Brevet FR2667612A1 — publié le 19920410

4, PPODUCTION STABLE DE POLYPEPTIDE ACTIF M-CSF La presente invention est relative à un vecteur recombinant capable d'exprimer de façon importante et stable le polypeptide actif M-CSF humain, à une cellule animale transformée ayant une capacité de production élevée et stable du polypeptide actif M-CSF, qui est préparée par introduction de ce vecteur recombirnant dans des cellules animales et sélection d'une cellule ayant une forte résistance au méthotrexate, et à un procédé de production de polypeptide actif M-CSF à l'aide de cette cellule animale transformée. Le polypeptide actif M-CSF est un facteur qui agit sur les cellules formant des colonies monocytiques qui sont des précurseurs de monocytes dans la moelle osseuse humaine, qui différencient donc et rendent matures les cellules formant des colonies monocytiques en macrophages via des monoblastes ou des prémonocytes De façon classique, on connait deux gè_nes clonés genétiquement qui ont une implication dans l'expression du polypeptide actif M-CSF; l'un est un gène correspondant à 256 résidus aminoacides, contenant un peptide signal consistant en 32 acides aminés dans le N-terminal lScience, 230, 291-296 ( 19851 l et l'autre est un gène correspondant à 554 résidus aminocides lScience, 235, 1504-1508 l 19871. Dans la formation d'un polypeptide actif M-CSF de type mature qui est produit par le gène correspondant aux 258 acides aminés (un tel polypeptide est dénommé par la suite M,1- CSF), un peptide signal consistant en 32 acides aminés est libéré pendant l'étape précoce de son expression Les portions restantes du polypeptide forme un homodimère, qui se déplace dans le corps de Oolgi On considère que l'homodimère est coupé et libère son C-terminal après la translation et se développe en polypeptide actif M-CSF de type mature Le site de coupure est identifié dans MI 1-CSF exprimé par la cellule CV-1 en tant que cellule-hôte lJ Biotechnology, 8, 45-88 l 198811 Selon ce rapport, il est confirmé que le MI 1-CSF de type mature est un polypeptide consistant en 158 acides aminés. Le polypeptide actif M-CSF qui est produit par le gne correspondant aux 554 résidus aminoacides (un tel polypeptide est dénommé par la suite M 2CSF) peut être extrait à partir d'urine humaine et purifié M 12-CSF peut donc âtre produit en des quantités conventables pour répondre aux besoins des évaluations cliniques et de la recherche. D'un autre côté, il n'y a aucun procédé pour produire des quantités suffisantes de M I-CSF pour la recherche et l'évaluation clinique, quoique, comme cela est mentionné ci-après, plusieurs procédés en soient aux stades des essais Il n'y a non plus aucun rapport traitant de la production d'autres polypeptides ressemblant au polypeptide actif M 1-CSF et possédant une activité M-CSF. J Biotechnology, 8, 45-88 ( 19881) se rapporte à la production de polypeptide M 1-CSF par une cellule hôte CV 1 transformée, transformée par le plasmide pc CSF 17 qui a été obtenu par introduction d'un gène d'origine naturelle impliquant la production de M 1-CSF (un tel gène peut 6 tre dénommé par la suite simplement gène M I -CSF de type naturel) dans un vecteur d'expression possédant le promoteur de gène précoce de SV 4 O. Comme cette méthode utilise le virus SV 40 pour promouvoir la production du polypeptide M 1-CSF, la cellule CV-1 n'est vivante que pendant 5-6 jours De plus, la cellule CV-i transformée peut produire le polypeptide actif M 1-CSF en une concentration limitée, c'est-à-dire environ 10 000 U/ml Si le virus SC 40 n'est pas utilisé, la quantité de polypeptide Mi 1-CSF produite est encore plus faible. WO 88/03173 décrit une méthode pour transformer une cellule COS par introduction d'un vecteur recombinant préparé de la même fasçon que le vecteur pc CSF 17 mentionné plus haut, mais en remplaçant le gène M 1- CSF par un gène modifié préparé par insertion des codons de terminaison à divers sites du gène MI -CSF La cellule transformée préparée par cette méthode ne peut maintenir son activité que pendant environ 1 semaine Elle peut produire le polypeptide M 1 I-CSF à une faible concentration d'environ 20 000 U/ml. La demanderesse a déjà décrit un procédé pour transformer une cellule hâte COS par un plasmide p SVL-Ml-del produit par introduction d'un oéne modifié par élimination de sites spécifiques du gêne M 1-CSF dans un vecteur d'expression possédant le promoteur de géne tardif de SV 40 lProceedings of the 8th M-eeting, Symposium on the Next Seneration Basic Industrial Technology, 258-259 ( 1988)l La cellule transformée préparée par cette méthode, cependant, ne peut maintenir son activité que pendant environ une semaine, tout en produisant le polypeptide actif M-CSF à une trés faible concentration d'environ 2.000 U/ml. Parmi les procédés ci-dessus pour la production de polypeptide actif M-CSF, des procédés dans lesquels un géne M 1- CSF modifié est utilisé fournissent une activité de production supérieure par rapport à un procédé utilisant un géne MI-CSF non modifié Les quantités produites par les premiers procédés, cependant, restent insuffisantes et les procédés ne peuvent pas non plus fournir longtemps une production stable de polypeptide actif M-CSF Il n'existe donc aucun procédé jusqu'à maintenant qui soit capable produire le polypeptide actif M-CSF de façon stable et avec une concentration élevée Le développement d'un procédé qui peut produire le polypeptide actif M-CSF de façon stable à grande échelle est donc recherché. Etant donnée cette situation, la demanderesse a entrepris des études poussées et trouvé que l'utilisation d'un vecteur recombinant construit de facon à contenir un ADN de M 1- CSF-del, qui est un ADN contenant en aval d'un promoteur, une portion d'un ADN codant pour une séquence d'acides aminés commençant à partir du N terminal jusqu'à l'acide aminé 179 d'un polypeptide qui contient le peptide signal de M 1-CSF et ne contenant pas une partie ou la totalité de l'A 3 N codant pour des acides aminés à partir de l'acide aminé 180 jusqu'au C terminal, et à posseder un ADN du marqueur dhfr en aval de l'AON de MI 1-CSF- del, dans un procédé de transformation et un procédé de sélection de cellules, peut produire un polypeptide actif l Ml-CSF avec une productivité élevée et de façon stable Cette constatation a conduit à la mise au point de la présente invention. En consequence, un objet de la présente invention est de fournir un vecteur recombinant capable d'exprimer un polypeptide actif M-CSF, contenant un ADN de M-CSF-del et un ADN du marqueur dhfr construit en aval de cet ADN de M-CSF- del, dans lequel cet ADN de M-CSF-del est un ADN contenant une portion d'un AODN codant pour une séquence commençant à partir du N terminal jusqu'à l'acide aminé 179 d'un polypeptide qui contient le peptide signal M 11-CSF et ne contenant pas une partie ou la totalité de I'AON codant pour les acides aminés depuis l'acide aminé 180 jusqu'au C terminal, et cet ADN de M-CSF-del est introduit par substitution dans un site d'AON du marqueur dhfr d'un vecteur d'expression possédant un promoteur et I'ADN du marqueur dhfr. Un autre objet de la présente invention est de fournir une cellule animale transformée par introduction de ce vecteur recombinant dans une cellule animale et capable d'exprimer de façon stable le polypeptide actif M-CSF. Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé pour la préparation du polypeptide actif M-CSF comprenant la culture de cette cellule animale transformée dans un milieu contenant du méthotrexate pour sélectionner une ceilule animale transformée qui résiste au méthotrexate et possède une oapacité d'expression élevée et stable de polypeptide actif M-CSF, et la culture dans un milieu de cette cellule animale transformée résistant au méthotrexate sélectionnée D'autres objets, aspects et avantages de l'invention sont mis en évidence par la description suivante. La figure 1 montre par un diagramme le vecteur recombinant p SV 2-dhfr- Ml -del de la présente invention capable d'exprimer le polypeptide actif M-CSF. La figure 2 illustre de façon schématique une méthode de construction du vecteur recombinant p SV 2-dhfr-M 1 -del. L'ADN de M 1-CSF-del dans la présente invention entend un ADN contenant une portion d'un ADN codant pour une séquence d'acides aminés commençc:ant à partir du N terminal jusqu'à l'acide aminé 179 d'un polypeptide qui contient le peptide signal Ml -CSF, et ne contenant pas une partie ou la totalité de I'ADN codant pour des acides aminés à partin de l'acide aminé 180 jusqu'au C terminal Les séquences d'acides aminés et de bases du polypeptide contenant le peptide signal M 1 -CSF ont déjà été clarifiées Il s'agit d'un gène codant pour 256 résidus d'acide aminé consistant en un peptide signal de 32 résidus d'acide aminé et en un polypeptide de 224 résidus d'acide aminé lScience, 230 291-296 ( 1985)l La délétion de la totalité ou d'une partie de I'ADN codant pour les résidus aminoacides ci-dessus existant dans le côté C terminal peut être effectuée par des techniques de manipulation génétique appropriées, par exemple, par coupure des sites d'endonucléase de restriction de l'ADN codant pour la séquence d'acides aminés avec une endonucléase de restriction convenable, éventuellement liaison des fragments d'ADN ainsi obtenus avec un petit fragment d'oligonucléotide d'origine naturelle ou synthétique ou création d'un codon de terminaison à un site convenable par une technique de mutation ponctuelle ou similaire L'ADN de M- CSF-del ainsi obtenu possède de préférence un codon de terminaison à son C terminal, Le codon codant pour l'acide aminé du C terminal du M 1-CSF de type mature qui est constitué par l'acide aminé 158 correspond au 190 ème codon du gène M 1-CSF de type naturel Cependant, la demanderesse a confirmé que l'activité M-CSF n'est présentée que s'il y a des codons jusqu'à 179 Un exemple typique d'ADN de Mvl-CSF-del est un gène modifié préparé par digestion du gène M 1-CSF avec les endonucléases de restriction Bam HI et Stu 1, et liaison des fragments appropriés avec l'enzyme de Klenow Un tel gène modifié est celui qui a une sequence de bases correspondant aux codons 1 189 du gène M 1- CSF de type naturel et ayant de plus, immédiatement après une telle séquence de bases, une sequence de bases correspondant aux codons du codon 217 au codon 256 qui est le dernier codon (ce gène modifié peut être dénommé ici M 1 -del) La séquence d'acides aminés codée par le gène Mf I -del est montrée par SEQ ID No 1. Une sàquence de bases spécifique est donnée en tarnt que SEQ ID No 1. Selon la présente invention, "ADN du marqueur dhfr" antend le gène de la déhydrofolate réductase Un ADN du marqueur dhfr dérivé de la souris lNature, 275, 617-624 l 1978 l 1 peut étre commodément utilisé dans le cadre de la pnrésente invention Oes cellules contenant un marqueur dhfn peuvent se développer dans des milieux de culture contenant du méthotnexate len abrégé -l TX) et sont convenables pour la sélection des cellules transformées en tant que marqueur nrésistant à un médicament. Il n'y a pas de restrictions spécifiques quant au promoteur qui est présent dans le vecteur d'exprnession possédant un marqueur dhfr et qui est introduit par substitution en amont de l'ADN de M-CSF-del du vecteur recombinant de l'invention Des exemples de ces promoteurs sont le promoteur de gène précoce de SV 40, le promoteur de gène de métallothionéine, le promoteur de gène de thymidine kinase, etc, le promoteur particulièrement préféré étant le promoteur de gène précoce de SJV 40. La construction du vecteur recombinant peut étre réalisée selon la présente invention, par exemple, par substitution du site d'AON du marqueur dhfr d'un vecteur d'expression possedant le promoteur et I'ADN du marqueur dhfr avec un ADN de M-CSF-del, et en introduisant l'ALN du marqueur dhfr en aval de l'ADN de M-CSF-del Ici, il n'y a aucune restriction spécifique quant au vecteur d'expression possédant le promoteur et l'ADN du marqueur dhfr, tant que celui-ci contient un ADN du marqueur dhfr Un vecteur préférable est celui qui a un site d'endonucléase de restriction convenable qui peut être facilement traité par une technique de manipulation génétique Un exemple typique est p SV 2-dhfr Ce type de vecteur est particulièrement avantageux parce qutil a un promoteur du type mentionné plus haut. La substitution mentionnée plus haut de l'ADN du marqueur dhfr avec un ADN de M-CSF-del peut étre effectuée par utilisation des sites d'endonuc 11 ases de restriction, par exemple Hind Ili et Bg I Il, existant en aval de ces promoteurs. L'introduction de l'ADN du marqueur dhfr peut être conduite par l'utilisation des sites d'endonuclases de restriction, par exemple Pvu II, Bam HI et Eco Pl existant en amont de l'ADN du marqueur dhfr et contenant ces promoteurs, par e:: illustration schématique de la méthode est donnée dans la figune 2. Les deux extrémités de l'ADN du marqueur dhfr du vecteur p SV 2-dhfr sont coupées par des endonucléases de restriction convenables pour obtenir un ADNI-I de vecteur purifié duquel l'ADN du marqueur dhfr a été enlevé Les terminaisons de l'ADN du vecteur peuvent être rendues collantes par sélection d'une endonucléase de restriction convenable La déphosphorylation des terminaisons par une phosphatase alcaline ou similaire, est aussi préférable. Hind II 1 et Bgt 11 sont indiqués en tant qu'endonucléases de restriction préférables pour couper les deux extrémités de I'AON du marqueur dhfr On peut rendre collantes les terminaisons par exemple, en rendant collante l'extrémité de coupe avec une enzyme de fragment de Klenow en présence de d ATP, d TTP, d Ei TP et d CTP. Pour la production du fragment d'ADN de lvl-CSF-del, un AO Nc impliquant la production de M i 1 -CSF est collecté à partir de cellules capables de produire -i l-CSF (par exemple les cellules M-il A-Pa Ca les cellules TRC-29 PR), inséré dans un vecteur convenable par une méthode classique, si nécessaire, et développé par culture pour obtenir un gène M i -C 53 F Un procédé pour éliminer une partie ou la totalité de l'ADN codant pour les acides aminés depuis l'acide aminé 180 jusqu'au C terminal du gène M 1 -CSF est ensuite conduit Geci est fait, par exemples par digestion du gène M 1-CSF avec une endonucléase de restriction convenable, éventuellement réunion des fragments d'AON ainsi obtenus avec un petit fragment d'oligonucleotide ou création d'un codon de terminaison par la technique de la mutation ponctuelle ou similaire Lorsque ces procédés sont effectués après insertion du gène M 1-CSF dans un vecteur, le fragment d'ADN de M,-CSF-del est obtenu par digestion avec une endonucléase de restriction convenable Les terminaisons du fragment d'ADN de M-CSF-del peuvent être rendues collantes en fonction de l'endonucléase de restriction utilisée De préférence, les terminaisons sont déphosphorylées par une phosphatase alcaline ou similaire. Un ADN de vecteur peut être préparé à partir du fragment d'ADN de vecteur à partir duquel l'ADN du marqueur dhfr a été enlevé et le fragment d'ADN de M CSF-del ainsi obtenu sont soudés, introduits dans une cellule hôte convenable pour transformer celle-ci et le transformant est cultivé pour produire un ADN de vecteur Ce vecteur contenant I'ADN de Ml-CSF-del est digéré avec une endonucléase de restriction convenable qui n'agit pas sur I'ADN de M CSF-del pour produire un fragment d'ADN de vecteur Un exemple d'une telle endonucléase de restriction qui n'agit pas surp IADN de M-CSF-del est Eco RP Il est souhaitable que les terminaisons de cet dernier ADN de vecteur soient déphosphor Ulees par une phosphatase alcaline ou similaires. Séparément, les deux extrémités de l'ADN du marqueur dhfr de l'ADN du vecteur p SV 2-dhfr, dans lequel le site de l'endonucléase de restriction Pvu Il a été converti en site d'endonucléase de restriction Eco Pl par un linlker Eco RI, sont couples par une endonucléase de restriction convenable pour préparer un fragment d'ADN du marqueur dhfr Dans ce cas, il est souhaitable de couper un fragment d'ADN assez large pour inclure un promoteur convenable pour l'expression de l'ADN du marqueur dhfr De préférence, un fragment d'ADN contenant l'ADN du marqueur dhfr est prépare à l'aide de l'endonucléase de restriction Eco RI La déphosphorylation des terminaisons par une phosphatase alcaline ou similaire est préférable aussi en ce qui concerne ce fragment d'ADN. Un vecteur recombinant peut être construit par soudure du fragment d'ADN contenant l'ADN de M-CSF-del et du fragment d'ADN contenant l'ADN du marqueur dhfr préparé selon les procédures ci-dessus et par introduction de celui-ci dans un microorganisme hôte, par exemple E coli, pour transformer ce dernier. Dans les procédures ci- dessus, les endonucléases de restriction sont utiisées en une quantité équivalent à la quantité d'ADN, de préférence 1-2 U pour 1 ilg d'ADN à digérer Les quantités d'autres enzymes sont déterminées en fonction du système réactionnei impliqué, généralement dans la gamme d'environ 10 à 20 LU. Un vecteur recombinant particulièrement préférable parmi les vecteurs de la présente invention préparés par la méthode ci-dessus est montré dans la figure 1, dans lequel l'ADN de M-CSF-del et l'ADN du marqueur dhfr contenu sont situés en aval du promoteur de gène précoce de SV 40 avec une distance de 1,5 kpb Une séquence d'acides aminés spécifique codée par l'ADN de M-C 5 F-del contenue dans le vecteur recombinant de la figure 1 est montrée dans SEQ ID No 1 Une séquence de bases pour l'ADN de M-CSF-del est montrée dans S Em ID No 1. Les cellules animales transformées peuvent être obtenues selon la présente invention par introduction du vecteur recombinant dans des cellules animales par la méthode de précipitation du phosphate de calcium, la méthode l DEAE-dextrane, la méthode de l'impulsion électrique ou similaire Parmi ces méthodes, la méthode de l'impulsion électrique est particulièrement préférable. Il n'y a pas de restrictions spécifiques quant aux cellules animales à utiliser en tant que cellules hôtes, tant que ces cellules peuvent _tre développees par culture Des cellules préférables sont celles qui ont des caractéristiques dhfr- Un exemple particulièrement préférable de telles cellules est la cellule CHO ldhfr CHO; Proc Natl Acad Soi USA, 77, 4216-4220 l 19801 l. Cependant, la cellule TPC-29 (FEPM BP-23751 qui ne possede pas de caractéristiques dhfr peut aussi être utilisée. Des cellules animales transformées ainsi obtenues sont ensuite cultivées dans un milieu contenant du méthotrexate (IMTX pour sélectionner de cellules resistant fortement au MTX, afin d'obtenir un transformant capable de fournir une production stable de pol 5 peptide actif M-CSF En général, il est préférable de cultiver les cellules résistant au MITX en augmentant progressivement la teneur en Ml TX, dans la gamme comprise entre environ 0,1 et 10 p H Les cellules résistant au MTX manifestant une forte résistance au Mi-TX au-delà d'environ 10 JPIM ainsi obtenues fournissent une cellule animale transforme capable 2 C O d'une production forte et stable de polypeptide actif M-CSF. A titre d'exemple préférable d'une telle cellule transformée, on peut citer M 1 -del 14-2 qui est déposée au Fermentation Research Institute, Agenc of Industrial Science and Technologyu IFEP-M BP-352-21 La cellule est produite par introduction d'un vecteur recombinant à expression élevée et stable contenant le gène l 1 -del dans des cellules CHO dhfr pour transformer celles-ci, et sélection des cellules résistant au M 1 TX. Dans la présente invention, le terme "stable" est utilisé pour indiquer la caractéristique d'une cellule capable de produire un polypeptide actif M-CSF sans diminution du rendement du polypeptide pendant sa sous- culture et plus spécifiquement, la capacité de la cellule à produire le polypeptide actif M-CSF pendant au moins 2 semaines sans réduction du rendement de la culture dans les conditions normales La cellule M 1 - del 14-2 peut produire le polypeptide actif M-CSF en une quantité atteignant ll environ 600 000 Ufml au moins pendant environ I mois. Une méthode de culture classique de cellules animales peut être utilisée dans la production du polypeptide actif HM-CSF par culture des cellules transform 6 es Par exemple, le transformant est inoculé dans un milieu de culture de cellules CHO ou TRC-29 R, comme par exemple dans un milieu HEM de Eagle modifié par Dulbecco contenant 10 % de FCS, dans un incubateur ou par simplificité, dans un Shale, en une quantité d'environ 104/cm 2 et cultivé à 30-37 'C pendant 2 à 6 jours Le surnageant du bouillon de culture est collecté et soumis à la détection de l'activité du polypeptide actif M-CSF cible Le polypeptide actif M- CSF est ensuite collecté à partir du surnageant et purifié par un moyen convenable qui est classiquement applicable à la récupération et la purification des protéines Pour une production de masse, les cellules sont fixées à des micro-supports et cultivées dans des conditions convenables, par exemple des conditions d'agitation, de p H et de concentration d'oxygène. La solution contenant le polypeptide actif M-CSF ainsi obtenue est soumise a un ou plusieurs des moyens choisis parmi une concentration sous vide, une concentration avec une membrane, un traitement de dessalage avec du sulfate d'ammonium, du sulfate de sodium, ou similaires, une précipitation fractionnee aveo un solvant hydrophile comme le méthanol, l'éthanol, l'acétone ou similaires, et d'autres moyens appropriés, de façon à obtenir un précipité contenant le polypeptide actif M- CSF Le précipité est davantage purifié, si nécessaire, par exemple, par dissolution de celui-ci dans de l'eau ou une solution tampon et par dialyse de la solution pour éliminer les impuretés de bas poids moléculaire, ou de plus par chromatographie d'échange d'ions, chromatographie d'adsorption ou filtration sur gel avec des adsorbants ou des agents de filtration sur gel Le polypeptide actif M-CSF purifié ainsi obtenu peut être stocké après lyophilisation. D'autres aspects de la présente invention sont illustrés par la description des modes de réalisation exemplaires non limitatifs de l'invention. EXEMPLES Exemple 1 Des cellules humaines TPRC- 29 P (FEP Mt BP-23751 sont incub Dees à 37 C pendant 4 jours dans un incubateur aveo 5 % de CO 2 dans un milieu D-MEM Iun produit de i 3 ibcol contenant 5 % de FCS 108 celilules sont homogénéisées dans 400 ml d'isothiocyanate de guanidine 6 M et envoyées à travers une aiguille d'injection de calibre 18,5 pour fragmenter l'ADN de haut poids moléculaire et diminuer sa viscosité L'homogénat est étalé en plusieurs couches sur un 1/3 de volume d'une solution de chlorure de césium 5,7 M EDTA 0,1 M (p H 7,5) et centrifugé pendant 18 heures à 25 'C et à 35 000 tpm Le précipité est dissous dans 3 mi d'eau et traité avec une quantité équivalente de phénol- chloroforme La couche aqueuse est transférée dans un autre tube à essais, puis additionnée d'un 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M et de 2,5 volumes d'éthanol Après centrifugation, le résidu est collecté et séché sous vide pour produire 5 mg d'ARN brut. Le précipité est dissous dans 1,5 ml d'eau, incubé à 65 'C pendant 5 minutes et trempé, puis le mélange est adsorbé dans une colonne de 75 mg d'oligo(d T)- cellulose (un produit de Pharmacia) préalablement équilibrée avec un tampon (Tris-HCI 40 m 1 (p H 7,6), Na CI 1,0 M 1, EDTA 1 m M et 0, 1 % de SDS) Après lavage avec 10 ml du même tampon, 5 ml d'un tampon (Tris- H Ii 20 m M (p H 7,61, Na CI 0,1 M, EDTA I m M et 0,1 % de SDS) sont envoyés dans la colonne pour éluer les A Pl N autres que le poly(A)+ AIPN Le polylA)+ ARN est ensuite élué avec un tampon (Tfris-HCI 10 m M (p H 7,51, EDTA 1 m M et 0,05 % de SDSl Un ml d'une fraction initialement déchargée est additionné de 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M et de 2,5 volumes d'éthanol et le mélange est laissé reposer une nuit à -20 'C, centrifugé pendant 30 minutes à 15 000 tpm pour collecter le précipité Le précipité est séché sous vide pour fournir 50 ig de poly(Al+ APRN. Exemple 2 Le poly(Aî+ APN préparé dans l'e xemple 1 est dissous dans de l'eau a une concentration de I gg/ l 5 Ul de la solution sont transférés dans un microtube, chauffés pendant 5 minutes à C et trempés La solution est additionnée d'un tampon (Tris-H Cl m M (p H 8,3 l, Mg CI 2 10 m M, K Ci 140 m M, dithiothréitol 10 m M et d NTP 2 m M (un mélange de quantités équivalentes de d ATP, d 6 TP, d CTP et d TTP); de 5 pg d'oligo(d TI (un produit de Pharmacial et de 1,5 unité de transoriptase inverse (un produit de Takiara Shuzo Co. Ltd) pour faire un volume total de 20 Pil et le mélange est traité pendant 1 heure à 42 'C Le mélange réactionnel est additionné d'un tampon (Tris-HCI 80 m M (p H 7,5 l, KCI 200 m-i, -1 MNCI 2 10 m M et 25 gg/ml de,BSA 1; de 60 unités de P Nase H (un produit de Takara Shuzo Co, Ltd) et 5 unités d'ADN polymér-ase I (un produit de Boehringer Mannheim) pour faire un volume total de 150 Il Apres une heure de réaction à 122 C, une heure à 22 "C et arrét de la réaction par addition de 20 pl de EDTA 0,25 M et de 10 ul de 505 %, une quantité équivalente de phénolchloroforme est ajoutée, suivie d'une centrifugation à 10 000 tpm pendant 5 minutes La couche aqueuse est additionnée d'une quantité équivalente d'acétate d'ammonium 4 M 1 et de 2 volumes d'éthanol et le mélange est à nouveau centrifugé à 15 000 tpm pendant 15 minutes pour collecter le résidu Le résidu est collecté et séché sous vide et additionné d'un tampon (Tris-HCI I 00 ml (p H 8,01), EDTA 10 m M, S- adénosylmethionine 80 IN et 100 lig/ml de BSA 1) et de 2 unités de Eco Pl méthylase lun produit de Promeoga Corp) pour faire un volume total de 10 1 l, puis le mélange est incubé a 37 C pendant une heure Le mélange réactionnel obtenu est additionné de 40 j-l d'eau, le mélange est traité avec une quantité équivalente de phénol-chloroforme et centrifugé pour séparer une couche aqueuse Après addition d'une quantité équivalente d'acétate d'ammonium 4 M et de 2 volumes d'éthanol le mélange est laissé reposer pendant 15 minutes à -70 'C et centrifugé à 15 000 tpm pendant 15 minutes pour, collecter un résidu Le résidu est additionné d'un tampon lTris-HC;I i 167 m M (p H 8,81, lt'g CI 2 6,7 m M, sulfate d'ammonium 16,6 m M, 2-mercaptoéthanol 10 m M, EDTA 6,7 JPM, 0,167 % de BSA) de d ATP, d 6TP, d CTP et d TTP chacun à 750 UM et de 4 unités de T 4 ADN polymérase (fabriquée par Takara Shuzo Co, Ltd l pour faire un volume total de 12 J-Pl et le mélange est traité à 37 "C pendant une heure Le mélange réactionnel est traité avec une quantité équivalente de phénol- chloroforme et d'éthanol pour produire un précipité Le précipité collecté par centrifugation est séché sous vide et additionné de I 1 i de Eco R Pl linhker, d'une solution tampon (Tris-HCI 50 m M (p H 7,61, Mg C 12 10 m M, dithiothréitol 10 m M, spermidine 0,1 m M, EDTA 0,1 m M, ATP 1 m M) et de 3 unites de T 4 polynucléotide kinase (fabriquée par Takara Shuzo Co Ltd) pour faire un volume total de ii I, puis traité à 37 'C pendant 30 minutes Le mélange total est ajouté à un échantillon préalablement traité avec de la T 4 ADN polymérase Après addition de 60 unités de T 4 ligase (un produit de Pharmacia)l et réaction du mélange à 14 "C pendant une nuit, une solution de Na CI 100 m M, Tris- HCI 50 m M (ph 7,5 l, Mg CI 2 10 m M, 2-mercaptoéthanol 7 m M, 100 Pg/ml de BSA et 250 unités de Eco R Pl est ajoutée au mélange réactionnel résultant pour faire un volume total de 40 i Il et la réaction est poursuivie pendant 2 heures à 37 'C Le mélange réactionnel ainsi obtenu est fractionné dans un gel d'agarose à bas point de fusion à 1 pour collecter un gel contenant un ADN à 600-2 000 bases Le gel est incubé à 65 'C pendant 10 minutes pour fondre et, après addition d'une quantité équivalente de phénol et refroidissement par de la glace pendant minutes, le mélange est centrifugé à 4 C pendant 10 minutes à 15.000 tpm La couche aqueuse ainsi obtenue est additionnée d'une quantité équivalente de phénol et la méme procédure est répétée. La couche aqueuse est traitée deux fois avec du ohloroforme et un 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M et 2,5 volumes d'éthanol sont ajoutés Après repos à -70 'C, le mélange est centrifugé à 15 000 tpm pendant 15 minutes pour collecter le résidu Celui-ci est lavé deux fois avec de l'éthanol à 75 %, séché sous vide et après addition de 1 Pg de vecteur phage, Lamda-gtll lfabriqué par Stratagene), traité à 26 'C pendant 10 minutes avec un kit de ligature (un produit de Takara Shuzo Co Ltd) Ensuite, l'échantillon est traité avec un kit de conditionnement in vitro fabriqué par Stratagenel De l'Escherichia ocli LE 392 lun produit de Stratagenel est infecté avec le phage Lamda Le nombre total du phage est compté, il est de 5,0 x 105 pfu (unité formant une plaquel. Exemple 3 La bibliothèque d'AD Nc de TRC-29 R ( 5,0 x 105 pfu) ainsi préparée est distribuée sur un milieu d'agar LB à 1,5 % l O lcontenant 10 g de bacto-tryptone, 5 g d'extrait de bacto-levure et 10 g de Na CI par litrel Le clone du gène M-CSF est sélectionné par la méthode d'hybridation sur plaque avec Escherichia coli LE 392 comme indicateur De plus, un nucléotide à 24 bases: S'- OAOO 6 AQQTETC Oi SASTACT Ei TAEC est synthétisé en fonction de la séquence d' ADN connue du gène M-CSF lScience, 230, 293-296 " 1985 H, La plaque sur une plaque de LB est transférée sur une membrane de nylon et la membrane est traitée avec du Na OH 0,5 H-Na Cl 1,5 M pendant 5 minutes, puis avec de l'acétate de sodium 3 M lp H 5,5 l pendant 5 minutes et séchée à 80 "C pendant 2 heures sous pression réduite La membrane est mise dans un sachet vinylique et incubée à 37 C pendant 4 heures dans 10 ml d'une solution de 5 fois SSC (une fois: Na Ci 150 mi 1, citrate de sodium 15 m M), 5 fois une solution de Denhardt (une fois: 0, 02 % de phycol, 0,02 % de polyvinyl pyrrolidone, 0,02 % de BSA), du phosphate de sodium 50 m M (p H 651,, et 0,1 % de SDS (lauryl sulfate de sodiuml, 250 Fg/ml d'ADN de sperme de saumon et 20 % de formamide Après élimination du liquide, 20 ng de la sonde oligonucléotidique synthétisée mentionnée plus haut ( 108 cpm/lgg sont ajoutés et l'hybridation est effectuée à 37 'C pendant une nuit La membrane est lavée trois fois avec 2 x SSC, 0,1 % de SDS à température ambiante, à 37 "C pendant 10 minutes, séchée à l'air et soumise à une autoradiographie pendant une nuit Des portions du milieu dans lesquelles des signaux apparaissent sont découpées 1.6 et mises en suspension dans I ml d'une solution SM (Na CI 0,1 M, t 1 SO 4 8 m M, Tris-H Cl 50 m M (p H 7 * 51, 0:01 % de gélatine) La suspension est diluée, chargée sur une plaque LB et le criblage est répétée avec la même sonde La plaque est purifiée pour obtenir deux lots du clone. Exemple 4 Un microorganisme hâte, Eschenichia coli LE 392, est infecté avec le phage 1 amda recombinant ( 1 xl 05 pfu), préparé dans l'exemple 3 et distribue sur deux feuilles de plaque de milieu d'agar LB ( 1-3 x 9 cm) On ajoute 1 i 5 ml de solution S Mit à chaque feuille pour infiltrer le phage dans celles-ci Le produit d'infiltration et la couche d'agar supérieure sont transférés dans un tube a' essais et centrifugés à 8000 tpm pendant 10 minutes Le surnageant est additionné de 60 unités de B Nasel (un produit de Takara Shuzo Co, Ltd) et de 100 i Lg de P R Nase A (un produit de Sigma Co) et le mélange est incubé à 37 'C pendant 30 minutes Après addition d'une quantité équivalente de poléqthglène glycol à 20 % et de Na CI 2, 5 1, le mélange est refroidi par de la glace pendant une heure, centrifugé à 15 000 tpm pendant 20 minutes pour fournir un 2-0 résidu La suspension du résidu dans 0,5 ml de solution SH est traite avec une quantité équivalente de chloroforme et centrifugée pour séparer une couche aqueuse Du chlorure de crsium est ajouté à la couche aqueuse pour que la densité de la solution soit de 1,15 Cette solution est séparee en couches sur des solutions SM additionnées de chlorure de césium pour obtenir des densités respectives de 1,6 ( 2 mll 1,5 ( 3 mi i et 1 14 ( 3 ml) et centrifugée à 30 000 tpm pendant 3 heures Une bande apparaît entre les densités 1,4 et 1 > 5 qui contient le phage, elle est prélevée et dissoute dans un tampon Tris-HCI lp H r 7,51, centrifugée à 40 000 tpm pendant une heure pour obtenir un résidu Le résidu est traité avec une solution de EDTA 20 m M, 0,5 % de SOS, 50 p Il/mg de protéase K lun produit de Sigma Co) à 65 'C pendant une heure. Après addition d'une quantité équivalente de phénol à la solution de réaction, suivie d'une centrifugation pour séparer une couche aqueuse cette couche aqueuse est à nouveau traitée avec une quantité équivalente de phénol-chloroforme et à nouveau centrifugée La couche aqueuse obtenue est traitée avec du chloroforme, puis 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M 1 et 2,5 volumes d'éthanol sont ajoutés Après 15 minutes à -70 'C, le mélange est centrifugé à 15 000 tpm pendant 15 minutes pour collecter un résidu, qui est lavé deux fois avec de l'éthanol à 75 % et séché sous pression réduite Le résidu est dissous dans 50 ill d'eau contenant 5 Jg/mil de P Nase A 10 Il d'un aliquot de la solution sont complètement digérés avec Eco RI lun produit de Toyo Boseki Co, Ltd l dans un tampon H lM Ianiatis et col, Molecular Cloning, 104, Cold Spring Harbor ( 19821 l, fournissant le clone de M-CSF dont le fragment a une longueur maximum de 1,0 kpb Le fragment ayant la longueur de 1,0 kpb obtenu par digestion avec Eco R Pl est récupéré par électrophorse sun gel d'agarose a bas point de fusion. De plus, après digestion complète du vecteur p UC 1 18 avec Eco P Rl, 0, 5 unité de phosphatase alcaline bactérienne (un produit de Toyo Boseki Co, Ltd) est ajoutée et traitée dans du Tris-HCI 50 m 1 (p H 8,0) à 65 C pendant une heure (cette réaction est dénommée par la suite "traitement BAP"I Le produit de réaction est traité deux fois avec une solution de phénol- chloroforme La couche aqueuse est additionnée de 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 MH et de 2 volumes d'éthanol et le mélange est centrifugé pour collecter le vecteur Un fragment d'insertion récupéré à partir du gel et le vecteur p UC 1 18 digéré avec Eco 1 RI sont réunis avec un kit de ligature (un produit de Takara Shuzo Co, Ltd) pour obtenir un plasmide, dénommé p UC 118-M 1 -CSF. 0 Exemple 5 gg de p UC 1 18-Mvll- CSF sont digérés dans 100 jl d'une solution contenant du Na CI 100 m M, du Tris-HCI 50 m M (p H 7,5), du Mg C 12 10 mn, du 2-mercaptoéthanol 7 m M et 100 unités d'endonucléase de restriction Bam HI à 373 C pendant 2 heures Du n phenol saturé d'eau est ajouté à la solution réactionnelle et le mélange est agité et centrifugé La couche aqueuse est additionnee de 1/l O de volume d'acétate de sodium 3 tpl (p H 5,5) et de 2,5 volumes d'éthanol sous agitation Aprèes repos à -80 'C pendant 15 minutes, le mélange est centrifugé à 15000 tpm pendant 15 minutes pour obtenir des pellets blancs Les pellets sont dissous dans 10 ml d'une solution contenant du K 3 PO 4 67 m M, du M'1 g C,2 6,7 mr, du 2-mercaptoethanol 1 m Nl et des d ATP, d CTP, d STP et d TTP 33 PWI Aprs addition de 20 unités d'enzyme de fragment de Klenow (fabriquee par Ta Hara Shuzo Co Ltd), le mélange est traité a 228 C pendant une heure Le mélange réactionnel est soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose à bas point de fusion à:i (un produit de BSRL Col pour extraire et isoler des fragments d'ADN ayant une longueur d'environ 700 bp et environ 3,2 kpb 20 jlg du fragment d'ADN ayant une longueur d'environ 3,2 kpb sont digérés avec l'endonucléa 3 se de restriction Stu I de la méme façon que ci-dessus pour isoler un fragment d'ADN ayant une longueur d'environ 3,1 ipb 0,5 unité de phosphatase alcaline bactérienne est ajoutee à 2 izg du fragment ayant une longueur d'environ 3,1 kpb ainsi isole et traitée dans du Tris-H Cl 50 m Ml (p H 8,0) à 65 "C pendant une heure Le fragment d'ADN est collecté à partir du mélange réactionnel par extraction par, le phenol et précipitation par l'éthanol 100 ng du fragment d'ADN déphosphorype aiant une longueur d'environ 3,1 kpb et 300 ne du fragment d'AON ayant une longueur d'environ 700 pb prélablement obtenu, sont reliés avec un kit de lipature lun produit de Takara Shuzo Co, Ltd) et ajoutés à des cellules compétentes: Escherichia coli J-M 109 (un produit de Takara Shuzo Co Ltdl Le mélange est distribué sur un milieu d'agar LB contenant 50 1:g/ml d'ampicilline et cultivé à 37 'C pendant 16 heures pour obtenir un transformant Le plasmide, denommé par la suite plasmide p UC 1 18-Mtil-del, preparé à partir du transformant et la séquence d'ADN inséréee (dénommée par la suite 1 I-deli, est déterminée pour confirmer que la sequence est telle que représentee dans SEQ 10 l No 1. Exemple 6 pig du plasmide p SV 2-dhfr lproduit par EBRL Co) sont digérés à 37 "C pendant 2 heures avec les endonucléases de restriction Hind I 1 l et Bgl Il, en une quantité de 20 unités chacune. On ajoute ensuite 20 unités d'enz me de fragment de Klenow et fait réagir le mélange à 22 'C pendant une heure en présence de 4 sortes de d NTP La solution de réaction est soumise à une électrophorèse sur gel d'agarose à bas point de fusion pour isoler les fragments d'ADN ayant une longueur d'environ 3,6 kpb pour obtenir 5 ig de fragments d'ADN traités par une phosphatase alcaline bactérienne Séparément, 10 ug de p UC 18-Mil-del sont digérés avec 20 unités d'endonucléase de restriction Eco Pl à 37 'C pendant 2 heures et traités avec 20 unites d'enzyme de fragment de Klenow à 22 'C pendant une heure en présence de 4 sortes de d NTP La solution de réaction est soumise à une électrophorse sur gel d'agarose à bas point de fusion pour isoler un fragment d'ADN ayant une longueur d'environ 700 pb On réunit 300 ng du fragment d'ADN ayant une longueur d'environ 700 pb et 100 ng du fragment d'ADN ayant une longueur d'environ 3,6 kpb préalablement obtenu, avec un kit de ligature pour produire un transformant avec Escherichia coli comme microorganisme hôte, Le plasmide p SV 2-M 1 -del est obtenu à partir du transformant. Séparément, 5 ug d'ADN du plasmide p SV 2-dhfr sont digérés avec 30 unités des endonucléases de restriction Pvu Il et liés avec 1 Jg de linker Eco RI phosphorylé ( 6-6-A-A-T-T-C-C: produit par Takara Shuzo Co Ltd) avec un kit de ligature La solution de réaction est digérée avec 100 unités de l'endonucléase de restriction Eco RI à 37 "C pendant 2 heures et soumise à une électrophorése sur gel d'agarose à bas point de fusion pour isoler un fragment d'ADN ayant une longueur d'environ 2,4 kpb 300 ng de ce fragment et 5 i g de plasmide p SV 2-M 11-del préalablement préparé, sont digérés avec 10 unités de l'endonucléase de restriction Eco RP à 37 'C pendant 2 heures et ensuite liés avec ng de l'ADN traité par une phosphatase alcaline bactérienne :35 au moyen d'un kit de ligature Un transformant est produit avec Escherichia coli comme microorganisme h 6 te Le plasmide p SV 2- dhfr-Ml-del est obtenu à partir du transformant La carte des endonucléases de restriction du plasmide est montrée dans la figure 1, dans laquelle la portion ombrée par des lignes obliques est la sèquence de bases codant pour le peptide signal La même procédure est répétte avec 50 ng de p UC 1 18-MI 1-CSF pour la construction d'un vecteur d'expression à utiliser dans un test témoin pour produire le plasmide p SV 2-dhfr-M I -CSIF. Exemple 7 L'introduction du gène est effectuée par la méthode de percement par impulsion electrique au moyen d'une unité de traitement de cellules haute tension (un produit de Bioelectronics Co.l Les cellules CHO-dfhr lfournies par Tokyo University Microorganism Institute) cultivées sur une plaque plastique avec un milieu HAM F 12 contenant 5 % de FCS sont pelées avec une enzyme de détachement, Nagase lun produit de Nagase Industries, Ltd l, mises en suspension dans du PBS(-) et centrifugées pour collecter les cellules Les cellules sont mises en suspension dans du PB 51-) à une concentration de lx 107 /ml Les plasmides p SV 2- dhfr-M 1 i-del et p SV 2-dhfr 1 l-CSF, pr parps dans l'exemple 8 sont ajoutés à la suspension à une concentration de 40 Jig/ml chacun Après agitation, la suspension est transférée dans une chambre, dans laquelle est appliquée une impulsion électrique à 5 reprises dans des conditions comprenant une distance d'électrode de 3 mm, une tension de 1200 V et un intervalle entre impulsions de Psecondes Après application de l'impulsion, la suspension de cellules est rapidement récupérée et stockée dans des conditions de refroidissement par la glace Les cellules sont inoculées dans une boite de pétri en matière plastique contenant déjà du milieu HAM F 12 contenant 5 % de FCS. Les cellules sont cultivées à 37 'C dans un incubateur à 5 % de C 2 O pendant 48 heures, puis le milieu est remplacé par un milieu sélectif lmilieu o -MEI-EM contenant 5 % de FCS dialysé) 10 à 14 jours aprés le remplacement du milieu, on observe des colonies de cellules qui proliférent dans le milieu sélectif Les colonies sont lonéles par la méthode du papier filtre pour la mesure de l'activité M-CSF l'activité d'une colonie est prise en tant que I unité) sur le liguide surnageant de culture selon la méthode de Metcalf lJ Biol. led, 44 287-300 ( 1966)l Le transformant dont l'activité M-CSF est confirmée, est cultivé dans un milieu contenant du MTX (lc- H-EM contenant 5 % de FCS dialysé et 0,1 3 10 p 1 de MTX), dans lequel la concentration du MTX est augmentée par étapes à partir de 0, 1, 0,5, 2 et jusqu'à 10 UM On mesure l'activité M-CSF de la souche qui est résistante à une concentration de 10 i M de MTX. La productivité est de 70 000 Unités/ml lorsqu'un gêne M 1-CSF de tlype natif est utilisé La souche avec laquelle le gène M-11-del est employé présente une productivité de 600000 unités/ml, ce qui montre que l'introduction d'un géne dont le site de liaison de la membrane est enlevé aboutit à un transformant de productivité décuple Le transformant est dénommé M -del 14-2 et déposé au Fermentation Pesearch Institute, Agency of Industrial Science and Technology lFERPM BP-3522) Le transformant M 11 -del 14-2 présente une productivité de 600000 unités/ml uniformément pendant un mois dans un milieu -M 1 EM contenant 5 % de FCS. Exemple 8 PPMI 1640 contenant 5 % de FCS. Les ceilules sont cultivées à 37 'C dans un incubateur à 5 % de C 02 pendant 48 heures, puis le milieu est remplacé par un milieu sélectif (milieu RPPMI 1640 contenant 5 % de FCS, 200 gg/ml de 6418} 10 à 14 jours aprés le remplacement du milieu, on observe des colonies de cellules qui proliférent dans le milieu sélectif Les colonies sont clonées par la méthode du papier filtre pour la mesure de l'activité M- CSF (l'activité d'une colonie est prise en tant que 1 unitél sur le liguide surnageant de culture selon la méthode de Metcalf lJ Biol Med, 44 287-300 ( 1966)l Le transformant dont l'activité M-CSF est confirmée, est cultivé dans un milieu contenant du M 1 TX lPPMI 1640 contenant 6 % de FCS dialuysé et 0,1 à 10 p IM de MTX), dans lequel la concentration du MTX est augmentée par étapes à partir de 0,1, 0,5, 2 et jusqu'à 10 P Ml On mesure l'activité M-CSF de la souche qui est résistante à une concentration de 10 PM de t MITX La productivité est de 4 000 unités/ml lorsqu'un géne M 1 -CSF de type natif est utilisé La souche avec laquelle le géne M l-del est employé présente une productivité de 35 000 unités/ml, ce qui montre que l'introduction d'un gne dont le site de liaison de la membrane est enlevé aboutit à un transformant de productivité décuple Le transformant est dénommé de INM 15 Le transformant del M 16 présente une productivité de 35 000 unités/ml uniformément pendant un mois dans un milieu PPMI 1640 contenant 5 % de FCS. Exemple 9 Des cellules CHO, Ml -dei 142, sont cultivées à 37 'C dans un incubateur à C 02 à 5 % pendant deux semaines avec du milieu D-IEM contenant 5 % de FCS Vingt litres du surnageant du bouillon de culture sont concentrés à 2 litres avec une unité d'ultrafiltration lun produit de M-illipore Co l Le concentrat est additionné de Na Cl à une concentration de 4 M et le mélange est adsorbe dans du Phény I-Sepharose CL-4 B ( 50 x 50; dénomination commerciale, un produit de Pharmacia Co) préalablement équilibré avec un tampon au phosphate de sodium 10 m M I(p H 7,0 O contenant du Na C Il 4 M La colonne est éluée selon un mode à gradient linéaire avec un tampon au phosphate de sodium 10 m M (p H 7,0; dénommé par suite tampon A) à des concentrations de Na CI comprises entre 4 M et O M Une fraction active M-CSF est obtenue à partir des fractions éluées à des concentrations de Na CI comprises entre 1,5 et 1,0 M La fraction active est concentrée à 10 ml par une membrane YM-10 (dénomination commerciale, un produit d'Amicon Co.I et dessalée sur Sephadex 6-25 ( 9,1 mi, dénomination commerciale, un produit de Pharmacia Co l préalablement équilibré av.ec du tampon A contenant du Na CI 80 m M, adsorbée dans du DEAE-Cellulofine ( 2,5 x 1 O cm, dénomination commerciale, un produit de Seikakaka Kogyo Co) équilibré avec le méme tampon, et éluée selon un mode à gradient linéaire avec des concentrations de Na CI comprises entre 0,1 et 0,5 M Une fraction presentant une activité M-CSF éluée à des concentrations de Na CI de 0,12 à 0,15 M est concentrée à 6 ml avec une membrane YM-1 0, puis soumise à une filtration sur gel Ultrogel Ac A 34 1 ( 2,5 x 92 cm: dénomination commerciale, un produit de IBF Biotechnic Co) pour obtenir une -50 fraction active Mt CSF Cette fraction active est concentrée à 7 ml et du Na CI est ajouté pour faire une concentration finale de 4 M Le mélange est adsorbé dans du Phényl- Superose ( 1 Oxl O cm, dénomination commerciale, un produit de Pharmacia Co) préalablement équilibré avec du tampon A contenant du Na CI 4 Mh et élué selon un mode à gradient linéaire avec des concentrations de Na CI comprises entre 4 M et O M Une fraction active M-CSF obtenue à partir des fractions éluées à des concentrations de Na CI comprises entre 2 et 1 M est dialysée contre 200 volumes de tampon A pour produire un produit punrifié final Le poids mol&culaire de ce produit purifié est mesuré par Superose 12 ( 1,0 x 30 cm, dénomination commerciale, un produit de Pharmacia) équilibré avec du tampon A pour trouver que le poids moléculaire est d'environ 70 000 dalton Une électrophorèse sur SBS- polyacrylamide révèle une bande légèrement large de 28 000 + 2 000 dalton La quantité totale de produit purifié déterminée par absorption UV est A 280 = 0,26 L'activité M 1-CSF mesurée par la méthode de la colonie sur agar tendre est de 1,2 x 1 08/A 280. Exemple 10 c 250 gi ( 9 ml) du produit obtenu dans l'exemple 9 sont placés dans un tube de dialyse, concentrés à environ 1 mi par mélange avec du Sephadex 6-100 et dialysés contre 200 ml d'une solution tampon Tnis-HCI 65 m M (p H 6,8) contenant du r- mercaptoéthanol 0,1 M, 1 % de SDS et 10 % de glycérol pour effectuer la réduction du groupe SH et la modification des protéines Du monoiode acetate est ajouté au liquide interne de dialyse à une concentration finale de 150 m M et le mélange est laissé reposer à température ambiante pendant 30 minutes pour effectuer la réduction- carboxyméthylation de M 1-CSF Le mélange est dessalé et le SOS est éliminé par soumission du mélange à une colonne de résine A 51 1 AS ayant subi un échange d'ions ( 0,6 x 1 O cm, dénomination commerciale, un produit de Biolab Co.) équilibrée avec 0,001 % de PE 3 et une colonne Sephadex CI-50 l 1,Ox 9,0 cm: dénomination commerciale, un produit de Pharmacia, Co 1 qui sont reliées ensemble La fraction M 1-CSF ayant subi une réduction-carboxyméthylation identifiée par la méthode ELISA est Iyophilisée et dissoute dans 1 ml de tampon au phosphate de sodium 100 m M (p H 7,0 l contenant du EDTA 10 m M, du DTT 10 m M, 0,1 % de SOS et 1 % de Triton X-100 Après addition de 1 U de N- Olycanase (dénomination commerciale, un produit de 6 enzy me, Co.), la solution est incubée à 37 'C pendant 24 heures pour couper les chai'nes sucre de MI Vl I-CSF Le M 1-CSF dont les chaîines sucre sont éliminées est adsorbé dans du TMFIC-PACKI AP-303 3003 AODS (dénomination commerciale, un produit de M Hurawama Chemical Co) et élué selon un mode à gradient linéaire avec des concentrations d'acétonitrile allant de O à 70 ' % La fraction de M 1-CSF dont les chaînes sucre sont éliminées qui est éluée à une concentration de % d'acétonitrile, est Iyophilisée et dissoute dans 400 1 I d'un tampon au phosphate de sodium 10 m M (p H 7, 0) Après addition de J Lg d'endoprotéase Lys-C (dénomination commerciale, un produit de Beringer Mannheim), la solution est incubée à 37 'C pendant 17 heures Le mélange réactionnel est soumis à 500 jzl d'anhydrotripsine agarose (un produit de Takara Shuzo Co Ltd) équilibré avec un tampon à l'acétate 50 m M (p H 5,0) contenant du Ca CI 2 20 m M pour collecter les fractions passant à travers la colonne Les peptides du C terminal contenus dans les fractions ainsi collectées sont adsorbés dans TSKODS 120 T ldénomination commerciale, un produit de Toso Co) et élués selon un mode à gradient linéaire avec des concentrations d'acétonitrile de 5 à 60 %. Le peptide du C terminal élué à une concentration de 25 % d'acétonitrile est collecté et analysé par un séquenceur d'acides aminés PSG 1 La squence d'acides aminés ainsi trouvée est -Asn-X-Asp-Asn-Ser-Phe-Ala-Blu-X-Ser-Ser-61 n-Eily-His- 1 Iu-Arg-Oln-Ser-6 lu-Oly-Ser- A titre de contrôle, du M 1-CSF purifié est produit à partir d'une souche à forte production de M 1-CSF de cellules CHO maintenant le gène MI-CSF de type négatif selon les procédures des exemples 9 et 10 La séquence d'acides aminés du peptide du C terminal produit par digestion avec l'endoprotéinase Lys-C de ce M 1-CSF purifié, se révèle étre -Asn-X-Asp-Asn-Ser-Phe-Ala- Siu-X-Ser-Ser-Oln-1-Iy-His-r 31 u-Arg-rln-Ser-rllu-1 ly-Ser-, ce qui confirme que le polypeptide actif M-CSF produit par les cellules M l -del 14-2 est identique au M-CSF de type négatif. Comme cela est illustré plus haut, le vecteur recombinant de la présente invention peut exprimer le polypeptide actif M-CSF à un taux élevé et de façon stable Le transformant préparé par l'utilisation du vecteur recombinant assure une production de masse du polypeptide actif M-CSF à l'échelle industrielle. Il est évident que de nombreuses modifications et variations de la présente invention sont possibles d'après ce qui précède Il est donc bien compris que des modifications de la présente invention peuvent être pratiqu 6 es dans le cadre des revendications ci- jointes. DESCPIPTION DE LA SEQUENCE 1 1 SEQ ID No 1 2 Longueur de la séquence: 693 paires de bases 3 Type de la séquence: acide nucléique 4 Brins: à double brin Topologie de la séquence e: linéaire 6 Sorte: autre acide nucléique; ADN de synthèse 7 Source TPRC-29 R dérivé d'une cellule humaine 8 Nom ène MI -del 9 Séquence ATG ACC GCG CCG GGC GCC GCC GGG CGC TGC CCT CCC ACG ACA TGG CTG 48 Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu -32 -30 -25 -20 GGC TCC CTG CTG TTG TTG GTC TGT CTC CTG GCG AGC AGG AGT ATC ACC 96 Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr -15 -10 -5 -1 GAG GAG GTG TCG GAG TAC TGT AGC CAC ATG ATT GGG AGT GGA CAC CTG 144 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 0 1 5 10 15 CAG TCT CTG CAG CGG CTG ATT GAC AGT CAG ATG GAG ACC TCG TGC CAA 192 Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln 25 30 GAG TTT GTA GAC CAG GAA CAG TTG AAA Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys TAC CTT AAG AAG GCA TTT CTC Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu 55 ATG Met CGC TTC AGA GAT Arg Phe Arg Asp CAG GAA CTC TCT Gln Glu Leu Ser TTG Leu AAC Asn CTG GTA CAA TAC Leu Val Gln Tyr ACC CCC AAT GCC Thr Pro Asn Ala AGG CTG AAG AGC Arg Leu Lys Ser TGC Cys ATC Ile ATA Ile GAT Asp CCA GTG TGC Pro Val Cys ATG GAG GAC ACCMet Glu Asp Thr GCC ATT GTG CAG Ala Ile Val Gln TTC ACC AAG GAT Phe Thr Lys Asp CTG Leu TAT GAA Tyr Glu GAG CAT GAC Glu His Asp AAG Lys TTG CTG GAG AAG Leu Leu Glu Lys GCC ITGC GTC CGA Ala Cys Val Arg GTC AAG AAT Val Lys Asn GTC Val ACT Thr TTC TAT GAG ACA Phe Tyr Glu Thr TTT AAT GAA ACA Phe Asn Glu Thr AAG Lys CCT CTC CAG Pro Leu Gln AAT CTC CTT Asn Leu Leu GAC AAG GAC TGG AAT ATT TTC Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe 135 GAA Glu TGC TCC AGC CAA Cys Ser Ser Gln TTC TAC AGG TGG Phe Tyr Arg Trp GGC Gly *AGC AAG AAC TGC Ser Lys Asn Cys CAT GAG AGG CAG His Glu Arg Gln AGG CGG CGG AGC CAT CAA Arg Arg Arg Ser His Gln 170 TCC Ser AAC Asn AAC AGC TTT GCT Asn Ser Phe Ala GAG GGA TCC CTC Glu Gly Ser Leu GAG CCT CAG AGA Glu Pro Gln Arg GCG GAT Ala Asp TCT CCC TTG Ser Pro Leu GAG Glu CAA CCA GAG GGC Gln Pro Glu Gly AGC Ser CCC CTG ACT CAG Pro Leu Thr Gln GAT GAC AGA Asp Asp Arg CAG GTG GAA CTG CCA GTG TAG Gln Val Glu Leu Pro Val 198 ATT ACA TTT Ile Thr Phe TTG Leu REVENDICATIONS 1 Vecteur recombinant capable d'exprimer le polypeptide actif M- CSF, contenant un ADN de M-CSF-del introduit par substitution dans un site d'ADN du marqueur dhfr d'un vecteur d'expression possédant un promoteur et l'ADN du marqueur dhfr, et un ADN du marqueur dhfr construit en aval de cet ADN de M-CSF-del, dans lequel cet ADN de M-CSF- del est un ADN contenant une portion d'un ADN codant pour une séquence d'acides aminés commençant à partir du N terminal jusqu'à l'acide aminé 179 d'un polypeptide qui contient un peptide signal M 1-CSF et ne contenant pas une partie ou la totalité de l'ADN codant pour les acides aminés allant de l'acide aminé 180 au C terminal. 2 Vecteur recombinant suivant la revendication 1, dans lequel ce promoteur est un promoteur précoce de SV 40. 3 Vecteur recombinant suivant la revendication 1, dans lequel cet ADN de M-CSF-del code pour la séquence d'acides aminés suivante: Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 4 Vecteur recombinant suivant la revendication 1, dans lequel cet ADN de M 1-CSF- del a la séquence d'acides aminés suivante: ATG ACC GCG CCG GGC GCC GCC GGG CGC TGC CCT CCC ACG ACA TGG CTG GGC TCC CTG CTG TTG TTG GTC TGT CTC CTG GCG AGC AGG AGT ATC ACC GAG GAG GTG TCG GAG TAC TGT AGC CAC ATG ATT GGG AGT GGA CAC CTG CAG TCT CTG CAG CGG CTG ATT GAC AGT CAG ATG GAG ACC TCG TGC CAA ATT ACA TTT GAG TTT GTA GAC CAG GAA CAG TTG AAA GAT CCA GTG TGC IO TAC CTT AAG AAG GCA TTT CTC CTG GTA CAA TAC ATA ATG GAG GAC ACC ATG CGC TTC AGA GAT AAC ACC CCC AAT GCC ATC GCC ATT GTG CAG CTG CAG GAA CTC TCT TTG AGG CTG AAG AGC TGC TTC ACC AAG GAT TAT GAA GAG CAT GAC AAG GCC TGC GTC CGA ACT TTC TAT GAG ACA CCT CTC CAG TTG CTG GAG AAG GTC AAG AAT GTC TTT AAT GAA ACA AAG AAT CTC CTT GAC AAG GAC TGG AAT ATT TTC AGC AAG AAC TGC AAC AAC AGC TTT GCT GAA TGC TCC AGC CAA GGC CAT GAG AGG CAG TCC GAG GGA TCC CTC TTG TTC TAC AGG TGG AGG CGG CGG AGC CAT CAA GAG CCT CAG AGA GCG GAT TCT CCC TTG GAG CAA CCA GAG GGC AGC CCC CTG ACT CAG GAT GAC AGA CAG GTG GAA CTG CCA GTG TAG Vecteur recombinant suivant la revendication 1, ayant une construction telle que montrée dans la figure 1. 6 Ceilule animale transformée capable d'exprimer de façon stable un polypeptide actif M-CSI=SF, transformée par introduction dans une cellule animale d'un vecteur recombinant contenant un ADN de M-CSF-del introduit par substitution dans un site d'ADN du marqueur dhfr d'un vecteur d'expression possèdant un promoteur et I'ADN du marqueur dhfr, et un ADN du marqueur dhfr construit en aval de cet ADN de M-CSF-del, dans lequel cet ADN de M-CSF-del est un ADN contenant une portion d'un ADN codant pour une séquence d'acides aminés commençant à partir du N terminal jusqu'à l'acide aminé 179 d'un polypeptide qui contient un peptide signal M Pl -CSF et ne contenant pas une partie ou la totalité de l'ADN codant pour les acides aminés allant de l'acide aminé 180 au C terminal. 7 Cellule animale transformée suivant la nevendication 6, dans laquelle ce promoteur est un promoteur précoce de SV 40. 8 Cellule animale transformée suivant la revendication 6, dans laquelle cet ADN de M-CSF-del code pour la séquence d'acides aminés suivante: Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gin Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 9, Ceilule animale transformée suivant la revendication 6, dans laquelle cet ADN de M-CSF-del a la séquence d'acides aminés suivante ATG ACC GCG CCG GGC GCC GCC GGG CGC TGC CCT CCC ACG ACA TGG CTG GGC TCC CTG CTG TTG TTG GTC TGT CTC CTG GCG AGC AGG AGT ATC ACC GAG GAG GTG TCG GAG TAC TGT AGC CAC ATG ATT GGG AGT GGA CAC CTG CAG ATT TAC ATG CAG GAG TTG GAC GAA TTC TCT CAG TCT CTG ACA TTT CTT AAG CGC TTC GAA CTC CAT GAC CTG GAG AAG GAC TGC TCC TAC AGG CCC TTG GTG GAA CAG GAG AAG AGA TCT AAG AAG TGG AGC TGG GAG CGG TTT GCA GAT TTG GCC GTC AAT CAA AGG CAA CTG GTA TTT AAC AGG TGC AAG ATT GGC CGG CCA ATT GAC CTC ACC CTG GTC AAT TTC CAT CGG GAG GAC CAG CTG CCC AAG CGA GTC AGC GAG AGC GGC AGT GAA GTA AAT AGC ACT TTT AAG AGG CAT AGC CAG CAG CAA GCC TGC TTC AAT AAC CAG CAA CCC ATG TTG TAC ATC TTC TAT GAA TGC TCC GAG CTG GAG AAA ATA GCC ACC GAG ACA AAC GAG CCT ACT ACC GAT ATG ATT AAG ACA AAG AAC GGA CAG CAG TCG CCA GAG GTG GAT CCT AAT AGC TCC AGA GAT TGC GTG GAC CAG TAT CTC CTC TTT CTC GCG GAC CAA TGC ACC CTG GAA CAG CTT GCT TTG GAT AGA CTG CCA GTG TAG Cellule animale transformée suivant la nevendication 6, dans laquelle ce vecteur recombinant a une construction telle que montrée dans la figure 1. I 11 Cellule animale transformée suivant la revendication 6, dans laquelle la cellule hâte est une cellule animale possèdant des caractéristiques dhfr-. 12 Cellule animale transformée suivant la revendication 6, dans laquelle cette cellule hâte est une cellule CHO dhfr-. 13 Cellule animale transformée suivant la revendication 6, dans laquelle cette cellule hôte est une cellule TPC-29 PR 14 Cellule animale transformée suivant la revendication 6, qui est Ml-del 14-2 (FERPM BP-3522). Procédé pour la préparation d'un polypeptide actif M-CSF comprenant: la transformation d'une cellule animale par introduction dans celle-ci d'un vecteur recombinant capable d'exprimer le polypeptide actif M-CSF, contenant un ADN de M-CSF-del et un i ADN du marqueur dhfr construit en aval de cet ADN de M-CSF- del, dans lequel cet ADN de M-CSF-del est un ADN contenant une portion d'un ADN codant pour une sequence d'acides aminés commençant à partir du N terminal jusqu'à l'acide aminé 179 d'un polypeptide qui contient un peptide signal M 1-CSF et ne contenant pas une partie ou la totalité de I'ADN codant pour les acides aminés allant de i'acide aminé 180 au C terminal, et cet ADN de M- CSF-del est introduit par substitution dans un site d'ADN du marqueur dhfr d'un vecteur d'expression possédant un promoteur et l'ADN du marqueur dhfr; la culture de la cellule animale transformée dans un milieu contenant du méthotrexate pour sélectionner une cellule animale transformée résistante au méthotrexate capable d'exprimer de façon importante et stable le polypeptide actif M-CSF; et la culture dans un milieu de cette cellule animale transformée résistante au méthotrexate. 16 Procédé suivant la revendication 15, dans lequel ce promoteur est un promoteur précoce de SV 40. 17 Procédé suivant la revendication 15, dans lequel cet ADN de M-CSF- del code pour la séquence d'acides aminés suivante: Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Tyr Ile Met Glu Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Ash Cys Asn Asn Ser Phe Ala Ser Ser Gln Gly Arg Trp Arg Arg Leu Glu Gln Pro Glu Leu Pro Val 18 Procédé cet ADN de M-CSF-del a His Arg Glu Glu Ser Gly Arg His Ser Gln Gln Pro Ser Glu Glu Pro Leu Thr Gly Gln Gln Ser Arg Asp Leu Ala Asp Leu Asp Arg suivant la revendication 15, dans lequel la séquence d'acides aminés suivante: GCC TTG TAC CTG GTA TTT AAC AGG TGC AAG ATT GGC CGG CCA GCC GGG CGC TGC CCT CCC ACG ACA TGG CTG GTC TGT ATT GAC CTC ACC CTG GTC AAT TTC CAT CGG GAG TGT AGC GAC CAG CTG CCC AAG CGA GTC AGC GAG AGC GGC CTC CAC AGT GAA GTA AAT AGC ACT TTT AAG AGG CAT AGC CTG ATG CAG CAG CAA GCC TGC TTC AAT AAC CAG CAA CCC GCG ATT ATG TTG TAC ATC TTC TAT GAA TGC TCC GAG CTG AGC GGG GAG AAA ATA GCC ACC GAG ACA AAC GAG CCT ACT AGG AGT ACC GAT ATG ATT AAG ACA AAG AAC GGA CAG CAG AGT GGA TCG CCA GAG GTG GAT CCT AAT AGC TCC AGA GAT ATC CAC TGC GTG GAC CAG TAT CTC CTC TTT CTC GCG GAC CCA GTG TAG 19 Procédé suivant la revendication 15, dans lequel ce vecteur recombinant a une construction telle que montrée dans la figure 1. Procédé suivant la revendication 15, dans lequel la cellule hôte est une cellule animale possédant des caractéristiques dhfr-. 21 Procédé suivant la revendication 15, dans lequel cette cellule hôte est une cellule CHO dhfr-. Glu Phe Ser Gln Cys Tyr Pro Val ATG GGC GAG CAG ATT TAC ATG CAG GAG TTG GAC GAA TTC TCT CAG ACC TCC GAG TCT ACA CTT CGC GAA CAT CTG AAG TGC TAC CCC GTG GCG CTG GTG CTG TTT AAG TTC CTC GAC GAG GAC TCC AGG TTG GAA GGC TTG GAG CGG TTT GCA GAT TTG GCC GTC AAT CAA AGG CAA CCG CTG TCG CAG GAG AAG AGA TCT AAG AAG TGG AGC TGG GAG CTG ACC CTG CAA TGC ACC CTG GAA CAG CTT GCT TTG GAT AGA 22 Procédé suivant la revendication 15, dans lequiel cette cellule hâte est une cellule TPC-29 P. 23 Procédé suivant la revendication 15, dans lequel cette cellule animale transformée est M l -del 14-2 (FERM BP- 35221.