Brevet FR2649409A2 — publié le 19910111

FR 2649409 A2 19910111 FR 8908947 A 19890704 La présente Addltion est relative à un nou- veau vecteur jauge de promoteur actif dans la cyanobacté- rie, capable de fournir des vecteurs d'expresslon. Un des vecteur jauge de promoteur actlf conforme au Brevet principal se caractérise par le' fait qu'll comprend: (a) un segment d'ADN contenant une origine de réplicatlon fonctionnelle dans E. col et un gène de ré- sistance à un antibiotique approprié, permettant la sé- lection de transformants dans la cyanobactérle; (b) un gène dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité soit alsément détectable SOlt par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antlblotique, soit les deux; (c) immédiatement en amont de ce gène, un site multiple de clonage, dans lequel on peut introduire une séquence de promoteur approprié; (d) en amont de ce site multiple de clonage, un signal terminateur de transcription, qui empêche la transcription à partir de tout autre promoteur qui seralt situé en amont de celul introduit au site multiple de clonage, et (e) un fragment de plasmlde de Synechocystls sp. de 2,3 kb, qui correspond à la partie cyanobacté- rienne dudit plasmlde, ledit vecteur jauge de promoteur étant réplicatif dans la cyanobactérie, permettant de tester des séquences promoteurs dans ladite cyanobactérle et étant capable de fournir des vecteurs d'expression. Conformément au Brevet principal, le vecteur jauge de promoteur actif tel. que défini dans celui-ci constitue une partie d'un vecteur d'expression de gènes de protéines ou de polypeptldes dans une cyanobactérle pour les produire sous forme de pclypeptides marqués au 14C. Les vecteurs jauges de promoteurs actifs conformes au Brevet principal comportent nécessairement un fragment d'un plasmide de Synechosystzs sp. de 2,3 kb, qui correspond & la partie cyanobactérlenne dudit plas- mide. Il serait cependant intéressant de pouvoir disposer de vecteurs se multipliant à la fois dans E. coli et dans les cyanobactéries tout en ne comportant pas de fragments cyanobactériens; de tels vecteurs seraient notamment plus faciles à construire. La présente invention a pour but de pourvoir à un vecteur jauge de promoteur actif se répliquant à la fois dans E. coli et Synechocystls sp. et fournissant des vecteurs d'expressions conformes au Brevet principal. La présente invention a pour objet un vecteur jauge de promoteur actif permettant de tester dans des conditions appropriées l'efficacité de séquences promo- teurs dans la cyanobactérie et étant capable de fournir des vecteurs d'expression dans une cyanobactérie, compre- nant: - un gène dépourvu de son promoteur, mals dont l'activité est aisément détectable, soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique, soit les deux; immédiatement en amont de ce gène, un site multiple de clonage, dans lequel on peut introduire une séquence de promoteur approprié; - en amont de ce site multiple de clonage, un signal terminateur de transcription, qui empêche la transcription à partir de tout autre promoteur qui serait situé en amont de celui introduit au site de clonage, ca- ractérlsé en ce qu'il comprend en outre un segment d'ADN contenant une origine de réplicatlon provenant d'un plas- mide ubiqultaire, fonctionnelle à la fois dans E. coli et dans les cyanobactérles et au moins un gène de résistance à un antibiotique approprié, permettant la sélection de transconjuguants dans la cyanobactérle. Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, le plasmide ublquitalre est un plasmide Inc Q. Les plasmldes ublqulitaires Inc Q sont notam- ment décrits dans l'artlcle au nom de T.J. SCHMIDHAUSER et al., ("BroadHost Range Plasmid Clonlng vectors for Gram-negative bacteria") paru dans "Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses" (RODRIGUEZ R.L. et DENHARDT D.T. Eds, 1987, 285-332). Les plasmldes Inc Q ont l'avantage d'éviter la construction d'un plasmlde comprenant une origine iso- lée à partir d'un plasmlde cyanobactérien et de permettre directement la répllcation à la fois dans E. coli et dans les cyanobactérles. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qul va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé objet de la pré- sente invention. Il doit bien être entendu, toutefois, que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation. Exemple: Vecteur comportant un plasmide ubiquitaire. Le plasmide Inc Q utilisé est le vecteur pKT210 décrit dans BAGDASARIAN et- al. (GENE, 1981, lU, 237-247), ce plasmide porte un gène de résistance à la streptomycine (Sm') et un gène de- résistance au chloramphénicol (CmR). Ledit vecteur est transféré dans son lntégra- lité dans la cyanobactérie, o il se réplique de façon autonome et o les deux gènes de résistance aux antibiotiques sont exprimés de manière à conférer un phénotype de résistance à l'hôte cyanobactérien, alnsl qu'un haut niveau (1900 unités d'activité spécifique) de chloramphénicol transacétylase. Ce transfert est réalisé par conjugaison en utilisant comme souche donatrice une souche d'E. coli hé- bergeant outre ledit plasmide un plasmide mobilisateur appartenant avantageusement à la classe des plasmides IncP et contenant au minimum les gènes nécessaires au transfert de plasmide par conjugaison lntercellulaire. Un exemple commode de plasmide mobilisateur est le plasmide pRK2013 construit par FIGURSKI & HELINSKI (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1648-1652, 1979), dont la caractéristique est -de posséder les fonctions de transfert des plasmides IncP combinée avec une origine de répllcation de type colK, qui est spécifique de la répllcatlon dans E. coli et qui empêche- donc la répllcatlon du plasmide mobilisateur dans la cyano- bactérle. La conjugalson entre cellules donatrices (E. coli) et cellules receveuses (cyanobactéries) se fait par mise en contact direct dans un milieu permettant un taux de croissance sensiblement égal d'E. coli et de la cyanobactérle (par exemple le milleu BG11 utilisé généralement pour les cyanobactéries, avec addition de glucose à 50 mg/l pour fournir une source de C métabolisable par E. coli). Cette coculture peut se faire indifféremment en milieu liquide sous agitation modérée pendant un à deux jours, en milieu solide sur boite de Petri ou par les techniques plus élaborées de transfert sur filtre utilisées couramment lors d'expériences de conjugaison intercellulaire en laboratoire. Les cellules de cyanobactéries ayant acquis le vecteur pKT210 sont sélectionnées par croissance sur milieu BG11 dépourvu de glucose mais additionné de chloramphénlcol (10 mg/l) et réisolées sur le même milieu après une semaine d'incubation à 3D'C sous illumination dans les conditions usuelles de croissance des cyanobactéries. Le plasmide - pKT210 est ensulte extrait selon le procédé décrit dans l'exemple 4 et utilisé pour transformer des cellules compétentes d'E. coli qul sont étalées et incubées 24 h à 37C sur milieu LB contenant de la streptomycine (20 mg/1). Les plasmides présents dans lesdits transformants confèrent également la résistance au chloramphénicol et ont une carte de restriction identique à celle décrite par BAGDASARIAN et al. (1981) pour pKT210. Conformément au Brevet principal, ledit vec- 0 teur pKT210 associé à un promoteur thermorégulé tel que défini dans le Brevet principal est un vecteur d'expression de protéine dans la cyanobactérie. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vlen- nent d'être décrits de façon plus explicite, elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar- ter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVEMDICATION 1') Vecteur jauge de promoteur actif permet- tant de tester dans des conditions appropriées l'efficacité de séquences promoteurs dans la cyanobacté- rie et étant capable de fournir des vecteurs d'expression dans une cyanobactérie, selon la revendication 5 du Brevet principal, comprenant: un gène dépourvu de son promoteur, mals dont l'activité est aisément détectable, soit par un test enzymatique simple, solt par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique, soit les deux; - immédiatement en amont de ce gène, un site multiple de clonage, dans lequel on peut introduire une séquence de promoteur approprié; - en amont de ce site multiple de clonage, un signal terminateur de transcription, qui empêche la transcription à partir de tout autre promoteur qui serait situé en amont de celui introduit au site de clonage, ca- ractérisé en ce qu'il comprend en outre un segment d'ADN contenant une origine de réplication provenant d'un plas- mide ubiquitaire, fonctionnelle à la fois dans E. coli et dans les cyanobactéries et au moins un gène de résistance à un antibiotique approprié, permettant la sélection de transconjuguants dans la cyanobactérie. 2) Vecteur selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le plasmide ubiquitaire est un plasmide Inc Q.