Brevet FR2638170A1 — publié le 19900427

La presente invention concerne un système de détection de bactéries dans un milieu suppose stérile ainsi qu'un procede de mise en oeuvre de ce systéme. Les bactéries peuvent se revéler etre de redoutables agents pathogènes chez l'homme ou l'animal et la detection de leur presence dans des substances biolo giques, notamment le sang. ou des substances entrant en contact avec le corps humain ou animal, reste un problême actuel. Actuellement, en bacteriologie, la technique de l hemoculture pour la recherche de bactéries dans le sang est communément utilisée. Elle consiste à prélever du sang stérilement et à l introduire dans un flacon contenant un milieu stérile approprié à la pousse ou culture bactérienne. Ces milieux appelés bouillons d'hémoculture" sont des milieux aqueux, liquides ou faiblement gelosés. plus rarement des milieux diphasiques. Le choix de ces milieux de culture reste assez empirique. En général, ils comprennent des peptones auxquelles sont rajoutés des éléments favorables à la multiplication bactérienne comme par exemple - des facteurs de croissance (par exemple hémine, NAD) pour les germes exigeant notamment Actinobacillus Actinomycetem Comitans, Haemophilus spp., Cardiobactérium Hominis, Eikenella Corrodens - du saccharose (evite la lyse des bactéries à paroi déficiente) - du polyanéthol sulfinate de sodium (SPS) anticoagulant favorable pour certaines bactéries, toxique pour d'autres - des molécules à groupement thiol qui favorisent la croissance des germes anaerobies. Ces milieux de culture étant prêts à l'emploi et conservés à température ambiante, certains facteurs de croissance labiles ont une durée de conservation très courte. La visualisation dune culture bactérienne se fait genéralement par deux techniques t. Une technique d'observation visuelle appelée "mirage des flacons d'hémocultures" qui consiste en la recherche des différents signes plus ou moins évocateurs d'une pousse microbienne (trouble du bouillon, apparition de colonies sur milieu gélosé, hémolyse. production de bulles de gaz, etc.J. 2. Une technique de mise en évidence du dégagement de CC2 produit par le métabolisme des bacteries. La production de C02 étant détectee par un spectromètre à infra-rouge soit par la détection d'une augmentation de volume de gaz à pression sensiblement constante par le déplacement d'un piston situé sur le flacon. Ces techniques souffrent de plusieurs inconvénients : Technique N' 1 : le moment de l'observation de 1 hémoculture pour juger si elle est positive ou négative est souvent postérieur d'au moins ?4 heures après sa mise en route et s'effectue de 24 en 24 heures. Cette durée peut meme être de 4 à 7 jours. comme le soulignent les travaux de DENtS F., MOUNIER M., TOTYL, LABROUSS F., Médecine et Maladies Infectieuses, 1985, 10. 525-528. Ainsi sur 2200 flacons positifs, 85,2 Z de ceux-ci l'ont été en 4 jours et 95,2 Z en 7 jours. Cette duree fort longue peut être extrêmement préjudiciable à l'entre prise d'un traitement de la maladie. Certains germe tels que germes déficients, formes L, Mycoplasmes ne troublent pas les bouillons de culture et conduisent ainsi par l'utilisation de cette seule technique à des faux négatifs. Certains germes tels que Brucella, Campylobacter (pylorics. foetus ou intestinalis), Succini vibrio ou levure (Cryptococcus > poussent très difficilement dans les milieux de culture usuels et leur détection exige parfois jusqu'à 15 jours de culture. La technique N'2 exige un appareillage de manipulation difficile it couteux s'il comporte un spectrométre. Afin de pallier ces inconvenients, la Demanderesse s'est fixe comme but d'obtenir un système de détection de bactéries pouvant mettre en évidence plus rapidement la présence de bactéries et très facile à mettre en oeuvre par un procédé extrêmement simple. De manière plus précise encore, la Demanderesse s'est fixe comme but d'éliminer les faux négatifs de la détection de bactéries avant 48 heures, mesurees à partir de l'instant du prélévement et ceci avec une fiabilite superieure aux techniques classiques. Dans d'autres domaines, la Demanderesse s'est fixé comme but de pouvoir contrôler la qualité quasistérile des produits alimentaires ou cosmetiques à l'aide d'un moyen peu couteux et facile à mettre en oeuvre, et extrêmement fiable. Ces buts sont atteints par la présente invention qui comprend un système de détection de bactéries qui se caractérise en ce qu'il comporte comme constituants (a) au moins un substrat organique dont le catabolisme par les bactéries produit une base libre ou de l'ammoniac et/ou du dioxyde de carbone ; (b) un moyen indicateur de variation du pH. Selon un aspect préféré de la présente invention1 le moyen indicateur de variation du pH sera constitué par un indicateur coloré notamment rouge de phénol ou bleu de bromothymol, apte à virer entre un pH légèrement acide et un pH légèrement basique. D'autres moyens indicateurs de pH pourraient etre utilisés, par exemple une electrode de mesure de pH, reliée à un pH-mètre. Selon un aspect encore préféré, le(s) substrat(s) est (sont) choisis parmi les L-alpha-aminoacides et leurs sels et l'urée, afin de mettre en oeuvre au cours du fonctionnement du systéme de détection la réaction connue de décarboxylation ou de désamination des acides aminés de configuration naturelle et/ou de l'urée par les décarboxylases des bactéries. Selon un autre aspect préféré, les L-alphaaminoacides sont choisis dans le groupe constitué par la L-lysine, la L-ornithine, la L-arginine. Selon un autre aspect de l'invention, afin d'obtenir la multiplication rapide des bactéries à détecter, le système de détection comporte en outre comme constituant(s) supplémentaire(s) au moins un facteur de croissance du nombre de bactéries, notamment sérum de poulain, extrait de levure et analogues. L'objet le plus préféré selon la présente invention sera un système de détection des bactéries dans un milieu qui se-caractérise en ce qu'il comporte comme substrats de la L-lysine, de la L-ornithine, de la L-arginine ou leurs sels, de l'urée, du rouge de phénol. Cette palette de substrats permet à un maximum de bactéries connues de reconnaitre au moins un de ces substrats et de mettre en activité au moins une de leurs décarboxylases ou désaminases pour soutenir leur métabolisme. La décarboxylation ou désamination du ou des substrat(s), avec ou sans dégagement du gaz carbonique provoque, par perte d'acide carbonique ou par libération de NH3, une augmentation du pH mise en évidence par le virage du rouge de phénol. Pour des considérations de conservation et de bonne mise en oeuvre, tous les constituants ci-dessus sont de préference à l'état déshydraté, les facteurs de croissance particulièrement fragiles étant sous forme lyophilisée. Avec ce dernier système de détection, le pourcentage de faux négatifs est diminue de façon notable en comparaison des techniques conventionnelles, à partir du prélèvement sanguin. ce qui constitue un avantage important pour la bonne thérapie du malade, En effet, le systéme de détection de la pre- sente invention permet de visualiser l'activité enzymatique de décarboxylation des bacteries du genre transformant la L-lysine en cadavérine. Or l'activité enzymatique des bactéries est très rapide et précède souvent la culture de la souche elle-meme (donc le trouble du bouillon), ce qui entraine meme pour les bactéries classiques troublant le bouillon, un gain de temps utile pour le repiquage hâtif de l'hèmoculture et donc pour le rendu d'un résultat d'antibiogramme qui, dans certains cas, peut sauver un malade atteint de septicémie. La présente invention comprend egalement un procédé de mise en oeuvre du système de detection exposé ci-dessus qui se caractérise en ce qu'on effectue les étapes suivantes (a) on mélange une partie aliquote du milieu avec une partie aliquote du ou desdits substrats en évitant toute contamination externe au milieu et en ajoutant, si nécessaire, de l'eau pour obtenir une phase aqueuse Ibl on incube le mélange obtenu à une temperature optimale de multiplication des bactéries comprise généralement entre 37 et 37,5-C Icl on note au cours du temps la variation du pH. En bactériologie, le milieu est un milieu d'hémoculture. Pour la detection de germes ne troublant pas le milieu d'hémoculture au stade (a), on mélange une partie aliquote du milieu d'hemoculture ne contenant pas d'hématies, de préférence à 24 heures de la mise en hémoculture du prélèvement sanguin. D'autres aspects et avantages de l'invention ressortiront d'ailleurs de la description d'exemples qui va suivre, donnée à titre purement illustratif. Exemole t Un bouillon d'hémoculture classique est addi tionné du système de détection- selon la présente invention comprenant de la L-lysine et du rouge de phénol (milieu A). Le même bouillon de culture auquel on n'ajoute pas le système de detection selon l'invention sert de temoin (milieu B). Les milieux A et B sont addi tionnés chacun de 10 ml d'un meme prélèvement sanguin et mis en étuve thermostatée. Le milieu A vire du jaune au rouge au bout de 24 heures, décelant ainsi la présence de bactéries. Le milieu B se trouble seulement au bout de 48 heures. ExemDle 2 Un bouillon d'hémoculture est additionné d'un prélèvement sanguin de 10 ml de sang, en temps t = O. Au temps t = 24 heures, le bouillon décanté A est toujours limpide. Le surnageant au-dessus des hématies est prélevé aseptiquement par une aiguille vacutainer par perçage du bouchon en matière élastomère qui obture un récipient ou les constituants L-lysine, L-ornithine, L-arginine, rouge de phénol, sérum de poulain. gélatine (neutralisé, soit du SPS), sont conditionnés à l'état déshydraté, sous vide, à l'abri de toute contamination extérieure. Le vide transvase une partie aliquote du milieu de culture limpide dans le récipient. Cet ajout de liquide dissout les constituants déshydratés pour donner une solution jaune. L'aiguille est retirée du bouchon, ce qui provoque la fermeture du canal créé par l'aiguille. Cette fermeture empeche la contamination ulterieure de l'intérieur du récipient par des contaminants venant de l'extérieur. Le récipient est mis en étuve. Au. bout de 48 heures, on observe un virage au rouge que l'on peut aussi déceler par colorimétrie à l'aide d'un colorimètre. Les bactéries détectées peuvent être du genre de celles ne tro blant pas un milieu de culture du genre des Mycoplasmes, des formes L, des germes déficients, des germes aérobies stricts ou même des germes en bac tériostase due à la présence dans le sang du malade d'anticorps ou d'antibiotiques ou de SPS. Comme le surnageant a été prélevé à 24 heures, il peut s'agir aussi de germes comme 8rucella, Campylobacter (pyloridis, foetus voire-intestinalis), Succini Vibrio, ou levure (Cryptococcus1 qui, dans des milieux de culture usuels mettent parfois jusqu'à 15 jours à se révéler alors qu'ils possèdent des uréases très actives. Comme le systeme de détection contenait de la gélatine. élément neutralisant la toxicité du SPS vis-å- vis de certains germes isoles exceptionnellement dans les hémocultures classiques, les bactéries mises en évidence peuvent être également du genre Mycoplasmes. Gardnerella, Neisseria Meningitidis. Streptobacillus Monoliformis, Streptopeptococcus et analogues. 11 est remarquable que les réactions de décarboxylation et de désamination se réalisent toutes dans les mêmes conditions. Aussi permettent-elles de visualiser aussi bien la présence d'un germe aérobie strict (Pseudomonodaceae et analogues) qu'un germe aéroanaérobie facultatif (par exemple CollibacilleJ, microaérophile {Mycoplasme, Campylobacter) ou anaérobie strict. Dans le procédé ci-dessus, l'utilisation du surnageant de l'hémoculture de 24 heures (absence d'éléments figurés du sang) évite l'acidification due au métabolisme des hématies présentes lors de l'incubation des hémocultures (consommation du glucose et production de CO2 avec diminttion du pH). Cette activité glucidolytique étant moins rapide que les réactions de décarboxylation, elle ne masque jamais ces dernières. Tout au plus, un phénomène de dioxie peut se produire : virage au rouge dans un premier temps puis virage au jaune paille de l'indicateur coloré (rouge de phénol) dû à une réacidification par effet glycolvtique, Sans connaitre le genre des bactéries mis en évidence par le système de detection selon la présente invention, un antibiogramme est réalisé aussitôt que le virage au rouge est detecté. A cette fin. on prélève des quantités aliquotes de bouillon decanté A et on les place dans une série de cupules d'une galerie pour un antibiogramme par inhibition du métabolisme, notamment pour les germes ne troublant pas le bouillon d'hémoculture A. La galerie comporte huit paires de cupules successives. La premiere paire sert de témoin; elle contient le même mélange de constituants selon l'invention qui a mis en évidence la présence de bactéries dans le prélèvement sanguin. Les autres paires de cupules contiennent chacune, en plus de ce melange de constituants, un antibiotique représentatif d'une famille déterminée. L'antibiogramme se fait d'une manière habituelle dans un environnement aseptique. La présence d'une ou de plusieurs paires de cupules dont le contenu ne vire pas au rouge au cours du temps à la différence du témoin permet de choisir l'antibiotique correspondant en vue du traitement thérapeutique du malade. Exemple 3 Aux constituants du système de détection de l'exemple 2, il est rajouté des produits detoxifia-nts, notamment cystéine et acides gras pour augmenter les chances de culture des germes exigeants ainsi que des extraits de levures pour la culture des streptocoques deficients. Exemple 4 Un milieu selon l'invention a la composition suivante - gélatine 1 g/l - saccharose BO g/l - hémine 5 mg/l - vitamine K3 0,5 mg/l - NAD 10 mg/l - Agar 20 gil - peptone 0,6 g/l - L-ornithine, HCl 20 g/l - L-lysine, HCL 20 g/l - 5'-pyridoxalphosphate 0,05 g/l - extrait de levure 0,4 g/l - NaCl 3g/l -*KH2PO4 0,2 g/l -NA2HPO4 0,2 g/l - glucose 2 g/l - urée 8/10 g/l - rouge de phénol 0,04 g/l - L-arginine, HCI 20 g/l - eau qsp pour 1 litre il est préparé extemporanément par ajout d'eau stérile aux composés déshydratés. ExemDle 5 Des essais de tels diagnostics rapides ont été effectues au Centre Hospitalier Général de Hyères (France) et ont donné des résultats montrant une augmentation de près de 30 % des diagnostics de choc septique par rapport à une même période antérieure comparable. Le système de detection de la présente invention ne nécessite aucun appareillage particulier et peut donc etre non seulement mis en oeuvre dans les laboratoires de pays en voie de développement. mais aussi dans les services hospitaliers (réanimation, cancerologie, chambres stériles, etc.) où le personnel meme non spécialisé peut, non seulement, dépister rapidement la présence d'une septicémie, mais aussi visualiser l'effi cacite ou l'inefficacité d'un traitement antibiotique en cours. il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification, notamment au niveau des équivalences techniques, pourra y être apportée sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Système de détection de bactéries dans un milieu supposé stérile, caractérise en ce qu'il comporte comme constituants (al au moins un substrat organique dont le catabolisme par les bacteries produit une base libre ou de l'ammoniac et/ou du dioxyde de carbone et (b) un moyen indicateur de variation de pH. 2. Système selon la revendication 1, caractérise en ce que le pH est compris entre un pH légèrement acide et un pH légèrement basique. 3. Système selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le ou les substrat(s) sont choisis parmi les L-alpha-aminoacides ou leurs sels, notamment chlorhydrates, et l'urée. 4. Système selon la revendication 3, caracté- risé en ce que les L-alpha-aminoacides sont choisis dans le groupe constitué par la L-lysine, la L-ornithine, la L-arginine. 5. Système selon la revendication 4, caractérise en ce qu'il comporte comme substrats la L-lysine. la L-ornithine, la L-arginine ou leurs sels et l'urée. 6. Système selon l'une des revend-ications précédentes, caractérise en ce que le moyen indicateur est un indicateur coloré choisi dans le groupe comprenant le rouge de phénol et le bleu de bromothymol. 7. Système selon l'une quelconque des revendi-cations précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre comme constituant(s) supplémentaireIs) au moins un facteur de croissance du nombre de bactéries, 8. Système selon la revendication 7, caractérisé en ce que le ou les facteurs de croissance sont choisis parmi le sérum de poulain, l'extrait de levure et analogues. 9. Systeme selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que le ou les facteurs de croissance sont chacun sous forme lyophilisée. 10. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caracterise en ce que tous les constituants sont à l'état déshydraté. 11. Système selon l'une quelconque des revendications t à 10, caractérisé en ce que les constituants sont conditionnés sous vide dans un récipient hermétique et à l'abri de toute contamination extérieure. 12. Système selon la revendication t1, carac grisé en ce que le récipient est muni d'un bouchon en une matière élastomère, apte à etre percée d'un canal par le passage d'une aiguille creuse, ce canal étant apte à se refermer par enlèvement de l'aiguille. 13. Procédé de détection de bactéries dans un milieu suppose stérile à l'aide d'un système selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on y effectue les etapes suivantes (a) on mélange une partie aliquote du milieu avec une partie aliquote du ou desdits substrats en évitant toute contamination externe au milieu et en ajoutant, si nécessaire, de l'eau pour obtenir une phase aqueuse (b) on incube le mélange obtenu à une tempéra- ture optimale de multiplication de bactéries comprise généralement entre 37 et 37,5-C (c) on note au cours du temps la variation du pH. 14. Procédé selon la revendication 13, carac térise en ce que le milieu est un milieu d'hémoculture, 15. Procéde selon la revendication 14, carac térisé en ce que au stade (a) le milieu d'hémocuiture ne contient pas d'hématies. 16. Utilisation d'un système selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour l'établissement d'un antibiogramme par inhibition du métabolisme, notamment pour les germes ne troublant pas les bouillons d'hémocultufe.