Brevet FR2649411A1 — publié le 19910111

DETERMINATION QUANTITATIVE ET IDENTIFICATION DE BACTERIES L'invention concerne un procédé d'identification et de détermination quantitative de bactéries, notamment de bactéries phytopathogènes, présentes dans un milieu biologique. L'invention concerne également un kit (nécessaire) mettant en oeuvre le susdit procédé. Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection de bactéries qui sont minoritaires parmi une flore bactérienne totale. A ce jour, plusieurs méthodes ont été utilisées dans la détection de bactéries, notamment de bactéries phytopathogènes. On peut citer les méthodes comportant les étapes d' isolement et d'identification qui, sont lourdes et fastidieuses a mettre en oeuvre et s'appliquent donc difficilement en routine. Une autre approche a été l'utilisation de milieu semi-sélectif (Kado C.I., et Heskett M.G. (1970). Selective mendia for isolation of Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas and Xanthomonas; Phytopathology, 60,:pp.969-976), (Wesley W.C.C. (1982) - Identification and detection of Corynebacterium michiganense in tomato seed using the Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay Aster Thesis - University Hawai), (Fatmi M et Schaad N.W. (198B) - Semi-Selective agar sodium for isolation of Clavibacter michiganense subsp. richiganense fro Tomate seed - Phytopathology, 78:pp. 121-126). Comme le taux de contamination des bactéries à détecter, par exemple dans les semences, est souvent faible et qu'on ne peut avoir recours qu'a un milieu semi-sélectif, l'utilisation d'un tel milieu est très difficile pour repérer et identifier des bactéries pathogènes. On a également développé des techniques d'immunodétection, par exemple 1' immunofluorescence et la méthode ELISA, qui permettent le criblage rapide d'un nombre élevé d'échantillons, mais la fiabilité des résultats est entièrement dépendante de la spécificité des anticorps utilisés. Le manque d'anticorps hautement spécifiques vis- & vis des antigènes bactériens conduit fréquemment à des réactions croisées avec d'autres bactéries pathogènes ou saprophytes. Pour pallier ces inconvénients des techniques composées de deux ou trois étapes différentes et basées sur des tests immunologiques en combinaison avec un test de contrôle ont été développés. Par exemple, Van Vuurde et al 1983 (Seed Science and Technology 11, 523-533 et 547-559) décrit la détection de Pseudomonas syringe p.v. phasedicola dans des échantillons de semence d'haricots par immunofluorescence, suivi d'isolement et indentification de tous les échantillons positifs. Van Vuurde et al 1987 (Bulletin OEPP/EPPO 17, 139-148) décrit une autre technique, notamment l'enrobage d'une phase solide (bille de polystyrène, bâtonnet de repiquage, botte de Petri) avec des anticorps permettant le piégeage sélectif de bactéries homologues ou sérologiquement voisines par immuno-affinité. Après élimination des organismes non piégés par lavage, les organismes cibles sont désorbés et étalés sur un milieu adapté. Cette technique d'immunoisolement sélectif a été utilisée pour la détection de plusieurs bactéries phytopathogènes, dont Corvnebacterium michiaanense 55D. michiganense, Erwinia chrvsanthemli, E. carotovora 56D. atroseptica, Xanthomonas canvesiris Dv. beqoniae et Pseudomonas svrinaae pv. Dhaseolicola. Cet article ne décrit pas de technique qui permette simultanément la quantification, la localisation et le ré-isolement de la bactérie recherchée. A ce jour, toutes les méthodes classiques se heurtent à des problèmes de sensibilité et de spécificité et on ne dispose d'aucun procédé permettant la détection de bactéries dans un milieu, en particulier de bactéries phytopathogènes qui sont minoritaires par rapport à un ensemble d'autres bactéries également présentes dans le milieu. L'invention a pour objet de fournir une technique permettant la quantification de bactéries, qui est suffisamment sensible pour permettre la détection d'une quantité très faible de bactéries, et suffisamment spécifique pour ne pas donner lieu a des résultats faussement positifs, dus à des réactions croisées. L'invention concerne un procédé de détection quantitative et d'identification de bactéries dans un milieu biologique les contenant1 par amplification des bactéries à détecter sur un milieu de culture semi-sélectif par rapport aux bactéries a détecter, suivi de détection desdites bactéries, caractérisé par les étapes successives suivantes:: a) mise en contact d'un échantillon du milieu biologique contenant les bactéries a détecter - soit avec le milieu semi-sélectif, - soit avec un premier support membranaire préalablement posé - ou à poser directement sur la surface dudit milieu de culture, ce milieu de culture semi-sélectif étant solide ou solidifiable, b) amplification des bactéries jusqu'a l'obtention de colonies, lesdites colonies se trouvant alors sur la surface d'amplification, ladite surface d'amplification étant - soit la surface du milieu de culture, lorsque la mise en contact de l'échantillon a été faite avec le milieu semi-sélectif, - soit le premier support membranaire, lorsque la mise en contact de l'échantillon a été faite avec ce premier support membranaire, c) détection des colonies sur une surface de détection, ladite surface étant - soit le premier support membranaire qui a servi de surface d'amplification, - soit un support membranaire, dit "de transfert", qui est posé directement sur la surface d'amplification afin que les colonies se trouvant sur ladite surface soient au moins partiellement transféré par empreinte sur le support membranaire de transfert. Le procédé de l'invention permet l'amplification (croissance) sélective des bactéries a détecter, et leur localisation sur un support membranaire. L'amplification présente l'avantage de laisser croître une bactérie pour avoir une colonie, par exemple d'environ ioi à environ 1010 bactéries dépendant notamment du type de bactérie, ce qui par là rend ainsi possible la détection ultêrieure, par des techniques immunologiques, ou autres, d'une colonie parmi un grand nombre de colonies dans un rapport qui peut aller jusqu'a environ 1/10r et qui, dans certains cas, peut même dépasser cette valeur. Tant que les colonies restent individualisées sur le support, le nombre de colonies, et ainsi le nombre de bactéries dans l'échantillon, peut être compté, et l'isolement ultérieur des colonies pour d'autres études, par exemple test de pathogénicité, est possible. Avec les techniques actuelles existantes, il est possible dans le meilleur des cas, par immunofluorescence, de détecter une colonie de c.g.p.u. parmi 1000. Par milieu semi-sélectif, on désigne un milieu favorisant la croissance de tous les isolats de la bactérie pathogène recherchée, et ralentissant ou inhibant la croissance des bactéries non recherchées. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon du milieu biologique contenant les bactéries à détecter est mis en contact direct avec un milieu semi-sélectif, par exemple par étalement de l'échantillon sur le milieu semi-sélectif. Les bactéries poussent d'une manière sélective (dans la mesure où -, milieu est semi-sélectif) sur ce milieu jusqu'a l'obtention de colonies, et puis, un support membranaire est déposé sur la surface du milieu de culture afin de prendre l'empreinte de toutes les colonies, au moins partiellement. Une eproduction identique des colonies sur le milieu peut donc être transférée sur le support membranaire. Une étape de détection est effectuée sur le support membranaire. Dans un autre ode de réalisation de l'invention, on dépose sur un premier support membranaire, par exemple par étalement, l'échantillon contenant les bactéries a détecter ou bien on fait tremper -un premier support membranaire dans l'échantillon contenant les bactéries a détecter. Dans le cas oh on dépose l'échantillon sur le premier support membranaire, celui-ci peut avoir été préalablement posé sur le milieu semi-sélectif. Si le support membranaire, après avoir recueilli I'échantillon, n'est pas déjà sur le milieu semisélectif, il y est ensuite déposé et il y a croissance des bactéries jusqu'à obtention des colonies sur le support. Dans ce cas, la détection est effectuée après amplification soit sur ce même support membranaire, soit sur un support membranaire que l'on pose directement sur le premier pour prendre une empreinte des colonies. Ce support membranaire est appelé dans ce qui précède et ce qui suit "support membranaire de transfert". Si, après l'amplification, les colonies de bactéries recherchées ont été envahies, partiellement ou totalement, par des colonies de bactéries non-recherchées à croissance plus rapide, la prise d'une empreinte sur une membrane de transfert pourrait avoir pour effet de ne pas transférer les bactéries recherchées. Dans ce cas, il est donc avantageux d'effectuer l'amplification et la détection sur le premier support membranaire sans prendre d'empreinte. Pour libérer l'accès aux bactéries recherchées sur le premier support membranaire, on peut éliminer les colonies envahissantes par lavage. Dans le cas oh, ' on a recours a une prise de l'empreinte des colonies sur un support aembranaire "de transfert", l'intérêt est que ces colonies peuvent être visualisées par la détection, tout en laissant des colonies sur le premier support meibranaire ou sur le milieu semi-sélectif, ce qui permet l'isolement ultérieur des colonies, pour effectuer par exemple des études de pathogénicité. Un autre intérêt de l'empreinte est de pouvoir en prendre plusieurs, et donc de multiplier des analyses sur les bactéries détectées. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'étape d'amplification sur support membranaire peut être précédée par une étape d'immunosélection. Dans ce cas, un premier support membranaire est baigné dans un bain d'anticorps (polyclonaux ou monoclonaux) spécifiques vis-a-vis des bactéries a détecter pendant un temps suffisant, pour les immobiliser sur le support1 par exemple pendant environ 2 heures. Le support est ensuite lavé, les anticorps étant éventuellement fixés par chauffage, à une température ne modifiant pas la réaction immunologique, puis le support est placé dans un bain de l'échantillon contenant les bacteries à détecter, pendant par exemple une nuit a 40C ou 1 à 2 heures à température ambiante ou à 370C. Le support est ensuite lavé pour éliminer toutes les bactéries non fixées, et on le pose directement sur la surface du milieu semi-sélectif. L'amplification et 1' immunodétection s'effectuent de la même manière que dans les variantes précédentes. Dans le cas ou cette immunosélection est effectuée, il est avantageux d'utiliser des anticorps de spécificité et affinité très élevées afin de pouvoir piéger toutes les bactéries recherchées et le moins possible de bactéries nonrecherchées. Lors de l'étape d'immunosélection, il est possible de saturer les sites sur le support membranaire qui ne sont pas occupés par les anticorps en utilisant, par exemple, des protéines, par exemple du lait en poudre, ce qui augmente la spécificité du procédé de l'invention. En revanche, si on ne bloque pas les sites non occupés par les anticorps, on peut observer une amélioration au niveau de la sensibilité de la méthode. Le choix entre le blocage ou non des sites non occupés par les anticorps dépend de plusieurs paramètres, par exemple de la nature des autres bactéries éventuellement présentes, et de la nature des anticorps utilisés. En ce qui concerne l'étape de détection, il est possible d'utiliser n'importe quelle technique de détection qui peut s'effectuer sur un support membranaire. On citera, de préférence, l'immunodétection, et la détection par une sonde nucléique. Dans le cas d'une immunodétection, celle-ci peut être effectuée par exemple en trempant le support membranaire (ou de transfert) dans un bain d'anticorps spécifiques vis-B-vis des bactéries a détecter, ces anticorps pouvant être marqués à l'aide d'une enzyme, d'un agent radioactif ou d'un agent fluorochrome, auxquels cas on révèle respectivement par colorimétrie, autoradiographie ou par lecture au microscope.Dans le cas d'une révélation enzymatique, le support membranaire est ensuite transféré dans un bain de substrat de l'enzyme. Il est avantageux de choisir un substrat qui a la propriété de précipiter sur le support membranaire à l'endroit où se trouve le complexe antigène/anticorps. De tels substrats sont connus, par exemple lorsqu'on utilise une membrane de nitrocellulose et une enzyme type peroxydase, on peut utiliser le 4-chloro-l-naphtol comme substrat. De cette manière, la réaction enzymatique est localisée aux endroits de la membrane où il y a une colonie de bactéries recherchées et donne lieu à une tâche colorée à cet endroit. la réaction peut alors être arrêtée, par exemple dans le cas du 4chloro-1-naphtol par immersion du support membranaire dans un bain d'eau, et le support membranaire conservera ainsi sur sa surface les tâches correspondant aux colonies de bactéries recherchées. Les anticorps utilisés dans l'étape d'immunodétection peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Au moment de l'immunodétection, les sites non saturés peuvent être bloqués par des protéines par exemple du lait en poudre, notamment écrémé, ce qui les empêche de recueillir d'une manière nonspécifique les anticorps utilisés. Cependant, il est à noter que, dans le cas où une immunosélection est effectuée préalablement, et dans le cas où on utilise des anticorps monoclonaux lors de l'immunosélection et des anticorps monoclonaux lors de l'immunodétection, ces derniers doivent reconnaître un épi tope différent de celui reconnu par les anticorps monoclonaux utilisés lors de l'immunosélection. Une autre technique de détection qui s'effectue sur un support membranaire est l'hybridation de l'acide nucléique,- ADN ou ARN, des bactéries recherchées avec une sonde nucléique spécifique. Dans la plupart des cas, il est nécessaire de rendre libre l'accès de l'acide nucléique à détecter à la sonde nucléique sur le support et de dénaturer l'acide nucléique des bactéries recherchées. Ces techniques sont connues en soi (voir, par exemple, E. Thompson et al. 1989, Phytopathology, vol. 79, NO 3; pp. 311-314). Le milieu biologique contenant les bactéries, a détecter peut être n'importe quel milieu biologique, par exemple des extraits de semences, des suspensions ou extraits de sol. Par exemple, si la méthode de l'invention est appliquée au diagnostic de bactéries phytopathogènes transmises par les semences l'échantillon peut être un extrait de graines, un macérat de graines ou un mélange de graines broyées. Le support membranaire peut être tout support membranaire qui se prête au transfert des colonies de bactéries, par exemple les membranes de nylon ou de nitrocellulose. Les filtres du type nitrocellulose forment un très bon support pour la réalisation de la détection immunoenzymatique des colonies. Le milieu semi-sélectif est, bien entendu, choisi en fonction des bactéries a déterminer, par exemple pour la détection de Clavibacter michiaanense subsD. michivanense le milieu S.C.M. (Fatmi et al 1988) modifié par la suppression du tellurite de potassium peut être utilisé. Ce milieu modifié sera appelé dans la suite "milieu S.C.M.M". Le procédé de l'invention présente plusieurs avantages vis-à-vis des techniques de diagnostic connus, notamment l'amélioration de la spécificité et de la sensibilité, et l'obtention d'une réponse simultanément quantitative, localisée et permettant le ré-isolement. Par "réponse localisée", il faut comprendre une réponse qui, sur le support membranaire révèle la position et l'identité de chaque colonie individuellement. Le ré-isolenent permet d'effectuer n'importe quel test, tel qu'étude de pathogénicité ou autre vérification immunologique sur les colonies repérées. En outre, la localisation des bactéries dans l'espace supprime la compétition à laquelle les bactéries se livrent en milieu liquide. De plus, il est plus facile de détecter grâce aux anticorps des colonies pathogènes que la même bactérie en suspension dans une phase liquide. L'étalement d'un macérat brut ou même concentré directement sur un filtre est donc une méthode très bien adaptée à la détection d'un faible taux de contamination. Une colonie parmi 10' colonies est facilement détectable par cette méthode. Si le milieu sélectif inhibe 99 des saprophytes, il est donc possible de déceler une contamination dans un macérat où le rapport bactéries a détecter/flore bactérienne totale est de 1/109. Ceci est très supérieur atix techniques classiques (ELISA, immunofluorescence...). De façon générale, on peut étaler directement sur le milieu ou sur le filtre plusieurs dilutions du macérant ou du broyat. La botte de Petri où le nombre de colonies est maximum mais où il est toujours possible d'isoler les colonies (colonies individualistes) est choisie. Une empreinte sur filtre est effectuée si nécessaire. Après révélation,il est possible de repérer les colonies sur le milieu ou sur le filtre les colonies correspondant aux signaux. Dans le cas où le taux de contamination est supposé être faible c'est-à-dire d'environ 1/10', il peut être avantageux d'utiliser, dans certains cas, l'étape d'immunosélection sur filtre, sachant qu'elle est susceptible d'améliorer le rapport bactéries à détecter/flore bactérienne totale. Grâce à cette technique, et tenant compte d'une réduction des. bactéries, notamment saprophytes, de 99% par le milieu sélectif, il est possible d'isoler la bactérie pathogène lorsque la contamination dans les semences est de l'ordre de 1 bactérie cible pour 108 saprophytes totales, soit 1/106 sur milieu sélectif. L'efficacité de la méthode proposée réside dans l'association de différentes techniques de sélection d'un agent pathogène parmi une flore bactérienne. Cette méthode apporte une amélioration au niveau spécificité et sensibilité, et de plus permet un isolement de la bactérie pathogène. Ceci est très important pour caractériser l'isolat et en particulier vérifier sa pathogénicité. Le procédé de l'invention peut être avantageusement utilisé dans la détermination du chancre bactérien de la tomate. Le chancre bactérien de la tomate est caractérisé par un flétrissement rapidement irréversible de la plante. Cette maladie est causée par Clavibacter michisanense pv richisanense (C.m.p.m.), bactérie transmise par les semences. La commercialisation des semences saines est donc impérative pour éradication de la maladie. L'invention concerne également un kit ou nécessaire pour la détection quantitative et l'identification de bactéries, caractérisé en ce qu'il contient: - un ou plusieurs support(s) membranaire(s), - un milieu semi-sélectif par rapport aux bactéries a détecter, - des moyens de détection des bactéries. L'invention concerne également un kit tel que défini ci-dessus contenant en outre des anticorps spécifiques vis-a-vis des bactéries à détecter pour effectuer une immunosélection, notamment des anticorps monoclonaux. Ces anticorps monoclonaux reconnaissent un épi tope différent de celui reconnu par les anticorps utilisés dans le cas d'une immunodétection, lorsque ces derniers sont des anticorps monoclonaux. L'invention concerne notamment un kit dans lequel les moyens de détection des bactéries sont constitués par des anticorps spécifiques aux bactéries recherchées, notamment des anticorps monoclonaux et des moyens pour la révélation des anticorps. L'invention concerne en outre un kit dans lequel les moyens de détection des bactéries sont constitués d'une sonde nucléique spécifique des acides nucléiques des bactéries a détecter et les moyens de révéler la sonde. l'invention s'applique a toute autre bactérie, par exemple Pseudomonas Corynebacterium Erwinia Xanthomonas, etc. EXEMPLE I: DETECTION DE CLAVIBACTER MICHIGANENSE PATHOVAR MICHIGANENSE: Dans cet exemple, la surface d'amplification des bactéries à détecter est constituée par la surface du milieu semi-sélectif et la surface d'immunodétection est constituée par un filtre qui permet de prendre l'empreinte des colonies ayant poussé sur la surface du milieu semi-sélectif. Des graines de tomates sont macérées sous agitation (150 cps/mn) dans un tampon de macération, ou sont broyées dans un tampon de broyage. Tout type de broyeur peut être utilisé. Une centrifugation à faible vitesse et très courte est effectuée pour se débarrasser des gros débris. La concentration en bactéries totales du surnageant est en général de 103 a 105 cfu/ml. Le tampon de macération ou de broyage a la composition suivante: Na2HPO4, 12H20 32,926 g KH2PO4 1,088 g H2O q.s.p. 1 1 - cette solution mère est diluée 10 fois avant l'emploi et - on ajoute * Actidione 50 mg/l * Acide nalidixique 4 mg/l Le rapport graines (poids)/tampon (volume) utilisé est d'environ 1/5 à 1/10. La macération est effectuée à environ 40C pendant environ 24 à environ 72 heures. Dans ce macérat, en général, la concentration en bactéries est d'environ 105 à environ 10' c.f.u./ml (c.f.u.="colony forming units", c'est-à-dire "unité formant colonie"). A ce stade, les bactéries que l'on veut détecter, les Clavibacter michipanense pathovar michiganense (C.m.p.m.) sont en suspension dans le macérat. La proportion en C.m.p.m. par rapport à la flore bactérienne totale est faible, pour la plupart des lots contaminés comprise entre environ 1/102 et environ 1/10'. Il faut noter qu'avant l'amplification sur support, toutes les méthodes de dilutions ou de concentration des bactéries (filtration centrifugation) sont possibles. La mise en oeuvre du procédé de l'invention a lieu de la façon suivante: Amplification: - 100 ul de macérant concentré ou dilué, ou broyat, sont étalés directement sur un milieu semisélectif, le S.C.M.M. qui se trouve dans des boîtes de Petri; ce milieu a la composition suivante: KAPO4 0,5 g K2HPO4 2 g MgSO47H20 0,25 g Acide borique 1,5 g Saccharose 10 g Extraits de levure 0,1 g Agar 15 g HaO q.s.p. 1 l - auquel on ajoute après autoclavage:: * Acide nicotinique 100 mg/l * Acide nalixidique 30 mg/l * Cycioheximide 200 mg/l - les boites de Petri sont incubées de 5 à 7 jours à 280C; - un filtre de nitrocellulose est appliqué sur chaque boite de Petri de façon à prendre l'empreinte des colonies; - un repérage de la position du filtre est effectué. Immunodétection: L'immunodétection est mise en oeuvre en effectuant les étapes suivantes: - le filtre est agité vigoureusement plusieurs fois 10mn, dans 15ml de tampon TBS, de façon à éliminer les bactéries non adsorbées sur le filtre; le tampon T.B.S. (Tris Buffer Saline) a la composition suivante:: NaCl 11,69 g Tris HCl 6,06 g HzO q.s.p. 1 1, le pH étant ajusté a 7,4 - un séchage des colonies à 800C peut également être effectué; - une saturation des sites libres sur le filtre est effectué avec du lait écrémé en poudre de marque Régilait dilué à 1% dans un tampon TBS, pendant 15mn à 200C, et puis le filtre est incubé avec solution anticorps spécifiques vis-à-vis de C.m.p.m., dilués dans du TBS Régilait 1% pendant 2 heures à 200C; - trois lavages du filtre dans du TBS pendant 5mn à 200C sont effectués, suivi d'une autre saturation avec du TBS Régilait 1% pendant 15mn à 200C;; - le filtre est ensuite incubé d'un antianticorps, couplé à une enzyme type peroxydase et dilué dans du TBS additionné de Régilait à 1% pendant 30mn à 60mn à 200C; - les complexes antigène-anticorps sont révélés par addition d'un substrat de l'enzyme, par exemple le 4-chloro-l-naphthol lorsque les anti-anticorps sont couplés à la peroxydase. La formation d'un précipité bleu est induite et chaque colonie de C.m.p.fl. est donc repérée par un tache bleue sur le filtre. Pour une détection quantitative de l'infection, il suffit de compter le nombre de colonies, étant donné qu'une bactérie donne naissance à une colonie. EXEMPLE II: Dans cet exemple, la surface d'amplification est constituée par un filtre posé sur la surface du milieu semi-sélectif et la surface d'immunodétection est constituée soit par ce même filtre, soit par un deuxième filtre qui sert à prendre l'empreinte des colonies sur le filtre sur lequel s'est produite l'amplification. Les graines de tomates sont macérées ou sont broyées dans le même rapport graine/tampon que dans l'exemple I. AmDlification: - 100 pl de macérant ou broya t sont étalés sur un filtre type nitrocellulose préalablement appliqué sur le milieu S.C.M.M., contenu dans des boites de Petri; - les boites de Petri sont incubées pendant 5 à 7 jours, les colonies poussant directement sur le filtre; Immunodétection: L'immunodétection s'effectue de la même manière que dans l'exemple I. EXEMPLE III: Dans cet exemple, on procède à une immunosélection sur un filtre, lequel sert ensuite de surface d'amplification et peut également servir de surface d'immunodétection. La surface d'immunodétection peut être constituée par un deuxième filtre, que l'on applique sur le filtre qui sert de surface d'amplification pour prendre l'empreinte des colonies. Immunosélection: Dans un tampon additionné d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, on fait incuber le filtre pendant 1 à 2 heures. Le tampon peut être un tampon carbonate de sodium ou le tampon TBS de composition respective suivante: Tampon carbonate de sodium: Na2 CO3 1,6 g NaHC03 2,9 g H20 q.s.p. 1 l - on ajuste le pH à 9,6, Tampon TBS (Phosphate Buffer Saline): NaCl 11,69 g TrisHCl 6,06 g H2O q.s.p. 1 1 - on ajuste le pH à 7,4. On incube 10 à 15ml de solution d'anticorps dilués avec le filtre dans une boite de Petri. Le filtre est ensuite lavé pendant. i0mn avec 15ml du même tampon. Ce filtre est ensuite incubé 2 heures avec 10ml de macérat. Un lavage avec le tampon de macération (15ml pendant 10mn) est effectué de façon à se débarrasser des bactéries non retenues. Les C.m.p.m. liés par une liaison du type Antigène-Anticorps avec les isimunoglobulines elles-mêmes fixées au filtre de nitrocellulose sont retenus sur le filtre. Cette technique permet, dans certains cas, d'améliorer le rapport C.m.p.m./bactéries totales présentes dans le macérat. Le milieu semi-sélectif sur lequel est ensuite déposé le filtre joue le même rôle que dans les exemples I et II. Tout type de milieu seni-sélectif adapté à C.m.p.m. est utilisable. Le milieu suggéré est le milieu S.C.M. (Fatni 1988) modifié. Ce milieu a permis, suivant les lots de semences, d'inhiber 80 à 99% de la flore saprophyte. Amplification: Le filtre est ensuite posé directement sur la surface du milieu sélectif S.C.M. La boite de Petri est incubée pendant 5 à 7 jours. Immunodétection: L'immunodétection s'effectue de la même manière que dans l'exemple I. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection quantitative et d'identification de bactéries dans un milieu biologique les contenant, par amplification des bactéries à détecter sur un milieu de culture senti-- sélectif par rapport aux bactéries à détecter, suivi de détection desdites bactéries, caractérisé par les étapes successives suivantes:: a) mise en contact d'un échantillon du milieu biologique contenant les bactéries à détecter - soit avec le milieu semi-sélectif, - soit avec un premier support membranaire préalablement posé ou à poser directement sur la surface dudit milieu de culture, ce milieu de culture semi-sélectif étant solide ou solidifiable, b) amplification des bactéries jusqu'à l'obtention de colonies, lesdites colonies se trouvant alors sur la surface d'amplification, ladite surface d'amplification étant - soit la surface du milieu de culture, lorsque la mise en contact de l'échantillon a été faite avec le milieu semi-sélectif, - soit le premier- support membranaire, lorsque la mise en contact de l'échantillon a été faite avec ce premier support membranaire, c) détection des colonies sur une surface de détection, ladite surface étant - soit le premier support membranaire qui a servi de surface d'amplification, - soit un support membranaire, dit "de transfert", qui est posé directement sur la surface d'amplification afin que les colonies se trouvant sur ladite surface soient au moins partiellement transféré par empreinte sur le support membranaire de transfert. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détection est une immunodétection. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détection est une détection à sonde nucléique spécifique pour la bactérie recherchée. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support membranaire est un filtre de nitrocellulose. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en. ce que les bactéries sont des phytobactéries. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'échantillon contenant les bactéries à détecter est étalé directement sur la surface du milieu semisélectif et en ce que, après amplification, l'empreinte des colonies est réalisé sur un support membranaire "de transfert", ce support formant alors la surface de détection. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est mis en contact avec le premier support membranaire, ledit support membranaire ayant été posé préalablement .ou étant ensuite posé directement sur le milieu de culture seni-sélectif et formant ainsi la surface d'amplification. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le premier support membranaire a été préalablement mis en contact avec des anticorps spécifiques vis-à-vis des bactéries à détecter, et en ce que le support est lavé après contact avec l'échantillon du milieu biologique afin d'éliminer toutes les bactéries qui n'ont pas été fixées au support par les anticorps. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que un support membranaire "de transfert" est posé sur la surface d'amplification, ce deuxième support membranaire formant aprés le transfert des colonies sur ce support, la surface de détection. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 4 à 7, caractérisé en ce que l'immunodétection s'effectue au moyen d'anticorps spécifiques pour la bactérie à détecter marqués avec une enzyme, avec un agent radioactif ou fluorochrome. 11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les anticorps sont des anticorps monoclonaux 12. Kit ou nécessaire pour la détection quantitative et l'identification de bactéries, caractérisé en ce qu'il contient: - un ou plusieurs support(s) membranaire(s), - un milieu semi-sélectif par rapport aux bactéries à détecter, - des moyens de détection des bactéries, - des moyens de révélation des anticorps. 13. Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que les moyens de détection des bactéries sont constitués d'anticorps spécifiques vis-à-vis des bactéries à rechercher, notamment des anticorps monoclonaux, et des moyens de révéler les anticorps. 14. Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que les moyens de détection des bactéries sont constitués d'une sonde nucléique spécifique aux acides nucléiques des bactéries à rechercher et les moyens de révéler la sonde. 15. Kit selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérise en ce qu'il contient en outre des anticorps spécifiques vis-àvis des bactéries à détecter pour effectuer une imxunosélection, notamment des anticorps monoclonaux, ces anticorps monoclonaux reconnaissant un épitoge différent de celui reconnu par les anticorps utilisés dans le cas d'une immunodétection, lorsque ces derniers sont des anticorps monoclonaux.