Brevet FR2632968A1 — publié le 19891222

La présente~ invention concerne un procédé de sélection de clones bactériens producteurs d'exopolysaccharides, ainsi que des clones obtenus par ce procédé. La production de polysaccharides exocellulaires existe chez de nombreuses- bactéries Gram+ et Gram-. Certains de ces polysaccharides ont été étudiés en détail en raison de leurs propriétés texturantes, telles que les xanthines de Xantomonas campestris ou de. leur implication dans des mécanismes de pathogénicité, notamment des polysaccharides de Salmonella typhimurium ou dans des mécanismes cariogènes, notamment des polysaccharides de Streptococcus mu tans. L'utilisation de souches mucoldes, c'est-à-dire productrice d'exopolysaccharide, dans l'industrie laitière, revêt un intérêt particulier puisque la production de polysaccharides par les ferments lactiques augmente la viscosité finale du produit. La Demanderesse a décrit dans la demande due brevet N" 88 02405 un procédé d'épaissement de produits du type "lait fermenté", notamment de yaourt, caractérisé en ce qu'on ajoute audit produit un ou des polysaccharide(s) produit(s) à partir de bactérie(s) lactique(s) utilisée(s) pour la fermentation du lait, notamment de l'espèce Streptococcus thermophilus et/ou Lactobacillus bulgaricus. En effet, les bactéries lactiques mises en culture produisent des polysaccharides exopolysaccharides excrétés dans le milieu. Et, il a été découvert que ces polysaccharides incorporés au yaourt lui confèrent une texture plus épaisse sans nuire à la qualité organoleptique. Outre l'ajout de polysaccharides dans un lait comme agent épaississant endogène, la nature -thérapeutique du polysaccharide peut également amener à rechercher une production. de celui-ci à grande échelle sur milieu de fermentation. La mise en oeuvre d'un procédé de production optimum de polysaccharides à partir de bactéries lactiques nécessite au préalable la sélection des souches bactériennes les plus productrices de polysaccharides. Tel est donc le but de la présente invention. L'état de la technique ne fait que peu de référence à ce type de procédé de sélection de souches bactériennes productrices de polysaccharides Les souches hyperproductrices de polysaccharides Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius ont été identifiées par la morphologie des colonies et le toucher filant à l'anse de platine (Niven et al., 1940, 1941, 1946 Forsen et al., 1973). Toutefois, la production des souches bactériennes de certaines espèces, notamment de Streptococcus thermophilus n'est pas suffisante pour permettre la distinction des clones mucotdes des clones non mucoides par ces techniques. En particulier, I'état de la technique ne fait pas mention de procédé de sélection de souches productrices de polysaccharides en ce qui concerne l'espèce -Streptococcus thermophilus. Il a été mis au point, selon la présente invention, un procédé suffisamment sensible pour détecter et sélectionner les clones bactériens producteurs d'exopolysaccharides même si celui-ci est produit en faible quantité. La présente invention a en effet pour objet un procédé de sélection de clones bactériens producteurs d'exopolysaccharides ou clones Muc+, caractérisé en ce qu'on ajoute à un milieu de croissance d'une souche bactérienne donnée dont on veut sélectionner les clones producteurs d'exopolysaccharides, un colorant cationique qui provoque la coloration de tous les clones, les clones Muc+ étant révélés par masquage de la coloration par le polysaccharide produit ultérieurement. Les colorants cationiques présentent une affinité pour les polysaccharides anioniques et neutres car ceux-ci développent des interactions ioniques avec les anions organiques ou inorganiques du milieu environnant. Additionné au milieu de croissance, un colorant cationique se fixe sur le peptidoglycane de paroi de la bactérie de telle sorte que les colonies se colorent. La production de polysaccharides recouvre les colonies Muc+ productrices et par masquage celles-ci apparaissent en blanc sur fond coloré et révèlent ainsi la présence des clones producteurs de polysaccharides. On peut citer en-particulier comme colorant cationique le rouge de ruthénium qui, introduit dans le milieu de croissance, fait apparaître une coloration rose foncé. Les colonies Muc+ masquent petit à petit cette coloration et apparaissent en blanc ou rose très clair du fait de la production de mucus. Le phénotype clonal blanc est donc corrélé à des colonies productrices de polysaccharides, le phénotype rose foncé étant corrélé à une absence de polysaccharides. Ce type de procédé de sélection de clones bactériens est particulièrement approprié pour sélectionner les clones producteurs d'exopolysaccharides de l'espèce Streptococcus thermophilus, celle-ci étant en effet faiblement productrice et nécessitant un procédé de sélection particulièrement sensible. Avantageusement, le milieu de sélection est un milieu solide constitué d'un lait gélosé supplémenté en extrait de levure, de préférence dans une concentration de 2,5- à 5 g/l et en présence de saccharose. De façon appropriée, le colorant cationique est-ajouté dans une concentration de 0,05 à 0,15 g/l. En particulier pour le rouge de ruthénium, une concentration de 0,08 g/l à 0,15 g/l est particulièrement adaptée. L'addition de- sel de pyruvate, notamment de pyruvate de sodium, au milieu de sélection, facilite encore la distinction entre les clones Muc+ et les clones Muc-, le diamètre des clones Muc+ étant augmenté. Un objet particulier de la présente invention est donc la sélection de clones de Streptococcus thermophilus producteurs de polysaccharides, le milieu de sélection préconisé étant un lait gélosé additionné de 10 g/l de saccharose et 200 mg/l de pyruvate de sodium avec comme colorant cationique du rouge de ruthénium à 0,08 g/I Bien entendu, les concentrations données sont des valeurs optimales pour une souche, non limitatives du cadre de protection de la présente invention. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre. La production de polysaccharides pour les souches de Streptococcus thermophilus n'étant pas suffisante pour permettre la distinction des clones mucoldes et non mucoldes par les techniques connues, plusieurs indicateurs colorés susceptibles de révéler la présence de clones producteurs ou hyperproducteurs de polysaccharides ont tout d'abord été testés. Dans un premier temps, on a en effet utilisé des colorants agissant comme indicateur de pH. La production d'acide lactique due à la croissance fait virer le milieu et les colonies se colorent de la même façon. La production secondaire de polysaccharides recouvre les colonies Muc et par masquage, celles-ci apparaissent en blanc sur fond coloré. EXE.NIPLE I : Colorants indicateurs de pH I) Bleu de bromothymol (BBT) Les souches sont cultivées sur milieu .N117+Saccharose (\I 17 TERZAGHI et SANDINE, 1975) et incubées à leur température optimale de croissance de 30"C pour les leuconostocs et Streptococcus salivarius et 42"C pour les souches de Streptococcus thermophilus. On a réalisé à partir de la même culture un dosage du polysaccharide par méthode colorimétrique des oses au phénol sulfurique (DUBOIS et al. 1956) et une observation du phénotype des colonies sur le mileu coloré. Les souches de références productrices sont L. mesenteroîdes (Le 163, Le 164), L. dextranicum (Le 169) et L. salivarius (SA 121). Les souches de références non productrices sont L. cremoris (Le 161, Le 162) et S. thermophilus NCDO 1611 (CNRZ 160). Les résultats du tableau 1 ci-après confirment l'hypothèse théorique sur les souches de références pour les espèces productrices une grande quantité de polysaccharides. Le test colqré n'est pas suffisamment sensible pour les souches des espèces qui, même hyperproductrices, ont un niveau de production faible. TABLEAU 1 Aspect des colonies sur milieu gélosé+BBT et production d'équivalents dextranes en milieu liquide. Production Aspect des exprimée colonies en équiva- (Phénotype Souche Genre Phenotype lent dex- réel) Espèce théorique trane (*) Le 16l L. cremoris tluc- 615-670 g Jaunes Le 162 630-597 g Le 163 L, mesenteroïdes Muc+ 10 mg Blanches Le 169 L. dextranicum iuc+ I0 mg Blanches SA 121 S. salivarius Muc+ 3 mg Blanches NCD01611 S. thermophilus Muc- 175i200Crg Jaunes S22(3) S. thermophilus - Muc+ 273-300Cig Jaunes 266-207pg * La méthode de dosage au phénol-sulfurique est étalonnée par une solution de dextrane-sulfate (Serva)-0 à 80 lig par échantillon-. Les valeurs des dosages de polysaccharides de S. thermophilus à 490 nm sont lues sur cette courbe étalon. Les résultats sont donc exprimés en pg de dextrane.Le polysaccharide de S. thermophilus n'étant pas un dextrane, on a adopté le terme "équivalent -dextrane" pour quantifier le dosage. 2) Autres colorants Pour replacer S. thermophilus dans un milieu plus proche de son milieu naturel, nous avons recherché les colonies .Nluc sur un lait gélosé supplémenté en extrait de ~ levure (2,5 ou 5g/l) en ajoutant les colorants à 0,08 g/l. Le pourpre de bromocrésol (BCP), le rouge de phénol et le BBT développent une coloration jaune en milieu acide. - La souche Le 169 apparaît blanche en présence de colorants essayés aux 2 taux d'extraits de levure. - La souche S22 reste colorée en jaune sur BBT et BCP ou transparente sur milieu au rouge de phénol. Ces colorants ajoutés dans un lait gélosé ne permettent pas la mise en évidence de secrétion chez la souche thermophile. Exemple 2 : Colorants cationiques : Rouge de ruthénium I) Etude de concentration Le test est réalisé sur lait gélosé à 2,5 g/l d'extrait de levure, en présence de saccharose (10 g/l). Le colorant est ajouté en concentrations variables de 0,01 à 0,08 g/l ( rouge de ruthénium (Fluka) réf. S;571). Après incubation une nuit à 30"C et stockage 24 h à 100C, les colonies de la souche Le 169 décolorent le milieu. Le colorant à rJ,rj8 g/l fortement dilué dans le mucus donne un aspectlegèrement rosé aux clones. De 0,01 à 0,04 g/l, les colonies du S. thermophilus S22 (déposé à la Collection de l'Institut Pasteur CNCM I-735) apparaissent rose pâle. A la concentration de 0,08 g/l une hétérogénéité existe dans la population : certains clones sont rose fonçé, les autres très clair ou rose clair bordé de blanc. Cette différenciation met en évidence des colonies Muc- (rose fonçé) et deys colonies Muc+ (rose clair). L'homogénéité constatée sur les autres boîtes était due à une concentration trop faible de colorant dans le milieu, le test n'est distinctif qu'à partir de 0,08 g/l. I) Production clonale sur boîte Plusieurs souches de Streptococcus thermophilus testées sur ce milieu montrent un comportement clonal différent. La souche KA68 est homogène, tous ses clones sont Muc+. La souche S22 est constituée de 2 types de clones dont la stabilité phénotypique est différente, le clone S22-17 estde type Muc+ stable au cours des sous-clonages. Le clone 522-14 ségrège en clones Muc+ et en clones Muc- sans qu'il soit possible d-e stabiliser l'un ou l'autre des phénotypes. Les colonies Muc+ sont circulaires, blanches, légèrement bombées, de diamètre I à 1,5 mm. Les colonies Mucsont rose foncé, circulaires, de diamètre inférieur à -l mm. 10 colonies de chacune des souches et types clonaux ont été prélevées et reprises en mélange dans de l'eau distillée. Ce surnageant a été traité et- dosé par colorimétrie. Les résultats de la production clonale sont donnés au tableau 2 ci-apres (on entend par production clona, la production moyenne des 10 colonies d'un même type de clone). Tableau 2 Production clonale de polysaccharides, exprimée en équivalent dextrane de bactéries récoltées sur un milieu solide. ombre de Production pour bactéries/ml i O7 cellules X 107 S22-14R 1,96 2,55 - 7,65 S22-14B 1,96 2,55 - 7,65 S22-14B 1,78 5,16 - 15,73 S22-17 2,93 7,10 - 30,06 KA68 1,64 7,19- 0,24 S22-14R: Clones rose foncé de la souche S22-14 S22-14B : Clones blanc de la souche S22-14 S22-17 . Clones blancs homogènes de la souche S22-17- KA68 :Clones blancs homogènes de la souche KA68 Les colonies rose foncé du clone S22-14 (S22-14R) ne sont pas productrices de polysaccharide. Si on fixe ce niveau à 1, on voit que les clones blancs S22-14 Muc+, S22-17 et KA68 produisent respectivement 3,5 5,8 et 7,ru7 fois le niveau basal. Le phénotype blanc sur milieu au rouge de ruthénium est donc corrélé à une production de polysaccharide et le phénotype rose foncé à une absence de production. Les clones KA68, S22-17 et S22-14 tous blancs ne se distinguent par aucun caractère colonial (forme, diamètre, couleur). 3) Nature du milieu solide et phénotype clonal On a cherché à adapter le milieu solide aux conditions optimales de production en milieu liquide, en ajoutant de l'acide lactique (20mu/1) ou du pyruvate de sodium (200 mg/l) au milieu de base (lait gélosé+Sac+rouge de ruthénium). Les souches ont été cultivées 6 h à 42"C sur milieu ST1 Lac (GANCEL, 1988) puis étalées par inondation sur les 3 milieux. Le pourcentage des différents phénotypes obtenus est donné dans le tableau 3 ci-après - Les clones S22-17 et KA68 sont stables du point de vue de leurs phénotypes sur les 3 milieux. - Les clones S22-14 blanc et S22-14 rose ségrègent sur le milieu de base et sur le milieu au pyruvate. L'addition de 20 mM/I d;acide lactique permet de stabiliser le phénotype en clones Muc+. Le pyruvate et l'acide lactique affectent la croissance des colonies de façon inverse. L'acide lactique réduit le diamètre à celui d'une tête d'épingle alors que le pyruvate permet d'obtenir des colonies de 2 mm lorsqu'elles sont de type Muc+, le diamètre des colonies- Muc- restant inchangé. Pourcentage des phénotypes clonaux sur différents milieux au rouge de ruthénium (%) . Diamètre moyen des colonies sur ces différents milieux (d). S22,-14R S22-14 B S22-17 KA68 base % 43 % 57% 37% 63 % 100% 100% Base + % 37-96 63% 73% 27% 100% 10096 pyruvate 1-1,5 2mm 1-1,5 Zmm 2mm 2mm Base + % 0 100% 0 100% 100% 100% lactate # Tête d' épingle L'addition de pyruvate au milieu de base facilite donc la distinction entre les clones Muc+ et les clones Muc-. 4) Nature du sucre et phénotype Un certain nombre de clones analysés pour lueur spectre de croissance ont montré que le phénotype coloré dépendait de la nature de la source de carbone (lactose, saccharose, glucose, fructose). 5) Conclusions Un clone de S. thermophilus producteur de polysaccharide peut être détecté spécifiquement sur milieu au rouge de ruthénium. La nature du milieu gélosé utilisé, la source de carbone ainsi que la concentration du colorant influent sur le phénotype des colonies. Un milieu que l'on peut préconiser pour un crible est - lait gélosé - saccharose 10 g/l - +pyruvate de sodium 200 mg/l - +rouge de ruthénium 0,08 g/l. Bibliographie Forsen R. Raunio-v. and Myllymaa R (1973). Studies on slime forming. group N Streptococcus strains. 1 Differentiation between -some lactic Streptococcus strains by polyacrylamide gel electrophoresis of soluble cell proteins. Acta Univ. Oul. A12, Biochem. 3,1-19 Niven C.F., Smiley K.L. and Sherman J.M. (1940). The production of large amount of a polysaccharide by S. salivarius J. Bacteriol., 41, 479-484 Niven C.F., Smiley K.L., Sherman J.M. (1941). The polysaccharides synthesized by S. salivarius and S. bovis, Journal of Biological Chemistry, 140, 105-109. Niven C.F., Z.Kiziuta, and J.C.White, (194-6). Synthesis. of a polysaccharide from sucrose by Streptococcus S.B.E., J.Bacteriol., 51, 711-716. Terzaghi B. and Sandine N. (1975). An improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Applied and Environmental Microbiology, 29, 807-813. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J*K. Rebers P.A., Smith F. (1956). Analytical Chemistry, 28, 350-356. Gancel F. (1988). Métabolisme de production des polysaccharides chez S. thermophilus. Thèse de l'Université de Caen. REVENDICATIONS 1. Procédé de sélection de clones bactériens producteurs d'exopolysaccharides ou Muc+, caractérisé en ce qu'on ajoute un colorant cationique à un milieu de culture d'une souche bactérienne donnée dont on veut sélectionner les clones Muc+, ceux-ci étant révélés par masquage de la coloration desdits clones. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute du rouge de ruthénium, le phénotype clonal blanc étant corrélé à une production de polysaccharides, le phénotype rose à une absence de production. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la bactérie est une bactérie lactique. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la bactérie est de l'espèce Streptococcus thermophilus, 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le colorant est ajouté dans un milieu de croissance solide. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le milieu de croissance est un lait gélosé supplémenté en extrait de levure dans une concentration de 2,5 à 5 g/l. 7. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que le milieu de croissance comporte l'addition d'un sucre. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu de croissance comporte du saccharose. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu de culture est additionné de sel de pyruvate. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on détecte un clone de Streptococcus thermophilus, le milieu de culture comprenant du lait gélosé, du saccharose à 10 g/l" et du pyruvate de sodium à 200 mg/l, avec du rouge de ruthénium dans une concentration de 0,08 à 0,15 g/l.