Brevet FR2639959A1 — publié le 19900608

Bactéries recombinantes toxiques vis-à-vis des larves de Diptères et leur utilisation pour l'élaboration de compositions larvicides. L'invention concerne des bactéries recombinantes toxiques vis-à-vis des larves de Diptères et leur utilisation pour l'élaboration de compositions larvicides. On sait que les Diptères sont cause de nuisance et/ou transmettent des maladies. Ainsi par exemple r chez les Moustiques, qui pour la plupart appartiennent à 3 genres, à savoir Aedes, Culex, AnoPhelesw Aedes aeavnti est responsable de la fièvre jaune, certaines espèces de Culex transmettent des arbovirus, des filiaires et Anophèles sambiae transmet notamment le paludisme. Des activités larvicides vis-à-vis des Diptères ayant été mises en évidence chez certaines bactéries, ces dernières ont été utilisées pour l'élaboration de compositions larvicides. Il s'agit en particulier de bactéries du genre Bacillus thurinaiensis ou Bacillus sphaericus. En particulier on sait que Bacillus thurinaiensis israelensis (Bti) possède une activité toxique sur les larves de Moustiques appartenant à plusieurs genres, à savoir sur les larves de Culicinae (notamment les larves Aedes et Culex) et sur les larves d'AnoDhelinae (AnoDheles). L'activité de Bti est d'ailleurs apparemment plus marquée à l'égard des larves Aedes et Culex. De plus, on a mis en évidence l'activité de Bti sur des larves de Simulies.Des caractéristiques analogues aux précédentes r sur le plan de l'activité toxique et de la spécificité ont été mises en évidence chez une souche B.thurinviensis morrisoni. L'activité de B.thurinaiensis et en particulier de Bti sur des larves de Moustiques résulte de la production, au cours de la sporulation, d'un cristal protéique dont l'activité entomopathogène se manifeste au niveau des cellules du tube digestif des larves ingérant ce cristal. Le cristal protéique toxique de Bti est composé de plusieurs protéines, toxines ou protoxines, notamment les protéines de 28, 68, 125 et 135 kDalton (kDa) solubilisées et activées dans le tube digestif des larves par action conjuguée d'un pH alcalin et des protéases intestinales. Les formulations de Bti actuellement utilisées (notamment dans la lutte contre l'onchocercose) sont constituées des bactéries sporulées et de cristaux. De nouvelles formulations ont été développées à partir d'une souche asporogène productrice de cristaux. Cependant, l'efficacité de ces formulations s'avère insuffisante, notamment à cause d'une faiblesse de la rémanence de l'activité larvicide. On constate en effet que la persistance de l'activité de Bti est réduite et que son activité en eaux chargées en composés organiques est limitée. Par ailleurs, on connaît la propriété des bactéries de l'espèce Bacillus sPhaericus d'avoir une activité entomopathogène sur des larves de Moustiques. Comme chez Bti cette activité est due à une ou plusieurs protéines ou toxines synthétisées au cours de la sporulation et le plus souvent assemblées en cristaux. L'activité de B.sPhaericus vis-à-vis des larves de Moustiques varie également en fonction des genres de Moustiques concernés, à l'intérieur de cette famille. A la différence de Bti, la plupart des souches de B.sPhaericus sont inactives sur les larves Aedes et très actives sur les larves de Culex, d'AnoDhèles et de Mansonia On a toutefois constaté que l'action de B.sphaericus sur les larves de Moustiques est plus lente que celle attribuée à Bti vis-à-vis des mêmes insectes. On a également noté chez B.SPhaericus une perte d'activité des spores après exposition aux rayons solaires. De plus, B.sPhaericus présente plusieurs contraintes gênant son utilisation dans des compositions larvicides Cette bactérie ne se développe par exemple pas sur des milieux dont la source de carbone est constituée par des sucres, ce qui limite l'emploi de milieux peu onéreux pour la préparation de compositions larvicides. Les nombreuses limitations dont celles mentionnées plus haut, constatées chez des bactéries présentant une certaine activité larvicide vis-à-vis des larves de Diptères notamment de la famille des Moustiques ou des Simulies constituent un inconvénient pour l'extension de leur emploi. Les inventeurs ont recherché de nouveaux- moyens pour disposer de compositions larvicides améliorées ayant un rapport coût/efficacité plus performant. En mettant en oeuvre les techniques du génie génétique, des bactéries recombinantes possédant des propriétés larvicides de grand intérêt ont été élaborées. L'invention a donc pour but de fournir des bactéries recombinantes telles qu'obtenues par modification de bactéries sauvage s appartenant à la famille des Bacillacées, différentes de B sPhaericus, présentant une activité toxique vis-à-vis des larves de Diptères, notamment de la famille des Moustiques ou des Simulies. Des bactéries sauvages répondant aux critères ci-dessus (encore désignées par "bactéries hôte") sont soit des bactéries sporulantes, à tout le moins capables d'effectuer les premiers stades de la sporulation comme il sera défini plus loin, soit des bactéries en phase végétative de croissance, capables dans certaines conditions définies plus loin,-de se comporter sur le plan de la toxicité recherchée, comme des bactéries sporulantes. Par bactérie écologiquement acceptable on entend une bactérie qui ne produit pas d'effet polluant ou toxique au niveau de l'environnement dans lequel elle est administrée à l'exception de l'effet larvicide recherché dont question ci-dessus. L'invention vise également à fournir des vecteur recombinants contenant une séquence d'ADN étrangère au génome de la bactérie sauvage ci-dessus et capable de produire une protéine ou une partie active de protéine produisant ou induisant l'activité toxique définie ci-dessus ou encore participant à cette toxicité lorsqu'elle est en synergie avec une protéine ou une partie de protéine toxique ou potentiellement toxique. De tels vecteurs recombinants sont capables d'être introduits et exprimés dans une bactérie sauvage répondant aux critères précédents. L'invention vise aussi à fournir des compositions larvicides destinées à la lutte contre les larves de Diptères, en particulier contre les larves de Moustiques et les larves de Simulies. Les bactéries selon l'invention sont des bactéries recombinantes, telles qu'obtenues par modification génétique d'une souche de bactérie sauvage appartenant à la famille des Bacillacées et sont dotées d'une activité larvicide vis-à-vis des larves de Diptères, notamment vis-à-vis des larves de la famille des Moustiques et des Simulies. Ces bactéries recombinantes sont caractérisées en ce que - elles sont différentes de B.sphaericus, - elles comprennent, éventuellement sous le contrôle d'un promoteur exogène, une séquence d'ADN étrangère au génome de la bactérie sauvage, codant pour au moins la partie active d'au moins une protéine telle que produite par B.sPhaericus, ayant une activité toxique vis-à-vis des larves de Diptères ou capable d'induire cette activité, - elles sont capables d'exprimer à la fois la séquence d'ADN étrangère ci-dessus et le ou les gènes propres à la bactérie sauvage responsable(s) de son activité larvicide vis-à-vis des larves de Diptères, soit pendant le processus de sporulation de la bactérie recombinante formée, soit au cours de la phase végétative de croissance de cette bactérie recombinante, lorsque les gènes propres à la bactérie sauvage et la séquence d'ADN étrangère sont placés sous le contrôle de promoteurs fonctionnels en phase végétative chez la bactérie hôte, de manière à pbtenir une expression de la toxicité, comparable à celle constatée lors du déroulement de la sporulation. Pour des commodités de langage, on remplacera parfois dans la suite la caractéristique définie par "ayant une activité toxique vis-à-vis des larves de Diptères ou capable d'induire cette activité ou d'y participer en combinaison avec une autre protéine" par l'expression "impliquée dans l'activité larvicide vis-à-vis des Diptères. D'une manière avantageuse, les bactéries recombinantes selon l'invention s'avèrent capables de synthétiser dans un même organisme, les toxines propres à la bactérie sauvage et les produits résultant de l'expression de la séquence d'ADN étrangère. Les bactéries recombinantes de l'invention sont en particulier capables d'exprimer simultanément, l'activité larvicide de la bactérie sauvage ci-dessus et celle du produit d'expression de la séquence d'ADN étrangère incorporée à cette bactérie sauvage, ce qui leur confère une activité toxique accrue. De façon préférée le produit d'expression de la séquence d'ADN étrangère comprend une ou plusieurs protéines ou parties actives de protéines, produisant ou induisant l'activité larvicide spécifique recherchée, ou participant en combinaison avec une protéine ou partie de protéine à ladite activité larvicide. Ce produit est de préférence sous forme d'inclusions cristallines apparaissant soit lors de la sporulation de la bactérie recombinante, soit pendant la phase végétative lorsque les conditions déterminées ci-dessus, pour réaliser l'expression desdites inclusions cristallines sont présentes. Ces protéines ou polypeptides toxiques peuvent être localisés dans des cristaux distincts selon qu'ils résultent de l'expression des gènes de la bactérie hôte ou de l'expression de la séquence d'ADN étrangère. Ces cristaux peuvent aussi être assemblés dans une même entité pour former une nouvelle masse cristalline. Avantageusement, une bactérie recombinante de l'invention permet la synthèse de combinaisons spécifiques des différentes protéines et toxines recherchées. Selon le spectre d'action recherché, on peut en effet limiter l'expression des gènes de la bactérie sauvage notamment ceux qui codent pour les protéines toxiques ci-dessus, à certaines toxines spécifiques. Comme indiqué ci-dessus dans un mode de réalisation préféré de l'invention, une bactérie recombinante de l'invention conserve sa capacité de réaliser le processus de sporulation, à tout le moins la capacité de réaliser les phases de la sporulation nécessaires pour produire des cristaux contenant les toxines de la bactérie hôte et des cristaux contenant les protéines résultant de l'expression de la séquence d'ADN étrangère, lorsque les conditions extérieures naturelles de cette production sont réunies. Dans un mode de réalisation de l'invention faisant intervenir une bactérie sporulante, il est particulièrement avantageux que la bactérie recombinante soit apte à réaliser la sporulation au moins jusqu'au déroulement du stade 2. Dans la suite expression "sporulation" devra être entendue dans ce sens, et ne sera donc pas limitée à la réalisation de la totalité des stades du processus de sporulation c'est-à-dire à l'obtention de spores. La séquence d'ADN intégrée à la bactérie sauvage code pour au moins la partie active d'une ou plusieurs protéines présentant une activité toxique larvicide ou participant à une activité larvicide telle que l'activité larvicide liée directement ou indirectement à la protéine P43 de B.sPhaericus. Cette séquence d'ADN peut également coder pour au moins la partie active d'une protéine telle que la protéine P56 de B. sDhaericus dès lors que la protéine ou partie de protéine codée est impliquée dans l'activité recherchée. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux la séquence d'ADN intégrée à la bactérie hôte code pour au moins la. partie active de protéines telles que les P43 et P56 de B.sphaericus ensemble. Les gènes codant pour chacune de ces protéines P43 et P56 dont les poids moléculaires apparents en électrophorèse sur gel de polyacrylamide sont de 43 kDa et 56 kDa, ont été séquencés et décrits par BAUMANN et al (1). Une séquence d'ADN étrangère adaptée à la réalisation de l'invention est la séquence d'ADN codant pour au moins la partie active de la protéine P43 définie ci-dessus. Une autre séquence d'ADN code pour la protéine P56. Une autre séquence préférée code pour ces deux protéines de B.sPhaericus ensemble, dès lors que dans chaque cas on obtient l'activité larvicide recherchée.L'invention vise aussi une séquence qui conserve avec une des séquences ci-dessus, caractéristiques de B.shaericus, une homologie suffisante pour que la protéine ou la partie active de protéine codée par cette séquence d'ADN étrangère soit capable de présenter une activité toxique du meme ordre qualitatif et quantitatif, ou d'induire ou de participer à la production d'une toxicité du même ordre vis-à-vis des larves de Diptères notamment de larves de la famille des Simulies ou des Moustiques et de préférence vis-à-vis des larves du genre Aedes, Anophèles et Culex. On peut par exemple utiliser, dans un mode particulier de réalisation de l'invention, une protéine dérivée de la P43 à savoir la protéine P38 (ayant un poids moléculaire d'environ 38-40 kDa) forme activée de P43 en présence des protéases intestinales de Moustique. De façon avantageuse, pour permettre l'expression dans la bactérie recombinante des protéines, parties de ces protéines, ou des polypeptides, impliqués dans l'activité larvicide recherchée, la séquence d'ADN étrangère est incorporée sous le contrôle d'un promoteur spécifique. Différents types de promoteurs peuvent être mis en oeuvre parmi lesquels des promoteurs forts et avantageusement des promoteurs forts soumis à régulation. A titre d'exemple, on mentionne le promoteur spac tel que décrit dans (2) ou le promoteur du gène sacB de B. subtilis, tel que décrit dans (3). Ces promoteurs sont particulièrement adaptés lorsque l'on veut obtenir l'activité larvicide ci-dessus en phase végétative de croissance de la bactérie. Dans ce cas, des promoteurs doivent également être- placés en amont des gènes propres à la bactérie hôte afin d'obtenir prématurément leur expression. Concernant les gènes propres à la bactérie hôte, une étape préalable de clonage peut être réalisée pour les placer sous le contrôle du promoteur végétatif. Ainsi dans ce cas, l'expression des gènes propres à la bactérie hôte et de la séquence d'ADN étrangère codant pour au moins une partie de protéine impliquée dans l'activité larvicide, est réalisée sous le contrôle d'un promoteur végétatif capable d'induire la production des protéines à activité recherchée, pour obtenir un niveau de toxicité comparable à celui obtenu en phase de sporulation. D'autres promoteurs intéressants pour con trôler l'expression de la séquence d'ADN étrangère, lorsque la bactérie hôte est une bactérie sporulante, sont les -promoteurs dits de sporulation qui fonctionnent avec une ARN polymérase spécifique de sporulation. Un promoteur de sporulation peut être issu du génome de B.sPhaericus ou peut être constitué par tout promoteur exogène compatible avec l'expression du fragment d'ADN de B.sPhaericus ci-dessus, dans la bactérie sauvage. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la bactérie sauvage de départ ultérieurement modifiée par la séquence d'ADN étrangère ci-dessus définie, est une bactérie de la souche B.thurinaiensis (Bt). De façon particulièrement préférée, la bactérie sauvage appartient à la variété Bti ou à la variété B.thurinaiensis morrisoni, telle que la souche PG14 isolée par PADUA et a (4). LXinvention vise également un vecteur recombinant d'expression et de clonage contenant ladite séquence d'ADN étrangère. Ce vecteur est caractérisé par les propriétés suivantes - il contient un promoteur éventuellement exogène, permettant l'expression de la séquence d'ADN ci-dessus définie dans une bactérie hôte choisie parmi les Bacillacées différentes de B.sPhaericus, - il est compatible avec la production d'au moins la partie active d'au moins une protéine ayant l'activité larvicide propre à la bactérie hôte et l'activité larvicide obtenue par expression de la séquence d'ADN étrangère. Des vecteurs particulièrement avantageux pour réaliser l'invention sont des vecteurs bifonctionnels, capables de se répliquer dans plusieurs types de microorganismes, par exemple E. coli, B. subtilis et des bactéries recombinantes selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux, le vecteur recombinant contient la séquence d'ADN codant pour au moins la partie .active des protéines P43 et/ou P56 de B.sphaericus et est compatible avec leur expression dans Bt de préférence dans Bti en conjuguaison avec l'expression des gènes de toxicité propres à Bt. Lorsque la bactérie hôte est sporulanté, plusieurs types de vecteurs peuvent être mis en oeuvre pour l'obtention du vecteur recombinant ci-dessus, dès lors qu'ils n'inhibent pas la sporulation de la bactérie recombinante. On peut par exemple avoir recours à des vecteurs plasmidiques ne provoquant pas l'inhibition de la sporulation des bactéries et par conséquent n'entrainant pas de limitation dans l'expression des toxines de la bactérie modifiée. Lorsque l'expression de la toxicité a lieu dans une bactérie en phase végétative de croissance, le vecteur portant la séquence d'ADN étrangère est pourvu d'un promoteur végétatif fort du type de ceux décrits plus haut. Un même promoteur peut être dans ce cas, placé en amont des gènes de toxicité de la bactérie hôte. Pour réaliser les vecteurs recombinants selon l'invention, l'homme de l'art peut aisément tirer profit de l'enseignement des articles de SULLIVAN et al (5) et de MITEVA et al (6) dont le contenu fait partie de la présente description. De façon générale, l'insertion de la séquence d'ADN étrangère dans le vecteur est réalisée en un site tel que les propriétés de réplication du vecteur ne sont pas altérées. Un tel vecteur plasmidique qui après modification par la séquence d'ADN étrangère, est adapté à l'insertion dans une bactérie hote sporulante est le plasmide réplicable pBU4, obtenu par fusion des vecteurs pUCI9 et pBC16.1. Ces deux vecteurs ont été décrits dans (7) et (8). L'invention concerne donc en particulier'des vecteurs recombinants résultant de l'incorporation au vecteur pBU4, de la séquence d'ADN étrangère. Elle vise de façon particulièrement avantageuse les plasmides recombinants pGSP10 et pGSP11. Ces deux vecteurs décrits aux figures 1 et 2, formés à partir de pBU4 contiennent la séquence d'ADN de B.sDhaericus comprenant les séquences codant pour les protéines P43 et P56. Ce fragment d'ADN intéressant dans le cadre de l'invention est encore caractérisé par les sites de restriction suivants Hind III, Bgl II, Sph I, EcoR I, EcoR V, Sca I, EcoR V, Sca I, Hind III. Il est situé sur un fragment d'ADN Hind III de 3,6 kb. Pour réaliser les plasmides recombinants pGSPIO et pGSP11, la séquence d'ADN ci-dessus de B.sDhaericus est clonée au site Hind III du site de clonage multiple (polylinker) du vecteur pBU4. Les deux plasmides pGSP10 et pGSP11 diffèrent l'un de l'autre par l'orientation de la séquence d'ADN de B.sPhaericus vis-à-vis du promoteur du gène lacZ (placZ). Un autre vecteur adapté à la réalisation du vecteur recombinant ci-dessus est le vecteur pBU5 construit à partir des mêmes plasmides pUC19 et pBC16.1 et dans lequel l'orientation de pBC16.1 a été inversée par rapport à l'orientation de ce plasmide dans pBU4. Le plasmide pBU4 transformé comme indiqué cidessus n'inhibe pas la sporulation des bactéries transformées. Il a en outre la propriété d'être bifonctionnel, ce qui lui confère la capacité de se répliquer chez plusieurs types de micro-organismes, par exemple E.coli ou B.subtilis ou des bactéries de la famille des Bacillacées. En conséquence, on peut réaliser le clonage de l'ADN codant pour les protéines ou parties actives de protéines à activité larvicide décrite ci-dessus dans E.coli. Le clone ainsi produit permet de purifier aisément le vecteur recombinant formé entre pBU4 et la séquence d'ADN étrangère. Ce vecteur recombinant peut ensuite etre introduit dans Bti pour obtenir la bactérie recombinante finale. D'autres vecteurs recombinants peuvent être envisagés pour préparer les bactéries Bti recombinantes. A titre d'exemple, on cite les vecteurs pMK3 obtenus par fusion entre les plasmides pUC9 et pUB110 ainsi que pMK4 obtenu par fusion des plasmides pUC9 et pC194. Ces deux plasmides pMK3 et pMK4 ont été décrits par Sullivan et al. dans (5). Les bactéries recombinantes formées à partir d'une bactérie sauvage Bti transformée par les plasmides pGSP10 et pGSP11 entrent également dans le cadre de 1 'invention. Des clones particulièrement avantageux sont les clones 4Q2-72/pGSP10 et 4Q2-72ipGSP11 qui expriment à la fois les toxines propres à Bti et les toxines propres à B sPhaericus. Ces clones résultent de la transformation d'une souche "cristal+' de Bti (souche 4Q2-72) par les plasmides recombinants précédemment décrits. L'introduction de la séquence d'ADN étrangère dans la bactérie sauvage peut être réalisée selon les techniques classiques par exemple par transformation, conjugaison, électroporation suivant les techniques telles que celles décrites par LUCHANSRY et al (9) ou transduction. On peut à cet effet mettre en oeuvre les vecteurs recombinants précédemment définis. Ces vecteurs recombinants sont alors mis en contact avec des bactéries sauvages définies ci-dessus, dans des conditions permettant leur modification par le vecteur recombinant. Selon une variante de réalisation, ledit vecteur recombinant est utilisé pour transformer une bactérie du type E.coli ou B.subtilis. Cette étape permet le clonage et la production accrue dudit vecteur qui est ensuite inséré par transformation dans la bactérie sauvage sporulante. Les bactéries recombinantes obtenues sont sélectionnées- par tout moyen physique ou chimique approprié. Dans un mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus, les bactéries recombinantes résultent de la transformation de Bt, de préférence de Bti par la séquence d'ADN de B.sPhaericus précédemment décrite. La réalisation du procédé de transformation pourra notamment être contrôlée en détectant la production des cristaux à activité larvicide correspondant à ceux produits naturellement par chacune des bactéries d'origine impliquées dans l'obtention des bactéries recombinantes. L'introduction de la séquence d'ADN étrangère par conjugaison peut être effectuée en utilisant comme souche donneur une bactérie telle que B.subtilis ou E. coli suivant des techniques telles que celles décrites dans (10) ou (11). L'élaboration des bactéries recombinantes selon l'invention, a permis aux inventeurs de proposer de nouvelles compositions pour lutter contre les larves de Diptères, en particulier les larves de la famille des Moustiques. L'invention concerne donc une composition larvicide comprenant des bactéries recombinantes telles que définies ci-dessus, en quantité suffisante pour présenter une activité sur les larves de Diptères de la famille des Simulies ou des Moustiques, de préférence sur l'ensemble des larves du genre Aedes, Culex et AnoPhèles. Une telle composition larvicide peut être présentée sous diverses formes selon le lieu et le mode d'administration souhaités. Ainsi, les compositions larvicides pourront être élaborées sous forme de poudre, de suspension huileuse, ou de briquettes. De telles compositions seront avantageusement préparées à partir de bactéries recombinantes permettant une expression quantitative importante des différentes toxines actives sur les larves de Moustiques et/ou de Simulies. De façon avantageuse, une composition utilisable pour son activité larvicide vis-à-vis des larves de Diptères notamment de la famille des Moustiques et/ou de Simulies, comprend des bactéries B.thurinctiensis et en particulier Bti modifiées selon l'invention par une séquence d'ADN étrangère. Une composition larvicide particulièrement appropriée comprend des bactéries Bti modifiées par les séquences d'ADN de B.shaericus exprimant au moins la partie active d'au moins une protéine impliquée dans l'activité larvicide vis-à-vis des larves de Diptères notamment de la famille des Moustiques. D'autres caractéristiques et avantages de L'invention apparaissent dans les exemples qui suivent et dans les figures qui représentent - figure 1 : construction des plasmides pBU4 et pBU5, - figure 2 : représentation des cartes de restriction des plasmides pBU4, pGSP10 et pGSP11. Le fragment d'ADN Hind III contenant les gènes des protéines de 41, 9 et 51, 4 kDa de B. sPhaericus a été inséré dans pBU4 au site Hind III d'un site multiple de clonage (MCS) originaire du vecteur pUC. Tet et Amp indiquent les positions des marqueurs de résistance à la tétracycline et à l'ampicilline. Les noms des enzymes de restriction entre parenthèse correspondent aux sites de clonage utilisés pour construire pBU4 et ne sont plus utilisables. - figure 3 : carte de restriction des fragments d'ADN codant pour les protéines p43 et p56, - figure 4 : analyse des protéines des transformants de B. thurinqiensis exprimant les protéines du cristal de B. sPhaericus. Des extraits bactériens ont été déposés sur un gel de polyacrylamide 10 % contenant du'SDS et colorés avec du bleu de Coomassie. Lignes 1,2, 3 : la souche 4Q2-72 contenant pGSP11, pSGSP10 et pBU4 respectivement ; lignes 4, 5, 6 : la souche-4Q2-81 contenant pGSP11, pGSP10 et pBU4 respectivement ; ligne 7 : cristaux purifiés de Bti ; ligne 8 : cristaux purifiés de B. sPhaericus ; S : marqueurs. La taille des marqueurs est indiquée dans la marge de droite.Dans la marge de gauche, les petits chiffres indiquent la taille des protéines du cristal de Bti, les grand chiffres indiquent la taille des protéines des cristaux de B. sPhaericus. - figures 5 et 6 : immunodétection (WESTERN-BLOT) des protéines de transformants. Des échantillons ont été numérotés de la même façon que dans la figure 4. figure 5 : détection des protéines du cristal de B. sphaericus. figure 6 : détection des protéines de Bti. - figure 7 : observation au microscope électronique des souches Bti4Q2-81, a: 4Q2-81/pBU4, b et c : 4Q2-81/ pGSPl0 produisant les protéines du cristal de B. sPhaericus. - figure 8 : observation au microscope électronique de Bti4Q2-72, a: 4Q2-72/pBU4, b et c : 4Q2-72/pGSP10 produisant des grands (L) et petits (S) cristaux correspondant probablement aux protéines de Bti et aux protéines du cristal de B. sohaericus, respectivement. EXEMPLE 1 Transformation de B.thurinqiensis israelensis Par les ozènes des toxines de B.sphaericus. La transformation de B.thurinaiensis israelensis (Bti) par les gènes codant pour les toxines P43 (encore désignée par "protéine de 41,9 kDa" par référence à son poids moléculaire calculé à partir de la séquence d'acides aminés : 41,9 kDa) et la toxine P56 (poids moléculaire calculé : 51,4 kDa) a été réalisée conformément au protocole décrit dans un article de HEIERSON et al (2). Des aménagements au protocole de transformation décrit par HEIERSON et al ont cependant été réalisés afin de l'adapter à l'introduction des gènes codant pour les protéines P43 et P56 de B.shaericus dans B.thurinqiensis israelensis. Ces aménagements sont présentés dans le résumé des étapes du procédé adapté qui suit - on cultive sur un milieu tel que décrit par HEIERSON les bactéries Bti jusqu'à obtenir une densité optique de 1,5 (DO 1,5).On soumet-cette culture à une centrifugation pendant 10 mn à la température ambiante et avec une vitesse.de rotation de 3700 rpm ; puis on lave dans un tampon Tris 50mM à pH 7,5 (1/2V). Le produit est ensuite resuspendu dans un tampon Tris HCl pH 8,9, contenant 30% de saccharose de façon à obtenir une densité optique de 0,8 (DO 0,8). La suspension est ensuite répartie par 5ml dans des Erlenmeyer, et on agite doucement pendant 30mn (75 rpm) à 37'C. Les bactéries sont ensuite soumises à une centrifugation pendant îOmn à 3.700 rpm, puis resuspendues dans 0,5ml de milieu LBP. On ajoute ensuite sijg d'ADN dissous dans 100 l d'un milieu contenant du tampon TE et un milieu LBP (dans des proportions 1:1). On ajoute ensuite 1,5ml de polyéthylène glycol (PEG 40% dans un tampon Tris) puis on mélange doucement et on fait incuber pendant îOmn en agitant doucement (75 rpm) à 37 C. Une nouvelle centrifugation pendant 10mn à 3700 rpm et à température ambiante est effectuée, puis les cellules sont resuspendues dans 5 ml de milieu Luria. Après une nouvelle incubation pendant 1 h.30 à 37-C. sous agitation douce (75 rpm), les cellules sont étalées (0,5 ml) sur-boite Luria contenant 2,5 d'agar, 2,5% de gélatine et un antibiotique pour sélectionner les bactéries effectivement transformées avec le plasmide recombinant portant les gènes de B. sphaericus ; on utilise un antibiotique, tel que la tétracycline (3Og/ml) ou le chloramphénicol (5pg/ml) ou la Kanamycine (25 Ug/ml) selon le plasmide vecteur utilisé. Pour plus de détails concernant le principe de cette transformation on pourra aisément se reporter à l'article de HEIERSON précité dont le contenu est incorporé à la présente descriptïon. Le protocole de transformation précédemment décrit a été mis en oeuvre pour transformer deux souches de Bti, les souches 4Q2-81 et 4Q2-72 qui sont respectivement une souche "cristal -" et une souche "cristal +". Une souche "cristal +" est capable de produire des cristaux contenant les toxines de Bti, contrairement à une souche "cristal La souche 4Q2-81 est dérivée de la souche n 4Q2 (Bacillus Genetic stock Center the Ohio State University Columbus) ne possédant pas de plasmide (désigné encore par "plasmide -") ne synthétisant pas de cristaux et non toxique pour les larves de moustiques. La souche 4Q2-72 est dérivée de la même souche 4Q2 : elle est capable de produire des cristaux, elle possède un plasmide de 72 MDa portant l'ensemble des gènes des protéines du cristal de Bti, elle est dépouvue des petits plasmides présents à l'origine dans la souche 4Q2. Pour transformer ces deux souches on a utilisé les plasmides pGSP10 et pGSP11 contenant les gènes de toxines de B.sPhaericus reclonés dans le vecteur pBU4. Le vecteur pBU4 représenté sur la figure 1 a été obtenu par fusion des vecteurs pUCî9 et pBC16.1. Ce plasmide pBU4 a été réalisé après les étapes suivantes - hydrolyse du plasmide pUC79 au moyen de l'enzyme Eco 0109 puis réparation du site par le fragment de Klenow, - hydrolyse du plasmide pBC16.1 par l'enzyme Eco RI, puis réparation du site par le fragment de Klenow. Les deux plasmides ont ensuite été ligaturés pour former le plasmide pBU4 ou le plasmide pBU5. La séquence d'ADN de B.shaericus (présentée à la figure 3) a été clonée au site Hind III du site multiple de clonage (polylinker) du vecteur construit. Deux plasmides ont été préparés suivant le sens d'insertion de la séquence d'ADN de B.sphaericus dans pBU4 pGSP10 résulte d'une construction dans laquelle les gènes de B. sDhaericus sont transcrits dans le sens du promoteur lacZ (placZ) et le plasmide pGSP11 résulte d'une construction inversée par rapport au promoteur lacZ. Les plasmides pGSP10 et pGSP11 ont été isolés à partir de clones E. coli. Les plasmides ont ensuite été introduits dans Bti4Q2-81 et Bti4Q2-72-par transformation. Les plasmides recombinants étaient stables dans les deux cas. Les clones recombinants ont été analysés par la méthode d'immunodétection désignée par WESTERN BLOT pour caractériser les extraits protéiques produits. Les transformants 4Q2-81 (pGSP10) et 4Q2-81 (pGSPîl) ont synthétisé à la fois les protéines de 41, 9 kDa et de 51,4 kDa en quantité suffisamment importante pour que la détection de ces proteines soit faite par analyse d'extraits bactériens par électrophorese sur gel de polyacrylamide SDS et coloration au bleu de Coomassie (voir figure 4, lignes 4 et 5). De même, les clones recombinants formés à partir de la souche Bti4Q2-72, synthétisent les protéines de B. sphaericus en plus de leurs propres toxines (figure 4, lignes 1 et 2). Comme le montre la figure 4, l'expression de protéines a été plus importante dans les transformants contenant le plasmide pGSP1Or dans lequel la transcription des gènes de B. sPhaericus est effectuée dans la même direction que la direction de transcription du promoteur lacZ du vecteur. Cette constatation a été essentiellement vérifiée pour le polypeptide de 51,9 kDa. Dans tous les transformants, ce polypeptide apparaissait en quantité moindre par rapport au polypeptide de 41,9 kDa. La présence des protéines du cristal de B.sPhaericus dans les transformants Bti a été confirmée par immunodétection en utilisant un antisérum dirigé contre un extrait alcalin de spores de B.sphaericus (voir figure 5). Des protéines de haut poids moléculaire ont aussi été détectées en plus des protéines de 41,9 et 51,4 kDa . Elles peuvent représenter des polymeres non dissociés composés des protéines du cristal de B. sPhaericus. On a noté que la présence de la protéine de 51,4 kDa est requise pour induire la toxicite de la protéine de 41,9 kDa, lorsque leurs gènes respectifs sont exprimés dans E.coli. Ces résultats suggèrent que la protéine de 51,4 kDa de B sphaericus pourrait posséder une activité protéolytique capable d'activer la protéine de 41,9 kDa lorsque ces deux protéines sont exprimées dans E. coli. Parallèlement, la présence des protéines du cristal de Bti dans les transformants 4Q2-72 a été contrôlée par immunodétection avec une antisérum dirigé contre les cristaux purifiés de Bti (voir figure 6, lignes 1, 2, 3). Aucune protéine du cristal n'a été détectée dans les transformants 4Q2-81 (voir figure 6, lignes 4, 5, 6), cette souche étant "cristal-". Des réactions croisées faibles ont été observées entre les souches 4Q2-81 (pBU4) et 4Q2-81 (pGSpîO). Cependant, leur absence dans la souche 4Q2-81 (pGSP11) a suggéré que ces réactions ne sont pas spécifiques. De plus, des expériences d'hybridation réalisées entre l'ADN total de'la souche 4Q2-81 et le gène de la protéine de 125 kDa isolée de la souche 4Q2-72, et utilisée en tant que sonde, ont indiqué que cette souche de Bti ne contient pas les gènes correspondant aux protéines de 125 et de 135 kDa. Bti transformé avec les gènes de protéines du cristal de ss. sPhaericus présente des structures cristallines. Des observations au microscope électronique des transformants 4Q2-81 (pGSP10) ont montré que ce clone produit des inclusions ayant une configuration cris-talline régulière (figure 7). Dans le transformant 4Q2-72 (pGSPIO), des inclusions similaires ont été détectées en plus des cristaux irréguliers typiques de Bti (voir figure 8). Il est possible que les transformants 4Q2-72 (pGSP10), qui contiennent de larges inclusions du cristal de Bti contiennent également des protéines du cristal de B. sphaericus. Dans tous les cas, ces inclusions ont été localisées en dehors de l'exosporium, tel que habituellement dans les cristaux de Bti alors que les inclusions de B.sPhaericus sont localisées entre deux membranes de l'exosporium. Toutefois, on peut valablement penser que ces structures doivent être attribuées aux protéines de B. sPhaericus qui sont produites en une grande quantité dans les souches transformé-es. Exemple 2 : Activité biologique de souche transformées L'activité biologique des transformants a été déterminée sur trois espèces de Moustiques, Aedes segypti, Anophele stephensi et Culex pipiens. Les résultats du tableau I montrent que les transformants 4Q2-81 (pGSP10) et 4Q2-81 (pGSP11) qui expriment uniquement les protéines de B. snhaericus, étaient comme B. sPhaericus sauvage, les plus fortement actifs vis-à-vis de Culex pipiens et Anophèles stePhensi. Une légère toxicité pour Aedes aeavPti a également été observée. Au contraire les transformants 4Q2-72 (pGSP10) et 4Q2-72 (pGSP11) qui produisaient des protéines du cristal à la fois de Bti et de B. sPhaericus étaient très actives contre les trois espèces de Moustiques. Ce résultat est en conformité avec la spécificité associée aux cristaux de Bti.De plus, les transformants exprimant les deux types de toxines étaient plus actifs que la souche réceptrice TABLEAU I Souches Aedes aegypll Anopheles stephensi Culex pipiens Dilution 24 H 48 H 72 H 24 H 48 H 72 H 24 H 48 H 72 H 1x10-2 0 0 0 5 20 20 NT NT NT 0.5x10-2 5 5 5 20 20 20 NT NT NT 4Q2-81 1x10-3 0 0 0 10 10 10 0 0 0 /pBU4 0.5x10-3 0 0 0 0 0 0 0 5 10 1x10-4 0 0 0 25 30 30 0 0 5 0.5x10-4 NT NT NT NT NT NT 0 5 5 1x10-5 NT NT NT NT NT NT 0 0 0 1x10-2 30 75 85 95 100 100 NT NT NT 0.5x10-2 50 90 90 100 100 100 NT NT NT 4Q2-81 1x10-3 35 85 85 90 100 100 100 100 100 pGSP10 0.5x10-3 25 60 60 85 100 100 100 100 100 1x10-4 30 35 35 80 100 100 100 100 100 0.5x10-4 NT NT NT NT NT NT 100 100 100 1x10-5 NT NT NT NT NT NT 85 95 95 1x10-2 25 65 80 100 100 100 NT NT NT 0.5x10-2 10 75 ' 85 90 100 100 NT NT NT 402-81 1x10-3 15 35 35 85 100 100 100 100 100 pGSP11 0.5x10-3 0 5 10 70 90 90 100 100 100 1x10-4 5 5 0 25 80 85 80 95 95 0.5x10-4 NT NT NT NT NT NT 85 90 90 1x10.5 NT NT NT NT NT NT 0 10 10 1x10-4 10 10 15 75 95 95 100 100 100 0.5x10-4 0 0 0 40 85 95 100 100 100 B.sphaericus 1x10-5 O 0 0 20 35 35 @ 90 90 100 0.5x10-5 0 0 0 25 50 50 45 85 95 0.5x10-5 15 85 95 15 20 20 0 5 5 402-72 fx10-6 0 0 0 5 5 10 5 10 10 0.5x10-6 0 0 0 10 10 10 5 5 10 1x10-7 0 0 0 5 10 15 0 5 5 O.5x10-5 100 100 100 35 55 60 100 100 100 4Q2-72 1x10-6. 10 25 25 0 0 0 25 50 55 pGSP10 0.5x10-6 0 5 10 15 25 25 0 5 20 1x10-7 O a o 15 15 20 o o 5 0.5x10-5 95 100 100 35 35 35 90 95 100 402-72 1x10-6 0 15 20 10 10 10 20 30 30 pGSP11 O.5x10-6 0 10 10 15 15 15 0 0 15 1x10-7 O 0 - 0 0 5 5 0 0 0 ACTIVITE BIOLOGIQUE DES TRANSFORMANTS BIBLIOGRAPHIE (1) BAUMANN et al, J. of Bacteriol., vol 170 2045-2050. 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Mar. 1987. p.1147-1152 R E V E N D I C A T I- O N S 1/ Bactérie recombinante ayant une activité larvicide vis-à-vis des larves de Diptères, notamment vis-à-vis des larves de la famille des Moustiques et des Simulies, telle qu'obtenue par modification génétique d'une bactérie sauvage appartenant à la famille des Bacillacées caractérisée en ce que - elle est différente de B.sPhaericus, - elle comprend, éventuellement sous le contrôle d'un promoteur exogène, une séquence d'ADN étrangère au génome de la bactérie sauvage, codant pour au moins la partie active d'une protéine toxique vis-à-vis des larves de Diptères, telle que produite par B.sDhaericus, - elles sont capables d'exprimer à la fois la séquence d'ADN étrangère ci-dessus et le ou les gènes propres à la bactérie sauvage responsable(s) de son activité larvicide vis-à-vis des larves de Diptères, soit pendant le processus de sporulation de la bactérie recombinante formée, soit au cours de la phase végétative de croissance de cette bactérie recombinante lorsque les gènes propres à la bactérie sauvage et la séquence d'ADN étrangère sont placés sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel en phase végétative chez la bactérie hôte, de manière à obtenir une expression de la toxicité, comparable à - celle constatée lors du déroulement de la sporulation. 2/ Bactérie recombinante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est sporulante. 3/ Bactérie recombinante selon la revendication 1, caractérisée en ce que le ou les gènes propres à la bactérie sauvage, responsable(s) de l'activité larvicide et la séquence d'ADN étrangère sont placés sous le contrôle d'un promoteur végétatif, permettant leur expression lors de la phase végétative de croissance. 4/ Bactérie selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la séquence d'ADN étrangère à son génome code pour au moins la partie active d'une protéine toxique telle que la protéine P43 produite par B sphaericus. 5/ Bactérie selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la séquence d'ADN étrangère à son génome code pour au moins la partie active d'une protéine toxique telle que la protéine P56 produite par B sphaericus. 6/ Bactérie selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la séquence d'ADN étrangère à son génome code pour au moins la partie active de protéines toxiques, telles que les protéines P43 e P56 prises ensembles, de B. sPhaericus 7/ Bactérie recombinante selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4, à 6, caractérisée en ce que la séquence d'ADN étrangère insérée dans la bactérie sauvage est placée sous le contrôle d'un promoteur fort, notamment un promoteur de sporulation issu de B.sDhaericus. 8/ Bactérie recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la bactérie sauvage est une bactérie B.thurinaiensis toxique de manière spécifique vis-à-vis des larves de Diptères de la famille des Moustiques ou des Simulies, en particulier du genre Culex, Aedes ou Anophèles. 9/ Bactérie recombinante selon la revendication 8, caractérisée en ce que la souche B.thurinaiensis appartient a la variété israelensis ou morrisoni. 10/ Bactérie recombinante selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce qu'il s'agit du clone 4Q2-72/pGSP10 ou du clone 4Q2-72/pGSP11. 11/ Vecteur recombinant d'expression et de clonage contenant une séquence d'ADN étrangère telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1, 3 à 7. 12/ Vecteur recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pBU4 modifie par la séquence d'ADN codant pour au moins la partie active de la protéine P43 ou de la protéine P56 ou des deux protéines ensemble de B.sPhaericus. 13/ Vecteur recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il-s'agit du plasmide pGSP10. 14/ Vecteur recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pGSP11. 15/ Vecteur recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide résident de B.thurinaiensis, modifié par lai séquence d'ADN de B.sphaericus codant pour au moins la partie active dé la protéine P43 ou de la protéine P56 ou des deux protéines ensemble. 16/ Composition larvicide comprenant des bactéries recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, en quantité suffisante pour présenter une activité larvicide vis-à-vis des larves de Diptères notamment de la famille des Simulies et/ou des Moustiques, de préférence sur l'ensemble des larves du genre Aedes, Culex et Anophèles. 17/ Composition larvicide selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de poudre, de suspension huileuse ou de briquettes. 18/ Procédé pour la production de bactéries recombinantes selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 11 à 15 avec des bactéries sauvages sporulantes choisies parmi les Bacillacées et compatible avec l'expression de la séquence d'ADN étrangère contenue dans ledit vecteur recombinant, dans des conditions permettant la transformation desdites bactéries par ledit vecteur recombinant, - sélection des bactéries recombinantes obtenues, par tout moyen physique ou chimique approprié.