Brevet FR2658520A1 — publié le 19910823

NOUVEAUX SUBSTRATS PEPTIDIQUES, PROCEDE DE PREPÂRATION ET UTILISATION DANS LA DETERNINATION DE LA PROTEINE C DONAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne en tant que produits industriels nouveaux les substrats peptidiques de formule I ci-après et leurs sels d'addition. Elle concerne également le procédé de préparation de ces nouveaux produits et leur utilisation dans le domaine de la détermination de la Protéine C. ART ANTéRIEUR On sait que l'on a déjà proposé dans le passé un certain nombre de substrats peptidiques pour l'identification et le dosage de nombreuses substances intervenant dans le mécanisme en cascade de l'hémostase. On sait en particulier que le substrat E-L-Pyr-L-Pro-L-Arg-pNA (IIa) [où Pyr représente le reste pyroglutaminyle (i.e. 5-oxoprolyle ou 2-pyrrolidinone-5-carbonyle) et pNA le reste p-nitroanilino], décrit dans EP-A-O 004 256 en tant que substrat chromogène pour la détermination de sérine protéases et de SH-protéases, s'est révélé récemment efficace dans la détermination de la Protéine C. On sait également que le substrat E-D-Lys(Cbo)-L-Pro-L-Arg-pNA (IIb) a déjà été utilisé dans le domaine de la détermination de la Protéine C mais que son efficacité est inférieure à celle du composé IIa précité. BUT DE L'INVENTION Il existe donc un besoin en substrats peptidiques spécifiques pour la détermination de la Protéine C. En effet, à l'exclusion des substrats IIa et IIb précités, il n'existe aucun autre substrat spécifique de la Protéine C qui soit commercialement disponible. Pour satisfaire ce besoin, on propose suivant l'invention une nouvelle solution technique faisant appel à des substrats peptidiques structurellement différents des produits de formule IIa et IIb précités antérieurement connus. OBJET DE L'INVENTION Selon un premier aspect de l'invention, on préconise en tant que produits industriels nouveaux des substrats peptidiques caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi l'ensemble constitué par (i) les tripeptides de formule Y Al A2 A3 R (I) dans laquelle Y représente H ou un groupe approprié bloquant l'extrémité N-terminale, A1 représente un reste aminoacide choisi parmi l'ensemble constitué par les restes (2-oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyle [en abré gé : THC],(2-oxo-tétrahydro-1,3-thiazin 5-yl)carbonyle [en abrégé : TZC], thiazo lidine-4-carbonyle [en abrégé :ATC] et (tétrahydro-1,3-thiazin-5-yl)carbonyle [en abrégé = AZC], A2 représente un reste aminoacide choisi parmi l'ensemble constitué par les restes Pro, 3Hyp et 4Hyp, où le groupe OH latéral de 3Hyp et 4Hyp est susceptible d'être protégé par un groupe protecteur éther ou ester, A3 représente un reste aminoacide choisi parmi l'ensemble constitué par les restes Arg et Lys, et R représente un moyen de marquage; et (ii) leurs sels d'addition. Selon un second aspect de l'invention, on préco- nise l'utilisation des composés tripeptides de formule I et de leurs sels d'addition pour la détermination de la Protéine C. Dans cette optique, on recommande un procédé de détermination pour le dosage ou l'identification de la Protéine C comprenant la mise en contact d'un tripeptide de formule I ou l'un de ses sels d'addition avec un liquide corporel (notamment le plasma ou le sérum sanguin, ou encore l'urine) ou tout autre échantillon d'origine naturelle ou synthétique susceptible de contenir de la Protéine C. Selon un troisième aspect de l'invention, on préconise enfin un procédé de préparation des composés tripeptidiques de formule I et de leurs sels d'addition. ABREVIATION Dans la présente invention, on a utilisé par commodité les abréviations suivantes - pour les restes aminoacides Arg = arginyle ATC = thiazolidine-4-carbonyle (ou thioprolyle) AZC = (tétrahydro-l,3-thiazin-5-yl)carbonyle 3Hyp = 3-hydroxyprolyle (ou 3-hydroxy-2-pyrroli dinecarbonyle 4Hyp = 4-hydroxyprolyle (ou 4-hydroxy-2-pyrroli dinecarbonyle Lys = lysyle Pro = prolyle Pyr = pyroglutaminyle (ou 5-pyrrolidone-5-carbo nyle) THC = (2-oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyle TZC n (2-oxo-tétrahydro-i ,3-thiazin-5-yl)carbony- le - pour les autres abréviations Ac n acétyle AcOH = acide acétique Adoc = adamantyloxycarbonyle Aoc = t-amyloxycarbonyle Boc = t-butyloxycarbonyle Bop = hexafluorophosphate de l-(benzotria zolyl)oxy-tris(diméthylamino)phospho nium (autre nomenclature réactif de CASTRO) de formule Bu = n-butyle Bz = benzoyle Bzl - benzyle Cbo = carbobenzoxy CCM s chromatograhie sur couche mince o-Cl-pNA = o-chloro-p-nitroanilino [ou (2-Cl)pNA] DCCI = dicyclohexylcarbodiimide DIEA = diisopropyléthylamine DMF = diméthylformamide Et = éthyle Et3N ~ triéthylamine EtO = éthoxy Fmoc = 9-fluroenylméthyloxycarbonyle Foc = furfuryloxycarbonyle HOBT = l-hydroxybenzotriazole HMPT = N,N,N',N',N",N"-hexaméthylphosphoro- triamide HPLC = chromatographie liquide haute perfor mance H-TFA = acide trifluoroacétique (ou encore HTFA) Iboc = isobornyloxycarbonyle iPr = isopropyle Me = méthyle OD = densité optique Ph = phényle pH = cologarithme de la concentration en ions H+ PM = poids moléculaire pNA = p-nitroanilino [ou (4-N02)C6H4NH] Pr = n-propyle RT = température ambiante (15-200C) tBu = t-butyle THF = tétrahydrofuranne Tos = p-toluènesulfonyle (ou tosyle) Z = benzyloxycarbonyle Z (p-Cl) = p-chlorobenzyloxycarbonyle Z(p-OMe) = p-méthoxybenzyloxycarbonyle. DESCRIPTION DETAILLER DE L'INVENTION Dans la formule I ci-dessus, le reste aminoacide A1 peut être représenté par la formule développée suivante dans laquelle B représente une simple liaison ou le groupe CH2, et X représente CH2 ou CO. Lorsque dans la formule III, le couple (B;X) représente (-; CO), (CH2;CO), (-;CH2) et respectivement (CH2;CH2), A1 représente THC, TZC, ATC et respectivement AZC. Le reste aminoacide A1 sera suivant l'invention de configuration D ou L ou encore un mélange racémique (DL) de ces deux configurations. De préférence, A1 représentera D-THC, D-TZC, D-ATC, D-AZC et mieux L-THC, L-TZC, L-ATC et L-AZC. Le reste aminoacide A1 que l'on considère comme le plus intéressant suivant l'invention est L-THC. Parmi les groupes Y qui conviennent, on peut mentionner l'atome d'hydrogène et les restes bloquants l'extrémité N-terminale de peptides tels que décrits dans EP-A-O 110 306, US-A-4 480 030, FR-A-2 293 439 et US-A-4 440 678. Parmi les groupes Y, qui sont différents de H, bloquant ladite extrémité N-terminale on peut notamment signaler les groupes alkyle en Cl-C4 (notamment Me, Et, Pr, iPr, Bu, tBu), aryle éventuellement substitué (notamment Ph, tolyle, xylyle, chlorophényle, trifluorométhylphényle, methoxyphényle), aralkyle éventuellent substitué (notamment Bzl, chlorobenzyle, dichlorobenzyle, trifluorométhylbenzyle, difluorobenzyle, méthoxybenzyle, éthoxybenzyle, 3,4-méthylènedioxybenzyle) et les groupes protecteurs classiques de l'extrémité N-terminale de peptides notamment Ac, Tos, Adoc, Aoc, Bz, Cbo, Fmoc, Foc, Iboc, Z, Z(p-Cl) et Z(p-OMe)]. Le groupe Y différent de H est introduit dans le tripeptide de formule I selon l'un des deux schémas réactionnels suivants schéma A H Al OH Y-A1-OH Y-A1-OH + H-A2-A3-R I (Y + H) où le groupe OH (de la fonction acide carboxylique) lié à l'extrémité CO terminale de A1 est le cas échéant protégé; et schéma B H Al A2 A3 R I (Y # H) Le choix du schéma A ou B sera fonction de (i) la nature du groupe bloquant, et (ii) du caractère labile de l'atome d'hydrogène de l'extrémité N-terminale qui se trouve en position 3 du cycle de A1. Dans cette optique, quand Al sera THC ou TZC, on utilisera plutôt le schéma A. Par ailleurs, comme les cycles de THC et TZC sont en général obtenus par cyclisation à température élevée, il se trouve que dans les mécanismes réactionnels par pyrolyse la présence d'un groupe Y différent de H, notamment H = alkyle, aryle ou aralkyle, peut perturber la cyclisation et/ou diminuer les rendements. On a donc intérêt à préparer les acides H-THC-OH et H-AZC-OH par pyrolyse, puis à remplacer l'atome H de l'extrémité N-terminale selon le schéma A précité pour obtenir les composés de formule I où Y est différent de H. Le groupe Y préféré suivant l'invention est H. En bref, on remplacera le groupe Y=H par un groupe Y différent de H que si et seulement si un tel remplacement augmente de façon substantielle la spécificité du substrat Y-A1-A2-A3-R vis-à-vis de la Protéine C. Comme indiqué plus haut, le groupe OH latéral de 3Hyp et 4Hyp peut être protégé sous forme éther ou ester. Le groupe protecteur remplaçant l'atome H dudit groupe OH pourra notamment être un groupe alkyle en Cl-C4 (notamment Me, Et, Pr, iPr, Bu, tBu), aryle éventuellement substitué (notamment Ph, tolyle, xylyle, chlorophényle, trifluorométhylphényle, méthoxyphényle), aralkyle éventuellement substitué (notamment Bzl, chlorobenzyle, difluorobenzyle, trifluorométhylbenzyle, dichlorobenzyle, méthoxybenzyle, éthoxybenzyle, 3,4-méthylenedioxybenzyle) tel qu'envisagé dans la défintion de Y, dans le cadre de la protection sous forme éther; ou par un groupe acyle aliphatique en C2-C5 (notamment Ac, propionyle, butanoyle, pentanoyle) ou aromatique (notamment Bz, toluoyle, chlorobenzoyle, méthoxybenzoyle, 3, 4-méthylène- dioxybenzoyle), dans le cadre de la protection sous forme ester.Le cas échéant, ledit atome H pourra également être remplacé par un groupe Tos ou trialkylsilyle (notamment triméthylsilyle ou triéthylsilyle) ou analogue. De façon avantageuse, les restes aminoacides A2 et A3 seront de configuration L, et les groupes préférés pour A2 et respectivement A3 suivant l'invention seront t-Pro, L-3Hyp et L-4Hyp, et respectivement t-Arg et L Lys. Le moyen de marquage R est bien connu dans la technique des dosages biologiques et microbiologiques, voir à cet effet l'art antérieur précité et notamment le document US-A-4 448 715. Ledit moyen de marquage sera de préférence choisi parmi l'ensemble des groupes aminés NH-R' qui (i) induisent une modification de coloration, (ii) induisent une modification de fluorescence ou (iii) comportent au moins un élément radioactif (par exemple un groupe anilino ou benzylamino marqué par un radiosotope 14C ou 3H). Convient au but de l'invention tout groupe amino NH-R' donnant pendant ou après la réaction enzymatique un signal susceptible d'être amplifié pour être détecté (par exemple par mesure de la densité optique sous une longueur d'onde donnée, ou encore par mesure de la radioactivité).La quantité de produit H-R obtenu par clivage lors de l'hydrolyse enzymatique est proportionnelle à la quantité d'enzyme utilisée. Ladite quantité de H-R est déterminable photométriquement, spectrophotométriquement, fluorospectrophotométriquement ou électrochimiquement. Le groupe R que l'on préfère suivant l'invention est un groupe chromogène, de façon typique un groupe nitrophénylamino (dans lequel le reste phényle est susceptible d'être substitué par un groupe COOH, F, Cl, Br, CH3, OCH3, CN, CF3, et/ou S03H), ou un groupe fluorogène, de façon typique un groupe naphtylamino (dans lequel le reste naphtyle est susceptible d'être substitué par un groupe OCH3, COOH, S03H ou CH3), et les groupes 4méthylcoumaryl-7-amino, 4-trifluorométhylcoumaryl-7-amino et analogues. Parmi les groupes aminés chromogènes et fluorogènes, qui conviennent suivant l'invention, on peut notamment citer les p-nitroanilino (en abrégé pNA), 2-carboxy-4-nitroanilino et 3-carboxy-4-nitroanilino, 2-halogéno-4-nitroanilino et 3-halogéno-4-nitroanilino (où l'halogène est F, Cl ou Br), 2-méthoxy-5-méthyl-4nitroanilino, 2-hydroxysulfonyl-4-nitroanilino, 4-trifluorométhyl-2-nitroanilino, 4-trifluorométhyl-3-nitroanilino, 4-cyano-2-nitroanilino, 2-naphtylamino, 4-hydroxysulfonyl-l-naphtylamino, quinolylamino, nitroquinolylamino et analogues. Le groupe R préféré suivant l'invention est un groupe chromogène à savoir, d'une part, pNA et d'autre part, les groupes analogues, où le noyau phényle de pNA est substitué en position 2 ou 3, et répondant à la formule dans laquelle Y'est Br, Cl, F, CF3, COOH, COOW, CONH2, CONHW, CONW2, CONH(CH2)mNMe2, OH ou OW, où W est un groupe aryle en C3-C6, aryle en C6-C10, aralkyle en C7-C11 ou alicyclique en C3-C8 et m est un nombre entier ayant pour valeur 1 à 10. De tels groupes de formule Il où le noyau phényle du groupe pNA est substitué sont notamment décrits dans le document EP-A-O 110 306. Les sels d'addition suivant l'invention sont essentiellement des sels d'addition d'acide obtenus par réaction d'un composé de formule I avec un acide minéral ou organique. Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention, que l'on recommande ici, consiste à faire appel à un substrat choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les composés tripeptidiques de formule H-Al-Az-A3-PNA (I') dans laquelle A1 représente D-THC, D-TZC, D-ATC, D-AZC, L-THC, L-TZC, L-ATC ou L-AZC, A2 représente L-Pro, L-3Hyp ou L-4Hyp, et A3 représente L-Arg ou L-Lys; et (b) leurs sels d'addition. Suivant ce meilleur mode de mise en oeuvre, on recommande plus particulièrement de faire appel à un reste aminoacide A1 représentant L-TZC, L-ATC et mieux L-THC. Par commodité, dans la description qui va suivre, la Invention d'un reste aminoacide sans configuration (par exemple Pro), désigne sauf indication contraire que ledit reste aminoacide est de configuration L (soit, dans l'exemple en question L-Pro). De façon nullement limitative, on a consigné dans le tableau I ci-après un certain nombre de composés peptidiques suivant l'invention. TABLEAU I H-A1-A2-A3-pNA, HX Composé A1 A2 A3 HX Ex i THC Pro Arg H-TFA Ex 2 THC Pro Arg AcOH Ex 3 THC 3Hyp Arg AcOH Ex 4 THC 4Hyp Arg AcOH Ex 5 THC Pro Lys AcOH Ex 6 TZC Pro Arg AcOH Ex 7 ATC Pro Arg 2 AcOH Ex 8 AZC Pro Arg 2 AcOH CP i (a) Pyr Pro Arg AcOH CP 2 (b) D-Lys(Cbo) Pro Arg 2 AcOH Notes (a) produit de référence de formule IIa décrit dans EP-A-O 004 256 (b) produit de référence de formule IIb. Les composés tripeptides de formule I et leurs sels d'addition suivant l'invention peuvent être préparés selon une méthode connue en soi par application de mécanismes réactionnels classiques de la synthèse peptidique. Le procédé de préparation que lton préconise ici est caractérisé en ce qu'il comprend la réaction de I mole de dipeptide de formule H-A2-A3-R (fiv) où A2, A3 et R sont définis comme indiqué ci-dessus, avec 1,0 à 1,3 moles d'aminoacide de formule Y-A3-T (v) où Y et A3 sont définis comme indiqué ci-dessus et T représente OH, F, Cl ou Br. De façon avantageuse, la réaction IV + V = I est effectuée dans un solvant inerte, notamment DMF ou THF, à une température comprise entre O et 5O0C, notamment à RT. De façon toujours avantageuse, le milieu réactionnel comprendra une base en excès intervenant comme co-solvant et comme accepteur de protons, telle que Et3N ou DIEA. Lors de la mise en oeuvre de ladite réaction, on incorporera également dans ledit milieu réactionnel un agent couplant, notamment Bop ou HOBT, en particulier lorsque T est OH. Quand on utilisera HOBT comme agent couplant, on aura intérêt à associer au dit agent une quantité appropriée de DCCI. De façon pratique, on utilisera des rapports molaires IV/Et3N ou IV/DIEA de 1/2 à 1/4, et quand T = OH des rapports molaires IV/HOBT ou IV/Bop de 1/1 à 1/5; quand on utilisera DCCI, le rapport molaire IV/DCCI sera de l'ordre de l/1,5-l/2. Les moyens de couplage HOBT et Bop ont pour objet d'activer la fonction acide carboxylique COOH de l'extrémité CO terminale (quand T = OH) et offrent l'avantage de ne- pas être racémisants. Le moyen Bop sera utilisé à un pH de 7-8 et le moyen HOBT à un pH de 5 à 8. Eu égard à ses propriétés de couplage, on préférera le Bop au HOBT.Le tripeptide de formule I est isolé du milieu réactionnel de la réaction IV + V = I selon les étapes suivantes - évaporation du solvant inerte sous vide jusqu'8 sicci té, - précipitation par l'éther (MeOMe ou EtOEt) du résidu d'évaporation ainsi obtenu, puis récupération du préci pité par filtration, - reprise du précipité ainsi filtré dans une quantité mi nimale d'un mélange CHCl3 / MeOH /AcOH, - chromatographie du mélange résultant au moyen dudit solvant CHCl3/MeOH/AcOH - combinaison des fractions homogènes résultantes de ladite chromatographie et évaporation dudit solvant. Les composés tripeptides de formule I et leurs sels d'addition constituent des substrats spécifiques de la Protéine C. Le procédé de détermination de la Protéine C que l'on préconise est caractérisé en ce que l'on met en contact dans un milieu liquide aqueux approprié tel qu'un sérum physiologique tamponné, une quantité donnée d'un tripeptide de formule I ou l'un de ses sels d'addition (à une concentration de l'ordre de 10 mg/ml) et un échantillon à tester (éventuellement dilué) susceptible de contenir de la Protéine C, pendant au moins 0,5 h à une température compris entre RT et 400C, notamment 370C. L'activité des tripeptides suivant l'invention vis-à-vis de la Protéine C a été déterminée selon une des méthodes classiques, telle que décrite dans la publication EP-A-O 280 160 (voir page 14), en appréciant la vitesse d'hydrolyse par la variation de la densité optique dans le temps ( D/min). Les résultats qui ont été obtenus avec des doses équimolaires ont été consignés dans le tableau II ci-après où par commodité, l'activité du produit de référence de formule IIa est précisée comme étant égale à 100 Z TABLEAU il ACTIVITE VIS-A-VIS DE LA PROTEINE C Produit Activité Ex 1 148 % Ex 2 153 % Ex 3 118 % Ex 4 111 Z Ex 5 122 Z Ex 6 105 Z Ex 7 110 Z Ex 8 103 Z CP 1 100 Z CP 2 34 Z Les résultats comparatifs du tableau II mettent en évidence que les tripeptides suivant ltinvention sont au moins aussi actifs que le produit de référence CP 1. On préconise également suivant l'invention un nécessaire, kit ou trousse de dosage destiné à la détermination de la Protéine C renfermant un tripeptide de formule I ou l'un de ses sels d'addition, et le cas échéant, un échantillon étalon de Protéine C (d'origine humaine ou bovine) et de milieux tamponnés de dilution. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation. Ces éléments nullement limitatifs sont donnés à titre d'illustration. PREPÂRÂTION I Obtention de L-THC-L-Pro-L-Arg-pNA, H-TFA (Exemple 1) a) Z-L-Arg-pNA, HC1 On dissout 3,44 g (0,01 mole) de Z-L-Arg-OH, HC1 dans 20 ml de HMPT anhydre à RT, puis on ajoute 1,39 ml (0,01 mole) de Et3N à RT sous agitation. A la solution résultante, on ajoute 2,46 g (0,015 mole) de p-nitrophénylisocyanate. Le milieu réactionnel résultant est maintenu sous agitation pendant 24 h à RT, puis est évaporé sous vide et repris avec une quantité minimale de AcOH avant d'être dilué avec AcOEt.La solution résultante est ensuite extraite successivement trois fois avec de petites quantités de NaHC03 0,5 M, trois fois avec une solution de KHS04 à 50 g/l puis plusieurs fois avec H20 à demi-saturée en NaCl. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de sodium anhydre. Après filtration (élimination de Na2S04), on évapore le solvant et recristallise le résidu d'évaporation dans le mélange AcOEt/ MeOMe (3/7) v/v. On obtient 3,5 g du produit attendu, sous forme de poudre de couleur blanche. F = 128-1300C. Analyse (CCM sur gel de silice) Rf = 0,5 dans AcOEt/pyridine/AcOH/H20 (20/4,5/3/1) v/v; Rf = 0,69 dans CHC13/MeOH/AcOH (5/3/1) v/v. b) H-L-Arg-pNA 2HBr Dans un appareillage en verre et téflon, on charge 1 g (2,15 mmoles) de Z-L-Arg-pNA, HC1. On ajoute, sous atmosphère inerte (courant d'azote), successivement 8 ml de AcOH glacial, 2 ml d'anisole, 10 ml de HBr en solution (à 33 Z p/v) dans AcOH. On laisse réagir pendant 1 h à RT sous atmosphère d'azote. Après ce laps de temps, le mélange réactionnel, qui est devenu homogène au cours de la déprotection, est précipité dans de l'éther (MeOMe ou EtOEt). Après décantation, le surnageant est écarté et le précipité est lavé plusieurs fois à l'éther. On recueille le précipité par filtration, le sèche sous vide sur KOH pendant 24 h. On obtient 0,95 g du produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice) Rf = 0,04 dans AcOEt/pyridine/AcOH/H20 (20/4,5/3/1,5) v/v Rf = 0,38 dans BuOH/AcOH/H20 (3/1/1) v/v. c) Boc-L-Pro-L-Arg-pNA, HBr On dissout 1 g (2,19 mmoles) de H-L-Arg-pNA, 2HBr dans 10 ml de DMF puis on ajoute 0,854 ml (6,57 mmoles) de DIEA. Dans un autre récipient, on neutralise 4,71 mg (2,19 mmoles) de Boc-L-Pro-OH dissous dans 50 ml de DMF par 0,285 ml de DIEA. On mélange les deux solutions puis ajoute 970 mg de Bop tout en maintenant le mélange résultant à RT sous agitation, le pH étant maintenu entre 7,0 et 8,0 tout au long de la réaction par addition de faibles portions de DIEA. Au bout d'une heure, la réaction est terminée et le mélange réactionnel est évaporé à sec sous vide; le résidu d'évaporation est repris par un mélange AcOEt/MeOH et extrait par une solution aqueuse de NaHC03 0,5 M. On sèche la phase organique sur sulfate de sodium, la concentre et précipite dans l'éther (MeOMe ou EtOEt).On obtient 877 mg (rendement : 70 %) du produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice) Rf = 0,27 dans CHC13/MeOH/AcOH (20/3/1) v/v; Rf = 0,71 dans CHCl3/MeOH/AcOH (10/3/1) v/v. d) H-L-Pro-L-Arg-pNAs 2H-TFA Dans un réacteur on introduit successivement 850 mg (1,485 mmoles) de Boc-L-Pro-L-Arg-pNA, HBr puis 6 ml de CH2Cl2 et 6 ml de H-TFA. Après 0,25 h de réaction, le mélange réactionnel est directement précipité dans 1 Bz é l'éther. Après séchage du précipité résultant, on obtient 837 mg du produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice) Rf = 0,56 dans BuOH/AcOH/H20 (3/1/1) v/v; Rf = 0,13 dans CHCl3/MeOH/AcOH (5/3/1) v/v. e) L-THC-L-Pro-L-Arg-pNA, H-TFA Selon le protocole opératoire décrit au point c) ci-dessus, à savoir réaction à RT pendant 1,5 h d'un mélange réactionnel comprenant (i) 800 mg (1,3 mmoles) de H-L-Pro-L-Arg-pNA, 2H-TFA, (ii) 190 mg (1,3 mmoles) de H-THC-OH, (iii) 1 ml de DIEA et (iv) 5,75 mg (1,3 mmoles) de Bop, dans le DMF sous agitation. Le mélange réactionnel est ensuite évaporé sous vide puis précipité dans EtOEt. Le précipité blanc obtenu est repris dans une quantité minimale d'un système solvant CHCl3/MeOH/AcOH (5/3/1) v/v et chromatographié sur gel de silice au moyen du même système solvant. On récupère les fractions homogènes. Celles-ci sont rassemblées et évaporées. On obtient 410 g (rendement : 54 %) du produit attendu. Analyse (CCM sur gel de silice) Rf = 0,23 dans CHCl3/MeOH/AcOH (10/3/1) v/v; Rf = 0,33 dans CHCl3/MeOH/AcOH (5/3/1) v/v. PRRPARATION II Obtention de L-THC-L-Pro-L-Arg-pNA, AcOH (Exemple 2) A partir de L-THC-L-Pro-L-Arg-pNA, H-TFA obtenu selon la préparation I, on prépare le produit de l'exemple 2, le L-THC-L-Pro-L-Arg-pNA, AcOH par échangeuse d'ions sur résine AMBERLITER IRA 401 S (préalablement acétylée), l'éluant étant un mélange MeOH/H20 (3/2) v/v. PREPARATION III On prépare le produit de l'exemple 1 en rempla çant la chromatographie sur gel de silice prévue au stade Ie par une HPLC (colonne HYPERSILR C 18 de granulométrie 3 micromètres). On obtient un produit plus pur que celui obtenu à la préparation I. R8VENDICATIONS 1. Composé peptidique caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les tripeptides de formule Y A1 A2 A3 R (I) dans laquelle Y représente H ou un groupe approprié bloquant l'extrémité N-terminale, A1 représente un reste aminoacide choisi parmi l'ensemble constitué par les restes (2-oxo-thiazolidin-4-yl)carbonyle [en abrégé gé : THC], (2-oxo-tétrahydro-1,3-thiazin 5-yl)carbonyle [en abrégé : TZC], thiazo lidine-4-carbonyle [en abrégé :ATC] et (tétrahydro-1,3-thiazin-5-yl)carbonyle [en abrégé = AZC1, A2 représente un reste aminoacide choisi parmi l'ensemble constitué par les restes Pro, 3Hyp et 4Hyp, où le groupe OH latéral de 3Hyp et 4Hyp est susceptible d'être protégé par un groupe protecteur éther ou ester, A3 représente un reste aminoacide choisi parmi l'ensemble constitué par les restes Arg et Lys, et R représente un moyen de marquage; et (ii) leurs sels d'addition. 2. Composé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le reste aminoacide A1 est de configuration D ou L, et en ce que les restes aminoacides A2 et A3 sont de configuration L. 3. Composé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que Y est H. 4. Composé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que A1 est L-THC. 5. Composé peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce que avec en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les composés tripeptidiques de formule H-A1-A2-A3-pNA (i') dans laquelle A1 représente D-THC, D-TZC, D-ATC, D-AZC, L-THC, L-TZC, L-ATC ou L-AZC, A2 représente L-Pro, L-3Hyp ou L-4Hyp, et A3 représente L-Arg ou t-Lys; et (b) leurs sels d'addition. 6. Composé peptidique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par le H-L-THC-L-Pro-L-Arg-pNA et ses sels d'addition. 7. Utilisation d'un composé peptidique selon la revendication 1 dans la détermination de la protéine C. 8. Procédé de détermination de la protéine C, caractérisé en ce que l'on met en contact dans un milieu biologique aqueux une quantité donnée d'un composé peptidique selon la revendication 1 avec un échantillon à tester contenant de la protéine C. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on met en contact dans un milieu biologique aqueux une quantité donnée d'un composé peptidique selon la revendication 1 avec un échantillon à tester contenant de la protéine C pendant au moins 0,25 h, à une température comprise entre 15 et 4O0C. 10. Procédé de préparation d'un composé peptidique de formule I ou l'un de ses sels d'addition, ledit procédé, qui met en oeuvre des mécanismes de synthèse peptidique, étant caractérisé en ce qu'il comprend la réaction de 1 mole de dipeptide de formule H-A2-A3-R (IV) où A2, A3 et R sont définis comme indiqué ci-dessus dans la revendication 1, avec 1,0 à 1,3 moles d'aminoacide de formule Y-A3-T (v) où Y et A3 sont définis comme indiqué ci-dessus dans la revendication 1, et T représente OH, F, Cl ou Br. 11. Nécessaire pour la détermination de la Protéine C, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé choisi parmi les tripeptides de formule I et leurs sels d'addition selon la revendication 1, et le cas échéant, un échantillon étalon de Protéine C et des milieux tamponnés de dilution.