Brevet FR2663192A1 — publié le 19911220

L'invention concerne une méthode de diagnostic précoce de la contamination des-plants de céréales par un champignon. Elle est particulièrement avantageuse pour les agriculteurs céréaliers à qui elle apporte un test facile à réaliser et qui permet de déterminer, très tôt dans la saison, l'état phytosanitaire de leurs champs de céréales. L'invention concerne également un dispositif de type mini erre conçu pour la mise en oeuvre de la méthode de diagnostic. La méthode a été principalement mise au point pour l'étude de la contamination par l'agent responsable du piétin-verse Pseudocercosporella herpotrichoïdes, en raison de l'importance économique des dégats qu'il provoque, mais elle peut aussi avantageusement être appliquée à d'autres champignons parasites (comme l'oïdium du blé...) L'agent du piétin-verse est un champignon parasite qui attaque le pied des plantes de céréales, principalement le blé et l'orge mais aussi l'avoine et le seigle. La maladie est répandue dans toutes les régions à climat tempéré (Europe, Etats-Unis, Canada, Australie, Afrique du Sud...) Les premiers symptômes apparaissent sur les céréales d'hiver dès le mois de février, au pied des plantules à 3 - 5 feuilles.Des tâches ovales brunes caractéristiques apparaissent sur la face externe des gaines; puis le parasite traverse successivement les gaines jusqu a contaminer la tige où il détruit les tissus parenchymateux et conducteurs, provoquant les dégats connus sous le nom de verse des céréales. La maladie a une grande importance économique parce qu'elle provoque une réduction du nombre et de la fertilité des épis, entrainant une baisse de rendement de l'ordre de 6 à 25 %. Le développement du champignon ne comprenant que quelques cycles par an, les contaminations précoces sont les plus graves. Elles trouvent leur origine dans les chaumes contaminés laissés en place à la mauvaise saison et sur lesquels le champignon persiste à l'état saprophyte sous forme de mycelium (il se multiplie aussi dans les repousses après moisson et dans plusieurs espèces de graminées sauvages). La sporulation se produit pendant la période automnale et hivernale , à l'air libre, au niveau du sol, et entraine une dissémination aérienne (vent et pluie) à courte distance. Les contaminations les plus lourdes de conséquence se produisent avant le mois de février. Elles sont favorisées par les semis précoces, les rotations courtes, la densité de semis et la monoculture céréalière. Différents fongicides efficaces contre le piétinverse sont commercialisés mais des souches résistantes sont déjà apparues. Il est donc essentiel de faire un diagnostic très précoce de la contamination d'un champ de manière à choisir le traitement adéquat afin de limiter l'impact sur l'environnement et d'éviter l'utilisation d'un produit non efficace. C'est pourquoi la Demanderesse a mis au point une méthode de diagnostic précoce basée sur une croissance forcée des jeunes plants, dans des conditions qui favorisent simultanément le développement de la parasitose. Le but poursuivi était de rendre la méthode assez simple pour être utilisable par n' importe quel agriculteur, sans nécessiter d'installations de laboratoire sophistiquées ou la manipulation de réactifs immunologiques ou radioactifs impliquant des installations et du personnel spécialisé, contraintes qui sont actuellement liées aux différentes méthodes de diagnostic déjà utilisées ou en cours de mise au point - l'isolement et la culture du parasite en milieu artificiel, ( mais cette méthode ne permet pas un diagnostic précoce et une infection allogène peut fausser le résultat);; - l'observation au microscope des organes du végétal présentant des lésions, après coloration spécifique du mycelium (mais cette méthode est difficile à mettre en oeuvre et ne permet pas un diagnostic précoce) ; - l'identification de protéines spécifiques du champignon par immunocapture, en test ELISA ou l'identification de fragments du matériel génétique du champignon par hybridation moléculaire avec des sondes radioactives choisies et éventuellement l'application de la technique PCR pour augmenter la sensibilité de cette dernière méthode (mais ces techniques ne peuvent être appliquées que dans des laboratoires spécialisés). La méthode selon la présente invention peut être appliquée par n'importe quel agriculteur, après prélèvement dans un champ des plantules de céréales potentiellement contaminées et mise en forçage desdites plantules en atmosphère controlée jusqu a apparition des symptômes visibles et aisément identifiables par l'agriculteur. La méthode est mise en oeuvre dans un dispositif spécialement conçu dans ce but, consistant en une mini-serre d'un encombrement total inférieur à 1 m3 . Ce dispositif comprend un bac en plastique sur lequel sont disposés les pots de mise en culture des plantules, un réservoir à eau communiquant avec le fond du bac permettant une alimentation hydrique des racines, et une enceinte formant serre qui s'ajuste sur le bac, qui est munie d'un tube d'éclairage horticole à minuterie et d'une sonde de détection de l'humidité ambiante. Un thermomètre placé près d'une paroi permet de contrôler la température ambiante. La méthode par forçage permet de détecter la présence du parasite alors qu'aucun symptôme n ' est encore visible dans les autres plants du même lot, au champ. La méthode permet ainsi de faire prendre conscience aux praticiens du risque épidémiologique touchant une parcelle ou une région. Elle permet ainsi de décider de traiter ou non et de choisir le traitement adéquat, bien avant que la maladie ne se développe. La méthode de diagnostic précoce selon la présente invention est appliquée de préférence dès le début du mois de janvier et comprend un prélèvement d'un nombre d'échantillons statistiquement significatif. On prélève quelques plantules ensemble (en moyenne 4) à plusieurs endroits bien distincts d'un même champ (de 15 à 20 emplacements par exemple). La mise en "forçage" des plantules prélevées consiste en une induction de croissance accélérée par mise en culture en mini-serre dans des conditions bien controlées de température, d'humidité et de luminosité, de manière à favoriser simultanément une multiplication accélérée du parasite et 1 l'apparition très précoce de ses symptômes visibles. Plus particulièrement les conditions de forçage comprennent le maintien d'un degré d'humidité de 70 à 90 % et d'une température comprise entre 10 et 180C. La culture est exposée à la lumière d'un tube horticole standard pendant une durée de 16 heures par séquence de 24 heures. Les dimensions réduites du dispositif de miniserre tel que décrit plus haut permettent de réaliser les conditions optimales ainsi définies sans réquérir un équipement de contrôle sophistiqué du type qui serait nécessaire pour maintenir les mêmes conditions dans une serre horticole, où un diagnostic accéléré pourrait éventuellement aussi être obtenu. Dans le cas particulier de la recherche d'une contamination de plantules de blé par le piétin-verse, la méthode selon l'invention permet le développement de symptômes caractéristiques et visibles à l'oeil dès le 14ème jours après la mise en forçage. Les symptômes, bien décrits et photographiés dans les revues spécialisées et connus des agriculteurs, sont donc observés et éventuellement quantifiés entre la 2ème et la 3ème semaine de mise en forçage. Il est également possible d'isoler le champignon et de déterminer, avec plus de précision, s'il appartient à une souche à croissance lente ou rapide, ou du type particulièrement pathogène pour le blé et l'orge ou pour le seigle, le blé et l'orge, ou encore si on isole une souche résistant à certains fongicides. La méthode selon l'invention permet donc un diagnostic très précoce d'une contamination dont les symptômes n'apparaitront au champ que beaucoup plus tardivement. Elle permet ainsi le choix d'un traitement fongicide particulièrement bien adapté à la souche contaminante et d'envergure réduite grâce à la précocité de son application en champ. L'utilisation de la mini-serre selon l'invention pour la mise en oeuvre de la méthode de diagnostic précoce constitue un outil pédagogique permettant de sensibiliser les utilisateurs et les services officiels de la protection des cultures à l'existence de la maladie et au choix des moyens de traitement. Les exemples suivants illustrent un mode particulier de réalisation de l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1. Le dispositif du type mini-serre comprend un bac de support et une enceinte transparente souple formant serre, posée sur le bac. Le bac, de forme carrée, d'une longueur de 75 cm, d'une profondeur de 14 cm, est réalisé en matière plastique moulée. Il comprend sur son bord supérieur une glissière permettant l'ajustement de la serre. Il est compartimenté pour séparer les pots de mise en culture. Il est muni d'un réservoir à eau latéral relié avec le fond du bac par un tube en U permettant l'arrosage par le fond, par le principe des vases communiquants. L'enceinte formant serre qui s' ajuste sur ce bac est réalisée en matière plastique transparente en PVC et a une hauteur de 70 cm. La partie supérieure de la serre comprend un tube d'éclairage horticole contrôlé par une minuterie et une sonde de détection de l'humidité ambiante, à affichage digital. Un thermomètre placé dans un pot de mise en culture, proche d'une paroi, permet le contrôle de la température interne. Le faible encombrement de ce dispositif permet son utilisation dans des conditions d-'usage domestique. En le plaçant dans un endroit approprié sa température interne peut être ajustée dans la gamme choisie de 100C à 180C. L'humidité interne voulue est maintenue par un arrosage régulier et adapté aux mesures affichées par la sonde. Le dispositif peut être réalisé en "Kit de pièces détachées à ajuster par l'utilisateur. Exemple 2. La méthode est appliquée à un champ de blé et le champignon parasite recherché est le Pseudocercosporella herpotrichoïdes. a - Prélèvement On effectue le prélèvement des plantules d'une parcelle de culture supposée présenter un risque de contamination dès le mois de janvier, hors période de gel si possible. On prélève au minimmum 18 fois 4 plantules de blé par parcelle à analyser. Le prélèvement est effectué à l'aide d'une bèche en évitant de détériorer le système racinaire des plants et en préservant la terre d'origine. Les plants sont redisposés par 4, dans des petits pots en plastique, permettant l'arrosage par le fond. Il convient de bien tasser la terre pour limiter le stress physiologique et d'humecter la terre par trempage dans un bac d'eau, immédiatement après la transplantation. L'arrosage par aspersion est proscrit pour éviter de provoquer une nouvelle contamination par le champignon. Plusieurs prélèvements peuvent être effectués entre le début du mois de janvier et la fin du mois de février afin de préciser les différentes périodes de contamination et de suivre l'évolution du champignon sur les gaines et la tige. b - Phase de fortage Le "forçage" destiné à accélérer la croissance simultanée du blé et du champignon est réalisé dans une mini-serre, en atmosphère controlée. Cette phase de forçage exige des conditions particulières de température, d'humidité et de luminosité Température : le chamignon a une croissance, à l'intérieur des gaines, qui est une fonction linéaire de la température, avec un optimum situé entre 10 et 180 C. Il n'est donc pas nécessaire de chauffer artificiellement la serre si elle est maintenue sous abri, "l'effet de serre" suffisant à lui seul pour maintenir une température de 10 à 120 C. Humidité: la croissance optimale du champignon est obtenue à une humidité relative de l'air comprise entre 70 et 90 %. L'effet de serre combiné à la présence d'eau pour humecter la t-erre des plants permet en général de réaliser les conditions adéquates. Si une contamination par l'oïdium se manifeste pendant la phase de forçage destinée à la mise en évidence du piétin-verse, on appliquera un traitement classique et sans effet sur le piétin-verse. Les plants de blé restent en phase de forçage pendant un minimum de 14 jours et un maximun de 24 jours. c - Identification des symtômes Dans les conditions de forçage décrites plus haut, si le champignon est présent, il développe des symptômes caractéristiques et visibles sans aucun artifice. Ceux-ci sont déjà bien développés 2 semaines après le début du forçage. Ces symptôme s sont largement décrits dans la littérature et de nombreuses photos en sont publiées et peuvent servir de base de comparaison avec les plants étudiés. On peut quantifier l'analyse en dénombrant les plants atteints et les plants sains. En cas de besoin l'analyse peut être précisée par un isolement et une mise en culture in vitro du champignon pour déterminer la nature précise des souches ou la présence éventuelle de variants résistants à certains fongicides. REVEND ICATIONS 1. Méthode de diagnostic précoce de la contamination de plants de céréales par un champignon caractérisée en ce qu'elle comprend - un forçage des jeunes plants de céréales en atmosphère controlée dans des conditions qui assurent une croissance simultanée du champignon et de la plante parasitée - une identification visuelle des symptômes après un temps de croissance très court. 2. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que les jeunes plants de céréales sont choisis parmi ceux d'espèces d'intérêt économique comme le blé,l'orge, l'avoine, et le seigle. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que les jeunes plants représentent un échantillon statistiquement significatif de la zone de culture à analyser. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le forçage des jeunes plants et réalisé en mini-serre. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que les conditions de forçage comprennent le maintien, dans la mini-serre, d'une température comprise entre 10 et 180C. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que les conditions de forçage comprennent le maintien, dans la mini-serre, d'un degré d'humidité de 70 à 90 8. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que les conditions de forçage comprennent une exposition à la lumière d'un tube horticole d'une durée de 16 heures par séquence de 24 heures. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le champignon à diagnostiquer est l'agent du piétin-verse, Pseudocercosporella herpotrichoïdes. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que l'identification visuelle des symptômes est réalisée entre le 14ème et le 24ème jour après la mise en forçage. 10. Dispositif de type mini-serre conçu pour la mise en oeuvre de la méthode de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Dispositif selon la revendication 10 caractérisé en ce que son encombrement total est inférieur à 1 m3 12. Dispositif selon la revendication 10 ou 11 caractérisé en ce qu'il comprend - un bac muni d'un dispositif pour séparer les pots de mise en culture des plantules - un réservoir à eau, communiquant avec le fond du bac et permettant un arrosage par les racines - une enceinte formant serre qui s'ajuste sur le bac, munie d'un tube d'éclairage horticole a minuterie, d'un thermomètre et d'une sonde de détection de l'humidité ambiante. 13. Utilisation de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 et du dispositif selon l'une quelconque des revendication 10 à 12 pour le diagnostic précoce de la contamination de plants de céréales par un champignon. 14. Utilisation selon la revendication 13 pour la sélection d'un traitement fongicide efficace contre le champignon contaminant. 15. Utilisation selon la revendication 13 ou 14 comme outil pédagogique pour la mise en évidence de champignons parasites et de l'efficacité des traitements fongicides.