Brevet FR2672618A1 — publié le 19920814

FRAGMENT D'ACIDE NUCLEIQUE DE LA REGION DU CHROMOSOME X IMPLIQUE DANS LE SYNDROME X FRAGILE, SONDE NUCLEOTIDIQUE ET PROCEDE POUR LE DIAGNOSTIC DU RETARD MENTAL AVEC X FRAGILE. Le syndrome de retard mental avec X fragile est une maladie liée au chromosome X qui atteint environ un garçon sur mille cinq cent. Les femmes vectrices, environ une sur sept cent cinquante, ont un risque de 30% de présenter une débilité légère ou même moyenne. Le syndrome du retard mental avec X fragile constitue la cause la plus fréquente de retard mental héréditaire. Le diagnostic de la maladie est établi par une analyse cytogénétique délicate qui nécessite des conditions de culture particulières et l'analyse de 50 à 100 mitoses, car le site fragile détectable cytogénétiquement n'est présent que dans 5 à 50% des mitoses. Le diagnostic des femmes vectrices est encore plus difficile car seules 50 à 60% de ces femmes expriment le site fragile, dans une proportion généralement faible des mitoses. La difficulté du test cytogénétique fait qutil n1 est pratiqué de manière fiable que dans un nombre limité de laboratoires; en outre, le diagnostic de la maladie n'est souvent pratiqué qu'après la naissance d'un deuxième enfant atteint dans la même famille; or l'établissement précoce d'un tel diagnostic est capital pour mettre en oeuvre des investigations permettant le diagnostic prénatal et le dépistage des femmes vectrices qui transmettent la maladie à 50% de leurs enfants males, dans les familles à risque.La haute fréquence de la maladie et l'importance de d'un conseil génétique précoce justifie un dépistage systématique néonatal de la maladie. La présente invention vise précisément à fournir de nouveaux moyens dtinvestigation basée sur l'étude directe de 1'ADN et permettant un diagnostic rapide de la maladie et applicable à un nombre important de patients. Le syndrome du retard mental avec X fragile se caractérise par la présence d'un site fragile dans la région Xq27.3, induit in vitro par une privation en acide folique ou par des inhibiteur de la synthèse des déoxynucléotides. La cartographie génétique de la région Xq27-q28 a permis de confirmer que le locus de la maladie est localisé au niveau ou à côté du site fragile (Oberle et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1986; Suthers et al., Science, 1989; Rousseau et al. Am. J. Hum. Genet., 1991). Il apparait par ailleurs que la transmission héréditaire de la maladie est inhabituelle par rapport aux autres maladies liées au chromosome X. On a constaté que des hommes phénotypiquement normaux transmettent la mutation à leur filles, lesquelles présentent rarement les symptômes de la maladie, par contre les fils et filles de ces femmes présentent un fort taux d'apparition de la maladie (Sherman et al., Hum. Genet., 1985). Plusieurs hypothèses ont été proposées pour expliquer ce phénomène. Les marqueurs génétiques proposés dans l'art antérieur ne peuvent servir qu a suivre la transmission de la mutation dans les familles ou la maladie a déjà été diagnostiquée par une étude cytogénétique, il s'agit d'un diagnostic indirect par étude de liaison; il est en général nécessaire d'utiliser plusieurs marqueurs de part et d'autre du locus de la maladie, et ces marqueurs ne sont informatifs que dans des proportions variables de familles. La demande de brevet international W090/05194 décrit un nouveau locus intitulé lAl distant du site X fragile mais dont le polymorphisme de restriction permet de disposer d'un marqueur génotypique. Les sondes capables de détecter le locus lAl permettent le diagnostic de plusieurs maladies liées au chromosome X et notamment le syndrome du X fragile, par hybridation sélective au niveau de la région Xq27. - DXS52 du dit chromosome X. D'autres sondes proches du locus X fragile ont également été décrites, notamment par les inventeurs. Ainsi F. Rousseau et al (Am. J. Hum. Genet., 48 : 108-116, 1991) rapportent la mise en évidence de sept régions proches du locus X fragile (FRAXA). Deux de ces régions comprises entre DXS369 et DXS296 contiennent les marqueurs génétiques les plus proches de FRAXA connus à ce jour, l'une de ces régions contient deux sondes détectant un polymorphisme, ces sondes dénommées St677 (DXS463) et 2-34 (DXS477) détectent toutes deux les fragments de restriction Taql polymorphes; une autre sonde détectant également un polymorphisme, et dénommée Do33 (DXS465; 42% hétérozygocité) est localisée dans la même région que DXS296, proximale au point de clivage du chromosome correspondant au locus du syndrome Hunter (IDS).L'utilisation de ces sondes a permis de déterminer la disposition physique des régions précédentes Cen-DXS369-DXS4?6-(DXS463,DXS477)-(DXS296,DXS465 > -IDS- DXS304-tel, et leur position par rapport au locus X fragile. L'analyse par électrophorèse en champ pulsé du locus X fragile avec les sondes précédentes et plus particulièrement avec la sonde Do33 (DX465) ont conduit les inventeurs à remarquer que les patients avec X fragile et retard mental se distinguent des sujets normaux ou des sujets porteurs de la mutation X fragile mais sans expression clinique de la maladie, par une inhibition totale ou partielle de la digestion de sites de restriction proches de la sonde Do33, et notamment de sites pour les enzymes BssHII, SacII et EagI. Les inventeurs ont cloné sous forme de chromosome artificiel de levure (YAC), le segment d'ADN d'environ 225 kb défini entre les sondes St677 et Do33, et situé dans la région Xq27-q28 du chromosome X humain. Des sondes provenant de ce segment ont été préparées pour l'analyse des mutations, des méthylations de l'ADN et des gènes impliqués dans le syndrome X fragile. Ces sondes ont notamment permis l'étude, à partir d'ADN de leucocytes, de la digestibilité des sites de restriction BssHII, EagI, SacII et de manière générale des sites de restriction dont la digestion par l'enzyme correspondant est inhibée lorsque le site contient une cytosine méthylée; ces sites sont dénommés sites à CpG, il s'agit par exemple de site contenant le dinucléotide CpG tel que HpaII, CCGG ou HhaI, GCGC, ou de site susceptible de recouvrir partiellement un dinucléotide CpG tel que AVAIT GG(A ou T)CC, dans une séquence CGG(A ou T)CC ou GG(A ou T)CCG ou encore BanI (GG Py Pu CC);Les inventeurs ont mis en évidence une corrélation surprenante entre l'expression clinique de la maladie et l'inhibition de la digestibilité des sites à CpG situées dans la région d'environ 20 kb autour de la position 125 kb définie sur le segment d'ADN cloné par les inventeurs, à environ 100 kb de la sonde Do33 en direction du centromère. La figure 1 est une représentation schématique de la région du chromosome X autour de la position 125 kb se situant à environ 100 kb de la sonde Do33 en direction du centromère. Sur l'échelle, on a représenté la localisations des sondes St677, 2-34 et Do33. En concordance avec l'échelle on a représenté les clones YAC 141 H5 et 209G4 correspondant aux segments d'ADN sus-mentionnés, et la localisation de sites de restriction EagI, BssHII etc..., a été représentée sur la ligne du clone 141 H5. L'indication CpG sur la ligne du clone 141 H5 correspond à la région dont la méthylation est anormale chez les patients atteints de retard mental avec X fragile. Ce phénomène d'inhibition de digestibilité des sites CpG peut être détecté par la méthode du Southern Blot, en utilisant des sondes provenant de la région de 20 kb autour de la position 125 kb définie à la figure 1, sondes proches ou contenant les sites à CpG. Les inventeurs ont également mis en évidence par la même méthode, des anomalies de migration de fragments d'ADN, non nécessairement liées au phénomène de méthylation, anomalies qui sont caractéristiques des sujets porteurs d'une mutation X fragile. Ces anomalies ont été détectées notamment dans l'ADN digéré par les enzymes EcoRI ou Hindili après hybridation avec une sonde spécifique de la susdite région. Il apparait que les mutations germinales responsables du syndrome X fragile et susceptibles d'être transmise à la descendance se situent dans la région du chromosome X définie entre les sondes St677 et Do33, et la méthylation des sites à CpG dans cette région est une conséquence non obligatoire de ces mutation, conséquence qui est liée à l'expression clinique de la maladie. L'invention vise en conséquence tout fragment d'acide nucléique issus de la région Xq27-q28 du chromosome X, adjacent ou contenant les sites à CpG situés dans la région de 10 à 20 kb autour de la position 125 kb. De manière générale, l'invention concerne tout fragment d'acide nucléique compris dans le segment d'ADN défini entre les sondes St677 et Do33. Cette région du chromosome X est impliquée dans le syndrome X fragile et les sondes spécifiques de cette région sont avantageusement utilisées pour détecter la présence d'anomalies de méthylation liées à l'expression clinique de la maladie, ou pour détecter la présence de mutations responsables du syndrome X fragile et de sa transmission, ou encore pour localiser, identifier et analyser l'expression du ou des gènes impliqués dans le syndrome X fragile. Ces sondes peuvent en général être utilisées pour détecter les anomalies de l'ADN qui sont la conséquence directe ou indirecte des mutations associées au syndrome X fragile. L'invention concerne donc toute sonde nucléotidique capable de s'hybrider sélectivement avec un fragment d'acide nucléique compris dans le segment d'ADN défini entre les sondes St677 et Do33 et plus particulièrement avec un fragment d'acide nucléique adjacent ou contenant les sites à CpG dans la région d'environ 20 kb autour de la position 125 kb. Les sondes de l'invention s'hybrident spécifiquement dans des conditions de stringence appropriées avec les fragments d'acide nucléique sus-mentionnés mais ne s'hybride pas avec d'autres régions du génome humain dans des mêmes conditions d'hybridation. Une telle hybridation comporte les étapes suivantes - le traitement de pré-hybridation d'un support, comme un filtre de nitrocellulose ou une membrane de nylon, sur lequel est fixé 1'ADN à tester susceptible de s'hybrider avec les sondes sus-mentionnées, à une température de 420C et pendant 2 heures avec une solution de pré-hybridation ayant la composition suivante : 40 % formamide; 0,9 M NaCl; 200 Wg/ml d'ADN de sperme de saumon; 50mM de sodium phosphate pH 6,5; 4 % de dextran sulfate; o,08 % (poids:volume) deficoll et de polyvinyl pyrrolidone, - l'hybridation dans une solution identique à la solution de pré-hybridation , comprenant en outre au moins une sonde nucléotidique conforme à l'invention avantageusement marquée, à une température de 420C et pendant 18 heures, - 4 lavages successifs, - la révélation de l'hybride éventuellement formé par toute méthode adaptée au marquage de la sonde Les conditions d'hybridations définies ci-dessus constituent des conditions préférées, mais ne sont nullement limitatives et peuvent être modifiées sans affecter les propriétés d'appariement des sondes de l'invention et les séquences de nucléotides sus-mentionnés. Les sondes de l'invention sont avantageusement marqués par tout marqueur classiquement utilisé. Elles peuvent être marquées à l'aide d'un traceur radioactif comme 32p, 35S, 125I, 3H, 14C et le marquage radioactif peut être réalisé selon une méthode quelconque connue de l'homme du métier. Les sondes peuvent être marquées en 3' par addition d'un ou plusieurs déoxynucléotides ou ribonucléotides ou d'un didéoxynucléotide, marqué en alpha par le 32p, en présence de la Terminal Déoxynucléotidyl Transférase, ou en 5' par transfert d'un groupe phosphate radioactif d'un déoxynucléotide ou didéoxynucléotide libre marqué en position gamma, en présence de la T4 Polynucléotide kinase; elles peuvent encore être marquées à chaque extrémité par adjonction d'une séquence quelconque radiomarquée en présence de T4 DNA ligase. Les sondes peuvent encore être marquées en utilisant une ADN polymérase par "Nick Translation" ou "Random Priming" ou Polymeras Chain Reaction".. La méthode de détection de l'hybridation dépendra du marqueur radioactif utilisé et pourra reposer sur l'autoradiographie, la scintillation liquide, le comptage gamma ou tout autre technique permettant de détecter l'émission du rayonnement émis par le marqueur radioactif. Un marquage non radioactif peut également être utilisé, en associant aux sondes des groupements présentant des propriétés immunologiques comme un antigène, une affinité spécifique pour certains réactifs comme un ligand, des propriétés physiques comme la fluorescence ou la luminescence, des propriétés permettant la complétion des réactions enzymatiques comme une enzyme ou un substrat d'enzyme. Le marquage non radioactif peut être fait également directement par modification chimique de l'ADN, comme la photobiotinylation ou la sulfonation. Les sondes de l'invention sont utilisées pour la détection in vitro, des mutations responsables du syndrome X fragile, ainsi que des anomalies de méthylation des sites à CpG ou d'autres anomalies de l'ADN conséquentes à la présence de ces mutations et associées au syndrome. La détection de mutation vise à suivre la transmission familiale et permet notamment un diagnostic des personnes non atteintes susceptibles de transmettre la maladie, telle que des femmes vectrices ou des hommes normaux transmetteurs de la mutation. La détection des anomalies de méthylation permet un diagnostic de la maladie, exprimée cliniquement ou susceptible de l'être dans le cadre d'un diagnostic anténatal ou à la naissance. D'une manière générale, les procédés de détection des mutations responsables du syndrome X fragile, ainsi que des anomalies de méthylation des sites à CpG, ou d'autres anomalies de 1'ADN associées au syndrome, reposent sur l'utilisation d'au moins une sonde conforme à l'invention et d'au moins une enzyme de restriction appropriée de manière à ce que le fragment détecté par la sonde soit différent selon qu ' il contienne ou non la mutation ou l'anomalies de méthylation ou toute autre anomalie de l'ADN. Un tel procédé peut être réalisé selon la méthode dite "Southern Blot" (Sambrook, Fritsh and Maniatis; Molecular cloning : A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), comprenant les étapes suivantes - traitement de l'ADN génomique extrait par exemple de leucocytes ou de villosités choriales ou de toute autre source d'ADN génomique, par au moins une enzyme de restriction déterminée, dans des conditions permettant l'obtention de fragments de restriction issus du clivage de lTADN au niveau de ses sites de restriction reconnues par ladite enzyme, - séparation des fragments par électrophorèse;; - mise en contact d'une sonde nucléique selon l'invention susceptible de s'hybrider spécifiquement avec les fragments précédents dans des condition permettant la formation de complexes d'hybridation, - détection des complexes dthybridation, - mesure de la taille des fragments de restriction engagés dans les complexes d'hybridation. La recherche d'anomalies de méthylation pour le diagnostic in vitro du syndrome X fragile chez des patients atteints de retard mental est avantageusement réalisé selon le procédé précédent mettant en oeuvre au moins une enzyme de restriction à site sensible a la méthylation, avec au moins une sonde conforme à l'invention avantageusement marquée. Le procédé sus-mentionné peut être mis en oeuvre avec une seule enzyme à site de restriction sensible à la méthylation telles que BssHII, EagI, AvaII, BanI; ou encore avec deux enzymes, l'une à site de restriction sensible à la méthylation et l'autre à site de restriction non sensible à la méthylation. Les sondes de l'invention utilisées pour l'hybridation avec les fragments obtenus sont avantageusement adjacentes ou contiennent le site pour l'enzyme à site sensible à la méthylation. La méthode de Southern Blot est également utilisée pour détecter les mutations associées au syndrome X fragile, telles que des délétions ou des insertions de séquence d'ADN, ou d'autres anomalies de l'ADN telles que des anomalies de conformation ou de réplication, qui sont conséquentes à ces mutations. La détection de ces mutations pour le diagnostic in vitro du syndrome X fragile chez des patients atteints ou non de retard mental est réalisé selon la méthode de Southern Blot en soumettant l'ADN génomique à une digestion par toute enzyme de restriction appropriée non nécessairement sensible à la méthylation, telle que EcoRI ou Hindili. Les fragments de restrictions sont mis en évidence par hybridation avec une sonde de l'invention avantageusement marquée et la migration électrophorétique anormale desdits fragments est corrélée soit avec l'expression clinique de la maladie, soit à la présence de la mutation même en l'absence d'expression clinique de la maladie. L'invention concerne aussi les kit pour la mise en oeuvre du procédé précédent. Parmi les fragments d'acides nucléiques de l'invention, ceux de 20 à 30 nucléotides peuvent être avantageusement utilisés en tant qu'amorces dans un procédé d'amplification génétique d'un fragment d'acide nucléique de la région de 20 kb autour de la position 125 et plus particulièrement d'un fragmentcontenant les sites à CpG. Lequel procédé d'amplification consiste à fixer spécifiquement par hybridation sur l'ADN génomique extrait par exemple de leucocytes, deux oligonucléotides judicieusement choisis parmi ceux contenant les fragments d'acides nucléiques de 20 à 30 nucléotides de l'invention qui sont adjacents au fragment à amplifier, puis à mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADNpolymérase, suivi d'un processus de dénaturation, et à répéter le cycle hybridation-extension-dénaturation connu sous le nom de cycle PCR "Polymeras Chain Reaction", un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité du fragment amplifier dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles effectués. La méthode d'amplification décrite peut être appliquée à la détection d'anomalies de l'ADN qui sont la conséquence de la présence des susdites mutations. Le diagnostic in vitro du syndrome X fragile, notamment chez des patients atteints de retard mental, est avantageusement réalisé par une amplification génétique effectuée en parallèle sur l'ADN digéré par l'enzyme de restriction sensible à la méthylation, et sur l'ADN non digéré. L'analyse à des fins diagnostics est faite en comparant le produit d'amplification de l'ADN non digéré à celui de l'ADN digéré par l'enzyme de restriction choisie. Cette analyse des produits d'amplification est peut être réalisée par visualisation de la fluorescence induite par le bromure d'ethidium, après électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou par la détection du marquage radioactif ou non radioactif, tel que par un système biotine - avidine, des oligonucléotides amorces ou des nucléotides incorporés dans le fragment amplifié. Le nombre de cycle d'amplification est limité de façon à conserver une linéarité de l'amplification et donc une estimation quantitative de la digestibilité du site de l'enzyme sensible à la méthylation.Avantageusement des marqueurs internes sont utilisés, notamment d'autres fragments du génome co-amplifiés contenant également un site de l'enzyme sensible à la méthylation, non méthylé chez l'homme en tant que témoin de l'action de l'enzyme de restriction, et en tant que témoin de l'efficacité de l'amplification, un fragment ne contenant pas un tel site. La mesure quantitative de la méthylation de l'ADN génomique au site étudié peut se faire par adaptation de la méthode d'amplification décrite précédemment, notamment en utilisant en plus des oligonucléotides selon l'invention, des oligonucléotides dits "linker" et de l'ADN ligase, méthode dénommées "ligation mediated PCR" décrite par Steigerwald et al. (Nucleic Acids Res., 1990, 18, 1435-1439). L'invention concerne aussi les kit pour la mise en oeuvre du procédé précédent. De tels kits comprennent - des oligonucléotides marqués ou non pour l'amplification de fragment d'acide nucléique contenant un site sensible à la méthylation selon l'invention, - des oligonucléotides marqués ou non pour l'amplification des segments d'acide nucléique témoins, - des oligonucléotides "linkers" - les tampons, nucléotides et enzymes propice à l'amplification. Les délétions ou tout autre réarrangements susceptibles de constituer des mutations responsables du syndrome X fragile peuvent être également détectées par la méthode d'amplification d'ADN. La méthode repose sur l'utilisation de couples d'oligonucléotides, qui peuvent être mélangés dans une seule réaction, selon la méthode d'amplification dite multiplex permettant d'amplifier plusieurs fragments de la région autour de la position 125 kb et de détecter la disparition ou la modification de certains de ces fragments. La détection de mutation ponctuelle est avantageusement réalisée par amplification des segments d'ADN, suivi d'une analyse par les méthodes dites de SSCP (single strand conformation polymorphisme) ou de DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), ou encore de détection d'héteroduplex. Les sondes de l'invention correspondent à la région dans laquelle se situe le ou les gènes impliqué dans l'expression clinique du syndrome X fragile, en effet, l'identification de sites CpG tels que BssHII, EagI, SacII dans la région proche de la position 125 kb, indique la présence de gènes adjacents, dont l'expression est contrôlée par cette région (îlot CpG). Les sondes correspondant à ces gènes sont utiles pour la détection des ARN messagers correspondants, ou pour la construction de vecteurs d'expression des protéines correspondantes en vue d'application thérapeutique ou pour la production d'anticorps spécifiques susceptibles également d'être utilisés en diagnostic. L'homme de l'art dispose des moyens permettant d'identifier voir de sélectionner ceux des fragments d'acide nucléique correspondant aux gènes présents dans la région entre les sondes St677 et Do33 de part et d'autres de la position 125 kb, lesquels gènes sont susceptibles d'être inactivés directement par mutation ou indirectement en raison de la méthylation des sites CpG présents autour de la position 125 kb. A ce titre, l'invention concerne tout ADN recombinant contenant un fragment d'acide nucléique de l'invention, associé à toute séquence permettant la transcription et/ou la traduction dans la cellule hôte dans laquelle ledit ADN recombinant est susceptible d'être introduit. L'invention concerne aussi en conséquence les vecteurs de clonage et d'expression contenant un des fragments d'acide nucléique de l'invention. L'introduction de l 'ADN recombinant est avantageusement réalisé à l'aide d'un vecteur, notamment du type plasmide, apte à se répliquer dans la cellule hôte et à y permettre la transcription de l'ARN correspondant et l'expression des protéines codées par le fragment d'acide nucléique contenu dans 1'ADN recombinant. Les cellules hôtes sus-mentionnées peuvent être des cellules procaryotes, notamment des cellules de E. Coli, ou, d'une manière plus avantageuse, des cellules eucaryotes, qui permettent d'obtenir des protéines glycosilées et mature (levures, cellules CHO, ou cellules d'insectes infectées par le bacculovirus). Ces protéines peuvent avantageusement être utilisées pour la préparation d'anticorps spécifiques utiles pour le diagnostic du syndrome X fragile et dans des applications thérapeutiques. Outre les caractéristiques qui précédent, l'invention comporte d'autres caractéristiques qui apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfèrent à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention et qui sont illustrés par la figure, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée de l'invention. I - Préparation des sondes St677 et Do33 Des segments d'ADN correspondant aux sondes St677 et Do33 peuvent être obtenus à partir d'ADN humain par amplification génétique en utilisant les oligonucléotides suivants - pour St677 5' ACTCCTTCACAAATCTTCCG3' et 5 'ATCATGCAAGACAGTTCTCTGC3 I - pour Do33 5' GTGAAGCAATTTGAGTTGGTGGGAG3' et 5' CCCAAGTTTAGCTTCCGTAGAAGCC3' Les conditions d'amplification dans un millieu standard sont les suivantes - hybridation : 1 minute à 600C, - Elongation : 8 minutes à 720C - Dénaturation : 1 minute à 940C II - Préparation des sondes de l'invention Les sondes de l'inventions ont été obtenues par sous clonage des fragments d'acides nucléiques de l'invention provenant de la digestion de segments d'ADN contenus dans la région d'environ 225 kb définie entre les sondes St677 et Do33, et localisée dans la région Xq27-q28 du chromosome X humain, clonée sous forme de chromosome artificielle de levure (YAC) et représenté à la figure 1. En particulier le sous clonage vise à obtenir des sondes spécifique de fragments situés dans la région de 20 kb autour de la position 125 kb et correspondant donc spécifiquement aux fragments d'acide nucléique adjacent ou comprenant les sites CpG. A titre d'exemples une telle sonde est obtenue par sous clonage de fragments préparés par double digestion EagI et BglI du clone 141H5. La sonde obtenue dénommée 9B12.3 correspond à un fragment EagI-BglI d'environ 7 kb contenant le site EagI à la position 125 kb sur la carte de la figure 1. La figure 2 est une représentation schématique de la carte de la sonde 9B12 et de ses sous fragments 9B12.1, 9B12.2, 9B12.3, 9B12.4 et 9B12.5, orienté de façon inverse de la figure 1. Cette figure comporte 7 lignes suivantes - La ligne (1) est une échelle en kb sur laquelle est mentionné en 0 la position 125 kb définie sur la carte du segment cloné de la figure 1 entre les sondes St677 et Do33 à environ 100 à 125 kb de la sonde Do33. - La ligne (2) représente en concordance avec l'échelle la sonde 9B12 et de ses sous fragments 9B12.1, 9B12.2, 9B12.3, 9B12.4 et 9B12.5. - La ligne (3) représente la localisation, en concordance avec l'échelle, des sites Bani (GGPyPuCC) et notamment le site BanI polymorphique noté RFLP et le site BanI sensible à la méthylation noté Me. - La ligne (4) représente la localisation, en concordance avec l'échelle, des sites XmnI (GAANNNNTTC). - La ligne (4) représente la localisation, en concordance avec l'échelle, des sites XmnI (GAANNNNTTC). - La ligne (5) représente la localisation, en concordance avec l'échelle de la ligne (1), des sites BglII (AGATCT). - La ligne (6) représente la localisation, en concordance avec l'échelle de la ligne (1), des sites EcoRI (GAATTC). - La ligne (7) représente la localisation, en concordance avec l'échelle de la ligne (1), des sites HindIII (AAGCT). Les carte des sites BanI, XmnI et EcoRI correspondent aux fragments altérés chez les porteurs de mutation X fragile. III - Diagnostic du retard mental avec X fragile par détection d'anomalies de méthylation selon la méthode de Southern Blot L'ADN génomique extrait de leucocytes d'un patient atteint de retard mental, est coupé par les enzymes Avait, BanI ou XmnI. Les fragments d'ADN obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 0,9% en tampon TAE, puis transférés sur une membrane de nylon. La membrane sur laquelle sont fixés les fragments d'ADN est soumis à un traitement de préhybridation à 420C pendant 2 heures avec une solution ayant la composition suivante : 40 % formamide; 0,9 M NaCl; 200 Ag/ml d'ADN de sperme de saumon; 50mM de sodium phosphate pH 6,5; 4 % de dextran sulfate; o,08 % (poids:volume) de ficoll et de polyvinyl pyrrolidone; puis la solution de préhybridation est remplacé par une solution d'hybridation identique à la solution de prè-hybridation, et comprenant en outre la sonde 9B12.3 marquée au dCTP alpha 32P et d'activité spécifique 2 108 dpm/g; après incubation pendant 18 heures à 420C et lavages successifs avec une solution 0,5 SSC à 650C, on effectue une autoradiographie à - 800C. Tout ou partie des fragments Avait, BanI ou Xmn détectés chez les sujets normaux sont remplacés chez les sujets exprimant le syndrome X fragile par des fragments plus grands. En particulier avec l'enzyme XmnI, l'apparition de plusieurs bandes assez proches les unes des autres est très caractéristique des sujets ayant une expression phénotypique du syndrome. Cette distinction entre anomalies liées à l'expression clinique et/ou cytogénétique et anomalies présentes chez des personnes porteuses de mutation X fragile sans expression clinique et/ou cytogénétique est explicité dans les exemples suivants de détection desdites anomalies par la méthodes de Southern Blot. 1) Anomalies liées à l'expression clinique et/ou cytopénétique a-- Digestion par l'enzyme BanI (site GG Py Pu CC) La figure 3 est une représentation schématique d'une image d'autoradiographie sur gel d'agarose à 0,9%, D'ADN de leucocytes ou de villosités choriales d'hommes normaux (1 et 5), d'un homme avec X fragile (3), d'une femme vectrice (4) et d'une femme normale (2), digérés par BanI et révélés par la sonde 9B12.3. La figure 4 est une représentation schématique d'une image d'autoradiographie sur gel d'agarose à 0,9%, D'ADN de villosités choriales d'un homme normal (2), d'un homme avec X fragile (3), d'un foetus avec X fragile, digérés par BanI et révélés par la sonde 9B12.3. La sonde 9B12.3 détecte dans l'ADN génomique d'un homme normal, après digestion par l'enzyme BanI, soit un seul fragment de 2,9kb (allèle 1) ou deux fragments de 2,3 et 0,6 kb (allèle 2). L'existence de deux allèles est due à la présence d'un site BanI polymorphique indiqué RFLP sur la figure 2). Chez un patient mâle atteint de retard mental avec X fragile porteur de l'allèle 1, le frgment de 2,9 kb est remplacé, plus ou moins complètement par un fragment de 3,5 kb. Chez un patient porteur de l'allèle 2, le fragment de 0,6 kb est remplacé plus ou moins complètement par un fragment de 1,2 kb. Ces différences spécifiques, chez le mâle, du retard mental avec X fragile sont dues à la méthylation d'un site BanI, indiqué Me sur la figure 2. Ce site est inclus dans la séquence suivante TCGGTGCCGA, compatible avec une inhibition par méthylation de la cytosine. L'anomalie a été détectée non seulement sur ADN de leucocytes, mais également sur ADN de villosités choriales de foetus porteurs de mutation X fragile. Elle donc utilisable en diagnostic post natal ou anténatal chez les mâles. Les fragments de 3,5 kb et 1,2 kb peuvent par contre être détectés chez les femmes normales (méthylation du site BanI sur le chromosome X inactif). Toutefois leur intensité apparait plus forte chez les femmes vectrices avec expression clinique ou cytogénétique du syndrome X fragile. b - Digestion avec l'enzyme Xmn (site GAANNNNTTC) La figure 5 est une représentation schématique d'une image d'autoradiographie sur gel d'agarose à 0,9%,, D'ADN de leucocytes d'hommes normaux (1 et 10), d'hommes avec retard mental lié au X fragile (3, 4, 6, 9), de femmes vectrices (5, 7, 8) et d'une femme normale (2), digérés par XmnI et révélés par la sonde 9B12.3. La sonde 9B12.3 détecte un fragment de 9 kb chez les hommes et femmes ainsi que chez les porteurs de mutation X fragile n'exprimant pas cliniquement ou cytogénétiquement la maladie. Chez les hommes atteints de retard mental avec X fragile, le fragment de 9 kb est remplacé en tout ou partie par des fragments de taille apparente supérieure à 10 kb. L'apparition de tels fragments est également caractéristique des femmes vectrices avec expression clinique et/ou cytogénétique. 2) Anomalies présentes chez les personnes porteuses de mutation X fragile sans expression clinique et/ou cytogénétique La figure 6 est une représentation schématique d'une image d'autoradiographie sur gel d'agarose à 0,9%, D'ADN de leucocytes de femmes normales (9, 12, 13) et de femmes vectrices (1 à 8, 10 et 11) de la mutation X fragile n'exprimant pas toutes des signes cliniques ou cytogénétiques, digérés par EcoRI et révélés par la sonde 9B12.3. La sonde 9B12.3 détecte un fragment EcoRI d'environ 6 kb chez un homme normale ou une femme normale. Par contre chez une femme vectrice de mutation X fragile, un fragment additionnel plus grand, de taille variable selon les individus (6 à 7 kb) est présent. Cette anomalie apparait chez les femmes vectrices sans expression clinique et/ou cytogénéique, et peut donc être utilisée pour le diagnostic des femmes vectrices. Chez les hommes atteints, le fragment normal est remplacé par un fragment ou une série de fragments de taille apparente plus élevée. Des résultats très semblables sont obtenus avec l'enzyme Hindili. IV - Diagnostic du retard mental avec X fragile par amplification génétique de fragment contenant une anomalie de méthylation L'ADN génomique extrait de leucocytes d'un patient atteint de retard mental, est soumis à une digestion par une enzyme à site sensible à la méthylation telle que AvaII, BanI ou XmnI et l'amplification est réalisée en parallèle sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction sensible à la méthylation, et sur l'ADN non digéré. Deux oligonucléotides de 20 à 30 nucléotides adjacents au fragment d'ADN génomique à amplifier contenant le site pour l'enzyme sensible à la méthylation, sont hybridés avec l'ADN soumis à la digestion et l'ADN non soumis à la digestion. Puis un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase, suivi d'un processus de dénaturation est mis en oeuvre; le cycle hybridationextension-dénaturation est répété un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité du fragment contenant les sites à CpG dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles effectués. Le nombre de cycle d'amplificaton est limité de façon à conserver une linéarité de l'amplification et donc une estimation quantitative de la digestibilité du site de l'enzyme sensible à la méthylation. Avantageusement des marqueurs internes sont utilisés, notamment d'autres fragments du génome co-amplifiés contenant également un site de l'enzyme sensible à la méthylation, non méthylé chez l'homme, ou de fragments ne contenant pas un tel site. L'analyse des produits d'amplification est réalisée par visualisation de la fluorescence induite par le bromure d'ethidium, après électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide. Si le site site sensible à la méthylation est méthylé, le fragment amplifié est présent dans les deux réactions, si le site sensible à la méthylation est non méthylé, le fragment amplifié est présent seulement dans la réaction avec 1'ADN non digéré. REVENDICATIONS 1 - Fragment d'acide nucléique issus de la région Xq27-q28 du chromosome X, caractérisé en ce qu'il est compris dans le segment d'ADN d'environ 225 kb défini entre les sondes St677 et Do33. 2 - Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est adjacent ou contient les sites à CpG situés dans la région de 20 kb autour de la position 125 kb. 3 - Sonde nucléotidique pour détecter invitro des mutations responsables du syndrome X fragile, ou d'autres anomalies de 1'ADN conséquentes à la présences desdites mutations ou pour localiser le ou les gènes impliqués dans le syndrome X fragile, caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider sélectivement avec un fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2. 4 - Sonde nucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est marquée radioactivement, ou par un marqueur notamment enzymatique, ligand, luminescent ou fluorescent. 5 - Procédé de détection in vitro des mutations associées au syndrome X fragile ou d'autres anomalies de l'ADN conséquentes à la présence de ces mutations, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes - le traitement de 1'ADN génomique avec au moins une enzyme de restriction à site sensible ou non à la méthylation; - la séparation des fragments par électrophorèses et leur hybridations avec au moins une sonde selon la revendication 4; - la visualisation des hybrides formés et la comparaison avec un contrôle. 6 - Procédé de détection d'anomalie de 1'ADN selon la revendication 5 pour le diagnostic in vitro du syndrome X fragile, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes - le traitement de 1'ADN génomique par au moins une enzyme de restriction à site sensible à la méthylation; - la séparation des fragments par électrophorèse et leur hybridation avec au moins une sonde spécifique d'un fragment d'acide nucléique adjacent ou contenant les sites à CpG situés dans la région de 20 kb autour de la position 125 kb. - la visualisation des hybrides formés et comparaison avec un contrôle. 7 - Procédé pour le diagnostic in vitro du syndrome X fragile selon la revendication 6, caractérisé en ce que la digestion de 1'ADN génomique est réalisée par une enzyme de restriction à site sensible à la méthylation et une enzyme de restriction à site non sensible à la méthylation. 8 - Procédé d'amplification génétique d'un fragment d'acide nucléique contenant des mutations ou d'autres anomalies d'ADN conséquentes à ces mutations, associées au syndrome X fragile, caractérisé en ce qu'il consiste à fixer par hybridation sur l'ADN génomique deux oligonucléotides marqués flanquants ledit fragment, judicieusement choisis parmi les fragments d'acides nucléiques de 20 à 30 nucléotides selon les revendications 1 ou 2, puis à mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase, suivi d'un processus de dénaturation, et à répéter le cycle hybridationextension-dénaturation un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité du fragment dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles effectués. 9 - Procédé de diagnostic in vitro du syndrome X fragile, caractérisé en ce que l'on effectue en parallèle un procédé d'amplification génétique selon la revendication 8, d'une part sur de 1'ADN soumis à la digestion par une enzyme à site sensible à la méthylation et d'autre part sur de l'ADN non soumis à la digestion par ladite enzyme, puis en ce que l'on compare les fragments obtenus visualisés au Bromure d'ethidium ou détectés grâce au marquage des oligonucléotides amorces. 10 - Procédé de détection de mutation associées au syndrome X fragile caractérisé en ce que l'on effectue une amplification génétique selon la revendication 8 d'un ou plusieurs fragment d'acide nucléique de la région de 20 kb autour de la position 125 kb et en ce que l'on détecte la disparition ou la modification de certains de ces fragments. 11 - ADN recombinant contenant au moins un fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, associé à une séquence permettant la transcription et/ou la traduction dans la cellule hôte dans laquelle ledit ADN recombinant est susceptible d'être introduit. 12 - Vecteur de clonage et d'expression caractérisé en ce qu'il contient un ADN recombinant selon la revendication 11. 13 - Hôte cellulaire caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur recombinant selon la revendication 12.