Brevet FR2640640A1 — publié le 19900622

La présente invention a trait à l'industrie micro- biologique, et se rapporte plus précisément à une nouvelle souche de la bactérie Escherichia coli BKIIM 3-3996 produc- trice de L-thréonine. O5 La L-thréonine est un acide aminé essentiel qui est utilisé comme ingrédient de mélannes nutritifs varies à usage médical. De plus, la L-thréonine peut être utilis e comme ad- ditif dans la nourriture pour animaux, ainsi que comme réac- tif dans l'industrie pharmaceutique et chimique et comme fac- teur de croissance des microorganismes produisant d'autres acides aminés, par exemple la L-lysine et la L-homosérine. On Connait des souches productrices de L-thréonine appartenant à divers groupes de microorGanismes (3revibacte- rium flavum, Serratia marcascens, Escherichia coli et autres). Les producteurs les plus efficaces de L-thr onine sont les souches mutantes de E. coli dont les cellules contiennent des plasmides hybrides porteurs des gènes de l'opéron de la thréo- nine (US, 4278765, 4321325). Parmi celles-ci, la meilleure productrice est la souche VNII genetika M-I (US, 4321325) qui renferme le plasmide r pliqu pYN7, obtenu à partir du vec- teur pBR322 et comprenant dans sa structure l'op ron de la thréonine de la souche E. coli K12 résistante à l'analogue de la thr&onine-l'acide 4 amino- -hydroxyvalérianique. Les gènes de l'opéron de la thréonine du Dlasmide DYN7 codent l'enzyme e double fonction, l'aspartatekinase-homos rine de- hydrogénase, insensible à l'inhibition par la L-thréonine. La souche mentionnée M-I accumule la L-thr onine jusqu'à la concentration de 30 g/l en 40 heures de fermentation en cul- ture dans un milieu auquel est additionné un mélange nutritif de sucre et d'ammoniac qiuand un capteur de pH donne le sianal pour l'addition. La souche mentionnée ci-dessus est caractérisée par une faible productivité et une stabilité insuffisante du plas- mide, ce qui rend nécessaire l'utilisation d'antibiotiques pour conserver le plasmide durant le processus de fermentation. Le but de la présente invention est de créer une nouvelle souche de bactéries permettant d'obtenir un rende- ment élevé de L-thréonine en un temps de fermentation plus ccurt, possédant un plasmide de haute stabilité et n'exigeant pas l'adjonction d'antibiotiques pendant le processus de fer- mentation. Ce problème est résolu selon l'invention gràce à une nouvelle souche de bactéries Escherichia coli BKIIM B- 3996 productrice de L-thréonine, renfermant le plasmide de recombinaison pVIC40, déposée le 19 novembre 1987 dans la collection des cultures de microorganismes de Vsesojuzny nauchno-issledovatelskv institut antibiotikov et enreais- trée sous le numéro 1867. La souche selon l'invention est nouvelle et n'a pas été décrite dans la littérature. Elle permet d'obtenir 85 a/l de L-thréonine en 36 heures de fermentation. La souche selon l'invention renferme le plasmide de recombinaison pVIC40 qui porte le même frag- ment de chromosome de E. coli que le plasmide pYN7 de la sou- che connue E. coli VNII genetika M-I qui code les gènes de la biosynthèse de la L-thréonine, et transmet aux cellules la résistance à l'antibiotique streptomycine. A la différen- ce d'avec pYN7, le nouveau plasmide se conserve de façon sta- ble dans les cellules au cours de leur croissance en milieu non sélectif. La souche selon l'invention est obtenue en quel- ques étapes à partir de la souche connue E. coli VNII genetika M-1. Dans une première étape de préparation de la nouvel- le souche, on transmet à la souche mentionnée ci-dessus à l'aide de la transduction par le phage P I cultivé sur une souche assimilant le saccharose, le déterminant génétique de l'assimiltation du saccharose. La bactérie transformée obte- nue est capable d'utiliser le saccharose et les substrats en contenant, par exemple, la mélasse, comme source de carbone. Dans une deuxième étape, on sépare de la souche 2'640640 transformée sus-mentionnée assimilant le saccharose, les mu- tants spontanés capables de croître sur un milieu minimum M9 contenant des concentrations inhibitrices de L-thrgonine (5 mg/ml). Un de ces mutants, E. coli VNII genetika-472T23 (déposé & la collection nationale de microorganismes indus- triels de Vsesojuzny nauchno-issledovatelsky institut gene- tiki i selektsii promyshlennykh mikroorganizmov et enregis- tré sous le numéro BKIIM B-3207) ayant acquis à la fois de la stabilité vis-à-vis non seulement de la L-thréonine mais encore vis-a-vis de la L-homosérine, est utilisé pour la sé- lection ultérieure. Dans une troisième étape, on obtient à partir de la souche mentionnée E. coli VNII genetika-472T23, à l'aide de la transduction par le phage PI cultivé sur une souche mutante d'E. coli K12 dans laquelle est inséré le transposon Tn5b gentdh qui code l'enzyme thréoninedéhydrogénase parti- cipant à la dégradation de la L-thréonine, un transductant chez lequel l'activité de cette enzyme est complètement per- due. Le transductant obtenu VNII genetika-T I -6 (déposé à la collection nationale des microorganismes industriels de Vsesojuzny nauchno-issledovatelsky intitut genetiki i se- lektsii promyshlennykh microorganizmov et enregistré sous le numéro BKIIM B-3420) a perdu également la capacité de dégra- der la L-thréonine produite. Le clone apparu spontanément privé des propriétés déterminées par le plasmide pYN7, du fait de la perte de ce- lui-ci aar les cellules, est ensuite séparé de la souche VNII genetika-T Tr -6. Un nouveau clone producteur est obtenu par suite de la transformation génétique du plasmide pVIC40 des cellules de la variété privée de plasmide de la souche VNII génétika-T r -6. Le nouveau plasmide hybride pVIC40 est obtenu grâce à l'action des restrictases Bam HI et Pst i suivies d'une po- lynucléotidase sur le plasmide connu pYN7 (US 4278765), ainsi que sr le plasmide vecteur pAYC32 (Chistoserdov A.Y., Y.D. Tsygankov, Broad host range vectors derived fron an PSFIOIO- Tnl plasmid, Plasmid, 1986, v. 16, 161-167) dérivés des-plasmi- des connus pRSFIOIO et pBR322 et caractérisé par une grande stabilité à l'intérieur des cellules d'E. coli. On a transfor- m à l'aide du plasmide obtenu, après liaison, les cellules de la variété privée de plasmide de la souche VNII genetika- T T -6 et qui a besoin de L-thréonine. Dans un milieu gélosé minimum M9 dépourvu de L-thréonine mais contenant de la strep- tomycine (100 pg/ml) on a ensuite séparé des colonies trans- formées. Le plasmide pVlC40 a été mis en évidence, à partir des cellules d'une de ces colonies transformées. Sa masse soléculaire est de 9,7 mégadaltons. Le plasmide pVIC40 est composé des fragments suivants: - le fragment BamHI-PstI du plasmide vecteur pAYC32 de 7600 paires de nucléotides contenant le gène de la résistance à la streptomycine; - le fragment BamHI-PstI du plasmide pYN7 de 7000 paires de nucléotides contenant le gène d'E. coli pour la biosynthè- se de la thréonine (thr A, thr B, thr C). Le plasmide pVIC40 a des fragments uniques pour la reconnaissance des restrictases BamHl et Pst 1. La souche selon l'invention est caractérisée par les propriétés morphologiques, biochimiques et des cultures cellulaires suivantes: a) Morphologie des cellules. Ce sont des bâtonnets à bouts arrondis, Gramm-néga- tifs, peu mobiles, d'une longueur de 1,5 à 2 pm. b) Propriétés des cultures cellulaires. Sur un milieu gélosé additionné de bouillon conte- nant de la peptone: au bout de 24 heures, à une température de 37 C, il se forme des colonies rondes blanchâtres semi- transparentes de 1,5 à 3 mm de diamètre; la surface de ces colonies est lisse, leurs bords sont réguliers ou légèrement ondulés, leur centre est surélevé, leur structure homogène, leur consistance pâteuse, les colonies sont facilement émul- sifiées. Sur un milieu Agar de Louria. Au bout de 24 heures de croissance, à une température de 37 C, il se forme des colonies blanchâtres semitransparentes de 1,5 à 2,5 mm de diamètre, à surface lisse, aux bords réguliers, de structure homogène, de consistance pateuse, facilement émulsifiées. Sur milieu minimum gélosé M9, au bout de 40 à -48 heures de croissance, à une température de 37 C, il se l forme des.colonies de 0,5 à 1,5 mm de diamètre, de couleur gris-blanc, semi-transparentes, un peu convexes avec une sur- face brillante.. Dans un bouillon additionné de peptone, la vitesse spécifique de croissance à une température de 37 C est de 1,3-1h. Apres 24 heures de croissance, l'opacification est régulière et l'odeur spécifique. c) Propriétés physicochimiques et biochimiques. Croissance sur agar après ensemencement par piqûre. La croissance est bonne tout au long du canal de la piqûre. Le microorganisme est un germe anaérobie facultatif qui ne liquéfie par la gélatine, se multiplie bien dans le lait en le coagulant, et ne forme pas d'indole. Influence de la température. La souche se multiplie dans un bouillon additionné de peptone à une température de 43 C et moins. La température optimale est de 37 à 38 C. Influence du pH du milieu. La souche se multiplie dans des milieux liquides de pH allant de 6 a 8, le pH opti- mal étant de 7,0. Influence des sources de carbone. La souche se mul- tiplie bien en présence de saccharose, de glucose, de fructo- se, de lactose, de mannose, de galactose, de xylose, de gly- cérine, de mannite en formant de l'acide et du gaz. Influence des sources d'azote. La souche assimile l'azote sous forme d'ammonium, de sels d'acide nitrique, ainsi que l'azote de certains composés organiques. Elle est résistante à la streptomycine, à la L-thréo- nine et à la L-homosérine. La L-isoleucine est un stimulant de sa croissance. Contenance en plasmides. Les cellules renferment le plasmide hybride repliqué pVIC40 (de masse moléculaire 9,7 mé- gadaltons) qui assure la résistance de la souche à la strepto- mycine et porte les gènes de l'opéron de la thréonine. Formation d'amino-acétone. Lors de sa croissance en présence de L-thréonine elle ne forme pas d'amino-acétone. Stabilité du plasmide. La souche selon l'invention est caractérisée par une capacité élevée à conserver le plas- mide lors de sa croissance en l'absence d'une pression sélec- tive destinée à soutenir le plasmide. L'obtention de la L-thréonine à l'aide de la nouvel- le souche productrice selon l'invention s'effectue de la ma- nière décrite ci-dessous. On cultive une souche d'E. coli BKIIM B-3996 en mi- lieu gélosé M9 additionné de streptomycine, et on ensemence un milieu de culture liquide avec une suspension de cellules cultivées. Ce milieu contient une source de carbone, d'azote, les sels minéraux indispensables, ainsi que de façon opticn- nelle un ajout nutritif sous forme d'hydrolysats de substrats protéiniques. La culture s'effectue dans des conditions de pH constant, soit 6,8 à 7,2, à une température de 36 à 38 C avec aération et agitation permanentes. Le matériel préparé de cette façon ou une suspension de cellules séparées de l'agar par lavage sont utilisés pour l'ensemencement du mi- lieu de fermentation contenant une source de carbone, d'azote, des sels minéraux, ainsi qu'un ajout nutritif sous forme d'hydrolysats de substrats protéiniques (en cas d'ensemence- ment en faible quantité cet ajout permet de diminuer la durée de la fermentation; en cas d'ensemencement abondant, sa pré- sence n'est pas obligatoire). La fermentation s'effectue dans des récipients à fermentation pourvus d'un système de maintien du pH à un niveau constant de 6,8 à 7,2, à une température de 36 à 38 C avec aération et agitation permanentes. Pour maintenir le pH a un niveau constant, on utilise soit de l'eau ammoniacée, soit un mélange nutritif additionnel de sucre et d'ammoniac équilibré en carbone et en azote. La durée de la fermentation dépend de la quantité de matériel ensemencé et du degré d'en- richissement du milièu de fermentation en facteurs de crois- sance et oeut varier de 24 à 50 heures. A la fin de la fer- mentation 70 a 85 g/1 de L-thréonine sont accumulés. La d - pense spécifique de carbone nécessaire à la synthèse de 1 g de L-thréonine est de 2 a 2,3 g. Au cours du processus de fermentation, on ne cons- tate pas de perte de plasmide. Pour une meilleure compréhension de la présente in- vention, on présente les exemples suivants de culture de la co.secn l'init/m airsi cpqu'uefure rnréetatntunsd-a qui illustre le mo- de de construction du nouveau plasmide pVIC40 contenu dans la souche selon l'invention. EXEMPLE 1 On cultive une souche des bactéries Escherichia coli BKIIM B-3996 dans un milieu gélosé M9 contenant du sac- chrose (9,2 % en poids) et 100 pg/ml de streptomycine. Les cellules cultivées pendant 2 jours sont mises en suspension dans une solution à 0, 9 % de chlorure de sodium et 10 ml de suspension titrés à 108 sont utilisés pour l'ensemencement de 500 ml de milieu de composition suivante, comprenant en % en poids: saccharose 4,0 (NH4)2S04 0,5 KH2 P04 0,2 Mg S04.7H,0 0,04 mg S0 4.7H2000 Fe SO 7H 2 0,002 4' 2 Mg S04.5H,0 0,002 autolysat de levures 0,2 eau Q. S. P. 100. Le matériel d'ensemencement est cultivé pendant 20 heures dans des récipients à fermentation de laboratoire de capacité de 1,2 1 sous aération (0,5 1/min) et en mélangeant le tout à la vitesse de 10O tours/minute à la température de 37 C. Le pH est maintenu automatiquement dans les limites de 6,9 + 0,2 par addition d'eau ammoniacée. On ensemence un volu- me de 500 ml de milieu de fermentation à l'aide de 50 ml de matériel d'ensemencement titré à 7 à 8.109. La composition du milieu de fermentation est la même que celle du milieu d'ense- mencement, sauf que la concentration du saccharose est de 3 % en poids et qu'on ajoute du chlorure de sodium à raison de 0,06 % en poids. On effectue la fermentation dans des récipients à fermenter de laboratoire de capacité 1,2 1 en aérant à raison de 0,5 1 d'air par minute et en mélangeant le tout à une vi- tesse de 1200 tours/minute et à une température de culture de 37 C. Le niveau du pH est maintenu automatiquement dans les limites de 6,9 + 0,2 à l'aide de l'addition automatique d'un mélange nutritif additionnel de sucre et d'ammoniac compre- nant une solution de saccharose à 70 % et de l'eau ammoniacée à 25 % dans des proportions de 3,6/1 en volume. La fermenta- tion s'effectue mendant 36 heures. On obtient 85 g/1 de L- thréonine. La proportion de cellules ayant perdu leur plasmi- de est de moins de 1%. EXEMPLE 2 Le processus de culture de la souche selon l'inven- tion s'effectue de manière analogue à celle décrite dans l'exemple 1, sauf que le matériel d'ensemencement cultive est dilué dans une solution à 0,9 % de chlorure de sodium jusqu'à l'obtention d'un titre de 102, 1 ml de cette suspension est ensuite utilisé pour l'ensemencement de 500 ml du milieu de fermentation de composition analogue à celle mentionnée dans OS l'exemple 1, à l'exception d'une augmentation de sa teneur en autolysat de levures jusqu'à 0,5 % en poids. On effectue la fermentation dans des conditions analogues à celles de l'exem- ple 1 pendant 50 heures. On obtient la L-thréonine en concentration égale à 79 g/l. La proportion de cellules ayant perdu leur plasmide est de moins de 1 %. REVENDICATION Souche de bactéries Escherichia coli BKIIM B-3996 productrice de L-thréonine contenant le plasmide de recom- bLnaison pVIC40 déposé le 19 novembre 1987 dans la collec- tion des cultures de microorganismes de VNII antibiotikov et enregistré sous le numéro 1867.