Brevet FR2664613A1 — publié le 19920117

La présente invention se rapporte à une séquence peptidique immunogène d'Echinococcus gra- nulosus, une séquence d'ADN codant pour cette séquence peptidique ainsi que les applications diagnostiques et thérapeutiques de la séquence peptidique. L'hydatidose ou échinococcose uniloculaire est une maladie parasitaire due au développement chez l'homme ainsi que le bétail de la forme larvaire d'un petit cestode, Echinococcus sranulosus. Le chien représente le réservoir du parasite adulte. Cette parasitose est un véritable fléau dans les pays d'élevage en Afrique, en Amérique Latine et en Australie ainsi que les pays du pourtour du bassin méditerranéen où existent des répercussions économiques à la fois dans le domaine médical et vétérinaire. Si aujourd'hui l'on ne dispose pratiquement pas de test de diagnostic pour l'animal, le diagnostic médical est souvent délicat à cause de la non spécificité des symptômes observés.En revanche, plusieurs méthodes immunologiques classiques tel l'hémagglutination et la réaction de fixation du complément ont été pratiquées pour le dépistage de l'hydatidose. Le liquide hydatique, utilisé comme source d'antigènes, contient en plus des produits de métabolisme du parasite communs à d'autres helminthes1 plusieurs composants de l'hôte (CAPRON A. et al (1), RUSSI S. et al (2), BEN-ISMAEL R. et al (3). Cela pose le problème des réactions faussement positives. Cependant, il a été montré par la technique d'immunoélectrophorèse, la présence presque constante d'anticorps précipitant un antigène désigné antigène 5 (CAPRON A. et al (4) et (5)). Depuis, ce test demeure l'un des meilleurs tests immunologiques de référence pour toute étude épidémiologique de l'hydatidose. L'antigène 5, très immunogène, a fait l'objet de plusieurs travaux montrant qu'il s'agit d'une lipoprotéine capable de se fixer à la concanavaline A, thermolabile, de masse moléculaire relative d'environ 60 kDa (ORIOL R. et al (6), BOUT D. et al (7), PIANTELLI M. (8)). Analysé dans des conditions réductrices, cet antigène se dissocie en deux sous-unités de 37 et 22 Dka. En utilisant des techniques plus sensibles telles que l'ELISA, les potentialités diagnostiques de l'antigène 5 purifié ont été largement confirmées.Des anticorps anti antigène 5 ont été aussi détectés dans des sérums de patients ou d'animaux infectés par E. multilocularis ou par d'autres cestodes tels que Taenia hydatiqena, T. ovis et T. solium. Cependant leur taux reste faible. Ces quelques réactions faussement positives observées ont été attribuées en partie à la présence d'un épitope phosphorylcholine sur l'antigène 5. Le problème actuel est de pouvoir disposer d'antigènes parasitaires spécifiques, bien standardisés et en quantité suffisante pour les tests de diagnostic. C'est dans cette optique que les travaux actuellement menés sur l'hydatidose et qui sont basés sur les techniques des anticorps monoclonaux et de génie génétique cherchent à isoler et à identifier des composants parasitaires possédant un fort degré de spécificité. La présente invention a pour but de fournir un antigène parasitaire spécifique de l'hydatidose. Les inventeurs ont caractérisé un anticorps monoclonal d'isotype IgG1 désigné EG 02 154/12 dirigé contre un épitope protéique porté par l'antigène 5, et spécifique d'E. Granulosus. Cet anticorps monoclonal a permis d'isoler dans une banque d'ADN complémentaire obtenue à partir d'ARNm de protoscolex d'E. Granulosus des clones dé signés Eg 6 et Eg 14 correspondant à des séquences peptidiques qui se sont avérées être reconnues par l'anticorps monoclonal EG 02 154/12. La présente invention a, par conséquent, pour objet une séquence peptidique immunogène de l'antigène 5 d'Echinococcus sranulosus caractérisée en ce qu'elle est reconnue à la fois par des sérums de patients atteints d'hydatidose et par un anticorps monoclonal d'isotype IgG1 produit par l'hybridome EG 02 154/12 déposé à la CNCM le 25 juin 1990 sous le n 1-957. La présente invention a également pour objet une séquence d'ADN comprenant la séquence nucléotidique désignée Eg 6, La présente invention a également pour objet la séquence peptidique immunogène de l'antigène 5 d'E. Granulosus désignée séquence peptidique Eg 6 codée par la séquence nucléotidique ci-dessus comprenant tout ou partie de la séquence GluPhevalAsplleAsnlleAlaSerLysvalAlaAspAlapheGlnLysAsnLysGlu Lys IleThrThrThrAspLysLeuGlyThrAlaLeuGluGlnVallaSerGlnSerGlu LysAlaAlaProGlnLeuSerLysMETLeuThrGluAlaSerAspvalHisGlnArgMET AlaThrAlaArgLysAsnPheAsnSerGluValAsnThrThrPheIleGluAspLeuLys AsnPheLeuAsnThrThrLeuSerGluAlaGlnLysAlaLysThrLysLeuGluGluVal ArgLeuAspLeuAspSerAspLysThrLysLeuLysAsnAlaLysThrAlaGluGlnLys AlaLysTrpGluAlaGluValArgLysAspGluSerAspPheAspArgvalHisGlnGlu SerLeuThrIlePheGluLysThrCysLysGluPhe ainsi que les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs amino-acides et qui possèdent une activité immunogène analogue. A partir de la séquence du clone Eg 6, on peut envisager la synthèse de 13 peptides dont les séquences correspondent respectivement aux aminoacides 1 à 25, 12 à 34, 22 à 44, 35 à 48, 41 à 63, 46 à 65, 60 à 91, 66 à 96, 89 à 122, 93 à 115, 98 à 129, 118 à 152 et 130 à 152 et sont les suivantes EFVDINIASKVADAFQKNKEKITTT ADAFQKNKEKITTTDKLGTALEQ ITTTDKLGTALEQVASQSEKAAP VASQSEKAAP QLSK KAApQLSKMLTEASDVHQRMTA LSKMLTEASDVHQRMATARK MATARKNFNSEVNTTF IEDLKNFLNTTLSEAQ NFNSEVNTTFIEDLKNFLNTTLSEAQKAKTK EAQKAKTKLEEVRLDLDSDKTKLKNAKTAEQKAK AKTRLEEVRLDLDSDKTKLI(NAK EEVRLDLDSDKTKLKNAKTAEQKAKWEAEVRK EQKAKWEAEVRKDESDFDRVHQESLTIFEKTCKEF KDESDFDRVHQESLTIFEKTCKEF On préfère en particulier la séquence 89 à 122 EAQKAKTKLEEVRLDLDSDKTKLKNAKTAEQKAK qui est particulièrement intéressante car elle présen te une forte homologie au niveau de la structure secondaire (hélice a) avec la séquence peptidique obtenue à partir d'un clone Eg 14 sélectionné à partir de la banque d'ADNc de E. Granulosus, dont la séquence nucléotidique est la suivante 10 20 30 40 GAA TTC ATT CGA AAG TAT GAC AAG GGC AAT Ah-A GGC AAG ATC AAC 50 60 70 80 90 TTG GAA GAG TTG ACT GCT ATG CTC GAC AGT GTT CAT AGA AAA ACC 100 110 120 130 AGT AGA GCC TCA ATG AGC CGA TGA AGC ATT TAA AAT TAT GAG AIT Un autre objet de l'invention est également une séquence d'ADN comprenant la séquence du clone Eg14, ci-dessus. L'invention a également pour objet la sé quence peptidique immunogène de l'antigène 5 d'E. Granulosus codée par Eg14 comprenant tout ou partie de la séquence E F I R K Y D K G N K G K I N L E E L T A M L D S V H R K T S R A S M S R ainsi que les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs amino-acides et qui possèdent une activité immunogène analogue. Dans la présente invention les inventeurs ont tout d'abord obtenu un ADN complémentaire Eg 6 par les opérations suivantes - extraction de l'ARN des protoscolex d'E. Granulosus I - obtention de l'ADN complémentaire simple brin à partir de l'ARN messager, puis de l'ADN com plémentaire double-brin, - insertion dans un vecteur tel que le bactériophage agit11, - criblage de la banque et sélection de clones recombinants positifs, - transfert de l'ADNc sélectionné dans un vecteur phagique pour l'amplifier, le purifier et en réaliser le séquençage. Les séquences peptidiques selon l'invention peuvent être obtenues par synthèse peptidique classique ou par application de techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'invention dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression. La présente invention a donc également pour objet des plasmides et des vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'invention ainsi que des hôtes transformés avec ce vecteur. La présente invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro de l'hydatidose chez l'homme ou chez l'animal, par mise en évidence des anticorps dirigés contre une séquence peptidique immunogène telle que définie précédemment, dans un prélèvement biologique de l'homme ou de l'animal dans lequel on met en contact la ou les séquences peptidiques immunogènes avec le prélèvement biologique de l'homme ou de l'animal pouvant contenir lesdits anticorps et on révèle la présence des anticorps fixés. Ce procédé peut être basé sur une méthode radioimmunologique de type RIA, RIPA ou IRMA ou une méthode immunoenzymatique de type WESTERN-BLOT sur bandelettes ou de type ELISA. La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic in vitro de l'hydatidose pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus mentionné, comprenant au moins une séquence peptidique immunogène telle que décrite précédemment, et contenant en outre un anticorps spécifique d'un isotype d'immunoglobuline. La présente invention a également pour objet un vaccin destiné au traitement et à la prévention de l'hydatidose chez l'homme ou l'animal dans lequel l'agent vaccinant consiste en une séquence peptidique immunogène telle que définie précédemment. Outre la séquence peptidique immunogène, le vaccin peut contenir un adjuvant doué de propriétés immunostimulantes. Parmi les adjuvants que l'on peut utiliser figurent les sels minéraux tels que l'hydroxyde d'aluminium, des composés hydrophobes ou des surfactants tels que l'adjuvant incomplet de Freund, le squalane ou des liposomes, des polynucléotides synthétiques, des microorganismes ou composants de microorganismes tels que le murabutide, des molécules artificielles synthétiques telles que l'imuthiol ou le levamisole, ou encore des cytokines telles que les interférons , ss, X ou les interleukines. L'invention a en outre pour objet un anticorps monoclonal dirigé contre une séquence peptidique immunogène telle que définie précédemment. Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être préparés selon une technique classique. A cet effet, les polypeptides peuvent êtr couplés si nécessaire à un agent immunogène, tel que l'anatoxine tétanique, par un agent de couplage tel que le glutaraldéhyde, un carbodiimide ou la benzidine bis diazotée. On préfère, en particulier, l'anticorps monoclonal de la sous-classe Ig G1 obtenu à partir de l'hybridome EG 02 154/12 déposé à la CNCM le 25 juin 1990 sous le n 1-957 qui constitue également un objet de l'invention. On décrira ci-après plus en détail - l'obtention de l'anticorps EG 02 154/12 - l'obtention de l'ADNc Eg 6 et de l'ADNc Eg 14 codant pour les séquences peptidiques selon l'invention. I/ Préparation des anticorps monoclonaux EG 02 154/12 Des souris BALB/C ont été immunisées par voie intrapéritonéale avec 100 pg d'une préparation antigénique (SHFAg) obtenue en ponctionnant aseptiquement des liquides hydatiques de mouton à partir de kystes hydatiques prélevés dans le foie et les poumons de l'animal qui ont été assemblés, ultracentrifugés à 40 000 tr/mn puis lyophilisés et repris dans de l'adjuvant de Freund complet (v/v). Deux semaines après la dernière injection, une injection de rappel a été faite chez les souris avec 100 ug de la préparation antigênique 511F Ag en solution saline. Après 3 jours, les cellules de rate ont été récoltées, puis fusionnées avec des cellules de myélome SP 2/0 à un rapport de 1/5 dans du polyéthylène glycol (PEG 1500) selon la technique décrite par GALFRE et al (9). Les cellules ont été distribuées dans des puits sur des plaques de microculture et les cellules fusionnées sélectionnées dans un milieu HAT (Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine). Les surnageants de culture de chaque puits montrant une croissance dense de cellules hybrides ont été testés pour la présence d'anticorps dirigé contre la préparation antigénique SHF Ag, par une méthode ELISA. Parmi plusieurs anticorps monoclonaux réagissant positivement aux test ELISA avec la prépara tion antigénique SFH Ag, on a choisi une lignée cellulaire hybride (EG 02 154/12) produisant des anticorps de la sous-classe des Ig G1. Contrairement au sérum de lapin dirigé contre une préparation antigé nique SHF totale, l'anticorps monoclonal @G 02154@@@ montrait, en immunoélectrophorèse une ligne de préci pitation unique correspondant à l'antigène 5 tel que défini à partir de sérums hydatidiques humains de patients infectés par E granulosus. Aucune précipitation n'a été observée avec les antigènes de liquide de kystes d'E. multilocularis. Les puits positifs ont été clonés par dilution limitante. Des liquides ascitiques de souris additionnés de cellules d'hybridome ont été fractionnés par précipitation au sulfate d'ammonium suivie d'une filtration sur gel de Trisacryl GF OS (LKB, Suède). Les anticorps inonoclonaux ont été purifiés par chro- matographie d'échange d'ions sur DEAE-Tr:tsacryl (LKB, Suède) et dialysés contre 10 mM de solution saline de tampon phosphate (PBS). II/ Obtention de l'ADN complémentaire 1. Obtention des sérums I,es serums de patients ont été soumis aux tests classiques dtimmunodiagnostic de l'échinococcose: immunoélectrophorèse (IEP) et test d'hémagglutination. Ils sont caractérisés vis-à-vis d'E.granulosus et d'E. multilocularis. La présence de l'arc 5 en IEP est déterminante pour le diagnostic d'infection à E.granulosus. Le diagnostic est par ailleurs confirmé par examen médical et intervention chirurgicale et/ou traitement thérapeutique. 2. Préparation des parasites Le matériel parasitaire est récolté chez le mouton. Les kystes hydatiques sont prélévés dans le foie ou les poumons de l'animal et ponctionnés aseptiquement. Les protoscolex sont préparés par décantation du liquide recueilli. Le culot de sédimentation est repris, lavé plusieurs fois avec du liquide physiologique. Les scolex sont à chaque fois récupérés après sédimentation. Ils sont ensuite directement congelés dans un volume minimum d'azote liquide. 3. Extraction de l'ARN des protoscolex d'E.sranulosus L'ARN total est extrait des larves parasitaires selon un protocole modifié de la technique de CHIRGWIN J. et al (10). Les préparations de protoscolex d'E.sranulosus stockées dans l'azote liquide sont broyées manuellement avant d'être reprises dans une solution de thiocyanate de guanidium 4,2 M, Nlauroyl sarcosine 2%, EDTA pH8-10mM, 2-mercaptoéthanol 5% et acétate de sodium pH 4,5-20mM. Cette préparation est homogénéisée (Ultraturax) avant d'être soniquée et centrifugée à 10 000 tr/mn durant 20 mn (Sorvall-rotor HB-4). Le surnageant est ensuite déposé sur un coussin de 2 ml d'une solution de chlorure de césium (CsCl, densité = 1,72, EDTA pH8-lOmM, acétate de sodium pH 5,5-50mM).Les tubes sont centrifugés durant 20 heures à 20-C, à 28 000 tr/mn (Beckman- rotor SW41). Le culot d'ARN est ensuite repris dans de l'eau et précipité à l'éthanol absolu à -20C. 4. Préparation de la banque d'ADNc en vecteur magique lambda gtîî A partir de 300 pg d'ARN total extrait des protoscolex d'E.granulosus, on synthétise le brin d'ADN complémentaire par l'action de la transcriptase reverse grâce à une amorce oligo-dT. L'ARN est ensuite attaquée par la ribonucléase H qui le perfore. Les morceaux d'ARN restants servent ensuite d'initiateurs à l'action de l'ADN polymérase I d'E. coli qui synthétise ainsi le second brin de l'ADNc. L'utilisation en phase finale de la T4 Al)N polymérase permet de digérer les parties encore simple brin afin de créer un ADN complémentaire à bouts francs. le protocole et les réactifs nécessaires à la synthèse de l'ADNc sont fournis par Amersham International (kit "cDNA synthesis system") ainsi que les enzymes pour le clonage en vecteur phagique.Les sites EcoRI de l'ADNc sont ensuite protégés par méthylation à l'aide de l'action de l'EcoRI méthylase. Des octanucléotides de synthèse double brin déphosphorylés (Amersham International) de séquence 5'-GGAATTCC-3' sont attachés aux extrémités franches de l'ADNc à l'aide de l'ADN ligase de T4. Les sites EcoRI des segments de liaison sont ensuite libérés par digestion par EcoRI. L'exc de segments de liaison est éliminé par chromatographie sur colonne (Amersham International) . L 'ADNc ainsi préparé est intégré dans le site EcoRI du phage agit11 (YOUNG R. et DAVIS R. (11)) commercialisé par Promega Biotec sous la forme digérée par EcoRI et déphosphorylée.Après ligation, les phages sont encapsidés in vitro (système Packagen in vitro packaging system" - Promega Biotec). La banque est ensuite testée par inoculation de Ja souche E. Coli Y1090 comme décrit par YOUNG R. et DAVIS R. (12). 5. Criblage de la banque et sélection de clones recombinants positifs Un échantillon de cette banque en gtîî est inoculé sur la souche E. Coli Y1090 à une concentration de 5.1V3 à 8.10 ufp (unités formatrices de plaques)/boite de Pétri (90 mm de diamètre). L'expression de la protéine est sous le contrôle du promoteur lac et peut être induite par addition d'IPTG (Isopro pyl-ss-D-thiogalactopyranoside). L'IPTG est ajouté en plaçant sur les boîtes de Pétri, des filtres de nitrocellulose (Schleicher and Schuell) imprégnés d'IPTG 10 mM.Les protéines synthétisées sont adsorbées sur le filtre qui est ensuite incubé avec un mélange de 5 sérums de patients infestés par E.sranulosus, destiné au criblage de la banque, à une dilution de 1/100 (à 4"C pendant une nuit) en tampon PBS (Phosphate Buffer Saline : Na2HP04 1OmM, NaH2P04 10mu1 NaCl 150mM). Les sérums furent choisis en fonction de leurs caractéristiques immunoélectrophorétiques (de 3 à 6 arcs dont l'arc 5 en IEP classique). Les filtres sont ensuite lavés et les anticorps fixés sont reconnus par un second anticorps anti-immunoglobuline humaine (anti-IgG, A, M) marqué à la péroxidase (Pasteur Production - 1/500) et révélé par le réactif 4-chloro-1naphtol (Bio Rad). Sur les 1,5.106 recombinants constituant la 5 banque, environ 5.10 phages ont été testés : 13 clo- nes synthétisant une protéine ou une fraction de protéine portant des épitopes reconnus par le mélange de sérums de patients ont été sélectionnés. L'analyse électrophorétique en gel d'agarose a permis de mettre en évidence la taille des inserts d'ADNc pour chacun d'eux : clone 1 : un insert de 130 pb, clone 2 : 138 pb, clone 3 : 216 pb et pour les dix autres clones un insert de 456 pb. Un second criblage de la banque a permis d'isoler un 14ème clone (Eg14) synthétisant une protéine ou une fraction de protéine contenant des épitopes reconnus par l'anticorps monoclonal EG 02152/14. L'analyse électrophorétique en gel d'agarose a montré que l'insert d'ADNc comportait 135 bp. 6. Test d'hybridation Après clonage dans le site EcoRI du vecteur M13mp18, l'insert ADNc du clone 6(Eg 6 -456 pb) a été purifié et utilisé comme sonde lors d'un test d'hybridation. Afin d'éviter tout problème de bruit de fond, l'insert d'ADNc utilisé comme sonde a été préalablement intégré dans le site EcoRI du vecteur M13mp18, puis purifié à partir d'un clone recombinant M13. La sonde (60-80ng) a été préparée et marquée à l'aide de 32PdCTP en utilisant la technique de FEINBERG et VOGELSTEIN (13). Les clones ont été cultivés et déposés sur la même boite de Pétri sous forme de goutte individualisant chacun d'entre eux. L'ADN a ensuite été adsorbé sur nitrocellulose directement à partir des plages de lyse et préparé selon le protocole de MASON et WILLIAMS (14). L'hybridation a été réalisée selon les conditions décrites par WAHL et al (15), à 42 C en utilisant 5.107 cpm de la sonde considérée. Les lavages ont été effectués dans des conditions de forte stringence à 65-C en tampon 0,1 x SSC, 0,1% SDS (SSC x 20 NaCl 3M, Na3citrate 2H20, ajusté à pH7), ceci afin de rechercher les homologies les plus strictes. Aucun signal n'a été mis en évidence vis-àvis des clones 1, 2 et 3, suggérant que ces derniers possèdent une séquence différente de l'insert 6. Par contre, les clones 4 à 13 apparaissent s'hybrider avec la sonde considérée suggérant des séquences similaires. Une analyse des séquences nucléotidiques a par ailleurs confirmé la stricte identité des clones 4 à 13. 7. Détermination de la séquence nucléotidique et protéique correspondante L'ADN magique total des clones est préparé selon la technique décrite par MANIATIS T. et al (16), puis digéré par EcoRI et analysé par électrophorèse sur gel d'agarose "low melting". Les inserts d'ADNc sont extraits par la technique du phénol chaud. Ils sont ensuite intégrés en vecteur phagique M13mp18 (Amersham International). Après transformation de la souche E.coli TG1, les matrices monobrins des vecteurs recombinants sont préparées. La techique de séquençage est basée sur le principe de la terminaison des chaines par des didéoxynucléotides comme décrit par SANGER F. et al (17) et en utilisant des amorces photoluminescentes (Applied Biosystems).La fluorescence des fragments d'ADN est détectée par le séquenceur automatique 370 A DNA Sequencer (Applied Biosystems) et les séquences nucléotidiques sont ainsi déterminées comme décrit par SMITH L. et al (18). Les séquences protéiques correspondantes sont ensuite déduites par analyse informatique (PC Gene logiciel). Les homologies de séquences sont recherchées par ordinateur et consultation des banques de données Swissprot. (Switzerland) et NBRF (National Biomedical Research Fondation, Washington D.C.). L'insert ADNc du clone 6 d'E.vranulosus a été sous-cloné en vecteur phagique M13mp18 et la séquence nucleotidique a été déterminée (456 pb). Les extrémités 5' et 3' correspondent vraisemblablement à des sites internes EcoRI, non protégés lors de la réaction de méthylation de l'ADNc, où les séquences des segments de liaisons n'ont pas été retrouvées. Un seul cadre de lecture ouvert a été détecté, en phase avec le vecteur lambda, auquel correspond une chaine polypeptitique de poids moléculaire calculé de 17,3 kDa. Les séquences nucléique et protéique ont été représentées précédemment. L'analyse par ordinateur indique une structure secondaire en hélice alpha (pour plus de 90%) du peptide considéré. Deux sites de glycolysation ont été trouvés, présents sur les acides aminés 72 et 84.Des homologies de séquences ont été recherchées par consultation des banques de données. Le taux d'homologie le plus élevé (20% sur 117 AA) a été obtenu par comparaison avec la chaîne lourde de la myosine du muscle squelettique de lapin (AA 100 à 216) et la chaine lourde ss de la myosine du muscle cardiaque de lapin (AA 508 à 620). L'insert AUNc du clone 14 d'E. sranulosus a été sous-cloné et séquencé selon un protocole strictement identique à celui utilisé pour le clone 6. 8. Construction lysogénique - Expression de la protéine de fusion Des constructions lysogéniques sont obtenues en infectant des bactéries de la souche E.coli Y 1089 comme décrit par YOUNG R. & DAVIES (12) par 5 fois plus de pliages gtîî du clone considéré. Cette souche bactérienne possède le répresseur lac (produit du gene lac I) qui inhibe l'expression de la protéine de fusion jusqu'à l'introduction d'IPTG dans le milieu. Elle permet en outre, de par ses caractéristiques (hfl A 150 (high frequency lysogeny)-sup F ), d'obtenir la phase lysogénique chez le phage. Les colonies lysogènes sont sélectionnées pour leur caractère de sensibilité à la température (le répresseur du phage devient non fonctionnel à 42 C). Les lysats bactériens contenant la protéine de fusion sont préparés selon le protocole décrit par HUYNTH T. et al (19). Après sélection des colonies lysogènes recombinantes pour le clone 6, l'expression de la protéine de fusion a été induite et les extraits lysogéniques préparés. L'analyse sur gel de polyacrylamide-SDS a montré un poids moléculaire apparent de 133kDa pour la protéine de fusion considérée (FP6), correspondant effectivement au poids moléculaire attendu de la fusion d'un polypeptide 152 AA avec la ss-galactosidase. 9. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et immunoblotting Les extraits lysogéniques sont analysés sur gel de polyacrylamide-SDS selon les conditions décrites par LAEMMLI U. - (21) en conditions réductrices en utilisant un gel de concentration de 3% et un gel de séparation de 7%. Les gels sont colorés après électrophorèse au bleu de Coomassie ou soumis à un électrotransfert selon les conditions de TOWBIN. et al (20). Après saturation en PBS-lait 3%, la nitrocellulose est incubée toute la nuit à 4 C avec des sérums de patients infestés par E.sranulosus et E.multilocularis avec du PBS-lait 1. . Après lavages, un second anticorps spécifique marqué à la péroxydase est incubé (Pasteur Production - anti-Ig humaine 1/500, anti-IgG de souris 1/500). La révélation s'effectue dans les mêmes conditions que décrites précédemment au point 7 pour le criblage de la banque. Les sérums humains sont dilués en PBS de 1/100 à 1/500. L'anticorps monoclonal EG 02154/12 est dilué de 1/50 à 1/100 selon la concentration en immunoglobuline.Les sérums sont toujours préalablement incubés avec un extrait total de protéine E.coli ainsi qu'une solution de ss-galactosidase purifiée (Sigma), afin de diminuer le bruit de fond. Une dégradation protéolytique partielle a été observée lors de ces tests. Onze des 14 sérums humains anti-E.sranulosus (soit 80% des sérums testés) reconnaissent la protéine recombinante de 133 kDa ainsi qu'une autre molécule de 81 kDa, de manière importante, correspondant vraisemblablement à un produit de dégradation. Une bande secondaire de 104 kDa a aussi été révélée de manière plus faible. Les mêmes bandes ont été détectées par 9 des sérums d'infection à E. multilocularis. Par la suite, l'immunoréactivité de la protéine de fusion a été analysée vis-à-vis de l'anticorps monoclonal anti-antigène 5, EG 02 154/12. Cet anticorps a montré une reconnaissance de la protéine recombinante FP6 de 133 kDa, ainsi que des deux autres molécules de 104 kE)a et 81 kDa, produits de dégradation de la première. Analysé dans les mêmes conditions, un sérum humain spécifique en IEP de l'antigène 5 (un arc = arc 5) a reconnu de la même manière les bandes de 133, 104 et 81 kDa. D'autre part, l'anticorps monoclonal EG 02 154/12 et les sérums d'infection ont été testés vis-à-vis des composants protéiques d'E. coli et la ss-galactosidase purifiée, sans qu aucune bande de masse moléculaire correspondant aux produits de dégradation ou à la protéine de fusion ait été révélée. On donnera ci-après les résultats obtenus avec le peptide Eg 6 dans le diagnostic de 1 ' hydatidose . Le peptide Eg 6 fixé directement sur des microplaques PVC est parfaitement reconnu par l'anticorps monoclonal EG 02 154/12 ainsi que par les sérums des patients infectés par E sranulosus dans un test ELISA comme l'indique la mesure des densités optiques sur le tableau ci-après. Une bonne corrélation a été obtenue entre la reconnaissance de la protéine de fusion FP6 par les anticorps et leur fixation au peptide Eg 6. TABLEAU sérums et ascites moyenne des + déviation dilués au 1/100 densités standard sérums hydatiques reconnaissant FP6 1,96 0,57 (n = 25) sérums hydatiques ne reconnaissant pas FP6 0,77 0,11 (n = 5) sérums humains normaux 0,22 0,07 (n = 5) anticorps monoclonal (ascite EG 02 154/12) 3,4 0,3 ascite du myélome (SP2/0) 0,12 0,04 D'autre part, on a mesuré le pouvoir inhibiteur de ce peptide dans la liaison des anticorps humains au liquide hydatique, utilisé comme antigène fixé, en test ELISA. Le pourcentage d'inhibition varie de 30 à 66% suivant les sérums hydatiques utilisés. Svmboles des acides aminés A Ala alanine C Cys cystéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I île isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser serine T The thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine REFERENCES i - Capron, A., Biguet, J., Vernes, A. et Afchain D. 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Nature 227, 680 REVENDICATIONS 1 - Séquence peptidique immunogène de l'antigène 5 d'Echinococcus aranulosus, caractérisée en ce qu'elle est reconnue à la fois par des sérums de patients atteints d'hydatidose et par un anticorps monoclonal d'isotype IgG1 produit par l'hydridome EG 02154/12, déposé à la CNCM le 25 juin 1990 sous le n 1-957. 2 - Séquence peptidique immunogène selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence GlupheValAspîleAsnlleAlaserLysValAlaAspAlapheGlnLysAsnLysGlu LysIleThrThrThrAspLysLeuGlyThrAlaLeuGluGlnValAlaSerGlnSerGlu LysAlaAlaProGlnLeuSerLysMETLeuThrGluAlaSerAspvalHisGlnArgMET AlaThrAlaArgLysAsnPheAsnSerGluValAsnThrThrPheIleGluAspLeuLys AsnPheLeuAsnThrThrLeuSerGluAlaGlnLysAlaLysThrLysLeuGluGluVal ArgLeuAspLeuAspSerAspLysThrLysLeuLysAsnAlaLysThrAlaGluGlnLys AlaLysTrpGluAlaGluValArgLysAspGluSerAspPheAspArgvalHisGlnGlu SerLeuThrIlePheGluLysThrCysLysGluPhe et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs amino-acides et qui possèdent une activité immunogène analogue. 3 - Séquence peptidique immunogène selon la revendication 2, comprenant une séquence choisie parmi EFVDINIASKVADAFQKNKEKITTT ADAFQKNKEKITTTDKLcTALEQ ITTTDKLGTALEQVASQSEKAAP VASQSEKAAPQLSK KAAPQLSKMLTEASDVHQRMATA LSKMLTEASDVHQRMATARK MATARKNFNS EVNTTF IEDLKNFLNTTLSEAQ NFNSEVNTTFIEDLKNFLNTTLSEAQKAKTK EAQKAKTKLEEVRLDLDSDKTKLKNAKTAEQKAK AK'TKL.EEvRLDLD SDKTKLKNAK EEVRLDLDSDKTKLKNARTAEQKAKWEAEVRK EQKAKWEAEVRRDESDFDRVHQESLTIFEKTCKEF KDESDFDRVHQESLTIFEKTCKEF 4 - Séquence peptidique immunogène selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est constituée par EAQKAKTKLEEVRLDLDSDKTKLKNAKTAEQKAK 5 - Séquence peptidique immunogène selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence E F I R K Y D K G N K G K I N L E E b T A M L D S V H R K T S R A S M 5 R et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs amino-acides et qui possèdent une activité immunogène analogue. 6 - Séquence d'ADN comprenant une séquence nucléotidique codant pour une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications précédentes. 7 - Séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprenant essentiellement la séquence 8 - Séquence d'ADN codant pour un peptide selon la revendication 1 ou 5 comprenant essentiel lement la séquence le .2e 3 4 GAA TTC ATT CGA AAG TAT GAC AAG GGC AAT AhA GGC AAG ATC AAC se 6e 7e 8 9 TTG GAA GAG TTG ACT GCT ATG CTC GAC AGT GTT CAT AGA AAA ACC îee 110 12e 13 AGT AGA GCC TCA ATG AGC CGA TGA AGC ATT TAA AAT TAT GAG AAT 9 - Plasmide comprenant une séquence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'une quel conque des revendications 1 à 5. 10 - Vecteur d'expression comprenant une sé quence d'ADN codant pour une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 11 - Hôte transformé avec un vecteur selon la revendication 10. 12 - Procédé de diagnostic in vitro de l'hy datidose chez l'homme ou l'animal par mise en évidence des anticorps dirigés contre une séquence peptidique immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans un prélèvement biologique de l'homme ou de l'animal dans lequel on met en contact la ou les sé quences peptidiques immunogènes avec le prélèvement biologique de l'homme ou de l'animal pouvant contenir lesdits anticorps et on révèle la présence des anticorps fixés. 13 - Procédé de diagnostic selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il consiste en une méthode radioimmunologique de type RIA, RIPA ou IRMA, ou une méthode immunoenzymatique de type Western-blot sur bandelettes ou de type ELISA. 14 - Trousse de diagnostic in vitro de l'hydatidose pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 15 - Trousse de diagnostic selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un anti-anticorps spécifique d'un isotype d'immunoglobuline. 16 - Vaccin destiné au traitement et à la prévention de l'hydatidose chez l'homme ou chez l'animal, caractérisé en ce que l'agent vaccinant consiste en une séquence peptidique immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 17 - Anticorps monoclonal dirigé contre une séquence peptidique immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 18 - Anticorps monoclonal selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de l'hybridome EG 02154/12 déposé à la CNCM le 25 juin 1990 sous le n 1-957. 19 - Hybridome EG 02154/12 produisant des anticorps monoclonaux de type IgG1 déposé à la CNCM le 25 juin 1990 sous le n 1-957.