Brevet FR2652900A1 — publié le 19910412

La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de détermination de la concentration de substances antigèniques dans des liquides biologiques tels que le sérum ainsi que le nécessaire ou "kit" pour la mise en oeuvre de ce procédé. La présente invention a en outre pour objet, un procédé de dépistage prénatal in vitro de la trisomie 21, basé sur le dosage immunologique de la gonadotropine chorionique humaine selon le procédé précédent, ainsi que le nécessaire ou "kit" pour la mise en oeuvre de ce procédé de dépistage. La détermination de la présence ou de la concentration de substances antigèniques, par exemple celles qui sont associées à une grande variété de troubles physiologiques, dans des liquides biologiques tels que le sérum repose de plus en plus sur des techniques d'analyse immunologique. Ces techniques sont basées sur la formation d'un complexe entre la substance antigènique sur laquelle porte l'analyse et un ou plusieurs anticorps spécifiques de ladite substance antigènique, où l'un ou l'autre des composants du complexe est marqué. En particulier, la méthode de type "sandwich" est fréquemment utilisée en raison de la simplicité du procédé et de sa sensibilité élevée. La méthode de type "sandwich" comporte classiquement les étapes suivantes a - on fait réagir un premier anticorps insolubilisé avec un échantillon biologique contenant l'antigène à doser pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'un complexe binaire; b - on lave la phase solide pour éliminer les composés qui n'ont pas réagi; c - on fait réagir le complexe binaire insolubilisé avec une quantité connue d'un deuxième anticorps liant l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps, pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe ternaire; d - on lave pour séparer la phase solide et le deuxième anticorps n'ayant pas réagi; e - on mesure la quantité du deuxième anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou n'ayant pas réagi;; f - on met en relation la quantité d'anticorps marqué mesurée en (e) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée pour un ou plusieurs échantillons témoins préparés conformément aux étapes (a) à (d), lesdits échantillons contenant ou non des quantités connues de substances antigèniques. Le protocole précédent peut être modifié, notamment en supprimant l'étape de lavage (b) ou en faisant réagir l'échantillon biologique d'abord avec l'anticorps marqué puis avec l'anticorps insolubilisé. Des procédés d'analyse immunologique de type "sandwich" avec des anticorps monoclonaux ont été décrits notamment dans les demandes de brevet français NO 2 487 983 et NO 2 500 166. Dans le cas de fortes concentrations d'antigène dans l'échantillon biologique, ces procédés nécessitent un excès suffisant d'anticorps insolubilisés pour fixer la majeure partie ou la totalité de l'antigène présent afin d'éviter l'effet crochet encore appelé effet "Hook", pouvant conduire à une évaluation faussement négative ou faible de l'antigène à forte dose. Toujours dans le cas où la concentration d'antigène dans l'échantillon biologique est forte, on a recours à des dilutions de l'échantillon biologique pour prévenir l'effet crochet. Toutefois ces dilutions entraînent une diminution de la sensibilité et sont susceptibles de nuire à la précision du dosage. L'invention a pour but de remédier aux inconvénients des procédés de l'état de la technique en fournissant un procédé de dosage immunologique applicable même dans le cas où la concentration de l'antigène dans l'échantillon biologique est très importante, sans recourir à des dilutions et risquer de diminuer la sensibilité et la précision du dosage. Ce but est atteint selon l'invention qui fournit un procédé d'analyse immunologique de type "sandwich" pour détecter la présence ou déterminer la concentration d'une substance antigènique dans un échantillon biologique, comprenant la formation de complexes ternaires de la substance antigènique, d'un premier anticorps insolubilisé et d'un deuxième anticorps marqué et lié à l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps, par contact de l'échantillon avec lesdits premier et deuxième anticorps, caractérisé en ce que l'échantillon est mis en contact avec un troisième anticorps liant l'antigène en un site identique de celui reconnu par le premier ou le deuxième anticorps. L'utilisation de ce troisième anticorps permet dans le cas de forte concentration en antigène de désaturer le deuxième anticorps marqué et ainsi d'éviter l'effet crochet. Selon une forme de mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention le troisième anticorps est identique au deuxième anticorps non marqué. Le troisième anticorps n'est pas marqué et lie l'antigène en un site identique de celui reconnu par le deuxième anticorps. De manière avantageuse le premier anticorps est lié à un support solide qui est insoluble dans l'échantillon biologique et les deuxième et troisième anticorps sont solubles dans l'échantillon biologique. Avantageusement le premier anticorps est insolubilisé sur un support constitué par des billes ou par un récipient en matière plastique ou en verre. Selon une première forme de mise en oeuvre, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec le premier anticorps insolubilisé; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe binaire insoluble du premier anticorps et de la substance antigènique; c - mise en contact de l'échantillon biologique avec le deuxième et le troisième anticorps liant l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps, le deuxième anticorps étant marqué et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué;; d - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la substance antigènique et du deuxième anticorps marqué, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps de la substance antigènique et du troisième anticorps non marqué; e - séparation de l'échantillon et des deuxième et troisième anticorps n'ayant pas réagi; f - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi; ; g - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (e), ledit échantillon témoin étant dépourvu de ladite substance antigènique, pour déterminer la présence de substance antigènique dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de substances antigèniques préparés conformément aux étapes (a) à (e), pour déterminer la concentration en substance antigènique dans ledit échantillon biologique. Selon un mode particulier de mise en oeuvre du procédé précédent, on effectue une étape de lavage entre les étapes (b) et (c); ce lavage permet d'éliminer les composés n'ayant pas réagi. Selon une deuxième forme de mise en oeuvre, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique simultanément avec le premier, le deuxième et le troisième anticorps, le premier anticorps étant insolubilisé, le deuxième anticorps étant marqué et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué, lesdits deuxième et troisième anticorps liant l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation, d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la substance antigènique et du deuxième anticorps marqué, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps de la substance antigènique et du troisième anticorps non marqué;; c - séparation de l'échantillon et des deuxième et troisième anticorps n'ayant pas réagi; d - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi; e - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (c), ledit échantillon témoin étant dépourvu de ladite substance antigènique, pour déterminer la présence de substance antigènique dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de substances antigèniques préparés conformément aux étapes (a) à (c), pour déterminer la concentration en substance antigènique dans ledit échantillon biologique. Selon une troisième forme de mise en oeuvre, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec le deuxième et le troisième anticorps, le deuxième anticorps étant marqué et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe binaire du deuxième anticorps marqué et de la substance antigènique et d'autre part du troisième anticorps non marqué et de la substance antigènique; c - mise en contact de l'échantillon biologique avec le premier anticorps insolubilisé, ledit premier anticorps liant l'antigène en un site différent de celui reconnu par le deuxième et le troisième anticorps;; d - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la substance antigènique et du deuxième anticorps marqué, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la substance antigènique et du troisième anticorps non marqué; e - séparation des complexes binaires ayant pas réagi; f - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi;; g - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (e), ledit échantillon témoin étant dépourvu de ladite substance antigènique, pour déterminer la présence de substance antigènique dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de substances antigèniques préparés conformément aux étapes (a) à (e), pour déterminer la concentration en substance antigènique dans ledit échantillon biologique. Selon un mode particulier de mise en oeuvre du procédé précédent, on effectue une étape de lavage entre les étapes (b) et (c); ce lavage permet d'éliminer les composés n1 ayant pas réagi. De manière avantageuse au moins un des trois anticorps utilisés est un anticorps monoclonal. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la marque du deuxième anticorps marqué est choisie dans le groupe comprenant un isotope radioactif, une enzyme, une substance fluorescente, une molécule chargée électriquement, une particule colorée, la biotine, un composé organo-métallique et l'examen est effectué au moyen d'une méthode adaptée, radiométrique, fluorimétrique, enzymatique, électrique. colorimétrique ou par absorption des rayonnements infrarouges. L'invention a encore pour objet de fournir un nécessaire ou "kit" pour la mise en oeuvre des procédés précédents comprenant au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué liant l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps, - une quantité donnée d'un troisième anticorps identique au deuxième anticorps non marqué - des réactifs permettant la détection de l'anticorps marqué. Le procédé de l'invention permet de déterminer la présence ou la concentration d'une substance antigènique présente à forte dose dans des liquides biologiques tels que le sérum; cette substance antigènique pouvant être associée à un trouble physiologique. Le procédé de l'invention peut ainsi être appliqué au diagnostic invitro de pathologies telles que la trisomie 21 foetale à partir de la mesure de la concentration en gonadotropine chorionique humaine (hCG) dabs le sérum d'une femme enceinte. La gonadotropine chorionique humaine ci après dénommée hCG est une hormone glycoprotéique d'un poids moléculaire de 48000 qui est constituée de deux sous unités polypeptidiques alpha et bêta. La sous-unité alpha est commune à plusieurs hormones, la LH, la FSH, la TSH, la sous-unité bêta confère à l'hormone sa spécificité immunologique. L'activité biologique de l'hormone requiert l'association des deux sous-unités alpha et bêta, ci-après dénommées HcG totale. Le dosage de l'hCG totale est utilisé pour le diagnostic de la grossesse, comme cela est proposé notamment dans la demande de brevet français NO 2 407 475. Le dosage de l'hCG a également été proposé pour le dépistage prénatal de la trisomie 21 foetale (voir notamment RUTA, D. A. et al, The Lancet, 24 septembre 1988, page 752; WHITE, I. et al, The New England Journal of Medicine, Vol. 320, NO. 6, 9 février 1989). Le dosage de lthCG totale entre la 14ème et la î8ême semaine d'aménorrhée et préférentiellement entre la 14même et la 15ère semaine permet de sélectionner un groupe de femme à risque accru de trisomie 21 foetale. Dans ce groupe, les concentrations sériques en hCG bêta totale se situent au-dessus d'une médiane déterminée chez des femmes à grossesse dite "normale". L'invention concerne donc plus particulièrement le procédé d'analyse immunologique de type "sandwich" susmentionné, appliqué au dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de lthCG, comprenant - le dosage des chaînes bêta de l'hCG dissociées ou non des chaînes alpha, ci-après dénommées hCG bêta totale, entre la 14même et la 18ème semaine d'aménorrhée, selon le procédé d'analyse immunologique de l'invention; - la comparaison de la concentration d'hCG bêta totale à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine. Durant la grossesse, la concentration en hCG dans le sérum est très forte or les tests immunologiques de l'art antérieur ne sont pas fiables pour la mesure de forte concentration d'hCG, ce qui rend nécessaire une dilution pour éviter l'effet crochet, ainsi pour détecter 140 000 mUI/ml une dilution au 1/1000 est nécessaire. Le procédé de l'invention permet de détecter des valeurs comprises entre 5000 et 90 000 mUI/ml sans dilution et sans risque d'effet crochet. Les statistiques effectuées montrent qu'environ 1 nouveau né sur 700 est atteint de trisomie 21; ce taux est d'environ 1 pour 1000 dans le cas des femmes agées de moins de 38 ans. La valeur seuil d'hCG bêta totale normale audelà de laquelle un risque de trisomie 21 peut être diagnostiqué est avantageusement déterminée à partir dtun échantillonnage de X prélèvements tous effectués la même semaine d'amenohrrée et dont les Y prélèvements supérieurs correspondent aux concentrations d'hCG bêta totale les plus fortes, Y étant défini de façon à ce que le rapport Y/X soit très supérieur à environ 1/700, la valeur seuil étant la valeur la plus basse des Y prélèvements. Les Y prélèvements supérieurs constituent la population à risque, les X - Y prélèvements constituent la population de femmes à grossesse dite "normale", Cette méthode de détermination de la valeur seuil est particulièrement intéressante du fait des variations pouvant être observées d'un laboratoire d'analyse à un autre; selon cette méthode chaque laboratoire déterminera sa propre valeur seuil au delà de laquelle un risque de trisomie 21 pourra être diagnostiqué. A titre d'exemple, X et Y peuvent être déterminées en fonction des percentiles, toute valeur supérieure au 95è percentile étant signe de risque accru de trisomie 21. Ainsi pour chaque semaine d'aménorrhée au minimum 100 valeurs sont classés par ordre croissant, les cinq plus élevés -sont isolés et la plus basse des cinq est considérée comme la valeur seuil, dans ce cas X est 100, Y est 5 et le rapport Y/X est 5/100. Le dosage de l'hCG bêta totale est réalisé par un test immunologique de type "sandwich" utilisant trois anticorps spécifiques de la chaîne bêta de lthCG et liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, le premier anticorps étant insolubilisé, le deuxième anticorps étant marqué et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué. La sous-unité alpha étant commune à plusieurs hormones, on préfère, afin d'éviter toute interférence avec d'autres hormones éventuellement présentes dans l'échantillon biologique, utiliser des anticorps spécifiques de la chaîne bêta de lthCG. La chaîne bêta pouvant exister soit sous forme libre soit associée à la chaîne alpha, certains sites ne sont accessibles que lorsque la chaîne bêta est libre, autres sites ne sont accessibles que lorsque la chaîne bêta est associée à la chaîne alpha, d'autres enfin sont accessibles que la chaîne bêta soit associée ou non à la chaîne alpha. On préfère donc, afin d'augmenter la spécificité du test, utiliser pour le dosage de l'hCG bêta totale deux anticorps liant l'antigène en deux sites différents, accessibles que la chaîne bêta de l'hCG soit associée ou non à la chaîne alpha. Selon une première forme de mise en oeuvre, le procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 foetale dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec le premier anticorps insolubilisé spécifique de la chaîne bêta de l'hCG en liant l'antigène en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe binaire insoluble du premier anticorps et de la chaîne bêta de l'hCG;; c - mise en contact de l'échantillon biologique avec le deuxième et le troisième anticorps liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non et différent de celui reconnu par le premier anticorps, ledit deuxième anticorps étant marqué et ledit troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué; d - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG et du deuxième anticorps, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps de la chaîne bêta de l'hCG et du troisième anticorps; e - séparation de l'échantillon et des deuxième et troisième anticorps n'ayant pas réagi;; f - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi; g - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (e), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta de l'hCG, pour déterminer la présence d'hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de chaînes bêta de l'hCG préparés conformément aux étapes (a) à (e), pour déterminer la concentration en hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique;; h - comparaison de la concentration en hCG bêta totale mesurée en (g) à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine d'aménorrhée. Selon un mode particulier de mise en oeuvre du procédé précédent, on effectue une étape de lavage entre les étapes (b) et (c); ce lavage permet d'éliminer les composés n'ayant pas réagi. Selon une deuxième forme de mise en oeuvre, le procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 foetale dans un échantillon biologique susceptible de contenir de lthCG, comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec trois anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG et liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, le premier anticorps étant insolubilisé, le deuxième anticorps étant marqué et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué;; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG et du deuxième anticorps, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps de la chaîne bêta de lthCG et du troisième anticorps; c - séparation de l'échantillon et des deuxième et troisième anticorps n'ayant pas réagi; d - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi; ; e - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (d), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta de lthCG, pour déterminer la présence d'hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de chaîne bêta de l'hCG préparés conformément aux étapes (a) à (d), pour déterminer la concentration en hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique; f - comparaison de la concentration en hCG bêta totale mesurée en (e) à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine d'aménorrhée. Selon une troisième forme de mise en oeuvre, le procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 foetale dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG, comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec le deuxième et le troisième anticorps, le deuxième anticorps étant marqué et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué, lesdits anticorps liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe binaire du deuxième anticorps et de la chaîne bêta de l'hCG et d'autre part du troisième anticorps et de la chaîne bêta de l'hCG;; c - mise en contact de l'échantillon biologique avec le premier anticorps insolubilisé, ledit premier anticorps liant la chaîne bêta de l'hCG en un site différent de celui reconnu par le deuxième et le troisième anticorps, ledit site étant accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; d - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la chaîne bêta de lthCG et du deuxième anticorps, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de chaîne bêta de l'hCG et du troisième anticorps; e - séparation des complexes binaires n'ayant pas réagi;; f - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi; g - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (e), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta de l'hCG, pour déterminer la présence d'hCG bêta total dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de chaîne bêta de lThCG préparés conformément aux étapes (a) à (e), pour déterminer la concentration en hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique;; h - comparaison de la concentration en hCG bêta totale mesurée en (g) à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine d'aménorrhée. Selon un mode particulier de mise en oeuvre du procédé précédent, on effectue une étape de lavage entre les étapes (b) et (c); ce lavage permet d'éliminer les composés n'ayant pas réagi. De manière avantageuse au moins un des trois anticorps est un anticorps monoclonal. Selon un mode de réalisation avantageux le marquage du deuxième anticorps marqué utilisé dans le présent procédé de dépistage de la trisomie 21 est réalisé avec un isotope radioactif, une enzyme, une substance fluorescente ou une molécule chargée électriquement et l'examen est effectué au moyen d'une méthode radiométrique, fluorimétrique, enzymatique, électrique ou par absorption des rayonnements infrarouges. Il est admis que dans un même échantillon la concentration en chaînes bêta libres est très inférieure à la concentration en chaînes bêta associées aux chaînes alpha; aussi le procédé de dépistage invitro de la trisomie 21 selon l'invention, peut être effectué en première approximation à partir du dosage des chaînes bêta associées aux chaînes alpha ci-après dénommées hCG totale, ce complexe correspondant à la molécule totale d'hCG active. Le procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 comprend alors les étapes suivantes - le dosage de l'hCG totale entre la 14âme et la 18 sème semaine d'aménorrhée, selon le procédé d'analyse immunologique de l'invention; - la comparaison de la concentration d'hCG totale à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG totale normale, mesurée la même semaine. La valeur seuil d'hCG totale normale au-delà de laquelle un risque de trisomie 21 peut être diagnostiqué, est avantageusement déterminée comme précédemment pour l'hCG bêta totale à partir d'un échantillonnage de X prélèvements tous effectués la même semaine d'aménorrhée, les Y prélèvements supérieurs correspondant aux concentrations d'hCG totale les plus fortes, Y étant défini de façon à ce que le rapport Y/X soit très supérieur à environ 1/700, la valeur seuil étant la valeur la plus basse des Y prélèvements. Les Y prélèvements supérieurs constituent la population à risque, les X - Y prélèvements constituent la population de femmes à grossesse dite "normale", Les trois anticorps utilisés pour le dosage de l'hCG totale sont alors spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG et lient l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes alpha et bêta de l'hCG sont associées. Les différents procédés de dépistage reposant sur le dosage de l'hCG totale sont identiques à ceux décrits précédemment à partir du dosage de l'hCG bêta totale. L'invention a enfin pour objet de fournir un nécessaire ou "kit" pour la mise en oeuvre du procédé de dépistage prénatal in vitro de la trisomie 21 selon l'invention. Ledit "kit" comprenant au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps monoclonal insolubilisé, spécifique de la chaîne bêta de l'hCG et liant l'antigène en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps monoclonal marqué, spécifique de la chaîne bêta de l'hCG et liant l'antigène en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps; - une quantité donnée d'un troisième anticorps identique au deuxième anticorps non marqué; - des réactifs permettant la détection de l'anticorps marqué. Outre les caractéristiques qui précédent, l'invention comporte d'autres caractéristiques qui apparaltront au cours de la description qui suit et qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'invention, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications. Dans les dessins annexés - la figure 1 est une représentation graphique illustrant la courbe standard obtenue pour un dosage de l'hCG bêta total en utilisant trois anticorps monoclonaux selon le procédé de dosage immunologique de type "sandwich" de l'invention. Dans l'art antérieur la mesure de la concentration d'hCG est effectuée selon un test immunoenzymatique de type "sandwich" classique, dans le sérum et le plasma, comportant une étape immunologique d'une durée d'une heure, suivie d'une révélation enzymatique de trente minutes. L'étape immunologique est réalisée avec deux anticorps monoclonaux de souris spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG et dirigés contre deux épitopes différents, l'un des anticorps étant insolubilisé l'autre marqué par une enzyme; la gamme standard utilisée s'étend de 0 à 200 mUI/ml de hCG. Les échantillons, les standards ou les contrôles sont incubés avec des billes recouvertes d'un des anticorps ainsi insolubilisé, en présence d'un conjugué de l'autre anticorps et de la peroxydase. Après lavage des billes pour éliminer les composés non liés, la présence de peroxydase est révélée par la transformation d'un chromogène incolore (orthophénylène diamine, OPD, 2 HCl) en un produit de couleur jaune orangé. La réaction est stoppée par addition d'HCl 1 N, et l'intensité de la coloration mesurée à 492 nm à l'aide d'un spectrophotomètre est directement proportionnelle à la concentration d'hCG dans l'échantillon. Cette concentration est déterminée à l'aide d'une courbe d'étalonnage établie à partir des standards. Dans le procédé de l'invention, la mesure de la concentration dthCG bêta totale est effectuée également selon un test immunoenzymatique de type "sandwich", mais dans lequel l'étape immunologique est réalisée avec trois anticorps monoclonaux de souris spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG et dirigés contre deux épitopes différents, lesdits épitopes étant accessibles que la chalne bêta soit libre ou complexée à la chaîne alpha, un premier anticorps étant insolubilisé, les deux autres sont identiques, l'un étant marqué par une enzyme, l'autre pas; la gamme standard utilisée s 'étend de 0 à 90 000 mUI/ml d'hCG. L'anticorps insolubilisé est par exemple coaté dans les puits d'une plaque de microtitration. Les échantillons, les standards et les contrôles sont incubés dans les puits de la plaque de microtitration dans lesquels est coaté le premier anticorps, en présence d'un conjugué composé de l'anticorps marqué par la peroxydase et du même anticorps non marqué Après lavage des puits pour éliminer les composés non liés, la présence de peroxydase est révélée comme précédemment par la transformation d'un chromogène incolore (orthophénylène diamine, OPD, 2 HC1) en un produit de couleur jaune orangé. La réaction est stoppée par addition d'HCl 1 N, et l'intensité de la coloration mesurée à 492 nm à l'aide d'un spectrophotomètre est directement proportionnelle à la concentration d'hCG bêta totale dans l'échantillon. Cette concentration est déterminée à l'aide de la courbe d'étalonnage établie à partir des standards. Un nécessaire ou "kit" pour la mise en oeuvre du précédent procédé comprend - une plaque de microtitration sécable présentant 6 rangées de 16 cupules coatées d'un anticorps monoclonal spécifique de la chaîne bêta de l'hCG, - un flacon de 15 ml de diluant - une gamme standard de 0 à 90000 mUI/ml d'hCG comprenant 6 flacons de 500 l : 0, 5625, 11250, 22500 45000, 90000 mUI/ml, - un flacon contenant le conjugué lyophilisé, ledit conjugué étant composé de sérum de veau, thimérosal 0,01 %, 0,1 % NP 40, l'anticorps monoclonal anti-hCS (ECHO 1408:IgG marqué par la peroxydase, l'anticorps monoclonal anti-hCG (ECHO 1408:IgG1) non marqué. - 6 pastilles d'OPD, - 1 flacon de 60 ml de diluant de 1'OPD, - 1 flacon de 15 ml d'HCl. Le mode opératoire est alors le suivant - reconstitution du conjugué lyophilisé avec 11 ml d'eau distillée; - équilibrer tous les réactifs à température du laboratoire; - incubation distribuer 100 Al de diluant dans chaque puits, distribuer 2,5 111 de standard, contrôle ou sérum, . ajouter 100 Al de conjugué, . incuber 1 heure à température ambiante, . vider les puits en retournant la plaque, effectuer 3 lavages à l'eau distillée, - Révélation du signal . distribuer 200 Al de solution d'OPD dans chaque puits (1 pastille pour 10 ml), . incuber 30 minutes à l'abri de la lumière, - Arrêt de la réaction . distribuer 100 F1 d'HCl 1 N dans les puits, . lecture de l'absorbance à 492 nm, . le blanc optique étant effectué avec 200 Al d'OPD et 100 Al d'HCl. Le tableau 1 ci-dessous rapporte les valeurs de l'exemple de la courbe standard de la figure 1, à partir de laquelle la concentration en hCG bêta totale de l'échantillon est déterminée. TABLEAU 1 concentration des standards DO (492 nm) 0 mUI/ml 0,005 5625 mUI/ml 0,1 11250 mUI/ml 0,22 22500 mUI/ml 0,507 45000 mUI/ml 1,076 90000 mUI/ml 1,797 A titre d'exemple, 'ce dosage de l'hCG bêta totale a été effectué sur 612 sérums de femmes enceintes (X), les 30 sérums correspondant aux concentrations les plus fortes d'hCG bêta libre constituent la population de femmes à risques (Y), les 582 autres sérums constituent la population de femmes à grossesse dite "normale", soit un rapport Y/X d'environ 0,05 très supérieur au taux de 1 trisomie 21 pour 700 ou 1 000 naissances. La valeur moyenne de la concentration en hCG bêta totale est de 30 000 dans la population normale et de 75 000 dans la population à risques; les concentrations précédentes sont exprimées dans une unité arbitraire. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'analyse immunologique de type 1,sandwich" pour détecter la présence ou déterminer la concentration d'une substance antigénique dans un échantillon biologique, comprenant la formation de complexes ternaires de la substance antigénique, d'un premier anticorps insolubilisé et d'un deuxième anticorps marqué et lié à l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps, par contact de l'échantillon avec lesdits premier et deuxième anticorps, caractérisé en ce que l'échantillon est mis en contact avec un troisième anticorps liant l'antigène en un site identique de celui reconnu par le premier ou le deuxième anticorps. 2 - Procédé d'analyse immunomogique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le troisième anticorps est identique au deuxième anticorps non marqué. 3 - Procédé d'analyse immunologique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce le premier anticorps est lié à un support solide qui est insoluble dans l'échantillon biologique et les deuxième et troisième anticorps sont solubles dans l'échantillon biologique. 4 - Procédé d'analyse immunologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec le premier anticorps insolubilisé; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe binaire insoluble du premier anticorps et de la substance antigénique; c - mise en contact de l'échantillon biologique avec le deuxième et le troisième anticorps liant l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps, le deuxième anticorps étant marqué et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué;; d - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la substancess antigénique et du deuxième anticorps marqué, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la substance antigénique et du troisième anticorps non marqué; e - séparation de l'échantillon et des deuxième et troisième anticorps n'ayant pas réagi; f - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi;; g - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (e), ledit échantillon témoin étant dépourvu de ladite substance antigénique, pour déterminer la présence de substance antigénique dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de substances antigèniques préparés conformément aux étapes (a) à (e), pour déterminer la concentration en substance antigénique dans ledit échantillon biologique. 5 - Procédé d'analyse immunologique selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on effectue une étape de lavage entre les étapes (b) et (c). 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique simultanément avec le premier, le deuxième et le troisième anticorps, le premier anticorps étant insolubilisé, le deuxième anticorps étant marqué et le troisième anticorps monoclonal étant identique au deuxième anticorps non marqué, lesdits deuxième et troisième anticorps liant l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la substance antigénique et du deuxième anticorps marqué, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps de la substance antigénique et du troisième anticorps non marqué;; c - séparation de l'échantillon et des deuxième et troisième anticorps n'ayant pas réagi; d - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi; e - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (c), ledit échantillon témoin étant dépourvu de ladite substance antigénique, pour déterminer la présence de substance antigénique dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de substances antigèniques préparés conformément aux étapes (a) à (c), pour déterminer la concentration en substance antigénique dans ledit échantillon biologique. 7 - Procédé d'analyse immunologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec le deuxième et le troisième anticorps, le deuxième anticorps étant marqué et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe binaire du deuxième anticorps marqué et de la substance antigénique et d'autre part de troisième anticorps non marqué et de la substance ant igénique; c - mise en contact de l'échantillon biologique avec le premier- anticorps insolubilisé, ledit premier anticorps liant l'antigène en site différent de celui reconnu par le deuxième et le troisième anticorps;; d - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la substance antigénique et du deuxième anticorps marqué, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la substance antigénique et du troisième anticorps non marqué; e - séparation des complexes binaires n'ayant pas réagi; f - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi;; g - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (e), ledit échantillon témoin étant dépourvu de ladite substance antigénique, pour déterminer la présence de substance antigénique dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de substances antigèniques préparés conformément aux étapes (a) à (e), pour déterminer la concentration en substance antigénique dans ledit échantillon biologique. 8 - Procédé d'analyse immunologique selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on effectue une étape de lavage entre les étapes (b) et (c). 9 - Procédé d'analyse immunologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que au moins un des trois anticorps utilisés est un anticorps monoclonal. 10 - Procédé d'analyse immunologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la marque du deuxième anticorps marqué est choisie dans le groupe comprenant un isotope radioactif, une enzyme, une substance fluorescente, une molécule chargée électriquement, une particule colorée, la biotine, un composé organo-métallique et l'examen est effectué au moyen d'une méthode adaptée, radiométrique, fluorimétrique, enzymatique, électrique, colorimétrique ou par absorption des rayonnements infrarouges. 11 - Kit ou nécessaire pour la mise en oeuvre d'un procédé d'analyse immunologique de type "sandwich" selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps monoclonal marqué liant l'antigène en un site différent de celui du premier anticorps; - une quantité donnée d'un troisième anticorps identique au deuxième non marqué; - des réactifs permettant la détection de l'anticorps marqué. 12 - Procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de lthCG caractérisé en ce qu'il comprend - le dosage de l'hCG bêta totale entre la 14 verne et la 18 ême semaine d'aménorrhée, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10; - la comparaison de la concentration d'hCG bêta total à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG bêta totale normale mesurée la même semaine. 13 - Procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 foetale selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on compare la concentration d'hCG bêta totale à une valeur seuil déterminée à partir d'un échantillonage de X prélèvements tous effectués la même semaine d'aménorrhée, et dont les Y prélèvements supérieurs correspondent aux concentrations d'hCG bêta totale les plus fortes, Y étant défini de façon à ce que le rapport Y/X soit très supérieur à environ 1/700, la valeur seuil étant la valeur la plus basse des Y prélèvements. 14 - Procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 foetale selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que le dosage de l'hCG bêta totale est réalisé par un test immunologique de type "sandwich" utilisant trois anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG et liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, le premier anticorps étant insolubilisé, le deuxième anticorps étant marqué et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps, et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué. 15 - Procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 foetale selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec le premier anticorps insolubilisé, spécifique de la chaîne bêta et de l'hCG et liant l'antigène en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de lthCG soient dissociées ou non; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe binaire insoluble du premier anticorps et de la chaîne bêta de l'hCG;; c - mise en contact de l'échantillon biologique avec le deuxième et le troisième anticorps liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de lthCG soient dissociées ou non et différent de celui reconnu par le premier anticorps, ledit deuxième anticorps étant marqué et ledit troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué; d - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG et du deuxième anticorps, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps de la chaîne bêta de l'hCG et du troisième anticorps; e - séparation de l'échantillon et des deuxième et troisième anticorps n'ayant pas réagi;; f - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi; g - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (e), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta de l'hCG, pour déterminer la présence. d'hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de chaîne bêta de l'hCG préparés conformément aux étapes (a) à (e), pour déterminer la concentration en hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique;; h - comparaison de la concentration en hCG bêta totale mesurée en (g) à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine. 16 - Procédé de dépistage prénatal in vitro de la trisomie 21 selon la revendication 15 caractérisé en ce que l'on effectue une étape de lavage entre les étapes (b) et (c) 17 - Procédé de dépistage prénatal in vitro de la trisomie 21 selon l'un quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec trois anticorps monoclonaux spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG et liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, le premier anticorps étant insolubilisé, le deuxième anticorps étant marqué et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG et du deuxième anticorps, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps de la chaîne bêta de l'hCG et du troisième anticorps; c - séparation de l'échantillon et des deuxième et troisième anticorps n'ayant pas réagi; d - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi;; e - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (d), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta de l'hCG, pour déterminer la présence d'hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de chaîne bêta de l'hCG préparés conformément aux étapes (a) à (d), pour déterminer la concentration en hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique; f - comparaison de la concentration en hCG bêta totale mesurée en (e) à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine. 18 - Procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 foetale selon l'une quelconque des revendications 12 et 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a - mise en contact de l'échantillon biologique avec le deuxième et le troisième anticorps, le deuxième anticorps étant marqué et le troisième anticorps étant identique au deuxième anticorps non marqué, lesdits anticorps liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe binaire du deuxième anticorps et de la chaîne bêta de l'hCG et d'autre part du troisième anticorps et de la chaîne bêta de l'hCG;; c - mise en contact de l'échantillon biologique avec le premier anticorps insolubilisé, ledit premier anticorps liant la chaîne bêta de l'hCG en un site différent de celui reconnu par le deuxième et le troisième anticorps, ledit site étant accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; d - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation d'une part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG et du deuxième anticorps, et d'autre part du complexe ternaire insoluble du premier anticorps, de chaîne bêta de l'hCG et du troisième anticorps; e - séparation des complexes binaires n'ayant pas réagi; f - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi;; g - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (e), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta de l'hCG, pour déterminer la présence d'hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (f) avec la quantité d'anticorps mesurée pour des échantillons contenant des quantités connues de chaîne bêta de l'hCG préparés conformément aux étapes (a) à (e), pour déterminer la concentration en hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique; h - comparaison de la concentration en hCG bêta total mesurée en (g) à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine. 19 - Procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 foetale selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'on effectue une étape de lavage entre les étapes (b) et (c). 20 - Procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG caractérisé en ce qu'il comprend - le dosage de l'hCG totale entre la 14ème et la 18ème semaine d'aménorrhée, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10; - la comparaison de la concentration d'hCG totale à une valeur seuil correspondant à la concentration d'hCG totale normale, mesurée la même semaine. 21 - Procédé de dépistage prénatal invitro de la trisomie 21 foetale selon la revendications 20, caractérisé en ce que l'on compare la concentration d'hCG totale à une valeur seuil déterminée à partir d'un échantillonage de X prélèvements tous effectués la même semaine d'aménorrhée, et dont les Y prélèvements supérieurs correspondent aux concentrations d'hCG totale les plus fortes, Y étant défini de façon à ce que le rapport Y/X soit très supérieur à environ 1/700, la valeur seuil étant la valeur la plus basse des Y prélèvements. 22 - Kit ou nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic prénatal in vitro de la trisomie 21 foetale selon l'une quelconque des revendications 12 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend au moins - une quantité donnée d'un premier anticorps monoclonal insolubilisé, spécifique de la chaîne bêta de l'hCG et liant l'antigène en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; - une quantité donnée d'un deuxième anticorps monoclonal marqué, spécifique de lthCG bêta libre et liant l'antigène en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, et différent de celui reconnu par le premier anticorps; - une quantité donnée d'un troisième anticorps identique au deuxième non marqué; ; - des réactifs permettant la détection de l'anticorps marqué.