Brevet FR2654106A1 — publié le 19910510

La présente invention a pour objet des dérivés phos phorés de cytsine, leur préparation et leur application en thérapeutique Les composés de l'invention répondent à la formule (1) donnée en annexe 1 dans laquelle C est la cytosine R est. un cation N4+, Et3NH+, Na+ un radical (CH2)n Y où n va de 1 à 4, Y est un radical CZ, SZ, S 5 - S - Z, dans lequel Z est H, (C1-4)alkyle, aryle, CO(C1-4)alkyle ou (CH2)nCH, n allant de 1 à 5. Selon l'invention on prépare les composés (t, selon les schémas réactionnels donnés en annexe 2 à partir du nuclécside (1) qui conduit à l'intermédiaire (4) que l'on fait réagir avec les réactifs appropriés pour obtenir les composés (I). Les exemples suivants illustrent l'invention. Les chromatographies sur couche mince ont été réalisées sur plaques de silice Merck 60 F 254 (art. 55554). Les chromatographies sur colonne de gel de silics ont été effectuées avec la milice Merck 60 H (art. 7736) ou avec de la silice silanisée RP2 Merck (art. 7719). Les analyses CLHP ont été effeotuées sur colonne Waters Radial-Pek (# = # mm, 1 = 100 mm) C16 de granulométrie sphérique de 10 m. Cette colonne est insérée dens un module RCM 100 et protégés par un préfiltre et une précolonne Guard-Pak. Le système CLHP est composé de matériel Waters un injecteur U6 K, deux pompes M-6000 A, un programmateur M-720. Les spectres U.V. ont été enregistrés à l'aide d'un détecteur U.V. multicanal Pye Unicam PU 4021 et d'un centre de contrôle vidéo PU 4850 Philips. L'élution a été réslisée avec une solution d'acétonitrile dans un tampon d'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 5,9) a un débit de 2,5 ml par minute. Les spectres U.V. ont été enregistrés sur un spectrophotomètre UVIKON 810. Les spectres de masse Ont été pris sur un appareil JEOL JMS DX 300 par la méthode d'ionisation FAB. Les spectres RMN du proton ont été enregistrés sur un appareil Varian EM 360 ou sur appareil Brüker AC 250. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au signal du tétraméthylsilene (TMS). La multiplicité et l'allure des signaux observés par RMN sont indiquées par une (ou plusieurs) lettre (s) minuscule (s) : s (singulet), d (doublet), t (triplet), m (multiplet), l (large), p (pseudo). Les spectres RMN du phosphore ont été enregistrés sur un appareil Brüker WP 200 SY avec découplage du proton. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au signal de H3 PO4 pris comme référence externe. Préparation de l'intermediaire (4) 1. O-[N4-(Méthoxy-4 trityl) didésoxy-2'3' cytidine]-5' O-(chloro-2 phényl) phosphate de triéthylammonium (2) A une solution de 1,21 g (17,5 mmoles) de triazole dans 20 ml d'acétonitrile anhydre, on ajouta, sous agitation, 1,10 ml (6,7 mmoles) de chloro-2 phényl dichlorophosphate et 1,9 ml (13,6 mmoles) de triéthylamine anhydre. L'agitation est poursuivie durant 30 minutes avant une l'on @@@@@@@@@@@@@@@ (2,27 mmolas) du nucléoside 1 en solution dans 20 ml de pyridine anhydre. La phosphorylation est achevée en 30 minutes et un mélange de 0,75 ml de triéthylamine et 0,25 ml d'eau est additionné. Le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane, lavé avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3 puis avec de l'eau et séché sur Na2SO4. Le solvant est évaporé sous pression réduite et l'huile résultante est coévaporée plusieurs fois au toluène avant d'être précipitée dans l'hexane pour conduire à 1,43 g (85 %) du mononucléctide 2. Celui ci est obtenu sous forme de sel de triéthylammonium avec une pureté ne nécessitant pas de purifications supplémentaires. 1 : Rf = 0,27 (CH2Cl2-MeOH : 8-2) RMN H (CDCl3) : # = 7,6 (sl, 1H échangeable) ; 7,3 - 6,6 (m, 19 H ; mMTr, ClPh, H-6) ; 5,87 (m, 1H ; H-1') ; 5,08 (d, 1H ; H-5, J = 7,7 Hz) ; 4,2 (sl, 1H ; H-4') ; 4,1 - 3,9 (m, 2H ; H-5W, 5") ; 3,73 (s, 3H ; CH3O); 2,98 (m, 6H ; NH(CH2 CH3)3) ; 2,35 (m, 1H ; H-2') ; 2,05 - 1,7 (m, 3H ; H-2", 3' et 3") ; 1,24 (t, 9H t J = 7,3 Hz, HN(CH2CH3)3) ppm. RMN P (CDCl3) : # = 0 4,96 ppm. 2. Di-O-[N4-(méthoxy-4 trityl) didésoxy-2'3' cytidine]-5' O-(chloro-2 phényl) phosphate (3). Un mélange de 1,40 g (1,89 mmoles) du nucléotide 2 et 0,870 g (1,80 mmoles) du nucléoside 1 en solution dans 25 ml de pyridine anhydre est traité par 1,4 g Ç4,72 mmoles) de mésitylène sulfonyl-1 $nitro-3 triazole-1,2,4. La résotion est laissée deux heures avant d'être arrêtée par addition lente d'une solution aqueuse saturée de NaHCO3. Après extraction avec du dichlorométhane, la phase organique obtenue est lavée avec de l'eau, séchée sur Na2SO4, concentrée sous pression réduite et coévaporée avec du toluène. Une purification par chromatographie sur colonne de gel de silios [élution : MeOH (de 0 à 4 %) dans CH2Cl2] permet d'obtenir 1,48 g (72 %) du dimêre triester 3 pur. 3 : Rf = 0,35 (CH2Cl2 - MeOH : 92-8) RMN 1H (CDCl3) : # z 7,6 - 6,7 (m, 34 H ; 2 mMTr, sClPh, 2 H-6) ; 5,95 (m, 2H ; 2 H-1') ; 4,99 (d, 1H ; 1 H-5, J - 7,6 Hz) ; 4,98 (d, 1H ; 1 H-S, J = 7,6 Hz) ; 4,25 - 4,0 (m, 6H 2 H-4', 5' et 5") ; 3,765 et 3,760 (s et s, 3H et 3H ; 2 CH3 0) ; 2,40 (m, 2H ; 2 H-2') ; 2,05 - 1,8 (m, 2H ; 2 H-2') 1,8 - 1,5 (m, 4H ; 2H-3', 3") ppm. RMN P (CDCl3) : # = - 5,25 ppm. 3. Di-O-[N4-(méthoxy-4 trityl) didésoxy-2',3' cytidine]-5' phosphate de tétraméthylguanidinium (4). A une solution de 1,00 g (0,877 mmoles) du dimère triester 3 dans 7,3 ml de dioxanne et 3,6 ml d'eau, on ajoute 729 mg (4,39 mmoles) de nitro-4 benzaldoxime et 0,55 ml (4,38 mmoles) de tgtraméthylguanidine (TMG). Après 6 heures d'agitation, le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane, lavé à l'eau et séché sur Na2SO4. Le solvant est évaporé sous pression réduite et l'huile obtenue est précipitée trois fois dans l'hexane. Une dernière purification par chromatographie sur colonne de gel de silica [élution : MeOH (de O % à 25 %) dans CH2Cl2] suivie d'une filtration du produit dissout dans le dichloro- méthane, conduit, après évaporation, à 910 mg (90 %) du dimère diester 4 sous forme de sel de tétraméthyl- guanidinium. 4 : Rf 1 0,22 (CH2Cl2- MeOH : 8 - 2) RMN P (CDCl3) : # = 0,97 ppm Exemple 1. Di-O-(didésoxy-2'3' cytidine)-5 O-méthylphosphate. 1.1.Di-O-[N4-(méthoxy-4 trityl) didésoxy-2',3' cytidine]-5' O-méthyl phosphate (5) A une solution de 211 mg (0,184 mmoles) du dinucléoside phosphodiester 4 dans un m6lange de 18 ml de DMF anhydre, 8,0 ml de lutidine et 7,3 ml (0,180 moles) de méthanol anhydre sont ajoutés 3,5 g (18 mmoles) de chlorure de toluène-4 sulfonyle. Après une heure de réaction, 1,5 ml d'eau sont additionnés et le solvant est évaporé sous pression réduite. L'huile obtenue est reprise avec du dichlorométhane, lavée avec une solution saturée aqueuse de NaHCO3, puis avec de l'eau et séchée sur Na2SO4. Après évaporation du solvant, une purifi cation par chromatographie sur gel de silice [élution : MeOH de 0 à 6 % dans le CH2Cl2] suivie d'une précipitation dans 1'hexane conduit à 116 mg (60 96 ) du triester de méthyle protégé 5. 5 : RF = 0,30 (CH2Cl2 - MeOH : 92-8) RMN 1H(CDCl3) : S = 7,8 (sI ; 2 NH) ; 7,39 (d, 2H ; 2 H-6, J - 7,6 Hz) ; 7,35 - 6,75 (m, 28H ; 2 mMTr) ; 5,94 (m, 2H ; 2 H-1') ; 5,04 (d, 2H ; 2 H-5, J = 7,6 Hz) ; 4,2 - 3,95 (m, 6H; 2 H-4', 5' et 5") ; 3,76 (s, 6H ; 2 CH3O) ; 3,49 (d ; 3H CH3OP, J 1 11,2 Hz) ; 2,50 - 2,35 (m, 2S ; 2 H-2') ; 2,65 -1,85 (m, 6H : 2 H-2', 3' et 3") ppm. RMN P (CDCl3) : # = 1,12 ppm. 2. DI-O-(didésoxy-2'3' cytidine)-5 O-méthylphosphate Le phosphotriester de méthyle protégé 5 (110 mg ; 0,105 mmoles) est traité par 12,5 ml d'une solution 3 3 % d'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane anhydre. Apres 18 heures, le mélange résctionnel est neutralisé par addition de 10 ml de méthanol saturé d'ammoniac (à 0 C) et est rapidement évaporé sous pression réduite. Le brut obtenu est repris avec de l'eau et lavé au dichlorométhane avant d'être concentré. Une première purification sur colonne de silice silanisée RP2 (# = 1,8 cm ; h = 26 cm ; élution : 0 à 20 % de méthanol dans l'eau) conduit à LM 80 (40,2 mg, 76 %) contenant 1 % de ddC par CLHP (pourcentage spectrométrique). Trois purifications supplémentaires sur silice silanisée RP 2 permettent d'obtenir LM 80 avec une pureté de 99,2 * par CLHP (0,6 % de contamination par le dimere phosphodiester LM 93) avant évaporation des fractions rassemblées. Après filtration (filtre HV-4, Millipore), évaporation sous pression réduite (à une température inferieure a 25 C) et lyophilisation dans l'eau, on obtient 14,9 mg (28 *) de LM 80 d'une pureté spectroscopique de 97,1 % par CLHP (contaminé par 2,9 % de dimère phosphodiester LM 93). LM 80 : Rf X 0,08 (CH2Cl2- MeOH : 8 - 2) Temps de rétention : 360 s (12 % CH3CN dans AcONH4 0,1M aqueux) U.V. H2O) : A max = 271 nm (E = 17200) # min - 249 nm (s = 11300) Spectre de masse (FAB positif ; matrics: alcool nitro-3 benzylique) 499[(M + H)+]), 388 [(M - B)+]); 112 [(SH2)+]. RMN H (DMSO de) : #= 7,64 (d, 2H ; 2 H-6, J - 7,4 Hz) @ 7,1 (sl, 4H ; 2 NH2) ; 6,00 (m, 2H ; 2 H-1') ; 5,70 (d, 2H t 2 H-S, J @ 7,4 Hz) ; 4,25 - 4,05 (m, 6H ; 2 H-4',5' et 5") 3,68 (d, 3H ; CH3OP, J = 11,2 Hz) ; 3,15 - 2,20 (m, 2H ; 2 H2') ; 2,0 - 1,91 (m, 2H ; 2 H-3') ; 1,90 - 1,70 (m, 4H ; 2 H-2" et 3") ppm. RMN 31P (DMSO ds) : #= 0,762 ppm Exemple 2. Di-O-(didésoxy-2'3' cytidine)-5 O-éthylphosphate. 2.1. Di-O-[N4-(méthoxy-4 trityl) didésoxy-2',3' cytidine]-5' O-éthyl phosphate (6). Le dimère phosphodiester 4 (200 mg ; 0,175 mmoles) mis en solution dans 10,8 ml de DMF anhydre, 4,8 ml de lutidine anhydre et 4,4 ml (75 mmoles) d'éthanol est traité par 2,1 g (11 mmoles) de chlorure de toluène-4 sulfonyle. La réaction est laissée 2 heures et 1 ml d'eau est additionné. Le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire à une huile. Celle ci est reprise avec du dichlorométhane, lavée avec une solution aqueuse saturé de NaHCO3 et le solvant évaporée. Une purification par chromatographie sur colonne de gel de silice [élution : MeOH (de 0 à 4 %) dans le CH2Cl2] permet d'isoler 85 mg (47 *) du dimère phosphotriester protégé 6. 6 : Rf = 0,28 (Ch2Cl2- MeOH ; 8 - 2) RMN H (CDCl3) : # = 7,8 (sl, NH) ; 7,42 (d, 2H ; 2 H-6, J = 7,5 Hz) ; 7,35 - 6,8 (m, 28H ; 2 mMTr), 5,96 (m, 2H ; 2 H- 1') ; 5,06 (d, 2H ; 2 H-5, J s 7,6 Hz) ; 3,9 - 4,2 (m, 6H 2 H-4X, 5' et 5") ; 3,92 (td, 2H ; CH2CH2OP, JHp - 15,2 Hz ; = 7,1 Hz) ; 3,79 (s, 6H ; 2 CH3O) ; 2,55 - 2,35 (m, 2H ; 2 H-2') ; 2,1 (m, 6H ; 2 H-2', 3" et 3") ; 1,12 (t, 3H ; CH3 CH2OP, J - 7,1 Hz) ppm. 2.2.Di-O-(didésoxy-2',3' cytidine)-5' O-éthyl phosphate Le phosphotriester protégé 6 (75 mg, 0,072 mmoles) est traité durant 18 heures par une solution anhydre. L'acide est neutralisé par addition de 10 ml de méthanol saturé d'ammoniac et le mélange réactionnel est rapidement concentré sous pression réduite. La gomme formée est reprise avec de l'eau et lavée avec du dichlorométhane. Après évaporation de la phase aqueuse, le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de silice silanisée RP2 (# = 1,5 cm; h = 17 cm ; élution : 0 à 20 % de méthanol dans l'eau). Une filtration sur filtre HV-4 Milliore, suivic d'une lyophilisation dans l'eau conduisent à 23 mg (62 %) du dimère LM 91 d'une pureté spectométrique par CLHP de 87 %. Une purification suppl6mentaire sur RP2 dans des conditions identiques à celles précédentes permet d'obtenir LM 91 avec une pureté par CLHP de 99,1 % après lyophilisation (sans contamination par de la ddC ou du dimère phosphodiester LM 93). LM 91 : Temps de rétention : 648 s (12 % CH3CN dans AcONH4 0,1 M aqueux) U.V. (H2O) : # max : 271 nm (# = 15800) # min : 249 nm (# = 10700) Spectre de masse (FAB positif ; matrice : glycérol) : 513 [(M+H+], 402 [((M-B)+], 112 [(BH2)+]. RMN H (DMSO d6) : # = 7,62 (d, 2H ; 2 H-6, J = 7,4 Hz) ; 7,13 (sl, 4H ; 2 NH2) ; 5,99 (dd, 2H ; 2 H-1', J = 3,5 et 6,6 Hz) ; 5,79 (d, 2H ; 2 H-5, J= 7,4 Hz) ; 4,25 - 4,1 (m, Hz, JHH = 7,1 Hz) ; 2.25 (m, 2H ; 2 H-2') ; 2,1 - 1,6 (m, 6H ; 2 H-2', 3' et 3") ; 1,23 (td, 3H ; CH3CH2OP, JHP = 0,7 Hz, JHH = 7,1 Hz). -Exemple 3. Di-O-(didésoxy-2' ,3' cytidine)-5' O-(hydroxy-2 éthyl) phosphate. 3.1. Di-O-[N4-(méthoxy-4 trityl) didesoxy-2',3']-5' O-[(méthoxy-4 trityl)-2 oxyéthyl]-1 phosphate (7). A une solution de 230 mg (0,201 mmoles) du dimère phosphodi ester 4 et de 300 mg (0.897 mmoles) du monoéther de méthoxy-4 trityle de l'éthylène glycol dans 15 ml de pyridine anhydre sont ajoutés 267 mg (0,901 mmoles/) de mésitylène sulfonyl-1 nitro-3 triazole-1, 2, 4 (MSNT). La réaction est laissée 4 heures et 267 mg (0,901 mmoles) supplémentaires de MSNT sont additionnés. Après 3 heures d'agitation, le mélenge réactionnel est traîté avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3 et extrait avec du dichlorométhane. La phase organique est lavée avec de l'ea, séchée sur NaiSO2, évaporée sous pression réduite et coévaporée au toluène. L'huile obtenue est purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice (élution : MeOH (de 0 à 6 %) dans CH2Cl2] pour conduire à 170 mg (63 %) du phosphotriester 7 sous forme de mousse. 7 : Rf - 0,40 (CH2Cl2 - MeOH : 92 - 8) RMN H (CDCl3) ) : s = 7,4 - 5,7 (m, 44 H ; 3 mMTr, 2 H-6) ; 5,8 (m, 2H ; 2 H-1') ; 5,19 (m, 2H ; 2 H-5) ; 4,4 - 3,9 (m, 3H ; 2 H-4', 5', 5" et OCH2CH2OP) ; 3,8 - 3,7 (m, 9H ; 3 CH3 O) ; 3,25 (m, 2H ; CH3CH2OP) ; 2,5 - 2,3 (m, 2H ; 2 H-2') ; 2,25 - 1,6 (m, 6H ; 2 H-2", 3' et 3") ppm. 3.2.Di-O-(didésoxy-2',3' cytidine)-5' O-(hydroxy-2 éthyl) phosphate Le dimère protégé 7 (160 mg ; 0,119 mmoles) est dissout dans 11 ml d'une solution d'acide trifluoroecétique à 3 % dans le dichlorométhane anhydre. Après 6 heures, le mélange réactionnel est traité par 0,5 ml de méthanol saturé (à 0 C) d'ammonisc. L'excès d'ammoniac et le solvant sont rapidement chassés sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris avec de l'eau, lavé avec du dichdlorométhane et la phase aqueuse est concentrée. La purification est réalisée par deux chromatographies successives sur colonne de silice silanisée RP2 [# * 1,5 cm, h = 18 cm ; élution : MeOH [de 0 à 5 %) dans l'eau] pour conduire, après filtration (filtre HV-4 Millipore) et lyophilisation dans l'eau à 30 mg (48 %) du composé LM 93 d'une pureté spectrométrique par CLHP de 99,5 %. LM 92 : Temps de rétention - 240 s (12 % CH3CN dens AcONH4 0,1 M aqueux) U.V. (H2O) : # max = 271 nm (# = 15800) # min t 248 nm (# = 11600) Speotre de masse (FAB positif ; matrice : glycérol) : 528 [(M+H)+], 112 [(BH2)+]. RMN H (DMSO d6) : # = 7,63 (dd, 2H ; 2 H-6, J = 7,3 et 1,0 Hz) ; 7,1 (sl, 4H ; 2NH2) ; 6,01 (dd, 1H, 1 H-1, J = 2,4 et 4,0 Hz) ; 5,99 (dd, 1H ; 1 H-1', J = 2,3 et 4,3 Hz) ; 5,71 (d, 2H ; 2 H-6, J = 7,4 Hz) ; 4,9 (sl, 1H ; OH) ; 4,25 - 4,1 (m, 6H ; 2 H-4', 5' et 5") ; 3,99 (td, 2H ; HOCH2CH2OP) ; 3,58 (m, 2H ; HOCH2CH2OP) ; 2,3 (m, 2H ; 2 H-2') ; 2,0-1,95 (m, 2H ; 2 H-3') ; 1,90-1,7 (m, 4H ; 2 H-2" et 3") ppm. Exemple 4. Di-O-(didésoxy-2',3' cytidine)-5 phosphate d'ammonium Le dimère protégé 4 (190 mg ; 0,166 mmoles) est dissout dans 10 ml d'une solution d'acide trifluoroacétique à 4 % dans le dichlorométhane anhydre. Après 8 heures, 10 ml d'une solution de méthanol saturé (à 0 C) d'ammoniac sont ajoutés. L'excès d'ammoniac et le solvant sont chassés sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris avec de l'eau, lavé avec du dichlorométhane et la phase aqueuse concentrée sous pression réduite. Le composé LM 93 est isolé pur (45 mg ; 54 %) après chromatographie sur colonne de silice silanisée RP2 (# = 1,5 cm, h = 38 cm ; élution : eau), filtration sur filtre HV-4 Millipore et lyophilisation dans un mélange eau dioxanne. LM 93 : Temps de rétention : 324 s (élution 5 % CH3CN dans AcONH4 0,1 M aqueux). U.V. (H2O) : # max = 271 nm (e = 17000) # min = 248 nm (# - 10000) Spectre de masse (FAB négatif ; matrice ; glycérol) : 483 [(M-H)+]). RMN H (DMSO d6) : # = 7,92 (d, 2H ; 2 H-6, J = 7,4 Hz) ; 7,1 (sl, 4H ; 2NH2), 5,94 (dd, 2H ; 2 H-1', J = 3,1 et 6,5 Hz) ; 5,71 (d, 2H ; 2 H-5, J = 7,4 Hz) ; 4,10 (m, 2H : 2 H-4') ; 3,86 et 3,78 (m et m, 4H p; 2 H-5' et 5") ; 2,27-2,20 (m, 2H, 2 H-2') ; 1,95-1,75 (m, 6H ; 2 H-2', 3' et 3") ppm. Exemple 5. Di-O-(didésoxy-2' ,3' cytidine)-5' O-[S-(hydroxy-2 thio-l éthyl) thio-2 oxy-l éthyl]-1 phosphate. 5.1.Di-O-[N4-(méthoxy-4 trityl) didésoxy-2',3' cytidine]-5' O-[S-(hydroxy-2 thio-1 éthyl) thio-2 oxy-1 éthyl]-1 phosphate (8). A une solution de 630 mg (0,553 mmoles) du dimère phosphotriester 3 sont ajoutés 5,5 ml (45 mmoles) de dithio-2,2' diéthanol, 5,5 ml de dichlorométhane anhydre et 840 mg (5,5 mmoles) de fluorure de césium. Le mélange est plscé sous forte agitation durant 26 hèures puis dilué avec du dichlorométhane et lavé avec de l'eau avant d'étre concentré sous pression réduite. L'huile obtenue est chrometographiée sur colonné de gel de silice [élution : MeOH (de 0 à 6 %) dans le CH2Cl2] pour conduire à 400 mg (62 %) du composé 8. 8 : Rf : 0,21 (CH2Cl2 - MaOH : 92 - 8) RMN H (CDCl3) : # = 8,3 (sl ; 2NH) ; 7,41 (pt, 2H ; 2 H-6, J = 7,2 Hz) ; 7,35-6,8 (m, 28H ; 2 mMTr) ; 5,94 (m, 2H ; 2 H-1') ; 5,10 (pt, 2H ; 2 H-5, J = 7,3 Hz) ; 4,3-4,0 (m, 10 H, 2 H-4',5' et 5", MOCH2CH2SSCH2CH2OP) ; 3,79 (s, 6H ; 2CH3 O) ; 2,82 (m, 4H ; CH2SSCH2) ; 2,43 (m, 2H ; 2 H-2') ; 2,15-1,85 (m, 4H ; 2 H-2" et 3') ; 1,70 (m, 2H ; 2 H-3") ppm. 5.2.Di-O-(didésoxy-2',3' cytidine)5' O-[S-(hydroxy-2 thio-1 éthyl) thio-2 oxy-1 éthyl]-1 phosphate Le composé 8 (200 mg ; 0,172 mmoles) est traité par une solution d'acide trifluoroacétique à 3 % dans le dichlorométhane anhydre. Après 24 heures, 5 ml de méthanol seturé (à 0 C) d'ammoniac sont ajoutés. Le solvant et l'excès d'ammoniac sont immédiatement évaporés sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris avec de l'eau. lavé avec du dichlorométhane et la phase aqueuse concentrée. La purification est réalisée par deux chromatographies sur colonne de silice silanisée RO2 [# = 1,5 cm, h = 20 cm ; élution : méthanol (de 0 à 100 %) dans l'eau] pour conduire à 40 mg (38 %) du phosphotriester LM 99 d'une pureté spectrométrique de 99 % par CLMP (sans contamination par de la ddC ou par du dimère phosphodiester LM 93). LM 99 : Temps de rétention = 524 s (15 % CH3CN dans AcONH4 0,1 M aqueux) ; 284 s (20 % CH3CN dans AcONH4 0,1 M aqueux). U.V. (H2O) : # max = 271 nm (# = 18000) # min = 249 nm (# = 12000) Spectre de masse (FAB positif , matrice : glycérol) : 621 [((M+/h+], 510 [(M-B)+], 112 [(BH2)+]. RMN H (DMSO d6) : # = 7,62 (d, 2H ; 2 H-6, J = 7,4 Hz) ; 7,1 (sl, 4H : 2NH2) ; 6,01 (dd, 1H ; 1 H-1+, J = 2,3 et 4,0 Hz) ; 5,99 (dd, 1H ; 1 H-1+, J = 2,3 et 4,3 Hz) ; 5,71 (d, 2H ; 2 H-5, J - 7,4 Hz) ; 4,87 (t, 1H ; OH, J s 5,4 Hz) 4,2-4,1 (m, 8H, 2 H-4', 5', 5" et POCH2CH2S) : 3,61 (m, 2H CH2 OH ) ; 2,99 (t, 2H ; POCH2CH2S, J - 6,3 Hz) ; 2,79 (t, 2H p; SCH2CH2OH, J = 6,4 Hz) ; 2,28 (m, 2H ; 2 H-2') ; 2,00 (m, 2H : 2 H-3') ; 1,90-1,75 (m, 4H ; 2 H-2" et 3") ppm. Les composés de l'invention ont été soumis à des essais pharmacologiques montrant leur intérêt dans le traitement de malà- dies virales. - Evaluation de l'activité anti VIH 1 sur les cellules CEM VIS - virus de l'immunodéficience humaine CEM = cellule lymphoblastolde T humaine. La multiplication du VIH 1 (souche BRU) dans les cellules CEM est évaluée par le nombre de syncitia formés après 4 jours d'infection. Les composés testés sont ajoutés apres l'c5sorption du virus dans le milieu de culture aux concentrations finales 10-3M, 10-4M, 10-5M, 10-6M et 10-7M. La plus forte concentration utilisée dans l'analyse de molécules, peu solubles en milieu aaueux, est indiquée entre parenthèses. Les résultats sont exprimés par la concentration la plus faible de composé qui diminue la formation des syncitia d'au moins 50 %. Une confirmation de l'inhibition de la production de virus est recherchée par un dosage de la reverse transcriptase (RT) dont l'activité traduit la présence de virus relargué dans le surnageant de culture. (b) indique que bien qu'il y ait une diminution du nombre de syncitia, à la concentration du compose indiquée, l'activité RT est identique à celle de cultures in fectées non traitées. L'effet toxique sur les CEM non infectées est apprécié par une réaction colorimétrique basée sur la capacité des cellules vivantes à réduire le 3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)2,5 diphényltetrazolium bromide en formazan apres quatre jours d'incubation en présence de différentes concentrations des composes. Les résultats sont exprimés par la concentration la plus faible de composés qui provoque une inhibition d'au moins 50 % de la formation de formazan. - Evaluation de l'activité anti VIH-1 dans les cellules MT4. MT4 = cellule To humaine transformée par HTLVl HTLV = human T lymphotropic virus La multiplication du VIH 1 (souche t.7zLV III B) dans les cellules MT4 (cellules T4 transformées par wTLV-1) est suivie par l'effet cytopathogene induit par le virus. Les cellules sont infectées avec une dose de VIH 1 produisant après 4 jours une diminution de 90 % du nombre de cellules vivantes. es composés testés sont ajoutés, après l'adsorption du virus, dans le milieu de culture à différentes concentrations3.'a) La concentration la plus élevée utilisée est, soit 10 soit celle indiquée entre parenthèses. La viabilité des cellules est mesurée par une réaction colorimétrique basée sur leur capacité à réduire le 3-(4,5 diméthylthiazol-2-yl)2,5 diphényl-tetrazolium bromide en formazan, propriété due aux deshydrogénases mitochondriales. La quantité de formazan produit (D.O. à 540 nm) est proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Le pourcentage de protection des cellules infectées par le traitement avec les composés est calculé en appliquant la formule proposée par Pauwels et col. D.O. 540 des cellules infectées traitées - D.O. 540 des cellules infectées D.O. 540 des cellules non infectées - D.O. 540 des cellules infectées. La concentration des composés donnant une protection de 50 % (ED50) figure dans le tableau. Lorsque les concentrations utilisées ne permettent pas d'atteindre ce niveau, le pourcentage de protection est indiqué. L'effet toxique des composés sur les cellules MT4 non infectées est mesuré par la même réaction colorimétrique. La dose cytotoxique 50 % (CD50) est la concentration de composés provoquant une diminution de moitié de la D.O. 540 par rapport à celle des cellules témoins. Dans certains cas, la dose CD50 est inferieuge à la plus faible concentration de composé testée ( Le signe - indique l'absence de toxicité. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant CELLULES MT4 CELLULES CEM COMPOSE CONCENTRATIONS DONNANT UN EFFET DE L'EXEMPLE ANTIVIRAL TOXIQUE ANTIVIRAL TOXIQUE 1 4 10-6 M 6 10-4 M 5 10-7 M 6 10-5 M 2 5 10-5 M 10-3 M 5 10-6 M 10-3 M 3 4 10-6 M 8 10-5 M 10-7 M 7 10-5 M 4 2 10-7 M 4 10-4 M 5 10-8 M 5 10-6 M 5 4 10-7 M 2 10-4 M 5 10-8 M 6 10-6 M Les composés de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement de maladies virales. Ils peuvent être présentés à cet effet sous toute forme appropriée, en association avec un ou plusieurs excipients. Annexe 1 Annexe 2 MTr : méthoxy-4 trityle oClPh ; chloro-2 phényle Schéma 1 Schéma 2 Schéma 3 Annexe 2 (suite) Schéma 4 Revendications 1. Dérivés phosphorés de cytidine, répondant à la formule (I) dans laquelle C est la cytosine R est . un cation NH4+, Et3 NH+, Na un radical (CH2)n Y où n va de 1 à 4, Y est un radical OZ, SZ, , S - S - Z, dans lequel Z est H, (C1-4)alkyle, aryle, CO(C1-4)alkyle ou (CH2)nOH, n allant de 1 à 5. 2. Le di-O-(didésoxy-2'3' cytidine)-5 O-méthylphosphate. 3.Le di-O-(didésoxy-2'3' cytidine)-5 O-éthylphosphate. 4.Le di-O-(didésoxy-2' ,3' cytidine)-5' O-(hydroxy-2 ethyl) phosphate. 5. Le di-O-(didésoxy-2',3' cytidine)-5 phosphate d'ammonium. 6. Le di-O-(didésoxy-2' ,3' cytidine)-5' O-FS-(hydroxy-2 thio-l éthyl) thio-2 oxy-l éthyl]-1 phosphate. 7. Médicament caractérisé par le fait qu'il contient un composé tel que spécifié dans l'une quelconque des revendications I à 6.