Brevet FR2642761A1 — publié le 19900810

PROCEDE DE PREPARATION D'UNE FRACTION CONTENANT UN DERIVE GLUCIDIQUE DIOXYMETHYLE DE LA STROPHANTHIDINE ET DE CE DERIVE, ET COMPOSITION MEDICAMENTEUSE RENFERMANT, COMME PRINCIPE ACTIF. CE DERIVE OU LA FRACTION QUI LE CONTIENS La présente invention concerne le dérivé glucidique dioxyméthylé de la strophanthidine, qui est connu sous le nom de Mansonine, à savoir la 2',3'-dioxyméthyl68méthyl-38D-glucose-strophanthidine de formule brute C31H46010, de structure digitalo-mimétique, et répondant i la formule (I) suivante:: soit, dans sa représentation spatiale La présente invention porte, d'une part, sur un nouveau procédé de préparation d-! composé de formule (I', et d'autre part, sur l'utilisation de ce composé, ou de ses sels phermaceutiquement acceptables, dans des préparations pharmaceutiques pour le traitement et la prévention des insuffisances cardiaques et de maladies cerdio-vasculaires. L'invention porte égalenent sur une fraction contenant le composé de formule (I) et sur ses applications également pour le traitement et la préventIon des insuffisances cardiaques et des maladies cardio-vasculaires. La préparation ou composé de formule Agr. Trop. 27. 1947, p. 422". En Afrique de l'Ouest, des préparations d'écorces de M. altissima sont utilisées traditionnellement comme poisens de flèches, et comme décoctions en tains externes anti@démiques. La présente invention a donc d'abord pour objet un procédé de prépara ion du composé ce formule - dans une première étape, on conduit une extraction aqueuse a chaud d'écorces de Mansonia altissima, pour obtenir un extrait P1 - dans une seconde étape, on procède å une extraction de l'extrait P1 par ùn solvant organique capable de solubiliser P1, pour obtenir un extrait P2 - dans une troisième étape, on conduit un fractionnement de l'extrait P2 par une succession de chromatographies d'échange d'ions sur des résines enioniques et cationiques capable, d'éliminer les substances chromogène que ccntient l'extrait P2, en ne retenant à chaque chromatogaphie que la fraction capable d'inhiber l'ATFase Na , K , pour obtenir une fraction P3 :P - dans une quatrième étape, on conduit un fractionnement de la fraction P3 par une chromatographie d'élution ou de partage, afin de recueillir la fraction P4 qui est capable d'inhiber l'ATFase Na+, K+ et qui constitue le composé de formule (I? recherché ; et - le cas échéant, on transforme le composé de formule CI) en l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. On utilise notamment, comme produit de départ, des écorces de Mansonie altissima var. altissima. La première étape du procédé est donc une extraction aqueuse, à chaud, notamment à l'ébullition, à la pression atmosphérique ou, s on le désire, sous pression. A la deuxième étape, qui peut être conduite à froid, on utilise notamment, comme solvant d'extraction, un solvant organique chloré, tel que le chloroforme. De Fréférence, entre la première et la deuxième étape, on effectue une dêllpidation de l'extrait P1, à l'aide notamment d'un agent de délipidation classique, comme l'éther de pétrole. A la troisième étape, on utilise, comme résines anioniques, en particulier des résines de type dextrane ou polysaccharide, modifiées par l'introduction de fonctions anioniques, t-elles que la fonction carbamate de méthyle. A cette même étape, on utilise, comme résines cationiques, notamment des résines de type dextrane ou polysaccharide, modifiées par l'introduction de fonctions cationiques, telles que la fonction diméthylaminoéthyle, et des résines obtenues par condensation du formaldéhyde avec des acides phénol- et phényl-sulfoniques. A la quatrième étape, on peut conduire un fractionnement de la fraction P3 par une chromatographie d'élution, sur une colonne de gel de silice par exemple, ou encore par une chromatographie de partage sur couche mince. Le composé de formule (I) est obtenu notamment sous la forme de fins cristaux, à l'état très concentré dans un mélange esu-éthanol (1:1). Ce composé pourra donc entre présenté sous forme de solutions très diluées dans l'eau bidistillée OU le sérum physiologique. Par ailleurs, le composé de formule (I > pourra être salifié sur ses sites hydrophobes. La présente invention porte également sur la fraction P-, telle qu'elle est obtenue par le procédé qui vient d'être défini. Les présents inventeurs ont par ailleurs maintenant mis en évidence que le composé de formule (I) présente à la fois des activités tenicardiaque, vasodilatatrice, anticalcique et antiarythmique. Centes. il avait été démontré au préalnble que des extraits aqueux d'écorces de Mans@nis altissima var. altissima inhibent l'activité de l'ATPsse Na+, K+ des miorosomes de cerveau de lapin (C.R. Acad. Sc. Paris t. 284, en date du 6 juin 1977). Cependant, cet extrait total n'a pas de propriétée bien déterminées, s'agissant d'un mélange complexe de nombreuses substances. Les travaux menés par les présents inventeurs cnt maintenant permis de mettre en évidence que le composé de formule (I) possède des propriétés tonicardiaques en mema ta.- qu'antShyper- tensives, alors que a plupart des produits de ce type, s'ils sont tonicardiaques, sont plutôt des hypertenseurs. Cette double potentialité complémentaire est à souligner. Par ailleurs, il a été confirmé que le composé de formule (I) possède des propriétés anticalciques, évitant ainsi chez les hypertendus l'accumulation et l'absorption de calcium par les plaquettes du sang, qui peuvent boucher les vaisseaux sanguins. Il a aussi été confirmé que le composé de formule (I) a une activité antiarythmique, ce qui évite de faire appel au choc électrique pour lutter contre la fibrillation. Cette combinaison unique de propriétés rend le composé de formule (I) très intéressant comme médicement pour le traitement et la prévention des insuffisances cardiques et en pathologie cardio-vasculairer comme substitut des digitaliques classiques. Il a ainsi été montré que le composé de formule (I) présente, chez le chien anesthésié a) une action inotrope positive, avec une augmentation de la contraction à 70% au-dessus de la normale à la dose 10 nM plasmatique, et du tonus de la contraction du transversus de 200% à la dose 50 nM chez le mouton b) une action vasodilatatrice périphérique avec réduction de la résistance périphérique totale de 30% à la dose 10 M plasmatique c) un effet anticalcique avec réduction d'un courant calcique rentrant ce 30, à 70% à des doses de 5 à 50 nM sur 'a fibre sino-auriculaire de la grenouille. r ailleurs, le composé de formule (I) présente cas effets antiarythmiques à des doses picomolaires sur le coeur arythmique de rat et des effets anti-fibrillants à 50 nM, par un rallongement du délai diastolique du trabécule ventriculaire de singe. Ce médicament pourra donc être prescrit dans le traitement et la prévention des etats pathologiques tels que - las insuffisances cardiaques pour lesquelles les digitaliques sont prescrits, dans le but d'améliorer la cardiotonicité, pour améliorer le rythme cardiaque, et pour lutter contre la fibrillation - l'hypertension artérielle d'origine hypercalcique, pour lutter contre l'artériosclérose. La présente invention a donc pour objet une composition médicamenteuse pour le traitement et la prévention des insuffisances cardiaques et de maladies cardio-vasculaires chez l'homme et l'animal, caractérisée par le fait qu'elle renferme, å titre de principe actif, la fraction P3 telle que définie ci-dessus, ou de la 2',3'-dioxyméthyl-6ssméthyl-3ssD-glucose-strophanthidine de formule (I), ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable convenant au type d'administration considéré. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de la fraction P3 telle que définie ci-dessus, du dérivé de formule (I) ou de l'un des sels pharmaceutiquement acceptables de ce dernier, pour fabriquer une composition médicamenteuse ayant la destination précitée, La présente invention concerne aussi un procédé de préparation d'une composition médicamenteuse destinée au traitement et à la prévention d'insuffisances cardiaques et de maladies cardio-vasculaires chez l'homme et l'animal, caractérisé par le fait qu'on mélange une quantité pharmacautiquement efficace de la fraction P3 telle que définie ci-dessus, ou de la 2',3'-dioxyméthyl-6ssméthyl- 3ssD-glucose-strophanthidine, ou de l'un des sels pharmsceutiquement acceptables de cette dernière, avec au moins un excipient compatible pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon l'invention convient pour l'administration oraie, notamment sous forme de gélules ou de comprimés, ou bien pour l'administration par injection intraveineuse ou intramusculaire, ou encore pour l'administration intrapéritonéale. En particulier, elle convient pour le traitement des défaillances cardiaques et des maladies cardio-vasculaires, en particulier, de l'hypertension et de l'artériosclérose de type hypercalcique. procurant une quantité efficace du composé de formule ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, allant jusqu'à 300 ng par kg de poids corporel, ou, de préférence, jusqu'à 250 ng par kg de poids corporel. On va maintenant décrire de façon détaillée, tout d'abord en , la caractérisation des propriétés pharmacodynamiques de ce composé. 1 - Extraction Le composé de formule (I) a été extrait a partir d'écorces de Mansonia altissima var. altissima recueillies dans la forêt tropicale primaire de Côte d'Ivoire. 500 g de ces écorces débarrassées de leur cuticule sont hachés, portés à ébullition, pendant 2 heures, dans 2 litres d'eau bidistillée. La décoction brune et sirupeuse obtenue est filtrée sur de la gaze médicale, pour éliminer le résidu, puis sur du papier filtre Whatmann n 3MM doublé de coton hydrophile. Le filtrat est ensuite évaporé à siccité dans un évaporateur rotatif Rotavapor Buchi, å 30 C et a pression réduite. Les 100 g de l'extrait P1 qui en résulte, se présentant sous la forme d'une pâte brune, visqueuse, sont délipidés à l'éther ce pétrole (2 ml/g de P1), avec des agitations périodiques, pendant 48 heures. Le produit insoluble de la délioidation est redissous dans 300 ml d' eau bidistillée et extrait au chloroforme (rapport final CHCl3/H2O 60:20, v/v) dans une ampoule à décanter pendant 24 heures. On agite par retournements périodiques. La phase chloroforminue, évaporée à siccité à 30 C et à pression réduite, donne 10 g d'un extrait P2, poudreux, jaune, amer et très hygroscopique. 2) Purification Les 10 g de l'extrait P2 dissous dans du chloroforme (1 ml/g) sont purifiés par chromatographie sur une série de trois colonnes - la première méthyle (CM-)-Sephadex snionique C-25 (Pharmacia Fine Chemicals) ; - la seconde colonne (2,5 x 20 cn > , une colonne d'Amberlite 20-50 type IRA-68 cationique lot 40280 (Reagenzen) ; et - la troisième colonne (1,5 x 15 cm), une colonne de DEAE±Sephadex A25 (Pharmacia Fine Chemicals) lot 4994. Les substances sont éluées à travers les colonnes, pré-équilibrées avec un mélange CHCl3/H2O (50:50. v: v) ; en utiiisant, comme éludant, CHCl3/H20 (50:50, v/v), pendant 8 heures, 9 une vitesse d'élution d'environ 62,5 ml/heure, cn recueille 500 ml d'éluats incolores et limpides, qu'on soumet alors à une lyophilisation. On sélectionne et on retient les fractions capables d'inhiber fortement l'ATFase Na+,K+ de rein de porc, conformément à la méthode de Schöner et al, décrite dans "Eur. J. Biochem. 1 (1967), pp 334-343". On obtient alors 1 g d'une fraction P3, se présentant sous la forme d'une poudre blanche sale. La fraction P3, redissoute dans 10 ml de CHCl3/H2O (90:10, v/v). est chromatographiée sur une colonne (2,5 x 20 cm) de Silica gal (60 F 254, Merck Darmstad), équilibrée dans une phase mobile CHCl3/H2O (90 : 10, v/v) comme cela est décrit par Allgeier et coll. dans Helv. Chi:n. Acta. 50, 1987, pp. 456-460. La vitesse d'élution est de 62,5 ml/h et la fraction recherchée P4, sélectionnée par la méthode précitée de Schöner, est éluée dans le premier litre de la phase mobile recueillie. Ces. 1000 ml d'éluat sont lyophilisés et donnent 400 mg de P4 semi-cristallisé, qui sont redissous dans 20 ml d'éthanol et cristallisent dans ce solvant, à la température ambiante. 3) Analyse des fractions P3 et P4 Les fractions P3 et P sont chromatographiées sur couche mince de plaques Darmstad). 10 mg de chaque fraction dissoute dans du CHC13/H2O (50:50, v/v) ont été déposés en comparaison avec les mêmes quantités d'Ouabaïne (lot 7887-8545885, Merck Darmstad) et de Mansonine de référence t0,5 ml 10-3M. lot 67), fournie par le Docteur Allgeier de l'Institut de Chimie Organique de Bale. La chromatographie est à phase mobiie montante, composée de butanol/eau/acide acétique (5:3:2, v/v : v) dans une enceinte saturée de vapeurs butanoliques. L'élution dure 4 heures. La lecture par fluorescence aux rayons UV de ce chromatogramme donc - Pour P3 : quatre taches dont l'une à un Rf de 0,700 - Pour P4 : une tache à un Rf de 0,700 - Pour la Mansonine de référence : une tache à un Rf de 0,700 - Four l'Ouataïne ; une tache à un Rf de 0,6-0. La fraction P3 a donc été résolue en quatre taches, qui ont été retirées par grattage. Toutes les fractions ont ét dissoutes dans 3 ml d'eau chacune, puis elles ont été centrifugeas pendant 20 minutes à 10 000 x g. Les spectres UV (de 0 à 350 nm), réalisés sur des solutions 100 g/ml de CHCl3/H2O (50:50, v/v). permetttent d'évaluer le carra de pure des fractions chromato- graphiées - P3 : 4 pics à 160. 217, 218 et 230 nm - P4 : 1 seul pic à 217 nm - Mansonine de référence ç 1 seul pic à 217 nm D'autres chromatographies sur plaque (20 x 20 cm > à couche mince de silicagel, réalisées simultanément et comparativement avec l'ouabaïne et la fraction P4, ont été révélées avec le réactif de KEDDE (Pharmacol. Weekblad, 82 1947, p. 741). du H2SO4 2N et du Cl3Sb. Ces traitements permettent d'identifier une lactone insaturée et la nature stéroïdique et glycosidique de la fraction P4 comme chez 1' l'ouabaïne et la Mansonine de référence. La caractérisation de P4 ainsi identifié à la Mansonine, a consisté en la détermination de la formule brute, de la masse moléculaire et de la structure par une spectroscopie ce masse ionique (Modèle CH4 Ionic TO4 Einiascystem). Les résultats sont confirmés par un spectre de résonance magnétique nucléaire modèle Brucker (Fig 1). Le spectre UV (Fig 2) est aussi confirmé par une chromatographie phase liquide de haute performance (HPLC) (Système C18 inverse Modèle 440), en condition isocratique (Fig 3i. Légendes des figures 1, 2 et 3 : Figure 1 : RMN Résonance de H+ sous forme [3H]. Solvant : méthanol pur Figure 2 : UV Densité optique en fonction de la longueur d'onde en nm. Solvent : slcool-eau (50:50) Cencentrataen : 100 g/ml Figure 3 : HPL Densité optique en fenction du temps d'élution en mn (à 254 nm). Eluant ; méchanol/eau (30:70, v/v) Débit d'élution : 1 ml/minute Vitesse d'enregistrement = 1 cm/minute 5) Résultats Il résulte du traitement de P4 par la spectroscopie de masse et par la résonance magnétique nucléaire (Fig 1) que la substance est un stéroïde glucidique (C31H46O10), qui réagit positivement aux tests de Libermann, au trichiorure d'antimoine (Cl3Sb) et à la réaction de Kedde. Ces réactions confirment respectivement la nature glycosidique et stéroïdique porteuse drune lactone insaturée.Le spectre en HPLC détermine le degré de pureté avec un pic unique (Fig 3), et le spectre UV donne une abscrption maximale à 217 nm (Fig 2), La température de fusion est à 172 r 2 C. le pouvoir rotatoire [&alpha;]D20 = + 6.7 C dans le méthanol -t le poids moléculaire (PM) = 578, 71. (B) CARACTERISATION DES PROPRIETES PHARMACODYNAMIQUES DU COMPOSE DE FORMULE (I) Les études ont d'abord porté (1) sur la toxicité du composé (I), puis (1 > Limites de toxicité du composé (I) Les tests de toxicité portant sur la dose létale et la dose maximale tolérée (DMT), ont été effectués sur le rat, le cobaye et le lapin Tableau I). Tableau I : Doses limites de toxicité du composé (I) Paramètres Rat Cobaye Lapin DMT ( g/kg) 120 # 5 130 # 3 12 # 0,02 DL50 ( g/kg) 150 # 5 110 # 5 20 # 0,05 DL100 ( g/kg) 200 # 5 130 # 7 100 # 0,5 La toxicité du composé (I) est deux fois plus réduite chez le rat, réputé resistant aux digitaliques, que chez le cobaye reconnu assez sensible. En revanche, cher le lapin, cette toxicité est 5 fois plus forte que chez le cobaye. Par ailleurs, des tests sur la contracilité (effet inotrope), la fréquence effet chronotrope), la conductivité effet dromotrope) et l'excitabilité effet bathmotrope > cardiaques ont été réalisés sur le coeur isolé de lapin et de singe (Tableau Il). Tableau II : Limites de toxicité du composé (I) sur le ocarde (singe et lapin) | Dose thérapeutique Dose toxique Effets # 100 nM # 100 nM faible forte (5x10-8M (#10-7M) Inotrope ( + :: C ++ ) * ( +++) Chronotrope (-) (--) * (++) Dromotrope 1 ( - ) ( -- ) * ( Bathmotrope (-) (+) * (++ Effets dont l'ampleur croît avec les concentrations en composé de formule (I). (2. Effets bi@chimiques du commposé (I) Le composé (I) présente des effets inotropes positifs sur l'hémodynamie du chien anesthésié. Cet effet in@@@ope est corroboré par des effets inhibiteurs sur l'ATPase Na+K+. Le composé (I), en inhibant l'ATPase Na+K se fixe sur as sites oécifiques aux digitaliques avec une affinité de l'ordre de Ki=142 nM. Le composé (I) reconnaît. dans cette action, tous les isoformes &alpha;+ (sites de haute affinité KD 10 nM) et &alpha; (sites de basse affinité KD 10 M). Cette reconnaissance différentielle est bien marquée chez le rat, le chien, le cobaye et le singe, par une participation selon des pourcentages bien définis de populations de sites de haute affinité et de basse affinité. Les sensibilités comparées au composé (I) des isoformes de l'ATPase Na+K+ de sarcolemmes de coeur de rat. de cobaye, de chien et de singe, sont rapportées dans le Tableau III. Tableau III : Tableau comparatif de la sensibilité au + + composé (i) des isoformes de l'ATPase Na ,K des sarcolemmes du coaur du rat, cobaye, chien et du singe. Espèces CI50(nm) KD % contribution SR/activité &alpha;+(nM) &alpha;(vM) de fixation D&alpha;kD&alpha;+ HA BA Rat normal sans Ca2+ (n=8) 20#1 9#1 9 # 1 54#6 46#6 1000 avec Ca2+ nM+ (n=7) 1000#12 9#1 6 # 3 38#2 62#2 670 Rat en SA choc C+Ca2+ mM (n=5) 1200#20 60#7 50 # 6 30#2 30#2 830 Hypertrophie (n=5) + Ca2+ 2 mM 500#10 20#2 50 # 2 66#6 34#6 2500 Cobaye normal (n=8) 100#10 10#1 3 # 1 57#4 43#4 300 insuffisant (n=2) 100#10 10#1 15 # 5 48#5 52#5 1500 Chien normal 30#5 0,6#0,1 0,1#0,00 30#5 70#5 167 Singe normal coeur congelé 600#50 75#10 55 # 10 68#2 32#2 167 J choc : mêmes conditions opératoires que l'hypertrophie. On constate, dans ce Tableau, que le rapport de pourcentages des populations des sites de basse affinité (BA > sur ceux des populations de sites de haute affinité (HA), qui marque la sélectivité dans la fixation du composé (I) sur les isoformes de 1'ATPase Na K , peut être comparé à la notion d'indice thérapeutique IT qui est déterminé in vivo par le rapport de la dose toxique sur la dose thérapeutique. Dans ce tableau, le composé (I) présente, pour e rat, unanimement reconnu comme résistant aux digitaliques (sélectivité dans la fixation de l'ordre de 250), un indice quatre fois supérieur aux digitaliques Che-- le singe, pour lequel ce rapport est de 750, la sensibilité des isoformes au compos (I) est parfaitement représentée par es courbes de la Figure 4. Légende de la Figure 4 : ATPase Na+K+ du coeur du singe Mangabe + EGTA : sensibilité à l'ouataïne (@) et au composé (I) (@). La courbe donne le pourcentage d'activité résiduelle en fenction du logarithme de la concentration en ouabaïne ou en comp@@é (I), (3) Effets hémodynemiques et physiologiques du composé (I) On décrire cas effets en faisant référence aux Figures 5 à 9 ci-après : Figure 5A : Effet inotrope du composé (I) 3,3 nmolesikg/min et pendant 20 minutes sur la pression systolique du chien anesthésié (méthode de Jarreau et al 309-314.) La courbe représentée est la courbe de variation (#%) de la pression au cours du temps. Figure 5B : Evolution du couple potentiel d'action intracellulaire (PA)/tonus de la contraction du transversus ventriculaire droit de mouton (I) en présence du composé (I) 500 nM (dcse toxique > dans un temps allant de O à 20 minutes Variations du PA N+I O à 6 mn : 5% 2 10 mn : 9% 3 15 mn : 15% 4 20 mn : 26P (avec apparition de OAP > Variations du tonus de la ccntraction N 100% 1 120% 2 140% 3 175% 4 200% (avec apparition d'OAC) OAP : oscillation après potentiel OAC : oscillation après contraction (II) en fonction de concentrations de composé (I) de O a 500 nM à 20 minutes. Variations du PA N + 1 : 5% (0-5.10-8M) 2 : 10% (10-7M) 3 : 15% (2. 10 M) 4 : 26% (5.10-7M) (avec apparition d'OAP) Variations du tonus de la contraction N 100% 1 120% 2 140% 3 175% 4 200% (avec apparition d'OAC) La technique utilisée est celle de la microélectrode ( E) $Ling et al (1949), J. Cell. Comp. Physiol. 34, 383-396 ; Coraboeuf et al (1949), C. R. Soc. Biol., Paris, 143, 1329-1331). La solution de perfusion est du tyrode + du sucrase. Figure 6 : Effet vasodilatateur du composé (i) 3,3 nmoles/kg/min et Fendant 20 minutes sur plusieurs paramètres de l'hémodynamie de chien anesthésié. Les courbas représentées décrivent la variation d'un paramètre a à d ci-après en fonction du temps a la Pression Artérielle Moyennne : PAM b l'Indice de Katz : PAM/PC (FC = fréquence cardiaque) c la Résistance Périphérique Totale (RPT) : PAM/DC (DC = débit cardiaque > d la Consemmstion d'Oxygène : PAM X PC La solution du composé (I) injectée est diluée avec du NaCl Le controle est joint à NaCl et marque #% -O La méthode est la méthace précitée de Jarreau et al. Figure 7 : Courant calcique de dépolarisation de la fibre sino-auriculaire de grenouille par la méthode de voltage-clamp (50 mV) (Deck et al (1964), Pflügers Arch., 230, 50-62). Le milieu de perfusion est du Ringer physiologique + Tetrodontoxine (TTX) + mannitol + Ca2+ 2,5 mM sans Composé (I) O M (N) en présence de composé 5 x 10 8 M C2) Figure 8 : Effet -du compose (I) 20 picomolaire coeur rendu arythmique par hypothermie isolé de rat > A : Fonctionnement normal du coeur arythmique B : Addition du composé (I) å 20 pM (concentration finale) C : Modification du fonctionnement arythmique par le composé (I) D : Suite de C après 3 minutes Echelle verticale : 1 cm - Horizontale : 10s Figure 9 :Effet du composé (I) sur le temps de la dépolarisation diastolique du trabécule ventriculaire du singe Technique de la microélectrode. 9A Evolution de la phase diastolique des réponses électriques du trabécule de singe en présence du Ca et de composé (r). 1. 2mM 2. 2mM K+ et composé 3. 2mM K++ et 0,5 mM Ca++ 4. 2mN K+, 0,5 mM Ca++ et composé (I) 5 x lO # M 9B Action comparative de l'adrénaline et du composé (I) sur la phase diastolique de la réponse électrique transmembranaire du trabécule de singe (même technique que pour 9A). 1. 0,5 mM Ca 2. 0,5 mM Ca et adrénaline 10 5 mM 3. 0,5 mM Ca et composé Résultats 1) Résultats hémodynamiques chez le chien Les chiens anesthésiés sont perfusés pendant 20 minutes avec le composé (I) ou l'ouabaïne, à la dose de 3,3 nanomol/kg et par minute, à la vitesse de 1 ml/mn en i. v. (saphène). Les témoins sont perfusés dans les mêmes conditions avec une solution de NaCl 0, 0,9% (Pds/V). Ce protocole permet d'observer l'évolution jusqu'à 180 minutes des paramètres suivants, en présence du composé (I) et d'ouabaïne e. doses équimolaires et dans les mêmes conditions expérimentales.Les valeurs sont exprimées en #% de l'action de la drogue par rapport au témoin = 0%# La concentration finale des drogues, soumises à la diffusion étant estimée à 80 nM, cette dose inotrope exerce une évolution globale de 0 min (début d'observation) à 160 min (fin d'observation) des paramétres suivants, consignés dans le Tableau IV. a) a niveau du coeur - Fression systolique (P'max) de 0 à +70% (Fig. 5A) b) au niveau des vaisseaux - La pression artérielle moyenne (PAM) varie de 0 à -30% (Fig. 6a) - La consommation d'oxygène (PAMxFC) verie de O a -27% (Fig. Gd) - L'index Katz (PAM/PC) varie de 0 à -33% (Fig 8b) - la résistance périphérique totale (RPT) varie de 0 à -34% (Fig. 6c) On constate que le composé (I) 80 mM fait varier les paramètre de # de pression intravasculaire en dessous de zéro. Il y a donc action vasodilatatrice du composé (I). Tableau IV Variation des paramètres hémodynamiques chez le chien anesthésié en prsence du composé (I) (MSN) et d'ouabaïne (OUA) : 3,3 nanomoles/kg/min x 20 min. Paramètres Drogues %# à 0 min %# à 20 min %# max (min) %# à 90 min P'max MSN 0 70#1 75#1,5(45') 60#2 OUA 0 45#2 90#1,5(45') 75#2 P'max/P40 MSN 0 65#12 65#1,2(20') 40#1,5 OUA 0 30#2 55#2(40') 45#2 P'min MSN 0 18#2 18#2(20') -40#0,8 OUA 0 50#2 60#2(30') 35 Indexrelaxation MSN 0 -1#0,6 0,50(90') 0,5 PTVG OUA 0 -1#0,6 0,50(5') -1 Fréquence MSN 0 4#0,5 5#1(15') 4#0,5 cardique FC OUA 0 0 7#2(60) 7#2 Débit éjection MSN 0 12#1 13#1(60') 11#0,5 systolique DES OUA 0 10#2 15#2(25') 2#0,5 Index cardisque MSN 0 5#2 7#1(40') 5#1 OUA 0 10#2 15#1(35') 5#2 Consommation O2 MSN 0 20#1 20#1(20') -27#3 PAMxFC OUA 0 45#2 45#2(20') 25#2 Index Katz MSN 0 10#0,6 12#1(10') -33#2 PAMxFC OUA 0 45#3 45#3(20') 2#0,6 Travail(TWg) MSN 0 33#2 33#2(20') -26#1 PAMxDC OUA 0 60#3 65#2(25') 15#2 Résist. périf. tot. MSN 0 -0,13 7#1(10') -33#1 RPT=PAM/DC OUA 0 25#2 25#2(20') 5#1 Press. art. MSN 0 19#1 19#1(20') -14#1 sustol. PAS OUA 0 40#1 45#2(30') 15#2 Press. art. MSN 0 18#0,5 18#0,5(20') -40#1 diast. OUA 0 40#2 40#2(20') 5#1 TWg/batt. MSN 0 28#1 28#1(20') -29#1 OUA 0 65#3 70#5(25') 20#2 2) Résultats physiologiques Ces résultats caractérisent l'action ou composé (I) sur les activités électrique et mécanique du transversus ventriculaire droit de mouton, sur le courant calcique et de dépolarisation de l'oreillette gauche de grenouille et sur la pression carotidienne sanguine du rat anesthésié au Nembutal. a) Activités électrique et mécanique du transversus L'activité électrique est représentée par PA d'amplitude égale à 115 millivolts en valeur absolue, et une durée de 450 millisecondes. L'amplitude de ce PA subit une réduction de 5, 10, 20 et 30% de sa valeur normele de 0 à 20 minutes a:ac e composé (i > 5 x 10 # M (Fig. 5B(I)). Par ailleurs, la variation da la concentration du composé (I) de 5 x 10-8 à 5 x 10-7 M induit une réduction jusqu'à 25% en 20 minutes de l'amplitude du PA. Quant à la du PA, elle se trouve réduite jusqu'à 50 à 60', de sa valeur normale par une concentration du composé (I) de 5 x 10 M en 20 minutes (Fig. 5B (II)). L'activité mécanique est représenté par les tracés (Fig. 5B(I) et (II)) d'une contraction normale de 200 mg de tonus et 400 millisecondes de durée.' Ces paramètres qui évoluent jusqu'à 200% du tonus normal par 5 x 10-7 M de composé (I), varient avec les concentrations de composé (T > (5 x 10-8 à 5 x 10-7M) et avec le temps jusqu'à 20 min. La dose de composé (I > C5 x 10 7 M) donne les premiers signes de toxicité par l'apparition d'oscillation extra-potentielle Oscillation after potentiel . ainsi que d'oscillation extra-contraction osciliation after contraction; (O.A.C.) sur la contraction (Fig. 5B (I) et (II)). b) Le courant calcique de dépolarisation Le courant calcique a été réalisé avec un voltage imposé (voltage clamp) de 50 mV en présence de TTX qui élimine le courant sodique rapide. La présence de composé (I) 5 x 10 9 M donne une réduction de 30%, aggravée à 70% du courant calcique normal par le composé CI) 5 x10-8 M de concentration finale, dans un milieu Ringer + Ca2+ 2,5 m,M (Fig. 7). REVEND ICAT IONS 1. Procédé de préparation de la 2',3'-dioxymthyl- 6-bêta-méthyl-3-bêta-D-glucose-srophanthidine, égelement connue sous le nom de Mansonine, représentée par la formule (1): caractérisé par le fait que: - dans une première étape, on conduit une extrection aqueuse è chaud d'écorces de Mansonia altissima, pour obtenir un extrait P1; - dans une seconde étape, on procede à une extraction de l'extrait P1 par un solvant organique capable de solubiliser P1, pour obtenir un extrait P2;; - dans une troisième étape, on conduit un frac- tionnement de l'extrait P2 par une succession de chromsto- graphies d'échange d'ions sur des résines anioniques et cationiques capables d'éliminer les substances chromogènes que contient l'extrait P2, en ne retenant à chaque chromatographie que la fraction capable d'inhiber l'ATPsse Na+, K+, pour obtenir une fraction P3;; - dans une quatrième étape, on conduit un fractionnement de la fraction P3 par une chromatographie d'éluvion ou de partage, afin de recueillir la fraction P4 qui est capable d'inhiber l'ATPase Na+, K+, et qui constitue le composé de formule (1) recherché, et - le cas échéant, on transforme le composé de formule (1) en l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. 2. Procédé de préparation d'une fraction dite P3, contenant de la mansonine, caractérisé par le fait que: - dans une première étape, on conduit une extraction aqueuse à chaud d'écorces de Mansonia al t iss ima, pour obtenir un extrait P1; dans une seconde étape, on procède å une extraction de l'extrait P1 par un solvant organique capable de so lui tisser P1, pour obtenir un extrait P2; - dans une troisièrn? étape, on conduit un fraction nement de l'extrait P2 par une succession de chromatographies d'échange d'ions sur des résines anioniques et cationiques capables d'éliminer les substances chromogènes que contient l'extrait P2, en ne retenant à chaque chromatographie que la fraction capable d'inhiber d'ATPase Na+, K+, pour obtenir la fraction P3. 3. Procédé selon l'une des revendications I et 2, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme produit de départ, des écorces de Mansonia altissima var.altissima. 4. Procédé selon l'une des revendications I à 3, caractérisé par le fait qu'entre la première et la deuxième étape,- on effectue une délipidation de l'extrait P1. 5. Procédé selon l'une d-es revendications I å 4, caractérisé par le fait qu'a la seconde étape, on utilise, comme solvant d'extraction, un solvant organique chloré, comme le chloroforme. 6. Procédé selon l'une des revendications I à 5, caractérisé par le fait qu'à la troisième étape, on utilise, comme résines anioniques, des résines de type dextrane ou polysaccharide, modifiées par l'introduction de fonctions anioniques, telles que la fonction carbamate de méthyle. 7. Procédé selon l'une des revendications I à 6, caractérisé par le fait qu'à la troisième étape, on utilise. comme résines cationiques, des résines de type dextrane ou polysaccharide, modifiées par I # introduction de fonctions cet ioniques, telles que la fonction diméthylaminoéthyle, et des résines obtenues par condensation du formaldéhyde avec des acides phénol- et phényl-sulfoniques. 8. Procédé selon l'une des revendications I et 3 à 7, caractérisé par le fait qu'à la quatrième étape, on conduit un fractionnement de la fraction P3 par une chromatographie d'éluvion sur une colonne de gel de silice. 9. Procédé selon l'une des revendications I et 3 à 7. caractérisé par le fait qu'à à la quatrième étape, on conduit un fractionnement de la fraction P3 par chromatographie de partage sur couche mince. 10. La fraction P3 obtenue par le procédé tel que défini a l'une des revendications 2 à 7. il. Composition médicamenteuse pour le traitement et l-a prevention des insuffisances cardiaques et de maladies cardio-vasculaires chez l'homme et I 'animal, caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre de principe actif, la fraction P3 telle que définie à la revendication 10 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable convenant au type d'adrninistration considéré. 12. Composition médicamenteuse selon la revendication Il, caractérisée- par le fait qu'elle est destinée au traitement et à la prévention des états pathologiques tels que: - les insuffisances cardiaques pour lesquelles les digital iques sont prescrits, dans le but d'améliorer la cardiotonicité, pour améliorer le rythme cardiaque et-pour lutter contre la fibrillation; - I'hypertension artérielle d'origine hypercalcique pour lutter contre l'artériosclérose. 13. Composition médicamenteuse selon l'une des re vendications 11 et 12, caractérisée par le fait qu'elle convient pour l'administration orale, notamment sous forme de gélules ou de comprimés, ou bien pour l'administration par injection intraveineuse ou intramusculaire ou encore pour l'administration intrapéritonéale. 14. Composition médicamenteuse selon l'une des re vendications 11 à 13, pour le traitement des défaillances cardiaques et des maladies cardio-vasculaires, en parti culer de I 'hypertensi-on et de l'artériosclérose de type hy percaîcique, procurant une quantité efficace du composé de formule I), ou d'un des sels pharmaceutiquement acceptables, allant jusqu'à 300 ng par kg de poids corporel, ou, de préférence, jusqu'à 250 ng par kg de poids corporel. 15. Médicament contenant la fraction P3. 16. Utilisation de la fraction P3 telle que définie à la revendication 10, pour fabriquer une composition médicamenteuse destinée au traitement des insuffisances cardiaques et de maladies cardio-vasculaires chez l'homme et l'animal. 17. Procédé de préparation d'une composition médicamenteuse destinée au traitement et à la prévention d'insuffisances cardiaques et de maladies cardio-vasculaires chez l'homme et l'animal, caractérisé par le fait qu'on mélange une quantité -pharmaceutiquement efficace de la fraction P3, telle que définie å la revendication 10 avec au moins un excipient compatible pharmaceutiquement acceptable.