Brevet FR2642762A1 — publié le 19900810

JANTHINOMYCINE La culture d'une souche du micro-organisme Janthinobacterium lividum qui a été déposée dans la American Type Culture Collection sous la référence A.T.C.C. N 53 857 fournit une nouvelle famille d'antibiotiques ci- après désignés par les noms chimiques ordinaires "janthino- mycine A, B, et C". Les janthinomycines A,B et C sont acti- ves contre des bactéries gram-positives et gram-négatives * et des bactéries anaérobies. On a analysé la janthinomycine et on a trouvé qu'elle avait la structure chimique géné- rale suivante: i. 1-il e-6HLL-Thr-L-Ser-HL-&Abu-D-Se r-X-D-Orn-L-?he] dans laquelle &-Abu est l'acide déhydro-o- aminobutyrique; H est la D-érythro-p-hydroxyleucine; et en outre dans laquelle X est le (-hydroxy- tryptophane pour la janthinomycine A; X est le -cétotryptophane pour la janthino- mycine B;- X est le déhydrotryptophane pour la janthino- mycine C. En solution, le reste -cétotryptophane de la janthinomycine B existe sous la forme d'un mélange d'iso- mères géométriques, c'est-à-dire les énols E et Z du P-céto- tryptophane, ci-après les janthinomycines B1 et B2. Ces deux isomères sont séparables par chromatographie, mais se trans- forment lentement l'un en l'autre en donnant un mélange dont l'équilibre dépend du pH et du solvant. Les deux isomères sont appelés dans le texte janthinomycine B1 et janthino- mycine B2 La figure 1 représente le spectre ultraviolet de la janthinomycine A dans l'eau et dans HCI O,01M et NaOH 0,01M. La figure 2 représente le spectre infrarouge de la janthinomvcine A dans le bromure de potassium. La figure 3 représente le spectre RMN du car- bone 13 à 67,5 MHz de la janthinomycine A dans un mélange 1:4 d'acétonitrile deutéré et d'eau deutérée. La figure 4 représente le spectre RMN des pro- tons à 400 MHz de la janthinomycine A dans un mélange 4:1 d'acétonitrile deutéré et d'eau deutérée. La figure 5 représente le spectre ultraviolet de la janthinomycine B dans l'eau. La figure 6 représente le spectre infrarouge de la janthincmycine B dans le bromure de potassium. La figure 7 représente le spectre RMN du car- bone 13 à 67,5 MHz de la janthinoyzine B (B 1:B2 environ 3:1) dans un mélance:4 dcacétonitrile deutéré et d'eau deu- t6re. La f.gure 8 représente le spectre RMN des pro- tons à 400 Mhz de la janthinomrnycine B (B2:B 4:1 environ) 2 1 dans un mélange 1:1 d acetonitrie deutéré et d'eau deu- térée (pH 7,1 avec Cu N2a P04. a figure 9 représente le spectre RMN des protons à 400 MHz de la janthinomycine B (B2:B1 1:4 environ) dans un mélange 4:1 d'acâtonitrile deutaré et d'eau deutérée. La figure 10 représente le spectre ultraviolet de la janthinomycine C dans l'eau. La figure 11 représente le spectre infrarouge de la janthinomycine C dans le bromure de potassium. La figure 12 représente le spectre RMN du carbone 13 à 67,5 MHz de la janthinomycine C dans un mélange 4:1 d'acétonitrile deutéré et d'eau deutérée. La figure t3 représente le spectre RMN des protons à 400 MHz de la janthinomycine C dans un mélange 4:1 d'acétonitrile deutêré et d'eau deutérée. Le micro-organisme Le micro-organisme utilisé pour la production des janthinomycines A, B et C est une souche de Janthino- bacterium lividum isolée-d'eau stagnante recueillie dans le Tyler State Park, Newtown, Pennsylvanie, Etats-Unis d'Amérique. Une sous-culture de cet organisme peut être obtenue de l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique. Son numéro d'accès dans cette collection est A.T.C.C. N 53 857. Il faut bien comprendre que l'on peut également cultiver, pour obtenir le produit, outre le micro-organisme spécifique qui est décrit et caractérisé ici, des mutants de ce micro-organisme obtenus à l'aide de mutagènes chimiques ou physiques. On peut isoler la culture de Janthinobacterium lividum de l'échantillon d'eau stagnante en préparant une dilution convenable dans un milieu ainsi composé: Grammes NaCl 8,5 2' KH2PO 0,3 2 4 Na2HPO4 0,6 Gélatine 0,1 avec une quantité suffisante d'eau distillée pour faire 1 litre. On a déposé 0,1 ml de cette substance sur des plaques de gélose contenant: Mesure Peptone 1 g K2HPO4 0,2 g Glucose 1 g Cristal Violet (colorant) à1l% 0,1 ml Extrait de terre 1 litre Gélose 15 g On ajuste le pH à 6,8 et on passe le mélange à l'autoclave à 121 C pendant 15 minutes. On ajoute ensuite à 1 litre de mélange 10 ml d'une solution de cycloheximide à 1 % (poids/volume). On prépare l'extrqit de terre de la façon suivante. On fait bouillir 1000 ml de terre dans 2 litres d'eau pendant une heure. On sépare les solides par filtration sur de l'étamine, puis on centrifuge la solution pendant 20 minutes à 28 000 t/min. Cn filtre ensuite le surnageant sur du papier Whatman et on passe à l'autoclave pendant 30 minutes à 1210C. L'organisme est une bactérie gram-négative mobile qui est en forme de bâtonnet avec des flagelles sous- polaires à latéraux. Les colonies élevées sur de la gélose nutritive sont gélatineuses et de couleur violet foncé à noir. La matière gélatineuse est un polysaccharide extra- cellulaire; le pigment produit est la violacéine. Le glu- cose est utilisé de manière oxydante. De l'acide est produit à partir de tréhalose mais pas à partir de i-arabinose ou de d-xylose. L'organisme est négatif à l 'arginine dihydro- lase, a la production d'acide cvannydrique et à l'hydro- lyse de l'esculine. La bactérie est identifiée comme une souche aberrante de Canthinobacterium livi.,.m. L'Antibiotique Jantninomycine On peut oltenir l'antibiotique 4anthinomycine en cultivant JanthinzDacterium lividum. A.T.C.C. N 53 857 à une température égale ou proche de 25 C dans des condi- tions aérobies immergées dans un milieu nutritif aqueux con- tenant des sources assimilables d'hydrates de carbone et d'azote. On poursuit la fermentation jusqu'à ce qu'une activité notable soit conférée au milieu, soit habituelle- ment 24 à 28 heures. Après la fermentation. on ajoute à l'ensemble du bouillon du sulfate d'ammonium solide- 25 % en poids/ volume), on centrifuge le bouillon et on extrait la bou- lette résultante avec du méthanol. On centrifuge le mélange de méthanol et de boulette et on rend l'extrait méthanoli- que résultant aqueux à 10 % environ en lui ajoutant de l'eau, puis on l'extrait avec du tétrachlorure de carbone. On sépare les couches et on isole l'extrait méthanolique. 2642762 - On ajoute l'extrait méthanolique à du gel CHP2GP (MCI) dans de l'eau et on agite le mélange pendant une heure. On recueille la résine chargée par filtration sous vide et on la lave avec du méthanol, de l'eau et de l'acétcnitrile. On garnit ensuite une colonne avec la résine chargée et on élue les antibiotiques avec de l'acétonitrile, de l'eau et de l'acide formique. On réa- lise une purification plus poussée par chromatographie sur Sephadex LH-20 dans de l'acétonitrile et de l'eau. On effec- tue une résolution partielle des trois antibiotiques, les janthinomycines A, B et C, par chromatographie sur CHP20P, en éluant avec un gradient d'acétonitrile-eau-acide for- mique. On réalise une séparation et une purification finales des janthinomycines B et C par chromatographie sur CHP20P, en é1uant avec un gradient d'acétonitrile et de tampon aqueux de dihydrogène phosphate d'ammonium, puis en des- salant sur CHP20P, en éluant avec de l'acétonitrile, de 1 'eau et de l'acide formique pour -obtenir les antibiotiques purs sous la forme de poudres blanchâtres. La quantité de janthiinomycine C dans les fermentations est variable, et sa.Drsence peut être un résultat des conditions d'isole- ment ia janthinomycine A est transformée en janthinomycine C en -ilieu acide). Quand il y a de la janthinomycine C, elle est éluée en même temps que la janthinomycine B dans chacune des chromatographies initiales. Le spectre ultraviolet de la janthinomycine A est donné sur la figure 1 et montre: Xmax (E1%l cm) 337(8), 287(30), 276(36), 204 nm (270). Le spectre infrarouge de la janthinomycine A dans le bromure de potassium est repré- senté sur la figure 2. Les pics suivants sont évidents: 3342, 2962, 1743, 1-659, 1602, 1525, 1383 et 1126 cm1. Le spectre de masse FAB de la janthinomycine A dans le dithio- thréiîtol-dithioérythritol-diméthylsulfoxyde-glyécérol, avec addition d'iodure de sodium, montre les ions suivants: (M+Na; 1215, (M+H)+ 1193 (faible), (M+H-H20) 1175, (M+I) 1319. Sans addition d'iodure de sodium, on ne voit _ue les ions (MlH-H20) 1i75, et (M-H-H20).. Le spectre RMN de C à - 67,5 MHz de la janthinomycine A dans un mélange 1:4 d'acéto- nitrile deutéré et d'eau deutérée est représenté sur la figure 3. Le spectre RMN de 1H à 400 MHz de la janthino- mycine A dans un mélange 4:1 d'acétonitrile deutéré et d'eau deutérée est représenté sur la figure 4. La chromato- graphie en couche mince de la janthinomycine A, sur un gel de silice 60 de Merck en utilisant un mélange 7:3:5 de chloroforme, de méthanol et d'éthanoi aqueux à 70 %, donne une valeur Rf de 0,38. La chromatographie liquide à haute performance de la janthinomycine A dans une colonne Hamilton PRP-1 (150 x 4.,1 mm), en éluant avec le tampon A à 1 ml/mr, et en contrôlant l'absorbance à 220 nm. donne un temps de rétention de 3,90 minutes. Le tampon A est un mélange 33:67 de CH3CN et d'eau, à 1% dans du NH4H2PO4 ajusté à pH 3,6 avec du H P4O à 85 %. Le spectre ultraviolet de la janthinomycine Best donné sur la figure 5 et montre: Xmax(E1% cm' 312(82), 250(sh), 242(120), 204 nm (350). Le spectre infrarouge de la janthinomycine B dans le bromure de potassium est représenté sur la figure 6. Les pics suivants sont évidents: 3322, 3066, 2967, 1742, 1655, 1522, 1384, 1116 cm1. Le spectre de masse FAB de la janthinomycine B dans le dithiothréitol- dithioérythritol-diméthylsulfoxyde-glycérol, avec addition d'iodure de sodium, montre les ions suivants: (M+Na) +1213, (M+H)+ 1191, (M-I) 1317. Sans addition d'iodure de sodium, on ne voit que les ions (M+H)+ 1191 et (M-H)- 1189. Le spectre de masse FAB à haute résolution révèle un (M+H) de 1191,6142 en accord avec la formule moléculaire C57H83N12016 (1191, 6050). Le spectre RMN de 1'C à 67,5 MHz 057H8 3 1 2 1 6 de la janthinomycine B dans un mélange 1:4 d'acétonitrile deutéré et d'eau deutérée est représenté sur la figure 7. Le rapport entre les janthinomycines B1 et B2 dans cet échan- tiZlcn est de 3:1 environ. Le spectre RMN de H à 400 MHz de la janthinomycine B (B2:B1 4:1 environ) dans un mélange 1:1 d'acétonitrile deutéré et d'eau deutérée (pH 7,1 avec du Na2DP04) est représenté sur la figure 8. Le spectre RMN de 1H à 400 MHz de la janthinomycine B (B2:B. 1:4 environ) dans un mélange 4:1 d'acétonitrile deutéré et d'eau deuté- rée est représenté sur la figure 9. La chromatographie en couche mince de la janthinomycine B sur du gel de silice de Merck, en utilisant un mélange 7:3:5 de chloro- forme, de méthanol et d'éthanol aqueux à 70 %, donne une valeur Rf de 0, 35 pour la janthinomycine B2 et de 0,39 pour la janthinomycine B1. La chromatographie liquide à haute performance de la janthinomycine B dans une colonne Hamilton PRP-1 (15 x 4,1 mm), en éluant avec le tampon A à 1 ml/mn, et en contrôlant labsorbance à 220 nm, donne un temps de rétention de 1,74 mn pour B1 et de 2,76 mn pour B2. Le spectre ultraviolet de la janthinomycine C est donné sur la figure 10 et montre: >max(E 1%1 cm) 339(100), 220(250'. 195 nm(400). Le spectre infrarouge de la janthinomycine C dans le bromure de potassium est repré- senté sur la figure 11. Les pics suivants sont évidents: 3342, 3066, 2968. 1744, 1654, 1602. 1526, 1384, cm-1. Le spectre de masse FAB de la janthinomycine C dans le dithio- thréitol-dithioéryithritol-diméthylsulfoxyde-glycérol révèle les ions suivants: (M+H)+ 1175, (rM-H) 1173, et le spectre de masse FAB à haute résolution révèle un (M+H)+ de 1175,6205 en accord avec la formule moléculaire C57H83N12015 (1171.6101). Le spectre RMN de 13C à 67,5 MHz de la janthinomycine C dans un mélange 4:1 d'acétonitrile deutéré et d'eau deutérée est représenté sur la figure 12. Le spectre RMN de 1H à 400 MHz de la janthinomycine C dans un mélange 4:1 d'acétonitrile deutéré et d'eau deutérée est représenté sur la figure 13. La chromatographie en couche mince de la janthinomycine C sur du gel de silice 60 de Merck, en utilisant un mélange 7:3:5 de chloroforme, de mn- thbaoi et d'éthanol agueux à 70 %, donne une valeur Rf de 0,37. (La janthinomycine C n'est pas séparée de B1 lorsque les deux sont présentes). La chromatographie liquide à haute performance de la janthinomycine C dans une colonne Hamilton PRP-1 (150 x 4,1 mm), en éluant avec le tampon A à 1 ml/mn et en contrôlant P!absorbance à 220 nm, donne un temps de rétention de 2,06 mn. Les composés de formule I, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables, peuvent être utilisés comme ager:s pour combattre les infections bactériennes (en par- ticu'ier les infections gram-positives) chez les mammifères tels que les animaux domestiques (par exemple chiens, chats, vaches, chevaux, etc.) et chez l'homme. On peut les admi- nistrer à l'aide de modes d'administration qui ont été uti- lisés dans le passé pour faire atteindre le lieu de l'in- fect4on par les pénicillines et les céphalosporines. Ces modes d'administration comprennent l'injection intra- veineuse et intramusculaire et sous forme de suppositoires. La Dosologie de l'antibiotique de formule I utilisé variera naturellement avec l'antibiotique particulier, la tailVe de l'hôte et la gravité de l'infection. Pour un adute humain, des doses quotidiennes d'environ 250 mg à env Scn 2 g peuvent être données à titre d'exemple. Des rerseignements complémentaires sur la puissance des ccr:o- ses ce e.te invention sont donnés ci-dessous, sous le ti - 'Activité biologique". Les exemples suivants exposent plus en détai, la préparation et l'utilité de la janthinomycine. Exemple 1 On a maintenu Janthinobacterium lividum sur le m'ieu stérilisé suivant (A) : Grammes Extrait de levure 5,0 Glucose 5,0 MgSO4.7H20 0,1 FeSO4.7H20 0,1 4 2 Filtrat d'extrait de terre 200 ml Gélose 17,5 Eau du robinet 800 ml On a stérilisé le milieu à 121 C pendant minutes. *Filtrat d'extrait de terre - 1 volume de terre + 2 volumes d'eau extraits à 100 C pendant 1 heure et filtrés. On a utilisé une "loupe" de croissance super- ficielle provenant d'une culture inclinée de gélose (milieu A) de Janthinobacterium lividum pour inoculer chacun de trois erlenmeyer de 500 ml contenant chacun 100 ml du milieu stérilisé suivant (B): Grammes Extrait de levure 5,0 Gl ucose 5,0 MgSO4.7H20 O 0,1 FeS04. 7H20 0,1 Eau du robinet, quantité suffisante pour faire 1litre On a stérilisé le milieu à 121 C pendant 15 minutes. Après l'inoculaton, on a fait incuber les erlenmeyer à 25%C sur un secoueur rotatif (300 t/mn; course de 5,1 cm) pendant environ 96 heures avec un pH de bouillon résultant de 8,0 à 8.5. Après l'incubation appro- priée, comme décrit ci-dessus. on a procédé à des trans- ferts de 2 % (volume/volume des erlenmeyers de culture à 200 erlenmeyers de 500 m' contenant chacun 100 ml de milieu stérilisé (B) comme décrit ci-dessus. Après l'ino- culation, on a fait de nouveau incuber les erlenmeyers à C sur un secoueur rotatif (comme décrit précédemment) pendant environ 24 à 28 heures, avec un pH de bouillon résultant de 7,1 à 7,5. Au bouillon rassemblé on a ajouté environ 19 à 20 litres de sulfate d'ammonium (5 kg, 25 % en poids/volume) et on a agité le mélange pendant 1 heure. On a ensuite centrifugé le mélange de bouillon et de sulfate d'ammonium et on a jeté le surnageant. On a extrait la bou- lette (800 à 900 g) avec du méthanol (2,5 litres, 1,5 heure) et on à nouveau centrifugé le mélange. On a rendu le sur- nageant méthanoli que aqueux aà environ 10 % en lui ajoutdnt 0,2 litre d'eau, puis on l'a extrait avec 0,8 litre de tétra- chlorure de carbone. On a séparé les couches, et on a ajouté la couche supérieure à 0,6 litre d'eau et C-.6 litre de CHP20P. On a agité le mélange résultant pendant 1 heure et on a recueilli la résine par filtration sous vide. On a lavé la résine chargée (dans l'entonnoir) avec 2 litres de méthanol, 1 litre d'eau et 2 litres de cyanure de méthyle. On a ensuite garni de la résine chargée une colonne de 5 x 50 cm. et on a élué les composants actifs sous la forme d'une bande violette (60 ml) au front acide avec un mélange 70:30:1 de CH3CNH20- et HCO 2H. On a repris ces fractions à siccité sous vide (109,2 mg). On a chromato- graphié cette substance, comprenant un mélangé de janthino- mycines A et B. ainsi que d'autres impuretés, dans une colonne de 2,5 x 22 cm de Sephadex LH-20 dans un mélange 8:2 de CH3CN et eau. Les composants actifs éluaient 3. ensemble entre IC5 et 180 ml. On a concentré l'effluent actif sous vide ouï obtenir 53,5 mg de substance. On a effectué une rés "ion partielle des janthinomycines A et B par chromatcgra;nie sur CHP20P (1,5 x 34 cm, 2 ml/mn), en éeuant avec un - radient linéaire préparé à partir de CH3CN-H20-H^0n" 2:80:0 et 60:40:1 (220 g de chaçue). On a J2 2 rassemblé s e-p-êent, les fractions contenant une majorité de janthino'yzire B (éluant entre 138 et 152 ml) ou de janthinomyzine A (éluant entre 166 et 192 ml) et on les a concentrées à siccité sous vide pour obtenir 5,5 mg de janthinomycine B brute et 22,8 mg de janthinomycine A brute. Exemple 2 On a réalsé une purification finale de la jan- thinomycine A brute. (84,8 mg), obtenue à partir de 60 1 de bouillon comme décrit dans l'Exemple 1, par répétition de la chromatographie sur CHP20P (1,5 x 36 cm, 2 ml/mn) avec un gradient linéaire de CH3CN-H20- HCO2H, 20:80:0 à 60:40:1 (225 g de chaque). La janthinomycine A éluait entre 124 et 148 ml, et on l'a délicatement séparée d'une petite quantité de janthinomycine B, ainsi que d'une impureté jaune. On a repris les fractions actives à siccité sous vide, on a disscus le résidu dans 0,5 ml d'eau, et on a ajouté du cyanure de méthyle jusqu'à ce qu'il se forme un précipité. Une fois encore, on a chassé le solvant sous vide pour obtenir 58,5 mg de janthinomycine A sous la forme d'une poudre blanchâtre. Exemple 3 On a réuni la janthinomycine B partiellement purifiée (5,5 mg) obtenue par chromatographie sur CHP20P (décrite dans l'Exemple 1), avec une substance comparable (101,1 mg) provenant de fermentations antérieures. On a réalisé une purification finale par répétition de la chroma- tographie sur CHP20P (2,5 x 35 cm) avec un gradient liné- aire préparé à partir de CH3CN-H20-HCO 2H 20:80:0 et 60:40:1 (640 g de chaque). La janthinomycine B éluait entre 250 et 376 ml. On a réuni les fractions actives et on les a concentrées à siccité sous vide. On a obtenu la janthinomycine B sous la forme d'une poudre blanchâtre en dissolvant le résidu séché dans une quantité minimale d'eau, en ajoutant du cyanure de méthyle jusqu'à ce qu'il se forme un précipité et en concentrant l'échantillon à siccité sous vide (86,1 mg). Exemple 4 On a mis en suspension l'antibiotique brut obtenu à partir de plusieurs fermentations de 20 1 comme décrit dans l'Exemple I1, qui contenait à la fois de la janthinomyci'ne B (un mélange de B1 et B2) et de la janthino- mycine C (125,1 mg) dans un tampon préparé en ajoutant 3,3 ml de cyanure de méthyle à une solution de'6,7 ml d'eau et de 0,1 g de (NH4)2HPO4 ajustée à pH 7,1 avec de l'acide phosphorique à 85 %. On a ajusté le pH de cet échantillon à 3,6 avec de l'acide phosphorique à 85 % immédiatement avant de chromatographier sur CHP20P en éluant avec le tam- pon A (50 ml), suivi par un gradient linéaire du tampon A au-tampon B (220 g de chaque). On avait préparé A en ajou- tant 330 ml de cyanure de méthyle à une solution de 670 ml d'eau et de 10, 0 g.de NH4H2PO4, ajustée à pH 3,6 avec de l'acide phosphorique à 85 %. On avait préparé le tampon B en ajoutant 600 ml de cyanure de méthyle à une solution de 400 ml d'eau et de 10,0 g de NH4H2P04. ajustée à pH 3,6 avec de.l'acide phosphorique à 85 %. La janthinomycine C éluaitentre 63 et 75 ml, tandis que la janthinomycine B2 éluait entre 150 et 225 mi. On a regroupé séparément les tractions actives et on les a reprises à siccité sous vide. On a partiellement dessalé chacune d'elles en les parta- geant entre du butanol et de l'eau (3 fois, 3 ml de butanol et 3 ml d'eau) , en regroupant les couches de butanol et en les reprenant à siccité sous vide, ce qui a donné 44,8 mg de janthinomycine B (sous la forme d'un mélange de B1 et 92) et 39,5 mg de janthinomycine C. On a réalisé une puri- fication finale par dessalage sur CHP20P (1,5 x 20 cm), 1 en éluant avec un gradient linéaire de CH3CN-H20-HC02H, de 20:80:0 à 60:40:1 (120 g de chaque), pour obtenir 37,0 mg de janthinomycine B. Le dessalage d'échantillons simi- laires regroupés de janthinomycine C (94,1 mg) a donna 53.5 mg de substance pure. 15. Act ité biol ogi que On a utilisé la méthode suivante pour détermi- ner la concentration minimaie inhibitrice (ci-après MIC, du composé de cette inventionr. 2C On a dévelopé les organismes d'essai aérobies dans environ 15 à 20 ml de bouillon d'essai d'antibiotique (Difco) en inoculant (dans des tubes) le bouillon avec une loupe" de l'organisme provenant d'une culture inclinée de gélose BHI (Difco}. On a fait incuber les tubes inoculés à 37QC pendant 18 à 24 h. On suppose que ces cultures contenaient 109 unités de formation de colonies (CFU) par millilitre. On a dilué les cultures au centième pour obte- nir un taux final d'inoculum de 107CFU; on a réalisé des dilutions avec du bouillon de levure et de boeuf (Difco). 3C On a dissous la janthinomycine dans un diluant approprié à une concentration de 1000 Fg/ml. On a réalisé des dilutions doubles dans du bouillon de levure et de boeuf (Difco), ce qui a donné une gamme allant de 1000 mg/ml à 0,05 pg/ml. On a placé 1.5 ml de chaque dilution dans des boîtes de Pétri séparées, auxquelles on a ajouté 13,5ml de gélose K-O10. La composition de la gélose K-10 était la suivante: Grammes Extrait de boeuf 1,5 Extrait de levure 3,0 Peptone 6,0 Dextrose 1,0 Gélose 15,0 - Eau distillée, quantité suffisante pour faire 1 litre. La concentration finale de médicament dans la gélose s'échelonnait de 100 fg/ml à 0,05 ug/ml. On a pré- paré des plaques témoins de croissance des organismes,con- tenant uniquement de la gélose, et on les a inoculées avant et après les plaques d'essai. On a appliqué les orga- nismes sur la surface de gélose de chaque plaque à l'aide d'un inoculateur multipoint de Denly (qui délivre environ 0,001 ml de chaque organisme), avec pour résultat un inocu- lum final de i04 CFU sur la surface de gélose. On a fait incuber les plaques à 37 C pendant 18 heures et on a déterminé les MiC. La MC.était la con- centration la plus basse de composé inhibant la croissance de l'organisme. Les résultats des essais de dilution de la gélose sont les suivants: I TARLEAU I Organisme N SC MIC d(le la MIC de la MIC de la Janrithinomycinre A Jlanthinomycine B Janthinomycine C (/,J/mln) (j/ml) lgm) Staaphylococcus auveus 1,276 O,, 8 O,,6 Staphylococcus aureus 2399 1,6 1( 6 3,1 Staphylococcus aureus 2400 1/6 1,6 3,1 Staphylococcus aureus 10165 t1/6 0, 8 1,6 Streptococcus faecalis 9011 1;6 l,6 12,5 Streptococcus agalactiae 9287 0,2 100 Escherichia coli 10857 12,5 12,5 50 Escherichia coli 10896 6,3 6r3 50 Escherichia coli 10909 6?3 6,3 25 Klebsiella aerogenes 10440 25 50 100 Klebsiella pneumoniae 9527 25 25 >100 Proteus mirabilis 3855 100 100 >100 Proteus rettgeri 8479 50 100 >100 Proteus vulgaris 9416 12t5 1215 >100 Salmonella typhosa 1195 12,5 12 5 100 Shigella sonnei 8449 12,5 12r5 100 x Enterobacter cloacae 8236 25 50 >100 TABLEAU 1 Organisme N SC* MIC de la MIC de la MIC de la Janthinomycine A Janthinomycine B Janthinomycine C (g/ml) (rg/ml) (g/ml) Enterobacter aerogenes 10078 25 50 >100 Citrobacter freundii 9518 25 25 100 Serratia marcescens 9783 25 50 >100 Pseudomonas aeruginosa 9545 50 50 >100 Pseudomonas aeruginosa 8329 100 100 >100 Acinetobacter calCoaceticus 8333 12,5 25 25 C Le N SC est le numéro. du microorganisme dans la collection de E.R. Squibbh & Sons, Inc., Princeton, Jew Jersey, Etats-Unis d'Amérique. TABLEAU 2 Or!ianisni e N" SC* MIC (1e la MIC de la lJarit.hinomyc i ne A Janthi nomyci nrie B (a./m J)...........(u/m] Bacillus subtilis 3777 0,4 1 Staphylococcus epidermiidis 9052 Ofr 0,4 (P:nicillin)*** Staphylococcus epidermidis 9083 0.8 014 Penlclllil)** Staphylococcus epidermidis 9.087 ' 08 0,4 (P&nicillinQ) Staphylococcus epidermidis 9607 0 4 Or4 ( R (Penicilline) Staphylococcus epidermidis 10547 0,8 0,4 (Pénicillir.R) Staphylococcus saprophyticus 12875 0t8 0r4 Staphylococcus aureus 2399 0rs 0t4 (P&nicillin) Staphylococcus aureus 10016 0r2 014 (Tétracycline) Staphylococcus aureus 2400 Or4 018 (PRnicillin) (Penicilline..) TABLEAU 2 Organisme N SC* MIC de la MIC de la Janthinomycine A Janthinomycine B ( lg/ml) (g/ml) Staphylococcus aureus 9593 018 0 4 R (Pënicilline) Staphylococcus aureus 9998 0,8 0,1 (PénicillinR). Staphylococcus aureus 3184 1,6 0,4 (Méthicillic) 0R Staphylococcus aureus 10014 0/4 0,4 (MéthicillitR) 4 Staphylococcus aureus 10020 0,4 0,4 (Methicilli nt) Staphylococcus aureus 11239 8 0,2 R (GentamiclnrI-) Staphylococcus aureus 10820 0,8 0,2 (ErythromycinQ) Staphylococcus aureus 12691 04 04 (Erythromycinl) f Streptococcus faecalis 9011 08 1)6 Streptococcus faecalis 9376 0,8 1,6 Streptococcus faecalis 10938 16 0,8 TABLEAU 2 Organisme N SC* MIC de la MIC de la Janthinomycine A Janthinomycine B Stet_______________i e9285 (0g/m l) _g/ml_) Streptococcus agalactiae 9285 0,4 n de E.R. S(qluibb & Sons, Inc., Princeton, Jew Jersey, Etats-Unis d'Améri e. -" **( R) indique que l'organisme est résistanl: 1 l'antribioLiqute cité. *A*( S) indique que l'organisme est sensible à l'antibiotique cité. ro% os 0%. r'> On a également déterminé, par une technique de dilution de gélose. la susceptibilité d'un certain nombre de bactéries anaérobies à un mélange de janthinomycines A et B. On a préparé des organismes d'essai à partir de cultures de 24 à 48 heures développées dans un bouillon de viande hachée (Scott Laboratories, Fiskeville, R.I.), ou à partir d'eaux de lavage de cultures inclinées de gélose et de chocolat. On a préparé ces cultures inclinées en ajoutant de l'hémo- * globine à de la 9géose protéase N 3 (Difco) jusqu'à une con- centration de 1%. On a lessivé la culture -développée des cultures inclinées avec un bouillon d'infusion de cervelle et de coeur (BBL Microbiology Systems) et on l'a diluée à une densité de 1 x 10o CFU/ml. On a dissous le trifluor- acétate d'un mélange de janthinomycines A et B dans le diluant approprié à une concentration de 1 000 fg/ml. On a réalisé des dilutions doubles dans du bouillon de levure et de boeuf (Difco), ce Qui a donné une gamme allant de 1000 ug/ml à 0,5 àg/ml. On a placé un échantillon.de 1,5 ml de chaque dilution dans des boîtes de Pétri séparées aux- quelles on a ajouté 13.5 ml de gélose DST (Oxoid USA, Inc. Red Branch Road, Columria, Maryland) contenant 5 % de sang de mouton lysé et 0,5 fig/ml de yitamine K. La concentration finale de médicament dans la gélose s'échelonnait de 100 rg/ ml à 0,05 pg/mi. On a préparé des plaques témoins de crois- sance de l'organisme contenant uniquement de la gélose, et on les a inoculées avant et après les plaques d'essai. On a appliqué les organismes sur la surface de chaque plaque à l'aide de l'inoculateur miultipoint Denly (qui délivre envi- ron 0,001 ml de chaque organisme), ce qui a donné un taux final d'inoculum de 105 CFU à la surface de la gélose. On a fait incuber les plaques à 37 C pendant 18 heures dans une chambre anaérobie (Forma Scientific, Marietta, Ohio), puis on a déterminé les valeurs de la MIC. La MIC est la concentration ila plus faible d'antibiotique inhi- bant la croissance de l'organisme. Les résultats des essais de dilution de la gélose sont les suivants: MIC du mélange de Organisme N SC anthinomycines A et B (g/ml) Bacteroides 9005 6,3 thetaiotaomicron Bacteroides fragilis 9844 25,0 Bacteroides fragilis 10277 50,0 Bacteroides 10278 25,0 thetaiotaomicron Bacteroides fragilis 10279 25,0 Bacteroides fragilis 10280 50,0 Bacteroides fracilis 11085 50,0 Bacteroides 12885 ,elaninogenicus Clostridium 8572 0,4 histolyticum Clostridium 11256 0,4 perfringens Clostridium 1780 0,2 septicum Clostridium 2372 0,05 sporogenes Clostridium 11251 50,0 difficile Hemophilus 8568 0,4 vaginalis Hemophilus 9640 0,1 vaginalis Bifidobacterium 11260 0,2 dentium *N SC est le numéro du micro-organisme dans la collection de E.R. Sauibb & Sons, Inc., Princeton, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique. Organisme N SC* MIC du mélange de Janthinomycines A et B (1g/ml) Eubacterium lentum 11261 - Fusobacterium 10338 --- necrophorum Peptocsccus 11264 0,8 variazilis Peptostreptococcus 11263 0,8 anaercbius Prcpionibacterium 4020 0,4 acnes * N SC est le numéro du micro-organisme dans la collection de E.R. Squibb & Sons, Inc., Princeton, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique. REVENDICATIONS 1. Composé de formule L-I" " '-'-.."-'- e Z - Phe- ou sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, o &-Abu est l'acide déhyd"o-o-aminobutyrique; gHL est la D-érythro-rf:-hydroxyleucine; et X est le>-hydroxytryptophane, len-cétotrypto- phane ou le déhydrotryptophane. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est le thréo-/-hydroxytryptophane. 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est lej3-cétotryptophane. 4. Composé selon la revendicaticn 4, caractérisé en ce que X est le déhydrotryptophane. 3. Composé, ou sel pharmaceuticuement acceptable de ce composé, ayant le spectre ultraviolet de la figure 1, le spectre infrarouge de la figure 2. le spez-re RMN du carbone à 67,5 MHz de la figure 3 et le spectre RMN des protons à 400 MHz de la figure 4. 6. Composé, ou sel pharmaceutiquement accepta- ble de ce composé, ayant le spectre ultraviolet de la figure , le spectre infrarouge de la figure 6, le spectre RMN du carbone à 67,5 MHz de la figure 7 et les spectres RMN des protons à 400 MHz des figures 8 et 9. 7. Composé, ou sel pharmaceutiquement accepta- ble de ce composé, ayant le spectre ultraviolet de la figure 10, le spectre infrarouge de la figure 11, le spec- tre RMN du carbone à 67,5 MHz de la figure 12 et le spectre RMN des protons à 400 MHz de la figure 13.