Brevet FR2642767A1 — publié le 19900810

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs d'expression de protéines hétérologues dans des cellules eucaryotes, en particulier des cellules de mammifères. Par protéine hétérologue, au sens de l'invention, on entend une protéine qui n1 est pas exprimée naturellement par les cellules en cause, ou encore une protéine qui ntest pas nécessaire à la survie de ces cellules. De nombreux vecteurs faisant exprimer des gdnes codant pour de telles protéines hétérologues dans des cellules de mammifères ont déjà été décrits. Le besoin de disposer de vecteurs de plus en plus performants est permanent, notamment pour augmenter de façon sensible la quantité de produit synthétisé par le système hate et permettre la sélection des cellules productrices et la préparation de lignées cellulaires stables produisant ladite protéine en des quantités compatibles avec un rendement industriel. Différentes approches ont déjà été suggérées pour améliorer ltefficacité de ce type de vecteurs au niveau de la transcription comme au niveau de la traduction. Ainsi par exemple de nombreux vecteurs utilisent en tant que promoteur de la transcription de la séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue, des séquences hybrides comprenant les séquences activatrices du virus SV40 (répétitions de 72 paires de bases) associées au promoteur majeur tardif de l'Adénovirus 2. Une amélioration de l'efficacité de ce type de vecteur a déjà été obtenue par différents moyens, en insérant des séquences d'ADN supplémentaires originaires de SV40 (répétitions de 21 paires de bases) et capables de lier des facteurs de transcription ou encore des séquences du leader tripartite de l'Adénovirus 2 favorisant la traduction de l'ARN messager. La présente invention vise à fournir de nouveaux vecteurs, utiles notamment pour l'expression de protéines complexes tels que les facteurs de coagulation, dans les cellules de mammifères. Les vecteurs selon l'invention sont caractérisés en ce que les éléments assurant l'expression de la séquence codant pour la protéine hétérologue comprennent les éléments essentiels de la séquence leader et/ou de la séquence du promoteur du gène EIII de l'Adénovirus 2. Par élément essentiel on entend la séquence assurant il augmentation de la production de protéine et/ou le contrôle de 11 expression de la séquence pour le promoteur. Les adénovirus possèdent un ADN linéaire double brin qui dans le cas du sérotype 2 (Ad2) compte 35 eilobases. Les adénovirus ont cinq unités de transcription précoces ou plus dont celle du gène EIII et plusieurs unités de transcription tardives (1,2). La carte de restriction des éléments amont du gène EIII est représentée sur la figure 1. Les coordonnées indiquées pour les nucléotides correspondent à celles obtenues à partir de la séquence Ad2 de la banque de donnée EMBL. parmi les éléments importants du gene EIII, on distingue le promoteur et la séquence leader, le promoteur allant jusqu'au site Cap, et la séquence leader allant depuis le site Cap jusqu' l'ATG initiateur de la traduction. Différentes variantes de l'invention peuvent être réalisées. Dans une première variante, seule tout ou partie de la séquence leader du gène EIII, est présente sur le vecteur. De préférence, il s'agit d'une partie de la séquence qui comporte un intron, de sorte que le vecteur d'expression porte un intron dans la partie 5' non traduite de l'ARN messager (voir figure 1). Dans ce cas, on peut utiliser comme promoteur, tous les promoteurs fonctionnels pour exprimer des gènes hétérologues dans les cellules de mammifères. On peut citer par exemple celui du cytomégalovirus ou celui du gene de la métallothionine. Dans une seconde variante, le vecteur selon l'invention comprend tout ou partie du promoteur du gène EIII, c'est-à-dire la partie 5' des éléments de transcription allant jusqu'au site Cap. Une variante préférée est celle a le vecteur comprend à la fois la partié de la séquence'leader qui porte un intron et tout ou partie du promoteur du gène EIII de l'Adénovirus 2. Il est bien sûr préférable d'avoir à la fois la séquence leader et le promoteur correspondant au méme gène de l'Adénovirus 2. Il est avantageux, suivant une caractéristique supplémentaire de l'invention, d'ajouter un activateur de transcription, en particulier les séquences activatrices de SV40 (par exemple les répétitions de 72 paires de bases, ou encore celle de 21 paires de bases ou une association des deux). Les vecteurs selon l'invention sont en général des plasmides mais on peut également envisager des vecteurs viraux dans la mesure où il s'agit de virus dont le cycle comprend une étape dans laquelle le génome est sous forme d'ADN double brin comme par exemple les papillomavirus. Ils sont de préférence construits pour assurer l'intégration de la séquence codant pour la protéine hétérologue dans le génome de la souche hôte, de façon à obtenir des lignées cellulaires stables produisant ladite protéine. Afin d'obtenir des cellules comportant un grand nombre de copies du gène codant pour la protéine hétérologue, les vecteurs d'intégration peuvent c3mporter une séquence assurant l'intégration du vecteur en plusieurs centaines de copies comme par exemple le fragment d'ADN mitochondrial murin du plasmide p delta. Dans certains cas, il peut être intéressant, pour augmenter la production de la protéine hétérologue, que le vecteur comporte une séquence d'ADN supplémentaire, en aval de la séquence d'ADN codant pour ladite protéine hétérologue. Pour sélectionner les cellules transformées, le vecteur comporte de préférence un gene de sélection, par exemple le gene codant pour la xanthine-guanine phosphoribosyl-transférase (résistance à l'acide mycophénolique, XGPRT), ;e gène de résistance à la G418 (Néo), ou encore le gène ihydrofolate réductase (DHFR) qui confère la résistar. e au méthotrexate. On utilisera de préférence le gène Néo. Le gène de sélection peut être porté par une unité de transcription indépendante, ou encore être placé directement en aval de la séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue. Ce deuxième cas est particulierement avantageux, puisqu'il permet d'obtenir un double effet : augmentation de la production et amélioration de l'efficacité de sélection. Il peut aussi être avantageux de placer le gène de sélection dans un bloc d'expression polycistronique contenant un promoteur, une séquence drADN codant pour la protéine hétérologue, un gêne de sélection, un intron, un site de polyadénylation. En éffet, il a été démontré à plusieurs reprises que les ribosomes peuvent réinitier la traduction en aval du codon stop, et cette propriété est utilisée pour construire des plasmides contenant un bloc de sélection polycistronique. Comme gène de sélection, on peut employer ceux qui ont été cités plus haut; le gène de souris codant pour la dihydrofolale réductase (DHFR) et le gène bactérien de XGPRT. Afin de pouvoir sélectionner plus facilement, après transformation des cellules de mammifères, celles qui expriment la protéine hétérologue en quantité, il est particulierement avantageux d'ajouter à une unité polycistronique une unité de transcription d'un gène de sélection. De préférence, on utilisera un bloc d'expression du gène DHFR, par exemple sous le contrle du promoteur précoce de SV40 privé de sa séquence activatrice. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de cellules eucaryotes, afin d'obtenir des lignées cellulaires produisant une protéine hétérologue selon lequel on effectue la transformation de ces cellules par un vecteur selon l'invention et on sélectionne les cellules exprimant lesdites protéines. Parmi les méthodes de transformation utilisées, on peut citer en particulier la technique de coprécipitation au phosphate de calcium, qui sera mise en oeuvre dans les exemples ci-après. Enfin, l'invention a pour objet les lignées cellulaires obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, en particulier des lignées CR0 produisant du Facteur VIII ou du Facteur IX. En effet, l'invention est applicable à la préparation des facteurs de la coagulation sanguine et concerne donc également un procédé pour leur préparation, selon lequel on cultive les cellules sur un milieu de culture approprié et on récupère la protéine obtenue à partir de la culture. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description détaillée suivante. Celle-ci indique quelques exemples de constructions selon l'invention et leur application à l'expression de protéines complexes dans des cellules de mammifères. Les figures suivantes illustrent l'invention - La figure 1 schématise la carte de restriction des éléments de transcription amont du gene EIII. - La figure 2 représente schématiquement la structure du plasmide pSB394. - a figure 3 représente schématiquement la structure du plasmide pSBDH394. - La figure 4 représente schématiquement la structure des plasmides pTGEIII385, pTGEIIIDH385, pTGEIIINéo385. - La figure 5 représente schématiquement la structure du plasmide pTG2307. - La figure 6 représente schématiquement la structure du plasmide pTG2330. Exemple 1 Expression transitoire de facteur IX dans des cellules CR0 a) Construction de pSB394 et pSBDH394 Le plasmide pSB394 (fig. 2) est un vecteur dérivé de pTG157 décrit dans la publication européenne de brevet EP.A.0140762 où les séquences EcoRI - BglII codant pour la glycoprotéine rabique ont eté éliminées et remplacées par les fragments suivants - le fragment EcoRI - KpnI du polylinker de 113TG131 (3) - l'activateur entier du virus SV40 sous forme du fragment KpnI - Hindi de pSO (4) - une partie de la séquence du promoteur majeur tardif de l'Adénovirus 2, SmaI - BamHI de pM4 (5) - le fragment BamHI - BglII du polylinker de M13TG127, vecteur comprenant un polylinker de séquence 5' AGATCTGCAGGTCCAAGCTTGGACGGATCCCCGGGG CTC 3' comportant des sites de restriction BgIII, PstI, HindIlI, BamHI, SmaI et EcoRI.. - 1'ADN complémentaire du facteur IX BamHI de M13TG315 inséré dans le site BglII du polylinker. Il est obtenu en digérant le vecteur M13MP701 (3) par les enzymes BamHI et EcoRI puis en insérant les séquences EcoRI PstI de M13MP8 (6), le grand fragment PstI - FnuDII de 1'ADN complémentaire du facteur IX (de pTG397 (7)) et un adaptateur FnuDII - BamHI de séquence 5' GATCCATGCAGCG 3' 3' GTACGTCGC 5' restaurant la séquence codante complète de 1'ADN complémentaire. Les plasmides pSB394 et pSBDH394 diffèrent en premier lieu par le site d'intégration de 1'ADN complémentaire du facteur IX. Si dans pSB394 cet ADN est inséré dans le site BglII du polylinker, dans pSBDU394, c'est dans le site BamHI qu'il est inséré. De plus, en une seconde étape, 1'ADN complémentaire de DHFR de souris (fragment Hindîli - BgiII de pMTVdhfr(8)) est introduit entre les sites HindI Il et BglII du polylinker (voir fig. 3). b) Construction des plasmides pTGEIII385, pTGEIIIDH385 et pTGEIIISéo385 contenant un fragment du gène EIII de l'adénovirus 2 Pour réaliser ces constructions, on peut utiliser l'adénovirus 2 deposé sous NO ATCC VR-846.Le plasmide pTGEIII385 (fig. 4) est obtenu par digestion de pSB394 par EcoRI et BamHI puis en substituant le promoteur majeur tardif de 1'adénovirus 2 et l'ADNc du Facteur IX par les séquences suivantes - le fragment EcoRI - SmaI de l'Adénovirus 2 entre les séquences 27372 et 27571 (voir fig. 1) (les coordonnées correspondent à celles obtenues à partir de la séquence Ad2 de la banque de données de 1'EMBL) - le fragment EcoRV - KpnI de polylinker de 413TG131 (3) ;; - l'activateur du virus SV40 sous forme du fragment KpnI - Hindi de pSO (4) - la séquence de l'Adénovirus 2 des nucleotides 27572 à 28812 (du site SmaI du promoteur de EIII à i'ATG, voir fig. 1). - 1'ADN complémentaire du facteur I fusionné à 1'ATG initiateur de EIII. Pour réaliser cette fusion de 1'ADN complémentaire du facteur IX et du gene EIII au niveau des ATG initiateurs, 1'ADN complémentaire du facteur IX est excisé sous forme du fragment BamHI-XhoII par digestion partielle de M13TG390 (décrit ci-après) et cloné dans le site BamHI de M13TG131 donnant le vecteur M13TG373. N13TG390 dérive de M13TG120 (3) et contient entre les sites SalI et PstI les séquences suivantes - un adaptateur SalI - FnudlI de séquence 5' TCGACCATGCAGCG 3' 3' GTACGTCGC 5' - le fragment FnuDII - PstI de l'ADNc du facteur IX provenant de pTG397 décrit dans la publication européenne de brevet. EP-167420. Le fragment HindIII du leader du gène EIII (nucléotide 28653 à 28962, voir fig. 1) est inséré dans le site HindIII de M13TG373 et une mutagénèse par boucle utilisant un oligonucléotide de séquence 5' GGGGCAACATCCAAGATGCAGCGCGTGAACATGATC 3' permet d'obtenir la fusion des ADN complémentaires du facteur IX et du gène EIII au niveau des ATG initiateurs. Le plasmide pTGEIIINéo385 (fig. 4) résulte de l'insertion dans le site BamHI de pTGEIII385 du fragment BamHI de M13TG1823. Ce vecteur dérive de M13MP9 (6) ; il contient dans son site BamHI un fragment du gène néo, obtenu par digestion BamHI-BglII de pSv2-néo(9). Une fois introduit, ce fragment est muté localement avec un oligonucléotide de séquence 5'CAT & GAAAGGATCCTCATCC 3' permettant d'exciser le gêne néo sous forme d'un fragment BamHI de XL3TG1823. Le plasmide pTGEIIIDH385 (fig. 4) est obtenu par insertion dans les sites Hindîli et BglII de pTGEIII385 du fragment de gène DHFR de pMTVdhrf (8). c) Expression transitoire dans les cellules CHO Des bottes de culture (diamètre 5 cm) sont ensemencées avec 300 000 cellules. Au bout de 24 heures 1'ADN des vecteurs d'expression du facteur IX (2 ssg) et 1'ADN d'un vecteur d'expression de la beta-galactosidase, pCHllO (10), (2 g) sont cotransférés selon la technique classique de coprécipitation au phosphate de calcium (11). Après 24 heures, les cellules sont lavées avec PBS [137 mM NaCl ; 2,7 mM KC1 ; 8 mM Na2HP04 ; 1,5 mM KH2P04 pH = 7,- et du milieu neuf est ajouté. Après un délai de 48 heur s les milieux de culture sont prélevés et la quantité de facteur IX produit, F, est dosée au moyen d'un test ELISA commercialisé par Diagnostica-Stago.Les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS puis centrifu- gées. Elles sont reprises dans -0,2 à 1 ml de tampon Z (10) et cassées au moyen d'une courte sonication. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation, l'activité beta-galactosidase, B, est dosée dans le surnageant suivant une méthode classique (12) et la quantité totale de protéines, P, est déterminée par test Biorad. L'efficacité des constructions est évaluée par le rapport F.P/B. Les plasmides de la série pSB (pSB394 et pSBDH394) utilisent des promoteurs contenant des séquences du promoteur majeur tardif de- l'Adénovirus 2 jointes aux séquences de l'activateur de SV40 alors que les plasmides de la série pTGEIII (pTGEIIIDH385, pTGEIITNéo385 pTGEIII385) conformément à un aspect de la présente invention comportent la séquence leader et une partie du promoteur du gène EIII de l'adénovirus 2 ainsi que en amont du promoteur les séquences activatrices de SV40. pSB394 et pTGEIII385 sont deux vecteurs monocistroniques alors que pSBDH394, pTGEIIIDH385 et pTGEIIINéo385 sont polycistroniques utilisant comme second gène, l'ADNc du gène DHFR pour les deux premiers et le gène néo pour le dernier. Les résultats d'expression transitoire du Facteur IX dans les cellules CHO sont exposés dans le tableau I ci-après. Tableau I : Mesure de l'expression transitoire du Facteur IX dans des cellules CHO transfectées par différents plasmides, 14 Plasmide F x P* B pSB394 2.8 pSBDH394 7.8 pTGEIII385 17.0 pTGEIIIDH385 105.0 pTGEIIINéo385 150.0 * B : activité B-galactosidase P : quantité totale de protéines F : activité du facteur 5 mesurée par ENLISA Le tableau I met en évidence les résultats suivants 1) Le fait de remplacer dans le plasmide de départ, le promoteur majeur tardif de l'adénovirus 2 par les éléments du gène EIII de I'adénovirus 2, permet d'améliorer d'un coefficient 5 à 12 la quantité de facteur IX produite. 2) L'adjonction d'une séquence en aval de l'ADNc du facteur IX améliore d'un facteur 5 l'efficacité des constructions (pTGEIII385/pTGEIIZDH385). 3) L'adjonction de la séquence du gène néo en aval de 1'ADNc du facteur IX donne un résultat légèrement meilleur que l'adjonction de la séquence de l'ADNc du gène DHFR (pTGEIIIDH385/pTGEIIINéo385). Exemple 2 : Expression du facteur VIII#II L'analogue du facteur VIII désigné par FVIIILII a été décrit dans la demande française de brevet n 8711415 déposée au nom de la Demanderesse. il est caractérisé en ce qu'il s'agit du composé délété des acides aminés 771 à 1662. a) Construction de pTG2307 Le plasmide pTG2307 (fig. 5) contient une partie du plasmide p delta favorisant l'intégration du vecteur en un grand nombre de copies dans le génome et une unité de transcription polycistronique (promoteur + leader) EIII Facteur VIIItII/XGPRT. Il est construit de la façon suivante Le plasmide pTG2307 dérive de pTG1509 (déposé à la CNCM sous le numéro I-681 le 24 juillet 1987) décrit dans la demande française de brevet déjà citée n 8711415 digéré par les eazymes de restriction NcoI et AvaI. Le fragment court est éliminé et substitué par le fragment PvuI AvaI de M13TG347 (décrit ci-après) avec l'aide d'un adaptateur NcoI - PvuI de séquence 5' CCGGCCTAGGCCCGGGCTGCAGAT 3' 3' GGATCCGGGCCCGACGTC 5' M13TG347 dérive de M13TG131 (3) par-insertion dans les sites EcoRI et KnpI des fragments - EcoRI - EcoRV de pTGEIII385 portant le promoteur EIII suivi de son leader et une partie de l'ADNc du facteur IX. - SmaI - KnpI de pTG1080 (13) portant l'extrémité 5t de l'ADNc du facteur VIII. ta fusion au niveau des ATG des protéines EIII et du facteur VIII est réalisée par une mutagenèse par délétion par boucle grâce à un oligonucléotide de séquence 5' CTGGGGGCAACATCCAAGAATGCAAATAGAACTCTCC 3'. b) Production de facteur VZIIOII dans des cellules CH0 Le vecteur pTG2307 ainsi obtenu est transféré dans les cellules CHODXB11 (Dr. L. Chasin Colombia University, New York, USA) par la technique de coprécipitation au phosphate de calcium et les cellules transformées sont sélectionnées selon le procédé décrit dans la référence (14) mais en omettant ltaminoptérine. Les clones sont isolés après 1,5 à 2 mois de sélection puis testés pour leur production de facteur VIIILII. Sur 14 clones testé 7 produisent entre 1 et 6 U de Facteur VIII (activité coagulante) pour 106 cellules et pour 24 h.Ces niveaux de productions sont 12 fois supérieurs à ceux obtenus e utilisant le promoteur SV40 de l'Adénovirus 2 de pTG384 (construction pTG1539, décrit dans la demande française de brevet déjà citée, n 8711415) (voir tableau II). Tableau II : Production de facteur VIIItII dans les cellules CR0 en fonction du plasmide utilisé. Plasmide Activité coagulante U/106 cellules x 24h pTG1505 0.5 pTG2307 6.0 Exemple 3 : Expression du facteur von Willebrand è l'aide du plasmide pTG2330 (fig. 6) Le plasmide de départ est le plasmide p delta plus précisement le grand fragment de p delta entre les sites EcoRI et SalI. Le promoteur et le leader du gène Elîl sont introduits comme fragment EcoRI - HindIII de pTGEIII385 puis un adaptateur Hindîli - BamHI provenant de M13TG131 (3) et le bloc du gene Néo fragment BamHI de M13TG1823 (précédemment décrit) lié au fragment BglII SalI de pTGEIII385. Le plasmide ainsi formé est désigné par pTG2323. Pour obtenir le bloc DHFR, le plasmide pSBDH394 est digéré par HindIII et PvuII puis le bloc d'expression du facteur IX est substitué par le promoteur précoce de SV40, fragment Hindis - HindîlI de p delta. Le site HindIII est ensuite éliminé : le plasmide est digéré par HindlII, le site est rempli par 1'ADN polymérase (fragment de Klenow) et le plasmide est religué. Le bloc d'expression de DHFR est excisé par digestion SalI - SphI et cloné dans M13TG131 (3) coupé par ces mêmes enzymes donnant M13TG346. Par bloc DHFR, on entend donc uneFunité de transcription formée d'un bloc d'expression du gène DHFR sous le controle du promoteur précoce de SV40 privé de sa séquence activatrice . te plasmide pTG2323 est ensuite digéré par EcoRI puis traité à la- nucléase Si. Les extrémités sont remies avec 1'ADN polymérase (fragment de Klenow) puis liguées avec le bloc DHFR, fragment SmaI - SalI de M13TG346 (extrémité SalI remplie à la Klenow). La fusion du site SalI rempli avec le Klenow et le site EcoRI traité à la nucléase S1, régénère un site SalI. Le bloc DHFR est intégr-é de sorte que les genes EIII et DHFR sont transcrits dans des directions opposées (pTG2325). Un polylinker de séquence 5' AGCTTCGCGAATTCTCGAG 3' 3' AGCGCTTAAGAGCTCCTAG 5' possédant les sites de restriction HindIII, NruI, EcoRI, XhoI et BamHI est introduit entre les sites HindIII et BamHI de pTG2325, donnant pTG2328. Le polylinker permet d'insérer les ADNc ê exprimer. Le vecteur d'expression du facteur von Willebrand (vWF) est obtenu en insérant dans le site EcoRI de pTG2328 l'ADNc sous forme de fragment EcoRI, donnant pTG2330. L'ADNc codant pour vWF complet est préparé à partir d'ARNm extrait de poumon humain, un organe riche en tissu vasculaire et donc en cellules endothéliales qui sont reconnues comme site de synthèse de vWF. L'ADNc est cloné dans un Bactériophage go10. Les clones obtenus sont criblés en utilisant des souche nucléotidiques (13). Plusieurs clones ont été obtenus puis assemblés de façon è obtenir un clone d'ADNc codant pour la protéine entière. Le plasmide contenant les séquences assemblées est constitué du vecteur pTZ18R (Pharmacia) contenant dans son site EcoRI l'ADNc du vtXF du nucléotide -131 (co.sidérant que 1'ATG initiateur est à +1) au nucléotide 8557 (site SstI). Par construction l'ADNc comprend une extrémité polyG à son extrémité 5' et un fragment SstI-EcoRI de M13TG131 (3) à son extrémité 3'. Le vecteur pTG2330 contient deux unités de transcription : un bloc polycistronique vXF/néo et le bloc DHFR. Il est possible par conséquent de sélectionner les clones transformés en utilisant l'un des marqueurs néo ou DHFR, ou les deux simultanément. Le vecteur pTG2330 a donc été transfecté dans la lignée CHO-DHFR- DG44 (obtenue auprès du Dr. L. Chasin, Columbia University, New York, USA) en utilisant la méthode de précipitation au phosphate de calcium. Trois jours après le transfert les cellules sont trypsinées et réparties dans un milieu Alha 1900 (GIBCO) supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal (SVF) et avec de l'antibiotique G418 à une concentration de 400 Rg/ml ou dans un milieu Alpha 2000 supplémenté en SVF avec (à une concentration de 10 nM ou de 30 nM) ou sans méthotrexate. Après deux jours de sélection les cellules en G418 sont trypsinées et réparties soit dans un milieu Alpha 1900 supplémenté en SVF et- contenant 600 Ag/ml de G418, soit dans un milieu Alpha 2000 (GIBCO) supplémenté avec du SVF dialysé et contenant 200 ou -400 g/ml de G418. Les cellules sont maintenues dans ces milieux pendant deux à trois semaines puis les-clones ayant emmergés sont testés pour leur production de vWF au moyen d'un test ELISA commercialisé par Diagnostic-Stago. Des clones producteurs peuvent être obtenus dans toutes les conditions de sélection (Tableau I), les plus producteurs étant isolés en Alpha 2000 supplémenté avec du méthotrexate. A ce stade, il peut être intéressant d'améliorer les conditions de transfert dans les cellules de façon è obtenir des clones capables de résister à des concentrations plus élevées de méthotrexate ou de pouvoir dériver à partir des clones déjà isolés des lignées résistant å des concentrations plus élevées de méthotrexate. Tableau III Production des clones CHO-DG44 transformés par pTG2330 suivant les conditions de sélection Nombre de clones obtenus ayant une Milieu de production de vWF sélection (en ng/106 cellules/24h) de 0-10 10-100 100-500 500-1000 1000-3000 Alpha 2000SVF 26 8 20 1 0 Alpha 2000 SVF Méthotrexate 5 0 3 3 4 10nM Alpha 2000 SVF éthotrexate 1 0 0 0 2 30nM REFERENCES (1) RIGBY, P.W.J Dans Genetic Engineering Vol. 3, édité par R. WILLIAMSON. Académic Press p88-141. (2) ZIFF, F. (198-0). Nature 287, 491-499.- (3) KIENY, M.P., LATHE, R. et LECOCQ, J.P. (1983). Gene 26, 91-99. (4) TAHASASHI, K. et al. (1986). Nature 319, 121-126. (5) MIYAMOTQ, N.G. et al. (1984). Nucl. 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Vecteur d'expression d-'une protéine hétérologue dans les cellules eucaryotes comprenant une séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue ainsi que les éléments assurant son expression, caractérisé en ce que les éléments assurant l'expression de la séquence codant pour la protéine hétérologue comprennent les éléments essentiels de la séquence leader et/ou de la séquence du promoteur du gene EIII de l'Adénovirus 2. 2. Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence leader du gène EIII. 3. Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce que la partie de la séquence leader du gène EIII est celle qui comporte l'intron (nucléotide 27981-28360). 4. Vecteur selon la revendication 3 caractérisé en ce que la partie de la séquence leader du gène EIII est celle qui commence à l'întron (nucléotide 27981) et s'étend jusqu'à 1'ATG initiateur de la traduction. 5. Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie du promoteur du gène EIII. 6. Vecteur selon l'une des revendications i à 5 > caractérisé en ce que il comporte tout ou partie du promoteur et la partie de la séquence leader qui comporte l'introa (nucléotide 27981-28360) de l'Adénovirus 2. 7. Vecteur selon la revendication 6 caractérisé en ce que il comporte en outre une séquence activatrice de transcription. 8. Vecteur selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que il comporte des éléments assurant son intégration dans le génome de la cellule hôte, de préférence la séquence d'ADN mitochondrial murin du plasmide de p delta. 9 . Vecteur selon l'une des revendLcations I à 8, caractérisé en ce que il comporte une séquence d'ADN supplémentaire en aval de la séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue. 10. Vecteur selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comporte un gêne de sélection II. Vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce que le gène de sélection se trouve en aval de la séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue. 12. Vecteur selon la revendication il caractérisé en ce que le gêne de sélection se trouve sur un bloc d'expression polycistronique, en aval de la séquence d'ADN codant pour la protéine hétérologue. 13. Vec eur selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en We qu'il s'agit du gène Néo. 14. Vecteur selon l'une des revendications 10 à 13 caractérisé en ce que il comporte une unité de transcription d'un premier gène de sélection, et un bloc d'expression polycistronique pour la protéine hétérologue comportant un deuxième gène de sélection. 15. Vecteur selon la revendication 14 en ce que le premier gène de sélection est le gêne DHFR. 16. Procédé de préparation de cellules eucaryotes afin d'obtenir des lignées cellulaires produisant une protéine hétérologue caractérisé en ce que on effectue la transformation de ces cellules par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 15 et que l'on sélectionne les cellules exprimant ladite protéine hétérologue. 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que la ttansfection est effectuée par la technique de coprécipitation au phosphate de calcium. 18. ignée cellulaire obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 16 ou 17. 19. Procédé de préparation d'une protéine hétérologue par des lignées cellulaires caractérisé en ce qu'on cultive une lignée cellulaire selon la revendication 13 sur un milieu de culture approprié et en ce qu'on récupère la protéine hétérologue a partir de la culture. 20. Procédé selon la revendication l9 caractérisé en ce que la protéine hétérologue est choisie parmi les facteurs de la coagulation sanguine.