Brevet FR2628530A1 — publié le 19890915

La présente invention est relative à un appa- reil de détection et de numération de particules fluores- centes ou rendues fluorescentes, portées par un support so- lide et & un procédé de détection desdites particules, à l'aide dudit appareil. L'analyse qualitative et quantitative rapide de la présence de particules vivantes ou non vivantes aptes à être rendues fluorescentes (bactéries, levures, moisis- sures, parasites, pollen) ou naturellement fluorescentes (particules inorganiques, telles que l'amiante) dans des fluides liquides ou gazeux, des produits alimentaires ou des produits d'hygiène ainsi que la surveillance d'un pro- cessus de fermentation, au cours de sa réalisation s'avèrent très utiles. Les méthodes habituellement utili- sées dans le cas des particules vivantes sont basées sur la détection visuelle du développement des micro-organismes dans des milieux appropriés, après filtration sur membrane, permettant de concentrer lesdites particules à détecter; la membrane est ensuite déposée en gélose; les particules éventuellement présentes se multliplient alors, les colo- nies en résultant devenant visibles dans un délai de 2 à 30 jours.. Cette méthode a l'inconvénient d'être longue à mettre en oeuvre, de comprendre plusieurs étapes, de ne pas permettre une numération précise, et de ne pas identifier l'espèce ou le genre des particules présentes. De plus, cette méthode ne permet pas de détecter des particules non vivantes (amiante) présentes notamment dans l'air. Compte-tenu des délais nécessaires pour la détection de micro-organismes par la méthode ci-dessus décrite, le problème se pose de rechercher un procédé et un appareil de détection de particules vivantes, permettant une détection directe, rapide, sensible, facile à mettre en oeuvre et peu coûteuse desdites particules dans un fluide ou un milieu donné, notamment liquide ou semi-liquide. De même, le problème se pose de fournir un pro- cédé et un appareil de détection de particules non vivantes ou inorganiques., permettant une détection directe et rapide des agents polluants présents dans l'air, en particulier. En conséquence, la présente invention s'est donné pour but de pourvoir à un appareil de détection de particules vivantes, mortes ou inorganiques, qui répond mieux aux besoins de la pratique, en permettant une détec- tion et une numération immédiate desdites particules di- rectement sur un support solide, sans avoir à effectuer notamment une mise en culture des particules vivantes por- tées par ce dernier. La présente invention a pour objet un appareil de détection et de numération de particules, présentes nor- malement, ou éventuellement contenues en tant que conta- minants, dans un fluide liquide ou gazeux, ou dans un pro- duit notamment alimentaire ou d'hygiène, par fluorimétrie, comprenant une source lumineuse, des moyens de focalisation' du faisceau issu de ladite source lumineuse, au moins un moyen de détection de la lumière fluorescente émise par les particules présentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre:. - un support pour collecter les particules naturellement fluorescentes ou rendues fluorescentes à l'aide d'au moins un colorant approprié, - des moyens de balayage de la surface du support à analyser, par ledit faisceau lumineux, - et, au moins un moyend'enregistrement et de comptage desdits signaux de fluorescence. Selon un mode de réalisation avantageux de cet appareil, le support est un support filtrant continu ou discontinu, notamment une membrane filtrante. Ledit support filtrant n'est pas, lui-même, fluorescent et la dimension des pores varie de 0,2 pm à 0,2 mm, selon le type de particules à retenir. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit appareil, le support solide est un support non filtrant continu ou discontinu. Selon encore un autre mode de réalisation avan- tageux dudit appareil, les moyens de balayage comprennent un premier miroir oscillant dont l'axe d'oscillation est perpendiculaire & l'axe du faisceau lumineux, ledit premier miroir assurant le balayage rapide d'une ligne par ledit faisceau, et un second miroir dont l'axe est perpendicu- laire à l'axe d'oscillation dudit premier miroir. Selon un aspect de l'invention, ledit second miroir est animé d'un mouvement de balayage lent synchro- nisé avec le mouvement de balayage du premier miroir, l'incrément de déplacement de la tâche lumineuse - produite par la rencontre du faisceau lumineux avec le support solide sur le support solide, étant sensiblement de l'ordre de grandeur du diamètre de cette tâche lumi- neuse, ledit second miroir assurant le balayage de la sur- face totale du support à analyser par ledit faisceau, en lignes successives. Selon un autre aspect de l'invention, ledit second miroir est un miroir dichroïque fixe et le balayage de la surface totale du support à analyser par le faisceau- lumineux est assuré par une platine de translation portant ledit support et animée d'un mouvement de translation syn- chronisé avec le mouvement de balayage du premier miroir, et dont le pas est sensiblement de l'ordre de grandeur du diamètre de la tâche lumineuse produite sur le support.: Conformément à l'invention la source lumineuse est un faisceau laser. En variante, les moyens de balayage comprennent deux systèmes acoustooptiques, l'un des systèmes assurant le balayage par le faisceau lumineux, d'une ligne du support à analyser, le 4euxième système acousto-optique assurant le balayage de la surface totale dudit support, ledit deuxième système étant synchronisé avec le premier système. Le dispositif de détection des signaux de fluo- rescence émis par les particules marquées, comprend de manière connue au moins un filtre optique, au moins un photo-multiplicateur ou au moins un photodétecteur de conversion desdits signaux:lumineux et d'acheminement des signaux électriques correspondants vers un microprocesseur de traitement et de comptage, lequel traitement fournit des tracés. Conformément à l'invention, ledit microproces- seur de traitement est pourvu de moyens d'enregistrements simultanés des signaux électriques transmis par le disposi- tif de détection et le système de balayage, qui fournissent 15. la position d'une particule. La connaissaece de la position d'une particule donnée permet son identification par prélèvement direct ou autre méthode in situ. Cet enregistrement permet également le comptage individuel desdites particules. L'appareil selon l'invention est utilisé aussi bien pour la détection et la numération d'une seule sorte de particules marquées vivantes ou mortes, que de plusieurs sortes de particules marquées vivantes ou mortes; dans une telle utilisation, les particules sont marquées par des colorants d'identification différents, de sorte que les- dites particules réémettent une lumière fluorescente de longueur d'onde différente selon le colorant d'identification de départ.. La présente invention a également pour objet un procédé de détection et de numération de particules pré- sentes normalement, ou éventuellement contenues en tant que contaminants, dans un fluide liquide ou gazeux ou dans un produit, notamment alimentaire ou d'hygiène, caractérisé en ce que ledit produit ou fluide est tout d'abord, au cours d'une première étape, déposé sur un support approprié, en ce qu'au cours d'une deuxième étape, on réalise la détec- tion et le comptage individuel desdites particules naturel- lement fluorescentes ou rendues fluorescentes à l'aide d'un colorant approprié, par balayage de la surface dudit support qui porte lesdites particules, par un faisceau lumineux, et enregistrement des signaux de fluorescence émis par lesdites particules. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux, les particules à analyser sont déposées, au cours de la pre- mière étape, sur un support filtrant continu ou discontinu, notamment une membrane filtrante, par filtration de l'échantillon à analyser. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'étape de filtration est précédée d'une solubilisation de l'échantillon, ledit produit ou fluide étant mis sous forme appropriée à ladite filtration. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux, les particules à analyser sont déposées, au cours de la première étape, sur un support solide non filtrant continu ou discontinu, notamment une lame du type de celles utilisées en microscopie optique. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux, les particules sont rendues fluorescentes à l'aide d'un colorant approprié, préalablement à leur dép8t sur ledit support solide. Selon encore un mode de mise en oeuvre avanta- geux, les particules sont rendues fluorescentes in situ, c'est-à-dire sur le support solide. Comme moyen de marquage desdites particules, l'invention prévoit de faire application du procédé de mar- quage décrit dans une Demande de 'Brevet déposée en même temps que la présente Demande, au nom de la Demanderesse, pour autant qu'il concerne le marquage de micro-organismes par un colorant de viabilité positive. On entend par colorant de viabilité positive un colorant qui a la propriété de ne rendre fluorescentes que des particules vivantes. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le colorant est choisi dans le groupe qui comprend les colorants vitaux, les colorants de viabilité positive appropriés du type défini dans la demande de Brevet précitée et déposée en même temps et des substances fluorescentes portées par -des anticorps et/ou des sondes nucléiques. Selon une modalité avantageuse de ladite dispo- sition, lesdits anticorps sont choisis dans le groupé qui comprend les anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux, mono ou polyspécifiques, antilevures et/ou anti-bactéries et/ou anti-moisissures et/ou anti-parasites et/ou anti-virus et/ou anti-cellules animales et/ou anti-cellules végétales et les anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux, mono ou polygénériques anti-levures et/ou anti-bactéries et/ou anti-moisissures et/ou anti-parasites et/ou anti-virus et/ou anti-cellules animales et/ou anti-cellules végétales, notamment anti-pollen. Les particules à détecter sont choisies dans le groupe qui comprend les cellules animales ou végétales ou les micro-organismes, notamment les levures, les bactéries, les moisissures, les parasites et les virus, ainsi que les particules inorganiques telles que l'amiante. *À Le marquage desdites particules à l'aide de colorants a l'avantage de permettre: - la détection et la numération simultanée de particules de types différents et, - la différenciation des particules vivantes, mortes ou inorganiques. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mises en oeuvre du procédé conforme à l'invention et à une description détaillée de l'appareil de détection selon l'invention, avec référence aux dessins annexés, qul illustrent deux modes de réalisation d'un appareil conforme à l'invention et dans lesquels: - la figure 1 représente schématiquement un mode de réalisation d'.un appareil de détection de parti- cules marquées, conforme & l'invention, et dont les moyens de balayage comprennent deux miroirs oscillants, - la figure 2 représente schématiquement un autre mode de réalisation de l'appareil de détection de - particules marquées, conforme à l'invention et dont les moyens de balayage comprennent un miroir oscillant, un miroir dichroïque et une platine de translation, - la figure 3 représente des tracés obtenus avec le mode de réalisation décrit dans la figure 1, les particules étant des billes de latex fluorescentes, - la figure 4 représente des tracés obtenus avec le mode de réalisation selon la figure 1, les parti- cules étant des levures. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces' dessins et les parties descriptives correspondantes ainsi que les exemples, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Les appareils représentés aux figures 1 et 2 sont destinés à la détection et à la numération de parti- cules marquées, éventuellement présentes dans un fluide liquide ou gazeux ou un produit comme, par exemple, la détection et le comptage de levures vivantes dans du yaourt. La figure 1 représente un appareil de détection de particules vivantes, mortes ou inorganiques, conforme à l'invention et dont les moyens de balayage comprennent deux miroirs oscillants. Cet appareil comprend une source lumineuse 10, qui produit un faisceau lumineux 11, focalisé au moyen d'une lentille 12, des moyens de balayage comprenant un premier miroir 21 oscillant? et dont l'axe d'oscillation 22 est perpendiculaire à l'axe du faisceau lumineux, l'oscillation dudit premier miroir 21 étant assurée par un élément moteur 23, réalisé par exemple, mais non limitati- vement, sous la forme d'un galvanomètre; un deuxième miroir 31, dont l'axe de rotation 32 est perpendiculaire à l'axe d'oscillation dudit premier miroir 21, ledit second miroir 31 étant animé d'un mouvement angulaire par incré- ments au moyen d'un élément moteur 33, ledit mouvement étant synchronisé avec le mouvement de balayage du premier miroir 21. La combinaison des miroirs 21, 31 permet le balayage ligne par ligne de la surface totale du support solide 50 à analyser, par le faisceau lumineux 11. Le support 50 est, dans la réalisation repré- sentée, une membrane filtrante. Un fluide ou un produit, préalablement traité de manière appropriée, est filtré sur ledit support 50 puis le marquage des particules 60 présentes est effectué in" situ sur la membrane filtrante. Les particules 60, sont retenues en fonction de la dimension des pores de ladite membrane filtrante. Les particules 60 qui peuvent être'détectées et comptées sur la membrane filtrante peuvent être des cellules animales, des cellules végétales, notamment du pollen, des micro-organismes notamment des levures, des bactéries, des moisissures, des parasites ou des virus, ou des particules inorganiques telles que de l'amiante. Le marquage desdites particules 60 est avanta- geusement réalisé au moyen d'un colorant vital et/ou de viabilité et/ou un anticorps rendu fluorescent approprié et/ou une sonde nucléique rendue fluorescente appropriée, ledit marquage permettant la détection et la numération simultanée de particules de types différents, leur viabi- lité étant également évaluée par ledit marquage, lesdites particules réémettant de la lumière fluorescente visible à des longueurs d'ondes différentes, en fonction du colorant 2628530v et/ou de l'anticorps et/ou de la sonde nucléique marqués, utilisés. Dans ces conditions, on peut détecter les signaux de fluorescences émis par les particules au moyen d'un/de détecteurs de fluorescence 40, qui peuvent être notamment des photomultiplicateurs ou des photodiodes, convertissant les signaux lumineux en impulsions élec- triques. Un filtre optique 39 permet de sélectionner la gamme de longueurs d'ondes adéquats. Un microprocesseur de traitement 41 est pourvu de moyens d'enregistrements simultanés des signaux élec- triques transmis par le dispositif de détection 40 et le système de balayage 21,31, qui fournissent la position d'une particule. De bons résultats ont été obtenus lorsque la lentille 12 a une distance focale de 70 mm et est placée à cm de la source lumineuse 10 représentée par un laser, d'une longueur d'onde de 488 nm et dont le faisceau lumi- neux 11 à un diamètre initial de 650 pm, de manière à obte- nir une tâche lumineuse 13 d'un diamètre d'environ 140 pm sur le support 50. La fréquence d'oscillation du miroir 21 est.de Hertz, obtenue au moyen d'un déflecteur galvanomé- trique 23. L'incrément obtenu grace au miroir 31 est sen- siblement de l'ordre de grandeur du diamètre de la tâche lumineuse 13. Le support 50 est dans la réalisation représen- tée, une membrane filtrante d'un diamètre de 47 mm et dont un carré de coté X = 30 mm est exploré. La distance d entre la lentille 12 et le premier miroir oscillant 21 est de 10 mm; la distance D entre les deux miroirs oscillants est de 10 mm; la distance L entre le deuxième miroir oscillant 31 et le filtre 50 portant les particules 60 est de 50 mm. 10. Le photomultiplicateur 40 se trouve à 50 mm du support 50; un filtre optique 39 est interposé entre le support 50 et le photomultiplicateur 40. L'amplitude C de 5 - Le débattement du deuxième miroir est de (XL = X/2. L - la figure 2 représente un appareil de détec- tion de particules vivantes, mortes ou inorganiques, conforme & l'invention, et dont les moyens de balayage comprennent un miroir oscillant et un miroir dichroïque.. Cet appareil comprend une source lumineuse 10, identique à celle de l'appareil représenté sur la figure 1, ladite source étant située selon un axe parallèle au 15. support 50; dans ce mode de réalisation, les moyens de balayage comprennent un. miroir oscillant 21 du même type que celui décrit dans la figure 1, un miroir dichroXque fixe 35, réfléchissant totalement la lumière à une certaine longueur d'onde mais laissant passer au travers une lumière de longueur d'onde plus élevée telle que de la lumière fluorescente. Le balayage de la surface totale du support 50 à analyser par le faisceau lumineux 11,. est dans cette - réalisation, assuré par une platine de translation 51 portant ledit support 50, animée d'un mouvement de transla- tion, synchronisé avec le mouvement de balayage du miroir 21, et dont le pas est sensiblement de l'ordre de grandeur du diamètre de la tâche lumineuse 13. La focalisation du faisceau 11 est assurée par une lentille semicylindrique 36 dont la longueur est au moins égale à la longueur de la ligne à balayer sur le. support 50. Ledit mouvement de translation est assuré au moyen d'un moteur pas à pas 52. Le support 50 est, dans la'réalisation repré- sentée mais non exclusivement, une membrane filtrante. 1.1 Le produit ou fluide & analyser est traité, filtré et marqué comme décrit en référence à la figure 1. Ainsi, le faisceau lumineux 11 balaie toute la surface d'un carré inscrit dans le support à analyser. Les particules 60 marquées réémettent de la lumière fluorescente, qui est détectée au moyen du photo- multiplicateur 40, après passage par le filtre 39, ledit photomultiplicateur convertissant les signaux lumineux en impulsions électriques; les signaux électriques sont ensuite enregistrés et comptés et permettent de caractéri- ser et de compter les particules 60 présentes. L'installation selon la figure 1 a permis l'enregistrement de tracés représentés aux figures 3 et 4. La figure 3 représente le tracé obtenu pour des billes de latex fluorescentes de 3,2 pm. On a en abscisse la distance sur le filtre en mm et en ordonnée les diffé- rences de potentiel en volts proportionnelles à l'intensité de lumière émise par les particules. La figure 4 représente la détection de levures colorées au moyen d'un colorant de viabilité. Les levures vivantes provenant d'une culture pure sont déposées sur une membrane par filtration. Après un lavage rapide, une solution du colorant de viabilité appropriée à 45'C est mise en contact pendant 5 mn puis le colorant est éliminé par filtration, la membrane est lavée et ensuite montée dans l'appareil de détection conforme à l'invention. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ces modes de mises en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir & l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven- tion. REVENDICATIONS 1') Apparell de détection et de numération de particules, présentes normalement,'ou éventuellement conte- nues en tant que contaminants, dans un fluide liquide ou gazeux, ou dans un produit, notamment alimentaire:ou d'hygiène, par fluorimétrie, comprenant une source lumi- neuse (10), des moyens de focalisation (12) du faisceau issu de ladite source lumineuse, au moins un moyen de détection (40) de la lumière fluorescente émise par les particules (60) présentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre: - un support (50) pour collecter les particules naturellement fluorescentes ou rendues fluorescentes à l'aide d'au moins un colorant approprié, - des moyens de balayage (21,31,35) de la surface du support à analyser, par ledit faisceau lumineux, - et, au moins un moyen d'enregistrement (41) et de comptage desdits signaux de fluorescence. 2 ) Appareil selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le support (50) est un support filtrant, continu ou discontinu, notamment une membrane filtrante. 3') Appareil selon la revendication 1, caracté- risé en que le support (50) solide est un support non filtrant continu ou discontinu. 4') Appareil selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que les moyens de balayage comprennent un premier miroir oscillant (21) dont l'axe d'oscillation (22) est perpendiculaire à l'axe du faisceau lumineux (11), ledit premier miroir assurant le balayage rapide d'une ligne par ledit faisceau, et un second miroir (31) dont l'axe (32) est perpendiculaire à l'axe d'oscillation dudit premier miroir. ') Appareil selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit second miroir (32) est animé d'un mouvement de balayage lent synchronisé avec le mouvement de balayage du premier miroir, 2628530O l'incrément du déplacement de la tâche lumineuse (13) - produlte par la rencontre du faisceau lumineux (11) avec le support solide (50) - sur le support solide, étant sensiblement de l'ordre de grandeur du diamètre de cette tâche lumineuse, ledit second miroir (31) assurant le balayage de la surface totale du support à analyser par ledit faisceau, en lignes successives. 6') Appareil selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit second miroir (35) est un miroir dichroXque fixe, le balayage de la surface totale du support (50) à analyser par le faisceau lumineux (11) étant assuré par une platine de translation (51) portant ledit support, animée d'un mouve- ment de translation synchronisé avec le mouvement de balayage du premier miroir (21), et dont le pas est sensi- blement de l'ordre de grandeur du diamètre de la tâche lumineuse (13). 7) Appareil selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 6, caractérisé en ce que la source lumi- neuse (10) est un faisceau laser. 8') Appareil selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que les moyens de balayage comprennent deux systèmes acousto-optiques, l'un des systèmes assurant le balayage par le faisceau lumineux, d'une ligne du support à analyser, le deuxième système acousto-optique assurant le balayage de la surface totale dudit support, ledit deuxième système étant synchronisé avec le premier système. 9') Appareil selon, l'une quelconque des reven- dications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend un micro- processeur (41) de traitement pourvu de moyens d'enregistrements simultanés des signaux électriques trans- mis par le dispositif de détection (40) et le système de balayage (21, 31, 35), qui fournissent la position d'une particule. - 14 ') Procédé de détection et de numération de particules présentes normalement, ou éventuellement conte- nues en tant que contaminants, dans un fluide liquide ou gazeux ou dans un produit, notamment alimentaire ou d'hygiène, caractérisé en ce que ledit. fluide ou produit est tout d'abord, au cours d'une première étape, déposé sur un support approprié et en ce qu'au cours d'une deuxième étape, on réalise la détection et le comptage individuel desdites particules naturellement fluorescentes ou rendues lO fluorescentes à l'aide d'un colorant approprié, par balayage de la surface du support qui porte lesdites parti- cules, par un faisceau lumineux et enregistrement des signaux de fluorescence émis par lesdites particules. 11') Procédé selon la revendication 10, carac- térisé en ce que les particules à analyser sont déposées, au cours de la première étape, sur un support filtrant continu ou discontinu, notamment une membrane filtrante, par filtration de l'échantillon à analyser. 12') Procédé selon la revendication 11, carac- térisé en ce que l'étape de filtration est précédée d'une solubilisation de l'échantillon, ledit produit ou fluide étant mis sous forme appropriée à ladite filtration. 13') Procédé selon la revendication 10, carac- térisé en ce que les particules à analyser sont déposées, au cours de la première étape, sur un. support solide non filtrant continu ou discontinu, notamment une lame du type de celles utilisées en microscopie optique. 14') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 10 à 13, caractérisé en ce que les particules sont rendues fluorescentes à l'aide d'un colorant appro- prié, préalablement à leur dépôt sur ledit support solide. ') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 10 à 13, caractérisé en ce que les particules sont rendues fluorescentes in situ, c'est-à-dire sur le support solide. 16') Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 10 à 15, caractérisé en ce que le/les colorant(s) est/sont choisi(s) dans le groupe qui comprend les colo- rants vitaux, les colorants de viabilité positive et des substances fluorescentes portées par des anticorps et/ou des sondes nucléiques. 17') Procédé selon la revendication 16, carac- térisé en ce que lesdits anticorps sont choisis dans le groupe qui comprend les anticorps polyclonaux et/ou mono- 0lo clonaux, mono ou polyspécifiques, anti-levures et/ou anti- bactéries et/ou anti-moisissures et/ou anti-parasites et/ou- anti-virus etl/pu anti-cellules animales et/ou anti-cellules végétales et les anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux, mono ou polygénériques antilevures et/ou anti-bactéries et/ou anti-moisissures et/ou anti-parasites et/ou anti- virus et/ou anti-cellules animales et/ou anti-cellules végétales, notamment anti-pollen.