Brevet FR2649308A1 — publié le 19910111

ANIMAL D'EXPERIENCE, SON PROCEDE D'OBTENTION ET CONJUGUE UTILISABLE A CET EFFET La présente invention concerne un nouvel animal d'expérience utilisable comme modèle animal de la démence, son procédé d'obtention et un conjugué utilisable à cet effet. Le niveau de vie des japonais est parmi les plus élevés du monde et la fraction de la population totale qui est représentée par les personnes d'un certain âge qui travaillent augmente d'année en année, et de ce fait, le nombre de personnes qui souffrent de démence sénile, ce que l'on appelle la démence du type Alzheimer, augmente aussi. La démence du type Alzheimer est caractérisée du point de vue pathologique en ce que les neurones cholinergiques du noyau de Meynert ou du cerveau antérieur basal sont détruits de façon importante. En vue de développer un produit pharmaceutique destiné à la thérapie de la démence de type Alzheimer, il est nécessaire de disposer d'un modèle animal de maladie pour l'estimation de l'effet pharmacologique, et on connaît un animal dont le cerveau antérieur correspondant au noyau de Meynert des primates est détruit électriquement, ainsi qu'un animal dont le cerveau basai est détruit par administration d'une substance toxique telle que l'acide kainique, l'acide iboténique, l'ion aziridinium de l'éthylcholine de moutarde (AF64A). Cependant, dans le modèle animal obtenu par destruction électrique et dans le modèle animal obtenu par traitement par l'acide kainique ou par l'acide iboténique, les parties du système nerveux autres que les neurones cholinergiques, telles que par exemple les neurones non cholinergiques et les fibres qui passent sont également détruites. Dans le modèle animal traité par AF64A, les neurones cholinergiques autres que les neurones cholinergiques qui sortent du noyau de Meynert et pénètrent dans le cortex cérébral sont également lésés sans distinction. Pour ces raisons, ces modèles animaux ne conviennent pas nécessairement à l'évaluation de l'effet pharmacologique. Les présents inventeurs ont fait des recherches approfondies en vue de créer un animal d'expérience pour la démence, en particulier un mod-'le animal pour la démence de type Alzheimer, et ils ont trouve à la suite de ces recherches que par administration d'un conjugué d'un facteur de croissance des nerfs (NGF) et d'une neurotoxine, qui n'était pas connu dans la technique, dans le cortex cérébral d'un animal, ledit conjugué est incorporé par l'extrémité de l'axone des neurones cholinergiques dans le cortex cérébral, de sorte que les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau de Meynert (dans le cas d'un primate) ou du cerveau antérieur basal (dans le cas d'un animal autre qu'un primate) et qui pénètrent dans le cortex cérébral sont détruits de façon sélective, et aussi que l'étendue de cette destruction dépend de la dose du conjugué de NGF et de neurotoxine, et que l'étendue de la destruction peut être contrôlée en modifiant la dose. De plus, les présents inventeurs ont constaté que les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau du septum et qui pénètrent dans 1'hippocampe peuvent être détruits sélectivement et en fonction de la dose par administration du conjugué ci-dessus dans l'hippocampe d'un animal. Ainsi, sur la base de ces constatations, la présente invention concerne un mammifère, à l'exception d'un être humain, dont les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau de Meynert ou du cerveau antérieur basal et qui pénètrent dans le cortex cérébral et/ou dont les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau du septum et qui pénètrent dans l'hippocampe sont détruits sélectivement et son procédé d'obtention. La figure 1 représente une microphotographie d'une bande du cerveau antérieur basal d'un rat auquel on a administré le conjugué NGF 2,5Stoxine de la diphtérie sur le cerveau unilatéral dans l'exemple expérimental 1; A, C indiquent le côté de l'administration et B, D le côté qui n'a pas reçu le conjugué. Le mammnifère que 1'.an peut utiliser selon la présente invention peut être par exemple un primate comme le singe, un rongeur comme le rat, la souris et le cobaye, un canidé, ou un félin. On préfère utiliser un rongeur tel que le rat ou la souris. On peut obtenir l'animal selon la présente invention en lui administrant un conjugué de NGF et de -neurotoxine dans le cortex cérébral et/ou l'hippocampe, pour détruire de façon sélective les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau de Meynert ou du cerveau antérieur basal et qui pénètrent dans le cortex cérébral et/ou les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau du septum et qui pénètrent dans 1 'hippocampe. On peut préparer le conjugué de NGF et de neurotoxine en faisant réagir le NGF avec la neurotoxine. Comme NGF, on peut utiliser le NGF du placenta humain, le NGF de la glande sous-mandibulaire de souris, le NGF de prostate de taureau, le NGF de sperme de taureau et le NGF de la glande sous-mandibulaire du rat musqué. On utilise de préférence le NGF 7S, le NGF 0 et le NGF 2,5S du NGF de la glande sous-mandibulaire de souris. Comme neurotoxine on peut utiliser par exemple les toxines protéiques telles que la toxine de la diphtérie, la toxine du choléra et la ricine. Ces toxines protéiques comprennent en général des sous-unités de la chaîne A et de la chaîne B, mais selon la présente invention, on-peut utiliser toute toxine contenant la chaîne A. On peut réaliser facilement la réaction ci-dessus dans un solvant approprié en présence d'un agent de condensation en ajoutant une solution de facteur de croissance des nerfs à une solution de neurotoxine puis en ajoutant un agent de condensation, en laissant la solution au repos et en en séparant le conjugué. Il est préférable d'utiliser un excès de NGF par rapport à la neurotoxine afin d'éviter qu'il ne reste de la neurotoxine qui n'a pas réagi lorsque la réaction est achevée. Par exemple, il est préférable d'utiliser 1,5 à 3 molécules de NGF par molécule de neurotoxine. Comme agent de condensation, on peut utiliser l'un de ceux qui sont utilisés dans la synthèse peptidique. par exemple, on peut utiliser de préférence des agents de condensation hydrosolubles tels que le 1-éthyl-3-(3-L- diméthylaminopropyl)carbodiimide et le N-cyclohexyl-N'- morpholinocarbodiimide. Comme solvant réactionnel, on préfère l'eau. La réaction peut se dérouler à la température ambiante, mais il est préférable de maintenir au cours de la réaction le pH du mélange réactionnel entre 5,5 et 8,0 à l'aide d'un tampon approprié tel que le tampon phosphate. La réaction étant terminée il est souhaitable de purifier le conjugué formé par un procédé conventionnel utilisé dans ce domaine comme la dialyse et la filtration sur gel. Le conjugué de NGF et de neurotoxine ainsi obtenu peut être administré dans le cortex cérébral ou l'hippocampe de façon classique, par exemple en perforant l'os du crâne et en l'administrant par la partie perforée. Lorsque l'on opère de cette façon, il peut être préférable de faire une ou plusieurs perforations au niveau de chaque hémisphère cérébral, la partie de l'os du crâne qui contient la suture cruciforme étant située au centre, et d'injecter le conjugué par la partie perforée à l'aide d'une microseringue. De même, dans le cas d'une injection dans l'hippocampe, on peut faire une ou plusieurs perforations pour chaque hémisphère cérébral, et on peut injecter le conjugué de la même manière que ci-dessus. On peut choisir le site d'administration. Dans le cas du rat, par exemple, on peut choisir le site - d'administration situé danIs le cortex cérébral parmi le cortex frontal, le cortex pariétal, le cortex occipital en consultant l'atlas du cerveau de Paxinos et Watson [The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, Sydney (1986)], et le site d'administration situé dans l'hippocampe parmi les sites CA1, CA2 et CA3. La dose de conjugué peut varier légèrement en fonction du type d'animal, mais elle peut se situer approximativement dans la gamme d'environ 0,5 à 30 pg par animal. Par exemple, lorsque l'on pratique l'administration dans le cortex cérébral du rat ou de la souris, on peut administrer de façon appropriée 0,5 à 6 pg par rat ou souris. On peut commander l'étendue de la destruction des neurones cholinergiques en augmentant ou diminuant la dose de façon adéquate dans cette gamme. Après l'administration, on obtient l'animal d'expérience selon la présente invention en nourrissant normalement l'animal traité pendant environ 3 à 7 jours. On peut obtenir aussi l'animal d'expérience selon la présente invention en administrant le conjugué de NGF et de neurotoxine directement dans le noyau de Meynert et/ou le cerveau antérieur basai et dans le noyau du septum. On peut utiliser le mammifère selon la présente invention ainsi obtenu comme modèle expérimental pour la démence de type Alzheimer ou comme animal d'expérience pour examiner la fonction des neurones cholinergiques dans le cerveau antérieur basal et le noyau du septum-, étant donné que les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau de Meynert ou du cerveau antérieur basal et/ou les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau du septum et qui pénètrent dans l'hippocampe sont détruits de façon sélective. C'est ainsi que la présente invention concerne aussi un procédé pour tester un produit pharmaceutique destiné à la thérapie de la démence du -vype Alzheimer, qui comprend l'administration du produit pharmaceutique à l'animal d'expérience selon l'invention. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 (1) Préparation du conjugué de NGF et de neurotoxine: A une solution de 10 pg de NGF 2,5S (préparé par Colaborative Research Co.) dissous dans 40 p1 de sérum physiologique tamponné au phosphate 0,02M on a ajouté une solution de 22,3 pg de toxine de la diphtérie (poids moléculaire: environ 62000, préparée par Wako Junyaku K.K.) dissoute dans 40 il de sérum physiologique tamponné au phosphate 0,02M. Puis, on a ajouté au mélange 80 pil d'une solution de chlorhydrate de l-éthyl-3-(3-L- diméthylaminopropyl)carbodiimide dans l'eau distillée (100 mg/ml), et on a laissé le mélange au repos à la température ambiante pendant 10 heures, tout en secouant le mélange périodiquement. Ensuite, on a dialysé le mélange contre du sérum physiologique tamponné au phosphate 0,02M à 4 C pendant une nuit. On a ainsi obtenu un dialysat contenant le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie. On a prélevé une partie du dialysat et on a confirmé par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS la présence de la bande du conjugué (poids moléculaire d'environ 71000) et l'absence de bande de la chaîne A (poids moléculaire d'environ 21000) et de la chaîne B (poids moléculaire d'environ 37000) de la toxine de la diphtérie. (2) Administration du conjugué: On a fixé un rat (souche Wistar, mâle, pesant environ g) sur un dispositif stéréotaxique (fabriqué par Shigemo Kagaku K.K.) sous anesthésie au pentobarbiturate de sodium (administré par voie intrapéritonéale, 40 mg/kg). Ensuite, on a coupé la peau au sonmmet du crâne suivant la ligne médiane pour exposer l'os du crâne et on a perforé celui-ci des deux côtés (1) à 2,5 mm sur le devant, 2,5 mm sur le côté, (2) 0,5 mm sur l'arrière, 2,5 mm sur le côté et (3) 3,5 mm sur l'arrière, 3,0 mn sur le côté de la suture cruciforme. On a aspiré dans une microseringue la solution de dialysat contenant le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie obtenu ci-dessus en (1) et on en a injecté à chaque fois 1 pl dans le cortex cérébral à une profondeur de 0, 5 mm. Après l'administration, en nourrissant le rat normalement pendant 3 jours, on a obtenu un rat dont les neurones cholinergiques qui font saillie du cerveau antérieur basal et qui pénètrent dans le cortex cérébral étaient détruits. (3) Observation des cellules ChAT positives: On a soumis le rat obtenu cidessus à une thoracotomie sous anesthésie au pentobarbiturate de sodium (administré par voie intrapéritonéale, 40 mg/kg), on a introduit un cathéter par le ventricule gauche dans l'aorte gauche, et après perfusion avec 100 ml de sérum physiologique, puis avec 500 ml de solution de Zamboni (mélange de paraformaldéhyde à 4% et d'acide picrique à 0,2%) on a énucléé le cerveau et on l'a fixé par immersion dans la solution de Zamboni pendant un jour et une nuit. On a plongé l'échantillon de cerveau obtenu dans une solution de saccharose à 30% pendant un jour et une nuit 15. puis on l'a congelé rapidement sur de la glace sèche, on a préparé une bande épaisse de 30 pm à l'aide d'un Cryostat (Moriyasu Seisakusho K.K.) et on a plongé la bande dans du sérum physiologique tamponné au phosphate 0,02M. On a plongé la bande de cerveau dans une solution d'anticorps anticholine acétyltransférase (0,5 pg/ml, dérivée de rat-souris, fabriquée par Boehlinger-Mannheim Co.) pendant un jour et une nuit, puis on a examiné au microscope les cellules choline acétyltransférase (ChAT) positives en tant qu'indice des neurones cholinergiques selon le procédé par immunofluorescence indirecte aux anticorps. On a ainsi confirmé une réduction sélective des neurones cholinergiques qui font saillie dans le cortex cérébral des deux c8tés du cerveau antérieur basal (réduction des cellules choline acétyltransférase positives) et une diminution de l'immunoréactivité. Exeimle 2 De même que dans l'exemple 1-(2), on a exposé l'os du crâne d'un rat (souche Wistar,nmâle) pesant environ 150 g, on g a perforé l'os du crâne des deux côtés (1) à 5,5 mm à l'arrière et à 4,0 mm sur le côté de la suture cruciforme. On a aspiré dans une microseringue le dialysat contenant le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie obtenu dans l'exemple 1-(1) et on a injecté à chaque fois 1 pil dans le cortex cérébral à une profondeur de 4 mmn. Après l'administration, en nourrissant normalement le rat pendant 3 jours, on a obtenu un rat dont les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau du septum et qui pénètrent dans l'hippocampe étaient sélectivement détruits. Exemple expérimental 1 On a effectué le traitement de la même façon que dans l'exemple 1 sauf que l'on a injecté à chaque fois 0,5 pl de solution de conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie seulement dans le côté unilatéral du cortex cérébral du rat, et on a examiné les cellules choline acétyltransférase positives dans le cerveau antérieur basai. Les résultats sont illustrés dans la figure 1. Sur les photographies des figures 1A à 1D (A et C représentent le côté traité, et B et D le côté non traité), il apparaît clairement que les cellules choline acétyltransférase positives et l'immunoréactivité du côté administré sont réduites de façon marquée par rapport à celles du côté non administré. On peut en déduire que les neurones cholinergiques qui font saillie du cerveau antérieur basal et qui pénètrent dans le cortex cérébral sont détruits de façon sélective par administration du conjugué de NGF et de toxine de la diphtérie. Exemple expérimental 2 Objet de l'essai En utilisant une souris à laquelle on a administré le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie, on a réalisé l'essai d'acquisition de mémoire 3 jours après l'administration, et on a réalisé l'essai de rétention de mémoire 8 jours après pour étudier l'inhibition par le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie de l'aptitude à l'acquisition et à la rétention de mémoire. Méthode expérimentale (1) Essai d'acquisition de mémoire 3 jours après l'administration de la solution de conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie: (1) On a utilisé 29 souris (de 6 semaines, souche Slc:ddY) pesant de 26 à 30 g pour chaque groupe. On a administré au groupe d'essai 0,2 pl de conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie sur les sites situés sur le côté à environ 1,5 mm et à une profondeur de 0,3 à 0,5 mm du cortex cérébral et du cortex pariétal des deux côtés de la tête, à l'aide d'une seringue de Hamilton sous anesthésie à l'éther. Dans le groupe témoin, on a administré le même volume de sérum physiologique de la même façon que ci- dessus. (2) 3 jours après l'administration, on a placé la souris de façon stationnaire dans la chambre éclairée du dispositif du type à traversée comprenant une chambre éclairée et une chambre obscure (ledit dispositif étant muni d'un passage au milieu) la par&ie postérieure étant tournée vers le passage, et une fois que le corps entier de la souris s'est trouvé à l'intérieur de la chambre obscure, on a appliqué une décharge électrique (courant alternatif, 0,5 mA, 3s) à l'aide d'un dispositif brouilleur/producteur de décharges électriques (fabriqué par RBS Co., de marque LVE-11 ) pour susciter la mémoire d'évitement de la chambre obscure. (3) On a jugé que la mémoire d'évitement était acquise lorsque la souris restait dans la chambre éclairée de façon continue pendant 120 secondes ou plus, et le degré d'acquisition de la mémoire a été estimé par le nombre de décharges reçues jusqu'à l'acquisition de la mémoire. Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Nombre de décharges reçues Groupe traité 1,45+0,084 Groupe témoin 1,28 +0, 106 On peut voir d'après le tableau ci-dessus que les souris traitées avec le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie ont reçu un plus grand nombre de décharges avant l'acquisition de la mémoire que le groupe témoin. Ce fait démontre que le groupe traité souffre d'un trouble de l'aptitude à acquérir de la mémoire. (2) Essai de rétention de la mémoire: L'animal ayant acquis la mémoire dans l'essai (1) d'acquisition de mémoire ci-dessus a été placé de façon stationnaire dans la chambre éclairée du dispositif du type à traversée de la même façon que ci-dessus, le huitième jour,la partie postérieure étant tournée vers-le côté du passage. On a examiné la latence nécessaire pour que le marqueur fixé sur la premiAre vertèbre lombaire (L1) et les deux membres inférieurs penètrent complètement dans la chambre obscure ainsi que le nombre d'animaux pour lesquels 300 secondes ou plus étaient nécessaires pour que le marqueur et les deux membres inférieurs pénètrent totalement dans la chambre obscure, et à partir de ces données on a estimé le degré de rétention de la mémoire acquise 8 jours avant. 0 Les r ésultats sont prsents dns le tableau 2. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Tableau 2 (a> Latence (s) LI Membre inférieur Groupe traité 151,9-16,9 256,2+14,4 Groupe témoin 231,3+14,1 285,0+7,85 Tableau 2 (b) Nombre d'animaux pour lesquels 300 s ou plus sont nécessaires Li Membre inférieur Groupe traité 5/29 9/29 Groupe témoin 14/29 24/29 On peut voir d'après les tableaux ci-dessus que les souris traitées avec le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie pénètrent dans la chambre obscure au bout d'une durée remarquablement plus courte que la durée moyenne nécessaire pour le groupe témoin et que la rétention de la mémoire d'évitement de la chambre obscure acquise 8 jours auparavant est plus faible que celle du groupe témoin, c'est-à-dire que l'aptitude à la rétention de la mémoire est dégradée. Egalement, le nombre dm s?' is pour lesquelles une durée de 300 secondes ou plus eLait nécessaire pour pénétrer dans la chambre obscure était aussi remarquablement plus faible dans le groupe traité que dans le groupe témoin, ce que l'on peut interpréter cormmne un trouble de l'aptitude de rétention de la mémoire du fait du conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie. Ainsi, on comprend à la lumière des essais précédents que le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie perturbe à l'évidence l'aptitude des souris à l'acquisition de la mémoire et l'aptitude des souris à la rétention de la mémoire. Exeple expérimental 3 Objet de l'essai On a administré à une souris immédiatement après l'acquisition de la mémoire la solution de conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie et on a effectué le test de rétention de mémoire le huitième jour pour examiner comment l'aptitude à la rétention de la mémoire acquise était perturbée par l'administration de la solution de conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie. Méthode expérimentale On a utilisé pour chaque groupe 26 souris (pesant 26 à g, de 6 semaines, souche Slc:ddY) qui étaient considérées commrne ayant acquis la mémoire d'évitement de la chambre obscure dans'le test d'acquisition de mémoire pratiqué de la même façon que dans l'exemple 2. On a administré la solution de conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie au groupe traité et du sérum physiologique au groupe témoin de la même façon que dans l'exemple expérimental 2. Puis, le huitième jour, on a pratiqué le test de rétention de la même façon que dans l'exemple expérimental 2 pour examiner la rétentic:. de la mémoire acquise huit jours auparavant. Les résultats sont présentés dans le tableau 3. Tableau 3 (a) Latence (s) L1 Membre inférieur Groupe traité 105,0+20,7 192,1+19,8 Groupe témoin 179,2+22,7 252,3+15,3 Tableau 3 (b) Nombre d'animaux pour lesquels 300 s ou plus sont nécessaires LI Membre inférieur Groupe traité 3/26 10/26 Groupe témoin 11/26 17/26 On peut voir d'après les tableaux précédents que les souris traitées avec le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie présentent une latence moyenne remarquablement plus courte avant d'entrer dans la chambre obscure que le groupe témoin, et que la rétention de la mémoire d'évitement de la chambre obscure acquise huit jours auparavant est plus faible que celle du groupe témoin, c'est-à-dire que l'aptitude à la rétention de la mémoire est perturbée. - Egalement, le nombre de souris pour lesquelles 300 secondes ou plus étaient nécessaires pour entrer dans -la chambre obscure était aussi remarquablement plus faible dans le groupe traité que dans le groupe témoin, ce qui peut être attribué au fait que le conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie perturbe l'aptitude à la rétention de la mémoire. Ainsi, le conjugué de Nc- 2,5S et de toxine de la diphtérie perturbe à l'évidence l'aptitude des souris à l'acquisition de la mémoire et leur aptitude à la rétention de la mémoire. Exemnle expérimental 4 Test d'activité de la choline acétyltransférase: Méthode expérimentale On a utilisé dans chaque groupe 6 ou 7 rats (souche Wistar, mâles) pesant environ 150 g. On a administré la solution de conjugué de NGF 2,5S et de toxine de la diphtérie préparée de la même façon que dans l'exemple 1 au groupe traité à raison de 0,2 p1l à chaque fois sur le côté à environ 1,5 mmn et à une profondeur de 0,3 à 0,5 mm dans le cortex du cerveau antérieur et dans le cortex du cerveau supérieur des deux côtés de la tête, à l'aide d'une seringue de Hamilton sous anesthésie au pentobarbiturate de sodium (40 mg/kg, administration intrapéritonéale). On a administré de la mnême façon du sérum physiologique au groupe témoin. Après une période d'alimentation normale de 5 jours à la suite de l'administration, on a coupé la tête de l'animal pour prélever le cerveau, et immédiatement après la mesure du poids, on a recueilli le cortex du lobe frontal et le cerveau antérieur basal. On a homogénéisé le tissu dans 20 fois son volume d'une solution de tris-EDTA 100 mM (pH 7,4), et on en a utilisé 10 p1 pour tester l'activité de la choline acétyltransférase, et une partie du reste pour effectuer une analyse quantitative des protéines. On a mesuré l'activité de la choline acétyltransférase à l'aide de la méthode de Fonum (Journal of Neurochemistry, vol.24, pages 407-409 (1975), et la concentration en protéines à l'aide d'un réactif de dosage des protéines produit par Nippon Biorad Laboratory K.K., et on a calculé l'activité pour 1 mg de protéines. Résunta Les résultats sont présentés ci-dessous dans le tableau 4. Tableau_4 Activité de la choline acétyltransférase (nmole ACh/h/mg) Cortex cérébral Cerveau antérieur basal Groupe traité 8,78 0,26 17,56 0,88 Groupe témoin 9,78+0,30 19,28+0,87 On peut voir clairement d'après le tableau ci-dessus que l'activité de la choline acétyltransférase dans le cortex cérébral et le cerveau antérieur basal des animaux du groupe traité est diminuée d'environ 10% et 9%, respectivement, par rapport aux animaux du groupe témoin. REVIATIONS 1. Animal d'expérience qui est un mammifère, à l'exception d'un être humain, caractérisé en ce que les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau de Meynert ou du cerveau antérieur basai et qui pénètrent dans le cortex cérébral et/ou les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau du septum et qui pénètrent dans l'hippocampe ont été détruits sélectivement. 2. Animal d'expérience qui est un mammnifère, à l'exception d'un être humain, pour tester l'effet pharmacologique de composés chimiques destinés au traitement de la démence de type Alzheimer, caractérisé en ce que les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau de Meynert, dans le cas d'un primate, ou du cerveau antérieur basai, dans les autres cas, et qui pénètrent dans le cortex cérébral de l'animal, et/ou les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau du septum et qui pénètrent dans l'hippocampe de l'animal ont été détruits sélectivement. 3. Animal d'expérience selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rongeur, d'un canidé ou d'un félin. 4. Animal d'expérience selon la revendication 3, caractérisé en ce que le rongeur est un rat. 5. Rat selon la revendication 4, caractérisé en ce que les neurones cholinergiques qui font saillie dans le cortex cérébral ont été détruits sélectivement. 6. Rat selon la revendication 4, caractérisé en ce que les neurones cholinergiques qui font saillie dans l'hippocampe ont été détruits sélectivement. 7. Procédé d'obtention d'un animal d'expérience selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend l'administration d'un conjugué d'un facteur de croissance des nerfs et d'une neurotoxine dans le cortex cérébral et/ou l'hippocampe de l'animal d'expérience pour ainsi détruire sélectivement les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau de Meynert ou du cerveau antérieur basai et qui pénètrent dans le cortex cérébral et/ou les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau du septum et qui pénètrent dans l'hippocampe. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le facteur de croissance des nerfs est le NGF 2,5S, le o10 NGF ouleNGF7S. 9. Procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce que la neurotoxine est la toxine de la diphtérie, la toxine du choléra ou la ricine. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le conjugué est un conjugué du NGF 2,5S et de la toxine de la diphtérie. Il. Procédé selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'animal d'expérience est un rongeur,un canidé ou un félin. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le rongeur est un rat. 13. Procédé selon la r, -.cation 12, caractérisé en ce qu'il comprend l'administration d'un conjugué du facteur de croissance des nerfs et de la toxine de la diphtérie au cortex cérébral du rat pour ainsi détruire sélectivement les neurones cholinergiques qui font saillie du cerveau antérieur basal et qui pénètrent dans le cortex cérébral. 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend l'administration d'un conjugué du facteur de croissance des nerfs et de la toxine de la diphtérie dans l'hippocampe du rat pour ainsi détruire sélectivement les neurones cholinergiques qui font saillie du noyau du septum et qui pénètrent dans 1 'hippocampe. 15. Procédé pour tester un produit pharmaceutique destiné à la thérapie de la démence du type Alzheimer, caractérisé en ce qu'il coemprend l'administration du produit pharmaceutique à un animal d'expérience selon l'une des revendications 1 à 6. 16. Conjugué caractérisé en ce qu'il comprend un facteur de croissance des nerfs (NGF) et une neurotoxine. 17. Conjugué selon la revendication 16, caractérisé en ce que le NGF est choisi parmi le NGF du placenta humain, le NGF de la glande sousmandibulaire de la souris, le NGF du venin de serpent, le NGF de la prostate du cobaye, le NGF de la prostate du lapin, le NGF de la prostate du taureau, le NGF du sperme du taureau et le NGF de la glande sous- mandibulaire du rat musqué. 18. Conjugué selon la revendication 17, caractérisé en ce que le NGF de la glande sous-mandibulaire de la souris est le NGF 7S, le NGF f ou le NGF 2,5S. 19. Conjugué selon la revendication 16, caractérisé en ce que la neurotoxine est une toxine protéique. 20. Conjugué selon la revendication 19, caractérisé en ce que la toxine protéique est choisie dans le groupe formé par la toxine de la diphtE.ie, la toxine du choléra et la ricine. 21. Conjugué selon la revendication 20, caractérisé en ce que la neurotoxine est la toxine de la diphtérie. 22. Conjugué selon l'une des revendications 16 à 21, caractérisé en ce que le rapport du facteur de croissance des nerfs à la neurotoxine est de 1,5 à 3 molécules de NGF pour 1 molécule de neurotoxine. 23. Procédé de préparation du conjugué selon l'une des revendications 16 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à ajouter une solution de facteur de croissance des nerfs à une solution de neurotoxine, puis à ajouter un agent de condensation, à laisser le mélange au repos et à en séparer le conjugué. 24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'agent de condensation est hydrosoluble et peut être le 1-éthyl-3-(3-L-diméthylaminopropyl)carbodiimide ou le N- cyclohexyl-N'-morpholinocarbodiimide. 25. Procédé selon l'une des revendications 23 et 24, caractérisé en ce que le conjugué est séparé par dialyse ou filtration sur gel.