Brevet FR2640281A1 — publié le 19900615

La présente invention a pour objet un concentré enzymatique liquide contenant l'alpha-amylase provenant de Bacillus stearothermophilus, ainsi qu'un procédé pour sa production. Ces dernières années, différents enzymes thermostables du type alpha-amylase ont été élaborés. Des exemples de ces alpha-amylases thermostables comprennent celles produites par Bacillus licheniformis, brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 519 934; par Clostridium thermoamvlolvticum, brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 578 352; et par Clostridium thermohydrosulfuricum, brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 613 570. Les alpha- amylases produites par Bacillus stearothermophilus sont particulièrement intéressantes du point de vue commercial. Elles sont décrites par S.L. Pfueller et W.H. Elliott, J. Biol. Chem., 244, 48 (1969), et dans les brevets des Etats- Unis d'Amérique N 2 695 863 et 4 284 722. Des préparations d'alpha-amylases liquides provenant de Bacillus stearothermophilus sont disponibles dans le commerce. Cependant, ces préparations contiennent souvent des quantités appréciables de NaCl. La forte concentration en sel de la préparation enzymatique n'est pas avantageuse lorsque l'enzyme est utilisé dans des détergents liquides et d'autres applications en raison de sa tendance à provoquer une séparation de phases. L'ion chlorure est également indésirable car il peut provoquer une corrosion des récipients et des appareils métalliques. En outre, les préparations commerciales d'alpha-amylase liquide sont souvent de couleur foncée et leurs concentres peuvent présenter une tendance a former un précipité lors de l'entreposage. Pour ces raisons, les préparations liquides d'alpha-amylase provenant de Bacillus stearother- mophilus, disponibles dans le commerce, n'ont pas été largement admises par les fabricants de détergents liquides et d'autres fabricants qui exigent la formulation d'un produit enzymatique acceptable en cosmétologie. Un objectif de la présente invention consiste à proposer un concentré enzymatique liquide contenant l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus, qui possede une bonne stabilité enzymatique et physique ainsi qu'une faible coloration et qui est non corrosive. Les références à l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus précitées décrivent des modes opératoi- res en plusieurs étapes pour l'obtention de préparations enzymatiques d'alpha-amylases purifiées. Cependant, ces modes opératoires conviennent seulement pour des prépara- tions à petite échelle et seraient beaucoup trop coûteux pour la préparation d'un produit commercial. Il a été trouvé à présent un procédé peu coûteux qui donne un concentré enzymatique liquide stable qui est aisément adapté à une production commerciale à grande échelle. Conformément à la présente invention, il est proposé un procédé de production d'un concentré enzymatique liquide stable contenant l'alphaamylase de Bacillus stearothermophilus, qui comprend les étapes consistant: a) à mélanger une solution aqueuse d'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus à de l'amidon granulaire pour adsorber l'alpha-amylase; b) à séparer l'amidon, contenant l'alpha-amylase adsorbée, de la solution aqueuse; c) à laver l'amidon contenant l'alpha- amylase adsorbée; d) à former une suspension de l'amidon contenant l'alpha-amylase adsorbée dans une solution de tampon contenant des ions calcium; e) à chauffer la suspension de l'étape d) à une température supérieure à la température de gélatinisation de l'amidon pour former une solution de l'alpha-amylase et de l'hydrolysat d'amidon; f) à séparer la solution formée dans l'étape e) de toute substance solide insoluble; et g) à concentrer la solution obtenue dans l'étape f). Il est également proposé, conformément à la présente invention, un concentré enzymatique liquide stable contenant l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus préparé par le procédé précité, ayant une absorbance à 450 nanomètres (nm) inférieure à environ 4 et une concen- tration en C1- inférieure à environ 200 millimolaire (mM). N'importe quelle préparation enzymatique d'alpha-amylase thermostable produite par le micro- organisme Bacillus stearothermonhilus peut être utilisée dans la mise en prat.ique de la présente invention. Ces préparations sont disponibles sous forme de solutions aqueuses concentrées qui contiennent, outre l'enzyme, du chlorure de sodium et différents autres conservateurs ou stabilisants. Dans la mise en pratique de la- présente invention, la solution enzymatique du commerce est diluée avec de l'eau, puis l'enzyme est séparé de la solution aqueuse par adsorption sur de l'amidon granulaire. N'importe quel amidon granulaire peut être utilisé à cet effet. Un amidon convenant particulièrement est l'amidon de maïs granulaire, qui est aisément disponible sous une forme relativement pure comme produit de l'industrie de broyage du maïs par voie humide. Il a été trouvé que l'amidon adsorbe de beaucoup plus grandes quantités de l'enzyme à partir de solutions froides. Pour cette raison, il est préférable d'effectuer l'adsorption à des températures inférieures à environ 10 C, de préférence inférieures à environ 5 C mais non inférieures à une température qui provoque une congélation de la solution. Dans la mise en pratique de la présente invention, une quantité suffisante d'amidon est ajoutée pour que soit présent un gramme d'amidon pour 100 à 000 unités d'enzyme, de préférence 1 g d'amidon pour 1000 à 10 000 unités d'enzyme. La solution enzymatique est diluée avec une quantité suffisante d'eau pour que l'amidon représente environ 10 % à environ 40 % en poids, de préférence environ 20 % à environ 30 % en poids du mélange résultant d'amidon, d'enzyme et d'eau. La solution enzymatique d'alpha-amylase est stabilisée par addition d'ions calcium. Cela est effectué convenablement par addition à la solution enzymatique d'une quantité d'acétate de calcium suffisante pour parvenir à une concentration d'environ 1 à environ 100 mM, de préférence environ 10 mM. Cela donne une solution tampon qui maintient le pH dans l'intervalle d'environ 5,5 à environ 7,0, une plage de pH désirée pour l'adsorption de l'enzyme sur l'amidon granulaire. Une fois l'enzyme adsorbé sur l'amidon, l'amidon, contenant l'alphaamylase adsorbée, est séparé de la solution aqueuse. N'importe quelle technique classique de séparation, telle que la centrifugation ou la filtra- tion, convient pour la séparation. Puis l'amidon contenant l'enzyme adsorbé est lavé pour éliminer les sels et toute matière colorée. L'étape de lavage est de préférence effectuée à basse température (environ 1 C à environ 10 C) et l'eau de lavage contient environ 1 à environ 100 mM d'ion calcium. Après lavage de l'amidon contenant l'enzyme adsorbé, cet amidon est mis en suspension dans une solution tampon contenant des ions calcium. Le pH de la solution tampon est maintenu dans l'intervalle d'environ 5,5 à environ 7,0, de préférence d'environ 6,0 à environ 6,5. L'addition d'ions calcium et le tamponnement de la solution sont l'un et l'autre effectués convenablement par addition d'une quantité d'acétate de calcium suffisante pour parvenir à une concentration d'environ 1 à environ 100 mM, de préférence d'environ 10 mM, de ce sel. Puis la suspension d'amidon, contenant l'enzyme adsorbé, dans la solution tampon est chauffée à une température supérieure à la température de gélatinisation de l'amidon. Cette température varie quelque peu suivant l'amidon utilisé puisque chaque variété d'amidon possède une température caractéristique de gélatinisation. Si l'amidon utilisé pour l'adsorption est l'amidon de maïs, il est convenable de chauffer la suspension à une température d'environ 70 C à environ 80 C. La suspension est maintenue à cette température jusqu'à dissolution de la plus grande partie de l'amidon. Cela est habituellement effectué en un temps d'environ 15 à environ 30 minutes. Après l'étape de chauffage, la solution est séparée de toute substance solide insoluble, puis est concentrée pour donner un concentré enzymatique ayant la concentration désirée. Cette étape de séparation est effectuée par des moyens de séparation classiques, tels que la centrifugation ou la filtration. Dans la mise en oeuvre de cette étape, il est convenable d'ajouter à la solution un adjuvant de filtration, tel que la terre de diatomées. La concentra- tion de la solution clarifiée résultante est effectuée convenablement par des procédés de séparation sur membrane, tels que l'ultrafiltration. Le concentré enzymatique clarifié, décoloré, obtenu par le procédé de la présente invention contient l'hydrolysat d'amidon formé lorsque l'amidon est chauffé en présence de l'alpha-amylase. Cela constitue un autre avantage du procédé puisque l'hydrolysat contribue à la stabilité de l'enzyme. Le concentré enzymatique préparé par le procédé de la présente invention possède une absorbance à 450 nm inférieure à environ 4, de préférence inférieure à environ 35.2. La concentration en Cl- du concentré enzymatique est inférieure à environ 200 mM, de préférence inférieure à environ 100 mM. Les solutions d'alpha-amylase sont analysées par le mode opératoire suivant, qui définit l'unité enzymatique utilisée dans la présente invention. Analyse d'alpha-amylase L'activité enzymatique est déterminée par la mesure de la diminution de capacité de liaison de l'iode d'une solution d'amidon soluble. La solution à analyser est diluée avec une solution de chlorure de calcium 0,0025 M pour parvenir à une concentration finale d'environ 0,25 unité d'activité par ml. Un ml de solution enzymatique convenablement diluée est ajouté à 10 ml d'une solution à 0,5 % d'amidon soluble contenant un tampon à l'acide acétique 0,03 M (pH 6,0) et du chlorure de calcium 0,03 M. La réaction est conduite pendant 10 minutes à 60 C. Un ml de la solution réactionnelle est introduit dans une fiole graduée de 100 ml contenant 50 ml d'acide chlorhydrique 0,02 N et, après addition de 3 ml d'une solution d'iode à 0, 05 % à cette solution réactionnelle, le volume total est porté à 100 ml par addition d'eau. L'absorbance de la couleur bleue qui se développe est mesurée à 620 nm. La quantité d'enzyme requise pour la décomposition de 10 mg d'amidon en 1 minute à 60 C est définie comme étant égale à 1 unité. Activité enzymatique (unités/ml) = Do - Ds 50 (rmg d'amidon) x x (facteur de dilution) Do 10 (min) x 10 ( enzymatique diluée (en ml) correspondant à 1 ml d'échantil- lon. Les exemples suivants illustrent plus en détail la présente invention. Toutes les parties sont exprimées sur une base pondérale et tous les pourcentages sont exprimés en poids, sauf spécification contraire. EXEMPLE 1 Une alpha-amylase du commerce provenant de Bacillus stearothermophilus, GZYMETM, disponible auprès de Enzyme Bio-Systems Ltd., International Plaza, Englewood Cliffs, New Jersey, a été traitée par le mode opératoire suivant. Une solution de 500 g d'un enzyme liquide (3400 unités par gramme) dans 1000 g d'une solution d'acétate de calcium 10 mM a été refroidie à 0 C. Puis 500 g d'amidon de maïs granulaire (Code 3005, CPC Interna- tional Inc., International Plaza, Englewood Cliffs, New Jersey) ont été ajoutés sous agitation. Le mélange a été maintenu à 4 C pendant 30 minutes avant de recueillir par filtration l'amidon, contenant l'enzyme. La substance solide a été lavée avec 1000 g d'une solution d'acétate de calcium 10 mM. Le gâteau de filtre humide, d'un poids égal à 880 g, a été mis en suspension avec 620 ml d'une solution- d'acétate de calcium 10 mM. Puis le mélange a été chauffé à C et maintenu à cette température pendant 15 minutes.. L'amidon a été gélatinisé et la plus grande partie de l'amidon a été solubilisée par ce traitement. Puis la solution a été mélangée à de la terre de diatomées et a Èté filtrée. Le filtrat, en un volume de 1000 ml, a été concentré au moyen d'une cellule d'ultrafiltration Amicon de 2 litres munie d'une membrane YM10, à un volume final de 240 ml. Le concentré, qui était de couleur jaune pâle, contenait 1,44 x 106 unités d'alpha-amylase. Cela repré- sente une séparation de 85 % de l'enzyme. Ce concentré, qui contient l'hydrolysat d'amidon, présente une bonne stabilité et est compatible avec le propylèneglycol et des matières similaires utilisées dans des formulations de détergents. EXEMPLE 2 Le mode opératoire général de l'exemple 1 a été répété dans une installation pilote en utilisant 100 fois les quantités de matière utilisées dans l'exemple 1. Ce procédé à grande échelle a donné un concentré similaire à celui obtenu dans l'exemple 1, avec une bonne couleur et une bonne stabilité. EXEMPLE 3 Le mode opératoire de l'exemple 1 a été répété pour déterminer la couleur et la concentration en Cl- de la matière avant et après traitement de la solution enzymati- que par le procédé de la présente invention. La couleur a été mesurée par l'absorbance d'une solution à 450 nm. La concentration en Cl- a été mesurée, sous forme de NaCl, en utilisant une électrode spécifique des ions et un pH/iono- mètre Cole-Palmer. La solution enzymatique, avant traite- ment, contenait 4200 unités/ml et la solution enzymatique, après traitement, contenait 5400 unités/ml d'activité d'alpha-amylase. Les résultats présentés sur le tableau I montrent la réduction de couleur et de concentration en C1- obtenue par le procédé de la présente invention. TABLEAU I Absorbance Solution enzymatique à 450 nm Cl- (mM) Avant traitement 12,3 2150 Après traitement 1,9 25,8 Ainsi, il se révèle qu'il a été propose, conformément à la présente invention, un concentré enzymatique liquide stable, décoloré, et un procédé pour sa production qui répondent totalement aux objectifs, buts et avantages précités. Z640281 Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'un concentré enzymatique liquide stable contenant l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus, qui comprend les étapes consistant: a) à mélanger une solution aqueuse d'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus à de l'amidon granulaire pour adsorber l'alpha-amylase; b) à séparer l'amidon, contenant l'alpha-amylase adsorbée, de la solution aqueuse; c) à laver l'amidon contenant l'alphaamylase adsorbée; d) à former une suspension de l'amidon contenant l'alpha-amylase adsorbée dans une solution de tampon contenant des ions calcium; e) à chauffer la suspension de l'étape d) à une température supérieure à la température de gélatinisation de l'amidon pour former une solution de l'alpha-amylase et de l'hydrolysat d'amidon; f) à séparer la solution formée dans l'étape e) de toute substance solide insoluble; et g) a concentrer la solution obtenue dans l'étape f). 2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel l'amidon granulaire est l'amidon de maïs. 3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel de l'acétate de calcium est ajouté à la solution aqueuse de Bacillus stearothermophilus avant son traitement avec de l'amidon granulaire pour adsorber l'alpha-amylase. 4. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel toutes les solutions contenant Bacillus stearother- mophilus sont maintenues dans une plage de pH d'environ 5,5 à environ 7,0. 5. Procédé suivant la revendication 2, dans lequel l'étape e) est mise en oeuvre à une température d'environ 70 C à environ 80 C pendant un temps d'au moins environ 15 minutes. 6. Concentré enzymatique liquide stable contenant l'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus, préparé par les étapes consistant: a) à mélanger une solution aqueuse d'alpha-amylase de Bacillus stearothermophilus à de l'amidon granulaire pour adsorber l'alpha-amylase; b) à séparer l'amidon, contenant l'alpha-amylase adsorbée, de la solution aqueuse; c) à laver l'amidon contenant l'alpha-amylase adsorbée; d) à former une suspension de l'amidon contenant l'alpha-amylase adsorbée dans une solution de tampon contenant des ions calcium; e) à chauffer la suspension de l'étape d) à une température supérieure à la température de gélatinisation de l'amidon pour former une solution de l'alpha-amylase et de-l'hydrolysat d'amidon; f) à séparer la solution formée dans l'étape e) de toute substance solide insoluble; et g) à concentrer la solution obtenue dans l'étape f). 7. Concentré enzymatique liquide stable suivant la revendication 6, dans lequel l'amidon granulaire est l'amidon de maïs. 8. Concentré enzymatique liquide stable suivant la revendication 6, dans lequel de l'acétate de calcium est ajouté à la solution aqueuse de Bacillus stearothermophilus avant son traitement avec de l'amidon granulaire pour adsorber l'alpha-amylase. 9. Concentré enzymatique liquide stable suivant la revendication 6, dans lequel toutes les solutions contenant Bacillus stearothermophilus sont maintenues dans la plage de pH d'environ 5,5 à environ 7,0. 10. Concentré enzymatique liquide stable suivant la revendication 7, dans lequel l'étape e) est mise en oeuvre à une température d'environ 70 C à environ 80 C pendant un temps d'au moins environ 15 minutes. 11. Concentré enzymatique liquide stable suivant la revendication 6, dans lequel l'absorbance à 450 nm est inférieure à environ 4 et la concentration en C1- est inférieure à environ 200 mM. 12. Concentré enzymatique liquide stable suivant la revendication 11, dans lequel l'absorbance à 450 nm est inférieure à environ 2 et la concentration en Cl- est inférieure à environ 100 mM.