Brevet FR2654744A1 — publié le 19910524

L'invention a pour objet l'analyse de formules sanguines par comptage et discrimination de sous-populations leucocytaires et concerne plus particulièrement un réactif et une méthode d'utilisation de celui-ci pour la détermination, en cytométrie de flux, d'au moins une sous- population leucocytaire. L'importance diagnostique de la détermination précise des différentes populations leucocytaires est reconnue depuis longemps En effet, l'apparition de rapports leucocytaires anormaux peut être corrélée à l'apparition de certaines maladies (réactions immunitaires, réactions inflammatoires, apparition de néoplasmes ou de leucémies). Les méthodes traditionnelles d'analyse manuelle comprenant une séparation physique des érythrocytes (par sédimentation ou aggrégation) puis des colorations d iffêern 4 elles des cytoplasmes et des novaux des leucocytes et leur observation morphologique au microscope, permettaient déjà d'identifier tous les types de leucocytes c'est à dire les granulocytes (basophiles, éosinophiles et neutrophiles) et les agranulocytes (monocytes et lymphocytes) Ces méthodes donnent des résultats fiables mais leur mise en oeuvre est longue, ce qui les rend rarement ou difficilement transposables aux déterminations en appareils automatiques. Différents appareils sont déjà commercialisés qui permettent le comptage automatique des populations leucocytaires et divers réactifs et colorants ont été mis au point et adaptés aux principes de fonctionnement de ces appareils. Ainsi on peut mesurer les tailles des cellules (après lyse différentielle de leur cytoplasme) soit par mesure de variations de résistivité soit par mesure de diffraction optique; on peut aussi effectuer des colorations (enzymatiques ou non) spécifiques des différents types cellulaires et mesurer les tailles et densités optiques des cellules à différentes longueurs d'onde. Un des problèmes posés par l'automatisation est la confusion possible entre les erythrocytes et certains leucocytes de petite taille, artefact qui n'apparaissait pas à l'observation au microscope Il faut donc assurer la lyse totale des érythrocytes avant le passage de l'échantillon sanguin dans l'appareil, tout en préservant l'intégrité des leucocytes De plus, le mélange réactionnel doit comprendre un ou plusieurs réactifs qui faciliteront la discrimination des différents types de leucocytes et leur regroupement en zones bien distinctes sur un histogramme. Ainsi le brevet WO 8505684 (Coulter Electronics Inc) décrit un ensemble de réactifs qui assurent, en deux étapes, une lyse spécifique des érythrocytes par la saponine, puis, une fixation (et par ce fait une protection) des leucocytes par le glutaraldéhyde De plus, la discrimination des différents types de leucocytes est Favorisée par l'addition d'un réactif comme le phénoxy-2- éthanol; certaines populations peuvent encore être spécifiquement colorées et identifiées par fluorescence Ce procédé efficace e_ fiable mais complexe est particulièrement adapté à un appareil de type Coulter Counter ) tel que décrit dans le brevet US 3,502,974. D'autres méthodes, décrites par exemple dans le brevet US 3,740,143, particulièrement adaptées aux appareils Technicon G, mettent en jeu plusieurs réactions effectuées en parallèle et révélant chacune un type cellulaire, ces réactions spécifiques étant en outre précédées ou suivies d'un traitement de lyse des érythrocytes et éventuellement d'un traitement de fixation des leucocytes Les réactions spécifiques comprennent des colorations histologiques classiques (comme le "rouge neutre" pour les basophiles) et des colorations enzymatiques (comme la révélation du contenu en peroxydases des éosinophiles et neutrophiles par le chloronaphtol ou du contenu en lipases des monocytes par le butyrate de naphtol). D'une manière générale, des analyses détaillées et fiables ne sont réalisées que par des appareils fort complexes et par des méthodes qui comprennent plusieurs étapes successives, opérées avec des réactifs différents. Leur complexité rend le coût de ces analyses fort élevé, et, pour des diagnostics de routine, il est toujours souhaitable de simplifier le procédé, tout en gardant un même pouvoir de discrimination et un même degré de fiabilité. Ainsi la Demanderesse a mis au point une composition qui permet, en une seule réaction, d'effectuer la lyse des érythrocytes, la fixationprotection des leucocytes et la coloration des éosinophiles et d'assurer une très bonne séparation des différentes sous-populations leucocytaires sur un histogramme Le mode d'utilisation de la composition selon l'invention est particulièrement rapide et est adapté à n'importe quel type d'appareil de comptage automatique. Plus particulièrement, le réactif selon 1 T inventeon comprend, d'une par=, au moins un aaent de lyse des érythrocytes et, de préférence, une saponine et du dodécyl sulfate de sodium (SDS), d'autre part, un agent capable de colorer différentiellement les diverses populations leucocytaires et, en particulier, le Noir chlorazol à une concentration comprise entre 50 et 650 mg/l. Les autres contituants du réactif qui sont destinés à préserver l'intégrité et la morphologie cellulaires naturelles et à améliorer leur discrimination en détection optique, comprennent au-moins un sel physiologique pour maintenir le p H entre 7,0 et 12,0, un sel d'ammonium tertiaire ou quaternaire, un alcool primaire, secondaire ou tertiaire, un agent tensioactif, un préservateur des structures cellulaires et un alkylèneglycol. Le Noir chlorazol (aussi appelé Noir Erié ou Noir formique) est un réactif classique, utilisé depuis 1937 en histologie végétale (Cannon, H G, Nature, 139, 549) et utilisé pour la coloration spécifique des éosinophiles, pour l'observation au microscope (Ce réactif et son mode d'utilisation ont été décrits par M Piette, Ann Biol. Clin 1961, 19, 729-734 et K Lawrence, Am J Clin Pathol. 1981, 76, 810-812). Les conditions habituelles d'utilisation du Noir chlorazol ( 650 mg/l) ne sont pas du tout adaptées à une détection en appareil automatique à photodiode, les éosinophiles étant beaucoup trop noirs et les autres cellules apparaissant totalement transparentes De nouvelles conditions d'utilisation ont été mises au point, à la fois en diminuant la concentration du réactif et en augmentant la température à laquelle la réaction est opérée sur l'échantillon sanguin. Ainsi le réactif selon l'invention contient de préférence une concentration de Noir chlorazol inférieure à 100 mg/l La Demanderesse a observé que, dans ces conditions, les éosinophiles sont nettement colorés et, en outre, les autres granulocytes sont fixés et cla-e Dez= discriminés Une légère coloration de toutes les populations leucocytaires apparait mais elle s'efface si on prolonge la durée de rêaction. En cherchant le meilleur équilibre des divers constituants du réactif, la Demanderesse a constaté que l'addition de glutaraldéhyde en solution aqueuse améliorait la discrimination des tailles des cellules, quand la mesure est réalisée par résistivité Toutefois le glutaraldéhyde augmente la taille des stromas résultant de la lyse des érythrocytes Cet artefact est avantageusement corrigé par l'addition de SDS qui accélére la destruction des érythrocytes, à des concentrations qui n'abiment pas la morphologie des leucocytes En outre, l'addition d'un sel d'ammonium tertiaire ou quaternaire améliore encore la discrimination entre les souspopulations cellulaires et participe également à la destruction des stromas érythrocytaires On utilisera avantageusement le chlorure de dodécyltriméthylammonium On obtient des résultats équivalents avec les bromures et les iodures; de même on peut utiliser les sels tertiaires ou quaternaires dont les radicaux alcoyles préférés sont les C 12 et C 14 Ainsi on choisira un halogénure (Cl, Br ou I), de dodécyldi(ou tri) méthylammonium ou un tétradécyldi(ou tri)méthylammonium, seul ou en combinaison. Le réactif selon l'invention contient également un agent tensioactif choisi par exemple dans la famille des esters de polyoxyéthylène sorbitane et plus particulièrement le monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane (Tween 20), et le monooléate de polyoxyéthylène sorbitane (Tween 80 @). D'autre part l'addition d'un alkylèneglycol qui exerce également un effet préservateur sur les structures cellulaires, a surtout un effet favorable pour la lecture optique en limitant la diffraction du milieu. Ainsi selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif comprend les constituants suivants: une saponine, à une concentration comprise entre 100 et 700 mg/l, du SDS, à une concentration comprise entre 100 et 400 mg/l, du Noir chlorazol, de préférence à une concentration inférieure à 100 mg/l, un sel ou un mélange de sels physiologiques comprenant de 1,3 à 9,5 g/l de chlorure de sodium, de 15 à 20 g/l de sulfate de sodium, de 400 à 700 mg/l de carbonate de sodium, au moins un sel d'ammonium tertiaire ou quaternaire, dans un rapport final de 0,03 à 0,10 % en volume, un alcool primaire, secondaire ou tertiaire et, de préférence, l'alcool isopropylique dans un rapport final de 2 à 13 % en volume, un ester de polyoxyéthylène sorbitane en solution aqueuse, dans un rapport final de 0,2 à 2 % en volume, du glutaraldéhyde ou du formaldéhyde en solution aqueuse, dans un rapport final de 0,1 à 0,8 % en volume, de l'éthylèneglycol ou du propylèneglycol, dans un rapport final de 2 à 13 % en volume. L'invention concerne également une méthode d'utilisation de ce réactif pour la détermination en appareil de mesure automatique à cytométrie de flux d'au moins une sous-population leucocytaire La méthode selon l'invention comprend la mise en contact de l'échantillon sanguin à étudier et du réactif, dans une enceinte thermostatée, à une température comprise entre 20 et 80 C et, de préférence, entre 40 et 65 , pendant une durée inférieure à 20 secondes. La méthode comprend ensuite la détection et la discrimination des leucocytes par mesure des variations d'absorbance ou de résistivité ou la combinaison des deux, par un appareil de détection approprié et l'enregistrement de ces mesures sous forme de matrices ou d'histogrammes permettant de visualiser des contours représentatifs de la répartition des sous-populations leucocytaires. La figure 1 est un histogramme représentatif, obtenu par la mise en oeuvre de la méthode selon i 'nve tion,sur un échantillon de san ormal Sur l'histogramme inférieur (identique à l'histogramme supérieur) on a délimité les zones correspondant aux de l'invention sans toufefois en restreindre la portée. Exemple Les concentrations suivantes des divers constituants sont calculées pour la préparation d'un litre de réactif: saponine 650 mg SDS 200 mg Noir Chlorazol 65 mg chlorure de sodium 5,144 g sulfate de sodium 17,4 g carbonate de sodium 650 mg sel d'ammonium 0,3 ml alcool isopropylique 130 ml Tween 80 13 ml glutaraldéhyde 4 ml propylèneglycol 130 ml eau distillée, jusqu'à ajustement du volume final à 1 litre. Le réactif est utilisé par exemple dans un appareil de détection tel que décrit dans la demande de brevet français 89 14120 au nom de la Demanderesse mais il pourrait, de la même façon, être utilisé dans tout autre type de compteur automatique des populations leucocytaires. L'apareil est réacg pour mettre en contact un échantillon de 25 glde sang total et i ml de réactif Ce mélange est réalisé dans une enceinte thermostatée à une température co mprise entre 40 et 65 C. Un histogramme représentatif d'un échantillon de sang normal est présenté sur la figure 1. REVENDICATIONS 1. Réactif pour la détermination en appareil de mesure automatique en cytométrie de flux d'au moins une sous-population leucocytaire, caractérisé en ce qu'il comprend les constituants suivants: au moins un agent de lyse des érythrocytes du Noir chlorazol au moins un sel physiologique au moins un sel d'ammonium tertiaire ou quaternaire un alcool un agent tensioactif un préservateur un alkylèneglycol 2. Réactif selon la vn ' cacc éis en ce que l'agent de lyse des érythrocytes est choisi parmi les saponines et le dodécyl sulfate de sodium, seul ou en combinaison. 3. Réactif selon la revendication 2 caractérisé en ce que la concentration de saponine est comprise entre et 700 mg par litre de réactif. 4. Réactif selon la revendication 2 caractérisé en ce que la concentration de dodécyl sulfate de sodium est comprise entre 100 et 400 mg par litre de réactif. 5. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la concentration de Noir chlorazol est comprise entre 50 et 650 mg par litre de réactif 6. Réactif selon la revendication 5 caractérisé en ce que la concentration de Noir chlorazol est inférieure à 100 mg/l. 7. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il comprend un sel physiologique choisi parmi le chlorure de sodium, le sulfate de sodium, le carbonate de sodium, seul ou en combinaison, pour maintenir le p H entre 7,0 et 12,0. 8. Réactif selon la revendication 7 caractérisé en ce que la concentration de chlorure de sodium est comprise entre 1,3 et 9,5 g par litre de réactif. 9 Réactif selon la revendication 7 caractérisé en ce que la concentration de sulfate de sodium est comprise entre 15 et 20 g par litre de réactif. 10. Réactif selon la revendication 7 caractérisé en ce que la concentration en carbonate de sodium est comprise entre 400 et 700 mg par litre de réactif. 11. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un sel d'ammonium tertiaire ou quaternaire dans un rapport final de 0,03 à 0,10 % en volume du réactif. 12 Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que l'alcool est cbois parmi les alcools Prima -es, secondaires et tertiaires, dans un rapport final de 2 à 13 % en volume du réactif. 13 Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que l'agent tensioactif est un ester de polyoxyéthylène sorbitane en solution aqueuse, dans un rapport final de 0,2 à 2 % en volume du réactif. 14 Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que le préservateur est choisi parmi le glutaraldéhyde et le formaldéhyde, en solution aqueuse, dans un rapport final de 0,1 à 0,8 % en volume du réactif. 15 Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 caractérisé en ce que l'alkylène- glycol est choisi parmi l'éthylèneglycol et le propylène- glycol, dans un rapport final de 2 à 13 % en volume du réactif. 16 Méthode de détermination en appareil de mesure automatique en cytométrie de flux d'au-moins une sous-population leucocytaire, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un échantillon de sang avec le réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans une enceinte thermostatée, la détection et la discrimination des leucocytes par mesure des variations de résistivité ou d'absorbance ou la combinaison des deux, l'enregistrement de ces mesures sous forme de matrices ou d'histrogrammes pemettant de visualiser des contours représentatifs de la répartion des sous-populations leucocytaires. 17. Méthode selon la revendication 16 caractérisée en ce que la mise en contact du sang et du réactif est effectuée à une température comprise entre 20 et 800 C et pendant une durée inférieure à 20 secondes.