Brevet FR2648150A1 — publié le 19901214

La présente inventicn se rapporte à la biochimie, la médecine tropicale et la parasitologie, spécialement à un procédé de grande sensibilité et précision pour la détection immunochimique d'Endamoeba histolytica dans les matières fécales. Environ 10 % de la population mondiale est infectée par Endamoeba histolytica. L'amibiase est responsable de 40 000 à 100 000 décès chaque année dans le monde (L'amibiase et la lutte antiamibienne. Bull. OMS 63(5) : 821-831 (1985)). Dans quelques pays, par exemple au Méxique, l'amibiase est i'une des dix causes principales de mortalité par maladie parasitaire et au niveau mondial est seulement précédé par la malaria et la schistosomiase (Walsh. J.A. (1986) Problems in recognition and diagnosis of amebiasis : Estimation of the global magnitude cf morbidity and mortality. Rev. Infect. Dis. 8(2) : 228-238. L'examen microscopique des matrières fécales est assez ennuyeux, difficile, cher et il dépend de l'adresse et de l'expérience du technicien. Même les techniciens les plus expérimentés confondent les trophozoldes d'E. histolytica et les maîrcphages ayant ingéréS des érythrocytes (alsh, 1986). Par ailieurs, à cause de l'excrétion intermittente de kystes, il faut faire l'examen de trois échantillons ou plus sur plusieurs jours afin de détecter de 80 % à 90 % des infections. L'examen d'un seul échantillon par -orsonne uniquement détecte de 40 % à 50 % des cas véritablement infectés (Mathur.T.N. et J. Kaur (1973). The frequency of excretion of cyst of Endamoeba histolytica in known cases of non-dysenteric amoebic colitis based on 21 stool examinations. Indian J. Med. Res. 61:330-333). Malgré l'utilisation de plusieurs procédés différents pour l'examen des matières fécales, on arrive à obtenir beaucoup de faux positifs résultants de la confusion avec les macrophages ou protozoaires non pathogènes. Les procédés actuels pour la détection de ce parasi te sont de deux types : l'appréciation microscopique directe de la morphologie des kystes ou trophozoldes du parasite dans les matières fécales, et les tests immunologiques pour la détection d'antigènes dans les matières fécales. L'observation microscopique est le procédé,habituelle- ment utilisé en clinique. Ce procédé consiste à la dispersion d'un échantillon de matières fécales fraiches ou conservées dans un conservateur approprié dès son évacuation. Cette dispersion peut se colorer avec des colorants appropriés. On observe alors au microscope optique. L'apparition de kystes (ou rarement de trophozoides) d'Endamoeba histolytica est le critère pour considérer un cas positif. Le procédé peut être combiné avec une technique de concentration précise pour kystes de protozoaires. L'observation au microscope a beaucoup d'inconvénients. En premier ieu, le trophozoide est fragile et généralement n'apparait pas dans son intégrité dans les matières fécales. En plus, les personnes infectées n' excrètent pas de kystes dans toutes leursévacuations. D'ailleurs, habituellement' les kystes sont confondus avec ceux des autres protozoaires non pathogènes, ou même avec des cellules de l'h6te ou des particules de nourriture. (Healy. G.R. (1972) Laboratory Diagnosis of a amoebiasis. Clin. Trop. Med. Volume II, Ed. Kevin, M. Cahill University Press : 150-165 : Harrys. J. (1982). Amoebiasis : A review J. Roy ; Soc. Med. 75 : 190-197). D'autre part, on a décrit plusieurs tests immunologiques pour détecter les antigènes dans les matières fécales. Grundy (1987) décrit un Elisa multiphases (Grundy, M.S. A. Voller ; D. Warhurst (1987 An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the detection of Endamoeba histolytica. Antigens in Faecal material. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 81 627-632). Le procédé consiste à sensibiliser une plaque de microtitrage avec des anticorps spécifiques de moutons dirigés contre des antigènes de trophozoides d'E. histolytica. On ajoute ensuite une suspension de matières fécales et on incube pendant 2,5 h à 4 C. On lave la plaque et on ajoute une solution d'anticorps de lapin spécifiques des antigènes d'E. hlstolvtica et on incube pendant d'autres 2,5 h. On lave de nouveau la plaque et on ajcute la solution de conjugués (anticorps de mouton spécifiques des immunoglobulines de lapin conjugués à l'enzyme peroxydase). On lave de nouveau la plaque et cn ajoute alors le substrat de la peroxydase (o-phénylènediamine). On arrète la réaction et cn mesure la densité optique des produits à 492 rm. Ce procédé possède une basse sensibilité, c'est pourquoi les cas porteurs de kystes d'E. histolytica ne sont pas rapportés comme réels. En plus,les matières fécales de patients porteurs d'autres parasites, donnent des résultats plus élevés que ceiles de personnes saines. Un coffret de détection a commencé à être commercialisé par Millipore Co. Il se base sur un test "sandwich-ELISA" développé par Root, D. M. et coll. (Root, D.M. ; F.X. Cole : J. Williamson, (1978). The Development and Standardization of an E'ISA Method for the Détection of Endamoeba histolvtica Antigens in Fecal Samples, Arch, Invest. Med. Mex. 9, 203-210). Le procédé consiste à sensibiliser des disques de 6 mm ce diamètre de matériel immunoabsorbant avec des anticorps spe- cifiques contre les antigènes d'E. histolytica, à disposer ces disques sur une bande qui est immergée pendant 16 heures dans l'échantillon de matières fécales diluées, à laver la bande, à ajouter un deuxième anticorps conjugué avec de la peroxydase à température de chambre pendant deux heures, postérieurement le substrat et finalement, à arrêter la réaction. Le procédé a été retiré du marché à cause de sa basse sensibilité. En plus, il existe des interférences avec les substances qui sont présentes dans les matières fécales, telles que les lipides, pigments biiiaires, sang, quelques médicaments et aliments, ainsi que les substances qui contiennent les humes et les peroxydases ne rut du procécé cadet de la présente demande est la détection sensible et précise d'Endamoeba histolytlca dans les matières fécales. Ce procédé est nouveau par le fait qu'à la différence des procédés précédents, les anticorps @ oec lesquels la sur- face solide est sensibilisée sont spécifiques de l'histolysine, la protéase dépendente de la cysteine d'-E. histolytica. Un autre élément nouveau est que pour l'obtention du résultat intervient l'activité enzymatique de l'histolysine sur un substrat spécifique. On n'a pas besoin alors de l'addition d'une autre enzyme (conjuguée). Ce fait augmente la spécificité du procédé, car l'hîstolysine n'a jusqu'à présent été trouve que chez E. histolytica. Le procédé a pour objet la sensibilisation d'une surface solide en polystyrène, chlorure de polyvinyle ou autre surface synthetique ou Staphylococcus aureus avec une solution (0,05-2 um/ml) d'anticorps spécifiques contre l'histolysine. Cette surface solide est ensuite mise en contact pendant 1 à 24 heures avec une dilution de matières fécales (5 % à 50 %). On lave la surface solide cinq fois avec du PBS-T20 (Tampon phosphate salin, 0,05 % TWEEN 20). On ajoute un tampon pH 6-9,5, qui contient de la cystéine ou du 2-2 dithiothreitol 0,5-2 nM, et une concentration entre 0,05 et 10 nM du substrat ayant pour formule Benzyloxycarbonyle-X-Y-C où X = Arginyle ou phénylalanyle Y = Arginine C = Béta-naphtylamide ou amino méthyl coumarine ou NPhNO2 On incube pendant 1 à 72 heures à 25 à 400C et les produits de réaction coloriés sont déterminés d'une façon visuelle ou spectrophotométriquement et les produits fluorescents par appréciation visuelle de la fluorescence sous la lumière ultraviolette ou par un fluoromètre. On peut effectuer la détermination des produits alter nativement après avoir retenu la réaction par addition de solution retardatrice qui contient un inhibiteur de l'histolysine, ou par variation du pH ou dénaturalisation de l'histolysine. Cette solution retardatrice peut contenir 4-diazo-2',3-diméthylazobenzène (22,5 ug/ml) ou acétate de sodium monochloré 100 nM. Exemple de mise en oeuvre de l'invention Exemple N 1 On sensibilise une plaque en chlorure de polyvinyle avec une solution d'anticorps spécifiques contre l'histolysine (0,05 ug/ml). Alors on place sur la plaque une dilution à 50 % de matières fécales de patients atteints par E. histolytica et de personnes en bonne santé pendant 24 heures. On lave ia surface de la plaque cinq fois avec PBS-T20. On ajoute le substrat (TRIS 20 mM pH 7,5, 2 nM, 2,2 dithiothreitoi, benzyloxycarbonyl-arginyle-arginineamino méthyl coumarine 2 mM) et on incube a 400C pendant i neure. On ajoure de l'acide acétique jusqu'à obtenir pH 3 et an observe ie résultat cctenu en illuminant la plaque avec des rayons ultraviolets (360 nm). On observe la fluorescence dans les parties ae ia plaque où l'on a ajouté les échantillons des patients infectés. Exemple N02 On sensibilise une plaque en polystyrène avec des anticorps spécifiques, contre l'Xistolysine (2 ug/ml). On place sur la plaque une dilution de matières fécales positives et négatives à 5 % pendant une heure à 40C. La surface de la plaque est lavée cinq fois avec PBS-T20. On ajoute le Tampon du substrat (Carbonate-bicabonate 200 nM, Ph 9,5, 0,5 nM Cystéine, benzyloxycarbonyle-phénylalanylearginine-amino-méthyl coumarine, 0,05 nM) et on incube à 25 C pendant 48 heures. Le mélange de réaction est lu dans un fluorimètre. L'appareil est réglé à 100 % de fluorescen- ce avec une solution à 0,0625 nM d'amino méthyl coumarine, longueur d'onde d'excitation 360 rsn et longueur d'onde d'émission 460 nm. On obtient des valeurs majeures à 1 pour des échantillons positifs. Exemple N"3. On sensibilise une suspension de S. aureus avec une solution d'anticorps spécifiques contre l'histolysine (0,0; ug/ml). La suspension est mise en contactavec une dilution (20 %) de matières fécales de personnes positives et négativers pour E. histolytica pendant 3 heures. On lave trois fois par centrifugation et résuspension des staphylocoques. On ajoute du tampon pH 7,5, benzyloxycarbonyle-arginylearginine-4-méthoxy-béta-naphthylamide 10 nM. On incube pendant 1 heure à 40"C. On arrête la réaction avec de l'acide éthylène diamino tétra acétique 0,9 %, TWEEN 20 1 %, 4-diazo-2', 3-diméthylazobenzène (22,5 ug/ml). On centrifuge et on lit la densité optique à 520 nm dans le surnageant. Les cas positifs pour E. histolytica montrent une densité optique majeure à 0,300. Afin de montre l'efficacité du procédé proposé on a effectué une analyse de 150 volontaires. On a recueilli les matières fécales qui correpondent de 3 à 6 dons différents de ces volontaires. Tous les échantillons on été analysés par des techniciens en microscopie expérimentés par le procédé convehtionnel microscopique (avec la technique de la concentration. Parallèlement on a effectué la détermination par le procédé proposé dans la présente demande de brevet. Dans le tableau 1 sont reportés les résultats obtenus de l'analyse faite par les deux procédés. Résultats de l'analyse par le pro cédé proposé dans la présente demand (+) Résultats de l'analyse (+) 28 4 microscopique (-) 0 118 Parmi les cas positifs par microscopie on a pris 8 cas pour leur faire une analyse de comparaison de la sensibilité : 4 ont été positifs en microscopie dans le premier examen, 2 après 3 examens et 2 après 6 examens, ce qui confirme la meilleure sensibilité de la présente invention, qui est comparable-à l'analyse par microscopie de 6 échantillos de matières fécales de dons différents. Il y a des éléments qui suggèrent que les 4 cas négatifs par le présent procédé et positifs par microscopie sont des erreurs dans la détection microscopique. En premier lieu, les susdits cas ont été positifs, seulement dans la première série de six déterminations par microscopie. En second lieu, les matières fécales de ces personnes ont été cultivées en milieu Robinson ayant pour but de mettre a l'écart E. histolytica, et dont on n'a pas pu isoler l'organisme. On a analysé aussi les matières fécales de patients avec d'autres parasites intestinaux, non porteurs á'E. histolytica. Les résultats sont montrés dans le tableau 2. Tableau 2 Analyse des réactions croisees ave d'autres parasites intestinaux. Parasite Résultat par le procédé proposé observé .-) (+) T. TRICHIURA 33 0 G. LAMBLIA 10 0 E. NANA 34 o E. COLI 12 0 B. HOMINIS 30 0 S. STERCORALIS 3 0 A. LUMBROCOIDES 5 0 E. VERMICULARIS ~ 12 0 On n'a pas observé de réacrions croisées avec d'autres parasites. Les cas positifs ont reçu un traitement anti-amibien (diloxanide 500 mg/8h pendant 10 jours). Les matières fécales de 8 d'entre eux ont été receuiilies 10 jours après avoir fini le traitement et analysées. Tous les cas ont été alors négatifs. Un groupe de cinq échantillon positifs et cinq échantillons négatifs a été analysé immédiatement après évacuation et après avoir été conservé à 250C pendant une semaine. On n'a pas observé de variations significatives dans les résultats. Avantages de la solution proposée Le présent procédé possède une spécificité supérieure, car la spécificité de l'interaction anticorps-antigènes est potentialisée par la spécificité enzyme-substrat. C'est pour cela qu'il est possible d'ajuster les conditions du procédé afin d'obtenir une sensibilité supérieure. Cela permet la détection fiable d'amibiases intestinales par un seul echantiisson de matières fécales (par rapport à 6 ou plus nécessaires pour le diagnostic par microscopie). Etant donné que le procédé a pour objet la détermination de l'activité enzymatique, on nta pas besoin de la présence du parasite intact (soit dans une forme de kyste soit trophozoitique) dans i'échantilion analysé. Les échantillons peuvent se maintenir en congélation sans date limite précise, ou a 250C pendant, au moins, une semaine. Dans le procédé n'intervient pas l'appréciation des caractéristiques morphologiques du parasit , c'est pour cela qu'on évite l'erreur inhérente à l'adresse de l'observa- teur. Du fait de son efficacité supérieure et son bas coût, ce procédé peut être employé pour le dépistage dans la population. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la détection d'Endamoeba hlstolvtica dans les matières fécales, utilisant une surface solide en polystyrène, chlorure de polyvinyle, micro-organismes tels que par exempie Stathvlococcus aureus, ou autre matériel synthétique ou naturel sensibilisé avec des anticorps sur laquelle a lieu une réaction enzymatique chromogénique ou fluorogénique,caractérisé en ce qu'on sensibilise la surface solide avec une solution de 0,05 à 2 mg/ml d'anticorps spécifiques contre l'histoiysine, ladite surface solide étant mise en contact avec une dilution de matières fécales (5-50 %) de 1 heure a 24 heurs et étant lavée cinq fois avec DBS-T20 (Tampon phosphate salin, 0,05 % TWEEN 20), on ajoute le tampon-substrat et on incube de 1 heure å 72 heures de 250C à 400C. 2. Procédé selon ia revendication l,caractérisé en ce que ie tampon substrat, pH 6-9,5 contient de la cystéine ou du 2-2',dithiothreitol 0,5-2 mM et une concentration de 0,05 a 10 mM du substrat ayant pour formule Benzyloxycarbonyle-X-Y-C où : X = Argiryle ou phénylalanyle Y = Arginine C = Béta-naphtylamide ou 4-métn'oxy- 2-napntylamide cu go amino méthyl coumarine ou N?hNO