Brevet FR2644476A1 — publié le 19900921

Procédé de détection et/ou d'identification de micro-organismes vivants par vibrométrie. La présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou d'identification de micro-organismes vivants par vibromètrie. Elle concerne plus précisément un procédé rapide et automatique de détection et/ou d'identification à distance de micro-organismes vivants contenus dans un milieu donné par vibrométrie. La détection et/ou l'identification de micro-organismes vivants dans un milieu permet de connaître son état physiologique et son état physiopathologique.Cette analyse est couramment utilisée notamment dans le domaine médical pour la détection des états pathogènes et dans le domaine alimentaire pour la détermination des contaminations éventuelles. Actuellement ce type d'analyse nécessite, après le prélèvement d'échantillons, soit la mise en culture des micro-organismes contenus dans celui-ci puis l'identification desdits micro-organismes, soit la réalisation de dosages biochimiques. Les procédés couramment utilisés ne permettent pas d'obtenir immédiatement un résultat, en effet ces types de procédés comportent plusieurs etapes d'incubation, de lavages, etc..... Ces procédés d'analyse nécessitent donc beaucoup de temps; de plus ils requièrent du personnel expérimenté. On a maintenant trouvé un procédé de détection et/ou d'identification rapide de micro-organismes vivants par vibrométrie, qui consiste à recueillir les signaux de très faibles amplitudes émis par ces micro-organismes, à l'aide d'un capteur ultrasensible et à les comparer avec des signaux de référence. Aux fins de l'invention on peut utiliser tous les capteurs qui peuvent détecter des pressions acoustiques faibles, de préférence inférieures à environ 2 x 10 5 Pa, tels que par exemple les capteurs piézoélectriques, les capteurs électrodynamiques, les capteurs à condensateur, les capteurs à effet tunnel et les capteurs interférométriques. Avantageusement, on utilisera selon l'invention un capteur interférométrique de type laser. L'invention va être maintenant décrite en détail en référence à ce type de capteur sans pour autant la limiter à ce seul mode de réalisation. Dans ce cas, le procédé de l'invention consiste a) à diriger sur l'échantillon à tester un faisceau laser; b) à analyser le spectre du faisceau lumineux réfléchi; c) éventuellement à comparer celui-ci avec un spectre de référence, l'albedo du milieu à tester étant d'au moins 0,02 %. Lorsque l'albedo du milieu n'est pas suffisant, c'est-à-dire est inférieur à 0,02 %, on interpose avantageusement entre l'échantillon à tester et le faisceau laser une feuille d'un matériau réfléchissant ayant une épaisseur suffisamment faible pour pouvoir transmettre les vibrations du milieu. De préférence, on utilisera une feuille d'or ayant une épaisseur comprise entre 1 et 5 um, de préférence 2 2um. Par micro-organismes vivants " on désigne dans la présente description et les revendications toutes entités biologiques de petite taille, métaboliquement actives, animales ou végétales, simples ou ccmplexes capables de naître, de se développer et normalement de se reproduire. A titre d'exemples de micro-organismes on peut citer notamment les bactéries, les actinomycetes, les champignons, les levures, les virus, les phages, les mycoplasmes, les rickettsies, les cellules eucaryotes, les procaryotes, les fragments d'ADN et d'ARN, les nématodes et les protozoaires ainsi que les ensembles cellulaires. On a en effet constaté de façon surprenante que les micro-organismes vivants se comportent comme des micro-émetteurs de vibrations. I1 semble que tout se passe comme si les réactions biochimiques qui ont lieu dans les micro-organismes sont à l'origine de phénomènes thermoacoustiques qui ébranlent les structures cellulaires. De plus les signaux vibratoires émis par les micro-organismes sont caractéristiques de l'espèce considérée, de leur état physiologique et physiopathologique, des conditions physico-chimiques qui règnent dans le milieu où se trouve ces micro-organismes. Par "échantillon" on désigne selon l'invention tout fragment ou biopsie d'un substrat susceptible de contenir des micro-organismes. A titre d'exemples de substrats, on peut citer notamment tous les milieux biologiques, tels que par exemple le sang, l'urine, le sperme et les milieux alimentaires, tels que le lait, les jus de fruits, les jus de conservation, les aliments, etc.. Le procédé peut être mis en oeuvre avec: - des échantillons de consistance solide à visqueuse; - des échantillons de consistance solide à liquide; - des échantillons pulvérulents. Dans le cas des échantillons pulvérulents il y aura lieu de les placer dans un milieu propice au meilleur recueil acoustique, par exemple dans l'eau. Le faisceau laser dirigé sur l'échantillon à tester est émis par un interféromètre laser hétérodyne classique. Les interféromètres optiques fonctionnent par mélange de deux faisceaux de lumière, l'un des faisceaux est réfléchi par l'objet examiné et l'autre sert de référence de phase. Lorsque les deux faisceaux ont la même fréquence optique, l'interféromètre est un interféromètre homodyne. Par contre, lorsque la fréquence du faisceau de référence est différente de celui de l'objet, on parle d'interféromètre hétérodyne. Dans un interféromètre hétérodyne on introduit à l'aide de deux modulateurs acousto-optiques une faible différence de fréquence J'entre les fréquences optiques ffi et SL 2 des deux faisceaux interférants. Etant donné cette différence de fréquence, l'interférence entre le faisceau de référence et le faisceau réfléchi par la cible produit une modulation d'intensité de la lumière à la fréquence de battementtQqui est détectée par un photodétecteur. La longueur du chemin optique et par conséquent la phase du faisceau objet est modifiée par les déplacements de l'objet et directement convertie en un changement de phase de la fréquence de battement. La linéarité d'un interféromètre hétérodyne n'est pas limitée aux faibles variations de vibrations, puisque les variations de phases optiques ne sont pas converties en variations d'intensité comme c'est le cas dans- les interféromètres homodynes mais én variations de phase du signal à la fréquence de battement. Ainsi les interféromètres hétérodynes permettent la détection de très faibles variations. Les interféromètres laser qui conviennent aux fins de l'invention présentent avantageusement les caractéristiques ci-après: 1) faisceau étroit adapté à l'échelle microscopique, 2) albédo suffisant de la partie vibrante, 3) amplitude de détection d'au moins 10-11 mètre, 4) largeur spectrale étendue 100 Hz - 300 MHz, 5) linéarité étendue le long du spectre, 6) sensibilité peu perturbée par les basses fréquences, 7) puissance calorique adaptée à la biologie. Les interféromètres hétérodynes ont été decrits notamment par: - B. CRETIN et al. Optic Communications vol. 65 nO 3, 1988, p. 157-162; - J.F. WILLEMIN et al. J. Acoustic. Soc. Am. 83 (2), 1988, p 787-795, - Sietse M. VAN NETTEN J. Acoustic. Soc. Am. 83 (4), 1988, p. 1667-1674 - M.A. NOKES, Rev. Sci. Instrum. 49 (6) 1978, p. 723-728. Dans ces articles il est indiqué que les interféromètres hétérodynes sont appropriés pour mesurer les déplacements vibratoires de l'ordre du nanomètre d'objets microscopiques, tels que les vibrations de l'oeil de poisson et de systèmes biologiques, tels que les cils de l'organe de Corti ou l'axone géant de la sèche. Toutefois on n'a jamais proposé d'utiliser un interféromètre hétérodyne pour la détection et/ou l'identification de micro-organismes; une telle utilisation procure un avantage considérable par rapport aux techniques d'analyses classiques, comme cela a été indiqué précédemment. L'appareillage pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est constitué d'un interféromètre laser, d'un porte-échantillon constitué d'un support pouvant être déplacé selon les trois axes et d'un analyseur du faisceau réfléchi par l'échantillon à tester. L'invention va être maintenant décrite plus en détail en référence aux figures annexées, sur lesquelles: - Fig. 1 est une représentation schématique de l'appareillage pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention - Fig. 2 représente les enregistrements des spectres émis par l'échantillon à tester selon les exemples 1 et 3 ci-après: L'interféromètre 1 est constitué d'une source laser He-Ne(1), de modulateurs acousto-optiques (3) et (4) pour déplacer en fréquence respectivement le faisceau de référence (RB) de fréquence 4 et le faisceau dirigé vers l'échantillon å tester (08) de fréquence.% , un photodétecteur DET (5) pour détecter le signal de battement de fréquence (j - ss ), lequel est analysé dans l'analyseur (6). Le faisceau laser de fréquence #1 est dirigé vers l'échantillon à tester (7) dans lequel se trouve une colonnie de micro-organismes (7a), contenu dans une cuve (8), laquelle est posée sur un porte-échantillon (9). On notera que l'échantillon à tester (7), lorsqu'il est solide peut être posé directement sur le porte-échantillon (9). Lorsque l'albédo du milieu n'est pas suffisant, on interpose entre le faisceau laser de fréquence1 et l'échantillon une feuille en un matériau réfléchissant par exemple, une feuille en or (10), qui se maintient sur l'échantillon par capillarité. On indiquera que la mise en place du matériau réfléchissant peut être facilitée en utilisant un matériau de couplage, par exemple un gel. Cet appareillage peut comporter en outre un système de commande manuelle ou automatique (11) qui permet, en l'absence d'un signal utile correspondant à une information exploitable, de commander selon trois axes le déplacement du support de l'échantillon jusqu'à l'obtention d'un signal utile faisant apparaître des vibrations. On notera que le faisceau laser peut être conduit par une fibre optique. L'échantillon ou la feuille de matériau réfléchissant est placé sur le trajet du faisceau laser de l'interféromètre. La collimation est effectuée en déplaçant le support échantillons selon trois axes et la focalisation est effectuée en déplaçant l'objectif (12) pour que le foyer soit situé à l'interface t. Le spectre du signal détecté par le photodétecteur (5) est analysé et peut être comparé automatiquement à des spectres de référence, conservés sur des supports appropriés, tels que les supports papier, les supports magnétiques, les supports optiques, etc.. Si le signal diffère de celui réfléchi par un miroir immobile situé à la place de l'échantillon, on est en présence de micro-organismes vivants. Le procédé de l'invention permet donc de détecter la présence d'un micro-organisme vivent dans un échantillon donné. Il permet également de déterminer la sensibilité d'un micro-organisme vivant à une substance donnée; par exemple on pourra ainsi déterminer les composés qui inhibent ou au contraire favorisent la croissance des micro-organismes. En effet, on a constaté que sous l'effet d'une perturbation (photostimulation, action d'un bactericide par exemple) le spectre du signal détecté est différent de celui émis par le micro-organisme seul. Le procédé de l'invention est également adapté à l'étude de substances par l'analyse du comportement vibratoire de micro-organismes ou de mélanges de ceux-ci qui ont été mis en présence de ces substances. Par exemple, il convient pour la réalisation d'antibiogrammes ou l'étude des propriétés fongicides, herbicides, insecticides, mutagènes ou toxiques etc.. de substances données. Le procédé de l'invention permet en multipliant les capteurs de localiser les micro-organismes et de suivre en temps réel leur trajectoire. Ce procédé peut être utilisé pour le contrôle des fermentations, des stérilisations, la réalisation de biocapteurs utilisables en laboratoire d'analyse pour toutes les études et le contrôle des phénomènes liés à l'environnement des micro-organismes. L'invention va être maintenant décrite par les exemples illustratifs non limitatifs ci-après: EXEMPLE 1 : Limbe foliaire du céleri-commun APIUtl GRAVELENS Deux fragments de ce limbe d'un diamètre de 3 mm environ, prélevés sur une plante fraiche ont été placés et maintenus par une attache métallique dans le fond d'un tube de 1 ml. Le tube a été placé sur le porte-échantillon, puis rempli d'eau. A la surface du liquide on a déposé un fragment de feuille d'or d'un diamètre de 2 mm et d'une épaisseur de 2 um. Ce fragment a été maintenu à la surface du liquide par simple effet capillaire. Le fragment d'or constitue l'interface réfléchissante nécessaire à la mesure qui s'effectue ainsi à une distance d'environ 13 mm du fragment végétal. Le porte-échantillon a permis par micro-déplacements selon trois axes de déplacer l'ensemble tube, échantillon, milieu, interface réfléchissante et objectif. La focalisation et la collimation du sytème optique ont été obtenues par ajustement progressif de cet ensemble par rapport à l'interféromètre. L'étape suivante a consisté à analyser et les spectres du signal transmis par le photo-détecteur de l'interféromètre à t voir Figure 2 sur laquelle figurent les spectres émis par cet échantillon : (courbes 2 à 4) placés dans différentes conditions ainsi que le bruit de fond de l'ensemble interféromètre porte-échantillon vide d'éléments biologiques (courbe 1) les spectres représentés par les courbes 2 et 3 ont été obtenues dans les conditions ci-après: Courbe 2: spectre émis par l'échantillon selon le mode opératoire défini ci-dessus, l'échantillon étant dans l'obscurité. Courhe 3: spectre émis par l'échantillon selon le mode opératoire défini ci-dessus, l'échantillon étant photostimulé en approchant une lampe de 100 W à 15 cm du tube transparent pendant 60 secondes. On constate en observant les courbes 2 et 3 que - les spectres d'émission de l'échantillon placé dans des conditions différentes sont également différents. Divers essais ont permis de constater que les spectres des courbes (2) et (3) étaient toujours obtenus lorsque l'on plaçait l'échantillon soit dans l'obscurité, soit lorsqu'on l'a photostimulé. EXEMPLE 2. On a répété le mode opératoire de l'exemple 1 en utilisant comme échantillon un mélange volume à volume de sperme et de "Glucose Elbiol 5 %". On a enregistré le spectre d'émission du sperme par analyse du signal recueilli par le photodétecteur. L'introduction dans le tube contenant l'échantillon ci-dessus de 3 gouttes de "FONGIBACTYL" modifie le spectre enregistré. En effet, dès reprise de la mesure on observe lentement (environ 200 secondes) une extinction progressive de l'émission et un retour au bruit de fond du système. On en conclut que le FONGIBACTYL possède des propriétés spermicides. Cet exemple montre que le procédé de l'invention permet de tester l'action d'une substance à l'égard 'un échantillon donné, par exemple de déterminer les doses toxiques pour le micro-organisme contenu dans l'échantillon à tester. EXEMPLE 3 L'extrémité de la tige aérienne d'un jeune plant de soja commun GLYCENE HISPIDA obtenu au bout de 10 jours de germination a été placé, au foyer optique directement sur le porte-échantillon. La surface de cette plante étant suffisamment lisse et réfléchissante la mesure a été effectuée directement sur l'échantillon sans l'interposition d'une feuille d'or. L'analyse du signal détecté a donné la courbe 4 (voir Figure 2). REVENDICATIONS 1. Procédé de détection et/ou d'identification rapide de micro-organismes vivants par vibrométrie, caractérisé en ce qu'il consiste à recueillir les signaux de très faibles amplitudes émis par ces micro-organismes à l'aide d'un capteur ultrasensible. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le capteur ultrasensible est un capteur piézoélectrique, un capteur électrodynamique, un capteur à condensateur, un capteur à effet tunnel ou un capteur interférométrique. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le capteur ultrasensible est un capteur interférométrique de type laser. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste a) à diriger sur l'échantillon à tester un faisceau laser; b) à analyser le spectre du faisceau lumineux réfléchi ; c) éventuellement à comparer celui-ci avec un spectre de référence, l'albedo du milieu à tester étant d'au moins 0,02 '. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on interpose entre l'échantillon à tester et le faisceau laser une feuille en un matériau réfléchissant de faible épaisseur. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que la feuille en matériau réfléchissant est une feuille d'or. 7. Appareillage pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend un interféromètre laser hétérodyne, un porte-échantillon constitué d'un support pouvant être déplacé selon les trois axes, d'un analyseur du faisceau réfléchi par l'échantillon à tester, et éventuellement d'une feuille en matériau réfléchissant de faible épaisseur.