Brevet FR2647792A1 — publié le 19901207

La présente invention concerne un produit inhibiteur spécifique de La transcriptase inverse de rétrovirus, ainsi qu'une composition médicamenteuse le contenant. La transcriptase inverse sera ègatement dénommée reverse transcriptase. Les glycoproteines de virus a enveloppe, se propageant dans les oucaryotes, contionnent la sequence d'acides amincs : Asn-Xaa-Thr ou X = tout acide aminé à l'exception de Pro ou Asp. Cette sequence sert de site accepteur pour des N-oligosaccharides dans le tranfert d'intermediaires liés au dolichol (a la chaine polypeptidique nalssante). Ainsi, toute strategie chimiotherapeutique, qui est oriente vers le blocage de 1,' synthese et la charge du transfert du ou des intermediaires polyprenoliques, ou le traitcmcnt des oligosaccharides pour devenir Soit un complexe soit un hybride a teneur elevce en mannose - produira une ou des chaines oligosaccharidiques raccourcies ou de base. Cette modification des glycoconjuguès modifiera la structure tertiaire et quaternaire des protéines de fixation des virus et du (ou des) recepteur(s), faisant avorter l'entrce du virus : fixation, fusion (cellule a cellule, virus a cellule), de même que sa liberation. Lorsqu'il est utilise de façon appropriée, le 2-d2soxy-D-glucose (2dGlc) possède une activite antiviralc unique et il a ete utilisé avec succes pour traiter l'herpes genital humain (Blough H.A. et al : Herpes virus and virus chemotherapy (R. Kono ed.), pages 211-214, Elsevier, Amsterdam (1985) ; Blough H.A. et Giuntoli R., J. An. Med. Assoc. 241, 2798-2801 (1979)], Plus recemment, il a ete demontre que le 2dGlc présente une activite antivirale 3 l'rencontre de HIV ct d'autres rétrovirus, ainsi que leurs proteines de fixation [Blough H.A. Pauwels R., de Clercq E., Conieaux J., Goldberger S. & Thiry I.., Biochem. Blophys. Res. Commun. 141, 31-36 (1986 > ; Blough H.A. et al. : Herpes virus and virus chemotherapy (R. Kondo ed.), pages 211--214, Elsevier, Amsterdam (1985)]. Les présents inventeurs ont été les premiers à démontrer que des inhibiteurs de glycosylation étaient efficaces pour bloquer la fixation, la pénétration et la fusion de HIV et d'un certain nombre de rétrovirus [Blough H.A., fliochem. Biophys. Res. Commun. 141, 31-36 (1986) ; Blough H.A. et al: Herpes virus and virus chemotherapy (R. Kono ed.), pages 211-214, Elsevier, Amsterdam (1985) : Thiry L. Blough H.A. et al on Viral Pathophysiology" (R. Gallo, ed.) Italie (1984)), à savoir le virus de la leucémie bovine et le virus endogène du babouin. En fait, il a été montré que les inhibiteurs de glycosylation pouvaient induire la lyse de cellules infectées par les rétrovirus (par exemple, cellules infectées de façon chronique par le virus endogène de babouin). Dans le cas de l'herpès virus [Gallaher W.R. Levitan D.B. & Blough H.A., Virology 55, 153-202 (1973)), les infections chez l'homme ont été traitées avec succès [Thiry L. et al. indiqué cidessus ; Blough H.A. et Giuntoli R., J. Am. Med. Assoc. 241, 27998-2801 (1979)]. Plus de 7000 patients ont été traités avec succès par des composes tels que le 2-désoxy-D-glucose (cf. brevets américains n 4 315 001 et 4 603 122). Par ailleurs, deux des médicaments couramment disponibles pour le traitement du SIDA, à savoir la 5'-azido thynidine et la 3',5'-didésoxycytidine se sont avérés toxiques. De plus, ils nécessitent des kinases cellulaires pour les phosphoryler, sinon ils ne sont pas actifs. Les présents inventeurs ont choisi d'utiliser des composés qui agissent directement sur la transcriptase inverse (clonée et/ou purifiée), et ils ont déccuvert que l'addition d'or aux analogues du glucose et à certains composés aliphatiques du type alcool, de façon à obtenir, pour ces composés, au moins une liaison S-Au, produisait une action antivirale efficace a l'encontre de la reverse transcriptase de retrovirus tels que HIV-1 et AMV. Plusieurs de ces composés sont disponibles pour le traitement de l'arthrite rhumatoïde [Payne B.H. & Walz D.T., Vet. Pathol. 15, suppl. 5,1 (1979) ; Symposium : J. Rheumatol. 9, 1-209 (1982)) (comme immunosuppresseurs) et sont disponibles en Europe de l'ouest et aux Etats-Unis pour le traitement de cette dernière maladie. La présente invention a donc d'abord pour objet un produit inhibiteur spécifique de la reverse transcriptase de rétrovirus, consistant en un thio-composé organique ayant au moins une liaison S-Au. Ce thio-composé est notamment un thio-glucose. En particulier, celui-ci est un glucose ou un analogue du glucose dont un OH est substitué par un groupement SAu ou un groupement SAuR, où R représente un reste de molécule organique. Le thio-glucose peut comporter également une chaine acyle grasse. Des exemples de thio-glucose sont le l-ss-D-auro- thioglucose, de formule Composé (I) et le 2,3,4,6-tétra-O-acetyl-1-thio-ss-D-glucopyranasato-5 triacétyl-phosphine-or, de formule SAu=P-(CH2CH,)3 CH2R 0'I I Composé (II) R , P o II R = O-C-CH3 Ce dernier composé est commercialisé sous la marque de fabrique AURANOFI . On peut également envisager, comme thio-composé, des thio-composés aliphatiques, comprenant une fonction -SAu. Un exemple de ce thio-composé à fonction -SAu est le composé de formule CH3-CH2-CH2-S-Au.Na2SO3 La présente invention porte également sur une composition médicamenteuse pour le traitement et la chimioprophylaxie, chez l'homme et chez l'animal, de maladies provoquées par les rétrovirus, caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre de principe actif, en une quantité efficace du point de vue pharmacologique ou vétérinaire, au moins un produit tel que défini ci-dessus. En particulier, cette composition médicamenteuse est destinée au traitement et à la chimioprophylaxie des maladies provoquées par les virus de l'immunodéficience humaine HIV-1, HIV-2, HTLV1, HTLV2, par le virus K-IV (Avian Myoblastosis Virus), par le virus FLV (Felian Leukemia Virus) et par le virus EIAV (Equine Infectious Anemia Virus). De façon particulièrement avantageuse, dans la composition médicamenteuse de l'invention, le principe actif est piégé au sein de liposomes. On peut avantageusement utiliser à cet effet la technique décrite par Baron C. & Blough H.A., Intervirology 9, 33-39 (1985), avec le détergent neutre octyl glucoside. On peut ainsi préparer des liposomes avec une ou des molécules de CD4 et des quantités accrues de phosphatidylsérine par rapport à la phosphatidylcholine et au cholestérol. Les composés de l'invention seraient donc piégés à l'intérieur des liposomes à l'état stable. Toutes les préparations devraient être stockées en verrerie actinique et sous atmosphère inerte. Cette technique permet un accès rapide de ces composés au milieu intracellulaire et augmente la perméabilité des cellules du système nerveux ccntral et des monocytes à ces composés. En variante, on peut utiliser des composés modifiés par l'addition d'une chaine acyle grasse de C38, similaire à celle nécessaire à la synthèse d'octylglucoside. Cette technique permet un accès rapide de ces composés au milieu intracellulaire et augmente la perméabilité des cellules du système nerveux central et des monocytes. Ces composés, comme les propyl-, l'hexyl-, l'octyl-auriothiogîucosides, peuvent être synthétisés (Baron C. et Blough H.A., 1985, Intervirology, 9, 33,39). En eux-mêmes, les composés de l'invention sont stables en solutions aqueuses pendant au moins 2 semaines à -200C. Dans cette composition, le principe actif peut etre associé à au moins un inhibiteur de glycosylation, tel que le 2-désoxy-D-glucose, qui bloque l'entrée (fixation, pénétration, fusion) de HIV-1. En particulier, la composition médicamenteuse selon l'invention se présente sous une forme administrable par voie intraveineuse. Elle peut également être utilisée par voie orale. La présente invention porte également sur l'utilisation du produit tel qu'il vient d'être défini ci-dessus pour fabriquer une composition médicamenteuse destinée au traitement et à la chimioprophylaxie des maladies, chez l'homme et l'animal, qui sont dues à un rétrovirus. I1 a été démontré que les composés contenant la fonction SAu présentaient l'activité recherchée. Des produits de base comme le l-ss-D-thioglucose et le 5-B-D-thioglucose étaient actifs à l'encontre de la glycolysation de gp120 ou gp41, cependant à des concentrations dépassant 2mM, ils étaient cytotoxiques, mais ne présentaient aucun effet sur la polymérase. I1 a également été montré que les composés de l'invention sont moins toxiques que leurs analogues de base, en mesurant, à l'aide du microscope photonique, le temps de duplication cellulaire et l'exclusion au bleu trypan.. MODES OPERATOIRES La réplication virale a été testée par prétraitement des cellules infectées (infection chronique)) et/ou prétraitement de cellules CEM ou MT-4 non-infectées avant l'infection par HIV-1. Le virus partiellement purifié a été testé pour la réplication virale par la mesure de l'activité R.T. (Reverse Transcriptase) ; en outre, ces préparations virales lysées ont été incubées avec diverses concentrations d'inhibiteurs potentiels, comme décrit par Blough H.A. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 31-36 (1986). Effets de médicaments sur la synthèse de glycoprotéines : des cellules CEM ou MT-4 ont été infectées par HIV-1 ; 4 heures après l'infection, une moitié des cellules a été marquée avec [23H]Man ou [63H]GlcNAc à 2,5-5,9 yCi. Les milieux ont été changés et de l'inhibiteur frais (potentiel) et 2,5 uCi (ou 5 pCi) de l'isotope approprié ont été ajoutés. Les cellules ont été lysées à trois et sept jours après l'infection et les lysats cellulaires ont été clarifiés par centrifugation à 12 OOoxg; gpl20 et gp41 ont été l'une et l'autre isolées par immunoprécipitation sur colonnes et les produits, analysés sur gels de polyacrylamide à 12% et fluorographie [Kumarasamy R & Blough H.A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 109, 1108-1115 (1982)1. Les virus ont été récoltés et purifiés par centrifugation à vitesse contrôlée sur gradients préformés de citrate de sodium ou métrazamide à 5-40%, et analysés de façon similaire. Fusion : des cellules infectées de façon chronique ou des cellules MT-4 non infectées ont été prétraitées par divers inhibiteurs et la fusion a été testée (nombre de polycaryocytes) comme décrit par Blough H.A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 31-36 (1986). Transcriptase inverse : l'enzyme active du point de vue enzymatique, purifiée, clonée, a été préparée dans Escherichia coli à l'aide de la technique précédemment décrite par Hizi A., McGill C., Hugues G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1218-1222 (1988). Le dosage de la R.T. a été effectué à l'aide de matrices d'ADN (au hasard et avec des séquences HIV) et de primer(s) marqué(s) par radioactivité. Après formation de complexes entre la matrice d'ADN et les primers, la R.T. a été ajoutée et incubée. Diverses concentrations d'inhibiteur ont été ajoutées soit avant soit après que le ou les complexes aient été formés. L'initiation et l'élongation de la chaîne ont été étudiées à l'aide de P.A.G.E. à 20% [Shane D.L., Goodman M.F., Echols N.A., Nucleic Acids Res. 16, 1218-1222 (1988)]et les produits analysés par autoradiographie. Différentes matrices et conditions ont été utilisées pour distinguer ces fonctions. En outre, de la R.T. disponible dans le commerce provenant du virus de myeloblastose aviaire a été également utilisée. Le dosage de l'effet des inhibiteurs sur la R.T. était le suivant A) On prépare un mélange réactionnel de 17 yl contenant: ADN matrice 10 8M ADN primer 4 x 10-10M/ADN primer 5' [32P] 2 2 ul de tampon HIV-RT ([10x] (500 mM Tris-HCl pH 7,8 ; 60 m MgCl2 ; 10 mM dithiothréitol 500 mM KCl) ; et de l'eau bidistillée pendant 20 mn à 37 C. B) On ajoute 1 unité de HIV-RT (une unité correspond à l'activité enzymatique qui incorpore 1 nmol de [3H] TMP en produit insoluble dans l'acide en 10 mn à 370C avec du poly(A)-(dT)15 comme substrat) pendant 10 min. à 37 C. C) On ajoute un mélange de désoxy nucléotide triphosphates (dXTPs) contenant 0,25 mN de chaque dXTP pour un volume de mélange final de 20 l pendant 5 minutes à 37 C. D) Pour tester le ou les inhibiteurs, diverses concentrations de ces produits (sous un volume constant) sont ajoutées (selon Etape B) au mélange des dXTPs. Le mélange réactionnel est incubé à 376C pendant 10 mn. E) On fait cesser la réaction par de 1'EDTA 10 mM dans le formamide à 908. F) Des échantillons sont chauffés à 900C pendant 5 mn et les produits séparés par électrophorèse sur gels de Polyacrylamide à 20% en présence d'urée. G) Les variations dans l'élongation, la synthèse, etc. sont détectées par autoradiographie et testées par comparaison avec des témoins sans inhibiteur. Les tests effectués sur la HIV-RT et 1'AMV-RT, avec le l-aurothioglucose comme inhibiteur ont fourni des autoradiograrnmes selon les figures respectivement 1 et 2. Une quantité aussi faible que 3,uM de l-aurothioglucose s'est révélée efficace pour bloquer le complexe HIV-R.T.-substrat à 40 nm (Fig 1). De même, cet inhibiteur peut agir directement sur l'enzyme libre, à savoir par incubation avec les analogues substitués par Au avec de l'enzyme non complexée. Des résultats comparables ont été obtenus avec A > N (Fig 2), excepté que des concentrations supérieures en 1-aurothioglucose étaient nécessaires. Composés de base : par exemple, le l-thioglucose, le 5-thioglucose se sont révélés efficaces sur la glycosylation à des concentrations d'environ 3,5 mM (in vitro sur cellules ALEX et MT-4), mais ntont pas présenté d'effet sur la R.T. de l'un ou l'autre virus. Ils étaient trop toxiques vis-å-vis des cellules pour que l'on mette en évidence leur efficacité clinique. Des études préliminaires montrent que le mode d'action du composé (I) est totalement différent de celui de 1'AZT triphosphate et qu'il est considérablement plus actif que ce dernier. Les nouveaux composés de 1' invention sont administrables par voie intraveineuse ou intramusculaire. Les compositions correspondantes peuvent être présentées sous forme de soluté injectable par exemple avec un compose à 35% d'or dans un vehicule aqueux pour injection. Le soluté peut etre mis dans une ampoule avec une solution de chlorure de sodium à 0,9% pour injection à pH très voisin de 7, par exemple dans une ampoule de 2 ml. La posologie dépend de la maladie à traiter et de la gravité de l'affection. Au début du traitement, la fréquence d'administration peut être de quatre à six doses réparties en une ou deux fois par semaine. Ensuite on peut pratiquer deux injections par mois pendant trois mois, puis une injection par mois. Dans le cas du traitement du SIDA, on peut prévoir une administration une fois par mois pendant six mois, en vue de la prophylaxie. Pour changer la séropositivité , le traitement peut entre pratiqué tous les trois mois et répété, par exemple deux fois. Chez l'homme la quantite de produit actif par dose administree peut varier entre 25 et îoe mg environ, soit de 1,5 à 2,5 mg par kilo de poids corporel En vue de l'administration orale on prévoit les véhicules conventionnels appropriés, par exemple sous forme de capsules ou de dragées avec des stabilisants et des additifs appropriés tels que le lactose. La quantité de produit actif par dose peut varier chez l'homme entre 2,5 à 5,0 mg par kilo de poids corporel. L' administration peut etre quotidienne pendant les premiers mois, par exemple les trois premiers mois et ensuite plus espacée, notamment tous les deux jours. Les indications sont données bien entendu à titre général , et doivent etre adaptées aux conditions particulières de la maladie en cause. On veuillera aussi aux contre indications: cas de grossesse, d'insuffisance hépatique ou réale, de traitement des enfants. REVENDICATIONS 1 - Produit inhibiteur spécifique de la reverse transcriptase de rétrovirus consistant en un thio-composé organique ayant au moins une liaison S-Au. 2 - Produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est un thio-glucose. 3 - Produit selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le thio-glucose est un glucose ou un analogue du glucose dont un OH est substitué par un groupement SAu ou un groupement SAuR, où R représente un reste de molécule organique. 4 - Produit selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait que le thio-glucose est un thioglucose modifié par l'addition d'une chaine acyle grasse en C3-8. 5 - Produit selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le thio-glucose modifié est un propyl-, hexyl-, octyl-aurothioglucoside. 6 - Produit selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le thio-glucose est le l-B-D-aurothio- glucose. 7 - Produit selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le thio-glucose est le 2,3,4,6-tétra O-acétyl-l-thio-J3-D-glucopyranasato-5-triacétylphosphine-or. 8 - Produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est un thio-coposé aliphatique. 9 - Produit selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le thio-corposé aliphatique à fonction -SAu est le composé de formule : CH3-CH2-CH2-S-Au Na2S 3 10 - Composition médicamenteuse pour le traitement et la chimioprophylaxie, chez l'homme et l'animal, de maladies provoquées par les rétrovirus, caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre de principe actif, une quantité efficace du point de vue pharmacologique ou vétérinaire, d'au moins un produit tel que défini à l'une des revendications 1 à 9. 11 - Composition médicamenteuse selon la revendication 10, caractérisée par le fait qu'elle est destinée au traitement des maladies provoquées par les virus HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-2, AMV, EIAV et FLV. 12 - Composition médicamenteuse selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisée par le fait que le principe actif est piégé au sein de liposomes. 13 - Composition médicamenteuse selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée par le fait que le principe actif est associé à au moins un inhibiteur de glycosylation, tel que le 2-desoxy-D-glucose. 14 - Composition médicamenteuse selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous une forme administrable par voie intraveineuse. 15 - Ccmposition médicamenteuse selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous une forme administrable par voie orale. 16 - Utilisation du produit tel que défini à l'une des revendications 1 à 9 pour fabriquer une composition médicamenteuse destinée au traitement et à la chimioprophylaxie, chez l'homme et l'animal, des maladies qui sont dues à un rétrovirus.