Brevet FR2651006A1 — publié le 19910222

:1 L'invention concerne des compositions liquides aqueuses d'enzymes sous forme de préparations directement prêtes à l'emploi, en particuler d'enzymes a activite protéolytique, telles par exemple que le complexe pancreatique. Les préparations enzymatiques liquiaes ont acquis une certaine situation privilégiée dans les domaines d'application pratique des enzymes. Un point de vue important à cet égard a été la sécurite (cf. H.J. Rehm & e. Reed Ed. Biotechnology, vol. 7a "Enzyme Technology", pp. 722, 731, VCH 1987). Les préparations liquides d'enzymes offrent l'avantage indiscutable d'âtre sans poussière et, en consequence, de réduire le risque de réactions allergiques. En revanche, le risque de pollution microbienne croît, ce qui fait qu'en règle générale, les compositions liquides aqueuses d'enzymes comportent un antiseptique ou contiennent un véhicule qui abaisse l'"activité d'eau" favorab.e & la propagation microbiologique. Un autre avantage d'application technique réside dans la meilleure possibilité de dosage des préparations liquides en comparaison des préparations solides de l'état de la technique. La contamination microbiologique n'est toutefois pas la seule cause de l'altération de la qualité d'enzymes dans des compositions liquides au cours du temps. Dès que des enzymes protéolytiques sont en jeu, qu'il s'agisse d'enzyme principale ou de contamination, il faut s'attendre à une autodigestion des enzymes. La perte d'activité, le plus souvent rapide, qui est liée à ce phénomène est particulièrement marquée en presence de protéases pancréatiques et elle n'est guère évitable, même avec une très faible activité d'eau. Un expédient s'offre dans la fixation covalente de proteases sur des véenicules. Mais abstraction faite du prix élevé d'enzymes fixees sur un véhicule, une application judicieuse d'enzymes immobilisées suppose la mobilité relative des substrats & dégrader, qui n'existe par exemple que dans une mesure insuffisante en cas d'application dans le domaine des cuirs. En revanche, des mélanges d'enzymes non fixes par liaison covalente, par exemple inclus dans des microcapsules, des fils ou des gels Ce polymeres réticulés, sont décomposes autolytiquement ou dissocies par des protéases, de façon semblable aux enzymes solubles (cf. Ullmanns Encyklopadie der techn. Chemie, 4èm édition, vol. 10, p. 544, Verlag Chemie 1975). Les problèmes en cas de traitement de pancréas sont encore aggravés par le fait qu'en raison de leur origine zoogène, les jus de pancréas sont fortement chargés de germes au départ. Comme on le sait, des enzymes ayant différentes directions d'activité interviennent ensemble dans le système digestif. Les préparations de protéases du pancréas, utilisées ordinairement dans la technique, sont donc des mélanges de trypsine (E.C.3.4.21.4), de chymotrypsine (E.C;3.4.4. 5) et de différentes peptidases edition, vol. 10, pp. 515-537, Verlag Chemie 1975; Kirk- Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3ème éd., vol. 9, pp. 173224,.Wiley Interscience 1980), Le désir de disposer de compositions liquides aqueuses d'enzymes avec leurs. avantages importants, en evitant en nmême temps les inconvénients tels que la perte d'activité et la contamination, a conduit à différents essais de solution; par exemple dans le sens de la coupure avec des solvants organiques (DE-A 18 08 834, HU 2642, DDR 10 058) ou dans celui de compositions liquides non aqueuses. Jusqu'à maintenant, on n'a pas enregistre de succes convaincant a tous égards, notamment dans le cas d'enzymes à activité protéolytique et en particulier dans celui d'enzymes pancréatiques (cf. DE-A 37 04 465, US 3 741 902). Les inconvénients en ce qui concerne les compositions liquides dans des milieux organiques tiennent au fait qu'on ne peut guère eviter la préparation des enzymes sous forme sachée et au fait que les milieux organiques qui conviennent le mieux, comme par exemple le carbonate de propylène, sont excessivement coûteux. Tout comme avant, il restait donc à mettre A disposition des compositions liquides aqueuses, ayant une stabilité suffisante, d'enzymes à action protéolyique, en particulier du complexe pancréatique. Ce faisant, il fallait d'une part veiller aussi à la protection de l'environnement et, d'autre part, il ne fallait pas qu'il en résulte une charge financière excessive, eu égard par exemple a l'application industrielle, en particulier dans l'industrie du cuir. Or, il a été découvert que -ce but pouvait être atteint de façon très favorable par le procède selon 1 '4nvention. Le procédé selon l'invention pour la préparation de compositions liquides aqueuses d'enzymes consiste en ce que les enzymes présentes en milieu aqueux sont precipitées à l'état finement divisé de façon connue en soi et en ce qu'un état finement dispersé,- stable au dépôt des enzymes est crée par equilibrage de la masse volumique dans le milieu aqueux. Comme on l'a déJà exposé, le procédé convient à l'application pour des préparations enzymatiques aqueuses de protéases, de complexes enzymatiques à action proteolytique et d'enzymes telles que les amylases, les lipases, etc. qui ont une activité protéolytique secondaire. On mentionnera en particulier le complexe pancréatique (pancreatine). Les enzymes - Par enzymes & activité protéolytique, il y a lieu d'entendre en premier lieu les endopeptidases ("protéases" E.C.3.4), les enzymes utilisées dans la technique ayant un intérêt particulier dans le cadre de la présente invention , pp. 23-46, North Holand 1974). On distingue des protéases a) d'origine animale, comme par exemple ". la rennine (E.C.3.4.23.4) D) les protéases du pancréas pancréatine, en particulier trypsine, chymotrypsine (gamme de pH d'activité, 7-10 environ> , 26 5 1006 pepsine OE.C.3.4.23.1) (gamme de pH d'activité, 1,5-4,0 environ) cathepsine OE.C.3.4.23.5) (gamme de pH d'activité, 4,0-5,0 environ); b> d'origine végétale a) papaïne (E.C.3.4.22.1), garne de pH d'activité 5,0- 8,0 environ e) ficine 'E.C.S.4.22.3), gamme de pH d'activité 4,0- 9,0 environ X) bromeline (E.C.3.4.22.4 et 3.4.22.5) gamme de pH d'activité 5,0-7,0 environ; c) d'origine microbienne provenant d' especes de Streptococcus, y} provenant d'espèces de Streptomyces, telles que S. _tradiae, S. griseus, S. rectus, 6>) provenant d'espèces d'Aspergiltus, telles que A. flavus-oryzae, A. nager,.A. saltori, A. usamail, E) provenant d'especes de Mucor et de Rlhizopus, telles que M. pusillus, M. mietrei, d) provenant d'espèces d' Endothia, telles que E.- parasi t ica, ) provenant d'espèces de Trametes, telles que T. sangul nea. Outre la distinction d'après l'origine, on utilise aussi la distinction d'après le lieu d'attaque (exo/endo-enzymes) et sur la base du "site actif" des protéases DFP, sulfhydryle-enzymes). En outre, la dépendance de l'activité enzymatique & l'égard du pH a une grande importance pratique. C'est ainsi que d'un point de vue pratique surtout, on distingue: 2651006' i) des protéases alcalines, ayant un optimum d'activite dans la gamme de pH de 7,5 à 13 environ, en particulier des protéases bactériennes alcalines (E.C.3.4.21) (qui appartiennent pour la plupart au type serine) et des protéases alcalines de champignons; ii> des protéases neutres, ayant un optimum d'activite dans la gamme de pH de 6,0 a 9,0, en particulier des proteases bactériennes neutres (E.C.3.4.24 {qui font partie des metallo-enzymes) et des protéases de champignons, par exemple des proteases de Bacóllus, des proteases de Pseudomonas, des protéases de Streptomyces, des protéases d'Aspergillus; iii) des proteases acides, ayant un optimum d'activité dans la gamme de pH de 2,0 à 5,0 (E.C.3.4.23), en particulier des protéases acides de champignons, provenant par exemple de Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicill1um spp., Mucor spp. et d'Impex lacteus et Endothitia parasitica. Convient, comme substrat pour l'analyse de produits techniques, la caséine (méthode de Lbhlein-Volhard, Kunitz, Laskowski, cf. ci-après), l'hémoglobine viscosimétrique). Ordinairement, l'activité protéolyti- que est déterminée par la méthode de Ldhlein-Volhard (modifiée par Tegewa dans "Leder", 22, 121-126, 1971). Une unité Lhlein-Volhard (ULV) correspond, dans les conditions de l'essai (1 h, 37'C), à la quantité d'enzyme qui produit, dans 20 ml de filtrat de caséine, une augmentation de produit d'hydrolyse correspondant à un équivalent de 5,75 x 10-3 ml de NaOH 0,1 n. En outre, la détermination de l'activité protéolytique des enzymes par la méthode d'Anson & l'hémoglobine [L.L. Anson, J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939)] est appliquée couramment. Les protéases sont utilisées industriellement, entre autres applications, dans la fabrication du cuir, dans des produits de lavage et-dans le nettoyage, dans le désencollage, dans la fabrication 'de fromages, dans l'écharnage et dans la stabilisation de la bière. En outre, comme on l'a déjà mentionné, des complexes d'enzymes à action protéolytique et des enzymes ayant une activité protéolytique secondaire sont intéressants. En font notamment partie des amylases, en particulier des a-amylases (cf. Fischer et Stein dans "The Enzymes", 2ème éd., P.D. Boyer et al., vol. IV, pp. 313-334, Academic Press) qui, sous forme de préparations techniques, contiennent en règle générale des protéases en tant qu'enzymes d'accompagnement. Les o-amylases sont d'origine animale, végétale ou microbiologique. Les sources préférées sont par exemple les amylases pancréatiques, les amylases bactériennes et de champignons. La gamme de pH d'activité d'c-amylases de différentes provenances (c'est-à-dire d'amylases qui clivent la liaison x-1,4-glycoside dans l'amylose ou l'amylopectine) se situe entre 3,5- et 9,0. L'a-amylase obtenue à partir du pancréas a une gamme de pH d'activité de 5,5 à 9,0 (optimum de pH à 7, 2 environ), celle qui est obtenue à partir de bactéries a une gamme d'activité de 4,5 à 8,5 (l'optimum de pH pour l'a- amylase liquéfiante se situant entre 6,5 et 7,0 et pour l'a-amylase saccharifiante entre 4,8 et 5,2), celle qui est préparée & partir de champignons a une gamme *d'activité de 3,5 à 7,0 (optimum de pH à 5,0) et celle qui est préparée à partir de malt a une gamme d'activité de 4,5 à 7, 0 (optimum de pH à 4,7) (cf. Ullmann, op.cit., vol. 10, p. 507). La préparation & partir d'espèces de Bacillus telles que B. subtilis, B. mesentericus, B. polymixa, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, ainsi qu'à partir 26 5 1 0 0 6 de champignons, en particulier d'espèces d'Aspergillus telles qu'A. niger, A. phoenicis, A. oryzae, A. awamori, d'espèces de Mucor telles que M. roux1anus, d'espaces de Rhizopus telles que R. delemar, R. oryzae, R. japonicus, et d'espèces d'Hndomyces telles qu'E. flbulfger, a pris constamment de l'importance. Les amylases sont utilisables notamment dans le secteur de l'alimentation [cf. H.-J. Rehm et G. Reed Ed., "Biotechnology", vol. 5, Vrlag Chemie 1983; B. Spencer, Ed., Industrial Aspects of Biochemistry, vol. 30, partie I, pp. lS9-186, 213- 260, Elseviers (1973)], dans la liquéfaction de l'amidon, la preparation du malt, dans la préparation de l'éthanol, le désencollage, dans la fabrication du cuir, etc. L'activité d'a-amylases avec utilisation d'amidon comme substrat peut être déterminée par la méthode de Sandstedt, Kneen et Blish (Gereal Chem. 16, 172 (1939) et Technical Bulletin n' 1024, U.S. Dept. of Agriculture). Ici, 1 unité d'amylase (= 1 unité SKB) est la quantité d'enzyme qui est en mesure, & 30'C et dans les conditions de réaction fixées par ailleurs, de dextriniser 1 g d'amidon soluble en l'espace de 1 h. En outre, la méthode de Willst&tter est applicable pour la détermination de l'activité de l'amylase du pancréas [Hoppe-Seylers, Z. physiol. Chem. 126, 143 (1923)]. Ici, une unité Villstatter d'amylase est définie comme le centuple de la quantité d'enzyme qui, dans les conditions données de l'essai, clive l'amidon & une vitesse telle que la constante de réaction monomoléculaire est égale à 0,01. Entre en outre dans le domaine du procédé de l'invention l'application à des lipases (E.C.S.1.i.3) ayant une activité protéolytique secondaire. Comme on le sait, on désigne par lipases des carboxylestéraes qui clivent les esters de glycérine en émulsion aqueuse. On distingue à cet égard: - les lipases du pancréas qui sont contenues dans le complexe d'enzymes pancréatiques en tant.qu'enzymes d'accompagnement techniquement importantes à côté d'esterases, de protéases et d'amylases. L'optimum de pH (à l'égard de l'huile d'olive) se situe dans la gamme de 7 a 8,5, la gamme d'activité est comprise entre les pH de 6,5 et de 9,5. Les lipases passent en général pour tres instables, en particulier à l'egard de la dégradation protéolytique par des protéases d'accompagnement; - ainsi que des lipases microbiologiques, provenant par exemple de Fseudomonas fragii, d'Asper8-illus sp. (par exemple A. luchuensis), de Candida cylindracea. Geotrichum candidum, Humicoia lan8ulnosa, mucor pusillus, Penicillium sp. (par exemple P. clrysogenum. P. oxalicum), Rhizopus sp. (R. nigeri cans, R. oryzae). Ces lipases presentent en règle générale un optimum à un pH > 7,0. De façon classique, la détermination de l'activite de 1ipases est. effectuée avec de l'huile d'olive comme substrat, ainsi qu'avec de la triacetine et de la tributyrine [cf. M. Sémériva et al., Biochemistry 10, 2143 (1971>; Pharmaceutical Enzymes, édité par R. Ruyssen et A. Lauwers 1978 (FIP)]. Lorsque l'activité de clivage des graisses est exprimée en kilo-unités de lipase alpha-chymotrypsinogene, ainsi que trypsinogène. L'isolement des enzymes du complexe pancréatique a eté décrit en détail dans la littérature (cf. par exemple Ullmann, vol. 10 op.cit.. pp. 535-537). Le procedé A. Isolement à partir du complexe pancréatique Le procédé de l'invention peut s'appuyer en partie sur des procédés d'isolement de l'état de la technique (cf. Ullmann, vol. 10, op.cit., pp. 536-537. 1. Extraction L'isolement est effectué avantageusement à partir de glandes pancreatiques immédiatement après l'abattage, surtout de porcins et de bovins. On peut par exemple traiter environ 100 glandes pancréatiques en une charge, en éliminant aussi complètement que possible la graisse et le tissu conjonctif des glandes aussitôt après l'abattage, puis en homogénéisant le tissu glandulaire, par exemple au moyen d'un hachoir à viande. Immédiatement après, on procède opportunément à l'extraction avec à peu près le volume double (environ 1) d'acide sulfurique 0,25 n, à 5'C pendant 18 à 25 h. Après l'addition de flocons de filtration, on exprime le jus, de façon avantageuse au moyen d'une presse & empaqueter. Les plateaux de serrage peuvent être jetés. 2. Le procédé Le jus de pression des glandes pancréatiques, largement exempt de graisse, est précipité avec une forte quantité de sulfate de sodium ou de sulfate d'ammonium ("sel A"), de préférence par addition rapide et à la température ambiante. La quantité aJoutée de sel A solide anhydre est avantageusement d'environ 50 2% en poids par rapport au jus de pression. Il peut être avantageux de concasser la matière précipitée a un plus fin degré de division par agitation. vigoureuse (par exemple au moyen d'un agitateur a disque denté). Toutefois, cette mesure est superflue dans de nombreux cas, car la précipitation des enzymes pancréatiques se produit de toute façon sous forme finement 'divisése en consequence de l'addition rapide du - sel A. Pour la confection/standardisation du produit a une activité déterminée désirée, on dilue suivant les necessités avec une solution isotonique de sel A 'par exemple 38,3 kg de sei A et 61,7 kg d'eau). Par addition de sel A solide ou d'eau, il doit être réglé une masse volumique de 1,22 à 1,23 de la préparation aqueuse a'enzymes. Les expériences conduites avec le complexe pancréatique montrent que ce n'est que dans une gamme étroite de masse volumique, et plus précisément dans la gamme de masse volumique de 1,22 à 1,23 selon tous les résultats actuellement disponibles, que la suspension d'enzymes reste très stable au dépôt. Le respect de la gamme étroite de masse volumique nécessaire est donc fondamental pour la présente invention. Cette règle s'applique aussi a des extraits bruts d'enzymes d'autre provenance, tels que mentionnés précédemment. 3. Confection ultérieure Par le réglage isotonique selon l'invention. des filtrats de culture, en particulier d'origine pancréatique, on parvient & mettre à disposition des compositions stables au dépôt qui satisfont sûrement aux exigences pendant une période de plusieurs jours & plusieurs semaines, ce qui fait que dans de nombreux cas, les conditions préalables pour la possibilité d'application technique sont remplies. Cependant, une altération de la stabilité au dépôt peut se produire par évaporation du véhicule liquide (eau) ou, en cas de fortes variations de température, par les variations ou fluctuations de masse volumique qui y sont liées. Cela peut conduire alors à la rupture (crémage ou dépôt) de la suspension d'enzymes. Or, les exigences de la pratique visent constamment a des préparations d'enzymes complètement stables au dépôt et homogènes. De façon surprenante, ce n'est que par l'utilisation d'au moins un épaississant a base de xanthane que l'on parvient a un épaississement suffisant des suspensions d'enzymes à forte teneur en électrolyte (contenant par exemple 38,3% en poids de sel A). Le xanthane [polysaccharide B-1459, Keltrol F. Kelzan; cf. Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3èeme éd. vol. 12, pp. 62-66, J. Wiley & Sons 1980; Rees et Welch, Angew. Chemie 89, 228-239 (1977)] ou d'autres épaississants à base de xanthane ont fait en particulier leurs preuves. Par exemple, l'épaississement avec un dérivé de xanthane spécialement modifié (par exemple KlA96, hétéropolysaccharide anionique de la firme Kelco, San Diego, USA) à une concentration de 0,1 à 5%, de préférence de 0,1 à 1% pour une solution de sel A à 38,3% en poids, donne des viscosités de 200 &à. 1000 mPa.s. En règle générale, l'épaississement avec une solution à 0,1-5% (en poids) de xanthane ou de dérivés de celui- ci donne de très bons résultats dans une solution de sel A solide à 38,3% en poids, en particulier lorsque le xanthane est incorporé avec cisaillement, par exemple très rapide (par exemple à des vitesses périphériques de 1 à 5 m/s). Cette solution de xanthane est opportunément isotonique avec la solution de sel A utilisée pour la précipitation. Elle peut être aJoutée directement au Jus de pression du pancréas précipité avec le sel A, afin de régler ainsi l'activité finale désirée de l'enzyme. Toutefois, il a été constaté que méme dans des conaitions non isotoniques, par exemple dans la gamme de masse volumique plus large de 1 à 1,5, l'épaississement atteint suffit pour que l'on obtienne des compositions d'enzymes stables au dépôt. Il y a lieu de noter que lorsqu'une suspension de pancréas précipitée par le sel A est diluée avec la solution isotonique de sel A épaissie, il se produit une diminution de viscosité d'envlron 50%. La viscosité résiduelle de 100 a 500 Pa.s est suffisante pour que l'on obtienne des préparations d'enzymes homogènes, complètement stables au dépôt et & activité stable. B. Isolement a partir d'autres extraits bruts contenant ces protéinases A la place du jus de pression de pancréas, d'autres jus de culture contenant des protéinases, provenant par exemple de cultures de champignons ou de bactéries, peuvent être utilises concernant la provenance des enzymes>. En outre, l'application du procédé de l'invention a la combinaison protéinase de champignon/proteinase de pancreas ou protéase bactérienne/protéinase de pancréas est possible. A cet égard, il existe par exemple deux possibilités: a) On mélange les différents jus de culture à 5-10'C et on procède aussitôt à une précipitation avec le sel A. L'activité finale désirée est ensuite réEg ée par dilution isotonique, le cas échéant avec une solution épaissie de sel A. b) La préparation de protéinase de bactéries ou de champignons (précipitation par le sel A) est produite de façon analogue & la suspension pancréatique, mais separément. Puis la préparation de protéinase de- champignons ou de bactéries, isotonique avec la préparation pancréatique, est aJoutée, est éventuellement diluée isotoniquement en vue de la standardisation et est éventuellement stabilisée avec la solution isotonique de sel A épaissie. Dans un cas comme dans l'autre, on obtient des compositions qui sont aussi bien stables au dépôt que dotées d'activité stable. Dans toutes les suspensions d'enzymes, une stabilisation sur le plan microbiologique n'est en général pas nécessaire en raison de la forte teneur en électrolyte. D'autre part, aucune raison technique ne s'oppose a l'addition d'agents de conservation classiques (cf. la description de l'état de la technique). Pour toutes les enzymes, il s'avère d'après l'expérience dont on dispose jusqu'ici que le milieu liquide doit avoir une masse volumique dans la gamme de 1,22 à 1,23 pour que l'on obtienne la stabilité au dépôt. Cela s'applique aussi & la confection finale avec l'épaississant. Les exemples qui suivent servent a expliquer le procédé de l'invention. La détermination de la masse volumique est effectuée par pesée exacte d'une quantité volumique définie dans un cylindre gradué étalonné à 20'C. La détermination de la viscosité est effectuée avec le viscosimetre de Brookfield, egalement à 20'C. Préparation de la solution isotonique ayant la masse volumique de 1,22 à 1,2S g/cm à 20'C 61,7 kg d'eau de distribution sont chargés au préalable dans un récipient comportant un agitateur et additionnés de 38,3 kg de sulfate d'ammonium anhydre. On agite Jusqu'à ce que la quantité totale du sel soit dissoute. Si la masse volumique de 1,22 à 1,23 g/cm n'est pas atteinte, elle peut être réglée par addition de sel ou d'eau. Préparation d'une composition liquide aqueuse d'enzymes à base d'enzymes pancréatiques kg de jus de pression, ayant une activité de 30100 ULV, tel qu'obtenu à la suite du broyage, de l'activation et de l'extraction de glandes pancreatiques, sont chargés au préalable dans un récipient comportant un agitateur et additionnés de 50 kg de sulfate d'ammonium. Il se produit une précipitation des enzymes pancréatiques. La suspension d'enzymes pancreatiques (29 600 ULV) possède une activité moyenne de 28 000-32 000 ULV/g (masse volumique, 1,22-1,23 g/cm3). Par addition de la solution isotonique de sel d'ammonium de l'exemple 1, on peut régler toute activité en ULV voulue. Il se produit une sédimentation d'autant plus rapide de l'enzyme precipitée que la préparation d'enzyme est plus diluee. 1000-S3000 ULV: Sédimentation au bout de quelques heures ou jours 30009000 ULV:- Sédimentation au bout d'une semaine ou de plusieurs semaines à partir d'env. 16 000 ULV: Très stable a la sédimentatioan, - Perte d'activité de la solution aqueuse pure d'enzyme pancréatique après 6 semaines à 25'C: 81% - Perte d'activité de la suspension d'enzyme de pancreas precipitée après 6 semaines à 25'C: &,9%. Exemple 3 - kg d'un solution aqueuse limpide d'une protéase de champignon provenant d'Aspergillus parasi ticus; ayant une activité de 32 000 ULV, sont mélangés à 16'C avec 50 kg de sulfate d'a-onium et il en résulte que l'enzyme précipite. La suspension d'enzyme (31 400 ULV), ayant une masse volumique de 1,22 à 1,23 g/cme, est diluée à l'activité voulue avec la solution isotonique de sulfate d'anmmnium de l'exemple 1. On obtient des préparations d'enzyme qui sont stables au dépôt pendant plusieurs jours. Perte d'activité de la suspension d'enzyme après abandon pendant 6 semaines à 25'C: 4,3%. A titre de comparaison: Perte d'activite de la protéase de champignon aqueuse pure (sans précipitation) après abandon pendant 6 semaines à 25'C: 62%. Exepl e --4- 50 kg de Jus de pancréas liquide (de l'exemple 2), ayant une activité de 30 100 ULV et une température de 'C, et 50 kg de jus de protease de champignon liquide (de l'exemple.), ayant une activité de 32 000 ULV et une temperature de 10'C, sont mélangés dans une cuve comportant un agitateur. Immédiatement apres le mélange, kg de sulfate d'ammonium sont ajoutés *de façon continue sous agitation, ce qui produit la précipitation de l'enzyme. On obtient une suspension d'enzyme ayant une activité de 61 200 ULV. La masse volumique se situe entre 1,22 et 1,23 g/cm3. Par dilutiuon avec la solution isotonique de sulfate d'ammonium de l'exemple 1, on peut régler l'activité désirée. Perte d'activité du mélange d'enzymes précipitation) au bout de 6 semaines à. 25'C: 74%. Perte d'activité de la suspension d'enzyme au bout de 6 semaines à 25'C: 10,1%. Exemple 5 kg de protéase bactérienne liquide aqueuse (43200 ULV, 10'C) de Bacillus licheniformis et 50 kg de Jus de pression de pancréas liquide de l'exemple2 (31 100 ULV, 'C) sont mélangés dans une cuve comportant un agitateur et additionnés de 50 kg de sulfate d'ammonium. Il en résulte que les enzymes sont précipitées. On obtient une suspension d'enzymes ayant une activité de 35 400 ULV. Celle-ci a une masse volumique de 1,22-1,23 g/cm3 et elle peut être réglée & l'activité désirée par dilution avec une solution isotonique de sulfate d'ammonium (exemple 1). Après abandon pendant 6 semaines a 25'C, l'activité a baissé de 12%. Par comparaison, l'activité d'un mélange d'enzymes non précipité est abaissée de 88% dans les mêmes conditions. Ezemple 6 a) 3 kg de precipité d'enzyme pancréatique (dispersion de l'exemple 2 ayant une activité de 29 600 ULV/g) sont mélanges avec 26,6 kg de solution isotonique de sulfate d'ammonium. On obtient une suspension d'enzyme stable au dépôt pendant 3 jours, ayant une activité de 3000 ULV. Après abandon pendant 6 semaines à 25'C, le produit perd 8,7% de.son activité. b) 3 kg de precipité de protéase de champignon d'abandon, celle-ci perd 5,5% de son activité. kg de la suspension de protéase pancréatique de -'exemple 6a, ayant une activité de 3000 ULV, sont mélangés avec également 30 kg de la dispersion de protéase de champignon de l'exemple 6b, ayant une activité de 3000 ULV. Le mélange a une activité de 3000 ULV et une masse volumique de 1,22 g/cm3. Apres abandon pendant 6 semaines & 25'C, l'activité est abaissée de 9,8%. Par comparaison, un mélange non précipité des mêmes enzymes perd 88% de son activité dans des conditions correspondantes. Exemple 7 Préparation d'une composition aqueuse bien fluide d'enzymes, prête à l'emploi et entièrement stable au dépôt. a) 60,7 kg d'eau sont chargés au préalable dans une cuve. comportant un agitateur et 1 kg d'un épaississant & base de xanthane (par exemple K1A96, firme Kelco) y est incorporé au moyen d'un agitateur à disque denté (vitesse périphérique 2-3 m/s). Lorsque la viscosité de la solution s'élève a plus de 1000 mPa.s, 38,3 kg de sulfate. d'ammonium sont ajoutes. On agite Jusqu'à ce que le sulfate d'ammonium soit dissous dans une très large mesure. La viscosité retombe alors à 480 mPa.s. b) 3 kg de la suspension d'enzyme précipitée de l'exemple 4 (61200 ULV; enzyme de champignon) sont alors aJoutes à 58,2 kg de la solution de sulfate d'ammonium épaissie de l'exemple 7a) et on mélange jusqu'à l'homogénéité au moyen de l'agitateur a disque denté. On obtient une suspension d'enzyme complètement stable au dépôt, ayant une activité de S3000 ULV et une viscosité de 270 mPa.s. Alors qu'on observe, avec un- mélange d'enzyme non précipité, une baisse d'activité de 74% au bout de 6semaines d'abandon à 25'C, la suspension d'enzyme épaissie correspondante présente seulement une perte d'activité de 9,2%. REVENDICATIONS I.- Procédé de préparation de compositions liquides aqueuses d'enzymes à action protéolytique ayant une stabilité suffisante, caractérisé en ce que les enzymes presentes en milieu aqueux sont précipitées a l'état finement divisé, après quoi un état de répartition finement dispersé et stable 'au dépàt des enzymes est créé par équilibrage de la masse volumique dans le même milieu aqueux. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce que les enzymes présentes en milieu aqueux sont essentiellement des protéases (E.C.3.4). 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en de que les enzymes sont d'origine microbiologique. 4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les enzymes présentes en milieu aqueux sont des hydrolases du groupe des amylases aqueux font partie du complexe pancréatique. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les enzymes présentes en milieu aqueux sont mises en oeuvre sous la forme de produits résultant de l'extraction d'enzymes par des procédés usuels. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 & 6, caractérisé en ce que la précipitation conduisant a la fine répartition est produite par addition de sel inerte. 8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la précipitation est produite par du sulfate d'ammonium ou du sulfate de sodium. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérise en ce que la masse volumique du milieu aqueux, obtenue par équilibrage, se situe dans la gamme de 1,22 à 1,23. 10.- Procedé selon l'une quelconque des revendications i à 9, caractérisé en ce que des epaississants à base de xanthane sont ajoutés a la suspension d'enzyme finement dispersee en vue d'un surcroît de stabilisation au dépôt. 11.- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les épaississants à base de xanthane sont ajoutés sous la forme d'une solution aqueuse isotonique contenant du sulfate d'ammonium ou du sulfate de sodium. 12.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la solution contenant l'épaississant à base de xanthane a été préparée par délayage avec application de forces de cisaillement. 13.- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les épaississants à base de xanthane sont utilisés dans une proportion de 0,1 à 14 en poids de la solution. 14.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que des mélanges d'enzymes de différentes provenances sont précipités et traités ensemble. 15.- Procédé selon l'une quelconque -des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que des suspensions d'enzymes préparées' séparément sont mélangées pour donner des compositions stables.