Brevet FR2638169A1 — publié le 19900427

i DERIVES D'ADENYL CYCLASE ET LEURS UTILISATIONS BIOLOGIQUES L'invention a pour objet des dérivés d'adényl cyclase, leur préparation par mutagénèse et leurs utilisations biologiques, en particulier comme vaccins. Les vaccinations contre les infections algues causées chez les vertébrés par des bactéries pathogènes du genre Bordetella ou Bacillus anthracis, font appel le plus généralement à l'utilisation de bactéries entières virulentes ou atténuées. Toutefois, ces vaccins ne sont pas nécessairement dépourvus de toxicité en raison du processus même des maladies 'provoquées par ces bactéries. En effet, souvent ce sont des protéines produites par les bactéries, et non les bactéries elles-mêmes, qui sont responsables de la virulence. Même après la mort bactérienne, ces protéines peuvent être responsables de nombreux effets pathologiques. Dans la pathologie induite par B.Dertussis interviennent de façon primordiale une hémagglutinine filamentaire (FHA) ainsi que deux toxines qui entraînent une augmentation dérégulée de la production d'AMP cyclique pour les cellules hôtes. Il s'agit de la pertussis toxine (Ptx ou LPF) qui active essentiellement la cyclase de l'hôte, et de l'adényl cyclase, activée par la calmoduline (AC). Enfin, une hémolysine est associée à l'adényl cyclase. L'adényl cyclase de B.Dertussis a été appelée cyclolysine pour indiquer ce fait. Compte tenu de ces observations, les in- venteurs ont recherché des moyens de vaccination dans lesquels n'interviennent plus les bactéries de souches virulentes ou atténuées, mais les protéines produites modifiées de manière appropriée afin de détruire leur toxicité originelle. L'adényl cyclase a plus spéciale- ment retenu l'attention à cet égard. L'invention a pour but de fournir de nouveaux dérivés de l'adényl cyclase, ces dérivés étant dépourvus d'activité toxique mais étant capables de former des anticorps reconnaissant également les protéines toxiques. Elle vise également à fournir un procédé d'obtention de ces dérivés par mutagénèse in vitro des gènes codant pour l'adényl cyclase toxique. Un autre but de l'invention consiste dans la fourniture de vaccins assurant une action protectrice efficace contre les infections produites par des agents pathogènes. Les dérivés d'adényl cyclase de l'inven- tion sont caractérisés en ce qu'ils comportent un ou plusieurs acides aminés différents de ceux de la pro- téine toxique en leur conférant un caractère atoxique, ces acides aminés se trouvant impliqués dans le mécanisme catalytique et/ou dans le mode d'activation par la calmoduline et/ou le transfert de l'information du site activateur au site catalytique de l'adényl cyclase et n'affectant pas de manière notable- la configuration tridimensionnelle de la protéine toxique, de sorte que les anticorps formés contre les dérivés atoxiques reconnaissent également la protéine toxique. Une autre caractéristique de l'invention concerne la protéine entière dont les acides aminés responsables de l'activité hémolytique ont été altérés ou délétés. Le ou les acides aminés de remplacement sont choisis au vu de leurs propriétés physico-chim- ques, de manière à détruire la toxicité sans affecter notablement la forme de la protéine, tout au moins en ce qui concerne sa reconnaissance par le système immuni- taire. En possédant la même géométrie que la protéine toxique, ces dérivés jouent avantageusement le rôle de leurre pour le système immunitaire sans, toute- fois, exercer d'activité catalytique toxique. Parmi les propriétés permettant d'inter- venir sur le caractère toxique originel de la protéine et de le détruire, on citera notamment la taille des acides aminés, leur caractère hydrophobe ou hydrophile, leur charge, leur propension à former ou à détruire les structures secondaires de la séquence d'acides aminés, leur action sur la structure de l'eau, leur caractère rupteur ou formateur d'hélice, leur interaction avec tout ou partie de l'ATP intervenant comme substrat ou avec la calmoduline. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les dérivés d'adenyl cyclase renferment un ou avantageusement au moins deux acides aminés différ rents dans le site catalytique c'est-à-dire dans le domaine responsable de la production d'AMP cyclique (AMPc). Cette disposition permet de supprimer la production d'AMPc ou de la rendre minime tout en conservant les propriétés immunogènes de la protéine. Le ou les acides aminés différents dans le site catalytique sont choisis plus spécialement de manière à modifier la structure de l'eau ou l'interaction de la protéine avec l'eau ou avec le phosphate, la base nucléique et/ou le sucre de l'ATP, de telle sorte que l'activité ou le contrôle de l'activité du site soit détruit. Il s'agit par exemple d'acides aminés hydrophobes remplaçant des acides aminés hydrophiles de même taille ou l'inverse, d'acides aminés ayant perdu leur charge électrique ou de charge électrique modifiée, ou encore d'acides aminés de taille différente qui empêcheront la mise en place du substrat ATP, ou la réaction de cyclisation en AMPc. On citera, à titre d'exemple, le remplace- ment d'une ou au moins deux lysines qui interagissent avec l'ATP par des acides aminés de même volume, hydrophiles mais dépourvus de charge tel que la glutamine (Q). Au sein de la séquence peptidique cataly- tique, le coeur GLNVHAKS peut être modifié, et G et A remplacés chacun par l'un des acides aminés suivants M, L, I, V ou F. K, comme indiqué, peut être remplacé par Q mais aussi par N, D et E, ou encore M, L, I, V. Les significations des lettres utilisées communément pour désigner les acides aminés ci-dessus et ceux indiqués dans la suite sont donnés en fin de description. Le domaine responsable de l'activité hémolytique peut, dans la protéine entière, avantageusement être délété par exemple en coupant le gène aux sites Bgl II (AGATCT) et en délétant le fragment correspondant. Cela revient à enlever la portion de la protéine située entre EI xxx et EI xxx. En variante, ou comme disposition supplé- mentaire, on peut tirer parti du fait que la protéine ne contient pas de résidu cystéine pour y introduire cet acide aminé par mutagénèse localisée. Celui-ci pourra ensuite subir un traitement chimique approprié (oxydation par exemple ou réaction avec les réactifs des SH de type métalliques, organomercuriels ou iodo acétamide) dont le1 résultat sera l'inactivation de la protéine. Les acides aminés différents peuvent être également choisis parmi des analogues d'acides aminés incorporables par la machine de traduction, le cas échéant chimiquement modifiés. On citera à titre d'exemple la fluorophénylalanine, le bromotryptophane, ou la nor-leucine. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, mis en oeuvre le cas échéant avec le mode préféré ci-dessus, le ou les acides aminés de remplace- ment sont présents dans le site activateur sous l'effet de la calmoduline, et sont choisis en fonction des mêmes paramètres et ce, de manière à permettre une altération de la liaison avec la molécule activatrice de l'hôte. Ainsi, un résidu acide aspartique hydrophile chargé négativement et rupteur d'hélice remplacera avantageusement un résidu tryptophane de plus grosse taille et hydrophobe et formateur d'hélice, dans la région de liaison à la calmoduline. Dans encore un autre mode de réalisation, mis en oeuvre seul, ou en combinaison avec au moins l'un de ceux qui précèdent, le ou les acides aminés de remplacement, tels que considérés ci-dessus, sont présents dans la zone responsable du transfert de l'information du site activateur au site catalytique. De préférence, les dérivés de l'invention sont tels qu'obtenus par expression dans un organisme hôte d'un gène codant pour une protéine à activité adényl cyclase, ce gène ayant été modifié in vitro, après clonage, par mutagénèse dirigée. Outre les éléments de mutagénèse décrits ci-après, on peut aussi opérer par délétion de régions connues du gène, ou par insertion d'oligonucléotides de synthèse, de manière à détruire un sité doué d'activité. Les dérivés de l'invention sont plus spécialement des mutants d'adényl cyclase de Bordetella responsables de pathologies respiratoires des vertébrés telles que B.pertussis et B.parapertussis chez l'homme et B.bronchiseptica et B.avium chez l'animal. La partie active de l'adényl cyclase to- xique de B.Pertussis exprimée par le gène cloné présente la séquence (I) donnée sur les figures la à If. Cette séquence est rapportée dans la demande EP 88/401.935.7 du 25.7.88. <> qu La protéine correspondant à la séquence (I), qui contient 1706 acides aminés, comprend deux domaines présentant deux activités principales. Les 400 à 500 acides aminés de la partie N-terminale sont responsables de l'activité adényl cy- clase et les 1300 à 1200 de la partie carboxy-terminale de l'activité hémolytique et des propriétés de secrétion de la protéine. Dans la partie catalytiquement active pour la synthèse d'AMPc, l'adényl cyclase apparait organisée en deux domaines:- le domaine N-terminal de 25kDa qui porte le site cataly- tique et le domaine C-terminal de 12kDa qui porte le site principal de liaison à la calmoduline, plus spécia- lement la séquence correspondant aux résidus 235-254. Dans une autre forme de réalisation de l'invention, les dérivés d'adényl cyclase sont des mutants d'une adényl cyclase du type de celle exprimée par B.anthracis. La séquence de nucléotides du gène codant pour cette adényl cyclase et la séquence de cette dernière sont rapportées dans la demande France déposée ce jour aux noms des demandeurs, intitulée "SEQUENCES DE NUCLEOTIDES EXPRIMANT L'ADENYL CYCLASE DE B. ANTHRACIS, PROTEINES AYANT L'ACTIVITE DE CETTE ADENYL CYCLASE ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES". La séquence d'acides aminés de l'adényl cyclase de B. anthracis présente plusieurs régions com- munes avec celle secrétée par B. Pertussis (voir figure 2). La similitude la plus importante correspond au peptide de 24 acides aminés (de la position 342 à la position 365 chez l'adenyl cyclase de B. anthracis: GVATKGLNVHGKSSDWGPVAGYIP). Cette séquence contient cinq résidus gly et la séquence noyau G --- GKS (AKS chez B.pertussis) que l'on retrouve souvent dans les protéines ayant une affinité pour les nucléotides. Deux autres régions présentent une similitude plus faible. Elles correspondent chez B.anthracis aux domaines s'étendant des positions 487 à 501 (PLTADYDLFALAPSL) d'une part et 573 à 594 (DVVNHGTEQDNEEFPEKDNEIF)d'autre part. En variante, les dérivés de l'invention sont tels qu'obtenus par traitement chimique de la sé- quence d'adényl cyclase modifiée. L'invention vise également les anticorps polyclonaux dirigés contre ces adényl cyclases modi- fiées, ainsi que les anticorps monoclonaux capables de les reconnaître spécifiquement. -s5 Conformément à l'invention, les dérivés d'adényl cyclase définis plus haut sont obtenus par mutagénèse in vitro du gène cloné exprimant la protéine toxique, suivie d'expression du gène dans des hôtes appropriés, par exemple E.coli, B.avium ou Alcaliqenes eutroDhus avec éventuellement un traitement chimique subséquent (cas particulier des protéines à cystéine par exemple). Cette expression s'effectue avec des rende- ments élevés en particulier chez E. coli. Le gène peut être réintroduit dans la bactérie pathogène afin d'y exprimer la protéine atoxique. La bactérie ainsi modifiée fait également partie de l'invention. Le procédé d'obtention de dérivés d'adényl cyclase atoxiques selon l'invention comprend la mutagé- nèse in vitro du gène cloné exprimant l'adényl cyclase toxique, cette mutagénèse étant effectuée dans la région codant pour le site catalytique et/ou pour le site acti- vateur par la calmoduline et/ou pour le site de transfert de l'information du site activateur au site catalytique et/ou la région responsable de l'activité hémolytique, de manière à introduire un ou plusieurs codons codant pour des acides aminés différents de ceux présents dans la protéine toxique, ou à faire disparaître (déléter) des codons présents dans le gène original capables de lui conférer un caractère atoxique tout en n'affectant pas de manière notable la configuration tridimensionnelle présentée par la protéine toxique, de sorte que les anticorps formés contre les dérivés atoxiques reconnaissent également la protéine toxique. La mutagénèse porte avantageusement sur les codons codant pour les acides aminés définis 2 ci-dessus. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on met en oeuvre le système de mutagénèse in vitro d'Amersham ou de toute autre compagnie proposant des systèmes du même type comportant l'uilisation d'un oligonucléotide mutant pour diriger la mutagénèse. Cet oligonucléotide est construit de manière à comporter le codon capable de coder pour l'acide aminé que l'on souhaite introduire. Le codon final souhaité peut être introduit en une seule étape, ou en ayant recours à l'introduction intermédiaire d'un autre codon puis dans une étape ultérieure, à sa mise en place. En variante, il est aussi possible d'utiliser un oligonucléotide mutant comportant une ambiguité et capable de coder pour deux acides aminés différents. De même, on peut utiliser un oligonucléotide o il manque un ou plusieurs codons, de façon à produire une délétion. L'oligonucléotide mutant renferme avanta- geusement au moins 15 nucleotides, notamment de 20 à 25. Conformément à la technique classique de mutagénèse in vitro, utlisant le kit Amersham, on a recours aux étapes suivantes: - hybridation de l'oligonucléotide mutant avec une séquence d'ADN d'une matrice d'ADN monobrin construite de manière appropriée à partie d'un vecteur par mutagénèse in vitro: on utilise avantageusement, comme vecteur à ADN monobrin, un phage, notamment dérivé de M13, - synthèse et ligation du brin d'-ADN mutant, avec une polymérase telle que dCTPas, - élimination de l'ADN monobrin (non mutant), par exemple par filtration, - coupure du brin.d'ADN non mutant à l'aide d'une enzyme de restriction, telle que Ncil, - digestion du brin non mutant à l'aide par exemple d'une exonucléase, notamment l'exonucléase III, - repolymérisation et ligation de l'ADN partiellement lacunaire, - transformation de cellules hôtes compétentes avec l'ADN. Ce procédé présente l'avantage d'obtenir, avec des rendements élevés, le dérivé atoxique. Il est clair toutefois que d'autres modes de réalisation de la mutagénèse par exemple utilisant des sites de restriction pour créer des insertions, des délétions ou des remplacements, peuvent être mis en oeuvre ou que des modifications peuvent être apportées à la méthode basée sur l'utilisation du kit commercialisé par Amersham pour introduire les codons appropriés et obtenir les dérivés d'adényl cyclase atoxiques de l'invention. Le gène codant pour l'adényl cyclase exprimée par l'un des microorganismes indiqué ci-dessus est avantageusement cloné selon le procédé décrit dans la demande FR 87/10614 du 24 Juillet 1987 aux noms des demandeurs. Dans ce procédé, on utilise l'interaction adényl cyclase-calmoduline qui se traduit par la pro- duction de cAMP. Le clonage du gène est effectué dans une souche réceptrice déficiente en adényl cyclase, portant un plasmide exprimant de hauts niveaux de pratu calmoduline. On observera que les gènes qui coopèrent dans ce procédé de clonage, à savoir celui qui code pour l'adényl cyclase et celui qui code pour la calmoduline sont d'origines différentes. Le fragment d'ADN cloné de la partie' active du gène codant pour l'adényl cyclase de B.pertussis, utilisable dans le procédé de mutagénèse de l'invention, répond à la séquence représentée également sur les figures la à if. La partie catalytique pour la synthèse d'AMPc du fragment d'ADN comprend la séquence de nucléotides localisée entre les positions 0 et 2050, la position 0 correspondant au site de restriction BamHI. Toute séquence de nucléotides qui s'hybride avec la séquence de nucléotides des figures la à If et code pour une protéine à activité adényl cyclase, que cette séquence soit obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant ou par synthèse chimique est utilisable dans le procédé selon l'invention aux fins de mutagénèse. L'invention vise également les séquences de nucléotides comportant ou constituées par le gène codant pour au moins la partie active d'une adényl cyclase, mais mutées de manière à coder pour un dérivé d'adényl cyclase tel que défini ci-dessus ainsi que les 1 1 oligonuléotides mutants. Ainsi, par rapport au fragment d'ADN des figures la à If, une séquence nucléotidique selon l'in- vention comporte un codon CAA à la place du codon AAA en position 58, ou encore un codon CAG à la place d'un codon AAG en position 65. De préférence, ces oligonucléotides ne pourront pas permettre une hybridation non spécifique avec le vecteur M13. Les oligonucléotides mutants comprennent par exemple un codon CAA à la place d'un codon AAA en position 58 et comprennent tout ou partie de la séquence GTG GCC ACC CAA GGA TTG G. Il peut s'agir également d'oligonucléo- tides avec un codon CAG à la place d'un codon AAG en positon 65 et comprenant tout ou partie de la séquence GTGCACGCCCAGTCGTCCG. D'autres oligonucléotides comprennent à la place d'un codon TGG en position 242, un codon GAC et répondent à tout ou partie de la séquence CTTGTTGGAC- AAAATCGC, ou un codon GAC à la place du codon GAC de l'oligonucléotide précédent. Un mélange d'oligonucléotides peut permettre d'obtenir plusieurs mutants dans une seule expérience. En variante, on obtient les dérivés ato- xiques de l'invention en soumettant la séquence protéique d'une adényl cyclase ou tout au moins sa partie active à un traitement chimique par exemple les traitements d'inactivation utilisés en vaccination, par exemple pour les vaccinations tétaniques. Les essais de toxicologie réalisés sur les dérivés de protéines de l'invention ont démontré leur absence de toxicité. Les propriétés fortement immunogènes des dérivés de l'invention sont donc avantageusement mises à profit pour l'élaboration de vaccins. Les vaccins de l'invention sont caractéri- sés en ce qu'il s'agit de vaccins moléculaires.renfer- mant au moins un dérivé atoxique d'adényl cyclase tel que défini cidessus, en association avec un véhicule pharmaceutique. Ils peuvent également renfermer la bactérie porteuse des gènes mutés et rendue ainsi atoxique. La vaccination est effectuée selon les doses et avec les formes d'administration habituelles. D'une manière avantageuse, les dérivés d'adényl cyclase de l'invention donnent lieu à une réaction immunologique croisée avec des anticorps dirigés contre l'adényl cyclase de B.Pertussis. Des compositions de vaccins avantageuses comprennent le dérivé d'adényl cyclase de l'invention associé à une préparation de bactéries tuées de B.pertussis utilisée comme adjuvant.. Pour illustrer l'invention, on rapporte ci-après des exemples de préparation de mutants d'adényl cyclase de B.pertussis. Dans ces exemples, on se réfère aux figures la à if qui représentent, les séquences de nucléotides de la partie active du gène codant pour l'adényl cyclase respectivement de B.Pertussis et de B.anthracis, clonée dans E.coli et la séquence d'acides aminés correspondante exprimée, et à la figure 2 la séquence complète du polypeptide de l'adényl cyclase de B.anthracis (ligne supérieure) et la séquence polypeptidique N-terminale de l'adényl cyclase de B.pertussis (ligne inférieure). EXEMPLES: 1/ - Clonage du gène codant pour l'adényl cyclase de B.Pertussis. Des souches cya, restriction de E.coli sont transformées par un plasmide porteur d'un gène spécifiant la synthèse de calmoduline tel que le plas- mide pVUC-1, ou de tout autre plasmide exprimant la calmoduline du groupe d'incompatibilité ColE1 et porteur du gêne de résistance à l'ampicilline. On introduit ensuite dans les souches cya des vecteurs renfermant de l'ADN de B.Pertussis total fragmenté de diverses manières (coupures partielles par des enzymes de restriction EcoRI et SauIIIa, sonication suivie d'addition de "linkers" EcoRI par exemple). En raison des problèmes posés par l'incom- patibilité d'autres plasmides ayant le réplicon ColEI le clonage de fragments d'ADN total de B.pertussis partiellement coupé par l'enzyme SauIIIa a été effectué dans le vecteur compatible pACYC184, au site unique BamHl. Les souches réceptrices ont été transformées et étalées sur des boites Mc Conkey Maltose. Plusieurs clones fermentant le maltose ont été isolés. Il a ensuite été démontré, que ces clones produisent de l'AMP cyclique. Par ailleurs, les plasmides extraits des souches productrices ont été intégrés par transformation dans des souches qui soit ne contiennent pas le plasmide pVUC-1, soit le contiennent. Dans le premier cas, les clones sont blancs sur les milieux Mc Conkey maltose, rouges dans le second, confirmant que c'est bien la pré- sence des plasmides permettant la synthèse de calmodu- line qui a permis le clonage. 2/ - Mutagénèse in vitro du gène cloné codant pour l'adényl cyclase. En opérant comme décrit par Carter et al dans Nucl. Acids Res. 13. 443143, 1985, on remplace un codon AAA (codant pour K) par un codon CAA (codant pour Q) en position 58 en utilisant l'oligonucléotide GTGGCCACCCAAGGATTGG. De même, on remplace un codon AAG 3. (codant pour K) en position 65 par un codon CAG (codant pour Q) en utilisant l'oligonucléotide GTGCACGCCCAGT- CGTCCG. Les deux modifications sont effectuées sur le fragment d'ADN BamHI-EcoRV cloné dans le phage M13tg130. Le codon TGG en position 242 (codant pour un tryptophane) est tout d'abord modifié en un codon GAC (codant pour l'acide aspartique) en utilisant l'oligo- nucléotide CTTGTTGGACAAAATCGC. Le codon GAC est ensuite modifié en un codon GAG (codant pour l'acide glutamique) en utilisant l'oligonucléotide CTTGTTGGAGAAAATCGC. On observera que, dans ce cas, la mutagénèse porte sur un codon qui ne se trouve pas dans une zone de similitude avec les séquences de nucléotides d'autres gènes codant pour un adényl cyclase, plus spécialement celle de B. anthracis. Les modifications sur la positon 242 ont été effectuées sur le fragment d'ADN EcoRV-EcoRI cloné dans le phage M13tg130. Pour chaque mutagénèse, on contrôle sur le fragment muté l'absence de tout autre mutation par la méthode de séquençage avec un didéoxynucléotides. 3/ - Obtention des dérivés atoxiques d'adényl cyclase. Par expression du gène muté dans une souche de E.coli selon les techniques habituelles, on obtient l'adényl cyclase atoxique qui est ensuite purifiée. On constate que le remplacement du tryp- tophane par l'aspartate réduit d'un facteur de 1000 l'activabilité de l'enzyme par la calmoduline, son activité de base étant maintenue. Le remplacement de la lysine en position diminue l'activité de base intrinsèque de l'enzyme d'un facteur d'au moins 100. Les lettres pour désigner les acides aminés présentent les significations suivantes: D Acide aspartique E Acide glutamique A Alanine R Arginine N Asparagine C Cystéine Q Glutamine G Glycine H Histidine I Isoleucine L Leucine K Lysine M Méthionine F Phenylalanine P Proline S Sérine T Thréonine W Tryptophane Y Tyrosine V Valine REVENDICATIONS 1. Dérivés d'adényl cyclase, caractérisés en ce qu'ils comportent un ou plusieurs acides aminés différents de ceux de la protéine toxique, en lui conférant un caractère atoxique, ces acides aminés se trouvant dans le site catalytique et/ou dans le site activateur par la calmoduline et/ou dans le site de transfert de l'information du site activateur au site catalytique et/ou dans la région hémolytique, et n'affectant pas de manière notable la configuration tridimensionnelle de la protéine toxique, de sorte que les anticorps formés contre les dérivés atoxiques reconnaissent également la protéine toxique. 2. Dérivés selon la revendication 1, ca- ractérisés en ce que le ou les acides aminés de rempla- cement présentent des tailles et/ou un caractère hydro- phobe ou hydrophile et/ou une charge et/ou une propension à former ou à détruire les structures secondaires de la séquence d'acides aminés et/ou une action sur la structure de l'eau et/ou une interaction avec tout ou partie de l'ATP intervenant comme substrat et/ou avec la calmoduline différents de celles des acides aminés de la protéine toxique. 3. Dérivés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils renerment un ou avantageuse- ment au moins deux acides aminés différents dans le site catalytique de l'adényl cyclase. 4. Dérivés selon l'une quelconque des revendication 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils comportent une ou au moins deux glutamines ou asparagines, aspartates, ou glutamates à la place de résidus de lysines. 5. qérivés selon la revendication 3, caractérisés en ce que le noyau de la séquence peptidique catalytique GLNVHAKS est modifié, G et A étant remplacé chacun par l'un des acides aminés suivants: M, L, I, V ou F, K pouvant être remplacé par Q, mais aussi par N et D, E, ou encore M, L, I, V, les lettres utilisées pour désigner les acides aminés ayant les significations suivantes: A: alanine, F: phénylalanine, G: glycine, H: histidine, I: isoleucine, K: lysine, L: leucine, M: méthionine, N: asparagine, S: sérine, et V: valine. 6. Dérivés- selon l'une quelconque des revendication 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils comportent un ou plusieurs résidus cystéine, le cas échéant chimiquement modifiés. 7. Dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en -ce qu'ils renferment un ou plusieurs analogues d'acides aminés incorporables par la machine de traduction, le cas échéant chimiquement modifiés. 8. Dérivés selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que le ou les acides aminés de remplacement sont présents dans le site activateur. 9. Dérivés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils comportent un résidu aspartate, glutamate, asparagine ou glutamine, à la place d'un résidu tryptophane de la région de liaison à la calmoduline. 10. Dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'il s'agit de mutants d'adényl cyclase de Bordetella telles que B.Pertussis, B. bronchiseptica, B.avium, et de Bacillus anthracis. 11. Dérivé selon la revendication 10, ca- ractérisé en ce qu'il s'agit d'un mutant de la partie active de l'adényl cyclase de B.Dertussis représentée par la séquence (I) des figures la à lf. 12. Dérivés d'adényl cyclase selon la revendication 1 tels qu'obtenus par expression dans un organisme hôte d'un gène codant pour une protéine à activité adényl cyclase, ce gène ayant été modifié in vitro, après clonage, par mutagénèse dirigée. 13. Procédé d'obtention de dérivés d'adényl cyclase atoxiques selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'il comprend la mutagénèse in vitro du gène cloné exprimant l'adériyl cyclase toxique, cette mutagénèse étant effectuée dans la région codant pour le site catalytique et/ou pour le site activateur par la calmoduline et/ou pour le site de transfert de. l'information du site activateur au site catalytique et/ou la région responsable de l'hémolyse, de manière à introduire un ou plusieurs codons codant pour des acides aminés différents de ceux présents dans la protéine toxique, ou de déléter certains codons capables de lui conférer un caractère atoxique, tout en n'affectant pas de manière notable la configuration tridimensionnelle présentée par la protéine toxique, de sorte que les anticorps formés contre les dérivés atoxiques reconnaissent également la protéine atoxique. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les codons mutés codent pour les acides aminés différents de ceux de la protéine toxique définie dans l'une quelconque des revendications 2 à 9. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on utilise un oligonucléotide mutant pour diriger la mutagénèse. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'oligonucléotide mutant comprend un codon CAA à la place d'un codon AAA, en position 58 de l'adényl cyclase de B. Dertussis, et comprend tout ou partie de la séquence GTGGCCACCCAAGGATTGG, ou encore qu'il comporte un codon CAG à la place d'un codon AAG en position 65 et comprend tout ou partie de la séquence GTGCACGCCCAGTCGTCCG, ou un codon GAC à la place d'un codon TGG en position 242 et comprend tout ou partie de la séquence CTTGTTGGGACAAAATCGC, ou un codon GAG à la place du codon GAC de l'oligonucléotide précédent. 17. Vaccins induisant la synthèse d'anticorps dotés d'une action protectrice contre les infections à Bordetella et Bacillus anthracis, caractérisés en ce qu'il s'agit de vaccins moléculaires renfermant un dérivé d'adényl cyclase selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, en association avec un véhicule pharmaceutique, ou le cas échéant des bactéries entières porteuses des gènes mutés. 18. Compositions de vaccins selon la revendication 17, caractérisées en ce que le dérivé d'adényl cyclase est associé à. une préparation de bactéries tuées de B.pertussis utilisées comme adjuvant. 19. Séquence de nucléotides comportant ou constituée par le gène codant pour au moins la partie active d'une adényl cyclase, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence d'adényl cyclase mutée de manière à coder pour un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et oligonucléotides mutants formés d'une partie de ces séquences.