Brevet FR2647638A1 — publié le 19901207

La présente invention concerne le domaine de l'alimentation humaine ou animale. Telle a particulièrement pour objet une composition elimenteire originale ainsi qu'un procédé pour valoriser de manière améliorée certains produits déjà utilisés en alimentation. Il est bien connu que certaines substances résis- tent à la digestion. Les organismes supérieurs possèdent au niveau de leur tube digestif des complexes enzymatiques permet tant de dégrader l'essentiel des composés organiques des aliments. Par organismes supérieurs on entend, au sens de la présente description, I'homme ou les animaux de rente, de compagnie ou de laboratoire. Les protides, les lipides et la plupart des glucides sont hydrolysés rapidement en petites molécules ensuite absorbées et utilisées par l'organisme. Cependant certains substrats, principalement de nature glucidique, échappent à la digestion par suite d'une carence en enzymes nécessaires à leur hydrolyse. Ce sont principalement les alpha-galactosides, les glucides pariétaux qui sont les constituants majeurs des fi brefs, telles que la cellulose ou les hémi-celluloses, mi - c e I I u I ose s , i e les pectines, la lignine. D'autres substances sont aussi intéressées par ce type de problème, même si ces dernières sont trouvées e-n quantité moindre ou de manière anecdotique, il s agit notamment de phytates, de polyphénols, de tannins, de cutines, ou meme d'inuline trouvée par exemple en grande quantité dans le topinambour ou dans l'artichaut. D'autres substances faisant parties du bol alimentaire mais ayant été introduites dans un but non nutritionnel, par exemple dans un but de conservation ou de coloration de l'aliment, sont aussi concernées par ce problème. Chimiquement ces additifs peuvent être classés parmi les gommes, les mucilages, les alginates et les carraghénates. Les alpha-galactosides sont définis comme des oli- gosaccharides de formule générale: (galactose),-saccharose. Ces petits polymères par suite d'une ddficience des organismes supérieurs en alpha-galactosidase, ne sont pas hydrolysés dans l'intestin grele. Ils parviennent donc intacts dans le colon où ils sont fermentés sous l'action de nombreux microorganismes avec production de gaz. Il en résulte deux inconvénients majeurs, d'une part une diminution globale de la valeur énergétique de l'aliment, et d'autre par t cette fermentant ion est une source d'inconfort pour l'homme ou l'animal, et elle peut provoquer des troubles digestifs. Une dépolymérisation des alpha-galactosides en galactose et saccharose facilement rntabol isables par l'organisme permettrait de résoudre ces problèmes. Cependant la destruction de ces alpha-galactosides nécessite l'emploi d'enzymes. En effet, ces composés sont très résistants et ne peuvent être altérés par les procédés chimiques et physiques habituels. Dans l'état des connaissances du Demandeur, le traitement des aliments pour animaux en vue de la dégrada- tion des substances ne pouvant être digérées dans des condit ions physiologiques normales dans le tube digestif, a toujours eu lieu avant l'ingestion per l'animal de sa nourriture. A titre illustratif, un procédé pour la dégradation d'alpha-galactosides -a fait l'objet d'une demande de brevet européen N0 O. 081. 262. Celle-ci concerne une souche de Saccharomyces cerevisiae capable de produire une activité alpha-galactosidasique ainsi qu'une méthode de préparation de ce microorganisme. Cette demande a aussi pour objet une méthode de dégradation des ol igo-saccharides et monosaccharides contenus dans le lait de soja, ladite méthode étant caracterisée en ce que l'on met en contact des extraits de fermentation de la souche revendiquée avec le lait de soja. Ce document antérieur décrit une diminution dans le lait de soja du taux de stachyose, passant de 5,5% à 0,1%, et de raffinose, passant de 1,5% à 1, après traitement. Tous les procédés de dégradation par traitement enzymatique de substances non dégradables, connus à ce jour, sont des traitements effectués avant l'ingestion de l'aliment par l'homme ou l'animal. Le fait de devoir insérer une telle étape de dégradation avant l'ingestion représente un inconvénient majeur pour l'industrie agro-alimentaire, car notamment elle nécessite des quantités d'eau irpportan tes; de plus les monomères ainsi libérés peuvent alors être dégradés avant l'ingestion par l'animal. La présente invention concerne une composition comprenant au moins un produit pour l'alimentation humaine ou animale et au moins un enzyme, ledit enzyme permet tant la dégradation in si tu 'de substances non digérées dans les conditions physiologiques normales, ainsi qu'un procédé pour la valorisation d'un produit pour l'alimentation humaine ou animale, ledit produit contenant au moins un constituant échappant à la digestion dans les conditions physiologiques normales. L'objet de l'invention est donc une composition contenant un produit pour l'alimentation humaine ou animale et un enzyme dont l'activité permet la dégradation in situ, c'est-à-dire dans le tube digestif de l'homme ou de l'animal des substances échappant à la digest ion non-microbienne dans les conditions physiologiques normales. Cet enzyme résiste au moins partiellement à la dégradation par les protéases du système digestif et possède une activité importante de dégradation des substances dont il est spécifique. Ledit enzyme fonctionne de manière optimale dans les conditions physiologiques du tube digestif et de plus ne présente de toxicité ni pour l'homme ni pour l'animal. L'objet de l'invention est donc une composition comprenant au moins un produit pour l'alimentation humaine ou animale, ledit produit contenant au moins un constituant échappant å la dégradation lors de la digestion non microbien ne par l'organisme, ladite composition étant caractérisée en ce qu'et le comprend en outre au moins un enzyme capable d'hydrolyser ledit constituant au cours de la diges tion, ledit enzyme n'étant pas présent naturellement dans le système digestif et étant sensiblement sans effet sur ledit constituant avant l'ingestion de la composition. Au sens de la présente description, I'expression "enzyme non présent naturellement dans le tube digestif" signifie que cet enzyme n'est pas synthétisé, ou est synthétisé en quantité insignifiante, par l'organisme dans les conditions normales de la digest ion. Cette expression exclut donc les enzymes provenant de microorganismes hôtes du tube digestif. Il n'était nullement prévisible que l'enzyme se trouvant sous forme sèche, au sein de la composition alimentaire. puisse exercer son activité de manière efficace lors de la digestion. On sait à ce sujet que, dans de nombreux cas, les enzymes sont dégradés dans la partie antérieure du système digestif à un point tel qu' ils perdent leur activité spécifique. Une autre difficulté est que l'enzyme, même après avoir résisté aux premières phases de la digest ion, puisse exercer son activité dans les conditions de pH et de température propres à celle-ci. Dans un mode de mise en oeuvre préféré de t' inven- tion, la composition est présentée sous une forme sèche et notamment sous forme de farine ou sous forme agglomérée, tels que des granulés, ou autres formes de présentation usuelle dans l'alimentation humaine ou animale. Ce type de présentation présente un intérêt notable pour la nutrition des animaux. Les produits convenant à t ' a I i me n t a t i o n peuvent tre notamment les grains, graines, tourteaux et autres sous produits industriels. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, l'enzyme est spécifique du ou des constituants à hydrolyser dans ledit produit pour l'alimentation humaine ou animale, et ledit enzyme est présent en une quantité efefficace pour hydrolyser au moins partiellement ledit consti tuant au cours de la digestion. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, cet enzyme est choisi parmi les enzymes spécifiques dont l'activité est optimale dans les conditions, notamment de pH et de température, de la digestion dans l'organisme. Cet enzyme peut être sous une forme purifiée, ou être mélangé à d'autres enzymes ayant d'autres activités. On peut aussi ajouter l'enzyme sous forme d'une préparation de microorganismes capables de produire ledit enzyme. Pour les besoins de l'invention, on peut utiliser un enzyme d'origine quelconque, ou des mélanges de tels enzymes, la seule condition étant que la préparation enzymatique possède l'activité enzymatique recherchée. On peut ainsi mettre en oeuvre des enzymes provenant de bactéries, de levures ou de champignons ou même des enzymes synthétiques. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, ledit enzyme est thermorésistant, notamment en vue de résister aux températures mises en jeu dens la préparation de la composition. Ladite composition est préparée par des procédés connus en eux mêmes par l'homme de l'art, par mélange intime de l'enzyme spécifique et du produit pour l'alimentation huma inde ou animale, suivi éventuellement d'un traitement d'agglomération. L'invention a également pour objet, un procédé pour la valorisation d'un produit pour l'alimentation humaine ne ou animale, contenant au moins un constituant échappant à la digestion dans l'organisme, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on mélange intimement audit produit une quantité efficace d'au moins un enzyme capable d'hydrolyser ledit constituant au cours de la digest ion, ledit enzyme n'étant pas présent naturellement dans le tube digestif et étant sens i b I eme n t sans effet sur ledi t constituant avant l'ingestion de la composition. La description qui suit donne à titre illustratif et non limitatif un exemple d'application de l'invention aux alpha-galactosides. EXEMPLE Comparaison de l'efficacité de quatre régimes alimentaires chez le rat a) Composition des régimes alimentaires Les quatre régimes suivants ont été utilisés:. - le régime de base (B) dont la composition figure tableau I a été conçu de manière à contenir un minimum de substances fermentescibles et à couvrir les besoins de rats en croissance. Ce régime a servi de base à la constitution des autres régimes expérimentaux. - le régime BE a été obtenu par adjonction de 5% de l'enzyme au régime B. - le régime BR a été réalisé à partir du régime B par adjonction de 5% de raffinose. - le régime BRE a été constitué par adjonction de 5% de raffinose et 5% d'enzyme au régime B. La cellulose est une cellulose de bois de type COLMALCEL. La composition du complément minéral (CM) est donnée dans le tableau 2 et celle du complément vitaminique (CV) est donnée dans le tableau 3. Dans le cas des régimes BR et BRE, le raffinose a été fourni par la Société SIGMA (R0250) et la préparation enzymatique est une préparation cel lulasique de la Société hollandaise GIST-BROCADES, contenant une activité secondaire alpha-galactosidasique. L'activité galactosidasique a été déterminée par la méthode de BERGMEYER (1974 - Methods of enzymatic analysis - Academic Press, New York). L'activité est dosée par libération de phénol après action de l'enzyme sur du para-nitro-phényl-galactose (PNPGai ) . 0.4 ml d'une solution 4 mM de PNPGal en tampon phosphate 0,1 mM à pH 6,5 et 0,4 ml d'une solution enzymatique à 0,01 M en tampon phosphate 0,1 mM à pH 6,5 sont mises à incuber à 400C pendant 0, 10, 20 et 30 minutes. Ensuite 0,1 ml du milieu réactionnel est ajouté à 0,6 ml d'une solution de carbonate de sodium @M. La densité optique est lue à 400 nm. La pente de la droite obtenue en fonction de la durée de l'incubation permet d'estimer l'activité alpha-galactosidasique L'enzyme utilisé possède une activité correspondant à la dégradation de 52 mg de raffinose par mg d'enzyme en 2 heures à 400C et pH 6,5. Les teneurs en raffinose ont été déterminées sur les aliments BR et BRE. Afin de tenir compte des transformations susceptibles d'intervenir à 250C durant la période de mesure, les aliments ont été conservés pendant 3 jours à cette température avant analyse. Le raffinose a été extrait avec un mélange éthanol /eau (80/20) à ébullition et à reflux; I'emploi d'éthanol permet d'inactiver rapidement toute activité alpha-galactosidasique. Après extraction, le raffinose a été dosé par chromatographie liquide à haute pression selon la méthode de QUEMENER (1988 - Improvement in the high pressure liquid chromatographic determination of amino-sugars and alpha-galactosides in Faba bean, lupine and pea. J. Agric. Food. Chem -36: 754 - 759). La teneur en raffinose a été dosée dans les aliments BR et BRE afin de déterminer le taux d'hydrolyse sous l'action éventuelle de l'alpha-galactosidase. La teneur des deux ai piments en raffinose est identique et égale à 5,15% de matière sèche (MS): l'enzyme n'hydrolyse pas le raffinose dans l'aliment et les animaux ont reçu des quantités identiques de raffinose. Durant le déroulement de l'expérimentation, les aliments ont été conservés au froid, à 4 0C. TABLEAU 1 Composition du régime de base (RB) Taux d'incorporation (% en frais) Amidon de mais 68,6 Caséine 20,0 Methionine 0,4 Cellulose 1,0 Huile de mais | 5,0 t CM 1 4,5 CV 0,5 TABLEAU 2 Composition du complément minéral CM CONSTITUANTS t TENEURS % j Carbonate de calcium 18,2 Oxyde de magnésium 2,0 t Iodure de potassium I 0,001 | | Phosphate bicalcique, 2H2O 1 38,0 1 Phosphate bipotassique 24,0 Chlorure de sodium 7,0 | Sulfate de cuivre (25% Cu), 5 H20 | 0,1 | Sulfate de zinc (34% Zn), H2O 0,5 Sulfate de cobalt (21% Co), 7H2O 0,001 Sulfate de fer (20 % Fe), 7 H20 | 0,7 j | Sulfate de manganèse (30% Mn), H2O 1 0,45 f Sulfate de magnésie (16% MgO), 7 H2O 9,0 Selenite de sodium (30% Se), 5 H2O 0,001 Molybdate d'aluminium, 4 H2O 0,001 TOTAL 100 TABLEAU 3 Composition du complément vitaminique CV CONSTITUANTS TENEURS % Vitamine A (500000 UI/g) 0,81 Vitamine D3 (100000 UI/g) 0,40 Vitamine E (250 UI/g) 8,06 Vitamine K 0,04 (Chlorhydrate de thiamine (B1) j 0,10 I Riboflavine (B2) 1 0,16 (Chlorhydrate de pyridoxine (86) 1 0,10 Acide ascorbique (C) f 2,02 j Acide folique 1 0,04 | Acide para-aminobenzoique 1 2.02 Concentrat de vitamine B12 (500 mg/kg) 1,21 Inositol 2,02 Blotine (1%) 0,81 t Pantothénate de calcium 1 0,81 | t Concentra t de choline à 50% 1 81,41 f Niacine 0,81 1 | TOTAL 1 100 b) - Cycles d'alimentation des rats L'expérimentation 8 été réalisée sur 4 rats mâles de race WISTAR recevant successivement, dans un ordre aléatoire, selon un dispositif en carré latin (tableau 4), quatre régimes (PI, PII, PI il, PIV) différant par leur teneur en alpha-galactosides et en alpha-galactosidase. Les animaux étaient âgés de 8 semaines en début d'expérimentation et 15 semaines en fin d'expérimentation. TABLEAU 4 Plan du carré latin i Période | Animal 1 | Animal 2 Animal 3 Animal 4 1 I BE BRE B BR II B BR BE BRE III BRE BE BR B IV BR B BRE BE Pour chaque animal, l'expérimentation comporte donc 4 périodes correspondant à chacun des 4 régimes. Chaque période comprend une période d'adaptation de 9 jours, effectuée dans des cages individuelles de croissance et une période de mesure de 3 jours. c) - Consommation alimentaire des animaux Durant les périodes d'adaptation, les animaux ont été nourris ad libitum; la distribution d'aliment a été effectuée quotidiennement. Les refus ont été collectés quotidiennement et regroupés sur la durée de la période. Les teneurs en MS des aliments et des refus ont été déterminées par séchage à poids constant à 1000C. Lors des périodes de mesure, les aliments ont été distribués en une fois à raison de 110% de la consommation de 3 jours mesurée lors de la période d'adaptation. Les re- fus ont été collectés en fin de période de mesure. Les teneurs en MS des aliments et des refus ont été déterminées. Le comportement général des animaux a été très satisfaisant. La consommation alimentaire, représentée tableau 5, est voisine pour tous les régimes expérimentaux et proche de 20 g de MS/j/animal. Les régimes ont été bien acceptés, sans effet néfaste de la présence de raffinose ou de la préparation enzymatique. En particulier, aucun cas de diarrhée n'a été constaté. La croissance des animaux (Figure 1) a été mesurée à titre indicatif. Non différente statistiquement selon les régimes, elle se situe en moyenne à 4,8 g/j/animal. La Figure I est un graphique illustrant l'influence de la nature des régimes sur la croissance des animaux. On a porté en ordonnées, exprimés en grammes calculés sur trois jours, les chiffres correspondant à la croissance des rats. L'indice de consommation est en moyenne de 4,4. Cette valeur élevée traduit essentiellement une croissance faible des animaux; les conditions de content ion imposées par la présence en chambre respiratoire peuvent expliquer ce résultat. TABLEAU 5 Consommation d'aliments (g/MS/j) B BE BR BRE Période I 14,2 18,0 23,7 23,1 Période II 21,7 18,9 16,1 17,4 Période III 17,5 17,1 20,2 17,6 Période IV 21,6 17,5 17,4 17,4 f f f f r Moyenne 1 18.7 17,9 19,3 18,9 Erreur STD 1,8 0,4 1,7 1,4 d) - Détermination des productions de gaz intestinaux La mesure de la production de gaz intestinaux consécutive aux régimes e xpé r i mentaux a été réel isée au moyen d'une chambre respiratoire dont le schéma de principe est représenté Figure I. L'animal en expérience est placé dans une enceinte (I) où il a à sa disposition de l'eau à volonté et l'aliment testé. Le renouvellement et l'homogénéïsation de l'air sont assurés par une pompe à membrane (2). Le gaz carbonique (CO2) dégagé est capté par bar bottage dans une solution aqueuse de potasse (3). L'eau provenant de la respiration est fixée par passage sur gel de silice ACTIGEL (4). Une électrode à oxygène (5), placée en sortie de cage, mesure la concentration du circuit en oxygène et permet de la maintenir constante par action sur un régulateur (6) relié à une électrovanne (7), elle meme reliée à une bouteille d'oxygène (8). Le sens de circulation des gaz dans le dispositif est signifié par la flèche (F). Durant les périodes de mesure, la température a été maintenue à 250C; l'hygrométrie, suivie en continu, a été comprise entre 50 et 60. Au cours des périodes de mesures, deux échant il - lons quotidiens d'air ont été pré levés dans la chambre respi oratoire pour analyse de l'hydrogène et du méthane. Les déterminations des concentrations en hydrogène et en méthane ont été effectuées dans les conditions suivantes: * chromatographie en phase gazeuse (QUINTRON) * colonne remplie (2m, température ambiante) * phase: tamis moléculaire * gaz vecteur: a i r médical. La pente de la régression de la concentration de gaz en fonction du temps a été utilisée pour déterminer la concentration théorique de chacun des gaz issus des fermentalions intestinales au bout de 3 jours. La production d'hydrogène étant seule reconnue comme liée à la fermentation de sucres indigestibles, les résultats relatifs à la production de méthane n'ont pas été pris en compte. Les concentrations en hydrogène pour les di ffé- rents régimes sont représentées dans le tableau 6. Le régime BR donne des valeurs très élevées et significativement différentes des autres régimes (p Les régimes B et BE donnent des résultas très semblables: la préparation enzymatique ajoutée au régime n'a aucune ac- tion sur la fraction pariétale de l'aliment. Sa seule action décelable consiste donc en une dégradation du raffinose contenu dans les régimes expérimentaux. TABLEAU 6 Concentrations en hydrogène après 72 heures dans l'air expiré (ppm) B BE BR BRE Période I 28 23 928 37 Période II 26 35 117 67 Période III 35 55 381 27 Période IV 40 33 362 63 Moyenne 32 37 447 49 Erreur STD 3 7 171 10 Le résultant majeur de cette expérimentation est la mise en évidence d'une diminution des fermentations liées à l'ingestion de raffinose consécutive à l'incorporation d'une activité alpha-galactosidasique dans l'aliment. L'absence de fermentation traduit une hydrolyse totale du raffinose qui ne parvient plus au côlon. Le raffinose n'est pas hydrolysé dans l'aliment où il a été retrouvé intact: l'action de l'enzyme s'est située dans le tube digest if. II est également montré dans cette expérience que le niveau d'incorporation de l'enzyme et ses conditions d'action, proches de celles existant dans l'intestin grêle, ont conduit à une hydrolyse totale du raffinose ajouté. Les conditions d'action de l'enzyme, proches de celles existant dans l'intestin grêle et le niveau d'incorporation de l'enzyme au régime sont des paramètres favorables. Cette expérimentation démontre l'activité dans le tube digestif d'un enzyme incor po ré dans l'aliment. L'expérimentation réalisée montre aussi que l'alpha-galactosidase étudiée résiste à la dégradation par des enzymes endogènes et exprime sa potentialité dans le tube digestif, permettant ainsi, ajoutée à un régime alimen- taire d'en détruire totalement les alpha-galactosides. REVENDICATIONS 1. Composition comprenant au moins un produit pour l'alimentation humaine ou animale, ledit produit contenant au moins un constituant échappant à la dégradation lors de la digestion non microbienne par l'organisme, ladite composition étant caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un enzyme capable d'hydrolyser ledit constituant au cours de la digestion, ledit enzyme n'étant pas présent naturel lement dans le système digestif et étant sensiblement sans effet sur ledit constituant avant l'ingestion de la composition. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est présentée sous forme sèche. 3. Composition selon la revendication 2. caracté risée en ce qu'elle est présentée sous forme de farine ou sous forme agglomérée, tels que des granules ou autres formes de présentation usuelle existant pour l'alimentation huma inde ou animale. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisée en ce que le produit convenant à l'alimentation est choisi parmi les grains, graines, tourteaux, et autres sous-produits industriels. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisée en ce que l'enzyme est spécifique du ou des constituants à hydrolyser dans ledit produit pour l'alimentation humaine ou animale. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications I à 5, caractérisée en ce que ledit enzyme est présent dans un mélange d'enzymes ayant des activités diverses. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications I à 6, caractérisée en ce que ledit enzyme est présent en une quantité efficace pour hydrolyser au moins p a r t i e i I eme n t ledit constituant au cours de la digest ion. 8. Composition selon l'une quelconque des revendi cations I à 7, caractérisée en ce que ledit enzyme est choisi parmi les enzymes spécifiques dans les conditions notamment de pH et de température de la digestion dans l'organisme. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications I à 8, caractérisée en ce que le constituant résistant à la dégradation est un slpha-galactoside et en ce que ledit enzyme est une alpha-galactosidase. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications I à 9, caractérisée en ce que ledit enzyme est thermorésistant notamment en vue de résister aux températures mises en jeu lors de la préparation de la composition. il. Procédé pour la valorisation d'un produit pour 'ai imentat ion humaine ou animale, contenant au moins un constituant échappant à la digest ion non-microbienne dans ltorganisme, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'on mélange intimement audit produit une quantité efficace d'au moins un enzyme capable d'hydrolyser ledit constituant au cours de la digestion avant la fin de l'intestin grêle, ledit enzyme n'étant pas présent naturellement dans le système digestif et étant sensiblement sans effet sur ledit constituant avant l'ingestion de la composition.