Brevet FR2644474A1 — publié le 19900921

L'invention concerne un procédé pour la purifica- tion de protéines, en particulier d'enzymes, à partir de la biomasse, en particulier de l'enzyme pénicilline- amidase. On sait purifier des protéines, en particulier des enzymes, par l'intermédiaire d'une chromatographie hydrophobe. C'est ainsi que l'on peut purifier par exem- ple sur phénylglycine-Sepharose, par chromatographie d'affinité, l'enzyme pénicilline-amidase (pénicilline- acylase PcA) à partir de E.coli (E.C. 3.5.1.11), qui est utilisée pour la transformation technique, en acide 6- aminopénicillanique, des pénicillines préparées par fer- mentation (cf. H.J. Rehm & G. Reed, dans Biotechnology, vol. 7a, p. 168, 169 VCH 1987) (brevet indien 15 50 51A; purification de l'enzyme pénicilline-acylase; P.S. Bor- kar et P.B. Majahan). On utilise en outre, pour la purification par chro- matographie d'affinité de la PCA, le benzyl-EUPERGIT. La chromatographie d'affinité,utilisant des ligands d'affinité constitués d'acide phénylacétique ou de ses dérivés, est décrite dans Chem. Abstr. 97, 35363a. D'autres travaux ont utilisé des conjugués d'aga- rose ou de Sepharose et d'ampicilline ou d'amoxicilline en tant que matrices pour la chromatographie d'affinité (brevet indien N 155 050; P.B. MahaJan et al. Hind. Antibiot., Bull. 24 (1-2) 38, 1982, Chem. Abstr. 97, 87551e, de même que Chem. Abstr. 95,, I10 740 K). Tous les procédés proposés à ce jour, sans excep- tion, sont chers, tant pour ce qui est du nombre des opérations individuelles nécessaires, que des appareil- lages qui y sont nécessaires. Le temps nécessaire & cette opération est long, ce qui a des répercussions négatives sur le caractère non dénaturé de la protéine à purifier. Il est donc néces- saire de mettre au point un procédé pour la purification ou l'isolement de protéines, qui permette la purifica- tion aussi rapide que possible, ménagée et sans pertes. On a maintenant trouvé que le procédé selon l'invention correspond pour l'essentiel à ces exigences de la technique. L'invention concerne en particulier un procédé pour la purification d'enzymes, qui sont dirigées sur des substrats contenant des groupes aromatiques, et surtout des groupes phényle. D'une manière particulièrement pré- férée, l'invention concerne un procédé pour la purifica- tion de l'enzyme pénicilline-amidase (PcA) (cf. E.C. 3.5.1.11), en particulier de l'enzyme provenant d'E.coli ou de B. megaterium. Dans le procédé selon l'invention, la protéine à purifier est, par adsorption hydrophobe, fixée sur un support spécifique T, qui contient de la phénylbutylamine (laquelle, par réaction avec un groupe actif AG du matériau support, avait été fixée au support par liaison covalente). Le matériau support peut être d'origine naturelle ou synthétique. Les groupes actifs AG du matériau support doivent réagir avec la phénylbutylamine par l'intermédiaire d'un mécanisme de liaison électriquement neutre. Il ne doit -alors en résulter aucune modification du caractère élec- trochimique du ligand phénylbutylamine (PbA). Cette exigence est satisfaite d'une manière parti- culièrement favorable par exemple grâce à un copolymère, lequel est constitué du composant matrice (méth)acryl- amide, d'un agent de réticulation, par exemple le N,N- méthylène-bis-(méth)acrylamide, et des composants actifs du point de vue de la fixation que sont le (méth)acry- late de glycidyle et/ou l'allylglycidyléther. Des pro- duits correspondants sont commercialisés sous la dési- gnation EUPERGIT(R) C (Sté Rbhm GmbH). Conviennent aussi, en outre, d'autres matériaux supports, par exemple l'agarose ayant subi une réticula- tion croisée, et qui est substituée par des groupes épo- xydes ("epoxyactivated SEPHAROSE(R)"), de même que des supports polymères synthétiques à base de poly(acétate de vinyle) réticulé, dont les groupes acétyle ont été éliminés par voie hydrolytique et ont été remplacés par des groupes époxy (support époxy VA de la Sté Riedel-De Haen). On obtient aussi des supports appropriés T-PbA quand, dans les matériaux supports mentionnés ci-dessus, on procède à la substitution non pas par des groupes époxy, mais par des groupes trésyle (K. Nilsson et K. Mosbach, Biochem. Biophys. Res. Communications, vol. 102, Ne 1, pp. 449-457 (1981)) , servant de groupes actifs AG (par exemple "tresyl activated Sepharose(R) ", ou EUPERGIT(R)-Diol activé au trésyle). Pour préparer le matériau-support T-PbA pouvant être utilisé pour la purification des protéines, on peut procéder d'une manière connue en soi (les précurseurs du matériau-support seront appelés ci-après T-VS, et leur forme activée sera désignée par T-VS-A). Le composant actif AG peut être introduit par réac- tion analogue à une polymérisation (par exemple par addition d'épichlorhydrine à des groupes hydroxyle du polymère), ou par copolymérisation directe de ces mono- mères comportant des groupes actifs. Conviennent d'une manière optimale, en tant que monomères de matrice MM, les composés vinyliques hydro- philes et électriquement neutres, comme le (méth)acryla- mide, le groupe amide pouvant éventuellement être subs- titué par des groupes alkyle en C1-C4 (substitués par des groupes hydroxyle), ce à quoi on peut ajouter les (méth)acrylates d'hydroxyalkyle, les groupes alkyle du radical ester ayant de 1 & 6 atomes de carbone, par exemple des esters de polyols, et enfin des alcools vinyliques, l'alcool allylique, des esters vinyliques comme l'acétate de vinyle et le propionate de vinyle. La part des monomères contenant le composant actif AG dans le matériau support est en règle générale de 4 à % en poids. La part du composant monomère réticulant est en général de 5 à 80 % en poids. La part du monomère de matrice correspond au complément à 100 % en poids. Conviennent en tant que monomères de réticulation des agents de réticulation connus en soi, par exemple des monomères électriquement neutres, à réticulation hydrophile,comme le N,N'-méthylène-bis-(méth) acrylamide, les polyols plusieurs fois, mais au moins deux fois estérifiés à l'aide d'acide (méth)acrylique, en particu- lier les (méth)acrylates de pentaérythritol de ce type. La densité de ligands est avantageusement de 10 à 2000 pmol de groupes PbA par gramme de matériau support à l'état sec, et de préférence de 50-500 pmol. Présentent un intérêt particulier, en liaison avec la présente invention, les matériaux supports ayant une structure macroporeuse, et de préférence une forme sphé- rique, auxquels est fixé par liaison covalente le radi- cal phénylbutylamine (cf. Jahrbuch der Biotechnologie, 1986-1987, p. 404, Carl-Hanser-Verlag). Présentent des structures macroporeuses de ce genre par exemple les produits du commerce du type EUPERGIT(R) C (EUPERGIT C, Eupergit C30N, EUPERGIT C250 L), de même que le. FRACTOGEL(R) et le TOIOPEARL(R), ce à quoi il faut ajou- ter les échangeurs d'ions macroporeux correspondants (par exemple la LEWATITE(R) de la Sté Bayer AG, 1'AMBER- LITE de la Sté Rohm & Haas), après conversion correspon- dante en des matériaux électriquement neutres. Comme il a déjà été dit, présentent un intérêt par- ticulier les précurseurs de matériaux supports (activés) T-VS-A du type EUPERGIT(R) C. Avec ce matériau, il s'agit d'un copolymêre réti- culé d'acrylamide ou de méthacrylamide et d'acrylate ou de méthacrylate de glycidyle, qui de préférence est constitué de particules en forme de perles. Des polymè- res de matrice de ce genre sont décrits dans les brevets DE-C 27 22 751 et US-A 4 190 713, de même que dans le brevet US-A 4 511 694. Les perles ont en règle générale un diamètre de 5-1000 pm, en particulier de 30-1000 pm. On peut donner comme valeur indicative de la teneur du matériau support TVS-A en groupes glycidyle pouvant être mis en réaction une valeur de 0,82,5 pmol par mg de matériau support sec. D'autres caractéristiques res- sortent du tableau ci-après. Caractéristiques Valeur - Granulométrie moyenne 140-180 pm - Diamètre des pores 40 nm - Limite d'exclusion MLIM: 2.105 daltons - Surface active (pour la fixation) 180 m2/g (à sec) - Teneur en groupes époxydes: 8001000 mmol/g (à sec) - Absorption d'eau 2,3 ml/g (à sec) - Densité d420: 1, 20 - Masse volumique apparente: 0,34 g/ml - Capacité de liaison (dans les conditions courantes) Albumine humaine 48 mg/g (humide) IgG humaine 34 mg/g (humide) - Gonflement en présence d'eau 1 ml (à sec) donne 1,4 ml (humide) - Solubilité (dans l'eau, les tampons et les solvants organiques) insoluble - Stabilité à la pression: 300 bar Au microscope électronique, on reconnait la struc- ture macroporeuse des perles, avec canaux et cavités, qui ont un diamètre de 0,1-2,5 pm (1000-25 000 t), de sorte que les molécules d'enzyme ou de substrat, qui ont une grosseur de 10-100 AngstrOms (1-10 rinm), peuvent pénétrer en tout point de la matrice macroporeuse. Le ligand responsable de la purification des pro- téines est en règle général préparé par la réaction des précurseurs de matériau support T-VS-A sur l'amine phé- nylbutylamine. D'une manière générale, la réaction peut être mise en oeuvre par conversion directe, par exemple du maté- riau support contenant des groupes époxydes, avec la phénylbutylamine, de préférence dans un milieu liquide approprié, par exemple l'eau, ou dans un alcool, comme l'éthanol. Avantageusement, l'amine est utilisée selon un cer- tain excès par rapport aux groupes fonctionnels du pré- curseur T-VS-A. La réaction est de préférence mise en oeuvre à température élevée, par exemple entre 30 et C. Apres la réaction, l'amine en excès est éliminée par traitement à l'aide d'un acide, par exemple à l'aide d'acide sulfurique dilué, et lavage à l'eau. Plus précisément, la fixation de la phénylbutylamine sur le précurseur de matériau support T-VS-A peut être réalisée de la manière suivante: Dans un milieu liquide inerte approprié, par exem- ple l'éthanol, ou dans une cétone telle que l'acétone, on ajoute avantageusement au précurseur de matériau sup- port T-VS-A de préférence un excès (par rapport au nom- bre des groupes actifs AG du matériau support) de phé- nylbutylamine, par exemple un excès allant Jusqu'à un excès quintuple, de préférence un excès approximative- ment double, et, en un certain temps, qui dépend de la température choisie, laquelle peut être comprise entre la température ambiante et environ 100 C, par exemple à la température d'ébullition du milieu, on laisse réagir en général entre 3 et 72 heures. Puis le produit est, pour éliminer l'amine en excès, lavé à l'aide du sol- vant, puis à l'eau, le poids du milieu organique étant -15 fois, et celui de l'eau étant de 10-30 fois le poids du matériau support sec. Puis on lave encore une fois avec un acide minéral dilué, en particulier avec de l'acide sulfurique 0,5 M (3-5 fois le poids du matériau support sec), et, éven- -tuellement encore, on porte au reflux pendant 10-30 minutes dans de l'acide sulfurique 0,5 M (3 fois la quantité en poids), avant de laver à l'eau jusqu'à réaction neutre. On peut mettre en oeuvre d'une manière générale comme suit la réaction, sur la protéine, spécialement l'enzyme, en particulier l'enzyme du type pénicilline- amidase, du matériau support T-PbA à utiliser. L'homogénéisat obtenu lors de la production de l'enzyme est de préférence sédimenté dans une centrifu- geuse & refroidissement, par exemple à 5000 à 10 000 g, puis le surnageant (limpide), qui en règle générale con- tient de 15 à 20 unités de pénicilline-amidase par ml, est placé sur une colonne chromatographique, garnie du matériau support T-PbA, colonne qui avait été remplie d'une solution tampon A (par exemple tampon phosphate de potassium 0,05 M pH 7,5 plus i mole NaCi). Une colonne garnie de ce genre peut être garnie de 30-100 unités de pénicilline-amidase par ml de support humide, ce qui donne 10 à 80 mg de protéine par ml de support. Les colonnes ont un diamètre de 1 mm à 30 cm et une hauteur d'environ 10 cm à 1 m et au-delà. Il est recom- mandé de maintenir un débit (linéaire) de 60 à 100 cm/h. La colonne est rincée à l'aide du tampon A, et l'enzyme est ensuite éluée avec un tampon d'rélution (dans le cas de la pénicilline-amidase, 0,1 mole d'un tampon formiate de sodium pH 3,8), puis est reprise dans 0,1 volume d'un tampon phosphate de potassium 1 molaire pH 7,5. En géné- ral, le processus d'élution est, selon la colonne, ter- miné en 5 à 60 minutes, de préférence en environ 20 10 minutes. L'éluat convient par exemple à l'immobilisation immédiate,en particulier à une immobilisation covalente, sur un support solide, par exemple i'EUPERGIT C. Le ren- dement d'immobilisation est d'environ 80 %, l'activité du produit étant de 100 unités/g de poids humide. La même colonne peut être utilisée au moins 50 fois de suite pour la purification des enzymes, du moment que, après chaque opération, la colonne est traitée avec 2-5 volumes de colonne d'rune solution de protéase, com- portant de préférence 0,006 unités Anson à pH 10. Con- viennent de préférence en tant que protéases les protéa- ses alcalines, en particulier celles qui sont d'origine bactérienne (cf. Keay,Process Biochemistry, 17-21, 1971; H.J. Rehm, G. Reed, Biotechnology, vol. 7a, loc. cit. p. 156-168; Ullmann's Encyclopadie der Techn. Chemie, 4ème édition, vol. 10, 517-522, Verlag Chemie 1975). On peut citer à titre d'exemple des protéases alca- lines provenant de Bacillus subtilis, ou encore d'Asper- gillus sp., en particulier d'A.oryzae. L'efficacité protéolytique des enzymes est avanta- geusement déterminée par ce que l'on appelle la méthode de LOhleinVolhard ("die LOhlein-Volhard'sche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivitat", Gerberei- technisches Taschenbuch, Dresde-Leipzig 1955), et elle est donnée ou déterminée en unités "LVE" (unités Lôhlein-Volhard). Il convient de comprendre par "unité LVE" la quantité d'enzyme qui, dans les conditions par- ticulières de la méthode, digère 1,725 mg de caséine. Pour déterminer l'activité des enzymes efficaces en milieu acide, détermination faisant appel à la méthode d'Anson (M.L. Anson, J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939)), on utilise comme unités les "Proteinase-Units (hémoglo- bine)", - UHb. Une unité UHb correspond à la quantité d'enzyme qui catalyse la libération de fractions d'hémo- globine, solubles dans l'acide trichloracétique, équiva- lentes à 1 mole de tyrosine par minute à 37 C (la mesure étant effectuée à 280 nm). 1 mUHb = 10-3UHb. Les effets avantageux de l'invention, par rapport à l'état actuel de la technique, résident entre autres dans la capacité de fixation extraordinairement élevée du matériau support selon l'invention. Il en résulte aussi la possibilité, par réticulation croisée, d'immo- biliser la protéine directement sur le support, ce qui permet d'obtenir un produit présentant une activité suffisante, par exemple pour les applications indus- trielles. Un autre avantage réside dans la possibilité d'effectuer rapidement la purification des enzymes. Le temps nécessaire peut être considéré comme 2 à 5 fois moins long que dans les procédés de l'état actuel de la technique. Il en résulte un avantage, selon lequel on a besoin pour l'élution d'un volume relativement faible. Au lieu de procéder à l'isolement des enzymes, on peut aussi utiliser l'enzyme, adsorbée par le matériau support, et après une réticulation croisée correspon- dante, directement en tant qu'enzyme immobilisée (cf. Ullmann's Encyclopadie der Techn. Chemie, 4ème édition, vol. 10, p. 542, Verlag Chemie 1975). Les protéines fabriquées à l'échelle industrielle, en particulier les enzymes, le sont généralement sous la forme d'une biomasse. On trouve dans la littérature des renseignements suffisants sur la production de la biomasse à partir de laquelle on peut obtenir l'enzyme pénicilline- amidase (3.5.5.1.11) (par exemple H.J. Rehm et G. Reed dans Biotechnology vol. 7a, VCH 1987; Ull- mann's Encyclopâdie of Industrial Chemistry, 5éme édi- tion, vol. A9, p. 371-382; VCH 1987). Pour le traitement, il faut procéder à une homogé- néisation de la biomasse, par exemple par le procédé French Press utilisant un équipement French Pressure Cell Press (SLM-Aminco), ou à l'aide d'un disperseur haute pression (cf. Ullmann's Encyclopâdie der Techni- schen Chemie, 4ème édition, vol. 10, loc. cit., p. 493- 495). L'homogénéisation peut être suivie d'une sépara- tion de la solution enzymatique, par centrifugation ou filtration, comme déjà décrit plus haut. La présente invention est expliquée plus en détail à l'aide des exemples ci-après: Exemple 1 Préparation d'EUPERGIT(R) C substitué par la phé- nylbutylamine (PbA-EUPERGIT) On place dans un ballon à fond rond à trois cols, de 4 1, 50 ml de phénylbutylamine à 98 % dans 1325 ml d'éthanol absolu et, sous agitation à l'aide d'un agita- teur à pales en faucille, on introduit 250 g d'EUPERGIT C sec. Cette suspension est portée au reflux sous agita- tion modérée pendant 4 heures. Puis le produit, un peu refroidi, est placé sur une plaque de verre fritté Gi et lavé avec environ 3 1 d'éthanol technique et environ 7 1 d'eau purifiée sur Millipore, en des portions plus peti- tes (500 ml). Après avoir été soigneusement filtré à la trompe, le produit est mis en une fois en suspension à l'aide d'acide sulfurique 0,5 M (laisser agir), subit de nouveau une filtration à la trompe, et est renvoyé dans le ballon de réaction avec 750 ml d'acide sulfurique 0,5 M. Cette suspension est portée au reflux pendant 30 minutes. Puis le produit, sur la plaque de verre fritté G1, est lavé à l'aide d'eau purifiée sur Millipore (env. 1) jusqu'à perte de toute acidité. Le produit est stérilisé & la chaleur en 30 minutes à 121 C. Exemple 2 Purification de la pénicilline-amidase d'E.coli par chromatographie d'affinité. Colonne: garnie d'EUPERGIT(R) C substitué par de la phénylbutylamine (PbA EUPERGIT C) selon l'Exemple 3). On a placé sur une colonne (volume 8 ml, diamètre 1 cm) dans le tampon A (tampon phosphate de potassium 0,05 M, pH 7,5 plus NaCl 1 M), à un débit de 1 ml/min (ce qui correspond à un débit linéaire de 76,4 cm/heure) 15 ml du surnageant de l'homogénéisat de E.coli (10,7 mg/ml de protéine, activité du support humide 39 U/ml), puis on l'a lavé à l'aide de 30 ml du tampon A et, à l'aide du tampon B (tampon formiate de sodium 0,1 M pH 3,8), on a élué l'enzyme dans 35 ml. Le rendement de l'activité enzymatique est de 89 %, l'activité spécifique passe de 2,0 U/mg dans le surna- geant de l'homogénéisat à 10,2 U/mg dans l'éluat. Pour n'exposer que peu de temps l'enzyme au tampon d'élution acide, on ajoute aux fractions (chacune 5 ml) de l'éluat 1 ml de tampon phosphate de potassium (1 M, pH 7,5). Puis la colonne est régénérée avec 40 ml d'une solution de 0,006 unité Anson de protéase alcaline bac- térienne dans un tampon glycine-NaOH 0,02 M pH 10, et lavée avec 60 ml du tampon A jusqu'à neutralité, avant de recommencer un nouveau cycle. Exemple 3 Immobilisation de la pénicilline-amidase sur EUPER- GIT C. La pénicilline-amidase (PcA) purifiée sur une colonne de PBA-Eupergit a été dialysée contre de l'eau et concentrée à l'évaporateur rotatif. Comme la PcA était très trouble, elle a été centrifugée à 20 000 t pendant 15 minutes à 4 C. Le surnageant obtenu était limpide. Mesure de l'activité On dilue la PcA à 1:10 à l'aide d'un tampon phos- phate de potassium 0,1 M (pH 7,5) (à env. 180 U/ml). L'activité enzymatique a été déterminée contre le subs- trat pénicilline G-potassium (brut) par titrage alcali- métrique à pH 7,8. Dans ce but, on a dans chaque cas utilisé 20 ml d'une solution de substrat à 2 * dans un tampon phosphate de potassium 0,05 M pH 7,8, et titré à 37 C avec du NaOH 0,5 M. Immobilisation On complète à un volume total de 4 ml 510 U de PcA à l'aide d'un tampon phosphate de potassium 1,5 M pH 7,5, et on place l'ensemble sur 1 g d'Eupergit C. Le mélange est laissé au repos pendant 72 heures à 23 C. Puis la masse est, sur une plaque de verre fritté, lavée 3 fois avec un tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,5. Rendement humide: 3,49 g Activité: 91 U/g. Exemple 4 Mesure de l'activité de la pénicilline-amidase immobilisée. Principe La méthode se fonde sur le titrage de l'acide phé- nylacétique qui se dégage au cours de l'hydrolyse enzy- matique de la pénicilline G-potassium à pH 7,8 et 37*C. Appareillage - Système d'autotitrage à pH-stat enregistreur, de Radiometer-Copenhagen A/S ou Metrohm SA (Suisse) - Burette automatique pH-mètre - Poste de titrage - Servographe - Réacteur (volume 100 ml) avec chemise extérieure thermostatée et dispositif d'agitation (non magnétique, car un agitateur magnétique détruit les perles). -Thermostat. Mode opératoire Après plusieurs lavages à l'eau désionisée, on place 500 mg d'EUPERGIT-PcA dans un réacteur thermostaté à 37 C. On place sur le support enzymatique 20 ml de solu- tion de substrat, chauffé à 37 C (substrat: on dissout 2 % de pénicilline G-potassium ou sodium (brut) dans un tampon phosphate de potassium 0,05 M pH 7,5,et on ajoute à la solution de l'hydroxybenzoate d'éthyle à 0,05 %. Sous agitation continue, on ajoute du NaOH 0,5 M à l'aide d'une burette automatique, le pH étant ajusté à pH 7,8 à l'aide d'un pH-stat. Simultanément, on enre- gistre la consommation de NaOH en fonction du temps de réaction (lère détermination). L'incubation est inter- rompue au bout de 10 minutes, le support enzymatique est placé sur une plaque de verre fritté (P2 ou P3), aspiré à la trompe, et lavé 3 fois avec 2 ml d'un tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,5. Les perles lavées sont de nouveau placées dans le réacteur et on procède comme décrit ci-dessus à la détermination de l'activité (2ème détermination). On reprend encore la détermination de l'activité, sur l'échantillon obtenu de cette manière (3ème détermi- nation). On calcule comme suit l'activité du catalyseur immobilisé: L'activité du support enzymatique est donnée en U/g de produit humide. * Une unité (U = pmol/min) correspond au nombre de micromoles de pénicilline G hydrolyséespar minute. i ml de NaOH 0,5 M correspond à 500 pmol de pénicilline G hydrolysée. Pour déterminer l'activité, on utilise la partie linéaire de la courbe (habituellement, la zone comprise entre 1 et 5 minutes). On obtient l'activité du catalyseur immobilisé en calculant la moyenne de l'activité de la 2ème et de la 3ème incubations. Exemple 5 Immobilisation de l'enzyme pénicilline-amidase provenant de PBA-Eupergit, par réticulation croisée. On lave trois fois 10 g de PBA-Eupergit (poids humide) chaque fois dans 10 volumes de tampon phosphate 1 M pH 7,5, et on aspire sous vide sur une plaque de verre frittée. Le produit humide correspondant est placé dans un bécher de 20 ml d'un homogénéisat d'E.coli selon l'Exem- ple 6, présentant une activité de pénicilline-amidase de 39 U/ml, et on secoue pendant 60 minutes à 21 C. Puis le produit est séparé par filtration (plaque de verre fritté/vide), lavé deux fois avec un tampon phosphate de potassium 1,0 M pH 7,5, puis mis en suspension dans 10 ml d'un tampon phosphate de potassium 1,0 M. Puis on ajoute 0,250 ml d'une solution aqueuse à 25 % de glutar- dialdéhyde (qui a été stabilisée sur la résine échan- geuse d'ions Amberlite(R) A 21). La suspension est secouée pendant 2 heures, puis lavée trois fois avec un tampon phosphate de potassium 0,05 M (pH 7,5). Rendement humide 9,8 g. La détermina- tion de l'activité donne un rendement d'activité de 62 t et un produit à 49 U/g de poids humide. Exemple 6 Obtention de l'extrait brut de cellules d'Escheri- chia coli. On a centrifugé à 4 C pendant 20 minutes 20 1 d'une solution de culture en fermenteur (10 000 g, Cryofuge, Heraeus). Après décantation du surnageant, la masse cel- lulaire humide a été mise en suspension dans 900 ml d'un tampon phosphate de potassium 0,05 M pH 7,5 et centrifu- gée de nouveau. Après le lavage, la masse cellulaire humide (550 g) a été de nouveau mise en suspension dans 1200 ml d'un tampon phosphate de potassium 0,05 M pH 7,5. La suspension cellulaire a été, avant désagrégation des cellules, congelée à -800C. Les cellules de E.coli présentent, par rapport à une solution de pénicilline G à 2 % (20 ml, 37C), une activité de 58 U/g de cellule. La désagrégation des cellules a été réalisée par le procédé French-Press (différence de pression 1000 bar, French Pressure Cell Press, SLM-Aminco). Pour éviter des pertes d'activité, la suspension n'a été décongelée dans de l'eau glacée que peu de temps avant la désintégration des cellules. Des aliquotes de 40 ml de suspension cellulaire ont été chacune homogénéisées quatre fois, pour obtenir une activité maximale de l'homogénéisat. Au bout de quatre cycles successifs, on a pu atteindre une activité de l'homogénéisat, par rapport à une solution de pénicil- line G à 2 %.(20 ml, 37 C), de 23 U/ml. L'homogénéisat a été directement congelé à -80 C après désintégration des cellules. Pour séparer les débris cellulaires, l'homogénéisat décongelé a été cen- trifugé & 4 C pendant 30 minutes (10 000 g, Cryofuge Heraeus). Le surnageant peut être directement utilisé pour l'isolation ultérieure, par chromatographie, de la pénicilline-amidase (activité du surnageant 18,75 U/ml). Z644474 Revendications 1. Procédé pour purifier, par adsorption, des enzy- mes dirigées sur des substrats contenant des groupes aromatiques et qui se trouvent en milieu aqueux, carac- *térisé en ce que les enzymes sont fixées par adsorption hydrophobe sur un matériau support spécifique T-PbA, qui contient des groupes phénylbutylamine, lesquels sont liés par liaison covalente au matériau support. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les groupes phénylbutylamine, sont liés au T-PbA par liaison covalente sous forme de produit de la réaction avec un groupe glycidyle servant de groupe activé d'un précurseur de support T-Vs-A. 3. Procédé selon les revendications 1 et 2, carac- térisé en ce que le précurseur de support activé T-Vs-A est un copolymère réticulé, constitué des monomères de matrice acrylamide, méthacrylamide, des monomères actifs acrylate de glycidyle, méthacrylate de glycidyle, et des monomères réticulants N,N'-méthylène-bis-acrylamide et N,N'-méthylène-bis-méthacrylamide. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la part des monomères actifs dans le précurseur de support T-Vs-A est de 4 à 40 % en poids. 5. Procédé selon les revendications 3 et 4, carac- térisé en ce que la part des monomères réticulants dans le précurseur de support T-Vs-A est de 5 à 80 % en poids. 6. Procédé selon les revendications 1 à 5, caracté- risé en ce que la densité de ligands de la phénylbutyl- amine fixée est de 10 à 2000 pmol par gramme de matériau support. 7. Procédé selon les revendications 1 à 6, caracté- risé en ce que l'enzyme purifiée est la pénicilline- amidase (E.C.3.5.1.11). 8. Procédé pour la purification d'enzymes selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'enzyme, fixée sur un matériau support T-PbA,est éluée à l'aide d'une solution tampon faiblement acide, l'éluat étant ajusté de nouveau & un pH proche du point neutre. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le matériau support T-PbA est, après élution de l'enzyme, traité à l'aide d'une protéase, puis est lavé. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on utilise en tant que protéase une protéase alcaline dans un tampon alcalin, puis que le matériau support T-PbA est lavé à l'aide d'un tampon à pH neutre. 11. Procédé pour l'immobilisation permanente de l'enzyme pénicillineamidase, caractérisé en ce que l'enzyme, fixée selon la revendication 2 au support T- PbA par adsorption hydrophobe, est réticulée par des agents chimiques. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on utilise comme agent chimique pour la réticu- lation le glutardialdéhyde.