Brevet FR2642760A1 — publié le 19900810

i La présente invention est relative à un proceda pour la préparation de primycne soluble dans l'eau et la séparation de ses composants individuels. L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques et vétérinaires comprenant la primycine soluble dans l'eau ou ses composants en tant que composant(s) actif(s). La primycine est un antibiotique largement utilisé ayant une puissante activité antimicrobienne. Sa formule empirique a été décrite par d. Aberhart et coil. [J. Am. Chem. Soc. 92, 5816 (1970)1; les auteurs ont aussi donné la formule structurale supposée de la primycine. Des études ultérieures ont révélé, cependant, que l'antibiotique primycine est un mélange comprenant trois composants majeurs et au moins dix composants mineurs [J. Chromatogr. 295, 141-151 (1984]]. Le terme de "primycine" se réfère donc à ce mélange de plusieurs composants à chaque fois qu'il est utisé ici; les composants individuels du mélange sont notés par des lettres de code spécifiques. De nombreux articles traitent de la préparation de la primycine et de ses composants, parmi lesquels il faut citer en plus des références citées plus haut, les brevets hongrois No. 146.332, 153.593, 158.241, 177.299, 194.493 et 195.514. La primycine et ses composants préparés selon toutes les méthodes connues jusqu'à maintenant, sont à peine solubles dans I'eau, ce qui implique de nombreuses difficultes lors de leur application en thérapie, puisque des compositions pharmaceutiques ne peuvent être préparées qu'avec des teneurs en agents actifs plutôt faibles (ainsi par exemple, la teneur en agent actif du Gel d'Embrimycine0 bien connu contenant de la primycine n'est que 0,2%]. A cela s'ajoute le fait que la séparation des composants individuels de la primycine nécessite des méthodes longues et complexes. Le but de l'invention est de convertir la primycine, préparée par exemple de la façon décrite dans les brevets hongrois No. 146.332 et 153.593 en une substance soluble dans -l'eau par une méthode simple et économique. Le but de l'invenFtion est aussi de séparer deux des composants majeurs de la primycine, soit individuellement soit sous forme de mélange par une simple opération. Conformément à la présente invention, on procède de la façon suivante: (il de la primycine insoluble dans l'eau est traitée dans un alcool en C1 -3, de préférence l'éthanol, avec une substance condensable comprenant un pont C-C-C, de préférence avec le cyanoacétate d'éthyle, en présence de méthylate ou.d'éthylate de sodium ou de potassium, de préférence le méthylate de sodium, le produit résultant ay!'ant une solubilité dans l'eau de 40 à 60 mg/ml est séparé, et, si cela est désiré, (ii) la substance résultante est soumise à une chromatographie sur colonne sur un gel de silice, dans laquelle on applique une solution aqueuse à environ 1% de mélange de Partridge comme agent éluant, pour obtenir un mélange de composants de formules A)ll et (A3) ayant une solubilité dans l'eau d'environ 50 mg/ml, et, si cela est désiré,- - Miiil le mélange à deux composants résultant est soumis à une chromatographie d'échange d'ions, dans laquelle on utilise une carboxyméthyl cellulose dans un cycle ammonium comme adsorbant et l'on élue l'adsorbant avec une solution aqueuse de carbonate acide d'ammonium pour obtenir le composant de formule [A3] ayant une solubilité dans l'eau d'environ 50 mg/ml sous une forme pure, et, si cela est désirée, livl l'élution est poursuivie avec du methanol absolu comprenant environ 10 mmoles d'acide acétique pour obtenir le composant de formule lAI] avec une solubilité dans l'eau d'environ mg/ml sous une forme pure. La formule empirique et le chromatogramme sur couches minces de la primycine soluble dans l'eau obtenue dans la première étape du procédé de l'invention, sont tous deux identiques à ceux de la substance de départ, la seule différence résidant en un changement radical de la solubilité dans l'eau. Les raisons de ce fait ne sont pas complètement élucidées, on suppose cependant, que les positions stériques des groupes -OH de la primycine de départ changent au cours du traitement selon l'invention, ce qui se traduit par une brutale augmentation de la solubilité dans l'eau. Les deux composants principaux de la primycine, c'est-à-dire les composés de formules (AI) et (A3), séparés de la primycine résultante soluble dans l'eau sont aussi solubles dans l'eau et leurs formules empiriques sont les mêmes que celles qui sont fournies dans la littérature. La primycine soluble dans I'eau et ses composants préparés selon l'invention peuvent être utilisés avantageusement en thérapie, puisqu'ils conservent les excellents effets antimicrobiens des substances insolubles dans l'eau correspondantes et permettent la préparation de compositions pharmaceutiques ayant une teneur en agent actif bien supérieure à celle qu'on avait auparavant, par exemple des solutions aqueuses comprenant même 50 à 100 mg/ml d'agent actif. L'invention se rapporte aussi à des compositions pharmaceutiques ou vétérinaires comprenant à titre d'agent actif, la primycine soluble dans l'eau ou un mélange soluble dans l'eau des composants de formules (A1J et (A3) ou un seul composé soluble dans l'eau de formule (AI ou (A3) avec un support, un diluant ou un autre adjuvant acceptable du point de vue pharmaceutique. Le procédé de la présente invention est maintenant davantage détaillé. La primycine insoluble dans I'eau préparée suivant les brevets hongrois No. 146.332 et 153.593 est utilisée comme substance de départ dans le procédé de l'invention. Cette substance a des propriétés ionophores. Des études antérieures de la Demanderesse ont révélé qu'en fonction de la concentration et du temps, de la primycine insoluble dans l'eau introduite à une concentration de 1 à Jlmoles/ml, bloque les canaux de K+ au repos de la membrane de surface des muscles du squelette. Ceci aboutit à une diminution du potentiel de membrane, qui entraîne également le changement fonctionnel du système contractile. L'antibiotique primycine a la caractéristique structurale unique résidant en ce que la molécule de grande complexité comprend une partie guanidine et une partie arabinose, les effets biologiques et eIQs caractéristiques physico- chimiques de la molécule sont donc déterminés par la macrolide lactone de type non-polyène et par les parties guanidine et arabinose fixées à celleci. Ces parties de la molécule définissent conjointement, par leurs propriétés amphipatiques [c'est-à-dire hydrophile et hydrophobe), I'orientation et la liaison de l'antibiotique à la membrane. On peut aussi supposer que la propriété de formation de canal de la primycine est reliée à la formation de dimères ou de polymères supérieurs. Un bouleversement partiel ou complet des interactions ci-dessus peut avoir une influence considérable sur la polarité de la molécule et donc sur ses conditions de solubilité également. La protonation partielle ou complète de la partie guanidine de la molécule peut avoir une grande influence sur la distribution des charges de surface (polarité brute], laquelle soit directement soit indirectement, peut supprimer ou même augmenter l'apparition d'interactions intermoléculaires. Pour élaborer la première étape du procédé de la présent invention, la Demanderesse a réalisé environ 150 experiences mettant en oeuvre des réactions de condensation largement appliquées dans la synthèse des composés ayant un squelette pyrimidine. Ces réactions ont une caractéristique commune en ce que le cycle hétéroaromatique est formé à partir d'un compose comprenant un pont N-C-N ou C-C-C. En tant que composants ayant un pont C-C-C, on peut appliquer par exemple l'aldéhyde propargylique, le formylacetate d'éthyle, le cyanoacétate d'éthyle, le dinitrile d'acide malonique, la méthyléthynylcétone, l'acétylcétone et des esters d'acide formyl-p-éthoxypropionique et de préférence en particulier, le cyanoacétate d'éthyle. Des alcools anhydres de I à 3 atomes de carbone peuvent être appliqués comme milieu réactionnel. La réaction est effectuée de préférence dans l'éthanol absolu, qui peut être préparé à partir id'éthanol préséché par une réaction de Orignard. En règle générale, les solvants anhydres utilisés dans les expériences ont été conservés sur un tamis moléculaire (comme un tamis moléculaire Sigma avec un diamètre de pore de 3-4 A). Le méthylate ou l'éthylate de sodium ou de potassium, de préférence le méthylate de sodium, peuvent être appliqués comme catalyseur. Lorsque l'éthanol sert de milieu réactionnel et que le mélange est maintenu à reflux, la réaction demande environ 3 à 6 heurs. A la fin de ce temps de réaction, le mélange réactionnel est décoloré avec du charbon actif (Charcoal activ. Merckl, filtré (de préférence à travers un papier de microfibres de verre EF/C Whatman) et partiellement évaporé sous vide. L'évaporation peut être réalisée par exemple dans un appareil Iotavapor P 110 (B chi]. L'éthanol utilisé comme milieu réactionnel est remplacé en continu par du -méthanol anhydre pendant la procédure d'évaporation et ensuite, de l'éther et de l'acétone absolus sont ajoutés au concentré pour faire précipiter le produit Le solide blanc obtenu est pulvérisé et conservé pendant 24 heures dans un pistolet sécheur à vide ("Blaue.', chloroforme/éthanol, 65'C) pour Fournir un échantillon permettant une identification et une analyse. Des données caractéristiques de la primycine soluble dans l'eau résultante, par rapport à celles de la matière de départ insoluble dans l'eau, sont rassemblées dans le Tableau I suivant. TABLEAU 1 Primycine de départ Primycine produite insoluble dans l'eau soluble dans l'eau Formule empirique CSSH 104N3017 CBBH I 04N3017 Point de fusion, 'C 180-184 162-164 Activité biologique 0,05 Ig/ml 0, 1-0,5 Pig/ml Solubilité dans l'eau 0,04 mg/mi 40-60 mg/ml On constate d'après la formule empirique de la primycine soluble dans I'eau obtenue, que la réaction de condensation effectuée dans les conditions de synthèse des composés de la pyrimidine n'aboutit pas à une cyclisation, c'est-à- dire que le noyau hétéroaromatique attendu ne se forme pas. Il est vraisemblable que la réaction procède par la formation d'un "intermédiaire" qui change fondamentalement l'orientation des groupes -OH du cycle macrolide. On suppose que ce changement aboutit a cette considérable augmentation de la solubilité dans l'eau et qu'également ce changement permet la séparation des principaux composants par une opération relativement simple. Une explication possible de ce phénomène est présentée par la suite. Le procédé de la présente invention permet de préparer une primycine soluble dans l'eau de façon reproductible à partir de primycine insoluble dans l'eau d'une quelconque origine, sans une quelconque purification préalable de la substance de départ On préfère particulièrement -utiliser de la primycine insoluble d'eau contaminée par du plomb comme substance de départ. Il a été observé en fait, que la présence de plomb exerce 0 une influence favorable à la fois sur le rendement de la primycine soluble dans l'eau fqui est généralement de 80 à 85%l et sur la solubilité maximum dans l'eau qui peut être atteinte [qui est de 50 à 1 00 mg/mil. Une étude par spectroscopie d'absorption atomique lfPerkin-Elmer Mod.J indique que la primycine de départ non purifiée comprend environ 6 à 10 ppm de plomb contaminant. Si l'on utilise une primycine insoluble dans I'eau purifiée de qualité thérapeutique icomme l'EbrimyLcineó] comme matière de départ, le rendement en primycine soluble dans l'eau tombe à environ 50-60%; et la solubilité maximum dans l'eau qui peut être atteinte n'est que de 5 à 10 mg/ml. Si une primycine insoluble dans l'eau purifiée est utilisée comme matière de départ, il est donc préféré d'ajouter 15 à 20 ppm de plomb au mélange réactionnel sous la forme d'un composé soluble du plomb, de préférence l'acétate de plomb. La primycine soluble dans l'eau a une autre caractéristique très avantageuse. On a observé que sa solution aqueuse se gélifie spontanément, le temps de gélification dépendant de la teneur en primycine de la solution. L'importance de la gélification en fonction du temps et de la concentration de primycine, est montrée dans la Figure 1. On constate à partir de ces courbes, que la gélification complète d'une solution aqueuse à -10 mg/ml de primycine demande environ I à 2 jours, celle d'une solution de primycine à 20-40 mg/ml est de 6 à 12 heures, tandis qu'une solution aqueuse de primycine comprenant plus de 50 mg/ml de primycine est complètement gélifiée en seulement 1 à 2 heures. L'effet de la température sur la gélification est montré dans la Figure 2. La gélification (polymérisationl dépendant de la concentration, du temps et de la température peut être attribuée vraisemblablement aux changements d'orientation des groupes -OH dans la molécule. Le gel de primycine résultant est complètement translucide, stable et ne change pas- 4ors de l'addition d'une quantité supplémentaire de solvant Cette propriété d'association favorable de la primycine soluble dans l'eau permet l'application de gels polymérisés ou de membranes lyophilis es dans des domaines thérapeutiques dans lesquels une forte concentration locale d'agent actif revêt une importance essentielle. 13râce à cette aptitude à former un gel de la prirmycine soluble dans l'eau, on peut préparer très facilement des compositions pharmaceutiques colloïidales ayant une teneur en agent actif très variable sans mettre en oeuvre un quelconque agent gélifiant particulier. L'utilisation d'éthanol, mélangé jusqu'à maintenant à des preparations de primycine insoluble dans l'eau pour atteindre une teneur en agent actif supérieure, peut aussi être évitée, si bien que les effets secondaires indésirés de l'éthanol peuvent être éliminés, Selon une première approche, la primycine préparée selon l'invention ne diffère de la substance de départ que par la solubilité dans l'eau. Cependant, en raison des changements survenant dans des propriétés de solvatation, les conditions d'association et les rapports dits d'hétérogénéité peuvent également changer, si bien que la primycine lqui est un mélange de plusieurs composants} devient plus accessible pour des traitements ultérieurs. C'est la raison pour laquelle on a réussi à obtenir un mélange à deux composants et deux composants uniques distincts biologiquement actifs par une opération chromatographique relativement rapide et bien reproductible. Pour préparer un mélange des composants de la primycine de formules fAIl et fA31, on utilise une primycine soluble dans l'eau préparée- selon l'invention comme matière de départ. La chromatographie est réalisée sur une colonne de gel de silice. Les conditions préférées pour une chromatographie sur colonne sont les suivantes: du Kieselgel 60 (dimension particulaire: 0,063-0,2 mm ou 0,020,5 mm) est appliqué comme adsorbant Le gel est lavé plusieurs fois avec de l'eau désionisée, la phase aqueuse est décantée et la suspension de gel résultant est débarassée des bulles sous vide. Une -colonne Pharmacia (2,6 x 230 cm) équipée d'un adaptateur de flux est employée comme colonne chromatographique. La traversée en continu est entretenue par une pompe péristaltique à quatre canaux Gilson Minipuls-2. On utilise un équipement Oilson pour la chromatographie liquide, comprenant un spectrophotomètre différentiel Holochrome Model M, un collecteur de fractions Model 201 et un enregistreur servopotentiometrique a deux canaux Model N2. pour collecter les fractions et surveiller le déroulement de la chromatographie en continu. La primycine soluble dans l'eau est envoyée sur la colonne en tant que solution aqueuse à 5-10 mg/ml. Les pics chromatographiques sont montrés dans la Figure 3. La colonne est d'abord éluée (lavée) avec de l'eau, ce qui élimine une notable partie des composants mineurs de la primycine (fraction "A" dans la Figure 31. On étudie les fractions individuelles des pics par chromatographie sur couches minces en utilisant des Merck OC Alufolien ou OC Plastikfolien Kieselgel 60 F254 comme plaques chromatographiques, la phase supérieure d'un mélange 38:2 10:50 en v/v de n-butanol, éthanol, acide acétique et eau comme solvant (mélange de Partridgel et un mélange de vanilline et d'acide sulfurique à 1 05C comme agent de détection. La substance liée-à la colonne, qui est un mélange des composants de formules fAi) et [A3), est éluée alors avec une solution -aqueuse à 1i% du mélange de Partridge indiqué plus haut. Comme le montre la Figure 3, les composants mineurs sont d'abord élués, suivis par un mélange pur des composés de formules (A1i) et (A3] et ensuite,. dans l'étape descendante de le diagramme d'élution. une substance contaminante ayant une valeur Rf supérieure (désignée sous le nom de composant "B" dans les descriptions des brevets cités plus haut), est éluée. Les fractions des pics sont rassemblées, évaporées, graduellement déshydratées avec du méthanol distillé, puis du méthanol absolu et ensuite, un mélange d'éther et d'acétone absolus est ajouté au concentré résultant pour faire précipiter le produit. Le produit précipité est un mélange de composés de formules lAI] et [A3], ce mélange est un produit biologiquement actif et soluble dans l'eau. Il est obtenu généralement avec un rendement de 50 à 60% calculé à partir de la primycine de départ soluble dans l'eau. Le melange à deux composants fond à 165- 168C. Dans ce qui suit, la Demanderesse a essayé de séparer les composés de formules l(AI) et (A3) à l'état pur à partir de leur mélange. Les études précédentes de la Demanderesse ont montré que les caractéristiques d'adsorption de ces deux composants majeurs sont presque les mêmes, si bien que leur séparation semblait être une opération longue et complexe impliquant une grande perte de matière. En cherchant.à élucider le mécanisme de l'effet de la primycine, la Demanderesse a toujours attribué une importance essentielle aux changements de la structure de charge de la molécule. Tout changement de la structure de charge peut modifier fondamentalement (1l l'orientation membranaire de la molécule de primycine (à savoir, seule une orientation discrète peut assurer par exemple la séparation des effets antibactérien et toxiqueJ et (21 les propriétes d'adsorption de la molécule ou des composants individuels de la primycine. Des tests chromatographiques antérieurs effectués avec une primycine soluble dans I'eau sur du Sephadex LH-20 ont montré qu'un changement de polarité et des conditions d'association peuvent avoir une influence considérable sur l'hétérogénéité de la primycine. En d'autres termes, le rapport des composants individuels présents dans les fractions des pics dépend des propriétés diélectriques du système solvant appliqué. A partir de ces observations, on a essayé de séparer les composants individuels du mélange obtenu de la façon décrite plus haut par chromatographie d'échange d'ions. Une méthode préférée, fournissant une séparation complète des composants de formules (AI) et IA3) est donnée ci-après. Le mélange soluble dans l'eau des composants de formules (Ai) et [A3), préparé de la faron décrite plus haut. est appliqué comme matière de départ. Une solution aqueuse à 4-5 mg/ml de ce mélange à deux composants est appliquée sur une colonne de carboxyméthyl cellulose dans un cycle NH4+ (cellulose Whatmnan CM-52, prégonfleel. Une colonne Pharmnacia K-26 (2,6 x cm) équipée d'un adaptateur de flux est utilisée comme colonne. Les conditions de la chromatographie et le diagramme d'élution sont donnes dans la Figure 4. La colonne est d'abord lavée a l'eau pour éliminer les composants mineurs résiduels ("A"] et ensuite l'élution est poursuivie avec une solution aqueuse de carbonate acide d'ammonium 5-8 molaire pour obtenir le composant pur de formule fA31. Le composant de formule LAI) reste lié à la colonne. Les effluents de carbonate acide d'ammonium sont rassemblés, une petite quantité de n-butanol (agent antimoussant] est ajoutée et le mélange est évaporé presque jusqu'à siècite. Le lavage à l'eau et l'évaporation sont répétés plusieurs fois pour éliminer le carbonate acide d'ammonium, puis le résidu est complètement déshydraté par évaporation d'abord de méthanol distillé et ensuite de méthanol 1l absolu du résidu. Le concentré résultant est traité avec de l'éther absolu pour faire précipiter le produit, le solide séparé est séparé par filtration et lavé avec une petite quantité d'acétone anhydre. Le solide résultant fond à 159-61]C et il est obtenu avec un rendement d'environ 45-50% calculé pour le mélange de départ à deux composants. La solubilité dans l'eau de la substance résultante est d'environ 2-6 mg/mi. La diminution du point de fusion (celui du mélange de départ est de 16516801C et de la solubilité dans l'eau [celle du mélange de départ est de 40-60 mg/mil] peut être attribuée à la présence de quantités mineures de NH4' liées et de contaminations de carbonate acide d'ammonium. Pour éliminer ces contaminations, la substance résultante est dissoute dans I'eau, la solution est appliquée sur une colonne de carboxyméthyl cellulose dans un cycle H+, la colonne est complètement lavée à l'eau et ensuite graduellement déshydratée d'abord avec du méthanol distillé, puis avec du méthanol absolu. La substance est ensuite éluée avec du méthanol absolu comprenant 10 mmoles d'acide acétique. L'effluent est évaporé a un petit volume, du méthanol absolu est ajouté au concentré et l'évaporation est répétée à plusieurs reprises et ensuite, le produit est précipité à partir du concentré avec de l'acétone absolue. La substance séparée est filtrée à travers un filtre de verre fritté 14, lavée à plusieurs reprises avec de l'acétone et sechee. 2 5 On obtient de cette facon, un composé de formule fA3) à l'état pur. fondant à 164-166'C. La solubilité dans l'eau du composé de formule [A3) est d'environ 50 mg/ml. La chromatographie d'échange d'ions répétée fonctionne avec une perte de matlere de 10% au maximum. Le second composant du mélange de départ à deux composants, c'est-à-dire le composé de formule (AI) qui reste liée à la colonne de carboxyméthyl cellulose CMH-52 dans un cycle NH4+ apres élution de celle-ci avec du carbonate acide d'ammonium aqueux, est séparé de la façon suivante: La colonne est lavée à l'eau pour éliminer complètement le carbonate acide d'ammonium et ensuite graduellement déshydratée d'abord avec du méthanol distillé, puis avec du méthanol absolu. La substance liée est ensuite éluée avec du méthanol absolu comprenant 10 mmoles d'acide acétique. L'effluent est évaporé à un petit volume, du méthanol absolu est ajouta au concentré et l'évaporation est répétée à plusieurs reprises pour éliminer l'acide acétique et ensuite, le produit est précipité à partir du concentré par addition d'acétone absolue. On obtient de cette facon, un composé de formule [AI) sous forme d'un solide pur, fondant à 167-168EC. Le composé est bien soluble dans l'eau. Aucune-chromatographie d'échange d'ions n'est nécessaire pour purifier ce composant, puisque dans l'étape d'élution par l'acide acétique, le NH4+ résiduel et "lié", ainsi que tout le carbonate acide d'ammonium éventuellement present, sont élués sous la formne d'acétate d'ammonium et que ce composé reste dissous dans l'étape de précipitation par l'acétone. Ainsi, une primycine insoluble dans l'eau peut fournir selon l'invention une primycïne soluble dans l'eau, à partir de laquelle, si cela est désiré, un mélange soluble dans l'eau des composants de formules (AI) et (A3J peut être préparé et les composants individuels de ce mélange à deux composants peuvent aussi être sépares. Tous les produits préparés selon l'invention sont solubles dans l'eau et biologiquement actifs. Les chromatogrammes de comparaison sur couches minces et les résultats de l'evaluation biologique sont montrés dans la Figure 5. Une chromatographie sur couches minces a été effectuée sur une plaque Kieselgel 60 DC Alufolien F254 avec la phase supérieure d'un mélange 38:2:10:50 en v/v de n-butanol, ethanol, acide acétique et eau utilisée comme solvant et avec un mélange de vanilline et d'acide sulfurique à 105"C comme agent de détection. L'évaluation biologique a été effectuée par un test de diffusion sur agar sur Bacillus subtilis. Les concentrations inhibitrices minimum (CIM) mesurées dans l'évaluation biologique sont rassemblées dans le Tableau Il ci-après. TABLEAU 11 CIM (pg/mlJ v Primycine de départ insoluble dans I'eau 0,04-0,06 Primycine soluble dans l'eau 0,08-0,2 Mélange de (AI) et (A3, '0,05-0.1 Composé de formule (A31 0,5-l,0 Composé de formule (A I) 0,03-0,06 Les résultats de l'évaluation biologique montrent que les composants individuels de la primycine ont une activité différente. Cette différence d'activité peut être attribuée [5 vraisemblablement au fait que les composants individuels exercent leurs effets antibactériens de différentes façons, ou peuvent avoir différents points d'attaque lorsqu'ils agissent sur l'organisme vivant Ceci explique le fait qu'un seul -composant est capable d'augmenter par synergie l'effet de l'autre composant (voir par exemple le brevet hongrois No. 196.309). Les propriétés gélifiantes des composants individuels de formules fA1I et GA3J et celles du mélange à deux composants ont été aussi examinées. On a trouvé que lorsque la concentration est maintenue à une valeur constante, la vitesse de gélification diminue. Les solutions aqueuses à 5-10 mg/ml des composants uniques peuvent être conservées pendant des jours (maximum d'une semaine! sans modification observable, tandis qu'une solution aqueuse du màlange à deux composants à la même concentration se gélifie en 1 à 2 jours et que la durée de gélification de la primycine soluble dans I'eau à la même concentration est inférieure à un jour. On peut supposer que ce retard de la gélification est relié à un changement de conformation ou à l'orientation des groupes hydroxy. On sait d'après des publications antérieures2 que la primycine est extrêmement sensible aux électrolytes, En accord avec cette observation qui concorde aussi avec la nattLre lonophorique de la primycine, on a observé que dans la primycine soluble dans l'eau, I'orientation des groupes hydroxy peut être retournée par des cations, ce qui se traduit par une diminution brutale mais réversible de la solubilité dans l'eau de la primycine. Cependant, lorsqu'elle est stochée dans une solution de sucre de concentration appropriée (comme dans une solution de glucose isotoniquel, la polymérisation et la sensibilité aux cations de la primycine peuvent être supprimées dans une grande mesure. Les spectres RMN pour 13C des produits préparés selon l'invention sont présentés dans les Figures 6 à 11. La Figure 6 montre le spectre PMN normal pour 13C de la primycine soluble dans l'eau (c = 500 mg/400 Jl1 de méthanol- d4, T = 323 K1. La Figure 7 montre le spectre PMN normal pour 13C avec découplage desprotons d'un mélange à deux composants de composés de formules (A1) et (A31 (c 250 mg/1,5 ml de méthanol- d4, T = 323 K. NS = 30001. _ La Figure 8 montre le spectre RMN normal pour 13C avec decouplage des protons du composé de formule (A3) [(c = 100 mg/400 1l de méthanol-d4, T = 323 K, NS = 50001. La Figure 9 montre le spectre RMN pour 1 3C du *-amposé de formule [A31 contenant de l'acétate d'ammonium; le spectre a été construit en utilisant une fréquence de pulsation EPT (c = 50 maf400.Il de methanol-d4. T = 323 K, NS = 20001. La Figure 10 montre le spectre RPMN normal pour 13r avec découplage des protons du composé de formule [A31 contenant de l'acétate d'ammonium (c = 50 mg/400 1I de méthanol- d4, T = 323 K, NS = 27001. La Figure I 1 montre le spectre PMN pour 13C normal découplé par des protons du composé de formule (AIl (c = 80 mg/400 jil de méthanol-d4, T = 323 K, NS = 27001. Les conclusions suivantes peuvent être tirées des données spectrales précédentes: Aucune cyclisation ne se déroule dans la réaction réalisée pour préparer la primycine soluble dans l'eau. Il est clair d'après le spectre PMN pour 13C, que la molécule étudiée contient quatre atomes de carbone quaternaire. Le signal du carbone du groupe carbonyle apparaît à 176,7 ppm. Le signal de l'atome de carbone quaternaire dans le groupe guanidine apparaît à. 58,8-ppm tandis que les signaux des deux atomes de carbone quaternaire restants apparaissent à 145,7 et 135,8 ppm respectivement [Figure 61. S'il y avait eu une cyclisation, deux atomes de carbone quaternaire supplémentaires auraient fait leur apparition dans le spectre PMN. Selon les spectres PMN, il est hautement probable qu'un intermédiaire est formé dans la réaction de quasi- condensation (Figure 6, signal à 170,4 ppm qui peut être le signal d'un carbonyle quaternaire]. Ce signal n'apparaît que si la primycine soluble dans l'eau est séparée des solvants anhydres (absolus). La primycine est chromatographiée ensuite en milieu aqueux, le signal à 170,4 ppm disparaît alors [voir la Figure 7, le spectre RMN du mélange à deux composants]). Ceci peut révéler que l'intermédiaire supposé subit une hydrolyse ou une adsorption sélective, aboutissant toutes les deux à sa disparition. Dans ce qui suit, sur la base de la construction du spectre RMN pour 13C (DEPTI et avec une technique d'écho de spin J-modulée, le nombre d'atomes de carbone de différents ordres [quaternaire, tertiaire (CHI, secondaire (CH2) et primaire (CH-;d a été déterminé dans les principaux composants. A la suite de cette détermination, la molécule contient quatre atomes de carbone quaternaire correspondant aux signaux discutés plus haut. 22 atomes de carbone tertiaire (le signal à 105,6 ppm correspond au carbone anomère de l'arabinose et les signaux a 129,1 et 124,9 ppm aux atomes de carbone tertiaire des deux liaisons insaturées], 22-23 atomes de carbone secondaire (le doute peut être attribué à la coïncidence accidentelle des signaux des atomes de carbone du radical méthylène dans des environnements chimiques similaires) et 6 atomes de carbone primaire. A partir de ceci, il s'ensuit que les formules empiriques des composants majeurs de la primycine soluble dans I'eau sont pratiquement identiques à celles qui sont discutées dans la littérature. Dans le spectre IMN de la primycine soluble dans l'eau, on peut distinguer les signaux de deux épimères, lesquels en raison des configurations stériques différentes des groupes -OH, -CH3 et butyle, apparaissent en tant que doublets. Des groupes -OH apparaissent aux positions 4, 8, 12, 16, 28, 30, 32, 34, 36 et 21' de la molécule; des groupes -CH3 apparaissent aux positions 3, 15, 21, 23 et 20' de la molécule; et le groupe butyle apparaît a la position 17 de la molécule. Le spectre RMN pour 13C du mélange à deux composants préparés selon la présente invention est montré dans la Figure 7. En comparent les Figures 6 et 7, on peut dire que les rapports pondéraux des composants principaux changent; la primycine soluble dans l'eau contient davantage de composé de formule (A3) (voir la Figure 61, tandis que dans le mélange à deux composants, le composé de formule (A1) prédomine. Ceci concorde 0 bien avec les résultats obtenus par chromatographie sur couches minces, tels que représentés dans la Figure 5. Les spectres PMN pour 13C montrés dans les Figures et 1 1, indiquent que le nombre d'atomes de carbone présents dans les deux composants maJeurs de formules (A3) et fA1l sont pratiquement les mêmes, à condition que le nombre d'atomes de carbone secondaire [CH21 puisse varier d'une unité, en raison des incertitudes discutées plus haut. Les petites differences, parfois négligeables, des déplacements chimiques des atomes de carbone dans des positions identiques dans les deux composants majeurs, peuvent indiquer qu'il n'y a aucune différence notable entre les deux composants majeurs; il peut apparaître peut-être une différence de conformation ou une interaction monomére-dimère [Figure 81. L'invention est davantage détaillée (matières et méthodes] et illustrée en référence aux exemples ci-après. Matières et méthodes Tous les solvants et les produits chimiques utilisés dans les exemples étaient des produits chimiques fins de la plus grande pureté chimique (produits par Merck, Fluha, Peanal, Whatrnan, MachereyNagel Co., Sigmai. Certains des solvants ont étQ purifiés ou re-purifiés (rendus absolus) par la Demanderesse. Les solvants anhydres ont été stockés sur un tamis moléculaire (diamétre des pores: 3-4 A)., Les substances suivantes ont été appliquées comme adsorbants dans la chromatographie sur colonne: Kieselgel 60 [dimension particulaire: 0,062-0,2 mm ou 0,2-0,5 mm), Carboxyméthyl cellulose MN 2100 CM (Macherey-Nagel), CM-52, prégonflée, microgranulaire (Whatmanl. Les substances suivantes ont été appliquées comme adsorbants dans la chromatographie sur couches minces: OC Alufolien Kiesel5el 60 F254 20 x 20 cm/0,2 mm (Merch No. 5554), - OC Plastikfolien Kieselgel 60 F254 20 x 20 cm/0,2 mm (Merck No. 573,5), Pol=lygram Sil, G-iUV254 20 x 20 cm/0,25 mm (Macheray-Nagel). La chromatographie liquide a été effectuée sur un appareil Oilson Medical Electronics équipé d'un spectrophotomPtre différentiel (moniteur Holochrome HM type UV), d'un collecteur de fractions Model 201, d'une unité d'enregistrement Model N2 et d'une pompe péristaltique Minipuls-2. Les chromatogrammes sur couches minces ont été détectés avec un réactif modifié de vanilline-acide sulfurique. On a dissous 250 mg de vanilline (qualité analytique) dans 100 ml d'éthanol anhydre. refroidi la soluton à -1 'GC et ajouté goutte-à- goutte 2,5 ml d'acide sulfurique concentré. La solution a été pulvérisée sur la plaque (avec de l'azote comme agent propulseur) ou la plaque a été plongée dans la solution de réactif. Les plaques ont été séchées dans un courant d'air froid et ensuite activées à 1 05"C pendant 1 à 2 minutes. La réaction de Sakaguchi a été effectuée de deux manières: (il Les plaques convenablement séchées ont étQ traitées sans chauffage avec une solution acétonique à 0,2% de 8- hydroxyquinoléine, séchées dans un courant d'air froid, puis une solution d'hydroxyde de sodium 0,5 N comprenant 0,2% de brome a été pulvérisée sur les plaques et celles-ci ont été séchées sans chauffage. (ii] On a dissous 2,5 g d'hyldroxyde de sodium dans 5 ml d'eau. La solution a été refroidie à 2-5'C, diluée avec 45 ml de méthanol prérefroidi, filtrée et 50 mg de 8-hydroxyquinoléine ont été dissous dans le filtrat. La solution résultante constituait le premier mélange réactif. Le second mélange réactif a été préparé par dissolution de 250 mg de N-bromosuccinimide dans 50 ml d'éthanol aqueux à 10% refroidi à 2-5'C. Les plaques ont été traitées avec les mélanges réactifs de la façon décrite dans le point (i) ci-dessus. La réaction de Sakaguchi a-été aussi utilisée pour détecter la primycine dans des solutions. Dans ces examens, la méthode microchimique discutée dans la littérature a été appliquée avec les modifications suivantes: les mesures ont été faites avec du N-bromosuccinimide. La dilution en série standard a été faite sur J'arginine et la densité de la couleur révélée a été mesurée sur un spectrophotomètre Opton à 520 nm. Les réactifs suivants ont ete aussi appliqués toujours sous des formes fraîchement préparées: [1 Solution alcaline d'c-naphtol à 0,01% ( préparée par dilution d'une solution éthanolique à 0,2% d'o-naphtol avec une solution d'hydroxyde de sodium aqueuse à 10%), (2) Solution de N-bromosuccinimide à 0,45% (NBS] dans de I'éthanol aqueux à 10%, [31 Solution aqueuse d'urée à 40%. Les déterminations ont. été réalisées à O'C. Contrairement aux données de la littérature, le volume du mélange réactionnel était de 1,7 mi. et le mélange réactionnel comprenait les composants suivants: Solution à étudier I ml Solution alcaline d'ónaphtol 0,4 ml Solution de réactif NBS 0, 1 ml Solution d'urée 0,2 ml 11 est bien connu que la réaction de Sakaguchi est très sensible à divers alcools et en général, aux composés oxo. Ainsi par exemple, avec la primycine, même une teneur de 20% en alcool- (méthanol, éthanol) résulte en une considérable réduction de l'extinction mesurée à 520 nm. Cette diminution n'est pas cependant reliée à la densité de la couleur révélé6e, mais à son déplacement chimique (déplacement vers la gamme de longueurs d'onde inférieures). Si la primycine n'est pas dissoute dans l'eau pure mais dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques (comme dans un mélange 1:1:2 en v/v de butanol, éthanol et eau), le produit coloré caractéristique révélé lors de la réaction de Sakaguchi peut être extrait quantitativement dans la phase butanol; le maximum d'absorption de la couleur dans cette phase est à 480 nm. Une technique de diffusion sur agar a été appliquée pour l'évaluation biologique de la primycine. L'organisme d'essai utilisé était Bacillus subtilis ATCC 6633. Bacillus subtilis ATCC 6833 a été cultivé sur un milieu Schaeffer (bouillon nutritif No. 2/oxoïde) ayant la composition suivante: Extrait de boeuf 3,2 g Peptone 3,2 g NaCI 1,6 g t-1.Su4,7H20 0,25 g KCI 1,0 g FeSO4,71-1H20 - 278 plg (10-6 mole) La solution a été chauffée dans un récipient sous pression pendant 30 minutes à une pression de 1,5 atmosphère, puis le pH a été ajusté à 7,0-7,2 avec 5 à 6 gouttes de solution d'hydroxyde de sodium 10 N. des portions de 90 ml de. la solution ont été versées dans des boîtes de culture et chaque portion a été complétée avec 10 ml des solutions suivantes: a] 238 mg (10-3 molel de Ca(N0312,41-120 dissous dans 100 ml d'eau distillée, et b) 1979 mg (10- 5 mole) de MnCI2,4H20 dissous dans 100 ml d'eau distillée. Le milieu nutritif de titration a été préparé de la façon suivante' g d'extrait de viande (Beel Extract -Difco), 0,5 g de peptone (Bacto Peptone Oifcol, I g de Na2HP04 et 0,1 g de KHi2P04 ont été dissous dans 100 ml d'eau distillée, la solution a été portée à ébullition pendant 2 heures et le pH a été ensuite ajusté à 8. La solution chaude a été filtrée, laissée refroidir, le filtrat a até dilué avec 900 ml d'eau distillée et 20 g d'agar (Bacto Agar DBfco], dissous dans un pot de Koch, ont été ajoutés à 1 litre de la solution. Le pH de la solution chaude a été évalué. Des portions de 100 ml de la solution résultante ont été introduites dans des flacons de stockage et ensuite traitées à chaud pendant minutes dans un récipient sous pression à une pression de 1,5 atmosphère. Les plaques de titration ont été préparées à partir du milieu nutritif ci-dessus de la façon suivante: 100 ml du milieu nutritif ont été fondus dans-un bain d'eau, la masse fondue a été refroidie à 40-50'C et 0,5 ml d'une suspension de spores de Bacillus subtilis ATCC 6633 a été mélangé avec précaution au milieu nutritif liquide immobile. Le milieu nutritif inoculé a été mis dans un plateau de verre de 30 x 30 x 3 cm fait de plaques de verre de 3-4 mm d'épaisseur, la plaque d'agar solidifiée a été preincubée à 37'C pendant 0,5-1 heure et ensuite 42 trous de 10 mm de diamètre ont té découpés dans la plaque. Des solutions contenant 20-50 ig/ml d'agent actif ont été préparées à partir des substances à étudier [primycine de départ insoluble dans l'eau; primycine soluble dans l'eau;. mélange des composés de formules [A1] et 1A3); composé de formule (Aij; composé de formule {A3)] dans de l'eau ou un mélange 1:1:2 en v/v de butanol, éthanol et eau, et les solutions résultantes ont été diluées avec de l'eau distillée tamponnée (tampon au phosphate 0,15 M, pH 7,6), à des concentrations de 0,05-0,1, 0,5-1,0 et 2, 0 Jlig/ml. Des portions de 0,1 ml des solutions résultantes ont été introduites dans les trous des plaques d'agar de titration et les plaques d'agar ont été incubées dans un milieu thermostaté à 37'C pendant 18-20 heures. Ensuite, les diamètres des zones d'extinction de la diffusion ont été mesurées en mm, les valeurs obtenues ont été rapportées sur une échelle semi-logarithmique en fonction des concentrations des dilutions en série standards et les valeurs d'activité ont été déterminées par extrapolation. Exemple 1 Préparation de primycine soluble dans I'eau. 500 mg (0,46 mmole) de primycine finement pulvérisée (contaminée par du plomb) et 100 ml d'éthanol absolu ont été introduits dans un ballon de 250 mi. Le ballon a été équipé d'un condenseur à reflux muni d'un tube de dessication rempli de CaCI2 et de chaux sodée et le mélange a été chauffé à reflux jusqu'à dissolution maximum (environ 15 à 30 minutes). Ensuite, 50 pl [0,46 mmolel de cyanoacétate d'éthyle ont été ajoutés au mélange; le réactif a été lavé dans le ballon avec une petite quantité d'étlhanol absolu. Le mélange a été chauffé à reflux pendant 15 minutes et ensuite, 25 mg (0,46 mmolel de méthylate de sodium ont été ajoutés au mélange en trois portions égales à des intervalles de 30 minutes. Les portions individuelles du réactif ont été lavées dans le ballon avec 1-2 ml d'éthanol distillé (96%). Le mélange réactionnel a commencé à devenir limpide dès l'introduction de la première portion de méthylate de sodium, puis la quantité totale de primycine a été dissoute et le mélange réactionnel a pris une couleur rose clair. A la fin de la durée de réaction [4 heuresl, le mélange a été laissé refroidir, filtré à travers un filtre en verre fritté 04 et concentré à un faible volume dans un appareil Potavapor P 110 (B chi). La teneur en éthanol du milieu réactionnel a été ensuite peu-à-peu remplacée par du méthanol de facon à dissoudre la substance séparée dans le méthanol absolu, le solvant a été évaporé et cette opération a été répétée. A la suite de ce traitement, la substance dotée d'une solubilité limitée dans l'éthanol, était devenue fortement soluble dans le méthanol et restait dissoute même dans quelques ml de méthanol. A ce moment, on a fait précipiter le produit a partir du concentré méthanolique avec de l'éther absolu. La substance séparée a été filtrée à travers un filtre en verre fritté 34, lavée avec de l'acétone absolue et séchée dans un pistolet sécheur à vide ("Blaugel", chloroforme/éthanol, p.é. 65-70CGI. 410 mg (82%) de primycine soluble dans l'eau ont été obtenus; le chromatogramme sur couche mince de celle-ci est fourni dans la Figure 5. Solubilité dans l'eau: 50 mg/ml, p.f.: 162- 1 64C, activité biologique (sur Bacillus subtilisi: 0,08-0,2 pig/ml. Exemple 2 Préparation d'un mélange à deux composants des composants de la primycine de formules (A1])t [3). La primycine soluble dans l'eau préparée dans l'exemple 1 a été utilisée comme matière de départ Les 2 0 composants majeurs de la primycine ont été séparés par chromatographie sur colonne sur un gel de silice. Du gel de silice (Kieselgel 60, dimension particulaire; 0,2-0,5 mm) a été purifié par lavages répétés avec de l'eau désionisée et décantations. La suspension homogène a été débarassée des bulles sous vide avant d'être introduite dans la colonne. Le gel de silice a été introduit dans une colonne Pharmacia de 2,6 x 230 cm, équipée d'un adaptateur -de flux. Une solution aqueuse à 5-10 mg/ml de 500 mg de substance de départ, filtrée à travers un filtre en verre fritté (3, a été appliquée an continu sur la colonne à travers l'adaptateur de flux La colonne a été ensuite éluée avec de l'eau à raison de 130 ml/heure (c'est-à- dire 25 ml/h/cm2) et des fractions d'effluent de 24 mi ont été collectées. Les conditions de la chromotographie et le diagramme d'élution sont montrées dans la Figure 3. L'élution a été poursuivie ensuite avec une solution aqueuse à 1% de mélange de Partridge (le mélange de Partridge est la phase supérieure d'un mélange 38:2:10:50 en v/v de n-butanol, éthanol, acide acétique et eau). Les fractions individuelles des pics ont été étudiées par chromatographie sur couches minces. Les fractions des pics contenant les deux composants ont été Passemblées, additionnées d'une petite quantité de n-butanol (agent antimoussant), la solution a été concentrée dans un appareil P:otavapor, le concentré a été graduellement déshydraté d'abord avec du méthanol distillé, puis avec du méthanol absolu. Le concentré résultant a été traité avec de l'éther absolu, la substance précipitée a été séparée par filtration, lavée avec de l'acétone et séchée dans un pistolet sécheur. On a recueilli 260 mg [52%) d'une substance solide; p.f. : 165-168"C, solubilité dans l'eau mg/ml, activité biologique (sur Bacillus subtilisa: 0,05-0,1 J.g/ml. Exemple 3 Préparation du composant deformnule (A3! Le mélange soluble dans I'eau à deux composants préparé dans l'exemple 2 a été utilisé comme matière de départ Les composants ont été séparés l'un de l'autre par chromatographie d'échange d'ions sur une carboxyméthyl cellulose dans un cycle NH4+. De la cellulose CM-52 lprégonflée, microgranulaire, Whatman) dans un cycle H+ a été mise en suspension dans l'eau, traitée avec une solution aqueuse molaire de carbonate acide d'ammonium, lavée à plusieurs reprises avec de l'eau, décantée et traitée sous vide pour chasser les bulles. Cet adsorbant a été introduit dans une colonne Pharrnacia (2,6 x 6 cm) équipée d'un adaptateur de flux. 450 mg du mélange à deux composants de départ ont été appliqués sur la colonne en tant que solution aqueuse à 4, 5 mg/ml à travers l'adaptateur de flux L'élution a été réalisée à un débit de 150 ml/heure ( = 29 ml/h/cm2) et des fractions d'effluent de 24 ml ont été collectées. Les conditions de la chromatographie et le diagramme d'élution sont montrés dans la Figure 4. -La colonne a été éluée (lavée) d'abord avec de l'eau. Après un lavage complet, l'élution a été poursuivie avec une solution aqueuse 5 mmolaire de carbonate acide d'ammonium. Les fractions des pics de cet éluat contenaient le composant homogène pur de formule (A31. Les fractions de carbonate acide d'ammonium comprenant le composé de formule fA3) en tant qu'unique composant, ont été collectées, une petite quantité de n- butanol a été ajoutée et le mélange a été évaporé presque à siccité. De l'eau a été évaporée de façon répétée à partir du résidu afin d'éliminer le carbonate acide d'ammonium volatil, puis le concentré a été déshydraté d'abord avec du méthanol distillé, puis avec du méthanol absolu. Enfin, on a fait précipiter la substance à partir du concentré avec de l'éther absolu. La substance précipitée a été séparée par filtration sur un filtre en verre fritté 64, lavée avec de l'acétone et séchée. On a obtenu 190 mg (42]) d'un composé de formule [A3); p.f.:159-161'C; solubilité dans l'eau: environ 5 mg/ml (cette diminution de solubilité dans I'eau peut être attribuée à la présence d'un peu de Ni-4 lié et de résidus de carbonate acide d'ammonium); activité biologique (sur Bacillus subtilis)' 0,5-1 tg. 0 C;Comme cela a été mentionné plus haut, la substance a eté soumise a une chromatographie d'échange d'ions répétée sur une carboxyjméthyl cellulose dans un -cycle H+ pour éliminer les contaminations qui diminuent sa solubilité dans l'eau. La substance a été envoyee sur la colonne en tant que solution aqueuse à 2-4 mg/ml, la colonne a été complètement lavée à l'eau et ensuite déshydratée graduellement d'abord avec du méthanol distillé, puis avec du méthanol absolu. La substance a été éluée avec du méthanol absolu comprenant 10 mmoles d'acide acétique. L'efftuent a été filtré à travers un filtre en verre fritté 14 ou à travers une plaque de fibres de verre W\hatman, le filtrat a été concentré à un petit volume et le produit précipité à partir du concentré avec de l'acétone absolue. Ensuite, la méthode décrite dans le paragraphe précédent a été suivie. On a obtenu un composé pur de formule [A3]; p.f.:164-166SC (contrairement à la valeur initiale de 159- 161'C); solubilité dans l'eau: 40-50 mg/ml. La chromatographie d'échange d'ions répétée a abouti à une perte de matière de 10% au maximum. Exemple 4 Préparation du composant de formule _(). Le composant de formule [A31 a été élué selon la méthode décrite dans l'exemple 3, tandis que le composant de formule (AI) restait lié à la colonne de carboxyméthyl cellulose dans un cycle NH4+. Le composant de formule (AIl) a été éliminé de la colonne de la façon suivante- La colonne a été lavée à l'eau pour éliminer complètement le carbonate acide d'ammonium et ensuite graduellement déshydratée d'abord avec du méthanol distillé, puis avec du méthanol absolu. Ensuite, le composant de formule (A1] a été élué avec du méthanol absolu comprenant 10 mmoles d'acide acétique. Les effluents ont été rassemblés, filtrés à travers un filtre en verre fritté 84, évaporés à un-faible volume. On a fait ensuite précipiter le produit à partir du copcentré avec de l'acétone absolue, La méthode décrite dans l'exemple 3 a été ensuite suivie. On a obtenu 150 mg [33% rendement calculé pour la quantité de rrmatière de départ appliquée dans l'exemple 31 du composé de formule AIl); p.f,.: 164-1 68C; solubilité dans l'eau mg/ml; activité biologique (sur Bacillus subtilis): 0,03-0,06 ilP. :EVENOICATIONS 1. Procédé pour la préparation de primycine soluble dans l'eau et la séparation de ses composants de formules (AI) et (A3] soit en tant que composants uniques, soit en tant que mélange des deux composants, caractérisé en ce que: (i) de la primycine insoluble dans l'eau est traitée dans un alcool en C1-3 avec une substance condensable comprenant un pont C-C-C, en présence de méthylate ou d'éthylate de sodium ou de potassium, le produit résultant ayant une solubilité dans l'eau de 40 à 60 mg/ml est séparé, et, si cela est désiré, (ii] la substance résultante est soumise à une chromatographie sur colonne sur un gel de silice, dans laquelle on applique une solution aqueuse à environ 1% de mélange de Partridge comme agent éluant pour obtenir un mélange de composants de formules (AI) et (A31 ayant une solubilité dans l'eau d'environ 50 mg/ml, et, si cela est désiré, (iii) le mélange à deux composants résultant est soumis à une chromatographie d'échange d'ions, dans laquelle on utilise une carboxjméthyl cellulose dans un cycle ammonium comme adsorbant et l'on élue l'adsorbant avec une solution aqueuse de carbonate acide d'ammonium pour obtenir le composant de formule [A3) ayant une solubilité dans l'eau d'environ 50 mg/ml sous une forme pure, et, si cela est désiré, (ivi l'élution est poursuivie avec du méthanol absolu comprenant environ 10 mmoles d'acide acétique pour obtenir le composant de formule [AI] avec une solubilité dans l'eau d'environ mg/ml sous une forme pure. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le cyanoacétate d'éthyle est utilisé comme substance condensable comprenant un pont C-C-C dans l'étape (il. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'éthanol est utilisé en tant qu'alcool en C1 -3 dans l'étape (il. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce que l'étape (il est effectuée en présence de méthylate de sodium. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications I à 5, caractérnisé en ce que l'étape (i) est effectuée en présence de 15 à 20 ppm de plomb introduit sous la forme d'un composé soluble du plomb. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l'acétate de plomb est utilisé comme composé soluble du plomb. 7. Composition pharmaceutique ou vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant qu'agent actif, une primycine soluble dans l'eau ou un mélange soluble dans l'eau des composants de formules (AI1 et (A3] ou un composé unique soluble dans I'eau de formule fAl1 ou (A31, avec un support, un diluant ou un autre adjuvant acceptable du point de vue pharmaceutique.