Brevet FR2652901A1 — publié le 19910412

L'invention concerne une protéine de surface cellulaire de 94 kDa ainsi que ses applications, notamment pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection d'anticorps dirigés contre cette protéine et présents dans le sérum des patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED). Le LED est une maladie auto-immune caractérisée par un dérèglement du système immunitaire aboutissant à la production d'anticorps anti-ADN double brin, responsables de lésions tissulaires. Ainsi la plupart des lésions tissulaires observées dans les cas du LED humain sont considérées comme étant dues à la formation de complexes immuns ADN-anti-ADN et à leurs dépôts au niveau des reins et d'autres tissus (HEIKKILA, R. et al, (1987) Nature (London) 328, 445-449 ; HAREL-BELLAN A. et al (1988) J. IMMUNOL., 140, 2431-2435). La présence de titres très élevés d'anticorps dirigés contre l'ADN double brin dans les sérums d'individus atteints de LED a jusqu'à ce jour, été considérée comme un marqueur caractéristique du LED. Les souris auto-immunes chez lesquelles la maladie peut se développer de la meme manière que chez l'homme, constituent un bon modèle pour l'étude des mécanismes immunitaires présumés être responsable du LED. En particulier; les souris auto-immunes B/W et MRL/I présentent un LED Identique au LED humain. Le sérum des patients atteints de LED contient un mélange d'anticorps dirigés contre des acides nucléiques variés. Il était donc légitime d'utiliser la technique des hybridomes pour mieux caractériser la spécificité des anticorps anti-ADN. On a été amené à distinguer les anticorps dirigés contre l'ADN simple brin et les anticorps dirigés contre l'ADN double brin. Cette distinction qui a connu un certain succès par les corrélations cliniques auxquelles elle a donné lieu, s'est rapidement révélées peu satisfaisante car il est techniquement difficile de caractériser l'ADN en termes d'ADN simple brin ou d'ADN double brin. Il a en outre été constaté que les sérums de malades atteints de LED contiennent un mélange d'anticorps respectivement capables de réagir, non seulement avec l'ADN mais aussi avec l'ARN (acides ribonucléiques) et des nucléoprotéines. Il devenait difficile d'apprécier la signification individuelle d'un anticorps donné, dès lors que l'antigène correspondant n'était pas parfaitement défini. Les obstacles à l'analyse fine des anticorps anti-ADN produits spontanément chez des souris lupiques ont été récemment levés par la production d'hybridomes synthétisant des anticorps monoclonaux anti-ADN simple brin (J. Immunol. (1980), 124, 1499-1502) et contre l'ADN double brin (J. Immunol. (1982) 128, 895-898). Les expérimentations n'ont pas non seulement montré que ces titres ne pouvaient pas être corrélés aux normes révisées, d'appréciation de l'évolution clinique de la maladie, publiées par l'American Rheumatism Association Tan EM Cohen AS, Fries J.F. et al (1982), The revised criteria for the classification of systematic lupus erythematus ; elles ont révélé que certains malades présentant les signes cliniques du LED n'étaient pas porteurs d'anticorps anti-ADN. Au demeurant, la mise en jeu des ADN dans la formation des complexes immuns ADN-anti-ADN antérieurement envisagés était déjà sujette à caution. C'est ainsi qu'il avait déjà été reconnu que des anticorps monoclonaux spécifiquement dirigés contre 1'ADN double brin (ci-après désignés par ACM PME77) et obtenus à partir de souris auto-immunes B/W, se fixaient à la surface de cellules lymphoblastoldes B humains de Raji, et que cette liaison était abolie par un traitement ménagé à la protéinase K (10 ssg/ml) mais pas par un traitement avec l'ADN-ase I (200 ssg/ml) (enzyme clivant l'ADN) démontrant que l'antigène reconnu à la surface cellulaire était de nature protéique (PNAS, 81, 3843-3845 (1984) ; Eur. J. Imunol., 14, 283-286, (1984)). Le fait que des anticorps monoclonaux anti-ADN, dirigés contre plusieurs antigènes, réagissent avec des molécules telles que les phospholipides (LAFER, E.M. et al (1981) J. Exp. Med., 153, 897-909) ou des protéoglycanes (FAABER, P. et al (1986) J. Clin. Invest., 77, 1824-1827) laisse à penser qu'il est possible que d'autres antigènes cibles que l'ADN lui-même puissent etre impliqués dans le LED. En outre, l'analyse du surnageant cellulaire, obtenu après le traitement ménagé sus-mentionné, avait montré également que celui-ci contenait, en mélange avec un nombre considérable d'autres protéines, 5 polypeptides reconnaissables par les AcM PME77 après électrophorèse sur gel et immunotransfert. Leurs poids moléculaires sont respectivement de l'ordre de 34000, 33000, 17000, 16000 et 14000 (JACOB, L. et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., (USA) 81, 3843-3845 ; JACOB, L. et al (1986) Proc. Natl. Acad. Sci., (USA) 83 6970-6974). Compte tenu de la stratégie utilisée, il a alors suggéré que ces polypeptides étaient distribuées à la surface cellulaire. Il avait également été suggéré que la liaison des anticorps anti-ADN à la surface cellulaire, se fait soit directement r soit indirectement, par l'intermédiaire de complexes immuns (JACOB L. et al (1986) sus-mentionné). Selon des études récentes menées à partir de membranes cellulaires de leucocytes ou de monocytes, des histones, ou des complexes ADN-histones, ou encore un récepteur d'ADN seraient présents à la surface de ces cellules (REKVIG, O. P. et al (1980) J. Exp. Med., 152, 1720-1733 ; HOLERS, V.M. et al (1985) J. Clin. Invest., 76, 991-998 ; BENNETT, R.M. et al (1987), J. Exp. Med., 166, 850-863). Récemment, une protéine de surface cellulaire de 80 KDa a été mis en évidence par purification sur une colonne de cellulose liée à un oligo (dT) (oligonucléotide constitué de désoxythymidine). Cette protéine de surface cellulaire pourrait jouer un rôle dans le transport des oligonucléotides de l'extérieur vers l'intérieur des cellules mais ceci n'a pas été démontré de façon formelle puisque l'internalisation proposée dans ce modèle est un processus long (environ 50 heures) (LOKE, S.L. et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86, 3474-3478). Cependant, aucune des différentes études récentes ne permettent de déduire le mécanisme pathologique responsable du développement du LED. La présente invention découle précisément de la découverte de conditions spécifiques dans lesquelles un polypeptide de surface cellulaire, impliqué dans le développement du LED, peut être mis en évidence. Elle découle plus particulièrement encore de la découverte de facteurs biologiques dont la détection in vitro, notamment dans le sang d'un individu, est corrélable au LED. La présente invention vise, notamment, une nouvelle méthode de diagnostic in vitro du LED. De manière avantageuse, la méthode de diagnostic in vitro de l'invention permet le suivi du LED chez un individu. Elle permet notamment de traduire une poussée de LED chez un individu, ou encore de surveiller ltévolution d'un LED en phase aiguë vers une phase de rémission chez cet individu. La présente invention a pour objet une protéine de membrane cellulaire de 94 kDa caractérisée : - en ce qu'elle est susceptible de former un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal PME77 purifié, ou avec tout autre anticorps susceptible de reconnaître un épitope analogue à celui reconnu par l'anticorps monoclonal PME77, lorsque ledit anticorps est associé à des nucléosomes, ou à un complexe formé d'ADN et d'histones, - en ce qu'elle n'est pas reconnue par l'anticorps monoclonal PME77 purifié en l'absence de nucléosomes, ou en l'absence de complexe formé d'ADN et d'histones, ou tout fragment de ladite protéine susceptible de conserver les propriétés immunologiques susmentionnées. A titre illustratif, les histones sus-mentionnés sont du type H1, H2A, H2B, H3 ou H4. Dans l'organisme, l'association des histones avec l'ADN conduit à la formation de nucléosomes (particules unitaires de la chromatine). La protéine de 94 kDa de l'invention est susceptible de former un complexe immunologique avec l'anticorps PME77 lorsque ce dernier est associé à un complexe formé d'histones et d'ADN de toute sorte, notamment d'ADN de phage A. Comme il l'a déjà été précisé ci-dessus, la protéine de 94 kDa de l'invention est également susceptible de former un complexe immunologique avec l'anticorps PME77 lorsque ce dernier est associé à des nucléosomes, notamment aux nucléosomes obtenus à partir de cellules de souris leucémiques du type L1210. La protéine de 94 kDa de l'invention est plus particulièrement caractérisée - en ce qu'elle est isolable à partir de la surface de cellules telles que les cellules humaines Raji, les cellules fibroblastiques de singes (cellules CVI), les cellules tumorales pancréatiques de rat RINm, - en ce qu'elle est hydrophobe, - en ce qu'elle est exempte de constituants de membrane cellulaire insolubles dans une solution de détergent, notamment du type Triton X-ll4, ou X-l00, - en ce qu'elle est retrouvée dans la phase détergente, notamment dans le Triton X-114, après traitement de cellules susceptibles de la contenir à leur surface par ledit détergent, - en ce qu'elle est éliminée de la surface des cellules par action de la trypsine. L'invention concerne également la protéine de 94 kDa définie ci-dessus, ou tout fragment de cette protéine, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de former un complexe immunologique avec les sérums de patients atteints de LED. L'invention est plus particulièrement illustrée à l'aide des figures suivantes - la figure 1 est représentative de la réaction de l'anticorps monoclonal (ACM) PME77 purifié avec l'ADN double brin (ADNdb), et avec l'ADNdb associé à des histones, par les techniques ELISA (Enzyme Linked Sorbent Assay), - la figure 2 représente l'étude de la réaction de 1'ACM PME77 purifié par ELISA avec l'ADNdb, la chromatine, les polynucléosomes, les oligonucléosomes, et les mononucléosomes, - la figure 3 (a, b et c) représente l'étude de la liaison de 1'ACM PME77 purifié aux cellules CVI par immunofluorescence, en présence d'ADN et d'histones (figure 3a), ou en présence de mononucléosomes (figure 3b), ou seul (figure 3c), - la figure 4A représente l'étude par immunotransfert de la réaction de 1'ACM PME77 purifié avec les cellules Raji et les histones purifiés, en présence ou en absence d'ADN, - la figure 4B représente l'étude par immunotransfert de l'ACM PME77 purifié avec la protéine de 94 kDa, en présence ou non de complexes d'ADN et d'histones, - la figure 5 représente l'étude de la présence de la protéine de 94 kDa dans la fraction de membrane plasmatique avant (figure 5A) ou après traitement de ces membranes par la trypsine (figure 5B), - la figure 6 représente la liaison , par expérience d'immunotransfert, d'un anticorps polyclonal anti-ADN purifié à partir d'un sérum d'un individu atteint de LED, à la protéine de surface cellulaire de 94 kDa, en présence ou en l'absence du complexe d'ADN et d'histones. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de la protéine de 94 kDa comprenant - l'extraction de la protéine par traitement de membranes de cellules humaines ou animales purifiées, susceptibles de contenir ledit polypeptide à leur surface, à l'aide d'un détergent du type Triton X-114, suivie de la récupération de la phase détergente contenant ladite protéine. - la mise en contact de la phase contenant ladite protéine avec des nucléosomes purifiés, ou avec des complexes formés d'acide nucléique et d'histones purifiés, ces complexes étant immobilisés sur un support de chromatographie d'affinité, et - la récupération de ladite protéine retenue par mise en contact du support de chromatographie d'affinité avec une solution permettant la séparation de ladite protéine et des complexes sus-mentionnés, et sa récupération. A tire illustratif, cette solution est la suivante NaCl 2M ; carbonate-bicarbonate 0.1 M, pH 9, urée 3M. Le procédé d'obtention défini ci-dessus est avantageusement réalisé à l'aide d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux spécifiquement dirigés contre la protéine de 94 kDa de l'invention, ou contre tout fragment de cette protéine tel que décrit cidessus. Dans ce cas, les nucléosomes ou les complexes formés d'acide nucléique et d'histones, utilisés dans le support de chromatographie d'affinité sus-mentionné, sont remplacés par un anticorps, notamment monoclonal spécifiquement dirigé contre la protéine de 1' invention. Le procédé d'obtention de la protéine de l'invention est également réalisable en utilisant un support de chromatographie d'affinité comprenant un oligo (dT) selon la méthode décrite dans l'article de LOKE S.L. (1989) sus-mentionné. L'invention concerne également les anticorps euxmêmes formés contre la protéine de 94 kDa de l'invention ou contre tout fragment de cette protéine tel que décrit ci-dessus. I1 va de soi que cette production n'est pas limitée aux anticorps polyclonaux. De tels anticorps monoclonaux peuvent être produits par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après. Dans un premier temps, on immunise un animal avec la protéine de 94 kDa, ou un fragment de cette protéine, tel que décrit ci-dessus, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre cette protéine. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on réalise alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de la protéine de l'invention pourront être testés par exemple par immunotransfert en une ou deux dimensions, et immunofluorescence. Il va de soi que l'invention concerne également des fractions polypeptidiques pouvant avoir des poids moléculaires plus faibles que celui de la protéine de 94 kDa, dès lors qu'ils porteraient des sites antigéniques susceptibles d'être reconnus par les mêmes anticorps monoclonaux. Il apparaîtra clairement au spécialiste qu'à partir de l'instant où l'on dispose des anticorps monoclonaux considérés ci-dessus, on peut envisager l'isolement à partir de l'antigène sus-indiqué, des séquences peptidiques plus petites contenant les mêmes sites antigéniques, par exemple en ayant recours à des techniques en soi connues de découpage des polypeptides par des enzymes susceptibles de découper les polypeptides plus grands en des sites spécifiques. A titre d'exemple de telles protéines, on peut mentionner l'enzyme de Staphylococcus aureus V8, l'alphachy- motrypsine, la "protéase de glandes sous-maxillaires de souris" (mouse submaxillary gland protease) commercialisée par la société BOEHRINGER, la collagénase de Vibrio alginolyticus chemovar iophaqus qui reconnaît spécifiquement lesdits peptides Gly-Pro et Gly-Ala, etc.. D'autre part, après détermination de la séquence peptidique de la protéine de l'invention, il devient possible de reconstituer des séquences nucléotidiques correspondantes ; ces dernières peuvent à leur tour être synthétisées et clonées. L'invention concerne également un procédé de détection in vitro de complexes formés d'anticorps liés à des nucléosomes, ces complexes étant corrélables au lupus érythémateux disséminé (LED), dans un tissu ou fluide biologique susceptible de les contenir, ce procédé comprenant la mise en contact de ce tissu ou fluide biologique avec la protéine de 94 kDa, ou tout fragment de cette protéine, selon l'invention dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ladite protéine et lesdits complexes éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique, et la détection in vitro du complexe immunologique éventuellement formé entre ladite protéine d'une part, et les anticorps liés aux nucléosomes d'autre part. De préférence, le milieu biologique est constitué par un sérum humain ou par des glomérules de reins de patients lupiques. Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection. A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, ou immunofluorescents, ou radioimmunologiques (RIA) ou équivalent. Ainsi, l'invention concerne également la protéine de 94 kDa ou tout fragment de cette protéine tel que défini ci-dessus, marqué à l'aide d'un marqueur adéquat du type enzymatique, fluorescent, radioactif, etc... De telles méthodes comprennent, par exemple, les étapes suivantes - dépôt de quantités déterminées de la protéine selon l'invention dans les puits d'une microplaque de titration., - introduction dans lesdits puits de dilutions croissantes du sérum devant être diagnostiqué, - incubation de la microplaque, - rinçages répétés de la microplaque, - introduction dans les puits de la microplaque d'anticorps marqués contre les immunoglobulines du sang, le marquage de ces anticorps ayant été réalisé à l'aide d'une enzyme sélectionnée parmi celles qui sont capables d'hydrolyser un substrat en modifiant l'absorption des radiations de ce dernier, au moins à une longueur d'onde déterminée, - détection, en comparaison avec un témoin de contrôle, de la quantité de substrat hydrolysé. L'invention concerne également des coffrets ou kits pour le diagnostic in vitro du LED qui comprennent: - une composition contenant la protéine de 94 kDa (marquée ou non) de l'invention, ou tout fragment de cette protéine tel que décrit ci-dessus, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique, - les réactifs permettant la détection des complexes formés entre ladite protéine et les complexes anticorps-nucléosomes sus-mentionnés, produits par la réaction immunologique.De tels réactifs peuvent également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où la protéine susmentionnée n'est pas marquée, - un tissu ou fluide biologique de référence dépourvu d'anticorps reconnus par la protéine sus-mentionnée, - le cas échéant également, un échantillon de comparaison contenant les complexes anticorps-nucléosomes sus-mentionnés. L'invention a également pour objet une méthode de transfection cellulaire comprenant la mise en contact d'un complexe formé entre un acide nucléique déterminé d'une part, et des histones d'autre part, avec des cellules susceptibles de présenter à leur surface une protéine de l'invention, pour permettre l'internalisation dans lesdites cellules de l'ensemble formé de l'acide nucléique déterminé, des histones et dudit polypeptide. Selon un aspect avantageux, le procédé de transfection décrit ci-dessus permet l'internalisation dudit acide nucléique en quelques minutes, au lieu de plusieurs heures dans le procédé décrit dans l'article de LOKE.S.L. et al (1989) sus-mentionné. L'invention concerne plus particulièrement une méthode de transfection telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit acide nucléique déterminé comprend une séquence nucléique codant pour un polypeptide déterminé, et, le cas échéant, des éléments de régulation permettant l'expression de ce fragment d'acide nucléique dans la cellule hôte, notamment un promoteur reconnu par les polymérases de ladite cellule hôte. L'obtention du polypeptide déterminé se fait par mise en culture des cellules hôtes transformées dans un milieu de culture approprié, suivie de la récupération du polypeptide déterminé à partir de ces cellules ou du milieu de culture. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant un acide nucléique déterminé thérapeutiquement actif, lié à des histones, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable. Par acide nucléique thérapeutiquement actif, on entend tout nucléotide (en particulier oligonucléotide) actif par "blocage sélectif" de l'expression d'un gène dont le produit d'expression est responsable d'une maladie déterminée. Par "blocage sélectif", on entend aussi bien le blocage d'une séquence impliquée dans l'initiation, la propagation, ou la terminaison de la réplication d'un acide nucléique, lors de la transcription d'un, ou plusieurs, gènes, et/ou de la traduction des ARN messagers leur correspondant. Il peut s'agir également d'une action de protection qui rend la séquence "bloquée" inaccessible pour une protéine, ou une enzyme ou un composé chimique par exemple. L'invention a aussi pour objet l'utilisation de ces compositions pharmaceutiques pour le traitement de pathologies d'origine virale, bactérienne, parasitaire ou encore tumorale. L'invention vise également les anticorps monoclonaux anti-idiotypes dirigés contre les anticorps monoclonaux de l'invention définis ci-dessus. l'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques comprenant des anticorps anti-idiotypes tels que définis ci-dessus, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, et l'utilisation de ces compositions, notamment pour le traitement du LED. L'invention vise également des compositions constituées par des cellules de rates humaines ou animales couplées de manière covalente selon les techniques connues de l'homme de l'art, à une quantité déterminée de la protéine de 94 kDa, ou tout fragment de cette protéine selon l'invention. Ces compositions sont utilisables, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable, pour induire après intro duction dans l'hôte (homme ou animal) des cellules T suppressives spécifiques de la protéine 94 kDa. La quantité de protéine 94 kDa couplée sur les cellules de la rate est fixée en fonction du degré de suppression immunitaire recherchée. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description des techniques et conditions dans lesquelles la protéine conforme à l'invention a eté obtenue. I- MATERIELS ET MéTHODES lignées cellulaires La lignée RINm de cellules tumorales d'ilots de pancréas de rat (GAZDAR A.F. et al (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 3519-3523), la lignée cellulaire de lymphoblastoïde humain de Raji, et les fibroblasts de singes (cellules CVI) ont été obtenus et maintenus de la manière décrite dans TRON F. et al (1984) Eur. J. Immunol., 14, 283-286. - anticorps monoclonal (ACM) murin L'hybridome PME77 secrétant l'anticorps anti-ADN a été isolé après fusion entre une lignée myélomateuse non secrétant (P3 x 63Ag8.653) et les cellules de la rate du type (NZB x NZW) F1B/W. ' La sélection de lthybride, le clonage et le sous-clonage de la lignée, la purification de l'anticorps, la caractérisation de sa classe et sous-classe et sa spécificité ont été décrits en détail dans TRON F. et al (1980) J. Immunol., 125, 2805-2809 ; et JACOB. L. et al (1982) J. Immunol., 128, 895-898). L'ACM PME77 a été décrit comme étant un anticorps IgG2b et comme étant spécifique de l'ADN double brin (ADN db) (JACOB. L. et al (1982) sus-mentionné). - préparation de la fraction de membrane purifiée La fraction de la membrane purifiée a été préparée selon la méthode décrite dans GASTINEL L.N. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 684, 117-126. Dix millions de cellules viables ont été lavées trois fois dans un tampon phosphate (PBS). Les cellules ont été suspendues dans 7 ml d'un tampon A contenant 10 mM de tris-HCl, 10 mM de CaCl2, et 0,25 M de saccharose ajustée à pH 7,4. L'homogénéisation a été réalisée dans un homogénéisateur Dounce en présence d'inhibiteurs de protéases. L'homogénat a été centrifugé à 1000 x g pendant 20 minutes. Puis le surnageant a été centrifugé. à 20.000 x g pendant 60 minutes. Le culot a été resuspendu dans du PBS (pH 7,4). Cette fraction correspond à la préparation enrichie en protéines de membrane plasmatiques. - extraction de la fraction de membrane purifiée par le Triton X-114 (TX-114) La fraction préparée telle que décrite ci-dessus a été solubilisée avec 1 % de TX-114 (Fluka) (BORDIER J. (1981) J. Biol. Chem. 256, 1604-1607) dans du PBS à 4"C centrifugé dans 20 % de saccharose pendant 1 heure à 100.000 x g à 4"C, puis transféré dans un tube à 37"C et incubé pendant 3 minutes. Après centrifugation pendant 3 minutes à 3.000 rpm à température ambiante, le culot et le surnageant ont été conservés et analysés. Les protéines de membranes hydrophobes (culot) ont été récupérées dans la phase détergente et les protéines solubles (surnageant) ont été récupérées dans la phase aqueuse. - traitement par la trypsine Les cellules vivantes RINm ont été traitées avec de la trypsine à 50 yg/ml pendant 5, 10 et 20 minutes à 0 C. La viabilité des cellules a été estimée par le test d'exclusion du bleu tripan ; cette viabilité était de 98 % dans toutes les préparations et demeure inchangée à la fin du traitement par la trypsine. Les extraits cellulaires ont été extraits par TX-114 comme décrit ci-dessus. La phase détergente obtenue par traitement à la trypsine a été analysé par technique d'immunotransfert. - colonne d'ADN-cellulose Le surnageant de l'anticorps monoclonal PME77 a été déposé sur une colonne d'ADN cellulose (Sigma). Après lavage dans le PBS, l'ACM PME77 a été élué en NaC1 2 M (pH 8). - Histones liés de façon covalente aux billes Trisacryl activées au chloroformiate de paranitrophényle L'ACM PME77 élué à partir de la colonne d'ADN cellulose a été passé à travers une colonne constituée d'histones liés de façon covalente à des billes de Trisacryl activé (IBF) dans un tampon de PBS. L'effluent correspond à l'ACM PME77 purifie utilisé dans ces expériences. - préparation d'ADN et d'histones L'ADN de phage À (Boehringer Mannheim) a été purifié par digestion par la protéinase K (Boehringer Mannheim ; 100 ssg/ml pendant 1 heure à 4"C) suivi d'une extraction au phénol. Les histones ont été traités par l'ADN-ase I (Worthington) dissoute dans un milieu de Hanks contenant du MgCl2 10 ssM (200 pg) pendant 1 heure à 4"C. - Analyse d'immunotransfert Cette analyse a été réalisée selon la méthode décrite dans JACOB L. et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83, 3843-3845. - expérience d'immunofluorescence Les cellules CVI ont été sujettes à une procédure d'immunofluorescence indirecte. Les cellules non perméabilisées ont été fixées avec une solution de paraformaîdehyde fraîchement préparée, incubée avec l'ACM PME77, et révélée par une anti-IgG de souris marquée avec de la fluoroscéine (Biosys. Compiègne FRANCE). - préparation de chromatine et nucléosome La chromatine et les nucléosomes ont été préparés à partir de noyau de cellules leucémiques L1210 développées en culture de cellules de la manière décrite dans LUTTER C. (1978) J. Mol. Biol., 124, 391-420. Afin d'analyser la pureté de la préparation, des électrophorèses sur gel d'agarose à 0,8 % , et sur gel de NaDodSO4 3,6 %/ polyacrylamide dans le bromure d'éthydium ont été réalisées. Seulement une bande a été visualisée avec les mononucléosomes. Leur pureté est d'au moins 95 %. - méthode ELISA pour les anticorps anti-ADN et les anticorps anti-histones. Cette méthode a été réalisée selon celle décrite dans l'article KOTZIN B.L. et al (1984) J. Immunol., 133, 2554-2557. II- RESULTATS Afin d'analyser le mécanisme par lequel l'anticorps anti-ADN pourrait reconnaître une protéine à la surface cellulaire, la séquence partielle des polypeptides libérés par action de l'élastase et reconnue par l'anticorps monoclonal en immunotransfert, a été déterminée. Ces polypeptides ont des séquences identiques aux histones intacts et le surnageant de la culture cellulaire de l'ACM PME77 réagit également avec les histones purifiés par immunotransfert. Ces résultats suggèrent que la liaison de l'anticorps monoclonal PME77 à la surface des cellules pourrait impliquer la formation de complexes ADN-histones. Puisque l'ACM PME77 pourrait avoir une forte affinité pour les complexes ADN-histonesr des anticorps libres pourraient ne pas être obtenus par les procédures de purification conventionnelles. Les méthodes de purification de l'ACM PME77 qui suivent ont par conséquent été sélectionnées. Les anticorps ont tout d'abord été fixés sur une colonne d'ADN cellulose. L'anticorps monoclonal élué en 2M NaCl contient des chaînes lourdes et légères par électrophorèse sur gel de NaDodSO4/polyacrylamide et pas d'histones. L'anticorps élué a ensuite été placé sur une colonne d'histones liés de manière covalente à du Trisacryl activé afin de supprimer tout ADN contaminant. L'effluent obtenu est désigné ci-après par l'expression ACM PME77 purifié (PmAb). Le PmAb réagit avec l'ADNdb (figure 1) mais ne réagit pas avec les histones purifiés par immunotransfert (voir figure 4A, ligne c) et par ELISA (figure 1). Le PmAb plus ADN réagit avec les histones purifiés par immunotransfert (voir figure 4A, ligne d) et ELISA, contrairement à ce qui se passe avec PmAb en l'absence d'ADN (voir figure 4A, ligne c). Ainsi,le PmAb est capable de former un complexe avec 1'ADN et les histones. Le PmAb réagit mieux avec l'ADNdb associé à des histones purifiés qu'avec 1'ADN seul en ELISA (figure 1). Puisque le PmAb réagit avec le complexe ADN-histone, la possibilité que PmAb réagit également avec la chromatine et les nucléosomes a également été testée.Comme il l'est montré à la figure 2, le PmAb se lie à la chromatine, aux polynucléosomes, aux oligonucléosomes et aux mononucléosomes en ELISA. Ces résultats suggèrent que le PmAb a une meilleure affinité pour les complexes ADN-histones et particulièrement pour les monoculéosomes et les oligonucléosomes, que pour l'ADN seul. - liaison des complexes PmAb-ADN-histones à la surface des cellules Le PmAb ne se lie pas à la surface des cellules par expérience d'immunofluorescence (figure 3c). Si toutefois, de 1'ADNdb associé à des histones purifiés est ajouté au PmAb, les complexes formés réagissent fortement et uniformément à la surface cellulaire (figure 3a). Aucune réaction significative n'est observée quand l'ADN ou 1'histone sont manquants. Ces résultats démontrent que PmAb se lie à la surface cellulaire par l'intermédiaire d'un complexe ADNhistones. - liaison des complexes PmAb-ADN-histones à la protéine de 94 kDa La liaison du PmAb en présence ou en l'absence des complexes d'ADN-histones a également été testée dans la phase riche en détergent TX-114 obtenue à partir de fractions de membrane de cellules RINm purifiées. Une protéine unique de 94 kDa a été détectée par expérience d'immunotransfert lorsque les complexes PmAb-ADN-histones ont été appliqués aux bandes de nitrocellulose (figure 4B, ligne c). Aucun polypeptide n'a été détecté si l'ADN était manquant (figure 4B, ligne a). Une faible réaction a été observée en présence de complexes de PmAb-ADN (figure 4B, ligne b). La protéine de 94 a a des propriétés correspondant aux protéines de surface cellulaire. Cette protéine de 94 kDa se comporte comme une protéine de membrane plasmatique puisque elle requiert l'utilisation d'un détergent afin d'être solubilisée et est quantitativement récupérée dans la phase riche en détergent TX-114 (figure 5A, ligne b). De plus, un bref traitement des cellules vivantes avec la trypsine, qui ne modifie par la viabilité cellulaire, supprime cette protéine montrant que cette dernière est exposée sur la face externe de la membrane plasmatique (figure 5B). Aucun fragment tryptique n'a été découvert par analyse d'immunotransfert du surnageant obtenu lors du traitement par la trypsine, suggérant que le site des liaisons des nucléosomes sur la protéine de 94 kDa est très sensible à la trypsine. La protéine 94 kDa a été trouvée à la surface de différents types de cellules les cellules de la lignée de lymphoblastoïdes B humains de Raji, les cellules de singes CVI, et la lignée cellulaire RINm tumorale d'ilots de pancréas du rat. - liaison du complexe PME77-nucléosomes à la protéine de 94 kDa Lorsque la chromatine, les polynucléosomes, les oligonucléosomes, et les mononucléosomes purifiés sont substitués au complexe ADN-histones, des résultats identiques au précédent ont été observés par expérience d'immunofluorescence (figure 3b) et par immunotransfert. Toutefois, une réaction plus faible a été observée par immunotransfert avec les complexes mononucléosomes- PmAb. Cela démontre que les complexes nucléosomes-PmAb réagissent avec la surface des cellules par expérience d'immunofluorescence et avec -la protéine de 94 kDa de surface cellulaire par immunotransfert. - liaison des anticorps anti-ADN, obtenus à partir de sérums de patients atteints de LED en phase active, à la protéine de 94 kDa par l'intermédiaire de complexes ADN-histones Des sérums de patients atteints de LED ont été passés à travers une colonne d'ADN-cellulose. Les anticorps ont été élués dans NaCl 2 M. Les anticorps purifiés forment une réaction immunologique avec une protéine de 94 kDa à condition que les complexes ADNhistones soient ajoutés (figure 6, ligne c). Les fluents, qui contiennent probablement des anticorps complexés à 1'ADN et aux histones, provenant de trois sérums de patients en phase aigue de la maladie réagissent avec la protéine de 94 kDa tandis que ceux provenant de deux sérums en phase inactive (ou phase de rémission) ne réagissent pas avec la protéine de 94 kDa. La légende des figures mentionnées ci-dessus sont les suivantes - figure 1 : réaction de PmAb avec l'ADNdb, les histones, et l'ADNdb + histones en ELISA. correspond à : ADN (1 pg/ml) + histones (2,5 ssg/ml)- correspond à : ADN (1 jg/ml). o correspond à : hîstones (2,;5 pg/ml). - figure 2 : réaction de PmAb (15 g/ml) avec l'ADNdb la chromatine les polynucléosomes les oligonucléosomes et les mononucléosomes en ELISA. - figure 3 : liaison de PmAb à la surface de cellules en immunofluorescence à l'aide de cellules CVI. (a) PmAb (20 ssg) + ADN (1 pg) + histone (5 g). (b) PmAb (20 ssg) + mononucléosomes (8 yg). (c) PmAb (20 Mg). - figure 4 figure 4A : réaction de PmAb avec un extrait de cellules Raji et d'histones purifiés, par immunotransfert, en présence ou en l'absence d'ADN. Lignes (ou colonnes ou bandes verticales) a, réaction de PmAb (20 ssg) avec un extrait de cellules Raji b, réaction de PmAb (20 g) + ADN (1 g) avec un extrait de cellules Raji c, réaction de PmAb (20 pg) avec des histones purifiés (1 g) ; d, réaction de PmAb (20 Ag) + ADN (1 Ag) avec des histones purifiés (1 g). figure 4B : liaison de PmAb avec la protéine de 94 kDa, en présence ou en l'absence de complexes ADNhistones, par immunotransfert. Une extraction de la fraction de membrane purifiée obtenue à partir des cellules RINm a été réalisée par TX-114. La phase riche en détergent TX-114 a été utilisée en tant qu'antigène dans ces expériences. Lignes a, PmAb (20 g) b, PmAb (20 yg) + ADN (1 ssg) c, PmAb (20jg) + ADN (1 ssg) + histones (1 yg). LMW (Law Molecular Weight Markers) indique les marqueurs de référence de faible poids moléculaires utilisés. figure 5 : présence de la protéine de 94 kDa dans la fraction de membrane plasmatique. figure 5A : détection de la protéine de 94 kDa par immunotransfert après extraction de la fraction de membrane plasmatique purifiée à partir des cellules RINm par TX-114. Liaison de PmAb (20 yg) + ADN (1 yg) + histone (1 pg) avant traitement par la trypsine, par immunotransfert. Lignes (verticales) a, surnageant TX-114 avant la phase de séparation b, phase riche en détergent TX-114 ; c, phase aqueuse TX-114. (LMW a la même signification que celle indiquée précédemment pour la figure 4). figure 5B : liaison de PmAb (20 yg) + ADN (1 ssg) + histone (1 ssg) après traitement par la trypsine à une concentration de 50 yg/ml pendant 5, 10 et 20 minutes à 0 C par immunotransferts. Lignes verticales a, phase riche en détergent TX-114 sans trypsine b, phase riche en détergent TX-114 après traitement par la trypsine (50 pg/ml pendant 5 minutes) c, phase riche en détergent TX-114 après traitement par la trypsine (50 ssg/ml pendant 10 minutes) d, phase riche en détergent TX-114 après traitement par la trypsine (50 ssg/ml pendant 20 minutes). - figure 6 : liaison d'un anticorps anti-ADN polyclonal purifié à partir du sérum d'un individu atteint de LED (actif) à la protéine de surface cellulaire de 94 kDa, en présence ou en l'absence de complexes ADN-histones, par immunotransferts. La phase riche en détergent TX-114 obtenue à partir d'une fraction de membrane purifiée de cellules RINm a été utilisée comme antigène. Le sérum de l'individu atteint de LED a tout d'abord été fixé sur une colonne d'ADN-cellulose. L'anticorps polyclonal élué a ensuite été passé à travers une colonne constituée d'histones liés de manière covalente à du Trisacryl activé. L'effluent obtenu correspond à l'anticorps polyclonal anti-ADN purifié. Lignes (verticales) a, PmAb (20 ssg) + ADN (1 ssg) + histone (1 ssg) b, PmAb (20 ssg) ; c, anticorps anti-ADN polyclonal purifié (20 ssg) + ADN (1 g) + histone (1 ssg) d, anticorps anti-ADN polyclonal purifié (20 ssg). Selon une variante particulièrement intéressante, la présente invention concerne un procédé de détection in vitro d'anticorps, le cas échéant liés à des nucléosomes, ces anticorps étant corrélables au LED, dans un tissu ou fluide biologique susceptible de les contenir, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact de ce tissu ou fluide biologique:: avec des complexes formés entre la protéine de 94 kDa décrite ci-dessus, et des nucléosomes, ou avec des complexes formés entre des nucléosomes et tout fragment de cette protéine de 94 kDa, dès lors que ce fragment est susceptible de se lier aux nucléosomes, et, le cas échéant, qu'il porte un ou plusieurs sites susceptibles d'être reconnus par l'ACM PME77 et/ou par les anticorps présents dans le sérum de patients atteints de LED, cette mise en contact étant réalisée dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre lesdits anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique et les complexes sus-mentionnés, et, - la détection in vitro des complexes immunologiques éventuellement formés entre lesdits complexes et lesdits anticorps. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus comprenant - la fixation de ladite protéine de 94 kDa, ou d'un fragment de cette protéine tel que décrit ci-dessus, sur un support solide, notamment dans des puits de plaques du type de celles utilisées dans les méthodes de dosage enzymatique ELISA ((Enzyme Linked Sorbent Assay), - le rinçage du support solide afin d'éliminer la quantité de protéine de 94 kDa, ou de fragment de cette dernière, non fixée sur le support, - l'incubation de cette protéine de 94 kDa, ou du fragment de cette dernière, ainsi fixée sur le support solide, avec une préparation de nucléosomes de manière à former des complexes entre ladite protéine de 94 kDa, ou le fragment de cette dernière, et les nucléosomes (ci-après désignés complexes 94 kDa-nucléosomes), - le rinçage du support solide afin d'éliminer les nucléosomes, non liés à la protéine de 94 kDa, ou au fragment de cette protéine, - l'incubation des complexes 94 kDa-nucléosomes, fixés sur le support solide avec ledit tissu ou fluide biologique, - le rinçage du support solide afin d'éliminer les constituants du tissu ou fluide biologique non fixés sur les complexes 94 kDa-nucléosomes, - la détection des complexes immunologiques éventuellement formés entre les anticorps, le cas échéant, liés aux nucléosomes, susceptibles d'être présents dans le tissu ou fluide biologique, et les complexes 94 kDa-nucléosomes. L'invention vise également un procédé tel que décrit ci-dessus comprenant - la fixation de complexes 94 kDa-nucléosomes, préalablement formés par liaison entre ladite protéine de 94 kDa avec des nucléosomes, sur un support solide, notamment dans des puits de plaques du type de celles utilisées dans les méthodes ELISA, - le rinçage du support solide afin d'éliminer les complexes 94 kDa-nucléosomes sus-mentionnés non fixés sur le support, - l'incubation des complexes 94 kDa-nucléosomes fixés sur le support solide avec ledit tissu ou fluide biologique, - le rinçage du support solide afin d'éliminer les constituants du tissu ou fluide biologique non fixés sur les complexes 94 kDa-nucléosomes, - la détection des complexes immunologiques éventuellement formés entre les anticorps, le cas échéant, liés aux nucléosomes, susceptibles d'être présents dans le tissu ou fluide biologique, et les complexes 94 kDa-nucléosomes. Selon un mode préféré de réalisation des procédés décrits ci-dessus, l'étape de détection des anticorps spécifiques du LED est réalisée à l'aide d'antiimmunoglobulines, de préférence humaines, susceptibles de former une réaction immunologique avec les anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique, et marquées notamment à l'aide d'une enzyme telle que la phosphatase alcaline. Par l'expression nucléosomes, on entend aussi bien les polynucléosomes (plusieurs centaines de nucléosomes), les oligonucléosomes entre environ 10 à 20 nucléosomes, les mononucléosomes la chromatine ou encore des complexes formés d'ADN et d'histones. De préférence, la protéine de 94 kDa est liée à des mononucléosomes, notamment ceux issus de souris leucémiques L1210, constitués de fragments d'ADN de 150 à 200 paires de bases et d'histones, notamment du type H1, H2A, H2B, H3, ou H4. L'invention a pour objet l'application des procédés décrits ci-dessus au diagnostic in vitro du LED, et permet plus particulièrement le suivi de l'évolution du LED de la phase aiguë vers la phase de rémission. De préférence, le milieu biologique est constitué par un sérum humain ou par des glomérules de reins de patients lupiques. L'invention concerne également les complexes biologiques formés entre la protéine de 94 kDa décrite ci-dessus et les nucléosomes. Des complexes biologiques préférés de l'invention sont caractérisés en ce que ladite protéine de 94 kDa est liée à des mononucléosomes issus notamment de souris leucémiques L1210 et constitués de fragments d'ADN de 150 à 200 paires de base. Par complexation entre la protéine de 94 kDa et les nucléosomes, on entend tout type de liaison (covalente ou non) susceptible de s'effectuer entre ces nucléosomes et ladite protéine. Il va de soi que l'invention concerne également des complexes formés par liaison de nculéosomes à des fractions polypeptidiques pouvant avoir des poids moléculaires plus faibles que celui de la protéine de 94 kDa, dès lors qu'ils porteraient des sites de liaison susceptibles d'être reconnus par les nucléosomes. L'expression "complexes 94 kDa-nucléosomes" utilisée dans ce qui précède et dans ce qui suit, correspond aussi bien aux complexes formés entre les nucléosomes et la protéine de 94 kDa, qu'à ceux formés entre les nucléosomes et tout fragment tel que décrit ci-dessus de cette protéine de 94 kDa. L'invention a également pour objet des réactifs biologiques (ou réactifs de laboratoire) comprenant des complexes biologiques définis ci-dessus et l'utilisation de ces réactifs notamment pour la mise en oeuvre des procédés décrtis ci-dessus ou dans ce qui suit. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic pour la détection in vitro des anticorps caractéristiques du LED comprenant - la protéine de 94 kDa décrite ci-dessus, ou tout fragment de cette protéine tel que décrit ci-dessus, le cas échéant, fixée sur un support solide, - des nucléosomes et des réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de complexes entre les nucléosomes et la protéine de 94 kDa susmentionnée, ou de complexes entre les nucléosomes et un fragment de cette protéine tel que décrit ci-dessus, - des réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique entre les anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique et les complexes 94 kDa-nucléosomes sus-mentionnés, - des réactifs permettant la détection des complexes formés, lors de la susdite réaction immunologique, entre lesdits anticorps et les complexes 94 kDanucléosomes sus-mentionnés. Un kit de diagnostic particulièrement avantageux pour la détection des anticorps caractéristiques du LED comprend : - des complexes biologiques 94 kDa-nucléosomes tels que ceux décrits ci-dessus, ces complexes étant le cas échéant fixés sur un support solide, - des réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique entre les anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique et les complexes 94 kDa-nucléosomes sus-mentionnés, - des réactifs permettant la détection des complexes formés, lors de la susdite réaction immunologique, entre lesdits anticorps et les complexes 94 kDanucléosomes sus-mentionnés. Avantageusement les réactifs permettant la détection des complexes formés entre lesdits anticorps et les complexes 94 kDa-nucléosomes, portent un marqueur ou sont susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué. L'invention concerne également les anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre les complexes formés de la protéine de 94 kDa liée aux nucléosomes, ou contre les complexes formés de tout fragment de cette protéine tel que décrit ci-dessus lié aux nucléosomes. Ces anticorps susceptibles de former une réaction immunologique avec les complexes 94 kDa-nucléosomes définis ci-dessus, sont plus généralement désignés par l'expression anticorps anti-94 kDa-nucléosomes. De tels anticorps monoclonaux peuvent être produits par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après. Dans un premier temps, on immunise un animal avec les complexes 94 kDa-nucléosomes selon l'invention, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ces complexes. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on réalise alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis des complexes de l'invention pourront être testés par exemple par immunotransfert en une ou deux dimensions, et immunofluorescence. De manière particulièrement avantageuse, la présente invention met à profit les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre les complexes 94 kDa-nucléosomes décrits ci-dessus (ou encore anticorps anti-94 kDa-nucléosomes) pour la mise en oeuvre d'un procédé de dosage in vitro quantitatif des anticorps caractéristiques de LED susceptibles d'être contenus dans un échantillon biologique. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de dosage in vitro de la quantité d'anticorps corrélables au LED, susceptible d'être contenue dans un tissu ou fluide biologique, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact de complexes 94 kDa-nucléosomes avec une quantité déterminée d'anticorps anti-94 kDanucléosomes de telle façon que la totalité des complexes sus-mentionnés sont engagés dans une liaison immunologique avec les susdits anticorps, - la mise en contact des produits de la réaction immunologique précédente, à savoir des complexes (94 kDa-nucléosomes)-(anti-94 kDa-nucléosomes), avec le tissu ou fluide biologique dans des conditions permettant une réaction de compétition entre les anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique et les anticorps anti-94 kDanucléosomes vis-à-vis des complexes 94 kDa-nucléosomes sus-mentionnés, - la détection in vitro soit de la quantité d'anticorps anti-94 kDa-nucléosomes qui n'est plus fixée sur les complexes 94 kDa-nucléosomes, soit de celle qui demeure fixée sur ces complexes, cette quantité d'anticorps anti-94 kDa-nucléosomes ainsi détectée étant corrélable à la quantité d'anticorps spécifiques du LED contenue dans le tissu ou fluide biologique. Un procédé de dosage in vitro tel que décrit cidessus est avantageusement réalisé suivant les étapes suivantes - la fixation de complexes 94 kDa-nucléosomes sur un support solide, notamment dans des puits de plaques du type de celles utilisées dans les méthodes ELISA, - le rinçage du support solide afin d'éliminer la quantité de complexes sus-mentionnés non fixée sur le support, - l'incubation des complexes précédents fixés sur le support avec une quantité déterminée d'anticorps anti-94 kDa-nucléosomes, en excès par rapport à la quantité desdits complexes, - le rinçage du support afin d'éliminer les anticorps anti-94 kDa-nucléosomes, non fixés sur les complexes précédents, - l'incubation du tissu ou fluide biologique, avec les complexes (94 kDa-nucléosomes) - (anti-94 kDa-nucléosomes), formés lors de l'étape d'incubation précédente entre les complexes 94 kDa-nucléosomes et les anticorps anti-94 kDa-nucléosomes, - le rinçage du support afin d'éliminer et, le cas échéant, de récupérer dans la solution de rinçage les anticorps anti-94 kDa-nucléosomes qui ne sont plus fixés sur les complexes 94 kDa-nucléosomes, - la détection in vitro soit de la quantité d'anticorps anti-94 kDa-nucléosomes qui n'est plus fixée sur les complexes 94 kDa-nucléosomes, soit de celle qui demeure fixée sur ces complexes, cette quantité d'anticorps ainsi détectée étant corrélable à la quantité d'anticorps spécifiques du LED contenue dans le tissu au fluide biologique. Selon un mode avantageux de réalisation du procédé de dosage in vitro décrit ci-dessus les anticorps anti-94 kDa-nucléosomes sont marqués, notamment de manière enzymatique. La détermination de la quantité d'anticorps spécifiques du LED, éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique, est réalisée - soit directement par détection de la quantité d'anticorps marqués anti-94 kDa-nucléosomes récupérée après la dernière étape de rinçage ; dans ce cas, la quantité d'anticorps spécifiques du LED correspond directement à la quantité d'anticorps marqués anti-94 kDa-nucléosomes récupérés dans la solution de rinçage, - soit indirectement par détection de la quantité d'anticorps marqués anti-94 kDa-nucléosomes fixée sur les complexes 94 kDa-nucléosomes ; dans ce cas, la quantité d'anticorps spécifiques du LED correspond à la différence entre d'une part, la quantité d'anticorps marqués anti-94 kDa-nucléosomes fixés sur les complexes 94 kDa-nucléosomes avant l'étape d'incubation avec le tissu ou fluide biologique, et d'autre part, la quantité d'anticorps marqués anti-94 kDa-nucléosomes fixés sur les complexes 94 kDa-nucléosomes après les dernières étapes d'incubation avec le tissu ou fluide biologique, et de rinçage selon le procédé de dosage décrit ci-dessus. En variante du mode de réalisation du procédé de dosage in vitro décrit ci-dessus, les anticorps anti-94 kDa-nucléosomes ne sont pas marqués, et la quantité d'anticorps anti-94 kDa-nucléosomes récupérée après la dernière étape de rinçage, dans la solution de rinçage, ou la quantité de ces anticorps demeurant fixée après les dernières étapes d'incubation avec le tissu ou fluide biologique, et de rinçage, est détectée à l'aide d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former une réaction immunologique spécifique avec ces anticorps. L'invention concerne également des kits de diagnostic pour la détection et le dosage in vitro des anticorps caractéristiques du LED caractérisés en ce qu'ils comprennent l'ensemble des constituants des kits décrits ci-dessus pour la détection in vitro de ces anticorps, ainsi qu'une quantité déterminée d'anticorps anti-94 kDa-nucléosomes, le cas échéant marqués, notamment à l'aide d'un marqueur enzymatique ou radioactif. Un protocole pour la détection des complexes 94 kDa-nucléosomes de l'invention est donné ci-après a titre illustratif. Les nucléosomes se lient directement à la protéine de 94 kDa en immunotransfert. La phase détergente de la préparation membranaire (telle que décrite dans le chapitre MATERIELS ET METHODES ci-dessus), après extraction au triton X-114, est soumise à une électrophorèse en gel SDS polyacrylamide 7,5 % puis transférée sur une feuille de nitrocellulose. Les nucléosomes sont ensuite incubés sur cette feuille pendant 1 heure à température ambiante puis la feuille est lavée par une solution tampon TBST (Tris 100 mM, NaCl 150 mM, tween 0,05 %, pH 8), 3 fois pendant 10 minutes. Puis on incube l'anticorps monoclonal PME77 purifié. Après lavage, on incube un anticorps antiimmunoglobuline de souris marqué à la phosphatase alcaline diluée au 1/1000 . Après un nouveau lavage, on révèle avec un tampon Tris 100 mM, NaCl 100 mM, et MqC12 5 mM à pH 9.5. On arrête la réaction avec l'EDTA 10 mM. L'hybridome secréteur de l'ACM PME77 a été déposé à la COLLECTION NATIONALE DES CULTURES DE MICRO ORGANISMES (C.N.C.M.) de l'INSTITUT PASTEUR à PARIS sous le numéro I-555. Les nucléosomes, et en particulier, les mononucléosomes, liés à la protéine de 94 kDa, ou à un fragment tel que décrit ci-dessus de cette protéine, dans des complexes biologiques de l'invention, sont d'une manière générale, choisis parmi ceux susceptibles de se fixer sur la protéine de 94 kDa. Les nucléosomes sont obtenus à partir de tout tissu ou fluide biologique suceptible de contenir des nucléosomes, selon les techniques classiques utilisés pour l'obtention de nucléosomes à partir de noyaux de cellules, notamment selon la méthode décrite dans LUTTER C. (1978), J. Mol. Biol., 124, 391-420. Des parties aliquotes des préparations de nucléosomes ainsi obtenues peuvent être utilisées dans un test de reconnaissance de la protéine de 94 kDa et de fixation sur cette dernière, afin de vérifier si ces nucléosomes sont utilisables dans les complexes de l'invention. A titre illustratif, ce test comprend la mise en contact de ces nucléosomes avec la protéine de 94 kDa fixée sur un support solide, suivie d'une étape de rinçage afin d'éliminer les éventuels nucléosomes non fixés sur la protéine de 94 kDa, suivie de la détection des nucléosomes fixés sur la protéine de 94 kDa à l'aide de tout réactif marqué susceptible de reconnaître spécifiquement les nucléosomes complexés à la protéine de 94 kDa, notamment à l'aide de l'ACM PME77, et d'anti-immunoglobuline marquée à la phosphatase alcaline selon la méthode décrite cidessus. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection in vitro d'anticorps, le cas échéant liés à des nucléosomes, ces anticorps étant corrélables au LED, dans un tissu ou fluide biologique susceptible de les contenir, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact de ce tissu ou fluide biologique avec des complexes formés entre une protéine de 94 kDa et des nucléosomes, cette protéine de 94 kDa étant elle-même susceptible de former un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal PME77 purifié, lorsque ledit anticorps monoclonal est associé à des nucléosomes, ou avec des complexes formés entre des nucléosomes et tout fragment de cette protéine de 94 kDa, dès lors que ce fragment est susceptible de se lier aux nucléosomes, et, le cas échéant, qu'il porte un ou plusieurs sites susceptibles d'être reconnus par l'ACM PME77 et/ou par les anticorps présents dans le sérum de patients atteints de LED, cette mise en contact étant réalisée dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre lesdits anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique et les complexes sus-mentionnés, et, - la détection in vitro des complexes immunologiques éventuellement formés entre lesdits complexes et lesdits anticorps. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend : - la fixation de ladite protéine de 94 kDa, ou d'un fragment de cette dernière selon la revendication 1, sur un support solide, notamment dans des puits de plaques du type de celles utilisées dans les méthodes ELISA, - le rinçage du support solide afin d'éliminer la quantité de protéine de 94 kDa non fixée sur le support, - l'incubation de cette protéine ainsi fixée sur le support solide avec une préparation de nucléosomes de manière à former des complexes 94 kDa-nucléosomes, - le rinçage du support solide afin d'éliminer les nucléosomes, non liés à la protéine de 94 kDa, ou au fragment de cette protéine, - 11 incubation des complexes 94 kDa-nucléosomes, fixés sur le support solide avec ledit tissu ou fluide biologique, - le rinçage du support solide afin d'éliminer les constituants du tissu ou fluide biologique non fixés sur les complexes 94 kDa-nucléosomes, - la détection des complexes immunologiques éventuellement formés entre les anticorps, le cas échéant, liés aux nucléosomes, susceptibles d'être présents dans le tissu ou fluide biologique, et les complexes 94 kDa-nucléosomes. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend : - la fixation de complexes 94 kDa-nucléosomes, préalablement formés par liaison entre ladite protéine de 94 kDa avec des nucléosomes, sur un support solide, notamment dans des puits de plaques du type de celles utilisées dans les méthodes ELISA, - le rinçage du support solide afin d'éliminer les complexes 94 kDa-nucléosomes sus-mentionnés non fixés sur le support, - l'incubation des complexes 94 kDa-nucléosomes fixés sur le support solide avec ledit tissu ou fluide biologique, - le rinçage du support solide afin d'éliminer les constituants du tissu ou fluide biologique non fixés sur les complexes 94 kDa-nucléosomes, - la détection des complexes immunologiques éventuellement formés entre les anticorps, le cas échéant, liés aux nucléosomes, susceptibles d'être présents dans le tissu ou fluide biologique, et les complexes 94 kDa-nucléosomes. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3r caractérisé en ce que l'étape de détection est réalisée à l'aide d'anti-immunoglobulines susceptibles de former une réaction immunologique avec les anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique, et marquées notamment à l'aide d'une enzyme telle que la phosphatase alcaline. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit complexe est formé de la protéine de 94 kDa liée à des mononucléosomes issus notamment de souris leucémiques L1210 et constitués de fragments d'ADN de 150 à 200 paires de base. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, appliqué au diagnostic in vitro du LED et en ce que le fluide biologique est un prélèvement de sérum humain. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il permet le suivi d'une évolution du LED de la phase aiguë vers la phase de rémission. 8. Complexes biologiques caractérisés en ce qu'ils sont formés par une protéine de 94 kDa ou tout fragment de cette protéine selon la revendication 1, cette protéine, ou le fragment de cette dernière, étant liée à des nucléosomes. 9. Complexes selon la revendication 8, caractérisés en ce que ladite protéine de 94 kDa, ou le fragment de cette dernière,est liée à des mononucléosomes issus notamment de souris leucémiques L1210 et constitués de fragments d'ADN de 150 à 200 paires de base. 10. Réactif biologique comprenant des complexes selon la revendication 8 ou la revendication 9, pour la mise en oeuvre notamment d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 7. 11. Kit de diagnostic pour la détection in vitro des anticorps caractéristiques du LED comprenant - la protéine de 94 kDa ou tout fragment de cette protéine selon la revendication 1, le cas échéant, fixée sur un support solide, - des nucléosomes et des réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de complexes 94 kDanucléosomes, - des réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique entre les anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique et les complexes 94 kDa-nucléosomes sus-mentionnés, - des réactifs permettant la détection des complexes formés, lors de la susdite réaction immunologique, entre lesdits anticorps et les complexes 94 kDanucléosomes sus-mentionnés. 12. Kit de diagnostic pour la détection in vitro des anticorps caractéristiques du LED comprenant - des complexes selon la revendication 8 ou la revendication 9, ou encore un réactif selon la revendication 10, le cas échéant fixés sur un support solide, - des réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique entre les anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique et les complexes 94 kDa-nucléosomes sus-mentionnés, - des réactifs permettant la détection des complexes formés, lors de la susdite réaction immunologique, entre lesdits anticorps et les complexes 94 kDanucléosomes sus-mentionnés. 13. Kit de diagnostic selon la revendication 11, ou la revendication 12, caractérisé en ce que les réactifs permettant la détection des complexes formés entre lesdits anticorps et les complexes 94 kDanucléosomes, portent un marqueur ou sont susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué. 14. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre les complexes, selon la revendication 8 ou 9, formés entre la protéine de 94 kDa et les nucléosomes. 15. Procédé de dosage in vitro de la quantité d'anticorps corrélables au LED, susceptible d'être contenue dans un tissu ou fluide biologique, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend - la mise en contact de complexes 94 kDa-nucléosomes, avec une quantité déterminée d'anticorps selon la revendication 14 de telle façon que la totalité des complexes sus-mentionnés sont engagés dans une liaison immunologique avec les anticorps selon la revendication 14, - la mise en contact des produits de la réaction immunologique précédente avec le tissu ou fluide biologique dans des conditions permettant une réaction de compétition entre les anticorps éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique et ceux selon la revendication 14 vis-à-vis des complexes 94 kDa-nucléosomes sus-mentionnés, - la détection in vitro soit de la quantité d'anticorps selon la revendication 14 qui n'est plus fixée sur les complexes 94 kDa-nucléosomes, soit de celle qui demeure fixée sur ces complexes, cette quantité d'anticorps ainsi détectée étant corrélable à la quantité d'anticorps spécifiques du LED contenue dans le tissu ou fluide biologique. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - la fixation de complexes 94 kDa-nucléosomes sur un support solide, notamment dans des puits de plaques du type de celles utilisées dans les méthodes ELISA, - le rinçage du support solide afin d'éliminer la quantité de complexes sus-mentionnés non fixée sur le support, - l'incubation des complexes précédents avec une quantité d'un anticorps selon la revendication 14, en excès par rapport à la quantité dudit complexe, - le rinçage du support afin d'éliminer les anticorps selon la revendication 14, non fixés sur les complexes précédents, - l'incubation du tissu ou fluide biologique, avec les complexes formés, lors de l'étape d'incuhtion précédente, entre les complexes 94 kDa-nucléosomes et les anticorps selon la revendication 14, - le rinçage du support afin d'éliminer et, le cas échéant, de récupérer dans la solution de rinçage les anticorps selon la revendication 14 qui ne sont plus fixés sur le complexe 94 kDa-nucléosomes, - la détection in vitro soit de la quantité d'anticorps selon la revendication 14 qui n'est plus fixée sur les complexes 94 kDa-nucléosomes, soit de celle qui demeure fixée sur ces complexes, cette quantité d'anticorps ainsi détectée étant corrélable à la quantité d'anticorps spécifiques du LED contenue dans le tissu au fluide biologique. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les anticorps selon la revendication 14 sont marqués, notamment de manière enzymatique, et en ce que la détermination de la quantité d'anticorps spécifiques du LED éventuellement présents dans le tissu ou fluide biologique est réalisée - soit directement par détection de la quantité d'anticorps marqués selon la revendication 14, récupérée après la dernière étape de rinçage ; dans ce cas, la quantité d'anticorps spécifiques du LED correspond directement à la quantité d'anticorps marqués selon la revendication 14, récupérés dans la solution de rinçage, - soit indirectement par détection de la quantité d'anticorps marqués selon la revendication 14, fixée sur les complexes 94 kDa-nucléosomes ; dans ce cas, la quantité d'anticorps spécifiques du LED correspond à la différence entre d'une part, la quantité d'anticorps marqués selon la revendication 14, fixés sur les complexes 94 kDa-nucléosomes avant l'étape d'incubation avec le tissu ou fluide biologique, et d'autre part, la quantité d'anticorps marqués selon la revendication 14, fixés sur les complexes 94 kDa-nucléosomes après les dernières étapes d'incubation avec le tissu ou fluide biologique, et de rinçage selon la revendication 14. 18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les anticorps selon la revendication 14 ne sont pas marqués, et en ce que la quantité d'anticorps selon la revendication 14 récupérée après la dernière étape de rinçage, dans la solution de rinçage, ou la quantité de ces anticorps demeurant fixée après les dernières étapes d'incubation avec le tissu ou fluide biologique; et de rinçage, est détectée à l'aide d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former une réaction immunologique spécifique avec ces anticorps. 19. Kit de diagnostic pour la détection in vitro des anticorps caractéristiques du LED selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend également une quantité déterminée d'anticorps, le cas échéant marqués, selon la revendication 14.