Brevet FR2653888A1 — publié le 19910503

DESCRIPTION La présente invention a pour objet des procédés et des réactifs colorimétriques pour détecter quantitativement des bactéries pathogènes dans l'eau. Le secteur technique de l'invention est celui des analyses biologiques. Les laboratoires d'analyses biologiques doivent souvent contrôler la qualité bactériologique des eaux ou des solutions aqueuses. C'est le cas par exemple des analyses périodiques d'eau de piscine, d'eau de mer à proximité-des plages, des eaux de sources ou de puits ou de cours d'eau, des eaux utilisées en conserverie etc... Les eaux à analyser contiennent souvent des ions chlore. C'est le cas notamment de l'eau de mer, des eaux de piscine et des eaux ayant subi un traitement de stérilisation par le chlore ou l'eau de javel. A ce jour, la recherche en laboratoire des bactéries pathogènes dans l'eau entraîne un processus long et coûteux. Le biologiste chargé d'une analyse bactériologique d'eau commence à rechercher la présence ou l'absence de germes pathogènes et, en cas de présence, il procède ensuite à une identification longue et coûteuse de ceux-ci. On rappelle qu'une bactérie n'est pathogène dans un milieu donné, que si elle est présente en grandes quantités supérieures à un seuil qui est fixé par les normes internationales à 105 germes/ml. Les eaux à analyser contiennent toujours des nitrates. Les micro-organismes pathogènes actifs qui peuvent polluer une eau appartiennent dans la grande majorité des cas aux genres ci-après Escherichia-Coli, Proteus, Salmonelles, Citrobacter, Pseudomonas ruginosa, Enterocoque, Staphylocoques etc.... Tous ces micro-organismes pathogènes produisent un enzyme, la nitrate réductase qui catalyse la transformation des nitrates en nitrites, lesquels n'existent pas dans une eau dépourvue de bactéries pathogènes. La présence de nitrites est donc un indice de la présence de bactéries pathogènes dans l'eau et la quantité de nitrites est proportionnelle à la quantité de germes pathogènes présents dans l'eau, et indépendante de la quantité de nitrates. On admet que 104 germes pathogènes/ml d'eau produisent 0,5pg de nitrites/ml. L'objectif de la présente invention est de procurer un procédé permettant de détecter la présence de germes pathogènes dans l'eau et de déterminer l'ordre de grandeur de la quantité de germes par millilitre d'eau par une analyse colorimétrique beaucoup plus simple économique et rapide que les procédés utilisés à ce jour. L'objectif de l'invention est atteint par un procédé selon lequel on dose la quantité de nitrites présents dans l'eau au moyen d'un réactif colorimétrique et on déduit du dosage des nitrites l'ordre de grandeur de la quantité de germes pathogènes par unité de volumes qui est proportionnelle à la quantité de nitrites. Selon un mode de réalisation préférentiel, le réactif colorimétrique contient de l'acide sulfanilique qui réagit avec les nitrites pour produire un sel de diazonium et contient également de la n-(lnaphtyl)-ethylènediamine sous forme di-hydrochloride, qui réagit avec ledit sel de diazonium pour donner un colorant diazoïque, et du bleu de méthylène qui stabilise la couleur, de sorte que l'ordre de grandeur de la quantité de bactéries pathogènes est indiqué par l'échelle de teintes suivantes - bleu très clair : absence de germes pathogènes. - mauve clair : environ 104 germes/ml. - violet clair : environ 105 germes/ml. - violet foncé : plus de 106 germes/ml. Avantageusement, le réactif colorimétrique contint, en outre, du nitrate mercurique qui neutralise les ions chlore et au moins un acide faible qui évite l'hydrolyse du nitrate mercurique. Selon un mode de réalisation préférentiel, un réactif colorimétrique selon l'invention, est une solution dans de l'eau déminéralisée qui contient par litre de solution - de l'acide sulfanilique entre 0,1 g et 1,5 g. - de la n-(l naphtyl)-éthylènediamine di-hydrochloride entre 0,1 g et 1,5 g et du bleu de méthylène entre 0,001 g et 0,15 g. Avantageusement, un réactif colorimétrique selon- l'invention contient, en outre, par litre de solution aqueuse - du nitrate mercurique entre 5 g et 20 g. - de l'acide tartrique entre 0,05 g et 0,25 g. - de l'acide acétique entre 2 g et 5 g. Le déroulement d'une analyse de bactéries pathogènes par un procédé selon l'invention comporte les étapes suivantes - on prépare d'abord un réactif colorimétrique en mélangeant à de l'eau déminéralisée, les produits suivants, pris dans les quantités suivantes par litre d'eau. - acide sulfanilique entre 0,1 g et 1,5 g. - n-(l naphtyl)-éthylènediamine di-hydrochloride entre 0,1 et 1,5 g. - nitrate mercurique entre 5g et 20 g. - bleu de méthylène entre 0,001 g et 0,15 g. - acide tartrique entre 0,05 et 0,25 g/l. - acide acétique entre 20 ml et 50 ml d'une solution aqueuse contenant 10% d'acide acétique. Pour détecter la présence de bactéries pathogènes dans de l'eau, on verse dans un tube à essais un petit volume du réactif colorimétrique par exemple 1 ml, puis un volume d'eau à analyser sensiblement égal à la moitié du volume de réactif colorimétrique, par exemple 0,5 ml. - on agite et on laisse séjourner pendant une durée minima comprise entre 30 secondes et 5 minutes. On peut ensuite comparer visuellement la couleur du liquide à une échelle de couleur. On peut également déterminer la couleur du liquide au moyen d'un appareil de lecture automatique, par exemple un spectrophotomètre. En variante, on peut également utiliser des indicateurs colorimétriques constitués par une bande de papier imprégnée du réactif colorimétrique que l'on trempe dans un échantillon d'eau à analyser et que l'on compare ensuite visuellement à une échelle de couleurs. Une couleur bleue clair signifie une absence de germes pathogènes. Une couleur mauve clair signifie une quantité de germes pathogènes inférieurs à 104 par litre-d'eau. La qualité de l'eau doit alors être recontrôlée. Une couleur violet clair signifie une eau polluée contenant une quantité de germes pathogènes de l'ordre de 105 par litre. Une couleur violet foncé signifie une eau très polluée contenant une quantité de germes pathogènes égale ou supérieure à 106 germes par litre. L'action du réactif colorimétrique sur un échantillon d'eau à analyser fait intervenir les phénomènes ci-après. Dans la majorité des cas, l'eau à analyser contient des ions chlore. C'est le cas, notamment, des eaux salées, des eaux de piscine et des eaux ayant subi un traitement de stérilisation par du chlore ou des sels de chlore. Or, le chlore gêne la formation des colorants azoïques. Les ions mercuriques qui sont libérés par le nitrate mercurique fixent les ions chlore. Toutefois, le nitrate mercurique est hydrolysé par eau et, si aucune précaution n'était prise, les ions mercuriques seraient neutralisés. La présence dans le réactif colorimétrique d'acide tartrique et acétique évite l'hydrolyse du nitrate mercurique. Les bactéries pathogènes éventuellement présentes dans l'échantillon d'eau à analyser secrètent de la nitrate réductase en quantité infinitésimale et cet enzyme catalyse la formation de nitrites. L'acide sulfanilique contenu dans le réactif colorimétrique est un acide diazoté. I1 réagit sur les nitrites en produisant un sel de diazonium qui maintient le pH au voisinage de 7, quel que soit le pH initial de 1 eau à analyser. Cet effet tampon n'est pas perturbé par la présence d'acide tartrique et d'acide acétique dans le réactif coloré, car il s'agit d'acides faibles, utilisés en très faibles proportions. Le sel de diazonium agissant sur le noyau naphtylique de la n. (lnaphtyl) -éthylène diamine di-hydrochloride, produit un colorant azoïque rouge violacé. La présence de bleu de méthylène dans le réactif colorimétrique permet de stabiliser la couleur obtenue. Les quantités d'enzymes libérées varient légèrement d'une bactérie à une autre. Afin d'obtenir une échelle colorimétrique donnant des résultats indépendants du type de bactéries présentes dans l'eau, on ajoute au réactif colorimétrique une très petite quantité de bleu de méthylène, qui réduit considérablement les fluctuations optiques du colorant azoïque et permet d'obtenir une densité optique qui est la moyenne des densités optiques que l'on obtiendrait pour chaque type de bactérie. On obtient ainsi une densité optique égale pour une même plage de concentration des différentes bactéries. REVENDICATIONS 1. Procédé pour détecter quantitativement la présence de bactéries pathogènes dans l'eau, caractérisé en ce que l'on dose la quantité de nitrites présents dans l'eau au moyen d'un réactif colorimétrique et on déduit du dosage des nitrites l'ordre de grandeur de la quantité de germes pathogènes par unité de volume qui est proportionnel à la quantité de nitrites. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit réactif colorimétrique contient de l'acide sulfanilique qui réagit avec les nitrites pour produire un sel de diazonium et contient également de la n-(l naphtyl)-éthylènediamine di-hydrochloride qui réagit avec ledit sel de diazonium et du bleu de méthylène, de sorte que l'on obtient une échelle de teintes qui sont les suivantes - bleu très clair : absence de germes pathogènes - mauve clair : environ 104 germes/ml - violet clair : environ 105 germes/ml - violet foncé : plus de 106 germes/ml. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit réactif colorimétrique contient, en outre, du nitrate mercurique qui neutralise les ions chlore et au moins un acide faible qui évite l'hydrolyse du nitrate mercurique. 4. Réactif colorimétrique destiné à détecter quantitativement la présence de bactéries pathogènes dans une eau, caractérisé en ce qu'il est composé d'une solution aqueuse contenant par litre de solution - de l'acide sulfanilique entre 0,1 g et 1,5 g - de la n-(l naphtyl)-éthylènediamine dihydrochloride entre 0,1 et 1,5 g - et du bleu de méthylène entre 0,001 g et 0,15 g. 5. Réactif colorimétrique selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite solution aqueuse contient, en outre, par litre de solution - du nitrate mercurique entre 5 g et 20 g - de l'acide tartrique entre 0,05 g et 0,25 g - de l'acide acétique entre 2 et 5 g.