Brevet FR2639116A1 — publié le 19900518

L'invention concerne un procédé de préparation de gels sur supports pour électrophorèse, permettant d'appli- quer aussi bien des techniques de séparation que des techni- ques de transfert. Les procédés modernes de séparation par électro- phorèse conmme, par exemple, la focalisation iso-électrique (FIE) et l'électrophorèse utilisant du dodécylsulfate de so- dium (DSS) utilisent des gels plans. Pour cela, on applique des gels ultra-minces, sur des plaques en verre ou sur des feuilles de matière plastique présentant de l'adhérence (RADLA, B.I. Electrophoresis I (1980), 43-56), pour stabi- liser les gels pendant la suite du traitement. Ces matériaux de support présentent un inconvénient décisif: ils sont per- méables aux liquides et au passage de courant électrique et i5 ne conviennent donc pas pour des techniques de transfert (diffusion et électro-absorption des taches ou "électroblot- ting"). Pour ces techniques, on doit donc se tourner vers des gels qui. pour bien garantir une résistance mécanique suffisante dans les bains de traitement, doivent présenter une épaisseur de couche au moins égale à 1 à 2 mm. Ces gels présentent, en comparaison des gels ultra-minces, une série d'inconvénients: - une plus faible netteté de séparation, - une plus faible sensibilité de détection, - un plus long temps nécessaire pour les étapes de traitement (fixage, coloration, décoloration et séchage), - une plus grande consommation de réactifs parfois très onéreux. Pour pouvoir utiliser les avantages des gels ul- tra-minces et permettre cependant des techniques correspon- dantes de transfert, on a proposé dans la littérature technique toute une série de procédés. C'est ainsi que, pour préparer des gels ultra-minces de polyacrylamides sur supports, on utilise différents tissus en polyester (Nishisawa et coll.. Electrophoresis 6 (i985), 349-350; Kinzkofer et coll., Electrophorese Forum 1986, 253-257), qui, après la réalisation du processus de séparation par électrophorèse, garantissant une électro-absorption par transfert ("électroblotting"). Lors de l'utilisation du tissu en polyester, le prétraitement nécessaire de cette étoffe, qui est indispensable pour enlever des adj'uvants (préparation, enduits ou ensimages) nécessaires pour ta fa- brication de l'étoffe, constitue un inconvénient. Ces subs- tances (paraffines de type (CH2)n=>4 tensio-actifs fluorés, i0 esters aliphatiques) possèdent dés propriétés hydrophobes fortement marquées qui exercent une influence défavorable sur le comportement en mouillage et en coloration de l'étoffe. C'est ainsi que l'on prescrit de nombreux livages à l'eau et un post-traitement par une solution de tunsio- i5 actif(s). Le procédé indiqué pour cette préparation ne peut par ailleurs pas garantir une production de gel absolument dépourvue de bulles ou boursoufflures (absolument dépourvue d'inclusions d'air). Dans le cas des tissus en polyester, utilisés en partie et qui présentent des grosseurs de pores supérieures à 800,BO la structure de l'étoffe se dégrade dans le gel, ce qui crée des inhomogénéités du gel. Des ano- malies de l'étoffe, provoquées par des variations de qualité des soies et apprêts utilisés, une ouverture des raccords des fibres des soies pendant la formation des parties planes etc., créent des inhomogénéités du gel. On ne doit pas né- gliger le point de vue économique, car la qualité nécessaire de l'étoffe de polyester coûte extrêmement cher. Pour des gels classiques en gélose ou agarose, on a utilisé des feuilles de polypropylène hydrophile, de 0,089 rmn d'épaisseur, ayant des pores de 35 /.un (Saravis et coll., Electrophoresis 4 (1983), 367). En plus de la limita- tion d'application due au pouvoir d'adhérence (ne convenant que pour des gels de gélose), les prétraitements nécessaires pour les feuilles présentent des inconvénients particuliers. C'est ainsi qu'il faut traiter par des adhésifs spéciaux les bords ou lisières des feuilles pour empêcher une traversée par absorption de la gélose ou éviter un séchage possible des bords du gel plan. En outre, il faut, par un traitement sous vide, débarrasser les pores d'air ou bien il faut ensui- te les recouvrir de gélose et l'on doit alors éliminer à l'aide d'une lame bien aiguisée l'excès de gélose solidi- fiée. Il est donc facile de constater que ces opérations de traitement préliminaires prennent beaucoup de temps, peuvent provoquer la formation de défauts mécaniques à la surface des feuilles et ne peuvent donc exclure des non-homogénéités du gel. Pour permettre le transfert des protéines, on a en outre stabilisé des gels de polyacrylamide en utilisant des non tissés de polyester liés par voie thermique ou à l'aide d'adhésifs (Starita-Geribaldi et coll., Electrophoresis 8 ( 988), 234-236). On applique pour cela des gels de polya- crylamide, ayant une épaisseur de 1,5 rrmn, sur des nappes ayant un poids surfacique de 10 g/m2 et un diamètre des fi- bres de 30 yjn. De telles nappes sont très inhomogènes et mécaniquement instables. Leur liaison avec le sel est réali- sée de manière inégale. Il en résulte notamment de fortes difficultés lors de la préparation des cuvettes de gel et surtout lors du traitement subséquent (enroulement dans les bains de fixage, de teinture et de décoloration). Un séchage n'est possible que dans le cas de gels fortement tendus, lorsqu'on souhaite une stabilité des formes et des dimen- sions. Des difficultés analogues de manutention apparais- sent quand on utilise des tissus en "Nylon (Kopacek, Biome- dical Application of Chromatography and Elektrophoresis, Zinkovy 1988), qui présentent encore en outre l'inconvénient d'une couleur persistante d'un fond bleu lorsqu'on utilise des procédés de teinture par ailleurs usuels et qui n'ont qu'une faible résistance à de l'acide trichloroacétique. L'invention a pour but de développer un procédé simplifié et économiquement favorable, permettant de prépa- rer. en utilisant une matière de support spécifique, perméa- ble au courant électrique, des gels pour électrophorèse présentant des propriétés favorables pour les opérations d'absorption ("blotting"). A la base de l'invention se trouve donc le problè- me consistant à mettre au point et développer un procédé pour préparer des gels mécaniquement stables pour électro- phorèse, obtenus à l'aide d'une matière de support spécifi- i0 que perméable au passage du courant, permettant la formation de gels ouverts des deux côtés, convenant particulièrement bien pour les opérations d'absorption par le transfert ("blotting"). Selon l'invention, on résout ce problème en produisant des gels ultra-minces sur un non tissé de polyes- i5 ter dépourvu de liant calandré, renforcé par tourbillon- nements hydrodynamiques de fibres. On peut préparer selon l'invention, de façon particulièrement avantageuse, des gels sur supports lorsqu'on utilise, pour l'enchevêtrement hydrodynamique des fibres, des fibres de polyester présentant un diamètre de fibre individuelle de 10 à 18 dmn. Sur ce sup- port ayant un poids surfacique de 10 à 50 g/rn2, on applique des gels, à base de polyacrylamide et/ou d'agarose ou gélose ou de leurs dérivés, ayant une épaisseur de couche de 0,1 à 0,75 mmn. Les non tissés de polyester que l'on prépare ainsi possèdent un bon pouvoir d'aspiration des solutions de gels. Les gels une fois séchés ont des dimensions stables, envers les sollicitations mécaniques et sont très résis- tants. Les gels sur supports pour électrophorèse que l'on prépare ainsi répondent de manière presque idéale à toutes les exigences édictées à propos de la séparation par élec- trophorèse, des étapes de traitement concerna- l'immobili- sation, la visualisation et l'archivage et pour l'électro- absorption de transfert ("électroblotting"). Pour la préparation de gels dépourvus d'inclusions d'air (dépourvus de bulles), le pouvoir de mouillage du non tissé obtenu par enchevêtrement présente une importance décisive. Il repose sur la caractéristique structurelle du tissu, en particulier sur sa faible épaisseur et sur le nom- bre élevé des extrémités libres de fibres présentes à la sur- face du non tissé et fermement maintenues dans ce non tissé ainsi que sur le fait que les jets d'eau sous pression éle- vée, que l'on utilise pour le traitement par enchevêtrement débarassant complètement la nappe de constituants étrangers, commrne des agents de préparation, de la matière grasse, etc., ainsi que de débris détachés de fibres. Le non tissé résis- te bien au découpage de ses bords ou lisières. Dans les gels préparés par une technique de pliage modifiée selon Radola, on élimine d'assez petites bulles d'air, éventuelle- ment présentes, du fait que ce pouvoir d'aspiration lors de la fermeture du "sandwich". En particulier, le procédé selon l 'invention comporte les étapes partielles suivantes: 1. L'application d'une feuille de couverture ten- due (feuille de polyester, 100 Xm, non traitée) sur une pla- que de support. 2. Application précise des bords du non tissé de polyester, enchevêtré sur la feuille de couverture placée selon le point 1. 3. Fixation d'organes d'espacement sur les deux côtés longitudinaux superposés du non tissé traité par tour- billonnement, ce qui détermine l'épaisseur de la couche de gel. 4. Application d'une feuille de couverture tendue (feuille de polyester, 100. m, non traitée) sur une plaque de verre de couverture. En cas d'une électrophorèse utili- sant du dodécylsulfate de sodium (DSS), la feuille de cou- verture doit être munie de formateurs de fentes. 5. Sur le non tissé prétraité obtenu selon le point 3, coulé de la solution de formation d'un revêtement de gel. La solution de revêtement par un gel doit représen- ter le triple environ de la quantité théorique calculée. 6. Fermeture du "sandwich", par lent abaissement de la plaque de verre de couverture (point 4) comportant une feuille de couverture sur le non tissé enchevêtré selon le point 5, la solution de formation de l'enduit de gel étant refoulée en forme de coin vers l'autre extrémité. 7. Durée de la polymérisation: une heure. 8. Après la polymérisation, on obtient un gel sta- bilisé sur un support et protégé par deux feuilles de cou- p0 verture, gel que l'on peut utiliser pour l'électrophorèse et pour des opérations subséquentes de transfert de taches par absorption ("blotting"). On peut considérer que des avantages essentiels du procédé selon l'invention résident notamment dans les points ú5 suivants: Le non tissé, traité enchevêtré, consolidée par voie hydrodynamique et appliquée selon l'invention peut ser- vir directement, sans traitement préliminaire supplémentai- re, pour des séparations par électrophorèse (focalisation isoélectrique, électrophorèse utilisant du dodécylsulfate de sodium) et pour un procédé d'absorption et de transfert ("blotting"). La liaison intense entre le gel et le non tissé enchevêtré est garantie même pour des compositions les plus diverses du gel et pendant toutes les étapes opératoires partielles. En ce qui concerne une coloration résiduelle, lors du processus de séparation et du transfert, le non tissé s'avère être inerte. Le procédé de l'invention permet de préparer sans problème des gels ultra-minces (0,1 à 0,75 rrmm). Les gels renforcés par le non tissé présentent de la stabilité de forme et des dimensions pendant la totalité des opérations de traitement ainsi qu'à l'état sec. Une mes- ure de la réflexion permet une exploitation densitométrique. Exemples de mise en oeuvre L'invention sera maintenant explicitée plus en dé- tail à l'aide des exemples suivants de mise en oeuvre: Conduite de la focalisation isoélectrique Epaisseur de couche: 0,2 rrmm Solution for- matrice du gel: 2,5 ml d'une solution d'acrylamide (20,Og i0 d'acrylamide et 0,54 g de N,N'-mé- thylènebisacrylamide dans 100 ml de H20) 1,5 mi de glycérol (à 87%) 1,0 ml de "Servalyt T 4-9" 1,0 ml d'une solution d'acriflavine (10 mg de chlorhydrate d'acriflavine dans ml d'eau) 4,0 ml d'eau. La polymérisation de la solut-ion dégazée sous I-e vide d'une trompe à eau a lieu sous l'effet d'un éclairage durant une heure (lumière blanche d'un tube au néon). Aprbs application de la feuille de couverture comportant le gel armé à l'aide du n-nonane sur le bloc froid de la chambre d'électrophorèse, on effectue la focalisation isoélectrique en utilisant le programme suivant de conduite de la tension électrique: V, 60 minutes, pour la préfocalisation application de l'échantillon (mélange d'essai) 200 V, durant 60 minutes enlèvement des bandelettes d'applica- tion 400 V, durant 30 minutes 800 V, durant 30 minutes 1200 V, durant 60 minutes Anolyte: 0,73 mole d'acide phosphorique Catholyte: 0,51 mole de solution d'éthylènediamine. Comme ponts pour le passage du courant, on utilise des "bandes pour électrophorèse" de PHARMACIA. Fixage: 30 minutes à l'aide d'acide trichloroac4tique à 20%) Coloration: 30 minutes avec du bleu "Serva G 250" (0,1%) dans un "mélange universel" (mélange à 5:4:1 d'eau:méthanol:acide acétique cristallisa- O ble) Décoloration: "mélange universel" jusqu'à absence de colo- ration du fond Séchage: séchage à l'air des gels armés suspendus. Conduite de l'électrophorèse utilisant du dodécylsulfate de t5 sodium: Epaisseur de couche de gel: 0,4 mm Solution for- matrice de gel: 15 ml d'une solution d'acrylamide (voir ci- dessus pour focalisation isoélectrique) iO ml d'un tampon de dodécylsulfate de sodium pH 8,8 (dissoudre dans 800 ml d'eau 193,7g de tris, 80,0 g de glycine, 4,0 de EDTA sodique (sel de sodium de l'acide éthylènediamine tétraacétique) et 4,Og de dodécylsulfa- te de sodium, ajuster à 8,8 le pH et compléter à 1000 ml) 8,4 ml de glycérol (à 87%) i100 p1 de TENED / l d'une solution de persulfate d'ammrrrnonium (à 50,0 g/l) La polymérisation se déroule durant trente minutes à la température ambiante et durant trente minutes à environ 500 C. La feuille de couverture comporte des formateurs de fentes pour permettre l'application des échantillons. Tampon pour électrophorèse: on dilue à 800 ml un volume de 100 ml d'un tampon de réserve (obtenu par dissolution de 24g de tris, 115,2 g de glycine, 2,0g de EDTA sodique, 2,Og de dodécylsulfate de so- dium et 0,5 g d'azoture de sodium dans de l'eau, en'complétant à 1000 ml). i0 Apres application de la fe.uille de couverture com- portant le gel armé sur le bloc ou chevalet de refroidisse- ment de la chambre d'électrophorèse (en utilisant du n-nonane comme liquide de contact), on effectue l'applica- tion de l'échantillon. Puis l'on produit le contact électri- que entre le tampon et le gel. Après une électrophorèse préliminaire durant cinq minutes à 100 V, on élève à environ 300 V la tension électrique. Quand la bande de bleu de bro- mophénol a reculé de 4 cm, on arrête l'électrophorèse. Fixage: 30 minutes dans de l'acide trichloroacétique (à 20%)o Coloration: 60 minutes dans une solution de bleu Serva à 0,1% dans le mélange universel (voir ci- dessus pour la focalisation isoélectrique) Décoloration: à l'aide du mélange universel jusqu'à absen- ce de couleur du fond; addition de 2% de glycérol (à 87%) au dernier bain de décolo- ration. Séchage: séchage à l'air dés gels armés suspendus. EXEMPLE 1 On revêt par du gel une matière, en opérant comme décrit par StaritaGeribaldi (Elektrophoresis 2 (1988, 234-236) puis on effectue une focalisation isoélectrique ou bien ou soumet aux étapes opératoires décrites pour l'obtention du phérogramme. EXEMPLE 2 On répète l'exemple I en utilisant la matière non tissée selon l'invention, la matière de support étant consti- tuée par un non tissé en polyester enchevêtré, calandré (PE-F-bt-0,16 tex, 38 rmm) ayant un poids surfacique de 30 g/ m2. EXEMPLE 3 On utilise un tissu en "Nylon" selon Kopacek (Biomedical Applications of Chromatography and Elektrophoresis, Zlnkovy 1988) conmme matériau de support pour la conduite d'une séparation avec utilisation de dodé- cylsulfate de sodium. Exemple 4 On répète l'exemple 3 en utilisant un matériau en nappe selon l'invention, le matériau de support étant un non tissé en polyester calandré enchevêtré (PE-F-bt-0,13 tex, 38 mm) ayant un poids surfacique de 35 g/m2. En utilisant les matériaux de support décrits dans les exemples I à 4, on obtient les résultats ci-après (voir page suivante). Il ressort du tableau ci-après que la nappe selon l'invention est nettement supérieure par ses capacités et caractéristiques d'utilisation, aux matériaux de l'état ac- tuel et antérieur de la technique. Séparation par Traiterrent après Transfert par absorption électrophorèse séparation par électrophorèse de taches Exerrple I Pas de rermarques défa- Pas de stabilité des dirrensi.ons 'Pas de remarques défavora- vorables après le bain de teinture et le bles dans le cas de gels bain de décoloration arrrs et à dimensions sta- bles Exerrple 2 " Pas de rermarques défavorables Pas de remarques défavora- bles Exerrple 3 "Dissolution partielle de I'é- Pas de rerrmarques défavora- toffe dans le bain d'acide tri- bles dans le cas des gels chloroacótique; forte colora- arrns et à dimrrensions sta- tion résiduelle bles Exerrple 4 " Pas de remarques défavorables Pas de rerrmarques ddvafora- | | | bles %0 bios w ho REVENDICATIONS i. Procédé de préparation des gels à base de po- lyacrylamide et/ou de gélose, sur supports, pour des procé- dés de séparation par électrophorèse ou pour des techniques de transfert, par application d'un milieu séparateur sur une nappe, procédé caractérisé en ce qu'on produit des gels ultra-minces sur un non tissé de polyester sans liant, ca- landré et consolidé par enchevêtrement hydrodynamique des fibres. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise, pour l'enchevêtrement hydrodynamique des fibres, des fibres de polyester ayant un diamètre de 10 à 18 in. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on applique sur le non tissé en polyester des gels ayant une épaisseur de couche de 0,1 à 0,75 rrm.