Brevet FR2636231A1 — publié le 19900316

Cellules eucaryotes recombinées productrices d'interleukine-l B mature N-glycosylée, procédé et vecteurs nécessaires pour leur obtention et procédé d'obtention d'interLeukine-1 X mature N-glycosyLée. La présente invention concerne des cellulars eucaryotes recombinées productrices d'interleukine-1 p mature N-glycosylée. Elle concerne également un procédé et les vecteurs pour l'obtention de ces cellules. Enfin, elle a aussi pour objet l'obtention d'interLeukine-1 p mature N-glycosylée par mise en culture desdites cellules. Les cellules eucaryotes selon l'invention contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour la forme mature de l'interleukine-l X précédée d'une séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine. Ces cellules eucaryotes recombinées sont obtenues par le procédé qui consiste à transfecter des cellules eucaryotes à l'aide d'un vecteur portant, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour La forme mature de L'interleukine-l S précédée d' une séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine, et à sélectionner Les cellules transfectées, productrices d'interleukine-1 p mature, par croissance en milieu sélectif. L'interleukine-l humaine, dénommée ci-apres IL-1 humaine est un médiateur polypeptidique produit principalement par des monocytes activés, qui joue un rôle important dans le système de défense immunitaire. A partir de l'ARN messager de macrophages stimulés par des liposaccharides, on a récemment isolé deux clones de L'ADN complémentaire représentant deux formes molécuLaires distinctes de l'IL-1 humaine. Ces deux formes, dénommées IL-l x etIl-1 9 sont décrites en détail par MARCH et al. dans NATURE, vo. 315, 1985, p. 641-647. Le mode de sécrétion de l'IL-1,B est encore inconnu. Cette protéine est synthétisée par les monocytes ou d' autres cellules sous la forme d'un précurseur intracellulaire d'un poids moléculaire d'environ 31000 daltons, qui est clivé par des enzymes protéolytiques en une forme active sécrétée ayant un poids moléculaire d'environ 17500, dénommée également forme mature (MARCH et al. dans NATURE, vol. 315, 1985, p. 641-647). Le précurseur intracellulaire de l'IL-1 p ne contient pas de peptide signal classique N-terminal ou de région hydrophobe interne. AURON et al. dans J. MOL. CELL. IMMUNOL. 1985, 2:169, ont décrit toutefois une séquence légérement hydrophobe de 17 acides aminés dans la partie N-terminale de cette protéine, cependant, le rôle possible de cette séquence dans le processus d'excrétion est encore hypothétique. Les cellules eucaryotes transfectées avec de l'ADN complémentaire codant pour le precurseur de l'IL-1 9 se sont montrées relativement peu efficaces pour la sécrétion de l'IL-1 mature dans les milieux de culture. Jusqu'a présent, il n'a donc pas été possible d'obtenir des quantités importantes d'IL-1 p mature à partir de cellules eucaryotes transfectées. On a maintenant trouvé un procédé qui permet d'obtenir l'IL-1 p mature en quantités importantes à partir de cellules eucaryotes. De plus, ce procédé permet d'obtenir l'IL-1 p mature sous la forme glycosylée, qui peut être utilisée comme principe actif de médicaments pour le traitement de maladies, telles que les cancers et certaines maladies infectieuses ou parasitaires. On sait en effet que L'IL-1 o( ou p ont de multiples propriétés biologiques, et qu'elles jouent un rôle de médiateur dans les mécanismes de défenses immunitaires (C.A. DINARELLO Bull. Inst. Pasteur 1987, 85, 267-285). Selon un premier aspect, l'invention concerne donc des cellules eucaryotes recombinées productrices d'interleukine-I JB mature qui contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour la forme mature de I'interleukine-l X précédée d'une séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine. Elle a également pour objet un procédé d'obtention desdites cellules consistant 1) à transfecter des cellules eucaryotes à l'aide d'un vecteur portant, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour la forme mature de l'interleukine-1 ss précédée d'une séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'un des précurseurs de l'hormone de croissance humaine, puis 2) à sélectionner les cellules transfectées productrices d'interleukine-1 p mature par culture en milieu sélectif. Enfin, elle a pour objet le procédé d'obtention d'interleukine-1 fi mature consistant à mettre en culture des cellules eucaryotes recombinées, en présence d'un systéme de sélection, à recueillir le milieu de culture et à séparer l'interleukine-1 p contenue dans le milieu de culture des autres constituants de celui-ci, procédé dans lequel les cellules mises en culture sont issues de cellules eucaryotes 1) transfectées à l'aide d'un vecteur portant, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour la forme mature de l'interleukine-î p précédée d'une séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine, puis 2) sélectionnées par culture en milieu sélectif. Il doit être précisé que ledit procédé peut s'appliquer, non seulement et de manière particulièrement adaptée, à l'obtention d'interleukine-îp d'origine humaine, mais également à l'obtention d'interleukine-l p d'autre origine animale, dans la mesure où de telles molécules présentent un intoret particulier justifiant une application industrielle, par exemple en qualité d'agent de diagnostic ou de principe actif d'un médicament notamment à usage vétérinaire (C.R. MALISZEWSKI et al., Molecular Immunology, vol. 25, no. 5, p 429-437, 1988). La présente invention concerne également les vecteurs recombinants pour la mise en oeuvre dudit procédé ainsi que les lignées cellulaires productrices d'IL-1B X mature. Les cellules eucaryotes utiles pour la mise en oeuvre de l'invention sont des cellules d'origine animale capables de glycosylation. Parmi ces cellules, les cellules communément désignées par l'appellation CHO par référence à leur origine (cellules d'ovaire de hamster chinois) sont particulièrement adaptées. Les techniques liées à l'utilisation de ces cellules, qu'il s'agisse de leur propagation ou de leur transfection par les vecteurs ou encore de la sélection des cellules effectivement transfectées, sont connues de l'homme de l'art. Certaines seront plus précisément décrites lors de la présentation des exemples. Les vecteurs nécessaires pour la mise en oeuvre de l'invention peuvent revêtir diverses formes. Il peut s'agir de tout ou partie d'un génome viral et notamment du génome d'un rétrovirus ou d'un plasmide ou encore d'un cosmide. De façon avantageuse, on met en oeuvre un plasmide. Les vecteurs recombinants selon l'invention, dénommés ci-aprés vecteurs, portent, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour la forme mature de l'interleukine-1 B, précédée d'une séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine. La séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine, dénommée ci-après "séquence d'ADN codant pour le peptide signal de l'hGH ou séquence d'ADN codant pour ps-hGH" peut avoir l'une des séquences que permet la dégénérescence du code génétique : un mène acide aminé - hormis la méthion:ne - pouvant être codé par 2, 3, 4 ou même pour certains, 6 codons différents. Une séquence de nucléotides préférée codant pour ps-hGH est la séquence ci-après, où a été noté, pour chacun des 26 codons, l'acide aminé lui correspondant. ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC 3 Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala La séquence d'ADN codant pour l'IL-1 p mature mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est une séquence obtenue selon des techniques classiques, -à partir d'un ADN complémentaire ou par voie de synthése. On décrira ci-aprés en détail la synthèse de la séquence d'ADN codant pour la forme mature de l'IL-1 p humaine ; la séquence synthétique obtenue est représentée sur La figure 1 sur laquelle on a noté pour chacun des 153 codons, l'acide aminé lui correspondant. On sait que pour permettre, à l'issue d'une transfection, la mise en évidence, au sein d'une population de cellules eucaryotes, les cellules qui ont effectivement intégré un vecteur particulier, il est nécessaire d'utiliser un système de sélection qui permet auxdites cellules de vivre dans des conditions létales pour les cellules non transformées. Ce système de sélection comprend un gène codant pour une protéine appelée marqueur de sélection permettant la sélection dans les conditions ci-dessus. La séquence d'ADN codant pour le marqueur de sélection peut appartenir soit à une unité d'expression autonome portée par le même vecteur ou un vecteur différent, soit à la même unité d'expression que celle de l'ILw Les moyens nécessaires à ltexpression de ces séquences sont choisis parmi ceux généraiement utilisés pour la construction de vecteurs destinés à la transfection de cellules eucaryotes. D'une manière avantagquse, ils sont issus du génome du virus SV40 à partir duquel peuvent notamment être préparées des séquences d'ADN incluant en particulier le promoteur précoce, des introns et/ou les signaux précoces ou tardifs de polyadénylation (Fiers, W.(1978) Nature, 273, 113-120). Des exemples de marqueurs de sélection appropriés sont la thymidine kinase, la guanine phosphoribosyltransferase, la néomycine phosphotransférase et la dihydrofolate réductase ; à cet effet, on peut se référer à l'article de KAUFMAN et al. dans J. Mol. Biol. t1982) 159, 601-621, cité dans la présente description à titre de référence. Un gène particulièrement adapté aux fins de l'invention est une séquence d'ADN codant pour la dihydrofolate réductase (enzyme ci-apres désignée par l'abréviation DHFR) ; décrite par Subraman, et al (1981 Mol. Cell. Bol. 1, 854-864), une telle séquence, portée par un vecteur d'expression, permet, aprés transfection de cellules incapables de synthétiser sous une forme fonctionnelle de la DHFR (-cellules DHFR ), la croissance sur un milieu déficient en hypoxanthine, en glycine et en thymidine, des seules cellules ayant effectivement incorporé le vecteur. L'intérêt accordé à l'utilisation d'un vecteur portant, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour la DHFR est accentué par le fait qu'elle peut être à l'origine, que la cellule eucaryote transfectée soit capable (cellule DHFR ) ou non (cellule DHFR-) de synthétiser sous une forme fonctionnelle la DHFR, d'un processus d'amplification conduisant à une obtention accrue d'une protéine d'intérêt codée par une séquence d'ADN portée, avec les moyens nécessaires à son expression, par ledit vecteur. Le mécanisme de cette amplification reste à préciser. On sait que la DHFR est inhibée par le composé connu sous l'appellation méthotrexate (acide N-((((diamino-2,4 ptéridinyî-6) méthyl) méthylamino)-4 benzoyl) L-glutamique) et que la présence de méthotrexate dans le milieu de culture séléctif entrain la mort de la plupart des cellules et que seules subsistent des cellules devenues capables de synthétiser des quantités importantes de DHFR. Et il a été constaté (Kaufman, R.J. et al. (1982) J. Mol. Biol., 159, 601-621), chez des cellules ayant incorporé un vecteur portant, avec les moyens nécessaires à leur expression, une séquence d'ADN codant pour la DHFR et-une séquence d'ADN codant pour une autre protéine, que cette production amplifiée de DHFR était accompagnée d'une production amplifiée de ladite protéine. La construction des vecteurs selon l'invention fait appel à des techniques maintenant bien connues de l'homme de i'art. Elle comprend notamment l'isolement de fragments d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction à partir de vecteurs préexistants, la synthèse par voie chimique d'oligonucléotides, L'assemblage eventuellement après modification de leurs extrémités - de ces divers fragments en utilisant une enzyme telle que l'ADN-ligase du bactériophage T4, la sélection par clonage - après transformation bactérienne dans Escherichia coli - des vecteurs puis leur purification selon des techniques également bien connues de L'homme de L'art. Ces techniques sont notamment décrites dans l'ouvrage intitulé Moiecular Cloning : a Laboratory Manual de Maniatis, T. et al. publié en 1982 par les Editions Cold Spring Harbor Laboratory à New York (E.U.A.). L'ensemble des enzymes de restriction nécessaires à la construction des vecteurs ci-apres présentés est commercialisé notamment par la Société New England Biolabs (E.U.A.). L'ADN-ligase du bactériophage T4 est disponible auprès de la Société PHARMACIA (Suède). Selon un autre aspect, l'invention concerne des lignées cellulaires sélectionnées, à partir des cellules eucaryotes ayant incorporé un vecteur selon l'invention, par culture desdites cellules en milieu sélectif. La présente invention va être maintenant décrite plus en détail en référence à l'IL-1 w mature humaine sans pour autant limiter la portée de celle-ci à l'obtention de cette IL-1 fi particulière. I - Synthèse de la séquence d'ADN codant pour la forme mature de L'IL-1 ss humaine (figure 1? Les oligonucléotides ont été synthétisés avec un Synthétiseur "Biosearch 4600" en utilisant des nucléosides diisopropyîphosphoramidites, et purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12 % - urée 8M. Le gène synthétique de l'IL-1 9 a été obtenu par assemblage de 19 oligonucléotides contenant de 35 à 58 nucléotides, indiqués par des flèches, sur la figure 1 annexée, la longueur de chaque fragment étant précisée entre parenthèses. Cette séquence synthétique diffère de la séquence naturelle par quelques nucléotides ; on a noté au-dessus de la séquence synthétique les bases de la séquence naturelle qui ont été modifiées. D'autre part, on a noté les sites de restriction introduits dans cette séquence. Les fragments (1 g), à l'exception des fragments 1 et 11, ont été phosphorylés soit en paires complémentaires soit en un groupe de 3 oligonucleotides (fragments 4, 5 et 16) dans un mélange standard de libation contenant les ingrédients suivants : Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; MgCl2 10 mM; dithiothreitoî 10. mM; spermidine 1 mM ; ATP I mM ; 1 mg/ml de sérum albumine bovine et 10 unités de T4-polynucleotide kinase (-1yuL) dans un volume total de lîjil. Après 30 minutes à 370C, les mélanges ont été placés dans un bain-marie à 650C et maintenus pendant 10 minutes à cette température. Les solutions ont été rassemblées, les fragments 1 et 11 ont été ajoutés et le mélange résultant a été chauffé pendant 10 minutes à 650C. On a ensuite laissé le mélange refroidir jusqu'à 22C, puis on a ajouté I' ADN ligase du bactériophage T4 (1 > l - 5 unités) et le mélange ainsi traité a été maintenu pendant 10 minutes à 220C. Le gène synthétique (représenté sur la figure 1) a été purifié par électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant (5%) et le fragment d'ADN souhaité a été électroélUé pendant 16 heures dans un tampon composé de Tris-acétate 20 mM pH 7,9 ; EDTA 500 mM et 0,1 X de dodécylsulfate de sodium (SDS). Le fragment d'ADN a été ensuite purifié par chromatographie sur calonne de DE-52 (Pharmacia) en éluant avec un tampon composé de NaCl 1,5 M ; Tris-HCl 50 mM pH 7,6 ; EDTA 5 mM et précipité par de I'éthanol. Ce fragment d'ADN a été introduit dans le vecteur M13mp18 (voir MESSING et al. dans METHODS in Enzymology 101 (part C) Recombinant DNA, Academic Press, New-York 1983, p. 20) précédemment digéré par les enzymes EcoRI et HindIII et cloné dans la souche E. coli JM 103. Les clones obtenus ont été analysés par digestion par des enzymes de restriction. Parmi les clones présentant la carte de restriction attendue, le clone 18IL9 s'est avéré contenir effectivement le gêne synthétique après séquençage de chacun de ses brins d'ADN par La méthode de SANGER et al (Proc. Natal. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467). Il - CouDlage de La séquence d'ADN codant pour La forme mature de l'IL-1 B humaine avec la séquence d'ADN codant pour le ps-hGH La séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'hGH et la séquence d'ADN codant pour les premiers acides aminés de l'IL-1 X mature ainsi que les séquences de contrôle appropriées ont été insérées au site unique BgIII du clone 18IL9, de telle sorte que la séquence d'ADN codant pour L'IL-îp mature soit précédée directement par la séquence d'ADN codant pour Le peptide signal de I'hGH. A l'extrémité 3' de la séquence d'ADN codant pour l'IL-1 p mature, un site SacI adjacent au site HindîlI a été inséré pour faciliter l'introduction d'un signal de polyadénylation eucaryote. Le clone résultant a été digéré par les enzymes de restriction HindîlI et BamHI et le fragment HindlII - BamHI contenant la séquence codant pour l'IL-1 X précédée -de la séquence codant pour ps-hGH a été utilisée pour fabriquer le plasmide pSV1003. III - Construction du plasmide pSV1003 Le plasmide pSV1003, représenté sur la figure 2, résulte de l'assemblage des 8 fragments d'ADN par mise en oeuvre des méthodes indiquées précédemment : a) Un fragment PvuII-BglI de 278 paires de bases (pb) issu du génome du virus SV40 (Fiers, W. (1978), Nature 273, 113-120) et contenant la partie 5' du promoteur précoce de ce virus. b) Un fragment BglI-PstI de 329 pb issu du plasmide pL1 (Okayama, H. and Berg, P. (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 280-289), et contenant la partie 3' du promoteur précoce du virus SV40 suivie des introns tardifs de ce même virus. Le site BamHI initialement présent dans ce fragment a été éliminé par remplissage du site en présence du fragment de Klenow de la DNA polymerase I (Pharmacia). c) Un fragment PstI-HindIII de 12pb issu du plasmide pUC18 (Yanisch Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene 33, 103-119). d) Le fragment HindIII-BamHI contenant la séquence codant pour l'IL-1 p mature, précédée de la séquence codant pour ps-hGH, décrit au point II ci-dessus. e) Un fragment BamHI-BclI de 237pb issu du génome du virus SV40 et contenant Le signal tardif de polyadénylation de ce virus. f) Un fragment BamHI-EcoRV de 190pb issu du plasmide pBR322 (Bolivar, F. (1977) Gene 2, 95-113). g) Un fragment PvuII-PvuI de 2556pb issu du plasmide pSV2-dhfr (Subramani, S., Mulligan, R. and Berg, P. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) et comprenant une unité d'expression pour la DHFR. Ce plasmide a été déposé à I'ATCC sous le nO 37146. Cette unité de transcription contient, entre les sites PvuII et EcoRI, le promoteur précice du virus SV40, la séquence codant pour la DHFR de souris, l'intron de l'antigène t du virus SV40 et le signal précoce de polyadénylation de ce même virus. Cette unité d'expression est suivie du fragment EcoRI-PvuI de 626pb issu du plasmide pBR322. Les sites HindIII, BamHI et EcoRI initialement présents dans ce fragment g, ainsi que la totalité de la région d'ADN comprise entre les sites BamHI et EcoRI, ont été élimines par remplissage, comme précédemment décrit pour le fragment b. h) Un fragment PvuI-PvuII de 1438pb issu du plasmide pUC9 (Vieira, J. and Messing, J. (1982) Gene 19, 259-268). Ce fragment ne contient pas les séquences proches de l'origine de réplication bactérienne qui sont nuisibles à l'expression des gènes eucaryotiques (Peterson, D.O., Beifuss, K.K. and Morîey, K.L. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 1563-1567). Le plasmide psV1003 contient donc : - une unité d'expression pour la protéine de fusion (ps - hGH) IL-1 B, laquelle unité comporte le promoteur précoce du virus SV40, suivi des introns tardifs de ce même virus, et en aval de ces derniers, la séquence codant pour la protéine de fusion (ps hGH) - IL-1 p, suivie du signal tardif de polyadénylation du virus SV40. - une unité d'expression pour la DHFR de souris, laquelle unité comporte le promoteur précoce du virus SV40, la séquence codant pour la DHFR de souris et en.aval de cette dernière l'intron de l'antigène t du virus SV40, suivi du signal précoce de polyadénylation de ce même virus. La Légende suivante a été adoptée pour la figure 2 séquence d'ADN issue du génome du virus SV40 séquence d'ADN codant pour la DHFR séquence d'ADN codant pour l'interleukine-1 p précédée de la séquence codant pour ps-hGH séquence d'ADN issue du plasmide pBR322 séquence d'ADN issue du plasmide pUC9 séquence d'ADN issue du plasmide pUC18. IV - Transfection des cellules CHO et expression de l'IL-1 dans celles-ci. L'expression transitoire du plasmide pSV1003 a été réalisée dans des cellules CHO DHFR sélectionnées par Urlaub et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980) en utilisant la méthode au DEAE-dextran décrite par LUPKER et al. (Gene 1983, 24 : 281-287). Cette expression a été effectuée dans des boîtes de culture de 10cm ; les cellules ont été ensemencées La veille de la transfection à une densité de 106 cellules par boite. Les milieux de culture ont été recueillis 4 jours après la transfection et clarifiés par centrifugation. Les surnageants ont été recueillis. Les mono-couches des cellules restant sur les boites de culture ont été lavées deux fois avec le tampon phosphate ou tampon PBS (R. DULBECCO et M. VOGT, J. Exp. Med. 99 (1954) 167), grattées remises en suspension dans 5 ml de ce tampon, puis soumises à un traitement aux ultra-sons. On a obtenu ainsi des lysats cellulaires. La quantité d'IL-I p contenue dans les surnageants et les lysats a été évaluée par un dosage biologique en mesurant la proliférationde la lignée lymphocytaire D10.G4.1 en présence de concanavaline A selon la méthode de KAYE et al., (Lymphokine Res. 3(1984) 175-182). Comme Le montrent Les résultats du tableau 1 ci-après, le plasmide pSV1003 permet une synthèse d'IL-1 sous forme biologiquement active. La quasi totalité de'l'IL-1ss produite est exportée dans le milieu de culture. Tableau I Activite biologique Plasmide (Unités x 1b2/boite) X d' IL-1 recombinant secrétée surnageant Lysat pSV1003 986 21 98 On précisera qu'une unité correspond à 10 pg Lorsque l'on utilise La référence IL-1 obtenue auprès du National Institute for Biological Standards and ControL (Londres). Les cellules CHO DHFR ont été transformées avec le plasmide pSV003 pour établir des lignées cellulaires stables sécrétant l'IL-I p. La transformation stable des cellules CHO DHFR-, la sélection des clones transformés et l'amplification des gênes ont été réalisées selon les techniques décrites par FERRARA et al. (FEBS Lett. 226, (1987) 47-52). 50 colonies DHFR (clones 1003,1 à 1003,50) ont été isolées et mises en culture. La présence de l'IL-1 p dans le milieu de culture a été déterminée par dosage immunoenzymatique (ELISA commercialisé par Cistron). Ce dosage a indiqué que les clones transformés par le plasmide pSV1û03 secrétaient très efficacement l'IL-1 )3. Les clones qui secrétaient les plus grandes quantités d'IL-I a ont été soumis à une procédure d'amplification, en augmentant progressivement les concentrations de méthotrexate dans le milieu sélectif. Plusieurs clones se sont avérés hautement producteurs d'IL-1 p à la concentration de 100 nM de méthotrexate. La meilleure expression a été obtenue pour le clone 1003,26. Lorsque 4 x 105 cellules dece clone ont été ensemencées dans une boite de Petri de 6 cm dans un milieu sélectif contenant 100 nM de méthotrexate et cultivées pendant 4 jours, il a produit 215 ng/ml d'Il-1 ss mature. V - Caractérisation de L'IL-1 B produite par le clone 1003,26 Les cellules du clone 1003,26 ainsi que des cellules CHO DHFR choisies comme témoins ont été ensemencées dans des boites de Pétri de 35 mm, à raison de 4 x 105 cellules par boite. 24 heures plus tard, les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon phosphate (PBS), et pré-incubées dans un milieu MEM dépourvu de méthionine (milieu commercialisé par la société GIBCO) contenant 0,2 X de sérum de veau foetal dialysé (GIBCO), 300 g/ml de L-glutamine et î50jjg/ml de L-proline. Après deux heures, Le milieu de pré-incubation a été éliminé et remplacé par 0,8 ml du même milieu contenant 100,uCi de methionine-(35S) (Amersham 37TBq/mmole). Après une incubation de 16 heures à 37C, les milieux de culture ont été recueillis et clarifiés par centrifugation à 1000 tpm pendant 10 minutes à température ambiante. 200 > uL de chaque surnageant marqué ont été incubés pendant 2 heures à 40C sous agitation avec 10 l de sérum pré-immun de lapin en présence de 200 jil de cellules de Staphylococcus aureus (vendues sous la marque Pansorbin par la société Calbiochem) fixées pour limiter les interactions non spécifiques. Le mélange résultant a été centrifugé pendant 5 minutes à 5000 tpm ; aux surnageants résultants, on a ajouté 5,DL de sérum de lapin anti-IL-1 p humaine (commerciaLisé par la société CISTRON) et 200 l de cellules de Staphylococcus aureus fixées. Ce dernier mélange a été incubé pendant 16 heures à 4 C sous agitation. Les immunoprécipités ont été ensuite traités selon le mode opératoire décrit par KESSLER (Meth. Enzymol. 73 (1981) 442-459) et analysés sur des gels de poîyacryîamide 20 % en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS) selon la méthode de LAENMLI (Nature 1970, 277, 680-685) en utilisant le dispositif "Phast System" de Pharmacia ; on a seche les gels et on les a autoradiographiés. A titre de contrôle, on a utilisé l'IL-1 ss recombinante 125 produite par E. CoLi et marqué par l'iode 125 I. Dans ces conditions, une forme prédominante ayant un poids moléculaire de 22.000 et deux formes mineures de 21.000 et 17.500 ont été immunoprécipités à partir des surnageants des cellules de la Lignée 1003,26, comme cela ressort sur la figure 3 qui est la photographie de l'autoradiogramme sur laquelle a représente l'IL-1 p produite par E. Coli et marquée par l'iode 125 I ; b et d représentent ltIL-1 ss immunoprécipitée à partir des surnageants de culture des cellules du clone 1003,26 (b en absence de tunicamycine et d en présence de tunicamycine) ; c correspond aux cellules CHO-DHFR On a vérifié que la différence de poids moléculaire entre l'IL-1 ss produite par les cellules CHO et celle produite par E.Coli était due à une N-glycolysation de la protéine produite par les cellules CHO. Cette vérification a été effectuée en utilisant la tunicamycine qui est connue pour être un agent inhibiteur de la N-glycosylation. La tunicamycine (SIGMA) a été ajoutée au milieu de culture des cellules de la lignée 1003,26 pendant la préincubation et le marquage, à raison de 10 g/ml, et I'immunoprécipitation a été réalisée comme indiquée ci-dessus. La disparition des deux bandes correspondant aux poids moléculaires enlevés et leur remplacement par une bande unique correspondant à un poids moléculaire de 17.500 montrent que ltIL-1 secrétée par les cellules de la lignée 1003,26 est sous la forme N-glycosylée. REVENDICATIONS 1. Cellules eucaryotes productrices d'interleukine-l mature N-glycosylée, caractérisées en ce qu'elles contiennent, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour l'interleukine-1 ss mature précédée d'une séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine. 2. Cellules eucaryotes selon ta revendication 1, caractérisées en ce que la séquence d'ADN codant pour l'interleukine-1 5 est la séquence d'ADN codant pour l'interleukine-1 d'origine humaine. 3. Cellules eucaryotes selon l'une des revendications î ou 2, caractérisées en ce qu'elles sont des cellules CHO. 4. Procédé d'obtention des cellules eucaryotes productrices d'interleukine-î 9 mature selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste à transfecter des cellules eucaryotes à l'aide d'un vecteur portant, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour I'interleukine-1ss précédée d'une séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine, puis à sélectionner les cellules transfectées productrices d'interleukine-Ifi mature par culture en en milieu sélectif. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les cellules eucaryotes sont des cellules CHO. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que le vecteur porte en outre une séquence codant pour un marqueur de sélection. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, ca acterise en ce que le marqueur de sélection est la dihydrofolate réductase. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le vecteur porte une seule unité d'expression pour la dihydrofolate réductase et l'interleukine-1 9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que le vecteur porte deux unités d'expression distinctes, l'une pour la dihydrofolate réductase et l'autre pour I' interIeukine-I. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour l'interleukine-1 9 mature est celle codant pour I'interleukine-I,B d'origine humaine 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que Le vecteur a les caractéristiques du plasmide pSV1003. 12. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il porte, avec les moyens nécessaires à son expression, une séquence d'ADN codant pour l'interleukine-1 9 mature précédée d'une séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'un des précurseurs de l'hormone de croissance humaine. 13. Vecteur selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il porte en outre une séquence codant pour un marqueur de sélection. 14. Vecteur selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que le marqueur de sélection est la dihydrofolate réductase. 15. Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il porte une seule unité d'expression pour la dihydrofotate réductase et I'interleukine-1ss. 16. Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il porte deux unités d'expression distinctes, l'une pour la dihydrofolate réductase et l'autre pour l'interleukine-1 9. 17. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'il a les caractéristiques du plasmide pSV1003. 18. Procédé d'obtention d'interleukine-I X mature N-glycosylée consistant à mettre en culture des cellules eucaryotes productrices d'interleukine-1 ss, à recueillir le milieu de culture et à séparer des autres constituants l'interleukine-1 | contenue dans ledit milieu, caractérisé en ce que les cellules mises en culture sont issues de cellules eucaryotes transfectées à l'aide d'un vecteur portant à la fois, avec les moyens nécessaires à leur expression, une séquence d'ADN codant pour L'interleukine-1 mature précédée d'une séquence d'ADN codant pour le peptide-signal de l'un des précurseurs naturels de l'hormone de croissance humaine, puis sélectionnées par culture en milieu sélectif.