Brevet FR2638099A1 — publié le 19900427

La présente invention concerne un immunoadsor- bant à faible taux de relargage, comportant un anticorps et un support chromatographique. Un immunoadsorbant est défini comme étant un anticorps monoclonal ou polyclonal fixé directement ou indirectement à un support chromatographique solide du type résine ou gel et conservant la totalité ou la plus grande partie de son affinité initiale, avant liaison au 1n support, pour un antigène correspondant. L'affinité anticorps-antigène est à la fois très forte et sélective et permet ainsi la capture sélective de l'antigène par mise en contact d'une solution diluée de ce dernier avec l'immunoadsorbant. Le rinçage au- moyen d'une solution dissociante permet, en diminuant l'affinité de l'anticorps fixé au support pour l'antigène, la libération de ce dernier et sa récupéra- tion dans la solution dissociante. Cependant, l'antigène ainsi obtenu n'est pas on parfaitement pur car il contient toujours une proportion non négligeable de substances, notamment d'anticorps ou de fragments d'anticorps provenant de l'instabilité de l'immunoadsorbant. Cette instabilité se situe à trois niveaux: - la fragilité du support lui-mime, surtout lorsqu'il s'agit d'un gel de polysaccharide; - la fragilité de la liaison chimique entre le support et l'anticorps; - l'instabilité de l'anticorps lui-même, sen- 3n sible aux agents protéolytiques présents dans la prépa- ration à purifier et clivable en fragments Fab et Fc ou même en domaines (Biochim. 3. 1971 123, 538; Connell GE and Porter R.R., Biochemistry, 1=73, 12, 1130; Hochman 3., Imber Q. and Givo! D.). La contamination des effluents des colonnes d'immunopurification par les anticorps ou fragments de ceux-ci constitue un problème important. En effet, si les effluents sont destinés à un objectif analytique, l'anticorps ou ses fragments peuvent interférer dans les dosages de l'antigène qui présente alors des valeurs de concentration plus faibles que la réalité, du fait de la disparition d'une partie de l'antigène à doser par com- plexation du type anticorps-antigène. De même, si les effluents doivent servir à la préparation d'un médicament, les anticorps ou fragments de ceux-ci sont considérés comme des impuretés immunogé- niques d.e l'antigène purifié. Il convient alors de con- tinuer la purification du mélange obtenu dans les ef- fluents des colonnes d'immunopurification par l'utilisa- tion d'une technique telle que filtration sur colonne échangeuse d'ions ou filtration sur une colonne protéine A-sépharose. Cette étape supplémentaire ne permet pas d'éliminer totalement les produits relargués et a l'in- convénient général de diminuer fortement le rendement en antigène d'une pureté suffisante pour être utilisé dans la fabrication d'un médicament. Les résultats présentés dans la publication Thrombosis and Haemostasis 59(3), 364-371 (1988) mon- trent que le relargage en anticorps monoclonal (anti- vWF) peut être réduit en sélectionnant la méthode de couplage entre l'anticorps anti-vWF et le support chro- matographique constitué par du Sephacryl S-1000. En effet, lorsque le Sephacryl S-1000 est activé à la benzoquinone selon la méthode de Brandt et al (Biochim. 8iophys Acta 1975; 386: 196-202), le relargage en anticorps monoclonal anti-vWF est minimal mais atteint cependant environ 90 ng/cm d'immunoadsorbant (soit environ 75 ng/ml d'éluant). Ainsi, bien que la méthode d'élution à la triéthanolamine permettrait une lyophilisation directe des éluants, la forte teneur en impuretés oblige la mise en oeuvre d'un procédé de purification supplémentaire afin d'obtenir un médicament d'une pureté suffisante. Afin de remédier aux inconvénients rappelés ci-dessus, la Demanderesse s'est fixé comme but l'obten- tion d'un immunoadsorbant o le taux de relargage est considérablement réduit par rapport aux meilleurs résul- tats de l'art antérieur. Ce but- est atteint par l'objet selon la présente invention constitué par un immunoadsorbant à faible taux de relargage, comportant un anticorps et un support chromatographique, qui se caractérise en ce qu'il comprend à l'échelle moléculaire: a) des molécules d'anticorps, chacune d'entre elles liée de façon covalente à plusieurs chaînes latérales comportant chacune un radical biotinyle, au moins une de cesdites chaînes étant engagée dans une liaison d'affinité avec une molécule d'avidine liée de façon covalente audit support chromatographique, au moins une de cesdites chaînes étant libre et constituant un ligand potentiel du type biotine d'un site avidine d'une molécule du type avidine; b> des molécules d'avidine liées de façon covalente audit support chromatographique et comportant des sites libres, récepteurs potentiels de ligands du type biotine. Les molécules d'avidine peuvent être d'origines biologiques diverses, notamment avidine de l'oeuf et streptavidine. Ainsi, un immunoadsorbant selon la présente invention a, en plus de sa capacité de capture d'anti- gène correspondant à chaque molécule d'anticorps, une capacité de capture de haute affinité de molécules du type avidine et une capacité de capture de haute affi- nité de molécules du type biotine. 263S099 Ainsi, une solution comportant des molécules de biotine libre (non complexée par de l'avidine). est déplétée de sa biotine par contact avec un immunoadsor- bant selon la présente invention. De même, une solution comportant des molécules d'avidine libre (non complexée par de la biotine) est déplétée de son avidine par contact avec un immunoadsor- bant selon la présente invention. Cette double capacité intrinsèque de capture à In la fois de la biotine et de l'avidine est une propriété générale de tout immunoadsorbant selon la présente invention. Lorsque la solution entrant en contact avec l'immunoadsorbant selon l'invention ne contient pas des 1t5 quantités saturantes en biotine ou avidine des sites actifs libres du type biotine ou avidine dudit immuno- adsorbant, la double capacité de capture de molécules du type avidine et biotine s'exprime sur les constituants de l'immunoadsorbant et s'oppose ainsi au relargage dans les effluents de fragments de l'immunoadsorbant pouvant entrer dans une liaison de forte affinité du type avidine-biotine, notamment molécules ou fragments de molécules d'anticorps ayant une chaîne latérale comportant un radical biotinyle. Ceci a pour effet de réduire considérablement les taux de relargage de l'immunoadsorbant, aussi bien lors de la phase de cap- ture de l'antigène que pendant le déblocage de celui-ci par une solution d'éluant dissociant. Selon un autre aspect de l'invention, afin de se prémunir contre le relargage de fragments de l'antigène produits par protéolyse, le nombre moyen de chaînes latérales biotinylées par molécule d'anticorps sera compris entre 3 et 20 et de préférence entre 12 et , de façon à ce que ces chaînes soient distribuées statistiquement sur toute la surface de l'anticorps et qu'il y en ait de préférence au moins une par domaine d'anticorps. Le calcul théorique suivant modélise un immunoadsorbant polybiotinylé selon l'invention o l'anticorps n'est pas fragmenté par des protéases. L'immunoadsorbant placé dans une colonne est instable et libère l'anticorps avec la constante de vitesse k'. La contribution dC à la concentration d'anticorps libéré, durant un intervalle de temps dt est: dC = k'.C.dt o o C est la concentration d'anticorps dans l'immunoad- o sorbant et qu'on suppose constante car sa variation est négligeable. A la sortie de la colonne, cette contribu- -kt tion se trouve atténuée par la fraction e o k constante de réassociation, est la probabilité élémentaire de re-capture et t la durée de transit (voir Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1975 72 4840-4843 Denizot FC and Oelaage M.A.). La concentration C éluée représente la somme e de toutes les contributions élémentaires et en supposant la colonne illimitée: tk = k C = k.C e -ktdt = -- Co e o _t = 0 k la constante de réassociation k est une constante appa- rente du premier ordre qui s'écrit k = k.c a a o k est la constante de vitesse du deuxième ordre pour a la réaction d'association avidine-biotine et cau la con- centration en sites avidine libre. Il vient donc k'.C o C - e ka.Ca On voit que la concentration Ce éluée d'anti- e 3R corps est proportionnelle à Co Par conséquent, il sera Ca' avantageux d'augmenter le rapport R du nombre total de molécules d'avidine liées au support sur le nombre total des molécules d'anticorps biotinylées de façon à diminuer C --o Ca Ce rapport R sera de préférence d'environ 3 et plus. Selon un autre aspect préféré de l'invention. l'immunoadsorbant aura un taux en anticorps polybio- tinylé compris entre 0,1 et 5 mg par cm d'immunoadsor- bant. La présente invention comporte également un procédé d'obtention d'un immunoadsorbant, caractérisé en ce qu'on effectue les opérations suivantes: a) on fixe de manière covalente des molécules d'avidine à un support chromatographique en utilisant une méthode connue pour conserver aux molécules d'avidine ainsi greffées des sites libres, récepteurs potentiels de ligands du type biotine; ?Ce b) on choisit un anticorps spécifique d'un antigène déterminé puis on fixe de façon covalente sur cet anticorps des chaines contenant chacune un radical biotinyle de manière à obtenir un anticorps polybio- tinylé; ?5 cc on mélange, en présence éventuellement d'un solvant de dilution notamment du tampon phosphate isotonique (PBS), l'anticorps polybiotinylé obtenu en b> avec un excès du produit obtenu en a) de façon à ce qu'il reste des sites avidine libres, récepteurs potentiels de ligands du type biotine, notamment anti- corps polybiotinylé. D'autres aspects et avantages de l'invention ressortiront de la description d'exemples qui va suivre. donnée à titre purement illustratif. Exemole 1 Préparation d'un immunoadsorbant comportant un anticorps monoclonal anti-vWF polyvbiotinvlé par plusieurs radicaux biotinvie et de l'avidine greffée sur un support chromatoQraphiaue. 1. Préparation du suooort chromatoqraphiaue avidine-Seohacryl. Le Sephacryl S-1000 (Pharmacia) est activé par la benzoquinone (Merck) selon la méthode de Brandt et coll. (8iochem. 8iophys. Acta 1975, 386, 196-202). Un volume de gel activé est incubé une nuit à 4-C sous agitation avec un volume d'une solution d'avidine (BioPartners, Bastogne) à 4 mg/ml dans du phosphate de sodium à pH 8. Le gel est ensuite incubé 4 heures à température ambiante en tampon glycinate de sodium à pH 8,5. Puis il est placé successivement une heure en tampon d'acétate de sodium 0,1 M, NaCl 1 M., de pH 4 et une heure en tampon borate de sodium 0,02 M, NaCl 1 M., de pH 9. Finalement il est lavé avec du PBS et conservé dans 80 Z de PBS mélangé à 20 Z d'éthanol. 2. Détermination du nombre de sites de liaison Dour la biotine sur le gel avidine-Seohacrvl obtenu ci- dessus Un dosage radio-immunologique par compétition est effectué comme suit: Pi d'une solution de PBS/BSA (sérum albumine bovine)/Tween contenant 20 mg de gel avidine-Sephacryl sont mélangés avec 1io pl d'une solution de 3H-biotine (Amersham) et 100)l d'une solution de biotine froide de concentration connue (entre 10-8 et 10- 7 mole/ ml) dans une solution PBS/BSA/Tween. Après une nuit d'incubation à température am- biante, le gel est lavé deux fois avec 1 ml de NaCI 0,15M. Les solutions de lavage sont prélevées et la radioactivité contenue dans les surnageants est évaluée avec un compteur en présence d'Instagel (Packard) comme liquide scintillant. La fraction libre de H-biotine est exprimée en fonction de la quantité connue de biotine froide. Une droite est obtenue. Son intersection avec l'axe des abscisses permet de calculer le nombre maximal de sites libres, récepteurs potentiels d'un ligand du type biotine, du gel avidine-Sephacryl. Ces sites correspon- dent à 3,2 mg d'avidine par ml du gel, soit 145 nano- moles de sites par ml du gel, au maximum. 3. Préparation de l'anticorps monoclonal anti- vWF humain. L'anticorps choisi est anti-Facteur de von Willebrand humain (vWF) et provient d'un hybridome sélectionné après une série d'hybridations de cellules du myélome X63 de souris et de splénocytes de souris BALB/C immunisées avec le complexe FVIII/vWF selon les modes opératoires et de sélection décrits dans Thrombosis and Haemostasis 59(3), 364-371 (1988), O. Méjan et al, ou le brevet FR 84-14480 publié sous le N' 2.570.276.- L'anticorps retenu anti-vWF couplé directement à des particules solides gel de Sépharose 48 ou Ultrogel AcA22, a montré à la fois: - une capacité à fixer le complexe FVIII/vWF - une aptitude à relâcher le complexe FVIII/ vWF en milieu alcalin (pH 8,7 à 10,4), les activités antihémophiliques A et Willebrand du complexe fixé puis relâché étant testées in vitro. Cet anticorps retenu (AcM) par les tests pré- cédents est purifié à partir du liquide d'ascite, par chromatographie d'affinité sur protéine A-Sépharose puis dialysé toute une nuit à 4'C contre un tampon borate de sodium 0,02 M, pH 8,2. La concentration protéique est ajustée à 1 mg/ml. La biotinylation est réalisée avec un excès molaire de 20 fois en ester biotinamidocaproate N- hydroxysuccinimide. Cet ester réactif est dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour obtenir une solution de 10 mg d'ester/ml de DMSO. Cette solution est ajoutée à la solution de AcM de concentration 1 mg/ml dans du tampon à pH 8,2 et le mélange est laissé à la tempé- rature ambiante pendant 30 minutes. La réaction d'acylation des groupes amines des résidus lysine de l'anticorps est arrêtée par l'addition de NH4Cl 1,. pH 7,5 en un rapport de 10 volumes pour un volume du mélange cidessus. Les chaines latérales ainsi formées comportent chacune un radical biotinyle et sont chacune dans une liaison covalente amide avec un groupe amine de 1i l'anticorps. L'excès de produit biotinylant est éliminé par dialyse contre du PBS. Le rapport des densités optiques DO 280 nm/DO 260 nm doit être entre 1,5 et 1,7 pour le produit dialysé. 4. Préparation de l'immunoadsorbant L'AcM polybiotinylé ci-dessus est mélangé une nuit à 4'C avec le gel avidineSephacryl à raison de 0,8 mg d'AcM polybiotinylé par ml de gel. Le produit ainsi obtenu est ensuite incubé une heure à température ambiante en tampon pH 4 puis 9. Finalement, il est stocké dans un liquide contenant 80 Z de PBS et 20 ' d'éthanol. Après immobilisation de l'AcM polybiotinylé, l'immunoadsorbant conserve 6,5.10-11 moles de sites avidine libres (récepteurs potentiels de ligands du type -8 biotinel par mg d'immunoadsorbant (soit 6,5.10 a moles de sites/ml d'immunoadsorbant). Résultats L'immunoadsorbant précédent a une concen- tration en anticorps polybiotinylé de 5.106 M et une -5 concentration c en sites avidine de 6,5.10 m. On a prépare avec celui-ci une colonne remplie sur 10 cm de hauteur et on élue cette colonne avec un éluant (tampon triéthanolamine 100 mM, pH 10) avec un flux de 80 ml/ h/cm3. On observe une concentration en anticorps relargués de 0,2 + 0,1 ng/ml d'éluant (soit 1.3.10 12 0,7 M). Dans un essai effectué parallèlement, on utilise une colonne de dimensions identiques remplie à la même hauteur par un immunoadsorbant de l'art antérieur ou le même anticorps anti-vWF est couplé directement au même support chromatographique (Sephacryl S-1000) par la méthode à la benzoquinone (O. Méjan, publication ci-dessus référencée). Ensuite, on élue avec le même éluant (tampon triéthanolamine 100 mm, pH 10). Le relargage en -10 anticorps est alors de 4,8.10 M. Confrontation avec un modèle théorique Les valeurs précédentes permettent d'évaluer la proportion k' d'anticorps détachés de l'immunoadsor- 2n t bant de l'exemple 1: -10 4,8.10- X 80 -7 -1 k' = 2,1.10 -sec -6 5.10 X 10 X 3600 sec Donc, pour une concentration en sites avidine de 6,5.10 5 M et une constante de vitesse d'association 4 -l - avidine-biotine de k 10 M.sec.. Le relargage a attendu est de: 2,1.10- X 5.10 X M c 1,6.10-1 M e=5 4 6,5.105 X 10 La valeur expérimentale observée de 1,3.10 12M est donc très proche de cette valeur théorique. Le temps de recapture tr est estimé: Log 2 0,7 X sec tr -- _ _ _ _ _ = 1, 1 sec k.c 6,5. 10- X 10 a a 26d8099 Le temps de transit observé sur la colonne expérimentale ci-dessus est de 450 sec et l'approxima- tion, qui a consisté à considérer dans les calculs précédents la colonne comme illimitée, trouve ici sa justification. Démonstration d'un phénomène de stabilité dynamique L'AcM ou ses fragments et domaines qui se détachent de l'édifice moléculaire de l'immunoadsorbant peuvent être récupérés par les molécules d'avidine liées par liaison covalente au support, dans la mesure ou l'AcM, ses fragments ou domaines sont eux- mêmes pourvus d'une chaine biotinylée. La stabilité apparente du gel est alors une stabilité dynamique. Par, ailleurs, les molécules d'avidine peuvent créer, par l'intermédiaire des radicaux biotinyle des chaines latérales fixées de manière covalente à l'AcM, un réseau tridimensionnel qui stabilise la liaison de l'AcM au support chromatographique. Afin d'évaluer la part respective de ces deux phénomène, les sites résiduels avidine de l'immunoadsor- bant de l'exemple I ont été saturés par de la biotine et on a contrôlé le relargage en AcM et fragments par une technique ELISA, en sandwich spécifique des chaînes L d'immunoglobulines de souris. Dans ces conditions d'élution (tampon tri- éthanolamine. pH 10) un relargage de 1,2.10 laM a été observé, proche de la valeur trouvée de 4,8.10 M10 pour un immunoadsorbant témoin o le même anticorps (non polybiotinylé> est fixé directement sur du Sephacryl S-1000 activé à la benzoquinone. Il a été-indiqué ci-dessus que l'immunoadsor- bant de l'exemple 1, relargue de l'anticorps dans le même éluant à une concentration de 1,3.1012 + 0,7M. Ainsi, la saturation par de la biotine des sites libres des molécules d'avidine liées de façon covalente au support a bien supprimé la stabilité dynamique qui représente l'essentiel de la stabilisation de l'AcM dans l'immunoadsorbant selon la présente invention. Exemple 2 Utilisation de 1'immunoadsorbant de l'exemple 1 pour l'immunopurification du comolexe facteur VIII/vWF humain à partir du plasma. Cet immunoadsorbant permet d'obtenir un complexe FVIII/vWF ayant une contamination maximale de ng d'AcM murins pour 100 U.I. de FVIII du complexe immunopurifié à 2 U.I./ml Dans le cadre d'un traitement antihémophilique A chez l'homme, ces quantités semblent pouvoir être injectées sans danger d'après Hrinda et coll. Symposium international INSERM "Biotechnologie des protéines du plasma" Nancy 17-19 mai 1988 Communication orale: Monoclonal antibody purification of plasma proteins removes viral contaminants. Exemple 3 t Préparation d'un immunoadsorbant comportant un anticorps monoclonal anti-hFSH ("Follicule stimulatinq hormone") polvbiotinvlé et de l'avidine greffée sur un support chromatooraohioue. L'anticorps monoclonal utilisé est un anti- hFSH (N' 32621-Benkirane et al, 3. Immunol. Meth., 1987, 98 pp. 173-181). Cet anticorps est polybiotinylé par de l'ester biotinamidocaproate Nhydroxysuccinimide à raison de 8 Z en poids d'ester par rapport au poids de l'anticorps par mélange durant 15 minutes sous agitation modérée. La réaction d'acylation est bloquée par l'ajout d'une solution aqueuse 10 mM en NH4Cl, La solution résultante est dialysée contre du PBS. Le gel Séphacryl S-1000 avidiné comme dans l'exemple 1 est lavé avec 5 volumes de NaCI 0,15 M. puis on mélange l'anticorps anti-hFSH polybiotinylé avec le gel à raison de 1 mg d'anticorps par ml de gel pendant 18 à 24 heures, à 4'C, sous agitation rotative. Le produit ainsi obtenu est lavé avec 5 volumes d'une solution de NaCl 0,15 M, puis avec 5 volumes d'une solution acétate de sodium 1M, NaCI 1M à pH 4 avant d'être équilibré et stocké dans une solution de NaCl 0.15 M contenant 10 mH d'azoture de sodium ou dans une solution de PBS 80 Z et d'éthanol 20 Z à pH 7,2. 2' Utilisation pour une immuno-épuration et l'obtention d'un sérum zéro en h FSH. On prépare une colonne d'environ 100 ml chargée de l'immunoadsorbant cidessus (100 mg d'anticorps> et l'on fait passer 10 litres de sérum à ml/heure. La colonne est à température' ambiante. Le réservoir de sérum à éluer et les fractions récoltées sont maintenus à 4'C (volume de chaque fraction: 1 li- tre). Les dix fractions récoltées sont chacune testées en h FSH en RIA avec et sans surcharge. La concentration résiduelle en h FSH est indétectable (inférieure à 0.1 U.I./litre de sérum épuré, ce qui correspond à une épuration d'au moins 99,9 ZX. D'autres essais ont été effectués en rempla- çant l'ester biotinamidocaproate N-hydroxysuccinimide par l'ester dbiotinyl-N-hydroxysuccinimide en opérant selon le mode préparatoire de l'exemple 1. On obtient un anticorps anti-vWF polybiotinylé. Le nombre moyen de molécules de biotine couplées à chaque molécule d'AcM est déterminé en utilisant de l'ester 3H-d-biotinyl-N- hydroxysuccinimide (Amersham) à 10.000 cpm par ml et en mesurant la radioactivité associée à l'AcM ainsi poly- biotinylé. Les mesures donnent 12 chaînes latérales comportant chacune un radical biotinyle, par molécule d'AcM. Enfin, d'autres essais ont montré qu'en changeant les conditions de 1*acylation de 1'AcM par l'ester réactif ci-dessus, il était possible de greffer en moyenne de 3 à 20 chaînes biotinylées sur chaque molécule d'AcM. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification notamment au niveau des équivalences pourra y être apportée, sans sortir de son cadre. !5 REVENDICATIONS 1. Immunoadsorbant à faible taux de relargage comportant un anticorps et un support chromatographique, caractérisé en ce qu'il comprend, à l'échelle molécu- laire: (a) des molécules d'anticorps, chacune d'en- tre elles liée de façon covalente à plusieurs chaînes latérales comportant chacune un radical biotinyle, au moins une de cesdites chaines étant engagée dans une liaison d'affinité avec une molécule d'avidine liée de façon covalente audit support chromatographique, au moins une de ces dites chaines étant libre et consti- tuant un ligand potentiel du type biotine d'un site avidine d'une molécule du type avidine; (b) des molécules d'avidine liées de façon covalente audit support chromatographique et comportant des sites libres, récepteurs potentiels de ligands du type biotine. 2. Immunoadsorbant selon la revendication 1, caractérisé en outre en ce que l'anticorps est monoclo- nal. 3. Immunoadsorbant selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal est anti- vWF et provient d'un hybridome sélectionné après une série d'hybridations de cellules de myélome X63 de souris et de splénocytes de souris BALBIC immunisées avec le complexe FVIII/vWF humain. 4. Immunoadsorbant selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal est anti-h FSH. 5. Immunoadsorbant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit support chromatographique est un gel du type Séphacryl. 6. Immunoadsorbant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le rapport du nombre total des molécules d'avidine liées au support sur le nombre total des molécules d'anticorps est d'environ 3 et plus. 7. Immunoadsorbant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre moyen de chaînes latérales biotinylées par molé- cule d'anticorps est compris entre 3 et 20. 8. Immunoadsorbant selon la revendication 7. caractérisé en ce que ledit nombre moyen est compris entre 12 et 20. 9. Immunoadsorbant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le taux en anticorps polybiotinylé est compris entre 0,1 et mg par cm d'immunoadsorbant. 10. Procédé d'obtention d'un immunoadsorbant, caractérisé en ce qu'on effectue les opérations sui- vantes: (a) on fixe de manière covalente des molécules d'avidine à un support chromatographique en utilisant une méthode connue pour conserver aux molécules d'avidine ainsi greffées des sites libres, récepteurs potentiels de ligands du type biotine; (b) on choisit un anticorps spécifique d'un antigène déterminé puis on fixe de façon covalente sur cet anticorps des chaînes contenant chacune un radical biotinyle de manière à obtenir un anticorps polybio- tinylé; (c) on mélange, en présence éventuellement d'un solvant de dilution notamment du tampon phosphate isotonique (PBS), l'anticorps polybiotinylé obtenu en (b) avec un excès du produit obtenu en a) de façon à ce qu'il reste des sites avidine libres, récepteurs poten- tiels de ligands du type biotine. notamment anticorps polybiotinylé.