Brevet FR2640141A1 — publié le 19900615

Conjugués macromoléculaires d'hémoglobine, leur procédé de préparation et leurs applications. L'invention concerne de nouveaux conjugués macromoléculaires, leur procédé de préparation et leurs applications comme transporteurs d'oxygène, notamment dans le cadre des transfusions. On sait qu'il est possible d'injecter par voie intraveineuse une solution aqueuse d'hémoglobine exempte de stroma et rendue isotonique du sang. Cependant, l'hémoglobine native présente deux inconvénients'majeurs, à savoir qu'elle ne reste pas dans le circuit sanguin mais qu'elle diffuse à l'extérieur du systeme 'vasculaire, en raison notamment de sa dissociation en moléculoede petite taille, et que son affinité pour l'oxygène, en l'absence du diphospho-2,3-glycérate intraérythrocytaire, est trop élevée, d'où une libération insuffisante de l'oxygène lié. Afin de remédier au problème de la diffusion de l'hémoglobine, on a déjà fixé l'hémoglobine à des macromolécules hydrosolubles dépourvues de toxicité, non antigéniques et hémocompatibles. La fixation de polymères hydrosolubles variés (polysaccharides, polyoxyalkylènes, polyvinylpyrrolidone, ...) sur l'hémoglobine a souvent été proposée (FR-A-2 328 478 ; DE A-2 616 086 , FR-A-2 460 674) mais, si cet artifice conduit bien à augmenter le temps de résidence de l'hémoglobine dans l'organisme, en revanche, l'affinité pour l'oxygène de l'hémoglobine modifiée est encore supérieure à celle de l'hémoglobine libre. Ainsi, le FR-A-2 328 478 décrit une composition utilisable comme substitut du sang ou diluant du sang chez les humains ou les animaux, qui comprend une suspension ou solution aqueuse d'une substance macromoléculaire soluble dans l'eau, capable de transporter de l'oxygène, la substance étant le produit macromoléculaire du couplage covalent de l'hémoglobine avec un polysaccharide ayant un poids moléculaire compris environ entre 5 000 et 2 000 000, le polysaccharide étant un dextrane ou de lthydroxyéthylamidon. Cependant, r ce couplage, qui se produit sur de l'hémoglobifte naturellement oxygénée, conduit à une composition dont l'affinité pour l'oxygène est plus de deux fois supérieure à celle de l'hémoglobine libre. Pour améliorer ce dernier paramètre, il a donc été généralement proposé de fixer d'abord sur l'hémoglobine, une petite molécule à caractère effecteur, c'est-à-dire susceptible de moduler les propriétés oxyphoriques de l'hémoglobine (pyridoxal-5'-phosphate, glyoxylate, dérivé de l'inositol hexaphosphate), ceci ayant pour but de préparer une hémoglobine à faible affinité pour l'oxygène, puis de fixer sur ce dérivé d'hémoglobine un polymère du même type que ceux mentionnés ci-dessus (EP-A-O 043 675 ; EP-A-O 067 029 ; EP-A-O 140 640). Dans le FR-A-2 600 894, il a été proposé un procédé qui consiste à préparer des polymères capables de jouer le râle d'effecteurs vis-à-vis de lthémoglobine r donc d'abaisser son affinité pour l'oxygène, puis de les fixer sur la forme désoxy de l'hémoglobine. Les conjugués résultants possèdent une affinité pour l'oxygène plus ou moins abaissée selon la nature des polymères et les conditions de réaction avec l'hémoglobine. Ces polymères effecteurs sont obtenus par fixation, sur des polymères hydrosolubles classiques, de groupements polyanioniques renfermant des carboxylates et/ou des phosphates et/ou des sulfates. Pour certains des polymères fonctionnalisés, il a même été observé que la fixation sur l'oxyhémoglobine permettait, de manière surprenante, d'obtenir des conjugués à faible affinité pour l'oxygène. Cependant, ce procédé est assez complexe puisqu'il nécessite de faire la synthèse de polymères polyfonctionnels sophistiqués. L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients en proposant de nouveaux conjugués macromoléculaires d'hémoglobine, dont la taille soit telle qu'ils persistent pendant le temps durant lequel le conjugué doit assurer des fonctions oxyphoriques dans le plasma et dont l'affinité pour l'oxygène soit inférieure à celle de l'hémoglobine libre et soit dans des limites appropriées à l'usage prévu, afin que lesdits conjugués puissent passer de façon appropriée de la forme désoxygénée à la forme oxygénée, et vice versa, dans l'organisme Un autre objectif de l'invention est de fournir un conjugué physiologiquement compatible, facile à synthétiser et peu onéreux. Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé de préparation simple et facile à mettre en oeuvre. Un autre objectif encore de l'invention est de fournir des solutions aqueuses des conjugués selon l'invention susceptibles d'être utilisées comme substitut du sang, notamment dans les interventions nécessitant des transfusions ou la perfusion d'organes. La présente invention a pour objet un conjugué macromoléculaire hydrosoluble d'hémoglobine, provenant du couplage covalent d'hémoglobine et de polysaccharides oxydés de façon à présenter des fonctions aldéhydes, caractérisé en ce que le conjugué est obtenu par réaction en milieu sans oxygène sur la desoxyhémoglobine. De préférence, on oxyde le polysaccharide par un agent oxydant attaquant les fonctions diols des maillons glycosylés pour former des paires d'aldéhydes. La fixation covalente de ces polysaccharides dialdéhydes sur la désoxyhémoglobine se fait sur les fonctions amines et donne naissance à des liaisons imines, qui peuvent alors etre avantageusement réduites en liaisons amines par un réducteur doux. On pense que les aldéhydes du polysaccharide oxydé viennent ' notamment réagir sur les amines du site allostérique de la désoxyhémoglobine et qu'il se produit une réticulation à l'intérieur de ce site, ce qui a pour effet de stabiliser la forme désoxygénée de l'hémoglobine et ainsi d'abaisser l'affinité de la protéine pour l'oxygène. De préférence, les polysaccharides selon l'invention ont un poids moléculaire compris entre environ 1.000 et environ 500.000. Des valeurs supérieures peuvent conduire à des chocs anaphylactiques. Des valeurs inférieures peuvent être insuffisantes pour assurer la persistance intravasculaire. Les polysaccharides préférés sont le dextrane de masse moléculaire comprise entre 1.000 et 500.000, l'hydroxyéthylamidon de masse moléculaire également comprise entre 1.000 et 500.000 et l'inuline. Le conjugué présente de préférence un rapport massique polysaccharide/hêmoglobine compris entre environ 0,5 et 1, de préférence de l'ordre de 1, le polysaccharide comprenant, de préférence, environ 5 à 15 % de motifs oxydés, par exemple environ 10 %. Par motif oxydé, on entend les motifs glucose ouverts et portant chacun une paire d'aldéhydes. Il a été observé, par exemple, qu'en fixant sur la désoxyhémoglobine du dextrane de poids moléculaire égal à 10 000 environ, possédant 6,6 w de motifs glucose ouverts et donc portant chacun une paire d'aldéhydes, on obtenait une hémoglobine modifiée dont la masse moléculaire moyenne est supérieure à celle de l'hémoglobine native et dont la P50 (c'est-à-dire la pression partielle en oxygène pour laquelle 50%- de l'hémoglobine est sous forme oxygénée) est de 1204 Pa (P50 de l'hémoglobine native dans les mêmes conditions : environ 500 Pa). La même réaction effectuée sur l'oxyhémoglobine et à l'airr toutes choses égales par ailleurs, conduit à un conjugué dont la P50 est de 439 Pa. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des conjugués selon l'invention. Le procédé selon l'invention consiste, en ambiance sans oxygène, à fixer sur la désoxyhémoglobine des polysaccharides oxydés. Tput au long des réactions, on opère en ambiance sans oxygène, par exemple sous gaz inerte, tel que l'azote, et avec des solutions et réactifs désoxygénés. De préférence, après fixation, on ajoute un réducteur o doux du type NaBH4 ou NaCNBH3. L'oxydation des polysaccharides est de préférence menée avec de l'acide periodique ou du periodate, notamment du periodate de sodium. Ce réactif attaque les fonctions diols des maillons glycosylés du polysaccharide et conduit à la formation de paires d'aldhéhydes selon La fixation de ces polysaccharides dialdéhydes sur la désoxyhémoglobine se fait sur les fonctions amines de.la protéine et donne naissance à des liaisons imines. L'emploi du réducteur doux permet de réduire les liaisons imines en liaisons amines. De préférence, on fixe les polysaccharides oxydés sur la désoxyhémoglobine selon un rapport massique polysaccharide/hémoglobine compris entre environ 0,5 et 1, de préférence de l'ordre de 1, les polysaccharides comprenant environ 5 à 15 % de motifs oxydés. De préférence, on élimine ensuite la proportion de polysaccharide n'ayant pas réagi. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'un exemple de réalisation non limitatif appliqué à un conjugué dextrane-hémoglobine. 1*/ Synthèse de dextrane dialdéhyde a) Synthèse de dextrane dialdéhyde de poids moléculaire (PM) égal à 10.000 et ayant 8,3 % de motifs oxydés. Une solution aqueuse de dextrane à 5 % est additionnée de NaI04 dans un rapport molaire NaI04/motifs glucose égal à 0,115. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 5 heures. Une solution de métabisulfite de sodium à 5 % est alors ajoutée au milieu jusqu'a sa décoloration complète. Le mélange est ensuite dialysé contre de I'edll,, Jl..is 'yopl1ilisé et gardé à froid, au sec et à l'abri de la lumière. b) Synthèse de dextrane dialdéhyde de PM = 10.000 et ayant 6,6 % de motifs oxydés. On opère de la même manière que précédemment avec un rapport molaire NaI04/motifs glucose égal à 0,082. c) Synthèse de dextrane dialdéhyde de PM = 10.000 et ayant 14,3 % de motifs oxydés. On opère de la même manière que précédemment avec un rapport molaire NaI04/motifs glucose égal à 0,198. 2*/ Préparation de conjugués -de dextrane dialdéhyde et d'oxyhémoglobine. On dissout 2 g de dextrane dialdéhyde à 6,6 % ou 8,3 % de motifs oxydés, dans 15 ml d'eau distillée. On ajoute alors 20 ml de solution d'hémoglobine å 10 % sous agitation lente à 25-C. Le pH est ajusté à 8 par NaOH 0 3*/ Préparation de conjugués de dextrane dialdéhyde et de désoxyhémoglobine. a) Préparation de désoxyhémoglobine. On place l'hémoglobine dans une boite à gants et l'on alterne successivement des mises sous vide et sous atmosphère d'azote. On contrôle le taux de désoxygénation par spectrophotométrie. On préfère avoir moins de 10 % d'oxyhémoglobine. b) Couplage dextrane-désoxyhémoglobine. On dissout 2 g (ou 1,2 g) de dextrane dialdéhyde déoxygéné, à 6,6 %, 8,3 % ou 14,3 % de motifs oxydés, dans 15 ml d'eau distillée désoxygénée. Sous azote, on ajoute alors 20 ml de solution de désoxyhémoglobine à 10 % sous agitation lente à 25*c. Toutes les opérations suivantes sont alors réalisées comme au 2-/ ci-dessus, mis à part le fait que toutes les étapes sont effectuées en absence d'oxygène avec des réactifs désoxygénés. A la fin des réactions, le mélange est dialysé à l'air contre de l'eau. 4-/ Résultats. On réalise une filtration sur gel haute performance sur une colonne TSK G3000 SW. Les chromatogrammes obtenus apparaissent sur les figures 1 et 2 qui représentent la variation de la densité optique (D.O.) en fonction du volume d'élution (Ve). La P50 des conjugués figure dans le tableau I suivant: Forme de R (a) Rapport massique F50 du Référence I'hemoglobine a dextranevhémoglobine conjugue du produit Fa (b) (c) Oxy 6,6 1 439 i 8,3 1 372 2 Désoxy 6,6 i 1204 3 8,3 1 1543 4 14,3 0,6 1769 5 14,3 i 2035 6 Tableau I : caractéristiques des conjugués de dextrane dialdéhyde et d'hémoglobine a) ez de motifs du dextrane portant des paires d'aldéhydes b) déterminée en tampon Tris 0,05M; pH 7,2; 25*C. c) la référence renvoie à la courbe correspondante sur la figure 1 ou 2. La P de l'hémoglobine native dans les mêmes conditions est d'environ 500 Pa. L'affinité pour l'oxygène du conjugué selon l'invention (références 3, 4, 5, 6) est donc inférieure à celle de l'hémoglobine native et à celle d'un conjugué dextrane/hémoglobine (références 1 et 2) réalisé en atmosphere oxygénée. Le conjugué selon l'invention (dextrane/désoxyhémoglobine) présente les caractéristiques appropriées à son utilisation comme transporteur d'oxygène Pour des dextranes de différents. poids moléculaires ou pour d'autres polysaccharides selon l'invention, par exemple l'hydroxyéthylamidon et l'inuline, on préfere conserver approximativement les mêmes proportions en poids que celles utilisées ci-dessus. REVENDICATIONS 1. Conjugué macromoléculaire hydrosoluble d'hémoglobine, provenant du couplage covalent d'hémoglobine et de polysaccharides oxydés de façon à présenter des fonctions aldéhydes, caractérisé en ce que le conjugué est obtenu par réaction en milieu sans oxygène sur la désoxyhémoglobine. 2. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que les polysaccharides sont oxydés par un agent oxydant attaquant les fonctions diols des maillons glycosylés. 3. Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent oxydant est l'acide periodique ou du periodate. 4. Conjugué selon l'une des revendications 1 à 3 r caractérisé en ce que les polysaccharides sont fixés de façon covalente sur les fonctions amines de la désoxyhémoglobine, formant des liaisons imines. 5. Conjugué selon la revendication 4, caractérisé en ce que les liaisons imines ont été réduites en liaisons amines par un réducteur doux. 6. Conjugué selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les polysaccharides ont un poids moléculaire compris entre environ 1 000 et environ 500 000. 7. Conjugué selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide est un dextrane, un hydroxyéthylamidon ou de l'inuline. 8. Conjugué selon la revendication 7, caractérisé en ce que le conjugué présente un rapport massique polysaccharide/hémoglobine compris entre environ 0,5 et 1, de préférence de l'ordre de 1, le polysaccharide comprenant environ 5 à 15 % de motifs oxydés, par exemple environ 10 %. 9. Procédé de préparation d'un conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que, en ambiance sans oxygène, on fixe des polysaccharides oxydés sur la désoxyhémoglobine. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que, après la fixation, on ajoute un réducteur doux du type NaBH4 ou NaCNBH3. 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que l'on effectue l'oxydation des polysac .charides avec de l'acide periodique ou du periodate. 12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11 r caractérisé en ce que l'on fixe les polysaccharides oxydés sur la désoxyhémoglobine selon un rapport massique polysaccharide/hêmoglobine compris entre environ 0,5 et 1, de préférence de l'ordre de 1, les polysaccharides comprenant environ 5 à 15 % de motifs oxydés, par exemple 10%. 13. Procédé selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que l'on élimine ensuite la proportion de polysaccharide n'ayant pas réagi.