Brevet FR2651321A1 — publié le 19910301

La présente invention concerne de façon générale un procédé permettant de former une image de la distribution bidimen- sionnelle de la concentration en ions de calcium, de la concen- tration en ions d'hydrogène, etc., dans une cellule, à l'aide d'un système de microscope à fluorescence dans lequel un réactif fluorescent est employé comme capteur. Plus spécialement, l'invention concerne un procédé permettant de visualiser nettement l'image du contour d'une cellule et l'image de la distribution bidimensionnelle de la concentration ionique en relation position- nelle précise avec le contour de la cellule. Récemment, dans le domaine de la neurologie et de la biologie cellulaire, il a été largement employé, pour étudier le métabolisme d'une cellule, un procédé permettant de déterminer la concentration en ions de calcium libres dans une cellule vivante. Dans ce procédé, on introduit dans une cellule vivante un réactif fluorescent approprié (ci-après appelé "capteur fluorescent") qui est en mesure de faire fonction de capteur permettant de titrer une substance cible. Sur la base de l'intensité de fluorescence du capteur, on détermine la concentration de L'espèce chimique cible. Ce procédé permet de titrer différents types d'ions dans une cellule, tels que ions de calcium, ions de sodium, ions de magnésium et ions de chlore, ou des macromolécules de la cellule, telles que protéine et acide nucléique. On va maitenant expliquer le princioe du titrage. Lorsque le capteur fluorescent établit une liaison avec une substance spécifique à titrer, son spectre de fluorescence ou son spectre d'excitation change. Le degré de changement varie en fonction de la concentration de la substance. Ainsi, si l'on mesure l'intensité de fluorescence du capteur à l'aide d'un spectrophotomètre de fluorescence ou d'un microscope de fluorescence, on peut détermine la concentration de la substance particulière sur la base des variations du spectre. Par exemple, lorsqu'on détermine des ions de calcium, on administre, comme capteur fluorescent, du fura-2, et on mesure la variation du spectre d'excitation provoquée par la liaison particulière entre le capteur et les ions de calcium. Lorsqu'on utilise un microscope à fluorescence, il faut noter que l'on mesure la variation de l'intensité de fluorescence non par rapport à l'image de fluorescence toute entière, mais par rapport à une petite région circulaire particulière de l'image de fluorescence. Avec le procédé ci-dessus exposé, on peut facilement déterminer la concentration en ions de calcium dans une petite région particulière d'une cellule, mais il est très difficile de trouver la répartition de la concentration en ions de calcium dans une région bidimensionnelle relativement grande. Pour obtenir cette distribution de concentration, il est nécessaire de mesurer des échantillons pris en de nombreux points, ce qui nécessite beaucoup de temps et de travail. D'autre part, en neurologie et en biologie cellulaire, il est très important de trouver la distribution de la concentration en ions de calcium dans une region relativement grande comportant par exemple plusieurs cellules. Eu égard à cette situation, il existe une demande pour un procédé perfectionné permettant d'obtenir facilement une distribution bidimensionnelle de la concentration par mesure, à un instant, de la concentration d'une substance cible à titrer dans une région bidimensionnelle relativement grande. Pour satisfaire cette demande, la demande de brevet des E.U.A. n0 340 326, déposée le 19 avril 1989 propose un système de micros- cope à fluorescence combiné avec une technique de traitement d'image. L'utilisation de ce système de microscope à fluorescence rend possible d'obtenir facilement la distribution intracellulaire de la concentration ionique dans une région bidimensionnelle rela- tivement grande. Ce type de microscope à fluorescence est employé dans un mode de réalisation préféré de l'invention. Ainsi, on présentera de façon détaillée ce microscope dans la description du mode de réalisation de l'invention. Toutefois, même si l'on emploie le microscope à fluorescence ci-dessus présenté, les problèmes suivants se posent avec le procédé classique d'obtention de la distribution bidimen- sionnelle de la concentration ionique intracellulaire. Lorsqu'on étudie la fonction physiologique d'une cellule, il est très important de pouvoir obtenir des données relatives à la partie de la cellule dans laquelle la concentration en ions libres de calcium augmente ou diminue. Toutefois, L'image de L'intensité de fluorescence obtenue par le procédé classique ne comporte géné- ralement que des données se rapportant à la concentration ionique et ne contient pas de données se rapportant à la relation positionnelle entre la concentration ionique et la cellule. Par conséquent, même si l'image d'intensité de fluorescence ainsi obtenue subit un trai- tement, il n'est pas possible d'obtenir une image dans laquelle la distribution de la concentration ionique est reliée au contour de la cellule. De plus, l'image d'intensité de fluorescence obtenue comporte une fluorescence de fond externe à la cellule. Pour trouver la distribution bidimensionnelle de la concentration en ions à titrer, il faut soustraire de l'image d'intensité de fluorescence la fluorescence de fond. Toutefois, il est difficile de déterminer objectivement la valeur de la fluorescence de fond. Sur le procédé classique, l'expérimentateur détermine empiriquement la valeur d'un niveau de fond sur la base du profil d'une image d'intensité de fluorescence. Ainsi, la base permettant de déter- miner la valeur d'un niveau de fond est incertaine et varie d'un expérimentateur à un autre. IL est donc difficile de déterminer avec précision la concentration ionique. Un but de l'invention est de produire une image de la distribution bidimensionnelle de la concentration en ions spécifiques dans une cellule en relation avec le contour de la cellule, à l'aide d'un système de microscope à fluorescence utilisant un capteur fluorescent. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé permettant de déterminer objectivement le niveau de la lumière de fluorescence de fond et il mesure exactement la concentration ionique. On réalise ces buts à l'aide d'un procédé de formation de l'image de la distribution bidimensionnelle de la concentration d'ions spécifiques devant être titrés dans une cellule vivante, sur la base des variations du spectre de fluorescence ou du spectre d'excitation d'un capteur fluorescent, ledit procédé comprenant les opérations suivantes: administrer un capteur fluorescent dans une cellule; obtenir l'image de la distribution de l'intensité de fluorescence en déterminant la lumière de fluorescence venant du capteur fluorescent dans une région contenant la cellule; mesurer optiquement la cellule, de manière à obtenir une image de la cellule sélectionnée dans le groupe comprenant une image à fond clair, ou une image en contraste de phase, une image en contraste interférentiel différentiel de Nomarski, et une image de polarisation; déterminer une valeur de la fluorescence de fond à partir d'un profil de l'image d'intensité de fluorescence et d'un profil de l'image de la cellule; former une image de la distribution bidimensionnelle de la concentration des ions à titrer, par un traitement d'image comportant la soustraction de la valeur de fluorescence de fond vis-à-vis de l'image de la distribution d'intensité de fluorescence; et soumettre l'image de la cellule et l'image de la distri- bution bidimensionnelle de la concentration des ions à un trai- tement d'image, de manière à visualiser les deux images en super- position. Selon le procédé de l'invention, pour déterminer la valeur de la fluorescence de fond, non seulement on utilise un profil d'une image d'intensité de fluorescence, mais aussi un profil d'une image de la cellule, laquelle est sélectionnée dans le groupe formé par une image à fond clair, une image en contraste de phase, une image en contraste interférentiel différentiel de Nomarski et une image de polarisation, comme image de référence. On peut donc contourner le jugement subjectif de l'expérimentateur et déterminer avec exactitude et objectivité la valeur de la fluorescence de fond. Ainsi, on peut trouver exactement la concen- tration ionique et la distribution de la concentration. De plus, puisque l'image de la concentration bidimensio- nelle des ions à titrer est superposée à l'image de la cellule, la relation entre la distribution de la concentration et la structure de la cellule est rendue claire. Par conséquent, on comprend nette- ment quelle partie d'une cellule correspond à la concentration ionique pour chaque point de L'image de la distribution de la concentration. La description suivante, conçue à titre d'illustration de l'invention, vise à donner une meilleure compréhension de ses caractéristiques et avantages; elle s'appuie sur les dessins annexés, parmi lesquels: les figures 1 à 4 sont des graphes permettant d'expliquer le principe d'un procédé de détermination de la concentration ionique utilisant un capteur fluorescent; la figure 5 est un organigramme illustrant un procédé de mise en superposition d'images selon l'invention; les figures 6 et 7 sont des vues servant à décrire un système de microscope à fluorescence utilisé dans l'invention; la figure 8 est un organigramme illustrant un mode de réalisation de l'invention; la figure 9 est une photographie montrant une image à fond clair de cellules selon le mode de réalisation de l'invention; la figure 10 est un graphe illustrant un procédé de détermination de la valeur de fluorescence de fond selon le mode de réalisation de l'invention; la figure 11 est une photographie montrant l'image de la distribution bidimensionnelle d'ions de calcium, qui était obtenue selon le mode de réalisation de l'invention; et la figure 12 est une photographie montrant l'image super- posée d'une image à fond clair et d'une image de la distribution bidimensionnelle d'ions de calcium, laquelle a été obtenue selon le mode de réalisation de l'invention. Pour permettre de mieux comprendre l'invention, on va maintenant décrire de façon plus détaillée un procédé permettant de déterminer la concentration d'une substance cible dans une cellule vivante, à l'aide d'un capteur fluorescent. Comme décrit ci-dessus, ce procédé emploie un capteur fluorescent possédant un spectre d'excitation ou un spectre de fluorescence qui est variable en fonction de la concentration d'ions spécifiques. Par exemple, lors de la détermination de la concentration des ions de calcium, on peut utiliser, comme capteur fluorescent, des réactifs fluorescents qui sont commercialement disponibles sous les noms de marque suivants: fura-2, Quin-2 et Indo-1 (fabriqués par la société Molecular Probes, Inc.). Le réactif fluorescent fura-2 est exprimé par la formule structurelle (I) présentée ci-dessous. Le réactif, possédant un groupe carboxyle libre, n'est pas en mesure de traverser la membrane cellulaire d'une ligne de cellule nerveuse établie (NG108, N115) ou d'une ligne de cellule établie dérivant d'une cellule gliale (C6Bu-1). Ainsi, on administre le fura-2 à une cellule échantillon sous la forme de fura-2/AM, qui est un dérivé estérifié d'acétoxy- méthyle et est en mesure de traverser la membrane cellulaire. Dès que le fura-2/AM a été introduit dans la cellule, il est immédia- tement métabolisé et converti en fura-2, qui se fixe spécifiquement aux ions de calcium. N (CH2COO-)2 N(CH2COO-)2 OCH2-CH2- 0' CH3 N. "T (I) COO- Lorsque le fura-2 est fixé aux ions de calcium, le spectre d'excitation du fura-2 varie en fonction de la concentra- tion en calcium. La fluorescence du fura-2 possède une unique crête à 510 nm et une bande passante à 10 nm. La figure 1 montre les spectres qui sont obtenus lorsqu'on détermine l'intensité de la fluorescence à une longueur d'onde de 510 nm à l'aide d'un spectro- photomètre à fluorescence, tout en faisant varier la longueur d'onde de la lumière d'excitation, en présence d'ions de calcium de diverses concentrations. Comme on peut le voir sur la figure 1, le changement de l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration de calcium est le plus grand lorsque la- longueur d'onde de la lumière d'excitation est 340 nm. Au contraire, lorsque la longueur d'onde de la lumière d'excitation est 360 nm, on n'observe pas de variation pour l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration en calcium. De plus, lorsque la longueur d'onde de la lumière d'excitation est 380 nm, l'intensité de fluorescence varie de façon inverse à ce qui est observé lorsque la longueur d'onde de la lumière d'excitation est 340 nm. Lorsque l'on modifie la variation de l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration en calcium en changeant la longueur d'onde de la lumière d'excitation, on obtient un procédé efficace de détermination à deux longueurs d'onde. Plus spécialement, on excite le capteur fluorescent à deux longueurs d'onde différentes, et on détermine la concentration en calcium à partir du rapport des intensités de fluorescence correspondant aux deux longueurs d'onde d'excitation. On fixe l'une des deux longueurs d'onde d'excitation à la valeur pour laquelle l'intensité de fluorescence varie le plus, et on fixe l'autre à la valeur pour laquelle l'intensité de fluorescence ne varie pas ou varie en sens inverse. A l'aide du procédé de détermination à deux longueurs d'onde, on peut normaliser la concentration et l'atténuation du capteur fluorescent et la variation de l'intensité de la lumière d'excitation. On va maintenant décrire de façon plus détaillée, en relation avec la figure 1, le procédé de détermination à deux longueurs d'onde utilisant des longueurs d'onde d'excitation de 340 nm et 360 nm (340 nm pour la lumière de mesure; 360 nm pour la lumière de référence). Si l'on suppose que l'intensité de fluorescence est I340 lorsque la longueur d'onde d'excitation est 340 nm et que l'intensité de fluorescence est I360 lorsque la longueur d'onde d'excitation est 360 nm, alors on peut calculer la valeur du rapport I340/I360 sur la base des données représentées sur la figure 1. Cette valeur varie dans l'intervalle de 0,64 à 1,89, en fonction de la concentration en calcium. Lorsqu'on utilise une caméra de télévision pour la déter- mination, il est nécessaire de tenir compte de l'intervalle dynamique de la caméra de télévision afin de pouvoir effectuer une détermination précise à deux longueurs d'onde. Plus spécialement, puisqu'on n'obtient la Linéarité entree/sortie souhaitable que dans un intervalle dynamique prédéterminé, il est nécessaire que La valeur de I340/I360 (Le signal d'entrée appliqué à La caméra) varie dans un certain intervalle dynamique pour pouvoir obtenir un signal de sortie précis. A cet effet, on ajuste l'intensité de la lumière d'excitation au moyen d'un filtre de densité neutre (ci-après appelé "filtre ND") et on normalise la valeur de I340/I360 de façon que la valeur centrale de I340/I360 puisse devenir 1. La figure 2 représente la relation qui existe entre la valeur normalisée de I340/I360 et la concentration en calcium. Les données présentées sur la figure 2 peuvent servir de courbe d'étalonnage lors de la détermination de la concentration en calcium à l'aide d'un système de microscope à fluorescence. Un autre capteur fluorescent utilisé pour déterminer la concentration en calcium est l'Indo-1, qui est exprimé par la formule structurelle (II) présentée ci-dessous. Ce réactif, qui possède un groupe carboxyle libren'est pas en mesure de traverser la membrane cellulaire d'une cellule vivante. Par conséquent, on administre l'Indo-1 à une cellule échantillon sous la forme d'Indo- 1/AM, qui est un dérivé estérifié d'acétoxyméthyle. Ce n'est pas l'Indo1/AM, mais l'Indo-1, produit par le métabolisme dans la cellule, qui se fixe spécifiquement aux ions de calcium. N (CH2COO-)2 N(CH2COO-)2 OCH2CH2 0 CH3 A (II) COo- Au contraire du cas o l'on utilise le fura-2, Lorsqu'on utilise L'Indo-1, c'est le spectre de fluorescence, et non pas le spectre d'excitation, qui varie en fonction de la concentration en calcium. La figure 3 montre des spectres qui ont été obtenus lorsqu'on a irradié l'Indo-1 en présence d'ions de calcium de diverses concentrations à l'aide d'une lumière d'excitation possédant une longueur d'onde de 340 nm. Comme on peut le constater à partir des spectres, la variation de l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration en calcium est la plus grande lorsque la longueur d'onde de fluorescence est 410 nm ou une valeur approchante. Au contraire, lorsque la longueur d'onde de fluorescence est 460 nm, on n'observe pas de variation de l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration en calcium. De plus, lorsque la longueur d'onde de fluorescence est dans l'intervalle de 460 à 480 nm, l'intensité de fluorescence varie à l'inverse de ce qui est observé lorsque la longueur d'onde de fluorescence est 410 nm. En fixant la longueur d'onde de la lumière d'excitation, on détermine l'intensité de fluorescence pour deux longueurs d'onde choisies, de manière à mettre en oeuvre un procédé de détermination à deux longueurs d'onde, comme dans le cas du fura-2. Normalement, on combine les longueurs d'onde 410 nm et 460 nm, ou bien les longueurs d'onde 410 nm et 480 nm. Lorsqu'on emploie pour la détermination une caméra de télévision, on normalise la valeur de I410/I460 ou la valeur de I410/I480 pour exactement les mêmes raisons que celles ci-dessus établies en relation avec le cas du fura-2. Plus spécialement, on utilise le filtre ND pour positionner à 1 la valeur centrale de I410/I460 ou I410/I480. La figure 4 montre la relation existant entre la valeur normalisée de 1401/I460 et la concentration en calcium. On peut utiliser les données présentées sur la figure 4 comme courbe d'étalonnage lors de la détermination de la concentration en calcium à l'aide d'un système de microscope à fluorescence. On va maintenant décrire les particularités de l'invention. Selon l'invention, on détermine la valeur de la fluo- rescence de fond en visualisant, de préférence sur un tube à rayons cathodiques ou un moyen analogue, le profil obtenu suivant une ligne données d'une image de distribution de l'intensité de fluorescence et le profil obtenu suivant cette ligne donnée pour l'image de la cellule produite sous forme d'image à fond clair, ou autre. Comme déjà décrit cidessus, l'image de la distribution de l'intensité de fluorescence et l'image de la distribution bidi- mensionnelle de la concentration en ions sont obtenues par un procédé identique à celui de la demande de brevet des E.U.LLA n 340 236 cité ci-dessus. Selon l'invention, on peut superposer, par exemple par le procédé illustré sur l'organigramme de la figure 5, l'image de la distribution bidimensionnelle à concentration en ions à titrer est l'image de la cellule. Sur la figure 1, on convertit en une image d'échelle de gris une image de cellule se présentant sous la forme d'une image à fond clair, d'une image en contraste de phase, d'une image en contraste interférentiel différenciel de Nomarski ou une image de polarisation, sur la base de la luminance de l'image de la cellule. On visualise l'image d'échelle de gris obtenue sur l'écran d'un tube à rayons cathodiques. On superpose à l'image d'échelle de gris l'image de la distribution bidimensionnelle de la concentration (image de fluorescence) pour l'ion cible. De façon générale, l'image à fond clair, l'image en contraste de phase, l'image en contraste interférentiel différen- ciel de Nomarski ou l'image de polarisation ne se superposent pas exactement avec l'image de fluorescence. Pour faire coincider les coordonnées des deux images, on soumet les données d'image de l'image de la distribution bidimensionnelle de la concentration en ions à une transformation affine au cours d'une étape 2. On suppose que les coordonnées de l'image d'entrée sont (I, J) et que celles de l'image de sortie sont (x, y). Alors, on transforme, par trans- formation affine, les coordonnées (x, y) en coordonnées (u, v), qui sont des coordonnées d'image du type nombre réel en (I, J). Ensuite on interpole les coordonnées (u, v) et on mémorise le niveau de concentration interpolé I' en (x, y). Une formule de la transfor- mation affine des coordonnées est données par: u = a1x + a2y + a3 v = b1x + b2y + b3 o a1, a2, a3, b1, b2 et b3 sont des coefficients arbitraires. On colore, en fonction des concentrations ioniques, les données d'image résultant de la transformation pour l'image de la distribution bidimensionnelle de la concentration ionique et on les superpose à l'image de la cellule en échelle de gris qui est obtenue à l'étape 1. Dans ce cas, pour maintenir les données de l'image en échelle de gris obtenues à l'étape 1, on effectue une opération OU-exclusif aux emplacements respectifs des coordonnées lorsque les deux images sont superposées (étape 3). Ainsi, l'image de la cellule en écheLLe de gris qui est obtenue à l'étape 1 est superposée à l'image de la distribution de la concentration ionique, et l'image superposée est affichée. L'opération OU-exclusif (XOR) de base est représentée ci-dessous: Entrée A Entrée B Sortie 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 Avec cette opération, l'image de la cellule en échelle de gris est superposée à l'image de la distribution de la concentration ionique et produit une image composite de la manière suivante: Image de la cellule: o o o x x o x o Image de la distribution de la concentration: x x o o x o x x Image composite: o o x o x x x o o "o" indique l'état dans lequel la donnée est positionnée sur l'écran, et "x" indique l'état dans lequel la donnée n'est pas positionnée sur l'écran. On va maintenant décrire l'invention de manière plus détaillée. Sur les figures 6 et 7, va être décrit un exemple d'un système de microscope à fluorescence qui convient pour l'invention. La figure 6 est une vue simplifiée du système de microscope à fluo- rescence, et la figure 7 est un schéma de principe montrant celui-ci. Ce système est décrit dans la demande de brevet des E.U.A. o n 340 236 citée ci-dessus. Dans ce système, un microscope à fluorescence du type épifluorescence inversée (fabriqué par la société Olympus Optical Co., Ltd., IMT-2) est combiné à une caméra de télévision et à un appareil de traitement d'image (processeur d'image). Grâce à cette structure, l'analyse de fluorescence s'effectue, à un moment, dans une région bidimensionnelle prédéter- minée, et la distribution de la concentration en calcium peut facilement être déterminée. Ce système de microscope à fluorescence est conçu pour effectuer l'analyse sur la base de la variation du spectre d'excitation, par exemple pour titrer les ions de calcium à l'aide du fura-2 comme capteur fluorescent. Sur la figure 6, un appareil d'éclairement 1 produit une lumière d'excitation. L'appareil d'éclairement 1 contient une lampe à mercure 2 servant de source de lumière. La lampe à mercure 2 peut être remplacée par une lampe à xénon ou toute autre lampe susceptible d'émettre une lumière de longueur d'onde voulue. L'appareil d'éclairement 1 est doté d'un tube de projection 3 qui est couplé au corps d'un microscope. Une unité filtrante 6 comprenant un filtre de densité neutre (filtre ND) 4 et un filtre interférentiel 5, est disposée dans le tube de projection 3 sur l'axe optique de la lampe à mercure. Le filtre interférentiel 5 ne laisse passer que la lumière ayant une longueur d'onde prédéterminée. Le filtre ND 4 commande la quantité de lumière qui est laissée passer pour chaque longueur d'onde. Si les conditions l'autorisent, on peut omettre le fitre ND 4. La lumière d'excitation, qui est placée dans l'unité de filtrage 6 entre dans un objectif optique 8 via un système optique (non représenté) disposé à l'intérieur du corps du microscope. La lumière venant de l'objectif 8 est concentrée sur une cellule échantillon 10 placée sur un porte-objet 9. On a administré préalablement le fura-2 à la cellule échantillon 10, et la cellule échantillon 10 émet de la lumière de fluorescence sous l'effet de l'irradiation par la lumière d'excitation. La lumière épi- fluorescente émise est observée au travers d'un oculaire 12 dans un système optique (non représenté) et est simultanément fournie à une caméra de télévision 13. La caméra de télévision 13 est raccordée à un processeur d'image 14, un ordinateur 15, un écran de contrôLe 16 et une imprimante 17. Le système de microscope à fluorescence est conçu pour effectuer non seulement la détermination de la concentration en calcium par l'intermédiaire de la fluorescence, mais aussi L'obser- vation microscopique normale. Sur la figure 6, une source de lumière visible 20a émet de La Lumière pour permettre l'observation microscopique de la cellule échantiLLon 10. La lumière visible émise par la source 20a est concentrée par un condenseur 20b et rayonne sur La cellule échantillon 10. La lumière visible rayonnée traverse la cellule échantillon 10 et atteint l'oculaire 12 via le système optique afin de permettre l'observation. En d'autres termes, la lumière suit une trajectoire lumineuse du type transmis- sion suivant le mode normal de l'observation microscopique. Grâce à cette structure, on peut obtenir l'image à fond clair d'une cellule. On peut obtenir une image de Nomarski en combinant le microscope à fluorescence avec un condenseur de Nomarski IM2-LWDNC (fabriqué par la société Olympus Optical Co., Ltd.), un diaphragme coulissant de Nomarski IM2-NA (OLympus Optical Co., Ltd.), un objectif de Nomarski LWDCD Plan 40x (Olympus Optical Co., Ltd.). De même, on peut obtenir une image en contraste de phase en combinant le microscope à fluorescence avec un condenseur à contraste de phase IMT-2-LWCD (Olympus OpticaL Co., Ltd.) et un objectif à contraste de phase LWDCD Plan 40x-PL (Olympus Optical Co., Ltd.). En outre, on peut obtenir une image de polarisation en combinant le microscope à fluorescence avec un condenseur de Nomarski IM2-LWDNC (Olympus Optical Co., Ltd.) et un objectif de Nomarski LWDCD Plan x (Olympus Optical Co., Ltd.). On va maintenant décrire en détail le système de micros- cope à fluorescence en relation avec la figure 7. Comme on peut le voir sur la figure 7, l'unité filtrante 6 possède trois filtres interférentiels permettant de ne laisser sélectivement passer qu'une lumière d'excitation ayant la longueur d'onde 340 nm, 360 nm ou 380 nm. L'un des trois filtres interférentiels est placé sur l'axe optique si bien que la lumière d'excitation nécessaire pour effectuer la détermination à deux longueurs d'onde à l'aide du fura-2 peut être réaLisée à partir de La lumière émise par La lampe à mercure 2. De plus, L'unité filtrante 6 possède plusieurs filtres ND 4. Les filtres ND 4 servent à commander l'intensité des Lumières d'excitation des différentes longueurs d'onde, qui sont employéesporu la détermination. Plus spécialement, il faut que les deux faisceaux lumineux de longueurs d'onde différentes qui sont utilisés pour la détermination à deux longueurs d'onde aient sensi- blement la même intensité. Toutefois, la lumière venant de la lampe à mercure 2 présente des intensités différentes pour les longueurs d'onde respectives. Ainsi, on ajuste les intensités lumineuses à l'aide des filtres ND 4. On peut déplacer le filtre ND 4 et le filtre interférentiel 5 dans une direction qui coupe le trajet de la lumière à l'aide de moteurs pas à pas 18 de manière à placer les filtres voulus sur le trajet de la lumière. Bien que ceci ne soit pas représenté, il est prévu un deuxième filtre ND servant à effecter une correction, laquelle est nécessaire en cas de changement de l'objectif optique 8. A cet effet, plusieurs filtres NC présentant des coefficients de transmission différents, par exemple O %, 25 %, 40 % et 100 %, sont utilisés, et le filtre approprié est placé sur le trajet de la lumière. Comme représenté sur la figure 7, un filtre dichroique 7 se trouve sur l'axe optique de la lampe à mercure 2. Le miroir dichro que 7 est placé juste en dessous de l'objectif 8 de la figure 6. La lumière d'excitation, qui a traversé l'unité filtrante 6, est réfléchie par le miroir dichroique 7 et est envoyée sur la cellule échantillon 10 via l'objectif 8. La lumière de fluorescence produite dans la ceLlule échantillon est amenée à tomber sur le miroir dichro que 7 via l'objectif 8. Le miroir dichroïque 7 a pour fonction de permettre le passage de la lumière de fluorescence. Un filtre d'émission 19 est situé juste au dessous du filtre dichroîque 7. Le filtre d'émission 9 ne permet le passage que de la lumière de fluorescence de longueur d'onde 510 nm et est utilisé pour la détermination de la fluorescence à l'aide du fura-2. La lumière de fluorescence possédant la longueur d'onde 510 nm, qui est passée dans le filtre d'émission 19, entre dans un séparateur de faisceau (non représenté). Une quantité correspondant à 20 % de La lumière incidente traverse Le séparateur de faisceau et atteint L'ocuLaire 12 (représenté sur la figure 6) via un système optique (non représenté). D'autre part, 80 % de la lumière incidente entre dans la caméra de télévision 13 par l'intermédiaire d'un autre système optique. La caméra de télévision 13 est raccordée au processeur d'image 14. Le processeur d'image 14 a pour fonction de commander la caméra de télévision 13 et d'intégrer les données d'image envoyées par la caméra de télévision 13. Le processeur d'image 14 est connecté à l'ordinateur 15, dans lequel est monté un disque RAM (mémoire vive), à l'écran de contrôle 16, et à l'imprimante 17, dans cet ordre. L'ordinateur 15 traite les données d'image intégrées envoyées par le processeur d'image 14, de manière à produire la concentration en calcium et la distribution de la concentration en calcium. L'ordinateur 15 est connecté aux moteurs pas à pas 18 afin de commander le fonctionnement des moteurs 18. Dans le microscope à fluorescence ci-dessus décrit, La longueur d'onde de fluorescence est fixe et la longueur d'onde d'excitation varie. Inversement, on peut fixer la longueur d'onde d'excitation et faire varier la longueur d'onde de fluorescence. Dans ce cas, il est possible d'utiliser un capteur fluorescent, par exempLe l'Indo-1, qui possède un spectre de fluorescence variable. Lorsqu'on utilise le microscope à fluorescence ci-dessus décrit ainsi que le fura-2 comme capteur fluorescent, on peut obtenir l'image de la distribution de concentration en ions de calcium dans une celluLe, de la manière suivante. La lumière de fluorescence émise par la cellule d'échantillon 10 entre dans la caméra detéLévision 13. La caméra de télévision 13 convertit la lumière de fluorescence en signaux éLec- triques proportionnellement à l'intensité de la lumière fournie et en correspondance avec tous Les éLéments d'image distincts. Les données d'image présentes sous forme de signaux électriques sont appliquées au processeur d'image 14. La caméra de télévision 13 délivre les données d'image au processeur d'image 14 avec un temps d'exposition prédéterminé (généralement 1/30 s). Le processeur d'image 14 intégre Les données d'image fournies un nombre prédéter- miné de fois. L'image produite par intégration est déLivrée à L'ordinateur 15. Les données d'image venant du processeur d'image 14 sont écrites dans une mémoire de bloc contenue dans l'ordinateur 15. Les données d'image écrites dans la mémoire de bloc sont emmagasinés dans un disque RAM (mémoire vive) intégré. Dans le cas de la détermination à deux longueurs d'onde, une image mesurée (première image) qui est obtenue à l'aide d'une première longueur d'onde et une image mesurée (deuxième image) qui est obtenue à l'aide d'une deuxième longueur d'onde sont mémorisées séparément. Par exemple, lorsqu'on utilise le fura-2 pour la détermination, la première image est obtenue à la longueur d'onde d'excitation de 340 nm, et la deuxième image est obtenue à la longueur d'onde d'excitation de 360 nm. En fonction de programmes de traitement d'image, l'ordi- nateur 15 compare les première et deuxième images avec tous les éLéments d'image distincts, de manière à trouver le rapport (par exemple I340/I360) des intensités de fluorescence. Ensuite, le rapport des intensités de fluorescence est converti en la concen- tration en calcium sur La base de la courbe d'étalonnage de la figure 3. En fonction de la concentration en calcium obtenue, chaque élément d'image reçoit une couleur artificielle. Plus spécialement, les éléments d'image présentant la même concentration en calcium reçoivent la même couleur artificielle, et les éléments d'image ayant des concentrations en calcium différentes reçoivent des couleurs artificielles différentes. En résultat, les concen- trations en calcium des parties respectives de la cellule sont représentées par des couleurs correspondant à des concentrations particulières. De plus, on peut facilement comprendre la distri- bution de la concentration en calcium dans la cellule grâce à l'utilisation de couleurs correspondant à des concentrations parti- culières. IL faut noter que les données d'image écrites dans le disque RAM de l'ordinateur 15 à chaque étage peuvent être emmaga- sinées, si nécessaire, dans une disquette. Les données d'image emmagasinées dans Le disque RAM de l'ordinateur 15 ou dans la disquette peuvent être visualisées sur l'écran de contrôLe 16, les couleurs artificielles leur ayant été ajoutées. En résultat, on peut observer, sous la forme d'une image colorée, la concentration en calcium de la cellule Lorsque cela est nécessaire, on peut imprimer une copie sur papier de l'image en couleur à l'aide de l'imprimante 17. Comme on peut le voir sur la base de ce qui vient d'être énoncé, avec le système de microscope à fluorescence ci-dessus décrit, les données obtenues à partir du microscope à fluorescence subissent un traitement d'image, et la distribution bidimension- nelle de la concentration en caLcium dans une cellule peut être observée. Toutefois, comme établi ci-dessus, avec cette technique, il n'est pas possible de déterminer objectivement la valeur de la fluorescence de fond, et l'image de la distribution de concen- tration ne peut pas être visualisée en relation avec le contour de la cellule ou la structure de la cellule. On va maintenant présenter la description d'un mode de réalisation dans lequel ces problèmes ont été résolus à l'aide du procédé de l'invention. On va décrire ce mode de réalisation en relation avec l'organigramme de la figure 8. A l'étape 1, on utilise le système de microscope à fluorescence ci-dessus décrit, et une ligne de cellule nerveuse établie (NG108, N115) est fixée sur le porte- objet 9 au titre de la cellule d'échantillon 10. A l'étape 2 suivante, une image à fond clair de la cellule d'échantillon 10 est obtenue. La figure 9 est une photographie montrant l'image mono- chromatique à fond clair. Comme on peut le voir sur la figure 9, le contour et la structure interne de la cellule apparaissent clairement dans l'image à fond clair. Les données d'image de l'image à fond clair sont emmagasinées dans l'ordinateur 15. A l'étape 3, on administre le fura-2, comme capteur fluo- rescent, à la cellule échantillon 10. En utilisant deux faisceaux lumineux d'excitation possédant des longueurs d'onde 340 nm et 360 nm, on détermine l'intensité de la lumière de fluorescence possédant la longueur d'onde 510 nm, de sorte qu'on obtient deux images d'intensité de fluorescence. Les deux images d'intensité de fluorescence sont mémorisées dans l'ordinateur 15. A l'étape 4, on détermine, de la manière suivante, la valeur de la fluorescence de fond. Sur la base de l'image à fond clair mémorisée dans l'ordinateur 15, on visualise sur l'écran de contrôle 16 un profil de luminance suivant la ligne X-X de la figure 9. Ensuite, sur la base des deux images d'intensité de fluo- rescence mémorisées dans l'ordinateur 15, on visualise un profil d'intensité de fluorescence sur l'écran de contrôle 16 au même emplacement que le profil de luminance, en superposition. Cette visualisation superposée est possible sans qu'il faille effectuer une transformation de coordonnées. La figure 10 montre les profils visualisés en superposition. La courbe C est le profil de luminance de l'image à fond clair, la courbe 0 est le profil d'intensité de fluorescence obtenu lorsque la longueur d'onde d'excitation est 340 nm, et la courbe est le profil d'intensité de fluorescence obtenu lorsque la longueur d'onde d'excitation est 360 nm. A partir du profil de luminanceOde l'image à fond clair, on comprend que les positions indiquées par les lignes A et B en trait interrompu correspondent au contour de la cellule. La partie des profils d'intensité de fluorescence située à l'extérieur des lignes en trait interrompu A et B indique la lumière de fluorescence de fond présente à l'extérieur de la cellule. Ainsi, on peut déterminer la valeur de la fluorescence de fond sur la base de l'intensité de fluorescence (dans cet exemple, 10) existant aux points de croisement des lignes en trait interrompu A et B avec les courbes ( et C9 des profils d'intensité de fluorescence. La ligne droite C indique le niveau de fond ainsi déterminé. Avec ce procédé, on peut déterminer objectivement et exactement la valeur de la fluorescence de fond. Si une valeur de fond inexacte (par exemple 5 ou 15) a été déterminée, l'image de la distribution bidimensionnelle de la concentration en calcium qui est obtenue à l'étape suivante ne coïncidera pas avec la région de la cellule de l'image à fond clair. A l'étape 5, on corrige les deux images d'intensité de fluorescence emmagasinées dans L'ordinateur 15 sur la base de la valeur déterminée pour la fluorescence de fond. On effectue cette correction en soustrayant, de la vaLeur d'intensité de fluo- rescence, La valeur de fluorescence de fond pour chaque point des images d'intensité de fluorescence. Ensuite, on applique, à l'aide de l'ordinateur 15, un traitement d'image aux deux images d'intensité de fluorescence, et on effectue une opération arithmé- tique de division des images. Ainsi, on obtient une image dont les éléments d'image sont représentatifs des valeurs de I340/I360. A l'étape 6, le rapport des intensités de fluorescence obtenu à l'étape 5 est converti en une concentration en calcium, sur la base de la courbe d'étalonnage de la figure 3. De plus, chaque élément d'image de l'image se voit recevoir une couleur artificielle en fonction de la concentration en calcium obtenue, si bien qu'on obtient une image de la distribution bidimensionnelle de concentration o les éléments d'image correspondant à une même concentration en calcium ont reçu la même couleur artificielle. La figure 11 est une photographie montrant l'image obtenue pour la distribution bidimensionnelle de concentration. Alors que la photo- graphie de la figure 11 est monochromatique, la photographie réelle est une photographie en couleur dans laquelle les éléments d'image ont reçu des couleurs artificielles en fonction de leurs concentration en calcium. L'image de la distribution bidimension- nelLe de concentration est mémorisée dans l'ordinateur 15. A l'étape finale 7, on superpose l'image de la distri- bution bidimensionnelle de concentration à l'image à fond clair obtenue à l'étape 2. On effectue l'opération de superposition au moyen d'une transformation affine et d'une opération OU-exclusif (XOR), comme expliqué en relation avec la figure 5. La transfor- mation et l'opération sont réalisées par l'ordinateur 15. La figure 12 est une photographie montrant l'image superposée obtenue. Bien que la photographie de la figure 12 soit monochromatique, la photo- graphie actuelle est une photographie en couleur sur laquelle une image colorée artificiellement qui représente la distribution de la concentration en calcium apparaît sur l'image monochromatique à fond clair de la cellule. Dans cette image composite, La distri- bution de la concentration en calcium dans la cellule apparaît clairement en relation avec le contour de la cellule ou la structure de la cellule. Dans les modes de réalisation ci-dessus représentés, on a utilisé comme image de la cellule une image à fond clair. Toutefois, il est possible de choisir l'image de la cellule dans le groupe formé par une image à fond clair, une image en contraste de phase, une image en contraste interférentiel différentiel de Nomarski et une image de polarisation, de sorte qu'on peut nettement distinguer la luminance relative à l'intérieur de la cellule de celle relative à l'extérieur de la cellule. Les modes de réalisation ci-dessus présentés se rapportent à la détermination de la concentration en ions de calcium dans la cellule. Toutefois, l'invention peut également être appliquée à la détermination de la concentration en ions d'hydro- gène ou à celle de la concentration en macromolécules, par exemple protéine. Dans un autre cas, on peut obtenir les mêmes effets. Comme décrit ci-dessus, selon l'invention, on peut obtenir des effets pertinents. Par exemple, on peut obtenir la distribution bidimensionnelle de la concentration dans une cellule en relation avec le contour de la cellule. De plus, on peut fixer objectivement le niveau de la lumière fluorescente du fond afin de déterminer exactement la concentration ionique. * Bien entendu, l'homme de l'art sera en mesure d'imaginer, à partir du procédé dont la description vient d'être donnée à titre simplement illustratif et nullement limitatif, diverses variantes et modifications sont en bas du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de formation d'une image de la distribution bidimensionnelle de concentration d'ions particuliers devant être titrés dans une cellule vivante, sur la base du changement du spectre de fluorescence ou du spectre d'excitation d'un capteur fluorescent, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les opérations suivantes: administrer un capteur fluorescent à une cellule (10); obtenir (1 à 8) une image de la distribution d'intensité de fluorescence en déterminant la lumière de fluorescence venant du capteur fluorescent dans une région comportant la cellule; mesurer (20a, 20b, 12) optiquement la cellule, de manière à obtenir une image de la cellule choisie dans le groupe constitué par une image à fond clair, une image en contraste de phase, une image en contraste interférentiel différentiel de Nomarski, et une image de polarisation; déterminer la valeur de la fluorescence de fond à partir d'un profil de l'image d'intensité de fluorescence et d'un profil de l'image de la cellule; former une image de la distribution bidimensionnelle de concentration des ions à titrer en appliquant (14, 15) un traite- ment d'image comportant la soustraction de la valeur de fluo- rescence de fond vis-à-vis de l'image de la distribution d'intensité de fluorescence; et soumettre l'image de la cellule et l'image de la distribu- tion bidimensionnelle de concentration ionique à un traitement d'image, de manière à visualiser (16) les deux images en superpo- sition. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'opération consistant à obtenir une image de la cellule est effectuée avant l'opération consistant à obtenir une image de la distribution d'intensité de fluorescence par détermination de la lumière de fluorescence. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on forme une image de la distribution bidimensionnelle de con- centration d'ions de calcium dans une cellule vivante en utilisant un capteur fluorescent choisi dans lé groupe comprenant le fura-2, le Quin-2 et l'Indo-1. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on soumet à une transformation affine les données d'image de l'image de la distribution bidimensionnelle de concentration ionique, afin de faire coïncider le système de coordonnées de l'image de la distribution bidimensionnelle de concentration ionique avec le système de coordonnées des données de l'image de la cellule. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite image de la cellule est une image monochromatique, et ladite image de la distribution bidimensionnelle de concentration ionique est une image en plusieurs couleurs o les couleurs correspondent à des concentrations ioniques. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la visualisation superposée de l'image de la cellule et de l'image de la distribution bidimensionnelle de concentration ionique est effectuée à l'aide d'une opération OU-exclusif.