Brevet FR2658301A1 — publié le 19910816

" Procédé de mise en évidence et d'analyse de la dégénérescence cellulaire La présente invention a pour objet un procédé de mise en évidence et d'analyse de la dégénérescence cellulaire consécutive à l'oxydation induite par des radicaux libres des acides gras polyinsaturés des phospholipides membranaires. La vie d'une cellule ou d'un tissu dépend de l'activité d'un grand nombre d'effecteurs intrinsèques et extrinsèques dont la parfaite coordination assure le fonctionnement optimal du système considéré. Toutefois, cette activité optimale ne peut être assurée que si l'intégrité du système est maintenue. Le maintien de cette intégrité dépend, avant tout, de l'organisation macromoléculaire des constituants organiques et tout particulièrement des composés lipidiques. Au niveau des membranes plasmiques ou des membranes intracellulaires, la quantité et la qualité des acides gras est déterminante pour assurer leurs rôles physiologiques. Ces aspects qualitatifs et quantitatifs dépendent des apports nutritionnels, du niveau de synthèse intrinsèque, mais également de l'intensité des mécanismes impliqués dans leur dégradation. La lipoperoxydation, qui correspond à un ensemble de réactions radicalaires des acides gras polyinsaturés présents dans les phospholipides constitutifs des membranes des cellules vivantes constitue l'un des plus importants de ces mécanismes de dégradation : on sait que celle-ci est initiée par des espèces moléculaires très réactives telles que des radicaux libres oxygénés ou des espèces apparentées parmi lesquelles les plus connues sont l'anion superoxyde 2 -, le radical hydroxyl OHO, l'oxygène singulet 0*, les radicaux peroxydes ROOO et même le peroxyde d'hydrogène H202. Il est connu que cette lipoperoxydation constitue un mécanisme fondamental du vieillissement et de la dégénérescence cellulaire. On a pu déterminer, expérimentalement, que, sous l'effet des radicaux libres, les molécules d'acides gras polyinsaturés tendent à s'oxyder et à générer de nombreux produits de dégradation. Ce catabolisme a pour conséquence une augmentation de la réactivité des acides gras polyinsaturés et, corrélativement, une perte de leur stabilité, ce qui, au sein d'une membrane cellulaire, se traduit par une altération profonde de la structure cellulaire. L'évaluation qualitative et quantitative de ces phénomènes pourrait donner lieu à des applications d'une extrême importance : en effet, on sait que la lipoperoxydation est impliquée dans des pathologies aussi variées que certains cancers, l'athérosclérose, le diabète, les syndromes inflammatoires ... Les seuls procédés qui ont été proposés jusqu'à présent dans ce but sont basés sur le dosage des produits de dégradation des acides gras parmi lesquels les plus importants sont des dialdéhydes notamment le malondialdéhyde. Ces procédés ne peuvent, malheureusement, pas donner entière satisfaction, compte tenu de leur manque de spécificité, du caractère instable de certains produits de dégradation et, surtout, du fait que ces procédés font appel à des techniques "in vitro" ; cette obligation empêche toute estimation de l'intensité du phénomène "in vivo". La présente invention a pour objet de remédier à cet inconvénient en proposant un procédé permettant de mettre en évidence et d'analyser les phénomènes de lipoperoxydation au sein même de la cellule. Le terme d'analyse sous-entend une évaluation de ces phénomènes non seulement qualitative mais également quantitative. La mise au point de ce procédé est basée sur les résultats de travaux antérieurs qui ont montré que les dialdéhydes libérés lors de la lipoperoxydation, réagissent avec les fonctions amines primaires libres des protéines cellulaires pour donner des bases de schiff stables selon une réaction bien connue des chimistes pouvant induire une polymérisation des protéines donnant naissance à des protéines modifiées. Or, on s'est aperçu que ces protéines modifiées sont immunogènes chez l'animal. L'invention a pour objet d'utiliser ce caractère immunogène pour mettre au point un procédé du type susmentionné permettant la mise en évidence et l'analyse de la dégénérescence cellulaire. Selon l'invention, ce procédé est caractérisé en ce que l'on fait réagir, avec le dialdéhyde, un peptide ou un polypeptide échantillon prédéterminé, on injecte le peptide ou le polypeptide échantillon modifié ainsi obtenu à un animal expérimental, de manière à induire la formation d'anticorps antipeptide ou antipolypeptide échantillon modifié, puis après obtention de ces anticorps, on les met en contact avec les cellules à analyser et on met en évidence et analyse le complexe antigène-anticorps ainsi obtenu. Lors des recherches préalables à la mise au point de ce procédé, on s'est aperçu que, de manière surprenante, il existe un site antigénique commun à tous les peptides ou polypeptides, notamment à toutes les protéines, modifiés par les dialdéhydes. Conformément à 1 invention, cette caractéristique essentielle permet, à partir d'un peptide ou d'un polypeptide échantillon quelconque traité par le malondialdéhyde dans des conditions essentiellement similaires à celles régnant à l'intérieur des cellules (température de l'ordre de 37"C, pH, concentration ... déterminés) de produire expérimentalement un peptide ou un polypeptide échantillon modifié. Conformément à l'invention, les anticorps antipeptide ou antipolypeptide échantillon modifié peuvent être des anticorps polyclonaux ou des anticorps monoclonaux et être obtenus d'une manière quelconque. Toutefois, selon une caractéristique préférentielle de l'invention, pour obtenir les anticorps antipeptide ou antipolypeptide échantillon modifié, on prépare un immunsérum à partir du sang de l'animal, de façon connue en elle-même, le cas échéant, on purifie cet immunsérum de façon à -isoler les anticorps spécifiques du peptide ou du polypeptide échantillon modifié et l'on met cet immunsérum, le cas échéant, purifié en contact avec les cellules à analyser avant de mettre en évidence et d'analyser le complexe antigène-anticorps ainsi obtenu. L'expérience a prouvé que, lors de la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, il est particulièrement avantageux de choisir en tant que dialdéhyde le malondialdéhyde qui constitue l'un des principaux produits de dégradation des acides gras polyinsaturés cellulaires et dont le mode de préparation peut être quelconque (biologique ou chimique). On peut, bien entendu, également obtenir des résultats satisfaisants à partir d'autres dialdéhydes. Le peptide ou le polypeptide échantillon peut lui aussi être choisi de manière quelconque sans pour cela sortir du cadre de l'invention ; l'expérience a montré que l'on peut avantageusement choisir le lysozyme dont le principal intérêt est lié à son faible poids moléculaire. Conformément à l'invention, on a pu tester l'activité et la spécificité dtimmunsérums obtenus à partir de lysozyme et prélevé sur des lapins, trois semaines après immunisation, par différentes techniques immunologiques telles que - Dosages immunoenzymatiques de type ELISA (Enzyme linked immunsorbent assay) - Immunodiffusion selon la méthode d'Ouchterlony - Immunotransfert selon la méthode de Towbin. Une caractéristique essentielle du procédé conforme à l'invention est liée, par ailleurs, au processus utilisé pour mettre en évidence le complexe antigène-anticorps. Selon une caractéristique préférentielle de l'invention, dans ce but, on met le complexe antigène-anticorps en contact avec des anticorps antiimmunoglobulines de l'animal expérimental immunisé marqués à la fluorescéine qui viennent se fixer sur les anticorps antipeptide ou antipolypeptide échantillon modifié provenant de l'immunsérum. Il s'agit là d'une méthode immunofluorimétrique connue en elle-même : elle permet de localiser par observation microscopique le lieu de fixation des anticorps et donc les altérations membranaires. Il est possible, conformément à l'invention, d'analyse des cellules soit isolées soit en culture. Cette analyse peut, en outre, être qualitative (et permettre de rechercher quels sont les organites cellulaires constituants de la cellule préférentiellement marqués) ou quantitative (évaluation de l'intensité de fluorescence enregistrée). On a pu vérifier l'efficacité du procédé susmentionné à partir d'hématies et de spermatozoïdes humains ; on a également obtenu des résultats satisfaisants avec des cellules en culture (cellules de Sertoli et Fibroblastes). REVENDICATIONS 1") Procédé de mise en évidence et d'analyse de la dégénérescence cellulaire consécutive à l'oxydation induite par des radicaux libres des acides gras polyinsaturés des phospholipides membranaires, oxydation libérant un dialdéhyde réagissant avec les fonctions amines primaires libres des protéines cellulaires pour donner des protéines modifiées à caractère immunogène, procédé caractérisé en ce que l'on fait réagir, avec le dialdéhyde, un peptide ou un polypeptide échantillon prédéterminé, on injecte le peptide ou le polypeptide échantillon modifié ainsi obtenu à un animal expérimental, de manière à induire la formation d'anticorps antipeptide ou antipolypeptide échantillon modifié, puis après obtention de ces anticorps, on les met en contact avec les cellules à analyser et on met en évidence et analyse le complexe antigène-anticorps ainsi obtenu. 2") Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour obtenir les anticorps antipeptide ou antipolypeptide échantillon modifié, on prépare un immunsérum à partir du sang de l'animal, de façon connue en elle-même, le cas échéant, on purifie cet immunsérum de façon à isoler les anticorps spécifiques du peptide ou du polypeptide échantillon modifié et l'on met cet immunsérum, le cas échéant, purifié en contact avec les cellules à analyser avant de mettre en évidence et d'analyser le complexe antigène-anticorps ainsi obtenu. 3") Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le dialdéhyde est le malondialdéhyde. 4") Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, pour mettre en évidence et analyser le complexe antigène anticorps, on le met en contact avec des anticorps anti-immunoglobulines de l'animal expérimental immunisé, marqués à la fluorescéine qui viennent se fixer sur les anticorps antipeptide ou antipolypeptide échantillon modifié provenant de l'immunsérum. 5") Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le peptide ou le polypeptide échantillon est le lysozyme.