Brevet FR2653020A1 — publié le 19910419

L'interleukine 2 (IL2) qui est une lymphokine produite par les lymphocytes T activés possède une activité immunomodula- trice et une activité antitumorale décrites par exemple par Fletcher, M. et ai. (Lymphokine Research 6 (1987) 47-57), activités qui comprennent en particulier la capacité d'initier la prolifération des lymphocytes T et l'induction de la cyto- toxicité des cellules NK (natural killer) et des cellules LAK (lymphokine activated killer). On a observé que l'administra- tion de l'IL2, soit seule à haute dose, soit associée avec des cellules LAK, est capable d'induire la régression de certains cancers établis chez la souris et chez des patients ayant des cancers métastatiques tel que le mélanome, le cancer du rein, le cancer colorectal ou le lymphome non Hodgkinien (Rosenberg, S. A. et al. N. Engl. J. Med. (1987) 316 889-897). Aucun résultat clinique n'a montré l'efficacité de la thérapie avec l'IL2 seule ou associée avec une immunothérapie adoptive dans les diverses leucémies chroniques ou aiguës connues, notamment dans la leucémie myéloïde aiguë (LMA). Les phénomènes de dysrégulation aboutissant à la prolifération des cellules leucémiques sont complexes. On admet généralement que leur contrôle nécessiterait l'utilisation en association de différents facteurs de différentiation, notamment l'utili- sation de 1'IL2 avec par exemple un interféron, le facteur de nécrose tumorale, une autre interleukine ou d'autres facteurs de différentiation, comme décrit par exemple pour la leucémie lymphoïde chronique dans la demande de brevet WO 88/06991. Il a été suggéré puis confirmé que 1'IL2 stimule in vitro de façon significative la prolifération de cellules blastiques de malades atteints de LMA (J. A. Carron et J. C. Cawley Br. J. Haematol. 71 (1) (1989) 168). Or la demanderesse vient d'obtenir de façon inattendue des résultats montrant que, dans certaines conditions d'utilisa- tion I'IL2 seule présente une activité thérapeutique sur la LMA. L'invention concerne donc l'utilisation d'un polypeptide ayant l'activité de l'interleukine 2 humaine pour préparer une composition pharmaceutique destinée au traitement des leucé- mies. On entend par polypeptide ayant l'activité de l'IL2 humaine, 1'IL2 humaine naturelle, 1'IL2 humaine recombinante, c'est-à-dire obtenue par la technologie de i'ADN recombinant, par exemple comme cela est décrit par Taniguchi, T. et al. (Nature (1983) 302 305-310) ou dans le brevet EP 91530 B, des allèles ou des dérivés de ces produits tels que décrits par exemple par Ju, C. et al. (J. Biol. Chem. (1987) 262 5723-5731). Les leucémies que concerne l'invention comprennent les leucémies myéloide ou lymphoïde chroniques et les leucé- mies aiguës lymphoïde ou non lymphoblastique par exemple les leucémies myéloides d'une façon générale caractérisées par la prolifération des cellules blastiques. L'invention a notamment pour objet l'utilisation carac- térisée en ce que la leucémie est une leucémie myéloïde aiguë, diagnostiquée par les examens histologique, cytologique et biologique usuels. L'utilisation selon l'invention est des- tinée au traitement de la LMA, au traitement de la rechute de celle-ci ou au traitement préventif de la rechute. L'invention décrit l'utilisation de l'IL2 dans un traitement dont l'effi- cacité est montrée par un taux de réponse d'environ 20 % chez des malades atteints de LMA soit réfractaires à la chimiothé- rapie conventionnelle, soit en rechute après la chimiothérapie ou après une greffe de moelle osseuse. L'invention a particulièrement pour objet l'utilisation caractérisée en ce que l'IL2 humaine est une IL2 recombinante pure. Les compositions pharmaceutiques préparées selon l'invention renferment une IL2 humaine recombinante, des allè- les ou des dérivés de celle-ci, telle que décrite ci-dessus, pour laquelle on utilise des techniques de purification connues de l'homme de métier, qui permettent de préparer des produits purs. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisa- tion caractérisée en ce que l'IL2 est une IL2 recombinante non glycosylée sous forme réduite. L'IL2 non glycosylée utilisée est notamment celle ayant la séquence de l'IL2 naturelle à 133 aminoacides avec éventuellement une Méthionine N-terminale supplémentaire, dont les 3 cystéines en position 58, 105 et sont sous la forme réduite, manifestant une activité biologique comparable à celle de l'IL2 oxydée ayant la même séquence comportant un pont disulfure en position 58-105. Un exemple de préparation de l'IL2 réduite à partir d'une souche d'E. coli est donné plus loin dans la partie expérimentale. Par forme réduite, on entend que les restes cystéines que contient 1'IL2 renferment un groupement sulfhydryle libre dont la détermination est faite, par exemple, par spectrophotomé- trie avec la dithiodipyridine comme réactif des thiols. L'ac- tivité biologique est déterminée par mesure de la proliféra- tion de lignées cellulaires leucémiques de souris dépendantes de 1'IL2, CTLL-2, avec un test colorimétrique au sel de tétra- zolium (Mossmann, T. J. Immunol. Meth (1983) 65 55-63). L'activité spécifique*des IL2 recombinantes utilisées dans l'invention est au moins égale à 0,5 x 106 U BRMP/mg, de préférence 1 x 107 U BRMP/mg. L'unité d'activité IL2 est définie comme la quantité qui produit 50 % de la réponse maximum dans le test. On utilise comme standard un échantillon "Biological Response Modifier Programm (BRMP) reference agent human IL2 (jurkat)" fourni par le National Cancer Institute (NCI). L'invention a spécialement pour objet l'utilisation carac- térisée en ce que i' IL2 est administrée par voie intraveineuse en bolus lent à la dose de 2 à 20 x 106 U/M2 par injection, de préférence 3 à 10 x 106 U/M2 et plus spécialement celle carac- térisée en ce que 1'IL2 est administrée à la dose de 8 x 106 U/M2 par injection. L'invention a tout spécialement pour objet l'utilisation caractérisée en ce que 1'IL2 est administrée de façon répétée au moins 2 fois par jour par cycle de plusieurs jours par semaine et caractérisée en ce que 1 'IL2 est administrée de façon répétée pendant au moins 3 semaines non consécutives. La dose administrée, la fréquence de l'injection et la durée du traitement varient en fonction de l'état du malade. La dose journalière est généralement comprise entre 2 x 106 U/M2/24h et 30 x 106 U/M2/24 h, de préférence de l'ordre de 20 x 106 U/M2/24h par cycle de plu- sieurs jours chez l'adulte ou l'enfant. L'IL2 est comprise dans une composition pharmaceutique, de préférence lyophilisée en flacon-dose contenant de 0,1 à 2 mg de principe actif et que l'on reconstitue avec de l'eau distillée pour injection. La solution obtenue est immédiatement diluée à l'aide d'un soluté, par exemple le chlorure de sodium à 0,9 % ou le glu- cose à 5 % pour l'administration en bolus lent. Par bolus lent, on entend une perfusion de courte durée par exemple de mn. Selon l'utilisation préférée de l'invention, l'IL2 est l'IL2 recombinante réduite dont la préparation est donnée plus loin ainsi qu'un exemple de préparation pharmaceutique, la dose est de 8 x 106 U/M2 par injection, la fréquence de l'in- jection est de toutes les 8 heures (3 doses/jour) ou toutes les 12 heures (2 doses/jour) selon un cycle de 5 jours consé- cutifs, la durée de l'administration est de 3 semaines non consécutives, représentant environ 360 x 106 U/M2 et 36 mg administrés au total chez le malade par voie intraveineuse en bolus lent de 15 minutes. Toutes les publications qui sont citées sont incorporées, par référence, dans le texte de la présente demande. Les figures ci-annexées illustrent la préparation décrite plus loin: - la figure la est un chromatogramme de RP-HPLC analytique de l'extrait brut en guanidine 8M de la préparation. - la figure lb est un chromatogramme de RP-HPLC analytique des IL2 standard réduite et oxydée. - la figure 2 est un chromatogramme de RP-HPLC analytique de la "resolubilisation" de la préparation. - la figure 3 est un chromatogramme de RP-HPLC de la "fraction principale" de la préparation. - la figure 4 est un chromatogramme de RP-HPLC analytique de la fraction "59" de la préparation. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute- fois la limiter: Préparation de l'IL2 humaine recombinante (r-hIL2) réduite: L'IL2 est préparée à partir de granules qui sont obtenus par centrifugation de cultures d'une souche d'E. coli trans- formée à l'aide d'un plasmide comprenant la séquence codant pour l'IL2 native et capable d'accumuler l'IL2 sous cette forme à l'intérieur des cellules, comme décrit par exemple par Sato, T. et al. (J. Biochem. (1987) 101 525-534). Les cellules ainsi obtenues d'un fermenteur de 10 litres sont soumises à un éclatement dans un homogénéisateur Manton Gaulin. A partir des débris cellulaires isolés et lavés (90-170 g en poids humide) l'IL2 est solubilisée dans 2,5 volumes d'un tampon Tris, HCl mM pH 8 contenant du chlorhydrate de guanidine (Gu, HCl) 8M et du Dithiothréitol (DTT) 100 mM. La quantité d'IL2 solu- bilisée (1,5 à 2,5 g) est estimée par RP-HPLC analytique sur une colonne C4 VYDAC (0,46 x 15 cm) 300 A , 5 microns, au débit de 2 cm3/mn, avec un gradient linéaire d'acétonitrile (30 à 70 % sur 10 minutes) contenant 0,1 % de TFA, une détec- tion spectrophotométrique à 280 nm ou 210 nm, dont on évalue la surface du pic à 280 nm après calibration avec un standard d'IL2 (fig. la et fig. lb). L'IL2 est ensuite précipitée par abaissement à 2M de la concentration en Gu, HC1, en présence de DTT. Après lavage du précipité à l'aide d'une solution aqueuse de TFA à 0,1 % jusqu'à obtention d'un pH du surnageant inférieur à 5,0, 1'IL2 est solubilisée dans une solution aqueuse à 20 % d'acétonitrile et 0,1 % de TFA. La "resolubi- lisation" obtenue, qui renferme selon la RP-HPLC analytique (fig. 2) une teneur en IL2 réduite supérieure à 85 %, a une activité biologique inférieure à 0,01 x 107 U/mg d'IL2 réduite et une teneur en groupements sulfhydryles de 2,85 SH/mole d'IL2 réduite. Une fraction de la solution obtenue, correspon- dant à environ 200 mg d'IL2 estimée par RP-HPLC analytique, est diluée de façon à ajuster la concentration en acétonitrile inférieure à 10 % dans du TFA à 0,1 %, puis appliquée à une colonne C4 VYDAC (5,7 x 30 cm). L'IL2 est éluée au débit de cm3/mn, à l'aide d'un gradient linéaire d'acétonitrile (30 à 80 % sur 40 minutes) contenant 0,1 % de TFA, à une concentration d'environ 60 % en acétonitrile dans un pic majeur détecté par spectrophotométrie à 280 nm et analysé par RP-HPLC. La "fraction principale" recueillie qui renferme 1'IL2 réduite est diluée immédiatement par 2 volumes de solu- tion aqueuse d'acide citrique à 0,5 % et appliquée à une colonne C4 VYDAC (5,7 x 30 cm) que l'on développe avec un gradient linéaire d'isopropanol (20 à 70 % sur 40 minutes) contenant 0,5 % d'acide citrique, au débit de 50 cm3/mn. L'effluent, suivi par spectrophotométrie à 280 nm, montre l'élution successive d'un pic mineur à une concentration d'environ 48 % en isopropanol (fraction "48") et d'un pic majeur à une concentration d'environ 59 % en isopropanol (fraction "59") (fig. 3). La fraction "59" est recueillie. Elle est stable à la conservation à 0 C pendant au moins 24 h, à l'abri de l'air. Après élimination de l'isopropanol par distillation azéo- tropique sous vide, la fraction "59" est analysée en RP-HPLC analytique et donne un pic homogène (fig. 4) élué à environ % d'acétonitrile alors que 1'IL2 oxydée de référence est éluée à environ 57 % d'acétonitrile (fig. lb). La fraction "59" qui, après élimination de l'isopropanol, a une concentra- tion en IL2 supérieure à 1 mg/cm3 et un pH de 3 0,5, peut être conservée à +4 C, à l'abri de l'air, pendant au moins une semaine ou être immédiatement lyophilisée ou formulée pour l'obtention d'une composition pharmaceutique. La fraction "59" lyophilisée est dosée en activité biologique, selon le test in vitro de prolifération de cellules CTLL-2, et a une activité spécifique de 1,3 0,5 x 107 U/mg comparable à celle de 1'IL2 native. La teneur en groupements sulfhydryles libres de la frac- tion "59" lyophilisée, déterminée par la méthode colorimétri- que à la dithiodipyridine, est de 2,94 SH/mole comparativement à 0,76 SH/mole pour 1'IL2 oxydée de référence. à 300 mg titrés par RP-HPLC analytique de r-hIL2 réduite, contenant 3 groupements SH, biologiquement active, homogène en RP-HPLC, sont obtenus dans la fraction "59" à partir d'un fermenteur de 10 litres. EXEMPLE 1: Composition pharmaceutique pour perfusion. On a réalisé une préparation pour injection par voie intravei- neuse en perfusion de formule: IL2 réduite 0,5 mg acide citrique 5 mg mannitol 50 mg eau stérile 1 cm3 glucose à 5 % 50 cm3 EXEMPLE 2: Etude clinique dans le traitement de la LMA. L'étude inclut des malades ayant une LMA primitive de diagnostic cytologique (type Ml à M5 selon la classification FAB) pour laquelle ils ont eu une chimiothérapie d'induction suivie soit d'une chimiothérapie de maintenance, soit d'une greffe de moelle osseuse autologue (noté GDMA) et dont un diagnostic ultérieur a établi la rechute ou le caractère réfractaire à la chimiothérapie, évalué sur la présence de plus de 10 % de blastes dans deux prélèvements de moelle osseuse réalisés au moins à 1 semaine d'intervalle, par exem- ple à 2 semaines d'intervalle. Les compositions d'IL2 préparées selon l'invention permettent d'injecter des doses de 8 x 106 U/M2, soit 0,8 mg/M2 par injection, à raison d'une injection toutes les 8 heures pen- dant 5 jours consécutifs de la première semaine, puis la même dose que cidessus à raison d'une injection toutes les 12 heures pendant 5 jours consécutifs de la troisième semaine et de lacinquième semaine, par voie intraveineuse en bolus lent de 15 minutes. On utilise les compositions décrites à l'exem- ple 1. L'évaluation des malades est faite avant et après le traite- ment à i'IL2 sur les prélèvements de moelle osseuse par déter- mination du pourcentage de blastes et évaluation de l'état de différentiation des précurseurs médullaires. Sur 11 malades réévalués, les réponses suivantes ont été obtenues: Patient Age Sexe Type Etat hématologique % de blastes médul laires après IL2 Réponse à l'inclusion (JO - dJ - J14 - J36) 1 68 H M5 1ère rechute sous chimio 30 4 2 0 RC 2 17 F M5 Résistance primaire 85 83 80:30 échec 3 60 H MS 2ème rechute résistant 42 24 43 16 échec à la chimio 4 5 H MS 3ème rechute après GDHMA 81 3 ND 0 RC 56 H M4 1lre rechute sous chimwio 13 ND 19 60 échec 6 25 H M2 1èr-e rechute sous chimio 14 ND ND 0 échec 7 45 H M4 Résistance primaire 75 ND 22 83 échec 8 28 H M4 1ère rechute après GDMA 61 89 57 70 échec 9 53 F M1 lère rechute résistant 83 74 93 92 échec à la chimio 59 F M4 lère rechute après GDMl 80 74 89 ND échec 11 39 H M1 1ère rechute sous chimio 44 38 64 70 échec Les résultats montrent 2 réponses complètes (RC), soit un taux de réponse de 20 %. Parmi les échecs, 2 malades (patients n 3 et n 7) présentent une diminution significative du pourcen- tage des blastes médullaires. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un polypeptide ayant l'activité de l'inter- leukine 2 humaine pour préparer une composition pharmaceutique destinée au traitement des leucémies. 2) Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la leucémie est une leucémie myéloïde aiguë. 3) Utilisation selon la revendication 2 caractérisée en ce que 1'IL2 humaine est une IL2 recombinante pure. 4) Utilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que 1'IL2 est une IL2 recombinante non glycosylée sous forme réduite. ) Utilisation selon la revendication 3 ou 4 caractérisée en ce que 1'IL2 est administrée par voie intraveineuse en bolus lent à la dose de 2 à 20 x 106 U/M2 par injection. 6) Utilisation selon la revendication 5 caractérisée en ce que 1'IL2 est administrée à la dose de 8 x 106 U/M2 par injection. 7) Utilisation selon la revendication 6 caractérisée en ce que 1'IL2 est administrée de façon répétée au moins 2 fois par jour par cycle de plusieurs jours par semaine. 8) Utilisation selon la revendication 7 caractérisée en ce que 1'IL2 est administrée de façon répétée pendant au moins 3 semaines non consécutives.