Brevet FR2657882A1 — publié le 19910809

La présente invention est relative au clonage du gène de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, à des fragments d'ADN comprenant ce gène, ainsi qu'à des micro-organismes transformés par introduction desdits fragments et à l'utilisation desdits fragments et microorganismes pour la production de A1-déshydrogénase et pour la synthèse et le dosage de substances stéroïdiennes La biotransformation des stéroïdes par les micro-organismes, ou par des enzymes issues de ceux-ci, dans le but de synthétiser des médicaments est utilisée couramment dans l'industrie pharmaceutique, du fait de la très grande spécificité et du faible coût de revient des réactions effectuées de la sorte. Par exemple, la A1-déshydrogénase obtenue à partir de certaines souches d'Arthrobacter est couramment utilisée dans la synthèse des stérols à usage thérapeutique, tels que, par exemple, la prednisone et la prednisolone, à partir de substrats tels que, par exemple, la cortisone ou l'hydrocortisone. Pseudomonas testosteroni est une bactérie à Gram-négatif, se trouvant naturellement dans le sol, et qui est capable de croître en utilisant les stérols comme seule source de carbone. Cet organisme dégrade complètement les stérols, et plusieurs enzymes sont impliquées dans ce métabolisme: - la 3- (ou 17)ss-hydroxystéroïde déshydrogénase (EC 1.1.1.51) désignée également sous le nom de ss-enzyme, - la 3a-hydroxystéroïde déshydrogénase (EC 1.1.1.50) désignée également sous le nom de a-enzyme, - la 3-cétostéroïde 4-5-isomérase (EC 5.3.3.1) désignée également sous le nom d'isomérase, - la 3-cétostéroïde A1-déshydrogénase (EC 1.3.99.4) désignée également sous le nom deA1-déshydro- génase, ainsi que deux autres déshydrogénases (EC 1.3.99.5 et EC 1.3.99.6) La A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni présente, par rapport aux enzymes de même type actuellement utilisées, l'avantage d'une grande stabilité physico-chimique Des tentatives pour isoler et caractériser cette enzyme ont été réalisées [LEVY et TALALAY, Journal of Biological Chemistry (1959), 234, 2014-2021]; toutefois, elles n'ont pas abouti à la purification complète de la protéine, dont la séquence demeure, jusqu'à présent inconnue. En outre, en raison de la complexité du métabolisme des stérols chez Pseudomonas testosteroni et des différentes enzymes impliquées dans ledit métabolisme, il est impossible d'utiliser directement Pseudomonas testosteroni dans l'industrie pour des réactions de synthèse spécifiques Les inventeurs se sont en conséquence fixé pour but d'isoler et de cloner le gène de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, de façon à permettre, d'une part l'expression dudit gène dans un hôte approprié, tel qu'une bactérie à usage industriel, et d'autre part l'obtention de la A1-déshydrogénase sous une forme purifiée. La présente invention a donc pour objet des fragments d'acide nucléique, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué par: a) la séquence nucléotidique codant pour la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, b) la séquence nucléotidique régulant ltexpression du gène de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, c) les séquences nucléotidiques homologues ou complémentaires de tout ou partie de l'une ou l'autre des séquences définies en a) ou b). Lesdits fragments sont obtenus soit par l'une quelconque des techniques utilisables en biologie moléculaire ou en génie génétique, soit par l'association de plusieurs de ces techniques. Lesdites techniques comprennent, sans que ceci constitue une énumération limitative, les techniques d'extraction et de purification des acides nucléiques, les techniques de fragmentation de molécules d'acide nucléique par des enzymes de restriction ou par toute autre méthode appropriée, les techniques de synthèse ou d'hémisynthèse d'acides nucléiques, les techniques de mutagenèse ou de transformation de micro-organismes, les techniques de marquage ou d'hybridation de sondes, les techniques de recombinaison d'acides nucléiques, etc... Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le fragment obtenu comprend au moins une séquence homologue ou complémentaire de l'une des séquences suivantes 5r ACCCCACCGGCATTACGACCCACACGCCCGACAGCACACATTGGCCACCGCCACCGCCTGAAS CTCGATCACAGAATTTGCCCCTGCTCGCGCGCCTAATGTGCATGGCACTGCCCCTCCAGCGAC ACACATGTGGATGGACATCAACTATGGCGAATAGGTTCAAGGTTGTGGTGTGATGTTTTAGAT GGATTTGTTGGATTGAGAGTGGTTGGAGTCATATAGGAATGGA...3' (I) 5'.CGAGAGGCAAGGGTTTGCCTACCATGTCAGCCACGGCGGCGCGGAAGGCAACGTCATGGCC GGCCCCAGGGTGGAGCCAGCGCCGGCGTAGGCGCCATAGCCCCATTGACGGAGGCGGAGTTG TTGCCCACGCAATACACCCCTCGATGATCCTGCCTTGCGTTCGAGCACACGGCTTTCCTGTCG- GTCAGCACCCCTTGGTGCGATTACGG... 3' (2) 5'.CCACGCAATACACCCCTCATATCCTGCCTTCTGTCAGCACACGGCCTTCCTTCGTCACACC CCCCCATGATGCCGATCGCACCGGGCCACAACGCATGGCGTAAAACGGACCTTTCTCATGGGAC CCAGTTGGATTCTTGAAACGCGGAACGCCGGTAATAACGGTCAAACAACATTCCGCCCCGGTCA AAAGTCCAAGGTCCTTGCCAAGCTCTGGCGTAATTCGGTCAATGCGACGCGCACTTGTCC...3' (3) 5'.CACAACATGCTAAACGACCTTTCTCTGACCAGTGATTCTTAACGCGAGTCGCCTTAATTAA CGTCAAACAACATTGCCGCCCCCGTCAAAATCCAGGTCCTTGCCAAGCTCTGGCTAATTCGGTA TGCGACGCGCACTTGTCCTG...3' (4) 5'.TCGAGAGGCCAAGGGTTTGCCTACCATGTCAGCCACGGCGCGGAAGGCAAACGTCATGGC CGGCCCCAGGGTGGAGCCAGCGCCGGCGTAGGCCCCATGAGGAGGCGGAGTTGTTGCCCAGAA TAAGCTGATGATCTGCTTGGTGTGAGAAGGCT...3' (5) 5'.TTCCAGCAGGCCATGCTGGCCTGAAAATCCCAAGGGCAATGGCCGGTGTGCCGVGCAATGGA TGGATTGTTGTTCGAGCCACTTCCGCGCGCAAAACCCATGGCCGCTGATGCCAGGCTCGGCC GTGCCAGACAGAAGGTGCGCAAGAGTTGGCTGAAAAATGTCTACTGGAAGGGCGAGACGTGGA AGATCCAGAGTCGACTGCAGGCATGCAAGTTGGCGTAATCATGGTCATAGCGTGTCTGTTGAA TTGTTATCGTAATTCAAAATAGAGCGG...3' (6) 5'.TGCATGATTAACAGCCTTCGTCAAATTGCCCGTCATCCAGCTTGCACTTGCATTCGTCATC GCGCGCACTTCCTGCAGCCCAGCACTGGACGCCAGCTGCCGCAGATCTTCCACTCTCGCCCT TCCATAGACATGTGTTCACGCCAGCTCTTGCGCACCTTGCTGTGCTGGCACGGCCAGCCTGGC ATCAGCGGCCCTCATGGGGTTTTGCGCGCGGAAGCTGGCGTCGAACACAATCCATGCAGGCAC ACCGCCAGTTGCCCTTGGCATTGTTCGGCCAGGCATGGCCTTGCTGG...3' (7) 5'.TTGACGGCAGTTCCGCGCGCAACATGGGGCCGTATGCCAAGCTCGGCCGTGCCAGACAGCA AGGTGCGCAAGAGCTGGCTGAACAATGTCTTACTGGAAGGGCACACGCTGGAAGATCTGGCGCG CCAAGATCGGCGTGGAGCGTGCTGGG...3' (8) 5'.GCGAGACCATGGAATGCGCCTCGAAGGCCACTGATGCTCAATGCGGCCGAACAACTGGCC GCCGGGAGGGCCGGGGCGATGGTTTCATGTCCGTCACCCAGCCTGGCGGCATTGAAGTCCACC GGGTCCATGGAGCGGCCACGGGCTGGAGCCTTCGATAATGGGGGTAGTAGTCGCATACTTGCC ATGCGCGATAAGGGTCCGATTGCAGGTACTCGGCATTGCTCGCGTTT...3' (9) 5'.CCGTCATGCGACGATCGCGCCTGGTATGTTGCGCCAGGGGTAGTCCAGAAAATACTTGAG CAATGATGCCCAGGATGGTGAAGCGCGACCTGTGCGCTGACATCCTCTCAACAATGACACCCG TCACGCGGCCCGATGCATCCTGCACCAGCTCCTGAGCGGAGAGTTGCACCACATCTAGCCGCC GGCCTTGTTGGCAGCACTCAGCAGGCCTGCCACCAGCGCCTGGCCGC...3' (10) 5'.AATCGCCTCGAAGGCACTGAAGTCTCATGCGGCCGAACAACGTGGTTGCCGGGAGGCCGGG GCATGGTTTCAGTGCCGTACGCAGCTGCGATTGAGTCACGGGTCATGGTGCGGCCACGGCGAGC TTGATATGGTAGTAGTCATATTGCATGCTAGGTCATTGCAGTATGCATT...3' (11) 5'.CCTTCTCCGCAACTTATGATGGACTGTCGTCGCAAATACACGCTGCGGCAGCCTCCGTAT CGGAGCGTGCGAGCTGCTGACTGAATCAATCAGACAAAAGGTCCTGGTTGGGAATGCCCAGTC CCAGCACATGCGAGCCATAGGCGCGCACATAGGCATCCGTATGTTCGCAATGTGGGTCAGTCC CTGATGGATGTCGCGGAAGATGCGCTCGATGGGATTGTTCTTGAAG 3' (12) Des fragments d'acide nucléique conformes à l'invention sont, par exemple, des fragments d'ADN double brin, obtenus à partir du génome de Pseudomonas testosteroni par l'action d'une ou plusieurs enzymes de restriction appropriées. De façon particulièrement avantageuse, un fragment conforme à l'invention est constitué par un fragment d'ADN double brin, lequel fragment a une taille de 2,1 kb environ, résulte de la restriction de l'ADN de Pseudomonas testosteroni par l'enzyme KpnI, et porte en outre les sites de restriction suivants : BglII, EcoRI, HincII, PstI, SacI, XhoI. La présente invention a également pour objet des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'ils contiennent un fragment d'acide nucléique tel que défini plus haut. On entend par vecteur recombinant, une séquence d'acide nucléique résultant de la recombinaison d'une séquence d'acide nucléique capable de s'autorépliquer, et d'une séquence d'acide nucléique que l'on souhaite cloner et amplifier. Des vecteurs recombinants sont par exemple, constitués par des plasmides, des virus tels que des bactériophages, ou des cosmides. Lesdits vecteurs recombinants peuvent également être des vecteurs d'expression, portant des séquences nucléotidiques qui contrôlent la transcription et la traduction d'une séquence codante insérée en un site approprié dudit vecteur Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, un vecteur recombinant est constitué par le plasmide dénommé pTEK21, lequel plasmide résulte de l'insertion dans le plasmide pUC18 du fragment d'ADN de 2,1 kb défini plus haut. De façon avantageuse, lesdits vecteurs contiennent en outre des séquences assurant la régulation de l'expression de ce gène telles que, par exemple, des séquences permettant un contrôle de l'expression dudit gène en fonction de conditions du milieu ambiant, comme par exemple la température Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, un tel vecteur d'expression est constitué par le plasmide recombinant dénommé pLE689, lequel résulte de l'insertion dans le plasmide pNM185 de la séquence nucléotidique codant pour la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, associée à d'autres séquences nucléotidiques issues du génôme de Pseudomonas testosteroni, lesquelles séquences jouent un rôle dans l'expression et/ou dans la régulation de l'expression du gène de la A1-déshydrogénase. Le plasmide pNM185 est décrit dans la publication de MERMOD et al., [J.Bacteriol., 167:447-454, (1986)] La présente invention a également pour objet des micro-organismes transformés par l'un des vecteurs recombinants définis plus haut. Des clones de Es cheri chia coli, de Pseudomonas putida, et de Pseudomonas aeruginosa, transformés par les vecteurs mentionnés ci-dessus, ont fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), le 24 janvier 1990 - le clone de E.coli DH5a transformé par le plasmide pTEK21 porte le numéro de dépôt I-922 ; - le clone de E.coli RR1 transformé par le plasmide pLE689 porte le numéro de dépôt I-923 ; - le clone de P. putida KT2440 transformé par le plasmide pLE689 porte le numéro de dépôt I-924 ; - le clone de P. aeruginosa PAO1161 transformé par le plasmide pLE689 porte le numéro de dépôt I-925 ;; Les micro-organismes transformés par l'un quelconque des plasmides conformes à l'invention sont utilisables pour le clonage et l'amplification dudit plasmide, portant le gène de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni. En outre, des micro-organismes appropriés, transformés par un plasmide capable de se répliquer dans ceux-ci et permettant l'expression du gène de la A1-déshydrogénase, peuvent être utilisés, de façon avantageuse, dans la biotransformation des sté roïdes, car l'activité A1-déshydrogénase exprimée par ces micro-organismes n'est pas contaminée par d'autres activités de dégradation des stéroïdes. La présente invention a également pour objet des sondes d'acide nucléique permettant la détection du gène de la A1-déshydrogénase, ou d'un gène apparenté, chez Pseudomonas testosteroni, ou chez d'autres microorganismes portant un tel gène, lesquelles sondes sont caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un des fragments d'acide nucléique conformes à l'invention, tels qu'ils ont été définis précédemment, associé à au moins un moyen de détection approprié. La présente invention a en outre pour objet toute chaîne polypeptidique comprenant une séquence d'acides aminés dérivée de la séquence nucléotidique codant pour la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni. La présente invention a en outre pour objet un procédé de préparation de la A1 -dé shydrogénase de Pseudomonas testosteroni, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) culture d'un micro-organisme contenant un vecteur permettant l'expression du gène de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni b) isolement, à partir de ladite culture, de l'enzyme produite. La A1-déshydrogénase ainsi purifiée peut être avantageusement utilisée dans toutes les applications connues des préparations de A1-déshydrogénase, par exemple pour le dosage des stéroïdes. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de fragments d'acide nucléique conformes à l'invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I) PURIFICATION ET CLONAGE DE FRAGMENTS POR TANT LA SEQUENCE CODANT POUR LA A1-DESHYDROGENASE DE PSEUDOMONAS TESTOSTERONI. EXEMPLE 1: Préparation d'une sonde permettant la localisation de la séquence codant pour la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni. Cette sonde a été obtenue à partir de l'ADN de mutants dérivés de la souche de P.testosteroni désignée par le numéro de dépôt ATCC 17410. a) Mutagenèse La mutagenèse de la souche P. testosteroni ATCC 17410 est réalisée en utilisant le transposon Tn5 portant un gène de résistance à la kanamycine, inséré dans le vecteur suicide pSUP2021. Ce vecteur est transféré à partir d'E. coli S17-1. Lors de la conjugaison entre E. coli S17-1 et P.testosteroni ATCC 17410, le transfert du vecteur pSUP2021 se produit avec une fréquence élevée. La sélection des clones de P.testosteroni contenant le transposon Tn5 est effectuée sur un milieu de culture minimum (milieu M9) contenant 5mM de parahydroxybenzoate de sodium, et 500 Rg/ml de kanamycine. 5200 clones de la souche ATCC 17410, résistants à la kanamycine sont isolés. Parmi ces clones, 41 n'utilisant pas la testostérone comme seule source de carbone sont sélectionnés. L'un de ces 41 clones (clone 06) présente une très faible activité A1-déshydrogénase. L'ADN total du clone 06 est extrait et hydrolysé par EcoRI . Les fragments EcoRI ainsi obtenus ont été insérés dans pUC19 selon la procédure de religation aléatoire par la T4 ligase. Le mélange de ligation ainsi obtenu sert à transformer des cellules compétentes d'E. coli DHSa [fournies par GIBCO BRL, 14, rue des Oziers - 95051 CERGY PONTOISE CEDEX]. Les clones bactériens contenant le transposon Tn5 sont sélectionnés par leur résistance à la kanamycine. L'un de ces clones, porteur d'un plasmide recombinant pUC19 contenant un insert EcoRI d'environ 14kb est choisi. Un fragment BamHI-EcoRI de 0,8kb, adjacent à Tn5 est sélectionné pour être utilisé comme sonde. Ce fragment est sous cloné dans le plasmide pUC19 suivant la procédure suivante : hydrolyse de l'insert EcoRI de 14kb par BamHI, séparation du fragment BamHI-EcoRI par électrophorèse en gel d'agarose, purification par électroélution du gel, puis marquage par le [32p] dCTP par la méthode dite de nick translation. EXEMPLE 2: Obtention d'un fragment de 8,3kb portant le gène de la A1-déshydrogénase. L'ADN total de Pseudomonas testosteroni est extrait par précipitation à l'éthanol après lyse de la bactérie par le SDS. Cet ADN est hydrolysé par l'enzyme de restriction SalI dans les conditions suivantes : incubation à 37"C pendant 2 heures de l'ADN avec l'enzyme à raison de 3 unités par Rg d'ADN. Les fragments obtenus sont insérés dans le plasmide pUC19, par l'action de la T4 ligase. Les plasmides recombinants obtenus sont utilisés pour transformer la souche bactérienne E. coli DH5a dans les conditions définies par GIBCO BRL, fournisseur des cellules compétentes. La banque ainsi obtenue est criblée par hybridation avec la sonde de 0,8kb obtenue selon la procédure décrite à l'exemple 1. 5 clones contenant un fragment SalI de 8,3kb sont ainsi obtenus. EXEMPLE 3: Préparation du plasmide pTEK21 On procède au sous-clonage du fragment KpnI de 2,lkb à partir du fragment SalI de 8,3kb : le fragment de 8,3 kb est hydrolysé par l'enzyme KpnI. Le fragment de 2,lkb libéré est séparé par électrophorèse en gel d'agarose et purifié. il est ensuite religué dans un vecteur pUC18, préalablement linéarisé par KpnI. La carte de restriction de l'insert de 2,1 kb est illustrée par la figure 1. La présence du gène de la A1-déshydrogénase sur ce fragment de 2,1 kb est mise en évidence par la détection des produits résultant de l'action de cette enzyme. Le protocole opératoire utilisé pour cette détection est détaillé plus loin (exemple 3). II) SEQUENCAGE DU GENE DE LA A1-DESHYDROGENASE DE PSEUDOMONAS TESTOSTERONT. Le séquencage du fragment KpnI de 2,1 kb est effectué en utilisant la méthode de SANGER de marquage enzymatique aux di-désoxynucléotides en présence de désoxyribonucléotides marqués au [35S]. III) MISE EN EVIDENCE DE L'EXPRESSION DU GENE DE LA Al-DESHYDROGENASE DE PSE=DQMONAS TESTOSTERONI DANS DES CELLULES BACTERIENNES TRANSFORMEES. La souche E. Coli DH5a renfermant le plasmide recombinant pTEK21 est cultivée en bouillon nutritif, à 30 C, en présence de substrat de la A1-déshydrogénase (1,75mM de A4-androstène-3,17-dione). Après 16 h d'incubation, les stéroïdes sont extraits par 1 l'acétate d'éthyle et analysés par chromatographie en couche mince de silice, en utilisant un mélange solvant dichlorométhane/dioxanne. Le métabolite A1-déshydrogéné (#1,4-androstadiène 3,17-dione) apparaît aux rayons ultra-violets sous forme d'une tache caractéristique. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1) Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué par: a) la séquence nucléotidique codant pour la Al-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, b) la séquence nucléotidique régulant l'expression du gène de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, c) les séquences nucléotidiques homologues ou complémentaires de tout ou partie de l'une ou l'autre des séquences définies en a) ou b). 2) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu il est constitué par un fragment d'ADN double brin, isolé à partir du génome de Pseudomonas testosteroni. 3) Fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence suivante; 5' ACCCCACCGGCATTACGACCACACCGCCCGACAGCACACATTGGCCACCGCCACCGCCTGAAG CTCGATCACAGAATTTGCCCCTGCTCGCGCGCCTAATGTGCATGGCACTGCCCCTCCAGCGAC ACACATGTGGATGGACATCAACTATGGCGAATAGGTTCAAGGTTGTGGTGTGATGTTTTAGAT GGATTTGTTGGATTGAGAGTGGTTGGAGTCATATAGGAATGGA...3' (1) 5'.CGAGAGGCAAGGGTTTGCCTACCATGTCAGCCACGGCGGCGCGGAAGGCAACGTCATGGCC GGCCCCAGGGTGGAGCCAGCGCCGGCGTAGGCGCCATAGCCCCATTGACGGAGGCGGAGTTG TTGCCCACGCAATACACCCCTCGATGATCCTGCCTTGCGTTCGAGCACACGGCTTTCCTGTCG GTCAGCACCCCTTGGTGCGATTACGG...3' (2) 5'.CCACGCAATACACCCCTCATATCCTGCCTTCTGTCAGCACACGGCCTTCCTTCGTCACACC CCCCCATGATGCCGATCGCACCGGGCCACAACGCATGGCGTAAAACGGACCTTTCTCATGGGAC CCAGTTGGATTCTTGAAACGCGGAACGCCGGTAATAACGGTCAAACAACATTCCGCCCCGGTCA AAAGTCCAAGGTCCTTGCCAAGCTCTGGCGTAATTCGGTCAATGCGACGCGCACTTGTCC...3' (3) 5'.CACAACATGCTAAACGACCTTTCTCTGACCAGTGATTCTTAACGCGAGTCGCCTTAATTAA CGTCAAACAACATTGCCGCCCCCGTCAAAATCCAGGTCCTTGCCAAGCTCTGGCTAATTCGGTA TGCGACGCGCACTTGTCCTG...3' (4) 5'.TCGAGAGGCCAAGGGTTTGCCTACCATGTCAGCCACGGCGCGGAAGGCAAACGTCATGGC CGGCCCCAGGGTGGAGCCAGCGCCGGCGTAGGCCCCATGAGGAGGCGGAGTTGTTGCCCAGAA TAAGCTGATGATCTGCTTGGTGTGAGAAGGCT...3' (5) 5'.TTCCAGCAGGCCATGCTGGCCTGAAAATCCCAAGGGCAATGGCCGGTGTGCCGVGCAATGGA TGGATTGTTGTTCGAGCCACTTCCGCGCGCAAAACCCATGGCCGCTGATGCCAGGCTCGGCC GTGCCAGACAGAAGGTGCGCAAGAGTTGGCTGAAAAATGTCTACTGGAAGGGCGAGACGTGGA AGATCCAGAGTCGACTGCAGGCATGCAAGTTGGCGTAATCATGGTCATAGCGTGTCTGTTGAA TTGTTATCGTAATTCAAAATAGAGCGG...3' (6) 5'.TGCATGATTAACAGCCTTCGTCAAATTGCCCGTCATCCAGCTTGCACTTGCATTCGTCATC GCGCGCACTTCCTGCAGCCCAGCACTGGACGCCAGCTGCCGCAGATCTTCCACTCTCGCCCT TCCATAGACATGTGTTCACGCCAGCTCTTGCGCACCTTGCTGTGCTGGCACGGCCAGCCTGGC ATCAGCGGCCCTCATGGGGTTTTGCGCGCGGAAGCTGGCGTCGAACACAATCCATGCAGGCAC ACCGCCAGTTGCCCTTGGCATTGTTCGGCCAGGCATGGCCTTGCTGG...3' (7) 5'.TTGACGGCAGTTCCGCGCGCAACATGGGGCCGTATGCCAAGCTCGGCCGTGCCAGACAGCA AGGTGCGCAAGAGCTGGCTGAACAATGTCTTACTGGAAGGGCACACGCTGGAAGATCTGGCGCG CCAAGATCGGCGTGGAGCGTGCTGGG...3' (8) 5'.GCGAGACCATGGAATGCGCCTCGAAGGCCACTGATGCTCAATGCGGCCGAACAACTGGCC GCCGGGAGGGCCGGGGCGATGGTTTCATGTCCGTCACCCAGCCTGGCGGCATTGAAGTCCACC GGGTCCATGGAGCGGCCACGGGCTGGAGCCTTCGATAATGGGGGTAGTAGTCGCATACTTGCC ATGCGCGATAAGGGTCCGATTGCAGGTACTCGGCATTGCTCGCGTTT...3' (9) 5'.CCGTCATGCGACGATCGCGCCTGGTATGTTGCGCCAGGGGTAGTCCAGAAAATACTTGAG CAATGATGCCCAGGATGGTGAAGCGCGACCTGTGCGCTGACATCCTCTCAACAATGACACCCG TCACGCGGCCCGATGCATCCTGCACCAGCTCCTGAGCGGAGAGTTGCACCACATCTAGCCGCC GGCCTTGTTGGCAGCACTCAGCAGGCCTGCCACCAGCGCCTGGCCGC...3' (10) 5'.AATCGCCTCGAAGGCACTGAAGTCTCATGCGGCCGAACAACGTGGTTGCCGGGAGGCCGGG GCATGGTTTCAGTGCCGTACGCAGCTGCGATTGAGTCACGGGTCATGGTGCGGCCACGGCGAGC TTGATATGGTAGTAGTCATATTGCATGCTAGGTCATTGCAGTATGCATT...3' (11) 5'.CCTTCTCCGCAACTTATGATGGACTGTCGTCGCAAATACACGCTGCGGCAGCCTCCGTAT CGGAGCGTGCGAGCTGCTGACTGAATCAATCAGACAAAAGGTCCTGGTTGGGAATGCCCAGTC CCAGCACATGCGAGCCATAGGCGCGCACATAGGCATCCGTATGTTCGCAATGTGGGTCAGTCC CTGATGGATGTCGCGGAAGATGCGCTCGATGGGATTGTTCTTGAAG 3' (12) 4) Fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'ADN double brin, lequel fragment a une taille de 2,1 kb environ, résulte de la restriction de 1'ADN de Pseudomonas testosteroni par l'enzyme KpnI, et porte en outre les sites de restriction suivants : BglII, EcoRI, HincII, PstI, SacI, XhoI. 5) Vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'ils contiennent un fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6) Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide dénommé pTEK21, lequel plasmide résulte de l'insertion dans le plasmide pUC18 du fragment d'ADN de 2,1 kb selon la revendication 4. 7) Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il constitue un vecteur d'expression du gène de la A1-déshydrogénase. 8) Vecteur d'expression selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est constitué par le plasmide recombinant dénommé pLE689, lequel plasmide résulte de l'insertion dans le plasmide pNM185 de la séquence nucléotidique codant pour la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni. 9) Clones de micro-organismes transformés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 5 à 8. 10) Clone selon la Revendication 9, déposé à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) sous le N I-922, et constitué par des cellules bactériennes de la souche E. coli DH5a, contenant le plasmide pTEK21 11) Clone selon la Revendication 9, déposé à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) sous le N'I-923, et constitué par des cellules bactériennes de la souche E. coli RR1, contenant le plasmide pLE689. 12) Clone selon la Revendication 9, déposé à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) sous le N" I-924, et constitué par des cellules bactériennes de la souche P. putida KT2440, contenant le plasmide pLE689. 13) Clone selon la Revendication 9, déposé à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) sous le N I-925, et constitué par des cellules bactériennes de la souche P. aeruginosa PAO1161, contenant le plasmide pLE689. 14) Application des micro-organismes, transformés par un vecteur d'expression selon une quelconque des revendications 7 ou 8, à la biotransformation des stéroïdes. 15) Application des micro-organismes, transformés par un vecteur d'expression selon une quelconque des revendications 7 ou 8, à la production de A1~ déshydrogénase. 16) Réactifs de diagnostic, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins un fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 ou 2, associé à au moins un moyen de détection approprié. 17) Chaîne polypeptidique comprenant une séquence d'acides aminés dérivée de la séquence nucléotidique codant pour la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni. 18) Procédé de préparation de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) culture d'un micro-organisme contenant un vecteur permettant l'expression du gène de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, b) isolement, à partir de la culture, de la A1-déshydrogénase produite par ledit micro-organisme. 19) Application de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, purifiée par le procédé selon la revendication 17, à la synthèse des stéroïdes 20) Application de la A1-déshydrogénase de Pseudomonas testosteroni, purifiée par le procédé selon la revendication 17, au dosage des stéroïdes.