Brevet FR2653891A1 — publié le 19910503

La présente invention concerne le dosage des bilirubines et/ou biliverdines présentes dans des échantillons bioLogiques tels que des échantil Lons de sérum sanguin. La mesure des diverses formes de bilirubine dans Le sérum humain est d'une grande importance pour le diagnostic et le traitement de certaines maladies chez l'enfant et chez l'adulte, en particulier pour apprécier le risque d'encéphalopathie hyperbilirubinémique chez le nouveau né. On connaît différents procédés de dosage de la bilirubine dans des échantillons de sang qui font appel à une oxydation chimique, une oxydation enzymatique ou une diazoréaction, comme il est décrit par W. J. Cashore et al dans Journal of Pediatrics, vol. 93, nO 5, p. 827 à 833, novembre 1978 ; par P. Fossati et al, dans Clin. Chem. 35/1, 173-176 (1989), et par B. T. Doumas et al dans Clin. Chem. 33/8, 1349-1353 (1987). Parmi ces procédés, les procédés faisant appel à une diazoréaction sont très intéressants car ils permettent le dosage séparé des formes conjug udes de la bilirubine ; mais ils sont peu standardisables car les réactifs sont instables. Les dosages par oxydation enzymatique qui sont les plus récents, posent certains problèmes liés à l'utilisation d'enzymes et ne présentent pas une sensibilité suffisante aux faibles concentrations. Ainsi, aucun des procédés connus actuel lement ne permet de réaliser le dosage rapidement avec une bonne sensibilité, et de façon standardisée. La présente invention a précisément pour objet un procédé de dosage des bilirubines et/ou biliverdines basé sur L'oxydation électrochimique, qui est facile et rapide à mettre en oeuvre, peut être standardisé aisément et présente une bonne sensibilité. On sait que La bilirubine et la biliverdine peuvent être oxydes rélectrochimiquement lorsqu'elles sont dans un solvant organique tel que Le sulfoxyde de diméthyle contenant un électrolyte comme le perchlorate de tétraéthylammonium, comme il est décrit par F. Moussa et al dans Analytical Chemistry, vol. 60, n 11, p. 1179-1185 (1988). Cependant, cette oxydation électrochimique ne peut être réalisée en milieu biologique car la bilirubine n'est pas télectro-oxydable dans ces mi lieux lorsque le rapport molaire bilirubine/albumine est inférieur à environ 0,7-0,8. La présente invention a précisément pour objet un procédé qui permet de doser les bilirubines et/ou biliverdines présentes dans un échantillon biologique sous forme conjuguée et/ou sous forme non conjuguée par oxydation électrochimique. Ce procédé comprend les étapes successives suivantes a) introduire un échantillon du milieu biologique dans une solution aqueuse, conductrice de l'électricité ayant un pH de 3 à 10, b) soumettre la solution ainsi obtenue à une oxydation électrochimique à un potentiel tel qu'on oxyde au moins une partie des bilirubine et/ou biliverdine présentes dans l'échantillon, et c) déterminer la quantité de biLirubine et/ou de biliverdine ainsi oxydée. SeLon l'invention, on réussit à oxyder éLectrochimiquement la bilirubine et/ou la biliverdine présentes dans un échantillon bioLogique en diluant cet échantilLon dans une soLution aqueuse ayant un pH approprié. En effet, on a découvert que le choix du pH de la solution permettait d'oxyder éLectrochimiquement certaines formes ou toutes Les formes des bilirubine et biliverdine à des potentiels appropriés, et ainsi de les doser. Dans certains cas, il est toutefois préférabLe d'ajouter à La soLution aqueuse un réactif capabLe de rompre Les Liaisons de La bilirubine et/ou de La biliverdine avec L'aLbumine et/ou de les solubiliser pour Les rendre oxydabLes par voie éLectrochimique. La soLution aqueuse peut être par exempLe une soLution aqueuse contenant un éLectroLyte comme une soLution de chLorure de sodium à 9 p. 1000 ou une soLution tampon, par exempLe un tampon phosphate ayant un pH de 5 à 8, un tampon gLycocolLe ou Lactate ayant un pH inférieur à 5. A titre d'exempLe, Les réactifs ajoutés peuvent être choisis parmi les accélérateurs de diazoréaction, les agents tensioactifs anioniques et cationiques, et les solvants organiques. A titre d'exemple d'accéLérateurs de diazoréaction, on peut citer les composés tels que la caféine, par exemple en solution dans de l'acide benzoïque, la diphylline, les dérivés de l'aniline comme la dichloroaniline, et leurs mélanges. A titre d'exemples d'agent tensioactif anionique, on peut citer Le dodécyLsuLfate de sodium et le cholate de sodium. A titre d'exemples d'agent tensioactif cationique susceptibLe d'être utilisé, on peut citer le chlorure d'hexadécyl triméthyLammonium. A titre de solvant organique utiLisabLe, on peut citer Le suLfoxyde de diméthyLe. On peut utiLiser bien entendu d'autres solvants organiques, mais les quantités utilisées doivent être telles qu'il n'y ait pas de précipitation des protéines de L'échantiLLon. Les quantités de solution aqueuse et de réactif ajoutées sont respectivement telles que l'on obtienne un degré de dilution suffisant du milieu biologique en vue de rendre oxydables Les bilirubine et/ou biliverdines et que Le réactif puisse remblir sa fonction, c'est-à-dire rompre toutes Les Liaisons de La biLirubine et de La biLiverdine avec L'albumine et/ou de soLubiLiser les bilirubines et biliverdines pour Les rendre oxydables. Généralement, on utilise 100 l à 1ml de solution pour 5 à 50 l d'échantiLlon. Le réactif utiLise doit être en excès par rapport à La biLiverdine et/ou bilirubine, par exempLe en quantité telle que L'on ait au moins 5 à 10 moL de réactif par moL de bilirubine et/ou biliverdine présente dans L'échantiLlon. Dans Le procédé de L'invention, on choisit Le pH de La soLution, Le réactif éventuellement ajouté et Le potentieL d'oxydation de façon à réaliser l'oxydation de La ou des formes voulues de bilirubine et/ou de biLiverdine. E En effet, dans Le sang, la biLirubine (BR) est présente sous diverses formes qui sont principalement - la bilirubine non conjuguée (BRnC), - La bilirubine non conjuguée liée à des protéines teLLes que L'albumine, - la biLirubine conjuguée (BRC), par exempLe Les monogLucuronides et digLucuronides de biLirubine, pLus ou moins Liées à des protéines comme L'aLbumine. - La biLirubine conjuguée Liée de façon covalente à des protéines tel Les que L'aLbumine. (Cette éventuaLité est rencontrée dans certaines circonstances pathologiques). Aussi, étant donné que toutes ces formes des biLirubine et biliverdine ne sont pas électrooxydables dans Les mêmes conditions, on peut selon L'invention choisir les conditions de pH et Le réactif ajouté si nécessaire de façon à doser Le(Les) forme(s) voulue(s) de biLirubine et/ou de biLiverdine. Ainsi, à un pH neutre (7 t 0,5) et pour un rapport (BR/Alb Aux pH alcalins Le rapport BRC/Alb pour lequel La BRC n'est pas électrooxydable baisse (aux alentours de 0,3 à 0,2). En revanche, en milieu acide (pH 2,6 à 3,8) et en présence d'albumine, La biLirubine conjuguée est oxydée à des potentiels de +0,4 V et + 0,6 V par rapport à ecs (électrode au caLomeL saturée). La biLirubine non conjuguée n'est pas électroactive en présence d'aLbumine pour un rapport BRnC/ALb Ainsi, selon un premier mode de réalisation de L'invention, on met en oeuvre le procédé de façon à doser la bilirubine totale présente dans l'échantillon. Dans ce cas, on peut opérer à un pH de 7,4 + 0,05 avec un réactif constitué par un agent tensioactif cationique ou par un accélérateur de diazoréaction, et réaliser l'étape b) à un potentiel tel que l'on oxyde La biLirubine conjuguée et La bi li rubine non conjuguée, ce qui permet de doser La bilirubine totale. On peut aussi déterminer la bilirubine totale en opérant à un pH d'environ 5, avec un potentieL teL que l'on oxyde La bilirubine non conjuguée et La bilirubine conjuguée. On peut encore doser La bilirubine totale en opérant à un pH de 8 avec un agent tensioactif anionique à un potentiel tel que L'on oxyde la bilirubine conjuguée et La bilirubine non conjuguée. Selon un second mode de réaLisation de L'invention, adapté au dosage de La bilirubine conjuguée, on opère à un pH d'environ 5 et à un potentieL tel que L'on oxyde uniquement La bilirubine conjuguée. Selon une variante, on peut doser la bilirubine conjuguée en opérant à un pH de 7,4 + 0,5 avec un réactif constitué par un agent tensioactif anionique en choisissant un potentiel tel que L'on oxyde uniquement La bilirubine conjuguée. SeLon un troisième mode de réalisation de l'invention adapté au dosage de La bilirubine non conjuguée, non liée, on élimine tout d'abord la bilirubine conjuguée de l'échantillon en utilisant une solution à un pH d'environ 5 et en réalisant une oxydation électrochimique à un potentiel tel qu'on oxyde toute La bilirubine conjuguée, on ajuste ensuite Le pH de La solution à environ 7,4, on réalise une oxydation électrochimique à un potentiel tel que l'on oxyde uniquement La bilirubine non conjuguée non liée à L'albumine, et on détermine la quantité de bilirubine non conjuguée, non liée ainsi oxydée, par exemple par spectrophotométrie ou par spectrofluorescence différentielle Ainsi, le procédé de L'invention présente de nombreux avantages.En effet, Le dosage peut être spécifique car l'oxydation est fonction du pH du réactif et du potentiel imposés. Toutefois, cette spécificité ne peut être obtenue directement que dans le cas où l'on réalise l'oxydation électrochimique en présence d'un réactif capable de rompre les Liaisons bilirubine - albumine et biliverdine albumine et/ou de solubiliser les biliverdines et bilirubines dans cette solution. Dans ce cas, on peut effectuer la mesure directement par ampérométrie ou coulométrie après un étaLonnage approprié. En revanche, dans le cas où l'on opère sans addition du réactif mentionné ci-dessus, l'oxydation électrochimique ne peut être spécifique car d'autres constituants de L'échantillon peuvent également être oxydés et interférer pour une Large part dans le résultat. En effet, Les bilirubine et/ou biliverdine Liées à L'albumine ne sont pas électrooxydables et les teneurs en bilirubine et/ou biliverdine non Liées sont généralement faibles par rapport à celles des autres constituants oxydables. Dans ce dernier cas, on peut toutefois obtenir La spécificité du dosage en combinant L'oxyde dation électrochimique à une autre technique de mesure différentielle telle que la spectrophotométrie, La spectrofluorométrie ou L'ampérométrie. Le dosage est très sensible car Les diverses méthodes utilisables pour déterminer La quantité de bilirubine et/ou biliverdine oxydées présentent toutes une bonne sensibilité de L'ordre de La nmole/ I. Le procédé ne nécessite pas L'utilisation de réactifs coûteux teLs que les enzymes. Par ailleurs, on peut utiliser moins de 10ri d'échantillon et réaliser le dosage en une à deux minutes de façon entièrement automatisée. Selon L'invention, on peut déterminer La quantité de bilirubine et/ou de biliverdine oxydée par des mesures ampérométriques, des mesures coulométriques, et des mesures spectrophotométriques. Les mesures ampérométriques et coulométriques peuvent être effectuées au moyen des appareillages classiques de microdosage existants. On peut également déterminer la quantité de bilirubines et/ou de biliverdines oxydée par mesures spectophotométriques ou spectrofluorométriques. En effet, Lors de l'oxydation, La bilirubine se transforme en bi Liverdine puis en d'autres produits possédant une fluorescence naturelle. Or, la bilirubine absorbe avec un maximum à 450nm alors que Le maximum d'absorption de La biliverdine se situe à 380nm. Aussi, en mesurant L'augmentation de La densité optique à 380nm ou la diminution de la densité optique à 450nm, on peut déterminer la quantité de bilirubine oxydée en biliverdine. Les appareillages utilisés peuvent être des spectrophotomètres classiques, on peut aussi effectuer cette mesure par spectrofluorescence. Le procédé de L'invention peut aussi être combiné avec Les techniques classiques de dosage de La bilirubine et/ou de La biliverdine, par exemple avec Les techniques de dosage par oxydation enzymatique. Dans ce cas, on effectue L'oxydation enzymatique et on détermine ensuite par Le procédé de L'invention au moyen de mesures ampérométriques ou coulométriques avec oxydation électrochimique, Les quantités de bilirubine et/ou biliverdine du milieu. L'enzyme (bilirubine oxydase)peut être soit en suspension dans la solution aqueuse utilisée, soit immobilisée sur L'électrode. L'invention concerne également une cellule de mesure pour La mise en oeuvre de ce procédé, qui comprend - une cuve parallélipipédique munie de deux faces paraLLèles formant une fenêtre optique pour Le passage d'un faisceau Lumineux en vue de mesurer la densité optique d'une soLution présente dans La cuve, - une électrode de travaiL disposée dans La cuve de façon à ne pas être située sur Le passage d'un faisceau lumineux traversant la fenêtre optique, - une éLectrode auxiLiaire et une électrode de référence disposées dans des tubulures en contact électrolytique avec une soLution présente dans la cuve, et - des moyens pour relier Les électrodes à un générateur électrique. D'autres caractéristiques et avantages de L'invention apparaitront mieux à La lecture de La description qui suit donnée bien entendu à titre illustratif et non Limitatif en référence au dessin annexé sur Lequel - La figure 1 représente de façon schématique une instalLation de mesure des potentieLs d'oxydation des bilirubine et/ou biliverdine, - Les figures 2 à 9 sont des courbes représentant L'intensité qui traverse La cellule (3) de l'installation de La figure 1 en fonction du potentiel imposé à l'éLectrode pour diverses soLutions contenant des échantillons de bilirubines et/ou biliverdines. La figure 10 représente L'évolution de La densité optique d'une solution en fonction du potentiel appliqué. La figure 11 représente de façon schématique une cellule de mesure convenant à la mise en oeuvre du procédé de L'invention. Comme on L'a vu précédemment, Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre de différentes façons selon que l'on veut doser la biLirubine totale, raz La bilirubine Libre, la bilirubine conjuguée et La bilirubine non conjuguée. Ces différentes possibilités dépendent en particulier de la solution aqueuse utilisée pour diluer l'échantillon à mesurer, du pH de cette solution, du réactif ajouté et du potentiel imposé. Le potentiel imposé dépend de La solution aqueuse et du réactif utilisés. Aussi, pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, on détermine au préalable Les poten tieLs d'oxydation des diverses formes de bilirubine et de biliverdine dans le milieu utilisé, au moyen de l'appareillage utilisé. Sur la figure 1, on a représenté de façon schématique une installation permettant de mesurer ces potentiels d'oxydation. Cette installation comprend un récipient (1) contenant la solution aqueuse de dilution qui peut être introduite dans une cellule coulométrique (3) constituée par exemple d'une cellule coulométrique ESA 5011 pilotée par un module Coulochem 5100A commercialisés par la Société ESA, par l'intermédiaire de La conduite (5) munie de La pompe (7) du type Spectra - Physics 8700. L'échantillon est introduit dans cette solution par L'injecteur Rheodyne 7125 (9), puis La solution est traitée dans Les filtres (11) et (13) ayant respectivement des ouvertures de 2rm et 0,5,ut. La cellule coulométrique est suivie d'un détecteur spectrophotométrique Spectra - Physics 8490 (15). La cellule (3) et Le détecteur (15) sont associés respectivement aux enregistreurs (17) et (19) constitués par des dispositifs Servo trace SEFRAM. La cellule comprend une électrode de travail sous forme d'un filtre poreux, une électrode de référence en contact électrolytique avec La solution présente dans La cellule et une électrode auxiliaire également en contact électrolytique avec la solution aqueuse. L'électrode de référence est une électrode au palladium. Pour effectuer Les mesures, on procède de la façon suivante - on règle la pompe pour obtenir un débit de 0,5 à 0,8ml/min. -L'échantillon sanguin (5 à 50 l) est préalablement dilué dans 0,5 à îml de La solution aqueuse de dilution et 100fL de cette solution sont injectés dans Le circuit à l'aide de L'injecteur (9). Lorsque l'échantillon atteint La cellule (3), La pompe (7) est arrêtée. Les mesures peuvent alors être commencées. La mesure consiste à appliquer à La cellule (3) des potentiels croissants à l'aide du moduLe Coulochem 5100A. Celui-ci sert par ailleurs à mesurer Les variations d'intensité traversant la cellule (3) au cours du balayage de potentiels appliqué. Les courbes intensité-potentiel (voltamogrammes) ainsi obtenues, sont enregistrées à l'aide de l'enregistreur (17). Les mesures spectrophotométriques, après oxydation coulométrique, sont réalisées à l'aide du détecteur spectrophotométrique (15). Dans ce cas, il n'y a pas arrêt de la pompe au cours des mesures qui sont effectuées en continu. Il s'agit de fixer la longueur d'onde de mesure du spectrophotomètre (15), et de faire varier le potentiel appliqué à La cellule (3), avant chaque injection. L'augmentation et la baisse de densité optique au cours de L'analyse sont enregistrées par (19). On va examiner ci-après Les résultats obtenus avec cette installation sur différentes solutions utilisables dans L'invention. I. SoLutions aqueuses à pH 7,4. Cette solution aqueuse est par exemple un tampon phosphate à pH 7,4. Sur la figure 2, on a représenté Les courbes intensité (luA) - potentiel (V) obtenues en injectant 100 l d'échantillon de bilirubine dans du tampon phosphate 0,066M. Sur cette figure, la courbe 21 concerne un échantillon contenant 401mol/l de bilirubine conjuguée, exempt de protéine. Sur cette courbe 21, on voit 3 pics d'oxydation qui se situent respectivement aux potentiels d'environ +0,03 (Epl), d'environ +0,19V (Ep2) et d'environ +0,49V (Ep3). Le premier pic correspond à l'oxydation de la biLirubine en biliverdine, le deuxième pic correspond à l'oxydation de la biliverdine et Le troisième pic correspond aux étapes d'oxydation ultérieures. Ainsi, la bilirubine conjuguée est oxydable dans ce milieu en L'absence de protéines La courbe 22 représente les résultats obtenus lorsque L'on ajoute en plus de La biliverdine à l'échantillon (361,umoL/L de bilirubine conjuguée et 76rmol/l de biliverdine). Dans ce cas, on remarque que le pic d'oxydation (Ep2) de La biliverdine est beaucoup plus important que dans Le cas de la courbe 21. Si l'on effectue la même expérience en utilisant un échantillon contenant de l'albumine avec un rapport molaire de la bilirubine conjuguée à l'albumine inférieur ou égal à 0,7, l'oxydation de la bilirubine conjuguée est inhibée et l'on observe seulement L'oxydation de La biliverdine conjuguée au potentiel Ep2 d'environ + 0,19V. Si l'on répète cette expérience en utilisant un échantillon contenant de La bilirubine non conjuguée, en présence d'albumine, avec un rapport molaire de la biLirubine non conjuguée à L'albumine inférieur ou égal à 0,8, La bilirubine non conjuguée n'est pas électro-oxydée. En revanche, si le rapport molaire de La bilirubine non conjuguée à l'albumine dépasse environ 0,8, on observe deux pics d'oxydation aux potentiels d'environ -0,05V et d'environ +0,19V respectivement. Ainsi, dans une solution aqueuse ayant un pH de 7,4, La bilirubine conjuguée ne peut être oxydée qu en L'absence de protéines et il en est de même pour la bilirubine non conjuguée. Aussi, pour effectuer des dosages dans une telle solution, il est préférable d'ajouter un réactif approprié, par exemple un agent tensioactif anionique, un agent tensioactif cationique ou un accélérateur de diazoréaction. Les résultats obtenus dans ce cas sont donnés sur la figure 3. Sur cette figure, La courbe 31 représente les résultats obtenus lorsque l'on utilise le tampon phosphate à pH 7,4, 0,066M, contenant 40g/L d'albumine auquel on ajoute du dodécyl sulfate de sodium (DSS) à raison de îOmmol/l. Sur cette courbe 31, il n'apparat aucun pic d'oxydation aux potentiels inférieurs à 0,2V. La courbe 32 ilLustre Les résultats obtenus lorsqu'on ajoute au tampon phosphate contenant le DSS 100,ut d'un échantillon de bilirubine non conjuguée (401gìmol/L) avec 36g/l d'albumine, soit un rapport BRnC / albumine de 0,77. Sur cette courbe, il n'apparaît qu'un seul pic d'oxydation à environ +0,1V. Ainsi, La bilirubine non conjuguée s'oxyde en une seule étape. La courbe 33 représente les résultats obtenus lorsque l'échantillon contient uniquement de la bilirubine conjuguée à raison de 379umol/l et 399/l d'albumine, soit un rapport bilirubine conjuguée / albumine de 0,67. Sur La courbe 33, on remarque deux pics d'oxydation, soit un premier pic à environ -0,05V et un deuxième pic à environ +0,16V. Ainsi, la bilirubine conjuguée s'oxyde en deux étapes distinctes, à des potentiels différents de ceux observés dans Le cas de la bilirubine non conjuguée. Aussi, dans une solution contenant de l'albumine, de La bilirubine non conjuguée et de La bilirubine conjuguée, on pourra oxyder sélectivement la bilirubine conjuguée en opérant à un potentiel inférieur à -0,05V pour ne pas oxyder La bilirubine non conjuguée. Sur la figure 4, on a représenté les résultats obtenus Lorsqu'on ajoute au tampon phosphate du chlorure d'hexadécyl triméthylammonium (HTMACl) à raison de Smmol/L. Sur cette figure, la courbe 41 représente Les résultats obtenus avec le tampon phosphate contenant uniquement HTMACL, La courbe 42 représente Les résultats obtenus lorsqu'on introduit un échantillon de bilirubine non conjuguée contenant 379 mol/l de bilirubine non conjuguée et 36g/l de protéines, soit un rapport BRnC / albumine de 0,73 ; et la courbe 43 illustre Les résultats obtenus Lorsque l'on introduit un échantillon contenant de la bilirubine conjuguée contenant S3îpmol/l de bilirubine conjuguée et 36g/l de protéines, soit un rapport bilirubine conjuguée / albumine de 1,02. Dans ces conditions, Les deux formes de bilirubines s'oxydent en deux étapes aux mêmes potentiels qui sont respectivement de +0,1V et de +0,22V. Sur La figure 5 on a représenté les résultats obtenus Lorsque L'on utilise comme solution aqueuse un tampon phosphate à pH 7,4 auquel on ajoute 50g/l d'acide benzoique puis 30g/L de caféine après solubilisation de L'acide benzoique. Sur cette figure, La courbe 51 se rapporte aux résultats obtenus avec La solution aqueuse seule contenant La caféine et L'acide benzoique ; la courbe 52 se rapporte aux résultats obtenus lorsqu'on ajoute à a solution aqueuse un échantillon contenant 313 mol/l de bilirubine non conjuguée et 35g/l d'albumine, soit un rapport BRnC / albumine de 0,62.La courbe 53 se réfère aux résultats obtenus Lorsqu'on ajoute à la solution un échantillon contenant 313;jmol/L de bilirubine conjuguée et 35g/l d'albumine, soit un rapport BRC / albumine de 0,62, et ta courbe 54 se réfère aux résultats obtenus lorsqu'on ajoute à la solution aqueuse un échantillon contenant 313 mol/l de bilirubine conjuguée seule. En comparant ces courbes, on remarque que toutes les formes de La bilirubine s'oxydent en deux étapes aux potentiels respectifs de -0,02V, et +0,16V. Les exemples suivants illustrent l'emploi d'une solution aqueuse à pH 7,4 pour effectuer Le dosage de la bilirubine totale et de la bilirubine conjuguée. Exemple 1 : Dosage de la bilirubine totale dans une solution à pH 7,4. Dans cet exemple, on utilise un tampon phosphate 0,066M à pH 7,4 auquel on ajoute 50g/L d'acide benzoïque puis 30g/l de caféine, et une microcellule de mesure analogue à celle de la figure 1, et on choisit comme potentiel d'oxydation le potentiel Ep1 de -0,02V. On détermine tout d'abord l'intensité I1 obtenue avec ce potentiel lorsque La solution aqueuse est constituée uniquement du tampon phosphate, et l'intensité I2 obtenue à ce potentiel lorsque la solution aqueuse est le tampon phosphate contenant La caféine et L'acide benzoique. On mesure ensuite L'intensité X1 obtenue à ce même potentiel lorsque l'on ajoute 5uL de sérum à tester à Iml de tampon phosphate seul, puis L'intensité X2 obtenue à ce potentiel lorsque l'on ajoute 5 l de sérum à Iml de tampon phosphate contenant La caféine et l'acide benzoïque. On en déduit ainsi L'intensité d'oxydation de la bilirubine au potentiel appliqué, qui est de : 1BRTOT= (Xz~I2) (X1 I1) Etant donné que l'intensité (I) est proportionnelle à la concentration (C) en bilirubine, I=KC, on peut déterminer cette concentration en bilirubine après avoir étalonné l'appareil pour déterminer la constante K qui dépend du matériel, des réactifs et des conditions opératoires utilisés. Exemple 2 : Mesure de la bilirubine conjuguée dans une solution à pH 7,4 contenant un tensioactif anionique. Dans cet exemple, la solution aqueuse est constituée par le même tampon phosphate à pH 7,4 que dans L'exemple 1 auquel on ajoute 10mmol/l de dodécyl sulfate de sodium. Dans ces conditions, comme il est représenté sur la figure 3, la bilirubine conjuguée et La bilirubine non conjuguée s'oxydent à des potentiels différents. On peut donc déterminer la concentration en bilirubine conjuguée seule d'un échantil- lon en opérant à un potentiel inférieur à -0,02V. Pour déterminer La concentration en bilirubine conjuguée d'un échantillon, on opère de la même façon que dans l'exemple 1 en déterminant tout d'abord les intensités Il et I2 correspondant respectivement au tampon phosphate seul et au tampon phosphate additionné de dodécyl sulfate de sodium, puis l'intensité X1 correspondant au tampon phosphate seul contenant l'échantillon à tester et L'intensité X2 correspondant au tampon phosphate additionné de dodécyl sulfate de sodium et contenant l'échantil- lon à tester.Dans ces conditions, l'intensité d'oxydation de la Br conjuguee est égale à (X2-12)-(X1-11 ) Cette intensité est proportionnelle à la concentration en bilirubine conjuguée, la constante dépendant également du matériel et des solutions utilisées. II.Utitisation d'une soLution à pH 8. La solution aqueuse utilisée peut être un tampon phosphate de Sorensen à pH 8. Dans ces conditions, lorsque les deux formes de bilirubines sont présentes dans un échantillon avec de l'albumine et un rapport molaire des bilirubines à L'albumine inférieur ou égal à 0,6 environ, L'intensité d'oxydation électrochimique des bilirubines est 3 à 4 fois moindre qu'en l'absence d'albumine. Lorsque le rapport molaire est supérieur à 0,6 environ, on obtient une oxydation de la bilirubine non conjuguée et de La bilirubine conjuguée en deux étapes. Sur la figure 6, on a représenté les résultats obtenus avec cette solution. Sur cette figure, Les courbes 61 et 62 se rapportent respectivement au tampon à pH 8 et au tampon à pH 8 contenant de l'albumine. La courbe 63 se rapporte au tampon à pH 8 auquel on ajoute 100ul d'un échantillon contenant 400rmol/L de bilirubine et 36g/L d'albumine, soit un rapport BrnC / albumine de 0,77. La courbe 64 se réfère aux résultats obtenus lorsqu'on ajoute à ta solution aqueuse 100 l d'un échantillon contenant uniquement 400rmol/l de bilirubine. La courbe 65 se réfère aux résultats obtenus lorsqu'on ajoute au tampon à pH 8, 100ul d'une solution à 400 mol/l de bilirubine conjuguée.On remarque sur Les courbes 63, 64 et 65 que la bilirubine non conjuguée et la bilirubine conjuguée s'oxydent en deux étapes qui ont respectivement les potentiels de +0,04V environ et +0, 19V environ. Sur la figure 7, on a représenté les résultats obtenus avec ce même tampon à pH 8 lorsqu'on lui ajoute un agent tensioactif anionique constitue par du dodécyl sulfate de sodium (DSS) à raison de îOmmol/l. Sur cette figure, la courbe 71 se réfère au tampon seul contenant le dodécyl sulfate de sodium, la courbe 72 se réfère au tampon contenant Le DSS auquel on ajoute 1001ut d'un ,échantillon de bilirubine non conjuguée à 512 mol/l contenant 39g/l d'albumine, soit un rapport BrnC / albumine de 0,9. La courbe 73 se réfère aux résultats obtenus lorsque l'échantillon ajouté contient uniquement de la bilirubine non conjuguée. La courbe 74 se réfère aux résultats obtenus lorsque l'échantillon contient de I' albumine seule dans le tampon avec DSS. En comparant ces courbes, on remarque que les deux formes de bilirubines s'oxydent aux potentiels suivants : de -0,02V et de +0,16V. III.UtiLisation d'une soLution à pH 5. Dans ce cas, on peut utiliser comme solution aqueuse, une solution tampon phosphate de Sorensen. Sur la figure 8, on a représenté les résultats obtenus avec une telle solution. Sur cette figure, la courbe 81 se réfère à La solution aqueuse de tampon phosphate à pH 5 contenant 40g/l d'albumine. La courbe 82 se réfère à la même solution aqueuse contenant de plus 100p1 d'un échantillon à 271 mol/l de bilirubine non conjuguée et 39g/l d'albumine, soit un rapport BRnC / albumine de 0,48, la courbe 83 se réfère à la même solution contenant 100 l d'un échantillon à 426 mol/l de bilirubine non conjuguée, soit un rapport BRnC / a tb de 0,77, et les courbes 84, 85 et 86 se réfè- rent aux résultats obtenus lorsque L'échantillon est de la bilirubine conjuguée à 345umol/l pour la courbe 84, 500umol/l pour la courbe 85 et 1000 mol/l pour la courbe 86, avec 39g/l d'albumine, soit un rapport BRC / alb de 0,63 pour la courbe 84, 0,91 pour la courbe 85 et 1,81 pour la courbe 86. En comparant toutes ces courbes, on remarque que la bilirubine non conjuguée s'oxyde en une seule étape à un potentiel de 0,16V environ avec une intensité limite très faible et que la bilirubine conjuguée s'oxyde en deux étapes à des potentiels respectifs de +0,1V et +0,22V. On peut ainsi utiliser une solution à pH 5 pour doser séparément la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée non liée à L'albumine et la bilirubine non conjuguée totale. Les exemples 3, 4 et 5 qui suivent illustrent de tels dosages. Exemple 3 : Dosage coulométrique de la bilirubine conjuguée. Dans cet exemple, on utilise comme solution aqueuse une solution acide à pH 5 constituée par un tampon phosphate 0,066M. D'après les courbes de la figure 8, on sait qu'à ce pH la bilirubine conjuguée s'oxyde en deux étapes à des potentiels de +0,1V et +0,2V, tandis que La bilirubine non conjuguée s'oxyde très faiblement à un potentiel différent (+0,16V). On choisit donc pour le dosage un potentiel de +0,06V pour oxyder uniquement la bilirubine conjuguée. On introduit dans la cellule coulométrique (voir figure 11) 5pl d'échantillon préalablement dilués dans ImI de tampon pH5. On effectue une première mesure photométrique à 450nm (I1) ou à 380nm (I'1). On applique ensuite un potentiel de +0,06V à L'électrode de travail 127 pendant une durée suffisante pour effectuer une électrolyse totale de L'échantillon. Après cette électrolyse on effectue une deuxième lecture photométrique à 450nm (I2) ou à 380nm (I'2) selon le cas. La différence entre les deux mesures (I'2-I'1) ou (I1-Iz) est directement proportionnelle à la quantité de BRC électrolysée. Après un étalonnage approprié de l'appareil, on obtient la concentration en bilirubine conjuguée de L'échantillon de départ. On pourrait encore effectuer la mesure par spectrofluorescence différentielle après électrolyse à +0,22V. ExempLe 4 : Dosage coulométrique de La bilirubine non coniuguée, non liée à l'albumine. Dans cet exemple, on effectue tout d'abord une électrolyse totale de ia solution aqueuse contenant L'échantillon à doser dans un tampon à pH 5 comme précédemment à un potentiel de +0,06V pour débarrasser définitivement l'échantillon de la bilirubine sous forme conjuguée. Après cette étape, on ramène le pH du milieu à 7,4 par addition de soude concentrée 2 à 10N. Dans un tel milieu, seules les fractions de bilirubine non conjuguée, non liée à l'albumine sont oxydées, comme cela a été indiqué précédemment, la réaction d'oxydation ayant Lieu en deux étapes à des potentiels de -0,03V et +0,19V. Aussi, après avoir ramené le pH du milieu à 7,4 par addition de soude, on applique à l'électrode (9) un potentiel de O,OV pour oxyder la bilirubine non conjuguée, non liée à l'albumine. On peut ainsi déterminer la concentration en bilirubine non conjuguée, non liée aux protéines (rapport BrnC / alb > 0,8). ExenpLe 5 : Dosage de la bilirubine non conjuguée. Dans cet exemple, on suit le même mode opératoire que dans l'exemple 4 pour débarrasser tout d'abord l'échantillon de la bilirubine sous forme conjuguée en réalisant L'électrolyse à un potentiel de 0,06V par exemple. Après cette opération, on amène le pH du milieu à 7,4 à l'aide de soude concentrée comme dans l'exemple 4, puis on introduit un agent capable de rompre les liaisons bilirubine-albumine, par exemple du dodécyl sulfate de sodium ou du chlorure d'hexadécyl triéthylammonium et on réalise ensuite l'oxydation électrochimique de La bilirubine conjuguée au potentiel voulu qui dépend du réactif ajouté. On détermine ensuite la concentration de bilirubine non conjuguée présente dans l'échantillon en utilisant l'une des méthodes de mesure citées précédemment. IV. UtiLisation d'une solution aqueuse ayant un pH de 3,7. La solution aqueuse utilisée est un tampon glycocolle à pH 3,7. On détermine comme précédemment les courbes intensité en fonction de la tension appliquée. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 9. Sur cette figure, la courbe 101 se rapporte au tampon glycocolle contenant de La bilirubine non conjuguée à 427rmol/l de bilirubine et de l'albumine avec un rapport BRnC a albumine de 0,77. La courbe 102 se rapporte au tampon glycocolle contenant de la biliverdine seule non conjuguée (500 mol/l), la courbe 103 se rapporte au tampon glycocolle contenant de L'albumine et 345 mol/l de bilirubine conjuguée (rapport BRC / Alb = 0,63), La courbe 104 se rapporte au tampon glycocolle contenant de L'albumine et 500,umol/l de bilirubine conjuguée (rapport BRC / alb = 0,91), la courbe 105 se rapporte au tampon glycocolle contenant 1000rmol/l de bilirubine conjuguée en présence d'albumine (rapport BRC / Alb = 1,81). En comparant ces courbes, on remarque que seule La bilirubine conjuguée est oxydée en deux étapes (courbes 103, 104 et 105). Les potentiels d'oxydation sont respectivement de -0,02V et +0,13V. Les résultats obtenus avec les différentes solutions décrites ci-dessus sont regroupés dans le tableau suivant qui donne les valeurs des potentiels d'oxydation observés. Bien que dans les exemples décrits cidessus, on ait pratiquement toujours effectué les mesures de concentration par coulométrie ou ampérométrie, on peut effectuer ces mesures par voie spectrophotométrique. A titre d'exemple, on donne ci-après les résultats obtenus en faisant circuler dans une cellule analogue à celle de la figure 1, une phase mobile constituée par du tampon phosphate à pH 7,4 contenant de L'acide benzoique (50g/l) et de la caféine (30g/l) et en injectant 1001ul d'un échantillon de sérum contenant 5,îjjmol/l de bilirubine pour un rapport BRnC / Alb de 0,35, à un débit de 0,8ml/min en appliquant à l'électrode des potentiels variables. On mesure en continu à la sortie de la cellule, la densité optique du milieu à 440nm. La figure 10 représente l'évolution de la densité optique de la solution traversant en continu l'installation de La figure 1 en fonction du potentiel appliqué. Sur cette figure, on remarque qu'à +0,7V, la baisse de densité optique à 440nm atteint 90% de la densité optique initiale. Dans ce cas précis, un potentiel de 0,7V est nécessaire pour oxyder 90% de la BR présente dans L'échantillon sanguin. En effet à un voltage inférieur, la surface de l'électrode de la cellule (3) de la figure 1 et le temps de passage de l'échantillon (0,5ml/min) ne sont pas suffisants pour obtenir l'électrolyse totale. La spécificité du dosage est néanmoins obtenue par la mise en évidence de la baisse de la densité optique à 440nm. Lorsqu'on veut réaliser la mesure par spectrophotométrie, on peut utiliser comme cellule de mesure, une cuve coulométrique à faces optiques pour effectuer directement dans la cellule d'électrolyse la mesure de densité optique. Sur La figure 11, on a représenté une cellule de ce type. Celle-ci comprend une cuve parallélépipédique (121) dans laquelle on peut introduire la solution d'échantillon (123) à doser. Un agitateur magnétique (125) est disposé au fond de la cuve et une électrode de travail (127) est plaquée sur la paroi Latérale de la cuve. Une microélectrode de référence (129) constituée par exemple par une électrode Ag/AgCl, est disposée dans une tubulure (130) en contact électrolytique avec la solution (123) par l'intermédiaire d'un verre fritté. Une électrode auxiliaire (131) constituée par exemple par un fil de platine, est disposée dans une tubulure (132) également en contact électrolytique avec la solution (123). La cuve (121) comprend deux faces optiques parallèles formant une fenêtre optique pour le passage d'un faisceau lumineux afin de pouvoir déterminer directement la densité optique de la solution (123) présente dans la cuve. Les trois électrodes sont reliées à un générateur électrique non représenté sur le dessin en vue d'appliquer à L'électrode de travail (127) un potentiel contrôlé par rapport à L'électrode de référence. Dans cette cellule, on pourrait remplacer L'électrode plaquée (127) par un fil immergé dans la solution, du moment qu'il soit disposé de façon à ne pas interférer avec le faisceau lumineux qui traverse le récipient pour mesurer la densité optique. Comme on l'a vu ci-dessus, le procédé de L'invention peut être mis en oeuvre pour effectuer différents dosages. Bien qu'aucun des exemples donnés ne se rapporte à la biliverdine, il est clair que le procédé de l'invention peut être utilisé pour déterminer de la même manière la concentration en biliverdine d'un échantillon. Exemple de dosage de La biLiverdine Par couLoiétrie. Dans une cuve de mesure (figure 11), on introduit l'échantillon préalablement dilué dans la solution de travail (tampon phosphate pH 7,4, contenant L'acide benzoïque et La caféine dans les proportions précédemment décrites). On effectue une première lecture photométrique à 380nm (in). On applique alors à l'électrode de travail un d.d.p de 0,00V. A ce potentiel, et si on laisse agir suffisamment, toute la BR est transformée en BV. On effectue alors une deuxième lecture à 380nm (11). On applique ensuite une d.d.p de +0,2V pour électrolyser toute la BV présente dans le milieu et on effectue une dernière lecture à 380nm (12). Ainsi, l'augmentation de D.O à 380nm correspondant à la différence I1-Io, est proportionnelle à la concentration en BR du milieu, alors que la baisse de D.O correspondant à la différence Io-I2 est proportionnelle à la concentration en BV de départ. Comme précédemment, un étalonnage approprié de l'appareillage est nécessaire. Dans les exemples décrits ci-dessus, on a utilisé les potentiels mesurés corréspondant aux figures pour choisir le potentiel à appliquer. Etant donné que la valeur de ce potentiel dépend de l'appareillage, de la solution et des réactifs utilisés, il convient dans chaque cas de déterminer préalablement les potentiels qui correspondent aux pics d'oxydation avec l'appareil- lage et La solution utilisée. POTENTIELS D'OXYDATION (an V/ Electrode de référence coulochem) pH neutre (7.4) pH alcalin (8) pH acide sans résctif +DSS +HTMACl +caféine sens réactif +DSS +HDTACl pH 5,0 pH 3,7 BRC sans +0,03 +0,04 +0,10 -0,02 albumine + 0,19 +0,19 +0,22 +0,13 + 0,49 BRnC sens +0,04 albumine insolubl@ +0,1@ insolubl@ insolubl@ -0,05 +0,10 -0,02 +0,04 -0,02 +0,10 +0,10 -0,02 BRC/alb#0,7 nul +0,1@ +0,22 +0,16 +0,19 +0,16 +0,25 +0,22 +0,13 +0,03 -0,05 +0,10 -0,02 +0,04 -0,02 +0,10 +0,10 -0,02 BRnC/alb > 0,7 +0,19 +0,16 +0,22 +0,16 +0,19 +0,16 +0,25 +0,22 +0,13 BRnC/alb#0,8 nul +0,10 -0,02 +0,04 -0,02 +0,10 négligeable nul +0,1 +0,22 +0,16 +0,19 +0,16 +0,25 POTENTIELS D'OXYDATION (en V/ Elactrode de référence coulochaml pH neutre [7,4] pH alcelin [8] pH acide sans résctif +DSS +HTMAC1 +ceféine sens réactif +DSS +HDTAC1 pH 5,0 pH 3,7 BRnC/alb > 0,8 -0,05 +0,10 -0,02 +0,04 -0,02 +0,10 +0,18 +0,19 +0,1 +0,22 +0,16 +0,19 +0,18 +0,25 négligesble nul BVC +,19 +0,16 +0,22 +0,16 +0,19 +0,18 +0,25 +0,22 +0,13 BVnC +0,19 +0,06 +0,22 +0,18 +0,19 +0,10 +0,25 négligesble négligesbl BRC = bilirubine conjuguée BVC = biliverdine conjuguée BRnC = bilirubine conjuguée BVnC = biliverdine non conjuguée REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage de la bilirubine et/ou de la biliverdine présentes dans un milieu biologique sous forme conjuguée et/ou sous forme non conjuguée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes a) introduire un échantillon du milieu biologique dans une solution aqueuse, conductrice de l'électricité ayant un pH de 3 à 10, b) soumettre la solution ainsi obtenue à une oxydation électrochimique à un potentiel tel qu'on oxyde au moins une partie des bilirubine et/ou biliverdine présentes dans l'échantillon, et c) déterminer la quantité de bilirubine et/ou de biliverdine ainsi oxydée. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que La solution aqueuse conductrice de l'électricité est une solution de chlorure de sodium. 3. Procédé selon La revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse conductrice de l'électricité est une solution tampon choisie parmi Les tampons phosphate ayant un pH de 5 à 8 et les tampons glycocolle ou lactate ayant un pH inférieur à 5. 4. Procédé selon L'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la solution comprend de plus un réactif capable de rompre les liaisons bilirubine-albumine et biliverdine - albumine et/ou de solubiliser les biliverdines et les bilirubines dans cette solution. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit réactif est choisi parmi les accélérateurs de diazoréaction, les agents tensioactifs anioniques et cationiques, et les solvants organiques. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'accélérateur de diazoréaction est constitué par au moins un composé choisi parmi la caféine et la diphylline. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, dans l'étape c), on détermine La quantité de bilirubine et/ou de biliverdine oxydée par ampérométrie différentielle et en ce que L'on déduit de cette mesure la quantité de bilirubine et/ou de biliverdine oxydable dans ces conditions, présente initialement dans le milieu biologique. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, dans L'étape c), on détermine la quantité de bilirubine et/ou de biliverdine oxydée par coulométrie différentielle. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, dans L'étape c), on détermine la quantité de bilirubine et/ou de biliverdine oxydée par spectrophotométrie différentielle. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH de 7,4 + 0,5, en ce qu'elle contient un réactif constitué par un agent tensioactif anionique, et en ce que l'on opère dans l'étape b) à un potentiel tel que l'on oxyde uniquement la bilirubine conjuguée. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH d'environ 8, en ce qu'elle contient un réactif constitué par un agent tensioactif anionique et en ce que l'on opère dans l'étape b) à un potentiel tel que l'on oxyde la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que l'agent tensioactif anionique est le dodécylsulfate de sodium ou le cholate de sodium. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH de 7,4 t 0,5, en ce qu'elle contient un réactif constitué par un agent tensioactif cationique ou par un accélérateur de diazoréaction, et en ce que l'on opère dans L'étape b) à un potentiel tel que l'on oxyde la bilirubine conjuguée et la bilirubine non conjuguée. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH d'environ 5 5 et en ce que l'on opère à un potentiel tel que l'on oxyde soit la bilirubine conjuguée seule, soit la bilirubine non conjuguée et la bilirubine conjuguée. 15. Procédé selon L'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution aqueuse a un pH d'environ 3 et en ce que l'on opère à un potentiel tel que l'on oxyde uniquement la bilirubine conjuguée. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on élimine tout d'abord la bilirubine conjuguée de L'échantillon en utilisant une solution à un pH d'environ 5 et en réalisant une oxydation électrochimi que à un potentiel tel que l'on oxyde toute la bilirubine conjuguée, on ajuste ensuite le pH de la solution à environ 7,4, on réalise une oxydation électrochimique à un potentiel tel que l'on oxyde uniquement la bilirubine non conjuguée, non liée à l'albumine, et on détermine la quantité de bilirubine non conjuguée, non liée ainsi oxydée par spectrophotométrie ou par spectrofluorescence différentielle. 17. Cellule de mesure pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend - une cuve parallélipipédique munie de deux faces parallèles formant une fenêtre optique pour le passage d'un faisceau lumineux en vue de mesurer la densité optique d'une solution présente dans la cuve, - une électrode de travail disposée dans la cuve de façon à ne pas être située sur le passage d'un faisceau Lumineux traversant la fenêtre optique, - une électrode auxiliaire et une électrode de référence disposées dans des tubulures en contact électrolytique avec une solution présente dans la cuve, et - des moyens pour relier les électrodes à un générateur électrique.