Brevet FR2644178A1 — publié le 19900914

i L'invention concerne un micro-organisme de l'espèce Bacillus coagulans, ainsi qu'un procédé pour préparer de l'acide L(+)-lactique, optiquement pur, que l'on obtient en cultivant cd micro-organisme dans ou sur un milieu nutritif convenable, ce qui permet d'obtenir un bouillon ou liquide de culture contenant de l'acide L(+)lactique, à partir duquel on isole préférentiellement l'acide L(+)-lactique formé. Des milieux nutritifs convenant pour la production d'acide lactique contiennent habituellement, en plus de diverses substances de croissance, comme des oligo-éléments et des vitamines, ainsi que des hydrates de carbone ou glucides intéressants et utilisables, également diverses sources d'azote, et de l'extrait de levure ou de l'eau d'infusion de maïs sert alors avantageusement de source organique de l'azote. La préparation de l'acide lactique, à partir de diverses matières de départ contenant des hydrates de carbone ou des glucides, avec addition de sources les plus diverses d'azote, de composés du phosphore, de vitamines et d'autres matières accélérant la production, est connue depuis le début du siècle. L'un des premiers à s'occuper de ce procédé a été le brevet FR-A-679 418 en l'année 1929. Puis l'utilisation de levure a été décrite dans le brevet EP 69 291-et la produc- tion de l'acide lactique par des bactéries de l'espèce lactobacillus a été décrite dans la demande de brevet EP-A- 0 113 215 en l'année 1984. Des travaux plus récents s'inté- ressent à des optimisations du procédé, qui se caractéri- sent surtout par l'utilisation de sources spéciales d'azote, comme décrit par exemple dans le brevet EP 0 266 258 (1988). Dans ce cas également, le micro- organisme producteur d'acide lactique appartient au genre des lactobacilles. Tous ces procédés n'ont cependant pas pu tenir compte de manière satisfaisante de l'importance croissante de l'acide L(+) lactique optiquement pur, ce qui ressort, en plus de l'introduction de l'acide lactique dans l'indus- trie des produits alimentaires courants et de luxe, de l'utilisation de l'acide lactique pour préparer des matières de synthèse et/ou des matières plastiques dégra- dables par voie biologique. Il en est ressorti le problème consistant à dévelop- per un procédé pour produire de l'acide L(+)-lactique opti- quement pur, procédé dans lequel on réussit à réduire à leur minimum l'utilisation de l'azote et le temps de fer- mentation, en particulier. En même temps, on souhaite rendre possible une réaction aussi bien du glucose que du saccharose, sans avoir à tenir compte du fait qu'il s'agit alors de matières premières pures ou, par exemple, de mélasses. On a donc conduit des opérations volontaires et ciblées d'isolement de bactéries productrices d'acide lac- tique que l'on obtient à partir d'une matière végétale. Il a été ainsi possible d'isoler/ à partir d'un produit ensilé,un microorganisme appartenant à la famille des Bacillaceae. Chose étonnante, il a été possible, par des méthodes spécialisées d'enrichissement, d'augmenter les capacités du métabolisme de la bactérie dans une mesure telle que cette bactérie soit capable de transformer des glucides ( hydrates de carbone), avantageusement du glucose ou du saccharose, contrairement aux procédés publiés jusqu'à présent, à des concentrations de départ supérieures à 140 g/l, en de l'acide L(+)-lactique. Des études effectuées sur ce micro-organisme selon l'invention ont conduit à l'identifier comme étant Bacillus coagulans et comme ayant les caractéristiques taxonomiques énumérées ci-après: - bâtonnets gram positifs ayant une grandeur de- 1,5-4 x 0,4-0,8pm - formation de spores *ellipsoidaux ou cylindriques non doué de mobilité - aérobie à facultativement anaérobie - croissance à 30-60 OC - température optimale à 48-54 C - croissance à pH 4,5-7,0 domaine optimal de pH compris entre 5,8 et 6,2 - catalase: résultat positif - formation d'acides à partir de D-glucose: résultat positif à partir de L-arabinose: résultat négatif a partir de D-xylose: résultat négatif à partir de D-mannitol: résultat négatif à partir de lactose: résultat positif - formation de gaz à partir de glucose: résultat négatif - désamination de la phénylalanine: résultat négatif - réduction de nitrate: résultat négatif - utilisation de citrate ou de propionate: résultat négatif - décomposition de l'amidon ou de la fécule: résultat positif de la caséine: résultat négatif de la gélatine: résultat négatif de la tyrosine: résultat négatif de l'ADN (acide désoxyribonucléique): résultat positif - formation d'indole: résultat négatif - comportement en fermentation: formation d'acide L(+) lactique par homofermentation. La souche caractérisée par les données indiquées ci- dessus a été déposée, selon les prescriptions du traité de Budapest, le 31 janvier 1989, en recevant le numéro de dépôt DSM 5196, auprès de l'Institution de dépôt habilitée "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (D.S.M.)". Il a été trouvé que le micro-organisme selon l'invention est capable de former, à des températures allant jusqu'au voisinage de 60 OC, de l'acide lactique; donc, une autre caractéristique du procédé selon l'inven- tion consiste à conduire la culture du micro-organisme à des températures comprises entre 30 et 60 , avantageuse- ment entre 48 et 54 C et en particulier à 52 C environ. Il a en outre été trouvé qu'à des températures assez élevées, comprises notamment entre 50 et 60 C, il n'est pas indispensable d'opérer de manière stérile. En particu- lier, on peut se dispenser d'une stérilisation du milieu nutritif (ce qui impliquerait par exemple un chauffage à 121 C durant 15 min). Une autre caractéristique du procédé selon l'invention consiste donc en la possibilité de cul- tiver le micro-organisme dans des conditions non stériles. La culture du micro-organisme a lieu en outre, avan- tageusement, dans des conditions aérobies. Ainsi qu'il ressort par exemple de la demande de brevet EP-A-0 266 258, il n'était pas possible jusqu'a présent de travailler avec des concentrations de départ en sucre supérieures à 140 g/l. Comme déjà indiqué au début du présent exposé, le micro-organisme selon l'invention est capable de travailler à des concentrations en sucre encore plus élevées. Une autre caractéristique du procédé de l'invention consiste donc à conduire la culture du micro-organisme dans ou sur un milieu dont la concentration initiale en sucre est supérieure à 140 g/l, et se situe de préférence entre et 200 g/l, en particulier à 190 g/l environ. A l'échelle technique ou industrielle, cela signifie surtout que la totalité de la quantité de sucre à faire fermenter peut être placée dès le départ et donc que le procédé selon l'invention peut être conduit sous forme d'un procédé discontinu, contrairement aux procédés connus, comme par exemple celui décrit dans la demande de brevet EP-A-0 072 010, dans lequel,ou lesquels, on ajoute pendant la culture, de manière continue ou discontinue, du sucre. Il a en outre été trouvé que, dans le procédé selon l'invention, le milieu nutritif doit présenter une teneur en de l'azote organique et minéral nettement plus faible que la teneur nécessaire jusqu'à présent. D'autres caractéristiques du procédé de l'invention sont donc d'une part que l'on conduit la culture du micro- 2644 1 78 organisme dans ou sur un milieu dont la teneur en eau de gonflement ou d'infusion de maïs se situe à une valeur maximale d'environ 30 g/l ou dont la teneur en de l'extrait de levure se situe à environ 3 g/l, ce qui donne une teneur en azote de fonction amine de 0,15 à 0,4 g/l et, d'autre part, que la culture du micro-organisme est conduite dans ou sur un milieu contenant au maximum environ 3 g/l de phosphate d'ammonium. Cela entraîne la possibilité d'isoler et de récu- pérer, à partir du milieu de culturel'acide L(+)-lactique formé que l'on obtient ainsi par un procédé nettement moins compliqué et/ou onéreux que ce n'était possible jusqu'à présent. Il suffit par exemple de neutraliser avec Ca(OH)2, ce qui provoque la séparation par cristallisation du L(+)- lactate de calcium. Il peut éventuellement s'avérer nécessaire, dans le procédé selon l'invention, d'appliquer des mesures desti- nées à combattre la formation de mousse. Les exemples non limitatifs suivants sont destinés à décrire plus en détail l'invention. Exemple 1: Isolement et amélioration de la souche de Bacillus coagulans On fait incuber durant 7 jours,à l'abri de l'air et à C, de la matière végétale, puis on la reprend dans de l'eau stérile, on la soumet à extraction par agitation et l'on filtre. On dilue le filtrat résultant de manière qu'après ensemencement en surface sur des boites de Petri contenant du milieu 1, et après incubation à 50 OC 2 OC, on obtienne des colonies individuelles. Milieu I: (gélose nutritive "CM 3 Oxoid") Extrait de viande 1 g/l Extrait de levure 2 g/l Peptone 5 g/l NaCl 5 g/l pH 7,4 Glucose 10 g/l Saccharose 10 g/1 Agar-agar ou gélose 15 g/l Au bout de 48 h, on isole environ 200 colonies et l'on en examine la capacité de fermentation. On ensemence à chaque fois 10 ml du milieu IIavec de l'isolat correspon- dant, et l'on fait incuber durant 5 j à 50 C 2 C. Puis l'on détermine par voie enzymatique la concentration en l'acide lactique de chaque charge. Milieu I.I: saccharose 120 g/l (NH4)2HPO4 1,5 g/l CaC03 70 g/l Autolysat de levure 5 g/l On utilisepour la poursuite des travaux de sélec- tion/ le produit d'isolement, ou isolat, présentant la teneur la plus élevée en de l'acide L(+)-lactique. Avec cet isolat, on ensemence à nouveau des ballons contenant du milieu II, en remplaçant le saccharose par du glucose et en augmentant de 10 g/l la concentration des glucides. On conduit l'incubation durant 4 j à 50 C. On répète cette façon d'opérer jusqu'à faire réagir à chaque fois 190 g/l de saccharose ou de glucose en 4 j pour obtenir de l'acide L(+)-lactique. L'entretien des souches a lieu par culture sur le mi- lieu I ou par conservation des cultures à -15 C. Exemples 2 à 5: production de l'acide L(+)-lactique On transfère sur du milieu III des cultures obtenues selon l'exemple 1 en prenant bien soin de ne pas utiliser moins de 1% pour une inoculation. Milieu III Glucides: 190 g/l, en équivalent de glucose (dans les exemples 2+4: saccharose dans les exemples 3+5: glucose) Azote minéral: 1,5 g, sous forme de (NH4)2HP04 Azote organique: 3 g/l sous forme d'un autolysat de levure (dans les exemples 2+3), et l'on admet que la teneur moyenne en azote de fonction amino est de 4,8 à 5,8 % ou que la teneur en protéine (Nx6,25) est de 56 à 62 % pour une substance sèche ayant une pureté de 94 à 98 %, ou bien g/l sous forme d'une eau d'infusion de maïs (dans les exemples 4+5), et l'on admet comme teneur moyenne en azote de fonction amino 2 à 3 % ou une teneur en protéine (Nx6,25) de 43 à 49 % pour une substance sèche correspondant à 45 % de pureté. On maintient constante à la température de 52 'C, grâce à des mesures convenables, la solution de production et l'on choisit les caractéristiques de l'agitation de manière à obtenir un mélangeage optimal du milieu. On ajoute du lait de chaux pour régler la valeur du pH à 6,0. RESULTATS OBTENUS Source de Source Temps Acide Pureté glucides d'azote de fer- L(+)- opti- organique menta- lacti- que tion (h) que (% de (g/l) L(+)) Ex. 2 saccharose autolysat de levure 39 140 99,8 Ex. 3 glucose autolysat de levure 49 133 99,8 Ex. 4 saccharose eau d'infu- sion de maïs 43 135 98,5 Ex. 5 glucose eau d'infu- sion de maïs 51 134 98,7 La proportion de 1 à 1,5 % d'acide D(-)-lactique apparaissant aux exemples 4 et 5 est à attribuer à l'acide lactique de l'eau d'infusion de maïs, acide qui est habituellement présent sous forme de racémique. REVENDICATIONS 1. Micro-organisme de l'espèce Bacillus Coagulans, déposé sous le numéro DSM 5196 le 31 janvier 1989 à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, et qui présente les caractéristiques taxonomiques - suivantes: - bâtonnets gram positifs ayant une grandeur de 1,5-4 x 0,4-0,8 pm - formation de spores ellipsoïdaux ou cylindriques, - non doué de mobilité - aérobie à facultativement anaérobie - croissance à 30-60 C température optimale à 48-54 C - croissance à pH 4,5-7,0 domaine optimal de pH compris entre 5,8 et 6,2 - catalase: résultat positif - formation d'acides à partir de D-glucose: résultat positif à partir de L-arabinose: résultat négatif à partir de D-xylose: résultat négatif à partir de D- mannitol: résultat négatif à partir de lactose: résultat positif - formation de gaz à partir de glucose: résultat négatif - désamination de la phénylalanine: résultat négatif - réduction de nitrate: résultat négatif - utilisation de citrate ou de propionate: résultat négatif - décomposition de l'amidon ou de la fécule: résultat positif de la caséine: résultat négatif de la gélatine: résultat négatif de la tyrosine: résultat négatif de l'ADN (acide désoxyribonucléique): résultat positif - formation d'indole: résultat négatif - comportement en fermentation: formation d'acide L(+) lactique par homofermentation. 2. Procédé pour produire de l'acide L(+)-lactique, caractérisé en ce qu'on cultive un micro-organisme selon la revendication 1, dans ou sur un milieu contenant des glucides (hydrates de carbone), de l'azote et de la ou des protéines, ce qui permet d'obtenir un liquide de culture contenant de l'acide L(+) lactique, à partir duquel on isole préférentiellement l'acide L(+) lactique formé. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on conduit la culture du micro-organisme à des tempé- ratures comprises entre 30 et 60 OC, avantageusement entre 48 et 54 OC et notamment au voisinage de 52 OC. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caracté- risé en ce qu'on conduit la culture du micro-organisme dans des conditions non stériles. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'on conduit la culture du micro- organisme dans des conditions aérobies. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'on conduit la culture du micro- organisme dans ou sur un milieu dont la concentration ini- tiale en sucre est supérieure à 140 g/l, et dont cette concentration initiale en sucre se situe de préférence entre 180 et 200 g/l, en particulier au voisinage de 190 g/l. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce qu'on conduit la culture du micro- organisme dans ou sur un milieu dont la teneur en azote de fonction amine est au maximum égale à environ 0,4 g/l ou dont la teneur en de la ou des protéines est au maximum égale à environ 6 g/l. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce qu'on conduit la culture du micro- organisme dans ou sur un milieu contenant au maximum environ 3 g de phosphate d'ammonium par litre.