Brevet FR2649121A1 — publié le 19910104

PROCEDE DE PREPARATION ENZYMATIOUE DE DIPEPTIDES COMPORTANT UN RESTE DERIVE D'UN ACIDE AMINO-CYCLOALRYL CARBOXYLIOUE La présente invention concerne un procédé de préparation de dipeptides comportant un reste aspartyl ou glutamyl ainsi qu'un reste dérivé d'un acide amino-cycloalkylcarboxylique. L'invention concerne également un procédé de préparation d'intermédiaires de synthèse desdits dipeptides. On connait notamment par la demande de brevet W0 8700732 des dipeptides de formule dans laquelle n est 0,1 ou 2 m est 1,2,3 ou 4 R est (1) OR1 avec R1 étant un groupe alcoyl en C1 - C7, un groupe alcényle ou alcynyle en C2 - C7, ledit groupe alkyle, alcenyle ou alcynyle pouvant être substitué par un groupe alcoxy en C1 - C47 un groupe hydroxyle, un atome d'halogène ; (2) N (R2)2 où chaque R2 représente indépendamment un atome d'hydrogène, un groupe alcoyl contenant au moins 4 atomes de carbone, ou un groupe hétérocyclique contenant un atome de soufre, d'oxygène ou d'azote, ou (3) R3 où R3 est R1 ou - CH2 Ri, et R' est un atome d'hydrogène, d'halogène ou un phényle. Ces composés sont décrits comme ayant notamment des propriétés édulcorantes. Ils peuvent être synthètisés par condensation d'acides aminés selon des voies chimiques connues. A titre d'exemple, il est décrit notamment la synthèse de l'ester propylique de l'acide L-aspartyl amino cyclopropyl carboxylique. Ce composé est obtenu à partir de l'ester t - butylique de l'acide aspartique N - protégé par un groupement butyloxycarbonyl (Boc), placé dans un milieu tétrahydrofuranne (THF) dans lequel on ajoute de la N- méthylmorpholine et un activateur, le chloroformiate d'isobutyle. A cette solution on ajoute du chlorhydrate de l'ester n-propylique de l'acide - amino cyclopropanecarboxylique en milieu THF. Le mélange réactionnel est agité trois heures et le solvant est évacué sous vide. Le produit obtenu est ensuite purifié et déprotégé afin d'obtenir le produit final. Un tel procédé est cependant complexe, couteux, essentiellement praticable en laboratoire et donc non industriel. La présente invention concerne donc un procédé industriel, de mise en oeuvre simple, permettant une synthèse enzymatique avec un rendement élevé de dipeptides comportant un reste aspartyl ou glutamyl ainsi qu'un reste dérivé d'un acide amino cycloalkylcarboxylique . Un autre objet de l'invention concerne la préparation d'intermédiaires de synthèse desdits dipeptides. La présente invention concerne un procédé de préparation d'un dipeptide comportant un reste aspartyl ou glutamyl de formule (I) suivante dans laquelle : n est égal à 1 ou 2 B représente un reste cycloalkyle saturé en C3 - Cg, substitué ou non sur au moins un de ses atomes de carbone par un ou deux radicaux aliphatiques, linéaires ou ramifiés, en C1 - C20 A représente (i) un radical D, D étant - un radical aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié en Cl - CS - un radical cycloaliphatique, saturé ou insaturé en C3 - C10, substitué ou non par un à trois radicaux aliphatiques, saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés en C1 - C4, ou (ii) un radical D et D'étant identiques ou différents, D' ayant la même signification que celle donnée ci-dessus pour D, le dit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes (a) on effectue une réaction de couplage entre un composé de formule (II) suivante dans laquelle - n est égal à 1 ou 2 - R et R' sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur des fonctions carboxyliques - P représente un groupement N-protecteur, et un composé de formule (III) suivante NH2 - B - COOA (III) dans laquelle A et B ont la même signification que celle donnée ci-dessus, ladite réaction de couplage étant effectuée dans un milieu organique comportant moins de 2,5%, en poids d'eau, en présence d'une thiol-protéase, (b) on élimine du dipeptide issu de l'étape (a), le groupement Nprotecteur et éventuellement le groupement R, quant R n'est pas un atome d'hydrogène. D'autres caractéristiques et avantages du procédé selon l'invention sont donnés dans la description qui suit. D'une manière préférentielle B est un reste cycloalkyle non substitué en C3- C8 et plus préférentiellement un reste cyclopropyle. Il peut être également avantageux que n soit égal à 1, que A soit un radical aliphatique saturé, linéaire ou ramifiée C1 - C4 et que de préférence A soit est un radical n -propyle, ou que A soit un radical fenchyle. Comme décrit ci-dessus, le procédé selon l'invention peut être réalisé à partir d'un composé de formule (II) dont les fonctions carboxyliques sont protégés par des groupes R et/ou R', mais il peut également être mis en oeuvre à l'aide d'un composé de formule (II) dont les fonctions carboxyliques sont libres. Ce dernier mode de réalisation peut être considéré comme surprenant dans la mesure où, au cours d'une synthèse peptidique il est généralement recommandé de protéger les fonctions carboxyliques des acides aminés dicarboxyliques intervenant dans ladite synthèse. Cette voie est particulièrement avantageuse dans la mesure où de cette façon on obvie à la préparation d'intermédiaires protégés et que de plus une étape de déprotection de la fonction p ou Y carboxylique des produits obtenus, est évitée. Dans le cadre de l'invention les composés de formule (II) peuvent être obtenus à partir de l'acide aspartique ou de l'acide glutamique selon le cas, N - protégés et éventuellement estérifiés sur au moins une de leurs fonctions carboxyliques selon des méthodes bien connues de l'homme de l'art. Quand R ou R' ne représentent pas un atome d'hydrogène, ils peuvent être (1) un radical aliphatique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié en Cl - C15, de préférence en C1 - Cg. (2) un radical aralkyle ou aryle de formule ou . n est compris entre 0 et 5 X X est un atome d'hydrogène, de chlore, de brome ou d'iode R1 est un radical aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié en C1 - ClO, de préférence en C1 - Cg, ou un radical alcoxy en C1 - C10, de préférence en C1 - Cg. Avantageusement, quand R et/ou R' ne représentent pas un atome d'hydrogène, ils sont choisis de manière à pouvoir être facilement éliminé en fin de réaction, par exemple par hydrogénolyse catalytique. Dans ce cas R et/ou R' peuvent par exemple représenter un radical benzyle. Les composés de formule (III) peuvent être obtenus par une réaction classique d'estérification ou d'amidation de la fonction carboxylique des acides amino cycloalcoylcarboxyliques substitués ou non correspondants. Quant à ces derniers, ils sont disponibles dans le commerce sous la forme non substitué. Ils peuvent également être obtenus sous une forme non substituée selon le procédé décrit dans l'article "Peptide sweeteners 6. Structural studies on the C - Terminal Amino Acid of L - Aspartyl dipeptide sweeteners" de Joseph W. TSANG et al., J. Ned. Chem. 1984, 27, 1663 - 1668. La forme substituée desdits acides aminocycloalcoyl carboxyliques peut être notamment obtenue selon le procédé décrit dans U. Schöllkopf et al., Liebigs Ann. Chem., pages 611 - 619, 1973. Dans le cadre de la présente invention le groupement N - protecteur P peut être un radical de formule W-0-CO- dans laquelle W est un radical benzyle, alcoxybenzyle, halogenobenzyle, nitrobenzyle ou alcoyle. Avantageusement P peut être un radical benzyloxycarbonyle ou p - methoxybenzyloxycarbonyle. Les thiol-protéases sont des enzymes appartenant à la famille des protéases. A titre de thiol-protéase particulièrement avantageuse dans le cadre de la présente invention on peut citer la papaïne. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre en présence d'un enzyme libre ou immobilisé. Ledit enzyme peut être immobilisé selon toutes méthodes connues de l'homme de l'art par exemple sur des résines d'absorptions ou des résines poreuses ou macroporeuses, telles des résines polyméthacrylates et plus particulièrement les résines XAD-8 ou XAD-7, commercialisées par la société Rohm et Haas. L'utilisation d'un enzyme immobilisé peut être avantageuse car elle permet la réutilisation du catalyseur enzymatique et la réalisation en continu du procédé selon l'invention En effet, il est possible dans ce cas de disposer l'enzyme immobilisé dans une colonne adéquate, telle une colonne chromatographique, et d'y introduire selon un débit régulier, au moyen d'un dispositif approprié, par exemple une pompe, le mélange réactionnel constitué par les composés (II) et (III), le ou les solvants organiques et éventuellement d'autres composés pouvant intervenir dans le procédé selon l'invention. On a pu constater qu'un tel procédé en continu pouvait permettre d'atteindre de meilleurs rendements. La quantité d'enzyme mise en oeuvre est généralement comprise entre 0,1 et 100 % en poids par rapport au composé de formule (il). Le milieu réactionnel peut également comporter un activateur d'enzyme tel le mercaptoethanol, la cysteine ou le dithiothreitol. Généralement on utilise de- O à 15 %, de préférence de 5 à 12 % en poids d'activateur d'enzyme par rapport au poids d'enzyme mis en oeuvre. Selon l'invention, la réaction entre les composés de formule (II) et (III) peut être réalisée dans un milieu organique comportant moins de 1 % d'eau. Il est d'ailleurs possible d'introduire les réactifs dans un milieu organique anhydre. Dans ce cas l'eau contenue dans le milieu réactionnel provient alors uniquement de l'eau liée à l'enzyme. Un telle réaction enzymatique réalisée dans un milieu organique est surprenante dans la mesure où habituellement ce type de réaction est généralement réalisé en milieu hydro-organique ou totalement aqueux. Or il a été constaté dans le cadre de la présente invention qu'une quantité d'eau supérieure à 2,5 % en poids par rapport à la phase organique ne permettait pas d'obtenir les composés recherchés ou alors avec de faibles rendements. Ledit milieu organique peut être avantageusement constitué par au moins un solvant organique non miscible à l'eau tels que (1) les alcools secondaires ou tertiaires, linéaires ou ramifiés en Cl C20, de préférence en C4 - C8 comme l'alcool t - butylique, l'hexanol -2, l'heptanol -2 ou l'octanol -2, le méthyl 2 - butanol ou l'alcool t-amylique, ou les alcools cycliques en C3 - C20, de préférence en C4 C8 tel que le cyclohexanol, (2) les esters de formules Ra - COO Rb, où Ra et Rb sont identiques ou différents et représentent (a) un radical aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié en Cl - C20, de préférence en C1 - C15 (b) un radical aryle en C6 - Cita, substitué ou non par 1 à 3 radicaux aliphatiques, linéaires ou ramifiés, saturés insaturés en C1 - C5 (c) un radical cycloaliphatique saturé ou insaturé en C3 - Cg, substitué ou non par 1 à 3 radicaux aliphatiques linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés en C1 - C5 ; parmi lesdits esters on peut cités l'acétate d'isopropyle, l'acétate d'isobutyle ou le décanoate de méthyle, (3) les éthers de formule Ra-O-Rb parmi lesquels on peut citer l'éther isopropylique ou le méthyl t-butyl ether, (4) les hydrocarbure aliphatiques ou aromatiques en C6 - Cle tel le toluène. Selon le procédé de l'invention la réaction enzymatique entre les composés de formules (II) et (III) peut être réalisée à une température comprise entre 20 et 60*C et de préférence entre 35 et 450C. Le rapport molaire entre le composé (III) et le composé (II) peut être compris entre 1 et 10 et de préférence entre 2 et 5. La concentration dudit composé (II) dans ledit milieu organique est généralement comprise entre 0,01 et 1 molaire et de préférence entre 0,1 et 0,5 molaire. A la fin de la réaction de couplage mettant en oeuvre les composés (II) et (III), on peut séparer le dipeptide obtenu des composés (II) et (III) n'ayant pas réagi selon des méthodes connues. Ainsi on peut séparer le composé (III) des composés (II) et du dipeptide obtenu, par addition d'une base, le composé (II) étant séparé du dérivé dudit dipeptide par une méthode d'extraction sélective. Quand le groupement R n'est pas l'hydrogène, il peut être éliminé selon des techniques classiques, par exemple par hydrogénolyse catalytique en présence de palladium sur charbon ou par hydrolyse acide ou basique. Le groupement N - protecteur P peut lui aussi être éliminé par des techniques classiques, telles l'hydrolyse acide ou encore l'hydrogénolyse catalytique en présence de palladium sur charbon. Dans ce dernier cas il peut être avantageux- d'utiliser le procédé décrit dans la demande de brevet EP 27319. Les produits de formule (I) issus du procédé selon l'invention peuvent être notamment utilisés en tant qu'édulcorants. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'intermédiaires de synthèse des composés de formule (I) décrits ci-dessus. Ce procédé concerne alors la préparation d'un composé de formule (IV) suivante dans laquelle n,R,R', P,B et A ont la signification donnée ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on effectue une réaction de couplage entre ledit composé de formule (II) et ledit composé de formule (III), dans un milieu organique comportant moins de 2,5% en poids d'eau, en présence d'une thiol-protéase. Les conditions de réalisations préférentielles de ladite réaction de couplage sont les mêmes que celles décrites ci-dessus pour ce qui concerne l'étape (a) du procédé de préparation du composé de formule (I). Des exemples illustrant l'invention vont maintenent être donnés. EXEMPLE 1 PréParation en continu de l'ester n ProDslioue de l'acide L - aspartvl 1 - aminocscloDroPane carboxYlique (composé (Y)) Cette préparation met en oeuvre de la papaine brute commercialisée par la société MERCK (30 000 U USP/mg), qui est immobilisée selon la méthode suivante 20 g de papaine sont dissous dans 100 ml de tampon phosphaté 0,1 M à pH 7. A cette solution est ajouté 40 g de résine XAD 8 (commercialisée par ROHM et HAAS) à 52 % d'eau. Le mélange est agité sur des rouleaux pendant 3 heures à température ambiante. Après filtration, le biocatalyseur ainsi obtenu est séché sous vide dans un dessicateur contenant de la potasse jusqu'à poids constant. 24,5 g de biocatalyseur prêt à l'emploi sont ainsi obtenu. Le composé (Y) est ensuite préparé selon le procédé suivant 5 g de biocatalyseur représentant un volume de 13 ml, sont chargés dans une colonne chromatographique à double enveloppe de 15 mm de diamètre et de 12 cm de hauteur, thermostatée à 370C. Par le bas de la colonne on injecte sur le biocatalyseur et avec un débit de 0,5 ml/h, une solution comportant - octanol-2 82 g - acide aspartique N - protégé par le groupement benzyloxycarbonyle (Z Asp), 6,7 g (0,025 mole) - ester n-propylique de l'acide aminocyclopropane carboxylique (AccOPr) 10,7g (0,075 mole) -mercaptoethanol 0,6g La solution sortant par le haut de la colonne contient (pour 100 g de solution) - octanol-2 82,00g - Z Asp 3,85g - AccOPr 8,9 g - Composé (Y) N-protégé par le groupement Z 4,9 g - mercaptoéthanol 0,6 g - Eau 0,225g Le rendement en composé (Y) N-protégé est donc de 50 % par rapport au Z Asp introduit. Le brut réactionnel est alors traité par de l'ammoniaque 1 M en quantité double par rapport aux fonctions carboxyliques présentent dans le milieu. Le Z Asp et le composé (Y) N-protégé passent dans la phase aqueuse, alors que l'AccOPr reste dans le milieu organique. La phase ammoniacale est amenée à pH 5,4 du moyen d'acide chlorhydrique 2 N après ajout d'un volume d'acétate d'isopropyle. La phase organique contient alors 90 % en poids du composé (Y) N protégé obtenu dans le brut réactionnel. La solution d'acétate d'isopropyle est ensuite additionnée d'eau de sorte que l'on obtienne un mélange eau-solvant 50/50 puis est hydrogénolysée dans un réacteur d'hydrogénation en présence de Palladium sur charbon à 3 % . Le composé (Y) est alors récupéré dans la phase aqueuse. EXEMPLE 2 Procédé de préparation du Z méthylester du composé (Y) à partir de diester de l'acide aspartique N - protégé par le groupement benzyloxycarbonyle (Z). En charge dans un flacon - diméthylester de l'acide aspartique N - protégé par le groupement Z 0,25 mmole - AccOPr 0,75 mmole - solvant 1 ml - papaine (immobilisée selon le procédé décrit dans l'exemple 1) 150 mg - mercaptoéthanol 5 microlitres Ce mélange est agité sur des rouleaux à température ambiante, pendant une durée variable. Les conditions de réalisation du procédé et les rendements exprimés en nombre de mole de Z méthylester du composé (Y) par rapport au nombre de mole de engagé, sont indiqués dans le tableau I suivant TABLEAU I ISSAI SOLVANT TEMPS DE REACTION RENDEMENT EN % EN HEURES A Ether ethylique 238 45 B Diisopropylether 66 70 C Diisopropylether 96 85 D Héthyl-2 Butanol-2 72 45 EXEMPLE 3 : Procédé de préparation du composé (Y) selon le procédé décrit dans l'exemple 2. Dans cet exemple, le mélange chargé dans le flacon est agité sur des rouleaux pendant 72 heures et l'on fait varier le rapport molaire M entre le nombre de mole d'AccOPr et le nombre de mole de En fin de réaction, le mélange réactionnel est repris par de l'acétonitrile et analysé par HPLC. Les rendements en Z methylester du composé (Y) figurent dans le tableau II suivant TABLEAU II M RENDEMENTS EN % 1,5 55 3 68 5 69 Le mélange réactionnel repris par de l'acétonitrile est évaporé à sec et le résidu est repris par un mélange 50/50 acétate d'éthyle/solution aqueuse à 0,1 M de Na HCO3. Après décantation la couche organique est séchée et concentrée jusqu'à obtention de 3 cm3 de solution. Le Z méthyl ester du composé Y est alors précipité par addition d'hexane, filtré et séché. Le composé Y est ensuite obtenu par élimination du groupe méthyle par hydrolyse en présence d'unè quantité suffisante de soude normale et suivie de l'élimination du groupement Z par hydrogénation catalytique comme décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE 4 Influence de la concentration en eau dans le solvant lors de la réaction de préparation du composé (Y) N - protégé par le groupement Z en présence d'un enzyme libre. On introduit dans un flacon. Z Asp 0,25 mmole AccOPr 0,75 mmole Papaine libre 40 mg Mercaptoethanol 5 microlitres Tampon * x microlitres Octanol 1 ml La papaine utilisée est commercialisée par la société Merck (30000 U USP/mg) Le tampon utilisé est soit un tampon phosphaté 0,1 M à pH 7, soit un tampon Mac Ilvaine à pH 4,5. Le mélange réactionnel est agité magnétiquement à 400C pendant 48 heures. Les rendements en composé (Y) N - protégé par le groupement Z obtenu, figurent dans le tableau III suivant TABLEAU III Tampon phosphaté I Rendement | Tampon Mac Ilvaine Rendement x microlitres en % x microlitres en % 10 27 10 29 20 34 20 15 40 15 40 10 80 5 - EXEMPLE 5 Influence de la concentration en eau dans le solvant lors de la réaction de préparation du composé (Y) N-protégé par le groupement Z en présence d'un enzyme immobilisée. On introduit dans un flacon Z Asp 0,25 mmole AccOPr 0,75 mmole Papaine immobilisée 150 mg Mercaptoethanol 5 microlitres Octanol-2 contenant 0,7 g/l d'eau 1 ml Eau x microlitres La papaine immobilisée est préparée selon le procédé décrit à l'exemple 1. Les rendements en composé (Y) N- protégé par le groupement Z obtenus figurent dans le tableau IV suivant TABLEAU IV eau rendement % en microlitré 0 40 5 ! 39 50 11 100 5 EXEMPLE 6 Procédé de préparation du composé Y N-protégé par le groupement t-butyloxycarbonyl (Boc). On charge dans un flacon. - Acide aspartique N-protégé par le groupement Boc 0,25 mmole - AccOPr 0,75 mmole - Papaine immobilisée 150 mg - Mercaptoéthanol 5 microlitres - Solvant organique 1 ml La papaine immobilisée est obtenue selon le procédé décrit à l'exemple 1. Le mélange réactionnel est agité sur des rouleaux pendant 72 heures à 370C. Les rendements en composé (Y) N-protégé par le groupement Boc, en fonction de la nature du solvant utilisé, sont donnés dans le tableau V suivant TABLEAU V solvant rendement en % Octanol 2 54 Alcool t-amylique 40 Decanoate de méthyle 56 EXEMPLE 7 Procédé de préparation du composé (Y) N-protégé par le groupement Z. Dans un réacteur thermostaté à 370C et agité, on charge - Z Asp 7,5 mmoles (2,01g) - AccOPr 22,5 mmoles (3,21g) - Papaine immobilisée 4,5 g - Mercaptoethanol 0,3 ml - Octanol séché sur tamis 30 ml Le mélange réactionnel est agité pendant 75 heures, puis est filtré. Le filtrat recueilli est analysé par HPLC. Le rendement en composé (Y) N-protégé par le groupement Z est de 46,6 %. EXEMPLE 8 Procédé de préparation du composé (Y) N-protégé par le groupement Z en continu. On place 10 g de papaine immobilisée selon le procédé décrit à I'exemple 1 dans une colonne chromatographique thermostatée à 370C. Au moyen d'une pompe, on injecte sous un débit de 1 g/h une solution ayant la composition suivante (% en poids) - Z Asp 6,74 % - AccOPr 10,76 % - Mercaptoethanol 1,1 % - Octanol 81,4 % Le rendement en composé (Y) N-protégé par le groupement Z est de 64 %. EXEMPLE 9 (non conforme à l'invention) On introduit dans un flacon - Z Asp 0,25 mmole - AccOPr 0,3 mmole - Tampon Mac Ilvaine à pH 4,2 1,25 ml - Ethanol 0,75 ml - Papaine libre 25 mg On agite le mélange réactionnel pendant 24 heures à 370C. L'analyse par HPLC du brut réactionnel montre que le composé (Y) N-protégé par le groupement Z ne se forme pas. Seul une faible quantité d'ester éthylique de l'acide aspartique N-protégé par le groupement Z a été détectée. EXEMPLE 10 (non conforme à l'invention) On introduit dans un flacon - Z Asp 2,5 mmole - AccOPr 2,5 mmole - Papaine libre 0,25 g - Tampon Mac Ilvaine pH 6,2 6,25 ml On agite le mélange réactionnel puis on introduit 95 ml d'acétate d'éthyle. Le mélange est agité à 370C pendant 72 heures. L'analyse par HPLC du brut réactionnel montre que le composé (Y) N-protégé par ce groupement Z ne s'est pas formé. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un dipeptide comportar.t un reste aspartyl ou glutamyl, de formule (I) suivante dans laquelle : -n est égal à 1 ou 2 -B représente un reste cycloalkyle saturé en C3-Cg, substitué ou non sur au moins un de ses atomes de carbone par un ou deux radicaux aliphatiques, linéaires ou ramifiés, en C1-C20 - A représente (i) un radical D, D étant - un radical aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié en Cl - C8 - un radical cycloaliphatique,saturé ou insaturé en C3-C10, substitué ou non par un à trois radicaux aliphatiques, saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés en C1 - C4, ou (ii) un radical D et D' étant identiques ou différents, D' ayant la même signification que celle donnée ci-dessus pour D, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes a) on effectue une réaction de couplage entre un composé de formule (II) suivante dans laquelle :. n est égal à 1 ou 2 R et R' sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur des fonctions carboxyliques P représente un groupement N- protecteur, et un composé de formule (III) suivante NH2 - B - COOA (III) dans laquelle A et B ont la même signification que celle donnée ci-dessus, ladite réaction de couplage étant effectuée dans un milieu organique comportant moins de 2,5 % en poids d'eau, en présence d'une thiol-protéase, (b) on élimine du dipeptide issu de l'étape (a), le groupement N-protecteur et éventuellement le groupement R, quand R n'est pas un atome d 'hydrogène. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisée en ce que B est un reste cycloalkyle non substitué en C3 - C8 et de préférence un reste cyclopropyle. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que n est égal à 1. 4. Procédé selon l'une des revendications I et 3, caractérisé en ce que A est un radical aliphatique saturé, linéaire ou ramifié en C1 - C4 ou un radical fenchyle. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que A est un radical n-propyle. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 et 5 caractérisé en ce que R et/ou R' sont (1) un radical aliphatique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié en C - C15 de préférence en C1 - C5t (2) un radical aralkyle ou aryle de formule ou : .n est compris entre O et 5 .X est un atome d'hydrogène, de chlore de brome ou d'iode .R1 est un radical aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié en C1-C10, de préférence en C1-Cs, ou un radical alcoxy en C1 -C10, de préférence en C1-Cg 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que R et/ou R' est un radical benzyle. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le groupement P est un radical de formule W-O-CO- dans laquelle W est un radical benzyle, alcoxybenzyle, halogenobenzyle, nitrobenzyle ou alcoyle. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 ,caractérisé en ce que la thiol-protéase est la papaine. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la thiol-protéase est sous forme libre ou immobilisée. Il. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'enzyme est immobilisée sur une résine poreuse telle que les résines polyméthacrylates. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que la quantité de thiol-protéase mise en oeuvre est comprise entre 0,1 et 100% en poids par rapport au composé de formule (II) 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que la réaction entre les composés (II) et (III) est mise en oeuvre en présence d'un activateur d'enzyme tels le mercaptoethanol, la cysteine ou le dithiothreitol 14.Procédé selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que ledit milieu organique est constitué par au moins un solvant non miscible à l'eau tels que (1) les alcools secondaires ou tertiaires, linéaires ou ramifiés en C1 C201 de préférence en C4 - Cg, ou cycliques en C3 - C20de préférence en C4 - Cg. (2) les esters de formules Ra -COORb, où Ra et Rb sont identiques ou différents et représentent a) un radical aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié en C1 C20, de préférence en C1 - C15 b) un radical aryle en C6 - C18, substitué ou non par 1 à 3 radicaux aliphatiques, linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés en C1 - C5 c) un radical cycloaliphatique saturé ou insaturé en C3 - Cg, substitué ou non par 1 à 3 radicaux aliphatiques, linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés en C1 - Cg, (3) les éthers de formule Ra-O-Rb, (4) les hydrocarbures aliphatiques ou aromatiques en C6 - C18. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le solvant est l'alcool t-amylique, l'alcool t-butylique, l'hexanol-2, l'heptanol-2, l'octanol-2, le méthyl 2-butanol, le cyclohexanol, l'acétate d'isopropyle, le décanoate de méthyle, l'acétate d'isobutyle, l'éther éthylique, l'éther isopropylique, le méthyl t-butyl éther, le toluène. 16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le milieu organique comporte moins de 1% en poids d'eau. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que la réaction de couplage est réalisée à une température comprise entre 20 et 600C, de préférence comprise entre 35 et 450C. 18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 17 , caractérisé en ce que le rapport molaire entre le composé (III) et le composé (Il) est compris entre 1 et 10 , et de préférence entre 2 et 5. 19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18 caractérisé en ce que la concentration en composé (Il) dans ledit milieu organique est comprise entre 0,01 et 1 mole/l, et de préférence entre 0,1 et 0,5 mole/l. 20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 19 caractérisé en ce que l'on fait réagir les composés (II) et (III) en continu. 21. Procédé de préparation d'un composé de formule (IV) suivante dans laquelle n, R, R', P, B et A ont la signification donnée ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on effectue une réaction de couplage entre ledit composé de formule (II) et ledit composé de formule (III), dans un milieu organique comportant moins de 2,5 % en poids d'eau, en présence d'une thiol protéase.