Brevet FR2645647A1 — publié le 19901012

PROCGDE DE DOSAGE DE COMPLEXES ANTTHROMBINE-PROTEASES DOMAINe DE L'INVEXTIOS La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de complexes Antithromoine-protéases mettant en oeuvre un matériau anticorps anti-Antithrombine (également dénommée Antithrombine III ou AT III) généré à partir d'Antithrombine modifiée. Ce nouveau procédé de dosage est notamment utile dans le domaine du diagnostic pour apprécier de façon précoce, avant tout accident thromboembolique, l'existence d'activations anormales de la coagulation du sang ou de déficiences cliniques au niveau de l'hémostase. L'invention concerne également une trousse, kit ou nécessaire de dosage comprenant les ingrédients essentiels, notamment les réactifs immunologiques et leurs diluants, qui sont requis pour la mise en oeuvre de ce nouveau procédé de dosage. ARBIKRE-PLUN THNOLOGIQOE L'organisme d'un animal à sang chaud, notamment celui d'un mammifère tel que l'homme, dispose de très importantes possibilités de régulation physiologique d'activation du sang, à savoir notamment des inhibiteurs (tels que lVAntithrotlibine III, le cofacteur II de l'héparine et les substances similaires), des régulateurs (tels que la Protéine C, la Protéine S, la Thrombomoduline et les substances similaires) et des moyens de fibrinolyse. Chez l'homne, l'altération progressive du système cardiovasculaire intervient chez tout individu et dépend de très nombreux facteurs liés au vieillissement, au mode de vie, aux caractères génétiques, aux épisodes pathologiques, à l'environnement psycho émotionnel, etc... L'altération progressive du système cardio-vasculaire se traduit par une activation chronique du sang, qui reste très longtemps cliniquement silencieuse grâce à l'action de tous les facteurs antithrombotiques précités. Lorsque tous ces facteurs sont saturés, l'accident thromboembolique intervient avec toutes ses conséquences. Toutefois, la phase cliniquement silencieuse peut être révélée par des moyens biochimiques intervenant en tant que "marqueurs" et résultant de l'activation du sang. Ces marqueurs peuvent notamment provenir de la génération de protéases et de leur action-sur leurs substrats naturels (notamment les FPA, PDF, D, DD et similaires), de l'activation plaquettaire (notamment les P Thromboglobuline, Facteur plaquettaire 4 et similaires) ou de l'intervention des inhibiteurs naturels empêchant l'extension de l'activation du sang (notamment ltAntithrombine III et similaires). Ainsi, l'Antithrombine III joue un rôle majeur en neutralisant, c'est-à-dire en inhibant, les activités protéasiques générées comme le Facteur Xiia, le Facteur XIa, le Facteur Ixa et, surtout, le Facteur Xa et le Facteur IIa (voir schéma de la figure 1 ci-après). I1 en résulte la formation de complexes Antithrombine-protéases; en particulier avec les protéases Xa, IIa, xIia, XIa et respectivement IXa, il se forme des complexes AT iIi-Xa, AT III-IIa, AT III-XIIa, AT III-XIa et respectivement AT III-IXa. ART ANTERIEUR On sait que l'on a déjà décrit la formation de complexes Thrombine-Antithrombine III (en abrégé : TAT), d'une part, et ltobtention d'anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-TAT pouvant intervenir dans des méthodes radioimmunologiques (RIA) ou enzymoimmunologiques (EIA), d'autre part. Voir à cet effet l'article de P. BAUER et al., Thronibos. Res., 28, pages 595-606, (1982) qui signale la fixation spécifique de complexes TAT sur les hépatocytes pour distinguer lesdits complexes de la Thrombine et de l'Antithrombine III suivant des essais radioimmunologiques; et, l'article de K.A. BAUER, Ann. Biol.Clin., 43, pages 451-455 (1985) qui étudie la formation de complexes TAT suivant une méthode RIA. L'article de J. DAINES et al., Thrombos. Res., 36, pages 397409 (1984) décrit également l'obtention d'anticorps monoclonaux anti TAT intervenant dans des essais RIA. L'article de J. JESTY et al., Analytical Biochenistry 128, pages 158-167 (1964) décrit ltobtention de complexes Antithrombine-Xa et leur détermination par des essais ETA. L'art antérieur le plus proche est constitué par l'article de H. PELER et al., Thrombosis and Haemostasis, 59 (No. 1), pages 101-106 (1988) et la notice "ENZYGNOSTR-TAT" jointe à la trousse de dosage commercialisée par la société dite BEHRISSWERKE AG dans le domaine de détermination de complexes Thrombine-Antithrombine III. Selon cet article et cette notice, l'on fait réagir le complexe TAT sur un anticorps polyclonal anti-Thrombine fixé sur un support (dans le cas d'espèce l'intérieur du godet ou de la microcuvette), le produit résultant anti (T)-TAT est mis à réagir avec un anticorps anti (AT III) conjugué à la peroxydase (POD) qui se lie au fragment TAT audit produit résultant pour donner un composé anti (T)-TAT-anti(AT III)/POD ce produit ainsi obtenu étant mis en contact avec le substrat POD contenant de l'eau oxygénée et on suit le clivage au moyen d'un spectrophotomètre.Les mécanismes réactionnels correspondants sont illustrés par les réactions suivantes 1) e anti(T) + TAT anti(T)-TAT 2) F anti(T)-TAT + anti(AT III)/POD ftanti(T)-TAT-anti(AT III)/POD 3) mesure de l'activité enzymatique après addition de POD en présence de H2O2 par formation de couleur En bref, la technique du test "ENZYGNOSTR-TAT" met en oeuvre des anticorps polyclonaux anti-Thrombine, d'une part, et des anticorps polyclonaux anti-Antithrombine III, d'autre part, qui se fixent sur le complexe TAT.D'autres résultats de la technique selon le test "ENZYGNOSTR-TAT" ont fait l'objet de communications au cours du 11sème Congrès International sur l'Hémostase et la Thrombose tenu à Bruxelles les 6-10 juillet 1987; voir à cet effet les résumés des communications publiées dans Thrombosis and Haemostasis, 58 (No. 1), page 237, (juillet 1987) : S. ASAKURA et al., résumé No. 874; H. PELZER et al., résumé No. 875; et, J.A. HOEK et al., résumé No. - 876. Le test "ENEZYGNOSTR-TAT" présente des inconvénients de trois natures différentes sur le plan de la technique, sur le plan biochimique et sur le plan biologique. Du point de vue technique, il convient de remarquer que la Thrombine est peu immunogène et présente des réactivités croisées (en anglais "cross-reactivities") avec la Prothrombine; dans ces circonstances il y a, soit perte de réactivité par inhibition compétitive de la fixation ("bindingn), ce qui réduit la sensibilité, soit la nécessité d'épuiser préalablement les anticorps communs à la Thrombine et à la Prothrombine, ce qui réduit également la réactivité et accroît le coût. C'est cette technique d'épuisement préalable qui intervient dans l'élaboration de la trousse de dosage ENZ YGNOSTR-TAT . Du point de vue biochimique, il se trouve que la formation des complexes TAT, en l'absence d'héparine, passe par divers stades d'évolution relativement lents - formation de complexes réversibles, - formation d'un peptide de clivage de ltAT III, - formation de complexes irréversibles, - dégradation possible de ces derniers complexes en produits inactifs. A ces mécanismes il convient d'ajouter le fait que la cinétique de clearance des complexes est rapide : les complexes se fixent sur la Vitronectine (S-protéine) plasmatique [Nota Bene : la S-protéine est différente de la Protéine S précitée] ce qui facilite et accélère la clearance, et les complexes TAT sont de plus éliminés par fixation sur la Thrombomoduline. Par suite l'on présume, de façon sérieuse, que le test "ENZYGNOSTR-TAT" ne dose qu'une faible partie des complexes Thrombine-Antithrombine III, à savoir les formes stables. Du point de vue biologique, il convient de constater que la participation de llAntithrombine III dans la régulation de l'activation de 1 'hémostase est importante en amont de la thrombinoformation; il est plus que probable que, avant que 1'AT III ne soit mobilisée pour la neutralisation de la Thrombine, 1'AT III ait déjà été sollicitée pour réagir contre le Facteur Xa, le Facteur IXa et le Facteur XIa; ainsi tout se passe comme si les complexes TAT stables peuvent ne représenter que "la partie émergée de l'iceberg" c'est-àdire qu'une partie des mécanismes de lthémostase illustrés par la figure 1 ci-après. Les inconvénients biologiques précités sont notamment expliqués par les faibles taux de TAT mesurés selon le test "ENZYJOSTR-TAT", qui sont de l'ordre de 1 ng/ml et qui ne montent au maximum qu'au voisinage de 10 ng/ml dans les cas cliniques courants, voire 30 à 50 ng/ml dans les états tumoraux avoir en particulier les résultats donnés dans ladite notice précitée, l'article de E. PELZER et al., Thrombosis and Haemostasis 59, (No 1), pages 101-106, (1988) précité et les résumés 875 et 876 susvisés]. OBJET DE L'INVENTION Selon l'invention on préconise une nouvelle solution technique pour apprécier de façon précoce les déficiences pathologiques au niveau de l'hémostase et plus particulièrement l'activation néfaste du sang. Cette nouvelle solution technique offre I avantage de pallier les inconvénients précités du test "ENZYGNOSTR-TA1"; elle repose sur l'utilisation d'un matériel iuunologique particulier choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les anticorps monoclonaux anti (Antithrombine III modifiée) [en abrégé :: anti(ATM) 1 générés contre la fraction Antithrombine III de complexes AT III-sérine estérase, dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaitre sur ladite fraction Antithrombine III une plage d'épitopes, et (ii) les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT III-protéases, notamment les complexes AT III-IIa, AT III-IXa, AT III-Xa, AT IIl-Xla et AT III-XIIa, mais ne réagissant pas avec la Prothrombine, la Thrombine ni 1 'Antithrombine III ni avec lesdites protéases IIa, vexa, Xa, XIa et Plia. Selon cette nouvelle solution technique, l'anticorps anti (AT III modifiée) [désigné ci-après anticorps anti-ATM] ou ses fragments F(ab')2 ou F(ab) réagissent avec toutes les portions protéases IIa, IXa, Xa, XIa, XIIa des complexes Antithrombine IIIprotéases qui sont contenus dans le milieu liquide à analyser, notamment le plasma d'un patient, la présence d'au moins un desdits complexes étant révélée au moyen d'un anticorps anti-Antithrombine III marqué. La solution technique selon l'invention est sensible à la présence de tous les complexes réversibles ou irréversibles obtenus suivant les réactions + IIa = AT III-IIa + lXa f AT III-IXa AT III + Xa ~ ~ AT III-Xa + XIa - AT III-XIa + XIIa su~~ AT III-XIIa alors que la technique du test "EN4ZYGNOSIR-TAT" est essentiellement sensible à la présence du complexe formé par la réaction AT III + IIa AT III-IIa Le procédé de dosage de complexes AT III-protéases que l'on préconise suivant l'invention, qui met en oeuvre l'utilisation d'un anticorps anti (ATM) en tant que matériel immunologique, est caractérisé en ce que l'on met en contact un milieu liquide à analyser contenant au moins un complexe AT III-protéase avec un matériel imminologique, de préférence fixé sur un support inerte, choisi parmi 1 'ensemble constitué par (i) les anticorps monoclonaux anti (Antithrombine III modifiée) [en abrégé : anti (AIM)] générés contre la fraction Antithrombine III de complexes AT III-sérine estérase dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaître une plage d'épitoges sur ladite fraction Antithrombine III, et (il) les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT III-protéases mais ne réagissant pas avec l'Antithrombine III, la Prothrombine, la Thrombine, les protéases IIa, IXa, Xa, XIa et XIIa, ladite mise en contact mettant en oeuvre la réaction anti(ATM) + AT III-protéases ) anti(ATM)-(AT III-protéases) L'invention concerne également en tant que produit industriel nouveau le matériel inunologique anti (ATM) généré contre la fraction AT III desdits complexes AT III-sérine estérase. L'invention concerne également la trousse ou nécessaire de dosage comprenant ledit matériel imnunologique. ATTT1ONS Dans ce qui suit, par comnodité les abréviations suivantes ont été utilisées. anti-Z désigne un anticorps généré contre le moyen Z [autre nomenclature : anti (Z)]; ATM désigne l'antithrodbine III modifiée; selon l'invention, le terme ATM désigne plus précisément une substance dans laquelle la portion de l'Antithrombine III préalablement complexée par la sérine estérase a été clivée de telle façon qu'un petit peptide de PM 5000 environ a été déplacé pour dénuder et faire apparaître une plage d'épitopes sur ladite portion d'AT III (le clivage peut être partiel: ledit petit peptide restant fixé à ladite portion d'AT III, ou total : ledit petit peptide n'étant plus lié à ladite portion d'AT III); AT désigne l'Antithrombine (également appelée Antithrombine III ou AT III); désigne le coefficient de variation moyen; D désigne le fragment D monomère des produits de dégradation du fibrinogène; DD désigne le fragment D dimère des produits de dégradation de la fibrine; DIC désigne l'expression coagulation intravasculaire disséminée ; DO désigne la densité optique (mesurée notamment à une longueur d'onde de 492 nm); ElA désigne une technique enzymimm1nologique (en anglais : "enzyme imuunoassay"); ELISA abréviation de l'expression anglaise "enzyme- linked immunosorbent assay", désigne une technique EIA particulière; F(ab) désigne un premier fragment d'un anticorps obtenu - par clivage dudit anticorps par la papaine; F(ab')2 désigne un second fragment d'un anticorps obtenu par clivage dudit anticorps par la pepsine;; un anticorps (tel que IgG) présente d'une manière générale une structure ayant schématiquement la forme d'un Y et comprend deux chaines dites légères (a) reliées entre elles au voisinage de leurs extrémités inférieures par un pont disulfure (1) et deux channes dites lourdes (b) [de PM et de longueur supérieurs à ceux des chaines (a)] reliées chacune à la channe (a) opposée, d'une part, par deux ponts disulfure (2) situés au-dessous du pont disulfure (1), et d'autre part, par au moins un pont disulfure (3) situé dans l'une des branches latérales de 1'Y; cette structure est illustrée par le schéma suivant (dans lequel seuls les ponts essentiels ont été représentés): clivage par la papaine clivage parla pepsine la digestion (ou dégradation) par la papaine ou la pepsine va cliver la branche inférieure de 1 : le clivage par la papaine intervient entre le niveau du pont disulfure (1) et le niveau des deux ponts disulfure (2), et le clivage par la pepsine intervient en-dessous du niveau du pont disulfure ( le clivage par la papaine illustré par le mécanisme suivant PaS X I H ; | 'ab) c IgG donne deux fragments F(ab) et un fragment Fc; le clivage par la pepsine illustré par le mécanisme suivant 'I pepsne + Pepsine F c IgS donne le fragment F(ab')2 et un fragment Fc (différent du fragment Fc précédent);; le clivage par la papaine ou la pepsine (ou tout autre moyen réducteur approprié) a pour objet d'écarter la majeure partie du fragment Fc qui peut réagir de façon aspécifique avec le Facteur Rhumatoïde (FR), ce qui implique la perturbation possible des dosages quand Fc est présent dans le matériel immunologique, d'une part, et recueillir les fragments F(ab) et F(ab')2 qui sont essentiellement insensibles audit Facteur Rhumatoide, d'autre part. FPA désigne le fibrinopeptide A; FT désigne le Facteur Tissulaire; FR désigne le Facteur RhumatoIde; PDF désigne les produits de dégradation du fibrinogè ne comme indiqué dans la demande internationale PCI WO-86-01298 (incorporée ici à titre de référence); PLP désigne tout phospholipide PM désigne le poids moléculaire; POD désigne la peroxydase; OPD désigne ltortho-phénylènediamine; R désigne un moyen de marquage; RIA désigne une technique radioimmunologique; SE désigne toute sérine estérase; T désigne la Thrombine; TAI désigne le complexe Thrombine-Antithrombine III intervenant selon l'art antérieur précité; II désigne le Facteur Il (autre nomenclature Prothrombine);; IIa désigne le Facteur II activé; V désigne le Facteur V, il s'agit du cofacteur du Facteur X; V* désigne le Facteur V activé; VII désigne le Facteur VII; VIIa désigne le Facteur VII activé; VIII * C désigne le Facteur VIII coagulant sous forme activée, ladite forme activée est le cofacteur de IXa; IX désigne le Facteur IX; IXa désigne le Facteur IX activé; X désigne le Facteur X; Xa désigne le Facteur X activé; XI désigne le Facteur XI; XIa désigne le Facteur XI activé; XII désigne le Facteur XII; XIIa désigne le Facteur XII activé; XIII-A désigne le Facteur XIII-A de la coagualtion qui stabilise sous sa forme active (XIIIA*); la fibrine en introduisant des liaisons covalentes. DESCRIPTION DlaSdJUUEZ DE L'INVENTION Les mécanismes en cascade intervenant dans l'hémostase sont illustrés par la figure I ci-après. Ils montrent que l'AT III réagit en particulier sur les Facteurs activés IIa, IXa, et Xa (comme représenté) ainsi que sur les Facteurs activés XIa et XIIa pour donner des complexes AT III-IIa, AT Ili-Ixa et AT III-Xa (comme représenté) ainsi que des complexes AT III-XIa et AT III-XIIa. En bref, suivant le schéma illustré sur la figure 1, 1'AT III agit - lors de la mise en contact avec le sang, le sérum ou le plasma; - sur le Facteur XIa (avec formation du complexe AT III-Xla, non représenté, en cas de difficulté ou déficience au niveau de l'hémostase); le Facteur IX est activé en IXa soit par le XIa soit par le complexe VII-FT [où le Facteur VII est sous forme activée VIIa (avec formation du complexe AT III-VIIa, non représenté, en cas de difficulté ou déficience au niveau de 1 'hémostase)]; le IXa forme un complexe enzymatique avec les phospholipides (PLP), le Ca2+ et son cofacteur VIII C, ce complexe active le Facteur X en Xa; le Xa ainsi obtenu forme un complexe avec les PLP, le Ca2+ et son cofacteur V (sous forme activée V*), ce dernier complexe active le Facteur II (Prothrombine) en IIa; - sur le IXa pour donner, comne représenté, un complexe AT III IXa, - sur le Xa pour donner, comne représenté, un complexe AT III-Xa, et - sur le IIa pour donner, comme représenté, un complexe AT III IIa. L'obtention du complexe AT III-sérine estérase qui permet de générer des anticorps monoclonaux spécifiques des complexes Antithrortibine III-protéases tels que AT III-IIa, AT III-IXa, AT III Xa, AT III-XIa et AT III-XIIa est illustrée par la figure 2 ci-après. En bref, lors de la mise en contact de 1'AT III (PM de l'ordre de 65000 environ) avec la sérine estérase, il se forme en premier lieu un complexe réversible (référencé 21) suivant la réaction d'équilibre AT III + SE AT III-SE dans ce complexe réversible, la portion AT III comporte un petit peptide de PM 5000 environ (référencé 22). En second lieu, ce complexe réversible est transformé (selon la flèche 23) en complexe covalent irréversible (référencé 24) dans lequel (i) ledit peptide (22) a été déplacé suivant un clivage partiel faisant apparaltre une plage d'épitopes (référencée 25) sur la portion AT III dudit complexe covalent irréversible, et (ii) la liaison AT III/SE a été soumise à un réarrangement. En troisième lieu, ledit complexe covalent irréversible (25) est soumis à un clivage pour donner (suivant 26) une ATM comportant ladite plage d'épitopes (25) et ledit peptide (22) fixé à la portion AT III au voisinage de ladite plage, ou (suivant 27) une ATM comportant ladite - plage d'épitopes (25) mais dépourvue dudit peptide (22). En variante cette dernière ATM peut être obtenue (suivant 28) par traitement de 1 'ATM précédente comportant le peptide (22) par clivage total dudit peptide (22). Suivant l'invention, le matériel immunologique, à savoir ltanticorps monoclonal anti (ATM), est généré contre une ATM choisie parmi (a) le complexe covalent irréversible, (b) la portion AT III modifiée séparée dudit complexe covalent irréversible et comportant ledit petit peptide de PM 5000 environ, et (c) la portion AT III modifiée séparée dudit complexe covalent irréversible et dépourvue dudit petit peptide, les moyens (a), (b) et (c) présentant bien entendu ladite plage d'épitopes précitée. Si nécessaire, on recueille à partir desdits anticorps monoclonaux, les fragments F(ab')2 et F(ab) par digestion des anticorps monoclonaux par digestion avec la pepsine et respectivement la papaine, ou tout autre moyen équivalent. Suivant l'invention, on préfère utiliser le moyen (b), à savoir la portion AT III modifiée séparée dudit complexe covalent irréversible et comportant ledit petit peptide de PM 5000 environ, pour la fabrication des anticorps monoclonaux anti (ATM) puis l'obtention, à partir desdits anticorps monoclonaux des fragments F(ab')2 et F(ab) qui sont insensibles au Facteur Rhwmatoide. Le meilleur mode de mise en oeuvre du procédé de dosage selon l'invention consiste à mettre en contact ledit matériel immunologique fixé sur un support inerte, notamment la paroi d'une microccvette, - par revêtement (en anglais : "coating"), selon la réaction F anti(AIM) + AT protéases F anti(ATM)-(AT III-protéases) où P désigne la fixation sur ledit support, puis la révélation de ladite réaction selon une méthode connue en soi. Cette réaction constitue "un signal" que l'on "amplifie" selon une méthode cornue en soi [par exemple, une méthode EIA (de préférence une méthode ElA sandwich) selon laquelle on couple le complexe anti (ATM)-(AT III-protéases) avec un conjugué enzymatique approprié, une méthode RIA, une méthode d'agglutination, une méthode de luminescence].Parmi les moyens utiles pour la révélation on peut notamment citer un anticorps monoclonal ou polyclonal anti (AT III) marqué, notamnent par la peroxydase, ou par un révélateur notamnent choisi parmi ltensemble comprenant les particules de latex coloré, d'agent fluorescent et d'or colloida1. D'une manière générale, l'amplification dudit signal peut être réalisée selon les techniques décrites dans EP-A-O 122 478 incorporé ici à titre de référence. Le support F peut être notamment une membrane réactive M (telle que bandelette ou biosenseur). L'utilisation d'une telle wsbrane fait appel à une méthode différente de la méthode ELISA quand on utilise un complexe M-anti (ATM)-(AT III-protéase) (où M représente une membrane remplaçant la microplaque ELISA), ce complexe peut être révélé par diverses méthodes, notamment (A) -par un anticorps anti (4T III) marqué, où le moyen de marquage (R ) est un enzyme, un radioisotope, un substrat chromogène, luminescent ou fluorescent, (B) par un anticorps anti (AT III) couplé au moyen de billes de latex colorées ou fluorescentes (pour lecture directe), ou (C) par un anticorps anti (AT III) couplé à de l'or colloïdal remplaçant les billes de latex précitées. L'amplification préférée suivant le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention consiste à faire réagir, selon une méthode EIA sandwich, le complexe anti (AT!)-(AT III-protéases) avec un anticorps anti-AT III marqué, suivant la réaction anti(ATM)-(AT III-protéases) + anti(AT III) F anti(AIM)-(AT III-protéases)-anti(AT III)/R* où R désigne un élément de marquage, et le matériel immunologique anti (ATM) est avantageusement le fragment F(ab')2. Le mode de marquage préféré consiste à utiliser un anticorps monoclonal ou polyclonal anti (AT III) marqué à la peroxydase. Dans ce cas, le substrat chromogène préféré est l'OPD, et le moyen développant la couleur est l'eau oxygénée. En variante, l'amplification peut faire appel à des particules de latex colorées, ou à des particules d'or colloïdal où l'or est éventuellement associé à de l'argent, comme indiqué cidessus. Cette amplification peut également être utilisée selon les techniques photométriques, turbidimétriques ou néphélométriques; en particulier, on peut utiliser les particules de latex de dimensions submicroniques revêtues d'un réactif immunologique tel qu'un anticorps [dans le cas d'espèce le matériel immunologique anti (ATM) selon l'invention], telles que décrites dans la demande antérieure de brevet français nO 89 00 660 du 20 janvier 1989 de la Demanderesse, pour des dosages turbidimétriques ou néphélométriques. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d ' exemples de mise en oeuvre nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. m5 1 Obtention du complexe AT III-sérine estérase On procède selon le mécanisme opératoire illustré par la figure 2 en mettant en contact l'AT III avec une sérine estérase. A 1 mi d'une préparation aqueuse d'AT III humaine purifiée (ayant une concentration de 0,150 g/ml) on ajoute 2 ml de sérine estérase à 170-300 Ui/ml. On incube pendant 1 h à 370C puis arrête la réaction par addition d'un agent inhibiteur (1 ml) neutralisant l'excès de sérine estérase. On complète par 6 mi d'un tampon phosphate à pH 7,5 contenant 1 g/l d'albumine bovine ultra pure. On obtient 10 ml d'une solution aqueuse d'ATM purifiée titrant 0,015 g/l d'ATM. Il s'agit du complexe covalent irréversible référencé (24) dans le schéma de la figure 2. Ce complexe covalent irréversible peut être dissocié par des agents nucléophiles l'hydroxylamine ou des solutions alcalines [canine indiqué par C. BOYER-NEUMANN et al., Ann. Biol. Clin., 45, pages 175180, (1987), I. BJORK et al., FEBS Lett., 126, 257, (1981) ou G. OSHIMA et al., Thrombosis Research, 46, pages 263-270, (1987)l pour donner une ATM comportant le peptide (22) ou une ATM dépourvue dudit peptide (22). EXEMPLE 2 Obtention du complexe AT III-T On procède comme indiqué ci-dessus avec une sérine-estérase particulière, la Thrombine. A 1 ml dune préparation aqueuse d'AT III humaine purifiée (ayant une concentration de 0,150 g/ml) on ajoute 2 ml de Thrombine à 200 NiH/ml. On incube pendant 1 h à 370C puis arrete la réaction par addition de 1 ml d'hirudine à 2000 ATU (afin d'inhiber l'excès de Throdbine). On complète par 6 mi d'un tampon aqueux à pH 7,5 [constitué de phosphate (0,05 M), glycine (0,1 M) et NaCl (0,15 M) et contenant 1 g/l d'albumine bovine ultra pure]. On obtient 10 ml d'une solution aqueuse d'ATM purifiée titrant 0,015 g/l d'ATM. I1 s'agit du complexe covalent irréversible référencé (24) dans le schéma de la figure 2. Le contrôle de cette ATM est effectuée par électrophorèse au moyen de SDS-PAGE (abréviation de "sodium Diodecylsulfate Polyacrylamide gel Electrophoresis" à 7 X . La génération de complexes AIN-IIa est visualisée par l'apparition d'une bande de PM 96000 environ. Le complexe covalent irréversible AT III-T constituant cette ATM peut être dissocié comme indiqué ci-dessus à l'exemple 1. XtEMPLe 3 Obtention de I'anticorps anti (ATM) A partir du complexe irréversible obtenu selon l'exemple 1 ou 2 on génère des anticorps monoclonaux contre la portion AT III dudit complexe AT III-sérine estérase. Le complexe AT III-protéases obtenu selon l'exemple.1 ou 2 est utilisé pour des immunisations de souris (BALB-C) selon des techniques usuelles d'immunisation, voir à cet effet "Methods in Immunology" W. A. BENJkMIN INC. Publishes, 159-182, (1970). Après immunisation, on sacrifie les souris et on prélève stérilement les rates (2 souris par fusion). On extrait les lymphocytes de la rate puis on procède à la fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome de souris en croissance exponentielle, selon notamment des protocoles classiques d'hybridation lymphocytaire [voir J.G.R. HURRELL, "Monoclonal Hybridoma Anti-bodies : Techniques and Applications", CRC PRESS INC., (198l)i. On procède ensuite à la sélection des hybridomes sécréteurs par screening des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant avec les complexes AT III-protéases mais ne réagissant pas avec l'AT III native, la Prothrombine, la Thrombine et les autres protéases du sang telles que IIa, IXa, Xa, XIa et XIIa. EXEMPLE 4 Obtention du fragment F(ab')2 On introduit 100 mg d'anticorps monoclonal- anti (ATM), obtenu selon l'exemple 3, dans un tampon acétate 0,07 M à pH 4,0 contenant 0,05 M de Nazi. A la composition aqueuse résultante on ajoute 3,2 mg de pepsine (par exemple la pepsine commercialisée par la société dite SIGMA CHEMICALS) et on incube 18 h à 370C. On concentre ensuite le mélange résultant jusqu'à un volume de 5 ml puis soumet le concentrat à une filtration sur gel (par exemple le gel commercialisé par la société dite PHARMACIA sous la nomenclature de SEPHACRYLR S 200 HR), le gel garnissant une colonne de i m de hauteur et de 50 mm de diamètre extérieur.On recueille la fraction contenant le fragment F(ab')2 ainsi séparé du fragment Fc et de la pepsine. La fraction contenant le fragment F(ab')2 est dialysée contre un tampon glycine à 0,1 M contenant 0,15 M de NaCI et ayant un pH de 8,2. Le fragment F(ab')2 ainsi purifié est prêt à l'utilisation pour le revêtement ('.coating") d'un support approprié, notamment des microplaques. EXEMPLE 5 Réactivités Le fragment F(ab')2 de l'anticorps monoclonal, tel qu'obtenu selon l'exemple 4, reconnaît les complexes AT III-protéases et en particulier les complexes AT III-IXa, AT III-Xa et AT III-IIa. I1 ne reconnaît pas 1'AT III native, les facteurs ISa, Xa et IIa, la Prothrombine et les autres protéases plasmatiques. A titre d'exemple on a mis en contact ledit fragment avec un milieu contenant diverses quantités de complexes AT III-IXa, AT III Xa et AT III-IIa en présence de diverses quantités d'AT III et de Facteurs IXa, Xa et IIa. Les courbes de la figure 3 ci-après concernent les réactivités dudit fragment déterminées par dosage imsuno-enzymatique (technique ElA sandwich) et exprimées, après révélation de couleur au moyen du système POD/HD2O2, par la variation de la DO à 492 nm en fonction de la concentration donnée en ng/ml. Les courbes de la figure 3 montre que, suivant ce dosage, les complexes AT III-IXa, AT III-Xa et AT III-IIa réagissent spécifiquement avec ledit fragment. La cross-réactivité de 1'AT III mesurée dans ledit dosage est inférieure à 1/30000. EXEMPLE 6 Effet de l'addition de IIa, Xa, IXa à un plasma Lorsqu'on ajoute les Facteurs IIa, Xa et IXa à un plasma contenant de 1'AT III, il se forme des complexes AT III-IIa, AT III Xa et respectivement AT III-IXa. La formation de ces complexes est dite "dose-dépendante". On a ajouté à un plasma citraté et hépariné les produits suivants - sérum physiologique (témoin), - Facteurs IIa, IXa ou Xa suivant des concentrations finales allant de O à 5000 ng/ml. Après incubation de 0,5 h à 370C et arrêt de toute réaction par l'hirudine et le PPACK (dichlorhydrate de D-phenylalanyl-Lprolyl-L-arginine-chlorométhyl-cétone, puissant inhibiteur synthétique de la Thrombine), on a dosé les quantités des complexes AT III IIa, AT III-IKa et AT III-Xa qui ont été formés, selon une technique EIA sandwich en utilisant le fragment F(ab'32 pour fixer chacun desdits complexes puis en faisant réagir chaque produit résultant avec un anticorps (monoclonal ou polyclonal) anti (AT III) marqué à la peroxydase, la révélation étant effectuée au moyen du système OPD/H202. Les courbes de la figure 4 obtenues selon cette technique donnent la teneur en complexe AT III-protéase formée en fonction de la concentration (C) de chaque protéase IIa, IXa et Xa donnée en ng/ml. La teneur en AT III-protéase reste égale. à 0 pendant toute l'expérience pour les témoins. EXEMPLE 7 I;Imunoblotting Les substances à analyser (à savoir : AT III, IIa, Xa, XIa, AT III-IIa, AT III-Xa ou AT III-IXa) sont sabord séparées sur plaque de gel de polyacrylamide. Elles sont ensuite transférées sur une feuille de nitrocellulose puis incubées avec le fragment F(ab')2 obtenu selon l'exemple 2 ci-dessus. Les anticorps ayant réagi sont ensuite révelés par un second anticorps marqué (dans le cas d'espèce un anticorps monoclonal ou polyclonal anti-IgG de souris produit chez le lapin et marqué à la peroxydase). On constate que ledit fragment F(ab')2 ne réagit qu'avec les complexes AT III-protéases et qu'il ne. fixe pas 1'AT III ni les protéases IIa, Xa et XIa. EXEMPLE 8 Trousse de dosage La trousse de dosage comprend de façon avantageuse les ingrédients suivants - plaque de 96 puits, en six barrettes sécables pré-revêtues au moyen du fragment F(ab')2 anti (ATM) obtenu selon l'exemple 2; cette plaque doit être conservée à + 40C; - tampon de dilution (de préférence un flacon de 100 mi prêt à ltemploi); - complexes AT III-protéases de référence (de préférence un flacon renfermant 1' ensemble des complexes AT III-protéases sous forme lyophilisée obtenus à partir d'AT III humaine, le contenu de ce flacon est à reprendre avec 5 ml de tampon de dilution afin d'obtenir une solution titrant 50 ng/ml, ce qui correspond à un plasma titrant 500 ng/ml dilué au 1/10); - anticorps anti (AT III)/peroxydase (immunoglobulines de lapin spécifiques de lttT III et couplées à la peroxydase); sous forme lyophilisée (on dilue le contenu du flacon par 20 ml de tampon de dilution pour avoir la solution dlimmunoconjugé prête à ltem- ploi); - solution de lavage (de préférence un flacon de 20 ml de solution de lavage à diluer au 1/20 afin d'obtenir la solution requise prête à l'emploi); - substrat ortho-phénylènediamine (OPD); le substrat OPD est conservé lyophilisé avec son tampon d'utilisation; avant emploi on reconstitue la solution de substrat par addition de 20 mi d'eau distillée puis ajoute 10 microlitres d'eau oxygénée à 30 % (i.e. H202 à 110 volumes). Les autres réactifs nécessaires non inclus dans la trousse de dosage comprennent : l'eau oxygénée et l'acide sulfurique 3 M. Le lecteur de plaque est réglé pour opérer à la longueur d'onde de 492 nm. Le protocole opératoire est le suivant. Recueil et traitement du plasma On recueille le plasma au moyen de citrate de calcium 0,109 M à raison de 1 volume de citrate pour 9 volumes de sang en écartant le premier millilitre de sang. On centrifuge 10 minutes à environ 300 tours/minute. Le plasma ainsi obtenu peut être conservé 8 heures à la température ambiante (15-2O0C) ou un mois après congélation (si le plasma traité est utilisé après congélation il est recomnandé de le décongeler préalablement à 370C pendant au moins 15 minutes avant utilisation. Etalonnage A partir du point titrant 50 ng/ml de AT III-protéases on réalise la gamme d'6talonnage suivante au moyen du tampon de dilu tion taux de AT III-protéases (ng/ml).. .50 20 10 5 2,5 0 tampon de dilution (ml) ............0 0,6 0,8 0,9 0,95 1 ml de AT III-protéases à ioo ng/ml 1 0,4 0,2 0,1 0,05 0 Plasma à tester On dilue le plasma à tester au 1/10 au moyen de tampon de dilution; pour des concentrations plus élevées, il convient de diluer le plasma au 1/20 ou au 1/40. Dosage - Fixation de l'antigène - On introduit par cupule 200 microlitres de dilution d'étalonnage ou de plasma à tester dilué au moyen du tampon de dilution. - On incube 2 heures à une température comprise entre 15 et 40 C (de préférence à 370C). - On effectue ensuite 5 lavages successifs à l'aide de la solution de lavage. - Addition du conjugué - Dès que le dernier lavage a été effectué, on introduit aussitôt par cupule 200 microlitres d'immunoconjugué. - On incube 2 heures à une température comprise entre 15 et 4O0C (de préférence à 370C). - On effectue ensuite 5 lavages successifs à l'aide de la solution de lavage. - Développement de la coloration - Dès que le dernier lavage a été effectué, on introduit aussitôt dans chaque cupule 20Q microlitres de substrat OPD/H202. - On incube très exactement pendant 6 minutes, puis arrête la réaction par addition de 50 microlitres d'acide sulfurique 3 M. Lecture - On laisse reposer la plaque pendant 10 minutes à la température ambiante. - On mesure ensuite la DO à 492 nm. Résultats Sur du papier millimétré, on porte en abscisses la concentration d'AT III-protéases et en ordonnées la DO correspondante mesurée à 492 nm. Sur la courbe ainsi obtenue, on détermine le taux d'AT III-protéases du plasma à étudier, en multipliant la valeur obtenue par 10 (ou par le facteur d'ébullition si celui-ci est différent). On constate que lorsque des complexes AT III-protases sont ajoutés à des plasmas normaux le taux de recouvrement desdits complexes se situe entre 90 à 110 X du taux attendu. La plage de mesure, selon le présent procédé de dosage, des complexes AT III-protéases va de O à 50 ng/ml. Les coefficients de variation moyens (CV) intra-essais et inter-essais sont inférieurs à 10 % Le seuil de sensibilité du procédé de dosage selon l'invention est de l'ordre de 0,2 ng/mi. Des valeurs cliniques relatives à la teneur en complexes AT III-protéases qui ont obtenues sur des patients normaux, d'une part, et des patients ayant des déficiences au niveau de l'hémostase, d'autre patt, ont été consignées ci-après - valeurs normales : sur 15 individus normaux on a obtenu moyenne : 11,4 ng/ml écart type : 2,7 ng/ml extrêmes : 5 à 17 ng/ml - valeurs pathologiques - DIC : 26 à 160 ng/ml - Chirurgie ortho pédique sous pro phyllaxie de Love nox (24 h après injection) : 20 à 250 ng/ml - Toxémie gravi dique : 50 à 1000 ngfml On constate que lesdites valeurs cliniques chez les individus normaux et respectivement les cas pathologiques, sont nettement supérieures à celle rapportées ci-dessus et obtenues suivant le test de l'art antérieur mettant en oeuvre le complexe TAT. BEEBDICATI0NS 1. Procédé de dosage de complexes AT III-protéases que 1on préconise suivant l'invention, qui met en oeuvre l'utilisation d'un anticorps anti (AIM) en tant que matériel immunologique, est caractérisé en ce que l'on met en contact un milieu liquide à analyser contenant au moins un complexe AT III-protéase avec un matériel imnunologique choisi parmi 1'ensemble constitué par (i) les anticorps monoclonaux anti (Antithrombine III modifiée) générés contre la fraction Antithrombine III de complexes AT III-sérine estérase dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaître une plage d'épitopes sur ladite fraction Antithrombine III, et (ii) les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT III-protéases mais ne réagissant pas avec l'Antithronibine III, la Prothrombine, la Thrombine, les protéases IIa, IXa, Xa, XIa et XIIa, ladite mise en contact mettant en oeuvre la réaction anti(ATM) + AT III-protéases anti(AT!)-(AT III-protéases) 2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le matériel irmrunologique est le fragment F(ab) de l'anticorps monoclonal anti (ATM). 3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le matériel immunologique est le fragment F(ab')2 de l'anticorps monoclonal anti (ATM). 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le matériel imuunologique est fixé sur un support inerte. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 et 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la fixation d'un immunoconjugué. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que ledit immunoconjugud est un anticorps anti (AT III), qui est de préférence marqué à la peroxydase. 7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que ledit irrmunoconjugué est un anticorps anti (AT III) lié à un révélateur notamnent choisi parmi 1'ensemble comprenant les particules de latex coloré, d'agent fluorescent et d'or colloïdal. 8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes 1 et 5, caractérisé en ce qu'il comprend les réactions 1 ) F anti(ATM) + AT III-protéases F anti(ATM)-(AT III-protéases) 20) F anti(AIX)-(AT III-protéases) + anti(AT III) F anti(ATM)-(AT III-protéases)-anti(AT III)/R* où R désigne un élément de marquage, et F désigne la fixation sur un support inerte. 9. Matériel Ùirminologique utile pour le dosage des complexes AT III-protéases, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les anticorps monoclonaux anti (Antithrombine III modifiée) générés contre la fraction Antithrombine III de complexes AT III-sérine estérase dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaître une plage d'épitopes sur ladite fraction Antithrombine III, et (ii) les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT III-protéases mais ne réagissant pas avec l'Antithrombine III, la Prothrombine, la Thrombine, les protéases IIa, IXa, Xa, XIa et XIIa. 10. Nécessaire de dosage caractérisé en ce qu'il renferme le matériel immunologique selon la revendication 8, et, le cas échéant, (a) un anticorps monoclonal ou polyclonal anti (AT III) éventuellement marqué, et éventuellement (b) un milieu de dilution, d'une part, et un milieu de rinçage, d'autre part.