Brevet FR2673000A1 — publié le 19920821

PROCEDE DE DOSAGE DU RECEPTEUR CD23 SOLUBLE La présente invention concerne un procédé de dosage immunologique du récepteur soluble de l'IgE de faible affinité FcRII, encore appelé récepteur Cl 23. Plus précisément la présente invention concerne un procédé de dosage immunologique du récepteur soluble CD23 dans tout fluide biologique, y compris les plasmas sanguins contenant des agents chélatant ou séquestrant les ions métalliques, tels que EDTA, EGTA. A l'origine de la présente invention un problème a été mis en évidence en observant que les taux de CD23 dosés dans le cadre d'un immunodosage dans des échantillons de sérum, puis de plasma prélevé avec de l'héparine et surtout de plasma prélevé avec de 1'ENTA, ne correspondaient pas aux quantités connues de récepteur CD23 introduites initiallement dans lesdits échantillons. Ceci est illustré par les données figurant dans le Tableau I ci-après où le récepteur soluble CD23 est dosé avec une méthode de dosage du type IRMA. Tableau I Dosage du CD23 par la méthode IRMA CD23 ajoute a CD23 mesuré CD23 mesuré CD23 mesure l'échantillon dans le sérum dans le plasma dans le plasma hépariné EDTA (Ulmi) (U/ml) (U/ml) (U/ml) 2,86 2,21 2,65 0 5,57 3,22 3,21 0 13,24 8,48 11,31 o 29,78 28,61 26,57 0 La majorité du CD23 ajouté est retrouvée dans le sérum ou le plasma prélevé avec de l'héparine et on ne récupère aucune trace de CD23 dans le plasma prélevé avec de 1'ENTA. Les problèmes tenant principalement dans le taux de récupé ration- du récepteur CD23 dans le plasma prélevé avec de 1'EDTA, on a ajouté différents ions métalliques dans le traceur. Alors que les ions magnésium ou zinc n'ont pas d'effet, on a découvert de façon surprenante qu'en ajoutant dans le milieu réactionnel de la réaction immunologique des ions calcium on recouvrait entièrement -lors d'un dosage immunologique- les quantités de récepteurs CD23 introduites dans l'échantillon dosé. La présente invention a donc pour objet un procédé de dosage immunologique du récepteur soluble de faible affinité de l'lgE, appelé récepteur CD23, dans tout fluide biologique, notamment les plasmas sanguins contenant des agents chélatants ou séquestrants d'ions métalliques, tels que EDTA, EGTA, caractérisé en ce qu'on ajoute dans le milieu réactionnel de la réaction immunologique un sel de calcium. Selon l'invention le calcium est ajouté en excès pour saturer l'agent chélatant ; toutefois on a, en outre, mis en évidence l'existence de doses optimales d'ions calcium à ajouter. Ainsi le calcium n'a pas d'effet jusqu'à une concentration de 20 mM, mais à 100 mM le dosage permet de recouvrer entièrement le taux de récepteur soluble CD23 introduit dans un échantiilon de plasma prélevé avec de l'EDTA. Au-delà de 100 mM, on observe un effet négatif sur le signal dose-reponse et, partant, sur la courbe standard ; ce signal est diminué, c'est-à-dire que la courbe standard s'applatit. En général, l'ajout de 50 mM d'ions calcium suffit pour rétablir complètement la détection du CD23 dans du plasma prélevé avec de 1'ENTA. Le sel le plus communément utilisé est le chlorure de calcium CaC12. Dans un mode de réalisation du procédé, on aura recours à un dosage immunométrique à deux sites (non compétitif ou sandwich) en utilisant plusieurs anticorps monoclonaux qui se fixent sur des épitopes différents du Cl 23. Un premier anticorps est immobilisé sur une phase insoluble, telle que la paroi intérieure de tubes. Les autres anticorps non immobilisés portent un marqueur (anticorps traceur). Après réaction, la séparation du complexe libre-lié est réalisée par simple lavage et le complexe lié est mesuré. Dans ces conditions, et en présence d'un excès d'anticorps, le signal mesuré augmente lorsque la concentration de l'antigène à doser augmente. Selon une variante, les dosages sont des dosages par déplacement basés sur une compétition entre l'antigène natif à doser (CD23) et l'antigène marqué, vis-à-vis de l'anticorps. Après réaction, le complexe antigène-anticorps est séparé de l'antigène libre. Généralement, la mesure est effectuée sur l'antigène lié. Dans ces conditions et en présence d'une concentration constante en anticorps, le signal mesuré diminue lorsque la concentration de l'antigène à doser augmente. Dans ces deux types de dosages, le traceur ou marqueur permet de quantifier la réaction immunologique. I1 est fixé soit sur l'antigène CD23, dans le cas d'un dosage par déplacement, soit sur l'anticorps pour un dosage immunométrique. Quel que soit le type de dosage, le choix du marqueur dépend à la fois de la sensibilité désirée et des équipements des laboratoires d'analyses. Actuellement, il existe quatre classes principales de traceurs - les isotopes radioactifs. L'iode 125 représente le meilleur compromis entre la sensibilité et la stabilité. Par déplacement, les dosages sont de type RIA (Radio Immuno Assay), et par immunométrie, les dosages sont de type IRMA (Immuno Radio Metric Assay) - les enzymes telles que la galactosidase, la phosphatase alcaline ou la peroxydase.Par déplacement, les dosages sont de type ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), et par immunométrie, les dosages sont de type IEMA (Immuno Enzymometric Assay). Dans un mode particulier de réalisation non limitatif du dosage selon l'invention, ces dosages sont des dosages immunologiques, tels que les dosages radioimmunologiques ou enzymoimmunologiques. Notamment, il peut s'agir de dosages immunologiques par déplacement -tels que des dosages RIA ou ELISA- ou de dosages immunométriques à deux sites notamment du type IRMA ou EIMA. De façon pratique, le calcium sera ajouté dans la solution du traceur le cas échéant. De préférence, on emploie un système à plusieurs anticorps monoclonaux, dit "oligoclonal", comportant -outre la paire ACM adsorbé/ ACM marqué sélectionnée en fonction de sa sensibilité- au moins un deuxième ACM adsorbé sélectionné pour donner un taux de récupération le meilleur possible de valeurs connues de CD23 dans un dosage immunométrique, tel qu'un dosage ARMA, à l'aide d'une paire ACM adsorbé/ACM marqué dans laquelle 1'ACM adsorbé est ledit deuxième ACM adsorbé. La présente invention a donc également pour objet un dosage immunométrique, tel qu'un dosage IRMA du CD23, dans un fluide biologique, caractérisé en ce qu'on utilise au moins deux anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes différents du CD23, anticorps adsorbés sur une phase solide. De façon appropriée, un premier anticorps adsorbé est sélectionné comme donnant un dosage très sensible, un second anticorps adsorbé étant sélectionné comme donnant un taux de récupération maximum, lorsque l'on dose des valeurs connues de CD23 (exogène). La présente invention permet d'avoir recours à des dosages en une étape principale, c'est-à-dire dans lesquels la solution à doser et l'anticorps marqué sont incubés simultanément. Enfin, la présente invention a également pour objet un kit de dosage ou trousse de réactifs pour dosages immunologiques du CD23 comportant, entre autres réactifs, une solution d'ions calcium. Le cas échéant, la trousse comportera un tube de prélèvement sous vide, tel qu'un vacutainer pouvant prélever 5 à 10 ml de plasma, comportant de 1'ENTA. La présente invention a donc également pour objet une trousse (ou kit) de dosage immunologique du récepteur CD23 dans laquelle la solution du traceur ou son lyophilisat comporte des ions calcium conformément à la présente invention. Bien entendu, alternativement les ions calcium peuvent être ajoutés indépendamment du traceur dans l'échantillon à doser ou dans le récipient de dosage, tel qu'un tube le cas échéant. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples suivants EXEMPLE 1 : INFLUENCE DES IONS METALLIQUES Les problèmes étant liés au plasma prélevé avec de 1'EDTA, on a essayé de contrebalancer l'effet de 1'EDTA en ajoutant différents ions métalliques blvalents dans le traceur. Princlpe des tests IRMA Dans des tubes en plastique à l'intérieur desquels sont adsorbés des anticorps monoclonaux anti CD23 reconnaissants des épitopes différents on ajoute 200 p1 de standards ou d'échantillons à doser et 50 ul de solution du traceur consistant en un anticorps monoclonal anti CD23 marqué à 1125 (200.000 cpm). On laisse incuber 15 à 20 heures à température ambiante. Le contenu des tubes est alors aspiré et les tubes sont lavés avec du Tween 20 à 20 % dans l'eau distillée. On compte la radioactivité des tubes au compteur gamma pendant 60 secondes. La concentration en CD23 de l'échantillon est déterminée par interpolation par rapport à une courbe standard réalisée dans le même temps. Tableau II Dosage par la méthode IRMA Le tampon de base du traceur est un tampon TRIS (TP-A). On a utilisé des tampons modifiés en ajoutant - MgC12 5 mM + héparine 100 U/ml (TP-B) - ZnC12 0,5 mM + héparine 100 U/ml (TP-C) - CaC12 5 mM + héparine 100 U/ml (TP-D) - CaC12 20 mM + héparine 100 U/ml (TP-E) - CaC12 100 mM + héparine 100 U/ml (TP-F) - CaCl2 500 mM + héparine 100 U/ml (TP-G) L'héparine est destinée à éviter une coagulation éventuelle de l'échantillon lorsque 1'EDTA est saturée par les ions métalliques. Tampon TP-A TP-B TP-C TP-D TP-E - TP-F TP-G Traceur Courbe stan- B/T B/T B/T B/T B/T B/T B/T dard (U/ml (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) de CD23) STD 0 0,21 0,24 0,32 0,22 0,29 0,27 0,33 STD 1,4 1,37 1,39 1,40 1,25 1,21 0,80 0,26 STD 3,8 4,35 4,14 4,40 4,19 4,03 2,62 0,43 STD 7 10,52 11,08 10,21 9,47 9,57 6,55 0,61 STD 15 18,02 17,88 19,44 17,64 17,54 13,65 1,28 STD 35 28,43 28,42 30,79 29,40 29,26 26,66 4,11 Récupération U/ml U/ml U/ml U/ml U/ml U/ml U/ml Plasma EDTA 0,28 0,08 0,03 0,01 0 1 - 0,24 + 0 U/ml de CD23 Plasma EDTA 0,84 0,38 0,38 0,43 0,38 25,11 18,35 + 20 U/ml de CD23 Plasma hépa- 0,86 0,56 0,83 0,71 0,68 0,66 1,23 riné + 0 U/ml de CD23 Plasma hépa- 27,39 28,86 23,52 26,16 23,96 21,15 18,83 riné + 20 U/ml de CD23 T = Radioactivité totale initiale du traceur (50 p1) B = Radioactivité du traceur lié aux anticorps spécifiques en présence de 4 croissants de CD23 (échantillon de 200 ijI). On observe donc que les ions magnésium et zinc n'ont pas d'effet sur la récupération de CD23 aux concentrations utilisées. Le calcium n'a pas d'effet jusqu'à 20 mM mais à 100 mM la récupération en plasma EDTA est entièrement rétablie. A 500 mM, le calcium a un effet négatif sur la courbe standard. EXEMPLE 2 : OPTIMISATION DE DOSES DE Ca2+ Différentes concentrations de calcium entre 20 et 500 mM ont été testées dans le tampon du traceur dans une méthode IRMA et dans le tampon du traceur dans une méthode ELISA. Tampon traceur de base : tampon TRIS (TP-A). Le tampon a été modifié en ajoutant - CaCl2 50 mM + héparine 100 U/ml (TP-B) - CaC12 75 mM + héparine 100 U/ml (TP-C) - CaC12 100 mM + héparine 100 U/ml (TP-D) - CaC12 150 mM + héparine 100 U/ml (TP-E) - Héparine 100 U/ml (TP-F). Tableau III Dosage par la méthode IRMA Tampon A B C D I E F Traceur Courbe stan- B/T B/T B/T B T B/T BJT dard (U/ml (%) (%) (%) (%) (%) (%) de CD23) STD 0 0,34 0,26 0,37 0,23 0,29 0,25 STD 1,4 1,13 1,03 0,96 0,71 0,62 0,80 STD 3,8 3,24 3,16 2,78 2,34 1,77 2,62 STD 7 7,29 7,30 6,45 5,58 4,14 6,55 STD 15 13,56 13,79 13,07 / 11,69 9,51 13,65 STD 35 24,75 26,15 26,15 24,90 21,55 26,66 Récupération U/ml U/ml U/ml Ulmi U/ml U/ml Plasma EDTA 0,06 1,51 1,54 1,61 1,52 0,09 + 0 U/ml de CD23 Plasma EDTA 0,31 33,21 32,96 28,91 27,84 0,83 + 30 U/ml de CD23 Plasma hépa- 1,78 1,53 1,62 1,45 1,73 1,79 riné + 0 U/ml de CD23 Plasma hépa- 38,91 35,21 32,15 27,07 29,73 34,56 riné + 30 U/ml de CD23 Sérum + 0 1,41 1,41 1,29 1,52 1,53 1,66 U/ml de CD23 Sérum + 30 36,21 29,43 31,57 28,38 29,31 32,26 U/ml de CD23 Tableau IV Dosage par la méthode ELISA Tampon A B C D E F Traceur Courbe stan- DO DO DO DO DO DO dard (U/ml de CD23) STD 0 0,013 0,002 0,000 0,004 0,004 0,008 STD 1,4 0,158 0,135 0,134 0,121 0,097 0,225 STD 3,8 0,570 0,564 0,536 0,445 0,395 0,664 STD 7 1,420 1,343 1,379 1,223 1,054 1,625 STD 15 2,595 2,610 2,689 2,557 2,253 3,010 STD 35 3,741 3,878 4,070 4,027 3,451 4,298 Récupération U/ml U/ml UlmI UlmI UlmI UlmI Plasma EDTA 0 2,11 2,07 2,26 2,11 0,03 + 0 U/ml de CD23 Plasma EDTA 0,02 34,66 30,39 26,36 35,24 0,05 + 30 U/ml de CD23 Plasma hépa- 2,51 2,25 2,13 2,32 2,08 2,32 riné + 0 U/ml de CD23 Plasma hépa- 42,4 33,96 27,57 26,93 34,65 30,37 riné + 30 U/ml de CD23 Sérum + 0 2,12 1,97 1,82 1,96 1,91 2,01 U/ml de CD23 Sérum + 30 40,18 36,92 31,24 28,63 37,69 31,45 de CD23 Le protocole du test ELISA est le même que celui du test IRMA en ce qui concerne les quantités de réactifs, le traceur est toutefois un anticorps monoclonal anti CD23 marqué à l'enzyme péroxydase de Raifort. Le temps d'incubation peut être réduit à deux heures à température ambiante.Après aspiration du contenu des tubes, on verse 200 Cil d'une solution de chromogène TMB substrat de l'enzyme (tétraméthyl benzydine) dilué dans un tampon Acétate-citrate que l'on laisse incuber pendant 15 minutes. On verse 50 1ll d'un agent bloquant (H2SO4) et on mesure l'adsorbance selon les procédures connues. Conclusions Les Tableaux III et IV nous montrent qu'aussi bien en dosage IRMA qu'en dosage ELISA, l'ajout de 50 mM de CaC12 dans le tampon traceur suffit pour rétablir complètement la détection du CD23 dans du plasma prélevé avec de 1'ENTA. Cela est valable pour le dosage du CD23 natif présent dans le plasma-EDTA aussi bien que pour la récupération de CD23 exogène. Des concentrations de CaC12 supérieures à 100 mM altèrent la sensibilité du dosage en diminuant le signal dose-réponse (courbes standards plus plates). Enfin, les Tableaux III et IV montrent également que ce n'est pas l'héparine qui est responsable de l'effet observé, mais bien le calcium. Le dosage dans des fluides biologiques contenant des agents chélatants (EDTA, EGTA, ...) nécessite donc l'apport de calcium exogène. Les doses optimales se situent entre 20 mM et 100 mM pour un traceur qui est utilisé dans les proportions de 50 Cil de traceur pour 200 Cil d'échantillon ou de standard. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage immunologique du récepteur soluble de faible affinité de l'IgE, appelé récepteur CD23, dans tout fluide biologique, notamment les plasmas sanguins contenant des agents chélatants ou séquestrants d'ions métalliques, tels que EDTA, EGTA, caractérisé en ce qu'on ajoute dans le milieu réactionnel de la réaction immunologique un sel de calcium. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute des ions Ca 2+ à une concentration supérieure à 20 mM et inférieure à 100 mM. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les ions calcium sont ajoutés à la solution du traceur. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dosage du type IRMA. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que des ions calcium sont ajoutés sous forme de chlorure de calcium CaCI2. 6. Trousse de réactifs pour la mise en oeuvre d'un dosage immunologique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'un flacon comporte une solution contenant des ions calcium. 7. Trousse selon la revendication 6, caractérisée en ce que le calcium est contenu dans la solution du traceur.