Brevet FR2645020A1 — publié le 19901005

Médicament pour le traitement des maladies infectieuses dues aux retrovirus ainsi que pour le traitement des tumeurs Il est connu depuis les travaux de KIDD en 1953 que la L-asparaglnose est un agent antitumoral. Cette activité s'avérant insuffisante. on a essaye de la renforcer en associant la L-asparaginase à d'autres produits. En particulier, on a proposé dans la demande de brevet n- 86.e8874 du 19 3uin 1986 d'associer * la L-asperaginase le D-aspartique acide ss hydroxamate (DAH). Cependant. cette association n'a pas apporte les résultats escomptes, de sorte que les recherches sur cette association ont été interrompues et la demande de brevet 86.08874 a été abandonnée. Les travaux du demandeur ont permis de découvrir que le DAH employé seul avait b la fois une activité antiretrovirale et une activite antitumorale. La presente invention concerne l'application, en tant que médicament d'un composé chimique : le Daspartique acide ss-monohydroxamate (DAH). Le D-aspartique acide ss-monchydroxamate est typiquement formé par la réaction d'un groupe acyle active de l'isomère D de l'acide aspartique ou d'un de ses dérivés, avec l'hydroxylamine suivant la réaction: COX étant un reste amide, ester ou anhydride. On exposera ci-après, tout d'abord, son activité antivirale, et ensuite, son activité antitumorale. Ce médicament peut se présenter sous toute forme appropriée par exemple sous la forme d' une poudre lyophilisée de la substance active å dissoudre extemporanément dans une solution physiologique en vue de l'injection ou sous une forme appropriée pour l'administration par voie orale. Activité antirétrovirale du D-aspartique acide 8monohydroxamate Bien que des progrès aient été accomplis en ce qui concerne la lutte contre les infections virales, on ne dispose pas encore d'une gamme d'agents antiviraux aussi étendue, sure et efficace que le sont, par exempie, les antibiotiques. De par leur mode d'action, les agents antiviraux peuvent être classés d'une façon large, en trois catégories, les frontières entre elles étant souvent arbitraires : les agents chimiques, les stimulateurs du système immun ou activateurs de la réponse immune, et les inducteurs de l'état cellulaire antiviral. Les agents chimiques : Ce groupe est le plus étendu et celui qui se développe le plus vite. Etant donné que les virus sont des parasites intracellulaires obligés, l'efficacité de ces agents est déterminée par leur capacité a différencier le métabolisme viral du métabolisme cellulaire, ou dit d'une autre maniere, entre le métabolisme de la cellule infectée et celui de la cellule non infectée. Ge qui revient à dire que la caractéristique essentielle de ce groupe d'agents est leur spécificité d'action.Gelle-ci détermine en même temps la force et la faiblesse de ces agents, car s' ils sont souvent très efficaces, du fait qu'ils peuvent inhiber spécifiquement une enzyme virale, leur spectre d'action est généralement très limité et ils finissent souvent par sélectionner des variants viraux résistants, de la même manière que le font les antibiotiques avec les bactéries (De Clercq E., Biochem. J., 26, 1-13, 1982 ; Becker Y. et Hadar J., Prog. Med.Virol., 26, 1-44, 198 > . Les activateurs de la réponse immune : Mis à part les différents types de vaccins, ce groupe est constitué par des agents capables d'activer les défenses non spécifiques (macrophages, cellules "tueuses" naturelles > ou, plus rarement, les défenses spécifiques (lymphocytes "B" ou "T" > de l'organisme. Pour la plupart, ces agents sont encore en phase expérimentale. Contrairement aux agents chimiques, les caractéristiques essentielles de leur mode d'action sont leur spectre d'action très large et le fait qu'ils ne peuvent pas sélectionner des variante résistants. Mais ils sont pour l'instant en nombre limité et peu efficaces, bien que des progrès aient été récemment accomplis dans ce sens (Koff W.C., Showalter S. D., Hampar B. et Fidler I. J., Science, 228, 495-496, 1965v. Les inducteurs de l'état cellulaire antiviral : Ce groupe comprend l'interféron (IFN), les inducteurs d'IFN et les substituts d'lFN. Il s' agit d'un groupe encore trés réduit de substances qui se caractérisent par le fait qu'ils éveillent dans les cellules un état de résistance a l'infection virale. Ces agents cumulent la puissance de l'action au niveau cellulaire des agents chimiques et le spectre d'action très large des activateurs du système immun. Du fait qu'ils vagissent sur toutes les cellules, qu'elles aient eté infectées ou non, un élément déterminant de leur efficacité est leur faible pouvoir toxique envers les cellules. L'agent pris en considération appartient vraisemblablement, bien que son mode précis d'action n'ait pas encore eté élucidé, au premier groupe de substances avec un spectre d'action limité aux rétrovirus ou à des virus dont la réplication s'y apparente, tels que les hepadna viridae. Les rétrovirus, comme tout autre virus, ne peuvent se reproduire sans détourner à leur profit l'appareil biosynthétique de la cellule. La particularité réside dans leur aptitude à inverser le courant habituel de l'information génétique. Dans les rétrovirus, le matériel génétique est constitué d'ARN, qu'une enzyme, la transcriptase inverse, utilise pour synthétiser de 1'ADN ; cet ADN viral peut s'intégrer au génome de la cellule hôte. Les rétrovirus et leur pouvolr cancérigène ne sont pas une nouveauté scientifique. Des le début du siècle, plusieurs chercheurs avaient identifié, chez l'animal, des agents transmissibles susceptibles de causer des leucémies et des tumeurs solides (Rous P., J. Am. Med. Assoc., 56, 198, 1911), Au cours des décennies suivantes, on a trouvé des rétrovirus chez de nombreuses espèces animales. Les efforts prolongés de chercheurs amenèrent l'isolement, en 198e, du premier rétrovirus humain : le virus lymphotrope des lymphocytes T humains de type I (HTLV-I) (Poiesz B.J. et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77, 7415, 1980). Le HTLV-I engendre un cancer, rare et extremement malin, la leucemie a lymphocytes T de l'adulte, qui est endémique dans certaines régions du Japon, de l'Afrique et des Carabes. Les premiers cas de SIDA furent diagnostiques en 1981 (Gottreb, M. S. et al, Weekly Record, 30. 25Z, 1981). L'agent responsable : le virus de l'immunodéficience humaine Devant les problèmes que pose la mise au point d'un vaccin dans un bref avenir, les recherches de drogues pouvant inhiber la replication de retrovirus sont nécessaires. Les travaux du demandeur ont permis de decouvrir que le DAH provoque une importante inhibition de la multiplication de virus appartenant à la famille des rétrovirus. Ceci a été démontré IN VITRO avec le virus du SIDA (VIH) et IN VIVO avec le virus de FRIEND CFLV Friend Leukemia Virus) qui est un rétrovirus murin de type C. Effet du DAH sur la réplication du VIH. Les travaux effectuée ont permis de découvrir que le D-aspartique acide ss hydroxamate inhibe de manière totale la multiplication virale du VIH. Cette inhibition est dose-dependonte. Cette activité a été mise en évidence sur deux modèles de réplication du VIH, a > lymphocytes normaux infectes par le virus purifié, et b) coculture de lymphocytes de malades du SIDA et de lymphocytes normaux. On a mesuré l'activité transcriptase inverse pendant 22 jours dans le surnageant de cultures cellulaires comme critère de prolifération virale.Le traitement avec DAH a duré 72 heures de JO * J3 de la manipulation. Les figures t, 2 et 3 montrent l'effet sur la production de transcriptase inverse virale, de la dose appliquée au cours des trois premiers jours, lors du traitement des lymphocytes témoins infectés a JO, soit par coculture avec des cellules de malade, soit avec du virus purifié. On a constate que les lymphocytes ont proliféré pendant le traitement avec la drogue, que cette drogue n'est pas toxique pour les lymphocytes non infectés par le virus VIH. Les figures 4 et 5 montrent l'effet d'un traitement au cours des trois premiers jours, aux doses indiquées, sur des lymphocytes de donneur sain.Par contre, le DAM s'est montré plus toxique vis-à-vis des lymphocytes infectés par le virus du SIDA. Les figures 6 et 7 montrent l'effet d'un traitement au cours des trois premiers jours, aux doses indiquées, sur des lymphocytes de donneur sain, infctés par du virus purifié. Effet du DAH sur la malade induite par le virus de Friend Le virus FLV est un rétrovirus murin de type C qui produit des effets rapides sur l'érythropoîèse, les précurseurs érythrodes étant les cellules cibles de ce virus. Le complexe de Friend comprend un virus transformant défectif pour la réplication, appelé le SFFV Leukemia Virus) qui sert à la réplication. Il existe deux variants de. ce virus : le FV-A qui induit une anemie et le FV-P sur lequel ont été effectues les travaux et qui produit une polycytemie. L'erythro- leucemie induite par le FL-V montre deux etapes stade précoce caractérisé par la croissance rapide du nombre des précurseurs érythropoïétiques relativement matures avec une capacité de prolifération limitée. et un stade tardif, caractérise par l'émergence de précurseurs indifférenciés avec une capacité de prolifération intense. In vivo, les manifestations de cette maladie sont une spiénomégalie accompagnée d'une hépatomégalie, d'une hyperplasie érythroide dans la rate et la moëlle osseuse, d'une polycytémie et de foci macroscopiques dans la rate.Les dernières étapes sont caractérisées par la présence de cellules érythroïdes immortelles et transplantables. Lors des travaux effectués le virus a été maintenu par passages successifs intrapéritonéaux chez la souris DBA/2. Get entretien a été fait a partir de la rate de l'animal tous les 21 jours. L'activité de la drogue a. été évaluée en comparant les durées de survie des animaux à qui est injecté le virus, avec ou sans drogue. Le traitement a commencé trois jours après l'infection virale car on considere qu'il faut ce laps de temps pour qu'il y ait des séquences du virus dans le génome des précurseurs érythroïdes de la souris infectée.Après avoir fait varier le nombre d'injections journalières et la durée du traitement pour une dose donnée, il a été établi que 3 injections de lg/kg/dose de DAH durant les ie premiers jours et 2 injections de 1g/kg/dose de DAH pendant les 2 jours suivants, produisent un T/C de 239% . Les résultats sont rapportés dans le tableau suivant Substance Dose (g/kg Jours de T/C x 100 Nombre active de poids traitement (%) d'animaux corporel) (2) survivants DAH l x 3/j J 1-3 239,86 (i > 1 x 2/j DAH l x 3/j J 1-10 193 0/10 (1) les animaux sont traités 3 fois par jour de J 1-10 et 2 fois par jour de J 11-3. (2) T/C = rapport de la durée de survie des animaux traités (T) et de la durée de survie des animaux témoins (C). Activité antitumorale du D-spartique acide fi monohydroxamate Les travaux du demandeur ont permis de découvrir que l'isomère D de l'acide aspartique, lorsqu'il est administré dans des dosages spécifiques, tels que définis ci-après, a une action inhibitrice sur les tumeurs. Dans la demande de brevet français précitée n' 86.e8874, il est rapporté que le D-aspartique acide 8 hydroxamate n'a montré aucune activité in vivo, après un traitement par DAH à raison de 600 mg/kg par jour pendant 5 jours, sur trois modèles tumoraux murins leucémie 12 ie, lymphome RBL5 et mélanome B16, les souris ayant été inoculées avec les cellules tumorales précitées.Il a maintenant été observe, d'une part, que, dans les mêmes types d'essais conduits in vitro, l'inhibition de la croissance des cellules tumorales a lieu pour des doses de DAH commençant entre 0,8 et 1 mM par litre de milieu cellulaire, et, d'autre part, que, sur le modèle tumoral murin de la leucémie 1210, réputée difficilement guérissable, une administration de l g/kg de poids corporel, è raison de 4 fois par jour pendant trois jours, conduit déjà à une prolongation tres significative de la survie des animaux traités. Dans ces mêmes conditions de dosage, le Laspartique acide ss hydroxamate est très toxique. Ainsi, l'augmentation des doses du dérivé D précite par rapport au dérivé L fait apparaître une activité du dérivé D, sans présenter la toxicité que présente le dérivé L aux mêmes dosages @la DL 50% pour le DAH est de 10g/kg alors que la DL 50% pour le LAH est de 2,5 g/kg > . Les doses employées pour le traitement des souris ont varié de e,5g /kg à 1,5 g/kg pendant une période minimale de 3 jours pouvant s'étendre jusqu'à 10 jours. Il s'avère cependant qu' il est possible d'employer des doses plus élevées, jusqu'à 5 g/kg et que si la dose est faible, il faut une période dé traitement plus longue. Etude comparative in vivo du DAH et du LAH L'activité antitumorale du DAH et du LAH a été étudiée sur le modèle de leucémie L1210. Les cellules leucémiques Ll21 sont maintenues par passages intrapéritonéaux dans la souris B6D2F1/J mule. Le nombre de cellules utilisées pour les essais thérapeutiques est de 10@ cellules par souris dans 8,5 ml de PBS. La durée d'observation est de 30 jours. Les résultats sont rapportés dans le tableau suivant Substance Dose (g/kg Jours de T/0x100 Nomore (3) Evolution active de poids traitement (%) d'animaux pondérale corporel) (2 > survivants (4) DAH 1x3/j 1-10 347 3/5 +1.300 DAH 1.5x4/j (1) 1,2,3,4 347 3,5 + 1,000 DAH 1,5x4/j 1,2,3 276 0/5 +1,200 DAH 1x4/j 1,2,3 171 0/5 +1,100 DAH 0,5x4/j 1,2,3 113 0/5 +1,400 LAH 1,5x4/j 1 1 e,5 LAH 1x4/j 1,2 (2) T/C = rapport de la durée de survie des animaux traités (T) et de la durée de survie des animaux témoins (C). (3) à 30 jours (4 > Evolution pondérale (en grammes > de J1 - J5. On constate que le DAH manifeste une activité antitumorale significative sur ce modèle pour une administration à une dose supérieure où égale à 1 g/kg, 3 ou 4 fois par Jour. En revanche, pour le LAH, le meme protocole n'est pas applicable en raison de la toxicité, et même en utilisant un protocole plus léger, on n'a pas observé d'activité antitumorale, mais toujours une toxicité très importante (mort des animaux traités avec le LAH avant le groupe témoin > . L'activité antitumorale du DAH a été aussi étudiée sur deux autres modèles murins : le lymphome L5178Y et la leucémie P388. Les cellules de lymphome murin (L5178Y) sont maintenues par passages intraperitonéaux successif s chez la souris DBA/2 et injectées, pour les essais, a la dose de 10@ cellules par souris. Les cellules de la leucémie P388 sont maintenues par passages intrapéritonéaux chez la souris DBA/2 et injectées, pour les essais, à la dose de 10 cellules par souris sur la souris *6D2F1. Les résultats sont rapportés dans le tableau suivant: Lymphome L5178Y Substance Dose (g/kg) Jours de T/Cx100 Nombre active de poids traitement (%) d'animaux corporal) survivants# DAH 1 x 4/j 1,2,3,4,5 576 5/5 DAH 1 x 3/j 1,2,3,4,5 576 5/5 # g 128 jours. Leucémie P388 Substance Dose active de poids traitement (%) d'animaux corporal) survivants@ DAH 1,5 x 4/j 1,2,3,4,5 190 0/5 DAH 1,5 x 41j 1,2,3 155 # à 30 jours. Revendicatlons 1. Médicament caractérisé par le fait qu'il consiste en le D-aspartique acide ss monohydroxamate (DAM). 2. Médicament selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'tir est destiné au traitement des maladies infectieuses dues aux rétrovirus et au traitement des tumeurs. 3. Composition médicamenteuse selon les revendications 1 et 2, caractérisée par le fait qu'elle renferme à titre de principe actif le D-aspartique acide ss monohydroxamate (DAH). 4. Composition médicamenteuse selon la revendication 3, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous la forme d'une poudre lyophilisée de la substance active à dissoudre extemporanément dans une solution physiologique en vue de l'injection. 5. Composition médicamenteuse selon la revendication 4, caractérisée par le fait qu'elle se presente sous une forme appropriée pour l'administration par voie orale.