Brevet FR2655990A1 — publié le 19910621

Agent viral responsable de l'hépatite non-A non-B et polypeptides dérivés de celui-ci utiles pour le diagnostic et la vaccination. ______________ La présente invention a trait à la séparation et à la caractérisation de l'agent viral responsable de l'hé- patite non-A non-B post-transfusionnelle (PT-NANBH) et en particulier aux polypeptides viraux PT-NANBH, aux séquences d'ADN encodant ces polypeptides viraux, aux vecteurs d'expression contenant ces séquences d'ADN, et aux cellules hôtes transformées par ces vecteurs d'expression Elle se rapporte également à l'utilisa- tion d'une séquence d'ADN dans un essai d'hybridation d'acide nucléique pour le diagnostic de la PT-NAN Bi H. Elle a trait, en outre, à l'utilisation de polypepti- des viraux PT-NANBH ou d'anticorps polyclonaux ou mo- noclonaux contre ces polypeptides dans une immuno- analyse pour le diagnostic de PT-NANBH ou dans un vac- cin pour sa prévention. L'hépatite non-A, non-B (NANBH) est par définition un diagnostic d'exclusion et a généralement été utilisée pour décrire des cas d'infection hépatique virale chez l'être humain qui ne sont pas dus à des virus d'hépa- tite A ou B Dans la majorité de ces cas, la cause de l'infection n'a pas été identifiée bien que pour des raisons cliniques et épidémiologiques, on ait pensé à un certain nombre d'agents qui pourraient être respon- sables, cfr Shih et al (Proq Liver Dis, 1986, 8, 433-452) Rien qu'aux Etats-Unis d'Amérique, jusqu'à % des transfusions sanguines peuvent avoir une NANBH comme conséquence, ce qui en fait un problème d'impor- tance Même pour la PT-NANBH, il peut y avoir au moins plusieurs agents viraux responsables de l'infection et au fil des années, les revendications quant à l'iden- tification de l'agent n'ont pas manqué, mais aucune n'a été établie. La demande de brevet européen 88310922 5 tend à décri- re la séparation et la caractérisation de ll'agent é- thiologique responsable de la PT-NANBH que l'on appel- le également virus de l'hépatite C (HCV) Uine biblio- thèque d'AD Nc a été préparée à partir d'acide nucléi- que viral obtenu d'un chimpanzé atteint de PT-NANBH et a été sélectionnée au moyen d'antisérums humains Uine série de clones ont été isolés et mis en séquence Les données de séquence d'acide nucléique et d'acide aminé en résultant et qui sont décrites dans la demande, re- présentent approximativement 70 % du génome viral 10 kb et sont entièrement dérivées de son extrémité 3 ' cor- respondant à la région de programmation non structu- rée. -2- Les inventeurs ont à présent isolés et caractérisés les polypeptides viraux de la PT-NANBH par le clonage et l'expression de séquences d'ADN encodant ces poly- peptides viraux D'une manière surprenante, les don- nées de séquence d'acide nucléique et d'acide aminé présentent des différences considérables avec les don- nées correspondantes rapportées dans la demande de brevet européen 88310922 5 Dans l'ensemble, ces dit- férences sont d'environ 20 % au niveau de l'acide nu- cléique et de 15 % au niveau de l'acide aminé, mais certaines régions des séquences présentent même des différences plus importantes Le niveau global de dif- férence est plus important que ce que l'on attendrait pour deux isolats du même virus, même en tenant comp- te de facteurs géographiques, et peut s'expliquer par l'une des deux raisons suivantes. Tout d'abord, les inventeurs de la présente invention et ceux de la demande de brevet européen susmentionnée ont utilisé des sources différentes pour l'acide nu- cléique utilisé dans le clonage du c ADN En particu- lier la demande de brevet européen décrit l'utilisa- tion de plasma de chimpanzé comme source du matériel de départ de l'acide nucléique viral, le virus ayant été transmis à un chimpanzé à deux occasions La PT- NANBH est, bien sfûr, une maladie humaine et le passage du virus dans un hôte étranger, même s'il est proche parent de l'homme, se traduira vraisemblablement par une mutation intensive de l'acide nucléique viral De ce fait les données de séquence que contient la deman- de de brevet européen 8831022 5 peuvent ne pas être exactement représentatives de l'agent viral réel res- ponsable de la PT-NANBH chez l'homme Par contraste, les inventeurs de la présente invention ont utilisé l'acide nucléique viral d'une source de plasma humain comme matériel de départ pour le clonage du c ADN Les données de séquence ainsi obtenues sont plus suscepti- bles de correspondre aux séquences natives d'acide nu- cléique et d'acide aminé de la PT-NANBH. Deuxièmement, il peut se faire que l'agent viral exis- te sous la forme de plus d'un sous-type et que les données de séquence décrites dans la demande de brevet européen et celles élucidées par les inventeurs de la présente correspondent à des sous-types séparés et distincts du même agent viral Alternativement il peut se faire que le niveau de différence entre les deux groupes de données de séquences soit d à une combi- naison de ces deux facteurs. La présente invention donne un polypeptide viral PT- NANBH comprenant un antigène ayant une séquence d'aci- -3- de aminé qui est pour au moins 90 % homologue à la sé- quence d'acide aminé indiquée dans les SEQ ID NO: 314, ,18,19,20,21 ou 22, ou en est un fragment antigéni- que. Les SEQ ID NO 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 indiquent la sé- quence d'acide aminé telle qu'on la déduit de la sé- quence d'acide nucléique La séquence d'acide aminé sera de préférence homologue à au moins 95 % ou même 98 % avec la séquence d'acide aminé indiquée en SEQ ID NO 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 Facultativement l'antigène peut être fondu avec un polypeptide hétérologue. Deux antigènes ou plus peuvent facultativement être utilisés soit en combinaison soit fondus en un seul polypeptide L'utilisation de deux antigènes ou plus de cette manière dans un essai de diagnostic donne des résultats plus fiables que l'utilisation de l'essai de criblage du sang pour le virus PT-NANBH On obtiendra de préférence un antigène dans la région de programma- tion structurée (l'extrémité 5 ') et un autre dans la région de programmation non structurée (J'extrémité 3 ') La préférence est donnée en particulier à la fu- sion des antigènes entre eux pour donner un polypep- tide résultant de la recombinaison Cette dernière ap- proche présente une série d'avantages en ce sens que les antigènes individuels peuvent être combinés dans un rapport fixe déterminé à l'avance (habituellement équimolaire) et qu'il ne faut produire, purifier et caractériser qu'un seul polypeptide. 0 Un fragment antigénique d'un antigène ayant une sé- quence d'acide aminé homologue à au moins 90 % avec ce qui est indiqué dans les SEQ ID N O 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 contiendra de préférence un minimum de cinq, six, sept, huit, neuf ou dix, quinze, vingt, trente, quarante ou cinquante acides aminés Les emplacements antigéniques de ces antigènes peuvent être identifiés au moyen de procédures type Celles-ci peuvent impli- quer la fragmentation du polypeptide lui-même au moyen d'enzymes protéolyptiques ou d'agents chimiques et la détermination subséquente de l'aptitude de chaque fragment à se lier aux anticorps ou à provoquer une réponse immune en cas d'inoculation à un animal ou dans un système de modèle in vitro approprié (Stroh- maier et al, J Gen Virol, 1982, 59, 205-306) Al- ternativement l'ADN encodant le polypeptide peut être fragmenté par digestion par des enzymes réducteurs ou d'autres techniques réputées et ensuite introduit dans un système d'expression pour produire des fragments (facultativement fondus en un polypeptide généralement d'origine bactérienne) T Les fragments qui en résultent sont évalués comme décrit précédemment (Spence et al, J Gen Virol, 1989, 70, 2843-51; Smith et al, Gene, 1984, 29, 263-9) Une autre approche consiste à syn- thétiser chimiquement de courts fragments de peptides (longueur de 3-20 acides aminés; conventionnellement longueur de 6 acides aminés) qui couvrent la totalité de la séquence du polypeptide long avec chaque peptide chevauchant le peptide adjacent (Ce chevauchement peut être à partir de I-10 acides aminés, mais l'idéal est n-i acides aminés, o N est la longueur du pepti- de; Geysen et al, Proc Natl Acad Sc, 1984, 81, 3998-4002) Chaque peptide est alors évalué comme dé- crit précédemment, si ce n'est qu'il est généralement d'abord couplé à une molécule porteuse pour faciliter l'induction d'une réponse immune Enfin il y a des méthodes de prédiction qui comportent l'analyse de la séquence du point de vue de caractéristiques particu- lières, par ex, l'hydrophilicité, dont on pense qu'elles ont un rapport avec des emplacements impor- tants immunologiquement parlant (Hopp et Woods, Proc. Natl Acad Sc, 1981, 78, 3824-8; Berzofsky, Science, 1985, 229, 932-40) Ces prédictions peuvent alors être testées par les approches du polypeptide ou du peptide résultant de la recombinaison décrites précédemment. Le polypeptide viral sera, de préférence, fourni sous une forme pure, c à d avec une pureté supérieure à %, voire 95 %. Le polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu au moyen d'un synthétiseur d'acide aminé, s'il s'agit d'un antigène n'ayant pas plus d'environ trente résidus ou par la technologie de l'ADN résultant de la recombinaison. La présente invention fournit également une séquence d'ADN encodant un polypeptide viral PT-NANBH tel que défini ici. Ta séquence d'ADN de la présente invention peut être synthétique ou clonée La séquence d'ADN sera, de pré- férence, telle qu'indiquée dans la SEQ ID n 3,4,5,18, 19,20,2 l ou 22. Pour obtenir un polypeptide viral PT-NANBH comprenant de multiples antigènes, il est préférable de fondre les séquences de programmation individuelles en un seul cadre de lecture ouvert La fusion devra, bien snr, se faire de manière à ce que l'activité antigéni- que de chaque antigène ne soit pas compromise de ma- nière importante par sa position par rapport à un au- tre antigène On accordera, bien entendu, une atten- -5- tion particulière à la nature des séquences à l'en- droit de la jonction entre les antigènes Les méthodes d'obtention de tels polypeptides simples sont bien connues dans ce domaine. La présente invention fournit également un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN telle que définie ici, et capable, en présence d'un hôte appro- prié, d'exprimer la séquence d'ADN pour produire un polypeptide viral PT-NANBH. Le vecteur d'expression contient normalement des élé- ments de contrôle de l'ADN qui réalisent l'expression de la séquence d'ADN dans un hôte approprié Ces élé- ments peuvent varier en fonction de l'hôte, mais com- prennent généralement un activateur, un site de liai- son aux ribosomes, des sites de démarrage et d'arrêt transcriptionnel, et un site d'arrêt de la transcrip- tion Des exemples de tels vecteurs sont les plasmides et les virus Les vecteurs d'expression de la présente invention comprennent à la fois des vecteurs extra- chromosomiques et des vecteurs qui sont intégrés dans le chromosome de la cellule hôte Pour utilisation dans des E coli, le vecteur d'expression peut contenir la séquence d'ADN de la présente invention facultati- vement sous forme dle fusion liée soit à i 'extrémité 5 ' ou 3 ' de la séquence d'ADN encodant, par exemple, la g-galactosidase ou à l'extrémité 3 ' de la séquence d'ADN encodant, par exemple, le gène trp E Pour uti- lisation dans le système de bacillovirus de l'insecte (Ac NPV), la séquence d'ADN est facultativement fondue avec la séquence de programmation de la polyhédrine. La présente invention fournit également une cellule hôte transformée avec un vecteur d'expression tel que défini i ci. Des exemples de cellules hôte utilisées avec la pré- sente invention comprennent les cellules procaryoti- ques et eucaryotiques, telles que cellules bactérien- nes, de levure, de mammifères et d'insectes Des exem- ples particuliers de telles cellules sont les E coli, les S cerevisiae, les P pastoris, des cellules d'ovai- re de hamster chinois et de souris, et la Spodoptera fruqiperda et la Tricoplusia ni Le choix de la cellu- le hôte peut dépendre d'une série de facteurs, mais si la modification post-translationnelle du polypeptide viral PT-NANBH est importante, on choisira de préfé- rence un hôte eucaryotique. -6- La présente invention fournit également un procédé pour préparer le polypeptide viral PT-NANBH qui com- prend le clonage ou la synthèse d'une séquence d'ADN encodant le polypeptide viral PT-NANBH, tel que défini ici, insérant la séquence d'ADN dans un vecteur d'expression capable, dans un hôte approprié, de s'ex- primer, de transformer une cellule hôte avec le vec- teur d'expression, de faire une culture de la cellule hôte transformée et d'isoler le polypeptide viral. Le clonage de la séquence d'ADN peut être effectué aul moyen de procédures type bien connues dans ce domaine. Par ailleurs, il est particulièrement avantageux dans ces procédures d'utiliser les données de séquence ré- vélées ici de manière à faciliter l'identification et la séparation des séquences d'ADN clonées souhaitées. T,'ARN sera isolé, de préférence, en pastillant le vi- rus à partir du plasma d'humains contaminés identifiés par implication dans la transmission de PT-NANBH. L'ARN isolé fait 1 'objet d'une transcriptase inverse dans l'AD Nc par amorçage sélectif ou par oligo-d T Fa- cultativement l'ARN peut être soumis à une étape de pré-traitement pour en retirer toute structure secon- daire qui pourrait interférer avec lla synthèse AD Nc, par exemple, par chauffage ou par réaction avec de l'hydroxyde mercurique de méthyle L'AD Nc est habi- tuellement modifié par addition de linkers suivie d'une digestion avec un enzyme réducteur Il est alors inséré dans un vecteur de clonage, tel que le p BR 322 ou un dérivé de celui-ci ou les vecteurs lambda gtl O et gtll (Huynh et al, DNA Cloning, 1985, Vol 1: A Practical Approach, Oxford, IRC Press), conditionné en virions le cas échéant, et les molécules d'ADN résul- tant de la recombinaison utilisées pour transformer les E coli et donc générer la bibliothèque souhaitée. La bibliothèque peut être examinée de manière sélecti- ve en utilisant une stratégie de sélection type S'il s'agit d'une bibliothèque d'expression, elle peut être examinée sélectivement aul moyen d'une méthode immuno- logique avec des antisérums obtenus à partir de la mê- me source de plasma que le matériel de départ de l'ARN et également avec des antisérums provenant de sources humaines supplémentaires supposées positives pour des anticorps contre la PT NANBH Etant donné que les an- tisérums humains contiennent généralement des anti- corps contre les E coli qui peuvent donner lieu à un important mouvement propre pendant la sélection, il est préférable de les traiter d'abord avec un lysat d'E coli non transformé de manière à retirer ces anti- corps Il est avantageux d'avoir recours à un contrôle négatif au moyen d'antisérums provenant de donneurs 7 - humains accrédités, c à d des donneurs humains ayant été soumis à des tests répétés et ne présentant pas d'anticorps contre l'hépatite virale Une stratégie de sélection alternative serait d'utiliser un ou plu- sieurs oligonucléotides marqué(s) comme sondes d'hy- bridation TL'utilisation d'oligonucléotides dans J'examen sélectif d'une bibliothèque c ADN est généra- lement plus simple et plus fiable que la sélection avec des anti sérums Les oligonucléotides seront syn- thétisés de préférence en utilisant les informations de la séquence d'ADN contenues ici Un ou plusieurs tours de criblage supplémentaires d'une sorte ou de l'autre peuvent être effectués pour caractériser et identifier les clones positifs. Après avoir identifié un premier clone positif, la bi- bliothèque peut être réexaminée sélectivement pour dé- tecter des clones positifs supplémentaires en utili- sant le premier clone comme sonde d'hybridation Al- ternativement ou en sus, d'autres bibliothèques peu- vent être préparées et celles-ci peuvent être sélec- tionnées au moyen d'immuno-sélecteurs ou de sondes d'hybridation De cette manière, on peut obtenir d'au- tres séquences d'ADN. Alternativement, la séquence d'ADN encodant le poly- peptide viral PT-NANBH peut être synthétisée au moyen de procédures type et cette solution peut être préfé- rée au clonage de l'ADN dans certaines circonstances (Gait Oligonucleotide Synthesis: A Practical AP- proach, 1984, Oxford, IRL Press). Donc clonée ou synthétisée, la séquence d'ADN souhai- tée peult être insérée dans un vecteur d'expression utilisant des techniques type connues T Le vecteur d'expression est normalement coupé au moyen d'enzymes réducteurs et la séquence d'ADN insérée au moyen d'une ligature à extrémité émoussée ou en zigzag La coupure est généralement réalisée en un site de restriction dans une position adéquate dans le vecteur d'expres- sion de manière à ce qu'une fois insérée, la séquence d'ADN soit sous le contrôle des éléments fonctionnels de l'ADN qui réalisent son expression. La transformation d'une cellule hôte peut être effec- tuée par des techniques type Un marqueur phénotypique est habituellement utilisé pour faire la distinction entre les transformants qui ont repris avec succès le vecteur d'expression et les autres La mise en culture de la cellule hôte transformée et la séparation du po- lypeptide viral PT-NANBH peut également se faire par des techniques type. 8 - L'anticorps spécifique d'un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu au moyen du polypeptide Il peut être polyclonal ou monoclonal. L'anticorps peut être utilisé pour les essais de con- trôle de qualité de lots de polypeptides viraux PT- NANBH; la purification d'un polypeptide viral PT-NANBH ou du lysat viral; la topographie des épitopes; lors- qu'il est marqué, comme élément conjugué dans un essai type compétitif, pour la détection des anticorps; et dans les essais de détection des antigènes. L'anticorps polyclonal contre un polypeptide viral PT- NANBH de la présente invention peut être obtenu en in- jectant un polypeptide viral PT-NANBH, facultativement couplé à un support pour promouvoir une réponse immu- ne, dans une cellule de mammifère: souris, rat, mouton ou lapin, et en récupérant l'anticorps ainsi produit. Le polypeptide viral PT-NANBH est généralement admi- nistré sous forme d'une formulation injectable dans laquelle Je polypeptide est mélangé à un diluant phy- siologiquement acceptable Des adjuvants tels que l'adjuvant complet de Freund (FCA) ou l'adjuvant in- complet de Freund (FIA) peuvent être inclus dans la formulation La formulation est normalement injectée dans l'hôte sur une période de temps appropriée, des échantillons de plasma étant prélevés à intervalles réguliers pour essai relatif aux anticorps viraux an- ti-PT-NANBH Lorsqu'un niveau d'activité approprié est obtenu, l'hôte fuit L'anticorps est alors extrait du plasma sanguin et purifié par des procédures type, par exemple, par protéine A ou par chromatographie en ré- sine échangeuse des ions. L'anticorps monoclonal contre un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu en fusionnant des cellules d'une lignée cellulaire immorta- lisante avec des cellules produisant des anticorps contre le polypeptide viral et en faisant une culture de la lignée cellulaire fusionnée rendue immortelle De manière typique, on inocule à un hâte mammifère non humain, tel que souris ou rat, le polypeptide viral. Après un temps suffisant pour que l'hôte ait pu élabo- * rer une réponse anticorps, des cellules produisant des anticorps, telles que les splénocytes, sont retirées Les cellules d'une lignée cellulaire immortalisante, telle qu'une lignée cellulaire de myélome de souris ou de rat, sont fusionnéesavec les cellules produisant des anticorps et les fusions en résultant examinées de manière sélective pour identifier une lignée cellulai- re, telle'qu'un hydridome, sécrétant l'anticorns mono- clonal souhaité La lignée cellulaire fusionnée peut être mise en culture et l'anticorps monoclonal purifié du 9 - milieu de culture de manière similaire à la purifica- tion de l'anticorps polyclonal. Les essais de diagnostic basés sur la présente inven- tion peuvent être utilisés pour déterminer la présence ou l'absence d'infection PT-NANBH Ils peuvent égale- ment être utilisés pour contrôler le traitement de cette infection, par exemple dans une thérapie d'in- terféron. Dans un essai pour le diagnostic d'une infection vi- rale, il y a fondamentalement trois approches distinc- tes quii peuvent être adoptées impliquant la détection de l'acide nucléique viral, l'antigène viral ou l'an- ticorps viral L'acide nucléique viral est générale- ment considéré comme le meilleur indicateur de la pré- sence du virus lui-même et identifierait des substan- ces susceptibles d'être infectieuses Par ailleurs, la détection de l'acide nucléique n'est généralement pas aussi directe que-la détection d'antigènes ou d'anti- corps puisque le niveau cible peut être très bas. L'antigène viral est utilisé comme marqueur pour la présence du virus et comme indicateur de l'infecti- vité En fonction du virus, la quantité d'antigènes présente dans un échantillon peut être très faible et difficile à détecter La détection d'anticorps est re- lativement directe car, en effet, le système immunitaire de l'hôte amplifie la réponse à une infection en produi- sant d'importantes quantités d'anticorps qui circu- lent La nature de la réponse des anticorps peut sou- vent être cliniquement utile, par exemble des anti- corps de catégorie Ig M plutôt qu'Ig G indiquent une in- fection récente, ou la réponse à un antigène viral particulier associé à la clairance du virus Donc l'approche exacte adoptée pour le diagnostic d'une in- fection virale dépend des circonstances particulières et de l'information recherchée Dans le cas du PT- NANRH, une analyse de diagnostic peut incorporer n'im- porte laquelle de ces trois approches. Dans un essai pour le diagnostic de PT-NANBH impli- quant la détection d'acide nucléique viral, la méthode peut comprendre l'hybridation de l'ARN viral présent dans un échantillon ou de l'AD Nc synthétisé à partir de cet ARN viral, avec une séquence d'ADN correspon- dant à la séquence de nucléotide de la SEQ ID n O 3,4, ,J 8,19,20,21 ou 22 et la sélection des hybrides d'a- cide nucléique en résultant pour identifier tout acide nucléique viral PT-NANBH L'application de cette mé- thode est habituellement limitée à un échantillon d'un tissu approprié, tel que biopsie du foie, o l'ARN vi- ral est susceptible d'être présent dans de fortes pro- - portions La séquence d'ADN correspondant à la séquen- ce de nucléotide de la SEQ ID n 3,4,5,18,19, 20,2 l ou 22 peut prendre la forme d'un oligonucléotide ou d'une séquence AD Nc contenant facultativement un plasmide. La sélection des hybrides d'acide nucléique sera, de préférence, effectuée au moyen d'une séquence d'ADN marquée Un ou plusieurs tours de sélection supplémen- taires d'un type ou de l'autre peuvent être effectués pour mieux caractériser l'hybride et donc identifier tout acide nucléique viral PTNANBH Les étapes de l'hybridation et de la sélection sont effectuées sui- vant des procédures connues. Par suite de l'application limitée de cette méthode dans l'essai de l'acide nucléique viral, une méthode privilégiée et plus pratique implique la synthèse d'AD Nc à partir de l'ARN viral présent dans un échan- tillon, l'amplification d'une séquence d'ADN présélec- tionnée correspondant à une sous-séquence de la sé- quence de nucléotide de la SEQ ID n 3,4,5,18,19,20,21 ou 22, et l'identification de la séquence d'ADN présé- lectionnée L'échantillon pour essai peut être prélevé dans tout tissu approprié ou fluide physiologique et sera de préférence concentré pour tout l'ARN viral présent Un exemple de tissu approprié est une biopsie du foie Des exemples de fluide physiologique appro- prié sont: l'urine, le plasma, le sang, le sérum, le sperme, Jes larmes, la salive ou le fluide cérébrospi- nal Les exemples de premier choix sont le sérum et le plasma. La synthèse de l'AD Nc s'effectue normalement par transcription inverse amorcée au moyen d'amorces sé- lectives, définies ou oligo-d T L'amorce la plus avan- tageuse est un oligonucléotide correspondant à la sé- quence nucléotide de SEQ ID n 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 et conçu pour enrichir en AD Nc contenant la séquence présélectionnée. L'amplification de la séquence d'ADN présélectionnée est de préférence effectuée au moyen d'une technique de réaction en chaîne de polymérase (PCR) (Saiki et al, Science, 1985, 230, 1350-4) Dans cette technique, on utilise une paire d'amorces oligonucléotides dont l'une correspond à une portion de la séquence de nu- cléotide de SEQ ID n 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 et dont l'autre se trouve du côté 3 ' de la première et corres- pond à une portion de la séquence complémentaire, la paire définissant entre elles la séquence d'ADN présé- lectionnée Les oligonucléotides ont généralement une longueur d'au moins 15, de manière optimale de 20 à 26 il - bases et bien que quelques erreurs puissent être tolé- rées en variant les conditions de la réaction, l'ex- trémité 3 ' des oligonucléotides devrait être parfaite- ment complémentaire pour pouvoir amorcer de manière efficace La distance entre les extrémités 3 ' des oli- gonucléotides peut être d'environ 100 à environ 2000 bases Pratiquement l'un des oligonucléotides de la paire utilisée dans cette technique sert également pour amorcer la synthèse d'ADNc La technique ACP elle-même est effectuée sur l'AD Nc sous forme d'une seule chaine utilisant un enzyme tel que la polymérase Taq, et un surplus d'amorceurs oligonucléotides de plus de 20-40 cycles conformément aux protocoles pu- bliés (Saiki et al, Science, 1988, 239, 487-491). Pour raffiner la technique, il peut y avoir plusieurs tours d'amplification, chaque tour étant amorcé par une autre paire d'oligonucléotides Donc, après le premier tour d'amplification, une paire interne d'oli- gonucléotides définissant une séquence d'ADN plus courte (disons, de 50 à 500 bases) peut être utilisée pour un deuxième tour d'amplification Dans ce raffi- nement quelque peu plus fiable, auquel on se réfère sous le nom de "Nested ACP", c'est bien entendu, la séquence d'ADN amplifiée finale qui constitue la sé- quence présélectionnée (Kemp et al, Proc Natl Acad. Sc., 1989, 86 ( 7), 2423-7 et Mullis et al, Methods in Enzymoloqy, 1987, 155, 335 350). L'identification de la séquence d'ADN présélectionnée peut se faire par analyse des produits ACP sur un gel agarose La présence d'une bande au poids moléculaire calculé pour la séquence présélectionnée est une indi- cation positive de la présence d'acide nucléique viral dans l'échantillon Des méthodes alternatives d'iden- tification comprennent celles basées sur le transfert Southern, le transfert de points, la restriction oli- gomère et mise en séquence de l'ADN. La présente invention fournit également un kit d'essai pour la détection de l'acide nucléique viral PT-NANBH, qui comprend i) une paire d'amorces oligonucléotides dont l'une correspond à une portion de la séquence de nuclé- otides de SEQ ID n 3,4,5,18,19,20,21 ou 22 et dont l'autre se trouve du côté 3 ' de la première et correspond à une portion de la séquence com- plémentaire, la paire définissant entre elles une séquence d'ADN présélectionnée; 12 - ii) un enzyme de transcriptase inverse pour la syn- thèse de l'AD Nc à partir de l'ARN de l'échantil- lon en amont de l'amorce correspondant à la sé- quence de nucléotides complémentaire de SEQ ID NO 3,4,5,18,19,20,21 ou 22; iii) un enzyme capable d'amplifier la séquence d'ADN présélectionnée; et facultativement iv) des solutions de lavage et tampons de réaction. Avantageusement le kit d'essai contient également un échantillon de contrôle positif pour faciliter l'iden- tification de l'acide nucléique viral. T Les caractéristiques des amorces et des enzymes seront de préférence celles indiquées ci-dessus en rapport avec la technique ACP. Dans un essai pour le diagnostic de la PT-NANBH impli - quant la détection d'antigènes viraux ou d'anticorps viraux, la méthode peut comprendre la mise en contact d'un échantillon avec un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention ou un anticorps polyclonal ou monoclonal contre ce polypeptide, et la détermination de l'existence ou non d'une liaison antigènes-anti- corps contenue dans l'échantillon L'échantillon peut être prélevé dans tout tissu ou fluide physiologique approprié mentionné ci-dessus pour la détection de l'acide nucléique viral Si on obtient un fluide phy- siologique, il pourra être concentré de manière opti- male pour détecter tout antigène ou anticorps viral. présent. Une série de formats d'analyse peuvent être utilisés. Le polypeptide viral PT-NANBH peut être utilisé pour capturer les anticorps de manière sélective par rap- port à la PT-NANBH dans la solution, pour marquer de manière sélective les anticorps déjà capturés ou à la fois pour capturer et pour marquer les anticorps De plus, le polypeptide viral peut être utilisé dans une variété de formats d'analyse homogènes dans lesquels l'anticorps réagissant avec l'antigène est détecté dans la solution sans séparation de phases. Les types d'essai dans lesquels on utilise le polypep- tide viral PT-NANBH pour capturer les anticorps dans la solution impliquent l'immobilisation du polypeptide sur une surface solide Cette surface devrait pouvoir être lavée d'une manière ou d'une autre Des exemples de surfaces adéquates sont des polymères de différents types (moulées dans des cupules de microtitrage; des perles; des tigettes de différents types; des pipettes 13 - de Pasteur; des électrodes; et des appareils opti- ques), des particules (par ex, latex; érythrocytes stabilisés; cellules bactériennes ou fongiques; spo- res; sols contenant contenant de l'or ou d'autres mé- taux; et gels protéinacés), la dimension habituelle de la particule étant de 0,02 à 5 microns, des membranes (par ex, de nitrocellulose; papier; acétocellulose; et des membranes haute porosité/haute surface d'un ma- tériau organique ou inorganique). La fixation du polypeptide viral PT-NANBH à la surface peut se faire par adsorption passive d'une solution de composition optimale contenant des tensio-actifs, des solvants, des sels et/ou des chaotropes; ou par liai- son chimique active La liaison active peut être ef- fectuée au moyen d'une variété de groupes fonctionnels réactif ou activables qui peuvent être exposés à la surface (par exemple agents de condensation; esters acides actifs, halogénures et anhydrides; groupes ami- nés, oxhydrile ou carboxyle;-groupes sulfydrylef grou- pes carbonyle; groupes diazo; ou groupes insaturés). Facultativement la liaison active peut se faire via une protéine (elle-même attachée à la surface passive- ment ou par liaison active), telle l'albumine ou la caséine, à laquelle le polypeptide viral peut être lié chimiquement par toute une série de méthodes. L'utilisation d'une protéine de cette manière peut conférer des avantages par suite d'un point isolélec- trique, d'une charge, de l'hydrophilicité ou de toute autre propriété physico-chimique Le polypeptide viral peut également être attaché à la surface (générale- ment, mais pas nécessairement, une membrane) suite à la séparation électrophorétique d'un mélange réaction- nel, tel que la précipitation immune. Après avoir mis en contact (avoir fait réagir) la sur- face supportant le polypeptide viral PT-NANBH avec un échantillon, en laissant le temps nécessaire pour qu'il y ait réaction, et le cas échéant, en retirant le surplus d'échantillon par l'un des nombreux moyens disponibles (lavage, centrifugation, filtration, ma- gnétisme ou action capillaire), l'anticorps capturé est détecté par n'importe quel moyen qui donnera un signal détectable On peut, par exemple, y arriver en utilisant une molécule ou une particule marquée comme indiqué ci-dessus qui réagira avec l'anticorps capturé (par exemple, protéine A, protéine G, etc; anti-espè- ce ou sous-type d'anti-immoglobuline; facteur rhuma- toïde; ou anticorps de l'antigène utilisé de manière compétitive ou bloquante), ou toute molécule contenant un épitope contenu dans le pojypeptide. 14 - Le signal détectable peut être optique, radioactif ou physicochimique et peut être fourni directement en marquant la molécule ou la particule avec, par exem- ple, un colorant, un marqueur radioactif, une espèce électroactive, une espèce magnétiquement résonante ou fluorogène, ou indirectement en marquant la molécule ou la particule au moyen d'un enzyme capable luimême de donner lieu à un changement mesurable de n'importe quel type Alternativement le signal détectable peut être obtenu, par exemple, par agglutination ou par un effet de diffraction ou de biréfringence si la surface est sous forme de particules. Des essais dans lesquels un polypeptide viral PT-NANRH est utilisé luimême pour marquer un anticorps déjà capturé demandent une certaine forme de marquage de l'antigène qui permettra sa détection Le marquage peut être direct en attachant chimiquement ou passive- ment, par exemple, un marqueur radioactif, une espèce magnétiquement résonante, un marqueur sous forme de particule ou d'enzyme au polypeptide; ou indirect en attachant toute forme de marque à une molécule qui ré- agira elle-même avec le polypeptide La chimie de liaison d'une marque au polypeptide viral PT-NANBH peut se faire directement via une moitié déjà présente dans le polypeptide, telle qu'un groupe aminé, ou par le biais d'une moitié intermédiaire, telle qu'un grou- pe de maléimides La capture de l'anticorps peut se faire sur n'importe laquelle des surfaces déjà men- tionnées par n'importe quel réactif y compris l'ad- sorption passive ou activée qui se traduira par la liaison de complexes spécifiques d'anticorps ou im- munes En particulier, la capture de l'anticorps pour- rait se faire par une anti-espèce ou un sous-type d'anti-immoglobuline, par facteur rhumatoïde, protéi- nes A, G, etc ou par toute molécule contenant un épi- tope contenu dans le polypeptide. Le polypeptide PT-NANBH marqué peut être utilisé dans une liaison compétitive o la liaison à toute molécu- le spécifique sur n'importe Laquelle des surfaces don- nées comme exemple ci-dessus est bloquée par l'anti- gène dans J'échantillon Alternativement, il peut être utilisé d'une manière non-compétitive dans laquelle J'antigène dans l'échantillon est lié spécifiquement ou non spécifiquement à l'une des surfaces ci-dessus et est également lié à une molécule spécifique bi ou polyvalente (par ex, un anticorps), ses autres valen- ces étant, utilisées pour capturer le polypeptide mar- qué. - Souvent, dans des analyses homogènes, le polypeptide viral PTNANBH et un anticorps sont marqués séparément de manière à ce que lorsque l'anticorps réagit avec le polypeptide viral en solution libre, les deux marques interagissent pour permettre, par exemple, le trans- fert non rayonnant d'énergie capturée par une marque vers l'autre marque avec détection appropriée de la deuxième marque excitée ou de la première marque éteinte (par ex, par fluorimétrie, résonance magnéti- que ou mesure des enzymes) L'addition de polypeptide viral ou d'anticorps dans un échantillon se traduit par une restriction de l'interaction de la paire mar- quée et donc par un niveau différent du signal dans le détecteur. Un format d'essai convenant pour la détection de l'an- ticorps PT-NANBH est le format de l'immuno-dosage avec enzyme en sandwich (EIA) Un polypeptide viral PT- NANBH est appliqué sur des cupules de microtitrage Un échantillon et un polypeptide viral PT-NANBH auxquels sont couplés un enzyme, sont ajoutés simultanément. Tout anticorps PT-NANBH présent dans l'échantillon se lie à Ja fois avec le polypeptide viral recouvrant la cupule et avec le polypeptide viral couplé à l'enzyme. De manière typique le même polypeptide viral est uti- lisé des deux côtés du sandwich Après lavage, l'enzy- me lié est détecté au moyen d'un substrat spécifique impliquant un changement de couleur Un kit d'essai pour utilisation dans un tel EIA comprend: ( 1) un polypeptide viral PT-NANBH marqué d'un enzyme; ( 2) un substrat pour l'enzyme; ( 3) un moyen procurant une surface sur laquelle un polypeptide PT-NANBH est immobilisé; et ( 4) facultativement, des solutions de lavage et/ou tampons. Les polypeptides viraux de la présente invention peu- vent être incorporés dans une formulation de vaccin pour induire l'immunité contre le PT-NANBH chez l'hom- me A cette fin, le polypeptide viral peut être pré- senté en association avec un support acceptable du point de vue pharmaceutique. Pour son utilisation dans une formulation de vaccin, le polypeptide viral peut facultativement être présen- té comme un élément d'une particule née de la fusion du noyau de l'hépatite B, telle que décrite dans Clar- ke et al (Nature, 1987, 330, 381-384), ou un polymère à base de polylysine, tel que décrit dans Tam (PNAS, 1988, 85, 5409-5413) Alternativement, le polypeptide 16 - viral peut facultativement être attaché à une structu- re particulaire telle que liposomes ou ISCOMS. Les supports acceptables du point de vue pharmaceuti- que sont, entre autres, des milieux liquides pouvant être utilisés pour véhiculer le polypeptide viral dans l'organisme d'un patient Un exemple de tels milieux liquides est la solution saline Le polypeptide viral luimême peut être dissous ou mis en suspension sous forme de solide dans le support. La formulation de vaccin peut également contenir un adjuvant pour stimuler la réponse immune et ainsi, ac- centuer l'effet du vaccin Des exemples d'adjuvants sont, entre autres: l'hydroxyde d'aluminium et le phosphate d'aluminium. La formulation de vaccin peut contenir une concentra- tion finale du polypeptide viral allant de 0,01 à 5 mg/ml, de préférence de 0,03 à 2 mg/ml La formulation de vaccin peut être incorporée dans un conteneur sté- rile qui est alors scellé et stocké à basse températu- re, par exemple, à 40 C, ou peut être lyophilisée. Pour introduire l'immunité contre le PT-NANBH chez l'homme, on peut administrer une ou plusieurs doses de la formulation du vaccin Chaque dose peut être de 0,1 à 2 ml, de préférence de 0,2 à 1 ml Une méthode pour induire l'immunité contre le PT-NANBH chez l'homme consiste à administrer une quantité efficace de formu- lation du vaccin comme il a été dit précédemment. La présente invention fournit également l'utilisation d'un polypeptide viral PT-NANBH dans la préparation d'un vaccin pour utilisation dans l'induction de l'im- munité contre le PT-NANBH chez l'homme. Les vaccins de la présente invention peuvent être ad- ministrés par toute méthode appropriée pour l'adminis- tration de vaccins, y compris l'injection orale et pa- rentérale (ex, intraveineuse, sous-cutanée ou intra- musculaire) Le traitement peut consister en une seule dose de vaccin ou en plusieurs doses réparties dans le temps. Les souches de E coli transformées suivantes ont été déposées auprès de la National Collection of Type Cul- tures (NCTC), Central Public Health T Laboratory, 61, Colinda Je Avenue, Londres, NW 9 5 HT aux dates indi- quées: 17 - i) E coli TG 1 transformés par p DX 113 (WDOO 1); Dépôt n NCTC 12369; 7 décembre 1989. ii) E coli TG 1 transformés par p DX 128 (WD 002); Dépôt n NCTC 12382; 23 février 1990. iii) E coli TG 1 transformés par p 136/155 (WD 003); Dé- pôt n NCTC 12428; 28 novembre 1990. (iv) E coli TG 1 transformés par p 156/92 (WD 004): Dé- * pôt n NCTC 12429; 28 novembre 1990. (v) E coli TG 1 transformés par p 129/l 64 (WD 005); Dé- pôt N O NCTC 12430; 28 novembre 1990. (vi) E coli TGl transformés par p DXl 36 (WD 006); Dépôt n NCTC 12431; 28 novembre 1990. Dans les figures, la figure 1 représente la production de p DX 122 décrite à l'Exemple 7, la figure 2 représen- te deux séquences fondues alternatives décrites à l'Exemple 17, et la figure 3 représente des cartes de restriction, de SEQ ID n 21 et 22. Dans la liste de séquences, il y a des listes SEQ ID n 1 à 25 auxquelles référence est faite dans la des- cription et dans les revendications. Les exemples suivants servent à illustrer l'invention. EXEMPLE 1 Synthèse de l'AD Nc Le plasma regroupé ( 160 mls) de deux personnes (appe- lées A et L) connues pour avoir transmis la NANBH via des transfusions a été dilué ( 1:2,5) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite centri- fugé à 190 000 g (par ex, 30 000 t/min dans un rotor MSE 8 x 50) pendant 5 heures à 4 C Ce qui surnageait a été retenu comme source des anticorps spécifiques pour la sélection ultérieure des bibliothèques d'AD Nc I,a pastille a été remise en suspension dans 2 mls de 20 m M trischlorhydrate, 2 m M EDTA 3 % SDS, 0,2 M Na Cl ( 2 x PK) extrait 3 fois avec un volume égal de phénol, 3 fois avec du chloroforme, une fois avec de l'éther, et ensuite précipité avec 2,5 volumes d'éthanol à -20 C. Le précipité a été remis en suspension dans 10 ul de J.10 m M tris-chlorhydrate, lm M EDTA à p H 8 0 (TE). L'acide nucléique a été utilisé comme modèle dans un kit de synthèse d'AD Nc (Amersham International plc, Amersham, Royaume-Uni) avec amorçage oligo-d T et hexa- nucléotide sélectif Les conditions de la réaction étaient telles que recommandées par le fournisseur du 18 - kit Spécifiquement lul d'acide nucléique a été utili- sé pour une première réaction de synthèse de brin qui a été marquée ( 4 _-32 P) d CTP (Amersham; activité spé- cifique 3000 Ci/mmol) dans un volume final de 20 ul et incubé à 42 C pendant 1 heure La totalité de première réaction de brin a ensuite été utilisée pour la deu- xième réac tion de synthèse du brin, contenant E co- li R Nase H ( 0,8 U) et de la polymérase ADN I ( 23 U) dans un volume final de 100 ul, incubé à 12 C pendant 60 minutes, ensuite à 22 C pendant 60 minutes L'en- semble de la réaction a ensuite été incubé à 700 C pen- dant 10 minutes, placé sur glace, 1 U de polymérase d'ADN T 4 y a été ajoutée et ensuite il a été incubé à 37 C pendant 10 minutes La réaction a été arrêtée en ajoutant 5 ul de 0,2 M EDTA p H 8. Les nucléotides non incorporés ont été enlevés en pas- sant la réaction dans une colonne NICK (Pharmacia Ltd, Milton Keynes, Royaume-Uni) L'AD Nc a ensuite été ex- trait deux fois avec du phénol, trois fois avec du chloroforme, une fois avec de l'éther et ensuite 20 ug de dextran ont été ajoutés avant précipitation avec 2,5 volumes d'éthanol 100 %. EXEMPLE 2 Production de bibliothèques d'expression La pastille d'AD Nc séchée a été remise en suspension dans 5 ul de TE stérile et ensuite incubée avec 500 ng de linkers Eco RI (Pharmacia, GGATTCC phosphorylé) et 0,5 U de Jigase d'ADN T 4 (New England Bio Labs, Bever- ley, MA, USA) dans un volume final de 10 ul contenant m M de tris-H Cl p H 7,5, 10 m M Mg C 12, 10 m M DTT, lm M ATP pendant 3 heures à 15 C La ligase a été neutrali- sée en chauffant à 65 C pendant 10 minutes et l'AD Nc a été digéré avec 180 U d'Eco RI (BCL, Lewes, UIJ K) dans un volume final de 100 Oul à 37 C pendant 1 heure De l'EDTA a été ajouté à une concentration finale de 10 m M et l'ensemble de la réaction chargé sur une colonne Ac A 34 (LKB) Des fractions ( 50 ul) ont été collectées et comptées Le pic d'AD Nc dans le volume exclu ( 980 cpm) a été regroupé, extrait deux fois avec du phénol, trois fois avec du chloroforme, une fois avec de l'é- ther et ensuite précipité à l'éthanol. L'AD Nc ds a été remis en suspension dans 5 ul de TE et ligaturé sur des bras lambda gtll Eco RI (Gibco, Pais- ley, Ecosse) dans une réaction de lOul contenant 0,5 U de ligase d'ADN T 4, 66 m M de tris-hydrochlorate, 10 m M de Mg C 12, 35 m M de DTT p H 7,6 à 15 C pendant la nuit. Apres neutralisation de la ligase par chauffage à 65 C pendant l 0 minutes, 5 ul de la réaction ont été ajoutés à une réaction de repliage d'Amersham et incubés à 19 - 22 C pendant 2 heures Le matériel replié a été titré sur le brin Y 1090 E coli (Huynh et al 1985) et conte- nait un total de 2,6 x 104 résultant de la recombinai- son. Des cellules pour monocouches (Y 0190) ont été prépa- rées en inoculant 10 mis de bouillon-L avec une seule colonie d'une plaque d'agar et en agitant pendant la nuit à 37 C Le jour suivant, 0,5 mls de la culture de la nuit ont été dilués avec 10 mls de bouillon-L frais et 0,lml IM Mg SO 4 et 0,lml 20 % (p/v) de maltose ont été ajoutés La culture a été agitée pendant 2 heures à 37 C, les bactéries récoltées par centrifugation à 5.000 g pendant 10 minutes et remises en suspension dans 5 mis de l Om M Mg SO 4 pour produire le stock de cellules pour monocouches Une portion (lul) du maté- riel replié a été mélangée avec 0,2 ml de cellules pour monocouches, incubée à 37 C pendant 20 minutes avant d'ajouter 3 mis de gélose de couverture et l'ensemble du mélange versé sur une plaque L-agar de 90 min Après incubation pendant la nuit à 47 C, les plaques ont été comptées et le nombre total de phages résultant de la recombinaison a été déterminé Le matériel replié restant ( 500 ul) a été stocké à 4 C. Des bibliothèques supplémentaires ont été préparées de manière substantiellement similaire. EXEMPLE 3 Sélection des bibliothèques d'expression La bibliothèque initiale décrite à l'Exemple 2 a été plaquée sur le brin Y 1090 E coli à une densité d'envi- ron 5 x 103 pfu par plaque de 140 mm et incubée à 37 C pendant 2 heures jusqu'à ce que les plaques soient vi- sibles Des filtres de nitrocellulose stériles ayant été imprégnés d'IPTG (isopropyl-thiogalactoside) ont été laissés en contact avec la plaque pendant 3 heures et ensuite retirés Les filtres ont d'abord été blo- qués par incubation avec une solution de blocage ( 3 %(p/v)BSA/TBSTwee(lOm M Tris-H Cl p H 8, 150 m M Na Cl, 0,05 %(v/v) Tween 20) contenant 0,05 % bronidox) ( 20 mls/ filtre) et ensuite transférés vers la solution tampon de liaison (l%(p/v)BSA/TBS/Tween contenant 0,05 % bro- nidox) contenant des anticorps purifiés (par chromato- graphie en résine échangeuse des ions) provenant du plasma regroupé de A & L ( 20 ug/ml) Après incubation à température ambiante pendant 2 heures, les filtres ont été lavés trois fois avec TBS-Tween et ensuite incubés dans la solution tampon de liaison contenant un sérum anti-humain de mouton biotinylé (l:250) Après I heure à température ambiante, les filtres ont été lavés 3 fois avec TBS/Tween et ensuite incubés dans la solu- tion tampon de liaison contenant un complexe de strep- - tavidine/peroxydase ( 1:100) Le signal s'est développé avec DAB Les signaux positifs sont apparus ous forme de plaques (colorées). Sur un total de 2,6 x 104 plaques sélectionnées, 8 signaux positifs ont été obtenus lors du premier tour de sélection En utilisant les filtres comme calibre, les régions des plaques originales correspondant à ces signaux positifs ont été cueillies au moyen d'une pi- pette de Pasteur stérile Les bouchons agar ont été mis en suspension dans 0,1 ml de tampon SM et les pha- ges ont pu se diffuser Le titre de phages de chaque bouchon a été déterminé sur le brin Y 1090 E coli Le stock de phages de chaque bouchon a ensuite été réexa- miné de manière sélective comme auparavant sur des plaques séparées de 90 mm à une densité d'environ 1 x 103 pfu par plaque Sur les 8 signaux positifs du premier tour, un était clairement positif au second tour, c à d > 1 % de plaques positives, il a été appelé JG 2 Cela correspond à un taux positif de 40/106 dans la bibliothèque. Ceci et d'autres phages positifs identifiés de façon similaire dans d'autres bibliothèques d'AD Nc décrites à l'Exemple 2 ont ensuite été purifiés par des tours répétés d'examen sélectif de plaques à faible densité (I-200 pfu/plaque de 90 mm) jusqu'à ce que 100 % des plaques soient positives avec la sélection d'anticorps A&L Trois phages résultant de cette recombinaison sont JGI, JG 2 et JG 3. EXEMPLE 4 Sélection secondaire de JG 1, JG 2 et JG 3 avec un échantillonnage de sérum Chacun des phages résultant de la recombinaison, JG 1, JG 2 et JG 3, ont été purifiés sur plaque et stockés sous forme de stocks titrés dans un tampon SM à 40 C. Ces phages ont été mélangés ( 1:1) avec un stock de phages identifiés comme étant négatifs dans l'Exemple 3 et le mélange utilisé pour contaminer le brin Y 1090 E.coli à 1000 pfu par plaque Des décollements de pla- que ont été effectués et traités comme décrit à l'Ex- emple 3, si ce n'est que les filtres ont été divisés en quadrants et que chaque quadrant a été incubé avec un anticorps différent; il s'agissait des anticorps A&L ( 20 ug/ml); du plasma de A ( 1:500); du plasma de L ( 1:500) et d'Ig G de H ( 20 mg/ml) H est un patient pro- bablement positif pour les anticorps PT-NANBH car il s'agissait d'un hémophile qui avait reçu un Facteur VIII n'ayant pas subi de traitement thermique A la fin de la réaction, chaque filtre a été jugé à l'insu comme étant positif (lorsqu'il y avait manifestement deux types de signal) ou négatif (lorsque toutes les plaques donnaient le même signal) Ce pouvait être un jugement subjectif et les résultats ont donc été com- parés et seuls les filtres pour lesquels un acord é- tait atteint à la majorité ont été considérés comme positifs Les résultats sont présentés au tableau 1. TABLEAU 1 A&L A L H JG 1 + + JG 2 + + + + JG 3 + + + + JG 1 est apparu comme réagissant uniquement avec des anticorps du patient A et non de I ou H; ce n'est pas ce qu'on attendrait d'un véritable polypeptide résul- tant de la recombinaison lié à PT-NANBH et donc JG 1 a été écarté de l'analyse Par ailleurs, JG 2 et JG 3 ont montré des réactions positives nettes avec les trois sérums PT-NANBH A, L et H; on a poursuivi leur analy- se. Le type d'analyse décrit ci-dessus a été répété pour JG 2 et JG 3, si ce n'est que les filtres ont été divi- sés en portions plus petites et que celles-ci ont été incubées avec des panneaux de sérums positifs et néga- tifs L'échantillonnage de sérums positifs comprenait les sérums de 10 hémophiles et de 9 drogués utilisant la voie intraveineuse (IVDA) Ceux-ci représentaient la meilleure source de sérums positifs même si le taux positif réel était inconnu L'échantillonnage de sé- rums négatifs a été obtenu de donneurs accrédités étroitement contrôlés pendant de nombreuses années par le North London Blood Transfusion Centre, Deansbrook Road, Edgware, Middlesex, U K et n'ont jamais présen- té aucun signe d'infection pour toute une série d'a- gents y compris PT-NANBH Les résultats sont présentés aux tableaux 2 et 3. 22 - TABLEAU 2 I.D. V 19146 V 27083 V 29779 V 12561 V 15444 V 18342 V 8403 V 20001 V 21213 Hémophiles M 1582 M 1581 M 1575 M 1579 M 1585 M 1576 M 1580 M 1578 M 1587 MI 577 JG 2 4/4 2/4 0/4 0/5 3/4 4/4 3/4 4/4 3/4 4/4 /5 3/5 /5 3/5 1/5 1/5 1/5 1/5 2/5 JG 3 0/5 0/5 0/5 4/5 /5 0/5 0/5 0/5 0/5 4/5 /5 0/5 /5 0/5 1/5 0/5 0/5 3/5 1/5 Les positifs sont soulignés. TABLEAU 3 IVDA JG 2 JG 3 JG 2 +JG 3 JG 2 ou JG 3 6/9 ( 66 %) 2/9 ( 22 %) 1/9 ( 11 %) 7/9 ( 77 %) Hémophile /10 ( 50 %) 4/10 ( 40 %) 3/10 ( 30 %) 6/10 ( 60 %) Donneur ac- crédité 0/10 ( 0 %) 0/J O ( 0 %) 0/10 ( 0 %) 0/10 ( 0 %) Ces données sont compatibles avec l'hypothèse selon laquelle les deux résultats de la recombinaison ex- priment des polypeptides associés avec un agent res- ponsable du PT-NANBH et que ces polypeptides ne sont pas identiques mais pellvent partager certains sites antigéniques. EXEMPLE 5 Cartographie de la restriction et mise en séquence de l'ADN de JG 2 et JG 3 Une portion ( 10 ul) des stocks de phages de JG 2 et JG 3 a été bouillie pour dénaturer les phages et exposer l'ADN Cet ADN a alors été utilisé comme modèle dans une amplification PCR en utilisant la polymérase Taq; chaque réaction contenait ce qui suit dans un volume final de 50 ul: l Om MTris-H Cl, 50 m MKC 1, 3,5 m M Mg C 12, 0,01 % de gélatine, p H 8,3 à 25 C plus des IVD As amorces oligonucléotides d 19 et D 20 (SEQ ID n 1 et 2 respectivement; 200 ng chacun); ces amorces sont si- tuées dans les séquences lambda flanquant le site de clonage Eco RI et amorcent donc l'amplification de tout ce qui est cloné dans cette région. Une portion de la réaction a été analysée sur un gel agarose à l% et comparée aux marqueurs L'amplifica- tion de JG 2 a produit un fragment d'environ 2 Kb; JG 3 un d'environ l Kb Le reste du mélange de la réaction a été extrait avec du phénol/chloroforme en présence de m M EDTA et de SDS à 1 % et l'ADN récupéré par préci- pitation par l'éthanol Le matériel amplifié a alors été digéré avec 201 J d'Eco RI pendant 60 minutes à 37 C et séparé sur un gel agarose 1 % LGT dans TAE Les fragments ont diminué de taille comme prévu et ont été élués et purifiés au moyen d'Elutips (S&S) Les in- serts JG 2 et JG 3 ont été ligaturés avec p UC 13 digéré par Eco RI et transformés en brin TG 1 E coli Les élé- ments résultant de la recombinaison ont été identifiés comme colonies blanches sur des plaques X-gal/L-Amp (plaques L-agar complétées par 10 Oug/ml d'ampicilline, 0,5 mg/ml X-gal) et ont été vérifiés par des prépara- tions de plasmide à petite échelle et digestion d'en- zymes réducteurs Eco RI pour déterminer la taille de l'insert ADN Le plasmide résultant de la recombinai- son contenant l'insert JG 2 a été appelé DM 415 et celui contenant JG 3, DM 416. La séquence de l'insert JG 2 a été déterminée par mise en séquence bicaténaire de l'ADN plasmide et par sous- clonage en vecteurs de mise en séquence M 13 tels que mp 18 et mp 19 suivi d'une mise en séquence monobrin La séquence de l'insert JG 3 a été déterminée de la même manière L'ADN en résultant et les séquences d'acides aminés qui en résultent sont indiqués dans SEQ ID n 3 et 4. EXEMPLE 6 Expression du polypeptide PT-NANBH dans les E.coli Le plasmide p DM 416 ( 5 ug) a été digéré avec Eco RI ( 20 U) dans un volume final de 20 ul et l'insert l Kb récupéré par élution dans un gel agarose 1 % LGT Ce matériel a alors été "poli" en utilisant un fragment de Klenow et un mélange d NTP pour remplir les extrémités en sur- plomb de l'Eco RI L'ADN a été récupéré par précipita- tion à l'éthanol après extraction avec du phénol/ chloroforme Le fragment à bord émoussé a été ligaturé en p DEV 107 clivé/phosphatasé Sma I (un vecteur qui per- met le clonage à l'extrémité 3 ' de lac Z) et ensuite transformé en cellules TG 1 E coli Il y a eu une aug- mentation de l'ordre de 30 fois des colonies pendant un contrôle vecteur seul Les transformants contenant le plasmide requis résultant de la recombinaison ont été identiés par hybridation au moyen d'une sonde radioactive produite par amplification ACP du produit de recombinaison JG 3 Douze colonies ont été analysées par digestion avec des enzymes réducteurs (Sal I) des mini-préparations de plasmide pour déterminer l'orien- tation de l'insert Un quart de ces produits de recom- binaison étaient correctement orientés pour exprimer la séquence PT-NANBH sous forme d'une fusion avec 5- galactosidase L'un de ceux-ci (p DX 113) a été pris pour continuer l'analyse. Une colonie de p DX 113 a été utilisée pour inoculer 50 mis de bouillon de L, incubé à 37 C et agité jusqu'à la phase "mid-log" et poussée à s'exprimer par addi- tion de 20 m M IPTG Après 3 heures, les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5 000 g pendant 20 minutes, remises en suspension dans 50 mls PBS et re- pastillées T Les cellules pastillées ont été remises en suspension dans 5 mis de solution tampon ( 25 m M Tris- HC, lm M EDTA, lmg/ml lysozyme, 0,2 %(v/v) Nonidet-P 40, p H 8,0) par gramme de pastille et incubées à O C pen- dant 2 heures T,'ADN bactérien émis a été digéré par addition de D Nase I et de Mg SO 4 pour atteindre des concentrations finales de 40 ug/ml et 2 m M respective- ment pour réduire la viscosité. Ce lysat brut a été analysé par PAGE et le modèle des protéines coloré au bleu Coomassie Une protéine d'en- viron 150 k D a été induite dans p DX 113 contenant des bactéries et on a estimé que cette protéine représen- tait 10-15 % de la protéine totale Des gels similai- res ont été transférés à la membrane PVDF (GRI, Dun- mow, Essex, Royaume-Uni) et les membranes incubées avec des sérums PT-NANBH positifs et négatifs; la pro- téine 150 k D a réagi avec les sérums A et L mais pas avec le sérum humain normal Des traces de contrôle contenant du lysat des E coli exprimant la g-galacto- sidase n'ont pas réagi avec les sérums A, L ou avec le sérum humain normal. On a ajouté de l'urée au lysat brut pour avoir une concentration finale de 6 M et le matériel insoluble a été récupéré par centrifugation L'extrait d'urée 6 M a été utilisé pour recouvrir directement les cupules de microtitrage pendant 1 heures à 37 C Les cupules ont été lavées trois fois avec de l'eau distillée double et ensuite bloquées par addition de 0, 25 ml de BSA à 0,2 % par cupule contenant 0,02 % Na N 3 pendant 20 mi- nutes à 37 C Ta plaque a alors été aspirée Des pla- ques de contrôle recouvertes d'un lysat brut d'un brin E coli produisant de la g-galactosidase (p XY 461) ont été produites de la même façon Ces plaques ont été utilisées dans des analyses ELISA comme décrit à l'exemple 10. EXEMPLE 7 Expression du polypeptide PT-NANBH dans des cellules d'insectes TL'insert PT-NANBH de JG 3, isolé comme décrit à l'Exem- ple 5, a été cloné en châssis avec les 34 premiers nu- cléotides de polyhédrine dans le vecteur p Ac 360 (Tuck- ow et Summers, Biotechnology, 1988, 6, 47-55), en uti- lisant notre connaissance du cadre de lecture du gène lac Z dans le vecteur gtll Des oligonucléotides ont été synthétisés qui ont été en mesure de s'hybrider en séquences gtll flanquant le site de clonage Eco RI et qui permettraient l'amplification de l'insert par PCR. Ces oligonucléotides comprenaient des sites de res- triction Bam HI convenablement placés pour permettre le clonage direct dans le site Bam HI de p Ac 360, en pla- çant le gène inséré en châssis avec les séquences ter- minales aminées de la polyhédrine. Une petite quantité de produit de recombinaison gtll JG 3 a été bouillie pour exposer l'ADN et ensuite uti- lisée dans une amplification PCR contenant les amorces oligonucléotides d 75 et d 76 (SEQ ID n O 6 ry 7; 200 mg) et 0,5 U de polymérase Taq. Après amplification, la réaction a été extraite avec un volume égal de phénol/chloroforme, précipitée avec de l'éthanol et digérée avec 10 U de Bam HI dans un vo- lume final de 30 ul Le fragment amplifié a été résolu dans un gel agarose à 1 %, élué et ligaturé dans le p Ac 360 digéré avec le Bam HI pour produire le construct de transfert p D Xl 19 Le plasmide résultant de la re- combinaison ( 2 ug) et l'ADN de type sauvage Ac NPV (tug) ont été cotransfectés dans des cellules d'insectes par précipitation du phosphate de calcium Te virus négatif d'inclusion résultant de la recombinaison a été choisi par sélection visuelle Apres trois tours de purification de plaque, le virus résultant de la recombinaison (BHC-5) a foisonné et l'expression de la protéine résultant de la recombinaison dans les cellu- * les d'insectes a été évaluée par SDS-PAGE, transfert Western et ELISA Une protéine abondamment exprimée d'environ 70 k D est produite dans les cellules contami- nées Cette protéine réagit avec les sérums PT-NANBH suivant transfert Western et ELISA. Un autre produit de recombinaison du bacillovirus (BHC-7) a été construit pour inclure des séquences JG 2 en sus des séquences JG 3 présentes en BHC-5, comme dé- 26 - crit à la figure 1 Les séquences PT-NANBH présentes dans JG 2 ont été amplifiées et clonées dans le vecteur p Ac 360 comme dit ci-dessus pour produire p D X 118 et les fragments appropriés de Bam HI/Sal I de p DX 119 et p DX 118 ont été liés ensemble dans cet ordre dans p Ac 360 pour produire le construct de transfert p DX 122. Les plasmides résultant de la recombinaison ont été identifés par hybridation et l'orientation de 1 'ADN inséré déterminée par analyse des enzymes réducteurs. Le virus résultant de la recombinaison a été produit comme décrit ci-dessus et la protéine exprimée analy- sée par SDS-PAGE, transfert Western et ELISA Un poly- peptide très abondant ( 40 % du total de la protéine de la cellule) 95 k Da réagissant avec les sérums PT-NANBH a été trouvé dans les cellules infectées. EXEMPLE 8 Purification du pol Ypeptide DX 113 Le brin TGA E coli contenant le plasmide p DX 113 (ap- pelé brin WDL 001) a été incubé et induit dans un fer- menteur de 1,5 litres (modèle SET 002, SGT, Newhaven, East Sussex, Royaume-Uni) à 37 C pendant 5 heures Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5 000 g pendant 20 minutes et traitées comme suit. a) Extraction. L,es cellules humides sont remises en suspension ( 1:20, p/v) dans la solution tampon A ( 50 m M Tris-H Cl, 5 Om M Na CI, Am M EDTA, 5 m M DTT, 10 %(v/v) glycérol, p H 8,0) Un lysozyme est ajouté à 5 mg solide par ml de suspension et le mélange est laissé à 4 C Après 15 minutes, le méllange était soniqué ( 6 um amplitude crête à crête) sur de la glace pendant 3 minutes au total (poussées de 6 x 30 sec) De la D Nase I a été ajoutée à raison de 4 ug par ml de suspension et le mélange abandonné pendant 30 minutes La suspension a été centrifugée pendant 20 minutes à 18 000 g(max) et le surnageant écarté. La pastille a été remise en suspension dans la solu- tion tampon B ( 25 m M Hepes, 4 m M urée, 5 m M DTT, ph 8,0) dans un rapport de 1:6 (p/v) pour obtenir une suspen- sion fine Celle-ci a été centrifugée à 18 000 g(max) pendant 20 minutes et le surnageant écarté La pas- tille a été remise en suspension dans la solution tampon C ( 25 m M Hepes, 8 M urée, 2 m M DTT, p H 8,0) dans un rapport de 1:6 (p/v); avant la mise en suspension, on a ajouté: de la leupeptine (lug/mil), de la pep- statine (lug/ ml) et E 64 (lug/ml) La suspension a été centrifugée à 18 000 g(max) pendant 30 minutes et le surnageant décanté et conservé La pastille a été re- 27 - mise en suspension dans 25 m M Hepes, SDS à 1 % p H 8,0. b) Chromatographie. Le surganeant de la fraction de 8 M d'urée a été dilué 1:5 (v/v) dans 25 m M Hepes, 8 M urée, 2 m M DTT, p H 8,0 et fractionnée sur une colonne de 7 ml Q-Sépharose Les protéines ont été éluées via un gradient de sel de 0- l M Na CI La chromatographie et la manipulation des données ont été contrôlées par un FPLC_(Pharmacia) Le DX 113 élue à environ 500 m M Na Cl et est virtuellement homogène suivant analyse SDS Page et transfert Western. EXEMPLE 9 Purification du polypeptide BHC-5 Des cellules Sf 9 ( 2 xl 09) ont été contaminées par un stock de virus BHC-5 résultant de la recombinaison (moi 5) Après incubation à 28 C pendant 2 jours, les cellules ont été récoltées par centrifugation et en- suite traitées comme suit: a) Extraction. La masse de cellules humides ( 1,2 g) a été remise en suspension dans 6 msl de solution tampon A ( 25 m M Hepes, m M DTT, lug/ml de leupeptine, lug/ml de pepstatine, Jug/mo d'E 64 p H 8,0) Les cellules remises en suspen- sion ont été placées sur de la glace et soniquées par 3 secousses de 15 secondes (amplitude crête à crête 6 um) séparées par des périodes de repos de 30 secondes. La suspension soniquée a été centrifugée à 18 000 g (max) pendant 20 minutes et le surnageant écarté La pastille a été remise en suspension dans la solution tampon A plus 4 M d'urée ( 6 mls) et centrifugée à l 8 000 g(max) pendant 20 minutes Le surnageant a été écarté et la pastille ré-extraite avec la solution tampon A plus 8 M d'urée ( 6 ml) Après centrifugation à 18.00 Og (max) pendant 30 minutes, le surnageant a été retenu et dilué 1:6 dans la solution tampon plus 8 M urée Cet extrait a été chromatographié sur une colon- ne mono-Q équilibrée dans la même solution tampon La colonne a été élulée au moyen d'un gradient de sel ( 0- 1 M Na Cl) sur l 2 volumes de colonne Le BHC-5 a élué à environ 0,45-0,55 M Na CI et avait une pureté supérieure à 90 % suivant l'estimation de SDSPAGE Le rendement était d'environ 70 %. EXEMPLE 10. Performance de DX 113 et des polypeptides BHC-5 et 7 dans une ELISA Les plaques Microelisa ( 96 well, Nunc) ont été direc- tement recouvertes de 50 mm de solution tampon de bi- carbonate ( 50 m M bicarbonate de sodium et 50 m M carbona- 28 - te de sodium, titrés à un p H de 9,5) avec soit un ly- sat brut de BHC-5 de 6 M urée ou avec du p DXI 13 puri- fié Les plaques ont été bloquées avec BSA à 0,2 % et ensuite incubées pendant 30 minutes à 37 C avec des sérums dilués dans un rapport de 1:20 (bacille) ou 1:100 (E coli) Après lavage dans une solution saline Tween ( 0,85 % saline, 0,05 % Tween 20, 0,01 % Bronidox), les plaques ont été incubées avec de l'immuno-giobuli- ne anti-humaine de chèvre en conjonction avec la péro- xydase ( 1:2000) pendant 30 minutes à 37 C Les plaques ont alors été lavées dans une solution saline Tween et colorées en ajoutant le substrat chromogénique TMB (tétraméthyl-benzidine-H Cl) ( 100 Oul/cupule) et en incu- bant pendant 20 minutes à température ambiante La ré- action a été arrêtée avec 50 ul d'acide sulfurique 2 M et l'OD 450 déterminée (Tableau 4). TABLEAU 4 Format ELISA Iq anti-humain indirect pour la détection des anticorps NANB Bacille E coli BHC-5 (phase DXl 13 (phase solide) solide) > 2 1,670 1,855 1,531 1,083 3,015 Sérums de patients 1,842 1,558 à haut risque posi 0,526 0,638 tifs dans l'essai > 2 1,516 1,823 1,602 1,779 1,318 1,122 0,616 1,686 1,441 0,259 0,205 0,158 0,120 0,298 0,209 Sérums de patients 0,194 0,111 à haut risque néga 0,282 0,181 tifs dans l'essai 0,263 0,165 0,184 0,163 0,121 0,099 0,243 0,104 Donneur accrédité 0,224 0,119 Les sérums de patients à haut risque d'infection PT- NANBH (IVDA's, hémophiles) ont été essayés comme dé- crit; toutes les données sont exprimées sous forme de lectures O D 450, avec le donneur accrédité comme contrôle négatif Dans ce groupe particulier de sérums, 10/19 sont positifs dans les deux phases solides- - En outre, le DX 113 a été conjugé à une phosphatase al- caline au moyen d'une réduction SATA/maléimide et une analyse immunométrique a été réalisée Les sérums NANB positifs et négatifs connus ont été dilués comme indi- qué dans le sérum du donneur accrédité et ajoutés à une phase solide recouverte de BHC-7 Soit simultané- ment ou après incubation ( 30 minutes à 37 C), on a ajouté le conjugué DX 11 13 ( 50 l-1, 1:2000) Après incuba- tion à 37 C pendant 30 minutes, les plaques ont été lavées avec une solution tampon de 50 m M de bicarbonate et colorées au moyen d'un système d'amplification IQ Bio et l'OD 492 déterminé (Tableau 5). TABLEAU 5 ELISA immunométrique (polypeptide marqué) pour la détection d'anticorps NANB Positifs Négatifs Donneur ac- dans l'essai dans l'essai? crédité > 2 0,217 0,234 0,821 0,252 > 2 0,214 0,542 0,257 0,876 0,308 1,583 0,278 > 2 0,296 > 2 0,273 1,830 0,262 > 2 0,251 Je Ainsi, que ce soit dans l'essai format-antiglobuline ou dans l'essai immunométrique, tous les patients à haut risque donnent des résultats concordants. EXEMPLE 11 Formulation de vaccin Une formulation de vaccin peut être préparée par des techniques conventionnelles au moyen des constituants suivants dans les quantités indiquées: Polypeptide viral PT-NANBH > 0,36 mg Thiomersal 0,04-0,2 mg Chlorure de sodium Eau 1 mi. - EXEMPLE 12. Production d'anticorps monoclonaux contre les polypep- tides PT-NANBH L'insert ADN du DM 415 a été sous-cloné dans le vecteur p 36 C de transfert du bacillovirus et le virus résul- tant de la recombinaison produit par une méthode es- sentiellement similaire à celle décrite à l'Exemple 7. Te virus résultant de la recombinaison a été appelé BHC-l et présentait de très faibles niveaux de protéi- ne spécifique à PT-NANBH Des cellules Sf-9 ( 5 x 107 cellules/ml) contaminées avec BHC-l ont été lysées dans du PBS contenant 1 % (v/v) NP 40 et centrifugées à 13000 g pendant 2 minutes Le surnageant a été passé sur Extractigel-D (Pierce Chemicals) pour retirer le détergent et ensuite mélangé sous forme d'émulsion 1:3 avec un adjuvant complet de Freund On a effectué une injection sous-cutanée de 0,1 ml d'émulsion (équivalent à 5 x 106 cellules) à des souris 14 et 28 jours sui- vant l'injection, on a fait aux souris une injection intrapéritonéale de 0,lml (équivalant à 5 x 106 cellu- l.es) d'un extrait exempt de détergent de cellules Sf-9 contaminées par BHC-7; le BHC-7 contient un insert ADN produit en ligaturant ensemble les régions de chevau- chement de DM 415 et DM 416 (Exemple 7) Elles ont subi une ablation de la rate trois jours plus tard. Les cellules de rate ont été fondues avec des cellules de myélome N So en présence de PEG 1500 en utilisant des techniques type Les cellules d'hybridome en résultant ont été choisies par croissance dans un milieu HAT (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine) 10-14 jours après la fusion, le surnageant a été examiné de maniè- re sélective par ELISA pour constater l'activité anti- PT-NANBH Les cupules qui montraient une réactivité à la fois aux antigènes DX 113 et BHC-7 (Exemple 10) ont été identifiées et les colonies individuelles ont été transférées dans d'autres cupules, incubées et re-tes- tées Les cupules présentant une réactivité spécifique à ce stade ont été re-clonés à une dilution limitée pour assurer la monoclonalité. EXEMPLE 13 Détection de l'acide nucléique viral PT- NANBH chez des patients séropositifs Sérums: Les échantillons de 1400 donneurs enrôlés dans une étude prospective sur l'hépatite post-transfu- sionnelle ont été congelés à -20 C Des échantillons avant transfusion et après transfusion sériels des 260 récipients ont été stockés de la même manière Les échantillons d'après la transfusion ont été prélevés tous les quinze jours pendant 3 mois, une fois par 31 - mois pendant 6 mois et 6 mois plus tard, jusqu'à 18 mois Les sérums gelés du donneur et du récipient relatifs à trois incidents de PT-NANBH survenus en 1981 étaient également disponibles pour étude Le diagnostic de la PT-NANBH était basé sur une augmenta- tion de la transférase de l'acide aminé alanine du sé- rum (ALT), dépassant 2,5 fois la limite supérieure à la normale dans au moins deux échantillons séparés après transfusion D'autres virus hépatotropes ont été exclus par des essais sérologiques et les causes non virales de lésion hépatocellulaire ont été exclues par des études conventionnelles cliniques et en laboratoi- re. Immuno-dosage: Des échantillons de sérum ont été tes- tés rétrospectivement afin de détecter la présence d'anticorps contre 1 'HCV (antigène C 100) aul moyen du kit Ortho Diagnostics ELISA utilisé d'après les ins- tructions du fabricant Des sérums réactifs à plu- sieurs reprises ont été titrés jusqu'au point final dans un sérum humain négatif pour 1 'anti-C 100. Détection des séquences virales PT-NANBH: L'ARN du sé- rum ou du plasma a été extrait, soumis à transcriptase inverse et amplifié comme dit ci-dessous Les amorces oligonucléotides de la transcriptase inverse/PCR ont été dérivées de la séquence de nucléotide du clone JG 2 isolé dans l'EXEMPTE 3, et synthétisées-sur un synthé- tiseur Applied Biosystems 3831 A Les séquences des qua- tre amorces oligonulcléotides ont été les suivantes: Désignation SEQ ID N Dimension du produit d 94 sens 8 829 bp d 95 anti-sens 9 Ni sens 10 402 bp N 2 anti-sens 11 (i) Extraction ARN -50 ul de sérum (ou de plasma) ont été portés à 200 ul en ajoutant de J'eau distillée stérile L'échantillon de 200 ul a été ajouté à un volume égal de solution tampon 2 x PK ( 2 x PK = 0 2 M Tris Cl, p H 7,5, 25 m M EDTA, 0,3 M Na Cl, 2 % w/v SDS, protéinase K 200 ug/ml), mélangé et incubé à 37 C pendant 40 minutes Les pro- téines ont été enlevées en extrayant deux fois avec du phénol/chloroforme et une fois avec du chloroforme seulement On a ajouté 20 ug de glycogène à la phase aqueuse et l'ARN a alors été précipité en ajoutant 3 volumes d'éthanol absolu glacé Après stockage à -70 C 32 - pendant 1 heure, l'ARN a été pastillé dans une centri- fugeuse Eppendorf ( 15 minutes, 14000 t/min, 4 C) La pastille a été lavée une fois dans de l'éthanol à 95 %, séchée sous vide et dissoute dans l Oul d'eau distillée stérile Les solutions d'ARN ont été stockées à -70 C. (ii) Synthèse AD Nc Un mélange de 10 ul contenant 2 ul de solution d'ARN, ng d'oligonucléotide synthétique d 95, 10 m M Hepes-H Cl p H 6,9 et 0,2 m M EDTA p H 8,0 a été préparé Ce mélange de O 10 ul a été recouvert de 2 gouttes d'huile minérale, chauffé pendant 2 minutes dans un bain d'eau à 90 C et rapidement refroidi sur de la glace La synthèse de l'AD Nc s'est effectuée après ajustement de la réaction de manière à ce qu'elle contienne 50 m M Tris-HCl p H 7,5, 75 m M Kl CI, 3 m M Mg C 12, 10 m M DTT,0,5 m M de d ATP, d CTP, d GTP et d TTP, 20 unités d'inhibiteur R Nase (Pharmacia) et 15 unités de transcriptase inverse MIV cloné (Phar- macia) dans un volume final de 20 ul Le mélange de ul a été incubé à 37 C pendant 90 minutes Après synthèse, l'AD Nc a été stocké à -20 C. (iii) "Nested" PCR Tout au long de cette étude, des résultats de PCR po- sitifs erronés ont été évités en appliquant stricte- ment les mesures de prévention de la contamination de Kwok et Higuchi (Nature, 1989, 339, 237-238). a) Tour I La réaction en chaîne de polymérase s'est effectuée dans un mélange de 50 ul contenant 10 m M Tris-H Cl p H 8,3, m M KC 1, 1,5 m M Mg Clz, de la gélative à 0,1 % p/v, 1 unité de polymérase ADN Taq résultant de la recombi- naison (Perkin Elmer Cetus), 200 u M de d NTP, 30 ng de chaque amorce "externe" (d 94 et d 95; SEQ ID n 8 et 9 respectivement) et 5 ul de solution d'AD Nc Après une première dénaturation de 5 minutes à 94 C, 35 cycles de 95 C pendant 1,2 minutes, 560 C pendant l minute, 72 C pendant 1 minute ont été effectués, suivis d'une extension finale de 7 minutes à 72 C (Techne PHC-l Automated Thermal Cycler). b) Tour 2 Le mélange réactionnel était comme décrit ci-dessus pour le Tour I, mais 125 ng de chaque amorce "inter- ne", NI et N 2 (SEQ ID n 10 et 11 respectivement) ont été utilisés au lieu des amorces "externes" d 94 et d 95 Un petit échantillon d'lul des produits PCR du Tour I a été transféré dans le mélange réactionnel de ul du Tour 2 25 cycles de 95 C pendant 1,2 minutes, 46 C pendant 1 minute, 72 C pendant 1 minute, ont été 33 - effectués, suivis d'une extension à 72 C pendant 7 minutes. c) Analyse Ml des produits PCR du Tour 1 et du Tour 2 ont été analysés par électrophorèse sur un gel agarose à 2 %. Des bandes ont été visualisées par coloration au bro- mure d'éthidium et photographiées à 302 nm. Valeur de prédiction de la sérologie anti-CI 00 et PCR dans l'étude prospective: Six des 1400 donneurs ( 0,43 %) enrôlés dans l'étude prospective ont présenté des anticorps contre le C 100 dans leur sérum Parmi ces six donneurs aux anticorps positifs, un seulement (le donneur D 6) s'est avéré être contaminé comme on a pu l'apprécier par le développement de la séroconver- sion PT-NANBH et HCV dans un receveur (receveur R 6) cfr tableau 6 ci-dessous. Les séquences virales ont été détectées par PCR dans le sérum du donneur D 6 mais pas dans les sérums des cinq autres donneurs séropositifs Le receveur R 6 o s'est développé la p T-NANBH avait également reçu du sang de sept autres donneurs (D 7 à D 13) Les sérums de ces donneurs ont été testés et se sont avérés négatifs à la fois pour les anticorps et pour le ACP. TABLEAU 6 RESUME DES DONNEES DONNEUR/RECEVEUR ETUDE PROSPECTIVE Donneur Dni D 2 D 3 D 4 D 5 D 6 D 7 D 8 D 9 D 10 Dll D 12 D 13 DONNEURS anti-HCV + + + + + + RECEVEUR: PCR Récipient PT-NANBH Séro- conver- sion anti- HCV Rl Non Non R 2 Non Non R 3 Non Non R 4 Non Non R 5 Non Non + R 6 Oui* Oui * * Période d'incubation 1 mois + Séroconversion 5 mois après la transfusion 34 - EXEMPLE 14. Isolement et Expression de Séquences d'ADN PT-NANBH supplémentaires Les bibliothèques lambda gtll préparées à l'Exemple 2 ont également été sélectionnées avec les sérums de pa- tients à haut risque pour le PTNANBH mais qui n'ont pas réagi aux antigènes viraux, DX 113, BHC-5 et BHC7, le raisonnement étant qu'ils pourraient bien contenir des anticorps qui reconnaissent différents antigènes. Ies sérums PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, New- castle), Bi rm-64 (Queen Elizabeth Medical Centre, Bir- mingham), PG et Le (University College and Middlesex School of Medicine, Londres) satisfaisaient à ce cri- tère et ont été utilisés pour sélectionner les biblio- thèques suivant une procédure identique à celle décri- te dans les Exemples 3 et 4 Une série d'éléments ré- sultant de la recombinaison ont, donc été identifiées, dont aucun ne s'est croisé avec des sondes de JG 2 et JG 3 L'un des produits de recombinaison, BR 1 l, iden- tifié par réaction avec PJ-5, a été choisi pour pour- suivre l'analyse. T Le clone, BR 11, contenait un insert d'environ 900 bp qui a été ampl ifié par PCR au moyen des amorces d 75 et d 76 (SEQ ID n 6 et 7) comme décrit à l'Exemple 7 La séquence amplifiée a été directement clonée dans le vecteur bacillovirus p Ac 360 pour former du p DX 128 con- tenant un cadre de lecture ouvert en phase avec les 11 premiers acides aminés de la polyhédrine Les stocks de bacillovirus résultant de la recombinaison (appelés BHC-9) ont été produits suivant la procédure décrite à l'Exemple 7 Des cellules d'insectes ont été contami- nées avec un virus résultant de la recombinaison puri- fié et un polypeptide d'environ 22 k D a été obtenu dans des extraits de cellule marqués radioactivement. L'insert amplifié de B Ril a également été cloné dans le vecteur phage p UC 13 et M 13 pour mise en séquence; l'ADN et les données de séquence des acides aminés sont présentés en SEQ ID n 5 L'insert contient 834 bp plus les linkers Eco RI ajoutés pendant Je clonage. EXEMPLE 15. Performance du polypeptide BHC-9 dans une ELISA Une ELISA a été établie au moyen de cupules de micro- titrage revêtues d'un extrait de cellule infectée BHC- 9 et d'un système de détection de conjugué Ig antj- humain suivant la procédure décrite à l'Exemple 10. - Une panoplie de sérums à haut risque a été testée en parallèle avec BHC-7 et BHC-9 et a également été exa- minée par PCR au moyen de la méthode décrite à l'Exem- ple 13 Les résultats sont indiqués au Tableau 7 dans lequel les échantillons positifs sont soulignés. TABLEAU 7 Numéro PCR BHC-7 BHC-9 l + 2,09 2,0 2 + 2,09 2,0 3 + 1,89 1,37 4 + 1,57 0,27 + 1,26 2,00 6 + 0,91 2,0 7 0900,51 8 + 0,84 1,19 9 0,53 0,43 0,45 2,0 11 + 0,37 1,07 12 0,32 2,00 13 0,23 0,30 14 0,15 0,43 + 0,16 0,76 16 0,09 1,74 17 0,27 2,00 18 0,15 2,00 19 0,12 2,00 0,08 0,05 *coupure 0,27 0,29 De ces 20 échantillons, 50 % sont manifestement posi- ti Es avec le BHC-7 alors que 85 % sont positifs avec le BHC-9 Deux échantillons ( 11 & 12) qui sont à la limi- te du positif avec le BHC-7 sont clairement positifs avec le BHC-9 et certains échantillons qui sont au ni- veau de la coupure ou en-dessous avec le BHC-7 sont positifs avec le BHC9 De plus, deux échantillons ( 13 & 15) qui étaient à la limite ou négatifs avec le BHC- 7 mais positifs avec le BHC-9 sont PCR positifs. Dans l'ensemble il n'y a que deux échantillons ( 1 3 & 20) qui sont négatifs avec les deux polypeptides et l e PCR. EXEMPLE 16. Isolation des séquences d'ADN PT-NANBH chevauchant des clones existants La sélection immunologique des bibliothèques d'expres- sion AD Nc décrites aux Exemples 3,4 et 14 ne peut identifier que les clones qui contiennent une région immuno-réactive du virus Une autre approche de la 36 - production de clones spécifiques à la PT-NANBH est d'utiliser le ACP pour amplifier les molécules d'AD Nc qui chevauchent les clones existants Des jeux d'a- morces peuvent être préparés lorsqu'un membre de la paire se trouve dans des séquences clonées existantes et l'autre en-dehors; cette approche peut être étendue aux paires d'amorces "nichées" également. L'AD Nc préparé comme à l'Exemple 1 a été amplifié par ACP, avec des paires d'amorces simples ou "nichées", au moyen des conditions de réaction décrites à l'Exem- ple 13 L'approche est illustrée par l'utilisation des paires d'amorces suivantes: d 164 (SEA ID n : 12) et d 137 (SEQ ID n 16); d 136 (SEQ ID n : 14) et d 355 (SEQ ID n : 15); d 156 (SEQ ID n 16) et d 92 (SEQ n 17) Un membre de chaque paire est conçu pour amorcer dans les séquences clonées existantes (d 137 et d 136 amorcent respectivement dans les extrémités 5 ' et 3) de BRII, d 92 amorce l'extrémité 5 ' de JG 3) Les autres amorces sont basées sur des séquences disponibles pour d'au- tres agents PT-NANBH I,'amorce d 164 correspond aux bases 10 à 33 de la figure 2 dans Okamoto et al, Ja- pan, J Exp Med, 1990, 60, 167-177) l Ies amorces d 155 et d 156 correspondent aux positions 462 à 489 et 3315 à 3337 respectivement de la figure 47 de la de- mande de brevet européen 88330922 5 Une ou plusieurs substitutions de nucléotides peuvent se faire pour in- troduire un site de reconnaissance Eco RI près de J'ex- trémité 5 ' des amorces, sauf pour d 164 o un site de reconnaissance Bg 12 a été introduit; ces changements facilitent le clonage ultérieur du produit amplifié. Les produits ACP ont été digérés par l'enzyme/les enzymes réducteur(s) approprié(s), décomposés par électrophorèse sur gel agarose et des bandes de la dimension attendue ont été excisées et clonées en vecteurs plasmides et bactériophages tels que décrits à l'Exemple 5 Les séquences des ADN amplifiés 164/137 (SEQ ID n 38), 136/355 (SEQ ID n 19) et 156/92 (SEQ ID n 20) sont présentées dans la liste des séquences. Ces nouvelles séquences étendent la couverture du gé- nome PT-NANBH au-delà de celle obtenue par immuno- sélection (SEQ ID n 3,4 & 5) Ces séquences, ainsi que d'autres qui se trouvent dans les régions déjà décrites, peuvent être combinées en une séquence con- tinue à l'extrémité 5 ' (SEQ TD n 21) et à l'extrémité 3 ' (SEQ ID n 22) du génome PT-NANBH. EXEMPLE 17. Fusion de différents antiqènes PT-NANBH en un seul polypeptide résultant de la recombinaison Les données présentés au Tableau 7 indiquent qu'alors qu'on détecte plus d'échantillons de sérum anticorps positifs en utilisant BHC-9 comme antigène cible ( 17/20) plutôt que BHC-7 ( 10/20), il y a certains échantillons (par ex, #4) qui ne sont positifs qu'a- vec BHC-7 Cette image est confirmée par la poursuite des essais De même, un construct de fusion a été in- duit au moyen de la séquence à partir de BHC-7 'et BHC-9. Les séquences de BHC-7 et B Hi C-9 peuvent être combinées de toute une série de manières: chaque séquence peut être positionnée all terminal de l'acide aminé de la fusion résultante et la nature de la séquence de liai- son peut également varier La figure 2 illustre deux manières possibles de combiner ces séquences. Les fragments de restriction appropriés portant des sites d'enzymes réducteurs appropriés et des séquences de liaison ont été générés soit par ACP au moyen d'a- morces spécifiques ou par digestion des plasmides ex- istants par les enzymes de digestion Le vecteur de transfert DWl 43 consiste en un fragment Bam Hl/Pstl de DX 122 (figure 1; le site Pst est à la position 1504 JG 2, SEQ ID n 3) lié à l'extrémité 5 ' de l'ensemble de la région de programmation de B Rul (SEQ ID n 7) qui a été amplifiée en tant que fragment de Pstl/Bam Hl utilisant des amorces d 24 (SEQ ID n 23) et d 126 (SEQ ID n 24); la région de liaison consiste en six acides aminés dérivés de l'amorce d 126 et en séquences lambda bactériophages résiduelles Le vecteur de transfert DX 136 diffère de DX 143 en ce que le fragment BR 11 a été généré au moyen de d 24 (SEQ ID n 23) et d 132 (SEQ ID n 25) et ainsi la région de liaison contient cinq lysines Ces vecteurs de transfert ont été utilisés pour co-transfecter des cellules Sf-9 d'insectes en culture avec l'ADN Ac NPV et des stocks purifiés de plaques de bacillovirus résultant de la recombinaison ont été produits comme décrit à l'Exemple 7 BHC-10 a été produit comme résultat de la transfection avec DX 143; BHC-11 comme résultat de la transfection avec DX 136 - 38 - Les polypeptides résultant de la recombinaison expri- més par ces deux virus ont été analysés par SDS-PAGE et transfert Western Le BHC-10 a produit un polypep- tide avec un poids moléculaire apparent de 118 k Da Le BHC-11 a produit un polypeptide avec un poids molécu- laire apparent de 96 k Da Les deux polypeptides ont ré- agi avec des sérums connus pour réagir dans ELISA uni- quement avec RHC-7 (par ex, sérum A) ou uniquement avec BHC-9 (sérum B 64, exemple 14) Les deux polypep- tides ne diffèrent que dans la séquence de liaison et ceci peut affecter soit leur mobilité sur SDS-PAGE ou la manière dont ils sont traités dans les cellules infectées. EXEMPLE 18. Performance des antiqènes de fusion PT-NANBH dans une ELISA Une ELISA a été établie au moyen de cupules de micro- titrage recouvertes d'extraits de cellule infectées au BHC-9 et d'un conjugué Ig anti-humain suivant la pro- cédure décrite à l'Exemple 10 Le tableau 8 présente les données à partir d'une comparaison des deux fu- sions avec les autres antigènes PT-NANBH résultant de la recombinaison BHC-7 et BHC-9 ainsi que la protéine résultant de la recombinaison HCV, C-100-3 (Ortho Dia- gnostic Systems, Raritan, New Jersey) Les sérums sont groupés par modèle de réaction avec-BHC-7, BHC-9 et C-100-3 Les sérums du Groupe I réagissent violemment avec les trois antigènes; le Groupe II réagit violem- ment avec BHC-7 uniquement; le Groupe III réagit vio- lemment avec BHC-9 uniquement et le Groupe IV réagit violemment avec seulement deux des trois antigènes. eawsuel aied 8 rib S 9 ?sal uu U, Y+ Y+ O ' Z O 'ZE O'g O ' Z 0 'g O ' Z ++ Y+ Y+ O 'Z O ' Z O'Z O ' Z O'g 89 Z'0 Lú'0 O'ZC O ' Z 0 'g Z O 'O Zr'O g'0 SZ ' O LO'0 O 80 '0 ZC'0 l'O 0 'Z O ' Z O ' Z O ' Z 0 'Z O ' Z LZ'0 O Jz '0 O'g SL 9 '1 ZLZ'I ú O 'I O'Z 181 '0 ú:Ot ', O O' O'Z O'g O'Z Eg I ' srd ZSI'0 aq LS'I X O'Z ú 9:'O 6-908 911 '0 Z 8-908 690 '0 LS-908 Zú'0 sr III acdno JD O'Z O' Z O'Z II adno-i 0 'g Z O'Z 0 'Z O'Z I adnoif ú-001-D Nlnuss 8 f Vsi L 066999 Z o' S il-DHU arts uiqqsam quou suolliqueq Dg Se D 4 Ces données montrent qu'à la fois BHC-10 et BHC-lt ont une réactivité similaire avec ces sérums et, ce qui est plus important, que les deux activités antigéni- ques semblent avoir été retenues par les fusions Tous les sérums des Groupes II & III qui ne réagissent res- pectivement qu'avec BHC-7 ou BHC-9, donnent une réac- tion claire avec les fusions En outre il semblerait qu'avoir les deux antigènes ensemble donne un essai plus sensible Par exemple, l'échantillon KT donne des OD de 1,57 et 0,27 avec BHC-7 et BHC-9 respectivement, alors qu'avec les fusions, l'OD est > 2,0. 41 - SEQ ID N : 1 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 21 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthéti que ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: bactériophage lambda gtli SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 19 CARACTERISTIQUES: de 1 à 21 bases homologues à la partie amont du gène lac Z flanquant le site Eco R 1 dans le bactériophage lambda gtll PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN à partir du vecteur phage dans l'AD Nc inséré au site d'Eco R 1 - GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C 42 - SEQ ID N : 2 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 21 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: bactériophage lambda gtll SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 20 CARACTERISTIQIJES: de 1 à 21 bases homologues à la partie amont du gène lac Z flanquant le site Eco Rl dans le bactériophage lambda gtll PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN à partir du vecteur phage dans l'AD Nc inséré au site d'Eco Rl. TTGACACCAG ACCAACTGGT A 43 - SEQ ID N : 3 TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE: 1770 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: AD Nc à ARN génomique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone JG 2 de biblio- thèque AD Nc dans lambda gtll CARACTERISTIQUES: de 1 à 1770 bp portion de la polyprotéine PT-NANBH PROPRIETES: encode structurelles CAA AAT GAC TTC CCA Gln Asn Asp Phe Pro CGG CAT GAG ATG GGC Arg His Glu Met Gly GTA GTA ATC CTG GAC Val Val Ile Leu Asp CGG GAA GTG TCC GTC Arg Glu Val Ser Val CCA CCA GCG ATG CCC Pro Pro Ala Met Pro CTG GAG TCC TGG AAG Leu Glu Ser Trp Lys probablement protéines virales non GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp t O 15 GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG Gly Asp lle Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys 30 TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Gl u Asp Glu 45 CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe 60 GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu 75 80 GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly 95 TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA Cys Pro I Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg 105 110 AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG Lys Arg Thr Val Val Teu Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala l,eu Ala 1 ll 5 120 l 25 al I O d a L, n ID 8001,LY V VD 3 YDV YVO S.FH us V al I el 096 DVD DYV L Lj V DDD O AID a qd s AV -15 Zg 6 DDD, LLL, L r D. aq L dsy IDY DYD SÀVr I l S DYV D O V 00 E SAX' ski Oúú n ID naq naq dsy VVD DOL O Ak DV O aa S naq usy Bay DDI VID Dtyf ODDD e LY ea S D O D O D 3 56 Z STH Oad Oad IVD V D DDD SZú nl D dal Ie A Ja S DYO D 00 DAD DD 3 1 e A D D.D DVV YDD jq,1 I naq SI SAD D 3 V DA 3 D DVV D;O Bay a II DOD DI KID JAI DDD MI 06 Z DD 9 O h 9 a V O V L 8 Z n 1 f) IPA Je S naql t 9 g Y)VID YLE) Y;) YD 918 so V s Y 918 DVY 9 't Y OLZ nariq IA D 3 D DDL neq s Aq ely LD DYV L 3 DD dsy Ul D 1 A DYD DVD D 3 V S Ar Ie 1 A jth L DYV IID 1 YV 3 59 Z s IH dsy dsy DVD IVD DYD Z aqd jq I 89 L Ili DDY ye A sÀq DJ,9 O YY S Ar I UIO DVV DYD 0 Z y DDD 03 Ul I las ely jas VDYD 3 DDY YDD 3 Dy 9 Pg 5.x DOD jas a VD DD e IY DDL YDY DDY;:)0 OPZ *KAL I 3 A OZL D I Di D ae N us V STH 0 DVD ay V naq nq las 0 DD DID D O il O D 3 I O O Z usy D 3 V ja S naq el V D 9 V Dl DDD O oid neq S Aq jas ZL 9 DDD DI 3 D DVV DDY OZZ nio YYD nid e IY DDVO DDD 3 g SI el Y SAD Oid LDD DD& Y 3 DD PZ 9 DDú VDV s O u AL leas DVI 33 ú qae ao S SAD 1 V DDI 3 D 09 OOZ s AD l Ie A I 2 A D O DID DID 31 ja S 1 e A 9 L 5 9 Lt AID tilt, 8 Z 9O D ODLV 09 l AID AID 089 VOD DDD 06 L l D Las )JY L)L dil aa S À 19 ODDL LDJ ODD nal oad oad la ID D 33 DD DDD 3 DV ds V dsy a S DYVD DY D 3 D 99 g -las )L D 3 Y DDY DLD LVO -a S a AA la S rild DOD k 03 ú DVOV O O l ulo dsy o Id oad ely Ved DYD 3 DD 3 DD DD 3 Oad dsy Aro DDD DYD D 9 D 1 PA 0 DDD VYD dsy a S MID ely DVO q 1 e I IY g DDY O YDD DDY 917 l AID jas DDD 3 D 9 dsy IPA e 1 V Ia S f Zú DYD D DVY VDV D 39 0665599 Z aas ely 3 DD DDD natl a L 1 DLD D;)V SLZ s Ar elv Dy V O DD 09 Z Ul D tto VD f XL 3 s Ar I aw OYVY OLZV Bl V ds V YDY DYD SZZ us all :)YVV DY OIZ KID lu DDD O YD dsy n ID DYVD OYO 6 I ÀID PIY IDD DDD 1 l J ni LD VYD DVO 0 ú 1 noq nid L;D 9 9 tp - 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066999 Z q 99 AID DDD -1 d DDD usy LV Yv 98 C Old 3.DD 46 - ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC CAA CCA GAA TAC 1680 Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gln Pro Glu Tyr 545 550 555 560 GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG TCG GTC GCG CAC 1728 Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His 565 570 575 GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT GAC CCG 1770 Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro 580 585 590 47 - SEQ ID N : 4 TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE: 1035 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: AD Nc à ARN génomique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone JG 3 de biblio- thèque AD Nc dans lambda gtll CARACTER I STIQUES: de 1 à 1035 bp portion de la polyprotéine PT-NANBH PROPRIETES: encode probablement protéines virales non structurelles ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC GCT CCG GCG TGC AAA 48 Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Lys 10 15 CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC GGG CTC AAC CAA TAC 96 Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gln Val Gly Leu Asn Gln Tyr 25 30 CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA CCG GAT GTA GCA GTG 144 Leu Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val 40 45 CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC ACA GCA GAG ACG GCT 192 Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala 55 60 AAG CG-C AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC TCT TCA 240 Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser 70 75 80 GCT AGC CAG TTG TCT GGC CCT TCC TCG AAG GCG ACA TAC ATT ACC CAA 288 Ala Ser Gln Teu Ser Gly Pro Ser Ser Lys Ala Thr Tyr Ile Thr Gln 90 95 AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG CGG 336 Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg 105 110 CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG GTA 384 His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val 120 125 Svú: ot D biey UD jas ely jas Bay DOD DV;) DDY YDD 1 O DD o,DO) lasg L L IL DDJL VZ)V DDV qúz 8 U 01 ID 9 D I 9 E:E at I Old 096 D Ly V DDD q II dai Z 16 VDV O 9 L n 1 o las h 9 ot) g t 98 D Yt JIDY nit) AID 9 g 8)YVO DOD U 9 L VDD VOD 09 gz a S ds V OZL DD Dt YD n 1 O ely ZL 9 D Vt) DD s Ar I Bay PZ 9 Dvy 'DI s AD AID 9 L 5 D Di DDD 9 Lt naq nar 89 Y Z S)D XL:D 09 l Oid a B, 08 t VDD D)i fiy n ID EZút O)D 3 Y 9 ITA IJON usy s IH DID DIY DYY DYVD nao s Aq ia S n I 9 DID DYY DDY YYD 00 ú aq L UAI le S oaw YDY DYI DDI DIY 58 E IRA 2 q I 4 les dal DID DDY LDI DDI 0 LZ iltd nao I old o d DYO 1 LD DDD DDD AlD dsy dsy la S DDD DYD DDYO DDI qi XZ e 2 A e 2 Y Jas Oud naq ely jas jas Z Da oa oad oa DD YDD) IDD DD 06 L SIH IA IRA Old IYD YID DID YDD o Ja oad USV a AL DDD IDD DYY Dv L SÀql S Aq les SÀr I VYY 9 VY DDJI YVY *09 t dsy nl Do nid ely LYD D 3 Y D 9 Y 9 D 9 0 Eú: s FH Bay DYD IDD hid e IY la S s AD 9 DL DOL las KID IIDI DD 9 59 Z a ON jas DIV DDI 0 y' a S Ul D DDII 1 D AID jas YOD DDI 1 e A aq A DID DDY Ol I oad i 8 l ozd Ie A IIDD DIID OLI dsy oad L Yf 9 ODD Biy nari DDD DID ay n Aeq YVD Dt LD gzú naq na'l ja S usy jas nerq Ry usy 9 ID i LL LDI DV DO DIAl D ODY el s AD od aq L O In ner e 1 Y AID LDD DDIL YD D)DY DIY DID IDD DDO 96 Z 06 Z SAD 12 A Ie A dsy n LD AI 9 Ply N 1 D DDL D 9 ID DI D)Y 9 D Yt IDD DD)9 D 9 08 Z 5 LZ Lg dsv las naq dsy oid dsy Al D) Oid DYD DDY DID) VD DDD D;) D O)0) DDD) la S IAJL la S nl 1) DDJ ivi DDI OYD dsy oid o d e IY DVD IDD IDD DDD 0 úZ ja S AID agad ly V DD Y 9 LDDLL LDD SIZ ja S n ID igl naq DDII D YDY DID 00 E old q I s Arq aît IDD DDY 9 DVY IDY Al dsy o Jd p Iy DYI DY DDD 3 DDD) 99 t B 5 ay l V dai L IY 3 DDD YDD 9 DL YDD 091 I al I n'lD ely oad DIY DYD DD)D DDD 9 E 1 o Id dsy aqd las ODD 3 DY 9 Di LL LDI 09 g IEA MOD dsy las ÀID DVD LDL V 03 1,i, ely ag I A E 9 DVY YDD DD)Y DDD SZZ s Aq aq L el V nalq DV 3 YDI D Dt D 1 LD OIZ IA Ie A aq LI 5 JI Lt) LL 3 YDY JDDY Oad oad naeq oad IDD DD DID VDD s Aq dl I ja S nlo DYV DDI DDI DVD Oad 8 o N 2 ly oad DD 9 DI 9 ODD YDD le A *a S IRA n ID DID DDI DID VILY 0 ú 1 dsy nr I al I le A DYVD DID DIY YVID 8 i - 066999 Z 49 - SEQ ID N : 5 TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE: 834 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECUILE: AD Nc à ARN génomique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone BR 11 de bibli- othèque AD Nc dans lambda gtll CARACTERISTIQUES: de 1 à 834 bp portion de la polyprotéine PT-NANBH PROPRIETES: structure l es encode probablement protéines virales AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CTC CGC CCA CAG GAC Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Leu Arg Pro Gln Asp 10 CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu 25 GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser 40 45 CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg 55 60 GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu 70 75 GAG GGC ATG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg 90 CCT AGT TGG GGC CCC ACT GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg 105 AAA GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GAC TCT lys Val lle Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Ser 120 125 GTC AGG TTC Val Arg Phe CCG Pro CGC AGG Arg Arg GAG CGG TCG Glu Arg Ser CAG CCC GAG Gln Pro Glu TAT GGC AAC Tyr Gl y Asn GGC TCC CGG Gly Ser Arg - AAT Asn TTG GGT Leu Gly CAT GGG GTA His Gly Val Y 9 L? O.d aqd le A JS AI 9 s AD 9 DD Di L ILLJ ILDL V 9 D,)tlL OLZ naq dsy AID 9 l 8 DJD IVD D 99 Z naq dsy e 12 A 89 L Dll LY Dt D:Dt el V e Iy naq OZL;DD O DDD DAD n I 9 5 v Ie A ZL 9 DVD DDD DLD aqi 4 L nlD a 1 A t 99 VDV DYVD DYVL Às AID jas 9 L 9 DIL DDD DD: Y 9 Z 09 Z le A IAI la W IV Ja 8 S Ja S aqd el YV el V el AID Te A nrarl DID DVL DLV LYD DXDL OXDD D Jl DDD IDD DDD DDD LLL DLD si H 6 Ey by al I Lqj, e IV' 3 j 1 L otad a lI jas ery dsy s A r JYD DJDD YVD) V'LY YV)Y t)t) LLJY J) LV ')OY D)D DYD DY Yv i SZ OEZ SZZ x L od t LL naq ely Te A dij, s AD aiy jas aa S usy AID DDY D)DD a DV DLD D 9 YVLD 9 o L DDL DOD DZ Zl DDL i VV ILDD OZZ 71 SgIZ OIZ SAD oid IPA SKD AID o j qj AL sl H qa W ar I 1 a W dsy ely À DJ DDD DO JD D 3 9 DD Dx DDY DYD 9 LY DIY DOY DYD DDD SOZ 00 61 le A ali as Ja S usy eas s AD dsy USV T 4,L IA SIRH 1 À DJI DI DDY VDI DVV DDL Df XL 1 VD DVV DDV DLD JYD DVIL Y 81 OWI 1 e A usy 1 y te A n ID 1 AI ely ia S e Iv oaid a'1 T 4 q L naq DID D Y DDD DLD V D LYL LDD DD DL OD DD LLY J V Dl l S Lt OL 1 591 s D a Sas naq' a I naq y na naq aqd 8 la LI a S aqd a S s AD Al) Oald naq 8 ZSY D DA DD I L D Dl IDD DJLL DLD DJLL DAY JDI DML YDI D LDD X V LLJ 091 Y 51 O l Yil usy AID Jq JL elr -1 A us V Iu A AID dsy n ID noaq 'lA 5 1 Ie A Af)s s TH 08 LVY DDD YDY YDD Y Lv DY ' DAD DDD DVD DYD DLD LLD DDD LDD DDD JYD 0-Pl GúT O ú 1 e IV nao e IV 56 y ely ely AID 6 bay nauq ja S 5 Jy 5 Iy 651 y ely a S s BH Uú DD Di 3 D DDD DOV D;DD ID DOD Do 9 LV D DD; DDD X ODD IIDD ADD DD 2 LYVD os - 066999 Z 51 - SEQ ID N : 6 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 31 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECUILE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: bactériophage lambda gt 13 SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 75 CARACTERISTIQUES: de 4 à 9 bases site Bam Hl de 10 à 31 bases homologues à la portion amont du gène lac Z flanquant le site Eco R 1 dans le bactériophage lambda gtll de 26 à 31 bases site Eco R 1 PROPRIETES: amorce la synthèse à partir du vecteur phage dans l'AD Nc inséré au site d'Eco R 1 et introduit un site Bam Hl approprié pour le clonage ultérieur en vecteurs d'expression. TAAGGATCCC CCGTCAGTAT CGGCGGAATT C 52 - SEQ ID N : 7 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 30 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: bactériophage lambda gtll SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 76 CARACTERISTIQUES: de 4 à 9 bases site Bam Hl de 10 à 30 bases homologues à la portion aval du gène lac Z flanquant le site Eco Ri dans le bactériophage lambda gtll PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN à partir du vecteur phage dans l'AD Nc inséré au site d'Eco Rl et introduit un site Bam Hl approprié pour le clonage ultérieur en vecteurs d'expression. TATGGATCCG TAGCGACCGG CGCTCAGCTG 53 - SEQ ID N : 8 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 19 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, nonB post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 94 CARACTERISTIQUES: de 1 à 19 bases homologues aux bases 914 à 932 du brin de sens de JG 2 (SEQ ID n 31 PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH. ATGGGGCAAA GGACGTCC Gq 54 - SEQ ID N : 9 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 24 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECUILE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 95 CARACTERISTIQUES: de 1 à 24 bases homologues aux bases 1620 à 1643 du brin anti-sens de JG 2 (SEQ ID n 3) PROPRIETES: amorce la synthèse d(le l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH. TACCTAGTCA TAGCCTCCGT GAAG - SEQ ID NO: 10 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 17 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECUILE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo NI CARACTERISTIQUES: de 1 à 17 bases homologues aux bases 1033 à 1049 du brin du sens de JG 2 (SEQ ID no 3) PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH. GAGGTTTTCT GCGTCCA 56 - SEQ ID N : 11 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 17 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECUJLE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo N 2 CARACTERISTIQUES: de 1 à 17 bases homologues aux bases 1421 à 1437 du brin anti-sens de JG 2 (SEQ ID n 3) PROPRIETES: amorce la synthèse de 1 'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH. GCGATAGCCG CAGTTCT 57 - SEQ ID N : 12 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 22 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, nonB post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 164 CARACTERISTIQUES: de 1 à 22 bases homologues aux bases 10 à 31 de la séquence à la fig 2 d'Okamoto et al, Japan, J Exp. Med, 1990, 60, 166-167, base 22 changée de A en T pour introduire un site de reconnaissance du Bg 12 de 8 à 13 bases du site de reconnaissance Bg 12 PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in- troduit un site Bg 12. CCACCATAGA TCTCTCCCCT GT 58 - SEQ ID N : 13 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 30 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétiqule ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo dl 37 CARACTERISTIQUES: de 1 à 30 bases homologues aux bases 154 à 183 du brin négatif de B Rll (SEQ ID n 5); bases 174, 177 et 178 modifiées pour introduire un site de reconnaissance d'Eco R 1. de 5 à 10 bases de site de reconnaissance d'Eco R 1. PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in- troduit un site Eco R 1 pour clonage. GCGAGAATTC GGGATAGGTT GTCGCCTTCC 59 - SEQ ID N : 14 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 27 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, nonB post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 136 CARACTERISTIQUES: de 1 à 27 bases homologues aux bases 672 à 698 du brin positif de B Rll (SEQ ID n 5); base 675 changée en G pour introduire un site de reconnaissance d'Eco Rl. de 5 à 10 bases de site de reconnaissance d'Eco Rl. PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de 1 'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in- troduit un site Eco Rl pour clonage. GGGGAATTCC TCCCGCTGCT GGGTAGC - SEQ ID N : 15 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 28 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: chimpanzé; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 155 CARACTERISTIQUES: de 1 à 28 bases homologues aux bases 462 à 489 du brin négatif de la figure 47, demande de brevet européen 88310922 5; bases 483 et 485 modifiées pour introduire un site de reconnaissance Eco Rl de 5 à 10 bases site de reconnaissance d'Eco R 1. PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in- troduit un site Eco Ri pour clonage. ACGGGAATTC GACCAGGCAC CTGGGTGT 61 - *SEQ ID N : 16 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 23 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: chimpanzé; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 156 CARACTERISTIQUES: de 1 à 23 bases homologues aux bases 3315 à 3337 du brin positif de la figure 47, demande de brevet euro- péen 88310922 5; base 323 changée en C pour introduire un site de reconnaissance Eco R 1 de 4 à 9 bases site de reconnaissance d'Eco R 1. PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le br Jn négatif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in- troduit un site Eco R 1 pour clonage. CTTGAATTCT GGGAGGGCGT CTT 62 - SEQ ID N : 17 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 29 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, nonB post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 92 CARACTERISTIQUES: de 1 à 29 bases homologues aux bases 36 à 64 du brin négatif de JG 2 (SEQ ID N 3); bases 57, 58 et 60 chan- gées pour introduire un site de reconnaissance Eco R 1 de 5 à 10 bases site de reconnaissance d'Eco Rl. PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la PT-NANBH et in- troduit un site Eco R 1 pour clonage. CGCCGAATTC ATGCCGCCAC AGGAGGTTG 63 - SEQ ID N : 18 TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE: 504 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, nonB post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone 164/137 CARACTERISTIQUES: à partir de 308 à 504 bp, début de la poloyprotéine PT-NANBH. PROPRIETES: encode probablement des protéines virales structurel es. GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60 TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120 ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180 ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240 AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300 GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 349 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn 10 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 397 Thr Asn Pro Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 445 Val Gly Gly Val Tyr T,eu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493 Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg 55 60 CAA CCT ATC CC 504 Gln Pro Ile Pro 64 - SEQ ID N : 19 TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE: 1107 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, nonB post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone 136/1355 CARACTERISTIQUES: de I à 1107 bp portion de la poloyprotéine PT-NANBH. PROPRIETES: encode probablement des protéines virales structurelles. TCC TCC Ser Ser GCC AGC Ala Ser GGG GCG Gly Ala CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala 10 ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu 25 30 GCT GCC TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 40 45 AAG GAC Lys Asp CTC GTT Leu Val TGC GGA Cys Gly TCT GTT TTC CTC GTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGA CAT Ser Val Phe leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His 55 60 CAG ACG Gln Thr GGT CAC Gly His GCC CTA Ala Leu ATG GTG Met Val GTA CAG GAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser 75 S 80 CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA GCA Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala 90 95 GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp 105 110 GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT Ala Gly Ala Hls Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr 120 125 usv s AD 800 r DVV D;L OZú dil jql 096 DDL 3 D neq naq Z 16 LD -9 LD aqd 6 i P 98 Dil IDD) Te A Oad 9 C 8 LO V DD e 21 V -LA 89 L YDD Dyl aÀI IM 11 U ZL j VI IDI ua S ely ZL 9 DCY DD) aqa noq PZ 9 Di LL XLD e ly qú 9 L DDD ID 9 LI f I AKID 089 Dx DD DDD aqd noerq Zgt LII DID Oud oad AID AID SAD ay I s Aiq lql;)qd AID aq I as us q U a DDD DDD D:; D 9 O J 9 DOL) DV DDV Di LL D 9 DD Y D 9 Y IV DLLV gitÂ OIE s AD AID aqd dcl USV AID 6 iv Oid Oad Iy Iq II us V L DI DDD Di LL DDL DYY DDD DDD YDD ODD ODD ODV D'Y 00 ú 56 Z 3 L 3:)Y 3 9 DY OYO t YY D 9 Y Et 9 DDL Y 9 Y DYL 90 Y ADD: GSZ 08 Z SLE ds q I q AID 1 e A 12 A 12 A oad Ja S O d Jq IL;qd LC)DY 3 V Y DID DDD DDL D LLC J 3 DD DDY YD)D LD D Ll OLE 99 Z 09 Z Al D s AD lu A u 1 l naeq ely od 1 IA el I Ai D s AD old D 9 i Li L DID YVD 9 Dii L DDD DDD DCLC D;)V ID i L Ci L 03 D s FH dil SXD JAJ oid 6 V u Il D dsy taq AÀD Sj H aa S DYD DDI Do IYLî DDD DD) DYD DYD DIL D 09 DVD DD& úZ OUZ Gl I oad ID da L AID Ul Dt) dsy eqd Ul D dsy ll o O d DII DDD IDD D 9 I ODCD DVD L Di L DVD DVD A:)O DDD Ozu 51 '9 U as 6 a n Id -ae S SAD AKID e S el V usy aqad 61 y sig )JIY DDD YV DIL DDI Vt DD DDL DDD ' LYI Diii D O DYD SOZ OOZ 500 g 961 e Iy ely naq aqd AID a Ui Ul D neq ra S dsy usy s D ODD 33 DD D Di LL 099 JLDI 11 D DLD DO 3 DV I;IV DDLI 061 981 08 11 j USV 91 I Sl H d i a S AID us V q IL us V le A nar IDY D;V DI;Y DYD CDDC DDV DDD DIY DDY DIYY YID LLD OLI 99 L e IY o-d ALD O od j UL aqd naq 1 a S j I nr Iq A Kl D si H LDO 9 ODD Do D) IDD VDV DIIL DID DDIL VDYV YLD 333 DVD 991 I 091 STH Iq L AID AID q L q, a L j o, d n 10 I AID dsy Ie A DYD)DY DD) O)DD 1 O YDD DIY IDD VYD DDC DYD LLID n 9 q 419 Ie TA te A N 9 q IPA SAI ely dl, usy AID le A VID DIJ DCD L LO Dil DID Cv 3 LIDD D)l Dvv DDD 913 c i Of usy neq DII DID 06 Z El V AID DDD DDC s AD IAI ILCI DVII ULD OYL U 13 C O ld VD JDD rtl C U Sy )Vt LLV SZZ Day SAD DOD DDú OIZ I 4 II 1 AJ, 3 DY DYL us V neq DVV Dil UIC al I YVD DII e Iy e I DDD O DD 3 D 9 i 7 l Alo^ e 1 y D;D DDD Oú 1 CIII 99 - 066999 Z 66 - ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC 1056 Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe 340 345 350 CGG AAG CAT CCC GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG 1104 Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp 355 360 365 TTG Leu 67 - SEQ ID N : 20 TYPE SEQUENCE: Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR SEQUENCE: 2043 PAIRES DE BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOIECUITE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: clone 156/192 CARACTERISTIQUES: de 1 à 2043 bp portion de la poloyprotéine PT-NANBH. PROPRIETES: encode probab 3 ement des protéines virales non structurelles. TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile 55 ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu 70 ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC Thr His Pro Ile Thr lys Phe GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG Glu Val Val Thr Ser Thr Trp CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr CTC ACC CAC Leu Thr His GAC AAC TTC Asp Asn Phe GCC CAG GCC Ala Gln Ala CGG CTA AAG Arg Leu Lys GGA GCC GTC Gly Ala Val ATC ATG GCA Ile Met Ala GTG CTG GTG Val Leu Val ACA GGC AGC Thr Gly Ser GTG GAT GCC CAC TTC CTG Val Asp Ala His Phe Leu CCC TAC CTG GTG GCG TAC Pro Tyr Leu Val Ala Tyr CCA CCT CCA TCA TGG GAT Pro Pro Pro Ser Trp Asp CCT ACT CTG CGC GGG CCA Pro Thr Leu Arg Gly Pro CAA AAC GAG GTC ACC CTC Gln Asn Glu Val Thr Leu 80 TGC ATG TCA GCC GAC CTG Cys Met Ser Ala Asp Leu GGC GGG GTC CTT GCA GCT Gly Gly Val Leu Ala Ala GTG GTC ATT GTG GGT AGG Val Val Ile Val Gly Arg çúú O úú 9 U le A na Iq ely AID oad jas nfq al I el Y O Jd nq I naq us V le A nrlq dsy 800 f D LD D r D DDD r C Lr D 1 L:DL DJID D Ly L DDC 'LOD DILD V LJ DV IL Jf 3 Dr L D DVD OV Slú O TU oú ni -it L Jas ojd îa; 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sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: contig formé par des clones d'AD Nc à partir de l'extrémité 5 ' du génome CARACTERISTIQIJES: de 308 à 2116 bp début de la poloyprotéine PT-NANBH. PROPRIETES: protéines virales structurelles et non structurelles. GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60 TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120 ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180 ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240 AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300 GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 349 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn 10 - ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 397 Thr Asn Pro Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 445 Val Gly Gly Val Tyr Leu rleu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Teu Gly Val 40 -45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493 Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg 55 60 CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG 541 Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln 70 75 CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC GAG GGC ATG GGG TGG GCA 589 Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala 85 90 06 Z Sg 8 nloq 9 qd Ie A as AI ID s D naq dsv AID IA 9 Il DILD Di LL L Li C ILDI VCC DOL DID JNC 999 9)LL 08 Z JL iai PIV Jas sk D aud DVI t XLV LDD DDL DCJ 1 Dil L 9 LZ OLZ i 99 Z 09 E ely ely ely MID Te A nar I nea dsy îe A sl H 5 6 Y buy al I gq I ely -î l LITI DDC IDD DDD 999 JL DID Dil J V DID DVD DDD y D iy VïD CDD ILDV oad ali les ely ds V s Ar E Iy Ily naq gj U 690 t DD 3 DZI DO DDD DY s Vy DDD DCDD DILD CD SAXD 6 Y Je S ia S usy e ID ni 93 56 V IA s AD I O Z ODDIL DDD 3 DD L Xtf,VV ICDD YICD DDCD DILD t Li L si H a W l I a a W dsy ely IL nl D a CJ, ITA úL 6 DVD D Ci Y Dt LY 9 & I' DYC ODC D CIC DYA 9 VII dsy usy ELI Te A s IR JAI a II ID ea S Ie A Z 6 IV Df V DDY DIAD I D DY&L DIIY D ZL DDAL DD 9 PE oad lqi nar I lIY A d Jl DOD IDY DID ODC VID CII OúZ oad Ie A s XD KID oid aq I DD DLC LIDI CCDD DDD DDY a II las las usy las s K) DLY DOY YD Ia Do I D Oa DCI 00 g usy Dy le CA nlD V LL ejly D;i Y DUD DID YVO LV 1 D) 6 E 06 C 8 t 08 t as S ELI oad all aqij, tal SA) aas 1 tln O, l 'l l PY nall nal a T 4 d all as LL 8 D Dii ADC YDD LLY 33 a Y e L Li LCJ DDL DI 3 D 3 C Dii ID 3 DCL DD 3 DILI DI JI 3 I S Ll OLL aqd ja S s K) ÀlD O O d nar usy A'l Itq e IY 6 Z D 8 Lii LD OIL ODD ID DDD ')) O YY VIID YLDY YD 9 JAI us Y le A AIl dsy nie IIVL DIY DD ODC DYD DC 09 U Sy t 1 OS I naq IWA Ba Y TIA MID STH ely naq ely Bay ely e Ip ID IDM M naq oad l 8 L CIOD MI CD 93 DLC DC 3 199 D CDDC I 3 D OD 9 CC DDC ILJD DO D 399 IL ODDD Y f'1 I 01 elu MID Te A naq Oid ali i AL MID qa N naq úYL IDD DDD DILD DLD CDD IMY DYI DD 9 I DAY DID gel dsy e Iy aqd AID SAD q U DY 9 D 3 D Di I DCD DDI Y DY 0 ú 1 9 SZ OZI naq jq LI dsy a II Ie A S Aq AID naq usy Day as Day Bay 5 ay oia dsy 589 DID DD IIC DIY DI: O IYY LCO Ci L úY 1 ADCD CDI DCC IOD DCD ODO DIC SII 011 501 OOI jq I oid Al C dil ja S oid 61 ja S AID 6 j I Od la S naq naq dl Me D Lú 9 LDY 3 DD DCO DO 9 I LDY 03 C D 9 D LDL DD ID Oa DDD O DCID DILD COD 9 C ZL - 06655999 Z S FH Jas nr LD 1 b I DYD DDJ DYD a 11 oad bay ú 69 l C L D 3 DD DDD O Si" 0 g, 99DD H D ID DD 9 lt 9 l 001 313: 031 usy JÀI Jq a I GI VY T Vr DY DIV SÀD jas r I lo N DD 1 DDY D 3 DD DIV :k agqd nao e yl DYJ D l DJD DDD g L 7 O O Lb Oid Àl D di ÀID ul D ds aqd UlD dsy DDD Ji DD DD O DDD DYD YLD D 1 L DSD DYD JV nlf E SAD AID> ao S el V usv aqd 3 DD 3 9 9 3 LD D 9 00 339 DDI D 3)D 93 Dúl e Iy n UI aqd Ml -Lr j ul 9 naq I,i S dsy DDJ ' D Di 1 JLL j Dy LYD DYY D DDJ' DLY usy s KD usy na I ely 14 L Bay usy aj I s IH dal Ja S ÀID usy a I usy L 6 S IY;: DDIY D OLL D 1 DD LODY VOY DVV D 1 D;YD D 9 DOV DD 9 DVV DDV DVY Ie A nfq u ID 6 t,91 1 D M 1 D DYD AID SIH ely OIC 000 DYD DDD O 9 '8 ú dsy le A AID ú 951 DYVD LD DDD O aij S Aq u Ij prv 001- DIV vvv DYD IDD u Tly by AID STH DDD DOD DED 9 DVD e I aqd naq neq DDD 30 LL D 3 D VD oit, 90 i Oid KID oid jq I atd naq -a S jq nfq 3 DDD DDD DD YDY Dil D;D DD 3 YDY 11 D 96 f 06 ú Ig L A-I AOID Jg 1 11 q UAJ o N 9 l AID Y:Y DDD D O VDV DV D::) DD Y O D 00 DD 08 úE 9 LY la N Te A Te A naq le A s Aq e 1 y d x usy OLY D 3 D JID Dil DD DOYY LD; 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sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionelle SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: contig formé par des clones d'AD Nc à partir de l'extrémité 3 ' du génome CARACTERISTIQUES: de 1 à 3750 bp portion de la poloyprotéine PT-NANBH. PROPRIETES: protéines virales non structurelles. TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG 48 Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala His Phe Leu 10 15 TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC 96 Ser Gln Thr Tys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr 25 30 CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT 144 Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp 40 45 CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA 192 Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro 55 60 ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC 240 Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu 70 75 80 ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG 288 Thr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu 90 95 GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT 336 Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala 105 110 CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG 384 Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg 120 125 OZú (il E () LE 90 U nl 9 D JII ja S oaa qae nf O lf O Jas a 4 W Ie A S Ari a Ld elt V Ie A nar ely 096 DYVD DDV DDL DDD DúY VYD DD t)C D OL DY DIU Dyï 9 Li DDD DLD DID ODD UOú 56 Z U 6 Z RID el V Im A Xt D ely Rl D a Ji Xl R e-V rnal all ds IRA lnal Te A sq Z U 6 a De VD Vv D VDO V 9 y D O ILI D 99 DDD O OL lve ojjg j LD D 91 D CVV ei 8 Z 08 Z 9 LZ XlO naq RIî al I Ja S RC IRA el V el V RKID el V al I CID e IV KID t 2 A P 98 CDD MD LD DD VIY D Y DOD ILILD IDD DDD IOD IDD LL DC)D DDD DDD YDL OLZ 99 Z 09 g lld 'Ely aa S RIV ely ias Old Oad o IV nlq UID el V 21 V IA daj, KID 918 DM WD VDL ILDC IIDD LOV DDD DDD LDO DIID VY D D DD DL LO D Di VDC Z ûSZ t FZ AID nar ae I usy naq n;q naq iq L jas ul D Iqj jq L naq oid ja S aq L 89 L CDD CD 9 DII DIV L IID CIID DLD DDY jj Djj vy D D Dy X)V Dj ID C)DD DC Iy Lj D ggE Ov Zu 5 úZ OúZ SZZ IA -a S UIY i T 4 I aeqa ely aoj naq jas lly ai I e 21 Oid usy Al') o d 0 ZL DILD ILDI Y DDD VDV DJL 9 D 9 DLVY C 9 LD VDJL VD LLIV C 9 D DDD LVY t CCD 9 LDD naq tql jas naq Rle 2 lv naq ai Al ulo al I AID Jas air ZL 9 CIID IDY DDJ Di L L DO) Dt) YDD Ili DYI DYD vi Yi O 9) D Ol DLLY Z OOZ 4 a SIH s R ef Y dal aqd atti, rl-D niaq 21 V f 5 Y dla, S K 1 tz 9 Li LY DVD VVV DD 9 DCLC DLM DDV Df 9 V LLD DD 3 VDD DI DYVV 06 l 981 08 L Ie A o O l el V e 12 V P 1 V n If) 2 YV Ul C SAI *tlL e 2 Y Iq J, UIl 9 L DJDL D' D DD D DD LDY DD)D D Dlrt DD 3 Y DDD Y'DY D g Lt OL 1 991 najq Iy s Rr ul D s Ar aqa Ul) n Ie 1 IY naq u Iu) aw RID 8 ZS DID YDD v Y VYD OVY DMILL 9 VD DCV DDC ODID DVD o IIV V 9 091 991 091 iÀ,L oad naq Si H a S e 1 y s K N 1 id n-i qa W nid dsy aqa 08 f DVYI AIDD DID YD D DDD D DEVC YVO) DIIVY 9 YI IYD Di II oto Sú 1 nar I 12 A nli 5 jy dsy Oad 12 A a II e 1 V Old DV AKID -a S Zct DILD DC VISD L 99 V DYV DDD MLD LL L IDD ODD CCD DD C DDI 01 T aqd us V dil DLL DVYY DI 96 f -as N LD Ie A DDI CYV OLLC na Z rlaq r I DID Di LL DOD UID nid ail DVD CYC DII 9 tl n ID Ul D i ARI 9 YD CYD DVI 0 ú 1 na 9 ali ali CLIO DIV D;)Y 9 L - 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066999 Z *016 906 006 s Aq ul D Say ul D Uas PI las ba V Ias Jq I aq I PIV a KA ITA q GW usy 9 LZO DCV CV DDC DYVD DOV VDC DOV DC 3 DD VDV DDV D 13 O DVI DLC Di V DVY 968 068 988 Sl H si H 5 a naq I narq 1 S us jas narl e'El 2 s V OLI O d nor I SAl aog S 889 Z DYD DVD A O DD DLD DAL 1 i Dilk DDY DC L CLJ DYJ DA DVDD DV;D DVV DDV 088 9 L 8 O L 8 998 nli nl O P Iy e-y s AD od a Til a-EI naol e 2 V ALD tq L, dij L iq L Sj, ia S Op 9 z YYD OYVO CD DD 1 D D, YVDD DDV DZV DID 1 D O DOD YDV DD Oi VDV D 3 YI DD %aw ja S s D s AD Te A IPA dsy n ID ÀID Z 69 SZ DIY ODI DL D 011 DA 10: )YD OVYO 10 e D hi V n IV 1 as DDD 9 Y DYO LDY le A DDV IJS DOD DOY AD& 958 O 08 da 11 ja S AI dsy ja S naq dsy Oid dsy p g O DO 1 D 1 ODO DYV D 9 Y DAD VY DDD D Yv AID Oid nl D AID 1 999 DDD 9 D D 99 0 e 8 O Id O o N Jas 96 t 9 E DDD DIY DD) SZ 8 as a Al -a S nl le TA ds V DDI L O i O DD 9 YD D DVYD 0 08 a S Àlo e IV AMI 1 D 1 YOD YDD Y 90 t 8 o 018 Ua S O O d Ul D dsy oad oad e Iy jtq e Iy 8 pgt D Doi DDD VVD D 9;D) i D DDD DDV YDD jq L AECD as dsy DDV DCC D 9 Y DYV IUA Ul V ja S DID DDC DDL 96 L 06 L o.d n-ED Jas ja S A l auqd e Vy s I a L e ly naq nr LC e Ly narl e YV ags OO 000 11 D 11 DDJ DOV ID D 311 IDD D 11 1 DY DDC J ID DYD DCD D 1 D D 3 D IDI 3 08 L SLL OLL -a S ITA Iqt L Jas nl D at 11 noql IEA ITA "TI 4 5 Ba s Aiq f 5 l B 5 Y Oad Old Zgi ALDD DD DD DD 11 VYC VDV DAD j 1 I LD V Dv DCCV DVV DD V ODCD VDD IDD 99 L 09 L 99 L Old al I O Id ojd q 1 t SA Kq I lq O Id oad nar O Cd s A D AID SFH -e A le A t O úz YDD;) Y 'DD A 1 DD DDV DVI 1 DV;DD VDD DLD YDD DCA CCDD 1 YD VIAD DD 1 OSL 9 i L Of L Oid oad TUA x A 1,1 dsy oad p 1 Y s Aq dj,1 a S n ID naq naq oid oid usy 99 VDD 1 DD D 1 DY 3 D 3 YD DDD DDD 1 YV CD Di DD 1 DYOD DCD DCD CDD IDD DVV 9 úL OL 9 ZL A 1 A dsy Oid a Vy ely dil ely oid 1 o W ely Oid oid aqd s Aq s Aq jas g ZZ DI CYD DDD DODD I O DD DD YVDO DDD OV DDD CCDD VDD DM VVV CV VY DI 3 6 L - 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06655999 Z 82 - SEQ ID N : 23 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 23 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: baculovirus Autographa californica Nuclear Polydedrosis virus (Ac NPV) SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 24 CARACTERISTIQUES: de 1 à 23 bases homologues à la portion de gène poly- hédrine Ac NPV en aval du site de clonage Bam Hl dans les vecteurs p Ac 360 et similaires. PROPRIETES: amorce la synthèse de I'ADN à partir des séquences du vecteur de transfert du baculovirus qui flanquent 1 'ADN inséré au niveau du site Bam Hl. CGGGTTTAAC ATTACGGATT TCC 83 - SEQ ID N : 24 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 31 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: baculovirus Autographa californica Nuclear Polydedrosis virus (Ac NPV) SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 126 CARACTERISTIQUES: de 1 à 31 bases homologues aux séquences de jonction en amont produite lorsque l'AD Nc amplifié par d 75 (SEQ ID n 5) est cloné dans le site de clonage Bam Hl dans des vecteurs p Ac 360 et similaires; des déséquilibres au niveau des bases 13 et 14 introduisent un site Pstl de 3 à 10 bases homologues à la région du site Bam Hl dans des vecteurs p Ac 360 et similaires de 4 à 9 bases site Bam Hl de 12 à 17 bases site Pstl. PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN à la jonction des séquences du vecteur de transfert du baculovirus et des séquences amplifiées précédemment par l'oligo d 75; introduit un site de reconnaissance Pstl pour le travail de clonage ultérieur. TAAGGATCCC CCT GCA GTA TCG GCG GAA TTC 31 Ser Ala Val Ser Ala Glu Phe 84 - SEQ ID N : 25 TYPE SEQUENCE: Nucléotide LONGUEUR SEQUENCE: 45 BASES ETAT EN BRIN: monobrin TOPOLOGIE: linéaire TYPE MOLECULE: ADN synthétique ORGANISME SOURCE D'ORIGINE: N/A SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligo- nucléotide; oligo d 132 CARACTERISTTQIUES: de 5 à 10 bases site de reconnaissance Pstl de 13 à 27 bases codage de liaison pour cinq résidus Lys de 28 à 45 bases homologues alux bases 4 à 21 de B R 11 (SEQ ID 7). PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN à l'extrémité ' de BRII et introduit une séquence synthétique qui code 5 lysines ainsi qu'un site de reconnaissance Pstl pour le travail de clonage ultérieur. CTGCCTGCA GTA AAG AAG AAG AAG AAG AAA ACC AAA CGT AAC ACC A 45 Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Leu 10 - Revendications: 1 Un polypeptide viral PT-NANBH comprenant un anti- gène ayant une-séquence d'acide aminé qui est au moins homologue à 90 % avec la séquence d'acide a- miné dont question à la SEQ ID n 3,4,5,18,19,20, 21 ou 22, ou en est un fragment antigénique. 2 Un polypeptide viral PT-NANBH selon-la revendication 1, dans lequel la séquence d'acide aminé est-au moins ho- mologue à 90 % avec la séquence d'acide aminé dont question à la SEQ ID n 3,4 ou 5 ou en est un fragment antigéniqule. 3 Un polypeptide viral PT-NANBH selon la revendication 2, dans lequel la séquence d'acide aminé est au moins ho- mologue à 90 % avec la séquenc d'acide aminé dont question à la SEQ ID n 3 ou 4 ou en est un frag- ment antigénique. 4 Un polypeptide viral PT-NANBH selon la revendication 2, dans lequel la séquence d'acide aminé est au moins ho- mologue à 90 % avec la séquence d'acide aminé dont qestion à la SEQ ID n 5 ou en est un fragment an- tigénique. Un polypeptide viral PT-NANBH suivant l'une des revendications précédentes, dans lequel la sé- quence d'acide aminé est au moins homologue à 95 % avec la séquence d'acide aminé dont question à la SEQ ID n 3,4,5,18,19,20,-21 ou 22, ou en est un frag- ment antigénique. 6 Un polypeptide viral PT-NANBH selon la revendication 5, dans lequel la séquence d'acide aminé est au moins homologue à 98 % avec la séquence d'acide aminé dont question à la SEQ ID n 3,4,5,19,19,-20,21 ou 22, ou en est un fragment antigénique. 7 Un polypeptide viral PT-NANBH comprenant un anti- gène provenant de la région de programmation structurée du génome viral et un antigène prove- nant de la zone de programmation non structurée du génome viral. 8 Un polypeptide viral PT-NANBH selon la revendication 7, dans lequel l'antigène de la région de programmation structurée a une séquence d'acide aminé qui est au moins homologue à 90 % avec la séquence d'acide a- miné dont question à la SEQ ID n 5, ou en est un fragment antigénique, et l'antigène de la région de programmation non structurée a une séquence d'acide aminé qui est au moins homologue à 90 % avec la séquence d'acide aminé dont question à la 86 - SEQ ID n 3 ou 4, ou en est un fragment antigéni- que. 9 Une séquence d'ADN encodant un polypeptide viral PT-NANBH suivant l'une des revendications 1 à 8. 10 Une séquence d'ADN conformément à la revendica- tion 9 telle qu'indiquée à la SEQ ID n 3,4,5, 18,19,20,21, ou 22. 11 Un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN, conformément à l'une des revendications 9 ou 10, et capable en présence d'un hôte approprié d'exprimer la séquence d'ADN pour produire un po- lypeptide viral PT-NANBH. 12 Une cellule hôte transformée avec un vecteur d'ex- pression conformément à la revendication 11. 13 Un procédé pour la préparation d'un polypeptide viral PT-NANBH comprenant le clonage ou la syn thèse d'une séquence d'ADN encodant un polypep- tide viral PT-NANBH conformément à l'une des re- vendications 1 à 8, l'insertion de la séquence d'ADN dans un vecteur d'expression telle qu'elle puisse, en présence d'un hôte approprié, s'expri- mer et transformer une cellule hôte au moyen du vecteur d'expression, de mettre en culture la cel- lule hôte transformée et d'isoler le polypeptide viral. 14 I Un anticorps polyclonal ou monoclonal contre un polypeptide viral PTNANBH, conformément à l'une des revendications 1 à 6. Une méthode pour la détection d'acide nucléique viral PT-NANBH comprenant: i.) l'hybridation de l'ARN viral présent dans un échantillon, ou l'AD Nc synthétisé à partir de cet ARN, avec une séquence d'ADN correspondant à la SEQ ID n 3,4,5,18,19,20,21 ou 22, et la sélection des hybrides d'acide nucléique en résultant pour identifier tout acide nucléique viral PT-NANBH; ii) la -synthèse d'AD Nc à partir de l'ARN vi- ral présent dans un échantillon, l'amplifica- tion d'une séquence d'ADN présélectionnée cor- respondant à une sous-séquence de la SEQ ID n 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22 et l'identifica- tion de la séquence d'ADN présélectionnée. 87 - 16 Un kit d'essai pour la détection d'acide nucléique viral PT-NANBH comprenant: i) une paire d'amorces oligonucléotides dont l'une correspond à une portion de la séquence de nucléotide de SEQ ID N O 3,4,5,18,19,20, 21 ou 22 et dont l'autre se trouve du côté 3 ' de la première et correspond à une portion de la séquence complémentaire, la paire définissant entre elles une séquence d'ADN présélection- née; ii) un enzyme de transcriptase inverse pour la synthèse de l'AD Nc à partir de l'ARN de l'é- chantillon en amont de l'amorce correspondant à la séquence de nucléotide complémentaire de la SEQ ID N O 3,4,5,18,19,20,21 ou 22; iii) un enzyme capable d'amplifier la séquence d'ADN présélectionnée; et en option iv) des solutions de Javage et tampons de réac- tion. 2017 Une méthode pour la détection de l'antigène viral PT-NANBH ou de l'anticorps viral, comprenant la mise en contact d'un échantillon avec un polypep- tide viral PT-NANBH conformément à l'une des re- vendications 1 à 8, ou un anticorps polyclonal ou monoclonal conformément à la revendication 14, et la détermination de la présence ou non d'une liai- son antigène-anticorps au sein de l'échantillon. 18 Un kit d'essai pour la détection d'antigène viral PT-NANBH ou d'anticorps viral comprenant un poly- peptide viral PT-NANBH conformément à l'une des revendications 1 à 8, ou un anticorps polyclonal ou monoclonal suivant la revendication 14, et des moyens pour déterminer l'existence ou non d'une liaison antigène-anticorps au sein de l'échantil- lon. 19 Une formulation de vaccin comprenant un polypepti- de viral PT-NANBH conformément à l'une des reven- dications t à 8, en association avec-un support acceptable du point de vue pharmaceutique.