Brevet FR2657883A1 — publié le 19910809

La présente invention concerne une nouvelle séquence d'ADN codant pour une glutathion Stransférase (GST) de Schistosoma mansoni de 26 kDa, appelée p26. Cette séquence peut être exprimée dans une cellule hôte, en particulier E. coli. Les glutathion S-transférases sont des enzymes très largement distribuées, présentes aussi bien chez les animaux que chez les végétaux, et qui jouent un rôle dans la détoxification de diverses molécules (composés électrophiles hydrophobes, superoxides endogènes, agents alkylants, herbicides...). La schistosomiase (ou bilharziose) est une maladie parasitaire (due aux schistosomes) des régions tropicales et sub-tropicales du monde entier (à l'exception de l'Amérique du Nord). Cette maladie affecte de 200 à 400 millions d'êtres humains. I1 existe un médicament efficace contre le parasite adulte, le praziquantel, mais il coûte trop cher pour qu'on puisse envisager son usage généralisé dans les pays en voie de développement. Le seul espoir sérieux de prévention de la maladie ne peut venir que de la mise au point d'un vaccin efficace contre le parasite. Des études faites sur les vaccins contre la schistosomiase ont montré que les GSTs sont des candidats intéressants, Sher et al. (1989) [Parasitology, , pp 61-68]. Ces enzymes semblent jouer un rôle important dans le système de détoxification du parasite. Ainsi leur inactivation par une réponse immunitaire spécifique pourrait être létale pour le parasite. Lorsque des extraits totaux de vers adultes de S. mansoni sont passés sur une colonne de glutathion agarose, deux molécules sont détectées dans l'éluat, par électrophorèse sur un gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE). La molécule prédominante est une protéine de 28 kDa, décrite dans la demande de brevet EP-0 268 501, de la Demanderesse. L'autre molécule est une protéine de 26 kDa (p26). Cette protéine peut être importante dans l'induction d'une réponse immunitaire, son clonage et sa caractérisation ont donc été entrepris. Des infections expérimentales faites par Mitchell et al. (1984) [J. Parasitol., L,0 pp 983-985], avec S. iaponicum ont permis d'identifier un antigène de 26 kDa (SJ26), reconnu par des souris résistantes. Cet antigène s'est avéré être une GST, Smith et al. (1988) [Mol. Biochem. ParasitoL, 27, pp 249-256]. Une protection partielle de souris contre l'infection par S. iaponicum a été obtenue après vaccination avec une protéine de fusion ss-galactosidase-SJ26. La présente invention concerne l'identification et la détermination de la séquence d'ADN complémentaire (cADN) qui code pour une glutathion S-transférase (GST) de Schistosoma mansoni, de 26 kDa, appelée p26. C'est pourquoi la présente invention concerne tout d'abord une séquence d'ADN codant pour une protéine p26 mature telle que décrite figure 1. La présente invention concerne également une protéine qui comprend les épitopes de la protéine p26 reconnus par les antisérums anti-p26 native, et qui présente une activité glutathion S-transférase. La synthèse de cette protéine est dirigée par la séquence d'ADN représentée à la figure 1, ou par un fragment de ladite séquence. La présente invention concerne également la protéine préparée à partir de cellules telles que les bactéries, les levures ou les cultures de cellules supérieures. Les technologies permettant le clonage et l'expression d'un gène étranger dans des cellules hôtes sont connues de l'homme du métier. Elles seront illustrées dans les exemples ci-après, étant entendu que d'autres vecteurs et d'autres cellules hôtes peuvent être utilisés. L'expression du gène correspondant à p26 dans une bactérie, en l'occurrence E. coli a été obtenue avec un vecteur comprenant le promoteur pL du phage lambda et une séquence rbs synthétique comme site de fixation des ribosomes. La protéine exprimée est non fusionnée. L'invention concerne également les cellules hôtes transformées par le vecteur d'expression de la protéine selon la présente invention ainsi qu'un procédé de préparation de telles protéines, caractérisé en ce qu'on cultive ces cellules hôtes et que l'on récupère les protéines selon l'invention. Les méthodes de culture, de récupération et de séparation des protéines sont connues de l'homme du métier. Enfin la présente invention concerne une composition pharmaceutique destinée notamment à la prévention de la schistosomiase, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent actif au moins une protéine selon l'invention. La présente invention concerne en outre l'application de la protéine p26 et des cellules précédemment décrites, transformées par un bloc d'expression de la protéine, à titre d'agent présentant une activité glutathion S-transférase. Dans la présente invention les séquences de nucléotides des gènes ou d'acides aminés des protéines qui sont représentés dans les figures ne seront pas reprises mais sont partie intégrante de l'invention et de la présente description. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. La description sera faite en utilisant les figures suivantes: .La figure 1 représente la séquence complète du cADN de p26 et la séquence d'acides aminés déduite. .La figure 2 représente les fractions insolubles et solubles de E.coli TGE901 transformé par le plasmide d'expression de p26, pTG4170 (TGE901/pTG4170), après électrophorèse en gel d'acrylamide-SDS et coloration au bleu de Coomassie. A. Marqueur de poids moléculaire rainbow de Amersham B. Fraction non soluble de l'extraitTGE901/pTG4170 après induction pendant 6h à 37"C. C. Fraction non soluble de l'extrait TGE901/pTG4170 après induction pendant 6h à 42 C. D. Fraction soluble de l'extrait TGE901/pTG4170 après induction pendant 6h à 37 C. E. Fraction soluble de l'extrait TGE901/pTG4170 après induction pendant 6h à 42 C. .La figure 3 représente la comparaison des séquences complètes d'acides aminés des protéines p26 et sj26. La séquence de p26 est au dessus de celle de sj26. L'alignement optimal est montré avec les identité marquées par (=), une substitution d'acides animés de même type par (-), et un trou par ( ). .La figure 4 représente la comparaison des séquences peptidiques des parties N-terminales de p28, décrite dans la demande de brevet EP 0268501, de p26 et des chaînes ybl et yb2 de GSTs de foie de rat. Les acides aminés conservés entre les séquences p26 et GST de mammifères de classe ,u sont encadrés. Les acides aminés conservés entre p26 et p28 sont connectés par des lignes verticales. Le numéro (NO) des résidus relie le premier acide aminé à sa position dans la protéine. Il est à noter que dans cette zone particulière (45-80), le pourcentage d'homologie p26 et les chaînes ybl et yb2 des GSTs de foie de rat (classe ) atteint 71% alors que globalement le pourcentage d'homologie est respectivement de 36 et 29% Cette région pourrait jouer un rôle dans la fixation du glutathion. EXEMPLE 1: Identification et clonage d'un ADN complémentaire codant pour une protéine p26 La stratégie choisie pour cloner le gène codant pour un antigène p26 dont la séquence n'est pas connue a été d'identifier les produits d'expression dans E. coli d'une banque d'ADN complémentaire de schistosomes, à l'aide d'antisérum anti-p26 de lapins préalablement immunisés avec p26 purifiée. Préparation d'antisérum anti-p26 Une souche du parasite Schistosoma mansoni est maintenue dans Biomyhalaria glabrata (escargot aquatique) et dans des hamsters dorés. La forme adulte du parasite est prélevée dans le sang issu de la veine porte de hamsters infectés depuis 40 jours puis lavés dans le milieu d'Eagle minimum (MEM). Les antigènes totaux des schistosomes adultes sont obtenus par homogénéisation des vers dans un tampon dont la composition est la suivante: 10 mM de phosphate de potassium à pH 7,0; 1,15% KCl; 0,5 mM de PMSF (Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride) et 1 mM d'EDTA (Ethylene Diamine TetraAcetic acid disodium salt). L'homogénat est ensuite soumis aux ultrasons et centrifugé pendant 20 min à 10000 tours par minute à 4"C en utilisant un rotor Sorvall HB-4. Les glutathion S-transférases sont ensuite purifiées. Les antigènes solubles sont passés sur une colonne gluthation-agarose (Sigma Chemical Co, St Louis, Mo) équilibrée avec le tampon décrit ci-dessus. Après lavage intensif avec ce même tampon, la fraction fixée est éluée avec un tampon 50 mM de Tris-HCl à pH 9,1 contenant 7 mM de gluthation réduit et 0,1 mM de dithiotréitol. La fraction éluée est ensuite neutralisée à l'aide d'un tampon 0,5 M phosphate de potassium à pH 7 puis dialysée contre 10 mM de tampon phosphate de potassium à pH 7 et enfin concentrée avec de l'aquacide II (Calbiochem-Behring Corp, CA). Les gluthation S-transférases totales de S. mansoni ainsi purifiées sont fractionnées sur gel préparatif de polyacrylamide (13%) suivant le technique décrite par Laemmli [Nature, 227 pp 680-685 (1970)]. Après coloration au bleu de Coomassie, la bande migrant à 26 kDa est récupérée. La protéine p26 en est electro-éluée suivant le protocole décrit par Balloul et al. (1985) [Mol. Biochem. Parasitol., il pp 105-114]. Elle est dialysée contre de l'eau puis concentrée à l'aide d'aquacide IL Des lapins sont immunisés par injection de 1 ml (100 llg de protéines) de p26 purifiée en présence d'adjuvant complet de Freund. Deux semaines plus tard 20 llg de la protéine p26 sont injectés en présence d'adjuvant incomplet de Freund en administration sousclaviculaire Préparation de la banque d'ADN complémentaire L'ARN total des schistosomes adultes est extrait par la méthode décrite par Chirgwin et al. (1979) [Biochemistry , pp 5294-5299] et modifiée par Gausz et al. (1983) [Mol. Biochem. Parasitol., 2, pp 293-301]. L'ARN poly A est obtenu par chromatographie d'affinité sur colonne de cellulose oligo (dT)12-18 (Collaborative Research, Lexington, MA). Une banque d'ADN complémentaire exprimée dans le vecteur lambda gt 11 est construite en utilisant la trousse Amersham. Ainsi à partir des ARN poly A' purifiés des ADN complémentaires (cADN) sont synthétisés suivant la méthode de Gübler et Hoffman (1983) [Gene 25 pp 263-269]. Après protection des sites EcoR1 internes des cADN, des adaptateurs EcoR1 sont accrochés aux fragments de cADN. Les cADN sont alors digérés par EcoR1 et les adaptateurs en excès sont éliminés par chromatographie sur colonne.Ces fragments de cADN sont insérés dans un vecteur d'expression, le phage lambda gt 11 qui permet l'expression de gènes étrangers sous le contrôle du promoteur lac, après fusion du cADN avec le gène de la '3-galactosidase de E.coli (Young et Davis, 1983). Les phages recombinants sont empactés in vitro. Une banque de 1,5.106 phages ainsi constituée est ensuite amplifiée par inoculation dans E. coli Y1090 (Young et Davis, 1983). Criblas de la banque et sélection des candidats La banque d'ADN complémentaire est criblée par la méthode décrite par Huynh et al. (1985) [in : DNA cloning, a Practical Approach, (Glover D.M., ed.) 1 pp 49-78] modifiée de la façon suivante : un échantillon de cette banque en lambda gt 11 est inoculé sur la souche E. coli Y1090 à une dilution représentant 5000 phages par boîte de 85 mm de diamètre et incubée à 42"C. Les plages sont transférées pendant 5h à 37 C sur des filtres de nitrocellulose (Scheicher et Schuell) préalabement imprégnés d'isopropyl-ss-D-thiogalactopyranoside (IPTG) â 10 mM ; l'IPTG permet d'induire 1' expression de la protéine de fusion qui est sous contrôle du promoteur lac. Les filtres sont incubés en présence de l'antisérum de lapin antip26 (préalablement absorbé avec un extrait d'antigènes de E.coli).Les anticorps fixés sont reconnus par un second anticorps anti-IgG de lapin marqué à la biotine; une streptavidinepéroxidase se fixe alors à la biotine, et ce complexe est révélé par une réaction de la péroxydase sur un réactif coloré nommé "HRP color development reagent", commercialisé par Bio Rad. Cette détection par anticorps permet d'identifier les phages recombinants dont l'insert de cADN dirige la synthèse d'une protéine ou une fraction de protéine portant des épitopes reconnus par les anticorps spécifiques anti-p26. Détermination de la séquence de l'ADN complémentaire portée par les phages recombinants et de la protéine correspondante Le cADN des clones positifs de lambda est purifié et digéré par EcoRI. Les fragments d'ADN ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose La bande correspondant à l'insert de cADN est electméluée par la méthode de Genechean (Bio 101 hic. La Jolla, CA) puis sousclonée dans le vecteur-phage Mî3TGI3O décrit par Kieny et al (1983) [Gene, 26. pp 91-99], et séquencée par la méthode de Sanger et al. (1977) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 pp 54635467]. Le cADN séquencé n'a pas la base A du codon d'initiation ATG. Cette base est donc rajoutée et le site EcoRI est transformé en site BgllI par mutagénèse dirigée en utilisant un oligonucleotide OTG2467, dont la séquence est la suivante: 5'-GCTCTCCCGGAGATCTATGGCACCTAAGTT-3'. On obtient ainsi le vecteur M13TG4116. La séquences du cADN et celle d'acides aminés déduite sont présentées figure 1. EXEMPLE 2: La stratégie générale développée pour l'expression de la protéine p26, est de l'exprimer sous forme native, non fusionnée. Cette protéine sera reconnue par l'antisérum antip26. Expression de la protéine p26 dans E. coli Pour obtenir l'expression de la protéine p26 dans E. coli le vecteur d'expression pTG959, dont la construction est décrite dans la publication de brevet EP-0292404, est utilisé. ll contient le promoteur pL du bactériophage lambda, le gène N, une séquence rbs synthétique, lacz et ampR. Le vecteur M13TG4116 est digéré par EcoRI et BglII, et les fragments d'ADN sont séparés par électrophorése sur gel d'agarose. Le fragment correspondant au cADN de la p26 est élué par la méthode de Geneclean, puis ligué dans le vecteur PTG959 préalablement coupé par EcoRI et BglII, ce qui élimine un fragment 5' du gène lacz. Le cADN est donc directement en aval du promoteur pL et de la séquence rbs synthétique ce qui permet l'expression de p26 non fusionnée. On obtient ainsi le vecteur pTG4170 qui contient le promoteur pL du phage lambda, une séquence rbs synthétique, le cDNA de p26, un fragment 3' de lacz, ampR et le gène N. Une culture de E.coli TGE901 (F-sup-his ilv bio (lambda-cI 857 delta-Bam delta-H1)) transformée par le plasmide pTG4170 est mise en croissance sur milieu LB jusqu'à une DO, de 0,2 puis la synthèse de la protéine est induite par une augmentation de température à 42"C, pendant les 6 heures suivante. En fin de culture, les extraits cellulaires sont analysés sur gel d'acrylamide-SDS par coloration au bleu de Coomassie (figure 2). La protéine p26 se retrouve la fraction non soluble obtenue après lyse des cellules par sonication. EXEMPLE 3 Comparaison de séquence Une comparaison entre p26 de S. mansoni et sj26 de S. iaponicum, montre de fortes homologies de séquence entre ces deux protéines (figure 3). De même il existe des homologies de séquence entre p26 et des GST de mammifères, en particulier les GST de classe CL (figure 4). Ces éléments ainsi que la rétention de p26 isolée à partir de vers adultes, tendent à prouver que p26 est bien une glutathion S-transférase. De plus, la protéine recombinante exprimée dans E.coli, présente une activité glutathion S-transférase vis à vis de son substrat: le 1, chloro-2,4dinitrobenzène. REVENDICATIONS 1. Séquence d'ADN codant pour une glutathion S-transférase (GST) de Schistosoma mansoni, de 26 kDa, appelée p26. 2. Séquence d'ADN selon la figure 1. 3. Protéine qui comprend les épitopes de la protéine p26 qui sont reconnus par les antisérums anti-p26 native et et qui présente une activité glutathion S-transférase. 4. Protéine dont la synthèse est dirigée par la séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 ou 2, ou par un fragment de ladite séquence, ladite protéine étant reconnue par les antisérums anti-p26 native et présentant une activité glutathion S-transférase. 5. Protéine selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisée en ce qu'elle est préparée à partir de cellules telles que les bactéries, les levures ou les cultures de cellules supérieures. 6. Cellules transformées par un vecteur d'expression de la séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 ou 2. 7. Procédé de préparation d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'on cultive dans un milieu approprié une cellule selon la revendication 6 et que l'on récupère ensuite ladite protéine. 8. Composition pharmaceutique destinée notamment à la prévention de la schistosomiase, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent actif au moins une protéine selon l'une quelconque des revendications 3 à 5. 9. Application d'une protéine selon l'une des revendications 3 ou 4, ou des cellules selon la revendication 6, à titre d'agent présentant une activité glutathion S-transférase.