Brevet FR2640145A1 — publié le 19900615

La présente invention se rapporte au traitement de maladies virales, et en particulier à celle du SIDA (syndrome immunodéficitaire acquis). Le SIDA est provoqué par un rétrovirus qui est trans- mis principalement par le sang et des composants du sang. Aux Etats-Unis par exemple, la maladie se manifeste de pré- Férence dans-:certains groupes: homosexuels, Haïtiens, rece- veurs de transfusions sanguines et drogués par voie intravei- neuse. Les épidémiologistes pensent maintenant que la maladie est plus infectante et plus répandue qu'oo ne le croyait jusqu'ici. Les patients, immunopositifs au regard du virus du SIDA, désigné ci-après par HIV (Virus d'immunodéficience humaine) ne présentent pas tous de symptômes. En effet, bien souvent le virus n'est pas décelé chez des patients qui sont immunopositifs vis-à-vis de l'HIV. C'est pourquoi le clini- cien a besoin d'un moyen permettant une détermination rapide des risques d'un patient qui se révèle immunopositif au regard de l'HIV.- Le virus u SIDA a été identifié et largement caractéri- sé. La publication "Science", Volume 224, (1984), comporte qua- tre articles sur l'identification d'un produit d'isolation de l'HIV, identifié ici comme HTLV-III. Le génome viral a été complètement établi. Une représen- tation développée figure -dans la publication "Nature", 313; 277-284 (1985). L'HIV est un rétrovirus, c'est-à-dire un virus qui utilise l'ARN au lieu de l'ADN comme matériel génétique, et qui doit produire un équivalent ADN du gène ARN pour sa répli- cation. En raison de ce mode de réplication inhabituel, le virus doit coder pour une enzyme qui est la transcriptase in- verse. La transcriptase inverse est une enzyme qui transcrit le code génétique de l'ARN viral dans l'ADN viral, à l'in- térieur de l'hôte cellulaire. Cela constitue un stade néces- saire au cours du cycle de réplication du virus. La transcriptase inverse pour l'HILV-III/LAV est décri- te dans "Science",Vol. 231, page 1289 (1986). La publication "Virology", Vol. 147, pages 326-335 (1985), caractérise la transcriptase inverse et décrit les conditions optimales pour la déceler. La transcriptase inverse pour l'HIV provoque habituel- lement une forte réponse immune chez les humains en bonne santé. On a maintenant découvert qu'il était possible d'effectuer une détermination des risques concernant l'évolution future de la maladie chez un patient donné, connu pour être immunoposi- tif au regard de l'HIV, grâce à la détection d'anticorps qui inhibent l'action de la transcriptase inverse. Lorsque ces anticorps inhibant la transcriptase inverse sont présents, la détermination est bonne. Cependant, lorsque l'individu ne possède pas d'anticorps pour la transcriptase inverse, la détermination est sombre. Un tel individu peut présenter la gamme entière de symptômes relatifs au SIDA, qui peuvent con- duire à la mort de l'individu. La présente invention se rapporte à un ensemble pour le traitement d'une affection par le virus, de l'immunodéfi- cience humaine (HIV) caractérisé par le fait-qu'il comporte une formulation pharmaceutiquement acceptable d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse et qui est obtenue à partir de la gamma globuline d'un patient connu pour produire des - titres élevés de cet anticorps, soit sous la forme d'un anti- corps monoclonal humain qui inhibe la, transcriptase inverse de l'HIV, l'anticorps étant destiné à être injecté à un patient immunopositif à l'égard de l'HIV. 3- Le virus qui provoque le SIDA et les symptômes cor- respondants, tel qu'entendu ici, est identifié comme le vi- rus de 1,immunodéficience humaine (HIV). L'HTLV-III et le LAV peuvent être considérés comme des produits spécifiques d'iso- lation de l'HIV. En dépit de confusion dans la nomenclature, la plupart des chercheurs sont convaincus que les virus identifiés par ces différentes désignations sont, en fait, des variantes du même virus et provoquent tous le SIDA. Tel qu'utilisé ici, le terme "SIDA" (Syndrome Immuno. déficitaire Acquis) se réfère à la maladie cliniquement définissable, définie par la présence d'infections opportunis- tes, comme sarcome de Kaposi, pneumonie pneumocystis carinii et similaires. Tel qu'utilisé ici, le terme "pré-SIDA" se rapporte à une réponse immune, fortement déprimée chez des patients positifs au regard de l'HIV, mais pas assez grave pour abou- tir à un diagnostic de SIDA. Le terme "transcriptase inverse de l'HIV", employé ici, désigne l'enzyme qui est produite par le virus naturel pour transcrire l'ARN viral en ADN. "Transcriptase inverse de il'HIV" est utilisé ici pour désigner cette enzyme, sans considération de sa source. Toute variante de transcriptase inverse de l'HIV, par exemple une transcriptase inverse similaire, pouvant avoir une ou plusieurs substitutions d'amino-acide, peut être considérée comme une transcriptase inverse de l'HIV, si le virus qui la produit est considéré comme une variante de l'HIV. Cette enzyme peut être produite *naturellement par le virus, ou artificiellement par des techniques du génie génétique, ou similaires. L'appellation "anticorps inhibant la transcriptase in- verse de l'HIV" représente ici tout anticorps de transcrip- tase inverse de l'HIV, qui arrête ou inhibe l'action enzyia- tique de la transcriptase inverse de l'HIV. Il est à remar- quer que de nombreux anticorps différents peuvent être pro- duits par la réponse immune humaine à la transcriptase in- verse de l'HIV, mais la plupart des anticorps produits n'inhi- bent pas l'action de la transcriptase inverse de l'HIV. La présente invention ne se rapporte qu'aux anticorps qui inhi- bent le mode d'action de la transcriptase inverse de l'HIV. On notera également que de nombreux anticorps spécifiques, différents, peuvent inhiber la transcriptase inverse de l'HIV. Tous ces anticorps, ainsi que toutes leurs combinaisons, font partie de la présente invention. "Immunopositif au regard de l'HIV", signifie ici qu'un patient donné présente des quantités décelables d'anticorps de l'HIV dans son sang, sans se préoccuper de savoir si on peut isoler le virus de son sang, ou s'il présente des symptômes manifestes de la maladie. Le terme "ensemble", tel qu'utilisé ici, se rapporte à un ensemble ou trousse de réactifs simplement emballés et d'utilisation facile pour déceler la présence d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV. Le nombre précis des tubes de réaction, leurs supports, et ainsi de suite, constituent des choix qui peuvent être aisément faits par l'homme de l'art. Le terme "matrice d'ARN", utilisé ici, se réfère à un polymère ARN utilisable dans l'appareil et le procédé selon s l'invention. La matrice préférée d'ARN est l'acide polyadény- lique (ci-après désigné par "poly rA". Le Poly rA amorcé, en présence de transcriptase inverse et de triphosphate-5', de thymidine (désigné ciaprès par dTTP), et en l'absence d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse de l'HIV, produit de l'acide polythymidylique (ci-après appelé "poly dT"). Dans la présente description, "matrice d'ARN amorcé" se rapporte à un long brin d'ARN comportant un brin complémen- taire court d'ADN à l'extrémité des OH-3. De manière caracté- ristique, l'ADN est long d'environ 12 à 18 bases. Un modèle d'ARN amorcé, particulièrement préféré, est l'acide polyadé- nylique/acide oligothymidylique (ci-après désigné par "poly rA. aligo dT"). Tel qu'utilisé ici, le "triphosphate de nucléoside pour la synthèse d'ADN" peut être tout triphosphate de désoxy- ribonucléosite qui aboutit à la détection de la transcriptase inverse de l'HIV. Un triphosphate de nucléosite préféré, et le seul qui opère si la matrice d'ARN est le poly rA, est le dTTP. Ce dTTP peut être radio-marqué avec du tritium ou avec toute autre substance qui détecte le produit ADN, comme l'enzyme biotine-avidine. Au cours de la détection selon la présente invention, l'absence d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse de 1'HIV peut être indiquée par la synthèse et la présence de poly dT radio-marqué. Inversement, la présence de l'anticorps peut être indiquée par l'absence de synthèse et d'existence de poly dT radio-marqué. Dans la présente description, un "témoin de sérum posi- tif" est une solution avec une quantité connue d'anticorps inhi- bant la transcriptase inverse. Un "témoin de sérum négatif" est du sérum humain nor- mal, sans anticorps de protéines dues à l'HIV. Par "fluide corporel", on entend tout fluide conte- Z0 nu dans, ou'produit par, le corps humain qui a des anticorps. Le fluide corporel préféré est le sérum sanguin. La présente invention s'avère intéressante pour traiter des patients connus pour être immunopositifs au regard de l'HIV. Le test de dépistage décrit ici permet une détermina- !5 Ltion précoce de qui présente des faibles titres d'anti- corps d'inhibition de la transcriptase inverse et peut par con- séquent développer le SIDA. Ces patients peuvent être traités par une immunothérapie passive dans laquelle le patient re- çoit des doses d'anticorps d'inhibition de la transcriptase in- O verse. Le pronostic précoce peut également permettre une in- tervention clinique précoce, dans un cas qui peut n'avoir pas évolué vers des symptômes de pré-SIDA. L'ensemble de la présente invention comprend un traitement pour une immunothérapie passive. Il comporte princi- palement une formulation pharmaceutiquement acceptable d'agent inhibant la transcriptase inverse en vue d'une injection. La matrice d'ARN amorcé convenable est normalement le poly rA/oligo dl. Le triphosphate de nucléoside approprié pour la synthèse de l'ADN est normalement du dTTP tritié. Ce triphosphate de nucléoside doit être naturellement le complé- ment du modèle de l'ARN amorcé. Lorsqu'on utilise de l'ARN naturel comme amorce, il s'agit d'un brin naturel d'ARN fait des quatre bases, et alors les quatre triphosphates de désoxyriboside sont présents. Lorsqu'on utilise le poly rA comme matrice, le précurseur doit être le dTTP. Le poly dT, complément de poly rA, est ensuite produit au cours du proces- sus de transcription inverse. Le poly rA est amorcé avec un brin court d'oligo dl ayant environ 12 à 18 nucléotides à l'extrémité OH-3 du brin d'ARN. Les triphosphates de nucléoside, la matrice amorcée et la transcriptase inverse sont dans un tampon de réaction en- zymatique. Un tampon de réaction approprié est constitué par: mM de TrisHCl, pH 7,9, 5 mM de dithiotreitol, 0,3 mM de glutation réduit, 5 mM de chlorure de magnésium, 150 mM de chlorure de potassium, 0,5 mM d'acide éthylène glycol-bis- (aminoéthyléther) N,N'-tétraacétique (ci-après EGTA), 0,05% de triton X-100, 2V d'éthylène glycol, 2,5 microgrammes de ma- trice amorce, et 20 microcuries de dTTP tritié radio-marqué. Le sérum positif témoin est un étalon ayant une concen- tration connue d'un anticorps inhibant la transcriptase in- verse. Le sérum négatif témoin est du sérum humain normal, ne présentant pas d'anticorps de HIV. Les témoins de sérum positif et de sérum négatif, sont utilisés pour former une ligne de base. La quantité d'anticorps peut être déterminée par la comparaison de la radioactivité provenant de l'incon- nu avec celles que l'on décèle à partir des deux témoins.- On met à incuber à environ 30 à 37e C, de préférence à 370C, pendant 24 à 48 heures, de préférence environ 48 heu- res, la solution de transcriptase inverse, la matrice d'ARN amorcé et le triphosphate de nucléoside. La période d'incu- bation permet la formation d'ADN à partir des triphosphates de nucléoside sur la matrice d'ARN amorcé en présence de la transcriptase inverse. La présente invention nécessite un moyen pour isoler, s'il se forme, le brin d'ADN marqué. Un procédé préféré con- siste à précipiter l'ADN. L'ADN, produit dans la forme de réali- sation préférée de l'invention, est le poly rA/poly dT. On peut faire passer la solution incubée à travers un filtre micro- poreux qui permet le passage de dTTP, mais non celui de l'ADN. Convient notamment, comme filtre microporeux, le filtre en microfibre de verre GF/A de WHATMAN. On peut ensuite analyser la radioactivité retenue par ce filtre. Une fois l'ADN isolé par tout moyen connu de l'homme de l'art, la radioactivité retenue est décelée quantitativement. La quantité de radiation décelée est alors comparée avec la quantité décelée lorsqu'on utilise, au lieu d'un échantillon de patient, les témoins positif et négatif. Dans la pratique, un échantillon de sérum du patient est essayé quant à la présence d'un anticorps inhibant la trans- criptase inverse de l'HIV, par sa mise en contact avec les réactifs de l'ensemble. Lorsque le sérum du patient renferme un anticorps inhibant la transcriptase inverse de 1'HIV, la for- mation de poly dT est inhibée ou empêchée. La quantité d'anti- corps inhibant la transcriptase inverse de 1'HIV, dans le sérum du patient, peut être mesurée par comparaison avec le témoin sérum positif qui renferme une quantité connue d'anti- corps de transcriptase inverse. Lorsque le sérum du patient ne contient pas d'anticorps inhibant la transcriptase inverse, la formation d'acide polythymidylique se fait à un taux proche de celui du témoin de sérum négatif. I1 est connu de l'homme de l'art que les anticorps de transcriptase inverse de l'HIV peuvent être décelés par de nombreuses autres méthodes connues des spécialistes. Par exem- ple, des complexes antigbne/anticorps peuvent être formés et détectés au moyen de techniques comme le test ELISA, le Western Blot, et similaires. Cependant, seules les techniques qui déterminent l'inhibition de la transcriptase inverse de HIV peuvent être utilisées pour déceler un anticorps inhibant cette enzyme. L'immunothérapie peut être divisée en deux grands types, à savoir le type actif et le type passif. Dans l'immuno- thérapie active, on expose l'individu à un immunochallenge qui provoque une réponse de la part du propre système immunitaire du patient. Si le système immunitaire du patient est grave- ment compromis, des quantités d'un anticorps obtenu par ail- leurs peuvent être injectées pour provoquer artificiellement une immunité. L'administration de l'anticorps inhibant la transcrip- tase inverse constitue une immunothérapie passive. Un patient gravement atteint bénéficiera donc de ce traitement. Le patient doit recevoir les doses de l'anticorps à des intervalles régu- liers et fréquents pouvant aller de une à huit semaines. La meilleure source habituelle d'agent inhibant la trans- criptase inverse est fournie par des personnes affectées de l'HIV qui fournissent des titres élevés d'agent inhibant la transcriptase inverse. La gamma globuline qui comporte cet agent est isolée pour ces donneurs et elle est purifiée par des procédés conventionnels. La gamma globuline peut être admi- nistrée par voie intramusculaire conventionnelle ou par voie intraveineuse en utilisant des solutions plus diluées. La voie intraveineuse est de loin préférable car elle place la gamma globuline directement dans le courant sanguin receveur o elle procure le meilleur effet. Du fait que rien n'est perdu lors de la migration intramuscilaire ou analogue, on a besoin de moins de gamma globuline valable. Il existe une technologie pour fabriquer des anticorps monoclonaux humains. En utilisant cette technique, on peut pro- duire des quantités beaucoup plus importantes d'anticorps très pur inhibant la transcriptase inverse. Le traitement peut être commencé à tout moment après le diagnostic ou la détection de la présence de l'HIV. Toutefois, de manière caractéristique, le traitement commence à l'un de trois moments identifiables. Tout d'abord, il est connu que les porteurs de l'HIV asymptomatiques présentent fréquemment des titres élevés d'an- ticorps inhibant la transcriptase inverse. Par conséquent, une approche pour maintenir asymptomatiques des patients présen- tant un faible titre d'anticorps inhibant la transcriptase in- verse consiste à commencer la thérapie dès que le patient réa- git positivement au virus. Ensuite, le premier tournant biologique majeur dans l'évolution défavorable de la maladie se produit lorsque le rapport des lymphocytes T CD 4/CD 8 commence à décroître. CD4 est le marqueur pour les cellules d'assistance T et CD8 est le marqueur pour les cellules suppresseuses T. Dans un corps humain en bonne santé, le rapport CD4/CD 8 est d'environ 2. L'HIV infecte les cellules d'assistance T et, par conséquent, pendant l'évolution de l'infection, le rapport commence à dé- croitre. Lorsque ce rapport décroît jusqu'à environ 1, le traitement est indiqué. En données chiffrées, le nombre absolu de cellules d'assistance T est habituellement établi d'environ à environ 1000 cellules/ml. Lorsque ce nombre décroît pour atteindre 100 cellules par ml ou moins, le traitement est alors indiqué. Cela constitue la dernière occasion pour commen- cer la thérapie avant que n'apparaissent les symptômes cliniques manifestes. Enfin, l'administration peut commencer lorsque cer- tains symptômes cliniques sont apparus. Il est préférable que le traitement commence dès l'apparition des premiers symptômes cliniques. Toutefois, la thérapie peut avoir un effet si elle est appliquée à tout moment pendant l'évolution de la maladie. La transcriptase inverse de l'HIV, utilisable dans l'ensemble ci-dessus, peut être fournie soit en l'isolant de cellules infectées par l'HIV, soit par des techniques du génie génétique. Un anticorps, inhibant la transcriptase inverse de l'HIV, peut être obtenu par isolation à partir d'individus con- nus pour produire cet anticorps à partir de leur sérum sanguin. Des anticorps intéressants peuvent être également produits au O moyen de techniques utilisant un anticorps monoclonal. REVÈNDICATIONS 1. Ensemble pour traiter une infection par le virus de l'immunodéficience humaine (HIV), caractérisé par le fait qu'il comporte une formulation pharmaceutiquement acceptable d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse isolé de la gamma globuline d'un patient connu pour produire des titres élevés de cet anticorps en vue d'une injection à un patient immunopositif à l'égard de 1'HIV. 2. Ensemble pour le traitement d'une infection par le vi- rus de l'immunodéficience humaine (HIV), caractérisé par le fait qu'il comporte une formulation pharmaceutiquement accepta- ble d'un anticorps inhibant la transcriptase inverse produit comme anticorps monoclonal humain qui inhibe la transcriptase inverse de l'HIV en vue d'une injection à un patient immunopo- sitif à l'égard de i'HIV. 3. Ensemble selon l'une des revendications I et 2, caractérisé par le fait que la formulation est destinée à être administrée par voie intramusculaire. 4. Ensemble selon l'une des revendications I et 2, caractérisé par le fait que la formulation est destinée à être administrée par voie intraveineuse. 5. Ensemble selon la revendication 4, caractérisé par le fait qué la formulation est dans une solution saline physio- logique