Brevet FR2651503A1 — publié le 19910308

APPAREIL INDICATEUR POUR L'ANALYSE ENZYMATIQUE D'ECHANTILLONS GAZEUX La présente invention concerne un appareil indicateur pour l'analyse enzymatique de composants de gaz et d'aérosols, qui possède un corps de remplissage poreux, absorbant la solution aqueuse de réactif, les substrats et les enzymes, dans un boîtier qui présente au moins une ouverture par laquelle le corps de remplissage se trouve en contact de décèlement avec l'échantillon d'air. On connaît un appareil indicateur de ce type par la demande de brevet allemand DE-A 37 20 506. L'appareil indicateur connu possède un corps de remplissage poreux dans un récipient tubulaire ouvert des deux côtés, le corps de remplissage étant constitué d'un matériau de support sur lequel l'enzyme est appliqué par covalence ou par lyophilisation, ou bien le matériau de support étant initialement absolument exempt de charge. Afin de préparer la mesure, on ouvre l'appareil indicateur, qui était fermé à l'état de réserve, et le matériau de support est imprégné d'une solution de réactif. Si le matériau de support contient déjà l'enzyme, la solution de réactif est constituée par exemple d'un complexe donneur/accepteur d'électrons et d'un chromogène qui permet une réaction colorée nécessaire pour le décèlement ; si le matériau de support était absolument exempt de charge, la solution de réactif contient également l'enzyme nécessaire pour le décèlement.Dans les deux cas, la solution de réactif doit être préparée spécialement avant chaque mesure, afin de pouvoir être appliquée sur le corps de remplissage juste avant l'analyse de l'échantillon d'air. Il est également possible de conserver séparément une solution de réactif déjà préparée, mais la manipulation et surtout l'approvisionnement des réserves nécessaires sont alors coûteux. La préparation de l'analyse de l'échantillon de gaz nécessite de la part de l'utilisateur des manoeuvres exercées, qui doivent être exécutées sans erreurs pour que l'analyse soit réussie. En outre, l'utilisateur doit pouvoir évaluer à l'avance quelles quantités de composants il faut prévoir dans la solution de réactif afin que la quantité prévisible du composant gazeux à déceler puisse être entièrement transformée.Mais comme cela ne peut pas toujours être déterminé à l'avance, des mesures de contrôle ou de bornage, selon le résultat de mesure, sont nécessaires. La présente invention a donc pour but d'améliorer un appareil indicateur du type mentionné en introduction de façon que l'approvisionnement séparé des composants nécessaires pour le décèlement ait lieu dans le boîtier lui-même, la réunion des composants pouvant s'effectuer sans expédients ni manipulations supplémentaires. Selon l'invention, ce but est atteint par le fait que le corps de remplissage poreux est reçu dans un support et est fixé en application hermétique dans ce support, duquel dépasse une partie terminale du corps de remplissage qui peut être immergée dans un récipient de stockage contenant la solution de réactif, une membrane de recouvrement perforable, étanche à l'eau, étant disposée entre cette partie terminale et le récipient de stockage. L'avantage de l'invention réside pour l'essentiel en ceci que les composants nécessaires pour une plage de décèlement préétablie sont stockés dans l'appareil lui-même et ne sont réunis au corps de remplissage, à l'état prêt pour la mesure, que juste avant la réalisation de l'analyse de l'échantillon de gaz. A l'état de réserve, l'appareil indicateur ainsi préparé est en quelque sorte "inactif", et il est activé par la simple réunion du corps de remplissage et de la solution de réactif en vue de la mesure, sans que des préparations chimiques supplémentaires soient nécessaires. Pour réaliser une série de mesures, on peut approvisionner une série d'appareils indicateurs sensibles à des concentrations différentes du composant gazeux à déceler. La manipulation s'effectue ainsi en toute sécurité et peut être facilement réalisée, même par des utilisateurs non exercés.A la suite de l'immersion de la partie terminale du corps de remplissage dans la solution de réactif, le corps de remplissage s'imbibe totalement. Le composant à déceler arrive par diffusion dans le corps de remplissage et y est transformé de manière spécifique par l'enzyme. Au cours d'une réaction colorée secondaire, un colorant qui se trouve dans la solution est formé, avec une intensité de coloration qui est directement proportionnelle à la concentration du composant à déceler. Comme résultat de la mesure, on peut donc constater, sur la surface du corps de remplissage exposée à l'échantillon d'air, une zone de décoloration d'une profondeur donnée.Les participants à la réaction (enzyme, colorant) sont émis en continu depuis le récipient de stockage, de sorte que la zone de décoloration, dont la profondeur de décoloration augmente avec la durée de la mesure, demeure sur la surface observable du corps de remplissage. L'évaluation peut s'effectuer soit à l'oeil nu, par comparaison avec un standard coloré étalonné, soit par réflectométrie. Les enzymes qui déterminent la spécificité de la réaction peuvent être présents soit dissous dans la solution de réactif, soit liés au corps de remplissage poreux. La membrane de recouvrement peut être avantageusement conçue comme fermeture pour le récipient de stockage. Cela permet de pouvoir approvisionner le récipient de stockage rempli de solution de réactif pendant une longue durée, sans perturbations. La membrane de recouvrement n'est perforée que lors de la réunion de la partie terminale du corps de remplissage avec le récipient de stockage. La membrane de recouvrement peut être soudée sur le bord du récipient ou serrée à l'aide d'une bague de serrage dans une rainure annulaire correspondante de la paroi du récipient. Si, par exemple, une faible stabilité à long terme de la solution de réactif nécessite de remplir le récipient de stockage juste avant la mesure, il est avantageux de concevoir la membrane de recouvrement comme couverture pour la partie terminale du corps de remplissage qui dépasse du support. La membrane est percée par un avancement limité de cette partie terminale hors du support, de sorte que la solution de réactif est absorbée lors de l'immersion consécutive dans le récipient de stockage rempli. Ici aussi, la membrane peut être soudée sur le bord de la douille ou maintenue à l'aide d'une bague de serrage. Pour une introduction fiable de la partie terminale du corps de remplissage dans le récipient de stockage, il est avantageux de prévoir une partie supérieure sur ce récipient. La partie supérieure de récipient peut être une douille filetée dans laquelle on peut visser le support. Il est également avantageux de réaliser la partie supérieure de récipient sous la forme d'une douille d'ajustement dans laquelle le support peut être enfilé en assemblage par contact. Dans les deux cas il est assuré que la partie terminale du corps de remplissage absorbe la totalité de la réserve de solution de réactif, et qu'il n'y a pas de liquide qui s'échappe sur la paroi latérale entre cette partie terminale et la paroi intérieure du récipient pendant l'introduction, liquide qui serait alors perdu pour l'analyse. La réalisation de la partie supérieure de récipient en forme de douille filetée permet d'effectuer l'introduction de la partie terminale du corps de remplissage de manière contrôlée et de prédéterminer l'avancement par le pas de filetage et le nombre de filets. Afin de permettre un enfoncement rapide de la partie terminale du corps de remplissage lorsque la partie supérieure de récipient est une douille d'ajustement, il est avantageux d'équiper cette partie terminale d'au moins un alésage compensateur s'enfonçant dans le corps de remplissage. Le corps de remplissage peut maintenant être immergé rapidement dans le récipient de stockage, sans que du liquide soit expulsé entre le corps de remplissage et la paroi intérieure du récipient suite à la compression rapide de la solution de réactif. Lors de l'enfoncement, une grande partie de la solution de réactif est initialement pressée dans l'alésage compensateur, à partir duquel, lorsque l'enfoncement est terminé, elle peut se propager uniformément dans le corps de remplissage. La membrane pour la fermeture du récipient de stockage peut être collée ou soudée dans ce dernier. Mais il est avantageux de réaliser la partie supérieure de récipient sous la forme d'une douille de serrage, de sorte que la membrane peut être serrée d'une manière simple entre le récipient de stockage et cette partie supérieure, et empêcher ainsi la solution de réactif de sortir du récipient. Afin d'assurer le perçage de la membrane, il est avantageux de munir la partie terminale du corps de remplissage d'une surface coupante. Cette dernière peut consister en une pointe qui s'élargit en cône vers le corps de remplissage ; mais il s'est avéré particulièrement avantageux de réaliser le corps de remplissage comme corps de verre fritté. On assure ainsi d'une part une porosité suffisante et, d'autre part, la partie terminale en verre fritté possède des propriétés coupantes pour la membrane et sert donc simultanément de surface coupante. Si l'on doit réaliser avec l'appareil indicateur une dosimétrie à long terme, l'entrée du composant à déceler doit s'effectuer d'une manière contrôlée. Cela peut être obtenu, par exemple, en fermant l'ouverture du corps de remplissage vers l'environnement par une membrane de diffusion, ou en utilisant un couronnement de diffusion de forme tubulaire, ou encore en combinant ces deux mesures. Le couronnement de diffusion contribue également à calmer la diffusion. Il peut être solidaire du support, ou bien apte à être monté sur le support à l'aide d'une fixation par serrage. Le couronnement de diffusion peut être prévu à la place ou en plus de la membrane de diffusion. Afin de pouvoir déceler simultanément avec l'appareil indicateur deux ou plus de deux composants gazeux, ou de pouvoir réaliser une mesure de référence, il est avantageux de réaliser le corps de remplissage divisé au moins une fois dans son développement longitudinal entre sa partie terminale et l'ouverture, et d'assembler entre eux les corps partiels, sur leur face de séparation, par l'intermédiaire d'une feuille de séparation imperméable à la solution de réactif et aux composants à déceler. Afin d'analyser simultanément plusieurs composants gazeux, les corps partiels sont chargés d'enzymes différents qui, à la suite de leur immersion dans la solution de réactif, sont capables de réactions différentes avec les composants gazeux qui leur sont sensibles.Si, par ailleurs, on veut effectuer simultanément une mesure de référence, un des corps partiels est muni d'un enzyme et l'autre pas, de sorte que seul le corps partiel muni de l'enzyme se décolore. Afin d'améliorer l'aptitude au stockage, il est conseillé de réaliser le support en un matériau opaque, ainsi qu'éventuellement le récipient de stockage et la partie supérieure de récipient, afin de permettre l'utilisation de substances sensibles à la lumière. Afin d'améliorer encore la sécurité des manipulations, il est avantageux de prévoir une butée de guidage, qui doit être surmontée pour l'immersion du corps de remplissage dans la solution de réactif. Cette butée peut être réalisée, par exemple, sous la forme d'un bossage en forme d'ergot sur le récipient de stockage, qui, lors du vissage du support ou de l'immersion dans le récipient, forme une résistance qui doit être surmontée de manière consciente. L'ergot est alors brisé. Si la partie terminale de corps de remplissage est recouverte par la membrane de recouvrement, cette dernière est simultanément transpercée. L'exposé qui suit décrit plus en détails un exemple de réalisation de l'invention en référence au dessin schématique annexé. L'unique figure est une vue en coupe d'un appareil indicateur qui possède un récipient de stockage 1 qui reçoit une solution de réactif 2 et qui est fermé par une membrane de recouvrement 3 étanche à l'eau. Une partie supérieure de récipient 4, qui enserre hermétiquement le bord de la membrane 3 en position, est enclenchée sur le récipient de stockage 1. La partie supérieure de récipient 4 possède un filetage intérieur dans lequel un support 5 pour un corps de remplissage poreux 6 est vissé jusqu'à une butée en forme d'ergot 7. Le corps de remplissage 6 dépasse du support 5 par sa partie terminale 8 et s'étend, par son extrémité présentant une surface coupante 9, jusque peu avant la membrane de recouvrement 3. Il est divisé en deux régions partielles A, B qui sont assemblées par une feuille de séparation 16. Seule la région partielle A contient l'enzyme nécessaire pour la réaction de décèlement. Vers l'environnement, le support 5 présente une ouverture il munie d'une membrane de diffusion 10 perméable au composant gazeux à déceler. L'ouverture 11 est munie d'un collet 12 au-dessus duquel est enclenché un couronnement de diffusion 13 jouant le rôle de chemin de diffusion. La partie terminale 8 du corps de remplissage contient un alésage compensateur 14 s'enfonçant dans le corps de remplissage 6. La solution de réactif 2 est totalement absorbée par le corps de remplissage poreux 6. En allant vers la surface 17 du corps 6 qui est exposée à l'échantillon d'air, les substrats, lyophilisés dans la région inférieure 18 du corps 6, et les enzymes, lyophilisés dans sa région supérieure 15, sont dissous par la solution de réactif 2 et amenés à la surface 17. A la suite de cette activation, le composant à déceler traverse la membrane de diffusion 10 et atteint la surface 17 exposée à l'environnement. La transformation spécifique du composant à déceler par l'enzyme se traduit, dans une réaction colorée secondaire, par le développement du colorant qui se trouve dans la solution de réactif 2. On utilise pour l'évaluation, l'intensité de coloration, qui est directement proportionnelle à la concentration du composant à déceler. L'évaporation de l'eau de la solution de réactif 2 sur la surface 17 du corps de remplissage poreux 6 se traduit par un transfert de liquide depuis le récipient de stockage 1 vers la surface 17. Suite à ce transfert, les réactifs, substrats et enzymes sont concentrés sur la surface 17. Dans le même temps, la diffusion du colorant formé à partir de la surface 17 dans le corps de remplissage 6 est empêchée, de sorte qu'il n'y a pas de colorant qui est perdu pour l'évaluation. Etant donné que, parmi les corps partiels A, B, seul le corps partiel A contient l'enzyme nécessaire pour le décèlement, la réaction de décoloration ne se produit également que sur le corps partiel.La feuille de sépartion 16 est imperméable à la solution de réactif et au composant à déceler, de sorte qu'on peut nettement distinguer la réaction de décoloration, dans le corps partiel A, du corps partiel B qui n'est pas décoloré. L'appareil selon l'invention peut être utilisé dans les applications suivantes : pour la détection de peroxyde d'hydrogène comme substrat pour l'enzyme peroxydase de raifort est préparée une solution de 1 m Mole/l de 4. aminoantipyrine et de N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidine dans un tampon phosphate à 50 m Moles/l comme réactifs colorés. Le tampon phosphate doit assurer un pH de 7,3. De cette façon, le peroxyde d'hydrogène est détectable par une réaction colorée, sélectivement par la peroxydase agissant comme bio-catalyseur. Ainsi, l'aminoantipyrine et I' ethyl-sulfopropyl toluidine forment les chromogènes, qui produisent une combinaison colorée du fait de la réaction enzymatique. La détection de peroxyde d'hydrogène avec un chromogène comme réactif coloré du fait de la réaction enzymatique, résulte d'une solution, qui comprend d'une part deux unités internationales de l'enzyme peroxydase de raifort et d'autre part aussi un réactif coloré comportant 1 m Mole de 2-2'-azino-bis-(3-ethylbenzthîazoline-6-acide sulfonique) dans 0,1 Mole de tampon TRIS-HCl à pH 8. Pour une mesure dans le temps de peroxyde d'hydrogène est utilisé un système coloré moins sensible, comme par exemple une solution de 1 m Mole/l de 4-chlore-1-naphtol dans 50 m Mole/I de TRIS-HCl et 0,2 Mole/l de solution de chlorure de sodium. REVENDICATIONS 1. Appareil indicateur pour l'analyse enzymatique de composants de gaz et d'aérosols, qui possède un corps de remplissage poreux, absorbant la solution aqueuse de réactif, les substrats et les enzymes, logé dans un boîtier qui présente au moins une ouverture par laquelle le corps de remplissage se trouve en contact de décèlement avec l'échantillon d'air et produit une réaction colorée, caractérisé en ce que le corps de remplissage poreux (6) est reçu dans un support (5) et est fixé en application hermétique dans ce support, duquel dépasse une partie terminale de corps de remplissage (8), qui peut être immergée dans un récipient de stokage (1) contenant la solution de réactif (2), une membrane de recouvrement perforable (3), étanche à l'eau, étant disposée entre la partie terminale (8) et le récipient de stockage (1). 2. Appareil indicateur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane de recouvrement (3) est prévue comme fermeture pour le récipient de stockage (1). 3. Appareil indicateur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane de recouvrement (3) est prévue comme couverture pour la partie terminale du corps de remplissage (8) qui dépasse du support (5). 4. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le récipient de stockage (1) possède une partie supérieure (4) pour guider la partie terminale du corps de remplissage (8) pendant l'immersion. 5. Appareil indicateur selon la revendication 4, caractérisé en ce que la partie supérieure du récipient est une douille filetée (4) dans laquelle peut être vissé le support (5). 6. Appareil indicateur selon la revendication 4, caractérisé en ce que la partie supérieure du récipient est une douille d'ajustement (4) dans laquelle le support (5) peut être enfilé en assemblage par contact. 7. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la partie terminale du corps de remplissage (8) contient au moins un alésage compensateur (14) s'enfonçant dans le corps de remplissage (6). 8. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 2 ou 4 à 7, caractérisé en ce que la partie supérieure du récipient est réalisée sous la forme d'une douille de serrage (4), qui maintient la membrane de recouvrement (3) dans sa position en tant qu'élément de fermeture du récipient de stockage (1). 9. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la partie terminale du corps de remplissage (8) est munie d'une surface coupante (9). 10. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le corps de remplissage est un corps de verre fritté (6). 11. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'ouverture (11) est fermée par une membrane de diffusion (10). 12. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le support (5) possède un couronnement de diffusion (13) qui entoure l'ouverture (11). 13. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la partie supérieure du récipient (4) munie du support (5) possède une butée de guidage (7) qui peut être surmontée pour l'immersion du corps de remplissage (6) dans la solution (2). 14. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le corps de remplissage (6) est divisé au moins une fois dans son développement longitudinal entre sa partie terminale (8) et l'ouverture (11), et en ce que les corps partiels (A, B) sont mutuellement assemblés, sur leur face de séparation, par l'intermédiaire d'une feuille de séparation (16) imperméable à la solution de réactif (2) et au composant à déceler. 15. Appareil indicateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le support (5), le récipient (1) et la partie supérieure du récipient (4) sont réalisés en matériau opaque.