Brevet FR2643647A1 — publié le 19900831

1. La présente invention concerne un procédé d'obtention de méthylcétones par incubation d'acides carboxyliques avec des spores de Penicillium roqueforti! en milieu organique. Parmi les molécules aromatiques caractéristiques de la saveur du fromage bleu, se trouvent des méthylcétones, et notamment l'heptanone-2 et la nonanone-2, qui résultent d'une f - oxydation suivie d'une décarboxylation d'acides gras par des enzymes de ce champignon, présentes dans les spores et le mycélium. On peut se réferrer, par exemple, à la revue de John E. Kinsella et Dong H..Hwang, publiée dans Critical Reviews in Food Science lOand Nutrition 8 (2) p. 191-228 (1976), qui fait la synthèse des nombreux travaux publiés sur ce sujet. Les composés obtenus par action des enzymes, contenues dans les spores de Penicillium roquefortii, sur les matières grasses du lait sont utilisés pour renforcer le goût des fromages jeunes ou pour aromatiser au "bleu" des produits alimentaires divers, tels que sauces, biscuits, laitages. Ces produits sont très appréciés des consommateurs et il était souhaitable, pour permettre leur large diffusion, de diminuer le coût de leur obtention. Pour cela, il faut notamment améliorer la bioconversion des acides gras précurseurs des méthylcétones aromatiques, que ce soit au stade de la production des spores par fermentation de Penicillium, ou lors de la production des composés aromatiques sous l'influence des spores. Récemment, C. Larroche et al. ont décrit un procédé amélioré de production de spores par fermentation en milieu solide, sur grains de sarrasin, dans Appl. Microbiol. Biotechnol. 28 85-92 (1988) et rapporté leur étude de l'influence de la souche du champignon et de divers activateurs sur la production de l'heptanone - 2 à partir de l'acide octanoïque en milieu aqueux, dans J. of Ind. Microbiology 3 p 1-8 (1988), ou avec des spores immobilisées dans Enzyme Microbiotechnology 11 (2) p. 106-112 (1989). On sait que la mise en oeuvre de microorganismes immobilisés permet de diminuer le coût des bioconversions que l'on opère en continu ou par additions successives du substrat et l'utilisation des spores fixées dans des billes d'alginate de calcium reticulé ou enrobé, comme décrit dans cette publication est avantageuse, bien qu'avec les conditions opératoires indiquées, on constate une forte inhibition de la réaction par le substrat. On a maintenant trouvé que l'on pouvait augmenter très sensiblement la concentration initiale en substrat, la productivité en méthyl-cétones des spores, et diminuer les pertes en méthylcétones volatiles en effectuant la bioconversion en milieu organique. Les exemples de bioconversion en milieu organique ne sont pas nombreux malgré leurs avantages potentiels, parce que de nombreux biocatalyseurs sont inactivés ou dénaturés par les solvants organiques7 il est donc surprenant de constater que les spores de Penicillium roquefortii, libres ou immobilisées dans des billes d'alginate effectuent la bioconversion des acides gras en méthylcetones, dans les milieux organiques de l'invention avec des résultats supérieurs à ceux obtenus en milieu aqueux. Ainsi, la présente invention concerne un procéde d'obtention de méthylcetones en C5 à C10 par conversion d'un acide gras ou d'un mélange d'acides gras en C6 à Cl en milieu organique aérobie sous l'action de spores de Penicillium roqueúfortii libres ou immobilisées, par exemple dans une matrice d'alginate, ou de gélatine réticulee. Le solvant organique utilisé comme milieu réactionnel doit évidemment être inerte mais aussi avoir une faible polarité; on a ainsi constaté que pour l'acide octanoïque, la réaction n'avait pas lieu dans l'éther éthylique ou le toluène et que dans l'hexane ou le méthylcyclohexane, les résultats étaient proches de ceux obtenus en milieu aqueux; tandis que les hydrocarbures aliphatiques en C7 à C20, c'est-à-dire les hydrocarbures liquides paraffiniques, isoparaffiniques et cycloparaffiniques, purs ou en mélanges, permettent d'obtenir des rendements de bioconversion supérieurs à ceux des milieux aqueux. Aussi, pour la mise en oeuvre du procéde de l'invention, on préfère utiliser comme milieu réactionnel un solvant pratiquement apolaire, c'est-à-dire dont le coefficient de partage P entre l'eau et l'octane est élevé. On considère ici que P est élevé si log P, déterminé par la méthode de R.F. Rekker décrite dans Eur. J. Med. Chem. 14 479 (1979), est supérieur à 4 et de préférence compris entre 7 et 9. 264364? Les spores utilisées dans le procédé de l'invention, obtenues selon des procédés classiques de fermentation en phase solide ou liquide, sont, par exemple, immobilisées dans une matrice constituée de billes d'alginate consolidées par action de la polyéthylôneimine et du glutaraldéhyde, comme décrit par S. Birnbaum dans Biotechnol. Lett. 3 p 393-400 (1982) ou par enrobage avec un polymère, tel qu'un copolymère acrylique, selon le procédé décrit par W. Hartmeier et A. Heinrichs dans Biotechnol. Lett. 8 p 567-572 (1986) pour l'immobilisation de mélanges de cellules microbiennes et d'enzymes. Elles peuvent aussi être immobilisées dans des microbilles de gélatine réticulée avec un polysQccharide oxydé, ou par toute autre méthode connue de l'homme du métier. Dans des billes d'alginate, préparées selon la méthode de Birbaum, on peut inclure de 1010 à 1012 spores, fraiches ou décongelées et réhydratees, dans 1OOml de gel préparé avec 1 à 4 g d'alginate de calcium; les billes consolidées peuvent être conservées plusieurs semaines en suspension dans l'eau à une température inférieure à 10 C sans perte sensible d'activité catalytique. Pour la bioconversion, les billes sont mises en suspension dans le solvant choisi, en général à raison de 0,2 à 0,4 g de billes par ml de solvant, soit de 107 à 1010 spores par ml de solvant et de préférence environ 108, et le milieu est agité et aéré de façon classique par bullage d'air; l'ensemble est maintenu à une température comprise entre 25 C et C. On peut introduire l'acide à transformer dans le milieu par étapes successives, distantes de quelques heures, ou en continu; les concentrations d'acide dans le milieu réactionnel dépendent de la nature de l'acide et de celle du solvant mais sont toujours nettement supérieures à celles admissibles lorsque le procédé est mis en oeuvre en milieu aqueux, et c'est un autre avantage de l'invention. Dans le cas de l'acide octanoïque et d'un solvant isoparaffinique de log P voisin de 7, la bioconversion n'est pas inhibée par une concentration d'acide de 300 mM par litre de solvant pour environ 1011 spores immobilisées dans l'alginate, et elle est maximale pour 100 mM. Dans ce qui suit, des exemples de mise en oeuvre du procédé de l'invention sont décrits. Exemple 1 a) Obtention des spores On inocule des grains de sarrasin, cuits au bain marie à 100 C, pendant minutes dans de l'eau contenant 350 mgl/1 de chloramphenicol puis stérilisés à l'autoclave 20min à 120 C après égouttage, à raison de 105 à 106 spores, provenant de la souche de Penicilium roquefortii ATCC 64383, par gramme de matière sèche. Ces grains sont mis dans des fermenteurs aérés préalablement stérilisés et on obtient en 12 à 15 jours environ 5 x 109 spores/g de matière sèche. Les spores externes aux grains sont alors extraites par agitation à température ambiante dans une solution aqueuse de Tween 80 R à 0,05 %, à raison de 5 à 10ml de solution par gramme de milieu de fermentation et les grains sont séparés par filtration. On peut aussi utiliser des spores décongelées, qui ont été conservées à température inférieure à - 15 C dans leur milieu de fermentation; les spores sont alors réhydratées par maintien en suspension dans l'eau à C pendant 10 heures au moins. 264364? b) Immobilisation des spores On introduit 8 x 1010 spores en suspension dans 10ml d'eau, dans 120ml d'une solution à 2 % (p/v) d'alginate de sodium, préalablement homogénéisée par agitation violente, puis désaérée sous vide. Le mélange est ensuite pompé à l'aide d'une pompe péristaltique et passe à travers des aiguilles de 0,6mm de diamètre permettant la formation de gouttes qui tombent dans 200ml d'une émulsion constituée d'une solution aqueuse d'un mélange de CaCl2 et d'un copolymère acrylate/méthacrylate de masse moléculaire voisine de 150000, tel que l'Eudragit RL100R commercialisé par Rohm Pharma (RFA); l'émulsion a été préparée par introduction à 18 C dans un volume de solution aqueuse de CaCl2 0,1 M d'un volume d'une suspension d'Eudragit à 1 % (p/v) dans de l'eau distillée, préalablement chauffée pendant 20 minutes à 121 C. La suspension de billes est agitée 30 minutes après la fin de l'addition de la solution d'alginate puis abandonnée 15 heures à 5 C; le liquide surnageant est alors éliminé et les billes, dont le diamètre est de 3 mm environ, sont rincées deux fois avec de l'eau distillée stérile contenant 350mg/l de chloramphénicol. c) Bioconversion On introduit 130g des billes humides préparées selon b) dans 400 ml d'un solvant isoparaffinique, commercialisé par Total Solvants (France) sous la référence IP 230 OS, constitué d'un mélange d'hydrocarbures saturés en C13 à C16, de point d'ébullition supérieur à 230 C, de viscosité mesurée selon la norme NF T 60-100 à 20 C égale à 4,10 mm2/s. Le réacteur de 750ml est agité par une turbine à pales tournant à 600 tours par minute, et on introduit dans le solvant de l'air à raison de 1, 2 1 par heure; l'ensemble est maintenu à 27 C par une circulation de liquide dans la double enveloppe du réacteur. On introduit 7g (100mM) d'acide octanoïque au début de la bioconversion, puis toutes les 12 heures environ, on réajuste la concentration en acide octanoïque dans le réacteur à sa valeur de départ (100 mM), par addition de la quantité nécessaire d'acide. Au bout de 212 heures, la quantité d'acide transformée est de 111 g et on isole par distillation à 79 C sous 9kPa à partir du solvant, après élimination du catalyseur 70g d'heptanone - 2. Exemple 2 On prépare le catalyseur comme à l'exemple 1, et on introduit 50g de billes contenant 210 x 10 8 spores par g dans 150 ml du même solvant que précédemment dans une fiole d'Erlenmeyer agitée maintenue à 27 C, avec seulement une aération de surface. 28 heures après l'addition de 2,4g d'acide octanoïque, on constate que tout l'acide a été transformé; le rendement en heptanone - 2 isolée est de 80 %. - Exemple 3 On prépare le catalyseur comme à l'exemple 1, et on introduit 50g de billes contenant 2 x 108 spores par g dans 150ml d'hexadecane dans un réacteur agité maintenu à 27 C avec seulement une aération de surface. On introduit 2,4g (10OmM) d'acide octanoïque au début de la bioconversion, puis toutes les 24 heures environ, on réajuste à lOOmM la concentration en acide octanoïque dans le réacteur. Au bout de 160 heures, la quantité d'acide transformée est de 9,6g et on isole par distillation 6,5g d'heptanone - 2. 264364? Exemple 4 En opérant dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1 avec de l'acide caprique en C10, à la concentration initiale de 100 mM, le rendement moyen de conversion est de 70 % et la productivité - c'est-à-dire la concentration d'acide transformé - est de 0,71 mmole par heure. Exemple 5 En opérant dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1, mais avec de l'acide caproïque en C6, à la concentration initiale de 50 mM, le rendement moyen de conversion est de 70 % et on obtient 8 g/l de pentanone -2 en 5 jours. Exemple comparatif: bioconversion en milieu aqueux. On introduit 115g de billes de spores immobilisées, comme préparé à l'exemple 1 dans 350 ml d'eau contenant 350gg/ml de chloramphénicol pour eviter les contaminations bactériennes, 0,2 gg/ml d'éthanol comme activateur de la bioconversion et du chlorure de calcium à raison de 0, 005 mole par litre, pour consolider les billes d'alginate. Le milieu est aéré par soufflage d'air dès la fin de la phase de latence, et agité comme à l'exemple 1. L'air sortant du réacteur est chargé en heptanone - 2, qui peut être retenue, au moins partiellement, par barbotage dans du toluène. Apres addition de 0,11g d'acide octanoïque, le pH est ajusté à 6,5 par addition de NaOH aqueux, et maintenu pendant 166 heures à cette valeur par addition d'acide octanoïque. Dans ces conditions, 8 g d'acide sont transformés; la phase de latence est de 4 heures environ. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de méthylcétones en C5 à CI, par bioconversion d'acides gras en C6 à Cil, par des- spores de Penicillium roquefortii, caractérisé en ce - que le milieu réactionnel est un solvant organique inerte, dont le logarithme du coefficient de partage entre l'eau et l'octane est supérieur à 4. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le logarithme du coefficient de partage est compris entre 7 et 9. 3. Procédé selon l'une des revendications i ou 2, caractérisé en ce que les spores sont immobilisées dans des matrices d'alginate. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le solvant est. choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques en C7 à C20, et leurs mélanges. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications i à 4, caractérisé en ce que l'acide gras est l'acide octanoique. 6. Procédé selon I'une quelconque des revendications i à 4, caractérisé en ce que l'acide gras est l'acide caprique.