Brevet FR2658300A1 — publié le 19910816

L'invention a pour objet l'analyse de formules sanguines par comptage et discrimination d'au-moins une sous-population leucocytaire et concerne plus particulièrement un réactif et une méthode d'utilisation de celui-ci pour la numération des granulocytes basophiles en cytométrie de flux par mesure de résistivité. L'importance diagnostique de la détermination précise des différentes population leucocytaires est reconnue depuis longtemps, en effet, l'apparition de rapports leucocytaires anormaux peut être corrélée à l'apparition de diverses maladies. Les méthodes traditionnelles de coloration spécifique et l'observation au microscope permettaient déjà de distinguer tous les types de leucocytes, c'est à dire les granulocytes (basophiles, éosinophiles et neutrophiles) et les agranulocytes (monocytes et lymphocytes), mais leur mise en oeuvre est très longue. Divers appareils automatiques sont déjà commercialisés qui permettent le comptage des différentes populations leucocytaires du sang total et divers réactifs et colorants ont été mis au point pour être utilisés dans ces appareils. Ainsi on peut mesurer les tailles des cellules, après lyse différentielle de leur cytoplasme, soit par mesure de variations de résistivité (comme décrit, par exemple, dans le brevet WO 84/03771) soit par mesure de diffraction optique (comme décrit par exemple dans le brevet US 3 740 143) ; on peut aussi effectuer des colorations (enzymatiques ou non) spécifiques des différents types cellulaires, et particulièrement des trois types de granulocytes, puis mesurer les tailles et densités optiques des cellules à différentes longueurs d'onde (brevet US 3.740 143). Le comptage des granulocytes basophiles est particulièrement délicat parce que ce type de cellule ne représente que 0,5 à 1 % des globules blancs. Les granulocytes basophiles se distinguent par leur contenu élevé en héparine, un polysaccharide sulfaté qui peut être révélé par des colorants de la famille des phtalocyanures comme le Bleu Alcian ou le Bleu Astra. La coloration des granulocytes basophiles au Rouge Neutre, classiquement utilisée en méthode manuelle, peut aussi être combinée au traitement de lyse différentielle des leucocytes pour être utilisée en appareil automatique (brevet US 3 740 143). La demande de brevet européen 0 177 137 décrit un réactif lytique qui permet la destruction progressive de toutes les cellules sanguines à l'exception des basophiles. Ce réactif endommage les membranes cellulaires ce qui entraine la fuite du cytoplasme A différents intervalles de temps on voit disparaître les différents types cellulaires c'est à dire successivement les érythrocytes, les lymphocytes, les éosinophiles, les neutrophiles et les monocytes Après 80 secondes, seuls les basophiles conservent leur taille et leur morphologie normales Le principe actif de ce réactif est un mélange de surfactant et d'acide dilué Ce mélange doit être utilisé dans une gamme étroite de p H comprise entre 1,8 et 2,3. Ce réactif donne de bons résultats dans les appareils de comptage par lecture optique mais il n'est pas adapté aux mesures par résistivité; en particulier, il pose un problème important d'encrassement de l'orifice de comptage de l'appareil, la destruction des membranes des hématies n'étant pas complète. Le principe de numération cellulaire par résistivité repose sur le maintien d'un champ électrique o est entretenu un courant constant; le passage d'une cellule dans ce champ provoque une augmentation de la tension nécessaire au maintien du courant constant (selon la loi d'Ohm) L'impulsion de tension générée par le passage d'une cellule (et qui constitue la mesure enregistrée par l'appareil) est proportionnelle à la résistance opposée, donc au volume de la cellule, indépendamment de sa forme Ce mode de détection ne s'applique donc qu'à des cellules préalablement traitées (plus particulièrement par cytolyse différentielle) pour obtenir une discrimination très nette des tailles des sous-populations. Cette méthode est d'un emploi très simple puisqu'il n'est pas nécessaire de colorer les cellules. La Demanderesse a mis au point une nouvelle formulation du réactif de lyse différentielle qui préserve les granulocytes basophiles pour permettre son utilisation dans les appareils de mesure par résistivité. Ainsi le réactif selon la présente invention comprend un surfactant de type éther de polyoxyéthylène (comme le Brij 35 ou 23-lauryl-éther) à une concentration comprise entre 1 et 5 g/l et un mélange d'acide phtalique à une concentration de 0,5 à 1,5 g/l et d'H Cl 0,25 m M Les concentrations relatives des différents constituants sont ajustées pour réaliser un p H compris entre 2,5 et 3,2. La Demanderesse a constaté qu'on améliorait la sensibilité de la détection en ajoutant au réactif du SDS (dodécyl sulfate de sodium), à une concentration comprise entre -50 et 300 mg/l, comme agent dénaturant des protéines ce qui diminue la formation de dépôts dans l'instrument de mesure; en outre le SDS accélère la lyse des cellules. Le réactif sera avantageusement additionné d'un agent antioxydant comme l'hydroxytoluène butylé ou BHT (Cll H 60-di-tert-butyl-4-méthylphénol) à une concentration de 10 à 30 mg/l Ainsi selon un mode préféré de l'invention, le réactif comprend les constituants suivants 1 à 5 g/l de Brij 35 0,5 à 1,5 g/l d'acide phtalique 0,25 m M H Cl à 300 mg/l de SDS à 30 mg/l d'hydroxytoluène butylé Selon un mode de réalisation de l'invention, le réactif peut encore être additionné de Bleu Astra, colorant spécifique des granules d'héparine, qui assure une meilleure fixation de ceux-ci. L'invention concerne également une méthode d'utilisation de ce réactif en appareil automatique à cytométrie de flux, par mesure de résistivité, pour la détermination des leucocytes basophiles. La méthode selon l'invention comprend la mise en contact de l'échantillon sanguin à étudier et du réactif, dans une enceinte thermostatée à une température comprise entre 30 et 40 C pendant une durée de 5 à 30 secondes (la température et le temps de contact étant ajustés, en fonction inverse l'un de l'autre). La méthode comprend ensuite la détection des cellules intactes, c'est à dire les basophiles, par une mesure de résistivité dans un appareil de détection approprié et l'enregistrement de ces mesures sous forme d'histogramme. La figure est un histogramme représentatif obtenu par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention sur un échantillon de sang normal. L'exemple suivant illustre un mode de réalisation de l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple Les concentrations suivantes des divers constituants sont calculées pour la préparation d'un litre de réactif: Brij 35 2,5 g acide phtalique 0,9 g H Cl-l N 0,25 ml SDS 200 mg hydroxytoluène butylé 25 mg Eau distillée ajusté à 1 litre Le p H est maintenu à 2,7 (entre 2,5 et 3,2) Le réactif peut être additionné de Bleu Astra, à une concentration de 10 à 100 mg/l; dans les conditions de p H choisies le Bleu Astra est soluble et stable. Ce réactif peut être utilisé dans tout appareil de comptage automatique des globules sanguins basé sur le principe de la mesure de résistivité lpar exemple ABX modèle 504 Fl La tension des électrodes est ajustée à 100 V. L'appareil est réglé pour mettre en contact un échantillon de 15 gl de sang total et 2 ml de réactif Ce mélange est réalisé dans une enceinte thermostatée à une température de 40 'C pendant 17 secondes (On obtient le même résultat en diminuant la température et en augmentant le temps de contact et vice et versa). Le réactif provoque une lyse immédiate des globules rouges puis une lyse progressive de tous les autres types de globules à l'exception des granulocytes basophiles. Après 30 secondes de contact à 40 c C on peut vérifier par détermination manuelle et observation au microscope que tous les basophiles ont conservé une morphologie intacte Quand le réactif contient du Bleu Astra, la coloration des basophiles est proportionnelle à la concentration de Bleu utilisée. Un histogramme représentatif d'un échantillon de sang normal est présenté sur la figure 1: la courbe 1 1 représente la détermination effectuée dans du milieu sans SDS ni Bleu Astra et à p H 1, 9; on observe que les résidus de membrane d'hématies gênent la mesure de résistivité La courbe 1 2 représente la détermination effectué dans le réactif de la présente invention; la zone A correspond aux noyaux des cellules lysées; la zone B correspond aux leucocytes basophiles dont le cytoplasme est intact. REVENDICATIONS 1 Réactif lytique différentiel pour la numération des leucocytes basophiles du sang dans un analyseur automatique par mesure de résistivité, caractérisé en ce qu'il comprend un surfactant de type éther de polyoxyéthylène un mélange d'acide phtalique H Cl du SDS (dodecylsulfate de sodium) un antioxydant de type hydroxytoluène butylé, en ce que son p H est compris entre 2,5 et 3,2 et qu'il est électriquement conducteur. 2. Réactif selon la revendication 1 caractérisé en ce que le surfactant est du Brij 35 à une concentration finale comprise entre 1 et 5 g/l. 3. Réactif selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le mélange d'acide comprend de l'acide phtalique à une concentration finale de 0,5 à 1,5 g/l et de l'H Cl à une concentration finale de 0,25 m M. 4. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il contient du SDS à une concentration finale comprise entre 50 et 300 mg/l. 5. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il contient de l'hydroxytoluène butylé à une concentration finale de 10 à mg/l. 6. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il contient du Bleu Astra à une concentration comprise entre 10 et 100 mg/l. 7. Méthode de numération en appareil automatique en cytométrie de flux de la population de leucocytes basophiles du sang, caractérisée en ce qu'elle comprend: la mise en contact d'un échantillon de sang avec le réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans une enceinte thermostatée, la détection des cellules intactes c'est à dire des basophiles par mesure de variation de résistivité, l'enregistrement de cette mesure sous forme d ' histogramme. 8 Méthode selon la revendication 7 caractérisée en ce que la mise en contact du sang et du réactif est effectuée à une température comprise entre 30 et 40 O C et pendant une durée de 5 à 30 secondes.