Brevet FR2644463A1 — publié le 19900921

PROTEINE HYBRIDE MalE-CD4 OU POLYPEPTIDE CD4 ISSU DE LA PROTEINE HYBRIDE AYANT DES PROPRIETES NEUTRALISANTES VIS-A-VIS DES VIRUS HIV L'invention est relative à des polypeptides résultant de la fusion entre, d'une part, au moins une partie de la molécule CD4 (également dénommée T4), plus particulièrement celle comportant la région proche de son extrémité N-terminale qui contient un site de fixation pour les virus HIV et, d'autre part, une protéine périplasmique bactérienne affine du maltose (MalE).Elle concerne encore plus particulièrement des polypeptides hybrides de ce type, voire même la susdite partie de molécule CD4 séparée à partir de tels polypeptides hybrides, plus particulièrement lorsque ces divers polypeptides consistent en des produits d'expression dans E. coli de séquences d'ADN correspondantes sous le contrôle d'éléments de régulation appropriés, ces produits d'expression ayant été exportés dans le périplasme bactérien, extraits et purifiés, de préférence en une seule étape sur colonne d'affinité et, le cas échéant, traité par des protéases choisies pour récupérer un polypeptide dont l'essentiel de la séquence consiste en celle de la protéine CD4'ou de la susdite partie de protéine CD4, à partir de ces polypeptides hybrides. I1 est entendu que dans ce texte l'abréviation HIV se rapporte à tout rétrovirus susceptible d'induire un SIDA chez l'hôte, notamment l'homme. A ce titre, HIV se rapporte à HIV1, HIV2 ou à tous variants pathogènes de ces derniers. Les chiffres entourés de signes entre parenthèses renvoient à la bibliographie jointe au présent texte. La protéine CD4 est une glycoprotéine intégrale de la membrane des lymphocytes T (helper/inducer). La partie externe (située du côté N-terminal) se compose de quatre domaines semblables à ceux des chaînes légères des immunoglobulines. Elle est suivie d'une partie transmembranaire et d'une partie cytoplasmique (1). Cette protéine sert de récepteur pour le virus HIV (responsable du SIDA) pàr le biais d'une interaction avec la protéine virale gp120 (2 > . Il a été montré que les deux premiers domaines (qui sont dépourvus de sites de glycosylation) contiennent le site de liaison à gap120 ainsi que ceux des anticorps monoclonaux anti-CD4, nommés IOT4 et sKT4A et possédant un pouvoir neutralisant sur l'infectivité virale (3), (4), (5).Il a été montré qu'une protéine tronquée, contenant ces deux domaines, et secrétée par des cellules eucaryotes a la faculté d'inhiber l'infection virale dans des tests in vitro (3), (4), (6), (7), (8), (9) et chez le singe rhésus (10). Un procédé permettant de faire exprimer dans E. coli un rédepteur CD4 fonctionnel fusionné à la protéine bactérienne périplasmique MalE, affine pour le maltose et les maltodextrines, a déjà été exposé dans la demande 'de brevet européen publiée le 18 janvier 1989 sous le n 299.810. Il permet la réalisation de fusions entre le gène MalE et d'autres gènes bactériens qui ont déjà été réalisées (11), (12). Les protéines hybrides obtenues conservent les fonctions des deux composants. De plus, elles sont susceptibles d'être exportées dans le périplasme. L'invention met à profit le fait que cet environnement parait dans les bactéries gram négatif, dont en particulier E. coli, favoriser à la fois l'établissement des ponts disulfure importants pour l'activité biologique de CD4, et plus particulièrement de la partie N-terminale de cette dernière. Les protéines hybrides peuvent aussi être exprimées dans des cellules eucaryotes telles que la lignée C1102 (fibrioblastes embryonnaires de hamster) quand elles sont tranféctées par des constructions associant les gènes MalE et CD4 fusionnés à des signaux de transcription propres aux cellules eucaryotes (par exemple origine de réplication et signaux de polyadénylation du virus Su40), On applique pour cela des techniques connues de l'homme de l'art. Le procédé décrit dans le brevet permet d'envisager à court terme une production massive de telles protéines hybrides. Les étapes de purification sont simples et rapides. En effet, comme la protéine MalE, la protéine hybride est susceptible d'être produite en abondance et d'être purifiée en une étape sur colonne d'amylose avec élution par le maltose à pH neutre. Il est apparu, conformément à la présente invention, que cette technique permettait d'ores et déjà, en ce qui concerne plus particulièrment la protéine CD4, une évaluation de son pouvoir thérapeutique, qu'elle soit à l'état hybride ou non, et donnait accès à certaines études telles que sélection de mutants CD4 ayant des propriétés modifiées (stabilité, interaction avec le virus ...), évaluation du pouvoir thérapeutique de parties de la molécule CD4. L'invention concerne plus particulièrement un polypeptide hybride contenant une chaîne peptidique dérivée de la protéine CD4 fusionnée, en amont de son extrémité N-terminale avec une première séquence et, le cas échéant, en aval de son extrémité C-terminale, avec une seconde séquence, respectivement issues de la protéine MalE, ce polypeptide hybride étant plus particulièrement caractérisé - en ce que la chaîne peptidique dérivée de la protéine CD4 contient au moins la partie de région Nterminale de cette protéine qui comprend elle-même un site de fixation du virus HIV et - en ce que ladite première séquence issue de MalE et, le cas échéant, la seconde présentent lorsque l'on a recours à des techniques de production par génie génétique pour la production de la protéine hybride, des longueurs suffisantes pour que le polypeptide hybride conserve à la fois les propriétés de la protéine MalE eu égard à son transport dans le micro-organisme transfecté alors utilisé, notamment E. coli hors du cytoplasme et d'exportation dans le périplasme de cet organisme et l'affinité spécifique de MalE pour le maltase ou l'amylose. Un polypeptide préféré de l'invention est dépourvu de la susdite seconde chaîne. Il a en effet été constaté que ces derniers types de polypeptides hybrides étaient beaucoup mieux tolérés par les bactéries en culture qui les produisent que ceux dans lesquels la séquence issue de CD4 était intercalée entre les deux chaînes précédemment indiquées. Il est remarquable aussi que l'activité propre à la protéine CD4 soit conservée, alors même que celle-ci est fusionnée avec la chaîne issue de MalE au niveau de sa propre extrémité N-terminale, dont on sait qu'elle est elle-même proche d'un site de fixation sur les virus du type HIV. En particulier le polypeptide selon l'invention contient au moins la région VI de la protéine CD4, voire aussi la région V2. L'invention concerne plus particulièrement encore les polypeptides hybrides tels que définis ci-dessus, lorsqu'ils ont été produits dans une bactérie gram négatif dont E. coli dans les conditons rappelées plus haut, ou encore un polypeptide dérivé du précédent, après séparation des chaînes contenant les séquences issues de MalE. Les polypeptides selon l'invention peuvent être produits notamment par les techniques décrites dans la demande de brevet européen nO 299.810, à laquelle il a été fait référence dans ce qui précède. Ce sont les mêmes techniques qui ont été mises en oeuvre dans les exemples qui suivent. D'autres caractéristiques de l'invention résultent encore de la description de ces exemples considérée en combinaison avec - la fig. 1 qui montre de façon schématique les parties essentielles de la protéine CD4, et leur relation à l'égard de la membrane des lympohocytes qui normalement la portent, - la fig. 2 qui fournit des représentations schématiques de polypeptides conformes à l'invention et des constructions des plasmides correspondants qui permettent la production dans E. coli de tels polypeptides. Il est fait référence à l'article de P.J. Maddon et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, pp. 9155-9159, December 1987, Immunology, avec la correction apportée par Littman et al, Cell 55, 541, 1988, pour ce qui est de la séquence peptidique de la protéine CD4 et la numérotation de ces aminoacides, telle qu'elle est employée dans le présent texte. La structure globale de la protéine CD4 est montrée schématiquement dans la fig. 1, dans laquelle: - la partie représentée par un trait épaissi -(et à laquelle renvoie la flèche partant de HIV) correspond au site de fixation auquel il est plus particulièrement fait référence dans le présent texte, - les désignations à droite de la représentation schématique de la protéine se réfèrent aux différentes parties de la protéine (VI, V2, V3 et V4), ainsi qu'aux positions des sites de la protéine CD4 reconnus par les anticorps monoclonaux identifiés dans la figure, - les lettres "G" font référence aux sites normalement glycosylés de la protéine CD4 et - les lettres E, M et C aux régions respectivement extracellulaires (E), membranaires (M) et cytoplasmiques (C) de la. protéine CD4. Expression et localisation Deux vecteurs d'expression portant un gène chimérique (fig. 1) ont été construits. Le premier détermine -une protéine hybride (CIMER) où les 177 acides aminés de la partie N-terminale de CD4 sont fusionnés à l'extrémité C-terminale de MalE (369 acides aminés). Le second code pour une protéine hybride (CISREM) comprenant le même fragment de CD4 fusionné cette fois à l'extrémité N-terminale de la protéine MalE. Dans ce dernier cas, afin de faciliter l'exportation dans le périplasme, la partie Nterminale de CD4 a été elle-même fusionnée au peptide signal de MalE : la partie soluble de CD4 se trouve donc entre le peptide signal de MalE et la protéine mature (voir fig. 1). Les constructions en cause sont schématiquement représentées dans la fig. 2 : on en rappelle -ci-après les caractéristiques principales (appréciées en combinaison avec la fig. 2). Fusion MalE-CD4 = CIMER Un fragment d'ADN (Fnu4H-NdeI) contenant les codons -4 à +177 du gène CD4 a été inséré dans un plasmide (dérivé de pBR322) portant les gènes de résistance à l'ampicilline et à la tétracycline, le gène lac1 et le gène MalE placé sous le contrôle du promoteur tac (inductible à 1'IPTG). Un adaptateur a été inséré à l'extrémité distale de MalE, si bien que l'insertion de CD4 se situe en phase au niveau du dernier codon de malt. La structure de la protéine est indiquée au-dessus du schéma représentant celle du plasmide. Fusion CD4-MalE = CISREM Dans un premier temps, le même fragment de CD4 a été inséré en aval de la séquence signal de malE (après le 27ème codon de la protéine mature). Dans un deuxième temps, la totalité de malE (codons -2 à +370) a été insérée en phase après le 177ème codon de CD4. Le reste du plasmide (résistances å l'ampicilline et à la tétracycline, gène lacN et promoteur tac) sont identiques au précédent. La structure de la protéine est indiquée au-dessus du schéma représentant celle du plasmide. Dans les deux cas, la transcription des gènes chimériques est placée sous le contrôle du promoteur tac (13). Elle est insensible à la répression catabolique et peut être induite à volonté par l'addition d'IPTG (Isopropyl B-D-thiogalactoside) : la présence sur le plasmide du gène lace (qui détermine un répresseur se fixant au promoteur tac) assure un faible niveau d'expression en absence d'inducteur. Pour favoriser la production d'une protéine stable, l'on a eu recours à des souches d'E. coli portant les mutations loir et degp qui inactivent respectivement des protéases cytoplasmiques et périplasmiques (14), (15). Lorsque les cellules porteuses des vecteurs d'expression sont induites pendant trois ou quatre générations à 300C, elles produisent une protéine majoritairement exportée (CIMER) ou partiellement exportée (CISREM) dans le périplasme, identifiable par sa taille (60 KD), et par les anticorps spécifiques dirigés contre ses déterminants antigéniques MalE et CD4. La fraction de molécules synthétisées qui présentent des tailles intermédiaires entre la protéine hybride complète et la protéine MalE, probablement des produits de dégradation ou d'expression abortive, n'a représenté qu'une proportion minoritaire des protéines hybrides produites. Dans des conditions de faible expression (niveau non induit), les protéines de fusion sont capables de complémenter une souche délétée pour MalE (croissance normale en milieu synthétique contenant du maltose comme unique source de carbone). Dans des conditions de pleine induction, la surproduction de CISREM tend à devenir toxique pour les bactéries alors que celle de CIMER ne l'est pas. Nous avons purifié cette dernière protéine et étudié ses propriétés, Il a été montré que les deux constituants des protéines hybrides purifiées, et plus particulièrement de la protéine CIMER sur colonne d'amylose conservent leurs fonctions respectives. 1 - La partie MalE conserve son site de reconnaissance du maltose et des maltodextrines. Le passage du contenu périplasmique (choc osmotique) sur colonne d'amylose conduit à la fixation spécifique d'une fraction des protéines périplasmiques à l'amylose. Cette fraction peut être éluée de la colonne par du maltose et purifiée en une seule étape avec un rendement de l'ordre de 500 ug de protéine hybride par g de bactéries. Cette population moléculaire, affine pour l'amylose et le maltose, présente sur gel de polyacrylamide-SDS la masse moléculaire apparente de 60 kD attendue pour la protéine hybride et est reconnue par des anticorps polyclonaux anti MalE et monoclonaux anti-CD4. Le poids moléculaire de 60 kD (indiqué ci-dessus) a été apprécié par comparaison des distances de migration sur gel respectivement de la protéine hybride et de protéines de référence de poids moléculaires élevés connus, dans les conditions décrites à propos de la mise en oeuvre du kit de haut poids moléculaire Amersham RAINBOW. Les susdites protéines de référence étaient constituées par les proteines suivantes - phosphorylase 92.500 daltons, - ovalbumine 46.000 daltons, - sérumaîbumine bovine 69.000 daltons, - lyzosyme 14.300 daltons. 2 - La Dartie CD4 de la Drotéine hybride est capable de lier les particules virales HIV par l'intermédiaire de leur protéine d'enveloppe ail20. i. Des expériences mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux "neutralisants" montrent que ces derniers (IOT4 et OKT4A déjà mentionnés) réagissent avec la protéine hybride en tests ELISA ou par immunoprécipitation aux mêmes concentrations que le CD4 soluble purifié a partir des cellules de mammifères. ii. Une interaction directe entre la protéine hybride et une protéine purifiée gpl20 ou gp160 de HIV1 a pu être mise en évidence par coimmunoprécipitation et par immunotransfert; iii. Finalement la mise en présence de la protéine hybride avec des particules virales "neutralisent" ces dernières. Cela est mis en évidence dans un test où le pouvoir infectieux du virus HIV1 sur les cellules de la lignée lymphocytaire CEM est mesurée par l'activité de la trasncriptase réverse et la cytotoxicité. La préincubation du virus avec une concentration de CIMER de 1 pg/ml a le même pouvoir neutralisant que l'utilisation d'azidothymidine (ou AZT, l'un des agents anti-HIV le plus utilisé) à la concentration de 10 nM.On observe une inhibition supérieure à 90 % du virus à partir de concentrations de CIMER supérieures à 10 vg/ml. Ces résultats sont en bon accord avec ceux obtenus avec du CD4 soluble produit par d'autres méthodes (3), (7), (8), (9). Toutes ces données convergentes indiquent que la composante CD4 de la protéine hybride a conservé une configuration lui permettant de se lier avec la particule virale entière. Il est probable en particulier que les ponts disulfure de CD4 se sont formés correctement. En utilisant la construction MalE-T4 décrite dans la demande de brevet européen nO 299.810, il a aussi été montré que la protéine hybride MalE-T4, exprimée, purifiable en une seule étape par affinité sur une colonne d'amylose, à partir de bactéries soniquées ou à partir d'un choc osmotique, possède les propriétés suivantes 1) Elle est reconnue par des anticorps polyclonaux dirigés contre MalE et par des anticorps monoclonaux (IOT4, OKT4, OKT4A) dirigés contre CD4 (alias T4). 2) Elle interagit avec les protéines virales gpl20 et gpl60. Ceci a été montré de trois manieres a) expériences de "dot blot" (protéines natives), b) co-immunoprécipitation du complexe MalE T4:gp160 (protéines natives) par des anticorps polyclonaux dirigés contre MalE ou gp160, c) rétention de gpl60 par la protéine hybride ("dénaturée") fixée sur nitrocellulose ("Western Blot" incubé avec gp160 et révélé par des anticorps dirigés contre gpl60). 3) Elle est capable d'inactiver le virus HIV1 dans un test in vitro. La préincubation du virus avec des concentrations croissantes de la protéine fusion (0, 2, 20 et 50 ug/ml) aboutit a une inhibition croissante- du virus (0, 55, 90 et 100 %) pour sa capacité à se répliquer dans des cellules de la lignée CEM (les chiffres indiqués se rapportent à l'inhibition de l'activité transcriptase réverse au bout de 15 jours). La protéine MalE, purifiée et utilisée dans des conditions identiques ne produit aucune inhibition de la réplication virale. Les protéines hybrides, résultats de fusions entre le gène bactérien malE et une fraction du gène CD4 humain, et exprimées dans E. coli conservent donc les propriétés des deux composants, notamment le pouvoir neutralisant de CD4 envers le virus HIV, notamment HIVI. L'invention concerne donc aussi les compositions destinées a l'usage thérapeutique in vivo, contenant, en association avec un véhicule pharmaceutique approprié au mode d'administration choisi, notamment par voie parentérale, une dose efficace pour neutraliser in vivo un rétrovirus appartenant à la classe des HIV, du polypeptide hybride MalE-CD4, tel que défini ci-dessus ou du peptide soluble CD4 dérivé du susdit polypeptide hybride, apurés clivage et séparation de ses séquences MalE. La susdite dose efficace peut être variable d'un patient à l'autre et devrait chaque fois être appréciée par le clinicien.A titre purement indicatif, et sans pour autant restreindre la portée de l'invention, les doses quotidiennes devraient se situer entre 100 pg et 10 g, par exemple être de l'ordre de 1 gramme. Les protéines hybrides selon l'invention peuvent être produites en grande quantité. L'utilisation d'E. coli en tant qu'agent d'expression de CD4 rend envisageable l'introduction de modifications au niveau du gène CD4 et la mise au point de techniques de sélection permettant d'isoler des mutants plus efficaces encore. Ces protéines hybrides autorisent aussi des études de structure de CD4, par exemple par des rayons X. Elles peuvent également être appliquées, après fixation sur une colonne affine, notamment à base de maltose polymérisé ou d'amylose, à la purification de virus HIV contenu dans un milieu de culture, notamment par rétention sélective du virus à l'occasion de la mise en contact d'un tel milieu avec une telle colonne affine. L'invention concerne également un procédé de détection in vivo de la présence éventuelle de virus HIV ou d'antigènes de ce virus dans un échantillon biologique, ce procédé comprenant la mise en contact de cet échantillon biologique avec un polypeptide hybride ou non, tel que défini plus haut, dans des conditions autorisant la fixation de ce polypeptide sur l'HIV ou l'antigène d'HIV éventuellement présent et la détection du complexe éventuellement produit. BIBLIOGRAPHIE [1] Maddon, PJ., Littman, D.R., Godfrey, M., Maddon, D.E., Chess, L. et R. Axel. Cell 42 (1985) 93-104. [2] Mc Dougal, J.S., Kennedy, M.S., Sligh, J.M., Con, S. P., Mawle, A. et J.K.A. Nicholson. Science 231 (1986) 382-385. [3] Traunecker, A, Lücke, W. et K. Karjalainen. Nature 331 (1988) 84-86. [4] Berger, E.A., Fuerst, T.R., et B. Moss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 2357-2361. [5] Richardson, N.E., Brown, N.R., Hussey, R.E., Vaid, A., Matthews, T.J., Bolognesi, D.P. et E.L. Rheinhertz. Proc. Natl. Acad. Sci. 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Polypeptide hybride contenant une chaîne peptidique dérivée de la protéine CD4 fusionnée, en amont de son extrémité N-terminale avec une première séquence et, le cas échéant, en aval de son extrémité C-terminale, avec une seconde séquence, respectivement issues de la protéine MalE, ce polypeptide hybride étant plus particulièrement caractérisé - en ce que la chaîne peptidique dérivée de la protéine CD4 contient au moins la partie de région Nterminale de cette protéine qui comprend elle-même un site de fixation du virus HIV et - en ce que ladite première séquence issue de MalE et, le cas échéant, la seconde présentent lorsque l'on a recours a des techniques de production par génie génétique pour la production de la protéine hybride, des longueurs suffisantes pour que le polypeptide hybride conserve à la fois les propriétés de la protéine MalE eu égard à son transport dans le micro-organisme transfecté alors utilisé, notamment E. coli hors du cytoplasme et d'exportation dans le périplasme de cet organisme et l'affinité spécifique de MalE pour le maltose ou l'amylose. 2. Polypeptide hybride selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de la susdite seconde chaîne. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient la partie dite soluble de la protéine CD4, notamment la région N-terminale de la protéine CD4. 4. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient la région V1 de la protéine CD4. 5. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient les régions V1 et V2, notamment la séquence d'aminoacides 1-177 de la protéine CD4. 6. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste en un produit d'expression dans des hôtes tels que cellules eucaryotes ou bactéries telles que les gram négatif, par exemple des bactéries E. coli, transformé avec un acide nucléique recombinant contenant une séquence nucléique codant pour ledit polypeptide et, associé avec celle-ci,des éléments de régulation autorisant son expression dans un hôte, lorsque ces bactéries sont mises en culture, ce produit ayant été purifié par un procédé comprenant la mise en contact dudit polypeptide préalablement extrait de ces E. coli avec un polymère insoluble de a(l-4)glucose ou d'amylose, et la récupération du susdit polypeptide alors fixé sur le polymère, après séparation des produits non fixés. 7. Polypeptide dérivé du polypeptide selon la revendication 6, comportant uniquement la chaîne peptidique issue de la protéine CD4, telle qu'elle est obtenue après clivage et séparation de la séquence ou des séquences issues de MalE. 8. Composition apte à neutraliser un virus HIV in vivo et contenant, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable pour l'hôte auquel il est administré, le polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, en une dose efficace pour lui conférer cette aptitude. 9. Procédé de détection in vitro d'un HIV ou d'antigène de HIV, notamment de sa glycoprotéine d'enveloppe, éventuellement contenus dans, un échantillon biologique, caractérisé par la mise en contact de cet échantillon biologique avec un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 a 7, dans des conditions autorisant la fixation de ce polypeptide sur l'HIV ou l'antigène d'HIV éventuellement présent et la détection du complexe éventuellement produit.