Brevet FR2632308A1 — publié le 19891208

i - 2632308 La présente invention concerne un procédé et une installation de fractionnement en continu de protéines végé- tales animales ou humaines permettant d obtenir des pro- téines purifiées et concentrées. Les techniques industrielles de fractionnement des protéines les plus utilisées reposent sur une précipintation sélective des protéines par mise en contact d'une solution de protéines avec un agent précipitant et en jouant sur les conditions de pH de force ionique la nature et la concen- tration des agents précipitants. Parmi les aqents pr-cipi- tants qui ont été essayés à cet effet on peut citer les acides qras comprenant de 6 b 14 atomes de carbone et en particulier l'acide caprylique qui présente]l avantage de permettre une séparation à température ambiante et d'être un agent stabilisant de nombreuses protéines. La présente invention concerne des perfentionnements apportés à un tel procédé de manière h permettre sa misr, en oeuvre d'une manière continue avec un rendement élevé- A cet effet ce procédé de frsctionnement en continu de protéines végétales animales ou humaines par précipi- tation sélective des protéines résultant de la mise en con- tact d'une solution de protéines avec un aqent précipitant constitué par un acide gras de 6 à 14 atomes de carbone tel que l'acide caprylique est caractérisé en ce qu'on met en contact d'une manière continue des débits respertifs d'acide gras et de la solution de protéines dans une chambre de mélange de volume faible par rapport aux débits en créant une forte agitation dons cette chambre de ml-nnqe, on ajuste les débits individuels d'acide qras et de solution de protéines à pH et température contrô]és de-mnni.ère à main- tenir leur rapport égal à une valeur prédéterminée) on lnis- se le mélange évoluer ensuite perndant une phase de matura- tion de manière h formPr une suspension on sépare c-ette suspension en une partie liquide-dont on extrait les protéi- nes restées solubles et en une partie solide contenant des protéines de nature différente) et on controle en pnrmanen- ce les paramètres intervenant dans le procédé tels que le débit la pression la température le pH, la résistivité. L invention a dgnlement pour objet une instal lation mettant) en oeuvre le procédé de fractionnement en continu susmentionné. On décrira ci-après à titre d exemple non limitatif une forme d exécution de la présente invention en référence au dessin annexé sur lequel: La figure 1 est un schéma synoptique d'une instnl- lation mettant en oeuvre le procédé de fractionnement en continu de protéines suivant]linvPntion. ]0 La figure 2 est une vue en coupe horizontale dlun hydroclone utilisé comme dispositif de mise en contact dans l'installation suivant l invention. La figure 3 est une vue en coupe axiale et verti cale de 1 h>droclone de la figure 2 La figure 4 est un dingramme il-lustrant la variation du pourcentage de 1 albumine précipitée h partir d un plasma sanguin. en fonction du temps Les figures 5 6 et 7 sont des diagrammes illustrant i influence de la teneur en acide cnprylique sur la sélecti vité de la précipitation 1 éqgard des proté'inps Le procédé de fractionnement de protéines suivant 1 invention est mis en oeuvre au moyen d unp installation telle que représentée schématiquement sur la fiqure 1 et il sera décrit principalement à titre d exemple non limitatif dans le cas d une application au fractionnement de protéines plasmatiques Le plasma contenant lps protéines devant etre fractionnées est contenu dans un réciDient I et il est sou tiré de ce récipient au moyen d une pompe 2 dont 'le déhit est controlé par un capteur de débit 3 La matièrr premibre qui peut etre constituée par un plasma humain déhbnrassé des facteurs de coagulation par cryoprécipitation est de pré férence diluée au tiers avec un tampon ncétate O 06 ayannt un pH de 4 B L acide gras qui est utilisé Pn tant au agent pré cipitant est contenu dans un récipient 4 dont il est sou tiré par une pompe 5 le débit de cette pompe étant con trolé par un capteur de débit 6. L acide oras peut etre préa]ablement dispersé dans un tnmpon acétnte 0 06f din pH 4 8 lequel est contenu dans un récipient 7 Cre tampon est soutiré par une pompe 8 dont le débit est controlé par un capteur de débit 9 Les débits-d acide qras Pt der tampon acétate sont introduits dans un homoqgénéiseur il qui fournit à sa sortie une émulsion de] acide gras dans le tampon acétate L émulsion d acide qras et le plasma sont mis en contact en continu dans un dispositif]2 lequel comporte une chambre de mélange 12a de volume faible p-ar rapport a-ux débits de la solution de protéines plasmatiques et d aqrent précipitant. chambre dans laquelle est créée une forte agi tation favorisant la mise en contact et une chambre de maturation 12b dans laquelle séjourne. pendant un temps pré déterminé le mélange intime de solution de protéines plas matiques et d aqent précipitant La mise en contact'et la maturation subséquente provoquent la précipitation prati quement instantanée de certaines protéines du plasma notamment de 1 albumine avec un. rendement de lfnl, de cel le ci Les autres protéines 8 savoir les immunoqlobulines restent en solution La suspension sortant de la chambre de maturation 12b est ensuite transmise par un circuit comprenant une pompe 13 dont le débit est controlé par un capteur de débit 14 à 1 entrée d un étage de séparation 17 qui peut etre constitué par une centrifuqeuse ou une unité de microfiltra tion A titre d exemple cette unité drp mirrofiltrntion peut etre constituée d-une pompe de recirculation 15 dont le débit est contrôlé par un capteur de débit 16. Le débit entrant dans le filtre 17 est In somme des débits provenant de la pompe 13 et d une boucle de recirculation 18 Des cap teurs de pression 19 et 21 sont prévus pour relever les pressions respectivement à 1 entrée de 1 unité de microfi] *tration 17 et dans la boucle de recirculation 18 L unité de microfiltration 17 assure la séparation de la suspension qui entre en continu en un filtrat et un rétentat Le filtrat est transmis h un dtage 22 de connentra tion par ultrafiltration Cet étage fournit h sa sortie les immunoglobulines I La pression et le débit à I entrée dnns 1 étage de concentration 22 sont respectivemnnt controlds par des capteurs 23 et 24 Le rétentat sortant de I unité de microfiltration 17 peut etre additionné d un liquide de lavage dont la composi tion est choisie de manière à ne provoquer aucune modifica tion de la quantité et de la composition du précipité. Dans le cas de 1 exemple présentement décrit ce liquide de lavaqe est constitué d un tampon acétate de sodium 0 0611 en acétate de pH4 8 saturé en acide caprylique Le liquide de lavaqge est introduit par une canalisation 25 raccordé à une canali sation 26 sur laquelle est branchée une pompe 27 et qui s étend entre la sortie du rétentat de 1 unité de microfi] tration 17 et 1 entrée d une autre unité de microfiltration 28. Cette unité de microfiltration 28 est b son tour pourvue d une boucle de recirculation 29 comportant une pompe de recirculation 31 A cette unité de microfiltration 28 sont associés des capteurs de débit et de pression non représen tés semblables à ceux illustrés à propos de la première unité de microfiltration 17 La deuxième unité de microfil tration 28 assu.e ainsi le traitement du rétentat provenant de la première unité de microfiltration 17 et Ia séparation de celui ci en un filtrat qui est transmis à 1 étage de concentration 22 par 1 intermédiaire dune canaln]isation 32 et un nouveau rétentat. Cette opération peut etre répétée plusieurs foi.s ai nécessaire Le rétentnt sortant du dernier étage de lavage. illustré par l'unité de microfiltration 28 est transmis h un solubiliseur 34 dans lequel est éqnlement introduit un milieu solubi]isateur contenu dans un récipient 35 Le milieu solubilisateur est pompé dans le solubiliseur 34 par une pompe 36 de débit variable en fonction de données mesu rées par un capteur 37. Le milieu solubilisateur est choisi soit pour solubiliser la totalité du précipité soit pour produire un précipité de composition différente. Dans le premier cas ln solution sortant du solubiliseur 34 est 26323O8 - transmise à un étage de clarification 38 puis à un étage 39 de concentration par ultrafiltration. Cet étage de concen tration 39 délivre à sa sortie de] albumine concentrée A Le réactif. r est h dire 1 acide grns ost rt-upcdrd! h partir des deux étages de concentration 22 et 39 et il est trans mis par une canalisation 41 sur laquelle est branchée une pompe 42 au récipient 4 contenant 1 acide qras afin d etre recyclé. Dans le cas o la solubilisation conduit à un préci pité de composition différente il est possible de récupérer ce précipité par passage dans une autre unité de microfil tration 43 avec ou sans lavaqe. A cet effet la sortie du solubiliseur 34 est reliée par une canalisation 44 à 1 entrée de 1 unité de microfiltration 43 qui est pourvue d une boucle de recirculation 45 et la sortie du filtret do ] unité 43 est reliée par une canalisation 46 à 1 étaqe de concentration 39 L ensemble de 1 installation est piloté par un dis positif de commande 47 qui reçoit des informations relati ves aux divers paramètres mis en oeuvre dans le procédé suivant l'invention en provenance des différents capteurs tels que les capteurs de débit 6 9 14 16 23 les capteurs de pression 19.21.24 ainsi que d autres captours non repré- sentés tels que des capteurs de température de pH de ré- sistivité et qui commande en conséquence les diverses pompes assurant la mise en circulation des différents flux liquides de manière à maintenir toujours la meme proportion des débits élémentaires On peut ainsi réaliser un fraction nement en continu des différentes protéines à savoir des immunoglobulines I et de l'albumine A contenues dans le plasma introduit dans le récipient 7. Comme il a été dit précédemment la séparation des protéines peut aussi être effectuée au moyen d une centri fugeuse à la place de 1 unité de microfiltration 17 don nant un surnageant et un précipité traités ensuite séparé ment. La chambre de méInnqe 12a peut être avantaqeusempnt celle d un hydroclone 48 tel que représenté sur les fiqures 2 et 3 Cet h>droclone comprend un corps 49 dans la pnrtie centrale duquel est ménanée nla chambre de mlInnqe verticanle 12a de forme cylindrique et de petit diamètre. Dans la par tie supérieure de la chambre de mélanqe cylindrique 12n débouchent tangentiellement deux orifices d entrée opposés à savoir un orifice d'entrée 51 pour la solution de protéi nes plasmatiques lequel communique avec un raccord d entrée 52 relié è la canalisation d'alimentation en solution de protéines venant du récipient 1 et un orifice d entrée 53 pour 1 agent précipitant lequel communique avec un raccord 54 relié à I homogénéiseur 11 Les diamètres des orifices 51 et 53 choisis en fonction des débits respectifs de solu tion de protéines plesmatiques et d agent précipitant qui doivent etre introduits dans la chambre de mêlanqe 12a. Dans le cas présent le diamètre de l'orifice d entrée 51 de la solution de protéines plasmatiques est supérieur au diamê tre de l'orifice 53 d entrée de 1 aqent précipitant Le rapport entre les débits d'aqent précipitant et de solution de protéines plasmatiques est inférieur à I unité et est maintenu à une valeur prédéterminée, ce rapport étant par exemple de 0.048 Le maintien de ce rapport des débits h une valeur constante est assuré par le dispositif de commande 47 agissant sur les pompes doseuses Les débits de solution de protéines plasmatiques et d agent précipitant sont introduits tanqentiellement dans la chambre de mélanqe verticale 12a de faible volume et ils s'écoulent vers le bas. en suivant un mouvement tourbillon naire qui favorise le contact entre les deux liquides A sa partie inférieure la chambre de mélanqe 12n communique avec un raccord de sortie 55 qui est relié à la chambre de matu ration 12b On décrira maintenant quelques exemples de mise en oeuvre du procédé et de 1 installation de précipitation suivant 1 invention, dans le cas de différentes solutions protéiques comprenant un plasma humain et des solutions de protéines végétales. fIn considèrera tout d'sbord le cas du plasma humain dont les protéines sont précipitées par un acide aras. A un volume de plasma préalablement dilué à 20g/I en albumine et ajusté à un pH de 4.8 on ajoute. par I intermédiaire de I'hydroclone 48 un volume d émulsion d acide gras dispersé Par -suite de ce. contact entre] émulsion d acide qras et la solution de protéines on précipite rapidement] albumine du plasma. en moins de 5 minutes comme le montre la courbe A représentée sur la figure 4. Sur le diagramme de cette fi- gure le pourcentage d'albumine précipitée A est porté en ordonnée tandis que le temps t est indiqué en abscisse. en minutes L'essai a été effectué à une température de 200C et avec un rapport pondéral c8/alb =2 2. La mise en contact de la solution de protéines plasmatiques et de 1 acide gras a été de quelques centièmes de seconde dans la chambre de mélange 12a de 1 hydroclone 48 et pour le reste du temps ce contact a été maintenu dans la chambre de maturation sui vante 12b. Les diagrammes des figures 5 6 7 illustrent 1 in fluence de la teneur en acide caprylique sur la sélectivité de la précipitation. En effet suivant la quantité d'acide caprylique ajoutée on précipite sélective.ment certaines protéines. Le diagramme de la figure 5 illustre lan variation du pourcentage d'albumine (courbe A) et de-transferrine (courbe T) précipitées indiqué en ordonnée en fonction du rapport en poids c8/alb entre 1 acide caprylique et 1 albu- mine. indiqué en abscisse. On voit d après ce diagramme qu'un rapport de 2.2 en poids entre 'ascide rnpryliqur et 1 albumine est nécessaire pour précipiter toute l'albumine et la transferrine. Le diagramme de la fiqure 6 montre par contre qu'un rapport 1 en poids entre l'acide caprylique et l'albumine est suffisant pour précipiter totalement] alpha 2 macroglobuline (pourcentage de précipitation porté en ordonnée). Le diagramme de la figure 7 illustre la variation du pourcentage de protéines non précipitées c est h-dire de protéines présentes dans le surnageant, porté en ordonnée en fonction.du rapport en poids entre]- 'acide capr>lique et 1 albumine (cB/alh) porté en abscisse. Les courbes n. h.c et d correspondent respectivement à 1 albumine Pt aux immu noglobulines M.A et G. Ces essais ont été effectués à une température de 220C avec un pH de 4.8 et un temps de matu ration de 10 minutes. Les essais ont par ailleurs montré que l'on obtient la même sélectivité de la précipitation en utilisant des acides gras autres que 1 acide caprylique. tels que I acide hexanoique (c6) et 1 acide nonaoique (c9). La précipitation de 1 albumine en utilisant ces acides oras. est complète après 5 minutes de mise en contact. Toutefois. comme le rendement d extraction des immunoglobulines G est plus fai ble en présence d acide hexanoique et que le resolubilissa- tion de 1 albumine est plus faible en présence d acide none o!que (67%) que dans le cas o] on utilise de l'acide ca- prylique (80%). on préfère pour ces raisons utiliser comme agent précipitant] acide capr>lique. On a constaté éqnlement au cours dps divers essais effectués. que l'on obtient une sélectivité de la précipi tation identique pour un pH compris entre 4 et 4.8. Par contre pour un pH de 5.5 on observe un rendement d extrac tion des immunoglobulines G pius faible. La précipitation peut s'effectuer sans.perdre de sélectivité dans une gamme de température comprise entre C et 300C. Si on effectue la précipitation à une tempéra ture inférieure h 170C on introduit de 1 nlhumine dans le surnageant (1% 'h 140C) et si la température utilisée est supérieure à 3noC on dénature les immunoqlobulinns. On a appliqué également le procédé suivant l'inven tion à la précipitation, eu moyen d acide caprylique. de protéines extraites à partir de tourteaux de soja. Dans ce cas on extrait les protéines du soja au moyen d'une solution de chlorure de sodium (0.5M) dans un rapport 1/10 en poids. à une température de 450C pendant 1 heure avec un pHi de 8 5. La concentration en protéines totales que]'on a obtenue avec une telle extraction. est de 10.509/1. On procède en suite à une première précipitation des protéines du soja.par changement de pH. en ajustant la solution de protéines à un pH de 4.80 en ajoutant de l'acide acétique. Apres un tel ajustement du pH à 4 8 on obtient une concentration totale en protéines de 8 75Q/1. ce qui correspond à un rendement de précipitation de 17%. On voit que cette précipitation à l'acide ne précipite qu une faible partie des protéines totales contenues dans l'extrait. Par contre on a procédé à une deuxième précipita-- tion. suivant l'invention, par complexation des protéines avec de 1 acide caprylique en ajoutant un volume de so.lu- tion de protéines à un pH de 4.80. par l'intermédiaire de l'hydroclone 12a. le volume d'émulsion contenant 1 agent complexant dispersé. Le rapport-des concentrations comple xant-protéines. exprimées en q/g. étant fixé à 2.2. on a alors obtenu une concentration totale en protéines'dans le surnageant caprylique. à pH=4.8. égale à 2.70 q/l. soit un rendement de précipitation à l'acide capr>lique de 69%. On a procédé à un essai similaire sur des protéines extraites à partir de tourteaux de colza. Les protéines du colza sont extraites par une solution de chlorure de calcium (0.0511) dans un rapport 1/10 en poids. à une température de 500C. pendant 30min avec un plH 6al s] 1 Il rin n ajusté ensuite la solution protéique à un pH d-e 4 8, par ajout d'acide acétique, et on n'a constaté aucune précipitation des protéines du colza à la suite du changement de pH. On a procédé également à une complexation des protéines avec de l'acide caprylique, dans les mêmes conditions que dans le cas de l'exemple décrit précédemment relatif aux protéines de soja. Dans ce cas la concentration en protéines totales après extraction. avec un pH de 10. était de 12.50g/1 et cette concentration dans le surnaqeant caprylique. avec un pH de 4.8. est tombée à 4.50q/1 ce qui se traduit pnr un rendement de précipitation à l'acide caprylique de 64%. REVENDICATIOnNS 1. Procédé de fractionnement en continu de protéi- nes végétales. animales ou humaines par précipitation s.ilr- tive des protéines résultant de la mise en contact dune solution de protéines avec un agent précipitant constitué par un acide 'gras de 6 à 14 atomes de carbone. tel que l'acide caprylique. caractérisé en ce qu on met en contact d'une manière continue. des débits respectifs d'acide qras et de la solution de protéines dans une chambre de mélange 12a de volume faible par rapport aux débits. en créant une forte agitation dans cette chambre de mélanqe on ajuste les débits individuels d'acide gras et de solution de protéines à pH et température contrôlés de manière h maintenir leur rapport égal à une valeur prédéterminée on laisse le mélan- ge évoluer ensuite pendant une phase de.maturation de maniè- re à former une suspension. on sépare cette suspension en une partie liquide dont on extrait les protéines restées solubles. et en une partie solide contenant des protéines de nature différente. et on contrôle en permanence les param, tres intervenant dans le procédé, tels que]e'débit. la pression. la température. le pH la rsistivité. 2.- Procédé suivant la revendication 'caractérisé en ce qu'on sépare la suspension par filtration pour obtenir un filtrat et un rétentat. 3.- Procédé suivant la revendication 2 caractérisé en ce qu'on solubilise le rétentat avant d'en extraire sé- lectivement les protéines qu il contient. 4.- Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce qu'on sépare la suspension par centrifuqgation pour obtenir un surnageant et un précipité. 5.- Procédé suivant l'une quelconque des revendica tions précédentes caractérisé en ce qu'on forme en continu une émulsion de l'acide gras dans un tampon et on met en contact cette émulsion avec la solution de protéines pour provoquer la précipitation des protéines. l'1 6.- Procédé suivant 1 une quelconque-des revendica tions précédentes caractérisé en ce qu'-on fait varier la teneur en acide gras en fonction des protéines que l-on veut faire précipiter. 7?-- Tnstallation de fractionnement en continu de protéines par précipitation sélective des protéines résul tant de la mise en contact d'une solution de protéines avec un acide gras de 6 à 14 atomes de carbone. tel que l'acide caprylique, caractérisée en ce qu'elle comprend un disposi- tif (12) de mise en contact continu de la solution de pro- téines et de l'acide gras. ce dispositif (12) comportant une chambre de mélange (12a) de volume faible par rapport aux débits de la solution de protéines et d acide qras chambre dans laquelle est créée une forte agitation favori- sent la mise en contact. ce dispositif étant relié à des récipients contenant respectivement la solution de protéi- nes et l'acide gras. par des canalisations sur lesquelles sont branchées des pompes doseuses. et une chambre de matu-- ration (12b) reliée à la sortie de la chambre de mélange (12a) un étage de séparation solide/liquide (17) relié à la sortie de la chambre de. maturation (12b). par]'intermé diaire d'un circuit comprenant au moins une pompn (13.15). un étage (22) de concentration, par ultrafiltration du liquide sortant de l'étage de séparation (17). et un dis. positif de commande (47) relié à des capteurs de débit (6.9.14.16,23). de pression (19.21.24) et h d'autres cap- teurs et commandant les pompes assurant la mise en circula-. tion des différents flux liquides de mani.ère à maintenir toujours la même proportion des débits élémentaires. 8.- Installation suivant la revendication 7 cn-- ractérisée en ce qu'elle comporte un homoqénéiseur (11) relié, par des circuits comport.eant des pompes (5.8). au récipient (4) contenant l'acide gras et h un récipient (7) contenant un tampon. la sortie de l'homoninéiseur (11) étant reliée au dispositif de mise en contact continu (12) de manière à mettre en contact en continu. dans ce dispositif, ]'émuision d'acide qras dans le tampon. fournie par l'homo généiseur (11). et la solution de protéines provenant du récipient (1). 9.- Installation suivant l'une quelconque des re vendications 7 et 8 caractérisée en ce qu'elle comporte un solubiliseur (34) qui est relié à la sortie de l'étage de séparation (17) fournissant le rétentat et également à un récipient (35) contenant un milieu solubilisateur. par une canalisation sur laquelle est branchée une pompe doseuse (36) de débit variable en fonction de données mesurées par un capteur (37). 10.- Installation suivant la revendication 9 ca ractérisée en ce qu'elle comporte. à 1a sortie du solubili- seur (34). un étage de clarification (38) branché entre la sortie du solubiliseur (34) et un second étage (39) de con- centration par ultrafiltration fournissant à sa sortie une protéine concentrée. 11.- Installation suivant la revendication 9 carac- térisée en ce qu'elle comporte une unité de microfiltrstion (43) branchée entre la sortie du solubiliseur (34) qui ne solubilise alors que partiellement le précipité. et le second étage (39) de concentration par ultrafiltration. 12.- Installation suivant 'une quelconque des re- vendications 9 à 11 caractérisée en ce qu'elle comporte. entre l'étage de séparation (17) et le solubiliseur.(34). au moins une unité de microfiltration et de lavage (28) dont la sortie du filtrat est reliée au premier étagqe (22) de concentration. 13.Installation suivant l'une quelconque des re vendications 10 h 12 carncterisée en ce qu'elle comporte un circuit s'étendant entre les deux étages de concentration (22.39) et le récipient (4) contenant l'acide qras et une pompe (42) branchée sur ce circuit pour transmettre au réci- pient (4) l'acide gras récupéré à partir des deux étages de concentration (22.39). 14.- Installation suivant l'une quelconque des revendications 7 à 13 caractérisée en ce que la chambre de mélange (12a) fait partie d'un h>droclone (48) comprenant un corps (49) dans la partie centrale duquel est ménagée la chambre de mélange verticale (12a) de forme cylindrique et de petit diamètre et dans la partie supérieure de laquelle débouchent tangentiellement.deux orifices d'entrée opposaes à savoir un orifice d'entrée (51) pour la solution de protéi- nes.et un orifice d'entrée (53) pour l'aqent précipitant.