Brevet FR2671099A1 — publié le 19920703

La présente invention concerne un procédé de production de tréhalose par fermentation. On entend par tréhalose dans la présente demande l'isomère de a, a-tréhalose rencontré dans la nature. C'est un disaccharide constitué de deux molécules de glucose reliées entre elles par une liaison (1-1). Le a, a-tréhalose ou encore a-D-glucopyranosyl-D-glucopyranoside a pour formule Le tréhalose a été isolé la première fois de l'ergot de seigle par WIGGERS en 1832. Depuis, il a été trouvé chez un grand nombre d'organismes différents. I1 a été découvert chez de nombreuses bactéries, notamment chez les bactéries proches des champignons que sont les actinomycètes. Il est présent chez les spores et myceliums des streptomycètes (1) et chez les corynebactéries (2). Récemment, le tréhalose a été découvert chez un certain nombre de archaebactéries (3), halophiles, thermophiles et méthanogènes. Enfin de nombreuses cyanobactéries (4) accumulent le tréhalose. Chez la plupart de ces organismes, une grande partie du tréhalose est estérifié avec des acides gras à longues chaînes. Il semble dans ces cas que le tréhalose libre ne soit qu'un précurseur du tréhalose estérifié (5). Une grande partie du tréhalose présent chez les bactéries telles que mycobactéries, nocardia et corynebactéries est estérifiée et devient un constituant de la paroi bactérienne. Ainsi, le composé toxique des membranes cellulaires de Mycobactérium tuberculosis, appelé "cord factor" est un glycolipide, l'a, a-tréhalose 6,6'-diester de l'acide mycolique. Si des glycolipides similaires ont été trouvé chez d'autres organismes, Nocardia et Corynebacterium (5), le tréhalose est quant à lui estérifié avec d'autres acides gras (nocardique et corynomycolique) à la place de l'acide mycolique. Chez les bactéries pouvant utiliser les hydrocarbures (6), le "cord-factor" aurait un puissant effet émulsifiant et permettrait aux enzymes microbiennes d'accéder au substrat qui possède une très faible solubilité dans l'eau. La quantité de tréhalose produite dans le monde est inférieure à la tonne et est utilisée uniquement comme produit de laboratoire. Actuellement, le tréhalose est produit industriellement principalement par fermentation et extraction à partir de levures. Les procédés de production par fermentation de levures sont caractérisés par une accumulation de tréhalose intracellulairement suivi d'une extraction du tréhalose contenu dans les cellules. Il est également possible de faire une synthèse chimique en traitant du 2,3,4,6 tétra-O-benzyl D-glucopyranoside avec deux équivalents du chlorure du glycosyl correspondant, on obtient de l'a, tréhalose et de l'a, ss-tréhalose avec des rendements de 18 % et 2 % respectivement. Le problème de cette synthèse chimique est l'obtention du mélange racémique. On peut également citer une méthode enzymatique de synthèse de tréhalose à partir de maltose. Le procédé utilise deux enzymes : la maltose phosphorylase et la tréhalose phosphorylase, le taux de conversion obtenu est de 60 %. Le procédé enzymatique implique cependant une matière première plus chère et surtout des enzymes dont le coût est très élevé. En outre, la purification est rendue difficile à cause de la présence en quantité importante de glucose ou de maltose dans le milieu final. La production de tréhalose par fermentation bactérienne est pratiquement inexistante dans la littérature. Il existe des publications décrivant des souches excrétant le tréhalose dans le milieu extérieur (dont Nocardia, Brevibacterium, Arthrobacter) mais les conditions de production et les performances rapportées ne sont pas susceptibles de permettre une production industrielle importante dans des conditions économiques intéressantes. Le but de la présente invention est de fournir un procédé de production de tréhalose par fermentation de microorganisme dans des conditions économiques intéressantes pour une production industrielle. La présente invention fournit en effet un procédé de production de tréhalose par fermentation, caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme produisant naturellement du tréhalose sur un milieu de culture contenant au moins une source de carbone dans des conditions induisant une variation de la pression osmotique du milieu de culture. Dans le procédé selon l'invention, la fermentation peut être conduite en discontinu, semi-continu ou continu. De préférence, le milieu de culture contient du potassium dans une quantité d'au moins 1 g/l. Cette concentration en potassium est essentielle pour la survie du microorganisme puisque l'entrée du potassium dans la cellule est la réponse primaire du microorganisme à une élévation de la pression osmotique. Dans un deuxième temps, le potassium contribue à l'induction de la réponse secondaire. Cette réponse secondaire consistant en l'augmentation de la concentration intracellulaire soit du tréhalose, soit d'un autre composé. Les performances du procédé selon l'invention permettent d'extraire le tréhalose produit en utilisant les techniques classiques de l'industrie. Dans un mode de réalisation, on contrôle la variation de pression osmotique de façon à créer un gradient de pression durant la fermentation tel que la variation de pression osmotique entre la pression osmotique initiale et la pression osmotique finale soit comprise entre 1000 et 5000 mosmoles et de préférence de 2000 mosmoles. Selon une caractéristique du procédé selon l'invention, on provoque la variation de pression osmotique du milieu par addition d'un composé osmoinducteur tel qu'un sel, notamment KCl, NaCI, (NH4)2S04 ou un sucre ou encore un composé sucre-alcool du type glycérol, sorbitol ou mannitol, ou des mélanges de ces composés. Selon une autre caractéristique du procédé selon l'invention, on déclenche et/ou amplifie l'excrétion du tréhalose dans le milieu - en effectuant un ajout dans le milieu de tensioactif(s) cationique(s) ou neutre(s) et/ou ou d'antiobiotiques, - et/ou en provoquant une variation de la température comprise entre 1 et 200C, de préférence 5 et 100C par rapport à la température normale de croissance - et/ou en ajustant la concentration en vitamine notamment biotine et desthiobiotine au minimum nécessaire pour assurer la croissance du microorganisme. L'originalité du procédé de production de tréhalose selon l'invention réside donc dans le contrôle de la pression osmotique du milieu de culture couplé le cas échéant à l'excrétion naturelle ou induite du tréhalose dans le milieu extérieur. Toute cellule tend à établir et à maintenir dans le milieu intracellulaire une pression osmotique supérieure à celle du milieu exocellulaire. Cette "pression de turgescence" est nécessaire à une croissance normale des bactéries. Lorsque la bactérie est soumise à un choc hyperosmotique, elle met en route divers processus de régulation osmotique afin de maintenir sa pression de turgescence. Par ailleurs, il semble que le tréhalose aurait une fonction de protection des cellules contre les stress naturels, tels que stress hydrique ou thermique. L'effet protecteur du tréhalose s'effectuerait au niveau de membranes en maintenant leur fluidité et leur intégrité. Dès lors, les conditions de stress qui résultent notamment de la variation de la pression osmotique du milieu et le cas échéant la forte excrétion de tréhalose qui caractérisent le procédé selon l'invention pourraient résulter d'un phénomène de régulation des cellules. Les microorganismes utiles dans le procédé sont notamment du genre Corynebacterium, Brevibacterium, Nocardia, Escherichia, Bacillus arthrobacterium, Streptomyces, Microbacterium, de préférence Corynebacterium ou Brevibacterium. Les souches sont choisies pour leur capacité à produire du tréhalose pour leur capacité à excréter du tréhalose (avec ou sans additif) pour leur capacité à croître et à fermenter sur au moins un sucre; pour leur croissance rapide pour leur nature aérobie pour leur capacité à croître et à fermenter sur un milieu à haute pression osmotique. Une souche utilisée pour illustrer l'invention est un Corbynebacterium glutamicum, bactérie Gram+, Corynebacterium melaseccola ATCC n" 17965. Elle est auxotrophe pour la biotine. Dans un mode de réalisation du procédé selon l'invention a) on effectue une préculture en aerobiose à 30"C dans un milieu de préculture contenant au moins un sucre, des sels minéraux notamment de phosphate et/ou magnésium, des vitamines telles que biotine, desthiobiotine b) on inocule le milieu de pied avec le milieu de préculture. Le milieu de pied contient - de 50 à 100 g/l de sucre, - des sels minéraux notamment de phosphate et/ou de magnésium, et au moins 1 g/l de potassium, - des vitamines telles que biotine et desthiobiotine, - une source d'azote, telle que (NH4)2SO4 ou des hydrolysats acides de protéines et des extraits de bactéries ou de levures.Dans ces conditions de concentration la pression osmotique est comprise entre 400 et 2000 mosmoles, notamment entre 600 et 2000 mosmoles c) on effectue l'étape de croissance et fermentation sous agitation rigoureuse - à un pH compris entre 7 et 8 et une température comprise entre 30 et 420 C, notamment entre 32 et 380 C, - le milieu d'alimentation comportant une concentration en sucre de 500 à 1000 g/l et, - les concentrations en composé osmoinducteur ainsi que les concentrations en composés favorisant l'excrétion du tréhalose, notamment les tensioactifs et vitamines sont ajustés de telle façon que la pression osmotique augmente d'au moins 1000 mosmoles par rapport à la valeur initiale et la pression osmotique finale atteigne 1500, voire 5000 mosmoles. L'adaptation du pH varie selon la souche bactérienne pour Corynebacterium, le pH optimum extracellulaire de croissance de la souche est de 7,8. En particulier, à l'étape c), le milieu d'alimentation peut contenir une concentration en composés osmoinducteurs pilotée de façon à obtenir en fin de fermentation une pression osmotique comprise entre 1500 et 5000 mosmoles, la concentration en sel osmoinducteur peut être par exemple de 100 à 500 g/l. Lorsque la vitamine est la biotine la concentration en biotine peut être notamment de l'ordre de 5 ug/l. Le milieu pied représente en général 40 à 70 % du volume final, le milieu d'alimentation représentant respectivement 60 à 30 % du volume final. Dans le procédé de fermentation selon l'invention, la durée de fermentation est courte : 20 à 40 heures ; le rendement de tréhalose/sucre (p/p) élevé 15 à 20 % ; la concentration finale dans le milieu importante 15 à 50 g/l ; le tréhalose est présent dans le milieu extérieur ; la concentration de sucre autre que le tréhalose est très faible en fin de fermentation ((1 %). Le procédé peut être exécuté en continu ou en discontinu, dans des fermenteurs d'une capacité pouvant varier de quelques litres à quelques centaines de mètres cubes. La matière première sera par exemple le sucre choisi parmi le glucose, fructose ou saccharose ou des matières premières en comportant, comme les mélasses, les sirops, les hydrolysats d'amidon. De façon appropriée, on extrait le tréhalose après environ 40 heures de culture. L'extraction peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme de l'art par séparation des bactéries par filtration, ultrafiltration et/ou centrifugation, éventuellement par concentration, éventuellement par acidification (enlèvement des acides organiques contaminants), éventuellement par filtration, éventuellement par neutralisation, par un passage sur résine anionique et/ou cationique, éventuellement par une concentration, éventuellement par cristallisation, éventuellement à froid ou éventuellement par l'addition d'alcool, passage sur résine cationique puis anionique, une concentration (rendement 90 %, 90% de pureté) et/ou cristallisation à froid avec ou sans addition d'alcool (rendement 30 %, 96 % de pureté). D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre 1. DEFINITIONS DES MILIEUX 1.1 - MILIEU A Ce milieu est utilisé pour la conservation des souches du genre corynebactérium en repiquage sur boîte de Petri et gélose inclinée. Beef extract 20 g/l Agar 20 g/l Bactopeptone 20 g/l NaCI 5 g/l 1.2 - MILIEU B Ce milieu est utilisé pour la réalisation des précultures en milieu liquide. Mélasse de betterave (équivalent sucre) 40 g/l H3PO4 3 g/l MgSO4 0,5 g/l Urée 8 g/l Biotine 50 pg/l 1.3 - MILIEU C1 Ce milieu est utilisé pour la réalisation du milieu pied des fermentations dans les exemples 1 et 2. Saccharose 70 g/l H3PO4 2,1 g/l Extrait de levure 0,5 g/l (NH4)2SO4 1,3 g/l MgS04 1,3 g/l Solution 1 d'oligoéléments* 2 ml/I Solution 2 minérale** 5 ml/l Catéchol 1,1 mg/l K+ 1 g/1 Biotine 1 mg/l Thiamine 0,2 mg/l Le pH du milieu est ajusté à 7,8 après autoclavage avec de la soude. (*) Solution 1 d'oligoéléments Na2B407,10H20 88 mg/l (NH4)6Mo7024,4H20 40 mg/l ZnS04,7H20 10 mg/l CuS04,5H20 270 mg/l MnC12,4H20 7,2 mg/l FeC13,6H20 0,87 g/l (**)Solution 2 minérale FeS04,7H20 20 mg/l MnS04,7H20 2 mg/l NaCI 25 mg/l 1.4 - MILIEU C2 Ce milieu est utilisé pour réaliser la solution d'alimentation en sucre dans les exemples 1 et 2. Saccharose 550 g/l 1.5 - MILIEU D1 Ce milieu est utilisé pour la réalisation du pied des fermentations pour les exemples 3 à 6. ***Sirop (équivalent en saccharose) 70 g/l Extrait de levure 0,5 g/l H3P04 2,1 g/l (NH4)2S04 1,3 g/l MgS04 1,3 g/l Biotine I mg/l K+ 1 g/l 1.6 - MILIEU D2 Ce milieu de base est utilisé comme solution d'alimentation en sucre pour l'exemple 5. ***Sirop (équivalent en saccharose) 550 g/l En fonction des exemples 3,4,6 il est complété avec un sel jouant le rôle d'osmoinducteur comme le sulfate d'ammonium ou chlorure de potassium. 1.7 - MILIEU D3 (NH4)2S04 100 g/l ***Sirop (équivalent en saccharose) 550 g/l 1.8 - MILIEU D4 KCI 112 g/l ***Sirop (équivalent en saccharose) 550 g/l (***) Le sirop est le jus de diffusion épuré, filtré et concentré des cossettes de betterave. 2. CONDITIONS GENERALES DE FERMENTATION 2.1 - Préparation de la préculture On récupère, dans 30 ml d'eau physiologique, les cellules développées sur gélose inclinée (milieu A). Cette suspension bactérienne sert à ensemencer une préculture (milieu B) à raison de 3 %. La préculture est incubée à 30 C en aérobiose et culture immergée pendant 6 heures. Un volume de 35 ml de cette préculture sert à ensemencer 750 ml de milieu pied de fermentation (milieu C1 ou D1). 2.2 - Fermentation F1 Dans le cadre des exemples 1, 2 et 3, la fermentation est réalisée de la façon suivante pH de fermentation de 7,3, agitation de 1200 t/mn, aération de 0,6 v/v.mn, pression de couverture de 0,2 bars, Température de 34,5 C. Lorsque la biomasse estimée par densité optique du milieu (mesurée à 650 nm) atteint la valeur de 0,33, le premier tensio-actif est ajouté pour une concentration de 0,6 g/l. Ce tensio-actif est de type non ionique composé d'un ester polyoxyéthylénique d'acide gras principalement d'acides palmitique et stéarique. Lorsque la densité optique atteint 0,58, le deuxième tensio-actif est ajouté à une concentration de 0,3 g/l. Ce tensio-actif est un mélange d'acétate d'amine grasse, principalement dodécylamine. Une heure après, on ajoute par pulses successifs la solution d'alimentation (milieux D2,D3,D4) telle que la concentration résiduelle dans le milieu soit maintenue à 30 g/l. Au bout de 20 heures de fermentation, la température est augmentée et maintenue à 38 C. La fermentation est poursuivie jusqu'à épuisement du saccharose (concentration résiduelle en sucre inférieure à 0,1 %). 2.3 - Fermentation F2 Dans le cadre des exemples 5 et 6 la fermentation est réalisée de la façon suivante pH de fermentation de 7,8, agitation de 1200 t/mn, aération de 0,6 v/v.mn, pression de couverture de 0,2 bars, Température de 34,5 C. Lorsque la biomasse estimée par densité optique du milieu (mesurée à 650 nm) atteint la valeur de 0,33 le premier tensio-actif est ajouté pour une concentration de 0,6 g/l. Ce tensio-actif est de type non ionique composé d'un ester polyoxyéthylénique d'acide gras principalement d'acides palmitique et stéarique. 1 h 30 après le premier tensio-actif, la température est augmentée à 41,5 C et il est ajouté par pulses successifs la solution d'alimentation (milieu C2) de telle façon que la concentration résiduelle dans le milieu soit maintenue à 30 g/l. La fermentation est poursuivie jusqu'à épuisement du saccharose (concentration résiduelle en sucre inférieure à 0,1 %). 3. PURIFICATION Du charbon actif (3 % p/v) est ajouté au milieu qui est alors ultrafiltré sur membrane SCT à 65" C pour éliminer les bactéries puis concentré par évaporation jusqu'à 30 brix. La majeure partie des sels sont éliminés par acidification à l'acide sulfurique (pH = 3,3) puis filtration. Après concentration la solution est ajustée à pH 4 puis passée successivement sur résine anionique et cationique. L'éluat est alors concentré. 4. TABLEAU RECAPITULATIF Le tableau récapitulatif suivant reprend pour tous les exemples les conditions de milieu et de procédé. Exemples Milieu Milieu Milieu Pied Milieu Procédé Procédé osmotique Entretien Préculture Fermentation Alimentation Fermentation EXEMPLE 1 A B C1 C2 F1 EXEMPLE 2 A B C1 C2 F1 CHOC Osmotique avec KCl EXEMPLE 3 A B D1 D4 F1 Gradient continu de pression osmotique avec KCl EXEMPLE 4 A B D1 D3 F1 Gradient continu de pression osmotique avec (NH4)2SO4 EXEMPLE 5 A B D1 D2 F2 Choc osmotique initial avec KCl EXEMPLE 6 A B D1 D4 F2 Gradient continu de pression osmotique avec KCl TABLEAU RECAPITULATIF EXEMPLE 1 Souche : Corynebactérium glutamicum ATCC n" 17965. Les conditions de préculture sont faites selon le schéma décrit dans les conditions générales. Les caractéristiques des milieux correspondent aux milieux C1 en pied et C2 en alimentation décrits dans les conditions générales. Les conditions de fermentations correspondent au procédé FI décrit dans les conditions générales. Les éléments principaux étant - Utilisation de deux tensio-actifs pour déclencher l'excrétion, - Teneur minimale en K+ dans le pied (1 g/l), - Pression osmotique initiale de 460 mosmoles, - Pression osmotique finale de 1000 mosmoles, - Durée de fermentation de 42 heures, - Dans ces conditions, il n'y a pas de production de tréhalose. EXEMPLE 2 Souche : Corynebactérium glutamicum ATCC n" 17965. Les conditions sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1 pour les milieux et la fermentation, excepté le choc osmotique qui est provoqué par ajout d'une solution de KCl (330 g/l) ce qui permet d'établir une teneur en KCI dans le milieu de 27 g/l. Ce choc osmotique est effectué une demiheure après l'ajout du premier tensio-actif. - Pression osmotique initiale de 460 mosmoles, - Pression osmotique finale de 1824 mosmoles, - Durée de la fermentation de 42 heures, - La teneur en tréhalose dans le moût de fermentation est de 17 g/l. Après fermentation le tréhalose est purifié selon le procédé décrit dans les conditions générales et après concentration il est récupéré 9,8 g de tréhalose à 90 B de pureté. EXEMPLE 3 Souche : Corynebactérium glutamicum ATCC n" 17965. Les conditions de préculture sont faites selon le schéma décrit dans les conditions générales. Les caractéristiques des milieux correspondent aux milieux sirops D1 en pied et D4 en alimentation décrits dans les conditions générales. Les conditions de fermentations correspondent au procédé Fl décrit dans les conditions générales. Les éléments principaux étant - Utilisation de deux tensio-actifs pour déclencher l'excrétion, - Teneur minimale en K+ dans le pied (1 g/l), - Pression osmotique initiale de 450 mosmoles, - Pression osmotique finale de 3000 mosmoles, - Il est provoqué une variation continue de la pression osmotique sur toute la durée de la fermentation en alimentant avec une solution mixte constituée de saccharose et d'un sel de type KCl. - La durée de fermentation est de 40 heures, - La teneur en tréhalose dans le moût de fermentation est de 40 g/l. Après fermentation le tréhalose est purifié selon le procédé décrit dans les conditions générales et après concentration il est récupéré 23 g de tréhalose à 90 % de pureté. EXEMPLE 4 Souche : Corynebactérium glutamicum ATCC n" 17965. Les conditions de milieu et fermentation sont identiques à celles décrites dans l'exemple 3 précédent exceptée la solution d'alimentation (D3) utilisée qui contient en plus du sucre, un sel de type sulfate d'ammonium. - La pression osmotique initiale est de 450 mosmoles, - La pression osmotique finale est de 1500 mosmoles, - La durée de fermentation est de 42 heures, - La teneur en tréhalose dans le moût de fermentation est de 25 g/l. Après fermentation le tréhalose est purifié selon le procédé décrit dans les conditions générales et après concentration il est récupéré 14,4 g de tréhalose à 90 % de pureté. EXEMPLE 5 Souche : Corynebactérium glutamicum ATCC n" 17965. Les conditions de préculture sont faites selon le schéma décrit dans les conditions générales. Les caractéristiques des milieux correspondent aux milieux sirops D1 en pied et D2 en alimentation décrits dans les conditions générales. Les conditions de fermentations correspondent au procédé F2 décrit dans les conditions générales. Les éléments principaux étant - Utilisation d'un seul tensio-actif pour déclencher l'excrétion, - La composition du milieu pied est renforcée par ajout d'un sel de KC1 de façon à ce que la teneur dans le milieu en ce sel soit de 22 g/l. - Pression osmotique initiale de 1125 mosmoles, - Pression osmotique finale de 2300 mosmoles, - La durée de fermentation est de 30 heures, - La teneur en tréhalose dans le moût de fermentation est de 17 g/l. Après fermentation le tréhalose est purifié selon le procédé décrit dans les conditions générales et après concentration il est récupéré 9,7 g de tréhalose à 90 % de pureté. EXEMPLE 6 Souche : Corynebactérium glutamicum ATCC n" 17965. Les conditions de préculture sont faites selon le schéma décrit dans les conditions générales. Les caractéristiques des milieux correspondent aux milieux sirops D1 en pied et D4 en alimentation décrits dans les conditions générales. Les conditions de fermentations correspondent au procédé F2 décrit dans les conditions générales. Les éléments principaux étant - Utilisation d'un seul tensio-actif pour déclencher l'excrétion, - I1 est provoqué une variation continue de la pression osmotique sur toute la durée de la fermentation en alimentant avec une solution mixte (milieu D4) constituée de saccharose et d'un sel de type KCI. - La pression osmotique initiale est de 600 mosmoles, - La pression osmotique finale est de 2050 mosmoles, - La durée de fermentation est de 30 heures, - La teneur en tréhalose dans le moût de fermentation est de 16 g/l. Après fermentation le tréhalose est purifié selon le procédé décrit dans les conditions générales et après concentration il est récupéré 9,2 g de tréhalose à 90 % de pureté. REFERENCES BIBIOLOGRAPHIQUES 1. MARTIN, M.C., DIAZ,L.A., MANZANAL, M.B. and HARDISSON, C. Role of trehalose in the spores of Streptomyces FEMS Microbiol. Lett. 35, 49-54 (1986). 2. BRENNAN, P.J. Free trehalose in Corynebacterium xerosis, Biochem. J.110, 9 p (1968). 3. NICOLAUS, B., GAMBACORTA, A., BASSO, A.L., RICCIO, R., DE ROSA, M. and GRANT, W.D. Trehalose in Archaebacteria. System. Appl. Microbiol. 10, 215-17 (1988). 4. MACKAY, M.A., NORTON, R.S. and BOROWITZKA, L.J. Organic osmoregularoty solutes in Cyanobacteria, J. General Microbiol. 130, 2177-2191 (1984). 5. ELBEIN, A.D., The metabolism of a,a-trehalose, Adv.Carbohydr. Chem. Biochem. 30, 227-256 (1974). 6. STEPHENS, G.M., and DALTON, H. Is toxin production by coryneform bacteria linked to their ability to utilize hydrocarbons ? Tibtech 5 (1987). REVENDICATIONS 1. Procédé de production de tréhalose par fermentation, caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme produisant naturellement du tréhalose sur un milieu de culture contenant au moins une source de carbone dans des conditions induisant une variation de la pression osmotique du milieu de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on déclenche et/ou amplifie l'excrétion de tréhalose dans le milieu. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu contient du potassium dans une concentration d'au moins 1 g/l. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on contrôle la variation de pression osmotique de façon à créer un gradient de pression durant la fermentation tel que la variation de pression osmotique entre la pression osmotique initiale et la pression osmotique finale soit comprise entre 1000 et 5000 osmoles et de préférence de 2000 mosmoles. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on provoque la variation de pression osmotique du milieu par addition - d'un composé osmoinducteur tel qu'un sel, notamment KCl, Nazi, (NH4)2S04 ou, - d'un sucre ou, - d' un composé sucre alcool du type glycérol, sorbitol ou mannitol, ainsi que leur mélange. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on déclenche et/ou amplifie l'excrétion du tréhalose dans le milieu durant la phase de fermentation, - en effectuant un ajout dans le milieu de tensioactif(s) cationique(s) ou neutre(s) et/ou d'antiobiotiques, - et/ou en provoquant une variation de la température entre 1 et 20"C, de préférence 5 et 100C par rapport à la température normale de croissance, - et/ou en ajustant la concentration en vitamine notamment biotine et desthiobiotine au minimum nécessaire pour assurer la croissance du microorganisme. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le microorganisme est du genre Corynebacterium, Brevibacterium, Nocardia, Escherichia, Bacillus Arthrobacterium, Streptomyces, Microbacterium, et de préférence du genre Corynebacterium ou Brevibacterium. 8. Procédé selon l'une des revendications I à 7, caractérisé en ce que a) on effectue une préculture en aerobiose à 30"C dans un milieu de préculture contenant au moins un sucre, des sels minéraux notamment de phosphate et/ou magnésium, des vitamines telles que biotine et desthiobiotine b) on inocule ensuite du milieu de préculture dans un milieu pied contenant - de 50 à 100 g/l de sucre, - des sels minéraux notamment de phosphate et/ou de magnésium et au moins 1 g/l de potassium, - des vitamines telles que biotine, desthiobiotine, et une source d'azote, telle que (NH4)2S04 ou des hydrolysats acides de protéines et des extraits de bactéries ou de levure, dans des conditions de concentrations telles que la pression osmotique soit comprise entre entre 400 et 2000 mosmoles, notamment entre 600 et 2000 mosmoles c) on effectue l'étape de croissance et fermentation sous agitation rigoureuse - en augmentant le pH à un pH restant entre 7 et 8 et la température entre 30 et 420 C, notamment entre 32 et 380C, - le milieu d'alimentation comportant une concentration en sucre de 500 à 1000 g/l et, les concentrations en composé osmoinducteur ainsi que les concentrations en composés favorisant l'excrétion du tréhalose, notamment les tensioactifs et vitamines sont ajustés jusqu'à ce que la pression osmotique augmente d'au moins 1000 mosmoles par rapport à la valeur initiale et que la pression osmotique finale atteigne 1500, voire 5000 mosmoles. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce à l'étape c) , le milieu d'alimentation a une concentration en sel osmoinducteur de 100 à 500 g/l. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la vitamine est la biotine et la concentration en biotine de l'ordre de 5 pg/l.