Brevet FR2656800A1 — publié le 19910712

La présente invention concerne des protéines produites par des lymphocytes humains et, en particulier, une protéine exprimée à la surface de ceux-ci, des séquences d'ADN codant pour ces protéines et les applications pharmaceutiques et biologiques de ces protéines Un certain nombre de structures protéiques de la surface cellulaire "appartiennent" à la "superfamille" des immunoglobulines (IgSF). Cette famille de molécules inclut les protéines comprenant au moins un domaine avec une région de repliement caractéristique appelée repliement Ig. Plusieurs de ces molécules possèdent des fonctions essentielles dans les réponses immunologiques. En plus d'assurer une reconnaissance spécifique de l'antigène comme le font par exemple les im- munoglobulines ou les récepteurs T, elles peuvent fonctionner comme des ligands monomorphiques essentiels dans les interactions cellule-cellule (par exemple ICAM, CD4, CD8), des récepteurs pour des virus (par exemple CD4, ICAM) ou des récepteurs pour les lymphokines (par exemple IL1-R, ILó-R). La découverte et la caractérisation des protéines membranaires exprimées sur les lymphocytes a été rendu possible par la mise au point des techniques de génie génétique. Cette méthodologie permet par diverses techniques expérimentales de caractériser les gènes codant pour des protéines et donc à travers la séquence nucléotidique du gène de connaitre la séquence peptidique. D'autres applications de ces techniques de génie génétique fondées sur les mêmes principes expérimentaux permettent grâce à des systèmes d'expression procaryotes ou eucaryotes de produire en quantités virtuellement infinies les protéines dont le gène a été découvert. Les inventeurs ont cherché à découvrir de nouveaux gènes codant pour des protéines membranaires non décrites à ce jour. Le développement des travaux des inventeurs a permis d'isoler à partir de lymphocytes cytotoxiques naturels un nouvel ADNc complémentaire (ADNc) désigné FDC. Cet ADNc code pour une protéine appelée LAG-3 (pour Lymphocyte Activation Gene-3) qui présente une séquence signal dont on pense qu'elle s'élimine dans la protéine mature. La présente invention a, en conséquence, pour objet une séquence d'ADN comprenant la séquence nucléotidique, désignée FDC, 10 20 30 40 50 60 # # # # # # TCAGGCTGCC TGATCTGCCC AGCTTTCCAG CTTTCCTCTG GATTCCGGCC TCTGGTCATC CCTCCCCACC CTCTCTCCAA GGCCCTCTCC TGGTCTCCCT TCTTCTAGAA CCCCTTCCTC CACCTCCCTC TCTGCAGAAC TTCTCCTTTA CCCCCCACCC CCCACCACTG CCCCCTTTCC TTTTCTGACC TCCTTTTGGA GGGCTCAGCG CTGCCCAGAC CATAGGAGAG ATGTGGGAGG CTCAGTTCCT GGGCTTGCTG TTTCTGCAGC CGCTTTGGGT GGCTCCAGTG AAGCCTCTCC AGCCAGGGGC TGAGGTCCCG GTGGTGTGGG CCCAGGAGGG GGCTCCTGCC CAGCTCCCCT GCAGCCCCAC AATCCCCCTC CAGGATCTCA GCCTTCTGCG AAGAGCAGGG GTCACTTGGC AGCATCAGCC AGACAGTGGC CCGCCCGCTG CCGCCCCCGG CCATCCCCTG GCCCCCGGCC CTCACCCGGC GGCGCCCTCC TCCTGGGGGC CCAGGCCCCG CCGCTACACG GTGCTGAGCG TGGGTCCCGG AGGCCTGCGC AGCGGGAGGC TGCCCCTGCA GCCCCGCGTC CAGCTGGATG AGCGCGGCCG GCAGCGCGGG GACTTCTCGC TATGGCTGCG CCCAGCCCGG CGCGCGGACG CCGGCGAGTA CCGCGCCGCG GTGCACCTCA GGGACCGCGC CCTCTCCTGC CGCCTCCGTC TGCGCCTGGG CCAGGCCTCG ATGACTGCCA GCCCCCCAGG ATCTCTCAGA GCCTCCGACT GGGTCATTTT GAACTGCTCC TTCAGCCGCC CTGACCGCCC AGCCTCTGTG CATTGGTTCC GGAACCGGGG CCAGGGCCGA GTCCCTGTCC GGGAGTCCCC CCATCACCAC TTAGCGGAAA GCTTCCTCTT CCTGCCCCAA GTCAGCCCCA TGGACTCTGG GCCCTGGGGC TGCATCCTCA CCTACAGAGA TGGCTTCAAC GTCTCCATCA TGTATAACCT CACTGTTCTG GGTCTGGAGC CCCCAACTCC CTTGACAGTG TACGCTGGAG CAGGTTCCAG GGTGGGGCTG CCCTGCCGCC TGCCTGCTGG TGTGGGGACC CGGTCTTTCC TCACTGCCAA GTGGACTCCT CCTGGGGGAG GCCCTGACCT CCTGGTGACT GGAGACAATG GCGACTTTAC CCTTCGACTA GAGGATGTGA GCCAGGCCCA GGCTGGGACC TACACCTGCC ATATCCATCT GCAGGAACAG CAGCTCAATG CCACTGTCAC ATTGGCAATC ATCACAGTGA CTCCCAAATC CTTTGGGTCA CCTGGATCCC TGGGGAAGCT GCTTTGTGAG GTGACTCCAG TATCTGGACA AGAACGCTTT GTGTGGAGCT CTCTGGACAC CCCATCCCAG AGGAGTTTCT CAGGACCTTG GCTGGAGGCA CAGGAGGCCC AGCTCCTTTC CCAGCCTTGG CAATGCCAGC TGTACCAGGG GGAGAGGCTT CTTGGAGCAG CAGTGTACTT CACAGAGCTG TCTAGCCCAG GTGCCCAACG CTCTGGGAGA GCCCCAGGTG CCCTCCCAGC AGGCCACCTC CTGCTGTTTC TCACCCTTGG TGTCCTTTCT CTGCTCCTTT TGGTGACTGG AGCCTTTGGC TTTCACCTTT GGAGAAGACA GTGGCGACCA AGACGATTTT CTGCCTTAGA GCAAGGGATT CACCCTCGCA GGCTCAGAGC AAGATBEAGG AGCTGGAGCA AGAACCGGAG CCGGAGCCGG AGCCGGAACC GGAGCCCGAG CCCGAGCCCG AGCCGGAGCA GCTCTGACCT GGAGCTGAGG CAGCCAGCAG ATCTCAGCAG CCCAGTCCAA ATAAACGTCC TGTCTAGCAG C La traduction commence au nucléotide 231 et se termine au nucléotide 1724 inclus. La présente invention a également pour objet la protéine codée par FDC, à savoir la protéine LAG-3 ayant la séquence suivante.* 10 20 30 40 50 60 # # # # # # MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGPQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA WHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEG QLNATVTLAI ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL LLFLTLGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPRRLRAR Les 28 premiers amino-acides devraient constituer une séquence signal qui est éliminée dans la protéine mature. La présente invention a donc plus particulièrement pour objet la protéine ayant la séquence suivante* 10 20 30 40 50 60 # # # # # # VPVVWAQEGA PAQLPCSPTI PLQDLSLLRR AGVTWQHQPD SGPPAAAPGH PLAPGPHPAA PSSWGPRPRR YTVLSVGPGG LTSGRLPLQP RVQLDERGRQ RGDFSLWLRP ARRADAGEYR AAVHLRDRAL SCRLRLRLGQ ASMTASPPGS LRASDWVILN CSFSRPDRPA SVHWFRNRGQ GRVPVRESPH HHLAESFLFL PQVSPMDSGP WGCILTYRDG FNVSIMYNLT VLGLEPPTPL TVYAGAGSRV GLPCRLPAGV GTRSFLTAKW TPPGGGPDLL VTGDNGDFTL RLEDVSQAQA GTYTCHIHLQ EQQLNATVTL AIITVTPKSF GSPGSLGKLL CEVTPVSGQE RFVWSSLDTP SQRSFSGPWL EAQEAQLLSQ PWQCQLYQGE RLLGAAVYFT ELSSPGAQRS GRAPGALPAG HLLLFLTLGV LSLLLLVTGA FGFHLWRRQW RPRRFSALEQ GIHPRRLRAR La protéine mature constitue une protéine membranaire de type I de 470 amino-acides, de poids moléculaire théorique de 51295 Daltons et de point isoélectrique égal à 10,9.Elle comporte une région * La signification des symboles selon la nomenclature internationale est rappelée en annexe. extracellulaire incluant environ 420 amino-acides et, une région cytoplasmique incluant environ 24 aminoacides reliées par un peptide transmembranaire incluant environ 26 amino-acides. La partie extracellulaire de la protéine LAG-3 correspond aux amino-acides 29 à 448 de la protéine LAG-3 décrite plus haut. La comparaison de la séquence du gène LAG-3 représentée par l'ADNc FDC ci-dessus ainsi que de l'organisation exon/intron du gène LAG-3 avec celles d'autres molécules de type Ig-SF a révélé une relation étroite de la protéine LAG-3 avec la protéine CD4. Il est connu que les gènes des cellules eucaryotes présentent un phénomène de polytypie. Par ce phénomène, certains des amino-acides de la protéine codée sont parfois remplacés sans modification de l'activité. La présente invention englobe les protéines provenant de ce phénomène. La présente invention a donc plus généralement pour objet une protéine ayant la séquence peptidique 10 20 30 40 50 60 # # # # # # XVP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL QDLSLLRRAG VTWQHQPDGS PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEG QLNATVTLAI ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSO RSFSGPWLEA OEÀOLLSOPW OCOLYOGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL LLFLTLGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPRRLRAR dans laquelle X est choisi parmi H, un résidu méthionine ou la séquence MWEAQ FLGLL FLQPL WVAPV KPLQP GAE et les séquences qui en différent par un ou plusieurs amino-acides et qui possèdent la même activité. Les inventeurs ont en outre trouvé une sé quence d'ADN qui est une région promotrice d'un gène codant pour une protéine selon l'invention. Cette séquence est la suivante 10 20 30 40 50 60 CCTGCAATGT CATTCTTTGA GCTCAGTTCC TCATCTCTGT CATGGAGAGC ATTAGATTTC 70 80 90 100 110 120 ATGAATTCAT ACTAAGTGTC CAATACAGTG CTTAGCACGT AATGAAGCCT CAATACAATG 130 140 150 160 170 180 TAGTTATTCT CCATGCCCCA CAAAGCTGCA TGCCTAGCCT CAGACCTACC ATTTTTTGGG 190 200 210 220 230 240 GTGCAGTAAG GCTTCCTGTC CACCATGTTC CCAGGGACAT TGTACTGATG GGTGGAAAGG 250 260 270 280 290 300 CAGGTCTAAA GGGGTCACGA AGTTCTGGGA GGTTAAGGGA ACGAGGAAGG AGATTGAGCA 310 320 330 340 350 360 ACAAGGAAAG AGCTTGCCAA GAAGGAGGTG TGAATATTGG GACTGAGGAG GCAGCTTAGA 370 380 390 400 410 420 GATGGGCAAG GGGGCAGTTC CAGGCAGAAA TGGTTCGTGG AGGCAGAAGG TCCCTGGGAG 430 440 450 460 470 480 AGGGAGCAGT CTGGAGGGTG GGGCAGGGGC GAGGAGGGGG AGGTGGGGAG ACCCAGGACT 490 500 510 520 530 540 GAGGAAGTAA ACAAGGGGAG CGCCACCACA GAGGTGGAGA GGTGGAGGGT GCTGCTGCTG 550 560 570 580 590 600 GGAATCAACC CCCTCAGACT TTCCACTGCG AAGCGAAACC GTAAGCCCTG GGGTGCGGGG 610 620 630 640 650 660 GGCGGGCCGG GAGGAGGGGA AGTGGGGAAG GTGGAGGGAA GGCCGGGCAC AGGGGTGAAG 670 680 690 700 710 720 GCCCAGAGAC CAGCAGAACG GCATCCCAGC CACGACGGCC ACTTTGCTCT GTCTGCTGTC 730 740 750 760 770 780 CGCCACGGCC CTGCTCTGTT CCCTGGGACA CCCCCGCCCC CACCTCCTCA GGCTGCCTGA 790 800 810 820 830 840 TCTGCCCAGC TTTCCAGCTT TCCTCTGGAT TCCGGCCTCT GGTCATCCCT CCCCACCCTC 850 860 870 880 890 900 TCTCCAAGGC CCTCTCCTGG TCTCCCTTCT TCTAGAACCC CTTCCTCCAC CTCCCTCTCT 910 920 930 -tO 950 960 GCAGAACTTC TCCTTTCCCC CCACCCCCCA CCACTGCCCC CTTTCCTTTT CTGACCTCGT 970 980 990 1,000 1,010 1,020 TTTGGAGGGC TCAGCGCTGC CCAGACCATA GGAGAGATG La présente invention a en conséquence également pour objet cette séquence d'ADN. La présente invention a également pour objet une séquence d'ADN comprenant la séquence d'ADN pro motrice telle que définie ci-dessus et une séquence d'ADN codant pour une protéine selon la présente in vention. Dans la présente invention, les inventeurs ont tout d'abord obtenu un ADN complémentaire FDC par les opérations suivantes - culture de cellules lymphocytaires dites cellules cytotoxiques naturelles - isolement à partir de ces lymphocytes de l'ARN messager lié aux membranes du réticulum endo plasmique intra-cellulaire - obtention de l'ADN complémentaire simple brin à partir de l'ARN messager, puis de l'ADN com plémentaire double brin - insertion dans un vecteur tel que le bac tériophage lambda GT10 - préparation d'une sonde d'ADN simple brin à partir de l'ARN messager des cellules et purifica tion par une technique d'hybridation-soustraction de façon à sélectionner les copies des ARN présentes dans les cellules lymphocytaires cytotoxiques naturelles et absentes dans d'autres cellules hématopoïétiques transformées. - sélection des ADN complémentaires insérés dans le vecteur qui réagissent avec la sonde - transfert de 1'ADN sélectionné dans un vecteur plasmidique pour l'amplifier, le purifier et en réaliser le séquençage. La séquence protéique selon l'invention a été obtenue par - traduction de la séquence nucléotidique de 1'ADNc FDC. L'existence de cette protéine à l'état naturel sur les cellules T a été démontrée par - préparation de sérums dirigés contre un peptide synthétique représentant une région probablement exposée vers l'extérieur du produit de traduction de l'ADNc FDC, ayant une structure protéique en forme de boucle, - immunoprécipitation de la protéine LAG-3 par les hétéro-anticorps anti-peptide. Les protéines selon l'invention peuvent, en outre, être obtenues par d'autres méthodes de purification de protéines membranaires ou synthèse peptidique classique ou encore par application de techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour une protéine selon l'invention dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression. La présente invention a donc également pour objet des plasmides et des vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine selon l'invention ainsi que des hotes transformés avec ce vecteur. La présente invention a également pour objet une composition thérapeutique comprenant à titre de principe actif une protéine selon l'invention ou une partie de cette protéine, en particulier la partie soluble correspondant à la région extracellulaire de la protéine s'étendant de l'amino-acide 29 à l'amino-acide 448 de la séquence protéique précédemment décrite ou une partie de cette région extracellulaire. Cette composition thérapeutique est active dans le traitement de certaines maladies impliquant le système immunitaire où la fixation du ou des ligands de la protéine LAG-3 sur cette protéine provoque la transmission de signaux vers l'intérieur de la cellule. Dans ce cas, la composition objet de l'invention peut agir en fixant le ou les ligands de la protéine membranaire LAG-3 empêchant de cette manière la fixation néfaste de ce ou ces ligands sur la protéine LAG-3, par un phénomène d'inhibition compétitive. La présente invention a également pour objet des anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine selon l'invention ou une séquence immunogène d'une telle protéine, en particulier la séquence peptidique comprenant la séquence GPPAA APGHP LAPGP HPAAP SSWGP RPRRY. La présente invention a également pour objet des hybridomes produisant de tels anticorps monoclonaux. La présente invention a également pour objet un procédé de dosage ou d'identification des protéines selon l'invention qui comprend l'utilisation d'anticorps monoclonaux selon l'invention. A cet effet, on peut utiliser dans le cas où une partie de la protéine LAG-3 est soluble à l'état naturel une méthode radio-immunologique de type RIA ou de type IRMA (technique de type sandwich utilisant un antigène froid et la compétition entre un anticorps froid et un anticorps marqué) ou une méthode immunoenzymatique de type ELISA ou de type IEMA (technique de type sandwich). Pour identifier la protéine LAG-3 fixée à la membrane, on peut utiliser des méthodes telles que l'immunofluorescence directe (par anticorps anti-LAG-3 marqués par une substance fluorescente) ou indirecte (en utilisant une immunoglobuline marquée anti-Ig de souris dans la cas où les anticorps anti-LAG-3 ont été produits dans cette espèce). Les anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines selon l'invention ou des fractions de celles-ci peuvent être préparés selon une technique classique. A cet effet les fractions de protéines peuvent être couplées si nécessaire à un agent immunogène, tel que l'anatoxine tétanique par un agent de couplage tel que le glutaraldéhyde. On décrira ci-après plus en détail l'obten- tion de l'ADNc FDC et du gène LAG-3 codant pour la protéine en se reportant aux figures annexées sur lesquelles - la figure 1 représente la carte de restriction de l'ADNc FDC et les clones d'ADNc qui ont permis d'obtenir la séquence du clone FDC; - la figure 2 représente la carte de restriction et la répartition exons-introns du gène LAG-3; - la figure 3 est une représentation schématique de la protéine LAG-3; - la figure 4 représente un modèle du d maine 1 de la protéine LAG-3; - la figure 5 représente l'alignement des domaines 1 et 2 avec les domaines 3 et 4 de la protéine LAG-3; - la figure 6 représente l'alignement des séquences peptidiques de LAG-3 et de la protéine CD4 de rat. I - Culture et PréParation de l'ARNm lié aux membranes du réticulum endoPlasmique L'isolement et les caractéristiques du clone foetal, F55IIIE5 (phénotype CD3 - CD2 +) ont été décrites préalablement par Nowill et al (1). La culture de masse a été effectuée en pré- sence d'interleukine-2 recombinante, de surnageant de milieu conditionné lymphocytaire, sur une sous-couche nourricière de cellules sanguines mononuclées irradiées allogéniques et d'une lignée cellulaire transformée par le virus EBV (appelée LAZ 388) dans des plaques à fond en V à 96 trous. Les cellules ont été mises à 3000 cellules par puits au jour 0. Le recueil de 200 plaques à 3 x 106 cellules par ml au jour 12 a permis de recueillir 6 x 109 cellules. La préparation des ARN cytoplasmiques, des ARN liés aux membranes du réticulum endoplasmique et des ARNm ont été faites en apportant certaines variantes aux méthodes décrites par Maniatis (2) Mechler (3) et Aviv (4). Ainsi 4 x 10 cellules de F55IIIE5 ont été déposées sur des gradients de saccharose après choc hypotonique et broyage mécanique selon la méthode décrite par Mechler. Les ARN cytoplasmiques portés par les ribosomes liés aux membranes du réticulum endoplasmique ont été purifiés entre des gradients de saccharose. Ceci permet de travailler par la suite avec des ARNm qui ont une séquence signal et qui par consé- quent codent pour des protéines portées par la membrane ou secrétées dans la partie interne de l'ergastoplasme (et vers l'extérieur de la cellule).Cette méthode d'isolement de l'ARN de type dit MB (membrane-bound) permet d'emblée d'éliminer environ 90% des gènes transcrits qui codent pour des protéines intra-cellulaires ne pouvant pas être secrétées vers l'extérieur ou transportés vers la membrane et par conséquent sans intérêt dans le cadre de l'in-vention. En plus de l'isolement du ARNm MB-F55IIIE5 qui sert de substrat à d'une part la construction de la banque et d'autre part la fabrication de la sonde, les méthodes de purification décrites par Aviv (4), Maniatis (2) et Triebel (5) ont permis d'isoler des ARN de divers clones et lignées cellulaires qui sont utilisés et des ARNm des cellules Jurkat, U937, Laz388 et K562 (environ 109 cellules de chacune des lignées) qui sont utilisés pour soustraire la sonde. Ces méthodes comprennent A - Préparation de l'ARN cytoplasmique. 6 A une ampoule de 20 à 30.10 cellules en culot sec, on ajoute 1 ml de tampon de lyse (Tris HCl 50mM, EDTA 62,5 mM, Triton X-100 0,4%, LiCl 2,5 M). Après dissolution douce du culot, on transfère le tampon de lyse dans les tubes Eppendorf froids, contenant 50 ijl de NP40 10%. Après 5 mn sur glace, on centrifuge 1 min à 8000 trs/min. On prélève le surnageant (ARN) et on l'ajoute dans les tubes Falcons contenant 1 ml de phénol, 1 ml de CHCl3, 1 ml de STE SDS 2% (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, MgCl2 1 mM, 2% SDS). On centrifuge 10 mn à 5000 trs/min. On prélève la phase supérieure, on ajoute 1 ml de phénol et 1 ml de chloroforme. On centrifuge 5 mn à 5000 trs/min. On prélève la phase supé- rieure. On ajoute 100 p1 EDTA 0,2 M, 200 pl NaAc 3M et 5 ml éthanol. On mélange et on laisse à - 20 C la nuit. On centrifuge 30 mn à 10000 trs/min. On sèche le culot. On reprend dans 400 pl de NaAc 0.3 M froid. On ajoute 1 ml d'éthanol dans le tube Falcon.On transfère lréthanol dans l'Eppendorf, on mélange, on laisse 1h à - 20 C. On centrifuge 10 min à 13 K, aspire l'alcool et sèche. On ajoute 30 p1 d'eau. On centrifuge, on congèle immédiatement à - 80 C. On contrôle la dégradation et la quantité en mettant 1 pl sur gel dénaturant (1% agarose dans tampon TBE (Tris, Base, EDTA) pH 8,5 autoclavé (BET 1 pg/ml). B - Préparation de l'ARN messager lié aux membranes du réticulum endoplasmique On reprend les cellules à 108 cellules/ml dans du tampon hypotonique RSB (KCl îOmM, MgC12 1,5 mM, Tris-HCl îOmM pH 7,4) à la température de la glace traité préalablement avec 0,1% DEPC. On laisse 5 min sur la glace. On rompt les cellules mécaniquement avec 10 coups d'homogéniseur de Dounce (type B). On centrifuge à 1000 g pendant 2 min pour sédimenter les noyaux.Le surnageant ou "extrait cytoplasmique" est ensuite utilisé pourla séparation ribosomes libres/extraits membranaires. 0,7 ml d'extrait cytoplasmique est mélangé avec 3,2 ml de tampon 2,5 M saccharose TK (Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, KCl 0,15 M, MgC12 0,005 M) puis ce mélange est déposé sur 2 ml de 2,5 M saccharose TK. Puis on ajoute 8 ml de 2,05 M saccharose TK et ensuite 4 ml de saccharose 1,3 M TK. On fait tourner à 4 C pendant 5 h dans un rotor pendulaire type Spinco SW28 à 25000 trs/min. On pique avec une aiguil- le la bande comprise entre le gradient de 2,05 M et celui de 1,3 M de saccharose. On ajoute un volume égal de TE 10 : 1 (Tris HCl îOmM, EDTA 1mM). On fait une extraction avec du phénol puis un mélange phénolchloroforme.On précipite avec 1/10 de NaAc 3 M et 2,5 vol. d'éthanol. Pour la sélection de l'ARN poly (A) on utilise une colonne d'oligo (dT)-cellulose comprenant 1,2 ml de gel équilibrée avec le tampon de charge Tris-HCl 20mM (pH 7,6), Nacl 0,5 M, EDTA 1mM complété avec SDS. On lave avec H20, une solution NaOH 0,1 M et EDTA 5mM et de l'eau. On lave avec 5 volumes de tampon de charge. On dissout l'ARN dans de l'eau et on chauffe à 65 C 5 min. On ajoute deux fois un volume identique de tampon de charge. On attend que la température s'équilibre. On récolte l'effluent. On chauffe à 65*C et on recommence. On lave la colonne avec 5 à 10 volumes de tampon de charge puis 4 volumes de tampon de charge NaCl 0,1 M. On élue le poly(A) + avec 2-3 volumes de Tris-HCl (pH 7,5) 1OmM, EDTA 1mM, SDS 0,05%. On ajoute de l'acétate de sodium 3 M (pH 5,2) au 1/10. On précipite avec 2,2 vol. d'éthanol. II - Obtention de la banque d'expression La préparation de l'ADN complémentaire simple brin à partir de l'ARN messager lié aux membranes du réticulum endoplasmique cellulaire de la cellule F55IIIE5 puis de l'ADN complémentaire double brin in vitro ont été réalisés selon les techniques décrites par Gubler et al (6). Après protection des sites internes EcoRI par la méthylase EcoRI et sélection des tailles sur gel d'agarose à basse température permettant de sé lectionner des fragments dont la taille est supérieure à 500 pb, les ADNc double-brin ont été clonés dans le site EcoRI du phage Lambda GT10 à l'aide du linker EcoRi. L'empaquetage in vitro des phages Lambda GT1O recombinants a été réalisé en utilisant un kit de clonage commercial (Amersham Corp. Arlington Heights, IL). Après culture sur E. coli C 600 Hfl r on obtient 6 x 104 phages recombinants. III - Préparation de la sonde d'ADN complémentaire La préparation de la sonde d'ADN complémentaire simple brin est effectuée par soustraction par deux cycles d'hybridation sur un excès d'ARN messager des cellules dites "a éliminer" (Jurkat, Laz 388, U937, K562) suivi de passages sur colonnes d'hydro xyapatite, ce qui permet de se séparer du complexe double brin ADNc-ARNm. Après 2 cyles d'hybridation et 2 passages sur colonne il reste environ 6-7% de la radioactivité, c'est-à-dire qu'environ 7% du matériel dit MB ("membrane-bound") F55IIIE5 n'existe pas dans les cellules tumorales Jurkat, K562,U937 et Laz 388. C'est ce matériel qui sert de sonde pour aller rechercher dans la banque MB-F55IIIE5 les ADNc correspondants. Cette technique utilise les conditions d'hybridation-soustraction décrites par Davis et al (7). Préparation de la sonde soustraite /MB-FSSI IIES -ArNm de Jurkat, K562,Laz 388,tu937/ A partir de 5 pg de ARNm MB-F55IIIE5 on pré- pare une sonde d'ADNc simple brin marquée au 32 P-dCTP (activité spécifique : 800 Ci/mmol 1) dans un volume de 50 p1. Après incubation de 2 h à 420C avec l'enzyme transcriptase réverse, on ajoute 5 p1 EDTA 0,2 M puis 50 pl NaOH 0,2 N. On incube à 65 C, 1 h. On ajoute 60 pl HCl 1N et 30 pl Tris-HCl (pH 8) 2 M. On ajoute 1/10e vol. NaAc 3M. On ajoute 7 pl d'ARNm de chacune des 4 lignées tumorales pour précipiter la sonde, puis on ajoute 2,5 vol. d'éthanol. On laisse 1 h à -20 C. On centrifuge, on )ave à l'éthanol 70% et on sèche. On reprend dans 7,5 pl d'H2O, on ajoute 7,5 p1 NaH2P04 0,5, M pH 7, 1mM EDTA, 0,25% SDS. On incube à l'étuve 680C pendant 20 heures. On dilue le contenu dans 1 ml NaH2P04 0,12 M, 0,1% SDS. On charge sur une colonne d'hydroxyapatite équilibrée à 60 C dans le même tampon. L'effluent (matériel simple brin) est concentré par du sec-butanol et passé sur une colonne G-50 pour enlever le tampon phosphate. On ajoute de nouveau 7 pg de ARNm de chacune des lignées et on recommence l'hybridation et le passage sur colonne. Après ces 2 passages, on récupère 7% de la quantité de la radioactivité du départ. IV - Isolement et caractérisation des clones d'ADNc La banque d'ADNc obtenue précédemment (2 x 104 phages recombinants) est ensemencée sur E. coli C600/Hfl. Le criblage est effectué selon les techniques habituelles en utilisant des filtres de nylon comme décrit par Huynh (8). Il'hybridation avec la sonde obtenue pré- cédemment est effectuée à 42eC avec préhybridation avec une solution d'hybridation de type Southern et addition de la sonde soustraite MB - F55IIIE5 simple brin à 5.106 cpm/ml. Après deux cycles d'hybridation-soustraction, on identifie 120 phages Lambda GT10 positifs sur 4 les 2.10 recombinants. La mise en culture des phages positifs, la purification des ADN correspondants, la purification des ADN complémentaires sous forme de fragments par excision à partir d'une électrophorèse sur gel d'agarose à point de gélification bas ont été réalisés selon les méthodes décrites par Maniatis (2) et Huynh (8). La ligation des ADNc les plus longs dans le vecteur plasmidique pBS digéré par l'endonucléase EcoRI et traité par la phosphatase alkaline d'intestin de veau, la transformation de bactéries JM 109 compétentes et le criblage des recombinants par un double système de sélection (ampicilline + X-gal/IPTG) ont été effectués selon des méthodes de génie génétique classiquement utilisées. La purification et la préparation en quantité importante des ADN complémentaires recombinants clonés dans pBS ont été réalisés en utilisant la méthode de purification par gradient sur chlorure de césium décrite par Maniatis (2). On a isolé un clone d'ADNc que l'on a nommé FD47 qui comportait 400pb et s'hybridait avec la sonde obtenue par hybridation-soustraction. Ce clone a été retenu d'une part parce que dans les techniques de "Northern blot" il s'hybridait avec un transcript de 2 kb constamment retrouvé dans les cellules F55IIIE5 et non retrouvé dans les cellules Jurkat, Laz 388, K 562 et U937 et, d'autre part, parce qu'il ne présentait pas d'homologie avec l'une quelconque des séquences connues de la banque de données intitulée "Genbank". Le clone FD47 portait une région nucléotidique pouvant coder pour une région transmembranaire hydrophobe. V - Isolement et structure d'un ADN complémentaire comPlet Parmi les 120 phages Lambda GTîO positifs obtenus après soustraction-hybridation, on n'a pas observé d'autre phage présentant une hybridation croisée avec FD47. Afin d'établir la séquence d'ADNc dite FDC, on établit trois nouvelles banques d'ADNc à partir soit d'amorces d'oligo-dT, soit d'un hexamère de séquence aléatoire ou soit d'une amorce spécifique comprenant les nucléotides 704 à 688 de FDC. D'autre part, on réalise une sonde d'ARN simple brin marquée au 32P à partir de FD47 par transcription in vitro à partir du plasmide pBS à l'aide de la polymérase T7 en présence d'UTP-32p (800 Ci.mmole -1) selon la méthode décrite par Triebel (5). Les trois banques sont réalisées à partir d'ARN messager provenant de clones CD3+ portant les chaînes y et a du récepteur T et qui transcrivent un message LAG-3 en quantité importante lorsque leur ARN est testé avec la sonde FD 47. La sonde FD47 est utilisée pour cribler la première banque d'ADNc, ce qui permet d'obtenir le clone Fi19. De la même manière que précédemment, on marque un fragment génomique Bam HI - Hind III de 0,3 kb comprenant la partie la plus ' de l'exon IV en utilisant comme amorce un hexamère aléatoire et on l'utilise pour cribler la seconde banque ce qui permet d'obtenir les clones FD 61 et FD 101, et la troisième banque pour obtenir un cDNA contenant de manière presque complète l'extrémité 5', appelé FD191. Les séquences des clones FD47 et FD19 ont été déterminées directement dans le vecteur pBS par la méthode de Sanger (9) à l'aide d'une amorce M13 uni verselle ou un amorce M13 inversée et la polymérase T17 modifiée. Les séquences de FD6î, Fi101 et FD191 ont été déterminées à partir d'ADN simple brin après clonage dans le vecteur M13mp18. Après différents cycles d'hybridation de proche en proche ("DNA walking") en utilisant les 3 banques d'ADNc obtenues à l'aide d'amorces différentes, on a isolé ainsi des clones d'ADNc dont les séquences se chevauchent et qui couvrent un total de 1,8 kb. L'ensemble des séquences nucléotidiques totales de ces ADNc appelée "séquence FDC" comportant 1871 pb indique que l'ARN messager du gène LAG-3 a un cadre de lecture long et ouvert et code pour une protéine de 498 amino-acides dont on obtient la séquence peptidique par déduction à partir de la séquence nucléotidique de l'ADNc. L'ADNc FDC, lui-même, a été obtenu par ligation des 2 fragments complémentaires EcoRI-Hind III, l'un couvrant la partie 5' du clone Fi191, l'autre couvrant la partie 3' du clone FD19, obtenant ainsi un clone couvrant toute la séquence connue, comme illustré par la Fig. 1. VI - Isolement et structure du crène LAG-3 A/ Clonage moléculaire du crène LAG-3 On isole des clones d'ADN génomique à partir de la banque LY67 obtenue à partir d'ADN d'une lignée de cellules B humaines transformées par EBV, digéré partiellement par Mbo-I et inséré dans le phage Lambda 2001 comme décrit par Dariavach (10). On marque le segment d'insertion FD47 par la méthode des amorces hexaméres aléatoires décrites par Feinberg (11) et on l'utilise pour cribler 2 x 105 plaques de la banque d'ADN de génome humain. On isole neuf plaques positives (GD1 à GD9) et on caractérise des ADN de phages par des cartes de restriction à l'aide de la sonde FD19 contenant la moitié de la région codant pour la protéine et la région 3' non traduite. Deux fragments d'ADN se recouvrant correspondant à 16,4 kb (EcoRI) et 11,5 kb (Hind III) sont obtenus et sous-clonés dans le plasmide pUN121 pour produire les clones GD3Eco et GD1 Hind, comme représenté sur la Fig. 2. On construit des cartes de restrictions détaillées de ces sous-clones et on les compare avec la carte de restriction de la séquence FDC de la fig. 1. De nombreux fragments sont obtenus sur gel d'agarose à point de gélification bas et sont sousclonés dans les bactériophages M13mp18 ou M13mp19. Les séquences de ces fragments sont obtenues à partir d'ADN simple brin à l'aide de la technique de terminaison de chaine di-deoxy décrite. On synthétise des oligonucléotides de 17 bases dont les séquences sont obtenues soit à partir d'ADNc de FD19, soit de la séquence de la région adjacente 5' du gène LAG-3 et on les utilise dans un but de séquençage. B - Structure du gène LAG-3 La Fig. 2 illustre l'organisation exon-intron du gène LAG-3 humain. La carte a été construite après digestion simple et double par des endonucléases des clones GD2 et GD3 obtenus à partir de Lambda 2001 et de leurs sous-clones GD3 ECO et GD1 Hind. Les régions non traduites sont représentées par un trait fin. Le gène LAG-3 comprend approximativement 6,6 kb et est divisé en 8 exons dont les premiers nucléotides sont respectivement ceux en position 1, 289, 437, 742, 1012, 1288, 1531 et 1662 de la séquence d'ADN précédemment décrite. La région dite promotrice en position 5' du gène LAG-3 dont la séquence a été décrite précédemment a été étudiée et a permis les observations suivantes - on ne retrouve pas de séquence TATA caractéristique en amont de la région 5' non traduite de 239 pb; - la séquence nucléotidique comprend une séquence CCAAT inversée (ATTGG) en position -662 à partir de la séquence ATG donnant le signal de traduction. La séquence CCAAT est connue pour être cruciale dans de nombreux promoteurs et peut fonctionner dans l'orientation inversée. - on trouve également en position -389 à partir de la séquence ATG donnant le signal de traduction un site de liaison Spl contenant le groupe hexa-nucléotidique caractéristique GGGCGG. Pour évaluer le nombre de copies du gène LAG-3 dans le génome humain, on met à digérer de l'ADN de la lignée cellulaire tumorale K562 et de l'ADN de lignées cellulaires polyclonales T et NK IL2 dépendantes avec EcoRI, Hind III, Bam HI ou XbaI. On réalise des hybridations de type Southern Blot en utilisant la sonde FDC, (1871 pb) construite par fusion du fragment 5' ECORI/Hind III du clone FD 191 avec le fragment 3' Hind III/EcoRI du clone FD 19. On obtient avec EcoRI 3 fragments de 2, 8,2 et 10 kb, avec Hind III, 2 fragments de 5,7 et 9,5 kb, avec Bam HI, 3 fragments de 2,8, 4 et 13 kb et avec XbaI 3 fragments de 3, 4 et 6 kb. Ces résultats indiquent qu'une seule copie du gène LAG-3 est présente dans le génone haploïde humain. De plus, l'analyse des cellules T, B et NK par la même technique montre qu'il n'y a pas dans ces cellules de réarrangement du gène LAG-3 au cours de la différenciation des lymphocytes. VII - ExPression du crène LAG-3 On a utilisé le fragment inséré de 1004 bp du clone FD19 comme sonde pour analyser la distribution cellulaire de l'expression et de la régulation de l'expression du gène LAG-3. Les résultats du "blotting" d'ARN montrent clairement que les procédés d'hybridation-soustraction utilisés dans le premier criblage de la sous-banque F55IIIE5 ont été réalisés avec succès en ce qui concerne l'isolement du clone FD19 de la banque d'ADNc dans la mesure où aucun transcript de LAG-3 n'est exprimé dans les lignées de cellules transformées T, B et d'origine myéloide (en particulier Jurkat, Laz 388, K 562, U 937). On a réalisé des essais sur d'autres lignées de cellules T transformées comprenant CEM et MOLT-4 et on a trouvé qu'aucune n' exprimait LAG-3. Il en était de même pour les monocytes circulants périphériques. On a par ailleurs testé un échantillonnage de lignées polyclonales ou de clones de cellules normales T et NK mises en culture. Dans ce dernier cas, on a mis en évidence de l'ARN messager de LAG-3 en tant qu'échantillon unique d'environ 2kb dans toutes les lignées étudiées : 3 lignées CD3 (F55 III E5, SIIH4, SIII G5), 4 lignées CD3 TCRa/ (CD4+ : SIF8 et F55IIIG5 et une lignée CD3+ TCRt/6+ (le clone TCR61+ TiTA+ BK). Cependant, on n'a pas retrouvé d'ARN messa ger dans des cellules T purifiées fraîches, ni dans les macrophages périphériques, ni dans les lymphocytes au repos. L'expression du gène LAG-3 a en outre été étudiée dans les tissus nerveux d'origine neuroecto dermique et aucun ARN messager n'a été retrouvé ni dans les lignées de cellules de neuroblastome en cul ture, ni dans le tissu cérébral frais. Le gène LAG-3 n'est exprimé dans les cellules T et NK qu'après activation. L'expression du gène LAG-3 est maximale 3 à 4 jours après activation des lymphocytes du sang par la phytohémaglutinine. La protéine correspond donc à ce qu'il est convenu d'appeler un antigène d'activa tion. VIII - Structure de la Protéine LAG-3 Les caractéristiques de la protéine LAG-3, représentées sur les Figures 3, 4 et 6, ont été déduites d'après la structure du gène et d'après l'analyse de son produit de traduction. Elle apparaît comme une protéine membranaire de type I comportant 498 aminoacides. Comme représenté sur la fig. 3 les domaines sont désignés par L (domaine d'initiation), V (domaine de type V d'immunoglobuline), C2 (domaine de type C2 d'immunoglobuline)(19), TM (transmembranaire) et CYT (cytoplasmique). La position des introns est indiquée par des flèches. Les sites de N-glycosylation, et la séquence RGD (sites de liaison cellulaire) sont également indiqués. La protéine mature comprend 470 aminoacides avec un poids moléculaire théorique de 51295 Daltons et un point isoélectrique de 10,9. Elle comprend un peptide de tête L (28 aminoacides) codé par les exons I (19 aminoacides) et II (9 aminoacides parmi 50). La région extracellulaire est codée par les exons II (41 aminoacides parmi 50), III (101 aminoacides), IV (90 aminoacides), V (92 aminoacides) et VI (81 aminoacides), la région transmembranaire (TM) par l'exon VII (44 aminoacides) et la région cytoplasmique incluant des aminoacides fortement chargés par l'exon VIII (21 aminoacides). La région extracellulaire comporte 8 résidus cystéine et 4 sites potentiels de N-glycosylation (Asn-X-Ser,Thr). La fig. 4 représente un modèle du domaine 1 de la protéine LAG-3. La séquence du premier domaine de type Ig (aminoacides + 1 à + 139) est représentée selon le modèle utilisé par Amzel et Poljak (12). Le pont disulfure est indiqué et la séquence RGD encadrée. Le segment peptidique codé par les exons II et III correspond à un domaine IgSF de type V tel que décrit par Williams (13) comprenant les feuillets A, B, C, C', C", D, E, F et G représentés sur la fig. 6, possédant deux caractéristiques inhabituelles. Premièrement, ce domaine de type V comprend une super boucle ayant approximativement 30 aminoacides codée par la première partie de l'exon III. Cette boucle représentée sur la Figure 4 joint le feuillet-ss C au feuillet-R C' et contient en particulier dix résidus proline. Il semble qu'une telle insertion puisse être compatible avec un repliement de type IgSF dans la mesure où il ne provoque pas de rupture du noyau central du repliement que l'on considère comme étant constitué par les feuillets-(3 A, B, E et G, F, C tel que décrit par-Lesk (14). Cette super-boucle a servi d'immunogène car elle est probablement exposée à l'extérieur de la molécule et par conséquent exposée à une reconnaissance par des anticorps. Les différences dans les domaines de type V et de type C apparaissent d'une façon générale au milieu du repliement de type Ig. De plus, dans le domaine 4 de la molécule N-CAM, il a été décrit l'insertion d'une structure peptidique codée par un exon supplémentaire (15). Le second point inhabituel est que la cystéine en aval du domaine 1 semble être positionnée sur le feuillet-ss G plutôt que sur le feuillet-s F (résidu 121) comme cela est presque invariablement le cas. Le motif AspxGlyxTyrxCys est de manière très caractéristique positionné sur le feuillet-(3 F et se retrouve ici, sauf qu'un résidu Ala remplace le résidu Cys. Il semble possible qu'un pont disulfure puisse se former et, par exemple il est à noter qu'un pont disulfure inhabituel d'un type différent a été observé dans le domaine de type V de la chaîne cc de CD8 comme décrit par Kirszbaum (16). On trouve une séquence Arg-Gly-Asp (RGD) sur le feuillet-(3 E (Figure 4). Ce motif est connu pour représenter un adhésiotope potentiel comme décrit par Ruoslahti (17) mais il n'est pas établi qu'il forme le centre d'une séquence de liaison essentielle dans la mesure où, dans cette position, une telle séquence se trouverait problablement à l'intérieur du repliement de type IgSF. Les exons IV, V et VI codent pour des domaines de type apparentés aux IgSF comme décrit par Williams (13) ayant respectivement 51, 50 et 42 ami noacides entre les deux résidus cystéine conservés. ces trois domaines possèdent des repliements de type c et montrent des fragments de séquence caractéristiques du domaine de type C2 (13). ils ont été comparés aux séquences du domaine de type C2 à l'aide du programme ALIGN selon la méthode décrite par Dayhof f (18) et Williams (19). Sur 57 séquences examinées, on a obtenu des scores supérieurs à 3DS, (déviations standards) 32, 41 et 11 fois pour les domaines respectifs 2, 3 et 4. Le domaine 4 appartient au domaine de type C2 tronqué dans la mesure où il ne possède pas le feuillet -ss D. Les domaines 1 et 2 de LAG-3 ont été alignés et comparés visuellement avec les domaines 3 et 4 en prenant en compte les identités et les considérations structurales. La fig. 5 représente l'homologie interne de LAG-3. Les séquences d'aminoacides du domaine 1 (en partant de la position 119 après la super-boucle) et du domaine 2 ont été alignées avec les positions correspondantes dans les domaines 3 et 4. Les identités sont indiquées par des (*) et les similarités par des (.). Dans la mesure où le domaine 1 contient une séquence formant une super boucle, l'alignement a été commencé à l'acide aminé 91 dans ce domaine et à l'amino acide 276 dans le domaine 3. Sur les 129 associations possibles entre les résidus on a observé 34 identités, 35 similarités et 9 coupures de séquences (score d'alignement supérieur à + 8,5 DS). En outre, sur le feuillet-ss F des domaines 2 et 4, il existe une séquence WxC qui est tout à fait inhabituelle en cette position où on trouve habituellement la séquence Y ou FxC comme décrit par Williams (13). L'ensemble de ces résultats suggère que LAG-3 a évolué par dédoublement génique à partir d'une structure préexistante à deux domaines du type d'une chaîne Ig L. On a également aligné les séquences de LAG-3 et de CD4 de rat, comme représenté sur la fig. 6. Les lignes en pointillés au-dessus des séquences indiquent les positions des feuillets-ss dans les quatre domaines de type IgSF. La séquence de tête L et la séquence transmembranaire (TM) sont indiquées par une ligne continue au-dessus de la séquence. La position des introns est indiqué par des flèches au-dessus de la séquence (pour LAG-3) et en-dessous de la séquence (pour CD4) comme décrit par Maddon (20) pour le CD4 humain. Deux grands intervalles sont insérés correspondant à la séquence de la super boucle dans le domaine 1 de LAG-3 et pour tenir compte du fait que le domaine 3 de CD4 est du type appartenant au domaine de type V, tandis que le domaine 3 de LAG-3 est du type appartenant au domaine de type C2.Les fragments de similarités comprennent le début du domaine 1 (9 identités et 10 similarités sur 17 associations possibles), et la très inhabituelle séquence WxC dans les domaines 2 et 4 de LAG-3, qui sont également présentes en les positions correspondantes dans CD4. Ce motif de séquence n'est retrouvé en position équivalente sur aucun autre domaine de type IgSF. En tout, il y a 87 identités et 82 similarités sur 338 résidus alignés (19 coupures de séquences) lorsque on compare les régions extracellulaires de LAG-3 et de CD4 de rat. Une des caractéristiques principales de LAG-3 est par conséquent sa relation avec CD4. Tout comme dans la structure de LAG-3 des fragments connus ayant des homologies de séquence in ternes ont été retrouvés dans la molécule CD4 entre les domaines 1 et 3 aussi bien qu'entre les domaines 2 et 4. Plus généralement, l'organisation intron/exon de LAG-3 et de CD4 est très similaire : les deux gènes comprennent un intron à l'intérieur du premier domaine de type IgSF et la position des introns (indiquée par les flèches sur la Figure 7) dans LAG-3 est très proche de celle de CD4. Il a été suggéré que CD4 avait évolué par dédoublement génique à partir d'une structure préexistante à 2 domaines de type IgSF. La présente découverte renforce cette hypothèse et les inventeurs proposent, sur la base des similarités de séquence et de l'organisation exon/intron, que CD4 et LAG-3 ont alors partagé un ancêtre commun à 4 domaines. La protéine LAG-3 fonctionnerait donc comme le font de nombreuses autres molécules de la super famille de type Ig, comme ligand pour une protéine soluble ou une protéine membranaire. Les exemples connus comprennent des protéines dont l'expression est régulée positivement par activation cellulaire telle que ICAM-1, connue pour être impliquée dans les interactions cellule-cellule, ou IL1-R et IL6-R qui fonctionnent comme des récepteurs de facteurs de croissance. Il est à noter qu'on a montré récemment que ICAM-1 représentait un récepteur majeur pour les rhinovirus et CD4 pour le VIH (virus du SIDA). Il semblerait donc étant donné les analogies de structure, que LAG-3 puisse être une porte d'entrée pour un virus. Un des sites de fixation possible du VIH comprendrait dans ce cas tout ou partie de la séquence d'amino-acides suivante correspondant à un feuillet- C" du domaine V GLRSG RLPLQ (correspondant aux aminoacides 80 à 90 de la protéine LAG-3). IX - Mise en évidence de la molécule naturelle LAG-3 Des anticorps de lapin anti-LAG-3 ont été obtenus après injections répétées à des lapins d'un peptide synthétique couplé à la KLH. Ce peptide comprend 30 aminoacides formant la séquence suivante GPPAA APGHP LAPGP HPAAP SSWGP RPRRY inclus dans la super-boucle du domaine V de LAG-3. 125 Après marquage à 1' I des protéines de membrane de cellules T activées par la phytohémaglutinine, immunoprécipitation par les anticorps de lapin spécifiques et purification sur gel de SDS - polyacrilamide, une seule bande d'environ 60 kDaltons a été détectée en conditions réduite et non réduite. Cette masse moléculaire observée d'environ 60 kDaltons pourrait correspondre à la masse moléculaire dérivée de l'analyse de la translation de la protéine LAG-3 (51 kDaltons) à lauqelle s'ajoutent environ l0kDaltons dus à la présence de sucres (notamment sur certains des 4 sites de N-glycosylation), faisant de la protéine LAG-3 naturelle une glycoprotéine membranaire. La protéine LAG-3 existe donc sous forme d'une chaine unique, probablement glycosylée, à la surface des cellules T. REFERENCES 1. Nowill, A., P. Moingeon, A. Ythier, M. Graziani, F. Faure, L. Delmon, M. Rainaut, F. Daffos, C. Bohuon and T. Hercend, 1986. Natural killer clones derived from fetal (25 wk) blood : probing the human T cell receptor with WT31 monoclonal antibody. J. Exp. Med. 163, 1601. 2. Maniatis, T., E.F. Fritsch and J. Szmbrook 1982. Molecular cloning : A laboratory manual, Cold spring harbor laboratory New York. 3. Mechler, B., and T.H. Rabbitts 1981. 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Svmboles des acides aminés A Ala alanine C Cys cytéine D Asp acide aspartique E Glu acide glutamique F Phe phénylalanine G Gly glycine H His histidine I Ile isoleucine K Lys lysine L Leu leucine M Met méthionine N Asn asparagine P Pro proline Q Gln glutamine R Arg arginine S Ser serine T Thr thréonine V Val valine W Trp tryptophane Y Tyr tyrosine REVENDICATIONS 1 - Protéines constituées par ou comprenant la séquence peptidique 10 20 30 40 50 60 # # # # # # VPVVWAQEGA PAQLPCSPTI PLQDLSLLRR AGVTWQHQPD SGPPAAAPGH PLAPGPHPAA PSSWGPRPRR YTVLSVGPGG LTSGRLPLQP RVQLDERGRQ RGDFSLWLRP ARRADAGEYR AAVHLRDRAL SCRLRLRLGQ ASMTASPPGS LRASDWVILN CSFSRPDRPA SVHWFRNRGQ GRVPVRESPH HHLAESFLFL PDVSPMDSGP WGCILTYRDG FNVSIMYNLT VLGLEPPTPL TVYAGAGSRV GLPCRLPAGV GTRSFLTAKW TPPGGGPDLL VTGDNGDFTL RLEDVSQAQA GTYTCHIHLQ EQQLNATVTL AIITVTPKSF GSPGSLGKLL CEVTPVSGQE RFVWSSLDTP SQRSFSGPWL EAQEAQLLSQ PWQCQLYQGE RLLGAAVYFT ELSSPGAQRS GRAPGALPAG HLLLFLTLGV LSLLLLVTGA FGFHLWRROW RPRRFSALEQ GIHPRRLRAR et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs amino-acides et qui possèdent la même activité. 2 - Protéine selon la revendication 1, constituée par la séquence peptidique 10 20 30 40 50 60 # # # # # # XVP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL QDLSLLRRAG VTWQHQPDGS PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEG QLNATVTLAI ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL LLFLTLGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPRRLRAR dans laquelle X est choisi parmi H, un reste méthionine ou la séquence MWEAQ FLGLL FLQPL WVAPV KPLQP GAE et les séquences qui en différent par un ou plusieurs amino-acides et qui possèdent la même activité. 3 - Séquence d'ADN comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2. 4 - Séquence d'ADN codant pour une protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2. 5 - Séquence d'ADN selon la revendication 4 comprenant essentiellement la séquence 10 20 30 40 50 60 # # # # # # TCAGGCTGCC TGATCTGCCC AGCTTTCCAG CTTTCCTCTG GATTCCGGCC TCTGGTCATC CCTCCCCACC CTCTCTCCAA GGCCCTCTCC TGGTCTCCCT TCTTCTAGAA CCCCTTCCTC CACCTCCCTC TCTGCAGAAC TTCTCCTTTA CCCCCCACCC CCCACCACTG CCCCCTTTCC TTTTCTGACC TCCTTTTGGA GGGCTCAGCG CTGCCCAGAC CATAGGAGAG ATGTGGGAGG CTCAGTTCCT GGGCTTGCTG TTTCTGCAGC CGCTTTGGGT GGCTCCAGTG AAGCCTCTCC AGCCAGGGGC TGAGGTCCCG GTGGTGTGGG CCCAGGAGGG GGCTCCTGCC CAGCTCCCCT GCAGCCCCAC AATCCCCCTC CAGGATCTCA GCCTTCTGCG AAGAGCAGGG GTCACTTGGC AGCATCAGCC AGACAGTGGC CCGCCCGCTG CCGCCCCCGG CCATCCCCTG GCCCCCGGCC CTCACCCGGC GGCGCCCTCC TCCTGGGGGC CCAGGCCCCG CCGCTACACG GTGCTGAGCG TGGGTCCCGG AGGCCTGCGC AGCGGGAGGC TGCCCCTGCA GCCCCGCGTC CAGCTGGATG AGCGCGGCCG GCAGCGCGGG GACTTCTCGC TATGGCTGCG CCCAGCCCGG CGCGCGGACG CCGGCGAGTA CCGCGCCGCG GTGCACCTCA GGGACCGCGC CCTCTCCTGC CGCCTCCGTC TGCGCCTGGG CCAGGCCTCG ATGACTGCCA GCCCCCCAGG ATCTCTCAGA GCCTCCGACT GGGTCATTTT GAACTGCTCC TTCAGCCGCC CTGACCGCCC AGCCTCTGTG CATTGGTTCC GGAACCGGGG CCAGGGCCGA GTCCCTGTCC GGGAGTCCCC CCATCACCAC TTAGCGGAAA GCTTCCTCTT CCTGCCCCAA GTCAGCCCCA TGGACTCTGG GCCCTGGGGC TGCATCCTCA CCTACAGAGA TGGCTTCAAC GTCTCCATCA TGTATAACCT CACTGTTCTG GGTCTGGAGC CCCCAACTCC CTTGACAGTG TACGCTGGAG CAGGTTCCAG GGTGGGGCTG CCCTGCCGCC TGCCTGCTGG TGTGGGGACC CGGTCTTTCC TCACTGCCAA GTGGACTCCT CCTGGGGGAG GCCCTGACCT CCTGGTGACT GGAGACAATG GCGACTTTAC CCTTCGACTA GAGGATGTGA GCCAGGCCCA GGCTGGGACC TACACCTGCC ATATCCATCT GCAGGAACAG CAGCTCAATG CCACTGTCAC ATTGGCAATC ATCACAGTGA CTCCCAAATC CTTTGGGTCA CCTGGATCCC TGGGGAAGCT GCTTTGTGAG GTGACTCCAG TATCTGGACA AGAACGCTTT GTGTGGAGCT CTCTGGACAC CCCATCCCAG AGGAGTTTCT CAGGACCTTG GCTGGAGGCA CAGGAGGCCC AGCTCCTTTC CCAGCCTTGG CAATGCCAGC TGTACCAGGG GGAGAGGCTT CTTGGAGCAG CAGTGTACTT CACAGAGCTG TCTAGCCCAG GTGCCCAACG CTCTGGGAGA GCCCCAGGTG CCCTCCCAGC AGGCCACCTC CTGCTGTTTC TCACCCTTGG TGTCCTTTCT CTGCTCCTTT TGGTGACTGG AGCCTTTGGC TTTCACCTTT GGAGAAGACA GTGGCGACCA AGACGATTTT CTGCCTTAGA GCAAGGGATT CACCCTCGCA GGCTCAGAGC AAGATAGAGG AGCTGGAGCA AGAACCGGAG CCGGAGCCGG AGCCGGAACC GGAGCCCGAG CCCGAGCCCG AGCCGGAGCA GCTCTGACCT GGAGCTGAGG CAGCCAGCAG ATCTCAGCAG CCCAGTCCAA ATAAACGTCC TGTCTAGCAG C 6 - Gène codant pour une protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend environ 6,6 kb et comporte 8 exons dont les premiers nucléotides sont respectivement ceux en position 1, 289, 437, 742, 1012, 1288, 1531 et 1662 de la séquence d'ADN selon la revendication 5. 7 - Gène selon la revendication 6, caractérisé en ce que sa carte de restriction par les endonucléases Sp I, Xba I, Pst I, Sac I, Bam HI, Hind III, Eco RI est telle que représentée à la Fig. 2. 8 - Composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif une protéine ou une partie de protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2. 9 - Composition pharmaceutique selon la revendication 8 comprenant à titre de principe actif tout ou partie de la fraction soluble de la protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2. 10 - Composition pharmaceutique selon la revendication 9 comprenant tout ou partie de la région extracellulaire soluble de la protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2 s'étendant de l'amino-acide 29 à l'amino-acide 448 inclus. 11 - Séquence peptidique immunogène comprenant la séquence GPPAA APGHP LAPGP HPAAP SSWGP RPRRY de la protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2. 12 - Anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2 ou une séquence immunogène d'une telle protéine, notamment la séquence selon la revendication 11. 13 - Hybridomes produisant des anticorps monoclonaux selon la revendication 12. 14 - Procédé de dosage d'une protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2, comprenant l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2 ou une séquence immunogène d'une telle protéine. 15 - Plasmide contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine selon la revendication 1 ou 2. 16 - Vecteur d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine selon la revendication 1 ou 2. 17 - Hote transformé avec un vecteur selon la revendication 16. 18 - Séquence d'ADN comprenant essentiellement comme séquence promotrice tout ou partie de la séquence 10 20 30 40 50 60 CCTGCAATGT CATTCTTTGA GCTCAGTTCC TCATCTCTGT CATGGAGAGC ATTAGATTTC 70 80 90 100 110 120 ATGAATTCAT ACTAAGTGTC CAATACAGTG CTTAGCACGT AATGAAGCCT CAATACAATG 130 140 150 160 170 180 TAGTTATTCT CCATGCCCCA CAAAGCTGCA TGCCTAGCCT CAGACCTACC ATTTTTTGGG 190 200 210 220 230 240 GTGCAGTAAG GCTTCCTGTC CACCATGTTC CCAGGGACAT TGTACTGATG GGTGGAAAGG 250 260 270 280 290 300 CAGGTCTAAA GGGGTCACGA AGTTCTGGGA GGTTAAGGGA ACGAGGAAGG AGATTGAGCA 310 320 330 340 350 360 ACAAGGAAAG AGCTTGCCAA GAAGGAGGTG TGAATATTGG GACTGAGGAG GCAGCTTAGA 370 380 390 400 410 420 GATGGGCAAG GGGGCAGTTC CAGGCAGAAA TGGTTCGTGG AGGCAGAAGG TCCCTGGGAG 430 440 450 460 470 480 AGGGAGCAGT CTGGAGGGTG GGGCAGGGGC GAGGAGGGGG AGGTGGGGAG ACCCAGGACT 490 500 510 520 530 540 GAGGAAGTAA ACAAGGGGAG CGCCACCACA GAGGTGGAGA GGTGGAGGGT GCTGCTGCTG 550 560 570 580 590 600 GGAATCAACC CCCTCAGACT TTCCACTGCG AAGCGAAACC GTAAGCCCTG GGGTGCGGGG 610 620 630 640 650 660 GGCGGGCCGG GAGGAGGGGA AGTGGGGAAG GTGGAGGGAA GGCCGGGCAC AGGGGTGAAG 670 680 690 700 710 720 GCCCAGAGAC CAGCAGAACG GCATCCCAGC CACGACGGCC ACTTTGCTCT GTCTGCTGTC 730 740 750 760 770 780 CGCCACGGCC CTGCTCTGTT CCCTGGGACA CCCCCGCCCC CACCTCCTCA GGCTGCCTGA 790 800 810 820 830 840 TCTGCCCAGC TTTCCAGCTT TCCTCTGGAT TCCGGCCTCT GGTCATCCCT CCCCACCCTC 850 860 870 880 890 900 TCTCCAAGGC CCTCTCCTGG TCTCCCTTCT TCTAGAACCC CTTCCTCCAC CTCCCTCTCT 910 920 930 940 950 960 GCAGAACTTC TCCTTTCCCC CCACCCCCCA CCACTGCCCC CTTTCCTTTT CTGACCTCCT 970 980 990 1,000 1,010 1,020 TTTGGAGGGC TCAGCGCTGC CCAGACCATA GGAGAGATG 19 - Vecteur d'expression comprenant une séquence d'ADN selon la revendication 18. 20 - Hote transformé par un vecteur d'expression comprenant une séquence d'ADN promotrice selon la revendication 18 et la séquence d'ADN codant pour une protéine selon la revendication 1 ou 2 pour l'expression de ladite protéine sous le contrôle de ladite séquence promotrice. 21. Séquence peptidique comprenant tout ou partie de la séquence peptidique GLRSG RLPLQ de la protéine selon la revendication 1 ou la revendication 2, constituant un site de fixation de rétrovirus.