Brevet FR2644038A1 — publié le 19900914

PREVENTION DE LA CONTAMINATION PAR AFLATOXINE DES CEREALES ET DES NOIX PAR APPLICATION D' ITURINE Champ de l'invention Cette invention se rapporte à une méthode pour empecher une contamination par aflatoxine des céréales et des noix en appliquant à celles-ci un mélange de peptide cyclique , nommé Iturine A Arrière-plan de l'invention L'aflatoxine est l'un des plus puissants carcinogènes parmi ceux connus jusqu'ici (Nihon Rinsyo , 39 (1) 135 (1981) . L'aflatoxine est un métabolite sécrété par les champignons producteurs d'aflatoxine comme l'Asperoillus flavus, Aspergillus parasiticus et 1'Aspergillus nomius et plusieurs autres semblables à ceux-ci renfermant de l'aflatoxine B1 et de l'aflatoxine G1 sont également connus. Parmi les céréales comme le froment , l'orge. le riz , le mais (grains) etc , et les noix comme les noisettes ,les amandes, les noix du Brésil , les cacahuètes, etc.. celles contaminées avec l'aflatoxine ont été d'couvertes (cf. A.. Assoc. Cernal Chemists Inc. 595 (1974) : An. Assoc. Cercal Chemists Inc. 603(1975) ; JAOCS , 980A ,Decembre (1981) ; J. Agric. Food chem. , 26 249(1978) Dtsch Lebensm Rudsch. , 76 , 47 (1980) ; Lebensm. Wiss. u . Technol ., 14 , 252 (1981) . Les microbes des chempignons producteurs d'aflatoxine sont supposés pouvoir s'étendre autour des zones où des moissons de ce genre sont cultivées et produites .Dans les zones tropicales et subtropicales par ticulibrement , d'assez nombreuses zones de culture ont été trouvées infectées et contaminées par ces champignons producteurs d'aflstoxine Quand les céréales et les noix sont cultivées dans un champ infecté par les champignons producteurs d' aflatoxine , la possibilité que les céréales et les noix produites soient aussi contaminées par l'aflatoxine est très élevée . Puisque de telles céréales et noix contaminées par l'aflatoxine posent un sérieux problème de santé beaucoup de pays ont strictement réglementé l'importation des céréales et des noix contaminées de façon à ce qu' elles n'entrent pas sur leurs territoires .C'est une mesure urgente d'empêcher la contamination par aflatoxine des céréales et des noix et de produire des céréales et des noix non contaminées par ces aflatoxines carcino gènes On sait que les aflatoxines peuvent être supprimées dans le sol (cf. Sail.Suc.Am. J. , 44 1237 (1980) et l'adsorption des aflatoxines par le sol et la participation de quelques microbes dans la suppression des aflatoxines sont supposées en être la cause . En outre, on a découvert que beaucoup de microbes peuvent réduire expérimentalement la quantité d'aflatoxine dans une solution test aqueuse dans laquelle 1' aflatoxine est dissoute (cf. J. Bact. , 93 464 (1967) ; J. gen . Microbiol. 54 , 185 (1968) ; Naturmissenschaften ,62 537 (1975) ; Proc. Jepan. Assoc. Mycogoxicol. 12, 33 (1980), Parmi ces microbes Flayobacterium surantiacum, Bacillus megaborium ; Corynebecterium rubrum, Penicillium islandicum, Stachybotrys Iobulara, Cunninghamelle echinulate, Streptococcus lactis et autres ont éte répertoriés comme des microbes éliminant un peu les aflatoxines dans la solution test Cependant , beaucoup des réductions des aflato- xines par les microbes mentionnés ci-dessus sont dues à l'adsorption de l'aflatoxine par les parois cellulaires des microbes (cf . J. gen . Microbiol. 54 185 (1968) ; J. Bac teriol., 93, 464 (1967) et de plus l'élimination d'aflatorine e pris place dans la solution test expérimentale la contenant.En référence à ces publications, 1a suppression de l'aflatoxine des céréales et des noix poussant dans les champs et la prévention de la contamination par aflatoxine de ces céréales et de ces noix n'ont pas pas encore été actuellement réalisées en faisant usage des microbes mentionnés ci-dessus De plus , la suppression de l'aflatoxine des céréales et des noix produites peut demander une grande quantité de microbes , ce qui ne convient pas aux denrées alimentaires . De plus , il est difficile d'éliminer complètement les aflatoxines qui sont présentes à l'intérieur des céréales et des noix .En outre , on ne sait si ces microbes sont nocifs ou non pour l'homme lorsqu' ils sont appliqués aux denrées alimentaires.Ils renferment peutitre des microbes associés aux problèmes d'hygiène tels que ceux d'onze pathogène. De plus. ils peuvent te d'une espèce telle que Steotococcus lactis qui demande une exigence nutritionnelle spécifique et en conséquence, ne convient pas au traitement des céréales et des noix alimentaires. Les substances suivantes ont également été testés pour empêcher la contamination par aflatoxine Anmonisque, (Transactions of the ASAE 1160(1977) ; Acide proprionique (Poult . Sci . 56 ,1630 ,I977) ; Bisulfite de Sodium (J. flood Prot . 43 ; 571 (1980) ; Dérivés de l'Acide benzoïque (Microbios ,31,93 (1981) Cannelle (J.Food Sci 42, 1107(1977) ; Epices (Z. Lebensm . Unters.Forsch. 171, 344 (1980) ; et des Pesticides Parmi ces substances , l'ammoniaque et l'acide proprionique sont employés pratiquement pour empêcher la contamination , Cependant, l'ammoniaque est strictement limitée au traitement des denrées alimentaires en raison de l'activité préventive insuffisante et de la coloration importante sur les moissons traitées , La prévention par l'acide proprionique n'est applicable ni à la pré-récolte ni à l'après-récolte et est seulement possible pour le stockage des moissons. Une substance nommée iturine A représentée par la formule suivante (I) : dans laquelle R est un radical alkyle, est connue conne un mélange de peptides ayant une acti vité anti.fongique contre les champignons phytopathogéniques (J. Antibiotics XXIX ,1043 (1976) ; Tetrahedron Lett . , 23 3065 (1982) ; Japa- nese Patent Application Laid-Open (KOKAI ) N , 59-212416). L'iturine A est identifiée comme un mélange de huit peptides dans lequel chaque R de la formule (I) est éthyle , propyle, l-ne'thylpropyle , 2- méthylpropyle, butyle , 3-méthylbutyle , pentyle , ou 3-me'thylpentyle On sait que le Bacillus subtilis ATCC 18774 produit de la bacillomycine-B qui est identique à l'iturine A (Proc. Soc. Exp. Biol . Med,67 539 (1948). Cependant , on ne sait pas Si l'iturine A inhibe à la fois la croissance des champignons producteurs d'aflatoxine et leur production d'aflatoxines De plus , la prévention de la contamination par aflatoxine par l'iturine A n'a pas, jusqu'ici, été rapportée Les présents inventeurs ont recherché les microorganismes présents dans le sol en différentes ré gions pour développer une méthode pour empecher la contamination par aflatoxine des céréales et des noix en utilisant un microbe qui soit sain et sans danger pour l'homme meme appliqué aux denrées alimentaires , et en conséquence ils ont trouvé des lignées faisant partie du Bacillus subtilis qui a été jusqu'ici étroite ment lié au champ de l'industrie des denrées alimentaires, lesquelles lignées peuvent réduire la quantité de l'aflatoxine dans la solution aqueuse et inhiber à la fois la croissance des champignons producteurs d'aflatoxine et leur production d'aflatoxines Maintenant , les inventeurs trouvent que certaines lignées de Bacillus subtilis produisent de 1'iturine A et que la substance inhibe fortement à la fois la croissance des champignons producteurs d'aflatoxine et leur production d'aflatoxines . De plus, l.'iturine A est trouvée être capable d'empêcher la contamination par aflatoxine des céréales et des noix D'autre part , R. Mann et coll. (Z.Lebensm. Unters - Forsch . 163 , 39 (1977) décrivent qu' il y a des lignées capables d'éliminer les aflatoxines parmi les B. subtilis (ATDC 5633 at ATCC 9372 ) .R.Mann et coll. décrivent d plus que 4D à 50 % de l'aflatoxine a été réduite dans une solution d'aflatoxine en 20 jours . Mais ,à un te degré de réduction , la suppression des eflatoxines des céréales et des noix poussant dans les champs ne peut pas être attendue . Suh décrit également une des lignées ci-dessus( ATCC 6633) supprimant la production d'aflatoxine par l'Asperaillus flavus . Cependant , l'tendue de la suppression est encore insuffisante . La lignée ATCC 6633 est connue pour produire un autre antibiotique mycosubti line qui diffère de l'iturîne A (Eur . J. Biochem. 77,61 (1977). D.T Wicklow et coll. (Phytophathology, 70 , 761 (1980) rapportent que 1'Aspergillus flavus peut être inhibé dans sa prolifération et son activité productrice d'aflatoxine en coexistence avec i'Asperqillus nipper ou le Trichoderma viride qui est connu pour ne pas produire de l'iturine A SOMMAIRE DE L'INVENTION :: Selon un aspect de l'invention ,une méthode est fournie pour empêcher la contamination par aflatoxine des céréales et des noix en leur appliquant de l'iturine A mentionnée ci-dessus , ce qui permet de fournir des céréales et des noix non contaminées par les aflatoxines et de les cultiver dans un champ infecté par les champignons producteurs d'aflatoxine De plus, selon l'autre aspect de l'invention une composition pour empêcher une contamination par aflatoxine des céréales et des noix, comprenant une teneur en iturine A définie ci-dessus produisant de l'effet en agriculture , est également fournie Un autre aspect de l'invention fournit encore une utilisation de l'iturine A pour fabriquer une composi tlon pour empêcher une contamination par aflatoxine des céréales et des noi DESCRIPTION DETAILLEE DES MODES DE REALISATION PREFERES Une iturine A préparée selon soit une méthode chimique soit une méthode biologique peut être appliquée dans la présente invention . La substance peut être produite d'une manière convenable par un procédé microbiologi que utilisant une lignée de Bacillus subtilis capable de produire de l'iturine A L'exemple de le lignée de Bacillus subtilis inclut une lignée NK -330 , une lignée NK -C - 3 , une lignée ATCC 10774 , et une lignée IAM 1145 .Les lignées NK-330 et NK -C-3 ont été déposées au Fermentation Research Institute , Tsukuba ,Ibsraki eu Japon , avec numéros d'accès FERM P- 9162 (date de dépôt;;30 janvier 1987 ) et FERM P-9404 (date de dépôt 6 JUin 1987) respectivement , qui ont été transformés le 27 Novembre 1987 en numéros d'accès FERM BP-1580 et FERM BP-1581 , respectivement, selon le traité de Budapest sur la Reconnaissance Internationale du Dépôt des Microorganismes pour l'Objet des Procédures de Brevet La culture pour la production de l'iturine A utilisant les microbes ci-dessus , peut btre habituellement appliquée dans un milieu liquide normal comme un milieu de culture de dextrose de pomme de terre , milieu de culture de bouillon nourrissant , avec addition possible de sels minéraux comme le diphosphate de potassium et le sulfate de magnésium ,de 20 à 300 C pendant 2 à 7 jours dans des conditions aérobiques avec mération, Après l'incubation , les cellules bactériennes ont été recueillies par centrifugation ou filtration pour obtenir im "surnaoeant" Après contration du "surnageant" 1 iturine A peut être isolée par une combinaison conve nubile d'une précipitation par un acide , une extraction par un solvant organique comme l'éthanol, et une chromato- graphie de partage ou d'adsorption sur gel de silice La prévention de la contamination par aflatoxine des céréales et des noix peut etre achevée en leur appliquant l'iturine A ainsi obtenue selon la présente invention .La méthode de la présente invention comprend aussi l'application d'une solution ou composition contenant de l'iturine A , un liquide de culture de celle-ct sans isolation de l'iturine A , et une lignée de B. subtilis capable de produire de l'iturine A per se Parmi les récoltes cibles, des exemples de céréales incluent le mais (grains ), le riz , le froment, l'orge et le millet queue-de-renard . Les noix peuvent être des cacahuètes ,des pistaches, des amandes ,des noisettes et des noix du Brésil .Les récoltes particulièrement importantes sont le mais (grains) , les cacahuètes , les pistaches et les amandes à cause des hauts risques de contamination par aflatoxine, Selon la présente invention, le contrôle de la contamination peut être achevé par le traitement des céréales et des noix par l'iturine A non- seulement durant leur stockage mais aussi avant et après la récolte . De plus, en vaporisant et en traitant les champs dans lesquels les céréales et les noix sont en train de pousser , leur protection d'une contamination par l'aflatoxine est possible . La contamination peut aussi être évitée en vaporisant et en traitant le champ dans lequel les céréales et les noix doivent être semées , ou en traitant les graines avec de I t iturine A avant de semer a Les mots " avant récolte" sont aussi dits "pré-récolte" ,ce qui signifie le temps depuis la fondation du fruit jusqu'à la récolte . "Aprèsrécolte -It également dit "post-récolte " signifie le temps depuis la récolte jusqu'au stockage. La teneur nécessaire d'iturine A dépend du procédé d'application de l'iturine A . En cas de traitement du champ avant de semer les céréales et les noix, il est préférable d'appliquer l'iturine A dans une teneur de 1 à 100 g par ha , ou une lignée de 10 à 10 cellules par ha . Pour une vaporisation sur les céréales et les noix en culture ou avant récolte, la teneur préférable d'iturine A est de l'ordre de 1 à 50 g par ha , ou une lignée de 10 à 10 cellules par ha est appliquée de marnière convenable . Les graines de céréales et de noix peuvent être enveloppées par trempage dans une solution de 1 à 50 MG/1 d'iturine A ou 106 b 108 cellules / 1 de la lignée .Après récolte ou durant le stockage , la contamination des céréales et des noix peut etre effectivement empêchée en ajoutant de 1'iturine A dans une proportion d'au moins 0,005S en poids , de préférence 0,01 à 0,05X en poids L'iturine A peut être appliquée aux récoltes comme une composition contenant une proportion de substance effective pour l'agriculture , qui constitue l'autre aspect de la présente invention . La composition peut être sous forme d'une solution ou d'une suspension diluée avec un diluant acceptable pour l'agriculture comme de l'eau ou d'autres solvants , et aussi ,après formulation , en poudre mouillable , émulsion , poudre ou granule .La forme d'appli cation peut être choisie selon le temps et le procédé d'application La poudre mouillable peut contenir de 5 à 20% en poids de l'iturine A , supportée sur un diluant accep table pour l'agriculture ,(appelé aussi support ) tel que l'argile , la bentonite , la silice , le charbon blanc ou 1'attapulgite mêlé à une substance suxiliaire telle que le sel de l'ester de l'acide sulfurique d'un alcool supérieur un sel d'ester de l'acide sulfurique d'un Ahcr alkyle supérieur, des sels de l'acide alkylbenzenesulfo nique , un sel d'ester de l'acide phosphorique d'un alcool supérieur, un produit additionnel d'un alcool sup(rieur et d'oxyde d'éthylene, un ester d'un acide gras de sorbitane et un sel d'un acide gras supérieur, et un produit propagateur tel que le dinaphthylméthanesulfonate de sodium, condensé de formaline , un sel de l'acide lignosulfonique ,une gomme et une méthylcellulose Pour préparer l'émulsion, l'iturine A peut être émulsifiée avec un diluant acceptable pour l'agriculture (également appelé liquide support ) tel que l'éthylèneglycol et la glycé rine aussi bien qu'une substance auxilliaire tel qu'un chlorure d'alkyle dimethylbenzylammonium dans un mélange d'un solvant tel que méthanol , éthanol , isopropanol , acetone et méthyléthylcétone avec un solvent polaire- tel que le dimethylformamide et le dimethylsulfoxide La poudre mouillable et l'émulsion ainsi obtenue peuvent entre appliqués aux récoltes après dilution par l'eau Pour le traitement direct avec une lignée de Bacillus subtilis , la lignée mélangée avec un diluant acceptable pour l'agriculture comme la dextrine ramifiée et séchée peut être mise en suspension avec un produit propagateur mentionné ci-dessus dans de l'eau de façon à ajuster la concentration dans la gamne de 105 à 107 cellules par ml. Dans le cas de culture liquide , la culture peut erre d'abord formulée en la séchant avec un diluant cité ci ossus et en lui ajoutant un propagateur. Ainsi , la culture formulte peut être suspendue et/ou dissoute dans de l'eau pour son application aux récoltes La présente invention sera décrite- , de plus , en détail avec référence aux exemples et exemples comparatifs qui suivent. Dans les tables suivantes , N.D. signifie que 1' aflatoxine n'a pas été détectée EXEMPLES PREPARATION DE L'ITURINE A Dans un flacon de 100 ml, on a ajouté 50 ml du milieu de culture montré en Table 1, puis on 1 stéri- lisé à 1200C pendant 15 minutes . Une pleine boucle d' une lignée de Bacillus subtilis NK -330 a été inoculee au milieu et incubée à 300C pour la nuit . La culture résultante (50 ml) a été inoculée à 7 litres du milieu de culture stérilisé ci-dessus placé dans un bocal de 10 litres pour fermenteur et incubée à 300C pendant 3 jours sous agitation (300 rpm ) et aération ( 1/2 vvm) La culture (7 litres ) a été centrifugée pour fournir 9,5 g de cellules bactériennes et 6 litres de liquide libre de cellules bactériennes .Le liquide a été concentré à 300 ml au moyen d'un évaporateur . Auprès addition d'l,2 litre de d'éthanol à 99,5X au concentré, le tout a été remué pour extraire les substances actives et centrifugé pour séparer l'extrait et le précipité . Le précipité a été en plus traité avec 1,5 litre d'éthanol à 80% et centrifugé pour séparer un extrait .Les extraits ont été combinés et sèchés sous pression réduite pour fournir 35, g d'une substance brune , La substance brune a été dissoute dans 500m1 d'eau et le pH de la solution a été ajusté à 4,0 où a lieu la précipitation Le précipité a été Tyophilisé pour fournir 4,18 g d'une poudre brune TABLE 1 Pomme de terre 200g Eau distillée 10009 Après ébullition dans une eau bouillante pendant 20 minutes environ , le mélange résultant a été filtré à travers une toile métallique pour séparer la masse solide de pomme de terre restante Glucose 209 pH 6,7 - 6,8 La poudre brune a été dissoute dans 200ml d'eau dont le pH a été ajusté à un pH alcalin en ajoutant de 1 'ammoniaque diluée.Après addition de 4,2 g de charbon actif , le mélange a été chauffé à 600C sous agitation pour adsorber les substances actives sur le charbon actif , Après filtrage , le charbon actif a été lavé avec 200 ml d'eau set alors les substances actives éluées avec 500 ml de propanol à 80% L'éluat a été concentré jusqu'à sec sous pression réduite pour fournir 770 mg d'une poudre légèrement brune * Après dissolution d'environ 300 mg de poudre dans 5ml d'éthanol , la solu tion d'éthanol a été soumise à une chromatographie sur colonne (gel de silice 60 colonne; 47 mm diamètre intérieur ) x 350 mm) utilisant 1,2 litre d'un mélange solvant d'éthanol/acide acétique/eau = 17 / 1 / 2 comme éluant. L'élust a été fractionné dans un volume de 15 ml et les substances actives ont été éluées entre les 30eme et 60eme fractions. Ces fractions ont été recueillies et concentrées jusqu'à sec par un évaporateur sous pression réduite . L'opération ci-dessus a été répétée trois fois pour donner 115 mg d'une poudre blanche grossièrement purifiée d'iturine A, Après dissolution de 5mg de poudre contenant des substances actives dans du méthanol ,la solution a été soumise à la chromatographie en phase liquide inverse (colonne : J4Bondasphare ODS , éluant : acétonitrile/ eau '= 2/3 , vitesse de flux : 8ml/min , longueur d'onde de détection : 210 nm ) et les fractions actives séparées ont été collectées.Cette purification chromatographique a été répétée 20 fois pour donner 79,1 mg d'iturine A purifiée en totalité sous forme de poudre blanche L'iturine A purifiée a été séparée en six fractions comme composants principaux des séparations par chromatographie en phase liquide inverse ci-dessus . Les six fractions ont été référencées comme A,B,C,D,E et F dans un ordre des temps de rétention et pesaient respectivement 22,2 mg , 15,7 mg, 23,1 mg , 10,7 mg , 4,9 mg, et 2,5 mg Chaque substance a été hydrolisée dans l'acide chlorydrique 6x à 110 C pendant 20 heures pour fournir un mélange d'acides aminés qui présente , en détection par TLC , des marques d'acide aspartique , d'acide glutamique, de proline , de tyrosine , de sérine , et une marque positive au test de ninhydrine qui est supposée être due à un acide aminé anormal ayant un temps de rétention plus long que celui de tout acide aminé normal . A l'analyse au moyen d'un analyseur automatique d'acides aminés , trois molécules d'acide aspartique , une molécule d'acide glutamique , une molécule de tyrosine, une molécule de proline, une molecule de sérine et quatre molécules d'ammoniaque ont été détectées pour une molécule de chaque substance . Ce résultat signifie que chaque substance de A à r comprend trois molécules d'asparagine , une molécule de glutamine , une molécule de tyrosine , une molécule de proline , une molécule de sérine. Le tableau 2 montre les spectres de masse FAB (les valeurs du pic parent, (M+H)+) , les spectres de 1H-RMN ( seulement le pic des protons méthyle à environ # 0,9 est cité ) et les spectres UV ( # max dans le méthanol) de ces substances. Dans les spectres 1H-RMN , chaque substance A à F montre une allure de sprectre pratiquement identique l'une à l'autre sauf pour l'allure du groupe méthyle dans le spectre 1H-RMN. L'allure du spectre de la substance A coincide avec celui d'un échantillon de référence. D'après ces résultats , il est confirmé que les substances de A à F sont identifiées comme des composés ayant les chaines latérales suivantes : A) R = -CH2 -CH2 -CH3 B) R = -CH(CH3)-CH2 -CH3 C) R = -CH2 - CH(CH3)2 D) R = -CH2-CH2-CH2-CH3 E) R = -CH2-CH2-CH(CH3)2 F) R = -CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 Table 2 Composés Masse Acides IM-RMN moléculaire aminés de UY (MeOH) (FAB-MASS) construction #(CH3) (# Max) A 1043 AspNH2 (GLu (NH2), 0,9 (3H,t) 278 Tyr , Pro ,Ser B 1057 " " (6H,m) C 1057 " " (6H,d) D 1057 " " (3H,t) " E 1071 " " (6H,d) F 1071 " "( 3H,t) ACTIVITE INHIBANTE DE L'ITURINE A POUR LA CROISSANCE DE L'ASPERGILLUS PARASITICUS NRRL 2999 Exemple 1 Dans un plat rond de laboratoire (diamètre 90 mm) a été placé un milieu agar de dextrose de pomme de terre contenant 0,01S de l'iturine A grossièrement purifiée obtenue ci-dessus . UNe pleine boucle d'une supension concentrée de spores (env. 10 spores / ml ) d'Asperqillus oarasiticus NRRL 2999 a été inoculée sur la partie centrale de la culture sur plaque dans le plat et incubée à 250C,, Le diamètre de la colonie a été déterminé avec l'intervalle de temps et tabulé dans la Table 3. Pour comparaison , la même suspension de spores a été inoculée sur une culture sur plaque du meme milieu agar de dextrose de pomme de terre dans lequel l'iturine A n'a pas été ajoutée (contrôle). TABLE 3 Diamètre de la colonie (mm) après 3 jours après 8 jours Controle 28 90 (assiette pleine) 0,01% d'iturine A 3 12 ACTIVITE INHIBANTE DE L'ITURINE A POUR LA PRODUCTION D' AFLATOXINE PAR L'ASPERCILLUS PARASITICUS NRRL 2999 EN MILIEU DE CULTURE Exemple 2 s A un milieu agar de dextrose de pomme de terre contenant 0,01 d'iturine A grossièrement purifiée obtenue ci-dessus, on a inoculé à peu prbs 50 spores d'Asperqillus parasiticus NRRL 2999 pour un plat rond de laboratoire et on a incubé à 250C . Les concentrations des aflatoxines B1 et G1 dans le milieu ont été déterminées avec l'intervalle de temps et tabulées dens la Table 4 , avec en même temps les résultats sans addition d'iturine A (contrôle). TABLE 4 Concentration des aflatoxines B1 (ppb) G1 (ppb) 4 jours 9 jours 4 jours 9 jours contrôle 9720 - 8000 0,01% d'iturine A N.D. N.D. N.D. N.D. - 1 non déterminé ACTIVITE INHIBANTE DE L'ITURINE A POUR LA PRODUCTION D' AFLATOXINE PAR L'ASPERGILLUS PARASITICUS NRRL 2999 DANS 1 LES CACAHUETES Exemple 3 Des petits -grains de cacahuète,de la variété des Etats-Unis Florunner , récoltés en 1986 aux Etats-Unis , ont été trempés dans de l'eau pendant deux heures environ ,(coefficient d'absorption d'eau : environ 50% 1 et ensuite 15 g de cacahuète trempée ont éte intoduits dans un erlenmever ue l'Iturine A a éte ajoutée aux grains de cacahuète dans une proportion de 0,005 , 0,01 et 0,1S en poids par flacon et ensuite l'Aspergillus parasiticus NRRL 2999 à éte inoculé à cela ,environ 20 spores par flacon. Incubant à 2 > C les quantités d'aflatoxine B1 (table 5 -1) et G1 (table 5-2) dans les grains de cacahuète ont eté déterminées avec les intervalles de temps . il a eté trouvé que dans les cacahuètes auxquelles l'iturine A était ajoutée, la production des aflatoxines B1 et G1 a été remarquablement réduite en comparaison à celle de l'exemple comparatif 1. L'iturine A a donc effectivement inhibé la production d'aflatoxines B1 et G1. Ainsi , l'Exemple comparatif 1 a déterminé les teneurs d'aflatoxine fournie lorsque T'iturine A n'a pas été ajoutée. mais que soulement A. parasitiqus NRRL 2999 avait été inoculé. Table 5-1 Quantité d'aflatoxine B1 (ppm) Jours 5 7 10 Ex. 3 (0,005%) 0,01 0,05 0,91 (0,01%) trace trace trace " (0,1%) N.D. N.D. N.D. Ex. Comp 1 11,30 17,80 24,70 Table 5 - 2 Quantité d'aflatoxine G1 (ppm) J oors 5 7 10 Ex. 3 (0,005%) 0,12 0,87 1,56 " ( 0,01S ) trace trace trace (0,1% ) N.D N.D N.D EX.Comp 1 12,90 23,50 37,50 ACTIVITE INHIBANTE DE L'ITURINE A POUR LA PRODUCTION D'AFLATOXINE PAR L'ASPERGILLUS FLAVUS NRRL 3357 DANS LES CACAHUETES Exemple 4 Ues petits grains de cacahuète,de la variété des Etats-Unis Florunner , récoltés en 1986 aux Etats-Unis ont été traités de la même manibre que décrite dans l'exemple 3 . 15 g de cacahuètes trempées ont alors été introduits dans un erlenmeyer , L'iturine- A a été ajoutée aux cacahuètes dans une proportion de 0,005 , 0,01 et 0,1S en poids par flacon, puis on a inoculé dedans Aspergillus flavus % raison d'environ 20 spores par flacon. Incubant % 250C, les quantités d' aflatoxine B1 (Table 6) des cacahuètes ont été déterminées avec l'intervalle de temps . On a trouvé que dans les cacahuètes auxquelles l'iturine A a été ajoutée la production de l'aflatoxine B1 a été remarquablement réduite en comparaison à celle de l'exemple comparatif 2 .Donc l'iturine A a effectivement inhibé la production d 'aflatoxine B1 Ainsi , l'exemple comparatif 2 a déterminé les quantités d'aflatoxine lorsque i 'iturine A n'a pas été ajoutée mais que 1'A. Flavus NRRL 3357 seulement était inoculé. Table 6 Quantité d'aflatoxine B1 (ppm) Jours 5 7 10 Ex, 4 (0,005S) 0,21 0,55 1,75 " (0,01%) trace trace trace " (0,1%) N.D. N.D, N.D. Ex . Comp 2 15,20 30,60 48,7 ACTIVITE INHIBANTE DE L'ITURINE A POUR LA PRODUCTION D' AFLATOXINE PAR L'ASPERGILLUS PARASITICUS NRRL 2999 DANS LE FIS Exemple 5 Environ 15 g de grains de mats disponible dans le commerce pour la consommation alimentaire ont été introduits dans un erlenmeyer . De l'iturine A a été ajoutée aux grains dans une proportion de 0,005 ,O,Ol et 0,1% en poids par flacon , puis de l'AsPernillus parasiticus NRRL 2999 a été inoculé à celui-ci ,20 spores par flacon environ. Incubant è 250 C , les quantités d'aflatoxines 81 (Table 7-1) et G1 (Table 7-2) dans les grains de maïs ont été déterminées avec les intervalles de temps .On a trouvé que dans le grain auquel de l'iturine A a été ajoutée , la production des aflatoxines Bl et G1 était remarquablement réduite en comparaison à celle de l'exemple compara tif 3. Donc , 1'iturine A a effectivement inhibé la production des aflatoxines 81 et G1 Ainsi , l'exemple comparatif 3 a déterminé les quantités d'aflatoxine lorsqw T'iturine A n'a pas té ajoutée mais que seulement IA. parasitious NRRL 2999 tait inoculé. Table 7-1 Quantité d'aflatoxine BI (ppm) Jours 5 7 10 Ex. 5 (0,005 %) 0,01 0,07 0,14 (0,01%) trace trace trace " (0,1%) N.D N.D N.D Ex. Comp. 3 3,20 4,50 6,70 Table 7-2 Quantité d'aflatoxine G1 (ppm) Jours 5 7 10 Ex. 5 (0,005%) trace trace 0,10 (0,01%) trace trace trace " (0,1%) N.D N.D N.D Ex. Comp 3 4,20 6,70 9,10 ACTIVITE INHIBAS E DE L'ITURINE A POUR LA PRODUCTION D' AFLATOXINE PAR L'ASPERGILLUS FLAVUS NRRL 3357 DANS LE MAïS Exemple 6 : Environ 15 g de grains de maTs disponibles dans le commerce sont introduits dans un erlenmeyer . De l'iturine A a été ajoutée aux grains de mats dans une proportion de 8,005 , 0,01 et 0,1% en poids par flacon puis de l'Aspergillus flavus NRRL 3357 a été inoculé à cela ,à environ 20 spores par flacon .Incubant à 250C , les quantités d'aflatoxine B1 (Table 8) des grains de maïs ont été déterminées avec les intervalles de temps . On a trouvé que dans le grain auquel l'iturine A a été ajoutée, la production d'aflatoxine B1 8 été considérablement réduite en comparaison à celle de l'exemple comparatif 4 . Donc , l'iturine A a effectivement inhibé la production de l'aflatoxine B1 Ainsi , l'exemple comparatif 4 a déterminé les quantités d'aflatoxine lorsque l'iturine A n'a pas ité ajoutée, ars que seulement l'A. flavus NRRL 3357 était inoculé Table 8 Quantité d'aflatoxine Bl(ppm) Jours 5 7 10 Ex. 6 (0,005%) trace O,11 0,54 (0,01%) trace trace trace " (0,1%) N.D N.D N.D Ex.Comp. 4 5,80 7,10 12,10 ACTIVITE INHIBANTE POUR LA PRODUCTION D'AFLATOXINE DE L' ASPERGILLUS PARASITICUS NRRL 2999 DANS LES CACAHUETES. Exemple 7 : Des petits grains de cacahuète, de la variété Natalcommon ' récoltés en 1986 en Afrique du Sud ont été trempés dans de l'eau pendant environ 2 heures, (coefficient d'absorption : environ 5DS) et ensuite 15 g des cacahuètes trempées ont été introduits dans un erlenmeyer puis stérilisés à 1210C pendant 15 minutes dans un autoclave . La lignée NK -330 (exemple 7-1) ou la lignée ATCC 10774 (Exemple 7-2) du Bacillus subtilis 7 environ 200 cellules par flacon , a étéinoculée aux cacahuètes stérilisées, avec de l'Aspergillus parasiticus NRRL 3357 à 20 spores par flacon environ . Incubant à 250C ' les quantités d'aflatoxines B1 (Table 9-1) et G1 (Table 9-2) dans les cacahuètes ont été déterminées avec l'intervalle de temps. On a trouvé que dans les cacahuètes auxquelles on a ajouté ~ subtilis NK-330 ou ATCC 10774 ,la production des aflatoxines B1 et G1 a été remarquablement réduite en comparaison à celle de l'exemple comparatif 5-1, 5-2, et 5-3 . Donc, les lignées ont effectivement inhibé la production d'aflatoxine B1 et G1 Ainsi , l'exemple comparatif 5-i a déterminé les quantités des aflatoxines lorsque le B.subtilis n'avait pas été ajouté, mais que l'A. parasiticus NRRL 2999 seulement était inoculé. Dans les exemples comparatifs 5-2 et 5-3 la lignée de B. Subtilis a été remplacée par la lignée de B. subtilis IAM 1026 et Pseudomonas seruginosa (lignée) IAM 1514 , respectivement .Ces lignées ont montré seulement une faible inhibition de la production des aflatoxines B1 et G1 Table 9 - l quantité d'aflatoxine B1 (ppm) Jours 3 5 7 Ex. 7-1 trace 1,70 2,80 Ex. 7-2 3,00 4,30 3,29 Ex. Comp. 5-1 4,70 59,3 43,3 Ex. Comp. 5-2 1,80 38,2 34,9 Ex. Comp. 5-3 4,15 7,60 11,8 Table 9 - 2 Quantité d'Aflatoxine Gl(ppm) Jours 3 5 7 Ex. 7-1 trace 3,54 5,81 Ex. 7-2 trace 5,87 7,31 Ex. Comp. 5-1 6,84 61,9 52,7 Ex. Comp. 5-2 4,72 51,8 44,1 Ex.Comp. 5-3 trace 10,1 13,4 ACTIVITE INHIBANTE POUR LA PRODUCTION D'AFLAT OXINE PAR L'ASPERGILLUS FLAVUS NRRL 3357 DANS LES CACAHUETES Exemple B : Des petits grains de cacahuète , de la variété Natalcommon , récoltés en 1986 en Afrique du Sud ont été traités de la même manibre que celle décrite dans l'exem- ple 7 et 15 g de cacahuètes trempées ont ensuite été introduites dans un erlenmeyer suivi d'une stérilisation à 1210C pendant 15 minutes dans un autoclave .La lignée NK-330 (exemple 8-1) ,ou la lignée ATCC 10774 (Exemple 8-2) de Bacillus subtilis, environ 200 cellules par flacon a été inoculée aux cacahuètes stérilisées avec L 'Asper- gillus flavus NRRL 3357 , environ 20 spores par flacon Incubant à 25 C , les quantités d'aflatoxine B1 (table 10) dans les grains de cacahuète ont été déterminées avec l'intervalle de temps . On a trouvé que dans les cacahuètes auxquelles le B. subtilis NK -330 ou ATCC 10774 a été ajouté la production de l'aflatoxine B1 a été remarquablement réduite comparée à celle des exemples comparatifs 6-1 6-2 et 6-3 . Les lignées ont donc effectivement inhibé la production de 1' aflatoxine B1. Ainsi , l'exemple comparatif 6-1 a déterminé les quantités de l'aflatoxine lorsque les lignées de B.subtilis n'ont pas été ajoutées, mais que 1 ' A. flavus NRRL 3357 seulement était inoculé . Dans les exemples comparatifs 6-2 et 6-3 , le B.stlbtilis a été remplacé par le B.subtilis (lignée) IAM 1026 et le Pseudomonas aeruni- nosa (lignée) IAM 1514 , respectivement . Ces lignées ont montré seulement une faible activité inhibante de la production de l'aflatoxine B1. Table 10 Quantité d'Afletoxine Bl(ppm) Jours 3 5 7 Ex. 8-l trace 1,47 2,75 Ex. 8-2 2,85 5,76 6,33 EX. Comp. 6-1 7,98 72,6 51,6 Ex. Comp 6-2 3,09 48,2 31,1 Ex. Comp. 6-3 4,57 7,69 17,8 ACTIVITE INHIBANTE POUR LA PRODUCTION D'AFLATOXINE PAR L' ASPERGILLUS PARASITICUS NRRL 2999 DANS LE MAIS Exemple 9 15 9 environ de grains de iaTs disponibles dans le commerce pour la consommation alimentaire ont été introduits dans un erlenmeyer .La lignée NK-330 (exemple 9-l) ou la lignée ATCC 10774 (exemple 9-2) de Bacillus subtilis , environ 200 cellules par flacon , a été inoculé au grain avec l'Asperaillus parasiticus N6RL 2999 , environ 20 spores par falcon Incubant 9 250 C , les quantités d'aflatoxines Bî (table 11-1) et G1 (table 11-2) dans les graines de naTs ont été déterinées avec l'intervalle de temps . On a trouvé que dans les grains auxquels B.subtilis NK -330 ou ATCC 10774 a ajouté la production d'aflatoxines B1 et G1 a été considérablement réduite en comparaison à celle des exemples comparatifs 7-1 ,7-2 et 7-3 .Donc, les lignées ont effectivement inhibé la production des aflatoxines B1 et G1 Ainsi , l'exemple comparatif 7-1 a déterminé les quantités d'aflatoxine lorsque les B. subtilis n'étaient pas ajoutés mais que 1'A. parasiticus NRRL 2999 seulement était inoculé . Dans les exemples comparatifs 7-2 et 7-3 , la lignée de B.subtilis a été remplacée par la lignée IAM 1026 de 8. subtilis et la lignée IAM 1514 de Pseudomonas- aeruginosa respectivement . Ces lignées ont montré seulement une faible inhibition de la production des aflatoxines B1 et Gî Table 11-1 Quantité d'Aflatoxine B1 (ppm) Jours 3 5 7 Ex. 9-1 trace 0,98 3,27 Ex. 9-2 1,16 3,85 4,88 Ex. Comp. 7-1 4,20 45,1 39,4 Ex. Comp 7-2 2,00 30,4 29,1 Ex. Comp. 7-3 3,01 9,31 14,3 Table 11-2 Quantité d'aflatoxine G1 (ppm) Jours 3 5 7 Lx. 9-1 trace 4,02 5,20 Ex. 9-2 trace 6,02 8,09 Ex.Comp. 6-1 7,83 70,11 58,2 Ex. Comp. 6-2 4,55 53,8 40,7 Ex.COmp. 6-3 I,19 14,-S 20,7 ACTIVITE INHIBANTE POUR LA PRODUCTION D'AFLATOXINE DE L'ASPER GILLUS FLAVUS NRRL 3357 DANS LE nAIs Exemple 10 Environ 15 g de grains de maïs commercialement disponibles pour la consommation elimentaire ont été introduit dans un erlenmeyer . La lignée NK -330 (exemple 10-1) ou la lignée ATCC 10774 (Exemple 10-2) de Bacillus subtilis , environ 200 cellules par flacon, a été inoculée au train avec l'Asoerqilîus flavus NRRL 3357, environ 20 spores par flacon . Incubant à 250C , les quantités d'aflatoxine B1 (Table 12) dans les grains de maïs ont été déterminées avec l'intervalle de temps .On a trouvé que dans le "aTs auquel le B.subtilis NK -330 ou ATCC 10774 a été ajouté la production de l'aflatoxine B1 a été réduite d'une manière remarquable comparée à celle des exemples comparatifs 8-1 ,8-2 et 8-3 . Donc , les lignées ont effectivement inhibé la production d'aflatoxine B Ainsi , l'exemple comparatif B-1 a déterminé les quantités d'aflatoxine lorsque les lignées de B.subtilis n'étalent pas ajoutées , mais que l'A.Flavus NRRL 3357 seulement était inoculé . -Dans les exemples comparatifs 8-2 et 8-3 , la lignée de B, subtilis a été remplacée par / le B.subtilis IAM 1026 (lignée) et lePseudomonas seruginose (lignée) IAM 1514, respectivement Ces lignées ont montré seulement une faible acivité inhibante de la production de l'aflEtoxine B1 Table 12 Quantité d'Aflatoxine Bl(ppm) JOurs 3 5 7 Ex. 10-1 trace 0,B2 2,42 Ex. 10-2 3,26 7,B7 8,99 Ex. Comp. B-1 8,96 78,35 62,7 Ex. Comp. 8-2 2,98 47,3 40,3 Ex. Comp. 8-3 3,88 12,2 21,9 ACTIVITE INHIBANTE POUR LA PRODUCTION D'AFLATOXINE DE L'ASPER CIL LUS PARASITICUS NRRL 2999 DANS LA CACAHUETE ENFONCEE DANS LE SOL Exemple 11 Environ 25 g de terrain de culture disponible commercialement a été introduit dans un erlenmeyer de .500ml et stérilisé en autoclave à 1210C pendant une heure . Puis, de l'Aspergillus parasiticus (lignée) NRRL 2999 , environ 20 spores par flacon, aussi bien que du Bacillus subtilis (lignée) NK-330 (exemple 11-1) ou ATCC 10774 (exemple 11-2), environ 200 cellules per flacon , lui out été inoculés. Ensuite, 15 g de cacahuètes stérilisées de l'exemple 7 , qui ont été récoltées en Afrique du Sud ont été ajoutés è cela et enfoncés dans un sol de culture .L'incubation s'est faite è 250C . Les quantités d'aflatoxines B1 et G1 accumulées dans les cacahuètes ont été déterminées et les résultats ont été mis en tableau dans les tables l)-l et 13 -2 Comme montré dans les tables , dans les exemples 11-1 et 11-2 dans lesquels le B.subtilis NK-330 ou ATCC 10774 a été ajouté , la production des aflatoxines a été remarquablement inhibée en comparaison de l'exemple comparatif 9 dans lequel les lignées n'ont pas été inoculées Table 13-1 Quantité de l'aflatoxine Bl(ppm JOurs 3 5 7 Ex. 11-1 trace 1,45 3,42 Ex. 11-2 2,27 6,97 7,99 Ex. Comp. 9 9,96 88,75 52,7 Table 13-2 Quantité d'aflatoxine G1 (ppm) Jours 3 5 7 Ex, 11-1 trace 1,42 3,42 Ex. 11-2 4,16 5,37 9,19 Ex.Comp. 9 7,96 8B,5 72,7 ACTIVITE INHIBANTE POUR LA PRODUCTION DE L'AFLATOXINE DE L'ASPERGILLUS FLAVUS NRRL 3357 DANS LES CACAHUETES ENFONCEES DANS LE SOL Exemple 12 25 g environ de sol de culture commercialement disponible a été introduit dans un erlenmeyer de 500 ml et stérilisé en autoclave à 1210C pendant une heure. Puis de l'Asperaillus flavus (lignée) NRRL 3357 , environ 20 spores par flacon ,aussi bien que du Bacillus subtilis (lignée) NK -330 (exemple 12-1) ou ATCC 10774 (Exemple 12-2), environ 200 cellules par flacon , lui ont été inoculés. . Ensuite ,15 g des cacahuètes stérilisées de l'exemple 7 , qui ont été récoltées en Afrique du Sud ont été ajoutés à cela et enfoncés dans le sol de culture . L'incubation s'est faite à 25 C Les quantités d'aflatoxine B1 accumulées dans les cacahuètes ont été déterminées et les résultats mis en tableau dans la table 14 Comme montré dans la table , dans les exemples 12-1 et 12-2 dans lesquels B.subtilis NK-330 ou ATCC 10774 a été ajouté , la production de l'aflatoxine a été remarquablement inhibée en comparaison à l'exemple comparatif dans lequel les lignées de B.subtilis n'ont pas été inoculées Table 14 Quantité d'Aflatoxine B1 (ppm) Jours 3 5 7 Lx. 12-1 trace 2,43 3,69 Ex. 12-1 5,02 6,47 10,9 Ex. Comp. 10 8,48 83,5 66,7 MEYEMDICATIONS 1 . Une méthode pour emp8cher une contamination par aflatoxine dans les céréales et les noix, comprenant l'application d'une quantité effective d'iturine A représentée par la formule suivante (I) aux céréales et aux noix dans laquelle R est un radical alkyle 2 . UNe méthode comme revendiquée en revendication 1 dans laquelle ladite iturine A est vaporisée sur le champ et pénètre dans le champ, suivie par les semailles des céréales et des noix dans le champ traité. 3 . Une méthode comme revendiquée en revendi- > cation 1 , dans laquelle ladite iturine A est appliquée avant ou après la récolte des céréales et des noix 4 . Une méthode comme revendiquée en revendication 1 , dans laquelle ladite iturine A est vaporisée sur le champ et pénètre à llintérieur du champ dans lequel les céréales et les noix sont en train de pousser. 5 . Une méthode comme revendiquée en revendication 1 dans laquelle ladite iturine A est appliquée aux céréales et aux noix en semant leurs graines qui sont enveloppées d'avance avec de l'iturine A 6 . Une méthode comme revendiquée en revendication 1 dans laquelle ladite iturine A est appliquée aux céréales et aux noix durant leur stockage. 7 . Une méthode comme revendiquée en revendication 1 dans laquelle les céréales et les noix sont choisies parul le .êTs (grains). le cacahuète, le pistache. Ou l'a-nde. 8 . Une méthode comme revendiquée dans 1 'une quelconque des revendications précédentes 3 à 6 , dans laquelle ladite iturine A est appliquée dans une proportion de 0,005 à O,lX en poids par rapport aux céréales et noix à traiter 9 . Une méthode comme revendiquée en revendication 1 , dans laquelle- ladite iturine A est celle produite par une lignée de Bacillus subtilis capable de produire de l'iturine A 10 . Une méthode comme revendiquée en revendication 9 dans laquelle la lignée de Bacillus subtilis capable de produire de l'iturine A est appliquée directement aux céréales et aux noix 11 .Une méthode comme revendiquée en revendication 9 dans laquelle une culture liquide de la lignée de Bacillus subtilis contenant de l'iturine A est appliquée directement 12 . Une méthode comme revendiquée en revendication 9 , dans laquelle la lignée de Bacillus subtilis est une lignée NK -330 (FERM BP -1580) ou une variante de celleci capable de produire de l'iturine A 13 . Une méthode comme revendiquée en revendication 9 dans laquelle la lignée de Bacillus subtilis est une lignée NK -C-3 (FERM BP-1581) ou une variante de celle-ci capable de produire de l'iturine A 14 . Une composition pour empêcher une contamination par aflatoxine des céréales et des noix ,comprenant une proportion d'iturine A effective pour l'agriculture, représentée par la formule (I) : dans laquelle R est un radical alkyle, et un diluant. une substance auxiliaire ou un mélange de ceux-ci acceptable pour l'agriculture. 15 . Utilisation de 1 titurine A représentée par la formule (I) pour fabriquer une composition pour empêcher une contamination par aflatoxine des céréales et des noix: dans laquelle R est un radical alkyle