Brevet FR2659352A1 — publié le 19910913

La présente invention concerne un procédé de la préparation d'une gélatine de poids moléculaire accru ayant une viscocité et un point de fusion élevés, ce procédé consistant à réticuler de la gélatine avec la transglutaminase, puis à arrêter la réaction enzymatique en inactivant la transglutaminase. La gélatine est un hydrolysat du collagène qui est l'une des protéines principalement contenues dans la peau et les os des organismes vivants, et la gélatine est abondamment utilisée dans les industries photographique et alimentaire et dans la microencapsulation de médicaments et de produits cosmétiques. Cependant, du fait que la gélatine a un point de fusion proche de la température ambiante, elle est sujette à un ramollissement à la température ambiante, de sorte que la gélatine naturelle ne peut être transportée sans être séchée, ni utilisée dans des applications exigeant un point de fusion et une viscosité élevés. Pour tenter de résoudre ce problème, des aldéhydes tels que le glutaraldéhyde ou des substances minérales du groupe de l'alun, telles que l'alun de potassium, ont classiquement été utilisés comme agents gélifiants (ou agents réticulants), mais il n'a pas été obtenu de résultats satisfaisants. La transglutaminase est une enzyme qui réticule une protéine en formant une liaison g-(y-glutamyl)lysine entre le groupe y-carboxamido d'un résidu de glutamine et le groupe s-amino d'un résidu de lysine. La littérature a déjà mentionné l'utilisation de transglutaminase pour son action sur des solutions contenant de la caséine, de la globuline de soja et d'autres protéines à diverses concentrations. Il existe également des exemples de cas dans lesquels la transglutaminase est mise à agir sur des solutions fortement concentrées de protéines et de gélatine (demandes de brevet japonais non examinées publiées sous les NO 149 645/1983 et 27 471/1989).Cependant, il n'est signalé aucun cas d'utilisation de transglutaminase de la manière proposée par la présente invention, à savoir en faisant agir la transglutaminase sur la gélatine et en inactivant ensuite l'enzyme pour produire de la gélatine hautement polymérisée. La gélatine naturelle fond à un point proche de la température ambiante et son bas point de fusion, ainsi que sa faible viscosité, ont souvent posé des problèmes pendant son transport à l'état non séché ou lorsqu'elle est utilisée sous forme de capsules pour aliments, médicaments et produits cosmétiques. Divers agents gélifiants ont été utilisés pour traiter ces problèmes, mais leur emploi a été principalement limité à la fabrication de gels. Les aldéhydes classiquement utilisés comme agents gélifiants sont trop irritants pour être utilisables avec des aliments et des médicaments. D'autres agents gélifiants classiques, typiquement des substances minérales du groupe de l'alun, ne réalisent pas une réaction de gélification satisfaisante. De plus, ils subissent une réaction si rapide qu'il a été difficile d'exercer le contrôle nécessaire pendant la fabrication. Devant cet état de choses, la Demanderesse a conduit des études poussées en vue de résoudre les problèmes susmentionnés de l'art antérieur. Elle a ainsi découvert qu'une gélatine possédant les caractéristiques souhaitées, telles qu'un point de fusion, une viscosité et un poids moléculaire plus élevés, peut être produite en laissant agir de la transglutaminase sur une solution de gélatine ayant une concentration de 0,1 à 5 % en poids, de préférence 1 à 4 % en poids, ladite transglutaminase étant utilisée en une quantité d'au moins 0,1 unité, de préférence 2 à 80 unités, par gramme de gélatine. La présente invention a été mise au point sur la base de cette découverte. Sur les dessins annexés la Figure 1A est un diagramme de chromatographie en phase liquide montrant les résultats d'analyse de la distribution de poids moléculaires de la gélatine hautement polymérisée préparée à l'Exemple 1 la Figure 1B est un diagramme de chromatographie en phase liquide montrant les résultats d'analyse de la distribution de poids moléculaires de la gélatine hautement polymérisée préparée à l'Exemple 2 la Figure 1C est un diagramme de chromatographie en phase liquide montrant les résultats d'analyse de la distribution de poids moléculaires de la gélatine hautement polymérisée préparée à l'Exemple 3 la Figure 1D est un diagramme de chromatographie en phase liquide montrant les résultats d'analyse de la distribution de poids moléculaires de la gélatine hautement polymérisée préparée à l'Exemple 4 ; et la Figure 1E est un diagramme de chromatographie en phase liquide montrant les résultats d'analyse de la distribution de poids moléculaires de la gélatine utilisée comme matière de départ dans les Exemples 1 à 4. Sur chacune des Figures 1A à 1E, l'axe vertical porte l'absorbance à une longueur d'onde de 230 nm et l'axe horizontal porte le temps d'élution de la colonne. On sait que la transglutaminase est une enzyme qui réticule une protéine en formant une liaison g-(y- glutamyl)lysine entre le groupe y-carboxamido d'un résidu de glutamine et le groupe -amino d'un résidu de lysine. La transglutaminase retirée d'un actinomycète, Streptoverticillium, est utilisée de préférence dans la présente invention, mais on peut également utiliser de la trans -glutaminase provenant d'autres sources, telle que celle extraite du foie de cobaye. Il n'a été signalé aucun cas où de la transglutaminase est mise à agir sur une solution de gélatine et la réaction enzymatique est arrêtée en inactivant la transglutaminase afin de produire une gélatine hautement polymérisée. Si la solution de gélatine à traiter présente une concentration dans l'intervalle de 0,1 à 5 % en poids, elle subit peu de variation de viscosité avec le temps, même après l'addition de la transglutaminase. Etant donné que la viscosité de la solution de gélatine reste sensiblement constante, celle-ci peut être soumise à la réaction enzymatique pendant une durée suffisante pour atteindre le degré de polymérisation souhaité.En réglant convenablement les conditions réactionnelles, telles que la concentration de gélatine, la quantité de transglutaminase ajoutée, la durée, la température et le pH de réaction, on peut obtenir de la gélatine avec divers degrés de réticulation et un large éventail de propriétés physiques. Le procédé de la présente invention est caractérisé en ce que l'on ajoute de la transglutaminase en quantité importante à une solution de gélatine de concentration relativement basse, et l'on conduit la réaction enzymatique pendant une longue durée, si bien qu'une composition constituée d'un mélange de la gélatine initiale et de la gélatine réticulée possède une plus haute teneur relative en gélatine polymérisée, ce qui permet la production de gélatine hautement polymérisée en un rendement plus élevé. La gélatine utilisée comme matière de départ dans le procédé de la présente invention peut être soit une gélatine de procédé alcalin, soit une gélatine de procédé acide, mais les liaisons transversales de réticulation se forment plus facilement dans une gélatine de procédé acide dont la teneur en résidus de glutamine est plus élevée. Si la concentration de gélatine est inférieure à 0,1 % en poids, il en résulte une réticulation insuffisante et l'on ne peut obtenir aucun avantage industriel étant donné le faible rendement et la mauvaise rentabilité. A l'inverse, si la concentration de gélatine dépasse 5 % en poids, l'accroissement de viscosité est si prononcé qu'il en résulte une certaine difficulté à effectuer le contrôle nécessaire pendant la fabrication. La concentration de gélatine se situe dans l'intervalle de 0,1 à 5 % en poids, de préférence entre 1 et 4 % en poids. Si l'on ajoute moins de 0,1 unité de transglutaminase par gramme de gélatine, il ne se produit pas de réticulation efficace. Par contre, une addition excessive de transglutaminase n'est pas économique. En conséquence, la transglutaminase est ajoutée en une quantité d'au moins 0,1 unité, de préférence dans l'intervalle d'environ 2 à environ 80 unités. Si la durée de réaction est trop brève, la réaction de réticulation ne se développe pas jusqu'au degré souhaité. Si la durée de réaction est trop longue, il faut prendre des mesures pour parer à la décomposition thermique ou microbienne de la gélatine. En considération de ces points, la durée de réaction se situe typiquement entre environ 1 et environ 30 heures, de préférence entre 2 et 10 heures. Si la température de réaction est inférieure à la température ambiante, la réaction est ralentie et si elle est supérieure à 600C, la décomposition thermique de la gélatine prend de l'importance et, en plus des composés de haut poids moléculaire produits par réticulation enzymatique, il se forme des composés de bas poids moléculaire sous l'effet de la décomposition thermique.La réaction est donc conduite de préférence à des températures comprises entre la température ambiante et 600C, au mieux entre 40 et 500C. Des conditions neutres sont optimales, notamment la plage de pH de 6 à 7, mais la réaction envisagée s'effectue même si le pH se situe dans la plage de 4 à 10. La transglutaminase peut être inactivée non seulement par la chaleur, mais également par un pH extrêmement bas ou élevé. On peut utiliser éventuellement un inhibiteur d'enzyme tel que EDTA, pourvu seulement qu'il prive la transglutaminase de son activité et n'exerce pas d'effets défavorables sur la gélatine polymérisée. Les exemples suivants sont fournis dans le but de mieux expliquer la présente invention mais ils ne doivent nullement être considérés comme limitatifs. Dans les exemples qui suivent, on a utilisé comme matière de départ une gélatine de procédé acide ayant une résistance de gel de 196 degrés Bloom et une viscosité de 54 mp telles que mesurées selon la méthode des normes JIS. Cette gélatine a présenté une viscosité de 13 mPa.s à 500C lorsqu'on l'a mesurée avec un viscosimètre Brookfield, son point de fusion était de 31,00C, tel que mesuré par une méthode à chute de bille, et son point de solidification était de 25,40C tel que mesuré par la méthode des normes JIS. Les composants ayant des poids moléculaires supérieurs à celui du composant a (poids moléculaire : 105) constituaient 48 % de cette gélatine (voir la Figure 1E). Exemple 1 On ajoute de l'eau pure à 150 g de gélatine de façon à obtenir une concentration de gélatine de 1,5 % en poids. Après gonflement, on dissout la gélatine à 500C et l'on ajuste le pH de la solution à 7,0 avec NaOH. On ajoute 2,5 g de para-hydroxybenzoate de propyle comme antiseptique, puis on ajoute 20 unités de transglutaminase retirée d'un actinomycète, Streptoverticillium, (produit de Amano Seiyaku). La réaction enzymatique est effectuée sous agitation à 500C pendant 20 h, la température étant ensuite élevée à 800C et maintenue à cette valeur pendant 15 min pour inactiver thermiquement l'enzyme. On filtre la solution réactionnelle et concentre le résidu jusqu'a une teneur en matière sèche de 10 %, après quoi on le refroidit pour former un gel que l'on sèche ensuite pour produire une gélatine polymérisée. La gélatine a une résistance de gel de 118 degrés Bloom, une viscosité de 23 mPa..s, un point de fusion de 33,00C et un point de solidification de 27,90C. Il est clair que cette gélatine présente une plus forte viscosité et un plus haut point de fusion que la gélatine de départ. La distribution de poids moléculaires déterminée par chromatographie en phase liquide révèle que les composants ayant des poids moléculaires supérieurs à 105 constituent 68 % de la gélatine, ce qui montre que la gélatine est fortement réticulée (voir la Figure 1A). Les conditions de chromatographie en phase liquide sont les suivantes colonne : Asahipak GS-620 ; phase mobile : tampon phosphate 0,1M ; pH 6,8 ; température : 500C ; longueur d'onde de détection : 230 nm. Exemple 2 On ajoute de l'eau pure à 60 g de gélatine de façon à obtenir une concentration de gélatine de 3 % en poids. Comme à l'Exemple 1, la gélatine est mise à gonfler et dissoute, et l'on ajuste le pH de la solution. Ensuite, on ajoute de la transglutaminase à la solution de gélatine en une quantité de 5 unités par gramme de gélatine. Après 3 h de réaction enzymatique à 500C, on inactive la transglutaminase et on filtre la solution réactionnelle, le résidu étant refroidi pour former un gel que l'on sèche ensuite pour produire la gélatine polymérisée. La gélatine a une solidité en gel de 196 degrés Bloom, une viscosité de 650 mPa.s, un point de fusion de 42,30C et un point de solidification de 41,70C. Il est clair que cette gélatine présente une plus forte viscosité et un plus haut point de fusion que la gélatine de départ. Une distribution de poids moléculaires révèle que les composants ayant des poids moléculaires supérieurs à 105 constituent 70 % de la gélatine, ce qui montre que la gélatine est fortement réticulée (voir la Figure 1B). Exemple 3 On ajoute de l'eau pure à 50 g de gélatine de façon à obtenir une concentration de gélatine de 1 % en poids. Comme à l'Exemple 1, la gélatine est mise à gonfler et dissoute, et l'on ajuste le pH de la solution. Ensuite, on ajoute de la transglutaminase à la solution de gélatine en une quantité de 5 unités par gramme de gélatine. Après 3 h de réaction enzymatique à 500C, on inactive la transglutaminase et on concentre la solution réactionnelle à une teneur en matière sèche de 10 %, puis le résidu est refroidi pour former un gel que l'on sèche ensuite pour produire la gélatine polymérisée. Les composants ayant des poids moléculaires supérieurs à 105 constituent 60 % de la gélatine, ce qui montre que la gélatine est fortement réticulée. La gélatine a un point de fusion de 31,70C, un point de solidification de 26,00C, une viscosité de 17 mPa.s et une résistance de gel de 197 degrés Bloom. Il est clair que cette gélatine présente un plus haut point de fusion et une plus forte viscosité que la gélatine de départ (voir la Figure 1C). Exemple 4 On ajoute de l'eau pure à 120 g de gélatine de façon à obtenir une concentration de gélatine de 0,5 % en poids. Comme à l'Exemple 1, la gélatine est mise à gonfler et dissoute, et l'on ajuste le pH de la solution. On ajoute 6 g de para-hydroxybenzoate de propyle à titre d'antiseptique. De plus, on ajoute de la transglutaminase à la solution de gélatine en une quantité de 80 unités par gramme de gélatine. Après 5 h de réaction enzymatique à 500C, on inactive la transglutaminase et l'on filtre la solution réactionnelle, le résidu étant concentré à une teneur en matière sèche de 7,2 % et refroidi pour former un gel que l'on sèche ensuite pour produire la gélatine polymérisée. Une distribution de poids moléculaires révèle que les composants ayant des poids moléculaires supérieurs à 105 constituent 61 % de la gélatine, ce qui montre que la gélatine est fortement réticulée (voir la Figure 1D). Comme le démontrent les Exemples 1 à 4, le procédé de la présente invention est efficace pour augmenter la viscosité, le point de fusion et le point de solidification de la gélatine. Etant donné que cela contribue à donner une plus grande résistance à la chaleur et de meilleures propriétés de solidification à des couches de gélatine, on peut produire des feuilles comestibles et des capsules pour médicaments dont la qualité est améliorée. De plus, on peut obtenir une gelée comestible ayant une meilleure résistance à la chaleur. En outre, le point de solidification plus élevé confère à la gélatine des propriétés supérieures pour la manipulation. REVENDICATION Procédé de préparation dssune gélatine hautement polymérisée, caractérisé en ce qu'il comprend l'addition d'au moins 0,1 unité de transglutaminase par gramme de gélatine à une solution de gélatine ayant une concentration de 0,1 à 5 % en poids, la réalisation d'une réaction enzymatique et l'inactivation de la transglutaminase.