Brevet FR2651438A1 — publié le 19910308

La présente invention a trait au domaine de l'inactivation in vitro d'agents infectieux de nature virale, bactériologique ou encore parasitaire susceptibles de contaminer des milieux liquides biologiques, et concerne plus particulièrement un nouveau procédé de traitement d'un tel milieu biologique pour au moins partiellement inactiver les agents infectieux qu'il peut contenir. La gravité des problèmes de contamination des receveurs de transfusions de sang ou de dérivé sanguin est actuellement remise en lumière en liaison avec le développement épidémique du SIDA. Cela étant, ce sont de nombreux virus qui peuvent être transmis d'un patient à l'autre par transfusion de sang, et notamment les virus HIV, HTLV1 et CMV, les virus des hépatites, etc... De même, la sécurité des produits transfusionnels vis-à-vis de maladies comme le paludisme ou la maladie de Chagas est un souci majeur des centres de transfusion dans les zones d'endémie. Ainsi, à côté des précautions usuelles de dépistage, qui ne sont pas à même de résoudre complètement ces problèmes il est nécessaire d'utiliser des techniques destinées à réduire encore le risque de contamination par transfusion. Cela étant, on ne connaît pas à l'heure actuelle de moyen efficace pour inactiver les agents infectieux potentiellement présents dans des concentrés érythrocvtaires tout en conservant la qualité de ces concentrés. Par ailleurs, il existe à l'heure actuelle une demande croissante adressée aux centres de conservation du sperme et aux centres de fécondation in vitro par des hommes séropositifs vis-à-vis du virus du SIDA VIH, hommes qui souhaiteraient avoir des enfants mais ne le peuvent sans risque de contaminer leur partenaire et leur enfant. Et ces deux types d'organismes souhaitent légitimement mieux se prémunir contre les risques de contamination liés à l'utilisation du sperme des donneurs. Sur un plan plus général, il existe une forte demande pour inactiver in vitro des éventuels agents infectieux présents dans un liquide biologique destiné à une utilisation in vivo (par transfusion, insémination, ingestion...) sans pour autant dégrader les propriétés utiles d'un tel liquide et notamment capacité de conservation des hématies pour le sang, pouvoir fécondant pour le sperme, durée de vie, etc... Et actuellement il n'existe aucune technique de traitement de tels produits qui soit capable de satisfaire efficacement à cette demande. Par ailleurs, il est déjà connu dans la technique antérieure d'utiliser à titre expérimental des ultrasons pour: - libérer un virus (tel que le virus de la grippe) des cellules hôtes; - homogénéiser une suspension virale; - dissocier des complexes Ag-Ac; - désagréger les virus pour en séparer les divers constituants; ou encore - provoquer des altérations de diverses cellules, et en particulier le phénomène d'hémolyse. Par ailleurs, en ce qui concerne le domaine de l'inactivation virale, on a déjà utilisé des ultrasons de façon occasionnelle et anecdotique non pas pour l'inactivation des virus, mais pour l'étude purement expérimentale des propriétés virales ou encore pour la mise au point de techniques virologiques (notamment extraction de virions à partir de leurs cellules hôtes). En outre, toutes ces recherches sur ce sujet ont fait appel à des champs ultrasonores à basse fréquence (de 10 à 50 kHz) engendrés par des cuves de nettoyage ou de broyage cellulaire. Le document le plus représentatif de la technique antérieure est "Changes in light scattering, absorption, fluorescence and biological characteristics of influenza virus A(HlNl) exposed to sonification", C.N. ZAHARIA et A.L. PETRESCU, Rev. Roum. Med. - Virol., 35, 2, 105-107, 1984. Ce document enseigne l'application d'un champ ultrasonore d'une fréquence de 20 kHz dans une cuve de 600 W, en décrivant simplement les anomalies morphologiques, observées au microscope électronique, apparues pendant l'exposition, La présente invention est basée sur la découverte expérimentale selon laquelle, dans certaines conditions, une irradiation ultrasonore est capable d'inactiver de façon efficace des agents infectieux divers, c'est-à-dire de les empêcher définitivement de se répliquer sans pour autant dégrader les produits biologiques ainsi traités. Ainsi la présente invention concerne un procédé de traitement d'un milieu biologique liquide susceptible d'être contaminé par au moins un agent infectieux de nature virale, parasitaire ou bactériologique, caractérisé en ce qu'on applique au milieu un faisceau cohérent d'ultrasons à une fréquence comprise entre environ 0,1 et 100 MHz, de manière à inactiver le ou les agents infectieux. De façon préférée, on applique le faisceau d'ultrasons pendant une durée comprise entre 1 et 10.000 secondes. En outre, un faisceau d'ultrasons d'une puissance surfacique comprise entre 0,5 et 50 W/cm2 est particulièrement avantageux. Le mécanisme exact des inactivations virales observées en mettant en oeuvre le procédé de la présente invention n'est pas encore identifié avec certitude. On peut néanmoins mentionner les hypothèses suivantes - le champ ultrasonore crée à ces fréquences un phénomène intense de cavitation transitoire grâce auquel, au moment du collapsus des bulles, il est engendré des pressions et des températures locales élevées ainsi que des ondes de choc.Ces phénomènes créent des radicaux libres en grand nombre, dont l'activité chimique peut être une clé du phénomène d'inactivation observé; - les ultrasons sont à l'origine de relaxations moléculaires telles que certaines protéines ou l'acide nucléique de l'agent infectieux viennent à se modifier; ou encore:: - les ultrasons provoquent la mise en vibration du milieu à fréquence élevée à un degré tel que la structure mécanique de la capside virale se rompt On peut noter ici que l'analyse de la technique antérieure concernant le comportement de cellules, et notamment d'hématies, sous l'effet d'une irradiation ultrasonore, bien que toutes les études qui y sont décrites impliquent des ultrasons à basse fréquence, de l'ordre de 10 à 80 kHz, et malgré des conditions disparates de mise en oeuvre, conduit à favoriser l'hypothèse selon laquelle le phénomène de cavitation, soit directement par effet mécanique au voisinage du collapsus, soit indirectement par la production de radicaux libres ou d'ondes de choc, est responsable de l'effet d'inactivation observé. D'autres aspects, buts et avantages de la présente invention apparaîtront mieux à la lecture de la description détaillée suivante de formes de réalisation préférées d'appareils pour la mise en oeuvre du procédé, donnée à titre d'exemple non limitatif et faite en référence au dessin annexé, sur lequel la figure 1 est une vue schématique en élévation d'un dispositif expérimental pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, la figure 2 est une vue en coupe verticale axiale d'une cuve d'irradiation ultrasonore selon l'invention. On indiquera tout d'abord que, d'une figure à l'autre, des éléments ou parties identiques ou similaires sont désignés par les mêmes numéros de référence. En référence tout d'abord à la figure 1, un appareil d'irradiation pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention comprend une cuve 100, de préférence en aluminium, de forme parallélépipédique. Dans une paroi latérale 101 de la cuve 100 est pratiquée une ouverture 102 au droit de laquelle est fixée rigidement, par exemple par collage, une céramique 110, protégée par un boîtier étanche 120. Par exemple, la cuve 100 peut avoir un volume de 80 cm3 et la céramique 110 une surface de 9 cm2. Sur la paroi 102 de la cuve qui est opposée à la paroi 101 est fixé du côté intérieur, un réflecteur 130 d'ondes ultrasonores, de manière à créer dans la cuve un champ stationnaire d'ondes ultrasonores. Il est à noter que, dans une variante de réalisation, le réflecteur 130 peut être remplacé par un matériau absorbant les ultrasons aux fréquences considérées, de manière à créer dans ce cas un champ progressif d'ultrasons. Des moyens sont prévus pour assurer dans la cuve 100 une circulation d'eau réfrigérée. Ces moyens comprennent un bac 140 dans lequel sont disposés de l'eau et des glaçons. Un tube 141 relie le bac 140 à l'entrée d'une pompe à eau 142 dont la sortie est reliée par un second tube 143 à un raccord d'entrée 103 de la cuve 100. Un raccord de sortie 104 de la cuve est relié par un troisième tube 144 au bac 140. La partie d'alimentation de la céramique se compose d'un générateur à haute fréquence 150 dont la sortie est reliée d'une part à un amplificateur à haute fréquence 160 et d'autre part à un oscilloscope 170. La fréquence et l'amplitude du signal de sortie du générateur 150 peuvent être réglées. La sortie de l'amplificateur 160 est reliée, par un câble coaxial approprié 161, à la céramique 110. On peut ainsi créer dans la cuve 100, par l'intermédiaire de la céramique 110, un champ ultrasonore de fréquence et d'intensité déterminées, ces conditions étant visualisées sur l'oscilloscope. Un tube à essais 200 contenant l'échantillon de liquide biologique à irradier est plongé dans l'eau contenue dans la cuve 100, à travers une ouverture appropriée (non illustrée) formée dans la paroi supérieure 105 de la cuve. On a représenté sur la figure 2 une variante de réalisation de l'ensemble de la cuve 100. La cuve comporte ici une paroi latérale cylindrique 106, un fond 107 formant également platine support et un couvercle 108, assemblés entre eux par des movens mécaniques appropriés, avec des étanchéités convenables. La cuve peut être réalisée avantageusement en duralumin. Les ultrasons sont ici engendrés par une céramique 110 de forme circulaire disposée horizontalement et réalisée par exemple en une céramique ferro-électrique. La céramique 110 est fixée dans une ouverture 107a pratiquée dans la paroi de fond 107. L'âme 161a du câble d'alimentation 161 est soudée sur la face inférieure de la céramique, tandis que son blindage est soudé au fond 107. Par ailleurs, un cordon de soudure périphérique 107b entre la face supérieure de la céramique et la paroi 107 constitue l'autre connexion d'alimentation de la céramique. L'échantillon de liquide biologique à traiter est contenu dans un tube vertical d'échantillon 200, également en duralumin, traversant une ouverture prévue dans le couvercle 108. Le tube 200 est fermé à son extrémité supérieure par un bouchon 201 et à son extrémité inférieure par une membrane 202 en "Kapton" (Marque déposée), perméable à l'irradiation ultrasonore. De même que dans le cas de la figure 1, on fait circuler dans la cuve 100 de l'eau réfrigérée, en faisant intervenir les raccords 103 et 104. En disposant dans la région supérieure de la cuve 200 un réflecteur d'ultrasons approprié (non représenté), on établit ainsi lorsque la céramique 110 est alimentée un champ stationnaire d'ultrasons dans la cuve 100, champ auquel est exposé le liquide biologique contenu dans le tube 200. Conformément à un aspect essentiel de l'invention, la champ ultrasonore a une fréquence comprise entre 0,1 et 100 MHz, de préférence entre 1 et 20 MHz. L'intensité surfacique du champ ultrasonore est préférentiellement comprise entre 0,5 et 50 W/cm2 , et la durée d'irradiation optimale, qui varie en fonction de la fréquence et de l'intensité du champ et du type d'agent infectieux à inactiver, peut être comprise entre 1 et 10000 secondes. Esemple 1 On va décrire ci-dessous une expérience d'inactivation virale d'une souche d'herpèsvirus de type Il en suspension dans un milieu biologique de conservation. Des échantillons ont été soumis à un champ ultrasonore dans le dispositif représenté sur la figure 2. L'appréciation du pouvoir infectieux du virus a été réalisée par culture cellulaire pendant quatre jours, sur cellule MRC5. Le titrage a été réalisé par le calcul de la dose infectante 50 (DI 50%) , par la méthode de Reed et Muench; on peut rappeler ici que, selon cette procédure, on calcule la dilution 10- n qui aurait infecté 50% de la culture cellulaire. Une diminution de 4 log du titre des virus exposés aux ultrasons par rapport à celui de virus témoins a été retenue ici comme critère d'inactivation de cette souche virale. Cette expérience a été résumée dans le tableau I ciaprès, qui indique les résultats obtenus avec diverses énergies ultrasonores I et diverses fréquences ultrasonores F. Ces résultats sont symbolisés comme suit + indique une inactivation totale du virus; (+) indique une inactivation partielle du virus (diminution du titre viral, mais inférieure à 4 log); et - indique une absence de modification du titre viral, c'est-à-dire aucune inactivation. Par ailleurs, on a indiqué dans chaque case la durée minimale d'irradiation nécessaire pour atteindre le résultat indiqué (en secondes). TABLEAU I traitement du virus HSV Il Cultures cellulaires Véro/O#O25ul/4j i 2 5 F 1 2 5 10 20 4 CWo + + + + + I ~~~~~~~~~~~ 2000s 2000 s 2000 1000 s 500 s 3,5 fui+) L S (+) (+) 5 5000- Sffi + 7 2000s + 10000+ 7 10000s iCOOs il 2000s 500 s On peut observer sur le tableau I qu'un inactivation partielle ou totale est obtenue pour chacune des fréquences d'ultrasons utilisées. On note en outre qu'aux fréquences les plus basses (autour de 1 MHz), l'intactivation est réalisée avec de faibles intensités d'ultrasons. A 3 et 5 MHz, une intensité plus grande, de l'ordre de 20 W/cm2, est requise. Enfin aux fréquences les plus élevées (7 et 11 MHz) et avec une forte intensité, l'inactivation peut être réalisée avec les durées les plus courtes. Exemple 2 La deuxième expérience a consisté à étudier l'inactivation d'une souche d'échovirus, toujours en suspension dans un milieu biologique de conservation, dans les mêmes conditions et avec les mêmes méthodes que pour l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans le tableau Il cidessous. TABLEAU Il Traitement d'échovirus Cultures cellulaires Véro/O, O25ul/4j IF \#*(L#J(I1 2 5 10 | 20 I LHL(#I# ~ ~ ~ ~ 5Q00 s 3,5 10000 s 10000 IL 5 sonos foon ffi 1 7 + 5000 s + il IOOOOs On peut voir sur ce tableau que les conditions d'exposition aux ultrasons permettant l'inactivation sont proches de celles observées pour l'herpèsvirus type Il, mais les durées de traitement sont plus élevées. On note également que les fréquences les plus élevées (7 et 11 MHz) paraissent être les plus favorables. Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée à la forme de réalisation décrite ci-dessus et représentée sur les dessins, mais l'homme de l'art saura y apporter toute variante ou modification conforme à son esprit. En particulier, bien que l'on ait décrit ci-dessus des appareillages expérimentaux pour irradier des échantillons de liquides biologiques, l'homme de l'art saura concevoir des appareils capables de traiter des liquides biologiques en des quantités importantes, en multipliant la capacité de la cuve et la taille et la puissance du dispositif engendrant le champ d'ultrasons ou d'une autre manière. A cet égard, on peut envisager un traitement global d'un liquide contenu dans un récipient tel qu'un tube, une poche ou un bac, et ce de façon immédiate après le prélèvement ou différée. On peut également envisager d'appliquer le champ ultrasonore à une partie d'une tubulure de recueil du sang dans le cas des dons sanguins. Par ailleurs, le champ ultrasonore peut être comme on l'a indiqué plus haut stationnaire ou progressif, et les ondes ultrasonores peuvent être émises de façon continue ou pulsée, les modes de mise en oeuvre les plus appropriés étant déterminés par l'expérience au cas par cas. En outre, il est clair qu'on peut combiner le traitement par ultrasons décrit ci-dessus avec tout autre traitement susceptible d'amplifier l'effet des ultrasons. Par exemple, on peut utiliser des détergents de type désoxycholate ou sodium dodécylsulfate, ou encore des produits se fixant sur les acides nucléiques, tels que l'acridine et ses dérivés, les porphyrines, les chlorines, les composés cycliques, etc... Ces substances sont de préférence incorporées au milieu biologique à traiter avant l'exposition aux ultrasons. Enfin l'invention s'applique non seulement au traitement du sang total ou de produits sanguins (concentrés globulaires, plasma) et au traitement du sperme, mais également au traitement de tout produit biologique liquide ou semi-liquide, tel que la moelle osseuse ou encore les produits alimentaires les plus divers. REVENDICATIONS 1. Procédé de traitement d'un milieu biologique liquide tel que du sang, du sperme, des prélèvements de moëlle osseuse, ou des dérivés sanguins tels que des culots globulaires, du plasma ou des fractions protéiques, susceptible d'être contaminé par au moins un agent infectieux de nature virale, parasitaire ou bactérienne, caractérisé en ce qu'on applique au milieu un faisceau cohérent d'ultrasons à une fréquence comprise entre environ 0,1 et 100 MHz, de manière à inactiver le ou les agents infectieux. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on applique le faisceau d'ultrasons pendant une durée comprise entre 1 et 10.000 secondes. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on applique un faisceau d'ultrasons d'une puissance surfacique comprise entre 0,5 et 50 W/cm2. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'avant l'application du faisceau d'ultrasons, on ajoute au milieu biologique au moins une substance amplificatrice choisie parmi les détergents et les produits se fixant sur les acides nucléiques. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le faisceau d'ultrasons a une fréquence comprise entre 1 et 20 MHz. 6. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 5 à l'inactivation virale de produits sanguins et de leurs dérivés. 7. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 5 à l'inactivation virale du sperme. 8. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 5 à I'inactivation virale de prélèvements de moëlle osseuse. 9. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 5 à l'inactivation virale de produits alimentaires liquides ou semi-liquides.