Brevet FR2631626A1 — publié le 19891124

Nouveaux DentaDeDtides et leurs applications en tant que médicaments. notamment antithrombotiaues. La présente invention a été faite dans le cadre d'une collaboration entre le Laboratoire ASPECTS STRUC- TURAUX (GENES ET PROTEINES) ET FONCTION DE SUBSTANCES BIOLOGIQUEMENT ACTIVES de l'Université PARIS V et le Laboratoire PLAQUETTES ET HEMOSTASES de l'Université PARIS VII, laboratoires associés au C.N.R.S.. Elle a pour objet de nouveaux pentapeptides à activité antithrombotique. Plus précisément, l'invention a pour objet les pentapeptides Lys-X-GlnAsp-Lys, X pouvant représenter Asn ou Ile, ou, en désignant les aminoacides au moyen du système d'abréviations à une lettre, les pentapep- tides KXQDK. X pouvant représenter N ou I, et leurs applications thérapeutiques, notamment en tant qu'agents antithrombotiques. Pierre Jollés et Agnes Henschen [TIBS 7 (1982) 325-328] ont noté plusieurs analogies entre les phéno- mènes de coagulation du sang et du lait. C'est ainsi, par exemple, que des homologies entres les séquences peptidiques de la chaine - du fibrinogène humain et de la caséine K de vache ont été mises en évidence [P. Jol- lés, M.-H. Loucheux-Lefebvre et A. Henschen, J. Mol. Evol. 11 (1978) 271-277]. Quelques peptides provenant du fibrinogéne inhi- bent- l'agrégation plaquettaire. Il s'agit notamment du dodécapeptide correspondant a l'enchalnement C-terminal de la chalne Y du fibrinogène (résidus 400-411) et de peptides contenant la sequence RGD commune à des séquen- ces de la chalne u du fibrinogéne, du facteur de von Willebrand (VWF) et de la fibronectine. Un grand nombre de données accumulées ces der- nières années est en faveur du fait que le récepteur du fibrinogène est situé sur un complexe de deux glycopro- teines plaquettaires GPIIb et GPIIIa situées sur la membrane plasmatique des plaquettes. La liaison du fibrinogène au récepteur plaquettaire nécessite l'acti- vation des plaquettes par des agonistes tels que l'ADP, la thrombine. etc. , ce qui semble avoir pour effet d'exposer les sites de liaison du fibrinogéne (voir par exemple W.M. Isenburg et coll. dans Blood, Novembre 1986, n'1150). Récemment P. Jollès et coll. [voir Eur. J. Bio- chem. 158 (1986) 379-382] ont trouvé qu'un undécapeptide de la caséine K de vache, naturel ou synthétique, inhibe à la fois l'agrégation plaquettaire et la liaison du fi- brinogène. Ceci étant, les inventeurs, poursuivant les in- vestigations entreprises dans ce domaine-, ont eu l'idée de rechercher le (ou les) peptide(s) le(s) plus court(s) possible ayant une action similaire. C'est ainsi qu'ils ont eu l'idée de synthétiser deux pentapeptides nouveaux, à savoir le pentapeptide Lys-Asn-Gln-Asp-Lys ou KNQDK qui correspond à la sequen- ce 112-116 de la caseine K de lait de vache, et le pen- tapeptide Lys-Ile-Gln-Asp-Lys ou KIQDK qui, lui, cor- respond à la séquence 100-104 de la caséine K de lait humain, et d'étudier leur activité pharmacologique. Selon l'un de ses aspects, l'invention a donc pour objet un pentapeptide répondant à la formule: lysyl-X-glutaminyl-aspartyl-lysine (I) dans laquelle X représente asparaginyl ou isoleucyl. Les pentapeptides répondant a cette formule peuvent être obtenus par synthèse peptidique classique ou, plus simplement, en ayant recours à un synthétiseur de peptides. Ces pentapeptides sont capables d'.inhiber l'agrégation plaquettaire et la liaison du fibrinogéne -sur des plaquettes stimulées. Compte tenu de ces propriétés. ces peptides peuvent être utilisés en thérapeutique. notamment dans la prévention et le traitement des thromboses. Ils peuvent notamment être administrés par in- jection intra-musculaire, notamment en solution aqueuse physiologique, par instillation nasale, ou encore par voie orale, notamment sous forme de gouttes. L'exposé qui suit est destiné à mieux expliquer l'invention. Svnthese et Purification du oeptide KNODK Ce peptide a été synthétisé à l'aide du synthe- tiseur de peptides de la société Applied Biosystems commercialisé sous la référence 430A, selon la méthode de Merrifield. Il a ensuite été purifié par chromatographie liquide haute performance (HPLC) dans les conditions suivantes: Colonne: de 4,5 x 300 mm, silice greffée, phase in- verse, porosité 100 A, diamètre des parti- cules 5 p, commercialisée sous la dénomination Nucleosil C 18 par la société MACHEREY NAGEL. Eluant: eau/acétonitrile/acide trifluoroacétique dans les proportions volumétriques 970:30:1. Débit: 1-ml/min. Lecture à 215 nm. Sortie du pic à 9,50 min. Il a ensuite été lyophilisé. Analyse Apres hydrolyse totale par HCl 6N + mercapto-2 éthanol au 1/20004, pendant 18 heures à 110C sous vide, on a trouvé que la composition en acides aminés (résidus/mole) était la suivante: D: 1,80 E: 1,0 263 1-626 K 2,3 en utilisant un appareil Biotronik,' modèle LC 6000 com- mercialisé par la société SEMSA. La séquence du peptide a été établie à l'aide du séquenceur de la société Applied Biosystems. référence 470A. Les phénylthiohydantoines (PTH) des acides ami- nés ont été identifiées par HPLC avec le chromatographe de la société Applied Biosystems référence 120A. La séquence trouvée est la suivante: K N Q D K 7 ut - 7 71 *_ amino acide déterminé par dégradation automatique d'Edman. Aucune trace d'impureté n'a pu être décelée. Ce peptide est donc pur à 99 % au moins. Caractéristiques Phvsiques: Ce peptide est hydrophile et hygroscopique. Synthèse et Durification du oeptide KIODK Ce peptide a éte synthétisé à l'aide du synthé- tiseur de peptides de la société Applied Biosystems commercialisé sous la référence 430A suivant la méthode de Merrifield. Il a ensuite été purifié par chromatographie liquide haute performance (HPLC) dans les conditions suivantes: Colonne: de 3.9 X 300 mm de silice greffée, phase in- verse, porosité 125 A, diamètre des particules p. commercialisée sous la dénomination p Bondapake C 18 par la société WATERS CHROMA- TOGRAPHY. Solvant de départ: H20/acetonitrile/acide trifluoroacé- tique: 989/10/1 Gradient en acétonitrile: 1 à 16 % en 25 min. Débit: 2 ml/min. Lecture a 210 nm. Sortie du pic à 6.4 min. Il a ensuite été lyophilisé. Analyse Apres hydrolyse totale par HCl 6N + mercapto-2 éthanol au 1/2000è, pendant 18 heures à.110*'C sous vide, on a trouvé que la composition en acides aminés (rési- dus/mole) était la suivante: D: 1,0 E: 1,05 1: 1,0 K:1,97 en utilisant un appareil Biotronik, modèle LC 6000 commercialisé par la société SEMSA. La séquence du peptide a été établie à l'aide du séquenceur de la société Applied Biosystems, référence 470A. Les phénylthiohydantoïnes (PTH) des acides ami- nés ont été identifiées par HPLC avec le chromatographe de la société Applied Biosystems référence 120A. La séquence trouvée est la suivante: K I Q D K 7 7 7 -7 7 : amino acide déterminé par dégradation automatique d'Edman. Aucune trace d'impureté n'a pu être décelée. Ce peptide est donc pur à 99 % au moins. Caractéristiques ohvsiaues: Ce peptide est hydrophile et hygroscopique. Etude oharmacoloaioue: On a effectué une étude des pentapeptides KNQDK et KIQDK sur les fonctions plaquettaires à savoir: l'a- grégation des plaquettes et la liaison du fibrinogène. induites par l'ADP. En effet, il est maintenant claire- ment établi que le site de liaison du fibrinogéne se trouve sur le complexe GPIIb/IIIa de la membrane pla- quettaire: une inhibition de la liaison laisserait à penser que ces peptides agissent à ce niveau, soit directement, soit indirectement. Dans le cas du peptide KNQDK, il a ainsi été trouvé qu'une concentration 500 pM de ce peptide inhi- be 50 % de l'agrégation plaquettaire induite par 1'ADP pM, tandis qu'une inhibition de 50 % de la liaison du fibrinogène aux plaquettes est obtenue avec une concen- tration 200 pM de ce peptide. Dans le cas du pentapeptide KIQDK, il faut une - concentration beaucoup plus élevee pour obtenir 50 % d'inhibition de la liaison du fibrinogène soit 1100 pM, tandis qu'une concentration 350 pM suffit pour obtenir % d'inhibition de l'agrégation des plaquettes. La modification de N en I semble donc. affecter la liaison du fibrinogène. REVENDICATIONS 1. Pentapeptide répondant à la formule: lysyl-X-glutaminyl-aspartyllysine (I) dans laquelle X représente asparaginyl ou isoleucyl. 2. Le pentapeptide lysyl-asparaginyl-glutami- nyl-aspartyl-lysine. 3. Le pentapeptide lysyl-isoleucyl-glutaminyl- aspartyl-lysine. 4. Médicament caractérisé en ce qu'il contient, en tant que principe actif, au moins l'un des pentapep- tides selon la revendication 1.