Brevet FR2656531A1 — publié le 19910705

i Promoteur artificiel pour l'expression de protéines dans la levure La présente invention concerne un nouveau promoteur arti- ficiel pour l'expression dans la levure de protéines, en particu- lier des protéines hétérologues, un vecteur d'expression de celles-là portant celui-ci, les souches de levure et notamment de Saccharomyces cerevisiae transformées par ce vecteur d'expression, ainsi qu'un procédé de production d'une protéine recombinante à l'aide de ces souches. La levure, et en particulier Saccharomyces cerevisiae, microorganisme non pathogène dont la génétique a été étudiée en détail, est un hôte eucaryote de choix pour l'expression des protéines, notamment des protéines hétérologues Il est donc important de découvrir ou de construire de nouveaux promoteurs pour l'expression de celles-là, plus intéressants que les promoteurs connus. La structure d'un promoteur de levure, séquence d'ADN située en amont d'un gène et responsable de la transcription de celui-ci, commence à être partiellement connue et comprise On sait qu'il comporte un élément TATA situé dans une zone riche en AT, une région d'initiation de la transcription en aval de celui-ci et éventuellement en amont de ce dernier des séquences, dites séquences d'activation amont UAS (Upstream Activating Sequence) ou de répression amont URS (Upstream Repressing Sequence), qui règlent la force du promoteur sous l'effet d'un inducteur ou d'un répres- seur. La demanderesse a construit un nouveau promoteur hybride à partir de deux promoteurs connus: le promoteur du gène GAL 7 de Saccharomyces cerevisiae (TAJIMA et al, 1986, Molecular cellular Biology, 6, 246-256) et un promoteur de séquence proche de celle du promoteur ADH 2 naturel (région 5 ' flanquante du gène ADH 2 décrite par RUSSEL et al ( 1983), J Biol Chem 258, 2674-2682) appelé, dans cette demande, un promoteur ADH 2 Elle a ensuite inséré ce nouveau promoteur et à, titre comparatif, le promoteur ADH 2 qui a servi à le construire dans un vecteur d'expression pour une nouvelle protéine recombinante: l'urate oxydase d'A flavus, et dans un vecteur d'expression pour la p-ga Lactosidase, a transformé des souches de levure à l'aide de ces vecteurs, cultivé ces dernières dans différentes conditions et dosé, après lyse de ces cellules, la quantité de la protéine d'intérêt exprimée Elle a ainsi constaté que le nouveau promoteur permet un niveau maximal d'expression élevé parfois supérieur à celui du promoteur ADH 2, et une régulation du niveau d'expression à plusieurs niveaux. L'invention concerne donc un nouveau promoteur artificiel pour l'expression de protéines dans la levure, caractérisé en ce qu'il comporte: une sous-séquence en amont de l'élément TATA de la séquence du promoteur du gène GAL 7 de Saccharomyces cerevisiae, qui comporte les séquences d'activation amont UA 51 et UA 52. une sous-séquence de la séquence d'un promoteur ADH 2 comprenant l'élément TATA et la région d'initiation de la transcription. De préférence, la sous-séquence en amont de l'élément TATA du promoteur du gène GAL 7 de Saccharomyces cerevisiae est une sous-séquence de la séquence suivante: U I u CGCGTCTARTACTTCGGAGCACTG TTGAGCAAGGOC CAT TGTAATAT A TT TC TGTCAT * * 4 e e ** _ C:, OS 4 C AGATATGAAGCCTCGTGCACRACT CGCT TCCGAGTAATCTATATAAAAGAQCAGTA T T TCC T TAACCCAPA 4 AATAAOGGGP Ar GGGTCCAAAAGCGCTCGGACAACTOT TOACCOT AAAGGAT T GOTT TTATTCCCTCTCCCAGGTT TT TCGCGRGCCTGT TGACAACTGGCA GATCCGRAGGACTGGCTATRCAOTGT TCACAAAATAGCCACTAACTRA TAAGTOGTGAOC - e 4 # o -e 4 CTAGGCT TCCTGACCGATATGTCCAAGTGT a IT TATCGGT TCGACT T TATA RCACATCO 5 P pu h J. CTTTAGCTATGITCAGTTAGTT TGGCATC GAAAT CGATACAA Gt CAATCARACC On apprécie que La sous-séquence de la séquence d'un promoteur ADH 2 comprenant L'éLément TATA et La région d'initiation de La transcription soit choisie parmi les sous-séquences de La séquence ci-après: CCTATCRCATATAAATAGA T -CGGTGT TT TCT ji TACGGAYA Gl Gl AT Al 7 TAYCT GTGCCAGTAGCGACTTTT 1 TCRCACTCGAORATACTCI TACTCTGCTC CTG TOGTTTT CRCGGTCAICGCTGAAAAARGTGGAGC 7 CI RGIGRRTGATGACGAGAGAACRACAARAA TATCCI TCT G CT TCI TGGTARATGARTATCRAGCTRCRAARRGCATACRRTCAR _,c_ _ 4 0-0 4 O_. RATAGTORGRAACAAGAAGAACCA 1 TATCTTRATAGT TC Ga TGT 1 T ICGTAIGI TAGTT c J B CTRATCARCTATTAACTATA 1 ,, GATRAG TGRTRATTGRTRTAGC Un promoteur particulièrement intéressant est celuiqui comprend la séquence suivante: u I COCG TCTRTRCT Tc GGRAGCRCTGT TGRGCGAAGGCTCAT TAGATAT Al T T TCTGTCAT AGMTATGAAGCCTCGTGACAACTCGCT TCCGAGTRATC TTATRAAGACQA Gt A TY TCCYT Tr ACCCARTAAGGGAGGGGTCC:AAARGCTCGGCAACTOT TGACCOT RAAGGA ATTGGT T TAT TCCCTCTCCCAGQT Y TTCGCGAOCCTGT TGACAACTOGCA GATCCGRAGGACTGGCTATACAGTGT TCCAAATAGCCAAG T GAAAT TGATT TAGOC CTAGGCTTCCTGACCGARTAGTCRCAAGTGI T TATCOOGTTCGACT I TAI TTACAC Ar CO h I CT TAGCTATGT TCAGI TAGT T GGCCATGC Ct IAC CRIATAAATAGR GARATCGATACAAGTCAATCAAACCGTACGGATAGTGIRT AT TATCT G Tl GCCAGTARGCGCI 1 1 l TCACRCTCGATACC T TACTARCIGCTCTC Tt GT GTT T __ 4 4 CCGG 1 CA 1 CGC TGAAAA Af Gl GTGAGCTCTATGAGAAITG TGACGAGGACACACR, TAITCACIT C Ty IGT ICI C 1 T GGTA AAGAATATCAAG:TACRTAAAOCATARI C Al A. ATRGT Gr A GAACA AGAAGAACCA Il TRICTPATAGI CG i GT r r l CO T Ar GT TAGTT C I IJ CARTCAACT Rl TRACTAIA G r TGI I ATA TG_ A_ T T- GTAGI T Git AR Ti P 4 TTGA Tl RRGC. Le promoteur de l'invention présente des avantages impor- tants par rapport aux promoteurs connus et en particulier par rapport au promoteur ADH 2 et celui du gène GAL 7. Il permet un niveau maximal de transcription et donc d'expression élevée, en particulier pour l'urate oxydase d'A. flavus, et offre la possibilité de réguler celui-là à trois niveaux: en présence de glucose et en absence de galactose niveau nul: on ne détecte pas d'expression, résultat identique à celui publié pour le promoteur du gène GAL 7 dans une souche de Saccharomyces cerevisiae poussant dans ces conditions (TAJIMA et al, 1986, Molecular cellular Biology, 6, 246-256) Le promoteur ADH 2 présente un niveau d'expression faible mais détectable dans ces conditions. en l'absence de glucose et de galactose niveau de fond: il y a une expression faible, résultat intermédiaire entre celui observé pour le promoteur ADH 2 (niveau maximal) et celui publié pour le promoteur du gène GAL 7 (niveau nul: TAJIMA et al, 1986, Molecular cellular Biology, 6, 246-256). en l'absence de glucose et en présence de galactose niveau d'expression maximal. L'intérêt, pour l'expression de protéines hétérologues dans la levure, de disposer d'un promoteur présentant un niveau nul dans certaines conditions est d'avoir la possibilité d'éviter toute pression de sélection qui favoriserait les cellules les moins productrices pendant la propagation de la souche Ceci est particu- lièrement important dans le cas o la protéine est toxique pour la cellule hôte. L'avantage d'un promoteur à deux niveaux d'expression: l'un de fond (non induit) et l'autre maximal (induit) réside dans la faculté de choisir un niveau intermédiaire en jouant sur la concentration de l'inducteur. L'invention a également trait à un vecteur d'expression pour la levure portant un gène d'intérêt avec les moyens néces- saires à son expression, sa réplication et la sélection des cellules transformées, caractérisé en ce que le gène d'intérêt est sous le contrôle du promoteur précédemment défini. L'invention concerne également les souches de levure, en particulier de Saccharomyces cerevisiae, transformées par le vecteur d'expression précédent, ainsi qu'un procédé de production d'une protéine d'intérêt qui comprend la culture de ces dernières en présence de galactose. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après: EXEMPLE 1: Détermination de la séquence de l'AD Nc de l'urate oxydase d'A flavus 1) Isolement des ARN messagers d'Aspergillus flavus La souche d'A flavus productrice d'urate oxydase a été cultivée dans des conditions de production d'urate oxydase, c'est- à-dire dans un milieu contenant de l'acide urique de composition suivante: glucose 15 g/l, Mg SO 4,7 H 20 1 g/l, KH 2 PO 4 0,75 g/l, Ca CO 3 1,2 g/l, acide urique 1,2 g/l, KOH 0,5 g/l, huile de soja 0,66 ml/l, Fe SO 4,7 H 20 10 mg/l, Cu SO 4,5 H 20 1 mg/l, Zn SO 4,7 H 20 3 mg/l, Mn SO 4,H 20 1 mg/l Le milieu est ajusté à p H 7 avec H 25 04 1 M et est stérilisé à 120 C pendant 80 min. Dans un erlenmeyer de 5 l on ensemence 1,5 I de milieu avec environ 1 à 3 107 spores. La culture est incubée pendant environ 40 h à 30 C sous agitation ( 120 tr/min) Le mycélium est récupéré par filtration sur gaze, lavé avec de l'eau et congelé dans l'azote liquide. g de mycélium (poids humide) sont décongelés et resus- pendus dans 45 ml de tampon de lyse puis repris dans un même volume de billes ( 0,45 pm de diamètre) Le tampon de lyse est constitué de thiocyanate de guanidine 4 M, Tris-H Cl 10 m M p H 7,6, EDTA 10 m M, P- mercaptoéthanol 50 ml/l La suspension mycélienne est broyée au broyeur Zellm hler (vibrogène) pendant 5 min. Le broyat est récupéré et les billes décantées Le surna- geant est prélevé (environ 45 ml) et ramené à 3 M final en chlorure de lithium et conservé à O C. Après deux jours, on le centrifuge pendant 60 min à 000 tr/min Le surnageant est écarté et le culot est repris dans ml de Li CL 3 M et recentrifugé à 10 000 tr/min pendant 1 h 30. On ajoute la protéinase K (SIGMA) 40 pg/ml du SDS ( 0,1 % P/V) et de l'EDTA à 20 m M On incube à 37 C pendant 3 h On précipite avec 2 volumes d'éthanol, puis on effectue un lavage à l'éthanol 70 % On reprend le culot dans 0,5 ml de tampon TE (tris H Cl 10 m M EDTA, 1 m M p H 7,5), on extrait 2 fois au chloroforme, on précipite à l'éthanol Les ARN sont conservés à -80 C dans l'alcool. 2) Purification de la fraction poly A des ARN Environ 1 mg d'ARN est précipité 20 min à 4 C ( 15 000 tr/ min) puis lavé avec de l'éthanol 70 % puis séché Le culot est repris dans 1 ml de tampon TE et resuspendu par agitation au vortex L'oligo d T-cellulose type 3 (commercialisé par Collabo- rative Research Inc, Biomedicals Product Division) est préparé suivant les recommandations du fabricant L'ARN est déposé sur l'oligo d T, agité doucement pour remettre en suspension les billes, puis chauffé pendant 1 min à 65 C. La suspension est ajustée à 0,5 M Na Cl puis mise à agiter doucement pendant 10 min La suspension est alors centrifugée pendant 1 min à 1 000 tr/min, le surnageant est éliminé, le culot est lavé 2 fois avec 1 ml de tampon TE contenant 0,5 M Na CL Les surnageants sont éliminés L'élution de la fraction polyadénylée des ARN (constituée des ARN messagers) est obtenue par suspension des billes dans 1 ml de tampon TE, puis chauffage de cette suspen- sion à 60 C pendant 1 min, suivie d'une agitation pendant 10 min sur plaque basculante On centrifuge ensuite 1 min à 1 000 tr/min, ce qui permet de récupérer d'une part le surnageant contenant des AR Nm libres en solution et d'autre part le culot de billes de cellulose L'ensemble des opérations ci-dessus (à partir de l'élution) est répété Les surnageants ainsi obtenus sont rassem- blés, on élimine l'excès de billes par centrifugation et on préci- pite le surnageant à l'éthanol contenant du Na Cl suivant les techniques habituelles (Maniatis: op prec). 3) Constitution de la banque des AD Nc A partir des ARN messagers isolés comme décrit dans l'exemple précédent, on a réalisé une banque d'AD Nc dans le vecteur p TZ 19 R (commercialisé par PHARMACIA) Ce vecteur est un plasmide comprenant un polylinker contenant des sites uniques de restric- tion. La technique de clonage utilisée est celle décrite par Caput et a L, (technique de l'amorce-adapteur (Primer-adapter): (Caput et ai, Proc Natl Acad Sci (U S A) ( 1986) 83, 1670- 1674)). Elle consiste d'une part à digérer le vecteur par Pstl, ajouter une queue de polyd C sur l'extrémité 3 ' protubérante, puis à digérer Les plasmides ainsi obtenus par Bam HI Le fragment corres- pondant au vecteur est purifié sur colonne de Sépharose CL 4 B (Pharmacia) Il comprend donc une queue polyd C à une extrémité, l'autre extrémité étant cohésive, du type Bam HI D'autre part, les ARN messagers sont soumis à la transcription inverse à partir d'une amorce dont la séquence est la suivante 5 ' Ainsi, les AD Nc présentent-ils à leur extrémité 5 ' la séquence GATCC complémentaire de l'extrémité cohésive Bam HI. Les hybrides ARN-ADN obtenus par action de la transcrip- tase inverse sont soumis à une hydrolyse alcaline qui permet de se débarrasser de l'ARN Les AD Nc simple brin sont alors purifiés par 2 cycles sur colonne de Sépharose CL 4 B et soumis à un traitement à la terminal transférase de façon à ajouter des polyd G en 3 ' Les AD Nc sont inséréssous forme simple brin dans le vecteur préparé comme décrit plus haut Un second oligonuctéotide "l'adapter" complémentaire de l'amorce est nécessaire pour générer un site Bam HI "ouvert" à l'extrémité 5 ' des AD Nc Après hybridation du vecteur, de l'AD Nc et de l'adapter", les molécules recombinantes sont circularisées par l'action de la ligase du phage T 4 Les régions simple brin sont alors réparées grâce à l'ADN polymérase du phage T 4. Le pool de plasmides ainsi obtenu sert à transformer la souche MC 1061 pour la résistance à l'ampicilline (Casabadan Chou et Cohen J Bact ( 1980) 143 pages 9971-980). 4) Détermination de la séquence partielle de l'urate oxydase Une préparation d'urate oxydase d'A flavus (SIGMA) a été repurifiée par chromatographie sur une colonne Red-agarose 120 (SIGMA), suivie d'une filtration sur un gel acrylamide-agarose Ultrogel Aca 44 (IBF). Afin d'obtenir des informations sur la séquence des acides aminés de l'urate oxydase purifiée, permettant la synthèse des sondes nécessaires au clonage de l'AD Nc, un séquençage amino- terminal direct de la protéine a été tenté Ce dernier n'a pas abouti, probablement à cause d'un blocage amino-terminal de la protéine. La stratégie ci-après a donc été développée pour l'obten- tion de la séquence partielle de l'urate oxydase: coupure de la protéine par des enzymes protéolytiques (à l'aide des enzymes trypsine et protéase V 8 de Staphylococcus aureus) séparation des polypeptides obtenus par HPLC phase inverse séquençage des peptides purifiés. 1) Hydrolyse de l'urate oxydase par la trypsine, purification et séquençage des peptides: l'urate oxydase à 9 mg/ml dans un tampon de carbonate d'ammonium 100 m M p H 8,9 a été digéré par la trypsine (Worthington, TPCK) avec un rapport urate oxydase/trypsine de 30/1 en poids à C pendant 24 h Après l'hydrolyse tryptique, 60 pg d'urate oxydase digérée ont été directement injectés sur une colonne HPLC phase inverse de silice greffée Brownlee G 18 (colonne 10 x 0,2 cm), équilibrée en acétonitrile 1 % (v/v), acide trifluoro- acétique 0,1 % (v/v) dans l'eau Les peptides ont été ensuite élués par un gradient linéaire d'acétonitrile dans une solution d'acide trifluoroacétique ( 0,1 Z v/v) dans l'eau variant de 1 % à 60 % d'acétonitrile en 60 min, avec un débit de 150 pl/min Les peptides à la sortie de la colonne ont été détectés par mesure de la densité optique à 218 nm. Le profil d'élution est présenté dans la figure 1, dans laquelle les numéros suivant la lettre T (Trypsine) correspondent aux pics identifiés. Chaque pic a été collecté et conservé à -20 C jusqu'au moment de l'analyse sur un séquenceur de protéines (Le modèle 470 A d'Applied Biosystems), équipé d'un chromatographe (modèle 430 A d'Applied Biosystems) qui analyse en continu les dérivés phényl- thiohydantoiques formés, apres chaque cycle de dégradation. Le tableau ( 1) ci-après présente les séquences pepti- diques des 9 pics identifiés. 2) Hydrolyse de l'urate oxydase par La protéase V 8, purification et séquençage des peptides: L'urate oxydase, à une concentration de 2 mg/ml dans un tampon acétate d'ammonium 100 m M p H 6,8, a été digérée par la pro- téase V 8 de Staphylococcus aureus (Boehringer-Mannheim) avec un rapport urate oxydase/protéase V 8 de 60/1 à 30 C pendant 72 h. pg d'urate oxydase digérée ont ensuite été injectés sur une colonne HPLC phase inverse de silice greffée Brownlee G 18 (colonne x 0,2 cm); particules ( 7 x 0,03 pm) équilibrée en acétonitrile 1 %, acide trifluoroacétique 0,1 Z (v/v) dans l'eau Les peptides ont ensuite été élués par un gradient linéaire d'acétonitrile dans une solution d'acide trifluoroacétique dans l'eau ( 0,1 % (v/v)) variant de 1 Z à 60 % d'acétonitrile en 60 min, avec un débit de pl/ml Les peptides à la sortie de la colonne ont été détectés par mesure de la densité optique à 218 nm. Le profil d'élution est présenté dans la figure 2, dans laquelle les numéros suivant la lettre V (protéase V 8) corres- pondent aux pics identifiés. Chaque pic a été collecté et conservé à -20 C jusqu'au moment de l'analyse sur le séquenceur de protéines déjà mentionné. Le tableau ( 1) ci-après présente les séquences pepti- diques des 5 pics identifiés. TABLEAU ( 1) Séquençage des produits obtenus par hydrolyse T 17 Asn Val Gln Val Abp Val Val Glu Gly Lys f T 20 Asn Phe Ser Gly Leu Gln Glu Val A l'aide de T 23 Phe Asp Ala Thr Trp Ala la trypsine T 27 His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser T 28 Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys T 29 His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys T 31 Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp Gly Phe Leu Arg T 32 Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile - Leu Gly Thr T 33 Gln Asn -Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile - Leu Gly Thr V 1 Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu - Ser Trp His Lys A l'aide de V 2 Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser - la protéase Val Gln Ala V 8 V 3 Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Vat Ile Val Asp - Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr V 5 Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu - Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp Gly Phe - Leu Arg V 6 Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu - Thr Val Leu Lys i cn cn ) Criblage des bactéries 1) Préparation des sondes marquées: Deux pools de sondes déduites de séquences en aminoacides de la protéine ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 4600 Le premier pool correspond à la séquence de résidus His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp (partie de la séquence de T 27), soit de 5 ' vers 3 ': A T G G G TC G A T T C A A TA T G T C A A A Ce pool est en fait constitué de 24 x 3 = 48 oligonucléotides différents représentant toutes les combinaisons possibles. Le deuxième pool correspond à la séquence en résidus aminoacides Gln-PheTrp-Gly-Phe-Leu (partie de la séquence de V 5), soit de 5 ' vers 3 ': GG A G T A AAGCCCCA AA TG AA C A C T Ce pool est constitué de 24 x 4 = 64 combinaisons. Les sondes sont marquées à la terminale désoxynucléotide transférase (Td T) (commercialisé par IBI, Inc). La réaction s'effectue sur 100 ng d'un mélange d'oligo- nucléotides en solution ( 100 mg/ml) dans du tampon de réaction "Cobalt" (fourni 10 fois concentrée par IBI inc: 1,4 M de coco- dylate de potassium-p H 7,2, 300 m M de dithiothréitol, 1 p L d'enzyme désoxynucléotidyl-terminal-transférase (IBI Inc) et 50 p Ci de désoxycytidyltriphosphate d CTP marqué au P 32. La réaction se fait à 37 C pendant 10 min puis est arrêtée en ajoutant 1 pl d'EDTA 0,5 M. On extrait au phénol et on dialyse sur colonne de polyacrylamide Biogel P 10 (Biorad: 150-1050). 2) Hybridation et détection des colonies contenant l'AD Nc de l'urate oxydase: Environ 40 000 colonies sont criblées par la technique d'hybridation in situ mise au point par Grunstein et Hogness ( 1975, Proc Natl Acad Sci (U S A), 72 3961) Environ 6 000 bactéries sont étalées sur boites de Pétri de façon à obtenir des colonies iso Lées Après incubation pendant 24 h à 37 C, chaque boite est repliquée sur 2 filtres, chaque filtre étant destiné à être traité avec un des 2 pools de sondes, de façon que toutes les colonies obtenues soient testées avec les 2 pools de sondes en parallèle. Les filtres sont mis à hybrider avec un des 2 pools de sondes dans un tampon contenant 6 x SSC, 10 x Denhardt's et 100 pg/ m L d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé (SIGMA) La tempé- rature d'hybridation est de 42 C et la durée de 16 h La solution 6 x SSC s'obtient par dilution d'une solution 20 x SSC La prépara- tion du tampon 20 x SSC est décrite dans Maniatis, Fritsch et Sambrook (op cité) En résumé, ce tampon contient 175,3 g/l de Na Cl; 88,2 g/l de citrate de sodium et est ajusté à p H 7 par quelques gouttes de Na OH 10 N La solution 10 x Denhardt's contient 1 g de Ficoll, 1 g de polyvinylpyrrolidone, 1 g de sérum-albumine humaine pour 500 ml de volume final. Après lavage dans la solution 6 x SSC à 42 C ( 3 h avec changements de bain), les filtres sont essuyés au papier Joseph et mis en autoradiographie Les filtres sont révélés après 16 h Il est apparu qu'une fraction d'environ 0,5 % des colonies hybridait avec les 2 pools de sondes. colonies parmi celle-ci ont été reprises et purifiées. On a préparé l'ADN plasmidique de chacune de ces colonies, et l'on a analysé cet ADN par digestion avec soit Bam HI, soit Hind III, soit à la fois Bam HI et Hind III. Après analyse sur gel d'agarose, il est apparu que les 5 plasmides obtenus sont linéarisés par Bam HI et par Hind III Les doubles digestions permettent de libérer un fragment correspondant à l'intégralité de l'AD Nc clone La taille de ce fragment est d'environ 1,2 Kb dans 3 cas, d'environ 0,9 Kb dans les 2 autres cas Pour la détermination ci-après on a sélectionné un des fragments de 0,9 Kb et un des fragments de 1,2 Kb qui ont été reclonés (voir exemple 6 ci-après). 6) Détermination de la séquence de l'AD Nc de l'urate oxydase On a recloné un des fragments de 0,9 Kb d'une part (clone 9 A) et un des fragments de 1,2 Kb (clone 9 C) d'autre part, dans l'ADN de la forme réplicative de phage simple-brin M 13 L'ADN des clones M 13 contenant d'une part le fragment de 0,9 Kb et d'autre part le fragment de 1,2 Kb a été soumis à une digestion exonu- cléasique de manière à générer une série de clones M 13 chevauchants (procédure "Cyclone I Biosystem" de IBI) Ces derniers ont été séquences par la méthode des didéoxyribonucléotides (Sanger et a I, PNAS-U S A -1977, 14, 5463-5467). La séquence nucléotidique du clone 9 C est représentée sur la figure 3 laquelle indique également par une flèche le début du clone 9 A et par un symbole nucléotidique muni d'un astérisque * les nucléotides séquences du clone 9 A non identiques à ceux du clone 9 C (quand on fait correspondre les deux séquences et les sites de restriction Accl et Bam HI utilisés dans les constructions ulté- rieures (Cf 2)). On constate que: la séquence nucléotidique du fragment le plus long (clone 9 C) recouvre celle du fragment le plus court (clone 9 A), à deux différences près (v figure 3) Une des différences est silen- cieuse, l'autre correspond à un changement d'un résidu tryptophane en résidu glycine Ces différences peuvent être dues, soit à des différences dans les ARN messagers isolés, (Cf 2) ci-dessus), soit à des erreurs de la transcriptase inverse utilisée lors de la cons- titution de la banque des AD Nc (Cf 3) ci-dessus). Dans le cas du fragment le plus long, un codon ATG (en position 109 sur la figure 3) ouvre une phase ouverte correspondant à un polypeptide de 302 aminoacides, de masse moléculaire voisine de 34240 Da, dont la séquence correspond à la séquence partielle de l'urate oxydase d'A flavus purifiée (Cf 4)). On a représenté sur la figure 4 la séquence d'ADN ouverte par le codon ATG et le polypeptide codé, ainsi que par des flèches en vis-à-vis avec le polypeptide codé les peptides séquencés (Cf. 4)) obtenus par hydrolyse de l'urate oxydase d'A flavus à l'aide de la trypsine et de la protéase V 8. On constate que la séquence du polypeptide se termine par le triplet Ser-Lys-Leu, typique des enzymes à localisation peroxi- somale (Gould S J et al, J Cell, Biology 108 ( 1989) 1657-1664). EXEMPLE 2: Construction de trois vecteurs d'expression de l'AD Nc de l'urate oxydase dans la levure, le plasmide p EMR 469 porteur d'un promoteur ADH 2 et le plasmide p EMR 473 ainsi que le plasmide p EMR 515 porteurs du promoteur artificiel de l'invention La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T MANIATIS, EF FRITSCH et J. SAMBROOK dans "Molecular Cloning, a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) La synthèse des oligonucléotides est réalisée à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 4 600. La description ci-après sera mieux comprise à la lecture des figures 5, 6 et 7 qui représentent respectivement des cartes de restriction du plasmide p EMR 414, et des plasmides p EMR 469 ainsi que p EMR 473 Les symboles utilisés sur ces figures seront précisés dans l'exposé ci-après Dans le cas o un site a été rendu franc par la polymérase de Klennow, il lui est affecté l'indice "o"; lorsque les sites ont été suprimés par ligation, ils sont indiqués entre parenthèses. 1) Construction du plasmide p EMR 469: Ce plasmide a été construit à partir du vecteur navette E coli-levure p EMR 414, construit par ligations successives des éléments ci-après: le fragment Pst I-Hind III O symbolisé par ++++ sur la figure du plasmide p JDB 207 (BEGGS, 1978: Gene cloning in yeast-p 175-203 dans: Genetic Engineering vol 2 WILLIAMSON - Academic Press London UK) comprenant la partie amont du gène de résistance à l'ampicilline Amp de p BR 322 (Sutcliffe 1979 Cold Spring Symp Quart Biol 43, 779) et un fragment de 2 p endogène forme B portant le gène LEU 2 de S cerrevisiae partiellement délété de son promoteur (appelé LEU 2 d), le locus STB (REP 3) et l'origine de réplication du 2 p (HARTLEY et DONELSON, 1980, Nature, 286, 860-865) L'extrémité Hind III de ce fragment a été rendue franche par action de la polymérase de Kleenow Elle est notée Hind III sur La figure 5. Le fragment Hind III-Sma I représenté par //// sur la figure 5 du chromosome V de levure contenant le gène URA 3 avec son promoteur (ROSE et al, 1984, Gene, 29, p 113-124) Ce fragment Hind III-Sma I provient du plasmide p FL 1 (CHEVALLIER et al., 1980, Gene 11, 11-19)) L'extrémité Hind III de ce plasmide a été rendue franche par l'action de La polymérase de Kleenow. un fragment Sam I-Bamh I symbolisé par sur la figure 5 contenant une version synthétique du promoteur du gène ADH 2 ne différant de la versionnaturelle décrite par RUSSEL et SMITH (RUSSEL et al, 1983) J Biol Chem 258, 2674-2682) que par quelques paires de bases destinées à introduire des sites de restriction (La séquence naturelle pourrait être utilisée avec des résultats peu différents) La séquence de ce fragment est donnée ci-après: f$Vl Dl VJ 9 JV 9 E: H W e OVOD 9 IOOIOIUD 9 ff 31 g 9 099 UIOOUIWD 1 U 19 IU Og UIUIDIIUWI 9 I IgIWO 4 à à + à 1 àà+ ___+_________+______ __+____ ____+_________+_________+___O I I H w e a 119 Uú 191 ú 9 Dú 1 llgl U 9 t 19 ef D 3 ll l 31 UU 11 d ODD 93 UDU 9 i U 919 úUI + + + + + + U Ib I Og UOU Sbl Db EéDl Og UUOIIDlg UUlg DI IlúOl 11:l OOUOúlfú Ue U Oe O 3 DU 9 DO 9391 DIWD 9691 e 1 D 19 91919 Ud 910901 01990 O à+à +à à + à 111191 ú 911310199 ú O i D O D D 10 Dú 9 93 iúD 029111 ú 13 D 93919 t 03919 l Ddl Ubi 99 19 ie 9 li 19 113 Di U Ub 939 Dt 3 D 3 L 3 b 1 i 31193 _ ___+_ +_à_+ _ _+_ _ I d S _ 1_±_____ + _ ______ ____ + t O ú 11 Uúe 91199 9 190009919 ú 103990 9 99 9 0909 ZD 30 9 9 Oú 1 D 9111 DDúID 10 Dúo 99933 Oj 9993913 D 3 LD 1939 OD 999 I I n 8 I Ut W s T e 999 Z 9 le fragment Bg III-Hind III symbolisé par sur la figure 5 portant l'extrémité 3 ' du gène PGK de levure Ce fragment provient de la digestion complète à l'aide de Bg III du fragment Hind III de l'ADN chromosomique de levure, portant Le gène PGK décrit par HITZEMAN et al ( 1982 Nucleic Acids Res, 10, 7791-7808) lequel ne présente qu'un site Bg III Cette digestion permet d'obtenir deux fragments Hind III-Bg III, dont le plus petit d'environ 0,4 Kb, qui porte l'extrémité 3 ' du gène PGK de levure est retenu La séquence de ce dernier fragment est décrite par HITZEMANN et al (référence citée ci- dessus) Le site Bg III est cloné dans le site Bam HI du fragment précédent (les sites Bam HI et Bg III disparaissent donc) et le site Hind III, rendu franc par action de la polymérase de Kleenow, est cloné dans le site Pvu II du fragment de Pvu II-Pst I p BR 322 décrit ci-après. le fragment Pvu II-Pst I symbolisé par xx sur la figure 5 - de p BR 322 contenant l'origine de réplication et la partie aval du R gène de résistance à l'ampicilline Amp Le plasmide p EMR 414 ainsi constitué comporte donc les éléments suivants: une origine de réplication et un gène de résistance à l'ampicilline Amp R permettant la réplication et la sélection du plasmide dans les cellules E coli Ces éléments permettent la transformation dans les cellules de E coli. une origine de réplication pour la levure (ARS), le locus STB et le gène LEU 2 de S cerevisiae sans promoteur et le gène URA 3 avec son promoteur de S cerevisiae Ces éléments permettent la réplication et la sélection du plasmide dans les cellules de S cerevisiae ainsi qu'une efficacité de partition suffisante dans les cellules contenant le plasmide 2 p endogène. Le plasmide p EMR 414 a été soumis à une digestion complète par les enzymes de restriction Nhe I et Cla I Le petit fragment Nhe I-Cla I contenant le gène URA 3, appelé ci-après fragment A, a été purifié. Le plasmide p EMR 414 a été soumis à une digestion complète par les enzymes Nhe I et Bam HI Le grand fragment Nhe I-Bam HI conte- nant notamment le gène LEU 2 d et l'origine de réplication du plasmide p BR 322, appelé ci-après fragment B, a été purifié. * On a préparé d'autre part le fragment synthétique Cla I-Acc I contenant le début d'un gène codant pour la protéine déduite de la séquence de l'AD Nc de l'urate oxydase (clone 9 C) Ce fragment comporte des modifications par rapport au clone 9 C, introduites dans le but de mettre en place des codons usuels dans la levure (Cf SHARP et al, 1986, Nucl Ac Res Vol 14, 13, pp 5125-5143) sans changement des acides aminés codés La séquence de ce fragment, dénommé ci-après fragment C, est la suivante (les nucléotides soulignés sont ceux modifiés par rapport au clone 9 C). C A l c a c I I CGATATACACAATGTCTGCTGTTAAGGCTGCTAGATACGGTAAGGACAACGTTAGAGT + + + + + + TATATGTGTTACAGACGACAATTCCGACGATCTATGCCATTCCTGTTGCAATCTCAGA On a soumis le plasmide du clone 9 C (Cf figure 3) à une digestion par les enzymes Acc I et Bam HI Le fragment Acc I-Bam HI qui contient la fin de l'AD Nc de l'urate oxydase, ci-après appelé fragment D, a été purifié Ce fragment a la séquence suivante: Accl I Acci CTACAAGGTTCACAAGGACGAGAAG + GTTCCAGTGTTCCTGCTCTTC FGTTCCAAGTGTTCCTGCTCTTC ACCGGTGTCCAGACGGTGTACGAGATGACC TGGCCACAGGTCTGCCACATGCTCTACTGG TGGCCACAGGTCTGCCACATGCTCTACTGG GTCTGTGTGCTTCTGGAGGGTGAGATTGAG -________+ -+__-_ + CAGACACACGAAGACCTCCCACTCTAACTC ACCTCTTACACCAAGGCCGACAACAGCGTC ____ _+_______ -__ +, TGGAGAATGTGGTTCCGGCTGTTGTCGCAG ATTTACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTT -________±________+____-__ + TAAATGTAGTGGCGGTTCGTCTTGGGGCAA GGCACACACTTCATTGAGAAGTACAACCAC -_+ + + CCGTGTGTGAAGTAACTCTTCATGTTGGTG CACCGCTGGACCCGGATGGACATTGACGGC -________+ -_+__ _+ GTGGCGACCTGGGCCTACCTGTAACTGCCG AGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGAC -_________-±_+__-_______+ TCGCTCCTCTTCGCCTTACACGTCCACCTG TCGTCTCTGTCCGGCCTGACCGTGCTGAAG -_________++___-______+ AGCAGAGACAGGCCGGACTGGCACGACTTC CGTGACGAGTACACCACACTTAAGGAGACC -________+ -_+__ _+ GCACTGCTCATGTGGTGTGAATTCCTCTGG GCCACTTGGCAGTGGAAGAATTTCAGTGGA _________+_________+_________+ CGGTGAACCGTCACCTTCTTAAAGTCACCT TTCGATGCTACCTGGGCCACTGCTCGCGAG -________+_____-____+____ _ + AAGCTACGATGGACCCGGTGACGAGCGCTC AGTGCCAGCGTGCAGGCCACTATGTACAAG à_________+_____-____+____-__ + TCACGGTCGCACGTCCGGTGATACATGTTC CTGATCGAGACTGTCGAGTACTCGTTGCCT ______ __+_ + GACTAGCTCTGACAGCTCATGAGCAACGGA TGGCACAAGGGCCTCCAAAACACCGGCAAG ACCGTGTTCCCGGAGGTTTTGTGGCCGTTC CCCAACGGTCTGATCAAGTGTACCGTCGGC -_______±________+_______-__+ GGGTTGCCAGACTAGTTCACATGGCAGCCG AACATGATTCTCACGTTCCGGAGTTTCCAA -________+____-___+_______-_+ TTGTACTAAGAGTGCAAGGCCTCAAAGGTT TAGCATTCATTCACTTGTTTTTTACTTCCA _ _ _ _ _ _ _ _-±_±__ + ATCGTAAGTAAGTGAACAAAAATGAAGGT AUUAAU A AAAGGGC CCG TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCGGGCCT ATTGTCGCAACCGACTCCATTAAGAACACC -_______±________+_________+ TAACAGCGTTGGCTGAGGTAATTCTTGTGG ACTCCTCCCGAGCTGTTCGGCTCCATCCTG -_______±________+_______-__+ TGAGGAGGGCTCGACAAGCCGAGGTAGGAC ATCCATGCCGCTCACGTCAACATTGTCTGC -+__ ±__ _+ __ ___ TAGGTACGGCGAGTGCAGTTGTAACAGACG AAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCGCGAC -________±________+_____-___+ TTCGGTGTGGGAGTGAGGAAGTAGGCGCTG GTGGTCGAGGGCAAGGGCATCGATATCAAG + +_ + CACCAGCTCCCGTTCCCGTAGCTATAGTTC AGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGCTTCCTG -_______±________+_______-__+ TCGTGGTTGAGCGTCAAGACCCCGAAGGAC TGGGACCGTATCCTGAGCACCGACGTCGAT -______+_-____+___ _+mm% ACCCTGGCATAGGACTCGTGGCTGCAGCTA CTCCAGGAGGTCCGCTCGCACGTGCCTAAG + + GAGGTCCTCCAGGCGAGCGTGCACGGATTC GTCACTCTGAAGACTTTTGCTGAAGATAAC -________±________+_____-___+ CAGTGAGACTTCTGAAAACGACTTCTATTG ATGGCAGAGCAAATCCTGGCGCGCCAGCAG -_________+_____-____+____-__+ TACCGTCTCGTTTAGGACCGCGCGGTCGTC AACAAGCACTATTTCGAAATCGACCTGAGC _________+_________+_________+ TTGTTCGTGATAAAGCTTTAGCTGGACTCG AACGCCGAGGTCTTCGCTCCTCAGTCGGAC -_________+ + + TTGCGGCTCCAGAAGCGAGGAGTCAGCCTG CGGTCCTCTCTGAAGTCTAAATTGTAAACC _________+_________+_________+ GCCAGGAGAGACTTCAGATTTAACATTTGG GGCAAACTGTATATAGTCTGGGATAGGGTA _________+_________+_________+ CCGTTTGACATATATCAGACCCTATCCCAT _ _, TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Bam HI Les fragments A, B, C et D ont été ligués de manière à obtenir le plasmide p EMR 469 représenté sur La figure 6, dans laquel Le Les symbo Les ont La même signification que sur La figure , Les nouveaux fragments C La I-Acc I et Acc I-Bam HI étant symbolisés OS pa par___ ' Le p Lasmide p EMR 469 est porteur d'une séquence codant pour La protéine déduite de la séquence de l'AD Nc de L'urate oxydase, sous le contrôle d'un promoteur appelé promoteur ADH 2, proche du promoteur ADH 2 naturel, comprenant la séquence M I lu ICGCGI CI CC TCTOCCOGGAACACCOGGCATC T CCAA 4 CT TATAAGOT TGGAG AGAGGAGACGGCC 7 TGTGGCCCGTAG Al GGT TGA'1 ATATTCARCCTC AAA T AAGAGA 4 TJ TCAG/AT TGAOGAGATGAAAAAAAAAAAAAJAA GGCAGAGGAG T T TAT TCTCTTAAAAGTCTAACTCTCTTACTT T T T T T T TT TT TT TT TCCGTCTCCTCT p h Elémen' TATA GCATAGAAATGGGGT TCACT T T GG T: PGC T At GCATGCC:IATC Ac T- ATAGA CGTATC TTACCCC GTGAAI 4 ACCAI T ?CGATATCG'TACGGATRGTGTATT TTTATCT OT GCCAGTAGCGACTI T T T TCACRC TCGAGATACTCT TAC TACTGC TCTCT TGT TGT T TT CC GG TCA TCGC TGAAAA A Aq G TG TGAGC TC TAT GAGAAT GARTGAC G Ag G, TATCACT TCTTGTTTCTTCTTGGTIAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCQA ATAG TGA 4 GAACAAAGAAGRACCATTATCT TATAGTTCGA 7 TGTTTTTCGTATGTTAGTT Région d'initiation de la transcription l CTATCAACTAT TAACTATAT' 4 GATAGT TGATAATTGATATAGC 2) Construction du plasmide p EMR 473: Le plasmide p EMR 469 a été soumis à une digestion complète par les enzymes Mlu I et Sph I Le grand fragment Mlu I-Sph I contenant le gène de l'urate oxydase a ensuite été ligué au fragment synthé- tique, de séquence donnée ci-après, correspondant à une partie ( 200 pb) de la séquence en amont de l'élément TATA du promoteur GAL 7 de S cerevisiae, laquelle comprend deux séquences d'activa- tion amont de haute affinité appelées ULIA 51 et UA 52, encadrées cidessous (Cf R J BRAM et al ( 1986) EMBO Jvol 5 N 3, p 603-608). M u I UASI CGCGTCTRT TTCGGAGCACTGTTGAGCG-AAGCTCATTAGAATAT At TTCTGTCAT ', AGAT j AAGCCTCGTGACRACTCGCTTC GAGTAATCTATATAAAAGACAGTA UA 52 TTTCCTTAACCCAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGC CTCGGACAACTGTTGACCGT * _X_*I^*_+*+__ AAGGAATTGGGTTT TTATTCCCTCTCCCAGGTTTTTCG:GAGCCTGTTGACAACTGGCA G TCCGAAGGACTG Gc TATACA Gr GT TCACAAATAGCCAAGCTGAAAATAATGTG TAGC C GGCTTCCTGACCGATATGTCACAAGTGTTTTATCGGTTCGACTTTTATTACACATCG pu h CTTTAGCTATGTTCAGTTAGTTTGGCATG' GAAATCGATACAAGTCAATCRAAAC Ci Le plasmide p EMR 473 ainsi obtenu est représenté sur la figure 7, dans Laquelle les symboles ont la même signification que dans la figure 6, le nouveau fragment Mlu I-Sph I introduit étant symbolisé par I , Le plasmide p EMR 473 est donc porteur d'une séquence codant pour la protéine déduite de la séquence de l'AD Nc de l'urate oxydase, sous le contr 8 le du promoteur artificiel de L'invention, lequel comprend La séquence: M U UA 51 CGCGTCTATA TTCGGAGCACTGTTGAGCGAO GCTCATTAGATATAJTTTCTGTCAT * '1 '* ' '1 ' * AGATAT AAGCCTCGTGACAACTCGCT SCGGTAATCTATAUTAAAGACAGTA i UAS 2 TTTCCTTAACCCRAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGC CTCGGACAACTGTTGRCCGT AAGGAATTGGGTTTTTATTCCCTCTCCCAGGTTTTTCG GAGCCTGTTGACAACTGGCA _ G'CCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATAGCCAAGCTGAAAATAATGTGTAGC I À À CTTGGCTTCCTGACCGRTATGTCACAAGTGTTTTATCGGTTCGACTTTTATTACACATCG h Elément TATA h CTTTAGCTATGTTCAGTTAGTTTGGCATGCCTATCTCATATAAATAGA o O- GAARATCGATACAAGTCAATCAAACCGTACGGATAGTGTATATTTATCT GTGCCAGTAGCGACTT TITCACACTCGAGATACTCT RTAC TGCTCICTTGTTGTTTT CACGGTCATCGCTGAPAAAAGTGTGAGCTCTATGAGAATGATGACGGAGAGAACAAA TATCACT TCTTGTTICTTCITGGTAAATAGAATATCAAGCTACA/AAGCATACAATCAA o _, _ - ATAGTGAAGAACAAAGAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTT c Région d'initiation de la transcription CTATCAACTATTRACTATAT GTA TT TTGTT C GATAGI TGATAATTGATATAGC 3) Construction du plasmide p EMR 515: Le plasmide p EMR 473 a été soumis à une digestion partielle par l'enzyme Xba I et à une digestion totale par L'enzyme Mlu I Le grand fragment Xba I-Mlu I a été purifié Ce fragment contient notamment les séquences de l'origine de réplication et le locus STB du 2 p, le gène LEU 2 d, le gène de résistance à l'ampicil- line Amp R, l'origine de réplication du p BR 322 et la cassette d'expression de l'urate oxydase Il ne contient en revanche ni le gène URA 3, ni la partie du 2 p comprise entre lessites Xba I et Nhe I. Le grand fragment Xba I-Mlu I a été recircularisé via l'adaptateur de séquence suivant comportant des extrémités cohé- sives Xba I modifié et Mlu I: Xba I modifié TCTAGGCTAGCGGGCCCGCATGCA CGATCGCCCGGGCGTACGTGCGCY Mlu I Le plasmide p EMR 515 ainsi obtenu ne possède qu'un seul des trois éléments du site FRT cible de la recombinase codée par le gène FLP du 2 p. Le plasmide p EMR 515 est donc porteur d'une séquence codant pour la protéine déduite de la séquence de l'AD Nc de l'urate oxydase sous le contrôle du promoteur artificiel de l'invention. EXEMPLE 3: Transformation de la souche de levure EMY 761, par les plasmides p EMR 469, p EMR 473 et p EMR 515 Transformation des souches de levures EMY 500 et GRF 18 par le plasmide p EMR 515 Transformation avec sélection pour la proto- trophie de leucine On a utilisé comme souches réceptrices trois souches de Saccharomyces cerevisiae non isogéniques: la souche EMY 761 (Matoc, leu 2, ura 3, his 3, gal) la souche EMY 500 (Mata, leu 2, ura 3, pep 4) la souche GRF 18 (Matoc, leu 2, his 3); La souche GRF 18 est bien connue de l'homme de l'art (Gerry FINK, MIT, USA) Les souches EMY 761 et EMY 500 sont appa- rentées à la souche GRF 18 Elles ont été obtenues par croisements successifs de la souche GRF 18 avec une souche ura 3 dérivée de la souche FL 100 (déposée à l'ATCC sous le n 28 383) et avec la souche B 12 (Mata, tspl, pep 4) décrite par E W JONES (E W JONES et al. ( 1977) Genetics, 85, 23). On peut obtenir la souche GRF 18 par curage du plasmide p EMR 515 de la souche GRF 18 p EMR 515 (leu) déposée à la CNCM sous la référence n 1920, le 28 décembre 1989 et la souche EMY 500 par curage du plasmide p EMR 515 de la souche EMY 500 p EMR 515 (leu) déposée à la CNCM sous la référence n 1-919, le 28 décembre 1989. Ces souches contiennent des mutations (Leu 2 et ura 3), susceptibles d'être comp Lémentées par le marqueur de sélection défectif LEU 2 d et le marqueur de sélection URA 3, présents dans chacun des plasmides p EMR 469 et p EMR 473. La technique de transformation utilisée est une variante de celle décrite par Beggs et al (Beggs et al ( 1978), Nature 275, 104-109) Elle consiste à soumettre les levures à un traitement de protoplastisation en présence d'un stabilisant osmotique, Le sorbitol en concentration 1 M. Le protocole précis de transformation est précisé ci-après: a) 200 ml du milieu YPG liquide (Cf tableau I) sont inoculés avec environ 5 x 106 cellules d'une culture en phase stationnaire et la culture ainsi inoculée est placée une nuit sous agitation à C. b) Lorsque la culture atteint environ 107 cellules par ml, les cellules sont centrifugées à 4 000 tr/min pendant 5 min et le culot est lavé avec du sorbitol 1 M. c) Les cellules sont suspendues dans 5 ml de solution de sorbitol 1 M contenant 25 m M EDTA et 50 m M de dithiothréitol et incubées pendant 10 min à 30 C. d) Les cellules sont lavées une fois avec 10 ml de sorbitol I M et suspendues dans 20 ml de sorbitol De la zymolase-100 T (préparation obtenue par purification partielle sur colonne d'affinité du surnageant de culture d'Arthobacter luteus et contenant de la p-1,3-glucane-laminaripentahydrolase, commercia- lisée par SEYKAGAKU KOGYO Co Ltd) est ajoutée à une concentration finale de 20 pg/ml et on incube la suspension à température ambiante pendant environ 15 min. e) Les cellules sont resuspendues dans 20 ml d'un milieu contenant du sorbitol appelé milieu YPG sorbitol (Cf tableau I ci-après) et incubées pendant 20 min à 30 C sous agitation douce. f) On centrifuge pendant 3 min à 2 500 tr/min. g) On resuspend dans 9 ml de tampon de transformation (sorbitol 1 M, tris-H Cl de p H 7,5 10 m M et Ca C 12 10 m M). h) On ajoute 0,1 ml de cellules et 5 p L de solution d'ADN (environ 5 pg) et on laisse la suspension obtenue pendant 10 à min à température ambiante. i) On ajoute 1 ml de la solution: polyéthylène glycol PEG 4000 20 %, trisHCL de p H 7,5 10 m M et Ca C 12 10 m M. j) On verse 0,1 ml de la suspension obtenue en 9) dans un tube contenant du milieu solide de régénération sans leucine (Cf. tableau I ci-après) préalablement fondu et maintenu liquide à environ 45 C On verse la suspension sur une boite de Pétri conte- nant une couche solidifiée de 15 ml de milieu de régénération solide sans leucine. k) On répète l'étape j) avec le reste de la suspension cellu- laire obtenue en 9 h). Les transformés commencent à apparaître au bout de trois jours. On a ainsi retenu un transformé EMY 761 p EMR 469 (leu +), et trois transformés EMY 761 p EMR 473 (leu +) (clones 1, 2 et 3), un transformé EMY 761 p EMR 515 (leu), un transformé EMY 500 p EMR 515 (leu +) et un transformé GRF 18 p EMR 515 (leu +). TABLEAU I Principaux milieux utilisés dans les exemples 3, 4, 4 bis, 6 et 7 milieu solide sans uracile 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés (Yeast nitrogen base without Amino Acids de DIFCO) ,0 g d'hydrolysat de caséine (Casamino acids de DIFCO) 10 g de glucose g d'agar mélanger tous les ingrédients dans de l'eau distillée, compléter Le volume final à 1 I avec de l'eau distillée Autoclaver 15 min à 120 C. milieu liquide sans uracile Utiliser la formule du milieu solide sans uracile en omettant l'agar Autoclaver 15 min à 120 C. milieu solide sans leucine 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés (Yeast nitrogen base without Amino Acids de DIFCO) mg d'adénine 20 mg d'uracile mg de l-tryptophane mg de 1-histidine mg de 1-arginine mg de l-méthionine 30 mg de l-tyrosine mg de l-isoleucine mg de 1-lysine mg de l-phénylalanine mg de l-acide glutamique 150 mg de l-valine 400 mg de lleucine g de glucose g d'agar mélanger tous les ingrédients dans l'eau distillée Compléter le volume final à 1 l avec de l'eau distillée Autoclaver 15 min à C Après autoclavage, ajouter 200 mg de l-thréonine et 100 mg d'acide l-aspartique. milieu solide de régénération sans leucine utiliser la formule du milieu solide sans leucine en mélangeant g d'agar au lieu de 20 et en ajoutant au mélange 182 g de sorbitol. milieu liquide sans leucine utiliser la formule du milieu solide sans leucine en omettant l'agar Autoclaver 15 min à 120 C Après autoclavage, ajouter mg de l-thréonine et 100 mg d'acide 1-aspartique. milieu YP liquide g d'extrait de levure (Bacto-yeast extract de DIFCO) g de peptone (Bacto-peptone de DIFCO) mélanger les ingrédients dans de l'eau distillée Compléter le volume final à I I avec de l'eau distillée Autoclaver 15 min à C. milieu YPG liquide utiliser la formule du milieu YP liquide auquel on ajoute, après autoclavage, du glucose à une concentration de 20 g/l. milieu YPG sorbitol utiliser la formule du milieu YPG liquide auquel on ajoute, après autoclavage, du sorbitol à une concentration de 1 M. milieu YP éthanol-glycérol utiliser la formule du milieu YP liquide Après autoclavage, ajouter 10 ml d'éthanol 100 Z ( 1 % final) et 30 g de glycérol. milieu YP éthanol-glycérol-galactose utiliser la formule du milieu YP liquide Après autoclavage, ajouter 10 ml d'éthanol 100 %, 30 g de glycérol et 30 g de galac- tose. EXEMPLE 4: Expression de l'urate oxydase par Les souches EMY 761 p EMR 469 (leu +) et EMY 761 p EMR 473 (leu +) (clones 1, 2 et 3) Immunodétection par Wester Blot, dosage de l'acti- vité urate oxydase et des protéines solubles 1) Expression de l'urate oxydase: a) Souches transformées Dans un premier temps, une colonie de chacune des souches EMY 761 p EMR 469 (leu) et EMY 761 p EMR 473 (leu) (clones 1, 2 et 3) a été mise en culture dans 25 ml de milieu liquide sans leucine (Cf. tableau I, exemple 3) Ceci a permis d'obtenir et de maintenir un nombre de copies de plasmides élevé en pratiquant la sélection pour la complémentation de la mutation Leu 2 par le gène LEU 2 porté par les plasmides p EMR 469 et p EMR 473. Après 22 h à 30 C sous agitation, les deux cultures ont été centrifugées pendant 10 min à 7 000 tr/min Les culots ont été repris dans 10 ml d'eau distillée stérile et de nouveau centri- fugés pendant 10 min à 7 000 tr/min L'expression de l'urate oxydase a été induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP éthanolglycérol pour la souche EMY 761 p EMR 469 (leu +) et 20 ml de milieu YP éthanol-glycérol-galactose (Cf tableau I, exemple 3) pour la souche EMY 761 p EMR 473 (leu) Les cultures ont été replacées à 30 C sous agitation pendant 27 h. c) Souche témoin La souche EMY 761 non transformée, c'est-àdire sans plasmide, a été cultivée comme ci-dessus avec comme différence que la première culture a lieu dans le milieu YPG liquide Elle a subi d'une part l'induction dans 10 ml de milieu liquide YP éthanol- glycérol et, d'autre part, l'induction dans 10 ml de milieu YP éthanolglycérolgalactose. 2) Préparation des échantillons: a) Les cellules cultivées en la), lb) et lc) ont été centrifugées et le surnageant a été éliminé Les culots ont été repris dans 10 ml d'eau distillée et centrifugés pendant 10 min à 7 000 tr/min Les culots ainsi lavés ont été repris dans environ 1 ml de tampon triéthylèneamine TEA de p H 8,9 Environ 300 pl de cellules ainsi reprises ont été lisées en présence de billes de verre (de 400 à 500 pm de diamètre) représentant environ la moitié du volume final Ce mélange a été vortexé vigoureusement pendant 1 min, 4 fois, les échantillons étant placés pendant 30 S dans la glace entre chaque broyage Le liquide a été retiré des tubes avec une pipette pasteur et transféré dans un microtube Les billes de verre ont été lavées 1 fois avec environ 200 pl de tampon TEA de p H 8,9 Les billes ont été vortexées pendant 1 min, 1 fois, et le liquide a été retiré à la pipette pasteur pour être ajouté au lysat précédent Le lysat a été ensuite centrifugé dans un microtube pendant 5 min à 7 000 tr/min Le surnageant a été précautionneuse- ment retiré et conservé à -20 O C pour le Western Blot, le dosage de l'activité urate oxydase et le dosage des protéines totales solubles Le culot des cellules lysées a été conservé séparément à -200 C pour le Western Blot (Cf 3) ci-dessous). D'autre part, des prélèvements des cultures réalisées en la) et lb) ont été réalisés comme suit avant l'induction: 2 ml de culture ont été centrifugés pendant 10 min à 7 000 tr/min Les culots ont été repris dans 500 pl d'eau distillée et de nouveau centrifugés pendant 5 min à 7 000 tr/min Les culots ont été repris dans environ 200 pl de tampon TEA de p H 8,9 et lysés comme ci-dessus en présence de billes de verre Les surnageants et Les culots des cellules lysées ont été conservés à -200 C séparément Le dosage de l'activité oxydase et le dosage des protéines totales solubles ont été effectués sur les surnageants. 3) Immunodétection de l'urate oxydase par Western Blot: a) Mode opératoire Les culots et les surnageants des différents échantillons ont été soumis à un Western Blot, technique bien connue de l'homme de l'art, qui comprend les étapes suivantes: solubilisation du culot par ébullition pendant 10 min dans un tampon dénommé tampon de charge constitué de tris- H Cl 0,125 M p H 6,8 SDS 4 %, bleu de bromophénol 0,002 %, glycérol 20 %, P-mercaptoéthanol 10 % (selon le protocole décrit par LAEMMLI (U.K LAEMMLI, Nature, 227 ( 1970), 680-685)), (étape mise en oeuvre uniquement pour les culots), séparation électrophorétique des différentes protéines contenues dans le solubilisat selon le protocole décrit par LAEMMLI (U K. LAEMMLI, Nature, 227 ( 1970), 680-685), transfert desdites protéines contenues dans le gel sur un filtre de nitrocellulose (selon la technique de H TOWBIN et al Proc. Natl Acad Sci USA 76 ( 1979) 4350-4354), L'immunodétection, réalisée selon la technique de BURNETTE (W W BURNETTE Ana Biochem 112 ( 1981) 195-203), implique successivement: Le rinçage du filtre de nitrocellulose pendant 10 min avec un tampon A (tris-H Cl 10 m M, Na Cl 170 m M, Kl I m M). La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant min à 37 C avec un tampon B (tampon A additionné de sérum-albumine bovine à raison de 3 g pour 100 ml). La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 1 h à 37 C avec un immunsérum (des anticorps polyclonaux reconnaissant l'urate oxydase d'A flavus). Le rinçage du filtre de nitrocellulose avec le tampon B. La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 1 h à 37 C avec une solution de protéine G marquée à l'iode 125 à 0,1 microcurie/mi. À Le rinçage du filtre avec le tampon A. À Le séchage du filtre entre deux feuilles absorbantes. * La mise en contact d'un film radiographique. À La révélation du film. b) Résultats On constate que les souches EMY 761 p EMR 469 (leu+) et EMY 761 p EMR 473 (leu) (clone 1) produisent une protéine de poids mo Léculaire apparent d'envron 33 K Da qui est reconnue par les anti- corps dirigés contre l'urate oxydase d'A flavus (préparés chez le lapin selon des techniques bien connues de l'homme de l'art: Cf. VAITUKAITIS et al ( 1981) "Methods in enzymology" Academic Press, New York, vol 73, p 46) et qui est absente de la souche témoin. La comparaison entre les quantités de cette protéine pour les culots et les surnageants permet de déduire qu'environ 80 % de celle-ci est sous forme soluble dans le lysat. 4) Dosage de l'activité urate oxydase: L'activité urate oxydase a été mesurée sur les surna- geants des cellules lysées. a) Principe On suit la transformation de l'acide urique en allantoine par la diminution de l'absorbance à 292 nm La réaction est la suivante: o > Urate oxydase H 20 02 H 20 + CO 2 Acide urique Alantoine (absorbant à 292 nm) b) Réactifs a) Tampon TEA 0, 05 M p H 8,9/EDTA dissoudre 7,5 g de TEA (réactif pour analyse-Prolabo réf. 287 46 266) dans 400 ml d'eau distillée, dissoudre 0,372 g de Complexon III (Merck-réf 8418) dans 50 ml d'eau distillée, réunir les deux solutions et compléter à 500 ml (solution 1), ajuster le p H de cette solution à 8,9 par H Cl 0,2 N, compléter à 1 000 ml avec de l'eau distillée (solution 2). b) Acide urique Solution stock dissoudre 100 mg d'acide urique (Carbiochem réf 6671) dans 50 m L de la solution 1, ajuster par H Cl 0,2 N à p H 8,9, compléter à 100 ml par de l'eau distillée. La solution obtenue peut se conserver une semaine à 4 C. c) Acide urique Solution Substrat prélever 1,5 ml de solution stock d'acide urique (carbiochem réf. 6671) et diluer à 100 ml avec du tampon TEA/réactif pour analyse- Prolabo réf 287 46 266). Cette solution doit être utilisée dans la journée. c) Mode opératoire On introduit dans la cuve de quartz d'un spectrophoto- mètre réglé à 292 nm et thermostaté à 30 C les volumes suivants: 600 pl d'acide urique solution substrat (préchauffés à 30 C), 100 p L des surnageants ci-dessus auxquels ont été ajoutés 200 pl de TEA p H 8,9 (préchauffés à 30 C). On mélange et on lit le changement de densité optique, ci-après parfois abrégé DO, toutes les 30 S pendant 5 min On en déduit AE, variation de la densité optique par minute. d) Expression des résultats L'activité A enzymatique urate oxydase exprimée en U/ml est calculée à partir de la mesure de AE à l'aide de laformule: A = AE x Vr x d I x Vp E dans laquelle les symboles Vr, d, I et Vp E représentent respecti- vement le volume réactionnel ( 0,9 ml), Le taux de dilution ( 2), le coefficient d'extinction de l'acide urique à 292 nm ( 12,5) et le volume de la prise d'essai ( 0,1 ml). 5) Dosage des protéines totales solubles dans les lysats: Le kit protein assay de BIORAD a été utilisé pour doser les protéines totales présentes dans le surnageant des cellu Les lysées Il est basé sur l'observation que l'absorbance maximum pour une solution acide de bleu brillant de Coomassie g-250 passe de 465 nm à 595 nm lorsque des protéines viennent s'y fixer (Cf. Reisner et ai, Anal Biochem, 64, 509-( 1975)). Mode opératoire On introduit dans la cuve d'un spectrophotomètre réglé à 595 nm les volumes suivants: 10 pl d'échantillon auxquels ont été rajoutés 790 pl d'eau distillée pl de "Dye reagent" concentré (Biorad). On mélange et on lit la densité optique à 595 nm Une gamme étalon avec des concentrations croissantes de BSA (Bovine Serum Albumine) a été réalisée ainsi On lit la concentration inconnue des protéines totales des lysats sur la courbe étalon obtenue. 6) Résultats: Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau (II) ci-après Celui-ci précise pour chaque souche le milieu de culture, la source de carbone et d'énergie de la culture, l'acti- vité urate oxydase en U/ml, la quantité de protéines totales solubles en mg/ml et le pourcentage d'urate oxydase dans les protéines totales solubles Ce dernier paramètre est calculé en supposant que l'activité spécifique de la protéine recombinante est identique à celle de l'urate oxydase obtenue à partir d'A flavus: U/mg. TABLEAU II souche Milieu de culture Source de carbone et Activité urate Protéines Pourcentage au moment de la préparation d'énergie de la culture oxydase totales durate oxydase d'échantilions (U/ml) solubles dans les protéines (mg/ml) totales solubles EMY 761 p EMR 469 (leu+) milieu liquide sans leucine Glucose 0,04 4,9 0,03 EMY 761 p EMR 473leu+) (clone I milieu liquide sans leucine Glucose glucose, une meilleure répression que le promoteur ADH 2. b) en absence de glucose, mais en présence d'éthanol/glycérol, le niveau d'urate oxydase est important pour le promoteur ADH 2 (environ 14 % des protéines totales solubles) et faible mais détec- table pour le promoteur artificiel. c) en absence de glucose mais en présence d'éthanol/glycérol/ galactose, le niveau d'urate oxydase garde une valeur peu diffé- rente de celle du cas précédent pour le promoteur ADH 2 (environ 13,5 % des protéines totales solubles), mais atteint une valeur éLevée (environ 18 % des protéines totales solubles) pour le promoteur artificiel. Le promoteur artificiel de l'invention permet donc une production de protéine recombinante à un niveau éLevé et présente trois niveaux d'expression: niveau nul a) niveau de fond b) niveau maximal c) EXEMPLE 4 bis: Expression en erlenmeyer de l'AD Nc de l'urate oxydase par les souches EMY 761 p EMR 515(leu+), EMY 500 p EMR 515 (leu) et GRF 18 p EMR 515 (Leu) Une colonie de chacune des trois souches ci-dessus a été mise en culture dans 20 ml de milieu liquide sans leucine. Après une nuit à 30 C sous agitation, les trois cultures ont été centrifugées pendant 10 min à 7 000 tr/min Les culots cellulaires ont été repris dans 10 ml d'eau distillée stérile et de nouveau centrifugés pendant 10 min L'expression de l'urate oxydase a été induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP éthanol-glycérol-galactose (Cf tableau I, exemple 8) Les cultures ont été replacées à 30 C sous agitation pendant environ 20 h En témoin, une culture de chaque souche hôte, non transformée, a été effectuée. Les cellules de chacune des six cultures sont reculotées par centrifugation et le surnageant est éliminé Les culots ont été repris dans 10 ml d'eau distillée et centrifugés pendant 10 min à 7 000 tr/min Les culots ainsi lavés ont été repris dans environ 1 ml de tampon TEA de p H 8,9 et le broyage ainsi que l'élimination des particules par centrifugation ont été réalisés comme décrit dans l'exemple 9, 2) Le surnageant de chaque culture sert comme précédemment à un dosage de l'urate oxydase et des protéines totales Les principaux résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau VI ci-après TABLEAU VI Activité % d' urate oxydase Souche/cnditims de urate oxydase Protéines totales dans les protéines culture (U/ml) solubles (rg/ml) solubles GRF 18 p Ef 515 (leu+)/a) présence de galactose (induction). Le promoteur selon l'invention permet donc un niveau d'expression de l'urate oxydase dans trois souches non isogéniques. EXEMPLE 5: Construction de deux vecteurs d'expression de la pgalactosidase dans la levure: le p Lasmide p EMR 429 porteur d'un promoteur ADH 2 et Le plasmide p EMR 437 porteur du promoteur artificiel de l'invention La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T MANIATIS EF, FRITSCH et J. SAMBROOK dans "Molecular Cloning, a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) La synthèse des oligonuc Léotides est réalisée à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 4 600. 1) Construction du plasmide p EMR 429: Le plasmide p EMR 414 (Cf figure 5) a été soumis à une digestion complète par l'enzyme de restriction Bam HI Le site Bam HI, localisé entre les séquences promotrices (ADH 2) et termina- trices PGK) est unique L'ADN linéraire du plasmide est purifié par élution d'un gel d'agarose après électrophorèse Le plasmide p MC 1403 (réf Casadaban et al ( 1980), J Bactériol, 143, 971-980) a été soumis à une digestion complète par les enzymes Bam HI et Eco RI, laquelle a permis de libérer un fragment d'ADN Bam HI-Eco RI d'environ 3 Kb qui contient l'essentiel (partie amont) de la séquence codant pour la p- galactosidase d'E coli La séquence comp Lète a été reconstituée à l'aide du fragment synthétique de séquence suivante: Eco RI ' E ATTTCAGCTGAGCGCCGGTCG AGTCGACTCGCGGCCAGC CTACCATTACCAGTTGGTCTGGT GATGGTAATGGTCAACCAGACCA GTCAAAAATAATAATAAG CAGTTTTTATTATTATTCCTAGé& Bam HI Le fragment Bam HI-Eco RI provenant de la double digestion de p MC 1403 est ligué en Eco RI avec le fragment synthétique ci-dessus. Le fragment Bam HI-Bam HI obtenu est ensuite ligué à l'ADN linéraire du plasmide p EMR 414 digéré par Bam HI de façon à obtenir le plasmide p EMR 429, représenté sur la figure 8, dans laque Lle les symboles ont la même signification que dans la figure 5, les fragments Bam HI-Eco RI et Ico RIBam HI introduits étant représentés par Dans ce plasmide, la séquence codant pour la P-galacto- sidase est sous le contrôle du promoteur ADH 2 décrit dans L'exemple 2 (Cf p 17). 2) Construction du plasmide p EMR 461: Le plasmide p EMR 429 a été soumis à une digestion complète par les enzymes Mlu I et Sph I Le grand fragment Mlu I-Sph I contenant le gène de la p-galactosidase a ensuite été ligué au fragment synthétique, dont la séquence donnée ci-après comporte les séquences d'activation amont (Upstream Activation Séquence: UAS) du promoteur du gène Ga 17 de S cerevisiae et des extrémités cohé- sives Mlu I et Sph I. M u CGCGTCTATACTTCGGRGCACTGTTGAGCGAAGGCTCATTAGATARATTTTCTGTCAT * AGATATGAAGCCTCGTGACARCTCGCTTCCGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA TTTCCTTAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACAACTGTTGACCGT AAAGGAAT TGGGTTITTATTCCCTCTCCCAGG TTTTTCGCGAGCCTGTTGACAACTGGCA GRTCCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATRAGCCRAGCTGRAAATRATGTGTRGC e** wO " *- CTARGGCTTCCTGACCGRTRTGTCACAAGTGTTTTATCGGTTCGACTTTTA TTACACITCG p h I CTT TAGCTATGTTCAGT Tr AGTTTGGCATG , * GAAATCGA TACAAGTCAATCAAACCI Le plasmide p EMR 461 ainsi obtenu est représenté sur la figure 9, dans laquelle les symboles ont la même signification que dans La figure 8, le nouveau fragment Mlu I-Sph I introduit étant symbolisé par Dans ce plasmide, la séquence codant pour La P-galacto- sidase est sous le contrôLe du promoteur artificiel de l'invention décrit dans l'exemple 2 (Cf p 18). EXEMPLE 6: Transformation de la souche de S cerevisiae DBY 746 par les plasmides p EMR 429 et p EMR 461 Transformation avec sélection pour prototrophie de l'uracile: Une colonie de la souche DBY 746 qui est (Mato, his 3, leu 2, ura 3, trpl, cyh) (ROSE et al ( 1981), PNAS USA, 78, 2460- 2464) a servi à ensemencer 100 ml d'un milieu appelé milieu YPG liquide (CF; tableau I de l'exemple 3) Lors de l'obtention d'une densité cellulaire de 107 cellules par ml, les cellules ont été traitées à l'acétate de lithium 0,2 M pour la transformation selon une technique bien connue de l'homme de l'art, décrite par ITO et al (ITO et al, 1983, J Bacteriology 153, 163-168). Les cellules DBY 746 ont été transformées en parallèle avec environ 1 pg de chacun des plasmides p EMR 429 et p EMR 461 Les cellules transformées sont sélectionnées pour le caractère d'auxo- trophie d'uracile (ura) sur un milieu appelé milieu solide sans uracile, (Cf tableau I de l'exemple 3) On a ainsi retenu un transformé DBY 746 p EMR 429 (ura +) et un transformé DBY 746 p EMR 461 (ura+). EXEMPLE 7: Production de P-galactosidase à l'aide des souches DBY 746 p EMR 429 (ura) et DBY 746 p EMR 461 (ura) 1) Expression de la P-galactosidase: Une colonie transformée DBY 746 p EMR 429 (ura)et une colonie transformée DBY 746 p EMR 461 (ura+) ont servi à ensemencer chacune 20 ml de milieu liquide sans uracile auquel on a préalable- ment ajouté du tryptophane ( 10 mg/l) Après une nuit à 30 C sous agitation, on ajoute 1 % de glucose et on laisse la culture se poursuivre pendant 4 h On vérifie alors qu'il y a encore du glucose dans les cultures On prélève une fraction aliquote pour doser la p-galactosidase. Après une nuit à 30 C sous agitation, les deux cultures ont été centrifugées pendant 10 min à 7 000 tr/min Les culots ont été repris dans 10 ml d'eau distillée stérile et de nouveau centri- fugés pendant 10 min à 7 000 tr/min L'expression de p-galacto- sidase a été induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP éthanol-glycérol (Cf tableau I, exemple 3) pour la souche DBY 746 p EMR 429 (ura) et 20 ml de milieu YP éthanol-glycérol- galactose (Cf tableau I, exemple 3) pour la souche DBY 746 p EMR 461 (ura +) Les cultures ont été replacées à 30 C sous agitation pendant une nuit. 2) Préparation des échantillons et dosage: Les cellules cultivées cidessus ont été centrifugées et le surnageant a été éliminé Les culots ont été repris dans 10 ml d'eau distillée et centrifugés pendant 10 min à 7 000 tr/min Les culots ainsi lavés ont été repris dans environ 1 ml de tampon de -3 dosage de la p-galactosidase (EDTA: 2 x 103 M; Na HPO 7 x 102 M; Na H 2 PO 4 3 x 102 M; Mg SO 4 10 M; Mn SO 4 2 x 10 M). Environ 300 pl de cellules ainsi reprises ont été lysées en présence de billes de verre (de 400 à 500 pm de diamètre) repré- sentant environ la moitié du volume final Ce mélange a été vortexé vigoureusement pendant 1 min, 4 fois, les échantillons étant placés pendant 30 S dans la glace entre chaque broyage Le liquide a été retiré des tubes avec une pipette pasteur et transféré dans un microtube Les billes de verre ont été lavées 1 fois avec environ pl de tampon TEA de p H 8,9 Les billes ont été vortexées pendant 1 min, 1 fois, et le liquide a été retiré à la pipette pasteur pour être ajouté au lysat précédent Le lysat a été ensuite centrifugé dans un microtube pendant 5 min à 7 000 tr/min Le surnageant a été précautionneusement retiré et conservé à -20 C pour le Western Blot, le dosage de l'activité urate oxydase et le dosage des protéines totales solubles Le culot des cellules lysées a été conservé séparément à -20 C. L'activité P-galactosidase a été dosée selon la technique de PARDEE (PARDEE et al, J Mol B ( 1959), 1, 1656-178). Les protéines totales solubles ont été d'autre part dosées à l'aide du kit protein essay de BIORAD, comme décrit dans l'exemple 4. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau III ci-après: TABLEAU III Source de Activité Proteines Milieu de culture carbone et totales Souche d' énergie si se solubles de la Pmil pwml culture Milieu liquide dans DBY 746 p SP 429 (ura+)glucose 59 375 uracile + tryptqiiane im g J/l) + glucose ( 1 %) DBY 746 p EM 429 (ura)éthanoll 6 500 1 700 Milieu YP éthanol- glycérol glycol Milieu liquide sans DY 746 p Ef R 461 (ura+)glucose o 350 uracile/trptqane mg/1) + glucose ( 1 %) éthanol/ DBY 746 p ENR 61 (ura+)glycérol/480 520 Milieu YP étharnol- galactse glycéro-galactose Ce tableau montre: en présence de glucose, la souche EMY 746 p EMR 429 (ura+) produit un peu de 1-galactosidase alors que l'on ne détecte pas cette protéine pour la souche DBY 746 p EMR 461 (ura+) Le promoteur arti- ficiel de l'invention permet donc une meilleure répression que le promoteur ADH 2. en conditions d'induction, le promoteur artificiel conduit à un niveau d'expression élévé de p-galactosidase quoique, dans ces conditions, plus faible que le niveau obtenu avec le promoteur ADH 2. U u CGCGTCTATACTTCGGAGCACTGTTGAGCGAAGOCTCATTAGATATATTTY TCTGTCAT AGATATGAAGCCTCGTGACAACTCGCTTCCGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA TTTCCTTAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACRACTOTTGACCOT AAAGGAATTGGGTTITTATTCCCTCTCCCAOGTTTTTCGCGAGCCTGTTGACAACTGGCA GATCCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATAGCCAAGCTG RAAATAATGTGTAGC O C O CTAGGCTTCCTGACCGATATGTCACAAGTGTTTATCGGTTCGACTTTTATTACACATCO s P h CTTTAGCTATGTTCAGTTAGT TTOTGCATGCCTATCACATATAAATAGA GAAATCATACAATCAATCAAACTC ATAGT TATAT TATCT GAAATCGATACAAGTCARTCAAAC Ca TACGGATAGIGTATATTTATCT GTGCCAOTAGCGACTTT 1 TTCACACTCGAGATACTCTTACTACTGCTCTCICTTGTTGTTTT 4, " 4 #, _ CACGGTCAICGCTGAAAAAGGGAGGACCICTATGAGAATGATGOACAGAGAACAACAPAA TATCACT ICTTGTTTCTICITGGTAAATAGAATATCARGCTACAAAAAGCATACAATCAA * _, f, _ _,,,,, ATAGTGAAGAACAAAGAAGAACCATTTATCTTATAGT TCGATGTT TTTCGTATGTTAOGTT C I CTATCAACTATTAACTAIA 1 ATAOT TTATTAT RT CATAGI IGAIAAITGAIATAGC REVENDICATIONS 1 Promoteur artificiel pour l'expression de protéines dans la levure, caractérisé en ce qu'il comporte: OS une sous-séquence en amont de l'élément TATA de la séquence du promoteur du gène GAL 7 de Saccharomyces cerevisiae, qui comporte les séquences d'activation amont UA 51 et UA 52; une sous-séquence de la séquence d'un promoteur ADH 2 comportant l'élément TATA et la région d'initiation de la transcription. 2 promoteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la sousséquence de la séquence du promoteur GAL 7 de Saccharomyces cerevisiae est choisie parmi les sous-séquences de la séquence suivante: M U I CGCGTCTATACT TCGGAGCAC TG T TG OCOA*P GCTCAT TAGATAT A T TT TC TGICAT e * à e, e;, _ AGATATGAAGCCTCGTGACAACTCGCT TCCGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA TT T CCT TACCCRAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAGCGCTCGGACAACT O T TGACCGT AAAOGRAT TGGGT T TT TA TCCC TCTCCCPGGT TT T TCGCGRAOCCTGT TGACRAACTGGCA GATCCGAARGGRCTGGCTRTACAGTOT TCACAAAATAGCCARAOCTGRAAAATRAATGTGTRGC *, _ -à à_ f _ CTRGGCT TCCTGACCGRTATGTCACAAGTGI T TAICGOT TCGACT i TAT TACACRCATC es p h T- CT TAGC TA TGT TCAGTAGT T TGGCA Tc G - f,,,, * X #: G AAT CGRAT RCARAG TCARAT CAAACC 3 Promoteur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la sous-séquence de la séquence d'un promoteur ADH 2 comprenant l'élément TATA et la région d'initiation est choisie parmi les sous-séquences de la séquence ci-après: CCTATCACATATATAGA p TACGGATAGTGTATATTTA Tc T GTGCCAGTAGCGACTTI 1 TTCACACTCGAGATACICTTACTACTGCTCTCTTTGGTTTT 7 , CACGGICAICGCTGAAAAGTGTGAGCTC 1 RTGAGAATOATGACGAGAGACAACRAAIA TATCACTTCTTGTTTCTTCTTGGTAAATAGRATATCRAGCTACAARAAGCATACATC Rc ATAGTGAOGAACAAAGAAGAACCAT 1 TATCITATAGTTCGATGTT T 1 CGTATGTTAGTT ó l Z 1 O CTATCAACTATTRAACTATAI Xs GATAGTTGATRATTGATATAOGC 4 Promoteur selon L'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence suivante: u l CGCGTCTATACTICGGAGCACTG TGAGCGAAGGCTCATTAGATATA Tf TTTCTGTCRT AGATATGAAGCCTCGTGACAACTCGCTTCCGAGTRAATCTRTATAAAAGACAGTA TTTCCTTAACCCARAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACAACTGTTGACCGT * _,,, _ RAAG Gf TTGGGTTTTTTTCCCTTCCCAGGTTTTTCGCGAGCCTGTTGACAACTGGCA GATCCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATAGCCAAGCTGAAAATARTGTGTAOC CTRGGCTTCCTGACCGATATGTCACAAGTGTT TTCGG TTCGACT TTATTAACACATCG S P h l CTTTAGCTATGTTCAGTTAGTTTGGCATGCCTATCACATATAAATAGA GRARAATCGATACAAGICAATCAAACCGTACGGATRAGTGTATATTTATCT GTGCCAGTAGCGACTTTIITCACACTCGAGATACTCTTACTACTGCTCTCTTGITGTTTT CACGOTCATCGCTGAAAAAAGGTGTAGCTCTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAA TATCACT TCTTGTTTCTTCTTGGTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAGCATACAATCAA _ _ _, _______ _, RTAGTGOAGAACARAGAAGAACCATITATCTTATAGTTC Ga TGTTITTTCGTATGTTAGTT C TATCAACTATTAACTATA. GATAGTTGATAATTGATATAGC Vecteur d'expression pour la levure portant un gène d'intérêt avec les moyens nécessaires à son expression, sa réplica- tion et la sélection des cellules transformées, caractérisé en ce que ce gène d'intérêt est sous le contrôle du promoteur selon l'une des revendications 1 à 4. 6 Vecteur d'expression selon la revendication 5, carac- térisé en ce que le gène d'intérêt est un gène recombinant codant pour une protéine toxique pour la levure. 7 Vecteur d'expression selon la revendication 5, carac- térisé en ce que le gène d'intérêt est un gène recombinant codant pour l'urate oxydase. 8 Souche de levure, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 6 et 7. 9 Souche de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 5 à 7. Procédé de production d'une protéine d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une souche de Saccharomyces cerevisiae selon la revendicaton 9 en présence de galactose.