Brevet FR2655853A1 — publié le 19910621

I La présente invention a été faite au Laboratoire de Biologie Cellulaire de l'Université de POITIERS, Unité de Recherche Associée au Centre National de la Recherche Scientifique, N O 290. La présente invention concerne un procédé de culture intensive in vitro de Babesia divergens, de préparation d'exoantigènes et de protéines parasitaires et leur utilisation comme vaccin. Les babésioses, encore appelées piroplasmoses, sont des parasitoses intraérythrocytaires fréquentes chez les animaux domestiques et sauvages (bovins, chiens, chevaux, rongeurs notamment) et plus rares chez l'homme ( 16 cas cliniques en Europe, 200 environ aux Etats Unis ont été décrits depuis 1957) Elles sont transmises par des Acariens hématophages (tiques) et éventuellement chez l'homme par transfusion sanguine. Il existe de nombreuses espèces de Babesia. Parmi les différentes babésioses animales, la babésiose bovine causée par B bovis (= B argentina), B bigemina, B major, B divergens, est la plus importante du point de vue économique. En Europe, la babésiose bovine à B divergens provoque une mortalité limitée grâce à une chimiothérapie efficace (par exemple l'imidocarbe) Toutefois, des cas de chimiorésistance commencent à être observés, en particulier en France (Ecole Nationale Vétérinaire, Nantes). Par contre, la morbidité de l'infection est à l'origine de pertes économiques importantes. Dans les pays en voie de développement, la babésiose bovine représente un obstacle majeur à l'augmentation de la productivité de l'élevage bovin et une des principales causes de pertes économiques enregistrées dans certaines régions d'Afrique. Il existe plusieurs méthodes de lutte contre les Babesia lutte contre les arthropodes vecteurs (tiques), chimiothérapie antiparasitaire curative ou préventive, vaccination des animaux contre les Babesia: à l'heure actuelle, seuls sont utilisés à grande échelle les vaccins contre la babésiose bovine à B bovis et à B bigemina (Australie, Amérique latine, Israël, Afrique du Sud) et contre la babésiose canine à B canis (France); aucun vaccin commercialisé n'existe encore contre B divergens et B major, espèces responsables de la babésiose bovine en Europe, seul Taylor a proposé un vaccin obtenu à partir de sang de bovin parasité (GB-A-2 200 638) Parmi les vaccins anti-Babesia décrits, il existe deux types majeurs: les vaccins vivants et les vaccins inactivés (leurs avantages et inconvénients sont résumés dans le tableau 1). Les exoantigènes parasitaires recueillis dans les surnageants de culture ont déjà été utilisés pour la vaccination contre la babésiose bovine à B bovis et B bigemina (EP-0 018 579 BI) et la babésiose canine à B canis (EP-0 220 988 AI). Type de vaccin VACCINS VIVANTS: a) "Prémunisation" (infection puis chimiothérapie) b) Parasites irradiés c) Parasites atténués (passages rapides chez l'animal) VACCINS INACTIVES: Préparés à partir de bovins infectés: a) Antigènes figurés b) Antigènes solubles extraits d'hématies parasitées surnageants de lyse c) Antigènes solubles plasmatiques Préparés à partir de cultures in vitro: Exoantigènes solubles isolés de surnageants de culture Reproductibilité faible faible variable faible faible bonne faible bonne Tableau 1 Facilité Risque Risque de d'exploitation infectieux réveil de la commerciale potentiel virulence de la souche non non non non non oui non oui oui oui non non non non non oui ? oui non non non non non Risque Efficacité d'isoimmunisation du vaccin érythrocytaire faible faible faible élevé élevé faible faible faible bonne bonne bonne faible faible bonne faible bonne (n (n (n La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'exoantigènes et de protéines permettant d'obtenir un vaccin contre la babésiose bovine à B divergens et qui peut être étendu à d'autres espèces de Babesia. Le procédé de culture de Babesia est caractérisé en ce que la souche de Babesia est maintenue en culture sur un milieu de culture exempt de protéine sérique, mais contenant des lipoprotéines ainsi que des hématies. Les lipoprotéines utilisables selon la présente invention sont de préférence d'origine naturelle, notamment d'origine humaine. Parmi ces lipoprotéines, il faut citer plus particulièrement la lipoprotéine de haute densité, dénommée ci-après "HDL" "High Density Lipoprotein". Les index de multiplication de Babesia divergens en culture in vitro en milieu semi-défini sont comparables à ceux obtenus avec les milieux complexes contenant de 5 à 10 % de sérum humain. Cette nouvelle technique peut être adaptée à la culture in vitro d'autres espèces de Babesia telles que B bovis, B bigemina, B canis, B equi, B major, B microti. L'emploi de milieu semi défini permet la purification des exoantigènes présents dans le milieu et présente des avantages pour la culture de Babesia: diminution des risques de contamination des expérimenta- teurs par la présente éventuelle de virus dans les sérums (virus de l'hépatite, HIV); bonne reproductibilité du développement des parasites qui n'est plus dépendante de la variabilité des lots sériques; suppression des problèmes d'incompatibilité sérum/hématie et possibilité d'utiliser toutes les hématies du système ABO. Ce milieu semi-défini à base de lipoprotéines comporte de préférence des fractions HDL à une concentration comprise entre 0,2 et mg/ml, en particulier 0,5 et 3 mg/ml, additionnées ou non de LDL, à une concentration comprise entre 0,5 et 1,5 mg/ml Ce milieu peut contenir également des facteurs de croissance comme l'insuline bovine à une concentration comprise entre 0,5 et 10 iig/ml, la transferrine humaine à une concentration de 10 à 200 pg/ml, le selenium et la Béta-cyclodextrine. Ces milieux de culture exempts de protéine sérique sont connus Il s'agit par exemple de milieux tels que le RPMI 1640 utilisé pour les cultures cellulaires Ces milieux sont en général complémentés par des protéines sériques notamment par du sérum de veau foetal; dans le cas présent le complément est constitué par des lipoprotéines. Ces milieux sont connus de l'homme de métier et ne seront pas décrits plus avant On utilisera parfois pour ces milieux la terminologie d'équivalents au milieu RPMI 1640. Ce procédé de culture permet notamment la préparation d'exoantigènes de Babesia, lesquels sont isolés du milieu de culture. B divergens produit des exoantigènes dans le surnageant de culture, dont certains induisent une immunoprotection chez les animaux vaccinés L'emploi de milieu semi-défini permet le recueil des antigènes parasitaires candidats à la stimulation de l'immunité humorale et/ou de l'immunité à médiation cellulaire, en s'affranchissant des problèmes liés à la présence dans le milieu de culture de protéines plasmatiques majeures (albumine, immunoglobuline) Le procédé permet de réaliser une concentra- tion plus élevée de l'antigène en lui conservant une bonne solubilité Il améliore de même la purification des facteurs sériques protecteurs. Dans le cas de B divergens et B canis, le recueil d'antigènes se heurtait jusqu'ici aux difficultés de maintien des cultures en continu par les méthodes précédemment décrites Ainsi, lors de la culture de B canis utilisée pour le vaccin Pirodog (Rhône Mérieux), la parasitémie tombe en dessous de 1 %, en trois semaines (Moreau Y et Laurent N, In: "Malaria and Babesiosis", Ristic M, Ambroise-Thomas P, Kreier J P (eds), Martinus Nijhoff, Dordrecht, Hollande, 1984, 132) Cette situation entraînait donc la nécessité d'initier régulièrement de nouvelles cultures avec des hématies de chiens parasités. Les faibles parasitémies décrites dans la littérature obtenues lors de la culture de B divergens en hématies de bovins, l'utilisation de concentrations élevées de sérum bovin, ne permettent ni l'accumulation de grandes quantités d'antigènes parasitaires dans les surnageants de culture, ni une séparation aisée de la fraction protéique vaccinante; ces antigènes sont présents en très faible quantité dans le surnageant par rapport aux protéines sériques bovines. La souche de B divergens cultivée selon le procédé de l'invention et notamment sur hématies humaines depuis juin 1987 ne nécessite pas de changement de milieu quotidien pour des parasitémies inférieures à 5 % Comme il s'agit d'une culture continue, il n'est pas nécessaire d'initier régulièrement les cultures avec du sang de bovins ou de gerbilles parasités. Les exoantigènes de B divergens obtenus par ces procédé de culture peuvent être purifiés, concentrés et analysés après marquage par des acides aminés radioactifs On met ainsi en évidence les perturbations provoquées par les protéines sériques lors de la séparation des protéines parasitaires. L'analyse par gel filtration (colonne Superose 12, FPLC Pharmacia), permet de détecter trois ensembles de protéines parasitaires radiomarquées dans les surnageants provenant de milieux semi-définis, alors que la même expérience réalisée en présence de milieu complet ( 10 % de sérum) montre un seul pic majeur de radioactivité dû à une accumulation provoquée par la présence de protéines sériques. Les protéines solubles du surnageant de B divergens qui confèrent une protection contre une infection ont les masses moléculaires relatives suivantes: 31-33 k Da (doublet), 35-37 k Da (doublet), 43 + 2 k Da, 46 + 3 k Da, 50 + 2 k Da, 66-68 k Da (doublet), 70 + 3 k Da, 80 + 3 k Da, 90 + 3 k Da, + 3 k Da, 130 + 3 k Da, 140 + 5 k Da et 150 k Da. La technique de culture selon l'invention en hématies humaines ou en hématies bovines peut être utilisée pour une production industrielle, dans des systèmes semiautomatisés mettant en oeuvre de grands volumes de milieux de culture. Les exoantigènes provenant du surnageant des cultures en milieu semidéfini peuvent être utilisés pour obtenir des fractions vaccinantes. Ces fractions vaccinantes peuvent être obtenues par purifica- tion plus ou moins poussée des surnageants de culture Ces fractions purifiées peuvent être utilisées en mélange avec des adjuvants d'immunité. Différents antigènes peuvent être isolés et utilisés pour produire des immunsérums et/ou des anticorps monoclonaux. Ces fractions anticorps peuvent être utilisées en thérapie ou bien dans des buts de diagnostics Les anticorps monoclonaux peuvent également être utilisés pour fractionner les surnageants de culture et purifier les exoantigènes par des procédés connus. La présente invention concerne également ces différentes fractions antigènes et anticorps tant pour l'usage en thérapie, en prévention et/ou le diagnostic. Sur les dessins annexés à la présente demande, la figure 1 représente l'autoradiographie des protéines des fractions HDL (fig IA) et LDL (fig l B) marqués à l'iode-125 selon McFarlane ( 1958); A: dans la fraction HDL les apoprotéines A 4,E, AI, A 2 sont détectées, la sérum albumine humaine (HSA) est présente en quantité variable selon les préparations de la fraction HDL; B: dans la fraction LDL, l'apoprotéine B-100 est majoritaire la figure 2 A représente l'électrophorèse en SDS-PAGE ( 10 % d'acryl- amide) du surnageant de culture in vitro de B divergens marqué métaboliquement avec de la 35-S-méthionine, I: kit de poids moléculaire 2: surnageant de culture en milieu semi-défini (H + L) 3: surnageant de culture en milieu sérique ( 10 % de sérum humain); la figure 2 B représente l'immunoprécipitation de culture in vitro de B divergens marqué à la 35-S-méthionine par un immunsérum humain, 1: kit de poids moléculaire 2: surnageant de culture en milieu sérique ( 10 % de sérum humain) 3: surnageant de culture en milieu semi-défini (H + L) 4: antigènes totaux B divergens en milieu sérique ( 10 % de sérum humain) : antigènes totaux B divergens en milieu semi-défini (H + L) la figure 3 représente la séparation en gel filtration (colonne Superose 12, Pharmacia) des antigènes parasitaires présents dans le surnageant de culture de B divergens marqué à la 35-S-méthionine; la figure 4 illustre l'immunoprécipitation de cultures de B divergens marquées métaboliquement à la 35-S-méthionine. Exemple 1 Conditions de culture continue de B divergens en hématies humaines a) Souches de B divergens La souche de B divergens utilisée dans la présente stratégie de vaccination est une souche humaine recueillie à Rouen, en juin 1987, et maintenue en culture in vitro sur hématies humaines depuis cette date Elle sera désignée par B divergens souche Rouen 1987 Bien entendu, il est possible d'utiliser d'autres souches, celle-ci n'étant mentionnée qu'à titre d'exemple spécifique. Toute souche bovine de B divergens peut être mise en culture en hématies humaines en réalisant, dans un premier temps, une culture mixte hématies de bovins/hématies humaines ou hématies de gerbilles/ hématies humaines Dans le dernier cas, le sang parasité de gerbilles provient indifféremment de gerbilles infectées soit par du sang frais (ou cryoconservé) de bovins parasités, soit par du sang frais (ou cryoconservé) de gerbilles parasitées. Plusieurs centaines de souches bovines recueillies en France dans les zones à B divergens, cryoconservées dans l'azote liquide après passages préalables chez la gerbille, ont été rassemblées à l'Ecole Nationale Vétérinaire de Nantes (A Marchand). b) Milieu de culture continu Sa composition est la suivante RPMI 1640 10, 4 g Na HCO 3 2,1 g/I HEPES 8,3 g/l H 2 O qsp 900 m I Le p H est ajusté à 7,3 ( 7,2-7,4). On ajoute ensuite 100 ml de sérum humain décomplémenté par chauffage à 560 C pendant 30 minutes et éventuellement de la gentamycine ( 0,1 à 1 mg/l). Le DMEM, le MEM ou tout milieu synthétique équivalent pourront être utilisés à la place du RPMI 1640. Le milieu est ensuite filtré sur filtre 0,22 pm Le sérum humain utilisé est un mélange de sérums de sujets sains de groupes sanguins différents ou identiques dans le système A, B, O (sérologies virales négatives). Des sérums bovins décomplémentés, préalablement sélectionnés pour leur non-agglutination d'hématies O O peuvent aussi être utilisés. C'est dans ce milieu de culture continu (RPMI + 10 % sérum humain) que les souches humaines isolées à Rouen et au Mans sont maintenues depuis respectivement juin 1987 et mai 1988. c) Hématies Les hématies utilisées sont des hématies humaines, habituelle- ment de groupe O O, mais la culture de B divergens est réalisable dans des hématies de tout autre groupe sanguin du système A, B, O Dans ce dernier cas, s'il est préférable d'utiliser un sérum compatible, l'utilisation de sérums incompatibles est néanmoins possible car l'agglutination des hématies n'inhibe pas la croissance du parasite. Les sangs humains, recueillis stérilement sur anticoagulant de type A C D (acide citrique, citrate de sodium, dextrose) ou équivalent, peuvent être utilisés pour la culture pendant une durée maximale de 7 jours Avant mise en culture, les hématies sont lavées 2 fois en RPMI 1640, puis une fois en RPMI 1640 + 10 % sérum + gentamycine Le dernier culot de centrifugation d'hématies lavées est utilisé pour la culture. d) Condition de culture Quelle que soit la taille des boîtes de culture, l'hématocrite est compris entre 2 et 5 % Il faut en outre veiller à ce que le volume de la culture d'hématies soit adapté à la surface de la boîte de culture, à titre d'exemple, 5 ml de culture à hématocrite 2-5 % pour une boîte de culture conventionnelle de 25 cm 2. La culture de B divergens est effectuée à 370 C boîte fermée après gazage par un mélange gazeux ternaire: N 2: 91 %, 2 6 %, CO 2: 3 % boîte ouverte dans une cloche à bougie: CO 2: de l'ordre de 5 % boîte ouverte dans une étuve à CO 2: 5 %. Partant d'une parasitémie à 1 %, ces conditions de culture permettent d'atteindre régulièrement des parasitémies de 30 à 80 % après respectivement 3 à 5 jours de culture Le taux effectif de multiplication par 24 heures est voisin de 5 avec la souche B divergens souche Rouen 1987. Aucun changement de milieu n'est nécessaire avant que la parasitémie atteigne 5 % Un changement est effectué par 24 heures pour des parasitémies comprises entre 5 et 30 % Deux changements de milieu par 24 heures sont réalisés lorsque la parasitémie atteint 30 % Les surnageants des cultures dont la parasitémie est comprise entre 20 et 40 % sont recueillis: ils constituent la base du vaccin propose. Un repiquage de la souche humaine (Rouen 1987) de B divergens tous les 5 jours permet son maintien en culture continue depuis juin 1987. I 11 Exemple 2 Culture in vitro de B divergens dans des milieux semi-définis à base de lipoprotéines et de facteurs de croissance a) Préparation des lipoprotéines et des facteurs de croissance Les lipoprotéines sont préparées, en partant du sérum sanguin de donneurs sains, par ultracentrifugation différentielle selon la technique décrite par Havel et al, ( 1955, J Clin Exp Invest, 34, 1345-1353) La densité du sérum séparé après simple coagulation du sang sans additif (sang récolté sur flacon sec) est successivement ajustée à 1,019, 1,063 et 1,210 g/ml par addition de K Br et en présence d'EDTA ( 0,1 % final) Trois centrifugations successives de 22 heures à 120 000 g permettront d'isoler 3 fractions: "Very Low Density Lipoprotein" (VLDL) 1,006 1,019 g/ml "Low Density Lipoprotein (LDL) 1,019 1,063 g/ml "High Density Lipoprotein (HDL) 1,063 1,210 g/ml Les fractions LDL et HDL utilisées pour la culture sont dialysées à 4 C pendant 24 heures, d'abord contre une solution saline tamponnée à p H 7,4 avec du Tris-H Cl 5 m M, puis contre une solution de RPMI 1640 bicarbonate de sodium 17 m M, HEPES 25 m M (p H 7,4) Les solutions obtenues sont stérilisées par filtration sur filtre 0,22 pm et conservées à 4 C La quantité de lipoprotéines est estimée après dosage colorimétrique des protéines (Lowry et al, 1951, J Biol Chem, 193, 265275) en multipliant cette valeur par 2 pour les HDL et par 4 pour les LDL, il est en effet admis que les contenus en protéines des HDL et LDL sont respectivement de 50 et 25 % de la masse finale (Patsch et al, 1974, J Lip Res, 15, 356-366) La composition des apoprotéines des fractions isolées est contrôlée par électrophorèse en gel d'acrylamide à 15 % (SDS-PAGE). b) Milieu semi-défini permettant au moins 2 cycles de développement Le milieu de culture pour le développement in vitro de B divergens souche Rouen 1987 sur hématies humaines doit comprendre un mélange HDL, LDL, des facteurs de croissance additionnés dans le milieu RPMI 1640 ou milieux équivalents, HEPES 25 m M, Na HCO 3 17 m M, le p H est ajusté à 7,4 Ce milieu de base peut être complété par l'addition d'anbitiotiques. La fraction HDL totale, d'origine humaine, (d = 1,063- 1,210 g/ml), utilisée contient en général les apoprotéines AI 28 k Da, AII 17,4 k Da, AIV 45 k Da, C 6,6-8,8 k Da, et de la sérum albumine dont la quantité varie selon les préparations de la fraction HDL totale Les protéines de la fraction HDL peuvent être marquées spécifiquement à l'iode-125 selon la technique de McFarlane ( 1958, Nature, 182, 53) et détectées par SDS-PAGE et autoradiographie (Figure IA) Cette fraction HDL est utilisée à des concentrations comprises entre 0,5 mg et 2 mg/ml pour une parasitémie initiale de l'ordre de I % La concentration en apoprotéines des LDL totales dans le milieu est comprise entre 0,5 et 1,5 mg/ml et la technique précédente à l'iode-125 selon McFarlane montre un marquage majoritaire de l'apoprotéine B-100 (figure l B). La transferrine humaine et l'insuline bovine sont utilisées respectivement aux doses de 100 p Ig/ml ( 10-200 p Ig/ml) et 1 tig/ml ( 0, 5- Ig/ml) L'index de multiplication, défini comme le rapport entre le taux de parasitémie après réinvasion et le taux de parasitémie initiale, a été déterminé sur les différentes souches de B divergens cultivées en boîtes de 25 cm 2 Les incubations testées ont porté sur deux étapes de réinvasion, ce qui permet d'assurer que les parasites sont toujours viables au 2 ème cycle biologique consécutif à leur mise en culture en milieu semi-défini. Tableau 2 Index de multiplication entre le temps de mise en culture (TO) et la 36 ème heure de culture (T 36)et la période T 36 et 72 heures (T 72) (H, HDL, L, LDL) INDEX DE MULTIPLICATION T 0-36 T 36-72 Sérum 2,7 3,6 HL 2,7 2,6 Des cultures in vitro utilisant des HDL et des LDL additionnées de transferrine 50 pg/ml, sélénium 10 pg/ml et de béta-cyclodextrine 250 pg/ml ont également été effectuées Ces facteurs possèdent des propritétés stimulatrices des cultures (sélénium: inhibiteur des peroxy- dations; béta-cyclodextrine: inhibiteur de la toxicité de molécules présentes dans le milieu de culture) Des index de multiplications similaires aux précédentes ont été obtenus. Pour des parasitémies initiales élevées ( 15 à 20 %), les index de multiplication dans le milieu semi-défini HL sont similaires au milieu sérique de référence durant les 20 premières heures soit 2 cycles de développement érythrocytaire de B divergens (le cycle de multiplication de B divergens cultivé in vitro sur hématies humaines est en effet de l'ordre de 8 à 10 heures). Ces conditions de culture permettent la purification de protéines parasitaires solubles et notamment des exoantigènes. c) Milieu semi-défini simplifié pour l'obtention des protéines sécrétées au cours d'un cycle biologique Le milieu semi-défini ne contenant que la fraction HDL totale à 1 mg/ml permet de recueillir les protéines parasitaires libérées au cours des différentes étapes du cycle érythrocytaire et au moment de la réinvasion, notamment après marquage métabolique du parasite à l'aide d'acide(s) aminé(s) radioactif(s). Ce milieu permet donc une bonne maturation de B divergens, il serait possible de recueillir les antigènes produits pendant cette maturation et de les concentrer dans des conditions favorables caractérisées par l'absence de protéines plasmatiques dans le milieu de culture. Exemple 3 Obtention et purification des protéines de B divergens stimulatrices de l'immunité humorale et/ou de l'immunité à médiation cellulaire a) Marquage métabolique et obtention des protéines parasitaires Les cultures in vitro de B divergens sur hématies humaines sont incubées avec 40 Pi Ci/ml de L-l 35-Sl-méthionine (Amersham; supérieur à I Ci/pmole), dans du milieu RPMI 1640 ou équivalent sans méthionine additionné des constituants des milieux semi-définis D'autres acides aminés radioactifs peuvent être utilisés tels que la L-l 3 Hl-isoleucine ( 0,1 Ci/pmole) et la L-( 3 H)-histidine ( 0,05 Ci/lmole) Les milieux de culture contenant les protéines parasitaires sécrétées dans le milieu ou libérées lors de la réinvasion des globules rouges par les mérozortes sont centrifugés ( 600 g pendant 5 mn), puis filtrés sur filtres Millex 0,22 Pm pour éliminer les constituants particulaires Les protéines sont ensuite concentrées de 5 à 10 fois par ultrafiltration sur membranes (B 15 ou PMI O Centricon, Amicon) Les protéines parasitaires sont analysées par électrophorèse SDS-PAGE suivie d'une autoradiographie. b) Séparation des protéines parasitaires Les protéines parasitaires radiomarquées avec un ou plusieurs acides aminés peuvent être fractionnées par les techniques classiques de chromatographie liquide (échange d'ions, gel filtration, focalisation iso- électrique, caractère hydrophobe, etc) associées à une détermination de leur radioactivité par un compteur du type "Flow-one", modèle CR (Radiomatic, Tampa U S A) Les fractions de protéines parasitaires purifiées peuvent contenir les protéines de la fraction HDL mais se trouvent dépletées des nombreuses protéines sériques natives ou modifiées de l'hôte, susceptibles d'interférer avec la réaction immunitaire (humorale et/ou à médiation cellulaire). c) Identification des protéines parasitaires solubles de B divergens Les surnageants de culture in vitro de B divergens sur hématies humaines en présence de L-l 35-Sl-méthionine, concentrés par ultrafiltration montrent des modifications de migration électrophorétique dans le milieu complet ( 10 % sérum) pour les protéines de 40 à 70 000 (Figure 2 A) Les protéines solubles du surnageant de culture de B divergens qui confèrent une protection contre une infection peuvent être révélées par marquage métabolique à la 35-S-méthionine Elles ont les masses moléculaires relatives suivantes: 31-33 k Da (doublet), 35-37 k Da (doublet), 43 + 2 k Da, 46 + 3 k Da, 50 + 2 k Da, 66-68 k Da (doublet), 70 + 3 k Da, 80 + 3 k Da, 90 + 3 k Da, 110 + 3 k Da, 130 + 3 k Da, 140 + 5 k Da et 150 k Da. Parmi celles-ci, les plus immunogènes, révélées par immunoprécipitation chez tous les isolats testés ont des masses moléculaires variant de 34 à 37 k Da, de 43 à 46 k Da, de 69 à 72 k Da et de 90 à 100 k Da Les perturbations provoquées par les protéines sériques lors de la séparation des protéines parasitaires peuvent être confirmées par chromatographie liquide. Les surnageants d'une culture in vitro de B divergens (parasitémie 8 %), radiomarqués 12 heures à la L-l 35-Sl-méthionine peuvent, après filtration ( 0,22 tpm) être séparés par gel filtration (colonne Superose 12, FPLC Pharmacia) Trois ensembles de protéines parasitaires radiomarquées sont détectés dans les surnageants provenant de milieux semi-définis avec le compteur de radioactivité Flow-one, modèle CR (Figure 3) La même expérience réalisée en présence de milieu complet ( 10 % de sérum) montre un seul pic majeur de radioactivité dû à une accumulation provoquée par la présence des protéines sériques (figure 3). Les caractères antigéniques des parasites cultivés en milieu normal ou en milieux semi-définis sont similaires, aussi bien pour les protéines totales que pour les protéines solubles du parasite comme le montrent les expériences d'immunoprécipitation réalisées avec le même immunsérum (figure 2 B). Exemple 4 L'identification des protéines immunogènes de B divergens, à partir de culture in vitro sur hématies humaines, indispensable à la mise au point d'un vaccin, a nécessité l'étude de la réponse immunitaire à B divergens dans trois hôtes réceptifs: boeuf, homme, gerbille Pour cette étude, les immunsérums suivants ont éte utilisés: Immunsérums humains: Il s'agit de 5 sérums provenant de malades français et en particulier du malade traité avec succès à Rouen en juin 1987. Immunsérums de gerbilles: Les gerbilles ont été infectées expérimentalement par la souche B divergens, Rouen 1987 par 108 hematies parasitées/animal, puis traitées par de l'imidocarbe (Carbesia N D Lab. Coopers) quand la parasitémie a atteint 5 %, et enfin infectées par la même souche à plusieurs reprises, à partir du mois suivant Les animaux ainsi traités ont été protégés contre B divergens et désignés sous le nom de gerbilles super immunes. Immunsérums de veaux: Un veau splénectomisé (appelé VI) a reçu successivement 101 l hématies parasitées du malade de Rouen (souche Bdivergens, Rouen 1987), puis 1010 hématies de gerbilles parasitées par la même souche (les hématies du malade guéri ne pouvaient plus être utilisées). Un veau splénectomisé (appelé V 2) a reçu à deux reprises 1010 hématies de gerbilles parasitées par la même souche. 1) Identification dans des lysats d'hématies parasitées des protéines immunogènes de B divergens à l'aide d'immunsérums de boeuf, de gerbille et d'homme Un marquage métabolique de B divergens (souche Rouen 1987) cultivé in vitro sur hématies humaines a eté effectué selon les méthodes classiques à l'aide de la 35 S-méthionine, avec des temps d'incubation de 12 heures Les protéines immunoprécipitées grâce aux sérums du malade recueillis à partir du jour J 4 de l'épisode clinique jusqu'au 9 ème mois suivant ont eté analysées par électrophorèse SDS PAGE en milieu réducteur et autoradiographiées. Les anticorps dirigés contre le groupe de protéines de 35 k Da sont les premiers à apparaître. Une communauté antigénique, avec notamment les groupes de protéines majeures et des protéines mineures est observée quel que soit l'immunsérum utilisé. La figure 4 illustre l'immunoprécipitation de cultures de Babesia divergens marquées métaboliquement ( 35 S-méthionine) par différents immunsérums issus de a: gerbille b: homme c: boeuf (k = kit de poids moléculaires). 2) Immunoprécipitations des protéines parasitaires, présentes dans les surnageants de culture de B divergens (souche Rouen 1987) à l'aide des trois immunsérums (homme, gerbille, veau) Après élimination des immunoglobulines sériques par fixation sur de la protéine AStaphylococcus ou protéine A-Sépharose CL 4 B (Pharmacia), les surnageants de culture ont été immunoprécipités à l'aide des trois immunsérums (homme, gerbille, veau) précédents Ces immuno- précipitations ont permis de mettre en évidence des protéines majeures présentant la même mobilité électrophorétique en SDS-PAGE milieu réducteur chez les trois hôtes ( 30 à 100 k Da), ainsi que des protéines mineures pouvant présenter un poids moléculaire supérieur à 100 k Da et inférieur à 30 k Da. Exemple 5 Vaccin anti-B divergens 1) Antigènes vaccinants La vaccination est réalisée en utilisant comme antigènes les exoantigènes et protéines parasitaires recueillis dans le surnageant de culture in vitro sur hématies humaines de B divergens lorsque la parasitémie est de l'ordre de 30 à 40 % Le surnageant utilisé comme base de vaccin correspond à des cultures renfermant environ 108 hématies parasitées par ml de milieu Le milieu de culture contenant les antigènes parasitaires est centrifugé à 1500 g puis filtré stérilement sur filtre 0,22 pm La dose d'antigène vaccinant peut être adaptée, grâce aux procédés usuels de concentration des protéines, à l'animal à vacciner A la dose de protéines parasitaires contenues dans 0,2 ml dans le cas de la gerbille, est ajouté un volume correspondant de saponine à 1 mg/ml de RPMI 1640 à titre d'adjuvant pour obtenir une concentration finale de saponine à 0,5 mg/ml L'utilisation d'autres adjuvants est possible. 2) Utilisation de milieux de culture semi-définis pour le recueil des exoantigènes et protéines parasitaires Le milieu semi-défini décrit précédemment permet de recueillir les exoantigènes et protéines parasitaires avec une très faible contamination par les protéines sériques et présente par rapport aux brevets antérieurs un avantage certain (par exemple, le milieu de culture de Ristic (USA) contient 30 à 50 % de sérum; celui de Canning (GB) 40 %). Ce milieu apportera une amélioration sensible dans la concentration et le fractionnement des antigènes parasitaires nécessaire à la fabrication d'un vaccin de deuxième génération. 3) Vaccination de gerbilles Les gerbilles, réceptives à l'infection par B divergens (Lewis D et Williams H, 1979, Nature, 278, 170-171) sans que les passages répétés ne modifient l'antigénicité ou la virulence du parasite (Murphy T M, Gray J.S et ai, 1986, Res Vet Science, 40, 285-287), constituent un modèle de référence pour tester l'efficacité d'un vaccin contre B divergens. a) Protocole de vaccination 1 Le vaccin est administré par voie souscutanée, en deux points du dos des gerbilles (poids moyen: 52 g) selon le protocole suivant Animaux vaccinés: nombre: 8 4 x 1 dose nombre: 2 3 x 1 dose Chaque dose contient provenant de la concentration de 1,5 population de globules rouges humains 0,2 ml de saponine à 1 mg/ml. Animaux témoins/adjuvant: 4 x 1 injection nombre: 2 de 400 pl de saponine ( 0,5 mg/ml) à J 0, J 10, J 30, J 50 à J 0, J 10, 330 0,2 ml d'antigènes parasitaires ml de surnageant de culture d'une parasités à 30 % et est adjuvée par à J 0, J 10, J 30, J 50 Animaux témoins: nombre: 10 gerbilles maintenues dans les mêmes conditions d'élevage que les animaux précédents. b) Protocole de vaccination 2 Le vaccin est administré par voie souscutanée, en deux points du dos des gerbilles (poids moyen: 60 g) selon le protocole suivant Animaux vaccinés: nombre: 2 2 x I dose à J 0, J 20 Chaque dose contient 0,2 ml d'antigènes parasitaires provenant de la concentration de 1,5 ml de surnageant de culture d'une population de globules rouges humains parasités à 30 %, et est adjuvée à 0,2 ml de saponine à 1 mg/ ml. Animaux témoins: nombre: 2 gerbilles maintenues dans les mêmes conditions d'élevage que les animaux précédents. c) Résultats Immunoprotection contre la souche homologue de B divergens (souche Rouen 1987) (protocole de vaccination 1) A J 63 les gerbilles reçoivent par voie intrapéritonéale 5,5 104 globules rouges parasités par la souche humaine homologue (Rouen 1987). Les 10 gerbilles non vaccinées, ainsi que celles n'ayant reçu que l'adjuvant, meurent 6 à 9 jours après la contamination Les 10 gerbilles vaccinées survivent, sans avoir jamais présenté la moindre hémoglobinurie (signe clinique d'une babésiose avancée). Immunoprotection contre la souche homologue de B divergens (souche Rouen 1987) (protocole de vaccination 2) A 354 les gerbilles reçoivent par voie intrapéritonéale 1,6 106 globules rouges parasités par la souche humaine homologue (Rouen 1987). Les 2 gerbilles non vaccinées meurent 5 jours après la contamination Les 2 gerbilles vaccinées survivent, sans avoir jamais présenté la moindre hémoglobinurie. Immunoprotection contre des souches bovines hétérologues (protocole 1) Les 8 gerbilles précédentes ayant reçu 4 doses et protégées contre la souche homologue (Rouen 1987) ont été contaminées une nouvelle fois à J 79 par injection intrapéritonéale de 2,5 107 globules rouges de gerbilles parasitées par des souches hétérologues selon le protocole suivant: Souches de B divergens Animaux Animaux utilisées pour l'infection vaccinés témoins Souche homologue: Rouen (Haute Normandie) 1987 2 1 Souches hétérologues: Côte d'Or (Bourgogne) 1988 2 1 Indre (Centre) 1988 2 1 Loire-Atlantique (Pays de Loire) 1988 2 1 Les quatre gerbilles témoins meurent entre 78 et 116 heures après la contamination Les 8 gerbilles vaccinées survivent sans aucune hémoglobinurie. REVENDICATIONS 1) Procédé de culture de Babesia, caractérisé en ce que la souche de Babesia est maintenue en culture sur un milieu de culture exempt de protéine sérique mais contenant des lipoprotéines ainsi que des hématies. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les lipoprotéines sont d'origine naturelle. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les lipoprotéines sont des lipoprotéines de haute densité naturelle ou HDL. 4) Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que les lipoprotéines sont d'origine humaine. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le milieu de culture est le milieu RPMI 1640 ou un milieu équivalent. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu contient, en outre, des facteurs de croissance. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la teneur en HDL est comprise entre 0,2 et 5 mg/ml. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration en HDL est de 0,5 à 1,5 mg/ml. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les hématies utilisées sont des hématies humaines. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la souche de Babesia est du genre Babesia divergens. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à '10, caractérisé en ce qu'on récupère après culture les exoantigènes solubles dans le milieu et en ce que l'on les isole. 12) Exoantigènes de Babesia caractérisés en ce qu'ils peuvent être obtenus par le procédé selon la revendication Il. 13) Exoantigènes selon la revendication 12, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins l'un des trois ensembles de protéines majeures. 14) Exoantigènes de B divergens selon la revendication 12, caractérisés en ce que leurs masses moléculaires relatives varient respectivement de 34 à 37 k Da, de 43 à 46 k Da, de 69 à 72 k Da et de 90 à k Da. 15) Anticorps monoclonaux dirigés contre les exoantigènes de la revendication 12. 16) Vaccin caractérisé en ce qu'il comporte au moins un exoantigène selon la revendication 12. 17) Immunsérum dirigé contre les exoantigènes selon la revendication 12.