Brevet FR2641545A1 — publié le 19900713

Procédé de biosvnthése du xviltol L'invention a pour objet un procédé industriel de blosynthese du xylitol. Le xylitol est un sucre-alcool a cinq atomes de carbone. de formule brute C5H1205, obtenu essentiel le- ruent par reduction du xylose. Tres voisin du saccharose par son pouvoir sucrant et sa valeur alimentaire. cet edulcorant possède certaines propriétés physiques, chimiques et biochimiques qui justifient l'intérêt que les hygiénistes et diététiciens lui accordent depuis environ dix ans, notamment son inactivité vis-a-vis des processus de fornation de la carie dentaire et son métabolisme indépendant de l'insuline. ce qui permet son utilisation par les diabétiques. I1 convient également de noter son inertie chimique vis-a-vis de la réaction de Mail lard. En effet. ne possedant pas de groupement carbonyle réducteur. il ne peut réagir avec les acides aminés pour donner des produits bruns. De plus. s'agissant d'un monosaccharide, il ne peut, contrairement au saccharose, subir une inversion, ce qui autorise son emploi en milieu acide, sans risque d'altération. Enfin. sa température d'ébullition de 95*C peut être atteinte sans denaturation, ce qui présente l'avantage important de n'avoir pas a le dissoudre dans l'eau, par exemple pour l'utiliser dans des enrobages. Le xylitol existe à l'état naturel dans de nombreux fruits et légumes. mais a des concentrations tel liement faibles que son extraction å partir de telles sources ne peut être envisagee au plan industriel. Compte tenu de cette impossibilité d'obtenir industriellement du xylitol par extraction, on s'est adresse 3 sa synthése b partir d'un produit facilement accessible, le xylose qui peut lui-meme être obtenu aisément a partir de produits naturels. L'obtention du xylitol est basée sur la transformation, en quatre étapes, des xylanes de la matière végétale. selon le schéma général suivant - hydrolyse des matières premières - purification de l'hydrolysat pour obtenir du xylose pur - hydrogénation du xylose en xylitol ; et - cristallisation du xylitol. Il est en principe possible d'obtenir le xylitol par réduction du xylose selon trois voies différentes, a savoir la voie chimique. la voie biochimique et la voie biologique. La voie chimique consiste en une hydrogénation catalytique des "complexes sucre". Elle peut être réalisée par le borohydrure de sodium, ou plus classiquement par le nickel de Raney, dans des conditions de température et de pression variables d'une technique a l'autre. Selon la voie chimique, quelle que soit la technique particulière utilisée, en fin de réaction on est en présence d'un mélange de polyalcools dont le xylitol. en proportion plus ou moins élevée, doit etre extrait. Actuellement, on ne dispose pour ce faire que de techniques lourdes a mettre en oeuvre telles que la chromatographie suivie d'une cristallisation. Les spécialistes en ce domaine ont donc. depuis quelques années, conscience de l'intérêt qu'il y aurait a développer une technique industrielle d'hydrogénation sélective du xylose en xylitol. On a pour ce faire eu l'idée d'avoir recours a des procédes biochimiques ou biologiques. Les procédés biochimiques n'ont pu jusqu'à présent être développés en raison notamment des doutes qu'il existe quant a la sécurité de l'utilisation d'enzymes pour la fabrication de produits industriels destines å l'usage alimentaire. Les procédés biologiques devraient pouvoir apporter une solution satisfaisante aux problèmes inhérents aux autres techniques, tels que réduction non sélective des sucres dans les procédés chimiques et incertitudes quant à la sécurité des procédes biochimiques. L'hydrogenation des sucres en alcool par voie biologique présente une spécificité marquée, Ainsi, partant d'une solution hétérogène de sucres. on peut envi- sager de ne réduire que le xylose ou xylitol, les autres sucres restant inchangées. La purification ulterieure du xylitol s'en trouvera considérablement simplifiee. On savait que certaines levures cultivées sur un milieu contenant du D-xylose comme sources de carbone et d'énergie produisent du xylitol comme produit secondaire métabolique. Partant de cette connaissance. on a eu l'idée de rechercher des souches naturelles ou mutantes de levures qui, au lieue l'éthanol, seraient capables de produire, au moins dans certaines conditions, princi palment, ou si possible exclusivement, du xylitol à partir de D-xylose. C'est ainsi que Cheng-Shung GONG et coll. ont présenté dans Biotechnology Letters, 3(3). 130-135 (1981) une souche mutante de Candida troDicalis capable de produire. de manière quantitative, du xylitol à partir de D-xylose. D'après les résultats annoncés, cette souche permet de convertir en xylitol 96 X du D-xylose consommé, lorsqu'elle est cultivée en aérobie dans un milieu VME (Yeast = levure, Malt, ixtract-peptone = extrait de peptone) contenant du D-xylose, Le milieu en question est en fait très riche puisqu'il contient 3 g/i d'extrait de levure, 3 g/l d'extrait de malt et 5 g/i de peptone. Les résultats annonces ont été obtenus sur 100 mi et le niveau d'ensemencement ainsi que les conditions d'aération ne sont pas précisés. Aucune indication n'est donnée quant aux possi- bilites d'une éventuelle transposition de cette production en erlenmeyer de 250 ml a une production industrielle. De toute façon, à supposer même qu'une telle transposition soit possible. la richesse du milieu utilisé interdirait toute exploitation industrielle rentable. De plus, il est à craindre que l'utilisation d'une souche mutante ne se heurte 9 des interdictions administratives. S'intéressant toujours au problème de la conversion biologique du D-xylose en xylitol, GONG et coll. ont examiné vingt souches de Candida appartenant à onze espèces différentes. Les résultats de leur etude sont résumés dans Biotechnology and Bioengineering 25, 85-102 (1983). Il y est indiqué que les bons producteurs de xylitol sont Candida parapsilosis ATCC28474 et les cinq souches de Candida tropicales testées. Ici encore. le milieu de culture utilise est tres riche (c'est le même que précédemment). Son volume est encore plus faible (10 ml) et les conditions d'aération ne sont pas précisées, Au surplus. l'inoculum utilisé est très important (1 à 3.108 cellules/ml), ce qui exclut. compte tenu des coûts de préparation de l'inoculum, toute transposition industrielle rentable. à supposer meme qu'elle soit techiquement possible, les étapes du procédé n'etant pas indiquées. Par la suite Li-Fu CHEN et Cheng-Shung GONG ont étudié la possibilité d'obtenir du xylitol par voie biologique, à partir d'hydrolysats de canne à sucre. Dans Journal of Food Science 50, pages 226-228 (1985), ils décrivent l'utilisation d'une souche non identifiée, Candida 5D 8-22, "acclimatée" aux hydrolysats d'hémicel- lulose. Le rendement par rapport au xylose consommé est satisfaisant (91,9 %). Toutefois, le milieu de culture utilisé est non seulement additionné de glucose (30 g/l) et d'arabinose (47 g/l) mais comprend en outre une forte proportion de produits coûteux (extrait de levure 3 g/i ; malt : 3 g/l : peptone : 5 g/l).Les conditions de mise en oeuvre du procéde sont ici mieux précisées mais on constate ainsi que trois corrections de pH successives (10, 4 et 6) et une centrifugation sont necessaires. Enfin la taille de l'inoculum utilisé (4.109 cellules/ml) est telle qu'il est impensable de l'appliquer industriellement. En conclusion. il ne peut etre envisage de transposer au plan industriel ce procéde réalise ici sur 20 ml de milieu dans un erlenmeyer de 50 mi. Ainsi donc, les essaims réalisés jusqu'à ce jour en laboratoire pour transformer le D-xylose en xylitol par voie biologique. bien que montrant qu'une telle transformation quasl-sélective est possible, n'ont pas permis la mise au point d'un procédé utilisable à l'échelle industrielle. Selon l'invention. on a trouvé qu'il était possible. grace a une combinaison appropriée de parametres déterminant les conditions opératoires, de produire du xylitol à l'échelle industrielle, à partir d'un milieu naturel ou synthétique peu coûteux, contenant du D-xy loue. en utilisant la souche de Candida Daransilosis ATCC28474 pour la bioconversion de ce D-xylose en xylitol. Ainsi l'invention a pour objet un procéde de production du xylitol a partir de D-xylose par action de la souche de Candida DaraDsilosis ATCC28474, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant a 1". cultiver un lnoculum de 2 à 5.106 cellules/ml de C. Darapsiiosis ATCC28474. en aérobie, à une température de 25 à 35'C. pendant le temps nécessaire à la consommation du sucre, d un pH maintenu dans la gamme de 3,8 å 5.4. dans un fermenteur contenant soit un milieu synthétique comprenant - 30 à 100 g/l de D-xylose. - 2 à 10 g/l de KH2P04, - 1 à 5 g/l de (NH4)2S04, et - 0.1 à 1 g/i de MgSO4, 7H20 soit un hydrolysat de matières premières végéta- les comprenant 50 à 80 g/l de D-xylose, en présence de 0,5 à 3 g/l d'extrait de levure, dans des conditions d'aération et d'agitation assurant un apport en oxygène tel que la bioconversion du D-xylose en xylitol soit assurée, sans permettre la réutilisation du xylitol par la levure, et 2'. isoler le xylitol à partir du milieu de culture. L'inoculum utilisé selon l'invention, de l'ordre de 106 cellules/ml, est nettement plus faible que ceux utilisés selon l'art antérieur (de l'ordre de 1o8 et cellules/ml, respectivement), il est avantageusement de 3.106 cellules/ml. La température de culture et de bioconversion peut etre choisie dans la gamme de 25 à 35C et se situe de préférence dans la gamme de 27 à 32'C ; des résultats particulièrement avantageux ont été obtenus à 30'C. La durée de la culture qui se situe le plus gé néralement entre 50 et 200 h, dépend essentiellement de la quantité de xylose à convertir ; la fin de la réaction peut être aisément déterminée par l'homme du métier grâce à des prélèvements réguliers d'échantillons. Selon l'invention, on n'effectue pas de corrections de pH successives au cours de la mise en oeuvre du procédé. Une correction initiale est effectuée si nécessaire, par exemple pour régler le pH à 4.5 et une correction continue, pour le maintenir à l'intérieur de la gamme de 3,8 à 5,4 et de préférence à la valeur définie au départ, par exemple 4,5, est effectuée au moyen d'un systéme usuel de régulation du pH. Les hydrolysats de matières premières végétales qui peuvent être utilisés selon l'invention peuvent provenir de matières riches en xylanes d'origines très va riees (bois, graines et enveloppes notamment). Il peut s'agir par exemple d'hydrolysats de mais. de sorgho ou de tout autre hydrolysat d'origine végétale. riche en D-xylose. Ces hydrolysats peuvent être obtenus de manie- re classique, bien connue de l'homme du métier, par hydrolyse chimique, notamment par l'acide sulfurique ou l'acide chlorhydrique, par exemple selon le procédé Bergius-Rheinau décrit dans les brevets US 2 917 390 et 2 989 569. Quel que soit le milieu de culture utilisé, milieu synthétique ou hydrolysat, on l'additionne d'extrait de levure, qui a un effet important sur les rendements et les vitesses de réaction, mais en une quantité modérée. limite dans la majorité des cas à 1 g/l. Il est interessant de noter que contrairement aux procedés de l'art antérieur, le procéde selon lin- vention ne requiers la présence ni d'extrait de malt, ni de peptone. Afin d'économiser le D-xylose et d'augmenter sa conversion en xylitol on peut, selon un mode avantageux de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, effectuer la culture et la bioconversion sur un substrat car bonb mixte contenant notamment du glucose. Avantageusement, ce substrat carboné mixte, dans un milieu synthétique, est constitue de - 90 à 95 X de xylose. et - 10 à 5 X de glucose. Dans ces conditions, la croissance de la levure a lieu essentiellement aux depens du glucose et le xylose est converti en xylitol dans un stade ulterieur à la phase de croissance active. L'utilisation d'un substrat carboné mixte permet aussi de valoriser au mieux les hydrolysats de produits naturels. hétérogènes dans leur composition glucidique (xylose 80 à 90 X ; glucose 10 à 20 X, par exemple). Les conditions d'agitation et d'aération optimum sont liées entre elles d'une part, et dépendent de la structure du fermenteur utilisé, d'autre part. Elles peuvent être aisément déterminées par l'homme du métier sur la base de ses connaissances générales en la matiere, par des essais préliminaires. En tout état de cause, elles doivent être telles qu'il n'y ait dans le milieu ni carence en oxygène qui bloquerait la synthèse du xylitol. ni excès d'oxygène qui favoriserait la réutilisation du xylitol par la levure, diminuant ainsi la production du xylitol. Bien que des conditions d'aération et d'agitation applicables à tous les fermenteurs ne puissent être précisées, on peut indiquer que dans la plupart des cas, les conditions optimales d'aération seront de 0,25 à 0,45 volume d'air/volume de liquide/minute (ou vol. d'air/vol. liq./min. ou encore vvm) et les conditions optimales d'agitation seront de 200 à 500 tr/min. En fin de bioconversion. le xylitol est isolé du milieu de culture en mettant en oeuvre un procédé classique d'extraction-purification, comme par exemple celui décrit dans le brevet GB 1 532 101. Les effets de l'aération sur la productivité en xylitol de la réaction et le rendement de la conversion sont illustrés dans le tableau I de la partie expérimentale qui suit. Selon un mode avantageux de réalisation, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre selon un "découplage" partiel entre la croissance de la levure et la réaction de conversion du xylose en xylitol, ce qui conduit à un procédé de production par cultures successives permettant d'obtenir des biomasses plus importantes. Le tableau III de la partie expérimentale qui suit montre les gains ainsi réalisés, en termes de rendement et de productivité. Le tableau IV de la partie expérimentale qui suit montre que le xylitol n'a pas d'effet inhibiteur sur sa propre production. Par conséquent, selon un mode avantageux de realisation de l'invention, le procéde est mis en oeuvre avec un apport programme de substrat, c'est-a-dire selon le mode dit "fed-batch". Le procéde selon l'invention peut avantageusement être mis en oeuvre dans un fermenteur de 200 a 10 00Q litres, comprenant essentiellement une cuve munie d'une ouverture à la partie supérieure, d'un systeme de vidange a la partie inférieure, d'un systeme de remplissage commande par une horloge ou un micro-ordinateur. avec éventuellement un capteur multiétage permettant des apports successifs de milieu, d'un systeme de double régulation du pH par un acide et une base. d'un système de regulation de la température interne. d'un système d'aération. d'un système agitation et d'un dispositif de mesure de l'oxygène à l'intérieur de la cuve. La description qui suit d'exemples de réalisation de l'invention est destinée à l'illustrer et mieux l'expliquer, sans en limiter aucunement la portée. Données nérales Dans les études décrites ci-apres, les différentes valeurs données dans les tableaux sont calculées comme Suit, à partir des dosages effectués sur des pré lèvements - rendement Rx en biomasse, X : g/l - rendement Rp en xylitol - productivité, ou vitesse moyenne de production du xylitol Note 1 : les masses de xylitol et de xylose sont en g/l Note 2 : les calculs de rendements sont effectués sur le substrat carboné seul : on peut en effet négliger dans le bilan la part de l'extrait de levure apporte : 1 g/l dans tous les exemples de cette partie expérimentale. Ceci démarque cette étude des travaux cités en référence où des substrats autres que le sucre et apportés en quantités non négligeables (15 g/l de peptone. extrait de malt, extrait de levures...) sont cependant négligés dans l'établissement des rendements. I. Effet de l'aération sur le rendement de la conversion (c de xvlitol/ a de xviose) et la productivi- té en xylitol (p/i/h). Les conditions expérimentales sont les suivantes - fermenteur de 2 ou de 20 l - milieu synthétique composé de - D-xylose : 50 g/i KH2P04 5 g/l - (NH)2S04 : 2 g/l - MgS04, 7H20 : 0,4 g/l - extrait de levure : 1 g/l (provenant de la société b10Mérieux) - inoculum : 3.106 cellules/ml de Candida naraDsilosis ATCC28474 - pH : 4,5 (corrige initialement par de l'acide orthophosphorique et regulé en continu par addition d'ammoniaque a 5%) - temperature : 30*C - agitation : 250 tr/min. Les resultats obtenus en faisant varier l'aera- tion sont résumes dans le tableau I qui suit. TABLEAU I Effet de l'aération Aération Rendement en Productivité (vvm) xylitol (g/g) (g/l/h) O Pas de fermentation 0.2 0,66 0.24 0.3 0,65 0.31 0.4 0,67 0,32 0,5 0,52 0,20 0,7 0.5 0.18 1 Fin de la fermentation apres 55 h (arrêt de la réaction dû à une aération excessive) II. Effet de l'utilisation d'un substrat carbone mixte xvlose/aiucose. Des études effectuées. d'une part, sur un substrat synthétique contenant 50 g/l de D-xylose et, d'autre part, sur un substrat synthétique contenant 43 g/l de D-xylose et 7 g/l de glucose, les autres composants du milieu étant les memes et dans les memes proportions qu'indiqué sous I, ont montre que l'on pouvait améliorer à la fois le rendement et la productivité de la réaction de conversion du xylose en xylitol. TABLEAU II Rendement xylitol/ Productivité de xylose (9/9) synthèse du xylitol (g/l/h) Culture sur xylose seul 0.54 0.31 culture sur substrat 0.58 0,40 mixte III. Etude de la Production en cultures succes sites Après une culture en discontinu ou en "batch", dans les conditions expérimentales décrites sous I, des la fin de la réaction, on élimine le milieu de culture et les cellules restent dans le fermenteur puis on complète avec du milieu de culture frais de composition identique. Après épuisement du sucre. l'opération est renouvelée. Dans l'expérience décrite ici, cette opération est renouvelée cinq fois. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau III qui suit. TABLEAU III Production en cultures successives "Batches cvcliaues" k 'I vcl. 1 2 3 4 5 total moyenne Dur hG 95 66 55 53 49 318 Rendement de conversion en xylitel (g/g) 0.57 0.59 0.61 0.63 0.64 - 0.61 Rendement dr synthèse de bionsre (g/g) 0,13 0.08 0.07 0.085 0.07 - 0.087 Productivité (g/l/h) 0.28 0.46 0.60 0.60 0.70 - 0.53 IV. Production sur milieu naturel Conditions - fermenteur : 2 ou 20 l - milieu de culture : hydrolysat de sorgho obtenu par hydrolyse acide, concentration et filtration, comprenant 50 g/l de xylose. 14 g/l de glucose et 1 g/l d'extrait de levure - pH : 4,5 (corrigé en continu) - ensemencement : 3.106 cellules/ml - aération : 0,3 volume d'air/volume de liquide/minute : - température : 30'C. Dans ces conditions, la productivité est de 0.2 g/i/h et le rendement obtenu au bout de 72 h est de 0,72 g de xylitol/g de D-xylose. V. Absence d'effet inhibiteur du xvlitol sur propre Production Cette étude a été effectuée dans les conditions décrites sous I, mais avec des concentrations initiales de xylitol variant de O à 100 g/l. Les resultats obtenus sont rassembles dans le tableau IV qui suit. TABLEAU IV Influence de la concentration initiale en xvlitol sur le rendement de conversion du D-xvlose en xviitol et sur la roductivité. Concentration initiale en xylitol (g/l) 0 20 60 80 100 Rendement en Rendement en xylitol (g/g) 0,66 0,64 0,68 0,62 0,66 Productivité (g/l/h) 0,22 0,21 0,22 0,19 0,20 REVENDICATIONS 1. Procedé de production du xylitol à partir de D-xylose par action de la souche de Candida parapsilosis ATCC28474, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à 1 . cultiver un inoculum de 2 à 5.106 cellules/ml de C. Darapsilosis ATCC28474, en aérobie, à une température de 25 à 35'C, pendant le temps nécessaire à la consolation du sucre, à un pH maintenu dans la gamme de 3,8 a 5,4, dans un fermenteur contenant soit un milieu synthétique comprenant - 30 à 100 g/l de D-xylose, - 2 a 10 g/i de KH2P04, - 1 à 5 g/l de (NH4)2S04, et - 0.1 à 1 g/l de MgS04, 7H20 soit un hydrolysat de matières premières végétales comprenant 50 à 80 g/l de D-xylose, en présence de 0,5 à 3 g/l d'extrait de levure, dans des conditions d'aération et d'agitation assurant un apport en oxygène tel que la bioconversion du D-xylose en xylitol soit assurée, sans permettre la reutilisation du xylitol par la levure, et 2'. isoler le xylitol à partir du milieu de culture. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce que l'inoculum est de 3.106 cellules/ml. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la temperature de culture et de bioconversion est de 27 b 32 C, de préférence de 30'C. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la duree de la culture est de 50 a 200 h. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le pH est réglé et maintenu à 4,5 pendant toute la durée de la culture. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'hydrolysat de matières pre mièvres végétales a été obtenu par hydrolyse chimique. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'extrait de levure est present à raison de 1 g/l. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la culture et la bioconversion sont effectuées sur un substrat carboné mixte contenant de préférence du glucose. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le substrat carboné mixte, dans un milieu synthétique, est constitué de - 90 à 95 X de xylose, et - 10 à 5 X de glucose. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérise en ce que les conditions d'aération sont de 0,25 à 0,45 volume d'air/volume de liquidelminute et les conditions d'agitation sont de 200 à 500 tr/min. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10. caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre selon un découplage partiel entre la croissance de la levure et la réaction de conversion du xylose en xylitol. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11. caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre avec un apport programmé de substrat. 13. Fermenteur industriel pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 12, carac terse en ce qu'il présente un volume de 200 à 10 000 litres et comprend essentiellement une cuve munie d'une ouverture à la partie supérieure, d'un système de vidange à la partie inférieure, d'un système de remplissage commandé par une horloge ou un micro-ordinateur, avec éventuellement un capteur multiétage permettant des apports successifs de milieu, d'un système de double régulation du pH par un acide et une base, d'un systeme de régulation de la température interne, d'un système d'aération, d'un système d'agitation et d'un dispositif de mesure de l'oxygène à I'intérieur de la cuve.