Brevet FR2648148A1 — publié le 19901214

La présence inven:tionr. concerne un procédé de prcducticnr. d'un ncuveau pclvre b.ologlque et plus particulièrement un procédé de préparaltion d'un nouveau polymère blologliue par un procédé de fermentation utilisant du métnanci ccmre source de carDone et d'énergie. L';nvenic..n concerne égalemer.nt de nouveaux bioclvmères, c'esd--c.re des hé-rrczc'ysaccharzdes U cui.cmr.en dans la ca:--;cre des cmres biologiques. Le poiysaccnar:de aui était connu est la gomme de xan:hane produ:te par la fermentation d'une souche du genre Xantnomonas dans un milieu de culture qui utilise généralemen: un hydrate de carbone comme le glucose comme source de carbone assimilable. La gomme de xanthane a un poids moléculaire élevé d'environ 2 x 106 daltons, et consiste en du glucose, du mannose et de l'acide glucuronique. Etant donné qu'une faible quantité de gomme de xanzhane peut exercer une viscosité élevée, elle peut être utile comme agent de régulation de la ';rsos:e c_ rrc.e agent te suspension pour les dispersions solide-dans-eau et/ou huile-dans-eau et on peut l'appliquer dans la récupération secondaire du pétrole par injection d'eau (ACS Symposium Series N 45,144 -160,1977). Selon le procédé de fermentation, on peut préparer la gomme de xanthane en cultivant du Xanthomonas campestris sur un milieu de culture (Adv. Appl. Microbiol., 23, 19-49, 1973) constitué d'un hydrate de carbone à 2- 5% comme le glucose et le saccharose comme source de carbone et d'énergie et d'une bouillie à 0,3% provenant d'une fermentation alcoolique. La fermentation est conduite à pH 6,8 et à une température comprise entre 25 C et 350C, et l'on réalise la production par rapport à une source de carbone avec des rendements de 50 et 70%. Cependant, selon des considérations d'ordre éconcmique, le coût du substrat carboné tél que l'hydrate de carbone est re- lativement élevé, et il est nécessaire de mettre au pcint un nouveau système de fermentation pouvant utiliser d'autres sources de carbone, moins coûteuses. L'invention a pour but de fournir un procédé de production d'un nouvel nétéropolysaccharide par culture d'une bactérie utilisant des composés en C. dont la production est excédentaire à faible coût comme source de carbone assimilable. Le nouveau polysaccharide selon l'invention présente ces avantages qu'il est de nature biodégradable, qu'il ne provoque pas de problèmes de pollution de l'environnement à l'utilisation en dehors du polymère de synthèse chimique récalcitrant, et en ce qu'on peut le produire à un plus faible coût étant donné l'utilisa- :.on d'une source de carbone peu coûteuse, à savoir e méthanol. Le zcIysaccharide fonctionne comme agent de régulation rhéclogique dans l'. ndustrie alimentaire et dans l'industrle pétrochimique. I1 est également utile comme agent gélifiant et absorbant d'eau pour l'absorption d'une grande quantité d'humidité. Selon l'invention, le procédé de production d'un nouveau polysaccharide biologique par fermentation comprend la culture de méthylotrophes facultatifs de Methvlobacterium organoDhilum ou de ses mutants par mutation classique sur un milieu de culture contenant du méthanol comme source de carbone et d'énergie. On maintient le milieu de culture à une concentration comprise entre 0,2 et 1% en chargeant de manière lntermzttente du méthanol, et ce milieu se compose d'azote, de pnosphates, de sels de magné- i5 sm.e: d'oligoéléments. On emploie un sel d'ammoniaque, un nitrate ou de l'urée ccmme source d'azote inorganique. L'extra:_ de levure, la peptone, la loueur de mais macere ou un acide casamine serve.nt de source d'azote organique. 2 f Lra formulaticn minimale du.mTlieu est la su vane: source d'azce: 0, C2-0,5; pnosphates: 0,05-0,2%; sels de magnésium: 0,04%; et oligo- éléments tels que calcium, manganèse, molybdène et cuivre, etc. Le glucose, le galactose, le mannose ou l'acide succînique à environ 0,5% peuvent stimuler la formation du polysaccharide, et servent de pr=.rseur. On conduit la fermentation a un pH compris entre environ et 8 et à une température comprise entre 250C et 370C. Afin de maintenir l'oxygène dissous à un niveau compris entre 10% et 5% de saturation de l'air, on ajuste la vitesse d'agitation entre 300 et 1000 tpm 26 4 8 1 4 8 et la vitesse d'aération est située dans un intervalle allant de 0,2 à 2,0 vvm. On conduit des fermentations discontinues à deux étapes ou à charge séquentielle dans les conditions de culture décrites ci-dessus. On précipite le polysaccharide acellulaire brut qui est obtenu par centrifugation au moyen d'un solvant organique comme l'acétone, l'éthanol et le méthanol à partir du bouillon de fermentation. On sépare le polysaccharide précipité dans l'eau distillée et on dialyse contre l'eau distillée pour le dessalage. Après séparation et purification, on réduit en"poudre le polysaccharide brut par un procédé de lyophilisation. L'invention sera précisée cl-dessous au moyen des dessins joints, o la figure 1 montre un spectre de fluorescence du polysaccnaride selon l'invention; la figure 2 montre un spectre infrarouge du polysaccharide selon l'invention; la figure 3 montre le profil d'élution du polysaccharide selon l'invention; et un échantillon standard (bleu Dextran) dans une chromatographie à perméation des gels; la figure 4 montre une détermination du poids moléculaire du polysaccharide selon l'invention au moyen d'une chromatographie à perméation des gels avec du Sepharose 6B; la figure 5 montre des rhéogrammes des diverses concentrations du polysaccharide selon l'inven- tion; et s la f.gure 6 mcntre une relation entre la vlscosité et la vitesse de cisaillement à diverses concentrations du polysaccharide selon l'invention. Pour déterminer l'identité chimique et les caractéristiques du biopolymère ainsi obtenu, on procède à diverses expériences qui donnent les résultats suivants: (1) par analyse élémentaire du biopolymère, on trouve que la composition est constituée de: carbone (C), 25-35%; azote (N), 0,2-L0%; hydrogène (H), 3-6%; oxygène (O), 35-50%; et cendre 5-30%. (2) En procédant à une spectrofluorescence UV, on trouve que le polysaccharide contient une protéine mals ne contient pas l'acide nucléique car on observe des pics à 280 nm (figure 1). (3) ULn spectre.infrarouge suggère la présence ce groupes amine (340U-350 em i), de groupes amino -1 - (1610-1655 cm) et de groupes cétone (1710-1740 cm; C=O, 1050-1090 cm; C-O) (figure 2). (4) Le procédé phénoi-sulfur:nue pour les hydrates de carocne traités montre que le polymère contient 70-95% d'hydrate de carbone et le procédé de Lowry pour les protéines montre que le polymère contient 2-104 de protéine. Le procédé de Friedemann pour l'acide pyruvique, le procédé de l'acide hydroxamîque pour l'acide acétique, et le procédé du carbazole pour l'acide uronique indiquent une teneur en acides organiques de 5 à 15% (acides pyruvique: acétique: uronique = 4:1:8). (5) Après hydrolyse à l'acide trifluoracétique, chromatigraphle en couche mince et analyse par HPLC (chroma-craznie en pnase::de haute pression) du sucre constituant, on observe les résultats suivants: glucose, 20-40%; galactose, 30-50%; et mannose, 20- %. (6) Le test du polyhydroxybutyrate est négatif (Okon Procédé Okon). (7) Par chromatographie de perméation du gel, on détermine que le poids moléculaire moyen est compris entre 2 x 106 et 6 x 106 daltons. (Figures 3 et 4). Le poids moléculaire du nouveau polysaccharide fourni par l'invention est significativement supérieur à celui du xanthane (5-20 x 105) et du pullulane (1-5 x 105). (8) Les propriétés rhéologiques du polysaccha- ride étudié en mesurant la viscosité d'une solution d'un polymère contenant de 0,1 à 1% (p/v) du poly- saccharide à 25 C montrent les caractéristiques des fluides nonNewtoniens pseudoplastiques. Sa viscosité apparente, ou:nd.ce de consistance (K), augmente orutalement avec l'accroissement de sa concentration (figure 5 et figure 6). Par exemple, la viscosité apparente d'une -1 solution à 1 % à une vitesse de cisaillement de 1 sec est d'environ 18 888 mPa.s (cp) (15.000 - 20.000 mPa.s).Ceci est environ 10 fois supérieur à la viscosité de la gomme de xanthane et environ 200 fois supérieur à celle dd pullulane. (9) La viscosité de la solution de poly- saccharide reste stable à un pH allant de 2 à 13 et à une température allant de 20C à 60 C. La solution de polysaccharide présente les caractéristiques d'un fluide presque Newtonien aux températures supérieures à 60C. (10) Lorsqu'on ajoute des ions métalliques W mcnovalents ou dIvalents à une nouvelle sclution de polysaccharide, une grande quantité d'eau est absorbée et un gel est formé. L'addition de chlorure de sodium, par exemple à la solution de polysaccharide forme un gel et absorbe l'eau dans un intervalle allant de 300 à 500 fois à NaCl lM. En général, les biopolymères produits par fermentation avec un microcrganisme ne peuvent être désignés sur la base de leur structure moléculaire en dehors des polymères communs ou des composés organiques. On peut les nommer par une combinaison du nom du genre du microorganisme d'origine et un sufflxe "ane". Alnsi, le "xan:hane" est désigné en combinant le mot "xanth" provenan- du nom de genre de Xanthomonas camzestris et un su-fixe "ane". Cependant, le "pullulane" est désigné en combinant le mot "oullul" du nom d'espèce d'Aureobas:dium zullulans avec le suffixe "ane". Selon la pratique établie, on a nomré le pclvsaz:charide obtenu selon l'invention "méthylane'. Les exemples non--li.i an:s- ci-dessous sont donnés cour préciser '".nve.ntor. plus en détail. Exemcle. Cn str!:lise un litre d'un bouillon de culture ayant les compositlons suivantes à 212'C pendant 15 minutes. 3O Composition Quantité (NH) S04 0,3 g/l KH PO 0,63 g/1 2 4 Na2HPO4 1,06 g/l MgSO4. 7H2O 0,45 g/i Ca++, Fe++, Mn++, Zn++, Cu++, Mo++ 100 mg/1 On mélange le bouillon ci-dessus avec 0,5% en volume de méthanol on y inocule une souche de Methvlobacterium oraanoohilum, et on cultive tout en agitant à 600 tpm à 30 C pendant 2 jours. On ajuste le pH à 7,0 avec KOH à 10%, et on maintient le niveau d'oxygène dissous au-dessus de 30% de satura- tion de l'air. A la fin de la fermentation, on centrifuge le bouillon de culture pour enlever les cellules bac- t-riennes. On a2oute alors de l'éthanol en une quantité de deux volumes par volume du surnageant de bouillon obtenu. On mélange bien la combinaison éthanol-bouillon et on recueille les polymères acellu- laires résultants. On exprime les polymères, puis on les lave deux fois avec de l'éthanol à 75% (v/v), et enfin on sèche par un procédé de lyophilisation. On obtient 0,6 g de polymère sous forme solide. Leur analyse est la suivante: Glucose: 18,7% Galactose: 28,2% Mannose: 18,5% Protéine: 4,8% acide organique: 10,0% (acide pyruvique: acide uronique: acide acétique = 4:8:1) cendre inorga- nique: 22,2% (K 10,39%; Na+ 7,34%; Mg+@ 0,305%; Ca** 0,016%; Zn++0,0056%; Fe+ 0,0034%; Mn++0,0004%; Cu+' 0,004%; p4-3 1,60%; autres 2,54) ExemDle 2 Cn répèee l'exemple 1 en ut:ilsant 1,0% en volume de méthanol, et on cbt:en: 1,2 g/l de polysaccha- r:de. Exemole 3 On répète l'exemple 2 en ajoutant 5 g/'l de glucose comme précurseur, et on oot:en: 2,0 g/1 de polysaccharlde. ExemDle 4 On répète l'exemple 3 en a2outan: 0,5 g/i d'extra:: de levure comme source d'azote, et l'on obtient 1,5 g/il de polysaccharide. ExemDle 5 On répète la culture de l'exemple 1, et l'on maintient la concentration résiduelle de méthanol en dessous de 0,5% en ajoutant de manière:ntermittente du méthanol à la culture. Au bout de 3 à 4 jours de culture, on produit 4,6 g/i de polvsaccnarlde. Exemmle 6 On répète l'exemple 5 en utilisant un inoculum concentré à environ 5 g/l des cellules, et on ajuste le pH à 7,0 avec une solution d'ammoniaque à 10% pendant 10-20 heures. Ceci aboutit à la production de 10 g/l de polysaccharide. Exemple 7 On procède à la fermentation continue à une vitesse de dilution de 0,1 h1, lorsque la concentra- tion cellulaire atteint 5-6 g/1 dans le procédé de i0 l'exemple 5. On obtient 3,0 g/1 de polysaccharide au bout d'environ 2 jours. Bien que l'invention ait été décrite ci-dessus en se référant à plusieurs de ses modes de réalisation spécifiques, il apparait clairement que l'on peut procéder à des modifications, variantes et substi- tutions mineures dans le procédé de préparation du polysaccharide selon l'invention afin de diriger le procédé vers les dérivés suivants: 1) dérivés acylés; 2) dérivés carboxyméthyle; 3) dérivés méthylés; 4) dérivés ester de propylène glycol; ) dérivés hydroxypropyle; et 6) dérivés cationiques. l1 REVENDICATIONS 1. Nouvel hétéropolysaccharide et ses dérivés, qui sont identifiés par les caractéristiques suivantes: - poids moléculaire: 2 - 6 x 106 daltons Spectre UV: pas d'acide nucléique 2-10% de protéine (procédé de Lowry) Constituants: hydrate de carbone (glucose, 20-40%; galactose, 30-50%; mannose, 20-35%); protéine 2-10%; acide organique, i5.5-15% (acide pyruvique: acide uronique:acide acétique = 4:8:1); et cendre, 5-30%. - Indice de consistance (K): 15 000-20 000 mPa.s pour une solution à 1%. 2. Hétéropolysaccharide selon la revendication 1; dans lequel les dérivés sont choisis dans le groupe constitué par l'acétyle, le carboxyméthyle, l'ester de propylène glycol, les dérivés cationiques et l'hydroxypropylène. 3. Procédé de production de polysaccharides comprenant la culture d'une souche de Methylobacterium organoDhilum ou ses mutants sur un milieu de culture contenant une source de carbone et d'énergie, une source d'azote comme des sels d;ammonium, des nitrates, de l'urée, un extrait de levure, de la peptone, et un acide casaminé, des phosphates, du magnésium et des oligoéléments. 4. Procédé tel que défini dans la revendica- tion 3, dans lequel le milieu est composé d'une source d'azote à 0,02-0,5%; de phosphates à 0,05- 0,2%; de magnésium à 0,045%; et d'oligoéléments en dessous de 0,01%. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, dans lequel la source de carbone et d'énergie est le méthanol. 6. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 3, 4 ou 5, dans lequel le méthanol est chargé de manière intermittente dans le bouillon de culture de manière à être maintenu à une concentra- t;on comprise entre 0,2 et 1,0%. 7. Procédé selon la revendication 3, dans lequel on procède à l'inoculation avec 0,1- 20.0 g/l d'inoculum dans les conditions de culture sui- vantes: vitesse d'agitation 300-1000 tpm; vitesse d'aération de 0,2-2 vvm; pH de 5 à 8; température de 25 C à 37 C; l'oxygène dissous a un niveau de -50% de saturation d'air; et la vitesse de charge' de méthanol de 0,05 à 0,5 g-méthanol/g-cellule-h, et la vitesse de charge d'azote (équivalent NH4) de 1 à mg/g-cellule-h. 8. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, dans lequel on procède à l'addition d'un précurseur choisi dans le groupe constitué par le glucose, le mannose, le galactose et l'acide succinique. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel ledit précurseur est maintenu à une concen- tration d'environ 0,5%. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, dans lequel ledit hétéropciy- saccharide est en outre soumis a une acétylation, à une carboxyméthylation, à une méthylation, à une propylène-glycol-estérificat.on, à une hydroxypropy- lation ou à une cationation.