Brevet FR2646606A1 — publié le 19901109

La présente invention se rapporte à un rétrovirus le HIV-NDK et ses mutants. La structure génomique du virus SIDA, le virus d'immunodéficience humaine (HIV) a été bien établie. Ainsi, les séquences nucléotides de prototypes du LAV1 ou du HTLVIllB ont révélés une organisation complexe incluant trois gènes structuraux et au moins cinq gènes régulateurs. Cependant, la même organisation génomique quoique conservée dans plusieurs variants de l'Amérique du Nord, de l'Europe et de l'Afrique a été néanmoins accompagnée d'une - grande hétérogénéité génétique plus particulièrement dans l'extrémité 3' du gène env codant pour la glycoprotéine externe gap 120. Parallèlement à cette variation génomique, tous les isolats sont caractérisés par l'effet cytopathique (C.P.E.) sur les cellules CD4+ consistant en une dégénérescence massive de la population cellulaire. Une perte ou un gain dans cette cytopathogénicité des isolats HIV a récemment été mis en évidence par plusieurs groupes de chercheurs qui tend à indiquer qu'une variation biologique du HIV 1 peut exister à l'intérieur d'un seul patient. Ainsi des chercheurs ont décrit l'existence naturelle de variants d'isolats HIV I obtenus à diverses étapes de l'infection dans les individus : ces variants- révèlent un effet cytopathique accru in vitro qui correspond à la progression de la maladie. D'autre part, un effet cytopathique réduit à été démontré après l'introduction de délétion à l'intërieur de l'extrémité 3' du génome viral couvrant les gènes env et nef.Ainsi, des mutants résultants de délétions dans diverses parties du gène env ont mis en évidence une importance critique de quelques acides aminés pour l'infection virale et/ou la cytopathogénicité, suggérant ainsi des "distortions" entre la réplication virale et l'induction de syncitia. Plus précisément la présente invention se rapporte à un rétrovirus HIV dit NDK, hautement cytopathogène, caractérisé en ce qu'il s'agit du virus ayant la structure correspondant à la figure 2 ainsi que de ses mutants. Cette souche HIV 1-NDK a été isolée d'un patient porteur de SIDA. L'inoculation de ce HIV dit NDK isolé au chimpanzé induit une déplétion T4, la souche HIV 1-NDK est la seule souche capable de développer un tel effet in vivo. C'est pourquoi la présente invention concerne, non seulement comme cela a été dit précédemment, ce nouveau virus ainsi que ses mutants, mais également des fragments d'ADN dudit virus qui codent pour l'une des protéines du virus, en particulier pour les protéines antigéniques chez les primates. Par mutants du virus HIV-NDK, on entend désigner les virus HIV de type HIV 1 qui ne sont pas inhiber par OKT4A. Dans ce qui suit, on utilisera la terminologie HIV-NDK pour désigner aussi bien le virus lui-même, représenté à la figure 2, que ses mutants car la propriété de ne pas être inhibé par OKT4A distingue clairement cette classe de virus des autres virus HIV I tels que ROD ou BRU. Bieq entendu, parmi les protéines antigéniques en cause, il faut citer, plus particulièrement, les protéines correspondant à des composants structuraux du virion, en particulier les protéines antigéniques ou les fragments antigéniques des produits d'expression des gènes gal, pol ou env. Comme cela sera décrit plus en détail dans les exemples, parmi les séquences d'amino-acides présentant un intérêt tout particulier, il faut citer certaines séquences de la protéine d'enveloppe gap120 entre les amino-acides 397 et 439, comme cela est décrit dans la figure 4, et en particulier la séquence Gly - Asn - Gly - Lys et la séquence Ser - Lys - Gly - Asn - Gly - Lys - Val - Glu ainsi que les séquences d'ADN correspondant, notamment celles figurant dans le génome du virus NDK. Parmi les séquences présentant un intérêt dans le cadre de la détection et de la lutte contres les infections à HIV, il faut citer les séquences codant pour la protéine de nucléocapside p18 ainsi que la protéine elle-même et la séquence codant pour l'élément de régulation négative. En effet, l'étude comparative montre que ces éléments diffèrent notablement pour le virus NDK et présentent donc un intérêt tout particulier. La technique antérieure a déjà largement décrit les procédés permettant de cloner les fragments d'ADN codant pour les gènes en cause et la description indique comment les gènes en question peuvent être localisés et isolés par des technologies connues telles que la méthode des cADN après localisation avec une sonde, par exemple une sonde radioactive. L'invention concerne également les procédés permettant de préparer ces protéines et/ou enzymes des virus en cause, notamment grâce à un procédé dans lequel on cultive, sur un milieu de culture approprié, des cellules hôtes transformées, transfectées ou infectées par un vecteur d'expression de ladite protéine et/ou enzyme comportant la séquence d'ADN codant pour ladite protéine et/ou enzyme, sous le contrôle d'un promoteur de la transcription de cette séquence dans l'hôte, ainsi que les éléments assurant la traduction de la protéine et/ou enzyme des virus, et on sépare ladite protéine et/ou enzyme après culture. Les technologies permettant l'expression des protéines à partir du gène sont des technologies qui sont connues actuellement, qui ont déjà été utilisées à de nombreuses reprises pour l'expression des différents gènes des virus, aussi bien HlV-l que HIV-2 et d'autres virus encore. Suivant la nature de la protéine en cause,.on utilisera à titre d'hôte, afin d'assurer la production, des systèmes procaryotes, notamment les bactéries, lorsque la protéine ne nécessite pas de glycosylation, ou bien des systèmes eucaryotes tels que la levure ou des systèmes eucaryotes plus complexes tels que les cellules de mammifère lorsque l'on souhaitera obtenir une protéine qui soit très voisine de la protéine naturelle. Les systèmes d'expression dans ces différents hôtes sont, par ailleurs, considérés comme connus, de même que les techniques de fermentation et les techniques de culture des cellules en cause. Les protéines ainsi obtenues pourront être utilisées afin de réaliser des anticorps, notamment des anticorps monoclonaux correspondant à chacune de ces protéines, par des technologies qui sont là aussi connues de l'homme de métier et qui ont largement été développées depuis les travaux de Kohler et Milistein, là encore ces anticorps existent pour HlV-l et HIV-2, la technologie développée dans ce cas est transposable au cas du virus selon la présente invention. Les protéines et les anticorps du virus en cause peuvent être utilisés afin de mettre en évidence certaines maladies liées à des immunodéficiences, notamment induites par des rétrovirus tels que le virus NDK mais également les rétrovirus apparentés. Les protéines antigéniques en cause pourront être utilisées pour la réalisation de vaccins destinés à la prévention, mais également au traitement, des maladies induites par les rétrovirus du type NDK ou apparentés. Les protéines correspondant notamment à la gap120 peuvent également être utilisées à titre d'agent de blocage et de saturation des sites récepteurs correspondants. Il est également possible d'utiliser à titre de vaccin des virus recombinants comportant des-séquences codant pour une ou plusieurs des protéines en cause, les virus vecteurs étant, de préférence, des Virus connus pour leur innocuité ou ayant déjà été testés depuis fort longtemps, en particulier il pourra s'agir de virus de la famille des poxvirus tels que la vaccine, le virus correspondant pouvant etre vivant, atténué ou tué. Là encore, il s'agit d'une technologie qui a été largement développée dans le cadre de HIV-l et de ilIV-2 et qui peut être transposée au cas du virus en cause. La présente invention concerne également les anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine V1 de la protéine CD4 mais qui n'entrent pas en compétition avec l'anticorps monoclonal OKT4A. Ce type d'anticorps monoclonal a été expérimenté et a montré qu'il inhibait la production virale de HIV sur des cellules infectées. I1 s'agit notamment de l'anticorps monoclonal 1 3B8-2. Ces anticorps monoclonaux peuvent être utilisés in vitro ou in vivo afin d'inhiber la production virale dans le cas de cellules infectées. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lecture des figures et des exemples suivants Figure 1: Carte de restriction du pNDK contenant la longueur totale du génome HIV 1 -NDK sous-cloné dans le site HindIII de pUC 18. Figure 2 : Séquence nucléotidique complète de HIV l-NDK. Figure 3 : Multi-alignement des séquences d'acides aminés d'enveloppe de 4 isolats viraux. MIV 1-NDK a été utilisé en tant que séquence de référence. Figure 4 : Séquence d'acides aminés de la gap120 correspondant à la plus grande variabilité entre 6153 et 6215. Figure 5 : Alignement des séquences d'acides aminés gag du prototype HIV 1 et de HIV l-NDK. Matériels et méthodes a) Isolement du virus HIV 1-NDK a été isolé à partir de lymphocytes du sang périphérique comme décrit précédemment (1). Le virus a été ensuite propagé dans une lignée cellulaire CEM permissive continuelle (2). La production virale a été contrôlée par les dosages de réverse transcriptase, par immunofluorescence et par microscopie électronique. b) Détermination de la cytopathogénicité La cytopatogénicité des souches virales HIV a été déterminée par superinfection des lignées cellulaires MT4 positives au HTLV 1. Le nombre des cellules survivantes a été déterminée par exclusion au bleu Tryptan sept jours après l'infection. c) Clonage moléculaire par une banque génomique L'ADN de haut poids moléculaire extrait de cellules CEM infectées par du HIV 1-NDK a été digéré partiellement avec de Hind III afin d'obtenir des fragments compris entre 10 et 15 kb en taille qui ont ensuite été purifiés par un gradient de 10 % à 40 % en sucrose (3). Le produit de la digestion partielle a été lié dans le phage L47 clivé par HindIII. Les molécules importantes ainsi obtenues ont été conditionnées avec un extrait Gigapack-Gold. La banque a été criblée par la sonde pBTl correspondant à l'important fragment Sac I - Sac I du prototype du HIV I (4) selon la méthode "annealing plaque-filter" (8). Des phages positifs ont été purifiés, amplifiés et la localisation a été réalisée par la méthode double digestion (3) et par l'hybridation Southern Blot avec plusieurs sous clones dérivés du génome de pBTl. d) Séquençage nucléotidique 5 microgrammes d'ADN correspondant aux parties virales du phage recombinant HIV 1-NDK ont subit une sonication afin d'obtenir des fragments de 500 pb. Après réparation des extrémités avec l'enzyme Klenow, les fragments ont été sous clonés dans le site Sma I du vecteur M13 mpl8 (5). Le séquençage a été réalisé selon la méthode de terminaison de chaîne dideoxy avec "universal primer" (6). e) Transfection des cellules Eukariotiques Les cellules COS-l ont été ensemencées à une densité de 4.106 par flacon de 75 cm, 24 heures avant la transfection. La tranfection pour les analyses d'ADN ultérieures a été réalisée par la technique de coprécipitation au phosphate de calcium (7), en utilisant 10 g d'ADN plasmidique. Après 12 heures, la culture cellulaire a été agitée avec 15 % de DMSO durant I minute avant de la récupérer dans du DMEM avec 19 ,ó FCS. Les cellules CEM ont été additionnées aux cellules COS-l 16 heures après la transfection et co-cultivées pendant 21 jours pendant que l'activité réverse transcriptase était testée dans le surnageant libéré de toutes cellules. EXEMPLE I Cytopathogénicité de la souche HIV 1-NDK Afin de comparer la cytopathogénicité de l'isolat HIV 1-BRU (prototype HIV I) et HIV l-NDK, une série de dilution du surnageant du virus libéré de toutes cellules contenant du virus a été utilisée pour infecter les cellules MT4. La présence de syncitia a été déterminée dans la culture cellulaire 7 jours après l'infection. Les résultats montrent que des stocks de HIV I-NDK dilués à 10 7 sont capables d'induire la formation de syncitia alors que le prototype HIV 1 dilué au dessous de 10-3 ne conduit à aucun effet cytopathique. Afin de démontrer que le syncitia est dû à une réplication virale, une infection des lymphocytes du sang périphérique a été réalisée avec une série de dilutions des deux souches.Les résultats indiquent que les mêmes dilutions qui induisent une formation de syncitia sur MT4 sont capables d'infecter PBL suggérant que le HIV l-NDK est lu4 fois plus cytopathique et infectueux que le prototype. Le niveau de l'activité réverse transcriptase et le pourcentage de cellules infectées sont les mêmes dans les lignées cellulaires continues infectées avec le prototype HIV 1 ou HIV 1-NDK, suggérant ainsi que la production virale est quantitativement équivalente pour les deux souches. De plus, des études au microscope électronique ont montré plus de bourgeonnement à la surface des cellules infectées par le HIV 1-NDK. Ces données suggèrent que la plus importante infection et cytotoxicité de l'isolat HIV I-NDK pourraient être attribuées à des propriétés qualitatives du virus et non à une réplication virale plus importanté. EXEMPLE 2: Cartographie moléculaire du génome HIV I-NDK Des phages recombinants isolés à partir des banques génomiques L47 ont été sous clonés en utilisant la digestion partielle par Hind III dans le plasmid pUC 18. La carte de restriction de l'un des plasmides recombinants pNDK est présentée à la figure 1. En prenant en compte que les Sites Sac 1 et Hind III ont toujours été trouvés dans le LTR de tous les isolats pour l'instant publié, la digestion du pNDK avec ces enzymes a été réalisée. La digestion Sac 1 permet l'identification d'un fragment viral interne de 9,1 kb et, l'hybridation des fragments Hind III avec la sonde pBTl identifie clairement les fragments de jonction avec les génomes cellulaires. L'analyse de la carte de l'enzyme de restriction indique que le génome HIV 1-NDK est différent des autres isolats HIV 1 connus. EXEMPLE 3: Analyse des séquences du génome HIV 1-NDK La séquence complète nucléotidique du HIV 1-NDK est présentée en figure 2 avec la séquence d'acide aminé supposée pour tous les cadres de lecture ouverts. L'organisation génomique du HIV l-KDN est similaire à celle des des autres souches séquencées du HIV 1. Le génome HIV 1-NDK est long de 9143 nucléotides (dans sa forme ARN) et possède trois gènes de structure GAG, POL et ENV, les deux gènes TAT et REV, chacun étant constitué de deux exons codant. Les autres gènes de régulation VIF et NEF ont pu également être détectés. la séquence du HIV 1 -NDK contient le gène VPU qui a été récemment identifié en tant que gène fonctionnel.Aucun cadre de lecture ouvert supplémentaire autres que ceux présentés sur les autres souches HIV 1, n'a pu être détecté. Le pourcentage des homologues d'acides aminés a été calculé pour tous les cadres de lecture ouverts du HIV 1-NDK et du prototype VIH. Comme espéré, la plus grande variabilité génétique a été observée pour le cadre de lecture ouvert codant pour le gap120. Une comparaison a été également réalisée avec une autre souche Zairoise précédemment séquencée HIV 1- ELI (4). Ceci a indiqué une parenté plus proche du HIV 1-NDK au HIV 1-ELI qu'au prototype HIV 1 dans tous les cadres de lecture. Afin de faire correspondre ces ressemblances avec la fonction biologique, des souches HIV 1-ELI ont été testées dans le dosage MT4. Les résultats ont montré que le HIV 1-ELI est 200 fois moins infectueux et cytopathique que le HIV 1-NDK et qu'il correspond à une souche intermédiaire en terme de cytopathogénicité. La base moléculaire de l'importante virulence du HIV 1-NDK peut être issue du changement génétique existant dans plusieurs cadres de lecture ouverts. Afin de localiser les différences génétiques spécifiques entre le HIV 1-NDK et les autres souches séquencées, les alignements de tous les cadres de lecture ont été réalisés. Les régions hypervariables du produit gene env du HIV l-NDK ont été localisées comme dans les autres isolats. Les clusters d'hypervariabilité sont détectées au même position tant pour le prototype du HIV 1, le HIV l-ELI et d'autres souches Zairoises HIV-Z6 (Figure 3). La région du gap120 localisée entre les acides aminés 397 et 439 responsables de la fixation avec la molécule CD4 et un étirement de 12 acides aminés (410-421) joue un rôle crucial dans cette intéraction (figure 4). Une petite délétion de 3 acides aminés a été détectée à partir de l'acide aminé 122 des protéines GAG du HIV 1-NDK (figure 5). Cette observation plutôt inhabituelle n'a jamais été observée dans les séquences analysées précédemment de la protéine P18. Une autre délétion localisée dans l'extrémité 3' du gène GAG n est pas spécifique du HIV 1-NDK et a été trouvée dans d'autres souches. L'analyse des protéines POL n'a permis de mettre en évidence aucune différence spécifique. Afin de déterminer si l'important effet cytopathogénique pouvait être exprimé par des changements dans les gènes de régulation, des comparaisons de ces régions ont été réalisées entre le HIV 1-NDK et le prototype. L'alignement de REV, VIF, NEF et TAT n'a montré aucune différence majeure puisque les points de mutation ont généralement été observés dans toutes les régions déjà connues. Néanmoins, le rôle biologique de telles variations ne peut être exclu. Dans le cas du gène TAT, tous les résidus cystéine qui jouent un rôle important dans sa fonction ont étéconservé dans les deux souches. LTR du HIV l-NDK et du prototype HIV 1 partage 90 % d'homologues nucléotides. La région TAR (nucléotides -17 à +54) qui est-nécessaire pour la transactivation du produit de gène TAT est complètement conservé avec 68 des 71 nucléotides homologues.Les autres régions impliquées dans la séquence clef du facteur cellulaire Spl (nucleotides -43 to -85) (17) sont également très similaires. La région améliorée nucléotides (-80 to -105) qui est la séquence clef pour le facteur de transcription NF-KB est exactement la même pour le HIV 1-NDK et le prototype HIV 1. Toutes les différences ont été trouvées en amont du nucléotide -160 où l'élément cis-acting répondant pour le NEF pourrait être localisé. La souche HIV 1-NDK a été déposée le 3 mai 1989 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes - 28, rue du Docteur Roux - 75015. PARIS, sous le numéro : 1-857. REFERENCES 1) ELLRODT A.. BARRE-SINOUSSI F., LE BRAS P., NUGEYRE M.T., BRUN-VEZINET F., ROUZIOUX C., SEGOND P., CAQUET R., MONTAGNIER L, CHERMANN J.C., Isolation of human T-lymphotropic retrovirus (LAV) from Zaïrian married couple, one with AIDS. one with prodromes. Lancet, I (1984), 1383-1385. Z)FOLEY G.E., LAZARUS M., FARBER S., UZM;ANN B.G., BOONE BA., MAC CARTHY R.E., Continuous culture of human Iymphoblastes from peripheral blond of a chiid with acute leukemga. Cancer. la (1965) 522-529. 3) MANIATIS T.. FRITSCH E.F., SAMBROOK J., Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1982. 4) ALIZON M.. SONIGO P., BARRE-SINOUSSi F., CHERMANNN J.C., TIOLLLAIS P., MONTAGNIER L, WAIN-HOBSON S., Motecular cloning ofIymphadenopathy-associated virus. Nature. 312 (1984) 757-760. 5) MESSING J. and VIEIRA J.. A new pair of M13 vectors for selecting either DNA strand cf doubledigest restriction fragments. Gene 19 (1982), 269-276. 6) SANGER F.. NICKLEN S., COULSON A.R., DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74 (1977). 5463-5467. 7) GRAHAM F.L and VAN DER EB A J., A new technique for the assay of infectiviq of humain adenovirus 5 DNA. Virology, 52 (1973), 456-459. R) BENTON W.D. and DAVIS R.W., Screening i gt recombinant clones by hybridization to single plaques in vitro. Science. 196 (1977), 180-182. REVENDICATIONS 1) Rétrovirus HIV dit NDK, caractérisé en ce qu'il s'agit du virus ayant la structrure correspondant à la figure 2 ainsi que de ses mutants. 2) Fragment d'ADN de HIV-NDK selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine antigénique chez les primates. 3) Fragment d'ADN de HIV-NDK selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il code pour un composant strutural de virion. 4) Fragment d'ADN de HIV-NDK selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il s'agit du gène gal, pol ou env ou des fragments de ces gènes codant pour des produits antigéniques. 5) Fragment d'ADN codant pour le peptide ou une protéine comportant la séquence d'acides aminés Gly-Asn-Gly-Lys ou une séquence équivalente: 6) Fragment d'ADN selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés est Ser-Lys-Gly-Asn-Gly-Lys-Val-Glu. 7) Fragment d'ADN selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence codant pour la séquence d'acides aminés de la figure 2. 8) Fragment d'ADN codant pour tout ou partie de la protéine de nucléocapside pl8 du virus HIV-NDK. 9) Fragment d'ADN codant pour l'élément de régulation négative du virus HIV-NDK. 10) Procédé de préparation d'une protéine et/ou d'une enzyme du virus selon la revendication 1 ou correspondant au fragment d'ADN selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce qu'on cultive, sur un milieu de culture approprié, de cellules hôtes transformées, transfectées ou infectées par un vecteur d'expression de ladite protéine et/ou enzyme comportant la séquence d'ADN codant pour ladite protéine et/ou-enzyme ou fragment d'ADN sous le contrôle d'un promoteur de la transcription dé cette séquence dans l'hôte ainsi que les éléments assurant la traduction de la protéine et/ou enzyme du virus, et en ce que -l'on sépare ladite protéine et/ou enzyme après culture. 11) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule eucaryote. 12) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la cellule hôte est une levure ou une cellule animale ou d'insecte. 13) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule de mammifère. 14) Protéine et/ou enzyme du virus HIV-NDK selon la revendication 1 pouvant être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 8 à 13. 15) Protéine selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence Gly-Asn-Gly-Lys ou une séquence équivalente. 16) Protéine selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence Ser-Lys-Gly-Asn-Gly-Lys-Val-Glu. 17) Protéine selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence d'acides aminés correspondant à la figure 2. 18) Protéine selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisée en ce qu'elle est glycosylée. 19)-Anticorps dressés contre les protéines antigéniques selon. l'une des revendications 14 à 17. 20) Kit de diagnostic de la présence d'un virus HIV-NDK, caractérisé en ce qu'il comporte une protéine et/ou un anticorps selon l'une des revendications 14 à 19. 21r Agent vaccinant pour le traitement et/ou la prévention des maladies liées à des immunodéficits, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs protéines selon l'une des revendications 14 à 19 et/ou un virus recombinant comportant le gène codant pour ladite protéine sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans l'hôte. 22) A titre de médicaments destinés au traitement ou à la prévention des maladies liées à une infection virale, une protéine selon l'une des revendications 14 à 18 ou un anticorps bloquant selon la revendication 19. 23) Anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine VI de la molécule CD4 mais n'étant pas en compétition avec OKT4A. 24) Anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'il s'agit de 13B8-2. 25) Composition destinée à l'inhibition in vitro et in vivo de la production de virus HIV, caractérisée en ce qu'elle comporte un anticorps monoclonal selon l'une des revendications 21 et 22.