Brevet FR2655659A1 — publié le 19910614

L'invention a pour objet un procédé propre à inhiber la croissance des microorganismes dans un milieu de culture avant son utilisation. Elle vise également le milieu de culture obtenu par le susdit procédé ainsi que l'application de ce milieu à la culture des bifidobactéries. Par l'expression milieu de culture, on désigne toute composition organique et minérale apte à supporter une croissance microbienne; ladite composition peut être naturelle et d'origine animale telle que le lait, ou d'origine végétale telle que les végétaux éventuellement broyés; elle peut également être semi-synthétique telle que les milieux de culture tant solides que liquides classiquement utilisés pour la prolifération ou l'isolement de microorganismes. Il est souvent intéressant de pouvoir éviter la prolifération incontrôlée des microorganismes présents dans un milieu de culture avant l'utilisation de ce milieu. L'invention a pour but, surtout, de fournir une solution à ce problème. Or, l'inventeur a trouvé que, de façon surprenante et inattendue, ce but pouvait être atteint en faisant comporter au milieu de culture en question une proportion efficace d'acide propionique et en amenant son pH à une valeur suffisamment acide. En conséquence, le procédé propre a inhiber la croissance des microorganismes dans un milieu de culture avant son utilisation est caractérisé par le fait que l'on amène son pH à une valeur comprise entre 4,5 et 5,5 et que l'on lui fait comporter une proportion de 0,5 à 200/o o, de préférence de 2 à 150/o o d'acide propionique. Le milieu de culture conforme à l'invention est caractérisé par le fait qu'il présente un pH de 4,5 à 5,5, de préférence voisin de 5 et qu'il comporte une quantité de 0,5 à 200/o o, de préférence de 2 à 150/o o d'acide propionique. Dans le cas général, le milieu de culture conforme à l'invention peut être traité par une base pour neutraliser l'acide propionique, ce grâce a quoi il devient applicable à toute culture de microorganisme normalement inhibé par l'acide propionique. L'inventeur a également eu le mérite de trouver que, de façon tout à fait inattendue, le milieu de culture conforme à l'invention favorisait la croissance des bifidobactéries. L'invention a donc également pour objet un procédé de culture de bifidobactéries caractérisé par le fait que lton a recours au susdit milieu de culture. Cette application du milieu de culture conforme à l'invention revêt un intérêt particulier. En effet, il est connu que les bifidobactéries sont des microorganismes dont l'habitat naturel est l'intestin des vertébrés. Elles ont un rôle extrêmement important dans le maintien de la santé humaine et animale car leur prolifération empêche, au niveau de l'intestin, le développement de microorganismes produisant des substances nuisibles telles que les amines, l'ammoniaque, l'hydrogène sulfuré. Elles ont un effet d'inhibition sur la putréfaction provoquée par les bactéries putréfiantes et un effet d'inhibition du développement des bactéries pathogènes. Elles sont en outre capables de synthétiser de nombreuses vitamines appartenant essentiellement au groupe B, vitamines dont l'apport quotidien est nécessaire å la santé. En raison de l'importance industrielle de ces bactéries, de nombreuses tentatives ont déjà été faites pour mettre au point des milieux de culture qui favorisent leur croissance. On sait par exemple que certains sucres ou oligosaccharides tels que le lactulose, le lactitol (brevet français 1.317.216), les cyclodextrines ou polymères cycliques du glucose (brevet français 2.499.854), les sucres ramifiés tels que l'isomaltose, le panose, l'isomaltotriose (brevet US 4.782.045) ou encore les fructooligosaccharides tels que le kestose, le nystose (brevets Japon 81/154967 et 84/53834) favorisent la croissance des bifidobactéries parce qu'ils ne sont pas utilisables par d'autres bactéries et qu'ils le sont par celles-ci. D'autres substances, dérivées du N-acyl lactame, ont également les mêmes propriétés (brevets Japon 63/79586 et 61/224984). Certains extraits microbiens ou végétaux ont également été reconnus comme contenant des facteurs de croissance non identifiés favorisant la prolifération des bifidobactéries. On a également utilisé, pour sélectionner et isoler des bifidobactéries, des milieux de culture contenant des antibiotiques et du chlorure de lithium (Jap. Journal of bacteriology, 1978, 33, 6, p. 753-761). Ces milieux, s'ils se sont montrés capables d'inhiber la croissance des lactobacilles et de certains streptocoques, ne sont toutefois pas aptes à prévenir la croissance des entérobactéries. Tous ces milieux de culture permettant d'améliorer la croissance des bifidobactéries présentent de nombreux inconvénients: d'une part, ils font appel à des substances rares et chères, parfois toxiques, d'autre part, et surtout, s'ils montrent vis-à-vis de quelques espèces de bifidobactéries une certaine électivité en ce qu'ils permettent d'obtenir une croissance de ces espèces de bifido bactéries supérieure à celle que permettent d'obtenir les milieux traditionnels, ils ne se montrent toutefois pas suffisamment sélectifs vis-à-vis des bactéries n'appartenant pas au groupe des bifidobactéries. Le fait d'avoir trouvé que, grâce au milieu conforme à l'invention, il devenait possible de remédier à ces inconvénients, ledit milieu de culture permettant une croissance rapide et abondante des bifidobactéries tout en inhibant la croissance des autres microorganismes éventuellement présents, même dans des conditions non stériles, revêt une importance économique indéniable. Les cultures pures de bifidobactéries obtenues par le procédé conforme à l'invention peuvent être ensuite utilisées soit pour être ingérées, soit pour servir de levain pour des produits fermentés tels que les ensilages, le yaourt, et autres. L'invention pourra être encore mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs qui suivent et dans lesquels sont décrits des modes de réalisation avantageux. EXEMPLE 1 Sélectivité du milieu de culture selon l'invention. On a utilisé, pour démontrer les propriétés de sélectivité du milieu de culture selon l'invention, le milieu de base connu sous l'appellation COLUMBIA gélosé fabriqué par PASTEUR Production (code 64/677) et additionné de 50/o o de glucose monohydrate de marque ROFEROSER commercialisé par la Société Demanderesse et de O,50/oo de chlorhydrate de cystéine. Ce milieu présente un pH de 7,3. Ce milieu est désigné par A; on le coule en boites de Petri à raison de 15 ml par boite. Dans une deuxième série d'expérimentations, le pH du milieu A a été ajusté à une valeur de 5,0 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique; le milieu obtenu est désigné par B; il a été coulé en boites de Petri à raison également de 15 ml par boite. Dans une troisième série d'expérimentations, le milieu A a été additionné de 50/o o d'acide propionique et son pH a été ajusté à 7,0 par une solution de soude; on obtient ainsi un milieu désigné par C qui est coulé en boites de Petri à raison de 15 ml par boite. Dans une quatrième série d'expérimentations, le milieu A a été additionné de 50/o o d'acide propionique et son pH a été ajusté à 5 par de la soude formant ainsi un milieu désigné par D; ce milieu est coulé en boites de Petri à raison de 15 ml par boite; il constitue un milieu de culture conforme à l'invention. Les quatre susdits milieux ont été ensemencés en surface avec différentes souches de microorganismes identifiées dans le tableau I et apportées sous la forme de 1 ml de culture d'une concentration de 107 à 108 microorganismes par ml. Certaines séries des susdites boites de Petri comportant les milieux A à D ont été ensemencées selon le principe de la dilution logarithmique, ce qui a permis, dans le cas des bifidobactéries, de calculer la concentration exacte de la culture de départ en microorganismes revivifiables sur ces milieux. Toutes les boites ont été incubées pendant 72 heures à 37"C en anaérobiose obtenue en jarre par le procédé GASPAK. TABLEAU I Concentration en bactéries Microorganisme revivifiables après 72 h a 370c teste pour les milieux de culture A B C n E. Coli + + + + + O E. Faecalis + + + + + 0 S. Aureus + + + + + O Lact. Acidophilus * + + + + Propionibacterium + + + + + 0 Listeria + + + + + O Streptococcus + + + + + 0 Acinetobater + + + + + 0 Entérobactéries + + + + + O (35 souches) Levures et moisissures (20 souches) + + + + + O B. Longum a) 9,6.106 1 3.106 ATCC 15707 b) 1,4.108 5,6.107 c) 2,9.106 4,3.106 9,2.107 B. Animalis a) 3,4.106 4,3.106 ATCC 25527 b) 9,6.106 1,3.106 4,3.106 B. Adolescentis 7,6.107 3.108 3.108 ATCC 15703 B. Infantis 5,4.103 5.103 ATCC 15697 B. Pseudolongum 3,0.105 5,7.105 ATCC 25526 B. Breve a) 2,9.108 9,2.107 6,7.10 ATCC 15700 b) 9.107 6,7.107 9.W7 Signification de certains symboles dans le susdit tableau: B. = Bifidobacterium + + = supérieur à 107 bactéries + = supérieur à 106 bactéries 0 = 0 bactérie. De ces essais comparatifs, il ressort clairement que l'addition de 5 /oo d'acide propionique conjuguée à l'ajustement du pH à 5,0 pour le milieu COLUMBIA confère à celui-ci une sélectivité évidente pour les bifidobactéries puisqu'aucune autre espèce de microorganisme n'a été capable de s'y développer. Le même type d'essais réalisés avec un milieu de base WILKIN WEST et BRAIN HEART dont la composition est indiquée ci-dessous, a donné des résultats tout à fait similaires. Composition du WILKIN WEST (WW): tryptone 10 g peptone de gélatine (BioMérieux) 10 g extrait de levure (Pasteur Production) 5 g glucose 3 g chlorhydrate d'arginine 5 g pyruvate de sodium 5 g NaHCO3 1 g chlorhydrate de cystéine 0,5 g Tween 80 (solution à 5%) 5 ml hémine (solution aqueuse à 0,050 g pour 100) 10 ml vitamine K3 (sol. aqueuse à 0,050 g pour 100) 10 ml eau distillée 1000 ml pH : 7,2. Bouillon coeur cervelle ou Brain Heart (BH) (BioMérieux) supplémenté par: extrait de levure 5 g pour 1000 chlorhydrate de cystéine 0,5 g pour 1000 pH : 7,2. Les propriétés de sélectivité du milieu de culture selon l'invention ont également été démontrées pour des concentrations d'acide propionique de 10 /o o et ce, toujours en association avec un pH voisin de 5,0: milieu E (voir tableau II). TABLEAU II Concentration en microorganismes Microorganisme des milieux de culture A E B. Pseudolongum 4,0.107 1,7.10 ATCC 25526 B. Infantis ATCC 15697 5,0.106 1,0.106 B. Longum ATCC 15707 5,4.106 1,2.106 B. Animalis ATCC 25527 3,7.107 8,5.106 EXEMPLE 2 Electivité du milieu de culture selon l'invention. Les essais ont à la fois été réalisés sur milieu liquide constitué par une base TPY (dont la composition est la suivante: trypticase 10 g phytone 5 g glucose 5 g extrait de levure 2,5 g Tween 80 1 ml chlorhydrate de cystéine 0,5 g K2HPO4 2 g MgCl2, 6H20 0,5 g ZnS04, 7H20 0,25 g CaC12 0,15 g FeCl3 traces) et sur milieux gélosés COLUMBIA, d'une part et BH, d'autre part. A. Milieu liquide TPY Des cultures de Bifidobacterium longum (ATCC 15707), animalis (ATCC 252527), infantis (ATCC 15697) et pseudolongum (ATCC 25527) entretenues sur milieu de ROSENOW ont servi à ensemencer à raison de 5 ml soit 5.106 bactéries environ, des fioles coniques de 500 ml contenant 450 ml d'un milieu de base TPY, lentement agité et recouvert d'huile de paraffine. Le milieu TPY non modifié est désigné par F, le milieu TPY additionné de 50/o o d'acide propionique et ajusté à pH 5,0 est désigné par G et le milieu TPY additionné de 10 /oo d'acide propionique et ajusté à pH 5,0 est désigné par H. Les milieux F, G et H ensemencés ont été incubés pendant 48 heures à 37 C puis le dénombrement des bactéries a été effectué selon la méthode de dilution logarithmique par l'ensemencement en surface d'un milieu COLUMBIA gélosé à 5 /oo d'acide propionique et pH 5,0 tel que le milieu D de l'exemple 1. On a déterminé que la concentration en bifidobactéries revivifiables est celle indiquée dans le tableau III. TABLEAU III Concentration en microorganismes Microorganisme des milieux de culture F G H B. Longum ATCC 15707 1,1.105 2.106 1.107 B. Animalis ATCC 25527 2.105 5.106 6.107 B. Infantis ATCC 15697 1,5.105 4,3.106 2,3.107 B. Pseudolongum 1.105 1.106 2.107 ATCC 25526 On constate que, dans le milieu F, les bifidobactéries se sont multipliées de 10 à 20 fois et que, dans les milieux G et H conformes à l'invention, elles se sont multipliées respectivement selon un facteur de l'ordre de 100 et 1000. B. Milieu solide On a constaté que l'on favorise le développement des colonies de bifidobactéries dans des milieux gélosés COLUMBIA, WW, BH ainsi que dans un lait entier gélosé, lorsqu'on ajoute à ces milieux de 5 à 10 /oo d'acide propionique et que l'on amène leur pH à 5,0. Les cultures atteignent parfois 2 mm de diamètre contre 0,2 mm sur les milieux témoins à pH 5 sans acide propionique avec un maximum de croissance observé à 37 C le troisième jour. On a également constaté qu'en remplaçant, dans les milieux de culture utilisés, le glucose par une quantité équivalente d'autres sucres favorisant la croissance des bifidobactéries, notamment la cyclodextrine, on obtient des bifidobactéries revivifiables pendant un laps de temps plus important. REVENDICATIONS 1. Procédé propre à inhiber la croissance des microorganismes dans un milieu de culture avant son utilisation tout en favorisant la croissance des bifidobactéries, caractérisé par le fait que l'on amène son pH à une valeur comprise entre 4,5 et 5,5 et que l'on lui fait comporter une proportion de 0,5 à 200/oc, de préférence de 2 à 150/oc d'acide propionique. 2. Milieu de culture caractérisé par le fait qu'il présente un pH de 4,5 à 5,5, de préférence voisin de 5 et qu'il comporte une quantité de 0,5 à 20 /oo, de préférence de 2 à 150/cl d'acide propionique. 3. Procédé de culture de bifidobactéries caractérisé par le fait que l'on a recours au milieu de culture selon la revendication 2. 4. Application des cultures de bifidobactéries obtenues par mise en oeuvre du procédé selon la revendication 3, soit à l'ingestion, soit à titre de levain pour des produits fermentés tels que les ensilages et le yaourt. 5. Application du milieu de culture selon la revendication 2 à l r enrichissement, au dénombrement et à l'isolement des bifidobactéries.