Brevet FR2657884A1 — publié le 19910809

La présente invention concerne un procédé pour la préparation du facteur VIII humain et d'analogues du facteur VIII. Le facteur VIII est un facteur de la coagulation sanguine qui est utilisé pour le traitement des patients atteints d'hémophilie A. Le facteur VIII utilisé dans ce traitement est actuellement essentiellement constitué de concentrés de facteur VIII obtenus par fractionnement à partir de plasma humain Depuis, on a cherché à remplacer cette source de facteur VIII par une source plus facilement accessible et moins sujette aux contaminations virales ou autres, c'est pourquoi un effort important a été entrepris afin d'obtenir le facteur VIII par génie génétique Les résultats obtenus actuellement montrent que le facteur VIII de recombinaison présente toutes les caractéristiques du facteur VIII naturel et qu'il peut être obtenu dans des conditions industrielles très satisfaisantes. La préparation de facteur VIII par des procédés mettant en oeuvre des techniques de génie génétique a déjà été très largement décrite notamment dans les brevets suivants EP-A-162 067, EP-A-182 448, EP-A-150 735, EP-A-157 556, et EP-A-160 457. Notamment, le brevet EP-A-162 067 mentionne l'expression du facteur VIII dans différents types de cellules eucaryotes, en particulier des cellules CHO. Le brevet EP-A-160 457 décrit également l'expression du facteur VIII dans des cellules eucaryotes, en particulier des cellules BHK. Les brevets FR-A-86 08258 et FR-A-87 04699 décrivent la préparation de facteur VIII en utilisant des cellules eucaryotes et le virus de la vaccine comme système d'expression Afin de conduire à une production optimum de facteur VIII, le milieu de culture contient le facteur Von Willebrand. A titre de cellules eucaryotes, le brevet EP-A-253 455 suggère également d'utiliser des levures pour préparer du facteur VIII. De nombreux analogues du facteur VIII ont également été proposés Parmi les brevets traitant de ces dérivés, on peut tout particulièrement citer EP-A-232 112, EP-A-265 778, EP-A-294 910, et EP-A-303 540. Ces analogues du facteur VIII présentent divers avantages sur le "facteur VIII naturel" et peuvent être comme lui obtenus par des techniques de génie génétique. Les procédés actuellement retenus utilisent de préférence des cellules eucaryotes exprimant le facteur VIII, soit qu'il s'agisse de cellules ayant intégré une ou plusieurs séquences codantes pour le facteur VIII au niveau chromosomique, soit qu'il s'agisse de cellules incorporant des vecteurs viraux exprimant le facteur VIII. Ce type de technologie est largement décrit dans les brevets précités et ne sera pas redécrit ici en détail Il sera simplement fait mention des cellules exprimant le facteur VIII ou un analogue du facteur VIII. Par analogue du facteur VIII, on entendra désigner une molécule ayant l'activité du facteur VIII et obtenue à partir de facteur VIII par délétion de certains aminoacides ou encore une molécule de facteur VIII ayant subi certaines mutations potentielles mais qui conserve néanmoins l'activité principale du facteur VIII. Comme cela est décrit dans les brevets WO-87 04187, FR-A-8608258 et FR-A87 04699, il peut être intéressant, afin d'optimiser la préparation de facteur VIII ou d'un analogue du facteur VIII, de prévoir l'addition dans le milieu de culture de cellules du facteur Von Willebrand ou bien de phospholipide. Il a en effet été montré que la présence de ce facteur Von Willebrand dans le milieu de culture permettait de stabiliser le facteur VIII et d'améliorer considérablement le rendement. Pour des raisons similaires à celles qui viennent d'être mentionnées, le facteur Von Willebrand utilisé est bien entendu un facteur Von Willebrand recombinant afin d'éviter tout risque de contamination. Ceci nécessite la mise en oeuvre d'une étape supplémentaire de fabrication et une augmentation de coût du procédé de préparation du facteur VIII, notamment pratiquement un doublement du prix. Il serait donc intéressant de disposer d'un procédé de préparation du facteur VIII ne nécessitant pas l'utilisation de facteur Von Willebrand mais conduisant malgré tout à des rendements importants en facteur VIII. L'objet de la présente invention est précisément de proposer une solution à ce problème. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de préparation de facteur VIII ou d'un analogue du facteur VIII par culture dans un milieu de culture de cellules produisant ledit facteur VIII ou analogue du facteur VIII et séparation de facteur VIII ou de son analogue, caractérisé en ce que le milieu de culture contient au moins un dérivé de polymère polycationique et/ou polyanionique. Parmi les analogues du facteur VIII on citera tout particulière- ment le facteur VIII delta 2 qui correspond à une délétion des acides aminés 771 à 1666 du facteur VIII et dont la préparation est plus particulièrement décrite dans le brevet EP 303 540. Les polymères selon la présente invention sont de préférence des dérivés de polymères polyosidiques notamment de polysaccharides. Ces polymères sont de préférence sulfatés. Ce type de polymères est connu, il s'agit notamment de produits obtenus par fermentation bactérienne par exemple le dextran ou bien il s'agit de produits d'extraction tels que les mucopolysaccharides de type héparine, héparine de bas poids moléculaire ou héparino Tdes. Le sulfate d'hydroxyéthyl d'amidon peut également être utilisé à titre de polymère. Ces composés sont particulièrement intéressants compte tenu de leur faible coût et de leur grande disponibilité. Le polymère utilisé selon la présente invention a un poids moléculaire compris entre 1000 et 1 000 000. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le polymère utilisé est un dextran sulfaté Le degré de sulfatation de ce dextran sulfaté est de l'ordre de 0,5 % à environ 18 % en poids en soufre et de préférence de 10 à environ 18 %. Des dextran sulfatés de poids moléculaire très divers peuvent être utilisés selon l'invention Leur poids peut ainsi varier de 5 000 à 700 000 Daltons. La présence d'un polymère polycationique et/ou polyanionique selon l'invention, dans un milieu de culture approprié pour la production de facteur VIII ou analogue du facteur VIII et exempt de facteur Von Willebrand conduit donc à des rendements en facteur VIII ou analogue du facteur VIII nettement supérieurs à ceux obtenus dans un milieu ne contenant ni de facteur Von Willebrand ni de polymère selon l'invention. Ainsi, il ressort des expériences réalisées selon le procédé de la présente invention et décrites dans les exemples ci-après, qu'il est possible, à partir d'un milieu de culture à base de dextran sulfaté de poids moléculaire 500 000, d'obtenir des quantités importantes de facteur VIII delta 2 mesuré par deux méthodes différentes, l'une basée sur une méthode immuno-enzymatique, mettant en jeu des anticorps monoclonaux anti- facteur VIII, et l'autre par une méthode physico-chimique telle que l'analyse par PAGE-SDS en conditions réductrices ou non mettant en évidence une bande majeure à 165 K Da qui représente la forme majeure du facteur VIII delta 2 exprimée en l'absence de sérum de veau. Des poids moléculaires ( 5000, 8000, 15 000, 50 000, 500 000 Da) ont donné des résultats sensiblement équivalents sur l'expression du facteur VIII. Le milieu de culture supplémenté avec un polymère polycationique et/ou polyanionique peut bien entendu contenir d'autres agents susceptibles de favoriser la production du facteur VIII Il peut s'agir d'agents antiprotéasiques et/ou de chlorure de calcium connu pour ses propriétés stabilisantes. Dans ces conditions, il a été montré que, pour un milieu de culture supplémenté avec 1000 mg/I de dextran sulfaté et 2 mmoles de chlorure de calcium ( 1 m M dans le milieu de base + 1 m M rajoutée), il est possible d'accumuler en 24 heures des quantités de facteur VIII delta 2 mesurées par une méthode immunoenzymatique 6 à 7 fois plus importantes que la quantité accumulée en l'absence de facteur Von Willebrand exogène. La molécule de facteur VIII complète ou delétée de la région B a la particularité de présenter de fortes densités de charges très localisées créant des pôles chargés positivement et négativement capables de se lier par des forces de Coulomb (interactions de type ionique) à des polyanions et à des polycations respectivement L'effet bénéfique du dextran sulfaté sur la production de facteur VIII peut s'expliquer par l'existence de telles interactions entre les groupements sulfates du dextran et les aminoacides basiques du facteur VIII Cette stabilisation de la molécule du facteur VIII complète ou délétée est en outre à associer à une augmentation du taux d'expression du facteur VIII ou dérivé du facteur VIII. Il y a vraisemblablement formation d'un complexe entre la molécule de facteur VIII complète ou délétée et au moins une des molécules du dérivé polycationique et/ou polyanionique mis en oeuvre dans le milieu de culture. La présente invention se rapporte également à cette forme complexée du facteur VIII ou dérivé du facteur VIII. Cette forme stabilisée du facteur VIII ou d'un de ses dérivés peut présenter un grand intérêt en particulier pour le stockage dudit facteur VIII ou dérivé du facteur VIII au cours du procédé de production ou à la fin de celui-ci De plus, lorsque le facteur VIII ou l'un de ses dérivés est complexé à du dextran sulfaté qui est un agent de lyophilisation, on peut espérer que le complexe ainsi formé présentera également une bonne aptitude à la lyophilisation. La présence de dextran sulfaté peut donc avoir à la fois un effet stabilisant vis-à-vis du facteur VIII et également un effet de stimulation sur l'expression du facteur VIII par interaction au niveau des membranes cellulaires. Le milieu de culture utilisé selon l'invention est de préférence un milieu de culture sans sérum à base notamment d'insuline humaine recombinante et pouvant contenir d'autres protéines exogènes. Ces protéines sont de préférence utilisées à une concentration de l'ordre de 4 mg/l. Les cellules utilisées pour la production du facteur VIII ou analogue du facteur VIII sont de préférence des cellules de mammifères et plus particulièrement des cellules CHO recombinées exprimant le facteur VIII ou analogue du facteur VIII de façon permanente. Ces cellules sont transfectées par un vecteur d'intégration comportant le c ADN du facteur VIII ou dérive du facteur VIII entouré des éléments nécessaires à son expression dans les cellules eucaryotes et un segment d'ADN favorisant l'intégration du vecteur dans l'ADN cellulaire Il est ainsi possible d'utiliser à titre de vecteur d'expression du facteur VIII le PTG 1020 et du facteur VIII z\ II le p TG 1509 décrits dans le brevet EP O 303 540 de même que des vecteurs d'expression de constructions équivalentes Les souches des plasmides p TG 1509 et p TG 1020 ont été déposées sous le N O I-679 et I-681 à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes. La transfection des cellules CHO par ces vecteurs d'intégra- tion est réalisée selon la technique décrite dans le brevet EP O 303 540 et ne sera pas rappelée ici. Le procédé selon l'invention présente donc de nombreux avantages. Il permet d'obtenir le facteur VIII ou analogue du facteur VIII par génie génétique avec un rendement optimisé. Il s'affranchit de la présence de facteur Von Willebrand dans le milieu de culture et par là même conduit à un gain important de temps et de coût pour la production industrielle de facteur VIII ou analogue du facteur VIII. Enfin, le type de polymère utilisé selon l'invention n'entraîne aucun risque de contamination virale ou autres, est peu onéreux, et facile à se procurer pour l'homme du métier. La présente invention se rapporte également au facteur VIII ou analogue du facteur VIII obtenu selon le procédé de l'invention. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples présentés ci-dessous à titre non limitatif de celle-ci. PARTIE EXPERIMENTALE Les études des effets des polymères polyosidiques sulfatés sur l'expression du facteur VIII delta 2, ont été réalisées à partir du clone CHO TG 2307-1 1. EXEMPLE 1 Etude des effets du dextran T 2000 sur l'expression du facteur VIII delta 2 Dans un premier temps à titre de référence, les effets du dextran T 2000 (PHARMACIA PM: 2 000 000 Da) ont été évalués Le tableau N O 1 ci- après résume les résultats obtenus comparativement à un milieu contenant 2 U/ml de facteur Von Willebrand recombinant. Le dextran T 2000 (non sulfaté) est sans effets sur l'expression du facteur VIII delta 2 en l'absence de sérum et de facteur Von Willebrand recombinant. Par conséquent, la matrice de dextran constituée d'unités glucopyranosyles non substituées n'interfère pas avec la molécule de facteur VIII delta 2. Tableau 1 ETUDE DES EFFETS DE L'ADDITION DU DEXTRAN T 2000 MILIEUX DE PRODUCTION DU FACTEUR VIII DELTA 2 CLONE CHO TG 2307-11-3 MILIEUX DE PRODUCTION APTT m U/ML J 3-J 4 MOYENNE I/H INS HUM 4 mg/L 1000 + 2 U v W Frec CNTS/ML 1000 1000 I/H INS HUM 4 mg/L 250 + O mg/L DEXTRAN T 2000 280 265 I/H INS HUM 4 mg/L 250 + 1000 mg/L DEXTRAN T 2000 320 300 I/H INS HUM 4 mg/L 265 + 2000 mg/L DEXTRAN T 2000 300 280 PASSAGE P 15 POST DECONGELATION ET P 12 EN HEM HT CROISSANCE ( 37) ET ESSAIS DE PRODUCTION ( 35 C) EN CHANGEMENT DE MILIEU TOUTES LES 24 HEURES INS HUMAINE ELI LILLY 319 KK 9 B DEXTRAN T 2000 (PHARMACIA): PH 2 000 000 Da EXEMPLE 2 Etude des effets de polymères sulfatés sur l'expression de facteur VIII delta 1) Le dextran sulfaté Un effet dose du dextran sulfaté (PHARMACIA PM:500 000) a été effectué Le tableau N O 2 présenté ci-après rend compte également des données obtenues à partir du même milieu contenant deux unités de facteur Von Willebrand recombinant. Dans ces conditions, il est possible, dans un cycle de production, qui dure du 3 ème au 6 ème jour avec renouvellement du milieu chaque jour, d'obtenir sur une des périodes d'incubation, ( 5 ème au 6 ème jour) des quantités de facteur VIII delta 2, mesurées en ELISA, équivalentes au maximum aux 2/3 des activités accumulées en présence de deux unités/ml de facteur Von Willebrand recombinant. Ces activités représentent en outre environ 2 à 3 fois le niveau des activités obtenues dans un milieu ne contenant ni facteur Von Willebrand recombinant, ni de dextran sulfaté et cela en absence de phospholipides. 2) L'héparine bovine (KABI VITRUM) Les résultats d'une étude d'un effetdose héparine bovine sont résumés dans le tableau N O 3. Sur les premiers cycles de production, l'héparine montre un effet très limité voir nul sur l'expression du facteur VIII delta 2 Sur le dernier jour d'incubation 35-36 une relation effet-dose très faible peut être mise en évidence. Tableau 2 Ell E DES I 1 E L'AJDIT Ile:LI/v DE LE l M t W ILE NI Im U IE PIFI Lcg LU 1 m I VM DIIETI 2 a CN Ea D TG 2307-11-3 m TTT 'z Pl:Nx OU= AM' /L MI / lA/ m U/m 1,I' /m m Umu DJ/,L ZTSA MW/s J 3-% 4 J 3-J 4 J 4-J 5 J 4-j 5 JS-J 6 J 56 M gr 10 SVF N) 570 11700 720 15900 608 651 9000 760 16400 I/H IS HM4 ll/L 249 467 7300 500 10000 + 2 U vwrec QS/> 280 409 7500 510 IV 1 I; Ean 4 m/L ND 2800 ND 2200 ND 4200 + 250 w/L t 6000 1600 4500 IH l H lK 4 m/L ND 4500 1 N 4600 ND 4600 + 500 N//L DS 3100 4300 4300 MIEI KH 4 g/L ND 3400 Nl 4800 ND 5000 + 1000g/L DS 3000 4700 6400 IE m SN1 I 4 do/L ND 3800 Md 5000 1 N 6300 + 2000 /L DS 340 5000 6500 PASWOE P 24 PST 18 Tlg erzw ET P 21 E 1 Er SYF ND 70121 ISSMI ( 37) ET ESSATS l;PR Ml R ( 35 C) EU P S 6 U 1 TS MM EW IL) fn*:î 7 OTU IT 24 HES INS IUIMM El LUI 319 % P&r G 6 Pr TS MM. D 6: lt ON SUI F' 500 000 PE Rf l EW'1 17 % S -= NME DOMBE DU FMIT DU PMIR ITIM N DU 1 MOUAN M Im 1 1 Tableau 3 ETUDE D EFFST 5 DE L'ADITICN D'HEPARINE BOVINE DA I M 4 MIL 1 D DE PIA Ui LDU FI C=VI I: 2 X 2 COE CM TG 2307-11-3 Km L I EMIAX xo C A Fi T mu/MLSA m I/a Ap'IU/,L LT Sx EU/IKAPT JMUMLW MU/M J 3-J 4 J 33 J 4 J 4-J 5 J 4-j 5 J 5-j 6 J 5-J 6 MHX HT 10 SVF NO 1500 18530 1920 35000 5000 36000 1570 14920 2230 36000 2830 27300 I/H INS H It 4 m/L 900 11410 1220 24400 1870 28900 + 2 U v crec QNTS/ L 1050 11400 1070 29300 2100 32500 I/H IS EUK 4 g/L 213 1850 130 2630 142 2000 148 1460 110 3050 125 1100 I/H INS Hl 4 /L ND 2060 N 1110 D 800 Mt ARIDE 10 UL 1300 1560 1100 2950 1850 2400 I/H INS U 4 q/L ND 2430 ND 1650 ND 2400 MARINE 20 U/ML 2300 2060 3000 2480 m 40 3400 I/ DISU Em4 ag/L N 2500 N 2170 ND 3500 HEPARINE 40 U/PL 3620 3220 5300 3120 2350 4800 Lt INS HM 4 rf/1 ND 3120 ND 2850 ND 4000 EPARINE 80 U/L 3680 3400 5300 3920 3400 5000 PASSAGE P 24 Posr DE:lo G Ei ATION ET P 21 EIN 1 M RT SYF ND 701121 CROISSANCE ( 37) ET ESAIS IE P Fd XCTI= ( 35 C) EN PKLS 6 PUIS NMC C GM Nr DE MIIIJEU TUI LES 24 EMMl IS BLUME ELI LLLY 319 K 9 NMA NN DU F Km T D 'UI i CC E L'V 9 PARN NP, N O EXEMPLE 3 Il a été également évalué les effets de combinaison de dextran sulfaté et de chlorure de calcium sur le taux d'expression du facteur VIII delta 2 comparativement à des milieux témoins contenant soit % de sérum de veau foetal, soit 2 U/ml de facteur von Willebrand, soit uniquement de l'insuline humaine qui rentre dans la composition de tous les milieux sans sérum utilisés dans l'expérience. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau N O 4 ci-apres. Il ressort que pour les points qui sont proches de l'optimum c'est-à-dire 1000 mg/I de dextran sulfaté et 2 m M de chlorure de calcium (I m M dans le milieu de base + l m M rajoutée), il est possible d'accumuler en 24 heures entre 20 et 21 unités d'antigène de facteur VIII delta 2 soit environ les 2/3 de la quantité accumulée en présence de 2 unités de facteur Von Willebrand recombinant ( 2 U/ml) et 6 à 7 fois la quantité accumulée en l'absence de sérum de veau foetal ou de facteur Von Willebrand. On remarque également qu'en l'absence de sérum de veau foetal ou de facteur Von Willebrand recombinant, les activités accumulées en 24 heures ne dépassent jamais 3 unités/ml et sont en moyenne de 2,27 unités/ml, soit très significativement inférieures aux activités accumulées en présence de quantités optimales de dextran sulfaté. Tableau 4 El DETS l: L'A)rr I Cl 'E FATE DE IX=m Rl Dmm L Es MLF DE PRMTIQN DU F RH V/I MTA 2 CROE C TG 2307-11-3 Om Di XIRAN S t ML ( 0-2000 q/L)/ Ca C 12 ( 2-11 M KU= LDE PROU=:N A Prr i U/i L LISA r IJ/m LAP"TIW/t M MM B/V 1 T x QI/L EM flb N/L EI Mi/i L J 3-M J 3-J 4 J 4 M-J J 4- 15 J 5-6 J-j 6 J 6-37 J 6-J 7 IM Er 10 î SVF ND I/T l NS U 4 r/L + 2 U v W Frec DNTS/,L 1500 18500 1920 34000 1600 14900 2230 35000 1050 11400 1220 24400 900 11400 1070 29300 2830 28000 1310 3000 500 36000 1850 35000 28900 1750 33700 2100 32500 1370 26700 I/H INS M 1 4 z I/L 210 1850 130 2650 1460 110 3050 1130 142 1900 142 3000 124 3170 * I/H ls 511 4 m'/L + 1000 ag/L D I/B D Ns 51 4 i/L + 1000 m/L D 6 Ca 1 i O ND 856 1) _ O I) 980 ND 6150 E_ 5000 4700 I/H INS HM 4 w/L + 1000;/L DS Ca 1 lt I/H In SM 4/L + 1866 w/L D Ca 7 5 zd ID 1350 D 1380 1 D 8400 ND 8550 ND 10700 8 WO O I/H INS H 1 I 4 àg/L + 134 f/L DS Ca 2 5 M VB INS M 4 ag 1 + 134 zg/L DS Ca 7 5 B ND 655 ND 6600 ND 250 ND 6700 ND 9900 NE 7800 is l N am 4 z/L + 1866 /L D, Ca 2 5 M( ID 1420 ND 6300 PASSC P 24 POST IE=ITI Er P 21 i N Ef ET SUF ND 701121 a ISSIIM ( 37) ET vs 1 lE P:'E=' ( 35 C) EN Pl 6 KMIS MC C;Gg D E m ST, IE;S 24 HEl, INS H 51 lM EU IIL 3191 Pl 6 RTS MMC DS= IDMAM SUIZ PL 500 000 PM: = 17 i S Tm E 6 RPTS O) SHIES t,ME, 2 MTS :EZ 3 ra PFM 24 E MM hei &un ND: MM DM= DU FT LU KOU W ICDAUK W DU DR 1 Z M= ND ND l Osao ND ID EXEMPLE 5 D'autres polymères et en particulier la carboxyméthyl- cellulose, le sulfate d'hydroxyéthylamidon (PM: 200 000) à 3,76 et 13,1 % de soufre ont été évalués pour leur capacité à influencer le taux d'expression du facteur VIII delta 2 dans un milieu sans sérum et sans facteur Von Willebrand et ce, par rapport à des témoins contenant 10 % de sérum bovin, 2 unités/ml de facteur Von Willebrand recombinant ou ni sérum ni Von Willebrand. La carboxyméthylcellulose aux concentrations testées n'a pas d'effets marqués sur l'expression du facteur VIII delta 2, alors que le sulfate d'hydroxyéthylamidon à 13 % de soufre à des concentrations de 0,5 et 1,0 g/l permet d'accumuler en 24 heures jusqu'à environ 20 unités C: Ag/ml de facteur VIII delta 2 soit environ les 2/3 de ce qui est obtenu dans le même temps en présence de 2 unités/ml de facteur Von Willebrand recombinant. Le même polymère ne contenant que 3,76 % de soufre a un effet sensiblement moins marqué sur l'expression du facteur VIII delta 2 Cette expérience confirme l'intérêt des polysaccharides sulfatés et révèle l'importance du degré de sulfatation dans l'interaction des polymères avec la molécule de facteur VIII delta 2. TABLEAU V EIUDE DES E S DE L'ADDITION DE POLYMER ES S AT DANS LES MILIEUX DE PROIUCION DU FACTEUR VIII DLTA 2 CLME KCHO TG 2307-11-3 EFM S DE SULFATES D'HYD M n Ar Ei DE PH 200 000 Da A 3 76 % ET 13 1 % DE S ET DE CARBEOXYMEW Lb CE 1 Lo SE LOW VISOOSITY SIQGA MILIW Xr DE PRODUTION A Pr U/ML ELISA MU/ml AP Tln/ML ZELISA m U/M 1 Mr r J/ML ELISA m U/Ma Fr T mu/ML LISA mu/L J 3-J 4 J 3-J 4 J 4-J 5 J 4-J 5 J 5-46 J 5-J 6 J 6-J 7 J 6-J 7 ME gr 10 % Sm MD I/H INS HUM 4 nç/L + 2 U v W Yrec CS/ML I/H INS WN 4 rq/L 3200 000 124 1100 760 260 1900 I/H INS HUM 4 mr/L + 100 mr/L CMC I/H INS ITI 4 mu/L + 500 g/L CMC I/H INS IUM 4 mg/L + 1000 mg/L ICC I/M INS Hl M 4 ' /L + 100 mg/L SHEA 13 1 % I/H INS HM 4 mg/L + 500 mu/L SHEA 13 1 % I/H INS m JM 4 mg/L + 1000 mg/L SHEA 13 1 % I/H INS HUM 4 mg/L + 100 mg/L SHEA 3 76 % I/H INS H Um 4 rg/i 1 + 500 rq/L SHEA 3 76 % I/H INS HUM 4 mg/L + 1000 mg/L SHEA 3 76 % ND 5500 ND 4600 ND 4400 ND 8700 ND 12800 ND 11900 ND 7500 ND 8300 ND 8200 b D 1400 ND 1900 ND 2200 ND 10300 ND 21900 ND 18000 *ND 4900 ND 11000 ND 14200 ND 970 ND 850 ND 1200 ND 5800 ND 9900 ND 11500 ND 2100 ND 5000 ND 6700 ND 1820 ND 2100 ND 2350 ND 5700 ND 10500 ND 12800 Nm D 2240 ND 4740 ND 5530 PASSAGE P 19 POST DECOEOXATION ET P 18 ENl ME H Tr SVF ND 701121 CROISSANCE ( 37) ET ESSAIS DE PR$CID'IC ( 35 C) EN PLACUES 6 PUITS NIAC CANGE 4 EMT DE MILIEU TOUIES LES 24 HEURES INS HUMAI LI LILY 319 KK 9 B PL 1 QJ 6 PUMTS Nm C SULFATE D'HYDR EYLA Il Pl I:200 000 PFEIM ET Lr G 1 3 76 ET 13 1 % S v W Frec CNTS Ca ICENF A 63 7 U/ML WDU 11/12/89 ND: NON DOSABLE DU FAIT DU P(XOMIR AMNTICOAGJ Li NT DES POY 2 ES S Ul FATES ELISA DE J 4-J 5: INCUBATION Ag 14 H-RES A+ 200 C REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation de facteur VIII ou d'un analogue du facteur VIII par culture dans un milieu de culture de cellules produisant ledit facteur VIII ou analogue du facteur VIII et séparation du facteur VIII ou de son analogue, caractérisé en ce que le milieu de culture contient au moins un dérivé d'un polymère polycationique et/ou polyanionique. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère est un polymère polyosidique. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le polymère est un dérivé de polysaccharide. 4 Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le dérivé dudit polymère est un dérivé polysulfaté. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère est un polysaccharide sulfaté. 6 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le dérivé polysulfaté est choisi de préférence parmi l'héparine, le dextran sulfaté et le sulfate d'hydroxyéthylamidon. 7 Procédé selon l'une des revendications I à 6, caractérisé en ce que le polymère présente un poids moléculaire compris entre 1000 et I 000 000. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dextran sulfaté ayant un poids moléculaire compris entre 5 000 et 700 000 et un degré de sulfatation de 0,5 à 18 % en poids en soufre. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le dextran sulfaté a de préférence un degré de sulfatation de 10 à 18 %. Procédé selon les revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'analogue du facteur VIII préparé est le facteur VIII delta 2. Il Procédé selon les revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les cellules en culture sont des cellules de mammifères. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules en culture sont des cellules CHO recombinées exprimant la molécule de facteur VIII ou analogue du facteur VIII de façon permanente. 13 Procédé selon les revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu de culture est exempt de sérum. 14 Complexe du facteur VIII ou analogue du facteur VIII avec au moins un dérivé d'un polymère polycationique et/ou polyanionique, obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 13. Facteur VIII ou analogue du facteur VIII obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 13.