Brevet FR2655352A1 — publié le 19910607

La présente invention porte sur un procédé d'analyse quantitative très sensible des acides biliaires, en particulier des acides biliaires présents dans des échantillons provenant de corps vivants. L'analyse des acides biliaires dans des échantillons prélevés à partir de corps vivants, tels que le sérum et similaires, est importante pour le diagnostic clinique des fonctions du foie, de même que pour élucider la cause de maladies telles que la jaunisse, la cholélithiase, et similaires. De façon classique, divers procédés ont été décrits pour l'analyse des acides biliaires contenant l'acide cholique, l'acide désoxycholique, l'acide chéno- désoxycholique, et similaires L'un des procédés récemment utilisés pour le diagnostic clinique met en jeu l'utilisa- tion d'une hydroxy-3 a stéroïde déshydrogénase et, comme coenzyme, ou bien le nicotinamide adénine dinucléotide ou ses analogues (désignés ci- après collectivement comme les composés de NAD), ou bien le nicotinamide adénine dinucléo- tide phosphate ou ses analogues (désignés ci-après collec- tivement comme les composés de NADP) Les composés de NAD réduit (désignés ci-après comme les composés de NADH) ou les composés de NADP réduit (désignés ci-après comme les composés de NADPH) produits dans une quantité proportion- nelle à la quantité des acides biliaires sont ensuite mesurés quantitativement (publication du brevet japonais no 13 197/1984) Cependant, le procédé est susceptible d'être influencé par la bilirubine, et nécessite donc la séparation à l'avance des acides biliaires Ceci entraîne l'exigence d'une quantité importante d'échantillons pour l'analyse Un autre inconvénient de ce procédé réside dans sa faible sensibilité L'utilisation d'un chromogène très sensible a été proposée pour surmonter cet inconvénient lProceedings of the 33th of Annual Meeting of Japan Society of Clinical Pathology, 123 ( 1986); ibid, the 34th Annual Meeting, 124 ( 1987)l Cependant, ce procédé n'apporte pas de solution complète au problème. Un autre procédé comprend la conversion de l'oxo-3 stéroïde produit en l'oxo-3 A 4-stéroïde par l'action d'oxo-3 & 4-stéroïde déshydrogénase pour produire du formazan en une quantité double de celle produite dans un procédé classique en vue d'un dosage calorimétrique Un coffret pour la mise en oeuvre de ce procédé est disponible dans le commerce Cependant, ce procédé n'a qu'une sensibilité double de celle du pro- cédé classique. La publication du brevet japonais no 36 758/1988 décrit un procédé pour l'analyse des acides biliaires au moyen d'une réaction de cycle enzymatique de composés de NADH ou de composés de NADPH qui sont produits dans une quantité proportionnelle à la quantité d'acides biliaires. Pour amplifier la quantité de composés de NADH ou de composés de NADPH par une réaction de cycle enzymatique pour obtenir une meilleure sensibilité dans l'analyse, ce procédé nécessite une étape d'élimination des composés de NAD ou des composés de NADP en surplus par décomposition par chauffage dans un alcali Etant donné que ceci met en jeu un mode opératoire compliqué, le procédé est désavanta- geux lorsqu'il est appliqué à des fins d'examen clinique qui nécessitent l'analyse d'un grand nombre d'échantillons. Ainsi, les procédés analytiques enzymatiques couramment disponibles pour les acides biliaires ne sont pas adaptables à la mesure précise des acides biliaires dans des échantillons ayant une teneur en acides biliaires située au-dessous de la plage normale, par exemple, des échantillons prélevés sur des patients souffrant du syndrome de malabsorption qui entraîne une diminution de la teneur en acides biliaires dans le sang. Bien que les acides biliaires, pour la plupart, ont un groupe hydroxy en position 3 a, certains acides biliaires ont des groupes hydroxy en position 7 a et/ou 12 a, en plus de la position 3 a L'analyse de tels acides biliaires est théoriquement possible sans l'utilisation d'une chromatographie en phase gazeuse ou similaires, si on analyse l'échantillon en utilisant, en plus de l'hydroxy-3 a stéroïde déshydrogénase ( 3 a-HSD), la 7 a-HSD et la 12 a-HSD. La mesure des acides hydroxy-12 a biliaires en plus de la mesure des acides biliaires totaux par la 3 a-HSD est décrite comme étant éventuellement adaptable à la détermi- nation ou à l'examen du degré et du progrès des maladies du foie lJournal of Clinical and Experimental Medicine, vol 143, 10, 775-776 ( 1987)l Ceci est un autre aspect pour lequel le développement d'une analyse quantitative très sensible des acides biliaires a été souhaité. Compte tenu de cette situation, les présents inventeurs ont entrepris des recherches approfondies au sujet de la réaction réversible dans laquelle les acides oxobiliaires sont produits à l'aide des acides biliaires comme substrat Comme résultat, les inventeurs ont découvert que, dans le système réactionnel dans lequel des acides oxobiliaires sont produits à partir des acides biliaires à l'aide d'une stéroïde déshydrogénase issue d'un microorganisme spécifique et de composés de NAD (ou de composés de NADP) comme coenzyme, si une petite quantité d'une autre coenzyme, les composés de NADPH (ou composés de NADH), était présente pour effectuer une réaction de cycle réversible entre les acides biliaires et les acides oxo- biliaires, la quantité de composés de NADH (ou de composés de NADPH) produite augmentait de façon linéaire au cours du temps Les inventeurs ont également découvert que le taux d'augmentation était proportionnel à la teneur en acides biliaires d'un échantillon, et ils ont déposé une demande de brevet (demande de brevet japonais N O 98 443/1989). Cependant, le procédé pose le problème qu'il se produit une erreur lorsque seuls les types réduits produits proportionnellement à la quantité d'acides biliaires doivent être déterminés, étant donné qu'à la fois les composés de NADH et les composés de NADPH ont un pic d'absorption à 340 nm. La forme réduite du thionicotinamide adénine dinucléotide ou de ses analogues (désignés ci-après collectivement comme les composés de thioNAD) et la forme réduite du thionicotinamide adénine dinucléotide phosphate ou de ses analogues (désignés ci-après collectivement comme les composés de thio-NADP) sont connues pour présenter un pic d'absorption au voisinage de 400 nm, qui est différent de celui des composés de NAD et des composés de NADP de type réduit. Compte tenu de cette situation, les présents inventeurs ont entrepris de nouvelles études approfondies et ils ont découvert qu'un hydroxystéroïde ou un oxy- hydroxystéroïde peut être analysé quantitativement avec une sensibilité élevée si l'une des deux coenzymes utilisées dans la réaction de cycle enzymatique mentionnée ci-dessus est remplacée par des composés de thioNADP ou des composés de thio-NAD, et si la quantité de l'une ou l'autre des coenzymes est déterminée Cette découverte a conduit encore au développement d'un procédé pour un dosage précis des acides biliaires. Par conséquent, la présente invention a pour objectif de proposer un procédé d'analyse très sensible des acides biliaires, caractérisé par le fait qu'il comprend la réaction d'un échantillon contenant des acides biliaires avec un réactif comprenant: ( 1) une stéroïde déshydrogénase qui catalyse l'oxydation réversible des acides biliaires produisant les acides oxobiliaires, réaction dans laquelle (i) l'un des composés choisis parmi les composés de thio-NADP et les composés de thio-NAD et (ii) l'un des composés choisis parmi les composés de NADP et les composés de NAD sont utilisés comme coenzymes, ( 2) le Composé A 1 (défini ci-dessous); et ( 3) le Composé Bl (défini ci-dessous), pour effectuer la réaction suivante: A 1 A 2 \ Sté&of de t Acide 3 iliaire Acide Oxo Biliaire B 2 Bl dans laquelle: A 1 est un composé de thio-NADP, un composé de thio-NAD, un composé de NADP ou un composé de NAD; A 2 est un produit réduit de A 1; Bl est un composé de NADP réduit ou un composé de NAD réduit lorsque A 1 est un composé de thio-NADP ou un composé de thio-NAD, ou un composé de thio-NADP réduit ou un composé de thio-NAD réduit lorsque A 1 est un composé de NADP ou un composé de NAD; et B 2 est un produit oxydé de Bl; et la mesure des variations de la quantité de A 2 ou Bl dans la réaction ci-dessus. La présente invention a pour autre objectif de proposer une composition de réactif pour l'analyse des acides biliaires, caractérisée par le fait qu'elle comprend: ( 1) une stéroïde déshydrogénase qui catalyse l'oxydation réversible des acides biliaires produisant les acides oxobiliaires, réaction dans laquelle (i) l'un des composés choisis parmi les composés de thio-NADP et les composés de thio-NAD et (ii) l'un des composés choisis parmi les composés de NADP et les composés de NAD, sont utilisés comme coenzymes; ( 2) le Composé A 1; et ( 3) le Composé B 1. D'autre buts, caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront plus aisément ci-après à la lecture de la description suivante. La Figure 1 est un diagramme montrant le résultat de l'essai d'évaluation de l'acide cholique à 400 nm dans l'Exemple 1. La Figure 2 montre le résultat de l'essai d'évaluation de la quantité d'acide chénodésoxycholique à 400 nm dans l'Exemple 2. La Figure 3 montre le résultat de l'essai d'évaluation de l'acide cholique à 400 nm dans l'Exemple 3. La Figure 4 montre le résultat de l'essai d'évaluation de la quantité de sérum à 400 nm dans l'Exemple 4. La Figure 5 montre le résultat de l'essai d'évaluation de l'acide cholique à 400 nm dans l'Exemple 6. La Figure 6 montre le résultat de l'essai d'évaluation de l'acide cholique à 340 nm dans l'Exemple 7. La Figure 7 montre le résultat de l'essai d'évaluation de l'acide cholique à 340 nm dans l'Exemple 8. N'importe quelles stéroide déshydrogénases satis- faisant les exigences ci-dessus peuvent être utilisées pour l'objectif de la présente invention Des exemples spécifiques de stéroïde déshydrogénases utilisant des composés de NAD et des composés de thio-NAD comme coenzyme sont l'hydroxy-3 a stéroide déshydrogénase ( 3 a-HSD) (EC 1 1 1 50), qui est issue de Pseudomonas testosteronii, lJ.B C, 227, 37-52 ( 1957)l ou Bacillus sphaericus (publication du brevet japonais n 157 894/1979); la 7 a-HSD (EC 1 1 1 159), issue de Bacteroides fragilis (Biochim Biophys Acta, 384, 12-21 ( 1975)) ou Pseudomonas sp B-0831 (Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue No T-28); la 12 a-HSD (EC 1 1 1 176), issue de Bacillus sphaericus (Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue No T-29); et similaires On donne, comme exemples de stéroide déshydrogénases utilisant des composés de NAD, des composé de NADP, des composés de thio-NAD et des composé de thio-NADP comme coenzymnes, les 3 a-HS Ds issues de foie de rat, prostate lJ Steroid Biochem, 8, 41-46 ( 1977)l, ou Pseudomonas sp B- 0831 (Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue No T-27). A 1 et A 2 représentent un composé de thio-NADP, un composé de thio-NAD, un composé de NADP ou un composé de NAD Parmi ceux-ci, on donne, comme exemples de composés de NADP, le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP) et ses analogues, tels que l'acétylpyridine adénine dinucléotide phosphate (acétyl NADP), le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide phosphate (désamino NADP) et similaires pour les composés de NADP; et le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), l'acétylpyridine adénine - dinucléotide (acétyl NAD), le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (désamino NAD) et similaires, pour les composés de NAD. On donne, comme exemples de composés de thio- NADP, le thionicotinamide adénine dinucléotide phosphate (thio-NADP) et ses analogues, tels que le thionicotinamide hypoxanthine dinucléotide phosphate; et, comme exemples de composés de thio-NADP, le thionicotinamide adénine dinucléotide (thio-NAD) et ses analogues, tels que le thionicotinamide hypoxanthine dinucléotide et similaires. L'un ou l'autre parmi A 1 et Bl doit être un composé de thio-NADP ou un composé de thio-NAD dans la présente invention. Ils sont choisis en fonction de la stéroide déshydrogénase utilisée dans l'analyse Lorsque la stéroide déshydrogénase n'a que des composés de NAD comme coenzyme, par exemple, un composé de thio-NAD et l'un des composés de NAD mentionnés ci-dessus sont utilisés. Lorsque la stéroide déshydrogénase réagit avec à la fois les composés de NAD et les composés de NADP comme coenzymes, une combinaison appropriée d'un composé de thio- NADP et d'un composé de thio-NAD, et une combinaison appro- priée choisie parmi les composés de NAD et les composés de NADP mentionnés ci-dessus peuvent être utilisées. Les quantités de A 1 et Bl sont en excès par rapport à la quantité des acides biliaires contenus dans l'échantillon Il est également essentiel qu'elles soient en excès par rapport à la valeur de Km respective de la stéroïde déshydrogénase pour A 1 et B 1 Une quantité particulièrement préférable est de 20 à 10 000 fois la quantité en moles d'acides biliaires. Dans la composition de réactif pour l'analyse des acides biliaires de la présente invention, les concentrations des composants A 1 et Bl peuvent aller de 0,02 à 100 m M, et, de préférence, de 0,05 à 30 m M Une concentration préférable de la stéroïde déshydrogénase peut aller de 0,05 à 100 U/ml, et, de façon particulièrement préférée, de 1 à 50 U/ml La quantité peut être ajustée en fonction du type de l'échantillon La quantité dépassant la plage ci-dessus est acceptable. Dans le cas o la stéroïde déshydrogénase réagit à la fois avec les composés de NAD et les composés de NADP comme coenzymes, si la combinaison des deux coenzymes est un composé de thio-NAD et soit un composé de NAD, soit un composé de NADP, ou un composé de thio-NADP et, soit un composé de NAD, soit un composé de NADP, il est possible de faire réagir l'échantillon avec une deuxième déshydro- génase, le composant ( 4), qui ne réagit pas avec les acides biliaires mais agit de façon à faire se dérouler la réaction B 2 B 1, et le substrat pour la deuxième déshydrogénase Ceci assure une réaction entre Bl et B 2 pour la régénération de Bl comme présenté dans le schéma réactionnel (II), fournissant ainsi une réaction de cycle pour les acides biliaires Dans ce cas, la quantité de A 2 formée par la réaction est mesurée pour l'analyse. A 1 A 2 t Steroïde lVh Dronsh Acide Biliaire Acide Oxo Biliaire B 2 Bl Deuxièe re 9 Deshyo$ (II) dans laquelle: A 1 est un composé de thio-NADP, un composé de thio- NAD, un composé de NADP ou un composé de NAD; A 2 est un produit réduit de Al; Bl est un composé de NADP réduit ou un composé de NAD réduit lorsque A 1 est un composé de thio-NADP ou un composé de thio-NAD, ou un composé de thio-NADP réduit ou un composé de thio-NAD réduit lorsque A 1 est un composé de NADP ou un composé de NAD; et B 2 est un produit oxydé de Bl; et B 27 B 1 est une réaction enzymatique produisant Bl utilisant B 2 comme coenzyme. La deuxième déshydrogénase est ajoutée afin de régénérer B 1, réduisant ainsi la quantité de B 1 à utiliser dans la réaction Ceci est particulièrement efficace lorsque Bl est un composé coûteux Il est possible d'utiliser B 2 ou un mélange de Bl et B 2 à la place de B 1. Dans ce cas, une quantité préférable de Bl et/ou de B 2 est généralement égale au 1/10, de préférence au 1/100 ou moins, de la quantité en mole de A 1, bien que la quantité ne soit pas particulièrement limitée. Dans la composition de réactif pour l'analyse des acides biliaires utilisant le composant ( 4), la concentra- tion du composant A 1 peut aller de 0,02 à 100 m M, et, de préférence, de 0,05 à 30 m M, la concentration du composant B 2 et/ou Bl allant de 0,05 à 5 000 g M, et, de préférence, de 5 à 500 g M Une concentration préférable de la stéroide déshydrogénase peut aller de 0,05 à 100 U/ml, et, de façon particulièrement préférée, de 1 à 50 U/ml La quantité de la deuxième déshydrogénase peut être ajustée à 20 fois ou plus (unité: U/ml) la valeur de Km (unité: m M) pour B 2, par exemple, à 1-100 U/ml, la quantité de son substrat étant, de préférence, en excès,et par exemple égale à 0,05 20 m M Ces quantités peuvent être déterminées en fonction du type de l'échantillon La quantité dépassant la plage ci-dessus est acceptable. On donne, comme exemples des deuxièmes déshydro- génases et de leurs substrats, lorsque B 2 est un composé de NAD ou un composé de thio-NAD, l'alcool déshydrogénase (EC 1 1 1 1) et l'éthanol, la glycérol déshydrogénase (EC 1 1 1 6) issue de E Coli et le glycérol, la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (EC 1 1 1 8) issue de muscle de lapin et le L-glycérol-3-phosphate, la malate déshydrogénase (EC 1 1 1 37) issue de coeur de porc ou de boeuf et l'acide L-malique, la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (EC 1 2 1 12) issue de muscle ou foie de lapin, de levure, ou d'E Coli, le D-glycéraldéhyde phosphate et l'acide phosphorique; et lorsque B 2 est un composé de NADP ou un composé de thio-NADP, la glucose-6- phosphate déshydrogénase (EC 1 1 1 49) issue de levure et le glucose-6phosphate, l'acide iso-citrique déshydrogénase (EC 1 1 1 42) issue de coeur de porc ou de levure et l'acide iso-citrique, l'acide glyoxylique déshydrogénase (EC 1 2 1 17) issue de Pseudomonas oxalaticus, Co A, et l'acide glyoxylique, l'acide phosphogluconique déshydro- génase (EC 1 1 1 44) issue de foie de rat, de levure de bière, ou d'E Coli et l'acide 6-phospho-D-gluconique, la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (EC 1 2 1 13) issue il de chlorophylle végétale, le Dglycéraldéhyde-3-phosphate, et l'acide phosphorique, la benzaldéhyde déshydrogénase (EC 1 2 1 7) issue de Pseudomonas fluorescens et le benzaldéhyde, et similaires. Par ailleurs, dans le cas o la stéroïde déshydrogénase réagit à la fois avec les composés de NAD et les composés de NADP comme coenzymes, si la combinaison des deux enzymes est un composé de thio-NAD, et soit un composé de NAD, soit un composé de NADP, ou un composé de thio-NADP et, soit un composé de NAD, soit un composé de NADP, il est possible de faire réagir l'échantillon avec ( 5) une troisième déshydrogénase qui ne réagit pas avec les acides biliaires, mais réagit de façon à faire se dérouler la réaction A 2 A 1, et le substrat pour la troisième déshy- drogénase Ceci assure une réaction entre A 1 et A 2 pour la régénération de A 1 comme présenté dans le schéma réaction- nel (III), fournissant ainsi une réaction de cycle pour les acides biliaires Dans ce cas, la quantité de Bl formée par la réaction est mesurée pour l'analyse. Troisième Déshydrogénase A 1 A 2 \Stéroïde Acide Biliaire Acide Oxo Biliaire B 2 Bl (III) dans laquelle: A 1 est un composé de thio-NADP, un composé de thio- NAD, un composé de NADP ou un composé de NAD; A 2 est un produit réduit de A 1; Bl est un composé de NADP réduit ou un composé de NAD réduit lorsque A 1 est un composé de thio-NADP ou un composé de thio-NAD, ou un composé de thio-NADP réduit ou un composé de thio-NAD réduit lorsque A 1 est un composé de NADP ou un composé de NAD; et B 2 est un produit oxydé de Bl; et A 27 +Al est une réaction enzymatique produisant Ai utilisant A 2 comme coenzyme. La troisième déshydrogénase est ajoutée afin de régénérer A 1, réduisant ainsi la quantité de A 1 à utiliser dans la réaction Ceci est particulièrement efficace lorsque A 1 est un composé coûteux Il est possible d'utiliser A 2 ou un mélange de A 1 et A 2 à la place de A 1. Dans ce cas, une quantité préférable de A 1 et/ou A 2 est généralement inférieure au 1/10, de préférence, au 1/100 ou moins, de la quantité en mole de Bl, bien que la quantité ne soit pas particulièrement limitée. Dans l'analyse des acides biliaires de la présente invention utilisant le composant ( 5), une concentration préférable du composant Bl va de 0,02 à 100 m M, et, en particulier, de 0,05 à 30 m M La concentra- tion de A 2 et/ou A 1 va de 0,05 à 5 000 g M, et, de préférence, de 5 à 500 g M La quantité de la stéroïde déshydrogénase peut aller de 0,05 à 100 U/ml, et, de préférence, de 1 à 50 U/ml La quantité de la troisième déshydrogénase (U/ml) est de 20 fois ou plus la valeur de Km (unité: m M) pour A 2, et, par exemple, de I-100 U/ml. Le substrat pour la troisième déshydrogénase est utilisé dans une quantité, par exemple, de 0,5 à 20 m M La quantité spécifique de cescomposantsest déterminée en fonction du type de l'échantillon et similaires, et l'utilisation des composants en quantités dépassant celles définies ci-dessus est acceptable. On donne, comme exemples des troisièmes déshydro- génases et de leurs substrats, lorsque A 1 est un composé de NAD ou un composé de thio-NAD, l'alcool déshydrogénase (EC 1 1 1 1) et l'acétaldéhyde, la glycérol déshydrogénase (EC 1 1 1 6) issue d'E Coli et la dihydroxyacétone, la glycérol-3 phosphate déshydrogénase (EC 1 1 1 8) issue de muscle de lapin et le dihydroxyacétone phosphate, la malate déshydrogénase (EC 1 1 1 37) issue de coeur de porc ou de boeuf et l'acide oxaloacétique, la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (EC 1 2 1 12) issue de muscle, ou foie de lapin, de levure, ou d'E Coli et le 1,3-diphospho-D- glycérophosphate; et lorsque A 1 représente un composé de NADP ou un composé de thio-NADP, la glucose-6-phosphate déshydrogénase (EC 1 1 1 49) issue de levure et le glucono- lactone-6-phosphate, la glycéraldéhyde phosphate déshydro- génase (EC 1 2 1 13) issue de chlorophylle végétale et le 1,3-diphospho-D-glycérophosphate, et similaires. On peut utiliser n'importe quelles stéroide déshydrogénases capables de réagir avec un réactif d'acides biliaires tels que l'acide cholique agissant comme substrat en présence d'un composé de NAD (de préférence, NAD), un composé de thio-NAD (de préférence, thio-NAD), un composé de NADP (de préférence, NADP), ou un composé de thio-NADP (de préférence, thio-NADP), comme coenzyme. L'applicabilité d'une stéroide déshydrogénase vis-à-vis du réactif de la présente invention peut être confirmée par l'utilisation d'une telle coenzyme et d'un tel substrat à utiliser. La composition de la solution de réaction peut être déterminée comme suit Deux types de coenzymes sont tous d'abord choisis, en tenant compte de l'activité relative de la stéroide déshydrogénase et des coenzymes qui doivent être utilisées Ensuite, le p H est ajusté entre les p H optimaux de la réaction directe et de la réaction inverse, de sorte que le rapport de la vitesse de la réaction directe et de la vitesse de la réaction inverse soit proche de 1 Dans le cas, par exemple, o 3 a-HSD lissue de Pseudomonas sp B-0831; Toyo Jozo Co, Ltd. Catalogue No T-27 l est utilisée conjointement avec l'acide cholique comme substrat et un composé de thio-NAD est utilisé comi coenzyme, l'activité relative est d'environ 40 % par comparaison avec NAD comme coenzyme et les p H optimaux pour les réactions directe et inverse se situent respectivement au voisinage de 9,5 et 5,5 Les enzymes peuvent être utilisées soit individuellement,-soit en combinaison. Pour la détermination d'une quantité d'acides biliaires dans un échantillon en utilisant le réactif préparé comme décrit ci-dessus et conformément au procédé de la présente invention, 0,001 à 0,5 ml de l'échantillon est ajouté au réactif contenant les composants ( 1) à ( 3), ( 1) à ( 4), ou ( 1) à ( 3) et ( 5) ci-dessus et mis à réagir à environ 370 C La quantité de A 2 produite ou la quantité de Bl consommée par la réaction est ensuite déterminée par la mesure de l'absorption pendantiapériode de temps prescrite, de plusieurs minutes à plusieurs dizaines de minutes, à deux moments prescrits après le démarrage de la réaction, par exemple pendant 1 minute entre 3 minutes et 4 minutes après le démarrage de la réaction, ou 5 minutes entre 3 minutes et 8 minutes après le démarrage de la réaction. Par exemple, lorsque A 2 est thio-NADH et Bl est NADH, la quantité de A 2 produite est déterminée par la mesure de l'augmentation de l'absorption à 400 nm ou la quantité de Bl est déterminée par la mesure de la diminution de l'absorption à 340 nm Une détermination en temps réel de la concentration en acides biliaires dans un échantillon est possible par comparaison de la valeur ainsi obtenue avec la valeur obtenue à partir d'un échantillon ayant une concentration connue en acides biliaires. Etant donné que l'analyse quantitative conformé- ment à la présente invention est effectuée par l'intro- duction des acides biliaires eux-mêmes dans la réaction de cycle enzymatique, elle est moins influencée par les autres composés existant dans l'échantillon et elle permet d'omettre l'essai à blanc de l'échantillon Le procédé fournit ainsi un essai d'évaluation simple et facile De plus, le procédé analytique assure non seulement une mesure quantitative des acides biliaires totaux par 3 a-HSD, mais également une mesure quantitative séparée des acides hydroxy-7 a biliaires par 7 a-HSD et des acides hydroxy-12 a biliaires par 12 a-HSD. En plus de l'analyse à l'aide de la mesure d'absorption, la quantité de A 2 ou Bl peut être également déterminée par d'autres procédés analytiques enzymatiques connus. Comme illustré ci-dessus, l'utilisation de la forme réduite des coenzymes avec des longueurs d'onde d'absorption différentes dans le procédé de la présente invention réduit les erreurs de l'essai Elle peut favoriser considérablement la sensibilité par l'intermé- diaire de la combinaison avec une réaction de cycle enzymatique Le procédé assure une détermination rapide et précise des acides biliaires à l'aide d'une petite quantité d'échantillon. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description suivante des modes de réalisation qui sont donnés à titre d'exemple pour illustrer l'invention et qui ne sont pas destinés à en limiter la portée. EXEMPLES Exemple 1 Tampon Phosphate 40 m M (p H 8,0) Thio-NAD 1 m M NADH 0,2 m M Triton X-100 à 0,1 % 3 a-HSD (issue de Pseudomonas testosteronii, produite par Sigma Co) 5 U/ml. 1 ml du réactif ci-dessus a été ajouté à chacune d'une série de sept cuvettes en quartz, et 10 4 l d'une solution d'acide cholique à des concentrations de 0, 10, 20, 40, 60, 80 et 100 MM ont été respectivement ajoutés, à raison d'une concentration pour chacune des sept cuvettes, et mis à réagir à 37 C L'absorption à 400 nm a été mesurée 2 et 3 minutes après le démarrage de la réaction, et les différences ont été déterminées Les résultats sont représentés sur la Figure 1, qui démontre une bonne linéarité des variations d'absorption par rapport à la quantité d'acide cholique. Exemple 2 Tampon Phosphate 40 m M (p H 7,0) Thio-NAD 1 m M NADH 1 mTriton X-100 à 0,1 % 7 a-HSD (issue de Pseudomonas sp, Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue N T-28) 20 U/ml. 1 ml du réactif ci-dessus a été ajouté à chacune d'une série de six cuvettes en quartz, et 10 4 l d'une solution d'acide chénodésoxycholique à une concentration de 0, 100, 200, 300, 400 et 500 MM ont été respectivement ajoutés, à raison d'une concentration pour chacune des six cuvettes, et mis à réagir à 37 C L'absorption à 400 nm a été mesurée 2 et 3 minutes après le démarrage de la réaction, et les différences ont été déterminées Les résultats sont représentés sur la Figure 2, qui démontre une bonne linéarité des variations d'absorption par rapport à la quantité d'acide chénodésoxycholique. Exemple 3 Tampon Tris-H Cl (p H 8,5) 40 m M Thio-NAD 1 m M NADPH 2 m M 3 a-HSD (issue de Pseudomonas sp, Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue N T-27) 9 U/ml. 1 ml du réactif ci-dessus a été ajouté & chacune d'une série de six cuvettes en quartz, et 50 g 1 d'une solution d'acide cholique à des concentrations de 0, , 40, 60, 80 et 100 g M ont été respectivement ajoutés, à raison d'une concentration pour chacune des six cuvettes, et mis à réagir à 37 C L'absorption à 400 nm a été mesurée 3 et 4 minutes après le démarrage de la réaction, et les différences ont été déterminées Les résultats sont représentés sur la Figure 3, qui démontre une bonne linéarité des variations d'absorption par rapport à la quantité d'acide cholique. Exemple 4 Tampon Tris-H Cl (p H 8,0) 40 m M Thio-NAD 1 m M NADH 0,2 m M Triton X-100 à 0,2 % Acide oxamique 2 m M 3 a-HSD (issue de Pseudomonas sp, Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue N T-27) 10 U/ml. 1 ml du réactif ci-dessus a été ajouté à chacune d'une série de cinq cuvettes en quartz, et 100 g 1 de sérum dilué à différentes concentrations, allant de 5/5 à 1/5, ont été respectivement ajoutés, à raison d'une concen- ration pour chacune des cinq cuvettes, et mis à réagir à 37 C L'absorption à 400 nm a été mesurée 3 et 4 minutes après le démarrage de la réaction, et les différences ont été déterminées Les résultats sont représentés sur la Figure 4. Exemple 5 Tampon Tris-H Cl (p H 8,0) 40 m M Thio-NAD 1 m M NADH 0,2 m M Triton X-100 à 0,2 % Acide oxamique 2 m M 3 a-HSD (issue de Pseudomonas sp, Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue N T-27) 3,5 U/ml. 1 ml du réactif ci-dessus a été ajouté à chacun d'une série de trois tubes à essai, et 50 M 1 d'échantillons de sérum préparés par addition d'acide cholique à la concentration de 10 p M, 20 MM ou 50 g M ont été ajoutés. Chaque mélange a été ensuite traité de la même manière qu'à l'Exemple 4 Les résultats sont présentés dans le Tableau 1, qui montre que les taux de récupération allaient de 97,8 à 104,0 %. TABLEAU 1 Acide cholique Acide cholique Taux de ajouté (MM) trouvé (MM) Différence récupération (%) O 5,3 O - 15,2 9,9 99,0 26,1 20,8 104,0 54,2 48,9 97,8 Exemple 6 Tampon Phosphate (p H 7,0) 50 m M Thio-NAD 2,5 m M NADH 0,35 m M 7 a-HSD (issue de Pseudomonas sp, Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue N T-28) 59 U/ml. 0,5 ml du réactif ci-dessus a été ajouté à chacune d'une série de six cuvettes en quartz, et 25 41 d'une solution d'acide cholique à des concentrations de 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1,0 MM ont été respectivement ajoutés, à raison d'une concentration pour chacune des six cuvettes, et mis à réagir à 30 C pendant 60 minutes Après l'achèvement de la réaction par une addition de 0,5 ml de dodécyl sulfate de sodium (SDS), l'absorption à 400 nm a été mesurée Les résultats sont présentés sur la Figure 5, qui démontre une bonne linéarité des variations d'absorption par rapport à la quantité d'acide cholique. Exemple 7 Tampon glycine-Na OH (p H 10,0) 40 m M NADP 5 m M Thio-NAD 50/M Ethanol 0,4 M Alcool déshydrogénase (fabriquée par Oriental Yeast Co., Ltd) 30 U/ml 3 a-HSD (issue de Pseudomonas sp, B-0831, Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue N T-27) 10 U/ml. Triton X-100 à 0,2 %. 1 ml du réactif ci-dessus a été ajouté à chacune d'une série de six cuvettes en quartz, et 10 pi d'une solution d'acide cholique à des concentrations de 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 et 0,5 p M ont été ajoutés respectivement, à raison d'une concentration pour chacune des six cuvettes, et mis à réagir à 37 C L'absorption à 340 nm a été mesurée 3 et 4 minutes après le démarrage de la réaction, et les différences ont été déterminées Les résultats sont présentés sur la Figure 6, qui démontre une bonne linéarité des variations d'absorption par rapport à la quantité d'acide cholique. Exemple 8 Tampon PIPES-Na OH (p H 7,0) 40 m M NADPH 0,25 m M Thio-NAD 0, 025 m M Dihydroxyacétone phosphate 5 m M Glycérol-3-phosphate déshydrogénase (issue de muscle de lapin et fabriquée par Boehringer Co) U/ml 3 a-HSD (issue de Pseudomonas sp, B-0831, Toyo Jozo Co, Ltd Catalogue N T-27) 20 U/ml Triton X-100 à 0,2 %. 1 ml du réactif ci-dessus a été ajouté à chacune d'une série de six cuvettes en quartz, et 50 g 1 d'une solution d'acide cholique à des concentrations de 0, 10, , 30, 40 et 50 AM ont été ajoutés respectivement, à raison d'une concentration pour chacune des six cuvettes, et mis à réagir à 37 C L'absorption à 340 nm a été mesurée 3 et 4 minutes après le démarrage de la réaction, et les différences ont été déterminées Les résultats sont présentés sur la Figure 7, qui démontre une bonne linéarité des variations d'absorption par rapport à la quantité d'acide cholique. Il va de soi que de nombreuses modifications et variantes de la présente invention sont possibles à la lumière des enseignements ci-dessus Il doit par conséquent être entendu que le domaine de définition ne doit en aucune manière être limité aux modes de réalisation décrits ici d'une manière spécifique, et que l'invention peut être mise en oeuvre autrement qu'avec ces modes de réalisation spécifiquement décrits. REVENDICATIONS 1 Procédé d'analyse très sensible des acides biliaires, caractérisé par le fait qu'il comprend: la réaction d'un échantillon contenant des acides biliaires avec un réactif comprenant: ( 1) une stéroide déshydrogénase qui catalyse l'oxydation réversible des acides biliaires produisant les acides oxobiliaires, réaction dans laquelle (i) l'un des composés choisis parmi le thionicotinamide adénine dinucléotide phosphate ou ses analogues (composés de thio-NADP) et le thionicotinamide adénine dinucléotide ou ses analogues (composés de thio-NAD) et (ii) l'un des composés choisis parmi le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate ou ses analogues (composés de NADP) et le nicotinamide adénine dinucléotide ou ses analogues (composés de NAD) sont utilisés comme coenzymes, ( 2) le Composé A 1 (défini ci-dessous); et ( 3) le Composé Bl (défini ci-dessous) , pour effectuer la réaction de cycle suivante: A 1 A 2 \ stéroide Acide Biliaire Acide Oxo Biliaire Bl dans laquelle: A 1 est un composé de thio-NADP, un composé de thio-NAD, un composé de NADP ou un composé de NAD; A 2 est un produit réduit de A 1; Bl est un composé de NADP réduit ou un composé de NAD réduit lorsque A 1 est un composé de thio-NADP ou un composé de thio-NAD, ou un composé de thio-NADP réduit ou un composé de thio-NAD réduit lorsque A 1 est un composé de NADP ou un composé de NAD; et B 2 est un produit oxydé de Bl; et la mesure des variations de la quantité de A 2 ou Bl dans la réaction ci-dessus. 2 Procédé d'analyse très sensible des acides biliaires, caractérisé par le fait qu'il comprend: la réaction d'un échantillon contenant des acides biliaires avec un réactif comprenant: ( 1) une stéroïde déshydrogénase qui catalyse l'oxydation réversible des acides biliaires produisant les acides oxobiliaires, réaction dans laquelle (i) l'un des composés choisis parmi les composés de thio-NADP et les composés de thio-NAD et (ii) l'un des composés choisis parmi les composés de NADP et les composés de NAD sont utilisés comme coenzymes; ( 2) le Composé A 1 (défini ci-dessous); ( 3) le Composé Bl et/ou B 2 (défini ci-dessous); et ( 4) une deuxième déshydrogénase qui ne réagit pas avec les acides biliaires mais agit de façon à faire se dérouler la réaction B 2 B 1, et le substrat pour la deuxième déshydrogénase, pour effectuer la réaction de cycle suivante: A 1 A 2 Stéroide Acide Biliaire Acide Oxo Biliaire B 2 B \ Deuxierme shdroqérn dans laquelle: A 1 est un composé de thio-NADP, un composé de thio-NAD, un composé de NADP ou un composé de NAD; A 2 est un produit réduit de A 1; B 1 est un composé de NADP réduit ou un composé de NAD réduit lorsque A 1 est un composé de thio-NADP ou un composé de thioNAD, ou un composé de thio-NADP réduit ou un composé de thio-NAD réduit lorsque A 1 est un composé de NADP ou un composé de NAD; et B 2 est un produit oxydé de Bl; et B 2-B 1 est une réaction enzymatique produisant B 1 à l'aide de B 2 comme coenzyme; et la mesure de la quantité de A 2 produite dans la réaction ci-dessus. 3 Procédé d'analyse très sensible des acides biliaires, caractérisé par le fait qu'il comprend: la réaction d'un échantillon contenant des acides biliaires avec un réactif comprenant: ( 1) une stéroide déshydrogénase qui catalyse l'oxydation réversible des acides biliaires produisant les acides oxobiliaires, réaction dans laquelle (i) l'un des composés choisis parmi les composés de thio-NADP et les composés de thio-NAD et (ii) l'un des composés choisis parmi les composés de NADP et les composés de NAD sont utilisés comme coenzymes; ( 2) le Composé A 1 et/ou A 2 (défini cidessous); ( 3) le Composé Bl (défini ci-dessous); et ( 5) une troisième déshydrogénase qui ne réagit pas avec les acides biliaires mais agit de façon à faire se dérouler la réaction A 2 A 1, et le substrat pour la troisième déshydrogénase, pour effectuer la réaction de cycle suivante: Troisième Déshydrognase A 1 A 2 Astlroide A Acide Biliaire A;ide Oxo Biliaire B 2 Bl dans laquelle: A 1 est un composé de thio-NADP, un composé de thio-NAD, un composé de NADP ou un composé de NAD; A 2 est un produit réduit de A 1; Bl est un composé de NADP réduit ou un composé de NAD réduit lorsque A 1 est un composé de thio-NADP ou un composé de thio-NAD, ou un composé de thio- NADP réduit ou un composé de thio-NAD réduit lorsque A 1 est un composé de NADP ou un composé de NAD; B 2 est un produit oxydé de Bl; et A 2-A 1 est une réaction enzymatique produisant A 1 à l'aide d'A 2 comme coenzyme; et la mesure de la quantité de Bl consommée dans la réaction ci-dessus. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la stéroide déshydrogénase est une hydroxy-3 a stéroide déshydrogénase. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la stéroiïde déshydrogénase est une hydroxy-7 a stéroide déshydrogénase. 6 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la stéroide déshydrogénase est une hydroxy-12 a stéroide déshydrogénase. 7 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le composé de NADP est un composé choisi dans le groupe constitué par le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), l'acétylpyridine adénine dinucléotide phosphate (acétyl NADP) et le nicoti- namide hypoxanthine dinucléotide phosphate (désamino NADP). 8 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le composé de NAD est un composé choisi dans le groupe constitué par le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), l'acétylpyridine adénine dinucléotide (acétyl NAD) et le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (désamino NAD). 9 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le composé de thio-NAD est un composé choisi dans le groupe constitué par le thio- nicotinamide adénine dinucléotide (thio-NAD) et le thio- nicotinamide hypoxanthine dinucléotide. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le composé de thio-NADP est un composé choisi dans le groupe constitué par le thio- nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (thio-NADP) et le thionicotinamide hypoxanthine dinucléotide phosphate. 11 Composition de réactif pour l'analyse des acides biliaires, caractérisée par le fait qu'elle comprend: ( 1) une stéroide déshydrogénase qui catalyse l'oxydation réversible des acides biliaires produisant les acides oxobiliaires, réaction dans laquelle (i) l'un des composés choisis parmi les composés de thio-NADP et les composés de thioNAD et (ii) l'un des composés choisis parmi les composés de NADP et les composés de NAD sont utilisés comme coenzymes; ( 2) le Composé A 1 qui est choisi dans le groupe constitué par les composés de thio-NADP, les composés de thio-NAD, les composés de NADP et les composés de NAD; et ( 3) le Composé Bl qui est un composé de NADP réduit ou un composé de NAD réduit lorsque A 1 est un composé de thio-NADP ou un composé de thio-NAD, ou un composé de thio-NADP réduit ou un composé de thio-NAD réduit lorsque A 1 est un composé de NADP ou un composé de NAD. 12 Composition de réactif pour l'analyse des acides biliaires, caractérisée par le fait qu'elle comprend: ( 1) une stéroide déshydrogénase qui catalyse l'oxydation réversible des acides biliaires produisant les acides oxobiliaires, réaction dans laquelle (i) l'un des composés choisis parmi les composés de thio-NADP et les composés de thioNAD et (ii) l'un des composés choisis parmi les composés de NADP et les composés de NAD sont utilisés comme coenzymes; ( 2) le Composé A 1 qui est choisi dans le groupe constitué par les composés de thio-NADP, les composés de thio- NAD, les composés de NADP et les composés de NAD; ( 3) le Composé Bl qui est un composé de NADP réduit ou un composé de NAD réduit lorsque A 1 est un composé de thio-NADP ou un composé de thio-NAD, ou un composé de thio-NADP réduit ou un composé de thio-NAD réduit lorsque A 1 est un composé de NADP ou un composé de NAD et/ou le composé B 2 qui est un produit oxydé de Bl; et ( 4) une deuxième déshydrogénase qui ne réagit pas avec les acides biliaires mais agit de façon à faire se dérouler la réaction B 2 B 1, et le substrat pour la deuxième déshydrogénase. 13 Composition de réactif pour l'analyse des acides biliaires, caractérisée par le fait qu'elle comprend: ( 1) une stéroïde déshydrogénase qui catalyse l'oxydation réversible des acides biliaires produisant les acides oxobiliaires, réaction dans laquelle (i) l'un des composés choisis parmi les composés de thio-NADP et les composés de thioNAD et (ii) l'un des composés choisis parmi les composés de NADP et les composés de NAD sont utilisés comme coenzymes; ( 2) le Composé A 1 qui est choisi dans le groupe constitué par les composés de thio-NADP, les composés de thio-NAD, les composés de NADP et les composés de NAD, et/ou le composé A 2 qui est un produit réduit de A 1; ( 3) le Composé Bl qui est un composé de NADP réduit ou un composé de NAD réduit lorsque A 1 est un composé de thio-NADP ou un composé de thio-NAD, ou un composé de thioNADP réduit ou un composé de thio-NAD réduit lorsque A 1 est un composé de NADP ou un composé de NAD; et ( 5) une troisième déshydrogénase qui ne réagit pas avec les acides biliaires mais agit de façon à faire se dérouler la réaction A 2 A 1, et le substrat pour la O troisième déshydrogénase.