Brevet FR2624741A1 — publié le 19890623

La présente invention est relative à un agent immunostimulant, présentant notamment des propriétés d'amplification du pouvoir protecteur d'antigènes vaccinants, et en particulier du vaccin antirabique. L'interleukine-2 (IL-2) est une lymphokine qui joue un rôle déterminant dans la réponse immune. Précedemment désignée sour le nom de "facteur de croissance des cellules T", 1'IL-2 est produite par des cellules lym phoïdes (principalement des lymphocytes T) stimulées par des antigènes ou des mitogènes. L'IL-2 présente une grande variété de propriétés immunorégulatrices. Elle favorise la prolifération et/ou la différenciation de cellules qui expriment un récepteur spécifique d'IL-2, notamment des cellules T, y compris les CTL (lymphocytes T cytotoxiques), les cellules tueuses naturelles (NK) et les cellules B.En raison de son action immunostimulante, 1'IL-2 est å présent utilisée en immunothérapie de patients humains, une telle utilisation est rendue d'autant plus facile que l'on dispose maintenant d'IL-2 humaine recombinante. On connait, dans le brevet européen 0 047 480, des vaccins constitués par des particules inactivées, qui ne présentent pas les réactions secondaires locales et générales indésirables habituelles, en raison du fait qu'ils sont constitués par des "immunosomes" très immunogènes, qui sont formés par des antigènes fixés sur la membrane d'un liposome préformé, et qui sont plus immunogènes que les sous-unités d'antigène viral utilisées pour la préparation de l'immunosome. Les liposomes1 sur la membrane desquels sont ancrés les antigènes, sont, en effet, des structures de transport d'un intérêt fondamental : ces structures se composent d'une double couche de lipides, en général des phospholipides tels que des lécithines, en alternance avec de l'eau ou une solution aqueuse, refermé pour former une "gouttelette", à laquelle on peut ajouter, par inclusion et/ou ancrage, divers constituants -médicaments, enzymes notamment - que l'on cherche à faire véhiculer par le sang jusqu'à des organes-cibles, sans que ces constituants soient dégradés sur leur parcours. I.J. FIDLER (cf. son article Activation of macrophages by liposomes containing both lymphokines and muramyl dipeptide for treatment of heterogeneous metastases"), paru dans Dev. Target-Oriented Anticancer Drugs, 1983, 219-226, a fait application des propriétés des liposomes pour le traitement des métastases de tumeurs solides. Il a pu établir, en effet, que les macrophages activés peuvent, de manière sélective, détruire des cellules tumorales, quel que soit leur type et il a montré que les liposomes multilamellaires contenant des immunomodulateurs, tels que les lymphokines ou le MDP (Muramyl dipeptide) ou les deux à la fois, constituent d'exceptionnels agents d'activation des macrophages de rongeurs, aussi bien in vivo qu'in vitro, et augmentent ainsi la résistance de l'hôte aux métastases spontanées.De tels liposomes sont phagocytés et produisent une forte activation des macrophages. Dans un article paru dans CELLULAR IMMUNOLOGY, 108, 220-226, 1987, D. OTH et al. font référence d'une part au fait que la production d'IL-2 par des cellules lymphoïdes, en particulier par les lymphocytes T cytotoxiques, est d'une importance majeure en ce qu'elle indique la présence d'un antigène et l'imminence des réactions immunologiques résultantes, et d'autre part au fait que les cellules lymphoïdes prélevées d'un organisme quelques jours après une première vaccination par des substances très antigéniques, présentent une capacité accrue à produire de l'IL-2, qui peut également entre restaurée par addition de l'antigène en cause au milieu de culture, mQme dans le cas où les - cellules lymphoïdes ont été prélevées assez longtemps après une vaccination.Après avoir rappelé que ces observations ont été faites avec différentes sortes. de stimuli antigéniques, tels que des vaccinations contre des virus et qu'il a notamment été observé que les cellules T peuvent être activées après une vaccination antirabique, les Auteurs montrent que les immunosomes (liposomes portant sur leur membrane la glycoprotéine purifiée qui constitue l'une des formes de l'antigène rabique) sont capables d'induire une réponse IL-2 spécifique alors qu'une quantité équivalente de la glycoprotéine purifiée utilisée seule ne détermine pas de production d'IL-2. Quatre facteurs semblent jouer un rôle important dans la réponse immune induite par la vaccination antirabique : 1) l'anticorps neutralisant le virus (VNAb) 2) les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) ; 3) les cellules cytotoxiques anticorps-dépendantes (ADCC) ; 4) l'interféron (IFN). WIKTOR et al. (PROC. NAT. ACAD. SCI. US, 1977, 74, 334-338 et DEVELOP. BIOL STANDARD; 1978, 40, 255-264) ont suggéré que les lymphocytes T cytotoxiques jouent un rôle important dans l'élimination du virus de la rage. Partant de là et compte tenu du fait que la prolifération in vitro des CTL dépend de la présence d'IL-2, les Inventeurs ont pu établir, de façon surprenante, que 1'IL-2 d'origine exogène est capable d'assurer, seule ou associée à des antigènes, une action immunoprotectrice ou immunothérapeutique, lorsqu'elle est associée à des liposomes.Ils ont également pu établir de façon surprenante - que 1'IL-2 d'origine exogène, associée à des liposomes, induit une protection indépendamment de toute vaccination - que 1'IL-2 d'origine exogène, associée à des liposomes et à un antigène, notamment à la glycoprotéine purifiée du virus de la rage, induit une amplification du pouvoir protecteur de l'antigène - que la présence des liposomes potentialise l'activité de l'IL-2 aussi bien exogène qu'endogène - et que l'association de l'IL-2 avec des liposomes permet la mise en oeuvre de l'IL-2 à des doses non toxiques. La présente invention a pour objet une composition présentant des propriétés immunostimulantes, caractérisée en ce qu'elle contient en combinaison, des liposomes préformés et de l'interleukine-2 (IL-2) ou une autre lymphokine qui exerce une action similaire à celle de l'IL-2. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition selon l'invention contient en combinaison des liposomes préformés, de l'interleukine-2 et un agent immunogène, notamment un antigène. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'antigène est choisi tel qu'il soit susceptible d'induire une vaccination. Selon un autre mode de réalisation de la composition conforme à la présente invention, les liposomes sont unilamellaires et constitués par une seule couche externe d'une phase interfaciale en bicouche entourant une phase polaire aqueuse, la couche interfaciale contenant au moins un phospholipide choisi dans le groupe qui comprend notamment la phosphatidylcholine et le cholestérol. Le procédé de préparation des compositions conformes à l'invention comprend le mélange des liposomes préformés avec l'IL-2 et éventuellement avec un agent immunogène approprié. La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une composition selon 1' invention. Ces compositions selon l'invention peuvent être administrées seules ou en combinaison avec des supports inertes acceptables du point de vue pharmaceutique. Ces compositions selon l'invention peuvent être utilisées dans la prévention et le traitement des infections virales, notamment l'herpès HSV2, comme adjuvant de vaccination prophylactique ou thérapeutique, notamment antirabique, comme immunostimulant, notamment dans le traitement des cancers, etc... Les Demandeurs formulent l'hypothèse, actuellement en cours de vérification, que l'amplification de la prolifération in vitro des cellules T-cytotoxiques (CTLL) par les liposomes en présence d'IL-2 est due à une interaction entre 1'IL-2 et le liposome plutôt qu'à une interaction du liposome avec la cellule en présence d'IL-2. Une hypothèse peut être émise : 1'IL-2 qui est hydrophobe interagirait avec les liposomes (adsorption par exemple, comme c'est le cas de l'albumine et de l'interféron alpha) et serait ensuite mieux reconnue par le récepteur des cellules T dont la prolifération serait amplifiée ; ou encore, la sollicitation simultanée de plusieurs récepteurs d'une même cellule par l'IL-2 absorbée à.' la surface des liposomes serait accompagnée d'une - plus grande prolifération des cellules. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparations des compositions selon l'invention, des compte-rendus d'expérimentation relatifs à la potentialisation de la substance associée aux liposomes, compositions conformes à l'invention. Exemple 1 : Préparation des liposomes. La préparation des liposomes (vésicules constitués de deux couches monomoléculaires de phospholipides) est fondée sur la méthode d'injection dans une solution tamponnée, de lipides maintenus en solution à l'aide d'un détergent dialysable (substance amphophile : ici l'OGP (octyl-glucopyranoside)). Les lipides utilisés sont : la phosphatidylcholine (PC) (Avanti Biochemicals Inc) et le cholestérol (Chol) (même fournisseur). Ils sont tout d'abord dissous séparément dans une solution 100 mM et 200 mM d'OGP respectivement (tampon 10 mM Tris-HCl pH - 7,4). Les lipides sont mélangés à raison de 8 molécules de PC pour une molécule de Chol. Le mélange est ensuite injecté à l'aide d'une fine aiguille (26 G) dans environ 20 volumes de PBS préalablement refroidi (glace fondante). Après agitation, la formation des liposomes est achevée au cours d'une dialyse contre du tampon PBS. Cette méthode conduit à l'obtention de liposomes monolamellaires de taille homogène (60 à 80 nm de diamètre). Exemple 2 : Préparation d'un mélange liposomes- IL-2. On mélange 0,3 pM de liposomes préparés selon l'exemple 1 avec 0,5 UI/ml d'IL-2. Exemple 3 On procède comme décrit dans l'exemple 2, en utilisant 2,5 UI/ml d'IL-2. Exemple 4 On procède comme décrit dans l'exemple 2, en utilisant 5 UI/ml d'IL-2. Exemple 5 On procède comme décrit dans l'exemple 2, en utilisant 10 UI/ml d'IL-2. Exemple 6 : Préparation d'un mélange liposoies- IL-2-antigène. On procède comme décrit dans l'exemple 3 et on ajoute comme antigène, de la glycoprotéine d'enveloppe du virus rabique. Exemple 7 : Effet de différents antigènes et des liposoies sur l'activité de l'IL-2 et la prolifération des CTLL (Cytotoxic-T Lymphocytes line). TABLEAU I Prolifération des CTLL : facteur d'amplification de l'efficacité de l'IL-2 mélangée à Virus(a) G(b) Nc(c) ISS(d) LIPOS(e) Virus + lipides Quantité d'IL-2 testée (UI/ml) 0,5 : - - - 1,3 6 2,5 : 1,4 0,93 1,3 1,1 4,15 1,3 5 - - - 2,0 3,33 10 : 1 0,91 1,2 1,75 5,5 1,82 Prolifération des CTLL : facteur d'amplification de l'IL-2 préalablement mélangée à 0,3 M de liposomes et ensuite aux antigènes Milieu Virus(a) G(b) NC(c) IMs(d > 2,5 : 4,1 4,6 3,6 4,6 4,5 10 : 3,92 3,74 2,85 3,55 3,7 (a) : virus rabique ; cal : glycoprotéine d'enveloppe du virus rabique ; (c) : Nucléocapside (d) :Immunosome ; (* tiposomes constitués des mêmes lipides que ceux du virus. Ce tableau montre deux séries d'expériences dans la première, une même quantité d'IL-2 a été mélangée & différents antigènes puis titrée. pour son aptitude à induire la prolifération des cel lules ; dans la deuxième, 1'IL-2 a préalablement été mélangée à des liposomes (0,3 pM de lipides), puis aux antigènes. Le facteur d'amplification est exprimé par le rapport des cpm mesurés avec le mélange IL-2-pro duit sur les cpm mesurés avec la même quantité d'IL-2 mais sans antigène ni liposomes. Les cellules CTLL correspondent à des lymphocytes T de souris qui ont été transformés et de ce fait peuvent être maintenus en culture par passages successifs. Ce sont des cellules dont la survie et le développement dépendent de la présence d'interleukine-2 (5-10 Unités Internationales par ml -UI/ml-). Elles sont cultivées en suspension en présence de 10 % de sérum foetal bovin et de 10 % de C02 (milieu RPMI-CTLL-1 complet). Les cellules CTLL utilisées pour doser 1'IL-2 sont donc totalement IL-2-dépendantes. Les antigènes rabiques sont sans action directe sur les CTLL en l'absence d'IL-2. Cependant, on a remarqué que les IMS pouvaient, selon les préparations, induire en présence d'IL-2 une prolifération plus importante des cellules que ne le faisait l'IL-2 seule. L'IL-2 étant une protéine hydrophobe, les lipides et plus particulièrement les liposomes ont été pressentis comme étant responsables de ce phénomène. En effet, les résultats reportés dans le tableau I révèlent que les liposomes potentialisent l'action de l'IL-2 en augmentant le prolifération des CTLL. Les raisons de ce phénomène ne sont pas connues. Il semble que l'amplification de la prolifération soit due à une potentialisation de 1'IL-2 par les lîposomes (on peut penser à une sollicitation simultanée de plusieurs récepteurs de l'IL-2 par le mélange IL-2-liposomes) plutôt qu'à une interaction entre le liposome et l'antigène ou la cellule. En effet, le virus induit une plus grande prolifération des CTLL lorsqu'il est ajouté à un mélange d'IL-2 et de liposomes (facteur d'amplification 3,7 à 4,5) que lorsqu'il est mélangé à des liposomes puis ajouté à 1'IL-2 (facteur d'amplification 1,3 à 1,82). De plus, le liposome mélangé à l'IL-2 amplifie la prolifération -des cellules. Exemple 8 : Association d'interleukine-2 humaine recoibinante au traitement antirabique. L'IL-2 stimule la prolifération de lymphocytes T cytotoxiques responsables en majeure partie de la protection antirabique. On a injecté de l'IL-2 à.des hamsters préaiablement infectés avec une dose létale 4e virus sauvage et éventuellement traités avec les IMS. On a choisi d'utiliser de l'IL-2 humaine recombinante pour deux raisons 1) ce produit pourrait être utilisé chez lthomme s'il s'avérait non toxique et efficace chez l'animal ; 2) parce que cette préparation de recombinant d'IL-2 est exempte de lymphokines ou de tout autre média- teur de l'immunité. Les résultats obtenus lors de l'association d'IL-2 au traitement sont reportés dans le tableau II, ciaprès. Lorsque l'IL-2 est injectée aux mêmes temps que l'antigène, on constate qu'elle n'amplifie pas son pouvoir protecteur. Par contre, lorsque 1'IL-2 est injectée sans antigène on enregistre une protection significative et du même niveau que celle obtenue par la vaccination : il semble que dans ce cas l'IL-2 potentialiserait l'action soit de l'inoculum et l'immunité spécifique, soit de l'immunité non spécifique qui-interviendrait pour éliminer le virus. Cependant, ce roll 'de l'IL-2 est complexe, car il peut être positif ou négatif, comme en témoigne l'action d'un mélange d'IL-2 et de liposomes. En- effet, on enregistre une mortalité plus importante lorsque l'IL-2 est mélangée aux liposomes que lorsque les deux produits sont injectés séparément (Tableau 11).Ces résultats sembleraient signifier qu'un taux trop important de cette immuno-hormone, par un mécanisme non encore élucidé, inhiberait la (ou les) réponse(s) conduisant à la protection. TABLEAU II Conséquences de l'adjonction d'IL-2 au traitement antirabique après exposition au virus Activité protectrice après traitement avec IL-2 (l d'anlmaux survivants) 1ère exp. Quantité d'IL-2 UI/injection Sans IL-2 10 5 l Sans Ag 0 50 40 50 IMS 0,2 g 33 33 ND* ND* IMS 1 g 33 33 ND* ND* Activité protectrice après traitement avec IL-2 Nombre et jours d'injection Sans IL-2 IL-2 seule IL-2 + lipos. IL-2 + lipos. (mélange) (inj. séparées) 2 inj. 3 in. 3 inj. 3 inj. (JO,J3) (JO,J3,J7) (JO,J3,J7) (JO,J3,J7) Sans Ag 0 ND* 60 40 IMS 0,5 ijg 40 20 40 0 40 Virus 0,5 g 60 ND* 0 ND* ND* ND* , non déterminé. Le tableau II ci-dessus montre que, dans le cadre du test de contrôle des vaccins après exposition au virus sauvage, des hamsters ont été traités par les IMS ou par le virus inactivé en association ou non avec 1'IL-2 humaine recombinante- ; dans la deuxième expérience, des liposomes ont été soit mélangés à l'IL-2 soit in jectés séparément deux heures après l'IL-2. Exemple 9 : Essai de potentialisation du pouvoir protecteur (pré-exposition) par l'association d'IL-2 à la vaccination. Compte-tenu de la place qu'occupe l'IL-2 dans la réponse immunitaire et du fait que la rage sauvage des prime spécifiquement sa production, l'IL-2 humaine recombinante a été associée aux vaccinations. De plus, il a été mis en évidence un phénomène d'amplification de la prolifération des cellules T en présence de liposomes et d'IL-2 (exemple 7) ; un mélange de liposomes et de virus purifié a aussi été utilisé afin de vérifier si les liposomes amplifiaient l'action de 1'IL-2 exogène, voire'peut-Qtre l'IL-2 endogène. Tout d'abord, dans une expérience préliminaire on a étudié quels pouvaient être la dose d'IL-2 et le moment d'injection pour obtenir une éventuelle amplification du pouvoir protecteur des IMS. D'après les résultats reportés dans le tableau III, on constate que 1'IL-2 est capable d'amplifier le pouvoir protecteur des IMS. En effet, alors que seulement 30 % des animaux sont protégés lorsqu'on injecte des IMS (à une dilution inférieure à la dose efficace 50 *), la totalité.des animaux est protégée par addition d'IL-2 pour des quantités variant de 10 à 100 UI/ml. De plus, il apparait qu'une injection tardive (à 14 jours) n'est pas aussi efficace. Dans une autre série d'expériences, (tableau IV) on a étudié, pour une même dose d'IL-2 (10 UI/inj.), l'influence du moment de l'injection, de la dose d'antigène et de la présence éventuelle de liposomes. Pour une quantité d'IMS supérieure à la dose efficace 50 %, le rôle de l'IL-2 semble équivoque puisque nous n'observons que 75 % de protection au lieu de 100 %. Par contre, lorsque la quantité d'IMS est inférieure à la DE 50 ~% (ici 2 pg/injection), l'injection d'IL-2 (7ème jour) au moment du rappel antigénique augmente la protection induite par les IMS mais aussi celle induite par le virus purifié. Lors du traitement par l'IL-2 on a observé une mortalité précoce chez 1) les animaux immunisés et traités avec l'IL-2 au jour O 2) les animaux immunisés et traités avec 1'IL-2 au jour 7. Le traitement au jour 7 conduit à un profil de mortalité identique à celui des InS seuls. Par contre, l'adjonction de liposomes au vaccin entraîne une mortalité plus tardive. Tout semble se passer comme si a) une meilleure protection (IL-2 à J7 le jour du rappel) résultait d'une diminution de la mortalité précoce b) une plus faible protection (IL-2 à JO) résultait d'une augmentation de la mortalité précoce. Cette constatation conduirait à penser que 1'IL-2 exogène agirait plutôt surun facteur immunopathologique (positivement ou négativement) que sur une fonction éliminant directement le virus. Le taux d'interleukine-2 au moment du rappel (ou au voisinage) joue un rôle important pour la protection ultérieure contre la rage. Ce taux d'IL-2 est amplifié-par la présence de liposomes ou d'immunosomes. TABLEAU III Potentialisation de la protection par injection d'IL-2 Protection (%) après injection d'IL-2 (UI/inj) 100 10 1 0 JourS d'injection de 1'IL-2 7 100 100 50 9 100 50 75 14 50 75 50 sans IL-2 - - - 30 TABLEAU IV Nature et quantité Jour d'inJectlon Protection AcN IL-2 d'antigène injecté IL-2 : 10 UI/inj. O UI/ml (UI/ml) ng/in. 0 - 0 IMS 10 - 100 13 5,6 IMS 10 0 75 80 8 IMS 10 7 75 38 3,6 Ins lO 0 + 7 100 42 5,1 IMS 2 - 12 6 1,2 IMS 2 0 0 8 5,5 IMS 2 7 40 3 5,9 IMS 2 0 + 7 60 3 6,8 Vaccin 1,5 O ~ Vaccin 1,5 0 50 '- Vaccin 1,5 7 33 - Vaccin 1,5 10 33 - Vaccin 1,5 14 0 Vaccin 1,5 0 + 7 16 - Vaccin + Liposomes - 40 - Le tableau IV ci-dessus montre que, dans le cadre du test du NIH, des souris ont été vaccinées aux jours 0 et 7 puis éprouvées au jour 21. Certaines d'entre elles ont reçu une ou plusieurs injections d'IL-2 humaine recombinante. La protection est exprimée par le rapport du nombre d'animaux survivants sur le nombre d'animaux éprouvés. De plus, pour certains d'entre eux le taux d'anticorps neutralisants (AcN) et le taux d'IL-2 ont été déterminés le jour de l'épreuve après simple stimulation par le milieu de culture en absence d'antigène. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toute les variantes qui peuvent venir å l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1) Composition présentant des propriétés immu nostimulactes, caractérisée en ce qu'elle contient en combinaison des liposomes préformés et de l'interleukine-2 (IL-2) ou une autre lymphokine exerçant une action similaire à celle de l'IL-2. 2 ) Composition présentant des propriétés immunostimulantes, caractérisée en ce qu'elle contient en combinaison des liposomes préformés, de 1'IL-2 et un agent im munogène, notamment un antigène. 3.)' Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'antigène est choisi tel qu'il présente des propriétés vaccinantes. 4') Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les liposomes sont unilamellaires et constitués par une seule couche externe d'une phase interfaciale en bicouche entourant une phase polaire aqueuse, la couche interfaciale contenant au moins un phospholipide. 5') Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le phospholipide est choisi dans le groupe qui comprend notamment la phosphatidylcholine et le cholestérol. 6 ) composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle ccntient une composition selon lune quelconque des reveications 1 à 5. 7 ! Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est administrée seule ou en com Dina;son avec des supports inertes acceptables du point de vue pharmaceutique. 8-) Applications de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, notamment à la prévention et au traitement des infections virales, en tant qutadJuvant-de vaccination prophylactique ou thérapeutlque, notamment antirabique ou comme immunostimulant, notamment dans le traitement des cancers.