Brevet FR2635778A1 — publié le 19900302

La présente invention concerne de nouveaux composés chimiques dérivés de la 3'azido-3'déoxythymidine ainsi que des conjugués desdits dérivés avec une molécule transporteuse. Le syndrome immunodéficitaire acquis, ou SIDA, est causé par un rétrovirus, de la famille des lentivirus, appelé HIV (human immunodeficiency virus). Ce virus infecte et tue les lymphocytes T portant le récepteur CD4, qui jouent le rôle de stimulateurs de l'activité des lymphocytes B et des macrophages. La diminution du nombre de lymphocytes T4 entraîne une désorganisation profonde du système immunitaire du patient, qui devient la proie de toute une série d'infections opportunistes (virales, bactériennes, mycotiques) menant à une issue fatale à plus ou moins brève échéance. Le virus HIV s'attaque également au système nerveux central. Il est en effet capable d'infecter certaines cellules du cerveau ayant un récepteur très proche du récepteur CD4. Il s'ensuit une série de troubles neurologiques périphériques et centraux plus ou moins graves (neuropathies, démences, etc.) qui, associés aux infections opportunistes, accélèrent la dégradation de l'état du patient. Il n'existe actuellement pas de remède au SIDA. Ceci est dû en partie à une période de latence plus ou moins longue (de 6 mois à -10 ans) entre la première infection, souvent asymptomatique, et le moment o se déclare la maladie. En effet, lorsque le diagnostic peut être posé, la multiplication du virus a déjà entraîné une très forte diminution du nombre de lymphocytes T4, et, à ce jour, aucune drogue n'a montré un effet significatif sur le rétablissement de l'équilibre immunitaire. Actuellement, le traitement du SIDA fait plutôt appel à des inhibiteurs de la multiplication du virus HIV. Parmi ceux-ci, le produit qui donne les meilleurs résultats est la 3'azido-3'déoxythymidine (AZT). Cette drogue a permis d'augmenter significativement le temps de survie de patients ayant développé le SIDA. L'AZT offre en outre l'avantage de- passer la barrière hémato-encéphalique, ce qui permet d'atteindre le virus se multipliant au niveau du cerveau. L'idéal serait toutefois de pouvoir administrer la drogue aux personnes qui ont été infectées par le virus, avant que celui-ci ne commence' à se multiplier de manière important dans les lymphocytes T4 et à déséquilibrer le système immunitaire. Des observations cliniques plus récentes semblent en effet montrer que la première cible du virus ne serait pas les lymphocytes T4 mais bien les monocytes/macrophages. Ces derniers seraient le réservoir dans lequel le virus peut se multiplier sans entraîner la mort des cellules. Toutefois, l'administration prolongée d'AZT est difficilement réalisable en raison de sa toxicité à long terme pour les cellules hématopo étiques. En revanche, l'administration prolongée de ces mêmes drogues, mais sous des formes réduisant fortement leur toxicité, est envisageable. C'est dans ce but que la présente invention propose de nouveaux dérivés d'une molécule active contre le virus du SIDA, comme l'AZT. Plus particulièrement, les dérivés de l'AZT selon l'invention présentent une stabilité relative en présence de plasma humain à 37 C et relarguent lentement de I'AZT, ce qui a pour effet de diminuer la toxicité de ce produit. Les dérivés de l'AZT susceptibles d'agir comme prodrogues, selon la présente invention, sont des esters en 5'. le groupe substituant ajouté en position 5' par un lien ester contient en outre au moins une fonction polaire, notamment de type carboxylique, hydroxyle, éther, amine, thiol ou hydrazine. On peut citer essentiellement des esters en 5' du type hémisuccinate, et des esters d'acides aminés. Plus précisément, la présente invention a pour objet de nouveaux composés chimiques, dérivés de la 3'azido-3'déoxythymidine répondant à la formule' générale I: o RR2 HN a A-'C-01 O R2 formule dans laquelle R1 représente H, un radical alkyle inférieur, un radical alcoxy inférieur, un radical hydroxyalcoyle inférieur ou un halogène. R2 est choisi parmi N3 ou un radical -CN 15. A représente un radical hydrocarboné éventuellement substitué portant au moins une fonction polaire. Par fonction polaire, on entend des fonctions telles que les fonctions carboxylique, hydroxyle, éther, amino, thiol ou hydrazine ou telles que leur fonction dérivée par substitution d'hydrogène par un radical hydrocarboné inférieur qui peut, pour accentuer le caractère polaire, être raccordé à A en formant un hétérocycle. Dans la définition de Ri, on entend par radical inférieur un radical comportant de I à 5 atomes de carbone. Dans la définition de A, on entend par radical hydrocarboné un radical comportant de I à 20 atomes de carbone, le radical pouvant être éventuellement substitué, notamment par des radicaux alkyles, alcoxy alkyles, aralkyles en CI à C5. Bien entendu, parmi les composés de formule I il faut citer plus particulièrement les dérivés de l'AZT dans lesquels R1 est égal à CH3 et R2 à N3. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention A-C- représente X-( H) - R3 o n est un nombre entier compris entre I et 5 R3 peut être identique ou différent et représente H ou un radical hydrocarboné, tel qu'un alkyle, un aralkyle, un alcoxyalkyle, éventuel- lement substitués, la chaîne latérale en A de la fonction amino d'un acide aminé entrant dans la constitution des protéines naturelles, des protéines naturelles ou avec un autre R3 adjacent peut représenter simplement une liaison pour former une double liaison; et X = OH, NH2, COOH, SH, ou NH-NH2. On peut citer plus particulièrement les cas o X est un COOH, notamment lorsque ledit acide correspondant à A-COOH est susceptible de former un anhydride interne; o R3 est hydrogène; et o n =2. Une autre famille particulière de composés selon la présente invention est la famille o: n = 1; X = NH2 et R3 représente la chaîne latérale en A de la fonction amino d'un acide aminé entrant dans la constitution des protéines naturelles. Les composés de formule I peuvent être préparés en faisant réagir les composés de formule II suivante HN> ôR HANR1 I jI (d N II HO-H0C, O R2 avec un ester d'acide carboxylique de formule A-COOH ou un sel halogénure de cet acide, tel qu'un chlorure ou encore un anhydryde d'acide, externe ou interne, lorsque A inclut une fonction carboxylique. Le cas échéant, on aura bloqué les autres positions réactives des composés de formule II. Ces réactions sont bien connues de l'homme de l'art. La synthèse de P'AZT (composés de formule II) a été décrite par exemple dans l'article de DRUGS OF THE FUTURE, Volume 11, n 12, 1986, mais également dans de nombreux autres documents de l'état de la technique. Les dérivés d'esters en 5' selon l'invention relarguent l'AZT lentement en présence de plasmas (de 20 à 25 % en 24 heures), mais montrent une activité comparable à celle de l'AZT dans le système Cellules MT4 infectées par le virus HIV, tout en ayant une toxicité considérablement inférieure, ce qui leur confère un indice de sélectivité de l'ordre de 28 000, alors que l'indice de sélectivité pour P'AZT est de l'ordre de 6 000. D'autres avantages et caractéristiques-de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples non limitatifs qui vont suivre. L'exemple 5 fait référence aux figures 1 à 4. Les figures 1 et 2 représentent des courbes de survie des souris infectées par le virus MSV et traitées par t'AZT (figure 1) et par son dérivé hémisuccinate selon l'invention (figure 2). aux figure 1: o = contrôle * = 5 mg/kg/jour d'AZT à = 25 mg/kg/jour d'AZT m = 125 mg/kg/jour d'AZT figure 2 o = contrôle * = 6,8 mg/kg/jour de 5'hémisuccinate d'AZT A = 34 mg/kg/jour de 5'hémisuccinate d'AZT m = 170 mg/kg/jour de 5'hémisuccinate d'AZT Les figures 3 et 4 représentent des courbes d'apparition des tumeurs chez les souris infectées par le virus MSV et traitées par l'AZT (figure 3) et par son dérivé 5'hémisuccinate selon l'invention (figure 4). aux figure 3 o = contrôle * = 5 mg/kg/jour d'AZT - = 25 mg/kg/jour d'AZT = 125 mg/kg/jour d'AZT figure 4 o = contrôle * = 6,7 mg/kg/jour de 5'hémisuccinate d'AZT A = 34 mg/kg/jour de 5'hémisuccinate d'AZT A = 170 mg/kg/jour de 5'hémisuccinate d'AZT EXEMPLE 1: Préparation du 5' succinyle-3'azido-3'déoxythymidine La réaction a lieu selon le schema suivant O O- HN R R1 O O HN HO... i' pyridine CH !2'CH N3 COOH N3 3O De l'anhydride succinique (207 mg) est ajouté à la température ambiante à une solution de 3'azido-3'déoxythymidine (369 mg) dans la pyridine (10 ml). Le mélange est agité à température ambiante pendant 15 heures. Après contrôle de l'avancement de la réaction par CCM (chromato- graphie sur couche mince) la pyridine est évaporée sous vide et le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice 60 en utilisant comme système d'éluants un mélange d'éther, de méthanol et d'ammoniaque (65:35:0,5). les fractions contenant le produit désiré sont rassemblées, concentrées sous vide et lyophylisées. Après trituration dans l'acétonitrile, on obtient 450 mg de '-succinyl-3'azido-3'azido-3'-déoxythymidine sous forme d'une poudre blanche (rendement: 89 %). UV (NaCI 9%/ o) (nm) PI max (E) 266 (9730), 209 (9901) MS: 368 (M 1), 350, 325, 250 , 242, 207, 199, 185, 125 H1 RMN (DMSO-d6) 7.62 (S, 1H, H-6), 6.21 (t, 1H, H-1'), 4.57 (M, IH, H-3'), 438 (M, 1H, H-5'A), 4.23 (M, 1H, H-5B), 4.01 (M, 1H, H-4'), 2.64 - 2.23 (M, 6H, H-2' + 2 x CH2), 1.83 (S, 3H, CH3) IR: KBr 3200, 2819, 2100, 1745, 1708, I680, 1665, 1532, 1472, 1270, -1 1159, 1100 cm. EXEMPLE 2: préparation du 5'leucyl-3'azido-3'déoxythimidine La réaction a lieu selon le schéma suivant o' _o 04 Nei HN Boc-Leu-ONP C -O O DMF, DBU Boc N3 N3 (I) HN/I '4e HN C' 0 o NH2 N30(II) 30. \- N3 'O-(Boc-L-leucyl)-3'-azido-3'-déoxythymidine (I) A une solution de 3'azido-3'-déoxythymidine (150 mg, 0.561 mmoles) et du p-nitrophenyl ester de la N-Boc-L-leucine (395 mg, 1.122 mmoles) dans la N, N'(dimethylformamide (3 ml), on ajoute à température ambiante et sous agitation du 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-enc (168 pl, 1.123 mmoles). - Après 15 h à température ambiante, l'analyse par CCM (acétate d'éthyle) indique la transformation complète du produit initial. Le mélange réactionnel est concentré sous pression réduite. Le résidu est dissout dans l'acétate d'éthyle (40 ml), lavé par une solution aqueuse de Na2CO3 (IM, 2 X 20 ml), par de l'eau (20 ml) et par une solution aqueuse saturée en NaCI (20 ml). La phase organique est séchée à l'aide de MgSO4 et est concentrée jusqu'à l'obtention d'une huile jaune qui est purifiée par chromatographie sur silice (40 gr de Kieselgel 60/0.04- 0.063 mm) éluant: acétate d'éthyle). Le produit désiré est obtenu sous forme d'une poudre blanche après évaporation des fractions 9 à 13 et trituration dans un mélange acétate d'éthyle-éther de pétrole. Rdt: (201 mg, 74.6 %) Masse: FAB- 479.2 (M-1), 453.2, 406.2, 405.2, 379.2, 362.1, 310.1, 230.1, 201.9, 157.0, 156.0 FAB- (daughters of 479.2), 479.2, 436.2, 405.2, 362.1, - 266.2, 223, 212.1, 156 IR KBr (cm 1) 3360, 3190, 2960, 2935, 2875, 2110, 1745, 1700, 1518, 1470, 1369, 1273, 1165, 1102, 1052 RMN (CDCI3, 300 MHz): 8,71 (NH, 1H), 7.17 (s, 1H), 6.06 (m, 1H), 4.92 (m, 1H), 4.45 - 4.15 (m, 3H); 4.08 (m, 1H), 2.55 - 2.28 (m, 2H), 1.95 (s, 3H), 1.84 -1.49 (m, 3Hà, 1.43 (s, 9H), 0.96 (d, 6H) '0-(L-leucyl)-3'-azido3'déoxythymidine (II) Une solution de 5'0-(Boc-L-leucyl)-3'azido3'déoxythymidine (160 mg, 0.333 mmoles) dans l'acide trifluoroacétique (3 ml) est agitée à température ambiante pendant 4 heures. Le mélange réactionnel est concentré sous pression réduite et le résidu est purifié par chromatographie sur silice (40 g de Kieselgel 60, éluant: acétate d'éthyle/méthanol: 95/5). Le produit désiré est obtenu sous forme de mousse après évaporation des fractions 20 - 37. Rdt: (112 mg, 88 %) Masse: El + 381 (M+I), 355, 338, 289, 277, 259, 255, 227, 185, 180 El - 379 (M-1), 297, 275, 255, 227, 205, 183 El + (daughters of 381) 381, 255, 250, 227, 212 RMN (CDCI3 + DMSO, 300 MHz) 7. 20 (s, H-6), 6.06 (m, H-1'), 4.35 (m, 2H), 4.30 (m, 1H) 4.06 (m, 1H), 3. 55 (m, lHà, 2.44 (m, 2H-2'), 1.91 (s, Me), 1.49 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 0, 94 (d, 2 Me) IR (KBr cm 1) 3200, 2960, 2110, 1735, 1690, 1470, 1275, 1205 EXEMPLE 3: stablilité in vitro des dérivés de l'AZT selon l'invention La stabilité des dérivés de 1'AZT, et plus particulièrement du dérivé hémissuccinate, selon l'invention, a été testée dans différentes conditions, selon les schémas suivants I. tampon acétate pH 4.5 ou 5.5 40 mM AZT ou dérivé 5 pg/ml 2. Tampon acétate pH 4.5 ou 5.5 40 mM extrait Iysosomial de foie de rat (TS) 1.2 mg/ml en protéines cystéine 5 mM AZT ou dérivé 120 pg/ml 3. PBS I fois plasma ou sérum humain 56 % AZT ou dérivé 120 pg/ml Les incubations se font à 37 C; les produits sont extraits et anlysés par HPLC. Les résultats sont repris au tableau 1 Tableau 1: stabilité in vitro de P'AZT et de ses dérivés selon l'invention Pourcentage d'AZT présent après Produit Temps incubation en présence de: _. TS TS Serum Plasma pH4.5 pH.5 pH4.5 pH5.5 humain humain 3'azido-3'déoxythymidine 24 h 100 100 100 84 100 100 48 h 61.5 46 79 100 'hémisuccinyl-3'azido- 24 h 0 0 20 10 41 23 3'déoxythymidine 48 h 25 17 63 59 72 h 66 62 EXEMPLE 4: activité in vitro des dérivés de 1'AZT selon l'invention Des expériences pour établir l'activité anti-HIV des dérivés des exemples 1 et 2 sur: 1. cellules MT4 infectées par le virus HIV; et 2. cellules HUT/78 infectées par le virus HIV. 1. Expériences sur cellules MT4 infectées par le virus HIV Les produits (AZT, AZT-5' hémisuccinate et AZT 5' leucine) à différentes concentrations ont été mis en présence de cellules MT4 (4 X 104 cellules par puits de microtray) infectées ou non avec 100 CCID50 de virus HIV-1 (souche HTLV-IIIB). La CCID50 représente la quantité de virus à rajouter pour obtenir une infection de 50 % des cellules (doses infectieuses de cellules en culture 50). - Après cinq jours d'incubation à 37 C, le nombre de cellules vivantes a été déterminé par la méthode au MTT, basée sur la réduction par les cellules vivantes du 3'-(4, 5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5diphényltétrazo- liumbromide, jaune, en formazan, bleu. L'activité antivirale et la cytotoxicité sont exprimées sous forme de ED50 edt CD50. Le CD50 représente la dose qui tue 50 % des cellules non infectées et le ED50 représente la dose qui protège 50 % des cellules de l'infection virale. Les résultats sont exprimés au tableau 2 en CD50, ED50 et SI qui représente l'indice de sélectivité et qui est égal à CD50 sur ED50. Tableau 2 activité in vitro des dérivés de l'AZT selon l'invention Exp. N Produit CD50 ED50 SI SI dérivé/SI AZ 1 AZT 15.8 mm.0026 jM 6101 4.7 AZT 5'hémisucc. 196 pM.0069 pM 28543 2 AZT 14.2 pM.006 PM 2372 2.1 AZT 5'leuciue 25.4 pM.005 ltM 5080 2. Expériences sur cellules HUT-78 infectées par le virus HIV Les produits (AZT et AZT-5' hémisuccinate) à différentes concentrations ont été mis en présence de cellules HUT-78 infectées par le virus HIV-1 (souche HTLV-IIIB) à une multiplicité d'infection de 0.4. Tous les quatre jours, 3/4 du milieu ont été remplacés par du milieu frais. Après douze jours, l'expression des antigènes viraux a été mesurée par immunofluorescence indirecte à l'aide d'un sérum anti-HIV-I positif, et par cytofluorescence laser, tel que décrit par Powel et al. 3. Virol. Meth. 16, 171-185 (1987). Des résultats sont exprimés dans le tableau 3 en ED50 et en pourcentage d'effet protecteur selon la formule: nbre cellules positives en présence du produit - nbre cellules contre positives x 1- nbre cellules positives en absence du produit - nbre cellules contre positives TABLEAU 3 Concentration (pM) Pourcentage d'effet protecteur du produit AZT AZT-5' hémisuccinate 0 0 0 0.004 -74 0.008 -41 0.022 -23 0.04 -19 0.11 48 0.2 36 0.54 21 I 45 2.71 72 65 ED50 AZT = 2 pM EC50 AZT-5' hémisuccinate = 1,77 PiM EXEMPLE 5 activité in vivo des dérivés de I'AZT selon l'invention L'AZT et ses dérivés selon l'invention ont été testés in vivo chez la souris NMRI infectée par le virus MSV (Moloney arcoma virus). La drogue est adminitrée i.p. pendant 5 jours dans un volume de 25 pl/g de poids corporel. Le virus est inoculé dans la cuisse gauche de l'animal deux heures après la première administration de drogue. Les animaux sont contrôlés tous les jours selon trois critères: survie, apparition de la tumeur et poids (toxicité) pendant 50 jours. Les résultats sont repris au tableau 4 et dans les figures I à 4. % ILS = pourcentage d'augmentation du temps de survie temps médian de survie T - temps médian de survie C X 100 temps médian de survie C On entend par temps médian de survie le temps o la moitié des souris sont encore vivantes. % ITL = pourcentage d'augmentation du temps d'apparition de tumeur temps médian d'apparition - temps médian d'apparition de la tumeur T de la tumeur C X 100 temps médian d'apparition de la tumeur C T = testé, C = contrôle. O EnV o Vn O Vn Tableau 4: activité in vivo des dérivés de lVAZT selon l'invention Produit et dose Temps médian de Temps moyen de Z ILS Temps médian d'apparit. Temps moyen d'apparit. Z ITL survie survie de la tumeur de la tumeur Contr8le 9.2 Jours 8.7 Jours - 4.5 Jours 4.2 Jours AZT: mg/kg/jour 11.6 Jours 11.3 Jours 26.8 7.3 Jours 6.5 Jours 62.8 mg/kg/jour 16 Jours >19.8 Jours 74.8 13 Jours * 190 mg/kg/Jour 16 Jours >23.3 Jours 74.8 10.6 Jours 10.2 Jours 137 ZT 5' hémisuccinate: 6.8 mg/kg/Jour 11.0 Jours 11.5 jours 20.2 6.8 jours 7.3 Jours 52.4 34 mg/kg/Jour >50 jours > 41 Jours >446 11 Jours >25.5 Jours 145 mg/kg/Jour 13 Jours >22.7 Jours 42, 1 16 Jours >23 Jours 257 Lt n'est pas Évaluable, plusieura souris étant mortes avant de développer une tumeur. co n 'est pas évaluable, plusieurs souris étant mortes avant de développer une tumeur. REVENDICATIONS 1. Composés chimiques dérivés de la 3'azido-3' déoxy- thymidine et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale I o HN, R. O-b0 I R2 dans laquelle R1 représente H, un radical alkyle inférieur, un radical alcoxy inférieur, un radical hydroxyalcoyle inférieur ou un halogène. R2 est N3 ou un radical -CN et A représente un radical hydrocarboné éventuellement substitué, portant au moins une fonction polaire, notamment carboxylique, hydroxyle, thiol, éther, amine ou hydrazine. 2. Composés chimiques selon la revendication 1, caractérisés en ce que R1 est un radical -CH3 et R2 est N3/ 3. Composés selon l'une des revendications I ou 2, caractéri- sés en ce que A-- représente X-(H) - o n est un nombre entier compris entre 1 et 5, R3 peut être identique ou différent et représente H ou un radical hydrocarboné, tel qu'un alkyle, un aralkyle, un alcoxyalkyle, éventuellement substitués, ou la chaîne latérale en A de la fonctioh amino d'un acide aminé entrant dans la constitution des protéines naturelles, ou avec un autre R3 peut représenter simplement une liaison pciur former une double liaison; et X= OH, NH2, COOH, 5H, ou NH-NH2. 4. Composés selon la revendication 3, caractérisé par le fait que R3 = H. 5. Composés selon la revendication 4, caractérisé en ce que n= 2 et X = COOH. 6. Composés selon la revendication 3, caractérisé par le fait que n = 1 X, = NH2 et R3 représente la chaîne latérale en A de la fonction amino d'un acide aminé entrant dans la constitution des protéines naturelles. 7. Compostition pharmaceutique, caractérisé par le fait qu'elle comprend au moins l'un des composés selon l'une des revendications 1 à 6. 8. Procédé de synthèse des composés selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé de formule II suivant HN R1 I HO-HiC avec un réactif choisi dans le groupe constitué par les esters d'acide carboxylique de formule A-COOH, les sels halogénures de cet acide et les anhydrides d'acide interne ou externe.