Brevet FR2657168A1 — publié le 19910719

PROCEDE DE PREPARATION DE SUPPORTS D'ANALYSE MEDICALE La présente invention concerne la préparation de supports d'analyse médicale , et en particulier de plaques de microtitration pour groupage sanguin en phase solide. Le groupage sanguin est une analyse effectuée sur le sang d'un malade ou d'un donneur dans le but de réaliser des transfusions sanguines compatibles. Elle se fait par la recherche d'agglutinations susceptibles d'apparaître lorsqu'on met en présence un sérum-test et les globules rouges du sang dont on cherche à déterminer le groupe. Traditionnellement les réactions d'agglutination étaient réalisées sur différents supports , soit des plaques dites d'opaline ou des tubes dits à hémolyse. Depuis quelques années l'usage de plaques de microtitration à fond en U s'est développé. Ces plaques présentent l'avantage de la miniaturisation par rapport aux tubes à hémolyse, puisque le volume de chaque cuvette est de l'ordre de 250 microlitres, à comparer aux 7ml d'un tube à hémolyse. Pour réaliser un test d'agglutination , on dépose dans chaque cuvette d'une plaque de microtitration 50 microlitres de réactif ( sérum-test ou globule-test) dilué en moyenne de 5 à 10 fois ; on ajoute 50 microlitres d'une suspension globulaire réalisée à partir du sang dont on cherche à déterminer le groupe puis on effectue différentes opérations : agitation pour homogénéiser le mélange, incubation , centrifugation pour accélérer l'agglutination , agitation pour remettre en suspension homogène les hématies non agglutinées de manière à distinguer si la réaction est positive ou négative ; enfin on interprète les résultats en fonction de la présence ou non d'agglutinats, soit visuellement soit grâce à un lecteur automatique. On a déjà proposé des plaques de microtitration dans les cuvettes desquelles les réactifs (sérum-test ou globules-tests) sont préalablement déposés puis séchés. De telles plaques sont donc prêtes à l'emploi. Cependant , après réhydratation des réactifs, le mode opératoire du test d'agglutination est inchangé, et le seul avantage réside dans le fait que l'utilisateur est dispensé d'acheter des réactifs en flacon. Afin de simplifier les tests d'agglutination, on a aussi proposé des plaques de microtitration dans les cuvettes desquelles des anticorps d'origine humaine purifiés sont déposés et fixés par adsorption. Ces plaques sont dans un matériau plastique, notamment en polystirène, qui présente la propriété , lorsqu'il est mis en contact avec une solution contenant des protéines, d'absorber une partie de ces protéines. Les anticorps purifiés par chromatographie d'affinité sont mis en solution tamponnée phosphate, laquelle solution est déposée dans les cuvettes de la plaque de microtitration et laissée en contact pendant plusieurs heures. Les anticorps non fixés sont éliminés par rinçage à l'eau physiologique. Les plaques sont conservées humides.Du fait que les plaques sont préparées à partir d'anticorps purifiés , le test d'agglutination ne comporte plus qu'une addition de la suspension globulaire et qu'une centrifugation. Cependant le mode de préparation précité , décrit TRANSFUSION 1985 ; 25 : 21-23 présente différents inconvénients. Son rendement est faible , son temps de préparation est important. On pourrait compléter ou remplacer l'adsorption passive des anticorps par le matériau plastique par une adsorption active en utilisant comme fixateur le glutaraldéhyde à 0,25% , comme cela a été préconisé dans le J. Immunol,meth 1979 ; 26 : 87-95. Mais cette méthode présente l'inconvénient de détruire certains déterminants antigéniques et son application est donc limitée dans les recherches d'anticorps aux seules spécificités non altérées. Le problème que vise à résoudre le demandeur est d'améliorer la préparation des supports d'analyse médicale , et en particulier des plaques de microtitration pour groupage sanguin selon la méthode précitée d'adsorption passive dite en phase solide. Ce but est atteint par le procédé de préparation selon l'invention. Ledit procédé consiste à soumettre tout ou partie de la surface du support à un traitement électrique , puis à mettre la surface ainsi traitée en contact avec le ou les réactifs à adsorber. De façon inattendue , le demandeur a constaté qu'un traitement électrique de la surface du support améliorait de manière importante les propriétés d'adsorption du matériau constitutif du support pour les réactifs mis en jeu dans les analyses médicales , lorsque la mise en contact de la surface traitée électriquement avec le ou les réactifs intervenait dans un délai raisonnable , après le traitement , ce délai étant fonction du matériau et du traitement. Bien sûr on sait que les traitements thermiques sont utilisés dans l'industrie des plastiques pour permettre l'accrochage en surface d'encres, de vernis, de colles ou d'enduction d'autres matières plastiques. Cependant il n'était pas évident qu'un tel traitement modifierait l'adsorption d'un matériau donné vis-à-vis de réactifs pour analyse médicale du type anticorps , et que ces réactifs garderaient , une fois fixés , leur capacité de réaction. C'est le mérite de l'invention que d'avoir osé faire cette transposition d'un traitement usuel de l'industrie des matières plastiques dans le domaine médical , et d'avoir vérifié l'amélioration apportée. Selon le mode préféré de l'invention, le support d'analyse médicale est une plaque de microtitration pour groupage sanguin selon la méthode en phase solide et les réactifs à adsorber sont des sérums-tests ou globules-tests en solution. De préférence , le support est en polychlorure de vinyle, dont la capacité d'adsorption vis-à-vis des réactifs est particulièrement importante, après traitement électrique. Le traitement électrique destiné à modifier la surface du support selon l'invention est d'un type connu dans l'industrie des matières plastiques , par exemple la décharge électrique dite aussi effet couronne ou Corona su encore le plasma différé de micro-ondes. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui va être faite d'un exemple de préparation d'une plaque de microtitration pour groupage sanguin, illustré par le dessin annexé dans lequel la figure unique est une vue en perspective d'une plaque à 96 cuvettes. La plaque 1 de microtitration comporte 96 cuvettes 2 réparties en douze rangées de huit cuvettes Chaque cuvette 2 a un volume utile de l'ordre de 150 à 200 microlitres. Le fond 3 a une forme conique , sa section ayant une forme en Vé. Les cuvettes 2 sont solidaires par leur bord supérieur 2a du support-cuvettes 4, qui comporte des prolongements 5 débordant perpendiculairement au plan formé par les bords supérieurs 2a des cuvettes 2, de sorte que la plaque 1 peut être posée à plat sur les prolongements 5 en forme de rectangle. La plaque 1 est en polychlorure de vinyle , elle est obtenue par moulage. Elle est soumise à un traitement électrique par décharge à partir d'une électrode dite à chaînettes , chaque chaînette pénétrant dans une cuvette. La puissance mise en oeuvre, la distance entre l'électrode et la surface de la plaque et les autres conditions de traitement sont déterminées pour obtenir une augmentation de la tension superficielle de la plaque 1 d'au moins dix pour cent. Par analogie avec l'industrie des matières plastiques, on détermine l'intensité du traitement par l'évolution subséquente de la tension superficielle. Avant traitement électrique , la valeur de la tension superficielle de la plaque: est de 38 dyn. On a obtenu des résultats particulièrement intéressants avec un traitement ayant conduit à une tension superficielle de 50 dyn. Dans le délai d'une heure après le traitement électrique, on dépose dans chacune des cuvettes 2 50 microlitres de solution d'IgM spécifique à une concentration de 1 mg/ml en eau physiologique ou en tampon phosphate pH 7,2. On laisse en contact pendant 10 à 20 mm à l'étuve à 370C , puis on lave à l'eau physiologique à 90/,.,. de chlorure de sodium . Enfin on laisse sécher la plaque 1 pendant 2 heures à l'étuve à 370C. La plaque 1 est prête à l'emploi. Pour réaliser le test d'agglutination, on ajoute 50 microlitres d'hématies en suspension à 0,1 % en eau physiologique ou en tampon , puis on centrifuge une minute à 300 g environ. Sous 1' influence de la force centrifuge , les hématies descendent dans la cuvette 2 et viennent en contact des molécules d'IgM qui sont fixées par adsorption sur les parois de la cuvette 2, et qui portent l'activité anticorps spécifique. S'il y a correspondance entre la spécificité anticorps de l'IgM et les antigènes portés par la membrane du globule rouge, celui-ci est capté par l'IgM et reste fixé, grâce à la liaison anticorps-antigène, à la paroi de la cuvette. S'il n'y a pas correspondance , le globule rouge descend le long de la paroi sans s'y fixer jusqu'au centre du fond 3 de la cuvette 2. Ainsi une réaction positive se traduit par un voile monocouche d'hématies captées sur la paroi de la cuvette, produisant visuellement une teinte rosée homogène. Une réaction négative se manifeste par un culot de sédimentation au centre du fond conique 3 de la cuvette 2. La lecture du phénomène d'agglutination est grandement facilitée , tant visuellement que de manière automatique par lecteur photométrique ou densitométrique. On comprend que le traitement électrique vise à augmenter les propriétés d'adsorption , de la surface du support d'analyse qui est destinée à fixer les réactifs par adsorption, voire même à conférer au matériau de telles propriétés si celles-ci n'existent pas naturellement . Il n'est donc pas nécessaire d'effectuer le traitement électrique sur toute la surface du support , le traitement pouvant être localisé aux seules zones d'adsorption, notamment de l'intérieur des cuvettes de microtitration . Cependant un traitement électrique sur toute la surface ne s'avère pas gênant. Grâce au procédé de l'invention , on a pu préparer de nombreux supports d'analyse médicale , par exemple des plaques de phénotypage sanguin comportant les spécificités suivantes anti-A, anti-B, anti-A.B, anti-D (Rhésus), anti-C (RH 2), anti-E (RH 3). Pour la recherche d'anticorps , on a préparé des plaques de microtitration sur lesquelles ont été fixées, après traitement électrique , des hematies A1 , A2, B et 0. Après fixation sur le support, les hématies sont hémolysées puis séchées . Le protocole d'utilisation de telles plaques comporte les opérations suivantes: incubation des sérums à tester, lavage pour éliminer les anticorps non fixés sur le tapis de globules , addition d'une suspension de globules recouverts d'antiglobuline humaine, centrifugation et lecture. L'effet du traitement électrique se dissipe dans le temps, il est donc important que la mise au contact de la surface traitée du support et des réactifs soit réalisée dans un bref délai après le traitement électrique, en tout état de cause un délai suffisant pour que l'augmentation de la tension superficielle du matériau soit au moins de 10% lors de la mise en contact. L'invention n'est pas limitée au mode de réalisation qui a été décrit à titre d'exemple non exhaustif, mais en couvre toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de support d'analyse médicale par adsorption de réactif, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre tout ou partie de la surface du support à un traitement électrique , puis à mettre la surface ainsi traitée en contact avec le ou les réactifs à adsorber. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le support d'analyse est dans un matériau plastique possédant naturellement des propriétés d'adsorption dite passive vis-à-vis des réactifs moyennant quoi le procédé améliore lesdites propriétés. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le support est en polychlorure de vinyle. 4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que, le support étant une plaque de microtitration, le traitement électrique consiste à réaliser une décharge électrique, du type couronne, dans les cuvettes (2) grâce à une électrode à chaînettes. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la mise en contact de la surface traitée et des réactifs intervient dans un délai tel que la tension superficielle du support traité est au moins, lors de la mise en contact , 10% (dix pour cent) supérieure à celle du support non traité. 6. Procédé selon la revendication 1 de préparation de support pour groupage sanguin dans lequel les réactifs à adsorber sont des anticorps spécifiques , tels que anti-A, anti-B, anti-A-B, anti-D, anti-C, anti-E. 7. Procédé selon la revendication 1 de préparation de support pour la recherche d'anticorps, dans lequel les réactifs à absorber sont des hématies spécifiques, telles que A1, A2, B et 0.