Brevet FR2656626A1 — publié le 19910705

La présente invention est relative à un fragment peptidique obtenu à partir de la protéine 28 kDa de S. mansoni, ainsi qu'à des compositions vaccinantes et/ou thérapeutiques comprenant ledit fragment peptidiquet éventuellement associé à d'autres substances appropriées. BALLOUL et al. [MOLECULAR AND BIOCHEMICAL PARASITOLOGY, 17, (1985), p. 105-114] ont décrit la synthèse in vitro d'un antigène constitué par un polypeptide présentant un poids moléculaire de 28 kDa et un point isoélectrique compris entre 6,3 et 6,8, qui constitue un produit de traduction in vitro d'ARN total de Schistosoma mansoni. Ces Auteurs ont poursuivi leurs recherches dans le but d'isoler à partir de ce polypeptide de 28 kD, et d'identifier l'épitope ou les épitopes peptidiques responsables des propriétés antigéniques. Il est connu d'analyser les peptides qui constituent des protéines isolées de gels de SDS, par digestion partielle desdites protéines par une protéase dans un tampon contenant du SDS ; on obtient des produits de digestion partielle stables, qui se composent de nombreux peptides dont les poids moléculaires sont suffisamment élevés pour qu'il soit possible de les séparer en gels de SDS acrylamide à 15 % [CLEVELAND et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY r 252, p. 1102-1106, (1977)1, Comme les Inventeurs l'ont montré précédemment, notamment dans le Brevet français n 2 601 037, ils ont cherché à isoler, à partir de la protéine 28 kD de S. mansoni, le ou les peptides portant l'activité antigénique anti-Schistosome que présente la protéine 28 kD, et ont fait application dans ce but des techniques d'isolement de fragments peptidiques par protéolyse décrits dans llArt antérieur. Poursuivant leur travail dans cette voie, ils ont plus précisément mis en évidence les déterminants antigéniques impliqués dans 1 'immunité protectrice. L'article paru dans J. Immunol., 1988, 141, 5, 1687-1694 décrit notamment trois peptides dérivés de la séquence primaire de l'antigène P28 de Schistosama mansoni. Ces trois peptides comprennent respectivement les séquences 24-43, 115-131 et 140-153 dudit antigène P28. Cet article précise également que les peptides comprenant les séquences 24-43 et 115-131 contiennent des épitopes majeurs pour les IgG et non pour les IgE. Les IgG spécifiques obtenues après injection d'antigène P28 ou de peptide 24-43 couplé au toxoïde tétanique à des rats Fis cher sont essentiellement des IgG2a et dans une moindre mesure des IgG1 ; ces anticorps spécifiques sont cytotoxiques in vitro vis-à-vis des schistosomules en présence d'éosinophiles comme cellules effectrices. L'article paru dans J. Immunol., 1989, 142, 4, 1342-1350 met en évidence, pour sa part, la protection immunitaire de souris vaccinées avec l'antigène P28-1 de Schistosoma mansoni. Cet antigène P28-1 correspond aux 172 amino acides de l'extrémité COOH de la protéine 28 kDa native. I1 est en particulier précisé que les lymphocytes T de souris immunisées avec l'antigène recombinant P28-1 sont stimulés in vitro par des antigènes schistosomiques de différents stades de développement et par trois peptides synthétiques dérivés de l'antigène P28-1. La stimulation la plus efficace est obtenue avec le peptide 24-43. L'utilisation de deux fragments de ce peptide a montré que la spécificité vis-à-vis des lymphocytes T est fournie par la séquence NH2 terminale dudit peptide. Cependant, ces peptides ont l'inconvénient de ne pas être suffisamment immunogènes. En effet, un vaccin idéal contre la bilharziose doit être fortement immunogène et être capable d'induire à la fois une immunité spécifique contre le schistosome tant pour les cellules T que pour les cellules B. Les Inventeurs, poursuivant leurs travaux dans ce domaine ont mis au point des fragments peptidiques qui répondent mieux aux besoins de la pratique que les frag ments peptidiques de l'Art antérieur, notamment en ce qu'ils sont à la fois immunogènes et protecteurs et permettent ainsi d'obtenir une composition vaccinante beaucoup plus protectrice. La présente invention a pour objet un fragment peptidique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'amino-acides issue de la protéine 28 kDa de Schistosoma mansoni, représentée 2n fois dans ledit fragment peptidique, n étant un nombre supérieur à 1, laquelle séquence est en outre caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un épitope qui induit une réponse spécifique des lymphocytes T et/ou au moins un épitope qui induit une réponse spécifique des lymphocytes B. Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment peptidique, n est avantageusement un nombre compris entre 1 et 10. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, n est égal à 3. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit fragment peptidique, ladite séquence issue de la protéine 28 kDa est la séquence 115-131 de ladite protéine 28 kDa native ou recombinée. La séquence 115-131 comprend les acides aminés suivants : KPQEEKEKITKEILNGK-COOH Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la séquence 115-131 de la protéine 28 kDa est représentée 8 fois (n = 3). Un tel fragment peptidique dit multiantigénique a été dénommé fragment "octopus" par les Inventeurs. Ce fragment peptidique dit " octopus" a notamment l'avantage d'induire une réponse humorale et une réponse cellulaire. Le procédé de préparation dudit fragment peptidique comprend la synthèse récurrente de la séquence issue de la protéine 28 kDa telle que définie ci-dessus sur une matrice, portant 2n groupes fonctionnels, comme décrit dans J.P. TAM (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 5409-5413). La présente invention a, de plus, pour objet une composition immunogène et protectrice, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, éventuellement associé à au moins une autre substance appropriée et/ou à un adjuvant approprié. Une telle préparation présente, de manière inattendue, des propriétés immunogènes et protectrices importantes. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Procédé de préparation du fragment peptidique conforme à l'invention. La synthèse a été réalisée manuellement sur une résine t-butyloxycarbonyle (Boc) B-Alanine benzhydrilamide chargée à 0,3 mmole/g. Le montage de la matrice octovalente a été réalisé selon le protocole décrit en 1988 par l'équipe de Tam (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5409-5413) : après déprotection du groupe t-butyloxycarbonyle par l'acide trifluoroacétique à 50 % dans le chlorure de méthylène et neutralisation par la diisopropyléthylamine, la synthèse du premier niveau, pour obtenir Boc-Lys(Boc)-p Ala-résine BHA, est effectuée par couplage de 2,5 excès molaires de Boc-Lys(Boc) introduit sous forme de sel de dicyclohexylamine selon la procédure au BOP [CASTRO et al., SYNTHESIS, 1976 751-752 Peptide coupling reagents ; VI A novel cheaper preparation of benzotriazolyloxytris (dimethylamino) -hexafluoro- phosphate (BOP reagent > ] dans le diméthylformamide (DMF), suivi d'un recouplage dans le chlorure de méthylène.Le deuxième et le troisième niveau ont été synthétisés selon le même protocole, en considérant une charge multipliée par 2 puis par 4 respectivement, pour obtenir une matrice octavalente Boc-Lys(Boc)-matrice contenant 8 groupes amines fonctionnels. Par la suite, la synthèse de l'antigène peptidique est réalisée selon le schéma usuel Boc/TFA, les protections des chaînes latérales sont identiques aux protections utilisées dans la synthèse du monomère. Les couplages sont effectués selon la procédure au BOP dans le DMF, suivi d'un ou deux recouplages, si nécessaire, dans un mélange solvant NMP-DMSO [Curdy, Otteson, Applied Biosystems User Meeting, St Louis, May 1987 : the use of N-methylpyrrolidone-dimethylsulfoxyde as a coupling mixture in solid phase synthesis].La surveillance de la synthèse est réalisé au moyen du test de Kaiser à la ninhydrine. La séquence de l'antigène 115-131 est la suivante : KPQEEKEKITKEILNGK (en code une lettre). En fin de synthèse, le groupe Boc est clivé au TFA 50 %, puis l"'octopus 115-131" est libéré de son support et simultanément déprotégé par traitement à l'acide fluorhydrique (HF) anhydre ou l'acide trifluorométhane sulfo nique dans du sulfure de diméthyle, pour éviter les réactions néfastes catalysées par les acides forts. On obtient une structure octamérique, comme visible à la figure 1. Le produit brut est purifié par dialyse extensive sur une membrane YM5 (Amicon) contre une solution HC1 pH3. Le contrôle par analyse d'acide aminé après hydrolyse acide totale donne une composition en acide aminé satisfaisante. Exemple 2 : Rôle vaccinant de la composition conforme à l'invention. Les peptides synthétiques, dérivés de la séquence primaire de la protéine P28 recombinante ont été synthétisés et la présence de cellules T et B a été examinée chez le rat, la souris, le babouin et l'homme. Le peptide comprenant les amino-acides 115-131 contient les épitopes majeurs des cellules T et B. Un peptide multiantigénique 115-131 ("octopus") a été préparé comme précisé dans l'exemple 1 et utilisé comme composition immunogène chez le rat, la souris et le babouin. Dans les trois modèles expérimentaux, l"'octopus 115-131" induit à la fois une réponse humorale et une réponse cellulaire envers la protéine P28 recombinante ou la protéine P28 native. De plus, une immunisation antérieure avec l"'octopus 115-131" avant une injection de protéine P28 conduit à une augmentation de l'ordre de 4 à 10 fois de la prolifération des cellules T et de la production d'anticorps. L'immunisation active des rats avec ce fragment peptidique conforme à l'invention, avant une infection, permet une protection significative de l'ordre de 40 à 50 %. La protection obtenue est montrée à la figure 2, laquelle représente un histogramme dans lequel on a le nombre de vers présents avec en colonne (1), un contrôle négatif (injection d'ovalbumine) et en colonne (2), la protection obtenue après immunisation avec l'octopus 115131. Le protocole d'immunisation des rats est le suivant au jour 0 (JO), on immunise des rats Fischer à l'aide de 100 g "d'octopus 115-131" en adjuvant complet de Freund, par voie sous-cutanée, à la base de la queue des rats âgés de sept semaines ; à J7 (7ème jour), on effectue un premier rappel, avec 50 Fg d'octopus 115-131" en adjuvant incomplet de Freund (AIF), par voie sous-cutanée ; à J14 (14ème jour), on effectue un deuxième rappel, avec 50 Rg "d'octopus 115-131" en adjuvant incomplet de Freund (AIF), par voie sous-cutanée ;; à à J24 (24ème jour), on effectue un troisième rappel, avec 50 g "d'octopus 115-131" en adjuvant incomplet de Freund (AIF), par voie sous-cutanée ; à J30 (30ème jour), soit - l'on récupère les ganglions drainants, lorsque l'on veut réaliser un test de spéci ficité lymphocytaire ; - l'on infeste les rats avec 1500 furcocer caires, lorsque l'on veut réaliser des expé riences de protection. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1") Fragment peptidique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'amino-acides issue de la protéine 28 kDa de Schistosoma mansoni, représentée 2n fois dans ledit fragment peptidique, n étant un nombre supérieur à 1, laquelle séquence est en outre caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un épitope qui induit une réponse spécifique des lymphocytes T et/ou au moins un épitope qui induit une réponse spécifique des lymphocytes B. 2") Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est avantageusement un nombre compris entre 1 et 10. 3 ) Fragment selon la revendication 2, caractérisé en ce que n est égal à 3. 4 ) Fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite séquence issue de la protéine 28 kDa est la séquence 115-131 de ladite protéine 28 kDa. 5 ) Fragment selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence 115-131 de la protéine 28 kDa est représentée 8 fois (n = 3). 6 ) Composition immunogène et protectrice, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 éventuellement associé à au moins une autre substance appropriée et/ou à un adjuvant approprié.