Brevet FR2672822A1 — publié le 19920821

i PROCEDE DE FABRICATION D'UNE PLAQUE DE GEL POUR LA SEPARATION ET LE TRANSFERT DE MACROMOLECULES PAR ELECTROPHORESE, ET LES PLAQUES DE GEL AINSI OBTENUES. L'invention concerne un procédé de fabrication d'une plaque de gel pour la séparation et le transfert de macromolécules par électrophorèse, ainsi que les plaques de gel qui sont obtenues par exécution de ce procédé. Ces plaques comprennent une couche de gel, par exemple d'agarose ou de polyacrylamide, adhérant à une face d'une membrane microporeuse de faible épaisseur, par exemple de nitrocellulose, de "nylon", de PVDF (difluorure de polyvinylidène) ou encore de papier spé- cial Des échantillons de macromolécules telles que des acides nucléiques ou des protéines, sont déposés dans des puits formés dans la couche de gel à une extrémité de la plaque, puis cette plaque est placée dans un bain de li- quide approprié entre des électrodes de polarités oppo- sées Sous l'effet du champ électrique entre les élec- trodes, les macromolécules se déplacent longitudinalement dans la couche de gel à des vitesses qui sont fonction de leur masse moléculaire Au bout d'un temps donné, elles ont parcouru des distances ou longueurs différentes en fonction de leur masse moléculaire et peuvent ainsi être séparées les unes des autres Elles sont ensuite transfé- rées dans l'épaisseur du gel sur la membrane adhérant à la plaque de gel, en vue de leur hybridation et de leur détection ultérieures. Les plaques de gel utilisées dans cette tech- nique connue de séparation et de transfert de macromolé- cules (dite "Multi-Blotter") doivent satisfaire à un cer- tain nombre de critères, tels que la planéité de la mem- brane, la constance de l'épaisseur du gel, l'homogénéité du gel, l'absence de bulles d'air dans le gel et à l'interface gel-membrane, et la propreté de la face libre de la membrane opposée à celle qui est recouverte de gel. Pour la fabrication de ces plaques, on peut fixer les membranes à leur périphérie sur des cadres, 2 puis couler dans ces cadres le gel à l'état très liquide de façon à recouvrir les membranes On laisse ensuite so- lidifier le gel De par sa nature, le gel adhère assez fortement aux membranes et a tendance à remplir les mi- 5 cropores des membranes, par capillarité. Lorsque les membranes sont posées sur une sur- face plane pour la coulée du gel, on obtient des plaques dont les membranes sont planes, mais qui présentent des traces ou une épaisseur plus ou moins variable de gel sur leur face opposée à celle qui est normalement recouverte de gel En effet, lors de la coulée, le gel très liquide pénètre dans les membranes et les traverse pour venir sur la surface de support, o il s'accumule de façon plus ou moins importante De plus, des bulles d'air restent sou- vent emprisonnées entre la membrane et le gel ou dans le gel. Si, au contraire, seuls les cadres périphé- riques auxquels sont fixées les membranes sont posés sur un support pour la coulée du gel, les membranes elles- mêmes n'étant pas supportées par une surface plane, leur face libre reste propre, mais les membranes s'incurvent sous le poids du gel et prennent une forme bombée qu'elles conservent lorsque le gel s'est solidifié. Pour éviter ces inconvénients, on a déjà pro- posé de saturer les membranes d'eau avant la coulée du gel, puis de les poser sur une surface plane et de les soumettre à un roulage afin d'en éliminer les bulles d'air et de faire adhérer les membranes à la surface plane On coule ensuite le gel sur les membranes posées sur cette surface plane L'eau présente dans les micro- pores des membranes empêche le gel de traverser les mem- branes et préserve ainsi la propreté de la face des mem- branes opposée à celle recouverte de gel. Toutefois, ce procédé connu est très long et fastidieux à exécuter, et ne permet pas une fabrication rapide des plaques de gel. La présente invention a notamment pour but d'éviter ces divers inconvénients des procédés connus de la technique antérieure. Elle a pour objet un procédé de fabrication de plaques de gel, qui permette de satisfaire aux critères précités et qui soit simple et rapide à exécuter. L'invention a également pour objet des plaques de gel du type précité, qui soient d'une qualité parfaite et identiques entre elles. Elle propose, à cet effet, un procédé de fa- brication d'une plaque de gel pour la séparation et le transfert de macromolécules par électrophorèse, cette plaque comprenant une couche de gel adhérant à une face d'une membrane microporeuse, le procédé consistant à fixer la périphérie de la membrane sur un cadre, à couler le gel à l'état liquide dans le cadre et à le laisser so- lidifier, caractérisé en ce qu'il consiste, lors de la coulée du gel dans le cadre, à supporter la membrane par un fluide en évitant tout contact solide avec la face libre de la membrane opposée à celle recevant le gel, de façon à ne pas modifier ou perturber sur cette face libre les forces de tension superficielle entre la membrane et le gel remplissant les micropores de la membrane et à assurer simultanément la planéité de la membrane jusqu'à solidification du gel. L'invention repose sur la constatation que le gel, qui est versé sur une face d'une membrane et qui im- prègne cette membrane dans toute son épaisseur, ne s'écoule pas à l'extérieur de la membrane lorsque la face libre de celle-ci n'est pas touchée par un objet solide. Les forces de tension superficielle assurant l'adhérence entre le gel et la membrane sont en effet suffisantes pour empêcher le gel de sourdre sur la face libre de la membrane Cette face libre qui est opposée à celle recou- verte de gel, reste ainsi parfaitement propre. Dans un premier mode de réalisation de l'invention, ce procédé consiste à poser à l'envers sur une surface plane horizontale, le cadre portant la mem- brane, celle-ci se trouvant alors sur le dessus du cadre et à distance de ladite surface plane, et à couler le gel liquide sous la membrane à l'intérieur du cadre jusqu'à ce que la surface libre du gel atteigne un niveau prédé- terminé o le gel est en contact avec la face inférieure de la membrane et la supporte dans un plan horizontal. Dans ces conditions, c'est le gel qui supporte la membrane et assure sa planéité. Le niveau précité atteint par le gel est dé- terminé avantageusement par un orifice de trop-plein, formé par exemple dans des moyens d'amenée du gel à l'intérieur du cadre. On peut ainsi régler de façon précise la posi- tion de ce niveau, correspondant à une bonne planéité de la membrane. Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention consiste à supporter la membrane par un coussin d'air à champ de pression uniforme agissant sur la face libre de la membrane et à couler le gel liquide sur la membrane à l'intérieur du cadre Le champ de pres- sion du coussin d'air est réglé de façon à supporter le poids de la membrane, celui du cadre et celui du gel coulé dans le cadre sur la membrane L'uniformité de ce champ de pression assure une excellente planéité de la membrane Le coussin d'air précité peut être produit au moyen d'une table fluidisée à paroi supérieure poreuse ou micro perforée, alimentée par un débit d'air sous pres- sion. L'invention propose également une plaque de gel pour la séparation et le transfert de macromolécules par électrophorèse, comprenant une couche de gel d'épaisseur constante adhérant à une face d'une membrane microporeuse, caractérisé en ce que la membrane est plane et en ce que le gel remplit les micropores de la membrane sans déborder sur la face libre de la membrane opposée à celle recouverte de gel. Selon une autre caractéristique de l'invention, le gel forme des ménisques concaves dans les pores débouchant sur cette face libre de la membrane. De telles plaques de gel ont des caractéris- tiques identiques d'épaisseur de gel, de planéité de la membrane, d'imprégnation de la membrane par le gel et permettent de réaliser des séparations et des transferts reproductibles et fiables de macromolécules. L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci appa- raîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux des- sins annexés dans lesquels: la figure 1 illustre schématiquement un pre- mier mode de réalisation de l'invention; la figure 2 illustre schématiquement un second mode de réalisation de l'invention; la figure 3 est une vue très schématique à grande échelle, de la face libre d'une membrane dont les micropores sont remplis de gel. On se réfère d'abord à la figure 1, illustrant un premier mode de réalisation de l'invention. Dans cette figure, une membrane microporeuse , par exemple de nitrocellulose, de "nylon", de PVDF ou de papier spécial, est fixée à sa périphérie sur un cadre 12 ayant une hauteur égale à l'épaisseur de la couche de gel que l'on veut former sur la membrane 10 Le cadre est posé à l'envers sur une table de support 14 à surface su- périeure parfaitement plane, de telle sorte que la mem- brane 10 se trouve sur le dessus du cadre et à une dis- tance de la table 14 correspondant à l'épaisseur du cadre. La membrane a une épaisseur de 0,1 à 0,2 mm par exemple, ses pores pouvant avoir une dimension moyenne d'environ 0,5 jim La couche de gel à former sur la membrane a une épaisseur de quelques mm par exemple. Le cadre 12, de forme par exemple rectangu- laire, est à contour continu, sauf en une zone 16 asso- ciée à un conduit extérieur 18 d'amenée de gel liquide. L'extrémité inférieure du conduit 18 est raccordée de fa- çon sensiblement étanche à l'ouverture 16 du cadre 12, tandis que son extrémité supérieure est reliée à des moyens d'alimentation en gel. Une paroi du conduit 12 comporte un orifice 20 de trop-plein, dont le bord inférieur est à un niveau correspondant exactement à celui qui est souhaité pour la face inférieure 22 de la membrane qui doit être recou- verte de gel. Le procédé selon l'invention est des plus simples à mettre en oeuvre. Il suffit de poser le cadre 12 portant la mem- brane 10 sur la table 14 de la façon représentée en fi- gure 1, de raccorder son ouverture 16 à l'extrémité infé- rieure du conduit 18 et de couler le gel, liquéfié par exemple par chauffage à une température de l'ordre de 55.C (quand il s'agit d'agarose), dans le conduit 18 Le gel, très liquide à cette température, remplit alors le cadre 12, sa surface libre montant progressivement à l'intérieur de ce cadre jusqu'à venir au contact de la face inférieure 22 de la membrane et à supporter celle-ci dans un plan parfaitement horizontal Dès que le gel a atteint ce niveau à l'intérieur du cadre 12, l'excédent de gel amené par le conduit 18 s'écoule à l'extérieur par l'orifice de trop-plein 20 Simultanément, le gel im- prègne la membrane 10 et remplit par capillarité les mi- cropores de celle-ci. La planéité de la membrane correspond à la planéité de la surface libre du gel à l'intérieur du cadre 12 et est parfaite. Le positionnement correct de l'orifice de trop-plein 20 permet d'éviter que la membrane soit légèrement incurvée, de façon convexe ou concave et que le gel traverse la membrane pour venir déborder sur la face supérieure 24 de celle-ci. Par ailleurs, les bulles d'air susceptibles d'être emprisonnées sous la membrane sont chassées à l'extérieur de celle-ci au fur et à mesure que le gel remplit par capillarité les micropores de la membrane. Eventuellement, au début de la coulée du gel, à l'intérieur du cadre, on peut incliner la table 14, de telle sorte que le conduit 18 se trouve au point le plus haut de celle-ci, ce qui permet de dégazer le gel amené dans le cadre 12 en laissant s'échapper les bulles d'air vers le haut par le conduit 18. On a représenté en figure 2 une variante de l'invention. Dans cette variante, on utilise un coussin d'air à champ de pression uniforme pour supporter la mem- brane 10 fixée à sa périphérie sur le cadre 12, celui-ci étant alors disposé de telle sorte que la membrane 10 se trouve sous le cadre. Le coussin d'air de sustentation est produit par une table fluidisée 26 d'un type classique, dont la paroi supérieure 28 à face supérieure parfaitement hori- zontale et plane est poreuse ou microperforée pour lais- ser sortir l'air vers le haut comme indiqué par les flèches Cette table est alimentée par une soufflante re- présentée schématiquement en 30, fournissant un flux d'air à débit et pression prédéterminés Les pertes de charge importantes de l'air à la traversée de la paroi 28 assurent une uniformité de la pression s'exerçant sur la face libre 24 de la membrane opposée à la face 22 qui doit recevoir le gel. La paroi 28 est par exemple en matériau fritté, tel que du bronze ou un matériau composite à base de fibres de verre. Lorsque la table 26 est alimentée en air par la soufflante 30, la membrane et son cadre peuvent être disposés au dessus de la surface 28 et sont alors suppor- tés de façon stable par le coussin d'air qui se forme entre la membrane 10 et la surface 28 On coule ensuite le gel liquide à l'intérieur du cadre 12, jusqu'à ce que la couche de gel ait l'épaisseur voulue (qui peut être celle du cadre 12) Le gel imprègne la membrane 10, mais ne sort pas sur la face inférieure 24 de celle-ci et reste à l'intérieur des micropores de la membrane. On peut arrêter l'alimentation de la table 26 en air dès que le gel imprégnant la membrane 10 s'est so- lidifié. Comme dans le mode de réalisation précédent, on obtient des plaques de gel dont les membranes sont parfaitement planes, et dans lesquelles l'épaisseur de la couche de gel est constante Le gel imprégnant la mem- brane a chassé l'air contenu dans les micropores de celle-ci. Les plaques de gel fabriquées selon l'invention présentent dans la majorité des cas la caractéristique suivante, illustrée schématiquement en figure 3: le gel 32 remplit les micropores de la membrane et forme, au débouché de ces micropores sur la face 24 de la membrane opposée à la face recouverte de gel, des mé- nisques concaves 34 en raison des forces de tension su- perficielle entre le gel et la matière de la membrane. REVENDICATIONS 1 Procédé de fabrication d'une plaque de gel pour la séparation et le transfert de macromolécules par électrophorèse, cette plaque comprenant une couche de gel adhérant à une face d'une membrane microporeuse, le procédé consistant à fixer la périphérie de la membrane ( 10) sur un cadre ( 12), à couler le gel à l'état liquide dans le cadre et à le laisser solidifier, caractérisé en ce qu'il consiste, lors de la coulée du gel dans le cadre, à supporter la membrane par un fluide en évitant tout contact solide avec la face libre ( 24) de la membrane op- posée à celle ( 22) recevant le gel, de façon à ne pas mo- difier ou perturber sur cette face libre les forces de tension superficielles entre la membrane et le gel rem- plissant les micropores de la membrane et à assurer si- multanément la planéité de la membrane jusqu'à solidifi- cation du gel. 2 Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il consiste à poser à l'envers, sur une surface plane horizontale ( 14), le cadre ( 12) portant la membrane ( 10), celle-ci se trouvant alors sur le dessus du cadre et à distance de ladite surface plane ( 14), et à couler le gel à l'état liquide sous la membrane à l'intérieur du cadre. 3 Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce qu'il consiste à poursuivre la coulée du gel sous la membrane ( 10) jusqu'à ce que la surface libre du gel atteigne un niveau prédéterminé o le gel est en contact avec la face inférieure ( 22) de la membrane et la supporte dans un plan horizontal. 4 Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que le niveau précité est déterminé par un orifice de trop plein ( 20) formé par exemple dans des moyens ( 18) d'amenée du gel à l'intérieur du cadre ( 12). 5 Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il consiste à supporter la membrane et son cadre par un coussin d'air à champ de pression uniforme agissant sur la face libre de la membrane et à couler le gel liquide sur la membrane à l'intérieur du cadre ( 12). 6 Procédé selon la revendication 5, caracté- risé en ce qu'il consiste à produire le coussin d'air au moyen d'une table fluidisée ( 26) à paroi supérieure po- reuse ou microperforée ( 28) ayant une face supérieure plane et horizontale, alimentée par un débit d'air sous pression.10 7 Plaque de gel pour la séparation et le transfert de macromolécules par électrophorèse, compre- nant une couche de gel d'épaisseur constante adhérant à une face d'une membrane microporeuse, caractérisée en ce que la membrane ( 24) est plane et en ce que le gel rem- plit les micropores de la membrane sans déborder sur la face libre ( 24) de la membrane opposée à celle ( 22) re- couverte de gel. 8 Plaque de gel selon la revendication 7, ca- ractérisée en ce que le gel ( 32) forme des ménisques concaves ( 34) dans les pores débouchant sur ladite face libre ( 24) de la membrane.