Brevet FR2669538A1 — publié le 19920529

La présente invention concerne l'utilisation d'Immunoglobulines administrées localement dans le traitement des infections épithéliales. Les infections épithéliales sont causées par des agents bactériens ou viraux, pathogènes ou opportunistes, capables de proliférer in situ, durant les étapes précoces de l'infection. Cette phase de colonisation des tissus-cibles peut se compliquer ou non de lésions proximales ou de dissémination. Cette phase de l'infection est en outre, la plus dangereuse pour la transmission d'hôte infecté à hôte réceptif, et détermine ainsi le déclenchement d'épidémies. L'induction du mécanisme déclenchant de ces infections est le fait d'interactions moléculaires, entre d'une part, des factures d'adhésion de l'agent pathogène et, d'autre part, des recepteurs exprimés à la surface des cellules de l'hôte. Tout élément inhibant cette interaction primaire immunise sur le déclenchement de l'infection. Les infections épithéliales se manifestent anatomiquement pour tous les tissus de revêtement de l'organisme. Les épithéliums muqueux sont des sites d'infections plus ou moins spécifiques selon leur fonction et selon la flore saprophyte. Chez l'hôte immuno-compétent, les défensess contre ces infections sont assurées par des immunoglobulines à fonction anticorps, secrétées in situ (IgAs, IgG, IgM). Chez l'hôte immunodéficient ou immuno-immature (cas des jeunes enfants),, ces effecteurs sont absents ou non fonctionnels. Sur le plan épidémiologique, les infections respiratoires de l'enfant constituent un bon exemple de cette condition. Leur incidence décroissante avec l'âge est en corrélation avec une maturation du système immunitaire et l'acquisition d'une immunité naturelle spécifique. Chez l'adulte sain, les formations lymphoïdes associées aux épithéliums secrètent des anticorps locaux neutralisant une variété d'agent infectieux contre lesquels l'organisme est immunisé. Ces spécificités-anticorps locales sont également présentes dans le plasma des adultes cliniquement sains. Ceux-ci constituent la population sélectionnée des donneurs de plasma. L'objet de la présente invention est notamment l'utilisation des anticorps purifiés du plasma de donneurs adultes sains pour prévenir et traiter par voie locale les infections épithéliales et notamment les principales infections bactériennes respiratoires et ORL de l'enfant. Celles-ci sont majoritairement provoquées par Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae et Hemophilus influenzae. Selon les sources mondiales (WHO memorandum, Bull World, Hlth Org. 1984, 62:47), les infections respiratoires aigues constituent une cause majeure de mortalité infantile. L'incidence globale des infections respiratoires contribue, selon les pays, à 20% à 40% des motifs de consultation en pédiatrie et à 12-35% des motifs d'hospitalisation. Le caractère multifactoriel de ces infections rend difficilement concevables des vaccinations spécifiques. Les traitements anti-microbiens sont largement appliqués (béta-lactamines et macrolides, par exemple) mais ils posent de plus en plus le problème de la sélection/induction et donc de l'émergence de variants résistants. Des immunostimulants à base d'extraits d'antigènes bactériens se révèlent efficaces. Mais le besoin d'une immunothérapie supplétive qui permette de conférer une protection immédiate, sans solliciter l'arsenal des cellules immunocompétentes dans son ensemble et cç quelle que soit la compétence ou maturité immunitaire du patient, reste non couvert. Les Ig polyvalentes, purifiées du plasma de donneurs adultes sains, sont largement et efficacement employées par voie parentérale (IM ouIV) contre les déficits immunitaires. Cependant, l'administration parentérale ne semble pas garantir le passage des anticorps seriques vers le compartiment épithélial (Abraham, SN and Beachey, EH, in Advances in Host Defense Mechanisms, 1985, 4:63). C'est pourquoi, la présente invention concerne l'application locale de tels anticorps. Plus particulièrement la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un effecteur parmi les immunoglobulines polyvalentes ou spécifiques, leur fragment Fab'2 ou Fab et les constructions incorporant ces éléments pour la réalisation de compositions pharmaceutiques applicables par voie topique pour le traitement des infections épithéliales. De façon générale, on préférera utiliser des immunoglobulines polyclonales ou monoclonales ou un fragment de ces immunoglobulines notamment celles d'origine plasmatique. Toutefois, il doit être compris qu'il est possible d'utiliser des Ig spécifiques. En particulier, il est possible pour le traitement topique d'une affection particulière de sélectionner des donneurs possédant des taux élevés d'Ig spécifiques contre l'antigène en cause. Les immunoglobulines utilisées sont plus particulièrement des immunoglobulines polyvalentes ou leurs fragments, notamment les produits d'origine plasmatique humaine. Ces produits existent déjà pour l'injection, ils sont donc directement utilisables pour des administrations topiques notamment au niveau des voies respiratoires. La forme d'administration préférée est l'administration par voie nasale, mais on peut envisager des aérosols oro-pharyngés. La mise en forme galénique des formes topiques internes est connue aussi bien pour les aérosols que pour les formes goutte par exemple. Ainsi on pourra adjoindre aux effecteurs, des composants améliorant leur contact avec les épithéliums à traiter, notamment des produits de type tensio-actifs. Les compositions selon la présente invention peuvent être utilisées aussi bien à titre préventif qu'à titre curatif et plus particulièrement pour le traitement des infections bactériennes respiratoires et ORL de l'enfant, et de façon générale chez les sujets présentant des déficiences immuni tares. Les immuglobulines polyvalentes sont particulièrement utiles dans le traitement des injections bactériennes à Staphylocoque, et à Streptocoque, comme cela sera démontré dans les exemples. Les exemples suivants ont notamment pour objet de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de l'invention notamment par administration locale d'Ig polyvalentes à titre préventif ou curatif pour neutraliser l'infection pulmonaire par Staphylococcus aureaus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes et Hemophilus influenzae. Sur les figures ci-annexées: - la figure 1 schématise la cinétique d'élimination de la souche de S. aureus Cowan III, après instillations nasales chez des souris normales et traitées au CY. - La figure 2 schématise les effets comparés par rapport à un groupe témoins de l'administration des GVP par voie I.V. et I.N. - la figure 3 schématise les essais GVP H+3, souche 184-15. - la figure 4 schématise les essais GVP H+18, souche Cowan III. - la figure 5 schématise les essais GVP H-l, souche Cowan III. - la figure 6 schématise les essais (GVP-PA), souche Cowan III. MATERIELS ET METHODES Animaux On utilise des souris Balb/c femelles agées de 4 semaines, provenant de l'élevage du CERJ (Le Genest St Isle 53940). Elles sont groupées par lots de 3 ou 6, dans des conditions stériles : litière composée de copeaux stériles, eau et aliments stériles, cages recouvertes de capes filtrantes (fournisseur UAR : cages Techniplast type 2C code 1264C0-000 : capes filtrantes code 1264C0-401 ; granulés réf RO-340 copeaux réf 40). L'animalerie, maintenue en dépression par rapport à l'air ambiant, est entreposée dans un laboratoire type P3. Pour les infections expérimentales par instillation nasale, elles sont légèrement anesthésiées à l'éther ; elles sont sacrifiées par injection intrapéritonéale de 200 ul chacune de pentobarbital sodique (Sanofi) au moment de prélever les poumons. Souches bactériennes - Staphylococcus aureus 184-15 isolée d'un malade atteint de pneumonie, - Staphylococcus aureus CIP 82/03, létale pour la souris par voie intrapéritonéale, - Staphylococcus aureux Cowan III CCM 885 CIP 65/8, ATCC 12600, - Streptococcus pyogenes groupe A CIP 56/48, ATCC 12203, - Streptococcus pyogenes groupe A CIP 56/41, ATCC 12344, - Streptococcus pneumoniae référence Pn 40, laboratoire des Strepto coques, Institut Pasteur T. Horaud, - Haemophilus influenzae CIP 54/81, ATCC 9006. Conditions de préparation de l'inoculum infectieux Les souches de staphylocoques Ces bactéries sont cultivées en bouillon trypticase soja (DIFCO) ; une culture de densité suffisante est obtenue après une nuit à 370C, sous agitation régulière de 100 tours/min. La souche 82/03 a été "passée sur souris" après injection intrapéritoniale, puis ré-isolement sur gélose au sang, à partir de prélèvements de poumons ou de rate, afin d'augmenter sa virulence. Elle a été à nouveau éprouvée dans le cas d'inoculation par voie nasale, puis par aérosol. Les souches de streptocoques Afin d'obtenir une suspension bactérienne concentrée, 5 géloses enrichies avec 10% de sang stérile de cheval (Diagnostics Pasteur) sont ensemencées et incubées à 37"C pendant une nuit. Le lendemain les boîtes sont raclées avec une tige cotonnée stérile, et les bactéries ainsi prélevées sont mises en suspension dans 4 ml de tampon PBS stérile. La composition de ce soluté aqueux est la suivante : NaCI : 0,15 M ; KCI 2,7 x 10 3 ; KH2PO4 : 1,4 x 10 M ; Na2HPO4 : 9 x 3 M. La souche d'Haemophilus influenzae La suspension bactérienne de cette souche est obtenue de la même façon que précédemment, mais après culture de 48 heures sur gélose à l'extrait globulaire 10% (Diagnostics Pasteur). Méthodes de mesure des cinétiques infectieuses Les prélèvements de poumons A différents temps après instillations, les poumons des souris (par groupes de 3 à 6) sont prélevés stérilement et broyés dans 1 ml de tampon PBS. Les prélèvements sont effectués 1 heure, 3 heures, 6 heures, 24 heures, 48 heures, 72 heures et jusqu'à élimination complète des bactéries, chez les animaux traités. Les numérations de bactéries L'inoculum et les broyats sont dilués de 10 en 10 dans du tampon PBS ; 100 ul des trois ou quatre dernières dilutions sont étalés sur milieu trypticase - soja. L'incubation se fait pendant 18 à 48 heures à 37 selon la souche; après quoi le comptage des colonies est effectué. Calcul du nombre d'unités formant colonie (U.F.C.) - Soit N le nombre de colonies sur la boîte, - soit d la dilution, - la concentration bactérienne C par ml (ou par poumon de souris) s'établit comme suit C = N x l/d x 10 C'est exprimé en long10. Pour tous les points de la cinétique, la moyenne et la déviation standard sont calculées. Les résultats obtenus sont représentés graphiquement : log 10 UFC/ml = f (temps). L'immunodépression par le cyclophosphamide Afin d'obtenir des cinétiques de prolifération bactérienne durables, nous avons injecté par voie intraveineuse 500ul d'une solution de cyclophospfiamide (CY) à 200 mg/Kg (Aldrich). Le cyclophosphamide agit comme un immunodépresseur diminuant les leucoytes totaux avec une activité cytotoxique sur les cellules B et T. I1 empêche notamment les cellules B de régénérer à un rythme normal leurs immunoglobulines de surface. (In Immunologie fondamentale et appliquée, ROITT I.M., et coll. ed. 1985 MEDSI, Paris, pp 12,8). Pour contrôler l'efficacité de ce produit, des formules sanguines ont été effectuées tous les jours pendant 10 jours. Les bactéries sont administrées par instillation le 3ème jour après l'injection de cyclophosphamide. Traitement par Ig Les immunoglobulines polyvalentes du CNTS (GVP) lot n" 505 ont été administrées soit par voie veineuse (IV) soit par voie intranasale (IN) aux doses de 1 et 10 ug par souris, sous un volume de 50 ul. Pouvoir neutralisant des Ig in vitro Le pouvoir antibactérien des GVP a été évalué, dans le cas de Staphylococcus aureus (souche Cowan III) dans une épreuve d'inhibition de croissance en milieu liquide pendant 18 heures. Dans ces conditions et en absence de complément, l'inhibition est supérieure à 90%. RESULTATS DES TRAITEMENTS PAR GVP Afin de conférer une haute significativité aux effets mesurés, les épreuves sont réalisées chez des souris immunodéprimées par injection de cyclophosphamide (CY) à la dose de 200 mg/Kg, trois jours avant l'infection. 5 à 10x107 UFC de Staphylococcus aureus provoquent une infection prolongée au-delà de 96 h avec création d'une pneumonie massive dont les lésions sont macroscopiquement visibles dès 24 h. Une cinétique-type est présentée en figure 1. L'installation i.n de 1 pg de GVP par souris, 3 h après induction (GVP IN H+3)de l'infection est aussi efficace que l'administration iv de 10 ,ug (GVP 10 llg/iv) (figure 2). Comme le montre la figure 3, l'instillation de 1 ug de GVP est également efficace contre une souche de Staphylococcus aureus fraîchement isolée d'un malade, la souche 184-15. Le traitement de la pneumonie à Staphylococcus aureus est efficace même à une phase avancée de l'infection. Comme le montre la figure 4, l'instillation in de 1 ug de GVP, 18 h après l'induction de l'infection, diminue de 10 fois le nombre de bactéries pulmonaires, à 48 à 72 h. I1 est possible de prévenir le développement d'une infection pulmonaire par S. aureus par instillation in de 1 ug de GVP. Comme le montre la figure 5, l'administration topique des GVP 1 h avant l'infection exerce un effet inhibiteur contre l'infection bactérienne et permet d'en accélerer la guérison. Nous avons vérifié que l'activité neutralisante des GVP contre S. aureus n'est pas due à une interaction du fragment F c des Ig avec la protéine A. Comme le montre la figure 6, la saturation de la préparation de GVP par la protéine A de S. aureus (protéine A, Sigma) à la concentration finale de 1%, ne modifie pas son pouvoir immmunoprotecteur (les animaux ne recevant que la solution de protéine A). L'effet anti-bactérien des GVP administrées par voie locale est également démontrable dans l'infection respiratoire des souris par S. pneumoniae et S. pyogenes (tableau 1), bien que dans ce dernier cas l'effet neutralisant soit apparent à 48 h au lieu de 24 h dans les exemples précédents. En résumé, les préparations d'immunoglobulines plasmatiques humaines injectables, dont l'efficacité clinique est démontrée de longue date, peuvent être utilisées en tant qu'anticorps locaux pour traiter et prévenir des infections épithéliales chez le patient immunodéficient ou immuno-immature. TABLEAU I Effets neutralisants des GVP administrées par voie nasale, à la dose de 1 g (100/Kg) et à 3h après l'injection intranasale de S. pneumoniae ou S. pyogenes. inoculum infectleux No UFC / poumons (log10) 24h 48h Témoins Traités Témoins Traités S. pneumoniae Pn 40 * expérience 1 inoculum 7.7 6.75+/-0.25 4.65+/-0.60 ND* ND* * expérience 1 inoculum 5.0 5.20+/-0.40 4.40 5.0+/-1.1 4.38 S.pyrogenes 56.81 inoculum 8.3 4.90+/-0.40 5.50+/-0.60 5.50+/-0.40 4.0 *ND = donée non nesurée REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un effecteur parmi les immunoglobulines polyvalentes ou spécifiques, polyclonales ou monoclonales leur fragment Fab'2 ou Fab et les constructions incorporant ces éléments pour la réalisation de compositions pharmaceutiques préventives ou curatives applicables par voie topique pour le traitement des infections épithéliales. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les immunoglobulines utilisées sont des immunoglobulines polyvalentes ou leurs fragments. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que les immunoglobulines utilisées sont des immunoglobulines polyvalentes d'origine plasmatique humaine ou leurs fragments. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'infection épithéliale traitée est une infection bactérienne respiratoire et ORL de l'enfant. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les effecteurs sont utilisés sous la forme administrable par voie nasale. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les effecteurs sont utilisés sous forme d'aérosol.