Brevet FR2650393A1 — publié le 19910201

Le concentré de facteur VIII humain, obtenu à partir du plasma humain ou par génie génétique, est utilisé pour suppléer sa déficience chez l'hémophilé A. Les techniques actuelles permettent la purification du F VIII avec des activités spécifiques (unités internationales de F VIII par gramme de protéines) allant de 1 à 3000 et des rendements très variables (de 80-350 unités internationales/litre de plasma) selon la méthode utilisée. Plus le facteur de purification est élevé plus le rendement en unités de F VIII, par litre de plasma chute. A l'heure actuelle une seule technique, basée sur lim- munopurification, permet d'obtenir un concentré antihémophilique A avec un facteur de purification très élevé. L'inconvénient de ce procédé est le relargage d'anticorps monoclonaux, d'origine murine, dans le produit final, ce qui, dans certains cas, entraînerait des chocs anaphylactiques. Le but de l'invention est donc d'obtenir un concentré de facteur VIII ayant une activité spécifique et un rendement élevés, concentré exempt de protéines étrangères et d'origine non humaine. 1. MATIERE PREMIERS . - extrait de F VIII préparé à partir du cryoprécipité après absorption surhydroxyde d'aluminium (Al(OH)3) - extrait de F VIII préparé.à partir du cryoprécipité après absorption sur hydroxyde d'aluminium (Al(OH)3) et précipitation du fibrinogène à pH 6,5 et à 10 C. - extrait de F VIII préparé à partir du cryoprécipité après précipitation à la glycine 2 M et au chlorure de sodium (NaCl) 1,5 M. - facteur VIII obtenu par tout autre procédé. Dans les quatre cas, le F VIII se trouve dans le tampon 1 et peut subir un traitement d'inactivation virale par la méthode solvant détergent, avant chromatographie. 2. CHROMOTOGRAPHIE Le F VIII est déposé sur une colonne contrenant un gel, échangeur anionique, de type Q Sepharose Fast Flow prééquilibré avec du tampon 1. Le temps de contact F III, gel est de 100 minutes - ou - 20. Après avoir chargé le F III antihémophilique sur la colonne, le gel est lavé avec du tampon 2 et ce jusqu'à ce que la densité optique soit inférieure à 0,1. Le F. VIII, débarassé d'impuretés, est ensuite décroché du gel par le tampon 3. Les débits de lavage eut d'élution sont supérieurs, de 2 à 4 fois au débit d'absorption. Cryo extrait dans Cryo extrait dans Cryo extrait dans l'eau ppi (41/Kg) le tampon 1 (41,/Kg) l'eau ppi (41/Kg) I I I Absorptionsur Al(OH)3 Précipitation Absorption à à la glycine 2M sur Al(OH)3 v Précipitation Précipitation à pH 6,; et à 10 C au NaCl 1,5'A F F VIII dans tampon 1 Inactivation virale Chronotograpliie Chromotographie sur Q Sepharose Fast Flow prééquilibré dans tampon 1 Lavage du gel avec tampon 2 (environ S vol. de gel) Elution avec tarpon r (environ 1,5 vol. de gel) t Ultrafiltration Concentration * Cryo = cryoprécipité ** Eau ppi = eau pour préparations injectables. 3. TAMPONS Tapon i = Citrate trisodique 0,02M + ou - 0,005 pH 7,0 + ou - 0,4 Glycine 0,02M + ou - 0,01 NaCl 0,96M + ou - 0,01 CaCl2 0,0025M + ou - 0,0005 Tapon 2 = Tris 0,02M e ou - 0,005 pH 7,1 + ou - 0,2 Glycine 0,02M - ou - 0,01 NaCl 0,06M + ou - 0,01 CaCl2 0,05M + ou - 0,002 Tapon 3 = Tris 0,02M + ou - 0,005 pH 7,1 + ou - 0,2 Glycine 0,02M + ou - 0,01 NaCl 0,06M + ou - 0,01 CaCl2 0,02M + ou - 0,05 4.VOLUME DE GEL ET DEBITS F VII cryo F VII après F VII cryo et précipitation précipitation à pH 6,5 glycine, NaCl Volume de F VIII 4 - 6 8 - 12 1,5 - 2 Volume de gel Temps de contact du F VIII avec le gel = 100 minutes + ou - 20. Débits de lavage et d'élution = 2 - 4 X débit d'absorption. 5. RESULTATS DE LA PURIFICATION Activité spécifique avantchro,matographie = de l'ordre de 1 UI/mg de protéines Activité spécifique après chromatographie = 30 - 1600 tIZmg de protéines, en fonction de la qualité de la matière première. Le dosage protéique est réalisé selon la méthode de Bradford. 6. REALISATION INDUSTRIELLE Gel : Q Sepharose Fast Flow (201), Pharmacia. Colonne : KS37QA 37x1j avec entrées et sorties soit en 1/2" soit en 1/4", Pharmacia. Pompe : Serra R411, 4,20 mA avec entrée en 1/2" et sortie en 1/2" ou 1/4", Pharmacia. Facteur VIII déposé : 40 litres dans tampon 1 pH 7,0 + ou - 0,4 avec une concentration protéique jusqu'à 20 g'l. Débit de passage du F VIII : 27 1,/h. (Un temps de contact total, du F VIII sur le gel, de 90 mn est indispensable). Lavage du F VIII sur le gel : avec tampon 2 et un débit de 50 l,'h. Elution du F VIII : avec tampon 3 et un débit de 50 l'h. Après chaque utilisation le gel est lavé avec du NaCl 2M, du Na0H 0,2M, et de l'eau distillée, puis stocké soit dans le tampon 1 (pour des stockages courts) soit dans le tampon 1 à 20 r d'éthanol pour des durées de stpckages longues. L'invention permet l'obtention, à l'échelle industrielle d'un concentré antihémophilique A (facteur VIII) indiqué - pour le traitement de toutes les hémorragies de l'hémophile A, - dans l'hémophilie A sans ou avec inhibiteur anti-F VIII, et ceci avec une activité spécifique qui peut être très élevée et un rendement de l'ordre de 200 - 30Q unités par litre de plasma. REVENDICATIONS L'invention permet d'obtenir un concentré de facteur VIII ayant une activité spécifique et un rendement élevés, concentré exempt de protéines étrangères et d'origine non humaine. La méthode utilise les matières premières suivantes - extrait de F VIII préparé à partir du cryoprécipité après absorption sur hydroxyde d'aluminium (A1(OH)3). - extrait de F VIII préparé à partir du cryoprécipité après absorption sur hydroxyde d'aluminium (Al(OH)3) et précipitation du fibrino-gène à pH 6,5 et à 100 C. - extrait de F VIII préparé à partir du cryoprécipité après précipitation à la glycine 2 M et au chlorure de sodium (NaCl) 1,5 M. - facteur VIII obtenu par tout autre procédé. Le F VIII est déposé sur une colonne contenant un gel, échangeur anionique, de type Q Sepharose Fast Flow prééquilibré avec du tampon 1. Après avoir chargé le F VIII antihémophilique sur la colonne, le gel est lavé avec du tampon 2 et ce jusqu a ce que la densité optique soit inférieure à 0,1. Le F VIII, débarrassé d'impuretés; est ensuite décroché du gel par le tampon 3. Les débits de lavage et d'élution sont supérieurs, de 2 à 4 fois au débit d'absorption. Résultat de la purification - activité spécifique avant chromotographie = de l'ordre de 1 UI/mg de protéines. - activité spécifique après chromotographie = 30 - 1600 UI/mg de protéines, en fonction de la qualité de la matière première. Le dosage protéique est réalisé selon la méthode de Bradford.