Brevet FR2630439A1 — publié le 19891027

La présente invention concerne de nouveaux composés chimiques, leur procédé de préparation ainsi que leur utilisation, notamment en agriculture, pour la sélection des microorganismes de la rhizosphère et de la phyllosphère. C'est au niveau de la rhizosphère, partie du sol directement en contact avec les racines, que l'acti-vité microbienne liée au développement des plantes est la plus importante. Il peut donc s'avérer souhaitable, au niveau de ladite rhizosphère, d'introduire ou de sélectionner un microorganisme aux propriétés intéressantes pour la plante ou de favoriser sa multiplication. Or, le fort pouvoir neutralisant du sol dt en particulier au phénomène de compétition rend difficile le développement de bactéries allogènes. Il-est à présent admis que la présence ou l'absence de certains médiateurs chimiques libérés par les plantes conditionne en grande partie le type et le nombre de microorganismes situés dans cette rhizosphère. Les mêmes raisonnements s'appliquent à la phyllosphère, à savoir l'espace avoisinant les parties aériennes des plantes telles que les feuilles. La présente invention concerne des composés chimiques nouveaux pouvant être utilisés comme médiateurs nutritionnels (Tepfer et al, Journal ouf Bacteriology, tzars 1988, vol. 170, No. 3 ; FR 2 582.671). Il s'agit decom- posés répondant à la formule I suivante dans laquelle R1 est l'hydrogène ou un alkyl éventuellement substitué, R2 représente l'hydrogène, un alkyl éventuellement substitué ou un radical dérivé de la fonction hydroxyle, et n est compris entre 0 et 7 à condition que lorsque R1 est le méthyl alors n est différent de 0. Les composés de la présente invention pouvant être en conformation chaise ou en conformation bateau, les fonctions hydroxylées peuvent être en liaison axiale ou équatoriale. En outre, les fonctions hydroxyléesne sont pas, en général, fixées sur le même carbone cyclique. De préférence R1 et R2 représentent l'hydro gène,et les composés selon la présente invention possèdent au moins un hydroxyle positionné de facon à créer une structure aminoacétalique entre l'azote et cet hydroxyle. De préférence, l'hydroxyle impliqué dans la structure aminoacétalique est en position 1. A ce jour, une telle structure aminoacétalique n'a jamais été mise en évidence pour des molécules de type tropanique ; elle peut être schématisée par l'équilibre suivant entre deux formes tautomères, également incluses dans la formule générale des com posés de la présente invention De préférence, les composés selon l'invention possèdent, outre un hydroxyle en position 1, d'autres groupements hydroxyle et notamment en positions 2 et 3. Parmi ces composés, il faut citer les composés de formule II dans laquelle n' est compris entre 0 et 4 D'autres composés préférés de l'invention répondent aux formule (fIa) et (IIb) suivantes La présente invention concerne aussi le procédé de-préparation des composés mentionnés ci-dessus.Ce procédé comporte, de préférence, les étapes successives suivantes a) l'extraction à partir de racines de.plantes d'un mélange comportant un ou plusieurs iso mères desdits composés, des acides aminés et/ou de la mannopine, b) enrichissement biologique du mélange obtenu au cours de l'étape a) en un extrait enrichi en un ou plusieurs isomères desdits composés, c) le cas échéant, séparation des composés obte nus au cours de l'étape b) en leurs isomères respectifs. De préférence, l'extraction est réalisée à partir de racines de certaines convolvulacées, et notamment, Calystegia sepium ou Convolvulus arvensis. De préférence, le procédé suivant l'invention comporte - une extraction en phase aqueuse d'un broyat de racines et récupération du surnageant, - les composés selon l'invention sont extraits du surnageant par fixation sur une résine cationique et élution en milieu basique NH4OH, - l'éluat est éventuellement traité pour dli- miner les acides aminés et la mannopine, - les composés selon l'invention sont éven tuellement purifiés à l'aide d'une résine cationique comme précédemment. Plus particulièrement, on effectue en premier lieu un broyage des racines dans de l'eau suivi d'une centrifugation. On récupère la fraction soluble que l'on fixe sur une résine cationique (DOWEX 50). On effectue ensuite une élution par NH40H puis une évaporation à sec. L'extrait obtenu à l'issu de cette étape est un mélange complexe comportant un ou plusieurs isomères des composés de la présente invention, associés à diverses substances dont notamment des acides aminés et/ ou de la mannopine. Dans le but d'enrichir ce mélange en composés de la présente invention, on peut recourir à diverses techniques chimiques, de préférence biologiques, connues de l'homme de l'art pour éliminer les acides aminés et la mannopine. De préférence, après avoir stérilisé ce mélange par filtration, on réalise, au cours del'étape b) une dégradation des acides aminés et de la mannopine par une souche d'Agrobacterium tumefaciens, telle que la souche B6806. Oh élimine ensuite les bactéries par centrifu gation ; on fait passer le surnageant sur résine DOWEX 50. On élue par NH40H et on évapore à sec. A l'issue de cette étape, on obtient un mélange comportant un ou plusieurs isomères des composés de la pré sente invention et éventuellement des traces d'acides aminés. La dernière étape du procédé de la présente in vention consiste, le cas échéant, à séparer les principaux isomères des composés ainsi extraits et purifiés. Cette séparation peut être effectuée par deux étapes successives 1) une filtration sur colonne de trisacryl (GF05) suivie d'une élution à l'aide d'un tampon volatil au bicarbonate de triéthylamine et d'une évaporation à sec, puis 2) une séparation en H.P.L.C. Enfin, diverses techniques spectrométriques (spectrométrie de masse haute résolution, R.M.N.) permet tent de déterminer la structure et donc l'identité des isomères ainsi obtenues. Enfin, la présente invention concerne l'utilisation des composés mentionnés ci-dessus pour la sélection des microorganismes de la rhizosphère. En effet, les composés de la présente invention, ou médiateurs, ne sont métabolisables que par un nombre restreint de microorganismes. Ceux-ci se multiplient donc de façon préférentielle dans la rhizosphère des plantes secrétant ces médiateurs. C'est ainsi que des essais ont été réalisés en vue de comparer le nombre de bactéries capables de métaboliser les composés'de la présente invention dans la rhizosphère de Calystegid sepium et Convolvulus arvensis avec celui de la rhizosphère de deux plantes témoins, Allaria petiolata et la graminée. Les résultats sontd'environ 25 % pour la rhizosphère des deux liserons et de 0 % pour les plantes témoins. En outre, parmi une quarantaine de souches de bactéries du sol échantillonées en laboratoire que l'on a testées (dont Pseudomonas, Azospirillum, Klebsiella, Agrobacterium) seule la souche Rhizobium meliloti 41 s'est révélée capable d'utiliser les médiateurs de la présente invention comme unique source d'azote et de carbone. Les gènes permettant ce catabolisme sont portés par un plasmide de 225 kb, le pRme 41 et sont localisés dans une région de 50 Kb. C'est ainsi que, dans la rhizosphère de plantes produisant un tel médiateur, la multiplication des bactéries capables de cataboliser ce médiateur sera favorisée par rapport à celle des bactéries ne possédant pas cette propriété. La possibilité de préparer les composés selon la présente invention permet, en outre, en les.utilisant en combinaison avec les microorganismes déterminés, de favoriser le maintien de ces microorganismes au niveau de la rhizosphère. La présente invention concerne en particulier l'application des composés selon l'invention dans la rhizosphère ou dans la phyllosphère de plantes utiles afin d'y maintenir certains microorganismes présentant le caractère CAC+, ce caractère CAC+ étant défini comme la faculté de cataboliser les composés selon la présente invention. Pour l'implantation dans la rhizosphère, cette application peut être réalisée par des moyens connus tels que traitement des graines (enrobage, pelliculage, inoculation), enfouissement, épandage ou injection au voisinage des plantes utiles. Pour l'implantation dans la phyllosphère, cette application peut se faire par pulvérisation des parties aériennes (feuilles, tiges, bourgeons). Les microorganismes CAC+ seront sélectionnés par des procédés traditionnels sur des milieux sélectifs contenant les composés selon l'invention à partir de souches naturel les, de souches mutées ou bien de souches transformées par un ou des plasmides portant les gènes CAC comme cela sera explicité ci-après. Les composés selon la présente invention peuvent être utilisés en combinaison avec les microorganismes présentant une activité rhizosphèrique ou phyllosphéricrue favorable à la plante, éventuellement sur le même support, par exemple au support tels que la tourbe, mais il est possible également de prévoir des produits encapsulés comportant, outre le microorganisme, le ou les composés de la présente invention Ce type d'encapsulation est connu ; il s'agit par exemple, de billes d'alginates dont la technologie de préparation ne sera pas décrite en détail dans ce qui suit. L'utilisation des composés de la présente invention permet une amélioration des plantes, et notamment des légumineuses car elles facilitent le maintien dans la rhizosphère de microorganismes tels que les Rhizobium ou les Bradvrhizobium. En outre, il peut être intéressant d'introduire dans la rhizosphère de certaines plantes des bactéries productrices de facteurs de croissance ou d'antibiotiques et ce, en vue de fertiliser le sol ou de détruine les microorganismes phytopathogènes (John DAVISON, Biotechnology, vol. 6, Mars 1988). Les composés de la présente invention sont plus particulièrement destinés à être utilisés pour la détoxification de certains sols. On sait notamment que, suite à la culture intensive de plantes telles que la manioc, ou suite à un traitement chimique ou biologique particulier, certains sols non seulement s'appauvrissent en éléments énergétiques, mais aussi se chargent de substances particulièrement toxiques. Lorsque cela est possible, il est toujours préférable de remédier à ces problèmes par un procédé biologique plutôt que chimique. A cette fin, certains microorganismes peuvent se revéler particulièrement utiles et notamment s'ils possèdent la capacité de cataboliser lesdites substances toxiques. Or, l'introduction de tels microorganismes au niveau du sol à détoxifier conduit, le plus souvent, à une compétition entre microorganismes autochtones, et microorganismes introduits, au détriment de ces derniers. La présente invention vise à résoudre ce problème et ce, grâce à l'introduction conjointe de calystégines et de microorganismes déterminés sous la forme de poudres, capsules ou en mélange à des engrais et ce, au niveau du sol à détoxifier. Les composés de l'invention peuvent, de façon générale, permettre d'introduire des microorganismes permettant la dégradation de substances polluantes et ce, grâce à un pouvoir de sélection exercé en faveur de ceux-ci. Enfin, les composés de l'invention sont utilisés de façon avantageuse au niveau de la phyllosphère des plantes. A cs niveau, les copposés de 1' invention peuvent notamment permettre la lutte contre le gel et ce en favorisant la présence de bactéries anti-gel telles que Fesudomonas ou Erwinia. De façon générale, les opposés de l'invention peuvent permettre d'introduire, au niveau des parties aériennes de plantes, des microorganismes destinés à la lutte biologique, contre des agents patho gènes ou des prédateurs (bactéries, cl signons, insectes, nématodes). L'objet des différents exemples présentés ci-après est de mettre en évidence l'influence positive des copposés selon l'invention dans la rhizosphère de plantes sur la survie et la croissance de bactéries CAC+ par rapport à celle d'autres bactéries ne différant si possible que par leur caractère CAC. Les exemples ci-après démontrent successivement le rôle du plaside, l'effet de la calystégine purifiée, l'étude de la compétitivi- té pour la nodulation des souches utilisées (lorsque plusieurs souches de Rhizobium sont présentes, la légumineuse peut favoriser une ou plusieurs souches pour la formation de ses nodosités ; il y a compé- titivité pour la nodulation entre les différentes souches), et l'influente de l'envrronnenent chimique créé au niveau de la rhizosphère des plantes synthétisant les calystégines sur la population microbienne. Ces exemples sont illustrés par - la figure 1 représentant un schéma du dispositif expérimental utilisé pour étudier la multiplication des bactéries dans la rhizosphère - la figure 2 représentant un schéma du tube GIBSON utilisé pour l'étude de la compétitivité pour la nodulation. Les milieux de culture utilisés dans les exemples sont 1/ Le milieu JENSEN comportant, pour un litre de milieu CaRPO4 1 0 g K2HPO4 : 0,2 g MgSO4, 7H20 : 0,2 g NaCl : 0,2 g FeCl3 : 0,3 ml d'une solution à d = 1,26 oligoéléments : 1 ml d'une solution contenant B : 0,05 % Mn : 0,05 % Zn : 0,005 % Mo : 0,005 % Cu : 0,002 % eau permutée : 1 1 pH ajusté à 7 avec NaOH pour milieu gélosé : gélose 15 g Stérilisation : 20 min à 120 OC. 2/ Le milieu WRIGHT comportant pour un litre de milieu NaCl : 0,2 g CaC03 : 0,1 g MgSO4, 7 H20 : 0,2 g K2HPO4 : 0,5 g Mannitol : 10 g Extrait de levure : 2,5 g eau permutée : 1 1 pH 6,8 pour un milieu gélosé : gélose 15 g Stérilisation : 20 min à 1200C. Les composés selon la présente invention utilisés dans les exemples sont des produits de la plante qui correspondent essentiellement aux structures IIa et IIb ; ce mélange étant nommé parfois "calystégine". EXEMPLE 1 ROLE DU PLASMIDE A) Méthodes 1/ Origine des souches On dispose de deux types de souches (voir tableau 1) - Rhizobium meliloti 2011 ne contenant pas le plasmide pRme 41 et ne portant aucune résistance à des antibiotiques - Rhizobium meliloti 41. Des souches possé dant ou non le plasmide pRme 41 sont uti lisées. Afin de différencier les souches, des gènes de résistance à des antibiotiques sont utilisés comme gènes marqueurs. A par tir de la souche R. meliloti 41 guérie du plasmide par un traitement à la chaleur, deux mutants spontanés ont été isolés, l'un résistant à la spectinomycine (souche 3) et l'autre à la rifampicine (souche 4). Ces mutations sont situées sur le chromo some. Ce sont les deux souches ne catabo lisant pas les composés de l'invention qui seront utilisées (souches cac ). Dans ces deux souches, le plasmide pRme 41 portant une résistance à la kanamycine a été ré introduit : ce sont les deux souches cata bolisant les composés selon la présente invention (souches cac+) qui vont être uti lisées (souche 1 : résistance à la specti nomycine et à la kanamycine ; souche 2 résistance à la rifampicine et à la kana mycine). Tableau 1 : Récapitulation des souches de R. meliloti avec ou sans plasmide pRme 41 utilisées N DES SOUCHES CARACTERISTIQUES RESISTANCE 1 cas spectinomcine kanamycine 2 cac+ rifampicine kanamycine 3 cac spectinomycine 4 cac rifampicine 2/ Culture des Plantes en conditions axdnigues Des graines de Calystegia sepium et de Convolvulus arvensis sont scarifiées par trempage pendant 30 min dans de l!acide sulfurique concentré puis sont rincées cinq fois avec de l'eau permutée. Elles sont ensuite stérilisées en surface pendant 15 min dans une solution saturée d'hypochlorite de calcium et rincées six fois successivement avec de l'eau permutée stérile.Les graines sont réparties dans des bottes de Petri contenant de l'eau gélosée stérile à 15 % et sont mises à germer dans l'obscu- rité à la température du laboratoire. Au bout d'une période comprise entre 72 heures et une semaine, lorsque la racine atteint au moins un centimètre, les plantules sont repiquées dans des tubes de 22 cm X 22 mm contenant 12 ml de milieu Jensen stérile dilué au 1/5 additionné de 0,5 g/l de nitrate de potassium. Les graines sont disposées sur une bande de papier Chardin de 15 cm X 1 cm pliée en son milieu afin de servir de support. La racine est placée le long de la bande de papier pour éviter le dessèchement. Le tube est bouché avec du coton cardé, permettant ainsi les échanges gazeux (voir figure 1). Les tubes sont placés dans une chambre climatisée avec 16 heures de jour, une température de 220C le jour et de 180C la nuit et une humidité relative de l'air de 80 %. 3/ Préparation de l'inoculum La souche de R. meliloti 2011 est repiquée dans un tube contenant du milieu Wright gélosé et mise en culture pendant 48 heures à 280C. Puis les bactéries sont mises en suspension dans 9 ml d'eau stérile. La solution ainsi obtenue est diluée jusqu'au 1/100.000. On inocule chaque tube par 0,1 ml de la dilution au 1/100.000 afin d'avoir environ 103 bactéries par tube. Cette souche va servir à épuiser le milieu. Une semaine après, un mélange de souches cac et cac en proportion égale est apporté. Les souches cac et cac sont préalablement cultivées séparément sur milieu gélosé Wright pendant 40 heures à 280C. Puis elles sont mises en suspension dans 9 ml d'eau stérile et 0,1 ml de cette suspension est inoculé dans 10 ml de milieu Wright liquide contenu dans une fiole de 50 ml bouchée par du coton cardé. Les fioles sont mises en culture, ladite culture étant agitée pendant 48 heures à 280C. Un prélèvement est alors fait pour déterminer la concentration en bactéries des différentes cultures. Pendant la durée du dénombrement, les fioles sont conservées à 40C. Une fois. la concentration connue, les différentes souches de R. meliloti 41 sont mélangées deux à deux de façon à obtenir un mélange de proportion égale.Les deux mélanges suivants sont réalisés - souche 1 (cac+) + souche 4 (cac-) - souche 2 (cac +) + souche 3 (cac-) Le mélange est dilué au 1/1.000.000 et 0,1 ml des dilutions au 1/1.000.000, 1/10,000 ou 1/100 sont inoculées par tube afin d'avoir trois niveaux d'inoculations. Des témoins sont obtenus en inoculant des tubes dépourvus de plante. Au préalable, 0,3 ml du contenu de trois tubes aura été prélevé afin de dénombrer le niveau obtenu par la souche épuisante R. meliloti 2011. Trois répétitions sont faites par type de mélange, niveau d'inoculation et type de plante. 4/ Dénombrement des Rhizobium Dix jours après, des prélèvements de milieu sont faits dans les tubes et sont dilués de façon convenable. Les dilutions sont étalées sur des boites de Petri contenant 20 ml de milieu Wright gélosé additionné d'actidione à raison de 20 ssg/ml-afin d'éviter une contamination des boites par des champignons. Pour différencier les souches, des antibiotiques sont ajoutés au milieu Wright - kanamycine (100 ssg/ml) pour obtenir les sou + ches cac - spectinomycine (150 Fg/ml) pour obtenir la souche 3 - rifampicine (50 g/ml) pour obtenir la souche 4. Le milieu témoin (Wright plus actidione) permet d'obtenir la totalité des souches, y compris R. meliloti 2011. L'incubation des boîtes se fait -à 280C pendant 3 jours. Les prélèvements peuvent s'étaler sur plusieurs semaines car le niveau atteint par les bactéries reste stable. B) Résultats + Les nombres de bactéries cac et cac observées après dix jours sont donnés dans le tableau IV. Les résultats représentent la moyenne de trois répétitions. Le mesure du nombre de bactéries de la souche 2011 utilisée pour épuiser le milieu en l'absence de plante avant inoculation des souches cac et cac a permis de mettre en évidence qu'il existait dans le milieu suffisamment de nutriments pour permettre l'installation de 2,6 X 108 bactéries par tube. En présence de plantes, ce nombre est multiplié par 2 à 3. Durant le reste de l'expérience, ces nombres resteront stables. En llabsence de plante, il y a eu 8 générations de bactéries cac au plus bas niveau d'inoculationet 6 à 8 générations de cac , ce qui donne pour les deux.couples de souches un rapport cac+/çac de 4 à 1,4. P des niveaux d'inoculation plus élevés, il n'y a formation que de 2 ou 3 générations des souches cac et cac ce qui donne un rapport cac+/cac semblable au rapport de départ. En présence d'une plante secrétant de la calystégine, il y a une multiplication beaucoup plus importante des sou + ches cac par rapport aux cac . Cette multiplication dif- férentielle s'observe mieux au plus bas niveau d'inocula- tion : en présence de Calystegia pour le couple 1-4, la souche cac a donné il générations et la cac à peine 1, ce qui donne un rapport cac+/cac- de 1790. Aux niveaux d'inoculation 105 et 107, la souche CAC+ a donné de 2 à 3 générations alors que la cac en a donné de 0 à 1 ce qui donne des rapports cac+/cac de respectivement 13 et 1,4. Ce même phénomène s'observe un peu atténué en présence de Convolvulus et avec le couple de souches 2-3. Il existe donc un effet du niveau d'inoculation. Pour la même plante, selon le couple de souches, ie rapport cac + /cac varie. Les mutations de résistance aux antibiotiques influent donc sur la croissance des souches. Pour un même couple dé souches, le. rapport cac+/cac est plus faible avec C. arvensis qu'avec C. sepium. Tableau IV: Nombre des différentes bactéries 2011, cac+, cac-, contenues dans le milieu exprimé en nombre de bactéries par tube pour les deux couples de souches uti lisés aux 3 niveaux d'inoculation en présence ou en l'absence de Calystegla ou de Convolvulus. Le rapport des souches cac+/cac- est également donné Dilution IMOPCULUM SANS PLAMIE CALYSIEGIA CONVOLVULUS 2011 cac+ cac- cac+/cac- 2011 cac+ cac- cac+/cac- 2011 cac+ cac- cac+/cac- 2011 cac+ cac- cac+/cac 1,9 10 2,6 108 3,3 108 6,5 108 10 1+ 1,9 10 6,6 10 7,3 10 0,9 1,3 108 2,0 106 4,9 105 4 3,4 108 1,7 107 9,5 10 1790 3,1 108 4,5 107 1,3 105 346 105 + # 1,9 10 6,6 105 7,3 105 0,9 1,6 108 5,4 106 4,1 106 1,3 1,1 108 4,2 106 3,3 105 13 5,2 108 4,2 107 7,4 106 5,7 107 4 1,9 10 6,6 107 7,3 107 0,9 1,0 109 2,5 108 2,8 108 0,9 8,1 108 1,7 108 1,2 108 1,4 1,4 109 2,6 108 4,1 108 0,6 103 2+ 1,9 10 4,8 10 5,3 10 0,9 1,2 108 1,7 106 1,2 106 1,4 6,4 108 6,2 106 3,4 104 18,2 3,1 108 9,6 106 6,3 104 152 105 + 1,9 10 4,8 105 5,3 105 0,9 1,5 108 4,0 106 5,6 106 0,7 1,6 108 3,5 106 6,1 105 5,8 2,1 108 7,2 106 2,2 106 3,3 107 3 1,9 10 4,8 107 5,3 107 0,9 1,0 109 1,3 108 2,5 108 0,5 4,2 108 9,5 107 1,7 108 0,6 8,9 108 9,4 107 1,3 108 0,7 * souche 1: cac+, résistante à la spectinomycine et à la kanamycine souche 2: cac+, résistante à la rifampicine et à la kanamycine souche 3: cac-, résistante à la spectinomycine souche 4: cac-, résistante à la rifampicine EXEMPLE 2 ROLE DE LA CALYSTEGINE PURIFIEE A) Méthodes 1/ Origine des souches + La souche R. meliloti 2011 et les souches cac et cac -1 et 4 sont utilisées. 2/ Préparation des tubes Des tubes contenant du milieu de culture sont préparés selon la méthode décrite dans les exemples précédents, mais aucune plante n'est présente. Le milieu de culture est supplémenté par de la calystégine purifiée à différentes concentrations : 0 g/ml, 5 g/ml, 10 g/ml ou 20 g/ml. 3/ Préparation de l'inoculum L'inoculum est produit selon la méthode décrite dans les exemples précédents mais n'est inoculé qu'à la seule concentration de 10 bactéries par ml. Pour chaque concentration en calystégine quatre répétitions sont faut tes. B) Résultats Neuf jours après son introduction à un niveau de 6,3 X 102 bactéries/ml, la multiplication de la souche R. meliloti 2011 avant inoculation par le couple cac -cac est donnée dans le tableau VII. La souche 2011 trouve dans le milieu suffisamment de nutriments pour passer de 6,3 X 102 à 5 X 106 bactéries/ml, mais elle n'est pas capable d'utiliser la calystégine puisque selon les différentes concentrations sa multiplication ne varie pas. La croissance des bactéries cac et cac est exprimée dans le tableau VIII en nombre de bactéries/ml. Au départ, 4 X 10 bactéries cac et cac ont été inoculées (49 % de la souche 1 cac et 51 % de la souche 4 cac ). Lorsqu'il n'y a pas de calystégine rajoutée, le rapport cac+/cac reste peu différent de 1 : il n'y a pas eu de multiplication différentielle.Mais lorsqu'on rajoute les composés selon la présente invention au milieu, la souche cac ne se multiplie pas alors que la cac donne 13 à 14 générations ce qui donne un rapport cac+/cac de l'ordre de 104. L'augmentation du rapport n'est pas proportionnelle à l'augmentation de calystégine dans le milieu. Tableau VII Nombre de bactéries R. meliloti 2011 par ml dans le milieu 9 jours après inoculation et avant l'introduction des souches cac et cac en fonction de la concentration de calystégine Concentration de calystegine Nombre de bactéries 2011 ($g/ml) O 5.106 5 3,6.106 10 6,6.106 20 1,4.107 Tableau VIII Nombre des différentes souches (2011, cac cac ) contenues dans le milieu donné en nombre de bactéries par ml et rapport des souches cac icac en fonction de la con centration de calystégine CONCENTRATION DE CALYSTEGINE 2011 CAC+ CAC CAC+/CAC (llg/ml) 0 1,9.106 3,9.10 2,3.103 1,7 5 5,0.106 2,2.106 2,0.102 11.000 10 3,5.106 3 .îo6 2,0.102 15.000 20 1,1.107 5,5.106 2,3.102 24.000 EXEMPLE 5 COMPETITIVITE POUR LA NODULATION A) Méthodes 1/ Origine des souches Les souches 1, 2, 3 et 4 de R. meliloti 41 sont utilisées. De plus une souche de R. leguminosarum P153 est utilisée pour servir de souche épuisant le milieu. 2/ Culture des plantes Des tubes Gibson sont utilisés (voir figure 2). Des tubes de 22 cm X 22 mm sont remplis de 30 ml de milieu Jensen gélosé à 15 %. Ils sont bouchés par une triple épaisseur de papier aluminium maintenue en place par un élastique. Le papier aluminium est percé par un trou bouché par du coton. Après stérilisation par autoclavage, les tubes sont inclinés de façon à ce que la gélose vienne tou cher lepapier aluminium. 11 ml de milieu Jensen dilué au 1/4 et ne contenant pas de nitrate est ajouté. Les plantules de luzerne stérilisées et agées de 36 heures sont repiquées en faisant un trou dans la capsule d'aluminium à la limite de la gélose et en y introduisant la racine après avoir débarassé les cotylédons des téguments de la graine.Il faut s'assurer que la racine est bien en contact avec la gélose afin d'éviter son dessèchement.Les tubes sont ensuite recouverts d'un plastique prévenant la dessication des plantules et placés en chambre climatisée. 3/ PreEharatlon~de~l'inoculum Un inoculum de souche de R. leguminosarum est obtenu de la même manière que R. meliloti 2011 et est inoculé dans les tubes à une concentration de 8,7 X bactéries/ml afin d'épuiser le milieu. Six jours après, les luzernes sont repiquées dans les tubes et le lendemain sont inoculées par 0,5 ml d'un mélange de bactéries. Les mélanges de bactéries sont obtenus selon la technique déjà décrite. Huit types de traitements sont effectués selon l'inoculum apporté, avec 10 répétitions par traitement (voir tableau III) Traitement A : souche 1 (46 %) + souche 2 (54 %) Traitement B : souche 3 (52 %) + souche 4 (48 %) Taux ~ Traitement C : souche 1 (46 %) + souche 4 (54 %) d'inoculation # Traitement D : souche 2 (52 %) + souche 3 (48 %) 10 bactéries/ Traitement E : souche 1 + souche 4 + 120 g de ml calystégine - Traitement F : souche 2 + souche 3 + 120 g de calystégine Taux - Traitement G : souche 1 + souche 4 + 120 g de d'incoulation calystégine 10 bactéries/ - Traitement H : souche 2 + souche 3 + 120 g de calystégine Tableau III :Souches utilisées pour l'expérience de compétitivité pour la nodulation selon le traitement SOUCHES UTILISEES TRAITEMENT N CARACTERISTIOUES Ne CARACTERISTIOUES A 1 cac+, résistante specti- 2 cac+, résistante rifam nomycine et kanamycine picine et kanamycine B 3 cac , résistante specti- 4 cac, résistante rifam- nomycine picine C 1 cac+, résistante specti- 4 cac , résistante rifam nomycine et kanamycine picine D 2 cac+, résistante rifam- 3 cac, résistante specti picine et kanamycine nomycine E 1 cac+, résistante specti- 4 cac-, résistante rifam nomycine et kanamycine picine F 2 cac , résistante rifam- 3 cac , résistante specti picine et kanamycine nomycine G 1 cac , résistante specti- 4 cac, résistante rifam- nomycine et kanamycine picine H 2 cac+, résistante rifam- 3 cac-., résistante specti picine et kanamycine nomycine 4/ Identification des souches formant les nodosités Au bout d'un mois, les nodosités formées sont détachées des racines et aseptisées au chlorure mercurique de la même manière que les graines de luzerne. Par traitement, cinquante nodosités choisies au hasard sont écrasées dans 0,1 ml d'eau permutée stérile puis elles sont étalées sur boîte de Pétri afin de libérer les bactéries, puis elles sont étalées sur bote de Pétri contenant du milieu Wriqht gélosé comprenant les différents antibiotiques. Les boites sont mises à incuber 3 jours à 280C. B) Résultats Les pourcentages de nodosités occupées par les différentes souches sont donnés dans le tableau IX. D'après les traitements A et B, la différence de compétitivité pour la nodulation, faible entre souches sans plasmide, devient importante lorsque les deux souches ont le plasmide. La comparaison des traitements A à C et B à D montre l'effet du plasmide : l'introduction du pRme 41 dans la souche résistante à la rifampicine entraine une perte de compétitivité de la souche ainsi formée par rapport à celle résistante à la spectinomycine avec ou sans plasmide. De même, la comparaison des traitements A à D et B à C donne le même résultat pour la souche résistante à la spectinomycine par rapport à celles résistantes à la rifampicine avec ou sans plasmide, mais à un moindre degré. En comparant les traitements C et E ou D et F, l'effet de la calystégine peut être observé : en présence de calystégine, la souche cac résistante à la spectinomycine forme 36 % des nodosités au lieu de 24 % sans calystégine, la souche cac + résistante à la rifampicine en forme 6 % au lieu de O %. La calystégine permet donc l'augmentation de la compétitivité des souches capables de la cataboliser. Une augmentation de la compétitivité de la souche CAC par rapport à la souche CAC est également observée en présence de calystégine et lorsque le niveau de bactéries inoculées est plus grand. Tableau IX Pourcentage des nodosités occupées par les différentes souches testées calculé à partir de 50 nodosités par traitement SOUCHES FORMANT LES NODOSITES TRAITEMENT 1 2 3 4 DOUBLE OCCUPATION A 98 2 0 B 52 38 10 C 24 72 4 D 0 100 0 E 36 54 10 F 6 94 0 G 50 44 è H 25 75 0 EXEMPLE 6 ETUDE DE LA RHIZOSPHERE DE PLANTES SYNTHETISANT LES CALYSTEGINES A) Matériels et méthodes a) Echantiaaonaqes Il s'agit de comparer la rhizosphère de Calystegia sepium et Convolvulus arvensis synthétisant les calystégines avec la rhizosphère de plantes témoins, Alliaria petiolata et une Graminée ne synthétisant pas de calystégines. Les plantes échantillonées sont préalablement choisies de façon à ce que l'espèce végétale domine dans le lieu de prélèvement. Deux échantillons de terre sont prélevés autour des racines de Calystegia sepium et de Convolvulus arvensis, deux espèces de liserons très répandues, ainsi qu'un autour d'une Graminée et un autour d'une dicotylédone Alliaria petiolata (famille des Crucifères). La terre qui adhère aux racines des plantes est placée dans 50 ml d'eau stérile et agitée pendant 30 minutes, sur un agitateur magnétique. La solution mère ainsi obtenue est diluée selon la gamme 10 10-2, 10 3, 10 4. 200 ssl de chaque dilution ainsi obtenue sont étalés sur des boites contenant le milieu suivant Peptone : 5,0 g Extrait de levure deshydratée : 2,5 g Glucose : 1,0 g Agar-agar : 15,0 g Eau qsp : 1 000,0 ml pH = 7-+/- 0,1 On ajoute dans le milieu deux antifongiques: Nystatine : 50,0 mg/ml Métalaxyl : 20,0 mg/ml Les boîtes sont ensuite placées à l'étuve à 280C environ 48 heures, c'est-à-dire le temps nécessaire pour obtenir un bon développement bactérien. On sélectionne donc les bactéries sur au moins deux critères : leur aérobiose et leur capacité de pousser à 280C. On récupère ensuite - 25 colonies pour Calystegia sepium, - 23 colonies pour Convolvulus arvensis, - 42 colonies pour les témoins 32 pour Alliaria petiolata 10 pour la graminée. Puis, on fait un test catabolique. b) Test catabolique On utilise-une culture bactérienne. liquide d'en virer 12 heures à 280C (FR 2 582 671). On utilise pour cette Dréculture le même milieu que celui utilisé pour le développement. Les bactéries sont au bout de ce temps en phase exponentielle de croissance. Les bactéries sont lavées deux fois dans un milieu SM (milieu minimum). La composition de ce milieu est la suivante KH2PO4 : 4,00 g MgSO4, 7 H2O : 0,10 g CaC12 : -0,02 g (après autoclavage) MnC12, 4 H20 : 1,00 ml d'une solution 10 5 M NaOH qsp pH=7,1 La stérilisation est effectuée par filtration. La DO de la suspension bactérienne obtenue est ajustée.à 0,5 (longueur d'onde = 650 nm). 200 l de la suspension ainsi obtenue sont incubés à 28 C pendant 40 heures avec 5 l d'une solution de calystégines A et B de concentration 10 mg/ml environ. Les tubes sont agités pendant toute la durée de l'incubation. Après 40 heures, les tubes sont centrifugés et les surnageants récupérés. On évapore ces surnageants et les résidus sont repris dans 10 iil d'eau osmosée. Ils sont ensuite déposés sur papier Whatman 3 MM en vue d'une électrophorèse en milieu acide (tampon acide acétique/acide formique) pendant 20 minutes à 3000 V. Après séchage, on relève- avec un réactif au nitrate d'argent. Sa composition est la suivante - Solution 1 : AgNO3 (AgNO3 : 4g ; H2O : 20 ml Acétone qsp 1000 ml). On sèche rapidement. - Solution 2 : NaOH (NaOH 20 % dans H2O : 100 ml Ethanol 96 % : 900 ml). On sèche lentement. - Solution 3 : Fixateur photo (suivre la for mule du fabricant). On lave à l'eau plusieurs fois et on sèche. B) Résultats On voulait donc comparer le nombre de bactéries capables de dégrader les calystégines (dites CAC +) dans la rhizosphère de Calystegia sepium et Convolvulus arvensis avec celui de la rhizosphère de deux plantes témoins, Alliaria petiolata et de la graminée. Les résultats obtenus sont les suivants: Plantes testées nbre de nbre de CAC+ % de cAC+ colonies Calystegia sepium 25 6 24 Convolvulus arvensis 23 6 26 Témoins 42 0 0 C) Test de fluorescence Le caractère de fluorescence peut être observé de façon plus sure après culture sur un milieu gélosé particulier, le milieu King B. Les bactéries sont mis en culture à 280C pendant 48 heures sur ce milieu. Après développement bactérien, les colonies sont observées avec un éclairage W. Les résultats observés sont les suivants : une souche bactérienne est fluorescente. Il s'agit de la souche appelée D1. Elle a été isolée à partir du sol rhizosphérique deCalystegia sepium. Les souches de bactéries présentant oe caractère de fluorescence sont typiquement des bactéries possédant des sidérophores. Ils peuvent-intervenir dans des processus de protection de la plante contre des pathogènes. Les conclusions que l'on peut tirer des différents exemples sont les suivantes D'après les résultats obtenus lorsque les souches portant le plasmide sont comparées aux souches sans plasmide, il apparait que le pRme 41 joue un rôle non négligeable dans la multiplication des souches CAC . Dans le milieu assimilé à la rhizosphère, il existe une différence de multiplication entre les souches possédant ou non le plasmide en présence de plantes synthétisant de la calystégine. Une hypothèse expliquant les différences de rapport CAC+/CAC entre Convolvulus et Calystegia sepium serait que Convolvulus excrèterait dans le milieu plus de compo- sés non spécifiques que Calystegia. Cela entrainerait alors une plus grande multiplication de la souche CAC en présence de Convolvulus qu'en celle de Calystegia, et donc un rapport CAC+/CAC plus faible. L'utilisation de la calystégine purifiée montre que ce posé sert effectivement de substrat nutritif -aux souches possédant le pRme 41(Tepfer et al, Journal of Bacterioloav, Mars 1988, vol 170, N 3). Donc, les différences de multiplications observées avec Calystegia et Convolvulus peuvent bien s' expliquer par l'exsudation de calystégine par ces plantes et par son-utilisation comme nutriment spécifique. L'augmentation non proportionnelle du rapport CAC + /CAC comparée à la concentration en calystégine montre qu'il existe dans le milieu un facteur limitant au développement des souches. Ces résultats semblent également indiquer que, puisque pour une concentration en calystégine de 5 g/ml il y a eu 13 générations de bacté ries CAC formées et puisqu'en présence de Calystegia cette même souche CAC+ n'a donné que 11 générations, le Calystegia a excrété dans le milieu moins de 5 ssg de calystégine. Quant à la compétitivité pour la nodulation, puisque les deux souches CAC ou les deux souches CAC ne diffèrent que par des résistances différentes à des antibiotiques, les différences de compétitivité pour la nodulation apparues entre les deux souches CAC ou CAC ne peuvent s'expliquer que par les mutations de résistance aux antibiotiques. D'après les quatre premiers traitements, il est possible de classer les souches utilisées résistante à la spectinomycine) est plus compétitive que - la souche 4 (CAC résistante à la rifampicine) elle-même plus compétitive que - la souche 1 (CAC résistante à la spectinomy cine et la kanamycine) elle-même plus compé titive que - la souche 2 (CAC + résistante à la rifampicine et à la kanamycine). Bien que les traitements correspondants n'aient pas été réalisés, ce classement permet de déduire que la souche 3 est plus compétitive que la 1 et la 4 plus compétitive que la 2. L'introduction du plasmide diminue donc la compétitivité pour la nodulation des souches. Cette diminution est différente de celle entrainée par les résistances aux antibiotiques. Il y a peut-être sur le plasmide pRme 41, outre les gènes de catabolisme de la calystégine, des gènes entrainantune baisse de compétitivité pour la nodulation. Cela peut être également dû au transposon Tn5 introduit, portant un marquage de résistance à la kanamycine. L'apport de calystégine dans le milieu permet d'améliorer la compétitivité égale.La quantité de calystégine apportée et la différence du nombre de bactéries entrainée par cet apport a permis de rattraper en partie l'écart de compétitivité des souches CAC par rapport aux CAC . L'inoculation à un fort taux avec de la calystégine réduit les différences de compétitivité entre les souches avec ou sans plasmide. Enfin, dans la rhizosphère des deux liserons synthétisant des calystégines, on trouve des bactéries capables de dégrader ces substances et de les utiliser comme unique source de carbone et d'azote.Le nombre de ces bactéries est d'environ 25 %. Par contre, aucune bactérie des sols prélevés autour des plantes témoins n'a pu dégrader les calystégines. Leur taux de présence doit donc être plus faible que dans la rhizosphère des liserons étudiés. Les liserons semblent donc créer par leur exsudats racinaires un environnement favorable à certaines espèces de bactéries qui seraient capables de cataboliser les calystégines. Pour connaître un éventuel rôle de protection de la plante conféré par les bactéries CAC vis-a-vis d'autres bactéries par exemple, on peut utiliser la fluorescence de la souche D1 en mettant ces bactéries en culture avec d'autres bactéries CAC isolées du sol. La protection de la plante devrait se traduire par une croissance des bactéries CAC ralentie ou inhibée. REVEND I CATIONS 1. Composés chimiques, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule I suivante dans laquelle R1 est l'hydrogène ou un alkyl éventuellement substitué, R2 est l'hydrogène, un alkyl éventuellement substitué ou un radical dérivé de la fonction hydroxyle et n est compris entre 0 et 7 à condition que lorsque R1 est le méthyl alors n est différent de 0. 2. Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que R1 et R2 représentent l'hydrogène, n est compris entre 1 et 7.et en ce qu'ils comportent une structure aminoacétalique entre l'azote et au moins un hydroxyle. 3. Composés selon la revendication 2, caractérisés en ce que l'hydroxyle impliqué dans la structure aminoacétalique est en position 1. 4. Composés selon la-revendication 3, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule II suivante dans laquelle n' est compris entre 0 et 4. 5. Composés selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule IIa suivante 6. Composés selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule IIb suivante 7. Isomères des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'ils possèdent la conformation chaise. 8. Isomères des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu ils possèdent la conformation bateau. 9. Utilisation des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la sélection des microorganismes de la rhizosphère. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que les microorganismes comportent le plasmide pRme 41. 11. Utilisation selon la revendication 9, pour l'amélioration des plantes. 12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que les plantes sont des légumineuses. 13. Utilisation des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la sélection de microorganismes capables de dégrader une substance toxique ou polluante. 14. Utilisation des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la sélection des microorganismes de la phyllosphère. 15. Utilisation selon la revendication 14 pour la sélection de microorganismes destinés à la lutte biologique contre des agents pathogènes ou des prédateurs et contre le gel. 16. Procédé pour la sélection de microorganismes déterminés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à utiliser simultanément ou successivement lesdits microorganismes et les composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les microorganismes permettent l'amélioration des plantes. 18. Procédé selon la revendication 16; caractérisé en ce que les microorganismes sont capables de dégrader une substance toxique ou polluante. 19. Produit utile au procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte en mélange des microorganismes déterminés et les composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.