Brevet FR2650673A1 — publié le 19910208

La présente invention concerne une trousse de détection des bactéries coliformes destinée à être utilisée comme indicateur visuel pour les aliments et l'eau potable. Les bactéries coliformes sont généralement définies comme "tous les bâtonnets courts Gram-négatifs et non sporulés qui assimilent le lactose en produisant des gaz et des acides organiques de façon aérobie ou anaérobie facultative". Les genres Escherichia, Klebsiella et apparentés appartiennent aux bactéries coliformes. La présence de bactéries coliformes dans l'alimentation ou l'eau potable indique la possibilité d'un contact direct ou indirect entre les fèces et l'urine de l'homme ou de l'animal et l'agent contaminant. De ce fait, il est très important de détecter les bactéries coliformes dans la surveillance de l'hygiène alimentaire. Jusqu'à présent, on utilise pour la détection à grande échelle des bactéries coliformes, un bouillon de bile lactose vert brillant (BGLB) ou un bouillon de lactose dans lequel sont placés des tubes de Darham. On ajoute un échantillon -2- - alimentaire à ce milieu et on fait incuber à 35-37 C pendant 24 à 48 heures. L'accumulation de gaz est observée dans le tube de Darham. Le milieu contenant le tube de Darham dans lequel l'accumulation de gaz est observée doit être soumis à une confirmation par l'utilisation d'un milieu de Endo ou équivalent. Cette opération prend du temps, à savoir 48 à 72 heures, entre le début de la culture et la fin de la confirmation. De ce fait, il est impossible de tester des aliments traités avant distribution ou contrôle sanitaire de chaque étape à la fabrique. Il existe un petit nombre de procédés simples tels que l'utilisation d'une bande de papier. Cependant ces procédés manquent de précision absolue, et la culture des bactérie demande 12 heures. La recherche de bactéries nécessite un équipement maintenu dans des conditions stériles ainsi qu'un personnel qualifié. Les trousses utilisant un dosage par immunosorbant avec liaison enzymatique et une technique utilisant une sonde d'ADN pour détecter divers types de bactéries et de salmonelles responsables de colites ont été récemment commercialisées. Ces trousses sont plus pratiques que les procédés ci-dessus et leur utilisation prend moins de temps (environ la moitié). Cependant, comme ces trousses sont utilisées spécifiquement pour détecter les germes et les salmonelles responsables de colites dans des cas individuels, il ne faut pas les utiliser pour détecter toutes les bactéries coliformes. La détection des bactéries coliformes exige deux condi- tions. 1) La plupart des bactéries coliformes doivent être détectables et 2) le procédé d'essai doit être simple. L'objet de la présente invention est donc de fournir un procédé de détection des bactéries coliformes et une trousse d'application de ce procédé satisfaisant à ces conditions. La présente invention concerne une trousse de détection des bactéries coliformes, comprenant un support enrobé d'un anticorps polyclonal d'une souche d'enterobacteriaceae et d'un conjugué enzyme-anticorps. La trousse de détection de bacté- 3 - ries coliformes comprend de préférence un support recouvert d'un anticorps polyclonal de cellules appartenant à des enterobacteriaceae préalablement bouillies, un anticorps marqué par un enzyme obtenu par conjugaison d'une enzyme de marquage à l'anticorps polyclonal, un substrat de cette enzyme de marquage et un chromogène. N'importe quel type de souche d'enterobacteriaceae peut être utilisé dans la présente invention. De préférence, on peut utiliser Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae et Salmonella typhimurium pour l'obtention d'anticorps ayant une réactivité croisée entre les bactéries coliformes et les bactéries pathogènes appartenant aux enterobacteriaceae. L'anticorps polyclonal peut être obtenu à partir de sérum d'animaux tels que le lapin, le cobaye et la souris après injection de cellules d'enterobacteriaceae préalablement bouillies. Ltantisérum obtenu peut être utilisé tel quel ou après avoir été purifié par une méthode connue. Deux antisérums ou davantage peuvent être mélangés. Comme support, on peut utiliser un tube à essai en plastique, une plaque de microtitrage, un papier filtre, une membrane nitrocellulosique, des billes de plastique, des billes de verre, un tissu non tissé ou équivalent. Comme enzyme de marquage, on peut utiliser la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la 5-galactosidase ou équivalent. Comme substrat de la peroxydase, on peut utiliser- le peroxyde d'hydrogène ou le peroxyde d'urée. L'anticorps et l'enzyme de marquage sont conjugués par un procédé connu comme un procédé au glutaraldéhyde, un procédé à l'acide périodique, un procédé au maléimide, un procédé au pyridyldisulfure ou apparenté. Comme chromogène, on peut utiliser l'ABTS (acide 2,2'-azinodi(3-éthylbenzothiazo- line)-6'-sulfonique), l'acide 5-aminosalicylique, le luminol, le TMB (3, 3',5,5'-tétraméthylbenzidine) ou des composés équivalents. On peut utiliser l'acide p-nitrophényle phospho- rique comme substrat de la phosphatase alcaline, et le o- ou - 4 - p-nitrophényl-p-D-galactoside ou le 4-méthyl-umbelliféryl-p-D- galactoside comme substrat de la 5-galactosidase. On décrit ci-après de façon plus spécifique la méthode d'utilisation de la trousse de détection du groupe de bacté- ries coliformes. On dilue l'échantillon de nourriture ou d'eau potable dans une quantité appropriée d'une solution saline de tampon physiologique stérile, et on ajoute la solution obtenue à une portion d'une culture et on fait incuber à 37 C pendant quatre heures ou plus. On ajoute le liquide incubé à un support recouvert d'un anticorps polyclonal et on fait incuber à tem-pérature ambiante pendant 30 minutes. Dans le même temps, on ajoute au support une suspension de souches de Bacillus subtiles IFO 13719 préalablement bouillies et on fait incuber. On lave alors abondamment plusieurs fois les substances qui ne sont pas adsorbées par les anticorps recouvrant le support dans une solution tampon ou équivalente. On ajoute au support une solution ccnjuguée enzyme-anticorps et on fait incuber à température ambiante pendant 30 minutes. On lave alors le support dans une solution tampon ou équivalente, et on ajoute au support un substrat ou un substrat et un chromogène puis on fait incuber la solution de culture à température ambiante. On applique la même méthode que ci-dessus à un témoin négatif. Trente minutes plus tard, on stoppe la réaction en ajoutant de l'acide sulfurique dilué et l'on mesure l'absorption ou la fluorescence de l'échantillon. Lorsque le nombre de cellules de bactéries coliformes dans la culture après incubation est de 105/ml et plus, l'absorption et l'intensité de la fluorescence de l'échantillon sont proportionnelles au logarithme du nombre de cellules. Lorsque l'absorption ou l'intensité de la fluores- cence de l'échantillon sont 2,5 fois celles du témoin négatif ou plus, on admet qu'il y a présence du groupe de bactéries coliformes dans l'échantillon. La présente invention fournit une trousse pouvant détec- ter efficacement la plupart des bactéries coliformes, selon un procédé simple, ce test ayant une très bonne sensibilité et un temps de réalisation très court. -5- Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. EXEMPLE 1 On injecte par voie intrapéritonéale au lapin une solu- tion saline de tampon phosphate de pH 7,4 contenant des souches préalablement bouillies de Salmonella typhimurium IFO 12529 une fois par semaine pendant trois semaines puis on injecte cette solution par voie intraveineuse à ce lapin une fois par semaine pendant trois semaines. On recueille le sang huit semaines plus tard pour obtenir un antisérum. On dilue dix fois 5 ml de cet antisérum par une solution de Tween 80 à 0,5 % dans une solution saline de tampon phosphate, puis on passe à 2 ml de la solution obtenue à travers une colonne de 10 ml (taille: 1 cm de diamètre et 13 cm de hauteur) remplie d'un support de formylcellufine (fabriqué par CHISSO CORPORATION; nom commercial) auquel est lié un lipopolysaccha- ride. La colonne est lavée par 30 ml de la même solution tampon, et on élue l'anticorps anti-salmonelle par un tampon glycine-chlorhydrate pH 2,5. On ajoute de la tris-hydroxyl- amine à l'éluant pour obtenir une solution de pH 8,5. On dialyse la solution pendant 24 heures contre une solution saline de tampon phosphate pour obtenir une solution d'anticorps anti-salmonelles. On obtient des solutions d'anticorps d'Enterobacter cloacae IF0 13535 et de Klebsiella pneumoniie JCM 1662 par le procédé ci-dessus. On mélange des portions d'une partie de ces solutions d'anticorps. On dilue 1 ml de ce mélange 500 fois par un tampon phosphate 0,01 M pH 7,2, puis on répartit à la pipette des portions de 100 gl de la solution obtenue dans chaque puits d'une plaque de microtitrage. On place ensuite la plaque à 37 C pendant une heure, et la solution d'anticorps est jetée. On ajoute alors un tampon'carbonate de sodium 0,01 M pH 7,5 contenant de l'albumine d'oeuf à 3 % à raison de 300 gl par puits. Après avoir placé la plaque à 37 C pendant une heure, on jette son contenu et on lave la plaque avec un tampon phosphate 0,01 M de pH 7,0 à trois reprises et on élimine l'eau. On congèle la plaque, on la place dans un sac de vinyle comprenant un agent de dessiccation et on la stocke à 4 C. La plaque reste stable au moins six mois dans les conditions ci-dessus. D'autre part, on mélange 40 mg de l'anticorps anti- salmonelles décrit ci-dessus à une solution de 30 mg de peroxydase de raifort de qualité EIA dans 5 ml d'un tampon carbonate de sodium 0,1 M (pH 7,0). En agitant lentement la solution obtenue à l'aide d'un agitateur magnétique, on ajoute petit à petit 50 mg de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)- carbodiimide et on fait réagir pendant 20 heures à température ambiante en ajustant à pH 6,0 - 7,0 par de l'acide chlorhydri- que 0,1 N et de l'hydroxyde de sodium 0,1 N. On passe la solu- tion de réaction à travers une colonne de cellufine GCL-1000lsf (fabriquée par CHISSO CORPORATION, nom commercial) pour séparer et éliminer les substances non réactives. La solution obtenue est une solution d'anticorps anti-salmonelles marquée par une enzyme. On prépare de la même façon des solutions d'anticorps anti-enterobacter et anti-klebsielle marquées aux enzymes. On incube Escherichia coli K12 IFO 3301, Salmonella typhimurium IFO 12529, Enterobacter cloacae IFO 13535, Yersinia aldovae JCM 5892, Klebsiella pneumoniae JCM 1662, Aeromonas hydrophila subspecies hydrophilla JCM 1027, Serratia marcescens JCM 1239 et Proteus vulgaris IFO 3851 dans chaque cellule d'un récipient en platine dans un bouillon à 35 C pendant trois heures. Après avoir immergé la solution dans l'eau chaude pendant cinq minutes puis l'avoir refroidie, on ajoute cette solution à raison de 100 1l par puits dans la plaque de microtitrage préalablement préparée et incubée à 37 C. Trente minutes plus tard, on lave chaque puits de la plaque avec une eau distillée contenant du Tween 20 à 0,05 % à trois reprises. -7- On mélange alors des portions d'une partie de l'anti- corps anti-salmonelle marqué par l'enzyme, de l'anticorps anti-klebsielle marqué par l'enzyme et de l'anticorps anti- enterobacter marqué par l'enzyme. On ajoute ce mélange à chaque puits de la plaque et on le fait incuber à 37 C. Trente minutes plus tard, chaque puits de la plaque est lavé avec une eau distillée contenant du Tween 20 à 0,05 % à trois reprises. Après élimination de l'eau, on ajoute à chaque puits 0,2 ml du mélange d'ABTS (acide 2,2'-azinodi(3-éthylbenzothiazoline)-6'- sulfonique) et de solution tampon citrate pH 5,5 de peroxyde d'hydrogène 0,1 M et on laisse la coloration apparaître pendant 15 minutes. On mesure l'absorption à 405 nm à l'aide d'un immunolecteur. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Tableau 1 Souche Absorption à 405 nm* Escherichia coli K12 IFO 3301 0,86 Salmonella typhimurium IFO 12529 0,85 Enterobacter cloacae IFO 13535 0,74 Yersinia aldovae JCM 5892 0,90 Klebsiella pneumoniae JCM 1662 0,80 Aeromonas hydrophila sp. hydrophilla JCM 1027 0,05 Serratia marcescens JCM 1239 0,10 Proteus vulgaris IFO 3851 0,03 * Une absorption de 0,2 et davantage est considérée positive. L'absorption du témoin négatif est de 0,08. Comme le montre le Tableau 1, l'apparition d'une couleur a été positive pour Salmonella, Escherichia, Yersinia, Enterobacter et Klebsiella, l'apparition d'une couleur a été négative pour Aeromonas, Serratia et Proteus. Ces résultats sont préférables car ces dernières souches n'appartiennent pas -8- aux bactéries coliformes. Bien qu'au sens strict, Salmonella et Yersinia n'appartiennent pas aux bactéries coliformes, ces souches sont responsables d'empoisonnements alimentaires. Il est donc préférable d'inclure la détection de ces souches. EXEMPLE 2 On ajoute Escherichia coli K12 dans une quantité corres- pondante à une anse de platine à 50 g de viande hachée. Ce mélange est dilué avec 200 ml de sérum physiologique pour obtenir une suspension. On inocule 1 ml, 0,1 ml et 0,01 ml de suspension et 1 ml, 0,1 ml et 0,01 ml de solution diluée respectivement à 103 et 106 par du sérum physiologique avec des cultures BGLB de 10 ml renfermant cinq tubes à fermentation de Darham, et avec des cultures BGLB de 10 ml ne renfermant pas de tube à fermentation de Darham. On fait incuber les cultures BGLB renfermant les tubes à fermentation de Darham à 37 C pendant 24 heures et 48 heures, et on étudie la production de gaz. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 sous forme d'un exemple compara- tif. Tableau 2 Nombre de tubes à fermentation de Darham dans lesquels du gaz a été produit Quantité de l'échantillon (ml) Dilution 1 0,1 0,01 x 1 5 5 5 X 103 5 5 3 x 106 2 0 0 - 9 - On fait incuber les cultures BGLB ne renfermant pas de tubes à fermentation à 37 C pendant 5 heures et l'on mesure dans chaque échantillon par essai par immunosorbant lié à une enzyme (ELISA) avec des plaques à anticorps adsorbés et des solutions d'enzymes de marquage préparées par le procédé décrit dans l'Exemple 1. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3. Tableau 3 Nombre de tubes à essai dans lesquels on observe un résultat positif par le procédé ELISA Quantité de l'échantillon (ml) Dilution 1 0,1 0,01 xl 5 5 5 x 103 5 5 5 x 106 5 3 1 Comme le montre le Tableau 2 et le Tableau 3, les échantillons de l'Exemple 2 sont beaucoup plus sensibles que ceux de l'Exemple comparatif. Le temps nécessaire dans l'Exemple comparatif est de 48 heures. En revanche, le temps nécessaire dans l'Exemple 2 est de 7 heures. Cette durée est très raccourcie. - 10- REVENDICATIONS 1. Trousse de détection de bactéries coliformes comprenant un support recouvert d'un anticorps polyclonal d'une souche d'enterobacteriaceae et un coftposé ayant une enzyme de marquage liée à l'anticorps. 2. Trousse selon la revendication 1, dans laquelle la bactérie coliforme comprend Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae et Enterobacter cloacae.