Brevet FR2638607A1 — publié le 19900511

La présente invention est relative à un procédé de régénération et de clonage d'Angiospermes, notamment de Graminées ainsi qu'aux régénérants et clones obtenus par ce procédé. Chez les Angiospermes, on distingue deux grandes divisions : les Monocotylédones, dont la plantule n'a qu'un seul cotylédon et les Dicotylédones, dont la plantule comporte deux cotylédons. Les arbres fruitiers des pays tempérés, des arbres forestiers comme le Chêne, le Hêtre et d'assez nombreuses plantes herbacées (Pomme de terre, Betterave, Coquelicot etc...) sont des Dicotylédones. Certains arbres, tels que les Palmiers et surtout beaucoup de plantes herbacées (céréales, tulipes, muguet, orchidées etc...) sont des Monocotylédones. Bien qu'il soit fait référence, dans ce qui va suivre, aux Monocotylédones, il va de soi que l'invention s'applique aussi aux Dicotylédones. Les Monocotylédones, notamment les Graminées, représentent un marché mondial très important. I1 est essentlel, lorsque l'on dispose d'une variété présentant de nombreuses caractéristiques intéressantes, de pouvoir dégager ses conditions optimales de culture, de multiplication et d'amélioration. Les méthodes de culture in vitro, ou "vltro-mé- thodes" réalisent la culture in vitre d'organes, de méris- tèmes, de cals ou de cellules et sont de plus en plus utilisées pour les recherches sur l'organogénèse et leurs applications à la multiplication végétative et à l'amélioration des plantes. De manière générale, on entend par méthode ln vitre (ou vitro-méthode, tous les types de culture de ma tériel végétai effectués en conditions aseptiques. On peut citer notamment la culture d'embryons, la technique de mlcropropagation et la régénération de plantes à partir d'explants divers (cotylédon, racine, tige, feuille, fleur), de cultures de tissus indifférenciés ou de cellules. On entend par multiplication végétative in vitro, une technique récente qui permet de cultiver, a priori, n'importe quel fragment d'une plante sur un milieu nutritif artificiel approprié, en conditions aseptiques. A partir de ce fragment, de multiples "copies" de la plante de départ peuvent être régénérées, à la mutation prêt. Les cultures d'organes en particulier, constituent des moyens d'investigation précieux. Cependant il faut remarquer que les vitro-méthodes permettent rarement le maintien d'une morphogenèse et d'une organogenèse identiques à celles de la plante en tière (CHEVAUGEON J., 1987, C.R. Acad. Agric. Fr., 73, 9, 21-32). En plaçant les plantes dans un environnement complètement maitrisé, les vitro-méthodes se prêtent à des applications d'un haut intérêt agronomique. La micropropagation permet de multiplier du matériel sain sans aucun risque de contamination et il est possible de guérir des plantes atteintes de maladies parasitaires. La culture de méristèmes apicaux, associée ou non à la thermothérapie ou à la chimiothérapie, demeure un mode de traitement privilégié depuis les premiers succès de MOREL et MARTIN en 1952. D'autres techniques sont disponibles. Ainsi, dès 1975, MAIA et ses collaborateurs ont obtenu des tabacs guéris de la mosaïque par culture d'anthères. Pour les végétaux multipliés végétativement, les vitro-méthodes offrent les meilleurs et parfois les seuls moyens d'éliminer les virus et certaines bactéries comme les Xanthomonas des pélargonium hybrldes. Les vitro-méthodes rendent également possible la sélection de micro-organismes utiles aux plantes. MASON (1980) a ainsi isolé et sélectionné des espèces et des souches de champignons ectomycorhiziens, puis obtenu la création de matériels résistants. Dans le domaine des cultures d'organes, et plus particulièrement en ce qui concerne la régénération des plantes, on peut citer notamment - les travaux de V. VASIL et al. (Amer. J. Bot., 1982, 69, 9, 1441-1449) qui décrivent une culture de suspension embryogénique établie à partir de segments d'inflorescences de Graminées de l'espèce Pennisetum amers canum, mis en culture dans un milieu de MURASHIGE et SKOOG (MS) additionné de 2,5 mg/l d'acide 2,4- di chlorophénoxyacétique (2,4-D) et de 5 % de lait de noix de coco. Les suspensions ont été transferées sur un milieu agar présentant des concentrations faibles en 2,4-D. Ceci a entraîné la production de centaines d'embryoides. Le développement ultérieur de ces embryoïdes a été assuré par leur transfert sur un milieu contenant de l'acide abscissique. Beaucoup d'embryoides germent et produisent des plantes. Des embryoïdes atypiques ont également été observés. Z. HAYDU et al. ont décrit la régénération de plantes à partir de feuilles et d'anthères de Pennisetum purpureum Schurn, qui sont également des Graminées. Les explants obtenus à partir des feuilles produisent des cals lorsqu'ils sont cultivés sur un milieu nutritif dit MS contenant du 2,4-D ou du 2,4-D additionné d'acide naphtalène acétique et/ou de 6-benzyl aminopurine. Des embryoïdes se forment dans ces conditions et se développent ensuite en plantes. Les plantes obtenues à partir des cultures de feuilles et d'anthères croissent jusqu'a maturité et ont un nombre normal de chromosomes. Il s'agit donc d'induction de cal, d'embryogénèse somatique et de régénération de plantes à partir d'explants de feuilles ou d'anthères de Pennisetum purpureum. La culture d'inflorescences peut conduire à une néoformation de bourgeons, qui, repiqués, donnent des plantes entières. A partir de feuilles, il y a néoformation de bourgeons puis de plantes. Certaines cultures d'explants foliaires conduisent directement à la régénération d'embryons. La culture de cals peut, elle-aussi, conduire à la régénération de plantes. Le processus de multiplication végétative peut également débuter par la culture de cellules ou de protoplastes isolés. En ce cas, la régénération n'est pas immédiate. Les cellules isolées se multiplient, puis forment des cals de taille variable. C'est au sein de ces cals que s'organise une zone méristématique qui différencie des embryons somatiques ou des bourgeons. Chez les plantes qui se prêtent bien aux méthodes de culture in vitro, les procédés sont bien maitri- sés et les taux de régénération sont élevés. Comme il est précisé dans les travaux ci-dessus mentionnés, les cultures in vitro de Graminées sont classiquement initiées à partir d'embryons immatures, d'anthères et de jeunes feuilles. Cependant, dans le cas des Graminées, la régénération à partir d'organes différenciés (priScipale- ment les méristèmes) conduit à des résultats sporadiques et éphémères. Les plantes régénérées peuvent être, par ailleurs, très éloignées génétiquement et morphologiquement de la plante mère (Handbook of Plant Cell Culture, 1984, vol. 3, Crop. Species, B. REISCH p 748-767 ; T.S. RANGAN et I.K. VASIL p 126-150). Les recherches actuelles (BIOFUTUR, 1985, 39, 31-45) s'orientent vers la régénération à partir de cellules uniques (protoplastes, gamètes), ce qui limite le développement des cilimères. Les techniques demeurent cependant la source d'une certaine variabilité, appréciable pour la création de nouvelles variétés, mais interdisant le clonage exact d'un individu donné (Handbook of Plant Cell Culture, vol. 3, Crop Species, P. KING et K. SHIMAMOTO, p 6989). Il en résulte la situation suivante - La qualité et les succès commerciaux des résultats obtenus sur la plupart des Dicotylédones par les méthodes in vitro tradltionnelles, ne sont pas transposables dans le domaine des Graminées (Monocotylédones). - Diverses tentatives de régénération ont cependant été concluantes sur les céréales. Elles concernent le maïs, le sorgho, le mil, la canne à sucre, le blé et l'orge (voir V. VASIL et al., Amer. J. Bot., 1982, 69, 9, 1441-1449 ; Z. HAYDU et al., Theor. Appl. Genet., 1981, 59, 269-273 ; V. VASIL et al. BOT. GAZ. , 1982, 143, 4, 454-465 ; B. SWEDLUND et al., Theor. Appl. Genet., 1985, 69, 575-581 ; TANNER et al., Plant Science, 1986, 45, 119124). Cependant les résultats rapportés dans ces différentes publications montrent que les procédés décrits présentent un certain nombre d'inconvénients - la régénération des Graminées, est de manière générale, difficile à provoquer - la reproductibilité des protocoles expérimentaux est difficile à vérifier dans la plupart des cas - les régénérations obtenues ne concernent généralement qu'une très faible partie des cultures réali- sées. Il en résulte un très faible rendement, rarement supérieur à 1/100, qui ne permet pas d'envisager l'application industrielle des procédés de régénération de Graminées décrits à l'heure actuelle dans la littérature. - en dépit de la popularité de ces méthodes, il existe un fort décalage entre les espoirs et les acquis en effet, l'épreuve du champ est décisive et les rendements sont souvent très médiocres (CHEVAUGEON, op. cité). La Demanderesse s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un nouveau procédé de régénération des Angiospermes, notamment des Graminées, ne présentant pas les inconvénients des procédés antérieurs et aux régénérants obtenus par ce procédé. C'est également un but de l'invention de fournir un nouveau modèle d'étude de physiopathologie des Angiospermes, notamment des Graminées ainsi qu'un nouveau procédé de clonage desdites Angiospermes. La présente invention a pour objet un procédé de régénération d'Angiospermes, caractérisé (1) en ce que l'on prélève des inflorescences ou des fleurs d'Angiospermes infectées par un agent de virescence approprié (2) en ce que l'on cultive lfl vitro lesdites inflorescences ou fleurs prélevées, dans des conditions de température et de lumière appropriées, sur un milieu comprenant des macroéléments minéraux, des microéléments minéraux, de l'EDTA, des vitamines, de la gélose et du saccharose, ci-après dénommé milieu nutritif de base (MB) et comprenant en outre une substance favorisant l'expression de la virescence, choisie dans le groupe qui comprend notamment une auxine forte ou toute autre substance chimique à action analogue, et éventuellement une cytokinine et/ou de la benzyladénine et/ou du lait de noix de coco, pendant un temps approprié (3) en ce qu'on transfère les explants infectés et cultivés selon l'étape (2) sur un milieu de repiquage approprié, 3usqu'à obtention de bourgeons, qui correspondent à une structure végétative infectée (4) en ce que l'on induit la rhizogénèse desdits bourgeons infectés par transfert desdits bourgeons sur un milieu approprié contenant des auxines ou analogues, pendant un temps approprié, ledit repiquage étant éventuellement effectué plusieurs fois, pour obtenir des racines (5 en ce que l'on transfère lesdits bourgeons, éventuellement munis de racines, sur un milieu contenant un fongicide systémique, pour obtenir des plantules saines, dépourvues de parasites Les plantules saines, obtenues par régénération des explants infectés, sont prêtes à être repiquées en serre. Un tel procédé a l'avantage de présenter un rendement très élevé et une efficacité améliorée par rapport aux procédés de régénération proposés dans la littérature. De plus, toutes les inflorescences contaminées peuvent être placées en condition de culture in vitro et conduire à des régénérations en nombre important. Un tel procédé a également l'avantage de fournir des plantes présentant une très faible variabilité, car les plantules qui régénèrent proviennent de la réversion d'organes déjà formés. Les inflorescences ou fleurs infectées et soumises au procédé conforme à l'invention donnent naissance, de manière inattendue, à des plantules saines. En condition naturelle, le champignon parasite provoque chez la plante infectée la virescence de l'inflorescence qui brunit et se déssèche deux à trois semaines après sa sortie. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, l'agent de virescence est un agent de mildiou, notamment les genres Sclerospora, Peronosclerospora, Sclerophthora, Basldlophora, Plasmopara. Bremla, Peronospora, Pseudoperonospora. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, le milieu de culture des inflorescences infectées comporte un milieu nutritif de base (MB) comprenant comme macroéléments minéraux KAN03 à des concentrations comprises entre 606 et 2020 mg/l NH4NO3 à des concentrations comprises entre 240 et 1600 mg/l MgSO4, 7H20 à des concentrations comprises entre 246 et 369mg/l KH2PO4 à des concentrations comprises entre 136 et 170 mg/l Ca(NO3)2, 4H20 à des concentrations comprises entre 0 et 590 mg/l CaCl2, 2H20 à des concentrations comprises entre 0 et 441 mg/l KC1 à des concentrations comprises entre 0 et 149 mg/l comme microéléments minéraux FeCl3, 6H20 à des concentrations comprises entre 10-6 et 10-5 g/cm3 ZnSO4, 7H20 à des concentrations comprises entre 10-6 et 10-5 g/cm3 H3BO3 à des concentrations comprises entre 10-6 et 10-5 g/cm3 MnSOn, 4H20 à des concentrations comprises entre 10-7 et 10-6 g/cm3 CuSO4, 5H20 à des concentrations comprises entre 3.10-8 et 3.10-7 g/cm3 AlCl3 à des concentrations comprises entre 3.10-8 et 3.10-7 g/cm3 NiCl2, 6H20 à des concentratrions comprises entre 3.10-8 et 3.10-7 g/cm3 KI à des concentrations comprises entre 10-8 et10-7 g/cm3 Comme vitamines inositol à une concentration comprise entre 0,1 et 100 mg/i pyridoxine à une concentration comprise entre 0,1 et 1 mg/l acide nicotinique à une concentration comprise entre 0,2 et 2 mg/l thiamine HCl à une concentration comprise entre 0,5 et 30 mg/l biotine à une concentration comprise entre 0,1 et 2 mg/l, ainsi que de 1'EDTA, de la gélose et du saccharose, lequel milieu est, en poutre, associé & une auxine forte ou toute autre substance chimique à action analogue, telles que le 2,4 D à une concentration comprise entre 10-5 et 107 M et l'acide a picolinique à une concentration comprise entre 10-6 et 10-6 M, et éventuellement associé à de la benzyladénine à une concentration comprise entre 10-s M et 5.10-5 M et/ ou du lait de noix de coco à 5 %. Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, le milieu de repiquage de l'étape (3) est un milieu nutritif de base (MB). Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, le milieu de l'étape (4) est un milieu nutritif de base comprenant en outre des auxines choisies dans le groupe qui comprend l'acide a naphtalène acétique (ANA) et l'acide lndolylbutyrique (AIB). Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la concentration en ANA est comprise entre 10-7 et 10-5 M et la concentration en AIB est comprise entre 10-6 et 10- 4 M. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, le milieu de l'étape (5) comprend un milieu nutritif de base associé à du métalaxyl à une concentration comprise entre 10-5 M et 5.10-4 M. Un certain nombre de milieux sont décrits dans la littérature et comprennent des éléments communs avec les milieux utilisés dans l'invention. On peut citer notamment le milieu de MARGARA (J. MARGARA, Acad. Agric. Fr., 1978, 654-661), le milieu de HELLER (thèse, 1953) et le milieu de MURASHIGE et SKOOG (Physiol. Plant., 1962, 15, 473-497), qui décrivent des milieux comprenant notamment des éléments minéraux divers. La présente invention a également pour objet des régénérants obtenus au moyen du procédé de régénération conforme à l'invention. La présente invention a également pour objet l'application des inflorescences ou fleurs infectées mises en culture conformément au procédé de régénération de la présente invention, en tant que modèle d'étude de physiopathologie et/ou du mécanisme de floraison des Angiospermes, notamment des Graminées. Un tel modèle permet l'étude tant des mécanismes de floraison des Monocotylédones et des Dicotylédones que de la pathogénicité du parasite. Conformément à l'invention, pour une telle application, ledit modèle est mis en oeuvre dans une méthode d'étude et d'identification des systèmes physiologiques et physiopathologiques dont l'expression est impliquée dans les mécanismes de floraison, laquelle méthode est caractérisée en ce que ledit modèle est repiqué sur un/des milieu(x) de culture approprié(s). La présente invention a également pour objet un procédé de clonage d'Angiospermes, caractérisé (a) en ce que l'on sélectionne une plante appropriée ; (b) en ce que l'on inocule à ladite plante un agent de virescence approprié, pour obtenir des inflorescences ou des fleurs infectées (c) en ce que l'on prélève lesdites inflorescences ou fleurs infectées (d) en ce que l'on cultive in vitro lesdites inflorescences ou fleurs infectées selon le procédé de ré géneration conforme à l'inventlon, pour obtenir des plantes saines identiques au parent. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de clonage, conforme à l'invention, l'inoculation de l'agent de virescence est effectuée in vivo sur la plante entière. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de clonage, l'inoculation de l'agent de virescence est effectuée in vitro sur les inflorescences ou fleurs. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de clonage, conforme à l'invention, l'agent de virescence est un agent de mildiou, notamment les genres Sclerospora, Peronosclerospora, Sclerophthora, Basidlophora, Plasmopara, Bremla, Peronospora, Pseudoperonospora. Un tel procédé de clonage peut avantageusement être utilisé pour une variété donnée d'une espèce végétale qui ne se multiplie pas ou peu végétativement et qui possède un mode de reproduction sexuée allogame. Un tel procédé permet alors de multiplier sans variabilité un individu de structure génétique complexe et hétérogène, dont l'originalité serait perdue après croisement. L'application de ce procédé notamment au maïs, au sorgho et au mil est intéressante, car les sélectionneurs sont souvent confrontés au problème de la faiblesse en effectifs, des géniteurs de lignées, qu'ils ne peuvent multiplier sans en perdre la structure. Ceci est le cas notamment, et ce de manière non limitative, lors de prospections sur le terrain de formes sauvages rares ou lorsque le géniteur est issu de manipula tlons complexes à faible rendement, l.e. des manipulations génétiques, des croisements forcés successifs. Dans le domaine de la création variétale, en particulier, le problème des géniteurs de lignées est d'importance cruciale, ce qui souligne l'intérêt que peut apporter le procédé de clonage conforme à l'invention. La présente invention a également pour objet des clones obtenus au moyen du procédé de clonage conforme à l'invention. La présente invention a, en outre, pour objet un kit pour la mise en oeuvre du procédé de régénération et/cu de clonage et/ou de modélisation, conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend - un milieu nutritif de base comprenant en outre une substance favorisant l'expression de la virescence et éventuellement une cytokinine et/ou de la benzyladénine et/ou du lait de noix de coco - un milieu de repiquage - un milieu approprié comprenant des auxines ou analogues - un milieu approprié contenant un fongicide systémique ; et éventuellement un agent de virescence approprié. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limutation. Exemple : Procédé de régénération conforme à l'invention appliqué au mil. On utilise une lignée de mil 23-DB-, de forte homogénéité génétique infectée par S. graminicola par inoculation par injection d'une suspension de zoospores dans la pseudotige. 45 jours après l'inoculation, lorsque des symptômes foliaires traduisant l'infection apparâissent, des plantes contaminées, ainsi que des plantes témoins, en phase de morphogénèse florale sont prélevées, puis nettoyées et désinfectées par immersion dans l'hypochlorite de calcium à 5 % pendant 5 minutes, suivie de 4 rinçages successifs à l'eau stérile. Isolées en conditions aseptiques, les jeunes inflorescences infectées, de même que les inflorescences saines, de 0,5 cm à 3 cm de longueur, sont placées verticalement sur le milieu de culture. Les cultures sont conduites en boîtes de Petri ou en tubes de Pyrex, à une température de 23'C et placées sous un éclairage de 4000 lux de photopériode 16 heures. Le milieu de culture de l'étape (3) du procédé de régénération est le suivant - macroéléments KNO3 1313 mg/l NH4NO3 480 mg/l Ca(NO3)2,4H2O 590 mg/l MgSO4,7H20 246 mg/l KH2PO4 136 mg/l KCl 74,5 mg/l Cette composition en macroéléments corres pond à la solution N3oK de MARGARA. - Microéléments ZnSO4, 7H20 5 mg/l MnCl2 5 mg/l H3BO3 3 mg/l CuSOI, 5H20 0,01 mg/l Na2MoO4 0,05 mg/l KI 0,01 mg/l Cette composition en microéléments corres pond à la solution de MARGARA. - FeSO( 30 mg/l - EDTA disodique 30 mg/l - Vitamines pyridoxine 0,1 mg/l acide nicotinique 0,5 mg/l thiamine HCl 1 mg/l biotine 0,5 mg/l inositol 2 mg/l - saccharose à 30 g/l - gélose à 8 g/l - 2,4-D à 2.106 M Ce milieu sera dénommé ci-après MB1 ; Si, on ajoute au milieu MB1 de la benzyladénine à 0,5 mg/l et du lait de noix de coco à 5 %, on obtient un milieu dénommé ci-après MB2. Le milieu de repiquage peut être soit un milieu ci-après dénommé MS et dont la composition est celle définie par MURASHIGE et SKOOG (Physio. Plant., 1962, 476497), soit le milieu nutritif MB. La production de racines sur les explants caulogenes est favorisée par deux passages sur milieu auxi nique (MB + ANA à 10-6 M + AIB 10-5 M) et l'élimination du parasite est provoquée par l'incorporation de métalaxyl (10 mg/l) dans le milieu. Le calendrier des opérations est schématisé dans le tableau I ci-après. Tableau I Milieux de culture Date Temps Durée de Inflorescences Inflorescences jours chaque saines infectées phase (jours) 12.10. 0 , MB1 MB2 MB1 MB2 1987 (8) (12) (8) (14) 53 (2) (2) (8) (14) 24.11. 53 ....... MS MS MS MS 1987 24 (1) (0) (2) (1) 18.12. 77 ....... MB MB + ANA 10- 6 M 1987 + AIB 10-5 M 25 (1) (3) 12.01. 102 ....... MB MB + métalaxyl 1988 (10 ppm) 29 3 plantes sur (3) 10.02. 131 ' ....... argile expan- MB 1988 sée 29 (3) 10.03. 160 ....... 3 plantes en MB+ANA 10-6 M + 1988 terre AIB 10-5 M 10 36 plantes sur 20.03. 170 ....... argile expansée 1988 33 22.04 203 ....... 36 plantes en 1988 terre Les chiffres entre parenthèses indiquent le nombre d'explants vivants aux différentes dates Après cinquante trois jours de culture, les milieux MB1 et MB2 n'ont pas eu d'influence sur l'évolution des explants, mais un effet significatif dû à la présence du parasite est observé. Inflorescences infectées. On observe, sur les explants, le développement de lames foliacées courbes et épaisses, traduisant la réversion du méristème de l'inflorescence et des fleurs. La sporulation asexuée du parasite est parfois visible à leur surface. Un début de callogénèse sur les tissus de l'inflorescence est par ailleurs noté. Vingt quatre jours après le repiquage sur le milieu MS, seules 3 cultures sont demeurées vivantes. Les explants supportent de nombreux massifs foliacés, constitués de 3 ou 4 feuilles vrillées et gaufrées révélatrices de la présence du parasite (confirmée après prélèvements et coloration au calcofluor 0,05 %). Sur l'ensemble de l'inflorescence, on note, par ailleurs, la multiplication de cals blanchâtres, rigides et plissés, sur lesquels se développent des structures chlorophylliennes embryonnaires. Après traitements aux auxines (T= 77 j) et au métalaxyl (T= 102 ), un enracinement limité et l'élimination du parasite ont pu entre provoqués. Sur les fragments de culture obtenus, de nombreuses plantes d'aspect normal se sont développées. Les observations réalisées alors indiquent que la plupart d'entre elles sont issues du développement réverse de fleurs. Quelques unes seulement résultent d'une embryogénèse somatique dans les zones callogènes. Les dernières étapes de multiplication, suivies par un traitement rhizogène, ont permis l'individualisation de 11, 18 et 7 plantes selon l'inflorescence d'origine. Inflorescences saines. Cinquante trois jours après culture sur MB1 ou MB2, 4 inflorescences sur 20 sont demeurées vivantes, exprimant une callogènèse faible. Lors du troisième repiquage (T. 102 ), une élaboration de cals blanchâtres, d'aspect lipoïde, est intense sur l'unique explant ayant survécu, associée à la nécrose des fleurs. Aucune organogénèse n'est à ce moment observée. Ce n'est qu'après 131 jours de culture que l'apparition de bourgeons et de racines est visible sur certains cals, traduisant ainsi leur origine somatique. Seuls 3 d'entre eux donneront naissance à une plantule transférée sur argile expansée. Evolution des plantes régénérées en serre. La croissance et le développement des plantes repiquées se sont avérés conformes au phénotype 23 DB original quant à la taille, au délai de floraison et à la fertilité (taille moyenne de un mètre en pot, floraison en 30 jours après introduction en serre). On note cependant un tallage important, 2 à 3 fois supérieur à la normale : jusqu'à 25 talles filles sont dénombrées sur certaines plantes, 50 jours après repiquage. La présence du parasite dans les inflorescences apparaît, dans le cadre de la présente invention, comme un facteur favorisant la survie de l'organe en culture in vitro. A 53 jours, ce phénomène est particulièrement net. Toutes les inflorescences infectées ont survécu, contre 4 sur 20 des inflorescences saines. L'influence du parasite, dans le procédé conforme à l'invention, parait aussi déterminante quant aux modalités des processus de régénération observée. Alors que seule la callogenèse caractérise les explants sains, on note simultanément sur les explants infectés la réversion complète des bourgeons floraux (à l'origine de la plupart des régénérants), la réversion du méristème apical de l'inflorescence et une callogenèse importante. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mlse en oeuvre, et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite : elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. RF,VBNDICATIQNX 1') Procédé de régénération d'Angiospermes, ca caractérisé (1) en ce que l'on prélève des inflorescences ou des fleurs d'Angiospermes infectées par un agent de virescence approprié (2) en ce que l'on cultive in vitro lesdites inflorescences ou fleurs prélevées, dans des conditions de température et de lumière appropriées, sur un milieu comprenant des macroéléments minéraux, des microéléments minéraux, de l'EDTA, des vitamines, de la gélose et du saccharose, ci-après dénommé milieu nutritif de base (MB) et comprenant en outre une substance favorisant l'expression de la virescence, choisie dans le groupe qui comprend notamment une auxine forte ou toute autre substance chimique à action analogue, et éventuellement une cytokinine et/ou de la benzyladénine et/ou du lait de noix de coco, pendant un temps approprié ; (3) en ce qu'on transfère les explants infectés et cultivés selon l'étape (2) sur un milieu de repiquage approprié, jusqu'S obtention de bourgeons, qui correspondent à une structure végétative infectée (4) en ce que l'on induit la rhizogénèse des dits bourgeons infectés par transfert desdits bourgeons sur un milieu approprié contenant des auxines ou analogues, pendant un temps approprié, ledit repiquage étant éventuellement effectué plusieurs fois, pour obtenir des racines (5) en ce que l'on- transfère lesdits bourgeons, éventuellement munis de racines, sur un milieu contenant un fongicide systémique, pour obtenir des plantules saines, dépourvues de parasites 2 l Procédé de régénération selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de virescence est un agent de mildiou, notamment les genres Sclerospora, Peronosclerospora, Sclerophthora, Basidiophora, Plasmopara, Bremia, Peronospora, Pseudoperonospora. 3 ) Procédé de régénération selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le milieu de culture des inflorescences infectées comporte un milieu nutritif de base (MB) comprenant comme macroéléments minéraux KNO3 à des concentrations comprises entre 606 et 2020 mg/l NH4NO3 à des concentrations comprises entre 240 et 1600 mg/l MgSO4, 7H20 à des concentrations comprises entre 246 et 369mg/l KH2PO4 à des concentrations comprises entre 136 et 170 mg/l Ca(NO3)2, 4H20 à des concentrations comprises entre O et 590 mgii CaCl2, 2H2O à des concentrations comprises entre O et 441 mg/l KC1 à des concentrations comprises entre 0 et 149 mg/l comme microéléments minéraux FeCl3, 6H20 à des concentrations comprises entre 10-6 et 10-5 g/cm3 ZnSO4, 7H20 à des concentrations comprises entre 10-6 et 10-5 g/cm3 H3BO3 à des concentrations comprises entre 10-6 et 10- g/cm3 MnSO4, 4HzO à des concentrations comprises entre 10-7 et i0-6 g/cm3 CuSO4, 5H20 à des concentrations comprises entre 3.10-8 et 3.10-7 g/cm AlCl3 à des concentrations comprises entre 3.10-8 et 3.10-7 g/cm3 NiCl2, 6H20 à des concentratrions comprises entre 3.10-a et 3.10- g/cm KI à des concentrations comprises entre 10- et 10-7 g/cm Comme vitamines inositol à une concentration comprise entre 0,1 et 100 mg/l pyridoxine à une concentration comprise entre 0,1 et 1 mg/l acide nicotinique à une concentration comprise entre 0,2 et 2 mg/l thiamine HCl à une concentration comprise entre 0,5 et 30 mg/l biotine à une concentration comprise entre 0,1 et 2 mg/l, ainsi que de 1'EDTA, de la gélose et du saccharose, lequel milieu est, en outre, associé à une auxine forte ou toute autre substance chimique à action analogue, telles que le 2,4 D à une concentration comprise entre 10-5 et 107 M et l'acide a picolinique à une concentration comprise entre 10-6 et 10'8 M, et éventuellement associé a de la benzyladénine à une concentration comprise entre 10-s M et 5.10-5 M et/ ou du lait de noix de coco à 5 %. 4') Procédé de régénération selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu de repiquage de l'étape t3) est un milieu nutritif de base (MB). 5) Procédé de régénération selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le milieu de l'étape (4) est un milieu nutritif de base comprenant en outre des auxines choisies dans le groupe qui comprend l'acide a naphtalène acétique (ANA) et l'acide indolylbutyrique (AIB). 6') Procédé de régénération selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration en ANA est comprise entre 10-7 et 10-5 M et la concentration en AIB est comprise entre 10-6 et 10-r M. 7 ) Procédé de régénération selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de l'étape (5) comprend un milieu nutritif de base associé à du métalaxyl à une concentration comprise entre 10-5 M et 5.10-4 M. 8').Régénérants, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus au moyen du procédé de régénération selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9') Modèle d'étude de physiopathologie et/ou du mécanisme de floraison des Angiospermes, notamment des Graminées, caractérisé en ce qu'il est constitué par des inflorescences infectées mises en culture conformément au procédé de régénération selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10.) Méthode d'étude et d'identification des systèmes physiologiques et physiopathologiques dont l'expression est impliquée dans les mécanismes de floraison, laquelle méthode est caractérisée en ce que le modèle selon la revendication 9 est repiqué sur un/des milieu(x) de culture approprié(s). 11.) Procédé de clonage d'Angiospermes, ca caractérisé (a) en ce que l'on sélectionne une plante appropriée ; (b) en ce que l'on inocule à ladite plante un agent de virescence approprié, pour obtenir des inflorescences ou des fleurs infectées (c) en ce que l'on prélève lesdites inflorescences ou fleurs infectées ; (d) en ce que l'on cultive in vitro lesdites inflorescences ou fleurs infectées selon le procédé de régénération selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour obtenir des plantes saines identiques au parent. 12') Procédé de clonage selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'inoculation de l'agent de virescence est effectuée in vi vo sur la plante entière. 13' > Procédé de clonage selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'inoculation de l'agent de virescence est effectuée in vitro sur les inflorescences ou les fleurs. 14-) Procédé de clonage selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'agent de virescence est un agent de mildiou, notamment les genres Scierospora, Peronosclerospora, Sclerophthora, Basidiophora, Plasmopara, Bremia, Peronospora, Pseudoperonospora. 15-) Clones, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus au moyen du procédé de clonage selon l'une quelconque des revendications il à 14. 16') Kit ou coffret prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de régénération selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et/ou de clonage selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 et/ou de modélisation selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend - un milieu nutritif de base comprenant en outre une substance favorisant l'expression de la virescence et éventuellement une cytokinine et/ou de la benzyla dénine et/ou du lait de noix de coco selon la revendication 1 ou la revendication 3 - un milieu de repiquage selon la revendicatidn 1 ou la revendication 4 ; ; - un milieu approprié comprenant des auxines ou analogues selon l'une quelconque des revendications 1, 5 ou 6 - un milieu approprié contenant un fongicide systémique selon la revendication 1 ou la revendication 7 et éventuellement un agent de virescence approprié.