Brevet FR2657259A1 — publié le 19910726

La présente invention a pour objet l'utilisation de la N-myristoyl- (S)-phénylalanine en tant qu'inhibiteur de la N-myristoyltransférase (NMT). Il est connu de l'art antérieur, que le groupement amino N-terminal des protéines est bloqué par des groupements acétyle, pyroglutamyle et formyle Or, SHOJI et Coll ont mis en évidence que l'acide myristique était lié par une liaison covalente au groupement N-terminal des sous- unités catalytiques de la protéine kinase AMP cyclique dépendante (Proc. Natl Acad Sci USA, ( 1982), 79, 6123-6131). L'existence de ce groupement myristoyl terminal a depuis lors été montré dans diverses autres protéines comme la calcineurine B (AITKEN et Coll, Febs Letters, ( 1982), 150, n 2, 314-318) ou la tyrosine protéine kinase (TPK) (BUSS et SEFTON, J Virol, ( 1985),53, 7-12). Dans le domaine des oncogènes également, BISHOP a mis en évidence qu'une protéine transformante subissait une myristoylation lors de la maturation Il a d'ailleurs été montré depuis que cette étape de maturation passant par une myristoylation était essentielle au pouvoir transformant de cette protéine (KAMPS, BUSS et SEFTON, Proc Natl Acad. Sci USA, ( 1985), 82, 4625-4628) Ce concept a dès lors été généralisé à de nombreuses autres protéines transformantes d'origine virale (RHEE et HUNTER, J Virol, ( 1987), 61, 1045-1053) Cette maturation est catalysée par une enzyme appelée N-myristoyltransférase mise en évidence par TOWLER et GLASER (Proc Natl Acad Sci USA, ( 1986), 83, 2812-2816). Or, la NMT ne reconnait pratiquement comme cosubstrat que l'acide myristique d'une part et d'autre part, comme substrat, les protéines comportant une glycine comme dernier acide aminé du côté N-terminal, avec participation de la séquence peptidique jouxtant cette glycine (participation de 7 amino-acides). Ainsi, la myristoylation du résidu glycine N-terminal de certaines protéines joue un rôle très important sur certains mécanismes intervenant dans la transformation des cellules et le contrôle de leur prolifération. Il a d'ailleurs été montré par SHOJI et Coll (brevets japonais JP 63- 146851, JP 62-255810 et JP 62-126384) que la myristoylglycine ou des dérivés oligopeptidiques possédait un effet inhibiteur contre la transformation ou la prolifération cellulaire ou la multiplication de rétrovirus. L'invention consiste plus particulièrement en l'utilisation de la N- myristoyl-(S)-phénylalanine comme inhibiteur de la myristoylation de protéines telles que gag par le biais de l'enzyme responsable de cette myristoylation, c'est-à-dire de la N-myristoyltransférase. L'inhibition de l'activité de cette enzyme n'avait jusqu'alors jamais été mise en évidence par ce composé De plus, l'utilisation de la N-myristoyl(S)-phénylalanine en tant qu'inhibiteur de NMT conduit à une inhibition de l'activité de cette enzyme nettement supérieure à celle de composés décrits dans l'art antérieur comme inhibiteurs de la prolifération de cellules cancéreuses et de rétrovirus. En effet, une étude approfondie de l'influence exercée par la N- myristoyl-(S)-phénylalanine sur la prolifération et la transformation cellulaire a été réalisée à partir de cellules cancéreuses d'origine murine (L 1210) Après extraction de l'enzyme de ce milieu biologique et mesure de son activité, il apparaît que l'addition de N-myristoyl-(S)- phénylalamine inhibe fortement son activité. De plus, ce composé présente une activité cytotoxique sur des cellules cancéreuses en culture telles que L 1210 (d'origine murine) ou HL (d'origine humaine) Cette cytotoxicité s'est révélée être nettement supérieure à celle due à la N-myristoylglycine sur ces cellules. Ainsi, cette inhibition d'activité est d'autant plus intéressante que cette enzyme joue un rôle prépondérant, en particulier dans la maturation soit de protéines transformantes impliquées dans certains cancers, soit de protéines elles-mêmes impliquées dans la maturation de rétrovirus. La N-myristoyl-(S)-phénylalanine a donc potentiellement des applications dans le traitement du cancer et/ou de maladies à rétrovirus comme le SIDA. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la N- myristoyl-(S)-phénylalanine ou d'un de ses sels d'addition à une base pharmaceutiquement acceptable, sous la forme d'une composition pharmaceutique seule ou en combinaison avec un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes non toxiques. Parmi les compositions pharmaceutiques selon l'invention, on pourra citer celles qui conviennent pour l'administration orale, parentérale, nasale, les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les sachets, les paquets, les gélules, les glosettes, les tablettes, les suppositoires, etc La posologie varie selon l'âge et le poids du patient, la nature et la sévérité de l'affection ainsi que la voie d'administration Celle-ci peut être orale, nasale, rectale ou parentérale D'une manière générale, la posologie unitaire s'échelonne entre 0,1 et 100 mg pour un traitement en 1 à 3 prises par 24 heures. Les exemples suivants illustrent l'invention mais ne la limitent en aucune façon. Exemple 1: Synthèse de la N-myristoyl-(S)-phénylalanine Stade A: Nmyristoyl-(S)-phénylalaninate de terbutyle En utilisant la technique décrite par VAUGHAN J R jr et OSATO R L. (JACS, ( 1951), 7, 5553), on obtient à partir d'acide myristique et de (S)-phénylalaninate de terbutyle le produit attendu. Rendement: 92 % Stade B: N-myristoyl-(S)-phénylalanine 2 g du composé obtenu au stade A sont dissous dans 25 ml de dichlorométhane Après addition de 5 ml d'acide trifluoroacétique, la solution est abandonnée 24 heures à température ambiante Elle est alors évaporée à sec Le produit attendu est obtenu après cristallisation du résidu dans le pentane et filtration. Rendement: 49 % Point de fusion (Kofler): 74 C Microanalvse élémentaire: C % H % N% Calculé: 73,56 9,93 3,73 Trouvé: 73,30 9,81 3,58 ETUDE PHARMACOLOGIQUE: Exemple 2: Méthode pour inhiber la N-Myristoyl Transférase (NMT) par des analogues du produit de la réaction qu'elle catalyse Stade A: Culture en masse de cellules cancéreuses L 1210 Des cellules leucémiques d'origine murine (L 1210) sont cultivées en roller de 500 à 1000 ml dans un milieu comprenant: dans un milieu RPMI 1640 (Gibco); 10 % de sérum de veau foetal; 50 unités/ml de pénicilline; 50 p M de streptomycine; 2 m M de glutamine et 10 m M de HEPES (Gibco) Les cellules croissent sous agitation permanente à 37 C dans une atmosphère de 5 % C 02/95 % air Les cellules sont recueillies et lavées. Le culot final, comportant typiquement 2,5 1011 cellules est resuspendu dans un tampon de lyse l 50 m M TRIS, p H 7,9; 1 m M DTT; lm M EDTA et 250 m M de sucrosel Les cellules sont lysées et homogénéisées Les microsomes (réticulum endoplasmique vésiculisé) sont recueillis par centrifugation à 000 g comme culot. Stade B: Solubilisation de l'enzyme à partir de cette source biologique La NMT est une enzyme membranaire Pour solubiliser cette enzyme, cette suspension est alors diluée au 2/3 dans un tampon de solubilisation: l 50 m M HEPES, p H 7 5, 1 m M EDTA, 1 m M DTT, 10 % glycérol et 3 % de Triton 770 l est maintenue pendant 30 mn à 4 C sous agitation Cette suspension est ensuite à nouveau centrifugée à 105 000 g pendant 75 mn Le matériel insoluble dans le détergent sédimente en culot Le surnageant comprend la totalité de l'activité NMT présente dans les microsomes de L 1210. Stade C: Mesure de l'activité N-Myristoyl Transférase et de son inhibition par la N-myristoyl-(S)-phénylalanine Les composés sont alors testés sur le surnageant en compétition avec le substrat peptidique GlyAsn-(Ala)4-(Arg)2 ("G 8 R") selon les conditions suivantes comme décrites par TOWLER et Coll (PNAS, ( 1987), 84, 2708- 2711) Le Myristoyl-Coenzyme A est synthétisé extemporanément et enzymatiquement par incubation de Mysristate avec ATP, Coenzyme A (sel de lithium) et de l'Acyl-Coa synthetase de Pseudomonas ( 20 mn à 30 C) Puis sont ajoutés: le peptide substrat et la source biologique telle qu'obtenue ci-dessus Le mélange est incubé 10 mn à 37 C; puis la réaction est stoppée par 110 pl de méthanol et 10 pl d'acide trichloroacétique Le milieu est laissé à 4 C pendant 10 mn, puis centrifugé à 10000 g pendant 5 mn Une aliquote ( 30 pil) du surnageant final est injecté dans un système HPLC équipé d'une colonne pi Bondapak (Waters) et développé par un gradient linéaire tel que décrit par Towler et al (PNAS, ( 1987), 84, 2708-11) La détection du peptide acylé s'effectue à l'aide d'un détecteur radioactif en ligne (Berthold) grâce à l'adjonction de 5 ml/mn de liquide de scintillation (Zinsser) Le peptide acylé est élué à 85 % d'acétonitrile-TFA/15 % H 20-TFA. Les composés testés comme inhibiteurs sont suspendus dans une solution à 0.1 % de Triton 770, après une brève sonication à froid 10 il de la solution d'inhibiteur sont rajoutés au milieu réactionel Les conditions expérimentales sont identiques à celles décrites ci-dessus L'activité du composé est évaluée sur la base de la diminution de l'activité contrôle, incubée dans les mêmes conditions, mais en présence de la solution de suspension. Dans ces conditions, la N-myristoyl-(S)-phénylalanine présente une IC 50 égale à 2 10-4 M Ce qui correspond à une activité 15 fois supérieure à celle mesurée pour la N-myristoylglycine dont l'IC 50 est égale à 3 10-3. Exemple 3: Cytotoxicité La cytotoxicité des composés est appréciée par l'utilisation du test colorimétrique décrit par ALLEY et Coll (Cancer Res, ( 1988), 48, 589- 601) Ce test automatisé est utilisé en routine sur 2 lignées cellulaires: L 1210 (leucémie murine) et HL 60 (promyelocyte humain) Sur chacune de ces lignées, la cytotoxicité est appréciée en utilisant 9 concentrations des composés L'IC 50 est la concentration inhibant 50 % de la croissance des cellules. Les résultats sont regroupés dans le tableau suivant: IC 50 (M) sur cellules L 1210 IC 50 (M) sur cellules HL 60 N-myristoyl-(S) 29,5 12,8 phénylalanine N-myristoyl glycine 48,4 20,5 Ces résultats montrent que la N-myristoyl-(S)phénylalanine présente une cytotoxicité nettement supérieure à celle de la N-myristoyl glycine. t REVENDICATIONS 1/ Utilisation de la N-myristoyl-(S)-phénylalanine ou d'un de ses sels d'addition à une base pharmaceutiquement acceptable, pour l'obtention d'une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables, utilisable en tant qu'inhibiteur de N-myristoyl Transférase. 2/ Utilisation de la N-myristoyl-(S)-phénylalanine pour l'obtention d'une composition pharmaceutique selon la revendication 1 utilisable dans le traitement du cancer. 3/ Utilisation de la N-myristoyl-(S)-phénylalanine pour l'obtention d'une composition pharmaceutique selon la revendication 1, utilisable dans le traitement de maladies à rétrovirus comme le SIDA.