Brevet FR2651241A1 — publié le 19910301

BACTERIES PRODUISANT DE LA PYRIMINE ET PROCEDE POUR PREPARER DE LA PYRIMINE La présente invention concerne des bactéries qui peuvent produire la pyrimine, utile comme intermé- diaire d'un colorant naturel, la ferropyrimine, et un procédé pour préparer efficacement la pyrimine dans lequel des bactéries produisant de la pyrimine sont utilisées. Les formules de la pyrimine et de la ferro- pyrimine sont les suivantes: C a H, 00- co\ /- n FeII Les colorants naturels ont fait l'objet depuis peu d'une grande attention, car des doutes se sont élevés en ce qui concerne la sécurité des colorants synthétiques. Parmi ces colorants naturels, un colorant rouge naturel, la ferropyrimine, a été préparée en cultivant une souche de GH appartenant au genre Pseudomonas dans un milieu de culture pour faire produire à la souche de la pyrimine et associer en même temps la pyrimine obtenue avec des ions fer qui sont ajoutés à l'avance au milieu de culutre et en isolant la ferropyrimine ainsi formée du milieu de culture (voir Biochemistry, 1965, 4, NI 10). Un des buts de la présente invention est de fournir de nouvelles bactéries produisant de la pyrimine. Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé pour preparer efficacement la pyrimine. Ces buts de la présente invention ainsi que d'autres apparaîtront à la lecture de la des- cription et des exemples ci-après. Conformément à un aspect de la présente invention, il est fourni une première souche nouvelle produisant de la pyrimine appartenant au genre Pseudo- monas, présentant les propriétés bactériologiques suivantes: - réaction de dénitrification: négative - assimilation de sources de carbone: Darabinose: positive L-lysine: négative Conformément à un autre aspect de la présente invention, il est fourni une seconde et nouvelle souche produisant de la pyrimine appartenant au genre Pseudomonas présentant les propriétés bacté- riologiques suivantes: - réaction de dénitrification négative assimilation de sources de carbone: D-arabinose: positive L-lysine: positive Ces souches produisent de la pyrimine dans une quantité non inférieure à 400 pg/ml lorsqu'elles sont cultivées en présence d'une plante dans un milieu basal LS et elles commencent à produire La pyrimine au plus tard 8 jours après le début de la culture. Conformément à un autre aspect de la présente invention, il est fourni un procédé pour préparer la pyrimine qui comprend les stades consistant à soumettre une souche produisant de la pyrimine à une culture mixte dans un milieu de culture en présence d'une plante et à isoler la pyrimine produite du milieu de culture. Conformément à un autre aspect de la présente invention, it est fourni un procédé pour préparer la pyrimine qui comprend les stades de culture de bactéries produisant de la pyrimine appar- tenant au genre Pseudomonas, en présence d'une plante, dans un milieu de culture contenant un sucre, un composé contenant un atome d'azote, un composé conte- nant un atome de magnésium, un composé contenant un atome de phosphore, et un composé contenant un atome de fer, mais exempt d'ions calcium et chlorure, puis d'isolement de la pyrimine obtenue. Conformément à un autre aspect de la présente invention, il est fourni un procédé pour préparer la pyrimine qui comprend les stades de cul- ture de bactéries produisant de la pyrimine apparte- nant au genre Pseudomonas dans un milieu de culture contenant un composé organique contenant un atome d'azote, un sucre, un composé mineral contenant un atome d'azote, un composé contenant un atome de phos- phore et un composé contenant un atome de fer, mais exempt d'ions calcium et chlorure, et ayant un pH de 3,8 à 5, puis d'isolement de la pyrimine obtenue. La première et nouvelle souche produisant de la pyrimine de la présente invention présente les propriétés bactériologiques suivantes: Propriétés bactériologiques 1. Propriétés morphologiques Morphologie: le bacille existe indépendamment ou il est lié en forme de chaîne et ne forme pas de spore; Motilité le bacille a -de la motilité et un flagelle polaire; Dimensions: 0,6,, 0,8 im x 1,à 3,5 Mm; Coloration Gram: négative 2. Aptitude à la culture dans divers milieux de culture (1) Culture en bouillon Développement: modéré; Tunic: il forme un anneau: Précipités: léger; Turbidité: observée. (2) Culture inclinée sur bouillon Forme: fibreuse; Surface: lisse et brillante; Périphérie: il forme des colonies entières; Nuance colorée: blanc-laiteux; Transparence: opaque (3) Culture sur plaque de gélose au bouillon Forme: cercle parfait; Périphérie: il forme des colonies entières; Forme de la protubérance superficielle:lenticulaire. Surface: lisse et brillante; Nuance colorée: blanc-laiteux; (4) Culture en piqûre sur gélose au bouillon Il se développe sur la surface du milieu de culture et le long de la partie supérieure de la piqûre. 3. Propriétés physiologiques (1) Comportement vis-à-vis de l'oxygène: aérobie; (2) Catalase: + (3) Oxydase: + (4) Arginine déshydrolase: (5) Lipase: + (hydro- lyse du Tween 80) (6) Lécithinase: -(décompo- sition du jaune d'oeuf) (7) Hydrolyse de la gélatine: (8) Hydrolyse de l'amidon: (9) Hydrolyse de l'acide poly74- hydroxybutyrique (PHB) extracellulaire: - (10) Développement autotrophe avec utilisation de H2 (11) Formation de colorant: Il ne forme aucun colorant dans la gélose à Pseudo- monas F et dans la gêlose à Pseudomonas P. (12) Réduction des nitrates: (13) Réaction de dénitrification: (14) Point de décomposition dans le proto- catéchulate: position ortho (15) Accumulation intracellulaire de PHB: + (16) Formation de Levane à partir du saccharose: (17) Intervalle de température de déve- loppement: de 11 à 40 C; température de développement optimale: 30 à 32 C. (18) Intervalle de pH de développement: de 3,8 à 8,5. pH de développement optimum: 5,5 à 6,5. (19) Assimilation des sources de carbone D-glucose: + D-fructose + Darabinose + tréhalose + mannitol: + inositol: + glycérol: + L-lysine: Lvaline: + A-alanine + glycolate + p-hydroxybenzoate + La classification de la souche de la présente invention a été effectuée conformément à la méthode décrite dans le "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", 1984, Vol. 1 sur la base des propriétés bactériologiques qui précèdent. On trouve que cette souche est un bacille gram-négatif qui présente de la motilité grâce à un flagelle polaire, qui est aérobie, qui est positif à l'essai à la catalase et qui est positif à l'essai à l'oxy- dase. Par conséquent, on considère que cette souche est un bacille appartenant au genre Pseudomonas. Parmi les souches appartenant au genre Pseudomonas, on connait Pseudomonas cepacia et Pseudo- monas gladioli comme souches qui accumulent à l'inté- rieur des cellules de l'acide poly-_-hydroxybutyrique comme source de carbone-substance de stockage, qui se développent à 40 C et qui décomposent l'acide protocatéchuique à la position ortho. Cependant, cette souche ne peut pas utiliser le saccharose, mais peut utiliser la glycine comme source de carbone, comme on le montrera ci-dessous. La souche (Pseudomonas cepacia) diffère de la souche de l'invention (Pseudomonas sp. K-2) sur ces points. Propriétés Pseudomonas Pseudomonas sp. K-2 cepacia assimilation de produit hydrocarboné saccharose - + Glycine + - D'autre part, cette souche ne peut pas former de levane à partir du saccharose, elle ne peut pas hydrolyser la gélatine et elle ne contient pas de lécithinase comme on le montrera ci-dessous. La souche (Pseudomonas gladioli) diffère de la souche de l'invention (Pseudomonas sp. K-2) sur ces points. Propriétés Pseudomonas Pseudomonas sp. K-2 gladioli formation de levane à partir du saccharose - + hydrolyse de- la gélatine + lécithinase - + Par conséquent, il est raisonnable de consi- dérer que la souche de l'invention est une souche nouvelle appartenant au genre Pseudomonas et elle a été nommée Pseudomonas sp. K-2. La souche de l'in- vention a été déposée au Fermentation Research Institute (FRI) sous le numéro d'inscription FERM BP-2933. La seconde souche produisant de la pyrimine conforme à la présente invention présente les mêmes propriétés bactériologiques que la première souche produisant de la pyrimine de la présente invention, excepté en ce qui concerne les points suivants: Intervalle de température de développement: 11 à 35 C Assimilation des sources de carbone: L-lysine + Par conséquent, cette souche a été consi- dérée comme étant un bacille appartenant au genre Pseudomonas. Parmi les souches appartenant au genre Pseudomonas, on connait Pseudomonas Solanacearum comme souche qui accumule de l'acide poly-/9-hydroxybu- tyrique à l'intérieur des cellules comme source de carbone-substance de stockage, qui ne se développe pas à 40 C et qui décompose l'acide protocatéchuique à la position ortho. Cependant, cette souche (Pseudomonas solana- cearum) peut subir une réaction de dénitrification et ne peut pas utiliser le D-arabinose comme source de carbone, comme on le montrera ci- dessous. La souche (Pseudomonas solanacearum) diffère de la souche de l'invention (Pseudomonas sp. K-1) sur ces points. Propriétés Pseudomonas Pseudomonas sp. K-1 solanacearum Réaction de dénitrification - + Assimilation de produit hydrocarboné D-arabinose + - Par conséquent, il est raisonnable de consi- dérer que la présente souche est une souche nouvelle appartenant au genre Pseudomonas, et elle a été nommée Pseudomonas sp. K-1. La présente souche est déposée au Fermentation Research Institute (FRI) sous le numéro d'inscription FER BP-2932. Lorsqu'on cultive les souches Pseudomonas sp. K-2 et Pseudomonas sp. K-1 qui précèdent, on préfère les soumettre d'abord à une préculture à une température d'environ 25 C pendant 2 à 3 jours dans un milieu de culture tel qu'un milieu de culture de gélose nutritive ou un milieu de culture GS amé- lioré, puis les inoculer directement dans un milieu de culture LS, mais il est également possible d'ino- culer et de cultiver directement les souches dans un milieu de culture LS. Si l'on cultive les souches sp. K-2 et sp. K-1 qui précèdent ou d'autres souches produisant de la pyrimine en présence d'une plante, on peut obtenir la pyrimine avec un rendement élevé. Comme plante, on peut adéquatement utiliser par exemple des plantes de la famille des liliacées telles que la ciboule; des plantes de la famille des crucifères telles que la laitue, le chou, le raifort sauvage des vallées japonaises, le radis japonais et le cresson d'eau; des plantes de la famille de la Périlla telles que la périlla, le basilic et la menthe; des plantes de la famille des polygonacées telles que Rumex acétosa; des plantes de la famille des légumineuses telles que le haricot; des plantes de la famille des solanacées telles que la tomate, l'aubergine et le poivre de Guinée; et des plantes de la famille des gesnériacées telles que la centoporia. Des sections de mésophylle, de tige, de rhizome, etc. de ces plantes sont inoculées dans un milieu de culture de gélose LS complété par une hormone telle que l'acide kinétine, dans des conditions stériles, puis on pro- voque leur différenciation et on utilise de preference dans la présente invention le produit obtenu sous la forme d'une telle plante. Il est également possible d'utiliser celles obtenues en semant des graines d'une telle plante qui ont été soumises à un trai- tement de stérilisation dans le même milieu de culture de gélose LS pour les faire germer et se développer. De plus, il est également possible d'uti- liser des cellules végétales (telles que des cellules de tabac) et un cal obtenu en stérilisant le corps d'une plante, et d'inoculer les morceaux d'expIant obtenus dans un milieu de culture, dans des conditions stériles, pour provoquer la formation d'un cal. La quantité des plantes à ajouter au milieu de culture n'est pas déterminante, mais elle est en général de 0,01 à 5 g, et de preference de 0,1 à 0,5 g pour parties en poids du milieu de culture. En outre, la densité de la souche à inoculer dans le milieu de culture est de préférence non inférieure à 105/ml, mieux encore d'environ 105 à 107/ml. Le milieu de culture utilisé pour soumettre les souches qui précèdent et les plantes à une culture mixte comprend les constituants suivants, qui sont couramment incorporés aux milieux de culture: (1) Sources de carbone: sucres tels que le glucose, le fructose, le saccharose et/ou des sucres alcools tels que le glycérol; (2) Sources d'azote: composés inorganiques contenant un atome d'azote tels que les sels d'ammo- nium et/ou les nitrates; (3) Sels minéraux: phosphates, sulfates, etc. de métaux tels que le potassium et le magnésium. Dans la présente invention, il est avanta- geux d'ajouter à l'avance au milieu de culture des ions ferriques pour obtenir directement la ferro- pyrimine à partir de la pyrimine produite par la souche au cours de sa culture. Ces ions fer peuvent être apportés au milieu de culture sous forme de sels tels que le sulfate ferrique. La quantité d'ions ferriques dans le milieu de culture est avantageu- sement non inférieure à 10 ppm, et de preference de 20 à 100 ppm exprimée en quantité de sels. Les milieux de culture utilisés pour pyrimine peuvent être soit solides, soit préparer La pyrimine peuvent être soit solides, soit liquides. En outre, les souches de La présente inven- tion peuvent être cultivées par divers procédés, mais on les cultive de préférence par culture agitée tournante ou par culture aérée-agitée. En outre, les souches sont de preference cultivées dans des conditions aérobies. Par exemple, elles peuvent être cultivées tout en étant irradiées par des rayons lumineux. Les conditions de culture sont adéquatement choisies et ajustées de manière à ce que la quantité maxima de la pyrimine recherchée puisse s'accumuler dans le milieu de culture. Des conditions de culture préférées sont les suivantes: (1) pH du milieu de culture initial: 3,8 à 7,0; de preference 5,0 à 6,0. (2) Intervalle de température de culture: à 30 ; de préférence 20 à 25 . (3) Temps de culture: 8 à 20 jours. (4) pH du milieu de culture au cours de la culture: 3,8 à 6,0, de preference 4,0 à 4,5. On peut adopter n'importe quel moyen pour isoler et purifier la pyrimine produite par la souche et accumulée dans le milieu de culture conformément au procédé suivant. Les souches précédentes produisant de la pyrimine de la présente invention et d'autres souches produisant de la pyrimine sont soumises à une culture mixte en présence d'une plante dans un des milieux de culture indiqués ci-dessus. Cependant, le rendement optimum en pyrimine peut être obtenu en utilisant un milieu de culture qui comprend un sucre, un compose contenant un atome d'azote, un composé contenant un atome de magnésium, un composé contenant un atome de phosphore et un composé contenant un atome de fer, mais qui est exempt d'ions calcium et chlorure. Plus particulièrement, le milieu de culture utilisé dans la présente invention comprend par exemple 20 à 80 g, de preference 30 à 60 g de sucre; 1,0 à ,0 g, de preference 1,5 à 3,5 g d'un composé conte- nant un atome d'azote; 0,1 à 0,5 g, de preference 0,3 à 0,4 g d'un composé contenant un atome de magne- sium; 0,1 à 0,8 g, de préférence 0,15 à 0,5 g d'un composé contenant un atome de phosphore; 0,01 à 0,2 g, de preference 0,02 à 0,15 g d'un composé conte- nant un atome de fer; et le reste d'eau. Le milieu de culture peut comprendre en outre d'autres consti- tuants exempts de composés contenant des ions calcium et/ou chlorure. Par exemple, il peut comprendre O à 0,2 g d'un sel de métal alcalin de l'EDTA, 0 à g de gélose, etc. On peut également obtenir la pyrimine avec un rendement élevé en cultivant les souches produisant de la pyrimine, en présence ou en l'absence d'une plante, dans un milieu de culture qui comprend au moins un composé organique contenant un atome d'azote choisi par exemple dans le groupe constitué de l'extrait de viande, de la peptone, des casamino acides, des produits protéiniques pulvérulents du soja et de la liqueur de trempage du mais; un sucre, un composé minerat contenant un atome d'azote, un composé contenant un atome dephosphore et un composé contenant un atome de fer, mais qui est exempt d'ions calcium et chlorure. Des exemples des composés mine- raux contenant un atome d'azote sont les sels d'ammo- nium -et les nitrates. Le composé contenant un atome de phosphore fournit des ions phosphate au milieu de culture, et des exemples typiques de celui-ci sont le phosphate de potassium et le phosphate de sodium. Le composé contenant un atome de fer fournit des ions fer au milieu de culture et des exemples typiques de celui-ci comprennent le sulfate ferrique. Comme il a été expliqué ci-dessus, si des ions ferriques sont présents à l'avance dans le milieu de culture, la ferropyrimine peut directement être recueillie dans le milieu de culture. Un exemple particulier d'un tel milieu de culture comprend, par litre, 20 à 80 g, de prefe- rence 25 à 75 g de sucre; 1 à 5 g, de préférence 1,5 à 3,5 g d'un composé mineral contenant un atome d'azote; 0,2 à I g, de préférence 0,25 à 0,6 g d'un composé contenant un atome de phosphore; 0,01 à 0,2 g, de preference 0,02 à 0,15 g d'un composé conte- nant un atome de fer; 0,1 à 4 g, de preference 0,2 à 2 g d'un composé organique contenant un atome d'azote; et le reste d'eau. Un milieu de culture de cette espèce peut en outre comprendre d'autres constituants qui sont exempts d'ions calcium et chlorure. Par exemple, il peut comprendre 0 à 0,45 g d'un composé contenant un atome de magnésium tel que le sulfate de magnésium; 0 à 0,2 g d'un sel de métal alcalin de l'EDTA; 0 à 20 g de gélose etc. A cet égard, on utilise un tampon phosphate de potas- sium 1M (pH 5) comme composé contenant un atome de phosphore et, dans ce cas, le tampon est utilisé dans une quantité allant de 100 à 200 g. Conformément à la présente inventioin, il est fourni de nouvelles souches appartenant au genre Pseudomonas, qui peuvent produire de la pyrimine avec un rendement élevé, ainsi qu'un nouveau procédé pour préparer la pyrimine en utilisant ces souches. En outre, si les souches sont cultivées dans un milieu de culture approprié en présence de sels de fer, un colorant rouge naturel, à savoir la ferropyrimine, peut être obtenu aisément et directement à partir du milieu de culture. La présente invention sera décrite ci-après d'une manière plus détaillée en se référant aux exemples de travail non limitatifs suivants: Exemple 1 On ajoute 0,1 mg/L d'acideV- naphtylacétique et 0,1 mg/l de kinétine à un milieu basai de Linsmaier-Skoog (1650 mg de NH4NO3; 1900 mg de KNO3; 440 mg de CaCL2.2H20; 370 mg de MgSO4.7H20; 170 mg de KH2PO4; 6,2 mg de H3B03; 22,3 mg de MnSO4.4H20; 8,6 mg de ZnSO4.7H20; 0,83 mg de KI; 0,25 mg de Na2MoO4.2H20; 0,025 mg de CoCl2.6H20; 0,025 mg de CuSO4.5H20; 37,3 mg de Na2 - EDTA; 27,8 mg de FeSO4.7H204.7H20; 100 mg de myoinositol; 0,4 mg de chlorhydrate de thiamine; 30 000 mg de saccharose, i 000 ml d'eau distillée), puis on ajuste le pH de la solution obtenue à 5,8 pour obtenir un milieu de culture (désigné ci-après sous le nom "milieu de culture LS"). On introduit le milieu de culture LS par portions de 50 ml dans dix Erlenmeyer de 300 ml et on bouche les Erlenmeyer avec des tampons d'ouate pour effectuer la stérilisation à 121 C pendant minutes. Après refroidissement, on inocule dans le milieu de culture LS stérilisé des semences de raifort sauvage qui ont été cultivées séparément dans un milieu de culture de gélose LS (à 0,8 % de gélose) dans des conditions stériles, et une anse de la souche, Pseudomonas sp. K-2, qui a été cultivée séparément dans un milieu de culture GS amélioré (la préparation est décrite en détail ci-dessous). La culture est effectuée à 25 C en culture agitée tournante (150 t/min) sous irradiation avec des rayons lumineux. Au bout de 17 jours, on centrifuge le milieu de culture pour éliminer les corps cellulaires etc. et on filtre le liquide surnageant à travers un filtre à membrane ayant une taille de pore de 0,45 jum. Après addition d'une solution de FeSO4.7H20 (278 mg/l) au filtrat, on détermine son absorbance à 558 nm pour estimer la quantité de pyrimine présente dans le milieu de culture en se basant sur une courbe de calibrage, et on trouve qu'elle est de 1 650 lg/ml. La production de pyrimine a démarré au sixième jour de la culture. Milieu de culture GS amlioré (1) On prepare une solution (a) ayant la composition suivante: 30 000 mg de glucose; 770 mg d'extrait de viande (vendu par les Difco Laboratories); I 650 mg de NH4NO3; 370 mg de MgSO4. 7H20; 27,8,mg de FeSO4.7H20; 37,3 mg de Na2-EDTA; 20 000 mg de gelose; et 1 000 ml d'eau distillée. On règle son pH à 6,0 par addition de KOH 1N. (2) Une solution (b): tampon phosphate de potassium 1M (pH 6,0). Le milieu de culture GS amélioré est préparé en traitant les solutions (a) et (b) en autoclave à 121 C pendant 15 minutes pour effectuer la stérili- sation et en mélangeant les solutions (a) et (b) autoclavées dans un rapport de 2 ml de la solution (b) pour 11 ml de la solution (a). Exemple 2 On répète les mêmes opérations que dans l'Exemple 1, excepté que la souche Pseudomonas sp.K-1 est substituée à la souche Pseudomonas sp.K-2 utilisée dans l'Exemple 1. Au bout de 17 jours, on détermine la teneur en ferropyrimine dans le milieu de culture obtenu sur la base d'une courbe de calibrage et on trouve qu'elle est de I 750 pg/ml. La production de pyrimine démarre au cinquième jour de culture. Exemple 3 On introduit un milieu de culture S amélioré comprenant 30 000 mg de saccharose; 1 650 mg de NH4N03; 370 mg de MgsO4.7H20; 500 mg de KH2P04; 27,8 mg de FeSO4.7H20; 37,3 mg de Na2EDTA; et 1 000 ml d'eau distillée, ayant un pH de 7,0, par portions de 50 ml dans deux Erlenmeyer de 300 ml, et on bouche les Erlenmeyer avec des tampons d'ouate pour effectuer la stérilisation à 121 C pendant 15 minutes. Après refroidissement, on inocule dans le milieu de culture LS stérilisé, des semences de raifort sauvage qui ont été cultivées séparément dans un milieu de culture de gélose LS (à 0,8 % de gélose) dans des conditions stériles et une anse de la souche, Pseudomonas sp.K-1, qui a été cultivée séparément dans un milieu de culture GS amélioré (dont la préparation sera décrite en détail ci-dessous). On effectue la culture à 25 C par culture agitée rotative (à 150 t/min) tout en irradiant avec des rayons lumineux. Au bout de 12 jours, on centrifuge le milieu de culture pour éliminer les corps cellulaires, etc., on filtre le liquide surnageant à travers un filtre à membrane ayant une taille de pore de 0,45 pm. Après addition d'une solution de FeSO4.7H20 (278 mg/l) au filtrat, on détermine son absorbance à 558 nm pour évaluer la quantité de ferropyrimine présente dans le milieu de culture sur la base d'une courbe de calibrage, et on trouve qu'elle est de 1360 pg/ml./ Exemple 4 On répète les mêmes opérations que dans l'Exemple 3, excepté qu'on remplace la souche Pseudo- monas sp K-2 utilisée dans l'Exemple 3 par la souche Pseudomonas sp.K-1 et qu'au bout de 13 jours, on centrifuge le milieu de culture pour éliminer les corps cellulaires, etc. On trouve que la teneur en ferropyrimine du milieu de culture obtenu est de 940 pg/ml. Exemple 5 On prépare les solutions suivantes: (a) une solution de 36 000 mg de glucose dans 300 mL d'eau distillée; (b) une solution obtenue en dissolvant 1980 mg de NH4N03, 222 mg de MgSO4.7H20, 300 mg de KH2P04, 16, 68 mg de FeSO4.7H20 et 22,38 mg de Na2-EDTA dans 300 ml d'eau distillée, puis en ajustant son pH à 6,0 avec KOH 1N. (c) une solution de 1200 mg d'extrait de viande (vendu par les Difco Laboratories) dans 120 ml d'eau distillée; et (d) 120 ml de tampon phosphate de potassium 1M (pH ,0). On stérilise les solutions (a) à (b) ci-dessus à 121 C pendant 15 minutes et on les intro- duit dans un fermenteur à bocaux de 2 litres (stéri- lisé) pour les mélanger dans des conditions stériles. On précultive séparément la souche, Pseudomonas sp. K-2, à 25 C pendant 48 heures par une technique de culture agitée dans un Erlenmeyer de 300 ml contenant un milieu de culture qui a été préparé de la même manière et qui a la même composition que ci-dessus. On inocule 84 ml de la souche précultivée dans le milieu de culture contenu dans le fermenteur à bocaux et on les cultive à 25 C en culture aérée-agitée (débit d'air = 1,5 l/min; vitesse de rotation = 300 à 400 t/min). Après Le second jour de culture, on effectue la culture en ajustant le pH du milieu de culture à 4,2-4,5 par addition de KOH 1N et d'acide phospho- rique 1N. Au bout de 12 jours, on centrifuge le milieu de culture pour éliminer les corps cellulaires etc. et on filtre le liquide surnageant à travers un filtre à membrane ayant une taille de pore de 0,45 Vm. Après addition d'une solution de FeSO4.7H20 (278 mg/l) au filtrat, on détermine son absorbance à 558 nm pour évaluer la quantité de ferropyrimine présente dans le milieu de culture sur la base d'une courbe de calibrage et on trouve qu'elle est de 1940 pg/ml. Exemple 6 On répète les mêmes opérations que dans l'Exemple 5, excepté qu'on remplace la souche Pseudo- monas sp.K-2 utilisée dans l'Exemple 5 par la souche Pseudomonas sp. K-1 et qu'au bout de 8 jours, on centrifuge le milieu de culture pour éliminer les corps cellulaires etc. On trouve que la teneur en ferropyrimine dans le milieu de culture obtenu, est de 1950 pg/ml. REVENDICATIONS 1. Nouvelle souche produisant de la pyrimine appartenant au genre Pseudomonas présentant les pro- priétés bactériologiques suivantes: réaction de dénitrification: négative assimilation de sources de carbone: D-arabinose: positive L-lysine: négative 2. Souche de la revendication 1, qui est la souche FERM BP-2933. 3. Souche de la revendication 1, qui produit la pyrimine dans une quantité non inférieure à 400 yg/ml lorsqu'elle est cultivée en présence d'une plante dans un milieu basaI LS et dont la production de pyrimine démarre au plus tard 8 jours après le commencement de la culture. 4. Nouvelle souche produisant de la pyrimine appartenant au genre Pseudomonas présentant les pro- priétés bactériologiques suivantes: réaction de dénitrification négative assimilation de sources de carbone: D-arabinose: positive L-lysine: positive qui produit la pyrimine dans une quantité non infé- rieure à 400 pg/ml lorsqu'elle est cultivée en présence d'une plante dans un milieu basaI LS et dont la production de pyrimine démarre au plus tard 8 jours après le commencement de la culture. 5. Souche de la revendication 4, qui est une souche FERM BP-2932. 6. Procédé de préparation de la pyrimine comprenant les stades consistant à soumettre une souche produisant de la pyrimine à une culture mixte avec une plante dans un milieu de culture et à isoler la pyrimine du milieu de culture. 7. Procédé de la revendication 6, dans lequel la souche est précultivée aux environs de C pendant 2 à 3 jours dans un milieu de culture de gélose nutritive ou dans un milieu de culture GS amélioré, puis inoculée dans le milieu de culture. 8. Procédé de la revendication 6, dans lequel la densité de la souche dans le milieu de culture n'est pas inférieure à 105 par ml du milieu de culture. 9. Procédé de la revendication 6, dans lequel la quantité de la plante à ajouter au milieu de culture va de 0,01 à 5 g pour 100 parties en poids du milieu de culture. 10. Procédé de la revendicatioon 6, dans lequel la souche est FERM BP-2933 ou FERM BP-2932. 11. Procédé de la revendication 6, dans lequel la plante est choisie dans la famille des liliacées, dans la famille des crucifères, dans la famille des Perilla, dans la famille des polygonacées, dans la famille des légumineuses, dans la famille des solanacées et dans la famille des gesneriacées. 12. Procédé de la revendication 6, dans lequel la plante est un produit obtenu en inoculant le mésophylle, la tige ou le rhizome d'une plante dans un milieu de culture de gélose LS complété par une hormone dans des conditions stériles pour provo- quer sa différenciation; un produit obtenu en semant des graines d'une plante dans un milieu de culture de gélose LS pour que les graines germent et se développent en plants; ou des cellules végétales ou cals obtenus en stérilisant un corps de plante, en inoculant les morceaux d'expIant obtenus dans un milieu de culture dans des conditions stériles pour provoquer la formation d'un cal. 13. Procédé de la revendication 6, dans lequel le milieu de culture ne contient pas moins de 10 ppm d'ions ferriques. 14. Procédé de la revendication 6, dans lequel la culture est effectuée à un pH allant de 3,8 à 7,0 et à une température allant de 15 à 30 C. 15. Procédé de la revendication 6, dans lequel le pH du milieu de culture au cours de la culture est de 3,8 à 6,0. 16. Procédé de préparation de la pyrimine comprenant les stades de culture de bactéries produi- sant de la pyrimine appartenant au genre Pseudomonas, en présence d'une plante, dans un milieu de culture contenant un sucre, un composé contenant un atome d'azote, un composé contenant un atome de magnésium, un composé contenant un atome de phosphore et un composé contenant un atome de fer, mais exempt d'ions calcium et chlorure, puis en isolant la pyrimine obtenue. 17. Procédé de la revendication 16, dans lequel la souche est FERM BP-2933 et la culture est effectuée à une température allant de 11 à 40 C et à un pH allant de 3,8 à 8,5. 18. Procédé de la revendication 16, dans lequel la souche est FERM BP2932 et la culture est effectuée à une température allant de 11 à 35 C et à un pH allant de 3,8 à 8,5. 19. Procédé pour préparer la pyrimine, comprenant les stades de culture de bactéries produi- sant de la pyrimine appartenant au genre Pseudomonas dans un milieu de culture contenant un composé orga- nique contenant un atome d'azote, un sucre, un composé minéral contenant un atome d'azote, un composé contenant du phosphore et un composé contenant du fer, mais exempt d'ions calcium et chlorure, et ayant un pH de 3,8 à 5, en présence ou en l'absence d'une plante, puis en isolant la pyrimine obtenue.