Brevet FR2656330A1 — publié le 19910628

PROCEDE DE TRANSFORMATION DE SUBSTRATS ORGANIQUES PAR REACTIONS ENZYMATIQUES SEQUENTIELLES La présente invention a pour objet un procédé de transformation de substrats organiques dans un but analytique ou préparatif, à l'aide d'au moins deux enzymes immobilisés travaillant en séquence. Dans le domaine analytique il est connu d'utiliser des procédés à base de réactions enzymatiques séquentielles. Des enzymes immobilisés sur des matrices insolubles (membranes, cartouches, fibres gels, particules...) sont généralement mis en oeuvre afin de séparer plus facilement les produits réactionnels ; les enzymes immobilisés ont généralement une thermostabilité améliorée et peuvent souvent être réutilisés. La demanderesse a trouvé un procédé à base de réactions enzymatiques séquentielles dans lequel certains des enzymes immobilisés mis en oeuvre peuvent être sélectivement récupérés dans le milieu réactionnel hétérogène et dans lequel il est possible de stopper à tout moment la séquence enzymatique. Selon l'invention, il s'agit d'un procédé de transformation d'au moins un substrat organique par réactions enzymatiques séquentielles, caractérisé en ce que les enzymes mis en oeuvre pour effectuer les dites réactions sont immobilisés sur des particules de polymère non soluble dans le milieu réactionnel et en ce qu'au cours d'au moins une des réactions enzymatiques le ou les enzyme(s) mis en oeuvre pour la ou les séquence(s) est ou sont immobilisé(s) sur des particules de polymère magnétisable non soluble dans le milieu réactionnel. Comme exemple de substrats on peut citer tout particulièrement les métabolites (glucose, cholesterol, glycerol, creatinine...) et d'une manière générale les sucres, les alcools, les esters, les acide-alcools, les ami no-acides... susceptibles d'être transformés par réactions enzymatiques. Les polymères pouvant constituer les particules support magnétisables ou non magnétisables dérivent de monomères non miscibles à l'eau (c'est-à-dire de solubilité dans l'eau inférieure à 5 % en poids). Parmi ces monomères on peut citer - les monomères vinylaromatiques (styrène, vinyltoluène...) - les alkylesters d'acides a-g insaturés (acrylates et méthacrylates de méthyle,éthyle...) - les esters d'acides carboxyliques insaturés (acétate de vinyle...) - le chlorure de vinyle ; le chlorure de vinylidène - les diènes (butadiène...) - ceux présentant des fonctions nitriles (acrylonitrile...) - les siloxanes. La composition monomère dont dérive ledit polymère contient en outre jusqu'à 10 % de son poids (de préférence jusqu'à 4 % de son poids) d'au moins un monomère portant des groupes ionogènes ou réactifs tels que - S03H, - OS03H, - NR3, - COOH, - OH, - NH2, - NR2, - CH2Cl, CONH2, - SH, - - COOR, - PO(OR)2, R représentant un radical alkyle en C1 - C4, de préférence en C1 - C2 A titrejd'exemple on peut citer - le vinylbenzène sulfonate, les sulfoalkylesters d'acides insaturés (2-sulfoéthylméthacrylate...) - les acides carboxyliques insaturés (acide acrylique, méthacrylique, maléfique, itaconique...) - les hydroxyalkylacrylates ou méthacrylates (acrylate d'hydroxyéthyle, hydroxypropyle...) - les aminoalkylesters d'acides insaturés (2-aminoéthylméthacrylate...) - l'acrylamide - le chlorure de vinylbenzyle - le méthacrylate de glycidyle. Lesdites particules de polymère peuvent représenter une granulométrie de l'ordre de 0,01 à 20 microns et de préférence de l'ordre de 0,1 à 3 microns. Les particules de polymère magnétisable contiennent de 0,5 à 70 % en poids (de préférence de 5 à 50 %) d'une charge magnétique dont la taille est inférieure à 1 wn et de préférence comprise entre 0,002-0,02 pin ; la charge magnétique est bien évidemment suffisamment fine pour pouvoir être incluse dans les particules de polymère. Cette charge magnétique peut être constituée par exemple par - des métaux ou leurs alliages tels que : fer, fer-silicium, nickel, cobalt, samarium ou leurs alliages avec du molybdène, du chrome, du cuivre, du vanadium, du manganèse, de l'aluminium, du titane, neodyme.... - des oxydes de fer : Fe304 ou y-Fe203 pur ou en combinaison ou en mélange avec d'autre oxydes comme les oxydes de cobalt, manganèse, zinc, baryum, terres rares - du dioxyde de chrome. Les particules de polymère magnétisable peuvent être obtenues sous forme de latex selon des procédés connus par exemple selon les procédés décrits dans le brevet européen ne 38.730 ou le brevet américain n 4.157.323. La nature des enzymes travaillant en séquence selon le procédé de l'invention est bien entendu fonction du substrat à transformer et du type de transformation recherché. L'immobilisation des enzymes sur les particules de polymère magnétisable ou non magnétisable peut être réalisée par couplage, la réaction de couplage faisant intervenir les groupes superficiels réactifs ou fonctionnels du polymère et les groupements fonctionnels de l'enzyme à fixer. La réaction de couplage peut être réalisée selon des méthodes variées et connues par exemple en faisant appel le plus souvent à l'activation des fonctions du polymère en utilisant des agents de couplage (diazotation, bromure de cyanogène, chlorure de tosyle, glutaraldehyde, carbodiimide hydrosoluble, N-hydroxybenzotriazole...) avec ou sans l'utilisation de spacers du type 1-6 di ami nohéxane, polysaccharide..., puis réaction avec l'enzyme à fixer. Des exemples de réactions de couplage sont donnés dans les brevets américains n 3.857.931, 4.045.384, 4.140.662, 4.046.723, 4.421.896, anglais n 2.004.892, français n" 2.331.567, 2.345.459, 2.378.094, européen n" 15.841... Le protocole d'immobilisation doit être adapté en fonction des caractéristiques propres de l'enzyme utilisé (pH optimum, activité spécifique...). La quantité d'enzyme immobilisée sur les particules de polymère est généralement de l'ordre de 10 à 500 unités d'enzyme par gramme de polymère (de préférence 100 à 200). Le procédé faisant l'objet de l'invention peut être utilisé à titre analytique ou à but préparatif. Ainsi à titre d'exemple ledit procédé peut être mis en oeuvre pour - le dosage du maltose Le maltose est hydrolysé en glucose à l'aide de glucoamylase (GA) immobilisé sur des particules de polymère non magnétisable. Maltose + H2O GA 2 glucose Le glucose est ensuite oxydé en acide D-gluconique à l'aide de glucose oxydase (GOD) immobilisée sur des particules de polymère magnétisable. 8 - D-glucose + 2 GOD) Acide D-gluconique + H2O2 La quantité de H2O2 formée est proportionnelle à la concentration de maltose. Un aimant plongé dans la cuve réactionnelle au cours de la deuxième expérience permet de retirer la GOD interrompant ainsi la séquence qui peut être reprise à tout moment en injectant à nouveau la GOD immobilisée. - le dosage total du cholesterol (libre et estérifié) La mise en oeuvre de cholesterol oxydase immobilisée sur des particules de polymère permet de doser le cholesterol libre en suivant la formation de H2O2 qui est proportionnelle à la quantité de cholesterol libre. Le cholesterol estérifié est ensuite transformé en acide gras et cholesterol libre à l'aide de cholesterol esterase immobilisée sur des particules de polymère magnétisable. Un capteur de H202 permet de suivre en continu la transformation du cholesterol libre. La mesure des deux types de cholesterol peut donc être réalisée par différence. Des dosages successifs peuvent être réalisés en retirant l'enzyme immobilisé sur des particules de polymère magnétisable et en les réinjectant dans le milieu. Des dosages plus complexes peuvent être réalisés, comme la mesure d'activité enzymatique des transaminases par exemple (GOT, GPT...). 1) L-aspartate + a-cetoglutarate g oxaloacetate + L-glutamate 2) L-alanine + a-cetoglutarate GPT, pyruvate + L-glutamate 3) oxaloacetate OAC > CO2 + pyruvate 4) pyruvate + 2 + phosphate POP~ acetylphosphate + CO2 + H2O2 Les abréviations ont la signification suivante : GOT : glutamate oxaloacetate transaminase GPT : glutamate pyruvate transaminase OAC : oxaloacetate décarboxylase POP : pyruvate oxydase Dans le domaine préparatif le procédé de l'invention peut être utilisé par exemple - pour hydrolyser les polymères du glucose (amidon, amyloses, amylopectines) par exemple à l'aide d'une amylase ou d'une glucosidase immobilisée sur les particules de polymère non magnétisable ; on obtient ainsi selon le substrat et/ou l'enzyme utilisé, des milieux plus ou moins riches en a dextrines limites, maltotriose, maltose ou glucose. L'addition de glucose isomerase immobilisée sur des particules de polymère magnétisable conduit alors à la formation de sirop de glucose partiellement ou complètement isomerisé en fructose ; la présence de particules magnétisables permet de moduler le temps d'action de la glucose isomerase et ainsi d'obtenir un sirop de glucose contenant le taux souhaité de fructose. - pour la préparation d'acides aminés (lysine, proline...) par hydrolyse spécifique (entre deux acides aminés) de peptides à l'aide de protéases (chymotrypsine, trypsine, pepsine, papaïne, rennine...) immobilisée sur des particules de polymère non magnétisable, puis transformation en lysine, proline... à l'aide d'une peptidase choisie (carboxypeptidase, iminopeptidase...) immobilisée sur des particules de polymère magnétisable. L'exemple suivant est donné à titre indicatif et ne peut être considéré comme une limite du domaine et de l'esprit de l'invention. EXEMPLE Réactifs utilisés - G.A : glucoamylase (E.C. 3.2.1.3 d'Aspergillus niger) de BOEHRINGER - G.O.D : glucose oxydase (E.C. 3.2.1.3 d'Aspergillus niger) de BOEHRINGER - E.D.C : 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide HCl de MERCK (réactif de couplage) - ESTAPOR K1 - 080 : latex calibré de microsphères de polystyrène carboxylé présentant 5 microeq/g fonctions -COOH, un diamètre de 0,9 micron avec un extrait sec de 10 % en poids, de RHONE-POULENC - ESTAPOR M1 - 070/60 : latex de microsphères de polystyrène carboxylé magnétisable présentant environ 170 microeq/g fonctions -COOH, environ 58 % en poids d'oxyde de fer, un diamètre d'environ 1 micron, avec un extrait sec de 10 % en poids, de RHONE-POULENC. Immobilisation de la G.A. 1 ml de latex ESTAPOR K1 - 080 est centrifugé pendant 10 minutes. Le culot obtenu est lavé 4 fois à l'aide d'un tampon acetate 0,1 M de pH 5,5 et contenant 5 % en volume de glycerol. Au dernier culot on ajoute 2 ml de tampon acetate et 2 ml de E.D.C 40 mM. L'ensemble est incubé pendant 2 H 30 sous agitation à la température ambiante. Les particules sont à nouveau lavées 4 fois à l'aide d'un tampon acetate. Au dernier culot on ajoute 3 ml de solution de G.A contenant 3000 unités/ml dans un tampon acetate à pH 4,5 ; l'ensemble est incubé pendant une nuit à température ambiante. Les particules sont ensuite lavées en tampon acétate contenant du KCl 0,5 M, puis 0,1 M pour éliminer l'enzyme simplement adsorbé. La suspension finale de l'enzyme immobilisé est réalisée en ajoutant au dernier culot 5 ml de tampon acetate de pH 5,5, additionné de 0,01 % en poids de NaN3. Immobilisation de la G.O.D. L'immobilisation est réalisée en suivant le même protocole que ci-dessus à partir - de 2 ml de latex ESTAPOR M1 -070/60 - de 3 ml de solution de G.O.D contenant de 40 à 50 unités/ml. - tampon acetate 0,1 M pH 5,5 L'ensemble est incubé pendant 1 H 30 au lieu d'une nuit. Réactions enzvmatiaues séquentielles Dans une cuve thermostatée (30) équipée d'un agitateur à hélice non magnétique et d'un capteur ampérométrique à H2O2 relié à un enregistreur, on introduit 10 ml de maltose 0,5 M dans du tampon acetate 0,1 M de pH 5,5 contenant du KCl 0,1 M et 0,01 % en poids de NaN3. On ajoute 400 microlitres de suspension G.A immobilisée. Au bout de 2 à 3 minutes le courant de fond est stabilisé. On ajoute alors 400 microlitres de suspension de G.O.D immobilisée (le glucose issu de la transformation du maltose par la G.A. est hydrolysé par la G.O.D. pour former H202) L'eau oxygénée formée est oxydée directement électrochimiquement au niveau de l'anode du capteur ampérométrique, créant une variation de courant anodique ; on enregistre une pente au niveau de l'enregistreur prouvant que la séquence enzymatique fonctionne. On a constaté que l'on pouvait retirer sélectivement les particules de GOD (magnétisable) en introduisant un aimant dans la cuve réactionnelle. On observe alors un plateau traduisant l'arrêt de la séquence enzymatique (la production de H2O2 est stoppée). Si l'on injecte à nouveau la même quantité de GOD immobilisée sur des particules magnétiques, la séquence enzymatique reprend. On observe au niveau de l'enregistreur la même pente que précédemment, ce qui prouve que la production de H2O2 a repris avec la même vitesse. REVENDICATIONS 1) Procédé de transformation d'au moins un substrat organique par réactions enzymatiques séquentielles, caractérisé en ce que les enzymes mis en oeuvre pour effectuer les dites réactions sont immobilisés sur des particules de polymère non soluble dans le milieu réactionnel et en ce qu'au cours d'au moins une des réactions enzymatiques le ou les enzyme(s) mis en oeuvre pour la ou les séquence(s) est ou sont immobilisé(s) sur des particules de polymère magnétisable non soluble dans le milieu réactionnel. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les substrats sont des sucres, des alcools, des esters, des acide-alcools, des amino-acides susceptibles d'être transformés par réactions enzymatiques. 3) Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les substrats organiques sont des métabolites. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les particules de polymère sur lesquelles sont immobilisés les enzymes dérivent d'une composition monomère non miscible à l'eau contenant jusqu'à 10 % de son poids d'au moins un monomère portant des groupes ionogènes ou réactifs. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les particules de polymère magnétisable non soluble dans le milieu réactionnel contiennent jusqu'à 10 % de leur poids de charges magnétisables. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les particules de polymère présentent une granulométrie de l'ordre de 0,01 à 20 microns. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la quantité d'enzyme immobilisé sur les particules de polymère est de l'ordre de 10 à 500 unités d'enzyme par gramme de polymère. 8) Utilisation du procédé faisant l'objet de l'une quelconques des revendications précédentes dans un but analytique. 9) Utilisation du procédé faisant l'objet de l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans un but préparatif.