Brevet FR2652266A1 — publié le 19910329

L'invention concerne un vaccin protecteur contre l'hémophilose porcine et un procédé d'obtention du principe actif entrant dans la constitution dudit vaccin. La pleuropneumonie du porc ou hémophilose porcine est une maladie largement répandue géographiquement et qui a de graves conséquences économiques. Cette maladie se traduit notamment par une pleurésie fibrineuse et par une pneumonie hémorragique. Le germe responsable de cette maladie est Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae que l'on appellera par la suite H. pleuropneumoniae. Douze sérotypes capsulaires sont décrits dans le monde. Les facteurs de virulence d'H. pleuropneumoniae sont au nombre de trois: l'endotoxine (lipopolysaccharide LPS), la capsule (polysaccharide capsulaire) et une ou plusieurs toxine(s) responsable(s) de l'activité cytotoxique et de l'activité hémolytique d'H. pleuropneumoniae. Lesdites toxines sont encore mal définies et on ne sait pas avec certitude si ces deux activités sont le fait d'une seule ou de plusieurs toxine(s). -Devant les difficultés de mise en oeuvre des programmes d'assainissement, la vaccination a été souvent envisagée. A la suite de l'échec des vaccins préparés à partir de corps bactériens inactivés (protection faible et spécifique des sérotypes inclus dans le vaccin, mauvaise innocuité), des vaccins de type "sous-unité" ont été étudiés. Cependant, les tentatives de préparation de vaccins sous-unité à partir du lipopolysaccharide, du polysaccharide capsulaire et de protéines de la membrane externe n'ont pas abouti: l'effet protecteur est insuffisant et spécifique. On s'est intéressé à l'hémolysine (toxine hémolytique) à la suite des travaux de Bendixen et ai. (Toxicity of Hae- mophilus pleuropneumoniae for porcine lung macrophages, peripheral blood monocytes and testicular cells - Infect. Immun., 1981, 33, 673-676) et de Rosendal et al. (H. pleu- ropneumoniae lung lesions induced by sonicated bacteria and sterile culture supernatant - Proceedings IPVS Copenhagen, 1980, p. 221) qui ont montré la présence d'anticorps anti- hémolysine dans des sérums de porcs convalescents et l'effet neutralisant d'un sérum de lapin hyper-immun vis-à-vis des activités hémolytiques et cytotoxiques. Van Leengoed et al. (Vaccination of pigs with toxin containing supernatant of H. pleuropneumoniae - 1988, Thesis "Pathogenic studies on H. pleuropneumoniae", State Univer- sity of Utrecht) ont montré qu'un vaccin à base de toxine du sérotype 9 préparé en adjuvant huileux conférait une protec- tion lors d'un épreuve virulente homologue chez le porc. Les animaux vaccinés présentent des anticorps neutralisant les activités hémolytiques et cytotoxiques. Par contre, R. Hesse et al. (H. pleuropneumoniae vacci- nation - Challenge studies, 1984, IPVS de Ghent, Belgique, p. 111) ont montré qu'un vaccin à base de toxine ou d'anatoxine du sérotype 1 inactivée par la chaleur et non adjuvée, ne conférait pas de protection lors d'une épreuve virulente homologue et qu'un vaccin composé de toxine du sérotype 1 adjuvée par une émulsion ne protégeait pas contre une épreuve par le sérotype 5. Ils ont démontré une protec- tion pour un vaccin comprenant à la fois la toxine et des corps bactériens inactivées. Enfin, J.Frey et al.(Biochemical and genetic character- ization of Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin, 1988, IPVS de Rio de Janeiro, p. 79) ont montré l'importance de la présence de Ca++ dans le milieu de culture pour l'expression de l'hémolysine chez certains sérotypes, notam- ment le sérotype 1. Le milieu de culture qu'ils ont utilisé est le Columbia Broth additionné d'IsoVitaleX et de NAD. L'invention a pour objectif de fournir un vaccin contre l'hémophilose porcine qui confère une protection hétérologue contre tous les sérotypes d'H. pleuropneumoniae et qui présente une grande innocuité. Un autre objectif de l'invention est de fournir un vac- cin peu onéreux et facile à fabriquer. L'invention a pour objet un vaccin protecteur contre l'hémophilose porcine, caractérisé en ce qu'il comprend la toxine, du sérotype 1 d'H. pleuropneumoniae, qui est responsable de l'activité cytotoxique et hémolytique d'H. pleuropneumoniae, dans un véhicule ou excipient du type de ceux utilisés dans la constitution de vaccins. Pour des raisons d'innocuité, on préfère que la toxine soit inactivée, de préférence par le formol, et soit donc sous forme d'une anatoxine. De préférence, la toxine est adjuvée, notamment par de l'hydroxyde d'alumine. De préférence, la toxine est à une concentration finale de 50 pg/ml. De préférence, le vaccin est administré à raison de 100 lg de toxine par dose. De préférence, la toxine entrant dans la constitution du vaccin est obtenue par purification du surnageant d'une culture d'une souche d'H. pleuropneumoniae de sérotype 1 fortement productrice de toxine, dans un milieu additionné de Ca++ et de NAD. Le vaccin selon l'invention sera de préférence administré par voie intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique en une ou deux injections. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de la toxine responsable de l'activité cytotoxique et hémolytique chez H. pleuropneumoniae de sérotype 1, pour la constitution de vaccins protecteurs du type décrit ci-dessus. Dans ce procédé, on sélectionne une souche d'H. pleuropneumoniae de sérotype 1 fortement productrice de ladite toxine, on cultive la souche sélectionnée dans des conditions optimales d'expression de la toxine, on récupère le surnageant de culture et on extrait et purifie la toxine, puis, éventuellement, on inactive la toxine, l'inactivation pouvant être effectuée selon toute technique connue appropriée, notamment par le formol. Selon l'invention, on peut cultiver la souche sélectionnée dans notamment l'un des trois milieux de cul- ture suivants, contenant du Ca++ et du NAD: - milieu Bouillon CoeurCervelle - milieu Bacto Columbia Broth - milieu de Wilkins-Chalgren. L'invention va maintenant être décrite plus en détail à l'aide d'un procédé d'obtention de la toxine du sérotype 1 et à l'aide d'essais de vaccination chez la souris et chez le porc. I Procédé d'obtention de toxine On a choisi la souche de sérotype 1 décrite par Shope R.E. (1964), J. Exp. Med. 119, 357-368, en raison de sa pro- duction importante de toxine. Le milieu de culture utilisé doit contenir du Ca++ et du NAD. Les milieux Bouillon Coeur-Cervelle (BioMérieux), Bacto Columbia Broth (Difco) et Wilkins-Chalgren conviennent notamment. Dans ce procédé, on utilise le milieu Bacto Columbia Broth, additionné de 10 mM de CaClZet de 15 mM de NAD. On met une ampoule lyophilisée de la souche en- culture dans 5 ml de milieu, pendant 18 heures à 37'C et sous agitation. On ensemence ensuite 100 ml de milieu et on cul- tive 6 heures à 37'C, sous agitation. A ce stade, la culture peut être inactivée par addition de formaldéhyde à 1,6 mg/ml. On centrifuge ensuite la culture à 7000 g pendant 20 minutes. On concentre le surnageant par précipitation au sulfate d'ammonium à 40 % de saturation, pendant 30 minutes à 4C et sous agitation. Le précipité obtenu après centrifu- gation à 10 000 g pendant 10 mn est repris en tampon TNC (Tris HCl 10 mM, NaCl 9 b, CaClz10 mM). La toxine peut aussi être concentrée par ultrafiltra- tion (seuil de coupure: 10 000 Da). Le concentré peut être inactivé par la chaleur, I heure à 56*C. La toxine est ensuite purifiée par deux chromatogra- phies successives de filtration sur gel S200 HR (Pharmacia- LKB). Le domaine de fractionnement de ce gel se situe entre 000 et 250 000 pour des protéines globulaires. Les caractéristiques de la colonne sont les suivantes: Volume de gel 190 ml Hauteur 95 cm Section 2 cm Volume de dépôt 10 ml Débit 20 ml/h Tampon d'élution Tris HCl 10 mM NaCl 9 % CaClz1OmM. Le profil en électrophorèse PAGE-SDS (selon Laemli, 1970, Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, 680-685) montre une seule bande, qui correspond à un poids moléculaire de KDa (figure 1). Il semble donc qu'il n'existe, pour le sérotype 1, qu'une seule toxine responsable des deux activités, cytotoxique et hémolytique. II Préparation d'un vaccin Le vaccin est préparé à partir de l'anatoxine purifiée obtenue comme ci-dessus. La formulation en anatoxine se fait sur la base du titre hémolytique avant inactivation (titre de 3 environ) et pourra aussi se faire selon d'autres tests (ELISA par exemple). L'anatoxine est adjuvée en gel d'alumine (0,7 mg/ml) et formolée à 1,6 mg/ml. III Essai de vaccination de souris Le vaccin cité ci-dessus a été testé lors d'une vacci- nation épreuve sur souris: Les souris reçoivent à JO 0,5 ml de vaccin par voie sous-cutanée. L'épreuve est réalisée à J21 par injection de 10 doses létales 50 % par souris par voie intrapéritonéale sous 0,5 ml. Les résultats figurent dans le tableau 1 suivant: Les résultats sont exprimés en nombre de morts pour 10 souris éprouvées: TABLEAU 1 Sérotype d'épreuve Témoin Vaccin "anatoxine" i 9 O 2 4 O 3 9 3 4 8 3 5 0 6 5 O 7 9 2 8 7 1 9 5 0 10 2 11 10 3 12 10 3 Ceci démontre que le vaccin confère une protection efficace et hétérologue vis-à-vis de tous les sérotypes décrits dans le modèle souris, extrapolable à l'espèce por- cine. III Essai de vaccination chez le porc Deux groupes de porcelets EOPS (exempts d'organismes pathogènes spécifiques) sont élevés dans les mêmes conditions. L'un des groupes est vacciné à l'âge de 8 semaines et de 12 semaines. L'autre groupe sert de témoin. Les deux groupes sont éprouvés à l'âge de 14 semaines avec le sérotype 9 (épreuve hétérologue) par voie intrana- sale (104 germes). Les résultats sont regroupés dans le tableau 2 suivant. TABLEAU 2 symptômes mortalité lésions cliniques pulmo- naires groupe de porcs 1 vaccinés O 0 (petits abcès) (pour 8 porcs) groupe témoin 8 8 8 (pour 8 porcs) (en 48 h) Ces résultats démontrent bien l'efficacité du vaccin selon l'invention. REVENDICATIONS 1. Vaccin protecteur contre l'hémophilose porcine, caractérisé en ce qu'il comprend la toxine, du sérotype 1 d'Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, qui est responsable de l'activité cytotoxique et hémolytique d'H. pleuropneumoniae, dans un véhicule ou un excipient du type de ceux utilisés dans la constitution de vaccins. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que la toxine est inactivée par le formol. 3. Vaccin selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la toxine est adjuvée par de l'hydroxyde d'alumine. 4. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la toxine est à une concentration finale de 50 pg/ml. 5. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est administré à raison de 100 ug de toxine par dose. 6. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la toxine est obtenue par purification du surnageant d'une culture d'une souche d'H. pleuropneu- moniae de sérotype 1 fortement productrice de toxine, dans un milieu additionné de Ca et de NAD. 7. Procédé d'obtention de la toxine responsable de l'activité cytotoxique et hémolytique chez Hemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae de sérotype 1, pour la constitution de vaccins protecteurs selon l'une des revendi- cations 1 à 6, caractérisé en ce que l'on sélectionne une souche d'H. pleuropneumoniae de sérotype 1 fortement produc- trice de ladite toxine, on cultive la souche sélectionnée dans des conditions optimales d'expression de la toxine, on récupère le surnageant de culture et on extrait et purifie la toxine, puis, éventuellement, on inactive la toxine. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on cultive la souche sélectionnée avec un milieu Bouillon Coeur-Cervelle contenant du Ca++ et du NAD. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on cultive la souche sélectionnée avec un milieu Bacto Columbia Broth contenant du Ca-F et du NAD. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on cultive la souche sélectionnée avec un milieu de Wilkins-Chalgren contenant du Ca et du NAD.