Brevet FR2639358A1 — publié le 19900525

La présente invention a pour objet un procédé pour la détection de la présence ou de l'absence d'au moins une séquence variante en un seul test, ainsi que des kits destinés à être utilisés dans un tel procédé. La présente invention est particulièrement intéressante pour soumettre des échantillons d'ADN à un dépistage, à titre de diagnostic, d'états héréditaires. On sait qu'il existe chez l'homme plusieurs centaines de maladies génétiques qui résultent de mutations particulières au niveau de l'ADN. La cause moléculaire de certaines de ces maladies est déjà connue et les recherches mettent rapidement en évidence la cause moléculaire des maladies génétiques pour lesquelles la nature de la mutation est actuellement inconnue. Lorsqu'une cause moléculaire précise d'un état héréditaire n'est pas connue, le diagnostic du trouble ou l'emplacement des vecteurs peut être établi par la technologie de RFLP. Ainsi, la dys- trophie musculaire de Duchenne, la fibrose kystique et la chorée de Huntington peuvent être diagnostiquées, par exemple, en utilisant la technologie de polymorphisme de longueur des fragments de restriction (PLFR). Cependant, chaque état nécessite un essai distinct et un travail considérable est requis, chaque cas exigeant, entre autres, une fixation sur papier filtré par la méthode de Southern, une hybridation et une analyse généalogique. On sait que certains autres états héréditaires sont associés à des mutations ponctuelles uniques dans des gènes mais chacun de ces états doit être analysé séparément et des difficultés particulières surgissent lorsque les mutations ponctuelles sont hétérogènes. Ainsi, par exemple, plus de 20 mutations ponctuelles différentes peuvent provoquer une bêta- thalassémie et au moins 5, et probablement beaucoup plus de 12, mutations ponctuelles peuvent engendrer une hémophilie A. La présente invention est basée sur la découverte d'un procédé qui résout les difficultés précitées en permettant de détecter la présence ou l'absence d'au moins une séquence variante en un seul test et, ainsi, peut être intéressante pour soumettre des échantillons d'ADN & un dépistage, & titre de diagnostic, d'états héréditaires, y compris des prédispositions. Ainsi, conformément & une caractéristique de la présente invention, il est proposé un procédé pour la détection de la présence ou de l'absence d'au moins une séquence variante en un seul test, procédé qui consiste: 1) à hybrider une première sonde nucléotidique détectable et une seconde sonde nucléotidique & des segments adjacents de chaque portion diagnostique désirée d'une séquence de bases servant de cible, la séquence de nucléotides de la première et de la seconde sondes étant choisie de manière que, lorsqu'un hybride de la première et de la seconde sonde est formé avec une portion diagnostique d'une séquence de bases servant de cible, la première et la seconde sonde soient séparées par un intervalle, intervalle qui est défini par au moins deux nucléotides de la séquence-cible, les nucléotides de la séquence-cible normale et/ou variante comprenant la totalité, moins un, des différents nucléotides présents à l'état naturel; 2) à mettre en contact la portion diagnostique de la séquence de bases servant de cible avec un ou plusieurs types de nucléotides dans des conditions permettant une hybridation complémentaire, le ou les types de nucléotides utilisés étant choisis de manière que le nucléotide normal ou variant soit non complémentaire de ce ou ces types de nucléotides; 3) à soumettre tout hybride obtenu à une liaison; et 4) à déterminer la présence ou l'absence de chaque séquence variante par détection de la présence ou de l'absence d'une ou plusieurs sondes caractéristiques de la présence ou de 1l'absence de chaque séquence variante; le procédé étant mis en oeuvre de sorte que les nucléotides définissant l'intervalle entre la première et la seconde sondes hybridées à ladite portion diagnostique de la séquence de bases servant de cible soient choisis de manière à permettre une liaison de la première et de la seconde sondes en rapport avec la séquence-cible normale ou variante, mais non avec l'une et l'autre de ces séquences. Un hybride formé par hybridation de la première et de la seconde sondes & la séquence-cible, avec un intervalle entre les sondes suivant la définition précitée, est désigné dans la présente invention sous le nom de "hybride de sondes partielles" et, de manière similaire, la - première et la seconde sondes, à leur état non hybridé, sont désignées dans la présente invention sous le nom de "sondes partielles". L'expression "séquence variante" est utilisée dans la présente invention pour désigner un seul nucléotide ainsi que plusieurs nucléotides. En rapport avec la détection d'états héréditaires, l'expression désigne généralement un ou plusieurs nucléotides qui sont associés à la présence d'un trouble ou d'une prédisposition héréditaire, ou bien à un hétérozygotisme pour un tel trouble ou une telle prédisposition héréditaire. On notera que la détection de la présence d'une séquence variante peut être effectuée par la détection positive de ladite séquence en détectant la liaison des sondes partielles appropriées, ou bien par la détection de l'absence d'une séquence normale connue en détectant l'incapacité des sondes partielles appropriées à présenter une liaison. De manière similaire, l'absence d'une séquence variante peut être détectée par la détection positive de la présence d'une séquence normale connue en détectant la liaison des sondes partielles appropriées, ou bien par la détection de l'absence de la séquence variante en détectant l'incapacité des sondes partielles appropriées à présenter une liaison. Ainsi, par exemple, la présence ou l'absence de la séquence variante désirée peut être déterminée en détectant n'importe quelles sondes liées ayant une séquence qui est homologue, de préférence totalement homologue, de la portion de la séquence-cible à laquelle elles sont hybridées, ces sondes liées caractérisant la portion diagnostique de la séquence-cible à laquelle elles sont hybridées. En ce qui concerne chaque séquence variante potentielle, la première sonde nucléotidique doit être détectable mais la seconde sonde nucléotidique peut être ou non détectable suivant le cas. Le terme "détectable" est utilisé dans la présente invention pour signifier "pouvant être détecté". Ainsi, il n'est pas nécessaire que la première sonde nucléotidique porte un élément de marquage tel qu'un marqueur radio-actif ou un complexe non radio-actif de marquage, bien que cet élément puisse être présent, sous réserve que la sonde puisse être traitée ultérieurement pour la rendre apte a un marquage. L'expression "portion diagnostique", telle qu'elle est utilisée dans la présente invention, désigne la portion de la séquence de bases servant de cible (telle qu'elle est définie ci-après) qui contient la séquence variante potentielle, dont la présence ou l'absence doit être détectée. L'expression "séquence de bases servant de cible", telle qu'elle est utilisée dans la présente invention, désigne une séquence de nucléotides comprenant au moins une portion diagnostique (telle qu'elle a été définie précédemment). Ainsi, par exemple, dans un-seul test de diagnostic de la bêta-thalassémie, la séquence- cible peut contenir jusqu'à 50 portions diagnostiques, chaque portion diagnostique contenant une seule séquence variante potentielle. Lorsqu'une séquence de bases servant de cible contenant une seule séquence variante potentielle est présente, le procédé est mis en oeuvre en utilisant plus d'une séquence de bases servant de cible. Une caractéristique de la présente invention est que les sondes pour la détection, obtenues conformément au procédé de la présente invention, caractérisent la ou les portions diagnostiques de la séquence-cible auxquelles elles sont hybridées. Ainsi, par exemple, la sonde liée hybridée à une portion diagnostique de la séquence-cible peut être distinguée des sondes liées hybridées à d'autres portions diagnostiques de la séquence-cible. Cela peut être effectué par n'importe quel moyen convenable. Ainsi, par exemple, chaque première sonde nucléotidique détectable peut porter un signal ou résidu différent et reconnaissable pouvant engendrer un signal. Ces signaux et résidus pouvant engendrer un signal sont décrits en détail ci-après mais pourraient comprendre, par exemple, le système d'amplifica- tion en phase solide décrit par Wang C. G., dans World Biotech Report, 1986, volume 2, partie 2, pages 33-37, (Diagnostics Healthcare Proceedings de la conférence tenue en novembre 1986 à San Francisco), dans lequel des microbilles formées avec de nombreux éléments choisis, à l'état de traces, sont conjuguées à la sonde. La présence de sondes liées spécifiques peut être détectée par analyse par fluorescence aux rayons X. Un procédé beaucoup plus simple et préféré pour rendre les sondes, par exemple les sondes liées, reconnaissables consiste cependant à s'assurer que la longueur de chaque sonde détectable, par exemple la longueur de chaque sonde liée détectable qui peut être formée au cours de la mise en oeuvre du procédé de la présente invention, est différente. La présence ou l'absence d'une séquence variante potentielle donnée peut ainsi être avantageusement détectée par des techniques électrophorétiques, dans lesquelles les différentes sondes détectables, par exemple les différentes sondes liées détectables obtenues, peuvent être distribuées suivant leur poids moléculaire et, ainsi, identifiées par exemple par autoradiographie. Les longueurs des sondes liées peuvent seulement différer par un seul nucléotide mais, de préférence, les longueurs diffèrent par au moins trois nucléotides. La première sonde nucléotidique détectable et la seconde sonde nucléotidique sont choisies de manière qu'elles s'hybrident à des segments adjacents de chaque portion diagnostique désirée. On notera à cet égard qu'à l'intérieur de chaque portion diagnostique, la séquence variante potentielle est présente entre le segment auquel la première sonde nucléotidique détectable s'hybride et le segment auquel la seconde sonde nucléotidique s'hybride. On notera que, bien qu'il ne soit pas néces- saire que la première et la seconde sondes soient totale- ment homologues à la portion diagnostique a laquelle elles sont destinées à s'hybrider, sous réserve qu'elles soient en fait aptes à une hybridation, une homologie totale est préférable. Dans tous les cas, il est préférable que les nucléotides de la première et de la seconde sonde adjacents a l'intervalle soient totalement homologues à la portion diagnostique à laquelle elles sont destinées à être hybridées. L'intervalle entre les sondes est défini par au moins deux nucléotides de la séquence-cible, les nucléoti- des de la séquence normale et/ou variante comprenant la totalité, moins un, des différents nucléotides présents à l'état naturel. De plus, le ou les types de nucléotides utilisés pour la mise en contact de la portion diagnostique de la séquence de bases servant de cible dans le procédé de la présente invention sont choisis de manière que le ou les nucléotides normaux ou variants soient non complémentaires avec ces types de nucleotides. Ces impératifs caractérisent les dimensions de l'intervalle entre les sondes et fixent l'intervalle minimal & deux nucléotides, l'intervalle maximal dépendant de la nature des nucléotides de la séquence-cible qui définit l'intervalle. En outre, la position des nucléotides normaux ou variants à l'intérieur de l'intervalle est choisie de manière à éviter ou au moins réduire la probabilité d'une liaison à travers un intervalle d'un seul nucléotide sans comblement de l'intervalle par le nucléotide complémentaire correspondant. Ce cas peut se produire lorsque la première et la seconde sondes sont hybridées à la portion diagnos- tique de la séquence de bases servant de cible pour définir un intervalle d'au moins deux nucléotides, suivant la définition précitée, et le procédé de la présente invention est mis en oeuvre pour combler l'intervalle de sorte qu'il soit finalement formé un intervalle d'un seul nucléotide dans lequel l'unique nucléotide définissant l'intervalle est le nucléotide normal ou le nucléotide variant à détecter. Il est alors possible que la liaison de la première et de la seconde sondes puisse s'effectuer que l'intervalle de 1 nucléotide ait été comblé ou non, avec pour résultat l'impossibilité de différencier de manière fiable la présence d'un nucléotide normal et celle d'un nucléotide variant. Ainsi, il est important dans la présente invention de positionner le nucléotide normal ou variant à l'intérieur de l'intervalle de telle manière que, si le procédé est mis en oeuvre en présence d'un agent de polymérisation qui déclenche la synthèse dans la direction ' - 3', un nucléotide correspondant au nucléotide normal ou variant à détecter ne soit pas introduit en position 3' terminale de l'intervalle. Si cela n'est pas garanti, la première sonde sera alors prolongée par le nombre approprié de nucléotides pour combler l'intervalle, sauf en ce qui concerne la position 3' terminale, laissant ainsi un intervalle d'un seul nucléotide avec pour résultat l'existence d'un risque de liaison de la première et de la seconde sonde à travers l'intervalle, que l'intervalle ait été comblé ou non. De manière similaire, si l'intervalle est défini par deux ou plus de deux nucléotides et le procédé est mis en oeuvre en présence d'un agent de polymérisation qui déclenche habituellement la synthèse dans la direction 3' - 5', un nucléotide correspondant au nucléotide normal ou variant à détecter ne devrait pas être introduit dans la position 3' terminale de l'intervalle. Les nucléotides de la séquence-cible qui définissent l'intervalle entre les sondes partielles hybridées à la séquence-cible sont ainsi efficaces pour permettre la liaison des sondes en rapport avec la séquence-cible normale ou variante mais non avec l'une et l'autre de ces séquencescibles, la présence ou l'absence d'une séquence variante pouvant ainsi être détectée. Ainsi, par exemple, l'intervalle peut com- prendre deux ou trois nucléotides, qui peuvent être identiques ou différents, ou bien, lorsqu'un ou plusieurs des deux ou trois nucléotides est répété, l'intervalle peut être aussi grand que cela est désiré, de manière compatible avec les caractéristiques précitées. A titre d'exemple, l'intervalle entre les sondes partielles peut être défini par la séquence TC dans la séquence-cible normale et par la séquence GC dans la séquence-cible variante. La mise en contact de la portion diagnostique de la séquence de bases normale servant de cible avec les nucléotides G et A distincts dans des conditions permettant une hybridation complémentaire, suivie par la liaison de la première et de la seconde sondes, a pour résultat la formation d'une seule sonde d'une longueur équivalentes la somme des longueurs de la première et de la seconde sondes et comprenant les deux nucléotides qui ont comblé l'inter- valle entre la première et la seconde sondes. La mise en contact de la portion diagnostique de la séquence de bases variante servant de cible avec les mêmes nucléotides G et A distincts dans des conditions permettant une hybridation complémentaire, suivie par une tentative de liaison de la première et de la seconde sondes, n'a pas pour résultat l'extension de la longueur de la première sonde et, ainsi, aucune liaison des deux sondes n'a lieu. Ainsi, il sera possible de différencier la séquence de bases normale servant de cible de la séquence de bases variante par détection de la présence d'une seule sonde de la longueur calculée en ce qui concerne la séquence normale et par la détection de la présence d'une seule sonde de longueur calculée plus courte ou, le cas échéant, de deux sondes distinctes et de faible longueur en ce qui concerne la séquence variante. Un exemple similaire peut comprendre un intervalle entre des sondes partielles défini par la séquence ACTA dans la séquence-cible normale et par la séquence ACGA dans la séquence-cible variante, les nucléotides T, G et A distincts étant utilisés pour la mise en contact de la portion diagnostique de la séquence de base servant de cible. De manière similaire, l'intervalle entre les sondes partielles peut être défini, par exemple, par la séquence ACGT dans la séquence- cible normale et par la séquence ACCT dans la séquence-cible variante, les nucléotides T, G et A distincts étant utilisés pour la mise en contact de la portion diagnostique de la séquence de bases servant de cible. Le ou les nucléotides complémentaires de la séquence-cible entre les segments adjacents auxquels la première et la seconde sondes nucléotidiques sont hybridées peuvent être introduits, de préférence en présence d'une ADN-polymérase, par exemple le fragment de Klenow de l'-ADN- polymérase I ou l'ADN-polymérase de thymus de veau mais, de préférence, la polymérase Taq. La première et la seconde sondes nucléotidiques peuvent être liées par n'importe quel moyen convenable en lui-même connu tel que, par exemple, par ligation enzymatique en utilisant, par exemple, une ADN-ligase ou bien par une liaison covalente/non covalente en utilisant, par exemple, un enchaînement transversal biotine-avidine, mais sont de préférence liées par ligation, par exemple avec l'ADN-ligase. Le ou les nucléotides complémentaires de la séquence-cible entre les segments adjacents auxquels la première et la seconde sondes nucléotidiques sont hybridées sont introduits dans des conditions d'hybridation de sorte que des nucléotides non complémentaires ne soient pas incorporés. Le procédé de la présente invention peut être mis en oeuvre en utilisant un seul nucléotide, par exemple pour l'hybridation à un intervalle AA, GG, CC ou TT, mais est généralement mis en oeuvre en présence de deux nucléotides différents. Le procédé sera mis en oeuvre de manière convenable en utilisant un réacteur distinct pour chaque paire de nucléotides & introduire. Ainsi, jusqu'a dix réacteurs peuvent être utilisés, un pour chaque paire de nucléotides. Puisque l'on connait quelle paire spécifi- que de nucléotides a été introduite pour former une sonde liée, il sera possible de déterminer si une séquence normale ou variante était présente au niveau de la portion diagnostique concernée de la séquence-cible. Dans un tel cas, l'ADN-polymérase utilisée est avantageusement le fragment de Klenow de l'ADN-polymérase I ou l'ADN-polymé- rase alpha de thymus de veau, de préférence la polymérase Taq. De manière convenable, l'ADN-polymérase ne présente aucune activité notable d'exonucléase. Bien que la présente invention soit la plus utile pour diriger des oligonucléotides à des sites d'hybridation spécifiques dans des génomes complexes afin, par exemple, de rechercher la présence de mutations ponctuelles, elle est également utile pour rechercher d'autres variations dans des génomes complexes, telles que des translocation, et ces recherches peuvent être effec- tuées conjointement avec la recherche, par exemple, de mutations ponctuelles dans le même test. Pour la recherche de translocations, il est préféré que le second polynucléo- tide non détectable d'une sonde partielle possède un membre d'une paire de liaison qui lui soit associé et s'hybride à des séquences génomiques adjacentes à des points potentiels d'interruption de translocation. La sonde détectable possède de préférence une longueur allant jusqu'à plusieurs kilobases et s'étend sur une région de points potentiels d'interruption de translocation. Une liaison quantitative de polynucléotides comprenant la sonde partielle après hybridation avec des nucléotides complémentaires de l'intervalle d'au moins deux nucleotides entre les extrémités adjacentes de la première et de la seconde sondes nucléotidiques se produit seulement lorsque la région génomique est contiguë et non interrompue par des translocations. La présence d'une translocation exclut la liaison d'une certaine proportion de la sonde détectable au polynucléotide non détectable. Par dénaturation ultérieure du polynucléotide hybridé et application de l'autre membre de la paire de liaison, une certaine proportion du polynucléotide détectable se révèle être non associée au polynucléotide complexé avec l'autre membre de la paire de liaison. La paire de liaison comprend de préférence une -paire antigène-anticorps ou une interaction biotine- avidine, les hybrides dénaturés étant passés, par exemple, à travers une phase solide complexée avec un membre de la paire de liaison et l'éluat étant analysé pour rechercher la présence de la sonde détectable. Ainsi, dans une autre forme de réalisation de la présente invention, il est proposé un procédé - qui comprend au moins une analyse d'une translocation dans une séquence de bases servant de cible, par exemple un génome complexe dans lequel la première sonde nucléotidique détectable est apte & une hybridation & travers une région d'une ou plusieurs translocations potentielles et la seconde sonde nucléotidique non détectable est apte & une hybridation à des séquences adjacentes à ladite ou lesdites translocations potentielles, la seconde sonde nucléotidique non détectable portant un membre d'une paire de liaison, le procédé consistant à former un hybride de sondes partielles qui est soumis à une hybridation avec des nucléotides complémentaires de l'intervalle d'au moins deux nucléotides entre les-extrémités adjacentes de la première et de la seconde sondes nucléotidiques, puis à effectuer une liaison pour former un hybride de sondes liées. Le cas échéant, chacune de la première sonde nucleotidique détectable et de la seconde sonde nucléoti- dique peut porter un groupement choisi de manière qu'après formation de l'hybride de sondes liées, et lorsque cela est approprié une dénaturation, un signal soit seulement détectable s'il est obtenu une séquence de nucléotides qui porte à la fois le groupement fixé à la première sonde nucléotidique détectable et le groupement fixé à la seconde sonde nucleotidique. Les sondes nucléotidiques peuvent être, par exemple, des sondes oligonucléotidiques. Cette technique pourrait être mise en oeuvre, par exemple, en utilisant des procédés de transfert d'énergie non radioactifs (voir, par exemple, le brevet européen publié sous le NO 70 685 au nom de Standard Oil Co.) ou des techniques de cheminement enzymatique (voir, par exemple, le brevet européen publié sous N' 95 087 de Syva Co.). Le procédé de la présente invention peut comprendre également une analyse dans laquelle une séquence-cible ou une portion diagnostique de cette séquence est soumise à une hybridation avec plus de deux sondes oligonucléotidiques, puis à une hybridation à des nucléotides complémentaires du ou des intervalles d'au moins deux nucléotides entre des extrémités adjacentes des sondes oligonucléotidiques de sorte que, lorsqu'une séquence-cible complémentaire est présente, un hybride de sondes partielles soit obtenu, la première sonde nucléoti- dique détectable étant une sonde oligonucléotidique terminale qui est détectable et la seconde sonde nucléoti- dique étant l'autre sonde oligonucléotidique terminale à laquelle est fixé un membre d'une paire de liaison, une ou plusieurs autres sondes oligonucléotidiques distinctes étant hybridées séparément mais en position adjacente à une séquence-cible contiguê entre lesdites sondes oligonucléo- tidiques terminales, et les sondes oligonucléotidiques distinctes sont liées pour la jonction de la sonde oligonucleotidique détectable & la sonde oligonucléotidique & laquelle est fixé un membre d'une paire de liaison pour former un hybride de sondes liées qui est ensuite dénaturé et mis en contact avec l'autre membre de la paire de liaison, la séquence nucléotidique de la sonde liée détectable comprenant ladite paire de liaison pouvant ainsi être séparée d'autres séquences nucléotidiques. Ainsi, un oligonucléotide terminal (s'hybridant en position adjacente à une série d'autres oligonucléotides) porte, par exemple, un groupement détectable de marquage, tandis que l'autre oligonucléotide terminal porte un groupement faisant partie d'une paire de liaison, le groupement étant efficace pour permettre la séparation en solution de l'oligonucléotide d'un mélange contenant d'autres séquences de nucléotides. Les oligonucléotides hybridés en position adjacente sont liés les uns aux autres par un traitement approprié afin d'effectuer une jonction efficace des groupements de marquage et de liaison par l'intermédiaire d'une sonde liée. La perte de tout hybride d'oligo- nucléotides distinct a pour résultat une incapacité ultérieure & la jonction des groupements de marquage et de liaison. L'hybride de sondes liées est dénaturé et mis en contact avec l'autre membre de la paire de liaison qui reconnaît un oligonucléotide terminal dans la sonde liée. Ainsi, la sonde liée peut, le cas échéant, être séparée d'autres oligonucléotides dans le mélange, puis être analysée pour déterminer la présence du groupement détectable. Ainsi, l'association de l'oligonucléotide de liaison à l'oligonucléotide de marquage dépend de la présence, par liaison d'oligonucléotides hybridés en position adjacente, de tous les oligonucléotides adjacents entre l'oligonucléotide de marquage hybridé et l'oligo- nucléotide de liaison. La paire de liaison effectuant la séparation de la sonde liée avec un groupement de liaison associé peut être constituée de l'avidine et de la biotine ou bien d'un antigène et d'un anticorps spécifique associé. Cette forme de réalisation permet la recherche de bandes de séquences de nucléotides servant de cibles plus longues qu'avec seulement deux sondes liées ou partielles d'hybri- dation adjacentes, comme dans d'autres formes de réalisa- tion. Lorsqu'il est désiré que la sonde nucléotidique porte un signal ou un résidu capable d'engendrer un signal, ces signaux ou résidus peuvent être en eux-mêmes connus, comme cela est par exemple le cas d'un marqueur radio- actif. Le résidu qui est capable d'engendrer un signal non radioisotopique peut comprendre en variante un élément de marquage séparé normalement de l'oligonucléotide par un groupe d'espacement. Ce groupe d'espacement peut le cas échéant être lié à l'élément de marquage du complexe par une liaison covalente directe ou par une interaction protéine-ligand ou antigène-anticorps, par exemple- une interaction avidine-biotine ou dinitrophényl-anticorps antidinitrophényle. Il est entendu que l'élément de marquage du résidu peut être lui-même capable de marquage ou peut être capable d'engendrer un signal par interaction avec un agent approprié suivant des procédés en eux-mêmes connus. Ainsi, par exemple, un élément de marquage apprécié du résidu fixé de manière covalente renferme un système destiné à engendrer, à activation enzymatique, un change- ment de couleur. Les systèmes enzymatiques préférés comprennent laphosphatage alcaline, la phosphatage acide, la bêta-galactosidase, la luciférase ou la peroxydase de raifort. Ces systèmes enzymatiques ne sont pas en eux-mêmes aptes à un marquage mais sont aptes à engendrer un signal en présence d'un substrat approprié, suivant des procédés en eux- mêmes connus. L'élément de marquage du résidu fixé de manière covalente peut fonctionner suivant n'importe quelle technique classique telle que, par exemple, par luminescence, fluorescence ou par la présence d'une couleur. Lorsque l'enzyme utilisé est la phosphatage alcaline, un substrat particulièrement approprié est le système de substrat chimioluminescent décrit dans la demande de brevet européen publiée sous le N' 254 051 (Wayne State University) et par Schaap et collaborateurs, Tetrahedron Letters, 28, 11, 1155-1158. Lors de l'utilisation, il est généralement nécessaire que la sonde d'acide nucléique détecte de très faibles quantités de la séquence oligonucléotidique totalement complémentaire. Dans ces cas, il est avantageux d'incorporer & la sonde un moyen d'amplification du signal. L'amplification peut être effectuée par des techniques connues, par exemple en utilisant un ou plusieurs des systèmes décrits dans les brevets européens publiés sous les N' 27 036 (Self), 49 606 (Self), 58 539 (Self) et 60 123 (Self). La présence de n'importe quelles sondes liées peut être détectée par n'importe quel procédé convenable mais dépend du système ou résidu de marquage capable d'engendrer un signal, porté par les sondes détectables. Par exemple, les sondes liées peuvent être séparées de la séquence de nucleotides servant de cible, & laquelle elles sont hybridées, par dénaturation, si nécessaire par une dénaturation sélective et les sondes liées peuvent être analysées par électrophorèse et, lorsque cela est appro- prié, par autoradiographie. La détection peut également être effectuée par l'utilisation d'une paire de liaison. Ainsi, par exemple, la première ou la seconde sonde nucléotidique peut le cas échéant comprendre un membre d'une paire de liaison. En général, le membre d'une paire de liaison est porté par, ou constitue une partie de, la seconde sonde nucléotidique. L'autre membre de la paire de liaison peut être présent en solution ou sur un support. Ainsi, lorsque cela est approprié, la seconde sonde nucléotidique liée à la première sonde nucléotidique détectable peut être isolée sur un support portant l'autre membre de la paire de liaison. Une telle paire de liaison peut être, par exemple, une interaction protéine-ligand ou antigène-anticorps, telle qu'une interaction avidine- biotine ou dinitrophényl-anticorps-antidinitrophényle. Effectivement, un membre de la paire de liaison peut être une séquence de nucléotides, séquence qui peut être une portion de la séquence de la sonde ou bien peut être une ramification constituée d'une séquence de nucléotides sur la sonde. L'autre membre de la paire de liaison peut être, par exemple, une protéine qui se lie à la séquence de nucléotides ou bien une autre séquence de nucléotides à laquelle il s'hybride. Ainsi, le procédé de la présente invention permet de rechercher chez de nombreux individus des états héréditaires, comprenant la détection d'hétérozygotes, par exemple si un oligonucléotide "normal" suspecté, à détecter, et un oligonucléotide "mutant" suspecté, à détecter, sont substitués au niveau des sites appropriés. En outre, le procédé préféré de la présente invention permet d'en achever la mise en oeuvre notablement plus rapidement que dans le cas d'une analyse classique par PLFR puisque cela supprime la nécessité d'une fixation sur papier filtre par la méthode de Southern et que cela peut éviter l'utilisation d'une hybridation sur filtre. Ainsi, par exemple, lorsqu'un gène peut contenir un nombre X donné de mutations ponctuelles connues, l'une quelconque provoquant un état héréditaire particulier, le procédé de la présente invention peut être utilisé pour donner un diagnostic. Ainsi, il est possible de synthétiser X oligonucléotides, par exemple 30 motifs monomères, chacun complémentaire par exemple au côté 3' des mutations ponctuelles possibles. En conséquence, chaque oligonucléotide possède' une séquence différente. Chaque oligonucléotide peut être marqué, par exemple marqué en 5', de manière convenable radiomarqué (par exemple avec le 32p). Puis X autres oligonucléotides peuvent être syn- thétisés, chacun ayant des longueurs différentes, ayant par exemple des longueurs de 15, 20, 25 et 30 nucléotides, espacées de 5 nucléotides, et chacun ayant un résidu terminal adjacent au mutant suspecté et sa sonde marquée correspondante, par exemple une base d'un résidu 5' terminal. Cette seconde série d'oligonucléotides est également capable d'hybridation à la séquence d'ADN normale. Les oligonucléotides sont conçus pour une hybridation à l'un ou l'autre côté de la mutation ponc- tuelle suspectée de sorte qu'un hybride de sondes partiel- les est formé avec un intervalle d'au moins deux nu- cléotides entre les portions de sondes de l'hybride. Puis de l'ADN humain total peut être prélevé, dénaturé et la totalité de 2X oligonucléotides peut être introduite dans un seul réacteur. Les oligonucléotides peuvent être ensuite hybrides à l'ADN dénaturé et un ou plusieurs types de nucléotides ajoutés dans des conditions permettant une hybridation complémentaire, suivie d'une ligation. Puis le mélange de ligation peut être dénaturé et soumis à une électrophorèse, par exemple introduit sur un gel de polyacrylamide dénaturant. Une autoradiographie peut être ensuite effectuée de sorte que la présence ou l'absence de mutations ponctuelles possibles puisse être visualisée. En ce qui concerne l'ADN normal, aucune ligation ne s'effectue lorsque les types de nucléotides ajoutés sont complémen- taires de la séquence mutante correspondante et, ainsi, les séquences les plus longues visualisées ne sont pas plus longues que les matières oligonucléotidiques de départ les plus longues. Seule la présence d'une mutation ponctuelle a pour résultat une ligation et, ainsi, la présence d'une séquence nucléotidique plus longue. Cependant, si la seconde sonde nucléotidique est marquée, cette sonde peut être soumise & une extension limitée mais un choix approprié de la longueur de l'amorce dans le contexte de la région de diagnostic évite des produits d'extension plus longs qui peuvent être considérés par erreur comme étant des produits de ligation. La dimension de la bande de produit (c'est-à-dire la longueur de la séquence de nucléotides) caractérise formellement la nature de la mutation. On notera que la première série de X oligonu- cléotides décrite précédemment pourrait tout aussi bien être conçue de sorte que leurs résidus 3' terminaux soient adjacents à la base mutante suspectée. Une ligation sélective à une seconde série de X autres oligonucléotides de longueurs de chaine croissantes, de la manière précitée, pourrait alors être effectuée et détectée de la manière décrite. On notera également qu'il est possible de synthétiser l'une ou l'autre des deux séries de X oligo- nucléotides à des distances, par exemple, de 5 nucléotides. En général, la série d'oligonucléotides de longueur constante sera marquée de la manière décrite précédemment. La confirmation de la présence ou de l'absence d'une mutation ponctuelle donnée peut être obtenue en répétant les modes opératoires ci-dessus mais en effectuant un remplacement avec une série appropriée de nucleotides qui sont totalement complémentaires,devant être la séquence normale escomptée. Une association des deux voies offre un procédé pour la détection d'hétérozygotes qui sont intéressants pour l'analyse d'états héréditaires dominants et dans la détection de porteurs d'états héréditaires récessifs. Des exemples de substitutions de paires de bases provoquant une maladie génétique qui peuvent être détectées en utilisant le procédé de la présente invention comprennent les suivants q% Substit a'en de paires de base provoquant un trouble génétique A autocmiq.e qtuhle &,,,itutn Référunc de paire de DIficience en arnthithrine CS TG Dmhange et oxllabo- III rateurs, Nucleic Acids Basearch 14:2408 (1986) Polynrpathie amyloïde OS * CA Media S. et collabora- teurs, Mol.Biol.Fed, 329- 338 (1986) AC. GC Wallace M.R. et collabo- rateurs, J. Clin.Invest. 78:6-12 (1986) AG * GG Wallace M.R. et collabo- rateurs, J. Clin. Invest. 78:6-12 (1986) Déficienoe en alpha-l- TG CGO Nukiwa T. et collabora- antitryp6ine teurs, J.Biol.Chem. 261: 15989-15994 (1986) O CGCA Kidd V.J. et collabora- ts.rs, Nature 304:230-234 (1983) Déficiencea en adénosine- désaminase OG À CA Bonthron D.T. et collabo- rateurs, J.Clin Invest 76:894-897 (1985) AA AG Valerio D. et collabora- tours EMBO J 5:113-119 (1986) CTr O Déficience en apolipopro- téine E Gr À Cladaras et oollabora- teurs, J.Biol. Chem. 262:2310-2315 (1987) Diabète sucré, bénin TC * CC Haneda M. et collabora- teaurs, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80:6366-6370 (1983) Trci:le S&:tit]tin Mèfrce de paize de TC TG Shoelsn S. et collabora- teurs, Nature 302:540-543 (1983) TG T TT n I Maladie de Gau.xer de type 2 cr * OC n;uji S. et collabora- teurs, N.Engl.J. Ned. 316:570-575 (1987) Hyperinsulinrmie, familiale C. * Shibasaki Y. et collabora- teurs, J. C1 in.Invest. 76:378-380 (1985) Ch GA Chan S.J. et collabora- teurs, J.Clin.Invest. 76:378-380 (1985) Déficience en dcanes kppa Cr Stavn e-No rdgren J. et d' iminoglduline collaborateurs, Scierne 230:458-461 (1985) DIficienoe en réceeur de GG * GA lehzman M.A. et collabora LDL teurs, Cell 41:735-743 (1985) Osteoeesis inperfecta TG * Tr mhn D.H. et collabora (type II) teurs, Proc Natl ad Sci USA 83: 6045-6047 (1986) Phy ltcru.rie A > AA Dilella A.G. et collabora- tours, Nature 322:799-803 (1986) OCG TG Dilella A.G. et oollabora- teurs, Nature 327:333-336 (1987) Déficienoe en protéine C OS TG Romeo G. et collabora- teurs, Proc Natl Acad Sci USA 84:2829-2832 (1987) GG GC Déficience en purine- TG * TA William S.R. etcollabora nurclc3ide-Illsphorylase teurs, J. Biol. Chemn. 262:2332-2339 (1987) Anémie à héaties falciformes GA GT Chang J.C. et Kan Y.W., Iancet 2, 11279 (1981); Orkin S.H. et collabora- teurs, New Eng.J.Med. 307, 32-6 (1982); et Conner B.J. et collaborateurs Proc.Nat.Acad.Sci. USA, Q80, 278-82 (1983) Maladie de Tarngier A - AT Law SW. et Brewer HB, J.Biol.Chem 260:12810- 12814 (1985) Bâta-thalassie cat&xuue de tant e f e a) ANRm non fcoctionnel Mitants non sens (1) codon 17 (A - T) 0 Chang J.C. et collabora- teurs, Proc.Natn.Aca1.Sci. USA 76:2886 (1979) (2) codon 39 (C - T) 0 Trecartin R.F. et collaborateurs, J.Clin.In- vest. 68:1012 (1981) et Chehab F.F. et collaborateurs, Lancet i:3 (1986) (3) codon 15 (C - A) 0 Xazazian H.H. et collabo- rateurs, Eur. Molec. Biol.Org.J. 3:593 (1984) (4) codon 37 (G - A) 0 Bo"m C.D. et collabora- teurs, Blood 67:1185 (1986) (5) o:don 121 (G - T) 0 Kazazian H.H. et collabo- rateurs, Am.J.Hum.Geet. 38:A860 (1986) 29d&e de iY n Mutants à tram décalée (6) -2 codon 8 0 Orkin S.H. et collabora- teurs, J. Biol. Chem.256:9782 (1981) (7) - 1 codon 16 0 Fazazian H.H. et collabo- rateurs, Etr.IDlec.Biol. Org.J. 3:593 (1984) (8) - 1 codon 44 0 Kinniburgh A.J. et collaborateurs, N"ucleic Acids Pes 10:5421 (1982) (9) - 1 oodcn 8/9 O Kazazian H.H. et collabo- rateurs, Eur.Molec.Biol. Org. J.3:593 (1984) *et wng C. et collabora- teurs, Proc.Natn.Ac_.Sci. USA 83:6529 (1986) (10) - 4 codois 41/42 0 Kazazian, HH et collabora- teurs, Eur.M1lec. Biol.Org. J 3:593 (1984) et Kimura A. et collaborateurs, J. Bio1.Chem. 258:2748 (1983) (11) - 1 codon 6 O Fazazian H.H. et collabo- rateurs, Am.J.Hu.Genat. :1028 (1983) (12) + 1 codons 71/72 0 Ceng T.C. et collabora- teurs, Proc.Natn.Acad.Sci. UEA 81:2821 (1984 (b) Mutants de maturation d'ANR Variations de jonction d',pissre (1) IVS 1 position IGT>AT 0 Orkin S.H. et collabora- teurs, Nature 296:627 (1982), et Treisman R. et collabora- teurs, Nature 302:591 (1983) catêxirie de s*uant *e (2) IVS 1 position 1 GPTT O Kazazian, H.H. et collaborateurs, Eur. Molec.Biol.Org.J. 3:593 (1984) (3) IVS 2 position 1 GT>ATO Orkin, S.H. et collabora- t.urs, Nature 296, 627 (1982), et Tris-an R. et collaborateurs, Cell 29:903 (1982) (4) IVS I extrénité 3':-17pb 0 Burn H.F. et collabora- teurs, Haeioglcbin:mlé- cular genetic and clinical aspects, p. 293 (Sauders, ]ilaelhie 1986) (5) IVS I extrênité 3':-25çbO Kazazian, H.H. et collaborateurs, Eur.Molec. Biol.Org.J., 3:593 (1984) et Orkin, S.H. et collaborateurs, J. Biol.hem. 258:7249 (1983) "p) IVS Z extrmité 3':AGZ>GO Padanilam B.J. et collaborate;rs, Am.J.Hea- tol. 22:259 (1986) (7) IVS 2 extréité 3':ACaOG O Antonarakis S.E. et collaborateurs, Proc. Natn.Acad.Sci.USA 81:1154 (1984) et Atweh G.F. et collaborateurs, Nucleic Acids Res. 13:777 (1985). Variatics s (8) IVS 1 position 5 (CGC)+ Kazazian, H.H. et collaborateurs, Eur. Molec.Biol.Org.J. 3:593 (1984), et Treisman R. et collaborateurs, Nature 302:591 (1983) Ct ri Ce de rtant ?ye (9) IVS 1 position (G-T) O Wong C. et collaborateurs, Proc.Natn.Acad.Sci.UA 83: 6529 (1986), et Atweh G.F. et collaborateurs, NuLleic Acids 1es.13:777 (1985) (10) IVS i position 6 (TiC) + Orkin S.H. et collabora- teurs, Nature 296:627 (1982), et Atweh G.F. et ocllaborateurs, Am.J.Hum. Genet. 38:85 (1986) Vaariati s interne (11) IVS i poeition 110 (G-A) + Westaway D; et collabora- teurs, Nicleic Acids Res. 9: 1777 (1981) (12) IVS 2 position 705 (T-G) + Dobkin C. et collabora- teuanrs, Proc.Natn.Acad.Sci. USA 80:1184 (1983) (13) IVS 2 position 745 (CsG) + Orkin S.H. et collabora- teurs, Nature 296:627 (1982), et Treisman R. et collaborateurs, Nature 302:591 (1983) (14) IVS 2 position 654 (C>T) 0 Cheng T.C. et collabora- teurs, Proc.Natn.Acad.Sci. UBA 81:2821 (1984) (15 IVS i position 116 (TrG) ? Feingold E.A. et collabo- rateurs, Ann.N.Y.Acad.Sci 445:159 (1985) Ssit.tis de régits de codage (16) codon 26 (G-A) 0+,p6 Thein S.L. et collabora- teurs, J.Med.Genet. (mous presse en 1986), et Orkin - S.H. et ollaboratru, Nature 300: 768 (1982) (17) codon 24 (TI-A) + Goldsmith et collabora- teurs, Proc.Natn.Acad.Sci USA 88: 2318 (1983) Catêocrie atant m (18) codon 27 (G>T) e,m oe6ss Orkin SH et collabora- teurs, Blood 64: 311 (1984) (c) MLtants tra, fi ti.inels (1) -88 C>T + Wbng C. et collaborateurs, Proc.Natn.Aca.Sci.UEA 83: 6529 (1986), Orkin S.H. et collaborate, J. Biol. Cham. 259: 8679 (1984) (2) -87 C-G + Orkin S.H. et collabora- teurs, Nature 296: 627 (1982), et Treihnan R. et collaborateurs, Nature 302: 591 (1983) (3) -31 A-G + Takihara Y. et oollabora- teurs, Blood 67: 547 (1986) (4) -29 A-G + Antonarakis S.E. et collaborateurs, Proc. Natn.Acad.Sci.USA 81: 1154 (1984), et Wkng C. et Collabora- teurs, Proc.Natn.Acad.Sci. UEA 83: 6529 (1986) (5) -28 A-C + Surrey S. et oollabora- teurs, J.Biol.Chem. 260:6507 (1985) (6) -28 A-G + Orkin S.H. et collabora- teurs, Nucleic Acids Res. 11: 4727 (1983) (d) Mutant de polyainylation (1) AATAA-AACAA + Orkin S.H. et collabora- teurs, Eur. Molec. Biol.Org.J. 4: 453 (1985) Ctnrie de utant e (e) Déléticsr (1) 3'i(-619pb) O Spritz R.A. et collabora- tours, Nucleic Acids Res. 10: 8025 (1982), et Orkin S.H. et collabo- rateurs, Proc. Natn. Acad.Sci. USA 76: 2400 (1979) (2) 5'p(-1,35kb) 0 BbF Padanilam B.J. et oollaborateurs, Blood 64: 941 (1984) (3) j (-lOkb) 0 HbF Gilmn J.G. et collabora- tours, Br.J.Ha t. 56: 339 (1984) + = mxtant j-thalassênie (P-) qui provoque ue pro tn réduite de chaines de p-globine; 0 = un mitant (B') qui provoque une prodztion mille de Calnes de 6-globine. Trouble Substitution Bfé r e de eire de beses Déficience en triose- p!osphate-iscoérase AG * AC Daar I.0. et collabora- teors, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83:7903-7907 (1986) Déficience en uropor- phyrircgke-dcarbcxy- lase GG > GA De Verneuil H. et collaborateurs, Scienoe 234:732-734 (1986) B lié au chtro se X Hmophilie A Facteur VIII C;G > G (24) Gitschier J. et collabora- teurs, Nature 315:427-430 (1985) COG TG (26) n " CG * TG (18) Antonarakis S.E. et collaborateurs, N. Egl.J. Med. 313: 842-848 (1985) TnlbSe SusitituticnRféec o. c C (26) Gitschier J. et collabora- tears, Science 232: 1415- 1416 (1986) CG * TG (18) Youssoufian H. et collaborateurs, Nature 324: 380-382 (1986) CG * TG (22) CG TG (22) " Hkçi'lie B Facteur IX CG CA Beitley A.K. et collabora- tears, 45: 343-348 (1986) GTTr Rses D.J.G. et oollabora- teurs, Nature 316: 643-645 (1985) GA * GG Davis L.M. et ollabora- teurs, Blood 69:140-143 (1987). Le cas échéant, le procédé de la présente invention peut être mis en oeuvre de manière & amplifier le signal qui peut être engendré par la ou les sondes détectables. Il est possible d'y parvenir en effectuant n'importe quelle liaison, par exemple une ligation, et/ou n'importe quel comblement avec une ADN-polymérase en présence d'un excès d'une ou plusieurs séries de sondes, chaque série de sondes comprenant une première sonde nucléotidique détectable et une seconde sonde nucléotidique et chaque sonde ayant une séquence de nucléotides homologue de segments adjacents d'une portion diagnostique désirée d'une séquence- cible. Ainsi, par exemple, la sonde liée pour la détection peut être formée, dénaturée, par exemple pour une détection, et, en outre, des hybrides de sondes partielles peuvent être formes, liés et dénaturés le cas échéant à l'infini, engendrant ainsi l'amplification désirée. En conséquence, lorsque, par exemple, la quantité d'ADN génomique à tester est limitante, des techniques d'amplification peuvent être utilisées. Il est donc possible d'effectuer une ligation avec une ADN-polymérase, par exemple en solution, puis une dénaturation, par exemple une dénaturation par la chaleur, et d'utiliser ensuite une autre ligation avec une ADNpolymérase, les réactions étant effectuées en présence d'un excès de la ou des séries de sondes concernées et de nucléotides. Conformément à une autre caractéristique de la présente invention, il est proposé une série de sondes destinée à être utilisée dans le procédé de la présente invention, chaque série de sondes comprenant une première sonde nucléotidique détectable et une seconde sonde nucléotidique, hybridables à des segments adjacents d'une portion diagnostique d'une séquence de bases servant de cible, les séquences de nucléotides de la première et de la seconde sondes étant choisies de manière que, lors de l'utilisation, elles forment un hybride avec une séquence- cible complémentaire, hybride dans lequel la première et la seconde sondes sont séparées par un intervalle formé par au moins deux nucléotides de la séquence-cible complémentaire, les nucléotides de la séquence-cible normale et/ou variante comprenant la totalité, moins un, des différents nucléoti- des présents à l'état naturel, l'intervalle étant en outre caractérisé en ce que, lors de l'utilisation, un ou plusieurs types de nucléotides peuvent être utilisés pour la mise en contact de la portion diagnostique de la séquence de bases servant de cible, ces types de nucléo- tides étant aptes à une sélection de sorte que le ou les nucleotides normaux ou variants soient non complémentaires de ces types de nucléotides. La séquence variante potentielle présente dans la portion diagnostique d'une séquence de bases servant de cible est constituée de préférence par une substitution d'une paire de bases qui est, par exemple, révélatrice d'un trouble génétique. A cet égard, des séries de sondes basées sur les troubles génétiques mentionnés sur le tableau précité constituent une autre forme de réalisation de la présente invention. La première et la seconde sondes nucléotidiques possèdent n'importe quelle longueur convenable. En conséquence, les sondes peuvent contenir indépendamment 5 & nucléotides, par exemple 15 à 30 nucléotides. La première et la seconde sondes nucléotidiques sont séparées convenablement par un nombre de nucléotides de la séquence- cible allant jusqu'à 5. Dans une forme de réalisation appréciée, un intervalle de deux nucléotides est présent. Afin de permettre une mise en oeuvre convenable du procédé de la présente invention, il est généralement avantageux d'incorporer les sondes nucléotidiques à un kit et ce kit est donc considéré comme étant une autre caractéristique de la présente invention. Ainsi, conformément & une autre caractéristique de la présente invention, il est proposé un kit pour la détection de la présence ou de l'absence d'au moins une séquence nucléotidique variante, qui comprend au moins une série de sondes répondant à la définition précitée, chaque série de sondes comprenant une première sonde nucléotidique détectable et une seconde sonde nucléotidique, chaque sonde ayant une séquence de nucléotides homologue de segments adjacents d'une portion diagnostique désirée d'une séquence-cible, une séquence variante potentielle étant présente entre celles-ci, la séquence de nucleotides de la première et de la seconde sondes étant choisie de manière que, lorsqu'un hybride de sondes partielles est formé avec une séquence-cible complémentaire, les sondes soient séparées par un intervalle formé par au moins deux nucléotides de la séquence-cible complémentaire. Le kit peut contenir en outre une ou plusieurs séries d'un ou plusieurs nucléotides qui sont complémen- taires ou non complémentaires de la séquence de nucléotides servant de cible effectuant le pontage entre la première et la seconde sondes nucléotidiques, et contient en outre un ou plusieurs réactifs pour la liaison desdits sondes. Le kit contient également avantageusement des moyens pour l'extraction de l'ADN et/ou des moyens pour l'immobilisation de l'ADN sur un support solide. Le cas échéant, au moins l'une de la première sonde nucléotidique détectable et de la seconde sonde nucléotidique dans chaque série de sondes peut porter un membre d'une paire de liaison, l'autre membre de la paire de liaison étant présent, par exemple, sur un support solide fourni avec le kit. Le kit comprend également des solutions-tampons et/ou des solutions de lavage appropriées et contient des instructions écrites ou imprimées pour l'utilisation du kit conformément au procédé de la présente invention. La présente invention peut être illustrée, mais à titre non limitatif, par l'exemple et les figures suivants: La figure 1 illustre l'analyse de loci individuels. L'autoradiographie montre des bandes obtenues à partir de mélanges réactionnels soumis à une électropho- rèse sur gel, décrits en détail dans l'exemple mentionné ci-dessous. Les voies 1 à 6 correspondent aux réactions 1 à 6. La figure 2 illustre l'analyse simultanée de deux loci distincts. Les voies 7 et 8 correspondent aux réactions 7 et 8. L'autoradiogramme montre des bandes obtenues à partir de mélanges réactionnels soumis à. une électrophorèse sur gel, décrits en détail dans l'exemple mentionné ci-dessous. Sur l'une et l'autre des figures précitées, les dimensions des produits de réaction (en nucléotides) sont indiquées sur la droite. L'origine des gels est également indiquée. BBP indique la position du bleu de bromophénol servant de colorant de marquage. Des oligodésoxyribonucléotides (oligonucléo- tides) sont synthétisés de manière complémentaire à des régions & l'intérieur d'exons du gène de l'alpha-l- antitrypsine humaine (aIAT). La séquence de paires de bases des nucléotides 1112-1329 du gène est la suivante: Alul CTGCTGGGGCCATGTTTTTAGAGGCCATACCCATGTCTATCCCCCCCGAGGTC J GACGACCCCGGTACAAAAATCTCCGGTATGGGTACAGATAGGGGGGGCTCCAG AAGTTCAACAAACCCTTTGTCTTCTTAATGATTGAACAAAATACCAAGTCT I TTCAAGTTGTTTGGGAAACAGAAGAATTACTAACTTGTTTTATGGTTCAGA CCCCTCTTCATGGGAAAAGTGGTGAATCCCACCCAAAAAATAACTGCCTCTG I GGGGAGAAGTACCCTTTTCACCACTTAGGGTGGGTTTTTTATTGACGGAGAC GCTCCTCAACCCCTCCCCTCCATCCCTGGCCCCCTCCCTGGATGACATTA I CGAGGAGTTGGGGAGGGGAGGTAGGGACCGGGGGAGGGACCTACTGTAAT AAGAAGGGTTGAG Alul ] -. TTCTTCCCAACTC MODE OPERATOIRE Un plasmide contenant un élément d'insertion d'ADNc partiel codant pour l'extrémité carboxy de la aIAT humaine, contenant les nucleotides 1020 à 1340, tel qu'il a été défini par Cohan et collaborateurs (DNA, 3, 327-330, 1984), a été digéré totalement avec l'enzyme de restriction Alu I dans les conditions recommandées par les fabricants (Boehringer Mannheim). Des oligonucléotides, 5'd(CCCATGTCTATCCCCCCCG) (oligo 4), 5'd(CCAAGTCTCCCCTCTTCATGGG) (oligo 6), et ' d (ACCCCTCCCCTCCATCCCTGGCCCCCTC) (oligo 8), complémen- taires respectivement des nucléotides 1141-1159, 1208-1229, et 1275-1302 ont été phosphorylés en 5' dans des réactions distinctes en utilisant 100nM d'oligonucléotide et un excès double de 5' y-32p-adénosine triphosphate (5' y-32P-ATP) dans un tampon contenant 50 mM de Tris/HCl (pH 9,0), 10 mM de MgC12, 20 mM de DTT, 0,1 mM de spermidine et 0,1 mM de EDTA. L'activité spécifique du 5't -32P-ATP était égale à 5000 Ci/mmole. La phosphorylation a été effectuée en utilisant la polynucléotide-kinase (1, 5 unité par pmole d'oligonucléotide). Chaque mélange réactionnel a été incubé 37'C pendant 275 minutes, puis a été chauffé à 100-C pendant 5 minutes. Les oligonucléotides ont été purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et par électro- élution, suivies par une précipitation par l'éthanol. La phosphorylation a été confirmée par autoradiographie. Des oligonucléotides, 5'd(GGGGCCATGTTTTTAGAGGCCA), (oligo 3), 5'd(CCTTTGTCTTCTTAATGATTGAACAAAA) (oligo 5), et 5'd(CACCCAAAAATAACTGCCTCTCGCTCCT (oligo 7), respectivement complémentaires des nucléotides 1117-1138, 1178-1205; et 1245-1272 ont.été également utilisés. Les oligonucléotides 3 et 4 sont séparés par le dinucléotide 5'd(TA) complémentaire du dinucléotide 3'd(AT) dans le gène aIAT humain. De manière similaire, les oligonucléotides 5 et 6 sont séparés par le dinucleotide 'd(TA). Les oligonucléotides 7 et 8 sont séparés par le dinucléotides 5'd(CA) complémentaire du dinucléotide 3'd(GT) dans le gène aIAT humain. Le modèle pour le comblement et les ligations était un plasmide d'ANDc aIAT clivé avec Alu I (Alu I n'effectue de clivage ni entre chaque paire d'oligonucléo- tides (c'est-à-dire 3 et 4, 5 et 6 ou 7 et 8) ni & l'intérieur de la séquence de n'importe lequel des oligonucléotides. 20 Mg du plasmide ont été incubés dans un tampon à concentration moyenne en sels (fourni par BCL) avec l'enzyme de restriction Alu I (17,5 unités) pendant minutes à 37'C. La réaction s'est révélé être totale par électrophorèse sur un gel à 1,4 % d'agarose dans un tampon au Tris/borate contenant 0,5 pg/ml de bromure d'éthidium, et en effectuant une visualisation sous la lumière UV. Les séries suivantes d'oligonucléotides ont été réunies à l'ADNc servant de modèle, puis ont été traitées avec les paires de nucléotidetriphosphates (dNTP) menti-nnées ci-dessous. Réaction Oligonucléotides dNTP 1 3+4 C+A 2 3 + 4 T+A 3 5 + 6 C+ A 4 5 + 6 T+A A 7 + 8 C+A 6 7 + 8 T+A 7 3 + 4 + 5 + 6 C+A 8 3 + 4 + 5 + 6 T+A 9 3 + 4 + 5 + 6 + 7 + 8 C+A 3+ 4 + 5 + 6 + 7 + 8 T+A Chaque réaction a été conduite conformément au protocole suivant: Tampon de réaction: Tris/HCl 67 EM (pH 8,8), (NH4)2S04 16,6 mM, MgC12 6,7 mM, mercapto-éthanol 10 xM et EDTA 6,7 mM. ADNc servant de modèle: 50 fmole/réaction. '32P-oligonucléotide (4,6 ou 8): 300 fmoles/réaction. Oligonucléotide non marqué (3,5 ou 7): 75 fmoles/réaction. dNTP: 40 nmoles/réaction (volume réactionnel 20 p1) Etape (a) Dénaturation de l'ADNc servant.de modèle & 91VC pendant 2 minutes, (b) Réunion des oligonucléotides appropriés & 60'C pendant 5 minutes, (c) Addition de polymérase Taq (0,1 unité), (d) Addition des dNTP, en laissant la réaction s'effectuer pendant 2 minutes à 60'C, (e) Refroidissement instantané & -70C pendant minutes, en laissant ensuite le mélange décongeler & température ambiante, (f) Addition de 2,5 p1 de tampon ligase lox (Tris/HCl 660 mM (pH 7,6), MgC12 66 EM, DTT 100 mM, ATP 4 mM), (f) Addition d'ADN-ligase de T4 (2,5 p1, 0,125 uni- té, dilué préalablement dans du tampon ligase lX), (h) Incubation & 23*C pendant 40 minutes, puis incubation à 4'C pendant 40 minutes et ensuite incubation à 'C pendant 5 minutes, (i) Addition d'un tampon & concentration moyenne en sels (fourni par BCL) et de 0,5 unité d'enzyme de restric- tion Alu I, (j) Incubation à 37-C pendant 120 minutes, (k) Prélèvement de 4 p1 dans 10 p1 de formamide à %, 1 mM d'EDTA et 0,1 % de bleu de bromophénol, (1) Dénaturation de l'échantillon à 90'C, puis refroidissement rapide à OC, (m) Electrophorèse sur un gel à 15 % de polyacryl- amide dans un tampon Tris/borate contenant de l'urée 7M, (n) Autoradiographie du gel. L'examen de l'autoradiogramme a montré les bandes escomptées pour les produits obtenus par traitement avec la polymérase et la ligase, c'est-àdire le 32p_ oligonucléotide de départ une extension par incorporation des dNTP (lorsqu'il existe une complémentarité avec le modèle), ou bien des produits plus longs obtenus par insertion sélective des dNTP complémentaires entre des paires oligo, puis par ligation. Ainsi, les produits observés sont: REACTION LONGUEUR(S) ESCOMPTEE(S) LONGUEURS(S) OBSERVEE(S) DU OU DES PRODUITS DU OU DES PRODUITS 1 20* telle qu'escomptée 2 44 idem 3 26* idem 4 56 idem 60* idem 6 28 idem 7 20* + 26* idem 8 44 + 56 idem 9 20* + 26* + 60* idem 44 + 56 + 28 idem * Extension du 32P-oligonucléotide par du dNTP. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la détection de la présence ou de l'absence d'au moins une séquence variante en un seul test, caractérisé en ce qu'il consiste: 1) à hybrider une première sonde nucléotidique détectable et une seconde sonde nucléotidique à des segments adjacents de chaque portion diagnostique désirée d'une séquence de bases servant de cible, la séquence de nucléotides de la première et de la seconde sondes étant choisie de manière que, lorsqu'un hybride de la première et de la seconde sonde est formé avec une portion diagnostique d'une séquence de bases servant de cible, la première et la seconde sondes soient séparées par un intervalle, inter- valle qui est défini par au moins deux nucléotides de la séquence-cible, les nucléotides de la séquence-cible normale et/ou variante comprenant la totalité, moins un, des différents nucléotides présents à l'état naturel; 2) à mettre en contact la portion diagnostique de la séquence de bases servant de cible avec un ou plusieurs types de nucleotides dans des conditions permettant une hybridation complémentaire, le ou les types de nucleotides utilisés étant choisis de manière que le nucléotide normal ou variant soit non complémentaire de ces types de nucléotides; 3) à soumettre tout hybride obtenu à une liaison; et 4) à déterminer la présence ou l'absence de chaque séquence variante par détection de la présence ou de l'absence d'une ou plusieurs sondes caractéristiques de la présence ou de 1'absence de chaque séquence variante; le procédé étant mis en oeuvre de sorte que les nucléotides définissant l'intervalle de la première séquence de bases soient choisis de manière permettre une liaison de la première et de la seconde sondes en rapport avec la séquence-cible normale ou variante mais non avec l'une et l'autre de ces séquences. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la première et la seconde sondes nucléotidiques sont choisies de manière que, lorsqu'un intervalle d'un seul nucléotide est formé, l'unique nucleotide définissant l'intervalle n'est ni le nucléotide normal ni le nucléotide variant à détecter. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la première et la seconde sondes sont séparées par un intervalle, intervalle qui est défini par deux nucléotides de la séquence-cible. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la sonde caractéristique de la présence ou de l'absence de chaque séquence variante est une seule sonde liée comprenant la première et la seconde sondes nucléotidiques. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la présence ou l'absence de plus d'une séquence variante est détectée en une seule fois. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une analyse d'une translocation dans une séquence de bases servant de cible, dans lequel la première sonde nucléotidique détectable est apte à une hybridation à travers une région d'une ou plusieurs translocations potentielles et la seconde sonde nucléotidique non détectable est apte à une hybridation à des séquences adjacentes à ladite ou auxdites translocations potentiel- les, la seconde sonde nucléotidique non détectable portant un membre d'une paire de liaison. 7. Procédé suivant l'une quelconque -des revendications 1 & 6, caractérisé en ce qu'une séquence- cible ou une portion diagnostique de cette séquence est soumise à une hybridation avec plus de deux sondes oligonucléotidiques, puis à une hybridation avec des nucléotides complémentaires du ou des intervalles d'au moins deux nucléotides entre les extrémités adjacentes des sondes oligonucléotidiques de sorte que, lorsqu'une séquence-cible complémentaire est présente, un hybride de sondes partielles soit obtenu, la première sonde nucléoti- dique détectable étant une sonde oligonucléotidique terminale qui est détectable et la seconde sonde nucléoti- dique étant l'autre sonde oligonucléotidique terminale à laquelle est fixé un membre d'une paire de liaison, une ou plusieurs autres sondes oligonucléotidiques distinctes étant hybridées séparément mais en position adjacente à une séquence-cible contiguë entre lesdites sondes oligonucléo- tidiques terminales, et les sondes oligonucléotidiques distinctes sont liées pour la jonction de la sonde oligonucléotidique détectable à la sonde oligonucléotidique à laquelle est fixé un membre d'une paire de liaison pour former un hybride de sondes liées qui est ensuite dénature et mis en contact avec l'autre membre de la paire de liaison, la séquence de nucléotides de la sonde liée détectable comprenant ladite paire de liaison pouvant ainsi être séparée d'autres séquences de nucléotides. 8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, avant l'étape 4), la ou les sondes hybridées sont séparées de la séquence de bases servant de cible, puis les étapes 1), 2) et 3) sont mises en oeuvre successivement, le mode opératoire précité étant facultativement répété au moins une fois, ce qui permet d'obtenir de multiples copies de la ou des sondes destinées à la détection. 9. Série de sondes, caractérisée en ce qu'elle comprend une première sonde nucléotidique détectable et une seconde sonde nucléotidique, hybridables à des segments adjacents d'une portion diagnostique d'une séquence de bases servant de cible, les séquences de nucléotides de la première et de la seconde sondes étant choisies de manière que, lors de l'utilisation, elles forment un hybride avec une séquence-cible complémentaire dans lequel la première et la seconde sondes sont séparées par un intervalle formé par au moins deux nucléotides de la séquence- cible complémentaire, les nucléotides de la séquence-cible normale et/ou variante comprenant la totalité, moins un, des différents nucléotides présents à l'état naturel, l'intervalle étant en outre caractérisé en ce que, lors de l'utilisation, un ou plusieurs types de nucléotides peuvent être utilisés pour la mise en contact de la portion diagnostique de la séquence de bases servant de cible, ces types de nucléotides étant aptes & une sélection de sorte que le ou les nucléotides normaux ou variants soient non comr1lmentaires avec ces types de nucléotides. 10. Sonde suivant la revendication 9, carac- térisée en ce qu'elle est destinée au diagnostic d'une maladie, d'un état ou d'une prédisposition héréditaire. 11. Kit, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde suivant la revendication 9 ou la revendica- tion 10, conjointement avec des instructions écrites ou imprimées pour l'utilisation du kit, ainsi que des * solutions-tampons et/ou des solutions de lavage appro- priées. 12. Procédé in vitro de diagnostic, caractérisé en ce qu'il consiste & utiliser une série de sondes suivant la revendication 9 ou la revendication 10, ou bien à utiliser un kit suivant la revendication 11.