Brevet FR2645172A1 — publié le 19901005

La présente invention concerne un microorganisme capable de produire de la L-lysine et un procédé de fermentation l'utilisant pour produire de la L-lysine. Plus particulièrement, l'invention concerne une souche possédant une résistance aux anaLogues de L'arginine et à d'autres analogues, en plus des caractéristiques connues comme nécessaires pour la production de La L-Lysine, et un procédé de production de L-Lysine comprenant ta culture de La souche dans un milieu de culture nutritif et la récupération de La L-lysine à partir du bouillon de culture. La L-lysine, qui est un des amino-acides essentiels, a été utilisée comme additif alimentaire pour les animaux, par suite de sa capacité d'améliorer La qualité des aliments par accroissement de l'absorption des autres amino-acides, et utilisée également comme additif alimentaire pour l'homme. La L-lysine a été également utilisée en médecine, en particulier comme constituant de solutions de perfusion. La L-lysine peut etre produite selon un procédé de fermentation utilisant un mutant auxotrophe et/ou un mutant régulateur, ou selon un procédé de conversion enzymatique qui comprend le traitement du DL-or-amino-P- caprolactame (appeLé ci-après ACL) avec la L-ACL hydrolase et l'ACL racémase. Cependant, pour la production commerciale de la L-lysine, on a principalement utilisé le procédé par fermentation.Par exemple, les publications préliminaires de brevets japonais n" 82-9797, 82-14839 et 86-35840 décrivent des procédés utilisant des souches ayant pour caractéristiques de nécessiter de la vitamine B1, de l'acide pantothénique et/ou de la biotine pour Leur croissance ; de posséder une résistance vis-à-vis des analogues de la lysine, de la thréonine et/ou de l'isoleucine ; et de présenter une résistance vis-à-vis d'un ou plusieurs antibiotiques, comme la bacitracine, La pénicilLine G et/ou La poLymyxine. Les présents inventeurs ont effectué des études portant sur Corynebacterium glutamicum YJ-150 (déposé à la Fédération Coréenne des CoLLections de CuLtures sous Le numéro d'enregistrement KFCC 10014, Le 21 juin 1979) possédant Les caractéristiques connues comme nécessaires pour La production de L-Lysine. ILs ont découvert que, lorsqu'on confère à la souche CKFCC 10014) une résistance à au moins un anaLogue de L'arginine, La productivité de L-lysine de La souche est sensibLement accrue. Un but de L'invention est de fournir un microorganisme possédant une résistance à L'acide &alpha;-amino-ss- hydroxyvalérique, à La S-(-aminoéthyL)-L-cystéine, à La méthyLLysine, aux analogues de l'arginìne et à d'autres analogues, tels que La P-12-thiazolyL)-DL-aLanine, La canavanine, La cadavérine, La spermi ne, La spermi dine, La putrescine, La 5-hydroxyuridine, L'argininehydroxamate, Le 6-aza-uraciLe et Le 6-fluorotryptophane, et nécessitant de la Leucine et de L'homosérine. Un autre but de L'invention est de fournir un procédé qui comprend La culture du microorganisme décrit ci-dessus et La récupération de La L-Lysine à partir du bouillon de culture produit. Dans L'invention, on peut utiLiser tout microorganisme dont La souche appartient à L'espèce Corvnebacterium gLutamicum et qui possède Les caractéristiques connues comme nécessaires pour La production de La L-Lysine. On peut donc utiLiser, pour La production de La L-Lysine, non seulement les souches ayant Les caractéristiques précédemment mentionnées, teLLes qu'une exigence nutritive (homosérine, aLanine, Leucine, vaLine, acide nicotinique, acide pantothénique et lueurs méLanges) et ta résistance à divers dérivés d'amino-- acides (dérivés de Lysine, thréonine, méthionine, isoleucine et valine et leurs mélanges), mais également des souches possédant La résistance à d'autres anaLogues des amino-acides ou la résistance à des produits chimiques comprenant des antibiotiques.Les analogues de l'arginine et autres analogues comprennent La ss-2-thia- zolyl-DL-aLanine, la canavanine, la cadavérine, la spermine, la spermidine, la putrescine, La 5-hydroxyuridine, L'arginine-hydroxamate, te 6-aa-uracile et le 6-f luorotryptophane. On fait muter Corynebacterium glutamicum YJ-150 CKFCC 10014) par mise en suspension de La souche tKFCC 10014) dans une solution 0,1 M de sulfate de magnésium (107~108 cellules/ml) et exposition à un rayonnement ultraviolet (UV) pendant 30N180 s. Sinon on peut faire muter Corynebacterium gîutamicun YJ-150 CKFCC 10014) par mise en suspension de la souche CKFCC 10014) dans du tampon phosphate (pH 7,0) ou du tampon citrate (pH 5,5) (107N108 cellules/ml) et traitement avec 200~500 Fg/mL de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) à la température ordinaire ou à 320C pendant 10N30 min.On étale ensuite la suspension obtenue sur une boîte de géLose minimaLe contenant 1N10 g/L d'analogues de l'arginine et d'autres analogues et on incube à 320C pendant 4~7 jours pour faire pousser Les mutants. Au besoin, après mutation, on enrichit Les mutants par culture dans du milieu minimal contenant les amino-acides appropriés et dans du milieu hypertonique contenant 2 000N10 000 unités/ml de pénicilline G, 0,1 M de sulfate de magnésium et 20 % de saccharose, puis on étale la culture sur une botte de gélose appropriée pour obtenir des coLonies. Le milieu minimal comprend Les composants suivants : Glucose 10 g/l Sulfate d'ammonium 2 g/l Urée 2 g/l KH2P04 0,2 g/L K2HP04 0,2 g/L MgSO4,7H20 0,1 g/L CaCt2'2H2 0,1 g/t Biotine 100 g/l ThiamineHCL 100 Fg/L Na2B407,10H20 80 Fg/L (NH4)6M07027,4H20 40 g/l ZnS04,7H20 10 g/l CuS04,5H20 300 Fg/L MnCL2,4H2 10 g/l FeCL3,6H20 1 mg/L On ajoute au milieu minimal ci-dessus un amino-acide à une concentration dans La gamme de 50~100 mg/L. On confirme Les propriétés auxotrophes et Les résistances aux anaLogues des souches obtenues selon une méthode par répliques ou par évaluation des vitesses de croissance ou des activités enzymatiques relatives dans des cultures en fLacons. On séLectionne La souche nécessitant de L'homosérine et de La Leucine et résistante à La S-(ss-amino- éthyl)-l-cystéine, à l'acide &alpha;-amino--hydroxyvalérique, à la méthyllysine et aux anaLogues de l'arginine, ainsi qu'à d'autres analogues, tels que La ss-(2-thiazolyl)- DL-aLanine, La canavanine, La cadavérine, La spermine, La spermidine, La putrescine, La 5-hydroxyuridine, L'arginine-hydroxamate, Le 6-aza-uraciLe et Le 6-fLuoro- tryptophane, et on L'appele Corynebacterium sLutamicum CS-755. Corynebacterium gLutamicum CS-755 a été déposé à La Fédération Coréenne des CoLLections de Cultures sous te numéro d'enregistrement KFCC-10672 Le 29 mars t989 et à l'institut de Recherches sur Les Fermentations, Ministère des Sciences et Technologies, Japon, sous numéro d'enregistrement FERM BP-2763, Le 20 février 1990. Pour La fermentation produisant la L-lysine, on cultive ta souche (KFCC 10672, FERM BP-2763) en conditions aérobies (250~300 tr/min sur un agitateur rotatif ou à un débit d'aération de 0,5N1,5 v/v.min dans une jarre de fermentation) à 25N350C, en ajustant Le pH du milieu de culture dans la gamme de 5,0N8,0. Après 48N72 heures, une quantité sensible de L-Lysine est accumulée dans le bouillon de culture. Lorsqu'on utilise une jarre de fermentation pour la production de L-lysine, La fermentation peut etre effectuée selon un mode par alimentation discontinue par apport de sucre adcitionnel au bouillon de culture pendant ta culture. Dans la présente invention, on évalue Les performances de fermentation à partir des fermentations avec alimentation discontinue. Le milieu de fermentation a la composition suivante Glucose 75 g/l Sulfate d'ammonium 40 g/l CaC03 40 g/I Infusion de mais 100 g/l KH2P0 1 g/l MgS04,7H20 0,4 g/l FeS04,7H20 0,01 g/l MnS04,4H20 6 mg/L Biotine 300 Fg/L Thiamine-HCL 500 g/l Acide pantothénique 0,01 g/L pH 7,6ru8,0. On détermine La concentration de La L-Lysine (sous forme du monochlorhydrate) accumulée dans te bouillon de culture selon Le procédé à la ninhydrine acide ou par CLHP, et on détermine La composition des amino-acides dans Le bouillon de culture avec un autoanalyseur d'amino-acides. Exemple 1 On cultive Corynebacterium gLutamicum-YJ-150 (KFCC 10014) dans une jarre de fermentation de 30 L à 32 C à pH 6,8N7,0 avec un débit d'aération de 0,5N1,0 v/v.min. On détermine La composition des aminoacides du bouillon de cuLture avec un autoanaLyseur des amino-acides et Les résultats obtenus figurent dans Le tabLeau I. Pour étudier Les effets de divers aminoacides sur La production de La Lysine, on cultive La souche pendant 48 heures dans un mi Lieu contenant L'amino-acide spécifique à La concentration de 1 g/l et de 3 g/l. Les résultats figurent dans Le tableau II. TabLeau I. Composition des amino-acides dans Le bouillon de culture de Corynebacterium gLutamicum YJ-150 Anino-acide g/i Amino-acide g/l L-lysine.HCl 90,5 Acide glutamique traces Alanine 1,2 Leucine 1,8 Valine 0,5 Arginine traces Glycine 0,5 / Isoleucine traces Phénylalanine traces Tableau II. Effet de divers amino-acides sur La production de L-Lysine-HCL avec La souche YJ-150 L-lysine.HCi ajouté L-lysine.HCl produit (g/l) Amino-acide ajouté 1 g/l 3 g/l L-alanine 16,0 17,2 L-arginine 19,5 20,2 Acide L-aspartique 17,2 17,5 L-cystéine 16,9 17,4 Acide L-glutamique 17,2 17,7 L-glutamine 17,5 17,4 L-glycine 17,5 18,1 L-histidine 18,1 18,4 L-homosérine 17,4 17,3 L-isoleucine 18,1 17,6 L-leucine 15,1 14,7 L-lysine 17,2* 17,4* L-méthionine 17,5 17,3 L-phénylalanine 17,0 17,2 L-proline 16,9 17,2 L-sérine 17,4 17,3 L-thréonine 17,5 17,9 L-tryptophane 16,9 17,1 L-tyrosine 17,0 17,2 L-valine 17,9 18,2 Nota * :L-lysine-HCl net produit. Les résultats, qui figurent dans le tabLeau Il, montrent que La production de L-lysine est accrue lorsqu'on ajoute un de certains ami no-acides, tels que l'arginine, L'acide aspartique, L'isoleucine ou la valine, tandis que La production de L-lysine est réduite lorsqu'on ajoute de la Leucine. On a étudié L'inhibition de La croissance de Corynebacterium glutamicum YJ-150 pour diverses concen trations de S-CP-aminoethyL)-L-cystéine (AEC), qui est un analogue de L-Lysine, et l'effet de l'addition de l'arginine sur La croissance, et Les résultats obtenus figurent dans Le tableau III. Tableau III. Résistance à L'AEC de- Corynebacterium glutamicum YJ-150 (unité : taux de croissance relative, %) AEC ajoutée (g/l) Addition d'amino-acide 0 2,5 5 10 15 20 Pas d'addition 100 99 85 65 63 62 Arginine (1 g/l) 100 99 93 78 78 75 Comme Le montre le tableau III, Le degré d'inhibition de La croissance provoquée par L'AVEC est réduit Lorsqu'on ajoute I gZl d'arginine au milieu de culture. Les résultats ci-dessus montrent que La production de L-Lysine est accrue lorsqu'on utilise une souche présentant une résistance aux anaLogues de L'arginine. On obtient Les mutants résistants à un analogue de l'arginine selon Le mode opératoire de l'exemple 2 et on détermine les productivités de ta L-lysine des souches. Exemple 2 On fait muter Corynebacterium qlutamicum YJ-150 (KFCC 10014) par mise en suspension de la souche CKFCC 10014) dans une solution de sulfate de magnésium 0,1 M à La densité de 107~108 celLules/mL et exposition à des rayons UV pendant 30~180 secondes, ou par mise en suspension de la souche (KFCC 10014) dans du tampon phosphate CpH 7,0) ou du tampon citrate tpH 5,5) à une densité de 107~108 celluLes/ml et traitement avec 200N500 g/ml de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine à La température ordinaire ou à 32 C pendant 10~30 min. On obtient ainsi des souches productrices de L-Lysine ayant diverses caractéristiques de contrôle métabolique comme résumé dans le tableau IV. Tableau IV. Souches productrices de L-lysine et leurs caractéristiques Souches Souche parentes Caractéristiques Corynebacterium CS-1 YJ-150 Hse-, AECr, analogues d'Argr et autres analoguesr Corynebacterium CS-2 YJ-150 Hse-, AEC r Leu Corynebacterium CS-3 CS-1 Hse-, AECr, analogues d'Argr et autres analoguesr, AHVr Corynebacterium CS-4 CS-1 Hse-, AECr, analogues d'Argr et autres analogues r MLr Corynebacterium CS-5 CS-3, CS-4 Hse-, AECr, analogues dtArgr et autres analoguesr, AHVr, NLr Corynebacterium CS-6 CS-2 Hse-, Leu-, AECr, analogues d'Argr et autres analoguesr Corynebacterium CS-7 CS-6 Hse-, Leu-, AECr, AHVr, NLr analogues d'Argr, et autres analoguesr Nota Hse : homosérine AEC : S-(ss-aminoethyl- L-cystéine Leu : leucine AHV : acide -amino-ss- hydroxyvalérique ML : méthyllysine Analogues d'Arg et autres analogues D-(2-thiazolyl)-DL-alanine, canavanine, cadavérine, spermine, spermidine, putrescine, 5-hydroxyuridine, arginine-hydroxamate, 6-aza uracile et 6-fluorotryptophane. Pour évaluer les souches mutantes obtenues, on prépare, dans une fiole de 250 ml, 20 ml de milieu nutritif contenant 200 mg/L des amino-acides requis. On inocule le milieu avec une anse de chaque souche du tableau IV cultivée sur une boUte de gélose nutritive et on cultive pendant 48N72 heures.On détermine La L-Lysine accumulée pour sélectionner Corynebacterium glutamicum CS-755 CKFCC 10672, FERM BP-2763) possédant des caractéristiques telles que Hse-, Leu-, AECr, AHVr, MLr, P-(2-thiazoLyL)-DL-aLaniner, canavaniner, cadavériner, sperminer, spermidiner, putresciner, 5-hydroxyuridiner, arginine-hydroxamate, 6-aza-uraciter et 6-fluorotryptophane r partir des colonies de Corynebacterium glutamicum CS-7. On cuLtive Corynebacterium gLutamicum YJ-150 et CS-755 dans des fioLes, et on calcule Les quantités de Lysine produites et Les rendements qui figurent dans Le tableau V. Tableau V. Résultats de la fermentation avec Corynebacterium gLutamicum YJ-150 et CS-755 dans des fioles Souche utilisée L-lysine HC1 Rendement de L-lysine Croissance produit (g/l) relatif au sucre (%) (D0582 x 100) YJ-150 30 40 39 CS-755 34 45 32 Exemple 3 On effectue des fermentations avec alimentation discontinue dans une jarre de fermentation de 30 l avec Corynebacterium glutamicum CS-755 et YJ-150 (souche parente de CS-755). La quantité de lysine produite et La composition des amino-acides du bouillon de culture obtenu figurent respectivement dans le tabLeau VI et Le tableau VII. Tableau VI. RésuLtats de la fermentation avec Corynebacterium glutamicum CS-755 et YJ-150 dans une jarre de fermentation de 30 l Souche utilisée L-lysine HCl Croissance produit (g/l) (DO582 x 100) YJ-150 92 90 CS-755 120 81 Tableau VII. Composition des amino-acides dans le bouillon de culture de Corynebacterium gLutamicum CS-755 Amino-acide Quantité produite Amino-acide Quantité produite (g/l) (g/l) L-iysine.HCi 120 Acide glutamique traces Alanine 0,8 Leucine traces Valine 0,3 Arginine 2,5 Glycine 0,1 Isoleucine traces Phénylalanine traces Comme le montrent Les tableaux VI et VII, Corynebacterium glutanicun CS-755 produit jusqu'à 120 g/l de L-lysine.HCl. Le rendement de production du L-lysine-HCl relativement au sucre consommé est d'environ 45 % et 1,6~2,5 g/l d'arginine sont accumulés dans le bouiLLon de culture. Exemple 4 On soumet 10 litres du bouillon de culture, obtenu par culture de Corynebacterium gLutamicum CS-755 (KFCC 10672, FERM BP-2763), à un ajustement du pH avec de L'acide sulfurique et on adsorbe sur une résine échangeuse de cations fortement acide Duolite C-20N par ascension à partir du fond d'une colonne à une vitesse spatiale de 5. Lorsqu'on utilise ce procédé d'adsorption à courant ascendant, un appareil, tel qu'une centrifu geuse, pour éLiminer les microorganismes du bouiLLon de cuLture, est inutile et, par conséquent, La perte de L-lysine résultant de t'opération peut etre évitée. Après achèvement de I'adsorption, on Lave suffisamment La cotonne de résine avec de L'eau pour éLiminer Les microorganismes et Les particules. On élue la L-lysine adsorbée avec du NH4OH 2 N et on recueille La fraction active dont Le volume est égal à 0,6 fois celui de La résine (La concentration du L-Lysine-HCL est de 129 g/L et le rendement de récupération à partir du bouillon de culture est de 97 eS). On recycle les fractions de faibLe concentration dans le cycle suivant. On concentre la fraction active et on chasse L'ammoniac, puis on ajuste le pH à 5,0 avec de L'acide chlorhydrique et on traite avec du charbon actif. On concentre à nouveau La solution obtenue, puis on filtre pour recueillir les cristaux bruts formés (cristaux primaires). On concentre La Liqueur-mère primaire obtenue par filtration, puis on la sépare à nouveau en cristaux (cristaux secondaires) et liqueur-mère secondaire. On mélange les cristaux secondaires avec La fraction active du cycLe suivant éLuee de La colonne de résine décrite ci-dessus. On recycle La Liqueur-mère secondaire dans une cuve de bouiLLon de culture. On sèche Les cristaux obtenus selon Le procédé ci-dessus dans de L'air chaud pour preparer 993 g de chlorhydrate de L-lysine Cle rendement de récupération est de 94 % et ta pureté est supérieure à 99,5 %). Exemple 5 On éLimine par ultrafiltration Csystème X-FLo Biorecovery Co. U.S.A., MRC-Membrane ayant une limite de séparation correspondant à un poids moléculaire de 30 000) les cellules bactériennes de 10 L de bouillon de culture obtenus par culture de Corynebacterium glutamicum CS-755 CKFCC 10672, FERM BP-2763-). Le bouillon de culture obtenu par diafiltration a un volume total de 35 L. On ajuste Le filtrat à un pH de 5,0, on décolore avec du charbon actif, on concentre, on cris taI lise, puis on sépare en cristaux et en Liqueur-mère. On traite la Liqueur-mere selon le mode opératoire indi qué dans l'exemple 4 pour obtenir La fraction active. Après éLimination de l'ammoniac, on mélange La fraction active avec Le fiLtrat dans L'étape de traitement du bouillon et on ajuste Le pH, on décolore et on concentre pour obtenir 993 g de cristaux purs (Le rendement de récupération est de 94 % et La pureté est supérieure à 99 %) Bien entendu, diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'etre décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Nouveau microorganisme Corynebacterium glutamicum CS-755 CKFCC 10672, FERM BP-2763) capable de produire de La L-Lysine, qui possède la résistance à L'acide &alpha;-amino--hydroxyvalérique, la S-(ss-aminoéthyl)- L-cystéine, La méthyllysine et Les analogues de l'arglnine et d'autres analogues, tels que la ss-(2-thia- zolyl)-DL-alanine, La canavanine, la cadavérine, la spermine, la spermidine, la putrescine, La 5-hydroxyuridine, l'arginine-hydroxamate, Le 6-aza-uraciLe et Le 6-f luorotryptophane, et nécessite de la Leucine et de L'homosérine. 2. Procédé pour produire de La L-Lysine selon un processus de fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend La culture de La souche CKFCC 10672, FERM BP-2763) et la récupération de la L-lysine à partir du bouillon de culture obtenu.