Brevet FR2655425A1 — publié le 19910607

La présente invention est relative à un procédé de diagnostic des cryptococcoses par détection d'antigènes circulants, aux anticorps nécessaires à la réalisation du réactif de diagnostic pour ladite détection, à l'utilisation dudit réactif pour l'obtention desdits antigènes ainsi qu' aux compositions immunogènes contenant ledits antigènes. La cryptococcose est due à un champignon, Cryptococcus neoformans. Il existe quatre sérotypes de Cryptococcus neoformans, à savoir les sérotypes A, B, C et D. L'émergence du SIDA a entraîné une augmentation de la fréquence des cryptococcoses. Cette mycose se rencontre dans 6 % des cas de SIDA et se révèle être la première manifestation de ce syndrome dans 30 % des cas. C'est dire l'importance de son diagnostic. Celui-ci repose à l'heure actuelle, essentiellement sur les méthodes mycologiques classiques (mise en évidence de la levure à l'examen direct et par culture) ou sur la détection d'un antigène polysaccharidique circulant dans le sérum, les urines ou le L.C.R., le glucuro-xylo-mannane. Cette détection utilise l'agglutination de particules de latex sensibilisées par des immunoglobulines, dont la spécificité est dirigée contre cet antigène. Cependant, l'obtention de telles immunoglobulines est problématique, notamment à l'échelle industrielle, car la capsule de Cryptococcus neoformans est un puissant inhibiteur de la réaction immunologique. I1 est connu que Trichosporon beigelii, espèce type du genre Trichosporon, synonyme de Trichosporon cutaneum (L. do CARMO-SOUSA, 1970, 1309-1352, "The genus Trichosporon BEHREND" in J. LODDER ed., "The yeasts, a taxonomic study", North Holland Publi. Co. Amsterdam) appartenant au sérogroupe 2 du genre Trichosporon, présente des antigènes partiels communs avec le genre Cryptococcus, ainsi qu'avec le genre Candida, notamment Candida curvata et Candida humicola (SEELIGER H.P.R. et al, Sabouraudia, 1963, 2, 248-263). Ces Auteurs ont en particulier mis en avant la difficulté à préparer des antisérums de lapin contre T. beigelii et contre les extraits cellulaires totaux de Cryptococcus neoformans et T. beigelii et ont montré l'existence de réactions croisées entre les antigènes de ces deux champignons. T.C. WU et al. ont comparé (J. Clin. Microbiol., 1983, 18, 5, 1127-1130) trois kits de détection de l'antigène cryptococcique, comprenant des billes de latex recouvertes d'anticorps anti-cryptococciques ("CRYPTO LA TEST", "MYCO-IMMUNE", "IMMY")et montrent une variation de sensibilité importante, tant dans le sérum que dans le liquide céphalorachidien E.J. McMANUS et al. ont décrit (J. Clin. Microbiol., 1985, 21, 5, 681-685) un antigène de Trichosporon beigelii qui présente une réaction croisée avec le polysaccharide capsulaire de Cryptococcus neoformans, lequel antigène a été isolé à partir du sérum d'un patient présentant une infection disséminée par Trichosporon (souche UW). Les Auteurs de cet article montrent que des billes de latex revêtues d'anticorps anti-Cryptococcus neoformans ont été agglutinées par le sérum de ce patient. Ceci est dû au fait que Trichosporon beigelii possède un ou plusieurs antigènes qui sont communs avec l'antigène polysaccharidique capsulaire de Cryptococcus neoformans. Cet antigène peut donc entraîner un faux positif dans ce test d'agglutination au latex cryptococcique. I1 est donc nécessaire, d'après cet article, d'être prudent lors de l'interprétation d'un test d'agglutination au latex cryptococcique positif à partir d'un sérum de patient immunodéprimé dans lequel a été mis en évidence des Trichosporon beigelii en culture. T. TAKEUCHI et al. (J. Pathol., 1988, 156, 23 27) rappellent que le diagnostic de l'infection par Trichosporon bei gel ji, qui est observée de plus en plus fréquemment chez des patients immunodéprimés, est réalisé par cultures (hémocultures)ou par observation histologique du champignon et que ce diagnostic n'est pas toujours facile à interpréter en raison des possibilités de confusion entre ce champignon et l'espèce Candida. Les Auteurs proposent deux anticorps monoclonaux qui permettent de distinguer T. beigelii d'autres champignons et de détecter de manière plus spécifique T. beigelii sur des coupes de tissus inclus dans de la paraffine.Les anticorps décrits dans cet article, ne réagissent ni avec Cryptococcus neoformans, ni avec Candida aibicans. L'un de ces deux anticorps (K-16) permet de détecter spécifiquement T. beigelii, réagit à la fois avec les formes levures et les formes hyphes, la réactivité n'étant pas perdue après fixation au formol et inclusion dans de la paraffine. L'autre anticorps (K-30) réagit préférentiellement avec les formes levures tuées à l'éthanol et fixées à l'acétone. L'existence de réactions croisées d'une variation de sensibilité importante et de la difficulté de préparer les immunoglobulines dirigées contre Cryptococcus neoformans, ont conduit la Demanderesse à mettre au point un test de diagnostic de la cryptococcose facile à mettre en oeuvre, d'un coût moindre, dans la mesure où l'agent de diagnostic est préparé plus facilement que les agents proposés dans l'Art antérieur et d'une sensibilité nettement améliorée (de l'ordre de 10 ng/ml) par rapport aux tests proposés dans l'Art antérieur. La présente invention a pour objet des anticorps dirigés contre Cryptococcus neoformans, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié par un champignon qui présente une communauté antigénique avec Cryptococcus neoformans et qui est immunogène, en ce qu'il s'agit d'immunoglobulines G, et en ce qu'ils présentent une grande affinité pour Cryptococcus neoformans, exprimée d'une part par un titre d'agglutination desdits Cryptococcus neoformans au moins égal au 1/100ème et d'autre part par un seuil de détection des antigènes solubles capsulaires polysaccharidiques circulants de Cryptococcus neoformans compris entre 10 et 50 ng/ml, dans un tampon approprié et lorsque lesdits anticorps sont fixés sur des billes de latex appropriées. Selon un mode de réalisation avantageux desdits anticorps, ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié par un champignon du genre Trichosporon. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, le Trichosporon est une souche de Trichosporon beigelii La souche de Trichosporon beigelii est de préférence une souche IP n T49 1495-83. Cette souche a été déposée à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM), tenue par l'institut Pasteur, le 22 septembre 1983. Le champignon Trichosporon, notamment, permet d'obtenir des anticorps qui reconnaissent Cryptococcus neoformans, alors qu'il est très difficile d'obtenir une immunisation correcte et reproductible, directement à partir de Cryptococcus neoformans. Les animaux appropriés à l'immunisation sont en particulier des mammifères, mais peuvent également être des gallinacés. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits anticorps, le tampon est un tampon glycine. Selon un autre mode de réalisation avantageux, lesdits anticorps sont des anticorps polyclonaux. Selon un autre mode de réalisation avantageux, lesdits anticorps sont des anticorps monoclonaux. Lesdits anticorps monoclonaux sont obtenus par clonage d'hybridomes résultant de la fusion de cellules myélomateuses appropriées et de cellules spléniques immunisées par un antigène constitué par une souche appropriée de Trichosporon beigelii, notamment la souche T49 1495-83 en mettant en oeuvre une technique de clonage appropriée. La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic sous forme de particules, pour la détection des antigènes solubles de Cryptococcus neoformans dans des fluides biologiques, caractérisé en ce que lesdites particules sont recouvertes d'un anticorps conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit réactif, lesdites particules sont choisies dans le groupe qui comprend les billes de latex et les billes magnétiques, telles que décrites notamment dans le Brevet français 7 536 889. La présente invention a également pour objet un procédé de détection de l'antigène soluble circulant polysaccharidique capsulaire de Cryptococcus neoformans, éventuellement présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en présence ledit échantillon biologique avec le réactif de diagnostic conforme à l'invention, après quoi l'agglutination du complexe antigène polysaccharidique capsulaire-réactif de diagnostic est appréciée par tout moyen approprié. Le procédé conforme à l'invention a l'avantage d'être nettement plus sensible que les tests proposés dans 1 l'art antérieur et n'entraîne en particulier pas d'autoagglutination des billes de latex entre elles. La présente invention a, de plus, pour objet une trousse de diagnostic prête à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection de cryptococcose conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées de réactif de diagnostic conforme à l'invention. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'antigène cryptococcique polysaccharidique circulant, caractérisé en ce que l'on procède à la fixation dudit antigène sur une colonne d'affinité sur laquelle sont fixés les anticorps conformes à l'invention, puis en ce que l'on procède à une élution appropriée desdits antigènes. Un tel procédé permet d'obtenir spécifiquement les antigènes cryptococciques. La présente invention a, de plus, pour objet les antigènes obtenus à l'aide du procédé conforme à l'invention ci-dessus. La présente invention a, en outre, pour objet une composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un antigène conforme à l'invention, éventuellement associé à un adjuvant et/ou à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Préparation d'anticorps polyclonaux conformes à l'invention. a. Préparation des antigènes Des précultures de Trichosporon beigelii (souche dite T 49, IP 1495-83) sont réalisées par inoculation de fioles de 500 ml contenant 100 ml de milieu de culture Sabouraud chloramphénicol, liquide. L'incubation est de 48 heures, à 30je, avec agitation (150 tours par min). 10 ml de ces précultures servent à ensemencer des fioles de deux litres contenant 400 ml du même milieu de culture, qui sont ensuite incubées dans les mêmes conditions que les précultures. Les cellules sont traitées de différentes manières I) Cellules vivantes : après trois lavages en eau physiologique, une suspension de 107 est obtenue par comptage au microscope en cellule de Mallassez. 2) Cellules tuées : soit par traitement par le formol à 1 % pendant une nuit, soit par chauffage à 100"C pendant une heure. Le contrôle de la mort des cellules est fait par ensemencement des suspensions traitées. Des suspensions à 2 % ou 20 % sont alors préparées en présence de NaCl à 0,9 %. La souche T 49 présente les caractéristiques morphologiques et physiologiques des Trichosporon beigelii. La communauté antigénique de cette souche avec Cryptococcus neoformans a pu être prouvée. Le surnageant de culture de 48 heures, à 300C en milieu liquide agité, agglutine au 1/2000è les billes de latex recouvertes d'anticorps spécifiques des antigènes solubles de Cryptococcus neoformans. b. Immunisation des lapins Des lapins de race New Zealand, pesant 2,5 kg, ont servi aux immunisations. Le sang est recueilli sur tube sec par saignée de l'artère centrale de l'oreille. Après coagulation de 24 heures, le sérum est obtenu par centrifugation à 2000 tours par minute. Il est conservé à -20 C. Les immunoglobulines G sont ensuite extraites par purification. L'immunisation est réalisée par multiinjection sous cutanée (volume total lml) d'une suspension à 20 % de Trichosporon tués. La première injection est effectuée avec de l'adjuvant complet de Freund, les suivantes avec de l'adjuvant incomplet. Ces injections sont répétées jusqu'à l'obtention d'un titre d'agglutination au moins égal au 1/100è, c. Contrôle de l';mmunisation : 1) Aqqlutination avec Trschosporon beipelil Le contrôle d'immunisation se réalise par agglutination sur plaque, par le mélange de 25 jil d'une suspension de 2x107 cellules/ml de T 49 [culture de 48 heures lavée trois fois en tampon glycine (glycine buffered saline GBS 0,1 M ou G.B.S.) avec 25 1 de sérum ou de ses dilutions en tampon G.B.S.j. Après 10 minutes d'agitation à 200 tours par minute, la lecture est faite soit directement sous un tube fluorescent, soit au microscope, pour différencier les degrés d'agglutination. 2) Agglutination avec Cryptococcus neoformans Après obtention du titre d'agglutination avec la suspension de Trichosporon beigelii, un contrôle est effectué dans les mêmes conditions avec une suspension de Cryptococcus neoformans NIH 68 (souche IP 1207-79, sérotype A). d. Isolement des immunoglobulines Les sérums répondant au 1/400 et 1/800 ont été traités de manière à obtenir, par purification à l'acide caproïque, les immunoglobulines G (M. STEINBUCH et R. AUDRAN, Archives Biochem. Biophys., 1969, 134, 279-284, "The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid"). Exemple 2 : Préparation d'un réactif de diagnostic conforme à l'invention. Différentes concentrations d' immunoglobulines (90 à 200 Rg/ml) sont fixées sur des billes de latex en tampon glycine (G.B.S.) (Prolabo), en association ou non avec de la sérum albumine bovine (0 à 100 Rg/ml). iml de chacune de ces préparations est mélangée avec 1 ml de billes de latex. Le mélange est incubé à 37"C pendant 45 min, sous agitation à 100 tours par minute. Puis 0,5 ml d'une solution, comprenant pour 300 ml de la sérum albu mine bovine à 30 % (SAB) (100 ml) et du G.B.S. (200 ml) est ajoutée audit mélange, puis celui-ci est incubé dans les mêmes conditions que précédemment, pendant 30 minutes. Une centrifugation de 10 minutes à 20 000 g permet la séparation des billes de latex du milieu de réaction. On ajoute au culot de centrifugation 2,5 ml d'une solution stabilisante comprenant pour 1000 ml saccharose 54,0 g, NaCl 0,3 g, SAB 30 % (Sigma) 67,0 ml, Merthiolate 0,18 g, G.B.S. 933,0 ml). On obtient ainsi le réactif de diagnostic conforme à l'invention qui est alors conservé à +4 C, jusqu'à son emploi. Tous les tubes ou flacons dans lesquels a été réalisée la préparation du latex, ont été préalablement lavés avec le tampon glycine. Exemple 3 : Procédé de détection conforme à l'invention dans le sang. 1) Prélèvement des échantillons - on prélève le sang aseptiquement sur tube sec sans anticoagulant ; - on conserve le prélèvement dans un flacon en verre ou en polyéthylène hermétiquement fermé, puis on inactive les échantillons 30 minutes au bain marie à 56 . 2) Réactifs - réactif A : latex réactif, i.e. latex sensibilisé par une globuline anticryptococcique de lapin ; - réactif B :latex de contrôle, i.e. latex sensibilisé par une globuline de lapin non immunisé ; - contrôle positif : antigène polysaccharidique de Cryptococcus neoformans 0,200 Fg/ml ; - contrôle négatif : sérum de lapin non immu nisé. 3) Dosage qualitatif - sur une plaque de verre propre, déposer sur deux puits, 25 1 de l'échantillon à examiner ; - ajouter 25 fl de latex réactif dans l'un des puits, 25 Fl de latex contrôle dans l'autre puits ; - mélanger le contenu de chaque puits sur toute la surface du puits, avec un agitateur différent ; - placer la plaque de verre sur un agitateur rotatif pendant 10 minutes à température ambiante, à 160 tours/mn - observer immédiatement sous une source lumineuse et sur fond noir, la présence ou l'absence d'agglutination. Les contrôles positif et négatif doivent être traités comme le sérum à examiner. Un résultat positif correspond à une agglutination franche du latex réactif et à l'absence d'agglutination du latex contrôle. 4) Dosage quantitatif - préparer une série de dilutions de l'échantillon du 1/2 au 1/256 dans le tampon glycine ; - prendre deux plaques propres et déposer 25 1 de chaque dilution (rang A : latex réactif ; rang B : latex contrôle) ; - ajouter 25 Rl de latex réactif dans les puits du rang A et 25 Rl de latex contrôle dans ceux du rang B, et mélanger sur toute la surface du puits avec un agitateur à usage unique ; - placer 10 minutes sur un agitateur rotatif à 160 tours/mn, puis effectuer la lecture sous une source lumineuse et sur fond noir. Le titre est donné par la plus grande dilution présentant une agglutination. Exemple 4 : Procédé de détection conforme à l'invention dans le liquide céphalo-rachidien. Le protocole est identique à celui de l'exemple 3, à l'exception du prélèvement qui diffère en ce que le LCR est centrifugé 10 minutes à 1000 x g ou filtré sur filtre 0,2 clam, puis il est placé en flacon de verre ou de polyéthylène hermétiquement fermé. Exemple 4 : Sensibilité du procédé de détection conforme à l'invention. On compare le "CRYPTO LA TEST" qui comprend comme réactifs, un réactif A constitué par des billes de latex sensibilisées par une globuline anticryptococcique de lapin, un réactif B constitué par des billes de latex recouvertes par une globuline de lapin non immunisé, un contrôle positif constitué par an antigène polysaccharidique de C. neoformans 0,25 Rg/ml, un contrôle négatif constité par un sérum de lapin non immunisé et un tampon approrpié stabilisé avec un conservateur, avec un test conforme à l'invention.On constate - une plus grande sensibilité en tampon glycine : la concentration limite de détection du polysaccharide de Cryptococcus neoformans est de 10 ng/ml, soit six fois plus faible que celle obtenue avec le "CRYPTO LA TEST", - une plus grande sensibilité en sérum : les titres trouvés sont en moyenne quatre fois supérieurs à ceux obtenus avec le CRYPTO LA TEST, - une plus grande sensibilité en L.C.R.: même résultat que pour le sérum, - une absence d'autoagglutination en sérum particulièrement sensible lors du test d'agglutination, - une absence d'autoagglutination en L.C.R.: particulièrement sensible lors du test d'agglutination. CRYPTO CRYPTO LA TEST 79 LA Sensibilité de détection 62,5 ng/ml 10,0 ng/ml en tampon glycine Liquide CéPhalo Rachidien LCR H. (1) 1/2048è 1/8000è LCR D. (1) 1/256è l/1000è LCR G. (1) 1/1024è 1/4000è LCR P. (2) négatif négatif LCR M. (2) négatif négatif LCR M. (2) négatif négatif Sérums 88 7852 N6 (3) 1/512è l/l000è 88 7244 N7 (3) 1/2048è 1/4000è 88 7820 N1 (3) > 1/20.000è > 1/20.000è 88 8122 (4) négatif négatif 88 8123 (4) négatif négatif 88 8127 (4) négatif négatif * conditions optimales. (1) LCR de patients atteints de cryptococcose méningée. (2) LCR de patients ne présentant pas de cryptococcose (3) sérums -de patients atteints de cryptococcose généralisée. (4) sérums de patients ne présentant pas de cryptococcose. Dans ce tableau, la colonne "sensibilité de détection" indique la concentration minimum d'antigène cryptococcique décelée par "CRYPTO LA TEST" (marque déposée) et le test conforme à l'invention. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation qui viennent d'être décrits de façon explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVEND ICAT IONS 1.) Anticorps dirigés contre Cryptococcus neoformans, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié par un champignon qui présente une communauté antigénique avec Cryptococcus neoformans et qui est immunogène, en ce qu'il s'agit d'immunoglobulines G, et en ce qu'ils présentent une grande affinité pour Cryptococcus neoformans, exprimée d'une part par un titre d'agglutination desdits Cryptococcus neoformans au moins égal au 1/100ème et d'autre part par un seuil de détection des antigènes solubles capsulaires polysaccharidiques circulants de Cryptococcus neoformans compris entre 10 et 50 ng/ml, dans un tampon approprié et lorsque lesdits anticorps sont fixés sur des billes de latex appropriées. 2") Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié par un champignon du genre Trichosporon. 3 ) Anticorps selon la revendication 2, caractérisés en ce que ledit Trichosporon est une souche de Trichosporon beigelii. 4 ) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le tampon est un tampon glycine. 5 ) Anticorps selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisés en ce que lesdits anticorps sont des anticorps polyclonaux. 6 ) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que lesdits anticorps sont des anticorps monoclonaux. 7 ) Réactif de diagnostic sous forme de particules pour la détection d'antigènes solubles de Cryptococcus neoformans dans des fluides biologiques, caractérisé en ce que lesdites particules sont recouvertes d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8 ) Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce que lesdites particules sont choisies dans le groupe qui comprend les billes de latex et les billes magnétiques. 9 ) Procédé de détection de l'antigène circulant polysaccharidique capsulaire de Cryptococcus neoformans, éventuellement présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en présence ledit échantillon biologique avec un réactif de diagnostic selon la revendication 7 ou la revendication 8, après quoi l'agglutination du complexe antigène polysaccharidique capsulaire-réactif de diagnostic est appréciée par tout moyen approprié. 10 ) Trousse de diagnostic prête à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection de cryptococcose selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées de réactif de diagnostic selon la revendication 7 ou la revendication 8. 11 ) Procédé d'obtention d'antigène cryptococcique polysaccharidique circulant, caractérisé en ce que l'on procède à la fixation dudit antigène sur une colonne d'affinité sur laquelle sont fixés les anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, puis en ce que l'on procède à une élution appropriée desdits antigènes. 12 ) Antigènes obtenus à l'aide du procédé selon la revendication 11. 13 ) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un antigène selon la revendication 11, éventuellement associé à un adjuvant et/ou à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.