Brevet FR2650749A1 — publié le 19910215

La présente invention a pour objet l'utilisation à des fins de diagnostic et/ou de traitement, notamment du cancer, d'une glycoprotéine particulière, l'hyaluronectine. On sait les difficultés attachées tant au diagnostic qu'au traitement du cancer, et l'importance que revêt en particu- lier la mise au point d'une méthode de diagnostic efficace autori- sant un traitement aussi précoce que possible de la maladie. On a déjà proposé, à cette fin, une méthode scintigra- phique faisant appel à l'utilisation d'anticorps monoclonaux char- gés d'isotopes radioactifs. Toutefois les inconvénients liés à cette méthode sont nombreux, tenant pour une part à l'affinité relativement faible des anticorps monoclonaux pour les antigènes cancéreux, pour une autre part à leur étroite spécificité vis-à- vis desdits antigènes, et pour une dernière part aux réactions im- munologiques inévitables de l'organisme humain vis-à-vis d'anti- corps provenant d'animaux, le plus souvent des souris. A ces in- convénients s'ajoute celui créé par le fait que l'antigène qui fixe ces anticorps n'est pas toujours représenté dans les métastases cancéreuses mais seulement dans la tumeur primitive, en sorte que cette méthode ne permet pas de localiser avec certitude la totali- té des sites cancéreux d'un organisme. Le problème se posait donc de mettre au point une méthode qui ne présente aucun de ces inconvénients et qui permette un diagnostic sûr et complet en autorisant la localisation de tous les sites cancéreux d'un organisme humain, et ce sans risque de réactions.inmunologiques. La présente invention a pour but d'offrir une solu- tion au problème ainsi posé en proposant une méthode de diagnostic qui joint à l'avantage de l'efficacité et de la fiabilité celui de l'universalité, étant applicable à la détection de toutes les tu- meurs cancéreuses, quels que soient leur type histologique, leur localisation et leur nature, primitive ou métastatique. La présente invention a également pour but de propo- ser une méthode de traitement de certains types de tumeurs cancé- reuses, notamment les tumeurs intracérébrales. La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation à des fins de diagnostic et/ou de traitement, notamment du cancer, d'une glycoprotéine particulière, l'hyaluronectine. La présente invention est -en effet fondée sur cette double observation, d'une part que l'acide hyaluronique est présent dans toutes les tumeurs cancéreuses, sans exception, et d'autre part qu'il présente une affinité élevée pour l'hyaluronectine, laquelle est par ailleurs capable de fixer un produit tel qu'un radioisotope, susceptible d'avoir une action thérapeutique ou d'être détecté par des moyens d'exploration externes comme la scintigraphie. L'acide hyaluronique est un glycosaminoglycane qui constitue un composant des tissus conjonctifs lâches et inflamma- toires, et qui se retrouve en des proportions importantes dans les tissus cancéreux, o il est associé à la matrice extracellulaire. L'hyaluronectine, glycoprotéine présente dans l'encé- phale et le cordon ombilical de l'homme et des animaux, présente la propriété avantageuse d'être d'une taille notablement inférieure à celle des anticorps monoclonaux, puisque possédant une masse mo- léculaire de 68 000, en sorte que sa pénétration dans les tissus se fait facilement. L'acide hyaluronique se trouvant associé en propor- tions importantes à la matrice extracellulaire des tissus cancé- reux, est aisément accessible à l'hyaluronectine qui se fixe sur lesdits tissus préférentiellement aux tissus conjonctifs sains dans lesquels sa concentration est faible ou nulle. Marquee par un radioisotope approprié émetteur de rayons X comme l'indium, l'hyaluronectine peut ainsi permettre la localisation des sites cancéreux d'un organisme soit en imagerie externe,par scintigraphie, soit en repérage per-opératoire. Par ailleurs, une charge convenablement dosée d'un radioisotope émetteur de rayons P fixée sur l'hyaluronectine peut permettre un traitement très efficace de certaines tumeurs radio- sensibles, en particulier des tumeurs intracérébrales. L'hyaluronectine mise en oeuvre dans la méthode de diagnostic et/ou de traitement selon l'invention peut être isolée du cerveau d'animaux ou de cordons ombilicaux humains par passage d'un extrait acide sur un adsorbant d'acide hyaluronique couplé à une combinaison aminohexyl-sépharose, suivi d'une élution acide. Selon un premier mode-de réalisation de l'invention, applicable au diagnostic du cancer, l'hyaluronectine est marquée à l'aide d'un élréent détectable par des moyens d'exploration ex- ternes avant d'être injectée dans l'organisme humain sous forme de sôlution aqueuse. Le marquage de l'hyalurohectine peut s'effectuer au moyen d'un radioisotope détectable par scintigraphie, mais aussi au moyen d'un élément paramagnétique, tel que le gadolinium, détectable par résonance magnétique nucléaire (RMN). Dans le cas d'un radioisotope, on peut mettre en oeuvre n 'importe quel élément émetteur de rayons T approprié au radio- diagnostic, comme l'indium 111, le technétium 99, l'iode 123 ou l'iode 131, cette énumération n'étant pas limitative. La fixation de l'élément choisi sur l'hyaluronectine' peut s'effectuer par toute méthode de couplage connue appropriée à la fixation d'un tel élément sur une molécule de protéine. Ainsi, dans le cas de l'indium ou du technétium, on fait appel à un agent chélatant, l'acide diéthylènetriamine pentaa- cétique (DTPA), dont on réalise le couplage avec l'hyaluronectine, le DTPA libre étant éliminé par chromatograpllie de permeation sur gel avant fixation de l'indium. Dans le cas de l'iode, la fixation peut s'opérer au moyen de la chloramine T ou de l'iodogène. Le marquage de l'hyaluronectine s'effectue à l'aide des quantités d'élément radioactif les plus faibles possible sus- ceptibles d'être détectées par les moyens d'exploration habituels. On peut ainsi réaliser ce marquage de manière que l'hyaluronectine porte une charge de radioactivité n'excédant pas 10 microcuries par microgramme, et de préférence comprise entre 1 et 5 microcuries par microgramme. Selon un second mode de réalisation de l'invention, applicable au traitement du-cancer, l'hyaluronectine est chargée d'un isotope radioactif émetteur de rayons p utilisé dans la radio- thérapie du cancer, comme par exemple l'iode 131. Dans ce second mode de réalisation, l'hyaluronectine sert de vecteur au moyen thérapeutique qu'elle présente aux diffé- rents sites cancéreux. Ce moyen de traitement est particulièrement &pproprié à la thérapie des tumeurs intracérébrales, qui présentent la pro- priété de ne pas donner lieu à des métastases et d'être particulia- rement riches en acide hyaluronique accessible. Dans ce second mode de réalisation, le radioélément émetteur de rayonsP fixé sur l'hyaluronectine doit être mis en oeuvre à des doses permettant de délivrer à la tumeur une dose de quelques dizaines de grays, ordre de grandeur de: doses délivrées en radiothérapie externe dans le traitement des cancers. L'exemple qui suit illustre la méthode selon l'inven- tion appliquée au diagnostic du cancer, étant bien entendu que cet exemple ne présente aucun caractère limitatif vis-à-vis de l'inven- tion. EXEMPLE. On isole l'hyaluronectine à partir d'un cerveau d'agneau par passage d'un extrait acide sur un adsorbant d'acide hyaluronique (AH) couplé à de l'AH - sépharose, suivi d'une élution acide. On réalise ensuite le couplage de la protéine en ap- préciant la quantité de DTPA couplé sur une aliquote que l'on mar- que à l'indium et que l'on chromatographie sur feuille de silice, le DTPA libre étant éliminé sur Séphadex G 100. On contrôle l'activité de l'hyaluronectine (HN) par test, sur coupe de tissu,'de son affinité pour l'AH, puis on la marque à l'indium 111, à raison de 5 / Ci / P g et on l'injecte à des souris. On a choisi à cet effet des souris DBA/2 porteuses d'un carcinome mammaire greffé de génération en génération, aux- quelles on a injecté 6 P g d'HN marquée. Les souris ont été scinti- graphiées à J2, J3 et J4, des comptages d'activité dans les zones de tumeur ou d'organes délimitées sur les images étant effectués à ces différents temps, conduisant aux résultats rassemblés dans le tableau ci-après. J2 J3 J4 (3 cas) (4 cas) (5 cas) Tu/Foie 0,66-0,96-0,64 0,86-0,89 0,58-0,70-0,60 0,82-0,50 0,47-0,60 Tu/Tête 3,42-4,59-3,08 4,88-4,74 2,56-4,67-3,38 3,70-3,50 3,4?-2,95 Tu/Abdomen 3,33-4,37-3,42 2,75-3,68 1,85-3,85-2,84 3,57-1,90 2,56-2,27. A l'exception du foie et des reins, on a constaté que la fixation d'HN dans la tumeur a toujours été supérieure à sa fixation dans les autres organes, l'activité au niveau du-foie et des reins correspondant à des fixations non spécifiques du radiotracteur- (voies d'élimination). Par ailleurs, des comptages d'activité d'organes (foie, rate, rein, cerveau, muscle, poumon, coeur,sang) prélevés sur les souris sacrifiées ont été effectués à J2, J4 et J6 et ont montré que la radioactivité n'était pas retrouvée dans le cerveau, le coeur et les poumons. Les index de localisation de la protéine marquée dans la tumeur (Tu) par rapport au sang ont été les suivants: J2 J4 J6 (1 cas) (2 cas) (3 cas) Tu/Sang 6,5 11,7 il ,1 8,7 11,8 Les résultats, tant en imagerie qu'en étude de biodis- tribution, montrent que l'hyaluronectine injectée se fixe préfé- rentiellement dans la tumeur-, permettant sa détection et/ou son traitement. La méthode de diagnostic et/ou de traitement selon l'in- vention présente l'avantage, déjà exposé, de permettre la détection et la localisation de toutes les tumeurs cancéreuses, primitives ou métastatiques, quel que soit leur type histologique, ce qui constitue un progrès considérable par rapport aux méthodes connues, et de permettre.en outre le traitement efficace de certains types de tumeurs. A cet avantage s'ajoute ceux liés d'une part à la stabi- lité de l'hyaluronectine, qui peut être conservée plusieurs mois à 4 C et résiste quelques minutes à 100 C, et d'autre part à la sim- plicité de sa préparation, laquelle ne soulève pas de problème ju- ridique ou éthique, l'hyaluronectine pouvant être isolée à partir d'encéphales d'animaux ou de cordons ombilicaux. A cet égard, l'utilisation d'une préparation faite -à partir de cordon ombilical humain permet d'éviter en toute certi- tude les réactions immunologiques, constantes avec les anticorps monoclonaux de souris. Il va de soi que la présente invention ne saurait être limitée à la description qui précède, et qui peut subir un certain nombre de modifications sans pour autant sortir du cadre de l'inven- tion. Il convient en particulier de signaler qu'elle peut trouver une application en-dehors de la cancérologie, notamment en rhumatologie et dans tous les cas o apparaît une réaction du stroma conjonctif, entraînant l'accessibilité de l'acide hyaluroni- que à l'hyaluronectine. 7 2650749 REVENDICATIONS 1) Composition utilisable pour le diagnostic et/ou le traitement, notamment du cancer, caractérisée en ce qu'elle consiste en une solution aqueuse injectable d'une glycoprotéine, l'hyaluronectine, sur laquelle est fixé un élément radioactif. 2) Composition selon la revendication 1 utilisable pour le diagnostic, notamment du cancer, caractérisée en ce que l'élément radioactif fixé sur l'hyaluronectine est un radioisotope émetteur de rayons ' détectable par scintigraphie. 3) Composition selon Ia revendication 2, caractérisée en ce que le radioisotope est choisi dans le groupe formé par le technétium 99, l'indium 111, l'iode 123 et l'iode 131. 4) Composition selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisée en ce que le radioisotope est mis en oeuvre à raison de 1 à 5 microcuries par - microgramme d'hyaluronectine. ) Composition selon l'une quelconqde des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que le radioisotope est l'indium 111 ou le technétium 99, fixé sur l'hyaluronectine par l'intermédiaire d'un agent chélatant, l'acide diéthylènetriamine pentaacétique. 6) Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que le radioisotope est l'iode 123 ou l'iode 131, fixé sur l'hyaluronectine au moyen d'iodogène. 7) Composition selon la revendication 1, utilisable pour le traitement, notamment du cancer, caractérisée en ce que l'élément fixé sur l'hyaluronectine est un radioisotope émetteur de rayons B. 8) Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le radioisotope est l'iode 131. 9) Composition selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisée en ce que le radioisotope est mis en oeuvre à des doses permettant de délivrer à la tumeur une dose de quelques dizaines de grays. ) Composition selon la revendication 1, utilisable pour le diagnostic, notamment du cancer, caractérisée en ce que l'élément radioactif est remplacé par un élément paramagnétique détectable par résonance magnétique nucléaire.