Brevet FR2652086A1 — publié le 19910322

La présente invention concerne un composé nouveau, I'oraposide, qui est un dérivé de l'acide caféique extrait de végétaux de la famille des Orobanchaceae, des compositions à usage thérapeutique contenant l'oraposide comme principe actif et des compositions dermato-cosmétiques le contenant. Des études préliminaires du Demandeur et d'autres laboratoires avaient déjà révélé la présence de dérivés de l'acide caféique dans les extraits d'Orobanchacées, plantes phanérogames parasites sans chrorophylle (Andari et al. 1980, Il Farmaco, 1, 1-30; Bridel et Charaux, 1924, C.R. Acad. Sci. 178, 1839) mais leur structure n'était pas clairement établie. L'intérêt pharmacologique de l'acide caféique (ou acide 3,4-dihydroxycinnamique) et de plusieurs dérivés naturels de celui-ci a déjà fait l'objet de nombreuses études. Ainsi Kimura et al. (Planta Medica, 1984, 473-477) ont étudié l'effet de divers tanins et en particulier de dérivés de l'acide caféique et caféoylquinique extraits de plantes de l'espèce Artemisia et ont montré leur effet inhibiteur sur la peroxydation des lipides dans les mitochondries et les microsomes de foire de rat.L'action inhibitrice de ces molécules sur les lipoxygénases participant au métabolisme des leucotriènes et de l'acide arachidonique et leur utilisation potentielle dans le traitement d'affections inflammatoires comme l'asthme ont aussi été publiées par Kimura et Okuda (J. of natural products, 1987, 50, 392-399). L'activité de différents dérivés de tanins caféiques étant multiple et variable en fonction de leur structure, il est intéressant de rechercher de nouvelles molécules de cette familier dans les plantes médicinales ou vautres, et d'en chercher de nouvelles activités pharmacologiques ou des performances supérieures. Ainsi le Demandeur a obtenu, à partir d'extraits de plantes de la famille des Orobanchaceae qui parasitent divers genêts (Cytisus scoparius et purgans) ainsi que des plantes alimentaires comme les lentilles, les fèves, les solanées (tomates, aubergines...), un nouveau composé présentant des propriétés particulièrement intéressantes. La substance extraite de l'Orobanche rapumgenistae a été obtenue à l'état pur et cristallisé, par exemple par macération alcoolique d'un extrait de plante ou de cellules de plante et soumise aux diverses analyses classiques permettant d'en établir la configuration moléculaire et la structure (séparations chromatographiques, détermination du point de fusion, études des spectres RMN, de masse, aux rayons X, IR et UV et diverses analyses biochimiques). La formule qui a été déduite de ces analyses est la suivante O-ss-D-(3-O-&alpha;-L-rhamnopyranosyl) - (4-O- caféoyl)-[(1,2)-éthylidène-2'-e-(3",4"-dihydroxyphényl)]- glucopyranoside. Le Demandeur propose de l'appeler "oraposide". L'effet hépatoprotecteur de l'acide caféique et d'autres polyphénols ayant déjà été décrit, l'effet de ltoraposide a été comparé à celui de molécules connues, visà-vis de molécules hépatotoxiques comme le nitroxynyl et le chloroforme, dans des tests in vitro. Deux marqueurs biochimiques d'hépatotoxicité ont - été étudiés sur des hépatocytes de lapins - la libération de lactate déshydrogénase dans le milieu de culture des hépatocytes et son dosage, - le dosage de la malonyldialdéhyde lors de la réaction de peroxydation des lipides dans les microsomes hépatiques. L'effet hépatotoxique des produits utilisés étant probablement dû à la libération de radicaux libres, un "piégeur de radicaux libres" connu comme i'a-tocophérol (vitamine E) a été utilisé comme référence dans les mêmes tests. Le Demandeur a observé, avec surprise, que l'effet protecteur de l'oraposide, dans ces deux tests in vitro, est nettement supérieur à celui de l'acide caféique et de lla- tocophérol. La remarquable absence de toxicité des dérivés de l'acide caféique tant per os que par injection ou par contact permet donc d'envisager de nombreuses applications pour la molécule de la présente invention. Ainsi, la présente invention concerne également une composition à usage thérapeutique contenant comme principe actif une dose efficace d'oraposide, comprise de préférence entre 0,1 et 5 %, en association avec un excipient pharmaceutiquement inerte ou d'autres substances actives. Elle sera adaptée, en fonction de l'usage voulu, à une injection, à une administration orale ou à un traitement externe par voie topique. La composition selon l'invention pourra être utilisée comme médicament pour le traitement des affections nécessitant des piégeurs de radicaux, en particulier les phénomènes inflammatoires, les intoxications des hépatocytes et le vieillissement cellulaire, surtout au niveau de la peau. La présente invention concerne aussi une composition dermato-cosmétique contenant comme principe actif une dose efficace d'oraposide (de 0,1 à 5 %) et un excipient pharmaceutiquement inerte. Le Demandeur a également- mis en évidence des propriétés antibactériennes de ltoraposide. Ainsi la préparation dans laquelle sera utilisé ce composé pourra ne pas être additionnée d'agent conservateur antimicrobien. De plus, les remarquables propriétés de ltoraposide comme inhibiteur de la peroxydation rendent inutile l'addition d'un agent protecteur du rancissement de l'excipient qui peut être de nature lipidique en dermatocosmétique, le principe actif jouant lui-même ce rôle. La composition dermato-cosmétique selon la présente invention devrait être particulièrement efficace dans la prévention du vieillissement de la peau et dans le traitement des états inflammatoires qui accompagnent souvent l'érythème solaire. En effet, on sait que dans certaines conditions métaboliques ou perturbations d'origine externe comme l'exposition aux rayons ultra-violets, la réduction de l'oxygène est incomplète et aboutit à la formation de radicaux libres pouvant détériorer les phospholipides des membranes cellulaires. La production de radicaux libres entraîne diverses manifestations physiopathologiques qui participent au vieillissement cellulaire et peut-être à la cancérogénèse, aux phénomènes inflammatoires et au processus d'intoxication hépatique, ce qui justifie l'utilisation des hépatocytes comme système-modèle in vitro. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. Les 4 figures illustrent les résultats expérimentaux. La figure 1 représente la structure de ltoraposide. La figure 2 représente la quantité de LDH (lactate déshydrogénase) relarguée par 4.106 hépatocytes (culture de 8 jours) dans le milieu de culture, 3, 7, et 24 heures après traitement 1 = non traités, 2 = traités au nitroxynyl 10-4 M, 4 = traités. au nitroxynyl 10-4 M et à l'oraposide 5.10-5 M (3, 5, 6 = autres molécules testées). La figure 3 représente la quantité de LDH (lactate déshydrogénase) relarguée par 4.106 hépatocytes (culture de 24 heures) dans le milieu de culture, 3, 7, et 24 heures après traitement, 1 = non traités, 2 = traités par le chloroforme 10-4 M, 3 = traités par le chloroforme 10-4 M et l'oraposide à 5.105M. La figure 4a représente l'inhibition de la lipopéroxydation sur des microsomes hépatiques par différents composés phénoliques à 5.10-5 M dans le milieu réactionnel 1 = témoin sans compose phénolique, 3 = oraposide 10 = acide caféique, 11 = a-tocophérol, (2, 4 à 9 autres molécules testées). La figure 4b représente l'inhibition de la lipopéroxydation par l' oraposide à différentes concentrations sur des microsomes hépatiques de lapin 1 = témoin sans oraposide, 2 = 5 10-5 M 3 = 10-5 M 4 = 5 10-6 M 5 = 2.10-6 M 6 = 10-6 M. EXEMPLE A. Préparation de l'extrait véaétal purification des cristaux, analvse et établissement de la formule de 1 'oraposide. Le matériau de départ est de la poudre de plante (Orobanche) dégraissée à l'éther de pétrole. Cette poudre est mise à macérer dans de l'éthanol à 80 % ou du méthanol à 80 %, à raison de 10 l pour 400 g de poudre de plante, à 500C. Cette macération alcoolique, après filtration, est additionnée rapidement de 20 ml d'une solution aqueuse fraîchement préparée de métabisulfite de sodium à 10%. A la suite d'un repos d'une nuit à 40C cet extrait est filtré puis concentré de manière à chasser l'alcool. L'extrait devenu aqueux subit un dégraissage définitif par un mélange : éther éthylique débarrasé des péroxydes - éther de pétrole (3 : 1). Cet extrait dégraissé est épuisé par 20 litres d'acétate d'éthyle (redistillé sur chlorure de calcium). Les phases "acétate d'éthyle" sont desséchées par du sulfate de sodium (pur, sec) , puis réunies et évaporées à sec sous vide. Le résidu poudreux obtenu, de couleur blanc-crème, est dissout dans de l'eau chaude et la solution est mise à cristalliser à la température ambiante puis à +40C. Ces cristaux sont essorés et remis en solution à chaud dans un mélange éthanol 5 % - eau 95 % puis recristallisés à froid. L'opération est répétée plusieurs fois. Le composant obtenu à l'état de cristaux purs est soumis à diverses analyses classiques, biochimiques et chimico-physiques (séparation chromatographique, détermination du point de fusion, étude des spectres RMN, de masse, aux rayons X, IR et UV) pour déterminer sa structure. L'analyse des résultats donne la formule suivante : (3-G-a-L-rhamnopyranosyl)-(4-O-caféoyl) -g(1,2)-éthylidène- 2 '-e- (3", 4"-dihydroxyphényl)j-giucopyranoside. Sa structure après étude aux rayons X est représentée dans la figure 1. B. Etude in vitro des propriétés de ltoraposide pour la protection des hépatocytes de lapins en culture. Le modèle expérimental choisi est l'étude de la libération de lactate déshydrogénase (LDH) par les hépatocytes de lapin en culture primaire, cette libération de LDH représentant un marqueur de dégradation des hépatocytes. Les hépatocytes sont volontairement intoxiqués au nitroxynyl (10-4 à 10-5 M) ou au chloroforme (de 10-3 à 10-5 M). L'effet de ltoraposide est évalué pour une concentration de 0,05 mM final dans le milieu de culture. La figure 2 montre que ltoraposide diminue très significativement le relargage de LDH par les hépatocytes intoxiqués au nitroxynyl et la figure 3 montre un effet moins net sur les cellules traitées au chloroforme mais celui-ci a un effet moins toxique. L'oraposide par lui-même ne présente aucune toxicité cellulaire, même à une concentration de 100 pLM. C. Etude in vitro de l'inhibition de la lipoperoxvdation à partir des microsomes hépatiques de latin. Une réaction de lipoperoxydation se produit lorsqu'on incube des microsomes hépatiques de lapin en présence de NADPH. Les microsomes sont récupérés après traitement des hépatocytes aux ultra-sons. La lipoperoxydation est évaluée par la formation de malonyldialdéhyde selon la méthode de Placer et al. (1966, Analyt. Biochem. 16, 359-364). La réaction est effectuée en absence (témoin) et en présence d'acide caféique ou d'oraposide à la concentration de 5.10-5 M ou en présence d'a-tocophérol (Sigma) 5.10-5 M (référence d'activité inhibitrice connue). La figure 4a montre clairement que l'acide caféique et l'a-tocophérol ont une activité inhibitrice équivalente et que ltoraposide assure une inhibition plus forte (100 %). La dose d'oraposide nécessaire pour obtenir une inhibition de 50 % est de 10-5 M (figure 4b). De plus il est possible de potentialiser l'oxydation des lipides membranaires par des générateurs de radicaux libres (CC14- et H202) , dans ces conditions l'inhibition par ltoraposide est de 100 % avec le CCl4 et de 90 % avec l'H2 2 D. Mise en évidence d'une activité antibactérienne. On sait qu'un certain nombre de dérivés de l'acide caféique inhibent la multiplication des bactéries. Cette propriété a été confirmée pour l'oraposide sur 40 souches différentes, appartenant à 10 genres de bactéries. On observe 100 % d'inhibition de toutes les souches dès la dose de 0,5 mg/ml. Une étude plus détaillée réalisée avec 29 souches de Staphylococcus aureus montre une inhibition de 70 % dès la concentration 0,06 mg/ml et de 80 % à 0,12 mg/ml. REVENDICATIONS 1.- A titre de composé nouveau, le dérivé de l'acide caféique ayant la formule suivante : O-P-D-(3-O-a-L- rhamnopyranosyl)-(4-O-caféoyl)-ffi(1,2)-éthylidène-2l-e- 3 r 4" -dihydroxyphényl )2-glucopyranos ide. 2.- Procédé de préparation du composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on soumet un extrait de plante ou de cellules de plante à une macération alcoolique. 3.- Composition à usage thérapeutique caractérisée en ce qu'elle contient une dose efficace du composé selon la revendication 1. 4.- Composition à usage thérapeutique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,1 à 5 % du composé selon la revendication 1. 5.- Composition à usage thérapeutique selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle contient un excipient pharmaceutiquement inerte approprié à une administration par voie orale, parentérale ou topique. 6.- Utilisation du composé selon la revendication 1 pour la préparation d'un médicament pour le traitement des affections nécessitant l'utilisation de piégeurs de radicaux libres. 7.- Composition dermato-cosmétique caractérisée en ce qu'elle contient une dose efficace du composé selon la revendication 1. 8.- Composition dermato-cosmétique selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,1 à 5 % du composé selon la revendication 1. 9.- Composition dermato-cosmétique selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle n'est pas additionnée d'agents conservateurs antibactériens ou antifongiques. 10.- Composition dermato-cosmétique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce qu'elle n'est pas additionnée d'agents conservateurs antioxydants. 11.- Composition dermato-cosmétique selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce qu'elle a un effet protecteur contre les réactions inflammatoires et le vieillissement cellulaire dus à la libération de radicaux libres provoqués par l'exposition aux rayons ultra-violets ou autres générateurs de radicaux libres.