Brevet FR2640996A1 — publié le 19900629

Procédé pour la culture de bactéries du genre Pseudononas. La présente invention porte sur un procédé pour la production, avec un haut rendement et en grande quantité, de cellules de bactéries du genre Pseudomonas ayant une activité nitrile hydratase élevée. Ces dernières années, il y a eu des tentatives croissantes pour utiliser des microorganismes et des enzymes, tels qu'ils sont ou à l'état immobilisé, comme catalyseurs pour diverses réactions chimiques simples ou complexes. La nitrile hydratase est connue comme enzyme capable d'hydrater les nitriles pour produire les amides correspondants. (Référence: Agric. Biol. Chem. 46 1165(1982)). Comme l'un des exemples de l'utilisation de cette enzyme, on a proposé un procédé de préparation d'amides à partir de nitriles ayant 2 à 4 atomes de carbone en présence de bactéries ayant une activité nitrile hydratase. (Références: publication du brevet japonais n 37951/1984, brevet américain n 4 637 982, et Agric. Biol. Chem. 46 1183(1982)). En outre, plusieurs procédés de culture de telles bactéries ont été proposés. (Publications des brevets japonais n 43996/1986, n 43997/1986, n 43 998/1986, n 43999/1986, brevet européen EP-0 109 083, brevets américains n 4 661 457, n 4 661 456 et n 4 555 487). Pour utiliser des bactéries ayant une activité nitrile hydratase à une échelle industrielle, il est nécessaire de produire des bactéries en une grande quantité et, de ce fait, d'agrandir une cuve de culture de façon appropriée à partir d'une cuve expérimentale à l'échelle d'un bécher. Les bactéries du genre Pseudomonas capables de produire de la nitrile hydratase doivent être cultivées dans des conditions aérobies (à un débit d'alimentation en oxygène d'environ 3,5 kg d'02/m3.heure), par exemple, par agitation sous aération, en vue de la prolifération de cellules et de l'expression de l'activité de celles-ci. Cependant, lorsque ces bactéries étaient cultivées dans une cuve de culture de grand volume, autrement dit, agrandie, à la fois la concentration cellulaire après achèvement de la culture et l'activité spécifique des cellules étaient inférieures à celles obtenues dans une cuve à l'échelle d'un bécher, et la cuve de culture ne pouvait pas être agrandie doucement, et l'expression de l'activité nitrile hydratase n'était pas non plus suffisante. Bien que les causes de tels phénomènes ne soient pas élucidées, la force de cisaillement accrue des pales d'agitation en raison de l'agrandissement de la cuve de culture, nécessaire pour maintenir de cette manière le débit d'alimentation d'oxygène ci-dessus pendant la culture, peut être considérée comme ayant une certaine influence sur la croissance des bactéries d'une manière directe ou indirecte. En tout cas, les bactéries de la présente invention ne peuvent pas être cultivées à l'échelle industrielle sans que ces problèmes ne soient réglés. La présente invention a pour objectif de régler les problèmes précédents, et cet objectif a maintenant été accompli par un moyen très simple et pratique qui ne nécessite pas de modifications de la structure de la cuve de culture, à savoir, par addition à un milieu de culture de traces d'un composé du cuivre soluble dans l'eau. Ainsi, le procédé de culture des bactéries du genre Pseudomonas conforme à cette invention comprend l'addition d'un composé du cuivre soluble dans l'eau à un milieu de culture dans la préparation de cellules des bactéries ayant une activité nitrile hydratase par culture sous forme de cisaillement de bactéries Pseudomonas capables de produire de la nitrile hydratase. Dans le procédé de culture des bactéries Pseudomonas, l'expression de l'activité nitrile hydratase est remarquablement améliorée par l'addition d'ions cuivre au milieu de culture conformément à la présente invention, comme décrit ci-dessus, pendant la culture des bactéries utilisées ici, en particulier dans une cuve de culture d'un grand volume, par exemple, de 500 1 ou davantage, comme à l'échelle industrielle habituelle dans ce domaine de la technique, dans laquelle le système de culture est agité à l'aide de pales d'agitation. Comme il ressortira des résultats de l'Exemple présenté ci-après, l'addition d'un composé du cuivre soluble dans l'eau dans le cas o une cuve de culture de 700 1 a été utilisée, a augmenté d'une manière surprenante l'activité nitrile hydratase par unité de fluide de culture après une culture de 48 heures, de 2,35 fois l'activité atteinte lorsqu'un tel composé n'a été ajouté. Cette augmentation de l'activité nitrile hydratase par unité de fluide de culture peut être imputable à l'augmentation de la concentration cellulaire et de l'activité des cellules per se, mais les avantages propres à l'addition d'un composé du cuivre soluble dans l'eau sont d'autant plus uniques qu'ils étaient le moins attendus des résultats de la culture à l'échelle d'un bécher, telle que la culture agitée dans un flacon. Bactéries Pseudomonas Les bactéries utilisées dans la présente invention sont celles du genre Pseudomonas ayant une activité nitrile hydratase et la capacité d'hydrater les nitriles, en particulier, l'acrylonitrile, pour produire les amides correspondants, en particulier l'acrylamide. Des exemples spécifiques de telles bactéries sont Pseudomonas chlororaphis B23 (FERM BP-187) et Pseudomonas sp. SPI (FERM BP-188) décrits dans la publication du brevet japonais n0 37951/1984 et dans le brevet américain n 4 637 982 mentionné au début. Les détails de ces bactéries sont donnés dans la publication de brevet et dans le brevet. Composé du cuivre soluble dans l'eau Les composés du cuivre solubles dans l'eau utilisés dans la présente invention sont de façon typique les sels minéraux, les sels d'acides organiques et les sels complexes du cuivre, tels que le chlorure de cuivre, le sulfate de cuivre, le nitrate de cuivre, l'acétate de cuivre, le tartrate de cuivre, l'acétylacétonate de cuivre (II) et le cuivre (II) EDTA. Ces composés peuvent être ajoutés seuls ou en un mélange au milieu de culture, en une quantité d'environ 0,5 à 5 mg/l, de préférence, d'environ 1 à 3 mg/l, telle que calculée en termes de cuivre. Culture La culture selon la présente invention est effectuée de manière habituelle dans une cuve de culture de 500 1 ou davantage, en présence d'un composé du cuivre soluble dans l'eau, dans des conditions aérobies, par inoculation de bactéries du genre Pseudomonas ayant une activité nitrile hydratase, dans un milieu de culture contenant: des sources de carbone, telles que le glucose, le fructosè, le sucrose, la dextrine, le glycérol, l'éthanol, et l'acide succinique; des sources d'azote, telles que l'ammoniac, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, et l'urée; des sources de substances nutritives organiques, telles que l'extrait de levure, l'extrait de viande, l'extrait de malt, l'hydrolysat de caséine, et la peptone; des sources de substances nutritives minérales, telles que les phosphates, les sels de magnésium, les sels de potassium, les sels de fer, et des traces d'autres sels métalliques; et des inducteurs d'enzymes, tels que l'acrylamide, le méthacrylamide, le crotonamide, le n-butyramide, le propionitrile, l'isobutyronitrile, le propionamide, et l'isobutyramide. Le pH du milieu de culture est de l'ordre de 6 à 9, de préférence, de l'ordre de 7 à 8, alors que la température de culture est de l'ordre de 20 à 37 C, de préférence, de l'ordre de 25 à 30 C, les conditions d'aération sont d'environ 0,5 à 1,0 vvm, et le temps de culture est d'environ 1 à 3 jours. La force de cisaillement donnée au système de culture, qui augmente au fur et à mesure que le volume de la cuve de culture et que le diamètre des pales d'agitation associées à celle-ci augmentent, peut être généralement déterminée en termes de la vitesse périphérique des bords des pales d'agitation. Cette vitesse périphérique peut varier en fonction de la vitesse de rotation, de la forme, de la dimension et similaires, des pales d'agitation, mais elle est habituellement d'environ 2,5 à 3,0 m/seconde dans le cas d'une cuve de 500 1 et d'environ 3,0 à 4,0 m/seconde dans le cas d'une cuve de 1000 1. L'addition d'un composé du cuivre soluble dans l'eau selon la présente invention est particulièrement efficace dans un système tel que la vitesse périphérique des bords des pales d'agitation dépasse environ 2,5 m/seconde. Après l'achèvement de la culture, les cellules bactériennes ou la nitrile hydratase peuvent être recueillies ou utilisées d'après les descriptions de la publication du brevet japonais no 37951/1984 et du brevet américain n 4 637 982 mentionnés au préalable ou l'Exemple présenté ci-après. Exemples Expérimentaux Exemple 4,3 1 d'un fluide de culture obtenu à partir de Pseudomonas chlororaphis B23 (FERM BP-187), que l'on a fait croître dans les conditions de préculture suivantes, ont été cultivés dans les conditions de culture subséquentes pour déterminer l'activité nitrile hydratase des bactéries. 1. Culture de Bactéries (1) Conditions de Pré-culture Composition du milieu de culture (pH 7,2): peptone.......................... 5 g/1 extrait de levure............ 3 g/l extrait de malt...................3 g/l glucose........................... 5 g/l. Température de culture: 25 C Aération/Agitation: 1 vvm/200 tpm Temps de culture: 24 heures Volume de cuve de culture: 20 1 (245 g x 450 L) Quantité de fluide de culture introduit: 13 L Agitateur: agitateur avec une turbine à disques à six pales (115 X). (2) Conditions de Culture Composition du milieu de culture (pH 7,8): sucrose.................................. 30 g/l MIEKP *....... 20 g/1 méthacrylamide.................... 9,5 g/l MgSO4.7H20..................... .. 1 g/1 FeSO4.7H20........................ 0,05 g/l K2HPO4...............DTD: ............. 1 g/1 KH2PO4............................ 1 g/1..DTD: CuS04.5H20........................ 5 mg/l. Température de culture: 25 C Aération/Agitation: 0,75 vvm/220 tpm (Vitesse périphérique: 3,5 m/seconde) (Débit d'alimentation en oxygène: 3, 5 kg d'02/m3.heure) Temps de culture: 48 heures Volume de cuve de culture: 700 1 (800 0 x 1560 L) Quantité de fluide de culture introduit: 500 1 Agitateur: agitateur avec deux turbines à disques à six pales (260 9) * Hydrolysat de soja par l'acide chlorhydrique disponible auprès d'Ajinomoto Co., Japon. 2. Mesure de l'Activité Nitrile Hydratase 0,1 ml d'un fluide de culture et 4,90 ml d'un tampon phosphate 1/20 M (pH. 7,7) ont été mélangés ensemble, et 5 ml de tampon phosphate 1/20 M (pH. 7,7) contenant 5,0% en poids d'acrylonitrile ont été ajoutés. Le mélange a été amené à réagir à 10 C pendant 10 minutes et filtré pour séparer les cellules bactériennes. L'activité nitrile hydratase des cellules a été déterminée par mesure de la quantité de l'acrylamide (AA) produite, par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats obtenus après une culture de 40 heures ont été tels que présentés dans le Tableau suivant. L'activité a été déterminée pour l'activité spécifique (A.S.) et l'activité totale (A.T.) comme défini ci-après. A.S.: pm mole de AA/mg de cellules/minute A.T.:,m mole de AA/ml de liquide de culture/minute. Exemple Comparatif La culture a été effectué dans les mêmes conditions que dans l'Exemple précédent, excepté que CuSO4.5H20 n'a pas été ajouté au milieu de culture. Les résultats obtenus dans cet Exemple Comparatif après une culture de 48 heures sont également présentés dans le Tableau suivant. TABLEAU :: Concentration: A.S.: A.T.: ::cellulaire (g/l):: (valeur relative): :Exemple::: :Comparatif: 9,96: 59,9: 597 (100): :Exemple: 14,40: 97,4: 1402 (235): REVENDICATIONS 1.- Procédé de culture de bactéries du genre Pseudomonas, caractérisé par le fait qu'il consiste à ajouter un composé du cuivre soluble dans l'eau à n milieu de culture, dans la préparation de cellules de bactéries ayant une activité nitrile hydratase par culture sous force de cisaillement de bactéries Pseudomonas capables de produire de la nitrile hydratase. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le composé du cuivre soluble dans l'eau est choisi dans le groupe constitué par le chlorure de cuivre, le sulfate de cuivre, le nitrate de cuivre, l'acétate de cuivre, le tartrate de cuivre, l'acétylacétonate de cuivre (II), et le cuivre (II) EDTA. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la quantité du composé du cuivre soluble dans l'eau ajouté au milieu de culture est d'environ 0,5 à 5 mg/l, de préférence, d'environ 1 à 3 mg/l, telle que calculée en termes de cuivre.