Brevet FR2645024A1 — publié le 19901005

- 1 - ComDosition Dour médicaments antiviraux qui renferme des pro- duits issus de la fabrication de la Date a Dapier. La présente invention a trait a une compo- sition pour médicaments actifs contre le virus du SIDA ou contre d'autres virus, composition qui contient, comme cons- tituants principaux, une lessive résiduaire de la fabrication de la pâte a papier et/ou des produits résultant d'un traite- ment chimique de celle-ci. Elle a trait également à des inétho- des de traitement préventif ou curatif d'infections provoquées par le virus du SIDA ou par d'autres virus. La présente invention concerne l'applica- tion de dérivés de la lignine à la fabrication de médicaments antiviraux, destinés en particulier aux traitements préventif et curatif de la maladie virale qu'est le SIDA (syndrome d'immunodeficience acquise). Le nombre des personnes atteintes du SIDA a brusquement augmenté, d'après des études récentes faites aux Etats Unis d'Amérique et en Afrique, et on admet couramment qu'il est d'environ 50 000; le nombre de porteurs du virus dans le monde est environ 100 fois plus élevé. On dit que presque tous les porteurs du virus tomberont malades dans les cinq ans et que le taux de mortalité atteint environ 100%. Le SIDA provoque un affaiblissement du système immunitaire du fait que le virus du SIDA infecte les cellules T auxiliaires qui gouvernent le système immunitaire, et qu'il les détruit. Il en résulte que les personnes atteintes finissent par mourir d'une maladie infectieuse intercurrente, d'une tumeur maligne, etc. Jusqu'a présent seule l'azidothymidine ou "AZT" (composé dérivant d'un acide nucléique) a été admise comme médicament contre le SIDA. L'AZT ne peut cependant pas être utilisé pour un traitement de longue durée parce qu'il a des effets secondaires prononcés (anémie etc). Par ailleurs la lignine est abondante dans la nature (elle vient après la cellulose): on en trouve dans presque toutes les plantes. Il y a en dans la nourriture de -2 - 1'homme. Récemment les effets physiologiques(par exemple troubles intestinaux) de la lignine, sorte de fibre végétale, ont attiré l'attention. On prépare en outre des dérivés de la lignine a partir de la lessive résiduaire fournie par l'indus- trie de la pâte à papier et du papier. L'activité de ces substances en tant que médicaments n'a cependant guère été étudiée et on n'en connaît que les propriétés anti-tumorales. Cela étant, les présents inventeurs ont étudié les effets physiologiques de l'acide lignine-sulfonique et d'autres dérivés de la lignine, en particulier l'effet antiviral contre le virus de la maladie de Newcastle ou 'NDV", virus qui appartient à la famille des paramyxovirus, et contre le virus du sarcome de Rous ou "RSV" et le virus de l'immuno- déficience humaine ou "HIV", qui appartiennent à la famille des rétrovirus, à laquelle le virus du SIDA appartient égale- ment, et leurs recherches ont abouti à la présente invention. L'invention a essentiellement pour objet une composition pour médicaments actifs contre le virus du SIDA et contre d'autres virus, composition qui renferme, corme constituants principaux, de la lessive sulfitique résiduaire provenant de l'industrie de la pâte a papier et/ou des pro- duits résultant d'un traitement chimique de celle-ci. On a tout d'abord déterminé l'activité antivirale d'une lessive sulfitique résiduaire et on a trouvé, pour cette activité, une valeur d'environ 1,5 mg/ml contre le NDV et une valeur d'environ 100 pg/ml contre le RSV. On a ensuite fractionné la lessive sulfitique résiduaire à travers des ultrafiltres (type UK) correspondant à des masses molécu- laires fractionnaires de 10 000 et de 1000. On a déterminé les quantités de sucres, de cendres et d'acide lignine-sulfonicue dans chacune des fractions, ainsi que les activités anti- virales: les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Sucres Cendres Acide lignine- Activité Activité sulfonique *1 anti-NDV anti-RSV Liqueur sulfitique 24% 38% 37% 1,5 0,1 résiduaire *2 mg/ml mg/ml Masse moléculaire fractionnaire su- 10 14 75 0,3 0,03 périeure à 10000 Masse moléculaire fractionnaire su- 14 30 45 2,0 0,3 périeure à 1000 et inférieure à 10000 Masse moléculaire fractionnaire in- 33 55 12 7,5 2,0 férieure a 1000 *1 Dosé par la méthode au glycol-chitosan *2 Lignine résiduelle dans la pâte: 2,0% Comme ci-dessus on a trouvé que la substan- ce à activité antivirale se trouve dans l'acide lignine- sulfonique, et en particulier que la fraction qui présente une grande activité est du côte de la masse moléculaire élevée. Cette fraction exerce également une puissance d'activité anti- virale contre le HIV. Toutefois ce fait n'exclut par l'exis- tance de substances a activité antivirale autres que l'acide lignine-sulfonique dans la lqueur sulfitique résiduaire. Les méthodes utilisées pour étudier l'acti- vité antivirale sont exposées ci-dessous. Dans l'essai sur l'activité anti-NDV on fait croître des cellules CEF (fibroblastes d'embryon de pou- let) en culture primaire sur une plaque a 96 trous, et on les infecte par NDV. Ensuite, au bout de 30 minutes, on ajoute des échantillons a dilution progressive et, 24 heures plus tard, on évalue, en se servant d'un microscope, la concentration qui inhibe la fusion cellulaire provoquée par le virus. Dans l'essai relatif à l'activité anti-RSV, après la prolifération des CEF sur une plaque a 96 trous, on -4- les infecte par RSV. Au bout d'une heure on ajoute des échan- tillons a dilution progressive et, 5 jours plus tard, on détermine, en se servant d'un microscope, la concentration qui permet d'inhiber la transformation provoquée par le virus. Pour l'essai anti-HIV on utilise MT-4 (cel- lules T humaines infectées par RTLV-1) et HTLV-IIIb, respecti- vement comme cellules et comme virus. Le milieu viral est préparé a partir du surnageant de culture de cellules Molt 4/ HIVHTLVIIib, cellules productrices de HIV. Le titre viral est de 1 x 106 DI50CT/ml. En plus, on utilise RPMI 1640 (contenant des antibiotiques) comme milieu. Pour la culture on ajoute des quantités égales de cellules NT-4 à 1 x 106o cellules/ml et de HTLV-IIIb à 2 x 104 DI50CT/ml à chacun des puits d'une plaque à 24 trous, et on cultive pendant ue heure pour que le virus soit adsorbé. Apres cela on ajoute des solutions de l'échan- tillon qui ont été diluées à différentes concentrations, on étend a 1 ml avec le milieu et on cultive pendant 4 jours a 37 C dans un incubateur a CO2. A titre de comparaison on effectue des cultures avec des cellules non infectées par HTLV-IIIb et sans addition de l'échantillon. L'effet anti- viral est évalué par deux méthodes: l'inhibition de la degenérescence cellulaire due à HIV et l'inhibition du déve- loppement d'antigènes spécifiques de HIV sur la surface des cellules. Tout d'abord on évalue l'effet de dégénérescence cellulaire d'après l'inhibition de l'action létale provoquée sur des cellules par l'addition de l'échantillon, cela par comptage du nombre de cellules vivantes selon la méthode au bleu Trypan pour les milieux de culture de 4 jours, c'est-a- dire le milieu infecté par HIV et le non-infecté. De plus, pour doser l'antigène spécifique de HIV, après que les cellules fixées par du méthanol aient réagi avec le sérum humain anti-HIV pendant 40 minutes a 37 C, on ajoute de l'IgG anti-humaine marquée par de l'isothiocyanatofluorescénie (FITC), on laisse réagir à 37-C pendant 40 minutes, puis on compte, en se servant d'un microscope à fluo-rescence, le nombre de cellules marquees par fluorescence. Ensuite on détermine aussi l'activité anti- virale de différents dérivés de la lignine. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 2. Les méthodes que l'on a appliquées pour préparer les échantillons dudit tableau sont les suivantes LiQnine-sulfonate de sodium On le prépare en traitant le lignine- sulfonate de calcium par du sulfate de sodium pour provoquer un échange des bases. Lignine-sulfonate de calcium On le prépare par cuisson de pin rouge avec une liqueur de cuisson de sulfite de calcium (CaSO3). Lianine-sulfonate de magnésium On le prépare par cuisson de pin rouge avec une liqueur de cuisson de sulfite de magnésium (MgSO3). Lignine kraft On la prépare par réduction en pâte kraft de pin rouge conduisant a une pâte kraft blanchie (teneur résiduelle en lignine de la pâte: 2,0 %). Composition de la lessive résiduaire kraft: matière minérale: 6,2%, sucres 2,8%, lignine 6,0%. Dioxanne-lianine Elle est extraite de la farine de bois (sapin) traitée par un mélange d'alcool et de benzène par chauffage à 175C pendant deux heures dans une liqueur mixte dioxanne/eau (1:1) conformément à la méthode de Sakakibara et al.. Le rendement est d'environ 45%. Acide thioalvcoliaue/lianine On prépare ce produit selon Braun et al.: on introduit de la farine de bois (bouleau) dégraisséee dans une liqueur mixte d'acide thioglycolique et d'acide chlorhy- drique 2N, on fait bouillir pendant 7 heures, on sépare ensui- te la matière par filtration et, apres lavage avec de l'eau et avec de l'éthanol, on extrait le résidu avec de l'hydroxyde de -6- sodium a 2%. La lignine est isolée apres précipitation par de l'acide chlorhydrique. Produit de sulfomnéthylation de la lianine kraft Pour préparer ce produit on introduit du sulfite de sodium Na2SO3 (de 10 à 20% par rapport à la lignine kraft), puis du formaldéhyde HCHO (quantité équimolaire par rapport à Na2SO3) dans une bouillie (à environ 25%) de lignine kraft, on traite pendant 1 à 2 heures à 60-80'C, puis, après avoir traité pendant encore 2 à 3 heures à 130-150*C, on refroidit et on sèche. Tableau 2 Echantillon Activité Activité anti-NDV anti-RSV Lignine-sulfonate de sodium 0,3 mg/nl 0,03 mg/ml Lignine-sulfonate de calcium 0,4 0,04 Ligninesulfonate de magnésium 0,2 10,03 Lignine kraft 1,2 f0,1 Dioxanne/lignine 1,5}0,2 Acide thioglycolique/lignine 0,8 o,1 Produit de sulfomnéthylation de la 0,5 0,07 lignine kraft On voit que tous les dérivés de la ligr.ine mentionnés dans le tableau ci-dessus ont une activité anti- virale et que, parmi ceux-ci, les acides lignine-sulfoniques exercent une puissante activité anti-virale. Par ailleurs les dérives de la lignine ne sont pas limités à-ceux qui sont ci- tés dans le tableau: on peut avoir recours à n'importe.lequel de ceux qui sont connus. Les exemples suivants illutrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Exemple 1 A l'aide d'une membrane de dialyse on dialyse 100 ml de la liqueur sulfitique résiduaire définie -7- dans le tableau 1, pendant 4 jours contre de l'eau de ville et pendant 3 jours contre de l'eau désionisee. La liqueur obtenue après la dialyse est concentrée à environ 30 ml au moyen d'un évaporateur rotatif, puis elle est lyophilisée: on obtient ainsi environ 3,5 g d'une fraction riche en acide lignine- sulfonique. Dans cette fraction les teneurs en sucres réduc- teurs et en cendres sont abaissées à environ un centième des valeurs qu'elles avaient dans la lessive sulfitique résiduaire de départ. Lorsqu'on détermine l'activité anti-NDV et l'acti- vite anti-RSV de cette fraction on trouve des valeurs qui sont respectivement de 0,5 mg/ml et de 0,04 mg/ml. ExemDle 2 On ajuste a 3,0 le pH de 100 ml de la les- sive résiduaire kraft definie dans le tableau 2 pour faire précipiter la lignine kraft, puis on centrifuge (10000 tours par minute) et on recueille le précipité. On transforme ensuite celui-ci en une poudre par séchage sous pression réduite et on obtient ainsi environ 4,0 g d'une fraction riche en lignine kraft. Après avoir mis celle-ci en suspension dans de l'eau désionisée on ajoute de l'hydroxyde de sodium IN pour provoquer la dissolution totale et on prépare une solution qui a une concentration finale de 1%. Sur cette solution de ligni- ne kraft on détermine l'activité anti-NDV et l'acticité anti- RSV: les valeurs trouvées sont respectivement de 0,8 mg/ml et de 0,07 mg/ml, en matière solide. Exenmple 3 On détermine l'activité anti-HIV d'une partie de lessive sulfitique résiduaire qui a une masse molé- culaire fractionnaire supérieure à 10000 (voir le tableau 1). Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 3. Tableau 3 - Concentration Nombre de cellules Nombre de cellules Antigène de l'échantillonvivantes sans vivantes avec spécifique infection par HIV infection par HIV d'HIV 500 pg/mi 1,36 x 106/ml 1,08 x 106/ml 0% 250 1,46 1,41 0% 1,57 1,45 0% 63 1,53 1,62 0% 32 1,58 1,66 0% 16 1,56 1,53 0% 8 1,58 1,57 0% 4 1,59 0,96 20% 1,5 0 1,61 0,21 90% Ces résultats montrent clairement que l'ac- tivité anti-HIV de la fraction de liqueur sulfitique résiduai- re a masse moléculaire supérieure à 10000 inhibe complètement à la fois la dégenérescence cellulaire due au virus et le developperent de l'antigène spécifique de HIV, à une concen- tration très basse, à savoir 8 pg/ml, et que la toxicité contre les cellules n'apparaît que faiblement à une concentration élevee, à savoir 500 pg/ml. Cela montre que la fraction est un agent antiviral à très haut indice de sélectivité. -9- REvENDICATIONS 1. Composition pour médicaments destinés a combattre le virus du SIDA et d'autres virus, compositions qui contient, comme constituants principaux, de la lessive resi- duaire provenant de la fabrication de la pâte a papier et/ou des produits résultant d'un traitement chimique d'une telle lessive. 2. Composition selon la revendication 1 dans laquelle la lessive résiduaire provenant de la fabrication de la pàte a papier est une lessive sulfitique résiduaire et/ou une lessive résiduaire kraft. 3. Composition selon la revendication 2 dans laquelle la lessive sulfitique résiduaire est fractionnée par ultrafiltration, par filtration sur gel etc et elle contient, comme constituant principal, la fraction qui a une masse moléculaire au moins égale a environ 5000. 4. Application d'une lessive résiduaire provenant de la fabrication de la pâte à papier, et/ou de produits résultant d'un traitement chimique d'une telle lessive, comme constituants d'un médicament destine au traite- ment préventif et/ou curatif d'infections causées par le virus du SIDA ou par d'autres virus. 5. Composition pour médicaments actifs contre le virus du SIDA ou contre d'autres virus, composition qui contient des dérivés de la lignine comme constituants principaux. 6. Composition selon la revendication 5 dans laquelle les dérivés de la lignine ont été obtenus à partir d'une matière première qui est la lignine du bois ou de plantes herbacées. 7. Composition pour médicaments actifs contre le virus du SIDA et d'autres virus, composition qui renferme, comme constituants principaux, des composantes non- ligneuses de bois et/ou de plantes herbacées, et/ou des dérivés de ces composantes non-ligneuses.