Brevet FR2631705A1 — publié le 19891124

La présente invention est relative à des réac- tifs et à un procédé de dosage immunochimique du degré de dénaturation de substances protéiques, telles notamment que celles contenues dans des produits alimentaires soumis à des traitements de dénaturation thermiques, physiques, clii- miques ou enzymatiques. Il est important de pouvoir contrôler les pro- cédés utilisés dans les industries agro-alimentaires: 1. du point de vue hygiénique pour identifier les agents pathogènes ou toxiques susceptibles d'être pré- sents dans l'aliment; 2. du point de vue technologique pour s'assurer que le produit a subi le procédé industriel dans son inté- gralité: par exemple, il est nécessaire de -s'assurer qu'une viande dans une conserve ou dans un aliment préparé a été chauffée à 65'C (norme USDA) pour être certain que le produit ne renferme pas de germes pathogènes tels que coli- bacilles, salmonella ou staphylocoques. 3. du point de vue commercial, il est néces- saire de s'assurer que le produit ne contienne pas d'additifs frauduleux susceptibles d'amener à une altéra- tion de l'aliment (tels que nitrites ou nitrates) ou une modification organoleptlque. 4. du point de vue des procédés utilisés, afin que l'on puisse s'assurer du bon développement des tech- niques utilisées, qu'il s'agisse de fermentation, de chauf- fage, d'additifs, d'extraction etc... Différentes études ont été réalisées pour re- chercher des relations entre structures physico-chimiques, en particulier des protéines, et structures antigéniques et fonction des protéines. On a également recherché de telles corrélations pour détecter.la dénaturatlon par exemple d'une enzyme ou les modifications apportées à une structure par la dénaturation ou par les enzymes hydrolytiques. L'analyse des structures moléculaires, en particulier des protéines, a pu être réalisée avec des sub- stances pures, cristallisées ou en solution: des méthodes physiques, chimiques ou immunochimiques d'études ont été mises au point: pour ces dernières les anticorps polyclo- naux ou monoclonaux ont la propriété de se fixer sur des molécules natives solubles, ce qui permet la reconnaissance de sites antigéniques appelés épitopes. La littérature en la matière décrit en outre des travaux montrant qu'il est possible de détecter et d'identifier par des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, des substances dans des mélanges complexes n'ayant subi au- cun traitement. Depuis quelques années, l'on s'est attaché à identifier des substances dans des mélanges complexes, même après chauffage. Notamment, on a pu montrer qu'il existait dans les muscles de différentes espèces, des protéines thermorésistantes qui pouvaient être extraites et reconnues par leur activité enzymatique spécifique. En utilisant la lactate déhydrogénase comme protéine-test on a pu montrer que le chauffage de la viande à 65'C diminue l'activité de cette enzyme (Keeton J.T. Collins S.S. et Smith S.B.- 34th European meeting of Meat Research Workers 1987 Helsinki) mais la technique n'est pas assez précise pour assurer que 2. l'ensemble a été chauffé à au moins 65 C et le test n'est pas applicable aux températures supérieures. L'on peut, avec des anticorps spécifiques, identifier l'origine de la viande qui a été autoclavée (Erastus K. Kangethe and Kaare J. Lindqvist J. Sci. Food Agric. 1987, 179). De la même manière, des anticorps dirigés contre la protéine du soja ont permis, par une technique immunochimique, de reconnaître la présence de soja dans des mélanges de viandes, de façon qualitative après chauffage à C pendant cinq minutes (Frederik W. Janssen, Gerritt Voortman and Johannes A. de Baaii, Lebensm, Untersforsch, 1986, 182, 479). En ce qui concerne l'ovalbumine purifiée on a pu reconnaître les altérations immunochlmiques produites par la glycosylation de la molécule au cours de la réaction de Maillard réalisée à 50OC, mais aucune application n'en a été faite sur des mélanges d'aliments (Yasuko Kato, Tsukasa Matsuda, Kenji Watanabe et Ryo Nakamura, Agric. Biol. Chem. 1985, 49, 423). Il a été également montré que l'on peut obtenir des anticorps monoclonaux contre l'ovalbumine, qui différencient l'ovalbumine native de ltovalbumine dénaturée par l'urée. Certains de ces anticorps monoclonaux sont également capables de reconnaître l'ovalbumine pure chauf- fée à 75:C, mais ici encore l'utilisation de tels anticorps n'a été réalisée ni pour des milieux complexes, ni pour identifier les différentes étapes de la dénaturation de l'ovalbumine (Kilshow et al. Clin. Exp. Immunol. 1986, 66, 481). Une technique de détection d'ovalbumine dénatu- rée et d'ovalbumine native par des anticorps polyclonaux purifiés par chromatographie d'affinité, dirigés contre l'ovalbumine native, en utilisant la méthode ELISA, a été décrite dans J. OF FOOD SCI. Vol. 52, N 5, 1987, C. BRETON, L. PHAN THANH et A. PARAF "Immunochemical Properties of na- tive and Heat denatured ovalbumin" et l'application de cette méthode à l'identification et à la quantification d'ovalbumine utilisée comme additif, dans des champignons en boite, a été décrite dans un autre Article de la même publication, par les mêmes Auteurs. Il résulte de ce qui précède qu'aucune méthode immunochimique n'a été trouvée qui permette à la fois: 1. d'identifier une substance (en particulier protéique) 2. de quantifier une substance (en particulier protéique) 3. de définir à quelle température le produit destiné à l'alimentation a été chauffé ou quel traitement dénaturant physique, chimique ou enzymatique a été appliqué et à quel degré. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des réactifs immunochimiques qui permettent à la fois d'identifier une substance pro- téique, de la quantifier et de définir la nature du traite- ment dénaturant qu'elle a subi et à quel degré elle a subi ce traitement dénaturant. La présente invention s'est encore donné pour but de pourvoir à des réactifs immunochimiques très sen- sibles, aptes à analyser et à quantifier rapidement une ou plusieurs protéines contenues dans un produit alimentaire, lesquels réactifs sont stables, d'un prix de revient écono- miquement acceptable, disponibles en quantités importantes et permettent la réalisation des analyses susdites en grandes séries avant, durant, et/ou après le traitement au- quel sont soumis les produits alimentaires analysés, per- mettant de suivre les conséquences dudit traitement sur le- dit produit alimentaire. La présente invention a pour objet un réactif immunochimique d'identification et de quantification d'au moins une substance protéique et de reconnaissance de la nature et du degré du traitement dénaturant auquel elle est soumise, lequel réactif est caractérisé en ce qu'il est constitué par des anticorps dirigés contre ladite ou les- dites substance(s) protéique(s) et présentant différentes spécificités qui correspondent chacune à un état de ladite ou desdites substance(s) protéique(s). Selon un mode de réalisation avantageux du ré- actif immunochimique' conforme à l'invention, celui-ci est constitué par des anticorps dirigés contre ladite (les- dites) substance(s) protéique(s) à l'état natif et/ou contre ladite (lesdites) substance(s) protéique(s) dénatu- rée(s) à différentes températures et/ou contre ladite (les- dites) substance(s) protéique(s) dénaturée(s) par un trai- tement approprié tel, notamment, qu'un traitement physique, -5 d'extrusion en particulier, un traitement chimique ou un traitement enzymatique. Selon un autre mode de réalisation avantageux du réactif immunochimique conforme à l'invention, celui-ci est dirigé contre au moins une substance protéique qui fait -ou font- partie des constituants du produit alimentaire analysé. Selon encore un autre mode de réalisation avan- tageux du réactif immunochimique conforme à l'invention, celui-ci est dirigé contre au moins une substance pro- téique-test ajoutée au produit alimentaire à analyser, préalablement au traitement, thermique, physique, chimique, enzymatique ou autre, auquel elle doit être soumise. Selon un autre mode de réalisation avantageux 1 du réactif immunochimique conforme à l'invention, celui-ci est constitué par des anticorps polyclonaux. Selon encore un autre mode de réalisation avan- tageux du réactif immunochimique conforme à l'invention, celui-ci est constitué par des anticorps monoclonaux. u La présente invention a également pour objet un procédé de production de réactif immunochimique conforme à l'invention, qui est caractérisé en ce que des mammifères appropriés sont immunisés par au moins une substance pro- téique présentant différents états, et notamment différents 2E états de dénaturation, en ce que les anticorps polyclonaux ou monoclonaux obtenus à la suite de cette immunisation et dirigés contre les différents états de ladite substance protéique, sont recueillis pour servir de réactifs immuno- chimiques aptes à détecter et à quantifier les différents états de dénaturation de ladite substance dans un produit alimentaire. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé de production du réactif conforme à l'invention, la substance protéique utilisée dans plusieurs de ses états, notamment de dénaturation, pour immuniser des mammifères appropriés, est identique à une substance protéique qui entre dans la composition du produit alimentaire à analyser. Selon un autre mode de mise en oeuvre du pro- cédé de production du réactif, conforme à l'invention, la E substance protéique utilisée dans plusieurs de ses états, notamment de dénaturation, pour immuniser des mammifères. appropriés, est une substance protéique identique à une protéine ajoutée au produit alimentaire à analyser, en tant que protéine-test connue pour son aptitude à entrainer ' l'apparition de différents déterminants antigéniques sen- sibles aux anticorps susdits. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, appliquée à la production d'anticorps polyclonaux, le(s) serum(s). recuelli(s) après immunisation de mammifères appropriés par au moins une pro- téine-constituant du produit alimentaire ou par au moins une protéinetest, dans différents états de dénaturation et contenant des anticorps polyclonaux, est/sont traité(s) sur une colonne de chromatographie d'affinité pour séparer les différentes spécificités contenues dans lesdits sérums anti-substance-protéique en vue de leur utilisation comme réactifs aptes à reconnaître chacune l'un des différents états de ladite substance protéique,. dans le produit ali- mentaire à analyser. - La présente invention a en outre pour objet un procédé d'identification et de quantification d'au moins une substance protéique et de reconnaissance de la nature et du degré du traitement dénaturant auquel elle est sou- mise, caractérisé en ce qu'un réactif immunochimique, tel qu'un anticorps, apte à détecter différents états, no- tamment de dénaturation, d'une substance protéique présente dans un produit à analyser, notamment dans un produit ali- mentaire, est mis en contact avec le produit à analyser, puis le complexe antigène-anticorps formé est détecté et quantifié par une technique immunoenzymatique appropriée. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du pro- cédé d'identification, quantification, reconnaissance, conforme à l'invention, le produit à analyser est soumis préalablement à la détection de l'antigène (protéique) qu'il contient, par une technique immunoenzymatique, à un processus d'extraction propre à solubiliser les protéines présentes dans ledit produit. Les réactifs de dosage conformes à la présente invention permettent de caractériser le degré de dénatura- tion des produits alimentaires et en particulier permettent de déterminer la température à laquelle les produits ont été soumis. Ces réactifs sont constitués par des anticorps polyclonaux ou monoclonaux: chaque série d'anticorps poly- clonaux ou monoclonaux dirigés contre une protéine détermi- née permet d'identifier ou bien la molécule de protéine na- tive ou bien la molécule de protéine dénaturée ou des structures intermédiaires; de plus,. la méthode utilisée permet de mesurer de façon quantitative la molécule analy- 2u sée. Les anticorps sont préparés contre une ou plusieurs protéines à analyser et sont utilisés sur des produits fi- nis tels que pâtes, plats cuisinés, viandes et autres pro- duits carnés, notamment pâtés, sur les poissons, sur les oeufs, le lait, les produits laitiers (tels que fromages, yaourts, crèmes desserts, etc... ), sur les produits végétaux faits à partir de blé, de riz, de maïz, de soja, par exemple, etc... Conformément à l'invention, celle-ci comprend également l'introduction, préalablement au traitement du produit alimentaire, d'une protéine-test étrangère' à l'aliment (par exemple ovalbumine, serumalbumine bovine, inhibiteurs de trypsine, caséines; 0-lactoglobuline, etc...): les réactifs de dosage conformes à l'invention, constitués par une série d'anticorps..polyclonaux ou mono- clonaux dirigée contre une protéine, telle que l'ovalbumine par exemple, permettent de détecter et de quantifier ladite protéine et la température à laquelle l'aliment a été chauffé. L'identification des anticorps reconnaissant les différentes structures peut être réalisée par la technique ELISA. Il est ainsi possible à la fois d'identifier et de quantifier la protéine et de définir à quelle tempéra- ture le produit destiné à l'alimentation a été chauffé ou quel traitement dénaturant physique, chimique ou enzyma- tique a été appliqué et à quel degré. Par exemple, le réactif de dosage conforme à l'invention dirigé contre une protéine-test telle que l'ovalbumlne sous ses formes native, partiellement dénatu- rée ou totalement dénaturée, peut doser l'ovalbumine sous ces diverses formes. _ L'ovalbumine peut être introduite dans n'importe quel aliment destiné à être transformé par une méthode physique, chimique ou enzymatique. Les réactifs conformes à l'invention permettent par exemple de distinguer un aliment qui n'a pas été chauffé ou qui a été chauffé entre 40' et 135 C, en définissant avec précision la température de chauffage. La présente invention a par conséquent égale- ment pour objet un kit d'identification et de quantifica- tlon d'au moins une substance protéique et de reconnais- sance de la nature et du degré du traitement dénaturant au- quel elle est soumise, lequel kit est caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif immunochimlque tel que défini plus haut, éventuellement au moins une protéine-test propre à être dosée par le réactif susdit, ainsi que les _. moyens de révélation usuels pour l'identification de la présence,de la substance protéique à tester et/ou de la protéine-test. Selon un mode de réalisation avantageux du kit conforme à la présente invention, la protéine-test est pré- 33 sente sous différentes formes et notamment sous ses formes native, partiellement dénaturée et totalement dénaturée. Selon un mode de réalisation particulier du kit conforme à la présente invention, la protéine-test est de l'ovalbumine. Outre Ies dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui res- sortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux exemples de préparation de réactifs conformes à l'invention. Il doit être blen entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. ! Exemple 1 Préparatlon et utilisation d'anticorps polyclonaux spécifiques: Les anticorps polyclonaux sont obtenus contre de l'ovalbumine native ou de l'ovalbumine dénaturée à 100 C ou de l'ovalbumine dénaturée entre ces températures, par injection de lapins, de souris, de mouton, de chèvre, de poulet, avec l'un ou l'autre de ces différents antigènes, puis on sépare différentes spécificités contenues dans cha- cun des antisérums, par chromatographie d'affinité sur des colonnes réalisées avec chacun de ces antigènes, selon la figure 1 annexée (C. Breton. L. Phan Thanh, A. Paraf,J. of Food Science 1987. 52). Les méthodes d'immunisation des animaux sont classiques: les sérums des animaux sont utilisés tels quels en dilutions successives ou bien l'on prépare les an- tlcorps spécifiques par chromatographie d'affinité. Par exemple, conformément à la figure 1 an- nexée, un sérum antiovalbumine native peut être passé suc- cessivement sur de l'ovalbumine native, puis sur de l'ovalbumine dénaturée à la chaleur de 135'C et l'on ob- 3' tient les anticorps i et 4, ou bien encore le même antisé- rum peut être passé successivement sur de l'ovalbumine dé- naturée à 135'C, puis sur de l'ovalbumine native et l'on obtient les anticorps 2 et 3. Les anticorps de spécificités différentes obtenus par chromatographie d'affinité permet- tent d'identifier si la protéine a été chauffée ou non, par s exemple, dans le cas présent, d'identifier que la protéine a été chauffée à 50'C, 65'C, 85'C, 100 C, ou 135'C.. On peut traiter de la même manière un sérum provenant d'un animal immunisé contre de l'ovalbumine déna- turée à 135'C; chacun des anticorps purifiés ainsi possède des propriétés de reconnaissance de l'ovalbumine diffé- rentes. L'ovalbumine peut être ajoutée par exemple à des conserves de viandes, de légumes, de champignons ou de pro- duits lactés destinées à être préparées ou stérilisées par traitement à la chaleur de 40' à 135'C Les produits à analyser sont traités pour ex- traire l'ensemble des protéines y compris l'ovalbumine, soit' par le SDS, soit par la soude 0,01 -à 1 N, soit par l'acide chlorhydrique 0,01 à 1 N. Il a été montré par exemple (Breton C., Phan Thanh L. et Paraf A 1987) que l'extraction alcaline était susceptible.de conserver l'antigénicité de la molécule d'ovalbumine dénaturée par la chaleur. Après le traitement on peut par technique ÉLISA (directe, indirecte ou par compétition) identifier à la fois: = 1) la substance ajoutée 2) la quantité de substance ajoutée 3) la température à laquelle la conserve a été chauffée Les anticorps polyclonaux à utiliser préparés 3u comme ci-dessus, par' exemple dans le cas de l'ovalbumine, les anticorps 3, ne reconnaissent que l'ovalbumine chauffée entre 100'C et 135'C et pas du tout l'ovalbumine native, ainsi que cela ressort de la figure 2 annexée. De plus, il apparait que les anticorps AC2 ne reconnaissent pas l'ovalbumine dénaturée. La sensibilité peut atteindre 1 ng par gramme de produit. Par adsorption spécifique on peut obtenir des anticorps reconnaissant que le produit a été chauffé à 65'C, à 85'C, à 100'C ou à 135 C. On peut également préparer des anticorps poly- clonaux contre les protéines constituants de l'aliment telles que pour la viande de boeuf, une protéine thermo- stable, notamment l'inhiblteur de cystéine-protéinase ou une protéine thermosensible telle que l'inhibiteur de sé- rine-protéinase. Dans le cas du lait on peut choisir par exemple la 1-lactoglobuline thermorésistante et la K ca- smine thermosensible. Pour les végétaux, différentes en- zymes thermosensibles ou des inhibiteurs de protéases ther- morésistantes: dans chaque cas, la modification de la carte épitopique permet de reconnaître le traitement et en particulier le degré de chauffage auquel l'aliment a été soumis. Exemple 2 Préparation d'anticorps monoclonaux Des souris sont immunisées selon différents protocoles expérimentaux soit contre la protéine native, soit contre la protéine dénaturée par la chaleur à diffé- rentes températures. La rate de chacune des souris est alors traitée pour obtenir des anticorps monoclonaux selon la technique de Koehler et Milstein (1975). On obtient ainsi une collec- tion d'anticorps monoclonaux réagissant soit contre la pro- téine native, soit contre la protéine dénaturée par la cha- leur, solt contre les deux formes. Les techniques d'identification de la spécifi- cité de ces anticorps sont classiques et réalisées par dif- férentes méthodes ELISA (Engvall E. et Perlmann P. J. So Immunol. 1972, 109, 129) directe, indirecte ou par compéti- tion. Ces anticorps monoclonaux peuvent être utilisés seuls ou en mélange pour identifier la présence d'une pro- téine et la titrer soit dans des conserves chauffées à des températures de 50 C à 135 C, soit dans des produits soumis à thermo-extrusion, soit soumis à des traitements enzyma- 263 1705 tiques de produits tels que viandes, farines, produits lac- tés, *etc... Dans le cas de l'ovalbumine par exemple, on voit à la.figure 3 annexée, l'identification de différentes températures de chauffage par trois anticorps monoclonaux, qui permet d'identifier que le produit a été chauffé à 85 C ou plus. La figure 3 montre que l'un des anticorps monoclo- nal donne un signal moyen sur de l'ovalbumine native, maxi- mum sur l'ovalbumine chauffée à 50:C et minimum après chauffage à 100C (dans tous ces exemples on a soustrait pour chaque produit le bruit de fond). On obtient ainsi des réactifs qui permettent d'identifier comment l'aliment a été traité et en particulier lorsqu'il a été chauffé, à quelle température il a été soumis. Lorsqu'on ajoute de l'ovalbumine à 5% à des champignons mls en boîtes de conserves, puis chauffés à C, 65'C, 85'C, 100C et 130C, respectivement les anticorps monoclonaux 1 à 8 réunis dans le tableau I qui va suivre, permettent d'identifier ces températures de chauffage ainsi que d'identifier et de quantifier l'ovalbumine présente dans les boites. Le tableau I ci-après montre parmi 9 anticorps monoclonaux: 3 anticorps qui reconnaissent l'ovalbumine chauffée au dessus de 85'C, 2 anticorps monoclonaux recon- naissant le chauffage à 65 C et 4 anticorps monoclonaux spécifiques de l'ovalbumine native. Tableau I: Caractéristiques d'identification de l'ovalbumine par 9 anticorps monoclonaux dirigés soit contre la molécule native, soit contre la molécule dénatu- rée par la chaleur. OAN OAD Température ou apparait la modification de réactivité Ag/Pg/ml AcM I + - 50' 2 - + 80' 3 + + - 4 + - 850 - + 85' 6 - + 650 7 + - 100 8 + - 85 On peut alors,en mélangeant certains de ces an- ticorps, obtenir des réactifs très spécifiques de la tempé- rature de chauffage. De la même manière, on peut, pour un produit alimentaire, préparer des anticorps monoclonaux contre un ou plusieurs constituants du produit, en choisissant de préférence une protéine thermosensible et une protéine thermorésistante (pour la viande de boeuf, par exemple un inhibiteur de cystéine-protéinase est thermostable alors que l'inhibiteur de sérine-protéinase est thermosensible). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. *REYENDICATIQNS 1l) Réactif immunochimique d'identification et de quantification d'au moins une substance protéique et de reconnaissance de la nature et du degré du traitement déna- turant auquel elle est soumise, lequel réactif est caracté- risé en ce qu'il est constitué par des anticorps dirigés contre ladite ou lesdites substance(s) protéique(s) et pré- sentant différentes spécificités qui correspondent chacune à un état de ladite ou desdites substance(s) protéique(s). 2') Réactif selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il est constitué par des anticorps dirigés contre ladite (lesdites) substance(s) protéique(s) à l'état natif et/ou contre ladite (lesdites) substance(s) pro- téique(s),-,dénaturée(s) à différentes températures et/ou contre ladite (lesdites) substance(s) protéique(s) dénatu- rée(s) par un traitement -approprié tel, notamment, qu'un traitement physique, d'extrusion en particulier, un traite- ment chimique ou un traitement enzymatique. 3') Réactif selon l'une quelconque des revendi- cations 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre au moins uge substance protéique qui fait -ou font- partie des constituants du produit alimentaire analysé. 4 ) Réactif selon l'une quelconque des revendi- cations 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre O; au moins une substance protéique-test ajoutée au produit alimentaire a analyser, préalablement au traitement, ther- mique, physique, chimique, enzymatique ou autre, auquel elle doit être soumise. ) Réactif selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est constitué par des anticorps polyclonaux. 6') Réactif selon l'une quelconque des revendi- cations i à 4, caractérisé en ce qu'il est constitué par des anticorps monoclonaux. 7 ) Procédé de production d'un réactif immuno- chimique d'identification et de quantification d'une sub- 263170S stance protéique, constitué par des anticorps dirigés contre ladite (ou lesdites) substances(s) protéique(s) et présentant différentes spécificités correspondant chacune à un état de ladite ou desdites substance(s) protéique(s), lequel procédé est caractérisé en ce que desmammifères appropriés sont immunisés par au moins une substance pro- téique présentant différents états, et notamment différents états de dénaturation, en -ce que les anticorps polyclonaux ou monoclonaux obtenus à la suite-de-cette immunisation et dirigés contre les différents états de ladite substance protéique, sont recueillis pour servir de réactifs immuno- chimiques aptes à détecter et à quantifier les différents états de dénaturation de ladite substance dans un produit alimentaire.. 8 ) Procédé selon la revendication 7, caracté- risé en ce que la substance protéique utilisée dans plu- sieurs de ses états notamment de dénaturation, pour immu- niser des mammifères appropriés, est identique à une sub- stance protéique qui entre dans la composition du produit alimentaire à analyser. 9') Procédé selon la revendication 7, caracté- risé en ce que la substance protéique utilisée dans plu- sieurs de ses états, notamment de dénaturation, pour immu- niser des mammifères appropriés, est une substance pro- téique identique à une protéine ajoutée au produit alimen- taire à-analyser, en tant que protéine-test connue pour son aptitude à entraîner l'apparition de différents détermi- nants antigéniques sensibles aux anticorps susdits. ) Procédé selon la revendication 7, appliqué à la production d'anticorps polyclonaux, caractérisé en ce que le(s) serum(s) recueilli(s) après immunisation de mam- mifères appropriés par au moins une protéine-constituant du produit alimentaire ou par au moins une protéine-test, dans différents états de dénaturation et contenant des anticorps 375 polyclonaux, est/sont traité(s) sur une colonne de chroma- tographie d'affinité pour séparer les différentes spécifi- cités contenues dans lesdits sérums anti-substance-pro- téique en vue de leur utilisation comme réactifs aptes à reconnaltre chacune l'un des différents états de ladite substance protéique, dans le produit alimentaire à analyser. 11') Procédé d'identification et de quantifica- tion d'au moins une substance protéique et de reconnais- sance de la nature et du degré du traitement dénaturant au- quel elle est soumise, caractérisé en qu'un réactif immu- nochimique, tel qu'un anticorps, apte à détecter diffé- - rents états, notamment de dénaturation, d'une substance protéique présente dans un produit à analyser, notamment dans un produit alimentaire, est. mis en contact avec le produit à analyser, puis le complexe antigène-anticorps formé est détecté et quantifié par une technique immunoen- zymatique appropriée. 12 ) Procédé selon la revendication 11, carac- térisé en ce que le produit à analyser est soumis préala- blement à la détection de l'antigène (protéique) qu'il contient, par une technique immunoenzymatique, à un proces- sus d'extraction propre à solubiliser les protéines pré- sentes dans ledit produit. 13 ) Kit d'identification et de quantification d'au moins une substance protéique et de reconnaissance de la nature et du degré du traitement dénaturant auquel elle est soumise, lequel kit est caractérisé en ce qu'il com- prend au moins un réactif immunochimique selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, éventuellement au moins une protéine-test propre à être dosée par le réactif sus- dit, ainsi que les moyens de révélation usuels pour l'identification de la présence de la substance protéique à tester et/ou de la protéine-test. 14 ) Kit selon la revendication 13, caractérisé en ce que la protéinetest est présente sous différentes formes et notamment sous ses formes native, partiellement dénaturée et totalement dénaturée.