Brevet FR2649720A1 — publié le 19910118

Gêne recombinant codant pour une protéine telle que l'urate oxydase. L'invention concerne un nouveau gêne recombinant codant pour une protéine telle que L'urate oxydase qui catalyse La dégradation d'un métabolite, un vecteur d'expression portant ce gène, des micro-organismes procaryotes transformés par ce vecteur d'expression, ainsi qu'une nouvelle protéine recombinante obtenue à L'aide de ce gène et un médicament contenant cette dernière. L'urate oxydase (EC 1.7.3.3.), également dénommé uricase, est une enzyme de La voie de dégradation des purines. Cette enzyme n'existe pas chez les primates (comme l'Homme), les oiseaux, quelques reptiles ni chez la plupart des insectes. Certains chiens (comme le daLmatien) en sont également dépourvus. Chez l'homme, les bases puriques, adénine et guanine, sont converties en xanthine. La xanthine est oxydée par La xanthine oxydase pour former t'acide urique selon la réaction xanthine + H20 + O2 acide urique + 2 . Le radical 0 . substrat de la superoxyde dismutase, est transformé par cette dernière en peroxyde d'hydrogène L'acide urique, métabolite présent dans le sang, se trouve normalement essentiellement sous forme de sel monosodique soluble. Toutefois, il peut arriver que, chez certaines personnes, L'acide urique précipite et forme des calculs. L'hyperuricémie, augmentation de la quantité d'acide urique en circulation dans le sang, cause Le dépôt d'acide urique dans les tissus cartilagineux, ce qui entrain La goutte. L'hyperuricémie peut également avoir des conséquences sur Les reins : un excès d'acide urique dans L'urine. et dans tes reins peut conduire à une néphrolithiase à acide urique, c'est-å-dire à l'accumulation de calculs rénaux qui sont trés douloureux et peuvent endommager le rein. Ces calculs sont composés d'acide urique éventuellement associé avec des sels phosphates et oxalates. La surproduction d'acide urique peut avoir des origines diverses défauts métaboliques congénitaux, syndrome de Lesch-Nyhan, L'inges tion en excès de purine ou de protéines, traitements avec des drogues uricosuriques etc. (Gutman, AB et YU, T.F. (1968) Am. J. Med. 45 - 756-779). L'urate oxydase, enzyme qui catalyse la dégradation de L'acide urique en allantoine (composé beaucoup plus soluble que l'acide urique, ne cristallisant pas aux concentrations atteintes dans les liquides biologiques), présente donc un intérêt thérapeutique. Utilisée en injection, elle présente un grand nombre d'avantages dans le traitement de l'hyperuricémie et des néphroli- thiases : rapidité de l'effet hypo-uricémiant (diminution de L'ordre de 50 X de lthyperuricémie en moins de 24 h), meilleure protection du rein contre les lithiases par rapport à d'autres drogues comme l'allopurinol (inhibiteur de la xanthine oxydase), etc. L'urate oxydase utilisée actuelLement comme médicament est obtenue selon un procédé comprenant la culture d'un mycélium d'Aspergillus flavus et l'isolement de L'urate oxydase par extraction du milieu de culture ainsi que plusieurs étapes de purification de cette protéine. Ce procédé, qui permet l'obtention d'urate oxydase de grande pureté, présente toutefois des inconvénients. En effet, la physiologie et surtout la génétique d'A. flavus ne sont pas aisément travaillables (WOLOSHUK et al, (1989) Applied environ. microbiol. vol. 55, p. 86-90). IL n'est donc pas possible d'obtenir des souches qui produisent cette enzyme en quantités importantes. D'autre part, A. flavus est susceptible de produire des aflatoxines, lesquelles sont parfois difficiles à séparer. Il convient donc de vérifier que te produit purifié est exempt de ces toxines. Il existe donc un besoin pour des outils et des techniques de génie génétique permettant de s'affranchir de- ces inconvénients. La demanderesse a construit une bibliothèque d'ADNc à partir des ARN messagers d'une souche d'A. flavus cultivée dans des conditions de production d'urate oxydase, de laquelle elle a isolé, à l'aide de deux sondes construites sur la base de la séquence partielle de L'urate oxydase d'A. flavus déterminée expe;rimentate- ment, puis séquencé un ADNc codant pour L'urate oxydase. Elle a ensuite construit un vecteur d'expression comprenant cet ADNc, transformé une souche d'E. coli K12 avec ce dernier, cultivé celleci et vérifié que le lysat des cellules contenait une protéine recombinante de la masse moléculaire attendue, qui possède une activité urate oxydase (capacité de dégrader L'acide urique). L'invention concerne donc un gène recombinant caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN qui s'hybride avec une sonde de formule T C D1 A T D2 T C D3 A A D4 T A D5 T G dans laquelle les symboles D1, D2, D3, D4 et D5 représentent respectivement (A, G ou T), (T ou C), (G ou A) (G ou A) et (G ou A) ainsi qu'avec une sonde de formule A E1 E2 A A E3 C C C C A E4 A A E5 T G dans laquelle les symboles E1, E2, E3, E4 et E5 représentent respectivement (G ou A), (G ou A), (A, G, C ou T), (G ou A) et (T ou C) et code pour une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 33 kDa, qui catalyse la dégradation d'un métabolite. De préférence ce métabolite est l'acide urique. Un gène recombinant particulièrement apprécié est celui codant pour la protéine de séquence primaire ci-après MetSerAlaValLysAlaALaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis LysAspGluLysThrGlyValGlnThrVal TyrGluMetThrValCysValLeuLeuGlu GlyGluIleGluThrSerTyrThrLysAla AspAsnSerValIleValAlaThrAspSer IleLysAsnThrIleTyrIleThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPçe GlySerIlELeuGlyThrHisPheIleGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal AsnfleValCysHisArgTrpThrArgMet AspIleAspGlyLysProHisProHisSer PheIleArgAspSerGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly IleAspIleLysSerSerLeuSerGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhe TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrThr LeuLysGluThrTrpAspArgIleLeuSer ThrAspValAspAlaThrTrpGlnTrpLys AsnPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLysThrphe AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnIleLeu AlaArg6lnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu IleAspLeuSerX1HisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla ProGlnSerAspProAsnGlyLeuIleLys CysThrValGlyArgSerSerLeuLysSer LysLeu dans laquelle X1 représente Trp ou Gly. De préférence X1 représente Trp. A cause de la dégénérescence du code génétique, il existe un grand nombre de séquences d'ADN codant pour une protéine dont La séquence répond à la formule donnée ci-dessus. Parmi celles-ci une séquenc-e préférée est la suivante : ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AAATTG. L'invention concerne également un vecteur d'expression qui porte, avec les moyens nécessaires à son expression, Le gène recombinant défini précédemment. Pour une expression dans les micro-organismes procaryotes, en particulier dans Escherichia coli, La séquence codante doit être insérée dans un vecteur d'expression comportant notamment un promoteur efficace, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gêne à exprimer, ainsi qu'une séquence d'arrêt de transcription efficace en aval du gêne à exprimer. Ce plasmide doit également comporter une origine de réplication et un marqueur de sélection. Toutes ces séquences doivent être choisies en fonction de la cellule hôte. Pour une expression dans Les cellules eucaryotes telles que les cellules animales, notamment dans les cellules d'ovaires de hamster chinois CHO, la séquence codante est insérée dans un plasmide (par exemple dérivé du pBR 322) comportant deux unités d'expression. Une première unité dans laquelle est inséré le gène d'intérêt devant un promoteur efficace (par exemple le promoteur précoce de SV40 > . La séquence autour de L'ATG d'initiation est de préférence choisie En fonction de la séquence consensus décrite par KOZAK (M. KOZAK (1978) Celui., 15, 1109-1123).Une séquence intronique, par exemple t'intron de l'a-globine de souris, peut être insérée en amont du gène d'intérêt ainsi qu'une séquence comportant un site de polyadénylation, par exemple une séquence de polyadénylation du Sv40, en aval du gène d'intérêt. La deuxième unité d'expression comporte un marqueur de sélection (par exemple une séquence d'ADN) codant pour la dihydrofolate réductase (enzyme ci-après abrégée DHFR). Le plasmide est transfecté dans Les ceLluLes eucaryotes, par exemple les cellules CHO DHFR (incapables d'exprimer la DHFR). Une lignée est sélectionnée pour sa résistance au méthotréxate et exprime à un niveau suffisant le gène d'intérêt. Pour une expression dans les cellules eucaryotes telles que la levure, par exemple Saccharomyces cerevisiae, iL convient d'insérer La séquence codante entre d'une part des séquences reconnues comme promoteur efficace, d'autre part un terminateur de transcription. L'ensemble promoteur-séquence cùdante-términateur, appelé cassette d'expression, est cloné soit dans un vecteur multicopie pour la levure, soit intégré en multicopie dans le génome de la levure. L'intérêt de la levure est de présenter une machinerie ceLlulaire proche de celle de L'hôte naturel, A. flavus. L'invention concerne également une nouvelle protéine recombinante de séquence ci-après : SerAlaValLYsAlaAlaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis LysAspGluLysThrGLyVaLGLnThrVal TyrGluMetThrValCysVaLLeuLeuGLu GlyGluIleGluThrSerTyrThrLysAla AspAsnSerValIleValAlaThrAspSer IleLysAsnThrIleTyrIleThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPhe GlySerIleLeuGLyThrHisPheILeGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVaL AsnIleValCysHisArgTrpThrArgMet AspIleAspGlyLysProHisProHisSer PheIleArgAspSerGlyGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly IleAspIleLysSerSerLeuSerGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerglnPhe TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrThr LeuLysGluThrTrpAspArgîleLeuSer ThrAspValAspAlaThrTrpClnTrpLys AsnPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluvalThrLeuLysThrPhe AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnIleLeu AlaArgGlnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu IleAspLeuSerTrpHisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla ProGlnSerAspProAsnGlyLeuIleLys CysThrValGlyArgSerSerLeulysSer. LysLeu précédée éventuellement d'une méthionine. En effet, la protéine codée par Les séquences d'ADNc données ci-dessus peut subir une maturation par la méthionyl-aminopeptidase, qui la clive de son résidu méthionine amino-terminal. L'invention a également trait au médicament contenant la protéine définie ci-dessus. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ciaprès : une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de L'homme de l'art, est exposée en détail dans L'ouvrage de Maniatis et al : "Molecular cloning : a laboratory manual" publié en 1984 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York. EXEMPLE 1 : Isolement des ARN messagers d'Aspergillus flavus La souche d'A. flavus productrice d'urate oxydase a été cultivée dans des conditions de production d'urate oxydase, c'està-dire dans un milieu contenant de l'acide urique de composition suivante : glucose 15 g/l, MgSO4,7H2O 1 g/l, KH2PO4 0,75 g/k, CaCO3 1,2 g/l, acide urique 1,2 g/l, KOH 0,5 g/l, huile de soja 0,66 ml/l, FeSO4,7H20 10 mg/l, CuS04,5H20 1 mg/l, ZnS04,7H20 3 mg/l, MnSO4,H20 1 mg/l. Le milieu est ajusté à pH 7 avec H2SO4 1M et est stérilisé à 120 C pendant 80 min. Dans un erlenmeyer de 5 l on ensemence 1,5 l de milieu avec environ 1 à 3,107 spores. La culture est incubée pendant environ 40 h à 30 C sous agitation (120 tr/min). Le mycélium est récupéré par fiLtration sur gaze, lavé avec de l'eau et congelé dans L'azote liquide. 15 g de mycélium (poids humide) sont décongelés et resuspendus dans 45 ml de tampon de lyse puis repris dans un même volume de billes (0,45 m de diamètre). Le tampon de lyse est constitué de thiocyanate de guanidine 4 M, Tris-HCL 10 mM pH 7,6, EDTA 10 mM, ss- mercaptoéthanol 50 ml/l. La suspension mycélienne est broyée au broyeur Zellmühler (vibrogène) pendant 5 min. Le broyat est récupéré et les billes décantées. Le surnageant est prélevé (environ 45 ml) et ramené à 3 M final en chlorure de lithium et conservé à OOC. Après deux jours, on le centrifuge pendant 60 min à 10 000 tr/min. Le surnageant est écarté qt le culot est repris dans 40 ml de LiCl 3M et recentrifugé à 10 000 tr/min pendant 1 h 30. On ajoute, la proétinase K (SIGMA), 40 g/ml du SDS (0,1 % P/V) et de L'EDTA à 20 mM. On incube à 370C pendant 3 h. On précipite avec 2 volumes d'éthanol, puis on effectue un Lavage à l'éthanol 70 X. On reprend le culot dans 0,5 ml de tampon TE (tris HCI 10 mM EDTA, 1 mM pH 7,5), on extrait 2 fois au chloroforme, on précipite à l'éthanol. Les ARN sont conservés à -800C dans l'alcool. EXEMPLE 2 : Purification de la fraction poly A+ des ARN Environ 1 mg d'ARN est précipité 20 min à 40C (15 000 tr/ min) puis lavé avec de I'éthanol 70 X puis séché. Le culot est repris dans 1 ml de tampon TE et resuspendu par agitation au vortex. L'oligo dT-cellulose type 3 (commercialisé par Collaborative Research Inc, Biomedicals Product Division) est prépare suivant les recommandations du fabricant. L'ARN est déposé sur L'oligo dT, agité doucement pour resusprendre tes billes, puis chauffé pendant 1 min à 650C. La suspension est ajustée à 0,5 M NaCI puis mise à agiter doucement pendant 10 min. La suspension est alors centrifugée pendant 1 min à 1 000 tr/min, le surnageant est éliminé, le culot est lavé 2 fois avec 1 ml de tampon TE contenant 0,5 M NaCI. Les surnageants sont éliminés. L'élution de La fraction polyadénylée des ARN (constituée des ARN messagers) est obtenue par suspension des billes dans 1 ml de tampon TE, puis chauffage de cette suspension à 600C pendant 1 min, suivie d'une agitation pendant 10 min sur plaque basculante. On centrifuge ensuite 1 min à 1 000 tr/min, ce qui permet de récupérer d'une part.le surnageant contenant des ARNm libres en solution et d'autre part le culot de billes de celluLose.L'ensemble des opérations ci-dessus (ê partir de l'élution) est répété. Les surnageants ainsi obtenus sont rassemblés, on élimine l'excès de billes par centrifugation et on précipite le surnageant à I'éthanol contenant du NaCI suivant les techniques habituelles. (Maniatis : op. prec.). EXEMPLE 3 : Constitution de la banque des ADNc A partir des ARN messagers isoLés comme décrit dans L'exemple précédent, on a réalisé une banque d'ADNc dans Le vecteur pTZ19R (commercialisé par PHARMACIA). Ce vecteur est un pLasmide comprenant un polylinker contenant des sites uniques de restriction. La technique de clonage utilisée est celle décrite par Caput et al, (technique de L'amorce-adapteur (Primer-adapter) : (Caput et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) (1986) 83, 16701674)). Elle consiste d'une part à digérer le vecteur par Pstl, ajouter une queue de poLydC sur L'extrémité 3' protubérante, puis à digérer les plasmides ainsi obtenus par BamHI. Le fragment correspondant au vecteur est purifié sur colonne de Sépharose CL4B (Pharmacia). Il comprend donc une queue polydC à une extrémité, l'autre extrémité étant cohésive, du type BamHI. D'autre part, les ARN messagers sont soumis à La transcription inverse à partir d'une amorce dont La séquence est la suivante 5' Ainsi, Les ADNc présentent-ils à leur extrémité 5' la séquence GATCC complémentaire de L'extrémité cohésive BamHI. Les hybrides ARN-ADN obtenus par action de la transcriptase inverse sont soumis à une hydrolyse alcaline qui permet de se débarrasser de L'ARN. Les ADNc simple brin sont alors purifiés par 2 cycles sur colonne de Sépharose CL4B et soumis à un traitement à La terminal transférase de façon à ajouter des polydG en 3'. Les ADNc sont insérés sous forme simple brin dans Le vecteur préparé comme décrit plus haut. Un second oligonucléotide "l'adapter" complémentaire de l'amorce est nécessaire pour générer un site BamHI "ouvert" à L'extrémité 5' des ADNc. Après hybridation du vecteur, de L'ADNc et de l'"adapter:", les molécules recombinantes sont circularisées par L'action de la ligase du phage T4. Les régions simple brin sont alors réparées grâce à L'ADN polymérase du phage T4. Le pool de plasmides ainsi obtenu sert à transformer La souche MC 1061 pour La résistance à L'ampicilline (Casabadan Chou et Cohen J. Bact. (1980) 143 pages 9971-980). EXEMPLE 4 : Détermination de La séquence partielle de L'urate oxydase Une préparation d'urate oxydase d'A. flavus (SIGMA) a été repurifiée par chromatographie sur une colonne Red-agarose 120 (SIGMA), suivie d'une filtration sur un gel acrylamide-agarose Ultrogel Aca 44 (IBF). Afin d'obtenir des informations sur la séquence des acides aminés de l'urate oxydase purifiée, permettant La synthèse des sondes nécessaires au clonage de L'ADNc, un séquençage aminoterminal direct de la protéine a été tenté. Ce dernier n'a pas abouti, probablement à cause d'un blocage amino-terminal de La protéine. La stratégie ci-après a donc été développée pour l'obtention de la séquence partielle de L'urate oxydase - coupure de la protéine par des enzymes protéolytiques (à l'aide des enzymes trypsine et protéase V8 de Staphylococcus auréus) - séparation des poLypeptides obtenus par HPLC phase inverse - séquençage des peptides purifiés. 1) Hydrolyse de l'urate oxydase par la trypsine, purification et séquençage des peptides I'urate oxydase à 9 mg/ml dans un tampon de carbonate d'ammonium 100 mM pH 8,9 a été digeré par la trypsine (Worthington, TPCK) avec un rapport urate oxydase/trypsine de 30/1 en poids à 300C pendant 24 h.Après l'hydrolyse tryptique, 60 ;ig d'urate oxydase digérée ont été directement injectés sur une colonne HPLC phase inverse de silice greffée Brownlee G18 (colonne 10 x 0,2 cm), équilibrée en acétonitrile 1 X (v/v), acide trifluoroacétique 0,1 X (v/v) dans l'eau. Les peptides ont été ensuite élués par un gradient linéaire d'acétonitrile dans une solution d'acide trifluoroacétique (0,1 X v/v) dans l'eau variant de 1 X à 60 X d'acétonitrile en 60 min, avec un débit de 150 pL/min. Les peptides à la sortie de la colonne ont été détectés par mesure de la densité optique à 218 nm. Le profil d'élution est présenté dans La figure 1, dans laquelle Les numéros suivant La lettre T (Trypsine) correspondent aux pics identifiés. Chaque pic a été collecté et conservé à -200C jusqu'au moment de L'anaLyse sur un séquenceur de protéines (Le modèle 470 A d'Applied Biosystems), équipé d'un chromatographe (modèle 430 A d'Apptied Biosystems) qui analyse en continu Les dérivés phénylthiohydantoiques formés, après chaque cycle de dégradation. Le tableau (1) ci-après présente les séquences peptidiques des 9 pics identifiés. 2) Hydrolyse de l'urate oxydase par la protéase V8, purification et séquençage des peptides. L'urate oxydase, à une concentration de 2 mg/ml dans un tampon acétate d'ammonium 100 mM pH 6,8, a été digérée par la protéase V8 de Staphylococcus auréus (Boehringer-Mannheim) avec un rapport urate oxydase/protéase V8 de 60/1 à 300C pendant 72 h. 160 g d'urate oxydase digérée ont ensuite été injectés sur une colonne HPLC phase inverse de silice greffée Brownîee G18 (colonne 10 x 0,2 cm) ; particules (7 x 0,03 pm) équilibrée en acétonitrile 1 Z, acide trifluoroacétique 0,1 X (v/v) dans l'eau. Les peptides ont ensuite été élés par un gradient linéaire d'acétonitriîe dans une solution d'acide trifluoroacétique dans l'eau (0,1 X (v/v)) variant de 1 X à 60 X d'acétonitrile en 60 min, avec un débit de 150 ul/mI. Les peptides à la sortie de la colonne ont été détectés par mesure de la densité optique à 218 nm. Le profil d'elution est présenté dans ta figure 2, dans laquelle les numéros suivant La Lettre V (protéase V8) correspondent aux pics identifiés. Chaque pic a été collecté et conservé à -2O0C jusqu'au moment de l'analyse sur le séquenceur de protéines déjà mentionné. Le tableau (1) ci-après présente les séquences peptidiques des 5 pics identifiés. TABLEAU (1) Séquençage des produits obtenus par hydrolyse T 17 Asn - Val - Gln - Val - Asp - Val - Val - Glu - Gly - Lys T 20 Asn - Phe - Ser - Gly - Leu - Gln - Glu - Val La trypsine T 23 Phe - Asp - Ala - Thr - Trp - Ala T 27 His - Tyr - Phe - Glu - Ile - Asp - Leu - Ser T 28 Ile - Leu - Ser - Thr - Asp - Val - Asp - Ala - Thr - Trp - Gln - Trp - Lys T 29 His - Tyr - Phe - Glu - Ile - Asp - Leu - Ser - Trp - His - Lys T 31 Ser - Thr - Asn - Ser - Gln - Phe - Trp - Gly - Phe - Leu - Arg T 32 Gln - Asn - Pro - Val - Thr - Pro - Pro - Glu - Leu - Phe - Gly - Ser - Ile Leu - Gly - Thr T 33 Gln - Asn - Pro - Val - Thr - Pro - Pro - Glu - Leu - Phe - Gly - Ser - Ile Leu - Thr V 1 Tyr - Leu - Pro - Asn - Lys - His - Tyr - Phe - Glu - Ile - Asp - Leu Ser - Trp - His - Lys A L'aide de V 2 Val - Thr - Leu - Lys - Thr - Phe - Ala - Glu - Asp - Asn - Ser - Ala - Ser Val - Gln - Ala la protéase V8 V 3 Thr - Ser - Tyr - Thr - Lys - Ala - Asp - Asn - Ser - Val - Ile - Val - Asp Thr - Asp - Ser - Ile - Lys - Asn - Thr - Ile - Tyr - Ile - Thr V 5 Gly - Lys - Gly - Ile - Asp - Ile - Lys - Ser - Ser - Leu - Ser - Gly - Leu Thr - Val - Leu - Lys - Ser - Thr - Asn - Ser - Gln - Phe - Trp - Gly - Phe Leu - Arg V 6 Gly - Lys - Gly - Ile - Asp - Ile - Lys - Ser - Ser - Leu - Ser - Gly - Leu Thr - Val - Leu - Lys EXEMPLE 5 : Criblage des bactéries 1) Préparation des sondes marquées Deux pools de sondes déduites de séquences en aminoacides de la protéine ont été synthétisés 'à L'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 4600.Le premier pool correspond à la séquence de résidus His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp (partie de la séquence de T 27), soit de 5' vers 3' A T G G G TCGAT TC AA TA TG T C A A A Ce pool est en fait constitué de 24 x 3 = 48 oligonucléotides différents représentant toutes Les combinaisons possibles. Le deuxième pool correspond à la séquence en résidus aminoacides Gln-Phe-Trp-Gly-Phe-Leu (partie de la séquence de V5), soit de 5' vers 3' GG A G T A AAGCCCCA' AA TG AA C A C T Ce pool est constitué de 24 x 4 = 64 combinaisons. Les sondes sont marquées à La terminale désoxynucléotide transférase (TdT) (commercialisé par IBI, Inc). La réaction s'effectue sur 100 ng d'un mélange d'oligonucléotides en solution (100 mg/ml) dans du tampon de réaction "Cobalt" (fourni 10 fois concentrée par IBI inc. : 1,4 M de cocodylate de potassium-pH 7,2, 300 mM de dithiothréitol, 1 l d'enzyme désoxynucléotidyl-terminal-transférase (IBI inc) et 50 uCi de désoxycytidyttriphosphate dCTP marqué au P32. La réaction se fait à 37 C pendant 10 min puis est arrêtée en ajoutant 1 ul d'EDTA 0,5 M. On extrait au phénol et on dialyse sur colonne de polyacrylamide Biogel P 10 (Biorad : 150-1050). 2) Hybridation et détection des colonies contenant l'ADNc de l'urate oxydase : Environ 40 000 colonies sont criblées par la technique d'hybridation in situ mise au point par Grunstein et Hogness (1975, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 72 3961). Environ 6 000 bactéries sont étalées sur boites de Pétri de façon à obtenir des colonies isolées. Après incubation pendant 24 h à 370C, chaque boite est repliquée sur 2 filtres, chaque filtre étant destiné à être traité avec un des 2 pools de sondes, de façon que toutes les colonies obtenues soient testées avec les 2 pools de sondes en parallèle. Les filtres sont mis à hybrider avec un des 2 pools de sondes dans un tampon contenant 6 x SSC, 10 x Denhardt's et 100 g/ ml d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé (SIGMA). La,tempé- rature d'hybridation est de 420C et la durée de 16 h. La solution 6 x SSC s'obtient par dilution d'une solution 20 x SSC. La préparation du tampon 20 x SSC est décrite dans Maniatis, Fritsch et Sambrook (op. cité). En résumé, ce tampon contient 175,3 g/l de NaCI ; 88,2 g/l de citrate de sodium et est ajusté à pH 7 par quelques gouttes de NaOH 10N. La solution 10 x Denhardt's contient 1 g de Ficoll, 1 g de polyvinylpyrrolidone, 1 g de sérum-albumine humaine pour 500 ml de volume final. Après Lavage dans la solution 6 x SSC à 42 C (3 h avec 5 changements de bain), les filtres sont essuyés au papier Joseph et mis en autoradiographie. Les filtres sont révélés après 16 h. il est apparu qu'une fraction d'environ 0,5 Z des colonies hybridait avec les 2 pools de sondes. 5 colonies parmi celle-ci ont été reprises et purifiées. On a préparé l'ADN plasmidique de chacune de ces colonies, et l'on a analysé cet ADN par digestion avec soit BamHI, soit HindIII, soit à la fois BamHI et HindIII. Après ana lyse sur gel d'agarose, il est apparu que les 5 plasmides obtenus sont linéarisês par BamHI et par HindIIi. Les doubles digestions permettent de libérer un fragment correspondant à l'intégralité de l'ADNc cloné. La taille de ce fragment est d'environ 1,2 Kb dans 3 cas, d'environ 0,9 Kb dans les 2 autres cas. Pour la détermination ci-après on a sélectionné un des fragments de 0,9 Kb et un des fragments de 1,2 Kb qui ont été réclonés (voir exemple 6 ci-après). EXEMPLE 6 : Détermination de la séquence de l'ADNc de L'urate oxydase On a recloné un des fragments de 0,9 Kb d'une part (clone 9A) et un des fragments de 1,2 Kb (clone 9C) d'autre part, dans I'ADN de la forme replicative de phage simple-brin M13. L'ADN des clones M13 contenant d'une 'part le fragment de 0,9 Kb et d'autre part Le fragment de 1,2 Kb a été soumis à une digestion exonucléasique de manière à générer une série de clones M13 chevauchants (procédure Cyclone I Biosystem" de I8I). Ces derniers ont été séquencés par la méthode des didéoxyribonucléotides (Sanger et al, PNAS-U.S.A.-1977, 14, 5463-5467). La'séquence nucléotidique du clone 9C est représentée sur la figure 3 Laquelle indique également par une flèche + le début du clone 9A et par un symbole nucléotidique muni d'un astérisque * les nucléotides séquences du clone 9A non identiques à ceux du clone 9C (quand on fait correspondre les deux séquences). On constate que - la séquence nucléotidique du fragment le plus long (clone 9C) recouvre celle du fragment le plus court (clone 9A), a deux différences près (v figure 3). Une des différences est silencieuse, l'autre correspond à un changement d'un résidu tryptophane en résidu glycine. Ces différences peuvent être dues, soit à des différences dans les ARN messagers isolés, (Cf. exemple 2 cidessus), soit à des erreurs de la transcriptase inverse utilisée lors de la constitution de la banque des ADNc (Cf. exemple 3 cidessus). Dans le cas du fragment le plus long, un codon ATG (en position 109 sur la figure 3) ouvre une phase ouverte correspondant à un polypeptide de 302 aminoacides, de masse moléculaire' voisine de 34240 Da, dont la séquence correspond à la séquence partielle de l'urate oxydase d'A. flavus purifiée (Cf. exemple 4). On a représenté sur la figure 4 la séquence d'ADN ouverte par le codon ATG et te polypeptide codé, ainsi que par des flèches en vis-à-vis avec le polypeptide codé les peptides séquencés (Cf. exemple 4) obtenus par hydrolyse de l'urate oxydase d'A. flavus à l'aide de la trypsine et de la protéase Ve. On constate que la séquence du polypeptide se termine par le triplet Ser-Lys-Leu, typique des enzymes à localisation peroxisomale (Gould S.J. et al, J. Cell, Biology 108 (1989) 1657-1664). EXEMPLE 7 : Construction d'un vecteur d'expression de 1'ADNc de l'urate oxydase On a préparé le plasmide p466, vecteur d'expression dans E. coli. Ce dernier comprend un fragment de pBR327 incluant l'origine de réplication et le gène de résistance à l'ampicilline, il comprend également un promoteur synthétique d'E. coli (R. RODRIGUEZ et M. CHAMBERLIN "Promoters-Structure ans function (1982) Preager), une séquence de Shine-Dalgarno, suivi d'un polylinker présentant les sites uniques Ndel et Kpnl, un terminateur de transcription (dérivé du phage fd) et le gène lac i. Ce plasmide t été construit à partir d'un plasmide d'expression de l'hGH Enns E. coli (p462) par substitution d'un fragment portant le gene de l'hGH par 1'ADNc de l'urate oxydase. La construction du plasmide p466 va maintenant être décrite plus en détail dans l'exposé ci-après dans lequel il sera fait référence aux figures 5, 6, 7, 8, 9. La figure 5 représente une carte de restriction du plasmide p163,1. Les différents segments de restriction sont marqués de manière arbitraire selon la légende ci-dessous = Segment d'ADN issu du plasmide pBR322 = Localisation de l'origine de réplication (ORI) = Segment d'ADN contenant la séquence codant pour un précurseur naturel de l'hGH = Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur de transcription = Segment d'ADN contenant un promoteur-opérateur hybride tryptophane lactose UV5 = Segment d'ADN codant pour la !-lactamase (ApR résistance à l'ampicilline). La figure 6 représente la carte de restriction d'un plasmide pl60 dont les fragments PvuI-XhoI-BamHI(1) et PvuI-ORI-BamHI(2) proviennent respectivement des plasmides p163,1 et pBR327 et dont le petit fragment BamHI(2)-BamHI(1) est le fragment 3 décrit ciaprès. La figure 7 représente la carte de restriction du plasmide p373,2. Les différents segments de restriction sont marqués de maniere arbitraire'selon la légende ci-dessous = Séquence PvuI-BamHI issue du plasmide pBR327 = Séquence PvuI-XhoI issue du plasmide p163,1 = Séquence XhoI-HincII issue du plasmide p163,1 ClaI NdeI Pstl (Hindi) Il I Fragment 4 décrit ci-après = Fragment 3 décrit ci-après = Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur de transcription La' figure 8 représente une carte de restriction du plasmide p462, le fragment synthétique BglII-HindIII défini ci apres étant représenté par La figure 9 représente une carte de restriction du plasmide p466, le fragment NdeI-KpnI comprenant le gène codant pour l'urate oxydase étant représente par 1) Construction du plasmide p373,2 La stratégie mise en oeuvre fait appel à des fragments obtenus à partir de plasmides préexistants accessibles au public et à des fragments préparés par voie de synthèse selon les techniques maintenant couramment utilisées. Les techniques de clonage employées sont celles décrites par T. MANIATIS EF, FRITSCH et J. SAMBROOK, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). La synthèse des oligonucléotides est réalisée à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Biosearch 4 600. On a soumis le plasmide p163,1 (figure 5), décrit dans la demande de brevet EP-A-0245138 et déposée à la CNCM sous la référence I-530 le 17 février 1986, à une digestion par les enzymes PvuI et BamHI. Ce plasmide contient le gène codant pour l'hGH. Le fragment PvuI-BamHI - ci-après fragment 1 - contenant le site d'action de l'enzyme de restriction XhoI, représenté sur la figure 5, a été purifié. De même, on a soumis le plasmide pBR327, bien connu de l'homme de l'art, (cf. SOBERON, X et al., Gene, 9 (1980) 287-305) à une digestion par les enzymes PvuI et BamHI. Le fragment PvuI-BamHI - ci-après fragment 2 -, contenant l'origine de réplication, a été purifié. Puis on a préparé le fragment 3, qui est un fragment synthétique BamHI(1)-BamHI(2) contenant le gène lac i et son promo teur dont la séquence est la suivante sur laquelle les deux ext ré- mites du brin sont repérées par les nombres 1 et 2 pour préciser l'orientation du fragment dans les plasmides décrits aux figures 6 et 7. FRAGMENT 3 BamHI(1) 5' GATCC GCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTT ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CCAGGGTGGT TTTTCTTTTC ACCAGTGAGA CGGGCAACAG CTGATTGCCC TTCACCGCCT GGCCCTGAGA GAGTTGCAGC AAGCGGTCCA CGCTGGTTTG CCCCACCACC CGAAAATCCT GTTTGATGGT GGTTAACGGC GGGATATAAC ATGAGCTGTC TTCGGTATCG TCGTATCCCA CTACCGAGAT ATCCGCACCA ACGCGCAGCC CGGACTCGGT AATGGCGCGC ATTGCGCCCA GCGCCATCTG ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CAGTGGGAAC GATGCCCTCA TTCAGCATTT GCATGGTTTG TTGAAAACCG GACATGGCAC TCCAGTCGCC TTCCCGTTCC GCTATCGGCT GAATTTGATT GCGAGTGAGA TATTTATGCC AGCCAGCCAG ACGCAGACGC GCCGAGACAG AACTTAATGG GCCCGCTAAC AGCGCGATTT GCTGGTGACC CAATGCGACC AGATGCTCCA CGCCCAGTCG CGTACCGTCT TCATGGGAGA AAATAATACT GTTGATGGGT GTCTGGTCAG AGACATCAAG AAATAACGCC GGAACATTAG TGCAGGCAGC TTCCACAGCA ATGGCATCCT GGTCATCCAG CGGATAGTTA ATGATCAGCC CACTGACGCG TTGCGCGAGA AGATTGTGCA CCGCCGCTTT ACAGGCTTCG ACGCCGCTTC GTTCTACCAT CGACACCACC ACGCTGGCAC CCAGTTGATC GGCGCGAGAT TTAATCGCCG CGACAATTTG CGACGGCGCG TGCAGGGCCA GACTGGAGGT GGCAACGCCA ATCAGCAACG ACTGTTTGCC CGCCAGTTGT TGTGCCACGC GGTTGGGAAT GTAATTCAGC TCCGCCATCG CCGCTTCCAC TTTTTCCCGC GTTTTCGCAG AACGTGGCT GGCCTGGTTC ACCACGCGGG AAACGGTCTG ATAACAGACA CCGGCATACT CTGCGACATC GTATAACGTT ACTGGTTTCA CATTCACCAC CCTGAATTGA CTCTCTTCCG GGCGCTATCA TGCCATACCG CGAAAGGTTT TGCGCCATTC GATGGTGTCC G 3' BamHI(2) Les fragments 1, 2 et 3 ont été alors ligués de manière à obtenir le plasmide p160 représenté sur la figure 6. Ce plasmide a été soumis à une digestion partielle par les enzymes de restriction HincII et PstI. Le grand fragment HincII-PstI, contenant L'origine de réplication et représenté sur la figure 6, a été ensuite Ligué au fragment 4, représenté ciaprès, qui est un fragment synthétique d'ADN portant une séquence codant pour les 44 premiers acides aminés d'un précurseur naturel de l'hGH et en amont de cette séquence des signaux de régulation. FRAGMENT 4 -1 1 GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CTG TTG CGA TAC GAG GCG CGG GTA GCA GAC GTG GTC GAC CGG AAA CTG TGG ATC D N A M L R A H R L H Q L A F L T Y PstI CAG GAG m GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CA GTC CTC AAA CTT CTT CGG ATA TAG GGT TTC CTT GTC TTC ATA AGT AAG G Q E F E E A Y I P K E Q K Y S F 44 Dans ce fragment, Les acides aminés sont désignés par des lettres selon le code suivant : : A = Alanine M = Méthionine C = Cysteine N = Asparagine D = Acide aspartique P = Proline E = Acide glutamique Q = Glutamine F = Phénylalanine R = Arginine G = Glycine S = Sérine H = Histidine T = Thréonine I = Isoleucine V = Valine K = Lysine W = Tryptophane L = Leucine Y = Tyrosine Sont successivement soulignées dans ce fragment les séquences -35 (TTGCTT) et -10 (TATAAT) de la séquence promotrice, et la séquence de Shine et Dalgarno bien connue de l'homme de l'art. Le plasmide p380,1 a été ainsi obtenu. Le plasmide p380,1 a été ensuite soumis à une digestion par les enzymes de restriction Clal et NdeI de manière à en éliminer le petit fragment ClaI-NdeI du fragment 4 ci-dessus et à lui substituer le fragment CLaI-NdeI ci-après CLaI 5' CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT NdeI ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGGAGATATACA TAAAGTGTGTCAAAAAGCGCTTCTTCCTCTATATGTAT 5' Le plasmide résultant est le plasmide p373,2 (figure 7). 2) Construction du pLasmide p466 : Le plasmide p373,2 a été soumis à une double digestion par les enzymes BgLII et HindIII. Le grand fragment issu de cette digestion a été purifié et ligué avec un fragment d'ADN synthétique, dont la séquence donnée ci-après est destinée à reconstituer la fin du gêne de L'hGH suivie en 3' des sites de clonage KpnI et SnaBI. B g l I I GATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT ----±--------±--------±--------±--------+ A TTCGTCTGGATGTCGTTCAAGCTGTGTTTGAGTGTGTTGCTA GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTC ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ CTGCGTGATGAGTTCTTGATGCCCGACGAGATGACGAAGTCCTTCCTGTACCTGTTCCAG F S P I GAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGTAA ---------±--------±--------±--------±--------±--------+ CTCTGTAAGGACGCGTAGCACGTCACGGCGAGACACCTCCCGTCGACACCGAAGATCATT H i S n K n d p a i n B I I I I GGTACCCTGCCCTACGTACCA ---------±--------±--- CCATGGGACGGGATGCATGGTTCGA Ce fragment comprend les extrémités cohésives BglII et HindIII. Le nouveau plasmide ainsi formé p462 (Cf.Fig. 8) comprend ainsi un site KpnI et un site NdeI qui vont servir au clonage du fragment portant L'ADNc de l'urate oxydase dans te vecteur d'expression. Le plasmide hybride dérivé de pTZl9R portant l'ADNc d'environ 1,2 Kb (clone 9C), de L'urate oxydase (voir exemple 3) comprend un site KpnI unique. Ce site est localisé quelques paires de bases en aval du site de clonage de L'ADNc. D'autre part L'ADNc de l'urate oxydase contient un site AccI situé à proximité de l'extrémité 5'. On a donc isolé et purifié le fragment AccI-KpnI comprenant la plus grande partie de cet ADNc. D'autre part on a synthétisé deux oligonucléotides complémentaires dont la séquence donnée ci-après 5' -TATGTCTGCGGTAAAAGCAGCGCGCTACGGCAAGGACAATGTTCGCGT ACAGACGCCATTTTCGTCGCGCGATGCCGTTCCTGTTACAAGCGCAGA-5' est destinée à reconstituer l'extrémité 5' de l'ADNc. Ce fragment synthétique ainsi obtenu possède une extrémité NdeI et une autre AccII. Le fragment et la séquence synthétique ont été ligués avec le vecteur d'expression coupé par KpnI et par NdeI. Cette ligation à trois fragments permet d'obtenir Le vecteur d'expression nommé p466, de L'urate oxydase pour E. coli Le plasmide p466 contient donc par construction un gène codant pour l'urate oxydase de séquence ci-après : ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG AÇGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AAATTG. (Les nucléotides différents des nucléotides de l'ADNc isolé d'A. flavus sont soulignés dans la séquence ci-dessus. Ces différences ont été introduites sur le fragment synthétique Acci-Kpni de façon à avoir en aval de L'ATG une séquence nucléotidique plus conforme à celles habituellement rencontrées dans un gène procaryote). EXEMPLE 8 : Expression de l'ADNc de l'urate oxydase La souche E. coli K12 RR1 (Bethesda research Lab. Inc.) a été transformée pour la résistance à l'ampicilline avec le plasmide p466 et avec un plasmide témoin négatif pBR322. Des colonies résistantes à l'ampicilline ont été obtenues dans les 2 cas. 1 colonie de chaque type a été mise en culture dans du milieu (LB + ampicilline 100 ug/ml). Après une nuit à 370C sous agitation, les deux cultures ont été diluées 100 fois dans du milieu (LB + ampicilline 100 g/ml). Après I h de culture on y ajoute de L'IPTG (Isopropyl BDThiogalactoside) 1 mM pendant 3 h. Immunodétection de l'urate oxydase par Western blot 1) Mode opératoire : On prélève du milieu de culture obtenu après 3 h d'induction à L'IPTG une fraction aliquote correspondant à 0,2 ml à DO = 1. On centrifuge cette dernière et on élimine le surnageant. On soumet ensuite le culot à un Western blot, technique bien connue de l'homme de l'art, qui comprend les étapes suivantes - Solubilisation du culot par ébullition pendant 10 min dans un tampon dénommé tampon de charge constitué de Tris HCI 0,125 M pH 6,8 SDS 4 X, bleu de bromophénol 0,002 X, glycérol 20 X, p- mercaptoéthanol 10 Z (selon le protocole décrit par LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685)), - séparation électrophorétique des différentes protéines contenues dans le solubilisat selon le protocole décrit par LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685), - transfert desdites protéines contenues dans le gel sur un filtre de nitrocellulose (selon la technique de H. TOWBIN et al. Proc. Natal. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354), Immunodétection, réalisée selon la technique de BURNETTE (W.W. BURNETTE Ana. Biochem. 112 (1981) 195-203), elle implique successivement Le rinçage du filtre de nitrocellulose pendant 10 min avec un tampon A (Tris-HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KI 1 mM). La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 30 min à 370C avec un tampon B (tampon A additionné de sérum albumine bovine à raison de 3 g pour 100 mL). . La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 1 h à 370C avec un immunsérum (des anticorps polyclonaux reconnais sant l'urate oxydase d'A. flavus). Le rinçage du filtre de nitrocellulose avec le tampon B. La mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 1 h à 37 C avec une solutin de protéine G arquée à L'iode 125 à 0,1 microcurie/ml. . Le rinçage du filtre avec le tampon A. . Le séchage du filtre entre deux feuilles absorbantes. . La mise en contact d'un film. radiographique. . La révélation du film. 2) Résultats : On constate que la souche transformée par le plasmide p466 surproduit une protéine de poids moléculaire apparent d'environ 33 KDa qui est reconnue par les anticorps dirigés contre l'urate oxydase d'A. flavus et qui est absente dans la souche témoin. EXEMPLE 9 : Dosage de l'activité urate oxydase On prélève du milieu de culture obtenu après 3 h d'induction à L'IPTG dans les conditions de culture décrites à l'exemple précédent une fraction aliquote correspondant à l'équivalent de 0,5 ml à DO = 1. On centrifuge cette dernière et on élimine te surnageant. On reprend les culots dans 1 ml de tampon TEA (Triéthanolamine) 0,05 M pH 8,9. La suspension cellulaire est soniquée 2 fois pendant 30 s dans la glace avec un sonicateur ultrasonic W10 (réglé à puissance 8 et intensité 4). Les extraits sont centrifugés à 10 000 g pendant 10 min, les surnageants sont utilisés pour Le dosage. On effectue les opérations ci-dessus pour quatre colonies prises au hasard d'E. coli K12 transformé par le plasmide p466 (colonies À1, B1, C1 et D1) et une colonie transformée par le plasmide pBR322). 1) Principe On suit la transformation de L'acide urique en allantoine par la diminution de l'absorbance à 292 nm. La réaction est la suivante : S; 4 Urate oxydase Yo H2D + 02 H20 + C 2 - Acide urique Allantoine (absorbant à 292 nm) 2) Réactifs a) Tampon TEA 0,05 M pH 8,9/EDTA - dissoudre 7,5 g de TEA (réactif pour analyse-Prolabo réf. 287.46.266) dans 400 ml d'eau distillée, - dissoudre 0,372 g de Complexon III (Merck-réf. 8418) dans 50 ml d'eau distillée, - réunir les deux solutions et compléter à 500 ml (solution 1), - ajuster le pH de cette solution à 8,9 par HCl û,2N, - compléter à 1 000 ml avec de l'eau distillée (solution 2). b) Acide urique Solution stock - dissoudre 100 mg d'acide urique (Carbiochem réf. 6671) dans 50 ml de la solution 1, - ajuster par HCI 0,2N à pH 8,9, - compléter à 100 ml par de l'eau distillée. La solution obtenue peut se conserver une semaine à 40C. c) Acide urique Solution Substrat - prélever 1,5 ml de solution stock d'acide urique (carbiochem réf. 6671) et diluer à 100 ml avec du tampon TEA/réactif pour analyse Prolabo réf. 287.46.266). Cette solution doit être utilisée dans la journée. 3) Mode opératoire On introduit dans la cuve de quartz d'un spectrophotomètre réglé à 292 nm et thermostaté à 300C les volumes suivants : - 600 l d'acide urique solution substrat (préchauffés à 30 C), - 100 l des surnageants ci-dessus auxquels ont été ajoutés 200 l de TEA pH 8,9 (préchauffés à 3O0C). On mélange et on lit le changement de densité optique toutes les 30 s pendant 5 min. On en déduit LE, variation de la densité optique par minute. 4) Résultats L'activité A enzymatique urate oxydase exprimée en U/ml DO 1 est calculée à partir de la mesure de #E à l'aide de la formule A = #E x Vr x d #I x VPE dans laquelle les symboles Vr, d, EI et VpE représentent respectivement le volume réactionnel (0,9 ml), Le taux de dilution (2), le coefficient d'extinction de l'acide urique à 292 nm (12,5) et le volume de la prise d'essai (0,1 ml). Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau (II) ci-apres : TABLEAU (II) Souche d'E. coLi K12 Activité urate oxydase transformée par (U/ml DO 1) pBR322 0,001 coLonie A1 0,086 coLonie B1 0,119 p466 colonie C1 0,135 colonie D1 0,118 Il apparaît clairement sur le tableau ci-dessus que les cellules d'E. coli transformées par le-plasmide p466 sont capables en présence d'IPTG de produire une activité urate oxydase. REVENDICATIONS 1. Gène recombinant caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN qui s'hybride avec une sonde de formule : T C D1 A T D2 T C D3 A A D4 T A D5 T G dans Laquelle Les symboles D1, D2, D3, D4 et D5 représentent respectivement (A, G ou T), (T ou C), (G ou A), CG ou A) et (G ou A) ainsi qu'avec une sonde de formule : A E1 E2 A A E3 C C C C A E4 A A E5 T G dans laquelle les symboles E1, E2, E3, E4 et E5 représentent respectivement (G ou A), (G ou A), (A, G, C ou T), (G ou A) et (T ou C) et code pour une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 33 kDa, qui catalyse la dégradation d'un métabolite. 2. Gène recombinant selon La revendication 1, caractérisé en ce que le métabolite est l'acide urique. 3. Gène recombinant selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la protéine a la séquence ci-après MetSerAlaValLysAlaAlaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis LysAspGluLysThrGlyValGlnThrVal TyrGluMetThrValCysValLeuLeuGlu GlyGluIleGluThrSerTyrThrLysALa AspAsnSerValIleValAlaThrAspSer IleLysAsnThrIleTyrIleThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPhe GlySerIleLeuGlyThrHisPheIleGly LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal AsnIleVatCysHisArgTrpThrArgMet AsplîeAspGlyLysProHisProHisSer PheIleArgAspSerGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly IleAspIleLysSerSerLeuSerGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhe TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrThr LeuLysGluThrTrpAspArgIleLeuSer ThrAspValAspAlaThrTrpGlnTrpLys AsnPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLysThrphe AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnlleLeu AlaArgGlnGlnLeuIleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu IleAspLeuSerXiHisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla ProGlnSerAspProAsnGlyLeuIleLys CysThrValGlyArgSerSerLeuLysSer LysLeu dans laquelle X1 représente Trp ou Gly. 4. Gène recombinant selon la revendication 3, caractérisé en ce que X1 représente Trp. 5. Gène recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite séquence d'ADN contient la séquence ci-après: ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA CAAGGTTCAC .AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG ACCCCMCGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AMTTG. 6. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il porte, avec les moyens nécessaires à son expression, un gène recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Micro-organismes procaryotes, caractérisés en ce qu'ils sont transformés par un vecteur d'expression selon la revendication 6. 8. Protéine recombinante caractérisée en ce qu'elle a la séquence ci-après SerAlaValLysAlaAlaArgTyrGly LysAspAsnValArgValTyrLysValHis LysAspGluLysThrGlyValGlnThrVal TyrGluMetThrValCysValLeuLeuGlu GlyGlulleGluThrSerTyrThrLysAla AspAsnSerValIleValAlaThrAspSer IleLysAsnThrIleTyrIleThrAlaLys GlnAsnProValThrProProGluLeuPhe GlySerIleLeuGlyThrHisPheIleGlu LysTyrAsnHisIleHisAlaAlaHisVal AsnlleValCysHisArgTrpThrArgMet AsplleAspGlyLysProHisProHisSer PheIleArgAspSerGluGluLysArgAsn ValGlnValAspValValGluGlyLysGly IleAsplleLysSerSerLeuSerGlyLeu ThrValLeuLysSerThrAsnSerGlnPhe TrpGlyPheLeuArgAspGluTyrThrThr LeuLysGluThrTrpAspArgIleLeuSer ThrAspValAspAlaThrTrpGlnTrpLys AsnPheSerGlyLeuGlnGluValArgSer HisValProLysPheAspAlaThrTrpAla ThrAlaArgGluValThrLeuLysThrPhe AlaGluAspAsnSerAlaSerValGlnAla ThrMetTyrLysMetAlaGluGlnIleLeu AlaArgGlnGlnLeulleGluThrValGlu TyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlu IleAspLeuSerTrpHisLysGlyLeuGln AsnThrGlyLysAsnAlaGluValPheAla ProGlnSerAspProAsnGlyLeuIleLys CysThrValGlyArgSerSerLeuLysSer LysLeu précédée éventuellement d'une méthionine. 9. Médicament caractérisé en ce qu'il contient la protéine recombinante selon la revendication 8.