Brevet FR2652587A1 — publié le 19910405

La présente invention a pour objet un procédé de synthèse du cis-3-hexene- l-ol à partir d'acide gras insaturé. Elle a plus particulièrement pour objet un procédé biologique d'obtention d'alcool spécifié ci-dessus. De nombreux aldéhydes et alcools en C6 sont produits lors du broyage des tissus végétaux et possèdent des propriétés organoleptiques et physiologiques très intéressantes. Parmi ces composés, le cis-3-hexenol est largement employé dans les compositions aromatiques pour leur donner une note "verte et fraîche". L'obtention de cet alcool est difficile, que ce soit par les voies biologiques ou par les voies de la synthèse organique. De nombreuses études ont été menées pour déterminer et mesurer la faculté de certains tissus végétaux à former du cis-3-hexenol. Parmi ces études, il convient de citer l'étude du Professeur Peter Schreier qui a fait l'objet de l'article (1986) "C6 volatils in homogenates from Green Leaves: localization of hydroperoxidase lyase activity", Lebensm. Wiss.u.Technol. 19, 152-156. Cette étude a montré que de nombreux tissus végétaux, notamment les feuilles, étaient susceptibles de produire des quantités mesurables de cis-3-hexenol. Plus particulièrement, il a été montré que les fanes de radis et de vignes pouvaient produire jusqu'à 80 mg de cis-3-hexenol par kg de matériel végétal humide. L'article mentionné ci-dessus expose la voie enzymatique la plus généralement admise pour passer d'acides gras insaturés, notamment de l'acide linolénique, au cis-3-hexenal puis au cis-3-hexenol. Ainsi, une lipoxygénase catalyserait la formation d'un péroxyde qui serait ensuite ouvert par une hydropéroxyde lyase pour fournir les aldéhydes volatils en C6. Une aldéhyde réductase permettrait ensuite la réduction des aldéhydes en alcool correspondant. Les rendements évoqués ci-dessus, bien qu'ils démontrent l'existence d'un système enzymatique permettant de fabriquer le cis-3-hexenol à partir d'acide gras insaturé, sont insuffisants pour permettre une exploitation rentable de ces systèmes enzymatiques. C'est la raison pour laquelle, il a été proposé d'ajouter au broyat de feuilles de l'acide linolénique, précurseur naturel des aldéhydes et alcools en C6, pour augmenter la production du cis-3-hexenol et cis-3hexenal. Les brevets US 4 769 243 et 4 806 879 donnent une bonne illustration d'une telle technique. Toutefois, ces techniques ne permettent qu'un rendement en alcool désiré médiocre. C'est pourquoi, un des buts de la présente invention est de fournir un procédé de synthèse du cis-3-hexenol qui permette une amélioration significative par rapport aux résultats obtenus dans les procédés exposés ci-dessus. Ce but, et d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints au moyen d'un procédé de synthèse du cis-3-hexene-l-ol dans lequel ladite synthèse est réalisée à partir d'acide gras insaturé par l'action combinée d'un système naturel d'enzyme(s) permettant l'oxydation dudit acide gras en cis-3-hexenal et d'une levure permettant la réduction du cis-3-hexenal en cis-3-hexenol comme indiqué dans le schéma I à l'exemple 1. Ainsi, au cours de l'étude qui a mené à la présente invention, il a pu être montré que l'addition de l'acide linolénique conduisait à une légère augmentation de la teneur en aldéhyde cis-3-hexenal précurseur de l'alcool désiré et à une très forte augmentation de la teneur en trans-2- hexenal, lequel est un sous-produit d'isomérisation moins intéressant. Après une étude plus poussée, il est apparu que la concentration en cis-3hexenal passe par un maximum, et, progressivement, décroît plus au profit de son isomère, le trans-2-hexenal qu'au profit de son composé réduit, le cis-3-hexenol. De plus, selon la présente invention, il a été démontré que l'addition de levure permettait de privilégier la transformation du cis-3-hexenal en cis-3-hexenol, ce dernier composé étant plus stable que son homologue aldéhydique, aucune isomérisation en trans-2-hexenol n'est alors observee. Ces levures peuvent être toute levure présentant les caractéristiques suivantes: activité alcool déshydrogénase importante permettant de réduire les composés carbonylés en alcools correspondants. On utilise avantageusement une levure du type saccharomyces, de préférence Saccharomyces cerevisiae. Les résultats obtenus au cours de l'étude qui a mené à la présente invention ont tous été réalisés en utilisant des levures vendues dans le commerce telles que notamment celles vendues sous la marque LEVULINE par les LABORATOIRES OENOLOGIQUES DE FRANCE. Avantageusement, la réaction est réalisée dans un milieu de culture favorable aux systèmes enzymatiques et aux levures. Les milieux de culture favorables aux levures sont bien connus de l'homme de métier et n'ont pas besoin d'être détaillés dans la présente decription. Il convient toutefois de noter, que lorsqu'on utilise des broyats de feuilles comme système naturel d'enzyme, la pulpe obtenue par mélange en milieux aqueux dudit broyat constitue un milieu de culture convenable. Pour mettre en oeuvre le procédé selon la présente invention, il est souhaitable d'effectuer la séquence d'étapes suivantes: a) introduction dudit acide gras insaturé et dudit système enzymatique dans un milieu de culture aqueux; b) introduction de la levure dans ledit milieux de culture. Pour minimiser la production de composés indésirés, tels que le trans-2hexenal et le trans-2-hexenol, il est souhaitable que l'introduction de ladite levure soit effectuée au plus tard au moment o la concentration en cis-3-hexenal dans ledit milieu est maximale. Comme la courbe de la teneur en cis-3-hexenal en fonction du temps est une courbe relativement aplatie, la période de temps pendant laquelle il n'y a pas grand dommage à attendre pour ajouter la levure est assez étendue. Pour obtenir un meilleur résultat, il est préférable qu'au moment de l'introduction de la levure dans ledit milieu de culture, ladite levure soit en phase de croissance. Avantageusement, le pH du milieu de culture est maintenu entre les valeurs arrondies 2 et 7, de préférence entre 3 et 5. La température à laquelle doit avoir lieu la synthèse est limitée par les cinétiques des systèmes enzymatiques et des levures. En outre, à partir d'une certaine élévation de température, les levures sont tuées et ne sont plus utilisables. C'est pourquoi, en général, on utilise une température comprise entre 0 et 60 C avantageusement, entre 15 et 40 C, en général aux alentours de la température ambiante, c'est-à-dire entre 17 et 30 C. Toutefois, il peut être intéressant de mettre en oeuvre le système enzymatique à des températures comprises entre 0 C et 20 C, pour obtenir une excellente sélectivité de la production en dérivés du cis-3-hexene par rapport à ceux du trans-2-hexene. Le système enzymatique permettant d'obtenir une quantité importante de volatiles en C6 peut provenir d'un grand nombre de tissus végétaux. Ainsi, il peut provenir des feuilles de vigne, du tabac, de chicorée (notamment des espèces produisant des endives), de poireaux, de navet, de choux-rave et de divers radis. De tels systèmes existent également dans les tissus du soja et de différentes variétés de Rumex. On peut également citer les tissus de plantes fournissant des baies telles que les feuilles de fraisiers. Toutefois, les systèmes enzymatiques préférés sont ceux que l'on peut obtenir à partir des fanes de radis, de vignes et de Rumex. Ces systèmes enzymatiques sont en partie étroitement associés à la membrane des chloroplates. Selon la présente invention, le procédé de synthèse le plus utilisé est celui dans lequel le système enzymatique est introduit sous forme de fanes de radis broyées. En général, ces systèmes enzymatiques utilisent les acides gras constitutifs qui sont susceptibles d'être transformés en aldéhyde en C6. Il est cependant préférable d'ajouter certaines quantités d'acides gras comme précurseur pour augmenter le rendement. Ces acides gras sont en général des acides linoléniques ou linoléiques. Cela peut toutefois être tout acide gras insaturé à chaîne linéaire, possédant au moins trois insaturations, lesquelles insaturations sont situées en position 6, 9 et 12 à partir de l'extrémité CH3 de la chaîne carbonée. Lorsque l'on utilise comme système enzymatique une masse végétale obtenue par broyage de tissus adéquats, il est avantageux que l'acide gras introduit ait une concentration comprise entre 0,2 et 2 % en poids de la masse végétale humide. Celle-ci est en solution à 10 % dans de l'eau distillée. Les acides gras peuvent être introduits sous forme acide ou sous la forme d'un sel dont le cation associé à l'acide gras est acceptable pour les levures et pour le système enzymatique. Il est également souhaitable que les sels d'acide gras soient solubles en milieux aqueux. Les sels les plus couramment utilisés sont les sels des acides gras avec les métaux alcalins et avec le cation ammonium. L'acide linolénique peut être introduit soit sous forme pure, soit en mélange avec d'autres acides gras. En particulier, il est possible d'utiliser des mélanges d'acide gras provenant de la saponification d'huiles riches en acide linolénique, telle que l'huile de lin. La saponification peut être réalisée soit par voie chimique, soit par voie biologique, par exemple au moyen de lipases. Les exemples non limitatifs suivants illustrent l'invention. Protocole opératoire général des exemples g de feuilles de radis (de Raphanus Sativus L., variés 18 jours) sont broyées puis mises en suspension dans 0,200 litre d'eau. On ajoute simultanément la quantité d'acide linolénique testé. Sauf lorsque cela est indiqué autrement, la température est la température ambiante (20 C environ), les levures (1 g de levures régénérées) sont ajoutées après 45 mn d'incubation; sauf quand cela est indiqué autrement, le pH est le pH naturel. Dans les tableaux ciaprès, on a exprimé les résultats en quantité de volatiles formés (en mg) par rapport au poids de matériel végétal frais mis en oeuvre au cours du procédé, ceci pour des raisons de commodité de reproductibilité et de compréhension. Ces résultats peuvent être exprimés par rapport à la matière sèche mise en oeuvre, sachant que les mesures qui ont été effectuées montrent que les feuilles de radis fraîches contiennent 8,5 + 0,5 % de matières sèches. Les mesures ont été réalisées en chromatographie en phase gazeuse, selon la méthode décrite ci-après. Extraction et dosage des volatiles Après incubation, on ajoute au milieu 200 ml d'eau et le standard interne. Le milieu est ensuite soumis à un entraînement à la vapeur. 250 ml de distillat sont récupérés et extraits avec trois fois 100 ml de penthane ether (2:1). Après séchage et concentration à I ml, l'extrait est analysé en chromatographie en phase gazeuse comme décrit ci-dessous 20. Appareil: Chomatographie HEWLETT PACKARD 5890 équipé d'un injecteur split/splitless et d'un détecteur à ionisation de flamme. Colonne: FFAP HEWLETT PACKARD 50 m - diamètre: 0,32 mm - Epaisseur du film: 0,52)]m. Conditions d'analyse Débit colonne He: 2 ml/mn, make up: 30 ml/mn, air: 350 ml/mn, hydrogène: 30 ml/mn. Température de l'injecteur et du détecteur: 250 C. Programme 50 C isotherme 3 minutes, 3 C/mn jusqu'à 120 C, puis 2 C/mn jusqu'à 220 C, et isotherme à 220 C pendant 60 minutes. Exemple 1: essais de référence En mettant en oeuvre le protocole opératoire ci-dessus, différents essais ont été menés pour déterminer les différents paramètres ayant une influence sur la production du cis-3hexenal et du cis-3-hexenol par les tissus de radis. Les principaux paramètres examinés ont été la température et le pH. Pour ce dernier paramètre, le pH naturel du milieu après broyage du tissu végétal permet d'obtenir les meilleurs résultats. Les différentes données rassemblées dans le tableau I ci-après montrent d'une part, que les aldéhydes et alcools en C6 se forment très rapidement et d'autre part, qu'un abaissement de température significatif, bien que réduisant d'une manière importante la cinétique, permet de privilégier la formation du cis-3-hexenol par rapport au trans-2-hexenal et au trans-2hexenol en évitant l'évolution du cis-3-hexenal vers le produit thermodynamiquement le plus stable: le trans-2-hexenal. SCHEMA I SCHEMA DE PRODUCTION DU CIS 3 HEXENOL Feuilles fraîches + 200 ml d'eau distillée Broyage avec 0,5 % d'acide linolénique Homo1enat 45' à température du laboratoire sous agitation Homogenat riche en cis 3 hexenal Addition de levure en phase de croissance incubation 2 h Homogenat riche 'en cis 3 hexenol Entraînemen à la vapeur Extraction du distilla au pentane ether (2:1) J Extrait riche en volatiles en C6 TABLEAU I extraction 24 h 23 h immédiate t ambiante +3 C hexanal 1,6 6,9 2,0 cis 3 hexenal 158,6 36,5 36,1 trans 2 hexenal 14,4 241,0 35,1 hexanol 0,1 16,3 1,8 cis 3 hexenol 7,7 79,4 26,9 trans 2 hexenol 0,3 35,1 1,7 mg/kg/feuilles l Exemple II - Addition d'acide linolénique Il apparaît du tableau II ci-après, que l'addition d'acide linolénique augmente considérablement la teneur en aldéhydes et diminue les teneurs en cis-3hexenol. De l'examen de ce tableau, on déduit que l'addition de levures sèches pendant 2 heures, après 2 heures d'incubation, permet d'augmenter très significativement la teneur en cis-3-hexenol par réduction enzymatique du cis-3-hexenal. Ainsi, le cis-3-hexenal, aldéhyde instable, formé grâce à l'activité lipoxygénase libérée par le broyage du tissu végétal, est transformé en cis-3-hexenol, composé stable, évitant ainsi la formation d'isomères tels que le trans-2-hexenol. TABLEAU II BROYAGE DES FEUILLES EN PRESENCE DE PRECURSEUR ACIDE LINOLENIQUE Quantité d'acide 0,5 % 0,6 % 0,5 % linolénique - Temps à la tempé- 23 h 23 h 2 h* rature ambiante hexanal 1,7 2,7 1,1 cis 3 hexenal 57,7 76,0 15,4 trans 2 hexenal 319,4 359,3 99,2 hexanol 1,0 0,2 10,9 cis 3 hexenol 7,5 4,8 379,6 trans 2 hexenol 1,6 0,3 37,4 mg/kg/feuilles * + 2 h levures sèches Le tableau III rassemble les résultats obtenus avec une quantité variable d'acide linolénique. Il apparaît ainsi que la quantité optimale d'acide linolénique se situe aux alentours de 0,5, 1 %. Au delà de ces valeurs, l'acide linolénique devient très probablement inhibiteur de l'activité lypoxyagénase. TABLEAU III L'ACIDE LINOLENIQUE, 2 H à T AMBIANTE, + 2 H AVEC LEVURES SECHES feuilles ac. linolénique 0,5 % 2,5 % 5 % hexenal 0,2 0,2 0,8 cis 3 hexenal 30,6 2,4 3,2 trans 2 hexenal 53,4 5,2 2,2 hexanol 2,4 9,2 14,2 cis 3 hexenol 191,6 141,0 137,4 trans 2 hexenol 10,8 4,0 1,4 mg/kg de feuilles Exemple 3 - Rôle des levures Le tableau IV suivant rassemble les résultats obtenus à partir d'essais dans lesquels on a fait varier la teneur en acide linolénique, ainsi que la qualité des levures introduites. Les expériences ont été réalisées après une incubation d'une heure, suivie d'une adjonction de levure que l'on laisse agir pendant 2 heures. Les levures ont été introduites sous forme de levure sèche ou sous forme de levure en phase de croissance. Ce tableau IV montre que les levures préalablement régénérées, c'est-àdire en phase de croissance, développent une activité alcool déshydrogénase importante permettant d'obtenir jusqu'à 550 mg/kg de cis-3hexenol, ce qui représente, comme l'indique le tableau V, 95,5 % des volatiles totaux de l'extrait. Le même procédé a été testé en utilisant Rumex acetosa comme matériel végétal, ce qui a permis d'obtenir des résultats comparables (tableau V). TABLEAU IV BROYES AVEC L'ACIDE LINOLENIQUE, A pH 4,55 DUREE T AMBIANTE 1 H - LEVURES: 2 H Levures Levures sèches régénérées ac. linolénique 0,5 % 0,5 % hexanal - - cis 3 hexenal 7,6 8,4 trans 2 hexenal 15,4 2,3 hexenol 6,4 8,3 cis 3 hexenol 206,1 550,7 trans 2 hexenol 8,4 6,0 mg/kg de feuilles TABLEAU V BROYAGE + 0,5 % D'ACIDE LINOLENIQUE 45 MN A TEMPERATURE DU LABORATOIRE, PUIS INCUBATION 2 H AVEC LEVURES REGENEREES Feuilles de radis Feuilles de Rumex Acetosa I0 hexanal 2,70 cis 3 hexenal 1,45 1,30 trans 2 hexenal 0,4 4,80 hexenol 1,45 5,20 cis 3 hexenol 95,5 81,5 trans 2 hexenol 1,04 4,50 TOTAL 100,00 100,00 Exemple 4 - Etude cinétique Le tableau VI ci-après rassemble les résultats obtenus à partir de 0,5 % d'acide linolénique et un broyat de feuilles de radis à température ambiante. Ces résultats montrent que la somme des teneurs en cis-3-hexenal et en cis-3-hexenol est maximum dans les conditions de la réaction aux environs de 45 mn. Au delà de ce temps d'incubation, le cis-3-hexenal, instable, s'isomérise au profit du trans2-hexenal, les quantités de cis-3-hexenol restant stables. Co |i sellTnag op bx/I l ui OL'O 0t 0o t' I'I t" O ú'OO ouaxQ LOeX SUvIa Z'l 9'Zú Elú Z'ú t'z z'z O'Z jouTaxeú STO TOUX8t1 6'LL 5'65 0'6ú L'úú 0'8Ez 8'EI ú'EI Teuexaq Z sue t'L61 a'IOZ cú 'OOz 6'úúZCE L1'691 L'úLI 9'6SI TuUx3q ú STD q 0Oú q I q I uu, uui 0ú uuO uu 0T ENlNVIúEV uainmaNaHl 1O'INbIONIrI SIDVI, % L'0 9 f V i V REVENDICATIONS I. Procédé de synthèse du cis-3-hexene-l-ol à partir d'acide gras insaturé, caractérisé par le fait que ladite synthèse est réalisée à partir de ce dernier par l'action combinée d'un système naturel d'enzyme(s) permettant l'oxydation dudit acide gras en cis-3-hexenal et d'une levure permettant la réduction du cis-3-hexenal en cis-3-hexenol. 2. Procédé de synthèse selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comporte les étapes suivantes: a) introduction dudit acide gras insaturé et dudit système enzymatique dans un milieu de culture aqueux; b) introduction de la levure dans ledit milieux de culture. 3. Procédé de synthèse selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'introduction b) de ladite levure est effectuée au plus tard au moment o la concentration en cis-3-hexenal dans ledit milieu est maximale. 4. Procédé de synthèse selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait qu'au moment de l'introduction, ladite levure est en phase de croissance. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé par le fait que le pH dudit milieux de culture est maintenu entre 2 et 7, de préférence entre 3 et 6. 6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé par le fait que la température du milieu de culture est maintenu entre 15 et 40 C 7. Procédé selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé par le fait que ledit système enzymatique est introduit sous la forme de fanes de radis ou de Rumex. 8. Procédé selon l'une des revendications I à 7, caractérisé par le fait que ledit acide gras est choisi dans le groupe constitué par l'acide linolénique. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que ledit acide gras est l'acide linolénique et qu'il est introduit à une concentration comprise entre 0,1 et 2 % en poids de la masse végétale. 10. Procédé selon l'une des revendications I à 9, caractérisé par le fait qu'il comporte en outre une étape de récupération cis-3-hexene-lol par entraînement à la vapeur.