Brevet FR2650186A1 — publié le 19910201

monoclonaux dirigés contre des protéines impliquées dans les fonctions plaquettaires. Leur avolication en tant au' agent diagnostique et théraneutipue. L'invention concerne des anticorps onoclonaux dirigés contre des protéines impliquées dans les fonctions plaquettaires et leur application en tant qu'agent diagnostique et thérapeutique. Les mécanismes de l'adhésion, de 1'agrégation et de la sécrétion plaquettaires qui entrent dans les différentes étapes de la physiologie plaquettaire, font intervenir in vivo de nombreuses protéines et glycoprotéines, présentes au niveau des plaquettes, de façon permanente ou transitoire, ou/et présentes au niveau d'autres cellules telles que des cellules endothêliales. Certaines de ces protéines ou glycoprotéines ont été identifiées et des anticorps, notant des anticorps monoclonaux les reconnaissant, ont été préparés. En particulier, des anticorps utilisables en tant que parqueurs d'activation plaquettaire pour des tests de diagnostic ont déjà été décrits. Le brevet américain 4 783 330 concerne par exemple des anticorps du type 1gG1 qui reconnaissent des plaquettes activées et au contraire ne reconnaissent pas les plaquettes inactivées, les granules aiurophiles des monocytes et des granulocytes. De préférence, ces anticorps monoclonaux reconnaissent une glycoprotéine de poids moléculaire voisin de 140 000 Da (gp140) sur des plaquettes humaines activées. Les inventeurs se sont maintenant plus particulièrement intéressés aux pathologies liées à la physiologie plaquettaire et à leur traitement par des moyens contrôlés. Dans cette optique, ils ont mis au point de nouveaux anticorps dirigés contre des épitopes particuliers de protéines, glycoprotéines ou complexes protéiques impliqués dans la physiologie plaquettaire. Ces anticorps ont été sélectionnés pour leur capacité spécifique d'interférence avec les fonctions plaquettaires. L'invention concerne donc de nouveaux anticorps dirigés contre des protéines, des glycoprotéines ou des complexes protéiques intervenant spécifiquement dans les réactions d'adhésion, d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire pouvant conduire à la formation de thrombus ou encore impliquées dans les processus l'inflammation ou de cicatrisation. Ces anticorps présentent l'avantage tout à fait intéressant dans le cadre de l'invention d'être capables de moduler les réactions mettant en oeuvre les plaquettes, telles qu'elles ont été décrites ci-dessus. L'invention concerne en outre, la préparation et la sélection de ces anticorps monoclonaux ainsi que leur utilisation pour le diagnostic ou comme agent thérapeutique. Ils peuvent ainsi être appliqués au traitement de pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, l'athérosclérose, les rétinopathies, le diabète et également, pour certains d'entre eux, dans le traitement des métastases tumorales. Dans le cadre des définitions ci-dessus, l'invention concerne des anticorps monoclonaux, ou les fragments idiotypiques de ces anticorps monoclonaux, reconnaissant des antigènes impliqués, soit -dans au moins une des étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire-, soit dans l'adhésion des cellules endothéliales ou encore dans les deux types d'actions, caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de moduler les fonctions plaquettaires ou les fonctions endothéliales, induites par une faible concentration d'agonistes, par exemple en présence de 2.5 à 5 uM d'ADP, ou 2 pg/ml de collagene, -ou 0,016 U/ml de thrombine et en ce que leur capacité d'inhibition des fonctions plaquettaires est considérablement réduite voir absente en présence de concentrations élevées d'agonistes, par exemple en présence de concentrations en thrombine supérieure à 0,5 U/ml ou en collagène supérieure à 10 ug/ml. Les fragments idiotypiques dont il est question ci-dessus sont des fragments Fab, Fab', F(ab' )2 préparés selon les > éthodes classiques, notamment par digestion enzymatique par exemple avec la pepsine ou la papaine, selon le résultat recherché. Ces fragments idiotypiques sont encore caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de tout ou partie de leur fraction constante Fc. Des anticorps monoclonaux ainsi définis, ou leurs fragments idiotypiques présentent la propriété particulièrement intéressante de se fixer sur un épitope d'une protéine, d'une glycoprotéine ou d'un complexe protéique, de telle sorte que l'activité physiologique normale de cette protéine, glycoprotéine ou de ce complexe, est modulée. Dans la suite les termes de protéine, glycoprotéine. complexe protéique seront parfois regroupés scous le terme antigène. Cette modulation de l'activité physiologique normale plaquettaire ou au niveau des cellules endothéliales dont question ci-dessus correspond, dans le cadre des définitions de l'invention, à une inhibition partielle de certaines fonctions telles que les réactions d'adhésion, d'agrégation ou de sécrétion ou de plusieurs de ces réactions, qui ont lieu à la suite de stimulation provenant par exemple de lésions au niveau de l'endothélium vasculaire ou encore à une inhibition de réactions au niveau des cellules endothéliales. Cette limitation doit être telle que l'action des anticorps choisis ou de leurs fragments,. éventuellement en combinaison avec d'autres substances, prévient la formation d'un thrombus. Les propriétés de modulation des anticorps selon l'invention peuvent varier avec la nature de l'anticorps et l'antigène reconnu. En tout état de cause, les anticorps de l'invention n'inhibent plus les fonctions plaquettaires en présence de fortes concentrations de thrombine (supérieure à 0,5 U/ml) ou de collagène (supérieure à 10 ug/ml). Il en résulte que ces anticorps peuvent être utilisés dans le traitement de pathologies telles que celles citées précédemment, sans présenter le désavantage de bloquer de manière excessive les processus physiologiques plaquettaires, ce qui risquerait d'entrainer des phénomènes hémorragiques. Selon un premier aspect préféré de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une protéine, d'une glycoprotéine ou d'un complexe protéique choisi(e) parmi le groupe des glycoprotéine GMP140, complexe gpIIb-IIIa, complexe gpIa-IIa, complexe gpIc-IIa ou glycoprotéine gpIIa. Les antigènes ci-dessus, interviennent à différents niveaux de la physiologie plaquettaire. La GMP140 a été décrite par McEver et al dans Cell (vol 56 - 1033.1044, 24 Mars 1989 > . Les autres antigènes ont ' été décrits dans différentes publications telles que McEver et al, (1984) J. Biol. Chem. 259: 9799-9804; Hsu-Lin, S.C. et al, (1984) J. Biol. Chem. 259: 9121-9126; Kunicki, T.J. et al, (li88) J. Biol. Chem. 263: 4516-4519 et Hemler, M.E. et al, (1988), J. Biol. Chem. 263, 7660-7665. Selon un autre aspect préféré de l'invention une catégorie d'anticorps ou leurs fragments idiotypiques est encore caractérisée en ce que ces anticorps ou fragments reconnaissent un épitope ayant un effet fonctionnel vis à vis des fonctions normalement exercées par l'antigène qui le contient. Selon un autre aspect préféré de l'invention, certains anticorps monoclonaux sont sensibles à la réduction chimique de l'antigène qu'ils reconnaissent. En conséquence, ils sont inactivés lorsque l'antigène normalement reconnu est réduit chimiquement. L'effet fonctionnel de l'épitope vis à vis de l'antigène qui -1-e contient indique que cet antigène ne peut exercer ses fonctions dans la physiologie plaquettaire si l'épitope n'est pas présent ou s'il est inactivé. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent sur la GMP140, en un site exposé à la surface des plaquettes activées, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques étant capables d'interférer avec les réactions d'agrégation etou de sécrétion plaquettaire. Des anticorps particulièrement préférés sont les anticorps LYP20 ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. D'une façon générale, pour les anticorps monoclonaux selon l'invention, on évaluera les "propriétés immunologiques et - fonctionnelles équivalentes" par un test visant à vérifier que l'antigène reconnu est identique à celui qui est reconnu par l'anticorps de comparaison (en l'occurence LYP20) et un test déterminant la capacité des anticorps isolés, à moduler les fonctions plaquettaires dans les conditions (concentrations en agonistes) qui ont été définies précédemment. L'anticorps LYP20 (encore désigné par P20) a également la capacité de reconnaitre la GMP140 présente à la surface des cellules endothéliales. De plus cet anticorps ne reconnait plus la GMP140 lorsqu'elle est sous forme chimiquement réduite, c'est à dire lorsque son poids moléculaire passe de 128 kDa à 130 kDa. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épi tope présent au niveau de la glycoprotéine IIa, du complexe Ia-IIa, du complexe Ic-IIa, de la glycoprotéine GP110-120, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'interférer avec les réactions physiologiques plaquettaires. Ces anticorps reconnaissent un épi tope ou un déterminant porté par la glycoprotéine IIa. En conséquence ils reconnaissent les -complexes protéiques mettant en oeuvre la glycoprotéine IIa ou ses produits de transformation ou de dégradation. D'une façon particulièrement préférée, ces anticorps sont les anticorps LYP22 ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. Des tests anologues à ceux décrits ci-dessus sont utilisés pour sélectionner les anticorps ayant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes en prenant pour base de comparaison, LYP22. L'anticorps monoclonal LYP22 (encore désigné par P22) présente l'avantage particulier d'être dirigé contre- des -protéines fonctionnant comme récepteurs du collagène sur les plaquettes et qui sont donc importantes pour l'adhésion des plaquettes aux parois des vassaux sanguins endommagés. Cet anticorps reconnait également un épi tope localisé sur une sousunité beta (ss) des lymphocytes VLA. De plus l'anticòrps monoclonal LYP22 reconnait des antigènes présents sur des cellules endothéliales, ces antigènes ayant les mêmes caractéristiques que ceux présents sur les plaquettes. Les anticorps LYP20 et LYP22 présentent l'avantage inhiber l'activité plaquettaire à un niveau d'environ 60% en présence de faibles concentrations d'agonistes telles que par exemple (2,5-5 M d'ADP, 2 g/ml de collagéne, 0,016 U/ml throibine). Ceci correspond à une modulation de l'activité plaquettaire dans la mesure où celle-ci n'est pas totalement inhibée. D'autres anticorps particulièrement intéressants pour la réaii;ation de l'invention, sont des anticorps mônoclonaux où leurs fragments idiotypiques caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope du complexe IIb-IIIa à la surface des plaquettes stimulées, lesdits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'inhiber les fonctions plaquettairès et étant dépourvus de cette capacité lorsqu'ils sont en présence de fortes concentrations d'agonistes telles que décrites ci-dessus. Des anticorps particulièrement préférés sont les anticorps LYP18, ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes. Des tests analogues à ceux décrits ci-dessus sont utilisés pour sélectionner les anticorps ayant des propriétés immunologiques et fonctionnelles équivalentes, en prenant pour base de comparaison, LYP18. Ces anticorps et notamment l'anticorps LYP18 présentent l'avantage de détecter à la fois des antigènes présents sur des plaquettes au repos et des antigènes exprimés après stimulation des cellules. L'invention concerne également un mélange d'anticorps monoclonaux ou de fragments idiotypiques de ces anticorps ou encore un mélange d'anticorps et de fragments, caractérisé en ce qu'il comprend au moins- deux anticorps ou fragments différents décrits précédemment. Des mélanges particulièrement préférés d'anticorps et/ou de fragments de ces anticorps sont par exemple des mélanges comprenant LYP20 et LYP22 ou/et leurs fragments idiotypiques. Un autre mélange préféré est celui de LYP20 et LYP18 et/ou leurs fragments idiotypiques. Les anticorps ou leurs fragments idiotypiques répondant au définition de l'invention sont particulièrement intéressants pour leurs propriétés de modulation des fonctions plaquettaires. Ces anticorps ou leurs fragments idiotypiques peuvent à cet égard être utilisés en temps qu'agents antiplaquettaires chez des patients présentant des risques de troubles des fonctions plaquettaires et en particulier des problèmes concernant la formation des thromboses. A cet égard les anticorps de l'invention et leurs fragments permettent, de ne pas inhiber complètement les fonctions plaquettaires ce qui géneralement entrainent un risque de saignement dangereux pour le patient traité. Les anticorps ou leurs fragments définis dans les pages précédentes peuvent donc etre utilisés séparément ou dans des mélanges afin de cibler l'inhibition des fonctions plaquettaires selon les besoins et/ou -d'obtenir des niveaux d'inhibition des fonctions plaquettaires adaptés à la situation que l'on souhaite éventuellement traiter. L'invention vise par ailleurs des anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques tels qu'ils ont été décrits plus haut caractérisés en ce qu'ils sont marqués, le marquage étant de préférence réalisé avec une substance radioactive, notamment un radioélément halogénique ou métallique, par exemple 131I, 1111n ou 99T, ou par une substance fluorescente. La substance de marquage doit être choisie en fonction de l'utilisation souhaitée des anticorps, in vitro ou in vivo. Dans le cas où ces anticorps sont utilisés in vivo, la substance choisie doit être phisiologiquement acceptable pour l'homme, et adaptée à la détection par des moyens tels que l'imagerie. Différents protocoles de marquage pourront être utilisés, en fonction du marqueur choisi. On aura par exemple recours aux techniques décrites dans la publication Mason, DW et al (1980) Biochem J 187, 1-9. Pour les techniques relatives à l'utilisation des anticorps après le marquage, on se référera par exemple à la publication McGregor JL et al (1986) Eur J. Bioche 159, 443449. L'invention concerne à cet égard un procédé pour le marquage d'anticorps ou de leurs fragments tels qu'ils ont été definis précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - mise en contact de l'anticorps ou de ses fragments que l'on souhaite marquer, avec un marqueur déterminé, par exemple un radioélément, dans des conditions permettant le couplage du marqueur et de l'anticorps, - le cas échéant purification par exemple par filtration sur gel, pour éliminer les composants n'ayant pas réagi. Si le marquage sur les anticorps ou leurs fragments est réalisé de façon indirecte par exemple avec le technetium 99 on aura recours aux agents chélatants connus pour complexer le marqueur et réaliser le couplage avec l'anticorps ou les fragments. Des agents chélatants utilisables sont par exemple les acides polyaminocarboxyliques, notamment le DTPA (acide diéthylène triamine pentaacétique), des analogues de l'acide diethylène triamine pentaacétique (EDTA) des composés diaminodithiols, triaminothiols (ex : les (thioacétamide/ pentanoile) des amines polycycliques des dithiosemicarbozones et des métallothionines ou des anhydrides de ces acides, notamment des anhydrides cycliques. Ces agents chélatants sont préparés par des méthods connues. Pour le marquage au technetium, on pourra par exemple se référer à la publication Eckelman et al Nucl, Med. Biol. vol 16 nO 2, pp 171-176, 1989). Entre également dans le cadre de l'invention, ltépitope reconnu par les anticorps monoclonaux définis précédemment ou encore reconnu par les fragments idiotypiques de ces anticorps cet épi tope étant présent au niveau d'un antigène impliqué dans les étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/tu de sécrétion plaquettaire etZou dans les réactions d'adhésion des cellules endothéliales, ledit antigène étant choisi plus particuliérei.nt parmi les protéines GMP140 la glycoprotéine gplIa ou les complexes gpIIb-IIIa, gpIa-IIa, gpIc-Ila, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un épitope conformationnel, nécessaire à l'activité dans les réactions ci-dessus de l'antigène qui le contient. Un épitope particulier de l'invention est un épitope sensible à la réduction de l'antigène qui le contient. L'invention concerne de façon plus spécifique les épitopes distincts reconnus par chacun des anticorps LYP20 et LYP22. Un autre épi tope visé dans le cadre de l'invention est un épitope répondant aux définitions génerales ci-dessus caractérisé: a) en ce qu'il est reconnu par le complexe IIb Illa de plaquettes humaines. b) en ce-qu'il n'est, pas reconnu par le complexe IIb-IIIa de plaquettes de chien, c) en ce qu'il est reconnu par l'analogue du complexe IIb-IIIa (complexe IIb-IIIa like), présent sur des cellules endothéliales. De façon préférée cet épitope est l'épitope reconnu par l'anticorps LYP18. Les épitopes reconnus par les différents anticorps ou fragments idiotypiques de ces anticorps sont encore caractérisés comme suit Un premier protocole pour les caractériser comprend : - la dégradation protéolytique de la glycoprotéine supposée contenir l'épitope, - la localisation du déterminant de l'anticorps monoclonal par SDS PAGE et Western blot, à partir de petits fragments dé glycoprotéine, - l'obtention de la séquence d'acides aminés du (des) fragment(s) reconnu(s) par l'anticorps monoclonal, - la production de peptides se chevauchant, - la sélection du ou des peptide (s) capables d'inhiber la liaison de l'anticorps avec son récepteur lors d'un test de réaction d'inhibition mettant en oeuvre l'anticorps monoclonal et la glycoprotéine purifiée ou les plaquettes lavées. Cette technique peut être mise en oeuvre par référence aux publications de Foster P.A et al (1988) J Biol Chem 263, 5230-5234 et Geysen MH et al Ciba Foundation Symposium 119, 130-149. Un autre protocole pouvant être mis en oeuvre comporte - l'utilisation d'anticorps monoclonaux ayant un effet inhibiteur et capables de se livrer en Western blot, - l'isolement du gène complet de glycoprotéine à partir d'une banque de cDNA gtll d'une lignée cellulaire exprimant l'antigène reconnu par l'anticorps, - le séquençage du gène, - l'isolement de cDNA de différentes tailles, reconnus par l'anticorps monoclonal, - la détermination, à partir du cDNA isolé, du déterminant de l'anticorps monoclonal selon un procédé conforme au premier protocole. Ce protocole peut êtreréalisé par référence à la publication Bahou WF et al (1989) J Clin Invest 84, 56-61. L'invention vise également une composition pour le diagnostic de l'activation plaquettaire chez un sujet suseptible de présenter une pathologie associée à des troubles de la physiologie plaquettaire en particulier pour mettre en évidence une thrombopathie, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps différents ou leurs fragments idiotypiques tels qu'ils ont été définis ci-dessus, de préférence des anticorps dirigés contre des protéines ou glycoprotêines distinctes, en particulier un mélange d'anticorps choisi parmi LYP20, LYP22 et LYP18 ou encore leurs fragments idiotypiques. Pour les besoins de - la détection, ces anticorps ou fragments d'anticorps sont marqués. D'autres compositions pour le diagnostic de l'activation plaquettaire, répondant aux définitions ci-dessus. sont des compositions caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre des anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques dirigés contre la thrombospondine et de préférence des anticorps du type LYP9 ou/et LYP11. Les anticorps LYP9 et LYP11 sont des anticorps dirigés contre la- thrombospondine obtenus par une méthode telle que celle décrite dans la publication de Clezardin-et al (Eur J Biochem. 154, 95-102 (1986)). Let compositions pour la diagnostic décrites cidessus peuvent d'être utilisées pour détecter in vitro dans un échantillon biologique tel que [...] la présence d'antigènes plaquettaires, significative d'un état de throsbore. Ces compositions sont également utilisables pour le diagnostic in vivo, lorsque les anticorps monoclonaux ou leurs fragments ont préalablement été marqués avec 'une substance physiologiquement acceptable pour l'homme dans des conditions permettant leur détection avec des appareils adaptés et en particulier gracie aux méthodes de gamma-scintigraphie et de RNK. Un autre avantage des compositions pour le diagnostic précédemment décrites est de permettre un diagnostic sélectif de la présence de certains antigènes particuliers caractéristiques d'étapes déterminées de'la physiologie plaquettaire. Une catégorie d'anticorps monoclonaux ou de fragments selon l'invention peut également être utilisée, sous la forme d'une composition pour le diagnostic in vitro, pour la mise en évidence de mélanomes métastasiques et les différencier par rapport à des mélanocytes bénins. Ces anticorps monoclonaux sont de préférence les anticorps LYP18 de l'invention ou des anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles analogues, notamment leur capacité à reconnaître l'analogue du complexe IIb-IIIa (IIb-IIIa like). Le complexe IIb-IIIa like est caractérisé par un poids moléculaire identique, sous forme réduite ou non réduite, à celui de la glycoprotéine plaquettaire IIb-IIIa. Ce complexe IIb-IIIa like présente en outre un fragment IIb-ss like (forme réduite) comme les plaquettes IIb réduites. L'invention vise par ailleurs une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un anticorps monoclonal ou ses fragments idiotypiques ou encore un mélange d'anticorps et de fragments selon ce qui a été décrit précédemment ou un mélange des ces différents anticorps et ou fragments idiotypiques, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique acceptable. Selon un premier aspect préféré de l'invention, de telles compositions pharmaceutiques peuvent être utilisées pour les traitements de différentes pathologies résultant de troubles de la physiologie plaquettaire ou liés à ces fonctions plaquettaires. Une utilisation des compositions pharmaceutiques comprenant les anticorps de l'invention ou leurs fragments peut être le traitement de maladies cardiovasculaires. Selon un autre aspect particulier de la réalisation -de l'invention, les compositions phareaceutiques sont caractérisées en ce que le (les) anticorps ou leurs fragments idiotypiques, sont - soit couplés à une substance anticoagulante ou à une substance ayant une activité thrombolytique, cette substance pouvant être par exemple le TPA, la streptokinase ou l'urokinase, - soit modifiés au niveau de l'une de leurs chaînes idiotypiques de façon à remplacer l'un des fragments variables ou au moins une partie de ces fragments par l'une des susdites substances anticoagulantes. Lorsque le fragment idiotypique de l'anticorps est couplé avec- une substance ayant une activité décrite ci-dessus, la liaison entre le fragment et cette substance est une liaison covalente résultant de la mise en oeuvre d'un protocole tel que celui décrit par Bode et al (1985) Science 229, 765. D'autres techniques utilisables sont celles décrites par Frantz et Roberteon dans Infect and Immunity, 33, 193-198 (1981) ou celle décrite dans Environnement Microbiology (octobre 1981) vol. 42 n 4, 611-614 par P.E. Kauffrann. Dans la pratique, on utilisera avantageusement comme agent de couplage les composés suivants, cités à titre non limitatif : aldéhyde glutarique, chloroformiate d'éthyle, carbodiimides hydrosolubles [N-éthyl-N (3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, Hall, diisocyanates, -bis-diazobenzidine, di- et trichloro-s-triazines, bromures de cyanogène, benzoquinone, ainsi que les agents de couplage mentionnés dans Scand. J. Immunol., 1978, vol. 8, p. 7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON). Dans le cas où la composition pharmaceutique est composée d'un anticorps ou d'un mélange de ces anticorps et/ou de leurs fragments idiotypiques couplés ou modifiés par une substance anticoagulante ou thrombolytique, cette composition, associée à un véhicule physiologiquement acceptable est administrée au patient selon une dose comparable à celle qui serait utilisée pour un des constituants de la composition pris isolément. L'invention vise en outre l'utilisation d'anticorps ou de leurs fragments idiotypiques pris séparément ou en mélange, pour la fabrication d'un médicament déstiné au traitement des pathologies liées à des troubles de la physiologie plaquettaire. Selon un autre aspect préféré de l'invention les compositions pharmaceutiques ci-dessus peuvent être utilisées dans une application différente du traitement des maladies cardiovasculaires pour bloquer la prolifération des cellules malignes de mélanomes et ainsi contrarier l'invasion métastasique de ces cellules. L'invention concerne à cet égard des compositions pharmaceutiques comprenant l'anticorps monoclonal LYP18 ou encore un anticorps ayant la propriété de bloquer la prolifération des cellules malignes de mélanomes, pour le traitement pour inhiber la croissance des mélanomes tumoraux in vivo. L'invention concerne également un procédé de préparation des anticorps monoclonaux selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a/ fusion de cellules spléniques de souris avec des cellules myélomateuses, lesdites souris étant préalablement immunisées avec l'antigène contre lequel on souhaite produire des anticorps, les cellules spléniques étant en excès par rapport aux cellules' myélomateuses, en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le PEG, b/ culture des hybridomes formés par la fusion, c1 clonage et sous-clonage des hybridomes producteurs des ant-icorps recherchés, d/ production d'ascites dans les souris, et récupération et purification desdits anticorps. Pour la production des anticorps LYP18 ou LYP20 on utilise à titre d'antigène, des plaquettes de sang humain traitées d la chymotripsine. Dans ce cas, les cellules myelomateuses utilisées pour la fusion sont par exemple des cellules Sp2/0-Agl4. Pour a préparation des antidorps LYP21 ou LYP22, on utilise un mélange des antigènes GMP140, glycoprotéines Ia. Ic, IIa, GP110-115 pour ismuniser les souris. Dans ce cas, les cellules myélomateuses utilisées pour la fusion sont avantageusement des cellules P3 x 63 Ag 8 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples et les figures qui suivent Figure 1 Profile dilution des extraits plaquettaires traités au Lubrol obtenus à partir d'une colonne Q de Sepharone å flux rapide sur FPLC. La fraction éluée de la colonne de Sepharose WGA a été dialysé contre 0,1 b de Lubrol dans un tampon Tris. Le pic 1 a été élué à 0,15 M NaCl, le pic 2 à 0,25M NaCl et le pic 3 à 0,32M NaCl. Figure 2 : Comparaison des données obtenues en SDS-PAGE de GPIIb-IIIa, de l'antigène de S12 et P20. Des lysats de plaquettes marquées avec 1125 ont été incubés avec des IgG non-immunes (lignes 1, 5), P20 (lignes 2, 6), avec S12 (lignes 3, 7) et avec un anticorps anti-GPIIb-IIIa (lignes 4, 8). Des échantillons ont été dénaturés dans des conditions non-réductrices (lignes 1, 2, 3, 4) et réductrices (lignes 5, 6, 7, 8), placées sur un gradient SDS-PAGE 5-15 % et autoradiographiées. La ligne 9 montre le lysat total marqué non-réduit. Figure 3 Liaison d'anticorps monoclonal P20 à des plaquettes non-stimulées et stimulées. Des plaquettes lavées à une concentration de 108/ml ont été incubées pendant 30 minutes à 250C dans une solution complété de Tyrode avec différentes concentrations (0,1-4 g/ml) de P20 marqué avec 1125. Les plaquettes lavées ont permis de montrer une liaison accrue de P20 marqué avec I125 après stimulation par 1U/ml d'alpha-thrombine. Figure 4 Comparaison du nombre d'anticorps P20 marqués avec 1125 et des constantes Kd pour des plaquettes nonstimulées et des plaquettes stimulées avec la thrombine. Des plaquettes non-stimulées ont accroché 2,400 t 266 anticorps P20 marqués, par plaquette (Rd =2,3nM + 0,54). Les plaquettes stimulées à la thrombine ont permis d'accrocher 12200 t 1184 anticorps P20 marqués, par plaquette (Kd=5,0nM t 0,61). Une analyse Scatchard des donnés d'accrochage des plaquettes de 4 doneurs a été utilisée. Figure 5 : Effet de P20 sur l'adhésion plaquettaire. L'effet de P20 sur l'adhésion des plaquettes marquées avec Cr@@ au niveau des puits de microtitation recouverts avec de la fibronectine (FN), du fibrinogene (FG) et du collagène a été testé. Les plaquettes ont té incubées avec 10 pg/ml de P20 pendant 30 minutes à 370C avant. incubation dans les puits recouverts. Des contrôles négatifs ont été réalisés en utilisant des puits recouverts avec BSA et le nombre de plaquettes accrochées a été comparé avec celui obtenu pour de puits recouverts avec FN, FG et du collagène. Figure 6 : Effet de P2O sur l'agrégation plaquettaire L'anticorps monoclonal P20 (50 g/ml) inhibe partiellement t60 %) l'agrégation induite par 2,5 M d'ADP, une dose dé 40 g/ml inhibe l'agrégation induite par 2 g/ml de collagène (63 t d'inhibition). P20 (90 g/ml) inhibe égalemenmt (50 %) l'agrégation induite par 0,016 U/ml de thrombine. EXEMPLE 1 - Isolement et caractérisation de glycoprotéines de Dlaquettes par chromatographie FPLC suivie d'un séquence en phase gazeuse. Dans cette expérience on a isolé des glycoprotéines présentes en faible quantité à la surface des plaquettes. Pour cela on a utilisé la chromatographie rapide en phase liquide (FPLC) ainsi que le séquençage en phase gazeuse permettant de procéder à l'étude de la structure, des caractères immunologiques et fonctionnels des glycoprotéines présentes sur les plaquettes, en faible quantité. Les membranes plaquettaires solubilisées dans du sodium déoxycholate ont été appliquées sur une colonne de germe de blé (WGA) et de lectine (Lens Culinaris LCH) montée séquentiellement avec une chromatographie FPLC. Les glycoprotéines éluées des colonnes de lectine dans un détergent non ionique ont ensuité été séparées sur une colonne échangeuse d'anions (Mono-Q). Les pics élués à partir de la colonne Mono-Q à différentes concentrations de NaCl ont été soumis à des électrophorèses en une et deux dimensions sur des gels de polyacrylamide SDS et analysés en Western blot sur des membranes Immobilon PVDF. Les glycoprotéines présentes sur les membranes Immobilon ont été directement séquencées en utilisant un séquenceur automatique en phase gazeuse. La colonne WGA a permis de lier un mélange d'antigènes comprenant la gpIb, la gpIIIb (ou gpIV) la gpIIb-IIIa en plus d'un certain nombre de protéines telles que gpl50/155 (poids moléculaire non réduit/réduit) gap150/130, gap130/135, gp128/132 et gap115/120. Ces glycoprotéines séparées par FPLC ont ensuite pu être identifiées en utilisant un anticorps monoclonal (AcM) ou des anticorps polyclonaux. La gp128/132 a été identifiée comme correspondant' a la GMP140 ou PADGEM par un anticorps monoclonal LYP21. La gplSO/155-et la gp132/135 ont été identifiées sous s forme de complexe GPIa-IIa par un anticorps monoclonal LYP22.La colonne LCH a permis de lier principalem,ent le complexe GPIIb-IIIa, identifié par un anticorps monoclonal anti-GPIIb-IIIa (LYP4). Les parties N-terminales d'un nombre limité de ces glycoprotéines séparées ont été microséquencées en utilisant un séquenceur en phase gazeuse. L'usage combiné de FPLC et du séquençage en phase gazeuse permet un isolement rapide et une caractérisation des glycoprotéines plaquettaires. Par ailleurs, l'identification des séquences d'acides aminés Nterminales permet la synthèse de sondes oligonucléotidiques pour cribler et isoler différents clones cDNA de glycoprotéines à partir de banques de données. Matériels et méthodes Préparation des membranes Des concentrés de plaquettes humaines ont été obtenus au centre de transfusion sanguine de Beynost. Les membranes plaquettaires ont été préparées selon la méthode décrite par Cooper et al (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 1069-11073), en utilisant 10 unités de concentré de plaquettes humaines (50.10/unité). Les globules rouges sédimentés ont été séparés des plaquettes par centrifugation, à 160g pendant 25 minutes, a 25 C. Les plaquettes ont été isolées et lavées en utilisant la méthode de Massini et al modifiée par Mc Gregor et al, (respectivement 1974, Biochimica and Phyica Acta 372: 109-121; 1979, Thromb. Res. 16: 437-452). Les plaquettes lavées ont été resuspendues (5.10/ml) dans 15 mM Tris (Hydroxymethyl-Aminométhane) -HCL (Boerhinger Mannheim, Meylan France) à pH 7,4 avec 5mM EDTA (BDH, Poole, Grande Bretagne) et 1 uM de leupeptine (Boerhinger Mannheim). Ces plaquettes ont ensuite été soumises à un appareil à sonication Branson réglé sur le mode discontinu avec un cycle d'opération de 50 % et un niveau dtintensité des ultrasons de 5. Les plaquettes traitées par ultrasons ont été centrifugées à 40C pendant 20 minutes à 9000g dans un rotor à angle fixe SS34 en utilisant une centrifugeuse Sorvall RC2B (Dupont de Nemours, Newtown, Connecticut, . USA). Le surnageant a ensuite été retiré et centrifugé pendant une heure à 40C à 100 000g dans un rotor à angle variable TST 55.5 en utilisant une centrifugeuse Kontron 2060 (Kontron, Zurich, Swisse).Les membranes sous forme de culot ont été resuspendues dans un tampon contenant 10 mM Tris-HCL à pH 8,2, dans 5 mM EDTA et 1 uM de leupeptine. Extraction avec le sodium deoxycholate (DOC): Les membranes plaquettaires ont été traitées pendant 30 minutes à 40C avec du sodium deoxycholate 1 % (w/w) (Merck, Darmstadt, RFA) dans 10 MM Tris-HCl à pH 8,2 avec 5 mM EDTA et 1 pM de leupeptine. Les membranes extraites des plaquettes ont été soumises à une ultracentrifugation à 40C pendant 30 minutes à 100000 g dans un rotor à angle variable TST 55.5 en utilisant une centrifugeuse Kontron 2060. Le surnageant ultracentrifugé a été collecté. Chromatoqranhie d'affinité sur lectine Le germe de blé-lectine (WGA) lié au Sepharose 6MB (Pharmacia, Uppsala, Suède) a été placé dans une colonne de verre HR10/10 (100 mm x 10 mm) (Pharmacia). La colonne a ensuite été reliée à un système de chromatographie rapide en phase liquide (FPLC) (Phareacia). La colonne a été équilibrée dans un tampon de départ contenant 10 mM Tris-HCl à pH 8,2 avec 0,5 % DOC, 5 mM EDTA. Les membranes des plaquettes solubilisées ont été déposées sur la colonne avec un débit de 0,5 ml/mn et la colonne a été lavée avec unX tampon de départ jusqu'à l'obtention d'une de;isité optique égale à la valeur de base. Les glycoprotéines liées à la colonne de WGA ont été éluées aveç un sucre, le N-Acetyl Glucosamine 2,5 % [Sigma, Saint Louis, MO, USA). Les pics d'élution ont été dialysés pendant une nuit contre 10 mM Tris-HCl à pH 7,4 avec 0,1 % de lubrol PX (Sigma). Chromatographie d'échange d'anions: Les glycoprotéines éluées à partir de la colonne de lectine et resuspendues dans du lubrol PX ont été placées sur une colonne d'échange d'anions MONO Q HR5/5 (50 mm x 5 mm) (Pharmacia). Le tampon de départ contenait 0,1 % de lubrol PX dans 20 mM Tris-HCl à pH -7,4 et le tampon final était compsé de 0,1 % lubrol PX dans Tris-HCl a pli 7,4 contenant 1M de chlorure de sodium (Merck). Un grandient a été établi pendant 25 minutes avec un débit de 1 ml/mn. Chromatographie d'immunoaffinité Les glycoprotéines éluées à partir de la colonne MONO Q ont été- identifiées sur des colonnes d'immunoaffinité en utilisant les anticorps monoclonaux LYP21 (dirigés contre la GMP140) et LYP22 (dirigés contre la gplIa) liés au Sepharose-4B. Ces anticorps ont été obvenus après immunisation de souris avec un mélange de glycoprotéines isolées par affinité sur colonne WGA et chromatographie d'échange d'anions. Les glycoprotéines IIb-IIIa ont été identifiées sur colonne d'immunoaffinité en utilisant l'anticorps monoclonal LYP4 décrit par Mc Gregor et al (1986, Eur. J. Biochem. 159: 443-440). EXEMPLE 2 - Inhibition de l'agrégation plaauettaire induite par le collagène, avec des anticorps monoclonaux anti gpIa-IIa, On a mis en évidence qu'une glycoprotéine (gp) Ia-IIa (VLA-2) a un rôle important dans l'adhésion des plaquettes au collagène. Les plaquettes d'un patient présentant un défaut en gpIa ne subissent pas d'agrégation en réponse au collagène. Un anticorps monclonal LYP22, a été obtenu à partir de souris immunisées avec un mélange de glycoprotéines membranaires de plaquettes, isolées par chromatographie d'affinité à l'aide d'agglutinine de germe de blé couplée à une chromatographie d'échange d'anions. Une immunoprécipitation ultérieure d'un lysat de plaquettes solubilisées dans un détergent, iodées en surface, a montré que LYP22 précipitait deux glycoprotéines ayant un poids moléculaire estimé dans des conditions non réductrices et réductrices (NR/R) de 140/155 kDa, et de 120/135 kDa respectivement. Les changements des poids moléculaires de ces deux glycoprotéines dus à la réduction sont en accord avec ceux précédemment décrits -pour GPIa et bPIIa respectivement. Quand des plaquettes solubilisées avec du Lubrol ont été mises en contact avec le LYP22 sur une colonne d'affinité de sépharose, deux autres glycoprotéines (120/128 et 100/105 kDa) ont été détectées en quantité beaucoup plus faible à l'aide du bleu de Coomassie.Des études des liaisons de l'anticorps LYP22 marqué avec l'iode 125 (Il25) aux plaquettes ont montré que les liaisons sont de l'ordre de 7708 + 928 molécules par plaquette au repos et 8940 # 86 liaisons de molécules par plaquette activée avec la thrombine (Kd = 65,6nM i 1,43nM). Ces données suggèrent que l'expression en surface des sites de liaisons au LYP22 n'est pas augmentée après l'activation des plaquettes. Pour déterminer l'effet de LYP22 sur les fonctions plaquettaires, des études d'agrégation avec des plaquettes humaines lavées ont été réalisées. LYP22 inhibe partiellement l'agrégation plaquettaire induite par une faible dose de collagène (lug/ML) mais n'a pas d'effet sur d'autres agonistes. Cependant, LYP22 n*a pas d'effet sur l'adhésion des plaquettes au collagène, à la fibronectine ou au fibrinogène en présence de 2 mK de magnésium ou de calcium. Ces résultats montrent que a/ LYP22 est dirigé contre le complexe GPIa-IIa, b/ le complexe GPIa-IIa peut être lié à deux autres protéines qui ne ont pas exprisées à la surface des plaquettes, c/ le complexe GPIa-IIa est impliqué dans l'agrégation plaquettaire induite par le collagène. EXEMPLE 3 - Inhibition des fonctions plaguettaires de plaquettes humaines' Par fln anticorps monoclonal LYP20 dirigé contre une glycoprotéine de membrane dont l'exPression dépend de l'activation. Un nombre limité de glycoprotéines de membrane (Ib, IIb-IIIa, Ia-II,a, Ic-IIa, IIIb), jouent un rôle important dans l'agrégation plaquettaire et l'adhésion. On a utilisé les anticorps monoclonaux LYP2O-et LYP21. Les anticorps LYP20 ont été obtenus après ismunisation d'une souris BALB/C avec un concentré de plaquettes de sang humain lavées, traitées à la chymotrypsine. Les anticorps monoclonaux LYP21 ont été obtenus avec des glycoprotéines de membrane de plaquettes éluées à partir d'une colonne d'affinité à l'agglutinine de germe de blé.L'immunoprécipitation faisant appel à des lysats plaquettaires marqués en surface, activés à l'aide de thrombine, a montré que LYP20 et LYP21 précipitent une protéine de 128 kDa (non réduite) et 132 kDa (réduite) qui est appelée gap128. Les anticorps LYP20 et LYP21 reconnaissent des épitopes distincts sur la gp128, le déterminant antigénique de LYP20 étant dépendant de la présence de ponts disulfure intacts. Des plaquettes au repos lavées ont permis de lier 2400 + 270 molécules par anticorps LYP20 marqué avec l'iode 125 et 12.200 + 1.184 molécules par anticorps après activation par 1 U/ml de thrombine. Ces données montrent que LYP20 et LYP21 sont dirigés contre une protéine de surface plaquettaire (gap128) dont l'expression dépend de l'activation plaquettaire et de la sécrétion. La gp128 migre conjointement avec l'antigène plaquettaire immunoprécipité par un anticorps dirigé contre la glycoprotéine GMP140 ou PADGEM. Ceci montre que la gp128 est liée ou identique à la GMP140 ou PADGEM. Afin de déterminer le rôle potentiel de la gp128 dans les fonctions plaquettaires, les études concernant l'agrégation avec des plaquettes humaines lavées ont été réalisées. Des fragments F(ab)z' de LYP20 mais pas de LYP21 inhibent partiellement l'agrégation plaquettaire et la libération induite par 2,5uM d'ADP, 2ug/ml de collagène et 0,016U/ml de thrombine.Ces résultats montrent que a/ LYP20 et LYP21 sont dirigés contre des épi topes différents de la protéine de surface plaquettaire (gp128) dont l'expression dépend de l'activatión plaquettaire bX la gp128 est liée ou identique à la GMP140 ou PADGEM c/ la gpl28 exposée à la surface de plaquettes activées peut jouer un rôle important dans l'agrégation plaquettaire. EXEMPLE 4 - Préparation d'anticorPs monoclonaux dirigés contre la glycoprotéine GMP 140 - Matériel L'adénosyldiphosphate (ADP), l'aprotinine, la fibronectine (FN), la lactoperoxidase et la leupeptine, le lubrol WX, la N-acétyl glucosamine, l'orthophényldiamine (OPD), le fluorure de phénylméthylsulphonyle (PMSF), la prostaglandine El (PGE1) et le triton X-100 ont été obtenus auprès de Sigma (stLouis, MO, USA). Le 5' Chrome, l'125 Iode et la 14C séroténine ont été obtenus chez Amersham International (U.R.). La peroxidase de raifort conjuguée a des anticorps anti-souris de chèvre, la gélatine, le réactif de développement de couleur HRP et le Tween 20 ont été obtenus auprès de BioRad (Richront, CA, USA).Le sodium deoxycholate (DOC), le dithiothreitol (DTT), la leupeptine et le PMSF ont été obtenus auprès de Merck (Darmstadt, RFA). Le polyethylene Glycol (PEG) et le Sodium Dodecyl Sulphate (8DS) ont été obtenus auprès de BDH (Poole, U.K.) te gel à flux rapide Q-sepharose (Q Sepharose fast flow gel (marque déposée)), la protéine A sépharose, l'agglutinine de germe de blé (WGA) et un système complet FPLC ont été obtenus auprès de Pharmacia (Uppsala, Suède). La sérum albumine bovine (BSA) et les anticorps IgG anti-souris de lapin proviennent de Miles Laboratories (Naperville, IL, USA). Le collagène provient de Hormon-Chemie (Munich, RFA).La Thrombine a été obtenue auprès de Hoffman-La Roche (Bâle, Suisse) et l'alpha-thrombine, le fibrinogène (FG) proviennent de IMCO. La pansorbine provient de Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Tous les. réactifs de culture cellulaire ont été obtenus auprès des laboratoires Flow (Les Ulis, France) et Intermed (Lyon, France). Le 2,4,6,10 teramethylpentadecane (Pristane) provient de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA). Les membranes de difluorure de polyvinylidène (Immobilon) proviennent de Millipore Corporation (Bedford, MA, USA}. Le D-phényl-L-propyl L-arginine chloromethyl cétone (PPACK) proviennent de Calbiochem-Behring (Paris, France). - Méthodes a) Préparation de Plaquettes et Marquage Des concentrés de plaquettes (Centre de Transfusion Sanguine de de Beynost) ont été lavés selon la technique de Massini et al (1974), Biochim biophys. Acta 372, 109-121. Les protéines de surface ont été iodées selon la méthode décrite par Philipps et Al. (1977) J. Clin. Invest. 60, 535-545, en utilisant la lactoperoxidase. Les plaquettes utilisées dans les études de fixation, d'agrégation et d'adhésion proviennent du sang (1 volume ACD : 6 volumes de sang) de volontaires normaux. Les plaquettes ont été isolées et lavées selon la technique de Mustard et Al. (1972) Br. J. Haematol. 22, 193-204 avec de légères modifications 20 ng/ml PGE1 et 10-6M PPACK ont été ajoutés au premier lavage. b) Isolement des glycoprotéines de membrane plaquettaire Les plaquettes lavées conformément à la méthode de Massini et Al. citée. plus haut ont été resuspendues à 40 x 10@ cellules/ml dans 0,02 M Tris-HCl à pH 8,6, avec 0,005 M EDTA, 1% (w/v} de DOC, 17U/ml d'aprotinine, lmM de leupeptine. La solubilisation à été réalisée à 40C sous agitation constante pendant une heure. Le . lysat a été centrifugé à 100.000 g pendant une heure à 40C. Le surnageant a été dilué dans 5 volumes de 0,02 M Tris-HCl à pH 8,6, lmM EDTA, 0,5% (w/v) DOC tampon A) et déposé sur une colonne de sépharose 6B-WGA.La colonne était pré-équilibrée dans le tampon A et couplée à un système de chromatographie rapide en phase liquide (FPLC). La colonne a été lavée à 0,4 ml/minute avec le tampon A jusqu'a ce que le matériel non fixé soit éliminé. La fraction spécifiquement liée a été éluée par 2,5% (w/v) de Nacétyl glucosamine. La fraction collectée a été dialysée pendant une nuit contre un mélange de 0,02 M Tris-HCl à PH 7,4 avec 0,005 M EDTA et 0,1% de Lubrol PX à 4 C. L'échantillon dialysé a été soumis à une chromathographie d'échange d'anions en utilisant une colonne Q å flux rapide, reliée au système FPLC et pré-équilibrée dans 0,02 M Tris-HCl à pH 7,4 contenant 0,1% (w/v) de lubrol WX (tampon B).L'échantillon a été appliqué sur la colonne à un débit de 2 ml par minute et les différentes fractions ont été éluées en utilisant un gradient de NaCl(0 à l M) dans le tampon B. Chaque fraction a été collectée, concentrée et analysée par SDS-PAGE en utilisant la technique Laemmli (1970) Nature 227, 680-685. La concentration de protéine a été déterminée par la méthode de Lowry (1951) modifée par Markwell (1978) Anal. Biochem. 87, 206-210. Pour plus de détails concernant l'isolement des glycoprotéines on pourra se reporter à exemple 1. c) Production d'anticorps monoclonaux c.l) Préparation de l'anticorps LYP21 Des souris BALB/c (des femelles de 6 semaines), obtenues chez IFFA CREDO (L'Arbresle, France), ont été immunisées intrapéritonéalement avec 100ug d'un mélange de 4 glycoprotéines (isolées de la façon décrite ci-dessus et correspondant aux glycoprotéines GMP140, Ia, Ic, IIa, GP110-115), avec un volume égal d'adjuvant complet de. Freund. Deux semaines plus tard, 100ug de l'antigène ont été injectés aux souris en présence d'adjuvant incomplet de Freund. On a vérifié que le sérum des souris réagissait vis à vis de l'antigène en utilisant la technique ELISA. A cet égard, on rappelle brièvement la technique : des puits de plastique ont été recouverts avec 100u1 d'antigène (mélange de 4 glycoprotéines) dilués à 2pg/ml dans un tampon de bicarbonate (25 mM Na2CO3, 25mM NaHCO3, pH 9,6) laissés pendant 3 heures à 370C. Les puits ont été lavés et saturés avec 0,5% de BSA dans un tampon Tris(l5mM Tris-HCl, pH 7,4, 2mM CaCl2, 0,05% (w/v) Tween) pendant 30 minutes à température ambiante.Le sérum de souris ou les surnageants d'hybridomes (100p1) ont été incubés dans les puits pendant.l heure à 370C. Après 3 lavages dans un tampon Tris, un anticorps. anti-souris de chèvre (anticorps secondaire, dilué à 1/3000) conjugé à la peroxidase a été ajouté à chaque puits et soumis à réaction pendant 30 minutes à 370C. Les puits ont ensuite été lavés une nouvelle fois et remplis avec une solution de 100p1 de substrat (4 mg OPD dans 10 ml de 0,1M tampon citrate, à pH 5, avec 0,7 ul de 30%HzO2). La réaction a été arrêtée avec 100 l de 4NH2SO4, 4N. La densité optique a été mesurée avec un lecteur de plaque. Quatre semaines après la première injection, les souris immunisées ont subi un rappel avec i00pg de mélange d'antigènes. Les cellules spléniques ont été fusionnées 4 jours plus tard selon la méthode de Kohler et Milstein (1975) Nature 256, 177-18.1, avec des cellules myelomateuses 23X63Ag8 selon un rapport de lO:l, en présence de PEG. Les hybridomes ont été divises,. 24 heures plus tard, sur des plaques à 24 puits, dans un milieu hypoxanthine/aminoptérine/thymidine (HAT) avec des macrophages du péritoine de souris non immunes de la même souche que les souris immunisées, en tant que cellules nourricières.Les surnageants d'hybridomes ont été criblés en utilisant la technique ELISA décrite plus haut. Des surnageants positifs ont été testés pour leur capacité d'accrochage aux antigènes de surface de membrane plaquettaire marqués, selon le protocole décrit dans la partie "Immunoprécipitation", ainsi que pour leur capacité d'accrochage sur des antigènes de membrane plaquettaire non marqués, transférés sur des membranes Immobilon selon le protocole décrit dans "Ismunoblot". Des puits positifs ont été clonés et sous-clonés par dilution limitée et criblés à nouveau en utilisant les mêmes techniques avant la. production d'ascites dans les souris BALB/c traitées avec du pristane. Des immunoglobulines onoclonales ont été purifiées par la méthode Ey et al. (1978) Immunochemistry 15, 429-436 en utilisant une chromatotraphie d'affinité sur protéine Asépharose, Les fragments F(ab'): d'un anticorps monoclonal ont été préparés conformément à la technique décrite Lamoyi et al (1986) Meth in Enzym, vol 121, p 652-663, Acad. Press INC. c.2) Préparation de l'anticorps LYP20 L'anticorps monoclonal LYP20a a été obtenu après immunisation de souris BALB/C avec des plaquettes de sang humain traitées à la chymotrypsine et lavées. Le traitement à la chymotrypsine (0,2 mg/ml/l09 plaquettes) a été fait pendant 30 minutes à 370C. Les plaquettes ont ensuite été lavées. Les plaquettes traitées à la chymotrypsine (1 x 108 plaquettes/100 ml) ont été mélangées avec un volume égal (100 ml) d'adjuvant complet et injectées intrapéritonéalement à des souris BALB/C. Les souris ont été immunisées 3 fois en 3 semaines avec les plaquettes ainsi traitées. Puis ces souris ont été laissées au repos pendant un mois avant de surbir un rappel avec les plaquettes traitées à la chymotrypsine. Trois. jours après les cellules spléniques (de la rate) ont été prélevées et fusionnées avec des cellules Sp2/O.Ag4 selon la technique décrite précédemment pour préparer les anticorps LYP21. Les surnageants de fusion obtenus avec les plaquettes traitées à la chymotrypsine ont été sélectionnés pour leur capacité à inhiber les fonctions plaquettaires. Immunopréci ta tion L'immunoprécipitation a été réalisée selon la méthode décrite par McEver-et al (1984)' J. Biol. Chem. 259, 9799-9804. Les plaquettes ont été activées (lU/ml de trombine pendant. 10 minutes, suivi par 10-'M PPACK pendant 10 minutes) préalablement à une iodation, solubilisées dans 0,01M Tris-HCl, 0,15M NaCl, lmM EDTA, contenant 1% de lubrol PX (tamon S) et microcentrifugées. Les surnageants marqués ont été incubés avec soit le surnageant d'hybridomes, soit le fluide d'ascite ou l'anticorps purifié pendant 2 heures à température ambiante, sous agitation constante. 10 ul- d'anticorps purifié anti-souris de lapin, dilué selon un rapport 1/10 dans le tampon S ont été ajoutés à chaque échantillon et placé sur un agitateur à balancier à température ambiante pendant 30 minutes.La protéine A sépharose (10% dans le tampon S) a été incubée (1 volume de lysat pour 2 volumes de protéines A) avec chaque échantillon, sur un agitateur à balancier pendant 30 minutes à température ambiante. Une centrifugation a ensuite été réalise à 9.000 g pendant 2 minutes dans une centrifugeuse Eppendorf. Chaque culot de centrifugation a été lavé 4 fois dans le tampon S. Après le dernier lavage, chaque culot a été resuspendu dans 0,4 ml de tampon Laemmli (1970) Nature 227, 680-685, puis chauffé à 1000C pendant 5 minutes. Une partie aliquote de chaque échantillon a été réduite en présence de 0.04M DTT. Tous les échantillons ont été ensuite microcentrifugés et le surnageant a été conservé à -700C. SDS-PAGE et ismunoblot Une électrophorèse sur gel en une dimension a été réalisée selon la méthode de Laemmli. La technique SDS-PAGE en deux dimensions (non réduit/réduit) a été réalisée selon la méthode de Phillips et Al. (1977) J. Clin. Invest. 60, 535-545. Les gels ont été colorés à l'argent selon la méthode de Merril ét Al. (1982) Electrophoresis, 3, 17-23. Les gels et les membranes Immobilon ont été équilibres dans 0.025M Tris, 0,192 M glycine, à pH8,3, pendant 30 minutes avant de réaliser un western blot. Les protéines ont été transférêes par électrophorèe selon la méthode de- Towbin (1979) Proc. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354, à partir du gène vers la membrane Immobilon en utilisant un appareil miniblot de BioRad à 100 V pendant une heure. Après le transfert, la membrane a été laissée pendant 30. minutes dans un tampon TBS (0,02 M Tris, 0,05 M NaCl, pH 7.5) contenant 0,05% (w/v) tween-20 et 3% (w/v) de gélatine pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Les bandes Immobilon ont été coupées etplacées dans un tube contenant soit le surnageant d'hybridomes, soit le fluide ascitique soit l'anticorps purifié. Chaque tube a été soumis à réaction sur un bloc pendant une heure à température ambiante. Les bandes ont ensuite été lavées trois fois dans un tampon TBS contenant 0,05% (w/v) de Tween-20 et 1% (w/v) de gélatine. Ils ont ensuite été incubés pendant 30 minutes en présence de peroxidase de raifort conjuguée à des anticorps anti-souris de chèvre, dilués à 1/3000 dans un tampon tween TBS avec 1% de gélatine. Toutes les bandes ont été lavées et une fois dans un tampon TBS-tween et deux fois dans le TBS.Le substrat a été préparé rapidement en utilisant 60 mg de réactif de développement de couleur HRP dans 20 ml de méthanol à température de la glace, 100 ml de TBS et 60V1 de 30% de H202. La réaction a été arrêtée en rinçant les bandes avec de l'eau distillée. Etude de la fixation des plaquettes Le nombre d'anticorps monoclonaux LYP20 ET LYP21 marqués avec I-1 2 5 fixés à des plaquettes non stimulées et à des plaquettes stimulées (par l'ADP et la thrombine) ont été testés selon la méthode par McGregor et Al. (1986) Eur. J. Biochem. 159, 443-449. Lorsque la thrombine (lU/ml) a été utilisée, son activité a été bloquée avec 10-6 M PPACK avant l'addition des autres réactifs. Les plaquettes. non stimulées et stimulées ont été incubées avec différentes concentrations des anticorps monoclonaux marqués P20 'ou P21 (0,1 à 4 g/ml) pendant 30 minutes à 250 C. Ensuite 50 l de la suspension ont été repris et, étalés sur des tubes Eppendorf 400 ul contenant 300 ul de 20% (w/v) sucrose et 2% (w/v) BSA dans une solution. Les tubes ont été centrifugés dans une microcéntrifugeuse Eppendorf, pendant 6 minutes. Les extrémités des tubes de centrifugation ont été coupées et la quantité d'anticorps marqués avec l'iode 125 (I125) fixés a été déterminée avec un compteur gamma. La fixation non spécifique a été réalisé par l'addition d'anticorps non marqués concentrés 100 fois. Le nombre de sites de fixation et la constante de dissociation (CD) ont été déterminés par analyse Scatchard. Aaréaation et Sécrétion plaguettaires Des etudes d'agrégation ont été réalisées avec des plaquettes lavées traitées avec la sérotonine 14C selon la méthode de Greenberg et al. (1979...). Les plaquettes, ajustées à 2 x 108 plaquettes/ml ont aggrégé avec 2,5 pM ADP, 2pg/ml de collagène ou 0,016 U/ml de thrombine en présence ou à l'absence soit de l'anticorps monoclonal P20 soit de l'anticorps monoclonal P21, (anticorps monoclonal complet ou fragment F(ab)'2). Après chaque agrégation, la suspension a été microcentrifugée et 100 ul de surnageant ont été passés dans un compteur pour mesurer le niveau de sécrétion. Adhésion Dlaauettaire Les études d'adhésion ont été réalisées sur des plaquettes lavées traitées avec du 51Cr (0,1 mCi par 5 x 109 plaquettes) selon la méthode décrite par Cazenave et al. (1979...), PGE1 (20 ng/ml) a été ajouté à une solution de Tyrode pendant toute la procédure. Les puits plastiques ont été recouverts avec 100 ul de BSA (0,5 %), de la fibronectine (2 pg/ml), du fibrinogène (2 pg/ml) ou du collagène (2 pg/ml) dans 25 mM de tampon de bicarbonate à pH 9,5 pendant 3 heures à 37 OC. Les puits ont été bloqués pendant 90 minutes à température ambiante avec 1 % de BSA.Les plaquettes ajustées à hauteur de 5 x 108 cellule/ml ont été préincubées avec soit l'anticorps monoclonal P20 ou l'anticorps monoclonal P21 (10 ug/ml) à 37 C pendant une heure. La suspension de plaquettes préincubées (100 ul) a été ajoutée à chaque puits et soumise à réaction à 370C pendant une heure. Tous les puits ont été lavés soigneusement dans une solution de Tyrode afin d'enlever les plaquettes non accrochées. Les puits ont ensuite uété séparés et soumis un comptage individuel sur compteur gamma. RéSULTATS Isolement des glycoprotéines de membranes plaquettaires Des extraits de plaquettes obtenus après traitement avec un détergent ont été solubilisés dans 1 % de DOC et soumis un chromatographie d'affinité (WGA) en présence de 0,5 % DOC à pH 8,6. Aucune glycoprotéine du complexe GPIIb-IIIa n'était présente dans la fraction éluée comme le montrent les analyses SDS-PAGE et ELISA. Après dialyse contre 0,1 .% de Lubrol WX, cette fraction- a été appliquée sur une colonne Q d'échange d'anions à flux rapide, et éluée dans du NaCl. Le premier pic contient quatre protéines comme le montre le résultat de SDS-PAGE. Les poids moléculaires étaient respectivement de 85, 120, 130 et 150 kD dans des conditions non réductrices et 85, 125, 140 et 155 après réduction.Aucune glycoprotéine GPIb nétait présente dans cette fraction comme le montre la détection après coloration à l'argent du gel. Cependant, la GPIb était présente dans le pic n 3. La première fraction a-été séléctionnée pour immuniser les souris de façon à produire des anticorps monoclonoaux spécifiques pour les quatre antigènes de membrane plaquettaire. Production anticorps monoclonaux Des surnageants d'hybridomes ont été criblés avec un mélange de 4 glycoprotéines en utilisant la technique ELISA. Plusieurs surnageants ont présenté une réaction vis à vis du mélange d'antigènes. Les anticorps sélectionnés P20 et P21, ont été purifiés sur Sépharose protéine A et ces, deux anticorps ont été caractérisés comme étant des IgG1 puisqu'ils sont été élués à pH 6. Identification de l'antigène plaguettaire reconnu par P20 et P21 Les lysats de plaquettes marquées 'immunoprécipités par P20 et P21 ont été comparés dans la méthode SDS-PAGE, à ceux immunoprécipités par l'anticorps S12 dirigé contre la GMP-140 et décrit par McEver dans la publication déjà citée. Une autre comparaison a été faite vis-å-vis de 1'anticorps monoclonal spécifique du complexe GPIIb-IIIa. Des autoradiogrammes (Fig. 3l montrent clairement que l'antigène reconnu par P20 n'est ni la GPIIb ni la (GPIIIa. Le poids moléculaire apparent de cet antigène a été estimé à environ 130 kD (non-réduit) et 140 kD (réduit).L'antigène reconnu par P20 migre en même temps que l'antigène immunoprécipité par un anticorps S12 de McEver qui ne présente aucune réaction de modulation des fonctions plaquettaires. Les mêmes résultats ont été obtenus avec P21. Ce résultat a été confirmé par une analyse Western blot. L'anticorps monoclonal P20 s'accroche spécifiquement à l'antigène dans des conditions dénaturantes non-réductrices. Le poids moléculaire apparent de la tache était estimé à 128 kD. Cependant, P21 a reconnu l'antigène dénaturé dans des conditions non-réductrices et réductrices. Accrochage de l'anticorDs P20 aux plaquettes lavées Des plaquettes lavées (4 donneurs) ont accroché 2.400 t 266 molécules d'anticorps P20 marqués, par plaquette non-stimulée (Kd=2,3nM + 0,54) et 12.200 t 1184 molécules d'anticorps P20 marquées par cellule après stimulation avec la thrombine (Kd=5nM + 0,61) (Fig. 5, 6). L'anticorps marqué P21 n'a reconnu ni les plaquettes au repos ni les plaquettes stimulées. Effet des anticorps P20 et P21 sur l'adhésion plaquettaire Ni P20 ni P21 n1 ont un effet significatif sur l'adhésion des plaquettes présentes sur des puits plastiques recouverts de fibronectine, de fibrinogène ou de collagène (Fig. 7). Effet de P20 et P21 sur l'aaréqation plaguettaires et la sécrétion P20 inhibe partiellement l'agrégation induite à I'ADP (60 %), au collagène (63 %) et à la thrombine (50 %) comparée au contrôle. Des fragments Fab de P20 permettent l'obtention des mêmes résultats (Fig.8). P20 permet aussi la réduction de la sécrétion plaquettaire induite par le collagène et la thrombine. P21 n'a pas d'effet sur l'agrégation plaquettaire. DISCUSSION Des anticorps monoclonaux dirigés contre la, GMP-140 des plaquettes solubilisées ont été produits. Ces anticorps P20 et P21 testés par im.unoprécipitation ont montré qu'ils présentent une spécificité pour l'antigène de membrane plaquettaire également reconnu par l'anticorps S12 de McEver. Cependant, à la différence de l'anticorps S12, P20 et P21 sont dirigés contre un épi tope conformationel de la GMP-liO. De plus, P20 est actif sur les fonctions plaquettaires. Une autre caractéristique de ces anticorps est qu'ils reconnaissent la GMP-140 dénaturée comme le montrent les résultats positifs de Western "blot. P20 reconnait uniquement la GMP-140 non-rEduite alors que P21 reste actif contre la GMP-140 réduite. Ces résultats suggèrent que le site de liaison du P20 contiènt des ponts disulfure. En revanche, le site de liaison de P21 ne contient probablement pas dé ponts disulfure. On peut conclure à ce stade que P20 et P21 sont spécifiques d'épitopes différents sur la GHP-140 plaquettaire. Les plaquettes au repos lavées ont permis de fixer environ 2000 molécules d'anticorps P20 marqué avec l'iode. Après activation des plaquettes avec l'alpha-thrombine, les plaquettes ont accroché environ 12 000 molécules d'anticorps P20 marqués. L'activation à l'ADP n'a pas accru la liaison des anticorps P20. Les plaquettes ont probablement été légèrement activées" pendant les étapes de lavage bien que PGE1 et PPACK aient été ajoutées au niveau du premier lavage. Les' antièorps P21 marqués ne s'accrochent ni aux plaquettes au repos ni aux plaquettes stimulées avec la thrombine. Des expériences de controle sur des échantillons de P21 ont été réalisées afin de vérifier la réactivité de P21 vis-à-vis de la GMP-140 solubilisée. Ces résultats se sont averés positifs. On en conclut que P21 ne s'accroche pas à des plaquettes. entières qu'elles soient activées ou non, l'épitope reconnu par P21 n'étant en pas accessible sur la membrane native de la GMP-140. Le site de liaison de P21 pourrait être exprimé soit sur la face- cytoplasmique de GMP-140, cette séquence demeurant cytoplasmique après l'activation et l'expression des alpha-granules au niveau de membrane. On pourrait également penser que l'accrochage de P21 n'est pas possible à cause de la conformation de la GMP-140 native qui masque ltépitope de P21. Cependant, P21 réagit avec, des plaquettes entières solubilisées dans le Triton X-100 et soumises à une immunoélectrophorèse croisée, conditions qui ne sont apparement pas dénaturantes. P20 inhibe partiellement l'agrégation plaquettaire et la sécrétion. S12 est connu pour son absence d'effet au niveau de l'agrégation plaquettaire. Ceci confirme bien que S12 et P20 sont dirigés contre des épitopes différents. L'effet inhibiteur de l'anticorps P20 sur l'agrégation plaquettaire induite par la thrombine ou le collagène est tout à fait en accord avec la localisation de la GMP-140 à l'intérieur de la membrane des alphagranules. Après activation avec la thrombine ou le collagène la membrane des alpha-granules fusionne avec la membrane plasmatique des plaquettes et la GMP-140 devient un recepteur de surface. De plus, la sécrétion de Sérotonine C14 est affectée par la présence de P20. EXEMPLE 5: Recherche de la présence de glycoprotéine gplîb-I.IIa- like sur des ' tissus normaux et des tissus néoplastiaues, grâce à des anticorps LYP18 Matériels et méthodes. Etudes de tissus Des tissus normaux, anormaux et des tissus présentant des lésions benignes de la peau ont été obtenus auprès du Département de Pathologie et du Dermatologie à l'université de Stanford au centre medical. 16 échantillons des tissus normaux d'organes séléctionnés (tableau 1) et 96 biopsies de tumeurs (tableau 2-et 3) ont été obtenus auprès du département de pathotogie. Les biopsies de tumeur comprennent 21 cas de mélanome malin présentant des métastases au niveau des ganglions lymphatiques, 20 cas de lymphomes n'appartenant pas à la catégorie des Iymphooees Hodgkin (1 petit lymphocytaire, 5 lymphomes folliculaires divisés, 3'lymp'hoies folliculaires mixtes, 3 lymphomes diffus, 2,lymphomes diffus à large cellule, 1 lymphome immunoblastiques à grande cellule, 3 lymphomes petits non-divisés et 2 lymphoblastiques), 4 cas de maladie de Hodgkin, 2 cas de thynone, 28 cas de carcinomes comprennant '19 cas de carcinomes primaires (sein 6, ovaire 4, oropharynx 3, poumon 2, colon 2, éstomac 1, thyroide'. 1),- 9 cas de carcinomes métastasiques dans les ganglions lymphatiques (3 adénocarcinomes, 3 squameux, 3 faiblement différenciés), 7 tumeurs neuroendocrines (4 carcinomes du poumon, 2 tumeurs des îlots pancréatiques et un carcinome medullaire de la thyroide), 1 cas dysgerminome des ovaires, 10 cas de sarcomes (5 ostéosarcomes, 3 sarcomes d'Ewing et 2 histiocytomes fibreux maligne) et 3 cas de neuroblastomes. 13 cas de lésions benignes de la peau ont été obtenus au département de dermatologie comprennant 9 nevis (1 jonction, 1 composé, 2 dermiques, 2 displastiques et 3 congénitaux), 3 lentigo-éphélides et 1 dermatofibrome. AnticorPs monoclonaux Les anticorps monoclonaux LYP2 et LYP18 ont été. séléctionnés pour réaliser les expériences ci-après. LYP2 (IgGi) et LYP18 (IgG2.) ne croisent pas lors d'une immunoélectrophorèse croisée avec les glycoprotéines de plaquettes IIb ou Illa séparées par l'EDTA mais reconnaissent un déterminant présent sur le complexe glycoprotéique IIb-IIIa intact calcium médié (McGregor et al, Eur J Biochem 1986, 159: 443-449). LYP2 et LYP18 ont été purifiés à partir de fluide d'ascite sur une colonne protéine A-Sepharose 4B comme décrit dans la référence McGregor et al prédédemment cité, à des concentrations s'étalant dans un intervalle de 1,0 à 1,5 mg/ml et en utilisant une dilution de 1:200.L'anticorps monoclonal dirigé contre une glycoprotéine IIIa de plaquette (IgGz) a été obtenu auprès de Dakopatts (Santa Barbara, CA) sous forme d'un surnageant de culture puis utilisé à une dilution de 1:50. L'anticorps monoclonal purifié Leu 9 (CD7)(IgG2a) a servi d'anticorps contrôle à une dilution de 1:200 et a été obtenu de Becton-Dickinson (Mountain View, CA). Marquaqe immunohistologique Tous les tissus normaux, anormaux ainsi que les spécimens présentant des lésions bénignes de la peau ont été gelés, traités dans la même façon et colorés comme décrit par Bindl (Am J Clin Pathol 1986;85 490-493). En bref, des sections de cryostat séchées à l'air, fixées avec de l'acétone (4-5 pm) ont été incubées pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée, avec les différents anticorps monoclonaux. Les sections ont ensuite été incubées par série (avec des lavages dans un tampon salin de phosphate entre les incubations dans un récipient de Coplin contenant des immunoglobulines anti-souris de chèvres biotinylées (Jackson ImmunoResearch Laboratories, est Grove, PA). Puis ces sections ont été traitées avec de la peroxidase de, raifort conjugée avec de la streptavidine (Jackson), chaque incubation durant 30 minutes à 4 C. La coloration a été developpée avec 3 mg/ml 3,3 diamino-benzidine (Sigma Chemical Co/, St Louis, MO) et 0,3 s de peroxide d'hydrogène, pendant 5 minutes d temperature ambiante.Après coloration du produit -de réaction avec de sulfate de cuivre 0,5 % dans du NaCl IX pendant 5 minutes, les sections ont été lavées, colorées avec 2 % de bleu de méthylène, déshydratées et recouverts d'une lamelle-. Pour l'étude de la lésion dérivée de melanocbte pigmenté, la phosphatase alkaline conjugée avec la streptavidine (Jackson) a été substituée å. la peroxidase et la coloration a été réalisée dans un Fast Red Salt (FRS, Sigma) pendant 20 minutes comme décrit précédemment. Résultats LYP18 colore fortement les mégacaryocytes dans la moelle osseuse, les plaquettes, ainsi que les capillaires recouvrant les cellules endothéliales, les vénules- '- et' - les artérioles présents dans des tissus normaux L'anticorps monoclonal LYP18 presente également une forte réaction de coloration avec l'épithélium giomérulaire des glandes endométriques et colore faiblement les cellules des muscles lisses. Cependant, un grand nombre de tissus normaux, provenant de différents organes n'a pas été coloré avec l'anticorps monoclonal LYP18 (tableau 1). Les anticorps monoclonaux LYP2 ont coloré les mégacaryocytes et les plaquettes avec la même intensité que LiP18 mais ils n'ont pas présentés de liaison avec les les autres tissus normaux. L'anticorps monoclonal de controle Dako, dirigé contre la gpIIIa colore fortement les mégacaryocytes, les plaquettes, l'épithélium glomérulaire et les glandes endométriques mais colore faiblement les cellules endothéliales et les cellules du muscle lisse. Parmi les cellules normales d'un type donné, on observe pas de variation significative de l'intensité du nombre de cellule coloré par ces 3 anticorps monoclonaux. Parmi les 21 cas de mélanomes étudiés, 16 (75%) ont donné lieu à une réaction avec l'anticorps LYP18. Les anticorps monoclonaux LYP18 produisent une coloration variable au niveau des mélanomes. A l'exception d'un seul cas de coloration très faible, on a remarqué aucune variation de cellule à cellule dans l'intensité de la coloration pour chaque cas particulier. LYP18 présente une image cytoplasmique faible et diffuse avec une coloration renforcée au niveau de la membrane périphérique. Les intensités de coloration et le pourcentage de mélanomes liés avec l'anticorps Dako anti-gpIIIa est identique à la coloration obtenue avec LYP1S. LYP2 ne s'accroche pas au mélanome malin métastasique. En revanche les mélanocytes normaux présents au niveau de la peau, de lentigines, des dermatofibromes, et des mélanocytes activés formant un nevi, qui comprennent des mélanocytes de types de jonctionnel composé, dermique, displastique et congénital ne permettent pas l'accrochage des anticorps LYP18, LYP2 ou Dako anti-gpIIIa (tableau 2). Parmi les 75 tumeurs non mélanocytiques, seulement 3 (4%) ont entrainé une coloration pour LYP18 (voir tableau 3): un carcinome des papilles thyroïdiennes métastasiques, un adénocarcinome endométrique primaire des ovaires, très faiblement positif, et un ostéosarcome faiblement positif. 96% (72 parmi 75) n'ont pas présenté d'accrochage de LYP18. Les anticorps Dako anti-gpIIIa se sont accroches à différentes tumeurs, de la même façon que le LYP18. LYP2 n'est pas lié aux différentes tumeurs étudiées. Discussion Ces études démontrent la présence de glycoprotéines IIB-IIIa-like sur les cellules de mélanoses malins etastasiques et l'absence de ces complexes glycoprotéiques sur des mélanocytes bénins. Des sections congelées de biopsies de mélanomes n'ont pas été reconnues par d'autres anticorps monoclonaux (LYP2) également dirigés contre le complexe plaquettaire IIb-IIIa mais ont reconnu l'anticorps monoclonal anti-gpIIIa Dako, ce qui suggère que l'un des composants du complexe intégrine sur les mélanomes malins métastasiques est la gpIIIa. L'absence de reconnaissance par LYP2 pourrait indiquer des différences de structure entre les glycoprotéines IIb-IIIa-like des mélanomes et le complexe plaquettaire. La présence de glycoprotéines IIb-IIIa-like encore désignées par cytoadhésines sur les cellules des mélanomes malins mais pas sur des cellules de mélanocytes bénins, peut être interprêtée comme l'expression aberrante d'antigène ayant lieu lors du processus de passage à l'état malin. Les cytoadhésines présentes sur les mélanomes peuvent donner aux cellules. malignes des propriétés qui peuvent faciliter l'invasiofl métastasique et peuvent également expliquer leur interaction avec les protéines adhésives de la matrice extracellulaire et avec d'autres cellules du sang. La raison pour laquelle un quart n'a pas été reconnu par LYP18 n'est pas claire. Il est possible. que les cellules tumorales n'aient pas synthétisé ces glycoprotéines ou que les antigènes aient été exprimés mais à un niveau non détectable. Si la première hypothèse est correcte, elle peut impliquer le fait que l'expression des glycoprotéines de IIb-IIIa-like n'est pas un facteur essentiel pour l'établissement de métastases dans les mélanomes malins. Parmi les différents néoplasmes n'appartenant pas au type des mélanomes, seulement 4% présentaient une liaison avec LEP18. La réactivité de LYP18 avec 3 sur 75 néoplasmes non mélanocytiques malins, pourrait être due à la synthèse d'antigènes IIb-IIIa-like par ces tumeurs. Une autre hypothèse peut être que ce même épi tope est présent sur une molécule différente ou qu'une coloration non spécifique a eu lieu. L'absence de réactivité de LYP18 avec une grande majorité des tumeurs non mélanocytiques étudiée suggère que l'expression aberrante des glycoprotéines IIb-IIIalike n'est pas universelle parmi les cellules malignes, y compris celles qui présentent des sites métastasiques. Tableau I : Réactivité de LYP18 aux sections congelées de tissus normaux Tissus Coloration des types cellulaires * Hoelle osseuse megacaryocytes Amygdales o Thymus o Rate o Ganglion lymphatique 0 8ang périphérique 0 Foie o Reins épithelium glomérulaire Peau o Estomac o Thyroide o Poumon o Prostate o Seins Uterus -glandes endometriales * Tous les tissus présentent une réactivité de LYP18 avec les cellules endothéliales et avec les plaquettes dans les sections de tissus. Tableau 2 : Fixation de LYP 18 aux mélanomes et aux élanocytes normaux sur des sections congelées. Lésions Nombre de réactions/Nombre testés Mélanomes 16/21 (75S) N. Mélanocytes Peau normale 0/2 Lentigines 0/3 Dermatofibrome 0/1 Nevi 0/9 Tableau 3t Réaction de LYP18 avec des sections congelées de différentes tuteurs Types histopathologiques Nbre de réaction/Nbre testés Lymphomes non Hodgkiniesn 0/20 stade initial 0/9 stade intermédiaire 0/5 stade avancé 0/6 Maladie de Hodgkin (MCHD) 0/4 Thymomes 0/2 Carcinomes metastatiques malpighien 0/3 glandulaire 1/3 Tumeures neuroendocrines bin différentiées 0/3 mal différentiées 0/4 Sarcomes ostéosarcome 1/5 sarcoe Erwing 0/3 M.F.H. . 0/2 Autres neuroblastome 0/3 dygermonome 3/75 REVENDICATIONS 1/ Anticorps monoclonaux, ou les fragments idiotypiques de ces anticorps monoclonaux, reconnaissant des antigènes impliqués dans les étapes de la physiologie plaquettaire et en particulier dans les réactions d'adhésion et/ou d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire, et/ou d'adhésion des cellules endothéliales caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de moduler les fonctions plaquettaires ou les fonctions endothéliales induites par une faible concentration d'agonistes, par exemple en présence de 2,5 à 5M dlADP ou 2g/ml de collagène ou 0,016 U/ml de thrombine et en ce que leur capacité d'inhibition sur les fonctions plaquettaires est considérablement réduite, voire absente, en présence de concentrations élevées d'agonistes, par exemple en présence de concentrations en thrombine supérieure à 0,5 U/ml ou en collagène supérieur à 10g/ml. 2/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idictypiques selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une protéine ou d'une glycoprotéine choisie parmi la glycoprotéine GMP140, le complexe gpIIb-IIIa, le complexe gpIa-IIa, le complexe gpIc-IIa ou la gpIIa. 3/ Anticorps monoclonaux ou 'leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope ayant un effet fonctionnel vis à vis de la protéine, la glycoprotéine ou le complexe protéique qui le contient et en ce qu'il est sensible à la réduction de l'antigène qui le contient. 4/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 & à 3. caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent sur a GMPl4O, exposé à la surface des plaquettes activées, les dits anticorps ou leurs fragments idiotypiques étant capables d'interférer avec les réactions d'agrégation et/ou de sécrétion plaquettaire et étant en particulier caractérisés en ce qu'il s s'agit d'anticorps LYP20 ou d'anticorps présentant des propriétés imrunologiques et fonctionnelles, equivalentes. 5i Anticorps monoclon@ux ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 -à 3, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope présent au niveau de la glycoprotéine IIa, du complexe Ia-Ila, ces anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'interférer avec les réactions d'agrégation plaquettaires et étant en particulier caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps LYP22 ou d'anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles equivalentes. 6/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope du complexe IIb-IIIa à la surface des plaquettes stimulées le dits anticorps ou leurs fragments idiotypiques ayant la capacité d'inhiber les fonctions plaquettaires et tant dépourvus de cette capacité en présence d'une forte concentration d'agonistes par exemple de thrombine (supérieure à 0,5 U/ml) ou d'e collagène (supérieure à 10 g/ml) et étant en particulier caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps LYPIS, ou d'anticorps présentant des propriétés immunologiques et fonctionnelles éguivalentes. 7/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils sont marqués le marquage étant de préférence réalisé avec une substance radioactive, notamment 131I, 111In ou 99T, ou par une substance fluorescente. 8/ Epitope present au niveau d'un antigène impliqué dans les étapes de la physilogie plaquettaire et en particulier dans les réactions c'adhésion et/ou d'agrégation plaquettaire et/ou d'adhésion des cellules endothéliales ledit antigène étant choisi plus particulièrement parmi les protéines GMP140 la glycoprotéine gpIIa ou les complexes gpIIb-IIIa, gpIa-IIa, gpIc-IIa, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un épitope conformationnel, nécessaire à l'activité dans les réactions ci-dessus de l'antigène qui le contient - 9/ Epitope selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est sensible à la réduction de l'antigène qui le contient. 10/ Epitope selon la revendication D-. caractérisé en ce qu'il est reconnu par l'anticorps YP20. 11/ Epitope selon la revendication It. caractérisé en ce qu'il est reconnu par l'anticorps LYP22. 12/ Epitope selon la revendication 8 ou la revendication 9, a) en ce qu'il est reconnu par le complexe IIb IIIa de plaquettes humaines. b) en ce qu'il n'est pas reconnu par le complexe IIb-IIIa de plaquettes de chien, c) en ce qu'il est reconnu par l'analogue du complexe IIb-IIIa des cellules endcthéliales, et en particulier en ce qu'il s'agit de :'épitope reconnu par l'anticorps LYPîS. 13/ Composition pour le diagnostic de l'activation plaquettaire chez un sujet susceptible de présenter une thrombose ou pour la localisation d'un thrombus, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux anticorps différents ou leurs fragments idiotypiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, de préférence des anticorps dirigés contre des protéines ou glycoprotéines distinctes, en particulier un mélange d'anticorps choisis parri LYP20, LYP22, LYP18, ou leurs fragments idiotypiques. 14/ Composition selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'elle comprend en outre des anticorps monoclonaux, ou leurs fragments idiotyB ques. dirigés contre la thrombospondine et de préférence-des anticorps du type LYP9 ou/et LYP11. 15/ Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif un anticorps monoclonal ou/et ses fragments idiotypiques, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou un mélange de ces différents anticorps, ou/et fragments idiotypiques, en combinaison avec un véhicule pharmaceutique acceptable. 16/ Composition-pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que le ou les anticorps, ou fragments idiotypiques, de ces anticorps sont - soit couplés à une substance anti-coagulante, ou une substance ayant une un activité thrombolytique, cette substance pouvant être -par exemple le tPa, la streptokinase, l'urokinase, - soit modifiés au niveau de l'une de leurs chaines idiotypiques de façon à remplacer l'un des fragments ou au moins une partie de ce fragment, par l'une des susdites substances anticoagulantes. 17/ Utilisaticn d'anticorps, ou de leurs fragments idiotypiques, selon l'une quelconque des revendic@tions 1, 2 3, 4 ou 6 ou d'un mélange de ces anticorps monoclonaux ou de leurs fragments idiotypiques, pour la fabricatior. d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à des troubles de la physiologie plaquettaire. 18/ Procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux selon l'une quelconque es revendications 1 à 4, comprenant les tapes suivantes a) fusion ce cellules spléniques de souris ayant préalablement été immunisées avec des antigènes purifiés avec des cellules du myélo-e en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le PEG b) culture des hybridomes produites par la fusion dans un milieu HAT en présence de macrophages du péritoine de souris normales, c) criblage du surnageant des hybridomes pour détecter la présence des anticorps recherchés, notamment pal ira méthode ELISA, d) sélection et clonage, e cas échéant à plusieurs reprises, des hybridomes producteurs des anticorps, e) production d'ascites à partir de souris dans lesquelles ont été transférés les connes positifs pour la production d'anticorps monoclona-~x, f) purification des anticorps ronoclonaux obtenus . Elle concerne aussi l'application diagnostique et thérapeutique de ces anticorps. 19/ Hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux selon la revendication 4 ou la revendication 6, tels tels qu'obtenus par fusion des cellules myélomateuses Sp2/O-Agl4 avec des cellules spléniques de souris préalablement immunisées avec des plaquettes de sang humain traitées à la chymotrypsine 0,2mg @1/109 plaquettes). 20/ Hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux selon la revendication 5 caractérises tels qu'obtenus par fusion des cellules mélomateuses P3 x 63 Ag8 avec des cellules spléniques de souris préalablement immunisées avec un mélange d'antigènes GMP140, glyco@rotéines Ia, Ic, IIa, GP110-115.