Brevet FR2665163A1 — publié le 19920131

La présente invention concerne la prépara- tion de sels d'héparine ou de produits dérivés de l'héparine tels que les fractions de bas poids molé- culaire obtenues par extraction ou par dépolymérisa- tion partielle Le procédé qui fait l'objet de l'in- vention permet plus particulièrement de préparer le sel de calcium de l'héparine ou de ses dérivés. L'héparine, connue pour son action anti- coagulante du sang, est extraite sous forme de sel de sodium (héparine sodique) à partir de différents organes d'animaux tels que les poumons ou les intes- tins de boeuf ou de porc L'utilisation thérapeutique de l'héparine sodique est effectuée par administration intraveineuse Le brevet FR-2 225 149 ( 73 13581) dé- crit l'héparine calcique qui permet d'effectuer une thérapie héparinique par administration sous-cutanée, bien plus aisée. Le procédé de fabrication du sel de calcium utilisé le plus souvent à l'échelle industrielle con- siste à réaliser l'échange sodium-calcium en dissol- vant l'héparine sodique dans une solution d'un sel de calcium Bien que le calcium présente une plus grande affinité pour l'héparine que le sodium, un seul échan- ge, même en excès de calcium, ne suffit pas pour éli- miner totalement le sodium qui, d'après les diffé- rentes pharmacopées, ne doit être présent qu'à moins de O,1 % dans le produit final Il faut donc précipiter à l'alcool le mélange d'héparinate de sodium et de calcium obtenu lors du premier échange, puis redissou- dre le précipité obtenu dans une nouvelle solution riche en calcium Cette opération doit être renouvelée plusieurs fois avant que la teneur en sodium soit suffisamment basse La précipitation en milieu alcoo- lique étant une opération lente (un à deux jours), ce procédé présente l'inconvénient d'être long et consom- mateur d'alcool et de main d'oeuvre En outre, le ren- dement des précipitations n'étant pas de 100 %, une partie de l'héparine, récupérée sous forme de sous- fractions dans les surnageants, doit subir d'autres opérations de purification. D'autres méthodes ont été proposées pour réaliser l'échange de cations sur l'héparine: La dialyse statique de l'héparine sodique avec des sels de calcium qui est un procédé trop lent pour pouvoir être appliqué industriellement L'utili- sation d'un appareil de type hémodialyseur est décrite dans le brevet US-4 409 103. L'utilisation de résines échangeuses d'anions, décrite dans le brevet FR-2 225 149, pré- sente l'inconvénient de passer par l'héparine sous forme d'acide héparinique, notoirement instable car elle s'autohydrolyse rapidement. La diafiltration par une solution d'un sel de calcium est décrite dans le brevet US-4 409 103. Elle utilise des membranes d'ultrafiltration (non échangeuses d'ions) Les sels sont entraînés par le flux d'eau qui traverse les membranes sous l'action d'un gradient de pression L'héparine est retenue par un effet de filtration, sa taille étant plus grande que celle des pores de la membrane L'inconvénient de ce procédé est que, pour être suffisamment rapide, les membranes utilisées doivent présenter des perméabili- tés à l'eau importantes, donc des pores de gros dia- mètre ce qui entraîne des pertes d'héparine à travers les membranes. Dans une étude sur la solubilité de diffé- rents sels d'héparine et de chondroitine sulfate, ces produits ont été électrodialysés en utilisant des membranes de parchemin (E Jorpes, Biochem J 1935, 29, 1817-1830) La méthode de dosage n'étant pas assez précise, l'auteur ne déctecte pas de perte d'activité avant et après électrodialyse Néanmoins, il retrouve 1 % de l'activité initiale perdue dans le compartiment anodique En outre, la méthode décrite par E Jorpes passe par l'héparine sous forme acide, instable. La demande de brevet japonais publiée sous le numéro JP-01-149801 (chemical Abstract 112, 22607 m) décrit une méthode pour la préparation d'éther de cellulose modifiée, notamment des sels de la carboxy- méthylcellulose, selon laquelle on soumet le sel de sodium à une électrodialyse à travers une membrane échangeuse d'ions ou une membrane d'ultrafiltration pour donner une forme acide et en traitant l'acide ainsi obtenu avec l'hydroxyde ou un sel du cation pour obtenir le sel désiré Cette méthode aussi passe par l'intermédiaire de la forme acide et, lorsqu'elle est appliquée à l'héparine sodique, comporte une perte due à la dégradation de l'héparine sous forme acide. On a maintenant trouvé qu'en utilisant une succession alternée de membranes perméables aux anions (MPA) et de membranes perméables aux cations (MPC) dans un appareil d'électrodialyse classique, ces mem- branes étant assemblées de façon à permettre la circu- lation de liquides entre deux membranes adjacentes, et en faisant circuler une solution du sel de sodium de l'héparine ou de fragments ou fractions d'héparine et une solution du sel de calcium utilisé pour l'échange d'ions, on obtient directement le sel de calcium cor- respondant sans passer par l'héparine sous forme acide. On a également trouvé que la réaction est pratiquement quantitative et que, dans les solutions de saumure, telle que définie ci-dessous, et de rin- çage des électrodes, on détecte moins de 0,1 % de l'héparine initiale (ou de ses fractions ou frag- ments). La présente invention concerne donc un pro- cédé pour la préparation du sel de calcium de l'hé- parine ou de ses fragments ou fractions, caractérisé en ce que l'on fait circuler une solution de sel de sodium de l'héparine ou de ses fractions ou fragments et une solution d'un sel hydrosoluble de calcium dans un appareil d'électrodialyse comprenant des membranes perméables aux anions et des membranes perméables aux cations dans une succession alternée permettant la circulation des liquides. Comme produits de départ, on utilise de pré- férence l'héparine sodique ou une de ses fractions obtenues par fractionnement ou par dépolymérisation, notamment le produit connu comme CY 216, décrit dans le brevet US-4 686 288, sous forme de sel de sodium. Dans ce dernier cas, le procédé de la présente inven- tion est particulièrement avantageux, car la masse moléculaire du CY 216, d'environ 2 000 à environ 8 000 avec un pic qui se situe autour de 4 500 daltons, est nettement inférieure à celle de l'héparine; l'échange Na-Ca dans un procédé d'ultrafiltration ou de dialyse impliquerait des pertes importantes. Tous ces produits de départ sont appelés ci-après "héparines" alors que les produits finals sont appelés "héparines calciques". Le sel hydrosoluble de calcium utilisé de préférence est le chlorure. Le procédé de la présente invention consiste notamment à utiliser des membranes perméables aux anions (MPA) et des membranes perméables aux cations (MPC) dans un appareil d'électrodialyse classique Ces membranes échangeuses d'ions sont assemblées dans une succession alternée permettant la circulation de liquides entre deux membranes adjacentes Le procédé consiste à faire circuler dans la succession des membranes une solution contenant le sel de sodium de l'héparine ou l'un de ses fractions ou fragments et un sel hydrosoluble contenant le cation calcium que l'on désire échanger avec le sodium (par exemple Ca Cl 2). Les membranes ont de préférence une perméa- bilité telle qu'elles permettent le passage uniquement aux molécules ayant un poids moléculaire inférieur à environ 500 daltons. Le procédé selon l'invention est illustré sur les dessins annexés Sur ces dessins: La figure 1 montre schématiquement le fonctionnement d'un électrodialyseur dans le procédé selon l'invention. La figure 2 montre schématiquement la mi- gration des ions dans l'électrodialyseur dans le cas de la préparation de l'héparinate de calcium (héparine calcique). Dans un électrodialyseur E (Fig 1) d'une part est introduite et donc circule une solution 1 t ci-après appelée "solution produit", contenant une n + 1 héparine sodique (H, n Na) et un sel hydrosoluble de calcium, par exemple le chlorure de calcium et, d'au- tre part, circule une solution 2, ci-après appelée "saumure", qui au début ne contient qu'une petite quantité de sel (par exemple Ca Cl 2) pour assurer une conductivité et qui ensuite s'enrichit en sels (par exemple Na Cl et Ca C 12) et qui est remplacée pendant l'électrodialyse par des ajouts du sel hydrosoluble de calcium (par exemple Ca C 12)dans la solution produit 1 L'électrodialyseur E comprend un ensemble de cellules, chacune constituée d'une MPA et d'une MPC Le nombre des membranes M utilisées est de 30 à et de préférence de 40 à 50, qui sont perméables à des molécules inférieures à environ 500 daltons Les électrodes sont rinçées de façon connue, par exemple par une solution 3 de H Cl ( 0,5 %) ou de K Cl ( 1 o) La solution produit 1 circule dans un compartiment sur deux, alors que la saumure 2 circule dans les autres compartiments (voir figure 2). Sous l'effet d'un champ électrique continu perpendiculaire aux membranes (fourni par une source V en continu): Les ions Na traversent les MPC en direc- tion de la cathode et sont confinés dans le comparti- ment saumure adjacent car ils y rencontrent une MPA; Les ions que l'on désire échanger avec 2 + Na+r en l'espèce Ca, traversent également les MPC, en direction de la cathode, et sont confinés dans le compartiment saumure adjacent, car leur migration est bloquée par la rencontre d'une MPA. Les anions du sel de calcium rajoutés pour dépalcer le sodium traversent les MPA en direction de l'anode et sont confinés dans le compartiment saumure car ils y rencontrent une MPC. Les ions héparinate (H n-) migrent vers les MPA mais ne peuvent les traverser car leur masse molé- culaire est trop importante Les membranes d'électro- dialyse ne sont en effet perméables qu'à des espèces de masse moléculaire inférieure à 500 environ Les ions héparinate restent donc dans la solution pro- duit 1. Au fur et à mesure que les cations sodium et les cations calcium en excès sont transférés dans la saumure sous forme de sel de l'anion utilisé pour déplacer le sodium, de préférence sous forme de chlo- rure, on rajoute dans la solution produit le cation désiré, le calcium en l'espèce, de manière à déplacer totalement le sodium. Il suffit alors de récupérer la solution produit en vidangeant le circuit produit et de rajou- ter de l'éthanol (ou un autre précipitant de l'hépa- rine) dans cette solution pour faire précipiter le sel de calcium de l'héparine ou d'une de ses fractions. La tension qui est appliquée aux électrodes peut aller de 2 à 38 volt/cm, de préférence de 5 à 30 volt/cm Le procédé est conduit à une température de O à 80 C, de préférence à la température ambiante. Le procédé de la présente invention est de réalisation très simple, il est très rapide et donne des sels de calcium très purs, avec une teneur en sodium inférieur à 0,1 % et avec un très bon rendement en activité biologique. De plus, par rapport à une simple électro- dialyse, qui est un procédé de dessalage, le procédé de la présente invention réalise un échange direct de cations sur une macromolécule anionique D'autre part, les macro-anions sont connus pour colmater la surface des membranes d'électrodialyse; de façon surprenante, moyennant un simple rinçage à l'eau entre deux essais, on n'a constaté aucune baisse des performances des membranes, comme on aurait pu s'y attendre au départ. Par rapport aux procédés connus, le procédé de la présente invention comporte des améliorations considérables, notamment: Par rapport à l'ultrafiltration ou la dialyse, le procédé de l'invention allie rapidité et faibles pertes, ce qui est difficile à concilier par les deux méthodes sus-mentionnées; Par rapport aux précipitations succes- sives, on diminue considérablement la durée du trai- tement, le nombre de manipulations et la consommation de précipitant. Les exemples suivants illustrent l'inven- tion. Le matériel utilisé dans ces exemples est le suivant: Electrodialyseur SRTI modèle Pl Membranes ASAHI GLASS AMV/CSV ( 20 cellules de 69 cm) (une cellule étant constituée d'une MPA et d'une MPC) L'électrodialyseur est donc constitué d'un total de 41 membranes. Les conditions opératoires sont les sui- vantes: Tension appliquée aux électrodes: 25 volts pour l'exemple 1 et 30 volts pour l'exemple 2. Température: ambiante. EXEMPLE 1: Fabrication d'héparine calcique g d'héparine sodique (soit 20,6 x 1 o 6 unités selon la Pharmacopée Européenne, Ed 1990, page 333, monographie Héparinate de Sodium titrage: V 2 2 6) sont mis en solution dans 900 g d'eau On ajoute 15 g d'éthanol, 1,2 g de Na 2504 et 170 mg de Na Cl Cette solution est soumise à une électrodialyse, les ions sont transférés progressivement dans une solution saumure ayant la composition initiale sui- vante: Ca Cl 2: 5 g/H 20: 1 kg Les électrodes de l'appareil sont rincées avec 1,2 litre de K Cl à 1 % qui recircule en continu Des ajouts de 100 g d'une solu- tion de Ca Cl 2 à 38,5 % sont effectués dans le produit à 0, 30 et 90 minutes On remplace la saumure enrichie en sels par 1 kg de Ca C 12 à 0,5 % aux temps 30 et 90 minutes Au bout de 150 minutes on récupère la solu- tion produit par vidange L'héparine est alors préci-pitée à l'éthanol, broyée, lavée à l'alcool puis séchée à l'étuve sous vide On récupère 120 g d'un produit en poudre ayant les caractéristiques suivantes activité biologique: 20,6 x 106 unités (rendement %) teneur en sodium: 0,03 % teneur en calcium: 9,2 % Par dosage au bleu de toluidine (J P DU- CLOS, HEPARINE, Ed Masson, p 285) on n'a détecté que 0,6 % de l'héparine initiale dans les solutions saumure et de rinçage des électrodes Ceci prouve bien la quasi totale imperméabilité des membranes à l'hépa- rine. EXEMPLE 2: Fabrication du CY 216 calcique 220 g de CY 216 sodique (soit 62,0 x 106 unités anti-Xa selon Path Biol 1988, 36, 335-337), obtenu comme décrit dans l'exemple 1 du brevet US-4 686 288, sont mis en solution dans 1860 g d'eau Cette solution est divisée en deux parties égales, et chaque partie est soumise à une électrodialyse (l'appareil ne peut traiter qu'un litre par lot), les ions sont progressivement transférés dans une solution saumure ayant la composition initiale suivante: Ca C 12: 5 g/H 20: 1 kg Les électrodes de l'appareil sont rincées en continu avec 1,2 litres de H Cl 0,5 % qui recirculent en continu Des ajouts de 100 g d'une solution de Ca C 12 à 38,3 % sont effectués dans le produit à 0, 26 et 47 minutes pour l'électrodialyse du premier lot et 0, 37 et 77 minutes pour l'électr- dialyse du second lot La saumure est remplacée par 1 litre de Ca C 12 à 0,5 % à chaque ajout de Ca C 12 dans la solution Le p H de la solution est maintenu entre 6 et 7 par des ajouts de Ca(OH)2 Au bout de 83 minutes pour la première électrodialyse et 127 minutes pour la seconde, on récupère le produit par vidange et rinçage du circuit produit à l'eau distillée Le Cy 216-Ca est alors précipité à l'éthanol, broyé, lavé à l'éthanol et séché à l'étuve sous vide On récupère 220 g de poudre ayant les caractéristiques suivantes: activité biologique: 62,7 x 106 unités anti-Xa (rendement approximativement de 100 %) teneur en sodium 0,08 % teneur en calcium 9,8 % Par essai de précipitation à l'éthanol on estime à moins de 0,01 % la quantité de CY 216 qui est perdue à travers les membranes. 1 1 REVENDICATIONS 1 Procédé pour la préparation du sel de calcium de l'héparine ou de ses fragments ou frac- tions, caractérisé en ce que l'on fait circuler une solution de sel de sodium de l'héparine ou de ses fractions ou fragments et une solution d'un sel hydro- soluble de calcium dans un appareil d'électrodialyse comprenant des membranes perméables aux anions et des membranes perméables aux cations dans une succession alternée permettant la circulation des liquides. 2 Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'électrodialyse est conduite sous une tension de 2 à 38 volt/cm. 3 Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'électrodialyse est conduite sous une tension de 5 à 30 volt/cm. 4 Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que les membranes utilisées permettent le passage uniquement aux molé- cules ayant un poids moléculaire inférieur à environ 500 daltons. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé en ce que comme sel de calcium on utilise le chlorure. 6 Procédé selon l'un quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce que l'électro- dialyse est conduite à une température de O à 80 C. 7 Procédé selon la revendication 6, carac- térisé en ce que l'électrodialyse est conduite à la température ambiante.