Brevet FR2666584A1 — publié le 19920313

La présente invention a pour objet des dérivés de riboses, leur préparation et leur application en thérapeutique. Les composés de l'invention répondent à la formule (I) dans laquelle X est O ou S, C est le radical de la cytosine, n est un nombre allant de 3 a 30, le radical OCH3 pouvant être en a ou en ss. Les composés préférés de l'invention sont ceux dans lesquels n = 12. De récents travaux de M. Matsukura et Co. ont montré que les oligodésoxynucléotides phosphorothioates présentaient une activité antivirale marquée contre le VIH. En particulier, l'homopolymére S-dC28 inhibe l'infection "de novo" de cellules ATH8 (cellules non encore infectées) avec une ED50 de 0,5 FM. De plus, la séquence dirigée contre le site d'initiation de la traduction du gene viral "rev" inhibe, avec une ED50 de 5 FM, ltexpression du VIH dans les cellules H9 infectées de façon chronique. Cette inhibition est spécifique de la séquence antisens S-"rev". En effet, dans les mêmes conditions, l'homopolymére S-dC2 8 ne présente aucune activité antivirale. Les oligomères de l'invention, ne comportent pas de bases azotées, sauf aux extremités, et sont constitués d'unités dRMe ou désoxyribose-2 méthyl-1. Les oligomères de l'invention sont des 14-mères comportant 12 unites dRMe et 2 unités dC (une à chaque extrémité). Les unités dC permettent de faciliter l'analyse et la purification des oligomères. Les unités dRMe sont de configuration a ou B. Les oligomères sont des phosphodiesters ou des phosphorothioate-diesters. Les synthèses d'oligomères ont été effectuées à partir de synthon osidique ou nucléosidique 3 ou 3'-phosphoramidite et de support solide (CPGLCA = Long Chain Alkylamine Controlled Pore Glass) fonctionnalisé à 1 mol par du dCBZ. Le acBz x phosphoramidite ainsi que le support solide fonctionnalisé sont commercialisés chez Applied Biosystems. Avant de préparer les dRMe phosphoramidites, nous avons étudié leur stabilité dans différentes conditions acides utilisées lors de la réaction de détritylation ; réaction qui précède chaque étape d'incorporation en synthèse oligonucléotidique. La stabilité des unités osidiques étant vérifiée et les conditions étant choisies (TCA à 3% dans du CH2Cl2), nous avons alors préparé les dRMe phosphoramidites selon la méthode de synthèse représentée dans le schéma 1. C'est à étape de diméthoxytritylation que les anomères a et ss ont pu être isolés par chromatographie sur gel de silice2 La synthèse des oligomères a été réalisée sur un synthétiseur d'ADN Applied Biosystems (modèle 381 A) en utilisant le programme standard avec une augmentation du temps d'incorporation (45 secondes au lieu de 30) pour l'étampe de condensation des dérivés a et B phosphoramidites de dRMe. Les cycles d'élongation sont tout à fait classiques et sont représentés dans le tableau 1. N Etape Solvants et réactifs Temps (s) 1 lavage CH3CN séchage argon 52 2 détritylation TCA à 3% dans CH2Cl2 100 3 lavage CH3 CN séchage argon 225 4 couplage pour dC et dRMe : amidite 0,1 M (20 éq) dans CH3 CN + 30:dC tétrazole 0,5 M (100 éq) dans CH, CN 45::dRMa 5 séchage argon lO 6 "cappage" NMIm 5,5% dans THF + AC2 O/lutidine/ THF (1/1/8) 143 7 séchage argon 20 8 oxydation en P=O I2 0,1 M dans THF/Pyr/H2O (40/10/1) 55 en P=S Benzodithiazol-1,2 one-3 dioxide-1,2 30 0,2 M dans CH CN Tableau 1 - Cycle d'élongation utilisé sur le synthétiseur. Les oligomères ont été déprotégés selon des méthodes usuelles par - un traitement au thiophénol/Et3N/dioxanne (1/1/2) (l x 1/2h( ; - un traitement à 1ammoniaque à 32% à température ambiante (3 x 1/2 puis à 55 C (15 h). La purification de ces oligomères a été réalisée par HPLC sur une colonne nucléosil- Cl (granulométrie 5 microns) avec pour éluant de l'acétate de triéthylammonium 0,05 M (PH 7,5) et de l'acetnitrile Les composés de l'invention sont synthétisés en deux étapes préparation des phosphoramidites puis synthèse des oligomères. SYNTHESE DES PHOSPHORAMIDITES &alpha; ET ss. O-Diméthyloxytrityl-5 désoxy-2 O-méthyl-1 &alpha; et ss-D-ribofuran -nose,-la et lb Une solution de -désoxy-2 D-ribose -(25 mmoles, 3,35 g) dans 60 ml de méthanol anhydre est mise sous agitation à température ambiante puis traitée par 0,5 ml d'HCl 0,65 M dans le méthanol. Après 40 minutes, la réaction est arrêtée par addition de 20 ml de pyridine anhydre, puis évaporée à sec et coévaporée avec de la pyridine anhydre (2x50 ml). Au mélange anomérique desoxy-2 P-méthyl-l1 D-ribofurannose ainsi obtenu repris par 250 ml de pyriaine anhydre, est ajouté le chlorure de diméthoxytrityle (27,5 mmoles, 9,3 g). Après 2 heures d'agitation à température ambiante, le milieu réac tionnel est hydrolysé par 20 ml de MeOH.Le volume réaction nel est ensuite réduit de moitié puis versé sur une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium (200 ml) et les produits sont extraits avec du CH2 Cl2 (3x200 ml). Les phases organiques sont rassemblées, séchées au Na2 SO4, évaporées à sec et coévaporées au toluène. Le résidu huileux obtenu est chromatographié sur gel de silice (éluant : CH2Cl3/Et/MeOH de 99/1/0 à 94/1/5). Les fractions contenant l'anomère &alpha; la sont rassemblées et évaporées à sec séparément de celles contenant l'anomére ss lb. Les dérives tritylés &alpha; et ss sont obtenus sous forme d'une huile jaune avec des rendements respectifs de 45 et 36% après lyophilisation dans le benzène. Anomère &alpha;, 1a. -Rf:0,42 CH2Cl2/MeOH (97,5/2,5) : 0,37 Toluène/Cyclohexane/Et3 N (8/1/1). - RMN 1H (CDCl3) s 7,3 (m, 9H, H aromatiques du groupement DMTr) ; 6,85 (d, 4H, H aromatiques du groupement DMTr) ; 5,16 (d, 1H, H1, Jl 2= 4,45 Hz) ; 4,20 (m, 2H, H3 et H4) ; 3,80 (s, 6H, 2 OCH3 du groupement DMTr) ; 3,40 (s, 3H, OCH3) ; 3,15 (m, 2H, 2 H5) ; 2,88 (d, 1H, OH3, JOH-3= 10,65 Hz) 2,21 (m, 1H, H2) ; 2,08 (d, 1H, H2). Anomére ss, 1b. - Rf: 0,24 CH2 C12 /MeOH (97,5/2,5) : 0,20 Toluène/Cyclohexane/Et3 N (8/1/1). - RMN 1H (CDCl) b 7,3 (m, 9H, H aromatiques du groupement DMTr) ; 6,85 (d, 4H, H aromatiques du groupement DMTr) ; 5,06 (dd, 1H, H1) ; 4,43 (m, 1H, H3) ; 3,96 (q, 1H, H4) ; 3,80 (s, 6H, 2 OCH3 du groupement DMTr) ; 3,33 (m, 1H, H3) ; 3,23 (s, 3H, OCH3 ; 3,18 (m, 1H, H5) ; 2,20 (m, 1H, H2 ) ; 2,03 (m, 1H, H2) ;1,65(m, 1H, OH3). Preparation des phosphoramidites &alpha; et P 2a et 2b (mélange diastéréoisomérique). Au dérivé tritylé la ou lb (2 mmoles, 900 mg) solubilisé dans 10 ml de CH2Cl2 anhydre sont adaitionnées sous atmosphère d'argon la N,N-diisopropyléthylamine (8 immoles, 1,4 ml) et la chloro N,N-diisopropylaminométhoxyphosphine (5 immoles, 975 l). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 45 minutes puis est dilué avec 70 ml d'acétate d'éthyle. Cette solution organique est lavée avec de la saumure (4x120 ml), séchée sur Na2 S04, filtrée et évaporée à sec. Le résidu obtenu est chromatogra phié sur gel de silice (éluant : CH2 Cl2 /Cyclohexane/Et3N de 0/99/1 à 99/0/1).Les fractions contenant les produits dési- rés sont rassemblées, évaporées à sec, coévaporées et lyophilisees avec du benzène pour conduire aux dérivés phosphoramidites 2a et 2b sous forme d'huiles incolores. O-Diméthoxytrityl-5 O-diisopropylaminométhylphophinyl-3 désoxy-2 O-méthyl-1 &alpha;-D-ribofuranose 2a (mélange diastéréoisomérique). - Rdt : 62 % - Rf : 0,67 Toluene/Cyclohexane/Et3N (8/1/1). - RMN 31p (CD3CN) # 149,56 et 149,13. - RMN 1H (CDCl3) # 7,3 (m, 9H, H aromatiques du groupement DMTr) ; 6,82 (dd, 4H, H aromatiques du groupement DMTr); 5,14 (m, 1H, H i) ; 4,33 (m, lHr H3) ; 4,25 (m, 1H, H4) ; 3,79 (-s, 6H, 2 OCH3 du groupement DMTr) ; 3,55 (m, 2H, 2 CH des grou pements isopropyles) ; 3,43 et 3,42 (2s, 3H, OCH3) ; 3,35 et 3,21 (2d, 3H, P-OCH3, Jp x= 13,20 Hz) ; 3,31 et 3,10 (2m, 2H, 2 Hs) ; 2,41 et 2,04 (2m, 2H, 2 Hz) ; 1,13 et 1,00 (m, 12H, 4 CH3 des groupements isopropyles). O-Siméthyloxynitryl-5 O-diisopropylaminométhoxyphosphonyl-3 désoxy-2 O-méthyl-l ss-D-ribofurannose 2b (mélange diastéréo isomérique). - Rdt : 78 %. - Rf : 0,64 Toluène/Cyclohexane/Et3N (8/1/1). - RMN 31p (CD3CN) # 149,68 et 149,33. - RMN 1H (CDC13) # 7,3 (m, 9H, H aromatiques du groupement DMTr) ; 6,82 (dd, 4H, H aromatiques du groupement DMTr) ; 5,13 (m, 1H, H1) ; 4,45 (m, 1H, H3) ; 4,20 (m, 1H, H4) ; 3,79 (s, 6H, 2 OCH3 du groupement DMTr) ; 3,54 (m, 2H, 2 CH des groupements isopropyles) ; 3,26 et 3,35 (2d, 3H, P-OCH3, Jf-h= 13,20 Hz) ; 3,33 et 3,34 (2s, 3H, OCH3) ; 3,20 (m, 2H, 2 H5) ; 2,18 (m, 2H, 2 H2) ; 1,14 et 1,04 (m, 12H, 4 CH3 des groupements isopropyles). SYNTHESE DES OLIGOMERES (n = 12). Synthèse automatisée des oligomères sur support solide. Le support solide fonctionnalisé par du dCBZ et le phos phoramidite du dCBZ sont commercialisés par Applied Biosys tems. Nous avons synthétisé cinq oligomères, l'oligomère témoin S-dCl4 5 et les oligomères abasiques dC(&alpha;dRNE)12 dC et dC(ssdRME)12 dC en série phosphodiester 3a et 3b et en série phosphorothioatediester 4a et 4b, sur un synthétiseur d'ADN Applied Biosystems modèle 381 A. Le programme utilisé est standard avec une modification mineureau niveau de l'étape de condensation des dérivés phosphoramidites des O-méthyl-l &alpha; ou ss---ribofurannose 2a ou 2b.En effet, le temps d'incorpore tion est augmenté dé 15 secondes (45 secondes au lieu de 30) pour parvenir à des rendements par étapes plus élevés. -Le cycle d'élongation est tout à fait classique. Il peut se résumer en quatre étapes 1 ) détritylation du nucléoside ou de la chaine oligomérique fixée au support solide ; 2 ) condensation du phosphoramidite activé par du tétrazole; 3 ) "cappage" des fonctions OH-5 ou OH5' qui n'ont pas réagi ; 4 ) oxydation de la liaison phosphitetriester en phosphodi ester ou en phosphorothioatediester. Entre chaque étape des lavages et séchages sont effectués. Le cycle d'élongation résumé dans le tableau 1 dure environ 13 minutes. Chaque synthèse a été réalisée à partir d'une colonne fonctionnalisée à une pmole en ss-désoxycytidine, et le rendement moyen par étape d'incorporation est de 98,5 %. Déprotection des oligomères. Au terme des synthèses chaque oligomère est déprotegé au niveau des groupements phosphates par une traitement avec une solution de thiophénol/Et3N/dioxanne (1/1/2) pendant 30 minutes à température ambiante. Après lavages abondants avec du methanol (10x2 ml), l'oligomère est clivé du support solide par trois traitements successifs à l'ammoniaque concentré pendant 30 minutes à température ambiante. Les solutions ammoniacales sont récupérées dans un tube scellé et mises à incuber à 55 C pendant une nuit pour retirer les protections portées par les bases azotées. Purification des oligomères. Cette dernière étape consiste à éliminer les dérivés du thiophénol, la benzamide, et les oligomères dont les synthèses ont été avortées. La purification de chaque oligomères est réalisée par HPLC sur une colonne Nucléosil C18 (10x250 mm) d'une granulométrie de 5 Am avec pour éluant de l'acétate de triéthylammonium 0,05 M (PH 7,5) et de l'acétonitrile à un débit de 2,5 ml/min. Les contrôles de pureté ont été effectués par HPLC sur une colonne Beckman C1 (4,6x70 mm) d'une granulométrie de 3 m avec pour gluant de l'acétate d'ammonium 0,1 M (PH 5,9) et de llacétonitrile à un débit de 1 ml/min. Le pourcentage de pureté de chacun des oligomères déterminé par analyse HPLC entre 200 et 350 nm est de 98 à 100 %.Dans le tableau 2 sont résumés les gradients et temps de rétention (Tr) des purifications et des analyses de chacun des oligomères, le nombre d'unité d'absorbance obtenu à 260 nm et le rendement total de synthèse des différents oligomères. Les composés de l'invention sont représentés dans le tableau suivant Composé # X x Position de OCH3 3a # O # &alpha; 3b # O # ss 4a # S # &alpha;; 4b # S # ss Purification Analyse Oligomère # # #U,DO260 # Rmt gradient Tr gradient Tr 0% # 20% 16,61 dC(&alpha;;dRMe)10dC 10% # 15% # 30% 15,49 O' 25' 4,5 30% 3a O' 20' 30' 0% # 25% 15,51 O' 25' O' # 20% 18,88 O' 25' dC(ssdRMe)12dC 10% # 15% # 30% 21,61 10,4 70% 3b O' 20' 30' O' # 25% 17,46 O' 25' S-[dC(&alpha;;dRMe)12 dC] 15% # 15% # 30% 22,21 O% # 25% 20,25 8,8 60% 4a 0' 10' 25' 01 25' O% # 25% 20,92 O' 25' S-[dC(ssdRMe)12dC] 18% # 30% 14,53 8,8 60% 4b O' 25' O$ # 30% 16,00 O' 20 Tableau 2 EVALUATION DE L'ACTIVITE ANTI VIH1 DES DIFFERENTS COMPOSES SUR CELLULES CEM La multiplicationdu VIH 7 (souche BRU) dans les cellules CEM est évaluée après 5 jours d'infection par un dosage de la reverse transcriptase (RT) dans le surnageant de culture dont l'activité traduit la présence de virus relargué par les cellules Différentes concentrations des composés testés sont ajoutés après l'adsorption du virus dans le milieu de culture. Les résultats sont exprimés en poucentage d'inhibition de la multiplication du virus calculé par rapport à des cultures infectées maintenues en absences des composes. L'ED 50, dose effective 50 % est dérivés de la courbe représentant le pourcentage d'inhibition de la multiplication en fonction de la concentration des composés. Une confirmation de l'inhibition de la production de virus est obtenue par le dosage de l'antigène p24 dans le milieu de culture. L'effet toxique sur les CEM non infectées est apprécié par une réaction colorimétrique basée sur la capacité des cellules vivantes à réduire le 3- (4,5 diméthylthiazol-2-yl)2, diphényltetrazolium bromide en formazan après quatre jours d'incubation en présence de différentes concentrations des composés. % % d'inhibition de la multiplicaiton du VIH 1 Composés Concentrations (pM) ED 50 (MM). 25 5 1 0.5 0.25 3a O O O O O 3b O O O O O 4a 72 33 48 28 O I 4b 66 71 O O O 3.5 Les composés de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement de maladies virales. Ils peuvent être présentés à cet effet sous toute forme appropriée, en association avec un ou plusieurs excipients. Revendications 1. Dérivés de riboses répondant à la formule dans laquelle x est 0 ou S, C est le radical de la cytosine, n est un nombre allant de 3 à 30, le radical 0CM3 pouvant être en a ou en B. 2. Composés selon la revendication 1, caractérisés par le fait que n = 12. 3. Médicament caractérisé en ce qu'il est constitué par un composé selon la revendication 1 ou 2. 4. Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend un composé selon la revendication 1 ou 2 en association avec tout excipient approprié.