Brevet FR2644065A1 — publié le 19900914

La présente invention concerne des compositions thérapeutiques à base de peptides SDK. Les abréviations utilisées dans ce texte sont conformes aux réglementations de 1983 sur la nomenclature et les symboles à utiliser pour les peptides des amino- acides, de la Commission Mixte IUPAC-IUB sur la Nomenclature Biochimique (Eur. J. Biochem. 138, 9-37 (1984)). Toutefois, pour des facilités de compréhension, certaines de ces abréviations sont détaillées ci-dessous: Asp ou D acide aspartique Ser ou S sérine Lys ou K lysine Pro ou P proline Thr ou T thréonine Z benzyloxycarbonyle Boc t-butoxycarbonyle OBzl benzyloxy Ac acétyle Les autres abréviations utilisées sont: ATF acide trifluoroacétique BAR bombardement atomique rapide CCM chromatographie en couche mince CLHP chromatographie liquide haute pression DCM dichlorométhane DMF diméthylformamide NMM N-méthylmorpholine -2- Les peptides utilisés dans les compositions thérapeutiques selon l'invention répondent à la formule générale I H2N - W - Ser - Asp - Lys - X - OH I dans laquelle X représente un résidu Pro ou Lys ou une liaison de valence et W représente un résidu Thr ou Pro ou une liaison de valence avec la convention que, si X représente un résidu Pro, alors W représente également un résidu Pro. Les peptides compris dans la formule générale I peuvent être énumérés comme suit: Ser-Asp-Lys (i) Ser-Asp-Lys-Lys (ii) Pro-Ser-Asp-Lys-Lys (iii) Thr-Ser-Asp-Lys-Lys (iv) Pro-Ser-Asp-Lys (v)- Thr-Ser-Asp-Lys (vi) Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (vii) Ces peptides peuvent être employés tels quels ou sous la forme de leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Ce tripeptide (i), sur lequel sont basés d'autres peptides de l'invention, ne semble pas, à ce jour, avoir été isolé ou préparé. Toutefois, ces séquences d'amino- acides ont été trouvées dans diverses protéines vivantes, par exemple, Ser-Asp-Lys, dans la protéine de la membrane du lymphocyte T, o son action apparait lorsqu'une partie d'un marqueur lymphocytaire tel que le lymphocyte CD, ou les sous-ensembles a ou y du récepteur T, qui comportent cette séquence spécifique, prend position en regard de certains récepteurs spécifiques du lymphocyte; on peut également trouver ces séquences d'aminoacides dans -3- diverses protéines telles que les protéines des virus et également dans certaines protéines du complément ou du facteur a de nécrose des tumeurs. En conséquence, il était particulièrement intéressant d'étudier l'activité de séquences spécifiques d'aminoacides et, selon l'invention, on a trouvé que celles-ci jouaient des rôles actifs dans le domaine de l'immunomodulation, comme cela a été démontré par les rapports immunologiques. Les peptides utilisés dans les compositions thérapeutiques selon l'invention peuvent être obtenus par les voies de synthèse habituelles, par exemple, selon la séquence réactionnelle suivante: I Boc K(Z) - X() OH II Boc D(OBzl) - K(Z) - X() - OH III Boc S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X() - OH IV Boc W() - S(Bzl) - D(OBzl) - K(Z) - X() - OH avec la convention que: a) les parenthèses qui suivent W ou X sont vides lorsque W et X représentent Pro, que les parenthèses qui suivent W contiennent Bzl lorsque W représente Thr et que les parenthèses qui suivent X contiennent Z lorsque X représente Lys, et b) lorsque W et/ou X représente une liaison de valence, l'étape correspondante est omise. Lorsque l'on prépare un sel thérapeutiquement acceptable, par exemple, l'acétate, la salification doit 4 - être effectuée avant l'étape de déprotection finale. Les solvants utilisés ici sont de qualité Purex. Le DMF est conservé dans un tamis moléculaire 3 et 4 A. Les CCM sont effectuées sur des plaques analyti- ques commerciales. Les plaques ont été observées à 254 nm et analysées avec une solution de ninhydrine, selon Pataki. Les solvants suivants sont utilisés: A: DCM/méthanol (8/2 en volume) B: n-butanol/AcOH/eau (4/1/1 en volume) et C: n-butanol/AcOH/eau/pyridine (1/l/l/1-en volume). Les produits intermédiaires sont purifiés sur une colonne de silice si nécessaire (silice 60 A (40-60 p) SDS), ils se caractérisent par leur spectre de masse (pic moléculaire ou MH+), par bombardement atomique rapide (BAR). Les produits finaux sont purifiés par chromatogra- phie liquide haute pression (CLHP) sur une colonne semi- préparative (7,2 mm x 250 mm) C1O80DS Hypersil 10 j SFCC, en mode isocratique ou avec un gradiant. Les analyses des aminoacides sont effectuées après l'hydrolyse acide du peptide avec HCl 6N, à 110 C, pendant 12 heures, sur un appareil CLHP. Les compositions thérapeutiques selon l'invention contiennent, à titre de principe actif, une quantité suffisante des peptides en question, associée à des excipients appropriés au mode d'administration choisi. SYNTHESE DES PEPTIDES Les synthèses ont été effectuées étape par étape selon la méthode à l'anhydride mixte, en utilisant du chloroformate d'isobutyle ou selon la méthode des esters actifs, en utilisant les esters du N-hydroxy succinimide. Les aminoacides protégés sont des produits du commerce. Déprotection Le groupement Boc est clivé par acidolyse en utilisant de 1'ATF: le peptide est traité par un mélange (1/1 en volume) de DCM/ATF (10 a 30 équivalents) pendant 1 à 2 heures, à température ambiante. Les groupements ZBzl ou OBzl sont hydrogénolysés. Le peptide, en solution avec un mélange méthanol/eau (9/1 en volume), est hydrogénolysé en présence de Pd/C à 10 %. Acétylation L'acétylation est effectuée en faisant réagir de l'acetylimidazole sur un trifluoroacétate de l'amine neutralisée par le triéthylamine dans le DMF. Préparation de Boc D(OBzl) K(z) 1 L'ester du N-hydroxy succinimide de Boc D(OBzl) (1 mole) est dissout dans 2,5 ml de DMF. K(Z) (1,1 eq.) en suspension est ajouté à cette solution, placé dans un bain glacé et 1,1 eq. de triéthylamine sont ajoutés sous agitation. L'agitation est maintenue pendant 24 heures. Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite. Le résidu est ensuite traité par de l'acétate d'éthyle et une solution de HCl 0,5 N. La phase organique est lavée avec de l'eau puis avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur du sulfate de sodium et, enfin, évaporée sous pression réduite. Le résidu est chromatogra- phié sur une colonne de gel de silice et élué par un -6- mélange DCM/méthanol (95/5 en volume). Les fractions homogènes en CCM sont récupérées. Rendement: 0,540 g. Préparation de Boc S(Bzl) D(OBzl) K(Z) 2 On traite 0,5 mM de 1 par un mélange de 1,4 cm3 de ATF/DCM (1/1 en volume) (20 équivalents). Apres 60 minutes à température ambiante, les solvants sont éliminés par évaporation sous pression réduite. Le résidu est traité deux fois par du DCM et séché sous pression réduite en présence de KOH. L'ester du N-hydroxy succinimide de Boc S(Bzl) (1,2 eq.) et le trifluoroacétate obtenu précédemment sont dissous dans 1,3 ml de DMF. On ajoute un équivalent de triéthylamine sous agitation magnétique. L'agitation est maintenue pendant 24 heures. Le mélange réactionnel est traité comme pour 1. Le résidu est chromatographié sur gel de silice et le produit obtenu est élué par un mélange éther éthylique/méthanol (8/2 en volume). Les fractions homogènes en CCM sont récupérées (rendement: 0, 318 g, 83 %). En triturant avec du pentane, on obtient un solide (0,27 g). Masse spectrométrique (MS) (FAB) MH+, 763 ont été mesurés; on a trouvé 763 et 763.100 (MH+ - Boc). Préparation de NAc S(Bzl) D(OBzl) K(Z) 3 Le dérivé 2 est déprotégé par une solution de HCl 3,1 N (20 équivalents) dans du tétrahydrofurane. La solution est agitée à température ambiante pendant 6 heures et demie. Le mélange réactionnel est évaporé et séché sous pression réduite pendant une nuit en présence de KOH. Le chlorhydrate obtenu et un équivalent de 1,1 d'acétylimidazole sont dissous dans 1 ml de DMF. Le pH de cette solution est porté à 7,5 par addition de -7- triéthylamine. Le mélange est agité pendant 22 heures. Le mélange réactionnel est ensuite évaporé et le résidu est traité par de l'acétate d'éthyle et une solution de HCl 0,5 N. La phase organique est lavée avec de l'eau puis avec une solution saturée de chlorure de sodium, et enfin séchée sur du sulfate de sodium. MS FAB MH, 705 ont été mesurés et 705 observés. Préparation de NAc SDK 4 0,140 g de 3 (0,2 mM) dissous dans 3 ml de méthanol et 1 ml d'eau sont hydrogénolysés pendant 22 heures en présence de Pd/C à 10 %. Le catalyseur est filtré sur un tampon celite et le solvant est éliminé par évaporation sous pression réduite. Rendement: 0, 079 g. La CCM révèle 2 taches sensibles à la ninhydrine. Le produit est purifié par CLHP, mode isocratique; éluant: eau: ATF 0,1%; débit 4 ml/mn; t = 8 mn. Analyse des aminoacides: S: 0,9 (1); D: 1,3 (1); K: 1,3 (1) MS: FAB MH+ 391 ont été mesurés et 391 observés. Préparation de SDK 5 Le tripeptide 2 est initialement traité avec un mélange ATF/DCM (1:1 en volume) pendant une heure et demie; les solvants sont éliminés par évaporation sous pression réduite et le résidu est traité au toluène; le solvant est éliminé par évaporation et le résidu est hydrogénolysé dans une solution de 3 ml de méthanol et 0,3 ml d'eau, pendant 20 heures, à température ambiante et en présence de 0,030 g de Pd/C. Le catalyseur est filtré sur un tampon celite et le solvant est éliminé par 2644065. -8- évaporation sous pression réduite. Rendement: 0,090 g. MS MH+ 349 ont été observés et 349 mesurés. est purifié par CLHP, mode isocratique; éluant:eau, ATF 0,10 %, débit 2 ml/mn; t = 6 mn. Analyse des aminoacides: S: 1(1); D: 0,8(1); K: 1,3(1) Les autres peptides de l'invention sont préparés suivant la même technique que SDK. L'intérêt de la présente invention est mis en évidence par les rapports immunologiques qui suivent. PROTOCOLE DES ROSETTES I - PREPARATION D'HEMATIES DE MOUTON Laver trois fois- les hématies dans RPMI 1640 ou RBS ou Hanks + médicaments antibiotiques. Centrifuger pendant 7 mn à 3000 t/m. Mettre le suc cellulaire en suspension. Compter. Porter à 2,108 hématies/ml dans une solution RPMI à 20 % de sérum foetal de veau (SFV) (4 ml préalablement adsorbés sur 1 ml de suc d'hématies, 30 mn dans un bain glacé, puis centrifuger pendant 7 mn à 3000 t/m et récupérer dans des conditions stériles). II - PREPARATION DES CELLULES JURKAT T Prendre une aliquote de cellules Jurkat T en culture. Etablir la viabilité avec du bleu Trypan. -9 - Prélever le volume de cellules requis pour un travail pratique. Laver les cellules trois fois dans RPMI 1640 ou du tampon phosphate ou Hanks + médicaments antibiotiques. Centrifuger pendant 7 mn à 900 t/m. 5. Mettre le suc cellulaire en suspension. Compter. Porter à 2,106 cellules Jurkat T/ml de solution de RPMI à 20 % de SFV adsorbés. III - PREPARATION DU PEPTIDE Solution inhibitrice = SDK (2,10 -mole). Les peptides à évaluer sont dissous dans RPMI 1640 à une concentration appropriée. IV - TEST Placer, dans le tube, 200 pl de solution inhibitrice + pl de cellules Jurkat T 2,106 M dans RPMI + SFV 20 %; laisser 10 mn dans un bain glacé. Ajouter 100 p1 d'hématies 2,108 M dans RPMI + SFV 20 %. Centrifuger pendant 5 minutes à 500 t/m. Laisser reposer toute la nuit à 4'C. V - COMPTAGE DES ROSETTES 20. Régler le microscope: oculaire: x 6 objectif: x 7 Remettre les cellules en suspension avec précaution, par tapotement. Laisser reposer un instant. Ajouter, dans le tube, 30 1 de bleu Toluidine 1 % (pour colorer les lymphocytes. Tapoter légèrement. - 10 - Faire 3 lectures à l'hémocytomètre Malassex par point expérimental. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant. % ROSETTES (% INHIBITION) Peptide SDK PSDKP Contrôle 63 + 4 59 + 4 -4 M 38 + 3 (-40%) * 37 + 7 (-37%) ** -5 M 45 + 4 (-28%) *** 33 + 3 (-44%) * -6 M 50 + 2 (-22%) *** 27 + 5 (-54%) * -7 M 49 + 2 (-22%) * 45 + 6 (-24%) *** -8 M 40 +2 (-36%) * 48 +2 (-19%) *** -9 M 43 +1 (-32%) * 48 + 4 (-19%) *** -10 M 43 3 (-32%) * 52 + 5 (NS) 101" M 40 +1 (-36%) * -12 M 44 +3 (-30%) * I0-13 M 51 + 7 (-19%) *** I0-14 M 55 +2 (-14%) *** -15 M 63 +4 (NS) () % Inhibition *: a - 11 - ISOLATION DE CELLULES HUMAINES PERIPHERIQUES MONONUCLEAIRES I - ISOLATION DE (nPMN) Diluer le sang à 1/2 dans du tampon phosphate. Sur 15 ml de Ficoll-Hypaque, mettre 35 ml de sang dilué. Centrifuger 30 mn a 1800 t/m, a température ambiante. Récupérer l'anneau correspondant aux cellules mono- nucléaires (CMN) avec une pipette Pasteur. Laver deux fois dans du tampon phosphate (centrifuger pendant 10 mn à 1800 t/m). Porter à 2,106 cellules/ml avec RPMI 1640 milieu "complet" + 10 % SFV. II - PRODUITS REACTIFS Phytohémagglutimine: 15. Reconstituer une bouteille de 5 ml lyophylisée avec 5 ml de milieu "complet". Solution de 100 %. Diluer pour obtenir une solution à 0,4 %. Peptides: SDK: Tube 106 mole + 4,35 ml milieu "complet". Solution 2,3 10-4 M. Puis diluer successivement: 450 pl "milieu" + 50 p1 de dilution. III - PROTOCOLE Dans 96 boites NUNC bien stérilisées: 25. 100 pl de CMN à 2,106 cellules/ml (2,105 cellules) pl de phytohémagglutimine 0,4 % (0,1 % final) - 12 - pi de milieu pl de peptide (3,10-5 M) Laisser incuber pendant 3 jours à 37 C dans une atmosphère air/CO2 95/5. Pendant les 24 dernières heures, donner une impulsion de [EH] Thymidine: 1 pci/puits. Récupérer les puits sur les filtres et compter avec un compteur. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant. Stimulation de la prolifération des lymphocytes T par Ser-Asp-Lys (SDK) et Pro-Ser-Asp-LysPro (PSDKP) Synthèse ADN provoquée par CMN stimulée par 0,1 % de PBL avec phytohémagglutimine 0,1 % de phytohémagglutimine cellules % stimulation cpm x 103/2,105 Contrôle (RPMI 1640) 35 + 2 + RBC autologue 44 + 5 + 26 % ** + SDK 3,10-5 M 56 + 5 + 60 % * Contrôle (RPMI 1640) 40 + 3 + SDK 3,1010 M 52 + 5 + 30 % *** Contrôle (RPMI 1640) 38 + 3 + 42 % *** + PSDKP 3,10 SM 54 + 4 *: a - 13 - REPONSE HUMORALE Des souris agées de 6 à 8 semaines de souche B6D2F1 sont sensibilisées, le jour 0, par 0,2 ml d'une suspension d'hématies de mouton [cellules 108] dans une solution saline de Hanks. Les peptides Ser-Asp-Lys et Pro-SerAsp-Lys-Pro (3 pg/kg) sont injectés en solution dans un sérum physiologique, par voie IP, dans 0,2 ml, à un moment précis. - Le jour + 4, les animaux sont sacrifiés et le nombre de lymphocytes B qui sécrètent des immunoglobines IgM- est déterminé suivant la technique d'hémolyse de plaques (méthode Jerne). 8 souris/lot - 4 déterminations/animal test renouvelé: 2 expériences/point. Les résultats sont reportés dans le tableau qui suit. - 14 - Stimulation de la réponse humorale, chez les souris, aux hématies de mouton un antigène T dépendant dans les peptides Ser-Asp-Lys et Pro-SerAsp-Lys-Pro (Nombre de P.F.C./cellules 106) PERIODE SUBSTANCES INJECTEES D'INJECTION Saline Ser-Asp-Lys Pro-Ser-Asp-Lys-Pro - 24 h 444 44 644 +170 630 +142 (+ 45) * (+ 42) * 0 h 459+ 103 903 + 133 915 + 140 (+ 97) * (+99) * + 24 h 407+ 66 459 +103 475 + 82 (NS) (NS) + 48 h 407+ 66 673 +110 589 +101 (+ 65) * (+ 45) * + 72 h 459 + 103 1073 +348 543 +112 (+ 134) * (NS) *: a TOXICITE Aucune toxicité n'a été constatée pour tous les peptides selon l'invention lorsqu'ils sont administrés per os, aux doses maximales administrables, à des rats et des souris. Par voie IP, aucune mort n'a été constatée à 1 g/kg pour les mêmes animaux. - 15 - PRESENTATION - POSOLOGIE Seuls les peptides Ser-Asp-Lys peuvent être administrés oralement et atteindre leur cible thérapeuti- que sans dégradation importante; les comprimés et les gélules sont des formes appropriées avec des unités de dosage contenant 10 mg de Ser-AspLys. Par cette voie, les peptides supérieurs requièrent des formes protégées et un dosage unitaire plus élevé (20 mg). Les doses quotidiennes peuvent être comprises entre 10 et 100 mg (SDK) ou entre 20 et 200 mg pour les peptides supérieurs. Par voie IP, les doses quotidiennes sont de 1 à 10 mg pour une action immédiate mais des formes d'administration retardée (microgélules, microsphère et autres) peuvent contenir jusqu'à 300 mg pour une forme retardée a long terme. 2644-065 - 16 - REVENDICATIONS 1.- Compositions thérapeutiques à base de peptides de formule générale H2N - W - Ser - Asp - Lys - X - OH dans laquelle X représente un résidu Pro ou Lys ou une liaison de valence et W représente un résidu Thr ou Pro ou une liaison de valence avec la convention que, si X représente un résidu Pro, alors W représente également un résidu Pro, ou de sels thérapeutiquement acceptables de ceux-ci. 2.- Composition thérapeutique selon la revendication 1, dans laquelle le peptide est Ser-Asp-Lys. 3.- Composition thérapeutique selon la revendication 1, dans laquelle le peptide est Ser-Asp-Lys-Lys. 4.- Composition thérapeutique selon la revendication 1, dans laquelle le peptide est Pro-Ser-Asp-Lys-Lys. - 5.- Composition thérapeutique selon la revendication 1, dans laquelle le peptide est Thr-Ser-Asp-Lys-Lys. 6.- Composition thérapeutique selon la revendication 1, dans laquelle le peptide est Pro-Ser-Asp-Lys. 7.- Composition thérapeutique selon la revendication 1, dans laquelle le peptide est Thr-Ser-Asp-Lys. 8.- Composition thérapeutique selon la revendication 1, dans laquelle le peptide est Pro-Ser-Asp-Lys-Pro. - 17 - 9.- Composition thérapeutique selon l'une des revendications i à 8, contenant, comme ingrédient actif, de 1 a 300 mg du peptide, associé a des excipients appropriés au mode d'administration choisi. 10.- Composition selon la revendication 9, pour administration orale, qui contient de 10 à 200 mg d'ingrédient actif. 11.- Composition selon la revendication 9, pour administration IP, qui contient de 1 à 300 mg d'ingrédient actif.