Brevet FR2639253A2 — publié le 19900525

FR 2639253 A2 19900525 FR 8815246 A 19881123 DISPOSITIF D'ELECTROPHORESE MULTIPLE POUR ASSURER LA MIGRATION CONTROLEE DE MACROMOLECULES DANS DES PLAQUES RECTANGULAIRES DE GEL L'invention concerne des perfectionnements au dispositif d'électrophorèse multiple décrit au brevet prin- cipal. Selon ce brevet principal, un disposltlf d'électrophorèse multiple, permettant d'assurer la migra- tion contrôlée de macromolécules dans des plaques de gel, comprend une cuve destinée à recevoir les plaques de gel, des électrodes agencées pour créer un champ électrique dans les plaques de gel, et des moyens d'amenée dans la cuve et d'extraction de la cuve d'un liquide approprié d'électro- phorèse. Un support permet de recevoir un empilement de plaques de gel en les maintenant espacées les unes des autres, et des électrodes parallèles entre elles et aux plaques de gel sont disposées dans des plans perpendicu- laires à une direction souhaitée de migration des macromo- lécules à travers les plaques. Des moyens de liaison électrique sont prévus entre électrodes d'un même plan pour en particulier les maintenir à un même potentiel, et entre électrodes de plans _5 différents, pour en particulier maintenir une différence de potentiel entre deux plans consécutifs. Le dispositif décrit au brevet principal com- prend encore des moyens d'application de potentiel aux électrodes situées dans ces plans parallèles, et des moyens de commande pour faire varier dans l'espace et/ou dans le temps la distribution des potentiels des électrodes desdits plans. D'autres caractéristiques de ce dispositif sont décrites dans les revendications secondaires du brevet l principal. 2. Un tel dlsposltlf fonctionne de façon très sa- tlsfalsante et offre l'avantage essentiel de permettre le traitement simultané d'un très grand nombre de plaques de gel. avec des résultats fiables et répétitifs. Corollalrement, il devient possible d'automa- tiser ce traitement, et de le commander au moyen d'un ordl- nateur. La différence de potentiel qu'il faut appliquer entre les extrémités d'une plaque de gel est relativement importante, par exemple de 100 à 200 volts et peut même at- telndre des valeurs de l'ordre de 300 volts. Les dlffé- rences de tension électrique entre plans d'électrodes sont alors suffisantes pour causer, par électrolyse, la forma- tion au contact des électrodes de bulles libérées au sein du liqulde d'électrophorèse, qui risquent de gêner la migration des macromolécules ou leur transfert sur les mem- branes lorsqu'elles s'accumulent sous les plaques de gel disposées horizontalement dans la cuve d'électrophorèse. Pour éviter cet inconvénient, l'invention pro- pose un dispositif du type décrit au brevet principal, ca- ractérisé en ce que les plaques de gel sont disposées ver- ticalement dans la cuve entre lesdites électrodes. Alnsl, les bulles formées par électrolyse du liquide d'électrophorèse, peuvent librement remcnter jusqu'à la surface du liquide en partie supérieure de la cuve, sans pouvoir s'accumuler au contact des plaques de gel. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les électrodes précitées sont intégrées à un panier mobile formant le support des plaques de gel. En pratique, il suffit de réunir entre elles ces électrodes par des plaques, perforées ou non, ou des grilles de matériau diélectrique pour disposer d'un panier support, entre les électrodes duquel on peut disposer les plaques de gel, et que l'on va immerger dans la cuve et ex- v traire de la cuve par la face horizontale supérieure de celle-cl. L'invention prévoit également que les extréml- tés, par exemple inférieures, des électrodes précitées com- portent des moyens de liaison ou de raccordement à des électrodes portées par la paroi correspondante, par exemple de fond, de ladite cuve. Il suffit donc, dans ce cas, de déposer le pa- nler sur le fond de la cuve pour que les électrodes vertl- cales du panier puissent être reliées aux moyens d'application de potentiel et aux circuits de commande du dispositif, par l'intermédiaire des électrodes du fond de la cuve. Avantageusement, ces moyens de liaison ou de raccordement forment également des moyens de positionnement du panier dans la cuve. De préférence, les électrodes du fond de la cuve sont sensiblement ponctuelles, et forment un réseau à maille carrée ou rectangulaire, à côtés respectivement pa- rallèles et perpendiculaires à la direction souhaitée de migration des macromolécules. Elles sont reliées entre elles par des moyens de liaison commandés, permettant sélectlvement de maintenir à un même potentiel les électrodes situées dans un même plan perpendiculaire à la direction souhaitée de migration des macromolécules, et d'établir une différence de po- tentlel entre deux successifs de ces plans. L'invention prévoit également, dans ce cas, que les parois verticales de la cuve comportent des électrodes linéaires verticales, raccordées également à des moyens commandés. de liaison permettant sélectivement d'établir entre elles des différences de potentiel, ou bien de les mettre à un même potentiel. Afin d'augmenter la capacité de traitement du dispositif selon l'invention, le panier peut contenir, à un même niveau, au moins deux séries de plaques de gel, dispo- sées tête-bêche, c'est-à-dire dans lesquelles les plaques d'une série sont sensiblement dans le prolongement des plaques de l'autre série, mals orientées longitudlnalement dans un sens opposé, par rapport à la position initiale des macromolécules. On peut ainsi traiter plusieurs doubles séries de plaques de gel, sans augmenter pour autant la différence de potentlel totale dans la cuve au-delà de celle requise pour une plaque. L'invention prévoit également que les élec- trodes verticales du panier sont entourées par des manchons ou tubes cylindriques de matière diélectrlque, perforés ou poreux vis à vis du liquide d'électrophorèse. Ces tubes, ouverts à leurs extrémités, forment des pièges pour les bulles de gaz produites par électro- lyse au contact des électrodes, et guident les bulles vers la surface libre du liquide, sans qu'elles puissent venir au contact des plaques de gel. Dans la description qui suit, faite à titre d'exemple, on se réfère aux dessins annexés dans lesquels: la figure 1 est une vue schématique en éléva- tion d'un panier de support de plaques de gel; la figure 2 est une vue de côté de ce panier la figure 3 est une vue schématique en perspec- tive d'un panier de support de plaques; la figure 4 est une vue schématique en perspec- tive, avec arrachement partiel, d'une cuve d'électropho- rèse; la figure 5 est une vue partielle, à plus grande échelle, d'un moyen de positionnement de panier dans la cuve; la figure 6 est une vue schématique du circuit de liaison des électrodes du fond de la cuve; la figure 7 est une vue schématique en perspec- tive, avec arrachement partiel d'une autre forme de reall- sation d'une cuve d'électrophorèse; la figure 8 est une vue schématique partielle, en coupe transversale, de tubes poreux montés autour des électrodes verticales d'un panier. On se réfère d'abord aux figures 1 et 2 o l'on a représenté schématiquement un panier de support de plaques de gel selon l'invention. Ce panier 60 comprend essentiellement des plaques horizontales 62 verticalement superposées et sépa- rées les unes des autres d'une distance égale à la hauteur d'une plaque de gel- disposée verticalement, certaines plaques 62 étant en retrait des parois de la cuve et/ou perforées pour permettre le passage des bulles de gaz, ou même constituées par des grilles. Les plaques 62, en matériau diélectrlque, sont reliées entre elles par des électrodes verticales recti- lignes 64 qui peuvent être des tiges rigides de matériau électroconducteur, ou encore de simples fils électroconduc- teurs tendus entre les plaques 62, dans ce cas reliées par des montants rigides, non électriquement conducteurs, pos- sédant la résistance mécanique voulue et disposés par exemple aux coins et au centre des plaques 62. Comme décrit au brevet principal, les élec- trodes 64 sont disposées en un réseau à maille transversale rectangulaire ou carrée et ont essentiellement pour fonc- tlon d'être des lignes d'accrochage de surfaces équipoten- tielles. Les plaques de gel 66 sont disposées vertlcale- ment sur les plaques 62, entre les électrodes 64, de telle sorte que la direction souhaitée de migration des macromo- Z lécules dans les plaques de gel soit horizontale. Comme on le voit sur les figures 2 et 3, on peut disposer aux différents niveaux du panler 60 un assez grand nombre de plaques de gel 66, qui sont côte à côte et qui, à chaque niveau, forment par exemple deux séries de plaques, les plaques d'une série étant situées dans le pro- longement des plaques correspondantes de l'autre série. Comme on le souhalte, les plaques d'une série peuvent être orientées dans le même sens que les plaques de l'autre série, ou blen en sens contralre. Dans le premier cas, la différence de potentiel entre les extrémités du pa- nler sera de l'ordre de deux fois la différence de poten- tiel à appliquer aux extrémités d'une plaque de gel. Dans le second cas, la différence de potentiel entre les extré- mltés du panier sera sensiblement égale à la différence de potentiel entre les extrémités d'une plaque de gel: on ap- pliquera par exemple une tension V1 aux électrodes 64a des extrémités du panier, et une tension V2 aux électrodes 642 du plan médian transversal du panier, avec la différence V1 - V2 égale à la différence de potentiel à appliquer entre les extrémités d'une plaque de gel. La figure 3 est une vue en perspective d'une variante de réalisation du panier, qui ne comprend qu'un seul niveau de chargement des plaques de gel, délimité entre deux plaques 62 de matériau diélectrlque, dont seule la plaque supérieure est perforée pour permettre le passage des bulles de gaz formées par électrolyse dans le liquide d'électrophorèse. La figure 4 représente schématiquement une cuve destinée à recevoir le panier de la figure 3. Cette cuve 70 est de forme parallélépipedlque et comprend un fond 72 horizontal et quatre parois verti- cales 74, avec éventuellement une paroi horizontale supé- rieure mobile, non représentée sur le dessin. Le fond 72 de la cuve comprend une série d'électrodes sensiblement ponctuelles 76 formant un réseau à maille carrée ou rectangulaire, identique à celui des électrodes 64 du panier, de telle sorte que, lorsque le pa- nier sera placé dans la cuve, les électrodes ponctuelles 76 du fond 62 de la cuve se trouvent exactement dans le pro- longement des électrodes verticales 64 du panier. Comme représenté en figure 5, les extrémités inférieures des électrodes 64 peuvent comprendre des moyens de contact avec les électrodes ponctuelles 76 et de posi- tlonnement du panier dans la cuve. Dans l'exemple représenté, chaque électrode fl- liforme 64 du panier est raccordée, à son extrémité infé- rleure, à un plot conducteur 78 ayant une surface lnfé- rleure semi-sphérique en saillie sur la face inférieure de la plaque de fond 62 du panier, et qui est reçue dans un évidement tronconique 80 d'un plot conducteur formant une électrode ponctuelle 76 du fond de la cuve. Les électrodes ponctuelles 76 sont reliées entre elles, à l'extérieur de la cuve, par le circuit re- présenté en figure 6 et déjà décrit au brevet principal, qui comprend des moyens de liaison commandés entre élec- trodes 76 voisines. De façon résumée, les différentes ran- gées d'électrodes 76 sont reliées entre elles par des élé- ments de liaison 82 qui sont conducteurs avec une résis- tance électrique sensiblement nulle, ou bloqués avec une résIstance électrique sensiblement infinie. De même, les différentes colonnes d'électrodes ponctuelles 76 sont re- liées entre elles par des éléments de liaison 84, du même type que les éléments 82. En outre, des résistances 86, ou des éléments conducteurs équivalents, sont prévues entre les différentes rangées d'électrodes 76, et des résistances 88, ou des éléments conducteurs équivalents, sont prévues entre les dlfférentes colonnes d'électrodes ponctuelles 76. Les éléments de liaison 82 et 84 sont commandes de la façon suivante: quand les éléments de liaison 82 ont une résistance électrique sensiblement nulle, les éléments 84 ont une résistance électrique sensiblement infinie, de 3: telle sorte que les colonnes d'électrodes ponctuelles 76 définissent des lignes équipotentielles, et que deux co- lcnnes successives d'électrodes ont entre elles une dlffé- rence de potentiel déterminée par la valeur de la résls- tance 88 correspondante, les électrodes de l'angle supé- rieur gauche et de l'angle inférieur droit du circuit étant reliées à des sources de potentiel appropriées. Alternat.- vement, lorsque les éléments de liaison 82 ont une résis- tance électrique sensiblement infinie, et les élements 84 ont une résistance sensiblement nulle, les rangées d'électrodes ponctuelles définissent des lignes équi- potentlelles et deux rangées successives ont entre elles une différence de potentiel déterminée par la valeur de la résistance 86 correspondante. Les parois verticales 74 de la cuve 70 peuvent comprendre (figure 4) des électrodes linéaires verticales , formées par exemple par des lignes métallisées de leur surface interne, qui sont raccordées entre elles et aux rangées ou aux colonnes, respectivement, d'électrodes ponc- tuelles 76 du fond de la cuve par des éléments 82, 84. On comprend le fonctionnement de la cuve 70 re- présentée en figure 4. Le panier chargé du nombre voulu de plaques de gel est placé dans la cuve et y est positionné automatiquement, grâce aux moyens de la figure 5, qui assu- rent en même temps la liaison électrique entre les élec- trodes ponctuelles 76 et les électrodes 64 du panier. Par commande des éléments de liaison 82 et 84, on assure tout d'abord la migration des macromolécules dans les plaques de gel, parallèlement à la longueur de ces plaques, puis, en inversant les rôles des éléments de liaison 82 et 84, la migration des macromolécules à travers l'épaisseur des plaques de gel et leur transfert sur les membranes asso- ciees. Les rangées, puis respectivement les colonnes d'électrodes ponctuelles 76, ainsi que les électrodes li- néaires 90 des faces verticales de la cuve, définissent des surfaces équipotentielles planes permettant, comme explique au brevet principal, des mesures fiables et rigoureuses. En figure 4, la flèche en trait plein indique la direction dans laquelle les plaques de gel sont orlen- tées, et les flèches en pointillés indiquent les directions du champ électrique, pour la migration et le transfert res- pectivement des macromolécules. Le déplacement du panier dans la cuve 70 s'effectue par translation verticale, à travers la face su- pérleure ouverte de la cuve 70, par exemple au moyen d'un bras robct qul permet d'amener le panier dans une station de chargement-déchargement o l'on peut préparer un panier, pendant qu'un autre panier est en cours de traitement dans la cuve 70. Dans une variante de réalisation plus simple représentée en figure 7, le fond 92 de la cuve comprend des électrodes ponctuelles 94, disposées selon un réseau carré à maille carrée et formant des rangées dans lesquelles elles sont raccordées entre elles par des conducteurs noyés dans le fond de la cuve. Ces rangées correspondent respec- tivement aux rangées d'électrodes 64 d'un panier et sont raccordées à leurs extrémités à des électrodes verticales 96 formées sur deux faces verticales opposées 98 de la cuve. Ces électrodes 94 et 96 définissent, avec les élec- trodes rectilignes 64 d'un panier, des plans équipotentiels qui sont perpendiculaires à la direction souhaitée de m:- gration des macromolécules. On procède donc de la façon suivante: le pa- nier est placé dans la cuve de telle sorte que les plaques de gel qu'il contient s'étendent perpendiculairement aux plans équipotentlels définis par les électrodes linéaires 94 et 96. L'éle-trophorèse permet alors d'assurer la migra- tion des macromclécules dans les plaques de gel, parallè- lement à la longueur des plaques. On peut ensuite sortir le panier de la cuve, le faire tourner de 90' autour d'un axe vertical, puis de le replacer dans la cuve, de telle sorte que les plaques de gel seront parallèles aux plans équipo- tentiels définis par les électrodes linéaires 94 et 96. L'électrophorèse provoquera alors la migration des macrcmo- lécules dans l'épaisseur des plaques de gel, et leur trans- fert sur les membranes associées. Les deux flèches en pointillé indiquent les orientations longitudinales des plaques de gel, dans les deux positions respectives de migration et de transfert des macromolécules, et les flèches en traits pleins correspon- dent à l'orientation du champ électrique entre les plans d'électrodes. En variante, on peut prévoir deux cuves telles que celles de la figure 7, montées au voisinage immédiat l'une de l'autre, et réaliser dans l'une la migration des macromolécules sur la longueur des plaques de gel, et dans l'autre. le transfert des macromolécules sur les membranes associées. Les deux autres faces verticales 100 de la cuve de la figure 7 peuvent être dépourvues d'électrodes, ou bien comprendre sur la quasi-totalité de leur surface in- terne un revêtement électro-conducteur qui formera une sur- face équlpotentielle plane parallèle aux plans équipoten- tlels définis par les électrodes 94 et 96. On peut utiliser, pour fixer les potentiels des différents plans d'électrodes, des amplificateurs opéra- tionnels, commandés par un système de traitement de l'information. Il est alors très simple d'obtenir entre les plans d'électrodes des champs électriques variables dans le temps et dans l'espace, selon des lois cycliques ou non, d'utiliser des champs électriques de type impulsionnel, etc... Par exemple, comme représenté sur la partie droite de la figure 6, des amplificateurs opérationnels 102 sont reliés chacun, à leur sortie, à une rangée d'électrodes 76. Une de leurs entrées est reliée à une sor- tie d'un circuit de commande 104, tandis que leur autre en- trée est à la masse. Lorsque les électrodes 76 forment un réseau carré, un commutateur multiple 106 permet d'appliquer les tensions de sortie des amplificateurs 102 soit aux rangées, soit aux colonnes d'électrodes 76. En figure 8, on a représenté schématiquement des tubes ou manchons cylindriques 108 entourant les élec- Il trodes verticales 64 d'un panier. Ces tubes 108, ouverts à leurs extrémités, sont en matière diélectrlque, et sont solt perforés soit poreux, pour permettre le passage du li- qulde d'électrophorèse à travers leur paroi en direction des électrodes 64. Ces tubes forment ainsi des pièges à bulles, dans lesquels les bulles de gaz produites par élec- trolyse sont guidées vers la surface libre du liquide, sans venir au contact des plaques de gel. Ils servent aussi de protection des électrodes 64, et empêchent les plaques de gel 66 de venir au contact des électrodes. Dans ce qui précède, on a décrit des formes de réalisation de l'invention applicables au cas o, les plaques de gel étant verticales, les deux directions de mi- gration et de transfert des macromolécules sont horizon- tales. Bien entendu, l'invention couvre aussi le cas o, les plaques de gel étant verticales, la direction de migra- tion des macromolécules dans les plaques est verticale, et leur direction de transfert sur les membranes associées est horizontale. Il suffit pour cela d'utiliser des paniers dans lesquels les électrodes 64 sont horizontales. REVENDICATIONS 1) Dlsposltlf selon l'une des revendications 10 à 19 du brevet principal, caractérisé en ce que les plaques de gel (66) sont disposées verticalement dans la cuve (701 entre lesdites électrodes (64). 2) Dlsposltif selon la revendication 1, carac- térisé en ce que les électrodes (64) sont des barreaux d'un panier mobile (60) formant le support des plaques de gel (66). 3) Dispositlf selon la revendication 2, carac- térlsé en ce que les extrémités, par exemple inférieures, des électrodes (64) comportent des moyens (78) de liaison ou de raccordement à des électrodes (76, 94) portées par la paroi correspondante (72, 92), par exemple de fond, de la cuve. 4) Dlsposltif selon la revendication 3, carac- térlsé en ce que les moyens (70) de liaison ou de raccorde- ment forment également des moyens de positionnement du pa- nler (60) dans la cuve. ) Dispositif selon la revendication 3 ou 4. caractérisé en ce que les électrodes (76) de la paroi pre- citée (72) de la cuve sont des électrodes sensiblement ponctuelles. 6) Dlspositif selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que les électrodes (94) de la paroi pré- citée (92) de la cuve sont sensiblement ponctuelles, re- liées entre elles par des conducteurs parallèles, perpen- diculaires à la direction souhaitée de migration des macro- molécules dans les plaques de gel. 7) Dlspositif selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que lesdites électrodes (76, 94) sont re- llées entre elles par des moyens de liaison commandés (82, 84), permettant de maintenir à un même potentiel les élec- s3 trodes situées dans un même plan perpendiculaire à la di- rection souhaitée de migration des macromolécules, et de maintenir une différence de potentiel entre deux successifs de ces plans. 8) Dlspositlf selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que les parols verticales (74, 98, ) de la cuve comportent des électrodes linéaires (90. 96) perpendiculaires à la direction souhaitée de migration des macromolécules et raccordées à des moyens de liaison commandés permettant sélectivement d'établir entre elles des différences de potentiel ou de les mettre à un même po- tentiel. 9) Disposltif selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que ledit panier (60) contient au moins, à un même niveau, deux séries de plaques de gel (66) dans lesquelles les plaques d'une série sont sensiblement dans le prolongement des plaques de l'autre série, et orientées soit dans le même sens, soit dans le sens contraire. ) Dispositif selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que les électrodes (64) d'un pa- nler sont entourées par des manchons ou tubes cylindriques (108) en matière diélectrique, perforés ou poreux, formant des pièges à bulles.