Brevet FR2658517A2 — publié le 19910823

FR 2658517 A2 19910823 FR 9002028 A 19900220 I Le présent certificat d'addition se rapporte à un mode de réalisation particulier du procédé de préparation de la protéine C activée, objet de la demande principale N O 89 04814 déposée le 18 avril 1989 au nom de la Demanderesse. Plus particulièrement, il concerne un procédé de préparation de protéine C activée, APC, à partir d'une matière première contenant ladite protéine C selon la revendication I de la demande principale, caractérisé en ce que la matière première est un concentré de complexe prothrombique et, en ce que la protéine C y est activée par de la thrombine générée dans ladite matière première par addition de calcium, ledit calcium étant par la suite éliminé de manière à permettre l'activation de la protéine C par ladite thrombine. A titre de concentré du complexe prothrombique, on utilise de préférence la fraction dite PPSB. Il a ainsi été mis en évidence que l'ajout de calcium de préférence dans une concentration comprise entre 10 et 100 m M, dans un concentré du complexe prothrombique permettait de générer in situ de la thrombine qui est un des activateurs possibles pour la protéine C. Toutefois, cette activation de la protéine C par la thrombine étant inhibée par la présence du calcium, il est nécessaire de procéder au préalable à l'élimination de ce dernier L'ion calcium peut être éliminé de la matière première soit par dialyse ou encore diafiltration contre un tampon. Le présent certificat d'addition se rapporte également à la solution de protéine C activée obtenue par la mise en oeuvre du procédé. L'exemple donné ci-dessous permettra de mettre en évidence d'autres caractéristiques du procédé objet du présent certificat. EXEMPLE Le calcium ( 25 m M final) est ajouté au PPSB Après agitation douce pendant 30 minutes à 4 heures, le calcium est éliminé par dialyse ou diafiltration contre un tampon contenant par exemple 50 m M Tris-HCI 0,15 M Na Cl p H 7,4. Par la suite, l'activation de la protéine C s'effectue sous agitation douce à température ambiante ou à 41 C pendant 8 à 24 heures. La fraction ainsi obtenue est déposée sur aprotinine- Sepharose afin de purifier la protéine C activée. Cette purification de la protéine C activée est réalisée selon le procédé décrit dans la demande principale. REVENDICATIONS l Procédé de préparation de protéine C activée, APC, à partir d'une matière première contenant ladite protéine C selon la revendication I de la demande principale, caractérisé en ce que la matière première est un concentré de complexe prothrombique et, en ce que la protéine C y est activée par de la thrombine générée dans ladite matière première par addition de calcium, ledit calcium étant par la suite éliminé de manière à permettre l'activation de la protéine C par ladite thrombine. 1 O 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le concentré du complexe prothrombique est de préférence la fraction PPSB. 3 Procédé selon la revendication l ou 2, caractérisé en ce que le calcium est ajouté à la matière première, à une concentration comprise entre 10 et 100 m M\ 1. 4 Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le calcium est éliminé par dialyse ou diafiltration. Solution de protéine C activée, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par un procédé selon l'une des revendications l à 4.