Brevet FR2660197A1 — publié le 19911004

La présente invention se rapporte à des anticorps purifiés spécifiquement dirigés contre les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries gram-négatif. La surface de la membrane externe des bactéries à gram négatif est essentiellement constituée de lipopolysaccharides ou LPS. La libération de ces LPS dans l'organisme humain, accrue par l'utilisation d'antibiotiques, induisant la libération d'endotoxines à partir de bactéries tuées, provoque des chocs graves voire mortels (80 000 morts aux Etats-Unis chaque année). En effet, parmi les actions biologiques des LPS on peut citer - une toxicité qui peut être mortelle, - une modification de la régulation thermique, - des troubles circulatoires etc.. - des modifications leucocytaires. Peu de traitements existent à l'heure actuelle pour éviter ces chocs endotoxiniques, ce qui incite de nombreuses équipes à s'intéresser à toute substance pouvant jouer un rôle antagoniste à l'action de ces LPS. La structure des LPS de toutes les bactéries gram négatif peut être schématisée ainsi. Elles présentent toutes une structure constituée d'une partie lipidique, le lipide A, responsable en grande partie des effets toxiques des LPS. Ce lipide A est rattaché à un noyau (core) par un trisaccharide le 2-céto-3-desoxyoctonate ou KDO. Sur le noyau, dont la structure polysaccharide est commune à tous les LPS, sont liées des chaînes latérales ou séquences polyosidiques qui conservent à chaque souche sa spécificité antigénique. Des souches mutantes, dites rugueuses, ne synthétisent pas ces chaînes latérales. Leurs LPS possèdent des propriétés antigéniques dues uniquement au lipide A et au noyau. Puisque la plupart des effets toxiques de l'endotoxine sont à associer à la partie lipidique A du LPS, il a été envisagé qu'une immunisation avec des mutants rugueux des bactéries gram négatif permettrait d'obtenir des anticorps susceptibles d'éviter les chocs endotoxiniques d'une grande variété d'organismes gram négatif. Les anticorps dirigés contre les LPS de ces souches rugueuses seraient dirigés contre la plupart des LPS bactériens. E. Ziegler, aux U.S.A., a montré, dès 1985, que l'injection de plasma de sujets vaccinés par le LPS de la souche 55 de E. Coli (structure commune à toutes les bactéries gram négatif, responsable du choc septique mais sans danger pour les sujets vaccinés) entraînait une réduction significative, non pas des infections bactériennes elles-mêmes, mais des chocs septiques et de la mortalité. Toutefois, des immunoglobulines intraveineuses (obtenues par fractionnement de Cohn et traitées à la pepsine à pH 4), n'ont pas montré leur efficacité dans le traitement des chocs (le travail de Baumgartner à Lausanne : colloque à Amsterdam, 1988). En revanche, dans les études expérimentales animales, des immunoglobulines préparées à partir de plasmas sélectionnés pour leur titre en anti-LPS ont pu prévenir l'infection bactérienne chez des animaux infectés (GAFFIN et al. : Vox Sanguinis 48, 276-83, 1985). Toutefois, pour des raisons pratiques qui sont principalement dues à des difficultés d'approvisionnement, de stockage et d'administration, l'antisérum dirigé contre E. coli J5 n'est pas approprié pour une utilisation clinique à grande échelle. En revanche, une préparation d'immunoglobulines purifiées, obtenue à partir d'un pool de plasmas de volontaires naturellement immunisés, offrirait, elle, de nombreux avantages. Tout d'abord, une telle préparation pourrait être disponible sous une forme lyophilisée, appropriée à une longue conservation. Enfin, l'administration de cette préparation par voie intraveineuse permettrait l'injection de quantité importante en produit actif avec une perte limitée dans l'organisme. Le but de la présente invention est précisément de répondre à cet objectif. Il vise à élaborer des préparations riches en immunoglobulines spécifiques pour des utilisations thérapeutiques et utiles tout particulièrement pour prévenir le choc septique en clinique humaine. La technique utilisée selon l'invention pour préparer ces anticorps anti-LPS, sous une forme purifiée, consiste en une chromatographie d'immunoaffinité et met en oeuvre une immobilisation d'antigènes LPS sur un support. Des techniques de couplage d'antigènes LPS sur des supports ont certes déjà été décrites. Toutefois aucune d'entre elles n'est réellement satisfaisante. I1 a ainsi déjà été réalisé le couplage des antigènes LPS par l'intermédiaire de leurs fonctions hydroxyles sur des fonctions époxy du support à pH très basique et donc dans des conditions dénaturantes pour les LPS, ce qui rend la capacité de tels supports très faible voire inexploitable. (R.B. FICK et al. J. of Immunol. Method. 38 103-116 (1980); J. FOX et al. Infection and Immunity 20, 3 867-868 (1978)). De même, le couplage des antigènes LPS a été effectué par les fonctions amines du ligand sur un support activé comportant des fonctions cyanates et/ou imidocarbonates (gel sépharose activé au bromure de cyanogène). (E. RODAHL et al., Acta. pat. microbiol. immunol. scand. sect C, 92 : 247-254 (1984)). Or, les LPS contenant très peu de fonctions amines disponibles, ils se couplent difficilement à ce type de gel. L'originalité de la technique utilisée selon la présente invention et décrite plus en détail ci-après permet, elle, d'assurer de manière efficace le couplage des antigènes LPS au support. Plus précisément, la présente invention se rapporte à des anticorps purifiés spécifiquement dirigés contre les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries gram négatif, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus avec un facteur d'enrichissement supérieur à 500 et de préférence supérieur à 750, en réalisant une chromatographie d'immunoaffinité des anticorps anti-LPS présents dans des liquides biologiques, ladite chromatographie mettant en oeuvre la fixation desdits anticorps sur des antigènes LPS immobilisés sur un support. Par facteur d'enrichissement, on entend désigner le rapport activité anticorps anti-LPS par mg ou g de protéines ou d'immunoglobulines de l'éluat sur activité anticorps anti-LPS par mg ou g de protéines ou d'immunoglobulines du liquide biologique d'origine. Les liquides biologiques utilisés peuvent être de sources variées en particulier des plasmas ou sérums humains ou encore des plasmas ou sérums d'animaux. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les liquides biologiques utilisés ont été au préalable sélectionnés par une méthode ELISA pour leur spécificité anti-LPS. Cette méthode bien connue de l'homme du métier ne sera pas explicitée ici en détail. La chromatographie par immunoaffinité mise en oeuvre selon l'invention repose donc sur l'utilisation d'antigènes LPS insolubilisés qui retiennent les immunoglobulines du mélange dirigées contre eux. Ces immunoglobulines sont ensuite récupérées après dissociation des complexes antigène-anticorps. L'originalité de la technique proposée tient à la transformation des groupements hydroxyles du LPS en groupements aldéhydes très réactifs qui permettent un couplage soit directement sur une résine portant des fonctions hydrazines ou amines (aminohexyl sépharose, hydrazide d'acide adipique sépharose, lysine sépharose, gélatine sépharose) soit sur une protéine, par exemple l'albumine d'origine humaine ou animale, qui sera elle-même couplée sur une résine activée, du sépharose activé au bromure de cyanogène par exemple. Cette méthode a ainsi l'avantage de laisser accessible le lipide A des LPS, c'est-à-dire la partie antigénique commune à tous les LPS. Les immunoglobulines présentes dans le liquide biologique à purifier sont donc retenues par ces antigènes LPS. Les anticorps fixés aux antigènes sont ensuite lavés de façon à éliminer la plupart des molécules ne reconnaissant pas l'antigène puis récupérés par dissociation des complexes antigène-anticorps. Cette étape de dissociation, l'élution, est une étape importante de l'immunopurification. L'élution est le plus souvent réalisée à l'aide d'un agent chimique, qui modifie les propriétés physico-chimiques de la solution, permettant ainsi la dissociation des complexes antigènes-anticorps, sans pour autant altérer les propriétés biologiques des antigènes et des anticorps spécifiques. L'élution à pH acide est la plus utilisée. Le pH doit être suffisamment acide pour garantir un bon rendement d'élution mais pas trop acide pour ne pas être préjudiciable aux anticorps. Il sera de préférence de l'ordre de 2,5. On peut ainsi utiliser des tampons glycine-HCl et acétate de sodium. De préférence, l'antigène LPS immobilisé sur le support provient d'un mutant d'une bactérie gram négatif, dépourvu de chaînes latérales polyosidiques et constitué uniquement de lipide A et d'un noyau commun à de nombreux lipopolysaccharides de bactéries de gram négatif. Ce mutant possède ainsi des propriétés antigéniques communes à de nombreux LPS. I1 peut ainsi s'agir du mutant J5 d'E. coli O 111 ou du mutant Re de Salmonella minnesota 595. Selon un mode privilégié de l'invention, on utilise le mutant J5 dont la structure est la suivante P p p P Glc-Hep ~ Hep KDO-Lipide A GlcNAc KDO P Glc P KDO Ce mutant J5 d'E.Coli ne présente pas de chaîne O-spécifique et, son nucleus est d'autre part simplifié. Il est de ce fait un déterminant antigénique commun à de nombreux LPS naturels et reconnaît les anticorps dirigés contre le lipide A et le noyau. A la fin de la chromatographie par immunoaffinité, l'ensemble de l'activité anti-LPS se trouve alors concentré dans l'éluat : en une seule étape il est ainsi possible de purifier les anticorps d'un facteur d'environ 500 à 1 000 fois. A partir de ces anticorps de pureté protéique considérablement améliorée, il devient désormais possible d'évaluer quelles sont les classes d'immunoglobulines (IgG, M ou A) et les sous-classes (IgG 1,2,3,4) réellement responsables de l'activité. Compte tenu de leur pureté protéique, les anticorps anti-LPS, objets de la présente invention peuvent être administrés à l'animal et/ou à l'homme, seuls ou en combinaison avec un autre composé dans une composition pharmaceutique. Ils sont tout particulièrement utiles dans la prévention ou le traitement des chocs endotoxiniques. La présente invention se rapporte donc également aux compositions pharmaceutiques contenant au moins à titre de principe actif, des anticorps anti-LPS selon l'invention. Les exemples et figures donnés ci-après, à titre non limitatif, permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. La figure 1 décrit l'activité anti-LPS d'un concentré d'anticorps anti-LPS purifiés, objet de la présente invention. EXEMPLE 1)Matériel et méthodes 1-1- Préparation du support La réactivité chimique des LPS a été rendue possible par clivage oxydatif au periodate de sodium des alphadiols portés par le KDO (le trisaccharide 2-ceto-3-désoxyoctonate, reliant le nucléus et le lipide A) et les oses du nucléus (heptose et glucose), avec formation de fonctions aldéhydes (réaction de Malprade). Ces fonctions aldéhydes peuvent se condenser sur des fonctions amines ou hydrazines (réaction de Schiff) provenant soit d'un support chromatographique (par exemple hydrazide Sépharose), soit d'une protéine (albumine sérique bovine). La fonction imine formée peut être ensuite stabilisée par réduction au borohydrure de sodium ou au cyanoborohydrure de sodium. 1-2- Activation des LPS E.Coli J5 Dans un tube Falcon 50 ml (Becton Dickinson) en polypropylène, sont introduits successivement 35 mg de LPS E. Coli J5 (List Biological Laboratories) en solution dans de l'eau pour préparations injectables (soit environ 8 micromoles) et 0,35 ml d'une solution de 2,15 g de Nais4 dans 100 ml d'eau PPI (soit 35 micromoles). Le tube est ensuite agité 24 heures, dans l'obscurité et à température ambiante. 1-3- Couplage des LPS sur gel d'Hydrazide d'Acide Adipique-Sépharose 25 ml de gel sont lavés sur verre fritté avec dans un premier temps, 1 litre d'eau PPI, puis 500 ml de tampon acétate 100 mM pH5. Dans un flacon de 250 ml en verre, on introduit le gel lavé et essoré, les 11 ml de la solution de LPS activés et environ 80 ml de tampon acétate. Le tube est agité 24 heures, à température ambiante dans l'obscurité. Le gel est ensuite essoré et lavé sur verre fritté successivement avec 200 ml de tampon acétate et 200 ml d'une solution de NaCI 2M puis équilibré en tampon phosphate 100 mM pH 7,5. 2) Essai d'immunopurification 2-1- Chromatographie L'essai a été réalisé sur une colonne IBF 25 contenant 30 ml de gel susmentionné. Outre la colonne, le système chromatographique se compose de - une pompe péristaltique (Gilson, type minipuls 2), - un détecteur UV, DO : 280 nm (Pharmacia, S.P.M. UV-1), équipé d'une cellule HR-10, - un enregistreur (Pharmacia, REC-482). Avant l'injection de la source d'anticorps dans la colonne, un essai à blanc est effectué - lavage du gel avec 150 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 7,5, - lavage du gel avec 150 ml de tampon glycine-HCl 0,1 M pH 2,5, - rééquilibrage du gel avec 150 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 7,5. La source à purifier est du plasma humain (600 ml) sélectionné par méthode ELISA pour sa spécificité anti-LPS. Ce plasma est dilué au demi dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,5 (soit 1 200 ml total). Les 1 200 ml de plasma dilué (25 g/I 1 de protéines, titre en ELISA au 1/53e) ont été injectés dans la colonne à un débit de 60 ml par heure, assurant un temps de séjour de 30 minutes. Après lavage avec du tampon phosphate 0,1 M pH 7,5, les anticorps spécifiques sont élués par du tampon glycine-HCl pH 2,5. L'éluat est neutralisé extemporanément avec 5 ml de tampon phosphate 0,5 M pH 7,5. 2-2- Suivi analytique a) Dosages des classes d'immunoglobulines G, M et A dans l'éluat Ils sont effectués par néphelémétrie. On utilise un analyseur immunochimique (Immunochemistry Analyser ICS-II Beckman). Cet appareil mesure l'intensité de la lumière déviée par des particules en suspension dans une cellule de détection. Ces particules proviennent de la réaction d'immunoprécipitation entre l'antigène que l'on veut doser, et l'anticorps. Selon le calibrateur et l'anticorps utilisés, on peut doser les classes d'immunoglobulines humaines, G, A, ou M, l'albumine ou la transferrine humaines. La précision est de l'ordre de 5 ,b au centre de la gamme, de 10 b aux faibles concentrations. b) Dosage de la concentration protéique de l'éluat Elle a été évaluée à l'aide du dosage par BCA (acide bicinchoninique) (Kit PIERCE). Selon le principe de cette méthode, les protéines provoquent en milieu alcalin la réduction de l'ion cuivrique (cru2+) selon la réaction du Biuret. La réaction entre le sel de sodium de l'acide bicinchoninique (BCA) et l'ion cuivreux est sensible et très spécifique. Le complexe formé BCA-Cu+ est soluble dans l'eau et montre une forte absorbance à 562 nm. Le dosage est réalisé de la manière suivante - 1 part de solution à 4 ,b de sulfate de cuivre et 50 parts d'une solution de carbonate, bicarbonate, tartrate de sodium, de réactif BCA dans NaOH 0,2 M sont ajoutés à 0,1 ml de solution à doser ou 0,1 ml de tampon de dilution des échantillons pour le blanc + 2 ml de réactif, l'ensemble est agité, incubé 2 heures à température ambiante ou 30 minutes à 37"C puis révélé à 562 nm contre le blanc de lecture ; - Chaque échantillon est dosé en triple ; on réalise une gamme étalon de SAB (Pierce) et d'une préparation d'immunoglobulines humaines de 0,05 à 1 mg/ml. c) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide 4/30 (Pharmacia) en présence de SDS d) Dosage de l'activité anti-LPS dans la source, le filtrat et ltéluat I1 a été réalisé comme suit: - adsorber pendant 16 heures à température ambiante sur les puits de plaques de microtitration en PVC (Falcon réf. 3912, Becton Dickinson), les LPS E.Coli J5 (List Biological Laboratories) à raison de 0,1 ml par puits d'une solution de LPS à 10 ug/ml dans du PBS contenant 1,6% (p/v) de MgCl2 et 0,01% (p/v) de merthiolate;; - après 3 lavages avec une solution à 0,9% NaCl (p/v) et 0,1% tween 20 (v/v), les puits sont saturés pendant 1 heure à température ambiante avec 150 ,ul d'une solution d'albumine sérique bovine à 5% (p/v) dans du PBS. - après 3 lavages avec une solution à 0,9% NaCl (p/v) et 0,1% tween 20 (v/v), incuber 3 heures à 37"C les échantillons à doser à différentes dilutions dans du PBS à 5% (p/v) d'albumine sérique bovine. - après 5 lavages avec une solution à 0,9% NaCl (p/v) et 0,1% tween 20 (v/v), incuber 90 minutes à 37"C avec 100 pl d'une solution d'immunoglobulines de chèvre anti-immunoglobulines G + M humaines couplées à la peroxydase, diluées au 1/400 000 dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,5 avec 0,15/o d'albumine sérique bovine. - après 5 lavages avec une solution à 0,9% NaCI (p/v) et 0,1 ó tween 20 (v/v), l'activité enzymatique est révélée par addition d'orthophénylène diamine dans H202 0,03% (Diagnostics Pasteur) pendant 20 minutes à température ambiante en l'absence de lumière (100 pl de substrat par puits); la réaction enzymatique est arrêtée par ajout de H2 SO4 4N (50 ul par puits). La densité optique de chaque puits est déterminée à 492 nm, à l'aide d'un lecteur de microplaque ELISA (Molecular Devices, Vmax). 3) Résultats Le tableau I présenté ci-après et la figure 1 rendent compte des résultats obtenus. Tableau 1 CONCENTRATION (g/l) - Protéines 0,61 (BCA) - IgG 0,26 (néphélémétrie) - IgM 0,33 (néphélémétrie) - IgA 0,04 (néphélémétrie) - Ig totales 0,63 (IgG + IgM + IgA) TITRE 111050e PURETE ELECTROPHORETIQUE 90 o des Ig totales Les concentrations protéiques, correspondant au titre (dilution de l'échantillon qui donne un signal égal à la moitié de la densité optique maximale, soit 1,3/2 = 0,65) du plasma de départ et de l'éluat, sont respectivement de 0,lml x 25 mg/ml = 0,0472 mg = = 47,2 pg 53 0,lml x 0,63mg/ml = 0,00006 mg = = 60 ng 1 050 soit une "différence" de 47 200 mg ---------- = 787; 60 mg cette valeur peut être assimilée à un coefficient d'enrichissement. On peut évaluer le rendement de la purification par le biais du rapport (titre x volume) éluat x x 100 (titre x volume) plasma de départ soit 1 050 x 30 ---------- x 100 # 50% 53 x 1 200 D'une part cette valeur est toute relative, d'autre part la perte en anticorps n'est pas dramatique, dans la mesure où elle est dûe principalement aux anticorps de faible affinité, peu intéressants pour les applications envisagées. REVENDICATIONS 1. Anticorps purifiés spécifiquement dirigés contre les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries gram négatif, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus en une étape avec un facteur de purification supérieur à 500 et de préférence supérieur à 750 en réalisant une chromatographie d'immunoaffinité des anticorps anti-LPS présents dans des liquides biologiques, ladite chromatographie mettant en oeuvre la fixation desdits anticorps sur des antigènes LPS immobilisés sur un support. 2. Anticorps purifiés selon la revendication 1, caractérisés en ce que les antigènes LPS sont immobilisés sur un support de manière à laisser accessible leur lipide A auxdits anticorps. 3. Anticorps purifiés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que les antigènes LPS sont liés au support par couplage de leurs fonctions aldéhydes, issues de la transformation de leurs fonctions hydroxyles, avec des fonctions hydrazines ou amines. 4. Anticorps purifiés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que les antigènes sont couplés soit directement sur une résine portant des fonctions hydrazines ou amines, soit sur les fonctions amines d'une protéine, elle-même liée à un support. 5. Anticorps purifiés selon la revendication 4, caractérisés en ce que l'antigène LPS est couplé à du gel d'agarose sur lequel sont fixées des fonctions hydrazines ou amines.. 6. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que l'antigène LPS utilisé provient d'un mutant d'une bactérie gram négatif dépourvu de chaînes latérales polyosidiques et constitué uniquement de lipide A et d'un noyau commun à de nombreux lipopolysaccharides. 7. Anticorps selon la revendication 6, caractérisés en ce que l'antigène LPS provient du mutant J5 d'E. coli 0111. 8. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisés en ce que les liquides biologiques sont des plasmas ou sérums humains ou des plasmas ou sérums d'animaux. 9. Anticorps selon les revendications 1 à 8, caractérisés en ce que les liquides biologiques ont été au préalable sélectionnés par une méthode ELISA pour leur spécificité anti-LPS. 10. Anticorps selon les revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un mélange d'IgM, IgG et/ou IgA. 11. Anticorps selon les revendications 1 à 10, caractérisés en ce qu'ils présentent une pureté protéique supérieure ou égale à 50 %. 12. Anticorps selon les revendications 1 à 11, utiles pour la prévention ou le traitement des chocs endotoxiniques. 13. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient au moins des anticorps selon l'une des revendications 1 à 12.