Brevet FR2649993A1 — publié le 19910125

L'acide L-glutamique est un aminoacide important utile comme assaisonnement et pour d'autres applications. La présente invention propose un procédé amélioré de fermentation pour la production de cet aminoacide. On connaît déjà des procédés de fermentation pour produire L'acide L-glutamique, qui utilisent une souche sauvage de Brevibacterium ou de Corynebacterium, une souche résistante aux anaLogues de L'acide glutamique, une souche résistante aux inhibiteurs respitoires tels qu'acide cétomalonique et acide fluoroacétique ou une souche résistante à l'esculetine. La présente invention a pour objet d'améliorer le rendement de fermentation d'acide L-glutamique en réduisant ainsi son coût de production. Les recherches pour résoudre Le probLème cité ci-dessus ont amené t'inventeur à trouver que L'acide L-glutamique peut être produit avec un rendement plus élevé en utilisant des mutants résistants à la prumycine et ses dérivés et dérivés des microorganismes producteurs de L-glutamate déjà connus du genre Brevibactérium et du genre Corynebacterium. La prumycine est un antibiotique produit par des micro-organismes appartenant au genre Bacilles. Quelques exemples des souches de Brevibacterium et de Corynebacterium résistantes à La prumycine et à ses dérivés utilises dans cette invention sont énumérés ci-dessous. Brevibacterium Lactofermentum AJ 12475 FERM BP-2922) Brevibacterium lactofermentum AJ 12476 (FERM P-10828, FERM BP-2923) Brevibacterium flavum AJ 12477 (FERM P-10829, FERM BP-2924) Corynebacterium glutamicum AJ 12478 (FERM P-10830, FERM BP-2925). Ces souches sont dérivées de Brevibacterium Lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium flavum ATCC 14067 et Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, respectivement, par mutation. La mutation peut être effectuée par des procédés ordinaires tels qu'irradiation par Les rayons ultraviolets ou Les rayons X ou y ou par traitement par un agent mutagène (par exempLe, traitement par 200 yg/ml de nitrosoguanidine à O C pendant 20 min). Le tabLeau 1 montre les résultats expérimentaux sur La résistance de ces souches ou médicament. TABLEAU 1 Brevibacterium Brevibacterium Corynebacterium Lactofermentum flavum gLutamicum ATCC lu lu ATCC lu ATCC lu ATCC AJ AJ. ATCC AJ ATCC (mg/ml) 13869 12475 12476 14067 12477 13032 12478 0 100 100 100 100 100 100 100 2 51 1 115 110 40 100 53 105 3 23 110 110 O 98 2 99 4 8 105 104 0 88 0 90 5 6 100 90 0 70 0 85 L'acide L-glutamique est produit en utilisant ces souches comme décrit ci-dessous.La culture est effectuée en utilisant un mi lieu liquide contenant des matières sacchariques (telles que jus de sucre ou mélasse résiduaire de cannes à sucre ou de betteraves et hydrolysats d'amidon) et des matières non sacchariques (telles qu'acide acétique, éthanol et paraffine). Comme sources d'azote, on peut utiliser des sels d'ammonium, l'ammoniaque aqueuse et L'urée (composés utilisés dans La fermentation ordinaire en acide L-glutamique), ainsi que la liqueur de trempage de mais et les aminoacides obtenus par dégradation des protéines. En outre, on peut également utiliser si nécessaire des sels inorganiques (tels que phosphates et sels de magnésium) et des substances nutritives à L'état de trace (telles que thiamine et biotine).En outre, on peut également ajouter au milieu, si nécessaire, des substances inhibitrices contre L'action de la biotine (telles que monopalmitate de polyoxyéthylénesorbitanne et pénicilline). La culture doit de préférence être mise en oeuvre en conditions aérobies à une température de 24 à 370C en maintenant le pH dans l'intervalle de 6 à 9 par l'utilisation d'un acide ou d'une base inorganique ou organique, d'urée, de carbonate de calcium ou de gaz ammoniac. L'acide L-glutamique accumulé dans La liqueur de fermentation peut être récupéré par une combinaison convenable du traitement par une résine échangeuse d'ions et d'autres techniques connues. Le degré de croissance des souches dans le tableau 1 a été étudié selon La technique ci-dessous. Chaque souche a été cultivée dans un mi lieu naturel incliné (contenant 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de levure et-0,5 g/dl de NaCl ; pH .7,0) pendant 24. h, une suspension dans L'eau stérile des cellules ayant poussé a été inoculée dans un mi lieu contenant 0,5 g/dl de glucose, 0,15 g/dL d'urée, 0,15 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,3 g/dl de KH2PO4, 0,1 g/dl de K2HP04, 0,01 g/dl de MgS04.7H20, 0,1 mg/dl CaCt2.2H20, 10 y/dl de chlorhydrate de thiamine, 3 y/dl de biotine, 0,44 mg/dl de Na2B407. 10H20, 4,85 mg/dl de FeCl2.6H20, 1,95 mg/dl de CuSO4.5H20, 0,185 mg/dl de (NH4)6Mo7024.4H20, 44 mg/dl de ZnS04.7H20, 0,36 mg/dl de MnCl2.4H20 et La quantité de prumycine indiquée -dans te tableau (pH 7,0) et on a continué la culture pendant 24 h. Les exemples suivants illustrent L'invention sans toutefois en Limiter la portée. Exemple 1 On a préparé un mi lieu de culture contenant 10 g/dl de glucose, 0,1 g/dl de KH2PO4, 0,1 g/dl de MgS04.7H20, 20 y/dl de chlorhydrate de thiamine, 36 mg/dl de concentré de solution de dégradation de haricot, 2,0 g/dl de sulfate d'ammonium, 1 mg/dl de FeS04.7H20, I mg/dl de MnS04.4H20 et 3 y/l de biotine et on a placé chaque fois 20 ml du mi lieu ainsi obtenu dans des flacons à secousses de 500 ml et stérilisé en chauffant pendant 10 min à 1150C. On a inoculé chacune des souches dans Le mi lieu stérilisé et on l'a fait pousser å 31,50C en utilisant une secoueuse pour culture agitée. Le pH de La liqueur de culture a été maintenu dans l'intervalle de 6,5 à 8,0 par addition de 5 g/dl de carbonate de calcium, on a ajouté 2,5 g/dl de sulfate d'ammonium après 24 h, la fermentation était arrêtée après 46 h et on a mesuré le rendement en acide L-glutamique accumulé. Les résultats obtenus sont rassemblés dans Le tableau 2. TABLEAU 2 Rendement total en acide L-glutamique Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 48 % AJ 12475 54 X AJ 12476 51 % Corynebacterium glutami cum ATCC 13032 45 Z AJ 12478 .58 x Exemple 2 On a préparé un mi lieu de culture contenant 100 mg/ml de mélasse de betteraves (comme sucre réducteur) et 1 mg/dl de KH 2P04 (pH 7,0) et on a placé chaque fois 30 ml du milieu ainsi obtenu dans des flacons à secousses de 500 ml et on a stérilisé en chauffant pendant 10 min à 1150C. On a inoculé chacune des souches dans Le milieu stérilisé et on les a fait pousser à 31,5 C en utiLisant une secoueuse pour culture agitée et on a maintenu le pH de La Liqueur de culture dans l'intervalle de 6,-5 à 8,0 par addition de solution aqueuse à 400 mg/dl d'urée. On a ajouté du monopalmitate de polyoxyéthylènesorbitanne à une concentration de 4 mg/ml 30 h après l'inoculation (lorsque les cellules avaient poussé à un degré prédéterminé) pour terminer La fermentation et on a mesuré le rendement en acide L-glutamique accumulé. Les résultats obtenus sont rassemblés dans Le tableau 3. TABLEAU 3 Rendement total en acide L-glutamique Brevibacterium Lactofermentum ATCC 13869 57 % AJ 12475 61 % AJ 12476 62 X Brevibacterium flavum ATCC 14067 56 X AJ 12477 60 X Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 53 X AJ 12478 58 X REVENDICATION Procédé pour la fabrication d'acide L-glutamique, caractérisé en ce qu'il consiste à faire pousser un micro-organisme appartenant en genre Brevibacterium ou au genre Corynebacterium, résistant à La prumycine et à ses dérivés et capable de produire L'acide L-glutamique ; et à récupérer L'acide L-glutamique formé et accumulé dans La liqueur de culture.