Brevet FR2646914A1 — publié le 19901116

PROCEDE ET DISPOSITIF D'IDENTIFICATION ET DE NUIERISA- TION DE CELLULES DANS DU LAIT. La présente invention concerne un procédé pour détecter et numériser les cellules présentes dans du lait et notamment dans du lait de vache. Elle concerne également le dispositif mettant en oeuvre ce procédé. Les produits alimentaires d'origine animale sont soumis à un contrôle vétérinaire qui, au fur et à mesure des progrès de la recherche scientifique, tendent à s'intensifier, afin de proposer au consommateur des produits de qualité. Les produits laitiers sont particulièrement soumis à ces contrôles, du fait de leur propension à rapidement s'altérer. Parmi ceux-ci, le lait de vache, très large- ment consommé, subit des examens vétérinaires systémati- ques, notamment en vue de révéler la présence en nombre relativement important de cellules, d'origine épithélia- le en phase de desquamation et en voie de lyse, mais également d'origine inflammatoire, tels que des lympho- cytes et autres leucocytes, révélatrices de pathologie de la vache concernée, et notamment de mammites chroni- ques. Cette infection, bien que sans grande incidence sur l'état général de la vache, rend le lait tout à fait impropre à la consommation. De fait, un dépistage systé- matique de cette infection est réalisé sur le lait. Ce dépistage peut être effectué à différents niveaux, soit par le producteur dès que la traite est effectuée, soit par des services vétérinaires, soit par les laiteries ou les industries de transformation. A ce jour, on utilise deux types de techniques. La première consiste en une appréciation approximative du nombre de cellules contenues dans un échantillon, à l'aide.d'un détergent, du type connu sous la marque déposée TEEPOL, ou d'un indicateur colorimétrique. La deuxième technique, utilisée par les professionnels, consiste en un comptage des cellules soit de façon manuelle, impliquant la présence de personnel spéciali- sé, soit de façon automatisée au moyen d'un matériel approprié, qui ne peut hélas différencier les cellules entières des débris cellulaires, et qui de plus demande un étalonnage manuel préalable sur au moins deux échan- tillons. La présente invention vise à pallier ces inconvé- nients. Elle vise un procédé et un dispositif apte à permettre un diagnostic infraclinique de la mammite chronique, qui soit sûr et sans appel, par voie auto- matique, précis, rapide et de coût de fonctionnement léger. Ce procédé pour identifier et numériser les cel- lules dans du lait est caractérisé en ce qu'il consiste: - à prélever un échantillon d'un lait à analyser; - à colorer les cellules présentes dans cet échan- tillon par un colorant fluorescent spécifique de l'ADN (Acide desoxyribonucléique) contenu dans le noyau des cellules; - à faire défiler cet échantillon coloré dans un tube capillaire sur lequel est dirigé un faisceau laser stabilisé; - à recueillir sur un capteur une partie au moins du rayon lumineux transmis à travers le flux de l'échan- tillon s'écoulant dans le tube capillaire pour donner une première information Ix, significative de la quanti- té d'ADN, donc du nombre de cellules qui défilent; - à transmettre ladite information I. à une unité de traitement; - et enfin, à restituer au moins une valeur repré- sentative de la qualité du lait analysé. En d'autres termes, la présente invention consiste à analyser par cytofluorométrie un échantillon de lait préalablement coloré par un colorant approprié, afin de déterminer notamment la quantité et la qualité des cel- lules contenues dans ledit échantillon de lait, et à traiter les informations ainsi recueillies pour déter- miner la qualité de lait contenue dans ledit échantil- lon. Avantageusement, en pratique: - simultanément, on recueille sur des capteurs, respectivement: une partie du rayon lumineux diffracté à 90 de l'axe optique défini par le faisceau lumin- eux initial pour donner une seconde informa- tion I2, significative de la taille desdites cellules; au moins une partie du rayon lumineux légère- ment diffracté au voisinage de l'axe optique, pour donner une troisième information I3, significative de la densité desdites cellules; les dites informations I2 et I3 étant alors transmises à la dite unité de traitement puis restituées sous forme de valeur(s) représentati- ve(s) de la qualité du lait analysé; - simultanément à la coloration, on ajoute au lait un milieu hypotonique, destiné à lyser la membrane cel- lulaire, et un détergent tensio-actif destiné à perméa- biliser la membrane nucléaire afin de permettre la péné- tration du colorant fluorescent destiné à venir se fixer sur l'ADN; l'agent tensio-actif est introduit dans le milieu à raison de 0,1 % en volume, et l'agent hypotonique est du citrate de sodium à raison de 0,1 % en rapport Poids/ Volume; - le colorant fluorescent spécifique de l'ADN est de l'iodure de propidium, introduit en excès par rapport à la quantité d'ADN; - on laisse incuber le milieu réactionnel à tempé- rature ambiante et dans l'obscurité pendant au moins vingt minutes; - on fait défiler le milieu réactionnel au moyen d'un venturi à pression différentielle. L'invention concerne également un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé comprenant: - un rayon lumineux stabilisé; - une unité d'analyse constituée par: une cellule de lecture réalisée en quartz, située sur le trajet optique du faisceau laser; un système à pression différentielle destiné à permettre le passage dans ladite cellule de lecture de l'échantillon de lait à analy- ser; 25. un réservoir destiné à recueillir l'échan- tillon après analyse; - - au moins trois capteurs optiques dont deux sont munis d'un photomultiplicateur; - un microprocesseur apte à assurer le traitement des informations issues dudit capteur; - un organe d'affichage et/ou d'impression. Avantageusement, en pratique: - le rayon lumineux stabilisé est un rayon laser; - les trois capteurs sont constitués par des photo- diodes; - le système à pression différentielle est consti- tué par un venturi; - l'échantillon à analyser s'écoule dans un capil- laire au sein de la cellule d'analyse. La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux de l'exemple de réalisation qui suit, donné à titre indica- tif et non limitatif à l'appui des figures annexées, dans lesquelles: La figure 1 représente une vue schématique du sys- tème d'écoulement de l'échantillon en vue de son analyse du dispositif conforme à l'invention. Les figures 2 et 3 représentent des courbes éta- blissant le nombre d'entités, à savoir débrits cellulai- res et cellules entières, en fonction de la quantité d'ADN mesurée. Conformément à la présente invention, l'échantillon de lait devant être analysé est tout d'abord soumis à un traitement préalable. En effet, on laisse incuber une quantité excatement mesurée de l'échantillon, et ce en- viron une vingtaine de minutes dans un milieu hypotoni- que, tel que du citrate de sodium 0,1%, en présence d'un agent tensioactif (telle que du Triton (Marque Déposée)). La concentration de ce dernier est de l'ordre de 0,1 % en volume. On inclut également dans ce mélange réactionnel un colorant fluorescent dont la caractéris- tique essentielle est de se fixer spécifiquement sur l'Acide Desoxyribo Nucléique (ADN) contenu dans le noyau des cellules et ce, de manière stoechiométrique. On choisit pour cela de l'iodure de propidium connu pour cette application. Afin d'être sûr que la totalité de l'ADN soit coloré, on ajoute l'iodure de propidium en excès. Afin de ne pas exciter les molécules d'iodure de propidium, on réalise cette incubation à l'abri de la lumière. L'agent tensio-actif permet une lésion des membra- nes cellulaires permettant une pénétration de l'iodure de propidium au niveau de l'ADN nucléaire. De manière connue, toutes les cellules non tumora- les d'une même espèce contiennent la même quantité d'ADN. De la sorte, la quantité de fluorescence mesurée ultérieurement constitue une donnée absolue quant à la quantité de cellules analysées. Afin d'assurer une mesure analytique de l'échantil- lon de lait à analyser, on a recours à un système de venturi à pression différentielle en liaison avec un capillaire permettant la création d'un courant laminaire de dimensions très réduites dudit échantillon, destiné à être placé, sous la forme d'un flux monocellulaire, sur le chemin optique du dispositif de mesure décrit ulté- rieurement. Pour ce faire, on fait appel au dispositif représenté au sein de la figure 1. Ce dispositif com- prend une unité d'analyse dont l'élément essentiel est l'organe d'écoulement de l'échantillon. Ce dernier com- prend fondamentalement une cellule de lecture réalisée en quartz apte à permettre la transmission d'un faisceau lumineux, notamment d'un faisceau laser. Les parois de cette cellule de lecture sont avantageusement planes et parallèles, afin de diminuer les éventuels phénomènes de reflexion partielle ou totale. Une pompe à air (5), comprimant l'air extérieur préalablement filtré (6), et munie d'un régulateur de pression (7) permet d'envoyer le fluide porteur depuis son réservoir (8) jusqu'à la cellule de lecture (3), le dit fluide porteur, en l'occurence de l'eau permutée étant également filtré (9), notamment avec un filtre stérilisant, avant son introduction dans la chambre (12) du venturi. En parallèle, une boucle de contrôle fermée (10), régule la pression différentielle permettant à l'échantillon de lait (2) de passer par l'intermédiaire d'un tube capillaire (4) dans la cellule de lecture (3). Les parois de la chambre (12) du venturi convergent au niveau de la dite cellule de lecture (3), afin de former à ce niveau un capillaire (13). C'est dans ce capillaire (13) qu'est concentré le spot du faisceau lumineux uti- lisé pour le système de mesure et décrit ultérieurement. Pour compléter l'unité de traitement (1) ainsi définie, on munit l'ensemble d'un réservoir (11) recueillant l'échantillon et le fluide support après analyse. Le système de mesure conforme à l'invention com- prend essentiellement un laser à Argon de 15 milliwatts, produisant un faisceau stabilisé de longueur d'onde bien déterminée égale à 488 nm. Le faisceau Laser ainsi pro- duit est soigneusement collimaté par tout organe appro- prié et focalisé au niveau du capillaire (13) de la cellule de lecture (3) . La longueur d'onde du faisceau laser produit tombe avantageusement au voisinage du maximum d'absorption de l'iodure de propidium, utilisé pour colorer l'ADN cellulaire. Lorsque ce dernier est excité, il réemet une radiation dite de fluorescence de longueur d'onde bien connue et égale à 620 nm. Cette radiation de fluorescence est détectée au moyen d'un capteur constitué essentiellement d'un photomultiplica- teur, mesurant l'intensité du radiation émise selon un signal Ix, et de fait, la quantité d'ADN s'étant écoulé devant le faisceau laser. Cette dernière grandeur permet de remonter au nombre de cellules ayant transité par le capillaire (13), car comme déjà dit, la quantité d'ADN cellulaire est une constante constituant de la sorte un quantum de repère. Il est à noter qu'il existe toutefois un petit nombre ce cellules en phase de mitose.. De fait, leur quantité d'ADN est double par rapport aux cellules en interphase. Il va de soi que pour parvenir à une précision suffisante, le capillaire (13) doit avoir des dimensions suffisamment réduites afin de n'autoriser l'écoulement simultané que d'un nombre très limité de cellules, pour que la totalité des cellules émette une radiation de fluorescence via l'iodure de propidium. L'information Il ainsi obtenue ests en elle-même nécessaire et suffisante pour estimer la qualité du lait. Toutefois, afin de disposer d'éléments supplémen- taires d'appréciation, on procède à d'autres mesures. Ainsi, une partie du faisceau laser est diffractée par les cellules selon une grande variété d'angles par rap- port à l'axe optique défini par le faisceau lui-même. On place de fait à 90 degrés par rapport à cet axe optique un second capteur, constitué par une photodiode, afin de délivrer un signal I2 utilisable. Ce signal I2 est re- présentatif de la taille des cellules s'écoulant dans le capillaire (13). On place aussi à environ 10 degrés de l'axe optique défini précédemment un troisième capteur, également constitué par un photomultiplicateur, et détectant une partie du faisceau laser diffracté par les cellules. Les informations détectées à ce niveau correspondent à une partie du faisceau laser ayant été diffractée lors de la traversée des cellules par ledit faisceau. De la sorte, l'information I3 que ce capteur restitue est représen- tatif de la densité des dites cellules. De la sorte, on dispose d'au moins trois informa- tions Il, I2 et I3 correspondant respectivement au nom- bre, à la taille et à la densité des cellules s'écoulant dans le capillaire (13). Ces informations sont traitées au moyen d'un micro- processeur susceptible d'effectuer une selection parmi les informations transmises, en fonction de paramètres introduits dans le dit microprocesseur par l'utilisa- teur. Il est par exemple nécessaire dans la détermination du nombre de cellules par unité de volume de lait, de s'affranchir des cellules non entières. Il suffit dans ce cas de fixer un seuil pour la florescence, en dessous duquel les entités détectéess ne sont pas comptabili- sées comme des cellules, mais comme des débris, d'origi- ne cellulaire. Ce seuil est très facilement déterminé. Il correspond en effet, à la quantité de fluorescence équivalente, dans le cas du lait, donc des mammifères à la quantité d'ADN contenue dans le stock diploïde des 2n chromosomes. De fait, toutes les entités, dont l'inten- sité de fluorescence dépasse ce seuil sont des cellules entières. Dans les figures 2 et 3, on a représenté par S. ce seuil. On observe sur ces courbes, un pic très marqué, correspondant aux cellules entières en inter- phase. La détermination de la quantité d'ADN au dessus de ce seuil permet donc d'obtenir avec précision le nombre de cellules entières, aux cellules en cours de mitose près. Comme déjà dit, toutes les entités dont le signal de fluorescence apparait en dessous du seuil S. sont des débris cellulaires. De manière avantageuse, le rapport des débris cel- lulaires sur la quantité d'ADN totale et le rapport des cellules entières sur la quantité d'ADN totale sont déterminés, afin de donner avec une plus grande préci- sion l'état pathologique de l'animal concerné. De même, la différenciation entre particules cellu- laires et non cellulaires (par exemple globules lipidi- ques, très nombreux dans le cas du lait) s'effectue, dans le cas de mesure de fluorescence directe, par la sélection d'une plage d'intensité correspondant à la quantité connue d'ADN cellulaire. De la sorte, on obtient une valeur représentative de la qualité du lait analysé, sous la forme d'un nombre de cellules par unité de volume, voire d'un graphique matérialisant les différentes informations mesurées, tels que ceux représentés au sein des figures 2 et 3, et ce au moyen de tout organe de restitution sensorielle appropriée, tel que par exemple un écran et/ou une im- primante. L'utilisateur est donc à même de déterminer rapide- ment la qualité de son lait. De fait, les litiges poten- tiels entre producteurs et laiteries, ou entre laiteries et consommateurs peuvent être largement diminués, la résultante générale conduisant à l'amélioration de la qualité du lait. Ainsi, le procédé conforme à l'invention permet-il d'une part une numérisation des différents constituants cellulaires du lait par des colorants spécifiques tel l'Iodure de propidium et tous ses équivalents, et d'au- tre part, une caractérisation des cellules comptées au moyen d'un marquage immunologique spécifique avec des anticorps poly- ou monoclonaux couplés à des fluorochromes. Enfin, l'utilisation du cadrage des plages cellu- laires présentant des différences de taille et/ou de nature permet d'améliorer sensiblement la précision du diagnostic. REVENDICATIONS 1/ Procédé pour identifier et numériser les cellu- les contenues dans du lait caractérisé en ce qu'il con- siste: - à prélever une quantité déterminée d'un échantil- lon d'un lait à analyser; - à colorer les cellules présentes dans cet échan- tillon par un colorant fluorescent spécifique de l'ADN (Acide desoxyribonucléique) contenu dans le noyau des- dites cellules; - à faire défiler cet échantillon coloré dans un tube capillaire (13) sur lequel est dirigé un faisceau lumineux stabilisé; - à recueillir sur un capteur une partie au moins du rayon lumineux transmis à travers le flux de l'échan- tillon s'écoulant dans le tube capillaire (13) pour donner une première information I,, significative de la quantité d'ADN, donc du nombre de cellules qui défilent; - à transmettre ladite information Ix à une unité de traitement; - et enfin, à restituer au moins une valeur repré- sentative de la qualité du lait analysé. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, simultanément, on recueille sur des capteurs, respectivement: - une partie du rayon lumineux diffracté à 90 de l'axe optique défini par le faisceau lumineux initial pour donner une seconde information I2, significative de la taille desdites cellules; - au moins une partie du rayon lumineux légèrement diffracté au voisinage de l'axe optique, pour donner une troisième information I3, significa- tive de la densité desdites cellules; les dites informations I2 et I3 étant alors transmises à la dite unité de traitement puis restituées sous forme de valeur(s) représentative(s) de la qualité du lait analysé. 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que simultanément à la coloration, on ajoute au lait un milieu hypotonique, destiné à lyser la membrane cellulaire, et un détergent tensio-actif destiné à perméabiliser la membrane nucléaire afin de permettre la pénétration du colorant fluorescent destiné à venir se fixer sur i'ADN. 4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent tensioactif est introduit dans le milieu à raison de 0,1 % en volume, et l'agent hypotonique est du citrate de sodium à raison de 0,1 % en rapport Poids/Volume. 5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le colorant fluorescent spécifique de l'ADN est de l'iodure de propidium, introduit en excès par rapport à la quantité d'ADN. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on laisse incuber le milieu réac- tionnel à température ambiante et à l'abri de la lumière pendant au moins vingt minutes. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on fait écouler le milieu réaction- nel au moyen d'un venturi (5,7,8,10,12) à pression dif- férentielle. 8/ Procédé selon l'une des revendications 1 a 7, caractérisé en ce que le faisceau lumineux stabilisé est un faisceau laser. 9/ Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend: - - un laser stabilisé; - une unité d'analyse (1) constituée par: À une cellule de lecture (3) réalisée en quartz, située sur le trajet optique du faisceau laser; un système à pression différentielle destiné à permettre le passage dans ladite cellule de lecture (3) de l'échantillon de lait à analyser (2); un réservoir (11) destiné à recueillir l'échantillon après analyse; - un laser stabilisé; - trois capteurs optiques, dont deux sont munis d'un photomultiplicateur; - un microprocesseur apte à assurer le traitement des informations issues dudit capteur; - un organe d'affichage et/ou d'impressions. / Dispositif selon la revendication 9, caractéri- sé en ce que les capteurs sont constitués par des photo- diodes. 11/ Dispositif selon l'une des revendications 9 et , caractérisé en ce que l'échantillon à analyser (2) s'écoule dans un capillaire (13) au sein de la cellule de lecture (3). 12/ Dispositif selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le système à pression diffé- rentielle est constitué par un venturi. DEPOSANT: LABORATOIRE D'ETUDES EN CYTOMETRIE APPLIQUEE (L.E.C.A.) MANDATAIRE: Cabinet LAURENT