Brevet FR2626674A1 — publié le 19890804

La présente invention concerne un procédé analy- tique par "fixation de protéines" qui fait usage de réac- tifs spécifiques, marqués par des structures macromolécu- laires colorées. Les dosages ou déterminations par fixation de protéines constituent un type de techniques analytiques reposant sur la reconnaissance moléculaire entre des molé- cules biologiques, telles que des anticorps et des anti- gènes (dosages immunologiques), ou un récepteur et des molécules fixant le récepteur (dosages par fixation de récepteur). Ces types de dosages nécessitent généralement l'emploi de réactifs fixateurs biospécifiques sous une forme marquée. Divers types de marqueurs ont été utilisés jusqu'ici, chacun ayant ses avantages et ses inconvénients. (Réf. 1: T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T.S. Work, éd., Elsevier Biomedica Press, New York (1982)). Les radio-isotopes ont été et sont toujours largement utilisés pour marquer les réactifs fixateurs biospécifiques car ils confèrent au dosage une grande sensibilité et une grande précision, et ils ne sont pas affectés par des facteurs physiques ou chimiques au cours de l'analyse. Les principaux inconvénients de ce type de marqueurs découlent des risques que présentent les radiations pour la santé de l'utilisateur. En outre, il faut disposer d'un personnel entraîné et de coûteux appareils pour la mesure de la radioactivité. Par contre, le marquage des réactifs fixateurs biospécifiques par des enzymes, qui a été développé ultérieurement, ne présente pas de risques pour la santé et ne nécessite pas d'appareils spéciaux et/ou de mesures de radioactivité. De plus, les réactions colorées catalysées par des enzymes offrent la possibilité de déterminations qualitatives avec lecture visuelle d'un signal indica- teur. C'est là un remarquable avantage pour des épreuves diagnostiques effectuées en cabinet médical ou à domi- cile (par exemple des épreuves diagnostiques de grossesse et de féconditié, des épreuves diagnostiques pour la recherche de maladies sexuellement transmissibles, etc.) o la simplicité et la rapidité de détection d'un signal sont nécessaires. Les inconvénients des marqueurs enzymatiques comprennent la sensibilité des enzymes à la dénaturation par des facteurs physiques ou chimiques, l'inhibition par des composants du milieu analytique, et la nécessité de réactions supplémentaires pour la mesure de l'activité enzymatique. Ces inconvénients ont été partiellement élimi- nés par de nouveaux types de marqueurs basés sur l'emploi de composés fluorescents, chémoluminescents ou biolumines- cents. Cependant, tous ces types de marqueurs, bien qu'ils soient généralement stables et inoffensifs, nécessitent un appareillage complexe pour la mesure du signal et ne satis- font donc pas au besoin de simplicité et de rapidité de détection du signal qui est exigé, par exemple, par les épreuves diagnostiques effectuées en cabinet médical ou à domicile. Pour ces raisons, il a été recherché d'autres marqueurs qui permettent une lecture visuelle rapide des résultats et qui ne soulèvent pas les problèmes rencon- trés avec les marqueurs enzymatiques. Des exemples sont fournis par l'emploi de particules colorées, telles qu'un latex (Réf. 1), des érythrocytes (Réf. 1) et des bacté- ries colorées (EP-B-0 074 520), liées au réactif analy- tique (par exemple des anticorps ou des antigènes) afin de rendre visible la réaction biologique avec l'analyte. Ce- pendant, la masse relativement énorme de ce type de réactifs analytiques marqués peut restreindre le choix du meilleur système analytique pour ces épreuves qualitatives à lecture directe, notamment lorsqu'il faut utiliser des réactifs so- lubles qui soient libres de diffuser dans des matériaux po- reux (membranes, matrices chromatographiques, filtres, etc.). La présente invention concerne un procédé analy- tique par fixation de protéines comportant l'interaction entre un analyte et un réactif fixateur biospécifique mar- qué par des systèmes visuellement décelables, caractérisé en ce que le marqueur est constitué par des structures macro- moléculaires hydrophiles colorées. La présente invention porte aussi sur un réactif analytique coloré pour des dosages par fixation de protéines, caractérisé en ce qu'il consiste en un réactif fixateur biospécifique conjugué à des structures macromoléculaires hydrophiles colorées. Selon la présente invention, l'expression "réactif fixateur biospécifique" désigne une structure moléculaire capable de reconnaître sélectivement l'analyte en termes biologiques. Des exemples de réactifs fixateurs biospécifi- ques comprennent des anticorps, antigènes, haptènes, hormo- nes, récepteurs, médicaments, enzymes, inhibiteurs d'enzymes, coenzymes et structures fixatrices de parois bactériennes et de membranes. Le réactif fixateur biospêcifique peut être lié tel quel à la structure macromoléculaire colorée au moyen de réactifs bifonctionnels de pontage (par exemple le glutaral- déhyde, un carbodiimide, le N,N'-phénylène-dimaléimide, le métaperiodate de sodium, le N,N'-oxydiméthylène-dimaléimide, le 3-(2-pyridyldithio)proponiate de N-succinimidyle, la p- benzoquinone, l'iodacétate de N-succinimidyle, l'éther de bis(maléimido)méthyle, l'ester 3-maléimidobenzoylique de N-hydroxysuccinimide et l'ester maléimidohexanoylique de N-hydroxysuccinimide), ou par formation de liaisons non cova- lentes avec d'autres structures moléculaires. Des exemples de conjugaisons non covalentes de réactifs fixateurs biospécifiques à des structures ma- cromolculaires colorées cmprennent des complexes formés entre des réactifs analytiques biostannylés et l'avidine (ou la streptavidine) couplés à la structure macromoléculaire colorée; des complexes en sandwich formés entre un réactif analytique biostannylé, l'avidine, et des struc- tures macromoléculaires colorées biostannylées; des complexes formés entre un réactif analytique et des anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques dirigés contre le réactif analytique, liés par covalence à des structures macromoléculaires colorées ou complexées à leur tour avec la protéine A ou des anticorps anti-Fc liés à des structures macromoléculaires colorées. Les réactifs fixateurs analytiques biostanny- lés sont, par exemple, des anticorps ou des antigènes liés par covalence à une ou plusieurs molécules de biotine. Plusieurs types de "biotine activée", capables de réagir directement avec des molécules protéiques, sont disponibles dans le commerce (par exemple l'ester de D-biotine de N-hydroxysuccinimide, l'ester D-biotinyl-E- aminocaproylique de N-hydroxysuccinimide, le biotine- hydrazide, la sulfosuccinimido-biotine, le 6-(biotinamido)- hexanoate de sulfoccinimidyle et la N-iodacétyl-N'- biotinylhexylène-diamine). L'expression "structure macromoléculaire colorée" désigne un quelconque polymère coloré hydroso- luble. Des exemples de polymères colorés hydrosolubles sont des polysaccharides (par exemple les dextranes bleus), des protéines colorées disponibles dans le commerce (naturelles ou colorées par synthèse, par exemple la phosphorylase B, l'albumine de sérum bovin, l'ovalbumine, l'anhydrase carbonique, l'inhibiteur de la trypsine du soja et le lysozyme, préalablement colo- rés par synthèse), ou des protéines colorées nouvelle- ment synthétisées obtenues par conjugaison avec des colorants réactifs. Des exemples de colorants réactifs sont des colorants de la triazine (Bleu Cibacron F3GA, Rouge Réactif 120, Bleu Procion MX-R, Rouge du Texas). Des formes préférées de réalisation de l'in- vention sont représentées par les structures macromolé- culaires colorées o le colorant réactif est conjugué par covalence à un polymère de structure globulaire (par exemple une protéine globulaire) en un rapport molaire de 10 à 60. Une autre forme de réalisation préférée de l'invention est représentée par un copolymère de la structure macromoléculaire colorée, obtenu en utilisant des réactifs formateurs de ponts (par exemple le gluta- raldéhyde, des carbodiimides, le N,N'-o-phénylène-diama- léimide, un periodate, le N-maléimidobenzoyl-N-hydroxy- succinimide, des anhydrides mixtes, des imidates bifonc- tionnels) ou au moyen de ponts non covalents établis sur la base d'interactions biotine/avidine ou anticorps/ protéine telles que décrites ci-avant. EXEMPLE 1 MARQUAGE D'UN ANTICORPS ANTI-GONADOTROPHINE CHORIONIQUE AVEC DES STRUCTURES MACROMOLECULAIRES COLOREES, ET SON UTILISATION DANS UNE DETERMINATION IMMUNOCOLORIMETRIQUE QUALITATIVE DE LA GONADOTROPHINE CHORIONIQUE A) Conjugaison de Bleu Cibacron F3GA à l'albumine de sérum bovin On dissout 1 g d'albumine de sérum bovin (ASB) et 2 g de Bleu Cibacron F3GA (BC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, E.U.A.) dans 100 ml de bicarbonate de sodium 0,1M, et l'on porte le pH à 10,5 en ajoutant de l'hydroxyde de sodium 5M. On laisse le mélange réagir pendant 24 h à la température ambiante, puis on le filtre sur gel à tra- vers une colonne de Sephadex G-256 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suède) (5 cm x 60 cm) préalablement équilibrée avec du bicarbonate de sodium 0,1M. On rassemble les fractions éluées avec le "volume de vide" (ce produit est appelé BC-ASB) et on les conserve à -20 C jusqu'à l'emploi. B) Caractérisation de BC-ASB On détermine la quantité de BC dans le conjugué BC-ASB par des mesures spectrophotométriques à 600 nm (A1% = 100); on dose indirectement l'ASB par dosage de l'isoleucine (CLHP) après hydrolyse du conjugué dans l'acide chlorhydrique 6N pendant 72 h à 110 C. Les rapports molaires BC/ASB dans les conjugués BC-ASB s'avèrent être de 54 moles de BC/mole de ASB. C) Copolymérisation de BC-ASB On mélange 10 ml de BC-ASB dans du tampon bicarbonate de sodium, 0,1M, pH 8,9, avec 1 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 25% en volume et on laisse réagir à la température ambiante pendant 72 heures. On ajoute ensuite 1 ml de lysine JI, on mélange bien et on laisse réagir à la température ambiante pendant 20 min. Après la réaction, on filtre immédiatement sur gel à travers une colonne de Sephadex G-25e (2,5 cm x 30 cm) préalablement équilibrée avec du bicarbonate de sodium 0,1M. On recueille le pic coloré en bleu (50 ml), élué avec le "volume de vide" de la colonne, et on le conserve à 4 C pendant 24h jusqu'à l'emploi ultérieur. Dans tout le présent travail, ce produit est désigné par l'abréviation (BC-ASB)n. Une analyse de BC-ASB et (BC-ASB)n par électro- phorèse sur gel d'acrylamide à 8-25% dans SDS révèle une remarquable réduction de la mobilité électrophorétique de (BC-ASB)n par comparaison avec BC-ASB. D) Conjugaison de (BC-ASB)n avec l'anticorps monoclonal antigonadotrophine chorionique humaine INN22 On mélange directement les 50 ml de solution de (BC-ASB)n avec l'anticorps monoclonal anti-goradotro- phine chorionique humaine INN22 (Boehringer Mannheim GmbH, R.F.A.) et l'on fait incuber pendant 24 h à la tempéra- ture ambiante. On ajoute ensuite 5 ml de Tris-HCl lM, pH 8,0, et on fait incuber pendant 24 h pour bloquer tous les groupes actifs éventuellement restants. Dans tout le présent travail, ce produit est désigné par l'abréviation (BC-ASB)n-INN22. E) Purification de (BC-ASB) -INN22 On sépare l'anticorps marqué par le colorant, (BC-ASB)n-INN22, du (BC-ASB)n non conjugué en opérant par chromatographie d'affinité sur du GCh-CH-Sepharose préparé en couplant 20 000 UI de gonadotrophine à du CH-Sepharose activé (Pharmacia Fine Chemicals, Suède), suivant les instructions du fabricant. On fait adsorber une portion aliquote de 3 ml de (BC-ASB) -INN22 sur une colonne de GCh-CH-Sepharose n mesurant 0,8 cm x 3 cm, préalablement équilibrée avec une solution saline de chlorure de sodium 1,15M et un tampon phosphate de sodium 0,05M, pH 7,3, (STP) contenant 1 mg/ml de ASB (STP-ASB). On lave ensuite la colonne avec 20 ml du tampon d'équilibrage et on l'élue avec du thiocya- nate de potassium 3M. On dialyse immédiatement le produit recueilli (10 ml) contre STP, on le mélange à 1 ml d'une solution d'azoture de sodium à 1% en poids/volume et on le conserve à 4 C jusqu'au moment de l'emploi. F) Détermination immunocolorimétrique qualitative de GCh On mélange des portions aliquotes (0,5 ml) de (BC-ASB)n-INN22 ayant 0,2 unité de Densité Optique (600 nm) à 0,5 ml de solutions étalons de GCh à diverses concentrations (de 0 à 12,5 UI/ml) dans STP-ASB et l'on fait incuber pendant 30 min à la température ambiante; on place ensuite 0,5 ml de chaque solution sur une batte- rie de colonnes de GCh-CH-Sepharose (0,5 x 0,7 cm) préalablement équilibrées avec STP-ASB. Après 5 minutes d'incubation à la température ambiante, on lave les colonnes avec 3 ml de STP-ASB et l'on évalue visuellement la couleur fixée. On effectue parallèlement des expé- riences témoins en utilisant des batteries de colonnes contenant du CHSepharose (Pharmacia Fine Chemicals, Suède) sans GCh immobilisée, et de colonnes contenant du ASB-CH-Sepharose préparé comme décrit plus haut pour le GCh-CH-Sepharose en utilisant ASB à la place de GCh, en quantité molaire égale. Les résultats, résumés sur le tableau 1, révèlent clairement une fixation de (BC-ASB)n-INN22, qui n'est visuellement décelable que dans les colonnes de GCh-CH-Sepharose. Cette fixation est totalement inhibée lorsque (BC-ASB) -INN22 est mis n préalablement à incuber avec de la GCh à des concentra- tions qui sont supérieures à 0,5 UI/ml. En définitive, l'anticorps coloré (BC-ASB)n-INN22 peut être employé avec succès et avec une bonne sensibilité dans la détection qualitative de GCh. Tableau 1 Détermination immunocolorimétrique de GCh (voir texte) Echantillon Couleur fixée aux colonnes1) GCh (UI/ml) A2) B3) C4) O +++ - - 0,1 + 0,5 - 2,5 - - - 12,5 - - - 1) Telle qu'évaluée visuellement 2) GCh-CH-Sepharose 3) ASB-CH-Sepharose 4) CH-Sepharose EXEMPLE 2 MARQUAGE DE L'ANTICORPS MONOCLONAL ANTI-GCh M34III PAR DES MACROMOLECULES COLOREES ET SON UTILISATION DANS UNE DETERMINATION IMMUNOCOLORIMETRIQUE QUALITATIVE SUR MEMBRANE A) Conjugaison de BC-ASB avec MabM34III On fait incuber une portion de 2 ml de BC-ASB, préparé comme décrit à l'exemple 1, dans du tampon car- bonate de sodium 0,1M, pH 8,7, contenant 2,5% de gluta- raldéhyde, pendant 16 h à la température ambiante. On filtre le produit sur gel à travers du Sephadex F-25 PD10 (Pharmacia) préalablement équilibré avec du tampon carbo- nate de sodium 0,1M, pH 9,5. On recueille le pic élué avec le volume de vide de la colonne et on le mélange à 0,27 ml d'une solution de Mab34III (Boehringer Mannheim GmbH) (1 mg/ml dans du tampon carbonate de sodium 0, 1M, pH 9,5). Après incubation pendant 3 h à la température ambiante, on mélange la solution à 1 ml de lysine 1M et l'on fait encore incuber pendant une nuit à 4 C. On filtre le produit sur gel à travers une colonne de Sephacryl S-300 HR (2,6 cm x 60 cm) préalablement équilibrée avec STP (débit de 50 ml/h). On recueille le pic (DO à 280 nm) correspondant au volume de vide de la colonne et on le conserve à 4 C jusqu'au moment de l'emploi. Ce produit est appelé ci-après BC-ASB-M34III. B) Détezrmination immunocolorimétrique sur membrane de GCh On lave des membranes de nitrocellulose (2,25 cm2 chacune) (Biorad; 0,45 gm) pendant 10 min avec de l'eau distillée et on les laisse sécher pendant 15 min. On dépose ensuite une portion de 2 il d'une solution de MabINN22 (Boehringer Mannheim GmbH) à 1 mg/ml dans du STP au milieu de chaque morceau de membrane. On laisse ensuite sécher les membranes pendant 15 min et on les met à incuber pendant 30 min à la température ambiante dans du STP contenant 10% de ASB. On lave encore deux fois chaque membrane avec du STP, on les laisse sécher pendant 15 min et on les enferme chacune étroitement dans une boite de matière plastique (5 cm x 5 cm x 3 cm), préalablement remplie de quelques feuilles de papier de cellulose doux absorbant. Le couvercle de la boite est pourvu d'un trou de 1 cm2 en son centre, en correspon- dance avec la région de la membrane qui porte le MabIN22, et d'un entonnoir entourant le trou qui peut contenir au moins 5 ml de solution. On utilise divers dispositifs préparés comme décrit ci-dessus pour mettre à l'épreuve des solutions de GCh de la façon suivante: On introduit dans l'entonnoir de chaque dis- positif, au moyen d'une pipette, des portions aliquotes de 5 ml de solutions de GCh à diverses concentrations (de 0 à 10 UI/ml) dans du chlorure de sodium 0,14M contenant 0,1% de ASB, et on les laisse absorber complètement à travers la membrane. On laisse ensuite absorber à travers chaque membrane 0,5 ml de BC-ASB-M34III dilué à 1:5 avec du tampon Tris-HCl 0,02M, pH 8,3, conte- nant du chlorure de sodium 0,15M et 1% de ASB. On évalue visuellement la couleur des taches obtenues. Les résul- tats sont rapportés sur le tableau 2. Tableau 2 Détermination immunocolorimétrique de GCh sur des membranes de nitrocellulose (voir texte) Echantillon Couleur1) (fixée à la membrane) GCh (UI/ml) A2) B3) o 0,5 1 + - 2 + - 4 ++ ++ - 1) Telle qu'évaluée visuellement 2) Surface de membrane supportant du MabINN22 bloqué 3) Surface de membrane sans MabINN22 (bloquée par ASB, témoin négatif). REVENDICATIONS 1. Procédé analytique par fixation de pro- téines comportant l'interaction entre un analyte et un réactif fixateur biospécifique marqué par des systèmes visuellement décelables, caractérisé en ce que le mar- queur est constitué par des structures macromoléculaires hydrophiles colorées. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les structures macromoléculaires hydrophiles colorées sont choisies parmi des dextranes liés à des colorants par covalence, des protéines colo- rées disponibles dans le commerce, des polymères obtenus par conjugaison de colorants réactifs avec des protéines ou des polysaccharides hydrophiles. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les structures macromoléculaires hydrophiles colorées sont obtenues par conjugaion, par liaison covalente, de colorants réactifs avec des poly- mères ayant une structure globulaire. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les polymères hydrophiles colorés sont conjugués par réaction avec le glutaraldéhyde, un carbodiimide, un periodate, le N,N'-o-phénylène- dimaléimide, le N-maléimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide, des anhydrides mixtes ou des imidates bifonctionnels. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les polymères hydrophiles colorés sont liés à dé l'avidine ou de la streptavidine, à laquelle le réactif fixateur est lié par des ponts non covalents. 6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les polymères hydrophiles colorés sont soumis à une biostannylation et à la formation d'un complexe entre de l'avidine ou de la streptavidine et le réactif fixateur biostannylé. 7. Procédé selon la revendication 1 ou 2, pour la détermination immunocolorimétrique qualitative de la gonadotrophine chorionique humaine (GCh), carac- térisé en ce qu'on utilise un anticorps anti-GCh marqué par de l'albumine de sérum bovin conjuguée avec du Bleu Cibacron F3GA et copolymérisée avec du glutaral- déhyde et de la lysine. 8. Réactif analytique coloré pour des dosages par fixation de protéines, caractérisé en ce qu'il consiste en un réactif fixateur biospécifique conjugé à des structures macromoléculaires hydrophiles colorées. 9. Réactif analytique selon la revendication 8, pour la détermination de la gonadotrophine chorionique humaine (GCh), caractérisé en ce qu'il consiste en un anticorps anti-GCh conjugué à de l'albumine de sérum bovin qui est copolymérisée et conjuguée à un colorant de type triazine.