Brevet FR2646917A1 — publié le 19901116

La présente invention concerne notamment le dosage des anticorps anti-allergènes et un procédé permettant d'obtenir des immunoglobulines ayant un titre élevé en IgG spécifiques anti-allergènes, notamment anti-pollen de graminées. Le brevet européen n" 86 9018S7.9 décrit un procédé permettant d'obtenir des immunoglobulines présentant un titre important en IgG spécifiques anti-allergènes. L'un des inconvénients de ce procédé, comme d'ailleurs d'un grand nombre de procédés de purification d'immunoglobulines, est qu'il doit partir de sérum de patients dont la teneur en IgG spécifiques anti-allergènes est la plupart du temps inconnue. Ceci d'autant moins que les sérums traités sont la plupart du temps des mélanges provenant de différents donneurs. Maintenant, grâce au procédé qui sera décrit ci-après, il a été montré que seul 1 à 2 % de donneurs présentent un titre appréciable en anticorps puisqu'aucune sélection préalable nTest effectuée par interroga toire, alors que la fréquence des sujets ayant un titre appréciable d'anticorps, lorsqu'ils ont été sélectionnés par un interrogatoire portant sur l'existence d'antécédents allergiques, est comprise entre 10 et 30 %. Il est donc particulièrement intéressant de pouvoir disposer d'une méthode rapide qui permette de sélectionner les donneurs présentant des taux élevés d'anticorps recherchés, de même qu'il est particulièrement interessant de pouvoir ensuite standardiser les extraits d'immunoglobulines correspondants afin d'obtenir des traitements bien reproductibles et contrôlés. Enfin, le dosage des anticorps en cause permet de suivre l'efficacité du traitement, ce qui constitue également un avantage considérable lors du traitement de doésensibilisation par exemple. 3usqu'à présent les technologies mises en oeuvre afin de mesurer les teneurs en anticorps anti-allergènes spécifiques étaient inapplicables pour une application à grande échelle. En effet, il est important pour pouvoir sélectionner les donneurs présentant des teneurs élevées en anticorps de pouvoir disposer d'une méthode de dosage fiable et facile à mettre en oeuvre, ce qui exclut en particulier les méthodes de type radio-immuno-essais qui nécessitent la manipulation de produits radio-actifs. Le procédé selon la présente invention est donc un procédé destiné à doser la teneur en IgG spécifiques d'allergènes contenues dans un milieu, caractérisé en ce qu 'on utilise la technique ELISA, dans laquelle les IgG contenues dans l'échantillon du milieu sont fixées avec support par l'intermédiaire de l'allergène, les IgG spécifiques d'allergènes sont détectées grâce à un anticorps monoclonal non humain anti-IgG4 humain dont la présence est révélée par un anticorps marqué correspondant à la partie épitope non humaine de l'anticorps monclonal. Parmi les allergènes plus particulièrement importants à détecter par le procédé de la présente invention, il faut mentionner le pollen, les extraits de pollen d'arbres ou de graminées et d'acariens dermatophagoides farinae et pteronyssinus. La technique ELISA qui ne sera pas décrite en détail, elle sera simplement mentionnée dans le cadre des exemples, est une technologie qui est parfaitement connue de l'homme de métier et du spécialiste des méthodes de dosage immunologique. Cependant, selon la présente invention, cette technique ELISA est appliquée de manière originale à des allergènes de type extraits de pollen et d'acariens et utilise des anticorps monoclonaux anti-IgG4 qui permettent la détection des lgG4 spécifiques. Ainsi, à la différence de la seule technique proposée actuellement en laboratoire, ctest-à-dire la technique nRIA qui est inadaptée au dépistage en grand nombre et qui ne permet pas d'estimer précisément le taux des anticorps présents dans le sérum, la technique ELISA selon l'invention ne présente pas les inconvénients précités et permet d'exprimer les résultats en valeur absolue (mg/ml). La présente invention concerne plus particulièrement l'incorporation de ce procédé de dosage dans un procédé d'obtention d'immunoglobulines anti-allergènes hyper-immunes, procédé dans lequel, préalablement à la purification des sérums par toute méthode appropriée, on dose le sérum des donneurs et on sélectionne les sérums présentant des teneurs d'immunoglobulines anticorps IgG spécifiques anti-allergènes d'au moins 0,2 pg/ml et de préférence d'au moins 1 pg/ml. Parmi les procédés de purification qui peuvent être utilisés il faut citer le procédé de purification mentionné au début de la présente description, c'est-à-dire un procédé qui, dans les fractions I+II+III de Cohn, précipite les immunoglobulines spécifiques grâce à l'acide caprylique après remise en solution du précipité I+II+III. Ainsi la présente invention peut être mise en oeuvre selon le procédé qui comporte les étapes suivantes a) dosage des échantillons de sérum selon l'invention b) élimination des échantillons présentant une teneur en immunoglobulines anticorps IgG spécifiques anti-allergènes inférieure à 0,2 ug/ml c) purification des échantillons de sérum pour obtenir ladite fraction riche en IgG4. La présente invention a également pour objet une fraction riche en IgG4, pouvant être obtenue par le procédé ci-dessus. La présente invention a, en outre, pour objet une composition pharmaceutique utilisable dans les traitements de désensibilisation contenant la fraction riche en IgG4 visée ci-dessus. Les exemples ci-après permettront de mieux mettre en évidence certaines caractéristiques du procédé de dosage et de purification selon l'invention. Exemple I Obtention des sérums Les sérums de sujets allergiques au pollen et désensibilisés depuis plusieurs années ont été adressés par le Dr. Guinnepain de l'Institut Pasteur, ainsi que par les Centres de Transfusion de Lille : Dr. Descamps, Lyon : Dr. Chèvre, Rouen : Dr. Gilbert et Angers : Dr. Bidet. Environ 12 000 sérums provenant des cabines de prélèvement pour plasmaphérèse du Centre National de Transfusion Sanguine ainsi que des Centres Régionaux de Transfusion de Montpellier, Bordeaux et Nantes ont été prélevés sans sélection préalable des donneurs et stockés à -250C. Antigènes extraits du pollen Les extraits solubles du pollen de graminées (Dactylis Glomerata) proviennent de l'institut Pasteur, Paris (Professeur David). Les anticorps monoclonaux anti sous classe d'IgG humaines proviennent des anticorps et immunsérums Merck, Nogent-sur-Marne, France). L'immunsérum de chèvre anti-immunoglobulines G de souris conjugué à la phosphatase alcaline provient des Laboratoires Sigma Chemical Co. (Saint-Louis, USA). Il a été absorbé par les IgG humaines pour éviter les réactions croisées avec les IgG humaines. Technique ímmuno-enzymatique de dosage des IgG anti-pollen de graminées Après des essais préliminaires pour déterminer la concentration optimale d'antigènes, 0,1 ml d'une solution d'antigènes solubles de pollen (Dactylis Glomerata) à 2 ugiml en tampon phosphate saline pH 7 sont déposés dans les puits de plaques de microtitration. Après une incubation de 18 heures à 4"C, les puits sont lavés 5 fois en tampon phosphate saline, PH 7, avec 0,5 % de Twenn 20.La saturation des plaques est obtenue par incubation 1 heure à 37"C d'une solution d'albumine à 2 % suivie de lavages en tampon phosphate saline avec 0,05 % de Tween 20. 0,1 ml de dilution de sérum en tampon phosphate saline et albumine à 1 % sont pipettés dans chaque puits. Après une incubation de 2 heures à 37"C, les puits sont lavés en tampon phosphate saline avec 0,05 % de Tween 20. 0,175 ml d'anticorps monoclonaux anti sous classe d'lgG4 (clone RJ4) sont ajoutés et incubés 1 heure à 370cri Après 5 lavages, 0,175 ml d'anticorps anti-lgG de souris conjugués à la phosphatase alcaline sont ajoutés à chaque puits et incubés 1 heure à 370C. Le substrat p-nitrophényl phosphate est utilisé selon les recommandations du fabricant (Sigma). L'absorption à 405 nm est lue par un lecteur Titerteck Multiscan (Laboratoires Flow). Les résultats sont exprimés en densité optique (DO). La valeur minimale requise pour un sérum positif étant 0,2 DO à la dilution au 1/50 du sérum. Ces résultats peuvent être également exprimés en valeur absolue grâce à un sérum étalon contenant 110 pg/ml d'Ig spécifique. Cette valeur a été mesurée par des absorptions sur des colonnes de Sépharose sur lesquelles ont été immobilisés des extraits de pollen. Dans ces conditions, le taux minimum d'IgG4 spécifique est de 1 llg/ml, ce qui correspond à une DO de 0,2 pour une dilution au 1/50. Exemple 2 Un dépistage des sujets ayant des taux d'anticorps IgG anti-pollen de graminées élevés a été effectué chez 12 500 donneurs de phasmaphérèse. Les mesures ont été effectuées à une dilution unique du 50ème et exprimés en densité optique comme cela est décrit à l'exemple 1. Ce dépistage a été réalisé soit à partir de sujets sélectionnés par un interrogatoire portant sur l'existence d'antécédents allergiques, soit de sujets pris au hasard dans la population de donneurs de plasmaphérèse. Les plasmas sélectionnés ont été "poolés". Le taux des anticorps IgG spécifiques anti-pollen est de 7 Uug/ml d'lgG4 spécifiques, mesurées par ELISA, dans le "pool" de plasmas. Les immunoglobulines ont été fractionnés par une technique utilisant le fraction à l'éthanol et à l'acide caprylique. On précipite la fraction alcoolique II+III (précipité A du schéma de fractionnement de Kitler et Nisehman) selon un procédé utilisant l'acide caprylique. Des IgG pures à 95 % ont été obtenues. L'activité spécifique en anticorps anti-pollen de graminées dans ces immunoglobulines est 12 fois supérieure à celle du "pool" des donneurs, soit environ 90 pg d'anticorps spécifiques par mi de de solution d'immunoglobulines. Cependant, le taux d'IgE totales passe de 240 UI/ml dans le plasma de départ à 14 Ul/ml dans les immunoglobulines purifiées. Cette diminution est également observée pour les IgE spécifiques anti-pollen qui passent de classe 4 à la classe 1 lors de cette purification. REVENDICATIONS 1) Procédé destiné à doser la teneur en IgG spécifiques d'allergènes contenues dans un milieu, caractérisé en ce qu'on utilise la technique ELISA, dans laquelle les IgG contenues dans l'échantillon du milieu sont fixées avec support par l'intermédiaire de l'allergène, les IgG spécifiques d'allergènes sont détectées grâce à un anticorps monoclonal non humain anti-IgG4 humain dont la présence est révélée par un anticorps marqué correspondant à la partie épitope non humaine de l'anticorps monoclonal. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'allergène est le pollen. 3) Procédé de préparation d'une fraction riche en IgG4, caractérisé par le fait qu'il comporte les étapes suivantes a) dosage des échantillons de sérum selon le procédé des revendications 1 ou 2 b) élimination des échantillons présentant une teneur en immunoglobulines anticorps IgG spécifiques anti-allergènes inférieure à 0,2 llg/ml c) purification des échantillons de sérum pour obtenir ladite fraction riche en IgG4. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le procédé de purification (c) est un procédé qui, dans les fractions If II+III de Cohn, précipite les immunoglobulines spécifiques grâce à l'acide caprylique après remise en solution du précipité I+II+III. 5) Fraction riche en IgG4, caractérisée par le fait qu'elle peut être obtenue par le procédé de l'une des revendications 3 et 4. 6) Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle contient la fraction selon la revendication 5.