Brevet FR2669931A1 — publié le 19920605

La présente Invention concerne des nouveaux variants dérivés des interférons-a, notamment des interférons-a de classe II ainsi qu'un procédé de production de ces variants par les techniques de l'ADN recombinant à partir de la levure. Les interférons ont été identifiés à l'origine par leur capacité d'empêcher la réplication virale. Ils constituent une famille de protéines réparties en trois groupes principaux : les interférons a, P, et 7. Outre leur activité antivirale, les interférons peuvent posséder d'autres fonctions. Par exemple, il a déjà été établi que, chez les bovins et les ovins, un interférons-a pouvait favoriser le phénomène de reconnaissance maternelle de gestation. Cet interféron a, dénommé trophoblastine ou oTP, a été mis en évidence respectivement par MARTAL et al. [J. Reprod. Fert., 56, 63-73 (1979) ; Pro. lOth intern. Congress on Anim. Reprod. and A.l., Urbana Champaign (USA), 11, 509 (short communication) (1984)] et GODKIN et al. [J. Reprod. Fert., 65, 141-150 (1982)] chez les ovins où elle est produite en abondance par l'embryon, entre le 12e et le 21e jour de gestation ; chez les bovins, elle est produite entre le 16ème et le 24ème jour. Elle existe sous au moins 5 isoformes correspondant à différents allèles. Ces isoformes sont décrites dans la Demande Internationale PCT 89/08706, au nom de l'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE. Le poids moléculaire de la trophoblastine est de 20 KDa et son point isoélectrique est compris entre 5,3 et 5,5, suivant l'isoforme considérée. Il a été proposé de classer la trophoblastine parmi les interférons a de classe Il. Dans la plupart des cas, la durée d'une gestation dépasse largement celle de la phase lutéique du cycle ovarien. Lorsqu'il y a eu fécondation, certains mécanismes interviennent afin de prolonger la durée de vie du corps jaune et d'empêcher un retour du cycle ovarien. Chez les ruminants, l'embryon émet un signal biochimique sous forme de trophoblastine. Cette substance permet en quelque sorte à l'organisme de sécréter de la progestérone, une hormone qui est essentielle pour un développement embryonnaire normal. La trophoblastine n'est sécrétée par l'embryon que pendant une période relativement courte : du 16e au 24e jour de gestation en ce qui concerne les bovins et du 12e au 22e jour de gestation dans le cas des ovins (mouton, chèvre). Si la mère et l'embryon sont asynchrones, c'est-à-dire si l'embryon sécrète la trophoblastine avant que la mère soit physiologiquement capable d'y être sensible et de répondre à une telle stimulation, le corps jaune régresse et l'embryon meurt. Cette éventualité est particulièrement critique lorsqu'il s'agit de transfert d'embryon après fécondation in vitro. A ce jour, le taux d'échec lors des transfert d'embryons est d'environ 25%. D'un point de vue économique, ceci est particulièrement désastreux puisque le coût d'une fécondation in vitro est très élevé. Une majorité de gestations perdues serait due au fait que l'état de développement de l'embryon et les conditions physiologiques maternelles ne seraient pas "en phase" au moment de l'implantation de l'embryon dans l'utérus de la mère porteuse. De plus, les embryons sont souvent congelés avant transfert avec, pour conséquence, la perte d'une certaine quantité de trophoblastine produite par les embryons. Compte tenu de ce qui précède, il serait donc très intéressant de disposer de grandes quantités de trophoblastine afin de pouvoir traiter les animaux en début de gestation. Seules les techniques de l'ADN recombinant peuvent permettre d'atteindre ce but. Le clonage chez E. Coli de 1'ADN complémentaire (ADNc) des ARN messagers (ARNm) codant pour la trophoblastine ovine a été décrit dans la Demande PCT 89/08706 citée plus haut. Il pouvait donc être envisagé de construire, à partir de cet ADNc, des gènes chimériques permettant la production de trophoblastine dans des microorganismes. Néanmoins, les premiers essais d'expression d'un ADNc codant pour la trophoblastine ovine ne se sont pas révélés concluants. Ces premiers essais mettaient en oeuvre des bactéries (E. coli) ou des levures (S. cerevisiae). En particulier une cassette d'expression destinée à une production de trophoblastine ovine dans la levure et comprenant un fragment d'ADN codant pour un peptide signal associé à l'extrémité 5' du de l'ADNc codant pour la trophoblastine ovine mature n'a pas permis d'obtenir une synthèse convenable. D'autre part, ZSEBO et al., [J. Biol. Chem. 261 (13) : 5858, (1986)] rapportent qu'un interféron-a ne peut être sécrété dans de bonnes conditions et en grande quantité en utilisant le système "pré-pro" du facteur-a. En outre, d'une manière générale, les interférons-a sont caractérisés par la présence de quatre résidus cystéines en positions 1, 29, 99 et 139 qui s'associent entre eux pour former les ponts disulfures cysl-cys99 et cys29-cysl39, et il est considéré que le résidu cystéine en position N-terminale est essentiel pour le maintien d'une structure conformationnelle correcte. De manière surprenante, il a maintenant été trouvé que l'addition d'un fragment d'ADN codant pour le dipeptide Ala-Pro à l'extrémité 5' de l'ADNc codant pour un interféron-a était bénéfique dans la mesure où l'ensemble de la structure codante pouvait être convenablement exprimée dans la levure et le variant Ala-Pro-interféron-a ainsi produit correctement sécrété. De plus, il a pu être établi que les variants Ala-Pro-interféron-a conservent une activité biologique similaire à celle des interférons naturels. Par exemple, l'addition du dipeptide Ala-Pro à la trophoblastine donne lieu à des variants qui conservent l'activité antivirale et anti-lutéolytique de la trophoblastine ovine naturelle.Les applications des variants conformes à l'Invention font l'objet d'une Demande de Brevet au nom de l'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE, déposée en même temps que la présente Demande En conséquence, l'invention propose de nouveaux variants d'interféron-a, répondant à l'une des formule suivantes X1-Ro (I) ou bien X1-X2-R0 (11) ou bien X1-X2-X3-Ro (III) dans laquelle X1, X2 et X3 sont identiques ou différents, et représentent chacun un acide aminé à chaine latérale non polaire ou neutre, et Ro représente la séquence en acides aminés de la forme mature d'un interférona, Préférentiellement, X1, X2 et X3 représentent chacun un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, le tryptophane, la glycine, la sérine et la thréonine Pour une espèce donnée, les interférons-a préSentent généralement une certaine variété allélique naturelle. Par exemple, en ce qui concerne les interférons-a d'origine humaine, on connaît au moins une quinzaine de gènes dont les séquences codantes présentent entre elles plus de 85% d'homologie. Par interféron-a (IFN-a), on entend notamment un IFN-a de classe I (IFN-aI) ou de classe II (IFN-aII). Un IFN-aI est caractérisé par une séquence de 166 acides aminés tandis qu'un IFN-aII possède une extension C-terminale de 6 acides aminés par rapport à un IFN-aI. Pour exemple, on cite en particulier - l'IFN-aI d'origine bovine tel que décrit à la figure 1, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu acide aspartique en position 166, - l'IFN-aII d'origine bovine tel que décrit à la figure 1, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu acide proline en position 172, - l'IFN-aI d'origine humaine tel que décrit à la figure 2, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu acide glutamique en position 166, - l'IEN-aII d'origine humaine tel que décrit à la figure 2, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu sérine en position 172. De manière avantageuse, un variant selon l'Invention répond à la formule Ala-Pro-R0' (IV) dans laquelle Rg' est un IFN-aII. De préférence, un variant selon l'Invention répond à la formule Ala-Pro-R0,, (V) dans laquelle Ro'' est un IFN-aII d'origine bovine ou ovine. De manière tout à fait préférée, un variant selon l'Invention est de formule Ala-Pro-R0,,' (VI) dans laquelle RO"' représente la séquence en acides aminés de la forme mature d'une quelconque des isoformes de la trophoblastine ovine. Certaine des isoformes de la trophoblastine ovine, respectivement dénommées T1, T2, T3, T4, et T5 sont décrites dans la Demande PCT 89/08706. Dans le cadre de la présente Invention, les variants préférés de formule (VI) incluent des variants dans lesquels R0,,,représente la séquence en acides aminés de la forme mature de l'une quelconque des isoformes T1 à T5 de la trophoblastine. La figure 3 donne en exemple la séquence en acides aminés d'isoformes de la trophoblastine, commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu proline en position 172, dans laquelle . R5 est un résidu acide glutamique, glutamine ou arginine, . R6 est un résidu arginine ou lysine, . R35 est un résidu lysine ou acide aspartique, et R44 est un résidu acide glutamique ou acide aspartique. . R48 est un résidu leucine ou acide aspartique. R49 est un résidu leucine ou glutamine. Des variants préférés de formule (VI) incluent: - un variant de formule (VIa) dans laquelle R5 est un résidu arginine, R6 est un résidu lysine, R35 est un résidu acide aspartique, R44 est un résidu acide glutamique, R48 est un résidu leucine, et R49 un résidu glutamine, - un variant de formule (VIb) dans laquelle R5 est un résidu acide glutamique, R6 est un résidu arginine, R35 est un résidu lysine, R44 est un résidu acide glutamique, R48 est un résidu acide aspartique, et R49 un résidu leucine, - un variant de formule (VIc) dans laquelle R5 est un résidu glutamine, R6 est un résidu arginine, R35 est un résidu acide aspartique, et R44 est un résidu acide aspartique, et, - un variant de formule (VId) dans laquelle R5 est un résidu glutamine, R6 est un résidu arginine, R35 est un résidu acide aspartique, R44 est un résidu acide glutamique, R48 est un résidu leucine, et R49 un résidu glutamine. L'activité antivirale des variants selon l'Invention peut être notamment mise en évidence selon le protocole décrit par LA BONNARDIERE et LAUDE, [Infection and Immunity, 32, 28-31, (1981)], sur des cellules WIDBK (Madin Darby Bovine Kidney), en présence du virus de la stomatite vésiculaire. Un exemple de mesure de cette activité antivirale sera détaillé plus loin. D'autre part, l'Invention a aussi pour objet une cassette d'expression d'un variant selon l'Invention qui comprend au moins - un premier fragment d'ADN codant pour un variant selon l'Invention, - un deuxième fragment d'ADN codant pour un peptide signal, ledit deuxième fragment d'ADN étant associé à l'extrémité 5' du premier fragment d'ADN, - un promoteur permettant l'expression desdits fragments d'ADN dans la levure. Une telle cassette est capable de promouvoir l'expression d'un précurseur peptidique constitué du côté N-terminal d'un peptide signal et, d'un côté C-terminal d'un variant selon l'invention. Lors du passage dans le réticulum endoplasmique le peptide signal sera éliminé par clivage pour libérer le variant sous forme mature. Pour l'usage dans une cassette d'expression selon l'Invention, ledit deuxième fragment d'ADN est tel qu'il peut coder pour n'importe quel peptide signal dont l'extrémité C-terminale constitue un site de protéolyse capable d'être reconnu par une signal peptidase de l'organisme hôte destiné à l'hébergement de la cassette d'expression. La signal peptidase doit nécessairement couper l'extrémité C-terminale du peptide signal. Dans le cadre de la présente Invention, des peptides signal avantageux incluent par exemple - le peptide signal du précurseur du facteur-a ayant la séquence d'acides aminés Met-Arg-Phe-Pro-Ser-Ile-Phe-Thr-Ala-Val-Leu-Phe-Ala-Ala Ser-Ser-Ala-Leu-Ala (le site de protéolyse est souligné); - le peptide signal du précurseur de la ss-1,-3 glucanase de levure ayant la séquence d'acides aminés Met-Arg-Phe- Ser-Thr-Thr-Leu-Ala-Thr-Ala-Al a-Thr-Ala-Leu- Phe-Phe-Thr-Ala-Ser-Gln-Val-Ser-Ala (le site de protéolyse est souligné) ; ainsi que les dérivés fonctionnels de ceux-ci. Par exemples, des dérivés fonctionnels du peptide signal du précurseur de la 5-1,-3 glucanase sont décrits dans la demande PCT N de Dépôt FR90/00306 du 27.04.90. D'une manière générale, le promoteur destiné à l'expression du précurseur du variant selon l'invention peut être n'importe quel promoteur fonctionnel dans la levure, de préférence un promoteur capable d'induire un bon niveau d'expression d'une séquence codante quelconque. Un promoteur avantageux est, par exemple, le promoteur du gène MFal qui code pour le facteur-a ou un dérivé fonctionnel de celui-ci. Enfin, la demande a aussi pour objet i) une cellule de levure transformée par la cassette d'expression selon l'invention et, ii) un procédé de production d'un variant selon l'invention, qui comprend l'acte de cultiver une cellule de levure selon l'invention et de récolter ledit variant à partir du surnageant de culture. La cassette d'expression selon l'invention telle que présente dans la cellule de levure transformée peut être soit incorporée dans le génome de la levure, soit être portée par un plasmide capable de répliquer dans la levure. Dans ce dernier cas, il convient de choisir un couple plasmide:levure-hôte tel que le plasmide puisse être maintenu dans la levure par pression de sélection. Avantageusement, on choisit d'une part, une levure-hôte auxotrophe pour un métabolite indispensable à la croissance cellulaire et d'autre part, un plasmide qui permet de complémenter cette auxotrophie. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de variants d'interféron a conformes à l'Invention. Il va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Brève description des figures La figure 1 indique la séquence des acides aminés des précurseurs des IFN-aI et -aII d'origine bovine ainsi que leurs séquences nucléotidiques correspondantes. La séquence des peptides signal est numérotée de S1 à S23. La figure 2 indique la séquence des acides aminés des précurseurs des IFN-aI et -aII d'origine humaine ainsi que leurs séquences nucléotidiques correspondantes. La séquence des peptides signal est numérotée de S1 à S23. La figure 3 indique la séquence des acides aminés du précurseur naturel de la trophoblastine ovine ainsi que la séquence nucléotidique correspondante. La séquence du peptide signal est numérotée de -23 à -1. La figure 4 représente de manière schématique le plasmide pTG7908. EXEMPLE 1 : Construction du plasmide d'expression du variant Ala-Pro de la trophoblastine ovine dans la levure (pTG7908) La séquence d'ADN codant pour le précurseur de la trophoblastine ovine telle que décrite dans M. CHARLIER et al., Gene (1989) 77:341 (voir aussi figure 3) est clonée sous forme d'un fragment EcoRI dans le vecteur M13TG131 décrit dans l'article de M.P. KIENY et al., Gene (1983) 26:91. On obtient ainsi le vecteur M13TG771. Pour pouvoir isoler le fragment codant pour la protéine mature, c'est-à-dire, le fragment d'ADN sans la séquence signal, on crée, en 5' de la séquence mature de la protéine (Figure 1), un site HindîlI par mutagénèse dirigée en utilisant la trousse Amersham et l'oligonucléotide OTG2102 dont la séquence est la suivante : GAGGATCTCAAGCTTGTTACCTAT. Le brin antisens de la trophoblastine, porté par le vecteur M13TG771 simple brin, est représenté cidessous ligne I et l'oligonucléotide OTG2102 est représenté ligne II ; les étoiles * représentent les mésappariements qui vont provoquer les mutations recherchées. Ligne I : CT CCT AGA GAC CCA ACA ATG GAT A Ligne II : GA CGA TCT CAA GCT TGT TAC CTA T. ** * On obtient ainsi le vecteur M13TG7720. Les mutations ponctuelles qui ont été introduites dans la séquence codante induisent le remplacement des acides aminés Leucine en position -2 et Glycine en position -1 du précurseur de la trophoblastine respectivement par la glutamine et la Alanine. M13TG7720 est ensuite digéré par EcoRI et le fragment d'ADN EcoRI codant pour le précurseur muté de la trophoblastine est inséré dans le vecteur pTG769 (décrit dans la Demande de Brevet de EP0258118) préalablement digéré par EcoRI. On obtient ainsi le vecteur pTG7901. D'autre part, pour produire la trophoblastine dans la levure, le fragment d'ADN codant pour la trophoblastine doit être mis sous le contrôle d'un promoteur de levure. Pour cela on utilise le vecteur M13TG3841, décrit dans la Demande de Brevet PCT déposée le 28 Avril 1990, dont le numéro de dépôt est FR90/00306, et qui contient en particulier - le promoteur du gène codant pour le facteur alpha 1 (MFalphal) ; - la séquence pré de MFalphal codant pour le peptide signal du précurseur du facteur alpha 1 ; et - la séquence pro de MFalphal. Un site de restriction SmaI est créé entre le deuxième et le troisième codon de la séquence pro de MFalphal par mutagénèse dirigée en utilisant la trousse Amersham et l'oligonucléotide OTG2072 dont la séquence est la suivante : TCCGCATTAGCTGCTCCCGGGAACACTACAACAGAA. Le brin antisens des séquences pré-pro de MFalphal, porté par le vecteur M13TG3841, est représenté ci-dessus ligne I et l'oligonucléotide OTG2072 est représenté ligne II ; les étoiles * indiquent les mésappariements qui vont provoquer les mutations recherchées. Ligne I AGG CGT AAT CGA CGA GGT CAG TTG TGA TGT TGT CTT Ligne II TCC GCA TTA GCT GCT CCC GGG ARC ACT ACA ACA GAR * ** SmaI On obtient ainsi le vecteur M13TG3869. Les mutations ponctuelles qui ont été introduites dans la séquence codante induisent le remplacement de l'acide aminé Glycine par la valine. Le vecteur pTG7901 est digéré par HindIII pour libérer le fragment d'ADN HindIII, codant pour la trophoblastine mature qui est ensuite traité à la nucléase Mung Bean. Ce fragment est inséré dans le vecteur M13TG3869 préalablement digéré par 5maI. On obtient ainsi le vecteur M13TG7740 qui comporte en séquence et en phase - le promoteur de MFalphal, - la séquence pré de MFalphal suivie des deux premiers codons de la séquence pro, soit ceux codant pour les acides aminés alanine et proline et, - le fragment d'ADN codant pour la trophoblastine ovine. Le fragment d'ADN SphI, issu du vecteur M13TG7740, comportant le promoteur de MFalphal, la séquence pré suivie des codons de l'alanine et de la proline et la séquence d'ADN codant pour la trophoblastine mature est inséré dans le vecteur de levure pTG3828 (décrit dans la Demande de Brevet PCT dont le numéro de dépôt est FR90/00306) préalablement digéré par SphI. On obtient ainsi le plasmide pTG7908 dont la structure est schématiquement représentée sur la Figure 4. EXEMPLE 2 : Production du variant Ala-Pro-trophoblastine par la levure. Une souche de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae de génotype MATalpha, ura3-251,-373,-328, leu2-3,-112,his3,pep4-3 est transformée par le plasmide pTG7908 par la méthode à l'acétate de lithium [H. ITO, et al., J. Bacteriol. (1983) 153] et les prototrophes pour l'uracile (Ura+) sont sélectionnées sur un milieu YNBG (14 g/l de bases azotées pour levure (Yeast Nitrogen Base), 10 g/l de glucose) additionné avec 10 g/l de casaminoacides. Le variant Ala-Pro-trophoblastine est produit par "Fed-Batch" dans un fermenteur de 20 L BIOLAFFITE. 12 l de milieu D kàppeli [A. FICCHTER et al., Adv. Microbial. Physiol. (1981), 22, 123-183] concentré 1,5 fois qui contienne 10 g/l de glucose et de HY Case SF (vendu par SHEFFIELD) sont ensemencés avec 400 ml d'une préculture d'un clone de levure transformé par pTG9708. Cette préculture est effectuée en erlenmeyer à 30"C sur un milieu sélectif YNBG. Avant la mise en route de la fermentation la DO600 du milieu ainsi ensemencé est de 0,2. La fermentation se fait à 30"C, à un pH de 4,5 contrôlé par adjonction d'une solution d'ammoniaque à 10% et à une pression partielle d'oxygène correspondant à 30% de la pression de saturation, maintenue constante par une régulation de l'agitation. Lorsque tout le glucose est consommé, la DO600 est mesurée (DO de départ de 1'alimentation) et on commence l'alimentation en glucose par paliers exponentiels de 3 heures, sachant que le taux de croissance spécifique (W) est de 0,1 heurte~1 et que la quantité de glucose rajoutée (QS) est de 0,045 g/h/DO.La fermentation est arrêtée lorsque DO600 = 100, et la récolte se fait par centrifugation à 5000g. On obtient ainsi 13 1 de surnageant de culture contenant le variant Ala-Pro-trophoblastine. L'existence d'une activité anti-virale associée au surnageant du culture est mise en évidence selon le protocole décrit par LA BONNARDIERE et LAUDE, [Infection and Immunity, 32, 28-31, (1981)] et brièvement rappelé ci-après Un aliquot de la culture obtenue ci-dessus est prélevé ; ainsi qu'un aliquot d'un surnageant d'une culture témoin (souche de levure transformée par pTG3828 et cultivée dans les mêmes conditions que précédemment). A partir de ces aliquots on effectue des dilutions en série. D'autre part, 100 Al d'une suspensicn de cellules diluée à 5.106 cellules/ml sont déposés dans chacun des puits d'une plaque de microtitrage à 96 alvéoles (FALCON). On laisse incuber pendant 4h pour qu'un tapis cellulaire se forme. Des échantillons à titrer de variant Ala-Pro-trophoblastine sont alors déposés dans les puits par dilutions de 3 en 3 à l'aide d'un multidilueur (Titer kit). De même, une gamme témoin est établie à partir d'une préparation d'un IFN-a de référence, d'origine bovine, dont le titre est connu. L'incubation est poursuivie une nuit à 37"C sous atmosphère gazeuse de CO2. Puis le milieu d'incubation est retiré. 100 Rl de suspension du virus de la stomatite vésiculaire sont ajoutés dans chaque puits. Les plaques sont placées dans un caisson en présence de CO2 et incubées une nuit à 37"C. En fin d'incubation, une coloration par le cristal violet, suivie d'un lavage, permet de révéler l'activité antivirale car seules les cellules vivantes restent colorées en bleu. Dans ces conditions, l'activité antivirale du surnageant de culture contenant le variant Ala-Pro-trophoblastine est de 0,8 x 108 UI/mg. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente Invention. REVENDICATIONS 1) Variants d'interféron-a, répondant à l'une des formules suivantes X1-Ro (I) ou bien X1-X2-R0 (II) ou bien X1-X2-X3-Ro (III) dans laquelle X1, X2 et X3 sont identiques ou différents, et représentent chacun un acide aminé à chaine latérale non polaire ou neutre, et Ro représente la séquence en acides aminés de la forme mature d'un interférona. 2) Variants selon la revendication 1, caractérisés en ce que X1, X2 et X3 représentent chacun un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, le tryptophane, la glycine, la sérine et la thréonine. 3) Variants selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, de formule Ala-Pro-R0'' (V) dans laquelle Rg" est un IFN-aII. 4) Variants selon la revendication 3, de formule Ala-Pro-R0,,, (VI) dans laquelle Rg"' représente la séquence en acides aminés de la forme mature d'une quelconque des isoformes de la trophoblastine ovine. 5) Variants selon la revendication 4, dans lesquels Rn"' représente la forme mature de l'une quelconque des isoformes T1 à T5 de la trophoblastine ovine. 6) Variants selon la revendication 4, dans lesquels Ru' " représente une séquence générale d'acide aminés des isoformes de la trophoblastine ovine (Figure 3), commençant avec le résidu cystéine en position 1 et finissant avec le résidu proline en position 172, dans laquelle . R5 est un résidu acide glutamique, glutamine ou arginine, . R6 est un résidu arginine ou lysine, v R35 est un résidu lysine ou acide aspartique, et R44 est un résidu acide glutamique ou acide aspartique. R48 est un résidu leucine ou acide aspartique. R49 est un résidu leucine ou glutamine. 7) Variants selon la Revendication 6, lesquels variants sont sélectionnés parmi - un variant de formule (VIa) dans laquelle R5 est un résidu arginine, R6 est un résidu lysine, R35 est un résidu acide aspartique, R44 est un résidu acide glutamique, R48 est un résidu leucine, et R49 un résidu glutamine, - un variant de formule (VIb) dans laquelle R5 est un résidu acide glutamique, R6 est un résidu arginine, R35 est un résidu lysine, R44 est un résidu acide glutamique, R48 est un résidu acide aspartique, et R49 un résidu leucine,. - un variant de formule (VIc) dans laquelle R5 est un résidu glutamine, R6 est un résidu arginine, R35 est un résidu acide aspartique, et R44 est un résidu acide aspartique, et, - un variant de formule (VId) laquelle R5 est un résidu glutamine, R6 est un résidu arginine, R35 est un résidu acide aspartique, R44 est un résidu acide glutamique, R48 est un résidu leucine, et R49 un résidu glutamine. 8) Une cassette d'expression d'un variant selon n'importe laquelle des revendications 1 à 7, qui comprend au moins - un premier fragment d'ADN codant pour ledit variant, - un deuxième fragment d'ADN codant pour un peptide signal, ledit deuxième fragment d'ADN étant associé à l'extrémité 5' du premier fragment d'ADN, - un promoteur permettant l'expression desdits fragments d'ADN dans la levure. 9) Une cassette d'expression selon la revendication 8, dans laquelle le deuxième fragment d'ADN code pour le peptide signal du précurseur du facteur-a, pour le peptide signal du précurseur de la ss-1,-3 glucanase de levure ou un dérivé fonctionnel de ceux-ci. 10) Une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 8 ou 9, dans laquelle le promoteur est celui du gène MFal ou un dérivé fonctionnel de celui-ci. 11) Une cellule de levure transformée par une cassette d'expression selon n importe laquelle des revendications 8 à 10. 12. Un procédé de production d'un variant selon n importe laquelle des revendications 1 à 7 qui comprend l'acte de cultiver une cellule de levure selon la revendication 11 et de récolter ledit variant à partir du surnageant de culture.