Brevet FR2642526A1 — publié le 19900803

L- 2642526 UTILISATION DE GENERAT DE RADICAUX LIMRM DANS LE DOMAINE DES DOSAGE BIOLOGIQ DOMATNE DE LINVNTIgON La présente invention a trait à une nouvelle utilisation d'un générateur de radicaux libres en biologie. Cette nouvelle utilisation est particulièrement applicable au domaine des dosages biologiques. L'invention concerne également un procédé de dosage d'une substance quelconque afin d'apprécier ses éventuels effets sur l'organisme par des essais in vitro portant sur la lyse de cellules en présence de radicaux libres. ARRIE-PLAN TECHNOLOGIQUE On sait que les radicaux libres ont en général un effet néfaste sur l'organisme et en particulier au niveau des cellules de cet organisme. Les radicaux libres attaquent la paroi cellulaire plus ou moins rapidement en fonction de la résistance des cellules que confère le matériel (ou équipement) enzymatique et moléculaire desdites cellules. Lorsque la paroi cellulaire a été dégradée, perforée ou ouverte par des radicaux libres, le contenu de la cellule se répand à l'extérieur de la paroi. Selon l'invention on se propose de mesurer la lyse cellulaire en éva- luant le contenu de la cellule, qui s'est répandu à l'extérieur, ou un des composants dudit contenu. OBJET DE L'INVENTIO - Suivant l'invention on utilise de façon positive dans le domaine des dosages biologiques, l'effet agressif néfaste des radicaux libres en évaluant la cinétique de la lyse cellulaire par lesdits radicaux libres. 2 2642526 Plus précisément, on préconise selon l'invention une nouvelle solution technique qui repose sur l'utilisation d'un générateur de radicaux libres dans le domaine des dosages biolo- giques, cette utilisation étant caractérisée en ce que (i) l'on introduit, dans un milieu biologique à tester contenant des cellules vivantes, un générateur de radicaux libres, (ii) initie la libération des radicaux libres à partir dudit générateur de radicaux libres, et (iii) évalue la cinétique de la lyse cellulaire induite par lesdits radicaux libres. Selon l'invention on préconise également un procédé de dosage d'une substance au moyen de radicaux libres en vue d'apprécier les effets de ladite substance sur un organisme vivant quelconque, ledit procédé qui met en oeuvre une lyse cellulaire par des radicaux libres, étant caractérisé en ce que (1) l'on met en contact, dans un milieu biologique liquide approprié, un générateur de radicaux libres avec des cellules vivantes choisies parmi l'ensemble constitué par (A) les cellules d'un organisme sain mises en contact avec ladite substance à étudier, et (B) les cellules d'un organisme préalablement contaminées par ladite substance à étudier, (2) l'on induit la libération de radicaux libres à partir dudit générateur de radicaux libres, et (3) l'on évalue la variation de la lyse desdites cellules vivantes par rapport à la lyse de cellules vivantes d'un organisme sain utilisées comne contr8le et soumises dans ledit milieu biologique uniquement à l'action de radi- caux libres provenant dudit générateur de radicaux li- bres. DESRSIPTION DETAIILR DE L'INVE ION- Parmi les générateurs de radicaux libres qui conviennent selon l'invention, on peut notamment signaler les produits qui libèrent des radicaux libres et qui sont utilisés couramment dans le domaine de la polymérisation pour l'obtention de macromolé- cules. Parmi ces produits on peut notamment citer les générateurs de radicaux libres oxydants, tels que le peroxyde de benzoyle, les perbenzoates d'alkyle en C-C8, de préférence en C3-C4 (notamment les perbenzoates de n-butyle, t-butyle, i-propyle et n-propyle), les peroxydicarbonates de dialkyle o les groupes alkyle contien- nent de 1 à 8 atomes de carbone, de préférence de 3 à 4 atomes de carbone (notamment le peroxydicarbonate de diisopropyle), l'hydro- xyperoxyde de cumène, l'azo-bis(isobutyronitrile), le 2,2'-azo- bis(2,4-diméthylvaléronitrile)le 2,2'-azo-bis(2-amidinopropane) et leurs éventuels sels d'addition tels que les chlorhydrates, et,leurs analogues. - Parmi les générateurs de radicaux libres oxydants on préfère ceux qui présentent une cinétique ou vitesse de réaction d'ordre 0 (la libération des radicaux libres est constante dans le temps) et mieux d'ordre 1 (la libération des radicaux libres est linéaire dans le temps). Les générateurs de radicaux libres oxydants préférés selon l'invention sont, d'une part, le dichlo- rhydrate de 2,2'-azo-bis(2-amidinopropane) qui donne dans un milieu aqueux une cinétique d'ordre 1, et d'autre part, le 2,2'- azo-bis(2,4-diméthylvaléronitrile) qui donne dans un milieu liquide huileux ou organique une cinétique d'ordre 1. La libération des radicaux libres à partir d'un générateur de radicaux libres est réalisée selon une méthode connue en soi, par exemple la chaleur, la lumière (notamment la lumière du spectre visible ou les UV), les protons, les électrons, les rayons X; de préférence cette libération sera initiée par des photons, ou la chaleur. Par exemple, le fait de porter le dichlorhydrate de 2,2'- azo-bis(2-amidinopropane) en solution aqueuse à la température de 370C suffit pour déclencher la libération de radicaux libres oxydants selon la réaction CI-H2N+ CH. CH, +NH2CI- CI-H2N+ CH % t I! // C-C-N=N-C-C >2 C-C * + N2 /N H. CH NH HN CH H2N CH3 CH3 NH2 2 H 4 2642526 Le milieu biologique d'essai, qui est un milieu liquide aqueux ou un milieu liquide organique, comprend des cellules vivantes, une substance à tester, un générateur de radicaux libres, et, le cas échéant, un ou plusieurs additifs usuels dans le domaine des cultures cellulaires et des dosages biologiques, notamment un moyen conservateur. La substance à tester, qui intervient dans ledit milieu liquide d'essai, est introduite dans ledit milieu soit telle quelle, soit préalablement associée auxdites cellules après contamination. La contamination peut résulter de l'administration (volontaire ou accidentelle) de ladite substance à tester (ou l'un de ses précurseurs) à l'organisme d'o sont prélevées les cellules, ou de l'adsorption in vitro de ladite substance à tester par la membrane cellulaire. Dans le cas de la contamination par administration à l'organisme, les cellules comportent dans leur contenu et/ou au niveau de leurs membranes ladite substance contaminante ou au moins l'un de ses métabolites. Dans le cas de la contamination par adsorption la majeure partie de la substance contaminante fixée se trouve dans et/ou sur la paroi cellulaire. La contamination par adsorption s'applique avantageusement aux substances contaminantes lipophiles. L'adsorption au niveau de la paroi cellulaire peut être réalisée par incubation, dans un milieu et à une température appropriés, des cellules et de la substance contaminante préalablement diluée dans un solvant sélectif; selon la durée de l'incubation et la population cellulaire utilisée, la totalité ou (cas le plus fréquent) une partie seulement de la substance contaminante du milieu d'incubation est fixée par adsorption au niveau de la paroi cellulaire. Selon l'invention, on peut comparer les cellules contaminées par administration à des cellules d'un organisme sain, pour apprécier la résistance aux radicaux libres de cellules pathologiquement modifiées. La substance à tester est quelconque. Il peut s'agir notamment d'une substance oxydante, d'une substance anti-oxydante, d'une composition ou association de produits ou encore d'un métabolite. Parmi les substances que l'on peut tester et/ou doser, on peut également signaler les pigments (notamment les flavo- noVdes), les protéines, les enzymes, les peptides, les amino- acides, les anticorps et les antigènes, et d'une manière générale, tous produits à partir desquels on peut générer des anticorps. Parmi ces substances susceptibles d'être testées et/ou dosées, on peut en particulier citer les produits ou moyens intervenant sur l'organisme et/ou les cellules. Les cellules vivantes qui sont introduites dans le milieu biologique suivant l'invention peuvent être d'origine humaine, animale ou végétale. De façon pratique on préfère (mais cela n'est pas essentiel quand on veut tester un colorant) que lesdites cellules vivantes soient pigmentées, c'est-à-dire qu'elles contiennent un pigment ou colorant tel que l'hémoglobine, la chlorophylle, la xanthophylle, le carotène et les anthocyanes dont la libération lors de la lyse cellulaire est détectable notamment par la variation de la densité optique. Les cellules vivantes que l'on recommande sont des hématies d'origine humaine ou animale et de préférence des hématies prélevées sur des animaux à sang chaud tels que les mammifères. Le choix des hématies repose sur les éléments suivants: les cellules sanguines telles que les hématies ont une demi-vie relativement courte (80 jours pour les hématies d'origine humaine); - les hématies possèdent tout l'équipement moléculaire et enzymatique de la protection anti-radicalaire et, de ce fait, elles sont considérées commne représentatives des autres cellules de l'organisme; et, - l'accessibilité et la grande disponibilité des héma- ties, notamment par le biais d'une simple prise de sang d'un volume de quelques millilitres. Quand on soumet des hématies isolées de leur plasma à une agression de type oxydatif avec des radicaux libres, les hématies mettent en jeu tout leur équipement enzymatique et moléculaire pour résister à cette agression jusqu'à ce que la membrane ou paroi cellulaire en soit modifiée au point de laisser échapper leur contenu cellulaire. Dans le cas des hématies, cette libération dudit contenu peut être facilement déterminée par spectrophotométrie en mesurant la quantité d'hémoglobine passant dans le milieu biologique. La résistance de la population d'bhématies que l'on teste s'exprime donc par le temps de libération de 50 % p/p de l'hémoglobine contenue dans les hématies. Pour la mise en oeuvre du procédé de dosage selon l'invention, on prélève les cellules, les isole, les lave et les remet en suspension dans un milieu biologique liquide de préférence isotonique. On incube à une température située dans la gamme allant de 10 à 60 C, de préférence de 15 à 40 C et mieux à une température de 37 C, en présence d'un générateur de radicaux libres, à raison de 50 à 200 mM de générateur de radicaux libres pour une concentration de 10 à 20 % p/v de cellules. Le meilleur mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention consiste à mettre en suspension les hématies dans un sérum physiologique isotonique, et à les incuber à 37 C en présence de dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2amidinopropane) à la corncentration de 100 mM pour un volume final -de 2 ml de milieu biologique liquide aqueux. La libération des radicaux libres à partir du générateur de radicaux libres est initiée de préférence par des photons et mieux par un choc thermique (dans le cas d'espèce un chauffage à 37 C). Des prélèvements (0,02 ml) sont effectués à intervalles de temps réguliers (par exemple toutes les minutes) jusqu'à ce que le culot cellulaire ait disparu (soit une durée de l'ordre de 150 à 300 minutes en général, et notamment de 200-600 minutes); chaque prélèvement est dilué au moyen de 1 ml de sérum physiologique et centrifugé [par exemple 10-60 secondes à 3000-9000 g, de préférence à 3000-6000 g (une centrifugation trop poussée, notamment supérieure à 9000 g peut perturber la mesure en induisant une lyse mécanique)]; une partie aliquote (0,2 ml) du surnageant ainsi obtenu est alors transférée dans les puits d'une 7^ 2642526 microplaque ou d'un ensemble de microcuvettes pour lecture de la densité optique par spectrophotométrie (notamnent à 350-600 nm, quelle que soit l'origine des cellules pigmentées, et, en particulier à 405-410 et 540 nm, lorsque le matériel cellulaire est constitué par des hématies). En pratique les résultats des variations de la densité optique sont exprimés en pourcentage par rapport à la lyse maximale des hématies (100 %). Une courbe théorique ajustée aux points expérimentaux permet d'obtenir en particulier le temps correspondant à 50 Z d'hémolyse (ce temps est d'autant plus lông que les hématies résistent mieux au stress oxydatif in vitro. conduit dans les conditions opérat6ires précitées), la pente de la sigmotde du pic et le temps de latence (déterminé par la tangente du point d'inflexion de ladite sigmo!de). Le procédé de dosage selon l'invention est de mise en oeuvre très simple et peut être commercialisé sous forme de nécessaire, trousse ou kit de dosage soit à des fins diagnosti- ques, soit pour des études de "screening" de diverses molécules, notamment des molécules ayant une activité oxydante on: antioxy- dante, d'une part, et des molécules ayant une action à long terme, d'autre part. Le procédé de dosage peut également être effectué sur du plasma humain ou animal de façon à apprécier l'influence desdites molécules sur ledit plasma et/ou les hématies dudit plasma. Le procédé de l'invention est particulièrement intéres- sant pour (i) le dosage des agents anti-malaria qui sont d'une manière générale des substances réduisant la résistance des hématies aux radicaux libres, (ii) le diagnostic du diabète dès lors que cette maladie produit dans l'organisme un effet hypo- oxydatif, et (iii) apprécier l'influence d'aliments ou d'additifs alimentaires, notamment les colorants. Ce procédé de dosage présente l'avantage d'être effectué pendant des durées très courtes, de préférence inférieures ou égales à 5 h. 8 2642526 D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation. L'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais est donné à titre d'illustration. EXMPE! Pour quantifier le procédé selon l'invention on a étudié l'influence de la concentration du dichlorhydrate de 2,2'-azo- bis(2-amidinopropane) sur des hématies de rat. Après prélèvement et lavage les hématies de rat sont mises en suspension (hématocrite 15 % p/v) dans du sérum physiologique isotonique. Ces hématies sont mises en contact avec le dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2amidinopropane) à des doses de 0, 25, 50 et 100 mM, le volume final du milieu biologique liquide aqueux étant de 2 ml. On initie la libération des radicaux libres par la chaleur en portant le milieu réactionnel à 37eC. On effec- tue des prélèvements de 0,02 ml toutes les 20 minutes pendant 200- 240 minutes, chaque prélèvement étant dilué dans 1 ml de sérumn physiologique et centrifugé (15 secondes; 4000 g). Une partie aliquote (0, 2 ml) du surnageant est alors transférée dans les puits d'une microplaque pour lecture de la densité optique à 540 m par spectrophotométrie. Les résultats consignés dans la figure 1, sont exprimés par le temps et en minutes, correspondant à un taux de 50 Z d'hémolyse (t50 %). La courbe (a) est relative à la concentration de 100 mM de dichlorhydrate de 2,2'azo-bis(2-amidinopropane) et donne une valeur t50 % = 158 minutes; la courbe (b) est relative à la concentration de 50 mM de dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2- amidinopropane) et donne une valeur t50 % = 176 minutes; la courbe (c) est relative à la concentration de 25 mM de dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2-amidinopropane) et donne une valeur t50 % = 214 minutes; et la courbe (d) est relative à l'essai contr8le, c'est- à-dire à l'absence de dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2-amidino- propane). Les résultats de la figure 1 mettent en évidence la relation dose/dépendance de l'effet sur la lyse cellulaire par rapport à la molécule génératrice de radicaux libres. EMPLEI 2 Le présent exemple concerne l'effet d'un agent anti- oxydant, dans le cas d'espèce l'acide ascorbique. On procède selon les modalités opératoires décrites à l'exemple 1 cidessus en utilisant un milieu biologique liquide aqueux (sérum physiologique) contenant des hématies de rat, 100 mM de dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2-amidinopropane) et O (absence d'agent antioxydant) ou 0,1 mM d'acide ascorbique. Les résultats consignés dans la figure 2 montrent que, en l'absence d'acide ascorbique [courbe (a)], la -valeur t50 % est égale à 158 minutes, et que en présence de 0,1 mM d'acide ascorbique [courbe (b)], la valeur t50 % est égale à 244 minutes. En d'autres termes, la présence d'un antioxydant tel que l'acide ascorbique retarde la Iyse cellulaire provoquée par les radicaux libres. EXEPLE 3 Le présent exemple concerne l'effet d'un agent anti- oxydant incorporé au niveau de la membrane d'hématies de rat, à savoir le butylhydroxytoluène [en abrégé: BHT; nomenclature systématique: 2,6-di-(1,1-diméthyléthyl)-4-méthylphénol]. On procède suivant les modalités opératoires décrites à l'exemple 1, en utilisant des hématies de rat sain (contrôle) et des hématies préalablement préincubées à 37 C pendant 0,5 h en présence de BHT et de son solvant, l'éthanol (pour adsorption du BHT au niveau de la membrane cellulaire des hématies) puis remises en suspension pour effectuer le dosage. Les hématies ainsi traitées sont placées dans le sérum physiologique de l'exemple 1 et mises en contact avec 100 mM de dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis( 2-amidinopropane), le milieu réactionnel résultant étant ensuite porté à 37 C. Les résultats sont consignés dans la figure 3. La courbe contrôle (a) donne un t50 % égal à 163 minutes. La courbe (b) 2642526 relative aux hématies de rat sain préincubées avec le solvant du N{T, ici 0,5 Z p/v d'éthanol pendant 0,5 h à 370C, donne une valeur t50 X égale à 157 minutes. La courbe (c) relative aux m&mes héaties que la courbe (b) mais préincubées dans les mêmes coinditions avec le EIT et de l'éthanol (le milieu d'essai contenant 0,03 mM de EHT et 0,5 % p/v d'éthanol) donne une valeur en t50 % égale à 193 minutes. La comparaison de la courbe (c) avec les courbes (a) et (b) démontre la protection que confère le BHT visà-vis de la lyse cellulaire. En d'autres termes, l'agent antioxydant utilisé ici retarde dans le temps la lyse cellulaire provoquée par les radicaux libres. EXINLK 4 Le présent exemple a trait à la comparaison d'hématies provenant de deux sujets différents. Ces hématies, après séparation et lavage, sont remises en suspension à la mêmne concentration pour être soumises à l'action de radicaux libres provenant d'un générateur de radicaux libres, dans le cas d'espèce mM de dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2-amidinopropane). Les résultats sont consignés dans la figure 4. La courbe (a) représente le pourcentage d'hémolyse d'hématies d'un fumeur adulte et donne une valeur t50 % égale à 84,4 minutes. La courbe (b) représente le pourcentage d'hémolyse d'un non-fumeur adulte et donne une valeur t50 % égale à 93,3 minutes. La comparaison des courbes (a) et (b) montre que chez le fumeur les résistances normales vis-à-vis de l'agression par des radicaux libres sont diminuées par rapport aux non-fumeurs. REV&I>ICATII0 1. Utilisation d'un générateur de radicaux libres dans le domaine des dosages biologiques, ladite utilisation étant caractérisée en ce que (i) l'on introduit, dans un milieu biologique à tester contenant des cellules vivantes, un générateur de radicaux libres, (ii) initie la libération des radicaux libres à partir dudit générateur de radicaux libres, et (iii) évalue la cinétique de la lyse cellulaire induite par lesdits radicaux libres. 2. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules vivantes introduites dans le milieu biologique à tester sont d'origine humaine, animale ou végétale. 3. Utilisation suivant la revendication 2, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des hématies d'origine humaine ou animale. 4. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que ledit générateur de radicaux libres est choisi parmi l'ensemble constitué par les produits libérant des radicaux libres selon une cinétique de réaction d'ordre 0 ou 1. 5. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que ledit générateur de radicaux libres est choisi parmi l'ensemble constitué par les produits libérant des radicaux libres oxydants. 6. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisée en ce que ledit générateur de radicaux libres est le dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2-amidinopropane). 7. Procédé de dosage d'une substance au moyen de radicaux libres, ledit procédé, qui met en oeuvre une lyse cellulaire par des radicaux libres, étant caractérisé en ce que (1) l'on met en contact, dans un milieu biologique liquide approprié, un générateur de radicaux libres avec des cellules vivantes choisies parmi l'ensemble constitué par (A) les cellules d'un organisme sain mises en contact avec ladite substance à étudier, et 12 2642526 (B) les cellules d'un organisme préalablement contaminées par -ladite substance à étudier, (2) l'on induit la libération de radicaux libres à partir dudit générateur de radicaux libres, au moyen d'un choc thermique ou des photons, et (3) l'on évalue la variation de la lyse desdites cellules vivantes par rapport à la lyse de cellules vivantes d'un organisme sain utilisées comme contr8le et soumises dans ledit milieu biologique uniquement à l'action de radi- caux libres provenant dudit générateur de radicaux li- bres. - 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que ledit générateur de radicaux libres est choisi parmi l'ensemble constitué par les produits libérant des radicaux libres oxydants selon une cinétique de réaction d'ordre 0 ou 1. 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce queledit générateur de radicaux libres est le dichlorhydrate de 2,2'-azo-bis(2amidinopropane). 10. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que après avoir prélevé, isolé et lavé les cellules d'un organisme, on les remet en suspension dans un milieu biologique liquide isotoni- que, puis on les incube à une température située dans la gamme allant de 10 à 60 C, de préférence de 15 à 40 C et mieux à une température de 37 C, en présence d'un générateur de radicaux libres, à raison de 50 à 200 mM de générateur de radicaux libres pour une concentration de 10 à 20 % p/v de cellules. 11. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 7, 8 et 10, caractérisé en ce que lesdites cellules vivantes sont des cellules pigmentées. 12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des hématies. 13. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que lesdites cellules vivantes sont mises en contact avec ladite substance à tester dans ledit milieu biologique liquide. 13 2642526 14. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que lesdites cellules vivantes comportent ladite substance à tester fixée par adsorption au niveau de la membrane cellulaire.