquence de même longueur, de la séquence selon l'invention, ou complémentaires de ces nucléotides. D'autres amorces d'ADN ou d'ARN sont encore caractérisées en ce qu'il s'agit de fragments nucléotidiques capables d'hybrider avec les séquences selon l'invention dans des conditions 6xSSC, 2,5% lait, lO0pg/ml DNA harreng 65OC, lavages en 6xSSC, 2xSSC, 0,5xSSC Un fragment utilisable en tant qu'amorce est caractérisé en ce qu'il est susceptible d'induire la synthèse d'un acide nucléique complémentaire de celui auquel il s'hybride (ce dernier est alors appelé matrice) au sein d'une solution tamponnée et dans des conditions de pH et de température appropriées pour cette synthèse, en présence d'un agent inducteur de la synthèse, notamment une polymérase ou une réverse transcriptase et en présence des nucléotides appropriés. Le produit de synthèse obtenu à partir du fragment servant d'amorce est appele produit d'allongement de l'amorce. Des solutions tamponnées et conditions de pH et de température appropriées à la production du "produit d'allongement de l'amorce" peuvent être déterminées par référence aux enseignements des brevets américains précités dont le contenu est incorporé dans la présente demande. Pour la réalisation de l'amplification en chaine de 1'ADN, on choisira des amorces d'ADN ou d'ARN complémentaires des deux extrémités de la séquence dont on recherche l'amplification. De préférence ces amorces sont situées de chaque côté de l'enchainement répété de nucléotides qui a été présenté plus haut. Les amorces précédentes peuvent être utilisées soit pour la préparation des séquences nucléotidiques de l'invention et le cas échéant pour la préparation du polypeptide pour lequel elle code ou encore, pour la réalisation de la détection in vitro de la présence de séquences nucléotidiques de P falciparum selon l'invention dans un échantillon biologique chez un patient susceptible d'être infecté par cet agent. L'invention concerne donc un procédé pour l'amplification d'une séquence nucléotidique déterminée, comprenant les étapes suivantes, a/ la mise en contact, en présence de nucléosides triphosphates et d'un agent inducteur de polymérisation, de l'échantillon biologique suspecte de contenir l'acide nucléique recherché, préalablement rendu accessible à une première amorce dans des conditions autorisant l'hybridation entre ces amorces et cet acide nucléique recherché, et la polymérisation à partir de ces amorces hybridées d'acide nucléique complémentaire pour produire un duplex formé entre le produit d'allongement de l'amorce, hybridé avec le brin d'acide nucléique dont on réalise l'amplification b/ la dénaturation du duplex obtenu à l'étape a/ de façon à "séparer" le produit d'allongement de l'amorce de l'acide nucléique à détecter, c/ la mise en contact du produit d'allongement obtenu avec une deuxième amorce (au sens que l'on a donné plus haut de cette expression) ayant une séquence de nucléotides (1) non complémentaire de celle de la première amorce et (2) complémentaire d'une séquence du produit d'allongement précédemment formé, d/ le cas échéant la répétition des étapes a/ et b/ et c/ en présence des première et deuxième amorces utilisées en excès et des réactifs nécessaires à la production de nouveaux produits d'allongement utilisés à leur tour comme matrice pour obtenir des synthèses supplémentaires, jusqu'à obtenir une quantité suffisante pour être détectée de produits d'allongement des amorces utilisées, e/ la détection de la présence des produits d'allongement caractéristiques de la présence de 1'ADN ou de l'ARNm de P falciparum. Lorsque le nombre d'étapes d'amplification est juge suffisant, on peut réaliser la détection de la séquence recherchee en utilisant un nucléotide radioactif. Lorsque la métode d'amplification par la technique PCR est réalisée en vue de la production d'un antigène selon l'invention, on introduit les séquences nucléotidiques amplifiées dans un vecteur approprie, puis on réalise une culture dans un milieu de culture approprié d'un hôte cellulaire préalablement transformé par le susdit vecteur contenant l'acide nucléique amplifié, et on récupère à partir du milieu de culture, l'antigène produit par l'hôte cellulaire. L'hôte cellulaire peut être choisi de façon à ce que l'antigène soit exprimé dans le cytoplasme. Dans ce cas on récupère l'antigène par lyse de l'hôte cellulaire. Selon une méthode avantageuse, on peut choisir l'hôte cellulaire et les éléments de régulation du vecteur recombinant contenant la séquence à exprimer, de façon à ce que l'antigène produit soit excreté à sa surface ou sécrété dans le milieu. L'antigène est ensuite purifié à partir de ce milieu. Les peptides selon l'invention peuvent encore être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide. Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrite par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé "Methode der Organischen Chemie" (Méthode de la Chimie Organique) edité par E. Wunsch, vol. 15-I et II., THIEME, Stuttgart 1974. Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions amine de l'un et carboxyle de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides.En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la l-éthyl-3-(3-diméthyl-aminopropyl)- carbodiimide. Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront protégées, par exemple par des groupes t-butylester. Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'amino-acide Cterminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D. MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2154). Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de MERRIFIELD, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal de la chaîne. Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle. Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide. Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut être éliminé par traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique. On couple ensuite le deuxième acide aminé qui fournit le second amino-acyle de la séquence recherchée, à partir du résidu amino-acyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du premier acide aminé C-terminal fixé sur la chaîne. De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction amine est protégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle. On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux acide aminés, et dont la fonction amine terminale est protégée. Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième acide aminé C-terminal. On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois dêprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine. Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acides amines constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorydrique. De même, les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés soit par un procédé chimique, soit par d'autres procédés. Un mode de préparation approprié des acides nucléiques comportant au maximum 200 nucléotides (ou 200 pb, lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) de invention comprend les étapes suivantes - la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée des 8 ss-cyanethylphosphoramidite décrite dans Bioorganic Chemistry 4; 274-325 (1986), - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique par hybridation avec une sonde appropriée. Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques de longueur supérieure à 200 nucléotides (ou 200pb, lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) de l'invention comprend les étapes suivantes - l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; 7461-7465, (1983), - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée. L'invention concerne également un procédé pour le suivi de la vaccination de patient contre l'infection par P falciparum, à partir d'un échantillon biologique tel que le sang, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact de l'échantillon biologique susceptible de contenir des anticorps protecteurs contre P falciparum, avec au moins un antigène selon 1' invention, - la détection de la réaction antigene-anticorps. Pour la réalisation de cette méthode de détection in vitro, les antigènes selon l'invention sont avantageusement marques à l'aide d'un marqueur radioactif, d'un marqueur enzymatique ou fluorescent ou encore d'un marqueur de type marqueur physique. L'invention vise également des kits pour la détection in vitro de la présence d'anticorps dirigés contre les antigènes de l'invention, caractérisés en ce qu'ils contiennent - une composition antigénique comprenant au moins un antigène selon l'invention, - des réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction immunologique entre les susdits antigenes et les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique, - des réactifs permettant la détection du complexe antigène-anticorps produit par la réaction immunologique. Ces réactifs sont par exemple porteurs d'un marqueur ou susceptibles d'être reconnus par un réactif marqué. L'invention vise par ailleurs des anticorps dirigés contre les antigènes répondant aux définitions ci-dessus, ces anticorps étant polyclonaux ou monoclonaux. Les anticorps monoclonaux peuvent être produits par la technique des hybridomes, suivant les techniques classiques comprenant - la fusion d'une cellule myelomateuse avec des cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec l'un des antigènes selon l'invention, - la culture des hybridomes formés par la fusion des cellules précédentes et, - la selection de ceux des hybridomes capables de former des anticorps monoclonaux reconnaissant l'antigène utilisé pour l'immunisation des animaux. Les animaux choisis pour l'immunisation peuvent être par exemple des souris. Des anticorps monoclonaux préférés selon l'invention sont des anticorps de classe IgG1 ou IgG3, dirigés contre l'antigène R23 dont la séquence a été décrite plus haut. D'autres avantages de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent et dans les figures Figure 1 : carte de restriction de la séquence codant pour l'antigène P falciparum, Figure 2 : séquence nucléotidique de l'antigène de P falciparum, Figure 3 : séquence d'acides aminés de l'antigène de P falciparum, Figure 4 : clone R23, séquence nucléotidique et sa séquence en acides aminés correspondante, Figure 5 : clone R45, séquence nucléotidique et sa séquence en acides aminés correspondante, Figure 6 : clone R51, séquence nucléotidique et sa séquence en acides aminés correspondante, Isolement de clones R23, R45, at R51 a) Construction de la banque Une banque de DNA (ADN) génomique a été construite dans le bactériophage d'expression Agtll, en utilisant 1'ADN génomique du clone Tak 9-96 de P falciparum (ref clone Tak 9-96 : Science 212, 137; 1981) suivant le protocole décrit en détail dans la demande de brevet EP du 9 février 1987 publiée sous le numéro 0343186. En bref, l'ADN a été découpé par la DNAase I, en présence d'ions Mn2+, méthylé par la méthylase EcoRI pour protéger les sites EcoRI naturels, puis réparé par 1'ADN polymérase du bactériophage T4 et 1'ADN ligase d'EcoRI. Des "linkers" (oligomères synthétiques) EcoRI ont été ligaturés aux fragments de DNA de P falciparum et les sites artificiels ainsi rajoutés ont été libérés par coupure avec l'enzyme EcoRI. Les fragments ont été purifiés sur gradient de sucrose et ligaturés avec le DNA du vecteur Àgtll convenablement préparé (c'est à dire coupé par EcoRI et déphosphorylé - vendu par Promega Biotec). L'ADN a été encapsidé in vitro dans des particules virales. Les bactériophages issus de ce procédé constituent une banque d'ADN génomique. b) Criblaqe de la banque Les détails techniques du criblage sont donnés dans le texte de la demande de brevet 0343186. Le sérum utilisé était celui du Lapin R96. Ce lapin a été immunisé avec une préparation antigénique constituée des protéines migrant dans la région 100kDa, préparée par électroélution de gels préparatifs de polyacrylamide SDS chargés avec le surnageant de culture de formes très mûres de P falciparum (surnageant chauffé à 100"C 15 min). L'immunisation a eu lieu avec comme adjuvant le poly A/poly U. Le sérum a été épuisé en anticorps anti E.coli avant d'être utilisé pour cribler la banque. En bref on prépare des plages de lyse de bactériophages de la banque (environ 5 à 10.000 plages par boite). On cultive 3H à 37C. On ajoute alors un filtre de nitrocellulose saturé en IPTG 10-2M, on fait des repères sur la boîte et le filtre et l'on prélève le filtre que l'on sature puis on l'incube avec des anticorps. La révélation des complexes Ag/Ac est effectuée par la protéine A1I. Après lavage on artoradiogrphie les filtres. On positionne le filtre sur les boites, ouon prélève la région et on reétale pour réaliser un criblage secondaire en une série de 3-4 criblages successifs. On enrichit et on purifie les bactériophages produisant un antigène reconnu par le sérum et on termine avec un clone pur de bactériophage. c) Lysogénisation Le phage pur est utilisé pour infecter la souche Y1089 (Young et Davies, Science, 222, 778; 1983). Les lysogènes sont purifiées, on extrait 1'ADN du bactériophage , on coupe par EcoRI pour libérer l'insertion d'ADN gnomique de P falciparum véhiculée par le bactériophage en question (lysogène déposée pour le bactériophage Â R45 = SB95, I-986 27.07.90). d) Reclonage dans d'autres vecteurs L'ADN du bactériophage découpé est recloné dans le vecteur pMS1 coupé par EcoRI, déphosphorylé : on mélange ltADN du vecteur et 1'ADN du bactériophage R23 coupé par EcoRI avec de la T4 DNA ligase. On transforme ensuite des bactéries hôtes rendues compétentes à l'introduction d'ADN et on sélectionne les colonies ampiciline-R (résistantes à l'ampiciline). On effectue un criblage immunologique pour rechercher les colonies qui ont inséré le fragment R23. Les clones produisent une ss-galactosidase enzymatiquement active que l'on purifie sur colonne d'APTG-Sépharose,(clone SB275). e) Obtention de la séquence d'ADN L'insertion est préparée comme précédemment, mais reclonée dans le bactériophage ml3mpl8 ou ml3mpl9. Les bactériophages recombinants sont repérés par hybridation à l'insertion pure, et 1'ADN est préparé et séquencé selon la technique Sanger. f) Clonage de grands fragments (par exemple : Dde I) On établit une carte de restriction de la région génomique portant les séquences hybridant par exemple à R45 et on choisit une coupure ou un type de coupure qui produit des fragments dont on espère qu'ils contiendront tout le gène. Ici on a choisi Dde I : on digère le DNA génomique souche Palo Alto par Dde I, on électroélue les fragments migrant dans la zone de PM 4 à 6 Kb. Ensuite ces fragments sont réparés par la T4 DNA polymérase, des linkers EcoRI sont additionnés et ligaturés avec le bactériophage Agt WES coupé par EcoRI. Le criblage est fait par hybridation avec l'insertion du clone R45. A chaque étape de criblage, on éliminera manuellement (par ponction avec une pipette Pasteur) les bactériophages qui forment des grosses plages. En quatre séries successives d'amplification, on a obtenu suffisamment de bactériophages pour préparer de 1'ADN, extraire l'insertion par EcoRI et recloner dans le vecteur puce3 coupé par EcoRI et la phosphatase (Pharmacia). Après ligation avec ce vecteur, 1'ADN est introduit soit dans DH5 a soit dans CMK603 dans lequel il forme la souche SG363 déposée sous le numéro I-987. REVENDICATIONS 1/ Séquence nucléotidique de P falciparum, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchainement de nucléotides comportant n répétitions successives de fragments nucléotidiques identiques ou non de 18 paires de bases (bp) codant pour des peptides, identiques ou non, de 6 acides aminés répondant au motif de base suivant Asp b Asn His Lys Ser dans lequel b est un acide aminé quelconque, ou codant pour une variante de ce motif de base obtenue par substitution d'un ou plusieurs acides aminés dès lors que les propriétés antigèniques et/ou immunogènes de l'oligopeptide formé ne sont pas modifiées, n étant suffisant pour que l'enchainement nucléotidique formé code pour un oligopeptide capable d'induire in vivo des anticorps qui reconnaissent l'antigène codé par la séquence nucléotidique de P falciparum répondant à la carte de restriction donnée ci-après -- 250bp A : Alu I A : Alu Ac: Acc R: Rsa : codon stop Rp: 7rèpétitions 45 bp 2/ Séquence nucléotidique selon la revendication 1 caractérisée en ce que le motif de base est modifié et correspond à un peptide choisi parmi Asp Ser Asn His Met Ser Asp Ser Asn His Met Ser Ser Asn His Met Ser Glu Ser Asn His Lys Ser Asp Ser Asn His Glu Ser 3/ Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que b est de préférence Asn, His, Ser, Cys. 4/ Séquence nucléotidique de Plasmodium falciparum selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchainement nucléotidique R23 répondant à la séquence suivante R23 10 20 30 40 50 60 ù Q ù 5 ù t ACAAAAGTGATAGTAACCACMGAGCGATCATMTCACAAGAGTGATAGTAA 70 80 90 100 110 120 ù ù ù ù ù ù CCACATGAGCGATCATAACCACATGAGCGATCATAACCACAAGAGCGATCATAACCACAA 130 140 150 160 170 180 ù ù ù ù ù ù GAGCGATAATAACCACAAAAGTGATAGTAACCACAAAAGTGATAGTAACCACAAAAGTGA 190 200 210 220 230 240 ù ù ù ù ù ù IAGTAACCACAAGAGCGATCATAATC 5/ Séquence nucléotidique de Plasmodium falciparum selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchainement nucléotidique R45 répondant à la séquence suivante R45 10 20 30 40 50 60 ù ù ù ù ù ù CACAAGAGCGATAATAACCACAAAAGTGATAGTAACCACAAAAGTGATAGTA 7n 80 90 100 110 120 Ù Li b ù ù ù ACCACAAAAGTGATAGTAACCACAAGAGCGATCATAATCACAAGAGCGATCATAAGCACA 130 140 150 160 170 180 ù ù ù ù ù ù TGAGCGATAATAACCACAAGAGCGATAATAATCACAAGAGCGATAATAATCACAAGAGCG 190 200 210 220 230 240 ù ù ù ù ù ù ATCATAATCACAAGAGCGATAATAATCACAAGAGCGATCAGAATCACAAGAGTGATAGTA 250 260 270 280 290 300 ù ù ù ù ù ù ATCACAAGAGTGATAGTAACCACAAGAGTGATAGTAACCACAAGAGTGATAGTAACCACA 310 320 330 340 350 360 ù ù ù ù ù ù AGAGTGATAATAACCATAAGAGCGATCATAATCAC[AACAGT] 6/ Séquence nucléotidique de Plasmodium falciparum selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend 1'enchainement nucléotidique R51 répondant à la séquence suivante R51 10 20 30 40 50 60 ù ù ù ù ù ù AATTCCACAATCACATGAGCGATCATAATCACAAGAGTGATAATAACCATAAGAGTGATC 70 80 90 100 110 120 ù ù ù ù ù ù ATAATCACAAGAGTGATAGTAACCACATGAGCGATCATAACCACATGAGCGATCATAACC 130 140 150 160 170 180 ù ù ù ù ù ù ACAAGAGCGATCATAATCACAAGAGCGATCATAACCACAAGAGCGATAATAACCACAAAA 190 200 210 220 230 240 ù ù ù ù ù ù GTGATAGTAACCACAAAAGT[GAGGAATTCC] 7/ Séquence nucléotidique de Plasmodium falciparum selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend l'enchainement suivant ou toute partie de cet enchainement capable de coder pour un antigène susceptible d'être reconnu par des anticorps P falciparum ou d'induire de tels anticorps. Dde I CTGAGGAATGTCAAGGGGAAGTTTATTTATTTGTTAAAAAGATACCTATAGA -GGTATGGATAAGACAGTACAACTTGATGAATGATAATGATGGAGAATATTTATTAGATGG -GGAAAATTTTATTATGGAAGCAGTAGCCTGCGCTTATTTAAGCGAGCATTATCCTGGACT -CACACCTAAATTGTACAAGGTATTATATGAGCCTGAATGTGCTAACTGTAATGAAGAGGA -TAAGAATATGAGTGAAGATAATCATAAGAAGGATAGTAAACATAAGGGGGATAGTAATCA -CAAAAGTGATAGTAATCACAAAAGTGATAGTAATCACAAAAGTGATAGTAATCATAAAAG -TGATAGTAATCATAAAAGTGGTAGTAATCACAAAAGTGATTGTAATCACAAGAGTGGTAG -TAATCACAAGAGTGGTAGTAATCACAAGAGTGATAGTAATCATCAAAGTGATTGTAATCA # 80 REPETITIONS 18 bp -CGATCATAATCACAAAAGCGATCATAACCACAAGAGCGATAATAACCACAAGAGTGATCA -TAATCACAAAAGTGATCATAAAAAAAATAATAACAATAATAAGGATAATAAAAATGACGA -TAATGATGACAGTGATGCAAGCGATGCAGTTGATGAAGATATTGAGATACTTGAGTCTTA -TAGTGATTTGAATAAATTTAATGAGATGTTAACAGAACAATTAAATAAAAATAAGGATGG -ATATGTTGTTTTGGTTACTGAATTATTTGGTGAAGATCTTTTTCAATATATTAATAAAAG -GAATGAAAATGAAGATACGCGTGTAAGAGATGAAGATAAAAAAATAATTATGTTTGAATT -TTTAAAGTTATTAATAAAATTACATAATGCAGGATTGGTACATCTTGATATATCTCCTGA -AAATATATTGATAGAAAATAATGGTGAGTTACGCTTATGTGATCTAGCTAAATGTGCTCC -AATGTATACACACAATTTAAGACATATTAAAGGAAATGGAAACGATTTGTATTCATTTCA -ATCTTGTCAACCTTGTGTTGGAAAAATCCCATGTATTCCAAAAGAGTGTTGGGATATTAT -TAGACAACATATAAAATTAAAAATAGATAATCCTTTTGAACATTTATCAACTATTACTGA -TCAAGAAGAAAGAAAAAAATATTATTTTGATGTACATTGTGTAGATAAATATATGCTTGG -TATATTTTATATATGGATATGGAATTTAAATTATATATGGAAACGAGCTGACCCACCAAA -TGATAGAACATTTAATAATTTCTTAAAATATAATTTAAATATAAATGTATTTCAGTTAGC -CCAACAATGGCCAAAAGGTCTCAAAGATATAATTAACGTAAGATATATAAGAAAAAAAAA -AAAAAAAAAAAAAATAATAATAATAATAATGATGTTTTATATAGTATGTGCATAGTGAAT -GTTTTTTTTTTTTATTTTAATACATGAAATGATATATATATATATATATATATATATATT -TTCTCTTTATAGAAATTATTAAGCCTAGAAAAAGTAGAATGAGACAGACTTAAATGAATTA -ACTGAACATCCATGGTGGATTAATGAAGATTAATTTTAATTTTTTAAGTATTATATGAAT -ATTTATTATTAGTAGACTTTATATATAACAATAAATATTGACACTGTGCAATATTAAAAA -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATTAAAAAGGAATGTTTTATTGTTTAGGACTAT -ATGGAAAAATAATAATATATATATGTTTCCACATTAAAA...... *codons stop (3 phases) 8/ Séquence nucléotidique de Plasmodium falciparum caractérisée en ce qu'elle répond à l'un des enchainements I ou II suivants ou à une partie de ces enchainements codant pour un antigène reconnu par des anticorps contre P falciparum ou susceptible d'induire ou contribuer à la production in vivo de tels anticorps. I Dde CTGAGGAATGTCAAGGGGAAGTTTATTTATTTGTTAAAAAGATACCTATAGA -GGTATGGATAAGACAGTACAACTTGATGAATGATAATGATGGAGAATATTTATTAGATGG -GGAAAATTTTATTATGGAAGCAGTAGCCTGCGCTTATTTAAGCGAGCATTATCCTGGACT -CACACCTAAATTGTACAAGGTATTATATGAGCCTGAATGTGCTAACTGTAATGAAGAGGA -TAAG AATATGAGTGAAGATAAT AAAAATAATAACAATAATAAGGATAATAAAAATGACGA -TAATGATGACAGTGATGCAAGCGATGCAGTTGATGAAGATATTGAGATACTTGAGTCTTA -TAGTGATTTGAATAAATTTAATGAGATGTTAACAGAACAATTAAATAAAAATAAGGATGG -ATATGTTGTTTTGGTTACTGAATTATTTGGTGAAGATCTTTTTCAATATATTAATAAAAG -GAATGAAAATGAAGATACGCGTGTAAGAGATGAAGATAAAAAAATAATTATGTTTGAATT -TTTAAAGTTATTAATAAAATTACATAATGCAGGATTGGTACATCTTGATATATCTCCTGA -AAATATATTGATAGAAAATAATGGTGAGTTACGCTTATGTGATCTAGCTAAATGTGCTCC -AATGTATACACACAATTTAAGACATATTAAAGGAAATGGAAACGATTTGTATTCATTTCA -ATCTTGTCAACCTTGTGTTGGAAAAATCCCATGTATTCCAAAAGAGTGTTGGGATATTAT -TAGACAACATATAAAATTAAAAATAGATAATCCTTTTGAACATTTATCAACTATTACTGA - TcAAGAAGAAGAAATATTATTTTGATGTACATTGTGTAGATAAATATATGCTTGG -TATATTTTATATATGGATATGGAATTTAAATTATATATGGAAACGAGCTGACCCACCAAA -TGATAGAACATTTAATAATTTCTTAAAATATAATTTAAATATAAATGTATTTCAGTTAGC -CCAACAATGGCCAAAAGGTCTCAAAGATATAATTAACGTAAGATATATAAGAAAAAAAAA -AAAAAAAAAAAAAATAATAATAATAATAATGATGTTTTATATAGTATGTGCATAGTGAAT -GTTTTTTTTTTTTATTTTAATACATGAAATGATATATATATATATATATATATATATATT -TTCTCTTTATAGAAATTATTAAGCCTAGAAAAGTAGAATGAGACAGACTTAAATGAATTA -ACTGAACATCCATGGTGGATTAATGAAGATTAATTTTAATTTTTTAAGTATTATATGAAT -ATTTATTATTAGTAGACTTTATATATAACAATAAATATTGACACTGTGCAATATTAAAAA -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATTAAAAAGGAATGTTTTATTGTTTAGGACTAT -ATGGAAAAATAATAATATATATATGTTTCCACATTAAAA...... *codons stop (3 phases) 9/ Antigène de P falciparum susceptible d'induire la formation d' anticorps en particulier d' anticorps protecteurs contre P falciparum, caractérisé en ce qu'il s'agit du produit de traduction d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 10/ Antigène de P falciparum caractérisé en ce qu'il est susceptible d'induire des anticorps et en particulier des anticorps protecteurs contre P falciparum, et en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés comportant un oligopeptide constitué de n répétitions de peptides identiques ou non, répondant à la formule Asp b His Cys Ser,dans laquelle b est un acide aminé quelconque et de préférence Asn, His, Ser ou Cys ou une variante obtenue par substitution d'un ou plusieurs acides aminés dès lors que les propriétés antigèniques et/ou immunogènes de l'antigène fourni sont conservées, n étant suffisant pour que l'oligopeptide formé soit capable d'induire in vivo des anticorps qui reconnaissent l'antigène codé par la séquence nucléotidique de P falciparum répondant à la carte de restriction suivante GENE R45 11/ Antigène de P falciparum selon la revendication 10 en ce qu'il comprend l'une des séquences d'acides aminés suivantes 5 10 15 20 25 30 S E C Q S E V Y L F V E K I P I E V W I R Q T N L E N 35 40 45 50 55 60 D N D G E Y L L D G S N F I N E A V A C A Y L E S N I P S L 65 70 75 80 89 90 T P K I T E V L Y E P S C A N C H E E D K N N S N D N N E K 95 100 105 110 115 120 D S K/K K G U S N/N K S D S N /N K S N E N/N K S D S N/K K S 125 130 135 140 145 150 D S N/N L S C E N/N K S D N C /N K S G E N/N C S G S N/K K S 155 D S N/N Q S D C N .... # 80 REPETITIONS 6as D N N/L K S D E N/N K S D N N /N K S D N N/N K S D N K K E S N N K J D N K N D D N D D E D A S D A V D E D I E I L E S T S O L N K F N E K L T E Q L N K N K D G Y V V L V T E L F G E D L F Q Y I N K R N E N E D T R V R D E D E K I I N F E F L E L L I K L N N A G L V E L D I S P E N I L I E N N C E L A L C D L A K C A P M Y T E N L R N I K C N G E D L Y S F Q S C Q P C V G K I P C I P K E N W D I I R E N I E L K I D M P P E N L S T I T D Q E E R K K Y Y F D V E C V D E V E L S I F Y I W I W E L N Y I V K R A D F F N D R T F N N F L K Y N L S I N V F Q L A Q Q W P K G L K D I I N V Z Y I K K K K K K K K I I I I I N N F Y I V C A. 5 10 15 20 25 30 S E C Q G E V Y L F V E E I P I E V W I R Q Y N L N E 35 40 45 50 55 60 S N D G E Y L L D G S N F I N Z A V A C A Y L E E N T P G L 65 70 75 80 85 Y P K I T K V L Y E P E C A N C N E E D K K N S E D W K N N N N N K D N K N D D N D D E D A S D A V D E D I E I L E S T S O L N K F N E K L T E Q L N K N K D G Y V V L V T E L F G E D L F Q Y I N K R N E N E D T R V R D E D E K I I N F E F L E L L I K L N N A G L V E L D I S P E N I L I E N N C E L A L C D L A K C A P M Y T E N L R N I K C N G E D L Y S F Q S C Q P C V G K I P C I P K E N W D I I R E N I E L K I D M P P E N L S T I T D Q E E R K K Y Y F D V E C V D E V E L S I F Y I W I W E L N Y I V K R A D F F N D R T F N N F L K Y N L S I N V F Q L A Q Q W P K G L K D I I N V Z Y I K K K K G G K K I I I I I N N F Y I V C A. 12/ Antigène de P falciparum selon la revendication 10 en ce qu'il comprend l'une des séquences d'acides aminés R23, R45 ou R51 suivantes R45 HisLysSerAspAsnAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsn HisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspHisLysHisMet SerAspAsnAsnHisLysSerAspAsnAsnHisLysSerAspAsnAsnHisLysSerAsp HisAsnHisLysSerAspAsnAsnHisLys-SerAspHisAsnHisLysSerAspSerAsn HisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLys SerAspAsnAsnHisLysSerAspHisAsnHis R51 .HisAsnHisMetSerAspHisAsnHisLysSerAspAsnAsnHisLysSerAspHis AsnHisLysSerAspSerAsnHisMetSerAspHisAsnHsMetSerAspHisAsnHis LYSSerASPHÎsASflHisLysSerAspHisAsnHisysSerAspAsnAsnHisLysSer AspSerAsnHisLysSer R23 fHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspSerAsn AsnHisLysSerAspSerAsnHisMetSerAspHisAsnHisMetSerAspHisLys SerAspAsnAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAsp SerAsnHisLysSerAspHisAsn 13/ Antigène de P falciparum selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'induire in vivo la production d'anticorps protecteurs cytophiles, notamment des anticorps d'isotypes IgG1, IgG3. 14/ Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, le cas échéant sous le contrôle d'un promoteur et des éléments de régulation pour l'expression dans un hôte cellulaire déterminé. 15/ Vecteur recombinant selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il s'agit de pMS, Agtll, pGEX. 16/ Polypeptide recombinant caractérisé en qu'il comprend une séquence antigénique selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, en association avec un polypeptide, notamment un polypeptide caractéristique d'un stade sanguin ou hépatique de l'infection de P falciparum, par exemple l'antigène 96TR ou encore un polypeptide ou une protéine porteuse notamment la 8-galactosidase, l'anatoxine tétanique, l'ovalbumine, la sérum albumine, l'hémocyanine, le PPD de la tuberculine ou encore une molécule porteuse synthétique. 17/ Hâte cellulaire recombinant, caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, dans des conditions permettant l'expression de la séquence de P falciparum selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, et en ce qu'il s'agit notamment d'une bactérie telle que E.coli, d'une levure, d'une cellule d'insecte ou d'une cellule de mammifère telle que CHO. 18/ Hôte cellulaire selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche SB275 déposée à la CNCM sous le n"I-986 le 27 Juillet 1990. 19/ Hôte cellulaire selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche SG363 déposée à la CNCM sous le n" I-987 le 27 Juillet 1990. 20/ Composition vaccinante, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif un antigène selon l'une quelconque des revendications 9 à 14. 21/ Composition vaccinante selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un autre antigène des stades sanguin ou hépatique de P falciparum. 22/ Utilisation des séquences nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou des antigènes de P falciparum selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, pour la détection in vitro de la présence de P falciparum dans un échantillon biologique chez un patient susceptible d'être infecté par cet agent. 23/ Kit pour la détection in vitro de la présence d'anticorps dirigés contre les antigènes selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce qu'il contient - une composition antigénique comprenant au moins un antigène selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, - des réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction immunologique entre les susdits antigènes et les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique, - des réactifs permettant la détection du complexe antigène-anticorps produit par la réaction immunologique.