Brevet FR2637897A1 — publié le 19900420

La présente invention concerne un procédé pour le dosage immunologique de l'AZT (3'-azido-3'- désoxythymidine>, également connue sous le nom de zidovudine, dans des fluides biologiques tels que sérum, sperme, plasma et urine, ainsi que dans d'autres fluides corporels.L'invention comprend également (1) divers analogues nouveaux de l'AZT utilisables pour préparer des immunogènes pour des anticorps à l'AZT et pour préparer de l'AZT marqué, (2) des immunogènes pour des anticorps à 1'AZT, (3) des anticorps monoclonaux et polyclonaux à 1'AZT, des analogues de l'AZT marqués et (5) des nécessaires d'essais de diagnostic pour le dosage immunologique. Les dosages immunologiques par liaison compétitive pour mesurer quantitativement des composés physiologiquement actifs (ligands) sont basés sur la compétition entre un ligand d'un échantillon d'essai et un réactif marqué, designé sous le nom de traceur, pour un nombre limité de sites de liaison présents sur les anticorps ou de récepteurs spécifiques au ligand et au traceur.La concentration du ligand dans un échantillon à doser détermine la quantité de traceur ou de marquage qui se liera spécifiquement à un anticorps. La mesure de la quantité de complexe traceur-anticorps. permet une détermination quantitative de la quantité de ligand dans l'échantillon d'essai. Si nécessaire, une modification de ce ligand pour préparer un immunogène doit prendre en compte l'effet sur la spécificité structurale de l'anticorps. C'est-à-dire que dans le choix d'un site sur un ligand pour la conjugaison à un support tel qu'une protéine, le site sélectionné est choisi de telle sorte que l'administration de l'immunogène en résultant fournira des anticorps qui reconnaîtront le ligand initial. En outre, non seulement l'anticorps doit reconnaître le ligand initial, mais des caractéristiques importantes de la partie ligand de l'immunogène doivent subsister de telle sorte que l'anticorps produit après administration de l'immunogène aura plus de chance de distinguer des composés étroitement apparentés au ligand qui peuvent également être présents dans l'échantillon du malade. En conséquence, les anticorps doivent avoir des constantes de liaisons élevées. De même,le traceur doit entrer efficacement en compétition avec le ligand pour la liaison à l'anticorps d'une manière reproductible et donner lieu à des modifications significatives du signal mesuré avec de faible modifications de la concentration du ligand sur l'intervalle de concentrations intéressant. D'autres considérations pour une méthode de dosage immunologique sont qu'elle ne soit pas affectée par des matières présentes dans l'échantillon à doser, qu'un signal aisément déterminable soit obtenu, que le traceur, les étalons et les anticorps aient une bonne durée de conservation et soient stables dans les conditions du dosage. De même, le traceur et les étalons doivent aisément être reconnaissables par les anticorps pour le ligand. L'AZT (3'-azido-3'-désoxythymidine) qui peut être représentée par la formule: do vo b' J'C s'est révélée être un médicament efficace dans le traitement du Syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). Comme avec tout médicament, et en particulier ceux ayant des effets secondaires graves à des doses élevées tels que 1'AZT, l'établissement formel d'un intervalle thérapeutique pour un malade traité avec le médicament est nécessaire. La méthode admise pour mesurer les taux plasmatiques d'AZT utilise la chromatographie liquide à hautes performances (HPLC) qui est une technique sensible et raisonnablement précise. Cependant, bien que 1'HPLC puisse être utilisée pour mesurer des concentrations en AZT dans des échantillons non infectieux, et dans des échantillons HIV- positifs, la méthode d'HPLC n'est pas pratiquable pour le contrôle de routine de l'AZT dans des échantillons HIV- positifs en raisons des inconvénients de la longue durée d'analyse, et de la préparation minutieuse des échantillons qu'elle exige, comprenant une extraction en phase solide compliquée, une taille d'échantillon relativement importante (500 il) et une interférence des constituants des fluides corporels de l'échantillon. Un problème particulier de l'utilisation de la HPLC pour contrôler des taux d'AZT chez des malades pédiatriques est la difficulté d'obtenir des échantillons d'un volume suffisant. En outre, la HPLC est particulièrement sujette à des interférences de composés endogènes chez des malades souffrant d'une insuffisance rénale. La mise au point d'une méthode analytique pour mesurer des taux d'AZT chez un malade traité par l'AZT qui pourrait réduire au minimum la manipulation des échantillons, utiliser autant que possible un équipement jetable, réduire la taille d'échantillon nécessaire et raccourcir la durée du dosage est donc nécessaire. On préfère qu'une telle méthode ne soit pas sujette à des interférences provenant de composés endogènes (par exemple chez des malades souffrant de maladies rénales) ou d'une hémolyse ou de médicaments typiquement prescrits. Les dosages immunologiques fournissent une méthode utile pour la détermination quantitative de taux de médicaments dans de petits échantillons (1-250 Ri1), ils ont un délai d'exécution rapide, ils sont aisés à effectuer et peuvent être automatisés pour le traitement de grand nombres d'échantillons. Les dosages immunologiques conviennent donc pour mesurer des taux de médicaments chez des malades et sont particulièrement utiles lorsque la manipulation des échantillons doit être réduite au minimum. Un des buts de l'invention est donc de fournir un dosage pour la détermination de taux d'AZT (3'-azido-3'- désoxythymidine) dans un échantillon qui satisfasse aux besoins décrits ci-dessus, en particulier dans l'établissement d'un intervalle thérapeutique défini sur un malade subissant un traitement par 1'AZT. Plus précisément, un des buts de l'invention est de fournir un dosage immunologique pour déterminer la présence ou la quantité d'un ligand, à savoir 1'AZT, dans un échantillon. Le dosage immunologique comprend le mélange à cet échantillon d'un analogue marqué de l'AZT (traceur) ou d'un de ses sels biologiquement acceptables, et d'un anticorps capable de reconnaître spécifiquement ce ligand et ce traceur, puis la détermination de la quantité du traceur liée à l'anticorps par une technique appropriée. Un autre but est de fournir un dosage par liaison compétitive présentant de nombreux avantages par rapport au dosage par HPLC,y compris l'exigence d'une taille d'échantillon plus faible permettant son utilisation avec des malades pédiatriques, un temps de dosage réduit, des techniques d'extraction simples et l'absence d'interférences de constituants du sérum ou de réactivité croisée avec d'autres médicaments ou métabolites de médicaments. Il est admis que des dosages immunologiques non compétitifs sont possibles et il est envisagé que les anticorps de l'AZT entrant dans le domaine de l'invention soient utiles pour la détermination de la concentration en AZT en utilisant ces dosages immunologiques. En outre, l'application de ces anticorps de l'AZT à ces dosages immunologiques est de la compétence des techniciens. Un autre but est de fournir diverses matières nouvelles utilisables pour effectuer le procédé de l'invention ou pour la préparation de ces matières, comprenant (1) des analogues de l'AZT qui conviennent pour préparer des immunogènes pour 1'AZT par couplage à un support, tel qu'une protéine, ou qui conviennent pour préparer des dérivés marqués de l'AZT (traceurs) par couplage à des parties d'indicateur, telles que la fluorescéine; (2) des immunogènes convenant pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux à 1'AZT, (3) des anticorps obtenus par immunisation d'espèces animales appropriées avec ces immunogènes; et (4) des dérivés marqués de l'AZT convenant pour l'utilisation dans le procédé de l'invention. En outre, un des buts de l'invention est de fournir un nécessaire diagnostique utilisable dans la pratique des dosages immunologiques de l'invention. Il est également envisagé que des composés semblables par leur structure à l'AZT soient mis au point pour le traitement du SIDA, et un autre but de l'invention est par conséquent de fournir un dosage pour ces composés apparentés à l'AZT dans la mesure o ces composés sont reconnus par des anticorps à l'AZT. Ces buts ainsi que d'autres apparaîtront à la lecture de la description détaillée de l'invention. Pour toute méthode de dosage immunologique, il existe trois ingrédients essentiels: un traceur, un anticorps et l'échantillon à analyser. Evidemment, des étalons contenant des quantités connues de ligand sont également nécessaires pour fournir une base pour la détermination du taux de ligand dans l'échantillon à analyser. Des témoins peuvent aussi être utilisés pour vérifier l'exactitude de l'analyse. Dosaage immunoloaique de l'AZT Conformément au procédé de l'invention, un échantillon contenant ou soupçonné de contenir de l'AZT est mélangé avec un traceur ou un de ses sels biologiquement acceptables et un anticorps spécifique de l'AZT et du traceur. L'AZT présent dans l'échantillon et le traceur entrent en compétition pour un nombre limité de sites de liaison de l'anticorps, ce qui conduit à la formation de complexes AZT-anticorps et traceur-anticorps. En maintenant la concentration du traceur et de l'anticorps constantes, la quantité du complexe traceur-anticorps formée est inversement proportionnelle à la quantité d'AZT présente (sous forme de complexe AZT-anticorps) dans l'échantillon. En déterminant la quantité de complexe traceur-anticorps dans le mélange réactionnel, on effectue une détermination quantitative de la-quantité d'AZT dans l'échantillon. La concentration de l'AZT dans l'échantillon dosé variera en fonction de l'établissement d'une posologie thérapeutique basée par exemple sur le fluide corporel mesuré et la dose administrée. La sensibilité du dosage peut être optimisée en conséquence. Des concentrations élevées d'AZT peuvent être dosées par dilution de l'échantillon initial. En plus de l'intervalle de concentrations de l'AZT, des considérations telles que le caractère qualitatif, semi-quantitatif ou quantitatif du dosage, l'appareillage utilisé et les caractéristiques du traceur et de l'anticorps détermineront normalement la concentration du traceur et de l'anticorps à utiliser. Bien que la concentration de l'AZT dans l'échantillon détermine normalement l'intervalle de concentrations du traceur et de l'anticorps, pour optimiser la sensibilité du dosage, les concentrations individuelles du traceur et de l'anticorps- seront déterminées empiriquement. Ces dernières concentrations peuvent aisément être établies par les spécialistes. D'autres considérations intervenant dans l'optimisation d'un dosage immunologique particulier comprennent le pH et la température du dosage. Le pH auquel la méthode de la présente invention est mise en pratique doit être réglé- dans les dosages dans lesquels le pH est important, par exemple les dosages utilisant un dérivé de la fluorescéine. Divers tampons peuvent être utilisés pour obtenir et maintenir le pH désiré au cours des opérations de dosage. Des tampons représentatifs comprennent le borate, le phosphate, le carbonate, le tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris), le barbital etc. Le tampon particulier choisi n'est pas déterminant pour la présente invention, mais dans un dosage individuel, un tampon particulier peut être préféré compte- tenu de la méthode choisie et des constituants utilisés. La partie cation du tampon déterminera généralement la partie cation du sel de traceur dans la solution. Les méthodes de la présente invention sont pratiquées à des températures modérées, et de préférence à une température constante, La température ira normalement d'environ 0 C à environ 50 C, plus généralement d'environ 15 C à environ 400 C. L'invention n'est pas limitée à un mode opératoire particulier d'essai, et par conséquent, elle est destinée à comprendre à la fois des modes opératoires homogènes et hétérogènes parmi lesquels des modes opératoires tels que le dosage immunologique par polarisation de la fluorescence (FPIA), -le dosage immunologique par flu6rescence (FIA), le dosage immunologique enzymatique (EIA), le dosage immunologique par inhibition néphélométrique (NIA), et le dosage radio- immunologique (RIA). La partie indicateur est choisie de façon à satisfaire aux besoins de divers utilisateurs de la méthode, lesquels sont souvent dictés par la disponibilité de l'appareillage de dosage et par des modes opératoires de dosage immunologique compatibles. Les dosages immunologiques homogènes sont des dosages qui n'exigent pas la séparation du traceur lié à l'anticorps du traceur libre. L'interaction antigène- anticorps provoque, directement ou indirectement, une modification mesurable du signal. Les dosages homogènes préférés sont ceux utilisant une enzyme ou un réactif fluorescent, car ils sont non-isotopiques, ce qui pose moins de problèmes d'élimination des déchets.Les dosages immunologiques enzymatiques sont également préférés, car ils sont très sensibles et sont donc capables de mesurer une concentration en AZT plus faible. Ces deux types de dosage sont également précis et aisément automatisés, les dosages sont simples, la taille d'échantillon par dosage est relativement faible, et les résultats de dosage se comparent favorablement aux résultats obtenus par un dosage par HPLC. Un dosage immunologique homogène préféré est un dosage immunologique par polarisation de la fluorescence (FPIA). Par exemple, on peut utiliser comme traceur un AZT marqué par la fluorescéine.En résumé, un AZT marqué par la fluorescéine et un AZT non marqué présents dans l'échantillon à analyser entrent en compétition pour un nombre limité de sites de combinaisons de l'anticorps. Des quantités accrues d'AZT non marquée présentes dans un échantillon donné conduisent à une diminution correspondante de la quantité d'AZT marqué par la fluorescéine liée à l'anticorps et provoque une diminution de la polarisation de l'échantillon. Le degré de polarisation est donc inversement proportionnel à la concentration en AZT dans l'échantillon. Voir par exemple Dandliker, W.B. et de Saussure V.A.Immunochemistry, 7, 799 (1970). Un réactif précipitant les protéines peut être nécessaire dans les dosages immunologiques par fluorescence, y compris les dosages immunologiques par polarisation de la fluorescence. Le réactif précipitant est utilisé pour gagner de la sensibilité en réduisant la fluorescence de fond non spécifique et la dispersion de la lumière due aux diverses matières présentes telles que les protéines sériques et les complexes bilirubine-albumine. La présente invention comprend l'addition à l'échantillon à analyser d'un réactif précipitant tel que l'acide trichloracétique, avec ou sans méthanol; l'acide sulfosalicylique avec du méthanol, ou du dioxane ou du N,N- diméthylacétamide; l'acide polyvinylsulfonique avec ou sans méthanol, ainsi qu'avec de l'acide sulfurique ou de l'acide phosphorique, et l'acide chromotropique avec du méthanol. Après précipitation d'une partie des composés interférants et leur séparation, le pH de l'extrait de sérum (liquide surnageant) doit être ajusté en utilisant un tampon ayant une capacité tampon suffisante pour permettre à l'interaction ligand-anticorps de se produire dans des conditions favorables. Des exemples de ces tampons sont: la glycine; le phosphate; le borate; le carbonate; le tampon Tris; l'éthanolamine; la triéthanolamine, la diéthanolamine; la pipérazine; la tricine; et l'ammoniaque. Dans la présente invention, le tampon préféré est une solution à base de Tris. Le dosage immunologique fluorescent marqué par un substrat est un autre dosage immunologique homogène dans lequel une enzyme telle que la Zgalactosidase hydrolyse un conjugué non fluorescent de 1'AZT, tel que l'AZT- ombelliférone-B-galactoside, en donnant naissance à un produit fluorescent qui peut être mesuré dans un spectrofluoromètre. Comme l'anticorps à l'AZT se liera au conjugué de l'AZT non fluorescent et interférera avec la conversion du conjugué en le produit fluorescent, l'addition d'AZT donne lieu à une compétition pour les sites de combinaison de l'anticorps de l'AZT.Par conséquent, la concentration du produit fluorescent est proportionnelle à la concentration de 1'AZT. Les dosages immunologiques par réduction de la fluorescence et par augmentation de la fluorescence sont d'autres dosages fluorescents homogènes basés sur cette observation que certains anticorps, lors de leur liaison à une molécule fluorescente, provoquent soit une augmentation, soit une diminution de la fluorescence. Par exemple, l'AZT peut être conjuguée à une molécule fluorescente qui, lors de la liaison A des anticorps de l'AZT sélectionnés, réduira la fluorescence du conjugué de l'AZT fluorescent. L'AZT entrera en compétition avec le conjugué de l'AZT fluorescent pour un nombre limité de sites de combinaison de l'anticorps de 1'AZT, et réduira la quantité de réduction. Par conséquent, l'intensité de la fluorescence du dosage est proportionnelle à la concentration de 1'AZT. Un dosage immunologique homogène utilisant la diminution de la phosphorescence de l'érythrosine peut être effectué d'une manière similaire à celle utilisée dans la réduction de la fluorescence. Les dosages immunologiques enzymatiques (EIA) sont une large classe de dosages immunologiques basés sur la détermination de l'activité d'une enzyme comme mesure de l'interaction antigène-anticorps. Les dosages immunologiques enzymatiques homogènes sont des dosages qui n'exigent pas la séparation du traceur lié du traceur libre, mais sont basés sur la modulation de l'activité de l'enzyme par l'interaction spécifique de l'antigène avec l'anticorps, Par exemple, l'AZT peut être conjugué au voisinage du site actif d'une enzyme telle que la glucose- 6-phosphate déshydrogénase. Lors de l'addition d'anticorps à l'AZT, l'activité ultérieure de l'enzyme est réduite par l'interférence stérique de l'anticorps avec le substrat de l'enzyme. L'addition d'AZT entre en compétition avec le conjugué AZT-enzyme pur un nombre limité de sites de combinaison de l'anticorps, empêchant ainsi l'interférence d'anticorps à l'AZT avec l'activité enzymatique. L'activité de l'enzyme est directement proportionnelle à l'AZT présente dans l'échantillon. L'EIA d'un antigène marqué par un cofacteur est encore un autre type de dosage immunologique enzymatique homogène qui peut être effectué en conjuguant l'AZT à un cofacteur. Un tel cofacteur est le nicotinamide-6-(2-amino- éthylamino) adénine dinucléotide (aeaNAD+). L'addition d'anticorps à l'AZT lie le conjugué AZT-aeaNAD+ et inhibe l'activité d'une enzyme dépendant de la NAD telle que la lactate déshydrogénase. L'AZT entrera en compétition avec l'AZT-aeaNAD+ pour un nombre limité de sites de combinaison de l'anticorps de l'AZT. Il en résulte que la modification de l'absorbance du mélange réactionnel sera proportionnelle à la concentration de l'AZT. Un autre type de dosage immunologique homogène est le dosage immunologique par agglutination (AIA). Par exemple, des particules de latex peuvent être revêtues d'un conjugué de l'AZT multivalent (préparé en conjuguant des analogues de l'AZT à un support) et s'agglutineront (se prendront en masse) par addition d'anticorps à l'AZT. L'addition d'AZT provoquera une compétition pour le nombre limité de sites de combinaison de l'anticorps et entraînera une diminution de la turbidité du mélange. Les érythrocytes Il ont également été utilisés comme particules d'indicateur à la place des particules de latex. Le dosage immunologique par inhibition néphélométrique (NIA> est un autre type de dosage immunologique homogène qui utilise un conjugué de l'AZT multivalent. En général, ce conjugué est préparé à partir d'un support de masse moléculaire élevée tel que l'apoferritine de cheval ou des protéines sériques. Par addition d'anticorps à l'AZT, le conjugué de l'AZT multivalent forme des complexes avec l'anticorps à 1i'AZT, augmentant ainsi la quantité de diffusion de la lumière dans le mélange réactionnel. L'addition d'AZT diminue la taille des complexes formés par les conjugués multivalents de l'AZT et les anticorps à l'AZT en entrant en compétition avec le conjugué de l'AZT multivalent pour un nombre limité de sites de combinaison de l'anticorps. Le dosage immunologique par particules de sol (SPIA) utilise comme traceur des particules colloïdales minérales. Alors que le SPIA peut être effectué comme un dosage immunologique hétérogène, il peut également être structuré comme un dosage immunologique homogène. Par exemple, dans un SPIA par l'or, les anticorps à l'AZT peuvent être adsorbés sur des particules d'or. L'addition de conjugués de l'AZT multivalents provoque l'agglutination des complexes or-anticorps à i'AZT, entrainant une modification du spectre d'absorption des particules d'or, c'est-à-dire que la couleur passe du rouge au bleu.L'AZT entrera en compétition avec les conjugués multivalents de l'AZT, réduisant la modification de la couleur. Les dosages immunologiques hétérogènes sont des dosages qui exigent la séparation d'un traceur lié d'un traceur libre avant la détermination de la quantité de ligand présente dans l'échantillon. Bien que l'on préfère les dosages immunologiques homogènes, car ils n'exigent pas le stade de séparation supplémentaire des dosages immunologiques hétérogènes, parmi les dosages immunologiques hétérogènes, on préfère ceux utilisant un groupe radioactif ou un groupe d'enzymes comme groupe indicateur. Ceci provient de ce que, comme les EIA,. les dosages immunologiques hétérogènes radioactifs ou enzymatiques sont précis, aisément automatisés, ils utilisent une faible taille d'échantillon et peuvent être plus sensibles que les FPIA. Les dosages radio-immunologiques (RIA) sont des dosages immunologiques hétérogènes utilisant des ligands radiomarqués. Par exemple, l'AZT peut être marqué directement avec du 3H ou un analogue de l'AZT peut être marquée avec du 125I. L'AZT marquée entre en compétition avec i'AZT non marquée pour un nombre limité de sites de combinaison de l'anticorps. Après avoir séparé le complexe lié d'AZT marquée-anticorps à l'AZT, de l'AZT non marqué (libre), on détermine la radioactivité dans la fraction liée, ou la fraction libre, ou les deux, dans un compteur de rayonnement approprié. La concentration de l'AZT marquée liée est inversement proportionnelle à la concentration de l'AZT non marquée. L'anticorps à l'AZT peut être en solution, la séparation de l'AZT libre et liée étant accomplie au moyen de charbon ou d'un second anticorps spécifique de l'espèce animale dont l'immunoglobine contient l'anticorps à l'AZT. On peut aussi fixer l'anticorps à l'AZT sur la surface d'une matière insoluble. Dans ce cas,la séparation de l'AZT liée et libre est effectuée par un lavage approprié. Les dosages immunoradiométriques (IRMA) sont généralement des dosages immunologiques hétérogènes dans lesquels le réactif anticorps est radiomarqué (le traceur).Un IRMA exige la préparation d'un conjugué d'AZT multivalent, par exemple par conjugaison à une protéine telle que l'albumine de sérum de lapin. Le conjugué d'AZT multivalent doit avoir au moins deux radicaux AZT par molécule, et les radicaux AZT doivent être à une distance suffisante l'un de l'autre pour empêcher une interférence stérique de liaison par au moins deux anticorps à i'AZT. Par exemple, dans un IRMA, le conjugué d'AZT multivalent peut être fixé à une surface solide telle qu'une sphère de plastique. De l'AZT non marqué et un anticorps à l'AZT qui est radiomarqué sont introduits dans un tube à essai contenant la sphère revêtue du conjugué d'AZT multivalent. L'AZT entre en compétition avec le conjugué d'AZT multivalent pour les sites de liaison de l'anticorps de 1'AZT. Au bout d'un temps approprié, les réactifs non liés sont éliminés par lavage et la quantité de radioactivité sur la phase solide est déterminée. La radioactivité liée est inversement proportionnelle à la concentration de 1'AZT. On peut également utiliser pour revêtir la sphère de plastique un anticorps à 1'AZT. L'addition d'un conjugué d'AZT multivalent et d'AZT conduit à une compétition pour les sites de liaison présents sur la sphère d'anticorps en phase solide. Au bout d'un temps d'incubation approprié, on lave la sphère et on ajoute un excès d'anticorps à l'AZT radiomarqué. La sphère est à nouveau lavée au bout d'un temps d'incubation approprié, et la radioactivité liée à la sphère est déterminée. La quantité de radioactivité est inversement proportionnelle à la concentration de 1'AZT. Un autre dosage immunologique hétérogène préféré met en jeu l'utilisation de traceurs enzymatiques tels que la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline et la B-galactosidase. L'EIA hétérogène diffère de 1'EIA homogène en ce que la détermination de la quantité de ligand présente dans l'échantillon exige une séparation du traceur lié du traceur libre non nécessaire dans I'EIA homogène.Par exemple, la peroxydase de raifort marquée par l'AZT entre en compétition avec l'AZT non marquée pour un nombre limité de sites de combinaison d'anticorps présents sur des anticorps à l'AZT fixés sur une surface solide telle qu'une plaque de microtitrage. Les anticorps à l'AZT peuvent être fixés à la plaque de microtitrage aussitôt après fractionnement de l'anti-sérum contenant des anticorps à l'AZT avec du sulfate d'ammonium, ou indirectement en revêtant d'abord la plaque de microtitrage de conjugués de l'AZT multivalents (antigènes de revêtement) préparés par exemple en conjuguant l'AZT avec des protéines sériques telles que la sérumalbumine de lapin (RSA). Après séparation de 1'AZT marquée liée de 1'AZT marquée non liée, l'activité enzymatique de la fraction liée est déterminée spectrophotométriquement au bout d'un temps déterminé après l'addition de substrats. Les exemples ci-dessus de dosages immunologiques hétérogènes préférés décrivent l'utilisation de traceurs marqués par radioactivité et par des enzymes. On a décrit également des dosages autres que 1'EIA qui exploitent des systèmes de détection non isotopiques. Ces marques comprennent des matières fluorescentes telles que la fluorescéine, des dérivés 1-sulfonylés du 5- diméthylaminonaphtalène et la rhodamine; des matières phosphorescentes telles que l'érythrosine et l'europium; des matières luminescentes telles que le luminol et la luciférine; et des sols tels que l'or et des colorants organiques. Des variantes des principes de dosage décrits ci-dessus apparaîtront clairement aux spécialistes. Composés de l'AZT Conformément à l'invention, de nouveaux dérivés de 1'AZT ont été mis au point pour l'utilisation dans les dosages par liaison compétitive de l'invention ainsi que pour la préparation de ces dérivés qui peuvent être représentés par la formule générale: o dû! $,, 3 dans laquelle RI et R2 sont choisis parmi un atome d'hydrogène et R-A, pourvu que l'un des symboles R1 et R2 soit un atome d'hydrogène, R soit un groupe de liaison et A est L, X ou Y, o L est un groupe partant, X est une partie indicatrice et Y est un support. Groupes de liaison de 1'AZT Le groupe de liaison de l'AZT (espaceur) représenté par R peut être un groupe de 0 à 50 atomes autres que l'hydrogène, bien que des espaceurs encore plus grands puissent être utilisés efficacement pour préparer des dérivés de l'AZT en fixant un analogue de l'AZT à des groupes tels que des oligopeptides, des polyaminoacides, des polymères, des hydrates de carbone et/ou des groupes cycliques ainsi que par copolymérisation par le glutaraldéhyde d'analogues aminés de l'AZT avec des polyaminoacides. Les atomes comprenant R peuvent comprendre de O à 30 atomes de carbone et de 0 à 25 hétéroatomes choisis parmi l'oxygène, l'azote, le soufre et les halogènes. En général, les atomes de R sont présents dans des groupes fonctionnels tels que par exemple les groupes alkyle, carbonyle, nonoxocarbonyle, hydroxy, alcoxy,-amido, halo, thiocarbonyle, cyano, nitrilo, thio, imino, amino, carbalcoxy, mercuri, phtalimido, formyle, céto, succinimidoxy, thiocarbamyle,.azo, hydroxyphényle, et imidazolyle, ainsi que d'autres cycles carboxycliques et hétérocycliques saturés ou insaturés. R peut de préférence avoir O à 30 atomes autres que l'hydrogène, y compris 0 à 20 atomes de carbone, et O à O10 hétéroatomes. On préfère que R ait de 1 à 23 atomes autres que l'hydrogène, parmi lesquels 1 à 16 atomes de carbone et 0 à 7 hétéroatomes. Il est encore préférable que R soit un groupe succindioyle, aminoalkyle ou réponde à la formule -(rH2)n-CO- ou -(CH2)n- NH- ou -CO-(CH2)n-CO-, dans laquelle n est un nombre entier de 1 à 19, de préférence de 1 à 8. Des compositions de R encore préférées sont discutées ci-dessous à propos des divers groupes représentés par A. Pour plus de commodité, 16 2637897 la représentation AZT ainsi que d'autres désignations abrégées de divers substituants de l'AZT sont souvent utilisées ici pour nommer divers composés à la place de la nomenclature chimique communément acceptée. Par exemple,le 3'-azido-3'-désoxythymidyl-5'-hémisuccinate peut être désigné par AZT-5'-hémisuccinate ou simplement par AZT-5'- HS. Dans le cas de conjugués de l'AZT multivalents (antigène d'essai ou de revêtement) utilisés par exemple dans les EIA et les NIA ainsi que pour des immunogènes et des dérivés AZT-R-enzyme, on s'attendrait à ce qu'il soit un peu plus facile de les préparer en utilisant des groupes de liaison R ayant 1 à 35 atomes, comprenant 1 à 25 atomes de carbone et O à 10 hétéroatomes. Les modes de réalisation préférés pour R contiennent jusqu'à 7 atomes comprenant jusqu'à 6 atomes de carbone et jusqu'à 2 hétéroatomes. Des exemples de mode de réalisation préférés comprennent: (nombre d'atomes) Total Exemple NI. (Position de l'AZT)-R: (A) (Autres que H) Carbo HHtéroatomes 4 (AZT-3)-(CH2)4-CO:(SSA) 6 5 1 9 (AZT-3)-(CH2)4-CO:(RPO) 6 5 1 - 44 (AZT-5')-CO-(CH2)2-CO:(APO) 6 4 2 ru w -4 co 18 2637897 Dans le cas de dérivés fluorescents, il- faut tenir présent à l'esprit que tandis que, comme dans le cas des autres dérivés, il existe une limite théorique à la taille de R, lorsqu'on utilise un dérivé fluorescent dans un FPIA, ce dérivé fluorescent doit avoir une masse moléculaire inférieure à environ 60- OOO.Sinon, le traceur fluorescent libre est difficile à distinguer par FPIA du traceur fluorescent lié. On s'attendrait à une préparation plus aisée de dérivés fluorescents satisfaisants lorsque le groupe de liaison R a jusqu'à 48 atomes comprenant jusqu'à 24 atomes de carbone et jusqu'à 24 hétéroatomes. De bonnes performances ont été observées pour des dérivés fluorescents ayant des groupes R ayant jusqu'à 14 atomes comprenant jusqu'à 8 atomes de carbone et jusqu'à 6 hétéroatomes. Les modes de réalisation préférés des dérivés fluorescents ont jusqu'à 8 atomes comprenant jusqu'à 5 atomes de carbone et jusqu'à 3 hétéroatomes. Des exemples de ces dérivés préférés comprennent: R.(Nombre d'atomes) Total Exemple N (Position de l'AZT)- R:(A) (Autres que 11) Carbone Hétéroatomes 13 (AZT-3)-(CH2)3-CO-NH: (Isomère I de la fluorescéine) 6 4 2 (AZT-3)-(CH2)3-NH-CS-NH: (Fluorescéine) 7 4 3 Co w co no Il est également envisagé que le traceur puisse être radioactif. Dans ce cas, on s'attend à ce que le groupe de liaison R préféré puisse avoir jusqu'à 40 atomes, parmi lesquels il pourrait y avoir jusqu'à 30 atomes de carbone et jusqu'à 15 hétéroatomes. Avec des traceurs d'AZT radioactifs, il est à noter que lorsqu'on utilise 3H comme groupe indicateur,3H peut être substitué directement dans l'AZT ou n'importe quel analogue de l'AZT,et aussi être fixé à un autre composé qui est ensuite fixé à 1'AZT. La fixation de R à l'haptène (AZT) peut s'effectuer sur n'importe lequel des sites disponibles dans la molécule d'AZT. En général, les traceurs les plus satisfaisants sont obtenus lorsque R est fixé à la même position de la molécule d'haptène que celle à laquelle le groupe de liaison était fixé lorsqu'on préparait l'immunogène. De plus, le groupe de liaison R peut être le même pour le traceur et l'immunogène (groupes de liaison homologues). Par exemple, les traceurs pour les RIA sont fréquemment préparés à partir du même analogue hapténique que celui utilisé pour préparer l'immunogène. Par conséquent, R sera le même dans les deux cas. Il existe cependant des cas o il sera nécessaire d'avoir dans le traceur un groupe de liaison différent de celui qui était utilisé dans l'immunogène (groupes de liaison hétérologues) pour obtenir un dosage acceptable. Une des raisons en est que lorsque le groupe de liaison est identique à la fois dans le traceur et dans l'immunogène (groupes de liaison homologues), les anticorps obtenus tendent à présenter une affinité significativement plus grande pour le traceur que pour l'haptène naturel ou non transformé en dérivé (c'est- à-dire l'analyte), réduisant ainsi la capacité de l'analyte d'entrer efficacement en compétition avec le traceur dans un dosage, ce qui conduit à une perte de sensibilité du dosage. La nécessité de groupes de liaison hétérologues est particulièrement prononcée pour des traceurs destinés aux FPIA, car de faibles variations de R ont un effet important sur les propriétés de liaison traceur-anticorps dans un FPIA. Le choix d'un groupe de liaison hétérologue est un problème complexe mettant en jeu de nombreuses considérations, parmi lesquelles: 1. le groupe fonctionnel de l'haptène (AZT) ou du groupe partant (L) ou de la partie indicateur (X) ou du support (Y), à modifier; (2) la composition du groupe de liaison dans l'immunogène; (3) le procédé de fixation du groupe de liaison (R) à l'AZT et soit à L, soit à X, soit à Y, qui peut nécessiter la modification de l'AZT et/ou de L ou de X ou de Y avant la liaison, de telle sorte que le R du produit final peut être constitué en tout ou partie de ces modifications; (4) la composition du groupe de liaison considérée, y compris sa longueur, sa nature (aliphatique, carbocyclique, aromatique, hétérocyclique), ses hétéroatomes et les autres groupes fonctionnels présents; (5) la disponibilité des matières de départ; (6) les moyens d'isolement, de purification et de caractérisation de l'analogue hapténique ou du dérivé; (7) le mode opératoire de dosage; et (8) la quantité et les propriétés de liaison de l'anticorps disponible. Par conséquent, il est souvent avantageux de préparer un certain nombre de traceurs possibles ayant des groupes de liaison de compositions différentes (voir article 4 ci-dessus) et de choisir celui donnant la courbe d'étalonnage la meilleure pour une méthode et un anticorps donnés. Groupe partant Un groupe partant est corstitué d'un ou de plusieurs atomes qui sont abandonnés par un composé au cours de la réaction de ce composé avec un autre produit chimique. Dans le cas de la présente invention, un groupe partant est abandonné dans la synthèse d'analogues (à partir d'autres analogues ou d'AZT) et de dérivés tels que les immunogènes et les traceurs. Le groupe partant L peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy, un atome d'halogène, un groupe sulfonyloxy ou un groupe contenant 1 à 8 atomes de carbone choisi à titre non limitatif parmi les parties alkyle, alcoxy, acyle, carbobenzoxy ou succinimidoxy. Il peut comprendre également, par exemple un groupe phtalimido qui se décompose lorsqu'il part comme le montrent les schémas réactionnels suivants: O o ( NH2)2 AT-H PAZT-_CH2±NH O O 4 H o NaOH - AZT--+CH2 -NH2 ûO - o Immunoaènes de I'AZT Une exigence fondamentale commune à toutes les méthodes de dosage immunologiques est un anticorps contre le ligand ou un analogue du ligand étroitement apparenté. Comme l'AZT (haptène) est un ligand qui a peu de chance d'être immunogène en soi, il est transformé en un analogue comme il a été décrit ci-dessus, puis conjugué à un support qui est immunogène chez les animaux. Le support sera de préférence un support du type protéine, tel que les albumines, les protéines sériques, par exemples les globulines et les lipoprotéines. Des exemples de protéines comprennent la sérumalbumine de bovins, l'hémocyanine de patelle en trou de serrure, l'ovalbumine et les gamma- globulines de bovins. Des polyaminoacides synthétiques peuvent également être utilisés pourvu qu'ils aient un nombre suffisant de groupes appropriés. Ces conjugués peuvent être préparés par des déshydratations réalisées par l'intermédiaire de carbodiimides, ainsi que par de nombreux autres procédés de conjugaison. Cependant, il est préférable, lorsque cela est possible, de préparer ces conjugués par acylation d'amines avec des esters actifs, car un taux d'incorporation plus élevé de l'analogue de l'AZT au support a des chances de conduire à une meilleure réaction immunologique à l'immunogène. Des analogues ou des dérivés de l'AZT peuvent se préparer dans l'une quelconque des diverses positions de l'AZT, à savoir les positions 3, 5 ou 5'. Bien que la substitution de l'AZT soit accomplie plus aisément à la position 5', des analogues ou dérivés préparés dans la position 3 de l'AZT sont préférés, car les immunogènes préparés à partir d'analogues de l'AZT à la position 3 ont plus de chances que les immunogènes préparés à partir d'analogues de l'AZT à la position 5' de produire des anticorps ayant une réactivité croisée moins importante vis-à-vis du AZT-5'- glucuronide, qui est le métabolite principal de l'AZT, et que l'on suppose être pharmacologiquement inactif. Les analogues contenant une fonction carboxyle (désignés parfois ci-après sous le nom d'analogues d'acides carboxyliques) sont préférés aux analogues contenant une fonction amino (désignée parfois ci-après sous le nom d'analogues amino) dans la préparation d'immunogènes, car les analogues carboxylés peuvent être transformés en esters actifs qui peuvent réagir avec les groupes amino libres présents dans la protéine, en supposant qu'une protéine est utilisée comme support. Les haptènes d'AZT carboxylé pourraient être couplés directement à des protéines en utilisant les procédés au carbodiimide (CDI). Dans le cas des analogues de l'AZT à fonction acide carboxylique,le CDI activera les groupes carboxyle à la fois sur l'analogue de l'heptène et sur la protéine qui entrera en compétition pour la liaison aux groupes amino libres de la protéine. De même, dans le cas d'analogues de l'AZT à fonction amino, le CDI activera le groupe carboxyle de la protéine, conduisant à une compétition entre les groupes amino libres de l'haptène et les groupes amino libres de la protéine pour se lier aux groupes carboxyle activés de la protéine. Dans les deux cas, l'utilisation de CDI conduit typiquement à un taux d'incorporation plus faible de l'haptène au support que lorsqu'on utilise un analogue d'ester actif d'acide carboxylique, et l'activation des groupes carboxyle sur la protéine par le CDI conduit à une augmentation de la réticulation entre les protéines, et à un masquage concomitant des haptènes fixés dans les conjugués réticulés. Des immunogènes préférés sont préparés en couplant des protéines de support à des esters actifs de l'AZT formés en passant par des substituants carboxylés à la position 3 de l'AZT. Lors de la préparation d'un immunogène, la taille de l'haptène mise en jeu affecte en partie la longueur désirée de l'espaceur R reliant l'haptène et le support. Un haptène relativement grand tel que la digoxine, la longueur de l'espaceur n'est pas très importante, car les sites de liaison des anticorps produits ne sont capables de lier qu'une partie de l'haptène.Cependant, dans le cas d'un haptène relativement petit tel que l'AZT, les sites de liaison de l'anticorps seraient capables de se lier la plus grande partie de l'haptène. En conséquence, il est souhaitable que les cellules productrices d'anticorps (lymphocytes) soient mieux capables de "reconnaître" l'haptène sans interférence stérique du support. Une meilleure reconnaissance conduit généralement à la production d'anticorps ayant des réactivités croisées inférieures à des composés autres que l'haptène, et ayant des affinités plus élevées pour l'haptène, et par conséquent une plus grande sensibilité de dosage pour l'haptène. Il est donc envisagé d'utiliser des immunogènes ayant de préférence un espaceur ayant jusqu'à 7 atomes autres que l'atome d'hydrogène pour produire des anticorps à i'AZT. L'espaceur pour les immunogènes a de préférence une longueur de chaîne de quatre à cinq atomes, par exemple, AZT-3-V:BSA (Exemple 4) et AZT-5'-S:BSA (Exemples 39 et 40).I1 est en outre envisagé qu'avec une quantité d'optimisation plus élevée bien que restant raisonnable, des anticorps utilisables pourraient être produits à partir d'immunogènes ayant un espaceur de 1 à 23 atomes autres que l'hydrogène. Il doit être tenu présent à l'esprit que même des longueurs de chaîne de l'espaceur plus grandes pourraient être efficacement utilisées pour préparer des immunogènes en fixant l'AZT ou un analogue de l'AZT à des groupes de grande longueur tels que des oligopeptides ou des hétérocycliques. En général, le support utilisé pour former l'immunogène est un polyaminoacide qui peut être naturel ou synthétique et qui est habituellement un polypeptide ou une protéine immunogène. Le polyaminoacide peut comprendre des constituants en plus des aminoacides, et il aura habituellement une masse moléculaire comprise entre environ 000 et 5 000 000 de préférence entre environ 15 000 et 4 000 000, et mieux encore entre environ 30 000 et environ 3 000 000. Des hydrates de carbone, par exemple des polysaccharides, des liposomes etc. peuvent également être utilisés. Des protéines particulièrement utiles sont les albumines, les globulines, les enzymes, les hémocyanines, des protéines ayant des constituants non protéiniques importants, par exemple des glycoprotéines, etc. Des exemples préférés de protéines de support qui peuvent être utilisées pour préparer le conjugué (immunogène) sont la sérumalbumine de bovins (BSA), l'hémocyanine de patelle en trou de serrure (KLH) et l'hémocyanine de Limului polyphemus (LPH). Des albumines et globulines ayant des masses moléculaires comprises entre environ 30 000 et environ 200 000 sont particulièrement préférées. La préparation des immunogènes ou conjugués peut être effectuée par des procédés connus dans la technique. Voir par exemple Principles of Competitive Protein-Bindina Assays. 2ème Edition, Odell et coll., éditeurs, John Wiley and Sons, New York, 1983, Chapitre 4, Conjugation Techniques-Chemistry, et les références qui y sont discutées. Anticorps à l'AZT La préparation d'anticorps spécifiques utilisant les présents immunogènes peut être effectuée par des techniques connues des spécialistes. Habituellement, on injecte à un animal hôte tel qu'un lapin, une chèvre ou une souris, en un ou plusieurs sites, un immunogène normalement émulsionné avec un adjuvant. Des injections supplémentaires sont effectuées sur le même site ou sur des sites différents à des intervalles réguliers ou irréguliers. Comme il est connu, le système immunitaire d'un animal répondra à l'immunisation en produisant des anticorps qui réagiront avec un ou plusieurs épitopes du conjugué. Chaque clone de cellule plasmatique secrète un anticorps unique (idiotype). Les anticorps monoclonaux sont produits in vitro en séparant physiquement les clones de cellules plasmatiques individuelles qui ont été hybridées avec une lignée de cellules tumorales, permettant ainsi de produire des anticorps d'un idiotype choisi pendant une durée prolongée. Dans l'animal, des clones de cellules plasmatiques multiples sont généralement produits conduisant à un mélange hétérogène d'anticorps (c'est-à- dire à des anticorps polyclonaux) dans le sang. Lorsque le sang a été recueilli, il se coagule et le caillot peut être éliminé. Le liquide restant ou sérum restant qui contient les anticorps polyclonaux, peut alors être désigné sous le nom d'antisérum. Bien qu'elle ne soit généralement pas nécessaire, une purification de l'antisérum peut être entreprise lorsque l'on estime souhaitable d'éliminer une matière indésirable telle que des anticorps non spécifiques avant que l'antisérum ne soit considéré comme approprié à l'utilisation pour effectuer des essais. Il est à noter qu'alors que des anticorps monoclonaux provenant d'une lignée monoclonale particulière développée sont identiques et que les anticorps polyclonaux obtenus à partir d'un animal particulier ayant reçu l'injection sont similaires, il existe une variance dans les propriétés de liaison des anticorps entre des anticorps provenant de lignées monoclonales différentes et/ou d'animaux différents. ayant reçu l'injection. Une construction identique de la partie analogue de l'AZT du traceur et de l'immunogène peut conduire à un anticorps se liant au traceur d'une taille telle que l'AZT ne peut pas entrer efficacement en compétition avec le traceur pour la liaison avec l'anticorps. En conséquence, lorsqu'on évalue une population d'anticorps, on prépare un certain nombre de traceurs dans lesquels on fait varier la longueur et/ou la composition de l'espaceur liant la partie indicateur à l'AZT pour optimiser les propriétés de liaison des anticorps par rapport au traceur et à l'AZT. Traceurs de l'AZT La préparation des traceurs de l'invention à partir d'analogues de l'AZT met en jeu le couplage de l'analogue avec un indicateur ou un dérivé d'indicateur approprié. Le couplage peut être effectué par des moyens connus dans la technique. En outre, il ressort de la description ci-dessus du dosage de l'invention que la partie indicateur n'est pas déterminante pour l'invention et peut être choisie par les spécialistes sur la base des divers critères précédemment discutés. Les traceurs envisagés comprennent ceux obtenus en couplant un analogue de l'AZT à une partie fluorescente, radioactive, phosphorescente, chimioluminescente, bioluminescente, radicalaire ou similaire ainsi qu'à des polypeptides tels que des enzymes ou des protéines, à des polymères tels que des latex, à des polysaccharides tels que le polydextrane, à des récepteurs, à des cofacteurs et à des inhibiteurs d'enzymes. Pour préparer les traceurs de l'invention, on prépare d'abord un analogue de l'AZT de telle manière que l'analogue ait un ou plusieurs sites déterminants antigéniques capables de lier un récepteur (anticorps à l'AZT) au cours du dosage immunologique. Une caractéristique d'un tel analogue de l'AZT est par conséquent qu'il possède une similitude structurale suffisante avec l'AZT pour être reconnu par l'anticorps à l'AZT. L'analogue de l'AZT peut alors être utilisé pour préparer les traceurs de l'invention ainsi que pour préparer les immunogènes utilisés pour la production des anticorps de l'invention. En supposant que l'on utilise un analogue carboxylé pour préparer l'immunogène, un analogue amino serait alors un analogue préféré pour l'utilisation dans la préparation d'un traceur si un tel analogue peut être préparé avec un rendement raisonnable. En général, les analogues amino sont plus difficiles à préparer que les analogues carboxylés. Par exemple, dans le cas o AZR-3- valéryl:BSA est l'immunogène, un analogue amino de l'AZT en position 3 serait alors un analogue préféré pour l'utilisation dans la préparation des traceurs. La différence d'aspect entre le traceur et l'immunogène servirait à réduire au minimum la liaison d'anticorps sur la base de la similitude de l'espaceur, et conduirait ainsi à une mauvaise sensibilité du dosage,car les anticorps seront choisis sur la base de leur affinité avec l'AZT et non avec l'espaceur. En outre, ce choix nécessaire d'anticorps spécifiques de l'AZT peut conduire à une affinité des anticorps pour l'AZT par rapport au traceur plus proche de l'égalité, ce qui est généralement souhaitable dans un dosage immunologique par liaison compétitive. Les isothiocyanates, les chlorures d'acide et les esters actifs réagissent généralement spontanément avec les amines. En outre, les isothiocyanates de nombreux fluorochromes sont faciles à se procurer. Comme les dérivés de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) sont largement utilisés dans les techniques de dosage immunologique par fluorescence y compris le FPIA, un analogue amino de l'AZT en position 3 ayant réagi avec du FITC est un des moyens préférés pour préparer ces traceurs ainsi que pour fournir un traceur préféré. Le choix de l'isomère I ou de l'isomère Il du FITC ou d'un mélange de ceux-ci dépend des anticorps particuliers produits et des résultats empiriques obtenus avec ces anticorps. L'isomère I et l'isomère II du FITC se distinguent par le fait que le groupe isothiocyanate est fixé sur la fluorescéine à la position 5 ou 6, respectivement. Cette discussion s'applique également aux isomères I et II de la fluorescéinamine, de dérivés de la fluorescéinamine, et de l'érythrosine. La structure suivante montre l'emplacement des positions 5 et 6 de la fluorescéine. 2637897 Bien que la production d'un analogue amino de l'AZT en passant par un analogue phtalimido de 1'AZT soit difficile, l'analogue aminoalkylé de l'AZT obtenu est stable. Il est à noter aussi que l'aminopropyl-AZT est préparé avec de meilleurs rendements sans production de sous-produits immunologiquement inactifs, comme c'est le cas avec l'aminoéthyl-AZT. Cependant, il peut être souhaitable d'utiliser des dérivés du fluorochrome autres que les isothiocyanates. Alors que le FITC est un dérivé de la fluorescéine, d'autres dérivés de la fluorescéine ainsi que d'autres fluorochromes parmi lesquels les dérivés de la rhodamine et des dérivés 1-sulfonylés du 5- diméthylaminonaphtalène peuvent également être utilisés. Ces fluorochromes peuvent être des composés homogènes ou des mélanges isomères. De même, on peut les utiliser sous leur forme lactone ou sous forme de sels biologiquement acceptables. L'expression "sels biologiquement acceptables" désigne ici des sels tels que les sels de sodium, de potassium, et d'ammonium, etc. qui permettront aux traceurs de l'invention d'exister dans leur état ionisé lorsqu'on les utilise dans la méthode de la présente invention.En général, les traceurs existeront en solution sous forme de sels résultant du tampon, utilisé; par exemple, en présence d'un tampon phosphate de sodium, les traceurs existeront généralement dans leur état ionisé sous forme de sel de sodium. Des exemples de dérivés de la fluorescéine autres que le FITC qui sont préférés comprennent la fluorescéinethiocarbamyléthylènediamine (FTED) ou la fluores céinamine (FAM) ou 1 a dichlorotriazinylaminofluorescéine (DTAF) ou la méthoxychlorotriazinylaminofluorescéine (MTAF) ou l'aminométhylfluorescéine (AMF) ou la carboxyfluorescéine pour l'utilisation dans le FIA ou dans le FPIA. De même, il existe des techniques d'essai immuno:ogique exigeant des groupes indicateurs qui peuvent se préparer plus aisément par des réactions autres qu'en passant par des dérivés amino de l'AZT avec des isothiocyanates, des chlorures d'acide ou des esters actifs.Ces groupes indicateurs comprennent l'apoferritine ou le sérumalbumine de lapin (RSA) pour l'utilisation dans un EIA ou un NIA. Pour préparer des traceurs avec ces autres groupes de marquage, il est préférable d'utiliser des analogues de 1'AZT carboxylés en position 3. On préfère en outre préparer un ester actif à partir d'un analogue carboxylé de l'AZT pour une réaction ultérieure avec le groupe de marquage plutôt que d'activer le groupe carboxyle de l'analogue de l'AZT avec du CDI pour une réaction directe avec le groupe de marquage. Ceci provient de ce que, dans le cas de groupes de marquage autres que des protéines, les traceurs obtenus par des réactions passant par l'intermédiaire du CDI entre l'analogue de t'AZT et le groupe de marquage exigeraient davantage de purification et la perte concomitante de rendement.Dans le cas de protéines telles que l'apoferritine et la RSA, l'utilisation de CDI conduirait à davantage de réticulation entre les protéines et à un masquage correspondant de l'haptène fixé (AZT) dans le conjugué réticulé, de telle sorte que moins d'haptène serait disponible pour l'utilisation dans le dosage immunologique. Plus précisément, en ce qui concerne les dérivés du FTED, on peut utiliser un ester actif pour préparer par exemple l'AZT-3-A:FTED (Exemple 23), 1'AZT-3- B:FTED (Exemple 15) et l'AZT-3-V:FTED (Exemple 7). D'autre part, le groupe amino du FAM n'est pas suffisamment nucléophile pour permettre une réaction satisfaisante avec un ester actif d'un analogue carboxylé de l'AZT.C'est pourquoi on utilise le CDI pour servir d'intermédiaire dans la réaction du FAM avec un analogue carboxylé de l'AZT.. Il est à noter que les dérivés de la fluorescéine peuvent être radiomarqués pour donner des traceurs pour les RIA. Comme il a été précédemment discuté, en ce qui concerne les immunogènes, la préparation d'un antigène d'essai ou de revêtement, par exemple pour un NIA ou un EIA, est de préférence effectuée en faisant réagir l'ester actif d'un analogue carboxylé de l'AZT avec une protéine telle que l'apoferritine ritine ou la RSA. Par exemple, on prépare d'abord l'AZT-3-MV (Exemple 11) qui est ensuite soumise à une hydrolyse catalysée par les bases pour produire 1'AZT-3-VA (Exemple 2), après quoi on fait réagir 1'AZT-3-VA avec le N- hydroxysuccinimide (NOS) pour donner l'AZT-3-V:NOS (Exemple 3). L'AZT-3V:NOS es ensuite transformée en son dérivé de sérumalbumine de lapin (Exemple 8), qui est alors utilisé comme antigène de revêtement dans le dosage. Ce dérivé de la sérumalbumine de lapin peut aussi être utilisé comme antigène révélateur dans les dosages immunologiques par inhibition néphélométrique. Nécessaires d'essai En plus de ce qui précède, la présente invention envisage de fournir des nécessaires d'essai diagnostique convenant pour l'utilisation avec une préparation minimale de l'utilisateur en rapport avec les divers dosages décrits ci-dessus. Ces nécessaires peuvent être utilisés pour la détermination de la présence ou de l'absence de l'AZTdans un échantillon de fluide biologique ainsi que pour déterminer le taux d'AZT dans un échantillon contenant de l'AZT. Ces nécessaires seront généralement une série de réactifs optimisés comprenant la combinaison d'anticorps spécifiques de l'AZT et d'un traceur capable de réagir avec les anticorps pour produire une réaction anticorps-traceur détectable, gr&ce à quoi les anticorps peuvent être mélangés avec un échantillon de fluide biologique à essayer et avec le traceur, puis soumis à la technique appropriée pour indiquer la présence d'AZT et/ou le taux d'AZT dans l'échantillon. En outre, les nécessaires d'essai diagnostique de l'invention peuvent aussi contenir un agent précipitant, tel que décrit dans le présent mémoire, convenant pour réduire l'interférence de fond non spécifique, par exemple la fluorescence, due à la présence de diverses matières dans l'échantillon à analyser. Le nécessaire d'essai est également fourni avec un tampon approprié au dosage particulier auquel le nécessaire est destiné. Le nécessaire d'essai peut en outre être fourni avec des moyens pour séparer le complexe anticorps-traceur du traceur non lié ou libre dans le cas o la méthode de dosage du nécessaire est hétérogène, comme il est décrit dans le présent mémoire. Synthèse de composés de i'AZT Pour illustrer encore la discussion qui précède, des réactions représentatives qui peuvent être utilisées dans divers schémas réactionnels comprennent les suivantes: A. Acylation d'alcools avec des anhydrides dicarboxyliques cycliques. Par exemple, l'anhydride succinique réagit avec un alcool pour donner l'hémisuccinate correspondant. L'anhydride glutarique peut être utilisé à la place de l'anhydride succinique pour obtenir le dérivé glutaraldioylé. La réaction est de préférence effectuée dans un solvant organique aprotique. La pyridine et/ou la diméthylaminopyridine sont communément utilisées comme catalyseurs. B. Alkylation d'imides cycliques en utilisant un réactif halogéné, HalCH2-R, dans lequel Hal est habituellement le brome. C. Déshydratation par l'intermédiaire d'un carbodiimide.Les carbodiimides (CDI) agissent comme intermédiaires dans des réactions entre des acides carboxyliques et des amines, conduisant à la formation d'amides, y compris de peptides. Par exemple, des analogues carboxylés de l'AZT peuvent être condensés avec le groupe amino de divers isomères de la fluorescéinamine en présence de 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ou ses analogues de l'AZT peuvent être mis à réagir avec les groupes amino libres de protéines dans un environnement aqueux si l'on utilise un réactif soluble dans l'eau, tel que le chlorhydrate de l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)- carbodiimide (ECDI). Le DCC peut également être utilisé pour condenser des analogues carboxylés de l'AZT avec le N- hydroxysuccinimide en vue de préparer des esters actifs utilisables dans l'acylation d'amines. D. Acylation d'amines par des esters actifs. Des esters actifs obtenus à partir d'analogues carboxylés de l'AZT et de groupes partants tels que le N- hydroxysuccinimide, réagissent avec des amines aliphatiques telles qu'une protéine de support, conduisant à l'élimination du groupe partant et à la formation simultanée d'une liaison amide (peptide). E. Hydrolyse catalysée par une base d'esters alkyliques pour donner un acide carboxylique par acidification. F. Hydrazinolyse de phtalimides pour donner des analogues aminoalkylés de l'AZT. En faisant réagir un AZT phtalimidoalkyl-substitué (préparé par exemple par réaction de l'AZT avec un bromalkylphtalimide), avec l'hydrate d'hydrazine, on obtient des haptènes amino-terminaux tels que le 3-aminopropyl-AZT (Exemple 28). Ces analogues sont très utiles pour préparer divers autres dérivés de l'AZT, comme s'en rendront compte les spécialistes, en raison de la réactivité du groupe NH2.Par exemple, ces analogues réagiront avec les isothiocyanates, les esters actifs, les halogénures d'acides ou d'autres réactifs électrophiles. Ils peuvent aussi être mis à réagir avec des protéines en présence de carbodiimide et de divers autres réactifs. G. Addition d'amines à des isothiocyanates. Cette réaction générale est utile pour préparer des conjugués de la fluorescéine, de la rhodamine et similaires, car les isothiocyanates de ces fluorochromes existent dans le commerce. Ces réactifs de marquage peuvent * être des composés homogènes ou des mélanges isomères. H. Iodation de phénols. L'iode électrophile (I2) se fixe aux phénols en position 2, 4, ou 6 (par rapport au groupe hydroxyle phénolique), à moins que ces positions ne soient bloquées par d'autres substituants. Cette réaction est utile pur radio-ioder certains haptènes pour produire des dérivés radioactifs destinés à l'utilisation dans des dosages radioimmunologiques. L'iode peut être * *. 2637897 acheté à des sources commerciales sous forme de Na-(1251) ou de Na-(131I) non volatil qui est mélangé avec le phénol à radio-ioder. Un agent oxydant, par exemple la chloramine-T est alors utilisé pour transformer l'iodure en iode (I2) qui se fixe alors au cycle aromatique. Traditionnellement, des analogues de. l'ester méthylique de la tyrosine (TME) sont utilisés pour l'iodation. Bien que ces analogues puissent être préparés à partir de 1'AZT, ils ont une faible solubilité dans les solutions aqueuses rencontrées au cours des iodations. Il en résulte que le rendement en dérivés iodés solubles est faible.En conséquence, bien que le rendement soit suffisant pour préparer un dérivé AZT- R:TME iodé utilisable, on préfère ioder un analogue de l'AZT qui a une solubilité dans l'eau plus élevée, tel que l'analogue de la glycine-tyrosine ou un analogue p- hydroxyphényl-propionamidoalkylé. I. Substitution aromatique nucléophile. Les alkylamines déplacent l'halogénure de systèmes aromatiques ou hétérocycliques halogénés convenablement activés. Des schémas réactionnels représentatifs pour la préparation d'analogues, d'immunogènes et de traceurs de l'invention sont esquissés ci-dessous. Pour plus- de commodité, la représentation AZT est utilisée à la place de la nomenclature chimique communément utilisée. Un schéma réactionnel représentatif. pour l'introduction de substituants carboxy terminaux à la position 3 de l'AZT est le suivant: 1. L'AZT est mis à réagir avec le 5- 3Q bromovalérate de méthyle (Réaction B) pour donner l'ester méthylique de l'acide 5-(3'-azido-3'-désoxythymid- 3-yl)-valérique (AZT-3-MV) (Exemple 1). 2. Le produit du stade 1 est hydrolysé (Réaction E) pour donner l'acide 5(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-valérique (AZT-3- VA) (Exemple 2). 3. Le produit du stade 2 est mis à réagir avec le NOS (Réaction C) pour donner le N-[5-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-valéryloxy]- succinimide (AZT-3-V:NOS) (Exemple 3). 4. Le produit du stade 3 est mis à réagir avec le FTED (Réaction D) pour donner le réactif marqué 5-[[5- (3 '-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-valéramidol- éthylthiocarbamyll-fluorescéine (AZT-3-V:FTED) (Exemple 7). On peut aussi faire réagir le produit du stade 2 avec la fluorescéinamine (FAM) (Réaction C) pour donner le réactif 5-[5-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)- valéramido]-fluorescéine (AZT-3-V:FAM) (Exemple 6). Il est également envisagé de faire réagir le produit du stade 3 avec le TME (Réaction D) pour donner l'ester méthylique de l'acide 2-[5-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-valéramido]-3- (4-hydroxyphényl)-propionique (AZT-3-V:TME), lequel peut à son tour être mis à réagir avec du [125I] (Réaction H) pour donner le traceur, l'ester méthylique de l'acide 2-[5-(3'- azido-3'-désoxythymid-3-yl)-valéramido]-3-(4-hydroxy-3- [125I] iodophényl)-propionique, l'ester méthylique de l'acide 2-[5-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-valéramido]-3- (4-hydroxy-3,5-[125I) diiodophényl)-propionique ou un mélange des deux (AZT-3-V:TME-[125i1]n), o n est 1 ou 2. En outre, le produit du stade 3 peut être utilisé pour préparer n'importe quel nombre d'immunogènes en utilisant la réaction D, par exemple par réaction avec l'hémocyanine de patelle en trou de serrure (KLH) ou la sérumalbumine de bovins (BSA). En outre, le produit du stade 3 peut être mis à réagir avec l'enzyme, la peroxydase de raifort (HRPO) en utilisant la réaction D pour préparer un dérivé de l'AZT marqué par une enzyme qui peut être utilisé comme traceur dans un dosage immunologique d'enzyme. De même, le produit du stade 3 peut être mis à réagir avec de la sérumalbumine de lapin (RSA) en utilisant la réaction D pour donner un antigène d'essai pour la détection d'anticorps à l'AZT comme antigène de revêtement ou comme antigène de développement pour un NIA. De même, d'autres analogues en position 3, par exemple les analogues butyrylés ou acétylés, les immunogènes et les dérivés de l'AZT, peuvent se préparer par des schémas réactionnels similaires à ceux décrits ci- dessus pour les composés AZT-3-valérylés. Par exemple, le 4-bromobutyrate d'éthyle ou l'acide bromacétique peuvent être utilisés à la place du 5-bromovalérate de méthyle. Si l'on désire des analogues et des dérivés aminoalkylés, un schéma réactionnel approprié est le suivant: 1. L'AZT est mis à réagir avec le N-(2- brométhyl)-phtalimide (Réaction B) pour donner la 3-(2- phtalimidoéthyl)-3'-azido-3'-désoxythymidine (3-PHT-E-AZT) (Exemple 25). 2. Le produit du stade 1 est alors soumis à une hydrazinolyse (Réaction F) pour donner la 3-(2-aminoéthyl)- 3'-azido-3'-désoxythymidine (3-AE-AZT) (Exemple 27). 3. On peut aussi faire réagir le produit du stade 2 avec l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (Réaction G) pour donner la 5-[2-(3'-azido-3'-désoxythymid- 3-yl)-éthyl-thiocarbamyl]-fluorescéine (3-AE-AZT:FITC) (Exemple 29). De même, le produit du stade 2 peut être mis à réagir avec l'isothiocyanate d'érythrosine (EITC). Le produit du stade 2 peut aussi être mis & réagir avec l'ester N-hydroxysuccinimidique de l'acide 3- (p-hydroxyphényl)propionique (Réaction D) pour préparer la 3-[2-[3-(4-hydroxyphényl)-propionamido]-éthyl]-3'-azido-3'- désoxythymidine (3-AE-AZT:HPPA) (Exemple 33) que l'on peut envisager de transformer à son tour en le traceur radio- actif 3-[2-[3-(4-hydroxy-3-[125I] iodophényl)-propionamido]- éthyl]-3-azido-3'-désoxythymidine ou 3-[2-[3-(4-hydroxy- 3,5-[125I] diiodophényl)-propionamido]-éthyl]-3'-azido-3'- désoxythymidine ou un mélange des deux (3-AE-AZT:HPP- [125I]n), o n est 1 ou 2 par réaction avec le 125I. (Réaction H). Il est également envisagé d'ioder directement le produit du stade 2 par réaction avec l'ester actif iodé, le propionate de N-succinimidyl-3-(4-hydroxy-3- [125I]iodophényle ou le propionate de N-succinimidyl-3-(4- hydroxy-3,5-[125I] diiodiphényle) ou un mélange de ceux-ci en utilisant la réaction D pour donner les mêmes composés que ci-dessus. En plus de préparer des traceurs iodés à partir d'analogues de l'AZT ayant un groupe phénolique, on peut également préparer d'autres composés à partir du produit du stade 2, par exemple par réaction avec des imidazoles carboxylés en utilisant la réaction C. Pour préparer des analogues en position 5' et des dérivés, on peut utiliser les schémas réactionnels suivants. 1. L'AZT est acylé par l'anhydride succinique pour donner le 3'-azido-3'désoxythymidyl-5'-hémisuccinate (AZT-5'-HS) (Exemple 37). (Réaction A). 2. Le produit du stade 1 est mis à réagir avec le N-hydroxysuccinimide (NOS) pour donner le N-[(3'-azido- 3'-désoxythymid-5'-yl)-succinyloxy]-succinimide (AZT-5'- S:NOS) (Exemple 38). (Réaction C). 3. Le produit du stade 2 est mis à réagir avec l'ester méthylique de la tyrosine (TME) pour donner l'ester méthylique de l'acide 2-[(3 '-azido-3'-désoxythymid-5 '-yl)- succinamido]-3-(4-hydroxyphényl)-propionique (AZT-5'-S:TME) (Exemple 43). (Réaction D). 4. De même, le produit du stade 3 pourrait être mis à réagir avec le [125I] pour donner le réactif, l'ester méthylique de l'acide 2-[(3'-azido-3'-désoxythymid-5'-yl)- succinamido]-3-(4-hydroxy-4-[125I] iodophényl)-propionique ou l'ester méthylique de l'acide 2-[(3'-azido-3'- désoxythymid-5'-yl)-succinamido]-3-(4-hydroxy-3,5-[125I] diiodophényl)-propionique ou un mélange des deux (AZT-5'- S:TME-[[125I]n), dans lequel n est 1 ou 2 (Réaction H). On peut aussi faire réagir le produit du stade 1 en présence de carbodiimide avec la fluorescéinamine (FAM) (Réaction C) pour donner la 5-[(3'-azido-3'- désoxythymid-5'-yl)-succinamido]-fluorescéine (AZT-5'- S:FAM) (Exemple 41). Une autre possibilité est de faire réagir le produit du stade 2 avec la 5-[N'-(2-aminoéthyl)- thiouréido]fluorescéine (fluorescéinethiocarbamyléthylènediamine) (FTED) (Réaction D) pour donner le traceur 5-[2-(3'-azido-3'-désoxythymid- '-yl-succinamido)-éthylthiocarbamyl]-fluorescéine (AZT-5'- S:FTED) (Exemple 42). En outre, le produit du stade 2 peut être mis à réagir avec la sérumalbumine de bovins (Réaction D) pour donner un immunogène ou être mis à réagir avec un support autre que le sérumalbumine de bovins tel que la sérumalbumine de lapin ou l'apoferritine de rate de cheval (Réaction D) pour donner un antigène d'essai, lequel peut être utilisé à son tour pour détecter des haptènes ou des anticorps spécifiques d'haptènes. Par exemple, l'antigène d'essai peut être utilisé comme antigène de revêtement pour des dosages par immunosorbant lié à une enzyme (ELISA), ou comme antigène de développement pour les dosages immunologiques par inhibition néphélométrique (NIA). Les exemples non limitatifs suivants sont donnés pour démontrer encore aux spécialistes la préparation d'analogues de l'AZT, d'immunogènes, d'anticorps et d'analogues marqués particuliers, ainsi que des procédés pour déterminer la concentration de l'AZT dans le cadre de l'invention. Les quantités indiquées pour les systèmes de solvants utilisés dans les analyses chromatographiques sont des rapports volumiques. Les plaques de chromatographie sur couche mince ont été visualisées en utilisant un rayonnement UV court (254 nm), un rayonnement UV long (366 nm)r ou une lumière visible, selon les besoins, sauf indication contraire. EXEMPLE 1 Ester méthylique de l'acide 5-ó3'-azido-3'-désoxythymid-3- yll-valérique (AZT-3-MV): On agite pendant 1 heure à 70 C une solution de 640 mg d'AZT, 500 Jl de solution de méthylate de sodium (NaOMe 4,4 M dans MeOH) et 500 l de 5-bromovalérate de méthyle (MBV) dans I ml de N,N'diméthylpropylèneurée (DMPU). On ajoute un supplément de 200 1l de solution de NaOMe et de MBV et on agite le mélange pendant 1 heure supplémentaire à 70 C. - Puis, on ajoute 200 Ll supplémentaires de solution de NaOMe (soit un total de 900 il de NaOMe) et 200 jl supplémentaires de MBV (soit un total de 900 jl de MBV) et on poursuit le chauffage à 70 C pendant 1 heure supplémentaire (durée totale du chauffage: 3 heures). La chromatographie sur couche mince analytique (TLC) sur gel de silice F 250 de gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (95 + 5 + 0,5) montre qu'il ne reste pas d'AZT dans le mélange réactionnel. On dilue le mélange avec 20 ml d'eau froide, on l'acidifie avec du HOAc et on l'extrait dans l'EtOAc, on le concentre à faible volume sous pression réduite à 45 C et on le chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur gel de silice F de 2000 pm en utilisant le système de solvant CHC13/MeOH/HOAc (95 + 5 + 0,5). On élue la bande contenant le produit (Rf=0,4) avec du MeOH et on la concentre pour donner une huile à 45 C sous pression réduite. Le produit est homogène par chromatographie sur couche mince analytique. EXEMPLE 2 Acide 5-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-valérique (AZT-3- VA): On dissout environ 600 mg de l'ester AZT-3-MV (Exemple 1) dans 5 ml de MeOH,puis on ajoute 3 ml de NaOH lN. On agite le mélange à 60 C pendant 30 minutes, puis on l'acidifie par HOAc et on le dilue avec 25 ml d'une solution aqueuse saturée de NaCl. On extrait la suspension laiteuse avec du EtOAc (5 x 10 ml) que l'on concentre sous pression réduite à 45 C et que l'on chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 1000 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (92,5 + 7,5 + 0,5).On élue la bande principale (Rf = 0,4) avec du MeOH et on fait évaporer le solvant sous pression réduite à 45 C. La trituration du résidu avec du THF donne un solide jaune pâle que l'on conserve une nuit sous vide sur des pastilles de NaOH. Le produit est homogène par chromatographie sur couche mince. Son spectre IR montre un pic net à 2100 cm-1, indiquant la présence d'un groupe azido, et il présente aussi un pic large entre 3400 et 3200 cm-1, indiquant la présence d'un groupe carboxyle.Le spectre UV (220-320 nm) ressemble à celui de la 3-méthyl thymidine (préparée en faisant réagir la thymidine avec du diazométhane), qui a un maximum d'absorbance à 268 nm, avec une absorptivité molaire de 8630 et un minimum d'absorbance à 238 nm avec une absorptivité molaire de 2700. Sur la base de cette similitude, on calcule que le coefficient d'extinction pour le produit est E28o=6100. Tous les spectres UV ont été pris dans du NaPO4 O,1 M/NaC1 0,15 M/pH 7,4. EXEMPLE 32 N-[-(3'-azido-3'- Désoxythymid-3-yll-valéryloxyl- sugccinimide (AZT-3-V:NOSI: On refroidit une suspension de 200 mg d'AZ?-3- VA l'AZT-3-V:NOS serait d'environ 70 Imoles/ml. EXEMPLE 4 AZT-3-valéryl:BSA (AZT-3-V:BSA)1 On refroidit sur un bain de glace une solution de 100 mg de sérumalbumine de bovin (BSA) dans 25 ml d'eau désionisée et on ajoute environ 20 pimoles d'AZT-3-V:NOS (Exemple 3). On poursuit l'agitation sur le bain de glace tout en maintenant le pH entre 8,0 et 8,5 en ajoutant du K2C03 à 5 % jusqu'à ce qu'il soit stable (environ 2 heures). L'agitation pendant 30 minutes supplémentaires à la température ambiante donne une solution légèrement trouble que l'on clarifie par centrifugation et chromatographie sur Sephadex G-25 (lit de 2,5 x 50 cm), que l'on met en équilibre et que l'on élue avec du PBS (NaP04 0,01 M/NaCl 42 2637897 0,15 M/pH 7,4). On dilue le pic de la protéine (37 ml, 2,17 mg/ml par le biuret) avec du PBS jusqu'à un indice de biuret de 1 mg/ml et on le conserve à -20 C en parties aliquotes de 2 ml. Une partie aliquote du composé ci- dessus, rechromatographiée sur G-25, a une incorporation molaire de 29 moles d'haptène/66 000 g de protéine, qui ne change pas après un troisième passage à travers du G-25. Sephadex est une marque déposée de la société Pharmacie Fine Chemicals, Inc. EXEMPLE5 AZT-3-valéryl:hémocyanine de patelle en trou de serrure (AZT-3-V:KLH): On laisse reposer pendant une nuit de l'hémocyanine de patelle en trou de serrure (KLH),130 mg, dans 30 ml d'eau désionisée, en agitant de temps à autre, puis on la filtre sur de la laine de verre. On refroidit le filtrat qui contient environ 123 mg de protéine (biuret) sur un bain de glace et on le traite par environ 200 pmoles d'AZT-3-V:NOS (Exemple 3).On agite le mélange sur le bain de glace tout en ajoutant du K2C03 à 5 % pour maintenir le pH entre 8,0 et 8,5 jusqu'à ce qu'il soit stable (environ 2 heures). On ajoute 3 ml de NaHCO3 à 5 % et on ajuste le pH à 8, 4 avec du K2C0O3 à 5 %. On fait incuber la suspension pendant 24 heures à 4 C, puis on la dialyse pendant une nuit contre de l'eau désionisée courante froide.Une faible quantité de matière insoluble se dépose et est éliminée par décantation.Le liquide surnageant, trouble mais homogène est dilué à l'eau désionisée jusqu'à un indice de biuret de 1 mg/ml et il est stocké à -20 C en parties aliquotes de 2 ml. ^EXEMPLE fi -r5- (3 '-azido-3 '-désoxythymid-3-yl -valéramidol - fluorescéine(AZT-3V:FAM) On traite une solution de 10 mg d'AZT-3-VA (Exemple 2), 10 mg d'Isomère I de la fluorescéinamine (FAM) et 1,5 J1 de HCl concentré dans 2,5 ml d'acétone, par 50 gmoles de DCC et on l'agite pendant 30 minutes à la température ambiante. Sauf indication contraire, FAM désignera l'isomère I. Il est envisagé d'utiliser l'isomère I, l'isomère II ou un mélange d'isomères de la fluorescéinamine. On chromatographie une partie aliquote du mélange réactionnel par chromatographie sur couche mince sur gel de silice F de 250.m en utilisant le système de solvants CHCl3/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1). On gratte la bande principale (Rf=O,28), contenant le produit et du FAM, on l'élue avec du MeOH et on la rechromatographie sur une plaque à phase inversée en C18 contenant un indicateur fluorescent (RPF) de 250 Lm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (50 + 50 + 3). Le produit migre sous la forme d'une bande fluorescente (Rf = 0,37), tandis que l'AZT-3-VA et le FAM libre migrent à proximité du front du solvant. Le produit est immunologiquement actif par FPIA pour l'AZT, et ses caractéristiques de liaison ne se modifient pas par chromatographie répétée dans un système à phases inversées. EXEMPLE 7 - r 5-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yll-valéramidol- éthylthiocarbamyllfluorescéine (AZT-3-V:FTED) -: On refroidit sur un bain de glace une solution de 10 mg de fluorescéinethiocarbamyléthylènediamine (FTED) dans 1 ml de N,N-diméthylacétamide (DMA) et on la traite par environ 14.moles d'AZT-3-V:NOS (Exemple' 3). On agite la solution pendant 15 minutes au bain de glace, puis pendant 3 heures à la température ambiante. On dilue le mélange avec 10 ml d'eau désionisée et on l'acidifie par HCl pour précipiter le produit brut que l'on purifie partiellement par chromatographie sur couche mince préparative sur gel de silice F de 250 pm en utilisant le système de solvants CHCl3/MeOH/HOAc (80 + 20 + 1). On gratte la bande fluorescente migrant à un Rf = 0,6, on l'élue avec du MeOH et on la rechromatographie sur du RPF de 250 im en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (33 + 66 2). EXAZT-3-valEMPLEryl:RSA (AZT-3-V:SA AZT-3-valéryloRSA (AZT-3-V:RSA):- On traite une solution de 100 ml de sérumalbumine de lapin (RSA) et de 150 mg de NaHC03 dans 15 ml d'eau désionisée, par environ 35 lmoles d'AZT3-V:NOS (Exemple 3) après refroidissement sur un bain de glace. Or ajuste le pH à 8,5 avec du K2C03 à 5 % et on fait incuber le mélange pendant une nuit à 4 C. On filtre le mélange à travers une membrane de 1,2 pm et on le chromatographie sur Sephadex G-25 (lit de 2,5 x 50 cm) en éluant avec du NaP04 0,01 M/NaCl 0,15 M/pH 7,4/NaH3 0,1 %. Le pic de la protéine donne un indice de biuret de 2,53 mg/ml et A280 = 7,455. L'incorporation molaire (MI) calculée est de 27 moles d'haptène pour 66 000 g de protéine, en supposant Eooo=O, 61/mg/ml pour la RSA et E280 = 5800 pour l'haptène. On filtre l'antigène sur un filtre de 0,2 lm et on le conserve à 4 C. EXEMPLE 9 AZT-3-valéryl:peroxydase de Raifort (AZT-3-V:HRPO): On agite pendant 2 heures à la température ambiante une solution de 15 mg (40 Imoles) d'AZT3-VA (Exemple 2), 10 mg de NOS (87 gmoles) et 10 mg de DCC (50 -moles) dans 200 g1 de DMA sec. A ce moment, la chromatographie sur couche mince analytique en utilisant du gel de silice F de 250 gm et le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (95 + 5 + 0,5) montre une conversion d'environ 40 % en l'ester actif. On ajoute le mélange réactionnel à une solution de 13 mg de peroxydase de raifort dissoute dans 2 ml de borax 0,15 M-HCl, pH 8,5, qui est pré-refroidi sur un bain de glace. On agite le mélange pendant 30 minutes au bain de glace, puis on le filtre à travers une membrane de polytétrafluoréthylène (PTFE) de 0,45 gm pour éliminer la dicyclohexylurée. On chromatographie le filtrat limpide sur une colonne de 1 x cm de Sephadex R G-25, en éluant avec du PBS (NaP04 0,01 M/NaCl 0, 15 M/pH 7,4). On filtre le pi- de la protéine à travers une membrane de 0, 2 im et on conserve le filtrat limpide à -20 C. On trouve que la préparation a une activité de peroxydase dans une réaction colorée qualitative et qu'elle est un inhibiteur actif dans un FPIA 2637897 pour 1'AZT. Ultérieurement, on trouve qu'elle se comporte de manière satisfaisante comme traceur dans l'EIA..- - EXEMPLE 10 Ester éthylique de l'acide 4-(3'-azido-3'-désoxythymid-3- yl)-butyrique (AZT-3-EBI: On agite à 600C pendant une heure un mélange de 550 mg d'AZT, 500 i1 de 4-bromobutyrate d'éthyle, 500 l1 de solution de méthylate de sodium (NaOMe 4,4 M dans du MeOH) et 1 ml DMPU, puis on ajoute 200 I1 supplémentaires de 4- bromobutyrate d'éthyle et 200 Rl de solution de NaOMe et on chauffe une heure supplémentaire à 60 C.L'addition de 200 1 de base et de 200 p1 d'ester bromé supplémentaire,suivie d'un chauffage d'une heure supplémentaire à 60 C (soit un total de 3 heures) consomme ce qui reste de 1'AZT, comme le confirme la chromatographie sur couche mince. On dilue le mélange avec 15 ml d'eau désionisée, on l'acidifie à pH 3 avec du HCl 1 N et on l'extrait dans de l'acétate d'éthyle. On lave la couche organique avec une solution saturée de NaC1 et on la fait évaporer sous pression réduite à 45 C. Le produit est homogène par chromatographie sur couche mince (gel de silice F de 250 Lm, CHC13/MeOH (95 + 5) et son spectre UV ressemble à ceux de l'AZT-3-MV (Exemple 1), de l'AZT-3-VA (Exemple 2) et de la 3-méthylthymidine qui a été préparée par réaction de la thymidine avec le diazométhane. EXEMPLE 1. Acide 4-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-butyrique (AZT-3- BALL On ajbute 6 ml de NaOH 1N à 1,5 mmole d'AZT-3- EB (Exemple 10) dans 10 ml de MeOH. On agite la solution pendant 1 heure à 60 C, on l'acidifie à pH 3 avec du HC1 1N et on la dilue avec 40 ml d'une solution saturée de NaCl. On extrait le produit brut dans de l'acétate d'éthyle, on le concentre et on le chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur du gel de silice F de 2000 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + + 1). On gratte la bande contenant le produit purifié (Rf = 0,32), on l'élue avec du MeOH et on le concentre à l'état 46 2637897 d'une huile que l'on conserve sous vide sur des pastilles de NaOH. Le produit est homogène par chromatographie sur couche mince analytique sur gel de silice F de 250 lm en utilisant le même système de solvant que celui décrit ci- dessus, et son spectre UV ressemble à celui d'autres azidothymidines 3-alkylées. EXEMPLE12 N- r4-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl-butyryloxyl-succinimide (AZT-3-B:NOS): On agite pendant 1 heure à la température ambiante un mélange de 10 mg d'AZT-3-BA (Exemple 11), 5 mg de NOS et 10 mg de DCC dans 100 il de DMPU. EXEMPLE i3 - r4-(3 '-azido-3 '-désoxythymid-3-yl)-butyramidol - fluorescéine (AZT-3B:FAM Isomère I): On agite pendant 5 minutes à 0 C, puis pendant minutes à la température ambiante, une solution de 10 mg d'AZT-3-BA (Exemple 11), 10 mg de FAM Isomère I, 10 mg de DCC, 1,5 1 d'HCl concentré et 2,5 ml d'acétone. On chromatographie la solution par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 1000 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (85 + 15 + 1). On gratte la bande principale (Rf = 0,4) contenant le produit et le FAM et on l'élue avec du MeOH, puis on le rechromatographie sur RPF de 250 gm en utilisant un système de solvants MeOH/H20/HOAc (40 + 60 + 3>. Dans ce dernier système, le conjugué migre sous la forme d'une bande (Rf = 0,23), qui est bien séparée du FAM et d'un constituant immunologiquement inactif, migrant simultanément à Rf = 0,63. EXEMPLE14 6-r4-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-butyramidol- flugreâéÉine (AZT-3-B:FAM IsomèrC III; On agite 5 minutes à 0 C, puis 40 minutes à la température ambiante, une solution de 10 mg d'AZT-3-BA (Exemple 11), 10 mg de FAM Isomère II, 10 mg de DDC et 1,5 ml de HCl concentré dans 2,5 ml d'acétone, et on la chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 1000 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (85 + 15 + i). Le produit (Rf = 0,5) migre sous la forme d'une bande présentant une fluorescence verte juste au-dessus de la bande correspondant au FAM Isomère II (Rf = 0,43). Un témoin (AZT-3-B:FAM Isomère I; Exemple 13) a un Rf = 0,46 dans ce système. On élue le produit avec du méthanol et on le rechromatographie sur le RPF de 250 gm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (40 + 60 + 3). Dans ce dernier système, le conjugué migre sous la forme d'une bande (Rf = 0,4>. A titre de comparaison, le Rf de 1'AZT-3- B:FAM Isomère I est de 0,25. EXEMPLE 15 -rr4-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-vli-butyramidol- éthylthiocarbamyllfluorescéine (AZT-3-B:FTED): On agite 1 heure à la température ambiante un mélange de 10 mg d'AZT-3-BA (Exemple 11), 5 mg de NOS et 10 mg de DCC dans 100.1 de DMPU. On ajoute une solution de 10 mg de FTED dans 100 Rl de MeOH et 50 Il de NaHC03 à 5 % et on agite à la température ambiante pendant 1 heure, durant laquelle on ajoute du NaHCO3 à 5 % par parties aliquotes de 10.1 pour maintenir le pH au-dessus de 7,5. On dilue le mélange réactionnel avec 100 pl de MeOH et on le chromatographie par- portions par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 Im en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (85 + 15 + 1). On trouve que la bande fluorescente migrant à Rf = 0,41 contient la matière active. On rechromatographie le produit brut sur RPF de 250 pm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (33 + 66 + 3). On élue avec du MeOH la bande fluorescente principale migrant juste au-dessus de l'origine (Rf = 0,093). L'activité immunologique contre l'AZT est confirmée par une technique de polarisation de la fluorescence. EXEMPLE 16 Ester méthylique de l'acide 2-[4-(3'-azido-3'-désoxythymid- 3-yl -butyramidol-3- 4-hydroxyphényl)-propionique (AZT-3- B: TM:E) - On refroidit sur un bain glace-MeOH. une solution de 25 mg d'AZT-3-BA (Exemple 11) et de 15 mg de NOS dans 500 ml de THF, on ajoute 100 g1 de DCC 1 M (dans du THF) et on agite la solution sur le bain pendant 10 minutes, puis à la température ambiante pendant 3 heures. On ajoute une solution de 25 mg d'ester méthylique de la tyrosine (TME) dissous dans 500 p1 de THF plus 50 g1 de MeOH, et on agite le mélange pendant une nuit à la température ambiante. On centrifuge la suspension pour éliminer la dicyclohexylurée et on chromatographie le liquide surnageant par chromatographie sur couche mince préparative sur gel de silice F de 1000 lm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (85 + 15 + 1). La bande principale (Rf = 0,55), qui est constituée du produit et d'AZT-3-BA est éluée avec du MeOH et rechromatographiée sur RPF de 250 Jm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (33 + 66 + 3) dans lequel le produit (Rf = 0,32, donnant une réaction de Pauly positive et une réaction à la ninhydrine négative) est bien séparé de l'AZT-3-BA (Rf = 0, 55, réaction de Pauly négative, réaction à la ninhydrine négative). On élue le produit avec du MeOH. On trouve qu'il est immunologiquement actif dans un FPIA pour l'AZT. EXEMPLE 17 3-r2-r4-(fluorescéinvl-5)-6-méthoxy-s-triazin-2-yll- aminoéthyll-3'-azido-3'-désoxythymidine (3-AE-AZT:MTAF): On fait incuber pendant 2,5 heures à 56 C, puis pendant 24 heures à la température ambiante, une solution de 10 mg de MTAF (Exemple 31), 10 mg de 3-AE-AZT (Exemple 27) et 2,5 g1 de triéthylamine (Et3N) dans 250 g1 de THF/MeOH (1 + 4) et on la chromatographie sur gel de silice F de.250 Lm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1), puis on la rechromatographie sur RPF de 250 gm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (50 + 50 + 3). Le produit est immunologiquement actif dans un FPIA pour l'AZT et il est homogène dans les trois systèmes de chromatographie sur couche mince suivants: gel de 49 2637897 silice F de 250 im en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1) (Rf = 0,35); RPF de 250 pm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/ NH40H 15 M (40 + + 3) (Rf = 0,64); et RPF de 250 Im en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (50 + 50 + 3). (Rf = 0,36). EXEMPLE 18 N- [4-(azido-désoxythymid-3-yll -butyryll-glycyl-L-tyrosine (AZT-3-B:GlyTyrl: On traite une solution de 50 mg (d'AZT-3-BA (Exemple 11) et de 30 mg de NOS dans 500 1p de -DMA à -10OC par 200 il de DCC (1 M dans du THF) et on l'agite à -10 C pendant 10 minutes, puis à la température ambiante pendant 3 heures. On ajoute au mélange réactionnel une solution de 50 mg de glycyl-L-tyrosine (Gly-Tyr) et de 50 g1 de tri-(n- butyl)-amine dans 500 l1 de DMPU. On fait incuber la suspension pendant une nuit à la température ambiante, on la dilue avec 10 ml d'eau désionisée, on l'acidifie à pH 2,5 et on l'extrait dans de l'acétate d'éthyle. On lave la phase organique avec une solution saturée de NaCl, on la sèche sur Na2S04, on la concentre et on la chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 1000 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (75 + 25 + 1). Le produit migre sous la forme d'une bande (Rf = 0,3) qui est positive à la réaction de Pauly et négative à la réaction à la ninhydrine. Dans ce système, l'AZT-3-BA (Rf = 0,78) et le NOS (Rf = 0,65) sont tous deux négatifs à la réaction de Pauly et négatifs à la réaction à la ninhydrine. La référence Gly-Tyr (Rf = 0,05) est positive à la réaction de Pauly et positive à la réaction à la ninhydrine.On élue la bande contenant le produit avec du MeOH. Celui-ci est homogène par chromatographie sur couche mince analytique, et son spectre UV est en accord avec la structure attendue. On trouve qu'il est immunologiquement actif dans un dosage immunologique par polarisation de la fluorescence pour 1'AZT. EXEMPLE 19 3-carboxyméthyl-31-azido-3'-désoxythvmidine (AZT-3-AAI: On chauffe sous reflux pendant 5,5 heures un mélange de 560 mg d'AZT, 15 ml d'éthanol absolu, 2 ml de solution de méthylate de sodium (NaOMe 4,4 M dans du MeOH) et 500 mg d'acide bromacétique, puis on le laisse reposer une nuit à la température ambiante. Le matin suivant, on ajoute 1 ml de solution de NaOMe, puis 300 mg d'acide bromacétique et on chauffe le mélange sous reflux pendant 1 heure, au bout de laquelle la réaction se révèle être complète par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (85 + 15 + 1). On dilue le mélange réactionnel avec cinq volumes d'eau désionisée et on l'extrait par du CHC13.On acidifie la phase aqueuse avec du HC1 iN et on l'extrait dans de l'acétate d'éthyle. On concentre l'extrait dans l'acétate d'éthyle sous pression réduite et on le chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 1000 pm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (85 + 15 + 1). On gratte la bande de produit (Rf = 0,25), on l'élue avec du MeOH et on la concentre à l'état d'un sirop que l'on soumet plusieurs fois à une distillation éclair avec du CHC13, du MeC12 et du THF jusqu'à ce que l'odeur de HOAc ne soit plus détectable. On conserve l'huile sous vide sur des pastilles d'hydroxyde de sodium.Le produit est homogène par chromatographie sur couche mince, et son spectre UV ressemble à celui de l'AZT-3-VA (Exemple 2) et de la 3- méthylthymidine. Par FPIA, on montre ensuite que le produit possède une activité immunologique avec les antisérums à 1'AZT. EXEMPLE 20 N- r2- (3'-azido-3 '-désoxythymid-3-yl)-acétoxyl-succinimide (AZT-3-A:NOSI: On fait incuber pendant une nuit, à la température ambiante, un mélange de 16 mg d'AZT-3-AA (Exemple 19), 8 mg de NOS et 10 mg de DCC dans 2 ml de THF. EXEMNLE 21 3-carbéthoxy-3'-azido-3'-désoxythymidine (AZT-3-A-OEt): On traite une solution de 267 mg d'AZT dans 1 ml de DMPU par 500 il de solution de méthylate de sodium (NaOMe 4,4 M dans du MeOH) et 250 g1 de bromacétate d'éthyle, et on l'agite 30 minutes à la température ambiante. On ajoute 500 ml supplémentaires de NaOMe et 250 j1 de bromacétate d'éthyle et on chauffe le mélange pendant 1 heure à 60 C dans un bain-marie. On dilue la suspension obtenue avec 15 ml d'eau désionisée et on l'extrait par l'acétate d'éthyle. On lave la phase organique d'abord avec du NaHC03 à 5 %, puis avec une solution saturée de NaCl, on la concentre sous pression réduite et on la chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 2000 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (95 + 5 + 0,5). Trois bandes sont visualisées par les UV (254 nm) et sont éluées séparément par le MeOH. La fraction A (Rf = 0,19) est identifiée à l'AZT par chromatographie sur couche mince et par le spectre UV, par comparaison avec un échantillon de référence d'AZT authentique.Elle est également immunologiquement active dans un dosage de L'AZT par FPIA. Les fractions B (Rf = 0,37) et C (Rf = 0,57) ont des spectres UV similaires, ressemblant à celui de la 3- méthylthymidine. La fraction B est immunologiquement active (environ 110 % de "réactivité croisée" par rapport à l'AZT dans un dosage de l'AZT par FPIA). La fraction C est immunologiquement inactive. On fait donc évaporer à sec la fraction B et on la conserve. EXEMPLE 22 - [2- (3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-acétamidol- fluorescéine (AZT-3A:FAM): On agite à 0 C pendant 5 minutes, puis pendant minutes à la température ambiante, un mélange de 10 mg - d'AZT-3-AA (Exemple 19), 10 mg de FAM, 10 mg de DCC, 1,5 11 de HCl concentré et 2,5 ml d'acétone. On chromatographie la suspension par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 1000 gm et on la développe avec le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (85 + 15 + 1). La bande principale (Rf = 0,41) contenant le produit et du FAMI 52 2637897 est grattée et éluée avec du MeOH, puis rechromatographiée sur du RPF de 250 gm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (33 + 66 + 3>. Dans ce dernier système, le conjugué migre sous la forme d'une bande (Rf = 0,16), qui est bien séparés du FAM et de deux impuretés mineures qui migrent sous la forme d'une bande orange (Rf = 0,48). La technique ci-dessus donne 0,6 pmole de matière purifiée. EXEMPLE 23 -r 2-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-acétamidol- éthylthiocarbamyllfluorescéine (AZT-3-A:FTED): On fait incuber pendant une nuit à la température ambiante un mélange de 16 mg d'AZT-3-AA (Exemple 19), 8 mg de NOS et 10 mg de DCC dans 2 ml de THF, puis on l'ajoute à une solution de 20 mg de FTED dans 2 ml de DMA. On agite le mélange à la température ambiante pendant 60 minutes et on le dilue avec 10 ml de CHC13. On extrait le produit brut dans 5 ml de NaHCO3 à 5 %, on acidifie la phase aqueuse avec du HOAc et on l'extrait dans de l'acétate d'éthyle. On chromatographie la couche organique par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 Lm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (80 + 20 + 1). On gratte la bande fluorescente principale (Rf = 0,45), on l'élue avec du MeOH et on la rechromatographie sur - un RPF de 250 lm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (33 + 66 + 3). On élue le produit (Rf = 0,42) avec du MeOH. *EXEMPLE 24 Ester méthylique de l'acide 2-f2-(3'-azido-3'-désoxythymid- 3-yl)-acétamidol-3-(4-hydroxyphényl)-propionique (AZT-3- A:TME): ' On agite pendant 2 heures à la température ambiante un mélange de 25 mg d'AZT-3-AA (Exemple 19), 15 mg de NOS et 15 mg de DCC dans 1 ml de THF, puis on ajoute 25 mg de TME dans 500 g1 de THF/MeOH (9 + 1) et on agite le mélange pendant une nuit à la température ambiante. On filtre la suspension à travers une membrane de PTFE pour éliminer la dicyclohexylurée et on la chromatographie par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 53* Z637897 250 pm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1). Trois bandes absorbant les UV principales sont repérées: TME, Rf = 0,13), positive à la ninhydrine, positive à la réaction de Pauly, migre vers la référence de TME; NOS, Rf = 0,33, négative à la ninhydrine, négative à la réaction de Pauly, migre avec la référence NOS; et produit Rf = 0,40, négative à la ninhydrine, positive à la réaction de Pauly. On gratte la bande correspondant au produit, on l'élue avec du MeOH et on la rechromatographie sur du RPF de 250.m en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (33 + 66 + 2) pour éliminer une trace de NOS. Dans ce second système de chromatographie,Rf = 0,42 (produit) et Rf = 0,81 (NOS). On élue le produit avec MeOH/THF (1 + 1)> On prépare une solution aqueuse saturée, on la filtre à travers une membrane de PTFE, et on la conserve à -20 C.La solution aqueuse saturée est caractérisée par un balayage de longueurs d'onde UV et.on calcule que la concentration du soluté est de 47 lg/ml, en supposant E275 = 8600. On trouve aussi que la matière est immunologiquement active (c'est-à-dire que l'on trouve qu'elle inhibe la liaison) à la fois dans les dosages immunologiques par inhibition néphélométrique et dans les dosages par polarisation de la fluorescence pour l'AZT. EXEMPLE 25 3-(2-phtalimidoéthyll-3'-azido-3'-désoxythymidine (3-PHT-E- AZT: On traite une solution de 300 mg de N-(2- brométhyl)-phtalimide (BEP) et de 274 mg d'AZT dans 1 ml de DMPU séchée sur tamis par 300 pl de solution de méthylate de sodium (NaOMe 4,4 M dans du MeOH) et on la chauffe à C pendant une heure. On ajoute 300 111 supplémentaires de solution de NaOMe et 175 mg de BEP, et on chauffe à nouveau la solution à 70 C pendant un total de 3,5 heures. La réaction est suivie par chromatographie sur couche mince analytique sur un gel de silice F de 250 im en utilisant comme système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (95 + 5 + 0,5) et on trouve qu'elle est incomplète. L'addition d'un supplément de NaOMe et de BEP n'augmente pas le rendement 54 2637897 en le produit désiré. Le BEP (Rf = 0,81) et l'AZT (Rf = 0,2) n'ayant pas réagi sont identifiés en utilisant des marqueurs de référence et par leurs spectres UV. Le produit (Rf = 0,4) et un sous-produit (Rf = 0,62) sont différenciés sur la base de leurs spectres UV et de leur activité immunologique. On acidifie le mélange réactionnel par de l'acide acétique, on le dilue avec 15 ml d'eau désionisée et on l'extrait par l'acétate d'éthyle.On lave la phase organique avec une solution saturée de NaCl, on la sèche sur Na2SO4, on la concentre sous pression réduite et on la chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 2000 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (96,5 + 3,3 + 0,3). et on élue le produit avec du MeOH. EXEMPLE 26 3-(3-phtalimidopropylU-3'-azido-3'-désoxythymidine (3-PHT- P-AZT): On chauffe à 70 C pendant 1 heure une solution de 280 mg d'AZT, 310 mg de N-(3-bromopropyl)-phtalimide (BPP) et 300 1 de solution-de méthylate de sodium (NaOMe 4,4 M dans du MeOH) dans 1 ml de DMPU, puis on ajoute 145 mg de BPP et 300 g1 de solution de NaOMe, et on chauffe le mélange pendant 1 heure supplémentaire à 70 C. On ajoute mg supplémentaires de BPP et on poursuit le chauffage pendant un total de 4 heures à 70 C. On dilue le mélange réactionnel avec 10 volumes d'eau désionisée, on l'acidifie avec 200 ml d'acide acétique et on l'extrait dans l'acétate d'éthyle. On lave la phase organique avec du NaHC03 à 5 %, de l'eau désionisée, de l'acide acétique 0,1 M et du chlorure de sodium saturé, puis on la concentre et on la chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 2000 Pm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (96,7 + 3,3 + 0,33). On élue le produit (Rf = 0,35) avec du MeOH. I1 est immunologiquement actif dans un dosage de l'AZT par FPIA. EXEMPLE 27 3-(2-aminoéthyll-3'-azido-3'-désoxythymidine -2637897 On traite une solution de 100 mg de 3-PHT-E-AZT (Exemple 25) dans 1 ml d'EtOH absolu par 25 F1il d'hydrate d'hydrazine, on la fait incuber une nuit à la température ambiante et on la chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 1000 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/ NH40H 15 M (90 + 10 + 1). On élue la bande positive aux UV à Rf = Oj25 avec du MeOH. La chromatographie sur couche mince analytique de l'extrait méthanolique dans le même système de solvants avec du gel de silice F de 250 pm montre que le -produit est homogène et positif à la ninhydrine. Dans ce système, une référence d'hydrazine migre au voisinage de l'origine sous la forme d'une tache négative aux UV, positive à la ninhydrine, et le phtalhydrazide de référence reste à l'origine sous la forme d'une tache positive aux UV, négative à la ninhydrine. EXEMPLE 28. 3-(3-aminopropyl)-3'-azido-3'-désoxythymidine (3-AP-AZT): On traite une solution d'environ 0,5 mmole de 3-PHT-P-AZT (Exemple 26) dans du méthanol par 50 g1 d'hydrate d'hydrazine et on la fait incuber une nuit à la température ambiante.On filtre la suspension obtenue à travers une membrane de PTFE de 0,45 gm et on chromatographie le filtrat par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 2000 im en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/ NH4OH 15 M (85 + 15 + 1). La bande principale (Rf = 0,27; positive aux UV, positive à la ninhydrine) est bien séparée du 3-PHT-P-AZT (Rf = 0,78; positif aux UV; négatif à la ninhydrine) et de l'hydrazine (Rf = 0,0; négative aux UV; positive à la ninhydrine). On élue le produit avec du MeOH. On trouve qu'il est immunologiquement actif dans un dosage de l'AZT par FPIA, qu'il est homogène par chromatographie sur couche mince analytique et que son spectre UV ressemble à celui d'un dérivé 3-alkylé de 1'AZT. EXEMPLE 29 -r2- (3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-éthyl-thiocarbamyll- fluorescéine (3AE-AZT:FITC): 56 2637897 On mélange une solution de 10 mg de 3-AE-AZT (Exemple 27) dans 100 Rl de MeOH avec une solution de 10 mg d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dans 100 pl de THF. On agite le mélange pendant 15 minutes à la température ambiante, puis on ajoute 2,5 g1 d'Et3N et on agite la solution orange foncé pendant une heure à la température ambiante. On chromatographie ensuite le mélange par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 Im en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1). Le 3-AEAZT libre reste au voisinage de l'origine (Rf = 0,046), tandis que le FITC libre migre plus rapidement (Rf = 0,47) que la bande fluorescente principale contenant le produit (Rf = 0,28). On élue la bande contenant le produit avec du MeOH et on la rechromatographie sur du RPF de 250 gm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (40 + 60 + 2) qui élimine une faible quantité de matière fluorescente du produit (Rf = 0,23) . On élue le produit avec du MeOH et l'on trouve qu'il est un traceur satisfaisant pour le dosage de l'AZT par FPIA. EXEMPLE 30 -F3-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-propyl- thiocarbamyllfluorescéine (3AP-AZT:FITC): On mélange une solution de 10 mg de 3-AP-AZT (Exemple 28) dans 100 Rl de MeOH avec une solution de 10 mg de FITC dans 100 g1 de THF. On agite le mélange pendant 15 minutes à la température ambiante, puis on ajoute 2,5 l1 de triéthylamine (Et3N) et on agite la solution orange foncé pendant 1 heure à la température ambiante. On chromatographie ensuite le mélange par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F de 250 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1). Le 3-AP-AZT libre reste au voisinage de l'origine (Rf = 0,04) tandis que le FITC libre (Rf = 0,46) migre plus rapidement que le produit (Rf = 0,29) que l'on élue avec du MeOH et que l'on rechromatographie sur un RPF de 250 im en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (40 + 60 + 2). La bande du produit (Rf = 0,14) eEt éluée par le MeOH, et se révèle ensuite être un traceur satisfaisant pour le dosage de l'AZT par FPIA. EXEMPLE 31 - r (4-méthoxy-6-chloro-s-triazin-2-yll -aminol-fluorescéine (MTAF) On traite une solution froide de 1,2 g de 2,4- dichloro-6-méthoxy-s-triazine dans 10 ml d'acétone par une solution froide de FAM (2 g dans 100 ml de MeOH), on l'agite sur un bain de glace pendant 3 heures, on la filtre et on la lave avec de l'acétone puis de l'hexane et on la sèche. La poudre orangée est homogène par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 fm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1) (Rf = 0,45). EXEMPLE 32 3-r3-r4-(fluorescéinyl-5)-6-méthoxy-s-triazin-2-yll- aminopropyll-3'-azido-3'-désoxythymidine (3-AP-AZT:MTAF): On fait incuber pendant 90 minutes à 56 C, puis pendant 24 heures à la température ambiante, une solution de 10 mg de MTAF (Exemple 31), 10 mg de 3-AP-AZT (Exemple 28) et 2,5 i1 d'Et3N dans 250 Rl de MeOH, et on la chromatographie deux fois sur du RPF de 250 pm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (50 + 50 + 3). Le produit (Rf = 0,25) est homogène par chromatographie sur couche mince et se révèle constituer un traceur satisfaisant pour la quantification de l'AZT par FPIA. EXEMPLE 33 3- f2- f3-(4-hydroxyphényl)-propionamidol-éthyll-3'-azido-3'- désoxythymidine (3-AE-AZT:HPPA): On mélange une solution de 10 mg d'ester N- hydroxysuccinimidique de l'acide 3-(4-hydroxyphényl)- propionique (HPP:NOS) dans MeOH avec 10 mg de 3-AE-AZT (Exemple 27) dissous dans 100 1 de MeOH. On agite -le mélange pendant 30 minutes à la température ambiante, puis on ajoute 2,5 Rl d'Et3N. On fait incuber ce mélange pendant une nuit à la température ambiante, puis on le chromatographie par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 Im en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1). On observe par visualisation par les UV à 254 nm les Rf suivants:3AE-AZT, 0,034; NOS, 0,28; produit, 0,35; HPPA, 0,37; et HPP:NOS, O,55.Le produit, contrairement à l'acide 3-(4- hydroxyphényl)-propionique (HPPA) est un inhibiteur efficace de la polarisation dans un FPIA pour 1'AZT. EXEMPLE 34 3-r3-r4-(fluorescéinyl-5)-6-chloro-s-triazin-2-yll- aminoQpropyll-3'-azido-3'-désoxythymidine (3-AP-AZT:DTAFI: On fait incuber pendant 2 heures à 56 C une solution de 10 mg de dichlorotriazinylaminofluorescéine (DTAF), 10 mg de 3-AP-AZT (Exemple 28) et 2,5 Lm d'Et3N dans 250 pl de THF/MeOH (1 + 4), puis on la chromatographie sur un gel de silice F de 250 Jm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1), puis on la rechromatographie sur un RPF de 250 gm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (50 + 50 + 3). Le produit est immunologiquement actif dans un FPIA pour l'AZT et il est homogène dans les trois systèmes de chromatographie sur couche mince suivants: gel de silice F de 250 gm en utilisant le système de solvant CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1) (Rf = 0,37>; RPF de 250 Lm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/ NH40H 15 M (40 + + 3) (Rf = 0,34); et RPF de 250 gm en utilisant le système de solvant MeOH/H20HOAc (50 + 50 + 3) (Rf = 0,19). EXEMPLE 35 6-r2-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-éthyl- thiocarbamylliérythrosine (3-AE-AZT:EITC): On ajoute une solution de 5 mg de 3-AE-AZT (Exemple 27) dans 50 g1 de MeOH à une suspension d'isomère II de l'isothiocyanate d'érythrosine (EITC) dans 100 g1 de THF. Sauf indication contraire, EITC désignera l'isomère II. Il est envisagé d'utiliser l'isomère I, l'isomère II ou un mélange d'isomères de l'isothiocyanate d'érythrosine. La solution limpide obtenue est mise à incuber à la température ambiante pendant 15 minutes, on ajoute 2,5 g1 d'Et3N et on fait incuber la solution limpide pendant 1 heure à la température ambiante. On chromatographie ensuite le mélange réactionnel par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1) dans lequel le produit partiellement purifié (Rf = 0,07) est élué par du MeOH, puis rechromatographié sur du RPF de 250 gm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/ NH40H 15 M (40 + + 3).La bande principale (Rf = 0,87) se sépare du 3-AE- AZT libre (Rf = 0,52) et on élue le produit purifié avec du MeOH. Le produit présente une absorbance maximum à 534 nm, indiquant la présence d'érythrosine, il est immunologiquement actif dans un dosage de l'AZT par FPIA et il est chromatographiquement homogène. EXEMPLE 36 6- 3-(3'-azido-3'-désoxythymid-3-yl)-propyl- thiocarbamyllérythrosine (3-AP-AZT:EITC): On ajoute une solution de 5 mg de 3-AP-AZT (Exemple 28) dans 50 j1 de MeOH à 10 mg d'EITC dans 100 1l de THF. On fait incuber la solution limpide obtenue pendant minutes à la température ambiante, on ajoute 2,5 g1 d'Et3N et on fait incuber la solution limpide pendant 1 heure supplémentaire à la température ambiante. On chromatographie ensuite cette solution par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1) dans lequel le produit partiellement purifié (Rf = 0,076), contaminé par le 3-AP-AZT, est élué par le MeOH. L'extrait par le MeOH est ensuite rechromatographié par chromatographie sur couche mince sur un RPF de 250 gm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/NH4OH 15 M (40 + 60 + 3). La bande rouge principale (Rf = 0,66) se sépare de 1'3-AP-AZT (Rf = 0,26) et elle est éluée avec du MeOH. La matière purifiée présente l'absorbance maxima caractéristique de l'érythrosine à 534 nm, elle est immunologiquement active dans un dosage de l'AZT par FPIA, et elle est chromatographiquement homogène. EXEmlPLE 37A 3'-azido-3 -désoxythymidyl-5'-hémisuccinate (AZT-5'-HSI: On agite pendant 2 heures à la température ambiante un mélange de 267 mgd'AZT, 200 mg d'anhydride succinique, 200 1il de pyridine et 25 mg de diméthylaminopyridine (DMAP) dans 2 ml de THF. On élimine alors la masse de la pyridine par co-évaporation avec du CHCl3. On reprend le résidu dans 2 ml de MeOH, on l'acidifie avec 200 J1 d'HOAc et on le chromatographie par chromatographie sur couche mince préparative sur un gel de silice F 1000 de Lm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + O, 1). On élue la bande contenant le produit (Rf = 0,3) avec du MeOH. L'évaporation du solvant donne environ 160 mg (44 %) d'un solide cristallin jaune pale. Le spectre UV ressemble à celui de l'AZT.Le produit est homogène dans trois systèmes de chromatographie sur couche mince (gel de silice F, alumine F et phase inversée F). La chromatographie sur couche mince sur alumine démontre aisément que la matière isolée n'est pas 1'AZT. La forte bande d'absorption dans son spectre IR à 2100 cm-1 indique que le groupe azido est intact et la bande à 3465 cm-1 présente dans la matière de départ (5'-OH) manque dans le produit. EXEMPLE 38 N-r (3'-azido-3'-désoxythymid-5'-yl)-succinyloxyl- succinimide (AZT-5'-S:NOS): L'ester actif a été préparé en agitant un mélange de 96,5 mg d'AZT-5'-HS (Exemple 37), 31-mg de NOS et 110 mg de DCC dans 3 ml de THF pendant 2 heures à la température ambiante. Un taux de conversion de 75 % a été estimé par chromatographie sur couche mince, et le mélange a été utilisé immédiatement sans isolement de l'ester. EXEMPLE 39 AZT-5'-succinyl:BSA (AZT-5'-S:BSAî: On dilue une solution de 30 mg d'AZT5'-HS (Exemple 37) dans 2 ml de DMA avec 17 ml de NaCl 0,15 M et on l'ajoute à 75 mg de sérumalbumine de bovins (BSA) dissoute dans 25 ml d'eau désionisée. On ajoute en agitant rapidement du chlorhydrate de l-éthyl-3- (diméthylaminopropyl)-carbodiimide (ECDI) sec, ce qui donne 263?897 une solution limpide (pH 5,5) que l'on agite toute la nuit à la température ambiante. On chromatographie le mélange réactionnel sur une colonne de Sephadex R G-25 et on l'élue avec du PBS (PO4Na 0,01 M/NaCl 0, 15 M/pH 7,4). Le pic de la protéine est dilué par du PBS jusqu'à un indice de biuret de 1 mg/ml, on en prend des parties aliquotes et on le conserve à -20 C avant immunisation. L'incorporation molaire a été déterminée à partir de la différence de A280 entre le conjugué et la protéine (calculée à partir de l'indice de biuret) en prenant E28o=44 000 pour la BSA et E280=6 500 pour l'haptène (dans du PBS).Par cette méthode, l'incorporation molaire est de 4,7 moles d'haptène pour 66 000 g de protéine et ne change pas par rechromatographie. EXEMPLE 40 AZT-5'-succinyl:BSA (AZT-5'-S:BSA): On refroidit sur un bain de glace une solution de 100 mg de BSA dans 25 ml d'eau désionisée et on l'ajuste à pH 8,5 avec du K2C03 à 5 %. A cette solution de BSA, on ajoute environ 160 pl de AZT-5'S:NOS (Exemple 38) fraîchement préparée en agitant au bain de glace, en maintenant le pH entre 8,0 et 8,5 par addition d'une quantité supplémentaire de K2C03, en fonction des besoins, jusqu'à ce qu'il soit stable (environ 2 heures). On retire alors le bain de glace et on agite le mélange pendant 1,5 heures supplémentaires à la température ambiante, puis on le filtre à travers une membrane de 1,2 Lm pour éliminer la dicyclohexylurée. On chromatographie le filtrat sur une colonne de Sephadex R G-25 (2,5 x 50 cm) et on l'élue avec du PBS (phosphate de sodium 0,01M (NaPO4)/NaCl 0,15 M/pH 7,4. On dilue le pic de la protéine avec du PBS jusqu'à un indice de biuret de 1 mg/ml. L'incorporation molaire est déterminée à partir de la différence de A280 entre le conjugué et la protéine (calculée à partir de l'indice de biuret) en prenant E28o=44 000 pour la BSA et E280 = 6 500 pour l'haptène. Par cette méthode, les moles d'haptène pour 66 000 g de protéine (incorporation molaire) sont égales à 43 et ne changent pas par rechromatographie. EXEMPLE 41 -r (3'-azido-3'-désoxythymid-51-vl) -succinamido]- fluorescéine (AZT-5'S:FAM): On agite pendant 30 minutes à la température ambiante une solution de 10 mg d'AZT-5'-HS (Exemple 37), 10 mg de fluorescéinamine (FAM), 1,5 g1 de HCl concentré et 10 mg de DCC dans 2 ml de t-butanol. On chromatographie une partie aliquote du mélange réactionnel par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (90 + 10 + 1). Le produit migre sous la forme d'une bande présentant une fluorescence verdâtre (Rf = 0,19) juste au-dessous de la bande orangé forte du FAM (Rf = 0,25). On gratte la bande de produit, on l'élue avec du MeOH et on la rechromatographie sur du RPF de 250 Im en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (40 + 60 + 3). Le produit actif migre sous la forme d'une bande fluorescente (Rf = 0,26) qu'on gratte et qu'on élue avec MeOH. Une bande orangée (Rf = 0,64) migre au voisinage de la référence de FAM (Rf = 0,66) et l'AZT-5'-HS se déplace sous la forme d'une tache non fluorescente, positive aux UV (Rf = O, 69). L'immunoactivité du produit a été démontrée par une technique d'extinction de la fluorescence pour doser 1'AZT. EXEMPLE 42 -r2- 3'-azido-3'-désoxythymid-5'-yl)-succinamido)-éthyl- thiocarbamyllfluorescéine óAZT-5'-S:FTED): On agite pendant 60 minutes à la température ambiante un mélange de 10 mg d'AZT-5'-HS (Exemple 37), 5 mg de NOS, 10 mg de DCC et 100 1i de DMPU. On ajoute au mélange réactionnel une solution de 10 ml de FTED dans 100 g1 de MeOH et on ajoute au mélange réactionnel 50 1 de NaOH 1 N, puis on agite le mélange obtenu pendant 60 minutes à la température ambiante. Pendant ce temps, on ajoute du NaHCO3 à 5 % par parties aliquotes de 10 gl, en fonction des besoins, pour maintenir 1e pH au-dessus de 7,5.On dilue le mélange réactionnel avec 1 ml de MeOH et on en chromatographie une portion par chromatographie sur couche mince sur un gel de silice F de 250 gm en utilisant le système de solvants CHC13/MeOH/HOAc (85 + 15 + 1). Dans ce système, la matière active par FPIA pour 1'AZT. EXEMPLE 43- Ester méthyliquede l'acide 2-r(3'-azido-3'-désoxythymid- '-yl)-succinamidol-3-(4-hydroxyphényl)-propionigue (AZT- 51-S:TMEI On agite pendant deux heures à la température ambiante un mélange de 25 mg d'AZT-5'-HS (Exemple 37), 15 mg de NOS et 10 mg de DCC dans 550 g1 de THF. On ajoute au mélange réactionnel une solution de 25 mg de TME dans 500 1l de THF/MeOH (9 + 1) et on agite le mélange obtenu à la température ambiante pendant 4 heures.On clarifie la solution par centrifugation, on fait évaporer le liquide surnageant et on reprend le résidu dans du CHC13 qu'on lave avec du NaHC03 à 0,5 %, puis avec du HC1 0,1 M. On concentre la couche organique à un faible volume, on la clarifie par addition d'une faible quantité de MeOH et -on la chromatographie par chromatographie sur couche mince sur du RPF de 250 gm en utilisant le système de solvants MeOH/H20/HOAc (33 + 66 + 3). On gratte le produit (Rf = 0,4) et on l'élue avec du MeOH/THF (1 + 1). On dilue une partie aliquote de 25!l.de cet éluat avec 5 ml d'eau distillée et on la filtre à travers une membrane de PTFE de 0,45 pm. Un balayage des longueur d'onde UV montre une absorbance maxima à 268 nm, A275 = 1,255; E275 = 9 900 (calc). La chromatographie sur couche mince analytique sur.du RPF de 250 gm en utilisant comme système de solvants MeOH/H20/HOAc (33 + 66 + 2) montre un produit homogène (Rf = 0,4), réaction de Pauly positive, réaction à la ninhydrine négative, qui est bien séparé du AZT-5'-HS (Rf = 0,65), du TME (Rf = 0,80) et du NOS (Rf = 0,86). La matière est immunologiquement active dans les dosages de l'AZT par NIA et FPIA. EXEMPLE 44 AZT-5'-succinyl:apoferritine (AZT-5'-S:APO): On refroidit sur un bain de glace une solution de 23 mg d'apoferritine de rate de cheval dans 5 ml de tampon borax-HCl (0,075 M, pH 8,5) et on la traite par un mélange réactionnel contenant 50 gmoles de l'AZT-5'-S:NOS fraîchement préparé (Exemple 38). On agite le mélange à 0- 15 C pendant 1 heure, puis à la température ambiante pendant 1 heure et on le chromatographie sur Sephadex R G- 25. L'incorporation molaire est de 8,7 moles d'haptène pour 66 000 g de protéine, telle que déterminée par A280o et le biuret. Ce conjugué est utilisé comme antigène de développement pour le NIA et comme antigène de revêtement pour les méthodes d'EIA pour 1'AZT. EXEMPLE 45 Anticorps polyclonaux de lapin contre l'AZT On émulsionne l'immunogène (1 mg dans 1 ml) avec un égal volume d'Adjuvant Complet de Freund et on l'injecte intradermiquement à deux lapins albinos femelles. On répète le processus sur deux semaines. Deux semaines plus tard, des injections de rappel sous-cutanées mensuelles sont entreprises avec 0,5 mg dans 0,5 ml de l'immunogène et 0,5 ml d'Adjuvant Incomplet de Freund par animal. Les lapins sont saignés deux fois par semaine par la veine marginale de l'oreille en commençant six semaines après l'immunisation primaire. On réfrigère le sang recueilli, en laissant des caillots se former, et on retient le liquide surnageant (antisérum). On recueille l'antisérum de chaque lapin et on le stocke, soit à -20 C sans conservateur, soit à 4 C après addition d'azide de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,1 %. Le même - programme est suivi pour chaque immunogène.Les lapins immunisés produisent des anticorps à 1'AZT. EXEMPLE 46A Anticorps monoclonaux contre 1'AZT On injecte à des souris l'immunogène de l'AZT AZT-5'-S:BSA (Exemple 40; immunogène préparé par la méthode à l'ester actif). On effectue trois séries d'injections, éloignées d'au moins 10 jours. Les deux premières séries d'injections par souris consistent à injecter par voie sous-cutanée 20 gg d'immunogène dans environ 40 111 de solution saline émulsionnée avec environ 160 g1 d'Adjuvant Complet de Freund, et répartie entre 6 à 8 sites différents, ainsi que par voie intrapéritonéale (IP) en injectant 30 gg d'immunogène dans environ 300 jil de solution saline. La troisième série d'injections consiste seulement en des injections sous-cutanées telles que décrites cidessus. Au plus t6t 10 jours après la troisième série d'injection$ et 4 jours avant la fusion, on injecte aux souris, par voie intraveineuse, 50 gg d'immunogène dans 300 J1 de solution saline. Les fusions de splénocytes immuns sont effectuées en utilisant des cellules de myélome de souris SP2/0. les cellules fusionnées sont appliquées sur des plaques de culture de tissus à 24 puits dans le milieu de sélection approprié. Au bout de 3 semaines, les liquides surnageants sont soumis à des essais de production d'anticorps en utilisant des plaques de microtitrage revêtues d'AZT-5'-S:APO (Exemple 44) et de conjugués. Ig- anti-souris phosphatase alcaline. Les cellules survivantes (hybridomes) provenant de puits qui contenaient des anticorps à l'AZT sont clonées par dilution limitante dans des plaques de microtitrage à 96 puits. Après des durées d'incubation appropriées, les puits sont à nouveau soumis à des essais pour les anticorps à l'AZT et les hybridomes produisant ces anticorps sont reclonés. Après que la monoclonalité a été établie, les cellules d'hybridomes sont utilisées pour déclencher des ascites chez les souris pour la production de forts volumes d'anticorps monoclonaux à l'AZT. En résumé, 7 à 30 jours après le déclenchement, les souris reçoivent des injections intrapéritonéales de 0,5 ml de 2,6,10, tétraméthylpentadécane (pristane). Après amorçage par le pristane, on injecte aux souris 0,5 à 1,0 million de cellules d'hybridomes dans 0,5 ml de milieu de cultu.re de tissu exempt de sérum. Le fluide des ascites est récolté sur les souris 7 à 30 jours plus tard. EXEMPLE 47 Dosaae immunologique de 1'AZT par polarisation de la fluorescence Le mode opératoire suivant illustre l'utilisation de diverses matières de l'invention dans une méthode de FPIA préférée. (1) On introduit 50-250 Rl d'échantillon d'AZT (étalon ou inconnu) par tube de microcentrifugeuse. On ajoute un égal volume de réactif de précipitation par tube de microcentrifugeuse. Les tubes sont centrifugés à plus de 9 000 g pendant 1 minute. (2) On amène un échantillon de 17,5 i1 de chaque extrait de sérum à un pH d'environ 7-8 par addition de tampon. (3) On ajoute 25 1pi d'anticorps contre l'AZT et pl de traceur de l'AZT par tube et on amène le volume- par tube à environ 2 ml avec du tampon. (4) Après une durée d'incubation appropriée,on détermine la polarisation de chaque mélange réactionnel en utilisant un spectrofluoromètre de polarisation. Une courbe de la polarisation en fonction de la concentration de l'AZT pour une série d'étalons d'AZT peut être utilisée pour déterminer la concentration-de l'AZT dans un échantillon inconnu par interpolation. Sur la base de cette technique, en utilisant des anticorps stockés à 4 C avec de l'azide de sodium à 0,1 % provenant du lapin N 1 produits en réponse à l'immunisation avec de l'AZT-3-V:BSA qui a été préparé en passant par l'ester actif (Exemple 4) ainsi qu'en utilisant de 1'AZT-3B:FAM Isomère I (Exemple 13) et des étalons d'AZT dont les concentrations vont de 0,0 à 14,7 JIM, on obtient les résultats suivants: Echantillon N AZT (M) Unités de polarisation (PxlOOO) 1 0,00 166 2 0,2 155 Z637897 3 0,6 141 4 1,7 118 5,0 87 6 14,7 61 EXEMPLE 48 Dosaae immunoloaique de 1'AZT par les enzymes sur plaque de microtitrage Dans chaque puits d'une plaque de microtitrage à 96 puits, on introduit 100 R1 d'anticorps de lapin dilués (Exemple 45) dirigés contre 1'AZT-3V:BSA, préparés en passant par l'ester actif (Exemple 4) préalablement fractionnés par le sulfate d'ammonium. Après incubation pendant une nuit, on lave la plaque et on introduit dans chaque puits 300 g1 de sérum de lapin normal dilué pour bloquer les sites non liés éventuellement présents sur la surface de plastique de la plaque de microtitrage. On lave à nouveau la plaque et on élimine l'excès d'humidité. Puis on ajoute 50 g1 de l'échantillon d'AZT dans le puits approprié, après quoi on ajoute 50 p1 d'AZT-3-V:HRPO (Exemple 9) dans tous les puits. On fait incuber la plaque pendant 60 minutes à la température ambiante. On lave ensuite la plaque et on ajoute dans chaque puits 300 g1 de solution de substrat d'o-phénylènediamine-peroxyde d'hydrogène diluée. On laisse la couleur se développer pendant 90 minutes à la température ambiante, dans l'obscurité. On mesure ensuite spectrophotométriquement les absorbances pour chaque puits. Une courbe de l'absorbance en fonction de la concentration de l'AZT pour une série d'étalons d'AZT peut être utilisée pour déterminer par interpolation la concentration de l'AZT dans des échantillons inconnus. Sur la base de cette technique, en utilisant des anticorps du Lapin N 2 produits en réponse à l'immunisation par 1'AZT-3- V:BSA qui a été préparé en passant par un ester actif (Exemple 4) et conservé à -20 C sans conservateur avant le fractionnement par le sulfate d'ammonium, ainsi qu'en utilisant du AZT-3-V:HRPO (Exemple 9) et des étalons d'AZT dont la concentration va de 0,0 à 101,1 ng/ml, on a obtenu les résultats suivants. _hant, No AZT (nag/ml) Absorbance nette (B) B/Bo % 1 0,0 0,367 100 2 0,1 0,323 88 3 0,4 0,273 74 4 1,6 0,205 56 6,3 0,149 41 6 25,3 0,085 23 7 101,1 0,044 12 A titre d'illustration supplémentaire de l'invention, des anticorps polyclonaux ont été produits chez deux lapins par immunisation avec le conjugué de l'Exemple 4 (AZT-3-V:BSA), comme cela est décrit plus complètement dans l'Exemple 45 et conservé à 4 C avec de 1'azide de sodium à 0,1 %. Un certain nombre de traceurs ont ensuite été comparés en ce qui concerne leurs performances dans le FPIA en utilisant les antisérums produits à partir des deux lapins. Les résultats de cette comparaison sont donnés dans le Tableau 1 ci-dessous. En résumé, pour- les traceurs fluorescents de l'AZT en position 3, l'ordre de préférence, sur la base des résultats empiriques du Tableau l, est le suivant: AZT-3-butyryl:FAM Isomère II AZT-3-butyryl:FAM Isomère I AZT-3-acétyl:FAM Isomère I 3-aminopropyl-AZT:DTAF Isomère I 3-aminoéthylAZT:MTAF Isomère I AZT-3-acétyl:FTED Isomère I 3-aminopropyl-AZT:MTAF Isomère I L'AZTR-3-B:FAM Isomère.I s'est révélé avoir une affinité et une sensibilité satisfaisantes, cependant, si l'on désire une sensibilité et/ou une affinité plus élevées, on doit utiliser le traceur fluorescent AZT-3- B:FAM Isomère II qui est préféré. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront à l'homme de l'art. TABLEAU 1 Lapin 1 Lapin 2 Titre Unitts de po- DE50 (2) Titre nits de Po- DE (2) (n 3 150 1470 14 115 179 3 - 45 1701 4 M00 179 4 0 130 175 s, lsomerIe 3 150 167 0,6 74 159 1 4 8. AZT- (Cl2>) n-CO-NH-CH2-CH12-NH.CSNH-_F I 53 173 2,4 28 164 1,4 3 200 165 4>0 73 184 4,0 4 1 -- 3 197 "8 C. AZT- (C5z) n-NH-CS-NHH. 2 150 180 3,9 58 177 2,9 3 80 159 >410 80 170 4.,O D. A2T-(CH2)n-NiH:DTAF O 2 250 162 410 125 156 >8,0 3 500 171 210 140 168 40 E. A2T- (Clz) n-NH: MAF 2.190 160 2t5 100 179 4,9 3 550 1.7 3>; 133 170 a,0 * F indique le couplaqe par la position 5 (Isomère I) de la fluorescéine.sauf indication contraire, Isomère II indiquant un couplage par la position 6 de la fluorescéine. ()Le titre est défini comme la dilution de l'antisérum (c'est-à-dire (Ab)) nécessaire pour obtenir les unités de polarisation indiquées (p x 1000) avec 1 pmole de traceur. (2)La DE50 est définie cmme la concentration d'AZT (gg/ml) nécessaire pour donner une réduction de 50 % de la polarisation par rapport à un témoin (tube O) ne contenant pas d'AZT non marqué. - o %o 71 2637897 REVENDICATIONS 1 - Composé répondant à la formule: CH3 N-R1 -R 2 N3 dans laquelle un des symboles R1 et R2 est un atome d'hydrogène et l'autre comprend R-A, R est un groupe de liaison et, (a) lorsque R1 est un atome d'hydrogène, A est X ou Y, et (b) lorsque R2 est un atome d'hydrogène, A est L, X ou Y, o L est un groupe partant, X est une partie indicateur et Y est un support. 2 - Composé selon la revendication 1, dans lequel R2 est un atome d'hydrogène. 3 - Composé selon la revendication 2, dans lequel A est L. 4 - Composé selon la revendication 3, dans lequel L est un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy, halo, sulfonyloxy, phtalimido, ou un groupe ayant 1 à 8 atomes de carbone, dans lequel ce groupe est un groupe alkyle, alcoxy, acyle, carbobenzoxy, ou succinimidoxy. - Composé selon la revendication 4, dans lequel le groupe est un groupe alcoxy en Cl à C2. 6 - Composé selon la revendication 2, dans lequel A est Y. 7 - Composé selon la revendication 6, dans lequel Y est un polyaminoacide ayant une masse moléculaire d'au moins environ 5 000, un hydrate de carbone ou un liposome. 8 - Composé selon la revendication 7, dans lequel le polyaminoacide est une albumine, une hémocyanine, une enzyme ou une globuline. 9 - Composé selon la revendication 8, dans lequel l'albumine est la sérumalbumine de bovins. - Composé selon la revendication 8, dans lequel l'hémocyanine est l'hémocyanine de patelle en trou de serrure. 11 - Composé selon la revendication 2, dans lequel A est X. 12 - Composé selon la revendication 11, dans lequel X est une partie indicateur fluorescent. 13 - Composé selon la revendication 12, dans lequel la partie indicateur fluorescent est un dérivé 5- diméthylaminonaphtalène-l-sulfonylé, la rhodamine ou la fluorescéine. 14 Composé selon la revendication 11, dans lequel X est une partie indicateur radioactif. 15 - Composé selon la revendication 11, dans lequel X est une partie indicateur d'enzyme. 16 - Composé selon la revendication 15, dans lequel la partie indicateur d'enzyme est la glucose-6- phosphate déshydrogénase, la peroxydase de raifort ou une phosphatase alcaline. 17 - Composé selon la revendication 11, dans lequel X est une partie indicateur phosphorescent, une partie indicateur chimio-luminescent ou une partie antigène multivalent. 18 - Composé selon la revendication 17, dans lequel la partie antigène multivalent est un latex, un érythrocyte, l'apoferritine ou une protéine sérique. 19 - Composé selon la revendication 1, dans lequel R1 est un atome d'hydrogéne. - Composé selon la revendication 19, dans lequel A est X. 21 - Composé selon la revendication 20, dans lequel X est une partie indicateur fluorescent. 22 - Composé selon la revendication 19, dans lequel A es Y. 23 - Composé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 19, dans lequel R est -(CH2)m-NH-, o m est 1 à 8, copolymérisé avec une protéine. 24 - Composé selon la revendication 23, dans lequel la protéine est copolymérisée au moyen de glutaraldéhyde. 25 - Anticorps préparé en réponse à un composé répondant à la formule: o0 CH3 -R2 N3 dans laquelle un des symboles R1 et R2 est un atome d'hydrogène, et l'autre comprend R-Y, R est un groupe de liaison, et Y est un support. 26 - Méthode pour déterminer l'AZT dans un échantillon comprenant le mélange avec cet échantillon d'un traceur représenté par la formule: 74 2637897 o CH3 N -R1 0-R2 N -3 dans laquelle un des symboles RI et R2 est un atome d'hydrogène et l'autre comprend R-X, R est un groupe de liaison et X est une partie indicateur, et un anticorps capable de reconnaître spécifiquement l'AZT et ce traceur, puis la détermination de la quantité du traceur liée à l'anticorps en tant que mesure de la quantité d'AZT dans l'échantillon par une technique de dosage appropriée. 27 - Méthode selon la revendication 26, dans laquelle la partie indicateur est une partie indicateur fluorescent. 28 - Méthode selon la revendication 27, dans laquelle la partie indicateur fluorescent est la fluorescéine. 29 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 26, 27 ou 28, dans laquelle la technique de dosage est une technique de polarisation de la fluorescence. - - Méthode selon la revendication 26, dans laquelle la partie indicateur est une partie indicateur d'enzyme. 31 - Méthode selon la revendication 30, dans laquelle la partie indicateur d'enzyme est la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline. 2637897? 32 - Méthode -selon l'une quelconque des revendications 26, 30 ou 31, dans laquelle la technique de dosage est une technique enzymatique. 33 - Méthode pour déterminer l'AZT dans un échantillon, comprenant le mélange avec cet échantillon d'un traceur de la revendication 13 et d'un anticorps de la revendication 25, puis la détermination de la quantité de traceur liée à l'anticorps par une technique de polarisation de la fluorescence en tant que mesure de la quantité d'AZT dans l'échantillon. 34 - Nécessaire de diagnostic ayant des éléments constitutifs conçus pour être utilisés les uns avec les autres pour déterminer la concentration de l'AZT dans un fluide biologique, comprenant: (a) un anticorps de la revendication 25, et (b) un indicateur suivant l'une quelconque des revendications 11 à 18 ou 20 et 21, capable de réagir avec cet anticorps. - Nécessaire de diagnostic selon la revendication 34, -dans lequel R2 est un atome d'hydrogène et A est X. 36 - Nécessaire de diagnostic selon la revendication 34, dans lequel Rî est un atome d'hydrogène et A es X. 37 Nécessaire de diagnostic selon la revendication 35, dans lequel l'indicateur est un indicateur fluorescent. 38 - Nécessaire de diagnostic selon la revendication 36, dans lequel l'indicateur est un indicateur fluorescent. 39 - Nécessaire de diagnostic selon la revendication 34, dans lequel A est X et l'indicateur fluorescent est un indicateur représenté par la structure: HO OH H 40 - Nécessaire de diagnostic selon la revendication 34, dans lequel A est X et l'indicateur est un indicateur fluorescent, comprenant en outre un agent précipitant convenant pour réduire la fluorescence de fond non spécifique due à des matières présentes dans l'échantillon à analyser. 41 - Composé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, dans lequel R2 est un groupe succindioyle. 42 - Composé répondant à la formule: o Il O pH CH3H! 0 N3 s 43 - Composé répondant à la formule: O Z CH3 N-H I OH - 3) 2) r-NH./5N OH O O oH 3 OH dans laquelle n est un nombre de 1 à 8 et Z est un groupe chloro ou méthoxy. 44 - Procédé de production d'un hybridome, comprenant: (a) l'immunisation d'un animal avec un composé selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 ou 22, (b) la récupération des lymphocytes de cet animal immunisé, (c) la fusion de ces lymphocytes récupérés avec une lignée cellulaire de myélome pour produire des hybridomes, et (d) la récupération des hybridomes qui produisent des anticorps qui lient l'AZT. 45 - Lignée cellulaire d'hybridomes produite par le procédé de la revendication 44. 46 - Procédé de production d'un anticorps à l'AZT comprenant la culture d'une lignée cellulaire d'hybridomes de la revendication 45 et la récupération d'un anticorps à partir de cette lignée cellulaire. 47 - Anticorps monoclonal produit par des lignées cellulaires d'hybridomes formées par fusion de cellules d'une lignée cellulaire de myélomes de souris et de cellules de rate provenant d'une souris préalablement immunisée par un dérivé de l'AZT selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 ou 22. 48 - Anticorps préparé en réponse à un composé de la revendication 25, dans lequel Y est la sérumalbumine de bovins. 49 - Anticorps préparé en réponse à un composé de la revendication 25, dans lequel Y est l'hémocyanine de patelle en trou de serrure. - Composé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, dans lequel R2 est le glutardioyle.