Brevet FR2658610A1 — publié le 19910823

La présente invention se rapporte à un procédé utile pour le dosage du dextrométhorphane et/ou du dextrorphane dans des échantillons biologiques. Le polymorphisme génétique du métabolisme oxydatif de médicament produisant un grand nombre de réponses interindividuelles à la thérapie ou des effets secondaires, il est devenu important de le considérer lors du contrôle de médicaments destinés à l'usage humain. Ce type de déficiences génétiques a été rapporté pour la débrisoquine qui est un médicament antihypertenseur. Deux phénotypes ont été décrits : des métaboliseurs efficaces et des métaboliseurs faibles dont le pouvoir d'hydroxylation est considérablement réduit. Les métaboliseurs faibles présentent au niveau du foie une quantité très réduite, voire nulle, d'isozyme du cytochrome P450 (P450 II D6) impliqué dans l'hydroxylation de la débrisoquine. En fait, cette déficience semble être en relation avec un gène déficient et les métaboliseurs faibles sont homozygotes pour l'allèle récessif correspondant. Le dextrométhorphane ou (+) méthoxy-3-N-méthyl-morphinane est un médicament utilisé contre la toux. I1 a été montré que la O-déméthylation de ce principe actif se réalisait également sous contrôle génétique et que ce médicament était O-déméthylé par le même isozyme P450 métabolisant la débrisoquine. De nombreuses études sur la coségrégation de la O-déméthylation du dextrométhorphane et de la 4-hydroxylation de la débrisoquine ont été, à ce jour, réalisées. Au vu des résultats obtenus, le dextromé- thorphane est préconisé comme substitut de la débrisoquine pour des études importantes dans la recherche pharmacogénétique, en particulier chez l'enfant. I1 est donc important de disposer, notamment dans le cadre de ces études, d'une méthode de dosage du dextrométhorphane et de son métabolite majoritaire, le dextrorphane, qui soit d'une mise en oeuvre aisée et qui possède un seuil de détection optimale. Plusieurs méthodes de dosage, incluant la chromatographie gazeuse et la chromatographie liquide à haute performance HPLC, ont déjà été développées. Toutefois, ces méthodes sont complexes et nécessitent des équipements dont on ne dispose pas habituellement pour les examens de routine. L'objet de la présente invention est de proposer une méthode de dosage améliorée pour le dextrométhorphane et le dextrorphane. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un procédé de détermination de la concentration de dextrométhorphane et/ou dextrorphane dans un échantillon biologique caractérisé en ce que le dextrométhorphane ou le dextrorphane présent dans ledit échantillon biologique est mis en compétition avec une quantité connue du conjugué, correspondant à l'haptène dosé lié à un marqueur, vis-à-vis d'une quantité déterminée d'anticorps polyclonaux et en ce que l'on évalue en fin de réaction les conjugués fixés afin de déterminer la concentration de dextro méthorphane ou dextrorphane contenue dans l'échantillon biologique en se référant à des courbes de concentration obtenues dans les mêmes conditions avec des échantillons standards. I1 s'agit en fait d'une méthode d'immunodosage de type Elisa. Cette méthode de dosage implique la préparation des immunogènes correspondants qui sont de préférence des hémisuccinates de dextrométhorphane ou de dextrorphane couplés à de l'albumine de sérum bovin. Ces hémisuccinates de dextrométhorphane ou de dextrorphane sont aussi couplés à un marqueur qui est de préférence d'origine enzymatique. I1 s'agit plus particulièrement de la peroxydase de raifort. Les anticorps sont également préparés au préalable. La technologie utilisée pour préparer ces anticorps est une technologie qui est connue actuellement de l'homme du métier. Ces anticorps sont d'origine animale et il s'agit plus particulièrement d'IgG. Le liquide physiologique à doser est de préférence une urine de mammifère. Dans le cas du dosage du dextrométhorphane, cette urine ne subit aucun traitement préalable. En revanche, la détermination du dextrorphane nécessite au préalable son traitement par hydrolyse enzymatique. On utilise à cette fin un mélange de p-glucuronidase/ B-arylsulfatase. Le procédé selon l'invention permet d'évaluer le rapport concentration de dextrométhorphane sur concentration de dextrorphane ou l'inverse, dans le même échantillon biologique. Quel que soit le dosage considéré, celui du dextrométhorphane ou du dextrorphane, les seuils de détection obtenus avec le procédé selon l'invention sont très bas (30 pg par puit). Les variations intra et inter-dosages sont inférieures à 10 % et les réactions croisées entre le dextrométhorphane et le dextrorphane dans les deux dosages sont inférieures à 1 %. Le procédé selon l'invention peut être appliqué à la détermination du phénotype d'une population humaine dans les études pharmacogénétiques. L'application du procédé selon l'invention au dosage du dextrométhorphane/dextrorphane a permis de mettre en évidence de nombreux avantages de celui-ci par rapport aux autres méthodes habituellement utilisées, en particulier le procédé HPLC. Le procédé selon l'invention permet d'effectuer un plus grand nombre d'analyses dans un temps limité, 3 heures pour 200 dosages contre 15 minutes par dosage selon le procédé HPLC par exemple. I1 présente en outre une mise en oeuvre aisée. Il ne nécessite en effet aucune extraction préliminaire et on n'observe aucune interférence significative dans les urines diluées. Enfin, le procédé selon l'invention possède un seuil de détection très faible qui est inférieur à 0,4 ng/ml contre 40 ng/ml pour la méthode HPLC. De plus, en raison de ce faible seuil de détection, il est possible d'établir un rapport métabolique plus significatif pour des métabolismes où le dextrométhorphane urinaire est inférieur à 40 ng/ml, ce qui n'est pas le cas de la méthode HPLC. Les exemples et figures donnés ci-dessous à titre non limitatif de l'invention permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de celle-ci. La figure 1 représente les structures du dextrométhorphane (A) et de ses dérivés obtenus par synthèse chimique (B : dextrométhorphane désalkylé, C: dextrométhorphane hémisuccinate, D dextrorphane hémisuccinate). La figure 2 représente les courbes étalons pour les immunodosages du dextrométhorphane (A) et du dextrorphane (B), (l'absorbance est portée en fonction de la quantité d'haptènes par puits exprimée en ng sur une échelle semi-logarithmique). La figure 3 représente la comparaison de la distribution de fréquence des rapports métaboliques dextrométhorphane/dextrorphane (log (DEM/DOR)) déterminés par HPLC et ELISA sur 53 volontaires sains. La figure 4 représente la distribution de fréquence des rapports métaboliques dextrométhorphane/dextrorphane (log (DEM/DOR)) sur une population tout-venant de 216 sujets. MATERIELS ET METHODES Le dextrométhorphane et ses métabolites ont été obtenus auprès des Laboratoires HOFFMANN-LA-ROCHE (Bâle - Suisse) et l'albumine de sérum bovin débarrassée de toute trace d'acide gras (ASB)auprès des Laboratoires SIGMA (St Louis MO, USA). La peroxydase de Raifort (HPR 250 unités/mg de protéine) et la béta glucuronidase/bétaarylsulfatase ont été achetées aux Laboratoires BOEHRINGER (Mannheim, FRG). Les microplaques de 96 puits ont été obtenues auprès de NUNC (Kamstrup, DK). Les microplaques ont été lavées avec un laveur de plaques Immunowash NUNC (Kamstrup, DK) et lues avec un lecteur de plaques TITERTEK Multiskan MC (Laboratoires FLOW, F). EXEMPLE 1 1) Préparation des haptènes modifiés O-déméthylation du dextrométhorphane. Le chloroformate de chloroéthyle 473 ul (4 mmol), est prélevé à la seringue sous argon et additionné à une solution de dextrométhorphane (A) 578 mg (2 mmol) sous agitation dans du 1,2-dichloroéthane, fraîchement distillé, à -10 C. Le mélange est agité 15 minutes à -10"C , 30 minutes à température ambiante et 90 minutes à la température du reflux. Les 2/3 du 1,2-dichloroéthane sont évaporés sous vide et 8 ml de méthanol sont ensuite additionnés sous agitation vigoureuse. La solution est portée au reflux 2,5 heures puis les solvants sont évaporés sous vide. Le mélange résiduel, dissous dans 10 ml de chlorure de méthylène est extrait avec une solution de HC1 à 10 %. La phase aqueuse est basifiée avec une solution de NaHCO3 à 8 % et extraite avec du chlorure de méthylène pour conduire au dextrométhorphane O-déméthylé ou composé B (480 mg, 87 %). Hémisuccinate de dextrométhorphane (composé C) Au composé B, 245 mg (0,9 mmol), dans 10 ml de chlorure de méthylène, on additionne 125 mg de triéthylamine (1.5 eq), 10 mg de 4-diméthyl-aminopyridine et 107 mg d'anhydride succinique (1.2eq). Le mélange réactionnel est agité 18 heures à température ambiante puis extrait avec une solution de NaHCO3 à 8 %. La phase aqueuse est acidifiée avec de l'acide chlorhydrique 3N et extraite au chlorure de méthylène. Le produit résiduel est chromatographié sur gel de silice (MeOH/CH2C12: 1/9) pour conduire à l'hémisuccinate du dextrométhrophane (315 mg, 93 %). Déméthylation de l'hémisuccinate de dextrométhorphane (composé D). 140 ul de tribromure de bore, (1,45 mmol) sont additionnés à 181 mg de composé C, dans 10 ml de chlorure de méthylène anhydre sous argon à température ambiante. Après une nuit d'agitation, le réactif en excès et les complexes de bore sont hydrolysés par addition d'eau. La phase organique est extraite avec de la soude 2N puis éliminée. La phase aqueuse est acidifiée avec une solution d'acide chlorhydrique 10 % et extraite au chlorure de méthylène. Le produit résiduel est ensuite chromatographié sur gel de silice (MeOH/CH2Cl2 : 1/9) pour conduire à l'hémisuccinate de dextrorphane ou composé D (145 mg, 83 %). 2) Préparation des immunogènes 20 ul de triéthylamine et 12 ,ul de chloroformate d'isobutyle sont additionnés à 25 mg du composé C (ou 30 mg du composé D) dans 360 ijl DMF anhydre, refroidi dans de la glace, et agités durant 30 minutes. Ensuite, on ajoute, une solution aqueuse d'albumine de sérum bovin (100 mg dans 2,4 ml d'eau) refroidie dans de la glace et de la soude 1N (0,1 ml) au mélange précédent et l'ensemble est agité de nouveau à 4"C pendant 16 heures. Après dialyse contre de l'eau distillée pendant 48 heures, la solution est lyophilisée. 3) Préparation des conjugués La préparation des haptènes marqués à la peroxydase a été réalisée selon le procédé décrit par Nambara et ses collaborateurs (J. Stéroid. Biochem. 16 : 533-538, 1982) 4) L'immunisation Des lapins mâles ("fauve de Bourgogne", Orléans, F) ont été utilisés pour l'immunisation. Les immunogènes (0,5 mg/lapin) ont été dissous dans une solution de NaCI stérile à 0,9 % et émulsifiés (volume /volume) avec un adjuvant de Freund complet. Des inoculations souscutanées ont été réalisées à plusieurs sites le long de la chaîne ganglionnaire dorsale. Les injections suivantes ont été préparées telles que décrit ci-dessus mais avec de l'adjuvant de Freund incomplet et injectées sous-cutanément toutes les deux semaines pendant 4 mois. Les lapins ont été saignés 7 jours après le dernier rappel.L'antisérum a été obtenu par centrifugation à vitesse réduite et stocké à -20 C. 5) Préparation des immunoglobulines G Des immunoglobulines G (IgG) pures ont été préparées selon Steinbuch et Audran (Arch. Biochem. Biophys., 131 : 279-284,1969) en utilisant de l'acide caprylique. 6) Hydrolyse enzymatique Les échantillons d'urine ont été dilués (v/v) dans un tampon acétate 0,1 M, pH 5,0. Pour chaque échantillon, une addition de 20 Cil de béta-glucuronidase (0,275 u)/béta-arylsulfatase (0,052 u) suivie d'une incubation à 37"C pendant 12 heures, ont été réalisées. 7) Dosage immunoenzymatique La quantité de dextrométhorphane a été déterminée dans de l'urine non traitée alors que celle du dextrorphane a été mesurée dans de l'urine hydrolysée. Les puits des plaques EIA ont été tapissés à 20"C pendant 16 heures par des IgG à une dilution appropriée (1/500) dans un tampon de phosphate de sodium 0,1 M pH 7,2 (100 pl/puits). Les plaques ont été lavées 3 fois à l'eau distillée puis saturées avec de l'albumine de sérum bovin à 1 % dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,2 (150 Ill/puits) pendant 30 minutes à température ambiante. Les plaques sont de nouveaux rincées 1 fois à l'eau distillée et 50 p1 d'un témoin ou d'un échantillon et 50 p1 de conjugué dilué de façon appropriée (1/5000 au 1/1000) ont été distribués dans chaque puits. Après une incubation de 2 heures à température ambiante, les plaques ont été rincées 3 fois à l'eau distillée et 100 pI d'une solution de substrat de peroxydase de Raifort (75 mg d'O-phénylène diamine, dissous extemporanément dans 25 ml de tampon phosphate/ citrate 0,1 pH 5,8 contenant 0,02 % de peroxyde d'hydrogène), ont été distribués dans chacun des puits. On laisse la réaction se réaliser pendant 30 minutes à température ambiante, à l'obscurité. La réaction enzymatique est stoppée par addition de 100 p1 d'H2 SO4 1 N et les absorbances sont mesurées à 492 nm. Pour la détermination du dextrométhorphane, l'urine a été diluée au 1/50 et pour la détermination du dextrorphane au 1/200. Les plaques peuvent être tapissées d'anticorps, saturées par de la sérum d'albumine bovine 2 % et stockées à 4"C pendant 3 mois après séchage. EXEMPLE 2: L'immunodosage selon l'invention a été ensuite testé. Dans un premier temps, on a comparé cette méthode de dosage à la méthode HPLC habituellement utilisée puis, on a établi le phénotype de 53 sujets non sélectionnés en utilisant chacune des deux méthodes, l'immunodosage selon l'invention et la méthode HPLC. Méthode HPLC Le dextrométhorphane et le dextrorphane peuvent également être détectés dans les urines non extraites par une méthode HPLC selon Motassim et ses collaborateurs. Les échantillons humains Les échantillons d'urine (0-8 heures) ont été recueillis chez des individus dans une population française non sélectionnée et subissant un examen de santé au Centre de Médecine Préventive, VANDOEUVRE-LES NANCY (FRANCE). I1 s'agissait de 216 volontaires, présumés en bonne santé, comprenant 107 hommes (moyenne d'âge 41 ans + 6 années) et 109 femmes (moyenne d'âge 39 ans + 6 années) ; chaque sujet a reçu une dose unique par voie orale de dextrométhorphane (30 mg). Le dextrorphane étant principalement excrété sous forme de glucuronide, les échantillons urinaires nécessitent d'être traités par hydrolyse enzymatique en utilisant un mélange de béta-glucuronidase/ béta-arylsulfatase pour libérer l'aglycone qui est alors reconnu par les anticorps anti-dextrorphane. Résultats Les courbes standards typiques pour l'évaluation du dextro méthorphane et dextrorphane urinaires sont représentées en figures 1 et 2. Les seuils de détection sont respectivement de 37 pg et 30 pg pour le dextrométhorphane et le dextrorphane. Dans les deux cas, les domaines de concentration utilisables sont importants, de 0,7 à 180 ng/ml pour le dextrométhorphane et de 0,6 à 600 ng/ml pour le dextrorphane. La précision des dosages a été exprimée par les coefficients de variation (C V). Dans le cas du dextrométhorphane, pour 3 valeurs haute, moyenne et basse de la gamme étalon (18,3 ng, 1,83 ng et 0,18 ng), le CV intra essai est inférieur à 3,1 % (n=8) et le CV inter essai est inférieur à 5,7 (n=6). De même, dans le cas du dextrorphane pour trois valeurs haute, moyenne et basse de la gamme étalon (15,2 ng, 1,52 ng ou 0,15 ng), le CV intra essai est inférieur à 6 % et en inter essai, il est inférieur à 10 96. La spécificité des deux méthodes de dosage a été déterminée par l'étude des réactions croisées et définie comme suit : 100 x/y où x est la concentration du témoin et y la concentration de la molécule testée conduisant à 50 % d'inhibition de la fixation du conjugué. Divers pourcentages de réactions croisées avec des métabolites (3-morphinanol et 3-méthoxymorphinane) ou composés chimiques proches (morphine, éthylmorphine et codéine) sont représentés dans le tableau I ci-après. TABLEAU I Pourcentage de réactions croisées d'antiserums de dextrométhorphane et dextrorphane avec des métabolites (3-morphinanol, 3-méthoxymorphinane) et des dérivés chimiques (morphine, éthylmorphine, codéine) COMPOSE Réaction croisée vis- Réaction croisée à-vis des anticorps vis-à-vis des dextrométhorphane anticorps dextrorphane % % Dextrométhorphane 100 0,75 Dextrorphane 0,8 100 3-morphinanol 0,8 45 3-méthoxymorphinane 65 0,7 Morphine ( 0,05 0,05 Ethylmorphine ( 0,05 ( 0,05 Codéine ( 0,05 ç 0,05 On peut voir que la réaction croisée entre le dextrométhorphane et le dextrorphane est de 0,8 %. Pour tester ces immunodosages, on a établi tout d'abord des corrélations entre eux et la méthode HPLC puis, phénotypé avec le procédé selon l'invention et cette méthode HPLC, un groupe de 53 sujets non sélectionnés. Le coefficient de corrélation calculé entre les méthodes HPLC et le procédé selon l'invention est de 0,949. Le phénotypage est représenté en figure 3 par une représentation semi-logarithmique donnant le rapport métabolique dextrométorphane/dextrorphane en axe des abscisses. Ce rapport métabolique correspond au logarithme du rapport du dextromé- thorphane et du dextrorphane éliminés dans les urines recueillies sur une période de 8 heures. Dans les deux cas, la distribution est clairement bimodale. On note néanmoins que, lorsque la concentration de dextrométhorphane est très basse (inférieure à 40 ng/ml), la méthode HPLC donne, à la différence du procédé selon l'invention, des rapports métaboliques imprécis en raison de sa limite de détection. I1 a été ensuite établi le phénotype de 216 volontaires non sélectionnés. La figure 4 représente l'histogramme correspondant à la fréquence de distribution du rapport métabolique dextrométhorphane/ dextrorphane. On observe une représentation bimodale. Dans cette population, on a mis en évidence 11 métaboliseurs faibles sur les 216 sujets, ce qui correspond à 5,1 %. Dans cette population, le rapport métabolique dextrométhorphane/dextrorphane est de 0,013 + 0,031 pour les métaboliseurs efficaces et de 7,6 + 5,4 pour les métaboliseurs faibles. REVENDICATIONS 1. Procédé de détermination de la concentration de dextro méthorphane et/ou dextrorphane dans un échantillon biologique caractérisé en ce que le dextrométhorphane ou le dextrorphane présent dans ledit échantillon biologique est mis en compétition avec une quantité connue du conjugué, correspondant à l'haptène dosé lié à un marqueur, vis-à-vis d'une quantité déterminée d'anticorps polyclonaux et en ce que l'on évalue en fin de réaction les conjugués fixés afin de déterminer la concentration de dextrométhorphane ou dextrorphane contenue dans l'échantillon biologique en se référant à des courbes de concentration obtenues dans les mêmes conditions avec des échantillons standards. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est une urine de mammifère qui n'a pas subi de traitement pour la détermination de la concentration de dextrométhorphane et qui a subi une hydrolyse pour la détermination de la concentration du dextrorphane. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le marqueur est un marqueur enzymatique. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il s'agit de la peroxydase de raifort. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on évalue le rapport concentration dextrométhorphane sur concentration de dextrorphane ou l'inverse dans le même échantillon biologique.