Brevet FR2639958A1 — publié le 19900608

La présente invention concerne un support biologique pour cultures cellulaires, constitué du mélange coagulé d'un concentré de protéines plasmatiques et de thrombine, son utilisation pour la culture des kératino- cytes et leur transport sous forme d'épidermes reconsti- tués, et l'utilisation de ceux-ci à des fins thérapeutiques. La reconstruction en laboratoire d'une peau vivante semblable à la peau humaine à partir de quel- ques cellules d'une biopsie ou d'une peau simplifiée assu- rant les fonctions physiologiques de la peau normale fait l'objet de nombreuses études dans le but de remplacer la peau lésée par une affection grave (génétique...) ou dé- truite par d'importantes brûlures. La peau est un organe complexe composé de trois tissus juxtaposés: l'épiderme, constitué à 85 % de kératinocytes qui élaborent la couche cornée imperméable qui isole le corps du i!lieuextérieur; le derme quicomporte des ce2-es, dontlesfibrocvtes. séparés par un tissu conjonctif constitué surtout de collaagène; le derme repose sur l'hy- poderme qui comprend les cellules spécialisées dans le stockage des graisses. La reconstruction artificielle d'un organe aussi complexe pose donc de nombreux problèmes. Le premier tissu qui a été partiellement reconstruit in vitro est le derme, par l'équipe de Bell (Bell et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 76 - 1979 - 1274). A partir de biopsies de peau, les fibroblastes ont pu être mis en culture, d'abord en monocouches puis, après quel- ques passages, en dispersant ces cellules dans dumilieu de culture contenant du collagène (extrait de tendons de queues de rats), celui-ci constituant un gel et permettant une culture tridimensionnelle. On voit dans cette culture les fibroblastes interagir avec la matrice du collagène, 2 2639958 l'organiser et la contracter comme dans un derme normal. Ce tissu reconstruit in vitro est connu sous le nom de "derme équivalent". Apres quelques semaines de culture, les qualités mécaniques du derme équivalent permettent de ''utiliser pour greffer un malade ou un blessé. Il ne sen.mle pas &tre rejeté par le receveur. Toutefois ce derme équivalernt n'est qu'un pansement provisoire: il ne peut pas restaurer la ionction de barrière cutanée. D'autre part, l'équipe de Green (H. Green et al. Proc. Natl. Adac. Sci 76, 1979, 5665) a mis au point une méthode et un milieu de culture permet- tant de cultiver de façon prolongée des kératinocytes. Cette méthode comprend l'inoculation des kératinocytes dispersés à la trypsine sur une monocouche préétablie de = fibroblastes, en particulier des cellules 3T3, létalement irradiées et qui servent de couche nourricière et de ma- trice. Le feuillet épidermique se développe très rapide- ment -zur ezrrer u.- t ssu à 5 ce' lules d'paisseur;i pcurra &ee cre:ff s' - et cont.nuera se iferencier in situ. Des grands brtlés ont déjà pu être sauvés par cette technique ( G. Gallico et ai. New England J. Med. 311, 1984, 448). Par la technique de Green on peut ob- tenir, à partir d'une biopsie de deux centimètres carrés, un épiderme de un mètre carré après trois semaines. La récupération du tissu reconstitué pour en faire un greffon pose encore des problèmes tech- niques. En effet, il faut décoller les cellules de la boite de culture, par un traitement enzymatique, sans les dissocier entre elles; au cours de cette opération on ob- serve toujours une rétraction du taris cellulaire et donc une perte d'un certain pourcentage de la superficie du greffon. Le tissu reconstitué étant détaché, il faut l'a- crafer sur un support permettant son transport et sa greffe sur le patient. On utilise généralement un panse- 3 2639958 ment de gaze vaselinée. Cet ensemble de manipulations est délicat et prend beaucoup de temps. Il serait donc très bénéfique de dis- poser de nouveaux supports biologiques, résorbables au cours du temps par le patient greffé et simplifiant la manipulation des cellules. De plus, pour en garantir la disponibilité, ces supports ou leurs constituants de- vraient être susceptibles d'être préparés et condition- nés selon des procédés industriels. La Demanderesse a ainsi mis au point un support biologique pour cultures cellulaires, cons- titué du mélange d'un concentré de protéines plasmatiques coagulables par la thrombine et de la quantité de throm- bine calcique nécessaire pour déclencher la coagulation. La coagulation des protéines du plasma en présence de thrombine, est due principalement à la for- mation d'un réseau de fibrine polymérisée, qui mime la formation du caillot sanguin. Pour constituer un support adapté à la culture des cellules, la coagulation est réa- lisée dans des conditions favorisant la formation d'un film et plus particulièrement dans des boites de Petri ou dans tout flacon adapté à la culture de cellules. Le concentré de protéines plasmatiques a déjà été décrit par la Demanderesse dans la demande de bre- vet européen 88.401 961.3:il est obtenu par précipitation de plasma frais, par deux traitements successifs à l'éthanol à 10 %, à 40C. Le concentré comprend plus de 90 % de fibrinogène, et, par gramme de protéines, au moins 0,1 UI de Facteur XIII et de 0,03 à 0,1 gramme de fibronectine. Le concentré est conditionné et lyophilisé pour être con- servé jusqu'à son utilisation. La présente invention concerne donc également le concentré.de protéines coagulables par la thrombine, particulièrement conditionné pour la prépara- tion du support biologique pour cultures cellulaires. 4 2639958 Au moment de son utilisation, le corcentré est reCissDus dans une szuor. apeuse salie ou dar.ns une sclutior. ccnter,-.t ur.ite r polyvalent des proteases, préférentiel- lemner.nt 'arotinine, à une concentration de 3000 UIK/ml. Pour déclencher- le processus de coagu- lation et donc la formation du film servant de support pour Les cellulies, c. ajoute de la to. ne avec ou sans calcium. Le processus comprend la transformation du fibrinogène en fibrine sous l'action de la thrombine et la polyméri- sation de la fibrine monomère avec la fibronectine sous l'action du Facteur XIII activé par les ions Ca+. Pour constituer le support selon l'in- vention, particulièrement favorable aux cultures cellu- laires, on ajuste de préférence la concentration de thrombine à environ 10 Ui/ml (concentration beaucoup plus -fa!le cue celle qu'on uti-lise quand la consistance recher- chée est différente, comme dans le cas des colles biolo- gicues - brevet 8E.401 961.3, cité plus haut -). Selon différents modes de réalisation 2C de l'invention, on peut incorporer dans le support divers adidifs particulièrement destinés à favoriser la multi- plication cellulaire in vitro ou in situ et ainsi favori- ser la cicatrisation de la plaie après la greffe. Le support peut donc contenir un addi- tif favorisant la multiplication des cellules comme un facteur de croissance et plus particulièrement l'EGF ("epidermal growth factor"). On peut aussi incorporer un agent cica- trisant et/ou un antibiotique. I Le support selon l'invention est parti- culièrement favorable à la culture des kératinocytes hu- mains. Ces cellules peuvent être soit des cultures pri- maires dérivées de biopsies de peau d'un patient et ayant subi entre 1 et 4 passages en dilution 1/15 à 1/2C, - sco-t des cellules conservées sous fcrme de banque dans azcte izquice. Ces kératinocytes établis en tapis con- fluent sont trypsinés et remis en suspension dans du mi- lieu de culture approprié au moment de leur ensemencement sur le support selon l'invention. L'utilisation du support biologique selon l'invention peut être adaptée de trois manières diffé- rentes. Selon un premier mode d'utilisation, le support biologique est préparé sous forme de film, par le mélange de ses deux constituants sur une boite de culture; une suspension de kératinocytes est ensemencée sur ce film, - dans du milieu de culture approprié.Quand la culture de kérati- nocytes est devenue confluente ou semi-confluente;el3e constitue un tissu de remplacement directement récupérable comme greffon, qu'on peut détacher à l'aide de pinces et transporter de la boite sur le patient auquel il est applique tel quel, sans nécessiter de support transitoire tel que la gaze. Ceci permet un important gain de temps opératoire et une récupération de 100 % du tissu en culture. Selon un autre mode d'utilisation du sup- port selon l'invention, les deux constituants du support sont mélangés avec la suspension de kératinocytes de ma- nière à intégrer les cellules dans le film qui se formera ultérieurement. Selon ce mode d'utilisation, le mélange des deux constituants avec la suspension de cellules peut être réalisé sur une boite de culture et être ensuite uti- lisé comme greffon, comme dans le mode d'utilisation pré- cédent; il peut aussi être directement réalisé sur la plaie du patient, préparée pour accueillir un greffon,notamment en pulvérisation du support biologique et des cellules à l'aide d'un gaz vecteur (azote) sous une pression de 2 à 2,5 bars. Selon un autre mode d'utilisation du sup- port selon l'invention, le mélange de ses deux constituants est réalisé sur un tapis cellulaire de kératinocytes pré- établi dans une boite de culture, de telle manière que les cellules soient enrobées dans le film formé et puis- sent ainsi être détachées et transportées pour être appli- quées comme greffon. Les exemples suivants illustrent l'inven- tion sans toutefois en limiter la portée. Exemple I - Préparation du support biologique pour cul- tures cellulaires. On prépare un support biologique pour cultures cellulaires en mélangeant un concentré de pro- téines plasmatiques coagulables et la. quantité de throm- bine calcique nécessaire pour déclencher la coagulation. A. Préparation du concentré de protéines plasmatiques La préparation du concentré de protéines a déjà été décrite par la Demanderesse dans la demande de brevet européen 88.401 961.3. En résumé, on utilise du plasma humain non cryoprécipité; on le soumet à deux pré- cipitations successives à l'éthanol à 10 %, à pH 7,2 et à 4C. Entre les deux précipitations, le produit subit un traitement d'inactivation viraie. Le précipité, séparé du surnageant par centrifugation, est lavé à l'éthanol à 4 C et recentrifugé. Le précipité est remis en suspension dans du tampon Tris/citrate, ajusté à une concentration en protéines de environ 35 g/1 et additionné de lysine à une concentration finale de 0,1 à 0,2 g par gramme de pro- téines. Apres diafiltration pour éliminer l'alcool et le citrate et pour ajuster la force ionique, le concentré est conditionné en flacons et lyophilisé. Ce concentré de protéines renferme, pour un gramme de protéines, au moins 0,9 g de fibrinogène, de 0,03 à 0,06 g de fibronectine et de 0,15 à 0,30 UI de Facteur XIII. B. Préparation du support pour cultures cellulaires Le concentré de protéines décrit plus haut est remis ensusDension. dans ne solutior. auaeuse,avec ou sans aprc- tinine à 3000 UIK/ml (unités d'inhibiteur de kallicréine/ml) On mélange cette solution avec un vcume égal de thromb-nre calcicue à 10 U/ml.- Pour une boite de Petri de 10 cm de diamètre on utilise 2 ml de suspension de protéines et 2 ml de thron.-ine, ces deux solutions étant injectées simulta- nément par deux seringues reliées par un raccord mélan- geur. On agite la boite de Petri de manière à obtenir une répartition uniforme puis on laisse reposer pendant à 20 minutes. La préparation forme un film qui re- couvre la boite. Les boites de culture sont de qualité - "non traitéepour culture cellulaire" ce qui permet au support de ne pas adhérer de façon permanente ce qui facilite sa récupération ultérieure. Ce film est ensuite recouvert de milieu de culture pour cellules. Ce milieu est renouvelé plu- sieurs fois jusqu'à ce que la pression osmotique du film soit stabilisée dans une gamme compatible avec la phy- siologie des cellules, c'est-à-dire entre 260 et 340 m os M(milliosmoles). Alternativement, on peut dialyser le con- centré de protéines reconstitué avant de le mélanger à la thrombine. Exemple 2. - Mise en culture de kératinocvtes sur le supDDort bioloqique. On utilise des cultures primaires de kératinocytes réalisées selon la technique classique de Green à partir. de biopsie(s) de peau d'un patient (ou de peau d'un embryon pour constituer des banques de cel- lules foetales). Ces cultures primaires peuvent subir 4 à 5 passages en dilution 1/10. Un tapis de kératinocytes confluents est trypsiné, remis en suspension dans du milieu de culture et ensemencé en dilution 1/10 sur une boite de Petri re- couverte d'un film du support biologique décrit dans l'exemple 1. Après quelques heures, les cellules adhèrent au support; elles s'y multiplient ensuite norma- lement jusqu'à former un fragment d'épiderme confluent et d'une épaisseur de 3 ou 4 couches de cellules. Ce fragment d'épiderme reconstitué, adhérent au suppDcrt, peut être détaché de la boite de culture à l'aide de pinces et appliqué tel quel sur une plaie préparée pour accueillir un greffon. Grâce à l'adhérence des cellules au support, il n'est pas nécessaire d'agrafer l'épiderme reconstitué sur un autre support tel que la gaze vase- linée qui doit être utilisée avec les autres types de cultures. Ceci permet un important gain de temps opéra- toire: on arrive à manipuler 40 boîtes à l'heure au lieu de 4 par les techniques classiques. De plus, ce support résiste bien aux manipulations et ne se rétracte pas au moment o on le détache, ce oui permet de récupérer 100 % de la superfi- cie du taris cellulaire en culture. ExemDle 3 - Récupération d'un tapis cellulaire préétabli l'aide du suPort biolocicue. Des kératinocytes sont mis en culture selon la méthode classique de Green, dans une boite de Petri couverte d'une couche de fibroblastes létalement irradiés. Quand le tapis de kératinocytes est confluent et constitué de qualques couches de cellules, le milieu de culture est éliminé, on ajoute une solution d'EDTA durant 1 heure 30, puis on effectue deux lavages en PBS. On coule ensuite le support biologique directement sur le tapis de cellules, selon la méthode décrite dans l'exemple 2. Quand le film est formé sur les celiules, il peut être détaché avec des pinces et utilisé comme greffon, comme dans l'exemple précédent. ExemDle 4 - Incorporation des cellules dans le support biclocicue. On prépare une seringue de solution de protéines et une seringue de thrombine contenant les kératinocvtes en suspension. Ces kératinocytes peuvent' provenir d'une culture fraiche, trypsinée, ou d'une barue de cellules conservées à l'azote liquide. Les deux seringues sont reliées à l'aide d'un raccord mélangeur et on pulvérise le sup- port contenant ies cellules sur la boite de Petri (ou sur la plaie à greffer); les cellules se trouvent ainsi prises dans le film pendant sa coagulation.Cette pulvérisation peut se faire à l'aide d'un gaz vecteur (l'azote à une pression de 2 à 2,5 bars), Cette pulvérisation ne dénature pas les cellules et on observe la reformation d'un tapis cellulaire, en culture in vitro. Les cellules devraient donc se multiplier normalement ou quasiment normalement quand le mélange est pulvérisé, en couche très fine, directement sur une plaie. REVENDICATIONS 1. Support biologique pour cultures cellulaires, caractérisé en ce qu'il est constitué du mélange d'un concentré de protéines coagulables par la thrombine, obtenu par traitement à l'éthanol de plasma et contenant des proportions équilibrées de fibrinogène coagulable, de Facteur XIII et de fibronectine plasma- tiques, et, de la quantité de thrombine calcique néces- saire pour déclencher la coagulation. 2. Support biologique selon la reven- dication 1, caractérisé en ce que le concentré de pro- téines plasmatiques coagulables comprend plus de 90 % de fibrinogène et, par gramme de protéines, au moins 0,1 UI de Facteur XIII et de 0,03 à 0,1 gramme de fibronectine. 3. Support biologique selon la reven- dication 2, caractérisé en ce que le concentré de protéines est obtenu par précipitation de plasma frais, par deux traitements successifs à l'éthanol à 10 %, à 4 C. 4. Support biologique selon l'une quel- conque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le concentré de protéines est lyophilisé. 5. Support biologique selon l'une quel- conque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le concentré de protéines est mis en suspension dans une so- lution d'aprotinine. 6. Support biologique selon l'une quel- conque des revendications 1 -à 5, caractérisé en ce que la thrombine calcique est mélangée avec le concentré de pro- téines, à une dose de environ 10 UI/ml. 7. Support biologique selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il contient, comme additif, une substance favorisant la mul- tiplication cellulaire. 8. Support biologique selon l'une quel- conque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il contient, comme additif, un antibiotique. 9. Support biologique selon l'une quel- conque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il contient, comme additif, une substance favorisant la ci- catrisation des plaies. 10. Utilisation du support biologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la culture des kératinocytes humains, foetaux ou adultes, pour constituer un tissu de remplacement directement récu- pérable, transportable et applicable comme greffon. 11. Utilisation selon la revendication , caractérisée en ce que le mélange des deux constitu- anus du support biologique est réalisé de manière à cons- tituer un film uniforme dans une boite de culture et que les kératinocytes en suspension dans du milieu de culture sont ensemencés sur ce film. 12. Utilisation selon la revendication 10., caractérisée en ce que les deux constituants du support biologique sont mélangés avec une suspension de kératino- cytes de manière à intégrer les cellules dans le film formé ultérieurement. 13. Utilisation selon la revendication 1il ou 12, caractérisée en ce que la suspension de kératinocytes est réalisée après dispersion d'un tapis cellulaire préétabli, frais. 14. Utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que la suspension de kératinocytes est réalisée à partir d'une banque de cellules conservées dans l'azote liquide. - 15. Utilisation du support biologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la récupération et le transport d'une culture préétablie de kératinocytes humains, foetaux ou adultes. 16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que le mélange des deux constituants du support biologique est réalisé sur le tapis cellulaire préétabli dans une boite de culture. 17. Concentré de protéines coagulables par la thrombine, caractérisé en ce qu'il est conditionné pour la préparation du support biologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.