Brevet FR2661180A1 — publié le 19911025

L'invention a pour objet un nouveau dérivé de la LHRH, i'hydroxyproline 9 LHRH [(Hyp 9) LHRH], son procédé d'obtention ainsi que son application comme médicament. La LHRH (Luteinizing Hormone Releasing Hormone) appelée aussi GnRH (Mammalian Gonadotropin-Releasing Hormone) a été isolée pour la première fois à partir d'extraits hypothalamiques de porc (Matsuo et al. 1971, Biochem. Biophys. Res. Commun. 43, 1334-1339 ; Schally et al. 1971, Biochem. Biophys. Res. Commun. 43, 393-399) et d'ovin (Amoss et al. 1971, Biochem. Biophys. Res. Commun. 44, 205-210). De multiples formes moléculaires non associées avec des molécules précurseurs, mais correspondant à des substitutions d'amino-acides dans la séquence de la LHRH en position 3, 5, 6, 7 et 8, ont été décrites dans le cerveau d'espèces n'appartenant pas aux mammifères (Sherwood, 1987, Trends Neurosci. 10, 129-132). Dans ces espèces non-mammifères, au moins deux formes distinctes de LHRH peuvent coexister dans le cerveau. Cette particularité n'a pas été décrite chez les mammifères étant donné qu'on connait une seule séquence LHRH et seulement un gêne codant pour le précurseur de la LHRH, comme ceci a été montré dans le placenta humain (Seeburg et al. 1984, Nature, 83, 179-183) et dans l'hypothalamus de rat et humain (Adelman et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 179-183). Une hétérogénéité moléculaire dans l'immuno- réactivité de la LHRH de mammifère (ou mLHRH) a cependant été déjà décrite dans la glande pinéale (Piekut et al. 1981, J. Histochem. Cytochem., 29, 616-622 ; Piekut et al. 1982, J. Histochem. Cytochem., 30, 106-110 ; Millar et al. 1981, Neuropeptides Biochemical and Physiological Studies, 263271 ; King et al. 1981, J. Endocrinol. 91, 405-414) dans le placenta (Currie et al. 1981, Biochem, Biophys. Res. Commun., 99, 332-338 ; Nowak et al. 1984, Biol. Repro. 31, 67-75 ; Tan et al. 1982, Biochem. Biophys. Res. Commun., 109, 1061-1071 ; Siler-Khodr, 1986, Biol. Repro. 34, 245-254 et 255-264 ; Siler-Khodr. 1986, Biol. Repro. 35, 312-319 Mathialagan et al. 1986, Biochem. Internat. 13, 757-765 Gautron et al. 1989), dans les gonades (Dutlow et al. 1981. Biochem. Biophys. Res. Commun. 101, 486-494 ; Bhasin et al. 1983. Endocrinology, 112, 1144-1146 ; Hedger et al. 1985, Mol. Cell. Endocrinol, 42, 163-174) et dans l'hypothalamus (Fawcett et al. 1975, Endocrinology, 96, 1311-1314 ; Anthony et al., 1987 ; Brain. Res. 424, 258-263 ; King et al. 1988, Endrocrinology, 122, 2742-2752 ; Stopa et al. 1988. Peptides, 9, 419-423). A partir de ces différentes observations, il était donc possible que chez les mammifères il y ait au moins deux molécules de type LHRH, comme c'est le cas chez les espèces non-mammifères. Dans ce cas, la ou les différences entre la séquence peptidique de la mLHRH et la ou les séquences de molécules inconnues de type LHRH pourraient être aussi bien trop importante ou insuffisante pour permettre la détection de gênes distincts à l'aide des sondes oligodésoxynucléotidiques synthétisées en fonction de la séquence de la LHRH (Seeburg et al. 1984, Nature, 83, 179-183). Par ailleurs, des modifications enzymatiques posttranscriptionnelles de la séquence de la LHRH telles que celles suggérées dans la glande pinéale (Millar et al. 1981 précédememnt cité ; King et al. 1981, J. Endocrinol, 91, 405-414) pouvaient également expliquer l'apparente hétérogénéité de I 'immunoréactivité de la mLHRH, même avec un simple gêne codant pour le précurseur de la mLHRH. Dans des études préalables (Gautron et al. 1981, Mol. Cel. Endocrinol, 24, 1-15 ; Drouva et al. 1986, Neuroendocrinol, 43, 32-37), il a été montré que la LHRH hypothalamique de rat co-élue avec la LHRH synthétique par filtration sur tamis moléculaire mais n'est pas quantifiée de la même manière par trois sérums anti-LHRH différents. Les trois sérums anti-LHRH utilisés dans ces études sont appelés N, C et W, et reconnaissent respectivement les fragments N terminaux de la mLHRH ainsi que d'autres molécules de LHRH connues, sauf la LHRH de lamproie - les fragments C terminaux de la mLHRH, mais pas les autres formes de LHRH, et la conformation de la molécule de mLHRH (anticorps W). La présence d'un résidu pyroGlu à l'extrémi- té N est essentielle pour la détection par l'anticorps N. Par contre, le résidu glycine-amide situé à l'extrémité C est essentiel pour la reconnaissance par l'anticorps C. L'anticorps W quant à lui n'accepte pas de modification du résidu pyroGlu1 et du résidu Glyamide10. Cependant, ce dernier anticorps reconnait les autres molécules de LHRH sauf la molécule de LHRH de lamproie. La différence d 'immunoréactivité démontrée dans ces études préliminaires a été dans un premier temps attribuée à la présence de fragments de LHRH co-élués, mieux reconnus par l'un des anticorps que par les deux autres. Des études complémentaires n'ont pas confirmé cette hypothèse. La présente invention a permis de montrer de manière surprenante que deux molécules de type LHRH coexistent dans l'hypothalamus de mammifères, notamment chez l'homme et le rat et ces deux molécules ont été caractérisées. Plus particulièrement, la demanderesse a mis en évidence l'espèce moléculaire de type LHRH, qui montrait une immunoréactivité différente vis-à-vis des trois groupes d'anticorps précédemment cités par rapport à la mLHRH. La demanderesse a aussi mis au point une méthode d'obtention et de séparation préparative de ces deux formes, et notamment de la forme LHRH modifiée. L'invention a donc pour objet des peptides présentant une homologie importante de séquence avec la m LHRH caractérisés en ce qu'ils présentent une forte réactivité vis-à-vis d'anticorps dirigés contre l'extrémité N terminale de la LHRH et une faible réactivité vis-à-vis d'anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale de la LHRH ou dirigés contre des déterminants antigéniques liés à la structure tridimensionnelle tertiaire de la LHRH, par comparaison avec les réactivités respectives de la LHRH. Ces peptides peuvent possèder en spectromètrie de masse une bande correspondant à un poids moléculaire d'environ 1198,8 Da. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un peptide caractérisé en ce qu'il possède la séquence suivante 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pyroGLY-HIS-TRP-SER-TYR-X-LEU-ARG-HYP-Y dans laquelle, par rapport à la molécule de LHRH native, la proline en position 9 a été hydroxylée. Dans cette molécule, les acides aminés en position 1 à 5 et 7 à 9 sont en configuration L, et X peut représenter un résidu GLY, D-ALA, D-SER, D-TRP, ou D-HIS. Y peut représenter quant à lui un résidu -GLY-CO NH2 ou un groupement éthylamide. Ces peptides peuvent aussi présenter une activité agoniste ou antagoniste vis-à-vis de la LHRH. Ces peptides sont avantageusement obtenus par extraction à partir d'un tissu ou d'un fluide biologique qui peut être notamment l'hypothalamus de mammifères et en particulier du rat ou de l'homme. Ils peuvent aussi être obtenus par synthèse, en particulier par synthèse chimique. L'invention a d'autre part pour objet un procédé d'obtention de ces peptides à partir de tissus ou de fluides biologiques comprenant - au moins une étape d'extraction globale des protéines - au moins une chromatographie par échange de cations - et/ou au moins une chromatographie liquide à haute per formance (CLHP) en phase inverse. Plus particulièrement, ce procédé d'obtention sera mis en oeuvre sur des tissus ou des fluides faisant partie de l'hypothalamus de mammifères et en particulier de l'hypo- thalamus d'homme ou de rat. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de ces peptides et plus particulièrement de la (Hyp 9) LHRH dans le traitement d'affections pouvant être liées à la LHRH relevant de la gynécologie et/ou de l'endocrinologie de la reproduction, en particulier dans le traitement de la stérilité et de syndromes liés à la puberté précoce ou retardée. Ces peptides peuvent aussi être utilisés dans le traitement d'affections cancéreuses touchant les gonades (ovaires, testicules) ou les organes sexuels secondaires (glandes mammaires, prostate) et dans le traitement d'affections relevant de la psychiatrie, en particulier des troubles du comportement entraînant une agressivité sexuelle. Ces peptides peuvent aussi être utilisés pour l'exploration fonctionnelle de l'axe hypothalamo-hypophysaire, en particulier par mesure par dosages radioimmunologiques des taux plasmatiques et urinaires de LH, de FSH et de stéroïdes avant et après administration du peptide, ou pour des dosages radioimmunologiques ou biologiques de fluides biologiques et de biopsies de tissus. La présente invention a aussi pour objet des médicaments contenant comme principe actif au moins un de ces peptides et plus particulièrement la (Hyp 9) LHRH, et en particulier des médicaments pour le traitement d'affections pouvant être liées à la LHRH relevant de la gynécologie ou de l'endocrinologie de la reproduction, pour le traitement d'affections cancéreuses touchant les gonades ou les organes sexuels secondaires, ou pour le traitement d'affections relevant de la psychiatrie et en particulier de troubles du comportement entraînant une agressivité sexuelle. De plus, l'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un des peptides précédemment décrits, notamment la (Hyp 9) LHRH en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Ces compositions sont notamment destinées au traitement d'affections pouvant être liées à la LHRH relevant de la gynécologie et/ou de l'endocrinologie de la reproduction, au traitement d'affections cancéreuses touchant les gonades et/ou les organes sexuels secondaires, ou au traitement d'affections relevant de la psychiatrie, en particulier des troubles du comportement entraînant une agressivité sexuelle. Ces compositions peuvent être présentées en vue de l'administration parentérale ou entérale. La présente invention a d'autre part pour objet un procédé de dosage radioimmunologique ou biologique de fluide biologique et de biopsie de tissu caractérisé en ce que sa mise en oeuvre nécessite l'utilisation d'un peptide tel que précédemment décrit. L'invention sera encore illustrée sans être aucunement limitée par les exemples ci-après et notamment par les figures suivantes La Figure 1 représente la spécificité immunologique des trois types d'anticorps N, C, W, dirigés respectivement contre les extrémités N et C de la LHRH et contre la structure tridimensionnelle de la LHRH. La Figure 2 représente les profils d'élution de CLHP sur échangeur de cations (2A) et sur phase inverse (2B) de la mLHRH synthétique et radioactive (125I) qui a été soumise au procédé d'extraction en présence d'hypothalamus de rat. Les positions d'élution de la LHRH non extraite radioactive, de la LHRH non radioactive et de ses fragments N- et C- terminaux sont indiquées. Sur ces deux Figures, l'ordonnée représente la quantité de radio-activité en coups par minute. Les Figures 3 et 4 représentent respectivement les profils d'élution sur colonne de CLHP échangeuse de cations d'extraits hypothalamiques de rat et humain. Les colonnes ont été calibrées comme indiqué respectivement sur la Figure 3A et 4A par de la LHRH de mammifère (mLHRH), de la LHRH de poulet (cLHRH-I), de la LHRH de saumon (sLHRH) et de la LHRH de lamproie (lLHRH). Les Figures 3B et 4B représentent respectivement les chromatographies des extraits de 1000 hypothalamus de rat et de 6 hypothalamus humains. Les pics 1 et 2 des Figures 3B et 4B sont rechromatographiés séparément. Les résultats de ces secondes chromatographies du pic 1 sont représentés sur les Figures 3C et 4C. Des résultats identiques sont obtenus pour le pic 2. Les Figures 3D et 4 représentent la chromatographie des pics B des Figures 3C et 4C. La Figure 5A représente le calibrage de la colonne de CLHP en phase inverse (colonne micro-Bondapak) par la mLHRH synthétique. Les Figures 5B et 5C représentent respectivement l'élution sur colonne micro-Bondapak des pics B des Figures 4C et 3C. Les profils insérés dans des cadres représentent les pics correspondant approximativement à la fraction 40, à une plus grande échelle de représentation. Les Figures 6A et 6B représentent respectivement l'élution sur colonne phényl micro-Bondapak des pics C et D représentés sur la Figure 5C. L'élution de la mLHRH synthétique est représentée sur ces Figures. La densité optique à 280 nm est représentée en ordonnée. Les Figures 7A et 7B représentent respectivement la filtration sur tamis moléculaire de la mLHRH synthétique et des pics C et D de la Figure 5C. La Figure 7C représente quant à elle le volume d'élution (en ordonnée) en fonction du logarithme du poids moléculaire des pics D et C et de différents marqueurs de poids moléculaire. La Figure 8 représente le spectre de masse du pic C représenté sur la Figure 5C. La Figure 9 représente les sites de coupure par la trypsine et la clostripaïne de la mLHRH, de dérivés de la LHRH et du pic C représenté sur la Figure 5C. La Figure 10 représente l'analyse chromatographique sur échangeur de cations et sur phase inverse de molécules de type LHRH après digestion par de la trypsine ou de la clostripaïne. Les résultats présentés sont obtenus avec l'anticorps N. Les Figures lOA à 10E représentent l'analyse chromatographique sur échangeur de cations de la mLHRH (lOA), de la (Hyp 9) LHRH (lOB), de la (Leu 9) LHRH (1OC), de la (Lys 8) LHRH (10D) et du pic C représenté sur la Figure 5C (10E), après digestion par la trypsine (ronds non pleins) ou par la clostripaïne (ronds pleins). Les Figures 10F à 10I représentent l'analyse chromatographique sur phase inverse des fractions 25 à 30 isolées sur colonne échangeuse de cations et générées respectivement pour les Figures 10F à 10I à partir de mLHRH, (Hyp 9) LHRH, (Leu 9) LHRH et du pic C de rat. Dans la Figure lOI, les ronds pleins représentent l'analyse du matériel issu uniquement de la coupure du pic C de rat, et les ronds non pleins correspondent à l'analyse combinée des matériels provenant des coupures du pic C de rat et de la mLHRH. La Figure 11 représente l'analyse chromatographique sur échangeur de cations et sur phase inverse de différentes molécules de type LHRH digérées par la pyroglutamate-aminopeptidase. Les résultats présentés sont obtenus avec l'anticorps C. Les Figures 11A à 11D représentent l'analyse sur colonne échangeuse de cations respectivement de la mLHRH de la (Hyp 9) LHRH, de la (Leu 9) LHRH et du pic C de rat. Les Figures 11E à 11H représentent l'analyse en chromatographie sur phase inverse des fractions 25 à 29 isolées sur colonne échangeuse de cations et générées respectivement pour les Figures 11E à 11H à partir de mLHRH, (Hyp 9) LHRH, (Leu 9) LHRH et du pic C de rat. Pour la Figure 11H, les ronds pleins représentent l'analyse du matériel issu uniquement de la coupure du pic C de rat, et les ronds non pleins correspondent à l'analyse combinée des matériels provenant de la coupure du pic C de rat de la (Hyp 9) LHRH. La Figure 12 représente l'élution en chromatographie des pics C humain et de rat et de la (Hyp 9) LHRH. Sur ces Figures, les ronds pleins représentent l'élution du pic C de rat et les ronds non pleins représentent l'élution de la (Hyp 9) LHRH. L'élution de la mLHRH est également indiquée par une flèche. Les Figures 12A, 12B, 12C représentent respectivement l'élution après les stades de purification 1, 2 et 3, tandis que la Figure 12E représente l'élution du pic C de rat en présence de (Hyp 9) LHRH après l'étape de purification 3, et la Figure 12D représente 1'élution du pic C humain après l'étape de purification 3. La Figure 13 représente le diagramme des opérations ayant mené à l'isolement de la (Hyp 9) LHRH. La Figure 14 représente la variation de la secrétion de FSH ou de LH, exprimée en (ng/ml), en fonction du logarithme de la concentration en LHRH ou en (Hyp 9) LHRH exprimée en mole/l. EXEMPLE 1 : Obtention et purification des peptides de type LHRH 1. Procédé d'extraction des tissus 6000 hypothalamus de rat ont été collectés à partir des deux sexes (60 % de femelles, 40 % de mâles) durant 1 an sur de la carboglace puis lyophilisés et stockés à - 800C. Parallèlement, des hypothalamus de rat frais ont été immédiatement extraits, testés pour leur contenu en molécules de type LHRH et chromatographiés de la même façon que les tissus lyophilisés. De plus 6 hypothalamus humains des deux sexes (5 femmes, 1 homme) ont été collectés un jour après leur mort. Chez le rat, l'extraction se fait selon la méthode suivante appelée "procédé d'extraction combinée". Pour chaque extraction, 1000 hypothalamus de rat, d'un poids sec compris entre 12 + 0,05 grammes ont été homogénéisés (10 % poids/volume) dans de l'acide acétique 2 M (HOAc) à 40C à l'aide d'un broyeur en "Teflon" et d'un homogénéiseur en verre. L'homogénat est centrifugé à 30 000 g pendant 90 minutes. Le surnageant est stocké puis mélangé avec le surnageant obtenu après centrifugation à 30 000 g pendant 60 minutes du culot resuspendu dans HAc 2 M (la moitié du volume de l'homogénat initial). Les surnageants mélangés sont ensuite congelés à sec, puis lyophilisés. Les lyophilisats sont resuspendus (la moitié de l'homogénat initial) à 40C avec de l'acide acétique 2 M dans du méthanol (MeOH) à 70 % (volume/volume), puis centrifugés à 10 000 g durant 90 minutes. Le surnageant résultant est ensuite mélangé comme précédemment avec le volume de lavage du culot. Le méthanol est ensuite éliminé des surnageants en utilisant un évaporateur sous vide rotatif à une température maximale de 300C. Les extraits restants sont dilués dans de l'eau froide, congelés puis lyophilisés et stockés à - 800C sous la forme d'échantillons correspondant chacun à 200 hypotalamus. La totalité du matériel humain (6,5 grammes en poids sec) a été extraite selon la méthode décrite cidessus. Les résultats du tableau 1 montrent que la récupération de molécules détectables par des anticorps anti LHRH est la plus importante après extraction des tissus avec de l'acide acétique 2 M. L'extraction par le méthanol à 70 % est aussi très efficace. Dans tous les cas, la quantité de matériel immunoréactif de type LHRH est systématiquement plus importante (12 à 30 %) avec l'anticorps N, par comparaison avec les évaluations obtenues dans les deux autres tests radio-immunologiques (W et C). Les résultats du procédé d'extraction combinée sont rassemblés dans le tableau 2. Pour les hypothalamus humains et de rat, l'anticorps N détecte toujours plus de matériel immunoréactif que les deux autres anticorps après extraction combinée avec de l'acide acétique 2 M et par un mélange d'acide acétique 2 M et de méthanol à 70 %. L'étape d'extraction par le méthanol est nécessaire seulement du fait de l'élimination des contaminations protéiques. De plus, le contenu en molécules de type LHRH dans l'hypothala- mus de rat est identique dans les tissus frais ou lyophilisés. Une étude comparative n'est pas possible avec le matériel humain en raison de la faible quantité de tissu disponible. Le tableau 3 montre la récupération de la radioactivité associée à la LHRH marquée à l'iode 125I (1251 LHRH) ajoutée au tissu avant l'extraction combinée par de l'acide acétique 2 M et du méthanol à 70 %. La radioactivité est retrouvée avec un rendement de 90 % dans le surnageant. Elle est exclusivement associée avec les molécules de LHRH comme l'indiquent les chromatographies sur échangeur de cations et sur phase inverse de la Figure 2. Aucun pic radio-actif supplémentaire n'est observé. 2. Procédé de purification par CLHP L'ensemble du procédé est contrôlé à l'aide d'un équipement CLHP Gilson (France). a) Première étape : CLHP par échange de cations L'extrait total d'hypothalamus humain ou un échantillon correspondant à 200 hypothalamus de rat est resuspendu dans 50 ml d'un tampon d'acétate d'ammonium 20 mM (NH4Ac), à pH 4,10, contenant 30 % (volume/volume) d'acétonitrile (CH3CN) (tampon de départ), puis centrifugé à 30 000 g durant 30 minutes. Le surnageant est chromato graphié sur une colonne préparative TSK SP 5 PW (21,5 X 300 mm, LKB). Après une période de lavage de 60 minutes, l'élution est réalisée avec un gradiant de 120 minutes allant du tampon de départ jusqu'à 15 % de tampon d'acétate d'ammonium 200 mM, à pH 4,1 contenant 30 % d'acétonitrile. Le débit est de 2 ml par minute et des fractions de 4 ml sont collectées. Une boucle de 10 ml est utilisée pour les injections. Le matériel immunoréactif élué par cinq passages, correspondant à une quantité totale de 1000 hypothalamus de rat est séparé en deux groupes (groupes 1 et 2). Le matériel immunoréactif résultant co-éluant avec la LHRH synthétique (pic B) est rechromatographié sur la même colonne puis est lyophilisé et stocké à - 800C. Ce mode opératoire est répété six fois (six fois 1000 hypothalamus de rats). Le même mode opératoire est appliqué aux tissus humains. La chromatographie de différentes quantités de mLHRH synthétique génère un seul pic immunoréactif qui est clairement séparé aussi bien des fragments N- et C- terminaux de la LHRH ou des autres séquences LHRH connues comme le montrent les Figures 3A et 4A. Ce pic est détecté de la même manière par les trois anticorps. Sur les Figures 3 et 4, les profils d'immunoréactivité avec l'anticorps W ne sont pas indiqués pour éviter la confusion. Ces profils sont identiques à ceux obtenus avec l'anticorps C. Au cours du premier passage et dans les conditions d'élution utilisées, les matériels de type LHRH aussi bien humains que de rats éluent en un seul pic large qui est mieux reconnu par l'anticorps N que par les anticorps C ou W comme le montrent les Figures 3B et 4B. Ce pic ne co-élue pas parfaitement avec la mLHRH synthétique et ne co-élue pas avec d'autres molécules de type LHRH connues ou avec des fragments N et C terminaux de la mLHRH. Les chromatographies secondaires des groupes 1 et 2 des larges pics initiaux génèrent deux pics immunoréactif s étroits (les pics A et B) comme le montrent les Figures 3C et 4C. Le pic A élue avant la mLHRH synthétique et est exclusivement reconnu par l'anticorps C. La caractérisation de ce pic n'a pas été réalisée. Par contre, le pic B co-élue de manière parfaite avec la mLHRH synthétique mais est mieux reconnu par l'an- ticorps N que par les deux autres anticorps. La chromatographie répétée du pic B génère un seul pic, qui co-élue avec la mLHRH synthétique comme montré sur les Figures 3D et 4D. Ce pic est toujours mieux détecté par l'anticorps N que par les autres anticorps. b) Etape 2 : Chromatographie CLHP en phase inverse sur colonne micro-Bondapak Les pics B lyophilisés, issus de l'étape I et correspondant à la totalité des tissus humains et de rats extraits, sont resuspendus respectivement dans 2 ml et 10 ml d'une solution à 15 % (volume/volume) d'acétonitrile dans de l'eau contenant 0,1 % (volume/volume) d'acide trifluoroacétique (TFA) puis chromatographiés sur une colonne micro Bondapak C18 (3,9 X 300 mm, Waters). Les matériels humains et de rats sont fractionnés respectivement par un et cinq passages sur colonne. Après un lavage de 11 minutes, l'élution est effectuée durant 60 minutes avec un gradient allant de 15 à 25 % d'acétonitrile dans de l'eau contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique. Le débit est de 1 ml par minute et des fractions de 0,5 à 1 ml sont collectées. Une boucle de 2 ml est utilisée pour les injections. Comme le montre la Figure 5A, la mLHRH synthétique génère un simple pic immunoréactif qui est détecté de la même manière par les trois anticorps. Aucun pic additionnel n'est détecté. Dans les mêmes conditions d'élution, le pic B humain ou de rat, issu de la colonne à échange de cations, génère deux pics, les pics C et D représentés sur les Figures 5B et 5C. Un lavage avec 100 % d'acétonitrile ne permet pas de détecter d'autres pics immunoréactifs. Le pic C est élué avant la mLHRH synthétique. Des conditions d'élution plus rapides ou le passage de quantités importantes de matériel affectent la détection de ce pic. Le pic C est mieux détecté par l'anticorps N que par les deux autres anticorps. Cependant, la détection par les anticorps C et W est identique. Le pic D co-élue avec la mLHRH synthétique. Il est détecté de la même manière par les trois anticorps. Les pics C et D représentent respectivement pour l'anticorps N 12 % et 88 % de l'immunoréactivité totale des molécules de type LHRH récupérées sur la colonne micro Bondapak, par comparaison aux 4 % et 96 % pour les anticorps C et W. La même distribution est observée dans des fractions préparées à partir d'hypothalamus de rat et d'homme comme indiqué sur le tableau 4. c) Etape 3 : Chromatographie en phase inverse sur colonne phényl micro-Bondapak. Seul le matériel immunoréactif obtenu à partir d'hypothalamus de rats est soumis à cette étape. Les pics immunoréactif s (pics C et D) isolés durant l'étape 2 sont respectivement resuspendus en totalité avec 3 à 4 ml d'acétonitrile à 14 et 15 % (volume/volume) dans de l'eau contenant 0,1 % de TFA. Les pics resuspendus C et D sont ensuite respectivement chromatographiés par trois et quatre passages sur une colonne phényl micro-Bondapak (3,9 X 150 mm, Waters). Après 5 minutes de lavage, l'élution est effectuée durant 60 minutes à l'aide d'un gradient allant de 14 à 15 % (pic C) et 15 à 16 % (pic D). Le débit est de 1 ml par minute et des fractions de 0,5 à 1 ml sont collectées. Une boucle de 1 ml est utilisée pour les injections. Comme montré sur la Figure 6A, le pic C de rat est élué en un seul pic qui est toujours mieux reconnu par l'anticorps N que par les deux autres anticorps. Le pic d'immunoréactivité correspond de manière parfaite avec le pic W. La mLHRH synthétique est éluée plus tard dans ces conditions de chromatographie. Le pic D est aussi élué en un seul pic (Figure 6B) mais dans ce cas, il est toujours co-élué avec la mLHRH synthétique et sa détection est toujours identique avec les trois anticorps. Le pic d'immunoréactivité correspond aussi de manière parfaite avec le pic W. Le tableau 5 montre les données correspondant aux résultats des différentes chromatographies. Les pics C et D sont purifiés 75 000 fois et 78 000 fois respectivement à la suite de la chromatographie sur phényl micro-Bondapak. 3) Contrôle de l'extraction et des procédés chromatoqra phiques : Des quantités identiques d'hypothalamus de rat des deux sexes (15 femelles et 15 mâles) sont homogénéisées dans différents milieux d'extraction : acide chlorhydrique 0,2 M ; 0,1 % (volume/volume) de TFA dans de l'eau ; 70 % (volume/volume) de méthanol dans de l'eau ; acide acétique 0,2 M et 2 M d'acide acétique, et acide acétique 2 M et 70 % de méthanol. Dans cette dernière condition d'extraction, la mLHRH synthétique (entre 2 et 4 microgrammes) est aussi ajoutée avant l'homogénéisation des tissus. La présence de matériels de type LHRH est vérifiée dans les différents extraits bruts et dans les fractions obtenues sur colonne CHLP dans les conditions de chromatographie de l'étape 2. La récupération de la 125I LHRH est aussi vérifiée au cours d'extractions par de l'acide acétique 2 M et 70 % de méthanol. La LHRH synthétique radioactive est introduite dans le milieu avant l'homogénéisation des tissus. La radioactivité est suivie au cours de l'extraction et identifiée dans les deux systèmes de chromatographie CLHP. La première étape est similaire à l'étape 1 à la différence qu'une colonne échangeuse de cations TSK SP-5 PW (7,5 X 74 mm, LRB) est utilisée à la place de celle utilisée dans l'étape 1. Dans ce cas, l'élution est mise en oeuvre durant 60 minutes avec un gradient allant du tampon de départ à 20 % d'un tampon d'acétate d'ammonium 200 mm, à un pH 4,10 contenant 30 % d'acétonitrile. Le débit est de 1 ml par minute et des fractions de 1 ml sont collectées. Le second système CHLP est celui de l'étape 2. Toutes les étapes de chromatographie sont calibrées avec la mLHRH synthétique. Les quantités de mLHRH synthétique utilisées pour ces calibrages sont identiques à celles utilisées pour les matériels de type LHRH endogène. Le calibrage est aussi effectué avec de la LHRH I de saumon, de lamproie et de poulet, ainsi qu'avec des fragments N et C terminaux de la mLHRH. Après utilisation, toutes les colonnes sont lavées avec de I'acétonitrile à 100 % (pour les colonnes en phase inverse) et avec des solutions de 0,2 M en soude, 2 M en acide acétique et à 60 % d'acétonitrile dans de l'eau (pour les colonnes d'échange de cations). De plus, chaque étape de purification est précédée par un passage à blanc dans lequel le tampon de départ est injecté à la place de l'échantillon afin d'éviter toute contamination. 4) Récupération des pics C et D de rat après divers modes d'extraction A la différence de I'imnzunoréactivité des molécules de type LHRH qui a été décrite précédemment comme dépendante de la procédure d'extraction (tableau 1), le rapport des pics C et D reste constant après chromatographie sur phase inverse et ce indépendamment du milieu initial d'extraction utilisé (tableau 6). L'addition de mLHRH synthétique dans des quantités correspondant au contenu en LHRH de 300 à 600 hypothalamus de rat durant l'homogénéisation selon la méthode d'extraction combinée (2 M d'acide acétique et 70 % de méthanol) n'affecte pas l'immunoréactivité du pic C par comparaison à celle évaluée en l'absence de mLHRH synthétique éxogène. Par comparaison, l'immunoréactivité du pic D est considérablement augmentée après l'addition de peptide synthétique. 5) Description des tests de détection par radio immunolo qie (RIA) des molécules de tvpe LHRH Des aliquotes des extraits bruts et des fractions de CLHP obtenues sur colonne CHLP ainsi que de la mLHRH synthétique pour les courbes standard, sont lyophilisées en présence de 100 microlitres d'un tampon RIA (50 mM d'un tampon phosphate Na/Na2, pH 7, contenant 0,9 % (poids/ volume) de NaC1 et 0,1 % (poids/volume) de gélatine afin d'éviter l'absorbtion de matériel immunoréactif. Les échantillons lyophilisés sont resuspendus en présence d'un des trois anticorps et testés contre la LHRH monoiodée par l'iode 125 I comme décrit précédemment (Gautron et al. 1989, Placenta, 10, 19-35). Le test RIA est mis en oeuvre avec quelques modifications selon la méthode de Nett et al. (1973) Clin. Endocrinol. Métab. 36, 880-885). Les incubations sont réalisées en présence de 100 microlitres de sérum de lapin normal (dilution 1,60) et 10 microlitres d'un indicateur de pH (solution indicatrice universelle, pH 4-10, Merck) pour vérifier la présence de substances interférentes au niveau du pH dans les extraits bruts et les fractions collectées à partir de chromatographie CLHP. Le complexe antigèneanticorps est précipité avec 1 ml d'éthanol absolu après 48 heures de réaction à 40C. EXEMPLE 2 : Caractérisation des pics obtenus dans l'Exem ple 1 1) Filtration sur tamis moléculaire Les peptides purifiés et élués dans les pics C et D de rat sont resuspendus dans 200 jil de tampon acétate d'ammonium 20 mM, pH 4,2 contenant du chlorhydrate de guanidine 6 M. Ces peptides sont ensuite chromatographiés en condition CLHP sur une colonne TSK G 2000 SW (7,5 X 300 mm, Interchim.) éluée avec le même tampon utilisé pour la resuspension des échantillons. Le débit de la colonne est de 0,5 ml par minute et le volume des fractions collectées est de 0,1 à 0,5 ml. Une boucle de 200 microlitres est utilisée pour l'injection. La guanidine est éliminée des fractions collectées par passage sur cartouches SEP PAK C 18 (Waters). La colonne est calibrée avec de la mLHRH et des fragments N- et C- terminaux ainsi qu'avec les peptides suivants : le peptide vaso-actif intestinal (VIP), la béta endorphine humaine, le neuropeptide Y (NPY), les somatostatines-14 et-28, les angiotensines humaines 1 et 2 et la beta casomorphine (1, 4) amide. La Figure 7 représente les profils d'élution des pics C et D de rat. Après plusieurs chromatographies, les poids moléculaires des deux peptides élués dans les pics C et D sont estimés entre 1086 et 1188 Daltons. 2) Spectre de masse 420 picomoles du peptide du pic C de rat sont dissous dans un mélange de dithiothréitol et de dithioerythritol (5:1 en poids) pour analyses (Néosystème Laboratoires) et le pic a été analysé entre 1000 et 1400 m/z. Les résultats de la Figure 8 représentent le spectre de masse obtenu. Une intensité à 1198,8 m/z correspond à la masse du peptide élué dans le pic C. - Dans les mêmes conditions expérimentales, la masse du peptide synthétique mLHRH est déterminée à 1182,8 m/z. Le peptide contenu dans le pic C de rat et le peptide synthétique LHRH peuvent être considérés comme différents de 16 Daltons. 3) Analyse de la composition en amino-acides Cent picomoles de peptides purifiés et élués dans les pics C et D de rat sont hydrolysées dans de l'acide chlorhydrique 6 M à 1100C pendant 22 heures en l'absence d'acide mercapto-sulfonique. Les hydrolysats sont séchés et les acides aminés sont déterminés par la méthode PITC (Phenyl Iso Thio Cyanate). L'analyse des amino-acides montre que le peptide élué dans le pic D correspond à la mLHRH (tableau 7). L'analyse est moins claire pour le pic C en raison d'une contamination importante. Une comparaison entre la composition en amino-acides des pics C et D suggère que leur composition est à peu près similaire. La différence principale concerne l'absence apparente de proline dans le peptide du pic C, tandis qu'elle pourrait au contraire contenir une leucine et/ou une sérine additionnelle. La différence de masse (16,04 daltons) due au remplacement de la proline par la leucine est la valeur la plus proche de la différence de masse (16 daltons)-entre le poids moléculaire obtenu par spectromètrie de masse à partir du peptide dont le poids moléculaire est déterminé (1188,8 daltons) et la mLHRH (1182,8 daltons). Cependant, la correspondance parfaite est obtenue seulement par le remplacement de la proline par une hydroxyproline (Hyp) qui élue à proximité de la sérine lors de l'analyse des aminoacides. Ceci peut expliquer le haut niveau de sérine dans l'analyse de ce peptide. Dans le cadre de la présente invention, on a donc synthétisé la (Leucine 9) LHRH et la (Hyp 9) LHRH et comparé leur sensibilité à la digestion enzymatique ainsi que leur comportement en chromatographie par comparaison avec le peptide endogène élué dans le pic C. 4) Synthèse des (Hvp 9) LHRH et (Leu 9) LHRH : Des séquences de type LHRH ont été synthétisées par les Laboratoires Neosystem. La pureté des peptides est vérifiée par CLHP et confirmée par analyse des acides aminés. La synthèse de la HYP-9-LHRH est effectuée avec de la 4-hydroxyproline. 5) Disestion enzvmatique 5 ng de mLHRH synthétique, de (Lys 8) LHRH, de (Leu 9) LHRH et de (Hyp 9) LHRH ainsi que de peptide de rat purifié sont digérés par 0,25 ng de trypsine (7500 à 9000 unités par mg de protéine) traitée par du DPCC (chlorure de diphénylcarbamyle), ou par 10 ng de clostripaïne (215 unités par mg de protéine) ou par 5 mg de pyroglutamate aminopeptidase ( PGA) (160 unités par mg de protéine). Les réactions de digestion sont effectuées dans 50 microlitres de tampon phosphate Na/Na2 25 mM, à pH 7,5, et contenant soit 2,5 mM de dithiothreitol (DTT) pour la clostripaïne ou 2,5 mM de DTT et 2 mM d'acide tétraacétique éthylènediamine dans le cas de la digestion par la pyroglutamate aminopeptidase. Les temps de réaction sont 180, 120 et 25 minutes pour la trypsine, la clostripaïne et la pyroglutamate aminopeptidase. Ces réactions sont stoppées par chauffage à 9O0C. Les produits des digestions sont chromatographiés sur la colonne CLHP échangeuse d'ions décrite précédemment. Pour les produits de digestion par la trypsine et la clostripaine, l'élution est effectuée durant 60 minutes avec un gradient allant du tampon de départ jusqu'à 20 % d'un tampon contenant 200 mM d'acétate d'ammonium, pH 4,10, et 30 % d'acétonitrile. Le produit de la digestion par la PGA est élué durant 30 minutes avec un gradient allant de 50 à 70 % en acétate d'ammonium à 200 mM, pH 4,10, contenant 30 % d'acétonitrile dans le tampon de départ. Les fragments peptidiques isolés sont ensuite analysés sur une colonne Novapak (7,5 X 75 mm, Waters) avec un gradient durant 30 minutes allant de 15 à 20 ou 25 % en acétonitrile dans de l'eau contenant 0,1 % de TFA. Le débit est de 1 ml par minute et les fractions collectées sont de 0,5 ml. Les résultats de ces digestions sont les suivants : la trypsine coupe la liaison peptidique au niveau du groupement carboxyle des résidus arginine et lysine, à l'exception des séquences Arg-pro (ou Hyp) et Lys-pro (ou Hyp), la première de ces séquences étant seulement sensible à la clostripaïne. Dans ces conditions expérimentales la trypsine et la clostripaine coupent la liaison peptidique de l'arginine dans différents peptides synthétiques de type mLHRH à l'exception de la Lys-8-LHRH et coupe aussi le peptide enogène élué dans le pic C (peptide du pic C) qui peut ou non générer le fragment commun (1-8)m LHRH. Les coupures sont indiquées sur la Figure 9. La mLHRH synthétique, les (Hyp 9) LHRH et (Lys 8) LHRH ainsi que le peptide du pic C ne sont pas hydrolysés par la trypsine. Par contre, la (Leu 9) LHRH génère un fragment N-immunoréactif, qui a un comportement chromatographique identique à celui des fragments N-terminaux de la LHRH sur colonne échangeuse de cations comme montré sur la Figure 10. Après digestion par la clostripaïne, une N immunoréactivité comparable est obtenue à partir des molécules synthétiques de LHRH et à partir du peptide du pic C avec une exception pour la (Lys 8) LHRH. L'analyse en chromatographie sur phase inverse qui suit montre que ces N-immunoréactivités résultant de l'hydrolyse correspondent à un peptide commun qui co-élue avec la (1-8) mLHRH synthétique, ce qui indique que les coupures dans les séquences ont lieu exclusivement après l'arginine. La digestion par la pyroglutamate amminopeptidase de la mLHRH, de la (Hyp 9) LHRH, et de la (Leu 9) LHRH génère une immunoréactivité C qui a un comportement chromatographique identique à celui de la (2-10) mLHRH synthétique, qui est bien séparée des autres fragments LHRH Cterminaux sur colonne échangeuse de cations, comme montré sur la Figure 11. Une C immunoréactivité comparable est générée par le peptide du pic C. Une analyse chromatographique sur phase inverse montre que l'immunoréactivité C générée à partir de la mLHRH co-élue avec la (2-10) mLHRH synthétique, ce qui indique que la coupure a lieu exclusivement au niveau de la liaison pyro Glul-His2 dans les conditions expérimentales précédemment décrites. Au contraire, les immunoréactivités C générées à partir de (Hyp 9) LHRH et de (Leu 9) LHRH correspondant aux fragments respectifs (2-10) éluent respectivement avant et après la (2-10) mLHRH synthétique. D'autre part, l'immunoréactivité C générée à partir du peptide du pic C co-élue avec le produit d'hydrolyse de (Hyp 9) LHRH. 6) Comportements chromatoqraphiques du peptide du pic C et de la (Hvp 9! LHRH Les comportements chromatographiques du peptide du pic C de rat et de la (Hyp 9) LHRH ont été trouvés strictement identiques à différentes étapes du procédé de purification. Dans tous les cas le peptide endogène de rat ainsi que le peptide synthétique éluent à la même position comme un pic simple quand ils sont chromatographiés séparément, comme on peut le voir sur les Figures 12. Les Figures 12A, 12B et 12C correspondent aux peptides résultant des étapes de purification 1, 2 et 3. Le même résultat est obtenu avec le pic humain C dans les conditions de l'étape 3 (Figure 12D). La co-élution est confirmée quand le pic C de rat et la (Hyp 9) LHRH sont chromatographiés ensemble (Figure 11E). Dans ces deux exemples, la détermination de la concentration de protéines est effectuée selon Lowry et al. [(1951) J. Biol. Chem. 193, 165-275]. Les résultats précédents montrent sans ambiguité la présence de deux molécules de type LHRH dans les extraits d'hypothalamus aussi bien murins que humains : la LHRH de mammifère, déjà connue, et la (hydroxyproline 9) LHRH qui n'avait pas été mise en évidence. D'autre part, les contrôles effectués au cours de ces manipulations ont montré que la (hydroxyproline 9) LHRH n'était pas due à une transformation de la LHRH durant les manipulations, mais pré-existait dans les extraits. Ceci a été notamment mis en évidence lors de la chromatographie de LHRH pure et synthétique. Les résultats obtenus en spectrométrie de masse, par mesure du poids moléculaire, et après coupure par la trypsine, la clostripaïne ou la pyroglutamate amminopeptidase ont confirmé que cette deuxième forme de molécule du type LHRH est bien une (hydroxyproline 9) LHRH. EXEMPLE 3 : Activité biologique de la (Hvp 9) LHRH Dans des systèmes in vitro utilisant des cellules hypophysaires dispersées, la (Hyp 9) LHRH induit la libération de LH et de FSH en proportions comparables à celles de la LHRH elle-même. En concentration molaire, l'activité de la (Hyp 9) LHRH sur les sécrétions hypophysaires, de même que celle calculée sur le récepteur de la LHRH par mesure du déplacement de la LHRH radioactive par l'iode 125I liée à des préparations de membranes hypophysaires, est quinze fois plus faible que celle de la LHRH. Cette moindre activité apparente est cependant compensée par une biodisponibilité prolongée. La Figure 14 représente la variation de la secrétion de FSH ou de LH, exprimée en (ng/ml) en fonction du logarithme de la concentration en LHRH ou en (Hyp 9) LHRH exprimée en mole/l. Les études préliminaires réalisées sur l'activité biologique de la (Hyp 9) LHRH ont en effet permis de mettre en évidence une notable résistance de ce peptide vis-à-vis des enzymes de dégradation qui inactivent très rapidement la LHRH elle-même. Cette résistance tient à la configuration particulière de la (Hyp 9) LHRH dans sa portion C-terminale, qui en fait un mauvais substrat de la PPCE (post prolinecleaving enzyme ou enzyme effectuant un coupure après la proline). Cette résistance entraîne une augmentation importante de la demi-vie de la (Hyp 9) LHRH par rapport à la LHRH et donc de ses propriétés pharmacocinétiques. Dans des modèles in vivo, il a ainsi pu être montré que l'élévation des taux de LH plasmatique se maintient plus longtemps après administration de (Hyp 9) LHRH que de LHRH.En parallèle, des doses comparables des deux peptides entraînent une stimulation gonadotrope de même amplitude et ce bien que l'affinité de (Hyp 9) LHRH pour son récepteur soit moindre que celle de la LHRH. En revanche, dans d'autres tissus (notamment l'ovaire), le déplacement de la liaison de la LHRH à son récepteur peut être obtenu avec des concentrations équimolaires de LHRH et de (Hyp 9) LHRH. Ces données, ainsi que celles obtenues sur l'existence d'une hétérogénéité des récepteurs de la LHRH qui serait exprimée dans certains tissus (hypophyse) et pas dans d'autres (cerveau, ovaire) suggèrent que la (Hyp 9) LHRH est un ligand sélectif d'une des isoformes du récepteur. Les indications cliniques potentielles de la (Hyp 9) LHRH relèvent de la gynécologie et de l'endocrinologie de la reproduction. Les principaux avantages de cette molécule, par rapport à la LHRH, tiennent de sa biodisponibilité. Une activité réduite par rapport à celle de la LHRH, associée à une demi-vie prolongée, sont des éléments positifs pour des stimulations progressives de la fonction gonadotrope, en maîtrisant mieux le risque d'hyperstimulation. TABLEAU 1 TAUX DE MOLECULES DE TYPE LHRH DANS DES HYPOTHALAMUS DE RAT APRES EXTRACTION PAR DIVERSES PROCEDURES pg LHRH / hypothalamus C/N % W/N % Extraction(1) ANTICORPS-N % ANTICORPS-C % ANTICORPS W % (2) (2) (2) 2 M HOAc 5,924#138 100 5,236#210 100 3,973#134 100 88 67 0,2 M HOAc 4,087#134 69 5,560#131 68 2,848#94 72 87 70 0,2 M HCl 4,206#112 71 3,716#188 71 2,980#102 75 88 71 0,1 % TFA dans 4,265#156 72 3,770#100 72 3,155#125 79 88 74 H2O 70 % MeOH 4,875#78 82 4,300#112 82 3,377#108 85 88 69 (1) exctractions effectuées sur des groupes d'hypothalamus lyophilisés de 15 males et de 15 femelles (2) moyenne # écart type sur 3 extractions. TABLEAU 2 TAUX DE MOLECULES DE TYPE LEHR DANS DES HYPOTHALAMUS DE RAT ET HUMAIN APRES EXTRACTION COMBINEE Tissu pg LHRH/hypothalamus mg proteine/hypothalamus ANTICORPS-N ANTICORPS-C ANTICORPS-W RAT (TISSU FRAIS) (1) (1) 2M HOAc 6,600#255 4,855#227 N.T. N.T. 2M HOAc, 70 % MeOH 6,694#245 4,940#210 N.T. N.T. RAT (Tissu lyophilisé) (1) (1) (1) 2M HOAc 6,589#3634 5,436#378 4,842#185 2,515#0,095 2M HOAc, 70 % MeOH 6,680#314 5,110#116 4,864#116 0,530#0,040 mg LHRH/hypothalamus HOMME (TISSU LYOPHILISE) (2) (2) (2) 2M HOAc 45 36 33 32 2M HOAc, 70 % MeOH 48 38 34 7 (1) MOYENNE # écart type calculé sur 6 extractions (2) valeurs corresondant à une extraction N.T. = non testé. TABLEAU 3 RECUPERATION DE LA RADIOACTIVITE LIEE A LA m LHRH SYNTHETIQUE APRES EXTRACTION EN PRESENCE D'HYPOTHALAMUS DE RAT RADIOACTIVITE % CPM/VOLUME TOTAL PREMIERE ETAPE DE L'EXTRACTION (2M HOAc) (1) HOMOGENAT 230 500 + 3898 100 SURNAGEANT 221 200 + 5354 96 CULOT 1 153 + 165 0,5 DEUXIEME ETAPE D'EXTRACTION (2M HOAc/70% MeOH) (1) HOMOGENAT 215 600 + 4565 100 SURNAGEANT 215 208 + 3995 98 CULOT 861 = 132 0,4 (1) MOYENNE + ECART-TYPE SUR 5 EXTRACTIONS TABLEAU 4 DISTRIBUTION DES MOLECULES DE TYPE LHRH LORS DE LA CHROMATOGRAPHIE CLHP EN PHASE INVERSE A PARTIR DES PICS B HUMAIN ET DE RAT G LHRH (1) ANTICORPS-N % ANTICORPS-C % ANTICORPS W % Rat TOTAL (pics C et D) 24,200 100 22,300 100 22,340 100 pic C 2,880 12 0,940 4 0,960 4 pic D 21,320 88 21,360 96 21,380 96 ng LHRH (2) HUMAIN TOTAL (pics C et D) 38,240 100 35,450 100 35,468 100 pic C 4,200 11 1,450 4 1,418 4 pic D 34,040 89 34,000 95 34,050 95 (1) Valeurs correspondant à l'extraction de 6000 hypotalamus de rats. (2) Valeurs correspondant à l'extraction de 6 hypothalamus humains. note : les mêmes résultats sont observés à partir d'hypothalamus frais de rat. TABLEAU 5 DONNEES SUR LES PROCEDES DE PURIFICATIONS degré de LHRH(1) % mgProteine gLHRH/mg Prot. purification(2) EXTRAIT 2M HOAc, 70% MeOH 40,164 100 3180(3) 0,013 1 Echangeur de cations (étape 1) Pic B 25,160 65 0,6530(3) 38,530 2 964 Bondapak (étape 2) Pic C 2,880 7 0,0170(4) 169,410 13 032 Pic D 21,320 53 0,0640(4) 333,125 25 625 Phényl Bondapak (étape 3) Pic C 2 350 6 0,0024(4) 975,167 75 090 Pic D 19 188 48 0,0190(4) 1010 77 690 (1) Immunoréactivité N pour la totalité de l'extrait d'hypothalamus de rat (2) rapport g LHRH/mg proteine de l'étape donnée de purification per rapport à l'extrait brut (3) quantités mesurées de proteines (4) quantités estimées de protéines selon les spectres UV TABLEAU 6 RECUPERATION DES PICS C ET D DE RATS APRES CHROMATOGRAPHIE CLHP SUR PHASE INVERSE (Etape 2) APRES DIFFERENTES PROCEDURES D'EXTRACTION DES TISSUS ng de molécules de type LHRH/fraction totale collectée (1) Extraction PIC C % PI D % PIC C + PIC D % (2) (2) (2) 2M HOAc/70% MeOH 25#0,15 19 106#0,50 81 131#0,42 100 (100%) (100%) (100%) 0,2M HOAc 17#0,09 18 76#0,35 82 93#0,030 100 (68%) (71%) (71%) 0,2M HCl 18#0,11 18 81#0,31 82 99#0,25 100 (72%) (76%) (76%) 0,1 % TFA 18#0,07 17 88#0,40 83 106#0,29 100 (72%) (83%) (81%) 70% MeOH 21#0,12 19 89#0,45 81 110#0,32 100 (84%) (81%) (84%) 2M HOAc/70% MeOH 24#0,10 1,2 1995#2,50 98,8 2019#1,85 100 et 2 g mLHRH (3) (96%) (1882%) (1541%) 2M HOAc/70% MeOH 24#0,13 0,06 4090#2,75 99,4 4114#2,00 100 et 4 g mLHRH (3) (96%) (3858%) (3140%) (1) Immunoréactivité N des fractions collectées correspondant à la chromatographie d'extraits de 28 hypotalamus de rate (14 males, 14 femelles) (2) moyenne # écart type (3) la m LHRH synthétique a été ajoutée au milieu d'extraction avant homogénéisation des tissus. TABLEAU 7 COMPOSITIONS EN ACIDES-AMINES DES PEPTIDES ELUES DANS LES PICS C ET D DE RATS DANS LES CONDITIONS DE L'ETAPE 3 Résidu Pic C Pic D (PIC C- PIC D) Arg 1,16 0,96 (1) + 0,20 Ser 1,71 0,97 (1) + 0,74 Glx 1,18 0,83 (1) + 0,35 Gly 2,22 2,09 (2) + 0,13 Tyr 0,82 0,80 (1) + 0,02 Pro 0,23 1,08 (1) - 0,85 Leu 2 1 (1) + 1 His 0,98 0,96 (1) + 0,02 Trp N.D. N.D. N.D. Thr 0,14 - + 0,14 Ala 0,30 - + 0,30 Val 0,27 - + 0,27 Phe 0,19 - +0,19 Ile 0,16 - +0,16 N.D. non détectable - Les valeurs données sont des rapports molaires. Les nombres entre-parenthèses pour les pics D sont les rapports entiers les plus proches. Les résidus Trp sont détruits dans les conditions d'hydrolyse décrites dans le texte. REVENDICATIONS 1. Peptide présentant une homologie importante de séquence avec la LHRH caractérisé en ce qu'il présente une forte réactivité vis-à-vis d'anticorps dirigés contre l'extrémité N-terminale de la LHRH et une faible réactivité vis-à-vis d'anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale de la LHRH ou dirigés contre des déterminants antigéniques liés à la structure tridimensionnelle tertiaire de la LHRH, par comparaison avec les réactivités respectives de la LHRH. 2. Peptide selon 1A revendication 1, caractérisé en ce qu'il possède la séquence suivante d'acides aminés en configuration L pour les résidus 1 à 5 et 7 à 9. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pyroGLU-HIS-TRP-SER-TYR-X-LEU-ARG-HYP-Y 3. Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que X représente un résidu -GLY. 4. Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que Y représente un résidu -GLY-CO-NH2. 5. Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que Y représente un groupement éthylamide. 6. Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que X représente un résidu D-ALA, D-SER, D-TRP ou D HIS. 7. Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il possède en spectromètrie de masse une bande correspondant à un poids moléculaire d'environ 1198,8 Da. 8. Peptide selon la revendication 7, caractérisé en ce que X représente un résidu -GLY et Y représente un résidu -GLY-CO-NH2. 9. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est obtenu par extraction d'un tissu ou d'un fluide biologique. 10. Peptide selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de l'hypothalamus de mammi fères, et en particulier de l'hypothalamus de l'homme ou du rat. 11. Peptide selon la revendication 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est obtenu par synthèse. 12. Peptide selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il possède une activité agoniste ou antagoniste vis-à-vis de la LHRH. 13. Procédé d'obtention à partir de tissus ou de fluides biologiques du peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant la succession des étapes suivantes - au moins une étape d'extraction globale des protéines, - au moins une chromatographie par échange de cations, - et/ou au moins une chromatographie liquide à haute per formance en phase inverse. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les tissus ou les fluides font partie de l'hypo- thalamus de mammifères et en particulier de l'hypothalamus de l'homme ou du rat. 15. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 11 dans le traitement d'affections relevant de la gynécologie et/ou de l'endocrinologie de la reproduction, en particulier dans le traitement de la stérilité et de syndromes liés à la puberté précoce ou retardée. 16. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 11, dans le traitement d'affections cancéreuses touchant les gonades ou les organes sexuels secondaires. 17. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 11, dans le traitement d'affections relevant de la psychiatrie, en particulier troubles du comportement entraînant une agressivité sexuelle. 18. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 11, pour l'exploration fonctionnelle de l'axe hypothalamo-hypophysaire. 19. Utilisation d'un peptide selon l'une des re vendications 1 à 11, pour des dosages radioimmunologiques ou biologiques de fluides biologiques et de biopsies de tissus. 20. Médicament contenant au moins un des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 21. Médicament selon la revendication 20, pour le traitement d'affections relevant de la gynécologie ou de l'endocrinologie de la reproduction, en particulier pour le traitement de la stérilité et de syndromes liés à la puberté précoce ou retardée. 22. Médicament selon la revendication 20, pour le traitement d'affections cancéreuses touchant les gonades ou les organes sexuels secondaires. 23. Médicament selon la revendication 20, pour le traitement d'affections relevant de la psychiatrie et en particulier des troubles du comportement entraînant une agressivité sexuelle. 24. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace d'au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. 25. Composition selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement d'affections relevant de la gynécologie et/ou de l'endocrinologie de la reproduction, en particulier au traitement de la stérilité et de syndromes liés à la puberté précoce ou retardée. 26. Composition selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement d'affections cancéreuses touchant les gonades ou les organes sexuels secondaires. 27. Composition selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement d'affections relevant de la psychiatrie, en particulier des troubles du comportement entraînant une agressivité sexuelle. 28. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 24 à 27, présentée en vue de l'administration parentérale ou entérale. 29. Procédé de dosage radioimmunologique ou biologique de fluides biologiques et de biposies de tissus, ca ractérisé en ce que sa mise en oeuvre nécessite l'utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 11.