Brevet FR2648476A1 — publié le 19901221

ACIDE NUCLEIQUE ET OLIGONUCLEOTIDE EN DERIVANT, CONSTITUANT DES SONDES NUCLEOTIDIQUES SPECIFIQUES DE PLASMODIUM FALCIPARUM, ET LEUR APPLICATION POUR LA DETECTION PAR HYBRIDATION DE L'ADN DE PLASMODIUM FALCIPARUM. La présente invention a été faite au Laboratoire de Parasitologie et Pathologie Exotique et au laboratoire de Biologie moléculaire Végétale de l'Université Joseph Fourier-Grenoble I, tous deux Unités de Recherche associées au CNRS. Le paludisme est une maladie infectieuse parasitaire due à une infestation des hématies par un hématozoaire du genre Plasmodium, transmis à l'homme par un insecte, l'anophèle. Plasmodium falclparum est l'espèce plasmodiale la plus répandue et la plus dangereuse, à l'origine d'une morbidité élevée. Environ 40% de la population mondiale est exposée au paludisme. Des efforts considérables ont été entrepris pour contrôler, soigner et éventuellement éradiquer cette maladie; il reste toutefois nécessaire pour atteindre ces objectifs de disposer de moyens de diagnostic spécifiques, simples et peu onéreux. Les techniques usuelles de diagnostic reposent sur l'observation au microscope du sang du malade et doivent être effectuées par un manipulateur entraîné; la sensibilité de détection de ces techniques est de 10 à 200 hématies parasitées/mm3, cependant les faibles parasitémies (inférieure à 1000 hématies parasitées/mm3) nécessitent un temps de lecture important et peuvent donner lieu à de faux négatifs. Bien qu'impossible à automatiser ces techniques sont utilisées couramment pour le dépistage de l'accès palustre. Des techniques immunologiques reposant sur la détection d'anticorps dans le sérum de malade ont été proposées mais ce type d'analyse sérologique est peu intéressante car la présence d'anticorps ne témoigne que dXun contact antérieur avec le parasite et une faible positivité du sérum ne permet pas de conclure à la présence ou à l'absence de parasites dans le sang. Ces techniques sont toutefois utilisées dans les centres de transfusion sanguine pour contrôler les sujets particulièrement exposés. Pour pallier ces inconvénients, des techniques d'hybridation moléculaire ont été développées afin de détecter dans le sang de patients la présence de l'ADN de Plasmodium falciparum. L'utilisation de sondes moléculaires d'ADN spécifiques, pour diagnostiquer le paludisme a été décrite pour la première fois par Franzen, L. et al (The Lancet, 1984, 1, 525-528). Excepté l'ADN génomique total utilisé par Pollack et al (Pollack, Y. et al (1985) Am. J. Trop. Med. Hyg., li, 663-667), d'autres sondes, clonées dans différents vecteurs ( Barker, R.H. et al (1986) Science, 231, 14341436; Enea, V. (1986) Mol. Cell. Biol., 6, 321-324 ; Zolg, J.W. et al (1987) Mol. Biochem. Parasitol., 22, 145-151) ou préparées par synthèse nucléotidique (Mc Laughlin, G.L. et al (1987) The Lancet, 714-716) ont été développées. Parallèlement, l'étude du génome de Plasmodium falciparum a mis en évidence la présence de séquences nucléotidiques hautement répétées spécifiques du parasite. La construction puis le criblage de banques génomiques de Plasmodium falciparum ont permis d'identifier et de séquencer des fragments d'ADN génomique contenant ces séquences hautement répétées. Le clone d'ADN, dénommé pRep- Hind décrit par Aslund, L. et Franzen, L. et al ( J. Mol. Biol. 1985, 185, 509-516) contient 1,7 kb et présente un insert de 0,57 kb constituée de la répétition d'une séquence unitaire de 21 nucléotides, cette séquence unitaire a été dénommée PFR1; elle présente un taux de variation de 25% et a été identifiée par les mêmes auteurs dans d'autres clones d'ADN isolés de la même banque génomique de Plasmodium falclparum La Demande de Brevet Européen NO 135 108 au nom de ROCKFELLER UNIVERSITY décrit également des fragments de l'ADN génomique de Plasmodium falciparum contenant des séquences hautement répétées, lesdits fragments permettant de constituer des sondes d'hybridation pour la détection de l'ADN de Plasmodium falciparum. Cette demande décrit notamment deux clones dénommés pPFR1 et pPFR5 contenant respectivement un insert de 1,2 kb.et 0,32 kb. Le séquençage de ces inserts a montré que la séquence répétée de pPFR1 contenait 51 nucléotides et celle de DPFRS contenait 21 nucléotides. Zolg, J. W. et al ( Mol. Biochem. Parasitol. 1987, ZZ, 145-151) décrivent également un clone dénommé "26Xt contenant un insert de 0,147 kb constitué de la répétition d'une séquence unitaire de 21 nucléotides identique à celle décrite par Franzen, L. et al. Les tests d'hybridations réalisés à partir des sondes issues des clones pReo-Hind et "26" permettent une détection satisfaisante de l'ADN de Plasmodium falciparum, ainsi la sonde plasmidique pRep-Hlnd détecte 100 pg D'ADN génomique après 18 heures d'exposition (Mc Laughlin, G. E. et al (1987) J. Clin. Microbiol., 25, (5), 791-795)) La présente invention concerne un nouvel acide nucléique ainsi qu'un oligonucléotide en dérivant, lesquelles constituent des sondes nucléotidiques spécifiques de Plasmodium falciparum et pouvant hybrider l'ADN de souches d'origines géographiques différentes. L'invention concerne également le procédé d'hybridation de l'ADN de Plasmodium falciparum avec les sondes de l'invention, ainsi que le procédé pour détecter Plasmodium falciparum dans un échantillon et le kit pour la mise en oeuvre dudit procédé de détection. Les travaux de recherche réalisés par les Inventeurs ont concerné le clonage et le séquençage de fragments de l'ADN génomique de Plasmodium falciparum comprenant des séquences hautement répétées. Ces travaux ont permis d'obtenir l'acide nucléique de l'invention qui est représenté à la figure 1, dans laquelle les lettres indiquent les nucléotides suivants : A pour le résidu adénylique, C pour le résidu cytidylique, G pour le résidu guanidylique et T pour le résidu thymidylique; et où (5') et (3') indiquent les extrémités 5' et 3' dudit acide nucléique. Cet acide nucléique qui a reçu la dénomination oUF 28 comporte 1,846 kb dont 33,15 % de G et C. il est constitué par la répétition d'une séquence unitaire de 21 nucléotides en 87 copies; celles-ci diffèrent entre elles de 1 à 9 nucléotides mais présentent au moins une homologie de 55 % sur toute la séquence de l'acide nucléique pUF 28. Ces variations résultent de la duplication en nombreux exemplaires d'une séquence de base, et se traduisent par des remplacements et/ou des additions et/ou des suppressions de un ou plusieurs nucléotides. Ces modifications apparaissent clairement à la figure 1, dans laquelle les 87 copies de la séquence unitaire constituant l'acide nucléique pUF 28 sont superposées. La présente invention concerne donc un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique de la figure 1 ou la séquence complémentaire correspondante capable de s'apparier avec la même portion de l'ADN génomique de Plasmodium falclparum en raison de sa nature bicaténaire. L'invention concerne également un oligonucléotide qui a reçu la dénomination Qui 28 et qui dérive de l'acide nucléique de l'invention puy 28. L'oligonucléotide OLI 28 comprend 20 nucléotides dont la séquence est la suivante (5' ) TAGGTCTTAAGGTAACTAAT (3') L'oligonucléotide OLI 28 est présent dans l'acide nucléique pUF 28 en quatre copies soulignées dans la figure 1. L'invention concerne naturellement, aussi l'oligonucléotide complémentaire de OLI 28 et ayant la séquence nucléotidique suivante (5')ATTAGTTACCTTAAGACCTA(3') capable de s'apparier avec la même portion d'ADN génomique de Plasmodium falciparum en raison de sa nature bicaténaire. Font également partie de l'invention les acides nucléiques et les oligonucléotides dans lesquels les groupes thymidine sont remplacés par des groupes uracyles. L'oligonucléotide OLI 28 peut être préparé par synthèse chimique, l'acide nucléique puy 28 est lui isolé à partir d'un clone bactérien recombinant RRlSpUF28 par des méthodes connues dans l'état de la technique. L'acide nucléique puy 28 et 1'oligonucléotide OLI 28 présentent la caractéristique de s'hybrider spécifiquement avec 1'ADN de Plasmodium falciparum. L'invention concerne donc également les sondes pour détecter la présence de Plasmodium falciparum dans un échantillon biologique, constituées par ou comprenant tout ou partie de la séquence complémentaire d'un acide nucléique selon l'invention, ou toute sonde ne se distinguant des précédentes au niveau de ia séquence nucléotidique que par des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entralnant pas de modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec un acide nucléique selon l'invention, dans les conditions d'hybridation définies ci après - traitement de pré-hybridation du support sur lequel est fixé la sonde, à 330C pendant 30 minutes avec une solution de pré-hybridation ayant la composition suivante tampon 5 fois SSC (1 fois SSC=Nacl 0,15M; Citrate de Sodium 0,015M) Ficoll 400 0,1 % Poids/Volume Polyvinylpyrrolidone 0,1 z Poids/Volume Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM Glycine 0,1 % Poids/Volume SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1 % Poids/Volume ADN de Sperme de Hareng dénaturé 100 Rg/ml en présence de 50 % de formamide. - hybridation avec l'acide nucléique complémentaire, pendant 2 heures à 330C dans une solution tampon identique à la solution de pré-hybridation précédente, en présence de 50 % de formamide. - lavages successifs avec les solutions suivantes 4 4 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante, . 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 2 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante. L'invention concerne aussi les sondes pour détecter la présence de Plasmodium falciparum dans un échantillon biologique, constituées par ou comprenant une séquence de 10 à 450 nucléotides consécutifs contenus dans la séquence complémentaire d'un acide nucléique selon l'invention. L'invention concerne plus particulièrement les sondes pour . détecter Plasmodium falclparum dans un échantillon, constituées par ou comprenant une séquence nucléotidique complémentaire d'un oligonucléotide selon l'invention, ou toute sonde ne se distinguant de la précédente au niveau de la séquence nucléotidique que par des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entraînant pas de modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec un oligonucléotide selon l'invention, dans les conditions d'hybridation définies ci-après : - traitement de pré-hybridation du support sur lequel est fixé la sonde, à 300C pendant 30 minutes avec une solution de pré-hybridation ayant la composition suivante tampon 5 fois SSC Ficoîl 400 0,1 % Poids/Volume Polyvinylpyrrolidone 0,1 % Poids/Volume Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM Glycine 0,1 % Poids/Volume SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1 % Poids/Volume ADN de Sperme de Hareng dénaturé 100 Rg/ml - hybridation avec l'oligonucléotide complémentaire, pendant 4 heures à 300C dans une solution tampon identique à la solution de pré-hybridation précédente. - lavages successifs avec les solutions suivantes 2 2 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC à température ambiante, 1 1 lavage de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante. 1 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante. Les conditions d'hybridation définies ci-dessus constituent des conditions préférées, mais ne sont nullement limitatives et peuvent être modifiées sans affecter pour autant les propriétés de reconnaissance et d'hybridation des sondes et des acides nucléiques et des oligonucléotides conformes à l'invention. I1 est connu de l'homme du métier qu'une séquence nucléotidique peut présenter des modifications comme des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entrainant cependant pas de modification des propriétés, notamment d'hybridation de ladite séquence nucléotidique. L'invention concerne encore les sondes pour détecter Plasmodium faîciparum dans un échantillon, constituées par la répétition de la séquence d'une ou plusieurs sondes contenant de 10 à 450 nucléotides. On désignera ci-après par sonde pUF 28, la sonde correspondant à l'acide nucléique pUF 28 et présentant donc la séquence de la figure 1, et par sonde OLI 28, la sonde correspondant à I'oligonucléotide OLI 28 et présentant donc la séquence suivante (s' ) TAGGTCTTAAGGTAACTAAT (3') Les sondes sont avantageusement marquées par tout marqueur classiquement utilisé. Les sondes peuvent etre marquées à l'aide d'un traceur radioactif comme 32p, 35S, 125I, 3H, 14C. Le marquage radioactif peut être réalisé selon une méthode quelconque connue de l'homme du métier. Les sondes peuvent être marquées en 3' par addition d'un ou plusieurs déoxynucléotides ou ribonucléotides ou d'un didéoxynucléotide, marqués en alpha par le 32p, en présence de la Terminal Déoxynucléotidyl Transférase; les sondes peuvent également être marquées en 5' par transfert d'un groupe Phosphate radioactif d'un déoxynucléotide ou d'un didéoxynucléotîde libre marqué en position gamma, en présence de la T4 Polynucléotide Kinase, elles peuvent encore être marquées à chaque extrémité par adjonction d'une séquence quelconque radiomarquée en présence de T4 DNA ligase. La sonde puy 28 est marquée de manière avantageuse par "Nick Translation" ou par "Random Priming". La sonde oligonucléotidique OLI 28 peut être marquée lors de sa synthèse chimique en incorporant un ou plusieurs déoxynucléotides raàioactifs, la sonde OLI 28 est de manière avantageuse marquée à son extrémité 5'. La méthode de détection de l'hybridation dépendra du marqueur radioactif utilisé et pourra reposer sur l'autoradiographie, la scintillation liquide, le comptage gamma ou tout autre technique permettant de détecter l'émission du rayonnement émis par le marqueur radioactif. Un marquage non radioactif peut également etre utilisé, en associant aux sondes de l'invention des groupements présentant des propriétés immunologiques comme un antigène, une affinité spécifique pour certains réactifs comme un ligand, des propriétés physiques comme la fluorescence ou la luminescence, des propriétés permettant la complétion de réactions enzymatiques comme une enzyme ou un substrat d'enzyme. Le marquage non radioactif peut être fait par incorporation d'un analogue de nucléotide comportant l'un de ces groupements, par "Nick Translation" ou par "Random Priming"; ou par addition à l'extrémité 3' ou 5' de l'un de ces analogues. I1 peut être fait également directement par modification chimique de 1'ADN, comme la photobiotinylation ou la sulfonation. L'invention concerne également un procédé d'hybridation d'une sonde nucléotidique avec 1'ADN de Plasmodium falciparum, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - le traitement de pré-hybridation d'un support, comme un filtre de nitrocellulose ou une membrane de nylon, sur lequel est fixé 1'ADN extrait de Plasmodium falciparum, avec une solution de pré-hybridation, - l'hybridation dans une solution identique à la solution de pré-hybridation comprenant en outre une sonde nucléotidique conforme à l'invention, - plusieurs lavages successifs. L'invention concerne aussi un procédé de détection in vitro de Plasmodium falciparum dans un prélèvement biologique susceptible de le contenir, caractérisé en ce que après avoir rendu 1'ADN de Plasmodium faîcioarum, éventuellement contenu dans le prélèvement biologique, accessible et monocaténaire, on le met en contact avec une sonde nucléotidique conforme à 11 invention, dans des conditions favorables à l'hybridation et l'on détecte les hybrides éventuellement formés, la sonde ayant été préalablement marquée ou rendue apte à être détectée comme il a été dit précédemment. Les sondes conformes à l'invention peuvent être également utilisées pour détecter 1'ADN de Plasmodium falciparum présent au stade sporozoïte dans les glandes salivaires de l'anophèle. L'invention a en outre pour objet les kits de diagnostic du paludisme mettant en oeuvre des procédés de détection in vitre de Plasmodium falciparum sus-mentionnés. A titre d'exemple de tel kits comprennent notamment - une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique conforme à l'invention, - un milieu approprié à la réalisation d'une réaction d'hybridation entre 1'ADN de Plasmodium falciparum et ladite sonde, - des réactifs permettant la détection des hybrides formés entre 1'ADN et la sonde lors de ladite réaction d'hybridation. Les sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention peuvent être utilisées comme amorce dans un processus d'amplification génétique in vitre consistant à fixer la sonde sur 1'ADN de Plasmodium falclparum par hybridation, puis à mettre en oeuvre un processus d'extension enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase, suivi d'un processus de dénaturation , et à répéter le cycle hybridation-extension-dénaturation, connu sous le nom de cycle PCR ("Polymerase Chain Reaction" décrit par la société Cetus Corporation), un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence-cible de la sonde oligonucléotidique de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Outre les caractéristiques qui précèdent, l'invention comporte d'autres caractéristiques qui apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se référent à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention , étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications. I - PREPARATION DE LA SONDE pUF2S. A) Production de la sonde pUF 28 L'acide nucléique puy 28 est introduit dans une cellule hôte à l'aide d'un vecteur, du type plasmide apte à se répliquer dans ladite cellule hôte; de manière avantageuse l'acide nucléique pUF 28 a été introduit dans le plasmide pUC 19 et amplifié dans la souche d'Escherichia Coli RRlAMl5 (K 12), dérivée de HB 101. A partir d'un congelat à -700C, la souche est ensemencée sur un milieu solide SOB (Bacto Tryptone 2 %, Extrait de Levure 0,5 %, NaCl 10mM, KC1 2,5mM, MgC12 10mM, MgSO4 10mM), en présence d'Ampicilline (50 g/ml) et mise en culture pendant 18 heures à 370C. 10 ml de milieu liquide SOB (Ampicilline (50 gSml)) sont ensemencés avec une colonie et mis en culture durant 16 heures, à 37 C, sous une agitation orbitale de 200 rpm. 2 ml de cette préculture servent d'inoculum pour ensemencer un litre de milieu liquide SOB (Ampicilline 50 Ag/ml). La culture se fait sur 9 heures, à 370C et sous agitation (200rpm). L'addition de Chloramphénicol (170 g/ml) permet d'amplifier le nombre de copies du plasmide par cellule en bloquant la division bactérienne. Cette étape d'amplification se déroule toujours à 370C, sous agitation (200 rpm), durant 16 heures. Les bactéries sont récupérées par centrifugation à 5000 g, pendant 10 minutes et à 40C. Le plasmide est extrait de manière classique selon la technique de Birboim et Doly, décrite par Maniatis et al (1982 "Moiecular cloning, A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory) . Il est purifié, en dernière étape, par ultracentrifugation sur gradient de CsCl2 (n = 1,3860; 1,55mg/ml; 100000 g; 200C; 36 heures; en présence de 600 g/ml de Bromure d'Ethidium. Le Bromure d'Ethidium est éliminé par 6 ex-ractions au n-Butanol et 3 extractions au Diéthyl-Oxyde. B) Purification de la sonde pUF 28 Après précipitation dans l'éthanol 70 %, l'ADN plasmidial est déssiqué sous vide puis solubilisé dans l'eau et dosé par mesure au spectrophotomètre de la D.O. de la solution à 260 nm. La purification de l'insert pUF 28 se fait par une double digestion enzymatique du plasmide par 2 enzymes Sst I (ou Sac I) et Xba I dont les sites de coupure se situent de part et d'autre de l'insert, dans la séquence polylinker du plasmide pUC 19. De manière préparative, 100 g de plasmide sont digérés dans 200 1ll au moins de tampon Sac I (Tris-HCl pH 8, 50mM; NaCl 50mM; MgCl2 10mM) à raison de 1 unité/llg de chaque enzyme. Les deux digestions sont simultanées et sont incubées à 37 OC, pendant au moins 3 heures. L'insert pUF 28 (1,846 kb) et le plasmide pUC 19 (2,686 kb) sont séparés par électrophorése sur gel à 0,8 % d'agarose, (gel de 20 cm par 20 cm; deux puits de 7 cm de longueur par 1,5 mm de largeur par 0,8 cm de profondeur), dans un tampon TAE (0,5 g/ml de Bromure dEthidium). La bande inférieure est découpée et la sonde DUF 28 est électro-éluée dans un appareil BIOTRAP (dénomination commerciale), dans le tampon TAE (0,5 g/ml de Bromure d'Ethidium). L'insert ainsi purifié est prêt à l'emploi après 6 extractions du Bromure d'Ethidium au n-Butanol et 3 extractions au Diéthyl-Oxyde et précipitation dans l'éthanol 70 %. Après remise en solution dans l'eau, la qualité de la sonde est contrôlée par électrophorèse analytique et la concentration en ADN est déterminée par la mesure de la D.O. à 260nm. C) Marquage de la sonde pUF 28 Les résultats rapportés ci-dessous ont été obtenus par marquage de la sonde puy 28 au 32p, par l'intermédiaire d'un nucléotide triphosphate marqué en position alpha; par exemple le alpha 32P dTTP (800 Ci/mmol; AMERSHAM FRANCE (dénomination commerciale)). Un microgramme d'insert est ainsi marqué avec 140 Ci par nick translation, l'activité spécifique est alors de 1 à 5.108 cpm/ g. On peut aussi marquer l'insert par la technique du "Random Priming", l'activité spécifique est alors de 1 à 2.109 cpm/g. II - PREPARATION DE LA SONDE OLI 28. A) Production de la sonde OLI 28 La séquence oligonucléotidique OLI 28 de 20 bases est produite par synthèse chimique sur un appareil automatique (synthétiseur d'APPLIED BIOSYSTEM (dénomination commerciale)). 300 g ont ainsi été synthétisés sous forme monocaténaire en une seule fois. Les sels présents à haute concentration sont éliminés après précipitation de l'ADN monobrin dans l'éthanol 70 %. B) Marquage de la sonde OLI 28 L'oligonucléotide OLI 28 est marqué à l'extrémité 5' par la T4 Polynucléotide Kinase, en présence de gamma ATP. 50 pmoles de sonde OLI 28 (330 ng) sont incubées en présence de 7 Unités de T4 Polynucléotide Kinase et 150 pCi de gamma 32P ATP dans un volume final de 50 , L'activité spécifique moyenne est de l'ordre de 2 à 5.i08 cpm/ g III - PREPARATION DES ECHANTILLONS A ANALYSER A) Préparation des échantillons Le protocole de préparation des échantillons décrits ci-dessous a été mis au point par J. W. Zolg et al, et décrit dans Am. J. Trop. Med. Hyg. (1987), ;5, 33-41. Cette technique comporte 5 étapes et permet de manipuler des échantillons de sang parasité d'au moins 50W1. - première étape : Lyse des hématies parasitées en ajoutant 2 volumes (100 pL1) d'eau bidistillée, stérile. Incuber pendant 20 minutes. - deuxième étape : Lyse des parasites en ajoutant 0,33 volume (50 ptl) de tampon LE (Lauryl Sarcosine 1 %; EDTA pH8, 50 mM). L'EDTA inhibe l'activité enzymatique des DNAases. - troisième étape : Addition de 0,25 volume (50 pl) de trifluoroacétate de césium 5 M. Le trifluoroacétate de Césium est un sel fortement chaotropique qui dénature les protéines et les dissocie des acides nucléiques. - quatrième étape : Extraction des protéines par addition de 0,33 volume (83 Al) d'un mélange organique (éthanol 2,5 volumes /chloroforme 1 volume /alcool isoamylique 0,04 volume). - cinquième étape : Centrifugation à 12000 g pendant 5 minutes et récupération de la phase aqueuse supérieure. Toutes les solutions mères peuvent être conservées à température ambiante. Les ADN extraits selon cette méthode peuvent être conservés à 370C, pendant plusieurs mois. B) Dénaturation de l'ADN L'ADN est dénaturé en ajoutant 0,25 volume (62,5 pl) de soude 2,5 N (20 minutes à température ambiante). La solution est neutralisée avec 0,5 volume (156 l) de tampon Tris-HCL (pH8, 3M) et incubée dans la glace pour éviter la renaturation de l'ADN. C) Dépôt des échantillons Les échantillons sont déposés en duplica sur un support comme un filtre de nitrocellulose à l'aide d'un appareil de filtration 8 fois 12 puits, sous vide (appareil HYBRI-DOT MANIFOLD de BRL (dénomination commerciale)). Le filtre est préalablement mouillé dans le tampon 2 fois SSC (1 fois SSC = NaC1 0,15 M; Citrate de Sodium 0,015M) avant d'être placé dans l'appareil. Chaque échantillon est déposé sous vide. Avant et après chaque dépôt, le puits est rincé avec 200 Al de tampon 2 fois SSC. Après séchage à température ambiante pendant 30 minutes, le filtre est incubé à 800C pendant 2 heures, entre deux feuilles de papier WHATMAN 3MM (dénomination commerciale) pour fixer les ADN sur la membrane. IV - HYBRIDATION L'hybridation se déroule en trois étapes la préhybridation, l'hybridation, les lavages. A) La tréhvbridation Le filtre sec est placé dans un sac plastique soudé et incubé dans un tampon d'hybridation, à raison de 75 CLl/cm2. Le tampon d'hybridation a la composition suivante - Tampon 5 fois SSC - Ficoll 400 0,1 % Poids/Volume - Polyvinylpyrrolidone 0,1 % Poids/Volume - Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM - Glycine 1 % Poids/Volume - SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1 % Poids/Volume - ADN de sperme de Hareng dénaturé 100 EgXml La préhybridation avec la sonde pUF 28 est effectuée pendant 30 minutes à 330C en présence de 50 % de formamide. La préhybridation avec la sonde PLI 28 est éffectuée pendant 1 heure à 300C, en absence de formamide. B) L'hybridation Après dénaturation de la sonde pUF 28 par chauffage à 1000C pendant 10 minutes puis refroidissement dans la glace fondante (OOC) pendant 10 minutes, l'hybridation avec la sonde tUF 28 monocaténaire se fait dans le même tampon que la préhybridation; le filtre est hybridé avec 80 ng/ml de sonde pUF 28 pendant 2 heures à 330C, pour une activité spécifique de 108 cpmXllg au moins. L'hybridation avec la sonde OLI 28 se fait dans le même tampon que la préhybridation ; le filtre est hybridé avec 100 ng/ml de sonde OLI 28 pendant 4 heures à 300C, pour 1 1 lavage de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante. 1 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante. D) Révélation de l'hybridation Les filtres sont séchés à la température ambiante pendant 30 minutes, enveloppés dans un film plastique, et exposés à un film d'autoradiographie, à -700C, pendant 24 heures. V - SENSIBILITE DE DETECTION A) Sensibilité de la détection d'ADN La sonde pUF28, radiomarquée au 32P peut détecter 1100 pg d'ADN purifié de Plasmodium falclparum, après 24 heures d'exposition du film d'autoradiographie. La sonde OLI 28 radiomarquée peut détecter 1 ng d'ADN après. 24 heures d'exposition. B) Sensibilité de la détection d'hématies parasitées Afin de retrouver les conditions physiopathologiques, les tests de détection ont été réalisés sur des hématies parasitées invitro, synchrones au stade ring. La sonde puy 28 marquée au 32P détecte 50 hématies parasitées par mm3 de sang de culture à 50 % d'hématocrite, après 24 heures d'exposition du film, soit une parasitémie de 0,001 % de façon reproductible. La sonde OLI 28 radiomarquée détecte 500 hématies parasitées par mm3 soit une parasitémie de 0,01 % dans les mêmes conditions. Le tableau I ci-dessous rapporte la durée de manipulation et la sensibilité des sondes puy 28 et PLI 28 ainsi que de différentes sondes connues à ce jour. AUTEUR SO@D@ DUREF DE DUR@@ DE DORER DE QUANTITE D' PARASITEMIE FREPARATION L'MYBRIDATION LA REVELATION AD@ DETECTE DES EC@A@TILLONS pRep-Hind FRANLE@ (1,7 Kbp) 4 h 30 6 h 10 h 25pg 0,001 % 1984 DNA POLLACE qesenique 3 h 22 h 12 h ? 0,0001 % 1985 pFR1 McLAUGELIN (21 pb) 2 h 3C 14 h 18 h 100pg ? 1985 pFR1 McLAUGRLIE marqué au 2 h 4 h 45 48 h 100 pg 0,1 % 1987 32p CLONE 26 @OLG (147 pb) ? 20 h 2 h 25,0 pg ? 1987 PUF 28 50 mm 2 h 24 h 100 pg 0,001 % OLI 28 50 mm 4 h 24 h 1 ng 0,01 % Comme l'indique le tableau I, les sondes pUF 28 et OLI 28 ont une sensibilité de détection au moins équivalente à celle de pRep-Hind et PFR1 et qui est tout à fait reproductible. En outre, les conditions d'hybridation mises au point spécifiquement pour ces sondes, ont permis d'atteindre ces performances après seulement 2 heures d'hybridation pour la sonde pUF 28 et 4 heures pour la sonde OLI 28. Les sondes pUF 28 et OLI 28 sont spécifiques de l'ADN de Plasmodium falciparum; ainsi, en hybridation de "Southern Blots" elles ne reconnaissent pas l'ADN génomique humain, ni l'ADN des trois autre espèces plasmodiales Plasmodium malariae, Plasmodium ovale et Plasmodium vivax ainsi que Plasmodium cvnomolai bastianell11 qui infeste le singe. Elles reconnaissent l'ADN des souches de Plasmodium falciparum d'origine géographique différente suivantes - souche CAM du Sénégal - souche SGE-1 de Gambie - souche JEAN de Centrafrique - souche KENYA du Kenya - souche LILLY de Centrafrique - souche NF7 d'Afrique (aéroport d'Amsterdam) - souche NF 54 de Tanzanie - souche UPA d'Ouganda - souche HONDURAS du Honduras - souche INDOCHINA-1 du Vietnam REVENDICATIONS 1 - Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique de la figure 1 ou la séquence complémentaire correspondante. 2 - Oligonucléotide dérivant d'un acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence suivante (5')TAGGTCTTAAGGTAACTAAT(3') ou la séquence complémentaire correspondante suivante (5') ATTAGTTACCTTAAGACCTA (3'). 3 - Sonde pour détecter la présence de Plasmodium falcitarum dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou qu'elle comprend tout ou partie de la séquence complémentaire de l'acide nucléique de la revendication 1, ou toute sonde nucléotidique ne se distinguant de la précédente au niveau de la séquence nucléotidique que par des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entraînant pas de modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec l'acide nucléique de la revendication 1. 4 - Sonde pour détecter la présence de Plasmodium falciparum dans un échantillon selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou qu'elle comprend une séquence de 10 à 450 nucléotides consécutifs contenus dans la séquence complémentaire de l'acide nucléique selon la revendication 1. 5 - Sonde pour détecter la présence de Plasmodium falciparum dans un échantillon selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou qu'elle comprend une séquence nucléotidique complémentaire de l'oligonucléotide de la revendication 2, ou toute sonde nucléotidique ne se distinguant de la précédente au niveau de la séquence nucléotidique que par des substitutions et/ou additions et/ou suppressions de un ou plusieurs nucléotides n'entraînant pas de modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec l'olîgonucléotîde de la revendication 2. 6 - Sonde pour détecter la présence de Plasmodium falclparum dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle est constituée par la répétition de la séquence d'une ou plusieurs sondes selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5. 7 - Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle est marquée radioactivement ou par un marqueur du type enzymatique, antigènique, ligand, luminescent ou fluorescent. 8 - Procédé d'hybridation d'une sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 6 avec l'ADN de Plasmodium falciparum, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - le traitement de pré-hybridation d'un support, comme un filtre de nitrocellulose ou une membrane de nylon, sur lequel est fixé l'ADN extrait de Plasmodium falcitarum, avec une solution de pré-hybridation, - l'hybridation dans une solution identique à la solution de pré-hybridation comprenant en outre une sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendication 3 à 6, - plusieurs lavages successifs. 9 - Procédé d'hybridation d'une sonde nucléotidique selon la revendication 3 avec 1'ADN de Plasmodium falciparum, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - le traitement de pré-hybridation du filtre. Le filtre sur lequel est fixé 1'ADN extrait de Plasmodium falcitarum est placé dans un sac plastique soudé, et incubé pendant 30 minutes à 330C avec une solution de préhybridation ayant la composition suivante - Tampon 5 fois SSC - Ficoll 400 0,1 % Poids/Volume - Polyvinylpyrrolidone 0,1 % Poids/Volume - Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM - Glycine 1 % Poids/Volume - SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1 % Poids/Volume - ADN de sperme de Hareng dénaturé 100 llg/ml en présence de 50 % de formamide, - l'hybridation dans une solution tampon identique à la solution de pré-hybridation, comprenant en outre la sonde nucléotidique selon la revendication 3 marquée notamment de manière radioactive, en présence de 50 % de formamide, pendant 2 heures à 330C, - les lavages successifs suivants 4 4 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante, 1 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 2 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante. 10 - Procédé d'hybridation d'un sonde nucléotidique selon la revendication 5 avec l'ADN de Plasmodium falciparum. caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - le traitement de pré-hybridation du filtre. Le filtre sur lequel est fixé l'ADN extrait de Plasmodium falciparum est placé dans un sac plastique soudé, et incubé pendant 1 heure à 300C avec une solution de pré-hybridation ayant la composition suivante - Tampon 5 fois SSC - Ficoll 400 0,1 % Poids/Volume - Polyvinylpyrrolidone 0,1 % Poids/Volume - Phosphate de Sodium pH 6,5 50 mM - Glycine 1 % Poids/Volume - SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) 0,1 % Poids/Volume - ADN de sperme de Hareng dénaturé 100 Rg/ml - l'hybridation dans une solution tampon identique à la solution de pré-hybridation, comprenant en outre la sonde nucléotidique selon la revendication 5 marquée notamment de manière radioactive, pendant 4 heures à 300C, - les lavages successifs suivants 2 2 lavages de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC, à température ambiante, 1 1 lavage de 5 minutes dans un tampon 5 fois SSC en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante, 1 1 lavage de 20 minutes dans un tampon 5 fois SSC, en présence de SDS 0,1 %, à température ambiante. 11 - Procédé de détection in vitre de Plasmodium falciparum dans un prélèvement biologique susceptible de le contenir, caractérisé en ce que après avoir rendu 1'ADN de Plasmodium faîciparum éventuellement contenu dans le prélèvement biologique, accessible et monocaténaire, on le met en contact avec une sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans des conditions favorables à l'hybridation et l'on détecte les hybrides éventuellement formés. 12 - Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection in vitro de Plasmodium falciparum selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend - une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon l'une des revendications 3 à 6, - un milieu approprié à la réalisation d'une réaction d'hybridation entre 1'ADN de Plasmodium falciparum et ladite sonde, - des réactifs permettant la détection des hybrides formés entre l'ADN et la sonde lors de ladite réaction d'hybridation.