Brevet FR2635532A1 — publié le 19900223

PARTICULES HBsAg RECOMBINANTES HYBRIDES AYANT LES CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES DE L'ANTIGENE HBsAg CONTENANT UNE SEQUENCE IMMUNOGENE INDUISANT DES ANTICORPS NEUTRALISANTS DIRIGES CONTRE HIV OU SUSCEPTIBLE D'ETRE RECONNUE PAR DE TELS ANTICORPS. SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR DE TELLES PARTICULES. VACCINS LES CONTENANT. La présente invention concerne des particules recombinantes hybrides ayant les caractéristiques mor- phologiques de l'antigène HBsAg comprenant des séquences d'acides aminés immunogènes induisant des anticorps neutralisants dirigés contre les rétrovirus de la famille de HIV ou capables d'être reconnues par de tels anticorps. L'invention vise également des acides nucléiques recombinants ou vecteurs recombinants, comprenant eux- mêmes les insérats formés par des acides nucléiques re- combinants hybrides, éventuellement sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases d'un hôte cellulaire eucaryote, ces acides nucléiques recombinants portant l'information génétique requise pour rendre cet hôte cellulaire eucaryote apte à produire les particules hybrides recombinantes sus-mentionnées. L'invention a aussi pour objet des hôtes cellulaires eucaryotes transformés par les vecteurs recombinants précédents. La présente invention propose, par l'intermé- diaire des particules recombinantes ci-dessus, de nou- veaux moyens de prévention contre le SIDA ou contre les symptômes précurseurs du SIDA notamment des syndromes lymphadénopathiques (SLA). L'invention concerne plus particulièrement des particules recombinantes de ce type qui ont la capacité d'induire la formation d'anticorps neutralisants vis- à-vis des rétrovirus HIV et leur application pour l'élaboration de compositions vaccinantes pour lutter contre une infection due & un rétrovirus HIV. L'invention a également pour objet des peptides et polypeptides adéquats ayant des propriétés immuno- gènes protectrices contre le SIDA, notamment des poly- peptides de l'enveloppe d'un rétrovirus HIV ou SIV pour la réalisation des particules recombinantes ci- dessus. L'invention se rapporte également à des acides nucléiques codant pour ces peptides et polypeptides ainsi qu'aux vecteurs les contenant. L'invention vise -également l'utilisation des moyens ci-dessus pour réaliser le diagnostic in vitro d'une infection due à HIV. On sait maintenant que des agents étiologiques responsables du développement de syndromes de lymphadé- -nopathies (SLA) précèdent souvent le développement de syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). On a désigné par HIV (abréviation anglaise de "Human Immunodéficiency Virus") plusieurs rétrovirus humains susceptibles, dans certaines conditions, de provoquer un SLA, éventuellement relayé par un syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) chez l'homme. Ainsi un premier virus dénommé LAV-1 ou HIV-1 a été isolé et décrit dans la demande de brevet GB.83/ 24.800 et une demande EP.84/401.834 du 14/09/84. Ce virus a également été décrit par F.Barre Sinoussi et al. dans Science, 220 n' 45-99, 20, pages 868-871. Des variants de ce virus HIV-1 désignés par LAV ELI et LAV MAL, ont également été isolés, caractérisés et décrits dans la demande de brevet EP.84/401.834. L'isolement et la caractérisation de rétrovirus appartenant à une classe distincte et n'ayant qu'une parenté immunologique réduite avec les précédents, ont été décrits dans la demande de brevet européen n' 87/400. 151.4. publiée sous le n' 239.425. Ces rétrovirus qui ont été regroupés sous la désignation HIV-2, ont été isolés chez plusieurs malades africains présentant des symptômes d'une lymphadénopathie ou d'un SIDA. L'étude de ces rétrovirus HIV, l'isolement et l'analyse de leurs séquences nucléotidiques, ainsi que la caractérisation de leurs protéines antigéniques a permis d'effectuer des études comparatives entre les différentes souches obtenues au niveau de leur parenté ou au contraire de leurs spécificités tant structurales que fonctionnelles. Ces rétrovirus HIV-1 et HIV-2 ont également été étudiés en comparaison avec un rétrovirus d'origine simienne (désigné par l'abréviation SIV ou STLV-III) et cette étude a permis de montrer une parenté immuno- logique entre les protéines et glycoprotéines du rétro- virus HIV-2 et de ses variants et celles du rétrovirus SIV. La glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus SIV réagit immunologiquement avec des anticorps dirigés contre la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus HIV-2 et vice-versa. En revanche les glycoprotéines d'enve- loppe du rétrovirus SIV ou du rétrovirus HIV-2 ne don- nent pas lieu & des réactions immunologiques croisées avec les glycoprotéines d'enveloppe du rétrovirus HIV-1. Les études réalisées sur la structure des antigènes de surface de ces rétrovirus ont conduit les inventeurs & s'intéresser plus spécialement aux propriétés immunogènes de différents peptides et polypeptides appartenant & ces antigènes, notamment aux glycoprotéines d'enveloppe, ou aux glycoprotéines transmembranaires de ces rétrovirus. Différents peptides et polypeptides caractéristiques dont les séquences sont contenues dans les structures peptidiques de ces glycoprotéines, soit directement issus de ces rétrovirus, soit synthétisés par voie chimique, présentent une immunogénicité relativement faible. Dans le cadre de la présente invention les inventeurs ont recherché et défini des moyens suscepti- bles de renforcer l'immunogénicité de tels peptides ou polypeptides dérivés des glycoprotéines d'enveloppe ou des glycoprotéines membranaires de HIVs - ou élaborés à partir de la connaissance de leurs séquences respec- tives,- ou encore de séquences fonctionnellement voisi- nes, en particulier pour les rendre aptes à induire in yjvivo la formation d'anticorps neutralisants vis-à-vis d'un ou plusieurs rétrovirus du type HIV. Plus précisément, les inventeurs ont orienté leurs travaux vers la mise au point d'une structure biologique mixte dont l'un des éléments est constitué par les susdits peptides ou polypeptides, l'autre par des particules ayant les propriétés immunogéniques et immunologiques essentielles de l'antigène de surface-- (souvent désigné par l'abréviation HBsAg ou encore plus simplement HBs) du virus de l'hépatite B. Des particules ayant les propriétés morpholo- giques et immunogènes essentielles de l'antigène HBsAg naturel, et produites par expression du gène S du virus de l'hépatite B dans des cellules eucaryotes, ont été décrites dans le brevet européen n' 0038765 déposé le 22 avril 1981. On rappelle brièvement que ces particules HBs ont une taille approximative de 17 à 25, notamment 22 nm de diamètre. Elles ont également été décrites dans l'article scientifique correspondant de M.F. DUBOIS et al, (1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 4549-4553). Des particules semblables ont été obtenues dans des levures (P. VALENZUELA et al, (1982), Nature, 298, 347-350) ou par l'intermédiaire de virus recombinants (G.L. SMITH et al, (1983), Nature, 302, 490-495). Une méthode pour produire ces particules com- prend la transformation de cellules eucaryotes par un vecteur approprié, contenant le gène S sous la dépendance d'un promoteur efficace dans ces cellules eucaryotes, la culture des cellules transformées et la récupération des particules produites, soit & partir des cellules préalablement lysées, soit & partir du milieu de culture, lorsque les particules y ont été excrétées par les lignées cellulaires utilisées (notamment dans le cas de l'utilisation de lignées cellulaires de singe, de hamster, de souris etc...) Le polypeptide majeur des particules HBs, codé par le gène S a un poids moléculaire (PM) d'environ 25400 daltons. Ce poids moléculaire est de l'ordre de 27000 daltons lorsque la protéine majeure est sous forme glycosylée. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs se sont également intéressés & la préparation de protéines de PM plus élevé (de l'ordre de 34000 daltons), conte- nant non seulement la séquence polypeptidique du susdit polypeptide majeur codée pour la région S, ayant la même extrémité C-terminale que le polypeptide majeur et en outre une séquence supplémentaire de 55 acides aminés en position N-terminale (STIBBE X. et GERLICH W.H., (1983), J. Virology, 46, 626-628) codée par la région pré-S2 du génome de l'hépatite B. Les inventeurs ont aussi étudié des particules résultant de la transcription des régions S, pré-S1 et pré-S2 (l'ensemble de ces deux domaines est appelé région pré-S). Les protéines recombinantes ci-dessus s'assem- blent en particules d'une taille approximative de 22 nm. L'invention résulte de la conjonction dans une entité commune de facteurs concourant au résultat re- cherché à savoir: 1/ un support consistant en des particules de HBsAg comprenant plusieurs sites épitopiques T et B, dont l'immunogénicité protectrice est acquise, quand elles n'ont pas été modifiées (et lorsque ses protéines de surface comprenent la séquence d'acides aminés codée par la région pré-S du génome du virus de l'hépatite B), 2/ un épitope T immunogène dérivé d'une glycoprotéine d'enveloppe de HIV, 3/ un épitope B appartenant également à une glycopro- téine d'enveloppe de HIV et selon la forme de réali- sation de l'invention, 4/ avantageusement d'un site d'attachement au récepteur CD4 de lymphocytes T4. Ce site, en combinaison avec les facteurs précédents, participerait à l'induction in vivo des anticorps neutralisants contre HIV et à l'induction d'une réponse cellulaire, accompagnée d'une action blo- quante des anticorps formés, dès lors qu'ils sont diri- gés contre un site de fixation du virus. Le but que les inventeurs se sont fixé a été atteint grâce à la réalisation de particules hybrides recombinantes présentant les caractéristiques morpho- logiques essentielles des particules de HBsAg, et com- prenant, affleurant à la surface de ces particules, l'essentiel de la séquence d'acides aminés (S) codée par la région S et le cas échéant, tout ou partie de la séquence d'acides aminés codée par la région pré-S du génome du virus de l'hépatite B en amont de ladite séquence d'acides aminés (S), ces particules recom- binantes étant caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre, une séquence d'acides aminés immunogène in- duisant des anticorps neutralisants vis-à-vis d'un rétrovirus de la famille HIV, ou susceptible d'être reconnue par de tels anticorps, cette séquence com- portant elle-même au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes B, au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes T, cette séquence immunogène étant, soit insérée dans la séquence d'acides aminés pré-S, soit substituée tout ou partie de la protéine pré-S. De façon particulièrement avantageuse les particules hybrides recombinantes ci-dessus comprennent en outre un site d'attachement au récepteur CD4 de lymphocytes T4 humains. L'invention concerne aussi un vecteur recombi- nant pour la transformation ultérieure de cellules com- pétentes, alors aptes à produire de telles particules. Le vecteur recombinant selon l'invention com- prend un fragment d'acide nucléique correspondant à la région S et le cas échéant à tout ou partie de la région pré-S de l'antigène majeur de surface du virus de l'hépatite B, et permettant lorsqu'il est introduit dans un hôte cellulaire eucaryote compétent, d'induire la production de particules, ayant les caractéristiques morphologiques essentielles de l'antigène HBsAg et com- prenant une séquence d'acides aminés caractéristique de la protéine S de l'antigène HBsAg, à l'occasion de la culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé et, de préférence, l'excrétion de ces particules dans le milieu de culture, ce vecteur recombinant étant caractérisé: - en ce qu'il comprend en outre une séquence nucléoti- dique exogène codant pour une séquence d'acides aminés immunogène induisant des anticorps neutralisants vis- à-vis d'un rétrovirus de la famille de HIV ou suscep- tible d'être reconnue par de tels anticorps, comprenant au moins un épitope susceptible d'être Ixe-.;U par les lymphocytes B, et au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes T, et - en ce que ladite séquence nucléotidique exogène est soit insérée dans ladite région pré-S, soit substituée à tout ou partie de la dite région pré-S. Avantageusement, la séquence nucléotidique ex- gène code pour une séquence d'acides aminés immunogène telle que définie ci-dessus et qui comprend en outre un site d'attachement au récepteur CD4. Dans un mode de réalisation préféré du vecteur recombinant, le fragment d'acide nucléique correspondant à la région S et le cas échéant à tout ou partie de la région pré-S est placé sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases d'un hôte cellulaire euca- ryote. dL'incorporation des séquences caractéristiques de HIV dans la région pré-S (ou la substitution par- tielle ou totale de cette région pré-S par lesdites séquences caractéristiques) permet à la fois l'expre- ssion et l'exposition des séquences issues de HIV à la surface des particules ayant conservé les caractéristi-- ques essentielles des particules HBsAg, et ce dans une conformation autorisant la conservation de leur immuno- génicité naturelle et leur amplification, au point de les rendre aptes à induire in vivo la formation d'an- ticorps neutralisants vis-à-vis d'un rétrovirus HIV. Avantageusement on a recours à des vecteurs re- combinants comprenant des séquences nucléotidiques exo- gènes issues de HIV, choisies parmi celles qui présen- tent un grand degré de conservation au sein de diffé- rents isolats de rétrovirus HIV. La longueur des séquences nucléotidiques insé- rées dans l'enchainement nucléotidique comprenant la région S et le cas échéant tout ou partie de la région pré-S, doit être compatible avec le maintien des pro- priétés structurales et conformationnelles (morpholo- giques) essentielles des particules porteuses HBs. Cette longueur dépend dans 'une certaine mesure de la partie délétée de la région pré-S à titre indicatif... mais non limitatif... cette longueur correspond à une séquence de 5 à 100 résidus aminoacides. La longueur de la séquence insérée peut dans certaines formes de réa- lisation de l'invention, excéder celle de la séquence délétée. Dans un mode de réalisation préféré des vecteurs recombinants selon l'invention, la séquence nucléotidi- que exogène est insérée dans la phase de lecture appro- priée, dans la région pré-S (ou en amont du gène S) sous le contrôle d'un promoteur issu du SV40. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'acide nucléique recombinant est caracté- risé en ce que la séquence nucléotidique exogène (issue de HIV) est substituée à la plus grande partie, sinon la totalité de la région pré-S2. En d'autres termes, la région pré-S2 subsistant après l'insertion de ladite séquence nucléotidique exogène est pratiquement entièrement délétée, la séquen- ce nucléotidique exogène étant alors directement intercalée entre la région S, et la région pré-S1. Par séquence nucléotidique exogène, on entend les séquences dont les définitions sont données dans les pages précédentes ainsi que celles qui seront exemplifiées dans la suite. Entrent toutefois dans le cadre de l'in- vention des vecteurs transformés susceptibles de favo- riser l'intégration dans le fragment d'acide nucléiquede HBs, des susdites séquences nucléotides exogènes. Des vecteurs recombinants particulièrement adaptés à l'expression des séquences nucléotidiques exogènes dans le cadre des propriétés recherchées, résultent de la recombinaison d'un vecteur d'expression connu de HBsAg, désigné par pSVS (voir à ce sujet la référence 11) et d'une séquence exogène, issu de HIV-2 portée par un vecteur de clonage M13tgl30. Un tel vecteur résulte de l'insertion de.la séquence exogène dans la région pré-S2 de HBsAg (vecteur pM2S qui contient (la séquence pré-S1) ou de la substitution d'une partie de la région pré-S par la séquence exogène (pSV2S dans lequel la région pré-S1 a été délétée). Ces deux vecteurs, non limitatifs des possibilités de réalisation de l'invention, contiennent une séquence nucléotidique exogène caractéristique de la glycoprotéine externe d'enveloppe de HIV-1 obtenue par clonage et désignée par "clone 8". Elle est présentée à la figure 6. D'autres constructions peuvent être obtenues en remplaçant la séquence de HIV-1 ci-dessus par les sé- quences nucléotidiques de HIV-2 ou de SIV correspondan- tes, ou encore par des séquences modifiées, immunolo- giquement équivalentes, -capables cependant in vivo la production d'anticorps neutralisants dirigés contre un rétrovirus HIV. A titre d'exemple, les séquences insérées de façon préférée dans les enchaînements de nucléotides ci-dessus sont les séquences nucléotidiques codant pour l'une des séquences d'acides aminés suivantes: X1 CHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTC Z1 X2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSC Z2 X3 CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC Z3 dans lesquelles les couples Xi, Z1; X2, Z2 et X3, Z3 représentent soit des groupements COOH ou NH2, soit des séquences d'acides aminés normalement respectivement associées aux parties centrales correspondantes des sé- quences sus-indiquées dans les glycoprotéines des ré- trovirus SIV, HIV-2, HIV-1 qui normalement les con- tiennent: ces séquences comprenant notamment au total, jusqu'à 100 acides aminés. D'autres séquences nucléotidiques également pré- férées sont celles qui codent pour les séquences d'aci- des aminés suivantes: RGEFLYCKMNWFLNWVEDRSLTTQKPKERHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLP PREGDLTCNSTVTSLIANINWTDG; RGEFLYCNMTWFLNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNS TVTSIIANIDWQNN; GGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAM YAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN; Dans un mode de réalisation particulier des particules ci-dessus la séquence d'acides aminés exogène est soit insérée dans la séquence peptidique codée par la région pré-S2 du génome du virus de l'hépatite B, soit substituée à tout ou partie de cette séquence peptidique. De façon préférée, les particules hybrides re- combinantes contiennent une séquence d'acides aminés exogène choisie parmi celles qui ont déjà été indiquées à titre d'exemples préférés: X1 CHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTC Z1 X2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSC Z2 X CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC Z3 Ces séquences particulières présentent des ca- ractéristiques fonctionnelles intéressantes, notamment en ce qu'elles contiennent dans une séquence commune issue de HIV un site d'attachement aux lymphocytes T et récepteurs CD4 et un épitope T très proche l'une de l'autre. Une extension de l'application de l'invention consiste dans la réalisation d'un vecteur recombinant exogène caractéristique d'une glycoprotéine d'enveloppe de HIV mais dépourvu de la séquence codant pour le site d'attachement au récepteur CD4. Une telle séquence exogène insérée dans la région pré-S définie ci-dessus peut conduire de façon intéressante à la formation de particules hybrides recombinantes capables de présenter à leur surface les épitopes susceptibles d'être reconnus par les lymphocytes B et les lymphocytes T et capables respectivement de contribuer à l'induction d'anticorps ou d'une réponse cellulaire. Des séquences d'acides aminés exogènes préférées de l'invention, contiennent des séquences peptidiques respectivement caractéristiques des virus SIV, HIV-2, HIV-1 et ont les séquences suivantes: RGEFLYCKMNWFLNWVEDRSLTTQKPKERHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLP PREGDLTCNSTVTSLIANINWTDG RGEFLYCNMTWFLNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNS TVTSIIANIDWQNN GGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAM YAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN D'autres séquences peptidiques exogènes peuvent entrer dans le cadre de l'invention dès lors que les propriétés techerchées pour les particules recombinantes et qui ont été précédemment définies, sont respectées. Les peptides et polypeptides immunogènes ca- ractéristiques de HIV ou de SIV qui entrent dans le cadre de l'invention peuvent être obtenus par synthèse selon les techniques décrites dans le brevet US 4629783 délivré le 16 Décembre 1986 à la société GENETIC SYSTEMS. D'autres méthodes dont les principes sont résumés ci-après, pourront être mises en oeuvre. Un principe de synthèse est par exemple de mettre en présence une phase solide dans laquelle s'assemble la séquence du peptide et une phase liquide contenant solvants et réactifs. A chaque étape la séparation entre le peptide en croissance et les réactifs se fait par simples filtrations et lavages. Initialement, le support solide qui porte un groupement réactif réagit avec le carboxyle d'un acide aminé introduit avec son a-NH2 bloqué (protégé par exemple par le t-butyloxy carbonyle), pour établir une liaison covalente. Après déprotection de la fonction aminée (par exemple en lavant avec un acide tel que l'acide trifluoroacétique), un deuxième acide aminé protégé est introduit pour former par couplage la première liaison peptidique. Le deuxième acide aminé, qui fournit le deuxième amino-acyle de la séquence, est couplé à partir du résidu amino-acyle Cterminal sur la fonction amine déprotégée du premier acide aminé C- terminal de la chaine. De préférence la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par dicyclohexylcarbodiimide. Par une suite de réactions, déprotections et couplages, la synthèse progresse du résidu C- vers le résidu N- terminal. Lorsque la séquence voulue a été assemblée le peptide est décroché de la phase solide, par une réaction spécifique de coupure de la liaison peptide-résine établie initialement. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrit par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé mMéthode der Organischen Chemie" (Méthode de la Chimie Organique) édité par E. Wunsch, vol. 15-I et II, THIEME, Stuttgart 1974. Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou & condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces amino- acyles ou fragments, à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides. En variante, on pourra avoir recours & des réactions de couplage mettant en jeu des 26'35532 réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la 1-ethyl-3-(3-diméthyl-amino- propyl)-cdarbodiimide. Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront par exemple protégées par des groupes tbutylester. L'invention se rapporte aussi à un hôte cellu- laire transformé par un vecteur recombinant parmi ceux qui ont été précédemment décrits et compétents pour assurer l'expression de l'insérat contenu dans ce vecteur recombinant. A titre d'exemple, l'expression de la particule hybride recombinante HIVHBs peut être assurée dans différents types cellulaires par des vecteurs plasmi- diques ou viraux, par exemple les pox virus (du type du virus de la vaccine, les adénovirus, les baculo virus). Les techniques d'infection ou de transfection selon qu'il s'agit de virus ou de plasmide sont bien connues de l'homme de l'art. On pourra pour cela se reporter au brevet français n' 245.136 ou à la demande.de brevet européen publiée sous le n' 265.785. A titre d'exemple d'hôtes cellulaires adaptés pour la réalisation de l'invention, on mentionne des cellules eucaryotes de mammifère par exemple des cellules CHO, ou encore des levures, par exemple Saccharomvyces cerevisiae.. Les procédés de transformation mis en oeuvre pour obtenir l'expression de l'insérat du vecteur (et de mise en évidence du produit d'expression) sont en eux-mêmes classiques, comme il résulte des exemples qui suivent. L'invention vise par ailleurs une composition vaccinante contre des infections dues à un rétrovirus HIV, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que principe actif, des particules recombinantes hybrides telles décrites dans les pages précédentes, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. L'administration de ces compositions à un pa- tient pourra être faite en utilisant des doses contenant d'environ 5 à environ 20 pg de particules recombinantes hybrides purifiées par dose. Ces doses seront par exemple administrées trois fois à un mois d'intervalle. L'invention concerne également un procédé de préparation d'un vecteur recombinant, caractérisé par les étapes suivantes: - la recombinaison génétique in vitro le cas échéant sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases d'un hôte cellulaire eucaryote approprié, d'une part d'une séquence nucléotidique exogène codant pour une séquence d'acides aminés immunogène, induisant des anticorps neutralisants vis-à-vis d'un rétrovirus de la famille de HIV ou susceptible d'être reconnue de tels anticorps, cette séquence exogène comprenant au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes B, et au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes T, et d'autre part, un enchainement de nucléotides correspondant à la région S et le cas échéant à tout ou partie de la région pré-S du génome du virus de l'hépatite B et - la récupération du vecteur recombinant formé compre- nant les éléments tels qu'ils ont été définis plus haut. Un procédé semblable peut être appliqué pour obtenir la formation d'un vecteur recombinant précédem- * ment défini, dans lequel la séquence exogène insérée code pour une séquence d'acides aminés comprenant en outre un site d'attachement au récepteur CD4. La récupération du vecteur recombinant peut être réalisée par les procédés connus, notamment par hybrida- tion sélective avec, d'une part, des sondes nucléotidi- ques caractéristiques des séquences correspondantes du génome d'un rétrovirus HIV, d'autre part, avec des sondes caractéristiques de la région S du génome du virus de l'hépatite B. L'invention se rapporte aussi à des compositions pour le diagnostic -in vitro d'une infection due à HIV par détection de la présence d'anticorps neutralisants dans un milieu biologique d'un patient. De telles compositions comprennent des particules hybrides recombinantes exprimant à leur surface un ou plusieurs des polypeptides ou peptides de HIV-1 ou HIV-2 ou SIV, ou un mélange de ces particules hybrides recombinantes. L'invention concerne aussi l'utilisation de ces particules hybrides recombinantes pour réaliser un test de diagnostic in vitro de la présence d'anticorps résultants d'une infection par HIV caractérisé par: - la mise en contact d'un milieu biologique d'un patient avec des particules recombinantes hybrides, - la détection du produit de réaction éventuellement formé à savoir un complexe antigène-anticorps. Les moyens de détection du complexe antigène- anticorps sont ceux connus de l'homme de l'art notamment le marquage radioactif. Le test pourra, selon la com- position des particules hybrides recombinantes, être appliqué pour le diagnostic sélectif de HIV-1 ou HIV-2, ou pour le diagnostic non sélectif grâce à l'utilisation de compositions comprenant des particules exprimant à leur surface des séquences de HIV-1 et de HIV-2 ou une séquence caractéristique des deux virus à la fois. De même l'invention concerne un procédé pour le diagnostic in vitro d'une infection due à HIV, caracté- risé par les étapes suivantes: - mise en contact d'une composition cidessus définie avec un milieu biologique d'un patient susceptible de contenir des anticorps neutralisants contre HIV, - détection de la formation d'un éventuel complexe antigène-anticorps. Par milieu biologique on entend tout échantillon susceptible de contenir des anticorps, tel que le sérum d'un patient. L'invention vise encore un procédé pour la pro- duction des particules hybrides recombinantes ci-dessus, caractérisé par les étapes suivantes: - la transformation d'un hôte cellulaire déterminé avec un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus, dont le promoteur éventuellement présent dans le vecteur est reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire transformé, - la culture de l'hôte cellulaire sur un milieu appro- prié et la récupération des particules formées, plus particulièrement celles excrétées dans le milieu de culture. Ces particules sont alors caractérisables non seulement par leur caractéristiques morphologiques et leur réactivité immunologique avec des anticorps anti-HBs, mais également par leur aptitude à être re- connues par les anticorps anti-HIV correspondants ou & induire de tels anticorps. D'autres caractéristiques et avantages particu- lières de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et qui sont illustrés par les figures. MATERIELS ET METHODES Construction de vecteur M13tgl30 est un vecteur de clonage dérivé du bactériophage M13. Comme l'on décrit KIENY et al (14), il contient dans la séquence 5' du gène codant pour la beta-galactosidase, 11 sites uniques de restriction constituant un polyadaptateur (polylinker) (voir figure 1). L'insertion de fragments d'ADN exogène dans ce "polylinker" peut être détectée par absence de coloration par X-gal. Le criblage des plaques bleues par hybridation in situ permet la détection des fragments 3 d'ADN insérés en phase. Le vecteur d'expression de HBsAg, pSVS (11) a été modifié pour y insérer le segment EcoRI -SalI de l'ADN de M13tgl30 contenant 10 sites de restriction entre les sites EcorRI et XhoI de la région pré-S2 du génome du virus de l'hépatite B encore désigné par HBV (abréviation anglaise de Hépatitis B virus). La fusion entre les sites de restriction SalI et XhoI restaure le cadre de lecture dans la région pré-S2. La région pré-S1 du vecteur résultant pM2S a ensuite été délétée. Le vecteur obtenu a été désigné par pSV2S. Dans cette construction, la fusion entre l'ADN cloné et le gène S adjacent à la région pré S2 est placée sous le contrôle direct du promoteur précoce de SV40. En utilisant des moyens analogues, on a obtenu un vecteur désigné par pSVS XL par recombinaison entre pSVS et pM2S au niveau des sites XhoI etSmaI respective- ment. Transfection des cellules animales Des cellules d'ovaire de hamster. chinois dhfr (CHO) du clone DXB11 (15) ont été maintenues sous forme de monocouche dans un milieu Ham F12 complété avec 10 % de sérum de veau foetal. Les cellules ont été tranfec- tées en utilisant la méthode au phosphate de calcium décrite dans la référence (16) avec un choc au glycérol 6 heures plus tard (Parker et al.1979). Une cotrans- fection avec le vecteur pSV2 dhfr selon le principe rappelé dans la référence (17) permet la sélection des clones stables exprimant les protéines de fusion avec HbsAg(encore appelées protéines recombinantes). L'amplification des séquences transformantes a été obtenue en procédant à une culture cellulaire en présence de concentrations croissantes de méthothréxate (MTX) (18). Production et purification des particules recombinantes de HIV-HBsAq. Des clones stables exprimant les particules recombinantes de HBsAg ont été cultivées jusqu'à confluence et ont été alimentés tous les trois ou quatre jours avec un milieu de culture contenant seulement 5 % de sérum de veau foetal. Les surnageants de cultures cellulaires ont été récupérés, clarifiés et les particules de HBsAg ont été concentrées par précipitation par le sulfate d'ammonium et purifiées à deux reprises dans un gradient isopycnique de CsCl suivi par un gradient de vélocité en sucrose de 0 à 20 %. Immunoblots i mg environ des particules recombinantes puri- fiées a été soumis à ébullition dans un tampon de Laemmeli, séparé par électrophorèse sur gel de polyacry- lamide dodecyl sulfate de sodium 12,5% (NaDodSO4) et éléctrotransféré sur des filtres de nitrocellulose (SCHLEICHER & SCHULL). Les protéines immobilisées sur les filtres ont réagi avec les différents antiséra suivants: a-p49a (19), antisérum anti-peptide de lapin spécifique de HBsAg, 18/7 (20) anticorps spécifique de la région pré-S1 de HBV et un antisérum dirigé contre les régions de la GP160 de HIV1 (figure 2) obtenu à partir de lapins en utilisant des peptides synthétiques couplés avec un sérum albumine bovine (BSA: abréviation anglaise de bovine serum albumine") ou l'hémocyanine limpet keyhole (abréviation anglaise: KLH). Les protéines immunoréactives finales ont été détectées par des anticorps anti-lapin ou par des immu- noglobulines de souris conjuguées avec de la peroxydase (AMERSHAM) et ont été révélés avec la diaminobenzidine. Immunisations et mesures de la production d'an- ticorps Des lapins ont été immunisés deux ou trois fois à un mois d'intervalle par injection intradermique d'environ 4 pg de particules recombinantes de HBsAg pu- rifiées (tableau 1) dans l'adjuvant complet de Freund. Des séra ont été obtenus 30 jours après la dernière injection. Ces antiséra ont été testés pour connaître leur niveau de production d'anticorps, par la méthode ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay), en utilisant, en phase solide, des particules HBsAg dérivées du plasma (Hevac B.Pasteur, produit par Pasteur Vaccins France) ou des peptides synthétiques caractéristiques de HIV (voir figure 2). Les peptides synthétiques ont été fournis par Monsieur le Dr ROCHAT (UA. 553, CNRS MARSEILLE). Tous les antigènes ont été utilisés à une concentration de 1 pg/ml sur des plaques de microtitrage (FALCON "Probind") et les tests ELISA ont été réalisés comme décrit par CHARBIT et al (21). Essais sur les anticorps neutralisants Pour mettre en évidence l'activité neutralisante des anticorps contenus dans les séra, on a utilisé des lymphocytes stimulés du sang phériphérique humain (PBL). Ces cellules ont été utilisées pour leur sensibilité à l'infection à HIV. Différents échantillons d'un isolat LAVBRU décrit par MONTAGNIER et al (22) ont été utilisés comme inoculum de virus. Chaque dilution de sérum a été pré-incubée avec un volume égal d'inoculum viral pendant 1 heure à 37'C. Le mélange a ensuite été ajouté à une 6 er quantité de 4.106 PBL humains dans un milieu RPMI 16-40 complété avec 10 % de sérum de veau foetal contenant 20 U./ml d'interleukine, 2,2 pg/ml de polybrène et 25 U. /ml de séra anti-interféron. Après I heure d'incubation à 37'C, les cellules ont été rincées et cultivées dans des milieux RPMI com- plets. Les surnageants ont été retirés deux fois par semaine et les mêmes dilutions des séra testés ont été ajoutées dans les nouveaux milieux les deux premières fois. Les surnageants ont été congelés à -70'C et testés pour connaître leur activité reverse-transcriptase (activité RT) (23). RESULTATS Clonage des fraaments du aène d'enveloppe de HIV dans un vecteur d'expression eucarvote de HBsAq Le clonage a été réalisé en deux étapes: Dans une première étape, on a construit une banque génomique d'expresssion, dans le bactériophage M13tg130 et les fragments d'ADN sélectionnés ont été transférés dans le vecteur d'expression d'HBsAg. Le bactériophage M13tg130 est un vecteur de clonage et de séquençage portant au niveau du cinquième codon du gène lacZ de E. coli, un polylinker (polyadaptateur) contenant 11 sites de restriction uniques. Des fragments d'ADN du génome de HIV coupés au hasard et comprenant de & 1000 paires de base, ont été clones dans les sites SmaI et EcoRV du bactériophage M13tg130 (figure 1). L'hybridation in situ et le séquençage ont permis de repérér précisément le fragment cloné dans la région codant pour l'enveloppe de HIV1. Les fragments de HIV sélectionnés ont été transférés dans le vecteur d'expression de HBsAg, pSV2S (figure 1). pSV2S est obtenu par modification d'un vecteur d'expression pSVS précédemment décrit dans la partie "Matériels et Méthodes". pSVS comprend la sé- quence de SV40 contenant l'origine de réplication, les promoteurs tardif et précoce, l'activateur et les sites d'initiation de l'ARN m. On trouve au voisinage immédiat du promoteur précoce, des séquences de HBV contenant la région génomique pré-S2, le gène S, et une séquence permettant la polyadénylation de l'ARN messager de l'HBsAg. Dans le vecteur pSV2S, la partie de la région pré-S2 a été délétée et remplacée par le polyadaptateur M13tg130. Dans cette construction, le polyadaptateur permet l'insertion d'un fragment d'ADN en phase avec la région pré-52 et le gène S. Ainsi, tout fragment cloné dans le cadre de lecture correct du gène LacZ dans le bactériophage M13tg130 peut être facilement transféré en phase avec le gène S dans le vecteur d'expression pSV2S. Un autre dérivé de pSVS est le vecteur pSVS XL dans lequel l'adaptateur M13tg130 permet aisément l'insertion en phase d'une séquence exogène dans la région pré-S2. Dans cette construction, les antigènes pré-Sl et pré-S2 sont exprimés de façon adjaçente avec l'antigène étranger. Parmi les fragments correspondant à l'enveloppe de HIV et obtenus dans la banque, trois ont été étudiés en détail. Le clone n'2 contient un insérat de HIV formé de 52 paires de bases (bp) (nucléotides 6440 à 6491), situé dans la partie médiane dans la séquence codant pour la GP120 (figure 2). Il couvre une région conservée entre les différents isolats de HIV1 (3). Le clone n68 contient un insérat de HIV de 252 paires de bases (nucléotides 6915 à 7166), correspondant à la partie sub-carboxyterminale de la protéine GP120 (figure 2). Cettq région est relativement bien conservée parmi les différents isolats et présente une homologie avec la région constante de la chaine lourde de l'immunoglobuline (référence 24). De plus, une partie du fragment d'ADN code pour un domaine impliqué dans l'attachement de la protéine GP120 au récepteur du virus, la molécule CD4 (référence 25). Le clone n-6 contient un insérat de HIV ayant 55 paires de bases (nucléotides 7306 à 7360) situé dans une région codant pour la partie amino-terminale de la protéine transmembranaire GP41. Cette région est conservée dans les isolats de HIV et partage une homologie avec la protéine de fusion d'autres virus (26). Expression des Protéines de fusion HIV-HBV dans les cellules transfectées Les vecteurs d'expression de HBsAg contenant les fragments du gène d'enveloppe de HIV-1 ont été utilisés pour transfecter des cellules CHO. Les clones stables exprimant HBsAg, détectés par un test RIA spécifique pour la protéine majeure d'enveloppe d'HBV ont été criblés pour détecter l'expression du gène hétérologue. Ils ont ensuite été caractérisés par analyse selon la méthode dite wNorthern blotu et l'ARN messager hybride a été observé. Les particules secrétées ont ensuite été purifées à partir du surnageant de culture cellulaire par un procédé utilisé pour les particules de HBsAg (11). Les particules recombinantes HIV-HBsAg ont à peu près la même densité dans un gradient CsCl que les particules natives. Les protéines des particules recombinantes ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide NaDodSO41 transférées sur des filtres de nitrocellulose et testées avec des antiséra obtenus à partir de lapin et dirigés contre le peptide synthétique correspondant soit à la particule HBsAg soit aux déterminants de l'enveloppe de HIV (figure 3). Les résultats suivants ont été observés: Particule recombinante n'2: en plus de la protéine majeure HBsAg et de la protéine correspondante sous forme glycosylée GP26, le sérum anti-p49a a révèlé 4 bandes dans l'intervalle de 27 000 à 32 000 daltons correspondant à la protéine moyenne (figure 3A, ligne 1). les 4 bandes sont également fortement révélées par un sérum dirigé contre le peptide de HIV1 homologue (pep 5) (figure 3A, ligne 1). Ceci a montré que la particule recombinante HBsAg n'2 porte un déterminant étranger. Les quantités de protéines moyenne et majeure sont pratiquement les mêmes. La protéine moyenne fusionnée est présente sous quatre formes, en fonction de la glycosylation des régions de HBV (1 site de glycosylation) et de HIV (2 sites possibles de glycosylation). Particule recombinante n'8: Le sérum anti-p49a a révèlé une protéine majeure de HBsAg sous deux formes (P22 et GP26) ainsi que des bandes correspondant à un poids moléculaire s'étendant de 37 000 à 46 000 (figure 3B, ligne 1). Des séra dirigés contre deux peptides homologues n* 6 et n' 7 ont révélé la même répartition de protéines lourdes (figure 3B, lignes 2 et 3) démon- trant la présence d'un déterminant de HIV dans les particules. La quantité de protéine moyenne fusionnée est moins importante que la quantité de protéine ma- jeure. La protéine de 37 kd correspond à la protéine fusion non glycosylée et les protéines de plus de haut poids moléculaire correspondent aux formes glycosylées (5 sites possibles de glycosylation dans la partie HIV). Les séra anti-peptides ont également révélé une protéine de 67 kd qui correspond à la sérum-albumine co-purifiée. Particule recombinante n'6: le sérum anti-p49a a révélé une protéine majeure HBsAg et sa contrepartie glycosylée mais n'a pas révélé de protéine moyenne (figure 3C, ligne 1). Un triplet de bandes de hauts poids moléculaires a été observé; il est aussi révélé par un anticorps monoclonal contre l'antigène pré-Si (figure 3C, ligne 2). La taille de ces protéines est compatible avec celle de la grande protéine HBsAg, comprenant le peptide étranger dans ses formes glysosylée et non glycosylée. Réponse immutaire humorale à des Darticules recombinantes HBsAc Des lapins ont été immunisés deux ou trois fois à un mois d'intervalle, avec chacune des particules recombinantes HBsAg ci-dessus, dans un adjuvant de Freund complet (voir Matériels et Méthodes"). La spécificité de la réponse immunitaire a été déterminée par un test ELISA en utilisant des particules dérivées du plasma et différents peptides correspondants de HIV1. Des antiséra ont également été testés contre les pepti- des pré-S2 (séquence d'acides aminés de la protéine d'enveloppe de l'HBV comprise entre les numéros 120 à inclus) (tableau 1). Tous les lapins ont développé des anticorps contre les particules HBsAg natives, & différents niveaux. La plus faible réponse a été obtenue pour le recombinant n' 8, ce qui peut s'expliquer par la taille relativement grande de l'antigène étranger (84 acides aminés) qui peut entrer en compétition avec les déter- minants HBsAg ou les masquer. Au contraire, la meilleure réponse dirigée contre le peptide étranger à été obtenue avec ce recombinant n' 8, ce qui suggère dans ce cas une présentation prédominante des déterminants antigéniques HIV vis-à-vis des déterminants antigéniques de HBsAg. Dans les recombinants n' 2 et n'6, les antigènes exogènes appartenant à HIV sont plus petits et de taille comparable (18 acides aminés et 20 acides aminés). Les réponses dirigées contre les peptides observés dans les deux cas sont plus faibles que celles dirigées contre les particules HBsAg natives. Le taux de protéine de fusion vis-à-vis de la protéine majeure native est élevé dans le recombinant n'2 (voir figure 3). Ces résultats suggèrent une faible immunogénicité de la séquence insérée dans ce recombinant. Une réponse avec les peptides pré-S2 est obtenue uniquement pour le recombinant n'6 résultant de l'expression dans le vecteur pSV XL (figure 1). Des antiséra des deux autres lapins immunisés avec des particules obtenues par expression dans le vecteur pSV2S sont négatives et servent de contrôle. Neutralisation de l'infection due à HIV in vitro Par des séra immmuns dirigés contre les particules recombinantes n'8 Des lapins ont été immunisés avec des particules recombinantes HIVHBsAg et les séra ont été testés pour connaître leur capacité à neutraliser l'isolat LAV1BRU (24). L'infection virale dans les lymphocytes du sang périphérique a été étudiée grâce à l'activité reverse- transcriptase (RT) pendant trois à quinze jours. L'essai réalisé est fondé sur la réduction de l'activité RT en- présence de sérum immun, le résultat étant comparé au résultat obtenu en présence de sérum pré-immun du même lapin. Dans ce test, les anticorps ne peuvent pas neu- traliser efficacement le virus si des quantités satu- rantes de virions infectieux sont présentes. C'est pourquoi les tests ont été réalisés à partir des différents antiséra dilués (1:50) pour neutraliser les différents échantillons de virus (figure 4A, 4B, 4C). Le sérum du lapin immunisé avec la particule recombinante n'8 a neutralisé intégralement l'infectivité virale du virus le moins infectieux (figure 4) et on a observé une diminution de l'activité RT de 95 % à 63 % et 35 % lorsque l'on a augmenté l'infectivité de l'échantillon viral (figure 4D). Ceci montre que la capacité de neutralisation des antiséra est fonction de la quantité de virus. Des antiséra correspondant aux particules recom- binantes n'6 ont donné une neutralisation faible à une faible concentration de virus mais on n'a pas pu dé- tecter une réduction de l'activité RT avec l'antisérum de lapin immunisé avec le recombinant n' 2, même à une faible concentration de virus. De plus, la neutralisation de différents isolats de HIV1 a été examinée en utilisant une concentration constante de virus avec une dilution variable des antiséra dirigés contre la particule recombinante n'8. La figure 5 montre une réduction de 50 % de la capacité infectieuse de l'isolat LAVBRU avec une dilu- tion 1/50 comparée au sérum pré-immun. L'activité neutralisante de cet anti-sérum con- tre l'isolat zaïrois de HIV1 a également été montrée: un effet neutralisant de 50 % a été observé à une dilution 1/25, sur LAVELI (3) (figure 5). DISCUSSION la glycoprotéine interne d'enveloppe de HIV1, GP120, a priori intéressante pour sa capacité à induire une réponse immunitaire protectrice vis-à-vis de HIV, contient des régions conservées et d'autres régions va- riables entre les différents isolats de HIV. Les séquen- ces conservées à l'intérieur des domaines constants pourraient correspondre à des régions de séquences ayant une importance fonctionnelle potentielle. Comme le mon- trent les résultats rapportés plus haut, ces différentes régions conservées de l'enveloppe de HIV1 ont été choi- sies et exprimées sous forme de protéines de fusion avec la protéine moyenne de l'antigène de surface de l'hépatite B. La particule HBsAg présente de bonnes propriétés immunogènes selon deux aspects exploités par les inventeurs: i) c'est un polymère de haut poids moléculaire portant à sa surface de nombreuses copies de déterminants antigéniques; ii) elle porte également des épitopes T qui peuvent être utiles dans la reconnaissance d'épitopes B étrangers par le système immunitaire (27). Parmi les trois différentes régions conservées de HIV étudiées plus haut, l'une'd'entre elles (clone n'8) est liée au site de liaison CD4 (25), une autre (clone n'6) pourrait être impliquée dans le processus de fusion (26) , et la troisième (clone n'2) n'est reliée à aucune activité biologique connue. Les particules recombinantes HIV-HBsAg obtenues par fusion de ces déterminants antigéniques avec le produit du gène de la région pré-S2 ont été étudiées en utilisant des anticorps dirigés contre des peptides homologues synthétiques. Des analyses Western-blot ont permis de mettre en évidence la présence des détermi- nants antigéniques HIV sur les particules et la glyco- sylation probable des protéines de fusion. Les taux de protéine de fusion et de protéine native majeure observés dans les différentes particules recombinantes sont variables. Pour le recombinant n'8, la protéine de fusion est apparemment moins abondante, ce qui peut être lié à la taille relativement importante de la séquence étrangère insérée. La taille d'origine du produit de traduction pré-S2 de HBV est de 55 acides aminés alors que la construction de protéine de fusion augmente cette taille jusqu'à 111 acides aminés. La taille de la protéine à fusionner pourrait contrarier son insertion dans les particules de HBsAg. Pour les recombinants n'6 et n'2, le taux entre la protéine de fusion et la protéine majeure est compa- rable à celui observé entre la protéine moyenne et la protéine majeure dans les particules obtenues par trans- fection du vecteur d'expression pSVS des particules HBsAg d'origine (11). L'immunogénicité des particules recombinantes HIV-HBsAg a été rapportée plus haut. La réponse humorale est dirigée contre deux régions antigéniques et montre que les épitopes étrangers sont présents de façon effi- cace à la surface des particules. L'activité biologique des anticorps a été testée lors d'essais de neutralisation in vitro. Des épitopes neutralisants et non-neutralisants ont été mis en évi- dence dans les protéines d'enveloppe de HIV. Des anti- corps dirigés contre les recombinants n*8 ont un effet neutralisant potentiel sur l'isolat HIV (LAVBRU) utilisé & l'origine pour fabriquer des protéines de fusion. Un effet plus faible a été observé lorsque les anticorps ont réagi avec un isolat de HIV1 différent (LAVELI). L'insérat de HIV utilisé dans le recombinant n'8 couvre deux régions relativement bien conservées parmi les différents isolats HIV1, ces deux régions étant séparées par une région hypervariable caractéristique de l'iso- lat. Dans cette région, CEASE et al ont identifié un épitope de cellule T (30). De plus, des expériences faisant appel à des anticorps monoclonaux dirigés contre la GP120 ainsi que des expériences de mutagénèse in vitro ont permis d'identifier une séquence importante pour l'interaction avec le récepteur CD4 (25). On sait également qu'une protéine de fusion a été produite dans E. coli portant une séquence chevauchant en partie la séquence précé- demment utilisée et capable de conduire à la formation d'anticorps neutralisants et & une réponse immunitaire cellulaire (31). Dans le système HBsAg, les protéines de fusion peuvent être glycosylées normalement, ce qui peut être un élément important pour la production d'anticorps ayant une forte affinité vis-à-vis des épitopes et capa- bles de bloquer l'interaction de la protéine d'enveloppe de HIV et du récepteur CD4. De plus, le déterminant antigénique de HIV semble mieux exposé à la surface des particules que dans la protéine virale native GP. L'ef- ficacité inférieure de la neutralisation observée avec 1'isolat zairois LAVELI peut être attribuée à la va- riation de la séquence d'aminoacides d'environ 30 % dans une région déterminante pour- l'interaction entre le virus et le récepteur CD4 (25). Les anticorps dirigés contre les recombinants n'2 et n'6 ont également été testés dans des expériences de neutralisation. Les séquences de HIV portant le recombinant n'2 n'ont pas induit d'anticorps neutrali- sants lors de ces expériences. Une réponse immunitaire faible des animaux utilisés ou une faible immunogénicité de la région impliquée dans le recombinant n'2, pourrait expliquer ce résultat. La partie aminoterminale de la GP41 pourrait être impliquée dans le processus de fusion et en conséquence dans la neutralisation virale. De même, l'effet potentiel des anticorps obtenus par immunisation avec le recombinant n'6 vis-à-vis de l'infectivité de HIV1 a été testée. L'effet neutralisant est faible et l'inhibition de la formation des syncitia n'est pas complète. Ce résultat pourrait être attribué à à la taille limitée de l'insérat de HIV. Les inventeurs ont donc réalisé un système po- tentiellement capable de permettre la présentation des déterminants antigéniques étrangers de l'enveloppe de HIV, ce système permettant en outre la production d'anticorps neutralisants dirigés contre une région de la protéine d'enveloppe qui présenterait sous forme native des propriétés immunogéniques faibles ou ne serait pas présentée à la surface dans cette protéine native. Par ailleurs, la juxtaposition de déterminants antigéniques de HBV et de HIV à la surface de la même particule immunogénique peut permettre la réalisation de vaccins polyvalents. D'autres caractéristiques et propriétés de l'invention apparaîtront dans les figures qui suivent dont les légendes sont données ci-après. - FiQure 1 Vecteur d'expression et de clonage des fragments du gène de l'enveloppe de HIV. M13tg130 est un vecteur de clonage des fragments d'ADN de HIV. La région hachu- rée représente la partie N-terminale du gène de la p-galactosidase. Dans cette région, on trouve un adaptateur présentant de multiple sites de clonage. El: EcoRI, sm: SamI, Ss: SstI; EV: EcoRV, Sp: SphI, K: KpnI, Xb: XbaI, H: HindIII, B: BamHI, Sa: SalI, P: PstI. PSVS, pM2S, pSV2S et pSVS XL sont des vecteurs d'expres- sion. Xh: XhoI - Figure 2 Représentation schématique de la séquence d'aci- des aminés des fragments d'enveloppe de HIV fusionnée avec HBsAg. Le système de numérotation est celui qui a été donné par ALIZON et al dans l'article cité sous la référence (3). Les points et les flèches correspondent respectivement aux sites potentiels de glycosylation et aux cystéines conservées. Les séquences des 4 peptides représentent les régions conservées entre les isolats de HIV1 et de HIV2. - Fiaure 3 Analyse Western-blot des particules recombinan- tes de HBsAg. Les particules recombinantes n*2 (A), n* 8 (b), n'6 (C), ont réagi avec: un sérum ant-p49a dilué & 1:500 (lignes A1, B1, C1), un antisérum anti-peptide 5 (ligne A2), un antisérum anti-peptide 6 (ligne B2), un antisérum anti-peptide 7 (ligne B3) & une dilution de 1:25 et & une dilution de 1:200 d'un anticorps monoclo- nal 18/7 (ligne C2). Les tailles sont données en kilo- daltons. - Fiaure 4 Test de neutralisation: la cinétique de la neutralisation in vitro des différents échantillons de virus (A, B, C) par un antisérum dilué à 1:50 obtenu après immunisation d'un lapin avec le recombinant n'8 (o---o) ou avec un sérum pré-immun (o- o). L'activité réverse transcriptase a été déterminée par l'incorpo- ration de 13HI thymidine triphosphate (en cpm). Sur le graphique D, chaque point représente ie pourcentage d'inhibition RT pour A, B, C calculé comme suit cpm test RT sur culture avec sérum immun __ _ __ _ _ __ _ _ __ _ _ __ _ ___ x 100 cpm test RT sur culture avec sérum pré-immun - Fiaure 5 Neutralisation de HIV avec un sérum immun de lapin dirigé contre le recombinant n' 8: Des séra pré-immun (ligne continue) et immun (ligne pointillée) ont été testés pour connaitre la neutralisation du virus dans des cultures cellulaires, en utilisant deux isolats différents LAVBRU (cercles) LAVELI (triangles). L'activité reverse transcriptase a été mesurée après 7 à jours dans des surnageants de cultures cellulaires. - Fiaure 6 Sequences des protéines d'enveloppe des pro- téines d'enveloppe des rétrovirus SIVmac, HIV-2, HIV-1. Dans cette figure les tirets apparaissant dans les séquences ont pour seul objet de permettre l'alignement des séquences. Ces tirets n'ont donc pas de significa- tion scientifique. L'immunogénicité des particules préférées de l'invention peut également être attribuée à la glycosy- lation vraisemblable des peptides issus de HIV à l'occasion de l'expression des vecteurs recombinants sus-définis. Dans ce qui précède la région contenant la séquence d'acides aminés immunogène de HIV et son site d'attachement à des récepteurs CD4 des lymphocytes T4 provenaient le plus souvent d'une séquence commune appartenant à une glycoprotéine de surface ou trans- membranaire de HIV. Il va de soi que chacune de ces séquences peut provenir de régions éloignées l'une de l'autre dans les protéines naturelles de HIV. Dans ce dernier cas, elles consisteraient de préférence en une séquence recombinante ou en un polypeptide recombinant résultant de l'expression de deux séquences codées par les régions correspondantes du génome de HIV, voire même de HIV appartenant à des isolats différents. Dans ce qui précède il a également été remarqué que de préférence on avait recours à des séquences issues de HIV mais bien conservées dans les divers isolats disponibles de HIV. Il va néamoins de soi que l'on peut avoir recours même à des séquences moins bien conservées d'un isolat à l'autre. Dans une telle hypo- thèse, l'invention concerne également des compositions de particules répondant à la définition qui en a été donnée plus haut, ces particules se distinguant cepen- dant les unes des autres en ce qu'elles contiennent des séquences d'acides aminés communes avec des régions des glycoprotéines correspondantes d'isolats différents. L'invention concerne enfin les séquences d'acides aminés préférées issues de HIV, qui étaient identifiées dans le cadre de la présente description, par conséquent aussi les séquences d'ADN qui codent pour elles (comme d'ailleurs les polypeptides produits par synthèse chimique et présentant des propriétés immu- nologiques semblables, ainsi que toutes séquences d'acides nucléiques codant pour ces polypeptides, qu'il s'agisse de séquences naturelles ou produites par synthèse nucléotidique). En particulier les séquences d'acides aminés ci- dessus peuvent être utilisées pour la production de principes actifs de vaccins comprenant à titre de support une bactérie E.coli et, affleurant à la surface de cette bactérie, les séquences peptidiques sus-indi- quées de HIV. Pour la production de tels vaccins on peut avoir recours à la technique décrite dans la demande de brevet européen déposée le 6 Mars 1987 et publiée sous le numéro 0242.243. ut O TABLEAU I Antisera Antigène lapin dirigEs jnmbilisé HBsAg Pre-S2 contre les particudérivé du plasnma Peptide (120-145) Peptide 5 Peptide 6 Peptide 7 Peptide F les recoebinmates HIW-HBsA i 2 1I0-4 0 4.10'2 (2 x 3,5 pg)* n' 1032.10'3 5.10'2 (2 x 3,5 pg)* 2.1 -2 n; 6 5.10-5 1,6.10-3 - 10-3 (3 x 5 pg)* Tableau I: titres et spécificités des antiséra de lapin dirigés contre les particules recombinantes. * Les titres sont exprimés par la réciproque de la dilution du sérum donnant le triple de la densité obtenue avec un sérum pré-immun a la même dilution (=sérum témoin au jour 0). *: Les nombres entre' parenthèse font référence à des doses d'injection. tA Lfl (A K) REFERENCES 1. Allan,J.S. et al.(1985) Science 228, 1091-1093. 2. Robey, W.G. et al.(1985) Science 228, 593-595. 3. 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REVENDICATIONS 1/ Vecteur recombinant, comprenant un fragment d'acide nucléique correspondant à la région S et le cas échéant à tout ou partie de la région pré-S de l'antigène majeur de surface du virus de l'hépatite B, et permettant, lorsqu'il est introduit dans un hôte cel- lulaire eucaryote compétent, et à l'occasion de la culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, d'induire la production de particules ayant les caractéristiques morphologiques essentielles de l'antigène HBsAg, et, de préférence l'excrétion de ces particules dans le milieu de culture, caractérisé - en ce qu'il comprend en outre uà'séquence nucléo- tidique exogène codant pour une séquence d'acides aminés- immunogène induisant des anticorps neutralisants vis-à- vis d'un rétrovirus de la famille de HIV ou susceptible d'être reconnue par de tels anticorps, comprenant au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes B, et au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes T, et - en ce que ladite séquence nucléotidique exogène est soit insérée dans ladite région pré-S, soit substituée à tout ou partie de la dite région pré-S. / Vecteur recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique exogène code pour une séquence d'acides aminés immunogène com- prenant en outre au moins un site d'attachement au récepteur CD4. 3/ Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le susdit fragment d'acide nucléique est placé sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases d'un hôte cellulaire eucaryote. 4/ Vecteur recombinant selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur issu de SV40. / Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique insérée est substituée à la totalité de la région pré-S. 6/ Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique exogène est insérée dans la partie pré-S2 de la région pré-S. 7/ Vecteur recombinant. selon la revendication 6, caractérisé en ce que la région pré-S2 de part et d'au- tre de la séquence insérée a pour l'essentiel été délétée. 8/ Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications I à 7, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique exogène insérée comprend une séquence co- dant pour l'une des séquences d'acides aminés suivan- tes: X1 CHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTC Z1 X2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSC Z2 X3 CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC Z3 dans lesquelles les couples X1, Z1; X2, Z2 et X3, Z3 représentent soit des groupements COOH ou NH2 soit des séquences d'acides aminés comprenant normalement respectivement associées aux parties centrales correspondantes des séquences sus-indiquées dans les glycoprotéines des rétrovirus SIV, HIV-2, HIV-2 qui normalement les contiennent. 9/ Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications I à 8, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique exogène insérée code pour tout ou partie de l'une des séquences suivantes: RGEFLYCKMNWFLNWVEDRSLTTQKPKERHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLP PREGDLTCNSTVTSLIANINWTDG RGEFLYCNMTWFLNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNS TVTSIIANIDWQNN GGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAM YAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN / Vecteur recombinant selon la revendication 6, Caractérisé en ce qu'il est dérivé du vecteur pM2S. 11/ Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est dérivé du vecteur pSV2S. 12/ Particules recombinantes présentant les ca- ractéristiques morphologiques essentielles des par- ticules de HBsAg, et comprenant, affleurant à la surface de ces particules, l'essentiel de la séquence d'acides aminés (S) correspondant à la région S et le cas échéant à tout ou partie de la séquence d'acides aminés corres- pondant à la région pré-S du génome du virus de l'hépa- tite B, en amont de ladite séquence d'acides aminés (S), ces particules recombinantes étant caractérisées en ce- qu'elles comprennent en outre, une séquence d'acides aminés immunogène induisant des anticorps neutralisants vis-à-vis d'un rétrovirus de la famille HIV ou sucepti- ble d'être reconnue par de tels anticorps, cette séquen- ce comprenant elle-même au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes B, ou au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes T, cette séquence immunogène étant, soit insérée dans la séquence d'acides aminés pré-S, soit substituée tout ou partie de la protéine pré-S. 13/ Particules recombinantes selon la revendication 12, caractérisées en ce que la séquence d'acides aminés immunogène comprend en outre un site d'attachement au récepteur CD4 de lymphocytes T4 humains. 14/ Particules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisées en ce que la séquence d'acides aminés immunogène est soit insérée dans la séquence d'acides aminés codée par la région pré-S2 du génome du virus del'hépatite B, soit substituée à tout ou partie de la séquence d'acides aminés pré-S2. / Particules recombinantes selon l'une quelconque des revendication 12 ou 13, caractérisées en ce que la séquence d'acides aminés pré-S2 est, pour l'essentiel, délétée. 16/ Particules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisées par une activité immunogène lui permettant d'induire in vivo la production d'anticorps protecteurs contre un rétrovirus de la classe des cette séquence comportant elle-même au moins cette séquence comportant ellemême au moins s pathogènes pour l'homme. 17/ Particules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 & 16, caractérisées en ce qu'elles ont pour l'essentiel perdu la faculté d'induire in vivo la production d'anticorps neutralisants à l'égard du virus de l'hépatite B. 18/ Particules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 & 17, caractérisées en ce que la séquence d'acides aminés immunogène insérée est choisie parmi les séquences ci-dessous: X1 CHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTC Z1 X2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSC Z2 X3 CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC Z3 dans lesquelles les couples X1, Z1; X2, Z2 et X3, Z3 représentent soit des groupements COOH ou NH2 soit des séquences d'acides aminés comprenant normalement res- pectivement associées aux parties centrales correspon- dantes des séquences sus-indiquées dans les glycopro- téines des rétrovirus SIV, HIV-2, HIV-1 qui normalement les contiennent. 19/ Particules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 18, caractérisées en ce que la séquence d'acides aminés immunogène insérée est choisie parmis les séquences ci-dessous: RGEFLYCKM.WFLNWVEDRSLTTQKPKERHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLP PREGDLTCNSTVTSLIANINWTDG RGEFLYCNMTWFLNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNS TVTSIIANIDWQNN GGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAM YAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN / Hôte cellulaire d'origine eucaryote, caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, le rendant apte, lorsqu'il est mis en culture, à excréter des particules selon l'une quelconque des revendications 12 à 19. 21/ Hôte cellulaire selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule de mammifère. 22/ Hôte cellulaire selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une levure. 23/ Fragment immunogène d'acides aminés, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments ci-dessous: X1 CHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTC Z1 X2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSC Z2 X3 CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC Z3 dans lesquelles les couples X1, Z1; X2, Z2 et X3, Z3 représentent soit des groupements COOH ou NH2 soit des séquences d'acides aminés comprenant normalement respectivement associées aux parties centrales correspondantes des séquences sus-indiquées dans les glycoprotéines des rétrovirus SIV, HIV-2, HIV-1 qui normalement les contiennent. 24/ Fragment selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de l'un des enchaînements ci-dessous: RGEFLYCKMNWFLNWVEDRSLTTQKPKERHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLP PREGDLTCNSTVTSLIANINWTDG RGEFLYCNMTWFLNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNS TVTSIIANIDWQNN GGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAM YAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN / Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il code pour l'une des séquences d'acides aminés immunogènes selon la revendication 23 ou 24. 26/ Composition vaccinante destinée & la protection contre une infection par un rétrovirus de la famille de HIV, caractérisée en ce que son principe actif est for- mé, des particules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 19, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. 27/ Procédé de préparation d'un vecteur recombinant, caractérisé par les étapes suivantes: - la recombinaison in vitro et le cas échéant sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases d'un hôte cellulaire eucaryote, d'une part d'une séquence nucléotidique exogène codant pour une séquence d'acides aminés immunogène, induisant des anticorps neutralisants vis-à-vis d'un rétrovirus de la famille de HIV ou sucep- tible d'être reconnue par de tels anticorps, et compre- nant au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes B, au moins un épitope susceptible d'être reconnu par les lymphocytes T et le cas échant un site d'attachement au récepteur CD4, et d'autre part un enchaînement de nucléotides correspondant à la région S et le cas échéant à tout ou partie de la région pré-S, du génome du virus de l'hépatite B. - la récupération du vecteur recombinant formé compre- nant les éléments, tels qu'ils ont été définis plus haut. 28/ Procédé. selon la revendication 27, caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés immunogène correspond à l'insérat défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 11. 29/ Composition pour le diagnostic d'une infection due au rétrovirus HIV par la détection de la présence d'anticorps neutralisants dans un milieu biologique prélevé chez un patient, comprenant des particules recombinantes eslon l'une quelconque des revendications 18 ou 19 et/ou un fragment immunogène selon l'une' quelconque des revendications 23 ou 24 ou un 'mélange de ces composants. / Test pour le diagnostic in vitro d'une infection due à HIV par la détection de la présence d'anticorps neutralisants dans un milieu biologique prélevé chez un patient, caractérisé par: - la mise en contact, dans des conditions appropriées, d'une composition selon la reendication 29 avec le milieu biologique testé, - la détection de la formation d'un complexe antigène-anticorps. 31/ Procédé pour la production de particules recom- binantes selon l'une quelconque des revendications 12 à 19 caractérisé par: - la transformation d'un hôte cellulaire déterminé avec un vecteur recombinant selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 11, - la culture de l'hôte cellulaire transformé sur un milieu approprié et - la récupération des particules recombinantes formées.