Brevet FR2650184A1 — publié le 19910201

Procédé pour la préparation d'antigènes protecteurs de la coqueluche L'inventior, -oncerne un procédé pour la préparatior, d'antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche', servant à la production de vaccin absorbé DPT destiné au domaine médical. On conna!t un procédé pour obtenir des antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche, consistant à cultiver des microbes de la coqueluche dans la phase I à 36 C, sur un milieu d'agar de caséine et de carbone ou dans un milieu nutritif liquide, à rincer la masse micro- bienne du milieu d'agar de caséine et de carbone avec une solution iso- !0 tonique de chlorure de sodium, à faire précipiter la masse microbienne du milieu nutritif liquide par centrifugation ou avec de l'acide chlorydri- que puis à effectuer une centrifugation et une décantation du liquide hypersédimentaire, à diluer le précipité avec une solution isotonique tamponnméede chlorure de sodium, à chauffer Jusqu'à 56 C (ou sans chauf- fer), et effectuer un traitement avec du merthiolate pendant une période de 10 à 14 Jours jusqu'à quatre mois. On cornnat aussi un procédé pour l'obtention d'antigènes corpuscu- laires protecteurs de coqueluche, selon lequel la suspension microbienne est obtenue comme dans le premier procédé, mais elle est traitée avec du formaldéhyde pendant 20 à, 24 heures à la température ambiante. Ensuite, elle est centrifugée pour diminuer la concentration du formaldéhyde libre et est diluée avec une solution isotonique de chloPure de sodium contenant du merthiolate en tant qu'agent conservateur. L'inconvénient des procédés connus pour la préparation d'antigènes corpusculaires protecteurs de coqueluche, réside en ce que les agents chimiques utilisés ont une action nocive sur les protéines des cellu- les microbiennes ( le formaldéhyde réagissant avec leur groupes amino en provoquant une dénaturation et une coagulation tandis que les ions du mercure réagissent avec les radicaux sulfo et hydro) et, de cette façon réduisent les propriétés de protection des antigènes corpuscu- laires protecteurs de la coqueluche. Par ailleurs,' les procédés mis en oeuvre exigent un séjour pro- longé et un contact des microbes avec un agent inactivant (de 10 Jours à 4 mois> et une diminution ultérieure de sa concentration. Le traite- ment thermique utilisé, bien qu'il accélère dans une certaine mesure IF destruction des microbes, diminue en même temps l'activité protectrice et la stabilité du vaccinr.. Un inconvénient considérable lors de l'obtention d'antigènes cor- pusculaires protecteurs de la coqueluche dans un milieu nutritif liquide est la centrifugation obligatoire pour la séparation de la masse microbienne du milieu nutritif. Le remplacement de la centrifugation par la précipitation de la biomasse avec de l'acide chlorydrique diminue les propriétés protectrices et augmente la toxicité des antigènes et leur réactivité chez les enfants. L'objet de l'invention est de proposer un procédé pour l'obtention d'antigenes corpusculaires protecteurs de la coqueluche, qui permette d'augmenter les propriétés protectrices de ces antigènes, de diminuer leur toxicité et de réduire le temps nécessaire pour leur préparation. Cet objet est atteint.par un procédé de préparation d'antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche, dans lequel on cultive les microbes de la coqueluche, on prépare une suspension microbienne qui est inactivée par l'acide itaconique, puis après la précipitation conse- cutive de la masse microbienne, on fait décanter le liquide hypersédi- mentaire et on dilue le précipité bactérien avec une solution isotonique de chlorure de sodium. Ce procédé est mis en oeuvre en cultivant les microbes sur un mi- lieu nutritif solide ou liquide. La masse microbienne est rincée avec une solution isotonique de chlorure de sodium. La suspension microbienne ainsi obtenue est inactivée par l'addition d'acide itaconique à une concentration finale de 3,75 à 13 mg/ml et un pH de 3,7 à 4,2. L'exposi- tion inactivante est effectuée pendant 1 à 4 heures. Pendant le traite- ment, la masse microbienne précipite d'elle même. Après la décantation du liquide hypersédimentaire, le précipité est dilué avec une solution isotonique de chlorure de sodium. Les avantages du procédé selon l'invention sont les suivants: on obtient des antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche ayant une acti- vité protectrice plus grande et des propriétés toxiques plus faibles; le temps d'obtention de la préparation finale est réduit; on élimine la nécessité de procéder à un chauffage et une centrifugation et par suite d'utiliser des équipements spéciaux. L'invention sera décrite plus en détails en référence aux exemple cidessous. EXEMPLE 1 On cultive les microbes de la coqueluche dans la phase I sur un milieu nutritif d'agar de caséine et de carbone on rince la masse micro- bienne avec une solution isotonique de chlorure de sodium, on la dilue Jusqu'àune concentration de 59 à 80 unités internationales d'opacité (MEM/ml), on ajoute une solution d'acide itaconique jusqu'à une concen- tration finale de 3,75 mg/ml et un pH de 3,7 à 4,2, on agite le mélange et t on laisse la suspension au repos pendant 4 heures à la température am- biante et ensuite pendant la nuit à une température de 5 à 100. Lors du séjour des microbes, il se forme un dépSt cellulaire qui peut être facilement désagrégé. Le Jour suivant, on fait décanter le liquide hypersédimentaire et on met le précipité cellulaire à nouveau en suspension et on le dilue avec une solution isotonique de chlorure de sodium jusqu'àsa concentration cellulaire initiale, le pH étant porté de 7,0 à 7,2. La suspension microbienne ainsi préparée est une prépara- tion d'antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche. EXEMPLE 2 On réalise la suspension microbienne pour la préparation d'antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche comme décrit dans l'exemple I, mais on inactive son pouvoir infectieux par une concentration d'acide itaconique de 6,5 mg/ml, à un pH de 3,7 à 4,2, on laisse au repos pendant 2 à 3 heures à la température ambiante, on fait ensuite décanter le li- quide hypersédimentaire à une température de 5 à 10 C le même jour ou le matin suivant, puis on dilue le précipité avec une solution isotonique de chlorure de sodium dont le pH est amené à une valeur de 7,0 à 7,2. EXEMPLE 3 On prépare la suspension microbienne comme dans les exemples 1 et 2, mais on effectue l'lnactivation avec de l'acide itaconique à une con- centration de 13 mg/ml,à un pH de3,7 à 4,2 et on laisse au repos pendant 1 à 2 heures. On fait décanter le liquide hypersédimentaire limpide le me. e jour ou le jour suivar.t, on dilue le précipité avec une solution isotonaque de chlorure de sodium jusqu'à uneconcentratJon cellulaire de à 80 MEM/m!, à un pH de 7,0 à 7,2. EXEMFLE 4 On cultive les microbes de la coqueluche dans la phase I sur ur milieu semi-synthétique de Coen et de Viler (on peut éventuellement ajouter des resines échangeuses d'ions) pendant une période de 48 heures. On sépare la résine par filtration, on détermine la concentration des microbes dans la suspension (elle est ordinairement de 40 à 50 MEM/mI), et on ajoute une solution d'acide itaconique jusqu'à aueconcentration finale de 5 mg/ml et un pH de 3,7. On inactive le pouvoir infectieux de la suspension à la température ambiante pendant 3 à 4 heures, puis or. laisse la suspension au repos pendant la nuit à une température de 5 à C. Les cellules fcrmer.t un précipité qui peut être facilement désagré- gé. On sépare le liquide hypersédimentaire limpide et on dilue le pré- cipité cellulaire jusqu'à la concentration microbienne nécessaire avec une solution isotonique tamponnéeede chlorure de sodium ayant un pH de. 7,2. EXEMPLE 5 On prépare la suspension microbienne pour la préparation d'anti- gènes corpusculaires protecteurs de coqueluche comme dans l'exemple 14, mais on inactive le pouvoir infectieux à l'aide d'acide itaconique ayant une concentration finale de 10 mg/ml et un pH de 4,2, et on laisse au repos à la température ambiante pendant 2 à 3 heures. On effectue ensuite le traitement de la suspension microbienne comme décrit dans l'exemple 4. La préparation d'antigènes corpusculaires protecteurs de la coque- luche (suspensionsmicrobiennes) inactivées ainsi obtenus est contrôlée en ce qui concerne son inactivation (stérilité spécifique) et se pureté (absence de microflore associée) en effectuant la culture sur des milieux nutritifs, et en ce qui concerne l'innocuité par injection sous-cutanée à des souris. La toxicité et les propriétés protectrices sont vérifiées par des essais sur des souris suivant les procédés pour vaccin contre la coqueluche et vaccin adsorbé DPT. Toutes les préparations d'antigènes corpusculaires protecteurs de lé coqueluche obtenues se'or. les cinq exemples sont des suspensiorsn'cre- biennes homogènes de couleur blanc-lait et, au repos elles forment un dép6t qui peut être facilement désagrégé. Les cellules microbienne ont des propriétés morphologiques et tinctorielles typiques, et conservent leur agglutinabilité spécifique et leur aptitude à provoquer une agglutina- tion des érythrocytes chez le mouton et l'homme. L'efficacité de l'action bactéricide de l'acide itaconique est dé- terminée sur des suspension microbiennes préparées à partir de plusieurs souches à des pH différents, à des températures de 5 à 10 C et de 20 à 22 C en fonction de la concentration de l'acide et du temps de l'exposi- tion. Les cultures des suspensions bactériennes diluées sont réalisées après 1, 2, 3, 4, 16 et 18 heures dans une boite de Pétri sur un milieu nutritif d'agar de caséine et de carbone contenant 5 % de sang humain. Les résultats sont relevés après 5 jours. Pendant les expérimentations, on a établi que dans des conditions déterminées, le processus d'altéra- tion des cellules peut être terminé pour 1 à 4 heures. La précipitation des cellules pour une concentration de l'acide itaconique de 10 à 13 mg/ml et un pH de 3,7 cesse ordinairement après 3 à 4 heures. En employant une concentration plus faible, ce délai est prolongé (la suspension est laissée au repos jusqu'au matin à une température de 5 à 10 C). Parmi les diffé- rentes couches bactériennes, on remarque certaines petites différences dans les délais de formation des précipités. Les propriétés toxiques des préparations d'antigènes corpusculaires protecteurs de coqueluche obtenues d'après le procédé selon l'invention sont déterminées 10 à 30 Jours après leur obtention par les tests sui- vants: augmentation de la masse du corps des souris et après l'activité stimulante de la lymphocytose(LPF) en comptant le nombre de lymphocytes dans le sang périphérique à la suite de l'injection de la préparation. Au cours des essais, on utilise des souris ayant un poids de 14 à 16 g. Les antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche sont in- Jectés par voie intrapéritonéale à raison de 10 HEM dans un volume de 0,5 ml, notamment, on introduit une dose unique pour enfant. On injecte une solution Isotonique-de chlorure de sodium aux souris de contrôle. Les souris sont pesées tous les jours pendant 7 Jours. Selon les exigences de l'OMS, après l'injection sur chaque souris d'au mcirns la moitié de la dose unique d'immurisation d'un vaccinr pour enfar. t, le poids total du groupe de souris au 3ème jour doit être le même que le poids initial tandis qu'au 7è?e jour, il ne doitpas étre inférieur à 60 & du poids oes souris de contrôle. La perdition rie dcit pas être supérieure à 5 "k. L'injection d'antigènes corpusculaires protecteurs de la coque- luche obtenus après une inactivation avec de l'acide itaconique des microbes cultivis sur un milieu d'agar de caséine et de carbone ou dans un milieu nutritif liquide, même en utilisant des doses d'injection plus grandes, ne provoque par une diminution du poids des souris pendant les deux premiers jours. L'augmentation de la masse du poids au 7ème jour est dans les limites de 68,9 à 91,8 % (voir le tableau Joint en annexe). On n'observe pas de perdition des souris. Ces données montrent déjà que du 11ème au 30ème jour, les antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche ainsi préparés, non seulement correspondent aux exigences de l'OMS en ce qui concerne la toxicité, mais encore ils les surpassent. Les antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche ont une faible activité stimulante de la lymphocytose, dans certaines préparations, cette activité est inférieure à celle d'un vaccin préparé suivant le pro- cédé préconisant une précipitation avec de l'acide chlorydrique (voir le tableau 1). Les propriétés protectrices des antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche sont déterminés d'après la dose ED50, dose garantissant la survie de 50 % des souris d'essai. A cet effet, les souris sont immuni- sées par voie intrapéritonéale 3 fois avec les préparations étudiées qui sont diluées 5 fois et, après 14 jours leurs cerveaux sont contaminés par des.microbes de la coqueluche virulents vivants (une dose qui n'est pas inférieure à 100 LD50). Pour chacun des essais, on introduit des vaccins préparés suivant les procédés décrits dans l'introduction, à partir des mêmes suspensions microbiennesque celles à partir desquelles sont pré- parés les antigènescorpusculaires protecteurs de la coqueluche. Les antigènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche préparés selon le procédé proposé ont une activité protectrice plus élevée en com- paraison avec les vaccins préparés avec du formaldéhyde et du merthiolate. La dose ED50 de la préparation proposée ordinairement est supérieure ) a la dose ED5 des-vaccins indiqués de 2,3 à 5,3 fois (voir tatle>i 1). Il faut préciser que l'acide itaconique utilisé pour l'inactiva- tion: de la suspension microbienrne représente -un acide organique qui *st un produit intermédiaire naturel du métabolisme cellulaire des animaux et des plantes et qui entre dans le cycle cellulaire des acides tri- carboxyliques. Cette substance est toxique uniquement envers les micro- bes de la coqueluche. On notera ci-après l'état antérieur de la technique pris en con- sidération pour la mise au point de la présente invention et auquel on pourra Se référer pour avoir de plus amples informations: 1. Zaharova, M. C."Vaccin associé DPT. Manuel sur les vaccins et sérums". - 1978, Moscou, éd. "Medizina", 164 P. 2. Comité des experts de l'OMS sur la standardisation (normalisa- tion) des préparatiornsbiologiques, Rapports Techniques, 638, rapport 1V. 1982, 65 P, OMS, Genève. 3. Minimum requirements of biological products. Ministry of Health and Wlf., Japan. Government, 1982, P. 123 - 125. TABLELU 1 Propriétés toxi3ueF et protectrices de_ antiènes corpusculaires protecteurs de la coqueluche. Préparation Caractéristique de la Toxicité Propriétés de E préeparation protection Souche N Conc. de l'ac. Test MPP ED50 Activité itaconique du poids (mI) reltiVE des souris (1+) 2+) (3+) (4+) (5+) (6') Culture en milieu liquide 1. 222 10 91,6 1,38 2, 41405 1C 6E,E 1,64 0,018 4,2 3. n 10 81,3 1,19 0,031 2,2 4. 5, 76,7 1,8 0,62 4,3 5. " C1 et thio- 6t,5 2.3 0,087 1,0 -ersal Culture ea.milieu solide 6. 41405 13 74,5 Z,4 0,06 1,6 7. " úozmal hy i 70,5 2,7 0,0E 1,' 8. 41405, 65,9 2,1,029 4,3 "fQorDalzézyte 75 " 1,7 0,13 1,0 10. 38 13 78,1 1,c5 0,0165 3,6 11. " 6,5 85,4 2,76 0, 11 5,1 iZ.t " n formaldehyde 75,5 1,34 0,06 1,0 265O 184 Notes: (1'): Souche ne 41405 de'la Collection bulgare de microbes (Institut d'Etat pour le contrôle des médicaments) : Souches n 222 et 38 de la Collection des microbes de l'Institut ' d'Etat des recherches sur la normalisarion et le contr6le des préparations médicales "Tarassevitch", USSR (2'): Concentration de l'acide itaconique mg/ml (3+): Test du poids, augmentation de la masse du corps (4): Activité de stimulation de la leucocytose (LPF), augmentation des leucocytes dans le sang périphérique en comparaison avec les contrôles. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'antigènes corpusculaires protec- teurs de la coqueluche, consistant à cultiver les microbes, à préparer ur. e suspension microbiernre qui est inactivée puis, apres la précipit éin consécutive de la masse microbienne à faire décanter le liquide hypersé- mentaire, et à diluer le précipité avec une solution isotonique de chiorure de sodium, caractérisé en ce qu'on réalise l'inactivation avec de l'acide itaconique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la con.- centration finale de l'acide itaconique dans la suspension microbienne est de 3,75 à 13 mg/ml tandis que le pH est de 3,7 à 4,2. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la suspension microbienne est mise au contact de l'acide itaconique pen- dant 1 à 4 heures.