Brevet FR2655054A1 — publié le 19910531

La présente invention concerne des agents de protection de cellules, et en particulier des agents de protection de cellules qui contiennent des curcuminoides dérivés de Curcuma longa L.. Les agents de protection des cellules ont une activité de protection de La membrane cellulaire et peuvent etre utilisés avantageusement comme matières cosmétiques. Il est connu que les espèces chimiques à oxygène actif provoquent un endommagement des cellules, des mutations, des cancers, et un vieillissement en participant à la peroxydation des lipides, à la dégradation des protéines et à l'altération des acides nucléiques (Leibovitz, B.E. et Siegel, B.W. (1980), J. Gerontol., 35 ; 45 ; Foote, C.S. (1982), "Pathology of Oxygen" (A.P. Autor, éd), Academic Press, N.Y., 21 ; Straight, R.C. et Spikes, J.D. (1985), "Singlet Oxygen, Vol IV, Reaction Modes and Product, Part 2" (Frimer, A.A. éd.)). Les espèces chimiques à oxygène actif peuvent comprendre L'oxygène singulet, le radical hydroxyle, le radical anion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène etc., et des recherches poussées sur des produits chimiques ou des enzymes permettant de les inactiver ou de les piéger sont en cours. Il a déjà été signalé que le -carotène (Foote, C.S. et Denny, (1968), J. Am. Chem. Soc., 90 ; 6233) ou I'a-tocophérol (Fahrenholtz, S.R. et Doleiden, F.H. (1974), photochemistry and photobiology, 20 ; 505-509) présente une activité d'inactivation efficace contre L'oxygène singulet, ce qui a une grande importance biologique dans les cellules de la peau qui ont fréquemment l'occasion d'être exposees à la lumière solaire. Comme agent de piégeage pour le radical hydroxyle qui est connu pour être le plus réactif parmi les espèces à oxygène actif, on peut citer par exemple le mannitol (martien, J.P. et Logsdon, N. (1987), J. Biol. Chem. 262, 15 ; 7213-7219), le tryptophane, Le formiate, le t-butanol, l'éthanol (Bors, W. et Michel, C. (1977) Eur. J. Biochem., 95 ; 621-627) etc. A ltheure actuelle, des études poussées sur la superoxyde dismutase, une enzyme de l'organisme vivant transformant le radical anion superoxyde en peroxyde d'hydrogène, sur la catalase, une enzyme de l'organisme vivant décomposant le peroxyde d'hydrogène en eau et oxygène et sur la glutathion peroxydase sont en cours en relation avec le vieillissement (Hans Nohl et Dietmar Hegner (1979), Mechanisms of Ageing and Development, II ; 145-151). En outre, Les curcuminoides de Curcuma longea L. peuvent comprendre la curcumine, le 4-hydroxy cinnamoyl (feruloyl) méthane (désignés parfois ci-après par "HCFM"), le bis (4-hydroxy cinnamoyl) méthane (parfois désigné ci-après par "BHCM") etc., et ils sont utilisés comme pigments comestibles en raison de leur haute sécurité biologique. Récemment, leur activité anti-oxydante (shizuo Toda, Toshio Miyase, Hideko Arichi, Hisayuki Tanizawa et Yoshio Tokino (1985), Chem.. Pharm. Bull. 33(4) ; 1725-1728) et leur activité anti-inflammatoire (Srimal, R.C. et B.N. Dhawan (1973), J. of pharm. pharmc., 25 ; 447-452) ont été signales. Jusqu'à présent, cependant, on n'a effectué aucune recherche et aucun développement sur les agents de protection des cellules contre les espèces à oxygène actif contenant des curcuminoides, car la réaction biochimique provenant des espèces à oxygène actif n'est pas complètement élucidée, et par conséquent, les études sur les inhibiteurs de ces espèces sont limitées au ss-carotène, à I 'a-tocophérol qui reagissent photochimiquement et directement avec elles. En outre, on considère que le fait qu'aucun procédé expérimental quantitatif et biochimiquement-biologiquement significatif pour déterminer L'activité de protection des cellules des curcuminoides n'a été établi dans la pratique, contribue à cet état de choses. La demanderesse est partie de l'idée que l'activité anti-oxydante des curcuminoides refléterait leur reaction physicochimique directe avec les espèces à oxygène actif et que leur activité anti-inflammatoire résulterait de leur participation à la reaction biochi mique provenant des espèces à oxygène actif, et elle a mis au point des agents de protection des cellules contre les espèces à oxygène actif contenant des curcuminoides en utilisant le procédé de mesure de l'activité de protection des cellules mis au point par elle dans le brevet nO 90.00935, accomplissant ainsi la présente invention. Par conséquent, Le but de la présente invention est de fournir pour la première fois des agents de protection des cellules contre les espèces à oxygène actif contenant des curcuminoides. Un autre but de la présente invention est d'identifier L'excellent effet de protection des cellules des curcuminoides en comparant leur activité à celle d'autres agents de protection des cellules connus au moyen du procédé ci-dessus. Un autre but de la présente invention est de fournir des agents de protection des cellules plus efficaces en découvrant une synergie qui puisse augmenter l'activité de protection des cellules des curcumi noides. L'expérience importante du point de vue biochimique-biologique de photohémolyse des erythrocytes publiee par la demanderesse dans le brevet nO 90.00935 a été utilisée pour mesurer quantitativement L'activité de protection des cellules des curcuminoides contre les espèces à oxygène actif. A la suite de ces études, la demanderesse a trouvé que des curcuminoides tels que la curcumine, le 4-hydroxy cinnamoyl (feruloyl) méthane, le bis (4-hydroxy cinnamoyl) methane etc., ont une forte activité de protection des cellules vis-à-vis des espèces à oxygène actif nuisibles. La demanderesse a trouvé que cette très forte activité de protection des cellules des curcumi nos'des pouvait être attribuée au fait qu'une réaction biochimique secondaire autre que la réaction d'altération physicochimique directe par les espèces à oxygène actif entrait en jeu dans la photohémolyse des érythrocytes et que les curcuminoides, non seulement réagissent directement par voie physicochimique avec les espèces à oxygène actif, mais encore jouent un râLe important dans la réaction biochimique secondaire. Il est également considéré que la forte activité de protection des cellules des curcuminoides contre les espèces à oxygène actif nuisibles est en relation étroite avec leur activité anti-inflammatoire. En outre, la demanderesse s'attend à ce que l'activité de protection des cellules des curcuminoides contre les espèces à oxygène actif nuisibles soit fortement augmentée par l'addition d'acide ascorbique ou de superoxyde dismutase. La demanderesse a examiné l'effet synergique de l'acide ascorbique ou de la superoxyde dismutase dans l'activite de protection des cellules des curcumino,des en suivant la méthode expérimentale décrite dans l'exemple 1, et elle a obtenu les résultats figurant dans le tableau 1. Tableau 1 Activité de protection des cellules de curcuminoïdes, de L'acide ascorbique (AA) ou deLa suneroxyde dis.uta- se (SOD) ou de mélanges de ceux-ci. Echantillon Temps nécessaire pour que et concentration finale 50Z de 6x107 érythrocytes soient Lyses par L'oxygène actif (min) curcumine 25uM 55 AA 100 M 32 curcumine 25pM + AA 100 M 102 BHCM 25 M 62 BHCM 25 M + SOD 50ug/ml 72 HCFM 25pM 72 HCFM 25pM + SOD 50ug/ml 85 SOD 50pg/ml 32 SOD 100 g/ml 32 curcumine 25pM + SOD 100ug/ml 70 témoin 32 Comme le montre le tableau 1, les activités de protection des cellules contre les espèces à oxygène actif ont été augmentées d'une manière significative par l'addition d'acide ascorbique ou de superoxyde dismutase dans une quantité de 100 M ou de 50-100 g/ml respectivement à 25pM de curcuminoides. On a trouvé que l'acide ascorbique protégeait synergiquement les cellules en inhibant l'oxydation de la curcumine. La superoxyde dismutase est une enzyme qui est présente dans le cytoplasme ou les mitochondries des organismes et qui élimine l'oxygène actif 02- nuisible en protégeant les cellules contre l'altération par oxydation. On considère que dans les agents protecteurs des cellules contenant les curcuminoides et la superoxyde dismutase conformes à L'invention, les curcuminoides protégeraient les cellules en transformant L'oxygène actif '02 nuisible en 02 moins nuisible, et qu'ensuite la superoxyde dismutase élimi- nerait le 2-* protégeant ainsi synergiquement les cellules. Dans la présente invention, les concentrations des curcuminoides dans les agents de protection des cellules ne sont pas déterminantes. Lorsque L'agent contient le curcuminoide, plus de la superoxyde dismutase et/ou de l'acide ascorbique, leurs proportions, bien que n'étant pas particulièrement limitées, sont par exemple telles que 89 de la superoxyde dismutase ou 2,89 (16,Ommol) d'acide ascorbique sont dissous dans 1,01 d'eau et que l'on y ajoute une solution de 1,489 (4,0mmol) de curcumine, 1,86g (4,0mmol) de HCFM ou 1,249 (4,0mmol) de BHCM dans 20ml d'éthanol. La présente invention sera décrite d'une manière plus détaillée en se basant sur les exemples suivants. Exemple 1. Mesure de l'activité de protection des cellules des curcuminoides contre les espèces à oxygène actif. 1) Preparation des échantillons. On dissout un curcuminoide ou un composé phénolique choisi parmi la curcumine, le 4-hydroxy cinnamoyl (feruloyl) méthane (HCFM), le bis(4-hydroxy cinnamoyl) méthane (BHCM), l'acide cinnamique, l'acide paracoumarique, l'acide férulique, l'acide sinapique, l'acide chlorogénique, l'acide cafeique, le gallate de propyle, L'azine de la vanilline, la capsaicine, la braziline, lthematoxyline ou le triphénylphénol, ou l't-tocophérol en tant qu'antioxydants connus dans une quantité de 4mmol chacun dans 1,0 I L'méthanol pour obtenir des échantillons. 2) Mesure. On centrifuge le sang d'un lapin à 8000 t/min pendant 5 min et on le lave pour obtenir des érythrocytes que l'on dilue avec du sérum physiologique pour préparer la suspension d'érythrocytes (6x107 érythrocytes / 3,5ml). On prépare 6 tubes à essai de Pyrex de 10ml de 1,0cm de diamètre et on introduit dans chacun 3,5ml de la suspension. On prend 3 des 6 tubes à essai comme groupe témoin et on y ajoute respectivement SOIJI d'éthanol. On prend les 3 tubes à essai restant comme groupe d'essai, et on y ajoute respectivement SOUL d'échantillon, puis on les fait préincuber à l'obscurité pendant 30min.Lorsque la préincubation est terminée, on y ajoute 0,5ml d'une solution aqueuse de rose bengale (12 M) comme photo sensibilisant et on scelle les ouvertures de chacun des tubes à essai avec un film revêtu de paraffine. Dans une boite hexahédrique rectangulaire de 50x20x25cm dont l';nté- rieur a été peint dans une couleur foncée, et équipée d'une lampe fluorescente de 20W, on dispose les tubes à essai en un point distant de 5cm de la lampe et on les irradie pendant 15min. Le but de l'addition de photosensibilisant et de l'irradiation est de produire des espèces à oxygène actif. Lorsque l'irradiation est terminée, on mesure La transmittance de chaque tube à essai à 700nm à des intervalles de 15min à l'obscurité. L'aug mentation de la transmittance de ta suspension d'érythrocytes à cette longueur d'onde est proportionnelle au degré d'hémolyse des érythrocytes. Chacun des stades de l'expérience ci-dessus a été effectué dans une salle à température constante de 270C. L'activité de protection des cellules contre les espèces à oxygène actif de l'échantillon a été définie comme le temps de demi-hémolyse (min), c'est-à-dire le temps nécessaire pour que 50% des érythrocytes ajoutés dans les conditions de mesure ci-dessus soient photohémolysés. 3) Résultats. Les résultats sont donnés dans le tableau 2, qui montre que des curcuminoides comme la curcumine, le HCFM, le BHCM présentent une excellente activité de protection des cellules. Tableau 2 Effet de protection des cellules des curcuminoïdes et des composés phénoliques contre Les espèces â oxygène actif. Echantillon Temps de demi-hémolyse demi-hémolyse (min) curcuminoides curcuma ne 145 HCFM 240 BHCM 180 acide cinnamique 32 acide paracoumarique 32 acide férulique 32 acide sinapique 32 acide chlorogénique 32 acide caféique 32 gallate de propyle 34 azine de la vanilline 48 capsa i c i ne 65 brai linge 57 hematoxyline 98 triphénylphénol 120 a-tocophérol 45 témoin 32 * Concentration finale des échantillons : 50 M. ExeipLe 2. Effet synergique de L'acide ascorbique et/ou de la superoxyde dismutase sur L'activité de protection des cellules des curcuminoides. Pour examiner l'effet synergique de L'acide ascorbique et/ou de la superoxyde dismutase sur L'actif vité de protection des cellules des curcuminoides, on a effectué les mêmes expériences que dans l'exemple 1 en utilisant les divers échantillons indiques dans le tableau 3. Les résultats sont donnés dans le tableau 3, qui montre que les agents de protection des cellules contenant les curcuminoides en même temps que de l'acide ascorbique et/ou de la superoxyde dismutase conformes à l'invention ont un effet de protection des cellules contre les espèces à oxygène actif plus élevé que l'agent de protection des cellules connu, l'a-tocophérol Tableau 3 Effet synergique de L'acide ascorbique (AA) et/ou de La superoxyde disiutase (SOD) sur L'activité de protection des ceLLuLes des curcuminoides. Echantillon et concentration finale Temps de demi-hémoly se (min) curcumine (50 M) + SOD (350 UI/ml) > 300 HCFM (5OM) + AA(0,2mM) > 300 BHCM (50 M) + SOD (350 UI/ml) + AA (0,2mM) > 300 curcumine (50 M) 145 HCFM (50 M) 240 BHCM (50uM) 180 SOD (350 UI/ml) 32 AA(0,2mM) 32 a-tocophérol (50 M) 45 témoin 32 REVENDICATIONS. 1. Agent de protection des cellules contre les espèces à oxygène actif, caractérisé en ce qu'il comprend un curcuminoide obtenu à partir de Curcuma Longa L.. 2. Agent de protection des cellules suivant La revendication 1, caractérisé en ce que le curcuminoide est choisi parmi la curcumine, le 4-hydroxy cinnamoyl (féruloyl) méthane et le bis(4-hydroxy cinnamoyl)méthane. 3. Agent de protection des cellules contre les espèces à oxygène actif, caractérisé en ce qu'il comprend un curcuminoide obtenu à partir de Curcuma longa L., de L'acide ascorbique et/ou de la superoxyde di smutase.