Brevet FR2651326A1 — publié le 19910301

PROCEDE ET DISPOSITIF DE DOSAGE RAPIDE D'UNE PLURALITE D'ECHANTILLONS CONTENANT UNE SUBSTANCE D'INTERET CLINIQUE REACTIVE IMMUNOLOGIQUEMENT La présente invention concerne le domaine technique général des procédés et dispositifs de dosage d'une substance chimique, biologique ou biochimique contenue dans un mi lieu quelconque naturel ou artificiel. La présente invention s'applique, plus particulièrement mais non exclusivement, aux procédés et dispositifs de dosage qui ont pour but de doser des substances d'intérêt clinique réactives immunologiquement, du genre dosage d'un antigène par un anticorps et réciproquement. La présente invention s'inscrit dans le cadre d'un développement et d'une amélioration du procédé et du dispositif de dosage décrit dans la demande de brevet FR-A-2 604 526. Ainsi, par "substance réactive immunologiquement", on entend principalement tous les antigènes (incluant les haptènes) et les anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par fusion cellulaire et immunisation naturelle ou provoquée. De la même façon, par "substance d'intérêt clinique réactive immunologiquement", on entend principalement toutes les molécules antigèniques ou anticorps dont le dosage, dans un échantillon biologique d'origine humaine ou animale, peut présenter un intérêt dans le diagnostic médical, la recherche clinique ou le suivi d'un processus pathologique, ou d'une thérapeutique mise en oeuvre. La demande antérieure FR-A-2 604 526 décrit un procédé de dosage, notamment de dosage d'un antigène par un anticorps, dans lequel on procède à des phases particulières d'agitation et de lecture de résultat. On a ainsi recours à des micro-particules ou micro-sphères synthétiques ou naturelles qui, lors d'une phase d'agitation d'amplitude et de fréquence déterminée, conduisent à l'agglutination immunologique et spécifique des anticorps et des antigènes. Les micro-particules ou micro-sphères choisies présentent la particularité d'offrir, pour une longueur d'onde déterminée, de la lumière ultra-violet visible, un maximum d'absorption dénommée X max.Cette propriété particulière d'absorption vraie est alors utilisée dans la pratique pour déterminer, par spectro-photométrie classique, la concentration d'échantillons à doser, puisque seules les micro-sphères ou micro-particules non agglutinées dans un échantillon à doser présentent, par Lecture spectro-photométrique au voisinage du X max caractéristique desdites micro-particules ou micro-sphères, un maximum d'absorption. Par comparaison avec une courbe étalon obtenue par lecture à la même longueur d'ondes caractéristique X max, on peut ainsi obtenir, par simple lecture d'un échantillon traversé par un rayon de longueur d'ondes X max, la concentration dudit échantillon après la mise en oeuvre de dilutions appropriées, et le recours à des solutions de blocage. Le procédé ainsi décrit ne requiert, au préalable, que la connaissance ou la vérification de la longueur d'ondes X max caractéristique du maximum d'absorption des micro-sphères ou micro-particules utilisées. Le procédé et son dispositif de mise en oeuvre se sont révélés d'une utilisation pratique certaine, puisqu'ils sont susceptibles d'être employés par tout type de laboratoire possédant un appareil classique de lecture par spectro-photométrie. Cette technique est comparable aux lectures traditionnelles par spectro-photométrie utilisées dans d'autres domaines et est donc d'un usage facile, d'une exécution rapide et d'un coût final d'analyse relativement faible. Un tel procédé souffre cependant d'un inconvenient majeur relatif à La nécessité de procéder à la lecture individuelle et successive de chacun des tubes à lire, puisque ces derniers doivent être introduits dans l'appareil de lecture, puis lus et enfin retirés par l'utilisateur. Le nombre de manipulations est, en conséquence, directement proportionnel au nombre de tubes à doser, alors que le procédé de lecture en lui-même est instantané, ce qui conduit à rendre la technique globale de dosage d'une longueur sans rapport avec la technique même de lecture. Cette situation est d'autant plus préjudiciable que, dans la pratique, l'utilisateur est confronté à la nécessité de procéder au dosage d'un grand nombre d'échantillons, à savoir une ou plusieurs centaines par exemple. On connaît, par ailleurs, déjà des appareils de lecture susceptibles d'effectuer la lecture automatique, par spectro-photométrie notamment, d'un grand nombre d'échantillons à doser. Ces appareils de lecture, utilisant généralement le principe des fibres optiques, sont par exemple utilisés dans le domaine de l';mmuno-enzymologie et permettent de lire Le résultat du dosage propre à chaque échantillon, par le biais d'une micro-plaque comportant une série de micro-cupules dans lesquelles est insérée et maintenue verticalement la série des échantillons à doser. Il peut s'agir, par exemple, de micro-plaques du type ELISA dont la fonction habituelle est de permettre la lecture d'une série de réaction colorimétrique. Ces micro-plaques sont habituellement prévues pour permettre la lecture automatique de 96 tubes d'échantillons. Les appareils de lecture appropriés, plus communément désignés sous le terme de "lecteurs automatiques de micro-plaques" assurent, une fois mise en place dans l'appareil la micro-plaque munie de la pluralité des tubes à lire, la mise en oeuvre automatique de la lecture individualisée des tubes d'échantillons, par émission d'un ensemble de faisceaux optiques traversant généralement verticalement chacun des tubes. Dans la plupart des cas, une imprimante est reliée à l'appareil de lecture pour permettre une impression immédiate des résultats de lecture. Cette technique de lecture automatique est, bien évidemment, parfaitement adaptée à la lecture rapide d'une grande série d'échantillon, mais son utilisation est actuellement limitée à la Lecture de réaction colorimétrique. En effet, les possibilités optiques des appareils de lecture automatique communément utilisés sont réduites à un nombre limité de longueur d'ondes de lecture caractéristiques de la tête ou de la couronne de lecture de chaque type d'appareil. Ces caractéristiques sont en nombre fini et les longueurs d'ondes discontinues, à savoir par exemple 340 nanomètres, 405 nanomètres, 414 nanomètres, 450 nanomètres, etc... Cette particularité ne rend pas le procédé de lecture, decrit dans la demande de brevet FR-A-2 604 526, directement adaptable à la lecture par ces appareils automatiques, dans la mesure ou il est nécessaire que la longueur d'onde X max des micro-particutes ou micro-sphères utilisées dans le procédé selon la demande précitée présente un maximum d'absorption correspondant à La longueur d'onde de lecture de l'appareil. Par ailleurs, les procédés de lecture connus jusqu'à présent et mettant en oeuvre des micro-plaques consistent à avoir recours, de manière classique, à des tubes d'échantillons mis en place sur la micro-pLaque, ou à des utilisations successives pour un meme dosage de plusieurs micro-plaques incluant des lavages. Les procédés de lecture connus à ce jour ne permettent donc pas de procéder à une lecture rapide d'un grand nombre d'échantillons, dans la mesure où subsiste une série d'opérations de manipulations qui conduisent à l'allongement inconsidéré des phases de dosage et de lecture, dû notamment aux phases de lavage. En outre, la difficulté de lavage des micro-cupules conduit à une fiabilité altérée des résultats de lecture. L'objet de l'invention est de proposer un perfectionnement au procédé et au dispositif de dosage de substances d'intérêt clinique réactive immunologiquement selon la demande FR-A-2 604 526 qui permette d'assurer la lecture automatique du dosage d'une pluralité d'échantillons. Un autre objet de l'invention est de proposer un procédé et un dispositif de mise en oeuvre permettant l'adaptation du procédé et du dispositif selon la demande FR-A-2 604 526 aux techniques de lecture automatique permises par les Lecteurs automatiques de micro-plaques. Un objet secondaire de L'invention est de proposer un procédé et son dispositif de mise en oeuvre dans lequel l'ensemble des opérations de préparation et de manipulation des échantillons doser et de détermination de la gamme étalon est réduit et simplifié, en vue de réduire Le temps total de dosage. L'objet de L'invention est atteint grâce à un procédé de dosage d'une substance d'intérêt clinique réactive immunologiquement par d'autres substances du même type, du genre dosage d'un antigène par un anticorps et réciproquement, du type dans lequel : - on greffe préalablement une substance active immunologiquement, jouant le rôle d'agent doseur, sur des micro-particuLes naturelles ou synthétiques pour constituer un réactif doseur, - on détermine le maximum d'absorption de la lumière ultra-violet visible, soit d'une suspension en mi lieu Liquide desdites micro-particules non agglutinées, soit du réactif doseur en suspension liquide, la détermination étant effectuée en faisant le spectre d'absorption ultra-violet visible de L'une ou L'autre desdites suspension, la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorption étant dénommée X max, - on mélange le réactif doseur avec la substance à doser diluée de façon appropriée et de manière connue, - on incube ledit mélange, par agitation, pour réaliser l'agglutination immunologique desdites micro-particules dans le mi lieu d'incubation, - on effectue ensuite la lecture du résultat dans un appareil de lecture de type spectro-photomètre, par spectro-photométrie d'absorption ultra-violet visible, en se plaçant au voisinage de ladite longueur d'onde X max, - on calcule les concentrations de la substance à doser dans L'échantiLLon, par comparaison avec les résultats d'absorption ultra-violet visible mesurés à la même longueur d'onde X max obtenus, dans les mêmes conditions, sur une gamme étalon, caractérisé en ce que, en vue d'effectuer le dosage d'une pluralité d'échantiLLons en un seul passage dans l'appareil de lecture - on choisit préalablement, pour réaliser l'ensemble des opérations de dosage, un réactif doseur dont les micro-particules présentent au moins un X max correspondant sensiblement à au moins une longueur d'onde autorisée par l'appareil de lecture, - on effectue les mélanges du réactif doseur avec la pluralité des échantillons à doser dilués de manière connue dans une série du volumes individualisés, consistant en une série de micro-cupules ménagées dans une micro-plaque, - on incube simultanément la totalité desdits mélanges en soumettant à agitation ladite micro-plaque. - on effectue la lecture de la pluralité des résultats par introduction de la micro-plaque dans un lecteur spectro-photométrique et automatique de micro-plaque programmé sur une longueur d'ondes de lecture voisine du X max caractéristique des micro-particules choisies. L'objet de L'invention est également atteint grâce à un dispositif de mise en oeuvre du procédé comportant - au moins une micro-plaque dans laquelle est ménagée une pluralité de micro-cupules, - un réactif doseur comprenant des micro-particules greffées sur une substance active immunologiquement et apte à jouer le rôle d'agent doseur, - une solution de blocage de la réaction d'agglutination, - une gamme étalon de la substance active immunologiquement. Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous en référence aux dessins annexés qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de L'objet de L'invention. La fig. 1 représente une vue généra le schématique et en perspective d'une micro-plaque utilisée dans le procédé et le dispositif conforme à L'invention. La fig. 2 montre une vue de dessus d'une micro-plaque et la fig. Za montre une vue partielle d'une forme de répartition spécifique de la gamme étalon. La fig. 3 représente une vue généra le de dessus d'un coffret conforme à L'invention. Dans la description qui suit, il ne sera fait que succinctement référence à L'étape relative au greffage de la substance active immunologiquement sur des micro-particules ou micro-sphères ou à L'étape de détermination du maximum d'absorption X max d'une suspension en mi lieu liquide desdites micro-particules non agglutinées ou du réactif doseur lui-même. Pour plus de détails sur la réalisation pratique, on se reportera utilement à la demande FR-A-2 604 526. La plupart des appareils de lecture automatique de micro-plaques actuellement présents sur le marché sont munis d'un réseau de filtres interférentiels de lecture montés sur une couronne rotative permettant de sélectionner, par rotation de la couronne, une longueur d'onde de lecture spécifique à chacun des filtres. En pratique, les principales longueurs d'ondes de lecture qui peuvent être affichées sont 340 nanomètres, 405 nanomètres, 414 nanomètres, 450 nanomètres, 492 nanomètres, 540 nanomètres, 620 nanomètres, 690 nanomètres. En vue de pouvoir assurer, de manière significative, la mesure de L'absorption d'une suspension aqueuse contenant des micro-particules ou micro-sphères non agglutinées, par spectro-photométrie d'absorption aux longueurs d'ondes autorisées par les appareils classiques de lecture de micro-plaques correspondant aux valeurs ci-dessus mentionnées, il s'est avéré nécessaire d'utiliser des réactifs doseurs dont les micro-particules ou micro-sphères présentent une X max d'absorption pour au moins une de ces mêmes va leurs de lecture. En effet, la demande de brevet FR-A-2 604 526 a montré que si par spectro-photométrie d'absorption ultra-violet visible en se plaçant à une longueur d'ondes qui correspond au X max d'absorption des micro-sphères non agglutinées, on effectue la lecture d'une solution contenant un mélange de micro-sphères ou micro-particules non agglutinées et un mélange d'agglutinats de celles-ci, la mesure effectuée ne concerne, et donc ne détecte, que les particules non agglutinées, car ces dernières sont les seules à absorber à ce maximum. Le maximum d'absorption X max est donc une caractéristique des micro-sphères désagglutînées, et cette caractéristique est directement reliée soit à la taille des particules, soit à leur matière constitutive, soit à Leur couleur. Les investigations menées sur les micro-particules ou micro-sphères naturelles ou synthétiques actuellement disponibles ont permis de mettre en évidence que, pour des longueurs d'ondes de lecture couramment utilisées, la taille des micro-particules ou micro-sphères, susceptibles de présenter un X max aux longueurs d'onde de lecture des appareils de lecture à micro-plaque, devait être comprise entre 0,4 et 0,7 micromètres d'une part, et entre 0,8 et 1, 2 micromètres d'autre part. Les micro-particules ou micro-sphères d'un diamètre de 1 micromètre présentant, par exemple, un maximum d'absorption a une longueur d'onde de lecture de 405 nanomètres exactement. Pour des longueurs d'onde de lecture de 340 nanomètres, des micro-particules ou micro-sphères d'un diamètre de 0,5 à 0,6 micromètres en polystyrène, ou de 0,6 micromètre en vinyl butadiène conviennent également bien. Pour des Longueurs d'ondes inférieures, des tailles comprises entre 0,1 et 0,5 micromètres conviennent également bien. Pour une autre longueur d'ondes de lecture par exemple 405 nanomètres, un diamètre de 0,9 à 1,2 micromètres convient également bien. L'ajustement du X max d'une micro-sphère donnée sur une Longueur d'onde imposée par l'appareil de Lecture présente cependant une certaine tolérance, dans la mesure où il a été noté que les micro-particules ou micro-sphères d'une taille donnée pouvait présenter un X max variant de plus ou moins 5 manomètres autour de la valeur affichée de lecture sans nuire significativement au résultat. En résumé, il a été noté que des micro-sphères ou micro-particules synthétiques en polystyrène non colorées, d'un diamètre sensiblement égal à 0,1, 0,3, 0,3 à 0,7, 0,8 à 0,85, 1, 1,4 micromètres permettaient respectivement les lectures au voisinage de 300, 310, 320 à 350, 380, 405 et 420 nanomètres. Comme cela est également bien décrit dans la demande de brevet FR-A-2 604 526, il est possible de sélectionner les micro-sphères ou micro-particules sur leur caractéristique de couleur et, dans le cas présent, la couleur bleue s'est avérée donner de bons résultats au voisinage de 340 nanomètres. Avantageusement, des micro-particules ou micro-sphères en polystyrène bleu, d'un diamètre compris entre 0,4 et 0,7 micromètres, permettent une lecture entre 320 et 360 nanomètres. IL s'est également révélé qu'avantageusement les micro-particules devaient présenter une forme sphérique, devaient être synthétiques, et choisies dans Le groupe constitué par les polymères synthétiques de vinyl toluène, acrylo-nitrile, styrène butadiène, dérivés acrylo-nitriles-acide acrylique, esters acryliques, silicones, vinyl butadiène et, de préférence, du polystyrène. La sélection des tailles ou couleurs de micro-particules ou micro-sphères utilisables étant effectuée, on greffe, de manière connue, une substance active immunologiquement, jouant le rôte d'agent doseur, sur lesdites micro-particules ou micro-sphères, en vue de constituer un réactif doseur. Le procédé selon l'invention consiste, ensuite, à utiliser une micro-plaque standard pour les cultures de cellules ou, par exemple du type ELISA dont un exemple de réalisation est montré schématiquement aux fig. 1 et 2. Ces micro-plaques 1 se présentent généralement sous la forme d'un volume défini en forme de parallélépipède rectangle comportant une série de micro-cupules 2, de préférence, de forme cylindrique répartie réguLièrement dans la masse de La micro-plaque 1. Les volumes définis par les micro-cupules sont également, de préférence, constants et égaux les uns par rapport aux autres et présentent une ouverture, par exemple circulaire, débouchant au niveau de la face supérieure 3 de la micro-plaque 1. Il est bien évident que d'autres formes de micro-cupules 2 sont envisageables. Ces plaques sont généralement réalisées en un matériau plastique transparent du genre polystyrène.De manière courante, les micro-plaques 1 comportent une série de huit rangées numérotées de A à H, réparties sur douze colonnes, ce qui conduit à des micro-plaques 1 comportant 96 micro-cupules. Le procédé selon L'invention présente la particularité d'effectuer le mélange du réactif doseur, contenant donc des micro-sphères synthétiques greffées, avec la pluralité des échantillons à doser (au préalable dilués de manière connue) directement dans chacun des volumes individualisés définis par les micro-cupules 2 de la micro-plaque 1. Chaque micro-cupule 2 est ainsi susceptible de contenir un mélange d'une quantité connue de réactif doseur, avec une quantité également connue d'échantillons à doser, sans avoir recours à des tubes de lecture. De préférence, on réserve certaines micro-cupules, avantageusement trois rangées réparties sur neuf colonnes, pour constituer la gamme étalon de lecture. Dans une réalisation particulièrement avantageuse de L'invention, les points de la gamme étalon 4 sont présents d'origine au fond des micro-cupules 2 qui leur sont réservées, sous forme lyophilisée et en quantité également pré-étalonnée, La tâche de l'utilisateur consiste simplement à reconstituer la gamme étalon d'une micro-plaque par simple réhydratation des micro-cupules 2 contenant les points de la gamme étalon 4. De manière surprenante, il a été en effet constaté que les points de gammes étalon 4 lyophilisés déposés au fond d'une micro-cupule présentaient la particularité, d'abord de se répartir naturellement sous forme d'anneaux circulaires (fig.Za) au fond des microcupules hydrophiles, puis en cas de choc mécanique ou de mouvement quelconque imparti à la micro-plaque, avaient une tendance naturelle à demeurer naturellement liés et fixés au fond de ladite micro-cupule. Inversement, les points de gamme étalon se répartissent naturellement sous forme de croissant (fig 2) dans des micro-cupules hydrophobes. Même en cas de choc important ou de manipulation intempestive de La micro-plaque 1, y compris son retournement, les quantités de points de la gamme étalon ainsi déposées conservent constamment leur position au fond de la microcupule 2 et leur forme en croissant ou circulaire, et ce même si des quantités minimes de points de gamme étalon sont lyophilisées. De la même façon, il peut être envisagé de prévoir, de manière préférentielle, de déposer, au fond de tout ou partie des micro-cupules restantes non occupées par les points de La gamme étalon 4, des quantités pré-étalonnées du réactif doseur sous forme deshydratée ou même lyophilisée. L'utilisateur n'a plus alors qu'à déposer au fond desdites micro-cupules les quantités requises de chacun des échantillons à doser. Avantageusement, on prévoit un système de fermeture de la micro-plaque 1 qui peut, par exemple, consister en un opercule 5 maintenu par tout moyen connu de L'homme de l'art et, par exemple, par collage sur la face supérieure 3 de la micro-plaque. Par simple détachement de cette opercule 5, l'utilisateur obtient une micro-plaque prête à l'emploi. Une fois réalisé le mélange du réactif doseur avec la substance à doser, laquelle a été diluée de manière appropriée et de manière connue directement dans les micro-cupules, et dès lors que les points de la gamme étalon ont été reconstitués par réhydratation dans les micro-cupules réservés à cette effet au sein de la micro-plaque, on procède à L'incubation desdits mélanges par agitation simultanée de la pluralité des mélanges en soumettant à agitation la micro-plaque elle-même. Avantageusement, on soumet la micro-plaque 1 à un mouvement périodique de fréquence comprise entre 4 et 40 Hertz, de préférence voisin de L'ordre de 20 Hertz, et d'amplitude variant de quelques millimètres à quelques centimètres, de préférence de L'ordre de 4 millimètres. Ce mouvement périodique d'agitation a pour but de réaliser l'agglutination immunologique spécifique desdites micro-particules ou micro-sphères contenues dans chacun des mi lieux d'incubation présents dans chacune des micro-cupules. Pour réaliser cette agitation, on a recourt à des appareils d'agitation classique bien connus de L'homme de L'art. Après la phase d'agitation, on procède à L'aide d'une solution de blocage qui est introduite directement dans chacune des micro-cupules, au blocage de chacune des solutions. Après un temps de repos de L'ordre par exemple de 10 minutes, l'utilisateur peut alors procéder à la lecture directe de La pluralité des résultats de concentration relatifs à la pluralité des échantillons par introduction directe de la micro-plaque 1 dans un lecteur spectro-photométrique et automatique de micro-plaque. L'utilisateur doit cependant, au préalable, sélectionner la longueur d'onde de lecture de l'appareil sur une Longueur d'onde de lecture voisine du X max caractéristique des micro-particules ou micro-sphères choisies en tant que réactifs doseurs. L'appareil de lecture par spectro-photométrie assure, ensuite, par lui-même de manière automatique et en un seul passage de la micro-plaque 1, la lecture individualisée de chacun des échantillons par émission de rayons optiques verticaux à travers chacune des micro-cupules 2 de La micro-plaque. Le dispositif de mise en oeuvre du procédé selon L'invention doit, en conséquence, être constitué d'au moins une micro-plaque i dans laquelle est ménagée une pluralité de micro-cupules 2, et comprendre un réactif doseur contenant des micro-particules ou micro-sphères greffées sur une substance active immunologiquement et apte à jouer le rôle d'agent doseur. Ces micro-particules ou micro-sphères sont, bien évidemment, choisies en fonction des possibilités de lecture de l'appareil à utiliser, et leurs caractéristiques de matière constitutive, de taille et de couleurs correspondent à celles mentionnées précédemment. Une solution de blocage de la réaction d'agglutination, ainsi qu'une gamme étalon de la substance active immunologiquement doivent compléter le dispositif. De manière avantageuse, le dispositif de mise en oeuvre se présente sous la forme d'un coffret 6 (fig. 3) contenant au moins une et, de préférence, trois micro-plaques 1, chacune des micro-plaques possédant une gamme étalon 4 qui est déposée d'origine sous forme lyophilisée et pré-étalonnée au fond de 27 micro-cupules. Le coffret 6 présente, en outre, de manière préférentielle, des flacons d'une solution tampon 7 lyophilisée pour ta dilution finale de L'échantiLLon. La solution tampon est reconstituée par simple réhydratation. Le coffret 6 peut, en outre, comporter des flacons d'une solution de blocage 8, ainsi que des tubes de sérum de contrôle 9, par exemple deux, et, enfin, des tubes de réactifs 10 prêts à l'emploi pour le mélange des échantillons. Dans le cas où les points de la gamme étalon 4 ne sont pas distribués au fond d'une série de micro-cupules, il est bien évidemment nécessaire de prévoir, dans le coffret 6, des flacons ou des tubes contenant les points de la gamme étalon. De même, si le réactif destiné aux échantillons est distribué d'origine dans les micro-cupules, le coffret ne comprendra pas de tubes de réactif 10. A titre de variante, il est également envisageable, si la voie liquide est choisie, de distribuer le réactif prêt à l'emploi d'origine au fond des micro-cupules, l'opercule de fermeture 5 assurant alors L'étanchéité de l'ensemble. Le procédé et le dispositif de mise en oeuvre qui ont été décrits permettent ainsi à l'utilisateur de disposer d'une technique de dosage et de lecture qui permet de réduire considérablement les temps de préparation et de manipulation, puisque la micro-plaque est prête à l'emploi et est apte à contenir Les points de la gamme étalon et au besoin même le réactif doseur En outre, le mélange du réactif doseur et des échantillons à doser se faisant directement au sein des micro-cupules de la micro-plaque, il n'est plus nécessaire d'avoir recours à des séries de tubes supplémentaires, ce qui, une nouvelle fois, réduit le temps de manipulation. Le réactif doseur peut enfin, bien évidemment, être sous forme déshydratée et être présenté dans le coffret 6 dans des tubes ou flacons. La technique utilisée est, par ailleurs, considérablement simplifiée, dans la mesure où la micro-plaque elle-même est utilisée en tant qu'élément support pour L'agitation conduisant à l'agglutination. Enfin, la lecture automatique de la concentration de chacun des échantillons au sein d'un appareil de lecture automatique permet à l'utilisateur d'obtenir, de manière quasi simultanée, les résultats de concentration pour un grand nombre d'échantillons. Exemple de réalisation Le coffret destiné au dosage simultané d'une pluralité d'échantiLLons est livré avec trois micro-plaques, chaque micro-plaque comprenant 27 micro-cupules réservées aux points de gamme étalon réparties sur trois rangées, soit 9 points de gamme étalon en triple pré-lyophilisés. Les 69 autres micro-cupules de chaque plaque, soit au total 207 micro-cupules, sont vierges et disponibles pour L'incubation d'échantillons biologiques dilués. Toutes les distributions de fluide ou Liquide peuvent se faire très rapidement à L'aide de pipettes multicanaux (8 canaux). 1 > Distribution - l'utilisateur réhydrate simplement les micro-cupules de la gamme étalon, - l'utilisateur procède à La distribution des échantillons biologiques, dilués au préalable, dans les micro-cupules vierges, à raison par exemple de 10 microlitres par micro-cupules. 2) L'utilisateur procède ensuite à la distribution par des pipettes huit canaux du réacif prêt à l'emploi dans les micro-cupules, à raison par exemple de 20 microlitres de réactif. 3) L'utilisateur procède ensuite à la phase d'incubation et d'agitation pendant, par exemple, 6 minutes à La température ambiante et aux fréquence et amplitude mentionnées précédemment dans la description. 4) Après la phase d'incubation, l'utilisateur distribue, par une pipette huit canaux, le Liquide de blocage dans chacune des micro-cupules, à raison par exemple de 100 microlitres. 5) L'utilisateur n'a plus alors qu'à procéder à la lecture simultanée des 96 puits correspondant à chacune des micro-cupules en introduisant la micro-plaque dans un lecteur de micro-plaque, du type par exemple FLOW MCC 340. Auparavant, l'utilisateur a, bien évidemment, sélectionné le filtre de lecture de l'appareil et sur la longueur d'ondes correspondant au maximum d'absorption caractéristique des micro-particules du réactif utilisé. Il doit également être noté que l'appareil de vibration utilisé pour la phase d'incubation et d'agitation pouvant agiter quatre micro-plaques simultanément, il devient possible de doser très rapidement un grand nombre d'échantillons. L'invention n'est pas Limitée aux exemples décrits et représentés, car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1 - Procédé de dosage d'une substance d'intérêt clinique réactive immunologiquement par d'autres substances du même type, du genre dosage dlun antigène par un anticorps et réciproquement, du type dans lequel : - on greffe préalablement une substance active immunologiquement, jouant le rôle d'agent doseur, sur des micro-particules naturelles ou synthétiques pour constituer un réactif doseur, - on détermine le maximum d'absorption de la lumière ultra-violet visible, soit d'une suspension en mi lieu Liquide desdites micro-particules non agglutinées, soit du réactif doseur en suspension liquide, la détermination étant effectuée en faisant le spectre d'absorption ultra-violet visible de L'une ou L'autre desdites suspension, la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorption étant dénommée X max, - on mélange le réactif doseur avec la substance à doser diluée de façon appropriée et de manière connue, - on incube ledit mélange, par agitation, pour réaliser l'agglutination immunoLogique desdites micro-particules dans Le mi lieu d'incubation, - on effectue ensuite la lecture du résultat dans un appareil de lecture de type spectro-photomètre, par spectro-photométrie d'absorption ultra-violet visible, en se placant au voisinage de ladite longueur d'onde X max, - on calcule les concentrations de la substance à doser dans l'échantillon, par comparaison avec les résultats d'absorption ultra-violet visibLe mesurés à la même longueur d'onde X max obtenus, dans Les mêmes conditions, sur une gamme étalon, caractérisé en ce que, en vue d'effectuer le dosage d'une pluralité d'échantillons en un seul passage dans l'appareil de lecture - on choisit préalablement, pour réaliser l'ensemble des opérations de dosage, un réactif doseur dont les micro-particules présentent au moins un X max correspondant sensiblement à au moins une longueur d'onde autorisée par l'appareil de lecture, - on effectue les mélanges du réactif doseur avec la pluralité des échantillons à doser dilués de manière connue, dans une série du volumes individualisés, consistant en une série de micro-cupules ménagées dans une micro-plaque, - on incube simultanément la totalité desdits mélanges en soumettant à agitation ladite micro-plaque. - on effectue la lecture de la pluralité des résultats par introduction de la micro-plaque dans un lecteur spectro-photométrique et automatique de micro-plaque programmé sur une longueur d'ondes de lecture voisine du X max caractéristique des micro-particules choisies, 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à distribuer les dilutions des échantillons à doser dans une série de micro-cupules appartenant à la même micro-plaque que les micro-cupules contenant les points de gamme étalon. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à reconstituer la gamme étalon d'une micro-plaque par simple réhydratation de micro-cupules contenant les points de gamme étalon (4) lyophilisés dans la micro-cupule. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif doseur est déshydraté ou lyophilisé dans les micro-cupules (2) de la micro-plaque (1). 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les micro-particules naturelles ou synthétiques utilisées présentent un maximum d'absorption ultra-violet visible (; max) entre 300 et 420 nanomètres et, de préférence, au voisinage des longueurs d'onde suivantes : 340 nn - 405 nn - 414 nn - 450 nn 492 nn - 540 nn - 620 nn - 690 nn. 6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la micro-plaque (1) utilisée est, soit une micro-plaque standardisée du type ELISA dont la fonction habituelle est de permettre la Lecture d'une série de réactions colorimétriques, soit une micro-plaque de cultures de cellules. 7 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les micro-particules sont synthétiques et choisies dans le groupe constitué pour des polymères synthétiques de vinyl toluène, acrylonitrile, styrène butadiène, dérivés acrylo-nitriles-acide acrylique, esters acryliques, silicones, vinyl butadiène et, de préférence, du polystyrène. 8 - Procédé selon la revendication 1, 5 et 7, caractérisé en ce que les micro-particules synthétiques sont des micro-particules de polystyrène de diamètre compris entre 0,4 et 0,7 micromètres et entre 0,8 et 1,2 micromètres pour lire respectivement à 340 nn et 405 nn, ou de diamètre d'environ 0,1, 0,3, 0,8, 1 et 1,4 micromètres pour lire respectivement au voisinage de 300, 310, 380, 405 et 420 nanomètres. 9 - Procédé selon La revendication 8, caractérisé en ce que les micro-particules de polystyrène sont d'un diamètre compris entre 0,4 et 0,7 micromètres et de couleur bleue pour lire de 320 à 360 nanomètres. 10 - Dispositif de mise en oeuvre du procédé comportant - au moins une micro-plaque (1) dans laquelle est ménagée une pluralité de micro-cupules (2) - un réactif doseur comprenant des micro-particules greffées sur une substance active immunologiquement et apte à jouer le rôle d'agent doseur, - une solution de blocage de la réaction d'agglutination, - une gamme étalon (4) de la substance active immunologiquement. 11 - Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que La gamme étalon (4) est constituée d'une série de points de gamme lyophilisés pré-déposés d'origine au fond des micro-cupules (2) en quantité pré-étalonnées, les points de gamme étant prêts à l'emploi après réhydratation. 12 - Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que le réactif doseur et la gamme étalon sont Liquides ou lyophilisés et conservés en flacons (7, 8). 13 - Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que le réactif doseur est liquide et pré-déposé dans les micro-cupules, lesquelles sont recouvertes d'une opercule de fermeture (5). 14 - Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que le réactif doseur est déshydraté et pré-déposé à L'origine en quantité constante et prête à l'emploi par réhydratation au fond d'une série de micro-cupules. 15 - Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que la micro-plaque (1) est munie d'une opercule de fermeture (5) étanche et déchirable apte à fermer les micro-cupules. 16 - Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que le réactif doseur contient des micro-particules qui présentent au moins un maximum d'absorption (k max) entre 300 et 420 nanomètres et, de préférence, au voisinage des longueurs d'ondes suivantes : 340, 405, 414, 450, 492, 540, 620 et 690 nanomètres. 17 - Coffret (6) destiné au dosage simultané d'une pluralité d'échantillons comprenant un dispositif conforme aux revendications 10 à 16.