Brevet FR2635533A1 — publié le 19900223

La présente invention se rapporte à la médecine et, concerne, plus précisément, une préparation d'un mélange de ribonucléotides employé en thérapeutique comme médicament pour traiter les abiotrophies tapétorétiniennes et autres ma- ladies. Les abiotrophies tapétorétiniennes forment un grou- pe de maladies héréditaires de l'homme qui altèrent la vue et conduisent à la cécité. Ces maladies sont assez répandues et concernent de 0,5 à 5 personnes sur 1000 habitants. Or, jus- qu'à présent, il n'existe pas de moyens efficaces de traite- ment des abiotrophies tapétorétiniennes. On connatt un procédé de fabrication d'un mélange de ribonucleotides doué de propriétés pharmacologiques ("Bul- letin de biologie expérimentale et de médecine", 1969, Mos- cou, N 9, p. 23 à 26). Ce procédé consiste à traiter l'acide ribonucléique à une concentration comprise entre 5 et 10 mg/ ml par la ribonucléase pancréatique à une température de 45 C pendant 1 heure. Ce procédé a, cependant, un faible rendement en produit désiré. Le mélange de ribonucléotides obtenu contient en outre des additifs, tels que protéines, substances pyrogé- niques à haut poids moléculaire et ne peut donc être soumis qu'à une application locale sous forme de bandages externes. L'administration per os de la préparation indiquée peut, en outre, entraîner une dégradation importante des nucléotides du médicament, ce qui compromet l'efficacité du traitement. On connait aussi un procédé de fabrication d'un mé- lange de ribonucléotides (Vestnik de l'Académie des Sciences médicales d'U.R.S.S., 1971, Méditsina, N 7, p. 63 à 69). Le procédé consiste à hydrolyser l'acide ribonucléique de levu- re par la ribonucléase pancréatique, puis à dialyser l'hydro- lysat obtenu, et isoler et concentrer le produit désiré. Le rendement en produit désiré s'élève à 40 à 43 % en poids. Ce procédé a un faible rendement en produit désiré, une pureté insuffisante due à la présence de composés pyrogé- niques à bas et à haut poids moléculaire. Lors d'injections intramusculaires de la préparation mentionnée, on note une forte douleur, une élévation de la température corporelle chez la plupart des malades, des réactions allergiques, tan- dis qu'en injections subconjonctivales, on observe une hype- rémie et un oedéme de la conjonctive bulbaire avec gonflement et douleur des ganglions lymphatiques optiques. Le problème résolu par la présente invention consis- tait, par conséquent, à élaborer un procédé permettant-d'aug- menter le rendement en produit désiré, d'élever sa pureté et d'éliminer son action pyrogène. Par conséquent, l'objet de l'invention consiste en un procédé de préparation d'un mélange de ribonucléotides con- sistant en une hydrolyse de l'acide ribonucléique de levure au moyen de la ribonucléase pancréatique, suivie de la séparation à partir de l'hydrolysat obtenu de la fraction contenant les ribonucl&otides et de l'extraction à partir de celle-ci du produit désiré, caractérisé en ce que, l'hydrolyse de l'acide ribonucléotide de levure est réalisée à un pH compris entre 4,5 à 5,5, et que la séparation de la fraction contenant les ribonucléotides à partir de l'hydrolysat est effectuée sur des membranes dont les pores ont un diamètre compris entre 5 et nm. Afin d'augmenter le rendement en produit désiré, on préfère mener l'hydrolyse à une température comprise entre 62 et 65 C. A une température inférieure à 62 C, l'hydrolyse en- zymatique par la ribonucléase pancréatique, se déroule lente- *ment, tandis qu'à une température supérieure à 65"C, l'enzyme est partiellement dénaturée et l'hydrolyse devient incomplète. Afin d'éliminer la formation de flore microbienne, on ajoute de manière avantageuse dans l'hydrolysat, avant la séparation de la fraction contenant les ribonucléotides, dé l'éthanol en une quantité comprise entre 15 et 30 % du volume de l'hydrolysat. Une quantité d'éthanol inférieure à 15 % en volume ne freine pas la formation de la flore microbienne, alors qu'une quantité supérieure à 30 % en volume entraîne une précipitation partielle des ribonucléotides. Il est avantageux d'effectuer la séparation de la fraction contenant les ribonucléotides sur des membranes à une température comprise entre 20 et 30 C et à une pression comprise entre 0,15 et 0,4 MPa. La filtration du mélange à une pression inférieure à 0,15 MPa et à une température in- férieure à 20 C augmente notablement la durée du processus sans élever le rendement de la préparation, tout en laissant subsister le risque de contamination par la flore microbien- ne. Une pression supérieure à 0,4 MYa et une température su- périeure à 30 C peuvent conduire à une modification de la composition de la préparation en mime temps qu'à la destruc- tion des membranes. Selon l'invention, la séparation du produit désiré s'effectue par précipitation de la fraction contenant les ribonucléotides par 8 à 10 volumes d'éthanol, par volume de la fraction contenant les nucléotides, élimintation du sol- vant et séchage du produit désiré. La séparation du produit désiré peut aussi être réa- lisée par précipitation du mélange contenant les ribonucléoti- des par 8 à 10 volumes d'éthanol, par volume de mélange, éli- mination du solvant, dissolution du résidu dans une solution à 0,55 à 0,65 % de chlorure de sodium jusqu'à une concentra- tion du mélange contenant les ribonucléotides comprise entre 3,3 et 3,7 % en poids, filtration de la solution ainsi obte- nue sur des membranes dont les pores ont un diamètre de 200 à 220 nm sous une pression de 78 à 98 kPa. La précipitation du mélange des ribonucléotides par un volume d'éthanol inférieur à 8 volumes, volume du mé- lange, ne permet pas d'éliminer entièrement les composés py- rogènes à bas poids moléculaire, tandis que la précipitation par un volume d'éthanol supérieur à 10 volumes n'apporte au- cun effet positif. Quand on obtient une préparation de ribonucléotides à une concentration supérieure à 3,7 % en poids, on note une pyrogénéité prononcée, tandis que l'utilisation de la prépa- ration à une concentration inférieure à 3,3 % en poids impose une augmentation du volume de liquide injecté, ce qui est in- désirable pour le malade. Une filtration réitérée sur membranes, dont le dia- mètre des pores est inférieur à 200 nm, ralentit la vitesse du procédé, alors qu'une filtration sur une membrane dont le diamètre des pores est supérieur à 220 nm de diamètre, rend la préparation pyrogène et non conforme. Le procédé selon l'invention permet d'augmenter de 8 à 15 % le rendement en produit désiré par rapport au procé- dé connu, d'élever sa pureté, et aussi de supprimer sa pyro- généité. Le procédé selon l'invention est décrit plus en dé- tail, ci-après. L'acide ribonucléique de levure est mis en suspen- sion dans de l'eau distillée, le pH de la solution est ajus- té au moyen d'une solution alcaline jusqu'à un pH de 4,5 à ,5. A cette solution, on ajoute la ribonucléase pancréatique, on chauffe la solution jusqu'à une température de 62 à 65 C, et on maintient la solution à cette température de manière à réaliser l'hydrolyse de l'acide ribonucléique. L'hydrolyse étant terminée, on refroidit l'hydrolysat, on ajoute de l'é- thanol et on agite. Pour séparer le précipitat finement dis- persé, formé après l'addition de l'éthanol, le mélange est soumis à une microfiltration. La solution filtrée est ensuite fractionnée par ultrafiltration à travers des membranes ayant des pores de 5 à 15 nm de diamètre, de préférence à une tem- pérature de 20 à 30 C et à une pression de 0,15 à 0,4 MPa. Apres la séparation du filtrat, le concentrat est dilué à l'eau distillée et on obtient une quantité supplémentaire de filtrat. On ajoute à la quantité totale de l'ultrafiltrat, sous agitation, l'éthanol. Après défécation du mélange, le liquide surnageant est décanté, le dépôt de produit désiré est lavé avec une petite quantité d'éthanol, on filtre ensuite l'éthanol et le dépôt est séché. Le produit désiré peut aussi bien être obtenu sec qu'en solution. Dans ce cas, le mélange des ribonucléotides, séparé après précipitation par 8 à 10 volumes d'éthanol, est dissous dans une solution à 0,55 a 0,65 % de chlorure de so- dium jusqu'à atteindre une concentration de 3,3 à 3,7 % en poids. La solution obtenue est filtrée sur une membrane dont les pores ont un diamètre de 200 à 220 nm, sous une pression de 78 à 98 kPa. Le produit désiré est obtenu sous forme d'une pou- dre amorphe blanche ou légèrement jaunftre, bien soluble dans l'eau, dans les solutions aqueuses de chlorure de sodium, se dissolvant moins bien dans l'éthanol, et insoluble dans l'acé- tone et l'éther. La préparation comprend un complexe de mono- oligoribonucléotides (jusqu'aux hectomêres inclusivement) dont la principale partie (jusqu'à 40 % en poids) est composée de dinucléotides. Le mélange de ribonucléotides, obtenu d'après le procédé selon l'invention, a été expérimenté en clinique sous contrôle strict des résultats du traitement qui comportaient l'étude du champ visuel, les électrorétinogrammes, l'adapta- tion à l'obscurité et l'acuité de la vue. Les essais ont été réalisés sur un total de 2500 patients. La durée du traitement était de 10 à 15 jours. La préparation était administrée par injections intramusculaires de 150 à 200 mg par jour en 2 fois à un intervalle de 4 à 6 heures. Sur 2500 patients, 467 faisaient l'objet d'un trai- tement de longue durée (de 4 à 14 ans et plus). L'analyse des résultats obtenus lors d'une observa- tion prolongée montre que chez 60 % des malades, on note une stabilisation ou une stabilisation avec amélioration du cours de cette maladie grave évolutive. On observe, en outre, une meilleure aptitude des patients à s'orienter lors de déplace- ments aussi bien dans un local fermé qu'en plein air. Les exemples non limitatifs suivants donnent une meilleure illustration du procédé selon l'invention. EXEMPLE 1 On dissout 70 g d'acide ribonucléique de levure, dans 430 ml d'eau distillée, et on porte le pH de la solu- tion jusqu'à 5,1 avec NaOH2N. On ajoute 140 mg de ribonu- cléase pancréatique et on laisse l'hydrolyse s'effectuer durant 5 heures à la température de 65 C. Le volume total d'hydrolysat est de 465 ml. On refroidit ensuite jusqu'à une température de 25 à 35 C, on ajoute 120 ml d'éthanol, on filtre le dépôt finement dispersé formé et le filtrat est soumis à une ultrafiltration sur membrane d'acétylcel- lulose ayant des pores de 10 nm de diamètre (membrane à surface utile de 100 cm2), sous une pression de 0,4 MPa et à une température de 30 C. On obtient 360 ml de filtrat. A la masse restante, on ajoute à deux reprises par 70 ml d'eau et on obtient en supplément 140 ml de filtrat. Le filtrat (500 ml) est mélangé à 5 1 d'alcool éthylique (10 volumes d'éthanol 1 volume de filtrat). La suspension obte- nue est refroidie jusqu'à O à 4 C, et maintenue à cette température durant 4 heures. Le résidu est séparé par fil- tration, lavé avec 0,360 1 d'alcool éthylique et mis à sé- cher sous vide. Le rendement en produit désiré est de 36 g. L'extinction spécifique E1 cm 1 % = 240 pour = 260 nm et pH = 2. Les rapports des absorptions lumineu- ses (A) à pH 7 et aux Iongueurs d'ondes 230 nm, 260 nm, 280 nm sont respectivement: A 260/230 3,15 A 260/280 1,60 Composition du produit désiré obtenu, % en poids: nucléosides 1,5 mononucléotides 25,6 dinucléotides 28,1 trinucléotides 23,8 tétranucléotides 12,8 pentanucléotides et oligonucléotides supérieurs le complément à 100. EXEMPLE 2 On dissout 67 g d'acide ribonucléique de levure, dans 400 ml d'eau distillée, et on porte le pH de la solu- tion jusqu'à 4,5 avec NaOH2N. On ajoute 130 mg de ribonu- cléase pancréatique et on laisse l'hydrolyse s'effectuer durant 5 heures à la température de 62 C. Le volume total de l'hydrolysat est de 430 ml. Apres refroidissement jus- qu'à une température de 25 à 35 C, on ajoute à l'hydrolysat 64,5 ml d'éthanol et on filtre. On fractionne par ultrafil- tration sur membrane d'acétylcellulose dont les pores ont nm de diamètre (membrane à surface utile de 100 cm2) à une température de 20 C et sous une pression de 0,3 MPa. On obtient 380 ml de filtrat en 6 heures. On ajoute à la masse restante 65 ml d'eau, ce qui permet d'obtenir un supplément de 65 ml de filtrat. Le filtrat, ayant un volume total de 445 ml, est mélangé avec 3,6 1 d'alcool éthylique. Le dépôt qui se forme ainsi est filtré, lavé avec 0,3 1 d'éthanol et séché dans une étuve sous vide. Le rendement en produit désiré est de 39 g. L'extinction spécifique E1 cm ' 1 % = 240 pour 260 nm et pH = 2. Rapports des absorptions lumineuses à pH 7 et aux longueurs d'ondes de 230 n, 260 nm et 280 nm: A 260/230 3,90 A 260/280 1,70 Composition du produit désiré, % en poids: nucléosides 4,8 mononucléotides 19,3 dinucléotides 23,1 trinucléotides 20,2 tétranucléotides 16,9 pentanucléotides et oligonucléotides supérieurs le complément à 100 EXEMPLE 3 On dissout 77 g d'acide ribonucléique de levure, dans 460 ml d:eau distillée, et on porte ie pH de la solu- tion jusqu'à 5,5 avec NaOH 2N. On ajoute 150 mg de ribonu- clease pancréatique et laisse l'hydrolyse s'effectuer du- rant 5 heures à la température de 65 C. Le volume total de l'hydrolysat est de 500 ml. On refroidit ensuite jusqu'à une température de 25 à 35 C, on ajoute 150 ml d'éthanol. Le dépôt finement dispersé qui se forme est alors filtré. Le filtrat est soumis à une ultrafiltration sur membrane d'acétylcellulose dont les pores ont 5 nm de diamètre (mem- brane à surface utile de 100 cm2) sous une pression de 0,2 MPa et à une température de 25WC pendant 4 heures. Le fil- trat (560 ml) est mélangé à 4,5 1 d'alcool éthylique (8 vo- lumes d'éthanol 1 volume de filtrat), la suspension obtenue est refroidie jusqu'à O à 4 C, et maintenue à cette tempé- rature durant 4 heures. Le dépôt précipité est séparé par filtration, lavé avec 0,4 1 d'alcool éthylique et séché à l'étue sous vide. Le rendement en produit désiré est de 40 g. L'extinction spécifique E1 cm. 1 % = 228 à = 260 nm et pH 2. Rapports d'absorptionslumineuses à pH 7 et aux longueurs d'ondes de 230 nn, 260 nm et 280 nm: A 260/230 4 A 260/280 1,55 Composition du produit désiré, % en poids nucléosides 2,1 mononucléotides 12,6 dinucléotides 25,2 trinucléotides 24,2 tétranucléotides 18,5 pentanucléotides et oligonucléotides supérieurs le complément à 100. EXEMPLE 4 L'hydrolyse de l'acide ribonucléique de levure et la séparation de la fraction contenant les ribonucléotides sont effectuées de manière analogue à celle décrite dans l'Exemple 1. Le dépôt isolé (36 g de mélange sec) est dis- sout dans une solution de chlorure de sodium à 6 %, dans de l'eau distillée (958 ml), et on agite jusqu'à dissolution complète. La solution jaune obtenue est filtrée sur filtre à l'ouate et en gaze, puis sur une membrane ayant des pores de 200 nm de diamètre sous une pression de 98 kPa. Dans des conditions stériles, la solution de ribonucléotides est mise dans des ampoules de verre neutre de 3 ml qui sont ensuite autoclavées à la température de 119 C durant 34 minutes. La concentration des ribonucléotides dans le produit désiré est de 3,3 %, la densité, de 1, 01 g/cm3. On obtient un produit non toxique, stérile, apyrogène, dont la composition est analogue à celle décrite dans l'Exemple 1. EXEMPLE 5 L'hydrolyse de l'acide ribonucl ique de levure et la séparation de la fraction contenant les ribonucléotides sont menées de manière analogue à celle de l'Exemple 2. Le dépôt, après séparation, (39 g de mélange sec) est dissous dans une solution de chlorure de sodiuúm à 0,55 % (995 ml) dans de l'eau distillée et on mélange jusqu'à la dissolution complète. La solution jaune obtenue est filtrée sur filtre à l'ouate et en gaze, puis sur membrane dont les pores ont 220 nm de diamètre sous une pression de 78 kPa. Dans des conditions stériles, la solution des ribonucléotides est mise dans des ampoules de verre neutre de 3 ml qui sont ensuite autoclavées a 122 C durant 32 minutes. La concentration des ribonucl&otides dans le produit désiré est de 3,7 %, la den- sité, de 1,008 g/cm3. Le produit obtenu est non toxique, stérile. Son application ne provoque pas d'effet pyrogène, Sa composition est identique à celle de l'Exemple 2. REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication d'un mélange de ribonucléo- tides consistant en une hydrolyse de l'acide ribonucléique de levure au moyen de la ribonucléase pancréatique, suivie de la séparation à partir de l'hydrolysat obtenu de la fraction con- tenant les ribonucléotides et de l'extraction à partir de cel- le-ci du produit désiré, caractérisé en ce que l'hydrolyse de l'acide ribonucléique de levure est réalisée à un pH compris entre 4,5 et 5,5, et que la séparation de la fraction conte- nant les ribonucléotides à partir de l'hydrolysat est effec- tuée sur des membranes dont les pores ont un diamètre compris entre 5 et 15 nm. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrolyse est réalisée à une température comprise entre 62 et 65 C. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'avant la séparation de la fraction conte- nant les ribonucléotides, on ajoute dans l'hydrolysat une quantité d'éthanol comprise entre 15 et 30 % par rapport au volume de l'hydrolysat. 4. Procédé d'après l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séparation de la fraction des ribonu- cléotides sur membranes est réalisée à une température compri- se entre 20 et 30 C sous pression comprise entre 0,15 et 0,4 MPa. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'extraction du produit désiré est réa- lisée par précipitation de la fraction contenant les ribonu- cléotides par 8 a 10 volumes d'éthanol par volume de la frac- tion contenant les ribonucléotides, élimination du solvant et séchage du produit désiré. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séparation du produit désiré est ef- fectuée par précipitation de la fraction contenant les ribo- nucléotides avec 8 à 10 volumes d'éthanol par volume de la fraction contenant les ribonucl&otides, élimination du solvant, dissolution dans une solution de chlorure de sodium à 0,55 à 0,65 %, jusqu'à l'obtention d'une solution ayant une concentra- tion comprise entre 3,3 et 3,7 % en poids, filtration de la so- lution obtenue sur membranes dont les pores ont 200 à 220 né de diamètre sous une pression comprise entre 78 et 98 kPa.