Brevet FR2639637A1 — publié le 19900601

La présente invention a pour objet des dérivés cycliques et leurs métabolites,leur préparation et leur utilisation comme médicaments. Les composés de formule II Hem,CH O;0 AH H3 O o CH3 OCH 3 OC 3 3 3 CH dans laquelle R1 signifie un groupe méthyle, éthyle ou allyle et n signifie 1 ou 2, et leur préparation ainsi que leur activité comme agents immunosuppresseurs et anti-microbiens, ont été décrits dans la littérature. Ils sont isolés de cultures obtenues selon des méthodes connues par fermentation de souches de Streptomyces. Une souche préférée est la souche Streptomyces tsukubaensis N 9993 (FERM BP-927) décrite par Fujisawa dans le brevet européen 184162. Cette souche peut être obtenue au Fermentation Research Institute, Tsukuba, Ibaraki 305, Japon, conformément aux dispositions du traité de Budapest. Cette souche a été redéposée le 27 avril 1989 au Agricultural Research Culture Collection Interna- tional Depository Authority, Peoria, Illinois 61604, USA, conformément aux disposition du traité de Budapest, sous le numéro de dépôt NRRL 18488. La Demanderesse a maintenant trouvé que ce bouillon de fermentation contient des métabolites possédant une activité pharmacologique intéressante. Ils peuvent être obtenus selon un procédé comprenant, après séparation des composés de formule II, l'isole- ment des métabolites à partir des solutions restantes et des liqueurs de lavage, selon diverses méthodes comme la chromatographie. Ce procédé peut être effectué selon des méthodes connues, par exemple par chromatograhie. Le traitement du bouillon de fermentation est effectué par exemple comme suit: On agite pendant 6 heures à la température ambiante 6200 1 du bouillon de fermentation avec 6000 1 d'acétate d'éthyle et on les fractionne dans un séparateur. On évapore ensuite à siccité la fraction d'acétate d'éthyle sous pression réduite. On dégraisse l'extrait résultant par répartition entre 3 portions de 70 1 d'un mélange méthanol/eau (9:1) et 3 portions de 70 1 d'hexane. La fraction méthanol/eau donne un autre extrait après évaporation à siccité sous pression réduite. Cet extrait est chromatographié sur une colonne contenant 25 kg de Sephadex LH20. Les fractions qui après chromatographie en couche mince et en phase liquide (HPLC) contiennent les composés de formule II sont réunies et chromatographiées pour une purification supplémentaire sur une colonne (de 15 cm de diamètre) de 20 kg de Silicagel Merck (0,04 à 0,063 mm) avec comme éluant de l'éther de tert.butyle et de méthyle. Après élution de 50 litres, des fractions de 6,2 litres sont recueillies. Ces fractions qui, après vérification par chromatographie, contiennent le compo- sé de formule IIa oH O IIa -CH3H CH OH3 OCH 3 OCH 3 sont réunies et évaporées & siccité sous pression réduite. Apres cristallisation dans de l'acétonitrile, le composé de formule IIa est récupéré sous forme d'un produit cristallin. On rince ensuite la colonne avec 90 litres de méthanol. On récupère 91 g d'un mélange de métabolites que l'on fractionne par chromatographie sur 800 g de Silicagel H avec comme éluant un mélange éther de tert.-butyle et de méthyle/méthanol/eau (88/11/1, /17,5/2 et 70/25/4). La filtration sur Sephadex suivie par la chromatographie sur Lichroprep RP18 donne une autre fraction du mélange de métabolites. Les fractions qui après vérification par chromatographie en couche mince et en phase liquide (HPLC) contiennent des métabolites identiques sont réunies. 3 fractions avec des temps de rétention différents sont obtenues: Fraction Temps de rétention (minutes) Gradient 1 Gradient 2 ______________________________________________________________ A 10.21 17.69 B 4.99 13.94 C 9.65 Système HPLC: colornn -Lichroso.b RPI. fMerck, 250 x 4'mm- débit: 2 ml/minute, détection UV.220 nm/0O1 Eluants: triéthylamine-tamnon. phosphate-pH 3,5-avec 0,05 mole q'Acétonitrile a 10%; acétonitrile Gradient 1: en 20 minutes de 50:50-à 10:90 Gradient 2: en 20 minutes de 90:10 A 10:90 La fraction A est à nouveau purifiée sur Lichroprep RP18 avec comme éluant un mélange eau/mé- thanol (1/4) et le métabolite A est récupéré par chromatographie en phase liquide (HPLC) sous forme d'une substance homogène incolore. Les données caracté- ristiques sont les suivantes: Spectre IR: voir la figure 1 Spectre de masse: voir la figure 5 F - 70-750C - [=]20D - -75,6 (c - 1,17 dans du méthanol) Spectre UV: Xmax (méthanol) 320 log e' - 1,3074. La fraction B est à nouveau purifiée sur Sephadex LH20 avec comme éluant du méthanol et le métabolite B est récupéré par chromatograhie en phase liquide (HPLC) sous forme d'une substance amorphe incolore. Les données caractéristiques sont les suivantes: Spectre IR: voir la figure 2 Spectre de masse: voir 1-a figure 6 F = 72-78 C [î]2OD - -71,1 (c - 1,22 dans du méthanol) Spectre UV: Xmax (méthanol 225 log c' - 1,1561 323 log c' - - 0,0907 H-RMN (CDCl3): un mélange d'environ 2:1 de conformères: signaux caractéristiques (ppm): 6,70 (m,H- 24); 6,11 (d, large, J-15Hz, H-23) 3C-RMN (CDC13): signaux caractéristiques (ppm) du conformère présent en une concen- tration supérieure: 199,9 (C-22); 148,8 (C-24); 137,6 (C19); 131,8 (C-23); 98,1 (C-10); 128,1 (C-29); 134,0 (C-20) Le métabolite B a une double liaison A23. La fraction C est à nouveau purifiée sur Lichoprep RP18 en utilisant comme éluant un mélange méthanol/eau (4/1) et le métabolite C est récupéré par chromatographie en phase liquide (HPLC) sous forme d'une substance homogène amorphe. Les données caracté- ristiques sont les suivantes: Spectre IR: voir la figure 3 Spectre de masse: voir la figure 7 F - 55-60 C [] 2 D - + 7,50 (c - 1,0 dans du méthanol) Spectre UV: Xmax (méthanol 321 log e' - 1,2972 Les fractions résiduelles qui, après chroma- tographie sur gel de silice avec de l'éther de tert.-butyle et de méthyle, ne contiennent pas de composé de formule IIa, sont réunies, fractionnées à nouveau sur Silicagel H et Lichroprep RP18 et évaluées par chromatographie en phase liquide (HPLC). Les fractions avec un temps de rétention de 8,01 dans le gradient 1 sont réunies. Le métabolite D est récupéré sous forme d'une substance amorphe incolore. Les données caractéristiques sont les suivantes: Spectre IR: voir la figure 4 Spectre de masse: voir la figure 8 F - 74-780C []20D - - 131 (c - 1,02 dans du chloroforme) Spectre UV: Xmax (méthanol) 256 log e' - 0,3716 H-RMN (CDC13): signaux caractéristiques (ppm) à 5,33 (d,J-4Hz,H-26); 5,22 (d,J-9Hz,H-29); 4,53 (d,large,J-15Hz,H-6e); 4,37 (d, large,J-4Hz,H-2); 4,19 (ddd,Jl-2Hz, J2-SHz, J3-7Hz,H-24) 13C-RMN (CDCl3): signaux caractéristiques (ppm) à 208,4 (C-22); 202,6 (C-9); 169,6 (C-1); 167,5 (C-8); 131,6 (C-29); 124,2 (C-20); 135,1 (C-37); 116,6 (C-38); 81,4 (C-26); 68,3 (C-24). L'invention concerne donc également un procédé de préparation des métabolites A, B et C, procédé selon lequel, après séparation du composé de formule IIa du bouillon de fermentation, on rince la colonne avec du méthanol et on fractionne le mélange de métabolites résultant en solution par chromatographie répétée. L'invention concerne également un procédé de préparation du métabolite D, procédé selon lequel on fractionne les fractions mineures obtenues pendant la chromatographie du bouillon de fermentation avec de l'éther de tert.-butyle et de méthyle pour la sépara- tion du composé de formule IIa. Pendant le traitement ultérieur des produits de fermentation, on obtient des fractions secondaires qui, selon la chromatographie en phase liquide (HPLC), contiennent un nouveau métabolite supplémentaire ayant un temps de rétention de 11,7 min (gradient 1). Par fractionnement chromatographique et purification sur Silicagel H, Sephadex LH20 et Lichroprep RP18, on obtient le composé de formule la HCQ CH3O H3 0s4> Ia CH, H 0O CH3 O la CH1 HC CH3 H OCH 3 OCH3 sous forme d'une substance amorphe incolore et homogè- ne. Les données caractéristiques sont les suivantes: F = 103-105 C [=]20D - 41,8 (c - 0,95 dans du chloroforme) H-RMN (CDC13 + CH30H 5:1): un mélange d'environ 3:1 de deux conformères: signaux caracté- ristiques à 4,37 (ppm) (d,large,J-14Hz,H-6e); 3,91 (d,J=2Hz, H-26); 4,08 (H-26') 13C-RMN (CDC13): signaux caractéristiques (ppm) à 168,8 (C-1); 162,2 (C-8); 189,9 (C-9); 99,8 (C-10); 50,5 (C-18); 210,9 (C-22); 41,2 (C-23); 71,5 (C-24); 37,7 (C-25); 136,3 (C-28); 127,8 (C-29). L'invention concerne donc également un procédé de préparation du composé de formule Ia, procédé selon lequel on soumet à des chromatographies répétéesles fractions mineures qui sont obtenues pendant le traitement ultérieur du bouillon de fermen- tation pour séparer le composé de formule IIa [variante a) du procédé]. Comme il ressort de la formule Ia, le cycle lactone n'est pas fixé via le groupe oxy en position 26, mais via le groupe oxy en position 24. Cette structure isomère est désignée ci-après "iso". L'invention concerne également un procédé de préparation par synthèse des composés ayant cette structure isomère de base, à savoir les composés de formule I R2' '1 CHCH3 CH3 dans laquelle X signifie un groupe oxo ou un groupe hydroxy éventuellement protégé, R1' signifie un groupe méthyle, éthyle, n-propyle ou allyle et R2 signifie un groupe hydroxy éventuellement pro- tégé, procédé selon lequel b) pour la préparation des composés de formule Ib R2. o H o I CH3 CH3 jCH3 dans laquelle 3signifie un groupe hydroxy éventuellement protégé et R1' et R2 sont tels que définis plus haut, on fait réagir un composé de formule lIa' OH O 2 P; Ib O C CH3 y"CH3 H OCH3 0CH3 dans laquelle X' signifie un groupe hydroxy éventuellement prot6g6 et Rl', et R2 sont tels que définis plus haut, on fait réagir un composé de formule lia, H3 CH XI CFN fH CH3 dans laquelle X', RI' et R2 sont tels que définis plus haut, avec une base telle que l'imidazole ou c) pour la préparation des composés de formule Ic .HO., H CH - jCH C 33r 8 H 3, X'I' OCH 3 OC 3 dans laquelle X" signifie un groupe oxo ou hydroxy et Rl' est tel que défini plus haut, on déprotège un composé de formule Id R2' 3,,j il * | R fi Id R o O..CH I I OCH30CH3 CH3 OCH 3 OCH 3 dans laquelle R3 signifie un groupe hydroxy éventuellement protégé et R1', R2 et X sont tels que définis plus haut, au moins un des symboles X, R3 et R2 devant signifier un groupe hydroxy protégé. Les composés ayant cette configuration iso sont des produits intermédiaires importants pour la préparation de nouveaux dérivés biologiquement actifs. Lorsque X signifie un groupe hydroxy éventuellement protégé, ils peuvent avoir la configuration S ou R en position 22. Les diastéréoisomères désignés ci-après "diastéréo-isomères A" ont la configuration S en -position 22 et ceux désignés ci-après "diastéréo- isomères B" ont la configuration R à cette position. Le groupe hydroxy protégé est par exemple un groupe hydroxy protégé par un groupe protecteur habituel tel que le groupe tert.-butyldiméthylsilyle. Les variantes ci-dessus du procédé sont effectuées selon les méthodes habituelles. La variante a) est effectuée de préférence comme décrit plus haut. La variante b) est une réaction d'isomérisa- tion. Elle peut par exemple être effectuée par réaction d'un composé de formule IIa' dans un solvant inerte tel que le diméthylformamide, avec une base telle que l'imidazole, le carbonyldiimidazole ou la 4-diméthyl- aminopyridine. La réaction est effectuée de préférence à une température élevée, comprise par exemple entre environ 50 et environ 60 C. La séparation des produits finals désirés des impuretés, c'est-à-dire le fraction- nement des mélanges qui peuvent s'être formés, est effectuée selon les méthodes connues, par exemple par chromatographie. La variante c) est une réaction de dé- protection. Elle est également effectuée selon les méthodes habituelles, par exemple en utilisant de l'acide fluorhydrique et de l'acétonitrile, de préfé- rence à une température proche de la température ambiante. La réaction peut être effectuée de sorte qu'en fonction des conditions de réaction (durée, température) tous les groupes protecteurs ou seulement une partie d'entre eux soient éliminés. La déprotection partielle est spécialement préférée lorsque dans une étape ultérieure, on désire faire réagir un groupe hydroxy spécifique. La configuration demeure inchangée lorsqu'on effectue les variantes cidessus du procédé, en particulier lorsque X signifie un groupe hydroxy éventuellement protégé, en position 22. Lorsque des mélanges de diastéréo-isomères sont utilisés comme pro- duits de départ, le fractionnement en diastéréo- i-somères individuels peut être effectué de manière habituelle à n'importe quel stade du procédé de ré- action, par exemple par chromatographie. Les produits de départ peuvent être obtenus selon les procédés connus. Les composés de formule Id' snid STuT;gp anb staq quos Eu la z ',T aeTiaenbe suep ClHOO ClHOO a.Inuo pI CHO.. 59sodutoo sap uoTepXxo 2ed snua:qo a::%a uaAnad ' rneg snId sSuTap anb sia luos úÉ Ra:I 'a, Tu aI!anbei suep HOH HO0 0, ú1 Zú96ú93 haut. Le bouillon de fermentation utilisé comme produit de départ, peut par exemple être obtenu comme suit: A) Culture initiale sur milieu gélosé: on cultive la souche Streptomyces tsukubaensis NO 9993 pendant 14 jours à 27 C dans le milieu suivant: Extrait de levure 4 g/l Extrait de malt 10 g/l Dextrose 4 g/l Gélose 20 g/l pH 6,6 (NaOH/H2SO04). B) Préculture: dans 90 ml d'une solution à 0,9% de chlorure de sodium, on met en suspension les spores et le mycelium de 6 cultures initiales. 10 flacons Erlenmeyer contenant chacun 1 litre du milieu de préculture sont chacun inoculés avec 7 ml de cette suspension. Le milieu de préculture a la composi- tion suivante: Glycérol 10 g/l Amidon 10 g/l Glucose 5 g/l Extrait de grains de coton 10 g/l Extrait de levure 5 g/1 CaCO3 2 g/1 pH 6,8 On incube cette préculture pendant 96 heures à 27 C et à 200 tours par minutes. C) Culture intermédiaire: 2 portions de 500 litres du milieu de préculture sont incubées chacune dans un fermenteur en acier de 750 litres avec 5 1 de la préculture pendant 48 heures à 27 C, à 100 tours par minute et à une vitesse de ventilation de 0,5 1/min. par litre de milieu. D) Culture principale: 6000 litres du milieu principal de culture sont inoculés dans 2 fermenteurs en acier de 4500 litres, avec 600 litres de la culture intermédiaire. Le milieu de culture principal a la composition suivante: Amidon soluble 45 g/1 Liqueur de trempage de maïs 10 g/l Extrait de levure 10 g/1 CaCO3 1 g/1 pH 6,8 (NaOH) On effectue l'incubation pendant 96 heures à 27 C, à 50 tours par minute, à 0,5 bar et à une vitesse de ventilation de 0,5 1/min. par litre de milieu. Lorsque la préparation des composés de départ n'est pas décrite, ceux-ci sont connus ou peuvent être préparés selon des procédés connus ou de manière analogue aux procédés décrits dans les exemples. Un sous-groupe de composés de l'invention est constitué par les composés de formule Ie HCLe - " CH3CH ±^"C OCH3 CH 3 dans laquelle X est tel que défini plus haut. EXEMPLES: Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Dans ces exemples, les températures s'entendent en degrés Celsius. Les composés désignés "FK 506", "FR 520", "iso-FK 506" et "iso-FR 520" ont les structures suivantes: FK 506: HCHC3 CHH " 0 OH cHO3h H /"" CH3 OCH 3 OCH 3 FR 520: | H oSg C0 CH"CH iso-FK 506: mH....,H CH XOH CH 3CH CH -'"0CH OCH 3CCH 3 iso-FR 520: o3 ost CH 3 CH 3 OH CH3 Exemple 1: 33-O-tert.-butyldiméthylsilyl-22(S)-dihydro- iso-FK 506 [Formule I: Rl' - un groupe allyle; R2 - un groupe tert.-butyldiméthyl- silyloxy; X - (S)-OH] [variante b) du procédé] Dans i ml de diméthylformamide, on agite pendant 120 heures à 60 92 mg de 33-O-tert.-butyl- diméthylsilyl-22(S)-dihydro-FK 506 (diastéréo-isomère A) et 12 mg d'imidazole. On évapore la solution à siccité et on purifie le résidu par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange toluène/acétate d'éthyle (2/1). A la place de l'imidazole, on peut également utiliser d'autres bases telles que la 4-diméthylamino- pyridine ou le carbonyldiimidazole. Avec le carbonyl- diimidazole, la réaction est par exemple effectuée comme suit: A une solution de 459 mg de 33-O-tert.-bu- tyldiméthylsilyl-22(S)-dihydro-FK 506 (diastéréo- isomère A) dans 5 ml de benzène anhydre, on ajoute mg de carbonyldiimidazole et on agite le mélange pendant 12 heures à 50 . On évapore la solution à siccité sous pression réduite et on purifie le résidu par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange toluène/acétate d'éthyle (3/1). On obtient le composé du titre (ensemble avec le carbonate cyclique en position 22,24 du produit de départ) sous forme d'un solide amorphe incolore: Spectre 1H-RMN (CDC13, signaux caractéristiques, ppm): ,04 (m,H24); 3,84 (d,J-7Hz, H-26); 4,79 (d, large, J-10Hz, H-20); 3,28, 3,38 et 3, 41 (OCH3); 3,655 (dd,JI-2Hz, J2-9Hz, H-14). Les composés suivants de formule I sont obtenus de manière analogue à celle décrite à l'exemple 1: Exemple R1' X R2 Données caracté- ristiques 2 allyle (R)-OH tert.-butyldi- solide amorphe méthylsilyloxy incolore 3 éthyle (S)-OH tert.-butyldi- solide amorphe méthylsilyloxy incolore; RMN* 4 éthyle (R)-OH tert.-butyldi- solide amorphe méthylsilyloxy incolore *lH-RMN: (CDC13, signaux caractéristiques, ppm): 3,29+3,39+3,42 (s+s+s, OCH3); 3,59 (dd,J1-12Hz, J2-2,5Hz, H-15); 3,67 (d, J-10Hz, H-14); 3,85 (d,J7Hz, H-26); 4,49 (d, large, J-13Hz, H-6); 4,76 (d, J-10Hz, H-20). Exemple 5: 22(S)-dihydro-iso-FK 506 [Formule I: R1' - un groupe allyle; R2 - OH; X - (S)-OH] [variante c) du procédé] A une solution de 1 ml d'acétonitrile et pl d'acide fluorhydrique à 40%, on ajoute goutte à goutte 106 mg de 33-O-tert.-butyldiméthylsilyl-22(S)- dihydro-iso-FK 506 (diastéréo-isomère A; composé de l'exemple 1) dans 1,4 ml d'acétonitrile et on agite le mélange pendant 1 heure à la température ambiante. On concentre ensuite la solution sous pression réduite et on la purifie par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant de l'acétate d'éthyle. On obtient le composé du titre sous forme d'un solide amorphe incolore: Spectre 'H-RMN (CDC13, signaux caractéristiques, ppm): 3,895 (d,J-6Hz, H-26); 4,80 (d,large, J-10Hz, H-20); 3,67 (d,J-9Hz, H-14); 3,295, 3,39 et 3,42 (OCH3). Les composés suivants de formule I sont obtenus de manière analogue à celle décrite à l'exemple : Exemple Rl' X R2 Données caractérisques no 6 allyle (R)-OH OH solide amorphe incolore 7 éthyle (S)-OH OH solide amorphe incolore 8 éthyle (R)-OH OH solide amorphe incolore 9 éthyle oxo OH solide amorphe incolore allyle oxo OH solide amorphe incolore On peut obtenir les produits de départ de la manière suivante: A) 33-O-tert.butyldiméthylsilyl-FR 520 A une solution de 80 mg de FR 520 dans 3 ml de dichlorométhane, on ajoute sous agitation 15 mg d'imidazole et 17 mg de chlorure de tert.-butyldi- méthylsilyle. On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures à la température ambiante, on le dilue avec une solution aqueuse saturée de chlorure d'ammonium et on l'extrait 3 fois avec de l'éther diéthylique. On lave l'extrait avec de l'eau et une solution saturée de chlorure de sodium, on le sèche sur sulfate de sodium, on le concentre sous pression réduite et on le purifie par chromatographie. B) 33-O-tert.-butyldiméthylsilyl-22(S)-dihydro-FK 506 et 33-O-tert.butyldiméthylsilyl-22(R)-dihydro-FK 506 A -20 on dissout 3,9 g de triacétoxy-boro- hydrure de tétraméthylammonium et 2,75 g de 33-O- tert.-butyldiméthylsilyl-FK 506 dans 24 ml d'un mélange acétonitrile/acide acétique glacial (1/1) et on agite le mélange pendant 2 heures à 0-5 . On ajoute ensuite de l'eau, on agite la solution pendant 15 minutes à -15 et on l'extrait avec du chlorure de méthylène. On lave la phase organique avec de l'eau et une solu- tion aqueuse saturée de chlorure de sodium on la sèche sur sulfate de magnésium et on l'évapore à siccité. On isole les deux diastéréo-isomères du titre à partir du produit brut dans une proportion d'environ 10:1 (S/R) sous forme de solides amorphes incolores, par chtomato- graphie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange toluène/acétate d'éthyle (5/1): Diastéréo-isomère A (produit principal): H-RMN (CDC13): deux conformères dans une proportion d'environ 2:1: signaux caractéristiques (ppm) du conformère principal à 5,30 (H-26); 4, 66 (m,H-2); 4,44 (d,large,J-13Hz, H-6e). On trouve les signaux pour les groupes OCH3 des deux conformères à 3,31, 3,32, 3,335, 3,38, 3,39 et 3,42 ppm; 13C-RMN (CDCl3): signaux caractéristiques (ppm) du conformère principal à 195,9 (C-9); 169,1 (C-1); 165,0 (C-8); 137,4 (C-37); 136,4 (C-19); 132,2 (C-28); 128,9 (C-29); 126,1 (C-20); 115,7 (C-38); 98,4 ou 97,0 (C-10); Diastéréo-isomère B (produit mineur): 13CRMN (CDCl3): signaux caractéristiques (ppm) du conformère principal à 169, 1 (C-1); ,8 (C-8); 136,2 (C-19); 125,5 (C-20); 98,7 (C-10); 43,3 (C-21) et 36,8 (C-23). C) 33-O-tert.-butyldiméthylsilyl-22(S)-dihydro- FR 520 et 33-O-tert.-butyldiméthylsilyl-22(R)-dihydro- FR 520 On obtient les composés du titre de manière analogue à celle décrite sous B) plus haut, à partir du FR 520. D) 33-O-tert.-butyldiméthylsilyl-26-O-triméthyl- silyl-iso-FK 506 a) 33-O-tert.-butyldiméthylsilyl-26-O-trimé- * thylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 Dans 5 ml de toluène anhydre, on agite pendant 24 heures à la température ambiante 460 mg de 33-O-tert.-butyldi- méthylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 et mg de bis-triméthylsilylacétamide. On évapore la solution à siccité; on obtient le composé du titre ensemble avec le 33-O-tert.-butyldiméthylsilyl-22-O-tri- méthylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506, par fractionnement chromatographique du résidu sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange toluène/acétate d'éthyle (4/1). Le composé du titre se présente sous forme d'une substance amorphe in- colore: 1H-RMN (CDCl3): 3,30 + 3,40 + 3,44 (s+s+s, OCH3); 3,67 (d,J-9Hz, H-26); 4,52 (d,large,J-13Hz, H-6e); 4,81 (d,J-lOHz, H-20); b) 33-O-tert.-butyldimêthylsilyl-26-O-tri- méthylsilyl-iso-FK 506 A une solution de 60 mg de 33-O-tert.-bu- tyldiméthylsilyl-26-O-triméthylsilyl- 22(S)-dihydro-iso-FK 506 dans 2 ml de chlorure de méthylène anhydre, on ajoute 100 mg d'un tamis moléculaire 4A pulvérisé et 12 mg de N-oxyde de N-méthyl- morpholine. Après agitation pendant 30 minutes à la température ambiante, on fait réagir la solution avec environ 10 mg de pérruthénate de tétrapropylammonium et on agite pendant encore 3 heures. On évapore le mélange réactionnel à siccité, on le dissout dans de l'acétate d'éthyle, on le lave avec une solution aqueuse de NaHCO3 et de l'eau, on le sèche et on l'évapore à siccité. On peut purifier le produit brut par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange toluène/acétate d'éthyle (6/1). On obtient le composé du titre sous forme d'une substance amorphe incolore. E) 33-O-tert.-butyldiméthylsilyl-26-O-tri- méthylsilyl-iso-FR 520 On obtient le composé du titre sous forme d'un solide amorphe incolore en procédant de manière analogue à celle décrite sous D) plus haut. Les composés et les métabolites de l'inven- tion présentent d'intéressantes propriétés pharmacolo- giques et peuvent donc être utilisés en thérapeutique comme médicaments. Ils exercent en particulier une activité anti-inflammatoire et immunosuppressive. L'activité anti-inflammatoire de ces compo- sés peut être mise en évidence dans es essais suivants: 1. Dermatite de contact allergique à l'oxazolone chez la souris in vivo après application par voie topique, selon la méthode décrite par F.M. Dietrich et R. Hess, dans Int. Arch. Allergy 38 (1970) 246-259. On obtient les résultats suivants après application par voie topique d'une solution à 0,01% de la substance à essayer dans de l'éthanol: Composé % d'inhibition Métabolite A 44 Métabolite B 47 Métabolite C 48 Métabolite D 44 - Il ressort de cet essai que les composés et leurs métabolites exercent une activité anti- inflammatoire comprise entre environ 20% et environ % après administration par voie topique à une concentration de 0,01%. 2. Inhibition de l'explosion respiratoire oxydante chez les leucocytes polymorphonucléaires neutro- philes humains (inhibition de la chimioluminescence stimulée par FMLP ou A23187) in vitro: La préparation des leucocytes polymorpho- nucléaires (PMNL) et la mesure de la chimiolumi- nescence sont effectuées comme décrit dans la littérature (voir M. Schaude et coll., Mycoses 31 [1978] 259-267), la réaction de chimioluminescence étant initiée par addition du peptide N-formyl- L-méthionyl-L-leucyl-L-phényl-alanine (FMLP, 4xlO-6M) ou de l'ionophore calcique A23187 (4x10-6M). La concentration inhibitrice minimale est définie comme la plus faible concentration de substance active qui provoque une inhibition nette des trois paramètres; Les résultats suivants ont été obtenues dans l'essai ci-dessus (MIC - concentration inhibitrice minimale, #M): Composé Stimulant FMLP A23187 Métabolite A 0,001 Métabolite B 0,5 Métabolite D 0,5 0,5 3. Inhibition in vitro de la libération de PGE2 (prostaglandine E2), stimulée par le TPA (12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate),par les macrophages de souris (inhibition de l'activation des macrophages): L'inhibition de la synthèse de PGE2 par les macrophages péritonéaux de souris est eftectuée selon une méthode analogue à celle décrite par A. Haselberger et coll., dans Circ. Schock Res. 26 (1988) 185-192, en utilisant le TPA comme stimulant. Dans cet essai, on obtient les résultats suivants: Composé Concentration (#M) Inhibition % Métabolite A 0,5 40 Métabolite B 1 30 Iso-FK 506 1 35 L'activité immuno-suppressive peut être mise en évidence dans les essais suivants: 4. Réponse proliférative in vitro des lymphocytes à une stimulation allogénique dans la réaction lymphocytaire mixte (MLR) selon la méthode décrite par T. Meo, "The MLR in the Mouse", Immunological Methods, L. Lefkovits et B. Permis, Eds, Academic Press, N.Y. (i979), 227239: Dans cet essai, on obtient les résultats suivants: Composé..___CI5 (_g/ml) Métabolite A 0,1 Métabolite D environ 0,15 nM et environ 10 nM. 5. Inhibition in vitro de la réponse immunitaire humorale primaire à des érythrocytes de mouton: méthode décrite par R.I. Mishell et R.W. Dutton, Science 153 (1966) 1004-1006; R.I. Mishell et R.W. Dutton, J. Exp. Med. 126 (1967) 423-442. Dans cet essai, on obtient les résultats suivants: Composé CI50 (pg/ml) Métabolite A 0,1 Métabolite D 0,036 Il ressort de cet essai que les composés et les métabolites sont actifs à une concentration comprise entre environ 0,5 nM et environ 10 nM. Les composés et métabolites de l'invention peuvent donc être utilisés en thérapeutique comme agents immunosuppresseurs et anti-inflammatoires des- tinés à la prévention ou au traitement des conditions nécessitant une immunosuppression ou de conditions inflammatoires telles que a) la prévention et le traitement - de la résistance lors de greffes d'organes ou de tissus, par exemple pour les greffes du coeur, des reins, du foie, de la moelle et de la peau, - de la maladie greffe-versus-hôte, telle que suite à des greffes de moelles, - des maladies autoimmunes telles que l'arthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux systémique, la thyroidite de Hashimoto, la sclérose en plaque, la myasthénie grave, le diabète de type I et l'uvéite, - de manifestations cutanées de maladies immunolo- giques, telles que la pelade, et b) le traitement de maladies inflammatoires et hyper- proliférantes de la peau, telles que le psoriasis, la dermatite atopique, la dermatite de contact et d'autres dermatites eczémateuses, la dermatite séborrhéique, le lichen plan, le pemphigus, le pemphigus bulleux, l'épidermolyse bulleuse, l'urticaire, l'oedème de Quincke, les vascularites, l'érythème, l'éosinophilie cutanée, le lupus érythémateux et l'acné. Les composés peuvent être administrés par voie sytémique ou par voie topique. Pour les indications ci-dessus, la dose appropriée dépend bien sûr par exemple du patient, du mode d'administration et de la nature et de la gravité de la condition à traiter. Toutefois, des résultats satisfaisants sont obtenus par voie systémique avec des doses quotidiennes comprises entre environ 0,15 mg/kg et environ 1,5 mg/kg. Une dose quotidienne appropriée est comprise entre environ 0,01 mg et environ 100 mg, administrée avantageusement par exemple en doses fractionnées jusqu'à 4 fois par jour. Pour une application par voie topique, on obtient des résultats satisfaisants après une administration locale de la substance active à une concentration de 1-3% plusieurs fois par jour, par exemple de 2 à 5 fois. Comme exemple de formes galé- niques appropriées, on peut citer les lotions, les gels et les crèmes. Les composés et les métabolites de l'inven- tion peuvent être administrés selon l'un quelconque des modes habituels, en particulier par voie entérale, par exemple par voie orale, par exemple sous forme de comprimés ou de gélules, ou par voie topique, par exemple sous forme de lotions, de gels ou de crèmes. Les compositions pharmaceutiques contenant un composé ou un métabolite tel que défini plus haut, en association avec au moins un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable, peuvent être préparées selon les méthodes habituelles, par mélange avec un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les doses unitaires contiennent par exemple d'environ 0,0025 mg à environ 50 mg de substance active. L'administration par voie topique est par exemple destinée à la peau. Elle peut également être destinée à l'oeil, par exemple pour le traitement de conditions de l'oeil impliquant une réponse immuni- taire, par exemple les maladies auto-immunes de l'oeil par exemple l'uvéite, la kératoplastie et la kératite chronique, les conditions allergiques, par exemple la conjonctivite printanière, les conditions inflamma- toires et les greffes de cornée, par application topique sur la surface de l'oeil d'un composé ou d'un métabolite de l'invention dans un véhicule ophtalmique pharmaceutiquement acceptable. Le véhicule est tel que le composé ou le métabolite est maintenu en contact avec la surface oculaire pendant un intervalle de temps suffisant pour permettre au composé de pénétrer dans la cornée ou dans les régions internes de l'oeil, par exemple la chambre antérieure, la chambre postérieure, le corps vitré, l'humeur aqueuse, l'humeur vitrée, la cornée, l'ensemble iris/corps ciliaire, le cristallin, l'ensemble choroïde/rétine et la sclérotique. Le véhicule ophtalmique pharmaceutiquement acceptable peut être par exemple une pommade, une huile végétale ou une matière destinée à l'encapsulation. REVENDICATIONS 1. Les composés de formule I OCH30 O CH3 OO "" CH CHC H 3 dans laquelle R1' signifie un groupe méthyle, éthyle, n-propyle ou allyle, R2 signifie un groupe hydroxy éventuellement protégé et X signifie un groupe oxo ou un groupe hydroxy éventuellement protégé. 2. Le composé de formule Ia H 3 C OHHA, N I CO CH 30CH O CH3 H C H OCH 3 OCH 3 3. Le métabolite A, caractérisé en ce qu'il a un point de fusion de 7075 C, un ["]2OD - -75,6 (c - 1,17 dans du méthanol) et les spectres IR et de masse tels qu'indiqués sur les figures 1 et 5. 4. Le métabolite B, caractérisé en ce qu'il a un point de fusion de 7278 C, un [=]20D - 71,10 (c - 1,22 dans du méthanol), les spectres IR et de masse tels qu'indiqués sur les figures 2 et-6 et les signaux caractéristiques (ppm) suivants dans le spectre 1H-RMN (CDC13): 6,70 (m,H24) et 6,11 (d,large,J-15Hz, H-23). 5. Le métabolite C, caractérisé en ce qu'il a un point de fusion de 5560 C, un [a]20: = +7,50 (c - 1,0 dans du méthanol) et les spectres IR et de masse tels qu'indiqués sur les figures 3 et 7. 6. Le métabolite D, caractérisé en ce qu'il a un point de fusion de 7478 C, un [a]20D - -131 (c = 1,02 dans du chloroforme), les spectres IR et de masse tels qu'indiqués sur les figures 4 et 8 et les signaux caractéristiques (ppm) suivants dans le spectre H-RMN (CDC13): 5,33 (d,J4Hz, H-26); 5,22 (d,J-9Hz, H-29); 4,53 (d, large,J-15Hz, H-6e); 4,37 (d, large,J-4Hz, H-2); 4,19 (ddd,J1-2Hz,J2-5Hz,J3-7Hz, H-24). 7. Un procédé de préparation des composés de formule I tels que définis à la revendication 1, caractérisé en ce que a) pour la préparation du composé de formule Ia HCHH OH jH 04 4 OCH 3CH 3 CCH3 CHH on soumet à des chromatographies répétées les fractions mineures qui sont obtenues pendant le traitement ultérieur du bouillon de fermentation pour séparer le composé de formule IIa aeTTenbeT suep HOO ú HOO úHOO H qI A ?-' HO qI elnumio; ep ssod=oD sep uoTqevedead eT inod (q úHOO I HOO úHH t'II6: -Irv HOO Hú Zú96ú9Z X' signifie un groupe hydroxy éventuellement protégé et Ri' et R2 sont tels que définis à la revendication 1, on fait réagir un composé de formule IIa' R C OCH3 OCH3 dans laquelle X' est tel que défini plus haut et Ri' et R2 sont tels que définis à la revendication 1, avec une base telle que l'imidazole ou c) pour la préparation des composés de formule Ic )CH3H h3 X dans laquelle X" signifie un groupe oxo ou hydroxy et R1' est tel que défini à la revendication 1, on déprotège un composé de formule Id R2.... é 0 N Pl o iOH3 CH OH 30OCH-3 dans lquell XI sgifeungoup oo ouhdoye I'Is e u défni l reedcaton 1c dans laquelle R1 ', R2 et X sont tels que définis à la revendication 1 et R3 signifie un groupe hydroxy éventuellement protégé, au moins un des symboles X, R3 et R2 devant signifier un groupe hydroxy protégé. 8. Un procédé pour récupérer de nouveaux métabolites à partir du bouillon de fermentation utilisé pour la préparation des composés de formule II 0 4 I I CH3 OH 3 CH3 OCH 3 OCH 3 dans laquelle R1 signifie un groupe méthyle, éthyle ou allyle et n signifie i ou 2, par fermentation usuelle de souches de Streptomyces, caractérisé en ce qu'on isole, après séparation des composés de formule II, les métabolites à.partir des solutions et des bain de lavage restants selon des méthodes telles que la chromatographie. 9. Un procédé selon la revendication 8 pour la préparation des métabolites A, B et C tels que spécifiés aux revendications 3, 4 et 5, caractérisé en ce que, après la séparation du composé de formule IIa HO..., C $H 3 H 210I H 3 A s_0 oO H la CH3 H 2 1 C ô O H 3 A CH 3P00H CH3 OCH3 OCH 3 du bouillon de fermentation, on rince la colonne avec du méthanol et on fractionne le mélange de métabolites résultant en solution par chromatographies répétées. - 10. Un procédé selon la revendication 8 pour la préparation du métabolite D tel que spécifié à la revendication 6, caractérisé en ce qu'on fractionne les fractions mineures obtenues pendant la chromatograhie du bouillon de fermentation avec de l'éther de tert.-butyle et de méthyle pour la séparation du compo- sé de formule IIa spécifié à la revendication 9. 11. Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour l'utilisation comme médi- cament. 12. Une composition pharmaceutique contenant un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, en association avec un véhicule ou diluant pharma- ceutiquement acceptable.