Brevet FR2667077A1 — publié le 19920327

La présente invention concerne un procédé d'immobilisation d'une substance du type protéine ou analogue, notamment d'une enzyme, sur la surface sensible d'un support et un capteur utilisant la substance ainsi immobilisée. L'utilisation des biocapteurs, à électrodes enzymatiques, immunologiques etc..., présente un intérêt croissant en raison de la grande spécificité chimique des réactions mises en jeu et donc des produits détectés. L'immobilisation d'une enzyme sur la surface sensible d'un support ou électrode d'un capteur enzymatique, a apporté une amélioration considérable car elle a permis de réutiliser de nombreuses fois l'enzyme qui, autrement, à l'état libre, était pratiquement perdue d'une opération à l'autre. Dans les biocapteurs, l'immobilisation de l'enzyme sur l'électrode, soit directement, soit indirectement, par exemple sur une membrane, doit présenter une grande stabilité et elle doit assurer un contact maximal indispensable en vue d'une reproductivité et d'une sensibilité satisfaisantes. En outre, un temps de réponse très court de l'électrode du biocapteur est souhaitable. Les enzymes peuvent être immobilisées sur l'électrode d'un biocapteur par différents procédés chimiques et/ou physiques tels qu'adsorption physique, inclusion dans un gel, liaison covalente sur support, réticulation et coréticulation des enzymes. Parmi ces différents procédés, la liaison covalente de l'enzyme dans une matrice assure notamment une liaison solide résistant aux variations des conditions expérimentales et permettant une grande stabilité de l'enzyme après l'immobilisation. Cette immobilisation facilite le greffage de l'enzyme sur une électrode mais le temps de réponse de celle-ci reste encore long, l'épaisseur et la structure de la membrane ralentissant en effet la diffusion des corps en présence. La présente invention vise à remédier à cet inconvénient en procurant un procédé d'immobilisation permettant d'obtenir un temps de réponse très court, de l'ordre de quelques secondes, et assurant, de plus, une stabilité, une sensibilité et une réversibilité de 1' électrode particulièrement satisfaisantes. A cet effet, ce procédé d'immobilisation d'une substance du type protéine ou analogue, notamment une enzyme, sur la surface sensible d'un support solide, notamment d'une électrode d'un biocapteur, est caractérisé en ce qu'on forme, par adsorption, un revêtement très fin de la substance du type protéine sur le support solide et on procède à une réticulation directe de la substance du type protéine adsorbée sur le support par pulvérisation, sur cette substance, d'un agent réticulant. Grâce au procédé suivant l'invention, l'immobilisation des molécules de protéines et en particulier des enzymes est obtenue en procédant à leur pontage covalent à l'aide de réactifs polyfonctionnels tels que le glutaraldéhyde. Ces liaisons covalentes intermoléculaires donnent des composés de haut poids moléculaire qui sont insolubles dans l'eau. Dans le cas de l'application du procédé suivant l'invention, à l'immobilisation d'une enzyme, on obtient une couche enzymatique très fine et une meilleure dispersion des sites actifs, ce qui améliore considérablement la diffusion des corps en présence. Un capteur enzymatique comportant une couche enzymatique immobilisée par le procédé suivant l'invention présente un temps, de réponse très court, de l'ordre de quelques secondes, ce qui n'a jamais été atteint jusqu'à présent dans le cas des électrodes de verre recouvertes d'enzymes. Un tel temps de réponse très court est intéressant car il permet de détecter immédiatement des variations de concentration d'un substrat et par exemple de déclencher des systèmes d'alarme.En outre, une électrode enzymatique préparée par le procédé suivant l'invention est parfaitement applicable à un système FIA (technique d'analyse par injection dans un flux continu), la FIA ayant pour principal intérêt d'être facilement automatisable. Le procédé suivant l'invention s'applique non seulement à l'immobilisation des protéines proprement dites, telles que des enzymes, des anticorps etc... mais encore à d'autres substances notamment certains antigènes. On décrira ci-après, à titre d'exemples non limitatifs, diverses formes d'exécution de la présente invention, en référence au dessin annexé sur lequel La figure 1 est un schéma illustrant les diverses phases du procédé suivant l'invention appliqué à la fabrication d'un capteur enzymatique. La figure 2 est un diagramme illustrant le temps de réponse d'une électrode enzymatique obtenue par le procédé suivant l'invention comparativement à celui d'une électrode enzymatique fabriquée suivant la technique antérieure. Si on se réfère à la figure 1, on voit que cette figure représente schématiquement les diverses phases opératoires du procédé suivant l'invention. Ce procédé vise à immobiliser, sur un support solide 1, une couche fine d'une substance du type protéine, telle qu'une enzyme, pour obtenir, par exemple, une électrode enzymatique. Le support solide 1 peut être en n'importe quel matériau approprié tel que verre, métal, polymère, composite, toile, fibre optique etc... Dans ce qui va suivre, on décrira l'application du procédé suivant l'invention à la fabrication d'une électrode enzymatique mais il va de soi que ce procédé peut être également utilisé pour l'obtention d'autres dispositifs similaires tels que d'autres biocapteurs, des bioréacteurs etc...L'enzyme qui doit être immobilisée sur la surface sensible de l'électrode en verre 1 est présente sous la forme d'une solution 2 contenue dans un récipient (phase a). On plonge ensuite la surface sensible de l'électrode 1 dans la solution 2 contenant l'enzyme (phase b), la durée de l'immersion étant par exemple de 15 minutes à la température ambiante. Ensuite on retire l'électrode 1 de la solution 2, cette électrode 1 portant alors, à son extrémité constituant sa surface sensible, une mince couche d'enzyme 3 maintenue au contact de la surface sensible par adsorption (phase c). On maintient dans cet état l'électrode 1, pendant un certain temps, par exemple à +40C pendant 20 minutes. Au cours de la phase suivante du procédé (phase d), on vaporise un agent réticulant 4 sur la couche d'enzyme 3 précédemment adsorbée sur la surface sensible de l'électrode 1. Cet agent réticulant peut être constitué par exemple par du glutaraldéhyde à 2,5% dans un tampon phosphate de sodium. Cette vaporisation peut être réalisée par tous moyens appropriés connus dans la technique. A titre d'exemple, on peut utiliser, ainsi qu'il est représenté sur la figure 1, un nébuliseur 5, du type aérographe, relié à une source d'agent réticulant 6 et à une source de gaz vecteur sous pression 7, tel que de l'azote. Après la vaporisation de l'agent réticulant, on laisse l'ensemble de l'électrode 1 et de la couche enzymatique au repos pendant un temps approprié pour permettre la réticulation entre l'enzyme et le glutaraldéhyde. On obtient ainsi une électrode enzymatique 1 pourvue d'une couche enzymatique réticulée 8 d'épaisseur remarquablement faible, de l'ordre d'un micromètre, c'est-àdire plus mince que les couches obtenues par la technique antérieure et dont l'épaisseur est de l'ordre de 50 micromètres (Durand, Biochimica & Biophysica Acta, 1978, 527,277). Le procédé suivant l'invention permet ainsi de fabriquer des électrodes enzymatiques à couche enzymatique très mince, adhérant parfaitement à la surface de l'électrode. Par ailleurs, les conditions opératoires précises assurent une reproductibilité de la fabrication et donc de la réponse de l'électrode et par là-même cette technique est parfaitement adaptée à la fabrication en série d'électrodes. On donnera ci-après quelques exemples non limitatifs d'application du procédé suivant l'invention à la fabrication de différentes électrodes enzymatiques. EXEMPLE I 715 unités de pénicillinase (EC 3.5.2.6.) sont dissoutes dans 0,5 ml d'une solution aqueuse de tampon phosphate 0,01M, NaCl 0,1M, pH=7,0 et adsorbées sur la paroi d'une électrode de verre par immersion de la surface sensible. La durée de l'immersion est de 15 minutes à la température ambiante. Ensuite, l'électrode est maintenue à +40C pendant 20 minutes. La réticulation est réalisée par nébulisation de l'agent réticulant (glutaraldéhyde à 2,5% dans le tampon phosphate 0,01M, NaC1 0,1M, pH=7,0), en utilisant l'azote. Le nébuliseur, du type aérographe, projette un jet de glutaraldéhyde sur le film de la pénicillinase par l'intermédiaire d'une buse, sous la pression de 1,5 bar, pendant 5 secondes. Pendant la vaporisation, l'électrode est soumise à un mouvement de rotation à 50 tours par minute. La distance entre le vaporisateur et l'électrode est de 20 cm. L'ensemble est maintenu à la température ambiante. Après la vaporisation, on laisse encore tourner l'électrode pendant 3 minutes. Puis, l'ensemble est laissé au repos pendant 15 minutes à +40C pour permettre la réticulation entre l'enzyme et le glutaraldéhyde. Après cela l'électrode est immergée pendant 5 minutes dans une solution tampon phosphate 0,01 M, NaCl 0,1M, pH=7,0, à la température ambiante. Enfin, la solution est siphonnée et l'électrode est stockée à +40C. On réalise ainsi une électrode sensible à la pénicilline pour des concentrations comprises entre 10-4 et 0~1 M. Le diagramme de la figure 2 illustre la différence du temps de réponse obtenu avec une électrode enzymatique en verre fabriquée par le procédé suivant l'invention, dans le cas de l'exemple I ci-dessus, e avec une électrode similaire fabriquée par les procédés connus antérieurement. Dans le diagramme de la figure 2, le temps t, exprimé en secondes, est porté en abscisse, tandis que la variation du potentiel, en millivolts, est portée en ordonnée. Les courbes A et B correspondent à des mesures effectuées avec une concentration de la pénicilline de 5 mM.On voit d'après le diagramme de la figure 2 que le temps de réponse de l'électrode obtenu par le procédé suivant l'invention (courbe A) est de l'ordre de 5 à 8 secondes alors que celui de l'électrode obtenu par un procédé connu antérieurement et mentionnée dans la littérature (Enfors and Nilsson, Enzyme Microb, Techn., 1979,1, 260) comme ayant le temps de réponse le plus court, est d'environ 1 minute (couche B). EXEMPLE Il On répète les conditions opératoires de l'exemple I sauf en ce qu'on utilise, à la- place de la pénicillinase, 6000 unités d'uréase (EC 3.5.1.5). On obtient alors une électrode enzymatique sensible à l'urée pour des concentrations comprises entre 10 4 et 10 2 M. Le temps de réponse pour cette gamme de concentrations varie de 5 à 10 secondes. EXEMPLE III On reproduit les conditions opératoires de l'exemple I, en utilisant toutefois 5000 unités d'acétylcholinestérase (EC 3.1.1.7). On obtient alors une électrode enzymatique sensible à l'acétylcholine pour des concentrations comprises entre 10-5 et 10-2 M. Le temps de réponse pour cette gamme de concentrations varie de 5 à 8 secondes. REVENDICATIONS 1.- Procédé d'immobilisation d'une substance du type protéine ou analogue, notamment une enzyme, sur la surface sensible d'un support solide, notamment d'une électrode, d'un biocapteur, caractérisé en ce qu'on forme, par adsorption, un revêtement très fin (3) de la substance du type protéine sur le support solide (1) et on procède à une réticulation directe de la substance du type protéine adsorbée sur le support par pulvérisation, sur cette substance, d'un agent réticulant (4). 2.- Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce qu'on trempe d'abord le support solide dans une solution de la substance du type protéine on retire le support solide de la solution, pendant plusieurs minutes, on vaporise ensuite l'agent réticulant sur la mince couche de substance du type protéine adsorbée sur ie support et on laisse au repos l'ensemble du support et de la couche de substance pendant un temps suffisant pour permettre la réticulation. 3.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on utilise, comme agent réticulant, du glutaraldéhyde. 4.- Biocapteur comportant une électrode enzymatique dont la couche d'enzyme est immobilisée par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3.