Brevet FR2627588A1 — publié le 19890825

La présente invention concerne, d'une manière générale, un nouveau procédé de dosage immunologique par déplacement d'une substance de structure hapténique. Dans la présente demande, on entend par "substance de structure hapténique ou encore "haptène" une substance incapable de susciter à elle seule la formation d'anticorps et pouvant réagir avec un anticorps et devenir immunogénique par couplage avec une autre molécule, telle qu'une protéine porteuse via un lien chimique covalent ou non. Plus précisément, la présente invention concerne un procédé de dosage immunologique par déplacement d'une substance de structure hapténique, dosage mettant en oeuvre - un traceur consistant en ladite substance conjuguée à un élément de marquage via un lien chimique covalent (c'est-à-dire que la substance n'est pas marquée directement) - des anticorps obtenus à partir de ladite substance rendue immuccénique par couplage à une protéine por teuse immuncgenique, comme la sérum albumine de bovin via un lien chimique covalent. Plus particulièrement, la présente invention concerne un nouveau procédé de dosage immunologique de l'oestradiol par déplacement. La présente invention concerne également un nouveau dérivé de l'oestradiol utile pour la préparation d'un traceur et d'anticorps nécessaires au dosage de l'oestradiol, un procédé de préparation dudit dérivé de l'oestradiol, les traceurs obtenus à l'aide de ce dérivé de l'oestradiol et les antigènes obtenus par couplage de ce dérivé avec une protéine porteuse. Enfin, la présente invention concerne les anticorps obtenus à l'aide de cet antigène. Les dosages par déplacement sont basés sur une compétition entre la substance hapténique à doser et la substance marquée (traceur), vis-Z-vis de l'anticorps. Après réaction, le complexe substance-anticorps est séparé de la substance libre. La mesure est effectuée sur le complexe ou sur la substance libre. Dans ces conditions et en présence d'une concentration limitante en anticorps, le signal mesuré diminue lorsque la concentration de la substance à doser augmente dans les conditions de mesure du complexe. Le traceur est en effet doté d'un élément de marquage qui permet de quantifier la réaction immunologique. Dans la présente demande par élément de marquage, on entend une molécule ou un groupe chimique détectable en lui-même comme une enzyme ou sur lequel un élément détectable est fixé, par exemple la tyramine (Tyr) représente l'élément de marquage et l'iode radioactif l'élément détectable. Celui-ci est fixé sur le noyau phénolique de la tyramine. De manière appropriée, l'élément détectable est en effet un isotope radioactif, notamment l'iode 125 et les dosages sont alors du type RIA (Radio-Immuno Assay). Dans ces conditions, on peut facilement estimer une quantité inconnue de la substance hapténique d'après le comptage radioactif du complexe haptène-anticorps, par comparaison avec une courbe-tdmoin établie précédemment en utilisant des quantités connues d'anticorps, de substance et de traceur. Comme élément de marquage détectable en luimême, on peut citer les enzymes, les dosages étant alors du type enzymatique tels que les dosages Elisa. On peut citer à titre-d'exemple comme dosages spécialement concernés par la présente invention, les dosages de stéroïdes, notamment les dosages des hormones telles que l'oestradiol et la testostérone. De tels dosages ont fait l'objet de dépôts de nombreux brevets, notamment s'agissant de l'oestra- diol et de la testostérone, on peut citer les brevets FR 2 393 009 et FR 2 250 745 respectivement. Le brevet 2 393 009 propose un dosage immunologique de l'oestradiol (E2) dans lequel le traceur consiste en l'oestradiol couplé à un élément de marquage qui est la tyrosine, l'élément détectable étant de l'iode radioactif fixé sur le noyau phénolique de la tyrosine. Ce couplage est réalisé via un bras carboxyméthyloxime (CMO) en position 6 de l'oestradiol. Dans ce dosage, l'immunogène, ayant servi à la préparation de l'anticorps, consiste en un conjugué E2-6-CMO-BSA, c'est-à-dire utilisant le même lien covalent CMO-pour le couplage de E2 à la protéine immunogénique. Cette fixation du lien chimique covalent CMO en position 6 de l'haptène revêt un intérêt en ce qu'elle préserve les fonctions hydroxyle en positions 3 et 17 de l'oestradiol qui sont les groupes spécifiques de reconnaissance qui permettent, en restant libres, d'obtenir des anticorps particulièrement spécifiques de l'oestradiol. Toutefois, on a découvert selon la présente invention qu'en utilisant pour le traceur le même type de lien CMO en position 6, cette fois pour fixer l'élé ment de marquage, comme c'est le cas dans le brevet FR 2 393 009, la sensibilité du dosage n'est pas satis faisant comme il sera explicité par les résultats com paratifs de l'exemple 5. Un but de la présente invention a donc été d'améliorer la sensibilité des dosages concernés par le domaine de l'invention. Les solutions apportées par l'invention visent à proposer d'une part, une position de dérivation sur ladite subs tance, du lien chimique covalent dans le conjugué anti génique, telle qu'elle n'affecte pas les sites spéci fiques de reconnaissance de ladite substance et que les anticorps obtenus présentent la meilleure affinité pour ladite substance, ceci signifiant que ces sites non seulement doivent rester libres, mais également si possible ne pas être encombrés par le lien fixé à trop grande proximité d'autre part, un traceur qui présente une affinité avec lesdits anticorps compatible avec celle du dosage de ladite substance, c'est-à-dire généralement similaire ou la plus proche possible de celle de ladite substance pour lesdits anticorps. Pour ce faire, la présente invention a en effet pour objet un premier procédé de dosage immunologique par déplacement d'une substance de structure hap ténique, caractérisé en ce que le traceur consiste en ladite substance conjuguée à un élément de marquage, via un premier lien chimique covalent et l'anticorps est obtenu par immunisation de la substance conjuguée à une protéine porteuse, via un second lien chimique covalent distinct du premier, mais fixé sur ladite substance en une même position de dérivation, ladite position n'affectant pas les groupes spécifiques de la substance. Comme il sera explicité plus loin, ce procédé permet d'obtenir une sensibilité de dosage optimum vraisemblablement en fonction des considérations théoriques suivantes. Les anticorps obtenus par immunisation d'une substance conjuguée à une protéine porteuse via un lien chimique covalent développent deux types de reconnaissances, à savoir une reconnaissance de la substance proprement dite et une reconnaissance dudit lien chimique. Si le traceur comprend un même lien chimique fixé à la substance sur la même position que l'immunogène qui a permis de préparer l'anticorps utilisé dans le dosage, le système immunitaire réagissant contre la totalité de ce qui lui est présenté, les anticorps obtenus présenteront une affinité plus élevée pour le traceur que pour ladite substance à doser puisque dans le cas du traceur la reconnaissance sera double (reconnaissance de ladite substance et reconnaissance du bras). Si le même lien chimique est fixé sur la substance, mais à une position de dérivation différente que dans l'immunogène ayant servi à la préparation de l'anticorps utilisé dans le dosage, la reconnaissance de la substance par les anticorps sera trop dissemblable de celle du traceur. Notamment, si on a recours à une position de dérivation sur le traceur qui affecte les sites spécifiques de reconnaissance de la substance, laissés libres sur l'immunogène pour obtenir des anticorps les plus spécifiques ; par exemple dans le cas où la substance est l'oestradiol : les positions 3 ou 17 de l'oestradiol pour le. traceur, avec un immunogène dérivé en position 6 des anticorps présenteront alors une affinité insuffisante pour le traceur par rapport à l'affinité pour l'antigène à doser. A plus forte raison, si le lien chimique est différent et fixé sur la substance à une position de dérivation trop éloignée, les perturbations liées à la différence de reconnaissance entre la substance à doser et le traceur seront accentuées. Selon une autre solution, la présente invention a pour objet un deuxième procédé de dosage immunologique par déplacement d'une substance de structure hapténique, caractérisé en ce que le traceur consiste en ladite substance conjuguée à un élément de marquage via un lien chimique covalent et l'anticorps est obtenu à partir d'un antigène consistanten ladite substance conjuguée à une protéine porteuse via le même lien chimique covalent fixé sur la substance à la même position de dérivation que dans le traceur, ladite position n'affectant pas les groupes spécifiques de ladite substance, et la fixation du lien sur ladite substance se faisant selon une configuration isomérique différente dans le traceur et l'antigène. Les solutions apportées par les deux procédés constituent un moyen terme pour aboutir dans les deux cas à un traceur dont l'affinité avec les anticorps soit a plus proche possible de celle de la substance à doser malgré le recours à un lien chimique pour la fixation de l'élément de marquage et ainsi obtenir une sensibilité optimum de dosage. Selon une autre solution, la présente invention a pour objet un troisième procédé de dosage immunologique par déplacement d'une substance hapténique, carac térisé en ce que les anticorps utilisés sont obtenus en immunisant les mêmes animaux en alternance avec des immunogènes différents, chaque immunogène consistant en ladite substance conjuguée à une protéine porteuse via un lien chimique covalent différent pour les deux immunogènes mais fixé sur ladite substance à la même position de dérivation de ladite substance dans les deux cas, ladite position n'affectant pas les groupes spécifiques de reconnaissance, le traceur-étant marqué via une position de dérivation n'affectant pas les groupes spécifiques de ladite substance. De cette manière, on ne présente à l'animal de façon constante que la partie de la molécule qui est intrinsèquement intéressante et on réduit considérablement la probabilité de développer des anticorps dirigés contre le lien chimique. Dans ces conditions, la nature du marquage du traceur n'intervient plus de manière aussi importante relativement à son affinité avec les anticorps pourvu que les sites spécifiques de reconnaissance soient préservés. Les trois procédés selon l'invention se trouvent parfaitement illustrés par leur application au cas où la substance à doser est l'oestradiol, bien que cette application ne soit absolument pas limitative. En effet, comme rappelé précédemment, les anticorps les plus spécifiques de l'oestradiol sont obtenus avec un immunogène présentant une dérivation en position 6 plutôt qu'en position 3 ou 17 de l'oestradiol. Les anticorps proposés sont le plus souvent préparés à l'aide du conjugué E2-6-CMO-BSA. L'anti E2-6-CMO-BSA peut être produit dans les animaux d'espèces différentes, telles que des lapins, des souris, des cobayes, des chèvres ou des moutons et les méthodes classiques de productions d'anticorps lui sont applicables, y compris celle de la génération d'anticorps monoclonaux. Cependant, le traceur proposé dans le brevet FR 2 393 009 présente le même bras CMO, il s'agit de l'E2-6-CMO-tyrosine marqué à l'iode radioactif. C'est pourquoi, la présente invention a également pour objet, en vue d'un procédé de dosage immunologique de l'oestradiol, selon l'invention, un nouveau dérivé de l'oestradiol E2-6-hémisuccinate (E2-6HS) de formule (Ij avec R = OH ou NHR' qui représente le reste d'un élément de marquage présentant une fonction amine ou le reste d'une protéine porteuse immunogénique. Ce type de dérivés peut être également utile à titre d'agents d'imagerie dans le cadre de diagnostics in vivo ou encore à titre d'agents thérapeutiques. Le dérivé de formule I avec R = OH est en effet utile pour fixer sur l'oestradiol un élément de marquage présentant une fonction amine libre, par l'intermédiaire d'un lien amide entre la fonction carboxyle terminale du groupe hémisuccinyl et la fonction amine de l'élément de marquage, pour réaliser un traceur. L'élément de marquage peut être unie enzyme dans le cadre d'un dosage enzymo-immunologique du type Elisa. L'élément de marquage peut également être un groupe chimique accepteur d'iode pour un dosage RIA. La présente invention a donc également pour objet un dérivé de l'oestradiol utile comme traceur dans le cadre d'un procédé de dosage immunologique de l'oestradiol conforme à l'invention, dérivé de formule II suivante formule dans laquelle NHR' représente le reste d'une enzyme ou un reste d'un acide aminé ou le reste d'un dérivé de ce dernier. Ces deux derniers étant accepteurs d'iode et étant marqués à l'iode 125 ou 131. Plus particulièrement, l'acide aminé ou son dérivé peuvent être choisis parmi l'histidine, la tyrosine, l'histidinol, l'histamine, la tyramine et le tyrosinate de méthyle marqués à l'iode 125 ou 131. Parmi les enzymes, on peut citer par exemple la S-galactosidase, la phosphatase alcaline, la peroxydase. Le dérivé E2-6HS de formule I est également utile pour fixer une protéine porteuse et réaliser un immunogène par l'intermédiaire d'un lien amide entre la fonction carboxyle terminale du groupe hémisuccinyl et les fonctions amines de la protéine porteuse. On peut citer comme protéine porteuse immunogénique des protéines telles que la sérum albumine de bovin (BSA), la sérum albumine humaine (HSA), la Y globuline humaine ou bovine, des polypeptides tels que la polylysine, le copolymère de poly-L-lysine-acide polyglutamique, des glycoprotéines tels que les lipopolysaccharides. On peut encore citer des protéines telles que l'hémocyanine de patelle (KLH), et la tyroglobuline porcine (Tg). Un autre objet de la présente invention est un procédé de préparation d'un dérivé de l'oestradiol de formule I, caractérisé en ce que 1) on protège les fonctions hydroxyles en positions 3 et 17 d'un dérivé E2-6-céto de formule III notamment par silylation, le réactif utilisé pouvant alors être le chlorure de t-butyldiméthylsilyle, avec lequel on obtient un rendement de protection d'environ 100 %. 2) on réduit la fonction 6-céto en hydroxyl. Cette réduction peut se faire par NaBH4, mais on obtient un meilleur rendement avec l'hydrure d'aluminium de diisobutyl 82,3 % au lieu de 43 %. 3) on fait réagir la fonction 60H avec l'anhydride succinique. 4) on déprotège les fonctions OH en positions 3 et 17. Dans l'étape de réduction de la fonction 6-céto en hydroxyl par NaBH4,on obtient uniquement l'isomère a (c'est-à-dire que la fonction hydroxyle se trouve située de l'autre côté du plan de la molécule par rapport à la fonction hydroxyle en 17). Lorsque le réducteur est l'hydrure de diisobutyl aluminium, on obtient deux isomères a et ss dans un rapport molaire a/ss de 2. Ces deux isomères peuvent être séparés par HPLC. On obtient ultérieurement donc deux isomères E2-6HS j. ou Dans le premier procédé de dosage de l'oestradiol, selon l'invention, lorsque le traceur est l'oes- tradiol conjugué à l'élément de marquage via un bras CMO en position 6 de I'oestradiol, l'anticorps est préparé à l'aide d'un immunogène comportant un bras hémisuccinyl en même position 6 de l'oestradiol dans une isomérie définie. Inversement, toujours dans le cas du premier procédé de dosage de l'oestradiol selon l'invention, le traceur peut être l'oestradiol conjugué à l'élément de marquage via un bras hémisuccinyl en position 6, selon une isomérie définie, l'anticorps étant préparé à l'aide d'un immunogène comportant un bras CMO en même position 6 de l'oestradiol. Selon le deuxième procédé de l'invention, appliqué à l'oestradiol, le traceur est l'oestradiol conjugué à l'élément de marquage via le lien hémisuccinate en position 6 selon une isomérie définie a ou ss et les anticorps sont préparés à l'aide d'un antigène comportant le même lien hémisuccinate en position 6 mais selon l'autre isomérie. Le dérivé de formule (I) dans laquelle R = OH peut être couplé à une protéine porteuse ou à un élément de marquage présentant une fonction amine libre, tel que mentionné précédemment, par un procédé utilisant la N-hydroxysuccinimide comme agent activateur de la fonction carboxyle terminale du groupe hémisuccinyl et le dicyclohexycarbodiimide comme agent de condensation avec une fonction amine de la protéine ou de l'élément de marquage. Des antigènes résultant du couplage d'un dérivé de formule (I) dans laquelle R = OH avec une protéine porteuse permettent le développement d'anticorps lorsqu'ils sont injectés chez l'animal en présence d'un adjuvant. La présente invention a donc également pour objet des anticorps utiles pour un dosage immunologique de l'oestradiol selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont préparés par inoculation à l'animal d'un conjugué résultant du couplage drun dérivé de formule I dans laquelle R = OH à une protéine porteuse par l'intermédiaire d'un lien amide entre la fonction carboxyle terminale du dérivé de l'oestradiol et une fonction amine de la protéine. Dans le troisième procédé de l'invention appliqué à l'oestradiol, l'immunisation peut être réalisée en alternance avec E2-6CMO-BSA ou E2-6HS-BSA, étant bien entendu qu'une autre protéine que la BSA peut être utilisée. Le traceur, dans ce procédé, peut être par exemple E2-6HS- Tyr ou E2-6CMO-Tyr ou encore le traceur direct E2, c'est-à-dire marqué sur le noyau aromatique en position 2 ou 4. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre. EXEMPLE 1 - PREPARATION DE E2-6 HEMISUCCINATE (isomère ss) - Matériel de départ : E2 - 6 céto (750 mg = 2,62 mmole) - Etape 1 1 : protection des fonctions - OH Nise en solution dans 3 1 de N,N diméthylformamide (distillé). . Addition de 1,166 mg imidazole (P.M. = 68,08 17,1 mmole). Addition de 1,174 mg t-butyldiméthysilylchloride (P.M. : 150,73 ; 7,8 mmole). . Addition de diéthylaminopyridine comme catalyseur. . Précipitation rapide. . Addition de 17 ml N,N diméthylformamide (distillé). Solution trouble. . Agitation 1 nuit à température ambiante sous N2. - Solution trouble. . Addition de 60 ml H2O. . 3 extractions par l'éther (3 x 60 ml). . Lavage de la phase éther par NaCl saturé (60 ml). . Evaporation de l'éther. . Purification sur silice (éluant : éther 1/hexane 1). . Evaporation solvant. . Pesée : 1,211 g (2,34 mmole). R = 89,2 %. Produit obtenu - Etape 2 : réduction de la cétone 2,17 mmole du produit de l'étape 1, 11 mmole de diisobutylaluminium hydride (solution 1 M dans du toluène). P.M. = 114,22 et 20 ml toluène distillé, à température comprise entre 0 C et 50C, sont agités .45 minutes. Addition de 40 ml méthanol distillé. . Agitation 1 nuit à température ambiante. Solution laiteuse. Filtration. . Evaporation solvant. . Passage sur colonne de silice (éluant : éther 6/hexane 4). Evaporation solvant. . Pesée = 1,034 mg (1,98 mmole), R = 91,6 %. . Séparation des isomères a et ss sur colonne de silice HPLC (éluant hexane 9/éther 1). Rapport des quantités d'isomères : 2,54 = a Produits obtenus R1 R2 &alpha; OH H ss H OH Etape 3 : formation de l'hémisuccinate On part de 292 mg de produit de l'étape 2 (562 moles, isomère ss) et 3,37 mmoles d'anhydride succinique et 5 ml pyridine distillée. . Addition de diéthylaminopyridine comme catalyseur. Agitation 2 jours à température ambiante sous N2. . pH amené à 3 par HCl 1 M. . Extraction à l'acétate d'éthyle (3 x 10 ml). . Evaporation. Dissolution dans l'éther. . Elimination du précipité par filtration. Passage sur colonne de silice (éluant = éther). . Evaporation solvant. . Pesée = 320 mg (546 moles). R = 97 %. Produit obtenu - EtaEe 4 : déprotection des fonctions - OH 546 moles du produit de l'étape 3 (isomère ss). 3,280 moles de tétrabutylammonium, fluoride (solu tion 1 M en tétrahydrofuranne) et 2 ml de tétrahydrofuranne sont agités 5 jours à tem pérature ambiante. . Addition de 2,180 moles de tétrabutylammonivm fluoride. Agitation 5 jours à température ambiante. Addition de 32 ml de NH4CL saturé. pH amené à 3 par HCL 1 M. . Extractions par CH2Cl2 (4 x 30 mlJ. . Récupération de la phase organique et rinçage par NaCl saturé (60 ml). . Elimination de la phase aqueuse et addition de MgSO4 à la phase organique. Filtration. Evaporation du solvant. . Passage sur colonne de silice (éluant : CH2Cl290 / CH3OH 10 / CH3COOH 0,05). . Evaporation du solvant. . Purification sur phase inverse C 18 (HPLC). . Eluant : CH3OH 58 / H20 42. Evaporation de solvant. R = 77 %. Produit obtenu EXEMPLE 2 - COUPLAGE DE DERIVE E2-6HS AVEC LA TYRAMINE 1) Activation de E2-6HS On a utilisé 500 g de E2-6HS (P.M. : 1,36 moles) 151 g N-hydroxysuccinimide (P.M. = 111,15 1,36 moles) 281 g 1,3- dicyclohe-xylcarbodimide (P.M. = 206,33 1;36 moles) 80 1 de N,N- diméthylformamide 1 nuit à température ambiante dilution 50 x par N,N- diméthylformamide 2) Marguage de tyramine 2,2 g tyramine (16 nmoles) dans 10 iil tampon borate - 0,1 M- pH 8,0 2 mCi Na125I 10 1 chloramine T (2 mg/ml) 60 secondes à température ambiante 10 iil Na2S205 (2 mg/ml) 3) CouElaqe Au milieu final obtenu après le marquage (étape 2), addition de 50 1 du milieu final obtenu à l'étape 1. 6 heures à température ambiante Purification sur HPLC (phase inverse = C18) EXEMPLE 3 : COUPLAGE DU DERIVE E2-6HS AVEC LA BSA 1) Activation de E2-6HS : Cf 1) exemple 2 2) Couplage : Addition de .sérumalbumine bovine à 0,15 ssmoles/ml H2O de façon à obtenir un rapport molaire initial E2-6HS =59 BSA agitation 1 nuit à 40C dialyse contre H2O détermination par mesure UV à 282 nm de la quantité de stéroïde par quantité de complexe (17 g stérolde/100 Ag complexe). EXEMPLE 4 : PREPARATION D'ANTICORPS A L'AIDE DU DERIVE E2-6HS-BSA. Immunisation de moutons à raison de 80 g équivalent stéroide, 1- fois par mois. Le produit étant au préalable émulsionné dans un volume égal d'adjuvant de Freund. Saignée : réalisée après 10 jours, à dater de l'immunisa tion. EXEMPLE 5 : COMPARAISON DES TRACEURS - SENSIBILITE DES DOSAGES. Comparaisons fournies 1. traceur 6CMO versus traceur 6HS 2. traceur "direct" versus traceur 6HS. Les comparaisons fournies ont été établies à l'aide d'anticorps obtenus avec E2-6CMO-BSA comme immunogène. 1) Description de la méthode utilisée pour tester les traceurs La concentration de l'antisérum est choisie de façon à obtenir une liaison de 30 % de la radioactivité totale mise dans le tube Cette concentration est déterminée en incubant différentes concentrations d'anticorps avec Une quan tité fixe de traceur (30.000 cpm). Après 2 h de réaction, le traceur lié par l'anticorps et le traceur libre sont séparés par addition de polyéthylèneglycol qui précipite le complexe formé, par l'association du traceur et de l'anticorps. Le surnageant est éliminé et le culot est compté. La sensibilité de l'essai est déterminée dans les conditions suivantes . addition de quantité fixe de traceur (30.000 cpm) addition de quantité variable de l'hormone à doser . addition de quantité fixe d'anticorps permettant de réaliser 30 % de fixation de la radioactivité totale en l'absence d'hormone non radioactive. L'addition de quantité croissante d'hormone non radioactive a pour effet de réduire la quantité de radioactivité liée. Ceci permet d'établir une courbe étalon sur laquelle nous pouvons extrapoler la concen tration d'hormone non radioactive qui permet d'inhiber 50 % de la liaison maximale. 2J Comparaison des traceurs E2-6CMO-Tyr et E2-6HS-Tyr (a) L'idée est de renforcer la sensibilité du dosage par compétition de E2 (radioimmunoassay) avec des anticorps obtenus par immunisation de E2-6CMO-BSA. Les premières expériences ont été réalisées en utili sant comme traceur E2-6CMO-Tyramine (l'iode étant fixé sur la tyramine). Dans ce cas, le bras du traceur est identique à celui de l'immunogène. Le système immunitaire réagissant contre la substance qui lui est présentée, les anticorps obtenus présentent une affinité plus élevée pour E2-6CMO que pour la substance à doser (E2). L'intérêt de l'utili sation de E2-6HS Tyramine (ou de E2-6HS-Histamine) réside dans le fait que, utilisant la même position de dérivation, le traceur est préparé avec un bras diffé rent de celui de l'immunogène (E2-6CMO-BSA). Dans ce cas, l'anticorps présente une affinité équivalente pour E2 et pour le traceur et l'essai présente une meilleure sensibilité. Les valeurs indiquées dans le tableau I corres pondent à des concentrations (pg/ml) de E2 extrapolées à 50 % d'inhibition de la fixation de traceur. La comparai son des 2 colonnes montre clairement le gain de sensibi lité réalisé avec le traceur E2-6HS a r (a). TABLEAU I Anticorps (*) E2-6CMO-Tyr E2-6HS-Tur(&alpha;) | M 81 ! 670 i 220 ! M 82 450 117 M 83 1.000 247 | M 85 ! > 1.000 ï 378 M 86 1 > 1.000 1 257 , | M 87 1 > 1 .000 j 345 ! | M 88 360 178 | M 89 ! > 1.000 ! 283 M 90 900 457 (*) les anticorps M081 à M090 provenaient de différents moutons. 3) Comparaison des traceurs E2 direct et E2-6HS-Tyr (&alpha;) Les expériences reproduites au tableau II ci après ont été réalisées avec une deuxième série d'anti corps, toujours immunisées avec du E2-6CMO BSA. Le tableau II produit la sensibilité déterminée à 50 % d'inhibition de la liaison du traceur (pg/ml). Tableau II i Traceur IAnticorn ≈ E2 (direct) (*) i E2-6HS-Tyr (=r I I ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~I I I I M1 81 ! 270 ! w 220 ! M1 82 I 160 , 117 i M1 mu 85 ≈ 450 1 378 i M1 86 ' 580 ! 257 I M1 87 1 580 1 345 i M1 89 1 500 ! 283 i M1 90 ! 725 I 457 (*) E2 est marqué sur le noyau aromatique en position 2 ou 4. (**) Les anticorps M181 à M190 provenaient de diffé rents moutons. On obtient donc de meilleurs résultats avec le traceur E2-6HS-Tyr d'isomérie a. 4) Comparaison des traceurs -E2-6HS-TYR a et ss Les expériences reproduites au tableau III ci après ont été réalisées avec une troisième série d'animaux toujours immunisés avec du E2-6CMO-BSA. Le tableau III reproduit la sensibilité déterminée à 50 % d'inhibition de la liaison du traveur (pg/ml) Anticorps &alpha; ss M 82" 144 163 M 83" 234 38 M 88" 95 376 M 27 194 60 M 21 80 . 78 M 29 51 19 La comparaison des deux colonnes indique qu'en moyenne l'isomère a donne de meilleurs résultats, bien que le meilleur résultat soit obtenu avec l'isomère REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage immunologique, par déplacement, d'une substance de structure hapténique, caractérisé en ce que le traceur consiste en ladite substance conjuguée à un élément de marquage via un premier lien chimique covalent et en ce que l'anticorps est obtenu par immunisation de ladite substance conjuguée à une protéine porteuse via un second lien chimique covalent distinct du premier, mais fixé à ladite substance sur la même position de dérivation que le premier, ladite position n'affectant pas les groupes spécifiques de reconnaissance de l'haptène. 2. Procédé de dosage immunologique, par déplacement, d'une substance de structure hapténique, caractérisé en ce que le traceur consiste en ladite substance conjuguée à un élément de marquage via un lien chimique covalent et les anticorps sont obtenus à partir d'un antigène consistant à ladite substance conjuguée à une protéine porteuse via le même lien chimique covalent fixé sur la substance tala même position de dérivation que dans le traceur, ladite position n'affectant pas les groupes spécifiques de ladite substance, et la fixation du lien sur ladite substance se faisant selon une configuration isomérique différente dans le traceur et l'antigène. 3. Procédé de dosage immunologique, par déplacement, d'une substance de structure hapténique, caractérisé en ce que les anticorps sont obtenus en immunisant les mêmes animaux en alternance avec des immunogènes différents, chacun consistant en ladite substance conjuguée à une protéine porteuse via un lien chimique covalent différent pour les deux immunogènes, mais fixé sur ladite substance à la même position de dérivation dans les deux cas, ladite position n'affectant pas les groupes spécifiques de ladite substance, et le traceur etant marqué via une position de dérivation n'affectant pas également les groupes spécifiques de ladite substance. 4. Procédé selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que la substance à doser est l'oestradiol. 5. Procédé selon les revendications 1 et 4, caractérisé en ce que le stéroïde est conjugué à un élément de marquage présentant une fonction amine libre, ou à une protéine porteuse respectivement, par l'intermédiaire d'un lien chimique covalent consistant en un bras hémisuccinate en position 6 de l'oestradiol selon une isomérie définie, selon la formule I suivante dans laquelle R représente NHR' qui est un reste de l'élément de marquage ou de la protéine porteuse. 6 . Procédé selon la revendication 5, caracté risé en ce que le traceur-est un dérivé de formule I dans laquelle R = NHR' et représente un reste d'un élément de mar quage et l'immunogène ayant servi à préparer l'anticorps ren ferme un bras CMO (carboxyméthyloxime) en même posi tion 6 de l'oestradiol. 7. Procédé selon la revendication 5, carac térisé en ce que l'immunogène ayant servi à préparer l'anticorps est un dérivé de formule I dans laquelle R = NHR' et repré sente un reste d'une protéine porteuse et le traceur est conjugué à l'élément de marquage via un bras CMO en position 6. 8. Procédé selon les revendications 2 et 4 caractérisé en ce que le traceur et l'immunogène sont conjugués à un élément de marquage présentant une fonction amine libre, ou à une protéine porteuse respectivement, par l'intermédiaire d'un lien chimique covalent consistant en un bras hémisuccinate en position 6 de l'oestradiol selon la formule I suivante dans laquelle R représente NHR' qui est un reste de l'élément de marquage ou de la protéine porteuse, le traceur et l'immunogène présentant une isomérie a et a différente pour chacun des deux. 9. Procédé selon les revendications 3 et 4, caractérisé en ce que le traceur et/ou un des immunogènes consistent en un conjugué comportant un élément de mar quag présentant une fonction amine libre ou une protéine porteuse, respectivement, par l'intermédiaire d'un lien chimique covalent consistant en un bras hémisuccinate en position 6 de l'oestradiol selon la formule I suivante dans laquelle R représente NHR' qui est un reste de l'élément de marquage ou de la protéine porteuse. 10. Procédé selon la revendication 9,carac- térisé en ce que les deux immunogènes ayant servi à préparer les anticorps renferment respectivement un bras CMO et HS en même position 6 de l'oestradiol. 11. A titre de produit nouveau utile notamment en vue d'un dosage immunologique de l'oestradiol selon l'une des revendications précédentes, un dérivé de formule I dans laquelle R = OH ou NHR' avec les signifi cations données précédemment, le dérivé ayant une isomérie en position 6 a ou R. 12. Produit selon la revendication 11, utile pour un dosage enzymo-immunologique selon l'une des revendications 5, 6, 8 et 9, caractérisé én ce que l'élément de marquage est une enzyme, notamment la B-galactosidase, la phosphatase alcaline ou la peroxydase. 13. Produit selon la revendication 11, utile pour un dosage radioimmunologique de l'oestradiol, selon l'une des revendications 5, 6, 8 et 9, caractérisé en ce que dans la formule I, R est un reste d'un acide aminé ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce reste étant un accepteur d'iode et étant marqué à l'iode 125 ou 131, notamment R peut être choisi parmi l'histidine, la tyrosine, l'histidinol, l'histamine, la tyramine et le tyrosinate de méthyle marqués à l'iode 125 ou 131. 14. Produit selon la revendication 11, utile en vue de la préparation d'anticorps pour un dosage immunologique de l'oestradiol, selon les revendications 5, 7, 8, 9 ou 10, caractérisé en ce que dans la formule I, R' représente un reste de protéine porteuse tel que la sérum albumine de bovin, la sérum albumine humaine, l'hémocyanine de patelle, la tyroglobuline porcine, la y globuline humaine ou bovine, des polypeptides tels que la polylysine, le copolymère de poly-L-lysine-acide polyglutamique, des glycoprotéines tels que les lipopolysaccharides. 15. Procédé de préparation d'un dérivé de l'oestradiol de formule I d'isomérie a ou ss dans laquelle R = OH, caractérisé en ce que :- 1) on protège les fonctions hydroxyles en positions 3 et 17 d'un dérivé E2-6-céto de formule (Il) notamment par silylation, le réactif utilisé dans le chlorure de t-butyldiméthylsilyl. 2) on réduit la fonction 6-céto en hydroxyl, cette réduction se faisant avec l'hydrure d'aluminium de diisobutyl et on sépare par HPLC les deux isomères a et S. 3) on fait réagir la fonction 6-OH avec l'anhydride succinique. 4) on déprotège les fonctions OH en positions 3 et 17. 16. Procédé de préparation d'un dérivé d'oestradiol de formule I dans laquelle R = NHR' et représente le reste d'un élément de marquage ou d'une protéine porteuse, procédé caractérisé en ce qu'on utilise comme agent activateur de la fonction carboxyle du dérivé d'oestradiol 6-hémisuccinyl, la N-hydroxysuccinimide et, comme agent de condensation avec la fonction amine de la protéine ou de l'élément de marquage, le dicyclohexylcarbodiimide. 17. Anticorps utilisés pour un dosage immuno logique de l'oestradiol selon l'une des revendications 5, 7, 8, 9 ou 10, caractérisés en ce qu'ils sort préparés par injections chez l'animal, en présence d'un adjuvant, d'un dérivé de formule I dans laquelle R = NHR' et représente le reste d'une protéine porteuse, le cas échéant en alternance avec un autre immunogène.