Brevet FR2646160A1 — publié le 19901026

La présente invention est relative à une séquence polynucléotidique et à ses applications en tant que sonde moléculaire pour l'identification de variations gén6- tiques dans l'ADN gnomique et pour l'établissement d'empreintes génétiques de diverses espèces végétales et animales et, parmi ces dernières, d'empreintes génétiques aussi bien d'invertébrés que de vertébrés. La principale méthode proposée en premier lieu pour identifier les variations génétiques dans l'ADN gOno- mique humain a consisté à utiliser des sondes d'ADN humain non-rOpétitives pour détecter les polymorphismes de la longueur de fragments de restriction (ou RFLP) dont la plupart résultent de très petites modifications dans 1'ADN, telles que des substitutions de bases qui créent ou détruisent dés sites de coupure spécifiques d'endonucléases de restriction /cf. J.F. GUSELLA et al. NATURE (1983) 3QS, p p 234-238 et W.K. CAVANEE et al. NATURE (1983) 305, p 779-784/.Toutefois, comme le caractére hétérozygote moyen de 1'ADN humain est faible (environ 0,001 par paire de bases), il a été démontré que les endonucléases de restriction ne sont pratiquement pas en mesure de détecter un RFLP à un locus donné, même s'il a pu être établi que la probabilité de détection est améliorée pour des enzymes telles que MspI et TaqI qui contiennent le doublet mutable CpG dans leur séquence de reconnaissance. Même lorsqu'ils sont détectés, la plupart des RFLP sont seulement dimorphes - présence ou absence d'un site de coupure par une endonucléasse de restriction avec un caractère heterozygote, déterminé par des fréquences allèles, qui ne peut pas excéder 50% et qui est généralement très inférieur.Il en résulte que les RFLP ne sont pas capables de donner des informations dans l'analyse du "pedigree" dans le cas où les individus objets de l'analyse sont homozygotes. D'où l'intérêt de pouvoir disposer de sondes pour des régions hypervariables de l'ADN humain présentant une variation multi-allélique et par voie de conséquence des hétérozygocités élevées. La première région hypervariable a été isolée par hasard par WYNMAN et WHITE /PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 5(1980) r, p.6754/ à partir d'une banque de segments d'ADN humain, puis, à nouveau par hasard, d'autres régions hautement variables ont été identifiées à proximité du gène de l'insuline humaine, des gènes des a-globines et de l'oncogène c-Ha-ras-I /See Am. J. Human Genet 43 : 854-859, 1988/. Chacune de ces régions hypervariables est constituée par des répétitions en tandem d'une courte séquence (ou "minisatellite") et le polymorphisme résulte de différences alléliques dans le nombre de répétitions. Les variations de longueur résultantes du minisatellite peuvent être détectées à l'aide de n'importe quelle endonucléase de restriction qui ne coupe pas l'unité répétée et qui procure pour les locus considérés une série de marqueurs génétiques stables. I1 a été établi que l'organisation du gène de la myoglobine humaine contient un élément répété comprenant quatre répétitions en tandem de 33 pb à proximité de l'extrémité 3' du premier intron /P. WELLER et al., THE EMBO J. (1984) Vol. 3, N'2, p. 439-446/. Il a été établi que cette région répétitive détecte dans le génome humain des régions multialléliques. Les chercheurs de l'équipe du Pr. A.J.JEFFREYS de l'Université de LEICESTER ont effectivement vérifié cette hypothèse /JEFFREYS et al., NATURE, Vol.314, 7 Mars 1985, p.67-72/ en préparant une sonde à partir du minisatellite de la myogloblne humaine cette sonde a été obtenue par purification d'un élément de répétition de 33 pb, suivie d'une ligation tête-à-queue et du clonage du polymère résultant dans le vecteur plasmi dique pUC 13. La coupure de l'un des recombinants résultants, pAV33.7, par les enzymes BamHI + EcoRI, a libéré un insert de 767 pb constitué presque entièrement par 23 répétitions de la séquence de 33 pb.Par comparaison avec d'autres séquences chez d'autres organismes, il a été mis en évidence une séquence consensus nucléotidique "noyau" ("core"), comprenant 10 pb, apte à servir de sonde pour détecter non seulement les fragments d'ADN humain détectables par la bactérie pAV33.7, lais aussi d'autres minisatellites incapables de former des hétéroduplex stables avec la sonde de répétition de 33 pb. Ils ont vérifié l'efficacité de ces sondes pour la détermination d'un degré de parenté éventuel entre deux individus. La Demande de Brevet Européen 0 186 271 au nom du LISTER INSTITUTE 0F PRBVENTIVE MEDECINE, qui mentionne A.A.JEFFREYS comme Inventeur, revendique d'ailleurs des polynucléotides de formule générale H.(J.core.K)n.L dont le "core" est précisément constitué par la séquence core décrite dans l'Article de NATURE précité, précédée de sa séquence flanquante. Cette Demande de Brevet Européen décrit, en outre, l'établissement d'empreintes génétiques d'êtres humains, de chiens, de chats, de moutons, de porcs, de chevaux et de bovins en hybridant leur ADN avec les sondes minisatellites d'origine humaine décrites et revendiquées dans cette Demande. De même, ces sondes minisatellites d'origine humaine ont été utilisées pour réaliser une étude démographique d'une population de moineaux /J.H. WETTON et al., NATURE, Vol.327, 14 Mai 1987, p. 147-149 et T. BURKE et al. loc. cité p. 149-152/. Comme on a pu le voir, conformément aux travaux de A.J. JEFFREYS et al., les séquences minisatellites ont tout d'abord été isolées à partir d'ADN génomique humain, puis clonées dans un vecteur approprié, après quoi les sondes produites à partir de ces clones sont hybridées avec un échantillon d'ADN humain séparé par électrophorèse et fixé sur un support, pour donner une "image" (ou "pattern") d'hybridation spécifique de l'individu dont l'ADN est examiné et qui, par comparaison avec d'autres "images" d'hybridation permet d'établir, par exemple, l'identité de l'individu examiné ou sa parenté avec d'autres individus. Les recherches de G. VASSART et al., rapportées dans la Demande de Brevet Européen 0 264 305 et dans SCIENCE, Vol.235, 6 Février 1987,p.683-684 ont abouti à la démonstration du fait que le bactériophage M13, qui est l'un des vecteurs les plus couramment utilisés, est capable de détecter par lui-même des minisatellites hypervariables dans un grand nombre de mammifères, le facteur de détection étant consititué par une séquence présente dans le gène de la protéine III du bactériophage M13.La sonde nucléotidique obtenue, qui est constituée par un ADN, ou un fragment d'ADN, issu du bactériophage M13, et contient une séquence formée d'au moins un motif unitaire répété de façon monotone, de séquence GAGGGTGGXGGXTCT (X représentant la thymine, la cytosine, l'adénine ou la guanine et de préférence la thymine ou la cytosine), et est donc différente de la sonde proposée par JEFFREY et al., de séquence GGAGGTGGGCAGGAXG. La sonde selon G.VASSART et Al. est donc d'origine non-humaine puisqu'elle est constituée par le bactériophage M13 ou en est issue ; hybridée avec de l'ADN d'origine humaine ou animale, elle permet d'établir l'identité d'un individu et ses liens de parenté avec d'autres individus ; la Demande de Brevet Européen 264 305 précitée fait référence au fait que la sonde qu'elle revendique est capable de détecter des séquences d'ADN polymorphes humains, animals ou végétals, par hybridation avec celles-ci, mais ne donne pas d'exemples de reconnaissance de séquences d'ADN d'origine végétale. Il résulte de ce qui précède que la seule tentative de rechercher une alternative à l'utilisation de sondes d'origine humaine est représentée à ce jour par les travaux de G. VASSART et ai. Il résulte en outre des recherches rapportées qu'on ne savait pas, jusqu'à présent, s'il existait des régions hypervariables ou minisatellites chez les invertébrés et que, par voie de conséquence, des applications possibles de telles éventuelles régions, n'avaient pu être trouvées. La présente invention s'est donné pour but de pourvoir a une séquence nucléotidique de type minisatellite issue d'un organiste invertébré tel que la mouche domestique Musca domestics, qui permet la réalisation d'une sonde moléculaire utilisable pour l'obtention d'empreintes génétiques chez la mouche domestique et par hybridation avec différents organismes invertébrés1 l'obtention d'empreintes génétiques de ces organismes (mouche tsé-tsé, moustique, Aedes aegvpti1 abeille et autres espèces vectrices, notamment) mais aussi. par hybridation avec l'ADN d'organismes vertébrés, et notamment de mammifères, l'obtention des empreintes génétiques d'animaux domestiques et d'animaux d'élevage, ainsi que l'obtention d'empreintes génétiques chez l'homme ; la sonde conforme à l'invention permet également, par hybridation avec de 1'ADN végétal, le contrôle génétique des plantes et des semences. La présente invention a pour objet un polynucléotide issu de la mouche domestique, Musca domestica, qui est caractérisé en ce qu'il comprend un motif unitaire de 24 nucléotides de formule I ci-après GAGGTCGX1X2TTX3AGCTX4GTCTATX5 (I) dans lequel Xi est C ou T X2 est C ou T X3 est C ou A X4 est C ou Cet X5 est A ou G, en ce que ledit motif unitaire est amplifié au moins 35 fois en tandem, en ce qu'il comporte au moins un site de coupure pour Alu I et en ce qu'il est dépourvu de sites de coupure pour les autres endonucléases de restriction. Selon un mode de réalisation avantageux de l'objet de l'invention, ledit polynucléotide est caractérisé en ce qu'il répond â la formule II ci-après lue dans le sens 5'----- > 3' actataggccgaattggagctcgtgttaaatattcccttcagcttatctcaag actctcttcaggactcctttcagtcgtcaagaaagactccctttcagtcgtcga gagtgacagccttccattctccaatagtagccaggtctcctttcagatgcggtct (II) tcagctcqtctata (GAGGTCGXxX2TTX3AGCTX4GTCTATXs) n dans laquelle Xi, X2, X3, X4 et X5 ont la même significa tion que ci-dessus et n est égal ou supérieur à 35. Selon un aspect avantageux de ce mode de rFali- sation, ledit polynucléotide est caractérisé en ce qu'il ré- pond à la formule III ci-après, lue dans le sens 5 ---- > 3': actataggccgaattggagctcgtgttaaatattcccttcagcttatctcaaag actctcttcaggactcctttcagtcgtcaagaaagactccctttcagtcgtcga gagtgacagccttccattctccaatagtagccaggtctcctttagatgcggtct tcagctcgtctata con GAGGGTCGCCTTCCACTCGTCTATA 1 t 9 2 t g 3 a 4 t 5 7 8 9 t 10 il (III) 12 (III) 13 14 gaggtcgccttcagctcgtctata (gaggtcgccttcagctcgtctata ) n' où n' est supérieur à 20. Le polynucléotide conforme à la présente in vention est le premier élément minisatellite isolé d'ADN d'un invertébré. Il présente une structure analogue à celle des éléments minisatellites isolés chez l'homme et possède également la propriété d'être dépourvu de sites de res triction pour la plupart des endonucléases de restriction, excepté Alu I. La présente invention a d'autre part pour objet une sonde polynucléotidique caractérisée en ce qu'elle est constituée par un polynucléotide tel que précédemment défini, marqué â l'aide d'un marqueur approprié. Le marqueur mis en oeuvre peut aussi bien être un isotope radioactif qu'une enzyme ou analogue. La présente invention a, de plus, pour objet un procédé d'obtention des polynucléotides tels que définis plus haut. Conformément à l'invention, lesdits polynucléotides sont obtenus par voie de synthèse. Egalement conformément à l'invention, lesdits polynucléotides sont obtenus par lyse d'un homogénat de broyat d'insectes, suivie du traitement du surnageant de lyse par un solvant d'extraction approprié, de la centrifugation de l'extrait obtenu et de la précipitation de l'ADN d'insecte par addition d'éthanol, après quoi le culot obtenu est soumis à une dégradation enzymatique par une enzyme n'ayant pas de site de reconnaisance dans la séquence du polynucléotide répondant à l'une des formules (I) à (III) et le produit de dégradation, constitué par ledit polynucléotide, est récupéré par extraction, suivie d'une centrifugation et d'une précipitation par addition d'éthanol. La présente invention a également pour objet un profil électrophorétique apte à être utilisé en tant qu'agent d'établissement d'empreintes génétiques d'organismes végétaux ou animaux, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide de formule (I) à (III) susdit. Selon un mode de réalisation avantageux dudit profil électrophorétique, celui-ci comprend ledit polynucléotide associé à un marqueur approprié. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit profil électrophorétique, celui-ci est obtenu par transfert dudit polynucléotide, éventuellement marqué, sur un gel d'électrophorèse portant un marqueur de masse moléculaire approprié, sur lequel le profil est obtenu par migration électrophorétique. Selon un aspect avantageux de ce mode de réalisation, le profil obtenu par migration électrophorétique sur le gel d'électrophorèse est transféré sur une membrane de nitrocellulose, polyamide ou analogue. Selon un mode de réalisation avantageux du profil électrophorétique conforme à l'invention, celui-ci est mis sous forme de bandelettes pr8tes à l'emploi, destinées à être associées aux autres éléments d'un kit d'obtention d'empreintes génétiques. La présente invention a en outre pour objet une méthode d'obtention d'empreintes génétiques chez l'homme, ainsi que chez des organismes animaux ou végétaux, qui est caractérisée en ce qu'elle consiste à incuber une sonde obtenue par marquage d'un polynucléotide répondant à 1'une des formules (I) à (III), avec de 1'ADN extrait de l'organisme dont on cherche à établir les empreintes génétiques, dans un milieu d'hybridation approprié, pendant une durée et dans des conditions de température appropriées, puis révélation et lecture du profil d'hybridation obtenu. Selon un mode de mise en oeuvre de la méthode d'obtention d'empreintes génétiques conforme à la présente invention, la sonde de détection et l'ADN å tester mis en contact d'hybridation sont portés chacun par un support approprié. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la sonde est fixée sur une plaque de gel de polyacrylamide ou sur une membrane de nitrocellulose ou de polyamide , mise sous la forme d'un profil électrophorétique. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la sonde est fixée sur un papier filtre. Il résulte de ce qui précède que l'étude des régions hypervariables ou minisatellites chez les invertébrés a permis de pourvoir à une séquence nucléotîdique minisatellite qui permet la réalisation de cartes d'identité génétiques - chez les insectes pour l'obtention de marqueurs spécifiques permettant la caractérisation et la dis crimination d'espèces vectrices et le contraIs génétique pour la production en masse - chez les plantes pour le contrôle génétique des plantes et des semences commercialisées - chez l'homme pour la réalisation de tests de paternité et la solution de problèmes de médecine légale (meurtres, viols, etc...) - chez les animaux pour la solution de pro blèmes de filiation (chevaux, chiens, chats, etc...) et d'analyse de profils de ségrégation en vue d'associer des marqueurs moléculaires dans des expériences d'amélioration génétique chez des animaux d'élevage (bovins, ovins, porcins, etc...) L'élément de 24 nucléotides, amplifié au moins 35 fois, qui répond à la formule III ci-dessus, isolé de Musca Domestica et cloné, est une région génomique qui présente une structure analogue & celle des éléments satellites rencontrés chez l'homme, avec lesquels il a en commun la propriété d'être dépourvu de sites de coupure pour les endonucléases de restriction, à l'exception de l'enzyme AluI.Les différents motifs de chacune des unités de répétition montrent une faible divergence nucléotidique, alors que la comparaison avec les séquences minisatellites trouvées chez différents organismes ne montre aucune homologie évidente avec les séquences minisatellites d'origine humaine. Par hybridation moléculaire avec le clone conforme à l'invention utilisé comme sonde, qui sera désigné dans ce qui va suivre sous la désignation de pHMd.24, on a réalisé, pour la première fois, conformément & la présente invention des cartes d'identité génétiques spécifiques chez l'insecte Mussa dqluUELLm qui sont illustrées à la Figure 1. Par ailleurs, une hybridation croisée de la sonde conforme à l'invention a été réalisée avec d'autres insectes comme la mouche tsé-tsé, l'abeille et le moustique Aèdes gY2ti, comme le montre la Figure 2. L'analyse par hybridation moléculaire de la ségrégation des séquences minisatellites après le croisement d'une mouche femelle et d'une mouche mâle et de leur descendance, montre une transmission mendelienne des divers fragments (cf. Figure 3). Si chacun des individus du pedigree présente un profil de bande unique, il hérite en moyenne de 50t des fragments observés chez les parents. I1 est donc possible d'identifier avec certitude l'origine et l'appartenance génétique des individus. Au plan fondamental, à un locus donné, la détection des différentes régions hypervariables correspond à une variation de l'amplification du nombre d'unités de répétition. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention. I1 doit être bien entendu toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement å titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : PREPSEATION DE LA SONDE POLYNUCLEOTIDIQUE CONFORME A L'INVENTION A. ISOLEMENT DE L'ADN INDIVIDUEL DES INSECTES Les insectes stockés dans l'azote liquide sont répartis individuellement dans des tubes à fond conique. Ils sont broyés rapidement dans 400 pl d'une solution de NIB en utilisant un mortier conique en plastique s'adaptant sur un moteur de perceuse. Les homogénats obtenus sont centrifugés deux minutes à 10000 tours/mn les surnageants sont éliminés par aspiration, les différents culots sont resuspendus dans 200 pl de la solution HB et homogénéisés par agitation au "Vortex". On ajoute 100 til d'une solution de lyse et on mélange l'ensemble par inversions des tubes. Les échantillons sont incubés & 55*C pendant 30 à 45 mn.Après cette période, un volume égal de phinol/chloroforme saturé est ajouté, et les tubes sont mélangés lentement par inversions, puis centrifugés 10 mn & 10000 tours/n. Les surnageants sont à nouveau réextraits avec la même solution de phénol/chloroforme, mélangés, puis centrifugés dans les mêmes conditions. Les phases aqueuses des différents échantillons sont transférées dans des tubes à fond conique neufs et l'ADN est précipité & température ambiante après addition de 2 volumes d'éthanol absolu. Après centrifuga- tion durant quelques secondes, les différents culots sont rinçés avec 1 ml d'une solution aqueuse d'éthanol à 70% puis ils sont séchés sous vide. Ce procédé permet d'extraire de l'ADN de 24 insectes individuels en moins de trois heures, d'une qualité suffisante pour être dégradé enzymatiquement. En moyenne 1 g d'ADN est obtenu pour un moustique, et 4 à 8 g pour une mouche ou une abeille. Les compositions des solutions utilisées, dans cet exemple, sont notamment les suivantes solution de NIB = 0.1 M NaCl 30 mM Tris HCl, pH=8 30 mM B mercaptoéthanol 0,5% Nonidet NP40 solution de HB = 0,1 M NaCl 0,2 M Saccharose 10 mM EDTA, pH=8 solution de lyse = 0,25 M EDTA, pH=8 0,5 M Tris HCl, pH=8 2,5S 5115 solution de Phénol/chloroforme = . 100 parties en poids phénol . 100 parties en volume de chloroforme . 4 parties en volume d'alcool isoamylique 0,1 partie en poids de 8-hydroxyquinoléine B. DEGRADATION ENZYMATIQUE Les culots obtenus en A. ci-dessus, sont resuspendus dans 88 pl de 10 mH Tris/HCl, pH=7,5, et 10 til de tampon de digestion enzymatique (GIBCO/BRL) sont ajoutés. Après addition de 2 1 d'enzyme Hae III (GIBCO/BRL) A 10 unités/pl, les différents tubes sont incubés trois heures à 37 C. Une concentration enzymatique voisine de 5 unités/g est estimée lors de la réaction de dégradation. Les produits de digestion sont ensuite extraits par addition d'un volume égal de phénol/chloroforme, suivie d'une centrifugation (10 minutes à -80'C). Les phases aqueuses sont précipitées 10 mn à - 80. C après addition de lJ10 de tampon acétate, pH=5,6 et de 2 volumes d'éthanol absolu.Après centrifugation 15 minutes à 10000 tours/mn, rinçage du culot avec 500 pl d'éthanol à 70%, les échantillons sont séchés. Les précipités sont resuspendus dans 15 pl de lOmM Tris/HCl, pH=7,5 et 5 pl d'une solution de chargement. C. PREPARATION D'UN PROFIL ELECTROPHORETIQUE 1.) Séparation sur gel d'agarose Les gels d'électrophorèse sont préparés sur des plaques de verre de 15x20 cm de longueur avec 200 ml d'agarose à 0,7% (Sigma type 7)dans du tampon 1OXTBE, pH=8,3. La migration s'effectue pendant au moins 15 heures sous une tension de 60 Volts dans du tampon lOXTBE. A la fin de l'électrophorèse le gel est coloré par du bromure d'ethidium puis photographié sous ultra-violets pour confirmer l'efficacité de la dégradation de lTADN par l'enzyme Hae III. 2. Transfert Le gel est traité, sous agitation lente, dans une solution alcaline pendant 30 mn, la solution est éliminée par aspiration et ce traitement est répété une nouvelle fois. Il est ensuite équilibré pendant 2 fois 30mn. dans la solution de transfert. La membrane de nitrocellulose Schleicher et Schuell (type BA 85) est utilisée pour le transfert de l'ADN. Le gel est déposé sur une plaque de verre recouverte de 2 feuilles de papier Watmann 3MM humidifiées avec la solution de transfert, cet ensemble étant déposé à l'intérieur d'un plateau contenant également de la solution de transfert. La membrane de nitrocellulose mouillée préalablement dans l'eau est déposée délicatement sur le gel et une pression douce est appliquée avec les doigts de manière à éliminer les bulles. On recouvre cette membrane de deux feuilles de papier Watmann 3MM découpées à la dimension du gel, de 15 cm environ de papier absorbant, puis d'une plaque de verre et un poids de ikg est déposé au sommet. On laisse le transfert s'effectuer pendant une nuit à température ordinaire.Le lendemain, la membrane de nitrocellulose est rinçée brièvement dans une solution de 3xSSC, elle est ensuite cuite dans un four å 80'C pendant trois heures. Les solutions utilisées sont notamment les suivantes lOxTBE = 0,89 M Tris borate 0,89 M Acide borique 0,02 M EDTA lxSSC = 0,15 M NaCl 15 mM citrate trisodique, pH=7 Solution de chargement = 12,5% Ficoîl 400 0,28 bleu de bromophénol 0,2t M Tris Acetate 1 mM EDTA, PH=8 Solution alcaline = 0.5 M NaOH 1.5 M NaCl Solution de transfert = 1 M acétate d'ammonium 0,03 M NaCl D. PREPARATION DE LA SONDE Le marquage de la sonde est, dans le présent exemple, un marquage radioactif qui est effectué en suivant le protocole décrit par GEORGES et al. Nucleic Acid. Res., 15, (1987), 6295. EXEMPLE 2 : PREPARATION DE L'ADN A EXAMINER L'extraction de l'ADN chez les mammifères est effectuée à partir d'un prélèvement sanguin (7 ml) selon la technique décrite par JEFFREYS et al. (1985a) /Nature 316 76-79, 1985/. L'ADN obtenu est transféré sur une membrane en matériau approprié, après migration électrophorétique. EXEMp;E ss : HYBRIDATION REVELATION REVELATION ET ET LECTURE La membrane portant 1'ADN à tester et les filtres portant la sonde sont introduits dans une boîte hermétique appelée chambre d'hybridation. On ajoute 50 ml d'une solution lxDenhart et l'ensemble est agité dans un bain-marie pondant 30 minutes à 62 C. Après chauffage à 100 C pendant 5 mn la sonde est ajoutée à 20 ml de solution CFHM d'hybridation contenant 6% de polyéthyièneglycol dans laquelle sont immergés les filtres préalablement plongés dans 50 ml d'une solution CFHM et agités à 62 C pendant 30 mn, puis dans 50 ml de solution CFHM contenant 6% de polyethylène glycol 6000, puis agités pendant 30 mn à 62 C. L'ensemble est agité lentement au bain-marie pendant 24 heures à 62 C. Les filtres lavés, puis séchés à l'air ambiant sont rassemblés selon la configuration initiale et déposés dans une cassette étanche à la lumière. On recouvre l'ensemble d'une pellicule de plastique type "CELLOFRAIS". L'exposition de l'autoradiographie est effectuée avec un film "Fuji type RXOG" et un écran intensifiant pendant 4 jours à -80'C. Les réactifs mis en oeuvre sont les suivants lxDenhart = 0,28 Albumine bovine (Sigma frac tion V) 0,2% Ficoll 400 0,28 Polyvinylpyrrolidone (PM=44000) CFHM = lxDenhart 0,3% lait écrémé EXEMPLE : EMPREINTES GENETIQUES CHEZ MUSCA DOMESTICA La figure 1 est l'autoradiogramme correspondant à l'hybridation de l'ADN de 5 souches de M. domestica (super KDR, learn, OMS, NAIDM, Hirokawa) par la sonde radioactive pHHd 24. Pour chaque puits correspondant à l'ADN d'une mouche d'une des souches, on observe entre 15 et 30 bandes bien définies, et des profils différents d'un animal à l'autre dans une même souche.Le nombre de bandes est donc suffisant pour, statistiquement, obtenir des profils d'hybridation spécifiques pour chaque animal. EXEMPLE .5 PROFIL DE SEGREGATION SEQUENCES HYPERVA- RIABLES CHEZ M.DOMESTICA La figure 2 est l'autoradiogramme correspondant à l'hybridation de l'ADN d'un couple de mouches et de leur descendance, avec la sonde pHMd 24. Les deux puits extrêmes correspondent aux ADN parentaux et les puits intermédiaires à ceux de la descendance. L'analyse des profils montre que les descendants ont la moitié environ des séquences hypervariables de chaque parent et donc que la transmission des séquences hypervariables se fait de manière Mendelienne. EXEMPLE 6 : DETECTION DE REGIONS HyPERVARIABLES CHEZ D'AUTRES ESPECES a) Chez l'abeille et le moustique Aedes aegypti: La figure 3 est l'autoradiogramme correspondant à l'hybridation de l'ADN d'abeille (puits 1 à 5) et de 1'ADN de A.Aegypti (sondes TUF et ROCK) avec la sonde radioactive pHMd 24. Dans chaque puits on observe la présence de 15 à 30 bandes d'hybridation : ceci montre donc que la sonde pHMd 24 s'hybride avec les séquences hypervariables présentes dans l'ADN génomique de l'abeille et de A. aegysti. b) Chez le mouton Des expériences dthybridation entre de l'ADN génomique de mouton et la sonde pHHd 24 ont permis de montrer une hybridation croisée. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1.) Polynucléotide issu de la mouche domestique, Musez domestica, caractérisé en ce qu'il comprend un motif unitaire de 24 nucléotides de formule I ci-après GAGGTCGXlX2TTX3AGCTX4GTCTATXs (I) dans lequel Xi est C ou T X2 est C ou T X3 est C ou A X4 est C ou T et X5 est A ou G, en ce que ledit motif unitaire est amplifié au moins 35 fois en tandem, en ce qu'il comporte au moins un site de coupure pour Alu I et en ce qu'il est dépourvu de sites de coupure pour les autres endonucléases de restriction. 2 ) Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à la formule II ci-après lue dans le sens 5'----- > 3' actataggccgaattggagctcgtgttaaatattcccttcagcttatctcaaag agcgtcgtctcgaactcctttcacitgcagactccctttgtcgtctat (Il) tcagctcgtctata tcagctcgtctata (GAGGTCGX1X2TX3AGCTX4GTCTATX5) n dans laquelle Xl, Xz, X3, X4 et Xs ont la même signification que ci-dessus et n est égal ou supérieur à 35. 3) Polynucléotide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il répond à la formule III ci-après, lue dans le sens 5'----- > 3' actataggccgaattggagctcgtgttaaatattcccttcacttatctcaaag ectctcttcaqgactcctttcagtcgtcaagaaagactccctttcagtcgtcga gagtgacagccttccattctccaatagtagccaggtctcctttagatgcggtct tcagctcgtctata con GAGGTCGCCTTCAGCTCGTCTATA 1 t g 2 t g a 4 t 7 8 t 10 11 12 (III) 13 14 gaggtcgccttcagctcgtctata (gaggtcgccttcagctcgtctata ) n' où n' est supérieur à 20. 4 ) Sonde polynucléotidique caractérisée en ce qu'elle est constituée par un polynucleotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, marqué à l'aide d'un marqueur approprié. 5 ) Procédé d'obtention des polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on les prépare par voie de synthèse chimique. 6 ) Procédé d'obtention des polynucléotides selon l'un quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'ils sont obtenus par lyse d'un homogénat de broyat d'insectes, suivie du traitement du surnageant de lyse par un solvant d'extraction approprié, de la centrifugation de l'extrait obtenu et de la précipitation de l'ADN d'insecte par addition d'éthanol, après quoi le culot obtenu est soumis à une dégradation enzymatique par une enzyme n'ayant pas de site de reconnaisance dans la séquence du polynucléotide répondant à l'une des formules (I) à (III) et le produit de dégradation, constitué par ledit polynucléotide, est récupéré par extraction, suivie d'une centrifugation et d'une précipitation par addition d'éthanol. 7 ) Procédé d'obtention de la sonde polynucléo- tidique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on réalise le marquage du polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 ê 3, par un marqueur approprié. 8 ) Profil électrophorétique apte & Entre utilisé en tant qu'agent d'établissement d'empreintes géné- tiques d'organismes végétaux ou animaux, caractérisé en ce qu'il comprend un polynuciéotide de formule (I) å (III) selon l'une quelconque des revendications 1 & 3.. 9 ) Profil electrophorétique selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit polynucléotide est associé à un marqueur approprié. 10') Profil électrophorétique selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé en ce qu'il est obtenu par transfert dudit polynucléotide, éventuellement marqué, sur un gel d'électrophorèse portant un marqueur de masse moléculaire approprié, sur lequel le profil est obtenu par migration électrophorétique. 11.) Profil électrophorétique selon la revendication 10, caractérisé en ce que le profil obtenu par migration électrophorétique sur le gel d'électrophorèse est transféré sur une membrane de nitrocellulose, polyamide ou analogue. 12-) Profil électrophorétique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est mis sous forme de bandelettes prêtes à l'emploi, destinées à être associées aux autres éléments d'un kit d'obtention d'empreintes génétiques. 13-) Méthode d'obtention d'empreintes géné- tiques chez l'homme et chez des organismes animaux ou végé-. taux, caractérisée en ce qu'elle consiste à incuber une sonde obtenue par marquage d'un polynucléotide de formules (I) à (III), avec de l'ADN extrait de l'organisme dont on cherche à établir les empreintes génétiques, dans un milieu d'hybridation approprié, pendant une durée et dans des conditions de température appropriées, puis révélation et lecture du profil d'hybridation obtenu. 14') Méthode d'obtention d'empreintes génétiques selon la revendication 13, caractérisée en ce que la sonde de détection et 1'ADN å tester mis en contact d'hybridation sont portés chacun par un support approprié. 15') Méthode d'obtention d'empreintes géné- tiques selon la revendication 14, caractérisée en ce que la sonde est fixée sur une plaque de gel de polyacrylamide ou sur une membrane de nitrocellulose ou de polyamide , mise sous la forme d'un profil électrophorétique. 16) Méthode d'obtention d'empreintes génétiques selon la revendication 14, caractérisée en ce que la sonde est fixée sur un papier filtre.