Brevet FR2647119A1 — publié le 19901123

La présente invention concerne un nouveau procédé de culture de microorganismes en milieu solide. Les fermentations en milieu solide utilisent généralement la culture d'un microorganisme sur un substrat solide jouant à la fois le rôle de source carbonée, d'inducteur et de support de croissance. Ceci entraîne une limitation des possibilités de production d'enzymes et de métabolites par les champignons étant donné la nature des substrats solides agricoles (riz, soja, graines de céréales, tubercules amylacés, son de blé, pailles de céréales et divers autres substrats lignocellulosiques) essentiellement amylacés ou cellulosiques. De ce fait, un grand nombre d'enzymes ou de métabolites inductibles ne peuvent pas être obtenus par fermentation en milieu solide. Par ailleurs, la récupération de métabolites produits par les microorganismes en milieu solide pose un problème délicat de séparation des fractions solides et liquides, ce qui conduit dans tous les cas à pratiquer un ou plusieurs lavages successifs et à récupérer ces substances dans des solutions relativement diluées. Les fermentations aussi bien en milieu solide qu'en milieu liquide aboutissent de ce fait à l'obtention de solutions diluées, ce qui entraîne un coût global de production élevé. Dans certains cc les coûts de production empêchent les applications des bioconversions à aible valeur ajoutée. La présente invention propose un procédé de culture en milieu solide qui permet à la fois de diversifier la nature des substrats carbonés utilisables, d'augmenter la quantité d'eau libre, d'apporter des inducteurs spécifiques, de maintenir des conditions favorables pendant l'étape du métabolisme secondaire et permet également en fin de culture, l'extraction aisée des enzymes et des métabolites sous forme de solutions hautement concentrées. Plus précisément, la présente invention se rapporte à un procédé de culture de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide, caractérisé en ce que le milieu solide est constitué par un support solide absorbant, compressible et pratiquement non fermentable, ledit support solide étant imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance desdits microorganismes puis, compressé en fin de culture pour relarguer le liquide absorbé. Le procédé selon l'invention est de préférence basé sur la réalisation d'une fermentation en milieu solide impliquant les étapes suivantes - Le préconditionnement du support, qui implique successivement un broyage de celui-ci en particules, de préférence de I à 5 mm de diamètre, son humidification avec une solution contenant certains éléments du milieu de culture pouvant supporter la stérilisation par exemple des sels minéraux et/ou une partie de la solution nutritive non inoculée par exemple, puis la stérilisation de préférence par un traitement thermique du support ainsi imprégné. - L'imprégnation du support avec la solution nutritive contenant notam ment le ou les substrats carbonés solubles, les agents de croissance et l'inocu um. La quantité d'eau utilisée (3 à 5 fois le poids de support) permet d'élever l'humidité du mélange à une valeur comprise entre 50 et 85 oo. Le mélange du support et du milieu de culture liquide contenant l'inoculum est réalisé dans un mélangeur permettant d'assurer une bonne répartition et une bonne homogénéisation de la masse totale à fermenter. - La fermentation, qui peut être obtenue en plaçant le support imprégné de solution nutritive et inoculée dans un incubateur permettant de maintenir les conditions de température, d'humidité et d'aération favorables. Cet incubateur peut être par exemple une colonne de réaction, un incub-ateur agité ou statique. - L'extraction des enzymes et des métabolites solubles qui se fait à partir de la totalité du produit fermenté. Ainsi, le support imprégné fermenté peut être placé à l'intérieur d'une cellule de pressage munie d'orifices coniques de 0,5 à 1,5 mm sur toute la surface. A l'aide d'une presse hydraulique exerçant une pression de 22û. à 50G.105 Pa. on obtient alors un jus concentré contenant principalement les protéines solubles, les enzymes, les métabolites ainsi que les agents de croissance excédentaires. La fraction insoluble contient le support, les protéines insolubles ainsi qu'une faible partie de la solution soluble résiduelle, et - Eventuellement une purification.Le jus concentré contenant la substance soluble est alors soumis à des traitements classiques de précipitation, de chromatographie ou d'ultrafiltration, en vue de la purification et de la concentration du métabolite. La solution concentrée est séchée par évaporation, atomisation ou lyophilisation. Le choix du support n'étant pas lié à la nature du substrat carboné, il peut être choisi essentiellement en fonction des critères spécifiques tels que - une capacité de rétention d'eau qui doit permettre l'absorption de 3 à 6 fois son propre poids d'eau sans drainage sensible, - une porosité globale apparente de 50 96 du produit après imprégnation, - une résistance à la stérilisation, - un fractionnement sous forme de particules d'un diamètre rroven de 1 à 5 mm, et - des propriétés élastiques et mécaniques permettant le relargage d'au moins 70 99 de la quantité d'eau par un simple pressage. D'origine synthétique ou naturelle, le support solide pourra être une mousse de polymère, de la mousse de polyuréthanne par exemple, ou un résidus agro-industriel de type fibreux tel la bagasse de canne à sucre. Ce support est dit pratiquement non fermentable ceci signifie qu'après la fermentation avec le microorganisme, le support conserve pratiquement ses propriétés mécaniques. Affranchi des contraintes physiques liées à la structure solide, le substrat carboné est lui choisi en fonction de l'organisme à cultiver et des métabolites à produire parmi une gamme très large de substances solubles (sucre simple, polysaccharide, protéines, acides aminés, lipides, acides gras, hydrocarbures), dont on peut moduler la concentration. Quant aux agents de croissance, éventuellement présents dans la solution nutritive, ils peuvent comporter - des facteurs de croissance s'ils sont nécessaires, tels que extraits de levures, vitamines, acides aminés, oligoéléments, - des sels minéraux pouvant apporter l'azote, le phosphore, le soufre et autres éléments essentiels et pour augmenter le pouvoir tampon de la solution, - un ou plusieurs inducteurs permettant la biosynthèse d'enzymes inductibles, un précurseur ou inhibiteur afin d'orienter le métabolisme secondaire vers la production du métabolite souhaité, - des substances tensioactives et autres agents favorisant la production et la récupération des métabolites. Le procédé selon l'invention est plus particulièrement utilisable pour la culture de fungi. La solution nutritive qui contient l'inoculum, de préférence à une une concentration de 2 à 4.107 spores par gramme de matière sèche totale du microorganisme utilisé dans le procédé peut être constitué de spores ou du mycélium du champignon filamenteux. Les souches de fungi utilisées selon le présent procédé sont choisies d préférence parmi les genres Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma, Geotrichum, Fusarium, Mucor, Giberella. L'inoculum peut également être constitué par une association de champignons et de bactéries levures ou actinomycètes. Selon le procédé de l'invention, il est possible d'obtenir de nombreux métabolites tels une enzyme (pectinase, cellulase), un métabolite fongique primaire ou secondaire (gibbérellines, stéroides, alcaloîdes) ou un antibiotique (pénicilline). Les exemples et figure donnés ci-dessous à titre non limitatif permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention. La figure I représente une courbe cinétique d'évolution des principaux paramètres au cours d'une mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour la production d'enzymes pectiques par Aspergillus niger cultivé sur support naturel (bagasse de canne à sucre) en présence de saccharose (source de carbone) et de pectine (inducteur spécifique). Les principaux paramètres étudiés sont - les activités pectinolytiques U/g substrat poids humide ; - les acides nucléiques ; - la consommation de sucres ; et - le pH EXEMPLE 1: Mise en oeuvre du procédé dans le cas d'un support fibreux naturel, pour la production d'enzymes pectiques par Aspergillus niger Support : bagasse de canne à sucre finement broyée ( 1 GC g). Substrat carboné soluble : saccharose à 60 g/l dans la solution nutritive. Inducteur spécifique : pectine à 30 g/I dans la solution nutritive. La solution nutritive d'imprégnation contient (en g/1) : pe- .ne de citron, 37,2 g ; saccharose, 74,8 g ; KH2PO4, 5,68 g ; (NH4)2SO4, 1 i g ; Urée, 2,64 g. Le pH de la solution est ajusté à 4,4 avec de l'acide phosphorique. On utilise au total 250 ml de cette solution pour 1GO g de support. Préconditionnement : Le prétraitement à la chaleur permet d'obtenir l'élimination de la microflore indésirabie de la bagasse et du substrat. De plus, il améliore l'homogénéité du mélange. Pour ce faire, on mélange au support une partie de la solution nutritive de façon à ce que le produit homogénéisé contienne approximativement 50 % d'humidité. Ce mélange est autoclavé à 110 C pendant 1 heure. Après refroidissement à 40"C il est inoculé uniformément avec une suspension de 2.107 spores de A. niger par g de support, contenues dans le reste de la soluticn nutritive à imprégner. Après absorption et mélange de la suspension d'inoculum, le produit à fermenter contient 70 96 d'humidité. Fermentation : Le produit à fermenter ainsi conditionné et inoculé est placé dans des fermenteurs adaptés à la culture en milieu solide : colonne, mélangeur ou zymotis. La fermentation dure 45 heures. Les paramètres sont ainsi régulés: température 35"C, aération : 900 I/h/kg de produit poids sec. Résultats: Sur la figure 1 on a représenté les principaux paramètres de la fermentation. Les pectinases apparaissent après 20 heures et le maximum de production est obtenu après 45 heures de culture (1500 unités internationales par g de support). Extraction : Après 45 heures, le produit fermenté est partagé en lots de 500 g. Ces lots sont ensuite pressés à l'aide d'une presse hydraulique afin d'extraire les pectinases. A partir d'un lot de 500 g de produit fermenté humide on obtient après pressage une fraction insoluble de 321 g contenant 50 96 de matière sèche et une fraction soluble de 179 ml. La fraction insoluble est reprise dans 237 ml d'eau et pressée à nouveau, ce qui fournit une fraction insoluble de 300 g contenant 46,7 % de matière sèche et une seconde fraction soluble de 290 ml. L'activité pectinolytique, mesurée par viscosimétrie est de 100 U/ml dans la première fraction soluble, et de 50 U/ml dans la seconde. EXEMPLE 2 : Mise en oeuvre du procédé dans le cas d'un support fibreux naturel, pour la productio- de glucoamylase par Aspergillus niger Support + substrat: mélange de bagasse de canne à sucre et d'une solution d'amidon de mais, d'urée et de sels minéraux dans les proportions suivantes pour 1 kg : bagasse de canne à sucre, 200 g ; amidon de mais, 27,5 g (NH4)2SO4, 5 g ; KH2PO4, 1,4 g ; urée, 0,6 g ; eau, 768 g. Le pH de la solution est ajusté à 3.0 avec de l'acide phosphorique. Le prétraitement et les conditions de fermentation sont les mêmes que dans l'exemple précédent. Résultats: Le produit fermenté est partagé en lots de 500 g. Ces lots sont ensuite pressés à l'aide d'une presse hydraulique afin d'extraire les glucoamylases. A partir d'un lot de 500 g de produit fermenté humide, on obtient après pressage une fraction insoluble de 283 g contenant 43,3 % de matière sèche et une fraction soluble de 217 ml. La fraction insoluble est reprise dans 383 ml d'eau et pressée à nouveau, ce qui fournit une fraction insoluble de 283 g contenant 43,3 % de matière sèche et une fraction soluble de 383 ml. Les activités glucoamylasiques récupérées ainsi que les rendements d'extraction obtenus pour différents temps d'incubation figurent sur le tableau I. EXEMPLE 3 : Mise en oeuvre du procédé dans le cas d'un support synthétique, pour la production de pénicilline par Penicillium chrysogenum La mousse de polyuréthanne a été choisie comme support synthétique inerte pour illustrer la production de métabolites et d'antibiotiques fongiques en raison de sa capacité d'absorption et de relargage de quantités importantes d'eau, de sa structure poreuse et de sa résistance à I 'autoclavage. Solution nutritive (g/l) : Lactose 30 g ; Glucose 5 g ; Corn Steep Liquor (CSL) 30 g ; NaNO3 3 g ; MgSO4 3 g ; CuCO3 3 g ; huile 1,87 g Phénylacétamide 0,05 g ; pH : 4,5. Préconditionnement: Le support est préalablement lavé avef une solution acide (HCl), rincé et de nouveau lavé avec une solution alcaline (NaOH). Au support ainsi lavé on ajoute la solution nutritive avant stérilisation (autoclavage à Il 00C pendant 30 minutes). Après refroidissement l'inoculation du milieu de culture s'opère par simple absorption de la suspension des spores (2.107/g de polyuréthanne) de P. chrysogenum (souche Wisconsin 54-1255) pour obtenir une humidité finale de 70 % environ. Fermentation : le produit à fermenter ainsi inoculé est introduit dans un fermenteur adapté pour la culture en milieu solide. La fermentation dure 72 heures. La température a été régulée à 27 C et l'aération à 200 I/h/kg. Les plus fortes concentrations en pénicilline ont été obtenues après 50 heures de culture, et s'élèvent à 670,000 U/1 de jus récolté. Pour les cultures en milieu liquide on obtient dans des conditions similaires des concentrations de seulement 38,500 U/l après 160 heures de culture. Si on compare les productivités, on obtient alors 2.01 U/l-h et 0.23 U/l-h respectivement pour la culture sur support solide et la culture en milieu .quide, donc une productivité 10 fois plus élevée sur support solide inerte. EXEMPLE 4: Mise en oeuvre du procédé dans le cas d'un support synthétique, pour la production d'acide gibberelligue (AG3) par Gibberella fujikuroi Support: polyuréthanne broyé (0.5 - 1 cm) 375 g. solution nutritive : Glycérol 20 g ; Glucose 10 g ; Lactose 20 g ; (SH4)2SO4 1 g ; KH2PO4 0,5 g ; MgSO4 7H2O 0,5 g ; pH : 4,5. Préconditionnement: Le support est préalablement lavé avec une solution acide, rincé à l'eau et de nouveau lavé avec une solution alcaline. Au support a ainsi lavé on ajoute la solution nutritive avant stérilisation (autoclavage à Il 00C pendant 30 minutes). Après refroidissement du support, I'inoculation du milieu de culture s'opère par simple absorption de la suspention du mycélium le G.fujikuroi par le support. Fermentation : Le produit à fermenter ainsi préconditionné est placé dans un fermenteur adapté pour la culture en milieu solide. La fermentation dure 72 heures. La température a été réglée à 30 C et l'aération à 200 I/h/kg. Résultats: Après 72 heures de fermentation en milieu solide, il y a eu une production d'acide Gibberelique de 100 mg par litre de milieu de culture. Cette production est bien supérieure à celle obtenue en milieu liquide qui a été de 0,08 g/l. Temps Activité totale Activité de la Activité de Rendements d'incubation U.I./500g de fraction soluble fraction soluble D'extraction (h) produit fermenté #&num;1 (U.I.) &num;2 (U.I.) (%) 12.5 400 178 89 66.7 15.0 960 512 207 74.9 18.0 5015 3233 1122 86.8 21.0 5905 3342 1080 74.9 24.0 6025 3364 1241 76.4 32.0 2830 1254 471 61.0 Tableau I : Production de glucoamyalases par A. nigen cultivé sur support solide. REVENDICATIONS 1. Procédé de culture de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide, caractérisé en ce que le milieu solide est constitué par un support solide absorbant, compressible et pratiquement non fermentable, ledit support solide étant imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance des microorganismes puis, compressé en fin de culture pour relarguer le liquide absorbé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes - le support est broyé en particules, et humidifié avec une solution aqueuse pouvant contenir certains éléments de la solution nutritive non inoculée puis stérilisé, - le support est alors imprégné avec la solution nutritive contenant le ou les substrats carbonés solubles, les agents de croissance et l'inoculum, l'humidité du mélange ainsi obtenu ayant une valeur comprise entre 50 et 85 9Ó, - l'ensemble est mis en fermentation puis, - à la fin de la fermentation, on extrait plus de 70 % de la fraction aqueuse contenant les éléments biosynthétisés par les microorganismes par compression dudit support solide. 3. Procédé selon la revendication I ou 2, caractérisé en ce que le support solide est d'origine synthétique ou naturelle. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le support solide présente une capacité de rétention o'eau permettant l'absorption de 3 à 6 fois son propre poids d'eau. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le support solide peut être stérilisé et présente une porosité globale apparente d'environ 50 % du produit après imprégnation. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le support solide présente des propriétés élastiques et mécaniques permettant le relargage d'au moins 70 ó de la quantité d'eau absorbée par pressage. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 6, caractérisé en ce que le support solide est un résidus non fermentable d'origine végétale ou une mousse de polymère. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 7, caractérisé en ce que l'inoculum du microorganisme introduit dans la solution nutritive est constitué de spores ou du mycélium de champignon filamenteux pur ou en association avec des bactéries, levures ou actinomycètes. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 8. caractérisé en ce que l'inoculum est présent dans la solution nutritive à une concentraton de 2 à 4.107 spores par gramme de matière sèche totale. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications l à 9, caractérisé en ce que les souches de moisissures utilisées sont choisies de préférence parmi les genres Aspergillus, Penicillium, Rhizopus. Trichoderma Geotrichum, Fusarium, Mucor, Giberella. Il. Procédé selon l'une quelconque des revendu tions 1 à 10. caractérisé en ce que le métabolite produit est une enzyme (pectinase, cellulase), un métabolite fongique primaire ou secondaire (gibbérellines, stéroides, alcaloides) ou un antibiotique (pénicilline).