Brevet FR2654516A1 — publié le 19910517

Recherches sur la prolifération de certaines cellules sous certaines conditions et leurs conséquences. La présente invention concerne les moyens (produits et procédés) d'études des mécanismes d'entrée du virus HIV et de son tropisme dans une lignée cellulaire monocytaire continue T4+ = la lignée U937 dite indifférentiable et non infectable par les mycoplasmes. Les cellules de cette lignée sont habituellement entretenues à 370C dans du milieu "normal" (RPMI 1640, sérum de veau foetal 10 %, Pénicilline - Streptomycine - Néomycine 1 %, Glutamine 1 %) à raison de 0,5 x 106 cellules/ml. Tous les deux ou trois jours, les cellules vivantes sont comptées après coloration au bleu trypan puis centrifugées 10 minutes à 1 500 rpm. Les cellules sont alors resuspendues dans un milieu normal à la concentration de 0,5 x 106 cellules/ml et gazées (mélange d'oxygène, d'azote et de gaz carbonique). Partant du principe que les malades atteints de Sida sont stressés avant, pendant et après l'infection par le rétrovirus HIV et que les stress diminuent l'expression de CD4 et de CD8, une nouvelle méthode de culture et d'immunomarquage a été mise au point. La technique préférée de mise en oeuvre des procédés et méthodes selon l'invention est indiquée dans la description détaillée qui suit Préparation des cellules : Les cellules U937 dites indifférentiables et non infectées par les mycoplasmes sont amplifiées dans un milieu RPMI normal (RPMI 1640, SVF 10 % , PSN 1 %, Glutamine 1 %) jusqu'à la quantité finale de 126 millions de cellules maintenues à la concentration de 800 000 cellules/ml. Elles sont resuspendues en milieu RPMI 1640 normal à la concentration 7 de 10' cellules/ml. Traitement des cellules par l'acétylcholine : 12 millions de ces cellules sont répartis dans 5 flacons et traités une nuit (16 h) à 370C par différentes dilutions d'acétylcholine en eau stérile : 10 10 M, 10 9 M, 10 8 M, 10 7 M. Le cinquième flacon est le flacon témoin. Lavage des cellules traitées et non traitées Les cellules sont lavées en RPMI 1640 (deux centrifugations successives de 5 minutes à 1 500 rpm) et remises en suspension dans chaque flacon à la concentration de 0,5 x 106 cellules/ml. Préincubation des cellules en PBS-FCS 20 % 500 1 des différentes populations de cellules sont distribués dans des tubes eppendorf et centrifugés une minute à 10 000 rpm. Une solution de 50 ul de PBS-FCS 20 % est ensuite ajoutée aux culots 1/2 h à + 4 C. Immunomarquages - a t16h (stress refroidissants répétés) Les immunomarquages portent sur des cellules entretenues à 370C. Ils sont réalisés de manière non stérile à température ambiante et en partie à + 40C (incubations) après un temps de pause de 2 h à température ambiante. Les cellules sont centrifugées une minute à 10 000 rpm avant d'être resuspendues dans 501 d'une solution d'anticorps IgG2a de souris anti Homme, OKT4A, IOT8 dilués respectivement au 1/50, au 1/30 et au 1/30 en PBS-FCS 20 %. Après incubation 30 minutes à + 40C, les cellules sont centrifugées une minute (10 000 tours/mn) avant d'être lavées une fois en milieu de marquage. La présence des anticorps fixés aux cellules est révélée par l'addition de 50rl d'une dilution au 1/30 des immunoglobines de chèvre anti-souris marquées à la fluorescéine. Après incubation 30 minutes à + 40C, les cellules sont centrifugées une minute (10 000 tours/mn) puis lavées deux fois en milieu de marquage. - à t30h (stress refroidissant permanent) Les immunomarquages sont réalisés en totalité à + 40C sur des cellules lavées de toute trace d'acétylcholine depuis 14 h. - à t57h : Les immunomarquages sont réalisés en totalité à + 40C sur des cellules lavées de toute trace d'acétylcholine depuis 41 h et non repiquées. - à t100h (stress refroidissant d'une nuit) Les immunomarquages sont réalisés en totalité à + 40C sur des cellules entretenues une nuit à + 40C, non repiquées, et lavées de toute trace d'acétylcholine depuis 84 h. Lecture des résultats La lame est montée avec 10ssl1 d'une solution de PBS-glycerol (1 vol/ 9 vol) et lutée au vernis à ongle. La lecture des résultats se fait au microscope à épifluorescence. Mise en évidence par cette méthode d'une double population de cellules Tu+ : - cellules T4+ résistantes à l'infection par le rétrovirus HIV quand elles sont stressées : population de cellules antérieurement exposées à 1 nM d'acétylcholine et à la surface desquelles l'amplitude du signal lumineux transmis par RFcà T4 est diminuee. - cellules T4+ infectables par le rétrovirus HIV quand elles sont stressées : population de cellules antérieurement exposées à 100 nM d'acétylcholine et à la surface desquelles l'amplitude du signal lumineux transmis par RFc à T4 est augmentée. Ces cellules seront triées et clonées. Pour le triage des cellules U937 cultivées et marquées dans ces conditions, l'utilisation de sérumalbumine à 20 % dans du PBS-FCS 1 % sera plus appropriée que la solution de sérum de veau foetal (PBS-FCS 20 %) à l'identification de 100 % des cellules cibles du virus. Cette méthode permettra l'identification de la nature des différents rétrovirus HIV sélectionnés par ces cellules et notamment d'un rétrovirus non pathogène, peu énergétique, et qui y sera piégé. Le rétrovirus HIV peu pathogène pourra servir de vaccin immunitaire il détruira exclusivement les cellules infectables par le virus HIV lorsqu'elles sont stressées. On pourra l'intégrer à l'oeuf humain et protéger ainsi l'organisme tout entier : pour cela, on pourra utiliser comme vecteur de ce vaccin le matériel génétique contenu dans le spermatozoide. L'intégration du gène de la dysplasie ectodermique anhidrotique au génome des cellules U937 et l'étude de son expression dans des conditions de stress refroidissants ou intermittents lors de l'immunomarquage et dans des conditions d'absence de repiquage de ces cellules constituera un marqueur de l'infectabilité et du pouvoir infectieux du virus HIV. Ce marqueur sera la protéine de choc thermique HSP 70 ou un anticorps dirigé contre le signal peptide de la protéine myc. Cette méthode s'appliquera aussi à l'étude des cellules du système immunitaire de l'homme en bonne santé ou atteint de maladies chroniques où les facteurs de stress jouent un rôle déclenchant ou aggravant et où la participation de rétrovirus est soupçonnée mais non encore démontrée (psoriasis, cancer du sein de l'homme ou de la femme, stérilités autoimmunes, infections chroniques à mycoplasmes, psychose maniaco-dépressive, schizophrénies, etc ...). Les conséquences et les retombées de ces découvertes tant dans le domaine pharmacologique que dans le domaine de l'industrie chimique sont nombreuses et il serait superflu de les énumérer. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de cellules capables, lorsqu'elles sont stressées, de proliférer en l'absence d'exposition à tout antigène étranger puis de devenir les cellules-cibles et les cellules résistantes au virus HIV. L'originalité de ce procédé tient à ce qu'il prend en compte la variabilité des capacités de fixation des anticorps lOT8 ainsi que sa limitation conditionnée par la qualité des mécanismes d'adaptation au froid de ces cellules repiquées et non repiquées. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il consiste à partir de cellules U937 dites indifférentiables et non infectables par les mycoplasmes à les mettre en présence d'acétylcholine dans des conditions de surpopulation cellulaire, à les laver à température ambiante en présence de RPMI 1640, et aux différents temps de l'expérience, à les remettre en culture à différentes températures et à une concentration ne mettant pas en jeu la vie de ces cellules et à les marquer à froid : pour ce faire, les cellules sont préincubées à + 40C en PBS FCS 20 % et soumises à un stress refroidissant intermittent ou permanent susceptible de conditionner les qualités des marquages réalisés à l'aide de différents anticorps monoclonaux et polyclonaux se fixant ou se détachant de récepteurs RFc différents, notamment en ce qui concerne les anticorps OKT4A, lOT8 et les anticorps de chèvre anti-souris fluorescents directement impliqués dans les mécanismes de reconnaissance et de pénétration des cellules par les virus HIV. Toutes les incubations sont suivies d'une centrifugation à 10 000 tours/mn et de lavages en milieu de marquage. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en présence d'acétylcholine utilisée à une concentration de 10 10 0-10 M, 10 9 M, 10 8 M, M, 7 M, le stress refroidissant intermittent est effectué de la température ambiante à + 40C au moment de la préincubation en PBS FCS 20 %, après deux heures de pause à température ambiante, puis de la température ambiante à + 40C au moment des incubations portant sur des cellules repiquées, préalablement cultivées comme de coutume à 370C. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en absence d'acétylcholine, préalablement éliminée par le lavage, le stress refroidissant permanent est effectué de 370C à + 40C pendant la totalité de l'immunomarquage sur des cellules cultivées à 370C, non repiquées mais préincubées à + 40C en PBS FCS 20 %. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en absence d'acétylcholine, préalablement éliminée par le lavage, les marquages à froid portent, à t100h, sur des cellules non repiquées, cultivées à + 40C pendant une nuit et préincubées à + 40C en PBS FCS 20 %. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lavage en RPMI 1640 comporte deux centrifugations de 5 minutes à 1 500 rpm à température ambiante. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps OKT4A, lOT8, anticorps de chèvre anti-souris marqués à la fluorescéine, les IgG2a de souris anti-Homme sont respectivement dilués au 1/30 en PBS FCS 20 % pour les trois premiers anticorps et au 1/50 pour le dernier. 7. Application du procédé à l'identification de la nature des différents rétrovirus HIV sélectionnés par ces cellules et notamment de rétrovirus non pathogènes, peu énergétiques et susceptibles d'y être piégés. 8. Application du procédé à la fabrication de vaccins immunitaires à partir de ces rétrovirus non pathogènes obtenus dans la revendication 7, susceptibles de détruire exclusivement les cellules infectables par le virus HIV lorsqu'elles sont stressées. 9. Application du procédé à d'autres cellules monocytaires exprimant, comme la lignée U937, les récepteurs T4, T8 et RFct de façon à étudier les relations qui existent entre les troubles de la différentiation cellulaire, la résistance aux mycoplasmes et la sensibilité aux rétrovirus HIV. 10. Application du procédé aux cellules monocytaires de sujets atteints de maladies chroniques où les facteurs de stress jouent un rôle déclenchant ou aggravant (psoriasis, cancer du sein, stérilités autoimmunes, infections chroniques à mycoplasmes, psychose maniaco-dépressive, schizophrénies, hypertension, mal de mer, mal de l'espace, etc.). 11. Application du procédé à la mise au point d'une méthode permettant de lier les perturbations de ces cellules aux manifestations cliniques des maladies chroniques citées au paragraphe 10 et de faire disparaître ces perturbations. 12. Application du procédé à l'étude de l'expression du gène de la dysplasie ectodermique anhidrotique dans ces conditions de stress. 13. Application du procédé aux cellules du système reproducteur de l'Homme en utilisant le spermatozoide comme vecteur des rétrovirus HIV peu pathogènes afin de protéger l'organisme tout entier.