Brevet FR2644246A1 — publié le 19900914

La présente invention concerne des anticorps monoclonaux destinés à la détection du virus responsable de la rhizomanie de la betterave sucrière. L'invention couvre en outre un procédé d'obtention de tels anticorps ainsi que leur application à la détection du virus cidessus. Maladie relativement récente ou maladie fort ancienne dont les techniques modernes d'intensification des cultures favoriseraient l'extension, la rhizomanie de le betterave sucrière, quelle qu'en soit l'origine, est devenue de nos jours un fléau de la culture betteravière. Les trois principales raisons en sont l'extension rapide de la maladie dans divers pays du monde, son incidence économique considérsble et l'absence contre elle de techniques de lutte efficaces. L'agent causal de la maladie est un virus a ARN, dit Beet Necrotic Vellow Vein Virus" ou BNYVV, transmis par le champignon Polymixa betee. Des symptômes caractéristiques tels que flétrissement des feuillages, nécrose des nervures, intense et anormale prolifération des radicelles, sont généralement observables eu champ et permettent le diagnostic de cette maladie, mais ce diagnostic s'avère trop tardif. Un diagnostic précoce et rapide constituerait donc un instrument précieux pour l'agriculteur et le sélectionneur. Depuis longtemps, les anticorps, produits de la réponse immunitaire, sont utilisés en raison de leur spécificité comme outils de diagnostic, mais le caractère fondamentalement hétérogène de la réponse immunitaire conduit à une production polyclonale d'anticorps contre un antigène donné, dont les différentes populations ne sont pas fractionnables par les techniques biochimiques actuelles. De plus, une standardisation des essais immunologiques réalisés avec des anticorps polyclonaux ou immunsérums s'avère difficile, ces essais étant intimement liés è la nature des immunséruma utilisés.Ces difficultés ont été surmontées par l'apport de la technologie d'hybridation lymphocytaire (Kohier et Milstein, 1975) consistant à faire fusionner des cellules d'origine myélomateuse transmettant les informations assurant le caractère tumoral par culture in vitro, prise en tumeur chez animal, et les lymphocytes immunocompétents. Les cellules hybrides qui en résultent, ou hybridomes, possèdent à la fois le caractère immortel du myélome et la propriété lymphocytaire de produire des anticorps spécifiques de l'antigène choisi pour l'immunisation. Après élimination des cellules parentales sur milieu sélectif, les hybridomes sont sélectionnés pour leur spécificité vis-à-vis de l'antigène, puis clonés.Chaque clone produit de grandes quantités d'anticorps monoclonaux identiques, dirigés contre un déterminant unique, et peut.étre conservé indéfiniment. Le puissant pouvoir discriminatoire de ces anticorps, capables de reconnaitre un épitoge d'une molécule au sein de mélanges très complexes, et leur reproductibilité absolue, conséquence de leur production illimitée dans le temps, sont, ces dernières années, à la source du développement massif de tels outils dans la plupart des secteurs du diagnostic biologique et,plus récemment, dans le domaine de la pathologie végétale.On sait par exemple que des anticorps monoclonaux ont été déjà produits contre des virus responsables de pertes économiques très importantes dans le domaine des plantes, par exemple, la pomme de terre, la vigne, des plantes maraichères et ornementales, des arbres fruitiers. La présente invention vise donc des anticorps monoclonaux spécifiques d'un épitope de la protéine de capside du virus BNYVV responsable de la rhizomanie de la betterave sucrière, le procédé d'obtention de tels anticorps relevant de la technique d'hybridation lymphocytaire rappelée ci-dessus. Comme ce sera expliqué plus en détail ci-apès, l'anticorps monoclonal selon l'invention est une immuno- globuline d'animal obtenue par hybridation entre les lymphocytes de l'animal et des cellules de myélome compatibles avec ces lymphooytes,et il présente la capacité de se combiner à un épitope particulier-présent sur une. protéine correspondant notamment à la protéine de capside du virus d'un poids moléculaire de 22 kd, formant ainsi un complexe sntigène-anticorps spécifique. Pour l'obtention des anticorps tels que définis ci-dessus, le procédé selon l'invention, du type par hybridation lymphocytaire entre des cellules d'un animal immunisé et des cellules de myélome,fournissent ainsi des hybridomes producteurs desdits anticorps, comprend l'immunisation d'un animal tel qu'une souris, et l'hybridation des cellules immunocompétentes utiles avec les cellules de myélome provenant de myélomes murins. Suivant une autre caractéristique, on sélectionne les hybridomes producteurs d'anticorps spécifiques d'antigènes viraux de manière indirecte, où l'antigène viral est immobilisé sur un support solide,où les complexes spécifiques antfgènes-anticorps monoclonaux formés sont détectés au moyen de sondes spécifiques. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description qui va suivre, faite en regard du dessin annexé représentant un graphique de caractérisation des anticorps selon l'invention, en comparaison avec des témoins respectivement positifs et négatifs. Le procédé d'obtention des anticorps utiles comprend une hybridation lymphocytaire et, conformément à l'invention, celle-ci est effectuée sur des cellules de souris. Les différents stades du procédé se déroulent comme suit - préparation d'un extrait de virus BNYVV, - immunisation de souris avec cet extrait, - récupération des cellules immunocompétentes de cette souris, - fusion de ces cellules avec des cellules de myélome pour l'obtention d'hybridomes, - culture des hybridomes, - sélection des hybridomes producteurs d'anticorps spécifiques du virus BNYVV, plus particulièrement de la protéine de la capside, - production en ascites du clone sélectionné, - purification de ces ascites, et - conjugaison des anticorps monoclonaux à la phosphatase alcaline et à l'isothiocyanate de fluorescéine. Le diagnostic de la présence d'un antigène viral (virus ou protéine particulière de virus) dans un échantillon végétal, par des techniques sur support so- lide, plaques de microtitration ou nitrocellulose, met en jeu des modes opératoires a) de type direct, comprenant . l'immobilisation de l'antigène viral sur un support solide . la formation d'un complexe binaire entre l'antigène et un anticorps capable de recon naltre cet antigène, anticorps conjugué à un marqueur b) de type indirect,comprenant :: . l'immobilisation de l'antigène viral sur un support solide la formation d'un complexe binaire entre l'antigène et un premier anticorps capable de reconnaltre cet antigène . la formation dTun complexe tertiaire entre le complexe binaire et un second anticorps dirigé contre le premier anticorps et conju gué à un marqueur c) de type sandwich, comprenant , l'immobilisation d'un anticorps sur le sup port solide , la formation d'un complexe binaire entre le premier anticorps et l'anticorps à détecter , la formation d'un complexe tertiaire entre le complexe binaire et un deuxième anticorps capable de reconnaitre l'antigène et pon- jugué ou non à un marqueur , la formation d'un complexe quaternaire en tre le complexe tertiaire et un troisième anticorps dirigé contre le deuxième anti corps, uniquement dans le cas où le deuxiè me anticorps n'est pas marqué. Les exemples 1 et 2 suivants, donnés à titre explicstif mais nullement limitatif, décrivent respectivement un mode opératoire détaillé pour la mise en oeuvre des phases successives ci-dessus et l'application des anticorps à la détection du virus BNYVV. Dans l'exemple 1, les milieux utilisés portant un numéro de référence sont définis dans le tableau annexé. EXEMPLE 1 I Multiplication et purification du virus BNYVV Après inoculation mécanique du virus BNYVV sur jeunes plants de Chenopodium quinoa, multiplication du virus dans les plantes sur une dizaine de jours, l'extraction et la purification du virus (Putz, 1977 - Kuszala et al, 1986 - Lemaire et al., 1988) sont réalisées après 1) broyage des feuilles de Chenopodium quinoa (100 g feuilles/170 ml tampon borate 0,lM, pH9 + 100 ml tétrachlorure de carbone) 2) filtration sur "miracloth" du surnageant obtenu après clarification suite à une centrifugation (7000 g, 30 mn, 40C), 3) précipitation du virus présent dans le surnageant (NaCl 0,8 %, PEG 6000 2 %, 2 h minimum, 40C) 4) centrifugation (15 000 g, 30 mn, 40C) 5) remise en suspension du culot (tampon borate O,OlM, 12 h, 40C, agitation) 6) centrifugation (20 000 g, 20 mn, 40C) (les étapes 3, 4, 5, 6, étant reconduites une deuxième fois) 7) purification du virus sur coussin de saccharose 20 % dans du tampon borate O,OlM, pH 9 (40 000 g, 2 h, 4 C) 8) remise en suspension du culot en tampon borate 0,OlM, pH 9. Les rendements d'extraction sont voisins de 3 mg de virus BNYVV pour 100 g de feuilles de Chenopodium quinoa. Dans les phases opératoires 111 à VI ci-dessous, la technologie de production des hybridomes suivie est adaptée å partir de celle de köhler et Milstein (1975), légèrement modifiée, II Immunisation des souris avec l'extrait de virus Animaux : souris BALB/C, femelles, de 5 à 6 semaines (Iffa Credo). Voie d'immunisation : voie intrapéritonéale. j = 0 100 g de virus BNYVV/100 ul NaCl9 /co+ 100 l adjuvant Freund complet j = 14 100 g virus BNYVV/100 l NaCl 9 /co+ 100 l adju vant Freund incomplet j = 28 100 g virus BNYVV/200 l NaCl 9 /oo j = 42 50 ug virus BNYVV/200 p1 NaCl 9 o/oo j = 43 50 ug virus BNYVV/200 pi NaCl 9 o/oo j = 44 50 pg virus BNYVV/200 l NaCl 9 o/oo j = 45 fusion. III Récupération des cellules immunocompétentes La souris est sacrifiée par dislocation de la nuque. La rate est prélevée en conditions stériles, rincée dans du milieu 2. Les cellules spléniques sont dispersées à l'aide de pince jusqu'à obtention d'une suspension cellulaire relativement homogène. Cinq minutes de sédimentation permettent ensuite d'éliminer les agrégats restants. Les splénocytes sont lavés deux fois de suite (milieu 3, 200 g, 7 mn, 20 C) : 140 millions de splénocytes ont été obtenus dans ce cas. IV Culture des cellules de myélome Des cellules de myélome X63Ag8.6.5.3 sont décongelées une semaine avant la date de fusion et mises en culture dans du milieu 4 (incubateur 370C, 100 S humidité, 7 % C02). La concentration et la viabilité des cellules sont contrôlées chaque jour. La croissance est optimale pour des concentrations de 1 à 5.105 cellules par mi, Le myélome doit être en phase exponentielle de croissance et contenir moins de 10 % de cellules non viables le jour de la fusion. V Hybridation lymphocytaire Les deux partenaires de la fusion, à savoir, cellules de myélome/lymphocytes de la rate, dans un rapport 1/10, sont mis en contact intime (200 g, 10 mn, 200C). Après aspiration du surnageant, on ajoute goutte à goutte 0,7 ml de PEG 4000 50 % (P/V) dans du tsmpon phosphate de sodium (1 mn, 370C). Après repos du culot en présence de PEG (1 mn, 370C), la réhydratation de la culture est effectuée avec le milieu 3, selon le protocole suivant 2 ml en 2 mn, 5 ml en 3 mn et 14 ml en 2 mn (37 C). Le gradient d'entrée d'eau doit être le plus doux possible. Les cellules sont alors centrifugées (250 g, 10 mn, 200C) et le culot cellulaire est remis délicatement en suspension è raison de 106 lymphocytes par ml de milieu 5. VI Entretien des cultures d'hybridomes L'ensemencement est effectué en boites 96 puits (Falcon) à raison de 100 fil par puits, puits contenant depuis la veille un lit nourricier de macrophages. Les puits de culture sont remplis avec du milieu 5 et les boites sont transférées dans l'incubateur (370C, 100 % d'humidité, 7 Z en C02 > . Tous les 5 jours, la moitié du surnageant de culture de chacun des puits est remplacée par du milieu frais 5. La croissance des clones est étalée dans le temps, les surnageants de culture sont testés pour leur spécificité et les clones intéressants sont transférés en boites 24 puits (selon) (milieu 5, mais sans aminoptérine). Après une deuxième vérification de la positivité des clones, ceux-ci sont sous-clonés (clonage par dilution limite), puis congelés (milieu 6). VII Sélection des hybridomes producteurs d'anticorps spécifiques du virus BNYVV et caractérisation La sélection des hybridomes est réalisée avec le système CROSS DOT (brevet français N 85-10 271) selon la technique développée par ALRIC et al (1986). Les antigènes utilisés sont, dans ce cas, du virus BNYVV à l'état natif ou dénaturé dans différentes conditions (Triton X100, urée, SDS, à différentes concentrations). Après incubation des surnageants de culture d'hybridomes, les complexes "antigènes-anticorps" formés sont détectés avec des anticorps dirigés contre les immunoglobulines de souris, anticorps conjugués 8 la peroxydase.Le substrat enzyma tique utilisé est du 4 chloro 1 naphtol. c'est ainsi que sont sélectionnés plusieurs clones dont l'un d'entre eux, de nomenclature "BNYVV,M.8B6" produit des anticorps(de classe IgG, de sous-classe IgG3) de forte affinité (voir graphique annexé) vis-à-vis du virus BNYVV, qu'il soit natif ou dénaturé. Tous les isolats de virus BNYVV sont reconnus par les anticorps du clone "BNYVV.M.8B6". Aucune réaction croisée avec d'autres virus n'est observée. VIII Purification des ascites Après centrifugation (300 g, 7 mn, 20 C), les surnageants d'ascites sont purifiés sur colonne d'immunoaffinité de sépharose 48 couplé à des anticorps monoclonaux anti-immunoglobulines de classe IgG, sous-classe IgG3, de souris. IX Conjugaison des anticorps du clone "BNYVV.M.8B6" Pour leur utilisation dans des tests ELISA, CROSS DOT ou CROSS BLOT, et dans des tests d'immunofluorescence sur lames, les anticorps sont respectivement couplés à la phosphatase alcaline selon la technique de Engvall E. et Perlmann P. (1971) et à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) selon la technique de H.BAZIN (Université Louvain - Bruxelles). TABLEAU DES COMPUSITIUNS DES MILIEUX Produite Milieu 3 constitutifs Milleu 1 Milieu 2 Lavages des milieux Lavage Dilacéra- avant fu (concentration, des tion de sion et ré- Milleu 4 Milieu 5 Milieu 6 Milieu 7 finale 1 x) cellules le rate hydratation Entretien Culture Congélation Décongéla de la cul- des des hybridomes tion ture sprès myélomes hydridomes et myélomes hybridomes et fusion myélomes Streptomycine Pénicilline + + + + + + + + g/Ul/ml 100 g/100UI/ml séreptomycine 2 à 3 % 10 % 20 % de 20 à 90% 10 % myélomes Pénicilline (diminution (selon de 10 % à % (V/V) à 10 % après Fragilité 20 % (décomplémenté) premier des clones) (hybridomes) clonage) Glutamine 2 mM + + Na pyruvate peut être 1mM supprimé en + même tempos que HT 1 X) H.A.T. jusqu'à dis N : 1.10-4M perltion des (éventuelle A : 4.10-7 M cellules ment pour des T : 1,6. 10-5M parentales) hybridomes + avant clonage) H.T (jusqu'au H : 1.10-4M premier + T : 1,6.10-5M clonage) (éventuelle ment pour des ss.SH + hybridomes) Z.10-6M DMSO% (V/V) 5 % 10 % Tous les milieux sont complétés avec du RP11 1640 En se référant au graphique annexé, où l'on a porté en échelle verticale des poids moléculaires (PM) en unités kd(kilodaltons) de protéines et en échelle horizontale des séries de différents anticorps de I à 9, la caractérisation des anticorps monoclonaux de l'hybridome M.8B6 est effectuée suite aux étapes suivantes a) Electrophorèse, sur gel dénaturant polyacrylamide/sodium dodécyl sulfate, des protéines virales de BNYVV (A) des protéines étalons (B). Migration des protéines selon leur poids moléculaire (PM. Kd). b) Electrotransfert de l'ensemble des protéines du gel dénaturant polyacrylamide/sodium dodécyl sulfate sur membrane de nitrocellulose (A et e > c) coloration des protéines au Rouge Ponceau (D), Mise en évidence de la protéine de la capside du BNYVV CPM = 22 Kd > . d > Hybridation des protéines virales du BNYVV avec les anticorps spécifiques (), à laide du système CROSS BLOT (brevet français N 85 10 271 précité) : - puits 1 : anticorps monoclonaux de l'hybridome M.8B6 - puits 2 et 3 : anticorps polyclonaux de la souris utilisée pour l'hybridation lymphocytaire (puits 2, dil. 1/50 ; puits 3, dil. 1/100). Pour confirmer cette caractérisation, comparaison avec des témoins positifs et négatifs. - puits 4, 5,-6 : témoins positifs. Anticorps polyclonaux dirigés contre le BNYVV, faits chez le lapin, suite à une immunisation de ce dernier avec du virus BNYVV extrait de plantes hôtes contaminées (des puits 4 à 6, progression dans le temps des prélè- vements sanguins) - puits 7, 8, 9 : témoins négatifs. Anticorps polyclonaux de lapin immunisé avec un extrait de plantes huttes saines. Hybridation des anticorps monoclonaux (hybridome M.8B6) et polyclonaux spécifiques du BNYVV avec le protéine de la capside du virus. EXEMPLE 2 s utilisation des anticorps du clone "BNYVV. M.8B6" à des fins de diagnostic de le présence du virus BNYVV ou de se protéine de capside, dans des échantillons végétaux. Les anticorps, conjugués ou non, sont utilisés dans les méthodes ELISA, CROSS DOT, CROSS BLOT ou immunofluorescence mettant en jeu des techniques de types direct, indirect ou sandwich connues en soi, pour mettre en évidence la présence ou non du virus BNYVV dans des échantillons végéteux ausceptibles d'entre infectés (Chenopodium quinos ou betterave) ou la présence ou non de la protéine de capside du virus BNYVV dans des échantillons végétaux susceptibles d'entre transformés. Le matériel végétal est utilisé soit brut, soit plus ou moins purifié selon les différents types d'expérience. - Les anticorps "BNYVV.M.886", conjugués ou non, sont utilisés à des dilutions comprises entre 1/10 000 et 1/1 000. Dens le ces particulier des techniques sandwich, deux types d'anticorps entrent en jeu : des anticorps polycloneux anti-BNYVV faits chez le lepin ou les enticorps monoclonaux selon l'invention dens la première étape du sandwich et, respectivement, les anticorps monoclonaux selon l'invention ou les anticorps polyclonaux faits chez le lepin dans la dernière étape du sandwich. Les anticorps utilisés dans cette dernière étape sont soit directement conjugués, soit couplés à l'utilisation de sondes du commerce. - Dans le majorité des essais, la saturation des sites aspécifiques est réalisée avec un tampon TRIS 50 mM, NaC1 200 mM, pH 7,4 ou un tampon cerbonate de sodium pH 9,6, additionnés de protéines de lait, par exemple de "régileit" à 5 %. - Le détection des échantillons infectés ou transformés et le quantification des résultats est fonction de la sonde utilisée dans le cas de conjugaison des anticorps monoclonaux BNYVV.M.8B6 ou polyclonaux à la phosphatase alcaline, les substrats utilisés en puits de microtitration (ELISA) et sur nitrocellulose (CROSS DOT, CROSS BLOT) sont respectivement le paranitrophénylphosphate et la composition 5 bromo 4 chloro 3 indolylphosphate/nitroblue tétrazonium. La quantification des réponses est alors respectivement réalisée à 405 nm, à l'aide d'un lecteur de plaques Titerkek Multiskan MCC, ou à 600 nm à l'aide d'un densitomètre à réflexion Shimadzu CS-930 et DR-2. dans le cas de conjugaison des anticorps au FITC, la présence des complexes spécifiques "antigènesenticorps" est détectée par utilisation d'un microscope à fluorescence Olympus. dans le cas d'utilisation d'anticorps BNYVV. M.8B6 non conjugués, les complexes "antigènes-anticorps" sont visualisés à l'aide de sondes commercialisées, soit conjuguées à des enzymes, soit marquées par des agents radioactifs ou fluorochromes. Le quantification des résultats dépend alors de la sonde utilisée. - la limite de détection pour l'ensemble de ces essais est voisine de 100 pg de virus. Comme mentionné plus haut en ce qui concerne les différents modes de diagnostic, les différents anticorps utilisés sont les suivants a) pour les techniques directes . l'anticorps monoclonal selon l'invention b) pour les techniques indirectes . le premier anticorps est l'anticorps mono clonal selon l'invention . le deuxième anticorps est un anticorps polyclonal. c) pour les techniques sandwich : . le premier anticorps est un anticorps poly clonal ou monoclonal selon l'invention , le deuxième anticorps est l'anticorps mono clonal selon 11 invention ou un anticorps polyclonal le troisième anticorps (éventuel) est un anticorps polyclonal. Il est bien entendu que la présente invention n'a été décrite et représentée qu'à titre explicatif mais nullement limitatif et qu'on pourre y apporter toute mo dification utile, notamment dans le domaine des équivalences techniques, sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Anticorps monoclonal destiné à la détection du virus responsable de la rhizomanie de la betterave sucrière, caractérisé par le fait qu'il est une immunoglobuline d'animal obtenue par hybridation entre les lymphocytes dudit animal et des cellules de myélome compatibles avec ces lymphocytes, et qu'il présente la capacité de se combiner à un épitope particulier présent sur une protéine correspondant notamment à la protéine de capside du virus d'un poids moléculaire de 22 kd, formant ainsi un complexe spécifique. 2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'animal est une souris, notamment BALB/C. 3. Anticorps selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'il est conjugué à des marqueurs enzymatiques ou fluorescents et susceptible d'être conjugué à des marqueurs radioactifs ou à la biotine. 4. Procédé d'obtention d'un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, du type dans lequel on effectue une hybridation lymphocytaire entre des cellules d'un animal immunisé et des cellules de myélome pour l'obtention d'hybridomes producteurs de l'anticorps, procédé caractérisé par le fait qu'on effectue l'immunisation d'un animal tel qu'une souris, puis l'hybridation des cellules immunocompétentes utiles avec les cellules de myélome provenant de myélomes murins. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on sélectionne les hybridomes producteurs d'anticorps spécifiques d'antigènes viraux, de manière indirecte où l'antigène viral est immobilisé sur un support solide, où les complexes spécifiques antigènes-anticorps monoclonaux formés sont détectés au moyen de sondes spécifiques. 6. Application d'un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications i à 3, à la dé tection du virus de la rhizomanie de la betterave su crière dans un échantillon végétal, caractérisé par le fait qu'on applique des techniques sur support solide, de type direct, indirect ou de type sandwich. 7. Application selon la revendication 6, caractérisée par le fait que la technique de type direct comprend l'immobilisation de l'antigène viral sur le support solide, l'anticorps de l'hybridome étant seul et tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8. Application selon la revendication 6, caractérisée par le fait que la technique de type indirect comprend l'immobilisation de l'antigène viral sur le support solide, la formation d'un complexe binaire entre l'antigène et un premier anticorps capable de reconnaitre ledit antigène, et la formation d'un complexe tertiaire entre le complexe binaire et un second anticorps dirigé contre le premier anticorps et conjugué à un marqueur, ledit premier anticorps étant tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, le second anticorps étant du type polyclonal. 9. Application selon le revendication 6, caractérisée par le fait que la technique sandwich comprend l'immobilisation d'un premier anticorps sur le support solide, la formation d'un complexe binaire entre le premier anticorps et l'antigène à détecter, la formation d'un complexe tertiaire entre ledit complexe binaire et un deuxième anticorps capable de reconnaltre l'antigène et conjugué éventuellement à un marqueur, puis la formation d'un complexe quaternaire entre le complexe tertiaire et un troisième anticorps dirigé contre le deuxième anticorps dans le cas où ce dernier n'est pas marqué, le premier anticorps étant polyclonal ou monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, le deuxième anticorps étant tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou un anticorps polyclonal, le troisième anticorps éventuel étant polyclonal.