Brevet FR2658534A1 — publié le 19910823

Procédé d'obtention d'irone par voie microbio Logique La présente invention concerne un procédé de préparation d'irone, dont les méLanges des trois isomères, o, p et y, sont utilisés dans L'industrie alimentaire et ce L Le des parfums et des cosmétiques, pour leur odeur de violette. Lors de leur récolte, les rhizomes d'iris ne contiennent pratiquement pas d'irone, et c'est au cours de leur stockage prolongé que celle-ci se forme, vraisemblablement par transforma- tion oxydative de triterpènes initialement présents. Dans Le procédé habituel d'obtention d'irone, il faut donc attendre plus de deux ans après la récolte des rhizomes pour extraire une quantité raisonnable d'irone par entraînement à la vapeur ou dans un solvant organique. Récemment, il a été proposé dans FR-A-2 620 702 un procédé qui supprime le stockage prolongé, caractérisé en ce que les précurseurs de l'irone sont extraits des rhizomes, peu après leur récolte, par un solvant lipophile puis soumis à une oxydation chimique, qui libère les mo Lécules d'irone. Ce procédé présente l'inconvénient de mettre en oeuvre des réactifs chimiques qui interdisent l'emploi de l'irone ainsi obtenue dans l'industrie alimentaire et il était souhaitable de trouver un procédé naturel de dégradation, tel qu'un procédé micro- biologique Néanmoins, il n'était pas évident de trouver des microorganismes susceptibles d'effectuer cette transformation, comme le font les enzymes végétales au cours du stockage. On a maintenant trouvé des micro-organismes aérobies qui dégradent les précurseurs, sans dégrader simultanément de façon appréciable l'irone formée, en quelques jours et avec des rendements en irone par rapport à la quantité de rhizomes d'iris mis en oeuvre nettement supérieurs à ceux obtenus avec le procédé classique, ce qui est d'autant plus intéressant que la quantité de rhizomes d'iris disponible sur le marché européen diminue actuel- lement, sans diminution de la demande en irone. Le procédé selon l'invention consiste à transformer les précurseurs de l'irone présents dans les rhizomes d'iris frais en les soumettant à l'action d'un micro-organisme du genre Botryotinia encore appe Lé Sclerotinia, dont la forme imparfaite est dénommée Botrytis Ces champignons sont décrits dans l'ouvrage de M B Ellis Hyphomycetes p 178184 ( 1971) Commonwealth Mycological Institute. Une espèce courante de ce champignon filamenteux, dont on peut se procurer diverses souches dans les collections internatio- nales de micro-organismes, est la Botryotinia convulata, mais d'autres espèces, telles que B draytonii, B ficariarum ou B fuckeliana peuvent convenir; celles-ci sont décrites dans: Microfungi on land plants An Identification Handbook M B Ellis et J P Ellis 1985 Croom Helm Londres. Le micro-organisme peut être utilisé entier dans son milieu de culture ou seulement le mycéLium; on peut aussi utiliser le milieu dans lequel a été cultivé le champignon, après l'élimina- tion du mycéLium. Le milieu de culture peut être l'un de ceux généralement utilisés pour ce type de champignons, c'est-à-dire de l'eau conte- nant une source de carbone, une source d'azote, et des sels métal- liques Comme source de carbone, on peut citer les sucres, tels que le glucose, le maltose ou le lactose ou encore le glycérol; comme source d'azote, on peut citer la caséine, la géLatine hydrolysée, des aminoacides ou des peptides et protéines dont la géLatine, un extrait de malt ou de rafle de mais, un extrait de viande, de l'urée, ou de la farine de soja; comme sels métalliques, on peut citer les phosphates, les citrates ou les acétates de sodium, magnésium, cuivre, manganèse ou fer et, mieux, un méLange de sels de fer, de cuivre et de manganèse Le p H du milieu de culture est acide ou neutre, compris entre 3,5 et 7 et, de préférence, entre ,5 et 6; on peut éventuellement fixer le p H du milieu avec un tampon à base de phosphate, phtalate ou Tris ou ajuster le p H au cours du développement du champignon La température du milieu lors de la culture est celle la plus favorable au développement du micro-organisme; elle est en général comprise entre 15 C et 30 C, et la réaction de transformation des précurseurs de l'irone sera de préférence effectuée à cette température. L'étape préalable d'extraction des précurseurs des rhizomes frais, éventuellement séchés, notamment pour faciliter leur transport, est effectuée par mise en suspension des rhizomes concassés ou broyés dans un solvant organique généralement utilisé dans l'industrie des arômes, tel que les solvants alcooliques, méthanol ou éthanol, les solvants chlorés, chlorure de méthylène ou dichloroéthane, les hydrocarbures aliphatiques ou aromatiques, hexane ou benzène; on peut éventuellement utiliser des méLanges de solvants ou faire deux extractions successives avec des solvants différents, par exemple avec un solvant miscible à l'eau et l'autre non Il est préférable d'utiliser des solvants alcooliques ou chlorés et, mieux, le méthanol et le chlorure de méthylène On peut éLiminer les composés hydrosolubles entraînés lors d'une première extraction, en redissolvant l'extrait dans un solvant non miscible à l'eau et en lavant cette phase organique, avant d'éliminer le solvant pour obtenir l'extrait qui sera soumis à l'action du champignon. On peut utiliser des Iris germanica, pallida ou florentina de diverses provenances, comme le Maroc ou l'Italie On sait que le rendement en irone et la proportion des isomères dans le produit obtenu peuvent varier sensiblement avec l'espèce, la provenance et la maturité des iris mis en oeuvre; dans tous les cas, le procédé selon l'invention donne des résultats nettement plus avantageux que le procédé classique. Selon l'invention, on introduit l'extrait, de préférence en suspension dans l'eau ou en solution dans un petit volume d'un solvant organique hydrophile tel que l'acétone, un alcool ou le dioxanne, dans le milieu o on a cultivé le champignon jusqu'à obtenir un maximum de biomasse, soit environ 48 h, à raison de 1 g à 20 g d'extrait par litre de milieu; étant donné l'insolubilité de l'extrait dans le milieu, comme il est courant dans ce domaine, on peut introduire simultanément une faible quantité d'un agent tensioactif comme un ester de sorbitol et d'acide gras tel que les Tween, ainsi qu'un agent antimousse comme une huile de silicone, un polyalky Lèneglycol, de l'huile de soja ou de mais Le milieu est maintenu sous agitation et éventuellement aéré par exemple pendant à 60 h à 20 C; on éLimine alors les corps cellulaires par fil- tration et on sépare l'irone formée par entraînement à la vapeur ou on l'extrait dans un solvant organique non miscible à l'eau La durée et la température optimales de la réaction dépendent des conditions opératoires: matériel, nature et concentration des réactifs, espèce et souche de champignons et le spécialiste sera à même de déterminer par des essais préalables les paramètres optimaux de la réaction, sachant que L'irone formée peut être dégradée par le champignon; le déroulement de la réaction peut, notamment, être suivi en chromatographie en phase gazeuse. La biomasse nécessaire pour transformer une quantité donnée d'extrait sera inférieure si, selon une technique d'enduc- tion connue, on introduit l'extrait dans le milieu de préculture et de culture du champignon, en faible concentration, de 0,05 % à 0,1 %. Par ailleurs, les rendements en irone sont nettement améliorés, si on ajoute en fin de culture, pour perméabiliser les membranes cellulaires, un surfactant non ionique, comme les esters de polyols et d'acide gras, tel que le Tween, ou les polyalky Lène- glycols, tel que l'octylphénoxypolyéthoxyéthanol ou Triton X, avant d'introduire l'extrait à dégrader Ces agents sont utilisés, en général, à une concentration de 0,05 % à 0,25 %. Selon un autre aspect de t'invention, on peut séparer la biomasse du milieu de culture par filtration avant d'y introduire l'extrait, éventuellement après avoir perméabilisé les membranes. On peut aussi, mais les rendements de transformation sont moins bons, séparer le mycéLium de son milieu de culture, éventuel- lement après perméabilisation des membranes, et le remettre en sus- pension dans une solution aqueuse tamponnée, de préférence contenant 5 à 15 g/l de glucose, et introduire dans ce milieu, de préférence en présence d'un agent tensioactif, l'extrait à trans- former. Selon un aure aspect de l'invention, le procédé est mis en oeuvre avec des micro-organismes immobilisés, ce qui peut per- mettre d'opérer en continu; l'immobilisation est effectuée, de façon classique, soit en cultivant le champignon dans un milieu contenant un solide, sous forme de billes, de pastilles, d'anneaux ou autre forme en verre ou en polymère inerte, sur lequel le mycé- lium en croissance se fixera, soit en séparant le champignon ou le mycéLium de son milieu de culture et en l'incorporant dans des matrices poreuses, formées par réticulation chimique de monomères convenables ou par coacervation. Dans ce qui suit, on décrit des exemples de mise en oeuvre de l'invention; des souches de Botryotinia convulata dispo- nibles dans la collection du Centraalbureau Voor Schlimmelcultures Baarn (CBS), Delft (Pays-Bas), sous les références 285-38, 286-38, 428-38, ont été utilisées. EXEMPLE 1 Culture du micro-organisme Le champignon conservé dans un milieu PDA (Potato Dextrose Agar), commercialisé par Merieux (France), est utilisé pour ensemencer 100 ml d'un milieu de préculture de p H 5,7, consti- tué de 15 g d'extrait de malt par litre d'eau, 10 g/L de glucose, 2 mg/l de sulfate de cuivre, 2 mg/l de citrate de fer et d'ammonium et 2 mg/l de chlorure de zinc avec une goutte d'une solution acétonique de l'extrait; après 48 h sous agitation, à C, la préculture est introduite dans 800 ml du milieu de culture de p H 5,7 constitué de 25 g/L d'eau de liqueur de mais (corn steep liquor) et de 2 mg/L de sulfate de cuivre, de citrate de fer et d'ammonium et de chlorure de zinc, avec 1 ml d'une solution acétonique d'extrait Après 48 h d'agitation à 200 C, on introduit dans le milieu du Triton X 100 à la conconcentration de 0,1 % puis, 2 h après, 5 g d'extrait en émulsion dans 10 ml d'eau et 1 ml d'acétone contenant 0,2 % de Tween 80 Le milieu est incubé à 20 C, puis l'irone est séparée par entraînement à la vapeur La quantité d'irone obtenue après des essais ayant duré de 12 h à 72 h, mesurée par chromatographie en phase gazeuse, figure dans le tableau 1; elle est exprimée en gramme d'irone par kilo de matière sèche de rhizomes mis en oeuvre pour préparer l'extrait traité. TABLEAU 1 g d'irone/kg d'extrait sec de rhizome 1,15 1,2 2,2 2,3 1,1 EXEMPLE 2 On répète le même mode opératoire qu'à l'exemple 1, mais sans introduire de Triton en fin de culture On obtient alors seulement 1,1 g d'irone au bout de 48 h. Durée 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h $^ 2658534 REVENDICATIONS 1 Procédé d'obtention d'irone, caractérisé en ce qu'on soumet Les précurseurs extraits des rhizomes d'iris frais à l'action d'un champignon du genre Botryotinia. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le champignon est de l'espèce Botryotinia convulata. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caracté- risé en ce qu'un sel de fer est introduit dans le milieu de culture du champignon. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que le p H du milieu de culture est compris entre 5,5 et 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que l'on effectue une induction du cham- pignon par addition de traces de l'extrait de rhizome dans le milieu de préculture et de culture du champignon. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé en ce qu'on traite le champignon par un agent perméabilisant des membranes avant d'introduire les précurseurs. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent perméabilisant est le Triton X. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que les précurseurs sont extraits des rhizomes par un solvant choisi parmi les solvants alcooliques, les solvants chtorés, les hydrocarbures aliphatiques ou aromatiques et leurs méLanges. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que le solvant est choisi parmi le méthanol, l'éthanol et le chlorure de méthylène.