Brevet FR2636965A1 — publié le 19900330

La présente invention concerne de souches de Rhizobium manipulées génétiquement présentant des capacités accrues de fixation de l'azote gazeux en conditions endosymbiotiques. La caractéristique la plus remarquable des bactéries diazotrophes est qu'elles sont capables de fixer l'azote moléculaire dans des conditions physiologiques très différentes. Par exemple, Klebsiella pneumoniae est une bactérie entérique qui est capable de fixer l'azote atmosphérique pour croître en l'absence d'oxygène ou d'azote fixé. Les bactéries du genre Rhizobium fixent l'azote seulement dans des conditions de non croissance microaérobiques et symbiotiques. Bien que des activateurs spécifiques nif similaires, nifA, existent dans K. pneumoniae et Rhizobium meliloti, la régulation de nifA est différente. La figure 1 résume la cascade de régulation dans le cas de Rhizobium. Les gènes fixL et fixJ sont des activateurs généraux de l'expression de gènes de fixation de l'azote chez R. meliloti. En réponse à un signal extracellulaire (vraisemblablement une baisse de la pression partielle d'oxygène), fixL et fixJ induisent l'expression de l'ensemble des gènes nif et fix par l'intermédiaire de deux gènes régulateurs spécifiques; nifA et fixK (figure 1). Le Demandeur a, en outre, mis en évidence le fait que le gène fixK, non seulement active l'expression de gènes fix tels que fixN, mais aussi réprime l'expression du gène nifA ainsi que sa propre expression par autorégulation. L'invention consiste à manipuler des souches de Rhizobium de façon à supprimer ou diminuer l'effet répresseur du ou des gènes fixK sans que la cascade d'activation des gènes nif et fix soit notablement affectée. C'est pourquoi, la présente invention concerne des souches de Rhizobium caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi a) les mutants fixK affectés seulement dans la répression des gènes nif et fix et peu ou pas dans l'activation des gènes fix ; b) les mutants rendus totalement ou partiellement insensibles à l'effet répresseur de fixK. Parmi ces souches, il faut signaler plus particulièrement les mutants fixK correspondant à des mutations dans la séquence de la figure 2 ou d'une séquence équivalente codant pour fixK, il s'agit là des mutants de type a. En particulier, il faut citer les souches ne synthétisant plus ou à un niveau réduit la forme répresseur de FixK ; les souches synthétisant une protéine FixK modifiée de façon à supprimer ou diminuer ses capacités de répresseur tout en gardant ses propriétés activatrices ; de telles souches pouvant provenir de la manipulation de la séquence nucléotidique de fixK présentée dans la figure 2 ou d'une séquence apparentée. Dans le cas des mutants de type b, il faut citer, en particulier, les souches affectées dans la biosynthèse d'un effecteur nécessaire à l'effet répresseur de FixK ; les mutants de la protéine FixJ- tels que l'effet activateur de cette protéine sur PnifA et PfixK soit insensible à l'action répresseur de FixK ; les souches mutées dans les promoteurs des gènes cibles nifA ou fixK au niveau des séquences impliquées dans la répression par FixK sans que cela affecte notablement l'activation de ces promoteurs par FixJ. Les souches selon la présente invention sont plus particulièrement les souches de Rhizobium meliloti, notamment les mutants des souches utilisées actuellement en agriculture pour le traitement de la luzerne. I1 faut savoir que la luzerne est une culture fourragère majeure en Europe et en Amérique du Nord et que, bien qu'en France la luzerne soit rarement inoculée par Rhizobium, 80 % des surfaces plantées en luzerne chaque année aux U.S.A. sont inoculées avec des Rhizobium. Un grand nombre de sociétés se sont intéressées à l'amélioration de la fixation de l'azote chez la luzerne par la voie qui semble la plus simple, c'est-à-dire l'amélioration de son symbionte fixateur d'azote, Rhizobium meliloti. Dans la plupart des cas, on a cherché essentiellement à surexprimer certains gènes impliqués dans la régulation de la fixation de l'azote. Dans le cas de la présente invention, c'est la diminution ou la suppression d'une action de répression qui est envisagée. C'est pourquoi la présente invention concerne également un inoculum contenant une souche de Rhizobium selon l'invention sur un support acceptable en agriculture ainsi que le traitement des cultures par cet inoculum. Les souches selon la présente invention pourront être utilisées à titre d'inoculum, comme cela est déjà fait pour les souches de Rhizobium utilisées actuellement, ctest-à-dire qu'elles pourront être utilisées, soit telles quelles, soit sur un substrat, et mises en place grâce à des procédés qui sont similaires aux procédés mis en oeuvre actuellement. Les exemples ci-après permettront de mieux cerner les caractéristiques de la présente invention. Exemple 1 Mise en évidence du rôle régulateur de fixK Pour ce fairc, on utilise deux souches qui sont décrites dans le tableau 1, ces souches étant transformées à l'aide du plasmide pCHK57. La souche GMI6050 exprime le gène fixK, alors que la souche GMI5630 n'exprime pas ce gène. L'introduction dans ces souches du plasmide pCHK57 (PnifA-lacZ) montre que l'expression du gène lacZ mis sous la dépendance du promoteur de nifA est pratiquement six fois plus importante dans la souche n'exprimant pas fixK. Ceci montre bien que le produit d'expression du gène fixK réprime l'expression du gène nifA. Un effet similaire est observé sur l'expression du gène fixK lui-même (tableau I). Tableau I Activité béta-galactosidase Souche Génotype (nmol/min/mg) en conditions microaérophiles pGMI93l pCHK57 pJJ5 PfixN-lacZ PnifA-lacZ PfixK-lacZ GMI6050 recA#JB16 JB16 970 570 2000 GMI5630 recAfixK2.81 fixK2.81 JB16 4 3400 10300 Des essais comparables avec le plasmide pGMI93l PfixN-lacZ (dans lequel le gène lacZ a été mis sous la dépendance du promoteur de fixN) montrent que dans ce cas, au contraire, l'absence d'expression du produit du gène fixK correspond à une expression très faible du gène lacZ. Ceci prouve que le produit d'expression du gène fixK régule positivement l'expression du gène fixN. I1 a été montré que ces effets régulateurs positifs et négatifs sont spécifiques puisque (1) ces effets sont observés avec le mutant fixK mais pas avec d'autres mutants nif ou fix ; (2) un gène hemA connu pour -être exprimé constitutivement chez R. meliloti s'exprime, en effet, indépendamment de fixK. Exemple 2 Séquence nucléotidique de fixK L'analyse de la séquence de fixK révèle un cadre de lecture ouvert (ORF "Open Reading Frame") de 633 bp avec une probabilité de codage très importante. Aucune ORF significative avec une probabilité de codage importante homogène n'a pu être identifiée. On peut prédire l'existence d'un site de fixation des ribosomes très fort correspondant au premier ATG de l'ORF de 633 bp. L'étude de mutation dans cette ORF permet d'affirmer qu'il s'agit bien là du gène fixK. FixK est homologue de protéines régulatrices se liant à l'ADN Le Demandeur a établi l'existence d'une homologie entre la protéine FixK et deux protéines régulatrices de Escherichia coli, Fur et Crp. Ces deux protéines ont en particulier les caractéristiques suivantes 1. Comme FixK, Fur et Crp sont des protéines bifonctionnelles (à la fois activateur et répresseur). 2. Dans le cas de Crp, il est bien établi que l'effet répresseur, comme l'effet activateur, requiert la présente d'un effecteur, le CAMP. L'intervention d'un effecteur dans le mode d'action de Fur, bien que supposée, reste à établir. I1 en est de même pour FixK. 3. Crp et Fur exercent leur effet régulateur en se fixant au niveau de motifs spécifiques dans le promoteur de gènes régulés. La forte conservation observée au niveau des régions C-terminales de 3 protéines permet de prédire qu'il est est très vraisemblablement de même pour FixK. Ceci suggère que l'effet répresseur de FixK pourrait s'exercer par liaison de FixK au niveau des promoteurs des gènes cibles PnifA et PfixK. REVENDICATIONS 1) Souche de Rhizobium manipulée génétiquement de façon à accroître son aptitude à la fixation symbiotique de l'azote, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi a) les mutants fixK affectés seulement dans la répression des gènes nif et fix et peu ou pas dans l'activation des gènes fix b) les mutants rendus totalement ou partiellement insensibles à l'effet répresseur de fixK. 2) Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit des mutants fixK correspondant à des mutations dans la séquence de la figure 2 ou d'une séquence équivalente codant pour fixK. 3) Souche selon la revendication I, caractérisée en ce qu'elle est affectée dans la biosynthèse d'un effecteur nécessaire à l'effet répresseur de FixK. 4) Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est mutée dans les promoteurs des gènes cibles nifA ou fixK au niveau de séquences impliquées dans la répression de FixK sans que cela affecte notablement l'activation de ces promoteurs pour FixJ. 5) Souche selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Rhizobium meliloti.- 6) Inoculum comportant une souche selon l'une des revendications I à 5 et un support acceptable en agriculture. 7) Plasmide ou séquence d'ADN comportant le gène fixK.