Brevet FR2655147A1 — publié le 19910531

Un cytomètre à écoulement est un instrument pour mesurer la fluorescence et la diffusion de la lumière de cellules biologiques et d'autres particules microscopiques Transpor- tées par un écoulement laminaire d'eau ayant une section transversale de l'ordre de 100 pm, les cellules passent une à une par le foyer d'une source intense de lumière d'exci- tation Lorsqu'une cellule passe par ce foyer, elle émet une courte impulsion de fluorescence ainsi qu'une impulsion de lumière diffusée Ainsi, on peut mesurer le contenu cellu- laire d'un constituant, tel qu'un ADN, qui a été marqué par un pigment fluorescent, ainsi que sa dimension, laquelle est déterminée par l'intensité de diffusion de la lumière. La source de lumière d'excitation peut être un laser continu ou toute autre source lumineuse de forte intensité, ayant une intensité constante, telle qu'une lampe à arc à haute pression contenant, soit du mercure, soit du xénon Au moyen de miroirs dichroiques, la fluorescence peut être séparée en divers composantes spectrales qui sont mesuées par des détecteurs séparés La lumière diffusée peut être mesurée par des détecteurs séparés sous des angles de diffusion différents pour procurer une information, non seulement sur la dimension des cellules, mais également sur des carac- téristiques structurales des cellules. La sensibilité à la fluorescence, ou limite de détection de fluorescence, d'un cytomètre à écoulement, est définie comme étant la plus petite quantité de matière fluorescente par cellule qui peut être détectée par l'instrument De même, la sensibilité à la diffusion de la lumière, ou limite de détection de la diffusion de la lumière, est définie comme étant la plus petite cellule d'une composition donnée qui puisse être détectée La limite de détection est déter- minée par la dimension du signal ainsi que par le niveau du fond, ou bruit, sur lequel le signal est superposé Ce bruit a deux sources principales différentes: (a) bruit électrique en provenance de l'électronique utilisée pour amplifier et transmettre les impulsions en provenance des détecteurs de lumière, et (b) bruit optique qui est dû au fond constant de lumière et résultant de filtres imparfaits et de la fluorescence en provenance de lentilles et d'autres composants optiques Tandis qu'on peut réduire à un niveau insignifiant le bruit électrique dans des cytomètres à écoule- ment, il y a une limite principale au bruit optique Ainsi, même si la consommation de puissance d'une source de lumière est parfaitement constante, le nombre de photons, n, émis pendant une période de temps donnée varie avec un écart standard, s, donné par l'équation 1: s = nl/2 ( 1) et l'écart standard relatif, cv, dans la mesure de S est donnée par l'équation 2 cv = n-1/2 ( 2) Cette variation de l'intensité lumineuse, qu'on peut appeler "bruit optique", est une conséquence de la nature aléatoire du processus d'émission de la lumière et elle est valable pour toutes les sources de lumière, y compris les cellules fluorescentes et les diverses sources de fond optique dans le cytomètre à écoulement Le bruit optique met ainsi une limite principale à toute mesure d'une intensité lumineuse. C'est seulement en augmentant n, c'est-à-dire soit en augmen- tant l'intensité lumineuse, soit en augmentant la durée d'observation, qu'on peut réduire cette limite Dans le cytomètre à écoulement, la durée d'observation est limitée par le temps de passage de la cellule à travers le foyer d'excitation. Du fait que le signal augmente proportionnellement à l'inten- sité d'excitation, tandis que, selon l'équation 1, le bruit optique augmente en proportion de la racine carrée de l'inten- sité, le rapport signal/bruit augmentera en proportion de la racine carrée de l'intensité d'excitation, et la limite de détection diminuera dans la même proportion La présente invention est un procédé pour augmenter l'intensité d'excita- tion dans des cytomètres à écoulement et pour augmenter ainsi la sensibilité et réduire la limite de détection. Le procédé selon l'invention se caractérise en ce que le signal produit par une cellule pénétrant dans le foyer d'exci- tation d'un cytomètre à écoulement déclenche une impulsion de courant électrique en provenance d'une source de courant électrique pour l'envoyer à la source de lumière d'excitation afin d'augmenter temporairement l'intensité d'excitation pendant le temps pendant lequel la cellule passe à travers le foyer d'excitation, produisant ainsi une augmentation de la sensibilité de mesure de ce cytomètre à écoulement. Par ailleurs, ce procédé se caractérise en ce que (a) la source de lumière d'excitation fonctionne sous un courant constant fourni par une source de courant électrique, (b) la partie initiale du signal en provenance de l'un des détec- teurs du cytomètre à écoulement libère une impulsion de déclenchement en provenance d'un discriminateur de hauteur d'impulsion, qui amène une source de courant électrique secondaire de la source de lumière d'excitation à envoyer à cette source de lumière d'excitation une impulsion de courant électrique, ayant une durée semblable au temps exigé par la cellule pour passer à travers le foyer d'excitation, et (c) lorsque la source de courant secondaire envoie une impulsion de courant électrique à la source de lumière d'exci- tation, elle fournit une impulsion de tension simultanée à des circuits de maintien de pointes de façon à déclencher la mesure des signaux en provenance des détecteurs de fluores- cence et de diffusion de la lumière. D'autre part, un miroir semi-transparent dévie une petite fraction de la lumière d'excitation sur un détecteur de lumière, dont le signal est envoyé à un ordinateur et y est utilisé pour corriger les signaux en provenance des détecteurs de l'augmentation temporaire du fond optique résultant de l'augmentation temporaire de l'intensité de la lumière en provenance de la source de lumière d'excitation. Enfin, l'intervalle entre les impulsions envoyées à la source de lumière d'excitation par la source de courant secondaire a une limite inférieure afin d'éviter que le courant moyen amené à cette source de lumière excède le maximum acceptable. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront dans la description suivante, donnée à titre d'exemple seulement, en liaison avec le dessin joint, sur lequel: la figure 1 montre le cytomètre à écoulement utilisé avec le procédé selon l'invention; et la figure 2 montre des formes d'ondes de signaux caracté- ristiques du cytomètre à écoulement. Le cytomètre à écoulement est représenté schématiquement sur la figure 1 La configuration optique de différents cytomètres à écoulement peut différer de façon significative. La figure 1 contient les caractéristiques générales qui sont exigées pour la présente invention La lumière en prove- nance de la source de lumière d'excitation 1 est concentrée sur une ouverture 6 par une lentille collectrice 3 et à nouveau dans le foyer d'excitation 2, à travers lequel cir- cule le courant de cellules, au moyen de lentilles appro- priées 4 et 5 Un filtre d'interférence 7 sélectionne la bande de longueurs d'ondes particulière qui est exigée pour exciter la fluorescence des cellules La fluorescence et la diffusion de la lumière produites par les cellules tandis qu'elles passent à travers le foyer d'excitation 2 sont recueillies par une lentille 8 qui forme une image des cellules sur une ouverture 9 Derrière cette ouverture 9 se trouvent un miroir dichroique 10 et un filtre de bandes 11 qui séparent la lumière diffusée de la fluorescence, laquelle est toujours d'une longueur d'onde supérieure, et des miroirs dichroiques 13 et des filtres de bandes 14 qui séparent les diverses composantes spectrales de la fluorescence, de telle sorte que cette lumière diffusée et les composantes de la fluores- cence peuvent être mesurées par des détecteurs de lumière séparés 12,15 Le signal en provenance de chaque détecteur est amené à travers des amplificateurs d'impulsions 16 dans des circuits de maintien de pointes 20 Le signal en prove- nance de chaque circuit de maintien de pointes est numérisé dans des convertisseurs analogiques/numériques 21, qui en- voient leurs sorties à un ordinateur 28 L'ordinateur stocke les données et les présente sous forme d'histogrammes Le signal en provenance de l'un des détecteurs, de préférence le détecteur de diffusion de la lumière 12, passe à travers un discriminateur de hauteur d'impulsions 19. On se reportera maintenant également à la figure 2 De façon caractéristique, chaque cellule passe à travers le foyer d'excitation en quelques microsecondes Lorsqu'une cellule pénètre dans le foyer d'excitation 2, le signal en provenance du détecteur de lumière 12 commence par augmenter Lorsque ce signal V 1 a dépassé un niveau donné Vo, que l'on appellera "niveau de déclenchement", une impulsion électrique Vt est émise par ce discriminateur de hauteur d'impulsions 19 Cette impulsion, Vt, est transmise à une source de courant secon- daire 18, dans laquelle elle déclenche une impulsion élec- trique qui est envoyée à la source de lumière 1, de telle sorte que l'intensité de la source de lumière augmente rapide- ment, exposant ainsi la cellule à cette intensité accrue. La source de courant secondaire 18 est reliée à la source de lumière 1 en parallèle avec la source de courant primaire 22, laquelle fournit à cette source de lumière le courant de fonctionnement constant. La figure 2 représente l'allure dans le temps du signal V 1 (figure 2 a), de l'impulsion Vt (figure 2 b) qui déclenche la source de courant secondaire 18, de l'impulsion de courant électrique ip (figure 2 c) en provenance de la source de courant secondaire 18, et de l'impulsion de lumière I (fi- gure 2 d)qui s'ajoute à l'intensité de lumière constante Io L'impulsion de déclenchement Vt a une durée qui est sensiblement la même que la durée exigée par la cellule pour passer à travers le foyer d'excitation 2. La source de courant secondaire 18 a un circuit déclencheur qui envoie une impulsion de tension Vp (figure 2 e) aux cir- cuits de maintien de pointes 20 des convertisseurs analogi- ques/numériques 21 et qui déclenche ainsi l'enregistrement du signal en provenance des divers détecteurs 15 De ce fait, la mesure de la cellule s'effectue avec une sensibilité notablement plus élevée que dans le cas de la seule source de lumière 1 fonctionnant à intensité constante, comme c'est le cas dans d'autres cytomètres à écoulement. Pour éviter une surcharge de la source de lumière 1 provoquée par une cadence excessive de cellules passant par le foyer d'excitation 2 et une fréquence d'impulsions de déclenchement de la source de lumière 1, l'intervalle entre deux impul- sions consécutives envoyées à la source de lumière d'excita- tion 1 par la source de courant secondaire 18 a une limite inférieure; de ce fait, la fréquence de ces impulsions a une limite maximale Cette limite est déterminée de façon à éviter que le courant électrique moyen qui est amené à la source de lumière 1 n'excède pas le maximum autorisé. Par exemple, le temps exigé par une cellule pour passer à travers le foyer d'excitation 1 peut être 10 us Si la durée des impulsions de courant électrique envoyées à la source de lumière d'excitation 1 est la même et si la dimen- sion de ces impulsions est dix fois le courant de fonctionne- ment constant de la source de lumière d'excitation, un temps minimal entre deux impulsions de 1 ms implique que le courant moyen alimentant la source de lumière n'excède pas le courant de fonctionnement constant de plus de 10 % De ce fait, si le courant de fonctionnement constant est réglé à 10 % en dessous de la valeur maximale autorisée, la consommation de courant moyenne de la source de lumière d'excitation n'excédera pas ce maximum La fréquence de mesure, c'est- à-dire 1000 cellules par seconde, est largement suffisante dans la plupart des applications des cytomètres à écoulement. La source de lumière secondaire 18 est également équipée d'un circuit déclencheur 23 qui envoie des impulsions de courant à la lampe à une fréquence constante indépendante de toute impulsion de déclenchement en provenance du discri- minateur 17 De ce fait, on ne peut mesurer indépendamment que le signal causé par les impulsions lumineuses. L'augmentation de la sortie de la source de lumière d'excita- tion 1, produite par l'impulsion de courant en provenance de la source de courant secondaire 18, provoque également une augmentation temporaire du fond optique aux détecteurs , qui s'ajoute au signal de la cellule ellemême Afin de tenir compte de cette augmentation, un miroir semi-trans- parent 24 dévie une petite portion de la lumière d'excita- tion, de l'ordre de quelques pour cents, sur un détecteur Le signal en provenance de ce détecteur 25, qui est proportionnel au fond optique, est transmis par un amplifica- teur électronique 17, un circuit de maintien de pointes 26 et un convertisseur analogique/numérique 27 à l'ordinateur 28 Dans le logiciel de cet ordinateur, le signal en prove- nance du détecteur 25 est soustrait des signaux en provenance des détecteurs 15 après multiplication par un facteur cons- tant, de sorte que le signal résultant est corrigé de l'aug- mentation temporaire du fond optique. Revendications 1. Procédé pour augmenter l'intensité d'excitation de cyto- mètres à écoulement, caractérisé en ce que le signal produit par une cellule pénétrant dans le foyer d'excitation ( 2) d'un cytomètre à écoulement déclenche une impulsion de cou- rant électrique en provenance d'une source de courant secon- daire ( 18) en l'envoyant à la source de lumière d'excitation (l)afin d'augmenter temporairement l'intensité d'excitation pendant le temps que met la cellule à passer à travers ce foyer d'excitation, produisant ainsi une augmentation de la sensibilité de mesure du cytomètre à écoulement. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que: (a) la source de lumière d'excitation ( 1) fonctionne avec un courant constant fourni par une source de courant élec- trique ( 22); (b) la partie initiale du signal en provenance de l'un des détecteurs ( 12) de ce cytomètre à écoulement libère une impulsion de déclenchement en provenance d'un discriminateur de hauteur d'impulsions( 19), qui amène une source de courant électrique secondaire de la source de lumière d'excitation ( 1) à fournir à cette source de lumière d'excitation ( 1) une impulsion de courant électrique, ayant une durée sembla- ble à la durée exigée par la cellule pour passer à travers le foyer d'excitation ( 2), et (c) lorsque la source de courant secondaire ( 18) envoie une impulsion de courant électrique à la source de lumière d'excitation ( 1), elle envoie une impulsion de tension simul- tanée aux circuits de maintien de pointes ( 20) de façon à déclencher la mesure des signaux en provenance des détec- teurs de fluorescence et de diffusion de la lumière ( 12 et 15). 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un miroir semitransparent ( 24) dévie une petite fraction de la lumière d'excitation sur un détecteur de lumière ( 25), dont le signal est envoyé à un ordinateur ( 28) et y est utilisé pour corriger les signaux en provenance des détecteurs ( 12 et 15) de l'augmentation temporaire dans le fond optique résultant de l'augmentation temporaire de l'intensité de la lumière en provenance de la source de lumière d'excita- tion ( 1). 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'intervalle entre des impulsions envoyées à la source de lumière d'excitation ( 1) par la source de courant secon- daire ( 18) a une limite inférieure, de façon à éviter que le courant moyen envoyé à la source de lumière ( 1) excède le maximum autorisé.