Brevet FR2659330A1 — publié le 19910913

-1 - COMPOSES DIASTEREOISOMERES DERIVANT DE L'ACIDE TETRAHYDROFOLIQUE, PROCEDE DE PREPARATION ET UTILISATION DANS LA SYNTHESE DE DIASTEREOISOMERES 6 S ET 6 R DE FOLATES REDUITS DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation de composés diastéréoisomères dérivant de l'acide tétrahydrofolique Ces composés comprennent en tant que produits industriels (i) le mélange de diastéré- oisomères 6 P et 6 Q tels que définis ci-après (et répon- dant vraisemblablement aux formules III et respectivement IV données plus loin), dans le rapport molaire 6 P/6 Q d'environ 7/3, (ii) le diastéréoisomère 6 P pur et (iii) le diastéréoisomère 6 Q pur. L'invention concerne également l'utilisation desdits diastéréoisomères 6 P et 6 Q dans la synthèse de diastéréoisomères 6 S et 6 R de folates réduits tels que notamment les acides 5-CHO-( 65)-THF, -CHO-( 6 R)-THF, -Me-( 65)-THF, -Me-( 6 R)-THF, ,10-CH±( 6 R)-THF, 5,10-CH±( 6 S)-THF, et leurs sels. ABREVIATIONS Dans la présente description on a utilisé par commodité les abréviations suivantes: a) pour les folates réduits THF = acide 5,6,7,8-tétrahydrofolique -CHO-( 6 RS)-THF = acide ( 6 RS)-5-formyl5,6,7,8- tétrahydrofolique (ou acide folinique) -CHO-( 6 S)-THF = acide ( 6 S)-5-formyl-5,6,7,8-té- trahydrofolique (ou facteur de croissance du Leuconostoc citro- vorum), appartenant à la série de configuration dite "naturel- le",le sel de calcium de cet acide étant connu sous le nom de "leucovorine" -CHO-( 6 R)-THF = diastéréoisomère 6 R de l'acide folinique, appartenant à la série de configuration dite "non-naturelle" -Me-( 6 RS)THF = acide ( 6 RS)-5-méthyl-5,6,7,8- tétrahydrofolique -Me-( 6 S)-THF = acide ( 6 S)-5-méthyl-5,6,7,8-té- trahydrofolique,appartenant à la série de configuration dite "naturelle" -Me-( 6 R)-THF = acide ( 6 R)-5-méthyl5,6,7,8- tétrahydrofolique appartenant à la série de configuration dite "non-naturelle" l 5,10-CH±( 6 RS)-THFlX = sel de l'acide ( 6 RS)-N 5,N 10- méthényl-5,6,7,8-tétrahydro- folique (ou "anhydro-leucovori- ne") avec l'anion X- l 5,10-CH±( 6 R)-THFlX = sel de l'acide ( 6 R)-N 5,N 10- méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique avec l'anion X-, apparte- nant à la série de configuration dite "naturelle" l 5,10-CH±( 6 S)-THFlX- = sel de l'acide ( 6 S)-N 5,N 10- méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofoli- que avec l'anion X-, appartenant à la série de configuration dite "nonnaturelle" l 5,10-CH±( 6 RS)-THFlX-,HX = sel de l'acide ( 6 RS)-N 5,N 10- méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique avec l'anion X et l'acide HX l 5,10-CH±( 6 S)-THFlX-,HX = sel de l'acide ( 6 S)-N 5,N 10- méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique avec l'anion X et l'acide HX ,10- ,10- ,10- DMSO -CH 2-( 6 RS)-THF = acide ( 6 RS)-N 5,N 10-méthylène- ,6,7,8-tétrahydrofolique -CH 2-( 6 R)-THF = acide ( 6 R)-N 5,N 10-méthylène- ,6,7,8-tétrahydrofolique appar- tenant à la série de configura- tion dite "naturelle" -CH 2-( 6 S)-THF = acide ( 6 S)-N 5,N 10-méthylène- ,6,7,8-tétrahydrofolique appar- tenant à la série de configura- tion dite "non-naturelle" b) pour les autres abréviations = diméthylsulfoxyde -4 - FAB = bombardement atomique rapide (de l'anglais: "fast atomic bombard- ment") HPLC = chromatographie liquide haute performance H-TSA = acide ptoluènesulfonique MS = spectrométrie de masse MS(FAB) = spectrométrie de masse avec dis- positif de bombardement atomique rapide Py = pyridine RT = température ambiante ( 15-20 C) TSA = ion p-toluènesulfonate ART ANTERIEUR On sait que l'acide folinique commercial lou 5- CHO-( 6 RS)-THFl, qui répond aux nomenclatures d'acide ( 6 RS)-5-formyl-5, 6,7,8-tétrahydrofolique et d'acide ( 6 RS)-5-formyl-5,6,7,8tétrahydroptéroyl-L-glutamique et qui est notamment préparé avec son sel de calcium à partir de l'acide folique ou de l'acide N 5,N'0-méthényl- ,6,7,8-tétrahydrofolique lvoir par exemple les brevets CH-A-496 012 et GBA-1 560 372 l, est un mélange molaire 1/1 de deux diastéréoisomères qui diffèrent l'un de l'autre par leur configuration en C 6 (atome de carbone en position 6 du cycle ptéridinyle). On sait que le brevet britannique GB-A-1 560 372 envisage dans sa description (voir page 2, lignes 4-6) l'utilisation d'un complexe, sel interne ou zwitterion, de l'anhydro-leucovorine (composé de formule l 5,10-CH± -( 6 RS)-THFlX-) dans lequel l'un des ions carboxylate COO- du reste R p-benzoyl-(L)-glutamique a réagi avec la char- ge positive délocalisée sur les atomes N 5, C-2 et N -0 comme matière première dans la synthèse de l'acide ( 6 RS)- folinique et de son sel de calcium. On sait de l'article de J C FONTECILLA-CAMPS et al., J Am Chem Soc, 101, 614 ( 1979) que le diastéréo- isomère biologiquement actif de l'acide folinique est de configuration 6 S Il est rappelé que ce diastéréoisomère a été dénommé dans le passé "isomère naturel" par commodité en raison de son activité biologique, d'une part, et "acide ( 1,L)-folinique" o le terme " 1 " se réfère à la configuration en C 6 et le terme "L" à la configuration de la chaîne latérale acide glutamique, d'autre part. L'acide ( 6 RS)-folinique 5-CHO-( 6 RS)-THF est généralement et communément utilisé, avec son sel de cal- cium, en tant que moyen thérapeutique de "secours" chez les patients soumis à une chimiothérapie anti-cancer à base de méthotréxate et en tant que moyen augmentant l'inhibition de la thymidylate synthétase par les agents anti-cancéreux tels que les 5-fluorouracil et 5-fluoro- 2 '-désoxyuridine. On a longtemps pensé que le diastéréoisomère 6 R de l'acide folinique, dénommé par commodité "isomère non- naturel" (par opposition au 6 S biologiquement actif) était inactif; cependant il a été signalé lvoir F M. SIROTNAK et al, Biochem Pharm, 28, 2993 ( 1979); et J.K SATO et al, Proc Am Assoc Cancer Res, 25, 312 ( 1984) l que ledit diastéréoisomère 6 R est susceptible d'interférer avec le transport ou la polyglumatation du diastéréoisomère 6 S actif. Il existe en conséquence un besoin de mettre au point, en ce qui concerne l'acide folinique, une techni- que d'obtention du diastéréoisomère 6 S pur par séparation du mélange ( 6 RS) ou par synthèse stéréospécifique. Il se trouve que les techniques décrites par D B. COSULICH et al, J Am Chem Soc, 74, 4215 ( 1952) lpro- posant la séparation des stéréoisomères de l'acide folinique par cristallisation fractionnée de leurs sels de calcium dans l'eaul, d'une part, et par C TEMPLE et ai., Cancer Treatment Reports, 65, 1117 ( 1981) lproposant la séparation de l'acide ( 6 S)-folinique à partir du mélange ( 6 RS) par solubilisation différentielle des sels de calcium dans l'eaul, d'autre part, sont inefficaces dès lors qu'elles conduisent à un mélange de 65 et 6 R dans le rapport molaire 1/1. Pour isoler le ( 6 S)-folinate de calcium à partir du mélange ( 6 RS) une autre méthode a été préconisée dans la demande internationale PCT publiée WO-A-8808844 (EPROVA) qui est fondée sur la cristallisation préféren- tielle du ( 6 S)-folinate de calcium à partir d'un milieu alcalin aqueux contenant Ca 2 + en excès. On sait par ailleurs que d'autres folates réduits ont été obtenus sous une forme diastéréoisomériquement pure, soit à partir d'acides ( 6 S) et ( 6 R)-tétrahydrofo- liques préparés par voie enzymatique lvoir notamment F M. SIROTNAK et al, Biochem Pharm, 28, 2993 ( 1979) pré- cité; H C S WOOD et al, Chem and Biol of Pteridines, 533 ( 1983); P L CHELLO et al, Biochem Pharm, 31, 1527 ( 1982)l, soit encore par d'autres méthodes chimiques et chromatographiques longues et fastidieuses lvoir notamment B T KAUFMAN et al, J Biol Chem, 238, 1498 ( 1963); S B HORWITZ et al, J Med Chem, 12, 49 ( 1969); B V RAMASASTRY et al, J Biochem Biophys Res. Comm, 12, 478 ( 1963); J C WHITE et al, Chem and Biol. of Pteridines, 625 ( 1979); et J FEENEY et al, Biochemistry, 20, 1837 ( 1981)l; or il se trouve que toutes ces méthodes, qui conduisent à l'obtention de très petites quantités (de l'ordre du milligramme) de pro- duits qui n'ont pas été isolés sous forme de solides cristallisés ou qui ont été obtenus sous forme de poudre lyophilisée de pureté toujours inférieure ou égale à 80 %, ne sont pas satisfaisantes. De plus, il se trouve que les tentatives de réduire asymétriquement l'acide dihydrofolique par voie -7- chimique n'ont jamais été couronnées de succès lvoir L. REES et al, Tetrahedron, 42, 117 ( 1986)l. Le fait de disposer de quantités importantes de folates réduits diastéréoisomériquement purs permettrait de comparer et apprécier de façon claire les activités enzymatiques, biologiques et/ou thérapeutiques de chaque diastéréoisomère En effet, jusqu'à présent la plupart des expérimentations qui ont été entreprises ont été réalisées soit avec le mélange molaire 1/1 des diastéréoisomères soit avec le diastéréoisomère dit "naturel", les activités du diastéréoisomère dit "non- naturel" étant extrapolées à partir des valeurs obtenues à partir dudit mélange molaire 1/1 et dudit diastéréoisomère naturel lvoir notamment J A STRAW et al, Cancer Research, 41, 3936 ( 1981)l A la connaissance de la Demanderesse, les seuls isomères foliniques "non- naturels" avec lesquels des expérimentations ont été effectuées sont ceux de l'acide folinique et de l'acide NS-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, qui ont été obtenus in situ par déplétion (i e élimination ou inhibition) enzymatique de l'isomère "naturel" correspondant lvoir notamment J K SATO précitél. On connait enfin de EP-A-0 348 641 (date de pu- blication: 3 janvier 1990), deux méthodes (I et II) d'accès aux folates réduits ayant la configuration de la série dite "naturelle" Selon -la méthode I, on traite le sel complexe dénommé "(acide ( 6 RS)-5,10-méthényl-5,6,7,8- tétrahydofolique) chlorure, chlorhydrate, dihydrate" de formule abrégée: l 5,10-CH±( 6 RS)-THFlCl-,H Cl,2 H 20 au moyen d'un mélange HCOOH/HC 1 2 N pour obtenir par cristal- lisation le diastéréoisomère naturel répondant à la formule l 5,10-CH±( 6 R)-THFlCl-,H Cl. La méthode II, comprend les étapes suivantes: en premier lieu (selon l'exemple 5 1 de EP-A-0 348 641), (a) on solubilise ledit sel complexe précité, de formule l 5,10-CH±( 6 RS)-THFlCl-,HC 1,2 H 2 O, dans l'acide HCOOH, (b) on traite la solution résultante avec une résine échan- geuse d'anions lAMBERLITER IRA-68 l, (c) on évapore sous pression réduite l'éluat qui a été recueilli, puis (d) on traite le résidu d'évaporation, ainsi obtenu, avec Ac OH et Me OH, pour précipiter un produit dénommé sel interne de l'acide 5,10-CH-( 6 RS)-THF, puis en second lieu (selon l'exemple 11 de EP-A-0 348 641), on fait réagir ledit sel interne avec une solution aqueuse de HCOOH à 20 C sous agitation, il se forme un précipité et, par filtration, on recueille le sel interne de l'acide 5,10- CH-( 65)-THF avec une teneur en diastéréoisomère de forme 6 S de 73 %, (en répétant l'opération de précipitation on augmente la teneur en diastéréoisomère de forme 6 S jusqu'à 90 %); et, par traitement des filtrats combinés au moyen d'acétone, on précipite le sel interne de l'acide 5,10-CH-( 6 R)-THF à % de pureté. BUT DE L'INVENTION Selon l'invention on propose une nouvelle solu- tion technique permettant la synthèse des diastéréoiso- mères 6 R et 6 S de folates réduits pour satisfaire les besoins précités Cette nouvelle solution technique se différencie de la méthode II de EP-A0 348 641 rappelée ci-dessus notamment par le fait que le traitement avec la résine échangeuse d'anions puis le mélange Ac OH/Me OH est remplacé par la réaction de 5-CHO-( 6 RS)-THF ou de l 5,10- CH±( 6 RS)-THFlX avec l'acide HC 00 H à un p H se situant dans la gamme de 2,0 à 2,6. Cette nouvelle solution technique conduit à l'ob- tention de composés diastéréoisomériquement purs, définis ci-après, de configuration 6 P et 6 Q et répondant très vraisemblablement aux formules III et respectivement IV données ci-après Cette solution technique constitue une nouvelle source d'accès aux folates réduits, dès lors qu'elle permet notamment la préparation de composés dias- téréoisomériquement purs tels que les acides ( 65) et ( 6 R)-foliniques, ( 6 S) et ( 6 R)-N 5,N 10-méthylène-5,6,7,8- tétrahydrofoliques, ( 6 S) et ( 6 R)-N 5-méthyl-5,6,7,8-té- trahydrofoliques et leurs sels, à partir des dits dia- stéréoisomères de formules III et IV. OBJET DE L'INVENTION Selon l'un des aspects de l'invention, on préco- nise un procédé de préparation d'un composé dérivant de l'acide tétrahydrofolique et de ses diastéréoisomères, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: 1 ) la réaction d'un composé tétrahydrofolique choisi parmi l'ensemble constitué par (i) l'acide ( 6 RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule O CHO Il 9 10 N 5 î CH 27 NH R () H 2 NN dans laquelle R représente le reste p-benzoyl-(L)-gluta- mique de formule: / \ CO-NH-CH-COOA (XIII) CH 2-CH 2-COOA o A est H; et ses sels, et (ii) 1 ' acide N 5, Nl O-méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofoli- que de formule 0 l N-R O L N â H H 2 N H dans laquelle X est un anion et R est défini comme ci- dessus; avec HCOOH à un p H se situant dans la gamme de 2,0 à 2,6; et 2 ) la récupération du précipité, qui s'est for- mé, par filtration, d'une part, et du filtrat correspon- dant, d'autre part; 3 ) la séparation, à partir dudit précipité, d'un premier diastéréoisomère pur appartenant à la série de configuration non-naturelle, dénommé ci-après diastéréo- isomère 6 Q, et répondant très vraisemblablement à la formule IV, par recristallisation fractionnée; et, 4 ) si nécessaire, la séparation, à partir dudit filtrat, obtenu selon le stade 2 ) et/ou des filtrats de recristallisation selon le stade 3 ), d'un second dia- stéréoisomère pur appartenant à la série de configuration naturelle, dénommé ci-après diastéréoisomère 6 P, et répondant très vraisemblablement à la formule III. Selon ce procédé, on obtient au stade 2 ) un précipité de diastéréoisomères 6 Q et 6 P dans un rapport molaire 6 Q/6 P d'environ 7/3. Dans la formule II, la liaison en pointillés reliant les atomes d'azote N 5 et N 10 a pour but de signa- -11- ler que la charge positive est délocalisée sur les atomes N 5, C" et N 20. Suivant un autre aspect de l'invention, on propo- se en tant que produits industriels nouveaux lesdits diastéréoisomères 6 Q, 6 P et leurs mélanges, notamment le mélange molaire 7/3 précité Le diastéréoisomère 6 P appartient à la série dite naturelle en ce sens qu'il conduit aux diastéréoisomères de folates réduits tels que les 5-CHO- ( 6 S)-THF, 5,10-CH-( 6 R)-THF, 5,10-CH 2-( 6 R)-THF et 5-Me-( 6 S)-THF, et à leurs sels Le diastéréoisomère 6 Q appartient a la série dite nonnaturelle en ce sens qu'il conduit aux diastéréoisomères de folates réduits tels que les 5-CHO-( 6 R)-THF, 5,10-CH-( 6 S)-THF, 5,10-CH 2-( 65) -THF et 5-Me-( 6 R)-THF, et à leurs sels. Suivant encore un autre aspect de l'invention, on préconise l'utilisation desdits diastéréoisomères 6 P et 6 Q pour l'obtention des folates réduits diastéréoisoméri- quement purs des séries naturelle et non-naturelle. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les diastéréoisomères selon l'invention ont été désignés 6 P et 6 Q par commodité, car il n'a pas été possible de déterminer de façon directe leur configura- tion On a néanmoins de sérieuses raisons de présumer que le composé 6 P est de configuration 6 R et que le composé 6 Q est de configuration 6 S; on a également de sérieuses raisons de penser que ces diastéréoisomères sont des com- posés du type orthoamide et répondent aux formules III et IV, (même si dans l'état actuel des connaissances il s'a- girait d'hypothèses ne liant pas la Demanderesse). Comme indiqué ci-dessus, le diastéréoisomère 6 P appartenant à la série naturelle répond très vraisembla- blement à la formule: H O} N-R I:I N H// HN NN N H(II % N et le diastéréoisomère 6 Q répond très vraisemblablement à la formule: H 0 Q} N-R H La transformation des dérivés orthoamides 6 P et 6 Q en 5-CHO-THF, 5-MeTHF et 5,10-CH 2-THF, n'affecte pas la stéréochimie du centre C 6 Ainsi les diastéréoisomères appartenant à la série de configuration naturelle présentent une configuration spatiale en C 6 telle qu'illustrée notamment par les formules V, VII, VIII, et XI ci-après, d'une part, et les diastéréoisomères appartenant à la série de configuration non-naturelle présentent une configuration spatiale en C 6 telle qu'illustrée notamment par les formules VI, IX, X, et XII ci-après, d'autre part En revanche, la notation R ou S change à l'intérieur de chaque série eu égard aux règles de nommenclature; dans la série de configuration naturelle on passe du diastéréoisomère 6 S lpar exemple 5- -12- -13- CHO-( 6 S)-THF ou 5-Me-( 6 S)-THFl au diastéréoisomère 6 R lpar exemple 5,10-CH-( 6 R)-THF ou 5,10-CH 2-( 6 R)-THFl quand le squelette bicyclique du reste ptéridinyle devient tricyclique. Il est important que lors de la mise en oeuvre du stade 1 ) le p H du milieu réactionnel soit ajusté entre 2,0 et 2,6 Le réglage du p H à l'intérieur de cette gamme sera avantageusement effectué par addition de NH 3 ou NH 4 OH De préférence, au stade 1 ), le p H du milieu réac- tionnel sera compris entre 2,2 et 2,4 et plus avantageu- sement de l'ordre de 2,30-2,35. De façon également avantageuse, la réaction du stade 11) sera effectuée pendant au moins 0,25 h, à une température de 40 à 65 C, et mieux à une température de 45-60 'C. De façon pratique, le stade 10) selon l'invention sera mis en oeuvre suivant deux voies différentes: (a) II > III + IV (b) I > III + IV. Dans la voie (a), on incorpore directement l'ammoniac dans le mélange II + H 20/ HCOOH pour réguler le p H, la réaction étant effectuée à une température de -650 C, pendant au moins 0,25 h Dans la voie (b), l'on fait réagir le composé I avec un mélange H 20/HCOOH à 60- 65 C pendant au moins lh, refroidit le milieu réactionnel résultant à 40-45 e C, puis introduit l'ammoniac, la réac- tion se poursuivant ensuite à 40-450 C pendant au moins 0,25 h. Dans les deux voies, le mélange réactionnel donne par refroidissement à RT un précipité cristallin de couleur jaune brillant qui est pratiquement insoluble dans les solvants usuels. L'analyse élémentaire de ce précipité est en accord avec les structures III et IV; il s'agit d'un mélange d'orthoamides résultant (i) de l'énolisation du groupe oxo exocyclique (en position C 4 du squelette ptéridinyle) de la fonction lactame et (ii) d'une cyclisation par formation d'une liaison entre l'oxanion et l'atome de carbone en Cl' de la formule II. La structure orthoamide des composés de formules III et IV est également confirmé par les faits suivants: l'analyse par spectrométrie de masse SM(FAB) des com- posés de formules III et IV donne un spectre pratiquement identique à celle du précurseur de formule II et indique que la réaction II = III/IV traduit une conversion du type protonation/déprotonation; un échantillon du produit III/IV traité avec un excès d'acide p-toluènesulfonique ne se distingue pas du produit de formule II (ou du couple VII/IX) par analyse HPLC (sur colonne non-chirale). Selon l'invention, les cristallisations fraction- nées des stades 3 ) et 4 ) peuvent être remplacées par une chromatographie sur colonne pour séparation chirale. En pratique on préfère enrichir les teneurs respectives en diastéréoisomères de configuration naturelle et respectivement de configuration non-naturelle des compo- sés III et respectivement IV par cristallisation frac- tionnée, puis, si nécessaire, purifier chaque produit par HPLC sur colonne chirale. Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'anion X du composé de formule II sera un anion approprié, et pourra notamment être choisi parmi l'ensemble constitué par les ions F-, Cl-, Br-, I-, N 03-, 1/25042-, 1/3 P 043-, oxalate, p-toluènesulfonate, maléate, benzènesulfonate, méthanesulfonate, trifluoroacétate, et trichloroacétate. Les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent être convertis en composés V et respectivement VI par hydrolyse à 100 C à p H 7 et en leurs sels: o CH 2 NH R H CH 2 NH R Les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent être également utilisés pour la préparation des acides diastéréoisomériquement purs 5,10-CH 2-( 6 R)-THF de formule VIII et respectivement 5,10-CH 2-( 6 S)-THF de formule X, et de leurs sels, par conversion de III et IV en VII et respectivement IX, traitement ensuite avec Na BH 4 dans un solvant aprotique contenant de la pyridine, puis purification suivant l'enseignement de la demande de brevet suisse No 02 736/89 de la Demanderesse: Il _; - o W (VII) I-H H 2 H (V) et CHO H 2 H H (VI) et X (Ix) H d'une part, o (VIII) H et Il I-IN-R (x) H d'autre part. Dans la synthèse des composés de formules VIII et X, (ou encore de formules XI et XII), on peut, si cela est nécessaire, isoler les composés intermédiaires VII et respectivement IX Toutefois, une telle opération n'est pas essentielle, et la suite de la synthèse est générale- ment effectuée sans isoler ledit composé VII ou respecti- vement IX. De même les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent être utilisés pour la prépara- ration des acides diastéréoisomériquement purs 5-Me-( 65)- THF de formule XI et respectivement 5-Me-( 6 R)-THF de formule XII, et de leurs sels, par conversion en VII et respectivement IX, suivie d'une réduction avec Na BH 3 CN dans un solvant aprotique: *0 CH 3 Il N; 1jy 1 (XI) "Nf H 2 IN H et H 2 N N Les sels des diastéréoisomères de configuration naturelle de formules V, VIII et XI, d'une part, et de configuration non-naturelle de formules VI, X et XII, d'autre part, comprennent selon l'invention (i) les sels métalliques, notamment ceux des métaux alcalins et alca- 18 2659330 lino-terreux, tels que Na, K, Ca et Mg, et (ii) les sels d'addition obtenus avec les bases organiques, telles que en particulier les éthylamine, 2-(N,N-diméthylamino)étha- nol, 2-(N,N-diéthylamino)éthanol, morpholine, pipéridine et analogues. Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention est illustré par les schémas réactionnels suivants. SCHENA 1 (a) (b) O CHO IIC _ N 2--R I X î îI H 2 N H _H 20 H 30 +C 1 - N X_ H OH 2 N Kn le)HCOOH/H 20 /A H 2 )NH 40 H HCOOH/H 20 NH 4 +HC 00 H + H O j N-R O} OR H o le groupe A intervenant dans le reste R de la formule I est 1/2 Ca 2 +, le groupe A intervenant dans le reste R des formules II, III et IV est H, et le groupe X intervenant dans la formule II est C 1-. SCEHA 2 A/tampon Tris III Ca 2 + purif /cristall. A/tampon Tris O CHO 12 8 M H 2-O- o O IV Ca 2 + purif /cristall. (VI) R 21 o le groupe A intervenant dans le reste R des formules V et VI est 1/2 Ca 2 +,le groupe A intervenant dans le reste R des formules III et IV est H. (v) SCHEMA 3 o Il H-TSA/DMSO III X 7 VII H I Py/Na BH 4/DMSO Mg 2 + Ipurif /cristall. Il VIII H H-TSA/DMSO o IV fi-M 1 X- Ix H I Py/Na BH 4/DMSO Mg 2 + purif /cristall. H 2 Y H X j o le groupe A intervenant dans le reste R des formules VIII et X est 1/2 Mg 2 +,1 e groupe A intervenant dans le reste R des formules III, IV, VII et IX est H, et le rs j groupe X intervenant dans les formules VII et IX est l'ion p-toluènesulfonate (TSA-). SCHEMA 4 CH 3 Na BH 3 CN/DMSO I A VII > purif /cristall X N XI Ha N 2 XI 0 C 3 Na BH 3 CN/DMSO i 11 IX mta)ea J 2-î purif /cristall H 2 XII o le groupe A intervenant dans le reste R des formules VII, IX, XI et XII est H, et le groupe X intervenant dans les formules VII et IX est l'ion p-toluènesulfonate. D'autre avantages et caractéristiques de l'inven- tion seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. PREPARATION I Obtention de l'orthoamide de formule III (exemple 1) et de l'orthoamide de formule IV (exemple 2) Dans un mélange de 1200 ml d'eau et 270 ml d'acide formique, sous agitation à RT et sous atmosphère inerte (azote ou argon), on ajoute une quantité suffisan- te d'ammoniaque pour arriver à un p H de 2,3 On chauffe la solution résultante à 60 C et ajoute 15,41 g de l 5,10- CH±( 6 RS)-THFlX de formule II (o X = Cl obtenu selon le procédé décrit par C TEMPLE et al, J Med Chem, 22, 731, ( 1979) On maintient l'agitation jusqu'à dissolution totale des matières solides On filtre le milieu réactionnel et laisse reposer le filtrat à RT pendant 48 h Le précipité volumineux de couleur jaune brillant qui s'est formé est recueilli par filtration sur B Uttchner et lavé avec de l'eau puis de l'acétonitrile (les filtrats sont recueillis pour traitement ultérieur) et séché pendant 1 h sous pression réduite à 50 C On obtient 7,76 g (rendement: 54 %) du mélange d'orthoamides de formules III et IV. Pour déterminer le rapport molaire des deux dia- stéréoisomères, un échantillon du mélange ainsi obtenu est transformé en un mélange d'acides N 5-méthyl- tétrahydrofolique de formules XI et XII puis analysé par HPLC au moyen d'une colonne chirale RESOLVOSILR selon l'enseignement de K E CHOI et al Anal Bioch,168,pages 398-404 ( 1988) Dans ce but, 11 mg du mélange III/IV qui a été obtenu est mis en supension dans 1,5 ml d'une solution aqueuse d'acide p-toluènesulfonique à 18 g/l; on ajoute 6 mg de Na BH 3 CN en solution dans une faible quantité d'eau et agite le mélange résultant pendant 0,25 h à RT; on dilue ce mélange avec 7,5 volumes d'eau avant introduction dans le système HPLC On déduit (du rapport des diastéréoisomères XII/XI) que, dans ledit mélange, III/IV les deux diastéréoisomères sont dans un rapport molaire IV/III de 7/3. Par recristallisation répétée dudit mélange III/IV au moyen de H 20/HCOOH 6/1 v/v, on obtient 1,1 g (rendement: 15,4 %) d'orthoamide de formule IV diasté- réoisométriquement pur. On combine les liqueurs mères de la préparation du composé IV, les traite avec 190 ml d'eau et les laisse reposer à 4 C pendant 62 h On obtient un précipité jaune brillant que l'on isole par filtration, lave avec H 20 puis avec de l'acétonitrile, sèche sous pression réduite pendant 1 h à 500C On obtient ainsi 2,2 g d'un produit qui est constitué (selon analyse HPLC sur colonne RESOLVOSILR) d'un mélange III/IV dans un rapport molaire 96/4 La recristallisation de ce mélange est réalisée comme suit: à un mélange de 252 ml d'eau et de 57 ml de JCOOH sous agitation, à RT et sous atmosphère inerte, on ajoute une quantité suffisante de NH 40 H pour ajuster le p H à 2,3; on porte le mélange résultant à la température de 601 C puis ajoute ledit mélange III/IV 96/4; on agite jusqu'à dissolution complète; le milieu réactionnel résultant est ensuite filtré à chaud sur B Uchner, et on laisse le filtrat reposer à RT pendant 8 h puis à 41 C pendant 60 h; le solide jaune brillant qui a précipité est isolé par filtration, lavé avec de l'eau puis de l'acétonitrile et séché sous pression réduite pendant 1 h à 500 C pour donner 1,41 g (rendement: 20 %) de l'ortho- amide de formule III diastéréoisométriquement pur, comme cela est confirmé par analyse sur colonne RESOLVOSILR. PREPARATION Il Obtention de l'orthoamide de formule III (exemple 1) et de l'orthoamide de formule IV (exemple 2) à partir du sel de calcium de l'acide ( 6 RS)-folinique Dans un mélange de 464 ml d'eau et de 136 ml de HCOOH sous agitation à 55-601 C et sous atmosphère inerte dans un réacteur pourvu d'une électrode de p H, on introduit 18,9 g de folinate de calcium pentahydraté de formule I, et agite le mélange résultant à 55- 600 C pendant 1 h On refroidit ledit mélange à 450 C, ajuste le p H (apparent) à 2,35 en ajoutant goutte à goutte la quantité appropriée d'ammoniaque concentrée, et agite pendant une nuit à RT Le précipité jaune qui s'est formé est isolé par filtration, lavage à l'eau puis à l'acétone Par séchage sous pression réduite à 500 C pendant 1 h, on obtient 8,81 g d'un mélange IV/III dans un rapport molaire de 7/3 selon l'analyse sur colonne RESOLVOSILR précitée. Par recristallisation répétée de ce mélange au moyen de H 20/HCOOH 6/1 on obtient 1,32 g (rendement: 18,4 %) d'orthoamide de formule IV diastéréoisoméri- quement pur (confirmation par analyse HPLC comme indiqué ci-dessus). Analyse élémentaire pour C 20 H 21 N 706,4 H 20 théorie: C = 45,55 %; H = 5,54 %; N = 18,59 % trouvé: C = 45,91 %; H = 5,27 %; N = 18,45 % Spectre de masse MS(FAB) (matrice:thioglycérine; 8 ke V): 456 (m+,100), 412 ( 7,5) , 410 ( 9,1), 326 ( 10), 311 ( 7,0), 283 ( 11,6), 282 ( 21,2) On combine les liqueurs mères et les dilue avec 80 ml d'eau On refroidit à O C et agite à cette température sous atmosphère inerte pendant 24 h On recueille le précipité formé par filtration sur B Uchner, lave avec de l'eau puis de l'acétone et sèche sous pression réduite à 50 C On obtient 2,67 g d'un produit constitué de III/IV dans un rapport molaire de 98/2, selon l'analyse HPLC sur colonne RESOLVOSILR précitée. Par recristallisation selon le mode opératoire donné à la préparation I ci-dessus (pour l'obtention du composé III), on recueille 1,91 g (rendement: 23,9 %) du produit de formule III diastéréoisométriquement pur (confirmation par HPLC sur colonne RESOLVOSILR précitée) Analyse élémentaire pour C 20 H 21 N 706,HCOOH,1/2 H 20 théorie: C = 49,42 %; H = 4,74 %; N = 19,21 % trouvé: C = 49,45 %; H= 4,70 %; N = 19,45 % Spectre de masse MS(FAB) (matrice:thioglycérine; 8 ke V): 456 (m+,100), 412 ( 13, 3), 410 ( 10,8), 326 ( 13,3), 311 ( 10,4), 283 ( 13,7), 282 ( 24,1), 232 (-39,4) - PREPARATION III Obtention du sel de calcium de 5-CHO-( 65)-THF (exemple 3; formule V) Dans un mélange dégazé de 2 litres d'eau et de 20 ml de 2-mercaptoéthanol maintenu sous agitation à RT sous une atmosphère inerte dans un réacteur pourvu d'un condenseur de reflux et d'une électrode de p H, on introduit 80 g du diastéréoisomère III pur obtenu selon la préparation II ci-dessus, puis 100 ml d'une solution t O aqueuse de tris(hydroxyméthylamino) méthane 2 M On chauffe le mélange résultant à 45-50 C et maintient le p H à 7,3 par addition de la quantité nécessaire de la solution de tris(hydroxyméthylamino)méthane jusqu'à dissolution com- plète de la matière solide Le milieu résultant est porté au reflux pendant 4,5 h; on ajoute 3,3 g de noir de carbone à la solution chaude et poursuit l'agitation pendant 1 h tandis que l'on refroidit ledit milieu à RT. Après filtration du milieu réactionnel sur celite, on ajoute au fitrat 87 ml d'une solution aqueuse de Ca C 12 2 M et dilue lentement la solution résultante avec 3,6 litres de Et OH (à 94 %) On conserve ladite solution ainsi diluée pendant une nuit à O C, on recueille par filtration le précipité formé, le lave avec Et OH (à 94 %) puis Me CO Me Par séchage sous pression réduite à 50 C pendant 2 h, on obtient 79 g de ( 6 S)folinate de calcium brut Ce produit présente par HPLC une pureté de 96 %; par recristallisation répétée au moyen de H 20 et séchage sous pression réduite à 50 C, on obtient 43,5 g (rende- ment: 48,5 %) de ( 6 S)-folinate de calcium pur. Analyses teneur en H 20 (selon FISCHER): 15 % teneur en Ca: 8,11 Z (théorie: 7,84 %) pureté HPLC: 100 % test HPLC l contre l'étalon ( 6 RS) de la phama- copée USl: 99,5 % pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : 100 % spectre UV ( 20 mg/l dans Na OH 0,01 N): max = 282 nm (E = 30 060) Aj min = 242 nm rapport des 2 pic d'adsorption A 1/A 2 = 4,96 lOlD = -14, 6 ( c = 1 dans H 20) PREPARATION IV Obtention du sel de calcium de 5-CHO-( 6 R)-THF (exemple 4; formule VI) En procédant selon les modalités opératoires décrites à la préparation III ci-dessus, mais en remplaçant le diastéréoisomère de formule III par le diastéréoisomère de formule IV, on obtient le produit attendu. Analyses teneur en H 20 (selon FISCHER): 10,2 % pureté HPLC: 99 % test HPLC l contre l'étalon ( 6 RS) de la phama- copée USl: 95 % pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale): supérieure à 98 % spectre UV ( 20 mg/l dans Na OH 0,01 N): max = 282 nm ( = 28 350) min = 242 nm rapport des 2 pic d'adsorption A 1/A 2 = 4,25 lKlD = + 39,8 ( c = 1 dans H 20) PREPARATION V Obtention du sel de magnésium de 5,10-CH 2-( 65)-THF (exemple 5; formule X) On met en suspension 10 g du diastéréoisomère orthoamide de formule IV dans une solution de 4,18 g de H-TSA dans 130 ml de DMSO sec et agite à RT sous atmosphère inerte jusqu'à dissolution complète On ajoute à RT 44 ml de pyridine puis on ajoute lentement (pendant minutes) une solution de 880 mg de Na BH 4 dans 44 ml de DMSO Après avoir agité le mélange résultant à RT pendant une durée de 10 minutes on refroidit le milieu réactionnel au moyen d'un bain de glace et on le dilue goutte à goutte avec un litre de méthyléthylcétone On agite pendant 20 minutes à O C et recueille le précipité jaune formé par filtration; on lave ce précipité avec de l'acétone ( 2 fois) et le sèche sous pression réduite à C pendant 1 h pour obtenir 6,14 grammes de 5,10-CH 2- ( 6 S)-THF brut (probablement sous forme d'un sel mixte de Na+/pyridinium) Ce produit a une pureté apparente par HPLC de 87,2 % et contient environ 11 % de 5-Me-THF. On ajoute par portion ce produit brut à 80 ml d'eau contenant des traces de Na OH sous agitation à O C sous atmosphère inerte: pendant cette opération le p H est maintenu à environ 9,0 par addition le moment venu de Na OH 1 N On ajoute à la solution résultante 6,0 ml d'une solution aqueuse de Mg Cl 2 M, ce qui amène le p H à 8,4 On élimine la petite quantité d'insoluble par filtration sur celite Le filtrat résultant est agité à O C tout en étant dilué goutte à goutte avec 105 ml d'acétone; après agitation pendant 45 autres minutes à O C on recueille le précipité par filtration, le lave ( 2 fois) à l'acétone et le sèche sous pression réduite à 50 C pendant 1 h On obtient 3,9 g du sel de magnésium attendu de formule X. Analyses teneur en H 20 (selon FISCHER): 14 % pureté HPLC: 92,3 % (le produit contient 6 % de 5-Me-( 6 R)-THF) pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale): supérieure ou égale à 98 % spectre UV ( 20 mg/1 dans Na OH O,01 N): max = 296 nm (ú = 28 300) Amin = 244,5 nm rapport des 2 pic d'adsorption A 1/A 2 = 3,68 llD = -88,7 ( c = 1 dans H 20) PREPARATION VI Obtention du sel de magnésium de 5,10-CH 2-( 6 R)-THF (Exemple 6; formule VIII) Ce produit est obtenu selon des modalités opératoires analogues à celles décrites dans la préparation V à partir du diastéréoisomère orthoamide de formule III. Analyses teneur en H 20 (selon FISCHER): 14,0 % pureté HPLC: 95,7 % (le produit contient 3,6 % de 5-Me-( 65)-THF) pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale): égale à 99 % spectre UV ( 20 mg/l dans Na OH O,01 N): max = 296 nm (ú = 28 300) >min = 245 nm rapport des 2 pic d'adsorption A 1/A 2 = 4,11 lIlD = + 123,9 ( c = 1 dans H 20) PREPARATION VII Obtention de l'acide 5-Me-( 65)-THF (Exemple 7; formule XI) A une solution de 910 mg de H-TSA dans 53 ml d'eau, sous agitation à RT et sous atmosphère inerte, on ajoute 1,0 g du diastéréoisomère orthoamide de formule III On ajoute ensuite goutte à goutte une solution de 500 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 1 ml d'eau puis agite le mélange résultant pendant 5 h à RT; il se forme un précipité blanc que l'on isole par filtration, lave avec de l'eau froide, de l'éthanol puis de l'acétone, sèche sous pression réduite à 50 C pendant 1 h On obtient 923 mg de l'acide brut de formule XI. Ce produit brut est mis en suspension dans un mélange de 37 ml d'eau et 0,25 ml de 2-mercaptoëthanol. Le mélange résultant est agité à RT sous atmosphère inerte et on ajoute une quantité suffisante de Na OH IN pour obtenir une dissolution complète On filtre et acidifie le filtrat en ajoutant goutte à goutte HC 1 i N pour atteindre un p H de 3,5 Après agitation de la suspension résultante pendant 1 h à O C, on centrifuge, remet en suspension le solide d'abord dans de l'eau, puis dans de l'éthanol et enfin dans de l'acétone Après séchage sous pression réduite à 50 C pendant 1 h, on obtient 636 mg de l'acide de formule XI attendu. Analyses teneur en H 20 (selon FISCHER): 10 % pureté HPLC: 96,0 % pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale): égale à 100 % spectre UV ( 20 mg/l dans tampon phosphate 0,1 M; p H 6,5): Amax = 290 nm (C = 32 100) Amin = 245 nm rapport des 2 pic d'adsorption A 1/A 2 = 3,65 D = + 38, 00 ( c = 0,5 dans tampon phosphate O,1 M; p H 6,5) PREPARATION VIII Obtention de l'acide 5-Me-( 6 R)-THF (Exemple 8; formule XII) En procédant selon les modalités opératoires décrites à la préparation VII, mais en remplaçant le diastéréoisomère de formule III par le diastéréoisomère de formule IV, on obtient l'acide attendu de configu- ration non-naturelle. Analyses teneur en H 20 (selon FISCHER): 11,5 % pureté HPLC: 96,3 % pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale): égale à 100 % spectre UV ( 20 mg/l dans tampon phosphate 0,1 M; p H 6,5): A max = 290 nm ( = 32 500) Amin = 245 nm rapport des 2 pic d'adsorption A 1/A 2 = 3, 74 l"lD = -9,2 ( c = 0,5 dans tampon phosphate O,1 M; p H 6,5) UTILISATION TRERAP Eu TIQUE L'acide N 5,N 10-méthylène-( 6 S)-5,6,7,8- tétrahydrofolique de formule X et ses sels (notamment le sel de magnésium obtenu selon le procédé de la préparation V ci-dessus) sont des produits diastéréoiso- mériquement purs, appartenant à la série des folates réduits de configuration non-naturelle, et utiles en thérapeutique On a trouvé qu'ils inhibent la thymidylate synthétase et sont avantageusement destinés à un usage cytostatique en thérapeutique, notamment contre le can- cer. Selon l'invention, on préconise donc en tant que produits industriels nouveaux, l'acide 5,10-CH 2-( 65)-THF diastéréoisomériquement pur et ses sels diastéréoisoméri- quement purs. On préconise également l'utilisation d'une substance diastéréoisomériquement pure, choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide 5,10-CH 2-( 6 S)-THF, ses sels et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médicament inhibant la thymidylate synthétase destiné à un usage cytostatique en thérapeutique, notamment contre le can- cer. En variante, on préconise également l'utilisa- tion dans laquelle ( 1) ladite substance diastéréoisoméri- quement pure, choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide 5,10-CH 2-( 6 S)-THF, ses sels et leurs mélanges est associée avec ( 2) un agent antinéoplasme notamment choisi -31- parmi le 5-fluorouracil, la 5-fluoro2 '-désoxyuridine, le méthotréxate, le cisplatine et leurs mélanges. Dans cette dernière utilisation, ladite substance ( 1) et ledit agent ( 2) sont avantageusement présentés sous la forme d'une composition en association avec un excipient physiologiquement acceptable L'association ( 1) + ( 2) offre l'avantage de présenter dés effets syner- gétiques. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un composé dérivant de l'acide tétrahydrofolique et de ses diastéréoisomères, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: 1 ) la réaction d'un composé tétrahydrofolique choisi parmi l'ensemble constitué par (i) l'acide ( 6 RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule 0 CHO HM CH 27NH R (I) I-IN Hk N N H 2 H dans laquelle R représente le reste p-benzoyl-(L)-gluta- mique de formule: CO-NH-CH-COOA I (XIII) CH 2-CH 2-COOA o A est H; et ses sels, et (ii) le composé acide N 5, N 10-méthényl-5,6,7,8-tétra- hydrofolique de formule O O N-R N X (II) HN H 2 N dans laquelle X est un anion et R est défini comme ci- dessus; avec HCOOH, ladite réaction comportant la régulation du p H dans la gamme de 2,0 à 2,6; et 2 ) la récupération du précipité, qui s'est for- mé, par filtration, d'une part, et du filtrat correspon- dant, d'autre part; 3 ) la séparation, à partir dudit précipité, d'un premier diastéréoisomère pur appartenant à la série de configuration nonnaturelle; et, 4 ) si nécessaire, la séparation, à partir dudit filtrat, obtenu selon le stade 2 ) d'un second diastéré- oisomère pur appartenant à la série de configuration naturelle. 2 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le stade 1 ) comporte: (a) la réaction du composé de formule I ou de l'un de ses sels avec un mélange H 20/HCOOH, pendant au moins lh, à une température de 55- C, (b) le refroidissement du mélange résultant à 40- 45 C, et (c) la poursuite de la réaction à 40-45 C, pen- dant au moins 0,25 h, à un p H régulé à 2,0- 2,6. 3 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le stade 1 ) comporte: la réaction du composé de formule II avec un mélange H 20/HCOOH, pendant au moins 0,25 h, à une température de 55-65 C, à un p H régulé à 2,0-2,6. 4 Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1, 2 et 3, caractérisé ence que au, stade 1 ), le p H du milieu réactionnel est ajusté entre 2,0 et 2,6 par addition d'ammoniaque. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que au, stade 1 ), le p H du milieu réactionnel est ajusté entre 2,2 et 2,4. 6 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les séparations des stades 3 ) et 4 ) comportent des cristallisations fractionnées. 7 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le produit obtenu au stade 2 ) est un mélange dudit premier diastéréoisomère et dudit second diastéréo- isomère dans un rapport molaire d'environ 7/3. 8 Composé tétrahydrofolique caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé du stade 4 ) de la revendica- tion 1, appartient à la série de configuration naturelle et répond à la formule orthoamide suivante: H N-R (III) H 2 N H 9 Composé tétrahydrofolique caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé du stade 3 ) de la revendica- tion 1, appartient à la série de configuration non- naturelle et répond à la formule orthoamide suivante: H (IV) % 2 N H Utilisation d'un composé tétrahydrofolique dias- téréoisomère selon l'une quelconque des revendications 8 et 9 pour l'obtention de folates réduits 65 et 6 R diastéréoisomériquement purs. 11 Utilisation selon la revendication 10 pour l'ob- tention, à partir du diastéréoisomère de formule III, d'un composé choisi parmi l'ensemble constitué par (a) l'acide ( 6 S)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofoli- que, (b) l'acide ( 6 S)-N 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique, (c) l'acide ( 6 R)-N 5,N 10-méthylène-5,6,7,8-tétra- hydrofolique, et (d) leurs sels. 12 Utilisation selon la revendication 10 pour l'ob- tention, à partir du diastéréoisomère de formule IV, d'un composé choisi parmi l'ensemble constitué par (a) l'acide ( 6 R)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofoli- que, (b) l'acide ( 6 R)-N 5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique, (c) l'acide ( 6 S)-N 5,N 1 O-méthylène-5,6,7,8-tétra- hydrofolique, et (d) leurs sels. 13 Acide N 5,N 10-méthylène-( 6 S)-5,6,7,8-tétrahydrofo- lique et ses sels d'addition diastéréoisomériquement purs. 14 Utilisation d'une substance diastéréoisomérique- ment pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide N 5,N 10méthylène-( 6 S)-5,6,7,8-tétrahydrofolique, ses sels et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médicament inhi- bant la thymidylate synthétase et destiné à un usage cytostatique en thérapeutique notamment contre le cancer. Utilisation selon la revendication 14, caractéri- sée en ce que ( 1) ladite substance diastéréoisomérique- ment pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide N 5,N 10méthylène-( 6 S)-5,6,7,8-tétrahydrofolique, ses sels et leurs mélanges, est associée avec ( 2) un agent anti- néoplasme, notamment choisi parmi l'ensemble comprenant le 5-fluorouracil, la 5-fluoro-2 '-désoxyuridine, le méthotréxate, le cisplatine et leurs mélanges.