Brevet FR2654344A1 — publié le 19910517

La présente invention concerne un nouveau complexe paramagnétique de gadolinium (III), utilisable pour le diagnostic, en particulier comme agent de contraste en imagerie par résonance magnétique (IRM). La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) a été mise au point en 1946 par Bloch et Purcell, et cette technique a été largement utilisée depuis dans les domaines de la physique, de la chimie organique et de la biochimie, pour étudier La structure chimique des molécules et des groupements moléculaires "in vitre". Le principe de la RMN utilise la conjonction de champs magnétiques et d'ondes de radiofréquence pour mettre en résonance les noyaux de certains atomes. L'un des atomes les plus intéressants étant l'hydrogène, qui est présent dans l'eau constituant la majorité des tissus biologiques (75 à 80% des tissus mous), il a été possible d' envisager l'utilisation de la technique RMN dans le domaine médical, et Le développement de l'imagerie par résonance magnétique nucléaire dans ce domaine a connu un essor considérable. L'image de la distribution des protons est obtenue à partir du signal émis, après mise en résonance des noyaux, et la reconstruction par ordinateur conduit à la visualisation des coupes transverses, sagittales et frontales du corps humain. Pour obtenir de meilleurs résultats en IRM, on a développé récemment des agents de contraste permettant d'accentuer artificiellement le contraste par introduction dans l'organisme à examiner d'éléments modifiant notamment le champ magnétique, par exemple les composés paramagnétiques, afin de perturber les temps de relaxation des noyaux déjà présents dans l'organisme, en ajoutant à la relaxation nucléaire une composante liée à des perturbations par un moment magnétique électronique. L'utilisation d'agents de contraste de ce type est en particulier décrite dans les documents EP-A- 0 071 564 (Schering A.G.), EP-A- 133 603 (Commissariat à L'Energie Atomique), FR-A- 2 596 992 (Guerbet S.A.) et WO- 87/02893 (Board of Regents, the University of Texas System). Parmi tous les produits décrits dans ces documents, seuls les complexes constitués par le sel de di N-méthyl-glucamine (diméglumine) du complexe Gd(III)-acide diéthylène triamine pentacétique (DTPA) et le sel de lysine du complexe gadolinium-acide 1,4,7,10-tétraasacyclododécane-N,N',N",N"'-tétracéti- que (DOTA) ont été développés respectivement par Schering et Guerbet, et sont utilisés dans les services hospitaliers. Cependant, le complexe constitué par le sel de di-N-méthyl-glucamine du DTPA-Gd(III) présente certains inconvénients. En effet, sa pression osmotique est élevée (1940mosm/kg selon les indications de Berlex Lab. qui commercialise ce produit sous la référence Magnevist&commat;), sa viscosité est importante et on doit L'utiliser en concentrations élevées, généralement sous la forme d'une solution à 0,5mol/l de complexe. Par ailleurs, sa toxicité reste élevée. Pour surmonter ces inconvénients, on a envisagé d'utiliser un complexe de Gd-DTPA sous la forme du sel de calcium qui a une pression osmotique et une viscosité plus faibles et qui peut être utilisé à des concentrations inférieures par exemple à 0,4mol/l. Cependant, ce complexe est lui aussi toxique et ne présente pas une stabilité suffisante car il y a décomplexation du Gd3+ ionique. De plus à l'injection, il conduit à une accélération du rythme cardiaque et à une hypercalcémie en libérant du calcium dans l'organisme. En revanche, Le sel de lysine du complexe Gd-DOTA est moins toxique, mais cet avantage ne peut être obtenu si L'on remplace la N-méthylglucamine (méglumine)du complexe Gd-DTPA par la Lysine, comme il est décrit dans Le document FR-A- 2 596 992. La présente invention a précisément pour objet un nouveau complexe de Gd(III) qui peut être formé à partir de ligands tels que le DTPA, tout en présentant une osmolalité plus faible que celle du complexe GD-DTPA-dimégLumine et une toxicité aussi faible que celle du sel de lysine du Gd-DOTA. Selon l'invention, le complexe paramagnétique est formé du sel mixte de N-méthylglucamine et de calcium d'un complexe de Gd(III). Le complexe de Gd(III) est un complexe ionique chargé négativement, comportant un ligand organique sous forme anionique Le Ligand organique peut être acyclique ou cyclique et contenir de l'azote, du phosphore, de l'oxygène et/ou du soufre. Parmi ces ligands, on peut citer en particulier Les acides aminopolycarboxyliques tels que ceux décrits dans EP-A- 0071564 et EP-A0 133 603, par exemple L'acide di éthylène tri amine pentacétique (DTPA), et les composés tétraaza ou diazamacrocylique comme L'acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécaneN,N',N",N"' tétracétique (DOTA). Le ligand peut aussi être couplé à une molécule biologique telle qu'un anticorps monoclonal. L'utilisation dans le complexe de L'inven tion d'un mélange de N-methylglucamine et de calcium sous la forme de sel mixte a un effet de synergie sur la composition finale car on obtient avec de tels complexes une bonne stabilité, une pression osmotique compatible avec une injection "in vivo" et une toxicité inférieure à celles du sel de Nméthylglucamine du DTPA-Gd et du sel de calcium de DTPA-Gd. Les complexes de l'invention peuvent être préparés facilement à partir d'oxyde de gadolinium, des ligands appropriés, d'un sel de calcium et de N-méthylglucamine. Aussi, l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un tel complexe, qui comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un complexe de GdIII par réaction d'oxyde de gadolinium avec un ligand capable de former avec le gadolinium un ion complexe chargé négativement, b) préparation d'un sel de calcium d'un complexe de GdIII par réaction d'oxyde de gadolinium avec un ligand identique à celui utilisé dans L'étape a), puis réaction du complexe de GdIII ainsi obtenu avec un sel de calcium, c) préparation d'une solution aqueuse du complexe de GdIII-Ca obtenu dans L'étape b) et du complexe de GdIII obtenu dans L'étape a), et d) neutralisation du complexe obtenu dans L'étape c) par la N-méthylglucamine. Avantageusement, le ligand est L'acide diéthylènetriamine pentacétique (DTPA). Dans le procédé de l'invention, le rapport molaire du complexe de Gd(III) au complexe de Gd(III) Ca utilisé pour former la solution aqueuse de L'étape c) a une influence très importante sur le résultat obtenu, notamment en ce qui concerne la toxicité, la stabilité et la pression osmotique du complexe. Le rapport molaire du complexe de Gd(III) au complexe de Gd(III)-Ca est de préférence de 0,75 à 1,25. Les meilleurs résultats correspondent à un rapport molaire égal à 1. Le complexe de l'invention peut être utilisé en particulier dans des compositions de diagnostic, administrables à l'homme, pour servir d'agent de contraste en imagerie par résonance magnétique (IRM). Aussi, l'invention a également pour objet une composition de diagnostic comprenant une quantité efficace d'un complexe paramagnétique conforme à l'invention. Cette composition peut être administrée à l'homme par voie parentérale (notamment vasculaire ou lymphatique), sous arachnoidienne, orale ou intrabronchique. Pour l'administration par voie parentérale, ou orale, la composition est de préférence constituée par une solution de ce complexe dans un solvant aqueux physiologiquement acceptable qui contient de préférence de 0,2 à 0,6 mol/l de complexe paramagnétique. La solution contient notamment 0,4 mol/l du sel mixte et la dose administrable est généralement de 0,05 à 0,15 mmol/kg. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante donnée bien entendu à titre illustratif et non limitatif, qui concerne la préparation et les propriétés d'un complexe parama gnétique conforme à l'invention, constitué par le sel mixte de calcium et de N-méthylglucamine du Gd-DTPA. l. Préparation du sel mixte de calcium et de N-méthyLglucamine du complexe Gd(III)-DTPA. a) Préparation du complexe H2Gd-DTPA. On dissout 1009 (0,275mol) d'oxyde de gadolinium Gd203 et 2179 (0,55 mol) d'acide di éthylène tri amine pentacétique (DTPA) dans 21 d'eau pour préparations injectables (ppi). On chauffe au reflux jusqu'à dissolution complète des produits, on filtre La solution et on mesure exactement Le volume de solution recueilli pour calculer la concentration en complexe H2Gd.DTPA. Cette concentration est de 0,44mol/l. b) Préparation du sel de calcium du complexe Gd(III)-DTPA (Ca-Gd-DTPA). On dissout 1009 (0,275mol) d'oxyde de gadolinium Gd2O3 et 2179 (0,55mol) d'acide diéthylène triamine pentacétique (DTPA) dans 2l d'eau (ppi), on chauffe à reflux jusqu'à dissolution complète des produits, on filtre la solution, puis on chauffe en ajoutant 55,239 (0,55mol) de carbonate de calcium CaC03. On réduit le volume de la solution de 1/4 en chauffant. On recueille le précipité que l'on sèche sous vide, puis on le redissout dans 21 d'eau (ppi), on réduit le volume de la solution de 1/4 par chauffage, on recueiLle le précipité et on le sèche sous vide. On obtient ainsi 279,69 (0,477mol) de Ca-Gd-DTPA. c) Préparation de la solution aqueuse de H2Gd-DTPA et Ca-Gd-DTPA. On mélange 1074ml de la solution de H2Gd DTPA obtenue en a) avec 1311mL d'eau, puis on dissout dans la solution obtenue 279,69 de Ca-Gd-DTPA obtenu dans l'étape b) et on mélange la solution jusqu'à dissolution complète du produit. d) Préparation du sel mixte Ca-N-méthyl glucamine-Gd-DTPA. On ajuste le pH de la solution obtenu dans L'étape c) à 7 en ajoutant 150g de N-méthyl glucamine. On obtient ainsi une solution à 0,4mol/l de Gd-DTPA sous La forme de sel mixte de calcium et de N-méthyl glucamine. On stérilise alors la solution par filtration et on la distribue dans des flacons, à raison de 20ml par flacon, en réalisant cette opération dans une enceinte stérile. II. Forrulation de La solution de complexe. - sel de calcium et de N-méthylqlucamine de Gd-DTPA : teneur par flacon de 20ml : 6,08g teneur par mi : 0,304g - qadolinium teneur par flacon de 20ml : 1,26g teneur par ml : 0,063g - calcium. teneur par flacon de 20ml : 0,16g teneur par ml : 0,008g - acide diéthylène triamine pentacêtique (DTPA) teneur par flacon de 20ml : 3,10g teneur par ml : 0,155g - N-méthylglucamine teneur par flacon de 20ml : 1,569 teneur par ml : 0,078g. Les caractéristiques physicochimiques de la solution, la stabilité du compLexe, sa toxicité igu#e, sa capacité de Liaison aux protéines plasmatiques et Les temps de relaxation T1 et T2 dans différents organes sont donnés ci-dessous. 1. Caractéristiques physicochimiques - Osmolalité déterminée au moyen d'un osmomètre par la technique propharmacopoea 360, Ordre National des Pharmaciens n 293, juin 1986 osmolalité = 812 mosm/kg à 370C. - Viscosité déterminez au moyen d'un tube capillaire selon les normes de La pharmacopée française viscosité = 0,096 cPas. 2. Stabilité du complexe. On a étuidé cette stabilité en milieu sanguin en suivant l'évolution de la concentration en gadolinium libre et en calcium libre par chromatographie sur papier avec des complexes de l'invention marqués au gadolinium 153 et au Ca 47. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 1 qui suit. TABLEAU 1 Stabilité du complexe DTPA-Gd-Ca (méglumine) SOLUTION DE SANG SOLUTION DE URINE COMPLEXE Plasma Hématies GLUCOSE 153Gd fixé par 153Gd complexé 99,05% les hématies 153Gd libre 0,95% 0,001% 0,85% 10-8 g/l 47Ca fixé par 47CA complexé 98.9% ls hématies 47Ca libre 0,4% 0,7% 6,4% Gd et Ca restent complexés en slution dans Le plasma en présence d'hématies. On teste également la présence de gadolinium libre dans les urines "in vivo". On obtient pour tous Les échantillons d'urine une coloration verte et la méthode colorimétrique ne met pas en évidence de gadolinium libre, la teneur en gadolinium libre étant inférieure à 2,5-10-8g/l. 3. Toxicité aigus du complexe de L'invention. On teste la toxicité aiguë du complexe chez la souris mâle par injection intraveineuse unique en 1 min, en utilisant la méthode de Bliss. Les résultats obtenus sont les suivants : - DL50=3760,6mg/kg (5,02mmol/kg). Cette valeur est supérieure à celle que l'on obtient avec le complexe DTPA-Gd diméglumine du document FR-A-2 596 992 (4,45 mmol/kg). Ainsi, le complexe de l'invention est moins toxique. 4. Capacité de Liaison aux protéines Plasmatiques. On n'observe pas de liaison protéqiue dans le plasma pour le complexe de l'invention testé en utilisant le chlorure de gadolinium 153 comme témoin. 5. EvaLuation des temps de relaxation T1 et T2 dans Les organes. Pour cette détermination, on utilise des rats mâles de souche Wistar pesant environ 2509 et l'on injecte à la moitié des rats une solution d'urée à 3mol/l dans la carotide droite pour rompre la barrière hématoencéphalique (BHE), puis la solution du complexe de l'invention DTPA-Gd-Ca-méglumine correspondant à la formulation décrite en II à une dose de 2 ml/kg par voie intraveineuse. I minute après, on tue Les rats, on prélève leur cerveau et on détermine les temps de relaxation T1 et T2 dans l'hémisphère gauche, L'hémisphère droit et le cervelet. Le temps de relaxation longitudinale T1 (Spin-réseau) est lié à la création de l'aimantation longitudinale axee sur le champ magnétique Bo et il est déterminé par les relations énergéltiques entre les noyaux et le réseau. Le temps de relaxation transversale T2 (Spin-spin) est défini par le retour à L'équilibre en grandeur et en orientation de l'aimantation longitudinale (parallèle à Bo) qui a été annutée ou modifiée par l'impulsion de radiofréquence. On l'exprime aussi par le retour à zéro de l'aimantation transversale qui a été créée par l'impulsion de radiofrequence. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 2 annexé. Ces résuLtats montrent que de 1min à 30min après l'injection, les temps de relaxation T1 et T2 sont raccourcis, ce qui prouve que L'agent de contraste est efficace. Ainsi, par rapport au complexe Gd-DTPA dimétglumine, les avantages du complexe de l'invention sont les suivants - une pression osmotique plus faible, - une viscosité plus faible, - une toxicité plus faible, et - la possibilité d'être utilisé à une concentration plus faible. Par ailleurs, il possède une très grande stabilité due à la complexation du calcium. En effet, le sel mixte de l'invention comprend moins de DTPA libre que le complexe de Shering Gd-DTPA-diméglumine, qui peut capter du calcium dans le sang donc produire une déminéralisa- tion due au DTPA libre. Dans le cas de L'invention, le complexe qui contient déjà du calcium complexe, ne complexera pas le calcium de l'organe. Dans le cas du sel de calcium de Gd-DTPA du document EP-A- 0 133 603, on risque de provoquer en revanche une hypercalcemie par libération de calcium. De plus, ce sel de calcium de Gd-DTPA n'est pas aussi stable car il se produit une décomplexation du Gd3+ ionique ; il est par ailleurs plus toxique que le sel mixte de l'invention et provoque une accétération du rythme cardiaque Lors de l'injection. TABLEAU 2 TEMPS DE RELAXATION DANS LE CERVEAU Animal sain Animal BHE rompue, sacrifice sans injection I minute, après injection de de produit de DTPA-Gd-Ca (méglumine) contraste Millisecondes Millisecondes % de diminution Hémisphère gauche 629,32 ms @ 344,42 ms 45,2 T1 Hémisphère droit 689,72 ms 302,32 ms S6,2 Cervelet 655,78 ms 291,04 ms 55,6 Hémisphère gauche 81,75 ms 70,05 ms 14,4 T2 Hémisphère droit 81,63 ms 65,72 ms 19,5 Cervelet 88,60 ms 69,70 ms 21,6 REVENDICATIONS 1. Complexe paramagnétique formé du sel mixte de N-méthylglucamine et de calcium d'un complexe de GdIII. 2. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le complexe de GdIII est le complexe GdIII-acide diéthylène triamine pentacétique (DTPA). 3. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le complexe de GdIII est le complexe GdIII-acide 1,4,7,10-tétra aza cyclododécane N,N',N"N"' tétracétique (DOTA). 4. Procédé de préparation d'un complexe paramagnétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un complexe de GdIII par réaction d'oxyde de gadolinium avec un ligand capable de former avec le gadolinium un ion complexe chargé négativement, b) préparation d'un sel de calcium d'un complexe de GdIII par réaction d'oxyde de gadolinium avec un ligand identique à celui utilisé dans l'étape a), puis réaction du complexe de GdIII ainsi obtenu avec un sel de calcium, c) préparation d'une solution aqueuse du complexe de GdIII-Ca obtenu dans L'étape b) et du complexe de GdIII obtenu dans l'étape a), et d) neutralisation du complexe obtenu dans L'étape c) par la N-méthylglucamine. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le ligand est l'acide di éthylène triamine pentacétique (DTPA). 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en en ce que dans L'étape c), le rapport molaire du complexe de GdIII au complexe de GdIII-Ca est de 0,75 à 1,25. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le rapport molaire est égal à 1. 8. Composition de diagnostic comprenant une quantité efficace d'un complexe paramagné-tique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 9. Composition de diagnostic comprenant une quantité efficace d'un complexe paramagnétiqe obtenu par le procédé selon L'une quelconque des revendications 4 à 7. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une solution du complexe dans un solvant aqueux physiologiquement acceptable. 11. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que la solution contient de 0,2 mol/l à 0,6 mol/l du complexe paramagnétique.