Brevet FR2652743A1 — publié le 19910412

L'invention concerne des compositions à base de proanthocyanidols ainsi que leur application dans des compositions pharmaceutiques. Les Proanthocyanidols appartiennent à la famille des polyphénols connus pour leurs facultés de se fixer, à des degrés très drivers, sur les protéines. Les polyphénols participent de façon générale à la formation de tanins présents notamment chez certains végétaux. L'invention se rapporte à des compositions contenant des classes spécifiques de tanins, appelés tanins catéchiques (synonyme de proanthocyanidols). Elle se rapporte plus précisément à des polymères de tanin catéchique. D'une façon générale on connaissait jusqu'à présent la capacité de certains extraits bruts de végétaux comprenant divers tanins, de présenter une activité antiseptique, voire quelquefois anti-virale. Certains tanins présents sous forme d'oligomères, étaient utilisés pour leurs propriétés veinotoniques. Jusqu'à présent, les tanins catéchiques ou autres, pharmaceutiquement utilisables étaient en général constitués par des oligomères (de poids moléculaires généralement inférieurs à 1000). On écartait systématiquement les tanins de poids moléculaires (PM) élevés, notamment les polymères. Par exemple, on rappelle que pour les tanins galliques (autre famille de tanins présents par exemple chez les végétaux) la cytotoxicité augmente avec le poids moléculaire, ce qui ne favorise pas leur utilisation. Les inventeurs ont maintenant constaté que des tanins catéchiques de poids moléculaire élevé, se présentant sous la forme de polymères, peuvent s'avérer intéressants pour leurs propriétés pharmacologiques. L'invention concerne à cet égard une composition à base de proanthocyanidols, notamment d'origine végétale, caractérisée par une proportion pondérale d'au moins 50% de molécules ayant des poids moléculaires apparents supérieurs à 2000, cette proportion étant constituée d'au moins 40% de proanthocyanidols, ce pourcentage étant exprimé en fonction tannante, et en ce que ladite composition est essentiellement exempte: - d'essences aromatiques et notamment d'huiles essentielles, de résines et autres substances lipophiles, - de sucres polymérisés tels que l'amidon, les gommes, les dérivés cellulosiques, - de sucres oligomères tels que le saccharose, le glucose, le levulose. Des méthodes particulièrement adaptées pour la sélection de compositions comprenant des proanthocyanidols et répondant à la définition cidessus sont par exemple les suivantes: a/ Pour caractériser le niveau de la fonction tannante des proanthocyanidols des compositions cidessus, on pourra mettre en oeuvre le dosage suivant qui comprend d'une part un dosage de la fonction polyphénolique, d'autre part, un dosage de la fonction tannante. 10/ -Dosage de la fonction polyphénolique: Dans ce dosage on utilise la propriété des polyphénols de réduire l'acide phosphotungstique. Le dosage est réalisé selon les normes de la pharmacopée française 90 édition. Réactif phosphotungstique (A): On chauffe à reflux 10g de tungstate de sodium avec 8ml d'acide orthophosphorique et 75ml d'eau désionnisée pendant 3 heures. On laisse refroidir et on complète à 100ml avec de l'eau désionnisée. Solution de carbonate de sodium à 15% dans de l'eau désionnisée: réactif B. On pèse 50mg de l'échantillon contenant le proanthocyanidol à doser et on les dissout dans 10ml d'eau mesuré exactement. On prélève 2ml de cette solution et on la dilue à 25ml dans une fiole jaugée, (solution C). Dans une fiole jaugée de 50ml, on place: Solution C: 5 ml Réactif A: îml Réactif B: q.s.50ml. On lit la densité optique (D.O.) à 715nm, 2 minutes exactement apurés le mélange du dernier réactif. On opère de même avec une gamme de quantités croissantes de pyrogallol (0 à 50mg) comme références et l'on mesure la densité optique obtenue avec chacune d'entre elles. La teneur en proanthocyanidol de l'échantillon étudié, est exprimé par référence à la quantité de pyrogallol (quantité mesurée) qui conduirait, dans les mêmes conditions d'analyse, à la même mesure de D.O. La détermination de cette quantité de pyrogallol se fait par référence aux résultats des mesures faites dans les conditions sus-indiquées avec les quantités croissantes de pyrogallol utilisées à titre de références. 20/ -Dosage de la fonction tannante: Une solution aqueuse de proanthocyanidol préparée comme la solution C ci-dessus. On effectue alors le dosage de la fonction polyphénolique comme indiqué ci-dessus. On agite ensuite 5ml de la solution pendant une heure à température ambiante avec 1g de poudre de peau préchromée (Merck réf. 4332); puis la solution est filtrée sur papier. On opère ensuite un dosage de la fonction polyphénolique totale sur le filtrat comme ci-dessus. La fonction tannante représente la différence entre la valeur trouvée pour les polyphénols totaux et la valeur trouvée sur le filtrat, séparé par la poudre de peau. b/ Pour déterminer la fraction des proanthocyanidols dont le poids moléculaire apparent est supérieur à 2000, on pourra utiliser la méthode de détermination du poids moléculaire suivante: On opère dans un premier temps une chromatographie haute performance d'exclusion sur gel pBondagel 125 (Waters) dans un solvant aprotique, contre des témoins de polystyrène (Aldrich) Débit: 0,5 ml/minute en isocratique. Solvant: Chloroforme-diméthylsulfoxyde 50-50 (v/v) Détection: D.O. à 283nm Concentration des témoins: lmg/ml dans le même solvant Concentration du proanthocyanidol: 0,05mg/ml dans le même solvant Poids moléculaires des témoins: 184.200, 50.000, 24.150, 7.025, 4.136 et 2.000. Le témoin de 184.200 de poids moléculaire est utilisé comme témoin d'exclusion total sur le gel. En effet ce type de gel ne retient pas les poids moléculaires supérieurs à 50.000. On calcule ensuite le temps de rétention relatif de chaque échantillon par rapport au témoin totalement exclu. On trace la courbe de correspondance entre les logarithmes décimaux des poids moléculaires des témoins et les temps relatifs de rétention correspondants. Le poids moléculaire des proanthocyanidols présents est apprécié par comparaison du temps de rétention mesuré pour eux et des temps de rétention des témoins. Ces méthodes sont données uniquement à titre d'exemple. D'autres méthodes permettant de déterminer la proportion de proanthocyanidols dans une composition donnée et conduisant également à donner la répartition en poids des proanthocyanidols présents, sont naturellement adaptées à la réalisation de 1' invention. L'invention vise également une composition à base de proanthocyanidols répondant aux définitions cidessus, caractérisée en ce qu'elle est en outre essentiellement exempte: - de protéines végétales, - d'acide gallique et de tanins galliques, - de flavonoïdes n'appartenant pas à la famille des flavanes-diols, - de flavanes-diols oligomères, - d'acides phénols. Selon un premier mode de réalisation avantageux de l'invention, les compositions de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'au moins 95% en poids sec de proanthocyanidols. Selon un autre aspect avantageux de l'invention, ces compositions à base de proanthocyanidols sont caractérisées en ce que les proanthocyanidols ont un poids moléculaire compris entre environ 2000 + 500 et environ 55000 + 5000. Une composition particulièrement intéressante comprend de préférence des proanthocyanodols de poids moléculaire d'environ 45000 + 5000. Une autre composition particulièrement intéressante comprend des proanthocyanidols ayant un poids moléculaire d'environ 5000 + 500. La détermination de la pureté du proanthocyanidol polymère, dans un intervalle de poids moléculaire choisi, peut être effectuée en utilisant une chromatographie sur gel, à l'aide d'une membrane organique ayant un seuil de coupure déterminé, par exemple une membrane de polyéthersulfone ou de difluorure de polyvinylidine. Des détails concernant le protocole mis en oeuvre sont donnés dans les exemples. Les compositions adaptées à la réalisation de l'invention sont selon une autre définition, caractérisées en ce qu'elles comprennent des proanthocyanidols sous forme de polymères, répondant à la formule suivante: dans laquelle n est un entier supérieur ou égal à 3 et de préférence compris entre 3 et 350, R1, R2, R3, R4 et Ra sont ensemble ou séparément, l'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxy, et de préférence en ce qu'il s'agit de polymères de procyanidols dans lequel Ri, Rz, R4 et Ra sont des groupements hydroxyle et R3 est de l'hydrogène, ou de polymères de prodelphinidols dans lequel R1, R2, R3, R4 et Ra sont des groupes hydroxyle ou en ce qu'il s'agit de polymères de promalvidols dans lequel Ri et R3 sont des groupes méthoxy et R2 , R4 et Ra sont des groupements hydroxyle. Les polymères de proanthocyanidols de l'invention peuvent être soit sous forme linéaire, ou encore organisés en réseaux. Les compositions de l'invention peuvent être formées d'un ou de plusieurs types de proanthocyanidols notamment lorsque ces compositions sont des extraits obtenus à partir d'une matière végétale, plusieurs types de polymères peuvent être présents dans la composition et leur répartition n'est pas nécessairement constante selon la matière végétale initiale utilisée. D'une façon particulièrement intéressante, les compositions de l'invention comprennent des proanthocyanidols présentant une certaine solubilité dans l'eau, fonction du poids moléculaire et de la nature de la molécule. Lorsque ces compositions sont des extraits végétaux, elles peuvent être obtenues à partir de tout matériel végétal de plantes riches en proanthocyanidol de poids moléculaire supérieur à 2000 et susceptibles, au terme de la mise en oeuvre des procédés de dosage des fonctions polyphénoliques et tannantes, de donner des compositions ayant les caractéristiques ci-dessus définies. Ainsi, à titre d'exemple d'espèces végétales utilisables comme source de proanthocyanidols, on cite les conifères tels que Cupressus sempervirens, Pinus maritima, les zingibéracées telles que Alpinia Galanga, les plantes à procyanidols, à prodelphinidols, telles que Vitis vinifera, Vaccinum myrtillus, Fragaria vesca et des plantes à proanthocyanidols plus rares telles que les plantes à profisetinidols du genre Schinopsis et à proguibourtinidols extraits de divers Acacia. On peut également citer des plantes de la famille des mimosacées. L'invention vise naturellement, dans un mode de réalisation préféré, des compositions comprenant plusieurs. types d'extraits végétaux satisfaisant aux définitions données. L'invention concerne également un procédé pour la préparation d'une composition de proanthocyanidols, à partir d'une partie de plante contenant des proanthocyanidols de poids moléculaire supérieur à 2000, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - décoction ou macération dans un alcool, notamment le méthanol ou l'éthanol, pour éliminer les polysaccharides notamment l'amidon, - récupération des extraits hydroalcooliques et évaporation à sec, sous pression réduite, suivie éventuellement de lavage et récupération du résidu sec, - reprise du résidu sec et filtration pour éliminer une partie de la fraction aromatique de l'extrait, - extraction à contre-courant, à l'aide successivement d'au moins 3 solvants de polarité croissante, notamment l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle, le butanol ou le méthanol notamment pour éliminer les essences aromatiques restantes, la plus grande partie possible des oligomères de PM inférieur à 2000 et des monomères de proanthocyanidols et pour récupérer dans la phase alcoolique un extrait végétal contenant les proanthocyanidols, de poids moléculaire supérieur à 2000, - le cas échéant, la purification de l'extrait obtenu pour éliminer les solvants restants. L'étape de purification peut consister en une dyafiltration avec de l'eau désionnisée afin d'éliminer la plus grande partie du solvant. Cette opération est par exemple réalisée en réfrigérant le liquide en continu à basse température en particulier à 40C. Pour la conservation du produit, une fois le solvant éliminé une possibilité offerte consiste à concentrer le plus possible la solution-suspension aqueuse de proanthocyanidols polymères puis à la lyophiliser. La conservation peut également être réalisée sous forme d'un produit cristallisé à partir de la solution-suspension aqueuse. L'extraction est de préférence menée de manière à éviter la dégradation des proanthocyanidols. Pour ce faire, il est préférable d'éviter de trop hautes températures et de réduire la quantité d'oxygène en contact avec les composés proanthocyanidoliques. Ainsi, l'extraction et les étapes ultérieures peuvent être réalisées sous atmosphère inerte, par exemple sous azote. Pour éliminer les proanthocyanidols de poids moléculaire inférieur à 2000, on pourra mettre en oeuvre la méthode suivante: la fraction extraite au moyen des divers solvants utilisés est ultrafiltrée sur une membrane organique et notamment de type membrane de polyéther sulfone, ou une membrane de difluorure de polyvinylidène ~~~~ dont le seuil de coupure est choisi en fonction de la fraction de proanthocyanidol que l'on souhaite éliminer. En fin d'opération, on obtient une solution concentrée de polymères retenus sur la membrane, et une solution diluée de produits de poids moléculaire inférieur à celui du seuil de coupure. Ces étapes peuvent être suivies éventuellement d'une étape de lavage jusqu'à obtention d'une teneur inférieure à 10%, avantageusement inférieure à 5%, et de préférence à 1% de produits légers, par rapport à la substance finale obtenue sèche. Un autre procédé particulièrement avantageux pour la préparation des compositions de proanthocyanidols, à partir d'une partie de plante contenant des proanthocyanidols de poids moléculaire supérieur à 2000, comprend les étapes suivantes: - décoction ou macération dans un alcool, notamment le méthanol ou l'éthanol, pour éliminer les polysaccharides, notamment l'amidon, - ultrafiltration des solutions hydroalcooliques sur une membrane organique d'une porosité telle que son seuil de coupure serait de 20000 Daltons pour une protéine globulaire ultrafiltrée dans une solution aqueuse. - récupération des extraits hydroalcooliques et évaporation à sec, sous pression réduite, suivie éventuellement de lavage et récupération du résidu sec. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé décrit ci-dessus peut être mis en oeuvre à partir d'une matière végétale initiale constituée par des cônes de Cupressus sempervirens, ou à partir de rhizomes frais d'Alpinia galanga. Les compositions de l'invention sont particulièrement intéressantes dans la mesure où elles sont dépourvues de cytotoxicité et partant peuvent être utilisées dans des compositions pharmaceutiques. De plus, les inventeurs ont constaté la capacité des proanthocyanidols de ces compositions de se fixer sur les récepteurs cellulaires des virus. A cet égard, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant à titre de principes actifs, une composition de proanthocyanidols telle que définie précédemment, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. De telles compositions peuvent être utilisées selon différents modes d'administration. A titre d'exemple on peut citer comme voies d'administration adaptées, la voie topique (dermique ou oculaire), la voie rectale, la voie orale. De façon particulièrement avantageuse, elles seront appliquées sous forme topique, dans ce cas elles comprennent des excipients ou des adjuvants habituellement utilisés pour ce mode d'administration. Ces compositions pharmaceutiques comprennent avantageusement entre environ 0,1% et environ 5% de principes actifs. L'utilisation des proanthocyanidols de l'invention dans des compositions pharmaceutiques est intéressante pour les propriétés antivirales de ces molécules. De telles compositions sont particulièrement adaptées pour combattre des virus tels que celui de l'herpès type I, de l'herpès type II, de la varicelle-zona, de l'Influenza A, le virus Echo 25 et le virus HIV, le rotavirus et le cytomégalovirus. Un avantage des compositions de l'invention réside dans le fait qu'elles entraînent peu d'effets secondaires néfastes, et sont d'une toxicité très faible. Une posologie adaptée à l'administration orale consiste à administrer de 0,01/kg/24 heures de composition à 0,2/kg/24 heures de composition et de préférence environ 0,lg/kg/24 heures. L'invention vise également des compositions pharmaceutiques comprenant à titre de principe actif, des proanthocyanidols en association avec une ou plusieurs substance(s) choisie(s) parmi les antibiotiques, les antiseptiques, les antiinflammatoires et les antipyrétiques, dès lors que ces substances sont chimiquement compatibles avec les proanthocyanidols. L'invention vise en outre lrutilisation des compositions de proanthocyanidols ci-dessus pour la fabrication d'un médicament à activité antivirale. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples donnés à titre non limitatif dans la suite Exemple 1: Extrait hydrométhanolique de cônes de Cupressus sempervirens 200g de cônes secs concassés de Cupressus sempervirens sont décoctés trois fois de suite pendant une demi-heure par 2000ml de méthanol à 80%. Les extraits hydrométhanoliques sont réunis et évaporés à sec sous pression réduite. On reprend ce résidu par 200ml d'eau distillée à 200C environ. On filtre. On reprend l'insoluble par 200ml d'eau distillée à 200C environ On filtre. Les filtrats sont réunis. Le résidu de cette solution est d'environ 33g soit un rendement de 16,5%. 1.2 - Fraction Procyanidolique La solution aqueuse, obtenue précédemment est ajustée à 400ml par de l'eau distillée et extraite à contre-courant par 5 fois 100ml d'éther éthylique. La phase éthérée est éliminée, l'éther éthylique est chassé de la phase aqueuse par évaporation sous pression réduite. On complète le volume de la solution aqueuse à 400ml par de l'eau distillée, puis on extrait à contre-courant par 5 fois 100ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est éliminée. On chasse l'acétate d'éthyle de la solution aqueuse par évaporation sous pression réduite. On complète le volume de la solution à 400ml par de l'eau distillée, puis on l'extrait à contre-courant par 5 fois 100ml de n-butanol. La phase butanolique est lavée par 2 fois 100ml d'eau distillée puis évaporée à sec sous pression réduite. Ce résidu est dissous dans 20ml de méthanol et la solution méthanolique est filtrée puis évaporée à sec. Le résidu est de 780mg soit un rendement de 0,39%. Le produit ainsi obtenu chromatographié sur plaque de gel de silice, révèle l'absence de substances susceptibles de migrer dans le solvant acétate d'éthyle, acide formique, eau (8-1-1 V/V), ce qui indique l'absence de substances de bas poids moléculaires ( 5.103). Exemple 2: Extrait hydroéthanolique de rhizomes d'Alpinia galanga 2.1 - Extrait brut soluble lkg de rhizomes frais d'Alpinia galanga contenant 88% d'eau sont broyés puis soumis à une première décoction d'une demi-heure dans 9,2 litres d'éthanol à 65,8% afin de réaliser en fait une décoction de l'équivalent de 220g de rhizomes secs par 10 litres d'éthanol à 60%. Puis les rhizomes sont décoctés deux fois de suite par 10 litres d'éthanol à 60% pendant une demi-heure. Les extraits sont réunis et évaporés à sec sous pression réduite. On reprend ensuite ce résidu par 220ml d'eau distillée à 200C environ et on filtre. L'insoluble est repris par 220ml d'eau distillée à 200C. Les filtrats sont réunis. Le résidu de cette solution aqueuse est de 38,4g soit un rendement de 3,84% par rapport aux rhizomes frais et de 17,45% par rapport aux rhizomes secs. 2.2 - Fraction proevanidoliaue La solution aqueuse précédente est traitée de la même façon que dans le cas de l'exemple 1.2 jusqu'à l'évaporation de la phase butanolique. Le résidu est alors lavé à 200C environ par deux fois 20ml d'eau distillée. Le résidu final est de 104mg soit un rendement de 0,01% par rapport aux rhizomes frais et de 0,4% par rapport aux rhizomes secs. Cette fraction présente les mêmes caractéristiques qualitatives que celles des cônes de Cupressus sempervirens. La mesure du poids moléculaire révèle un poids moyen de 4000. Exemple 3: Fraction procvanidoliaue insoluble de Cupressus Sempervirens 200g de cônes secs concassés de Cupressus sempervirens sont décoctés trois fois de suite pendant une demi-heure par 2000ml de méthanol à 80%. Les extraits hydrométhanoliques sont réunis et évaporés à sec sous pression réduite. On lave ce résidu par deux fois 200ml d'eau distillée à 200C environ. Les eaux de lavage sont éliminées. Le résidu est séché sous vide au dessicateur puis lavé à reflux par deux fois 200ml d'éther éthylique. La phasée éthérée est éliminée. Le résidu est ensuite lavé par deux fois 200ml d'acétate d'éthyle. La phase soluble dans l'acétate d'éthyle est éliminée Puis le résidu est repris par 20ml de méthanol à 200C environ. La solution méthanolique est filtrée. Le résidu de cette solution méthanolique est de 1,74g soit un rendement de 0,87%.Cette fraction insoluble dans l'eau présente les mêmes caractéristiques qualitatives que la fraction soluble obtenue à l'exemple 1. La détermination des poids moléculaires indique la présence très prépondérante de molécules de hauts poids moléculaires (5.104). Une étape supplémentaire peut être ajoutée après la dyafiltration finale au méthanol à 80%: on opère une autre dyafiltration avec de l'eau désionnisée afin d'éliminer totalement ou presque le méthanol. Cette opération se fait en réfrigérant le liquide en continu à +40C. Une fois que le méthanol est éliminé, on concentre le plus possible la solution-suspension aqueuse de procyanidol polymère et on la lyophilise. On peut aussi réaliser à ce stade une cristallisation à partir de la solution-suspension aqueuse. Le procyanidol polymère cristallise en aiguilles de couleur acajou foncé. Exemple 4: Méthodes de dosage et détermination de la pureté Le dosage de procyanidols obtenus à partir de Cupressus sempervirens peut faire appel à leur structure polyphénolique et donc à leur propriété réductrice de l'acide phosphotungstique (peu spécifique) ou à leur nature de proanthocyanidol c'est-à-dire à leur propriété de donner une anthocyane par traitement à chaud par les acides forts. Dans les deux cas on obtient une valeur relative à un témoin plus ou moins éloigné de la molécule elle-meme. On peut aussi faire appel à la propriété tannante des procyanidols en solution aqueuse: il s'agit dans ce cas de déterminer la fixation sur de la poudre de peau préchromée. 10/ -Dosage de la fonction polyphénolique: On chauffe à reflux 10g de tungstate de sodium avec 8ml d'acide orthophosphorique et 75ml d'eau désionnisée pendant 3 heures. On laisse refroidir et on complète à 100ml avec de l'eau désionnisée. Solution de carbonate de sodium à 15% dans de l'eau désionnisée: réactif B. On pèse 50mg de procyanidol et on les dissout dans 10ml d'eau mesuré exactement. On prélève 2ml de cette solution et on la dilue à 25ml dans une fiole jaugée, (solution C). Dans une fiole jaugée de 50ml, on place: Solution C: 5 ml Réactif A: lml Réactif B: q.s.50ml On lit la D.O. à 715nm, 2 minutes exactement après le mélange du dernier réactif. On opère de même avec une gamme de pyrogallol (0 à 50mg) comme référence. Le résultat pour le procyanidol polymère est de 43,5% de polyphénols totaux exprimés en pyrogallol. 20/ -Dosage de la fonction tannante: Une solution de procyanidol préparée comme la solution C ci-dessus est agitée pendant une heure à température ambiante avec lg de poudre de peau préchromée (Merck réf. 4332). On opère ensuite un dosage de la fonction polyphénolique totale comme ci-dessus. La fonction tannante représente la différence entre la valeur trouvée pour les polyphénols totaux et la valeur trouvée après le traitement par la poudre de peau. Le résultat pour le procyanidol polymère, est de 80% exprimé en fonction tannante. 30/ -Dosage de la fonction procyanidolique proprement dite: lOmg de procyanidol polymère mesurés environ exactement sont dissous dans 20ml d'éthanol à 75%. On réalise un tube essai avec lml de cette solution, 5ml d'éthanol à 75% et îml d'acide chlorhydrique concentré. On place au bain marie bouillant pendant 30 minutes. On réalise le tube témoin en mélangeant les mêmes constituants dans les mêmes proportions mais à la température ambiante et juste avant la lecture au spectrophotomètre. On lit la D.O. de la solution essai à 540nm contre la solution témoin. Le résultat pour le procyanidol polymère est de 0.60. 40/ -Détermination du poids moléculaire du procyanidol polymère: On opère une chromatographie haute performance d'exclusion sur gel WuBondagel 125 (Waters) dans un solvant aprotique contre des témoins de polystyrène (Aldrich) Débit: 0,5 ml/minute en isocratique. Solvant: Chloroforme-diméthylsulfoxyde 50-50 (v/v) Détection: D.O. à 283nm Concentration des témoins: lmg/ml dans le même solvant Concentration du proanthocyanidol: 0,05mg/ml dans le même solvant Poids moléculaires des témoins: 184.200, 50.000, 24.150, 7.025, 4.136 et 2.000. Le témoin de 184.200 de poids moléculaire est utilisé comme témoin d'exclusion total sur le gel. En effet ce type de gel ne retient pas les poids moléculaires supérieurs à 50.000. On calcule ensuite le temps de rétention relatif de chaque échantillon par rapport au témoin totalement exclu. On trace la courbe de correspondance entre le logarithme décimal du poids moléculaire et le temps relatif de rétention. Le résultat pour le procyanidol polymère obtenu en appliquant la technique décrite précédemment est de 45.000. 50/ -Détermination de la pureté du procyanidol polymère par chromatographie sur gel: La technique de chromatographie ci-dessus procure un tracé qui comprend deux pic. L'un correspond aux impuretés de poids moléculaire inférieurs à 5000. En effet par cette technique de chromatographie on constate que les poids moléculaires inférieur à 5000 sont rassemblés en un seul pic à la fin du chromatogramme. La méthode de préparation qui fait intervenir une ultrafiltration finale sur une membrane au seuil de coupure de 20.000 environ permet d'obtenir à la fin de l'opération une solution concentrée de polymère retenu sur la membrane et une solution diluée de produits de poids moléculaires inférieurs à 20.000 et qui ne contient pas de procyanidol (vérifié par la méthode du 30). On détermine alors la concentration en matière sèche totale des deux solutions. Puis on détermine leur absorption en U.V. à 283nm. On peut ainsi calculer le E% 1cm: Capacité d'absorption de la lumière du produit en solution à 1% sur 1cm de trajet optique de chaque produit. On calcule alors sur le chromatogramme le rapport des aires des deux pics et on en conclut la pureté du procyanidol polymère. Le résultat obtenu par cette méthode est de 98%. Exemple 5: Essais antiviraux in vitro Les essais antiviraux ont été réalisé sur le virus de l'herpès simplex de type I implanté sur des fibroblastes de poumon embryonnaire humain. On a déterminé sur un même lot de dilution virale correspondant à une dose infectante 50(DI 50)105^' virus par nuit, l'efficacité antivirale des différents produits proanthocyanidoliques obtenus, c'est-à-dire la quantité de produit par nuit, c'est-à-dire 100u1 de milieu qui provoque une diminution de moitié de la DI 50. A titre de comparaison, ont été testés également les oligomères (PM 103) ) de Pinus maritima obtenus à partir d'écorce de Pinus maritima sèche comme dans le cas de l'exemple 1. On retrouve ces oligomères en solution dans l'acétate d'éthyle qui sert normalement au lavage du résidu de poids moléculaire plus élevé. EXTRAIT QUANTITE PROVOQUANT LA DIMINUTION DE MOITIE DE LA DI 50 Procyanidols solubles de Cupressus sempervirens 4 9/100 pl Procyanidols insolubles de Cupressus sempervirens 7,2 erg/100 pl Procyanidols solubles d'Alpinia galanga 1 ut/100 ul Oligomères procyanidoliques de Pinus maritima 15,6 pg/100p1 Exemple 6: Essais de toxicité sur l'animal des proanthocyanidols obtenus dans les exemples précédents La toxicité par voie orale de tous les proanthocyanidols obtenus, recherchée chez la souris n'a pu être évaluée, les doses à ingérer dépassant les possibilités des animaux et étant supérieures à 2g par kg de poids corporel. Les tests d'irritation primaire cutanée des memes produits ainsi que les tests d'irritation oculaire pratiqués chez le lapin en solution aqueuse à 5% pour les fractions solubles ont permis de définir les produits comme non irritants. Les tests d'irritation primaire cutanée des protanthocyanidols insolubles en solution à 5% dans un mélange à 50% de monopropylèneglycol et d'eau ont permis de définir ces produits comme non irritants comparativement à un mélange pur de monopropylèneglycol et d'eau à 50%. Exemple 7: Essais cliniques sur les procyanidols d'Alpinia qalanqa Les essais cliniques ont été réalisés sur les proanthocyanidols d'Alpinia galanga obtenus à l'exemple 2. L'étude a porté sur 140 malades, présentant des symptômes herpétiques débutant depuis moins de 24 heures, répartis comme suit: .24 femmes d'âges compris entre 17 et 47 ans présentant un herpès récurrant lié au cycle menstruel. Parmi elles, on comptait 18 cas d'herpès labial et 6 cas d'herpès touchant des régions diverses du corps non muqueuses (ailes du nez, fesses, joues). 116 hommes d'âges compris entre 19 et 54 ans présentant tous un herpès labial. Les femmes ont été réparties en quatre groupes: un groupe témoin d'herpès labial récurrant, un groupe essai de la même affection soit à chaque fois 9 personnes, un groupe témoin d'herpès divers, un groupe essai d'herpès divers, soit à chaque fois 3 personnes. Les hommes ont été répartis en deux groupes égaux de 58 personnes, un groupe essai et un groupe témoin aussi homogène que possible. Les témoins sont traités jusqu'à disparition des lésions à raison d'une application à 7h, 9h, llh, 13h, 15h, 17h et 19h pendant trois jours puis d'une application matin, midi et soir jusqu'à la fin, d'un gel placebo de composition suivante: Polyacrylate de sodium réticulé: 0,75% Caramel: qs pour coloration Conservateurs: paraoxybenzoate de propyle et de méthyle: 0,35%. Eau distillée: qs 100%. Les groupes essais sont traités dans les mêmes conditions que les témoins avec un gel de la composition suivante: Polyacrylate de sodium réticulé: 0,75% Fraction de proanthocyanidols: 2% Conservateurs: paraoxybenzoate de propyle et de méthyle: 0,35%. Eau distillée: qs 100%. Résultats On apprécie le temps que met la lésion à disparaître complètement ne laissant plus qu'une trace cicatricielle totalement fermée et sèche. Groupe témoin des hommes: 5ème jour: 1 6ème jour: 4 et 1 abandon 7ème jour: 4 8ème jour: 16 et 2 abandons 9ème jour: 11 10ème jour: 14 llème jour: 2 12ème jour: 3 Groupe essai des hommes: ler jour: 1 2ème jour: 5 3ème jour: 37 4ème jour: 12 5ème jour: 1 6ème jour: 0 7ème jour: 1 abandon 8ème jour: 1 Premier groupe témoin des femmes: 5ème jour: 1 6ème jour: 1 7ème jour: 4 8ème jour: 0 9ème jour: 2 abandons 10ème au 15ème jour: 0 16ème jour: 1 Premier groupe essai des femmes: ler jour: 4 2ème jour: 2 3ème jour: 2 4ème jour: 1 Deuxième groupe témoin des femmes: 13ème jour: 2 17ème jour: 1 Deuxième groupe essai des femmes: 4ème jour: 3 Outre une efficacité importante du produit, on note chez tous les sujets traités une excellente tolérance au traitement, aucun effet secondaire n'ayant été signalé, les abandons en cours d'essai ne sont pas liés à une intolérance au produit. Exemple 8: Essai des procyanidols de Cupressus sempervirens solubles dans l'eau sur le virus du syndrome immunodéficitaire acquis humain (HIV-1). a/ Effet antiviral L'essai est réalisé sur des cellules H9 infectées par des dilutions décimales successives de HIV-1 pendant 90 minutes. Après infection des cellules, celles-ci sont traitées par des concentrations décroissantes de procyanidols à des doses inférieures à la cytotoxicité constatée sur cette lignée cellulaire (150ug/ml). Après 10 jours de culture, les cellules sont centrifugées et les virus sont recherchés par un examen radio-immunologique (recherche de la protéine p24) sur le surnageant. Résultats: Les procyanidols solubles du cyprès obtenus selon l'exemple 1 procurent une inhibition de l'expression virale de 97% à la concentration de 50pg/ml. b/ Effet virucide La suspension virale (HIV1) est traitée pendant 30 minutes à 370C par des concentrations décroissantes de procyanidols solubles du cyprès. Puis les cellules H9 sont infectées par des dilutions décimales successives de la suspension précédente. Résultats: Les procyanidols solubles du cyprès procurent une réduction du titre viral de 1,5 log (titre initial: 3.104) à la concentration de 50pg/ml, et une réduction de 2,5 log à la concentration de 150ug/mî. Exemple 9: Essai des procvanidols solubles dans l'eau de Cupressus sempervirens sur le virus de l'herpès Simplex de type II. Les essais antiviraux ont été réalisés sur le virus de l'herpès simplex type II implanté sur des fibroblastes de poumon embryonnaire humain. On a déterminé sur un lot de suspension virale correspondant à une dose infectante 50(DI 50)2,5.104 virus par puit, l'efficacité antivirale des procyanidols solubles de Cupressus sempervirens, c'est-à-dire la quantité de produit par puit (c'est-à-dire dans 100u1 de milieu) qui provoque une diminution de moitié de la DI50. La valeur trouvée est de 3,3pg/100p1. Exemple 10: Essai des procvanidols solubles dans l'eau de Cupressus sempervirens sur le virus Varicelle-Zona Les essais antiviraux ont été réalisés sur le virus de la varicelle et du zona implanté sur des fibroblastes de poumon embryonnaire humain. On a déterminé un lot de suspension virale correspondant à une dose infectante 50 (DI50) 5.103 virus par puit, l'efficacité anti-virale des procyanidols solubles de Cupressus sempervirens, c'est-à-dire la quantité de produit par puit (c'est-à-dire 1001 de milieu) qui provoque une diminution de moitié de la DI50. La valeur trouvée est de 6ug/100u1 Exemple 11: Essai des procyanidols solubles dans l'eau de Cupressus sempervirens sur le virus Influenza A Les essais antiviraux ont été réalisés sur le virus Influenza A implanté sur des cellules d'adénocarinome de colon humain. On a déterminé sur un lot de suspension virale correspondant à une dose infectante 50 (DI50) 7.103 virus par puit, l'efficacité antivirale des procyanidols solubles de Cupressus sempervirens, c'est-à-dire la quantité de produit par puit (c'est-à-dire dans 100pl de milieu) qui provoque une diminution de moitié de la DISO. La valeur trouvée est de 12pg/100 > 1. Exemple 12 Essai des procyanidols solubles dans l'eau de Cupressus sempervirens sur le virus ECHO 25 Les essais antiviraux ont été réalisés sur le virus EC11O 25 implanté sur des fibroblastes de poumon embryonnaire humain. On a déterminé sur un lot de suspension virale correspondant à une dose infectante 50 (DI50) 104 virus par puit, l'efficacité antivirale des procyanidols solubles de Cupressus sempervirens, c'est-à-dire la quantité de produit par puit (c'est-à-dire dans 100pl de milieu) qui provoque une diminution de moitié de la DISO. La valeur trouvée est de 31pg/100p1. Exemple 13 Préparation d'une fraction de poids noléculaire 45000 daltons de procyanidols de cônes de Cupressus sempervirens 20kg de cônes de Cupressus sempervirens sont macérés 3 jours trois fois de suite dans 300 litres de méthanol à 80% (20% d'eau en volume). Les solutions extractives sont réunies pour former environ 850 litres. La solution est ultrafiltrée sur des membranes tubulaires en polyéthersulfone présentant un seuil de coupure de 50000 daltons, afin d'éliminter les polymères très hautement polymérisés supérieurs à environ 5.104. Le filtrat est ensuite ultrafiltré sur des membranes de même type mais présentant un seuil de coupure de 20000 daltons. Le produit retenu sur ces membranes est lavé par diafiltration jusqu'à ce que les poids moléculaires faibles ne représentent plus que 1% du poids global de substance sèche. Exemple 14 Activité de la fraction procyanidolique de poids moléculaire 45000 sur les Rotavirus Les essais antiviraux ont été réalisés sur une souche sauvage de rotavirus implantée sur des cellules de reins embryonnaires de singes rhésus MA104. On a déterminé sur un lot de suspension virale correspondant à une dose infectante 50 (DI50) 2.103 virus par puit, l'efficacité antivirale de cette fraction procyanidolique, c'est-à-dire la quantité du produit par puit (c'est-à-dire dans 100u1 de milieu) qui provoque une diminution de moitié de la DISO. La valeur trouvée est de 8pg/100p1. REVENDICATIONS 1/ Composition à base de proanthocyanidols, notamment d'origine végétale, caractérisée par une proportion pondérale d'au moins 50% de molécules ayant des poids moléculaires apparents supérieurs à 2000, cette proportion étant constituée d'au moins 40% de proanthocyanidols, ce pourcentage étant exprimé en fonction tannante, et en ce que ladite composition est essentiellement exempte: - d'essences aromatiques et notamment d'huiles essentielles, de résines et autres substances lipophiles - de sucres polymérisés tels que l'amidon, les gommes, les dérivés cellulosiques, - de sucres oligomères tels que le saccharose, le glucose, le levulose. 2/ Composition à base de proanthocyanidols selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement exempte: - de protéines végétales, - d'acide gallique et de tanins galliques, - de flavonoïdes n' appartenant pas à la famille des flavanes-diols, - de flavanes-diols oligomères, - d'acides phénols. 3/ Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'au moins 95% en poids sec de proanthocyanidols. 4/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les proanthocyanidols ont un poids moléculaire compris entre environ 2000 + 500 et environ 55000 + 5000. 5/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce quelle comprend des proanthocyanidols de poids moléculaire environ 45000 t 5000. 6/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle comprend des proanthocyanidols de poids moléculaire environ 5000 + 500. 7/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elles comprennent des proanthocyanidols sous forme de polymères répondant à la formule suivante: dans laquelle n est un entier supérieur ou égal à 3 et de préférence compris entre 3 et 350. R1, R2, R3, R4 et Ra sont ensemble ou séparément, H, OH ou OCH3, et de préférence en ce qu'il s'agit d'un polymère de procyanidol r dans lequel Ri, R2, R4 et Ra sont des groupements hydroxyle et Ra de l'hydrogène, ou en ce qu'il s'agit de préférence un polymère de prodelphinidol dans lequel R1, R2, R3 r R4 et Ra sont des groupements hydroxyle ou en ce qu'il s'agit d'un polymère de promalvidol dans lequel R1 et R3 sont des groupements méthoxy et R2, , R4 et Ra sont des groupements hydroxyles. 8/ Extrait végétal selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, tel qu'obtenu à partir d'un végétal choisi parmi les conifères tels que Cupressus sempervirens, Pinus maritima, les acacias, les mirnosacees. 9/ Procédé pour la préparation d'une composition à base de proanthocyanidols à partir d'une partie de plante contenant des proanthocyanidols de PM supérieur à 2000 selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - décoction ou macération dans un alcool, notamment le méthanol ou l'éthanol, pour éliminer les polysaccharides notamment l'amidon. - récupération des extraits hydroalcooliques et évaporation à sec, sous pression réduite, suivie éventuellement de lavage et récupération du résidu sec, - reprise du résidu sec et filtration pour éliminer une partie de la fraction aromatique de l'extrait, - extraction à contre-courant, à l'aide successivement d'au moins 3 solvants de polarité croissante, notamment l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle, le butanol ou le méthanol notamment pour éliminer les essences aromatiques restant, la plus grande partie possible des oligomères de PM inférieur à 2000 et des monomères de proanthocyanidols et pour récupérer dans la phase alcoolique un extrait végétal contenant les proanthocyanidols de poids moléculaire supérieur à 2000, - le cas échéant, la purification de l'extrait obtenu pour éliminer les solvants restants. 10/ Procédé pour la préparation d'une composition à base de proanthocyanidols à partir d'une partie de plante contenant des proanthocyanidols de PM supérieur à 2000 selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - décoction ou macération dans un alcool, notamment le méthanol ou l'éthanol, pour éliminer les polysaccharides notamment l'amidon, - ultrafiltration des solutions hydroalcooliques sur une membrane organique d'une porosité telle que son seuil de coupure serait de 20000 Daltons pour une protéine globulaire ultrafiltrée dans une solution aqueuse, - récupération des extraits hydroalcooliques et évaporation à sec, sous pression réduite, suivie éventuellement de lavage et récupération du résidu sec, 11/ Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que l'extrait végétal récupéré est concentré puis lyophilisé ou cristallisé. 12/ Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que la matière végétale initiale est constituée par des cônes de Cupressus sempervirens. 13/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est non cytotoxique. 14/ Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, une composition de proanthocyanidols selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. 15/ Utilisation d'une composition de proanthocyanidols selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la fabrication d'un médicament à activité anti-virale.