Brevet FR2647677A1 — publié le 19901207

La présente demande concerne de nouvelles microprotéines, le procedé de préparation et l'application à titre de médica- ment de ces nouvelles microprotéines. On sait que les semences d'Ecballium elaterium plus commu- nément connu sous le nom de "cornichon sauteur" sont une, source très importante de protéines inhibant les proteinases. On a ainsi notamment isolé de ces semences une microprotéine connue sous le nom d'EETI II (Ecballium elaterium Trypsin Inhibitor II) de structure: G C P R I L M R C K Q D S D C L A G C V C G P N G F C G l I 4 5 7 10 15 20 25 (- Protease inhibitors from Ecballium Elaterium seeds. A. Favel, H. Mattras, M.A. Coletti-Previero, R. Zwilling, E.A. Robinson & Castro. International Journal of Peptide & Protein Research. - 1H 2D NMR and Distance Geometry of the folding of Ecballium elaterium, a member of the squash inhibitor family. A. Heitz, L. Chiche, D. Le- Nguyen & B. Castro, Biochemistry, (1989) 28, p. 2392, 2398.) La nomenclature utilisée est celle de la commission IUPAC- IUB (1984) European J. Biochem 183, 9-37. Cette microprotéine qui renferme 28 résidus d'amino- acides, 3 ponts disulfures et 5 résidus de glycine présente notamment la propriété d'inhiber la trypsine. En essayant de remplacer certains restes d'amino-acides de cette microprotéine par d'autres amino-acides, la demanderesse a préparé par synthèse de nouvelles microprotéines dans les- quelles l'activité anti-trypsine de l'EETI II a disparu au profit d'une activité anti-élastasique tant contre l'élastase pancréatique bovine que contre l'élastase leucocytaire humai- ne. Ces produits présentent en outre l'intérêt de pouvoir être préparés par synthèse totale en grandes quantités. La présente demande a ainsi pour objet de nouvelles micro- protéines renfermant 28 amino-acides répondant à la formule générale (I): G C P-X-Y-L-z R C K Q D S D C L A G C V C G P N G F C G iD LAG 4 5 7 10 15 20 25 dans laquelle: - X en position 4 représente un résidu de valine, de leucine, d'isoleucine, de norleucine, d'alanine, de cyclohexylalanine, d'o-m6éIylthéonine, de phénylglycine ou d'acide alpha-amino butyrique, Arginine, - Y en position 5 représente un résidu d'isoleucine ou de serine, - Z en position 7 représente un résidu de méthionine ou de norleucine, étant entendu que Z représente un résidu de nor- leucine lorsque X représente un résidu d'Arginine. Parmi les microprotéines telles que définies ci-dessus, on retient notamment celles caractérisées en ce que, Y en posi- tion 5 représente un résidu d'isoleucine, X en position 4 et Z en position 7 ont la signification déjà indiquée. Parmi ces dernières, on retient de préférence les micro- protéines dans lesquelles Z en position 7 représente un résidu de norleucine, ainsi que celles dans lesquelles X en position 4 représente un résidu de valine, d'alanine ou de norleucine. Parmi les microprotéines préférées de l'invention, on retient tout particulièrement celles dans lesquelles: - X en position 4 représente un résidu de valine, Y en posi- tion 5 représente un résidu d'isoleucine et Z en position 7 représente un résidu de norleucine, - X en position 4 représente un résidu d'alanine, Y en posi- tion 5 représente un résidu d'isoleucine et Z en position 7 représente un résidu de méthionine, - X en position 4 représente un résidu de norleucine, Y en position 5 représente un résidu de serine et Z en position 7 représente un résidu de méthionine. L''invention a également pour objet un procédé de prépara- tion des microprotéines telles que définies ci-dessus, carac- térisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquentiellement sur une résine oxyméthyl polys- tyrène réticulée les amino-acides dûment protégés en utili- sant un agent de couplage, libère de la résine la chaine peptidique ainsi formée et déprotège les amino-acides, puis, cyclise les 3 ponts disulfurés pour obtenir la microprotéine recherchée. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, le procédé ci-dessus décrit est caractérisé en ce que: - la résine oxyméthyl polystyrène réticulée est une résine de type "Boc-gly-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertio- butyloxycarbonyl, gly est un groupement glycine et CM désigne la résine oxyméthyl polystyrène réticulée, - l'agent de couplage est le BOP ou (benzotriazol-l-yloxy) tris(diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate, - la libération de la résine de la chaine peptidique ainsi que la déprotection des amino-acdies est effectuée au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température. Les microprotéines, objet de la présente invention présen- tent de très intéressantes propriétés pharmacologiques; on note en particulier une remarquable activité anti-élastase, tant contre l'élastase pancréatique bovine, que contre l'élas- tase leucocytaire humaine. L'activité anti-trypsine de ce produit a par contre disparu. Ces propriétés sont illustrées plus loin dans la partie expérimentale. Ces propriétés justifient l'utilisation des nouvelles microprotéines répondant à la formule (I) ci-dessus à titre de médicaments. La présente invention a ainsi également pour objet l'ap- plication à titre de médicaments des nouvelles microprotéines telles que définies par la formule générale (I) ci-dessus. Parmi les médicaments, objet de l'invention, on retient notamment les médicaments caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles microprotéines répondant à la formule générale (I) ci-dessus dans laquelle Y en position 5 représente un résidu d'isoleucine, X en position 4 et Z en position 7 ont la signification déjà indiquée. Parmi ces derniers on retient de préférence les médica- ments renfermant les microprotéines tellj que définies ci- dessus dans lesquelles Z en position 7 représente un résidu de norleucine, ainsi que dans lesquelles X en position 4 repré- sente un résidu de valine, d'alanine ou de norleucine. Parmi les médicaments préférés de l'invention, on retient tout particulièrement ceux constitués par des microprotéines dans lesquelles: - X en position 4 représente un résidu de valine, Y en posi- tion 5 représente un résidu d'isoleucine et Z en position 7 représente un résidu de norleucine, - X ee"osition 4 représente un résidu d'alanine, Y en posi- tion 5 représente un résidu d'isoleucine et Z en position 7 représente un résidu de méthionine, - X en position 4 représente un résidu de norleucine, Y en position 5 représente un résidu de serine et Z en position 7 représente un résidu de méthionine. Ces médicaments trouvent, par exemple, leur emploi en pneumologie dans le traitement de l'emphytème, des pneumonies, des bronchites, des troubles pulmonaires causés par le taba- gisme ou la pollution atmosphérique, en cardiologie dans le traitement de l'athérosclérose, en rhumatologie, dans le traitement des arthrites, ainsi que par exemple en dermatolo- gie dans le traitement du psoriasis, des brûlures, des bulo- ses, et dans le vieillissement de la peau, en gastroentérolo- gie, dans le traitement des pancréatites aigues et d'une manière générale dans le traitement de toutes les affections mettant en cause le disfonctionnement de l'élastase. La dose usuelle, variable selon le produit utilisé, le sujet traité et l'affection en cause peut être par exemple de 1 à 300 mg par jour par voie intraveineuse chez l'homme. L'invention a également pour objet les compositions phar- maceutiques qui renferment au moins un dérivé précité à titre de principe actif. A titre de principe actif, les microproteines répondant à la formule générale (I), peuvent être incorporées dans des compositions pharmaceutiques destinées à la voie digestive ou parentérale ou topique. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exem- ple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple, les comprimés simples ou drageifiés, les gélules, les capsules, les granulés, les suppositoires, les préparations injectables, les pommades, les aérosols; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les prin- cipes actifs peuvent être incorporés à des excipients habi- tuellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stearate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. Il va être donné maintenant à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE 1: Dérivé Val-4, Nle-7 STADE A: Assemblage de la chaîne peptidiaue On utilise la méthode de la synthèse en phase solide avec une résine de oxyméthyl polystyrène réticulée (ci-après CM- résine). On utilise une résine de type "Boc-Gly-CM-résine" dans laquelle Boc est un groupement tertiobutyloxycarbonyl, Gly représente un groupement glycine et CM-résine désigne la résine de oxyméthyl polystyrène réticulee. La résine renfermant 0,4 mmol Gly/g a été préparée par la méthode du sel de cesium selon la technique décrite par GISIN, BF (1973) Helv. Chim. Acta 56, 1476-1482. Les groupements protecteurs des acides aminés ont été les suivants: - pméthoxy benzyl pour la cysteine, - ester de cyclohexyl pour l'acide aspartique, - xanthyl pour l'asparagine et la glycine, - toryl pour l'arginine, - benzyl pour la serine, - o-chlorobenzyloxycarbonyl pour la lysine, - la méthionine n'est pas protégée. La réaction de couplage a été effectuée en utilisant le BOP (benzotriazoll-yloxy tris (diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate. Un cycle de couplage peut être résumé comme suit: Déprotection: 1 - Lavage avec de l'acide trifluoroacétiï-ue à 30 % dans le dichlorométhane, 1 minute. 2 - Déprotection avec de l'acide trifluoroacétique à 30 % dans le dichlorométhane, 30 minutes, 3 - Lavage avec de l'éthanedithiol à 3 % dans 1'isopropanol, une fois. 4 - Lavage au dichlorométhane, 2 fois. Coulaae: 1 - Addition de complexe Boc-acide aminé et de BOP. 2 - Addition de diisopropyléthylamine (4 équi.....) puis de soyant (dichlorométhane ou diméthylformamide) sous agita- tion. 3 - Après réaction négative à la ninhydrine lavage 2 fois au dichlorométhane. Pour l'acétylation la résine est traitée par le mélange (anhydride acétique/dichlorométhane (50/50 V/V) pendant 15 minutes. Comme la méthionine n'est pas protégée le dernier groupe- ment-Boc est éliminé par l'acide trifluoroacétique avant le traitement par l'acide fluorhydrique pour éviter une tert- butylation. Au départ de 3 g de résine "Boc-Gly-CM-résine" on a ainsi obtenu en opérant manuellement 9,5 g de complexe chaîne pepti- dique protégée, résine que l'on utilise directement au stade suivant. STADE B: Libération du complexe chaine Deptidiaue protégée- résine On fait réagir 3 g de complexe chaîne peptidique protegée- résine pendant 60 minutes avec 30 ml d'acide fluorhydrique à O'C en présence d'anisole (3 ml) et diméthylsulfide (1 ml). La résine est lavée à l'éther; le peptide brut est extrait par une solution aqueuse d'acide acétique à 20 %. Après lyophili- sation, on obtient 1,1 g de produit brut (non cyclisé) que l'on utilise directement au stade suivant: STADE C: Cvclisation et purification On dissout 400 mg du peptide brut obtenu ci-dessus, dans 350 ml d'eau, agite vigoureusement, ajoute de la diisopropyl éthylamine jusqu'à obtention de pH 8 (une goutte de mélange est recueillie toutes les heures et ajoutée à une goutte d'une solution contenant de l'acide dithiobis (2nitrobenzoique) dans un tampon molaire de K2HPO4 (pH 8) pour suivre la réac- tion d'oxidation). Pendant toute la réaction on maintient le pH à 8 par addition de diisopropyléthylamine. Après 50 heures, on constate l'absence de coloration jaune dans le test & l'acide dithiobis (2-nitrobenzoique). Le produit obtenu est purifié par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur colonne Whatman M20 OD3 et élué par une solution CH3CN/H20 renfermant 0,1 % d'acide trifluoro- acétique. On lyophilise la fraction obtenue et recueille finalement 40 mg de produit attendu. La composition en aminoacides figure dans le tableau I ci- après: EXEMPLES 2 à 7: En opérant de la même manière qu'à l'exemple 1 mais avec d'autres aminoacides, on a préparé 6 autres dérivés qui figurent dans le tableau I ci-après. Les compositions en amino acides sont également indiquées dans le tableau I. TABLEAU I I PRODUITS DES EXEMPLES I 1 1 2 1 3 i 4 1 5 1 6 I 7 1 I[Val4, l[Nle7]1[Ala4, I[Ala4]1[Phe4, i[Nle4, l[Nle4, t I Nle7] I | Nle7] E I Nle7] t Nle7] I SerS, I 1 1 1 1 1 1 I Nle7 I Asp 2,9 1 3 1 3,1 1 3,3 1 2,4 1 2,81 3 Glu 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I Ser I 1 1 0,9 1 1 0,9 1,1 1 i 1,8 | Gly I 5,4(6)15,7(6)1 6,4(6)j 6,6 1 5, 2(6)1 4,7 1 4,25 1 1 Arg I 1,1 1 2,1 1,2 1 1,2 1 1 1,3 1,17 1 Ala 1 1 1 2 1 2 1 I 1 1 Pro I 2,25 1 2,1 2,75 1 2,6 2,1 2,2 2,1 I Val 1,7 1,4 1,46 1 1,6 1,3 1,1 1 I Met 0 0 0 0,8 0 0 0 Ile 1,63 I 1,2 1,3 1 2 2 1 2,1 Leu 2 I 2 1 2 2,1 2 2 2,1 Phe I 1 I 1,3 I 1,3 1,6 1 2,3 1 1,5 1,6 Lys I 1 I 1 1 1 1 1 1, I 0,94 1 I I t I,, I EXEMPLE 8: On a préparé un soluté injectable répondant à la formula- tion suivante: - Produit de l'exemple 1 - 1 mg - excipient aqueux stérile 2 ml EXEMPLE 9: On a préparé des comprimés répondant à la formule suivante: - Produi4 de l'exemple 1 2 mg - excipient q.s.p. un comprimé terminé à 150 mg (composition de l'excipient: lactose, amidon, talc, stearate de magnésium). EXEMPLE 10: On a préparé une pommade répondant à la formule suivante: - Produit de l'exemple 1 10 mg - excipient q.s.p. 100 mg ETUDE DE L'ACTIVITE ANTI-ELASTASE L'activité anti-élastase a été déterminée par dosage spectrophotomatique vis à vis de l'élastase bovine et vi à vis de l'élastase leucocytaire humaine (par une technique analogue à celle décrite par Delmar et Tolia Biochem. 19, 468, 1980). I Produits I Elastase I Elastase leucocytaire humaine exemples I 1 5 x 10-6M I 2 x 10'9M I 3 6 x 10-7M 9 x 10-8M 4 2,5 x 10-8M 6 x 10-8M 2 x 10-7M 6 3 x 10-6M 2 x 10-7M 7 8 x 10-7M REVENDICATIONS 1) Nouvelles micro-protéines renfermant 28 amino-acides répon- dant à la formule générale (I): G C P-X-X-L-Z R C K Q D S D C L A G C V C G P N G F C G l l 4 5 7 10 15 20 25 dans laquelle: - X en position 4 représente un résidu de valine, de leucine, d'isoleucine, de norleucine, d'alanine, de cyclohexylalanine, d'o-méthylthéonine, de phénylglycine ou d'acide alpha-amino butyrique, d'Arginine, - Y en position 5 représente un résidu d'isoleucine ou de serine, - Z en position 7 représente un résidu de méthionine ou de norleucine, étant entendu que Z représente un résidu de nor- leucine lorsque X représente un résidu d'Arginine. 2) Microprotéines selon la revendication 1, caractérisées en ce que, Y en position 5 représente un résidu d'isoleucine, X en position 4 et Z en position 7 ont la signification déjà indiquée. 3) Microprotéines selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que Z en position 7 représente un résidu de norleucine. 4) Microprotéines selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3, caractérisées en ce que X en position 4 représente un résidu de valine, d'alanine ou de norleucine. 5) Microprotéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que X en position 4 représente un résidu de valine, Y en position 5 représente un résidu d'isoleucine et Z en position 7 représente un résidu de norleucine. 6) Microprotéines selon la revendication 1, caractérisée en ce que X en position 4 représente un résidu d'alanine, Y en position.5représente un résidu d'isoleucine et Z en position 7 représente un résidu de méthionine. 7) Microprotéines selon la revendication A caractérisee en ce que X en position 4 représente un résidu de norleucine, Y en position 5 représente un résidu de sérine et Z en position 7 représente un résidu de méthionine. 8) Procédé de préparation des nouvelles microprotéines telles que définies à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse en phase solide en introduisant séquen- tiellement sur une résine oxyméthyl polystyrène réticulée les amino-acides dûment protégés en utilisant un agent de coupla- ge, libère de la résine la chaîne peptidique ainsi formée et déprotèe les amino-acides, puis, cyclise les 3 ponts disul- furés pour obtenir la microprotéine recherchée. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que: - la résine oxyméthyl polystyrène réticulée est une résine de type "Boc-gly-CM" dans laquelle Boc est un groupement tertio- butyloxycarbonyl, gly est un groupement glycine et CM désigne la résine oxyméthyl polystyrène réticulée, - l'agent de couplage est le BOP ou (benzotriazol-l-yloxy) tris(diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate, - la libération de la résine de la chaine peptidique ainsi que la déprotection des amino-acdies est effectuée au moyen de l'acide fluorhydrique en opérant à basse température. ) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitues par les nouvelles microprotéines telles que définies par la for- mule générale (I) de la revendication 1. 11) Médicaments, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les nouvelles microprotéines telles que définies à l'une quelconque des revendications 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. 12) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment a titre de principe actif, l'un au moins des médi- caments tels que définis à l'une quelconque des revendications 10 ou 11.