Brevet FR2649865A1 — publié le 19910125

La présente invention est relative à un nouvel additif alimentaire microbien et à son application comme facteur de croissance dans l'alimentation ainsi qu'aux ali- ments le contenant. Il est connu-que le développement extrêmement rapide de l'élevage à l'échelle industrielle a conduit à l'utilisation d'additifs spéciaux pour l'alimentation des animaux afin de restaurer leurs fonctions biologiques, mo- difiées par les nouveaux modes d'élevage. Ces additifs alimentaires doivent d'une part, satisfaire aux besoins en micro-éléments, en macro-éléments et en vitamines des animaux élevés et nourris dans ces conditions intensives et leur assurer une prise de poids correcte et régulière; ils doivent d'autre part, jouer un rôle de facteurs de croissance pour ces animaux dans les nouvelles conditions intensives d'élevage. Parmi ces additifs utilisés, on peut citer no- tamment les antibiotiques ou autres agents chimio- thérapeutiques, ainsi que les compositions microbiennes. Ces différents facteurs ou promoteurs de crois- sance sont utilisés pour améliorer les performances zoo- techniques des animaux (mammifères, oiseaux, poissons) en leur assurant une meilleure régulation digestive. Les antibiotiques, présentant un certain nombre d'inconvénients, notamment des effets résiduels, des phéno- mènes de résistance et/ou de toxicité, l'utilisation de compositions contenant des antibiotiques doit être limitée dans l'intérêt de la protection du consommateur. C'est pourquoi les antibiotiques ont de plus en plus tendance à être substitués ou complétés par une autre classe de produits: les probiotiques, de plus en plus lar- gement employés. On entend par "probiotiques" des préparations sélectionnées, concentrées et revivifiables de bactéries lactiques ou autres germes aux propriétés nutritionnelles similaires; ils renforcent 'les performances zootechniques des animaux et leur assurent une meilleure prévention des troubles digestifs. Les probiotiques produisent leurs effets d'une part, en assurant la prophylaxie des agents pathogènes et d'autre part, en assurant un effet favorable sur la nutri- tion et l'augmentation de la valeur alimentaire. Comme exemples de compositions de ce type, on peut mentionnner les cultures vivantes, éventuellement lyophilisées de Lactobacillus acidophilus, bulgaricus, casei, lactis, Bacillus subtilis (brevet EP n' 287 699), de Bacillus cereus (brevet EP n' 296 051), de Streptococcus faecium (brevet EP n' 219 488), Torulopsis, Aspergillus orizae, Streptomyces, Bifidobacterium sp. avec des efficacités plus ou moins grandes sur les performances zootechniques des animaux. Cependant, bien que les probiotiques utilisés dans l'Art antérieur soient capables d'éliminer les pro- priétés désavantageuses des antibiotiques, leur utilisation est accompagnée de certains inconvénients, notamment en ce qui concerne leur efficacité irrégulière ou leur difficulté de stockage et de conservation. C'est pourquoi, la Demanderesse, afin de ré- soudre les problèmes posés par les probiotiques de l'Art antérieur, a isolé, sélectionné et produit des souches qui permettent d'obtenir des performances zootechniques nette- ment améliorées par rapport aux probiotiques de l'Art anté- rieur. En effet, les souches de microorganismes mises au point par la Demanderesse ont l'avantage: - d'augmenter la croissance des animaux, et/ou d'abaisser leur indice de consommation qui est définie comme la quantité d'aliment nécessaire à une unité de gain de poids, - d'augmenter leur indice de transformation dé- fini comme le gain de poids par unité d'aliment. Les probiotiques proposés par la Demanderesse sont également faciles A administrer et d'une bonne apti- tude à la conservation. La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à de nouvelles souches de mi- S croorganismes et notamment de streptocoque et de lactoba- cilles, seuls ou en association, qui en tant que probio- tiques, répondent mieux aux besoins de la pratique que les probiotiques de l'Art antérieur, notamment en ce qui concerne leurs performances zootechniques nettement amélio- rées. La présente invention a pour objet une souche de Streptococcus sp. SLB, caractérisée en ce que l'ADN de ladite bactérie présente notamment des sites de clivage par les enzymes de restriction EcoRV, Hind III, PstI, lesdites enzymes de restriction fournissant respectivement les frag- ments suivants: - EcoRV: 2 fragments: 16,5 - 14,0 kbp; - Hind III: 10 fragments: 12,0 - 7,9 - 7,4 - 6,7 - 6,1 - 5,8 - 5,2 - 4,3 - 4,0 - 2,5 kbp; - PstI: 9 fragments: 9,5 - 8,3 - 6,8 - 6,3 - ,7 - 4,7 - 3,9 - 2,2 - 1,9 kbp. Ledit Streptococcus sp. SLB a été déposé auprès de la Collection Nationale des Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur sous le n' 1-841. La présente invention a également pour objet une souche de Lactobacillus plantarum I3, caractérisée en ce que son ADN présente notamment les sites de clivage par les enzymes de restriction BamHI, EcorI, EcoRV, KpnI, XhoI, lesdites enzymes de restriction fournissant respectivement les fragments suivants: - BamHI: 5 fragments: 16,2 - 11,9 - 7,3 - 6,0 - 5,6 kbp; EcoRI: 10 fragments: 7,1 - 6,6 - 5,6 - 5,5 - 4,9 - 3,7 - 3,4 - 2,4 - 2,1 0,9 kbp; - EcoRV: 3 fragments: 11,4 - 10,3 - 9,0 kbp; - KpnI: 3 fragments: 11,3 - 5,9 - 4,7 kbp; - XhoI: 4 fragments de 12,5 - 10,5 - 5,4 - ,2 kbp. Ledit Lactobacillus a été déposé auprès de la Collection Nationale des Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur sous le n' 1-840. La présente invention a également pour objet un additif alimentaire microbien, promoteur de croissance des animaux, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la souche de Streptococcus sp. SLB conforme à l'invention, éventuellement associée à au moins une souche de lactoba- cille appropriée et éventuellement associée, en outre, à des supports, diluants et autres additifs, conservateurs adaptés à l'élevage des animaux. Selon un mode de réalisation avantageux dudit additif, il comprend comme souche de lactobacille, la souche. Lactobacillus plantarum I3 conforme à l'invention. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit additif -conforme à l'invention, les proportions lactobacilles/streptocoques sont comprises entre 10:90 et 90:10. Selon une disposition de ce mode de réalisa- tion, ledit rapport est avantageusement compris entre 30:70 et 50:50. La présente invention a également pour objet un aliment supplémenté pour animaux, caractérisé en ce qu'il contient un additif conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit aliment, il contient entre 105 et 109 germes revivifiables par gramme d'aliment. Les doses d'incorporation varient dans les fourchettes sus-citées selon l'espèce, l'age, le niveau d'ingestion des animaux et dans une certaine mesure selon l'effet recherché. Les aliments peuvent être présentés sous toutes les formes habituelles connues en élevage, simples ou com- posés, complets ou complémentaires. On notera que l'eau de boisson pourra être un vecteur possible de ces probiotiques. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui res- sortiront de la description qui va suivre, qui ae réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré- sente invention. Il doit bien être entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1: Caractéristiques morphologiques et biochimiques de Streptococcus SLB. Ladite souche présente: - les caractéristiques morphologiques sui- vantes: cellules sphériques ou ovoïdes ayant un dia- mètre d'environ 2 pm, se présentant sous forme de paires, plus rarement de chaînettes, 20. gram + , non sporulé, - mobile -, anaérobie facultative, À catalase -, 25. croissance à 10'C: -, À croissance à 40'C: +, croissance à 45'C: +, croissance à 6,5 % NaCl: -, À résistance à 63'C 30': +, 30. croissance à 0,1 % bleu de méthylène: -, (milieu de Sherman). - les caractéristiques biochimiques suivantes: hémolyse sur gélose au sang de mouton: -, arginine dihydrolase: -, 35. acétone :, culture sur lait tournesolé: réduction, acidification, coagulation (RAC), Le résultat d'une galerie API 50 CH donnant le profil de fermentation des sucres: souche inoculée selon API avec une suspension de densité optique d'environ 1,0 à 1,5 mesurée à 550 nanomètres, soit à tube 5 dans l'échelle de Mac Farland est montré sur la figure 1. Le résultat d'une galerie 20 strept. (même technique d'inoculation) est donné sur la figure 2. Exemple 2: Caractéristiques morphologiques et biochimiques de Lactobacillus plantarum I3. Ledit Lactobacillus conforme à l'invention pré- sente: - les caractéristiques morphologiques sui- vantes: 15.bâtonnet avec des extrémités arrondies, lar- geur de 0,9 à 1,2 pm, gram+, non sporulé, anaérobie facultatif, 20. mobilité - , pas de croissance à 45'C, croissance à 15'C. - les caractéristiques biochimiques suivantes: arginine -, 25. gaz - sur milieu Gibson et Abd-el-Malek, résultat d'une galerie API 50 CH donnant le profil de fermentation des su- cres: inoculation selon API avec une suspen- sion de densité optique d'environ 0,5 à 0,75, mesurée à 550 nanomètres, soit tube 2 - 3 dans l'échelle de Mac Farland. La figure 3 montre les résultats obtenus. Exemple 3: Profil de restriction de Strepto- coccus SLB. La méthodologie utilisée est celle décrite dans GRIMONT (Annales Institut Pasteur Microbiologie, 1986, 137B, 165-175) et comprend les étapes de - clivage de l'ADN par 18 endonucléases de res- triction: seules 3 endonucléases ont clivé l'ADN de Strep- tococcus SLB (EcoRV, Hind III, PstI); - transfert de Southern des fragments clivés d'ADN obtenus sur membrane de nylon-nitrocellulose; hybridation des fragments avec de l'ARN 16 + 23S d'Escherichia Coli marqué à l'extrémité de 5' par du P radioactif; - lavage, l'autoradiographie et la réalisation d'une échelle de fragment de taille connue (marqueur Raoul I) par hybridation avec une sonde constituée par le plas- mide pBR322 marqué au 32p; - détermination des fragments visualisés des gènes ARN ribosomaux de la souche SLB par l'algorithme de Schaffer et Sederoff. Exemple 4: Profil de restriction de Lacto- bacillus plantaru I3. La méthodologie utilisée est celle décrite dans GRIMONT (Annales Institut Pasteur Microbiologie, 1986, 137B, 165-175) et comprend les étapes de - clivage avec 18 endonucléases de restric- tion: seules 5 endonucléases ont clivé les ADN de Lacto- - bacillus plantarum I3: BamHI, EcoRI, EcoRV, KpNI, XhoI; - transfert de Southern des fragments clivés d'ADN obtenus sur membrane de nylonnitrocellulose; - hybridation des fragments avec de l'ARN 16 + 23S d'Escherichia Coli marqué à l'extrémité de 5' par du P radioactif; 30. lavage, l'autoradiographie et la réalisation d'une échelle de fragment de taille connue (marqueur Raoul I) par hybridation avec une sonde constituée par le plas- mide pBR322 marqué au 32p; - détermination des fragments visualisés des gènes ARN ribosomaux de la souche Lactobacillus plantarum I3 par l'algorithme de Schaffer et Sederoff: Exemple 5: Effet probiotique du Streptocoque selon l'invention par rapport à un lot témoin et par rap- port à d'autres streptocoques utilisés comme probiotiques. Des lots de 15 veaux pesant 50 kg en moyenne à l'entrée de l'étable ont été nourris pendant 80 jours en moyenne avec respectivement: - 1_tîA: un aliment "veau" contenant environ % de poudre de lait sans additif ni microbien, ni enzy- matique, ni antibiotique; - lo: un aliment "veau" contenant comme probiotique un Streptococcus thermophilus à raison de 106 germes/gramme d'aliment;. - 1lt C: un aliment "veau" contenant comme probiotique un Streptococcus lactis à raison de 106 germes/gramme d'aliment; - QLtD: un aliment contenant comme probio- tique un Streptococcus faecium SF1 à raison de 106 germes/gramme d'aliment; - oQt.: avec Streptococcus faecium SF2; - lQt F:avec Streptococcus SF3; - lot G:avec le Streptococcus SLB conforme à l'invention.- Le tableau I ci-après indique nettement l'effet "positif" sur le poids de carcasse moyen obtenu par les streptocoques (excepté le Streptococcus faecium SF3) par rapport au lot témoin et l'effet plus bénéfique du strepto- coque SLB de l'invention par rapport aux autres strepto- coques. 9. T^ABLE&%I. POIDS DE CAR- POIDS DE CAR- GAIN OU CASSE MOYEN CASSE MOYEN PERTE SOUCHE OBTENU AVEC OBTENU AVEC EN % CETTE SOUCHE LE TEMOIN LOT A Streptocoque lactique "SLB" Lot G 117,85 kg 113,32 kg + 4,0 % Streptococcus thermophilus "N4" Lot B 116,18 kg 113,32 kg + 2,53 % Streptococcus lactis "SL 20" Lot C 114,3 kg 113,32 kg + 0,85 % Streptococcus faecium "SF 1" Lot D 116,8 kg 113,32 kg + 3,07 % Streptococcus faecium "SF 2" Lot E 115,86 kg 113,32 kg + 2,24 % Streptococcus faecium "SF 3" Lot F 112,53 kg 113,.32 kg - 0,7 % Exemple 6: Effet probiotique d'une association Streptococcus SLB selon l'invention et de Lactobacillus. Des lots de 15 veaux pesant en moyenne 50 kg ont été nourris pendant 80 jours avec respectivement: - lot A: aliment "veau" sans additif ni micro- bien, ni antibiotique; - lot: aliment "veau" avec une association streptococcus SLB selon l'invention et un Lactobacillus thermobacterium dans des proportions lactobacil- lus/streptocoque 30/70 % et un taux d'incorporation dans l'aliment de 106 germes/gramme d'aliment. Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-après. TABLEAU.1 POIDS DE POIDS DE 5. CARCASSE OB- CARCASSE TENU AVEC MOYEN OBTENU GAIN EN SOUCHES ASSOCIEES CES SOUCHES AVEC LE TE- % ASSOCIEES ET MOIN LOT A STREPT. SLB SEUL LOT B Streptocoque lactique sp "SLB" Lactobacillus thermo- 117,3 kg 112,89 kg + 3,90 % bactérium "LT3" Streptocoque "SLB" seul 116,84 kg 112,89 kg +3,50 % Exemple 7: Effet probiotique de l'association Streptococcus SLB/Lactobacillus plantarum I3 selon l'invention. Des lots de 15 veaux pesant en moyenne 50 Kg ont été nourris pendant 80 jours avec respectivement: - lo_-A: aliment "veau" sans additif ni micro- bien, ni enzymatique, ni antibiotique; - lotB: aliment "veau" avec une association Streptococcus SLBlLactobacillus plantarum I3 à raison de 106 germes/gramme d'aliment et une proportion Lactobacillus plantarum I3/Streptococcus SLB de 35/65. Les résultats présentés sur le tableau III ci- après indiquent nettement l'effet bénéfique de cette asso- ciation par rapport au témoin. ll TABLEAU 1 Lt POIDS DE CAR- POIDS DE CAR- SOUCHES ASSOCIEES CASSE MOYEN CASSE MOYEN GAIN EN OBTENU AVEC OBTENU AVEC % CES SOUCHES LE TEMOIN ASSOCIEES Streptococcus lactique sp "SLB" Lactobacillus 118,53 kg 112,89 kg + 5 % plantarum I3 Il fait également nettement apparaître l'effet bénéfique de cette association particulière par rapport à une souche de Streptococcus SLB seul (exemple 5) et une as- sociation Streptococcus SLB/Lactobacillus thermobacterium (exemple 6). Exemple 8: Effet probiotique du Streptococcus SLB sur les performances zootechniques des porcs à l'engrais. Des lots de 32 porcs répartis en cases de 8 ont été nourris avec un aliment fourni en farine à base de blé jusqu'à des périodes de 75 jours d'engraissement. On a com- paré les résultats zootechniques d'un lot témoin à un lot essai. -lot A témoin: lot recevant uniquement de l'aliment sans additif ni microbien, ni enzymatique, ni an- tibiotique; - B: lot recevant de l'aliment dans lequel on a incorporé 1 % du Streptococcus SLB. -. Le tableau IV ci-après donne les résultats obtenus et précise d'une part l'indice de consommation et d'autre part le gain de poids moyen quotidien (GMQ) en g/j. TABLEAU.1V TEMOIN AVEC STREPTOCOQUE LOT A LOT B Indice de consommation 2,89 2,81 (- 2,77 %) GMQ en grammes/jour 686 702 (+ 2,33 %) Exemple 9: Effet probiotique de l'association Lactobacillus plantarum I3lStreptococcus SLB sur les performances zootechniques des porcs à l'engrais. Des lots de 32 porcs répartis en cases de 8 ont été nourris avec un aliment sous forme de farine à base de blé jusqu'à 75 jours d'engraissement. On a comparé les résultats entre un lot témoin et un lot essai. - lot A témoin: aliment sans probiotique, ni additif microbien, ni enzymatique; - _lot _L__ai: aliment avec-association de streptocoque SLB/Lactobacillus plantarum I3 à raison de 1 % et proportion du mélange Lactobacillus plantarum 13/streptocoque SLB: 30/70 %. Le tableau V ci-après donne les résultats obte- nus. TEMOIN ESSAI LOT A LOT B Indice de consommation 2,89 2,76 (- 4,5 %) GMQ en grammes/jour 686 713 (+ 3,94 %) Exemple 10: Procédé de préparation d'un addi- tif conforme à l'invention. On dilue à 10 % une poudre lyophilisée conte- nant au moins l'un des germes conforme & l'invention à 100 dans un mélange lactosérum/levure lactique 50/50 et dans lequel on ajoute 1 % de silice hydratée comme agent anti- mottant. Exemple 11: Exemple d'additif conforme à l'invention. Aliment "veau" avec une association Strepto- coccus SLB/Lactobacillus plantarum 13 à raison de 106 germes/gramme d'aliment et une proportion Lactobacillus plantarum I3/Streptococcus SLB de 35/65. Exemple 12: Exemple d'aliment conforme à l'invention. La composition d'un aliment est la suivante: - Poudre de lait écrémé 26,9 % - Poudre de lait réeigraissé Coprah 45,0 % - Amidon cru 4,3 % - Lactosérum 10,8 % - Farine de blé 1,1% - Babeurre 9,7 % - CMV (Complément-Minéral- Vitamines) 1,1 % - Additif, facteur de croissance selon l'invention comprenant 70 % de Lactobacillus plantarum I3 et de Streptococcus SLB 1,1 % Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1) Souche de Streptococcus sp. SLB, caractéri- sée en ce que l'ADN de ladite bactérie présente notamment des sites de clivage par les enzymes de restriction EcoRV, Hind III, PstI, lesdites enzymes de restriction fournissant respectivement les fragments suivants: - EcoRV: 2 fragments: 16,5 - 14,0 kbp; - Hind III 10 fragments: 12,0 - 7,9 - 7,4 - 6,7 - 6,1 - 5,8 - 5,2 - 4,3 - 4,0 - 2,5 kbp; - PstI: 9 fragments: 9,5 - 8,3 - 6,8 - 6,3 - ,7 - 4,7 - 3,9 - 2,2 - 1,9 kbp. 2') Souche Streptococcus sp. SLB selon la re- vendication 1, caractérisée en ce qu'elle a été déposé au- près de la Collection Nationale des Cultures de microorga- nismes de l'Institut Pasteur sous le n' 1-841. 3') Souche de Lactobacillus plantarum I3,- ca- ractérisée en ce que son ADN présente notamment les sites de clivage par les enzymes de restriction BamHI, Ecorl, EcoRV, KpnI, XhoI, lesdites enzymes de restriction fournis- sant respectivement les fragments suivants: - BamHI: 5 fragments: 16,2 11,9 - 7,3 - 6,0 - 5,6 kbp; -EcoRI: 10 fragments: 7,1 - 6,6 - 5,6 - 5,5 4,9 - 3,7 - 3,4 - 2,4 - 2,1 - 0,9 kbp; - EcoRV: 3 fragments: 11,4 - 10,3 9,0 kbp; - KpnI: 3 fragments: 11,3 - 5,9 - 4,7 kbp; - XhoI: 4 fragments de 12,5 - 10,5 - 5,4 - ,2 kbp. 4) Souche de Lactobacillus selon la revendica- tion 3, caractérisée en ce qu'elle a été déposée auprès de la Collection Nationale des Cultures de microorganismes de l'Institut Pasteur sous le n' 1-840. ') Additif alimentaire microbien, promoteur de croissance des animaux, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la souche de Streptococcus sp. SLB selon la revendi- cation 1 ou la revendication 2, éventuellement associée à au moins une souche de lactobacille appropriée et éventuellement associée, en outre, & des supports, diluants et autres additifs, conservateurs adaptés à l'élevage des animaux. 6') Additif selon la revendication 5, caracté- risé en ce qu'il comprend comme souche de lactobacille, la souche Lactobacillus plantarum I3 selon la revendication 3 ou la revendication 4. 7) Additif selon la revendication 5 ou la re- vendication 6, caractérisé en ce que les proportions lacto- bacilles/streptocoques sont comprises entre 10:90 et 90:10. 8') Additif selon la revendication 7, caracté- risé en ce que ledit rapport est avantageusement compris entre 30:70 et 50:50. 9') Aliment supplémenté pour animaux, caracté- risé en ce qu'il contient un additif selon l'une quelconque des revendications 5 à 8. ') Aliment selon la revendication 9, caracté- risé en ce qu'il contient entre 105 et 109 germes revivi- fiables par gramme d'aliment.