Brevet FR2635527A1 — publié le 19900223

La présente invention concerne une Interleukine 2 humaine recombinante, non glycosylée (notée r-hIL2), sous forme réduite, biologiquement active, son procédé d'obtention et son application comme médicament. L'IL2 naturelle humaine qui est une lymphokine stimulant la prolifération de cellules T activées, possède 3 Cystéines localisées en position 58, 105 et 125 de La séquence en acides aminés de la protéine. Les cystéines en 58 et 105 sont réunies par un pont disuLfure, tandis que la cystéine en 125 a un groupement suLfhydryle Libre (Robb,RJ et al. Proc. Natl. Acad.Sci.USA (1984) 81 6486-6490). Des procédés de préparation de L'IL2 humaine, d'alLéLes ou de dérivés, par la technologie de l'ADN recombinant, sont décrits. Par exemple, - Taniguchi,T et at. Nature (1983) 302 305-310 et Devos,R et aI. Nucleic Acids Research (1983) 11 4307-4323, ont décrit Le clonage du gêne de l'IL2 humaine et son expression dans des microorganismes, et Ju,C et al. J.Biol.Chem (1987) 262 5723-5731 ont obtenu l'expression de dérivés Jecombinants de L'IL2. Il est d'autre part connu que, Lorsque l'IL2 est accumulée dans Le microorganisme à l'état de granules insolubles, elle se trouve sous forme réduite contenant 3 groupes thiols et est dépourvue d'activité (demande de brevet japonais J6 1257931). Il était donc admis que pour disposer d'une IL2 active il fallait procéder à l'oxydation de la protéine réduite accumulée dans les granules. Pour ce faire, après dissolution de la protéine en milieu dénaturant, La formation du pont disulfure convenable 58-105 qui nécessite une renaturation, était effectuée en milieu oxydant contr8l. Différentes méthodes sont décrites telles que l'oxydation par l'oxygène seul (autooxydation à l'air) ou et en présence d'ions cuivriques, ou d'un oxydant faible tel qu'un thiol ou encore par un méLange thiol-disulfure (Tsuji,T et al. Biochemistry (1987) 26 3129-3134). Après renaturation oxydative, une purification par chromatographie est nécessaire pour éliminer les produits d'oxydation correspondant à la formation de ponts intramoléculaires isomères 58-125 et 105-125 ainsi que de ponts intermoléculaires dont on a montré qu'iLs sont inactifs et peuvent être séparés par chromatographie en phase inversée selon Wang,A et aI. Science (1984) 224 1431-1433 ou Browing,JL et aL. Anal Siochem (1986) 155 123-128) . L'obtention de l'IL2 recombinante oxydée homogène ayant L'activité biologique convenable en partant de la protéine accumulée sous forme de granules, pose donc des problèmes techniques, quelque soit Le procédé suivi, car elle nécessite plusieurs étapes de purification ce qui conduit à un abaissement du rendement en produit cherché. La présente demande concerne une nouvelle IL2 humaine recombinante non glycosylée active sous forme réduite et un procédé de préparation, de ce 2 2635527 produit, qui ne nécessite pas de stade de réoxydation pour obtenir.un produit manifestant l'activité biologique de L'IL2. Un aspect de l'invention concerne l'Interleukine 2 humaine recombinante non glycosylée ayant d'une part la séquence en acides aminés suivante: XALa Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu GLn Leu GLu His Leu Leu Leu Asp Leu GLn Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala GLn Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu ILe Ser Asn ILe Asn Val ILe Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr ILe VaL Glu Phe Leu Asn Arg Trp ILe Thr Phe Cys GLn Ser Ile ILe Ser Thr Leu Thr ainsi que les allèLes ou dérivés de cette séquence dans laquelle X représente une Méthionine ou un atome d'hydrogène -et dont les trois cystéines en position 58, 105 et 125 sont sous la forme réduite, d'autre part manifestant une activité biologique comparable à celle de L'IL2 oxydée ayant la même séquence et comportant un pont disulfure en position 58-105. Par aLLèles et dérivés, on inclut les séquences modifiées par substitution, délétion ou addition de un ou plusieurs acides aminées autres que les cystéines 58, 105, 125 pour autant que ces produits conservent l'activité biologique caractéristique de l'IL2 réduite. L'obtention de telles modifications est bien connue dans la méthode de l'ADN recombinant, par exemple par les techniques de mutagénèse dirigée qui oft été passées en revue par Lather, RF et Lecoq, JP dans Genetic Engineering Academic Press (1983) 31-50 ou Smith, M et GilLam, S Genetic Engineering Principles and methods Plenum Press (1981) 3 1-32. Par forme réduite, on entend que les restes cystéines que contient l'IL2 renferment un groupement sulfhydryle Libre dont la détermination est faite, par exemple, par spectrophotométrie avec la Dithiodipyridine comme réactif des thiols. L'activité biologique de la forme réduite concernée par l'invention est déterminée, comparativement à celle de la forme oxydée correspondante contenant le pont disulfure 58-105, par mesure de la prolifération de lignées cellulaires leucémiques de souris dépendantes de l'IL2 CTLL-2, avec un test colorimétrique au sel de tétrazolium (lossmann,T J. ImmunoL Meth. (1983) 65 55-63). L'invention concerne aussi une IL2 sous la forme réduite humaine recombinante non glycosylée ayant d'une part la séquence en acides aminés suivante: X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn GLy Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu 3 2635527 GIn Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala GLn Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu ILe Ser Asn ILe Asn Val ILe Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys GLn Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr ainsi que les allèles ou dérivés de cette séquence dans laquelle X représente une Méthionine ou un atome d'hydrogène et dont les trois cystéines en position 58, 105 et 125 sont sous la forme réduite, d'autre part manifestant une activité biologique d'au moins 0.5 x 1U7 u/mg. L'unité d'activité IL2 1U est définie comme la quantité qui produit 50 X de la réponse maximum dans le test. On utilise comme standard un échantillon "Biological Response Modifier Program (BRMP) reference reagent human IL2(Jurkat)" fourni par National Cancer Institute (NCI). L'invention concerne plus précisément l'interLeukine 2 humaine recombinante non glycosylée ayant la séquence en acides aminés suivante: X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu GIn Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn ILe Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser ILe ILe Ser Thr Leu Thr dans laquelle X représente une Méthionine ou un atome d'hydrogène et dont les trois cystéines en position 58, 105 et 125 sont sous La forme réduite et manifestant une activité biologique comparable à ceLLe de l'IL2 humaine native. Par activité comparable, on entend la même activité spécifique que ceLLe de L'IL2 naturelle isolée de ceLluLes Leucémiques Jurkat c'est à dire de 1.3 * 107 u/mg (référence BRMP), ou une activité différente au maximum de 25 % de cette activité spécifique. La séquence de L'IL2 réduite concernée par L'invention a éventuellement une Méthionine N-terminale supplémentaire selon le microorganisme transformé, tel que E. coLi, dans lequel elle est exprimée. Dans un mode préféré d'exécution de l'invention, on préfère la séquence comportant une méthionine, mais on peut Agalement utiliser un mélange de produit comportant une méthionine avec du produit ne comportant pas de méthionine ou le produit dépourvu de méthionine. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation de l'IL2 humaine recombinante non glycosyLée réduite comprenant d'abord l'extraction de l'IL2 accumulée sous forme de granules dans un microorganisme transformé par solubilisation en milieu réducteur à l'aide d'un agent chaotrope, puis La purification par précipitation suivie d'une chromatographie liquide à haute performance en phase inversée avec un éluant acide, et caractérisé en ce que: a) on soumet la fraction principale éluée de la dite chromatographie à un stade de refroidissement à une température de l'ordre de -20UC, puis sépare La phase aqueuse que b) L'on chromatographie sur une autre coLonne de chromatographie liquide à haute performance en phase inversée en milieu acide et isole la dite IL2. L'IL2 recombinante produite sous forme de granules, grâce à un taux d'expression élevé, par un microorganisme transformé tel que E.coLi, peut être, par des méthodes bien connues, solubilisée à l'aide d'une solution concentrée d'un agent chaotrope teLLe qu'une solution de seL de guanidine 6 à 8 M, puis purifiée par chromatographie liquide à haute performance en phase inversée (noté dans ce qui suit RP-HPLC) avec des supports disponibles dans le commerce, de préférence des silices greffées telles que C3, C4, C8 ou C18, avec un éluant acide ayant un pH compris de 1 à 4. L'IL2 peut être éluée de la colonne à l'aide d'un système de gradient comprenant un acide organique tel que l'acide acétique ou l'acide trifluoroacétique (noté dans ce qui suit TFA) et un solvant organique tel que l'acétonitrile. La fraction principale dont l'élution est détectée par spectrophotométrie à 280 nm est la matière première pour le stade de refroidissement qui fait partie du procédé de la présente invention. Par refroidissement on entend que la dite fraction principale recueillie à température ambiante est placée dans un environnement de température de l'ordre de -20oC qui permet la formation progressive d'une phase aqueuse solide dont on peut éliminer la fraction surnageante par décantation. La phase aqueuse ainsi séparée sert de matière première à la RP- HPLC en milieu acide décrite ci-après qui fait partie du procédé de L'invention. On chromatographie la phase aqueuse sur une colonne à phase inversée en utilisant des supports disponibles dans le commerce tels que des silices greffées C3, C4, C8 ou C18 ayant des pores de taille convenable pour L'utilisation avec des protéines, par exemple d'un diamètre d'au moins 150 A=. L'éLution de l'ILZ comprend l'emploi d'un gradient de concentration croissante d'un alcool inférieur miscible à l'eau et contenant un acide organique. Le procédé de l'invention est notamment caractérisé en ce que le stade de refroidissement est effectué dans une solution aqueuse d'acétonitrile contenant environ 0,1 % d'acide trifluoroacétique et en ce que l'IL2 est éluée dans la deuxième chromatographie, à l'aide d'une solution comprenant de l'isopropanol, de l'eau et un acide organique tel que l'acide citrique. La solution aqueuse d'acétonitrile contenant environ 0,1 % de TFA, qui est le 26355 27 mélange préféré soumis au stade de refroidissement que concerne l'invention, correspond à la fraction principale éluée de La première chromatographie. La deuxième chromatographie, qui fait partie du procédé revendiqué de L'invention, consiste à soumettre la phase aqueuse séparée après le stade de refroidissement à une RP-HPLC utilisant des supports disponibles dans Le commerce tels que des silices greffées C3, C4, C8 ou. C18 ayant des diamètres de pores d'au moins 150 Au. Le support préféré est une silice greffée C4 VYDAC 300 Au qui est un gel de silice qui a des groupements butyles greffés de façon covalente, dont les pores ont un diamètre de 300 Au et dont Les particules ont une taille moyenne de 15 à 20 microns. L'éLution de l'IL2 concernée par le procédé de l'invention est réalisée à l'aide d'un système de gradient comprenant un alcool tel que le propanol ou l'isopropanoL et un acide organique tel que l'acide formique, l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide trifluoracétique ou l'acide citrique. Le mélange préféré comprend de l'isopropanol, de l'eau et de l'acide citrique qui permet, à l'aide d'un système de gradient de concentration croissante d'isopropanol, l'élution d'une fraction mineure à environ 48 % d'isopropanol puis d'une fraction majeure à environ 59 % d'isopropanol, cette dernière comprenant l'IL2 humaine recombinante non glycosylée sous forme réduite susceptible d'être obtenue par le procédé décrit ci-dessus. La dite fraction obtenue peut être conservée à OuC. Elle est stable dans ces conditions. On peut également éliminer l'isopropanol par distillation azeotropique sous vide. La solution obtenue peut être conservée à + 4iC ou bien on isole directement L'IL2 de la présente invention par lyophilisation. Lorsque L'on dose les groupes thiols, l'IL2 obtenue selon l'invention présente 3 groupements sulfhydryles libres et manifeste une activité spécifique de 0.7 à 1.3 * 107 u/mg dans le test de prolifération des lignées CTLL-2 c'est à dire comparable à celle de L'IL2 native. Cette activité justifie l'un des aspects de l'invention qui concerne l'IL2 humaine recombinante non glycosyLée sous forme réduite telle que décrite ci- dessus pour son utilisation comme médicament de la même manière que l'IL2 native, dans une variété d'indications faisant usage de son activité immunomodulatrice ainsi que de son activité antitumorale qui ont été décrites par exemple par Fletcher,M et aI. Lymphokine Research 6 (1987) 47-57 et qui comprennent par exemple, la prolifération des lymphocytes T, l'induction de la cytotoxicité des cellules NK (natural killer) et des cellules LAK (lymphokine activated killer), la restauration de l'immunité cellulaire ou un effect protecteur contre l'infection dans les cas de 4U déficience immunitaire. L'administration peut être directe ou bien être une administration selon une méthode de L'immunothérapie adoptive qui a été décrite par Rosenberg, SA et aL. dans N.Engl.J.Ned. (1985) 313, 1485-1492. Comme l'IL2 native, l'IL2 de l'invention peut être utiLisée seule ou en association avec d'autres agents immunomodulateurs tels que l'interféron Y, et ou d'autres agents thérapeutiques. L'invention a enfin pour objet une composition pharmaceutique qui renferme comme principe actif L'IL2 humaine recombinante non glycosylée sous forme réduite selon l'invention. La composition peut être solide ou Liquide. L'IL2 de la présente invention peut être formuLée selon Les méthodes connues pour préparer une composition pharmaceutique utile dans laquelle l'IL2 est combinée à un véhicule support pharmaceutiquement acceptable. Cette composition contient une quantité efficace de L'IL2 avec une quantité appropriée de véhicuLe convenant à l'administration chez l'homme. La formulation peut être obtenue à partir de la solution aqueuse acide de l'IL2 de l'invention après élimination de l'isopropanol par distillation azéotropique sous vide à laquelle on ajoute un agent de charge soluble dans l'eau et que l'on lyophilise. Par agent de charge, on entend une substance soluble dans l'eau qui ne modifie pas le pH initial lorsque le méLange est reconstitué. Des exemples des agents de charge qui peuvent être ajoutés sont des sucres tels que le glucose, le ribose, le saccharose, le maltose, le tréhalose, ou des sucres réduits tels que le mannitol. Le mannitol est préféré. On ajoute le mannitol à la concentration de 10 à 50 mg/ml, de préférence de l'ordre de 50 mg/ml lorsque la concentration de l'IL2 de la présente invention est comprise entre 0.05 et 1 mg/ml, selon la dose à administrer. La solution que l'on a filtrée stérilement en absence d'oxygène est répartie en flacons-dose et on lyophiLise. Le mélange lyophilisé peut être reconstitué par injection, dans Le flacon, d'eau distillée convenant à l'injection parentérale. La composition de la présente invention peut être administrée par voie intraveineuse en bolus ou en perfusion continue, par voie intramusculaire, intrapéritonéaLe, intrapleurale ou sous cutanée. La dose efficace de L'IL2 de l'invention, qui dépend de La voie d'administration et du malade traité, est généralement comprise entre 1 * 106 u/M2/24 h et 16 * 106 u/M2/24 h, de préférence 3 * 106 u/M2/24 h chez l'adulte ou l'enfant. La dose journalière dépend aussi de la durée de l'administration et il n'y a pas lieu de se limiter aux doses ci-dessus. Lorsque la composition pharmaceutique est utile pour une administration en perfusion, elle est plus particulièrement caractérisée en ce qu'elle renferme de l'IL2 humaine recombinante non glycosylée sous forme réduite, de l'eau et un acide organique tel que L'acide citrique. Une telle composition peut être obtenue à partir de la composition pharmaceutique Lyophilisée de l'invention que l'on dissout en présence d'un véhicule approprié qui contribue à la stabilité du principe actif pendant la durée de la perfusion, par exemple du glucose. Les conditions préférées consistent à diluer le mélange lyophilisé reconstitué par injection d'eau distillée, en 1U l'introduisant dans une poche à perfusion contenant unvolume de glucose, à la concentration de 5U mg/ml, déterminé comme convenable pour la dose à administrer. Toutes Les publications qui sont citées sont incorporées, par référence, dans le texte de la présente demande. Les figures ci-annexées illustrent certain1d9pects de l'invention: La figure la. est un chromatogramme de RP-HPLC analytique de l'extrait brut en guanidine 8M de l'exemple 1. La figure lb. est un chromatogramme de RP-HPLC analytique des IL2 standard réduite et oxydée. La figure 2. est un chromatogramme de RP-HPLC analytique de la "resolubilisation" de l'exemple 1. La figure 3. est un chromatogramme de RP-HPLC préparative de la "fraction principale" après le stade de refroidissement de l'exemple 1. La figure 4. est un chromatogramme de RP-HPLC analytique de la fraction "59" de l'exemple 1. La figure 5. est le protocole de purification de l'exemple 1. La figure 6. est le gel de l'éLectrophorèse SDS-PAGE de l'exemple 2. Les figures 7a et 7b sont les cartes peptidiques de L'exemple 2. Les figures 8a et 8b sont les courbes de DC de L'exempte 2. 3U La figure 9 est la courbe d'effet mitogène sur les Lymphocytes humains de l'exemple 3. La figure 10 est la courbe de toxicité obtenue vis à vis des lignées K 562 et DAUDI. Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. ExempLe 1: purification de la r-hIL2 réduite bioLogiqument active i partir de granules. Les granules sont obtenus par centrifugation de cultures d'une souche d'E. coli transformée à l'aide d'un plasmide comprenant la séquence codant pour l'IL2 native et capable d'accumuler l'IL2 sous cette forme à L'intérieur des cellules, comme décrit par exempte par Sato,T et al. J. Biochem (1987) 101 525-534. Les celLules ainsi obtenues d'un fermenteur de 10 Litres sont soumises à un écLatement dans un homogénéisateur Manton GauLin. A partir des débris celLuLaires isoLés et lavés (90-170 g en poids humide) l'IL2 est soLubilisée dans 2.5 volumes d'un tampon Tris, HCL 20 mM pH 8 contenant du chlorhydrate de guanidine (Gu,HCI) 8M et du Dithiothréitol (DTT) mNi. La quantité d'IL2 solubilisée (1.5 à 2.5 g) est estimée par RP-HPLC. analytique sur une colonne C4 VYDAC (0.46 * 15 cm) 300 Au, 5 microns, au débit de 2 ml/mn, avec un gradient linéaire d'acétonitrile (30 à 70 % sur 10 minutes) contenant 0.1 % de TFA, une détection spectrophotométrique à 280 nm ou 210 nm, dont on évalue la surface du pic à 280 nm après calibration avec un standard d'IL2 (fig. la et fig. lb). L'IL2 est ensuite précipitée par abaissement à 2M de La concentration en Gu, HCL, en présence de DTT. Après lavage du précipité à l'aide d'une solution aqueuse de TFA à 0.1 % jusqu'à obtention d'un pH du surnageant inférieur à 5.0, L'IL2 est solubilisée dans une solution aqueuse à 20 % d'acétonitrile et 0.1 % de TFA. La "resolubiLisation" obtenue, qui renferme selon la RP-HPLC analytique (fig. 2) une teneur en IL2 réduite supérieure à 85 %, a une activité biologique inférieure à 0.01 * 107 u/mg d'IL2 réduite et une teneur en groupements sulfhydryles de 2.85 SH/mole d'IL2 réduite. Une fraction de la solution obtenue, correspondant à environ 200 mg d'IL2 estimée par RP-HPLC analytique, est diluée de façon à ajuster la concentration en acétonitrile inférieure à 10 % dans du TFA à 0.1 %, puis appliquée à une colonne C4 VYDAC (5.7 * 30 cm). L'IL2 est éLuée au débit de 100 ml/mn, à L'aide d'un gradient linéaire d'acétonitrile (30 à 80 % sur 40 minutes) contenant 0.1 % de TFA, à une concentration d'environ 60 Z en acétonitrile dans un pic majeur détecté par spectrophotométrie à 280 nm et analysé par RP-HPLC. La "fraction principale" recueillie qui renferme L'IL2 réduite est ensuite soumise à un stade de refroidissement lent, de la température ambiante à -20mC + 18, qui permet d'éliminer par décantation une phase organique supérieure riche en acétonitriLe. La phase inférieure, riche en eau et contenant L'IL2, peut être conservée à l'état congelé. Après décongélation, La solution obtenue est, après dilution par 2 volumes de solution aqueuse d'acide citrique à 0.5 %, appliquée à une colonne C4 VYDAC (5.7 * 30 cm) que L'on développe avec un gradient Linéaire d'isopropanol (20U à 70 X sur 40 minutes) contenant 0.5 % d'acide citrique, au débit de 50 ml/mn. L'effLuent, suivi par spectrophotométrie à 280 nm, montre L'éLution successive d'un pic mineur à une concentration d'environ 48 % en isopropanot (fraction "48") et d'un pic majeur à une concentration d'environ 59 % en isopropanol (fraction "59") (fig. 3). La fraction "59" est recueillie. Elle est stable à La conservation à O=C pendant au moins 24 h, à l'abri de L'air. 9 2635527 Après élimination de L'isopropanol par distillation azéotropique sous vide, La fraction "59" est analysée en RP-HPLC analytique et donne un pic homogène (fig. 4) éLué à environ 60 % d'acétonitriLe alors que L'IL2 oxydée de référence est éLuée à environ 57 % d'acétonitrile (fig. lb). La fraction "59" qui, après élimination de l'isopropanol, a une concentration en IL2 supérieure à 1 mg/ml et un pH de 3 + 0.5, peut être conservée à +4nC, à l'abri de l'air, pendant au moins une semaine ou être immédiatement lyophilisée ou formulée pour l'obtention d'une composition pharmaceutique. La fraction "59" lyophilisée est dosée en activité biologique, selon Le test in vitro de prolifération de cellules CTLL-2, et a une activité spécifique de 1.3 + 0.5 * 107 u/mg comparable à cettlle de l'IL2 native. La teneur en groupements suLfhydryles Libres de la fraction "59" Lyophilisée, déterminée par la méthode colorimétrique à la dithiodipyridine, est de 2.94 SH/mole comparativement à 0.76 SH/mole pour L'IL2 oxydée de référence. à 300 mg titrés par RP-HPLC analytique de r-hIL2 réduite, contenant 3 groupements SH, biologiquement active, homogène en RP-HPLC, sont obtenus dans la fraction "59" à partir d'un fermenteur de 10 litres (selon le schéma de protocole fig. 5). 2u ExmDle 2 a caractérlsation physlcochinique de La r-hIL7 réduite bioLogiquement active. La r-hIL2 réduite obtenue selon l'invention dans la fraction "59" de l'exemple 1 est examinée pour les propriétés suivantes: 1) Homogénéité L'électrophorèse SDS PAGE est effectuée sur un gel à deux phases (gel de concentration et gel de migration respectivement à 5 % et 15 Z en acrylamide) contenant 10 Z de SDS. L'échantillon est chauffé au préalable pendant 2 mn à 100nC dans un tampon à 3 Z de SDS et 5 % de mercaptoéthanol. La migration avec un tampon à 1 % de SDS est suivie d'une coloration à l'argent qui révèle une seule bande correspondant à une pureté supérieure à 99 Z pour un dépôt de 2/ug (fig. 6). 2) Poids moléculaire par électrophorèse En milieu réducteur, on détermine un PM apparent de environ 15 Kd, en accord avec le PMi calcuLé de 15420 (fig. 6). 3) Composition en acides aminés - Un échantillon, contenant 25pyg de la r-hIL2 réduite de l'invention dans 0.5 mL d'eau, est placé dans un tube à hydrolyse en verre auquel sont ajoutés .5 mI d'acide chlorhydrique concentré à 31.7 % de TFA et 4.8 % d'acide thioglycolique. Le tube est scellé sous vide, puis l'hydrolyse est 4U effectuée à 155mC pendant 40 mn. L'hydrolysat est ensuite évaporé à sec sous pression réduite. Le résidu est dissout dans 0.7 ml de tampon citrate pH=3, puis est soumis à l'analyse en acides aminés sur une colonne Interaction AA 511 (U.46 * 15 cm) à l'aide d'un gradient de pH (3 à 5) et de chlorure de sodium (0 à 70 g/l) dans le tampon citrate, à 60uC, au débit de 0.5 ml/mn et une détection par fluorescence, après dérivation à L'orthophtalaldéhyde à la sortie oe la cotonne. Les résultats sont montrés dans le tableau 1. Les valeurs sont la moyenne obtenue pour 2 hydrolyses répétées et 2 chromatographies respectivement répétées. La composition est en accord avec celle de L'IL2 native ayant une Méthionine N terminale supplémentaire. I N T E R L E U K I N E 2 I I II Acides Aminés Nombre théorique Nombre trouvé I I I,I GLN + GLU 18 17,56 ASN + ASP 12 12,61 THR 13 12,09 SER S 7,05 PRO 5 ND* GLY 2 2,59 ALA 5 5,50 VAL 4 4,34 MET 5 5,59 ILE 9 9,15 LEU 22 19,96 TYR 3 2,60 PHE 6 5,90 TRP I 1 NC** LYS 11 10,19 HIS 3 3,48 ARG 4 5,29 CYS 3 NC** * ND = non détecté ** NC = non calculé TABLEAU 1 4) Séquence en aminoacide N terminale La séquence N terminale est identifiée par microséquençage en utilisant la méthode automatique de dégradation d'Edman: l'analyse de 15)ug de r-hIL2 réduite, biologiquement active selon l'invention, sur un microséquenceur phase gaz Applied Biosystems 470A couplé à HPLC 120A, permet d'identifier les PTH acides aminés suivants: Etapes PTH AA Etapes PTH AA 1 Met 11 Thr Ala 2 Ala 12 Gln Pro 3 Pro 13 Leu Thr 4 Thr 14 GIn Ser Ser 15 Leu 6 Ser 16 Glu 7 Ser 17 His 8 Thr 18 Leu 9 Lys 19 Leu Lys 20 Leu La séquence d;s 20 résidus Nterminaux est en accord avec l'ordre d'enchainement théorique de l'IL2 native. On observe environ 10 X d'IL2 sans rMéthionine. ) Carte peptidique au bromure de cyanogène 7UO pg d'IL2 réduite selon l'invention (environ 53 nmoles) sont dissous dans 4 ml d'acide formique à 70 Z et additionnés de 5.6 mg de bromure de cyanogène. La solution est agitée pendant une nuit à température ambiante, diluée à l'eau puis lyophilisée. Le mélange réactiônnel est analysé par RP-HPLC sur une colonne/uBondapack C18 RP (0.46 * 20 cm), à L'aide d'un gradient de concentration d'acétonitrile variant de O à 70 X contenant 0.1 % de TFA, au débit de 1 mL/mn, à température ambiante et avec une détection spectrophotométrique à 220 nm. La carte peptidique de la r-hIL2 réduite (fig. 7a) montre une fragmentation différente de celLe de l'IL2 oxydée de référence (fig. 7b). 6) Dichroisme circulaire Les spectres de dichroisme circulaire (DC) sont déterminés à température ambiante sur un spectrographe Jobin Yvon Mark V. L'échantillon de r-hIL2 réduite, lyophilisé après RP-HPLC réalisée avec legradient linéaire d'isopropanoL dont on a remplacé l'acide citrique 0. 5 % selon t'exemple 1, par l'acide formique 0.1 %, puis distillation de l'isopropanol et Lyophilisation, est repris à la concentration de 1 mg/ml dans L'acide acétique. Les cuves utilisées sont de 0.01 cm et 0.5 cm respectivement pour la région peptidique (185-250 nm) et la région aromatique (260-320 nm). Le spectre du solvant est soustrait du spectre de l'IL2, pour chaque échantillon. Les résultats sont donnés en ellipticité B (poids moyen par résidu d'IL2=116). La figure Sa montre le spectre de DC dans l'UV lointain: la r-hIL2 réduite biologiquement active, selon l'invention, a un spectre qui indique la présence d'une structure secondaire ordonnée. La détermination des % d'hélicec&montre peu de différence significative avec l'IL2 oxydée de référence (% héLicedL# 50 %). La figure 8b montre le spectre de DC dans L'UV proche: L'IL2 oxydée de référence à un DC significatif qui indique un environnement asymétrique pour Les résidus aromatiques, tandis que la r-hIL2 réduite de l'invention a un DC peu significatif mais différent. ExempLe 3: activité biologique. L'efficacité biologique de la r-hIL2 réduite de L'invention est évaluée dans des expériences in vitro ou ex vivo. 1) Activité in vitro sur cellules humaines a. test de transformation Lymphoblastique Outre l'activité proliférative sur Lignées cellulaires de souris telles que CTLL-2 qui permet le dosage biologique de l'IL2, La rhIL2 réduite de l'invention manifeste un effet mitogène, dépendant de la dose, comparable à celui montré par l'IL2 oxydée de référence sur Les lymphocytes humains circulants normaux, montré par mesure de L'incorporation de thymidine tritiée dans L'ADN (fig. 9). b. induction de la cytotoxicité des ceLluLes mononucLées 13 2635527 L'étude est réalisée avec des cellules mononuclées circulantes humaines incubées en présence d'IL2 et dont on détermine l'effet cytotoxique vis à vis de cellules cibles tumorales, respectivement la lignée erythroleucémique K 562 (sensible aux cellules NK) et la lignée DAUDI dérivée d'un lymphome B (résistante aux cellules NK), par mesure du relargage de Cr 51 en 4 heures. Les résultats, exprimés en unités lytiques par 106 cellules (UL/106), montre que la r-hIL2 réduite de l'invention manifeste une capacité, dépendante de la dose, respectivement à augmenter l'activité NK ou à induire la cytotoxicité des lymphocytes T vis à vis de cibles tumorales, de façon comparable à celle connue pour l'IL2 native (fig. 10). 2) Activité ex vivo sur la souris (stimulation des macrophages péritonéaux) Chez la souris normale Balb/c et MRL-+/+ l'injection intrapéritonéale successive d'Interférong recombinant de rat à doses suboptimales (100 à 3000 u), puis 24 heures plus tard, de la r-hIL2 réduite de l'invention, déclenche les mécanismes oxydatifs des cellules ptag6cytaires, évalués par mesure de la chimiluminescence, en présence d'ester de phorbol (PMA), des cellules prélevées de la cavité péritonéale des souris sacrifiées 24 h après l'injection d'IL2. L'effet, dépendant de la dose, est comparable à celui observé avec l'IL2 oxydée de référence. Résultats: Dose Injectée Chimiluminescence (CPM x 104) (ng par souris) Après injection de r-hIL2 Réduite Oxydée 0 5 + 2 4+3 1 7 + 3 5+1 3U 3 90+ 5 71+ 5 130 + 10 140 + 70 350 + 50 400 + 70 710 + 20 695 + 25 300 375 + 25 350 + 20 Exemplte 4: composition pharmaceutique pour injection. La solution aqueuse de r-hIL2 réduite correspondant à la fraction "59" de l'invention dont on a éliminé l'isopropanol par distillation azéotro- 4U pique sous vide est extemporanément diluée à l'aide d'une solution aqueuse de 14 2635527 mannitol dégazée et saturée en azote, à raison de 100 ug d'IL2 réduite/mL et 50 mg/ml de mannitol. Après filtration sur une membrane de 0.22 u, répartition stérile de 1 mL dans des flacons et lyophilisation, les flacons- dose sont bouchés sous atmosphère d'azote et conservés à température 4mC avant usage. i 2635527 REVENDICATIONS 1.- Interleukine 2 humaine recombinante non glycosylée ayant d'une part La séquence en acides aminés suivante: X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu GLn Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn-Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr. ainsi que les allles ou dérivés de cette séquence dans laquelle X représente une Méthionine ou un atome d'hydrogène et dont les trois cystéines en position 58, 105 et 125 sont sous la forme réduite, d'autre part manifestant une activité biologique comparable à celle de l'IL2 oxydée ayant la même séquence et comportant un pont disulfure en position 58-105. 2U 2.- Interleukine 2 humaine recombinante non glycosylée ayant d'une part la sequence en acides aminés suivante: X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu GLn Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu GLn Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val ILe Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr ainsi que les allèles ou dérivés de cette séquence dans laquelle X représente une Féthionine ou un atome d'hydrogène et dont les trois cystéines en position 58, 105 et 125 sont sous la forme réduite, d'autre part manifestant une activité biologique d'au moins 0.5 x 107u/mg. - Interleukine 2 humaine recombinante non glycosylée ayant la séquence en acides aminés suivante: X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu GLu GLu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala GLn Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu ILe Ser Asn ILe Asn VaL Ile Val Leu Glu Leu Lys 6ly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp GLu Thr Ala Thr ILe VaL GLu Phe Leu Asn Arg Trp iLe Thr Phe Cys GLn Ser ILe ILe Ser Thr Leu Thr dans Laquelle X représente une Méthionine ou un atome d'hydrogène et dont les trois cystéines en position 58, 105 et 125 sont sous la forme réduite et manifestant une activité biologique comparable à celle de l'IL2 humaine native. 4.- Procédé de préparation de l'IL2 humaine recombinante non glycosylée réduite, telle que définie à l'une des revendications 1 à 3, comprenant d'abord l'extraction de l'IL2 accumulée sous forme de granules dans un microorganisme transformé par solubilisation en miLieu réducteur à l'aide d'un agent chaotrope, puis la purification par précipitation suivie d'une chromatographie liquide à haute performance en phase inversée avec un éluant acide, et caractérisé en ce que: a) on soumet la fraction principale éluée de la dite chromatographie à un stade de refroidissement à une température de l'ordre de -20C, puis sépare la phase aqueuse que b) l'on chromatographie sur une autre colonne de chromatographie Liquide à haute performance en phase inversée en milieu acide et isole ladite IL2. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le stade de refroidissement est effectué dans une solution aqueuse d'acétonitrile contenant environ 0,1% d'acide trifluoroacétique et en ce que Ladite IL2 est éluée dans la deuxième chromatographie, à l'aide d'une solution comprenant de L'isopropanol, de l'eau et un acide organique tel que L'acide citrique. 6.- IL2 humaine recombinante non glycosylée sous forme réduite susceptible d'être obtenue par le procédé selon L'une des revendications 4 ou 5.' 7.- IL2 humaine recombinante non glycosyLée sous forme réduite, telle que définie selon l'une des revendications 1 à 3 eou 6, pour son utilisation comme médicament. 8,- Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme comme principe actif l'IL2 humaine recombinante non glycosylée sous forme réduite, telle que définie selon la revendication 7. 9.- Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme de l'IL2 humaine recombinante non glycosyLée sous forme réduite telle que définie selon la revendication 7, de l'eau et un acide organique tel que l'acide citrique.