Brevet FR2634218A1 — publié le 19900119

La production du mélange de butanol et d'acétone (dite encore production de solvants) par fermentation est connue depuis longtemps et a été mise en oeuvre industriellement à partir de substrats amylacés tels que le mais ou sucriers tels que les mélasses. Dans ce dernier cas la capacité des souches de Clostridium solvantogènes à hydrolyser le saccharose constitue fréquemment une limitation de la performance de production de solvants. Avec certaines souches, la fermentation exige même que l'on effectue préalablement une hydrolyse complète (inversion) du saccharose de la mélasse en glucose et en o10 fructose (sucre inverti) comme rapporté par exemple dans le brevet US n0 2123078 ou par Beesch, S.C. (1952). Acetone-butanol fermentation on sugars, Ind. Eng. Chem., 44, 1677-1682. La présente invention concerne un procédé de fermentation des mélasses de canne à sucre en butanol et en acétone. Ces mélasses contiennent à la fois du saccharose et du sucre inverti. Le procédé de l'invention permet une bonne conversion des sucres et une concentration de solvants élevée sans avoir recours à l'inversion du saccharose de la mélasse. Ce procédé, qui met en oeuvre une souche- de Clostridium saccharolytique productrice de solvants dans un milieu réactionnel contenant comme substrat sucré une mélasse de canne, est caractérisé en ce que: a/ on fournit au.départ à ladite souche un milieu réactionnel contenant ladite mélasse à une concentration comprise entre O et 20 g de sucres totaux (saccharose plus sucre inverti), par litre du lO milieu réactionnel initial. b/ on laisse la concentration en sucre inverti (qui représente entre et 30 % en poids des sucres totaux de la mélasse) diminuer jusqu'à une valeur comprise entre O et 2 g par litre de milieu réactionnel initial. c/ on alimente ladite souche en ladite mélasse à un débit compris entre 1 et 5 g de sucres totaux par litre de milieu réactionnel initial et par heure et tel que la concentration résiduelle en sucre inverti pendant la durée d'alimentation est au plus égale à 4 g par litre du milieu réactionnel initial et d/ on récupère le mélange de solvants ainsi obtenu. Par mélange de solvants on entend un mélange comprenant habituel- lement en poids entre 60.et 75 % de n-butanol, 25 à 40 % d'acétone et, en général, une quantité faible, habituellement inférieure à 1 d'éthanol. On peut utiliser avantageusement une souche de Clostridium choisie parmi les souches saccharolytiques appartenant aux espèces productrices de solvants correspondant aux espèces Clostridium acetobutylicum et Clostridium beijerinckii. Le demandeur a constaté qu'avec de telles souches, cultivées dans des conditions de fermentation conventionnelles, c'est-à-dire lorsque la quantité totale de mélasse fournie est présente dès le départ, la production de solvants est plus faible lorsque la mélasse est fournie sans inversion préalable du saccharose que lorsqu'elle est préalablement invertie par exemple par voie enzymatique par action d'une inulase ou d'une invertase, en accord avec les données de l'art antérieur déjà cité. Avec le procédé de l'invention des performances de production de solvants supérieures à celle d'une fermentation classique sont obtenues avec des mélasses non inverties et les résultats se rapprochent alors de ceux obtenus en fermentation conventionnelle avec dès mélasses inverties. On a observé d'excellents résultats en opérant de préférence avec la souche Clostridium beijerinckii NRRL B-592 (anciennement connue sous le nom de Clostridium butylicum NRRL B-592), de la collection du Northern Utilization Research and Development Division, US Depàrtment of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. Les conditions de fermentation habituelles sont décrites ci-dessous. Un bon niveau d'activité a été obtenu à une température comprise entre 25 et 38 C et on observe d'excellents niveaux d'activité à une température comprise entre 32 et 35 C. De façon connue de l'homme du métier, la fermentation acétono-butylique comporte une phase d'acidogénése (production d'acides acétique et butyrique) se traduisant par une chute initiale du pH jusqu'à un niveau minimal auquel il est maintenu par injection d'ammoniaque au cours de la fermentation. Alternativement, cette chute de pH peut être limitée par l'incorporation préalable au milieu réactionnel d'un tampon tel que le carbonate de calcium. Cette première phase de la fermentation est suivie d'une phase de solvantogénèse au cours de laquelle les acides produits sont partiellement reconsommés, ceci se traduisant par une légère remontée du pH. Un bon niveau d'activité a été obtenu en maintenant le pH dans un intervalle de 5,0 à 6,8; on observe d'excellents niveaux d'activité à un pH de 5,2 à 6,1. La fermentation s'effectue dans des conditions d'anaérobiose et dans des conditions de stérilité rigoureuses. On agite généralement le milieu par des moyens mécaniques connus. Le milieu réactionnel contient habituellement une source d'azote minéral sous forme d'ions ammonium, par exemple du sulfate d'ammonium ou de l'ammoniaque. Un apport d'azote organique sous forme d'aminoacides provenant par exemple de l'extrait de levure ou de la liqueur de macération de mais est avantageusement effectué. L'addition d'ions potassium sous forme de phosphate peut améliorer la croissance. Le milieu réactionnel comprend comme substrat sucré de la mélasse de canne à sucre non invertie. Les sucres contenus dans cette mélasse sont, en général, sous la forme d'un disaccharide, le saccharose, habituellement à raison de 70 à 80 % en poids des sucres totaux et de monosaccharides, le glucose et le fructose (sucre inverti) à raison de à 30 % en poids des sucres totaux. La concentration en sucres totaux présents initialement est avantageusement comprise entre 0 et 20 g par litre de milieu réactionnel initial et de manière préférée comprise entre 5 et 15 g par litre de milieu réactionnel initial. Selon une caractéristique du procédé selon l'invention, on laisse diminuer la concentration en sucre inverti (glucose plus fructose) du fait de l'activité métabolique de la souche et de son développement cellulaire jusqu'à une valeur avantageusement comprise entre O et 2 g par litre de milieu réactionnel initial et de préférence comprise entre O et 1 g par litre de milieu réactionnel initial. Lorsque cette concentration résiduelle en sucre inverti est atteinte, on fait démarrer l'alimentation en substrat sucré. De bons résultats de production de solvants ont été obtenus lorsque le débit d'alimentation est avantageusement compris entre 1 et 5 g de sucres totaux par litre de milieu réactionnel initial et par heure. Avec un débit d'alimentation préféré de 2 à 3,2 g de sucres totaux par litre de milieu réactionnel initial et par heure, on obtient une augmentation notable de la production de solvants par rapport.à l'art antérieur. Le maintien d'une concentration faible ou nulle en sucre inverti pendant la fermentation est, selon l'expérience du demandeur, une condition inattendue mais essentielle d'une bonne production de solvant. On a cependant constaté que des débits d'alimentation en mélasse plus faibles que ceux indiqués pouvaient conduire à une augmentation de la production d'acides au détriment de celles de solvants. Le débit d'alimentation peut, soit être maintenu constant pendant toute la durée de l'alimentation, soit varier de façon continue ou discontinue dans les limites décrites ci-dessus. Un mar d'alimen- tation utilisable consiste à asservir le débit du substrat sucré à la vitesse de Gégagement gazeux de la fermentation. Cette façon d'opérer est possible lorsqu'un dispositif d'enregistrement automatique du débit gazeux tel que décrit dans l'exemple 1 est mis en oeuvre. Dans le cas de l'asservissement du débit du substrat à la vitesse de dégagement gazeux, le débit de sucre utilisé est, en général, compris entre 2,5 et 3 g de sucres totaux par litre de gaz produit. L'alimentation en mélasse peut durer de 20 à 100 heures et avantageusement de 35 à 45 heures. Avantageusement, l'alimentation en substrat sucré est -ctuée à partir d'un réservoir de stockage dans lequel la concentration en substrat est élevée, ce qui minimise les volumes réactionnels. Dans les conditions citées' ci-dessus, on a observé des durées de fermentation n'excédant pas 4 jours avec d'excellents -niveaux 'de production en solvants (acétone et butanol) et une production d'acides plus faible. Cette durée est avantageusement comprise entre 40 et 50 heures. Les apports globaux en substrat sucré sont généralement compris entre 80 et 130 g par litre de milieu réactionnel initial. Les exemples présentés ci-dessous illustrent les avantages du procédé de l'invention par rapport à une fermentation conduite selon l'art antérieur. Ces avantages sont notamment une concentration finale en solvants accrue, qui correspond à une meilleure consommation des sucres, et une durée de fermentation plus courte. Ces deux éléments concourent à l'obtention d'une meilleure productivité de la synthèse de solvants exprimée en g de solvants produits par litre de milieu réactionnel final et par heure. En outre, le procédé conduit également à une concentration plus faible en acides résiduels. Exemple 1: Fermentation avec alimentation en mélasse de canne à sucre avec la souche de Clostridium beijerinckii NRRL B-592. Cet exemple décrit une fermentation selon l'invention, c'est-à-dire que la souche de Clostridium beijerinckii NRRL B-592 est ensemencée sur un milieu à faible concentration en sucres de manière à minimiser la concentration en sucre inverti. La mélasse de canne à sucre est ensuite injectée au cours du temps à vitesse constante. Le milieu de fermentation est le suivant: * Sucres totaux provenant de la: 10 g/1 (dont 7,5 g de saccharose et mélasse de canne à sucre 2,5 g de glucose et fructose) e Extrait de levure:............ 0,8 g/1 * KH2PO4: .. ........K 00,8 g/l À (NH4)2SO4.6g/ e (NH 4)2 S04: ............ 1,6-9/1 2,3 litres de ce milieu sont placés dans un fermenteur de laboratoire de 6 litres et l'ensemble est stérilisé pendant 40 minutes à 110 C dans un autoclave, puis après refroidissement à 35 C sous courant d'azote, le pH est ajusté à 6,2 par addition d'ammoniaque à 10 v (poios/volume). Ce milieu est alors ensemencé sous anaérobiose avec..DTD: une préculture de la souche NRRL B-592. La chaîne d'ensemencement est la suivante: un tube de 10 ml du milieu constitué par: a Sucres totaux: 30 g/l a Extrait de levure: 0,5 g/1 e KH2PO4: 0,5 g/l e (NH4)2S04: 3 g/l e CaCO3: 5 g/l est ensemencé à partir d'un tube de conservation de la souche NRRL B-592. Cette culture en tube est réalisée sous anaérobiose pendant 24 heures. Elle permet d'ensemencer une fiole d'erlenmeyer contenant ml du même milieu que ci-dessus. Cette fiole est incubée à 34 C pendant 18 heures. On en verse le contenu stérilement dans lés 2,3 litres de milieu de fermentation décrit plus haut (d'o un volume de milieu réactionnel initial de 2,5 litres). La fermentation acétono-butylique produit un dégagement gazeux composé de C02 et H2. Ce dégagement est mesuré en reliant une sortie du fermenteur à un compteur à gaz volumétrique. Les volumes de gaz mesurés par le compteur sont enregistrés par un microordinateur qui calcule les débits gazeux instantanés. Le pH est également mesuré en permanence et régulé au moyen d'un pH-mètre régulateur, par apport d'ammoniaque à 10 % à pH 5,5. L'ammoniaque est injecté par l'intermédiaire d'une électrovanne reliée au pH-mètre et constitue à la fois le moyen de régulation et l'apport principal d'azote nécessaire à la croissance de la souche NRRL B-592. Les sucres totaux à l'ensemencement sont de 10 g/1 composé de 7,5 g/l de saccharose et 2,5 g/1 de sucres invertis (glucose et fructose). Quand la valeur de sucres sous forme invertie atteint zéro après 4 heures de réaction, on débute l'injection en continu au moyen d'une pompe péristaltique à un débit de 44 ml/h d'une solution de mélasse à 1.70 g/1 de sucres totaux, soit un débit d'alimentation horaire de 7,48 g de sucres totaux ou encore de 3 g de sucres totaux par litre de milieu réactionnel initial. Ce débit permet de se trouver à tout moment à une concentration résiduelle maximale en sucres invertis.inférieure à 4 g/1.. Ce débit est fixe pendant toute la durée de l'injection. Après ensemencement, le pH baisse rapidement jusqu'à la valeur de régulation de 5,5 atteinte après 4 heures de réaction. L'injection d'ammoniaque à 10 % débute automatiquement afin de maintenir le pI à cette valeur jusqu'à la 18ème heure de réaction, puis remonte jusqu'à la valeur 5,8-5,9 conservée jusqu'à la fin de la réaction. Parallèlement, le dégagement gazeux débute 2 heures après l'ense- mencement du milieu de fermentation. La vitesse du dégagement gazeux augmente et atteint un maximum de 4 1/h entre 24 et 30 heures de réaction puis décroît progressivement jusqu'à la fin de la réaction. La production totale de gaz est de 100 litres. Penoant cette fermentation on a injecté 1,5 litre de la solution de mélasse de canne à sucre à 170 g/l de sucres totaux, soit 255 g de sucres totaux. A la fin ce la fermentation qui dure 48 heures, les sucres résiduels s'élèvent à 1,7 g par litre de milieu réactionnel 25.final et sont constitués uniquement par du saccharose. La concentration finale en acétone est de 6,1 g par litre de milieu réactionnel final, celle en n-butanol est de 14,4 g par litre de milieu réactionnel final, la production totale de solvants étant donc de 20,5 g par litre de milieu réactionnel final. La production finale en acides totaux est de 1,6 g par litre de milieu réactionnel final (dont 1,0 g d'acide acétique et 0,6 g d'acide butyrique par litre de milieu réactionnel final). Les solvants produits, butanol et acétone sont récupérés de façon connue par distillation. - Cet exemple montre que, en cultivant la souche NRRL B-592 sous condition d'alimentation en mélasse de canne à sucre: a les concentrations finales en solvants et en acides sont respecti- vement de 20,5 et 1,6 g par litre de milieu réactionnel final, e la quasi totalité des sucres fournis est consommée, e,la productivité en solvants totaux est de 0,43 g par litre et par heure. Exemple 2: Comparatif Selon l'art antérieur, on a procédé à une fermentation convention- nelle (c'est-à-dire avec apport de substrat sucré réalisé en totalité au temps zéro) avec la souche de Clostridium beijerinckii NRRL B-592. Le milieu de fermentation est le suivant: À Sucres totaux provenant de la: 59,4 g/l (dont 40 g/l de saccharose mélasse de canne à sucre et 20 9/l de sucre inverti) * Extrait de levure:............ 0,5 g/l KH2P04:.............P 0,5 9/1 À (NH4)2PO4: ............ 1 9/1 Le milieu est préparé de la façon décrite dans l'exemple 1. La chaine d'ensemencement est identique à ce qui est décrit dans l'exemple 1. On constate que: 26 3 4218 e le pH descend à la valeur 5,5 dans les 6 premières heures de la fermentation, il est maintenu à cette valeur par régulation à l'ammoniaque à 10 % et remonte à partir de la 18ème heure, e le volume des gaz produits est de 74 litres, la vitesse de dégage- ment gazeux présente un profil particulier avec 2 maxima: un de 2,4 1/h après 22. heures de réaction, l'autre de 2 1/h après 34 heures de réaction, io e la durée de la fermentation est de 70 heures, e la production totale de solvants est de 15,6 g par litre de milieu réactionnel final (dont 3,6 g/l d'acétone et 12 g/l de n-butanol), e la production d'acides est de 4, 8 g par litre de milieu réactionnel final. Cet Exemple montre que en utilisant la souche NRRL B-592 selon l'art -néêrieur sur mélasse de canne à sucre: a les ccr-::rations finales en solvants et en acides sont respective- ment de 15,6 et 4,8 g par litre de milieu réactionnel final, e tous les sucres fournis ne sont pas consommés, il reste en effet 13 g/l de sucres constitués par du saccharose, e la productivité en solvants totaux est de 0,22 g par litre et par heure. il R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé de production d'un mélange de butanol et d'acétone ou -de butanol,..d'acétone et d'éthanol par- fermentation d'un milieu réactionnel contenant de la mélasse de canne à sur-e en présence d'au moins une souche de Clostridium saccharolytique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes: a/ on fournit à la souche une concentration initiale en mélasse comprise entre 0 et 20 grammes de sucres totaux (saccharose plus sucre inverti) par litre de milieu réactionnel initial, b/ on laisse la concentration en sucre inverti, qui représente entre 20 et 30 % en poids des sucres totaux de la mélasse, diminuer jusqu'à une valeur comprise entre 0 et 2 grammes par litre de milieu réactionnel initial, c/ on alimente la souche en mélasse à un débit compris entre 1 et 5 grammes de sucres totaux par litre de milieu réactionnel initial et par heure et tel que la concentration résiduelle en sucre inverti pendant la durée de l'alimentation en mélasse est au plus égale à 4 grammes par litre de milieu réactionnel initial, et d/ on récupère un mélange de butanol et d'acétone ou de butanol, d'acétone et d'éthanol ainsi produit. 2. Procédé selon la revendiction 1 caractérisé en ce que,dans l'étape a/, la concentration en sucres totaux présents initialement est comprise entre 5 et 15 grammes par litre de milieu réactionnel initial. 263 4218 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que, dans l'étape b/, on laisse la concentration en sucre inverti diminuer jusqu'à une valeur comprise entre 0 et 1 gramme par litre de milieu réactionnel initial. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que, dans l'étape c/, le débit d'alimentation en mélasse est compris entre 2 et 3,2 grammes de sucres totaux par litre de milieu réactionnel initial et par heure. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que, dans l'étape d/', on récupère un mélange contenant en poids 60 à 75 % de butanol et 25 à 40 % d'acétone. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ladite souche de Clostridium est choisie dans le groupe formé par les souches saccharolytiques de l'espèce Clostridium acetobutylicum et les souches saccharolytiques de l'espèce Clostridium beijerinckii. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ladite souche de Clostriaium saccharolytique est une souche de Clostridium beijerinckii NRRL B-592.