Brevet FR2656928A1 — publié le 19910712

DISPOSITIF AMELIORE D'IMMUNOTEST DU TYPE PLAOUETTE A PLONGER, ET TROUSSE CONTENANT CE DISPOSITIF L'invention concerne un dispositif amélioré d'immunotest, revêtant la forme d'une plaquette à plonger dans un liquide biologique. On a décrit divers procédés pour détecter la présence d'un analyte (constituant soumis à l'analyse) dans un échantillon de fluide biologique, qui font appel à l'immunochimie Dans ce que l'on appelle le procédé "sandwich", par exemple, un analyte cible tel qu'un antigène est "pris en sandwich" entre un anticorps marqué et un anticorps immobilisé sur un support solide Le résultat de l'essai est donné par l'observation de la présence et de la quantité de complexe antigène-anticorps marqué, lié à l'anticorps immobilisé Dans le procédé d'immunotest par compétition, un anticorps fixé à une surface solide est mis en contact à la fois avec un échantillon contenant une quantité inconnue d'un antigène constituant l'analyte et avec un antigène marqué du même type On détermine alors la quantité d'antigène marqué fixée à la surface solide, ce qui donne une mesure indirecte de la quantité d'antigène analyte dans l'échantillon. Comme ces procédés, ainsi que d'autres procédés discutés ci-dessous, permettent de détecter aussi bien des anticorps que des antigènes, on les appelle généralement "essais immunochimiques ligand-récepteur" ou simplement "immunotests". Les dispositifs d'immunotest en phase solide, qu'ils soient du type sandwich ou du type par compétition, permettent de détecter avec sensibilité un analyte dans un échantillon de fluide biologique tel que du sang ou de l'urine Les dispositifs d'immunotest en phase solide comprennent un support solide auquel est lié un élément d'une paire ligand-récepteur, habituellement un anticorps, un antigène ou un haptène Tout d'abord, ces supports solides revêtaient habituellement les formes de plaques, tubes ou perles de polystyrène, que l'on connaissait déjà dans les domaines des essais radio-immunologiques et des essais immuno-enzymatiques Plus récemment, on a utilisé comme supports solides un certain nombre de matériaux poreux, tels que nylon, nitrocellulose, acétate de cellulose, fibres de verre et autres polymères poreux. On a décrit un certain nombre de nécessaires autonomes d'immunotest, qui font appel à des matériaux poreux en tant que supports solides de composants immunochimiques tels qu'antigènes, haptènes ou anticorps. Ces nécessaires sont habituellement conçus selon le modèle de la plaquette à plonger, de la membrane traversée par un liquide, ou de la migration de l'analyte. Tom et coll, Brevet US N O 4 366 241 et Zuk, EP-A- 0 143 574, décrivent des dispositifs d'essai du type à migration, dans lesquels une membrane est imprégnée des réactifs nécessaires pour réaliser le test Une zone de détection d'analyte est ménagée, dans laquelle l'analyte marqué est fixé et le résultat de l'essai est lu. Bernstein, Brevet US N O 4 770 853, May et coll, WO 88/08534, et Ching et coll, EP-A-0 299 428, décrivent des dispositifs d'essai du type à migration dans lesquels sont incorporés des réactifs qui ont été fixés à des marqueurs directs colorés, ce qui permet de déchiffrer visuellement les résultats de l'essai sans ajouter de substances supplémentaires. Valkirs et coll, Brevet US N O 4 632 901, décrivent un dispositif d'immunotest du type à membrane traversée par un fluide, qui comprend un anticorps (spécifique pour l'antigène cible qui constitue l'analyte) fixé sur une membrane poreuse ou sur un filtre, auquel est ajouté un échantillon liquide Quand le liquide traverse la membrane, l'analyte cible se lie à l'anticorps L'addition de l'échantillon est suivie de l'addition de l'anticorps marqué La détection visuelle de l'anticorps marqué fournit une indication de la présence de l'antigène cible, l'analyte, dans l'échantillon. Korom et coll, EP-A-0 299 359, décrivent une variante du dispositif à membrane traversée par un fluide, dans laquelle l'anticorps marqué est incorporé dans une membrane qui fonctionne comme un système de libération de réactif. Baxter et coll, EP-A-0 125 118, décrivent une plaquette à plonger pour immunotest du type sandwich, dans laquelle des composants immunochimiques, comme des anticorps, sont fixés sur une phase solide Le dispositif de test est plongé pour incubation dans un échantillon suspecté de contenir, comme analyte, un antigène recherché. On ajoute alors un anticorps marqué par une enzyme, soit simultanément, soit après une période d'incubation Le dispositif est ensuite lavé, puis introduit dans une seconde solution contenant un substrat pour l'enzyme. L'enzyme marqueur, s'il y en a, interagit avec le substrat, ce qui provoque la formation de produits colorés qui se déposent sur la phase solide sous forme d'un précipité, ou bien produisent un changement visible de la couleur de la solution de substrat. Kali et coll, EP-A-0 282 192, décrivent un dispositif sous forme de plaquette à plonger, à utiliser dans des essais par compétition. Leuvering, Brevet US N O 4 313 734, décrivent l'utilisation de particules de sol d'or comme marqueur direct dans un dispositif du type plaquette à plonger. Rounds, Brevet US no 4 786 589, décrit un dispositif d'immunotest du type plaquette à plonger, dans lequel les anticorps ont été marqués avec un formazan. Dans les dispositifs d'immunotest du type plaquette à plonger qui font appel à des anticorps marqués par des enzymes, des étapes de lavage et des périodes prolongées d'incubation pour les substrats des enzymes sont nécessaires, et ceci augmente la variabilité des essais, et par conséquent, la probabilité que des personnes très peu préparées et des utilisateurs domestiques obtiennent des résultats erronés d'essai. La présente invention concerne des dispositifs d'immunotest du type plaquette à plonger En particulier, la présente invention englobe un dispositif immunologique du type plaquette à plonger, dans lequel on utilise des symboles dans la zone d'essai, et des anticorps marqués par une enzyme pour détecter des analytes dans un échantillon de fluide biologique Le dispositif de l'invention supprime la nécessité de l'étape intermédiaire de lavage, associée aux dispositifs d'essai du type plaquette à plonger, faisant appel à des anticorps marqués par des enzymes. La nature de l'invention apparaîtra à la lecture de la description suivante, ainsi qu'à l'examen des dessins annexés dans lesquels: la figure 1 est une vue en perspective d'une plaquette à plonger typique de la présente invention, comportant une zone indicatrice de test et une zone indicatrice témoin, de forme rectangulaire; et la figure 2 est une vue en perspective d'un autre mode de réalisation d'une plaquette à plonger conforme à la présente invention, qui comporte une zone indicatrice témoin et une zone indicatrice de test, qui forment une croix. Comme on le voit sur la figure 1, une zone d'essai est définie sur un support 12 Le support 12 est formé d'une bande de matériau imperméable à l'humidité, qui fournit un support rigide à la zone 10, afin d'en faciliter le déplacement d'un récipient à un autre Les matériaux typiques utilisés pour le support englobent le verre et un certain nombre de matières plastiques, mais ne se limitent pas à ceux-ci La zone 10 peut être fabriquée en divers matériaux, dont des exemples englobent, mais sans y être limités, le nylon, la nitrocellulose, la cellulose, l'acétate de cellulose, le verre en fibre, les polysulfones, le poly(difluorure de vinylidène), et les polyesters Un composant immunologique est immobilisé sur la zone 10 selon la forme de la zone indicatrice 14, représentée ici sous la configuration d'un simple rectangle Ce composant immunologique peut fonctionner de façon à fixer un anticorps marqué par une enzyme, par l'intermédiaire d'un analyte cible, formant ainsi un complexe sandwich sur la zone 10 Un second composant immunologique (anti-Ig G) est lui aussi immobilisé selon la configuration de la zone indicatrice témoin 16, elle aussi représentée sous la forme d'un rectangle Cette zone indicatrice témoin 16 sert d'élément interne de contrôle avec lequel on vérifie l'achèvement de l'essai. Les procédés de marquage d'anticorps par des enzymes sont bien connus dans la technique, comme le sont les réactions chimiques par lesquelles ces marqueurs provoquent la précipitation de produits colorés insolubles lorsqu'ils sont mis en contact avec une solution de substrat approprié. Lors de l'utilisation de la plaquette de l'invention, la zone d'essai 10 est introduite dans un récipient contenant un échantillon de fluide auquel on a ajouté un anticorps anti-analyte, marqué par une enzyme On laisse reposer le tout pendant une courte période (par exemple 3 à 4 minutes) au cours de laquelle l'analyte cible, s'il y en a, se lie au composant immunologique immobilisé dans la zone indicatrice 14 et l'anticorps marqué se lie à l'analyte pour former une multiplicité de complexes "sandwichs" étalés sur la zone d'essai 10, le long de la zone indicatrice 14 Une fraction des anticorps marqués, qui ne se lie pas à l'analyte cible, se lie à l'anticorps anti-immunoglobuline G immobilisé dans la zone indicatrice témoin 16 La plaquette est enlevée du premier récipient et introduite, dans un second récipient contenant un substrat pour l'enzyme A la suite de la mise en contact avec le substrat, les enzymes marqueurs qui se trouvent alors sur la zone d'essai 10 réagissent en libérant des produits colorés insolubles qui se déposent le long de la zone indicatrice 14 et de la zone indicatrice témoin 16, en des concentrations plus élevées que dans les autres zones non-indicatrices de la zone d'essai 10 Ceci donne comme résultat (i) une bande colorée visible dans la zone indicatrice 14 ainsi que dans la zone indicatrice témoin 16 si quelque analyte est présent, ou (ii) une bande colorée unique visible seulement dans la zone indicatrice témoin 16, si aucun analyte n'est présent. Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, la concentration de la substance immobilisée dans la zone indicatrice témoin 16 est ajustée de façon à fournir une échelle interne de la concentration d'analyte dans un échantillon Par exemple, une substance est immobilisée dans la zone indicatrice 16 à une concentration donnée, et l'essai est réalisé Si la couleur qui apparaît dans la zone indicatrice 14 est plus sombre que celle qui apparaît dans la zone indicatrice témoin 16, l'échantillon contient l'analyte cible en une concentration plus grande que la concentration donnée. En variante, comme le représente la figure 2, dans la zone d'essai 110, une zone indicatrice verticale 114 est placée perpendiculairement à une zone indicatrice témoin 116 et à cheval sur celle-ci, dans la configuration d'une croix On utilise le dispositif de la même manière que celle décrite à propos de la figure 1, mais maintenant, c'est une croix colorée (signe +) qui devient visible sur la zone 110 en présence d'un analyte cible, alors qu'en l'absence d'analyte cible, c'est un trait horizontal coloré (signe -) qui apparaît. Selon un autre mode de réalisation, le dispositif d'immuno-essai de l'invention comporte un support, une zone d'essai définie sur ce support, au moins un composant immunologique immobilisé, disposé dans cette zone en une configuration formant une zone indicatrice, ledit composant immunologique pouvant fixer à la fois un complément cible et un complément marqué par une enzyme Le complément marqué par une enzyme produit, lors du contact avec un substrat pour cette enzyme, une différence visuellement discernable entre la zone indicatrice et la zone d'essai. Le dispositif comporte en outre un inhibiteur pour l'enzyme marqueur, réparti dans la zone d'essai. La substance immunologique peut être immobilisée dans la zone d'essai selon toute configuration pratique ou facilement distinguable Ces configurations englobent, sans y être limitées, points, barres, lettres, chiffres, et signes + et - Cette dernière configuration, dans laquelle un anticorps anti-analyte ou un antigène spécifique d'un anticorps cible est immobilisé selon une perpendiculaire à un trait horizontal témoin d'anticorps anti- immunoglobuline, simplifie l'interprétation des résultats de l'essai pour les utilisateurs domestiques, puisque l'apparition d'un signe + indique un résultat positif, et celle d'un signe -, un résultat négatif. L'application ou la pulvérisation d'un composant immunologique sur la zone d'essai selon une configuration définie établit une différence interne de couleur sur la zone même d'essai de la plaquette à plonger, de sorte que l'on n'a pas besoin, en plus, d'échelles de couleurs normalisées pour interpréter les résultats de l'essai En outre, aucun lavage n'est nécessaire avant de mettre le dispositif en contact avec la solution de substrat Les substances colorées provoquent la formation de dépôts plus nombreux dans les zones indicatrices que dans les zones non- indicatrices de la zone d'essai Par conséquent, il n'est pas nécessaire d'effectuer des lavages pour éliminer la fraction d'anticorps marqués par une enzyme qui n'ont pas été fixées à la zone d'essai par l'intermédiaire de l'analyte cible. Pour marquer les anticorps, on peut utiliser un certain nombre d'enzymes Les enzymes typiques englobent, sans y être limitées, phosphatase alcaline, peroxydase de raifort, lysozyme, glucose-6-phosphate déshydrogénase, lactate déshydrogénase, uréase, glucose oxydase, B- galactosidase et cholestérol oxydase, la préférence étant donnée à la phosphatase alcaline. Normalement, une fois que l'essai a été réalisé, la différence de coloration engendrée entre les zones il indicatrices et les zones nonindicatrices de la zone d'essai est assez importante pour fournir une indication précise de la présence ou de l'absence d'un analyte donné dans un échantillon Toutefois, on peut augmenter cette différence de coloration en incorporant un inhibiteur d'enzyme dans les zones non- indicatrices de la membrane qui forme la zone d'essai Afin d'éviter une inhibition non souhaitée des enzymes placées sur les zones indicatrices, on préfère utiliser des substances qui ne présentent qu'un comportement inhibiteur relativement faible Dans les dispositifs faisant appel à des anticorps marqués avec la phosphatase alcaline, les inhibiteurs typiques englobent, mais sans y être limités, des acides aminés et leurs dérivés, tels que la cystéine, l'histidine, la L- phénylananine, la B-phényl-alanine, la p-fluorophényl- alanine et la tyrosine, des agents chélatants comme l'acide éthylènediamine-tétra-acétique, des anions complexes oxygénés tels que citrate, borate, arsénate, phosphate, orthophosphate, carbonate, polyestradiol-phosphate, pyrophosphate et polyphlorétine-phosphate, ou des dérivés d'acide carboxylique halogéné, comme iodobenzoate et iodoacétamide, ainsi que des substrats secondaires concurrents, engendrant une coloration, comme p- nitrophényl-phosphate Parmi les exemples précédents, on préfère le p-nitrophényl-phosphate. Quand une membrane constituant une zone d'essai et comportant du pnitrophényl-phosphate incorporé dans les zones non-indicatrices est mise en contact avec des anticorps marqués à l'aide de phosphatase alcaline, des produits insolubles de couleur jaune se forment à mesure que les ions phosphate sont coupés Ces produits se déposent sur la surface de la zone d'essai dans les zones non-indicatrices, tandis que les produits insolubles, habituellement de couleur bleue, qui résultent des interactions de l'enzyme avec le substrat primaire se déposent le long des zones indicatrices Les produits de couleur bleue qui peuvent se déposer sur des zones non- indicatrices sont masqués par ceux de couleur jaune. Selon encore un autre mode de réalisation, un premier polyol est contenu avec l'inhibiteur d'enzyme sur la zone d'essai dans les zones nonindicatrices Quand on utilise de la phosphatase alcaline comme enzyme marqueur, le polyol a pour rôle de capter les ions phosphates résultant des interactions enzyme-substrat Ceci remplit deux fonctions. En premier lieu, en recouvrant la membrane avec des ions phosphate, le polyol rend hydrophile la surface de la membrane, et par conséquent, il la rend répulsive pour les produits colorés hydrophobes qui résultent du contact de l'enzyme avec le substrat Puisque les produits colorés sont moins susceptibles de se déposer sur la surface de la membrane, on obtient ainsi un renforcement du contraste de coloration entre les zones indicatrices et les zones non- indicatrices. En second lieu, en fixant les ions phosphate produits, le polyol augmente la vitesse de la réaction entre la phosphatage alcaline et son substrat, et cette accélération fait diminuer le laps de temps nécessaire pour l'incubation de la plaquette dans la solution de substrat. Par conséquent, il est possible d'obtenir plus immédiatement les résultats de l'essai Des exemples de polyols que l'on peut utiliser englobent, sans y être limités, le poly(alcool vinylique), le polyéthylène-glycol, le sorbitol, le polypropylène-glycol et les hydrates de carbone comme le dextrane, la méthyl-cellulose, le lactose et l'amidon de maïs Parmi les exemples précédents, on préfère le poly(alcool vinylique). Dans le cas o l'on n'utilise pas de phosphatage alcaline pour marquer les anticorps, on peut incorporer, sur la surface de la membrane, une substance qui fixe les sous-produits de la réaction entre l'enzyme et le substrat, ce qui rend la surface de la membrane incapable d'accepter le dépôt des produits insolubles colorés, et/ou fait diminuer les périodes d'incubation de l'enzyme et du substrat. La présente invention englobe également un nécessaire (trousse) dans lequel le dispositif du type plaquette à plonger est associé à une solution d'anticorps marqué par une enzyme, et à une seconde solution de substrat pour l'enzyme, dont le rôle est de former des produits colorés insolubles à la suite de la mise en contact avec l'enzyme marqueur La nature du substrat dépendra de l'enzyme particulière utilisée comme marqueur. Par exemple, quand les anticorps ont été marqués avec la phosphatase alcaline, les solutions de substrat typiques renferment, mais sans y être limitées, phosphate de Naphthol AS-MX et sel de Bleu solide RR, phosphate de Naphthol AS-MX et sel de Violet solide B, phosphate de Naphtol AS-GR et sel de Bleu solide RR, phosphate de 5- bromo-4-chloro-3-indoxyle (BCIP) ou phosphate de 3- indoxyle Quand on utilise la peroxydase de raifort comme enzyme marqueur, les solutions de substrat typique renferment, mais sans y être limitées, 2,2 'azino-di-3- éthyl-benzothiazidine-sulfonate, 3,3 ',5,5 '-tétraméthyl- benzidine, 4-chloro-l-naphthol, 3,3 '-diaminobenzidine, p- phénylènediamine, pyrocatéchol, 3-amino-9-éthyl-carbazole ou naphthol/pyronine Des exemples de solution de substrat typiques pour un marqueur lactate déshydrogénase renferment, mais sans y être limités, nicotinamide-adénine- dinucléotide réduit (NADH), méthosulphate de phénazine ou chlorure de tnitro-bleu de tétrazolium Quand les anticorps sont marqués au lipozyme, une solution de substrat typique renferme des substances insolubles colorées, encapsulées dans des liposomes Une solution de substrat typique pour des anticorps marqués avec la B- galactosidase renferme, mais sans y être limitée, du 5- bromo-4-chloro-3-indoxyl-B-D-galactopyranoside Une solution de substrat typique pour des anticorps marqués avec la glucose oxydase renferme, mais sans y être limitée, du chlorure de t-nitro-bleu de tétrazolium ou du méthosulfonate de m-phénazine. En plus du substrat de l'enzyme, la seconde solution peut également contenir un second polyol dont le rôle est de fixer les ions phosphate résultant de la mise en contact de la phosphatase alcaline et du substrat Ce second polyol fournit un moyen supplémentaire de faire diminuer les durées d'incubation au cours de l'essai Les polyols typiques utilisés dans la solution de substrat englobent, mais sans y être limités, le propylène-glycol, l'éthane-glycol, le butane-diol, le 2-amino-2-méthyl-1,3- propane-diol, et le 2-amino-2-méthyl-1-propanol, la préférence étant donnée à ce dernier. En outre, les anticorps peuvent être marqués à l'aide de marqueurs directs Comme les marqueurs directs, contrairement aux enzymes marqueurs, donnent des signaux visuellement discernables en raison de leur concentration et non par le biais d'une interaction chimique, l'incorporation de caséine ou d'albumine de sérum de bovin dans les zones non-indicatrices de la zone d'essai est en général tout ce qui est nécessaire pour produire une différence entre les zones indicatrices et les zones non- indicatrices de la zone d'essai En outre, on n'a pas besoin de faire incuber la plaquette une seconde fois dans la solution de substrat Des exemples de marqueurs directs englobent, mais sans y être limités, des sols de métaux, des sols de non-métaux, des sols de colorants, des particules de latex, des sols de carbone et des liposomes contenant des corps colorés. Le composant immobilisé sur la zone d'essai en une configuration formant une zone indicatrice est soit un anticorps, soit un antigène, soit un haptène, bien qu'on puisse utiliser l'un ou l'autre protagoniste de n'importe quelle interaction ligand-récepteur Les anticorps utilisés peuvent être d'origine monoclonale ou polyclonale, et les procédés selon lesquels on les produit sont bien connus dans le métier Les antigènes et les haptènes peuvent être naturels ou synthétiques, et ils sont disponibles dans le commerce En outre, les composants immunologiques peuvent être fixés à la zone d'essai par l'intermédiaire de réactifs de jonction, immobilisés au préalable sur la zone, c'est-à-dire dans les surfaces formant les zones indicatrices Des exemples de réactifs de jonction typiques englobent, mais sans y être limités, l'avidine, la biotine, un anticorps anti-fluorescéine et la protéine A. Le dispositif d'essai est utilisé pour la détection d'anticorps, d'antigènes ou d'haptènes Des exemples d'anticorps que l'on peut détecter à l'aide de ce dispositif englobent, sans y être limités, ceux dirigés contre l'agent pathogène de la maladie Lymes, le cytomégalovirus, le virus d'Epstein Barr, le virus de l'hépatite, et le virus du sida Des exemples d'antigènes que l'on peut détecter à l'aide de ce dispositif englobent, sans y être limités, la gonadotropine chorionique humaine, l'hormone lutéinisante et l'a-foetoprotéine Des exemples d'haptènes que l'on peut détecter englobent, mais sans y être limités, la cocaïne, le tétrahydrocannabinol, la digoxine, la théophylline, la morphine et les amphétamines. En outre, la présente invention peut être utilisée dans le criblage génétique et la détection de séquences particulières de gènes, à l'aide de séquences complémentaires immobilisées et de sondes marquées d'acides nucléiques Les procédés de détection de séquences de gènes sont connus dans le métier. Les exemples suivants servent à illustrer davantage l'invention, mais sans en limiter le cadre d'aucune manière. EXEMPLE i A Préparation de plaquette à plonger Sur une feuille de matière plastique de 18 cm sur 9 cm et épaisse de 0,25 mm, servant de support, on fixe un morceau de membrane de nylon préactivée (Pall Immunodyne), large de 1,27 cm, et présentant une dimension de pores de 0,45 Mm Sur ce morceau de membrane, destiné à servir de zone d'essai, on pulvérise 36 Ml d'une solution de 3 mg/ml d'anticorps ovin anti-gonadotropine chorionique humaine dans du tampon de phosphate (p H 7,4), le long d'un trait situé à environ 7-8 mm à partir du bas, à l'aide d'un pulvérisateur Linomat IV (Camag) On fait incuber la feuille dans une solution tampon de phosphate (p H 7,4) contenant 2 % de lait sec (Carnation) et 0,5 % de poly(alcool vinylique) ayant une masse moléculaire de 10.000, pendant 30 minutes On lave la feuille avec une solution à 5 % de saccharose, on la sèche à l'air et on la découpe en bandes de 0,4 à 0,7 cm de large, pour produire une série de plaquettes à plonger semblables, que l'on peut conserver dans un dessiccateur à la température ambiante. B Préparation d'un conjugué enzyme-anticorps On conjugue une phosphatase alcaline (activité spécifique supérieure à 1400 U/mg) à un anticorps monoclonal de souris anti-gonadotropine chorionique humaine, en un rapport molaire de 1:1, selon le procédé au glutaraldéhyde en une étape On purifie le conjugué sur une colonne de diéthylaminoéthyl-Sephadex A 50 ( 5 ml), en utilisant un gradient d'élution linéaire ( 0-1 M) de chlorure de sodium dans du tampon de Tris 10 m M (p H 7,4) et chlorure de magnésium 5 m M On recueille des échantillons de conjugué ( 3,0 ml), on teste leur activité enzymatique, on les dilue à la concentration de 1 unité par ml dans une solution de 10 m M de Tris (p H 7,4), 1 % d'albumine de sérum de bovin, 150 m M de chlorure de sodium et 0,1 % d'azoture de sodium, et on les conserve à 4 C. On répartit le conjugué en fractions aliquotes dans des tubes à essai ( 10 x 75 mm) et on lyophilise ces fractions Les tubes sont bouchés et conservés. C Préparation d'un substrat Dans d'autres tubes à essai ( 10 x 75 mm), on place 0,8 ml par tube d'une solution de substrat de phosphate de -bromo-4chloro-3-indoxyle et de nitro-bleu de tétrazolium Les tubes sont conservés dans l'obscurité à la température ambiante. D Réalisation de l'essai Dans un tube contenant du conjugué, on ajoute 1, 0 ml d'urine standard, contenant 100 m UI/ml de gonadotropine chorionique humaine On homogénéise le contenu du tube, et on introduit une plaquette à plonger, puis on laisse reposer le tout pendant 4 minutes On retire la plaquette, et sans la laver, on l'introduit dans un tube contenant la solution de substrat, et on secoue le tube On laisse ensuite le tube reposer pendant 4 minutes supplémentaires. On retire la plaquette du tube et on l'observe Toute la zone d'essai est d'une couleur légèrement ternie, mais il y a un trait bleu horizontal que l'on peut discerner en travers de la surface de cette zone On détermine que la sensibilité de l'essai vaut 12 m UI/ml de gonadotropine chorionique humaine. EXEMPLE 2 On suit le même protocole que pour l'exemple 1, excepté que dans l'étape D, on introduit la plaquette dans un tube ne contenant que de l'urine et le conjugué, c'est- à-dire qu'il ne contient pas de gonadotropine Au bout de 4 minutes, on retire la plaquette, et sans la laver, on l'introduit dans un tube de solution de substrat, on la fait incuber pendant 4 minutes supplémentaires et on l'observe Toute la zone d'essai est d'une couleur faiblement ternie, et il n'y a aucun trait que l'on puisse discerner en travers de sa surface. EXEMPLE 3 On suit le même protocole que dans l'exemple 1, excepté que dans l'étape A, on pulvérise sur la membrane un anticorps anti-immunoglobuline de souris, le long d'une autre ligne située à environ 9-11 mm du bas de la plaquette. Toute la zone d'essai prend une couleur légèrement ternie, mais il apparaît 2 traits bleus horizontaux que l'on peut discerner en travers de sa surface. EXEMPLE 4 On suit le même protocole que dans l'exemple 3, excepté que la plaquetteest initialement introduite dans un tube qui ne contient que de l'urine et le conjugué, c'est-à-dire qu'il ne contient pas de gonadotropine. Toute la zone d'essai prend une couleur légèrement ternie, et il apparaît un seul trait bleu horizontal (témoin) que l'on peut discerner en travers de sa surface. EXEMPLE 5 On suit le même protocole que dans l'exemple 3, excepté que l'on pulvérise sur la membrane un anticorps ovin anti-gonadotropine chorionique humaine, le long d'un trait vertical coupant perpendiculairement le trait d'anticorps anti-Ig G de souris, afin de former une croix. Toute la zone d'essai prend une couleur légèrement ternie, mais il apparaît une croix bleue (signe +) que l'on peut discerner sur sa surface. EXEMPLE 6 On suit le même protocole que dans l'exemple 5, excepté que la plaquette est initialement introduite dans un tube qui ne contient que de l'urine et le conjugué. Toute la zone d'essai prend une couleur légèrement ternie, et il n'apparaît qu'un trait bleu (signe -) que l'on peut distinguer en travers de sa surface. o O EXEMPLE 7 On prépare une plaquette à plonger, selon le même protocole que dans l'exemple 1, étape A, sauf que l'on utilise un anticorps antihormone lutéinisante humaine (LH) à la place de l'anticorps antigonadotropine chorionique humaine. Sur quatre morceaux de membranes (Pall Immunodyne), on pulvérise un anticorps anti-hormone lutéinisante humaine selon un trait, d'après le procédé indiqué dans l'exemple 1, étape A Chaque morceau de membrane est ensuite trempé dans un tube d'urine contenant de l'hormone lutéinisante humaine en une concentration donnée ( 40, 70, 120, ou 200 m UI/ml) Il apparaît sur la membrane un trait bleu dont l'intensité de coloration est faible pour une concentration de 40 m UI/ml, modérée pour une concentration de 70 m UI/ml, forte pour une concentration de 120 m UI/ml, et très forte pour une concentration de 200 m UI/ml On prépare une échelle standard de coloration en arrangeant ces résultats sur un support solide, selon la progression de l'intensité de coloration. On introduit une plaquette dans un tube contenant un échantillon clinique d'urine, puis, sans la laver, dans un tube de solution de substrat Un trait bleu d'intensité modérée apparaît à la surface de la zone d'essai On compare la plaquette avec l'échelle de coloration, et on trouve que l'échantillon contient entre 40 et 70 m UI/ml d'hormone lutéinisante EXEMPLE 8 A Préparation du dispositif On prépare une plaquette selon le protocole de l'exemple 1 (A), excepté que l'on pulvérise sur la membrane, selon un trait situé à 7-8 mm du bas, un anticorps polyclonal anti-isothiocyanate de fluorescéine, au lieu de l'anticorps anti-gonadotropine chorionique humaine En guise de témoin, on pulvérise, selon un trait situé à environ 9-12 mm du bas de la membrane, une solution d'avidine. On bloque ensuite la zone d'essai de la plaquette en la trempant dans une solution tampon de phosphate (p H 7,4), contenant 2 % de lait sec (Carnation) et 0,5 % de poly(acétate de vinyle) présentant une masse moléculaire de 10.000, pendant 30 minutes On la rince ensuite avec une solution de saccharose à 5 %, on la sèche à l'air et on la conserve dans un dessiccateur à la température ambiante. B Préparation d'un conjugué d'isothiocyanate de fluorescéine et de phosphatase alcaline (plus de 1400 U/ml) 1 l d'une solution d'isothiocyanate de fluorescéine ( 3 mg/400 Al) dans une solution de borate de sodium 0,1 M (p H 9,3) sont ajoutés à 5 mg de phosphatase alcaline dans une solution de borate de sodium, pour un volume total de 0, 5 ml On laisse la solution résultante reposer à la température ambiante pendant 3 heures. La solution est ensuite séparée sur une colonne de Sephadex G 25 et éluée avec une solution de carbonate de sodium 0,1 M (p H 8,5) On y ajoute 100 ml d'une solution de ,0 mg de N-hydroxysuccinimidyl-biotine dans 1,0 ml de diméthylsulfoxyde On agite la solution résultante pendant 12 heures environ. On élimine la biotine libre en séparant le conjugué sur une colonne de Sephadex G 25 et en l'éluant avec un tampon contenant 10 m M de Tris, 1 % d'albumine de sérum de bovin, 150 m M de chlorure de sodium et 0,1 % d'azoture de sodium (p H 7,4) On conserve ensuite le conjugué à 4 C. La solution de conjugué est répartie en fractions aliquotes dans des tubes à essai ( 10 x 75 mm), puis ces fractions sont lyophilisées Les tubes sont bouchés et conservés. C Préparation du substrat Dans d'autres tubes ( 10 x 75 mm), on place des fractions aliquotes de 0,8 ml d'une solution de substrat de -bromo-4-chloro-3-indoxyl-phosphate et de nitro- bleu de tétrazolium Les tubes sont conservés dans l'obscurité à la température ambiante. D Réalisation de l'essai par compétition Dans un tube de conjugué, on ajoute 1,0 ml d'urine contenant de l'isothiocyanate de fluorescéine ( 11 ng/ml). On mélange le tout, et on y introduit la plaquette et on l'y laisse pendant 3 minutes. La plaquette est transférée dans un tube contenant du substrat, et on secoue le tube pour mélanger le tout On laisse ensuite reposer le tout pendant 2 minutes Un trait sombre apparaît sur la zone d'essai, dans la zone témoin, et un trait pâle apparaît dans la bande d'anti- isothiocyanate de fluorescéine. EXEMPLE 9 On reprend les mêmes protocoles que dans l'exemple 8, sauf que dans l'étape 8 (D), la plaquette est initialement plongée dans un tube ne contenant que de l'urine et le conjugué, c'est-à-dire ne contenant pas d'isothiocyanate de fluorescéine Sur la zone d'essai, il apparaît alors deux traits de couleur très foncée. EXEMPLE 10 A Préparation de plaquette On prépare une zone d'essai en fixant une bande ( 1,27 cm) de membrane de nylon préactivée (Pall Immunodyne), présentant une dimension de pores de 0,45 pm, à une feuille de matière plastique ( 18 cm sur 9 cm), épaisse de 0,25 mm A l'aide d'un pinceau à air, on pulvérise sur la membrane 36 pl d'une solution à 3 mg/ml d'un anticorps ovin anti-gonadotropine chorionique humaine dans une solution tampon de phosphate, selon un trait situé à environ 4 mm du bas De la même manière, on trace un second trait témoin, à environ 7 mm du bas de la membrane, avec un anticorps ovin anti-souris On laisse ensuite la membrane sécher à l'air à la température ambiante pendant heures. B Blocage de la membrane On prépare une solution avec 5 m M de p-nitrophényl- phosphate et 0,2 % de poly(alcool vinylique) (masse moléculaire 10 000) dans un tampon de chlorhydrate de diéthanolamine 20 m M (p H 8,5), contenant 5 m M de chlorure de magnésium On laisse la membrane tremper dans cette solution pendant 30 minutes à la température ambiante, on la rince avec une solution à 5 % de saccharose, on la fait sécher à l'air, on la découpe en bandes de 5 mm, et on conserve ces bandes dans un dessiccateur à la température ambiante. C Préparation d'un conjugué enzyme-anticorps De la phosphatase alcaline (activité spécifique supérieure à 1400 U/mg) est conjuguée à un anticorps monoclonal de souris anti-gonadotropine chorionique humaine, en un rapport molaire de 1:1, selon le procédé au glutaraldéhyde en une étape On purifie le conjugué sur une colonne de diéthylaminoéthyl-Séphadex A 50 ( 5 ml) en utilisant un gradient linéaire d'élution ( 0-1 M de chlorure de sodium) dans une solution de Tris 10 m M (p H 7,4) et de chlorure de magnésium 5 m M On recueille des échantillons de 3,0 ml de conjugué, on détermine leur activité enzymatique, on les dilue jusqu'à 1 unité/ml dans une solution contenant 10 m M de Tris (p H 7,4), 1 % d'albumine de sérum de bovin, 150 m M de chlorure de sodium et 0,1 % d'azoture de sodium, et on les conserve à 40 C. Le conjugué est réparti en fractions aliquotes dans des tubes à essai de 10 x 75 mm et lyophilisé Les tubes sont bouchés et conservés. D Préparation du substrat Dans d'autres tubes à essai de 10 x 75 mm, on place des fractions aliquotes de 0,8 ml d'une solution contenant du 5bromo-4-chloro-3-indoxyl-phosphate-nitro-bleu de tétrazolium dans du 2amino-2-méthyl-1-propanol Les tubes sont conservés dans l'obscurité à la température ambiante. E Réalisation de l'essai Dans un tube contenant du conjugué, on ajoute 1, 0 ml d'une urine standard, contenant 100 m UI/ml de gonadotropine chorionique humaine On mélange le contenu du tube, on introduit la plaquette à plonger et on laisse reposer le tout pendant 4 minutes On retire la plaquette et on l'introduit, sans la laver, dans un tube contenant la solution de substrat et on l'y laisse pendant 4 minutes supplémentaires En 30 secondes environ, toute la zone d'essai se ternit légèrement et deux traits bleu foncé commencent à apparaître sur la surface de la zone d'essai. On a déterminé que la sensibilité de l'essai vaut 12 m UI/ml. EXEMPLE 11 On suit les mêmes protocoles que dans l'exemple 10, sauf que dans l'étape 10 (E), on introduit initialement la plaquette dans un tube ne contenant que de l'urine et du conjugué, c'est-à-dire ne contenant pas de gonadotropine. Au bout de 4 minutes, on retire la plaquette, et sans la laver, on l'introduit dans un tube de substrat, on la laisse incuber pendant 4 minutes supplémentaires et on l'observe Au bout de 30 secondes, toute la zone d'essai s'est légèrement ternie, et un seul trait bleu foncé commence à apparaître sur la surface de la zone d'essai. EXEMPLE 12 On prépare un certain nombre de plaquettes à plonger, selon l'exemple 10, sauf que dans l'étape 10 (B), on trempe chaque membrane dans l'une des combinaisons suivantes de réactifs. 1 2 % de lait dans une solution tampon de phosphate 10 m M (p H 7,5), contenant 150 m M de chlorure de sodium et 0,1 % d'azoture de sodium. 2 2 % de lait dans une solution tampon de chlorhydrate de triéthanolamine 10 m M (p H 8,0). 3 0,5 % de poly(alcool vinylique) dans une solution tampon de phosphate 20 m M (p H 7,5) contenant 150 m M de chlorure de sodium et 0,1 % d'azoture de sodium. 4 0,5 % de poly(alcool vinylique) dans une solution tampon de Tris 20 m M (p H 8,0). 0,5 % de poly(alcool vinylique) dans une solution tampon de borate 20 m M (p H 8,5). 6 0,1 % de poly(alcool vinylique) et 0,1 % de lait dans une solution tampon de carbonate 20 m M (p H 8,0). 7 0,1 % de poly(alcool vinylique) dans une solution tampon de 2-amino-2-méthyl-1-propanol 20 m M (p H 8,5). 8 5 m M de p-nitrophényl-phosphate et 0,2 % de poly(alcool vinylique) dans une solution tampon de chlorhydrate de diéthanolamine 20 m M (p H 8, 5) contenant 5 m M de chlorure de magnesium. 9 5 m M de p-nitrophényl-phosphate et 0,2 % de poly(alcool vinylique) dans une solution tampon de chlorhydrate de diéthanolamine 20 m M (p H 8,0). 0,1 % de poly(alcool vinylique), 0,1 % de lait et 0,5 % de phényl-alanine dans de la triéthanolamine (p H 8,0). 11 0,1 % de poly(alcool vinylique) et 2 % de lait dan sune solution tampon de borate 20 m M (p H 8,5). 12 0,1 % de poly(alcool vinylique) et 1 % d'éthylène-glycol dans une solution tampon de phosphate. 13 5 % de sorbitol et 0,1 % de poly(alcool vinylique) dans de la triéthanolamine 20 m M (p H 8,0). 14 5 % d'amidon de maïs et 0,1 % de polyéthylène- glycol (masse moléculaire 6000). 0,1 % d'albumine de sérum de bovin dans du tampon de Tris. 16 Solution tampon de Tris 20 m M (p H 8,0). 17 20 m M de glycine dans une solution tampon de Tris 20 m M (p H 8,0). 18 Eau. 19 0,3 % de caséine dans une solution tampon de phosphate. Pas de solution de blocage. Les rapports signal/bruit de l'essai pour les compositions sont les suivants (le rapport est d'autant meilleur que le nombre est plus petit). Tableau 1 SOLUTION DE COULEUR INTENSITE RESULTAT BLOCAGE DE FOND DU SIGNAL COMBINE #1 claire faible 6 2 claire faible 6 3 modérée modérée 6 4 claire très forte 3 claire très forte 3 6 claire faible 6 7 claire forte 4 8 très claire très forte 2 9 claire forte 4 modérée modérée 6 il modérée modérée 6 12 modérée très faible 8 13 modérée très faible 8 14 modérée forte 5 très foncée faible 9 16 très foncée faible 8 17 modérée faible 7 18 foncée très faible 9 19 très claire forte 3 très foncée très faible 10 EXEMPLE 13 On suit les mêmes protocoles que dans l'exemple 10, sauf que dans l'étape 10 (A), on pulvérise un anticorps ovin anti-gonadotropine chorionique humaine sur la membrane, selon un trait vertical recoupant perpendiculairement le trait d'anticorps anti-Ig G de souris, pour former une croix (signe +) En 30 secondes environ, toute la zone d'essai se ternit légèrement, et une croix bleu foncé (signe +) commence à apparaître sur la surface de la zone d'essai. EXEMPLE 14 On suit le même protocole que dans l'exemple 13, sauf que la plaquette est initialement introduite dans un tube qui ne contient que de l'urine et du conjugué, c'est- à-dire qu'il ne contient pas de gonadotropine Toute la zone d'essai se ternit légèrement, et un trait bleu très foncé (signe -) se forme sur sa surface. EXEMPLE 15 On prépare une plaquette selon le même procédé que dans l'exemple 10, étape A, excepté que l'on utilise un anticorps anti-hormone lutéinisante humaine (HL) à la place de l'anticorps anti-gonadotropine chorionique humaine, et qu'il n'y a pas de bande témoin. Sur quatre membranes (Pall Immunodyne), on pulvérise, selon un trait, un anticorps anti-hormone lutéinisante humaine, selon le procédé de l'exemple 10, étape A On plonge ensuite chaque membrane dans un tube d'urine contenant de l'hormone lutéinisante humaine, en une concentration donnée (respectivement 40, 70, 120 et 200 m UI/ml) A la concentration de 40 UI/ml, il apparaît sur la membrane une bande faiblement colorée en bleu, mais très distincte; à la concentration de 70 m UI/ml, il apparaît une bande bleue très distincte, d'intensité modérée; à 120 m UI/ml, il apparaît une bande bleue très distincte et fortement colorée; et à 200 m UI/ml, il apparaît une bande bleue très distincte et très fortement colorée On établit une échelle standard de coloration en disposant ces résultats sur un support solide, dans l'ordre d'intensité de coloration. On introduit la plaquette dans un tube contenant un échantillon clinique d'urine, puis sans la laver, dans un tube de solution de substrat Un trait très distinct et fortement coloré en bleu apparaît sur la surface de la zone d'essai On compare la plaquette avec l'échelle de coloration, et on détermine que l'échantillon contient de à 200 m UI/ml d'hormone luténinisante. EXEMPLE 16 On prépare une plaquette selon le même protocole que dans l'exemple 10, étape A, sauf que l'on utilise un anticorps anti-hormone lutéinisante humaine à la place de l'anticorps anti-gonadotropine chorionique humaine, et que l'on pulvérise, pour la bande témoin, un anticorps anti- souris, pour une intensité de signal équivalente à la concentration de 40 m UI/ml d'hormone lutéinisante. * On introduit la plaquette dans un tube contenant un échantillon clinique d'urine, on la laisse incuber pendant 4 minutes, on la retire, puis on l'introduit, sans la laver, dans la solution de substrat Deux traits bleus distincts apparaissent sur la surface de la zone d'essai. Le second trait est plus sombre que le trait témoin, ce qui indique la présence de plus de 40 m UI/ml d'hormone lutéinisante dans l'échantillon. EXEMPLE 17 A Préparation du dispositif On prépare une plaquette selon le protocole de l'exemple 10 (A), excepté que l'on pulvérise sur la membrane, selon un trait situé à 7-8 mm du bas, un anticorps polyclonal anti-isothiocyanate de fluorescéine, au lieu de l'anticorps anti-gonadotropine chorionique humaine En guise de témoin, on pulvérise, selon un trait situé à environ 9-12 mm du bas de la membrane, une solution d'avidine. B Préparation d'un conjugué d'isothiocyanate de fluorescéine et de phosphatage alcaline (plus de 1400 U/ml) ,l d'une solution d'isothiocyanate de fluorescéine ( 3 mg/400 Al) dans une solution de borate de sodium 0,1 M (p H 9,3) sont ajoutés à 5 mg de phosphatage alcaline dans une solution de borate de sodium, pour un volume total de 0,5 ml On laisse la solution résultante reposer à la température ambiante pendant 3 heures. La solution est ensuite séparée sur une colonne de Sephadex G 25 et éluée avec une solution de carbonate de sodium 0,1 M (p H 8,5) On y ajoute 100 ml d'une solution de ,0 mg de N-hydroxysuccinimidyl-biotine dans 1,0 ml de diméthylsulfoxyde On agite la solution résultante pendant 12 heures environ. On élimine la biotine libre en séparant le conjugué sur une colonne de Sephadex G 25 et en l'éluant avec un tampon contenant 10 m M de Tris, 1 % d'albumine de sérum de bovin, 150 m M de chlorure de sodium et 0,1 % d'azoture de sodium (p H 7,4) On conserve ensuite le conjugué à 4 C. La solution de conjugué est répartie en fractions aliquotes dans des tubes à essai ( 10 x 75 mm), puis ces fractions sont lyophilisées Les tubes sont bouchés et conservés. C Préparation du substrat Dans d'autres tubes ( 10 x 75 mm), on place des fractions aliquotes de 0,8 ml d'une solution de substrat 5- bromo-4-chloro-3-indoxyl-phosphate et de nitro-bleu de tétrazolium Les tubes sont conserves dans l'obscurité à la température ambiante. D Réalisation de l'essai par compétition Dans un tube de conjugué, on ajoute 1,0 ml d'urine contenant de l'isothiocyanate de fluorescéine ( 11 ng/ml). On mélange le tout, et on y introduit la plaquette et on l'y laisse pendant 3 minutes. La plaquette est transférée dans un tube contenant du substrat, et on secoue le tube pour mélanger le tout On laisse ensuite reposer le tout pendant 2 minutes Un trait sombre apparaît sur la zone d'essai, dans la zone témoin, et un trait pâle apparaît dans la bande d'anti- isothiocyanate de fluorescéine. EXEMPLE 18 On suit le même protocole que dans l'exemple 17, sauf que l'on introduit initialement la plaquette dans un tube ne contenant que de l'urine et du conjugué, c'est-à- dire ne contenant pas de fluorescéine Deux traits très sombres apparaissent sur la zone d'essai. REVENDICATIONS 1 Dispositif d'immunotest du type plaquette à plonger, caractérisé en ce qu'il comporte un support ( 12; 112), une zone d'essai ( 10; 110) définie sur ce support, et au moins un composant immunologique immobilisé dans cette zone, selon une configuration formant une zone indicatrice ( 14; 114), ledit composant immunologique pouvant fixer un anticorps marqué par une enzyme, par l'intermédiaire d'un analyte cible, de façon à former un complexe sandwich sur ladite zone, lequel complexe, à la suite d'un contact avec un substrat pour ladite enzyme, produit une différence visuellement discernable entre ladite configuration et ladite zone d'essai; et un inhibiteur pour ladite enzyme réparti dans ladite zone. 2 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que le composant immobilisé est un anticorps, un antigène ou un haptène. 3 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 2, caractérisé en ce que le composant immobilisé est un anticorps. 4 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est la phosphatase alcaline, la peroxydase de raifort, le lysosyme, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, la lactate déshydrogénase, l'uréase, la cholestérol oxydase, la B- galactosidase ou la glucose oxydase. Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que l'enzyme est la phosphatase alcaline. 6 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que ledit inhibiteur d'enzyme est un acide aminé, un dérivé d'acide aminé, un agent chélatant, un anion complexe oxygéné ou un dérivé d'acide carboxylique halogéné. 7 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 6, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est la cystéine, l'histidine, la L-phénylalanine, la B-phényl- B-alanine, la p-fluorophénylalanine, la tyrosine, un iodobenzoate, l'iodoacétamide, un citrate, l'acide éthylène-diamine-tétraacétique, un borate, un arséniate, un phosphate, un orthophosphate, un carbonate, un polyestradiol-phosphate, un pyrophosphate, un polyphlorétine-phosphate ou un p-nitrophényl-phosphate. 8 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 7, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est un p-nitrophényl-phosphate. 9 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'analyte cible est un antigène, un anticorps ou un haptène. Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que ladite configuration est constituée de traits, de points, de nombres ou de lettres. 11 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que le support est constitué d'une matière plastique ou de verre. 12 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la zone d'essai est constituée de nylon, de nitrocellulose, de cellulose, de verre en fibres, de polysulfone, de poly(difluorure de vinylidène) ou de polyester. 13 Trousse, caractérisée en ce qu'elle comporte un dispositif d'immunoessai conforme à la revendication 1, une première solution contenant un anticorps marqué par une enzyme, et une seconde solution contenant un substrat capable de former des produits colorés insolubles à la suite d'un contact avec ladite enzyme. 14 Dispositif d'immunotest du type plaquette à plonger, caractérisé en ce qu'il comporte un support, une zone d'essai définie sur ce support, et au moins un composant immunologique immobilisé dans cette zone, selon une configuration formant une zone indicatrice, ledit composant immunologique pouvant fixer un anticorps marqué par la phosphatase alcaline, par l'intermédiaire d'un analyte cible, de façon à former un complexe sandwich sur ladite zone, lequel complexe, à la suite d'un contact avec un substrat pour ladite enzyme, produit une différence visuellement discernable entre ladite configuration et ladite zone d'essai; et un inhibiteur pour la phosphatase alcaline, réparti dans ladite zone; et un premier polyol réparti dans ladite zone. Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 14, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est un acide aminé, un dérivé d'acide aminé, un agent chélatant, un anion complexe oxygéné, un substrat compétitif secondaire, ou un dérivé d'acide carboxylique halogéné. 16 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 15, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est la cystéine, l'histidine, la L-phénylalanine, la B- phényl-B-alanine, la p-fluorophénylalanine, la tyrosine, un iodobenzoate, l'iodoacétamide, l'acide éthylènediamine- tétraacétique, un citrate, un orthophosphate, un arséniate, un pyrophosphate, un borate, un carbonate, un polyestradiol-phosphate, un polyphlorétine-phosphate, un p- nitrophényl-phosphate ou un phosphate. 17 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 16, caractérisé en ce que ledit inhibiteur est un p-nitrophényl-phosphate. 18 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 14, caractérisé en ce que l'analyte cible est un antigène, un anticorps ou un haptène. 19 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 14, caractérisé en ce que ladite configuration est constituée de traits, de points, de nombres ou de lettres. Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 14, caractérisé en ce que le support est constitué d'une matière plastique ou de verre. 21 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 14, caractérisé en ce que la zone d'essai est constituée de nylon, de nitrocellulose, de cellulose, de verre en fibres, de polysulfone, de poly(difluorure de vinylidène) ou de polyester. 22 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 14, caractérisé en ce que ledit premier polyol est un poly(alcool vinylique), un hydrate de carbone, un polyéthylène-glycol, du sorbitol, un polypropylène-glycol, du dextrane, de la méthylcellulose, du lactose ou de l'amidon de maïs. 23 Dispositif d'immuno-essai conforme à la revendication 22, caractérisé en ce que ledit premier polyol est un poly(alcool vinylique). 24 Trousse, caractérisée en ce qu'elle comprend un dispositif d'immunoessai conforme à la revendication 14, une première solution comprenant un anticorps marqué par la phosphatase alcaline, et une seconde solution comprenant un substrat pouvant former des produits colorés insolubles et des ions phosphates à la suite d'un contact avec ladite phosphatase alcaline, et un second polyol pouvant fixer un nombre important desdits ions phosphates. Trousse conforme à la revendication 24, caractérisée en ce que ledit second polyol est un propylène-glycol, de l'éthane-glycol, du 2-amino-2-méthyl- 1-propanol, du butane-diol ou du 2-amino-2-méthyl-l,3- propane-diol. 26 Trousse conforme à la revendication 25, caractérisée en ce que ledit second polyol est du 2-amino- 2-méthyl-1-propanol. 27 Dispositif d'immuno-essai du type plaquette à plonger, caractérisé en ce qu'il comporte un support, une zone d'essai définie sur ce support, au moins un composant immunologique immobilisé, disposé dans cette zone en une configuration formant une zone indicatrice, ledit composant immunologique pouvant fixer à la fois un complément cible et un complément marqué par une enzyme, lequel complément marqué par une enzyme produit, lors du contact avec un substrat pour ladite enzyme, une différence visuellement discernable entre ladite zone indicatrice et ladite zone d'essai, et un inhibiteur pour ladite enzyme, réparti dans ladite zone. 28 Dispositif d'immuno-essai du type plaquette à plonger, caractérisé en ce qu'il comporte un support, une zone d'essai définie sur ce support, et au moins un composant immunologique immobilisé, disposé dans ladite zone en une configuration formant une zone indicatrice, ce composant immunologique pouvant fixer un anticorps marqué par un marqueur direct, par l'intermédiaire d'un analyte cible, pour former un complexe sandwich sur ladite zone, lequel complexe produit une différence visuellement discernable entre ladite zone indicatrice et ladite zone d'essai.