Brevet FR2630457A1 — publié le 19891027

Utilisation de l'acide para:amino-salicylique pour la stabilisation de l'activité enzymatique de la peroxydase en solution, agent stabilisant et solution stabilisée en comportant application. La présente invention concerne l'utilisation de l'acide para-aminosalicylique pour la stabilisation de l'activité enzymatique de la peroxydase en solution, agent stabilisant et solution stabilisée en comportant application. La peroxydase de raifort est un enzyme très fréquemment utilisé dans des tests diagnostiques basés sur les réactions enzymo-immunologiques. Parmi ceux-ci, nous pouvons citer les tests de grossesse et les tests pour la détection des anticorps anti-viraux, tels ceux du SIDA, de l'hépatite et de la rubéole. La peroxydase est instable sous forme diluée.-Ceci oblige le fabricant de tests à fournir l'enzyme sous forme liquide concentrée. A ce niveau, la stabilité de l'enzyme est habituellement acquise par sa solubilisation dans un milieu complexe, constitué essentiellement d'albumine d'origine bovine ou de sérum, dont la concentration peut se monter à 20 % du volume total du réactif. L'utilisateur est souvent obligé de pratiquer une dilution extemporanée de ce réactif, ce qui engendre des sources d'erreur et des coûts de réactifs supplémentaires. Il est donc avantageux de trouver des substances stabilisantes qui permettent de fournir la solution de peroxydase prédiluée, prête à l'emploi, ce qui, dans certains cas, oblige de travailler à un pH de l'ordre de 7 à 8. Diverses recherches ont été effectuées dans ce sens, se traduisant par le dépôt de brevets: - DE 3 509 238, par Boehringer Mannheim et - DE 3 511 327, également de Boehringer, préconisant l'incorporation de phénol ou d'amino-pyrine à une concentration supérieure ou égale à 0,005 %; - CH 4944/84 de Hoffman-La Roche revendiquant le 4-amino-antipyrine et - EP-A0 110 429 de Abbott préconisant l'acide anilino-8-naphtalène-sulfonique-1. Aucune de ces substances ne s'est révélée réellement satisfaisante. La présente invention a dont pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un nouvel agent de stabilisation de l'activité enzymatique de la peroxydase en solution, sous forme prête à l'emploi, même dans le cas o celle-ci doit être à un pH de l'ordre de 7 à 8, d'activité stabilisatrice accrue. La présente invention a également pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un tel agent stabilisant de. l'activité enzymatique de la peroxydase en solution que-ce soit à basse température, autour de 4 C, ou à la température ambiante, pendant au moins environ une dizaine de jours. Ces nouveaux problèmes techniques sont résolus pour la première fois par la presente invention. Il a en effet été découvert de manière totalement inattendue que l'acide para-amino-salicylique, en abrégé PASA, présente des propriétés stabilisatrices remarquables de l'activité enzymatique de la peroxydase en solution, et ceci, que ce soit à faible température (environ 4 C, température de stockage habituelle) ou à environ 37 C, et ce pendant au moins 10 jours. Ceci est totalement surprenant dans la mesure o l'un des dérivés de l'acide salicylique, à savoir l'acide 5-amino salicylique, est un substrat de réaction enzymatique de la peroxydase. De ce fait, rien n'incitait l'homme du métier à essayer de trouver dans les dérivés de l'acide salicylique un composé capable de stabiliser l'activité enzymatique de la peroxydase. En outre, et comme il sera montré à partir des exemples comparatifs suivants, d'autres dérivés de l'acide salicylique ont un effet stabilisant de l'activité enzymatique de la peroxydase pratiquement nul. L'invention concerne donc l'utilisation de l'acide para-amino-salicylique comme agent stabilisant de l'activité enzymatique de la peroxydase en solution. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne l'agent stabilisant lui-même contenant l'acide para-amino-salicylique. Selon une caractéristique avantageuse, la concentration en acide paraamino-salicylique est comprise entre environ'8 pg/ml et environ 1000 pg/ml de la solution d'agent stabilisant ou de la solution à stabiliser. Cet agent stabilisant peut contenir avantageusement l'acide para-aminosalicylique solubilisé par un tampon Tris ramené à un pH compris entre environ 7 et 8 par un acide de préférence choisi parmi l'acide acétique, l'acide succinique, l'acide borique et l'acide diéthyl-barbiturique. Cet agent stabilisant peut en outre contenir au moins 2 de sérum. La présente invention concerne enfin une solution de peroxydase stabilisée, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace de stabilisation-d'acide para-amino-salicylique. De preférence, cette quantité efficace de stabilisation est comprise entre environ 8pg et environ 1000l g par millilitre de la solution stabilisée. Cette solution de peroxydase stabilisée est de préférence dans un tampon Tris. Selon un mode de réalisation particulier, cette solution contient en outre au moins 2 % de sérum. Selon encore un autre mode de réalisation, cette solution de peroxydase stabilisée contient au moins 0,01 % en poids de CaCl2 et au moins 0,01 % en poids de MgCl2, 6H20. Selon une variante préférée, cette solution stabilisée est sous une forme prête à l'emploi avec une concentration en peroxydase égale ou inférieure à 50ug/ml de la solution totale. Enfin, l'invention concerne également le procédé de préparation de l'agent stabilisant et de la solution de peroxydase stabilisée, qui résultent directement, pour l'homme du métier, de ce qui précède ainsi que de la description qui va suivre. D'autres buts, caractéristiques et avantages apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative, qui va suivre, faite en référence aux exemples ci-après, donnés simplement à titre d'illustration, et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. EXEMPLE 1 Les acides 4-amino-salicylique, également dénommé para-amino-salicylique (ou PASA en abrégé), sulfo-salicylique et -nitro-salicylique ont été solubilisés à 2 mg/ml dans une solution 0,02 M Tris. Le pH a été ajusté à 8 par 0,025 M acide acétique et à 7 par 0,025 M acide succinique, sauf pour l'acide sulfo-salicylique, qui est acide. De la peroxydase de raifort a été dissoute dans ces milieux et les solutions gardées à 40 C et 37 C durant 11 jours. L'activité enzymatique résiduelle a été mesurée par introduction de 5Spl de chaque solution de 100/l d'un substrat de réaction enzymatique consistant en 0,4 mg d'ortho-phénylène-diamine base solubilisés dans 1 ml d'un tampon citrate-phosphate pH 5,3 contenant 0,02 % H202. Après 10 minutes d'incubation, la réaction colorée jaune a été stoppée par addition de 100 1p de 4N H2S04 et l'intensité de la coloration a été mesurée à D.0. 492 nm. Les résultats sont assemblés dans le tableau 1 suivant: TABLEAU 1 :. ..::: : Contrôle: Acide: Acide: : : acétique: succinique: :: pH 8,0: pH 7,0: :: 37 C : 4 C : 37 C: 4 C: 37 C: 4 C: : peroxydase contrôle: 1,29:2,17: 0,54: 2,16: 0,10:0,77: PASA (invention) : 1,66:2,42: 1,75: 2,05: 1,19:1,88: Solfo-salicylique: 1,13:2,20: 0,83: 2, 22: 0,15:1,50: : Nitro-salicylique: 0,24:1,88: 0,73: 2,02: 0,15:1,20: :- - - - - -- - - - -- --:- - - - - -- - - -- - - --:- - -- La supériorité de l'acide para-amino-salicylique (PASA) est particulièrement évidente à 4 C ou à 37 C et également lorsque le pH des solutions d'incubation est abaissé à 8 ou 7. Par contre, avec l'acide sulfo-salicylique ou l'acide 5-nitro-salicylique, aucune activité stabilisante significative par rapport au contrôle n'a pu être mise en évidence. EXEMPLE 2 La concentration optimale de l'acide para-amino-salicylique a été ensuite déterminée. De la peroxydase a été diluée dans un tampon Tris-acide diéthyl-barbiturique en présence de concentrations variées de PASA durant 9 jours à 4 C et 37 C. L'activité enzymatique résiduelle a été analysée comme dans l'exemple 1 et les résultats rapportés dans le tableau 2 suivant: TABLEAU 2 : 37 C: 4 C: -:..........: - -: - -: : Contrôle 0 PASA: 0,40: 2: : 8,8g/ml PASA: 0,79: 1,97: : 40,ug/ml PASA: 1,11: 2: : 200 pg/ml PASA: 1,52: 2: : 1000 pg/ml PASA: 1,65: 2: :. .. .......:....:: Il est clair d'après ces résultats que l'action stabilisatrice de la PASA a lieu à des concentrations aussi basses que 8/ug/ml mais atteint un optimum à partir de 200ug/ml. EXEMPLE 3 Une solution de peroxydase dans 0,6 % Tris a été rendue 0,4 % en acide borique et 0,05 % en PASA. Cette solution a été additionnée de 2 % de sérum de dindon, puis les diverses solutions incubées à 4 C et à 37 C durant 7 jours, après quoi une analyse de l'activité enzymatique résiduelle a été effectuée. Les résultats sont rapportés dans le tableau 3 suivant: TABLEAU 3 -- - - - - - - - - - ---------------...: - --- : Contrôle: Sérum: . ..:.....:. . ...:.....:..DTD: : 37 C: 4 C: 37 C: 4 C: ::: :: : 0,40: 1,38: 1,40: 1,59: :- - - - -: - - - - -: -- - - -: --: On voit que la stabilité de la solution peroxydasique est renforcée à 37 C par l'incorporation de sérum dans le milieu. EXEMPLE 4 L'acide anilino-8-naphtalène-sulfonique 1, le phénol, l'amino- pyrine et le 4-amino-antipyrine ont été appliqués selon les recommandations décrites dans les brevets et comparés à l'activité enzymatique de la peroxydase solubilisée dans un milieu NaCl 0,9 % tamponnée à pH 8,00 par Tris-acide acétique 0,05 M, contenant 5 % de sérum, 0,25 % de PASA et 0,1 % de CaCl2 anhydre et MgCl2 6H20. Le précipité formé a été éliminé par filtration avant l'ajout de l'enzyme. Les solutions ont été placées à-4 C et 37 C durant 7 jours puis analysées selon la méthode décrite dans l'exemple 1.- Les résultats sont donnés dans le tableau 4 suivant: TABLEAU 4 :INVENTION:: A R T A N T E R I E U R :--::-.........:-.....-.--------.-.----- - - -- - -- - ::: Amino-: Phénol: Anti-: A-8-N.S-1: : PASA:: pyrine:: pyrine: *: : -..,:. .. ..:::. ....:. ....:.....: : 37 C: 1,78:: 0,4: 0,0: 0,55: 1,1: : 4C: 1,73:: 1,5: 1,2: 1,40: 1,5: * A-8-N.S-1 = Acide anilino-8-napthalène-sulfonique 1 On peut constater que la stabilité obtenue par l'incorporation de PASA dans un milieu complexe est bien supérieure aux autres substances testées. Cette stabilité est déjà accrue à 4 C, alors qu'à cette température, le risque de dégradation de l'enzyme est limité. Par contre, la dégradation de l'enzyme à 37 C en présence de PASA n'a pas été observée, contrairement à ce qui se produit avec les substances de l'art antérieur. REVENDICATIONS 1. Utilisation de l'acide para-amino-salicylique pour la stabilisation de l'activité enzymatique de la peroxydase en solution. 2. Agent stabilisant de l'activité enzymatique de la peroxydase en solution, caractérisé en ce qu'il contient 'l'acide para-aminosalicylique. 3. Agent stabilisant selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient l'acide para-amino-salicylique en une quantité efficace de stabilisation de préférence comprise entre environ 8 ug/ml et environ 1000 g/ml de la solution d'agent stabilisant ou de la solution à stabiliser. 4. Agent stabilisant selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l'acide para-amino-salicylique est solubilisé par un tampon Tris ramené à un pH compris entre environ 7 à 8 par un acide de préférence choisi parmi l'acide acétique, l'acide succinique, l'acide borique et l'acide diéthyl-barbiturique. 5. Agent stabilisant selon les revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il contient en outre au moins 2 % de sérum. - 6. Solution de peroxydase stabilisée, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace de stabilisation d'acide para-aminosalicylique. 7. Solution de peroxydase stabilisée selon la revendication 6, caractérisée en ce que la quantité efficace de stabilisation est comprise entre environ 8 pg/ml et environ 1000 pg/ml de solution stabilisée. 8. Solution de peroxydase stabilisée selon l'une -des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que la solution 'de peroxydase stabilisée est dans un tampon Tris. 9. Solution de peroxydase stabilisée selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu'elle contient en outre 2 % de sérum. 10. Solution de peroxydase selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce qu'elle contient au moins 0,01 % en poids de CaC12 et au moins 0,01 % en poids de MgCl2, 6H20. 11. Solution de peroxydase selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisée en ce qu'elle est sous une forme prête à l'emploi avec une concentration en peroxydase égale ou inférieure à 50 ug/ml de la solution totale.