Brevet FR2650951A1 — publié le 19910222

La présente invention est relative a des agents activant la sécrétion de l'insuline, ainsi qu' & leur application à la culture cellulaire et à l'obtention d'implantes biocompatibles. Il a été proposé, pour la réalisation de bio -implants, tels que des pancréas bioartificiels, d'utiliser des cultures de cellules insulino-sécrétrices, fixées sur des supports solides. Pour permettre une telle réalisation, les supports doivent à la fois permettre la culture des cellules dans des conditions assurant une insulino-6écré- tion optimale, et être biocompatibles. Il est connu, par exemple par le brevet fran çais 2 461 724, et par le brevet français 2 555 589, que la biocompatibilîté des polymères est considérablement améliorée lorsque ceux-ci sont substitués par des groupes qui leur confèrent des propriétés anticoagulantes, tels que des groupes sulfonates. D'autre part, des cultures cellulaires sont fréquemment réalisées sur des supports polymériques, de nature diverse, qui peuvent subir différents traitements ; on peut citer, par exemple, les supports de polystyrène sul foné ou hydroxylé ainsi que les microbilles de dextrane réticulé portant des chaînes latérales telles que des chaines de choline. Lesdits traitements sont en général destinés à améliorer l'adhésion des cellules au support. Ils peuvent également avoir pour effet la modification d'autres propriétés cellulaires. C'est ainsi que, par exemple, les travaux de N. AUBERT et al. (J.Biomat, Rez., 21, 585-601, 1987) montrent que l'utilisation d'un support constitué de billes en polystyrène sulfoné influence la morphologie de cellules insulino sécrétrices RINm5F ainsi que leur sécre- tion d'insuline ; la sécrétion basale est diminuée et l'accroissement de la sécrétion, en réponse à une stimulation arginine/théophylline est inhibé. Des travaux ultérieurs ont montré que ces effets inhibiteurs sur la sécr6- tion de l'insuline sont d'autant plus accentués que le taux de substitution du polystyrène par les groupes sulfonate est élevé. Les Inventeurs se sont en conséquence fixé pour but l'obtention de polymères,. utilisables pour les cultures cellulaires, plus particulièrement comme supports de culture cellulaire, qui contrairement & ceux décrits dans l'art antérieur, possèdent la propriété d'activer la sécrétion d'insuline des cellules insulinosécrétrices et qui sont biocompatibles, ou peuvent être rendus biocompatibles tout en conservant leurs propriétés. Ils ont ainsi mis en évidence de nouvelles propriétés de polymères fonctionnalisés qui, de façon inattendue, sont liées à la présence sur lesdits polymères de groupes alkylamide ou arylamide libres. Au sens de la présente invention, on entend par polymères fonctionnalisés des polymères solubles ou insolubles comportant dans leur chaîne des groupes substituables, dans lesquels une proportion variable des unités monomères sont substituées sur au moins un desdits groupes substituables. La présente invention a pour objet des agents activateurs de la sécrétion de l'insuline, caractérisé en ce qu'ils sont constitués par au moins un polymère fonctionnalisé portant, par l'intermédiaire de liaisons amide ou sulfamide, des fonctions alkylamine et/ou alkylamine libres. Différents homopolymères ou copolymères comportant dans leur chaîne des groupes substituables, peuvent être utilisés dans la réalisation de la présente invention on peut ainsi citer, de façon non limitative, les polystyrènes, les polyuréthanes, les polycarbonates, les polyacryliques, les polysaccharides, etc... Si on le souhaite, dans le but d'améliorer leur biocompatibilité, ces polymères peuvent en outre porter un certain pourcentage de fonctions telles que des fonctions sulfonate , libres Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le polymère fonctionnalisé est un polystyrène sulfamide d'alkylamine ou d'arylamine. Selon une modalité préférée de ce mode de réalisation, le polymère fonctionnalisé est un polystyrène sulfamide de benzylamine. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, le polymère fonctionnalisé est un dextrane, qui porte au moins 30 groupes carboxyméthyle, au moins 10 groupes carboxyméthylarylamide et/ou carboxyméthylalkylamide, pour 100 unités saccharidiques, et, éventuellement, au plus 10 groupes carboxyméthylarylamide sulfonate pour 100 unités saccharidiques, Selon une modalité préférée de ce mode de réalisation, les groupes carboxyméthylalkylamide sont des groupes carboxyméthylpropylamide. Selon encore une autre modalité préférée de ce mode de réalisation de la présente invention, les groupes carboxyméthylarylamide sont des groupes carboxyméthylbenzylamide. Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, le polymère fonctionnalisé est un polymère réticulé insoluble. Les polymères fonctionnalisés portant des groupes alkyiamide ou arylamide libres constituent, lorsqu'ils sont sous forme réticulée, des supports de culture cellulaire particulièrement utiles pour la mise en culture et l'étude des cellules insulino-sécrétrices. Grâce å la possibilité d'utiliser, pour leur réalisation,des polymères biocompatibles, les agents activateurs de la secré- tion d'insuline confirmés & l'invention sont en outre particulièrement appropriés à une utilisation pour la réalisation de bioimplants, par exemple, pour l'obtentionde pancréas artificiels. L'invention sera mieux comprise & l'aide du. complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et d'utilisation des agents activateurs de la sécrétion de l'insuline selon la présente invention. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I - PREPARATION DES AGENTS ACTIYATEWRS DE LA SECRETION DE L'INSULINE SELON LA PRESENTE INVENTION EXEMPLE 1 : OBTENTION DE SUPPORTS DE CULTURE CELLULAIRE PREPARATION DE MICROBILLES DE DEXTRANE RETICULE FONCTIONNALISE Des dextranes réticulés (Séphadex) peuvent être obtenus par exemple auprès des laboratoires PHARMACIA (Uppsala, Sweden). Ces dextranes sont fonctionalisés par des groupes carboxyméthyl (CM), carboxyméthylpropylamide (CMP), carboxyméthylbenzylamide (CMB), et carboxyméthylbenzylamide sulfonate (CMBS) selon les procédés décrits dans la publication de MAUZAC et al. /Biomaterials, 3, (1982)/. Des dextranes fonctionnalisés sont désignés par. les formules générales CMx BY Sz et CMx Py Sz dans laquelle X représente le nombre moyen de groupes carboxyméthyl pour 100 unités de sucre Y représente le nombre de groupes carboxyméthyl benzylamide (dans le cas de CNx BY Sz) ou carboxyméthylpropylamide (dans le cas de CNx PY Sz) pour 100 unités de sucre. Z représente le nombre de groupes carboxyméthylbenzylamide sulfonate pour 100 unités de sucre. STERILISATION DES MICROBILLES DE SEPHADEX FONCTIONNALISE 800 mg de microbilles sont mises à gonfler à 37'C pendant 3 heures, dans 50 ml de solution de tampon phosphate salin Dubelco sans calcium, ni magnésium (CMF, Flow Laboratories). Elles sont ensuite incubées à tempéra ture ambiante dans 50 ml d'méthanol à 90%, une première ois pendant une heure, une deuxième fois toute la nuit. Elles sont ensuite rincées 4 fois, chaque fois pendant une heure, dans 30 ml de CMF stérilisé par filtration sur un filtre de 0,22 ctm, puis 2 fois dans 430 ml de milieu RPMI 1640 (Eurobio, Paris) contenant 2 mH de L-glutamine, 100 UI/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine (Gibco).Les microbilles peuvent être stockées dans ce milieu, à 4 C, dans des conditions stériles. Avant l'utilisation, elles sont pré incubées une nuit dans un milieu RPMI fraichement préparé contenant 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur. PREPARATION DE MICROBILLES DE POLYSTYRENE SULFAMIDE DE BENZYLAMINE Des microbilles sont préparées, suivant une procédure classique, par chlorosulfonation du polystyrène, suivie de l'action de la benzylamine. Elles sont ensuite stérilisées suivant la procédure décrite plus haut. II - UTILISATION DES AGENTS ACTIVATEURS DE LA SECRETION DE L'INSULINE SELON LA PRESENTE INVENTION MISE EN CULTURE DES CELLULES Les cellules RINmSF, qui sont des cellules insulinosécrétrices dérivées d'un insulinome de rat, dont les caractéristiques ont été décrites par A.F. GAZDAR et al. /Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 3519-3523 (1980)/, sont utilisées. Les microbilles des polymères fonctionnalisés sont sédimentées, et 50 pl du culot obtenu sont déposés au fond des puits d'une plaque de microtitration (.balcon ou CML). Des aliquots de 100 pl d'une suspension de cellules (environ 100 000 cellules/ml) sont ajoutés chaque puits, et le volume final est complété å 250 pl par addition de milieu de culture. Des témoins sont réalisés par mise en culture de cellules directement sur les puits, sur des microbilles de Séphadex non fonctionnalisé, ou sur des micro- billes de CM Séphadex. EXEMPLE 2 : EFFET SUER LA CROIS.SACE CELLULAIE La croissance est mesurée par comptage des cellules, après séparation du support. Lorsque les cellules sont cultivées sur Séphadex fonctionnalise, quels que soient les substituants, et le pourcentage de substitution, la croissance est comparable, ou légèrement diminuée par rapport à celle observée sur les supports en plastique. - I1 en est de même lorsque les cellules sont cultivées sur polystyrène sulfamide de benzylamine. EXEMPLE 3 : EFFET SUR MORPHOLOGIE ET L'ATTACHEMENT ÇLLYIAIRg Sur un support plastique, les cellules sont bien attachées, ont une forme étoilée, et s'étalent en mo- nocouches. Sur les billes de Séphadex et de CM Séphadex, on observe au microscope des cellules rondes groupées en amas, et présentant un attachement très faible. Au contraire, sur les CMB Séphadex et- le CMBS Séphadex, ainsi que sur les billes de polystyrène sulfamide de benzylamine, on observe un meilleur attachement, et les cellules s'étalent. La figure 1 représente l'aspect des cellules cultivées sur support plastique (la), sur CM Séphadex (lb), sur CMB Séphadex (tic) et sur CMBS Séphadex (Id). EXEMPLE 4 : EFFET DES SEPHADEX FONCTIONNALISES SUR LA SECRETION D'INSULINE La sécrétion d'insuline, basale, ou bien en réponse à une stimulation arginine/théophylline est mesurée pour chaque support de culture. L'absence d'adsorption non spécifique de l'insuline sur les supports de culture est vérifiée au préalable. Les cellules cultivées sur support plastique, sur Séphadex et sur CM Séphadex, ainsi que sur les CMB Séphadex, CMP Séphadex et CMBS Séphadex portant moins de 30% de groupes carboxyméthyle, ont toutes une sécrétion basale d'insuline comparable. Dans tous les cas précédents, la sécrétion d'insuline est doublée par la stimulation arginine/ théo phylline. Lorsque les cellules sont cultivées sur CMB Séphadex et CMBS Séphadex portant plus de 30% de groupes carboxyméthyle, la sécrétion basale d'insuline est augmentée en fonction directe du pourcentage de groupes carboxyméthylbenzylamide. Le niveau de la sécrétion basale peut, dans ce cas, dépasser le niveau de la sécrétion stimulée par l'arginine/théophylline. Cette dernière stimulation devient alors inopérante. La figure 2 illustre l'influence des groupes substituants sur la sécrétion basale d'insuline. La sécrétion d'insuline est représentée en ordonnée, le pourcentage de groupes carboxyméthyle en abscisse. Les différents supports sont désignés comme suit O support plastique D Séphadex D carboxyméthyl Séphadex À carboxyméthylbenzylamide Séphadex Y carboxyméthylbenzylamide-sulfonate Séphadex La figure 3 représente la sécrétion d'insuline, basale ( .) , et stimulée par l'arginine/théophylline ( quand les cellules sont cultivées sur support plastique (W), et sur CMB Séphadex portant des pourcentages différents de substituants. Lorsque les cellules sont cultivées sur CMP Séphadex, la sécrétion basale d'insuline est deux fois plus importante que celle des cellules cultivées sur plastique, et la stimulation par 1' arginine/théophylline est conservée. EXEMPLE 5 : EFFET IMMEDIAT DES SEPHADEX FONCTIONNALISES SUR L'INSULINO-SECRETION Lorsque des billes de CMB Séphadex sont ajoutées à des cellules cultivées pendant 4 jours sur support plastique, aucun effet notable sur la sécrétion d'insuline, basale ou stimulée, n'est observée. EXEMPLE 6 : EFFET DES DEXTRANES FONCTIONNALISES SOLUBLES SUR L'INSULINO-SECRETION Un dérivé soluble, le CM64 B3eSo Dextrane est ajouté au milieu de culture lors de la mise en culture des cellules ; à des concentrations de 50 et 400 pg/ml, on n'observe aucun effet sur la croissance et la morphologie cellulaires, et un léger accroissement de la sécrétion d'insuline. Lorsque le même dérivé, aux mêmes concentrations, est ajouté aux cultures cellulaires après 4 jours de culture sur support plastique, un léger accroissement de la sécrétion d'insuline est également observé. EXEMPLE 7 :EFFET DES POLYSTYRENES SULFAMIDES DES BENZYLAMIDE SUR L'INSULINOSECRETION Lorsque les cellules sont cultivées sur des billes de polystyrène sulfamide de benzylamine, on observe, pour tous les pourcentages de substituants benzylamine essayés, un net accroissement de la sécrétion d'insuline, ainsi qu'une réponse à la stimulation arginine/théophylline. Ces résultats sont illustrés par la figure 4 qui représente la sécrétion d'insuline basale ( #) et stimulée ( ss ), en fonction du pourcentage de substituants benzylamine. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REYENDICATIQNS 1') Agents activateurs de la sécrétion de l'insuline, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par au moins un polymère fonctionnalisé portant , par l'intermédiaire de liaisons amide ou sulfamide, des fonctions alkylamine et/ou arylamine libres. 2 ) Agents activateurs de la sécrétion de l'insuline, selon la Revendication 1, caractérisés en ce que le polymère fonctionnalisé est un polystyrène sulfamide d'alkylamine ou d'arylamine. 3 ) Agents activateurs de la sécrétion de l'insuline, selon la Revendication 2, caractérisés en ce que le polymère fonctionnalisé est un polystyrène sulfamide de benzylamine. 4-) Agents activateurs de la sécrétion de l'insuline, selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le polymère fonctionnalisé est un dextrane, qui porte au moins 30 groupes carboxyméthyle, au moins 10. groupes carboxyméthylarylamide et/ou carboxyméthylalkylamide, pour 100 unités saccharidiques, et, éventuellement, au plus 10 groupes carboxyméthylarylamide sulfonate pour 100 unités saccharidiques. 5 ) Agents activateurs de la sécrétion de l'insuline, selon la Revendication 4, caractérisés en ce que les groupes carboxyméthylalkylamide sont des groupes carboxyméthylpropylamide. 6') Agents activateurs de la sécrétion d'insuline, selon la Revendication 4, caractérisés en ce que les groupes carboxyméthylarylamide sont des groupes carboxyméthylbenzylamide. 7 ) Agents activateurs -de la sécrétion de l'insuline, selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6, caractérisés en ce que le dextrane fonctionnalisé est un dextrane réticulé insoluble. 6') Support pour cultures cellulaires, caract6- risé en ce qu'il comprend des agents activateurs de l'insuline, selon la Revendication 7. 7 ) Bioimplant, caractérisé en ce qu'il com- prend des agents activateurs de ia sécrétion de l'insuline, selon la Revendication 7.