Brevet FR2648149A1 — publié le 19901214

SOUCHES MODIFIEES DE BACTERIES PHYTOPHATHOGENES ET LEURS APPLICATIONS POUR LE CRIBLAGE DE MOLECULES UTILISABLES POUR LA PROTECTION DES CULTURES L'invention a pour objet des souches modifiées de bactéries phxtopathogènes et leurs applications pour le criblage de molécules utilisables pour la protection des cultures. La lutte chimique qui vise à freiner le développement d'un microorganisme phytopathogène ou meme à le tuer en agissant sur certains de ses composants vitaux a prouve son efficacité dans la protection des plantes vis-à-'is de nombreuses maladies et, notamment, de celles provoquées par des champignons. Toutefois, des pesticides à large spectre modifient les équilibres entre populations au niveau de l'écosystème. C'est pourquoi des molécules présentant une spécificite étroite et un impact minimum au niveau des populations en piace ont été recherchées. Les inventeurs ont mis au point une nouvelle stratégie basée sur la recherche de molécules interférant avec l'expression des effets délétères de l'agent pathogène à combattre sans rechercher son élimination. Les données récentes de la génétique et de la biologie moléculaire ont permis de mettre en évidence que les gènes hrp sont communs à de grands groupes de bactéries phytopathogènes responsables de bacterioses très diverses sur des plantes hôtes tres variées. Ces gènes de pathogénécité contrôlent en outre l'aptitude à induire la réaction hypersensible sur les plantes non hôtes. En modifiant les gènes hrp chez Pseudomonas solanacearum Pseudomonas svrinqae (1) Nanthomonas camDestris et Erwinia amvlovora (2), on a constaté qu'il est possible d'utiliser de telles souches pour le criblage de molecules actives susceptibles d'interférer avec l'expression de ces gènes ( Les références bibliographiques sont données en fin de description) L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles souches de P. solanacearum. P. svrinqae, X. camDestris et E. amylovora. Elle vise également a fournir un procédé permettant la construction de ces souches. L'invention a également pour but de fournir un procédé de criblage de substances en vue de la détection de matières actives susceptibles d'entraver le déroulement normal du processus infectieux de bactéries phytopathogènes comportant la mise en oeuvre de ces souches. Les souches de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une séquence codante d'un gêne reporteur sous le contre du promoteur d'un gène hrp, cette séquence codant pour une protéine exprimant une activité biologique ou enzxmatique susceptible d'être réprimee totalement ou partiellement en presence de molécules capables d'interférer avec l'expression du gène hrp, ces souches ne présentant pas d'autre gène fonctionnel conférant le caractère biologique ou enzymatique codé par le gène reporteur. Cette disposition présente l'avantage de permettre la détection de molécules actives vis-å-vis de souches pathogènes, mais dépourvues d'activité antibiotique. Par gène reporteur, on désigne une séquence codante dépourvue de son propre promoteur et dont l'expression est placée sous la dependance d'un promoteur exogène, issu d'un gène hrp. I1 permet de mesurer l'activité transcriptionnelle de ce promoteur. Selon une variante, les souches de l'invention sont obtenues par fusion transcriptionnelle et comportent, en amont de la séquence codante du gène reporteur, un site de fixation des ribosomes et d'initiation de la traduction (sequence de Shine-Delgarno). Selon une autre variante, les souches de l'invention sont obtenues par fusion traductionnelle, les séquences codantes étant dépourvues de leur codon ATG initiateur de la traduction et/ou de leur séquence de Shine-Delgarno (13). Selon un aspect avantageux de l'invention, la séquence codante du gène reporteur code pour une protéine dotée d'une activite biologique ou enzymatique pouvant être révélée selon les techniques classiques. Parmi les gènes reporteurs utilisables. on citera le gène de structure de la ss-galactosidase. de la glucuronidase. de la néomycine phosphotransférase, de la chloramphénicol acétyltransfèrase. un gène conférant l'activité à nucléer ia prise en glace ou des gènes conférant la bioluminescence. Des souches appropriées pour la mise en oeuvre de l'invention sont des souches haploides pour les séquences nrp. portant la fusion dans un oene hrp. D'autres souches appropriées sont constituées par des souches mérodiploides pour tout ou partie des gènes hrp, dans lesquelles la fusion de gènes est réalisée dans une au moins des copies des gènes hrp. L'invention vise également un procédé d'obtention des souches définies ci-dessus. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes: - d'insertion dans les genes hrD d'une séquence codante d'un gène reporteur codant pour une protéine à activité biologique ou enzymatique susceptible d'être réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression d'un gene hrp, - de réintroduction de la fusion ainsi réalisée dans une souche dépourvue de l'activité conférée par le gène reporteur introduit. De manière avantageuse, la réintroduction est réalisée soit par une double recombinaison homologue qui aboutit au remplacement du gène sauvage par la construction ci-dessus, soit par introduction de la copie du gène muté cloné sur un vecteur capable de se maintenir de facon stable dans les souche de P. solanacearum, P. svrinqae, X. campestris ou E. amvlovora. L'activité biologique ou enzxmatique exprimée par les souches ainsi modifiées est mise à profit selon l'invention pour effectuer de facon simple le criblage de molécules susceptibles d'agir sur la transcription des gènes hrp L'invention vise donc un procédé de criblage de substances en vue de la détection de matieres actives susceptibles d'entraver le déroulement normal du processus infectieux de bactéries ph!tophathogènes, ce procédé étant caractérise en ce qu'on utilise une souche telle que définie ci-dessus et qu'on met en évidence l'aptitude de la matière active å réduire l'activité transcriptionnelle des gènes hrD. On observera que selon ce procéde, on retient les molécules réprimant, au moins partiellement, l'expression d'un gène hrp, ce qui correspond à une stratégie présentant l'avantage de respecter les équilibres de populations. Un tel procédé est particulierement adapté a la lutte contre les bactéries phytopathogènes étant donné l'interdiction d'emploi d'antibiotiques en agriculture. La mise en évidence de l'activité des matières testées fait intervenir notamment des détections d'activité enzymatique, des comportements différentiels en présence d'antibiotiques, une mesure d'émission lumineuse ou une activité glaciogêne. En utilisant par exemple une souche obtenue par fusion transcriptionnelle entre les promoteurs de genes hrr et la séquence codante du gène de structure de la ss-galactosidase, en culture pure, dans des conditions appropriees, de la B-galactosidase est produite. En présence de S-gal dans le milieu de culture, la souche donne une coloration bleue due å l'hydrolyse de X-gal par la ss-galactosidase. Toute substance ajoutée au milieu de culture et capable de réprimer spécifiquement un gène hrr de pathogénicité se manifeste par la disparition ou la diminution d'intensité de la coloration due à l'expression de la a-galactosidase sans que la croissance bactérienne soit affectée. La fusion entre la séquence codante du gène de la ss-galactosidase et le promoteur d'un gène hrD peut étre réalisée par les tanniques classiques de recombinaison de 1'AD in vitro ou in vivo. Des constructions utilisables å cette fin sont présentées cans la revue de Sllhavy et Beckwith (14) et dans la publication (5). A titre d'exemple de substances ainsi détectées utilisables comme matières actives, on citera les hydrolysats de caséine ou la peptone. Mais il'est clair qu'un large spectre de substances peut être détecté en mettant en oeuvre les dispositions de ;'invention, en choisissant un gène reporteur approprié. Les substances détectées selon l'invention permettent de lutter efficacement non seulement dans la lutte contre le flétrissement bactérien du a P. solanacearum, mais aussi contre d'autres maladies causées par l'ensemble des pathovars de P. svrinqae. et N. campestris ou par E. amvlovora. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans la suite de la description, en se référant aux exemples et aux figures 1 et 2. - la fiaure 1 représentant dans la région pVir2 et pAFE8, les groupes d'activité transcriptionnels tels qu'ils ont pu être définis au moyen des constructions de l'invention. et - la figure 2. la cynétique d'induction de l'activité ss-galactosidase mesurée sur un mutant de l'invention en présence d'extraits végétaux. EXEMPLE 1 : SOUCHE DE P. SOLANACEARUn MODIFIEZ PAR INSERTION DU TRANSPOSON Tn5-820 @ MATERIEL ET METHODES 1/ Souches bactériennes et plasmides utilisés Le tableau ci-apres indique les caractéristiques essentielles des souches et des plasmides utilisés. TABLEAU SOUCHES BACTERIENNES ET PLASMIDES DESIGNATION GENOTYPE ET/OU ORIGINE/ DE LA SOUCHE CARACTERES ESSENTIELS: REFERENCE CONSTRLLTION E.coli C600 Sm1- lambda-.F-,thi,thr,leu (11) rpsL,supE44,hsdR,hsdM@ S17-1 pro, hsdR, recA. RP4-2 (15) K12(pRK2013) lamdba-, P-; km@ du (12) pRK2013 P. solanacearum GMI1000 Souche sauvage, (3) pathogène sur tomate: pathotype I, Biovar 4 PLASMIDES CARACTERISATION pRK2013 TraRK2+, delts(rep RK2). (2) repEl : Kmr pVir2 Dérivé de pArR3 portant (4) une partie des gènes hrP de P. solanacearum pAFE8 Plasmide portant un insert de 25kb chevauchant les 3.5kb environ à l'extrémité gauche de l'insert de pVir2 2/ Cultures et conservation des souches bactériennes Les souches de P. solanacearum sont cultivées à 30 C: Les milieux utilisés et leurs compositions données en gramme par litre sont le milieu B (peptone 10 extrait de levure 1, hydrolysat de caseine 1). BG (identique à B et complémenté avec glucose : 5), BGT (identique à BG et complémenté avec du chlorure de triphényl tétrazolium : 0,05), MMG (Fe SO4, 7H2O : 1,25.10-4; (NH4)2 SO4 : 0,5; Mg SO4, 7H2O : 0.05; KOH (10N) : 1,75 ml.1-1; KH2PO4 : 3,4; glucose 2). Les souches d'E. coli sont cultivées à 37 C en milieu L contenant en grammes par litres (extrait de levure : 5: Bactotryptone : 10 ; NaCl : 10). Les milieux sont complémentés le cas échéant avec les antibiotiques suivants : streptomycine (Sm) à 200ug,ml-1; acide nalidixique (Nal) à 25 g.ml-1; tétracycline (Tc) à 10 g.ml-1 et kanamycine (Km) à 25 g.ml-1. Ils sont éventuellement rendus solides par addition de gélose à 15 y.l-:. 3/ Conjuqaisons bactriennes Les souches donatrices et réceptrices ainsi que la souche "helper" K12 (pRN2013) sont cultivées environ 14 heures dans du milieu nutritif liquide non sélectif. Les précultures des souches donatrices et helper sont ensuite diluées dans du milieu nutritif liquide frais. Lorsque la DO (650nm) de ces nouvelles cultures atteint 0,2 (10' bactéries/ml), 0,5 ml de celles-ci et 0,5 ml de la culture de la souche réceptrice sont mélangés et filtrés sur filtre Millipore de 0,45 um de diamètre de pores. Les filtres sont ensuite placés sur des boites de milieu nutritif solide, les bacteries étant au-dessus des membranes. La nature du milieu nutritif et les conditions d'incubation dépendent des bactéries impliquées dans le croisement - pour les croisements entre souches d'E. coli, les filtres sont déposés sur du milieu L et incubés à 370C pendant 4 heures, - lorsqu'un des partenaires du croisement est P. solanacearum, les filtres sont déposés sur du milieu BG et incubés de 4 à 18 heures à 30'C. Deux témoins sont réalisés en incubant séparément les partenaires du croisement dans les memes conditions. Les bactéries sont ensuite remises en suspension dans 3 ml de milieu nutritif et les dilutions adéquates de la suspension sont étalées sur milieu sélectif. 4/ flutagénèse par le transposon Tn5-B20 Le transposon Tn5-B20 (5) a été utilisé pour mutagéniser les cosmides recombinants pVir2 et pAFE8. Ce transposon est inséré sur un pnage lambda qui porte une mutation ambre. L'n lysat de ce phage a été produit par infection de la souche C600 (su+=supE), selon le protocole de préparation d lysat sur boite de Petri décrit dans (6). La mutagenèse est réalisée en infectant la souche de E. coli S17-1 renfermant le plasmide pVir2 ou pAFE8 par ce lysat de phage. A cet effet. les souches sont i=ultivées à "C en milieu L contenant 0,28 de maltose. Lorsque 1 #DO(650 nm) de la culture atteint 0,8 (10' bactéries/ml), celle-ci est infectée à 37'C pendant 2 heures par le lysat de phare à une multiplicité d'infection de 0,5 phages par bacterie. Les cellules subissent ensuite 2 lavages successifs pour les débarrasser des phages et sont étalées sur du milieu L SmTcKm, ce qui permet de sélectionner les souches portant une copie du transposon. Les mutants Km@ sont croisés en masse avec la souche réceptrice C21i0 Naîr en présence de la souche K-12(pRK2013). le produit du croisement est ensuite étalé sur milieu L NalTckm et incube à 37 C ce qui permet de sélectionner le transfert des cosmides portant le transposon. 5/ Dosage d'activité B-galactosidase Les dosages d'activité ss-galactosidase ont été effectués selon le protocole decrit par Miller (7). modifié de façon à réaliser le test enzymatique en tube Eppendorf de 1,5 ml. L'activité ss-galactosidase est dosée sur des cultures bactériennes pour lesquelles la DO à 600nm doit être comprise entre 0,2 et 0.8. Après avoir mesuré la DO de la culture à 600nm, 375 ul de celle-ci sont mélangés avec un volume égal de tampon Z (Na2HPO4 0,06M; NaH2PO4 0,04M: KCl 0,01M; MgSO4 0,005M ss-mercaptoéthanol 0,05M; pH : 7.0) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Les cellules sont lysées en ajoutant 100 l de chloroforme et 50 ul de SDS 0,1%, prés 5 mn d'incubation à 28:c. 150 l d'O.NPG (4mg.ml-1) sont ajoutés pour démarrer la réaction. Lorsque le jaunissement du milieu réactionnel s'intensifie, la réaction est arrétée par l'addition de 375 ul de Na2CO3 (1M). La DO du milieu récationnel débarrassé des débris cellulaires par centrifugation (12000g. 3 mn) est mesurée à 420 nm et 550 nm. La DO à 420 nm permet de mesurer la quantite de o-nftrophénol formé. La DO à 550 nm permet de corriger l'erreur sur la lecture à 420 nm générée par la présence de débris cellulaires. Les unités d'activité ss-galactosidase sont calculées en appliquant la formule présentee ci-dessous: Unités = 1000 (DO420 - 1,75 . DO550)/t . v . DO600 La DOsoo reflète la concentration bactérienne avant le test. t : temps de la reaction exprimé en minutes, : : volume de la culture utilisé pour le test, exprimé en ml. 6/ Tests du pouvoir pathogène sur torate La surface des graines de tomate (cultivar Marmande, fournis par la Société Vilmorin, Beaufort en Vallée, France) est stérilisée å 30:C pendant 45 minutes dans une solution d'hypochlorite de calcium 7% (p/v). Les graines sont ensuite abondamment rincées avec de l'eau stérile déionisee avant d'être déposées sur des boites de milieu B. Les boites sont incubées 60 heures à 30 C, ce qui permet d'obtenir la germination des graines et de contrôler la stérilité. Les graines germées sont transférées par paire dans des tubes à essai (22 mm de dlametre) stériles qui contiennent 1,5 g de vermiculite et 6 ml de solution nutritive (KNO3, 5mM; KH2PO4, 2mM, Ca(NO3)2, 2mM; MgSO4, 1,5mM; H3BO4, 24 M; MnSO4, 8,9 M; ZnSO4, 3,1 M; CuSO4, 1 M; KaMoO4, 0,1 M et FeSO4, 0,1mM complexé par de l'EDTA, 0,1mM). Les tubes sont placés dans une chambre de culture (16 h 3600 lux, 302C et 85% d'humidité relative; 8 h d'obscurité. 28:C et 85% d'humidité relative). . Quatre jours aprés, les plantules aux cotylédons entièrement déployés sont inoculées strérilement en ajoutant dans chaque tube 1 ml d'eau contenant 10" à 108 de bactéries à testeur. Chaque souche bactérienne est ainsi testée sur 4 tubes. Par ailleurs lors de chaque essai, 4 tubes sont inoculés par la souche GMI1000 et quatre autres par de l'eau stérile à titre de contrôle. Les mutants dérivant de la souche GMI1000 qui ont tué toutes les plantules i5 jours après l'inoculation sont considérés comme pathogenes. Les mutants qui n'induisent aucun symptôme 21 jours après l'inoculation sont considérés comme non pathogènes. Enfin. les mutants qui ne tuent qu'une partie des plantules de tomate inoculées, ou qui entrainent un retard dans l'apparition des symptômes de la maladie, ou bien encore un ralentissement notable dans la croissance des plantules, sont considérés comme hypoagressifs. 7/ Tests de la HR (réaction hypersehsible) sur tabac Les plants de tabac (cultivar Bottin Special) sont cultivés en serre (18+2 C, 16h de lumière. 8h d'obscurité) dans des pots de 15 cm contenant un mélange Les plants de tabac âgés de 9 semaines sont inoculés par les mutants dérivant de la souche GMI1000 selon le protocole décrit dans (8). Les cellules de cultures en phase exponentielle de croissance (1Cs bactéries/ml) des souches à tester sont récoltées par centrifugation (3000a. 10 mn) et remises en suspension dans de l'eau stérile de manière à avoir 107 bactéries'par ml. Les suspensions sont infiltrées dans les tissus compris entre 2 nervures de jeunes feuilles entiérement déploées. Lne feuille peut ainsi recevoir 3 ou 4 infiltrations indépendantes. Les plants de tabac inoculés sont places en chambre de culture (16h 3600 lux. 30 C et 85% d'humidité relative: 8h d'obscurité, 28 C et 85% d'humidité relative). Les résultats sont notés 48 et 60 heures après l'infiltration. 8/ Production d'exsudats de racines de toua te La méthode mise au point permet d'obtenir 300 ml de solution d'exsudats racinaires å partir de 600 graines de tomate (cultivar Marmande). Après stérilisation et rincage (cf paragraphe 6), les graines de tomate sont déposées dans une boite de Pétri (de 13,5.cm de diamètre) et recouvertes ensuite par une solution aqueuse à 0.7X de gélose molle en surfusion. La boîte de Pétri est légèrement agitée pour assurer une répartition uniforme des graines dans la gélose. Après solidification, la gélose est découpée et les morceaux sont transférés stérilement dans un bécher sur une grille qui repose à la surface de 300ml d'eau stérile désionisée. Le bécher est ensuite placé en chambre de culture (16h 3600 lux. 30:C et 85% d'humidité relative; 8h d'obscurité, 28 C et 85% d'humidité relative). Ces conditions permettent d'obtenir. dès le deuxième jour d'incubation, des plantules dont les racines se développent dans l'eau stérile. Après 5 jours d'incubation, lorsque les cotylédons des plantules sont entièrement déployés, les 300 ml d'eau sont recueillis et filtrés sur membrane Elillipore de 0,45 um de diamètre de pores. Deux cent microiltres de cette préparation d'exsudats de racines sont étalés sur une boite de milieu B incubée ensuite plusieurs jours à 30 C pour tester la stérilité. Le reste de la solution est conservée à -20 C. 9/ Extraits de tabac Les extraits de tabac ont été préparés au laboratoire à partir de suspensions de cellules de parenchyme méd@llaire de Nicotiane tabacum cultivar Wisconsin 38 (lignée 19-3). Les cellules de tabac sont cultivées selon la méthode décrite dans (9) et sont repiquées tous les 14 jours dans du milieu JPL frais. Pour préparer l'extrait de tabac. les suspensions cellulaires obtenues 14 jours aprés le repiquage (phase stationnaire de croissance) ont successivement été filtrées sur filtre de verre frité n=l et sur filtre Millipore de 0,45 um de diametre de pores. La stérilité du filtrat a été testee en étalant une partie de celui-ci sur milieu B et en incubant les boîtes de Pétri 4 jours à 30:C. L'extrait de tabac ainsi produit est stocké à -20:C. 10/ Induction de l'expression des gènes hrp Les dérivés de la souche GMI1000 portant une insertion du transposon Tn5-B20 dans la région hrp ont été cultivés en milieu minimum MMG. Lorsque les cultures entraient en phase exponentielle de croissance, celles- ci étaient diluées au 100ème ou au 50ème dans 5 ml de milieu MMG frais et dans 4 ml de milieu MMG contenant 1 ml d'estrait de tabac ou d'exsudat de racine de tomates. Ces nouvelles cultures réalisées dans des tubes a essai de 22 mm étaient alors incubées avec agitation & 300C pendant 20 heures avant de doser l'activité ss- galactosidase. 11/ Techniques de biologie moléculaire Les techniques utilisées (extraction de plasmides, analyse des fragments de restriction, fabrication de sondes radioactives, hybridation sur membrane de nylon ou autres) sont celles couramment employées et déjà décrites dans (10). @ RESULTATS 1. CARACTERISATION DU GROUPE DE CERNES hrp Chaque clone portant une insertion du Tn5-B20 au niveau de l'insert des cosmides pvir2 ou pXFE8 a été conjugué avec la souche GMI1000 dépourvue d'activité ssgalactosidase pour introduire chacune des insertions dans le génome de cette souche par la technique d'échange de marqueur. Après conjugaison, les transconjugants de P. solanacearum résistants à la kanamycine ont été sélectionnés. Tous les clones ainsi isolés se sont révélés sensibles à la tétracycline indiquant que le cosmide avait été perdu chez ces transconjugants et que le transposon s'était certainement intégré dans le génome de ces souches par un double événement de recombinaison homologue. Ceci a été vérifié par hybridation de 1'ADN génomique de ces transconjuguants avec les sondes constituées par les plasmides pXir2 et pFE8. Les souches recombinantes dérivées de GMI1000 ont individuellement été inoculées sur des tomates axéniques et infiltrées dans les feuilles de tabac. La localisation du site d'insertion du Tn5-B20 dans chaque clone obtenu a été réalisée par analyse de la taille des fragments de restriction. Ces sites sont donnés sur la figure 1. Cette figure représente la localisation des insertions Tn5-B20 dans les régions génomiques portées par les cosmides pVir2 et p.AFE8 et le niveau d'activité (3-galactosidase et les propriétés sur plantes des mutants correspondants. Les insertions dont les séquences du gène lacZ sont orientées de la gauche vers la droite sont figurées au dessus de la carte génétique de la souche G' > . GMI1000. Les insertions dont les séquences du gène lacZ sont orientées de la droite vers la gauche sont figurées en dessous. Les propriétés sur plantes sont indiquées par les symboles suivants 2 , 2 # réaction identique à la souche GMI1000; # , # perte totale ou partielle de l'aptitude à induire la HR sur tabac et du oouvoir pathogéne sur tomate. Le cadre hachuré par le t @it fin délimite le groupe de gènes hrD. Les insertions conferant une activité ss- galactosidase supérieure à 5 unités sont indiquées par des symboles pleins : Les insertions induisant une activité ss- galactosidase inférieure à 5 unités sont indiquées par les symboles vides : O, | O). Les flèches horizontales situées sous la carte génétique représentent les groupes de transcription hrD. Le sens de la flèche indique le sens de transcription de chacun de ces groupes. Le numéro de chaque groupe de transcription est figuré au-dessus de la fleche. Le niveau d'activité 8-galactosidase mesure pour les insertions ayant permis de définir ces groupes est reporté sous chaque flèche (200 : > 200 unités ; 150 de 120 à 170 unités ; 100 : de 70 à 120 unites ; 50 de 30 à 70 unités : 20 : 18 à 25 unités : 15 : 12 å 16 unités). 2. EXPRESSION DES GENES hrp Le transposon Tn5-B20 crée des fusions transcriptionnelles entre le gène lacZ dépourvu de son propre promoteur et les gènes dans lesquels il s'insère. Cette propriété a eté utilisée pour caractériser les séquences hrr transcrites, leur sens de transcription, et les conditions dans lesquelles elles s'expriment. L'expression au niveau d'un site d'insertion est testée en dosant l'activité (3-galactosidase, l'apparition d'une activité B-galactosidase significative dans un dérivé de la souche GMI1000 portant une insertion du Tn5-B20 dans le génome indique que les séquences du gene lacZ sont situées en aval d'un promoteur dans une région trancrite et dans la même orientation transcriptionnelle. L'activité a-galactosidase produite par chacun des dérivés de la souche GMI1000 portant une insertion du Tn5-B20 cultivés en milieu minimum a été mesurée. On a constaté que le niveau d'activité 8-galactosidase produit par ces dérivés était variable et qu'il etait possible de les classer en 6 groupes suivant le niveau d'activité ss-galactosidase obtenu - pour le premier groupe de dérivés, le niveau d'activité B-galactosidase mesuré est supérieur ou égal à 200 unités; - pour le second, ce niveau est de l'ordre de 150 unités (de 120 à 170 unités) - pour le troisiéme. ce niveau est de l'ordre de 100 unités (de 70 à 120 unités) - pour le quatrième, ce niveau est voisin de 50 unités (30 à 70 unités) ; - pour le cinquième, ce niveau est compris entre 15 et 20 unités; - enfin, pour le sixième groupe. qui correspond â peu près à la moitié des souches testées, ce niveau est inférieur à 5 unités. Ce dernier groupe correspond, probablement, å des insertions dont le gène lacZ n'est pas transcrit soit parce qu'elles sont: - situées en dehors d'une région transcrite, - localisées dans une région transcrite mais orientées (par rapport au géne lacZ) dans le sens inverse du sens de trancription; - insérées dans l'orientation correcte au niveau d'une région transcrite mais qui ne s'exprime pas dans les conditions expérimentales utilisées. Par contre, les mutants appartenant aux autres groupes de niveau d'activités portent certainement des insertions localisées au niveau de régions transcrites en MMG. En reliant pour chaque mutant le niveau d'activité ss-galactosidase conféré par l'insertion avec sa position et son orientation sur la carte physique de la région étudiée, on a observé une corrélation entre ces 3 paramètres. Ces résultats confirment que le Tn57B20 est utilisable pour détecter la transcription des gènes chez P. solanacearum. L'existence de plusieurs régions transcrites au niveau des groupes de gènes hrD a été établie. L'orientation des transposons au sein de ces différentes régions a permis de déterminer leur sens de transcription. En se basant sur les niveaux d'activité induits par les insertions présentes dans ces différentes régions, sur leur sens de trancription et sur le phénotype sur plante qu'elles confèrent aux souches, 9 groupes de trancription différents ont été distingues (figurel). -Les groupes hrpI et Il qui sont contigus et transcrits dans la même orientation (de la droite vers la gauche = dg) ont été séparés en deux groupes différents car les insertions du groupe hrpI induisent une activité ss-galactosidase de 50 unités alors que les insertions du groupe hrDII induisent une activité de 200 unités. Cette séparation est confirmee par le fait que les insertions 1484, 1457 et 1443 situées au niveau de l'extrémité 3' du transcrit (potentiel) du groupe hrDII et de l'extrémité 5' du trancrit (potentiel) du groupe hrpI induisent un phénotype sauvage alors que les insertions adjacentes des groupes hrDI et II induisent un phénotype Hrp-. Ces trois insertions suggerent par conséquent que les groupes hrnI et II sont séparés par une région non codante et n'appartiennent pas aux mêmes unités de trancription. Les insertions 1484 et 1457 n'affectent pas le pouvoir pathogène bien qu étant situées à l'extrémité 3' du groupe de transcription hrDII. Elles confèrent toutefois a la souche l'aptitude b produire la B-galactosidase à un niveau équivalent a celui des autres fusions réalisées dans la région hrPII. Ceci peut être expliqué par le fait que le Tn5-B20 produit des fusions transcriptionnelles et que ces insertions sont localisées en amont des séquences de terminaison de la transcription de cette région II et en aval des séquences codantes. De même, pour les groupes de transcriptions hrDVII et VIII, contigus et ayant un sens de transcription identique mais des niveaux d'expression différents, l'insertion 1421 induisant un phénotype sauvage confirme l'existence de 2 groupes de transcription distincts. Le fait que cette insertion située au niveau de l'extrémité 3' du trancrit (potentiel) du groupe hrDVII et dont l'orientation (par rapport au gène lacZ) est analogue au sens de transcription de ce groupe de transcription produise une activité ss-galactosidase semblable a celle produite par les insertions localises dans ce groupe peut etre justifié par les memes raisons que celles invoquées précédemment pour les insertions 1484 et 1457 du groupe de transcription hrpII. Les insertions 1503 et 1415 qui n'altèrent pas le pouvoir pathogène, montrent l'existence d'une region non transcrite entre les groupes de transcription hEpxI et VII dont les sens de transcription sont opposés. Dans ce cas encore, les résultats obtenus par l'analyse des activités ss-galactosidase et des phénotypes sur plantes s'accordent. 3. ETUDES DE LA REGULATION DES GENES hrD INDUCTION PAR DES EXTRAITS DE PLANTE Pour étudier la régulation de la trancription des gènes hrp, les dérivés de la souche GMI1000 portant une insertion du Tn5-B20 ont été cultives en MMG en présence et en absence d'exsudats de racine de tomate ou de filtrats de culture de cellules de tabac. Après 20 heures de mise en présence des bacteries avec les extraits, on a déterminé pour chaque insertion le rapport entre l'activité B-galactosidase produite dans le MMG contenant les extraits de tomate ou de tabac et l'activité produite dans le MMG sans extrait. Cette expérience a été répétée au moins trois fois pour chaque insertion. Pour toutes les insertions localisées dans les groupes de transcription hrpI, II, IV, V, VI, VII, VIII et I.Y telles que l'orientation du gène lacZ corresponde au sens de transcription de chacun de ces groupes, on a observé que ce rapport est compris entre 2 et 5, suivant les expériences et ce quelque soit l'extrait végétal utilisé (tomate ou tabac). Par contre, pour les insertions situées au niveau de ces groupes mais dans l'orientation inverse, aucune augmentation de l'activité B-galactosidase en présence d'extraits de plantes n'a été observée. Pour les insertions localisées au niveau du groupe de transcription hrpIII, le rapport est toujours voisin de 1 quelque soit l'orientation des insertions. I1 a été considéré que les insertions pour lesquelles le rapport est supérieur à 2 traduisent une activation de la transcription par les extraits de plante. Ces résultats montrent que l'expression des genes Situés dans les groupes de transcription hrDI, II, IV, V, VI, VII, VIII et IX est induite par les extraits de tomate et de tabac. Le niveau d'induction décelé au cours de ces expériences s'est révélé semblable pour tous ces groupes de transcription et aucune différence du niveau d'induction en fonction du type d'extrait végétal utilisé n'a été observée. Au contraire, le niveau de trancription du groupe hrDIII n'est pas affecté par ces extraits. Ce groupe de transcription est le groupe qui presente la plus faible activité ss-galactosidase (15 unités) en MMG. Ce faible niveau a été mesuré pour toutes les insertions présentes dans cette région et apparaît significativement différent du niveau détecté pour les insertions dont le gene lacZ n'est pas transcrit ( L'ensemble des résultats obtenus au cours de ces travaux indiquent que l'expression de certains gènes hrp est régulée positivement par un ou des produits de plante. La figure 2 (unités de B-galactosidase en fonction du temps en heures après repiquage en présence ou en absence d'exsudats de tomate) represente la cinétique d'induction de l'activité ss-galactosidase pour le mutant Hrp-, qui porte l'insertion 1388, cultivé en MMG en présence (courbe O - O) ou en absence d'exsudat de racine de tomate. Les courbes présentées montrent que l'augmentation de l'activité ss-galactosidase induite par cet extrait est detectable dès 9 heures et qu'elle atteint un plateau après 12 heures. 4. REGULATION NEGATIVE DES CENES hrp En cultivant le mutant Hrp- portant l'insertion 1388 en milieu B liquide, on a observé que l'activité B-galactosidase produite par les cellules bactériennes était inférieure à 10 unités alors qu'en MMG, l'insertion indult une activité voisine de 150 unités. Ce résultat suggère que l'expression du groupe de trancription hrpVII est soit réprimée en milieu B, soit spécifiquement induite en MMG. Des résultats similaires ont été obtenus avec des insertions localisées dans l'ensemble des groupes de transcription. Pour déterminer si la transcription de ces gènes hrp est induite en MMG ou réprimée en milieu B, le mutant portant l'insertion 1388 a été cultivé d'une part dans du milieu complet B complementé par cha @ n des constituants entrant dans la composition du MMG et d'autre part en MMG complémenté par chacun des constituants du MMG. Dans les deus cas, la concentration des constituants ajoutés est égale à celle que l'on trouve dans le milieu d'origine. L'activité B- galactosidase produite par le mutant dans chacune de ces cultures a ensuite été dosée. Le niveau d'activité en milieu B n'est pas modifié par l'addition des constituants du MMG. Par contre, l'addition d'un hydrolysa t de caséine ou de peptone dans le MMG entraine une baisse de l'activité ss-galactosidase produite par le mutant. Le niveau détecté alors est comparable à celui obtenu en milieu B. Ces résultats montrent que l'expression des gènes hrg (appartenant au groupe hrpVII) est réprimée en milieu B et que les hydrolysats de caséine ou la peptone sont responsables de cette répression. Une autre série d'expériences a montre que l'addition, des extraits de tomate ou de tabac dans le milieu B ne permet pas de lever la répression de l'expression déterminée par les hydrolysats de caséine ou la peptone. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. LINDGREN, P.B., PEET R.C., et N.J. PANOPOULOS, J. Bacteriol. 168:512-522, 1986 2. STEINBERGER E.M. et S.V. BEER, MPMI 1:135-144, 1988 3. MESSAGE, B., BOISTARD, P., PITRAT, M., SCHMIT, J. et C. BOUCHER, Proc. tth Int. Conf. Plant Pathog. Bact. Station de Pathologie Végétale INRA (ed.) INRA, Beaucouzé, Anges, France, p.823-833, 1978 4. BOUCHER, C.A., VAN GIJSEGEM. F., BARBERIS, P.A., ARLAT M. et ZISCHEK, C. J. Bacteriol. 169:5626-5632, 1987 5. KELLER M.. MULLER, P., SIMON R., et A. PUHLER, MPMI 1:267-274, 1988 6. SILHAVY, T. 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Souches de Pseudomonas solanacearum, de Pseudomonas syringae, de Xanthomonas campestris ou de Erwinia amvlovora, caractérisées en ce qu'elles comportent la séquence codante d'un gène reporteur sous le contrôle du promoteur d'un gene hrD, cette séquence codant pour une protéine exprimant une activité biologique ou enzymatique susceptible d'être réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression du gène hrp, ces souches ne présentant pas d'autre gêne fonctionnel conferant le caractère biologique ou enzymatique codé par le géne reporteur. 2. Souches selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par fusion transcriptionnelle et comportent en amont de la séquence codante du gène reporteur un site de fixation des ribosomes et d'initiation de la traduction (séquence de Shine-Delgarno). 3. Souches selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par fusion traductionnelle et que la séquence codarte est dépourvue de son codon ATG initiateur de la traduction et/ou de sa séquence de Shine-Delgarno. 4. Souches selon les revendications 1 à 3, caractérisées en ce que la séquence codante1 du gène reporteur est choisie parmi le gène de structure de la ss-galactosidase, de la glucuronidase, de la néomycine phosphotransférase, de la chloramphénicol acétxltrans- férase, un gène conférant l'activité à nucléer la prise en glace, ou des gènes conférant la bioluminescence. 5. Souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'il s'agit de souches haploides pour les séquences hrp, portant la fusion dans un gène hrp. 6. Souches selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'il s'agit de souches mérodiploïdes pour tout ou partie des genes hrD, dans lesquelles la fusion de gènes est réalisée dans une au moins des copies des genes hrD. 7. Procédé d'obtention d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérise par les étapes - d'insertion dans les genes hrp d'une séquence d'un gène reporteur codant pour une protéine à activité biologique ou enzymatique susceptible d'etre réprimée totalement ou partiellement en présence de molécules capables d'interférer avec l'expression d'un gène hrD, - de réintroduction de la fusion ainsi réalisée dans une souche sauvage dépourvue de l'activité conférée par le gène reporteur introduit. 8. Procédé selon la revendication .7, caracterisé en ce que la réintroduction est réalisée soit par une double recomblnaison homologue qui aboutit au remplacement du gène sauvage par la construction cidessus, soit par introduction de la copie du gène muté cloné sur un vecteur capable de se maintenir de facon stable dans les souches de P. solanacearum ou P. svringae ou X. campestris ou E. amylovora. 9. Procédé de criblage de substances en vue de la détection de matières actives susceptibles d'entraver le déroulement normal du processus infectieux de bactéries phytophathogènes, caractérisé en ce qu'on utilise une souche selon l'une quelconque des revendications 1 å 6, et qu'on met en evidence l'aptitude de la matière active à réduire l'activité transcriptionnelle. des genes hrD.