Brevet FR2634380A1 — publié le 19900126

La présente invention a pour objet un nouveau produit, extrait d'une plante, et a usage de régulateur biologique actif dans diverses pathologies. Pour la commodité de l'exposé ce produit sera appelé BIOPARYL dans la description et les reven- dications. Ce n'est pas une marque, c'est un nom proposé pour désigner ce produit. Le maintien cellulaire puis la division de la cellule exigent la reproduction du génome (ADN), puis la transcription de celui-ci en divers ARN dont les ARN-messagers, ces derniers dirigeant à leur tour la synthèse des protéines. L'extrême complexité du milieu biologique permet aux enzymes présentes d'assurer l'ensemble de ces fonctions. La pathologie peut résulter d'altérations ou de dégradations des éléments en cause dans l'une ou l'autre de ces étapes. En outre des facteurs endogènes ou exogènes peuvent également affecter le déroulement de ces diverses étapes. Mais inversement, une dérégulation, un état pathologique peuvent être améliorés par l'introduction dans le système biologique d'entités agissant directement ou indirectement, mais toujours de façon sélective, sur l'ADN, sur les ARN ou les enzymes. Brève description de l'invention Un matériel a été préparé et nommé "Bioparyl". Il joue un rôle important dans la régulation de certaines enzymes, les ribonucléases en particulier mais d'autres également, enzymes impliquées dans les mécanismes fondamentaux du fonctionnement des gènes Il agit à différents niveaux cellulaires, toujours de façon sélective sur ce qui est pathologique, enzymes déré- gulés, ADNs de cellules lésées ou même cancéreuses. Son mode 2634380 2 de préparation est original ainsi que son champs d'application. Bioparyl est obtenu à partir de feuilles dorées de l'arbre Gingko biloba, récoltées à la fin de l'automne. C'est une prépa- ration standardisée comportant plusieurs étapes: extraction du principe contenu dans les feuilles par plusieurs heures d'ébulli- tion en présence d'eau. Concentration de l'extrait. Hydrolyse à chaud, neutralisation partielle, centrifugation et fractionnement sur colonne de chromatographie. Seule une sous fraction-de l'extrait initial constitue le Bioparyl. Le Bioparyl est dépourvu d'effets toxiques ou secondaires, tant au niveau cellulaire que chez l'animal. Il peut être utilisé durant de longues périodes afin d'améliorer diverses pathologies. Il est exempt des effets sur la tension artérielle habituels aux autres produits préparés par d'autres méthodes à partir des feuilles du même arbre. Le Bioparyl est très efficace dans le traitement ou dans la- prévention de la fibrose de divers tissus ou organes survenue soit sans cause connue soit suite à différents traitements: rayons, médicaments (bieomycine).-1 peut guérir des fibroses déjà installées par ces agents. Il possède un certain pouvoir spécifique contre les cellules tumorales. Il normalise aussi le taux des gamma- globulines trop élevé, s'accumulant dans certaines maladies inflammatoires, maladies auto-immunes ou maladies virales, tel le Syndrome d'Immuno-Déficience (SIDA). Chez les patients atteints de maladies malignes (cancers solides, cancers du sang ou de la iymphe),on détecte pratique- ment toujours des anomalies quantitatives et/ou qualitatives de l'activité des ribonucléases (RNases).Le Bioparyl normalise le le fonctionnement et le taux de ces enzymes, ce qui apour conséquence 2634380 3 d'améliorer l'état général du malade et d'entraver l'apparition d'éléments nécessaires au développement de la pathologie. Illustrations Fig.l. Activité in vitro des RNases du plasma de personnes saine ou porteuse de cancer sur les ARN radioactifs ribosomique et de transfert (ARN-r et ARN 4 S). Fig.2 et 3. Effet du Bioparyl sur les activités des RNases du plasma de malades porteurs de différentes pathologies. Fig.4. Absence d'effet du Bioparyl sur les RNases du plasma des sujets sains. Fig.5. Action du fer sur l'activité des RNases chez un sujet atteint de cancer et chez une personne saine. Action du Bioparyl. Fig.6. Action normalisatrice du Bioparyl sur les RNases plasmatiques chez les sujets porteurs de cancers Fig.7. Activité des RNases de la peau humaine fibrosée.Action du fer et du Bioparyl. Fig.8. Stimulation par le Bioparyl de la synthèse in vitro de l'ADN de la peau saine.Belle action inhibitrice sur celle du mélanome. Fig.9. Inhibition de la synthèse d'ADN des cellules cancéreuses et les fig. , 11, 12 sont 3 tableaux, respectivement: Tableau I: Rôle du Bioparyl dans la normalisation du taux des gamma-globulines et immuno- globulines dans deux cas de maladies autoimmunes et dans un cas de SIDA. Tableau II. Inhibition de la multiplication des cellules cancéreuses chez la souris sous l'effet du Bioparyl (ascite d'Ehrlich) Tableau III: Inhibition de la multiplication des cellules cancéreuses chez la souris sous l'effet du Bioparyl (Lymphome YC8). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Méthode de préparation du Bioparyl à partir des feuilles dorées d'automne du Gingko bilQba En automne, juste au moment de leur chute, les feuilles dorées de l'arbre Gingko biloba (aussi quelque fois appelé Ginkgo, sont récoltées. Elles peuvent être soit congelées soit séchées. Cinq à sept kilos de feuilles congelées (ou environ 2,5 - 3 kg de feuilles sèches) sont recouvertes d'eau de robinet (environ 7-8 litres) et l'ensemble est porté à ébullition pendant 3 à 4 heures. Le liquide est prélevé puis concentré à 1 litre ( une deuxième ébullition des feuilles est pratiquée, et le liquide provenant de cette seconde extraction servira pour la première extraction d'un nouveau lot de feuilles). Pour 1 litre de liquide concentré, l'acide chlorhydrique concentré est additionné afin d'avoir une concentration d'acide de 1 N finale. Le mélange est alors porté à 100 C pendant min. Lorsque la température est redescendue à environ 50 C, le pH est ramené à environ 3 ou 4 ( par addition de KOH ou NaOH). Une centrifugation rapide ( 5-7 min à 6000 tours/ min..) est pratiqué..Une quantité très importante de matériel hydrolysé insoluble est alors 1éliminée. Le surnageant (liquide brunrouee) est seul conservé et utilisé soit directement soit congelé. Ce matériel est appelé ZAC. 2634380 5 - 300 gr de ZAC (environ 300-400 ml, poids sec déter- miné sur 0.5 ml) sont déposés au sommet d'une colonne de Sephadex G-25 fine ( 70 cm x 7 cm) préalablement gonflé et équilibré en eau déminéralisée. L'élution s'effectue à l'aide d'eau déminéralisée, du début de l'élution à la fin de la partie fluorescente blanc- jaune (visible en lumière ultraviolette); les éluats sont réunis et concentrés soit par distillation soit par ébullition sous air comprimé, ce qui est un moyen rapide. Lorsque l1éluat est concentré à environ 1 litre, le pH est ajusté à environ 7,0 et la quantité de matériel est déterminée par pesée poids sec d'une quantité aliquote. Le poids total divisé par 30 donnera le nombre de chaque malade pouvant utiliser pendant 30 jours (1 mois) 0.5 g x 2 chaque jour de bioparyl. Soit A ce nombre de malades. Le liquide est alors concentré à nouveau à environ 500 ml puis adsorbé sur de la poudre de cellulose (Whatman CF1) et séché dans un four ( 60 - 80 C) pendant plusieurs heures. Le matériel doit être mélangé de temps à autre afin d'éviter la formation de grumeaux Une fois séchée, la poudre est pulvérisée, pesée et ce poidsdivisé par le chiffre A donne le poids du mélange à répartir pour un mois en 60 gélules ( 2 gélules/jour, soit 2 X 0.5 gr de Bioparyl / jour) L'éluat de la colonne, concentré à 500 ml (pH 7.0) est soluble dans l'eau. Ce Bioparyl, préparé selon la technique qui vient d'être décrite a été utilisé dans toutes les expériences décrites ci-dessous. Cependant, pour des réactions fines, la préparation est préalablement diluée, recentrifugée et filtrée sur millipore avant que son poids soit à nouveau détermine. Les composés se trouvant dans les feuilles de Gingko biloba ont été étudiés par divers auteurs. Cependant aussi bien la méthode de préparation que les applications différent * totalement. Elle diffère dans le choix du matériel (feuille dorées et non vertes), dans le liquide d'extraction (ici de l'eau et non pas des solvents comme toujours décrit dans la littérature), par l'hydrolyse qui..élimine.beaucoup de composés non souhaitables, par la centrifugation après que le pH ait été ajusté, qui élimine encore une grande partie de matériel puis par la sélection sur colone. Ici encore, une importante partie du matériel initial est éliminé de ce qui constituera le Bioparyl ( lorsqu'en fait la colonne de séphadex est lavée à la soude (0,1 N 300 ml) puis à l'eau jusqu'à pH neutre on constate qu'une partie très importante de matériel était resté sur la colonne Ainsi lavée la colonne peut reservir) Des extraits de feuilles vertes de Gingko Biloba additionnés d'autres substances, sont dans le commerce et soit destinés à modifier la circulation artérielle, capillaire ou veineuse, soit à améliorer la circulation dans le cerveau. Toutes ces préparations présentent des contre-indications qui semblent ne pas exister pour le-Bioparyl dont un dosage à des quantités beaucoup plus importantes ( jusqu'à 2 gr / jour pendant des semaines) n'a pas permis de déceler la moindre variation ou altération de l'état du patient. 2634380 7 La difficulté d'analyse des divers composés se trouvant dans les feuilles de l'arbre Gingko biloba est bien-connue De nombreuses firmes pharmaceutiques s'y sont en vain essayéesetvendent une "composition standardisée"d'extrait de feuilles de Gingko biloba. C'est pourquoi nous insistons tout particulièrement sur le fait que notre technique de préparation standardisée diffère totalement de celle utilisée par les autres firmes pharmaceutiques et que les applications sont elles aussi totalement différentes. C'est d'autant plus important qu'à l'heure actuelle il n'existe aucun autre procédé de lutter contre la fibrose ou de réguler la synthèse de diverses enzymes ou protéines, particulièrement importantes dans des maladies qui, actuellement, occupent le devant de l'actualité. En outre et bien que notre extrait soit entièrement démuni d'effets secondaires, le Bioparyl possède un effet anticancéreux qui, sans être d'une très puis- sante activité, contribue néamoins à maintenir et recouvrir un état de santé déficient chez les animaux porteurs de cancers. Exemple 1: Action du Bioparyl sur les RNases Les personnes atteintes de divers cancers présentent très O généralement des anomalies au niveau de l'activité des RNases de leur plasma. Le Bioparyl possède un fort effet régulateur, in vitro comme in vivo, c'est à dire qu'il ramène l'activité des RNases du plasma à des activités proches de celles trouvées chez les personnes saines; En fonction du temps, un malade prenant régulièrement du Bioparyl normalise l'activité de ses ribonucléases; L'effet reste après que le traitement par le Bioparyl soit suspendu. 2634380O Le sang périférique est prélevé sur citrate de sodium (10 mg pour 5 ml de sang) afin d'éviter la coagulation du sang sans inter- férer avec l'activité des enzymes. Après centrifugation, le plasmaest délicatement prélevé, servant de source de ribonucléase.Le plasma est utilisé après dilution (10 fois) à l'aide de tampon Tris-HCl 3M, pH 7,60 et le taux de protéines déterminé (Biuret). Le Bioparyl dissous dans de l'eau distillée (pH 7.0, 5 mg/ml) est utilisé (0.01 à 0.05 ml). Le milieu d'incubation (0,15 ml final) contient: 0,05 ml de tampon Tris-Hcl 10- 2M (pH 7,6); 0,05 ml de 3H-ARN (ARN-r ou ARN 4 S, 100 pg, 15000 CPM); 0,01 à 0,05 ml de la dilution au 1/10 de plasma. Après incubation à 36 C pendant 10 min (bain marie), conditions généralement nécessaires mais pouvant varier en cas de nécessité, la réaction est arretée - par addition de 3 ml d'acide trichloracétique (ATC) à 5%, les tubes sont refroidis afin d'assurer une bonne précipitation des protéines et de l'ARN (3H) non dégradé. Le précipité filtré sur millipore de verre (GF/C, Whatman) est lavé par l'ATC 5% puis par l'alcool ethylique à 95 , les filtres sont séchés et la radioacti- vité est déterminée dans un compteur à scintillation. Les résultats sont exprimés en pourcent d'ARN radioactif-non dégradé (la radio- activité de l'ARN intact étant prise comme 100%). La figure 1 montre que la RNase du plasma d'une malade atteinte d'un cancer du sein dégrade fortement l'ARN ribosomique (ARN à longue chaine), alors qu'une telle dégradation ne s'observe pas avec l'ARN 4 S (ARN à courte chaine). Sur la figure 1, on voit que chez le sujet sain l'ARN à longue chaine est beaucoup moins dégradé que par l'enzyme du sujet cancéreux. D'une façon générale, les activités des RNases des sujets porteurs de cancers sont fortement augmentées, ce qui stimule le catabolisme, affaiblit le malade et participe au maintien de 1' état cancéreux. Dans l'état actuel des choses, on ne peut dire si cette augmentation des RNases est dûe à un taux plus élevé de ces enzymes (suractivation des gènes correspondants) ou à la présence d'un métal par exemple, accélérant ces activités. Le Bioparyl inhibe in vitro l'activité des RNases trop actives du plasma des malades (Fig.2 et 3),mais il est sans action sur O la RNase du plasma des personnes saines (Fig.4). Ceci indique soit que les enzymes sont différents, soit qu'il existe des co- facteurs particuliers permettant la sélectivité d'action du Bio- paryl, phénomène extrêmement important. Exemple 2.Effet du fer et rôle du Bioparyl sur l'activité in vitro des RNases Le fer ferrique accélère fortement l'activité in vitro des RNases des sujets atteints de cancers ( malades atteints de leucé- mies, de cancers solides (foie en particulier), de maladies auto- immunes (polyarthrites, thrombopénies) et dans certaines patholo- 0 gies virales, SIDA par exemple). Mais le fer est sans action sur l'activité in vitro des RNases du plasma des sujets sains. Figure 5. On sait que les RNases peuvent fournir des ARN amorceurs nécessaires à la réplication des ADN et que les amorceurs acceptés par les ADN des tissus sains ne sont pas les mêmes que les amor- ceurs nécessaires à la réplication des ADN de tissus cancéreux. De ce seul fait, la régulation des RNases est un phénomène capital en cancérologie et en virologie. Le Bioparyl, par son aptitude à réguler ce qui est perturbé et cela seulement, même en présence de fer, est un agent de normalisation extrêmement novateur et important. Exemple 3:Normalisation in vivo des RNases plasmatiques d'un sujet atteint de cancer et prenant régulièrement du Bioparyl. Dans les cas de cancers solides ou chez les leucémiques (leucémie myéloide chronique en particulier) soumis ou non à la chimiothérapie, le Bioparyl, administré per os (1 gr/jour chaque jour) corrige, en fonction du temps, l'activité perturbée au départ des RNases du sang circulant et rapproche leurs valeurs de celles observées chez les sujets sains. La Figure 6 montre en fonction du temps la normalisation de l'activité des RNases plasmatiques chez deux sujets porteurs de deux types différents de cancer (arrêt traitement 3 jours avant l'anayse). Exemple 4: fibrose radique. Etude in vitro. Un prélèvement de peau fibrosée par les-rayons a été broyé dans un mortier (4 C) en présence de tampon Tris-HC1 0,02 M contenant 0,06 M de KC1 et 0,001 M de MgC12. Volume final: 1,5 ml. L'activité des RNases contenues dans cet extrait a été testée vis à vis de l'ARN 4 S et vis à vis de l'ARN ribosomique (ARN-r); 0,01; 0,02; 0,03 et 0,04 ml d'extrait enzymatique sont incubés en présence d'ARN radioactif 3H-ARN-r ou 3H 4S ARN. Temps d'incubation:15 min à 36 C. Les résultats sont illustrés dans la figure 7. La dégradation des ARN marqués est linéaire er fonction de diverses concentrations d'extrait. L'ARN-r est plus rapidement dégradé que l'ARN 4 S. Le Bioparyl inhibe forte- ment mais non totalement la dégradation in vitro de l'ARN-r. 2634380 11 Le fer ferrique (FeC13) à faible concentration stimule la dégradation de l'ARN-r mais à fortes concentrations il l'inhibe. Pour des raisons d'éthique, nous n'avons pas utilisé la peau normale d'un sujet humain. Mais le Bioparyl n'agit pas sur la RNase de la peau normale de jeune agneau. Action du Bioparyl sur l'ADN de la peau Le Bioparyl stimule la synthèse in vitro de l'ADN de la peau saine de jeunes moutons ainsi que celle d'ADN isolés de la peau de souriceaux. L'ADN de la peau saine d'animaux jeunes a été isolée par le procédé décrit dans Experimental Cell Biol. 49: 220-231 (1981) qui donne également la methode utilisée pour la synthèse in vitro de l'ADN. La figure 8 montre que le Bioparyl stimule fortement la réplication de l'ADN de la peau saine. Il est tout à fait remarquable d'observer la très belle inhibition de la synthèse in vitro de l'ADN isolé du mélanome de la souris en présence de très fortes concentrations de Bioparyl ( méla- nome B 16 F 10 aimablement mis à notre disposition par Mme Poupon de l'Institut Gustave Roussy). Action in vivo du Bioparyl sur la fibrose Les lésions post-radiques ont été traitées chez des sujets ayant subi la radiothérapie, par le Bioparyl. La dose orale était de 0,5 g x 2 / jour pendant plusieurs semaines.L'effica- cité est certaine surtout dans les fibroses cutannées, musculaires (péricarde du coeur) ou muqueuses. On obtient 83 % de réponses objectives dans les fibroses cutanéo-muqueuses post-radiques. Les péricardites fibrosantes peuvent être efficacement guéries par le Bioparyl. Lorsque la fibrose 2634380 12 date de "moins d'un an", 71% de réponses objectives sont obtenues. L'effet dose' n'a pas encore été déterminé. Exemple 5 Le Bioparyl corrige le taux desk.- et immuno-globulines élevé chez les porteurs du virus du SIDA ou chez les malades atteints de maladies auto-immunes. Certaines pathologies (SIDA, polyarthrites, scléroses..ou autres maladies) induisent des taux anormalement élevés de diverses immuno- globulines (IgM, IgG etc..), ce qui est néfaste à l'équilibre immu- nitaire. La prise de Bioparyl par voie orale (1 gr/jour chaque jour) permet d'observer en 3-5 semaines de traitement une baisse du taux des globulines. On constate une amélioration clinique immédiate qui se poursuit tout au long du traitement par le Bioparyl. Résultats illustrés dans le tableau 1. Exemple 6 Inhibition de la synthèse d'ADN des cellules cancéreuses Dans les conditions in vitro, le Bioparyl agit seulement sur la synthèse de l'ADN des cellules cancéreuses (cancer du sein, de 1' ovaire et du poumon humains) sans affecter, dans les mêmes conditions celle de l'ADN des tissus sains (sein, poumon,rate ou moelle osseuse des humains). L'initiation et l'élongation de la formation d'ADN cancéreux sont arrêtées par le Bioparyl, alors que celles de l'ADN normal ne le sont pas. Figure 9. Ceci se démontre en introduisant le Bioparyl soit au départ soit après que la synthèse ait démarrée, comme ceci est décrit en détail dans ma demande de brevet français n 88-08434 du 23 juin 1988. In vivo chez les souris: 60 souris BALB C (30 0 et 30 de 18 gr) 2634380 13 porteuses de cellules tumorales (lymphome YC8) et 60 souris CDI Swiss ( 30 0 et 30 V) porteuses de cellules tumorales (Ascite d'Ehrlich) (4 à 6000 cellules par voie i.p. 48 h avant le début du traitement) reçoivent Bioparyl deux fois par jour (2 x 3 mg/j pendant 8 jours consécutifs, voie i.p.). Les lots témoins reçoivent, au lieu de Bioparyl, une-solution isotonique de NaCl. Les résultats exposés dans le tableau 2 révèlent un certain effet anticancéreux du Bioparyl qui toutefois, chez l'homme et per os, n'est pas suffisant. TOXICITE ET POSOLOGIE Toxicité aigue dlu Blioparyl: La préparation standardisée de Bioparyl administrée par voie orale à dose unique à des souris BALB C et Swiss ainsi qu'à des rats, s'est révélée non toxique. En effet, la DL50 chez les souris est supérieure à 2000 milligrammes par kilogramme. La DL50 chez le rat est supérieure à 3000 milligramme par kilogramme. Toxicité chronique.: Le Bioparyl administré par voie orale aux doses de 2000 milligrammes par kilogramme deux fois par semaine pendant trois mois consécutifs ne modifie pas le comportement des souris qui ont une croissance pondérale normale et une prolificité inchangée. Une dose de 1000 milligrammes par jour (voie orale, ce qui correspond à la dose active journalière) pendant des mois est parfaitement bien tolérée par le sujet humain. Toxicité aigue par voie intra-péritonéale ou intraveineuse: (souris BALB C et Swiss). Le DL50 se situe vers 1200 milligrammes/kg et la dose tolérée est de 1000 milligrammes par kilogramme. 250 milligram- mes/kg/jour pendant 2 mois sont parfaitement bien tolérés et le développement des souris est tout à fait normal. Une dose de 26354380 14 Bioparyl de 250 milligrammes à 800 milligrammes par kilogramme, injectée par voie intraveineuse chez les souris Swiss est parfai- tement tolérée. Chez l'homme, des doses orales de 1000 - 3000 milligrammes par jour et pendant des mois sont bien tolérées; la voie intramusculaire peut être envisagée aux doses de 250 - 1000 milligrammes/jour et par voie intraveineuse 250 - 800 milligrammes par jour. Revendications 1. Une méthode d'obtention d'une nouvelle substance a partir des feuilles dorees d'automne de l'arbre Ginko biloba qui comprend: ( 1) une extraction par l'eau, (2) une concentration de l'extrait, (3) une hydrolyse acide, (4) un ajustement du pH, (5) une centrifugation pour ne récupérer que le surnageant, (6) une chromatographie sur colonne avec élution par l'eau et sélection de certaines fractions constituant de Bioàrym, (7) une concentration et un conditionnement. 2. Nouvelle substance pouvant être obtenue selon la revendication 1. 3. Une composition pharmaceutique comportant la substance selon la revendication 2 et un support pharmaceutique acceptable 4. Une composition selon la revendication 3, sous forme d'unité de dosage. 5. Utilisation d'une substance selon la revendication 2 pour l'obtention d'un medicament destine a inhiber l'activité enzymatique de la ribonucléase consistant a soumettre un système biologique contenant la ribonucléase à l'action d'une concentration active de ladite substance. 6. Utilisation selon la revendication 5 o le système biologique contient des cellules cancereuses ou virosees chez les mammlfères 7. Utilisation selon la revendication 5 o le système biologique contient des cellules en dysfonctions que le fer suractive. 8. Utilisation selon la revendication 6 o ladite substance peut ralentir la formation de blastes chez les sujets leucemiques 9. Utilisation selon la revendication 6 ou ladite substance peut contribuer à freiner le développement des cellules cancéreuses. 10. Utilisation d'une substance selon la revendication 2 pour l'obtention d'un medicament destiné a traiter des mammifères développant une fibrose de certains tissus (suite à un traitement physique, chimique ou sans cause connue). 11. Utilisation selon la revendication 9 o le développernent de la tibrose est prevenue en maintenant les mammlferes sous l'action de ladite substance pendant le traitement. 2'634380 12. Utilisation selon la revendication 9 o la fibrose installée suite â un traitemnent (rayons ou traitement chimique) est supprimée par administration de ladite substance 13. Utilisation d'une substance selon la revendication 2 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement des mammifères atteints de cancer du poumon et consistant à administrer une concentration de Bleomycine capable d'entraver le cancer et en même temps une quantité de ladite substance entravant le développement de la fibrose. 14. Utilisation d'une substance selon la revendication 2 pour l'obtention d'un médicament destiné à réduire les taux élevés des garnma-globulines ou des lmmuno-globlilnes chez les mammiferes 15. Une unité de dosage selon la revendication 4 contenant 0,1 à 3 grammes de ladite substance.