Brevet FR2657783A1 — publié le 19910809

La présente invention est relative à un procédé de préparation de dérivés de cellules sanguines dans lequel on isole des monocytes à partir du sang et dans lequel on traite ces monocytes dans un milieu de culture. On a remarqué qu'en sélectionnant le milieu de culture, il était possible d'obtenir avec d'excellents rendements des macrophages, des facteurs de croissance, des monokines et des inhibiteurs de protéases. Le procédé suivant l'invention, qui est un procédé du type décrit dans le premier paragraphe du présent mémoire, est un procédé dans lequel on traite les monocytes dans un milieu contenant au moins 1 g/l d'acide(s) aminé(s), au moins 3 g/l de glucose et au moins 10 mg/l de vitamines placés dans une poche perméable aux échanges gazeux. De préférence, le milieu contient plus de 4 g/l de glucose et plus de 2 g/l d'acide(s) aminé(s). Un milieu avantageux suivant l'invention est un milieu contenant, à titre d'acides aminés, de la L-Cystine 2HC1, de la L-Glutamine, de la L-Isoleucine HCl H20, de la L-Leucine, de la L-Lysine HC1, de la L-Thréonine, de la L-Tyrosine et de la L-Valine. Le milieu suivant l'invention contient également avantageusement plus de 5 g/l de sels de métaux alcalins ou alcalino-terreux. Selon une particularité du procédé suivant l'invention, on traite les monocytes dans un milieu contenant au moins 2 %, de préférence de 2 à 5 % de sérum ou plasma décomplémenté. Le traitement suivant l'invention des monocytes est avantageusement réalisé à une température comprise entre 30 et 40"C, de préférence d'environ 37"C sous une atmosphère constituée d'un milieu oxygéné contenant de 2 à 10 % et, de préférence, 5 % de CC la concentration en monocytes dans le milieu à traiter étant, de préférence, comprise entre 1.106 et 3.106 cellules par ml. Un milieu oxygéné convenant pour le procédé suivant l'invention est, par exemple, de l'air humide contenant 5 % de CC2. Dans une variante du procédé suivant l'invention, on ajoute au milieu de culture au moins un facteur de croissance, ce facteur étant, de préférence, choisi parmi le monocyte-macrophage colony stimulating factor (MCSF), le granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GMCSF) et l'insuline. Dans une autre variante du procédé suivant l'invention, on ajoute au milieu de culture au moins un composé choisi parmi l'acide oxaloacétique, la glutamine, l'acide pyruvique ou des acides aminés. Selon une particularité avantageuse, on introduit dans le milieu de culture au moins un support poreux sur lequel les monocytes ou macrophages se fixent, de manière a produire des médiateurs extracellulaires, le support poreux étant, de préférence, des billes en verre poreux. Dans le cas où un support poreux est introduit dans le milieu, on retire, de façon avantageuse, le milieu et les billes de la poche perméable aux échanges gazeux, après un séjour de 2 a 24 heures dudit milieu et desdites billes dans la poche perméable et on place ce milieu et ces billes dans un réacteur sous atmosphère contrôlée en C02 et 02. Pour obtenir des macrophages différenciés, on traite les monocytes dans le milieu pendant au moins 6 jours. Ces macrophages différenciés peuvent être activés en ajoutant au milieu de culture des interférons y recombinants humains et un inhibiteur de cyclooxygénase, en particulier l'indométhacine. De façon avantageuse, on ajoute au milieu de 100 à 500 unités d'interférons par ml de milieu, de manière à obtenir après au moins 6 heures des macrophages antitumoraux. De tels macrophages sont avantageusement utilisés en thérapie cancéreuse. Pour libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance, des monokines et/ou des inhibiteurs de protéases, on ajoute au milieu de culture contenant les macrophages différenciés au moins un composé choisi parmi le murapeptide ou un formylpeptide, un agent oxydant, la polylysine amino 1-3 polyglucose, un immunomodulateur extrait de membranes bactériennes, du phorbol myristate acétate, de la phytohémagglutinine, un anticorps, un antirécepteur, de manière à libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance, des monokines et/ou des inhibiteurs de protéases.Pour extraire dudit milieu des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000, on soumet le milieu à une filtration moléculaire, tandis que pour extraire les cytokines et les inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur à 50.000, on soumet le milieu respectivement à une chromatographie d'affinité suivie d'une filtration et à une précipitation suivie d'une filtration moléculaire. Dans une forme de réalisation du procédé, on soumet le milieu, d'une part, à une filtration moléculaire, de manière à extraire des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000 et, d'autre part, à une chromatographie d'affinité, à une précipitation et à une filtration moléculaire, de manière à extraire du milieu des cytokines et des inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur à 50.000, On traite les cellules restant fixées aux billes de verre dans le milieu par de la phospholipase C et un détergent non ionique, de manière à solubiliser dans le milieu dépourvu de protéines des récepteurs membranaires que l'on purifie par chromatographie d'affinité La présente invention a également pour objet * une composition de macrophages différenciés en culture et repris dans un milieu glycérol, une telle composition pouvant être congelée de manière à permettre la cryopréservation des macrophages dans ledit milieu glycérol, ce dernier étant de plus biocompatible et bactéricide * des nouveaux facteurs de croissance, ces derniers se trouvant sous une forme glycosylée * des compositions contenant au moins un nouveau facteur de croissance. Un procédé suivant l'invention sera donné ci-après à titre d'exemple uniquement. On a collecté 300 ml de sang que l'on a centrifugé selon des techniques connues, de manière à en extraire un concentré leucocytaire ou buffy coat. On a soumis ce concentré à une centrifugation à 1700 tours/minute sur FICOLL# (Lymphoprep) de manière à le purifier en cellules mononucléées. On a remis en suspension les cellules mononucléées dans une solution physiologique (solution PBS, solution saline contenant 9 g/l de tampon phosphate et on a soumis cette suspension à une centrifugation à 1700 tours/minute de manière à obtenir un concentré. On a lavé deux fois ce concentré au moyen de ladite solution physiologique et on a mis ce concentré en suspens ion dans un milieu contenant plus de 1 g/l d'acides aminés et plus de 4 g/l de glucose. La composition du milieu est donnée dans le tableau 1. TABLEAU 1 Composants Mr Molarité mg/l L-Alanine 89,1 2,81 10-4 25 L-Arginine-HCL 210,784 3,99 10-4 84 L-Asparagine-H2O 150,1 1,89 10-4 28,4 L-Aspartique acide 133,1 2,25 10-4 30 L-Cystine 2HCl 313,3 2,91 10-4 91,2 L-Glutamique acide 147,1 5,10 10-4 75 L-Glutamine 146,1 4,00 10-3 584 L-Glycine 75,2 3,99 10-4 30 L-Histidine HClH2O 209,7 2,00 10-4 42 L-Isoleucine HclH2O 131,2 8,00 10-4 105 L-Leucine 131,2 8,00 10-4 105 L-Lysine HCl 182,7 7,99 10-4 146 L-Méthionine 149,2 2,01 10-4 30 L-Phénylalanine 165,2 4,00 10-4 66 L-Proline 115,1 3,48 10-4 40 L-Sérine 105,1 4,00 10-4 42 L-Thréonine 119,1 7,98 10,4 95 L-Tryptophan 204,2 0,784 10-4 16 L-Tyrosine 2Na 227,2 4,58 10-4 104 L-Valine 117,2 8,02 10-2 94 Glucose 180,2 2,50 10-2 4500 Pyruvate Na 110,0 1,00 10-3 110 Choline Cl 139,6 2,87 10,5 4 Inositol 180,2 4,00 10-3 7,2 Nicotinamide 122,1 3,28 10-5 4 Pridoxal HCl 203,7 1,96 10-5 4 Riboflavin 376,4 1,06 10-6 0,4 Thiamine Hcl 337,3 1,19 10-5 4 D-Ca-Pantothénate 238,3 1,68 10-5 4 Folic acide 441,4 9,06 10-6 4 Biotine 244,3 5,32 10-8 0,013 Vitamine B12 1,355 9,59 10-9 0,013 TABLEAU 1 (suite) Composants Mr Molarité mg/l Nacl 58,45 7,71 10-2 450,5 KCl 74,55 4,43 10-3 330 CaCl2 111,0 1,49 10-3 165 MgSO4 120,4 8,11 10-4 97,7 MaH2PO4 120,0 1,04 10-3 125 KNO3 101,1 7,52 10-7 0,076 Na2ScO3 172,9 1,00 10-7 0,0173 Hepes 238,3 2,50 10-2 5958 NaHCO3 84,0 3,6 10-2 3024 Rouge de Phénol 376,4 3,99 10-5 15 On a également ajouté au milieu 30 p molaire de mercaptoéthanol et 10 t de sérum ou plasma humain AB décomplémenté. On a placé la suspension cellulaire dans des tubes coniques en polypropylène et on a soumis cette suspension à 4 C à une lente rotation horizontale pendant 30 à 45 minutes jusqu'a ce qu'on observe une floculation de monocytes. Après avoir placé les tubes verticalement, on les a déposés dans un bassin contenant de la glace pendant 15 minutes jusqu'à ce que les monocytes sédimentent. On a aspiré le surnageant et on a ajouté aux monocytes 3 à 10 ml du milieu dont la composition est donnée dans le tableau 1. On a déposé cette suspension de monocytes sur 2 à 5 ml de sérum décomplémenté. On a laissé ensuite les monocytes agglutinés sédimenter à travers le sérum à 4 C. Cette sédimentation prenait de 5 à 30 minutes. On a aspiré ensuite le sérum et le milieu. On a mis en suspension les monocytes (1 à 10 millions/ml) dans le milieu dont la composition est donnée dans le tableau 1, ce milieu étant additionné de sérum humain décomplémenté (5 %), d'antibiotiques à savoir de la pénicilline et de la streptomycine et de billes en verre creux. On a placé ce milieu contenant les monocytes ainsi que les billes en verre creux dans une poche en téflon dont les parois permettent un échange gazeux sous atmosphère à 5 % de CO2 et à 37"C. Après 7 jours de culture, les cellules étaient différenciées en macrophages. Les cellules étant de préférence fixées sur le verre, on parvient par élimination du milieu de culture à obtenir un concentré de macrophages fixés sur les billes. L'activation des macrophages peut alors être obtenue selon les procédés décrits ci-après. Activation en macrophages antitumoraux On a ajouté au concentré de macrophages 200 unités/ml d'interféron y recombinant, 100 Vg/ml d'indométhacine en tant qu'inhibiteur de la cyclooxygénase et 10 ug/ml de cimétidine en tant qu'inhibiteur des sites de fixation du type 2 de l'histamine. Après 24 heures, les macrophages antitumoraux étaient activés Ces derniers peuvent être utilisés par exemple par injection pour le traitement du cancer et pour la lutte contre des infections. Activation des macrophages pour la production de facteurs de croissance et dérivés ainsi obtenus On a ajouté au concentré de macrophages différenciés 1 mg/ml de murapeptide, 5 ug/ml d'immunomodulateur extrait de membranes bactériennes LPS, lipopolysaccharide extrait de bactéries GRAM Ceci permet la libération de facteurs de croissance dans le milieu extracellulaire. On aurait également pu ajouter au concentré de macrophages différenciés, de manière a libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance, des monokines et/ou des inhibiteurs de protéases, un ou plusieurs des composés suivants polylysine (de 20 à 200 pg/ml) poly F extrait de la membrane de Streptococcus mutans (de 10 à 100 ug/ml) phorbol myristate acétate (de 0,01 à 0,5 Wag/ml) phytohémagglutinine (de 1 à 10 g/ml) fibronectine (de 1 à 10 pg/ml) Zymosan (de 10 à 100 Stg/ml) extrait de la membrane de Nocardia Opaca (de 10 à 100 Vg/ml) On peut également ajouter au milieu de 10 a 200 ig/ml de facteurs de croissance, en particulier de MCSF (monocyte macrophage colony stimulating factor) et de GMCSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor) Après 24 heures, on a soumis la préparation enrichie de facteurs de croissance à une filtration moléculaire, de manière à obtenir un concentré contenant essentiellement les facteurs de croissance suivants : - PDGF (Platelet derived growth factor - facteur de croissance dérivé de plaquettes) - IGF1 (Insulin like growth factor - facteur de croissance type insuline) - MDGF (Macrophage derived growth factor - facteur de croissance dérivé de macrophage) - MGCSF (facteur de croissance de granulocyte macrophage CSF) - NAF (Neutrophil activating factor - facteur de croissance d'activation neutrophile) - FGF (Fibroblast growth factor - facteur de croissance fibroblaste). On a chauffé le concentré à 60"C pendant 10 heures pour provoquer une inactivation virale et on a purifié lesdits facteurs par chromatographie d'affinité sur des supports non poreux sur lesquels sont couplés des anticorps antirécepteurs (anticorps antirécepteurs pour l'immunoglobbuline, MEDAREX, U.S.A.). Un schéma de purification et de préparation d'autres dérivés du sang est donné, à titre d'exemple, ci-après On a utilisé un concentré inactivé viralement. Par filtration moléculaire, on a récupéré dudit concentré des facteurs de croissance d'un poids moléculaire inférieur a 20.000 et après une chromatographie d'affinité et une précipitation au sulfate d'ammonium, on a extrait du milieu, par filtration moléculaire, des inhibiteurs de protéases d'un poids moléculaire supérieur a 50.000 (tels que a1 antiprotéase, inhibiteur de la plasmine, inhibiteur de l'activateur du plasminogene) et des cytokines. Les cellules restantes fixées sur les billes ont ensuite été traitées par de la phospholipase C et par du tween (un détergent non ionique), de manière à solubiliser dans le milieu extracellulaire des récepteurs membranaires. Les facteurs de croissance obtenus par le procédé suivant l'invention se différencient de ceux obtenus par génie génétique par le fait qu'ils se trouvent sous une forme glycosylée. Ils sont dès lors mieux absorbés par le corps humain et sont dès lors plus actifs. Les macrophages humains différenciés sont avantageusement mélangés â une solution contenant au moins 10 % de glycérol, de manière à permettre leur congélation dans de l'azote liquide et donc leur cryopréservation. Une telle composition macrophagesolution glycérol peut être utilisée après décongélation rapide pour le traitement de la peau (par voie topique), pour combattre des infections, pour induire le débridement et la cicatrisation des plaies. La présente invention a également pour objet une composition sous forme d'hydrogel contenant au moins un, de préférence un mélange de facteurs de croissance glycosylés. Une telle composition peut être utilisée pour favoriser la cicatrisation de plaies, la chirurgie esthétique, la cosmétologie, la néovascularisation, pour combattre le vieillissement cellulaire, la calvitie, etc. Les facteurs de croissance suivant l'invention peuvent être utilisés pour l'ostéoporose, la réparation osseuse, les maladies autoimmunes, l'arthrite, les ulcéres, l'ophtalmologie, l'odontologie, la régénération nerveuse et des cellules souches ainsi que pour leurs absorptions sur des prothèses diverses. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de dérivés de cellules sanguines dans lequel on isole des monocytes a partir du sang et dans lequel on traite ces monocytes dans un milieu de culture, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes dans un milieu contenant au moins 1 g/l d'acide(s) aminé(s), au moins 3 g/l de glucose et au moins 10 mg/l de vitamines placés dans une poche perméable aux échanges gazeux. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes dans un milieu contenant au moins 2 %, de préférence de 2 à 5 W de sérum ou plasma décomplémenté. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes a une température de 30 a 40"C, de préférence d'environ 37"C, sous une atmosphère constituée d'un milieu oxygéné contenant de 2 a 10 %, de préférence environ 5 % de CO2. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on traite de 1.106 à 3.106 cellules par ml de milieu. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu de culture au moins un facteur de croissance, ce facteur étant, de préférence, choisi parmi le monocyte macrophage colony stimulating factor (MCSF), le granulocyte macrophage colony stimulating factor (GMCSF) et l'insuline. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu de culture au moins un composé choisi parmi l'acide oxaloacétique, la glutamine, l'acide pyruvique ou des acides aminés. 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture au moins un support poreux sur lequel les monocytes ou macrophages se fixent de manière à produire des médiateurs extracellulaires. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le support poreux est une bille en verre poreux. 9. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes dans le milieu pendant au moins 6 jours, de sorte que les monocytes soient différenciés en macrophages. 10. Procédé suivant les revendications 7 et 9, caractérisé en ce qu'on traite les monocytes dans le milieu contenant au moins un support poreux dans une poche perméable aux échanges gazeux pendant une période de temps comprise entre 2 et 24 heures et en ce qu'on place ensuite le milieu ainsi que le ou les supports poreux dans un réacteur à atmosphère contrôlée en CO2 et O. 11. Procédé suivant la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'on active les macrophages en ajoutant au milieu de culture des interférons y recom binants humains et un inhibiteur de cyclooxygénase, en particulier l'indométhacine. 12. Procédé suivant la revendication il, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu de 100 à 500 unités d'interférons par ml de milieu de manière à obtenir après au moins 6 heures des macrophages antitumoraux. 13. Procédé suivant la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu un inhibiteur des sites de fixation de type 2 de l'histamine, de préférence la cimétidine. 14. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu de culture contenant les macrophages différenciés au moins un composé choisi parmi le murapeptide ou un formylpeptide, un agent oxydant, la polylysine amino 1-3 polyglucose, un immunomodulateur extrait de membranes bactériennes, du phorbol myristate acétate, de la phytohémagglutinine, un anticorps, un antirécepteur, de manière à libérer dans le milieu extracellulaire des facteurs de croissance, des monokines et/ou des inhibiteurs de protéases. 15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'on extrait par filtration moléculaire des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000. 16. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'on extrait par chromatographie d'affinité et filtration des cytokines. 17. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'on extrait par filtration moléculaire et par précipitation des inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur à 50.000. 18. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'on extrait du milieu par filtration moléculaire des facteurs de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000 et par chromatographie d'affinité et précipitation des cytokines et des inhibiteurs de protéases de poids moléculaire supérieur a 50.000, en ce qu'on traite les cellules restant dans le milieu par de la phospholipase C et un détergent non ionique de manière à solubiliser dans le milieu des récepteurs membranaires et en ce qu'on extrait ces récepteurs membranaires solubilisés dans ledit milieu. 19. Composition de macrophages différenciés en culture dans un milieu glycérol. 20. Composition suivant la revendication 19, caractérisée en ce que le milieu contient au moins 10 % de glycérol. 21. Facteur de croissance de poids moléculaire inférieur à 20.000, ledit facteur étant glycosylé. 22. Composition pour la cicatrisation, la chirurgie esthétique, la cosmétologie, la néovascularisation ou pour combattre le vieillissement cellulaire sous forme d'hydrogel contenant au moins un facteur de croissance suivant la revendication 21. 23. Composition pour la cicatrisation contenant des macrophages différenciés et du glycérol. 24. Composition pour le traitement du cancer ou pour la lutte antiinfectieuse contenant des macrophages obtenus selon le procédé suivant l'une quelconque des revendications 11 à 14.