Brevet FR2638462A1 — publié le 19900504

La présente invention a pour objet des complexes tridimensionnels à base de streptavidine (ou avidine) et de composés luminescents biotinylés. Elle concerne également le procédé pour l'obtention de ces complexes ainsi que leur application dans le domaine des dosages immunologiques et des dosages d'acides nucléiques. De manière générale, dans les dosages immunologiques et les dosages d'acides nucléiques, on met en évidence une substance biologique donnée en formant un complexe entre la substance recherchée et un composé spécifique de cette substance, ledit complexe étant visualisé à l'aide d'un marqueur, par exemple un radioisotope, un composé fluorescent, une enzyme etc. Le complexe formé est un complexe acide nucléique-cible/acide nucléique-sonde dans le cas de dosages d'acides nucléiques par la technique d'hybridation, et un complexe antigène/anticorps dans le cas des dosages immunologiques. Les dosages radioimmunologiques sont les techniques de dosages immunologiques les plus anciennes. Elles présentent toutefois des inconvénients liés notamment à la manipulation de substances radioactives. Parmi les autres techniques couramment utilisées, on peut citer principalement les dosages immunoenzymatiques et les dosages fluoroimmunologiques dans lesquels on utilise respectivement une enzyme ou un agent fluorescent comme marqueur. Parmi les agents fluorescents appropriés dans ce domaine, on peut citer notamment : les agents chélatants, tels que ceux décrits dans les demandes de brevets EP-A-0.068.875, EP-A-0.203.047, EP-A-0.195.413 et EP-A-0.171.978 ou la demande internationale WO 87/02708, les cryptates de terres rares, tels que ceux décrits dans les demandes de brevets FR 84.14799 et 87.17765. Les dosages d'acides nucléiques utilisant les fragments d'ADN ou d'ARN comme sondes sont beaucoup plus récents. Ils consistent essentiellement à hybrider l'acide nucléique recherché ou acide nucléique-cible avec un acide nucléique-sonde marqué, et 9 mesurer la quantité d'acide nucléique-sonde marqué qui s'est fixée. Le marquage des acides nucléiques-sondes est réalisé à l'aide de marqueurs analogues à ceux utilisés dans le domaine des dosages immunologiques. Ces marqueurs sont principalement les isotopes, les enzymes et les agents luminescents. D'autre part, on a proposé d'utiliser dans tous les types de dosages, l'affinité de deux substances entre elles, telles que par exemple la biotine et l'avidine ou la biotine et la streptavidine. A cet effet, on peut se référer notamment à l'ouvrage ci-après : M. WILCHEK et E. BAYER Anal. Liochem. (1988), 171, 1-32. Par exemple, les systèmes avidine-biotine ou streptavidine-biotine sont utilisés notamment dans les dosages immunologiques par fluorescence résolue dans le temps. A cet effet, on peut citer par exemple l'article de Chan et al. dans Clin. Chem. 33/11, 2000-2003 (1987) qui décrit le dosage de l'alphafétoprotéine à l'aide d'anticorps biotinylés et d'un complexe streptavidine-chélate d'europium. De même, dans le domaine des dosages d'acides nucléiques, on peut citer l'article de Dahlen, dans Analytical Biochemistry 164, 78-83 (1987) qui décrit la détection, par fluorescence résolue dans le temps, de sondes d'ADN biotinylées à l'aide de streptavidine marquée par un chélate d'europium. Il s'agit donc d'une méthode de dosage utilisant un conjugué covalent de streptavidine et de chélate d'europium comme traceur pour reconnaître un acide nucléique biotinylé. Chaque molécule de streptavidine peut être marquée par dix molécules de chélate. L'amplification au site de dosage est donc seulement de 10. Dans les dosages immunoenzymatiques, on a également proposé l'utilisation de complexes formés par interaction d'avidine avec une enzyme biotinylée, par exemple le glucose -6- phosphate déhydrogénase biotinylée comme décrit dans la demande internationale WO 85/03356. On notera dans ce cas que la mise en évidence du complexe formé ne peut se faire que par l'intermédimire d'une étape supplémentaire au cours de laquelle l'activité enzymatique du complexe est révélée en provoquant une émission de lumière (bioluminescence) en présence de réactifs appropriés. De même dans Nature vol 320, Avril 1986, on a proposé l'utilisation de l'interaction streptavidine-biotine et l'utilisation de complexes tridimensionnels de streptavidine et d'enzymes biotinylées. Les dosages par fluorescence directe sont plus rapides que les dosages mettant en oeuvre une enzyme dans la mesure ou le marqueur utilisé est directement fluorescent et n'a pas besoin d'être révélé, comme c'est le cas pour une enzyme. De plus, contrairement à une réaction de bioluminescence où l'émission de lumière, produite par la dégradation d'un substrat par une enzyme, est un phénomène irréversible et éphémère, la fluorescence, due à une molécule organique, est un phénomène reproductible et persistant. Il suffit de maintenir l'excitation du fluorophore à une longueur d'onde donnée pour observer une émission de fluorescence caractéristique. Toutefois, il s'est avéré que la sensibilité des dosages par fluorescence résolue dans le temps pouvait être relativement faible, notamment lorsque le dosage est réalisé en phase solide (voir WO 87/02708 page 51). On a maintenant trouvé des nouveaux composés qui permettent de réaliser des dosages par fluorescence et notamment des dosages par fluorescence résolue dans le temps avec une très grande sensibilité. Les nouveaux composés selon l'invention sont des complexes tridimensionnels constitués d'au moins une molécule de streptavidine (ou avidine) liée par liaison d'affinité à au moins un composé luminescent polybiotinylé ou è au moins une macromolécule polybiotinylée couplée à au moins un composé luminescent, l'un des sites de liaison par affinité de la streptavidine (avidine) avec la biotine étant libre. Les composés de l'invention peuvent être représentés par la formule statistique ci-sprès : (xi Pj Bkm An dans laquelle : X représente le composé luminescent P représente la macromolécule B représente la biotine A représente l'avidine ou la streptavidine i est un nombre entier supérieur ou égal à 1 j est un nombre entier égal à O ou 1 K est un nombre entier supérieur ou égal à 2 n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 m est un nombre entier supérieur ou égal à n, et inférieur à 4n. L'avidine, qui provient du blanc d'oeuf et la streptavidine, qui est extraite de Streptomyces avidinii, sont des protéines tétramères contenant quatre sites de liaison d'affinité pour la biotine, laquelle est une vitamine, de faible poids moléculaire, soluble dans l'eau. Les composés luminescents appropriés aux fins de l'invention sont aussi bien des composés phosphorescents, tels que l'éosine, l'érythrosine, l'acridine ou des dérivés de celle-ci, que des composés fluorescents, tels que notamment les agents chélatants, les cryptates ou les autres molécules luminescentes, notamment les phycobiliprotéines (V. OI et al. J. of Cell Biology (1982), 981-986). A titre d'agents chélatants, on peut citer par exemple les chélates de terres rares décrits dans les demandes de brevets EP-A-0.068.875, EP-A-0.2D3.047, EP-A-0.195.413, EP-A-0.171.978 et EP-A-0.203.407 ces documents étant incorporés à titre de référence dans la présente demande. Les cryptates qui conviennent aux fins de l'invention sont les cryptates de terres rares décrits dans les demandes de brevets FR 84.14799 et FR 87.17765 également incorporées dans la présente description à titre de référence. On préfère tout particulièrement les cryptates de terres rares décrits dans la demande de brevet FR 87.17765. On peut utiliser selon l'invention aussi bien les composés luminescents portant naturellement au moins deux fonctions réactives à l'égard de la biotine que les composés luminescents sur lesquels on a introduit par voie chimique de telles fonctions réactives. Par "fonctions réactives à l'égard de la biotine" on désigne les fonctions capables de former avec les fonctions réactives de la biotine des liaisons covalentes stables. Les fonctions réactives à l'égard de la biotine peuvent être par exemple des fonctions alcool, acide, amine et thiol. L'introduction des fonctions réactives sur le composé luminescent peut être réalisé par tout moyen classique à la portée de l'homme de métier en utilisant les composés hétérobifonctionnels disponibles commercialement. Selon une première variante, les composés de l'invention sont des complexes tridimensionnels constitués d'au moins une molécule de streptavidine (avidine) liée par liaison d'affinité à au moins un composé luminescent polybiotinylé, l'un au moins des sites de liaison par affinité de la streptavidine (avidine) à la biotine étant libre. Dans ce cas, le composé luminescent est directement biotinylé et sert de pont entre les molécules de streptavidine. Ils peuvent être représentés schématiquement comme suit B : biotine SA : streptavidine ou avidine X : composé luminescent Selon une seconde variante, les composés de l'invention sont des complexes tridimensionnels constitués d'au moins une streptavidine (avidine) liée par liaison d'affinité à au moins une macromolécule polybiotinylée, couplée à au moins un composé luminescent, l'un au moins des sites de liaison par affinité de la streptavidine (avidine) avec la biotine étant libre. Dans ce cas, les molécules de streptavidine sont reliées entre elles par l'intermédiaire d'une macromolécule non luminescente qui est couplée à la fois au composé luminescent et à la biotine.Ils peuvent être représentés schématiquement conme suit : B = Biotine SA = Streptavidine ou avidine X = composé luminescent = macromolécule Les macromolécules mises en oeuvre selon l'invention peuvent être des protéines ayant un poids moléculaire compris entre 104 et 106 daltons ou des polymères hydrosolubles ayant un poids moléculaire compris entre 104 et 106 daltons. A titre d'exemple de protéines appropriées aux fins de l'invention, on peut citer notamment les protéines plasmatiques humaines ou animales telles que par exemple la sérum albumine humaine ou la thyroglobuline. Comme polymères hydrosolubles, on pourra utiliser les polymères hydrosolubles définis dans la demande de brevet WO 88/02784, à savoir les polymères de type polyuréthane, polyéthylèneimine, polylysine, polyarginine, polysaccharides et leurs dérivés ainsi que les polyacrylamides. Les macromolécules mises en oeuvre selon l'invention doivent posséder au moins deux fonctions réactives à l'égard de la biotine. Ces fonctions réactives peuvent être naturellement présentes sur la macromolécule ou introduites par voie chimique par tout procédé à la portée de l'homme de métier utilisent les composés hétérobifonctionnels disponibles commercialement. Les macromolécules utilisées selon l'invention doivent posséder en outre des fonctions adéquates permettant le couplage avec le composé luminescent tel que défini précédemment. Par exemple, lorsque la macromolécule utilisée est la sérum albumine humaine, on pourra coupler à celle-ci un composé luminescent en utilisant les fonctions réactives naturellement présentes de celle-ci, telles que les fonctions amines et les fonctions acides et en utilisant les agents de couplage classiques bien connus de l'homme de métier. Les complexes de l'invention dans lesquels le composé luminescent est directement biotinylé, sont obtenus par le procédé qui consiste 1) à polybiotinyler le composé luminescent après avoir éventuellement introduit sur celui-ci au moins deux fonctions réactives vis-à-vis de la biotine 2) à mélanger ledit composé luminescent polybiotinylé avec de la streptavidine (ou avidine) en quantités stoechiométriques définies. Le composé luminescent choisi doit posséder au moins deux fonctions organiques réactives à l'égard de la biotine. Ces fonctions peuvent être des fonctions acide, amine, alcool ou thiol. Dans le cas où le composé luminescent ne possède pas de telles fonctions réactives, celles-ci peuvent être introduites sur ledit composé par des réactions appropriées bien connues de l'homme de métier, en utilisant les composés hétérobifonctionnels disponibles commercialement. Le composé luminescent, possédant naturellement au moins deux fonctions organiques réactives ou doté de ces fonctions selon les procédés ci-dessus, pourra alors autre polybiotinylé, c'est-à-dire condensé par liaison covalente avec au moins deux molécules de biotine par l'action de réactifs adéquats bien connus de l'homme de métier. Les fonctions réactives du composé luminescent réagissent alors avec les fonctions réactives de le biotine. On pourra utiliser, suivant les fonctions réactives portées par le composé luminescent : a) la réaction d'esters actifs pour les amines primaires pour former des amides b) la réaction d'esters actifs sur les alcools pour former des esters c) la réaction d'isocyanates ou isothiocyanates avec des amines pour former des urées ou thiourées d) la réaction des maléimides avec des thiols pour former des thioéthers e) la réaction de sels de diazonium avec des composés aromatiques pour former des composés diazo f) la réaction de chlorures d'acides sulfonîques sur des alcools ou des amines pour former des sulfonates ou des sulfamides. A titre d'exemple, on pourra former un csyptate d'europium dibiotinylé par action de la biotine N-hydroxysuccinimide ester (Biotine-NHS) sur le cryptate trisbipyridine diamine d'europium selon le schéma réactionnel ci-eprès : LEU c (bipy.bipy.bîpy(NH2)2) C13 + Biotine.NHS [Eu C (bipy.bipy.bipy (Biotine)2)] Cl3 Quant aux molécules biotinylées à base de chélates de terres rares, on pourra par exemple utiliser les produits suivants: Le complexe tridimensionnel selon le première variante est ensuite obtenu par mélange à température ambiante dans un tampon approprié (par exemple PBS pH 7,4) du composé luminescent ainsi polybiotinylé et de streptavidine (ou avidine). Comme indiqué précédemment, un au moins des sites de liaison de la streptavidine (ou avidine) pour le biotine doit être libre.La stoéchiométrie du complexe doit donc être optimisée de façon à ne pas saturer tous les sites. Les complexes selon la seconde variante, à savoir ceux qui possèdent au moins une macromolécule, sont obtenus par le procédé qui consiste 1) à polybiotinyler la macromolécule après avoir éventuellement introduit sur celle-ci, au moins deux fonctions réactives vis-à-vis de la biotine 2) à coupler par liaison covalente, la molécule polybiotinylée au composé luminescent 3) à mélanger le composé luminescent polybiotinylé avec de la streptavidine (ou avidine) en quantités stoéchiométriques définies. Ces quantités doivent être optimisées de façon à laisser au moins un site de streptavidine disponible. A titre d'exemple, on peut biotinyler de l'albumine en tant que macromolécule par action de biotine-NHS sur les fonctions amines de la protéine. Puis on peut la coupler à un cryptate d'europium diaminé en faisant réagir les fonctions COOH de la protéine en présence de EDC (ethyldimethylamino- propylcarbodiimide). Enfin, on forme le complexe tridimensionnel en mélangeant la molécule ainsi formée avec de la streptavidine en quantités définies dans un milieu tampon (PBS pH 7,4). Tous les complexes selon l'invention sont des composés stables, qui peuvent être conservés à 40C ou en solutions stériles. Ces complexes conservent les propriétés de fluorescence du fluorophore utilisé. Par exemple, pour le cryptate d'europium, on peut voir dans le tableau ci-après, que les longueurs d'ondes d'émission ainsi que les durées de vie sont inchangées, que le fluorophore soit sous forme libre, biotinylée ou complexée avec la streptavidine. Produit : )s Emission : Durée de vie maximale : (PBS 10 mM pH 7,4) . . : Cryptate : 620 nm : 0,59 ms : Cryptate dibiotinylé : 613 nm : 0,67 ms : Complexe : Cryptate dibiotinylé/ : Streptavidine : selon l'invention ... : 618 nm : 0,62 ms Les complexes selon l'invention conviennent comme marqueurs fluorescents pour la détection des biomolécules biotinylées (acides nucléiques, oligonucléotides, anticorps, protéines, antigènes, haptènes ou toutes autres substances biologiques) reconnaissant des biomolécules pour lesquelles elles ont une grande affinité dans un mélange selon un procédé de dosage ou de détection c assique. La biotinylation des substances à doser est réalisée selon des techniques bien connues de L'homme de l'art. A cet effet, on pourra avantageusement se référer aux ouvrages ci-après, cités dans la présente demande à titre de référence 1) P.R. Langer et Coll. dans P.N.A.S., 78, 6633-6637 (1981) pour la biotinylation des acides nucléiques 2) A. Chollet, N.A.R., 13, 1529-1541 (1985) pour la biotinylation des oligonucléotides 3) P. TIJSSEN "Practice and Theory of enzyme immunsassaysn (1985) Elsevier Press pour la biotinylation des protéines. Les complexes selon l'invention conviennent aussi bien pour les dosages ou détection d'acides nucléiques, tels que ceux décrits dans l'article de J. Matthews et L. Kricka dans Analytical Biochemistry 169, 1-25 (1988) intitulé "Analytical stratégies for the use of DNA probes", que pour les dosages de substances biologiques tels que ceux décrits dans les demandes de brevets internationales WO 85/03356 et WO 87/02708. De même on pourra utiliser les complexes selon l'invention comme marqueurs dans tous les types de dosages immunologiques par compétition ou par excès décrits notamment dans le brevet US 4.281.061 ou par "Monoclonal Antibodies and development in Immunoassay" Elsevier 1981, p. 3-21. On notera que ces dosages pourront être réalisés aussi bien en phase liquide que sur u support solide quelconque couramment utilisé dans ce domaine, tel que par exemple sur membrane en nitrate de cellulose ou en nylon, microparticules de latex, de polystyrène ou de cellulose, etc. L'invention va être maintenant illustrée par les exemples ci-après non limitatifs. Exemple 1 Synthèse de cryptate-trisbipyridine d'europium biotinylé Le cryptate LEu c(biPy.biPy.bipy (NH2)2)jCl3 a été obtenu selon le procédé décrit dans le brevet FR 84.14799 et plus précisément le mode opératoire décrit dans l'exemple 5 de ce brevet. 0,5 mg de cryptate diamine ci-dessus a été dissous dans 650 ul de tampon borate 0,1 M pH 9,0. On a ajouté alors 100 ul d'une solution 0,05 M de biotine L-C NHS (produit PIERCE) en solution dans un tampon borate 0,1 M pH 9,0. La réaction a duré une heure à 370C. Le mélange réactionnel a été alors purifié par HPLC (C18 Pharmacia) en gradient H20-CH3CN 0-60%. On a obtenu deux composés fluorescents élués respectivement à 24 min et 26 min après l'injection. L'éluant a été évaporé, et les produits recueillis sous forme de solides blancs ont été analysés Masse : Pic à 100 % à M/e 1576 pour KB2 correspondant au produit attendu (non chloré). Exemple 2 Préparation d'un complexe de streptavidine et de cryptete d'europium dibiotinylé (SA-KB2) 1 ml d'une solution de streptavidine à 2 mg/ml a été mis en contact de 1 ml d'une solution 5.105M de cryptate dibiotinylé d'europium dans 10 mM phosphate pH 7,4 (Na2 H P04 + Na H2 P04) 0,1 M NaCl et 1 mg/ml de HSA. Le mélange a été réalisé à température ambiante avec une légère agitation pendant 30 min minimum puis a été conservé à -200C en présence de glycérol (50 %). Exemple 3 Détection par le complexe de l'exemple 2 d'un fragment d'ADN cible fixé à une membrane de nitrocellulose et hybridé à une sonde biotinylée L'ADN à doser a été dénsturé par chauffage ou par action d'une solution dénaturante 0,5 M NaOH. Des quantités décroissantes de cible ont été alors déposées en solution dans du 6 x SSC (6 x SSC = 0,2 M NaCl, 0,09 M sodium citrate pH 7,0) sur une membrane de nitrate de cellulose (Transblot de Biorad ou BA 85 de Schleicher et Schuell). La membrane a été cuite pendant une à deux heures à 800C pour fixer l'ADN de façon irréversible. La membrane a été alors présaturée avec une solution (A) contenant 6 x SSC, 5 x FPG (ficoll 0,2 %, pyrovinyl-pyrrolidone 0,2 %, glycine 0,2 %) et du DNA de sperme de hareng à 100 Fg/ml pendant une nuit à 650C. La membrane a été alors mise en présence d'une solution de sonde biotinylée préparée comme dans l'exemple 3 et dénaturée à 100C pendant 5 min L'hybridation a été réalisée avec 0,5 ug/ml de sonde (B) dans le tampon (A) ci-dessus pendant une nuit à 650C. La membrane a été ensuite lavée 3 fois 15 min dans les solutions de forces ioniques décroissantes contenant 0,1 % de SOS. La membrane a été à nouveau traitée pour éviter l'adsorption non spécifique du complexe contenant le cryptate par une solution de BSA à 3 % dans 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) 0,15 M NaCl pendant 1 h à 659C. La membrane a alors été mise au contact pendant 30 min à température ambiante d'une solution de complexe streptavidine-cryptate dibiotinylée à raison de 5 ug de streptavidine/ml dans 10 mM phosphate (pH 7,4), 0,1 M NaCl et 1 mg/ml de HSA. La membrane a ensuite été lavée avec un tampon 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) 0,15 M NaCl deux fois 15 min puis séchée 5 min au four à micro-ondes. La membrane a pu alors être analysée sans autre traitement sur un appareil de lecture par é;lifluorescence résolue dans le temps. Les longueurs d'onde d'excitation d'émission étaient respectivement de 308 nm et 618 nm. Le délai de lecture était de 0,2 ms et la durée de la mesure était de 0,4 ms. Les valeurs de fluprescence mesurées pour des échantillons inconnus sont comparées à une courbe d'étalonnage établie pour des quantités connues d'ADN cible et permettent ainsi de trouver la quantité d'ADN cible fixée à la membrane. Exemple 4 Détection par le complexe de l'exemple 2 et une sonde oligonucléotidique biotinylée d'un fragment d'ADN cible fixé à une membrane constituant le fond d'une plaque à 96 puits Des dépôts d'ADN à doser ont été réalisés comme dansl'exemple précédent mais au fond de micropuits munis d'une membrane de nitrocellulose. La microplaque a été placée deux heures à 500 C. La préhybridation a été effectuée pendant une heure à 400C dans 4 x SSC, 0,1 % SDS, 100 ug/ml d'ADN de sperme de hareng dénaturé et 5 x Denhardt. Le mélange de préhybridation a été remplacé par la solution d'hybridation contenant 100 ng/ml d'un oligonucléotide biotinylé complémentaire à la séquence cible, comportant une ou plusieurs molécules de biotine en 5' et comportant 15 à 50 résidus. L'hybridation a duré une heure à 300C avec une légère agitation de la microplaque. Chaque puits a été lavé trois fois 15 min par des solutions de SSC (contenant 0,1 % de SDS) de forces ioniques décroissantes. Les membranes ont été alors présaturées avec 100 p1 d'une solution de BSA 3 % comme dans l'exemple 4 pendant une heure à 650C. Après élimination de cette solution chaque puits a reçu une solution de complexe fluorescent à 5 pg/ml en streptavidine. Les puits ont été ensuite lavés trois fois avec la solution de lavage comme dans l'exemple 4, puis la microplaque a été placée 5 min dans un four à micro-ondes (ou 5 min dans une étuve à 800C). La mesure de la fluorescence résiduelle a été effectuée alors sur un appareil automatique adapté à la lecture par épifluorescence sur plaque à 96 puits relié à un ordinateur permettant de traiter ces données. Comme pour l'exemple 3, la comparaison des valeurs mesurées avec des courbes d'étalonnage permet d'accéder à la quantité d'ADN-cible contenue dans chaque puits. Exemple 5 Préparation d'albumine humaine polybiotinylée et liée à un cryptate d'europium a) Biotinylation 10 mg d'HSA sont dissous dans SOOul de tampon carbonate 0,1 M, pH 8,5. On ajoute alors 35 ul d'une solution 0,1 M de biotine-LC-NHS (Pierce) dans le DMF. Le mélange réactionnel est légèrement agité pendant une nuit, puis dialysé contre du tampon HEPES 50 mM NaCl 2M, pH 7,0 dénommé ci-après tampon A. b) Couplage avec le cryptate diamine d'europium A 420 ul d'une solution d'HSA biotinylée à 24 mg/ml on ajoute 450 ail d'une solution 40 mM de sulfo NHS dans le tampon A et 430 ul d'une solution d'EDCi 80 mM dans le tampon A. Enfin, 1,7 ml d'une solution 3.10 3 M,du cryptate diamine d'europium utilisé dans l'exemple 1,dans le tampon A sont ajoutés à ce mélange. La réaction dure 3 heures à température ambiante et nécessite une légère agitation. A l'issue de la réaction, ce mélange est chromatographié sur phase inverse type C8 en gradient H20 - CH3CN de O à 50 % en présence de O,I % TFA. Les fractions protéiques sont ensuite rassemblées et dialysées contre un tampon HEPES îOmM NaCl 1M pH 7,4 dénommé ci-après tampon B. Le taux de marquage cryptate/HSA est d'environ 5. Exemple 6 Préparation d'un complexe de streptavidine et d'albumine humaine polybiotinylée et cryptatée 0,1 ml d'une solution de streptavidine à 2 mg/ml a été mis en contact de 1,3 ml d'HSA polybiotinylée et cryptatée, solution à 0,3 mg/ml dans le tampon B. Le mélange est réalisé à température ambiante avec une légère agitation pendant 30 min minimum et conservé à -200C en présence de glycérol (50 %). Le complexe ainsi préparé peut être utilisé aussi bien pour la détection d'acides nucléiques au moyen de sondes biotinylées que pour la détection d'antigènes au moyen d'anticorps spécifiques biotinylés, comme cela est décrit dans l'exemple suivant. Exemple 7 Détection par le complexe de l'exemple 6 d'un antigène cible sur plaque de polystyrène à 96 Puits. 1) Préparation du support Les micropuits d'une plaque de polystyrène ont été traités par une solution à 1 ug/ml d'un anticorps monoclonal dirigé contre un antigène spécifique (protéique) pendant 18 Heures à 40C dans un tampon carbonate 100 mM pH 8,6. Après lavage des micropuits à l'aide d'un dispositif semi-automatique de distribution et d'aspiration, par trois fois 300 l de tampon phosphate 100 mM, 0,1 % Tween 20, pH 7,4 les puits sont saturés par une solution à 1 g/l d'HSA dans un tampon phosphate 100 mM pH 7,4 pendant 45 min à 370C. Les puits sont à nouveau lavés selon la procédure ci-dessus et conservés jusqu'à utilisation en atmosphère humide en sacs plastiques hermétiques. 2/ Protocole d'essai Dans les puits ainsi préparés, on distribue : - 150 ul de solution d'antigène à doser en dilutions décroissantes dans un tampon phosphate 100 mM pH 7,4, 1 g/l en HSA - 150 p1 d'un deuxième anticorps biotinylé à 1 sg/ml dans le même tampon. Les puits sont placés sous légère agitation pendant 30 min à 3 heures selon la nature de l'antigène à doser, puis levés avec cinq fois 300 pi de tampon phosphate 100 mM pH 7,4, O,lX Tween 20. On ajoute alors dans chaque puits 300 pi de complexe fluorescent selon l'exemple 6 à raison de 2 pg/ml en streptavidine, puis les plaques sont agitées pendant 2 heures à température ambiante. Les puits sont ensuite lavés avec cinq fois 300 jul de tampon phosphate 100 mM, pH 7,4, 0,1 % Tween 20 puis séchés sous un courant d'air sec. 3/ Lecture du résultat Pour une lecture en milieu liquide, les puits sont traités pendant 30 min sous agitation per une solution de biotine libre 10 3 M dans du tampon phosphate 100 mM pH 7,4, 1 X SDS. Les mesures sont effectuées par épifluorescence sur un appareil automatique comme dans l'exemple 4. Pour une lecture sur phase solide, les puits sont séchés 5 min sous un courant d'air sec, la fluorescence résiduelle provenant du complexe fixé au fond des puits est mesurée par épifluorescence sans autre forme de traitement. Ces deux méthodes de mesure permettent, après traitement approprié des résultats, le tracé de courbes d'étalonnage spécifiques de l'antigène à doser. Les quantités d'antigène contenues dans des échantillons inconnus sont calculées à partir de courbes d'étalonnage et des mesures de fluorescence effectuées sur ces échantillons. REVENDICATIONS 1. Complexes tridimensionnels constitués d'au moins une molécule de streptavidine (ou avidine) liée par liaison d'affinité à au moins un composé luminescent polybiotinylé ou à au moins une macromolécule polybiotinylée couplée à au moins un composé luminescent, l'un au moins des sites de liaison par affinité de la streptavidine (avidine) avec la biotine étant libre. 2. Complexes tridimensionnels selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont représentés par la formule statistique ci-après EXi Pj Bk]m An dans laquelle X représente le composé luminescent P représente la macromolécule B représente la biotine A représente l'avidine ou la streptavidine i est un nombre entier supérieur ou égal à 1 j est un nombre entier égal à O ou 1 K est un nombre entier supérieur ou égal à 2 n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 m est un nombre entier supérieur ou égal à n et inférieur à 4n. 3. Complexe selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé luminescent est un chélate de terres rares. 4. Complexe selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé luminescent est un cryptate de terres rares. 5. Complexes selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que la macromolécule est une protéine ayant un poids moléculaire compris entre 104 et 106. 6. Complexes selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisés en ce que la macromolécule est un polymère hydrosoluble ayant un poids moléculaire compris entre 109 et 106. 7. Procédé pour l'obtention des complexes tridimensionnels selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste : 1) à dibiotinyler le composé luminescent après avoir éventuellement introduit sur celui-ci deux fonctions réactives vis-à-vis de la biotine 2) à mélanger ledit composé luminescent dibiotinylé avec de la streptavidine (ou avidine) en quantités stoechiométrîques définies. 8. Procédé pour l'obtention des complexes tridimensionnels selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il consiste 1) à polybiotinyler la macromolécule après avoir éventuellement introduit sur celle-ci, au moins deux fonctions réactives vis-à-vis de la biotine 2) à coupler par liaison covalente, la molécule polybiotinylée au composé luminescent ; 3) à mélanger le composé luminescent polybiotinylé avec de la streptavidine (ou avidine) en quantités stoéchiométriques définies. 9. Application des complexes tridimensionnels selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 comme marqueurs dans des dosages immunologiques. 10. Application des complexes tridimensionnels selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 comme marqueurs dans des dosages d'acides nucléiques.