Brevet FR2650183A1 — publié le 19910201

La présente invention concerne des protéines humaines immunostimulantes, leur procédé d'obtention et. leurs applications à des fins thérapeutiques et de diagnostic. Il a été démontré chez des souris qu'une réaction inflammatoire induite par des substances non diffusibles, non biodégradables et non antigéniques, induit, à distance du site de la réaction inflamma- toire, une augmentation de résistance envers divers agents pathogènes tels que bactéries, champignons, parasites et même envers des cellules malignes. Tou- jours chez la souris, il a-été trouvé qu'une fraction protéique isolée du site de la réaction inflammatoire rendait compte, au moins partiellement de cette aug- mentation de résistance (FAUVE et al, in "Phagocytosis - past and future", M.L. Karnovsky & L. Bolis, eds. 19B2, Academic Press, New York, pp. 295-322). Il fut ensuite montré que l'activité immunostimulante de cette fraction protéique était entièrement représentée par une protéine. Cette dernière, " mousé granuloma protein" ou MGP (FONTAN et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 1983, 80, 6395-6398) a un poids moléculaire de 56 kilodaitons (kD), un pHi de 5 et est capable, après injection à la souris (250 pg/kg) de protéger totalement celle-ci contre une infection létale à Listeria monocyto0enes. De plus, cette protéine mise en présence de cellules péritonéales de souris, rend ces cellules cytostatiques envers les cellules de la tumeur de Lewis (FONTAN el al, Int. J. Cancer, 1988, 42. 267-272). Grâce à des anticorps anti-MGP il a été pos- sible de détecter dans un sérum de malade, par test ELISA, une protéine présentant un ou des épitopes com- muns avec MGP. Cette protéine immunoréactive étant présente dans une fraction protéique de poids molé- culaire légèrement inférieure. à celui de l'albumine humaine, nous avons recherché cette fractioh dans l'urine humaine. Un test ELISA réalisé avec des anticorps anti-MGP étant positif, la purification de cette protéine puis sa caractérisation ont été entre- prises. La présente invention a ainsi pour objet une glycoprotéine immunostimulante ayant les caractéris- tiques suivantes: a. elle a une masse moléculaire d'environ 43 kD b. elle résiste à l'hydrolyse par la tryp- sine et par la pronase c. elle présente un pourcentage en sucre d'environ 10Z d. elle peut être obtenue à partir d'urine humaine. La' glycoprotéine immunostimulante selon la présente invention est caractérisée en outré en ce que le sucre comprend de l'. -b mannose et de 1 -D glucose. La présente invention a également pour objet une composition immunostimulante contenant les pepti- des obtenus après hydrolyse par le bromure de cyano- gène de la glycoprotéine immunostimulante purifiée selon l'invention. La présente invention a également pour objet la protéine native ayant une masse moléculaire d'envi- ron 92 kD, qui présente une activité immunostimulante et qui donne la glycoprotéine selon l'invention par hydrolyse par la pronase. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de la protéine native selon l'invention et qui consiste essentiellement à séparer cette protéine de l'urine humaine. Les étapes du procédé consistent à: - collecter, conserver et traiter les urines, - effectuer une chromatographie sur une colonne de DEAE Sephacel, et - éliminer l'albumine par passage sur une colonne de bleu cibacron0 La glycoprotéine immunostimulante selon l'invention peut être obtenue à partir de la protéine native de masse moléculaire d'environ 92 kD par un procédé consistant à: - hydrolyser la protéine native de masse moléculaire d'environ 92 kD par la pronase, - effectuer une filtration sur tamis moléculaire, et - réaliser une chromatographie sur hydroxylapatite. La présente invention a également-pour objet une composition thérapeutique comprenant à titre de principe actif les produits selon l'invention. Les compositions thérapeutiques selon l'in- vention peuvent être administrées à l'homme ou aux animaux par voie topique, orale ou parentérale. Elles peuvent être sous la forme de prépa- rations solides. semi-solides ou liquides. Comme exemples, on peut citer les comprimés, les gélules. les suppositoires, les solutions ou suspensions in- jectables, les pommades, les collyres huileux ou aqueux, les collutoires, les solutions nasales et otologiques, ainsi que les formes retard. Dans ces compositions le principe actif est généralement mélangé avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables habituels bien connus de l'homme de l'art. Les compositions thérapeutiques administra- bles par voie topique peuvent contenir notamment de 0,1 à 5Z en poids du principe actif. Les compositions thérapeutiques administra- bles par voie orale ou parentérale peuvent contenir notamment de 1X à 60Z en.poids de principe actif. La quantité de principe actif administré dépend évidemment du patient qui est traité, de la voie d'administration et de la sévérité de la maladie. Cependant, pour l:administration par la voie parenté- rale, on peut administrer le produit selon l'invention à la dose de 50 à 500 microgrammes/kg. Pour la voie orale on peut administrer environ de 0, 5 à 5 mg/kg de produit selon l'invention. Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées pour stimuler la résistance contre un agent pathogène. I20Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans le traitement des in- fections par Listeria monocvtoqenes. Mvcobacterium tubertulosis, Pseudomonas aeruqinosa et plus généra- lement contre des agents pathogènes capables de se multiplier à l'intérieur des cellules telles que les macrophages. Elles peuvent être utilisées notamment dans des traitements post-opératoires pour des opérations à haut risque ainsi que dans des situations d'immunodé- pression (cancer, greffes, brilures) o elles proté- gent les patients contre des infections à germes pathogènes fréquents dans ces situations, telles que les infections à Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans. Staphvylococcus aureus ou encore des agents pathogènes opportunistes. Les compositions selon la présente invention peuvent être utilisées également pour lutter contre les virus et les infections favorisées par eux. Ceci est valable en particulier pour les virus de la grippe et les virus HIV. La présente invention a en outre pour objet des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés con- tre un *pitope des protéines selon l'invention. La présente invention a également pour objet des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre un épitope des protéines selon l'inven- tion. La présente invention a également pour objet un procédé de dosage ou de détection de la protéine native dans dei tissus et des liquides biologiques qui comprend l'utilisation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention. A cet effet on peut utiliser notamment une méthode de type ELISA. P.^ 0 On décrira ci-après plus en détail les con- ditions permettant d'obtenir les produits selon l'in- vention, les caractéristiques de ces produits. ainsi que les propriétés des produits selon l'invention. I - Obtention et caractérisation des Droduits selon 1'iinvention. Lors de l'obtention des produits. selon l'invention, l'activité biologique des produits obtenus a été appréciée par leur capacité, comme dans le cas de. la protéine MGP, après leur injection à des souris, i protéger ces dernières contre une infection létale à Listeria monocvtoQenes. Pour cela, les dif- férentes fractions sont. après lyophilisation, re- prises par du sérum physiologique non pyrogène et in- 2650 183 jectéee à des doses variables en intraveineuse à des souris OF1 femelles, agées.de 6 à 8 semaines. Vingt-quatre heures plus tard, ces souris reçoivent, par voie veineuse une dose létale de Listeria monocvtoQenes (100.000). Les résultats ont été le plus souvent appréciés par la survie des animaux, 4 jours après l'infection. Dans d'autres expériences, l'activité fut quantifiée après numération bactérienne dans les rates des souris, 48 heures après l'infection. 1) Collecte, conservation et traitement des urines: Les urines de 24 heures provenant de per- sonnes des deux sexes sont gardées à 4'C entre chaque miction, dans des flacons stériles. Elles sont ensuite congelées et gardées à - 20C jusqu'à leur utilisa- tion. Ultérieurement, après décongélation, elles sont centrifugées et le surnageant obtenu est concentré 50 fois par ultrafiltration sur une membrane d'ultrafil- 0 tration Amicon PM 30. Ensuite, le concentrat est dia- lysé contre un tampon phosphate de sodium 0,07 M, pH- 6,8. Apres dialyse on procède à la deuxième étape. 2) Chromatographie sur une colonne de DEAE Sephacel0: Le concentrat urinaire (20 ml pour un litre d'urine) est déposé sur une colonne contenant 10 ml de gel de DEAE Sephacel au préalable.équilibré avec le même tampon que précédemment. La colonne est ensuite intensivement lavée avec le tampon jusqu'à ce que la densité optique (280 nm) de l'éluat soit inférieure à 0,05. L'élution des protéines retenues parmi les- quelles est présente celle douée d'activité immuno- stimulante est effectuée par le même tampon contenant du chlorure de sodium 0,2 M. La fraction correspondant au pic de cet éluat est alors concentrée sur Amicon PM et dialysée contre un tampon phosphate de sodium 10 mM pH 7,2 NaCl 0,15 M qui est soumis a l'étape sui-vante. 3) Elimination de l'albumine par passage sur une colonne de bleu cibacron. La solution ainsi obtenue est déposée dans une;colonne contenant un gel de bleu cibacron (Bio- rad), i raison de t ml de gel pour 5 unités de densité optique (280 nm), sous un débit de 10ml/heure. La solution protéique, alors débarassée de l'albumine est dialysée contre u n tampon bicarbonate d'ammonium 0,1 M pH 7,4 et soumise a l'étape-suivante. 4) Hydrolyse par la pronase. A la solution dialysée ci-dessus, contenant 2 mg de protéine par ml, est ajouté, 1%. en poids de pronase (Sigma). Après incubation du mélange pendant 9 heures à 37'C, on ajoute à nouveau 1Z. de pronase. L'incubation est poursuivie à 37 C pendant 15 heures. La solution est' alors lyophilisée. Le lyophilisat est dilué en tampon phosphate de sodium 0.1 M pM 7,2 à une concentration protéique de 20 unités de densité opti- que (280 nm). ) Filtration sur tamis moléculaire: Cette solution est déposée sur une colonne de perméation AcA 54 (IBF) équilibrée en tampon phos- 25. phate 0,1M pH 7,2 avec un débit de 8 ml/heure. On a reporté sur la Fig. 1 les valeurs de densité optique àa 280 nm des différentes fractions ainsi que les points de passage de marqueurs de masse moléculaire connue (68 kD = albumine bovine, 45 kD = ovalbumine, 25 kD = chymotrypsinogéne). Ces valeurs sont indiquées à + 5 Z. On 'a également reporté sur la Fig. 1 la zone qui correspond a 100Z de survie dans le test de l'infec- tion à Listéria monocvtoqenes. On constate que toute 2650 183 B l'activité immunostimulante est retrouvée dans une zone de masse moléculaire comprise entre 40 et 50 kD (Fig. 1). Ceci constitue la fraction active. 6) Chromatographie sur hydroxylapatite: Cette fraction active, après concentration sur Amicon PM30, et dialyse contre du tampon phosphate de sodium 5 mM pH 7,2. est déposée sur une colonne d'hydroxylapatite (Biorad) à raison de 1 mg de pro- téine par ml de gel. Le débit de la colonne est de 12 ml/heure. Les protéines retenues sur la colonne sont éluées par un gradient de phosphate de sodium compris entre 200 et 400 mM pH 7,2 (Fig. 2). On a reporté sur la Fig. 2 les valeurs de densité optique à 280 nm des différentes fractions ainsi que la zone qui correspond à 100% de survie dans le test de l'infection à Liste- ria monocvtooenes. On constate que l'activité biologi- que est présente dans les deux pics. Cependant seules les parties descendante du premier pic et ascendante du second sont gardées car les autres parties sont contaminées par des protéines non actives. AprEs mélange des fractions cl-dessus mentionnées, une dia- lyse est pratiquée contre de l'eau distillée pyrolysée et la solution est lyophilisée. L'examen par électro- phorése en gel SDS à 1.Z, de ce lyophilisat montre une seule bande après coloration au bleu de Coomassie ou au nitrate d'argent. On a représenté sur la Fig. 3 le résultat de l'électrophorése. Pour déterminer le poids moléculaire de la molécule active, on a utilisé les marqueurs de poids moléculaire de référence suivants: 92 kD (phosphorylase b), 68 kD (albumine bovine), 43 kD (ovalbumine), 30 kD (anhydrase carbonique). Ces valeurs sont indiquées à + 5 Z. La protéine ainsi obtenue est glycosylée. En effet, aprés hydrolyse de cette protéine par de l'ac- de sulfurique 6N et dosage des sucres par l'aothrone selon la technique de MELVIN-SCOTT, le pourcentage en sucre est d'environ 10Z. De plus, lorsque la protéine apres électrophorése sur gel de polyacrylamide est transférée sur une feuille de nitrocellulose, il est possible de révéler sa présence par fixation de con-canavaline A après révélation de cette dernière par de la peroxydase. Ceci indique qu'elle contient au moins de 1'-D mannose ou de l' o/-D glucose. Ces résultats amènent donc à considérer que cette protéine est une glycoprotéine de poids molécu- laire de 43 kD (+ 5 Z). Cette glycoprotéine est par suite appelée GP 43. Cette glycoprotéine est résistante à l'hy- drolyse par les enzymes suivants: 1) trypsine. 2) protease de staphylocoque V8, 3) pronase. La quantité de GP 43 obtenue par le procédé décrit ci-dessus, à partir d'urines d'hommes et de femmes cliniquement no,rmaux est de 1-2 Vg/ml. II - Obtention d'anticorDs monoclonaux: Chez des souris Balb/c femelles agées de 6 à 8 semaines fut injectée une fraction semi-purifiée de GP 43. dans de l'adjuvant de Freund complet à raison de 125 r9 par souris en cinq endroits différents, par voie sous cutanée, dans le dos de la souris. Deux semaines plus tard, les souris reçoivent, par la même voie, 125 gg de la méme fraction diluée dans une solu- tion de chlorure de sodium 0,15 M. Lorsque par test ELISA, fut constaté un taux d'anticorps au 1/1000, une injection de rappel fut pratiquée dans les mêmes con- ditions que précédemment. Cinq jours plus tard, les cellules spléniques furent isolées, fusionnées avec des cellules de myélome SP2/O Ag 14 dans un rapport de 2650 183 à 1 en présence de polyéthylène glycol 1000. Les cellules furent réparties dans des boites de culture à 24 godets à raison de 1.000.000-par godets eh pré- sence de 10Z de serum de cheval. Les hybridomes positifs obtenus ont été clones deux fois par dilution limite dans des plaques de microtitration à 96 puits en utilisant un tapis de macrophages comme adjuvant de la croissance des hybridomes. Ainsi fut sélectionné un anticorps monoclonal appelé K5 2,5 G2 qui réagit en test ELISA avec la fraction antigénique de départ et avec des antigènes décrits ci-dessous. Il reconnait uniquement la protéine de 92 kD après transfert des protéines 43 kD et 92 kD sur feuille de nitrocellu- lose. Mais il reconnait ces molécules en test ELISA. L'hybridome K5.2.5 G2 a été déposé le 24.7.89 à la CNCM sous le n I 898. III - Obtention d'anticorps polyclonaux: Des lapins neozélandais ont été injecté par vole sous-cutannée dans le coussinet plantaire avec 100 ug de GP 43 homogénéisée dans de l'adjuvant com- pleot de Freund. Deux semaines plus tard, les lapins reçoivent par voie sous-cutanée dans la région dorsale pg de GP 43 en solution dans 2 ml de chlorure de sodium 0,15 M et ceci, tous les quinze jours. La pré- sence d'anticorps reconnaissant GP 43 a été établie par test ELISA. IV - Recherche de la protéine native: L'utilisation de pronase pour l'obtention de GP 43 nous a amenés à considérer que cette protéine est le produit d'hydrolyse d une protéine de poids moléculaire plus important laquelle a été recherchée dans l'éluat obtenu après chromatographie sur bleu de cibacron (I.3). Pour cela, l'éluat est chromatographié sur un gel de perméation AcA 44 (IBF) équilibré en tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,2; le débit étant de 10 ml/heure. Ainsi que le montre la Fig. 4, sur laquelle on a reporté la densité optique à 280 nm et le taux de survie pour les différentes fractions, l'activité im- munostimulante est retrouvée dans deux pics ayant des poids moléculaires apparents de 90-95 kD et 40-45 kD. Pour déterminer le poids moléculaire des molécules actives, on a utilisé les marqueurs de poids molécu- laire de référence suivants: 68 kD (albumine bovine), kD (ovalbumine) et 25 kD (chymotrypsinogéne). Ces valeurs sont indiquées à + 5 Z. Aprés électrophorèse dans un gel de poly- acrylamide SDS à.1Z, sans réduction préalable et transfert des protéines de PM 90-95 kD sur une feuille de nitrocellulose,.. les anticorps polyclonal et monoclonal ne reconnaissent qu'une seule protéine de PM 92 kD. On a représepté sur la Fig. 5 le résultat de l'électrophorése de la protéine native ainsi que de la 0 protéine GP 43. Lorsque l'électrophorése est réalisée en présence de réducteur (dithiothreitol 20 mM). il est observé une disparation de la double bande 92 kD (C 5 ZY au profit d'une bande de 45 kD (C 5 Z)l. La protéine de 45 kD n'est reconnue que par l'anticorps polyclonal. Elle n'est reconnue par l'anticorps monoclonal qu'en test ELISA. L'action de la pronase sur la protéine de 92 kD et sur la protéine de 45 kD aboutit à l'apparition d'une protéine de 43 kD (! 5 ZX). Ces résultats permettent de penser que la protéine de 43 kD résulte de la disparition des ponts disulfure intercaténaire présents sur la région éliminée après action de la pronase. V - Recherche de GP 43 dans le sérum humain: Apres immunoélectrophorése de sérum humain normal, l'anticorps polyclonal (obtenu selon III) reconnait une protéine dont la migration électropho- rétique est semblable à celle de GP 43 et qui corres- pond à celle des O1 globulines ( Fig. 6). Pour cette raison fut vérifiée l'activité d'antisérums dirigés contre des protéines humaines ayant la même mobilité électrophorétique: -o 1 glycoprotéine acide - 41 antitrypsine - Gc globuline Il ne fut pas trouvé de communauté anti- génique avec GP 43. De plus. l'injection a des souris de 5 à 2p Vg d'une préparation obtenue selon les procédés décrits dans la littérature (Schutze et al.) d'C1 glycoprotéine acide n'est suivie d'aucun effet protecteur contre une infection par' Listeria monocvtoqenes. Les anticorps monoclonaux et polyclonaux peuvent être avantageusement utilisés dans un coffret de diagnostic afin de mettre en évidence et d autori- ser le dosage quantitatif des antigènes 92 kD et 43 kD selon les techniques connues de l'homme de l'art. VI - Activité bioloaique-de GP 43: 1) Protection contre une infection murine par Listeria monocvtogenes. Des groupes de quatre souris OF1 femelles âgées de 6 à 8 semaines, reçoivent par voie veineuse: soit du sérum physiologique (groupe témoin) soit 0, 2, 0.5, 1, 2, 5, 10 et 20 jg de GP 43. Vingt-quatre heures plus tard, les souris de tous ces groupes sont infectées par voie veineuse avec un inoculum de 100.000 Listeria monocvtonenes. Quarante-huit heures plus tard, des numérations bactériennes sont -prati- quées dans les rates. On a reporté sur la Fig. 7 le log10 du nombre de Listeria monocvtogenes pour des doses de 0t2 à 20 microgrammes. Il apparait que l'injection de 1 i de GP 43 entraîne une diminution d'un facteur 10 du nombre des bactéries spléniques. L'effet maximal est obtenu avec 10 pg de protéine GP 43. 2) Oes groupes de quatre souris OF1 femelles igées de 6 i 8 semaines, reçoivent par voie veineuse soit du sérum physiologique (témoins), soit 10 Pg de GP43, 48 h. 24 h et 6 h avant un inoculum intra-vei- neux de 100.000 Listeria monocvtooenes ou 1 h. 2 h. 4 h et 8 h après cet inoculum. Quarante-huit heures après l'infection les numérations bactériennes sont pratiquées dans les rates de toutes les souris. Ainsi qu'il apparait dans le Fig. 8, une réduction du nombre de bactéries n'apparait que lorsque la protéine GP 43 est injectée au moins 24 heures avant l'infection et est maximale quand l'injection a lieu 6 heures avant l'infection. Cette réduction de nombre des bactéries est encore notable lorsque GP 43 est injecté 1 à 4 heures apres l' infection. 3) Activité cytostatique de cellules péri- tonéales envers les cellules de la tumeur de Lewis. Des cellules péritonéales de souris C57 B1/ 6 (1:000.000 par tube) sont incubées avec 10 Vg/ml de GP 43 pendant 48 heures. Les cellules de Lewis sont ajoutées a raison de 50.000 par tube et, vingt-quatre heures plus tard, l'incubation est poursuivie en pré- sence de déoxyuridine marquée à l'iode 125. L'incor- poration de l'isotope dans les cellules de la tumeur n4 de Lewis est mesurée 17 heures plus tard. On a reporté sur la Fig. 9 le nombre de coups par minute pour différents échantillons: CP (cellules peritonéales), CP * 10 de GP 43 et surnageant de CP + 10 9g de GP 43). Ainsi qu'il apparait sur cette figure, on note une diminution de l'incorporation de déoxyuridi6e d'un facteur 10 en présence de GP 43. Cette cytostase existe aussi dans le surnageant de culture de cellules péritonéales incubées avec GP 43; ceci suggère, comme nous l'avions observé avec le MGP, que GP 43 induit. au niveau des cellules péritonéales la production d'une protéine cytostatique. 4) Activité bactéricide des macrophages de souris envers Mycobacterium tubertulosis (BCG). L'incubation des macrophages avec 5 yg/ml de GP 43 entraine une diminution de l'incorporation d'uracile tritiée dans les mycobactéries. ) Activité Leishmanicide des macrophages de souris C57 Bl/6. L'incubation de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris C57 Bl/6 avec 2 à 5 kg/ml de GP 43 permet de constater: - un plus grand étalement de ceux-ci - une restriction de la multiplication in- tracellulaire de Leishmanies. 6) Une expérience préliminaire montre qu'après hydrolyse de GP 43 par le bromure de cyanogéne effectuée selon les techniques connues de l'homme de l'art, le mélange des peptides ainsi obtenu a conservé l'activité immunostimulante anti Listeria. évaluée selon les mêmes conditions expérimentales que celles décrites au point I. REVENDICATIONS 1. Glycoprotéine immunostimulante ayant les caractéristiques suivantes: a. elle a une masse moléculaire d'environ 43 kD b. elle résiste à l'hydrolyse par la tryp- sine et par la pronase c. elle présente un pourcentage en sucre d'environ 10Z hm e d. elle peut être obtenue à partir d'urine humaine. 2. Glycoproteine immunostimulante selon la revendication 1, caractérisée en ce que le sucre comprend de l'Q -D mannose et de 1' o-D glucose. 3. Composition immunostimulante contenant les peptides obtenus après hydrolyse de la glycopro- teine purifiée selon la revendication 1. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'hydrolyse a été effectuée par 0 le. bromure de cyanogéne. 5. Protéine native ayant une masse molécu- laire d'environ 92 kD qui présente une activité immunostimulante et qui donne la glycoprotéine selon la revendication 1 par hydrolyse par la pronase. 6. Procédé d'obtention d'une protéine selon la revendication 5 qui consiste à séparer cette pro- téine de l'urine humaine. 7. Procédé selon -la revendication 6, caractérisé par les étapes suivantes: - collecte. conservation et traitement des urines chromatographie sur une colonne de DEAE SephAcel Z - élimination de l'albumine par passage sur 2650 1 83 une colonne de bleu cibacron. 8. Procédé d'obtention d'une protéine.selon la revendication 1. caractérisé en ce qu il consiste à hydrolyser par la pronase une protéine selon la reven- dication 5. 9. Procédé selon la revendication 8, carac- térisé par les étapes suivantes: - hydrolyse par la pronase d'une protéine selon la revendication 5 - filtration sur tamis moléculaire - chromatographie sur hydroxylapatite. 10. Anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 11. Hybridomes caractérisés en ce qu'ils produisent des anticorps monoclonaux selon la reven- dication 10. 1.2. Composition thérapeutique comprenant une protéine ou un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 13. Procédé de dosage ou de détection d'une protéine selon la revendication 5 dans des tissus et liquides biologiques, comprenant l'utilisation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre un épitope de cette protéine.