Brevet FR2664386A1 — publié le 19920110

La présente invention a pour objet une trousse pour le dosage immunologique spécifique de l'angiotensine II et le procédé pour l'immunodosage de l'angiotensine II utilisant ladite trousse. L'angiotensine II est un puissant agent vasopresseur qui est le produit biologiquement actif du système rénine-angiotensine: la rénine agit sur l'angiotensinogène du plasma pour produire un décapeptide, l'angiotensine I, celle-ci est convertie en un octapeptide, l'angiotensine II, par action de l'enzyme de conversion, puis une aminopeptidase produit un heptapeptide: l'angiotensine III. Les formules de ces différents peptides chez les mammifères sont données ci-après: Angiotensine I, ci-dessous dénommée Ang I: 1 10 H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-OH (I) Angiotensine II, ci-dessous dénommée Ang II: 1 8 H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH (II) Angiotensine III, ci-dessous dénommée Ang III 1 7 H-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH (III) L'exploration hormonologique du système rénine-angiotensine est très importante pour le diagnostic et le traitement de l'hypertension artérielle Actuellement cette exploration effectuée en clinique se limite à la mesure de l'activité enzymatique de la rénine plasmatique, de l'activité de l'enzyme de conversion et à la mesure de la concentration plasmatique de la rénine active. Le dosage direct de l'Ang II, qui est le peptide actif du système, est difficile à réaliser pour plusieurs raisons: très faible concentration plasmatique de l'Ang II ( 3 à 20 pg/ml chez le sujet normal, soit 3 10-12 à 2 10-11 M) qui nécessite l'utilisation d'un anticorps Anti- Ang II très affin; analogie de structure de l'Ang II avec différents peptides issus du clivage de l'angiotensinoqgène et présents dans le plasma, en particulier l'Ang I et surtout l'Ang III qui oeuvent interférer dans le dosage. Ainsi, J NUSSBERGER et al décrivent un dosage radioimmunologique qui ne permet pas de distinguer l'Ang II et l'Ang III dans le plasma humain (Hormon Metab Res, 1984, 16 (II), 606-610 et J Hypertens, suppl, 1988, 6 ( 4), 5424-5425). Par ailleurs, la demande de brevet européen 273 453 décrit olusieurs anticorps monoclonaux anti-Ang II qui présentent tous une réactivité croisée avec l'Ang III; la plus faible réactivité croisée, observée pour l'un d'entre eux, est de 32 % Ainsi la réaction de l'Ang II avec cet anticorps n'est pas spécifique. De plus, cet anticorps monoclonal a une affinité faible, de l'ordre de 109 M-1, qui est insuffisante pour permettre un dosage dans le plasma (Biochem Biophys Res Commun 1987, 143, p. 133-139). L'anticoros anti-Ang II, appelé 4 D 8, et décrit dans les actes du Congrès "The renin Angiotensin System as a Therapeutic Target" Bâle, 29-31 Octobre 1989, communication SANOFI, possède une forte affinité de l'ordre de 1011 M-1; mais il Drésente une réactivité croisée de l'ordre de 100 % avec l'Ang III En fait, il est très difficile et non connu à ce jour, d'avoir un anticorps à la fois très affin pour l'Ang II et sans réaction croisée avec l'Ang III. Par ailleurs, le dosage spécifique de l'Ang II présente ô ce jour, une difficulté méthodologique qui nécessite d'effectuer successivement plusieurs étapes (J NUSSBERGER et al, Hypertension, 1986, 8, 476-482): 1 une extraction des différentes angiotensines pour préparer l'extrait plasmatique, 2 une séparation par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) des différentes angiotensines issues du métabolisme de l'angiotensinogène et présentes dans le plasma, 3 un dosage radioimmunologique des fractions collectées après élution. L'extraction des angiotensines du plasma est une étape indispensable commune à toutes les techniques de dosage de l'Ang II; elle est effectuée par chromatographie sur une colonne de silice selon la méthode décrite par J NUSSBERGER et al dans Hypertension, 1985 ( 7), suppl l, I-1-I-7. A cause de l'étape de séparation par HPLC, cette technique est lourde et longue à mettre en oeuvre; c'est pourquoi elle ne peut pas être utilisée pour doser un grand nombre d'échantillons plasmatiques dans des conditions de routine. On a cherché à mettre au point un dosage spécifique de l'Ang II, permettant de mesurer avec précision le taux d'Ang II quelles que soient les concentrations d'Ang III et d'Ang I présentes dans le milieu et qui soit réalisable en un temps compatible avec une utilisation clinique en routine Un tel dosage spécifique présente un grand intérêt soit pour étudier la physiologie du système rénine-angiotensine chez différentes espèces animales dans des situations expérimentales, soit pour diagnostiquer des situations pathologiques chez l'homme, soit pour le diagnostic et le suivi des traitements de l'hypertension artérielle. Généralement, L'Ang II est dosée à partir du plasma On peut, selon la présente invention, réaliser Le dosage de L'Ang II, soit dans Le plasma soit dans tout autre Liquide biologique o elle est présente. Le dosage selon l'invention peut être effectué pour toute espèce animale chez laquelle on souhaite connaître la mesure spécifique de l'Ang II, et plus particulièrement chez l'homme. Selon la présente invention, il a été trouvé que l'on peut effectuer un immunodosage spécifique de l'Ang II en utilisant simultanément un anticorps dirigé contre l'Ang II destiné au dosage proprement dit et un anticorps spécifique de l'Ang III ainsi que, éventuellement, un anticorps spécifique de l'Ang I Par anticorps spécifique de l'Ang III et anticorps spécifique de l'Ang I, on entend des anticorps présentant chacun une réaction croisée vis à vis de l'Ang II, inférieure à 10 % Ainsi; l'Ang III et éventuellement l'Ang I, captées par un anticorps spécifique, ne sont pratiquement plus disponibles pour donner des réactions croisées avec l'anticorps anti-Ang II Le dosage de l'Ang II devient ainsi totalement spécifique c'est-à-dire totalement exempt de toute inter- férence due à la présence de peptides apparentés dans l'échantillon. Selon la présente invention, la mesure de l'Ang II ne comporte que 2 étapes: 1 l'extraction des différentes angiotensines pour préparer l'extrait de liquide biologique, 2 le dosage immunologique proprement dit de l'Ang II contenu dans ledit extrai Ainsi, on évité la séparation par HPLC des différentes angiotensines dans l'extrait: cette étape étant la plus lente et la plus laborieuse du protocole de dosage spécifique de l'Ang II. Le dosage immunologique utilisé est un dosage par compétition: l'Ang II marquée, liée à l'anticorps anti-Ang II est déplacée par l'Ang II non marquée contenue dans l'échantillon à doser La référence à une courbe d'étalonnage, réalisée avec des étalons contenant des quantités connues d'Ang II, permet de déterminer la concentration en Ang II présente dans l'échantillon. L'Ang II est marquée, soit par un radioélément, tel que le tritium ( 3 H) ou l'iode 125 ( 125 I); soit par une enzyme telle que, par exemple, l'acétylcholinesterase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, ou la 5-galactosidase, soit par un marqueur fluorescent, soit par un marqueur luminescent. Selon la présente invention on ajoute dans le milieu réactionnel, un anticorps spécifique de l'Ang III et, éventuellement, un anticorps spécifique de l'Ang I qui masquent celles- ci par formation du (ou des) complexe(s) antigène-anticorps correspondants et on évite ainsi l'appa- rition de réactions croisées entre l'Ang III, et éventuellement l'Ang I, présentes dans l'échantillon, avec l'anticorps anti-Ang II. La présente invention a pour objet une trousse pour le dosage spécifique de lt Ang II comprenant: l'anticorps anti-Ang II, une solution d'Ang II marquée, des solutions contenant les étalons d'Ang II en concentrations connues et croissantes, la ou les solutions de lavage nécessaires, une solution d'anticorps anti-Ang III, ledit anticorps présentant une réaction croisée avec l'Ang II, inférieure à 10 %, et le cas échéant, une solution d'anticorps anti-Ang 1, ledit anticorps présentant une réaction croisée avec l'Ang II, inférieure à 10 %. Lorsque ' Ang II est marquée par une enzyme, la trousse comprend en outre: une solution contenant le substrat de ladite enzyme et, le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires pour révéler l'activité de l'enzyme, une solution destinée à arrêter la réaction enzymatique. L'anticorps anti-Ang II utilisé dans la trousse de dosage peut être polyclonal ou monoclonal; il peut être utilisé en solution ou fixé sur un support solide Comme supports solides on peut citer les tubes, les plaques de microtitrations et les particules, magnétiques ou non. Selon la présente invention, l'anticorps anti-Ang II préféré est monoc Lona L; avantageusement, on Le fixe sur un support so Lide, se Lon Les méthodes classiques bien connues de L'homme du métier. L'anticorps anti-Ang III peut être un anticorps polyclonal ou un anticorps monoclonal Il en est de même pour l'anticorps anti-Ang I. La présente invention a également pour objet le procédé utilisant la trousse de dosage selon l'invention Ledit procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on prépare le milieu réactionnel comprenant l'extrait de liquide biologique à doser, l'anticorps anti-Ang II, l'Ang II marquée, l'anticorps anti-Ang III, et, le cas échéant, l'anticorps anti-Ang I b) on prépare simultanément les milieux réactionnels utiles pour l'étalonnage comprenant chacun un étalon d'Ang II, l'anticorps anti-Ang II, l'Ang Il marquée, l'anticorps anti-Ang III, et, le cas échéant, l'anticorps anti-Ang I c) on laisse incuber à une température comprise entre 40 C et la température ambiante, pendant 12 à 72 heures; d) on sépare l'Ang II liée à l'anticorps anti-Ang II de l'Ang II libre; e) enfin, on effectue la lecture des résultats selon une méthode appropriée. Préférentiellement, le procédé selon l'invention est utilisé pour le dosage spécifique de l'Ang II dans un extrait plasmatique. Lorsque l'anticorps anti-Ang II est utilisé en solution, les étapes a) et b) sont réalisées en mélangeant: - à 500 pi d'extrait de liquide biologique à doser, ou d'étalon d'Ang II, à 500 pi de solution d'anticorps anti-Ang II, à 500 pl de solution d'anticorps anti-Ang III, le cas échéant, 25 à 500 N 1 de solution d'anticorps anti-Ang I, et à 500 pl de solution d'Ang II marquée. On peut, éventuellement, effectuer une pré-incubation de 3 à 24 heures avant d'ajouter la solution d'Ang II marquée. L'étape d) est réalisée par un-procédé de séparation utilisé classi- quement: soit par fixation immunologique utilisant des anticorps dirigés contre les immunoglobulines de l'espèce animale à laquelle appartient l'anticorps anti-Ang II utilisé, ces anticorps étant eux-mêmes insolubilisés sur une phase solide (support insoluble tel que par exemple des tubes, des plaques de microtitration ou des particules, magnétiques ou non), soit par précipitation physico-chimique du complexe antigène-anticorps à L'aide d'un agent de précipitation, tel que Le po Lyéthy Lèneg Lyco L, soit par séparation de l'antigène libre par le complexe charbon-dextran (J NUSSBERGER et al, J Lab Clin Med, 1984, 103 ( 2), 304-312). Lorsque, suivant un autre mode de réalisation du procédé selon l'in- vention, l'anticorps anti-Ang II est fixé sur un support solide, la préparation du milieu réactionnel (étapes a et b) est effectuée en présence dudit support On peut par exemple utiliser des tubes revêtus d'anticorps anti-Ang II dans lesquels on mélange: à 500 p 1 d'extrait de liquide biologique à doser ou d'étalon d'Ang II, à 500 N 1 de solution d'anticorps anti-Ang III, le cas échéant, 25 à 500 pl de solution d'anticorps anti-Ang I, et 25 à 500 pi de solution d'Ang II marquée. Selon ce mode de réalisation du procédé selon l'invention, la séparation (étape d) est réalisée par aspiration de la solution d'incubation du milieu réactionnel puis lavage et nouvelle aspiration pour éliminer l'Ang II qui n'est pas complexée par l'anticorps fixé sur le support solide. On peut également préparer le mélange indiqué ci-dessus dans un tube ou récipient normal et y ajouter l'anticorps anti-Ang II sous la forme de particules, magnétiques ou non, sur lesquelles est fixé l'anticorps anti-Ang II Dans ce cas, la séparation (étape d) est réalisée selon le même principe que précédemment, mais par application d'un procédé permettant de retenir les particules (centrifugation, filtration, usage d'un aimant s'il s'agit de particules magnétiques). Dans tous les cas, on effectue ensuite directement l'étape e) de lecture qui s'applique à la phase solide dans laquelle est inclus ou à laquelle est lié l'anticorps anti-Ang II complexant l'Ang II à doser. D'une façon générale, l'étape de lecture dépend du mode de marquage utilisé pour l'Ang II Ainsi, on effectue: soit une mesure de radioactivité lorsque l'on a utilisé un radiomarquage, soit une mesure d'absorbance ou d'émission lumineuse lorsque l'on a utilisé un marquage fluorescent ou luminescent ou un marquage enzymatique selon la nature de l'enzyme et du substrat mis en oeuvre. Enfin, un autre objet de la présente invention est la préparation des anticorps anti-Ang III. Dans la description qui va suivre et dans les revendications, les aminoacides sont nommés en utilisant les abréviations recommandées par i'IUPAC; de plus, les abréviations suivantes sont utilisées: BOP: hexafluorophosphate de benzotriazolyloxy trisdiméthylamino phosphonium Boc:tert-butoxycarbonyle Mob:para-methoxybenzyle DCB:2,6-dichlorobenzyle Tos:tosyle Ac M:anticorps monoclonal SAB:serum albumine bovine BGG:gamma globuline bovine cpm:coup par minute PEG: polyéthylèneglycol LPH:hemocyaniûe de Limulus polyphemus Sulfo MBS: sel de sodium de N-( 3maleïmidobenzoyloxy) sulfosuccinimide Bo: concentration du complexe Ang II marquée-anticorps anti-Ang II, en l'absence d'Ang II, ou d'Ang III, non marquee. B:concentration du complexe Ang II marquée-anticorps anti-Ang II, pour chaque concentration d'Ang II ou d'Ang III non marquée. L'anticorps anti-Ang III est préparé de façon classique par immuni- sation de lapins avec un immunogène Ledit immunogène est constitué d'un dérivé peptidique fixé sur une protéine modifiée ou protéine vectrice (voir Am J Obstet Gynecol 1972, 113, p 751-757). L'utilisation de protéine vectrice dans l'immunisation vis à vis de molécules de faible poids moléculaire (haptène) permet d'induire la formation d'anticorps spécifiques anti-haptènes chez l'animal. Les protéines vectrices les plus utilisées sont actuellement les albumines d'origine animale (disponibles commercialement, stables, très immunogènes) La synthèse du conjugué protéine-peptide est réalisée par la formation d'une liaison covalente de type thio-éther entre le groupement thiol du peptide et le groupement maléimide de la protéine, introduit au préalable par réaction avec le sulfo MBS. Selon la présente invention, le dérivé peptidique choisi comme immunogène répond à la formule: Arg-Val-Tyr-Ile-His-RI-R 2-Cys-NH 2 (IV) dans laquelle RI désigne une liaison directe ou un enchainement comprenant 1 ou 2 acides aminés nature Ls Préférentiellement R 1 représente Pro ou Pro lié à un autre acide aminé naturel. R 2 représente un groupement de formule: -NH-(CH 2)n-CO- dans lequel N varie entre 1 et 9. Ainsi, selon la présente invention, l'anticorps anti-Ang III préféré est l'antisérum de lapin, obtenu par immunisation avec l'immunogène constitué du peptide IV fixé sur une protéine vectrice. Plus particulièrement préféré est l'antisérum de lapin obtenu par l'immunogène constitué du peptide de formule: Arg-Val-Tyr-Ile-His- R -Ahx-Cys-NH 2 dans laquelle R'1 représente Pro ou Pro lié à un autre acide aminé naturel et Ahx désigne le résidu de l'acide amino-6 hexanoïque, ledit peptide étant porté par la sérum albumine bovine modifiée par le sulfo MBS l'antisérum de lapin ainsi obtenu présente une réaction croisée avec l'Ang II, inférieure à 1 %. EXEMPLE I Préparation de l'anti-Ang III. A) Préparation du peptide (IV) dans lequel Rl=Pro. Le composé IV a été synthétisé en phase solide en utilisant les procédés connus en chimie des peptides. La phase solide utilisée est la résine méthyl-4 benzhydrylamine fonctionnalisée à un taux de 0,4 mmole par gramme La condensation successive des aminoacides est effectuée par le réactif BOP, les fonctions alpha aminées sont protégées de façon temporaire par un groupement Boc et déprotégées par une solution acide trifluoroacétique/dichloroéthane/ éthanedithiol ( 35/70/5; v/v/v) Les chaines latérales des différents aminoacides sont protégées par des groupements convenables: Mob pour Cys, Boc pour His, DCB pour Tyr, Tos pour Arg. Une fois synthétisé, le peptide est déprotégé et séparé de la résine par action de l'acide fluorhydrique contenant 10 % d'anisole pendant 1 heure à O C Le peptide est ensuite précipité à l'éther, repris par une solution acétonitrile/eau/acide trifluoroacétique ( 60/40/0,1; v/v/v) et lyophilisé La purification est effectuée par chromatographie liquide sous pression sur colonne de phase inverse. Les différents résultats analytiques sont en conformité avec la structure attendue pour le peptide (IV). B) Préparation de la protéine modifiée (LERNER, R A et al ( 1981) Proc. Nat Acad Sci USA, 78, 3403-3407). La protéine choisie pour fixer le peptide (IV) est la serum albumine bovine (SAB) modifiée par réaction avec le sulfo MBS. A une solution de 4 ml de SAB (à 10 mg/ml) dans le tampon phosphate de potassium 0,05 M p H 8,0 sont additionnés 22,4 mg de sulfo MBS (Pierce) solide, soit une stoechiométrie de 80 équivalents MBS/SAB On laisse la réaction évoluer 1 heure à température ambiante sous agitation douce, puis on dialyse le mélange 18 heures à 4 C contre 2 litres de tampon phosphate 0,1 M p H 7,0. La détermination du taux de substitution est réalisée par la mesure du nombre de groupements maléimide introduits grâce à la réaction à la cystéine radiomarquée par le 14 C A 0,4 ml de milieu réactionnel on ajoute 0,6 ml de tampon phosphate 0,1 M p H 7,0 et 0,05 ml de cystéine 20 m M additionnée de cystéine 14 C (concentration finale 3 K Bq/gmole de cystéine). Après incubation 1 heure 30 à 30 C puis filtration du milieu réactionnel sur une colonne de chromatographie dans des conditions convenables, la mesure de la radioactivité permet de calculer le taux de modification observé qui est de 1 l groupements maléimide par mole de SAB. C) Couplage du peptide (IV). mg de peptide (IV) préparé ci-dessus sont dissous dans 0,25 ml d'eau distillée Cette solution est additionnée à 1 ml de solution de SAB modifiée ( 10 mg/ml) Le mélange est incubé 3 heures à température ambiante et 18 heures à 40 C, puis on effectue plusieurs dialyses extensives contre du tampon phosphate 0,1 M p H 7,0. Le test à la cystéine radiomarquée est réalisé à nouveau sur la protéine après couplage du peptide La détermination du nombre de grou- pements maléimide non modifiés indique par différence un taux de substi- tution de 7 moles de peptide (IV) par mole de SAB. Deux autres conjugués immunogènes utilisant de l'hémocyanine de Limulus polyphemus (LPH) et de la transferrine humaine (SIGMA) comme protéines porteuses ont été préparés dans les mêmes conditions. D) Préparation de l'anticorps (ou antisérum) anti-Ang III. L'animal utilisé est le lapin de race néozélandaise La première immunisation consiste en l'injection de 1 mg d'immunogène en présence d'adjuvant complet de Freund par voie intradermique Les rappels sont effectués à intervalle de 1 mois avec la même quantité d'immunogène en présence d'adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée. E) Détermination du titre des sérums anti-Ang III. p 1 d'une dilution de sérum de lapin en tampon imidazole-H Cl 0,1 M p H 7,4 + SAB 0,2 % sont incubés en présence de 100 p 1 d'Ang III marquée à l'iode 125 ayant une activité spécifique de 74 T Bq/mmole (Amersham), apportant 5000 cpm. La séparation de l'Ang III liée à l'anticorps de l'Ang III libre est réalisée par l'addition de 1 ml de polyéthylène glycol 6000 (PEG) à 20 % et de 100 pl de solution de globulines bovines à 10 mg/ml Après centrifugation, la radioactivité du culot correspondant à l'Ang III liée à l'anticorps est mesurée La technique utilisée est celle décrite par GREENWOOD, F C et al (Biochem J, 1963, 89, 114-118). Le sérum de lapin lie au maximum 60 % de l'Ang III marquée à l'iode 125. F) Caractérisation immunologique de l'antisérum anti-Ang III. a) Evaluation de l'immunoréactivité de l'antisérum préparé vis à vis de l'Ang III. pl d'une solution diluée de l'antisérum anti-Ang III (correspondant à environ 50 % de liaison à l'Ang III iodée) sont incubés en présence de 50 pl d'Ang III froide et 50 pli d'Ang III iodée apportant 5000 cpm pendant 18 heures à 4 C La séparation Ang III liée et Ang III libre se fait par précipitation au polyéthylène glycol La liaison Ang III iodée- anticorps est déplacée de 50 % par l'addition de 250 pg d'Ang III L'anticorps reconnait donc l'Ang III b) Réactions croisées de l'anticorps anti-Ang III avec l'Ang I et l'Ang II. La réaction croisée des anticorps anti-Ang III a été mesurée vis à vis de l'Ang I et de l'Ang II Le pourcentage est inférieur à 1 % pour les deux peptides. L'anticorps anti-Ang III peut étre utilisé tel qu'il est obtenu dans l'antisérum ou après purification sur protéine A-Sepharose. EXEMPLE 2 Capacité de capture de l'Ang III par les anticorps anti-Ang III décrits ci-dessus en présence d'anticorps monoclonal anti-Ang II 4 D 8 et d'Ang II iodée. L'anticorps 4 D 8 est une immunoglobuline de souris; il est décrit dans les actes du congrès "The Renin Angiotensin System as a Therapeutic Target" Bâle, 29-31 octobre 1989, communication SANOFI. On prépare une solution contenant pi d'une solution d'anticorps de lapin anti-Ang III, obtenu à l'exemple 1, pi d'une solution d'Ang III, pl d'une solution d'Ang II iodée (activité spécifique de 74 T Bq/mmole (Amersham)), apportant 4000 cpm. p 1 d'une solution d'anticorps anti-Ang II ( 4 D 8), dilué de telle façon qu'il ne lie que 30 % de l'Ang II iodée. Le volume de réaction est complété à 400 1 l avec le tampon d'incubation, soit imidazole-H Cl ( 0,1 M; p H 7,4) contenant 0,2 % de SAB. L'incubation est réalisée pendant 18 heures à + 4 C. On ajoute une suspension de 500 pil de particules magnétiques recouvertes d'anticorps dirigés contré les immunoglobulines de souris (Amerlex M, commercialisé par Amersham) L'incubation est réalisée pendant 15 minutes, puis on sépare en utilisant un aimant les parti- cules magnétiques du milieu réactionnel et on mesure la radioactivité contenue dans la phase magnétique. On a réalisé une gamme de mesures en faisant varier la quantité d'Ang III de O à 40 pg/essai Des essais de contrôle ont été effectués en l'absence d'anticorps anti-Ang III. La mesure de la radioactivité permet d'exprimer les résultats par le rapport des concentrations B/Bo du complexe Ang II iodée-anticorps anti-Ang II pour chaque quantité d'Ang III. Ces résultats sont rapportés dans le tableau 1- TABLEAU 1 _________________________________________________________ :: B/Bo (en p cent): : Ang III :: en absence: en présence: : (pg/essai): d'anticorps: d'anticorps: :: anti-Ang III: anti-Ang III: :::: : O: 100 1: 00: : 5: 67: 100: : 10: 39: 100: : 20: 18: 100: : 40: 5: 96: :::: ____________ Comme le montrent les résultats du tableau 1, la liaison de l'Ang II iodée à l'anticorps 4 D 8 est diminuée par l'addition d'Ang III; cette liaison est restaurée intégralement par la présence d' anticorps anti-Ang III. Dans cette expérience, il a en outre été vérifié que l'addition au milieu réactionnel d'anticorps anti-Ang III à la concentration utilisée n'a pas d'influence sur la réaction de l'Ang II avec les anticorps anti-Ang II. EXEMPLE 3 Dosage spécifique de l'Ang II: Selon l'un des modes de réalisation décrits plus haut, la trousse utilisée dans cet exemple comprend les- anticorps monoclonaux anti-Ang II fixés sur un support solide. Plus précisément, les anticorps sont fixés sur les parois d'un tube (Startube Q commercialisé par NUNC) La trousse est alors constituée des éléments suivants: Startube NUNC revêtu des anticorps monoclonaux anti-Ang II 4 D 8 de telle façon que 30 % de l'Ang II iodée soit liée, des solutions d'Ang II, pour l'étalonnage, calibrées par rapport au standard international Ang II lot 86/538, fourni par le Medical Research Council, une solution d'Ang II marquée à l'iode 125, d'activité telle que définie à l'exemple 2, une solution de l'anticorps polyclonal de lapin anti-Ang III, préparé à l'exemple 1 ci-dessus et dilué de façon telle qu'il permette de capter au moins 10 pg dt Ang III par essai; Le dosage est réalisé en tampon imidazole-H Cl ( 0,1 M, p H 7,4) contenant 0,2 % de SAB Le volume final de la réaction est de 250 p 1 a) Courbe d'étalonnage en présence de 10 pg d'Ang III. Dans le tube revêtu d'anticorps monoclonal 4 D 8, 100 p 1 d'anticorps polyclonal de lapin anti-Ang III sont incubés avec 50 pl d'une solution d'Ang III (correspondant à 10 pg d'Ang III), 50 p I d'une solution d'Ang II étalon et 50 pl d'une solution d'Ang II iodée ( 4000 cpm), pendant 18 heures à + 4 C La radioactivité est mesurée dans les tubes secs après aspiration du milieu d'incubation et lavage avec 1 ml de tampon imidazole-HC 1 ( 0,1 M p H 7,4) La radioactivité est celle du complexe anticorps anti-Ang II-Ang II iodée. On a réalisé une gamme d'étalonnage en faisant varier les quantités d'Ang II de O à 40 pg/essai La mesure de radioactivité permet d'exprimer les résultats par le rapport de concentration B/Bo du complexe Ang II iodée anticorps anti-Ang II pour chaque quantité d'Ang II (colonne 1). On ajoute 10 pg d'Ang II dans chacun des essais correspondants à la courbe d'éta Lonnage (co Lonne 2) et L'on observe l'abaissement du rapport B/Bo dû à la réaction croisée de l'anticorps anti-Ang II avec l'Ang III présente. - Enfin, dans une troisième série d'expériences (colonne 3) on ajoute 10 pg d'Ang III et de l'anticorps anti-Ang III dans chacun des essais correspondants à La courbe d'étalonnage. Les résultats sont rapportés dans le tableau 2 ci-après: TABLEAU 2 ___________________________________________________________________ ::: Surcharge: :: colonne 1 : 10 pg Ang III: : Ang II:: B/Bo (p cent): :: B/Bo ::: colonne 2: colonne 3: : (pg/essai): (p cent): en absence: en présence: ::: d'anticorps: d'anticorps: *::: anti-Ang III: anti-Ang III i O: : : : ::0 100 : 23: 100: : 1,25: 84: 21: 86: : 2,5: 81: 22: 83: : 5: 67: 22: 66: : 10: 47: 18: 49: : 20: 29: 12: 36: : 40: 17: 11: 21: On observe que la présence d'anticorps anti-Ang III permet de retrouverles valeurs de La courbe d'étalonnage grâce à la capture spécifique de L'Ang III dans Le milieu réactionnel. On a par ailleurs vérifié, comme à l'exemple 2, que l'ajout d'anticorps anti-Ang III à la concentration utilisée, n'a pas d'influence sur la courbe d'étalonnage de L'Ang II. b) Dosage spécifique de 1 'Ang II à partir du plasma. Le dosage proprement dit est effectué sur un extrait plasmatique humain, extrait obtenu selon la technique décrite par J NUSSBERGER es al. dans Hypertension, 1985 (référence citée), puis concentré. Dans le tube revêtu d'anticorps monoclonal 4 D 8, 100 pl d'anticorps polyclonal de lapin anti-Ang III sont incubés avec 100 p 1 de solution d'Ang II étalon ou d'extrait plasmatique à doser et 50 pl d'une solution d'Ang II iodée ( 4000 cpm), pendant 18 heures à + 4 C. La radioactivité est mesurée dans les tubes secs après aspiration du milieu d'incubation, comme à l'exemple 3 a). Une détermination de l'Ang II effectuée en absence d'anticorps anti-Ang III, conduit à déterminer une quantité apparente de 81 pg dans l'essai, tandis que, en présence d'anticorps anti-Ang III, on ne mesure que 57 pg dans l'essai La différence résulte de l'élimination de la quantité d'Ang III immunocapturée par les anticorps anti-Ang III. On en déduit que la présence d'Ang III conduit dans ce cas à une erreur de: 81-57, soit de 42 % sur la détermination directe de l'Ang II réalisée à l'aide d'anticorps anti-Ang II ( 4 D 8), en raison de la réaction croisée entre cet anticorps et l'Ang III. Cette erreur peut être supprimée grâce à l'emploi simultané de l'anticorps anti-Ang III qui est l'un des objets de la présente invention. REVENDICATIONS 1 Une trousse pour le dosage spécifique de l'angiotensine II comprenant: l'anticorps anti-Ang Il, une solution d'Anq II marquée, des solutions contenant les étalons d'Ang II en concentrations connues et croissantes, la ou les solutions de lavage nécessaires, une solution d'anticorps anti-Ang III, ledit anticorps présentant une réaction croisée avec l'Ang II, inférieure à 10 %. et éventuellement, une solution d'anticorps anti-Ang I, ledit anticorps présentant une réaction croisée avec l'Ang II, inférieure à 10 %. 2 Trousse selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'Ang II est marquée par une enzyme. 3 Trousse selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une solution contenant le substrat de l'enzyme marquant l'Ang II, le cas échéant, un ou plusieurs réactifs pour révéler l'activité de l'enzyme et une solution destinée à arrêter la réaction enzymatique. 4 Trousse selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'Ang II est marquée, soit oar un composé fluorescent, soit par un composé luminescent, soit par un radioélément. Trousse selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'anticorps anti-Anq II est monoclonal ou polyclonal. 6 Trousse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'anticorps anti-Ang Il est en solution. 7 Trousse selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'anticorps anti-Ang II est fixé sur un support solide. 8 Trousse selon la revendication 7, caractérisée en ce que le support solide est un tube, une olaque de microtitration ou des particules magnétiques ou non. 9 Trousse selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que l'anticorps anti-Ang III est un anticorps monoclonal ou polyclonal. Trousse selon la revendication 9 caractérisée en ce que l'anticorps anti-Ang III est polyclonal et provient d'un antisérum de lapin. 11 Trousse selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'antisérum de lapin est obtenu par immunisation avec un dérivé peptidique de formule: Arg-Val-Tyr-Ile-His-R 1-R 2-Cys-NH 2 (IV) dans laquelle R 1 désigne une liaison directe ou un enchaînement comprenant 1 ou 2 acides aminés naturels, R 2 représente un groupement de formule: -NH-(CH 2)n-C 0- dans lequel N varie entre 1 et 9, ledit dérivé peptidique étant fixé sur une protéine modifiée. 12 Anticorps anti-Ang III spécifique de l'angiotensine III et présentant une réaction croisée avec l'angiotensine II, inférieure à 10 %. 13 Anticorps anti-Anq III selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est un antisérum de lapin obtenu par immunisation de lapin avec un dérivé peptidique de formule: Arg-Val-Tyr- Ile-His-R 1-R 2-Cys-NH 2 (IV) dans laquelle R 1 désigne une liaison directe ou un enchaînement comprenant 1 ou 2 acides aminés naturels, R 2 représente un groupement de formule: -NH-(CH 2)n-C 0- dans lequel N varie entre 1 et 9, ledit dérivé peptidique étant fixé sur une protéine modifiée. 14 Antisérum de lapin selon la revendication 13, caractérisé en ce que le dérivé peptidique répond à la formule: Arg-Val-Tyr-Ile-His-R'1- Ahx-Cys-NH 2 dans laquelle Ahx désigne le résidu de l'acide amino-6 hexanoique, et R'1 représente Pro ou Pro lié à un autre acide aminé naturel, et présente une réaction croisée avec l'Ang II, inférieure à 1 %. Dérivé peptidique de formule: Arg-Val-Tyr-I Le-His-R 1-R 2- Cys-NH 2 (IV) dans laquelle R 1 désigne une liaison directe ou un enchaînement comprenant 1 ou 2 acides aminés naturels; R 2 représente un groupement de formule: -NH-(CH 2)n-C 0- dans lequel N varie entre 1 et 9. 16 Dérivé peptidique selon la revendication 15 de formule: ArgVal-Tyr-Ile-His-R'1-Ahx-Cys-NH 2 dans laquelle Ahx désigne le résidu de l'acide amino-6 hexanoique, et R'1 représente Pro ou Pro lié à un autre acide aminé naturel. 17 Procédé utilisant la trousse de dosage selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on prépare le milieu réactionnel comprenant: l'extrait de liquide biologique à doser, l'anticorps anti-Ang II, l'Ang II marquée, l'anticorps Anti-Ang III, et l'anticorps anti-Ang I; b) on prépare simultanément les milieux réactionnels utiles pour l'étalonnage comorenant chacun: un étalon d'Ang II, l'anticorps anti-Ang II, l'Ang II marquée, l'anticorps anti-Ang III, et éventuellement l'anticor Ds anti-Ang I; c) on laisse incuber à une température comprise entre 4 C et la température ambiante, pendant 12 à 72 heures; d) on sépare l'Ang II liée à l'anticorps anti-Ang II de l'Ang II libre; e) enfin, on effectue la lecture des résultats selon une méthode appropriée. 18 Procédé selon la revendication 17 caractérisée en ce que les étapes a) et b) sont réalisées en mélangeant: à 500 pl d'extrait de liquide biologique à doser, ou d'étalon d'Ang II, à 500 >ul de solution d'anticorps anti-Ang II, à 500 pl de solution d'anticorps anti-Ang III, éventuellement 25 à 500 pil de solution d'anticorps anti-Ang I, et à 500 pl de solution d'Ang II marquée. 19 Procédé selon la revendication 17, caractérisée en ce que les étapes a) et b) sont réalisées en mélangeant: à 500 pl de solution d'extrait de liquide biologique à doser, ou d'étalon d'Ang II, à 500 pl de solution d'anticorps anti-Ang II, à 500 pl de solution d'anticorps anti-Ang III, et à 500 pl de solution d'Ang II marquée. Procédé selon la revendication 17, caractérisée en ce que les étapes a) et b) sont réalisées en utilisant des tubes revêtus d'anticorps anti-Ang II dans lesquels on mélange: à 500 pl d'extrait de liquide biologique à doser, ou d'étalon d'Ang II, à 500 pl de solution d'anticorps anti-Ang III, 25 à 500 pl de solution d'Ang II marquée, et l'étape d) est réalisée par aspiration de la solution d'incubation du milieu réactionnel puis lavage et nouvelle aspiration pour éliminer l'Ang II qui n'est pas complexée par l'anticorps fixé sur le support solide. 21 Procédé selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'anticorps anti-Ang Il est sous la forme de particules, magnétiques ou non, sur lesquelles est fixé l'anticorps anti-Ang II. 22 Procédé selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'il est utilisé pour le dosage d'un extrait plasmatique.