Brevet FR2628439A1 — publié le 19890915

La présente invention porte sur un procédé d'obtention de composants d'arômes ou d'arômes & partir de leurs précurseurs de nature glycosidique, ainsi que sur les composants d'arômes et arômes obtenus par ce procédé. Chez certains cépages, tels les muscats, les composés de l'arôme existent sous les deux formes, libre et liée. La fraction libre est constituée de substances - volatiles odorantes, essentiellement des terpénols. La fraction liée renferme des précurseurs des terpènols, surtout des diglycosides non odorants, faits de a-L-rhamnopyranosyl-P-Dglucopyranosides (noté Rha-Glc)'et de a-L-arabinofuranosyl-P-Dglucopyranosides (noté Ara-Glc), dans lesquels le glucopyranose assure la liaison entre le résidu terpénique (noté Terp) et le disaccharide selon les formules: Rha(146)Glc-Terp Ara(1-i6)Glc-Terp plusLa part d'arôme sous forme de précurseurs est le plus souvent très supérieure à la part d'arôme libre (typiquement d'un facteur 3 à- 10), et elle peut atteindre des teneurs importantes de l'ordre de quelques milligrammes par litre. Compte tenu, en outre, du seuil de perception olfactive particulièrement bas et de la qualité aromatique des alcools terpéniques, il y a, dans ces cépages, un potentiel d'arôme inexploité tout & fait intéressant. Les glycosides terpéniques, isolés du Jus, peuvent être hydrolysés à l'aide de préparations enzymatiques commerciales de spécifications très diverses. La libération des terpénols par vole enzayatique, qui reflète plus fidèlement l'arôme naturel libre du fruit que celui révélé par hydrolyse thermique au pH du Jus, est donc possible; cependant la maîtrise de cette libération pour une exploitation industrielle du potentiel aromatique, suppose que les glycosidases responsables des hydrolyses soient définies et leur mécanisme d'action établi. La présente invention repose sur la mise en évidence du mécanisme de l'hydrolyse enzymatique, un tel mécanisme étant de type séquentiel. Ainsi, le procédé conforme & la présente invention, pour l'obtention de composants d'arômes et d'arômes à partir de leurs précurseurs de nature glycosidique, est caractérisé par le fait que: - dans une première étape, on effectue une hydrolyse enzymatique d'un substrat glycosidique contenant au moins un desdits précurseurs avec au moins une enzyme choisie d'après la structure dudit précurseur, pour libérer, par coupure au niveau d'une liaison osidique, les monoglucosides correspondants; - dans une deuxième étape, on effectue une hydrolyse enzymatique du produit de la première étape avec aumoins.une enzymfe autr que ou identique celle(s) de la première étape et destinée & libérer les composants d'arômes et arômes par coupure de la liaison copule glucidique - aglycone. On entend par."substrat", toute substance contenant un précurseur de nature glycosidique de composant d'arôme ou d'arôme. A titre d'exemple, dans le cas o le précurseur glycosidique est un matériel végétal issu du raisin, comme les jus de raisin, les vins et leurs dérivés, par exemple toutes boissons renfermant du vin, du Jus de raisin ou substance apparentée, ainsi que les sous-produits de la * vinification de cépages aromatiques, en particulier des muscats. On connait maintenant, selon l'invention, les trois composants du système enzymatique nécessaire à l'hydrolyse des glycosides terpéniques du ranisin pour libérer les terpénols, substances volatiles odorantes: une aarabinosidase, une a-rhamnosidase, pour la première étape et une Pglucosidase, pour la deuxième étape. Les travaux ayant conduit à la présente invention ont permis en effet de conclure que l'hydrolyse des diglycosides terpéniques ne procède pas de l'action d'une seule glycosidase, mais au ontraire de plusieurs, npérant par paire, selon le mécanisme séqueptiel à deux étapes suivant: tage 1: Action d'une a-arabinosidase et d'une a-rhamnosi- dase libérant par coupure au niveau de la liaison osidique (146), les monoglucosides terpéniques correspondants. Etape: Action d'une 3glucosidase assurant la libération des terpénols par coupure de la liaison copule glucidique-aglycone terpénique. Ara(l!6)Glc-Terp a-arabinosidase GlcTerp -- Terpénol P-glucosidase Rha(le6)Glc-Terp a-rhamnosidase Etape 1 Etape 2 DO La dernière enzyme-clé, à savoir la P-glucosidase, dont dépend la libération finale des terpénols, doit présenter des caractères de moindre inhibition par le glucose, d'activité aux pH acides, et d'affinité la plus large possible vis-à-vis des aglycones engagés dans les substrats glycosidiques, pour que le procédé proposé présente une totale efficacité dans ses applications. Selon l'invention, ont également été définis les substrats (Ara-Glc-pIP, Rha-Glc-pNP, Ara-pNP, Rha-pNP, Glc-pNP) permettant les mesures des activités, conditions indispensables pour la production des enzymes correspondantes. Le procédé selon la présente invention est exemplifié par l'exploitation du potentiel aromatique du 4 -2628439 raisin, le matériel végétal de base étant choisi parmi les Jus de raisin, vins et dérivés, ainsi que les sous-produits de la vinification des cépages aromatiques, les muscats en particulier, mais non exclusivement. Toutefois, la présente invention n'est pas limitée à cette application. En effet, le mécanisme mis en évidence est un mécanisme général, conduisant à des composants d'arômes et arômes non nécessairement terpéniques, et applicable à tous produits végétaux autres que le raisin: fruits, dérivés de fruits (par exemple boissons) et !0 sous-produits de fruits; plantes aromatiques et plantes & fleurs ainsi que dérivés et sousproduits de ces plantes; autres plantes comme le thé et le tabac; et même matériel végétal provenant de cultures de cellules in vitro; aux conditions: (a) que ces produits végétaux renferment, en quantité suffisante, des précurseurs d'arôme ou de parfum de nature glycosidique même non exclusifs des seuls terpénols et des seuls glycosides rencontrés dans le raisin, (b) qu'à la structure des précurseurs glycosidiques correspondent les glycosidases spécifiques; et (c) que le milieu naturel ne contienne pas d'inhibiteurs des enzymes appliquées. Comme fruits renfermant des glycosides autres que le raisin que l'on peut utiliser dans le procédé de la présente invention, on peut mentionner, entre autres, l'abricot, la mangue, la papaye, le fruit de la Passion. Comme plante à fleur, on peut citer, entre autres, la rose. On peut également utiliser, comme substrat glycosidique, un extrait glycosidique, ou encore on peut conduire l'hydrolyse sur un milieu naturel contenant les précurseurs. Ainsi, de nombreuses possibilités sont offertes pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention: - en travaillant sur un milieu naturel, tel qu'indiqué ci-dessus, on libère l'arôme lié, augmentant ainsi l'arôme du produit lui-même; - on peut également traiter un extrait glycosidique donné (par exemple, de papaye) et introduire l'arôme obtenu dans un autre produit, par exemple, une boisson (Jus de raisin>; - on peut aussi introduire un (ou des> extrait(s) glycosidique(s) (par exemple, extrait de papaye; extrait de marc) dans un substrat liquide (par exemple, Jus de raisin; boissons naturelles> et appliquer le procédé selon l'invention, libérant ainsi l'arôme Ln situ. On peut aussi faire en sorte que l'arôme soit libéré a posteriori au moment souhaité, dans un -15 aliment, une boisson, un parfum. L'expression "enzyme" définit ici tout moyen capable de procurer l'activité enzymatique correspondante. Les enzymes mises en oeuvre dans le procédé conforme & la présente invention peuvent être de n'importe quelle origine: bactérienne, fongique, de levures, végétale, animale, ou de synthèse. Le procédé de l'invention permet d'obtenir, notamment comme composants d'arômes ou arômes, des terpénols, tels que géraniol, linalol, nérol et similaires, des polyols terpéniques et des alcools, tels que phényléthylique, benzylique ou similaires. Conformément & l'invention, on peut aussi, suivant le profil de l'arôme lié aux précurseurs, qui peut être différent de l'arôme libre, ou suivant la spécificité de l'enzyme utilisée, envisager l'obtention d'un arôme nouveau. La connaissance du mécanisme débouche sur la production d'enzymes de propriétés caractéristiques et d'aptitudes technologiques nouvelles. Conformément à un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, correspondant au cas o le substrat ne renferme que des monoglycosides, on effectue directement l'hydrolyse enzymatique sans passer par la première étape. La présente invention sera illustrée par les résultats expérimentaux rapportes ci-après A * LES SUBSTRATS UTILISES Parmi les substrats utilisés, les 3-D-gluco- pyranoside de p-nitrophényle (Sigma, USA), a-L-arabino- furanoside de p-nitrophényle (Sigma, USA) et a-L-rhamno- pyranoside de p-nitrophényle (Extrasynthése, France) sont commerciaux. Les autres glycosides ont été synthétisés: leur synthèse met en oeuvre trois étapes & partir du saccharide peracétylé correspondant. La première étape consiste en l'activation du carbone anomère du groupe glucosidique terminal du saccharide correspondant peracétylé, par l'introduction, sur ce carbone, d'un halogène, comme le chlore ou le brome, ou d'un imidate, comme le trichloroacétimidate. Ainsi, l'hexaacétyl a-chloro rutinoside est obtenu par action de dichlorure de zinc et de dichlorométhylméthyl- éther sur la rutine peracétylée dans un solvant inerte, comme le chloroforme ou le chlorure de méthylène, dans des conditions anhydres. Le tétraacétyl =-bromo-D-glucopyranoside et l'hexaacétyl abromorutinoside sont préparés par action d'acide bromhydrique gazeux respectivement sur le pentaacéto-D-glucopyranose et sur l'heptaacétorutinose, dans un solvant inerte, comme le chloroforme ou le chlorure de méthylène dans des conditions anhydres. Le mélange des O-(hexaacétyl a-et-p-rutinosyl)- trichloroacétimidates est obtenu par action d'hexaacétyl 1-rutinose sont obtenus de la même manière. La deuxième étape consiste en la substitution nucléophile catalytique du groupe partant introduit, par le para-nitrophénol, par un monoterpénol ou par un alcool. On obtient ainsi, après purification par chromatographie sur gel de silice, un P-p-nitrophényl, un P-terpényl ou un 9-alkyl-glycoside peracétylé. Ainsi, l'action de monoterpénols, comme le géraniol, le nérol, l'aterpinéol, le linalol, ou d'alcools, comme le benzylalcool ou le phényl-2 éthanol sur le peracétyl a-bromo D-glucopyranoside ou le peracétyl a-bromo- rutinoside est effectuée en présence de carbonate d'argent, dans un solvant aprotique, comme par exemple l'éther, le chlorure de méthylène ou le chloroforme, en présence de drierite ou de tamis moléculaire 0,4 nm (4 A); ou en présence d'un catalyseur soluble, comme le cyanure mercurique, dans l'acétonitrile, en présence de tamis moléculaire 0,4 nm (4 K); l'action du p-nitrophénol sur le peracétyl a-chloro-rutinoside est obtenue dans la pyridine, en présence de carbonate d'argent et de drierite; celle de monoterpénols comme le linalol1, le géraniol ou l'a- terpinéol sur les O- -a et P-D-glucopyranosyl)>tricholoracétimidates est réalisée en présence de tamis moléculaire 0,4 ns dans le chlorure de méthylène ou le chloroforme. La chromatographie sur gel de silice des peracétyl e-glycosides désirés est effectuée en éluant avec des mélanges d'éther-éther de pétrole, de chloroforme-éther, de chlorure de méthylène-éther, ou d'acétate d'éthyleéther de pétrole. La dernière étape consiste en l'élimination des groupes protecteurs acétyle de la partie sucre des glycosides formés: la désacétylation est effectuée par transestérification dans le méthanol en présence d'une catalyse basique, comme le méthylate de sodium. Parmi les saccharides peracétylés, produits de départ de ces synthèses, seul le 1,2,3,4-tétra-O-acétyl-6-O- (2,3,5-trl-O-acétyl-a-L-arabinofuranosyl)-e-D-glucopyranose n'est pas commercial. Sa préparation peut être effectuée par la synthèse précédemment décrite, à partir de 1,2,3,5-tétra-O-acétyl-c, P-Larabinofuranose et de 1,2,3,4-tétra-O-acétyl-D-D-glucopyranose. Cependant, il est préférable de la réaliser par activation du 1,2,3,5-tétra-O- acétyl-a, e-L-arabinofuranose en 3,5-di-O-acétyl-1,2-O- [ (1-exo et 1-endo-cyano)éthylidène]-p-L-arabinofuranoses à l'aide de cyanure de triméthylsilyle en présence d'acide de Lewis, comme le chlorure stanneux, et du 1,2,3,4-tétra-O- acétyl-P-D-glucopyranose par tritylation en 1,2,3,4-tétra-O- acétyl-6-O-trityl-9-D-glucopyranose. La réaction de glycosylation entre ces deux synthons est effectuée dans des conditions rigoureusement anhydres, en présence de triphénylméthylium perchlorate comme catalyseur. Il est possible d'appliquer cette synthèse à la préparation du p-nitrophényl-2,3,4-tri-O-acétyl-6-0- (2,3,5-tri-O-acétyl-a-L-arabinofuranosyl)-p-D-glucopyrano- side, par couplage du meme dérivé cyanoéthylidène avec le p-nitrophényl 2,3,4-tri-O-acétyl-6-0-trityl-$-D-glucopyrano- side. Toutefois, cette glycosylation conduit, & côté du diholoside attendu, au diholoside ayant une liaison intérosidique 1---4: leur séparation est possible par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange d'acétate d'éthyle-éther de pétrole. Decaacétyl rutine Dans un ballon de 500 ml muni d'un réfrigérant avec garde au chlorure de calcium, on ajoute sous agitation magnétique 25 g de rutine sans 150 ml de pyridine anhydre. En refroidissant dans un bain d'eau froide, on aJoute ensuite, en 10 minutes environ 100 ml d'anhydre acétique et on poursuit l'agitation pendant 24 heures. Le milieu réactionnel est ensuite versé dans 1,5 1 d'eau glacée: le dérivé acétylé précipite en cristaux blancs. Ces cristaux sont filtrés, lavés à l'eau, avec un peu d'éther éthylique, puis séchés sous vide dans un dessicateur sur silicagel. On obtient 38,3 g (rendement: 99%) - CCX gel de silice - éther Rf = 0,22, P.f. = 128-135'C. Chlorure de 2.3.4-tri-O-acétyl-6-O-(2.3.4-tri-O-acétyl- a-L-rhamnopyranosyl)-a-D-glucopyranosyle. On fait fondre, sur un bec bunsen, dans un creuset, environ g de ZnCl2. On laisse refroidir sous papier d'aluminium et on place rapidement 4 g de ce ZnCl2, qu'on a broyé grossièrement, dans un ballon de 250 ml muni d'un réfrigérant et équipé d'une garde de chlorure de calcium. On aJoute alors sous agitation magnétique: - -0 ml de chloroforme anhydre, puis - 20 g de rutine décaacétylée; - enfin, on introduit, en 5 minutes, environ 20 ml de 1,1dichlorométhyl méthyléther; - on porte alors le mélange à 75-77'C pendant 2 heures. On décante la solution chloroformique, et on lave le résidu pàteux du ballon avec 20 ml de chloroforme, Joints à la solution chloroformique qui est évaporée sous vide au rotavapor & 35-45'C. Le résidu Jaune huileux est repris dans 500 ml d'éther éthylique qu'on lave à l'eau glacée, avec une solution saturée de Na2CO3, puis à nouveau à l'eau glacée. On sèche sur Na2SO4, on filtre et on concentre la solution au rotavapor, sous vide, vers 35'C. Le résidu, qui a partiellement cristallisé, est recristallisé dans l'éther éthylique, puis une deuxième fois dans l'éthanol anhydre. Les cristaux blancs obtenus sont séchés sous vide au dessicateur sur silicagel. On obtient 6,3 g (rendement = 53%) - CCX gel de silice - éther Rf = 0,52, P.f. = 148-150'C. p-Nitrophényl-2.S-4-tri-O-acétyl-6-0-(2.3.4-tri-O-ac2tyl- a-L-rhamnopyranosyl)-B-D-glucopyranoside Dans un erlen équipé d'une garde à chlorure de calcium et d'une agitation magnétique, on introduit 3 g de drierite et 1,5 g de p-nitrophénol dans 50 ml de pyridine anhydre. On agite ainsi pendant 1 heure, puis on aJoute 5 g d'acétochloro-arutinoside et 3 g de carbonate d'argent fraîchement préparés et séchés. On poursuit l'agitation à l'obscurité et à la température ambiante, pendant 24 heures. Le milieu réactionnel est filtré, le précipité, lavé avec un peu de pyridine, puis le filtrat est concentré au rotavapor sous vide vers 4045'C. Le résidu est repris 2 fois avec 25 ml de benzène et concentré de la même façon pour éliminer les traces de pyridine. Le résidu est à nouveau repris dans 100 ml de benzène et la solution est lavée avec de l'eau glacée, une solution N de soude, puis à nouveau à l'eau glacée, et enfin elle est séchée sur Ra2SO4. Après filtration, on. concentre le fliltrat au rotavapor sous vide à.35-40'CG. Le résidu rouge&tre et pàteux est purifié par chromatographie sur gel de silice [d'une granulométrie correspondant au passage à travers un tamis de 67 pm à 199 Fm d'ouverture de maille (70 à 230 mesh)], en éluant avec de -l'éther éthylique Rf # 0,5). 1l Les fractions les plus pures sont concentrées au rotavapor et les cristaux blancs obtenus sont recristallisés dans l'éthanol & 95'. On obtient ainsi 1,4 g (rendement = 25%) - CCM gel de silice - éther Rf = 0,5, P.f. = 185-187'C. Bromure de 2.3.4-tri-O-acétyl-6-0-(2.3.4-tri-O-acétyl- a-Lrhamnopvranosyl) -a-D-glucopyranosyle Dans un ballon de 50 mI, on place sous azote à -4'C, 1,3 g d'heptaacétorutinose et 0,4 ml d'anhydride acétique dans 20 ml de chloroforme, et on ajoute goutte & goutte 3,8 ml d'une solution d'acide bromhydrique gazeux à 33% dans l'acide acétique. On continue l'agitation à -4C pendant 2 heures, puis le milieu réactionnel est versé dans ml d'eau glacée. La phase organique est décantée, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée au rotavapor sous vide à 35'C. L'huile Jaune obtenue est utilisée sans purification dans l'étape ultérieure. Toutefois, il est possible de la cristalliser en la reprenant par un peu d'éther éthylique et en l'abandonnant au froid. Par filtration sous azote, lavage avec un peu d'éther éthylique et d'éther de pétrole, et séchage au dessicateur à froid, on obtient 310 mg de cristaux blancs.(rendement = 23%) P.f. = 120-125'C. Géranyl-2.3.4-tri-O-acétyl-6-0-(2.S.4-tri-O-acétyl- a-L-rhamnopyranosyl)-B-D-glucopyranoslde Dans un ballon de 50 ml, on agite pendant 24 heures, sous azote à température ambiante: - 665 mg de bromo-2,3,4-tri-0-acétyl-6-O-(2,3,4-tri-0- acétyl-a-L-rhamnopyranosyl)-a-D-glucopyranoside (produit brut de la réaction de bromation); - 1 ml de géraniol; - 0,5 g de cyanure mercurique dans 10 ml d'acétonitrile. On concentre ensuite au rotavapor sous vide à 'C, et on reprend le résidu dans 50 ml d'éther éthylique. Le solide qui précipite est filtré, rincé à l'éther éthylique, et le filtrat, concentré au rotovapor, sous vide, à 35'C. Le résidu huileux est chromatographié sur gel de silice [d'une graTulométrie correspondant au passage à travers un tamis de 67 pm à 199 pum d'ouverture de maille (70 à 230 mesh)] en éluant successivement à l'éther éthylique- éther de pétrole 10/90 pour éliminer l'excès de géraniol, puis par l'éther éthylique-éther de pétrole 75/25 pour éluer le rutinoside. Les fractions contenant le rutinoside sont rassemblées et concentrées & 35'C sous vide au rotavapor. On obtient 140 mg d'une pâte incolore (rendement = 19%), qu'on n'a pu cristalliser, pure en CCX - gel de silice; éther-éther de pétrole 3/1 Rf = 0,33. 2.3.4-tri-O-acétyl-6-O-(2.3.4-tri-O-acètyl-a-L-rhamno- pyranosyl)-D-glucopyranose Dans un ballon de 100 ml, on laisse sous agitation magnétique et sous azote un mélange de 600 mg d'heptaacétorutinose et de 1,2 ml de benzylamine dans 80 1ml d'éther éthylique pendant 24 heures à température ambiante. Le milieu réaction est ensuite concentré au rotavapor sous vide, et le résidu huileux est chromatographié sur colonne de gel de silice [d'une granulométrie correspondant au passage à travers un tamis de 67 ym à 199 pm d'ouverture de maille (70-230 mesh)] en éluant à l'éther éthylique. Les fractions contenant l'hexaacétylrutinose sont concentrées au rotavapor sous vide. On obtient 500 mg Rf = 0,31. O-(2.3.4-tri-O-acétyl-6-O-(2.3.4-tri-O-acetyl-a-L-rhamno- pyranosyl)-a et B-D-glucopyranosyl)-trichloracétilmidate Dans un ballon de 100 ml, on mélange, sous azote et à température ambiante, 2,6 g de 2,3,4-tri-O-acétyl-6- O-(2,3,4-tri-O-acétyl-a-L-rhamnopyranosyl)-D-glucopyranose, 1,6 ml de trichloroacétonitrile et 25 ml de chlorure de méthylène. On aJoute ensuite, sous agitation magnétique 1,6 g de carbonate de potassium anhydre et on poursuit l'agitation pendant 18 heures. On filtre ensuite le milieu réactionnel et on rince le précipité avec 10 ml de chlorure de méthylène. Le filtrat est concentré au rotavapor sous vide à 35'C, et le résidu est chromatographié sur colonne de silice [d'une granulométrie correspondant au passage à travers un tamis de 67 lm à 199 pm d'ouverture de maille (70-230 mesh)], en éluant avec un mélange éther éthylique- chlorure de méthylène 1/1. Les fractions contenant l'imidate sont réunies et concentrées au rotavapor sous vide à S5'C. On obtient 2,3 g d'huile incolore (rendement = 71%) CCX - gel de silice-éther diéthylique Rf = 0,76. ( )-linalyl-2.S.4-tri-O-ac&tyl-6-O-(R,O,4-tri-O-acétyl- a-L-rhamnopyranosyl)-B-D-jlucopyranoside Dans un ballon de 100 ml, on agite, sous azote et à température ambiante, un mélange de 550 mg de (+)linalol, 650 mg de O-(2,3,4-tri-O-acétyl-6-O-(2,3,4-tri-O-acétyl- a-L-rhamnopyranosyl)-a et e-D-glucopyranosyl)- trichloracétimidate et 1 g de tamis moléculaire 0,4 nm (4 A> dans 3 ml de chlorure de méthylène, pendant 30 minutes. On aJoute ensuite 22 pl d'une solution à 50% de trifluorobore- éthérate dans le chlorure de méthylène ainsi qu'après minutes d'agitation magnétique. Apres 40 minutes d'agitation supplémentaire, on aJoute 650 mg de bicarbonate de sodium au milieu réactionnel qui est ensuite lavé, volume à volume, par une solution aqueuse X/2 de bicarbonate de sodium puis par de l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée au rotavapor sous vide à 35'C. Le résidu huileux est chromatographié sur gel de silice úd'une granulométrie correspondant au passage à travers un tamis de 67 jm à 199 um d'ouverture de maille (70230 mesh)] en éluant d'abord avec un mélange d'éther de pétrole-éther diéthylique 4/1 pour éliminer l'excès de linalol, puis avec un mélange d'éther diéthylique- chloroforme 1/4 pour éluer l'hétéroside acétylé. Les fractions contenant ce dernier sont rassemblees et concentrées au rotavapor sous vide à 35'C. On obtient mg d'huile incolore (rendement = 29%) CCM - gel de silice; éther diéthylique-éther de pétrole 4/1 Rf = 0,34. Géranyl 6-0-(x-L-rhamnopyranosyl)-B-D-glucopyranoside Dans un erlen de 50 ml balayé par un courant d'azote, on dissout, sous agitation mécanique, 0, 2 g de géranyl-2,3,4-tri-O-acétyl-6-0-(2,3,4-tri-O-acétyl- -L-rhamnopyranosyl)-g-D-glucopyranoside dans 2 ml de méthanol anhydre. On aJoute ensuite, en 30 secondes, 0,3-ml d'une solution de méthylate de sodium (préparée à partir de 230 mg de sodium et 100 ml de méthanol anhydre>, et l'on poursuit l'agitation, sous azote, dans un bain d'huile à 68-70'C -pendant 20 minutes. On refroidit ensuite l'erlen dans un bain d'eau-glace et on ajoute environ 0,2 ml de DOWEX 50W x 4(H+) [d'une granulométrie correspondant au passage à travers un tamis de 74/147 pm d'ouverture de maille (100/200 mesh) humide pour que le pH de la solution devienne voisin de 7. On filtre alors la résine et on concentre le filtrat au rotavapor sous vide à 25'C. Le résidu huileux obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice 60 [d'une granulométrie correspon- dant au passage & travers un tamis de 67 pm & 199 pm d'ouverture de maille (70 à 230 mesh)] en éluant avec un mélange d'acétate d'éthyle- méthanol 3/1. Les fractions contenant le géranyl e-rutinoside sont rassemblées et concentrées au rotavapor sous vide à 25'C. On obtient mg d'une pate incolore qu'on n'a pu cristalliser, pure en CCX - gel de silice; acétate d'éthyle-méthanol 3/1 Rf = 0,35. 2.3.4-tri-O-acétyl-6-O-(2.3.5-tri-O-acétyl-a-L-arabino- furanosyl)-a et B-D-glucopyranosen Dans un.ballon de 100 ml contenant 25 ml d'un mélange tétrahydrofuranne-méthanol 7/3 et maintenu & 0'C dans la glace pilée, on fait barboter de l'ammoniac gazeux pendant 15 minutes. On ajoute ensuite 400 mg de 1,2,3,4-têtra-O- acétyl-6-0-(2,3,5-tri-O-acétyl-a-L-arabinofuranosyl)- e-D-glucopyranoside. On laisse le ballon revenir & température ambiante en poursuivant l'agitation. La réaction est suivie par CCX réduite à 40'C. Le résidu est ensuite purifié sur colonne de silice, en éluant avec un mélange de chlorure de méthylène - éther 6/4. On obtient ainsi 250 mg de produit désacétylé en position 1 (rendement 67'%). CCX - gel de silice, chlorure de méthylène - éther 6/4; Rf = 0,36. O-(2.3.4-tri-O-acétyl-6-O-(2.3.5-tri-O-acétyl-a-L-arabino- furanosyl-a et B-D-zlucopyranosyl)-trichloroacétimidate Dans un réacteur maintenu sous azote, on introduit 250 mg de 2,3,4-tri-O-acétyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acétyl- a-Lrarabinofuranosyl)-a et P-D-glucopyranoses, 2,5 ml de chlorure de méthylène absolu, 0,16 ml de trichloroacéto- nitrile et 160 mg de carbonate de potassium anhydre. Le milieu est laissé 48 heures à température ambiante, sous agitation magnétique. On s'assure que la réaction est complète par CCX (gel de silice.; chlorure de méthylène - éther 6/4). Le milieu est alors repris par 10 ml de CH2C12, filtré sur fritté. La phase organique est lavée successivement, volume & volume, par une solution aqueuse de NaHCO3 saturée et par de l'eau glacée; elle est ensuite (dot S séchée sur sulfate de sodium anhydre, puis concentrée à sec à 35'C sous pression réduite. On obtient ainsi 264 mg d'huile Jaunâtre chlorure de méthylène - éther diéthylique 6/4 - Rf = 0,5. Géranyl-2.3.4-tri-O-acétyl-6-O-(2.3.5-tri-O-acétyl- a-L-arabinofuranosyl)B-D-glucopyranoside Dans un réacteur de 50 ml, maintenu sous azote, on introduit 250 mg de 0-(2,3,4-tri-O-acétyl-6-O-(2,3,5-tri-O- * acétyl-a-L-arabinofuranosyl)-x et P-D-glucopyranosyl)- trichloroacétimidates, 250 p1 de géraniol et 1,5 ml de chlorure de méthylène anhydre. Le milieu est maintenu sous azote et sous agitation magnétique; on ajoute goutte à goutte 20 pi d'une solution à 50% de trifluorobore-éthérate dans le chlorure de méthylène. Après 3 heures de réaction, on s'assure que la réaction est complète par CCX (gel de silice, chlorure de méthylène - éther 7/3), puis on aJoute au milieu 50 mg de bicarbonate de sodium. On aJoute 10 ml de chlorure de méthylène et le milieu réactionnel est lavé, volume à volume, par une solution de bicarbonate de sodium X/2 glacée, puis par de l'eau glacée. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et amenée à sec à 35'C sous pression réduite. le résidu huileux est rapidement purifié sur colonne de silice, en éluant d'abord l'excès de géraniol par un mélange éther-éther de pétrole 1-1, puis le produit par un mélange chlorure de méthylène - éther 8/2. On obtient ainsi 150 mg d'huile incolore (rendement = 58%). CCX: gel de silice, chlorure de méthylène - éther 8/2, Rf = 0,49. 0862; p-nitrophényl-2.3.4-tri-O-acètyl-6-O-trityl-B-D-gluco- Dans un ballon de 100 ml, on introduit 1,42 g de e-D-glucopyranoside de pnitrophényle et 1,5 g de chlorure de trityle anhydre dans 10 ml de pyridine anhydre, et le ballon est abandonné à l'obscurité, sous agitation, à 40'C. La réaction est suivie par CCX en rajoutant si nécessaire du chlorure de trityle. Après 24 heures, on porte le ballon à température ambiante, et on aJoute 6 ml d'anhydride acétique. Le milieu réactionnel est abandonné 48 heures sous agitation en suivant la réaction en CCX (gel de silice, éther-éther de pétrole 7/3); on le reprend dans 500 ml d'eau glacée et on agite 2 heures. On filtre ensuite sur célite, et on rince la célite avec du dichlorométhane. La phase organique est lavée successivement par de l'eau glacée, de l'acide chlorhydrique 10%, une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium, puis de l'eau glacée. Elle est séchée sur sulfate de sodium et concentrée sous vide & 35'C. Le résidu est chromatographié sur colonne de silice en éluant avec un mélange d'éther-éther de pétrole 7/3. Les fractions contenant l'hétéroside sont rassemblées et concentrées sous vide à 35'C. On obtient 2,6 g (rendement = 83%) d'huile pure en CCX: gel de silice, éther-éther de pétrole 7/3, Rf = 0,33. 1.2.3.5-tAtra-O-acétyl-a. B-L-arabinofuranose Un mélange de L-arabinose anhydre (10 g) et de - méthanol anhydre (200 ml) est traité par de l'acide chlorhydrique méthanolique 1,06 X (préparé par addition à O'C de chlorure d'acétyle (4,7 ml) et de méthanol anhydre (63 ml)], le mélange est agité une nuit & 0-5'C.. De la pyridine 0862 FR température ambiante, pendant 2 jours. L'extraction du milieu réactionnel par l*acétate d'éthyle ou le dichlorométhane donne un produit sirupeux, qui est ensuite dissous dans un mélange d'acide acétique (100 ml) et d'anhydride acétique (25 ml); 5 ml d'acide sulfurique concentré sont ajoutés & O'C, et le milieu est laissé une nuit à température ambiante. La solution est ensuite plongée dans la glace pilée (150 g) et le mélange est agité pendant 2 heures puis extrait au chloroforme. L'extrait est lavé à l'eau, puis par une solution aqueuse de bicarbonate de sodium; le résidu obtenu après concentration de la phase organique est chromatographié sur colonne de gel de silice (éluant: gradient benzène: éther) et donne les 1,2,3,5-tétra-O-acétyl-a, P-L-arabinofuranoses sous forme de sirop (18 g, 85%), Rf = 0,46 3.5-Di-O-acétyl-1.2-O-[1 exo et 1 endo-cyano) éthylidène]- B-L-arabinofuranose A une solution de 1,2,3,5-tétra-O-acétyl-a, P-L- arabinofuranose (S g) dans l'acétonitrile (10 ml), on ajoute du chlorure stanneux anhydre (360 mg) et du cyanure de triméthyl silyle (3 ml). Le mélange est agité une nuit à température ambiante, puis dilué par de l'éther et lavé avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium benzène: éther) pour donner le produit 1-exo-cyano (994 mg,. 37%) et 1-endo-cyano (700 mg, 26%). La cristallisation par l'étherpentane donne l'isomère 1-exo-cyano (35%), P.f. = 66-69'C, [a]D -6' (C1), Rf = 0,56 (éluant: benzène: éther 3/2). La cristallisation par letoluène donne l'isomère 1-endo-cyano (23%), P.f. = 107-O110'C, ta]D + 51 (Cl> Rf = 0,37. 0S62 = 1.2.3.4-tétra-O-acètvl-6-O-(2.3.5-tri-O-acétyl-a-L-arabino- furanosyl)-B-D-Elucopvranose et p-nitrophényl 2.3.4-tri-O- acétyl-6-O-(2.3.5-tri-O-acétyl-a-L-arabinofuranosyl)- B-D-glucopvranoside Dans deux ballons fermés et réunis par un tube en forme de diapason, on introduit d'une part (dans un ballon), une solution de glucoside tritylée (0,55 mmole) et de 3,5-di-O-acétyl-1,2-O-[(1-exo et 1-endo-cyano)-éthylidéne]- B-L-arabinofuranose (0,5 mmole) dans le nitrométhane (2 ml) et, d'autre part (dans l'autre ballon), une solution de perchlorate de triphényl méthylium (0,05 mmole) dans 0,2 ml de nitrométhane. Ces deux solutions sont lyophylisées, puis 2 ml de benzène distillé sont introduits dans chaque ballon qui sont lyophylisés de nouveau; l'opération est répétée une seconde fois: les ballons et les réactifs sont ainsi desséchés pendant plusieurs heures. Du dichlorométhane (2 ml) est distillé in situ dans chacun des deux ballons. Les deux solutions sont alors rassemblées et laissées en réaction pendant une nuit à température ambiante et à l'obscurité (la lyophilisation ainsi que la dessication des réactifs, de même que la distillation sur CaH2 du benzène et du dichlorométhane sont effectuées à une pression de -3 0,533 Pa (4.103 mmHg). Le milieu réactionnel, d'une couleur Jaune lumineuse, est traité par i mi de pyridine-eau 3/1, puis la solution décolorée est diluée avec du chloroforme (50 ml), lavée à l'eau (3 x 30 ml) et concentrée. Le résidu est purifié sur colonne de gel de silice, en éluant avec un gradient benzène-éther ou acétate d'éthyle-éther de pétrole, pour fournir: - à partir du 1,2,3,4-tétra-O-acétyl-6-O-trityl- P-D-glucopyranose, le 1,2,3,4-tétra-O-acétyl-6-O- (2,3,5-tri-O-acétyl-a-L-arabinofuranosyl)-$-D-gluco- pyranose, P.f. = 10,5-108,5*C (éther-pentane); CCX: gel de silice; benzène-éther 3/2, Rf = 0,35. - & partir du p-nitrophényl 2,3,4-tri-0-acétyl-6-O- trityl-P-D-glucopyranosidet le p-nitrophényl 2,3,4-tri- 0&..' R O-acétyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acétyl-a-L-arabinofuranosyl)- B-D-glucopyranoside; CCM: gel de silice; acétate d'éthyle-éther de pétrole 1/1, Rf = 0,24 et le p-nitrophényl 2,3,O-tri-O-acétyl-4-O-(2,3,5-tri-O- acétyl-a-L-arabinofuranosyl)-B-D-glucopyranoside; CCX: gel de silice; acétate d'éthyle-éther de pétrole 1/1, Rf = 0,28. Géranyl 6-O-(a-L-arabinofuranosyl)-B-D-glucopyranoside mg de géranyl 2,3,4-tri-O-acétyl-6-O- (2,3,5-tri-O-acétyl-a-L-arabinofuranosyl)>--D- glucopyranoside sont dissous, sous azote, dans 5 ml de méthanol anhydre avec agitation magnétique. On ajoute 0,1 ml d'une solution méthanolique de méthylate de sodium (préparée à partir de 20 mg de sodium et 10 ml de méthanol). On poursuit l'agitation 4 heures à température ambiante, puis on neutralise la solution par addition de résine DOWEX 50W x 4 (H+). On filtre et on concentre à sec la solution.au rotavapor. Le résidu huileux est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice en éluant avec un mélange de chloroforme7méthanol.8/2, pour fournir 105 mg de géranyl 6-O-(a-L-arabinofuranosyl)-$-D-glucopyranoside sous forme de sirop. Rendement 81%, CCX: gel de silice, chloroforme-méthanol 8/2, Rf = 0,17. p-nitrophényl 6-O-,a-L-arabinofuranosyl)-B-D-glucopyranoside Par désacétylation du p-nitrophényl 2,3,4-tri-O- acétyl-6-O-(2,3,5-tri-O-acétyl-a-L-arabinofuranosyl)- P-D-glucopyranoside selon le mode opératoire précédent, on * obtient le.p-nitrophényl 6-O-(a-L-arabinofuranosyl)- B-D-glucopyranoside. CCX: gel de silice, acétate d'éthyle- isopropanol-eau 65/30/10. Rf = 0,69. 0862 P.l B * MESURE DES ACTIVITES ENZYKATIQUES ET PURIFICATION DES ENZYMES 1 - Mesure des activités enzymatiques Les activités glycosidasiques sont déterminées en incubant 0,1 ml de substrat 4 mM (Glc-pNP, Ara-pNP, RhapNP) dans un tampon acétate 100 mM (pH 4,2) avec 0,1 ml de solution enzymatique à 40'C pendant 20 minutes. La libération du pNP est estimée en aJoutant 0,6 ml de carbonate de sodium i M dans le milieu d'incubation, puis en mesurant la densité optique à 400 nm. 1 nkat d'activité correspond à la libération de 1 nmol de pNP par seconde. Deux glycosidases, a-arabinosidase et a-rhamnosidase, ont été isolées et purifiées à partir de préparations commerciales qui renferment des mélanges complexes d'enzymes. La e-glucosidase d'amande douce (Koch-light, Grande Bretagne,lot n' 287201) ne présentant aucune activité contaminante (24 h d'incubation à 40'C, pH 4,2) de type a-arabinosidase et cx-rhamnosidase a été utilisée telle quelle. 2 - Purification des enzymes 2-1. Purification d'une "-Lrhamnopyranosidase L'a-rhamnosidase a été purifiée à partir de la naringinase (Sigma) riche en ces activités. Les activités P-glucosidases, quoique faibles (0,1% de l'activité de l'a-rhamnosidase>, mais susceptibles de libérer du glucose sur de longues périodes d'incubation, ont été éliminées par la technique de chromatofocalisation 06 2 FR Fs O.7 J V Yovnu, san bF -Fe|* itepn am r --lenpY ç-s ps- asvpTsoolnI-g a,. SUfl aunonf luvazuom au (Tmp,;su Ze) amgxnep vl '5i' > Id 0a L'S Id!-' Z'9 Id! sanbTzosalios$ s1uTod ap (as9pIsoumUqa)> ssmCzueosT ú su'oFO nw eaJ;euar esuursulivu ul anb asuc a enb;uqoa a;%.ao XI Tgv ap uonlTos aun,p agessd ael aid agnlTQ %a (L'S > Id) L'S Hd vnbsnF anuaa; -as asepTsoonIS-4 4TATowl, ap 9,4%$vIo% w1 anb siolw Hd ap;uaTpvJ5 al sump sagnlg %uos sassp$soulmqj-" S;TAT;$ov sea Hd op 1ueSpvao i..-+ mu oez V aouvqjosqy 0o- as8pTSOOnlt2-1 9%TAI-oy - : auW1ns %l ^sa apuasgI vI;uop T a:nS2T eT ans aquesjasac s anse qd omooT; od al mu o0Z V enbTIdo e,4Tsuap eî;a Hd al lasvpTsoonlg-1 asvpTsou=vqa_SeTATo' sel saginseu %uos saellnbsesI ans 'sagoalloo %uos Il 8'Z ap suoTome; sea se nualsai SauT9qoad sael Bqos9p (L' Hd) R =d OOT aoo qov uodim% np suep i It iox ap e2wssvd aT ';ueTpva2 np uT; vl sgady qj1m 9 ap:Tqqp un e [1' Hd un n esn %umajlqvlwad (o ç 4 'Jae;;nqXlod] sauitoqdiw,p uC eQj3Tm VI ap siol,aio '1' V bP'' ap Hd ap quaTpva2 un avd sainT9 %uos îae so ans sagxl; sauT$o.d sael uodme0 Oi. amm alT oaA ataiqlITnbg (ap glycosides naturels et de synthèse. Le rendement global de récupération des activités a-rhamnosidases est d'environ 62%. 2-2. Purification d'une a-L-arabinofuranosidase Parai les préparations enzymatiques commerciales étudiées, l'Hemicellulase REG-2 (Gist Brocades, France)' s'est révélée riche en activité a-arabinosidase. Néanmoins, elle présente des activités importantes de type e-glucosidase et arhamnosidase. Par6Kemple, 250 mg d'Hemicellulase renferment 2 327 nkat d'activité a-arabinosidase, 2 566 nkat d'activité P-glucosidase et 236 nkat d'activité a-rhamnosidase. Plusieurs techniques chromatographiques sont appliquées successivement pour isoler et purifier l'c-arabinosidase. Tamisage moléculaire de l'Hemicellulase sur Ultrogel AcA 44 Fractionnement La solution enzymatique (250 mg d'Hemicellulase dans 3 ml de tampon citrate-phosphate 100 mX, pH 7,2) est dialysée contre le même tampon (500 ml) pendant une nuit (+5'C). Le dialysat est alors déposé sur une colonne (1,6 x 100 cm) d'Ultrogel AcA 44 (IBF, France) précédemment équilibrée avec le même tampon. La colonne est ensuite éluée avec le tampon ci-dessus à un débit de 9 ml/h. Des fractions de 1,2 ml sont collectées et les activités a-arabinosidase, P-glucosidase, a- rhamnosidase ainsi que la densité optique à 280 nm sont mesurées. sutats Le profil chromatographique est représenté sur la figure 2 dont la légende est la suivante: - * Activité "-arabinosidase ou y Activité 3glucosidase -UO Activité i-rhamnosidase 0-0 Absorbance & 280 nm. Le tamisage moléculaire sur Ultrogel AcA 44 permet de séparer les deux activité maJeures a-arabinosidase et À-glucosidase. Les activités arhamnosidases sont co-éluées avec les activités a-arabinosidases. La majeure partie des protéines présentes dans la solution enzymatique de départ est éluée avec les activités a-arabinosidases. La fraction (52 ml) correspondant aux activités a-arabinosidases (1 750 nkat) renferma encore des activités parasites, c'est-à-dire, la Pglucosidase (23,4 nkat>) et l'x-rhamnosidase (37,4 nkat), soit 1,3% (Pglucosidase) et 2,1% (o-rhamnosidase) par rapport à l'activité aarabinosidase. Chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Sepharose CL-6 B de la fraction a-arabinosidase issue du tamisage moléculaire Fractionnement La fraction (52 ml) riche en a-arabinosidase a été dialysée contre 500 ml de tampon imidazole-HCl 25 mn (pH 7,5) pendant une nuit (+5*C). Le dialysat est alors déposé sur une colonne (1,6 x 40 cm) de DEAE Sepharose CL-6 B (Pharmacia) équilibrée précédemment avec le même tampon. Le gel est d'abord lavé par ce tampon & un débit de 108 ml/h. Les protéines retenues sur la colonne sont ensuite éluées par un gradient linéaire de chlorure de sodium (de 0 à 0,4 X) dans le même tampon (lmidazole-HCl) A à un débit de 40 ml/h. Des fractions de 4 ml sont recueillies sur lesquelles sont mesurées, les activités a-arabinosidase, P-glucosidase, a-rhamnosidase et la densité optique & 280nm. Le profil chromatographique est représente sur la figure 3 dont la légende est la suivante *5... Activité a-arabinosidase a Activité P- glucosidase -u = Activité a-rhamnosidase 0---O Absorbance à 280 nm Gradient de force ionique (NaCl) Dans ces conditions, les trois activités sont bien séparées. Le pic élué (69 ml) à partir de NaCl 0,3 X et correspondant aux activités a-arabinosidase (365 nkat) ne renferme plus que de faibles activités e-glucosidase (0,43 nkat) et a-rhamnosidase (0, 32 nkat), soit 0,1% ( l'activité a-arabinosidase. Il est à noter qu'au terme de cette étape, la fraction a-arabinosidase renferme beaucoup moins de protéines que la solution enzymatique de départ. Cette étape permet de purifier l'activité a-arabinosidase environ 14 fois. Cependant, la présence de faibles activités en P-glucosidase et itrhamnosidase pouvant intervenir dans l'hydrolyse de glycosides naturels et de synthèse, la purification a été poussée par l'application d'une autre technique chromatographique (affinité). Chromatozraphie d'affinité sur Concanavaline A-Ultrogel de la fraction a-arabinosid&se issue de l'étape chromato- graphique sur DRAE Sepharose CL-6 B Fracti onnemmnt La fraction =arabinosidase (69 mI) est concentrée dans un boudin de dialyse recouvert de gel de Sephadex G-200 (Pharmacia) Jusqu'à 12 ml. Elle est dialysée d'abord contre un tampon Tris-HC1 50 mN (pH 7,2) contenant du NaC1 0,1 > et du XnCl2 0,1 mM pendant une nuit (+5'C), puis injecté sur un uollntos u-1 -u01u8 STO >au iSu 6 spSuuç -x w;TaT;oe a a;;xnd u uo 'adw; a.guTuaep ae;ao V eoVi aIxq%@m ap apTsouaedouu=m-Q-ap:.ueTpe -- -lu 08Z g eouvq aosqy 0 Q-- esep;souTqexu-.0 a ) uTeuI -. uapei2 S un oae paoqup 'uodm%; amqm el suep (yg weaS) aelx;gu ap apTsoueiodouua--D, oA apnI; sa auuouoo we 'q/lTu Oe ap %qip un e Isnssap-To uodme; aI oaa e azqIn1b;uaemlqeled (Mo Oi X O') (niaV 'aSI) On-Y auTiAeumouoo ap ls enzymatique utilisée dans les essais d'hydrolyse renferme 29,9 nkat/ml d'activité. Les résultats numériques correspondant aux différentes étapes au cours de la purification de l'a-arabinosidase & partir de l'Hemicellulase sont rassemblées dans le tableau 1. Tableau Jl - Purification de l'a-arabinosidase de l'Hemicellulase REG-2 Etape Acti- Rende- Protéi- Rende- Acti- Facteur Volume vité ment nes (1) ment en spéci- de puri- (nl) totale en ac- totales protéi- fique fication (nkat) tivité (mg) nes %) (nkat) ($) mE-1) Hemicellu- lase brute 3,2 2327 100 322,6 100 7,2 1 (250 mg) Tamisage sur Ultro- 52 1759 75,6 112,3 34,8 15,7 2,2 gel AcA 44 Echange d'ions sur 69 365 15,? 3, 6 1,1 101,3 14,1 DEAE Sépha- rose Cl-6 B Affinité sur Conca- navaline 34 75 3,2 0,4 0,1 192,3 26,7 A-Ultrogel (1> Les protéines sont dosées d'après Lowry et coll (1951) "Protein measurement withthe Folin phenol reagent", 33 J. Biochem. 19_, pages 265-275. Propriétés de l'a-arabinosidase purifiée opt Ira I La solution enzymatique est incubée en présence de son substrat (Ara-pNP), dans du tampon universel (type BRITTON et ROBINSON) de pH variant de 2,0 & 7,0. Les mesures d'activité sont réalisées aux divers pH d'incubation dans les conditions décrites au début de ce chapitre A. L'activité résiduelle en fonction du pH est présentée sur la figure 5a (courbe:.- L'activité o-arabinosidase est maximale autour de pH 3,7-4,0. StabilIté de l'activité en fonction du pH La solution enzymatique est incubée pendant 50 mn À10 à 60'C dans un tampon universel dont le pH varie de 3,0 & 6,5. Les échantillons sont ensuite dialysés contre 1 1 de tampon acétate 100 mX (pH 4,2) pendant 5 heures (+5'C). L'activité rsiduelle mesurée est représentée sur la figure a (courbe o.-o. L'activité a-arabinosidase est rela':vement stable entre pH 3,8-4,9. Cette stabilité décroît rapidement à des pH inférieurs à 3,5 et supérieurs à 5,5. Tem2érature op2timale L'activité a-arabinosidase est déterminée après incubation du milieu réactionnel & différentes températures variant de 5'C à 80'C. L'activité relative en fonction de la température d'incubation est montrée sur la figure 5b. (courbe a =). L'activité est maximale à O'C. Stabilité thermique La solution enzymatique est maintenue à différentes températures (de 5'C à 80'C) dans du tampon acétate 100 mX (pH 4,2) pendant 30 minutes: l'activité résiduelle est ensuite msurée et les résultats sont représentés sur la figure 5b. (courbe-o 0). - L'activité a-arabinosidase est stable Jusqu'à 60'C et au-delà, la stabilité décroît brusquement. Elle est pratiquement totalement inactivée après un traitement à 7Q'C pendant 30 minutes. 29 262-8439 C * HYDROLYSES ENZYMATIQUES L'action séparée ou séquentielle de trois enzymes, une o-Larabinofuranosidase (E.C.3.2.1.55, notre a-arabinosidase), une a-Lrhamnopyranosidase (E.C.3,2.1.40, notée a-rhamnosidase) et une g-Dglucopyranosidase (E.C.3.2.1.21, notée P-glucosidase) a été étudiée sur différents substrats glycosidiques. Ceux-ci sont d'une part les c-Lrhamnopyranosyl (1-)6> -D-glucopyranosides de p-nitrophényle ou de géranyle (notés Rha-Glc-pNP ou Rha-Glc-Ger), l'o-L-arabinofuranosyl (1-6)-$-D-gluco- pyranoside de p-nitrophényle qui, pour deux d'entre eux, est le p-nitrophénol (pNP). L'hydrolyse enzymatique est suivie par des chromatographies sur couche mince (CCX), et en phase gazeuse (CPG). Chromnatographie sur couche mince (CCX) La chromatographie d'adsorption sur couche mince a été menée sur des feuilles d'aluminium recouvertes d'une mince couche (0,2 mm) de gel de silice (5553 Kieselgei 60 sans indicateur de fluorescence, Xerck). Le mélange acétate d'éthyle/isopropanol/eau (65/30/10) (v/v/v) a été utilisé comme solvant de migration. Les sucres et les glycosides sont révélés grâce au mélange suivant préparé extemporanément: 0,2% naphtorésorcinol dans l'éthanol/acide sulfurique concentré (19/1) (v/v). L'application de ce révélateur est suivie d'un séchage des plaques & l'étuve (105'C) pendant minutes. Outre leur distance de migration, les divers composés se distinguent aussi par leur couleur. Les glycosides sont rouge violacé; les arabinosides sont bleuâtres, le rhamnose roce verdâtre, l'arabinose bleu et le glucose rose. Par ailleurs, la CCX a permis la récupération de la partie de l'extrait glycosidique non hydrolysée par les enzymes. La zone de la plaque chromatographique o est localisée la tache correspondante a été grattée, le gel de silice récupéré et mis en suspension dans 50 ml de méthanol. Après une nuit sous légère agitation, l'ensemble est filtré sur BUchner et le gel est lavé par 3 x 10 ml de méthanol. Les éluats organiques sont rassemblés, amenés & sec sous vide à 40'C puis repris dans 500 p1 d'eau ultra-pure. L'échantillon aqueux ainsi obtenu est alors prêt pour l'hydrolyse acide. Chromatographie en phase gazeuse (CPG) Cette technique a été utilisée afin d'analyser aussi bien les sucres, les glycosides terpéniques, que les terpénols libres. Pour cela, deux systèmes chromatographiques distincts ont été mis en oeuvre. CPG des glycosides Les glycosides et les sucres sont des composés non volatils et ne se prêtent donc pas, en l'état, à une analyse par CPG. Il est indispensable de les transformer en composés volatils, grâce & un réactif choisi. On a donc procédé à la formation de dérivés triméthylsilylés selon le protocole suivant: pl d'extrait glycosidique et 60 pl d'une S0 solution de Glc-pNP (étalon interne) à 50 mg/1 dans l'acétate d'éthyle sont introduits dans un flacon approprié. L'ensemble est amené à sec à 40'C par un courant d'azote. pl du réactif de silylation (Tri-sil, Pierce, Rockford, IL, USA) sont alors introduits; le flacon est fermé hermétiquement et maintenu à 40C pendant 20 minutes. Après hermétiquement et maintenu à 40'C pendant 20 minutes. Après Z628439 un refroidissement rapide, l'échantillon silylé est alors prêt pour l'analyse par CPG. -- L'appareillage utilisé est constitué d'un chromatographe en phase gazeuse Série 30C, d'un injecteur "on-column" (volume inJecté 0,5 pl) et d'un détecteur à ionisation de flamme (Girdel, France). Sur la paroi intérieure de la colonne capillaire (50 x 0,32 mm D.I.) est greffé un film fin (0,20 pm) d'une phase silicone apolaire OV-1 (Girdel). La température du four est programmée de 125 à 305'C & raison de 5'C/minute, puis maintenue à 305'C pendant 15 minutes. Enfin, la température du détecteur est fixée à 300'C et l'hydrogène est utilisé comme gaz vecteur & une pression de 120 kPa. CPG des terpénols Les alcools monoterpéniques étudiés ici sont suffisamment volatils pour être chromatographiés en l'état. A l'extrait au pentane qui les contient, on ajoute l'étalon interne, le nonanol-4 (pour synthèse, Xerck, Darmstadt, RFA) à raison de 1 pi d'une solution a 2,89 mg/ml dans le pentane pour 50 pl de milieu. L'ensemble est alors séché sur sulfate de sodium, filtré sur laine de verre, puis concentré Jusqu'à un volume voisin de 100 pl. Pour cela, le pentane est d'abord éliminé à l'aide d'un distillateur classique, puis d'une colonne de type Dufton de taille adaptée au volume restant à concentrer. Les constituants de l'extrait concentré sont séparés & l'aide d'une colonne capillaire . Le film de polyéthylene glycol greffé a été choisi épais (1,28 ym), afin de permettre l'injection de grands volumes d'échantillon, Jusqu'à 4 pl. L'analyse est effectuée à l'aide d'un chromatographe Practovap Série 2900 (Carlo ERba, Xilan, Italie), équipé d'un détecteur à ionisation de flamme maintenu à 250'C, et d'un inJecteur "on-column". On a utilisé l'hydrogène comme gaz vecteur à une pression de 60-kPa et programmé la -5z? P température du four selon: isotherme à 7O'C pendant minutes puis montée à 195'C à raison de 2'C/minute et palier à 195'C pendant 15 minutes. Chromatographie liquide à haute performance (CLHP) La chromatographie en phase liquide à haute performance a été mise à profit pour isoler certains glycosides terpéniques. Pour cela, des fractions ont été collectées à la sortie du système chromatographlque (plus particulièrement lors de l'élution des pics A et B) au cours de la séparation des constituants de l'extrait glycosidique (figure 10 ci-après) . Quinze injections successives de y1 chacune ont permis d'isoler suffisamment de matière pour procéder aux hydrolyses enzymatiques et aux analyses par CPG afin d'identifier les composés concernés. Le système chromatographique est constitué des éléments suivants: un chromatographe Vista 5500 équipé d'un spectrophotomètre UV-Visible à longueur d'onde variable (Varian Assoc., Sunnyvale, CA, USA); une vanne d'injection à six voies (Valco) munie d'une boucle de 20 1pl; une colonne en acier inoxydable (220 x 4 mm D.I.) remplie de silice greffée octadécyle Sphéri-5 (Brownlee Labs., Santa Clara, CA, USA) de faible granulométtrie (5 um), ainsi qu'une précolonne (37 x 4 mm D.I.) garnie avec la même phase stationnaire. La chromatographie est réalisée à l'aide d'une phase mobile hydroorganique eau-acétonitrile (chromatographie à polarité de phase inversée) et d'une élution graduée selon une augmentation de la teneur enacétonitrile de 30 à 40 % (en volume) en 10 minutes. Le solvant d'élution est pompé à un débit de 1 ml/min. La détection est effectuée à 200 nm et 0,5 unité d'absorbance pleine échelle. Z628439 1 - HYDROLYSES ENZY>ATIQUES SUR SUBSTRATS SYNTHETIQUES Dans tous les essais concernant l'hydrolyse enzymatique des substrats synthétiques, les mêmes activités glycosidasiques'(0,15 nkat) pour chacune des enzymes (a-arabinosidase, a-rhamnosidase, P-glucosidase) sont utilisees. Les protocoles d'hydrolyse et d'analyse sont donnés sous forme de schéma (tableau 2). On rappellera ici les principales abréviations utilisées: pNP pnitrophénol Ara-pNP a-L-arabinofuranoside de p-nitrophényle Rha-pNP a-Lrhamnopyranoside de p-nitrophényle Rha-Glc-pNP a-L-rhamnopyranosyl-(I*6)*-$--glucopyranoside de p-nitrophényle Rha-Glc-Ger a-L-rhamnopyranosyl(16)-4-E-glucopyranoside de géranyle Ara-Glc-pNP a-L-arabinofuranosyl(186)-$--glucopyranoside de p-nitrophényle Ara-Glc-Ner a-Larabinofuranosyl-( -p-2-glucopyranoside de géranyle Glc-pNP P-Dglucopyranoside de p-nitrophényle Glc-Lin B-D-glucopyranoside de linalyle Glc-Ner P-D-glucopyranoside de néryle Glo-Ger e-D-glucopyranoside de géranyle S5 Tableau 2 - Sch4ma du protocole d'hydrolyse enzymnt:ique dn nubnl.rotr. synth6tiques lère Etape 2ème Etape Addition de Addition de 50 pl d'une solution de p-glucosi- soit 50 pl d'une dase (0,15 nkat) dans ESSAI I solution d' Réincubation 400C, 90 min, puis a-arabinosidase 15 pl C- CM pl d'Ara-Glc-pNP (0,15 nkat) Incubation 400C,90 min 36 p - pNP libéré 4mM dans (ESSAI I) puis du tampon ac6tate 12 pl - CCM mM (pH 4,2) soit 50 pl d'une 30 pl - pNP libéré solution de P-glucosidase (0,15 nkat) (ESSAI IX) Addition do Addition de 50 pl d'une solution de p-glUcosi- soit 50 pl d'une dase (0,15 nkat) dans ESSAI III solution d' Rlincubation 40 C, 90 min, puis pl de Rha-Glc-pNP a-rhamnosidase Incubation 40 C,90 min Extraction au pentane (5 x 250 pl) - CPG (4mM) ou de (0,15 nkat) puis 15 iil - CCM Rha-Glc-Ger (solution (ESSAI III) Extraction au pontane 36 pl pNP Llb6ré non titrée) dans du. (5 x 250 l)-.-CPG tampon acetate 100 mM soit 50 pl d'une (pH 4,2) solution de 12 pl - CCM -glucosidase 30 pl - pNP libéré (ESSAI IV) ri Les témoins sont réallsés dans les mêmes conditions, en présence des enzymes lnactivées (95 C, 30 minutes). w tg Ibo Les résultats obtenus en CCM sont présentés dans la figure 6, dont la légende est la suivante: Suivi par CCX de l'hydrolyse enzymatique de Ara-Glo-pNP (a) et Rha-Glc-pNP (b). la. Ara-Glc-pNP + P-glucosidase 2a. Ara-Glc-pNP + a-arabinosidase 3a. Ara-Glc-pNP + a-arabinosidase + Pglucosidase la. Rha-Glc-pNP + P-glucosidase 2a. Rha-Glc-pNP + arhamnosidase 3b. Rha-Glc-pNP + a-rhamnosidase + P-glucosidase L'action de la P-glucosidase sur les différents substrats synthétiques n'entraîne aucune modification. L'action de l'o-arabinosidase sur Ara-Glc-pNP provoque la disparition de ce substrat et l'apparition d'arabinose et de Glc-pNP. De mme, l'action de l'a-rhamnosidase sur Rha-Glc-pNP ou Rha-Glc-Ger entraîne la disparition de ces substrats et l'apparition.de rhamnose et de Glc-pNP ou de Glc-Ger. Ceci constitue la première étape de l'hydrolyse. L'action consécutive de la P-glucosidase sur chacun des milieux incubés précédemment avec l'a-arabino- sidase ou l'a-rhamnosidase conduit à la disparition des Glc-Ger et GlcpNP et & l'apparition de glucose (seconde étape>. En ce qui concerne les aglycones correspondants (pNP ou Géraniol), ils ne sont libérés qu'après l'action séquentielle des deux glycosidases: a-rhamnosidase ou a-arabinosidase, puis P-glucosidase. - Ces résultats montrent que l'hydrolyse enzymatique des glycosides étudiés se déroule bien avec les deux étapes décrites ci-dessus. décrites ci-dessus. 3f 2 - HYDROLYSE ENZYMATIQUE D'UN EXTRAIT GLYCOSIDIQUE PROTOCOLE D'OBTENTION DE L'EXTRAIT GLYCOSIDIQUE L'extrait glycosidique a été obtenu par extraction d'un moût de Muscat de Frontignan collecté à maturité dans les vignes de la Station Expérimentale de.Pech Rouge (INRA Gruissan, France), puis élimination des sucres et terpénols libres. Compte tenu du nombre élevé d'expérimentations à réaliser, il était indispensable de disposer d'un stock glycosidique conséquent. Pour cela, on a opéré sur un grand volume (80 litres) de moût préalablement centrifugé et sulfité (50 ppm) et procédé à l'extraction du matériel glycosidique à l'aide de 80 grammes de charbon actif classiquement utilisé en oenologie (charbon type CXV; Ceca S.A., Velizy-Villacoublay, France). L'ensemble a été maintenu sous agitation pendant 4 heures, puis au repos pendant une nuit. Le charbon a ensuite été récupéré par filtration & travers des filtres de cellulose (porosité 40- 50 pm). Afin d'éliminer la plus grande partie des sucres également extraits par le charbon, celui-ci a été lavé par 4 x 150 ml d'eau et filtré sur B chner. Le suivi en CCX a permis de vérifier que la teneur en sucres diminuait à chaque étape, sans qu'il y ait élution des glycosides. Ces derniers ont alors été récupérés par lavage avec x 200 ml d'acétone. Là encore, le suivi en CCX a permis de s'assurer de l'élution quantitative du matériel glycosidique. L'acétone a été éliminée par évaporation sous vide et l'échantillon repris dans 40 ml d'eau ultra-pure. Une purification plus poussée de l'extrait glycosidique a ensuite été réalisée par fractionnement sur une résine organique Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas Co., Philadelphie, CA, USA) préparée selon le protocole suivant: broyage et tamisage des particules de dimension correspondant & un tamis de 175 - 350 pm d'ouverture de maille (entre 80 et Z628439 mesh>, puis trois lavages au Soxhlet avec, dans cet ordre, méthanol, acétonitrile et éther diéthylique, pendant 8 heures pour chaque solvant. Le procédé de fractionnement, mis au point au Laboratoire des Arômes et des Substances Naturelles, a déjà été décrit en détail. Dans ce travail, il a été appliqué consécutivement.deux fois et a comporté les étapes suivantes: - - La résine, en suspension dans du méthanol, est versée dans une colonne en verre (35 x 1 cm) terminée par un robinet en Téflon et un tampon de laine de verre. Apres tassement, le dépôt de résine mesure environ cm. On procède alors à plusieurs passages.de 50 ml de méthanol, puis à un lavage par 50 ml d'éther diéthylique et enfin & un équilibrage de la résine à l'aide de 100 ml d'eau ultra pure. La colonne est alors prête à l'emploi. - Les 40 ml d'extrait glycosidique sont passés & travers la colonne à un débit compris entre 2 et 2,5 ml/minute. Celle-ci est alors lavée par 100 ml d'eau pour éliminer o0 les sucres résiduels et par 100 ml de pentane, afin d'éluer les terpénols libres fixés par la résine, ceci au même débit que précédemment. - Les glycosides sont alors récupérés par élution à l'aide de 100 ml d'acétate d'éthyle. La composition de cette fraction est étudiée par CC!, ce qui permet de vérifier l'absence de sucres libres (en l'occurrence au terme du second fractionnement sur XAD-2). La fraction glycosidique a été amenée & sec sous vide, puis reprise dans 18 ml d'eau. On a ainsi obtenu l'extrait glycosidique sur lequel ont porté les expérimentations chromatographiques et enzymatiques. HYDROLYSE - Les protocoles expérimentaux de l'hydrolyse enzymatique sur l'extrait glycosidique sont rassemblés dans le Tableau 3. Tableau 3 -Schém duprotocole d'hydrolys, enz2Èatlque de J'extrait glycogldIgue lère Etape 2ème Etape Addition de soit 50 pl d'une Incubation 40 c, 16 h ADDITION de 50 pl d'une solution de solution d' puis p-glucosidnse (0,15 nkat) dans les a-arabinosidase Extraction au pentane ESSAIS I et II (0,15 nkat) (5 x 250 pl)- CPG (ESSAI I) Rélncubatilon 400C, 16 h puis soit 50pl d'une 50 il phase aqueuse Extraction au pentane (5 x 250 P1) - CPG pl d'extrait solution de silylation--_CPG a-Rhamnosidase (0,15 nkat) 65 pi phase aqueuse silylation --'CPG glycosidlque (ESSAI IT) 12 pl-phase aqueuse 15 p1 phase aqueuse CCM -CCM SOIT p1 d'une O solution de p-glucosidase (0,15 nkat) (ESSAI III) Les témoins sont réalisés dans les mimes conditions, en pr6sence des enzymes inactivées (95'C, 30 minutes). À Avant les hydrolyses enzymatlques, l'extrait glycosidlque est relavé plusieurs fois avec le pentane pour enlever les traces de terpinols. w c Cette hydrolyse est suivie par CCX et CPG. Suivi de 1 'hydrolyse par CCX Les résultats sont présentés dans la figure 7: Suivi par CCX de l'hydrolyse enzymatique de l'extrait glycosidique. 1. Extrait glycosidique 2. Extrait glycosidique + P-glucosidase 3. Extrait glycosidique + a-arabinosidase 4. Extrait glycosidique + ao-rhamnosidase 5. Extrait glycosidique + a-arabinosidase + P-glucosidase 6. Extrait glycosidique + a-rhamnosidase + P-glucosidase L'extrait glycosidique de départ présente une tache majeure (Rf 0,71, n' 2 sur CCX) et deux taches mineures (Rf 0,67 et 0,79, n 1 et n' 3 sur CCX). L'hydrolyse de cet extrait avec la P-glucosidase fait apparaître une légère tache de même Rf (0,26) que le glucose et diminuer la tache supérieure (n 3>. Dans le cas de l'hydrolyse avec l'a-arabinosidase, on constate une diminution importante de la tache majeure (n' 2) et l'apparition de taches de Rf (0,76, 0,79) identiques à ceux des monoglucosides terpéniques, au Rf (0,31> de l'arabinose et d'une légère tache inconnue à un Rf inférieur (0,55) & celui du rhamnose. Lorsque l'extrait glycosidique est soumis. l'action de a-rhamnosidase, la tache n' 1 correspondant au Rf du Rha-GlcGer disparaît et une légère tache au Rf des monoglucosides terpéniques apparaît. Dans ce cas, on ne retrouve que le rhamnose (Rf 0,59) comme monosaccharide libéré. L'action consécutive de la P-glucosidase sur chacun des milieux incubés, soit avec l'a-arabinosidase ou l'a- rhamnosidase, fait diminuer sensiblement les taches au Rf de monoglucosides et apparaître le glucose. Cependant, la tache majeure (n' 2) de l'extrait glycosidique n'ayant pas complètement disparu après l'action séquentielle des glycosidases, la partie restante a été récupérée, puis soumise à une hydrolyse acide, dont les conditions sont indiquées ci-après, pour voir si elle renfermait ou non des terpénols. Son hydrolyse à pH 3,0 n'a ni entrainé des modifications (vérifié par CCX), ni libéré des terpénols (vérifié par CPG> . En revanche, l'hydrolyse totale par l'acide trifluoracétique 2 X a fait disparaître À10 cette tache et a libéré du glucose, du rhamnose et un composé inconnu (Rf 0,55), mais pas de terpénols (CPG). Ainsi, on a démontré que la tache qui résiste à l'action conJuguée des glycosidases ne renferme pas de glycosides terpéniques. Ces essais sur CCX ont fourni des informations sur le devenir de la partie glucidique des glycosides au cours de leur hydrolyse avec des enzymes purifiées. Il ressort de ces résultats que l'hydrolyse des glycosides terpéniques implique une hydrolyse séquentielle. On a démontré d'une façon plus précise le mécanisme de cette hydrolyse par analyse en CPG. Suivi de 1 'hydrolyse par CPG A chaque étape de l'hydrolyse, les produits de réaction (les sucres, les glycosides terpéniques et les terpénols) sont analysés par CPG. Les résultats sont présentés sur les figures 8 et 9: Figure 8: Suivi par CPG de l'hydrolyse enzymatique de l'extrait glycosidique. @30 Extrait glycosidique silylé Extrait glycosidique + a-arabinosidase Extrait glycosidique + a-arabinosidase ± -glucosidase E.I. Etalon interne (Glc-plP) i et 2. a et g-arabinose 5 et 6. a et p-glucose a. Glc- Lin b. Glc-Ner c. Glc-Ger A. Ara-Glc-Ner B. Ara-Glc-Ger Figure 9: Comme la figure 8 dans le cas de l'hydrolyse séquentielle a-rhamnosidase + 3-glucosidase. 3 et 4. a et P-rhamnose L'extrait glycosidique de départ (silylé) ne renferme ni monosaccharides, ni monoglucosides terpéniques (figure 8î). L'action de la D-glucosidase ne modifie pas sensiblement le profil de cet extrait hormis l'apparition de glucose. Ce dernier, observé également par CCO lors du suivi de l'hydrolyse de l'extrait giycosidique par cette enzyme, ne provient donc probablement pas de l'hydrolyse des précurseurs terpéniques, mais d'autres glycosides. L'action de l'c-arabinosidase ou de l'a-rhamnosidase entraîne des modifications importantes au niveau du profil de l'extrait glycosidique (figures 8b et 9h>. Notamment les deux pics maJeurs que l'on a identifiés (pic A = Ara-Glc-Ner; Pic B = Glc-Ger) disparaissent complètement après incubation du milieu avec l'a-arabinosidase, tandis qu'apparaît l'arabinose. Le pic C, correspondant au temps de rétention du Rha-Glc-Ger, diminue après l'action de l'a-rhamnosidase; on observe simultanément l'apparition du rhamnose. L'incubation de l'extrait glycosidique avec chacune de ces deux glycosidases fait appara!tre, d'autre part, trois monoglucosides abondants (glucosides de linalyle, néryle et géranyle>, identifiés par comparaison avec des substances de référence. La majorité (77%) de ces monoglucosides terpéniques est libérée par l'action de l'a-arabinosidase, le reste (23%) produit par l'action de l'a-rhamnosidase (tableau 5). Tableau 5 - Monoglucosides terpéniques libérés (1) par l'a-arabinosidase et l'a-rhamnosidase à partir d'un extrait glycosidique ! a-arabinosidase a-rhamnosidase % des mono- glucosides Glc-Lin 10 9 19 Glc-Ner 28 5 33 Glc-Ger 39 9 48 % des mono- glucosides 77 23 100 (1) Les résultats sont exprimés en pourcentage de la quantité totale de chaque composé libéré par les deux enzymes. Les quantités de terpénols détectés au cours de cette première étape de l'hydrolyse, à savoir l'hydrolyse de l'extrait glycosidique avec chacune des trois glycosidases seules, n'ont été que négligeables. L'action consécutive de la P-glucosidase sur les extraits glycosidiques précédemment incubés soit avec l'c-arabinosidase ou l'a-rhamnosidase (deuxième étape) entraîne la disparition des monoglucosides de néryle et de géranyle et la diminution du monoglucoside de linanyle et la production du glucose (figures 8g et 9g) et des terpénols en grande quantité. On suppose que le 3-glucosidase utilisée, qui est e.. extraite de l'amande douce, choisie dans le but d'étudier l'hydrolyse séquentielle des glycosides terpéniques, a une faible affinité vis-à-vis du glucoside de linalyle d'o l'hydrolyse incomplète de celui-ci dans les conditions utilisées. Les plus abondants, parmi les terpénols libérés, sont dans cet ordre le géraniol, le nérol et le linalol. 80% environ de ces terpénols sont issus de l'action conJuguée de l'a-arabinosidase et de la e-glucosidase. On a détecté également, après l'action séquentielle des enzymes, d'autres terpénols ou composés volatils, mais en faible quantité tels l'aterpinéol, le citronellol, les oxydes de linalol (furanniques cis et trans, pyrannique sis) et les alcools benzylique et phényléthylique. Les importantes modifications des profils chromatographiques observées après l'action de l'a-arabinosidase sur l'extrait glycosidique ont conduit & pousser plus loin l'investigation des glycosides majoritaires. Pour cela, des fractions correspondant aux pics A et B du profil CLHP ont été collectées. Une partie aliquote a été silylée, puis analysée par CPG. La correspondance entre les pics A et B des deux chromatogrammes des figures 10 et 8à.a ainsi été établie. Légende de la figure 10: Profil CLHP de l'extrait glycosidique A. Ara-GlcNer B. Ara-Glc-Ger. Par ailleurs, chaque fraction a été soumise à l'action séquentielle de l'a-arabinosidase puis de la 9-glucosidase. Au terme de chaque étape et selon les procédures décrites, le milieu incubé a été analysé par CPG pour la recherche des sucres et des glucosides, d'une part, et pour celle des terpénols, d'autre part. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4. Ainsi,les pics A et B - ont été identifiés respectivement comme les a-L-arabino- e =' furanosyl-P-D-glucopyranosides de néryle et de géranyle. L'identité de-ce dernier a été vérifiée, en outre, par co- injection de l'extrait glycosidique avec le composé synthétique. Tableau4Identification des pics A et B collectés par CLHP composés apparaissant après action de composés l-arabino- a-arabinosidase identifiés sidase puis P-glucosidase arabinose glucose a-l-arabinofuranosyl- Pic A + + 0-]-glucopyranoside-de Glc-Ner nérol néryle arabinose glucose a-L-arabinofuranosyl- 1_ Pic B + + P--glucopyranoside de Glc-Ger géraniol géranyle L'ensemble de ces résultats confirme que l'hydrolyse enzymatique des glycosides terpéniques du raisin, implique un mécanisme séquentiel identique à celui mis en évidence sur les substrats synthétiques. 3 - HYDROLYSE RNZYNATIOUE SUR MILIEUX NATURELS On a étudié l'hydrolyse enzymatique d'un extrait glycosidique incorporé, d'une part à un milieu naturel (moût ou vin sec) et d'autre part, à un milieu de référence (tampon) par l'action des préparations commerciales renfermant les trois glycosidases nécessaires. Le protocole d'hydrolyse est le suivant: 3O Un Jus et un vin d'un cépage ne renfermant pas de terpénols et de glycosides terpéniques, mais préalablement enrichis avec une quantité connue d'extrait glycosidique de muscat, sont additionnés de préparations enzymatiques commerciales. Les milieux, ainsi que les témoins sont mis à incuber à 25'C, pendant 86 heures (voir ci-après schéma de protocole d'expérimentation). Ils sont ensuite passés sur une colonne d'Amberlite XAD-2 selon le protocole appliqué pour l'obtention de l'extrait glycosidique et les terpénols sont dosés par.CPG. Schéma du protocole d'expérimentation + 0,5 ml Hemicellulase(1) ml moût + 0,5 ml Naringinase(2) Témoin (pH 3,4: sucres 180 g/l) +2 ml NaJ3 à 2% ou Vin blanc sec + 0,5 ml Hemicellulase (pH 3,1) + 0,5 ml Naringinase (4) + 1 ml Extrait glycosidique REG-2 utilisée présentait 70 nkat d'activité a-arabi- nosidase, 72 nkat d'activité P-glucosidase et 9 nkat d'activité a-rhamnosidase. (2) 0,5 ml de la solution (à 5 mg/ml) de Varinginase utilisée présentait 78 nkat d'activité a-rhamnosidase et 0,1 nkat d'activité 1-glucosidase. (3) NaN est utilisé pour éviter les développements microbiens. (4) L'extrait glycosidique utilisé est obtenu par passage de moût de muscat d'Alexandrie sur Amberlite XAD-2. La quantité d'extrait glycosidique (1 ml) additionnée dans S- les essais correspond à celle trouvée dans 50 ml de moût de muscat d'Alexandrie. - 0862 F. Dans des conditions proches de la pratique oenologique, on observe une libération des terpénols. Cette libération est plus faible dans le cas de moût que du vin (tableau 6). En terme de pourcentage d'arôme libéré au bout de 86 heures à 25'C par rapport & la quantité libérée dans un milieu de référence, cela se chiffre à 11% pour le moût et 28% pour le vin. On remarque que les glycosides de géraniol sont mieux hydrolysés que ceux de linalol et de nérol. On a montré que l'inhibition de l'activité Pglucosidase par le glucose présent en grande quantité dans le moût peut expliquer les plus faibles performances par rapport au vin. * Les résultats sont plus satisfaisants dans le cas du vin puisqu'il est alors possible, compte tenu de la prédominance des glycosides terpéniques, d'au moins doubler la fraction terpénique libre. Tableau 6 - Hydrolyse d'un extrait glycosidique incorporé à un moût et un vin par des préparations enzymatiques commerciales Composés libérés par rapport au milieu de référence (1) Linalol Nérol Géraniol Alcool Total benzylique terpénols NOUT 9 ô 15 46 11 VIN 14 18 49 50 28 (1> Référence: extrait glycosidique + tampon citrate - phosphate pH 3,3 + Hemicellulase REG-2 + Naringinase. HYDROLYSES ACIDES Afin de déceler la présence éventuelle de glycosides terpéniques de structure inconnue dans la tache (CCX) résistante aux hydrolyses enzymatiques par les glycosidases purifiées, on a appliqué des hydrolyses acides sur les composés correspondant à cette tache récupérée par CCX. l') Le milieu récupéré (250 pl) est amené à sec à 'C par un courant d'azote. 250 pl de tampon citrate- phosphate, 25 mX (pH 3,0) sont introduits dans le flacon qui est ensuite fermé hermétiquement, laissé à 100'C pendant minutes. Après refroidissement, le milieu est lavé au pentane (5 x250 pl). L'extrait pentane est additionné d'étalon interne, puis concentré et analysé en CPG. 25 pl de la phase aqueuse sont ensuite déposés sur une plaque de CCX. 2') Le milieu récupéré (250 pl) après avoir séché comme ci-dessus, est additionné de 250 pl d'acide trifluoroacétique 2 N, puis laissé à 120'C pendant 75 minutes. Apres refroidissement, le milieu est soumis aux mêmes analyses que ci-dessus. 1 - Procédé d'obtention.de composants d'arômes et d'arômes h partir de leurs.précurseurs de nature glycosidique, caractérisé par le fait que: dans une première étape, on effectue une hydrolyse enzymatique d'un substrat glycosidique contenant au moins un desdits précurseurs avec au moins une enzyme choisie d'après la structure dudit précurseur, pour libérer, par coupure au niveau d'une liaison osidique, les monoglycosides correspondants; - dans une deuxième étape, on effectue une hydrolyse enzymatique du produit de la première étape avec au moins une enzyme autre que ou identique à celle(s) de la première étape et destinée à libérer les composants d'arômes et arômes par coupure de la liaison copule glucidique - aglycone. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que, dans le cas o le substrat ne renferme que des monoglycosides, on effectue directement l'hydrolyse -20 enzymatique sans passer par la première étape. 3 - Procédé selon l'une des revendications i ou 2, caractérisé par le fait que l'on choisit, comme substrat glycosidique, un matériel végétal issu d'un fruit, d'une plante aromatique, ou d'une plante à fleur, ainsi que de leurs dérivés ou sous-produits, ou encore un matériel végétal provenant de cultures de cellules in vitro.. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait qu'on choisit un matériel végétal issu du raisin, comme les Jus de raisin, vins, et dérivés, ainsi que les sous-produits de la vinification de cépages aromatiques, en particulier des muscats. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme substrat glycosidique, un extrait glycosidique. 6 - Procédé selon les revendications 4 et 5, prises simultanément, caractérisé.par le fait qu'on utilise, comme extrait glycosidique, un extrait de moût provenant d'un cépage comme le muscat, dont on a éliminé au préalable les sucres et les terpénols libres. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'on conduit l'hydrolyse sur un milieu naturel. 8 - Procédé selon les revendications 4 et 7 prises simultanément, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme milieu naturel, des Jus et vins d'un cépage renfermant ou non des terpénols et des glycosides terpéniques, ledit milieu, dans le cas o il ne renferme pas de terpénols et de glycosides terpéniques, étant enrichi par un extrait glycosidique tel que défini & la revendication 6. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 aà 4, caractérisé par le fait qu'on utilise un substrat synthétique. - Procédé selon les revendications 4 et 9 prises simultanément, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme substrat synthétique, l'ao-L-rhamnopyranosyl (146) 9-D-glucopyranoside de p-nitrophényle, l'a-L-rhamno- pyranosyl (1-e6)--D-glucopyranoside de géranyle ou l'a-L-arabinofuranosyl p-nitrophényle. 11 - Procédé selon l'une des revendications 4 à , caractérisé par le fait qu'à la première étape, on utilise deux enzymes consistant en une o-arabinosidase et une o-rhamnosidase, et & la deuxième étape, on utilise, comme enzyme, une P-glucosidase. 12 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme a-arabinosidase et a-rhamnosidase, respectivement une a-L-arabino- furanosidase (E.C.3.2.1.55) et une a-L-rhamnopyranosidase. (E.C.3.2.1.40), et qu'on utilise, comme p-glucosidase, une P-D-glucopyranosidase (E.C.3.2.1.21). t e I suoTT sTpuee sep aun,( e luT;p enb aIe ippooid 01O @1 avd snueaqo smgQav,p s;uesodtuao;a semgay - * touaxdo..I;Tued el anb sla: 'squviopo uou sauooXl2v selXnv,p -:cuaT:qc uo,nb e62 l -1ed,5JOZT04 e t suo;;ToTpuaAaa sep eun,I uoaes gpgoao - 1 s'. xwTTuxs no enbTlXzuaq *enbTIXqIXu;qd anb sla% 'SlOool sep % s$nb;Tuedj sloXlod sep 'sai1ITmTs - IO,-U 'TIOieuTI tIo;ueS anb s$eI. 'sIouqdia: sep: seutgi no sa9,p s;%esodoo auroo.ueT;qo uo,nb;%; I IQd eloe o ' ó suoT%'oupueAa s@p aun,1 uols ap0Do2 - el 6O9