Brevet FR2639714A1 — publié le 19900601

PROCEDE DE COLORATION DIFFERENTIELLE DES CELLULES DE LA PEAU ET DE LEURS NOYAUX. La présente invention concerne un procédé de coloration différentielle des cellules de la peau et de leurs noyaux, particulièrement avantageux lorsque la cellule est fixée sur un support adhésif. Il est connu d'utiliser pour le prélèvement de cellules, en particulier pour le prélèvement de cellules de la peau, des supports adhésifs. De nom- breux supports adhésifs sont commercialisés. On peut par exemple citer ceux vendus sous les dénominations commerciales "D'SQUAME" par la Société CUTECH,"TESA FILM" par la Société BEIERSDORF et "SCOTCH" par la Société 3 M. Ces supports adhésifs sont généralement sous forme de rubans ou de bandes, transparents ou translucides. Si on désire observer les cellules prélevées sur ces supports, il est nécessaire de procéder à une coloration desdites cellules; cette coloration doit être différente de celle des noyaux, si l'on veut dis- tinguer les noyaux dans les cellules, soit que leur couleur soit différente, soit que l'intensité de la coloration soit différente. Le problème est alors de trouver un procédé de coloration différentielle des cellules et des noyaux qui n'interfère pas avec le support, soit en le détruisant, soit en le colorant. Des essais ont été faits avec de nombreux colorants acceptables pour la coloration cellulaire ou nucléaire tels que ceux cités, par exemple, dans "His- tochimie normale et pathologique" par GANTER et GILLES, 1969, GAUTHIER VILLARDS éditeurs, et il n'a jamais été possible de mettre en évidence les noyaux car les colorants interfèrent avec le support adhésif. Selon la présente invention on a trouvé un procédé de coloration différentielle de la cellule et du noyau qui n'interfère pas avec le support adhésif et ne le 263 9 7 1 4 colore pas. La présente invention concerne un procédé de coloration différentielle de cellules de la peau et de leurs noyaux, les cellules étant fixées sur un support adhésif transparent ou translucide, caractérisé par le fait que l'on immerge successivement le support adhésif portant les cellules dans deux bains: - en premier lieu, un bain A contenant en poids: - 0,1 à 10 % d'au moins un colorant répondant à la formule générale I: o O N o 03. 03S NHéor o X@ et Y$ sont des cations d'origine minérale ou organique, de préférence sodium, - 10 à 80 % d'au moins un alcool miscible à l'eau, à 95 % d'eau, le bain ayant été amené à un pH basique compris entre 7, 5 et 13,5 par addition d'une base minérale ou organique, par exemple de la soude ou de ia potasse, - en second lieu, un bain B contenant en poids: - 0,01 à 10 % d'au moins un colorant de for- mule I définie ci-dessus ou encore de bleu de méthylene, - 0,2 à 10 %d'au moins un colorant de tor- mule I1: CH3-CH2 CH22CH3 C H CH/ N\ H HZ CH3!! 2 N j5j(" CI12-Cf43 z o Z est un anion minéral ou organique, R est l'hydrogène ou un cation minéral ou organique, - 5 à 40 % d'un solvant miscible à l'eau, - 5 à 50 X d'eau, le bain ayant été amené à un pH acide compris entre 2 et 6,5. On obtient ainsi, après coloration, un sup- port adhésif intact qui n'a pas été coloré et o les cellules sont colorées en rose mauve pale, les noyaux ayant sensiblement la meme teinte plus foncée. Selon l'invention, l'utilisation successive dans l'ordre des deux bains est nécessaire. En effet l'utilisation des deux bains dans un ordre différent, c'est-a-dire le bain B puis le bain A, ou l'utilisation d'un seul bain A ou B aboutit, soit à une absence de coloration cellulaire, soit a une absence de révélation des noyaux. Dans le bain A et/ou B le colorant de for- mule I utilisé est, de préférence, le bleu de méthyle correspondant à la tormule I dans laquelle t et Y sont Na. Dans le bain A, l'alcool miscible à l'eau est avantageusement de l'éthanol, de l'isopropanol ou du méthanol, ce dernier étant préféré. Le pH basique du bain A est obtenu par addi- tion de soude ou de potasse en quantité telle que le pH final soit compris entre 7,5 et 13,5. Par exemple dans le cas d'un bain contenant 1 % de bleu de méthyle une concentration finale à 0,3 N de soude ou oe potasse donne d'excellents résultats. Dans le bain B, le colorant de formule il utilise est, de préférence, la rhodamine B, corresponoant à la formule 11 dans laquelle Z est C1- et R est H. Dans le bain B, le solvant miscible à l'eau peut etre, en particulier, un alcool miscible à l'eau ou un mélange d'alcools miscibles à l'eau, de préférence, un mélange de methanol et d'éethanol en proportions quelconques. La durée d'immersion du support achésif dans le bain A est, de préférence, de 5 à 20 minutes, avan- tageusement voisine de 10 minutes. De même, la durée d'immersion dans le bain B est, de préférence, de 10 secondes à 10 minutes, avantageusement voisine de 2 minutes. Apres chaque bain le support adhésif est, de préférence, brièvement rince à l'eau. Cette eau peut être de l'eau du robinet ou de l'eau distillée. Le support est ensuite séche par tout moyen convenable, tel que sèche-cheveux ou étuve. Une fois séché, le support n'est pas abImÉ et peut encore être collé par son propre adhésif sur tout matériau apte à l'examen microscopique, connu de l'homme de l'art. Selon une variante préférée de l'invention, les bains A et B peuvent contenir de 0,01 à 1 % d'anti-oxydant tel que par exemple le butyl hydroxy toluène ou le butyl hydroxy anisole etc... Le procédé de coloration selon l'invention peut, plus particulièrement, être utilisé dans un procédé de diagnostic des états inflammatoires de la peau. En effet, il est connu que, dans le cas des peaux à l'état normal, donc non pathologique, les cel- lules cutanées de surface ou cornéocytes, sont des cellules totalement kératinisées qui sont dépourvues de noyau. Dans le cas o il y a inflammation de la peau, quelle qu'en soit la cause, l'accélération du renouvellement cellulaire épidermique a pour conséquence de délivrer à la surface de l'épiderme des cellules immatures qui possèdent encore un noyau. Le pourcentage de cellules nucléées, dites également parakératotiques, à la surface de la peau est donc un excellent indice de la sévérité de l'état inflamma- toire. Par exemple un pourcentage de cellules nucléées de: - moins de 10 %, indique une inflammation légère, - de 10 à 30 %, indique une inflammation modérée, - de 30 à 60 %, indique une inflammation importante et - de plus de 60 %, indique une inflammation sévère. Par conséquent, pour effectuer le diagnostic on prélève par "stripping" à l'aide d'un support adhésif les cellules cutanées de surface, et on effectue une coloration différentielle des cellules et des noyaux par le procédé de coloration selon la présente invention. On effectue ensuite l'analyse de l'image obtenue soit directement au microscope, soit par photographie et on détermine par comptage le pour- centage des cellules nucléées. On obtient ainsi une gradation quantitative de la sévérité de l'inflammation cutanée. Le diagnostic utilisant le procédé de coloration différentielle selon la présente invention est simple, rapide et non traumatisant pour le patient. Une telle mesure est notamment intéressante pour déterminer les érythèmes sur peau noire et dans les cas o l'inflammation est à l'état latent (pellicules du cuir chevelu). Un tel diagnostic permet de suivre de façon simple l'efficacité des traitements, notamment pour le psoriasis, les eczémas, les mycoses, l'acné, la dermatite séborrhéique, les pellicules, l'allergie de contact, ou l'érythème solaire, à l'aide d'agents anti-inflammatoires (par exemple, l'hydrocortisone et ses esters, la cortisone, la triamcinolone et ses dérivés, l'indométhacine, l'acide glycérrhétinique, l'aspirine, la dexaméthasone, la beta méthasone, la fluocinolone, la fluorométholone, le piroxicam, le diclofenac, le sulindac, l'acide niflumique, l'acide méfénamique, l'ibuprofène, le naproxène, le kétoprofène, la phénylbutazone, l'oxyphenbutazone et leurs dérivés). EXEMPLE On prélève à l'état d'un ruban adhésif, com- mercialisé sous la marque "SCOTCH" par la Société 3M, des cellules cutanées sur la joue d'un patient atteint de dermatite séborrhéique. Après prélèvement, on trempe le ruban adhésif successivement: - pendant 10 minutes, dans un bain A à pH 7,8 contenant, en % en poids: - eau 70 %, méthanol 29 %, - bleu de méthyle 1%, - pendant 2 minutes, dans un bain B à pH 5,8 contenant, en % en poids: - méthanol 30 %, - éthanol 10 %, - bleu de méthyle 0,25 %, - rhodamine B 2,5 X, - eau q.s.p. 100 %. Apres les bains A et B, le ruban adhésif est rincé à l'eau distillée puis séché à l'aide d'un sèche-cheveux pendant 3 minutes. On prend alors une photographie au micro- scope sur une zone du support adhésif ainsi préparé. On obtient une photographie dans laquelle les cellules sont colorées en rose mauve et les noyaux apparaissent dans la même teinte plus sombre. Par comptage, on établit que 80 à 90 X des cellules cutanées sont nucléées. REVENDICATIONS 1 - Procédé de coloration ditteérentielle ce cellules de la peau et de leurs noyaux, les cellules étant flxees sur un support adhésif transparent ou translucide, caractérise par le tait que l'on immerge successivement le support adhésif portant les cellules dans deux bains: - en premier lieu, un bain A contenant en poids: - 0, 10 % d'au moins un colorant de for- mule générale NH. SO3- X 03s Q3H NH $O3-X+ o X+ et Y+ sont des cations d'origine minérale ou organique, de préference sodium, - 10 à 80 X d'au moins un alcool miscible a l'eau, à 95 % d'eau, le bain ayant été amené a un pH basique compris entre 7, 5 et 13,5 par addition d'une base minéraie ou organique, - en second lieu, un bain B contenant en poids: - 0,01 a 10 % d'au moins un colorant de tor- mule I définie cl-dessus ou encore de bleu ce méthylène, - 0,2 à 10 X d'au moins un colorant de tor- mule li: 9, CH3-CH2 CH2C3 N N /CH2-CH3 X N 5 s e r CH2.CH3 Z- CH3-CH2 (I) 3 OR L_ o Z- est un anion minérai ou organique, R est l'hydrogène ou un cation minéral ou organique, - 5 a 42 % d'un solvant miscible a l'eau, - 5 à 50 S d'eau, le bain ayant été amene a un pi acide compris entre 2 et 6,5. 2 - Procédé de coloration selon la revendi- cation 1, caractérisé par le tait que le coiorant oe tormule I utilisé dans les bains A et/ou B correspono à la formule I dans laquelle X+ et Y+sont Nag. 3 - Procédé de coloration selon les revenoi- cations i ou 2, caractérise par le tait que, dans le oain A, l'alcool misclble a l'eau est de l'ethanol, de l'isopropanol ou du méthanoi. 4 - Procédé de coloration selon l'une des revendications i à 3, caractérisé par le fait que le colorant de formule Il utilisé dans le bain B correspond a la formule Il dans laquelle Z est Cl et R est H. 5 - Procécé de coloration selon l'une des revendications 1 à 4, caractérise par le tait que dans le bain B le solvant miscible à l'eau est un alcool miscible a l'eau ou un mélange d'alcools miscibies a l'eau, de préférence un mélange de méthanol ou 18 d'éthanol. 6 - Procedé de coloration selon l'une des revendications i à 5, caractérisé par le fait que la durée d'immersion cans le bain A est de 5 a 20 minutes, de préférence voisine de 10 minutes. 7 - Proceédé de coloration selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la durée d'immersion dans le bain B est de 10 secondes à minutes, de préférence voisine de 2 minutes. 8 - Procédé de coloration selon l'une des revendications I a 7, caractérisé par le fait qu'après chaque bain le support adhésif est rincé à l'eau puis séché. 9 - Procéde de coloration selon l'une des revendications 1 à 8 pour l'utilisation dans le diagnostic oes états inflammatoires de la peau.