Brevet FR2639650A1 — publié le 19900601

COMPLEMENTS DE MILIEUX DE CULTURE DE CELLULES EUCARYOTES A BASE DE PRODUITS DERIVES DE L'INDUSTRIE LAITIERE L'invention a pour objet des compléments de milieux de culture cellulaire, favorisant particulièrement la culture de cellules eucaryotes, notamment de fibroblastes, d'hybridomes ou de cellules sécrétantes. L'un des compléments de milieux de culture le plus largement utilisé est constitué par le sérum de veau foetal (SVF). Ce produit permet avantageusement d'augmenter la croissance cellulaire même à long terme. Cependant son coût élevé a amené à rechercher des substituts. Certains des co-inventeurs de la présente demande ont décrit, dans le brevet FR 8512907 du 29.8.85, l'utilisation de fractions de lait pour complémenter les milieux de culture, en remplacement partiel de SVF. Ces fractions permettent de réaliser de manière économique des milieux aussi efficaces que SVF pour la croissance cellulaire. Les inventeurs ont à présent constaté qu'un produit dérivé de l'industrie laitière, plus aisément disponible que les fractions de lait, est également utilisable comme substitut partiel de SVF. L'invention a donc pour but de fournir des compléments de milieux de culture, utilisables comme substituts partiel du SVF, présentant l'avantage d'un moindre coût de revient. Les compléments de milieux de culture de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont à base de fractions de lactosérum essentiellement dépourvues de constituants de poids moléculaire (PM) inférieur à 10 000. Ces fractions sont telles que récupérées au cours de la fabrication des fromages dans l'industrie laitière, après traitement du lait par un acide, des microorganismes et/ou des enzymes, suivi d'une élimination des constituants ayant un poids moléculaire (PM) inférieur à environ 10.000, par exemple en effectuant au moins une étape d'ultrafiltration. Par le terme lactosérum, on désigne le produit récupéré après traitement enzymatique du lait et/ou par des microorganismes (lactosérum doux), ou après coagulation du lait à l'aide d'un acide, tel que l'acide chlorhydrique (lactosérum acide). Le terme lait tel qu'utilisé dans la description et les revendications désigne aussi bien le lait entier que le lait écrémé, et/ou ayant subi des traitements de conservation. Il s'agit de lait le plus généralement d'origine animale, en particulier du lait de vache, ou encore d'autres mammifères tels que chèvre, brebis, buflonne, jument, yack ou chamelle. D'une manière inattendue, les fractions de lactosérum, dont la composition chimique présente des différences importantes avec les fractions de lait, en particulier en ce qui concerne la fraction protéique, possèdent cependant une capacité similaire pour induire la croissance des cellules eucaryotes en culture. Les travaus effectués ont ainsi montré la capacité des fractions de lactosérum pour stimuler la synthèse d'ADN dans les cultures de cellules eucaryotes, en particulier de fibroblastes, d'hybridomes ou de cellules sécrétant par exemple des hormones ou des facteurs de croissance. D'une manière avantageuse, en mettant en oeuvre les fractions de l'invention, de telles cultures peuvent proliférer à long terme, en n'utilisant que de faibles concentrations en SVF. En remplacement des 108 de SVF généralement utilisés, on mettra avantageusement en oeuvre jusqu'à environ 9% de fractions de lactosérum de l'invention et 1% de SVF. Ces proportions sont données à titre indicatif et seront adaptées selon la culture réalisée. En outre, d'une manière générale, la teneur en protéines des fractions de lactosérums est plus faible que celle du SVF, ce qui rend plus aisée la séparation de protéines sécrétées par les cellules en culture. Cet aspect de l'invention revêt un grand intéret notamment pour la récupération d'anticorps monoclonaux sécrétés par des hybridomes. Cette application des fractions de lactosérum en tant que complément de milieu de culture présente également l'avantage d'utiliser un produit aisément disponible, - en particulier, sa fabrication ne nécessite pas d'étape d'ultracentrifugation - seulement partiellement valorisé à ce jour et dont l'élimination des excédents pose des problèmes de retraitement. Le lactosérum mis en oeuvre comme complément de milieu de culture est avantageusement obtenu à partir de lait entier débarassé des matières grasses et débris cellulaires qu'il renferme, par exemple par centrifugation, ou d'un lait écrémé, de préférence chauffé à une température entre l'ambiante et la température d'ébullition,en particulier supérieure à environ 500C. Le traitement enzymatique, par des microorganismes et/ou un acide, réalisé selon les techniques habituelles, conduit à la précipitation des protéines, la phase liquide correspondant au lactosérum étant alors récupérée. Le lactosérum obtenu est soumis, conformément à l'invention, à au moins une étape d'ultrafiltration réalisée, d'une manière favorable à température ambiante, pour éliminer les molecules ayant un P inférieur à environ 10 000. Il s'agit essentiellement de composés inhibiteurs. Les fractions de lactosérum ainsi isolées sont avantageusement concentrées et stérilisées avant de les utiliser comme compléments de milieux de culture. Selon une disposition supplémentaire de l'invention, les fractions de lactosérum sont thermisées ou telles qu'obtenues à partir de lactosérum thermisé. L'étape de traitement thermique des fractions de lactosérum est réalisée pendant l'étape d'ultrafiltration ou en dehors de cette étape. On utilise avantageusement une température entre l'ambiante et la température d'ébullition, plus spécialement une température supérieure à environ 500C. De telles fractions constituent des compléments de milieux de culture particulièrement intéressants en raison de leur efficacité égale ou meme supérieure à environ 10% de SVF. Selon une autre diposition de l'invention, les fractions de lactosérum sont utilisées pour la conservation de cultures cellulaires. L'étude, avant et après stockage des cultures cellulaires, de la viabilité des cellules, de la récupération de la croissance et, le cas échéant, de la sécrétion de produits par les cellules, notamment de la sécrétion d'anticorps, a montré les propriétés avantageuses des fractions de l'invention. Des cultures d'hybridomes ont pu être en effet conservées plus de deux ans, à -800C, dans des milieux renfermant 30 à 50% environ de fractions de lactosérum, leur prolifération reprenant rapidement en les remettant en culture. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans les exemples qui suivent et en se référant aux figures 1 à 5. Les figures 1 à 3 représentent l'incorporation de thrmidine 3H, dans des hybridomes (figures 1 et 2) et dans des fibroblastes humain- (figure 3) en culture dans un milieu non supplémenté ou dans un milieu supplémenté en SVF ou en fractions de lactosérum de l'invention. La figure 4 représente le nombre de cellules viables d'une culture d'hybridomes en fonction des jours de culture. La figure 5 représente la concentration en immunoglobulines sécrétées par des hybridomes cultivés dans des milieux supplémentés avec SVF ou des quantités croissantes de fractions de lactosérum. EXEMPLE 1 : Etude de l'activité biologique de milieux de culture supplémentés en fractions de lactosérum. FRACTIONS DE LACTCSERE On prépare des fractions de lactosérum bovin en opérant selon l'un des trois protocoles suivants premier protocole : Après élimination des matières grasses et des débris cellulaires par centrifugation, on effectue une précipitation des protéines (en majorité des caséines) du lait entier de vache, soit à l'aide d'enzymes (mélange de rennine et de pepsine à 34 C) ou d'acide (HCl concentré ajouté pour l'obtention d'un pH de 4,6, 34CC). Les surnageants des fractions du lactosérum doux (F1) et du lactosérum acide (F4) sont soumis à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane à seuil de coupure de 10 000, à une température de 15 à 20CC. Chaque rétentat est concentré 6 fois (F2 rétentat du lactosérum doux, et F5 : rétentat du lactosérum acide), ou lavé 2 fois avec de l'eau distillée et concentrée 12 fois (respectivement F3 et F6). - Deusième protocole : On chauffe du lait écrémé 15 à 20 secondes à 673 C. On précipite les protéines à l'aide d'un mélange d'enzymes. Une partie du surnageant est est soumise à une ultrafiltration à 15 à 200C et concentrée 6 fois. Une autre partie de (F7) est soumise à une ultrafiltration à 505C et concentrée 6 fois (Fs) ou lavée 2 fois et concentrée 12 fois (Fio). Une troisième partie de (F,) est chauffée à 65CC pendant 60 min et soumise à ultrafiltration à 50CC. Le rétentat est concentré 6 fois (fiv) ou lavé 2 fois et concentré 12 fois (F12). Toutes les fractions sont stérilisées par filtration à 0,22u avant utilisation dans les milieux de culture. CUL TURES CELLULAIRES On utilise une lignée cellulaire d'hybridomes F34 sécrétant des anticorps monoclonaux IgGs contre la gonadotrophine humaine et une lignée cellulaire d'hybridomes A 49 sécrétant des anticorps monoclonaux Ig! contre le groupe sanguin A. Les cellules sont cultivées de manière habituelle dans un milieu de culture RPMI 1640 (Boehringer Mannheim) supplémenté avec 3 g/l de glucose, 0,1 g/l de pyruvate et 300 mg/l de glutamine. - Troisième protocole : On utilise du lactosérum tel qu'obtenu au cours de la fabrication du fromage (premier sérum de moulage) et on le soumet à une ultrafiltration à l'aide d'une membrane à seuil de coupure de 10 000 daltons. Des fibroblastes de peau humaine sont obtenus par trypsinisation de peau de genou d'une femme jeune et des passages successifs en culture cellulaire. Les fibroblastes ayant subi 6 à 9 passages après la culture primaire sont utilisés dans ces expériences. Des cultures de fibroblastes d'embryons de poulet ont été établies à partir de cartilages d'embryons de poulets âgés de 11 jours, traités avec de la trypsine et de la collagénase. Ils ont été utilisés entre les troisième et dixième passages. Des fibroblastes d'embryons de souris sises 3T3 proviennent de Gibco (ref. H4018). La culture des fibroblastes est réalisée dans un milieu RPMI 1640 supplémenté à l'aide de 1300 mg/l de glutamine et 10 microlitres/ml de mercaptoéthanol. En outre, les milieux de culture d'hybridomes et de fibroblastes sont supplémentés à l'aide de 10 000 u/l de pénicilline, de 100 mg/l de streptocmycin et de 10% de SVF. A) S} HERSE D '.AD.V L'activité biologique des fractions de lactosérum a été étudiée en mesurant l'incorporation de thymidine tritiée à l'ADN lors de sa réplication. On rapporte ci-après les résultats obtenus avec a) des cultures d'hybridomes murins, b) des cultures de fibroblastes, a) Cultures d'hvbridome Des aliquots (100 ul) de suspension cellulaire d'hybridomes sont appliqués à une concentration de 7 x 104 cellules/ml sur des plaques de microtitrage renfermant 96 puits (Falcon, Grenoble, France). 100 microlitres de fractions de lactosérum diluées de manière appropriée sont ajoutés.Les cellules sont mises à incuber pour 48 h et 50 microlitres de thymidine 3H 1 microCi/ml (Amersham, Les Plis, France) sont ajoutés pour 18 à 20 h. Les cellules sont recueillies, lavées et la radioactivité mesurée. Les résultats obtenus avec les cultures d'hybridomes F34 sont rapportés sur les figures 1 et 2 qui indiquent la radioactivité mesurée (cpm x 104) dans des hybridomes cultivés en milieux non supplémentés (M), en milieux supplémentés par SVF ou par les fractions de l'invention (Fs) à (F6) préparées selon le premier protocle (figure 1) ou (Fa) à (F, 2 ) préparées selon le deuxième protocole. Les essais ont été effectues à différentes concentrations, à savoir à 5% v/v 10% v/v et 20% v/v On constate que toutes les fractions testées stimulent la synthèse d'ADS, généralement d'une manière fonction de la concentration.Les fractions ayant subi un traitement thermique (Fl, et Fl2) ou les fractions ayant subi une 'ultrafiltration à 500C (F9 et Fîo) se sont révelées plus efficaces que les fractions obtenues de la même manière mais non chauffées (F2 et F3). L'examen de ces résultats montre également qu'avec (F11) et (F12), les cellules d'hybridomes ont une vitesse de croissance équivalente à celle observée avec SVF seul. b) Cultures de fibroblastes Des fractions de lactosérum de l'invention ont été testées dans des cultures de fibroblastes humains. Les fibroblastes sont appliqués sur des plaques de microtitrage renfermant 96 puits à la concentration de 4 x 104/puits. Ils sont synchronisés en Go/Gt par culture pendant 24 h dans un milieu RPNI 1640, lavés 2 fois et mis à incuber avec 200 ul de fractions de lactosérum diluées à tester, pendant 48 h. On ajoute 50 ul de thymidine 3H (1 xuCi/ml) pour une durée de 18 à 20 h. Les cellules sont recueillies et la radioactivité comptée. Les résultats obtenus avec des concentrations de 58 v/Er et de 10% v/v sont rapportés sur la figure 3 . Comme pour les cultures d'hybridomes, les fractions thermisées (F11) se sont révélées plus efficaces que les fractions similaires non chauffées (F2 > L'activité mitogène des fractions (fit) a été également testée sur des cultures de fibroblastes 3T3. Les résultats obtenus ont montré que ces fractions stimulent la synthèse d'ADN des cellules 3T3 B) PROLIFERATION DES CELLULES A LONG TERSE On indique ci-après l'effet des fractions de l'invention sur la prolifération d'hybridomes F34. Des sous-cultures de ces hybridomes sont effectuées 2 fois par semaine. A chaque passage, les cellules viables sont comptées en utilisant un hématocymètre après coloration des cellules avec 0,5% de bleu trypan. La suspension cellulaire est diluée à une concentration de 7 x 104 cellules/ml et ensemencée à nouveau (100 microlitres) dans des plaques de microtitrage à 96 puits dans un milieu contenant des quantités croissantes de fractions de lactosérum à tester. Les cultures témoins sont supplémentées avec 10% de SVF. Dans une autre série d'expériences, les passages des cellules d'hybridomes sont effectués directement dans un milieu contenant 9,5% de fractions de lactosérum et 0,52 de SVF. Les cellules d'hybridomes sont soumises deux fois par semaine à des sous-cultures comme indiqué cidessus. A chaque passage, les cellules viables sont comptées et ensemencées à nouveau à une concentration de 7 x 104 cellules/ml. On rapporte ci-après les résultats obtenus avec les fractions de lactosérum F7, Fii, F12 utilisées selon des quantités croissantes à chaque passage d'hybridomes F34 2,5 de FL (fraction de lactosérum) + 7,5 de SVF au de jour ; 5 FL * 5 SVF au 7e jour 7,5 FL - 2,5 SVF au 10e jour 9 FL i SVF au 14e jour 9,5 FL - 0,55 SVF au 18e jour. On a représenté, sur la figure 4, le nombre de cellules d'hybridomes viables par ml en fonction du nombre de jours de culture. La ligne pleine représente le nombre de cellules ensemencées à chaque passage. Les symboles utilisés présentent les significations suivantes témoin SVF 108 ; Fï Fi i et Fi 2. Il ressort des résultats obtenus que les hybridomes F34 cultivés en milieus supplémentés avec des fractions de lactosérum montrent une vitesse de croissance supérieure à celle des cellules cultivées en milieux suppplémentés avec du SVF. Il a cependant été nécessaire d'ajouter 0.5% du SVF aux fractions de lactosérum afin d'éviter un dépérissement rapide des cellules. Cette expérience montre que les fractions Fl et F12 (thermisées et ultrafiltrées) sont plus efficaces que les fractions F7 (uniquement thermisées). A l'arrêt de l'expérimentation, au 18e jour, 97% des cellules étaient viables. La concentration en immunoglobulines sécrétées par les hybridomes a été déterminée selon la méthode Elisa en utilisant des anticorps de chèvre anti-IgG ou anti-lgM de souris et un deuxième anticorps conjugué à la peroxydase. Sur la figure 5, on a représenté la variation de la concentration en immunoglobulines (en pg/ml) en fonction des jours de culture dans des milieus supplémentés avec 10% de SVF ou des quantités croissantes de fractions (FIl) et (F12) La sécrétion d' immunoglobulines s'est révélée aussi importante avec des cellules cultivées tant en milieux supplémentés avec des fractions de lactosérum qu'en SVF. Ces résultats ont été corroborés par les expériences utilisant des hybridomes A49. Les hybridomes F34 peuvent directement être transférés d'un milieu supplémenté avec 10% de SVF à un milieu supplémenté avec 9,5% de fractions de lactosérum et 0,58 de SVF sans adaptation progressive. Dès le 5e jour, la vitesse de croissance est apparue, en milieu supplémenté avec les fractions Fii supérieure à celle obtenue en qu'en milieu supplémenté avec du SVF seul (figure 6). La sécrétion d'immunoglobulines, mesurée au 12e jour de culture, indiquait 27pg/ml et 14 ug/ml respectivement. Des séries d'expériences réalisées selon des conditions standard de culture avec des souches d'hulridomes A49, 3C2 et TSH F021D6 corroborent les résultats ci-dessus, montrant que les fractions de lactosérum de l'invention sont particulièrement appropriées pour la croissance et la prolifération de d'hybridomes et de fibroblastes. On mesurera également l'intérêt du faible taux en protéine des fractions de lactosérum de l'invention qui facilite la récupération des produits sécrétés par les cellules en culture. On indique.ci-après, à titre comparatif, les résultats relatifs à la purification d'IgG1 et d'Ig! produites par les souches d'hybridomes F34 et A49 respectivement dans un milieu RPMI supplémenté 1/ par des fractions de l'invention, 2/ par du SVF. PURIFICATION D'IgG1 (F34) 1/ RPMI supplémenté par 9% de fractions de lactosérum + 1% de SVF Surnageant 0,049 mg/ml Produit purifié 1,2 mg/ml Pureté approximative 100% Taux récupéré 83% 2/ RPMI supplémenté par 10% de SVF Surnageant 0,039 mg/ml Produit purifié 0,84 mg/ml Pureté approximative 100% Taux récupéré 57% PURIFICATION D'IgM (A49) 1/ RPMI supplémenté par 9% de fractions de lactosérum + 1% SVF : Surnageant 0,029 mg/ml Produit purifié 0,840 mg/ml Pureté approximative 100% Taux récupéré 62,5% 2/ RPMI supplémenté par 10% SVF Surnageant 0,044 mg/ml Produit purifié 0,900 mg/ml Pureté approximative 100% Taux récupéré 44,4% Ces résultats montrent l'avantage des fractions de lactosérum par rapport au SVF seul lorsqu'on souhaite récupérer d'un milieu de culture des produits sécrétés par les cellules. L'intérêt de ces fractions de lactosérum pour la culture de cellules eucaryotes ressort également de résultats avantageux obtenus avec des cellules dites support-dépendantes. Des expériences ont été ainsi réalisées avec des souches de CHONl en milieu HAMF12 et des souches de BHR21 en milieu RP!I 1640 adaptées progressivement à des quantités croissantes de SVF ou de fractions de lactosérum. Les résultats obtenus montrent que le taux de cellules viables reste, d'une manière favorable, élevé dans les milieus de culture. D'une manière avantageuse, les fractions de lactosérum de l'invention ne modifient pas le métabolisme cellulaire. Une étude comparée des taux de consommation de glucose, de production de lactate et d'ammoniac et de consommation ou de production d'acides aminés (tels que respectivement la glutamine ou l'alanine), des cellules en culture dans des milieux complémentés en SVF ou en fractions de lactosérum met en évidence des métabolismes cellulaires similaires dans les deux cas. EXEMPLE 2 : Utilisation de fractions de lactosérum pour la conservation d'hybridomes On utilise une fraction de lactosérum obtenue comme suit On soumet du lait à une étape de centrifugation pour éliminer les matières grasses et les débris cellulaires. Le lait écrémé est ensuite chauffé 15 à 20 secondes à 670C et les protéines sont précipitées à l'aide d'un mélange d'enzymes (chymosine et pepsine) à 34 C. Le surnageant est chauffé à 65CC pendant 1 heure et concentré 6 fois par ultrafiltration à 50CC en utilisant une membrane à seuil de coupure de 10 000. Après une centrifugation à 30 100g pendant 1 heure, on stérilise la fraction de lactosérum récupérée par filtration à 0,22u et on la conserve à -200C. Cette fraction renferme 40 g/l de protéines selon la méthode de Lorry. Des milieux de culture sont congelés et décongelés comme suit Deux milieux de culture stériles sont préparés à 40C. Le milieu A contient 20% de DMSO, 80% de fractions de lactosérum inactivées par traitement thermique (å 56CC pendant 45 min) et un milieu B contenant 20% de DMSO et 80% de SVF inactivé par traitement thermique. On utilise une lignée cellulaire d'hybridomes F34 sécrétant des anticorps monoclonaus IgG1. Les cellules sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémentées à l'aide de 4m de glutamine, 100ug/ml de pénicilline, 100ug/ml de streptomycine et 10% de SVF. Un jour avant la congélation, les cellules sont réalimentées à l'aide du meme milieu. Les cellules ayant atteint une croissance jusqu'à la dernière phase log sont recueillies par centrifugation (800g, 5 min) et remises en suspension dans un milieu RPMI à la concentration de 2 x 106cellules/ml. On détermine une viabilité d'environ 95% par le test d'exclusion au bleutrypan. La suspension cellulaire est placée dans des cryotubes (0,5 ml/tube) sur de la glace fondante. On ajoute progressivement un volume égal de milieux réfrigérants froids (49C, A ou B) à tous les tubes. L'osmolarité finale de ces milieux de 2,194 OSmoles (A) et 2,185 OSmoles (B). Les cryotubes sont conservés à -200C deux heures et stockés à -800C. On récupère le nombre désiré de tubes après un stockage allant de 2 mois à 2 ans. Les cellules congelées sont décongelées rapidement à 370C et transférées dans des tubes stériles plastiques. Le DMSO est dilué lentement avec 9 ml de RPMI. Les cellules sont sédimentées (centrifugation à 400g pendant 5 min), remises en suspension dans 2 ml de milieu RPMI. L'étude de la prolifération cellulaire est effectuée comme suit On distribue des quantités identiques de cellules dans des plaques renfermant 24 puits. Les cellules congelées dans le milieu A (4 réplicats) sont additionnées de 2 ml de milieu RP.N1I supplémenté à l'aide de 10% de SVF. Les cellules congelées dans le milieu B sont mises en suspension dans 2 ml de milieu supplémentés à l'aide de 10% de SVF ou avec 2 ml de milieus RPMI supplémentés avec 1% de SVF et 9% de fractions de lactosérum.Les cellules viables sont comptées et réalimentées avec le même milieu au 2e jour (2 ml de milieu), au 4e jour (2 ml de milieu), au 7e jour après tranfert dans un flacon de 25 cm2 (8 ml de milieu) et au île jour après transfert dans un flacon de 75 cm2 (30 ml de milieu). On constate qu'après 2 ans de stockage à -80CC dans une fraction de lactosérum, environ 75% des hybridomes sont récupérés en ce qui concerne leur viabilité, alors que seulement environ 204 d'hybridomes conservés dans le SVF sont viables. Les cellules prolifèrent rapidement lorsqu'elles sont remises en culture dans un milieu RPMI renfermant une fraction de lactosérum de l'invention à raison, par exemple, de 94 et du SVF, à raison de 1t, ce résultat étant avantageusement similaire à celui obtenu avec 10% de SVF. On détermine selon la méthode Elisa le taux d'anticorps en utilisant des anticorps de chèvre antiIgG de souris et un deuxième anticorps conjugué à une peroxydase. On constate qu'après 2 ans de conservation dans les fractions de lactosérum de l'invention, les hybridomes F34 sécrétent une quantité d'anticorps aussi importante qu'après deux mois de conservation et que les cinétiques de sécrétion sont similaires. Les résultats qui précèdent mettent en évidence des propriétés avantageuses des fractions de l'invention pour la conservation des cultures cellulaires à basse température. L'invention fournit ainsi des moyens pour conserver les cultures cellulaires avec un appareillage ne nécessitant que des températures de -80-C permettant d'éviter l'utilisation de dispositifs avec azote liquide. REVENDICATIONS 1. Compléments de milieux de culture cellulaire caractérisés en ce qu'ils sont à base de fractions de lactosérum essentiellement dépourvues de constituants de poids moléculaire inférieur à 10 000. 2. Compléments selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit de fractions de lactosérum telles que récupérées au cours de la fabrication des fromages dans l'industrie laitière, après traitement du lait par un acide, des microorganismes et/ou des enzymes, suivi d'une élimination des constituants ayant un poids moléculaire (PM) inférieur à environ 10 000, par exemple en effectuant au moins une étape d'ultrafiltration. 3. Compléments selon la rexendication 2 caractérisés en ce qu'il s'agit de fractions de lactosérum thermisées. t. Compléments selon l'une quelconque des revendication 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils sont utilisés pour la culture d'hvbridomes, de fibroblastes et de cellules support-dépendantes. 5. Compléments selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont utilisés pour la conservation de cultures cellulaires.