Brevet FR2654623A1 — publié le 19910524

La présente invention a trait à la médecine et plus précisément à un procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe, que l'on peut utiliser pour le diagnostic de la grippe, l'étude de la structure antigénique des virus et l'obtention de vaccins. On connaît un procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe (W Lin, K Oishi a Ko Aida "Agricultural and biological chemistry", 1975, 39, n 03, pages 759-765). Ce procédé consiste à mettre le producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase en culture en milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux, des stimulants de la croissance Comme producteurs, on utilise des actinomycètes Après la culture du producteur, on sépare le liquide de culture et on le traite par l'éthanol à plusieurs reprises Le précipité obtenu est solubilisé dans un tampon phosphaté et dialysé dans un tampon phosphaté La durée du procédé d'extraction et de purification de la substance est de 12 heures sans compter le temps nécessaire à l'obtention et à l'identification de l'inhibiteur actif de la neuraminidase. Le rendement en produit final est de 33 mg par litre de liquide de culture Le produit final obtenu assure l'inhibition de 80 % de la neuraminidase du virus de la grippe du type A 2. Le procédé mentionné est caractérisé par une longue durée du processus, une activité insuffisante et un rendement médiocre en inhibiteur de la neuraminidase. Le problème posé dans la présente invention est celui de l'augmentation du rendement et de l'activité de l'inhibiteur de la neuraminidase obtenu ainsi que la diminution de la durée du procédé grâce à une modification du producteur et de la technologie de purification de la culture recherchée. Ce problème se voit résolu par le fait que, dans un procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe par la mise en culture du producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase en milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux et des stimulants de la croissance, la séparation du liquide de culture, son traitement par l'alcool éthylique avec extraction subséquente et purification du produit final, selon l'invention on utilise, comme producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase, un microorganisme du genre Staphylococcus aureus. Le nouveau producteur du genre Staphylococcus utilisé dans le procédé selon l'invention possède une haute activité antineuraminidase. Le prccédé selon l'invention est simple, caractérisé par un bon rendement et une haute activité du produit final L'inhibiteur de la neuraminidase des virus de la grippe obtenu assure à 100 % l'inhibition de cette enzyme et est 10 fois plus actif que l'inhibiteur obtenu par le procédé connu L'inhibiteur obtenu selon l'invention est résistant à la chaleur et ne subit aucun changement d'activité sous l'action des acides ou des bases. L'inhibiteur obtenu selon l'invention augmente la reproduction des virus de la grippe, ce qui peut être utilisé pour l'accélération et l'augmentation de la précision du diagnostic, pour l'obtention rapide de vaccins contre les souches circulantes des virus de la grippe et d'un monovaccin destiné à la prévention de la grippe. Dans le but de simplifier la technologie, il est avantageux d'effectuer la purification par la méthode de filtration sur gel Le procédé selon l'invention permet de diminuer la durée du processus d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase Le procédé s'effectue de la façon suivante. Comme producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe, on utilise n'importe quelle souche de Staphylococcus aureus Le producteur est mis en culture en milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux et des stimulants de la croissance La souche d'origine de Staphylococcus aureus est mise en culture dans 5 ml de milieu nutritif pendant 24 heures pour l'accumulation de la culture d'ersemencement, puis dans 100 ml de milieu nutritif pendant 24 heures supplémentaires La culture d'ensemercement obtenue est introduite dans le milieu nutritif de fermentation et mise en culture pendant 24 heures en mélangeant continuellement. Ensuite, on sépare le liquide de culture et cn le soumet à l'action de l'alcool éthylique On sépare le précipité obtenu et on enlève le liquide surnageant Le précipité est lavé à l'alcool éthylique, ensuite solubilisé dans un tampon phosphaté et de nouveau précipité par l'alcool éthylique Le précipité cbtenu est solubilisé, la solution réchauffée et le précipité obtenu enlevé. Le produit final est obtenu à partir du liquide surnageant purifié par filtration sur gel au moyen de Séphadex et séchage subséquent par lyophilisation. La durée de la séparation du produit final selon l'invention est de 5 jours Le rendement en produit final est de 67 à 70 mg par litre de milieu de culture. La substance obtenue est caractérisée par une haute activité inhibitrice, puisqu'une solution à 19/c de cette substance assure l'inhibition de 90 à 100 % de la neuraminidase des virus de la grippe de type A. La haute activité de la substance ne diminue pas après une ébullition prolongée de 10 à 60 minutes et une incubation de 24 heures en milieu à un p H variant de 1,0 à ,0. Pour une meilleure compréhension de la présente invention, les exemples suivants non limitatifs illustrent la rélisation du procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase. Exemple 1 La souche Staphylococcus aureus N O 392 du groupe phage II In de sérotype 18 selon Pillet est mise en culture sur un milieu neutritif de la composition suivante, en % en poids peptone de fermentation 1,C lactose 1, 0 extrait de levure 0,3 Mg 504 7 H 2 O 0,05 tampon phosphaté le complément à 100 p H du milieu: 7,2 Pour l'accumulation de la culture d'ensemence- ment, cn met la souche d'origine en culture dans 5 ml du milieu nutritif de la composition sus-mentionnée pendant 1 jour, puis dans 100 ml pendant un jour supplémentaire La culture s'effectue à une température de 370 C La culture d'ensemencement obtenue est introduite dans 3 litres de milieu nutritif et est cultivée pendant 1 jour en mélangeant continuellement Ensuite, on sépare le liquide de culture par centrifugation à 8000 tours à la minute perdant 15 minutes Le liquide surnageant obtenu est précipité à l'aide d'alcool éthylique à la proportion de 1: 1,5, est maintenu à + 40 C pendant 12 heures et est centrifugé pendant 15 minutes entre 6 et 8000 t/mn Cn enlève le liquide surnageant Le précipité est lavé à l'aide d'alcool éthylique à 60 % et solubilisé au moyen d'un tampon phosphaté de p H 7,2 Ensuite on effectue de nouveau la précipitation à l'alcool éthylique à 60 % à une proportion de 1:1,5 et on centrifuge pendant 15 à 30 mn entre 6 et 8000 t/mn Le précipité obtenu est de nouveau solubilisé dans un tampon phosphaté de p H 7,2, la solution est portée à 1000 C pendant 10 minutes, centrifugée 15 minutes entre 6 et 8000 t/min, le précipité est enlevé. Le liquide surnageant est filtré sur gel dans une colonne de 2,0 x 30,0 cm de Séphadex G 200. La substance éluée est séchée par lyophilisation jusqu'à obtention d'une masse poudreuse homogène sèche Le rendement en produit final est de 67 mg par litre du volume initial du milieu de culture. Le produit final obtenu a une masse moléculaire de 94000 à 12 C 000 CC, contient des protéines et des hydrocarbures en proportion de 1:10 et des acides gras comprenant de 11 à 20 atomes de carbone La composition des protéines en acides aminés est la suivante: phénylalanine, thyrosine, isoleucine, leucine, méthionine, valine, alanine, glycine, proline, glutamine, sérine, thréonine, asparagine, histidine, lysine. Les hydrocarbures de l'inhibiteur sont représentés par les monosaccharides mannose et glucose à la proportion de 24-:1 et par deux hexosamines, galactosamine et glucosamine, en proportion de 1:3,5. Le pic de densité optique de la substance obtenue se situe dans les longueurs d'onde de 210 nm. Du point de vue composition chimique, la substance obtenue est un complexe gluco-lipo protéinique analogue à l'inhibiteur de la neura minidase du virus de la grippe. La substance obtenue possède une activité inhibitrice sur la neuraminidase des virus de la grippe. Des essais en laboratoire de l'activité inhibitrice de la substance obtenue ont été effectués avec la neuraminidase des virus de la grippe des types Ao, Al, A 2. A C,2 ml d'une suspension de virus de la grippe Ao, A 1, A 2, Hongkong 68 (H 3 N 2) de concentration 1:1025 lg 7,5 EID 50, on ajoute 0,2 ml d'une solution aqueuse à 10 % de la substance obtenue Le mélange est incubé pendant 30 minutes dans un bain d'eau à une température de 370 C A une émulsion analogue de virus de la grippe témoin, or ajoute C,2 ml de solution saline physiologique On détermine l'activité de la neuraminidase des virus de la grippe dans tous les échantillons selon la méthode connue Les essais ont été effectués en comparaison avec l'activité de l'inhibiteur obtenu par le procédé connu Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau. Exemple 2 Le procédé est conduit de la même manière que dans l'exemple 1 Ccmme souche productrice, on prend la souche de Staphylccoccus aureus N O 1025 Le rendement en produit final est de 70,3 mg par litre de milieu de culture La substance obtenue est identique, par sa composition chimique, à celle décrite dans l'exemple 1. L'essai de l'activité inhibitrice de la substance obtenue sur la neuraminidase des virus de la grippe A 0, A. A 2 s'effectue de la même manière que dans l'exemple 1. Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau. Exemple 3 Le procédé est conduit de la même manière que dans l'exemple 1 On utilise la souche Staphylccoccus aureus N O 1431 Le rendement en produit final est de 66,7 mg par litre de milieu de culture La substance obtenue est identique par sa composition chimique à celle décrite dans l'exemple 1 L'essai de l'activité inhibitrice de la substance obtenue s'effectue de manière analogue à celle de l'exemple 1. Les résultats des essais sont présentés dans le tableau. TABLEAU Activité inhibitrice (en %) de la substance obtenue à partir de différentes souches de Staphylococcus aureus vis à vis de la neuraminidase des virus de la grippe A Souches du Producteur de l'inhibiteur de la neura- virus de minidase des virus de la grippe la grippe Selon l'exem Selon Selon Procédé ple i l'exem l'exem connu ple 2 ple 3 Souche A 100 100 100 80 o Souche A 1 o 10 C 100 100 80 Souche A 2 100 100 100 80 R E V E N D I C A T I O N S 1 Procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe à l'aide de la mise en culture du producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux et des stimulants de la croissance, de la séparation du liquide de culture de son traitement par l'alcool éthylique avec extraction subséquente du produit final et sa purification, caractérisé en ce que l'on utilise, comme producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase, un microorganisme du genre Staphylococcus aureus. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la purification du produit final s'effectue par la méthode de filtration sur gel.