Brevet FR2653034A1 — publié le 19910419

L'invention concerne un procédé de préparation d'un produit particulaire poreux régiospécifique. Par "régiospécifique", ont entend un produit dans lequel chaque particule poreuse possède sur sa surface interne des propriétés physicochimiques spécifiques différentes de celles de sa surface externe ; la surface interne d'une particule est constituée par la surface des pores qui s'étendent dans son volume interne, cependant que sa surface externe est constituée par la surface périphérique de la particule, qui forme l'interface avec le milieu extérieur. L'invention s'étend à des produits particulaires préparés par mise en oeuvre du procédé et aux applications du procédé pour la préparation de produits de séparation chromatographique. Les produits particulaires poreux régiospécifiques ont des applications intéressantes pour extraire, séparer ou purifier certains composés présents dans des mélanges de composés de tailles hétérogènes. La surface interne des particules peut en effet être adaptée pour exercer une rétention sur les composés de petites tailles à piéger, tandis que leur surface externe est adaptée pour ne pas interagir avec les composés de grosses tailles. Ainsi on évite les fixations parasites des composés de grosse taille sur la surface externe, écartant de la sorte, d'une part, les phénomènes de colmatage irréversible qui apparaissent avec les produits particulaires non régiospécifiques, d'autre part, la dénaturation d'une certaine proportion des composés de grosses tailles (suite à l'interaction avec la surface externe). La préparation des produits particulaires poreux sus-visés consiste à greffer des ligands rétentifs sur des particules poreuses inertes ; ces ligands se retrouvent aussi bien sur la surface interne que sur la surface externe, de sorte qu'apparaît une difficulté technique pour rendre le produit régiospécifique. Actuellement, deux procédés existent pour résoudre cette difficulté. L'un de ces procédés, dit "par effet bouclier (shîeld)" est décrit dans la publication suivante : "DARYL J. GISCH, BRIANT. HUNTER and BINYAMIN FEIBUSH, Journal of Chromatogr. Biomed. Appl. 433, 1988, 264, 268". Il consiste, après greffage des ligands rétentifs (généralement hydrophobes), à enrober chaque particule au moyen d'une couche non rétentîve (généralement hydrophile) pour masquer la réactivité des ligands fixés sur la surface externe.Mais cette couche modifie le calibrage des pores des particules de départ et le produit particulaire obtenu possède seulement la propriété d'éviter la pénétration des protéines à l'intérieur de la particule et ne peut pas être utilisé pour séparer des protéines entre elles par suite de l'absence de pores de tailles définies au niveau de la couche d'enrobage. L'autre procédé, d'application plus large, est décrit dans le brevet US 4.544.483 (PINKERTON) ; il consiste à greffer un ligand de nature particulière sur les surfaces des particules, ce ligand étant un ligand peptidique apte à être hydrolysable par une peptidase ; les particules sont ensuite traitées au moyen de peptidases de tailles supérieures à celles des pores de façon à hydrolyser et éliminer uniquement les ligands de la surface externe, ceux de la surface interne non accessibles par les enzymes restant intacts. Toutefois, de par son principe même, ce procédé limite la nature des ligands rétentifs utilisables qui sont nécessairement des ligands peptidiques ; dans les applications chromatographiques, ces ligands sont inhabituels et conduisent à des comportements difficiles à prévoir et à optimiser (réactions parasites, caractère ionique partiel...).En outre, les ligands peptidiques font appel à des méthodes de synthèse onéreuses, d'un coût beaucoup plus élevé que la synthèse des ligands habituellement utilisés en chromatographie, tels que les octadécyles qui correspondent à 80 y des applications analytiques ; une des conséquences graves de ce coût élevé est qu'il limite le procédé PINKERTON à des applications analytiques et exclut les applications préparatives de produits courants. De plus dans la chromatographie de protéines, les mélanges contiennent fréquemment des protéases de petite taille qui dénatureraient le ligand de la surface interne si elles y accédaient, de sorte que le procédé PINKERTON doit se limiter, pour ce type d'applications, à des porosités très faibles (inférieure à 10 nanomètres), interdisant aux protéases l'accès aux surfaces internes.Il est à noter au surplus que dans le cas de surfaces externes très irrégulières, l'hydrolyse par la peptidase est incomplète et laisse des ligands rétentifs sur certains sites desdites surfaces. L'invention se propose de fournir un nouveau procédé de préparation de produits particulaires poreux régiospécifiques. Un objectif essentiel de l'invention est de permettre d'utiliser des natures de ligands très variées et notamment les ligands chromatographiques classiques (par exemple ligands à chaînes hydrocarbonées en C4, C8, C18...) en vue d'éliminer les inconvénients du procédé PINKERTON dus au ligand peptidique. Un autre objectif est d'étendre la plage de porosité des produits particulaires obtenus, et ce quelle que soit l'application. Un autre objectif est d'obtenir un produit particulaire poreux à caractère régiospécifique très marqué, c'est-à-dire dans lequel les surfaces internes et externes ont des propriétés physicochimiques très différenciées (désignés par la suite par "pit pour les propriétés des surfaces internes et par "Pe" pour celles des surfaces externes). A cet effet, le procédé de préparation visé par l'invention est du type consistant (a) à greffer sur des particules à porosité calibrée un ligand apte à pénétrer dans les pores desdites particules et à se fixer sur la totalité de leurs surfaces en vue de leur conférer les propriétés physicochimiques (Pi) ; le procédé conforme à la présente invention se caractérise en ce que, après ledit greffage :: (b) l'on remplit les pores des particules au moyen d'un composé protecteur liquide, enzymatiquement hydrolysable et possédant une affinité pour le ligand lui permettant de pénétrer dans les pores et d'occuper le volume disponible, (c) l'on réalise une hydrolyse enzymatique du composé protecteur présent à la surface externe des particules au moyen d'une enzyme de taille supérieure à la taille des pores en vue d'éliminer sélectivement le composé protecteur sur ladite surface externe, (d) l'on réalise une attaque des particules au moyen d'un agent réactif vis à vis du ligand et non miscible avec le composé protecteur en vue d'éliminer sélectîvement le ligand de la surface externe, (e) et l'on élimine le composé protecteur encore présent dans les particules. Ainsi dans l'invention, le dégreffage s'effectue par une attaque notamment chimique qui peut s'appliquer à tout type de ligands ; les ligands internes sont préservés par le composé protecteur, ceiui-ci restant confiné dans le volume interne après action de l'hydrolyse enzymatique destinée à débarrasser les surfaces externes dudit composé protecteur. Il est à noter que cette hydrolyse enzymatique vise le composé protecteur et est donc adaptée à celui-ci (contrairement au procédé PINKERTON où l'hydrolyse enzymatique vise le ligand lui-même avec les défauts déjà développés). Le procédé de l'invention est donc compatible avec le greffage préalable de n importe quel ligand et en particulier des liqands hydrophobes classiques : méthyle, propyle, butyle, hexyle, octyle, octadécyle, phényle, cyanopropyle, ces ligands étant préférentiellement greffés sur des particules à squelette poreux silicique, qui donnent avec ceux-ci des liaisons siloxanes. Le greffage de ces ligands peut être réalisé sur place lors de la mise en oeuvre du procédé ; il est également possible d'utiliser des particules préalablement greffées par le fabricant, le procédé (b-e) étant mis en oeuvre sur lesdites particules greffées (le greffage du ligand est de toute façon une opération préalable nécessaire, qu'il soit effectué sur place ou par une opération antérieure). Dans le cas des ligands sus-évoqués, le composé protecteur peut être choisi parmi le groupe suivant triglycé ride, per-ester de mono ou droligosaccharide, polypeptide hydrophobe ou leurs dérivés acylés ; l'hydrolyse enzymatique est alors effectuée au moyen d'une hydrolase adaptée au composé protecteur utilisé : lipase, esterase ou peptidase. L'attaque chimique peut être effectuée au moyen d'une solution acide non miscible avec le composé protecteur, en particulier solution acide de pH inférieur à 1, dont le solvant a été choisi non miscible avec le composé protecteur. Le procédé de l'invention supprime tous les défauts afférents à l'utilisation de ligands peptidiques du procédé PINKERTON et notamment leur coût élevé. Il préserve la porosité des particules de départ puisque l'effet protecteur n'entraîne pas de modifications de la porosité celle-ci sera choisie en fonction de l'application, en particulier diamètre de pores égal ou inférieur à 30 nanomètres pour la séparation chromatographique des protéines. Il convient de souligner que l'hydrolyse enzymatique du composé protecteur peut être réalisée aussi bien avec des enzymes naturelles qu'avec des enzymes polymérisées ou fixées sur des macromolécules ; les techniques de polymérisation et de fixation sont connues en elles-mêmes et permettent d'obtenir des tailles désirées pour les enzymes, en particulier enzymes de grosse taille dans le cas de pores de gros calibres. Dans le cas de pores de diamètre supérieur à 10 nanomètres, on utilisera notamment des enzymes polymérisées ou fixées sur une macromolécule, ayant un poids moléculaire supérieur à 80 000 leur interdisant toute pénétration dans lesdits pores. De plus, l'attaque chimique des surfaces externes totalement débarrassées du composé protecteur conduit à une élimination totale des ligands externes et donc à un caractère régiospécifique très marqué. Les propriétés physicochimiques spécifiques (Pe) des surfaces externes peuvent être ajustées soit en choisissant des particules de départ qui possèdent déjà sur leurs surfaces ces propriétés, soit par un greffage ultérieur d'un autre ligand sur la surface externe ; il est à noter que ce greffage ultérieur peut être complet puisque tous les sites sont disponibles (l'autre liqand ayant été totalement éliminé sur les surfaces externes). Par ailleurs, l'élimination du composé protecteur encore présent à l'intérieur des particules peut facilement être effectuée par plusieurs processus connus en eux-mêmes, et en particulier par un lavage au moyen d'un liquide volatil présentant une affinité pour le ligand au moins égale à celle dudit composé protecteur, ledit liquide étant ensuite éliminé par évaporation. Dans le cas des composés protecteurs cités plus haut, on peut notamment choisir comme liquide de lavage un composé du groupe suivant alcane, organochloré, cétone, éther, alcool volatil. Le procédé de l'invention s'applique dans tous les cas où il est intéressant de disposer d'un produit particulaire poreux régiospécifique, et en particulier pour la préparation de produit de séparation chromatographique permettant de séparer deux groupes de composés qui présentent des tailles différentes. Dans ce cas, le procédé est mis en oeuvre, d'une part, en choisissant des particules ayant une porosité calibrée pour permettre la pénétration d'un groupe de composés et interdire celle de l'autre groupe, lesdites particules possédant la propriété physicochimique (Pe) de ne pas interagir avec les composés à séparer et, d'autre part, en greffant sur ces particules un ligand possédant la propriété physicochimique (Pi) de retenir les composés à séparer. Le procédé de l'invention permet de fabriquer des produits particulaires particulièrement bien adaptés pour la séparation chromatographique des protéines : par exemple séparation dans un plasma des protéines de grosses tailles des molécules de petites tailles en vue d'isoler ces dernières notamment dans un but analytique, ou de purification des protéines de grosses tailles d'un plasma (notamment Ig.M.) vis-à-vis des autres protéines et autres composés de tailles plus petites. L'invention s'étend à certains produits particulaires poreux régiospécifiques préparés par le procédé de l'invention et que ne permettent pas d'obtenir les procédés antérieurs ; ces produits sont composés de particules poreuses siliciques se caractérisant par la présence sur leur surface interne d'un ligand hydrophobe possédant au moins l'un des groupements suivants : méthyle, propyle, butyle, hexyle, octyle, octadécyle, phényle, cyanopropyle, en vue de présenter la propriété (Pi) de retenir les composés hydrophobes, par la présence sur leur surface externe d'un ligand hydrophile, en particulier glycéropropyle, en vue de présenter la propriété (Pe) de ne pas interagir avec les composés hydrophobes. Ces produits peuvent avoir une large plage de porosité en vue de s'appliquer à des séparations de molécules de tailles très variées. Dans le cas d'une séparation de protéines de grosses tailles, on choisira généralement un diamètre de pores égal ou inférieur à 30 nanomètres en fonction du point de coupure désiré. La description qui suit fournit plusieurs exemples de mise en oeuvre du procédé de préparation de l'invention et des exemples d'application ; la mise en oeuvre de l'exemple 1 est illustrée par les dessins annexés ; sur ces dessins - les figures 1 à 12 illustrent les étapes du procédé de préparation conforme à l'invention, - les figures 13 et 14 sont des chromatogrammes obtenus au terme des séparations décrites respectivement à l'exemple 2 et à l'exemple 4. EXEMPLE 1 Préparation d'un produit poreux régiospécifique bifonctionnalisé C18 et diol a) Greffage de ligands octadecyles sur des particules de silice On utilise 5 g de silice "NucléosilR" (diamètre des particules 15-25 micromètres, diamètre des pores 100 Angstrom, "Macherey-Nagel n0 712-32") ; une particule est symbolisée à la fiqure 1 avec ses pores 1, sa surface externe 2, sa surface interne 3 ; ces surfaces portent à l'origine des groupements silanols 4. Ces particules préalablement séchées 15 h à 1100 C sont mises en suspension dans 50 ml de toluène anhydre contenant 0,75 g de diméthyloctadécylchlorosilane et 1 ml de pyridine anhydre. Après 24 h de réaction à 1100 C (reflux du toluène) et sous agitation (agitation magnétique 500 tr/min), la silice est filtrée, lavée successivement avec 30 ml de toluène et 30 ml d'éther éthylique puis séchée 15 h à 450 C. On obtient 4,5 g de silice modifiée octadécyle (C18), telle que symbolisée à la figure 2. Les ligands hydrophobes octadecyle 5 sont fixés sur les surfaces internes et externes par des liaisons siloxanes. b) Remplissage des pores de la silice C18 par le composé protecteur La silice C18 greffée précédemment obtenue (1 g) est dispersée dans une solution de tridécanoate de glycérol (1,5 g) dans 10 ml de chloroforme. Le chloroforme est évaporé à l'évaporateur rotatif. Comme le symbolise la figure 3, chaque particule est imbibée de tridécanoate de glycérol 6 qui remplit ses pores et couvre sa surface externe. c) Hydrolyse enzymatique On ajoute au résidu précédemment obtenu, 50 mi de tampon tris-maléate 0,2 M puis la suspension est soniquée 15 minutes au bain pour obtenir une bonne dispersion. La suspension est alors placée dans une enceinte thermostatée à 450 C et agitée à 500 rpm. Le pH est maintenu à 7 par l'intermédiaire d'un pH stat qui permet grâce à un enregistrement de suivre l'état d'avancement de la réaction. On ajoute alors 100 mg de lipase extraite de Candida cvlindracae et possédant une activité enzymatique de 2 unités par mg. Une unité enzymatique correspond à la quantité d'enzyme nécessaire pour produire une m icromole d'acide gras par minute à 370 C à pH7. La lipase de C. cylindracae, symbolisée en 7 à la figure 4, a un poids moléculaire d'environ 67 000 et n'a donc pas la possibilité de pénétrer à l'intérieur des pores de la silice C18. Lorsqu'on n'observe plus de production d'acide gras (la quantité d'acide gras produite correspond à l'hydrolyse de 900 mg de triglycéride) on décante la silice, on la lave avec 10 ml d'eau puis avec 2 X 10 ml d'un mélange Methanol/ H20, 50/50 (V/V). On obtient une particule dont la surface externe 2 est totalement débarrassée du composé protecteur comme le symbolise la figure 5. d) Attaque chimique La silice est alors resuspendue dans un mélange Methanol/ H2S04 2N, 50/50 (V/V) (comme le symbolise la figure 6) et est maintenue agitée au moyen d'un agitateur à plateaux à 370 C pendant 24 H. Les particules obtenues sont symbolisées à la figure 7, leur surface externe étant totalement débarrassée des ligands. e) Elimination du composé protecteur La silice hydrolysée est alors décantée, lavée avec 3 X 20 ml de Methanol puis avec 2 X 30 ml de chloroforme et 2 X 30 mi d'hexane (e). Le solvant est symbolisé en 8 aux figures 8 et 9 qui illustrent la dissolution du composé protecteur. Après évaporation du solvant, on obtient 0,8 g de silice C18 hydrolysée régiosélectivement. Les particules sont symbolisées à la figure 10 : elles portent des ligands hydrophobes uniquement sur leur surface interne, tous les sites de la surface externe étant disponibles. Au niveau macroscopique, cette silice ne présente plus le caractère de non mouillabilité de la silice C18 de départ. Elle se disperse, au contraire, parfaitement dans l'eau. f) Fixation de greffons diols sur la surface externe 1 g de silice hydrolysée régiosélectivement est mis en suspension dans 20 ml d'une solution aqueuse de glycidoxypropyltriméthoxysilane ajustée à pH 3,5. Le mélange est chauffé à 900 C sous agitation pendant 2 H. La silice est ensuite filtrée et lavée avec 20 ml d'eau, 20 ml d'acétone et 20 ml d'éther éthylique successivement. Les conditions moyennement acides utilisées lors du couplage sont suffisantes pour convertir l'oxirane en glycol. Les particules obtenues sont symbolisées à la figure 11 ; elles se caractérisent par la présence sur leur surface interne des ligands 5 hydrophobes C18 et la présence sur leur surface externe des ligands 9 hydrophiles diol, leur conférant un caractère régiospécifique très marqué.Ce caractère a été mis en évidence par des mesures de rétention, d'une part, du naphtalène (petite molécule hydrophobe) qui rentre dans les pores et est retenu de façon similaire à ce qui se passe avec une silice C18 connue, d'autre part, de protéines de tailles supérieures à celles des pores (poids moléculaire 67 000) qui ne sont pas retenues par la surface externe (mesure "Break Through"). EXEMPLE 2 séparation chromatographique au moyen du produit obtenu à lrexemple 1 On réalise une chromatographie d'un mélange de deux principes actifs, le nesdonal (0,1 mg/ml) et le phénobarbital (0,3 mg/ml) et d'une protéine plasmatique l'albumine bovine sérique (BSA) (5 mg/ml). On injecte 10 du mélange précédent sur une colonne 30 X 4,6 mm remplie avec le produit C18/diol préparé plus haut. Cette chromatographie est symbolisée à la figure 12 (albumine en 10 et petites molécules en 11). Phase mobile : méthanol/ tampon acétate 0,lM pH 5, 40/60. Débit 1 ml/minute, détection UV 265 nm.On observe sur le chromatogramme correspondant (figure 13) un pic très important d'albumine bovine élué avant t (temps de rétention correspondant au volume mort) suivi des pics correspondant au nesdonal et au phénobarbital. La rétention de ces composés est analogue sur la phase C18/diol à celle sur une phase C18 conventionnelle. Toute l'albumine a été éluée, sans interaction avec le produit poreux. EXEMPLE 3 Préparation d'un produit t poreux réqiospécifique bifonctionnalisé à partir de silice 5 C4, 300 Angström a) La silice C4 n'a pas été synthétisée mais a été obtenue auprès de la société "Macherey-Nagei" ("Nucléosil 300-5C4 réf 71262"). Cette silice à larges pores possède un point de coupure à 250 000 daltons pour les protéines. b) Remplissage des pores de la silice C4 avec l'agent protecteur. 1 g de silice C4 est dispersé dans une solution de tridécanoate de glycérol (2 g) dans 20 mI de chloroforme qui est évaporé à l'évaporateur rotatif. c) Hydrolyse enzymatique La lipase de C. cylindracae ayant un poids moléculaire de 67 000 a donc la possibilité de pénétrer à l'intérieur des pores du produit. Pour la maintenir à l'extérieur, on effectue une polymérisation préalable. Polymérisation de la lipase de C. cylindracae 1 g de lipase est dissous dans 50 ml d'une solution à 5 a de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate O,lM à pH 8. Après une nuit à température ambiante, les sites non bloqués sont saturés par une solution de glycine (0,1 M concentration finale). Le mélange réactionnel est dialysé puis purifié par chromatographie sur une colonne de perméation de gel Nucléosil 300-70H. Les fractions correspondant au volume mort de la colonne et contenant les aggrégats de lipase de taille supérieure à celle des pores du support sont récupérées, dialysées et lyophilisées. On obtient 200 mg d'enzyme polymérisée possédant une activité enzymatique d'l unité/mg. Hydrolyse On ajoute au résidu 50 ml de tampon trismaleate 0,2 M. Le mélange est soniqué 15 mn au bain, puis placé dans une enceinte agitée, chauffée à 450 C et dont le pH est maintenu à 7 par un pH stat. On ajoute 200 mg de lipase polymérisée obtenue précédemment que l'on laisse agir jusqutà ce que l'on n'observe plus de production d'acide gras. La silice C4 est alors décantée, lavée à l'eau (20 ml) puis avec un mélange Methanol/ H20, 50/50 (v/v), (2 x 20 ml). d) Attaque chimique La silice C4 est ensuite resuspendue dans un mélange Methanol/ H2S04 2N, 50/50 (v/v) et agitée sur un agitateur à plateaux à 370 C pendant 24 H. La silice est alors décantée, lavée avec 20 ml d'eau, 2 x 20 ml de Methanol, 2 x 20 ml de chloroforme et 2 x 20 mI d'hexane puis séché(e). On obtient 0,8 g de silice C4 hydrolysée qui est regreffée diol selon le même protocole que précédemment (f). EXEMPLE 4 Chromatographie d'un mélange de deux protéines plasmatiques de poids moléculaire différent, la BSA (67 000) et l'Ig.M. (900 000) La chromatographie est effectuée sur une colonne de 30 x 4,6 mm remplie de produit préparé à l'exemple 3, dans un tampon acétate pH 5, 0,1 M avec une détection UV à 280 nm et un débit de 1 ml/minute. On injecte 10 1 d'une solution de BSA (5 mg/ml) et d'Ig.M. (0,1 mg/ml). On n'observe sur le chromatogramme (figure 14) qu'un seul pic correspondant à l'Ig.M. et élué avant tos la BSA est piégée sur le support. REVENDICATIONS 1/ - Procédé de préparation d'un produit particulaire poreux régiospécifique, dans lequel chaque particule poreuse possède sur sa surface interne des propriétés physicochimiques spécifiques (Pi) différentes de celles de sa surface externe, consistant (a) à greffer sur des particules à porosité calibrée un ligand apte à pénétrer dans les pores desdites particules et à se fixer sur la totalité de leurs surfaces en vue de leur conférer les propriétés physicochimiques (Pi), caractérisé en ce que, après ledit greffage (b) l'on remplit les pores des part-icules au moyen d'un composé protecteur liquide, enzymatique ment hydrolysable et possédant une affinité pour le ligand lui permettant de pénétrer dans les pores et d'occuper le volume disponible, (c) l'on réalise une hydrolyse enzymatique du composé protecteur présent à la surface externe des particules au moyen d'une enzyme de taille supérieure à la taille des pores en vue d'éliminer sélectivement le composé protecteur sur ladite surface externe, (d) l'on réalise une attaque des particules au moyen d'un agent réactif vis à vis du ligand et non miscible avec le composé protecteur en vue d'éliminer sélectivement le ligand de la surface externe, (e) et l'on élimine le composé protecteur encore présent dans les particules. 2/ - Procédé selon la revendication 1 pour préparer des particules poreuses possédant sur leur surface externe des propriétés physicochimiques spécifiques (P ) différentes de celles (Pi) de leur surface interne, dans lequel après élimination sélective du ligand (d) (f) l'on greffe un autre ligand sur la surface externe des particules en vue de conférer à celle-ci les propriétés spécifiques (Pe) 3/ - Procédé selon la revendication 1 pour préparer des particules poreuses possédant sur leur surface externe des propriétés physicochimiques spécifiques (Pe) différentes de celles (Pi) de leur surface externe, dans lequel l'on choisit des particules de départ possédant sur la totalité de leurs surfaces les propriétés spécifiques (Pe) 4/ - Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que (a) l'on choisit des particules à squelette poreux silicique et l'on greffe sur celle-ci un ligand hydrophobe capable de donner avec la silice des liaisons siloxane, (b) l'on remplit les pores des particules siliciques au moyen d'un composé protecteur hydrophobe, apte à se décomposer en sous-éléments ayant un caractère hydrophobe plus faible, (c) l'on réalise l'hydrolyse enzymatique du composé protecteur présent à la surface externe des particules au moyen d'une hydrolase en vue de le décomposer en ses souséléments, (d) l'on réalise une attaque chimique des particules au moyen d'une solution acide, non miscible avec le composé protecteur hydrophobe. 5/ - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que (a) l'on greffe sur les particules siliciques un ligand hydrophobe possédant au moins l'un des groupements suivants : méthyle, propyle, butyle, hexyle, octyle, octadécyle, phényle, cyanopropyle, (b) l'on remplit les pores des particules au moyen d'un composé protecteur du groupe suivant triglycéride, per-ester de mono ou d'oligosaccharide, polypeptide hydrophobe ou leurs dérivés acylés, (c) l'on réalise l'hydrolyse au moyen d'une hydrolase adaptée au composé protecteur : lipase, estérase, peptidase, (d) l'on réalise l'attaque chimique au moyen d'une solution d'acide fort de pH inférieur à 1, le solvant de ladite solution étant choisi non miscible avec le composé protecteur. 6/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 pour la préparation d'un produit particulaire de porosité supérieure à 10 nanomètres, caractérisé en ce que (c) l'on réalise l'hydrolyse enzymatique au moyen d'une enzyme polymérisée ou fixée sur une macromolécule en vue de lui conférer un poids moléculaire supérieur à 80 000. 7/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que : (e) l'on élimine le composé protecteur par un lavage au moyen drun liquide-volatil présentant une affinité pour le ligand au moins égale à celle dudit composé protecteur, ledit liquide étant ensuite éliminé par évaporation. 8/ - Procédé selon les revendications 6 et 7 prises ensemble, caractérisé en ce que (e) l'on élimine le composé protecteur par lavage au moyen d'un liquide du groupe suivant : alcane, organochloré, cétone, éther, alcool volatil. 9/ - Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 8 pour la préparation d'un produit de séparation chromatographique permettant de séparer deux groupes de composés présentant des tailles différentes, dans laquelle (a) l'on choisit des particules ayant une porosité calibrée pour permettre la pénétration d'un groupe de composés et interdire celle de l'autre groupe, lesdites particules possédant la propriété physicochimique (Pe) de ne pas interagir avec les composés à séparer et l'on greffe sur ces particules un ligand possédant la propriété physicochimique (Pi) de retenir les composés à séparer. 10/ - Application selon la revendication 9 pour la a préparation d'un produit de séparation chromatographique permettant de séparer dans un plasma les molécules de petites tailles des protéines de grosses tailles en vue d'isoler lesdites molécules de petites tailles. 11/ - Application selon la revendication 9 pour la préparation d'un produit de séparation chromatographique permettant de purifier les protéines de grosses tailles d'un plasma vis à vis des autres protéines et autres composés de plus petites tailles. 12/ - Produit particulaire poreux régiospécifique préparé par mise en oeuvre du procédé conforme à la revendication 6, comprenant des particules poreuses siliciques se caractérisant par la présence sur leur surface interne d'un ligand hydrophobe possédant au moins l'un des groupements suivants : méthyle, propyle, butyle, hexyle, octyle, octadécyle, phényle, cyanopropyle, en vue de présenter la propriété (Pi) de retenir les composés hydrophobes, par la présence sur leur surface externe d'un ligand hydrophile, en particulier glycéropropyle, en vue de présenter la propriété (Pe) de ne pas interagir avec les composés hydrophobes. 13/ - Produit particulaire poreux selon la revendication 12 pour la séparation chromatographique de protéines, dans lequel les pores des particules sont de diamètre égal ou inférieur à 30 nanomètres.