Brevet FR2641463A1 — publié le 19900713

La respiration cellulaire nécessite un apport d'oxygène chez les animaux aquatiques les plus primitifs (Protozoaires, Coelentérés ...). Ce gaz est prélevé par chaque cellule directement dans l'eau environnante ou par diffusion à travers les cellules voisines. Chez les organismes plus complexes, un certain nombre d'organes sont trop éloignés du milieu extérieur pour pouvoir y puiser directement l'oxygène qui leur est nécessaire. Ces organismes ont donc développé des systèmes de transport capables de véhiculer ce gaz entre un lieu d'absorption présentant une grande surface d'échanges avec l'extérieur (branchies, poumons) et les cellules des différents organes. Le système le plus connu est celui des Vertébrés chez qui l'oxygène est véhiculé dans le sang par l'hémoglobine, protéine globulaire d'un poids moléculaire de 64.500 daltons, composée de quatre chaines polypeptidiques contenant chacune un groupement prosthétiques ou hème (protoporphyrine) sur lequel est fixé un atome de fer (Fe II). Cet atome présente une liaison libre perpendiculaire au plan de l'hème, sur laquelle vient se fixer une molécule d'oxygène. Chaque molécule d'hémoglobine peut donc transporter quatre molécules d'oxygène. Un autre système, fonctionnant selon un principe analogue, s'eut développé chez les Invertébrés les plus évolués tels que les Mollusques et les Arthropodes. Chez, ces derniers le fluide analogue au sang est constitué par llhémolymphe qui contient en solution une protéine jouant le même rôle que l'hémoglobine : 1'hémocyanine. Cependant, tandis que l'hémoglobine des Vertébrés est une protéine de taille moyenne et de structure relativement homogène entre les différentes classes zoologiques, le terme hémocyanine recouvre au contraire un ensemble de protéines de haut poids moléculaire et de structure tres hétérogène.Le seul point commun entre les différentes formes d'hémocyanine réside dans le fait que toutes renferment des atomes de cuivre sur lesquels se fixent l'oxygène. Chez les Arthropodes, les hémocyanines sont composées de sous-unités d'un poids moléculaire d'environ 75.000 daltons chacune, assemblées en hexamètres. Selon son origine, chaque molécule est constituée de 6, 12, 24 ou 48 sous-unités. Chaque sous-unité contient un site de fixation pour l'oxygène comportant 2 atomes de cuivre (Cu II) situés à une distance d'environ 3,7 A l'un de l'autre, et liés à la Chez les Gastéropodes, la molécule d'hémocyanine a une structure totalement différente.Il s'agit cette fois-ci d'une macromolécule d'un poids moléculaire d'environ 9.000.000 de daltons, ayant la forme d'un cylindre creux de 38 nm de long et de 35 nm de diamètre. Cette molécule est composée de 20 sous-unités d'un poids moléculaire de 450.000 daltons. Chacune de ces sous-unités est elle-même formée de 8 unités fonctionnelles globulaires contenant chacune un site de fixation pour une molécule d'oxygène. Comme chez les Arthropodes, cette fixation est réalisée par l'intermédiaire de deux atomes de cuivre. Les sous-unités élémentaires sont distinctes les unes des autres et leurs poids moléculaires sont compris entre 45.000 et 65.000 daltons. Si la fonction des hémocyanines est la même que celle de l'hémoglobine, on constate donc que leur structure est par contre totalement différente, y compris au niveau des sites de fixation de l'oxygène qui ne contiennent pas d'hume et dans lesquels le fer est remplacé par du cuivre. De plus, tandis qu' une molécule d'hémoglobine ne possède que 4 sites de fixation pour une molécule d'oxygene, une molécule d'hémocyanine en possède entre 6 et 48 chez les Arthropodes et 160 chez les Gastéropodes. Au niveau de la peau, l'apport d'oxygène aux cellules cutanées est réalisé par un fin réseau de capillaires situés dans le derme. I1 est également complété au niveau des cellules épidermiques par un apport direct à partir de l'oxygène atmosphérique qui diffuse à travers le stratum corneum. On pourrait donc penser a priori que ce double flux d'oxygène est largement suffisant pour assurer la respiration des kératinocytes et des fibroblastes. Toutefois, il est apparu de façon tout à fait inattendue au cours d'essais systématiques que l'application d'hémocyanine de Gastéropodes à la surface de la peau exerçait une action bénéfique à long terme. Plus précisément, une étude a été réalisée sur des sujets traités sur une moitié du visage avec une composition contenant 0,04 % d'hémocyanine pure et, sur l'autre moitié, avec l'excipient seul. Cette étude a révélé après 30 jours de traitement un meilleur renouvellement du. stratum corneum, une peau plus souple et plus élastique ainsi qu'une diminution des rides du côté traité par rapport au côté témoin n'ayant reçu que l'excipient. L'explication de ces observations n'est pas évidente. On peut penser qu'elle fait intervenir une augmentation de la respiration, et par conséquent du Dbtabolisme des kératinocytes et des fibroblastes due à un apport d'oxygène véhiculé par l'hémocyanine. Toutefois, cette hypothèse doit être nuancée par deux remarques : d'une part, comme nous l'avons mentionné précédemment, les cellules cutanées sont correctement oxygénées dans les conditions physiologiques norrlales, d'autre part, la taille des molécules d'hémocyanine et de leurs sous-unités leur interdit de franchir la barrière constituée par le stratum corneum.Le mode d'action de 1'hiDocyanine est donc probablement complexe et il se peut qu'il fasse intervenir une diffusion progressive, régulée, de l'oxygène à travers le stratum corneum. Des essais complémentaires ont montré que l'activité cosmétique décrite ci-dessus pouvait être obtenue aussi bien avec les hémocyanines d'Arthropodes qu'avec celles de Mollusques. De même, le fait que les protéines soient sous forme native ou sous forme dénaturée, à l'état de sous-unités libres, n'a pas d'itportance. Les hémocyanines peuvent être employées sous forme pure ou en mélange avec d'autres substances. En particulier, l'activité revendiquée a également été observée avec de l'hèiolymphe brute. Toutefois, l'activité est plus élevée avec de l'hémocyanine purifiée. Globalement, une activité cosmétique intéressante peut être obtenue avec des concentrations comprises entre 0,004 et 0,4 t d'hémocyanine pure. L'hémocyanine peut être extraite de Mollusques ou d'Arthropodes. Par exemple, et de façon non limitative, l'extraction et la purification peuvent être réalisées avantageusement sur des animaux appartenant aux classes des Gastéropodes, des Céphalopodes ou des Crustacés au soyen des techniques décrites par HEIRWEGH et al. (Biochim. Biophys. Acta 1961,- 48:517-526), ELLIOTT et VAN BAELEN (Bull. Soc. Chia, Biol. 1965, 47:1979-1986), GHIRETTI-MAGALDI et al. (Biochemistry 1966, 5:1943-1948), ROCHU et FINE (Comp. Biochem. Physiol. 1978, 59A:145-152). Ces méthodes font intervenir une extraction de l'hémolymphe par ponction dans le coeur, l'aorte, 1'héocoele ou le sinus des periopodes, selon les espèces utilisées. L'hémocyanine est ensuite précipitée par le sulfate d'ammonium, ou décantée par ultracentrifugation. Les phases ultérieures de la purification font intervenir des centrifugations différentielles, des chromatographies ou des électrophorèses préparatives. Pour une préparation industrielle, on pourrait avantageusement remplacer ces étapes par des ultrafiltrations et des chromatographies. L'hémocyanine ainsi obtenue peut être utilisée soit sous forme native, soit sous forme dénaturée ou hydrolysée. Cette dernière étape peut être réalisée, par exemple et de façon non limitative, par hydrolyse enzymatique au moyen d'une protéase, par augmentation de la force ionique ou par action d'agents dénaturants tels que le sodium dodécyl sulfate, le mercaptoéthanol, l'urée ... Les préparations cosmétiques contenant l'hémocyanine peuvent être formulées sous n'importe quelle forme classique telle que crèmes, laits, gels, lotions, shampooings. L'hémocyanine peut être introduite dans ces formulations directement en solution dans la phase aqueuse, ou encapsulée dans des vecteurs permettant d'obtenir un relargage lent et progressif de l'hémocyanine ou permettant sa pénétration, au moins partielle, à l'intérieur du stratum corneum. De tels vecteurs peuvent être constitués, de façon non limitative, par des vésicules lipidiques de type liposomes ou par des particules ou des vésicules de polymères naturels ou synthétiques d'un diamètre compris entre 10 nm et 2 mm connus sous les noms de nanoparticules, nanocapsules, microparticules, microcapsules. L'emploi d'hémocyanine en cosmétologie peut être illustré par les exemples suivants Crème de jour : Stéarine 5,00 Stéarate de glycérol ..................... 5,00 Octyl dodecanol ......................... 5,50 Huile de vaseline ........................... 10,00 Eau ...................................... 73,15 Trièthanolamine .......................... 1,00 p-hydroxybenzoate de méthyle ............. 0,20 p-hydroxybenzoate de propyle 0,10 Hémocyanine .............................. 0,05 Crème antirides Polysorbate 60 ........................... 3,00 Stéarate de sorbitan ................... 2,80 Alcool cétylique ......................... 2,00 Huile de vaseline ......................... 15,00 Eau ...................................... 75,88 Sorbitol ................................. 1,00 p-hydroxybenzoate de méthyle ............. 0,30 Hémolymphe ............................... 0,20 Lait corporel Polysorbate 60 ............................. 1,50 Alcool oléique ............................. 0,50 Cire d'abeille ............................. 1,50 Myristate d'isopropyle ................... 3,00 Huile de lanoline ........................ 2,00 Eau ...................................... 86,77 Carbopol 940 ............................. 0,20 Trièthanolamine .......................... 0,20 Glycérine ................................ 4,00 p-hydroxybenzoate de méthyle ............. 0,30 Hémocyanine .............................. 0,03 REVENDICATIONS 1. Préparations cosmétiques caractérisées en ce qu'elles renferment de l'hémocyanine. 2. Préparations cosmétiques selon la revendication 1 caractérisées en ce que l'hémocyanine est introduite à l'état brut, en solution dans l'hémolymphe. 3. Préparations cosmétiques selon la revendication 1 caractérisées en ce que l'hémocyanine est introduite sous une forme purifiée. 4. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que l'hémocyanine est présente sous forme native. 5. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractrérisées en ce que l'hémocyanine est présente sous forme dénaturée. 6. Préparations cosmétiques selon la revendication 5, caractérisées en ce que l'Hémocyanine est présente sous forme de sous-unités isolées. 7. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que l'hèmocyanine est extraite d'Arthropodes. 8. Préparations cosmétiques selon la revendication 7, caractérisées en ce que l'hémocyanine est extraite de Crustacés. 9. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que l'hémocyanine est extraite de Mollusques. 10. Préparations cosmétiques selon la revendication 9, caractérisées en ce que l'hémocyanine est extraite de Gastéropodes. 11. Préparations cosmétiques selon la revendication 9, caractérisées en ce que l'hémocyanine est extraite de Céphalopodes. 12. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisées en ce que l'hémocyanine est introduite à une concentration comprise entre 0,004 et 0,4 %. 13. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous la forme d'une crème, d'un lait, d'un gel d'une lotion ou d'un shampooing. 14. Préparations cosmétiques selon la revendication 13, caractérisées en ce que l'hémocyanine est présente en solution dans la phase aqueuse. 15. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisées en ce que l'hécocyanine est encapsulée dans des vésicules lipidiques de type liposomes. 16. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisées en ce que l'hémocyanine est encapsulée dans des particules ou des vésicules de polymères synthétiques ou naturels de diamètre compris entre 10 nm et 2 mm, connus sous le nom de nanoparticules, nanocapsules, microparticules, microcapsules.