Brevet FR2644163A2 — publié le 19900914

FR 2644163 A2 19900914 FR 8903192 A 19890310 Procédé de marquage d'une sonde nucléique et trousse de réactifs pour la mise en oeuvre de ce procédé L'invention concerne un procédé de marquage non radioactif d'une sonde nucléique, ainsi qu'une trousse de réactifs pour la mise en oeuvre de ce procédé. Dans le Brevet français No 88 09598, on a décrit un procédé de marquage d'un acide nucléique dans une sonde nucléique comportant une séquence nucléique-sonde propre à s'hybrider avec une séquence nucléique-cible complémentaire, dans lequel on réalise le marquage de l'acide nucléique par pontage chimique direct d'un système de révélation au moyen d'un composé hétérobifonctionnel. Ce composé hérétobifonctionnel est capable de réagir à la fois avec le ou les acides nucléiques à marquer et avec un système de révélation, qui peut être notamment une pro- téine, ce qui permet d'établir un pontage entre les deux types de molécules. Le système de détection peut être ainsi lié directement à la sonde nucléique, et cela quelles que soient la longueur et la nature (ADN ou ARN) de la séquence nucléique-sonde. L'un des intérêts du procédé cidessus est que le pontage chimique du système de révélation ne s'effectue pas sur la séquence nucléique-sonde proprement dite, mais sur un acide nucléique qui est lui-même relié à cette séquence nucléique-sonde. Dans une forme de réalisation décrite au Brevet français précité, on réalise le pontage du système de révélation sur un acide nucléique de la sonde elle-même, à condition toutefois que ce pontage laisse la possibilité à l'acide nucléique qui forme la séquence-sonde de s'hybrider à la séquencecible, faute de quoi ladite séquence-sonde ne pourrait s'hybrider significativement à la séquence-cible, du fait de l'encombrement stérique créé par le pontage. Dans une autre forme de réalisation décrite au Brevet fran- çais précité, on réalise le pontage du système de révélation sur un acide nucléique ne faisant pas partie de la sonde et on accroche ensuite l'acide nucléique ponté ainsi obtenu sur la sonde. L'invention a pour objet un perfectionnement au procédé ci-dessus, selon lequel l'acide nucléique marqué est un vecteur simple brin comportant une séquence nucléique circulaire. L'avantage d'utiliser un tel vecteur réside notamment dans la possibilité de ponter le système de révélation tout autour de la séquence circulaire, par l'intermédiaire du composé hétérobifonctionnel, et d'amplifier ainsi le signal de révélation. Un autre avantage qui en résulte est de ne pas avoir à dénaturer cet acide nucléique et de ne pas craindre une auto-renaturation dans le milieu d'hybridation. Le vecteur simple brin est avantageusement un acide nucléi- que d'un phage, d'un plasmide ou encore d'un épisome. A ce titre, on préfère utiliser un phage de type M13. Les phages M13 sont des bactériophages filamenteux dont le génôme est constitué d'un ADN simple brin circulaire de 6500 nucléotides environ et ils sont utilisés habituellement comme vecteurs de séquençage. Mais on peut aussi utiliser tout autre bactériophage de ce type, par exemple le phage Fd, 4X 174, G 4, R 17, etc. Dans une première forme de réalisation du procédé de l'invention, le vecteur simple brin est hybridé en sandwich sur la sonde nucléique. Avantageusement, le vecteur comporte, clonée dans sa séquence circulaire, une partie d'un gène de résistance à un antibiotique propre à s'hybrider avec une partie d'un gène de résistance à un antibiotique qui est accrochée à la séquence nucléique-sonde. Bien que l'on préfère utiliser le gène de résistance à l'Ampicilline (AmpR), on peut faire appel à d'autres gènes du même type, par exemple au gène de résistance à la Tétra- cycline, au Chloramphénicol, à la Streptomycine, etc. Ainsi, le vecteur préalablement marqué par le système de révélation pourra s'hybrider avec la séquence nucléique- sonde et cette dernière pourra également s'hybrider avec la séquence nucléique-cible complémentaire éventuellement présente dans l'échantillon biologique à tester, d'o il résulte un procédé de détection à double hybridation. L'un des intérêts résultant de l'utilisation du gène de résistance à l'Ampicilline est que ce gène n'existe pas dans les cellules eucaryotes. On est donc assuré que la partie du gène clonée dans la séquence circulaire du vecteur ne pourra pas s'hybrider avec la séquence nucléiquecible, mais seulement avec la partie du gène liée à la séquence nucléique-sonde. De plus, le gène précité constitue un outil couramment uti- lisé dans les techniques de clonage. Selon l'invention, la double hybridation précitée peut être conduite selon deux modes d'exécution principaux. Selon un premier mode d'exécution, l'hybridation en sandwich du vecteur marqué sur la sonde nucléique est effectuée préalablement à l'hybridation de la séquence nucléique-cible sur la séquence nucléique-sonde. Selon un second mode d'exécution, l'hybridation en sandwich du vecteur marqué sur la sonde nucléique est effectuée simultanément avec l'hybridation de la séquence nucléique-cible sur la séquence nucléique-sonde. Quel que soit le mode d'exécution choisi -hybridations en succession ou hybridations simultanées- on conduit ces hybridations en milieu liquide, ainsi qu'il est bien connu dans la technique. La première forme de réalisation précitée, dans lequelle le vecteur simple brin est hybridé en sandwich sur la sonde nucléique, est particulièrement intéressante à des fins de recherches. En effet, le vecteur simple brin marqué par le système de révélation, est d'application universelle puisqu'il peut s'hybrider à n'importe quelle sonde, pourvu que celle-ci comporte, tout comme le vecteur, une partie du gène de résistance à l'antibiotique considéré, par exemple le gène de résistance à l'Ampicilline. Dans une variante de réalisation, le vecteur simple brin comporte, clonée dans sa séquence circulaire, la séquence nucléique-sonde. On obtient ainsi une sonde spécifique qui est prévue pour la détection d'une séquence nucléique-cible complémentaire de la séquence nucléique-sonde. Par exemple, la séquence nucléique-cible clonée dans le vecteur simple brin peut être celle du virus HIV du SIDA, ce qui permet d'obtenir une sonde de détection spécifique de ce virus. Cette variante de réalisation est donc tout particulièrement intéressante à des fins de diagnostic, du fait de la spécificité de la sonde. La détection de la séquence nucléique-cible éventuellement présente dans l'échantillon biologique à analyser implique alors une seule hybridation, c'est-à-dire l'hybridation entre la séquence nucléique-cible et la séquence nucléique-sonde. Dans le Brevet français No 88 09598, on a décrit différents systèmes de révélation propres à assurer le marquage de l'acide nucléique au moyen du composé hétérobifonctionnel. Les systèmes de révélation décrits peuvent être des proté- ines, notamment des enzymes telles que la phosphatase alca- line, des anticorps, etc., ou encore des systèmes de nature non protéique, notamment des composés fluorescents. Selon un autre aspect, l'invention préconise d'utiliser dans le procédé de marquage un autre système de révélation. Le système envisagé est un système de bio-luminescence, c'est-à-dire un système à la fois protéique et luminescent, qui est propre à transformer un substrat non fluorescent en un produit fluorescent ou un substrat non phosphorescent en un produit phosphorescent. Comme systèmes de bio-luminescence utilisables conformément à l'invention, on peut citer notamment les systèmes utilisant la luciférase et la luciférine selon la réac- tion suivante: LH2 + ATP + 02 M++> L = O + CO2 + AMP + PPi + hv Une autre réaction peut être utilisée dans laquelle le système luminescent consiste en deux catalyses: - l'une avec une NAD(P)H: FMN oxydoréductase, - l'autre avec une luciférase bactérienne selon les réac- tions suivantes: NAD(P)H + FMN + H+ > NAD(P)+ + FMNH2 FMNH2 + RCHO + 02 > FMN + RCOOH + H20 + hk Par ailleurs, sous un autre aspect, l'invention concerne aussi une trousse de réactifs, ou "kit", pour la mise en oeuvre du procédé défini précédemment. Cet ensemble comprend essentiellement: - 1 flacon contenant de la luciférine - 1 flacon contenant de 1'ATP et un tampon réactionnel - 1 flacon contenant de la luciférase ou bien - 1 flacon contenant un composé aldéhydique à longue chaine, - 1 flacon contenant du NAD(P) + FMN + H+ + un tampon réac- tionnel - 1 flacon contenant une diaphorase - 1 flacon contenant de la luciférase bactérienne ou encore - 1 flacon contenant un composé aldéhydique à longue chaine - 1 flacon contenant du FMNH2 et un tampon réactionnel - 1 flacon contenant de la luciférase bactérienne. Dans la description qui suit, donnée seulement à titre d'exemple, on se réfère au dessin annexé, sur lequel: - la figure 1 représente schématiquement une sonde propre à la mise en oeuvre du procédé selon la première forme de réalisation définie précédemment; et - la figure 2 représente une sonde propre à la mise en oeuvre du procédé selon la seconde forme de réalisation définie précédemment. Sur la figure 1, on a représenté schématiquement une séquence nucléiquecible SNC faisant partie d'un échantillon biologique à analyser. La séquence nucléique-cible, qui peut être par exemple un ADN monobrin, est fixée sur un support solide approprié (non représenté), par exemple une membrane de nylon ou de nitrocellulose. Pour détecter la séquence nucléique-cible, on fait appel à une sonde comprenant une séquence nucléique-sonde SNS mono-brin, de structure complémentaire de la séquence SNC, et propre à s'hybrider à celle-ci. Sur la séquence nucléique-sonde SNS est accrochée une séquence nucléique comportant une partie du gène de résistance à l'Ampicilline, désigné par AmpR. Cette partie de gène AmpR est propre à shybrider avec une autre partie de gène AmpR intégrée dans la séquence nucléique circulaire monobrin d'un phage M13. La partie du gène AmpR est clonée, par des techniques de clonage en elles-mêmes connues, au sein de la séquence circulaire du phage M13. Sur la séquence nucléique circulaire du phage M13 est ponté chimiquement, au moyen d'un composé hétérobifonctionnel CHB, un système de révélation SR pouvant être constitué notamment par une enzyme de révélation. Le pontage chimique du système de révélation sur la séquence nucléique du phage M13 s'effectue conformément à la technique décrite dans le Brevet fran- çais précité, dont le contenu est considéré comme incorporé à la présente description. Le vecteur M13 peut ainsi s'hybrider avec la séquence nucléique-sonde, et cela par l'intermédiaire des deux parties de gène AmpR. Le vecteur M13 marqué et incorporant le gène AmpR est ainsi d'une application universelle puisqu'il peut s'hybrider avec toute sonde comportant une séquence nucléique-sonde SNS quelconque. Ainsi, la détection de la séquence nucléique SNC, éventuellement présente dans l'échantillon à tester, s'effectue par une double hybridation. Ces deux hybridations peuvent être effectuées en succession: on hybride d'abord le vecteur M13 sur la sonde et on hybride ensuite la séquence nucléique-sonde SNS avec la séquence nucléique-cible SNC. On peut aussi effectuer simultanément l'hybridation du vecteur M13 avec la sonde et l'hybridation de la séquence SNS avec la séquence SNC. Dans tous les cas, ces hybridations s'effectuent avantageusement en milieu liquide, ainsi qu'il est bien connu dans cette technique. Dans la forme de réalisation de la figure 2, à laquelle on se réfère maintenant, la séquence nucléique-cible SNC à analyser est détectée au moyen d'une sonde spécifique. Ladite sonde comprend une séquence nucléique-sonde SNS, complémentaire de la séquence nucléique-cible SNC à détecter, et clonée dans la séquence nucléique monobrin circulaire d'un phage M13 identique ou analogue au phage décrit précédemment. Sur la séquence nucléique du phage M13 est également ponté chimiquement, par l'intermédiaire d'un composé hétérobi- fonctionnel CHB, un système de révélation SR. La détection de la séquence SNC s'effectue alors par simple hybridation. Si la séquence SNS de la sonde reconnaît une séquence SNC complémentaire, ces deux séquences s'hybrideront pour former un duplex et le système de révélation SR se trouvera ainsi lié in situ à la séquence SNC. Dans les deux exemples ci-dessus, le système de révélation SR peut être constitué par une enzyme ou par tout autre système de révélation déjà décrit dans le Brevet français précité. On peut également faire appel à un système de bio-lumines- cence comme décrit ci-dessus. Revendications 1.- Procédé de marquage d'un acide nucléique dans une sonde nucléique comportant une séquence nucléique-sonde propre à s'hybrider avec une séquence nucléique-cible complémen- taire, dans -lequel on réalise le marquage dudit acide nucléique par pontage chimique direct d'un système de révélation au moyen d'un composé hétérobifonctionnel, conformément à la revendication 1 du Brevet principal, caractérisé en ce que ledit acide nucléique marqué est un vecteur simple brin comportant une séquence nucléique simple brin circulaire. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le vecteur simple brin est un acide nucléique d'un phage, d'un plasmide, ou encore d'un épisome. - 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le vecteur simple brin est un phage de type M13. 4.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caracté- risé en ce que le vecteur est hybridé en sandwich sur la sonde nucléique. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le vecteur comporte, clonée dans sa séquence circulaire, une partie d'un gène de résistance à un antibiotique propre à s'hybrider avec une autre partie d'un gène de résistance à un antibiotique accrochée à la séquence nucléique-sonde faisant partie de la sonde. 6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le gène est le gène de résistance à l'Ampicilline (AmpR) ou tout autre gène du même type, tel que le gène de résistance à la Tétracycline, au Chloramphénicol ou à la Streptomycine. 7.- Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caracté- risé en ce que l'hybridation en sandwich du vecteur sur la sonde nucléique est effectuée préalablement à l'hybrida- tion de la séquence nucléique-cible sur la séquence nuclé- ique-sonde. 8.- Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caracté- risé en ce que l'hybridation en sandwich du vecteur sur la sonde nucléique est effectuée en même temps que l'hybri- dation de la séquence nucléique-cible sur la séquence nucléique-sonde. 9.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caracté- risé en ce que le vecteur comporte, clonée dans sa séquence circulaire, la séquence nucléique-sonde. 10.- Procédé de marquage d'un acide nucléique dans une sonde nucléique comportant une séquence nucléique-sonde propre à s'hybrider avec une séquence nucléique-cible complémentaire, dans lequel on réalise le marquage dudit acide nucléique par pontage chimique direct d'un système de révélation au moyen d'un composé hétérobifonctionnel, conformément à la revendication 1 du Brevet principal, caractérisé en ce que le système de révélation est un système de bio-luminescence propre à transformer un substrat non fluorescent en un produit fluorescent ou un produit non phosphorescent en un produit phophorescent. 11.- Trousse de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement les composants suivants: - 1 flacon contenant de la luciférine - 1 flacon contenant de 1'ATP et un tampon réactionnel - 1 flacon contenant de la luciférase ou bien - 1 flacon contenant un composé aldéhydique à longue chaîne, - 1 flacon contenant du NAD(P) + FMN H+ + un tampon réac- tionnel - 1 flacon contenant une diaphorase - 1 flacon contenant de la luciférase bactérienne ou encore - 1 flacon contenant un composé aldéhydique à longue chaîne - 1 flacon contenant du FMNH2 et un tampon réactionnel - 1 flacon contenant de la luciférase bactérienne.