Brevet FR2652747A1 — publié le 19910412

L'invention concerne l'application d'agents actifs pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies auto-immunes telles que le diabète juvénile, le psoriasis, la myasthénie et les polyarthrites. V.E. KELLEY et al. (The Journal of Immunology, vol. 140, 59-61, n0 1 de janvier 1988) ont traité des souris atteintes de diabète insulinique ou de lupus à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur de l'interleukine-2 (IL-2) des lymphocytes T, pour obtenir un blocage dudit récepteur par l'anticorps qui prend ainsi la place de l'interleukine-2, (CD25), responsable de la prolifération des lymphocytes T. Dans cet article il est fait allusion, sans plus de précision, à une application chez l'homme. S. BANERSEE et al. (the Journal of Immunology, vol 141, 1150-1154, n 4 du 15 août 1988) ont traité l'arthrite, induite par collagène, de la souris par un anticorps monoclonal de rat contre le récepteur de l'interleukine-2. Ce modèle murin d'une maladie auto-immune non spontanée et induite artificiclement est assez éloigné des maladies auto-immunes humaines. T. OH - ISHI et al. (Proc. Natl. Sci. USA, vol 85, 6478-6482, septembre 1988) ont utilisé un anticorps monoclonal anti-TAC pour inhiber la prolifération in vitro de lymphocytes T suppresseurs à antigènes non spécifiques. T. OH - ISHI et al. se contentent de suggérer qu'une thérapie orientée contre le récepteur IL-2 pourrait être intéressante pour les maladies auto-immunes chez l'homme. Enfin, D. OLIVE et al. (Eur.J. Immunology, 1986, 16 611-616) ont décrit un panel d'anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur de l'interleukine-2 humaine qui reconnaissent différents épitopes de la chaîne o( (p55) du récepteur de l'interleukine 2 humaine. La déposante a trouvé que des anticorps monoclonaux reconnaissant le récepteur de l'interleukine-2 humaine sont efficaces dans le traitement de maladies auto-immunes humaines notamment des maladies telles que le diabète juvénile, le psoriasis, la myasthénie et les polyarthrites et qu'il était donc possible de préparer des médicaments à cet effet. L'invention a donc pour objectif de fournir des médicaments à base d'anticorps qui soient efficaces dans leur utilisation pour le traitement des maladies autoimmunes citées ci-dessus. Un autre objectif de l'invention est de fournir de tels anticorps qui soient peu ou pas immunogènes. L'invention a donc pour objet l'application d'anticorps capables de se fixer sur le récepteur de I'interleukine-2 humaine, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies auto-immunes telles que, notamment, le diabète juvénile, le psoriasis, la myasthénie et les polyarthrites. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'anticorps capable de se fixer sur le récepteur de l'interleukine-2 humaine est un anticorps monoclonal de rat, notamment un anticorps de classe IgG2a et en particulier l'anticorps 33B3.1 (selon D. OLIVE et al., Eur. J. Immunol., 1986, 16 : 611-616). Selon un autre mode de réalisation, l'anticorps capable de se fixer au récepteur de l'interleukine-2 humaine est un anticorps "humanise" comprenant une région d'origine animale, qui reconnaît le récepteur de l'interleukine-2, et une région d'origine humaine. De préférence, la région d'origine animale est un fragment Fab ou F(ab') d'un anticorps monoclonal de rat, notamment de l'anticorps 33B3.1. Les fragments Fab et F(ab')g peuvent être des fragments d'anticorps monoclonaux obtenus par immunisation d'animaux contre le récepteur de l'interleukine-2 humaine (RIL2). De préférence, la région d'origine humaine est une IgG humaine ou un fragment Fc d'une IgG humaine. Les fragments Fc peuvent également être obtenus par coupure enzymatique sélective d'une IgG humaine, selon la méthode décrite par Barandun S. et al., Vox Sang. 28, 157 (1975). Dans ce cas, la région d'origine animale est un fragment Fab. Cette région d'origine humaine peut être un anticorps polyclonal ou monoclonal. De préférence, lesdites IgG ou lesdits fragments Fc sont respectivement des isotypes IgG 1, 2, 3 ou 4. Les fragments Fc peuvent aussi être obtenus par génie génétique. Les anticorps anti-RIL2 de l'invention peuvent également être construits par expression d'ADN recombinant, selon les méthodes du génie génétique, par exemple selon la méthode de Zenon Steplewski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 85, 4852-4856, juillet 1988. L'invention a également pour objet des médicaments comprenant les anticorps selon l'invention et des procédés de traitement de patients souffrant d'une maladie autoimmune selon l'invention, lesdits procédés utilisant les médicaments selon l'invention. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'un exemple de procédé de préparation d'anticorps selon l'invention et d'un exemple non limitatif d'application d'un anticorps selon l'invention à un traitement thérapeutique. I - Préparation d'anticorps humanisés. 1) anticorps Fab - IgG a) Obtention d'IgG humaines réduites. Le produit de départ est une solution à 50 mg/ml d'IgG polyclonales humaines en tampon O,2M Tris HCl pH 8,0 contenant 20mM de dithiothreitol et 1mM d'éthylènediaminetétracétate disodique (Nag EDTA). Après 30 minutes d'incubation à 30"C, on obtient une solution d'IgG humaines réduites. On purifie la solution obtenue par dialyse contre un tampon acétate de sodium 0,5 M lOmM éthylènediaminetétracétate disodique (pH 5,4). On obtient ainsi une solution purifiée d'IgG humaines réduites en tampon acétate. b) Obtention de fragments Fab d'un anticorps monoclonal de rat. L'anticorps monoclonal de départ est un anticorps de rat anti-RIL2 humain d'isotype IgG2a (référence 33B3.1) sous la forme d'une solution dans une solution saline isotonique. On purifie la solution par dialyse pendant 16 heures contre une solution de formiate de sodium O,îM pH 2,8, puis par dialyse pendant 24 heures contre une solution d'acétate de sodium 0,1 M pH 4,5. On ajoute ensuite une solution de pepsine jusqu'à une concentration de 2 %, pH 4,5, et on laisse incuber pendant 4 heures à 37"C. On arrête alors la réaction enzymatique par remontée du pH à 8. Par chromatographie de perméation sur Sephacryl S 200 (Pharmacia) et élution avec un tampon Tris 0,2M pH 8,0, on obtient une solution à 5 mg/ml de fragments F(ab') . On ajoute du bêta-mercaptoéthanol jusqu'à une concentration de iOmM et on laisse incuber pendant 30 minutes à 30 C. Par chromatographie sur Sephadex G 25 (Pharmacia), et élution par un tampon acétate de sodium 50mM + 2mM Naz EDTA, pH 5,3, on obtient une solution de fragments Fab exempte de bêta-mercaptoéthanol. L'anticorps monoclocal de départ a été décrit par OLIVE D. et al., article cité ci-dessus. c) Préparation du conjugué Fab-orthophénylènedimaléimide. L'orthophénylènedimaléimide en solution 4mM, obtenue par dissolution de ira,76 mg dans 3,5 ml de diméthylformamide, est ajouté à la solution de fragments Fab. On laisse incuber pendant 45 minutes à 4"C sous agitation, à pH 4,7. La solution est ensuite chromatographiée sur Phospho Ultragel AGR (IBF) équilibré avec un tampon acétate de sodium 40mM, NazEDTA 2mM, pH 4,7. On élue avec un tampon acétate de sodium 800mM, Na1EDTA 5mM, pH 5 r 7. On obtient une solution de fragments Fab maléimidés. d) Couplage du fragment-Fab avec l'IgG réduite. On mélange la solution obtenue au stade c) et la solution d'IgG humaines réduites obtenues au stade a); rapport molaire 1/1. On laisse incuber pendant 24 heures à 4"C puis on soumet à une dialyse contre un tampon PBS pendant 16 heures environ. Par chromatographie (Séphacryl S 200 ou S 300 (Pharmacia)), on sépare une solution de la chimère Fab-IgG obtenue. En électrophorèse en S.D.S. PAGE, la chimère Fab-IgG est caractérisée par une bande dont le poids moléculaire est environ 230 kD. 2) Préparation d'anticorps chimériques du type Fc-Fab et Fc-2Fab a) de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade a), en remplaçant les IgG par des fragments Fc d'IgG humaines, on obtient une solution purifiée de fragments Fc réduits. Les fragments Fc utilisés comme produit de départ sont obtenus à partir d'IgG polyclonales humaines selon la méthode de Barandun S. et al., Vox Sang. 28, 157(1975). b) Les fragments Fab sont obtenus comme à l'exemple 1 stade b, et couplés à l'orthophénylènedimaléimide comme à l'exemple 1, stade c. c) On mélange la solution de fragments Fab couplés au dimaléimide, obtenue au stade b, avec la solution de fragments Fc réduits obtenue au stade a (rapport molaire : 2:1). On laisse en contact 24 heures à +4 C puis on met en dialyse contre du PBS à +4"C. A la sortie de dialyser on réalise une chromatographie sur Sephacryl S 200 (filtration sur gel) en colonne de îm de longueur. On réalise trois chromatographies successives pour séparer les chimères puis une reconcentration par ultrafiltration. On obtient ainsi une chimère du type Fc-2Fab et une chimère du type Fc-Fab, caractérisées en électrophorèse et en filtration sur gel. En électrophorèse (SDS-PAGE), 3) Présentation. Le médicament préparé selon l'invention est présenté en flacons, à l'état lyophilisé et est à reconstituer par 10 ml d'eau pour l'injection par perfusion IV après dilution dans 50 à 100 ml de soluté physiologique. La composition du lyophilisat est la suivante IgG2a 10 mg NaCl 80 mg Mannitol 100 mg Na2HPOL:, 2 22,8 mg NaHZPO4r 2 11,7 mg II - Application-Essai pilote d'une association 33B3.1 - cyclosporine A dans le diabète de type I récent Cet essai a porté sur sept patients (4 hommes et 3 femmes). Ces adultes jeunes (20-37 ans) dont le diabète venait d'être découvert (durée des signes cliniques : 34,5 jours, 15-60 jours durée de l'insulinothérapie : 14 jours, 7-27 jours) souffraient de diabète de type I comme en attestaient l'absence d'obésité (BMI = 20,3 ; 17,8 - 23,4) et la fréquence des anticorps anti-ilots (6 ICA + /7) des antigènes DR3 et/ou DR4 (5 / 7). Le traitement a été entrepris après que la normalisation glycémique ait pu être établie. Il a associé le 33B3.1 (10 mg/jour) pendant 14 jours et la cyclosporine A (4 mg / kg / jour, en deux prises quotidiennes). La tolérance a été excellente. La perfusion de 33B3.1 n'a été accompagnée d'aucun signe général. Une leucopénie portant sur les polynucléaires neutrophiles a été observée chez 3 patients au cours du traitement par l'anticorps monoclonal. Une récupération complète a pu être obtenue au bout d'un mois. Jamais cette leucopénie n'a atteint des taux inquiétants. Aucune anomalie plaquettaire, hépatique ou rénale n'est survenue au cours du traitement. L'étude de la cinétique du 33B3.1 a montré chez tous les patients un pic à 30 - 60 minutes. Le taux résiduel a crû tout au long du traitement pour culminer à des valeurs tout à fait bloquantes (2à 6pg / ml). Une immunisation anti-immunoglobulines xénogéniques de type IgM et IgG a été décelable chez tous les patients entre le 7ème et le 14ème jours du traitement. Pendant le traitement par le 33B3.1 aucune cellule circulante exprimant l'antigène TAC n'a pu être détectée. Les taux de récepteur soluble de l'IL2 dans le plasma ont été effondrés chez tous les patients. Les cyclosporinémies (taux résiduel) pendant et après le traitement par l'anticorps monoclonal sont restées dans les limites acceptables (inférieures à 200 ng/ml de plasma). Les créatinémies sont demeurées inférieures à 105/i mol / 1. L'anticorps 33B3.1 ne semble pas modifier la pharmacocinétique de la cyclosporine A. Sur le plan du diabète, des rémissions complètes de 1' insulino-dépendance (équilibre métabolique parfait en l'absence de traitement hypoglycémiant) ont été obtenues 3/7 à 2 mois, 3/6 à 3 mois. On peut conclure que la tolérance est excellente, que les conditions de l'activité bloquante de l'anticorps 33B3.1 ont été remplies. Sur le plan du diabète, le taux de rémission obtenu est compatible avec une efficacité potentielle de l'association immunosuppressive. REVENDICATIONS. 1. Application d'anticorps capables de se fixer sur le récepteur de l'interleukine-2 humaine, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies autoimmunes telles que le diabète juvénile, le psoriasis, la myasthénie et les polyarthrites. 2. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps capable de se fixer sur le récepteur de l'interleukine-2 humaine est un anticorps monoclonal de rat. 3. Application selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal de rat est un anticorps de classe IgG2a. 4. Application selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal de rat est l'anticorps 33B3 - 1 - 5. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps capable de se fixer sur le récepteur de l'interleukine-2 humaine est un anticorps humanisé comprenant une région d'origine animale, qui reconnaît le récepteur de l'interleukine-2, et une région d'origine humaine. 6. Application selon la revendication 5, caractérisé en ce que la région d'origine animale est un fragment Fab d'un anticorps monoclonal de rat. 7. Application selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que la région d'origine animale provient d'un anticorps monoclonal 33B3.1. 8. Application selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la région d'origine humaine est une IgG humaine. 9. Application selon la revendication 5, caractérisée en ce que la région d'origine humaine est un anticorps monoclonal ou polyclonal. 10. Application selon la revendication 9, caractérisée en ce que lesdites IgG ou lesdits fragments Fc sont respectivement des isotypes IgG1, 2, 3 ou 4. 11. Application selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée par le fait que l'anticorps anti RIL2 humain est obtenu par expression d'ADN recombinant.