Brevet FR2653561A1 — publié le 19910426

La présente invention concerne des hétéro-anticorps plus particulièrement utilisables dans la prévention de la maladie hémolytique du nouveau-né et pour la thérapeutique des purpurea thrombopéniques idiopathiques. Les anticorps monoclonaux humains anti-RhD ont été développés essentiellement dans le but de pouvoir traiter les incompatibilités de sang foeto-marternel liées au facteur rhésus. Tout particulièrement, dans le cas d'un enfant qui résulte d'une femme rhésus moins avec un homme rhésus plus, celui-ci est rhésus plus dans 75 % des cas. La mère rhésus moins peut porter un enfant rhésus plus, mais cet antigène rhésus plus du foetus peut, pour des raisons diverses et notamment lors de l'accouchement, entrer dans la circulation de la mère qui développera une allo-immunisation. En cas de nouvelle grossesse, les anticorps ainsi produits vont entrer dans la circulation du foetus et réagir avec les cellules du foetus pour conduire à des hémolyses massives. Dans le cas de grossesses avec risque d'incompatibilité foeto-maternelle, on injecte actuellement des anticorps antî-RhD. Cette injection permet de neutraliser les éventuels globules rouges porteurs d'antigènes passant du foetus à la mère et donc de limiter les risques d'immunisation de la mère. Pendant assez longtemps, ces anticorps anti-rhésus étaient obtenus à partir de dons de sujets rhésus moins ayant eu un foetus rhésus plus ou des sujets porteurs des anticorps correspondants. Plus récemment, on a mis au point des technologies permettant d'obtenir des anticorps monoclonaux anti-RhD, qui permettent d'obtenir ceux-ci en quantité plus importante et dans des conditions plus satisfaisantes. Toutefois, il était intéressant de pouvoir obtenir des anticorps "plus efficaces" que les anticorps anti-RhD seuls, c'est le but de la présente invention. Plus particulièrement, la présente invention concerne un hétéro-anticorps caractérisé en ce qu'il comporte tout ou partie d'un anticorps anti-rhésus D et tout ou partie d'un anticorps antirécepteur du fragment Fc des immunoglobulines qui n'est pas bloqué par l'IgG. Par "hétéro-anticorps" on entend désigner un système comportant deux anticorps ou fragments d'anticorps différents liés entre eux de façon à conserver leur reconnaissance spécifique. Les anticorps monoclonaux anti-RhD ont déjà été décrits, de même que leur préparation, voir par exemple le brevet WO 85 02413 ou le brevet européen 87 401314. Les anticorps antirécepteurs du fragment Fc des immunoglobulines non bloqués par les IgG ont également été décrits dans le brevet WO 88 00052. De préférence, les parties d'anticorps utilisées seront des fragments Fab'2 et le récepteur du fragment Fc sera de préférence le récepteur Fc-gamma-R de type 1. L'hétéro-anticorps peut être obtenu par toute technique de couplage connue pour les anticorps qui n'altère pas les sites de reconnaissance, il pourra s'agir, par exemple, d'un couplage de type chimique, mais il est possible de prévoir des couplages d'un type différent, avidine/biotine par exemple. Pour l'essentiel, ces technologies sont connues de l'homme de métier dans le domaine de la chimie et du couplage des anticorps monoclonaux et ne seront pas décrites en détail dans la présente demande. On pourra se reporter, par exemple, aux brevets des Etats Unis 4 479 895 et 4 470 925. Bien que l'on préfère utiliser un couplage par ponts disulfures, il est possible d'envisager d'autres types de liaisons chimiques par exemple des liaisons de type peptidique ou par utilisation de chélate spécifique. La formation de ponts disulfure peut être réalisée en utilisant différents réactifs chimiques capables de former un pont disulfure à partir de fonctions thiol, on peut également utiliser des réactifs bifonctionnels tels que des épisulfures substitués, des dihalogénures etc. La réaction peut être conduite aussi bien en phase homogène qu'en phase hétérogène par fixation, par exemple des anticorps sur des supports solides. L'intérêt essentiel des hétéro-anticorps selon la présente invention est que leur action n'est pas bloquée par la présence d'IgG dans le milieu. Ceci permet d'envisager l'utilisation de ces hétéro-anticorps in vivo car ils permettent d'éviter les effets d'inhibitions que les IgG ont sur les fonctions dépendantes du récepteur Fc. La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits hétéro-anticorps, notamment sous forme injectable. Les exemples ci-après vont permettre de mieux mettre en évidence certaines caractéristiques et avantages de la présente invention. EXEMPLE 1 - PREPARATION DES HETERO-ANTICORPS Les anticorps monoclonaux murins anti-récepteurs du fragment Fc des immunoglobulines (anti-Fc-gamma-R) sont commercialisés par la société MEDAREX, 12 Commerce avenue, West Lebanon, New Hampshire 03784 (USA), en particulier l'anticorps monoclonal 32.2 qui est spécifique du Fc-gamma-R de type 1. Cet anticorps monoclonal a la particularité de se lier au Fc-gamma-Rl sur un épitope adjacent au site de liaison des immunoglobulines laissant donc possible le couplage d'un fragment Fc de l'immunoglobuline. L'anticorps monoclonal anti-D H2D5D2 est décrit dans le brevet européen 87 401314. Les fragments Fab'2 de chacun de ces anticorps ont été couplés chimiquement en utilisant le N-succimidyle-S-acétyl-thioacétate (SATA). 800 ,ug de mono D sont couplés avec un rapport molaire 10/1 de SATA pendant 4 heures, puis on ajoute de l'hydroxylamine pour arrêter la réaction. On ajoute, ensuite, en excès 11 moles du fragment Fab' de l'anticorps monoclonal 32.2 couplé au TNB (par réaction de Fab' avec l'acide dithio-bis-(nitrobenzoîque) (DTNB). On analyse ensuite le produit de couplage que l'on purifie par HPLC. On obtient ainsi un hétéro-anticorps qui sera étudié plus complètement dans les exemples ci-après. EXEMPLE 2 Deux techniques ont été utilisées pour étudier l'hétéro- anticorps a) technique ADCC (antibody Dependent Cellular cytotoxicity) b) technique d'érythrophagocytose. Les trois préparations d'anticorps anti-D sont les suivantes solution d'immunoglobulines humaines polyclonales (IgRh Biotransfusion n" 54085040) l'anticorps monoclonal anti-D H2D5D2F5 (lot 8901 = mono D = R 13) l'hétéro-anticorps selon l'invention : 32.2 x Mono D HAb. TITRE HEMAGGLUTINANT DES PREPARATIONS D'ANTICORPS Le titre a été mesuré par la méthode du Technicon (Lalezari P., A new method for detection of red cell antibodies transfusion - Philad. 8, 372, 1968). L'hétéro-anticorps possède une activité hémagglutinante supérieure à celle du monoclonal seul (ratio 2,3). A partir de ces résultats plusieurs concentrations seront ajustées pour sensibiliser les globules rouges. ETUDE FONCTIONNELLE a) ADCC Hb ERA Principe L'hémoglobine des globules rouges Rh positif sensibilisés par l'anti-D, relarguée après hémolyse, possède une activité peroxydasique capable de catalyser l'oxydation de l'orthophenylène diamine (OPD) en présence d'eau oxygénée. Cette réaction colorimétrique est mesurée par un spectrophotomètre (protocole modifié à partir de la technique de Hou Zheng, J. Immunol. Methods 85, 1985, 325-333. Cinq expériences ont été réalisées au total. Trois cas de figure ont été envisagés en l'absence d'immunoglobulines hétérospécifiques, en présence de ces immunoglobulines : un anticorps appartenant à la FNTS monoclonal d'isotype IgGl anti HBV utilisé à 80 fug/ml, en associant au cours d'une même réaction le monoclonal et l'hétéro conjugué. Résultats En l'absence d'immunoglobulines bloquantes on note une efficacité équivalente pour les 3 échantillons : environ 50 % de lyse pour la concentration de 8 uglml. En présence d'immunoglobulines bloquantes on observe à 8 uglml une chute de l'efficacité du polyclonal et du monoclonal anti-D mais pas de l'hétéro-anticorps 32.2 x Mono D. II n'y a pas d'effet de potentialisation significatif en associant les deux anticorps. Quatre remarques peuvent être faites sur ces résultats L'anticorps 32.2 x Mono D possède une activité hémagglutinante anti-D supérieure à celle de l'anticorps Mono D. L'hétéro-anticorps, l'anticorps monoclonal et le polyclonal ont une activité équivalente en ADCC, en absence de toute autre immuno globuline. I1 n'y a pas d'effet de potentialisation en associant l'hétéroconjugué et le Mono D. Mais, l'hétéro-anticorps 32.2 x Mono D n'est pas inhibé par les immuno globulines hétérospécifiques, ce qui lui confère un avantage certain quant à l'administration par voie intraveineuse de cette molécule thérapeutique. b) Erythrophagocytose Principe Des globules rouges rhésus positif (ORlr) préalablement sensibilisés par l'anti-D sont mis à incuber en présence de monocytes pendant une heure (37"C). La suspension est lavée, fixée au méthanol, colorée par le Giemsa. Au microscope le pourcentage de phagocytose est déterminé (obj. x 40) : il représente le nombre de monocytes ayant phatocyté un ou plusieurs globules rouges par rapport au nombre total de monocytes de la suspension (300 à 400 monocytes sont comptés). Trois expériences ont été réalisées On observe un pourcentage de phagocytose significatif pour les trois préparations d'anticorps. L'hétéroconjugué montre une efficacité supérieure à celle du monoclonal Mono D seul. Cette étude permet de valider l'activité fonctionnelle Fc de l'hétéro-anticorps 32.2 x Mono D par trois techniques différentes : ADCC, érythrophagocytose et Rosetting. Par la technique Rosetting, il a également été observé qu'en excès d'immunoglobulines, la formation de rosettes n'était pas inhibée avec le 32.2 Mono D, contrairement à ce qui est observé avec le Mono D. Cet hétéro-anticorps présente une efficacité supérieure à celle du Mono D seul. Enfin, n'étant pas inhibé par les immunoglobulines hétérospécifiques, l'anticorps 32.2 Mono D présente un intérêt certain quant à son application thérapeutique. REVENDICATIONS 1) Hétéro-anticorps caractérisé en ce qu'il comporte tout ou partie d'un anticorps anti-rhésus D et tout ou partie d'un anticorps anti-récepteur du Fragment Fc des immunoglobulines qui n'est pas bloqué par l'IgG. 2) Hétéro-anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie d'anticorps utilisée est un fragment Fab'2. 3) Hétéro-anticorps selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le récepteur de fragment Fc est le récepteur Fc-gamma-R de type 1. 4) Hétéro-anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les deux anticorps sont liés par des sites qui n'altèrent pas les sites de reconnaissance. 5) Hétéro-anticorps selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que les deux anticorps ou parties d'anticorps sont couplés chimiquement. 6) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif au moins un hétéro-anticorps selon l'une des revendications 1 à 5. 7) Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition injectable.