Brevet FR2666589A1 — publié le 19920313

Nouveaux virus herpès recombinants, vaccin à base de ces recombinants, leur procédé de préparation, gènes, vecteurs et plasmides utilisés dans ce procédé. La présente invention concerne des virus herpès recombinants, notamment pour la réalisation de vaccins, leur procédé de préparation et les plasmides réalisés au cours de ce procédé Elle concerne encore une partie du génome du10 virus de la maladie de Marek (MDV) qui est susceptible d'être utilisée pour la préparation de tels vaccins. Différents types de virus ont été utilisés comme vecteurs d'expression de gènes étrangers, en particulier de gènes codant pour des protéines antigéniques, et ont15 démontré leur potentiel pour l'immunisation des animaux Le virus de la vaccine a été largement utilisé pour la construction de virus recombinants Les virus herpès ont été également employés: le virus herpès simplex (HSV) (M Shih et al, Proc Natl Acad Sci, USA, 1984, 81, 5867-5870), le virus de la varicelle (VZV) (R Lowe et al, Proc Natl. Acad Sci, USA, 1987, 84, 3896-3900) Le gène étranger est inséré dans un fragment d'ADN génomique du virus herpès, correspondant à une région non essentielle pour la réplication virale, cloné dans un plasmide Ce gène est transféré dans le génome viral par recombinaison homologue. Cette dernière étape est effectuée par cotransfection de 1 'ADN génomique herpès et du plasmide puisque cet ADN génomique est naturellement infectieux. Différents gènes de virus herpès ont été identifiés comme non essentiels à la croissance virale, certains de ces gènes étant associés à la virulence. Le gène de la thymidine kinase du virus herpès simplex (D Dubbs et al, Virology, 1965, 22, 493-502), du virus d'Aujeszky (G Tatarov, Zentralbl. Vet Med, 1968, 15 B, 848853), du virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine (S Kit et al, Virology, 1983, 130, 381-389). Le gène g III du virus d'Aujeszky (A Robins et al, J Virol, 1986, 59, 635-645). Le gène g X du virus d'Aujeszky (D Thomsen et al, J Virol, 1987, 61, 229-232). Le gène g I du virus d'Aujeszky (C Mettenleiter et al, J Virol, 1987, 61, 4030-4032). Ces virus délétés gardent la capacité de produire une infection latente chez la souris. Des travaux similaires ont été entrepris sur le virus de la maladie de Marek qui appartient à la sous-famille des gamma herpès virus C'est un virus enveloppé possédant un ADN génomique linéaire double brin d'environ 175 kilobases. Son génome est composé d'un segment long (UL) et d'un segment court (Us) entourés par des séquences terminales inversées répétées. Le virus de la maladie de Marek cause des paralysies et une maladie lymphoproliférative chez le poulet, généralement à l'âge de 2 à 5 mois Cette maladie entraîne des pertes économiques très importantes (L Payne, Biology of Marek's disease virus and the herpesvirus of turkeys, dans The Herpesvirus, vol 1, p 347-431, édité par B. Roizman, Plenum Press). Les souches du virus de la maladie de Marek ont été classées en trois sérotypes: le sérotype 1 comprend les souches pathogènes et les souches atténuées qui en dérivent, le sérotype 2 comprend les souches naturellement atténuées, le sérotype 3 comprend le virus de l'herpès du dindon (HVT) et ses variants. Par la suite, le terme virus de la maladie de Marek atténué désignera à la fois les sérotypes 1, 2 et 3. Les virus de la maladie de Marek (MDV) et de l'herpès du dindon (HVT) possèdent des organisations génomiques analogues (A Buckmaster et al, J Gen Virol 1988, 69, 2033-2042) et de nombreuses homologies de séquence tout au long de leur génome (C Gibbs et al, Proc Acad Natl Sci. USA 1984, 81, 3365-3369). Les poussins sont vaccinés à I'âge d'un jour et sont protégés ensuite contre la maladie de Marek pendant leur vie entière Pendant de nombreuses années, la vaccination à l'aide du virus herpès du dindon vivant (HVT) a été très efficace pour contrôler la maladie. Néanmoins, l'émergence de nouvelles souches virales hautement virulentes a amené l'utilisation de souches de virus de la maladie de Marek atténuées d'un autre sérotype, pour vacciner et augmenter ainsi le niveau de protection, soit par exemple la souche CVI 988, MDV sérotype 1 atténué par passages sur cellules (B Rispens et al, Avian Dis. 1972, 16, 1108-125), soit par exemple l'association des souches HVT MDV sérotype 3 et SB 1, MDV sérotype 2 (K Schat et al, J Natl Cancer Inst, 1987, 60, 1075-1082). Des études portant sur la région courte unique du génome du virus herpès simplex HSV-1 ont été conduites (B. Megnier et al, Virology, 1988, 162, 251-254) et ont montré que des virus HSV-1 délétés dans la région courte ont subi une atténuation. Le génome du virus de Marek possède certaines similarités avec le génome des alphavirus, herpès simplex (HSV) et varicelle (VZV) La plupart des gènes localisés dans la longue région UL du génome sont approximativement colinéaires entre les virus herpès simplex, varicelle (D Mc Geoch, J Gen Virol, 1988, 69, 1531-1574) et virus de la maladie de Marek (A Buckmaster, 1988). Par contre, la localisation des gènes dans le segment Us montre une plus grande divergence entre virus herpès. Aussi parmi les douze phases de lecture identifiées pour le virus herpès simplex, seulement quatre présentent une homologie avec le virus de la varicelle (Mc Geoch, 1988, déjà cité). De fait, l'art antérieur ne suggère pas qu'il y ait un intérêt à procéder à une étude d'homologie des cadres de lecture ouverts de la région courte unique du génome du virus de la maladie de Marek avec des gènes de HSV-1. La présente invention divulgue pour la première fois la séquence codant pour la protéine kinase du génome du virus de la maladie de Marek (MDV) et a permis d'établir, de façon surprenante, que ce gène pouvait être délété sans bloquer la réplication virale et permettre l'insertion de séquences hétérologues ouvrant la voie au développement d'une série de vecteurs d'expression viraux. Un tel virus de la maladie de Marek recombinant et atténué constitue un candidat de choix pour le développement d'un vecteur viral exprimant des gènes étrangers destinés à la vaccination polyvalente des volailles puisqu'il présente l'avantage de pouvoir être utilisé pour ses propriétés vaccinales propres et comme vaccin contre d'autres maladies virales, bactériennes ou parasitaires, comme par exemple la bronchite infectieuse aviaire, la maladie de Newcastle, la peste aviaire, le syndrome chute de ponte, la maladie de Gumboro, l'anémie aviaire, la coccidiose, la variole aviaire, la laryngotrachéite infectieuse, la colibacillose, la pasteurellose, l'hémophilose. RESUME DE L'INVENTION L'invention a pour objet de fournir des virus herpès recombinants, y compris un virus de la maladie de Marek atténué (sérotypes 1, 2 ou 3) recombinant utilisable comme vaccin, la méthode pour construire un tel virus recombinant ainsi qu'un virus vecteur permettant la vaccination multivalente contre des maladies aviaires virales, bactériennes ou parasitaires. L'invention a pour objet la séquence nucléotidique et ses variantes correspondant au gène U 53 homologue du gène de la protéine kinase du virus herpès simplex et aux régions environnantes. L'invention a pour objet un virus recombinant choisi parmi les virus herpès, y compris les virus de la maladie d'Aujesky, de la rhinotrachéite infectieuse des bovins, de la rhinopneumonie équine, de la rhinotrachéite féline, de l'herpès canin. L'invention a également pour objet un virus de la maladie de Marek recombinant comprenant un ou plusieurs gènes hétérologues insérés dans la région de son génome correspondant au gène U 53 de manière à pouvoir être exprimés. Par "gène hétérologue", on entend notamment un gène codant pour une protéine ou une glycoprotéine immunogène d'un agent pathogène viral, bactérien ou parasitaire, notamment une agent associé à une pathologie aviaire Cela concerne également la construction de virus hybrides, par exemple en introduisant, dans le génome d'un virus herpès du dindon, des gènes codant pour des immunogènes d'un virus de la maladie de Marek du sérotype 1 et/ou du sérotype 2. On entend également par "gène hétérologue" un gène codant pour un peptide ou une protéine, par exemple hormone, facteur de croissance, immunomodulateur. Le gène hétérologue est exprimé de préférence sous le contrôle des séquences régulatrices de la transcription du gène U 53 On peut cependant faire en sorte que cette expression soit contrôlée par une séquence promotrice provenant d'un autre gène du virus considéré, par exemple le promoteur du gène TK, du gène g A, du gène g B, ou d'un autre virus herpès, par exemple le promoteur du gène g I du virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine ou du gène Il ou du gène III du virus d'Aujeszky. De préférence, on substitue les codons d'initiation et de terminaison du gène U 53 par ceux du gène à exprimer. DESCRIPTION DES FIGURES. La figure 1 représente la construction du plasmide p MDV 53 L qui contient le gène Lac Z inséré à la place du gène U 53. La figure 2 représente la construction du plasmide p MDV 53 CL qui contient le gène Lac Z sans le contrôle du promoteur i E du cytomégalovirus humain à la place du gène U 53. La figure 3 représente la plasmide p MDV 53 F qui contient le gène de la protéine fusion du virus de la maladie de Newcastle à la place du gène U 53. DESCRIPTION DE L'INVENTION: MATERIELS ET METHODES. Souche virale. La souche sérotype 1 RB 1 B du virus de la maladie de Marek (MDV) a été utilisée (Schat K A et al, 1982, Avian Pathol 11, 593-605). Les méthodes de culture du virus et d'extraction d'ADN viral de haut poids moléculaire ont été décrites (C Lee et al, 1980 J Gen Virol 51, 235-253; N Ross et al 1989, 70, 1789-1804). Culture cellulaire. Les fibroblastes d'embryon de poulet (CEP) ont été cultivés en milieu 199 F 10, supplémenté en pénicilline, streptomycine, fungizone et sérum de veau foetal, comme décrit (N Ross 1975, J Gen Virol 28, 37-47). Clonaqe de l'ADN viral De manière générale, les techniques utilisées pour la construction des plasmides recombinants sont celles décrites par T Maniatis et al (T Maniatis et al, 1982, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Pour toutes les étapes de clonage ou de sous-clonage, le vecteur linéarisé par les enzymes de restriction appropriées est déphosphorylé avant ligation La purification des fragments d'ADN à partir d'un gel d'agarose est faite selon la technique décrite par le fabricant: "Geneclean" (Bio 101, San Diego, Californie, USA). Séquenqaqe. Les fragments clones sont séquences selon la technique classique décrite par Sanger (G Sanger, S.Nicklen, A Coulson, 1977, Proc Natl Acad, USA 74, 5463-5467) Les séquences après traduction ont été comparées aux séquence publiées de virus herpès simplex et varicelle (Mc Geogh, 1985, J Mol Biol 181, 1, 13; K Davison et al 1986, J Gen Virol 67, 1759-1816). Mutagénèse dirigée. Les fragments d'ADN, sous-clonés dans le vecteur Blue Script (Stratagene, La Jolla, Californie, USA) sont mutagénéisés après séparation des AD Ns simple brin à l'aide du phage helper R 408 (Stratagene, La Jolla, Californie, USA)20 (M Russel, S Kidd, M Kelley, 1986, Gene 45, 333-338). La procédure de mutagénèse et de sélection des mutants en utilisant la souche CJ 236 dut-, ung d'E Coli (In Vitrogen, San Diego, Californie, USA) est décrite par T Kunkel, (T Kunkel 1985, Proc Natl Acad Sci, 82, 488-492 et T Kunkel et al, 1987, Methods of enzymology 154, 367-382, Acad Press). Recombinaison in vivo. Les virus recombinants sont obtenus selon les techniques classiques de transfection des cellules sensibles, telles que la méthode au phosphate de calcium ou celle utilisant le réactif Lipofectine décrite par le fabricant BRL (P L Felgner et al, 1987, Proc Natl Acad. Sci, USA, 84, 7413) Pour cela, les fibroblastes d'embryons de poulet, cultivés jusqu'à confluence, sont cotransfectés avec de l'ADN génomique et le plasmide porteur du fragment d'ADN à insérer, flanqué en 5 ' et 3 ' des séquences du génome qui permettent la recombinaison. Les virus recombinants peuvent ensuite être criblés par hybridation avec une sonde appropriée ou par la coloration des plages Lorsqu'un gène marqueur, le gène lac Z de la 1-galactosidase, est inséré dans le génome du virus de10 la maladie de Marek, l'expression de ce gène peut être suivie en additionnant, à la couche cellulaire, une surcouche d'agarose renfermant le substrat chromogène pour la 9- galactosidase, e g Xgal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl, B.D galactopyranoside).15 Exemple 1: Isolement d'un fragment Eco RI de 5,25 kilobases. L'ADN génomique viral a été digéré par l'enzyme de restriction Eco RI et les fragments clones dans le vecteur p UC 13 (Pharmacia) (Yannisch, Perron et al, 1985, Gene 33, 103-119). Parmi les fragments clones, un fragment de 5,25 kilobases, localisé au niveau du petit fragment Us, a été plus particulièrement analysé par séquençage (p MDV 05; séquence ID n 1). La séquence renferme six cadres de lecture ouverte (ORF) Les séquences traduites de 4 de ces ORF présentent une homologie avec des protéines de virus HSV de type I, localisées dans le fragment Us En particulier le gène U 5330 du virus de la maladie de Marek présente une homologie avec le gène de la protéine kinase du virus herpès simplex. De manière surprenante, l'étude de cette région a montré que le gène U 53 pouvait être délété sans bloquer la réplication virale. Exemple 2: Construction d'un plasmide p MDV 53 L pour lequel le gène U 53 a été remplacé par le gène lac Z (figure 1). Le fragment Eco RI de 5, 25 kilobases issu du clone p MDV 05 a été digéré par l'enzyme Nco I et les extrémités ainsi générées réparées par l'ADN polymérase fragment Klenow Il a ensuite été digéré par l'enzyme Kpn I, et le fragment de 1989 paires de bases ainsi libéré a été cloné dans le vecteur Blue Script linéarisé par les enzymes Eco RV et Kpn I pour donner le plasmide p MDV 52 de 4947 paires de bases. Les sites Nco I et Sal I ont été introduits respectivement aux extrémités 5 ' et 3 ' du fragment cloné par mutagénèse dirigée en utilisant les oligonucléotides désignés par Seq ID n 2 et 3, dans la liste des séquences annexées, ce qui génère le plasmide p MDV 53 Le gène lac Z a été purifié à partir du plasmide p MC 1871 (Pharmacia LKB, Uppsala, Suède) (S K Shamira et al 1983, Gene 25, 71- 82) par digestion par les enzymes Sma I et Sal I. Il a ensuite été inséré dans le plasmide p MDV 53, digéré partiellement par 1 ' enzyme Nco I, traité par 1 ' ADN polymérase fragment Klenow, et digéré ensuite par l'enzyme Sal I, ce qui génère le plasmide p MDV 53 L d'environ 6687 paires de bases. Exemple 3: Préparation d'un virus de la maladie de Marek renfermant le gène lac Z. Les fibroblastes d'embryon de poulet ont été 1 l cotransfectés avec l'ADN génomique total du virus et l'ADN du plasmide p MDV 53 L linéarisé ( 10 à 50 pg) Les cultures ont été suivies pendant 4 à 6 jours jusqu'à l'apparition de foyers infectieux Alternativement les cellules sont 5 trypsinées après 72 h, puis réinoculées ( 1:1 ou 1:2) en un passage secondaire, et cela jusqu'à l'obtention de plages de lyse. Le milieu est alors remplacé par du milieu neuf renfermant 1 % d'agarose et 0,5 % d'Xgal. Les foyers dus aux virus recombinants se distinguent par leur coloration bleue. Les virus peuvent alors être purifiés par plaque- purification et, après inoculation à des cellules saines, donnent des figures d'effet cytopathogène colorées15 en bleu en présence d'Xgal. Exemple 4: Construction du plasmide p MDV 53 CL qui renferme le gène lac Z sous contrôle du promoteur immédiat précoce du cytomégalovirus humain (CMV) (figure 2).20 Le gène lac Z de la 1-galactosidase a été placé sous le contrôle du promoteur immédiat précoce du cytomégalovirus humain (IECMV) dans le vecteur p CMV-Lac Z. Le fragment d'environ 4500 paires de bases renfermant l'ensemble, le promoteur IE du cytomégalovirus et le gène lac Z, a été digéré par l'enzyme Eco RI, et les extrémités remplies par l'ADN polymérase fragment Klenow Il a ensuite été digéré par l'enzyme Sal I. Le fragment ainsi libéré a été cloné dans le vecteur p MDV 53 digéré partiellement, par 1 ' enzyme Nco I, traité par l'ADN polymérase fragment Klenow, et digéré ensuite par l'enzyme Sal I Ce plasmide d'environ 8200 paires de bases construit est dénommé p MDV 53 CL. Exemple 5: Construction d'un virus Marek recombinant pour lequel le gène lac Z a été introduit sous le contrôle du promoteur immédiat précoce du cytomégalovirus, à la place du gène U 53. Les CEP ont été cotransfectées avec de l'ADN génomique du virus et de 10 à 50 mg d'ADN du plasmide p MDV 53 CL linéarisé. On peut ainsi obtenir des virus recombinants qui se distinguent par l'apparition de foyers infectieux colorés en bleu en présence du substrat chromogène Xgal Ces virus ont été purifiés selon la technique de purification de plages et ont permis d'infecter des fibroblastes d'embryon de poulet secondaires. Des foyers infectieux colorés en bleu peuvent être obtenus en présence d'Xgal, ce qui montre que le gène lac Z est inséré à la place du gène U 53. Exemple 6: Construction du plasmide p MDV 53 F qui renferme le gène de la protéine fusion du virus de la maladie de Newcastle à la place du gène U 53 (figure 3). Le gène fusion (J Taylor at al, 1990, J Virol. 64, 1441-1450) a été introduit sous forme d'un fragment à extrémités franches dans le vecteur Blue Script au site Sma I pour donner le plasmide p NF 1 de 5300 paires de bases. Des sites Nco I et Sal I ont été introduits par mutagénèse dirigée au niveau des codons ATG, et Stop, du gène fusion, grâce aux oligonucléotides répertoriés SEQ ID n 4 et SEQ ID n 5 respectivement dans la liste des séquences annexées. Le fragment de 1682 paires de bases Nco I/Sal I provenant de plasmide p NF 2, a été inséré dans le vecteur p MDV 53 digéré partiellement par l'enzyme Nco I et digéré par l'enzyme Sal I pour donner le plasmide p MDV 53 F de 5369 paires de bases. Exemple 7: Construction d'un virus de la maladie de Marek renfermant le gène de la protéine fusion du virus de la maladie de Newcastle. Les fibroblastes d'embryon de poulet ont été cotransfectés avec l'ADN génomique total du virus et de 10 à 50 mg d'ADN linéarisé du plasmide p MDV 53 F Les cultures ont été suivies jusqu'à apparition de foyers infectieux. Les virus recombinants ont ensuite été criblés par hybridation avec une sonde renfermant le gène fusion. Des procédures similaires sont utilisées pour la construction de virus herpès recombinants non aviaires, par insertion d'un gène hétérologue dans la région Us et en particulier dans le gène homologue au gène U 53 du virus de Marek. L'invention concerne également les vaccins, vivants ou non, constitués par ou contenant les virus recombinants construits selon l'invention, ou contenant des immunogènes exprimés par ces virus. ANNEXE 1 LISTE DES SEQUENCES SEO ID N 1 Longueur de la séquence: 5 255 paires de bases Type de molécule séquencée: ADN génomique Origine de la molécule: virus de la maladie de Marek, souche RB 1 B Source expérimentale: plasmide p MDV 05 Caractérisques: de 1 à 324 paires de bases: région non codante de 325 à 1 135 paires de bases: gène U 51 Le gène est codé par le brin d'ADN complémentaire à la séquence indiquée et est transcrit de droite à gauche (SEQ ID N 1 B) 623 à 1 214 paires de bases 1 215 à 1 245 paires de bases 1 246 à 2 451 paires de bases 2 452 à 2 563 paires de bases 2 564 à 3 004 paires de bases 3 005 à 3 190 paires de bases 3 191 à 4 384 paires de bases 4 385 à 4 494 paires de bases 4 495 à 5 253 paires de bases : gène U 52 : région non codante : gène U 53 : région non codante : gène U 54 : région non codante : gène U 55 : région non codante : gène U 56 de de de de de de de de de CAAAAATTTACATTAGTAATCTTTCTCGGTGGCTTACCAAATCGTCCTCTTGGTATATCCATATCATCGAAC 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ATA L As A Af A ie ATT Aif Ai TC A-sp -AT AT; Tr Leu Leu ACA CTT CTA Thr Leu Trp ACT TTA TGG Gly Val Pro ii T GTG CCC Leu le Leu i TTA ATT CTT Thr Gi Val ACT GGA GTIT Leu Ph'e u C Ti A TTT AA Tyr Leu Me-t TT T Tf-i AT V-al Gly Aa 1 Gi TT GGG Gl GC Gi Ar-g L eu Leu E i T A f- 1 Ut C u: -v 7 r Ar-o Asp Asa Prc 61 u 'Jsi F A G MA G AA GT ieu 1 Lys y Se f-C AT E TACC Sef Ser Tfr- A Gie T A-C-T AC:A -Srg,4,p A 1-l, P.3 Gi AT Ge CG; ih Lys Lys C-AG ^^^r' ^^^ts Asp lle ATA Ilte i ATA Pro CCT ti-, Arg is_ As 3 p bi AT Eau Ala Cy CA ATT Pr-o AT-T Gl u GAA TTC Tie i ATC Arg Vai 2 fii GTT G lu A Asp r AT C, e ATC A-. Pr-o i CA Ar-g AGA-'f Cys Leu CTT V a il Gtn CAA Thr Ata GCA T -r ATA Ls Ai AA Thr Hls CAT Ashf Ai AT ATT Aia C GAT f. 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