Brevet FR2649120A1 — publié le 19910104

La présente invention concerne une souche nouvelle de champignon filamenteux, ainsi que les dérivés de cette souche obtenus par mutation ou par manipulation génétique, et un procédé pour la production de protéine recombinante , à laide desdites souches. On entend par protéines recombinantes les molécules polypeptidiques synthétisées par un microorganisme ou une population cellulaire par suite de l'introduction dans le matériel génétique dudit microorganisme ou desdites cellules d'un gène codant pour la protéine considérée. Le gène en question, appelé gène hétérologue, peut provenir d'un autre organisme vivant ou entre synthétisé artificiellement. La possibilité d'introduire et de faire exprimer des gènes hétérologues a été tout d'abord mise en évidence et appliquée en utilisant des bactéries, et plus particulièrement Escherichia coli, comme cellules hôtes. Plus récemment, des productions de protéines recombinantes par d'autres microorganismes dont des levures et des champignons ainsi que par des cultures de cellules d'organismes supérieurs ont été décrites. Les champignons filamenteux sont utilisés couramment dans l'industrie des fermentations notamment pour la fabrication de certains antibiotiques (pénicillines, céphalosporines) et d'un grand nombre d'enzymes (glucoamylases, cellulases, protéases, pectinases Les champignons filamenteux présentent un certain nombre d'avantages par rapport aux microorganismes procaryotes (bactéries) en particulier la capacité d'excréter de grandes quantités et une grande variété de protéines, certaines de ces protéines présentant des modifications post traductionnelles, notamment des glycosylations, spécifiques des eucaryotes. Par rapport aux cellules d'eucaryotes supérieurs, les champignons sont beaucoup plus faciles a cultiver à grande échelle, la Séparation du mycélium et du milieu de culture après la fermentation est aussi très facile. La présente invention se rapporte à un procédé de productionde protéine recombinante à l'aide de champignons filamenteux, caractérisé en ce qu'on cultive sur un milieu approprié une souche du genre Tolypocladium dans laquelle on a introduit une séquence d'ADN codant pour ladite protéine placée sous le contrôle d'éléments assurant l'expression de ladite séquence dans ladite souche et en ce qu'on récupère ladite protéine. Plus précisément, la souche utilisée est une souche Tolypocladium geodes. Cette souche a été déposée sous le n" I-880 le 29 juin 1989 à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes - 28, rue du Docteur Roux - 75015 PARIS. L'invention concerne également les mutants déficients en activité protéasique et/ou hyperexcréteur de protéine exogène de cette souche. La présente invention repose notamment sur l'isolement d'une nouvelle souche de champignon filamenteux particulièrement adaptée à la production de protéines recombinantes. La souche sauvage NC14 a été isolée à partir d'un échantillon de terre riche en matières organiques en décomposition (humus d'un sous-bois de la région de Graulhet, Tarn, France). Elle a été primitivement sélectionnée pour sa forte activité protéolytique, et s'est avérée à l'analyse produire des quantités notables d'autres enzymes extracellulaires, chitinases et ss-glucanases en particulier, La souche NCl4 a été confiée pour identification au laboratoire du Muséum National d'Histoire Naturelle à Paris. Elle a été repiquée en boîtes de Pétri sur deux milieux de culture standard utilisés pour la détermination des hyphomycètes : Malt-agar 2% et Potato Dextrose Agar (PDA) puis incubée à 250C. La culture sur Malt se développe lentement, à peine 1 cm en 3 semaines de culture et forme une colonie serrée d'aspect humide. L'observation microscopique montre un mycélium hétérogène, au cytoplasme vacuolisé. Les conidies sont très rares et les cellules sporogènes peu nombreuses et dispersées. Le milieu PDA est plus favorable. La culture a une croissance lente, atteignant 13 à 20 mm en 10 jours. Le thalle est blanc, floconneux en surface, assez dense en profondeur, au contour irrégulier. On observe une légère pigmentation beige au revers, aucun pigment ne diffuse dans le milieu. Pas d'odeur caractéristique. L'observation microscopique montre des cellules sporogènes (phialides) solidaires ou groupées par deux ou trois sur une courte cellule latérale du mycélium. Les phialides mesurent de 9 à 14 pm de long, sont légèrement renflées à la base puis allongées vers le col qui est quelquefois recourbé. Les spores (conidies) sont groupées en têtes ; de forme très hétérogène (sphériques, cyclindriques, ovales) avec des rapports globalement entre 3,6-0,9 pm de long sur 2,9-0,9 pm de large avec deux classes principales : 3 x 1,5 (cylindriques > et 1,5 x 1,8 (globuleuses). Le mycélium mesure entre 1,5 et 2 sm de large. Pas de chlamydospores. L'aspect cultural, la vitesse de développement et la morphologie de l'appareil sporogène font que cette espèce appartient au genre Tolypocladium (Gams) par la forme, la taille et le groupement des phialides beaucoup plus renflées et groupées en verticilles chez inflatum. Elle diffère aussi de T.cylindrosporum (Gams) par la forme des phialides mais surtout par la forme des spores régulièrement cylindriques chez T.cylindrosporum. La souche NCl4 est finalement très proche de l'espèce geodes (Gams) par le mode de groupement des phialides décrit plus haut, par leur forme ainsi que par l'aspect cultural. Malgré l'hétérogénéité des spores, de taille et de forme très hétérogènes, 40% de celles-ci correspondent aux caractéristiques de Tolypocladium geodes (Gams) c'est à dire 1,6 sur 2,2 m. Il s'agit donc d'une souche de Tolypocladium geodes dont la morphologie des spores est quelque peu atypique. La souche NCl4 de Tolypocladium geodes a fait l'objet d'un programme d'amélioration génétique, consistant à sélectionner de façon récurrente des mutants de plus en plus fortement producteurs d'enzymes protéolytiques, puis d'enzymes chitinolytiques. Les méthodologies de mutagénèse et de sélection utilisées sont celles précédemment décrites pour Trichoderma reesei (GRAND et al., Enzyme Microb. Techncl., 1988, 1 : 341) et pour Penicillium occitanis (JAIN et ai., soumis à publication dans Enzyme Microbiol. Technology). La première étape de sélection a été effectuée à partir d'une suspension de spores de la souche NC14 traitée par un agent mutagène, la lumière ultraviolette. Une dilution de ladite suspension de spores a servi à inoculer des boîtes de Pétri contenant un milieu gélosé de composition suivante - poudre de lait écrémé : 10 g - phosphate monopotassique : 2 g - sulfate de magnésium : 0,3 g - chlorure de calcium : 0,2 g - sulfate de fer : 0,005 g - extrait de levure : 1 g - agar agar : 15 g - eau désionisée qsp : 1 litre pH ajusté à 7,0 avec de la soude Après incubation 5 jours à 270C, les colonies apparues sur ce milieu sont entourées d'un halo clair, dû à l'hydrolyse des protéines du lait par les enzymes protéolytiques excrétées par la souche. Ce crible de sélection, qui avait déjà été utilisé pour l'isolement de la souche NC14, a permis la recherche de mutants meilleurs producteurs de protéases ; ceux-ci sont détectés par l'apparition d'un halo d'hydrolyse d'un diamètre nettement supérieur à la moyenne de ceux observés autour des colonies de la souche de départ. Un mutant, appelé NC18, caractérisé par un halo d'hydrolyse très significativement augmenté, a fté isolé. A partir de la souche NC18, une deuxième étape de sélection a été éffectuée, après mutagénèse par la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) sur le milieu mentionné ci-dessus auquel a été rajouté de l'hydrolysat acide de caséine (Biokar) à la concentration de 5 g/l.Dans ces conditions, la production de protéases par la souche NC18 est reprimée, ce qui se traduit par une diminution très nette de la taille des halos d'hydrolyse. Une colonie entourée d'un large halo a été sélectionnée le mutant ainsi isolé, NC21 a fait l'objet d'une nouvelle étape de sélection après mutagénèse par l'éthyl-méthane sulfonate (EMS) sur le milieu à base de poudre de lait, auquel du sulfate d'ammonium à la concentration de 5 gll a été ajouté comme répresseur de la production de protéases. Un mutant dé-réprimé, NC28, a ainsi été isolé.A partir de cette dernière souche, un mutant hyperproducteur d'activité chitinolytique a été recherché, après mutagénèse par l'acide nitreux, sur le milieu de base précédemment décrit, où la poudre de lait a été remplacée par de la chitine colloldale à la concentration de 10 g/l. Un mutant hyperchitinolytique, NC35, sélectionné sur la base de la taille du halo d'hydrolyse de la chitine, a été soumis à une nouvelle étape de sélection sur le même milieu à base de chitine, contenant en plus 10 g/l de glucose comme répresseur. Une souche mutante isolée sur ce milieu, NC39 a été retenue. Cette souche s'est révélée hyperexcrétrice de protéines : des concentrations de l'ordre de 10 g/l de protéines ont été obtenues en 6 jours de fermentation, dans un milieu chimiquement défini (milieu salin de base selon MANDELS et WEBER, J. Adv. Chem. Ser., 1969, 95 : 391) contenant du glucose (ajouté en continu à raison de 20 gil par jour) comme seule source de carbone. Dans les mêmes conditions, la souche sauvage NC14 produit environ 0,5 g/l de protéines extracellulaires. Cette aptitude exceptionnelle de la souche NC39 à excréter des protéines dans des conditions et un milieu de culture extrêmement simples, qui constitue un des aspects de la présente invention, a conduit à envisager de l'utiliser pour la production de protéines hétérologues. Cependant, dans cette optique, la forte activité protéolytique des souches constitue un inconvénient. Aussi à partir de la souche NC39, des mutants déficients en protéases ont été recherchés. Après mutagénèse à la NTG, puis à l'EMS, des colonies ne produisant pas de halo d'hydrolyse sur milieu à base de poudre de lait additionné de glucose (2 g/l) et de sulfate d'ammonium (0,5 g/l) ont été sélectionnées en deux étapes. La souche NC46 ainsi isolée se caractérise par l'absence d'activité protéolytique détectable par le test à l'azocaséine (TOMARELLI et al., J. Lab. Clin.Med., 1949, 34 428) dans le surnageant de culture, dans les conditions de production de protéines extracellulaires mentionnées plus haut et décrites dans l'exemple II ci-après. Cette souche NC46 a été soumise à un nouveau traitement mutagène par l'acide nitreux, puis des mutants déficients en activité amino peptidase ont été recherchés selon une modification de la technique décrite par MILLER et MACKINNON (J. Bact., 1974, 120 355) : après croissance 4 jours sur le milieu à base de poudre de lait décrit ci-dessus, les colonies sont recouvertes d'une solution contenant : 0,5 mg/ml de L. Leucine-ss-natphtylamide et 2 mg/ml de Fast Garnet GBC (Sigma). La présence d'activité aminopeptidase est visualisée par l'apparition, après quelques minutes, d'une coloration brune autour des colonies.Les colonies ne produisant pas de coloration sont récupérées et re-testées, selon le meme protocole. Un mutant isolé par cette technique, NC50, ne présente plus l'activité Leucine aminopeptidase détectée dans le surnageant des cultures des souches NC46 et des générations précédentes. La généalogie de la souche NC50 est résumée sur le tableau 1. La souche mutante NC50 possède les mêmes capacités d'excrétion de protéines du point de vue quantitatif, que la souche hyperexcrétrice NC39 mentionnée ci-dessus. Un avantage supplémentaire de la souche NC50 réside dans l'absence d'activité protéolytique détectable dans les surnageants de culture, ce qui permet d'éviter ou tout au moins de minimiser la dégradation- des protéines produites, et particulièrement des protéines hétérologues, dans le milieu de fermentation. Ceci constitue un aspect important de la présente invention. Un autre aspect est constitué par la mise en évidence de la capacité des souches NCî4 et dérivées à être transformées selon un protocole simplifié, original par rapport à ceux mentionnés Tableau 1 : Généalogie des souches mutantes dérivées de Tolypocladium geodes NC14 I I I I I Etape Agent Phénotype Milieu de Souche n mutagène recherché sélection isolée I I I I I I I I ~~~~~ I ~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~ I ~~~~~ I I I I I I 1 UV Hyperproducteur Lait écrémé NC18 I I de protéases I I I I I I I I 1 2 | NTG I Protéases dé- | Lait écrémé + I NC21 I I I I réprimées I hydrolysat de caséine I I I I I | 5 g/l I I I I I I 3 3 | EMS I Protéases dé- | Lait écrémé + I NC28 I I I I réprimées | sulfate d'ammonium I I g I I | 5 g/l I I I I I | 4 I | HN03 I Hyperproducteur I Chitine colloidale I NC35 I I I I de chitinases I I I I I I I I 1 5 i UV I Chitinases dé- I Chitine colloidale + I NC39 | I I | réprimées I glucose 10 g/l I I I I I I j 6 6 | NTG i Protéases j Lait écrémé j NC41 j I I I déficientes I I I I I I I I I 7 7 | EMS 1 Protéases j Lait écrémé | NC46 l I I | déficientes | I I I I I I | I I 8 8 | HN03 I Aminopeptidase j Lait écrémé + test j NC50 | I I I déficiente I L-leucine-ss-naphtyl- I I amide antérieurement pour d'autres champignons comme Aspergillus nidulans (BALLANCE et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 1983, 112 : 284) ou Trichoderma reesei (KNOWLES et al., Brevet Européen nO EP 0244234 A2, 1987). L'originalité du protocole réside en particulier dans le fait qu'il ne fait pas appel à l'utilisation de protoplastes, dont la formation et la régénération constituent souvent une étape fastidieuse dans la mise au point d'un protocole de transformation.Dans le cas de la souche NC14 et de ses dérivés, il a été trouvé que de l'ADN étranger pouvait être introduit, avec une fréquence élevée, dans des spores traitées de façon ménagée avec une enzyme lytique de telle sorte que leur résistance à la pression osmotique et leur capacité de germination ne soient pas altérées. La mise au point du protocole de transformation a été effectuée en utilisant un ADN plasmidique portant un marqueur dominant sélectionable : un gène conférant la résistance à la phléomycine (ARMAU et al., Brevet Français, nc 2 569 723. Ce protocole est décrit dans l'exemple I ci-après. Selon la présente invention, les éléments assurant l'expression de ladite séquence d'ADN dans la souche comprennent essentiellement une séquence promotrice d'un gène d'origine fongique. Cette séquence d'ADN codant pour ladite protéine sera précédée d'une séquence signal assurant l'excrétion de la protéine et suivie d'une séquence terminateur de transcription. un aspect supplementaire de la présente invention est constituée par la possibilité de sélectionner des souches transformées pour lesquelles l'expression du gène d'intérêt est amplifié, grâce à un crible de sélection basé sur l'utilisation d'un gène conscituant un marqueur dominant, placé en aval du gène d'intérêt, sans promoteur ni signai d'arrêt de transcription entre les deux gènes. Cette technique est illustrée dans l'exemple V ci-après Ce gène constituant le marqueur code pour la résistance à un antibiotique qui est de préférence un composé de la famille des phléomycines. Dans le cas d'un gène codant pour la résistance à un antibiotique de la famille des phléomycines, ce gène est d'origine génomique et provient du génome des actinomycètes producteur dudit antibiotique. La séquence d'ADN codant pour ladite protéine ainsi que les éléments assurant l'expression de ladite séquence seront portés par un plasmide qui de préférence est un plasmide à réplication autonome comportant une séquence de réplication autonome efficace chez Tolypocladium T.A.R.S. Selon l'invention, ledit plasmide assure l'intégration chromosomique des séquences d'ADN en cause. En résumé, la présente invention concerne une nouvelle souche de champignon filamenteux, Tolypocladium geodes NCI4, et les mutants issus de cette souche, sélectionnés pour leur capacité à excréter de grandes quantités de protéines dans un milieu de culture extrêmement simple, constitué essentiellement de sucres et de sels minéraux, ce qui facilite l'extraction et la purification desdites protéines. Cette capacité exceptionnelle peut être exploitée pour la production de protéines recombinantes ce qui constitue un premier aspect de la présente invention. Selon un deuxième aspect, la présente invention fournit un moyen de préserver la stabilité des protéines excrétées dans le milieu de culture par l'utilisation de mutants déficients en activités protéolytiques. Selon un troisième aspect, la présente invention fournit un moyen d'introduire des gènes hétérologues dans la souche de Tolypocladium geodes NCl4 et ses dérivés selon un protocole simplifié ne faisant pas intervenir les protoplastes. Selon un quatrième aspect de la présente invention, l'expression des gènes hétérologues par Tolypocladium geodes NC14 et ses dérivés peut être augmentée par une technique de sélection faisant appel à un marqueur dominant placé en aval du gène d'intérêt sans promoteur ni terminateur entre les deux gènes. La présente invention se rapporte également aux protéines obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Parmi ces protéines codées selon l'invention, on citera plus particulièrement la pullulanase, le lysozyme humain et la protéine Sh, la séquence nucléotidique de cette protéine Sh étant représentée en figure 2. La présente invention concerne de même les souches de Tolypocladium transformées, obtenues lors du procédé de production de protéines recombinantes. Les exemples suivants servent à illustrer la présente invention de manière non limitative. Ces exemples seront décrits en se référant aux figures sur lesquelles - la figure I est un schéma du plasmide pUT720 - la figure 2 représente la séquence nucléotidique du gène de la protéine Sh précédé de la séquence synthétique utilisée comme signal d'excrétion - la figure 3 est un schéma du plasmide pUT715 - la figure 4 est un schéma du plasmide pUT771 - la figure 5 représente la séquence nucléotidique de la partie promotrice du plasmide pUT771 - la figure 6 est un schéma du plasmide pUT760 - la figure 7 représente la séquence nucléotidique synthétique codant pour le lysozyme humain - la figure 8 est un schéma du plasmide pUT772 Les abréviations utilisées sur ces figures sont considérées comme connues ou seront explicitées dans la description. Sauf indication contraire, les différents procédés et produits mentionnés sont mis en oeuvre selon les techniques connues et/ou préconisées par le fabricant. Exemple I : Transformation de Tolypocladium geodes La souche mutante NC50, déficiente en activités protéolytiques, a été transformée par le plasmide pUT703 (DURAND et al, Proc. Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, JP Aubert Ed., Academic Press, 1988, p 136). Ce plasmide se caractérise par la présence d'un gène de résistance aux antibiotiques de la famille des phléomycines (ARMAU et al., Brevet Français, n 2 569 723 placé sous la dépendance d'un promoteur fongique : le promoteur du gène de la glyceraldéhyde 3-phosphate deshydrogénase d'Aspergillus nidulans (noté promoteur gpd) (Van GORCOM et al., Gene, 1986, 48 211) et borné en aval par le terminateur CYCl de levure (SMITH et al., Cell, 1979, 16 : 753).Le gène de résistance provient d'un actinomycete producteur d'antibiotiques de la famille des phléomycines : Streptoalloteichus hindustanus. La protéine codée par ce gène, appelée protéine Sh, inactive les antibiotiques en question par formation d'un complexe équimoléculaire (GATIGNOL et al., FEBS Letters, 1988, 230 : 171). La phléomycine et les antibiotiques apparentés présentent wne toxicité élevée pour Tolypocladium geodes comme pour pratiquement tous les organismes vivants. Le gène de résistance fournit donc un moyen facile de sélectionner les clones transformés par leur capacité à se développer en présence de phléomycine. Le protocole utilisé pour la transformation est le suivant : des spores obtenues par culture de la souche NC50 sur milieu PDA pendant 7 jours à 270C sont suspendues dans du milieu MnP de composition suivante : nilieu salin de base selon Mandels additionné de saccharose 100 g/l, tampon MES 5 g/l, pH 5.5. Après filtration sur verre fritté n02 pour éliminer le mycélium, la suspension est centrifugée (10 min, 10000 rpm) et le culot est repris par le même milieu MnP additionné de Caylase C3 (enzyme lytique commercialisée par CAYLA) à 10 mg/ml. Après 4 heures d'incubation sur table agitée à 320C, 100 rpm la suspension est à nouveau centrifugée, et le culot est repris par du milieu MnP additionné de chlorure de calcium, 50 mM, dans un volume tel que le titre de la suspension de spores obtenue, déterminé par comptage microscopique à l'hématimètre, soit d'environ 108/ml. A 200 > 11 de cette suspension, une solution d'ADN plasmidique (5 a 10 pg d'ADN dans un volume de 5 à ~20vul) est ajoutée. Après 10 minutes à température ambiante, on ajoute 50 l de solution MPC (MOPS 10 mM pH 5,8, PEG 6000 60% p.v., CaC12 75 mM) et on incube le mélange 30 minutes dans la glace, puis on rajoute 2,5 ml de MPC. Après 15 minutes à température ambiante, des aliquots de 0,5 ml de ce mélange sont introduits dans des tubes contenant chacun 3 ml de gélose molle MnR (milieu salin selon Mandels additionné de saccharose 150 g/l, glucose 2,5 g/l, extrait de levure 2,5 g/l, agar 6 g/l) maintenu en surfusion à 45 C. Le contenu de chaque tube est ensuite versé à la surface d'une botte de Pétri contenant le même milieu MnR, gélosé à 15 g/l et additionné de 30 ug/ml de phléomycine (commercialisée par CAYLA) comme agent de sélection des clones transformants. Ceux-ci apparaissent sous la forme de petites colonies après 4 jours d'incubation à 270C. Les taux de transformation obtenus en utilisant le plasmide pUT703 ont été de l'ordre de 2000 à 5000 transformants par microgramme d' ADN. La stabilité des transformants a été testée par repiquage des colonies sur milieu PDA contenant 30 Fg/ml de phléomycine (la concentration minimale inhibitrice - CMI - pour la souche NC50 non transformée est d'environ 10 ug/ml dans ces conditions). Environ 90% des colonies repiquées ont confirmé leur caractère de résistance. Des expériences d'hybridation de l'ADN des souches transformées par une sonde marquée correspondant à une partie du gène de résistance à la phléomycine ont montré que ce gène était intégré dans le chromosome des transformants ; le ou les sites d'intégration et le nombre de copies varient d'une souche à l'autre. Exemple II : Expression et excrétion d'une protéine hétérologue Dans l'exemple I ci-dessus, l'obtention de clones transformants résistants à la phléomycine indique que le gène codant pour la protéine Sh s'exprime dans la souche NC50 de Tolypocladium geodes. Cependant, la protéine n'a pas pu être mise en évidence dans les surnageants de culture des souches transformées et n'est donc vraisemblablement pas excrétée en quantité détectable. Dans l'exemple suivant, la souche NC50 a été transformée selon le protocole décrit dans l'exemple I, en -utilisant le plasmide pUT720 dont la carte est représentée sur la figure 1. Ce plasmide se caractérise par la présence, sous la dépendance du promoteur gpd, du gène de la protéine Sh en amont duquel a été ajoutée une séquence signal synthétique d'excrétion (figure 2). Parmi les colonies résistantes, obtenues avec une fréquence de 3000 transformants par microgramme d'ADN, une centaine ont été repiquées sur des boîtes de PDA contenant des concentrations croissantes de phléomycine, de 25 à 1000 g/ml. 3 souches résistantes à plus de 1000 g/ml de phléomycine ont ainsi été sélectionnées ; l'une d'elles a été cultivée en fermenteur de laboratoire dans les conditions suivantes : les spores provenant d'une boite de PDA incubée 7 jours à 270C ont servi à inoculer 500 ml de milieu selon Mandels contenant 20 g/l de glucose et 1 g/l d'extrait de levure, réparti dans deux erlenmeyers de 1 1. Après incubation 48 h sur table agitée à 270C, 200 rpm, cette culture a permis d'inoculer un fermenteur de 14 litres de volume total (Chemap) contenant 8 litres du même milieu.La fermentation a duré 6 jours à 270C avec une agitation de 500 rpm et une aération de 0,5 v.v.m, le pH étant régulé supérieur à 5.0 avec de l'ammoniaque. A partir du 2ème jour, une solution stérile de glucose à 200 g/l a été introduite en continu à raison de 0,8 litres par 24 h, soit environ 20 grammes de glucose par litre et par jour. Après 6 jours, la culture a été récoltée et centrifugée. La concentration totale en protéines, déterminée selon la méthode de LOWRY (LOWRY et al., J. Biol. Chem., 1951, 193 : 265) a été trouvée égale à 9,6 g/l. La présence de protéine Sh dans le milieu de culture a été mise en évidence par chromatographie (FPLC > sur colonne échangeuse d'anions MonoQ, Pharmacia (tampon Tris-Hcl 20 mM pH 7,0 - elution gracient linéaire û - 0.6 W NaCl). En cuaparaison avcc le surnageant d'une culture effectuée dans les mêmes conditions avec la souche non transformée, on constate l'apparition d'un pic supplémentaire de protéines fortement retenues sur la colonne MonoQ, élué à 0,45 M. L'aire de ce pic représente environ 20% de l'aire totale du chromatogramme.L'analyse en électrophorèse SDS-PAGE, des fractions correspondant à ce pic a révélé la présence à l'état pratiquement pur d'une protéine d'environ 14000 kd de poids moléculaire, ce qui correspond à la taille de la protéine Sh (GATIGNOL et al., FEBS Letters, 1988, 230 : 171). La présence dans le surnageant de culture de protéine inactivant la phléomycine a été confirmée par le test suivant : sur des disques de papier imprégnés de solution de phléomycine à différentes concentrations (de 10 à 300 pg/ml) différents volumes de surnageant de culture (de 1 à 50 pl) sont déposés. Les disques sont ensuite posés à la surface d'un milieu gélosé (milieu n02 pour l'essai des antibiotiques, BioMérieux) ensemencé par une souche d'Escherichia coli sensible à la phléomycine : HBlOl. Après une nuit d'incubation'à 370C, des halos d'inhibition du voile bactérien sont visibles autour des disques contenant la phléomycine seule.Lorsque des quantités connues de protéine Sh purifiée sont ajoutées, on constate une diminution du diamètre des halos, et une disparition totale de ceux-ci pour un rapport en moles protéines/antibiotiques de 1/1 soit environ 10/1 en poids. Ce test permet donc un dosage semi-quantitatif de la protéine Sh dans une solution de concentration inconnue. Dans le présent exemple, la concentration de protéine Sh dans le surnageant de culture a été trouvée voisine de 2 g/l. Il a donc été possible par fermentation d'un transformant de la souche de Tolypocladium geodes NC50 par le plasmide pUT720 de produire environ 2 g/l de protéine recombinante extracellulaire en 6 jours. Exemple III : Isolement d'une séquence promotrice Le plasmide pUT715, dont la carte est présentée sur la figure 3 a été utilisé comme vecteur-sonde pour la recherche de séquences promotrices fongiques. Le plasmide a été linéarisé par double coupure BamHI-AsuII (les deux sites uniques de restriction sont situés dans la séquence multisites située immédiatement en amont de la partie codante du gène Sh). Après purification par électroélution, le grand fragment a été mis en présence d'ADN chromosomique de Trichoderma reesei partiellement digérée par les enzymes MboI et TaqI pour générer des fragments compris entre 1 et 5 kilobases et d'ADN ligase. La population de plasmides hybrides ainsi obtenue a servi à transformer la souche d'Escherichia coli DH5 a , avec sélection sur la base de la résistance à l'ampicilline. L'ADN plasmidique extrait du "pool" des transformants d'E.coli a servi à transformer la souche NCl4 de T.geodes selon le protocole décrit dans l'exemple I ci-dessus. 50 transformants fortement résistants à la phléomycine (CMI > 250 Fg/ml) ont été sélectionnés et répartis en 10 groupes de 5 clones. L'ADN de chaque groupe a été extrait, digéré par l'enzyme BstEII et soumis à ligation. Avec chaque préparation une transformation de E.coli DH5 a a été effectuée. L'ADN plasmidique de 6 colonies d'E.coli résultant de chaque transformation soit 60 transformants au total a été analysé individuellement par électrophorèse en gel d'agarose après micro-extraction. 7 plasmides de tailles différentes et supérieures à celle du vecteur pUT715 ont été choisis. Chacun de ces plasmides, extrait de la souche d'E.coli correspondante, a servi à transformer T.geodes NC14. L'une des transformations a conduit à l'apparition de clones fortement résistants à la phléomycine (CMI > 250 Fg/ml) avec une fréquence de l'ordre de 5000 transformants par microgramme d'ADN. Pour deux autres transformations, la fréquence et le niveau de résistance des transformants ont été trouvées beaucoup plus faibles (quelques transformants/ug, CMI Le plasmide ayant permis la transformation de T.geodes la plus efficace appelée pUT771, a été analysé, il comporte une insertion d'une taille d'environ 1,8 kb ; la cartographie de pUT771 est représentée sur la figure 4. La séquence nucléotidique de la partie promotrice est représentée sur la figure 5. Au cours d'expériences comparatives, le plasmide pUT771 a toujours conduit à des taux de transformation supérieurs d'un facteur deux environ à ceux obtenus dans les mêmes conditions avec pUT703. Exemple IV : Co-transformation de T.geodes avec un plasmide portant le marqueur de résistance à la phléomycine et un plasmide portant un gène non sélectionable. Une expérience de transformation a été réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple I ci-dessus, avec un mélange contenant environ 1 ug d'ADN plasmidique de pUT771 décrit dans l'exemple II et 10 ug d'ADN plasmidique de pUT760, dont la carte est représentée sur la figure 6. Le plasmide pUT760 se caractérise par la présence du gène de Klebsiella pneumoniae ATCC 15050 codant pour la pullulanase mature (MICRAELIS et al., J. Bact., 1985, 164 : 633), sous la dépendance du promoteur gpd d'Aspergillus nidulans et précédé par la séquence signal synthétique décrite dans l'exemple I (figure 2). Environ 500 transformants sélectionnés sur la base de la résistance à la phléomycine ont été repiqués individuellement d'une part sur un milieu PDA contenant 30 > ig/ml de phléomycine et d'autre part sur un milieu gélosé contenant : glucose 5 g/l, sulfate d'ammonium 1 g/l, phosphate monopotassique 2 g/l, sulfate de magnésium 0,3 g/l, chlorure de calcium 0,2 g/l, extrait de levure 1 g/l, pullulane.(Sigma) 10 g/l, agar 15 g/l. Après 7 jours d'incubation à 270C, la surface de ce dernier milieu a été recouverte d'alcool éthylique, et les boites de pétri ont été placées à -20 C pendant une heure. A cette température et en présence d'alcool, le pullulane précipite, rendant le milieu opaque.Environ 2% des colonies testées étaient entourées d'un halo clair plus ou moins large, dû vraisemblablement à l'hydrolyse du pullulane. Aucun halo n'a été détecté autour des colonies de la souche NC50 non transformée testées dans les mêmes conditions. Les 10 clones transformants semblant présenter la plus forte activité pullulanase, c'est à dire ceux correspondant aux colonies entourées des halos les plus larges ont été récupérés sur le milieu PDA-phléomycine et cultivés en fioles agitées dans le milieu selon Mandels additionné de glucose 30 g/l, extrait de levure 1 g/l et tamponné par le phtalate de potassium à 5 g/l. Après 5 jours d'incubation à 270C, 200 rpm, les cultures ont été centrifugées et l'activité pullulanase a été dosée dans les surnageants selon le protocole suivant : à 0,5 ml d'une solution de pullulane à 10 g/l dans du tampon acétate 0,1 M pH 5,5, on ajoute 0,5 ml de solution enzymatique (surnageant eventuellement dilué dans le même tampon). Après incubation 60 min. à 550 C, le glucose libéré est dosé par la méthode de MILLER (Analytical Chem., 1959, 31 : 426). L'activité est exprimée en unités internationales (u.i) correspondant au nombre de micromoles de glucose libérées par minute. Dans les surnageants des 10 cultures testées, des activités pullulanase de 12 u.i/ml à 350 u.i/ml ont été trouvées. Aucune activité n'a été détectée dans les surnageants de la souche non transformée cultivée dans les mêmes conditions. Exemple V Cet exemple est destiné à illustrer la possibilité de sélectionner préférentiellement des clones recombinants de T.geodes NC14 et de ses dérivés qui soient fortement producteurs d'une protéine hétérologue grâce à des constructions plasmidiques faisant appel au principe de la transcription polycistronique. L'expression de plusieurs gènes adjacents sous la dépendance du même promoteur et par l'intermédiaire du même ARN messager, dit polycistronique, est un phénomène bien connu chez les bactéries. En revanche, il est généralement admis que ce phénomène n'existe pas chez les eucaryotes. Cependant, il a été fait état récemment (KAUFMAN et al., EMBO J., 1987, 6 : 187) d'une expression par des cellules animales en culture du gène de la dihydrofolate réductase permettant la résistance au méthotrexate, dans des constructions où ledit gène était placé immédiatement en aval d'un autre gène non sélectionable, ce dernier étant précédé d'un promoteur. Ceci permet une sélection indirecte des clones exprimant fortement le gène non sélectionable sur la base du niveau de résistance conféré par le gène placé en aval. I1 a été montré par les auteurs de la présente invention que ce principe pouvait s'appliquer à T.geodes, en utilisant par exemple comme marqueur sélectionable le gène Sh de résistance à la phléomycine. Un gène synthétique pour le lysozyme humain a été préparé par assemblage de 10 oligonucléotides de synthèse. La séquence représentée dans la figure 7 comporte 14 paires de base précédant le codon d'initiation, suivi de 18 codons débutant par un ATG correspondant aux acides aminés du peptides signal du lysozyme humain à l'exception du 17ème codon (remplacement de la glutamine par une leucine) (CHUNG, KESHAU et GORDON, Proc. Natl. Acad. Sci. 1988, 85 6227) puis 130 codons des acides aminés du lysozyme humain (JOLLES et JOLLES, Mol. Cell. Biochem., 1984, 63, 165) et enfin un codon stop suivi de 6 paires de bases. Le fragment d'ADN bordé par les sites de restriction EcoRV-BamHI a été cloné au site EcoRV du plasmide pUT771 mentionné dans l'exemple Il pour donner dans l'une des 2 orientations possibles, le plasmide pUT772 (figure 8). La souche NC50 de T.geodes a été transformée par le plasmide pUT772 selon le protocole décrit dans l'exemple I avec la seule différence que la sélection des transformants a été réalisée avec une concentration moindre de phléomycine (15 (15)lg/ml). Les colonies obtenues avec une fréquence 50 à 100 fois moindre à celle fournie par 1'ADN pUT771 utilisé comme contrôle ont été repiquées sur milieu PDA et individuellement examinées pour le niveau de résistance à la phléomycine et vérifiée pour la production de lysozyme.La détermination des concentrations minimales inhibitrices de phléomycine des transformants par pUT772 a montré que les niveaux de résistances des clones étaient faibles (2 à 10 fois la CMI par rapport à la souche non transformée) alors que les transformants par pUT771 étaient au contraire très élevés (30 à 200 fois la CMI). La production de lysozyme est vérifiée indirectement par la méthode des cyclindres d'agar pour la production d'une activité lytique contre Micrococcus lysodeikticus sur PDA. Parmi 83 souches testées provenant de la transformation par pUT772, 61 produisaient une activité détectable par la présence d'une auréole d'inhibition autour des cylindres d'agar. En contraste aucune colonie issue de la transformation par pUT771 ne présentait cette activité (55 testées). Une analyse clonale a montré que le caractère de production était conservé pour 2/3 des souches positives après une étape de sporulation. La souche NC50 PUT772-28 sélectionnée parmi les souches les plus actives par le test sur boite a été plus particulièrement étudiée. Par cultures successives sur milieu solide PDA contenant des concentrations croissantes de phléomycine, un variant de la souche NC50/pUT772-28 a été sélectionné. Ce variant noté NC50/28R4 résiste à 100 Fg/ml de phléomycine alors que la concentration maximale de croissance pour le parent est de 20 pg/ml. Les auréoles d'inhibition sur un voile de Micrococcus lysodeikticus sont également supérieures pour la souche NC50/28R4 par comparaison au parent NC50/pUT772-28. Les deux souches ont été cultivées en fiole agitée dans les conditions décrites dans l'exemple IV. Après cinq jours d'incubation à 270C l'activité lysozyme a été déterminée par un dosage turbidimétrique à partir de cellules lyophilisées de Micrococcus lysodeikticus (SHUGAR, Biochim. Biophys., 1952, Acta 8 : 302). Les protéines des surnageants des cultures ont été fractionnées sur une colonne MonoS Pharmacia (tampon phosphate 50 mM pH7,2 - élution gradient linéaire de O à 1 M NaCl). Un pic protéique élevé à 0,25 M est présent dans les deux souches transformées et absent chez le parent NC50. Par le test d'activité biologique, identification immunologique avec une anticorps antilysozyme humain et électrophorèse en gel d'acrylamide, il a été vérifié par comparaison avec un échantillon authentique de lysozyme humain que les protéines éluées à 0,25 M renferment du lysozyme. Les concentrations finales dans les surnageants de culture ont été estimées à 25 > ig/l et 200 > ig/l de lysozyme recombinant respectivement pour les souches NC50 pUT772-28 et NC50-28R4. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de protéine recombinante à l'aide de champignons filamenteux, caractérisé en ce qu'on cultive sur un milieu approprié une souche du genre Tolypocladium dans laquelle on a introduit une séquence d'ADN codant pour ladite protéine placée sous le contrôle d'éléments assurant l'expression de ladite séquence dans ladite souche et en ce qu'on récupère ladite protéine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche est une souche de Tolypocladium geodes. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche est une souche de Tolypocladium geodes déposée sous le n" 1-880, le 29 juin 1989 à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes ou l'un de ses mutants déficients en activité protéasique et/ou hyperexcréteur de protéine exogène. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les éléments assurant l'expression comprennent essentiellement une séquence promotrice d'un gène d'origine fongique. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour ladite protéine est précédée d'une séquence signal assurant l'excrétion de la protéine. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour ladite protéine est suivie d'un gène marqueur sous le contrôle des mêmes éléments d'expression. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ce gène marqueur code pour la résistance à un antibiotique. 8. Procédé selon la revepidication 7, caractérisé en ce que l'antibiotique est un composé de la famille des phléomycines. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le gène codant pour la résistance à un antibiotique de la famille des phléomycines est d'origine génomique et provient du génome des actinomycètes producteur dudit antibiotique. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la protéine codée est choisie parmi la pullulanase et le lysozyme humain. 11. Procédé selon l'une des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que la séquence signal est la séquence signal synthétique figurant à la figure 2. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la séquence promotrice est la séquence promotrice figurant à la figure 5. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour ladite protéine est suivie d'une séquence terminateur de transcription. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour ladite protéine ainsi que les éléments assurant l'expression de ladite séquence sont portés par un plasmide. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit plasmide est un plasmide à réplication autonome comportant une séquence de réplication autonome efficace chez Tolypocladium : T-ARS. 16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que ledit plasmide assure l'intégration chromosomique des séquences d'ADN en cause. 17. Protéine obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications I à 16. 18. Protéine Sh caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 16. 19. Protéine Sh selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence d'acides aminés représentée en figure 2. 20. Souche de Tolypocladium obtenue au cours de la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications I à 16. 21. Souche de Tolypocladium déposée sous le n" 1-880 et ses mutants déficients en activité protéasique et/ou hyperexcréteur de protéine exogène.