Brevet FR2653227A1 — publié le 19910419

L'invention a pour objet des préparations d'AC purifiées, un procédé d'obtention de ces préparations et leurs applications biologiques. On sait que l'adénylate cyclase, ou en abréviation AC, est exprimée par des bactéries du genre Bordetella ou Bacillus anthracis, responsables d'in- fections aiguës chez les vertébrés. Divers travaux ont porté sur l'étude des effets biologiques de cette enzyme sur les cellules des vertébrés. Cependant, l'étudie de ses caractéristiques de structure et de ses propriétés se trouve limitée par le caractère hétérogène des préparations d'AC décrites à ce jour. La mise au point par les inventeurs d'un procédé de purification d'AC a permis d'obtenir des préparations d'AC ayant une activité spécifique au moins deux fois supérieure à celles des préparations connues et de mettre en évidence des caractéristiques propres de 1'AC. L'obtention de préparations de pureté élevée a permis également de développer des applications biologiques de grand intéret pour le diagnostic, le traitement et/ou la prévention des maladies provoquées par les bactéries évoquées ci-dessus. L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles préparations d'AC de pureté élevée. Elle vise également à fournir un procédé d'obtention de ces préparations de mise en oeuvre aisée. L'invention vise, en outre, les applications biologiques de ces préparations purifiées. En particulier, elle vise à fournir des anticorps polyclonaux formés contre ces préparations et selon un aspect spécialement intéressant des préparations d'anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement un épitope de l'AC et exerçant un rôle protecteur vis-à-vis des infections provoquées par les Bordetella. L'invention vise en,outre les réactifs biologiques élaborés à partir des anticorps polyclonaux et plus spécialement monoclonaux. Les applications biologiques comprennent également l'élaboration de vaccins contre les maladies infectieuses provoquées par ces bactéries, par mise en jeu de l'épitope reconnu spécifiquement par les préparations d'anticorps monoclonal. Les préparations enzymatiques d'AC selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles possèdent une pureté élevée et sont pratiquement totalement dépourvues de produits contaminants bactériens, notamment de pertussis toxines, de lipopolysaccharide (ou LPS) et d'hémagglutinine filamenteuse (ou PUA). Ces préparations sont également caractérisées en ce que 1'AC se présente sous une forme homogène sédimentant sur un gradient de densité en saccharose avec un coefficient S égal à 3,6. Dans ces préparations homogènes, l'tac peut exister sous deux formes moléculaires d'environ 45 et 43 kDa respectivement, structurellement apparentées. Selon un autre aspect, ces préparations sont caractérisées en ce qu'elles possèdent une activité pouvant atteindre et même dépasser 1600 pmole de cAMP min-1 mg-1. On notera qu'une unité d'AC correspond à une umole d'adénosine 3':5'-monophosphate ou, en abréviation, cAMP, formé en 1 min à 30'C à pH 8. Dans les préparations définies ci-dessus, l'AC est libre ou sous forme d'un complexe en association avec des protéines eucaryotes, plus spécialement avec la calmoduline. La constante d'association de l'AC avec la calmoduline dans ces complexes, est de 10 nM environ. Les préparations d'AC selon l'invention sont également caractérisées en ce que l'activité catalytique est portée par un fragment de 25 kDa, site de combinaison à la calmoduline et protégé par celle-ci contre les digestions trypsiques. Les préparations d'AC de pureté élevée selon l'invention sont des préparations élaborées à partir de cultures de bactéries exprimant l'AC. Il s'agit plus spécialement des bactéries pathogènes dont l'AC est capable d'interférer avec l'AC des cellules eucaryotes. On citera plus particulièrement celles du genre Bordetella ou Bacillus anthracis. - Des préparations dtAC de Bordetella particu lièrent préférées au regard des applications thérapeutiques envisagées comprennent de l'AC provenant de Bordetella responsables de pathologies respiratoires des vertébrés telles que, chez l'homme, Bordetella Pertussis et Bordetella parapertussis, et chez l'animal, Bordetella bronchiseptica et Bordetella avium. L'invention vise également un procédé d'obtention de préparations d'adénylate cyclase de haute pureté. Ce procédé est caractérisé par l'étape de mise en contact d'un surnageant préalablement concentré de cultures de bactéries exprimant l'adénylate cyclase, ou d'un extrait de ces bactéries, avec de la calmoduline. Selon un mode de réalisation permettant d'obtenir l'enzyme pur sous forme libre, on utilise de la calmoduline fixée à un support. L'enzyme présent dans le surnageant concentré ou dans l'extrait bactérien, fixé à la calmoduline lors de l'étape de mise en contact, est ensuite récupéré à l'aide d'un agent dénaturant, qui est à son tour éliminé pour obtenir la préparation enzymatique libre. Le support auquel est fixée la calmoduline est constitué par un matériau inerte vis-à-vis de la préparation renfermant l'enzyme, et capable de retenir les molécules de poids moléculaire élevé. Dans une variante, le support est constitué par un gel. On utilise avantageusement un produit sur lequel est déjà fixée la calmoduline, tel que le produit commercial Affigel calmoduline Pour obtenir la fixation de l'AC contenue dans le surnageant concentré ou dans l'extrait bactérien, on soumet le mélange gel-calmoduline et surnageant ou extrait à une agitation à basse température. Selon une autre variante, le support sur lequel est fixée la calmoduline est un matériau filtrant du type des filtres Millipore , capable de retenir sélectivement au moins la majeure partie de l'enzyme. D'une manière générale, le matériau filtrant est en nitrocellulose ou en une matière plastique et présente une porosité de 0,45-0,22 cm. On récupère l'adénylate cyclase fixée sur le complexe support-calmoduline à l'aide d'un agent dénaturant. De préférence, on utilise de l'urée en milieu tampon. Une dissolution satisfaisante de l'AC dans l'urée est obtenue avec de l'urée 4 à 8,8M L'urée est ensuite éliminée de la préparation enzymatique par exemple par dialyse ou filtration. On obtient ainsi des préparations enzymatiques de pureté élevée, ayant une activité spécifique atteignant ou même dépassant 1100 u/mg de protéines. On notera que lorsqu'on utilise un surnageant concentré, on purifie l'adénylate extracytoplasmique. Avec un extrait bactérien, le procédé de l'invention conduit à l'obtention de préparatiorSd'AC periplasmique. Les mêmes caractéristiques sont observées pour l'AC d'origine extracellulaire ou periplasmique. Selon un autre mode de réalisation permettant d'obtenir l'enzyme sous forme d'un complexe de grande stabilité avec la calmoduline, cn ajoute de la calmoduline à une préparation enrichie d'au moins 90 % en adénylate cyclase, puis on met en contact le mélange, de préférence en réalisant une chromatographie d'affinité, avec un échangeur d'ions de faible porosité, tel que le DEAE-Sephacel O. En augmentant la force ionique du tampon de lavage, on élue le complexe. Cette variante permet d'obtenir avec des rendements d'environ 400 des préparations d'AC fixée à la calmoduline, de grande stabilité, dont l'activité spécifique peut atteindre et même dépasser 1600 u/mg de protéine. La préparation enrichie en adénylate cyclase mise en oeuvre est obtenue à partir d'un surnageant de culture concentré, dont le pH a été amené. à 7,0 et filtré à l'aide d'un échangeur d'ions, avantageusement du DEAE-Sephacel Q Le surnageant concentré ris en oeuvre dans le procédé de l'invention est obtenu avantageusement en soumettant un surnageant de cultures bactériennes exprimant l'AC à une ou plusieurs cpérations de filtrations à l'aide de filtres de nitrocellulose ou en matière plastique, de porosité avantageusement 0,45-0,22 pm, en particulier ceux de type Millipore: puis en incubant les filtres avec un agent détergent afin de libérer l'AC et en éliminant de la préparation d'AC les matériaux insolubles présents. L'agent détergent est un détergent non ioni que, de préférence du Triton &commat; ou du NPrc# L'extrait bactérien utilisable aux fins de purification de l'adénylate cyclase est obtenu, par exemple, par traitement des cellules bactériennes exprimant l'adénylate cyclase avec de l'urée et récupération du surnageant. Les bactéries exprimant l'adénylate cyclase utilisées pour les cultures sont choisies parmi les bactéries pathogènes dont l'AC est capable d'interférer avec l'AC des cellules eucaryotes. Il s'agit plus particulièrement de Bordetella ou Bacillus anthracis. Parmi les Bordetella, on citera : Bordetella pertussis, Bordetella bronchisePtica, Bordetella Para Pertusis et Bordetella avium. L'étude sur un modèle de souris, d'infections produites par des bactéries synthétisant de l'adénylate cyclase avec des rendements élevés, a permis de mettre en évidence le rôle protecteur d'anticorps polyclonaux ou encore d'anticorps monoclonaux formés contre les préparations enzymatiques purifiées définies ci-dessus. L'invention concerne donc également en tant que produits nouveaux, des anticorps polyclonaux dirigés contre ces préparations enzymatiques. Ces anticorps sont obtenus par exemple par immunisation d'animaux tels que le lapin ou la souris à l'aide des préparations d'AC en question dans lesquelles l'AC est libre ou sous forme de complexe avec des protéines eucaryotes, notamment la calmoduline, et récupération selon les techniques classiques des immunsérums renfermant les anticorps, puis des anticorps eux-mêmes. L'invention concerne également des anticorps monoclonaux tels qu'obtenus par fusion, à un myélome de souris, de lymphocytes spléniques de souris immunisées avec l'adénylate cyclase purifiée. Ces préparations d'immunoglobulines monoclonales sont caractérisées en ce qu'elles reconnaissent spécifiquement un épitope de l'AC purifiée qui permet l'induction de la synthèse d'anticorps protecteurs. L'invention vise particulièremlent la préparation d'anticorps monoclonaux (8-25) qui iunoprécipite, dans les extraits bruts, et les préparations de l'enzyme purifiée à partir des cellules bactériennes, un triplet de 50,45 et 93kDa ainsi qu'une protéine de haut poids moléculaire supérieur à 100 kDa. La souche d'hybridome productrice d'anticorps monoclonaux entre également dans le cadre de l'invention. Une telle souche a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le n I-610 le 9 octobre 1986. D'une manière avantageuse, les anticorps selon l'invention exercent un effet immunoprotecteur vis-à-vis de l'AC. Ces propriétés sont mises à profit pour protéger l'homme ou l'animal des effets pathogènes des bactéries ci-dessus. Dans cette application, on a recours à une administration locale, dans le cas d'infections respiratoires par voie intranasale ou intratachéale, ou par voie parentérale. On utilise les excipients classiques tels que le phosphate de calcium ou l'hydroxyde d'aluminium. Les anticorps monoclonaux de l'invention permettent d'effectuer une sérothérapie et une séroprophylaxie spécifiques. Les anticorps de I'invention sont également utilisables pour la purification de l'AC, y compris des autres espèces en cas de réactivité croisée et pour le diagnostic précoce de la maladie. Ils sont en effet particulièrement appropriés pour le dépistage des malades et des porteurs latents. Ils permettent également l'isolement de bactéries et de mutants ce qui leur confère un intérêt supplémentaire. Ces applications en tant que réactifs de diagnostic mettant en jeu des radioimmunoessais, le test ELISA, ou des déterminations par produits marqués par 125I sont des produits nouveaux qui entrent dans le champ de l'invention. Selon un autre aspect de grand intérêt, l'invention fournit également, grâce aux anticorps monoclonaux définis ci-dessus, un épitope actif de l'AC reconnu spécifiquement. Les essais de toxicologie réalisés sur l'AC purifiée ayant démontré l'absence de toxicité de cette enzyme aaministrée par voie intranasale sur la souris, cette AC purifiée est avantageusement utilisée pour l'élaboration de principes vaccinants, sous réserve qu'elle ne donne pas de réactions croisées avec l'AC des eucaryotes traités. Les vaccins selon l'invention sont donc caractérisés en ce qu'il s'agit de vaccins moléculaires renfermant un épitope actif de l'AC en association avec un véhicule pharmaceutique, capable d'induire une infection et des effets toxiques chez l'homme ou l'animal. On a recours avantageusement aux doses et formes d'administration habituelles. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui suivent, relatifs à l'obtention de préparations purifiées d'AC et à leurs applications biologiques, et en se référant aux figures, qui représentent respectivement : - les figures 1ss. à 1C, la variation de la radioactivité et de l'activité AC, pour différentes dilutions de surnageants de culture concentrés, ces surnageants ayant été incubés avec de la 125I calmoduline, puis centrifugés selon un gradient de sucrose - les figures 2a et 2b, les photos de préparations purifiées selon l'invention soumises à une analyse SDS-PAGE - la figure 3, une carte peptidique par protéolyse limitée de 125I-AC ;; - les figures 4a et 4b, la variation de l'activité en pourcentage en fonction du temps - les figures 52 et 5b, l'analyse en gradient de sucrose de produits de digestion par la trypsine d'un complexe 125IAC-calmoduline - la figure 6, un radioimmunoessai d'AC - la figure 7, les cinétiques de l'infection pulmonaire induite par des inoculats - la figure 8, une photo d'une alvéolite hémorragique chez la souris produite par des clones de B. pertussis - les figures 9a et 9b, deux photos correspondant respectivement à une analyse selon SDS-PAGE de surnageant concentré, de deux préparations d'AC purifiées et d'un extrait bactérien, et à un inmunoblot avec l'anticorps monoclonal 8-25. Dans les exemples qui suivent, l'ioduration des produits est réal suée comme suit. On opère à température ambiante en utilisant la méthode à la chloramine-T (Greenwor.4 et al., Biochem. J. 89, 114-123, 1963). La calmoduline iodurée a une radioactivité spécifique de 20 Ci/mrnol ; elle est stable sur deux mois lorsqu'on la stocke à -20'C. Avant l'ioduration, le complexe AC-calmoduline obtenu après purification sur DSAE-Sephacel, est chroma- tographié sur hydroxylapatite afin d'éliminer l'agent détergent. La préparation 125 I-AC est stable pendant deux mois à -20'C. Les analyses des produits des exemples sont effectuées comme suit. L'activité de l'AC est mesurée selon la méthode de White A.A. dans Methods Enzymol., 38C, 41-46, 1974 telle que modifiée par Hanoune et al. (J. Biol. Chem., 252, 2 039-2 046, 1977). La réaction est effectuée dans un milieu contenant 50 mM Tris-HCl, pH 8, 6 mM de MgCl2, 100 ijg d'albumine de sérum bovin, 0,12 mM de CaCl2 et 0,1 d de calmoduline lorsqu'elle est ajoutée. Une unité d'AC correspond, comme indiqué cidessus, à 1 immole de cAMP formée en une minute à 30'C à pH 8. Les protéines sont mesurées soit selon Bradford (Anal. Biochem., 248-254) ou selon Schulz et al. (Anal. Biochem., 91, 354-356, 1978). On effectue la méthode SDS-PAGE selon Ltem1i (Nature, Londres, 227, 680-685, 1976). Les gels sont colorés à l'argent comme décrit par Morrissey (Anal. Biochem., 117, 307-310, 1981) ou autoradiographiés après exposition aux pellicules X-omat AT à -70'C. EXEMPLE 1 : Culture de Bordetella pertussis et obtention d'un surnageant à concentration élevée en adénylate cyclase. On effectue une préculture de Bordetella pertussis, 18323, phase I (souche ATCC 9797) et d'un variant avirulent, phase IV, spontanément, stable de cette souche, pendant 48 heures à 36 C, sur un milieu d'agar modifié Stainer-Scholte supplementé avec de la cyclodextrine (selon Imaizumi et al. dans J. Chim. Microbiol., 17, 781-786, 1983). On transfère ensuite la préculture dans un milieu liquide modifié de Stainer Scholte sans cyclodextrine. Les cultures liquides sont soumises à agitation à 150 t/min. pendant 24 heures à 36 C, dans un erlenmeyer de 1 litre contenant 250 ml de milieu. On poursuit la culture jusqu'à l'obtention d'une densité optique DO 650 = 1 1,2 + 0,2. Les bactéries sont alors éliminées par centrifugation à 5000 xg durant 25 min. Les surnageants de culture sont conservés à -30 C jusqu'à utilisation ou concentrés directement. Aux fins de concentration, on filtre, sur des filtres de type Millipore # HAWP de 0,45 m, 3 litres de surnageant de culture contenant environ 10 pg de protéines et 0,1 unité d'enzyme par ml. On retient ainsi plus de 90% de l'activité enzymatique sur les filtres. 80% environ de cette activité peuvent être récupérés par incubation des filtres dans 40 ml d'un tapon A constitué par du Tris.HCl, 50 mM, pH 8 contenant 6 mM de MgCl2 et 0,1% de Triton X.100 #. Le matériau insoluble est éliminé par centrifugation durant 30 min. à 15000 x g à 4 C. L'activité spécifique du surnageant de culture concentré est de 115 unités par milligramre de protéine. EXEMPLE 2 : Procédé d'obtention d'adénylate cyclase extracytoplasmique purifiée sous forme livre. On ajoute 40 ml de surnageant de culture concentré à 0,8 à 1 ml d'Affigel-calmoduline# et on agite lentement le mélange à 4 C pendant 18 heures. Plus des 2/3 de l'activité enzymatique sont retenus sur le gel. On fait sédimenter l'Affigel-calmoduline par centrifugation à 300 x g pendant 1 minute, on lave à plusieurs reprises avec NaCl 0,5 M dans le tampon A. On récupère l'adénylate cyclase à partir du gel à l'aide de 2,5 ml d'urée 8,8 M dans le tampon A. On élimine l'urée par filtration sur une colonne de Séphadex G-25#, équili- brée avec le tampon A. Cette préparaticn enzymatique possède une activité spécifique de 1100 unités/mg de protéine. On peut la conserver à -80' C sans perte d'activité sur plusieurs semaines. EXEMPLE 3 : Procédé d'obtention d'adénylate cyclase purifiée à partir d'extraits bactériens. On soumet une culture de bactéries exprimant de l'AC activable par de la calmoduline à un traitement avec de l'urée 8M durant environ 2 heures à température ambiante. On récupère le surnageant qui constitue l'extrait bactérien et on le met en contact avec le gel Affigel-calmoduline dans les conditions rapportées cidessus. On obtient une préparation enzymatique de pureté élevée présentant sensiblement la même activité spécifique. EXEMPLE 4 : Procédé d'obtention d'AC purifiée sous forme d'un complexe avec la calmoduline. On utilise un surnageant de culture concentré. On ajuste ce surnageant à pH 7 Sephacel. On fixe ainsi 95% de l'activité de AC sur la colonne. Après lavage avec NaCl 0,1M dans le tampon A, on élue le complexe AC-calmoduline avec NaCl 0,3M dans le tampon A, à un débit de 3 ml/h. L'activité spécifique de l'AC est de 1600 u/mg de protéines. Cet enzyme peut être conservé à -80' C sans perte de son activité sur plusieurs semaines. EXEMPLE 5 : Etude des préparations enzymatiques d'AC purifiées. - Etude des propriétés de liaison à la calmoduline On fait incuber différentes quantités d'enzyme avec une quantité constante de (I125) calmoduline, puis on sépare le mélange par centrifugation selon un gradient de densité en saccharose. Cette opération est réalisée comme suit On fait incuber 0,5 ml du tampon A contenant 20 nM de (125I) calmoduline de cerveau de boeuf (20 Ci/mmol) et 3 dilutions de surnageant de culture concentré (A : 5 u/ml, B : 1 u/ml, C : 0,2 u/ml). L'incubation est réalisée à 4 C durant une heure. On effectue ensuite une centrifugation avec gradient en saccharose de 5 à 20% durant 16 heures à 35000 t/min. dans un rotor SW41 QR On recueille des fractions de 0,5 ml dont on analyse la radioactivité et l'activité AC (mesurée en présence de calmoduline et exprimée en 10-3 /ml). Pour chaque opération, on utilise comme référence, a : la pyruvate kinase (S20,w 10S) b : la lactate déhydrogénase (S20 w = 7S); c : la créatine kinase (S20,w = 5S).Les résultats obtenus sont rapportés sur les figures 1A à 1C sur lesquelles on indique d'une part la radioactivité (courbe A -- À) et d'autre part l'activité AC (courbe ss -- # pour les fractions recueillies. Les courbes A, B, C correspondent aux dilutions des surnageants indiquées ci-dessus). L'examen de ces figures montre que lorsqu'on utilise de l'AC en excès par rapport à la calmoduline radiomarquée (figure 1A) 80% de la radioactivité sont déplacés d'un coefficient de sédimentation de 2S correspondant à celui de la calmoduline à 3,9S. L'enzyme mesurée par son activité, sédimente sous forme d'un pic non symétrique ayant une valeur S de 3,6 qui correspond à celle de l'AC libre et d'un épaulement à 3,9 S. Cet épaulement correspond au complexe AC-calmoduline. Lorsque Je rapport de l'AC à la calmoduline est de 1:1 (figure 1B) ou 1:5 (figure 1C) on récupère respectivement 70% de la radioactivité dans le pic 3,9s. La proportion de (125I) calmoduline libre à celle liée dans les trois conditions, permet d'estimer une constante d'association avec l'AC de 1OnM. Cette valeur est très proche de celle calculée de 5 nM à partir de la courbe d'activation de l'activité de l'AC par la calmoduline. - Etude par la métode SDS-PAGE (sodium dodecylsulfatepolyacrylamid gel electrophoresis) On étudie selon la méthode SDS-PAGE (10% d'acrylamide) avec coloration du gel à l'aide d'argent, l'AC purifiée avec a de l'Affigel-calmoduline, ou bu du DEAE-Sephacel. Les résultats obtenus sont rapportés sur les figures 2a et 2b. Sur la figure 2a, la piste 1 correspond au surnageant de culture concentré, la piste 2 aux protéines non liées à l'Affigel-calmoduline et la piste 3 aux protéines éluées à partir de l'Affigelcalmoduline. Sur la figure 2b, la piste 1 correspond au surnageant de culture concentré, la piste 2 aux protéines non liées à la première colonne de DEAE-Séphacel, la piste 3 aux protéines non liées à la 2ème colonne de DEAE-Séphacel, la piste 4 aux protéines éluées durant le lavage du DEAE-Séphacel, la piste 5 aux protéines éluées à partir de la 2ème colonne de DEAE-Séphacel et la piste 6 à la préparation de (125I) AC purifiée sur DEAE-Séphacel. Comme on le constate à l'examen de la figure 2a, piste 3, la préparation d'enzyme purifié renferme quatre protéines de 50kDa, 45 kDa, 43kDa, et 40kDa. Les bandes supplémentaires observées sont dues à des artefacts de coloration de l'argent. L'examen de la figure 2b, montre qu'une préparation purifiée à l'aide de DEAE-Séphacel renferme 2 polypeptides de poids moléculaire respectif de 45000 et 43000 et de la calmoduline en excès. Après traitement par l'iode, les deux polypeptides et la calmoduline sont marqués (figure 2b, piste 6). - Etablissement d'une carte des peptides par protéolyse limitée de la (1251) AC. Les 2 polypeptides marqués de 45kDa et 43kDa sont prélevés d'un gel SDS (5,5% d'acrylamide) sur lequel on applique un complexe (1251) d'AC-calmoduline. On effectue une autoradiographie du gel pour visualiser les positions des 2 polypeptides et les coupes de gel sont appliquées sur un deuxième gel SDS (15% d'acrylamide) en présence d'une protéase de Staphylococcus aureus (protéase V8) comme décrit par Cleveland et al., J. Biol. Chem., 262, 1 102-1 106, 1977). On rapporte sur la figure 3 les résultats obtenus A, C et E correspondent aux profils de digestion de peptides de 45kDa et B, D et F aux profils de digestion de la protéine de 43kDa avec respectivement 0,075 , 0,75 pg et 7,5 pg de protéase. Comme le montre cette figure, les deux polypeptides présentent des profils de digestion protéolytique semblables, ce qui indique qu'ils sont structurellement apparentés. - Etude de la sensibilité à la digestion par la trypsine de l'AC libre et de l'AC liée à la calmoduline. On étudie les différences conformationnelles éventuelles entre l'AC libre et l'AC liée à la calmoduline en investigant leur sensibilité à la digestion par la trypsine. Les résultats obtenus sont rapportés sur les figures 4a et 4b. Les expériences dont les résultats sont rapportés sur la figure 4a sont réalisées comme suit On incube à 50'C avec 50 p1 de trypsine TPCK (un microgramme par ml dans le tampon A) 50 pl d'AC purifiée sur Affigel-calmoduline (0-0) ou d'un complexe AC-calmoduline purifiée sur DEAE-Séphacel (@-@) (1,5 u/ml 1 g/ml dans le tampon A). A des temps déterminés, on dilue des parties aliquotes de 10 l dans 20 pl d'inhibiteur de trypsine de soja (0,2 mg/ml dans le tampon A), on mesure l'activité en présence de calmoduline. Les expériences dont les résultats sont rapportés sur la figure 4b sont réalisées comme suit On traite un complexe (125I) AC-calmoduline (1,5 u/ml) dans les conditions évoquées ci-dessus. Des parties aliquotes sont déterminées soit pour leur activité AC ou examinées selon la méthode SDS-PAGE (10% d'acrylamide). Les résultats obtenus montrent que l'incubation de l'AC libre avec la trypsine à 0. C (1:1, p:p) entrain une inactivation complète de l'enzyme dans les 2 minutes (voir figure 4b). Dans les memes conditions, le complexe de l'AC-calmoduline apparat beaucoup plus résistant à l'inactivation protéolytique. 70% de l'activité enzymatique est maintenue après 30 min. d'incubation. Le SDS-PAGE des produits du complexe AC-calmoduline marqué par (1251) montre une conversion rapide du polypeptide de 45kDa en polypeptide 43kDa, qui est lui-même clivé progressivement en peptide de 25kDa. Cette dernière forme apparat beaucoup plus résistante à la protéolyse ultérieure. La calmoduline marquée par (125I) en excès par rapport au complexe (12 51)enzyme-calmoduline est rapidement dégradée par la trypsine comme le montre la figure 4a. Pour étudier la fonction catalytique du peptide de 25kDa Après 16 heures de centrifugation à 52000 t/min. dans un rotor SW60# à 4 C, sur des gra- dients de saccharose allant de 5 à 20%, on recueille des fractions de 120 l dont on mesure l'activité AC (en présence de calmoduline) et la radioactivité. Dans les parties insérées sur les courbes, on indique l'autoradiographie selon une analyse SDS-PAGE (10% d'acrylamide) des fractions indiquées. La figure 5A correspond au complexe non traité 1251 AC-calmoduline (12x10 3 ; 6,8x105 cpm)et la figure 5B correspond au complexe (125I)AC-calmoduline digéré par de la trypsine pendant 30 mn à 0 C (l'activité initiale en l'absence de trypsine est de 22x10-3 ; 1,15 X cpm. Après 30 minutes de digestion : il x10 3 u; 5 1,15 x 10 cpm. Les résultats sont exprimés en pourcen- tage de l'activité initiale. Les références sont, a : la créatine kinase (320,w = 5S); b : adénylate kinase (520 20 ,w = 2,45). On constate que dans l'expérience témoin, sans traitement à la trypsine, la radioactivité est retrouvée dans 2 pics distincts correspondants au complexe enzymatiquement actif et à la calmoduline libre (figure 5a). Après 30 minutes d'incubation en présence de trypsine, 55% de l'activité originale est récupérée. L'analyse de l'enzyme digéré par la trypsine montre qu'elle a la même valeur S apparente que l'enzyme non traité (figure 5b). Cependant, l'analyse des fractions correspondant au pic d'activité sur le gel SDS révèle seulement un polypeptide de 25kDa. Il apparait ainsi que, bien cue la trypsine clive les liaisons peptidiques de la molécule d'AC, les fragments tiennent encore ensemble par des interactions non convalentes selon la même conformation active que dans le complexe non digéré d'AC-calmoduline. EXEMPLE 6 : Etude radio-immunologique de l'AC purifiée On utilise le complexe d'AC-calmoduline pour former des anticorps anti-enzymes chez la souris. On utilise des souris femelles BALB/c de 4 semaines qu'on immunise par voie sous-cutanée à 3 reprises à une semaine d'intervalle avec 10 pi de préparation d'AC purifiée sur Af figel-calmoduline. On effectue un rappel 1 mois plus tard en utilisant une préparation d'AC purifiée à l'aide de DEAE-Séphacel. On recueille les sérums 3 jours après le rappel. Les anticorps anti-AC sont détectés en utilisant le radio-immunoessai réalisé comme indiqué ciaprès. Toutes les réactions irrimunologiques sont effectuées dans le tampon A. le mélange réactionnel contient 100 pi de (1251)AC (2 x 104 cpm et 4 x 10 u d'activité enzymatique), 100 pi d'immunsérum de souris anti-AC dilué et 100 pi d'AC non marquée ou de surnageant de culture concentré.Après 18 heures d'incubation à 4 C, on ajoute 100 p1 d'anticorps de lapin, anti-immunoglobuline de souris et 100 pl de polyéthylène glycol à 8%, dilué dans un sérum de souris préim un. Après avoir effectué une autre incubation de 30 min. à 4 C, on centrifuge les tubes à 2000 x g pendant 30 min., on élimine les surnageants et la radioactivité du précipité est mesurée dans un compteur gamma. Les résultats du radioimmunoessai sont rapportés sur la figure 6. Sur cette figure, Bo correspond à la fixation initiale de 50 s de (1251) AC liée à l'antisérum en l'absence d'AC non marquée et B au pourcentage de (125I) AC résiduelle, liée en présence de différentes quantités d'AC non marquées (+ - t) ou de surnageant de culture concentré de la souche 18323 (,-,) ou d'un surnageant de culture du variant phase IV avirulent (n-s) les parties insérées correspondent aux résultats obtenus avec une préparation (1251)AC incubée avec un sérum préimmun ou un antisérum anti-AC de souris 18 heures à 4'C puis les complexes d'anticorps (1251) AC sont précipités comme décrits ci-dessus.Le précipité est solubilisé dans un tampon et étudié selon la méthode SDS-PAGE (10% d'acrylamide). La piste 1 représente la préparation témoin de (12 5 (125I) AC, la piste 2 l'immunoprécipitation avec le sé- rum avant immunisation et la piste 3 l'immunoprécipit,- tion avec l'antisérum de souris anti-AC. Comme le montre la figure 6, l'antisérum de souris précipite spécifiquement l'enzyme marquée par ( I) et non la calmoduline marqué par ( I). En développant un radioimmunoessai pour déterminer la concentration d'AC dans les surnageants bruts ou les extraits bactériens de Bordetella pertussis, on obtient les résultats suivants : Une courbe dose-réponse typique est donnée sur la figure 6 et ert obtenue avec une dilution de sérum anti-AC de 1:2000. En utilisant ce radioizrmunoessai, il est possible de détecter une quantité aussi faible que 5 ng. La courbe d'inhibition obtenue avec le surnageant concentré est parallèle à la courbe de référence déterminée avec l'enzyme purifié, Aucune AC ne peut ètre détectée dans le surnageant de culture dépourvu d'activité enzymatique, obtenu à partir du dérivé phase IV avirulent de la souche.On en conclut que le variant phase IV produit des niveaux d'AC qui ne peuvent être décelés et ne produit pas de protéines actives. EXEMPLE 7 : Etude de l'inhibition de l'activité d'AC par l'antisérum anti-AC. On incube 300 p1 d'AC (60x10-3 u/ml) purifiée sur Affigel-calmoduline en l'absence ou en présence de 250 pg d'albumine de sérum bovin ou de 50 pi de sérum. Après 18 heures à O' C, les parties aliquotes sont prélevées et on détermine l'activité AC en présence de calmoduline. Les complexes antigène-anticorps sont précipités comme décrits ci-dessus et l'activité enzymatique est déterminée dans le surnageant. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 1 ci-après TABLEAU 1 Activité adénylate cyclase (10-3 /ml) Additions avant : après précipitation précipitation - 62 62 Albumine de sérum bovin 100 64,5 Sérum préimmun 92 66 Sérum anti-adénylate cyclase . 9 0,7 On constate que l'incubation d'AC avec de la sérumalbumine ou du sérum préimmun, entraine une augmentation de 30 à 40% de l'activité, tandis que l'incubation de l'enzyme avec un antisérum spécifique conduit à une inhibition de 90% de l'activité. De plus, les anticorps anti-AC précipitent 99% de l'enzyme actif étant donné que moins de 1% de l'activité initiale se trouve dans le surnageant. EXEMPLE 8 : Etude des effets protecteurs d'anticorps anti-AC. On cultive la souche Bordetella Pertussis 18323 sur agar Bordet Gengou, supplémentée avec 15% (v/v) de sang de cheval défibriné (BGB) à 36'C pendant 72 heures. On effectue une sub-culture d'une colonie hémolytique (hly +) dans une infusion Steiner-Scholte pendant 20 à 24 heures jusqu'à l'obtention de A650 de 1,0 qui correspond à des unités formant des colonies + (CFU) de 2 (-i) x109 ml-l. 50 p1 de cette culture sont injectés dans les orifices externes des narines de souris femelles Swiss de 3 semaines.A partir d'une culture de Bordetella pertussis sur BGB à partir d'homogéneisats de poumons de souris infectés 48 h, on sélectionne les colonies au regard de la stabilité du phenotype hly+, en effectuant plusieurs essais, il apparat que la fréquence d'obtention des variants hly- est approximatIvement de 10 3. Deux clones isogéniques sont isolés : I clone hly+ désigné ci-après VIIIA7 et un deuxième clone, hly-, désigné 7-1. Le clone VIIIA7 et la souche parentale sont positifs vis-à-vis des effets du facteur engendrant la leucocytose (LPF) et les effets d'agglomération sur les cellules d'ovaires de hamsters chinois (CHO) du Ptx, les effets d'hémaglutination du FHA et la production d'AC extra cellulaire. Le clone 7-1 est négatif vis-à-vis de l'expression de Ptx et de AC mais retient l'activité FHA. La souche parentale et ses deux dérivés isogéniques cultivés sur un milieu agar Stainer-Scholte supplémenté avec de la cyclodextrine, sont ensuite cultivés dans des sub-cultures de bouillon de milieu Stainer Scholte pour injection aux souris. Pour estimer la virulence (en termes de quantités de CFU capable de s'établir et de se répliquer dans les poumons), et la pathogénicité (en termes de capacité à induire des lésions tissulaires) de la souche parentale 18323 et de ses dérivés isogéniques VIIIA7 et 7-1, on utilise un modèle murin quantitatif décrit par Alonso J. M. et al. dans FEMS Microbiol. Letter, sous presse. Sur la figure 7, on rapporte les cinétiques de l'infection pulmonaire induite par les 3 inoculats : la souche parentale et le clone VIllA?, expriment une virulence équivalente tandis que le clone 7-1 est éliminé des poumons dans les 3 jours. Bien que l'intensité de l'infection induite apparaisse équivalente à celle de la souche parentale, le clone VIIIA7 est léthal pour la souris en produisant une alvéolite hémorragique complète (figure 8). Compte tenu de ce résultat, on a cherché à identifier le facteur responsable de la léthalité et à distinguer le clone pathogène VIIIA7 de la souche parentale. En iitrant les activités AC et Ptx dans les surnageants de culture des 3 inoculats, il apparalt que le clone VIIIA7 secréte environ 10 fois plus d'AC activable par la calmoduline que la souche parentale. Le clone 7-1 ne secrète pas de quantité décelable de cet enzyme. La production de Ptx, estimée à partir des effets LPF dans la souris dans laquelle on a effectué une injection par voie intraveineuse et des effets d'agglomération CHO, est également environ 2 fois supérieure dans VIIIA7 que dans la souche parentale et n'est pas décelée dans le clone 7-1. Il apparait que l'alvéolite hémorragique léthale aiguë qui suit l'infection intranasale de la souris avec le variant VillA?1 est due à une libération plus importante d'AC et de Ptxt agissant tous deux comme agents augmentant le cAMP intracellulaire. Dans les expériences ci-après on a déterminé les effets inhibiteurs spécifiques des anticorps formés contre des antigènes de cellules entières, FHA, Ptx ou AC. Comme le montre le tableau 2, l'épreuve respiratoire léthale avec le clone VIIIA7 est fortement reproductible et induit la mort des souris dans les 4 jours. Les survivants au 5ème jour sont totalement guéris. En préincubant l'inoculum d'épreuve avec des sérums variés, on constate que seulement les anticorps anti-FHA et anti-AC sont protecteurs vis-à-vis de l'alvéolite hémorragique aiguë observée constamment dans les témoins non immunisés. Les anticorps anti-Ptx ne permettent pas de protéger la souris contre une épreuve expérimentale tout en possédant cependant les effets protecteurs contre des effets cytopathogènes sur des cellules en culture. TABLEAU 2 témoin Sérum Vaccion anti- Anti-FHA Anti-Ptx Anti-AC Anti-AC Normal cellule (polyclonal) (monclonal) entière log10 dilution du sérum -1 -1 -2 -1 -1.6 -2 -1 -2 -1 -1.6 -2.2 -2.2 -2.5 -2.8 -3.1 Exp.1::1.6x109CFU/ml* (AC=76 /ml)+ Léthalité 14/15 4/5 4/5 4/5 0/5 0/5 3/5 4/5 5/5 0/5 0/5 3/5 % inactivation d'AC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 89 84.5 56 % inhibition de Ptx 0 0 0 0 0 0 0 100 100 0 0 0 Exp.2:2.7x109CFU/ml* (AC=84 /ml)+ Léthalité + 9/10 5/5 4/5 4/5 0/5 2/5 4/5 1/5 % inactivation d'AC 0 0 0 0 78 67 52 0 % inhibition de Ptx 0 0 100 100 0 0 0 0 Exp.3::2.6x109CFU/ml* (AC=98 /ml)+ Léthalité# 5/5 4/5 1/5 0/5 0/5 1/5 % inactivation d'AC 0 0 0 15 25 0 % inhibition de Ptx 0 0 0 0 0 0 * - densité de l'inoculum + - activité de l'AC dans le surnageant de l'inoculum # - nombre de souris mortes/total - inactivation in vitro de l'AC extracellulaire dans l'inoculum - inhibition des effets d'agglomération - CHO du surnageant de l'inoculum. On considère que les effets protecteurs des anti-FHA sont dus à une inhibition efficace de l'adhérence bactérienne par ces anticorps, conduisant à une rapide disparition de B. pertussis de la surface de l'épithélium cible. L'efficacité des anticorps polyclonaux anti AC, inhibant l'activité catalytique de l'enzyme, suggère que l'AC de Bordetella pertussis intervient dans la pathogénèse de la coqueluche comme toxine majeure responsable pour le syndrome cytopathogène local dans le tractus respiratoire. Les effets protecteurs de l'anticorps monoclonal 8-25 obtenu à partir de la souche d'hybridome I sont mis en évidence par analyse SDS-PAGE de surnageant concentré, d'extrait bactérien et de préparations d'AC purifiée et immunoblot à l'aide d'une fraction avec 18% de sulfate de sodium de l'ascite 8-25 dilué au 1/100 (35 mg de protéines totales/ml). Les photos de l'analyse SDS-PAGE et de l'immunoblot sont rapportées sur les figures 9a et 9b respectivement. Les pistes A, B, C et D sur la figure 9a correspondent respectivement à un surnageant concentré 115 fois (activité 9 267 u/ml), à de 1'AC pure il 590 /mali, à une autre preparation d'AC pure (795 u/ml) et à un extrait bactérien ( 8,8 M) (231 u/ml). Les pistes A', B', C' et D' de la figure 9b correspondent aux produits des préparations ci-dessus transférées et immunoprécipitées une préparation d'IgG1 d'anticorps monoclonal 8-25 anti-AC. L'examen de ces résultats montre que ces anticorps monoclonaux reconnaissent spécifiquement le composé de 43-45 kDa de l'AC de B. pertussis. Ces expériences montrentque l'AC de B. Pertussis est un facteur pathogène majeur et un antigène protecteur contre la coqueluche. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection précoce de maladies causées par des bactéries du genre Bordetella ou Bacillus anthracis, et en particulier de la coqueluche, caractérisé en ce que ledit procédé met en oeuvre des anticorps dirigés contre une préparation d'adenylate cyclase (ou AC) possédant une pureté élevée et pratiquement dépourvue de produits contaminants bactériens, notamment de pertussis toxines, de lipopolysaccharide (ou LPS) et d'hémagglutine filamenteuse (ou FHA). 2. Procédé, selon la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps sont dirigés contre une préparation d'AC se présentant sous une forme homogène sédimentant sur un gradient de densité en saccharose avec un coefficient S égal à 3,6. 3. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les anticorps sont dirigés contre une préparation d'AC existant sous deux formes moléculaires de 45 et 43 kDa respectivement, structurellement apparentées. 4. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les anticorps sont dirigés contre une préparation d'AC possèdant une activité pouvant atteindre et même dépasser 1600 iimole de cAMP min-l mg-l. 5. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les anticorps sont dirigés contre une préparation d'AC libre ou sous forme d'un complexe, en association avec des protéines eucaryotes et plus spécialement avec la calmoduline. 6. Procédé, selon la revendication 5, caractérisé en ce que les anticorps sont dirigés contre une préparation d'AC ayant une constante d'association avec la calmoduline de lOnM environ. 7. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les anticorps sont dirigés contre une préparation d'AC dont l'activité catalytique est portée par un fragment de 25 kDa, site de combinaison à la calmoduline et protégé par celle-ci contre les digestions trypsiques. 8. Procédé, selon l'une quelconque des revendications l à 6, caractérisé en ce que les anticorps sont dirigés contre une préparation d'AC qui est élaborée à partir de cultures de bactéries exprimant l'AC, et plus spécialement, de bactéries pathogènes dont 1'AC est capable d'interférer avec l'AC des cellules eucaryotes. 9. Procédé, selon la revendication 8, caractérisé en ce que les bactéries sont du genre Bordetella ou Bacillus anthracis. 10. Procédé, selon la revendication 9, caractérisé en ce que les anticorps sont dirigés contre une préparation d'AC provenant de Bordetella responsable de pathologies respiratoires des vertébrés telles que, chez l'homme, Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis, et chez l'animal Bordetella bronchseptica et Bordetella avium. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les anticorps sont des anticorps monoclonaux, de préférence tels que ceux produits par l'hybridome déposé à la CNCM sous le numéro I-610 le 9 octobre 1986. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : la mise en contact de l'échantillon biologique sous test avec un réactif comprenant lesdits anticorps dirigés contre l'adénylate cyclase, et la détection, par exemple par des techniques de radioimmunoessais ou d'ELISA, des réactions entre lesdits anticorps et l'adénylate cyclase contenu dans l'échantillon. 13. Réactif de diagnostic comprenant, d'une part, des anticorps dirigés contre l'adénylate cyclase de pureté élevée, ledit adénylate cyclase étant pratiquement totalement dépourvu de produits contaminants bactériens, notamment de pertussis toxines, de lipopolysaccharide (ou LPS) et d'hémagglutine filamenteuse (ou FHA) et, d'autre part, des moyens aptes à détecter la réaction entre lesdits anticorps et l'adénylate cyclase.