Brevet FR2640385A1 — publié le 19900615

NOUVEAU PROCEDE DE DOSAGE DE L'HEPARINE ET SON UTILISATION DANS LES TROUSSES DE DOSAGE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de l'héparine notamment pour apprécier à partir d'un plasma de patient contenant de l'héparine les déficiences cliniques au niveau de l'hémostase. Elle concerne également l'utilisation de ce nouveau procédé pour l'élaboration de trousses ou kits de dosage destinés à être utilisés dans les analyseurs automatiques ou semiautomatiques. ART ANTERIEUR on sait que les analvseurs automatiques les plus perfectionnés actuellement disponibles dans le commerce ne permettent que le pipetage de deux réactifs au plus, c'est-à-dire qu'ils n'autorisent que l'introduction dans un godet ou une cuvette contenant un échantillon à étudier, d'au plus deux réactifs. Par suite, dans le domaine de l'hémostase pour l'analyse de l'héparine, un fabricant de trousses ou kits de dosage ne peut pas demander ni recommander à ses utilisateurs de modifier, voire "bricoler", leurs automates d'analyse pour effectuer au total 3 ou 4 pipetages. En effet, les modifications qui seraient requises impliquent des opérations relativement compliquées et exigent du personnel hautement qualifié pour ne pas déteriorer les automates d'analyse. L'art antérieur comprend les publications suivantes 10) les articles de E.T. YIN et al., J. Lab. Clin. Med. 81 (N02), pages 298-310 (1973) et J. Lab. Clin. Med. 82 (No 3), pages 390-398 (1973); 20) L'article de I. JUHAN-VAGUE et al., Feuillets de Biologie 22 (N 123), pages 33-37 (1981); et, 30) La demande de brevet européen publiée EP-A-O 217 768 (de E.T. YIN) et l'exposé de E.T. YIN effectué lors du symposium international sur i 'héparine et les substances correspondantes ("Internal Symposium on Heparin and Related Substances") tenu dans le Centre MEdlcal de l'Université Loyola à Chicago les 8-9 novembre 1984 [résumé dans Seminars in Thrombosis and Hemostatis 11 (No. 2), pages 243-247, (1985)1. Eh bref, la technique de dosage de i 'héparine décrite par E.T. YIN et al., J. Lab. Clin. Med. 81 (N 2), pages 298-310 (1973) permet de déceler des quantités de l'ordre de 0,01 unité d'hépa- rine par millilitre de plasma. Elle repose sur la mesure in vitro de l'héparine contenue dans un plasma par la mise en oeuvre de la neutralisation du facteur Xa, mais elle implique des essais fastidieux et exige beaucoup de temps pour sa mise en oeuvre [comme indiqué dans le préambule de EP-A-O 217 768 (voir page 2, lignes 116)]. L'article de I. JUHEN-VAGUE précité décrit une technique améliorée par rapport à celle de YIN et al., qui met en oeuvre un système anti-Xa, et qui a donné lieu à la commercialisation de trousses et kits de dosage sous la dénomination comnerciale de "HEPACLoTB3D". Cette technique améliorée comprend a) l'incubation du plasma contenant de l'héparine à doser avec une quantité constante et en excès de facteur Xa en présence d'antithrombine III (AT III), suivant le mécanisme plasma (Hep) + AT III + Xa complexe (Xa - AT III- Hep) + Xa résiduel, b) la réaction du facteur Xa résiduel avec un plasma substrat [plasma concentré apportant notamnent les facteurs II et V et supplémenté en céphaline (substance faisant partie de la famille des phospholipides)] et la coagulation du plasma substrat par Ca2+, suivant le mécanisme ca2+ Xa résiduel + plasma substrat (II, V) + céphaline lia IIa + I fibrine. Cette technique comporte des inconvénients liés à l'utilisation de plusieurs réactifs, à savoir quatre réactifs AT III, Xa, plasma substrat + céphaline et Ca2+. AT III n'est pas essentiel et peut être écarté. Les autres sont impératifs et le seul moyen de limiter les pipetages consiste à les "condenser" (i.e. les rassembler) puisque l'on ne peut les supprimer - le facteur Xa doit rester seul sinon on provoque une perturbation du dosage, - seuls peuvent être théoriquement mélangés les deux réactifs : plasma substrat + céphaline, d'une part, et Ca2+, d'autre part; ceci est possible par le biais d'un pipetage simultané, mais ces deux réactifs ne peuvent être conservés ensemble de maniera prolongée, dès lors que la seule présence du calcium dans un plasma fait coaguler celui-ci plus ou moins rapidement. On connaît de EP-A-O 217 768 une autre technique de dosage qui a donné lieu à la commercialisation de trousses et kits de dosage sous la dénomination commerciale de flHEPEST"R et qui comprend : a) l'incubation d'un échantillon de plasma à analyser contenant de 1 'héparine avec une quantité connue en excès de facteur Xa, pendant un temps suffisant pour faire reagir tous les complexes héparine-AT III, b) la mise en contact du produit résultant de ladite incubation avec un mélange comprenant - Ca2+ (sous forme CaCl2), - des phospholipides de cerveau (en abrégé PL), et - une fraction de plasma tamponnée produite par adsorption sur sel de baryum de plasma de sang de mammifère pour éliminer essentiellement les facteurs II, VII, IX et X et conserver essentiellement, d'une part, au moins 50 % du facteur de coagulation V, et, d'autre part, le fibri nogène. Schématiquement cette technique est illustrée par le mécanisme suivant Plasma (Hep) + Xa et incubation incubat Incubat + plasma adsorbé (dépourvu de facteur II, VII, IX et X ) + PL + coagulation. Cette technique, objet de EF-A-O 217 768 et qui avait été préalablement divulguée par E.T. YIN lors du symposium précité, implique l'absence de facteur II dans le plasma adsorbé ou incorporé dans ledit plasma et présente notamnent l'inconvénient que le facteur II nécessaire à la coagulation est apporté par le plasma du patient (i.e. l'échantillon de plasma à analyser), et que par suite, en cas de déficience en facteur II dudit plasma, les résultats donnés par ladite méthode sont aberrants. OBJET DE L'INVENTION Selon un premier aspect de l'invention, on se propose de pallier les inconvénients sus-visés en particulier celui précité de la technique HEPTEST suivant EPA-O 217 768, en fournissant une nouvelle solution technique dite à deux réactifs de pipetage dans laquelle du facteur Il et/ou du fibrinogène est (sont) ajouté(s) à la polylysine sans qu'il y ait coagulation du mélange ainsi obtenu. Suivant cette nouvelle solution technique, on préconise un procédé de dosage de l'héparine contenue dans un milieu liquide à analyser, notamnent un plasma, qui est caractérisé en ce que: 10) on met en contact le milieu à analyser contenant de 1 'héparine avec le facteur Xa et on procède à une incubation 20) l'incubat ainsi obtenu est mis en contact avec un mélange constitué de a) - une substance choisie parmi le facteur II, le fibrinogène et leurs mélanges, et b) - la polylysine, et c) - le cas échéant, une source de facteur V, et on procède à une incubation pour coagulation. Selon un second aspect de l'invention, on préconise une trousse ou kit de dosage comprenant les ingrédients essentiels pour mettre en oeuvre le procédé de dosage de l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Par commodité le mélange des ingrédients intervenant au stade 20) du procédé de dosage suivant l'invention est désigné ciaprès par le terme "réactif". Le facteur V, qui intervient dans le procédé de dosage de l'invention, peut être apporté par le plasma du patient que l'on veut étudier ou par une source de facteur V. La source de facteur V, que l'on ajoute avantageusement selon l'invention en tant que moyen c), peut être constituée - par le facteur V proprement dit [convient à cet effet le produit commercialisé sous la nomenclature de "FACTEUR V PURIFIE STAGO" par la société dite DIAGNOSTICA STAGO (référence No 0460 du catalogue de cette société)i, - par un sérum de mamnifère (notamment le sérum de boeuf absorbé) exempt de facteurs II, VII, IX et X et de fibrimo gène, - par un plasma de mammifère (notamment le plasma bovin ou humain absorbé sur sel de baryum) exempt de facteurs II, VII, IX et X et contenant du fibrinogène, ou - un de leurs mélanges. De préférence, on utilisera, comme source de facteur V, du sérum de boeuf (notamment adsorbé) exempt de facteurs II, VII, Ix et X et de fibrinogène, ou du plasma de mammifère (notamment adsorbé) exempt de facteurs II, VII, IX et X et contenant du fibrinogène.Le cas échéant, le facteur V du plasma à étudier pourra être complété par un ajout d'une quantité de facteur V telle que la teneur globale en facteur V provenant du plasma à étudier et de la source de facteur V soit inférieure ou égale à 40 % [pourcentage exprimé en facteur V dans 1 ml de plasma humain normal (i.e. plasma de sujet sain), la teneur en facteur V dans 1 ml de ml de plasma humain normal étant évaluée à 100 X]. Cet ajout de facteur V est recomnandé lorsque l'on se propose d'analyser un plasma synthétique ou hémisynthdtique dépourvu de facteur V et il peut intervenir au stade 10) et, mieux, au stade 20) dans la source de facteur V. Le seuil maximal de 40 Xlml pour la teneur globale en facteur V est inférieure au seuil minimal de 50 %/ml préconisé dans EP-A-O 217 768 précité. En pratique, la teneur globale en facteur V sera comprise entre 25 et 40 %/ml. Lorsque la teneur globale en facteur V est inférieure à 25 Xlml le dosage selon l'invention est trop dépendant du facteur V ; lorsque cette teneur est supérieure à 40 %/ml elle ne modifie plus les résultats des dosages dthéparinémie selon l'invention (voir à cet effet les résultats comparatifs donnés à l'exemple 6 ci-après). En bref, grâce à l'utilisation de polylysine, le procédé de l'invention permet de doser directement lthéparinémie sur des plasmas très déficients en facteur V ayant une teneur au moins égale à 25 Z de facteur V/ml et mieux une teneur de l'ordre de 40 X de facteur V/ml qui dénote déjà de graves troubles au niveau de l'hemoetase chez le patient. En ce qui concerne le moyen b), la polylysine, on peut faire appel à toutes les formes de polylysine : les formes D, L et DL ayant un poids moléculaire supérieur à 8 000 daltons. Les polylysines ayant un poids moléculaire inférieur à 8 000 daltons n'entraInent pas de coagulation selon le procédé de dosage de l'invention. De façon avantageuse les polylysines utilisées auront un poids moléculaire compris entre 14 000 et 300 000 daltons. De façon pratique, on préfère plus particulièrement les polylysines de forme D ayant un poids moléculaire de 100 000 à 200 000 daltons, qui sont notamment commercialisées par la société dite SIGMA. La quantité de polylysine que l'on préconise selon l'invention est celle qui correspond à la concentration optimale en polylysine de 20 à 80 g/ml de milieu à analyser contenant de l'héparine tel que le plasma d'un patient, et mieux de 40Jcg/ml. Cette concentration optimale est obtenue par dilution d'une solution mère renfermant 1 mg/ml de polylysine dans de 1 'eau distillée. En ce qui concerne le moyen a) on utilisera avantageusement un mélange contenant du facteur II et du fibrinogène. Le facteur II ou prothrombine est utilisé ici de façon à rendre le dosage insensible au taux de facteur II du patient. Comme dans certains cas, le taux de ce facteur peut être très diminué chez certains patients, ledit facteur Il est utilisé selon l'invention à la concentration de 0,8 à 1,2 unités/ml de milieu à analyser contenant de 1 'héparine, notamment un plasma à tester, (un plasma humain normal contient 1 unité/ml), et mieux à la concentration de 1 unitélml de milieu à analyser contenant de 1 'héparine, notamment le plasma d'un patient.Convient notamment selon l'invention le facteur II commercialisé sous la nomenclature de "PROTHROMBINE PURIFIEE STAGO" par la société dite DIAGNOSTICA STAGO (référence No 0548 du catalogue de cette société). Le fibrinogène est utilisé ici de façon à rendre le dosage insensible au taux de fibrinogène du patient. Il est ajouté selon l'invention à raison de 1 à 3 mg/ml de milieu liquide à analyser, notamment un plasma à tester,(un plasma normal contient 2 à 4 mg/ml de fibrinogène). De préférence on utilisera 2 mg de fibrinogène par ml de milieu à analyser contenant de l'héparine, notamment un plasma à tester. Le facteur Xa qui intervient lors du stade 10), est avantageusement utilisé à la concentration de 0,3 à 10 Unités par ml de milieu à analyser et de préférence à la concentration de 1 Unité/ml (notamment dans du tampon glycine). Convient notamment selon l'invention le facteur Xa commercialisé sous la nomenclature de "FACTEUR Xa BOVIN PURIFIE STAGO" par la société dite DIAGNOSTICA STAGO (référence No. 0972 du catalogue de cette société). D'autres ingrédients peuvent intervenir en association avec les moyens a), b) et le cas échéant c) mis en oeuvre au stade 20). Il s'agit essentiellement d'ingrédients usuels dans le domaine des dosages et en particulier celui de l'héparinémie intervenant soit comme inhibiteurs de certains facteurs, soit comme substances utiles pour rendre le dosage de l'héparinémie insensible à certains autres facteurs du plasma du patient à analyser, ou encore, des charges essentiellement organiques qui résultent de l'utilisation c'aides de lyophilisation lors de la préparation des divers ingrédients dudit stade 2 ). Conviennent notamment - l'hirudine qui est ajoutée eu regard à ses propriétés d'inhibiteur spécifique de la thrombine et qui offre l'avantage de ne pas inhiber l'activité du facteur Xa ; lthirudine est incorporée au réactif du stade 20) à la dose de 0,6 à 1,4 ATU/ml (i.e. unité antithrombine par ml) et mieux à la dose de 1 ATU/ml de milieu à Bn$er contenant de l'héparine ; convient notamment lthirudine commercialisée sous la nomenclature de "HIRUDINE STAGO" par la société dite DIAGNOSTICA STAGO (référence No. 0830 du catalogue de cette société); et, - les charges qui résultent de l'utilisation d'agents intervenant dans la préparation des ingrédients dudit stade 20) par lyophilisation ; parmi celles-ci on peut notamment citer la glycine, l'albumine et la nipagine. MEILLEUR MODE Le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention que l'on préconise ici consiste au stade 10) à ajouter à 1 volume du milieu liquide contenant de l'héparine que l'on souhaite analyser, dans le cas d'espèce un plasma à tester, 2 volumes d'une préparation liquide dans du tampon slYctne de facteur Xa, ledit facteur Xa étant présent à la dose de @ V/ml du milieu à analyser; puis à procéder à une incubation pendant 40 à 120 secondes à 35390C, de préférence pendant 60 secondes à 370C. Le cas échéant, avant l'addition du facteur Xa au milieu à analyser contenant de l'héparine, on peut introduire de l'antithrontine III (en abrégé : AT III). Ce produit est ajouté pour rendre, si cela est nécessaire, le dosage de l'héparinémie insensible au taux d'AI III du plasma du patient à analyser; de façon avantageuse, on utilisera dans ce cas 1'AT III à la dose de 0,5 à 1 U/ml de milieu à analyser contenant de l'héparine. Une telle addition, qui n'est pas essentielle quand on veut analyser un plasma de mammifère qui contient en général du facteur V, est requise au stade 1 ) quand on souhaite analyser la teneur en héparine dans un milieu synthétique tel que i 'eau contenant de i 'héparine. au stade 20) à ajouter à l'incubant ainsi obtenu le réactif déclenchant la coagulation constitué par un mélange al) de fibrinogène à la concentration de 1 mg/ml de plasma à analyser contenant de l'héparine (soit 0,5 U/ml de réactif), a2) de facteur II à la concentration de 0,8 à 1,2 U/ml de plasma à analyser (soit 0,4 à 0,6 U/ml de réactif), de préférence, à la concentration de 1 U/ml de plasma à analyser (soit 0,5 U/ml de réactif), b) de polylysine de forme D, ayant un poids moléculaire de 100 000 à 200 000 daltons, à la concentration de 20 à 80 g/ml de plasma à analyser (soit 10 à 40 g/ml de réactif), de préférence à la concentration de 40 g/ml de plasma à analyser (soit 20fzg/ml de réactif), c) le cas échéant, d'une source de facteur V choisie parmi l'ensemble constitué par le facteur V, le sérum de boeuf exempt de facteurs II, VII, IX et x et de fibrinogène, le plasma humain ou bovin exempt de facteurs II, VII, IX et X contenant du fibrinogène et leurs mélanges, de telle façon que la teneur globale en facteur V apportée par ladite source de facteur V et le plasma à analyser soit inférieure ou égale à 40 %/ml de plasma à analyser contenant de i 'héparine, et si nécessaire, - de l'hirudine à la concentration de 0,6 à 1,4 ATU/ml de plasma à analyser (soit 0,3 à 0,7 ATU/ ml de réactif); ledit réactif du stade 20) étant ajouté audit incubat à raison de 2 volumes dudit réactif pour 1 volume de plasma à analyser contenant de l'héparine. Suivant ce meilleur mode, le mélange du stade 10) est effectué à 370C, puis l'incubation est réalisée toujours à 370C de préférence pendant 60 secondes. Le cas échéant, on peut incorporer au milieu liquide à analyser contenant de l'héparine, de 1'AT III, comme indiqué plus haut, avant l'introduction du facteur Xa, 1'AT III intervenant dans ce cas à la concentration de 0,5 à 1 U/ml de plasma à analyser. Suivant l'invention l'étalonnage et les dosages sont effectués (i) sur plasma pur pour déterminer l'effet anti-Xa du complexe héparine-AT III, et (fi) sur plasma dilué [notamment au tiers (1/3) dans du sérum physiologique (solution de NaCl 0,15 M - i.e. NaCl à 9 g/l -)] pour déterminer l'effet anti-Xa du complexe héparine de bas poids moléculaire (HBPM)-AT III. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de réalisation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. m3 I Dans un tube à hémolyse maintenu à 370C on introduit - du plasma humain (dilué ou non) 0,050 ml - du facteur Xa........................ 0,100 ml On incube à 370C pendant 60 secondes puis introduit - le mélange du stade 20) (i.e. le réactif déclenchant la coagulation) comprenant le fibrinogène (1 mg/ml de plasma), le facteur II (1 U/ml de plasma) et la polylysine (40/g/ml de plasma) 0,100 ml On note les temps de coagulation qui figurent dans le tableau I ci-après. TAHLAU I Héparine (UI/ml) 0,0 0,2 0,4 0,6 remps de coagulation (secondes) 20 33,5 58 95 On trace ensuite la courbe d'étalonnage sur du papier semilogarithmique et obtient la courbe 1 de la figure 1 ci-après déterminée sans apport de facteur V (moyen c). La figure 1 comprend le temps T (en secondes) de coagulation donné en ordonnées en fonction de la concentration de l'héparine Hep (en unités internationales/ml) portée en abscisses. EXEMPLE 2 On procède comme indiqué à l'exemple 1 ci-dessus en ajoutant du facteur V (jusqu'à une teneur globale en facteur V égale à 40 Z/ml de plasma), puis note les temps de coagulation qui figurent dans le tableau II ci-après. TABLEAU II Héparine (UI/ml) 0,0 0,2 0,4 0,6 Temps de coagulation (secondes) 20 32 50 83 La courbe d'étalonnage correspondante est la courbe 2 de la figure 1 précitée. BZmB 3 On prépare le mélange du stade 2 ) à partir des ingrédients suivants où les concentrations sont exprimées par ml de plasma à étudier. - Fibrinogène 1 mg/ml - Facteur II 0,8 U/ml - Polylysine 20 g/ml - Source de facteur V de façon que l'apport en facteur V soit inférieur ou égal à 40 %/ml EXEMPLE 4 On prépare le mélange du stade 20) à partir des ingrédients suivants où les concentrations sont exprimées par ml de plasma à étudier. - Fibrinogène 3 mg/ml - Facteur II 1,2 U/ml - Polylysine 80A g/ml - Source de facteur V de façon que l'apport en facteur V soit inférieur ou égal à 40 %/ml EXEMPLE 5 On prépare le mélange du stade 20) à partir des ingrédients suivants. La présente formulation correspond à la préparation de réactif déclenchant la coagulation pour 1 000 flacons - Fibrinogène (commercialisé par la société dite KABI) 1 g - Facteur II ("PROTHROMBINE PURIFIEE STAGO", réf. 0548) 500 U - Polylysine (commercialisée par la société dite SIGMA, réf.P 0899) 0,020 g - Source de facteur V (plasma de boeuf adsorbé exempt de facteurs II, VII, IX et X et contenant du fibrinogène) 50 ml - Albumine bovine 5 g - Eirudine ("HIRUDINE STAGO", réf. 0830) 500 ATU - Glycine 20 g - Nipagine 0,300 g La durée de préparation qui tient compte de la fabrication proprement dite dudit mélange et des contrôles est de trois heures. EXEMPLE 6 On a étudié l'influence de l'apport de facteur V en utilisant la composition de I'exemple 5 avec la différence que la source de facteur V était remplacée par du facteur V (plasma de boeuf adsorbé exempt de facteurs II, VII, Ix et X et contenant du fibrinogène) à des doses croissantes allant de O à 100 Z de facteur V par mi de plasma. On introduit dans le mélange du stade 20) une quantité de facteur V, qui correspond à un taux de O X, 20 X, 50 X et 100 Z de facteur V par ml de plasma ; puis le réactif déclenchant la coagulation est ajouté à un plasma hépariné (contenant 0,20 UI/ml d'héparine et O %, 15 %, 30 Z , 50 % et 100 % de facteur V par ml de plasma). Les résultats des mesures d'héparinémie (en Ui/ml) sont consignés dans le tableau III ci-après et représentés par la figu- re 2 qui donne la concentration d'héparine Hep (en UI/ml), en ordonnées, dans le plasma d'essai telle que mesurée, en fonction du taux de facteur V (en abrégé "F.V", exprimé (en Z/ml de plasma), en abscisses, apporté dans le réactif déclenchant la coagulation, les courbes 3,4,5,6 et 7 correspondant respectivement aux taux plasmatiques de 0, 15, 30, 50 et 100 Z/ml de plasma. TaRTRAn In Taux plasmatique Héparinémie (UI/ml obtenue en fonc de F.V (%) tion du taux de facteur V (%) apporté dans le réactif/ml de plasma 0 % 20 % 50 % 100 % 0,29 0,22.1 0,19 0,21 15 0,25 0,21 0,19 0,20 30 0,23 0,20 0,19 0,19 50 0,22 0,20 0,19 0,21 100 0,20 0,20 0,20 0,20 Les valeurs données dans le tableau III mettent en évidence que le taux de facteur V du plasma à analyser n'influence pas les résultats relatifs à l'héparinémie si le mélange du stade 2 ), c'est-à-dire le réactif déclenchant la coagulation apporte 25 à 40 % (de préférence 40 %) de facteur V par ml de plasma. Selon l'invention on préconise un nécessaire, une trousse ou- un kit de dosage contenant ltensemble des ingrédients intervenant dans le dosage de l'héparine selon le procédé sus-visé. Ledit nécessaire comporte notamment le facteur Xa, qui intervient au stade 10) et le cas échéant 1'AT III qui intervient éventuellement au stade 1 ), le fibrinogène et le facteur II, qui sont les moyens a) du stade 20), la polylysine, qui est le moyen b) dudit stade 20), le cas échéant la source de facteur V, qui est le moyen c) dudit stade 20), et si nécessaire l'hirudine, d'une part, et éventuellement les solvants de dilution requis, d'autre part. Dans ce nécessaire certains moyens du stade 2 ) pourront être rassemblés et/ou mélangés dans le mene conditionnement. REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage de l'héparine contenue dans un milieu liquide à analyser, notamnent un plasma, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes 10) on met en contact le milieu à analyser contenant de l'héparine avec le facteur Xa et on procède à une incubation ; et 20) l'incubat ainsi obtenu est mis en contact avec un mélange déclenchant la coagulation et constitué de : a) - une substance choisie parmi le facteur II, le fibrinogène et leurs mélanges, et b) - la polylysine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange déclenchant la coagulation renferme en outre c) - une source de facteur V telle que la teneur globale en facteur V apportée par ladite source de facteur V et le milieu à analyser contenant de 1 'héparine soit inférieure ou égale à 40 Z/ml de milieu à analyser contenant de l'héparine. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la polylysine intervenant dans le mélange déclenchant la coagulation du stade 20) est une polylysine de forme D, L ou DL, ayant un poids moléculaire supérieur à 8 000 daltons. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la polylysine intervenant dans le mélange déclenchant la coagulation du stade 20) est une polylysine de forme D, L ou DL, ayant un poids moléculaire compris entre 14 000 et 300 000 daltons. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisé en ce que ladite polylysine est de forme D et a un poids moléculaire compris entre 100 000 et 200 000 daltons. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le facteur Xa intervenant au stade 10) est utilisé à une dose de 0,3 à 10 Unités/ml de milieu à analyser. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée pendant 60 secondes à 370C. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange déclenchant la coagulation du stade 20) comprend ai) 0,8 à 1,2 Unités de facteur II par ml de milieu à analyser contenant de l'héparine, a2) 1 à 3 mg de fibrinogène par ml de milieu à analyser contenant de l'héparine, b) 20 à 80 g de polylysine par mi de milieu à ana lyser contenant de llhéparine, c) le cas échéant, une source de facteur V choisie parmi ltensemble constitué par le facteur V, le sérum de boeuf exempt de facteurs II, VII, IX et X et de fibrinogène, le plasma humain ou bovin exempt de facteurs II, VII, IX et X contenant du fibrino gène et leurs mélanges, de telle façon que la teneur globale en facteur V apportée par ladite source de facteur V et le milieu à analyser con tenant de l'héparine soit inférieure ou égale à 40 % par ml de milieu à analyser contenant de l'héparine. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le mélange déclenchant la coagulation du stade 20) comprend en outre de l'hirudine à la concentration de 0,6 à 1,4 AIU/ml de milieu à analyser contenant de l'héparine. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que avant l'addition de facteur Xa au milieu à analyser contenant de l'heparine, on introduit au stade 10) de l'antithrombine III à la concentration de 0,5 à 1 U/ml de milieu à analyser contenant de l'héparine. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes au stade 10) ajouter à 1 volume du milieu à analyser contenant de 1 'héparine 2 volumes d'une préparation liquide dans du tampon glycine de facteur Xa, ledit facteur Xa étant présent à la dose de 1 U/ml du milieu à analyser; puis procéder à une incubation pendant 40 à 120 secondes à 35390C, de préférence pendant 60 secondes à 370C au stade 20) ajouter à l'incubant ainsi obtenu le réactif déclenchant la coagulation qui est constitué par un mélange al) de fibrinogène à la concentration de 1 mg/ml de milieu à analyser contenant de l'héparine, a2) de facteur II à la concentration de 0,8 à 1,2 U/ml de milieu à analyser, de préférence à la concentration de 1 u/ml de milieu à analyser, b) de polylysine de forme D, ayant un poids moléculaire de 100 000 à 200 000 daltons, à la concentration de 20 à 80rg/ml de milieu à analyser contenant de l'héparine, de préférence à la concentration de 40g/ml de milieu à analyser contenant de l'héparine, c) le cas échéant, d'une source de facteur V telle que la teneur globale en facteur V apportée par la dite source de facteur V et le milieu à analyser conte nant de 1 'héparine soit inférieure ou égale à 40 Z par ml de milieu à analyser contenant de l'héparine, et si nécessaire, - de l'hirudine à la concentration de 0,6 à 1,4 ATUlml de milieu à analyser contenant de 1 'hépari- ne, ledit réactif du stade 20) étant ajouté audit incubat à raison de 2 volumes dudit réactif pour 1 volume de milieu à analyser contenant de l'héparine. 12. Nécessaire de dosage contenant les ingrédients requis pour mettre en oeuvre le procédé de l'une quelconque des revendications i à 11.