Brevet FR2650956A2 — publié le 19910222

FR 2650956 A2 19910222 FR 8910992 A 19890817 AnticorDs inonoclonaux reconnaissant des qlycoprotéines ayant un rôle au niveau des fonctions plaquettaires. Leur application en tant qu'axent diagnostique et thérapeutique. Cette demande est une derande de certificat d'addition à la demande de brevet-français nO 89/10016 du 25 Juillet 1989 ci-après désignée par demande principale. L'invention concerne des anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines impliquées dans les fonctions plaquettaires et leur application en tant qu'agent diagnostique et thérapeutique. Les mécanismes de l'adhésion, de l'agrégation et de la sécrétion plaquettaires qui entrent dans les différentes étapes de la physiologie plaquettaire, font intervenir in vivo de nombreuses protéines et glycoprotéines, présentes au niveau des plaquettes, de façon permanente ou transitoire, ou/et présentes au niveau d'autres cellules telles que des cellules endothéliales et pour certaines d'entre elles, des monocytes. Certaines de ces protéines ou glycoprotéines ont été identifiées et des anticorps7 notamment des anticorps monoclonaux les reconnaissant, ont été préparés. En particulier, des anticorps utilisables en tant que marqueurs d'activation plaquettaire pour des tests de diagnostic ont déjà été décrits. Le brevet américain 4 783 330 concerne par exemple des anticorps du type IgG1 qui reconnaissent des plaquettes activées et au contraire ne reconnaissent pas les plaquettes inactivées, les granules azurophiles des monocytes et des granulocytes. De préférence, ces anticorps monoclonaux reconnaissent une glycoprotéine de poids moléculaire voisin de 140 000 Da (gpl40) sur des plaquettes humaines activées. Les inventeurs se sont maintenant plus particulièrement intéressés aux pathologies liées à la physiologie plaquettaire et à leur traitement par des moyens contrôlés. Dans cette optique, ils ont mis au point de nouveaux anticorps dirigés contre des épitopes particuliers de protéines, glycoprotéines ou complexes protéiques impliqués dans la physiologie plaquettaire. Ces anticorps ont été sélectionnés pour leur capacité spécifique d'interférence avec les fonctions plaquettaires. L'invention concerne donc de nouveaux anticorps dirigés contre des protéines, des glycoprotéines ou des complexes protéiques intervenant spécifiquement dans les réactions d'adhésion, d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire pouvant conduire à la formation de thrombus ou encore impliquées dans les processus l'inflammation ou de cicatrisation. Ces anticorps présentent l'avantage tout à fait intéressant dans le cadre de l'invention d'être capables de moduler les fonctions plaquettaires telles qu'elles ont été décrites ci-dessus. L'invention concerne en outre, la préparation et la sélection de ces anticorps monoclonaux ainsi que leur utilisation pour le diagnostic ou comme agent thérapeutique. Ils peuvent ainsi être appliqués au traitement de pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, 1 'athérosclérose, les rétinopathies, le diabète et également, pour certains d'entre eux, dans le traitement des métastases tumorales. Dans le cadre des - définitions ci-dessus, l'invention concerne des anticorps monoclonaux, ou les fragments idiotypiques de ces anticorps monoclonaux, reconnaissant des antigènes impliqués, soit dans au moins une des étapes de la physiologie plaquettaire et en particuAier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire, soit dans l'adhésion des cellules endothéliales ou encore dans les deux types d'actions, caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de moduler les fonctions plaquettaires ou les fonctions endothéliales, induites par une faible concentration d'agonistes, par exemple en présence de 2,5 à 5 pM d'ADP, ou 2 pg/ml de collagène, ou 0,016 U/ml de thrombine et en ce que leur capacité d'inhibition des fonctions plaquettaires est considérablement réduite voir absente en présence de concentrations élevées d'agonistes, par exemple en présence de concentrations en thrombine supérieure à 0,5 U/ml ou en collagène supérieure à 10 pg/ml. Selon un aspect particulier de l'invention, des anticorps monoclonaux répondant aux définitions cidessus, sont caractérisés en ce qu'ils présentent la capacité de moduler l'interaction entre les plaquettes et les monocytes, lorsque les plaquettes sont à l'état stimulé, par exemple lorsqu'elles ont été stimulées avec de la thrombine. Les fragments idiotypiques dont il est question ci-dessus sont des fragments Fab, Fab', F(ab')z préparés selon les méthodes classiques, notamment par digestion enzymatique par exemple avec la pepsine ou la papaïne, selon le résultat recherché. Ces fragments idiotypiques sont encore caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de tout ou partie de leur fraction constante Fc. Des anticorps monoclonaux ainsi définis, ou leurs fragments idiotypiques présentent la propriété particulièrement intéressante de se fixer sur un épitope d'une protéine, d'une glycoprotéine ou d'un complexe protéique, de telle sorte que l'activité physiologique normale de cette protéine, glycoprotéine ou de ce complexe, est modulée. Dans la suite les termes de protéine, glycoprotéine, complexe protéique seront parfois regroupés sous le terme antigène. Cette modulation des fonctions plaquettaires ou au niveau des cellules endothéliales ou pour certains anticorps de l'invention, de l'interaction plaquettes/monocytes dont question cidessus correspond, dans le-cadre des définitions de l'invention, à une inhibition partielle de certaines fonctions telles que les réactions d'adhésion, d'agrégation ou de sécrétion ou de plusieurs de ces réactions, qui ont lieu à la suite de stimulation provenant par exemple de lésions au niveau de l'endothélium vasculaire ou encore à une inhibition de réactions au niveau des cellules endothéliales. Cette limitation doit être telle que l'action des anticorps choisis ou de leurs fragments, éventuellement en combinaison avec d'autres substances, prévient la formation d'un thrombus. Les propriétés de modulation des anticorps selon l'invention peuvent varier avec la nature de l'anticorps et l'antigène reconnu. En tout état de cause, les anticorps de l'invention n'inhibent plus les fonctions plaquettaires en présence de fortes concentrations de.thrombine (supérieure à 0,5 U/ml) ou de collagène (supérieure à 10 pg/ml). Il en résulte que ces anticorps peuvent être utilisés dans le traitement de pathologies telles que celles citées précédemment, sans présenter le désavantage de bloquer de manière excessive les processus physiologiques plaquettaires, ce qui risquerait d'entrainer des phénomènes hémorragiques. Selon un premier aspect préféré de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une protéine, d'une glycoprotéine ou d'un complexe protéique choisi(e) parmi le groupe des glycoprotéine GMPl4O, complexe gpllb-IIIa, complexe gpIa-IIa, complexe gpIc-IIa ou glycoprotéine pifa. Les ' antigènes ci-dessus, interviennent à différents niveaux de la physiologie plaquettaire. La GMP140 a été décrite par McEver et al dans Cell (vol 56 - 1033.1044, 24 Mars 1989). Les autres antigènes ont été décrits dans différentes publications telles que McEver et al, (1984) J. Biol. Chem. 259: 9799-9804; Hsu-Lin, S.C. et al, (1984) J. Biol. Chem. 259: 9121-9126; Kunicki, T.J. et al, (1988) J. Biol. Cher. 263: 4516-4519 et Premier, M..E. et al, (1988), J. Biol. Chem. 263, 7660-7665. Selon un autre aspect préféré de l'invention une catégorie d'anticorps ou leurs fragments idiotypiques est encore caractérisée en ce que ces anticorps ou fragments reconnaissent un épitope contribuant aux fonctions normalement excercées par l'antigène qui le contient. Selon un autre aspect préféré de l'invention, certains anticorps monoclonaux sont sensibles à la réduction chimique de l'antigène qu'ils reconnaissent. En conséquence, ils sont inactivés lorsque l'antigène normalement reconnu est réduit chimiquement. L'effet fonctionnel de ltépitope vis à vis de l'antigène qui le contient indique que cet antigène ne peut exercer ses fonctions dans la physiologie plaquettaire si l'épitope n'est pas présent ou s'il est inactivé. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent sur la GMP140, en un site exposé à la surface des plaquettes activées, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques étant capables d'interférer avec les réactions d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire. Des anticorps particulièrement préférés reconnaissant la GMP140 sont les anticorps LYP20 ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. D'une façon générale, pour les anticorps monoclonaux selon l'invention, on évaluera les "propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes" par un test visant à vérifier que l'antigène reconnu est identique à celui qui est reconnu par l'anticorps de comparaison (en l'occurence LYP20) et un test déterminant la capacité des anticorps isolés, à moduler les fonctions plaquettaires induites par une faible concentration d'agonistes, par exemple en présence de 2,5 à 5 pM d'ADP, ou 2 pgXml de collagène, ou 0,016 U/ml de thrombine et en ce que leur capacité d'inhibition des fonctions plaquettaires est considérablement réduite voir absente en présence de concentrations élevées d'agonistes, par exemple en présence de concentrations en thrombine supérieure à 0,5 U/ml ou en collagène supérieure à 10 pg/ml. L'anticorps LYP20 (encore désigné par P20) a également la capacité de reconnaitre la GNP140 présente à la surface des cellules endothéliales. De plus cet anticorps ne reconnait plus la GMP140 lorsqu'elle est sous forme chimiquement réduite, c'est à dire lorsque son poids moléculaire passe de 128 kDa à 130 kDa. Des anticorps particuliers selon l'invention, qui ont la propriété de reconnaître un épi tope présent sur la glycoprotéine GMP140, ont également de façon tout à fait avantageuse, la capacité de reconnaitre des glycoprotéines du type GMP140 "like", présentes sur des cellules différentes des plaquettes, par exemple des monocytes. De façon avantageuse, LYP20 a également la capacité de reconnaitre un antigène GMP 140-"like" présent au niveau des monocytes, en particulier au niveau de monocytes transformés U937. Dans un autre mode de réalisation avantageux de 1' invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épi tope présent au niveau de la glycoprotéine IIa, du complexe Ia-IIa, du complexe Ic-Ifà, de la glycoprotéine GP110-120, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'interférer avec les ' réactions physiologiques plaquettaires. Ces anticorps reconnaissent un épitope ou un déterminant porté par la glycoprotéine IIa. En conséquence ils reconnaissent les complexes protéiques mettant en oeuvre la glycoprotéine IIa ou ses produits de transformation ou de dégradation. D'une façon pafticulierement préférée, ces anticorps sont les anticorps LYP22 ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. Des tests anologues à ceux décrits ci-dessus sont utilisés pour sélectionner les anticorps ayant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes en prenant pour base de comparaison,. LYP22. L'anticorps monoclonal LYP22 (encore désigné par P22) présente l'avantage particulier d'être dirigé contre des protéines fonctionnant comme récepteurs du collagène sur les plaquettes et qui sont donc importantes pour l'adhésion des plaquettes aux parois des vaissaux sanguins endommagés. Cet anticorps reconnait également un épitope localisé sur une sousunité beta (ss) des lymphocytes VLA. De plus l'anticorps monoclonal LYP22 reconnait des antigènes présents sur des cellules endothéliales, ces antigènes ayant les memes caractéristiques que ceux présents sur les plaquettes. Les anticorps LYP20 et LYP22 présentent l'avantage d'inhiber l'activité plaquettaire à un niveau d'environ 60% en présence de faibles concentrations d'agonistes telles que par exemple (2,5-5pM d'ADP, 2 pg/ml de collagène, 0,016 U/ml thrombine). Ceci correspond à une modulation de l'activité plaquettaire dans la mesure où celle-ci n'est pas totalement inhibée. D'autres anticorps particulièrement intéressants pour la réalisation de l'invention, sont des anticorps monoclonaux où leurs fragments idiotypiques caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope du complexe IIb-IIIa à la surface des plaquettes stimulées, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'inhiber les fonctions plaquettaires et étant dépourvus de cette capacité lorsqu'ils sont en présence de fortes concentrations d'agonistes telles que décrites ci-dessus. Des anticorps particulièrement préférés sont les anticorps LYP18, ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. Des tests analogues â ceux décrits ci-dessus sont utilisés pour sélectionner les anticorps ayant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes, en prenant pour base de comparaison, LYP18. Ces anticorps et notamment l'anticorps LYP18 présentent l'avantage de détecter à la fois des antigènes présents sur des plaquettes au repos et des antigènes exprimés après stimulation des cellules. L'invention concerne également un mélange d'anticorps monoclonaux ou de fragments idiotypiques de ces anticorps ou encore un mélange d'anticorps et de fragments, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux anticorps ou fragments différents décrits précédemment. Des mélanges particulièrement préférés d'anticorps et/ou de fragments de ces anticorps sont par exemple des mélanges comprenant LYP20 et LYP22 ou/et leurs fragments idiotypiques. Un autre mélange préféré est celui de LYP20 et LYP18 et/ou leurs fragments idiotypiques, ou ençore un mélange de LYP20, LYP22 et LYP18 ou de leurs fragments idiotypiques. Les anticorps ou leurs fragments idiotypiques répondant au définition de l'invention sont particulièrement intéressants pour leurs propriétés de modulation des fonctions plaquettaires. Ces anticorps leurs fragments idiotypiques peuvent à cet égard être utilisés en temps qu'agents antiplaquettaires chez des patients présentant des risques de troubles des -fonctions plaquettaires ét en particulier des problèmes concernant la formation des thromboses. A cet égard les anticorps de l'invention et leurs fragments permettent, de ne pas inhiber complètement les fonctions plaquettaires ce qui généralement entraîne un risque de saignement dangereux pour le patient traité. Les anticorps ou leurs fragments définis dans les pages précédentes peuvent donc être utilisés séparément ou dans des mélanges afin de cibler l'inhibition des fonctions plaquettaires selon les besoins et/ou d'obtenir des niveaux d'inhibition des fonctions plaquettaires adaptés à la situation que l'on souhaite éventuellement traiter. L'invention vise par ailleurs des anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques tels qu'ils ont été décrits plus haut caractérisés en ce qu'ils sont marqués, le marquage étant de préférence réalisé avec une substance radioactive, notamment un radioélément halogénique ou métallique, par exemple 1251, 1311, 1111n ou 99T, ou par une substance fluorescente. La substance de marquage doit être choisie en fonction de l'utilisation souhaitée des anticorps, in vitro ou in vivo. Dans le cas ou ces anticorps sont utilisés in vivo, la substance choisie doit être physiologiquement acceptable pour l'homme, et adaptée à la détection par des moyens tels que l'imagerie. Différents protocoles de marquage pourront être utilisés, en fonction du marqueur choisi. On aura par exemple recours aux techniques décrites dans la publication Mason, DW et al (1980) Biochem J 187, 1-9. Pour les techniques relatives à l'utilisation des anticorps après le marquage, on se référera par exemple à la publication McGregor JL et al (1986) Eur J. Bioche 159, 443-449. L'invention concerne à cet égard un procédé pour le marquage d'anticorps ou de leurs fragments tels qu'ils ont été définis précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - mise en contact de l'anticorps ou de ses fragments que l'on souhaite marquer, avec un marqueur déterminé, par exemple un radioélément, dans des conditions permettant le couplage du marqueur et de l'anticorps, - le cas échéant purification par exemple par filtration sur gel, pour éliminer les composants n'ayant pas réagi. Si le marquage sur les anticorps ou leurs fragments est réalisé de façon indirecte par exemple avec le technetium 99 on aura recours aux agents chélatants connus pour complexer le marqueur et réaliser le couplage avec l'anticorps ou les fragments. Des agents chélatants utilisables sont par exemple les acides polyaminocarboxyliques, notamment le DTPA (acide diéthylène triamine pentaacétique), des analogues de l'acide diethylène triamine pentaacétique (EDTA} des composés diaminodithiols, triaminothiols (ex : les (thioacétamide/ pentanoile) des amines polycycliques des dithiosemicarbozones et des métallothionines ou des anhydrides de ces acides, notamment des anhydrides cycliques. Ces agents chélatants sont préparés par des méthods connues.Pour le marquage au technetium, on pourra par exemple se référer à la publication Eckelman et al Nucl, Med. Biol. vol 16 nO 2, pp 171-176, 1989). Entre également dans le cadre de l'invention, l'épitope reconnu par les anticorps monoclonaux définis précédemment ou encore reconnu par les fragments idiotypiques de ces anticorps cet épitope étant présent au niveau d'un antigène impliqué dans les étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire et/ou dans les réactions - d'adhésion des cellules endothéliales, ledit antigène étant choisi plus particulièrement parmi les protéines GMP140 la glycoprotéine GPIIa ou les complexes GPIIb-IIIa, GPIa-IIa, GPIc-IIa, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un épitope conformationnel, nécessaire à l'activité dans les réactions ci-dessus de l'antigène qui le contient. Un épitope particulier de i'invention est un épitope sensible à la réduction de l'antigène qui le contient. L'invention concerne de façon plus spécifique les épitopes distincts reconnus par chacun des anticorps LYP20 et LYP22. Un autre épitope visé dans le cadre. de l'invention est un épitope répondant aux définitions génerales ci-dessus caractérisé: a) en ce qu'il est reconnu par le complexe IIb IIIa de plaquettes humaines. b) en ce qu'il n'est pas reconnu par le complexe IIb-IIIa de plaquettes de chien, c) en ce qu'il est reconnu par l'analogue du complexe IIb-IIIa (complexe IIb-IIIa like), présent sur des cellules endothéliales. De façon préférée cet épitope est l'épitope reconnu par l'anticorps LYP18. Les épi topes reconnus par les différents anticorps ou fragments idiotypiques de ces anticorps sont encore caractérisés comme suit Un premier protocole pour les caractériser comprend - la dégradation protéolytique de la glycoprotéine supposée contenir ltépitope pour obtenir de petits fragments, - la localisation du déterminant de l'anticorps monoclonal par SDS PAGE et Western blot, en utilisant les petits fragments de glycoprotéine résultant de la protéolyse, - l'obtention de la séquence d'acides aminés du (des) fragment(s) reconnu(s) par l'anticorps monoclonal, - la production de peptides se chevauchant autour de la séquence d'acides aminés supposée contenir 1' épitope, - la sélection du ou des peptide (s) capables d'inhiber la liaison de l'anticorps avec son récepteur lors d'un test de réaction d'inhibition mettant en oeuvre l'anticorps monoclonal et la glycoprotéine purifiée ou les plaquettes lavées. Cette technique peut être mise en oeuvre par référence aux publications de Foster P.A et al (1988) J Biol Chem 263, 5230-5234 et Geysen MH et al Ciba Foundation Symposium 119, 130-149. L'obtention des épitopes est encore caractérisée par les étapes suivantes: ~~~ - l'utilisation d'anticorps monoclonaux ayant un effet inhibiteur et capables de se fixer en Western blot, - l'isolement du gène complet de glycoprotéine à partir d'une banque de cDNA lambda gtll d'une lignée cellulaire exprimant l'antigène reconnu par l'anticorps, - le séquençage du gène, - l'isolement de cDNA de différentes tailles, reconnus par l'anticorps monoclonal, - la détermination, à partir du cDNA isolé, du déterminant de l'anticorps monoclonal selon un procédé conforme au premier protocole. Ce protocole peut être réalisé par référence à la publication Bahou WF et al (1989) J Clin Invest 84, 56-61. L'invention vise également une composition pour le diagnostic de l'activation plaquettaire chez un sujet suseptible de présenter une pathologie associée à des troubles de la physiologie plaquettaire en particulier pour mettre en évidence une thrombopathie, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps différents ou leurs fragments idiotypiques tels qu'ils ont été définis ci-dessus, de préférence des anticorps dirigés contre des protéines ou glycoprotéines distinctes, en particulier un mélange d'anticorps choisi parmi LYP20, LYP22 et LYP18 ou encore leurs fragments idiotypiques. Pour les besoins de la détection, ces anticorps ou fragments d'anticorps sont marqués. D'autres compositions pour le diagnostic de l'activation plaquettaire, répondant aux définitions ci-dessus, sont des compositions caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre des anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques dirigés contre la thrombospondine et de préférence des anticorps du type LYP9 ou/et LYP11. Les anticorps LYP9 et LYP11 sont des anticorps dirigés contre la thrombospondine obtenus par une méthode telle que celle décrite dans la publication de Clezardin et al (Eur J Biochem. 154, 95-102 (1986)). Les compositions pour la diagnostic décrites cidessus peuvent d'être utilisées pour détecter in vitro dans un -échantillon biologique tel que le sang, la présence d'antigènes plaquettaires, significative d'un état de thrombose. Ces compositions sont également utilisables pour le diagnostic in vivo, lorsque les anticorps monoclonaux ou leurs fragments ont préalablement été marqués dans des conditions physiologiques et permettant leur détection avec des appareils adaptés et en particulier grace aux méthodes de gammascintigraphie et de RNM. Un autre avantage des compositions pour le diagnostic précédemment décrites est de permettre un diagnostic sélectif de la présence de certains antigènes particuliers caractéristiques d'étapes déterminées de la physiologie plaquettaire. Une catégorie d'anticorps monoclonaux ou de fragments selon l'invention peut également être utilisée, sous la forme d'une composition pour le diagnostic in vitro, pour la mise en évidence de mélanomes métastasiques et les différencier par rapport à des mélanocytes bénins. Ces anticorps monoclonaux sont de préférence les anticorps LYP18 de l'invention ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles analogues, notamment leur capacité à reconnaître l'analogue du complexe IIb-IIIa (IIb-IIIa "like11). Le complexe IIb-IIIa "like" est caractérisé par un poids moléculaire identique, sous forme réduite ou non réduite, à celui de la glycoprotéine plaquettaire ITb-IIIa. Ce complexe IIb-IIIa "like" présente en outre un fragment IIb-ss "like" (forme réduite) comme les plaquettes IIb réduites (II-ss plaquettaire). L'invention vise par ailleurs une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un anticorps monoclonal ou ses fragments idiotypiques, traités dans desconditions physiologiques ou encore un melange d'anticorps et de fragments selon ce qui a été décrit précédemment ou un mélange des ces différents anticorps et/ou fragments idiotypiques, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique acceptable. Selon un premier aspect préféré de l'invention, de telles compositions pharmaceutiques peuvent être utilisées pour les traitements de différentes pathologies résultant de troubles de la physiologie plaquettaire ou liés à ces fonctions plaquettaires. Une utilisation des compositions pharmaceutiques comprenant les anticorps de l'invention ou leurs fragments peut être le traitement de maladies cardiovasculaires. Selon un autre aspect particulier de la réalisation de l'invention, les compositions pharmaceutiques sont caractérisées en ce que le (les) anticorps ou leurs fragments idiotypiques, sont - soit couplés à une substance anticoagulante ou à une substance ayant une activité thrombolytique, cette substance pouvant être par exemple le tpa, la streptokinase ou l'urokinase, - soit modifiés au niveau de l'une de leurs chaines idiotypiques de façon à remplacer l'un des fragments variables ou au moins une partie de ces fragments par l'une des susdites substances anticoagulantes. Lorsque le fragment idiotypique de l'anticorps est couplé avec une substance ayant une activité décrite ci-dessus, la liaison entre le fragment et cette substance est une liaison covalente résultant de la mise en oeuvre d'un protocole tel que celui décrit par Bode et al (1985) Science 229, 765. D'autres tecl,niques utilisables sont célles décrites par Frantz et Robertson dans Infect and Immunity, 33, 193-198 (1981) ou celle décrite dans Environnement Microbiology (octobre 1981) vol. 42 nO 4, 611-614 par P.E. Kauffmann. Dans la pratique, on utilisera avantageusement comme agent de couplage les composés suivants, cités à titre non limitatif : aldéhyde glutarique, chloroformiate d'éthyle, carbodiimides hydrosolubles [N-éthyl-N'(3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, HCl), diisocyanates, bis-diazobenzidine, di- et trichloro-s-triazines, bromures de cyanogène, benzoquinone, ainsi que les agents de couplage mentionnés dans Scand. J. Immunol., 1978, vol. 8, p. 7-23 (Avrameast Ternynck, Guesdon). Dans le cas où la composition pharmaceutique est composée d'un anticorps ou d'un mélange de ces anticorps et/ou de leurs fragments idiotypiques couplés ou modifiés par une substance anticoagulante ou thrombolytique, cette composition, associée à un véhicule physiologiquement acceptable est administrée au patient selon une dose comparable à celle qui serait utilisées pour un des constituants de la composition pris isolément. L'invention vise en outre l'utilisation d'anticorps ou de leurs fragments idiotypiques pris séparément ou en. mélange, pour la fabrication d'un médicament déstiné au traitement des pathologies liées à des troubles de la physiologie plaquettaire. L'invention vise aussi l'utilisation des anticorps selon l'invention pour moduler, voire inhiber l'interaction entre les plaquettes et les monocytes. Elle vise à cet égard un agent, capable de moduler les interactions entre des cellules de type monocytes et des plaquettes stimulées, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal selon l'invention. Un agent particulièrement avantageux est caractérisé en ce qu'il comprend l'anticorps LYP20. Selon un autre aspect préféré de l'invention les compositions pharmaceutiques ci-dessus peuvent être utilisées dans une application différente du traitement des maladies cardiovasculaires, pour bloquer la prolifération. des cellules de mélanomes et ainsi contrarier l'invasion métastatique de ces cellules. l'invention concerne à- cet égard des compositions pharmaceutiques comprenant l'anticorps monoclonal LYP18 ou encore un anticorps ayant la propriété de bloquer la prolifération des cellules de mélanome, pour inhiber la prolifération des mélanomes tumoraux in vivo. L'invention vise aussi l'application des anticorps LYP18 ou de leurs fragments idiotypiques, pour inhiber la croissance de cellules de mélanomes malins. L'invention vise aussi l'utilisation pour le diagnostic in vitro de mélanomes malins, notamment pour différencier ces tumeurs d'autres tumeurs telles que les lymphomes ou les carcinomesJd'anticorps LYP18 ou de leurs fragments idiotypiques ou encore d'anticorps ayant des propriétés de reconnaissance des mélanomes du type de celles décrites pour LYP18. A cet égard l'invention concerne une composition pour le diagnostic in vitro de cellules tumorales de mélanomes caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps LYP18. L'invention concerne également un procédé de préparation des anticorps monoclonaux selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a/ fusion de cellules spléniques de souris avec des cellules myélomateuses, lesdites souris étant préalablement immunisées avec l'antigène contre lequel on souhaite produire des anticorps, les cellules spléniques étant en excès par rapport aux cellules myélomateuses, en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le PEG, b/ culture des hybridomes formés par la fusion, c/ clonage et sous-clonage des hybridomes producteurs des anticorps recherchés, d/ production d'ascites dans les souris, e/ récupération et purification desdits anticorps. Pour la production des anticorps LYP18 ou LYP20 on utilise à titre d'antigène, des plaquettes de sang humain traitées à la chymotrypsine à une concentration de 0,2 mg/ml/109 plaquettes pendant 30 minutes à 370C. Dans ce cas, les cellules myélomateuses utilisées pour la fusion sont par exemple des cellules Sp2*gl4. D'autres cellules myélomateuses pour la fusion sont P3x6 Ag8. On se référera pour les détails au protocole d'obtention à l'exemple donné pour LYP20. Pour la préparation des anticorps LYP22, on utilise un mélange des antigènes GMP1QO, glycoprotéines Ia, Ic, IIa, GP110-115 pour immuniser les souris. Dans ce cas, les cellules myélomateuses utilisées pour la fusion sont avantageusement des cellules P3x63Ag8. D'autres cellules myénomateuses pour la fusion sont Sp2/Agl4. On se réfèrera pour les détails du protocole d'obtention aux exemples. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples et les figures qui suivent Fiqure 1 Profile d'élution des extraits plaquettaires traités au Lubrol obtenus à partir d'une colonne Mono~2 de Sepharose à flux rapide sur-FPLC La fraction éluée de la colonne de Sépharose WGA a été dialysée contre 0,1 % de Lubrol dans un tampon Tris. Le pic 1 a été élué à 0,15 M NaCl, le pic 2 à 0,25M NaC1, le pic 3 à 0,32M NaCl, les pics 4 5, 6 élués entre 0,6 - O,75M NaCl. Analyse SDS-PAGE des pics élués par chromatographie d'échange d'anions. Chaque fraction a été concentrée et traitée dans des conditions non-réductrices (NR) et dans des conditions réductrices (R). Les échantillons ont été soumis à une électrophorèse SDS-PAGE 7,5% et les gels ont été colorés à l'argent. Firuse 2 Comparaison des données obtenues en SDS-PAGE de GPIIb-IIIa, de l'antigène 512 et P20. Des lysats de plaquettes marquées avec 1251 ont été incubés avec des IgG non-immunes (C), P20 avec S12 et avec un anticorps P18 anhti-GPIIb-IIIa. Des échantillons ont été dénaturés dans des conditions non-réductrices et réductrices (R), placés sur un gradient SDS-PAGE 5-15% et autoradiographiées. La ligne.A montre le lysat total marqué non-réduit. Figure 3 Résultats immunoblott de l'antigène correspondant à P20. Les lysats plaquettaires ont été dénaturés dans des conditions non-réductrices (NR) et réductrices (R) et ont été placés sur un gradient SDS-PAGE à 5-15%, avant le transfert sur des bandes Immobilon. Les bandes P20 et P21 ont été incubées avec P20 et P21 respectivement, la bande C incubée avec des IgG nonimmunes (c). Le Western blot a été développé avec l'anticorps secondaire conjugué à la peroxidase. Figure 4 Liaison d'anticorps monoclonal P20 à des plaquettes non-stimulées et stimulées. Des plaquettes lavées à une concentration de 10/ml ont été incubées pendant 30 minutes à 250C dans unc solution complète de Tyrode avec différentes concentrations (0,1-4 pgXml) de P20 marqué avec 1251. Les plaquettes lavées ont permis de montrer une liaison accrue de P20 marqué avec 1251 après stimulation par 1U/ml d'alpha-thrombine. Fiqure 5 Effet de P20 sur l'adhésion plaquettaire. L'anticorps monoclonal P20 (50 pg/ml) inhibe partiellement (60%) l'agrégation induite par 2,5 M d'ADP, une dose de 40 g/ml inhibe l'agrégation induite par 2 g/ml de collagène (63% d'inhibition) P20 (90 g/ml) inhibe également (50%) l'agrégation induite par 0,016 U/ml de thrombine. Fiqure 6 Fixation de l'anticorps monoclonal LYP18 aux mégacaryocytes présents au niveau d'une biopsie de la moelle osseuse (sections congelées pour être découpées puis traitées avec la peroxidase jusqu'à coloration et colorées avec le bleu de éthylène (x200) Figure 7 Fixation de l'anticorps monoclonal LYP18 à des mélanomes ma.-lins métastatiques des ganglions lymphatiques.A et encadré (gauche): des sections congelées traitées à la peroxidase jusqu'à coloration puis colorées avec du bleu de méthylène comme colorant additionnel (x100 ; encadré x2O0). LYP18 ne se fixe pas à des nevo-mélanocytes du nevi- B (droite): sections congelées traitées avec la phosphatase alkaline pour une première coloration puis colorée avec l'hexatoxyline (x200). Figure 8 Croissance des tumeurs de M3Dau en présence d'anticorps LYP18, G7A5, IgG2a Figure 9 Effet de l'injection de LYP18 sur la croissance des tumeurs. EXEMPLE 1 - Isolement et caractérisation de alveocrotéines de plaquettespar chromatographie FPLC suivie d'un séquence en phase gazeuse. Dans cette expérience on a isolé des glycoprotéines présentes en faible quantité à la surface des plaquettes. Pour cela on a utilisé la chromatographie rapide en phase liquide (FPLC) ainsi que le séquençage en phase gazeuse permettant de procéder à l'étude de la structure, des caractéristiques imnologiques et fonctionnels des glycoprotéines présentes sur les plaquettes, en faible quantité. Les membranes plaquettaires solubilisées dans du sodium déoxycholate ont été appliquées sur une colonne de germe de blé (WGA) et de lectine (Lens Culinaris LCH) montée séquentvellement avec une chromatographie FPLC. Les glycoprotéines éluées des colonnes de lectine dans un détergent non ionique ont ensuité été séparées sur une colonne échangeuse d'anions (Mono-Q). Les pics élués à partir de la colonne Mono-Q à différentes concentrations de NaCl ont été soumis à des électrophorèses en une et deux dimensions sur des gels de polyacrylamide SDS et analysés en Western blot sur des membranes Inmobilon PVDF. Les glycoprotéines présentes sur les membranes Immobilon ont été directement séquencées en utilisant un séquenceur automatique en phase gazeuse. La colonne WGA a permis de lier un mélange d'antigènes comprenant la GPIb, la GPIIIb (ou GPIV) la GPIIb-IIIa en plus d'un certain nombre de protéines telles que GP150/155(GPIa) (poids moléculaire non réduit/réduit) GP15/13u(GPIc), GP130/135(GPIIa), GP128/132(GMP14G et GP115/120(encore identifiée sous GP110/115).Ces glycoprotéines séparées par FPLC ont ensuite pu être identifiées en utilisant un anticorps monoclonal (AcM) ou des anticorps polyclonaux. La GP128/132 a été identifiée comme correspondant à la GMP140 ou PADGEM par un anticorps monoclonal LYP21. La GP15Q/155 et la GP130/135 ont été identifiées sous forme de complexe GPIa-IIa et GPIc-IIa par un anticorps monoclonal LYP22. La colonne LCH a permis de lier principalement le complexe GPIIb-IIIa, identifié par un anticorps monoclonal anti-GPIIb-IIIa (LYP4). Les parties Nterminales d'un nombre limité de ces glycoprotéines séparées ont été microséquencées en utilisant un séquençeur en phase gazeuse. L'usage combiné de FPLC et du séquençage en phase gazeuse permet un isolement rapide et une caractérisation des glycoprotéines plaquettaires.Par ailleurs, l'identification des séquences d'acides aminés N-terminales permet la synthèse de sondes oligonucléotidiques pour cribler et isoler différents clones cDNA de glycoprotéines à partir de banques de données. Matériels et méthodes Préparation des membranes Des concentrés de plaquettes humaines ont été obtenus au centre de transfusion sanguine de Beynost. Les membranes plaquettaires ont été préparées selon la méthode décrite par Cooper et al (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 1069-11073), en utilisant 10 unités de concentré de plaquettes humaines (50.109 plaquettes/unité). Les globules rouges sédimentés ont été séparés des plaquettes par centrifugation à 160g pendant 25 minutes à 250C. Les plaquettes ont été isolées et lavées en utilisant la méthode de Massini et al modifiée par Mc Gregor et al, (respectivement 1974, Biochiica and Phyica Acta 372: 109-121; 1979, Thromb. Res. 16: 437-452). Les plaquettes laves ont été resuspendues (5.109plaquettes/@l) dans 15 mM Tris(Hydroxymethyl-Aminométhane) -HCL (Boerhinger Mannheim, Meylan France) à pH 7,4 avec 5mM EDTA (BDH, Poole, Grande Bretagne) et 1 M de leupeptine (Boerhinger Mannheim).Ces plaquettes ont ensuite été soumises à un appareil à sonîcation Branson réglé sur le mode discontinu avec un cycle d'operation de 50 % et un niveau d'intensité des ultrasons de 5. Les plaquettes traitées par ultrasons ont été centrifugées à 4 C pendant 20 minutes à 9000g dans un rotor à angle fixe SS34 en utilisant une centrifugeuse Sorvall RC2B (Dupont de Nemours, Newtown, Connecticut, USA). Le surnageant a ensuite été retiré et centrifugé pendant une heure à 4 C à 100 000g dans un rotor à angle variable TST 55.5 en utilisant une centrifugeuse Kontron 2060 (Kontron, Zurich, Suisse). Les merranes sous forme de culot ont été resuspendues dans un tampon contenant 10 mM Tris-HCL à pH 8,2, dans 5 mM EDTA et 1 ijM de leupeptine. Extraction avec le sodium deoxycholate (DOC}: Les membranes plaquettaires ont été traitées pendant 30 minutes à 40C avec du sodium deoxycholate 1 % (w/w) (Merck, Darmstadt, RFA) dans 10 MM Tris-HCl à pH 8,2 avec 5 mM EDTA et 1 pM de leupeptine. Les antigènes des membranes extraites des plaquettes ont été soumises à une ultracentrifugation à 40C pendant 30 minutes à 100.000 g dans un rotor à angle variable TST 55.5 en utilisant une centrifugeuse Kontron 2060. Le surnageant soluble contenant les antigènes des membranes ultracentrifugé a été collecté. Chroratographie d'affinité sur lectine Le germe de blé-lectine (WGA) lié au Sepharose 6MB (Pharmacia, Uppsala, Suède) a été placé dans une colonne de verre HR10/10 (100 m x 10 mm) (Pharmacia). La colonne a ensuite été reliée à un système de chromatographie rapide en phase liquide (FPLC) (Pharmacia). La colonne a été équilibrée dans un tampon de départ contenant 10 mM Tris-HCl à pH 8,2 avec 0,5 % DOC, 5 mM EDTA. Les antigènes des membranes des plaquettes solubilisées ont été déposées sur la colonne avec un débit de 0,5 ml/mn et la colonne a été lavée avec un tampon de départ jusqu'à l'obtention d'une densité optique égale à la valeur de base. Les glycoprotéines liées à la colonne de WGA ont été éluées avec un sucre, le N-Acetyl Glucosamine 2,5 % (Sigma, Saint Louis, MO, USA) . Les pics d'élution ont été dialysés pendant une nuit contre 10 mM Tris-HCl à pH 7,4 avec 0,1 % de lubrol PX (Sigma). Chromatographie d'échange d'anions: Les glycoprotéines éluées à partir de la colonne de lectine et resuspendues dans du lubrol PX ont été placées sur une colonne d'échange d'anions MONO Q HR5/5 (50 mm x 5 mm} (Pharmacia). Le tampon de départ contenait 0,1 % de lubrol PX dans 20 mM Tris-HCl à pH 7,4 et le tampon final était compsé de 0,1 % lubrol PX dans Tris-HCl à pH 7,4 contenant 1M de chlorure de sodium (Merck). Un grandient a été. établi pendant 25 minutes avec un débit de 1 ml/mn. Chromatographie dtimmunoaffinité : Les glycoprotéines éluées à partir de la colonne MONO Q ont été identifiées sur des colonnes d'imnunoaffinité en utilisant les anticorps monoclonaux LYP21 (dirigés contre la GMP140) et LYP22 (dirigés contre la gpIIa) liés au Sepharose-4B. Ces anticorps ont été obtenus après immunísation de souris avec un mélange de glycoprotéines isolées par affinité sur colonne WGA et chromatographie d'échange d'anions. Les glycoprotéines IIb-IIIa ont été identifiées sur colonne d'immunoaffinité en utilisant l'anticorps monoclonal LYP4 décrit par Mc Gregor et al (1986, Eur. J. Biochem. 159: 443-440). EXEMPLE 2 - Inhibition de l'aqréqation plaquettaire induite par le collaqène, avec des anticorps monoclonaux anti gpIa-IIa. On a mis en évidence qu'une glycoproteine (GP) Ia-IIa (VLA-2) a un role important dans l'adhésion des plaquettes au collagène. Les plaquettes d'un patient présentant un défaut en GPIa ne subissent pas d'agrégation en réponse au collagène. Un anticorps monclonal LYP22, a été obtenu à partir de souris immunisées avec un mélange de glycoprotéines membranaires de plaquettes, isolées par chromatographie d'affinité à l'aide d'agglutinine de germe de blé couplée à une chromatographie d'échange d'anions. Une immunoprécipitation ultérieure d'un lysat de plaquettes iodées en surface, solubilisées dans un détergent, a montré que LYP22 précipitait deux glyèoprotéines ayant un poids moléculaire estimé dans des conditions non réductrices et réductrices (NR/R) de 140/155 kDa, et de 120/135 kDa respectivement. Les changements des poids moléculaires de ces deux glycoprotéines dus à. la réduction sont en accord avec ceux précédemment décrits pour GPIa et GPIIa respectivement. Quand des plaquettes solubilisées avec du Lubrol ont été mises en contact avec le LYP22 sur une colonne d'affinité de sépharose, deux autres glycoprotéines (120/128 (GPIc) et 100/105 kDa > ont été détectées en quantité beaucoup plus faible à l'aide du bleu de Coomassie.Des études des liaisons de l'anticorps LYP22 marqué avec l'iode 125 (12 5I) aux plaquettes ont montré que les liaisons sont de l'ordre de 7708 + 928 molécules par plaquette au repos et 8940 + 86 liaisons de molécules par plaquette activée avec la thrombine (Kd = 65,6nM + 1,43nM). Ces données suggèrent que l'expression en surface des sites de liaisons au LYP22 n'est pas augmentée après l'activation des plaquettes. Pour déterminer l'effet de LYP22 sur les fonctions plaquettaires, des études d'agrégation avec des plaquettes huraines lavées ont été réalisées. LYP22 inhibe partiellement l'agrégation plaquettaire induite par une faible dose de collagène (lpg/ML) mais n a pas d'effet sur d'autres agonistes. Cependant, LYP22 n'a pas d'effet sur l'adhésion des plaquettes au collagène, à la fibronectine ou au fibrinogène en présence de 2 mM de magnésium. Ces résultats montrent que a/ LYP22 est dirigé contre le complexe GPIa-IIa, GPIc-IIa et indirectement contre un produit de dégradation de la GPIIa ou d'une glycoprotéine rattachée à la GPIIa. b/ le complexe GPIa-TIa et Ic-IIa est impliqué dans l'agrégation plaquettaire induite par le collagène, par l'intermédiaire de la GPIIa. c/ P22 a un effet sur l'adhésion des plaquettes lorsqu'elles sont en présence de collagène 10pg/ml. EXEMPLE 3 - Inhibition des fonctions plaquettaires de plaquettes humaines par un anticorps monoclonal LYP20 diriqé contre une glycoprotéine de membrane dont l'expression dépend de l'activation. Un nombre limité de glycoprotéines de membrane (Ib, IIb-IIla, fa-IIa, Ic-IIa, IIIb) jouent un rôle important dans l'agrégation plaquettaire et l'adhésion. On a utilisé les anticorps monoclonaux LYP20 et LYP21. Les anticorps LYP20 ont été obtenus après immunisation d'une souris BALB/C avec un concentré de plaquettes de sang humain lavées, traitées à la chymotrypsine (0,2rrig/ml/109 plaquettes pendant 30 minutes à 370C). Les anticorps monoclonaux LYP21 ont été obtenus avec un mélange de 4 glycoprotéines de membrane de plaquettes éluées à partir d'une colonne d'affinité à l'agglutinine de germe de blé.L'immunoprécipitation faisant appel à des plaquettes marquées en surface puis lysées, activées à l'aide de thrombine-, a montré que LYP20 et LYP21- précipitent une protéine de 128 kDa (non réduite) et 132 kDa (réduite) qui est appelée GP128. Les anticorps LYP20 et LYP21 reconnaissent des épitopes distincts sur la gp128, le déterminant antigénique de LYP20 étant dépendant de la présence de ponts disulfure intacts. Des plaquettes au repos lavées ont permis de lier 2400 + 270 molécules par anticorps LYP20 marqué avec l'iode 125 et 12.200 + 1.184 molécules par anticorps après activation. par 1 Ulmi de thrombine. Ces données montrent que LYP20 et LYP21 sont diriges contre une protéine de surface plaquettaire (gp128) dont l'expression dépend de l'activation plaquettaire et de la sécrétion. La gp128 migre conjointement avec l'antigène plaquettaire immunoprécipité par un anticorps dirigé contre la glycoprotéine GMPl40 ou PADGEM. Ceci montre que la gp128 est apparentée ou identique à la GMPl40 ou PADGEM. Afin de déterminer le rôle potentiel de la GP128 (encore désignée par GMP14d) dans les fonctions plaquettaires, les études concernant l'agrégation avec des plaquettes humaines lavées ont été réalisées. Des fragments F(ab' )2 de LYP20 mais pas de LYP21 inhibent partiellement l'agrégation plaquettaire et la libération induite par 2,5M d'ADP, 2pg/ml de collagène et 0,016U/ml de thrombine.Ces résultats montrent que a/ LYP20 et LYP21 sont dirigés contre des épitopes différents de la protéine de surface plaquettaire (GP128) dont l'expression dépend de l'activation plaquettaire b/ la GP128 est apparentée ou identique à la GMP140 ou PADGEM c/ la GP128 exposée à la surface de plaquettes activées peut jouer un rôle important dans l'agrégation plaquettaire. EXEMPLE 4 - Préparation d'anticormonoclonaux d-'riqés contre la qlvcoprotéine GMP 140 - Matériel L'adénosyldiphosphate (ADP), l'aprotinine, la fibronectine (FN), la lactoperoxidase et la leupeptine, le lubrol WX, la N-acétyl glucosamine, l'orthophényldiamine (OPD), le fluorure de phénylméthylsulphonyle (PMSF), la prostaglandine El (PGE1) et le triton X-100 ont été obtenus auprès de Sigma (StLouis, MO, USA). Le 5 1 Chrome, l'12s Iode et la 14C séroténine ont été obtenus chez Amersham International (U.K.).La peroxidase de raifort conjuguée à des anticorps anti-souris de chèvre, la gélatine, le réactif de développement de couleur HRP et le Tween 20 ont été obtenus auprès de BioRad {Richmont, CA, USA), . Le sodium deoxycholate (DOC), le dithicthreitol (DTT) , la leupeptine et le PMSF ont été obtenus auprès de Merck (Dar-...stadt, RFA). Le polyethylene Glycol (PEG) et le Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) ont été obtenus auprès de BDH (Poole, U.K.). Le gel à flux rapide Mono-Q-Sepharose (Mono-Q Sepharose fast flow gel marque déposée)), la protéine A sépharose, l'agglutinine de germe de blé (WGA) et un système complet FPLC ont été- obtenus auprès de Pharmacia (Uppsala, Suède).La sérun albumine bovine (BSA) et les anticorps IgG anti-souris de lapin proviennent de Miles Laboratories (Naperville, IL, USA). Le collagène provient de Hormon-Chemie -(Munich, RFA). La Thrombine a été obtenue auprès de Hoffman-La Roche (Bâle, Suisse) et l'alpha-thrombine, le fibrinogène (FG) proviennent de IMCO. La pansorbine provient de Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Tous les réactifs de culture cellulaire ont été obtenus auprès des laboratoires Flow (Les Ulis, France) et Intermed (Lyon, France).Le 2,4,6,10 teramethalpentadecane (Pristanej provient de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA). Les membranes de difluorure de polyvinylidène (Im.mobilon) proviennent de Millipore Corporation (Bedford, MA, USA). Le D-phènyl-L-propyl- L-arginine chloromethyl cétone (PPACK) proviennent de Calbiochem-Behring (Paris, France). - Méthodes a) Prépara ti on de Plaquettes et marquage Des concentrés de plaquettes (Centrè de Transfusion Sanguine de de Beynost) ont été lavés selon la technique de Massini et al (1974), Biochim biophys. Acta 372, 109-121. Les protéines de surface ont été iodées selon la méthode décrite par Philipps et Al. (1977) J. Clin. Invest. 60, 535-545, en utilisant la lac-toperoxidase. Les plaquettes utilisées darus les études de fixation, d'agrégation et d'alhésion proviennent du sang (1 volume ACD : 6 volumes de sang) de volontaires normaux. Les plaquettes ont été isolées et lavées selon la technique de Mustard et Al. (1972) Br. J. Eaematol. 22, 193-204 avec de légères modifications 20 ng/ml PGE1 et 10- 6 M PPACK ont été ajoutés au premier lavage. b) Isolement des glycoprotéines de membrane plaquettaire Les plaquettes lavées confor-ment à la méthode de Massini et Al. citée plus haut ont été resuspendues à 40 x 109 cellules/ml dans 0,02 M Tris-HCl à pH 8,6, avec 0,005 M EDTA, 1% (w/v) de DOC, 17U/ml d'aprotinine, lmM de leupeptine. La solubilisation à été réalisée à 4 C sous agitation constante pendant une heure. Le lysat a été centrifugé à 100.000 g pendant une heure à 40C. Le surnageant a été dilué dans 5 volumes de 0,02 M Tris-HCl å pH 8,6, lmM EDTA, 0,5% (w/v) DOC (tampon A) et déposé sur une colonne de sépharose 6B-WGA.La colonne était pré-équilibrée dans le tampon A et couplée à un système de chromatographie rapide en phase liquide (FPLC > . La colonne a été lavée à -0,4 ml/minute avec le tampon A jusqu a ce que le matériel non fixé soit éliminé. La fraction spécifiquement liée a été éluée par 2,5% (w/v) de Nacétyl glucosanine.La fraction collectée a été dialysée pendant une nuit contre un melange de 0,02 M Tris-HCl à PH 7,4, avec 0,005 M EDTA' et 0,1% de Lubrol PX à 4 C. L'échantillon dialyse a été soumis à une chromathographie d'échange d'anions en utilisant une colonne Mono-Q à flux rapide, reliée au système FPLC et pré-équilibrée dans 0,02 M Tris-HCl à pH 7,4 contenant 0,18 tw/v) de lubrol WX (tampon B). L'échantillon a été appliqué sur la colonne à un débit de 2 ml par minute et les différentes fractions ont été éluées en utilisant un gradient de NaCl(0 à 1 M) dans le tampon B. Chaque fraction a été collectée, concentrée et analysée par SDS-PAGE en utilisant la technique Laemmli (1970) Nature 227, 680-685. La concentration de protéine a été déterminée par la méthode de Lowry (1951) modifée par Markwell (1978) Anal. Biochem. 87, 206-210. Pour plus de détails concernant l'isolement des glycoprotéines on pourra se reporter à exemple 1. c) Production d'anticorps inonoclonaux c.1) Préparation de l'anticorps LYP21 Des souris BALB/c (des femelles de 6 semaines), obtenues chez IFFA CREDO (L'Arbresle, France), ont été immunisées intrapéritonéalement avec looijg d'un mélange de 4 glycoprotéines (isolées de la façon décrite ci-dessus- et correspondant aux glycoprotéines GMP140, Ia, Ic, IIa, GP110-115), avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund. Deux semaines ainesplus tard, 100pg de l'antigène ont été'injectés aux souris en présence d'adjuvant incomplet de Freund. On a vérifié que le sérum des souris réagissait vis à vis de l'antigène en utilisant la technique ELISA. A cet égard, on rappelle brièvement la technique : des puits de plastique ont été recouverts avec 100 l d'antigène (mélange de 4 glycoprotéines) dilués à 2pg/ml dans un tampon de bicarbonate (25 mM Na2CO3, 25mM NaHCO3, pH 9,6) laissés pendant 3 heures à 370C. Les puits ont été lavés et saturés avec d,5% de BSA dans un tampon Tris(15mM Tris-HCl, pH 7,4, 2mM CaCl2, 0,05% (w/v) Tween) pendant 30 minutes à température ambiante.Le sérum de souris (100 l) ont été incubés dans les puits pendant heure à 37 C Après 3 lavages dans un tampon Tris, un anticorps anti-souris de chèvre (anticorps secondaire, dilué à 1/3000) conjugue à la peroxidase a été ajouté à chaque puits et soumis à réaction pendant 30 minutes à 370C. Les puits ont ensuite été lavés une nouvelle fois et remplis avec une solution de 100po de substrat (4 mg OPD dans 10 ml de 0,1M tampon citrate, à pH 5, avec 0,7 pl de 30%H202), La réaction a été arrêtée avec 100wu de 4t1H2SO , 4N. La densité optique (492 nmi a été mesurée avec un lecteur de plaque. Quatre semaincs après la première injection, les souris immunisées ont subi un rappel avec 100pg de mélange d'antigènes. Les cellules spléniques ont été fusionnées 4 jours plus tard selon la méthode de Kohler et Milstein (1975) Nature 256, 177-181, avec des cellules myélomateuses P3X63Ag8 selon un rapport de 10:1, en présence de PEG. Les hybridomes ont été divisés, répartis avec des macrophages du péritoine de souris non immunes de la même souche que les souris immunisées, ces macrophages étant utilisés en tant que cellules nourricières, dans des plaques à 24 puits, dans un milieu hypoxanthine/aminoptérine/thymidine (HAT) 24 heures plus tard. Les surnageants d'hybridomes ont été criblés en utilisant la technique ELISA décrite plus haut pour le sérum souris.Des surnageants positifs ont été testés pour leur capacité d'accrochage aux antigènes de surface de membrane plaquettaire marqués, selon le protocole décrit dans la partie "immunoprécipitation", ainsi que pour leur capacité d'accrochage sur des antigènes de membrane plaquettaire non marqués, transférés sur des membranes Immobilon selon le protocole décrit dans "Immunoblot". Des puits positifs ont été clonés et sous-clonés par dilution limitée et criblés à nouveau en utilisant les mêmes techniques avant la production d'ascites dans les souris BALB/c traitées avec du pristane. Des immunoglobulines monoclonales ont été purifiées par la méthode Ey et a. (1978) 1.-n. unochemistry 15, 429-436 en utilisant une chromatotraphie d'affinité sur protéine A-sépharose. Les fragments F(ab' )2 d'un anticorps monoclonal ont été préparés conformément à la technique décrite Lamoyi et al (1986) Methin Enzym, vol 121, p 652-663, Acad. Press INC. c.2) Préparation de l'anticorps LYP20 L'anticorps monoclonal LYP20 a été obtenu après immunisation de souris BALB/C avec des plaquettes de sang humain traitees à la chymotrypsine et lavées. Le traitement à la chymotrypsine (0,2 mg/ml/109 plaquettes) a été fait pendant 30 minutes à 370C. Les plaquettes ont ensuite été lavées selon la technique de Massini et al.. Les plaquettes traitées à la chymotrypsine (1 x 108 plaquettes/50 mi) ont été mélangées ave un volume égal (50 ml) d'adjuvant complet et injectées intrapéritonéalement à des souris BALB/C. Les souris ont été immunisées 2 fois en 4 semaines avec les plaquettes ainsi traitées. Puis ces souris ont été laissées au repos pendant un mois avant de surbir un rappel avec les plaquettes traitées à a chymotrypsine.Trois jours après les cellules spléniques (de la rate) ont été prélevées et fusionnées avec des cellules Sp2/Ag14 selon la technique décrite précédemment pour préparer les anticorps LYP2î. Les surnageants de fusion obtenus avec les plaquettes traitées à la chymotrypsine ont été sélectionnés pour leur capacité- à inhiber les fonctions plaquettaires. Ces anticorps LYP21 ou LYP20 ont été purifiés par chromatographie sur colonne Protéine A Sépharose CL64B comme décrit précédemment par Ey P.L et al 1978, Immunochemistry 15, 429-436. Immunoprécitation L'immunoprécipitation a été réalisez selon la méthode décrite par McEver et al (1984) J. Biol. Chem, 259, 9799-9804. Les plaquettes ont été activées (lU/ml de trombine pendant 10 minutes, suivi par 10-6M PPACK pendant 10 minutes) préalablement à une iodation, solubilisées dans 0,01M Tris-HCl, 0,15M NaCl, lmM EDTA, contenant 1% de lubrol PX (tamon S) et microcentrifugées. Les surnageants marqués ont été incubés avec soit le surnageant d'hybridones, soit le fluide d'ascites ou l'anticorps purifié pendant 2 heures à température ambiante, sous agitation constante. 10 pi d'anticorps purifie anti-souris de lapin, dilué selon un rapport 1/10 dans le tampon S ont été ajoutés à chaque échantillon et placé sur un agitateur à balancier-à température ambiante pendant 30 minutes. La protéine A sépharose (10% dans le tampon S) a été incubée (1 volume de lysat pour 2 volumes de protéines A > avec chaque échantillon, sur un agitateur à balancier pendant 30 minutes à température ambiante. Une centrifugation a ensuite été réalisée à 9.000 g pendant 2 minutes dans une centrifugeuse Eppendorf. Chaque culot de centrifugation a été lavé 4 fois dans le tampon S. Après le dernier lavage, chaque culot a été resuspendu dans 0,4 ml de tampon Laemmli (1970) Nature 227, 680-685, puis chauffé à 1000C pendant 5 minutes. Une partie aiiquote de chaque échantillon a été réduite en présence de 0.04M DTT. Tous les échantillons ont été ensuite microcentrifugés et le surnageant a été conservé à -700C. SDS-PAGE et immunoblot Une électrophorèse sur gel en une dimension a été réalisée selon la méthode de Laemmli. La technique SDS-PAGE cn deux dimensions (non rédunt/réduit) a été réalisée selon la méthode de Phillips et Ai. (1977) J. Clin. Invest. 60, 535-545. Les gels ont été colorés à l'argent selon la méthode de Merril et Al. (1982i Electrophoresis, 3, 17-23. Les gels et les membranes Immobilon ont été équilibrés dans 0.025M Tris, 0,192 M glycine, à pH8,3, pendant 30 minutes avant de réaliser un western blot. Les protéines ont été transférées par électrophoree selon la méthode de Towbin (1979) Proc. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354, à partir du gel vers la membrane Immobilon en utilisant un appareil miniblot de BioRad à 100 V pendant une heure. Après le transfert, la membrane a été laissée pendant 30 minutes dans un tampon TBS (0,02 M Tris, 0,05 M NaCl, pH 7.5) contenant 0,05% (w/v) Tween-20 et 3% (w/vi de gélatine pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Les bandes Immobilon ont été coupées et placées dans un tube contenant soit le surnageant d'hybridomes, soit le fluide ascitique soit l'anticorps purifié. Chaque tube a été soumis à réaction sur un agitateur à balancier pendant une heure à temLpérature ambiante. Les bandes ont ensuite été lavées trois fois dans un tampon TBS contenant 0,05% (w/v) de Tween-20 et 1% (w/v) de gélatine. ils ont ensuite été incubés pendant 30 minutes en présence de peroxidase de raifort conjuguée à des anticorps anti-souris de chèvre, dilués à 1/3000 dans un tampon TBS-Tween contenant 1% de gélatine. Toutes les bandes ont été lavées et une fois dans un tampon TBS-Tween et deux fois dans le TBS. Le substrat a été préparé pour l'utilisation, en utilisant 60 mg de réactif de développement de couleur HRP aans 20 ml de méthanol à 40C, 100 nl de TBS et 60p1 de 30% de H202 . La réaction a été arrêtée en rinçant les bandes avec de l'eau distillée. Etude de la fixation des plaquettes Le nombre d'anticorps monoclonaux LYP20 ET LYP21 marqués avec I-' 25 fixés à des plaquettes non stimulées et à des plaquettes stimulées (par 1'ADP et la thrombine) ont été testés selon la méthode par McGregor et Al. (1986) Eur. J. Biochem. 159, 443-449. Lorsque la thrombine (lU/ml) a été utilisée, son activité a été bloquée avec 10-6 M PPACK avant l'addition des autres réactifs. Les plaquettes non stimulées et stimulées ont été incubées avec différentes concentrations des anticorps monoclonaux marqués P20 ou P21 (0,1 à 4pg/ml) pendant 30 minutes à 250 C.Ensuite 50p1 de la suspension ont été repris et étalés sur des tubes Eppendorf 400 pl contenant 300 pl de 20% (w/v) sucrose et 2% (w/v! BSA dilués dans une solution de Tyrode, Les tubes ont été centrifugés dans une microcentrifugeuse Eppendorf, pendant 6 minutes. Les extrémités des tubes de centrifugation ont été coupées et la quantité d'anticorps marqués avec l'iode 125 (12I) fixés a été déterminée avec un compteur gamma. La fixation non spécifique a eté réalisé par l'addition d'anticorps non marqués 100 fois concentrés. Le nombre de sites de fixation et la constate de dissociation (CD) ont été déterminés par analyse Scatchard. Agrégation et Sécrétion plaquettaires Des études d'agrégation ont été réalisées avec des plaquettes lavées traitées avec la sérotonine 14C selon la méthode de Çreenberg et ai. (Lab. Invest 1975 vol 32 p 476) . Les plaquettes, ajustées à 2 x 108 plaquettesXml ont aggrégé avec 2,5 uM ADP, 2ug/ml de collagène ou 0,016 U/ml de thrombine en présence ou à l'absence soit de l'anticorps monoclonal P20 soit de l'anticorps monoclonal P21, (anticorps monoclonal complet ou fragment F(ab)'2). Après chaque agrégation, la suspension a été microcentrifugee- et 100 l de surnageant ont été passés dans un compteur-ss pour mesurer le niveau de sécrétion. Adhésion plaquettaire Les études d'adhésion ont été réalisées sur des plaquettes lavées traitées avec du slCr (0,1 mCi par 5 x 109 plaquettes) selon la méthode décrite par Cazenave et al. (Lab. Invest n 34 p 471,1976), PAGE1 (20 ng/n:l) a été ajouté à une solution de Tyrode pendant toute la procédure. Les puits plastiques ont été recouvris avec 100 pl de BSA (0,5 %) , de la fibronectine (2 pg/ml), du fibrinogène (2 g/r:.l) ou du collagène (2 g/ml) dans 25 mM de tampon de bicarbonate à pH 9,5 pendant 3 heures à 370C. Les puits.ont été bloqués pendant 90 minutes à température ambiante avec 1 % de BSA. Les plaquettes ajustées à hauteur de 5 x 108 cellule/ml ont été préincubées avec soit l'anticorps monoclonal P20 ou l'anticorps monoclonal P21 (10 pgSml) à 370C pendant une heure. La suspension de plaquettes préincubées (100 pl) a été ajoutée à chaque puits et soumise à réaction à 370C pendant une heure Tous les puits ont été lavés soigneusement dans une solution de Tyrode afin d'enlever les plaquettes nDn accrochées. Les puits ont ensuite été séparés et souris un comptage individuel sur compteur gamma. RESULTATS isole.ent des glycoprotéines de membranes plaquettaires Des extraits de plaquettes obtenus après traitement avec un détergent ont été solubilisés dans 1 % de DOC et soumis un chroratographie d'affinité (WGA) en présence de 0,5 % DOC à pH 8,6. Aucune glycoprotéine du complexe GPIIb-IIIa n'était présente dans la fraction éluée comme le montrent les analyses SDS-PAGE et ELISA. Après dialyse contre 0,1 % de Lubrol WX, cette fraction a été appliquée sur une colonne Q d'échange d'anions à flux rapide, et éluée dans du Nazi. Le premier pic contient quatre protéines comme le montre le résultat de SDS-PAGE. Les poids moléculaires étaient respectivement de 85, 120, 130 et 150 kD dans des conditions non réductrices et 85, 125, 140 et 155 après réduction.Aucune glycoprotéine GPIb n'était présente dans cette fraction comme le montre la détection après coloration à l'argent du gel. Cependant, la GPIb était présente dans le pic ne 3. La première fraction a été séléctionnée pour immuniser les souris de façon à produire des anticorps monoclonoaux spécifiques pour les quatre antigènes de membrane plaquettaire. Production anticorps monoclonaux Des surnageants d'hybridomes ont été criblés avec un mélange de 4 glycoprotéines obtenues à partir d'un concentré de plaquettes traitées selon le mode opératoire ci-dessus en utilisant la technique ELISA. Plusieurs surnageants ont présente une réaction vis à vis du mélange d'antigènes. Les anticorps sélectionnés P20 et P21, ont été purifiés sur Sépharose protéine A et ces deu > : anticorps ont été caractérisés comme étant des IgGl puisqu'ils sont été élués à p.'i 6. Identification dc l'antigène Plaauettaire reconnu par P20 et P21 Les lysats de plaquettes marquées immunoprécipités par P20 et P21 ont été comparés dans la méthode SDS-PAGE, à coux immunoprécipités par l'anticorps S12 dirige. contre la GMP-140 et décrit par McEver dans la publication déjà citée. Une autre comparaison a été faite vis-å-vis de l'anticorps monoclonal spécifique du complexe GPIIb-IIIa. Des autoradiogrammes (Fig. 2) montrent clairement que l'antigène reconnu par P20 n'est ni la GPIfb ni la GPIIIa. Le poids moléculaire apparent de cet antigène a été estimé à environ 130 kD (non-rduit) et 140 kD (réduit).L'antigène reconnu par P20 migre en meme temps que l'antigène immunoprcipite par un anticorps S12 de McEver qui n'inhibe pas les fonctions plaquettaires. Les mimes résultats ont été obtenus avec P21. Ce résultat a été confirmé par une analyse Western blot. L'anticorps monoclonal P20 s'accroche spécifiquenent à -l'antigène dans des conditions dénaturantes non-réductrices. Le poids moléculaire apparent. de la tache était estime à 128 kD. Cependant, P21 a reconnu l'antigène dénaturé dans des conditions non-réductrices et réductrices (Fig. 3). Accrochage de l'anticorps P20 aux plaquettes lavées Des plaquettes lavées (4 donneurs) ont accroché 2.400 + 266 molécules d'anticorps P20 marqués, par plaquette non-stimulée (K=2,3nM + 0,54) et 12.200 t 1184 molécules d'anticorps P20 marquées par cellule après stimulation avec la thrombine (K=5nM + 0,61) (Fig. 5). L'anticorps marqué P21 n'a reconnu ni les plaquettes au repos ni les plaquettes stimulées. Effet des anticorps P20 et P21 sur l'adhésion plaguettaire Ni P20 ni P21 n'ont un effet significatif sur l'adhésion des plaquettes présentes sur des puits plastiques recouverts de fibronectine, de fibrinogène ou de collagène (Fig. 5). Effet de P20 et P21 sur l'aqréqation plasuettaire et la sécrétion P20 inhibe partiellement l'agrégation induite à 1'ADP (60 %), au collagène (63 %) et à la thrombine (50 %j comparée au contrôle. Des fragments Fab de P20 permettent l'obtention des merles résultats. P20 permet aussi la réduction de la sécrétion plaquettaire induite par le collagène et la thrombine. P21 n'a pas d'effet sur l'agrégation plaquettaire. DISCUSSION Des anticorps monoclonaux dirigés contre la GMP-140 des plaquettes solubilisées ont été produits. Ces ' anticorps P20 et P21 testés par immunoprécipitation ont montré qu'ils présentent une spécificité pour l'antigène de membrane plaquettaire également reconnu par l'anticorps S12 de McEver. Cependant, à la différence de l'anticorps S12, P20 et P21 sont dirigés contre un épitope conformationel de la GMP-140. De plus, P20 module les fonctions plaquettaires. Une autre caractéristique de ces anticorps est qu'ils reconnaissent la GMP-140 dénaturée comme le montrent les résultats positifs de Western blot. P20 reconnait uniquement la GMP-140 non-réduite alors que P21 reste actif contre la GMP-140- réduite. Ces résultats suggèrent que le site de liaison du P20 contient des ponts disulfure. En revanche, le site de liaison de P21 ne contient probablement pas de ponts disulfure. On peut- conclure à ce stade que P20 et P21 sont spécifiques d'épitopes différents sur la GMP-140 plaquettaire. Les plaquettes au repos lavées ont permis de fixer environ 2000 molécules d'anticorps P20 marqué avec l'iode. Après activation des plaquettes avec l'alpha-thrombine, les plaquettes ont accroche environ 12 000 molécules d'anticorps P20 marqués. L'activation à 1'ADP n'a pas accru la liaison des anticorps P20. Les plaquettes ont probablement été légèrement activées pendant les étapes de lavage bien que PGE1 et PPACK aient été ajoutées au niveau du premier lavage. Les anticorps P21 marqués ne s'accrochant ni aux plaquettes au repos ni aux plaquettes sti-ulées avec la thrombine. Ces résultats se sont averés positifs. On en conclut que P21 ne s'accroche pas à des plaquettes entières qu'elles soient actives ou non, ltépitope reconnu par P21 n'étant en pas accessible sur la membrane native de la GMP-l40. Le site de liaison de P21 pourrait etre exprimé soit sur la face cytoplasmique de GFIP-14Q. cette séquence demeurant cytoplasmigue après l'activation et l'expression des alpha-granules au niveau de membrane. On pourrait également penser que l'accrochage de P21 n'est pas possible à cause de la conformation de la GMP-140 native qui masque l'épitoge de P21. Cependant, P21 réagit avec des plaquettes entières solubilisées dans le Triton X-100 et soumises à une immunoéietropborèse croisée, conditions qui ne sont apparement pas dénaturantes. P20 inhibe partiellement l'agrégation plaquettaire et la sécrétion. S12 est connu pour son absence d' effet au niveau de l'agrégation plaquettaire. Ceci confirme bien que S12 et P20 sont dirigé:; contre des épitopes différents. L'effet inhibiteur de l' anticorps P20 sur l'agrégation plaquettaire induite par la thrombine ourle collagène est tout à fait en accord avec la localisation de la GMP-140 à l'intérieur de la membrane des alphagranules. Après activation avec la thrombine ou le collagène la membrane des alpha-granules fusionne avec la membrane plasmatique des plaquettes et la GMP-140 devient un recepteur de surface. De plus, la sécrétion de Sérotonine C14 est affectée par la présence de P20. EXEMPLE 5: Recherche de la présence de glycoprotéine qpIIb-IIIalike sur des tissus normaux et des tissus néoplastiques. grâce à des anticorps LYP18 Matériels et méthodes Etudes de tissus Des tissus normaux, anormaux et des tissus présentant des lésions benignes de la peau ont été obtenus auprès du Département de Pathologie et du Dermatologie à l'université de Stanford au centre médical. 16 échantillons des tissus normaux d'organes séléctionnés (tableau li et 96 biopsies de tumeurs (tableau 2 t 3t ont été obtenus auprès du département de pathologie.Les biopsies de tumeur comprennent 21 cas d mélanomes malins présentant des métastases au niveau des ganglions lymphatiques, 20 cas de lymphomes n appartenant pas à la catégorie des lymphomes Hodgkin (1 petit lymphocytaire, 5 folliculaires divisés, 3 folliculaires mixtes, 3 diffus à petites cellules, 2 diffus à grandes cellules, 1 à grandes cellules immunoblastique, 3 à petites cellules non-clivées et 2 lymphoblastiques, 4. cas de maladie de Hodgkin à cellularité sixte, 2 cas de thymome, 28 cas de carcinomes comprennant 19 cas de carcinomes primitifs (sein 6, ovaire 4, oropharynx 3, poumon 2, colon 2, estomac 1, thyroide 1) , 9 cas de carcinomes métastatiques dans les ganglions lymphatiques (3 adénocarcinomes, 3 malpighiens. 3 faiblement différenciés), 7 tumeurs neuroendocrines (4 carcinomes du poumon à petites cellules indifférenciées, 2 tumeurs des ilots pancréatiques et un carcinome medullaire de la thyroide), 1 cas dysgerminome des ovaires, 10 cas de sarcomes (5 ostéosarcomes, 3 sarcomes d'Ewing et 2 histiocytofibromes malins et 3 cas de neuroblastomes. 13 cas de lésions benignes de la peau ont été obtenus au département de dermatologie comprennant 9 nevis (1 jonctionnel, 1 composé, 2 dermiques, 2 displastiques et 3 congénitaux, 3 lentigines et 1 dermetofibrone. Anticorps monoclonaux Les anticorps nonoclonaux LYP2 et. LYP18 ont été séléctionnés pour réaliser les expériences ci-après. LYP2 (IgGz) et LYP18 (IgG2a) ne croisent pas lors d'une immunoélectrophorèse croisée avec les glycoprotéines de plaquettes IIb ou IIIa séparées par l'EDTA mais reconnaissent un déterminant présent sur le complexe glycoprotéique IIb-IIIa intact dépendant du calcium (McGregor et al, Eur J Biochem 1986, 159: 443-449). LYP2 et LYP18 ont été purifiés à partir de fluide d'ascite sur une colonne protéine A-Sepharose 4B comme décrit dans la référence McGregor et al prédédemment cité, à des concentrations.s'étalant dans un intervalle de 1,0 à 1,5 mg/ml et en utilisant une dilution de 1:200.L'anticorps monoclonal dirigé contre une glycoprotéine 111e de plaquette (IgGl) a été obtenu auprès de Dakopatts (Santa Barbara, CA) sous forme d'un surnageant de culture puis utilisé à une dilution de 1:50. L'anticorps monoclonal purifié Leu 9 (CD7)(IaG2a) a servi d'anticorps contrôle à une dilution de 1:200 et a été obtenu de Becton-Dickinson (Mountain View, CA). Marquage immunohistoloqique Tous les tissus normaux, anormaux ainsi que les spécimens présentant des lésions bénignes de la peau ont été directement congelés, traités dans la même façon et colorés comme décrit par Bindl (Am J Ciin Patio) 1986.85 : 490-493). En bref, des sections en série congElées séchées à l'air, fixées avec de l'acétone (4-5 pm) ont été incubées pendant 3d minutes dans une chambre humidifiée, avec les différents anticorps mcnoclonaux.Les sections ont ensuite té incubées par série (avec des lavages dans un tampon salin de phosphate entre les incubations dans un récipient de Coplin contenant des immunoglobulines anti-souris de chèvres biotinylées (Jackson SmmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Puis ces sections ont été traitées avec de la peroxidase de raifort conjuguée avec de la streptavidine (Jackson), chaque incubation durant 30 minutes à 40C. La coloration a été développée avec 3 mg/ml 3,3 diaminobenzidine (Sigma Chemical Co/, St Louis, MO) et 0,3 % de peroxide d'hydrogène, pendant 5 minutes à température ambiante.Après coloration du produit de réaction avec du sulfate de cuivre 0,5 % dans du NaCl 1N pendant 5 minutes, les sections ont été lavées, colorées avec 2 % de bleu de méthylène, déshydratées et recouverus d'une lamelle. Pour l'étude de la lésion mélanocytaire pigmentée, la phosphatase alkaline conjugée avec la streptavidine (Jackson) a été substituée à la peroxidase et la coloration a été réalisée dans un Fast Red Salt (FRS, Sigma) pendant 2d minutes contre décrit précédemment. Résultats LYP18 colore fortement les mégacaryocytes dans la moelle osseuse, les plaquettes, ainsi que les capillaires recouvrant les cellules endothéliales, les vénules et les artérioles présents dans des tissus normaux. L'anticorps monoclonal LYP18 présente égalent une forte réaction de coloration avec I'épithélium glomérulaire'des glandes endométriques et colore faiblement les cellules des muscles lisses. Cependant, un grand nombre de tissus normaux, provenant de différents organes n;a pas été coloré avec l'anticorps monoclonal LYP18 (tableau 1 > . Les anticorps monoclonaux LYP2 ont coloré les mégacaryocytes et les plaquettes avec la même intensité que LYP18 mais ils n'ont pas présentés de liaison avec les autres tissus normaux. L'anticorps monoclonal de controle Dako, dirigé contre la gpfIIa colore fortement les mégacaryocytes, les plaquettes, l'épithélium glomérulaire et les glandes endométriales, mais colcre faiblement les cellules endothéliales et les cellules du muscle lisse. Parmi les cellules normales d'un type donné, on observe pas de variation significative de l'intensité du nombre de cellules colorées par ces 3 anticorps monoclonaux. Parti les 21 cas de mélanomes étudiés, 16 (75%) ont donne lieu à une réaction avec l'anticorps LYP18. Les anticorps monoclonaux. LYP18 produisent une coloration variable au niveau des mélanomes. A l'exception d'un seul cas de coloration très faible., on a remarqué aucunc variation de cellule -à cellule dans l'intensité de la coloration pour chaque cas particulier. LYP18 présente un aspect de marquage cytoplasmique fin et diffus avec une coloration renforcée au niveau de la membrane périphérique. Les intensités de coloration et le pourcentage de mélanomes liés avec l'anticorps Dako anti-gpIIIa est identique à la ccloration obtenue avec LYP18. LYP2 ne se fixe pas au mélanome malin métastatique. En revanche les mélanocytes normaux présents au niveau de la peau8gjde lentigines(;)1des dermatofibromes (1) et des mélanocytes activés formant un nevi()y compris les cas étudiés jonctionnel(l) composé(1),dermique(2),displastique(2)et congénital (3) ne permettent pas l'accrochage des anticorps LYP18, LYP2 ou Dako anti-gpIIIa (tableau 2). Parmi les 75 tumeurs non mélanocytaires, seulement 3 (4% > ont entraîné une coloration pour LYP18 (voir tableau 3): un carcinome thyroidien papillaire métastatique, un adénocarcinome endometrolde primitif des ovaires, montrant une positivité focale et un ostéosarcome faiblement marqué. 96% (72 parmi 75 > ont pas présenté d'accrochage d-- LYP18. Les anticorps Dako anti-gpIIIa se sont accrochés à différentes tumeurs, de la même façon que le LYP18. LYP2 n'est pas lié àux différentes tumeurs étudiées. Discussion Ces études démontrent la présence de glycoprotéines IIb-IIIa-like sur les cellules de- mélanomes malins métastatiques et l'absence de ces complexes glycoprotéiques sur des mélanocytes bénins. Des sections congelées de biopsies de mélanomes n'ont pas été reconnues par d'autres anticorps ronoclonaux (LYP2) également dirigés contre le complexe plaquettaire IIb-IIIa mais ont reconnu l'anticorps monoclonal anti-gpIIIa Dako ce qui suggère que l'un des composantes du complexe intégrine sur les mélanomes malines métastasiques est la gpIIIa. L'absence de reconnaissance par LYP2 pourrait indiquer des différences de structure entre les glycoprotéines IIb-IIIa-like des mélanomes et le complexe plaquettaire. La présence de glycoprotéines IIb-IIIa-like encore désignées par cytoadhésines sur les cellules des mélanomes malins mais pas sur des cellules de mélanocytes bénins, peut être interprêtée comme l'expression aberrante d'antigène ayant lieu lors du processus de passage à l'état malin. Les cytoadhésines présentes sur les mélanomes peuvent donner aux cellules malignes des propriétés qui peuvent faciliter l'invasion métastatique et peuvent également expliquer leur interaction avec les protéines adhésives de la matrice extracellulaire et avec d'autres cellules du sang. La raison pour laquelle un quart n'a pas été reconnu par LYP18 n'est pas claire. il est possible que les cellules tumorales n'aient pas synthétisé ces glycoprotéines ou que les antigènes aient été exprimés mais à un niveau non détectable. Si la première hypothèse est correcte, elle peut impliquer le fait que l'expression des glycoprotéines de IIb-IIIa-like n'est pas un facteur essentiel pour l'établissement de métastases dans les mélanomes malins. Parmi les différents néoplasmes n'appartenant pas au type des mélanomes, seulement 4% présentaient une liaison avec LYP18. La réactivité de LYP18 avec 3 sur 75 néoplasmes non mélanocytiques malins, pourrait être due a la synthèse d'antigènes IIb-fIIa-like par ces tumeurs. Une autre hypothèse peut être que ce même épitope est- présent sur une molécule différente ou qu'une coloration non spécifique a eu lieu. L'absence de réactivité de LYP18 avec une grande majorité des tumeurs non mélanocytaires étudiées suggère que l'expression aberrante des glycoprotéines IIb-IIIa- like n'est pas universelle pari les cellules malignes. y compris les cellules métastatiques. EXEMPLE 6 Ihibition in vivo de la croissance des mélanomes humains par 1' anticorps LYP1S diriqé contre le complexe qlycoprotéique IIb-IIIa. Dans cette expérience on a testé la fixation de l'anticorps monoclonal LYP18 dirigé contre la glycoprotéine IIb-IIIa des plaquettes humaines sur une lignée cellulaire de mélanome humain fortement tumorigène (M3Dau). Les résultats da ce test montrent que les cellules de mélanome M3Dau se fixent spécifiquement aux anticorps LYP18 marqués à 'tI. Pour étudier le rôle biologique des glycoprotéines IIb-IIIa-like présentes en surface de mélanomes, une lignée de cellules de mélanome M3Dau a été incubée avec LYP18, ou avec un anticorps monoclonal de contrôle dirigé contre d'autres antigènes de surface de cellules de mélanome, puis implanté selon un mode sous-cutané chez des souris nude. Les resultats montrent que LYP18 inhibe considérablement la croissance de tumeurs in vivo. LYP18 n'est pas directement cytotoxique vis-à-vis des cellules de mélanome. Ces résultats démontrent que la glycoprotéine gpIIb-IIIa-like est présente sur des cellules de mélanome et joue un rôle important dans la croissance des cellules tumorales.Il est donc possible de penser à l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre certains récepteurs cytoadhésifs de tumeurs pour le traitement des tumeurs. MATERIELS ET METHODES - Cellules Les lignées cellulaires M3Dau ont été obtenues à partir d'une métastase acromique de la peau d'un patient présentant des mélanomes malins et les études d'immunofluorescence ont été réalisées comme rapporté précédemment. - Immunoprécipitation par LYP18 Des cellules confluentes de mélanome ont été marquées en surface avec 1251 ou ont été marquées métaboliquement avec la méthionine 35 S pendant 24 heures. Les lysats de cellules de mélanome extraits avec le triton X100 ont été immunoprécipités avec LYP18 ou avec une IgG de souris non immune, puis analysés par électrophorèse sur gel de SDS (SDS-PAGE) comme décrit précédemment. LYP18 ne se fixe pas à la gpIIb ou à la gpIII des plaquettes séparées par EDTA, d'après un résultat d'immunoélectrophorèse croisée, mais se fixe à un déterminant présent sur le complexe gpIIb-IIIa intact, médié par le calcium. - Fixation de LYP18 sur des cellules de mélanome Les cellules de mélanome humains poussant jusqu'à confluence ont été détachées des plaques de culture par la trypsine-EDTA ou par l'EDTA, puis resuspendues dans un milieu RPMI 1640 contenant BSA 2mgiml. Des concentrations croissantes de LYP18 12 sI ont été ajoutées et incubées pendant une nuit à 40C. Une fixation non spécifique de LYP18 marqué a été obtenue en utilisant un excès (100 fois) de LYPi8 non marqué. Le nombre de sites de fixation par cellule et la constante de dissociation ont été obtenus par analyses à l'aide d'un programr!e informatique désigné par "double-réciprocal plots and least-squares analysis". - Effet de LYP18~ sur la croissance des mélanomes tumoraux chez des souris. 200 microlitres de cellules M3Dau l.lOS ont été greffées de façon sous-cutanée sur le ventre de souris nude après pré-incubation pendant 20 minutes avec I'anticrrps LYP18 purifié, ou avec un anticorps GoAs (dirigé contre un antigène de surface des cellules de mélanome différent de la gpIIb-IIIa-like) ou une IgG2a de souris non immune (même isotype que LYP18) à une concentration finale de 35g/ml. Les tailles des tumeurs à différents moments ont été exprimées sous forme de la moyenne de la somme des diamètres opposés. Dans des études réalisées après la transplantation, LYP18 a été injecté 2, 14 et 21 jours après l'implar.tation de la tumeur. Dans ces expériences, 5 souris cnt été utilisées pour chaque test. RéSULTATS L'anticorps LYP18 présente une capacité de fixation sur des cellules de mélanome M3Dau. A partir de lysats de cellules de mélanome marquées en surface avec l^tI, LYP18 a immunoprécipiti deux protéines présentant le même poids moléculaire apparent que la glycoprctéine gpIIb et la glycoprotéine gpIIIa des membranes plaquettaires avec des changements caractéristiques dans la mobilité lors d'une réduction. Les études de marquage métabolique ont confirre que la gpIIb-IIIa-like était synthétisée par ces cellules Ces résultats démontrent clairement que la lignée M3Dau synthétise et exprime des protéines sur sa surface, protéines qui sont imunologiquement liées aux glycoprotéines gpIIb-III2 des plaquettes. Pour déterminer le nombre de molécules gpIIb-IIIa-like exprime à la surface des cellules de mélanome, des études de fixation de LYP18 marqué avec 1251 ont été réalisées. La fixation de LYP18 aux cellules de mélanose M3Dau était spécifique, dépendait de la concentration et était saturable avec environ 337.000 + 61.200 molécules par cellule (moyenne + déviation standard et une constante de dissociation (kd) de 6,8nmol/l. Les cellules de mélanome M3Dau poussent après injection sous cutanée chez des souris nude et produisent des ruasses tumorales aux sites d'implantation. Elles ont été utilisées comme modèle pour étudier l'invasion locale des cellules tumorales à travers la membrane basale. Le rôle biologique de la gpIIb-IIIa-like au niveau des cellules MRDau a été étudié en incubant des cellules de mélanome avec une quantité saturante de LYP18 (7 pg/106 cellules dans 200 l aliquotes), en injectant le mélange de façon sous-cutanée à des souris nude et en suivant la croissance des tumeurs in vivo. Des controles ont été réalisés avec les deux anticorps décrits ci-dessus G7As et igGza non immuns de souris de même isotype que LYP18, à la même concentration que LYPî8. La croissance des tumeurs de M3Dau chez les souris de contrôle est palpable après 20 jours et mesurable après 26 jours.Avec l'addition de LYP18, la croissance des tumeurs de M3Dau n'est pas visible ou palpable apres 26 jours et devient mesurable après 40 jours(figure 8). En augmentant le temps d'incubation à plus de 50 jours, on obtient de petites tumeurs visibles, à croissance plus lente ,que celles des contrôles et visibles uniquement chez l'une des 5 souris(figure 8). Un degré similaire d'inhibition de la croissance des tumeurs par LYP18 a été observé même lorsque plus de cellules de mélanome (2 x 106 cellules) ont été -utilisées.L'absence d'effet causé par les anticorps G,A5 anti-mélanome suggère que l'inhibition observée avec LYP18 in vivo n'était pas due a une cytotoxlcité dépendante du complément ou à une cpsonization. L'étude de la possibilité pour LYP18 d'avoir un effet cytotoxique direct sur les cellules de mélanome a été réalisée en préincubant ces cellules avec un excès de LYP18 (70pg/ml) et en suivant la viabilité des cellules et de leur croissance. Aucune perte de viabilité cellulaire des mélanomes n'a été détectée avec l'exclusion par le bleu trypan. De plus, les cellules traitées par l'anticorps contrôle et par LYP18 présentent un degré similaire de rétention de thymidine-3H et de croissance cellulaire in vitro. Les études après transplantation ont permis de déterminer si LYP18 inhibait la croissance tunorale dans le cas d'une injection après l'implantarion de de la tumeur. LYP18 injecté deux jours après la greffe de cellules tumorales montre un effet inhibiteur de 50% de la croissance tumorale. Cependant, l'injection de LYP18 au jour 14 ou 21 ne montre aucune réduction significative de la croissance tumorale comparée au résultat obtenu avec le contrôle (figure 9). DISCUSSION Cette étude démontre que les glycoprotéines IIb- IIIa-like sont synthétisées et présentes sur une lignée cellulaire de mélanome humain et jouent un rôle fondamental dans la croissance tumorale des cellules. L'utilisàtion d'une chromatographie d'affinité sur RGDS-sépharose a révélé deux protéines de poids moléculaires similaires à celui des glycoprotéines de plaquettes gpilb-IIia dans la lignée cellulaire de mélanome M21. Un autre anticorps monoclonal LYP2 également dirigé contre le complexe plaquettaire gpIIb-IIIa ne se fixe pas sur les cellules de mélanome M3Dau ou précipite l'une quelconque des protéines de ces cellules. L'absence de reconnaissance par LYP2 des antigènes de mélanome pourrait indiquer une différence de structure entre les glycoprotéines gpIIb-IT'a-like de la lignée M3Dau et leur contrepartie sur les plaquettes. ta croissance des cellules de tumeurs représente une interaction complète entre les cellules tumorales et leur matrice du stroma. Le stroma d'une tumeur est composé de fibrine, de fibronectine, de laminine, de collagène et d'autres tissus connexes, en plus de vaisseaux sanguins et de cellules inflammatoires. L'anticorps monoclonal LYP18 s'accrochant à la gpfb- fIfa-like pourrait bloquer des interactions critiques entre les cellules de mélanome et les céllules de la matrice du stroma, nécessaires pour la survie et la croissance des lignées M3Dau et cette fixation pourrait favoriser l'accès des macrophages et leur activation conduisant à une destruction rapide des mélanomes in vivo. Les études réalisées après la transplantation indiquent que LYP18 est plus efficace quand il est injecté au moent de l'implanttation de la tumeur. suggérant que LYP18 interfère avec une ou plusieurs étapes précoces de l'établissement de la tumeur. Les études d'immunocytochimiques réalisées sur des biopsies de tissu congelé en utilisant LYP18 montrent la présence de gpIIb-IIla-like sur des mélanomes malins métastasiques mais pas sur des mélanocytes humains bénins. EXEMPLE 7 Inhibition des monocytes transformés, par LYP20. Dans un premier temps des monocytes transformés US37 ont été incubés pendant 30 minutes avec des plaquettes stiumées avec la thrombine (0,0 U/ml). A l'issue de cette incubation, on a détecté des rosottes de plaquette stimulées autour des cellules U937. Dans un second temps l'anticorps monoclonal LYP20 (60 pg/ml) a été ajouté aux plaquettes stimulées pendant 5 minutes avec la thrombine. Puis on a ajouté du PPALK de manière à inhiber la thrombine. Ensuite les plaquettes ont été mises en présence des monocytes transformés U937 et incubées pendant 30 minutes. Le résultat obtenu montre en microscopie que LYP20 inhibe d'environ 50% la formation des rosettes. Par conséquent LYP20 inhibe d'environ 50% l'interaction plaquettes-monocytes transformés. Tableau I : Réactivité de LYP18 aux sections congelées de tissus normaux Tissus Coloration des types cellulaires * Moelle osseuse megacaryocytes Amygdales O Thymus o Rate 0 Ganglion lymphatique 0 Sang périphérique 0 Foie o Reins épithelium glomérulaire Peau 0 Estomac 0 Thyroide o Poumon O Prostate 0 Seins 0 Utérus glandes endometriales * Tous les tissus présentent une réactivité de LYP18 avec les cellules endothéliales et avec les plaquettes dans les sections de tissus. Tableau 2 : Fixation de LYP 18 aux élanones et aux iélanocytes normaux sur des sections congelées. Lésions Nombre de réactions/Nombre testés Mélanomes 16/21 (75%) N. Mélanocytes Peau normale 0/2 Lentigines 0/3 Dermatofibrome 0/1 Nevi 0/9 Tableau 3: Réaction de LYP18 avec des sections congelées de différentes tumeurs Types histopathologiques Nbre de reaction/Nbre testés Lymphomes non Hodgkiniens 0/20 stade initial 0/9 stade intermédiaire 0/5 stade avancé 0/6 Maladie de Hodgkin (MCHD) 0/4 Thymomes 0/2 Carcinomes metastatiques malpighien 0/3 glandulaire 1/3 Tumeures neuroendocrines bien differentiées 0/3 mal différentiées 0/4 Sarcomes ostéosarcome 1/5 sarcoe Erwing 0/3 M.F.H. 0/2 Autres neuroblastome 0/3 dygermonome 3/75 REVENDICATIONS 1/ Agent capable de moduler les interactions entre des cellules de type monocytes et des plaquettes stimulées, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal selon la revendication 2 de la demande principale. 2/ Agent selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'anticorps LYP20 3/- Composition pour le diagnostic in vitro de la présence de cellules tumorales de mélanomes, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps LYP18 selon la revendication 6 de la demande principale.