Brevet FR2653444A1 — publié le 19910426

La présente invention a pour objet un procédé d'inhibition de l'activité des enzymes B-glucanases. Les 13-glucanes, polymères du glucose liés par liaison ss, sont des polysaccharides qui possèdent des propriétés rhéologiques intéressantes et, en particulier, un pouvoir viscosifiant élevé, ce qui leur assurent des applications dans divers domaines et notamment dans le domaine pétrolier. Toutefois, certaines enzymes sont capables d'opérer des coupures dans les chaînes des polysaccharides et donc d'abaisser très rapidement leur poids moléculaire et en conséquence, leurs propriétés rhéologiques, dont le pouvoir viscosifiant. I1 est donc important de pouvoir inhiber ces enzymes et notamment les ss-glucanases qui sont spécifiques des ss- glucanes, considérés précédemment. I1 est bien connu que des enzymes présentes dans les milieux sont susceptibles d'attaquer certains sites ou certaines fonctions de composés macromoléculaires et de porter ainsi atteinte aux propriétés de ces composés. Afin de pallier ces inconvénients, on a recherché des moyens pour inhiber l'activité de ces enzymes contaminantes. C'est ainsi que dans le cas des protéases, notamment dans les industries alimentaires et pharmaceutiques, on a beaucoup travaillé les processus d'inhibition dont on connaît maintenant de nombreux agents. En revanche, dans le domaine des osidases (et celui des lipases), les travaux ont été moins approfondis et on connaît peu d'inhibiteurs. La présente invention a pour objet un procédé d'inhibition des enzymes ss-glucanases présentes dans un milieu aqueux, contenant un polymère du glucose, caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu un composé susceptible de libérer un ion borohydrure de formule [ Z - BH3 dans laquelle Z représente, soit l'hydrogène, soit le groupement C = N et comportant un cation X+ permettant de solubiliser le composé dans le milieu. Le cation utilisé proviendra de préférence d'un métal alcalin Li, K, Na par exemple ou d'un alcalino-terreux ou sera l'ion ammonium NH4+. La quantité de composé à ajouter au milieu dépendra naturellement de la concentration en ss-glucanase ; elle sera telle que la concentration du milieu en ion borohydrure sera comprise entre 0.01 et 20% poids. Le composé préféré du procédé de l'invention, sera, pour des raisons économiques, le borohydrure de sodium N2BH4 Le procédé de l'invention est utilisable pour la protection de l'ensemble des polysaccharides de la famille des glucanes liés par liaison B : celluloses, scléroglucanes, xanthane, etc... I1 sera particulièrement bien adapté à la protection du polysaccharide lors des processus d'obtention et de purification à partir des microorganismes sources, par exemple, Sclerotium rolfsii pour le scléroglucane. L'utilisation de l'ion borohydrure apparaît comme un moyen particulièrement efficace pour diminuer l'activité des 13-glucanases. I1 semble par ailleurs que cette action soit douée de spécificité, puisque dans les mêmes conditions, l'activité glucanase d'une préparation complexe d'osidases est complètement inhibée, alors que l'activité xylanase, par exemple, de la même préparation est beaucoup moins sensible à l'action de l'ion borohydrure. Le procédé de l'invention est illustré par les exemples suivants EXEMPLES 1 A 3 Préparation de la solution enzymatique Une glucanase de Botrytis cinerea est traitée en solution par NaBH4 à 6% pendant 1 heure. Le mélange réactionnel est alors neutralisé par CH3COOH puis centrifugé. Le surnageant est ajusté en volume avec de l'eau distillée pour donner une solution enzymatique à 10 mg/ml. Préparation de la solution de polymère : 100 mg de scléroglucane obtenu par fermentation de Sclérotium rolfsii sont dissous dans 50 ml d'eau distillée pour donner une solution à 2 g/l (sous agitation à 4"C pendant 24 heures). Ensuite on mélange 3 ml de solution mère de polysaccharide à 2 g/l et 3 ml de solution tampon phosphate 0.2 M à pH 7 pendant 2 heures à température ambiante pour donner une solution de scléroglucane 0.1 M pH 7 à 1 g/l de polysaccharide. Trois prises d'essai de 2 ml de la dite solution sont additionnées de 0.5 ml de solution enzymatique concentrée à 10 g/l (solution enzymatique traitée NaBH4, solution enzymatique native sans traitement et témoin sans enzyme). Ces trois prises sont placées dans la cellule de mesure d'un viscosimètre Low Shear. La concentration en substrat (scléroglucane) est de 0,8 g/l et la température maintenue à 30 C. Les résultats obtenus sont décrits par le tableau 1 Tableau 1 Solution Viscosité (mPa.s) après 5mn après 1h ≈ après 4h Solution enzymati- I que traitée NaBH4 | 155 | 95 55 Solution enzymati I 0 I 0 1 0 que native Témoin 160 160 160 On peut constater que En l'absence de 13-glucanase, la viscosité reste pratiquement inchangée (témoin). En présence de l'enzyme native, il y a dégradation immédiate et chute brutale de la viscosité. En présence de l'enzyme traitée par le borohydrure de sodium, l'activité ne décroit que très lentement avec le temps et il reste une activité résiduelle. L'inhibition de l'activité enzymatique est considérable. Cette activité a été évaluée à 1 UA/mn pour la solution traitée par NaBH4, alors qu'elle est de 20 pour la solution d'enzyme native. EXEMPLES 4 A 6 Comparaison de l'inhibition des activités xvlanase/slucanase Pour ces exemples, on a utilisé les 3 substrats suivants - glucuronoxylane extraite de bois de bouleau (Betula papyrifera Marsh.) - carboxyméthyl cellulose (CMC) : blanose cellulose gum 7H3 SXF HERCULES Ltd. - ss-glucane (scléroglucane de sclerotium rolfsii) que l'on soumet à l'action d'une solution enzymatique (complexe industriel brut comprenant plusieurs enzymes). Préparation des substrats Les substrats ont été préparés comme suit - xylane et CMC à 2,5 g/l dans tampon acétate 0,1 M pH 5 - scléroglucane à 1 g/l dans tampon phosphate 0,01 M pH 7 Préparation enzymatique avec inhibiteur L'enzyme est traitée 3 heures (50 g/l) dans une solution aqueuse contenant 20 g/l de NaBH4 et un agent anti-mousse. Le mélange réactionnel est alors neutralisé par l'acide acétique, puis centrifugé, le surnageant contenant les enzymes est lyophilisé pour sa conservation. Les essais d'activité sont réalisés à 40"C sous agitation sur 1,9 ml de solution ou suspension de substrat et 0,1 ml de solution enzymatique convenablement diluée, native puis traitée à NaBH4. Après la durée impartie, la réaction est arrêtée par addition de réactif de Somogyi, et les extrémités réductrices apparues (caractéristiques du nombre de coupures réalisées par l'enzyme) sont dosées par spectrophotométrie à 500 nm (méthode de Somogyi et Nelson Somogyi S., J. Biol. Chem. 195, p 19.23, 1952). Le temps d'incubation est de 30 minutes avec l'enzyme native et de 5 heures avec l'enzyme traitée NaBH4. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 2 ci-dessous Tableau 2 I I SUBSTRAT I I SCLERO ACTIVITE XYLANE | C M C GLUCANE Activité absolue : 1 9,3 1 29,3 1 enzyme native I I (nKat/mg) I Activité relative 100 1 100 100 I I I Activité relative : 1 52 0,02 1 0 enzyme traitée par NaBH4 On peut constater que sous l'effet du traitement par NaBH4, l'inhibition de l'activité ss 1 3 glucanase (sur sclérogucane) est totale et l'inhibition de l'activité 131 4 glucanase (sur CMC) est presque totale. En revanche, l'activité xylanase n'est affectée qu'à 50% environ par le traitement d'inhibition proposée. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'inhibition de l'enzyme ss-glucanase présente dans un milieu aqueux contenant un polymère de glucose caractérisé en ce qu'on ajoute au milieu un composé susceptible de libérer un ion borohydrure de formule [ Z - BH3 i dans laquelle Z représente, soit l'hydrogène soit le radical CN et comportant un cation X+ permettant de solubiliser le composé dans le milieu. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le cation X+ sera choisi parmi NH4+ et ceux provenant d'un métal alcalin ou d'un métal alcalinoterreux. 3 - Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le composé est NaBH4 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la concentration du milieu en ion borohydrure sera comprise entre 0,01 et 20 % poids.