Brevet FR2656927A1 — publié le 19910712

DISPOSITIF D'IMMUNOTEST DU TYPE PLAOUETTE A PLONGER, ET TROUSSE CONTENANT CE DISPOSITIF L'invention concerne un dispositif d'immunotest, revêtant la forme d'une plaquette à plonger dans un liquide biologique. On a décrit divers procédés pour détecter la présence d'un analyte (constituant soumis à l'analyse) dans un échantillon de fluide biologique, qui font appel à 1 l'immunochimie Dans ce que l'on appelle le procédé "sandwich", par exemple, un analyte cible tel qu'un antigène est "pris en sandwich" entre un anticorps marqué et un anticorps immobilisé sur un support solide Le résultat de l'essai est donné par l'observation de la présence et de la quantité de complexe antigène-anticorps marqué, lié à l'anticorps immobilisé Dans le procédé d'immunotest par compétition, un anticorps fixé à une surface solide est mis en contact à la fois avec un échantillon contenant une quantité inconnue d'un antigène constituant l'analyte et avec un antigène marqué du même type On détermine alors la quantité d'antigène marqué fixée à la surface solide, ce qui donne une mesure indirecte de la quantité d'antigène analyte dans l'échantillon. Comme ces procédés, ainsi que d'autres procédés discutés ci-dessous, permettent de détecter aussi bien des anticorps que des antigènes, on les appelle généralement "essais immunochimiques ligand-récepteur" ou simplement "iimmunotests". Les dispositifs d'immunotest en phase solide, qu'ils soient du type sandwich ou du type par compétition, permettent de détecter avec sensibilité un analyte dans un échantillon de fluide biologique tel que du sang ou de l'urine Les dispositifs d'immunotest en phase solide comprennent un support solide auquel est lié un élément d'une paire ligand-récepteur, habituellement un anticorps, un antigène ou un haptène Tout d'abord, ces supports solides revêtaient habituellement les formes de plaques, tubes ou perles de polystyrène, que l'on connaissait déjà dans les domaines des essais radio-immunologiques et des essais immuno-enzymatiques Plus récemment, on a utilisé comme supports solides un certain nombre de matériaux poreux, tels que nylon, nitrocellulose, acétate de cellulose, fibres de verre et autres polymères poreux. On a décrit un certain nombre de nécessaires autonomes d'immunotest, qui font appel à des matériaux poreux en tant que supports solides de composants immunochimiques tels qu'antigènes, haptènes ou anticorps. Ces nécessaires sont habituellement conçus selon le modèle de la plaquette à plonger, de la membrane traversée par un liquide, ou de la migration de l'analyte. Tom et coll, Brevet US N O 4 366 241 et Zuk, EP-A- 0 143 574, décrivent des dispositifs d'essai du type à migration, dans lesquels une membrane est imprégnée des réactifs nécessaires pour réaliser le test Une zone de détection d'analyte est ménagée, dans laquelle l'analyte marqué est fixé et le résultat de l'essai est lu. Bernstein, Brevet US N O 4 770 853, May et coll, WO 88/08534, et Ching et coll, EP-A-0 299 428, décrivent des dispositifs d'essai du type à migration dans lesquels sont incorporés des réactifs qui ont été fixés à des marqueurs directs colorés, ce qui permet de déchiffrer visuellement les résultats de l'essai sans ajouter de substances supplémentaires. Valkirs et coll, Brevet US N O 4 632 901, décrivent un dispositif d'immunotest du type à membrane traversée par un fluide, qui comprend un anticorps (spécifique pour l'antigène cible qui constitue l'analyte) fixé sur une membrane poreuse ou sur un filtre, auquel est ajouté un échantillon liquide Quand le liquide traverse la membrane, l'analyte cible se lie à l'anticorps L'addition de l'échantillon est suivie de l'addition de l'anticorps marqué La détection visuelle de l'anticorps marqué fournit une indication de la présence de l'antigène cible, l'analyte, dans l'échantillon. Korom et coll, EP-A-0 299 359, décrivent une variante du dispositif à membrane traversée par un fluide, dans laquelle l'anticorps marqué est incorporé dans une membrane qui fonctionne comme un système de libération de réactif. Baxter et coll, EP-A-0 125 118, décrivent une plaquette à plonger pour immunotest du type sandwich, dans laquelle des composants immunochimiques, comme des anticorps, sont fixés sur une phase solide Le dispositif de test est plongé pour incubation dans un échantillon suspecté de contenir, comme analyte, un antigène recherché. On ajoute alors un anticorps marqué par une enzyme, soit simultanément, soit après une période d'incubation Le dispositif est ensuite lavé, puis introduit dans une seconde solution contenant un substrat pour l'enzyme. L'enzyme marqueur, s'il y en a, interagit avec le substrat, ce qui provoque la formation de produits colorés qui se déposent sur la phase solide sous forme d'un précipité, ou bien produisent un changement visible de la couleur de la solution de substrat. Kali et coll, EP-A-0 282 192, décrivent un dispositif sous forme de plaquette à plonger, à utiliser dans des essais par compétition. Leuvering, Brevet US N O 4 313 734, décrivent l'utilisation de particules de sol d'or comme marqueur direct dans un dispositif du type plaquette à plonger. Rounds, Brevet US N O 4 786 589 décrit un dispositif d'immunotest du type plaquette à plonger, dans lequel les anticorps ont été marqués avec un formazan. Dans les dispositifs d'immunotest du type plaquette à plonger qui font appel à des anticorps marqués par des enzymes, des étapes de lavage et des périodes prolongées d'incubation pour les substrats des enzymes sont nécessaires, et ceci augmente la variabilité des essais, et par conséquent, la probabilité que des personnes très peu préparées et des utilisateurs domestiques obtiennent des résultats erronés d'essai. La présente invention concerne des dispositifs d'immunotest du type plaquette à plonger En particulier, la présente invention englobe un dispositif immunologique du type plaquette à plonger, dans lequel on utilise des symboles dans la zone d'essai, et des anticorps marqués par une enzyme pour détecter des analytes dans un échantillon de fluide biologique Le dispositif de l'invention supprime la nécessité de l'étape intermédiaire de lavage, associée aux dispositifs d'essai du type plaquette à plonger, faisant appel à des anticorps marqués par des enzymes. La nature de l'invention apparaîtra à la lecture de la description suivante, ainsi qu'à l'examen des dessins annexés dans lesquels: la figure 1 est une vue en perspective d'une plaquette à plonger typique de la présente invention, comportant une zone indicatrice de test et une zone indicatrice témoin, de forme rectangulaire; et la figure 2 est une vue en perspective d'un autre mode de réalisation d'une plaquette à plonger conforme à la présente invention, qui comporte une zone indicatrice témoin et une zone indicatrice de test, qui forment une croix. Comme on le voit sur la figure 1, une zone d'essai est définie sur un support 12 Le support 12 est formé d'une bande de matériau imperméable à l'humidité, qui fournit un support rigide à la zone 10, afin d'en faciliter le déplacement d'un récipient à un autre Les matériaux typiques utilisés pour le support englobent le verre et un certain nombre de matières plastiques, mais ne se limitent pas à ceux-ci La zone 10 peut être fabriquée en divers matériaux, dont des exemples englobent, mais sans y être limités, le nylon, la nitrocellulose, la cellulose, l'acétate de cellulose, le verre en fibres, les polysulfones, le poly(difluorure de vinylidène), et les polyesters Un composant immunologique est immobilisé sur la zone 10 selon la configuration de la zone indicatrice 14, représentée ici sous la forme d'un simple rectangle Ce composant immunologique peut fonctionner de façon à fixer un anticorps marqué par une enzyme, par l'intermédiaire d'un analyte cible, formant ainsi une multiplicité de complexes sandwichs sur la zone 10, le long de la zone indicatrice 14 Un second composant immunologique (anti- Ig G) est lui aussi immobilisé selon la configuration de la zone indicatrice témoin 16, elle aussi représentée sous la forme d'un rectangle Cette zone indicatrice témoin 16 sert d'élément interne de contrôle avec lequel on vérifie l'achèvement de l'essai. Les procédés de marquage d'anticorps par des enzymes sont bien connus dans la technique, comme le sont les réactions chimiques par lesquelles ces marqueurs provoquent la précipitation de produits colorés insolubles lorsqu'ils sont mis en contact avec une solution de substrat approprié. Lors de l'utilisation de la plaquette de l'invention, la zone d'essai 10 est introduite dans un récipient contenant un échantillon de fluide auquel on a ajouté un anticorps anti-analyte, marqué par une enzyme On laisse reposer le tout pendant une courte période (par exemple 3 à 4 minutes) au cours de laquelle l'analyte cible, s'il y en a, se lie au composant immunologique immobilisé dans la zone indicatrice 14 et l'anticorps marqué se lie à l'analyte pour former une multiplicité de complexes "sandwichs" sur la zone d'essai 10, le long de la zone indicatrice 14 Une fraction des anticorps marqués, qui ne se lie pas à l'analyte cible, se lie à l'anticorps anti-immunoglobuline G immobilisé dans la zone indicatrice témoin 16 La plaquette est enlevée du premier récipient et introduite, sans qu'il y ait besoin de la laver, dans un second récipient contenant un substrat pour l'enzyme A la suite de la mise en contact avec le substrat, les enzymes marqueurs qui se trouvent alors sur la zone d'essai 10 réagissent en libérant des produits colorés insolubles qui se déposent le long de la zone indicatrice 14 et de la zone indicatrice témoin 16, en des concentrations plus élevées que dans les autres zones non-indicatrices de la zone d'essai 10 Ceci donne comme résultat (i) une bande colorée visible dans la zone indicatrice 14 ainsi que dans la zone indicatrice témoin 16 si quelque analyte est présent, ou (ii) une bande colorée unique visible seulement dans la zone indicatrice témoin 16, si aucun analyte n'est présent. Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, la concentration de la substance immobilisée dans la zone indicatrice témoin 16 est ajustée de façon à fournir une échelle interne de la concentration d'analyte dans un échantillon Par exemple, une substance est immobilisée dans la zone indicatrice 16 à une concentration donnée, et l'essai est réalisé Si la couleur qui apparaît dans la zone indicatrice 14 est plus sombre que celle qui apparaît dans la zone indicatrice témoin 16, l'échantillon contient l'analyte cible en une concentration plus grande que la concentration donnée. En variante, comme le représente la figure 2, dans la zone d'essai 110, une zone indicatrice verticale 114 est placée perpendiculairement à une zone indicatrice témoin 116 et à cheval sur celle-ci, dans la configuration d'une croix On utilise le dispositif de la même manière que celle décrite à propos de la figure 1, mais maintenant, c'est une croix colorée (signe +) qui devient visible sur la zone 110 en présence d'un analyte cible, alors qu'en l'absence d'analyte cible, c'est un trait horizontal coloré (signe -) qui apparaît. La substance immunologique peut être immobilisée dans la zone d'essai selon toute configuration pratique ou facilement distinguable Ces configurations englobent, sans y être limitées, points, barres, lettres, chiffres, et signes + et - Cette dernière configuration, dans laquelle un anticorps anti-analyte ou un antigène spécifique d'un anticorps cible est immobilisé selon une perpendiculaire à un trait horizontal témoin d'anticorps anti- immunoglobuline, simplifie l'interprétation des résultats de l'essai pour les utilisateurs domestiques, puisque l'apparition d'un signe + indique un résultat positif, et celle d'un signe -, un résultat négatif. L'application ou la pulvérisation d'un composant immunologique sur la zone d'essai selon une configuration définie établit une différence interne de couleur sur la zone même d'essai de la plaquette à plonger, de sorte que l'on n'a pas besoin, en plus, d'échelles de couleurs normalisées pour interpréter les résultats de l'essai En outre, aucun lavage n'est nécessaire avant de mettre le dispositif en contact avec la solution de substrat Les substances colorées provoquent la formation de dépôts plus nombreux dans les zones indicatrices que dans les zones non- indicatrices de la zone d'essai Par conséquent, il n'est pas nécessaire d'effectuer des lavages pour éliminer la fraction d'anticorps marqués par une enzyme qui n'ont pas été fixés à la zone d'essai par l'intermédiaire de l'analyte cible. Pour marquer les anticorps, on peut utiliser diverses enzymes Les enzymes typiques englobent, sans y être limitées, phosphatase alcaline, peroxydase de raifort, lysozyme, glucose-6-phosphate déshydrogénase, lactate déshydrogénase, uréase, glucose oxydase, B-galactosidase et cholestérol oxydase. La présente invention englobe également un nécessaire (trousse) dans lequel le dispositif du type plaquette à plonger est associé à une solution d'anticorps marqué par une enzyme, et à une seconde solution de substrat pour l'enzyme, dont le rôle est de former des produits colorés insolubles à la suite de la mise en contact avec l'enzyme marqueur La nature du substrat dépendra de l'enzyme particulière utilisée comme marqueur. Par exemple, quand les anticorps ont été marqués avec la phosphatase alcaline, les solutions de substrat typiques renferment, mais sans y être limitées, phosphate de Naphthol AS-MX et sel de Bleu solide RR, phosphate de Naphthol AS-MX et sel de Violet solide B, phosphate de Naphtol AS-GR et sel de Bleu solide RR, phosphate de il -bromo-4-chloro-3-indoxyle (BCIP) ou phosphate de 3- indoxyle Quand on utilise la peroxydase de raifort comme enzyme marqueur, les solutions de substrat typiques renferment, mais sans y être limitées, 2,2 'azino-di-3- éthyl-benzothiazidine-sulfonate, 3,3 ',5,5 '-tétraméthyl- benzidine, 4-chloro-1-naphthol, 3,3 '-diaminobenzidine, p- phénylènediamine, pyrocatéchol, 3-amino-9-éthyl-carbazole ou naphthol/pyronine Des exemples de solution de substrat typiques pour un marqueur lactate déshydrogénase renferment, mais sans y être limités, nicotinamide-adénine- dinucléotide réduit (NADH), méthosulphate de phénazine ou chlorure de tnitro-bleu de tétrazolium Quand les anticorps sont marqués au lipozyme, une solution de substrat typique renferme des substances insolubles colorées, encapsulées dans des liposomes Une solution de substrat typique pour des anticorps marqués avec la B- galactosidase renferme, mais sans y être limitée, du 5- bromo-4-chloro-3-indoxyl-B-D-galactopyranoside Une solution de substrat typique pour des anticorps marqués avec la glucose oxydase renferme, mais sans y être limitée, du chlorure de t-nitro-bleu de tétrazolium ou du méthosulfonate de m-phénazine. Le composant immobilisé sur la zone d'essai en une configuration formant une zone indicatrice est soit un anticorps, soit un antigène, soit un haptène, bien qu'on puisse utiliser l'un ou l'autre protagoniste de n'importe quelle interaction ligand-récepteur Les anticorps utilisés peuvent être d'origine monoclonale ou polyclonale, et les procédés selon lesquels on les produit sont bien connus dans le métier Les antigènes et les haptènes peuvent être naturels ou synthétiques, et ils sont disponibles dans le commerce En outre, les composants immunologiques peuvent être fixés à la zone d'essai par l'intermédiaire de réactifs de jonction, immobilisés au préalable sur la zone, c'est-à-dire dans les surfaces formant les zones indicatrices Des exemples de réactifs de jonction typiques englobent, mais sans y être limités, l'avidine, la biotine, un anticorps anti-fluorescéine et la protéine A. On utilise le dispositif d'essai conforme à l'invention pour la détection d'anticorps, d'antigènes ou d'haptènes Des exemples d'antigènes que l'on peut détecter à l'aide de ce dispositif englobent, mais sans y être limités, la gonadotropine chorionique humaine, l'hormone lutéinisante, et l'a-foetoprotéine. Les exemples suivants servent à illustrer davantage l'invention, mais sans en limiter le cadre. EXEMPLE 1 A Préparation de placquette à plonger Sur une feuille de matière plastique de 18 cm sur 9 cm et épaisse de 0,25 mm, servant de support, on fixe un morceau de membrane de nylon préactivée (Pall Immunodyne), large de 1,27 cm, et présentant une dimension de pores de 0,45 pm Sur ce morceau de membrane, destiné à servir de zone d'essai, on pulvérise 36 gl d'une solution de 3 mg/ml d'anticorps ovin anti-gonadotropine chorionique humaine dans du tampon de phosphate (p H 7,4), le long d'un trait situé à environ 7-8 mm à partir du bas, à l'aide d'un pulvérisateur Linomat IV (Camag) On fait incuber la feuille dans une solution tampon de phosphate (p H 7,4) contenant 2 % de lait sec (Carnation) pendant 30 minutes. On lave la feuille avec une solution à 5 % de saccharose, on la sèche à l'air et on la découpe en bandes de 0,4 à 0,7 cm de large, pour produire une série de plaquettes à plonger semblables, que l'on peut conserver dans un dessiccateur à la température ambiante. B Préparation d'un conjugué enzyme-anticorps On conjugue une phosphatase alcaline (activité spécifique supérieure à 1400 U/mg) à un anticorps monoclonal de souris anti-gonadotropine chorionique humaine, en un rapport molaire de 1:1, selon le procédé au glutaraldéhyde en une étape On purifie le conjugué sur une colonne de diéthylaminoéthyl-Sephadex A 50 ( 5 ml), en utilisant un gradient d'élution linéaire ( 0-1 M) de chlorure de sodium dans du tampon de Tris 10 m M (p H 7,4) et chlorure de magnésium 5 m M On recueille des échantillons de conjugué ( 3,0 ml), on teste leur activité enzymatique, on les dilue à la concentration de 1 unité par ml dans une solution de 10 m M de Tris (p H 7,4), 1 % d'albumine de sérum de bovin, 150 m M de chlorure de sodium et 0,1 % d'azoture de sodium, et on les conserve à 4 C. On répartit le conjugué en fractions aliquotes dans des tubes à essai ( 10 x 75 mm) et on lyophilise ces fractions Les tubes sont bouchés et conservés. C Préparation d'un substrat Dans d'autres tubes à essai ( 10 x 75 mm), on place 0,8 ml par tube d'une solution de substrat de phosphate de -bromo-4chloro-3-indoxyle et de nitro-bleu de tétrazolium Les tubes sont conservés dans l'obscurité à la température ambiante. D Réalisation de l'essai Dans un tube contenant du conjugué, on ajoute 1, 0 ml d'urine standard, contenant 100 m UI/ml de gonadotropine chorionique humaine On homogénéise le contenu du tube, et on introduit une plaquette à plonger, puis on laisse reposer le tout pendant 4 minutes On retire la plaquette, et sans la laver, on l'introduit dans un tube contenant la solution de substrat, et on secoue le tube On laisse ensuite le tube reposer pendant 4 minutes supplémentaires. On retire la plaquette du tube et on l'observe Toute la zone d'essai est d'une couleur légèrement ternie, mais il y a un trait bleu horizontal que l'on peut discerner en travers de la surface de cette zone On détermine que la sensibilité de l'essai vaut 12 m UI/ml de gonadotropine chorionique humaine. EXEMPLE 2 On suit le même protocole que pour l'exemple 1, excepté que dans l'étape D, on introduit la plaquette dans un tube ne contenant que de l'urine et le conjugué, c'est- à-dire qu'il ne contient pas de gonadotropine Au bout de 4 minutes, on retire la plaquette, et sans la laver, on l'introduit dans un tube de solution de substrat, on la fait incuber pendant 4 minutes supplémentaires et on l'observe Toute la zone d'essai est d'une couleur faiblement ternie, et il n'y a aucun trait que l'on puisse discerner en travers de sa surface. EXEMPLE 3 On suit le même protocole que dans l'exemple 1, excepté que dans l'étape A, on pulvérise sur la membrane un anticorps anti-immunoglobuline de souris, le long d'une autre ligne située à environ 9-11 mm du bas de la plaquette. Toute la zone d'essai prend une couleur légèrement ternie, mais il apparaît 2 traits bleus horizontaux que l'on peut discerner en travers de sa surface. EXEMPLE 4 On suit le même protocole que dans l'exemple 3, excepté que la plaquette est initialement introduite dans un tube qui ne contient que de l'urine et le conjugué, c'est-à-dire qu'il ne contient pas de gonadotropine. Toute la zone d'essai prend une couleur légèrement ternie, et il apparaît un seul trait bleu horizontal (témoin) que l'on peut discerner en travers de sa surface. EXEMPLE 5 On suit le même protocole que dans l'exemple 3, excepté que l'on pulvérise sur la membrane un anticorps ovin anti-gonadotropine chorionique humaine, le long d'un trait vertical coupant perpendiculairement le trait d'anticorps anti-Ig G de souris, afin de former une croix. Toute la zone d'essai prend une couleur légèrement ternie, mais il apparaît une croix bleue (signe +) que l'on peut discerner sur sa surface. EXEMPLE 6 On suit le même protocole que dans l'exemple 5, excepté que la plaquette est initialement introduite dans un tube qui ne contient que de l'urine et le conjugué. Toute la zone d'essai prend une couleur légèrement ternie, et il n'apparaît qu'un trait bleu (signe -) que l'on peut distinguer en travers de sa surface. EXEMPLE 7 On prépare une plaquette à plonger, selon le même protocole que dans l'exemple 1, étape A, sauf que l'on utilise un anticorps anti-hormone lutéinisante humaine (LH) à la place de l'anticorps anti-gonadotropine chorionique humaine. Sur quatre morceaux de membranes (Pall Immunodyne), on pulvérise un anticorps anti-hormone lutéinisante humaine selon un trait, d'après le procédé indiqué dans l'exemple 1, étape A Chaque morceau de membrane est ensuite trempé dans un tube d'urine contenant de l'hormone lutéinisante humaine en une concentration donnée ( 40, 70, 120, ou 200 m UI/ml) Il apparaît sur la membrane un trait bleu dont l'intensité de coloration est faible pour une concentration de 40 m UI/ml, modérée pour une concentration de 70 m UI/ml, forte pour une concentration de 120 m UI/ml, et très forte pour une concentration de 200 m UI/ml On prépare une échelle standard de coloration en arrangeant ces résultats sur un support solide, selon la progression de l'intensité de coloration. On introduit une plaquette dans un tube contenant un échantillon clinique d'urine, puis, sans la laver, dans un tube de solution de substrat Un trait bleu d'intensité modérée apparaît à la surface de la zone d'essai On compare la plaquette avec l'échelle de coloration, et on trouve que l'échantillon contient entre 40 et 70 m UI/ml d'hormone lutéinisante REVENDICATIONS 1 Dispositif d'immunotest du type plaquette à plonger, caractérisé en ce qu'il comporte un support ( 12; 112), une zone d'essai ( 10; 110) définie sur ce support, et au moins un composant immunologique immobilisé dans cette zone, selon une configuration formant une zone indicatrice, ( 14; 114) ledit composant immunologique pouvant fixer un anticorps marqué par une enzyme, par l'intermédiaire d'un analyte cible, de façon à former un complexe sandwich sur ladite zone, lequel complexe, à la suite d'un contact avec un substrat pour ladite enzyme, produit une différence visuellement discernable entre ladite configuration et ladite zone d'essai. 2 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que le composant immobilisé est un anticorps, un antigène ou un haptène. 3 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 2, caractérisé en ce que le composant immobilisé est un anticorps. 4 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est la phosphatase alcaline, la peroxydase de raifort, le lysosyme, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, la lactate déshydrogénase, l'uréase, la cholestérol oxydase, la B- galactosidase ou la glucose oxydase. Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que l'enzyme est la phosphatase alcaline. 6 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que l'analyte cible est un antigène, un anticorps ou un haptène. 7 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que ladite configuration est constituée de traits, de points, de nombres ou de lettres. 8 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que le support est constitué d'une matière plastique ou de verre. 9 Dispositif d'immunotest conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que la zone d'essai est constituée de nylon, de nitrocellulose, de cellulose, de verre en fibres, de polysulfone, de poly(difluorure de vinylidène), ou de polyester. Trousse, caractérisée en ce qu'elle comporte un dispositif d'immunotest conforme à la revendication 1, une première solution contenant un anticorps marqué par une enzyme, et une seconde solution contenant un substrat capable de former des produits colorés insolubles à la suite d'un contact avec ladite enzyme.