Brevet FR2631964A1 — publié le 19891201

GLUCOSYL PHOSPHOTRIESTERS DE DERIVES DE THYMIDINE AYANT UNE ACTIVITE CONTRE LES RETROVIRUS L'invention a pour objet des glucosyl phospho- triesters de dérivés de thymidine ayant une activité contre les rétrovirus, en particulier contre HIV-1 et HIV-2. De nombreux travaux sont consacrés & la re- cherche et la mise au point de moyens de détection d'anticorps, de prévention et de traitement de ce type d'infections. Pour la prévention et le traitement des infections provoquées par HIV-1 et HIV-2, on a proposé de mettre en contact in vitro le virus avec des dérivés de nucléosides. Dans EP 0216510, on décrit l'utilisation de dérivés de base puriques, tels que la 2',3'-didéoxyino- sine (ddI), la 2',3'-didéoxyguanosine(ddG) ou la 2',3'- didéoxyadénosine (ddA), et des mono- et triphosphates correspondants. D'autres nucléosides antiviraux, constitués par des dérivés de 3'-azido 3'-déoxythymidine (AZI)sont décrits dans EP 0196175. La mise au point par les inventeurs d'un procédé de synthèse de dérivés de phosphotriesters de nucléo- sides a permis de disposer de produits dont l'étude a révélé une activité avantageuse contre les rétrovirus. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux glucosyl phosphotriesters de dérivés de thy- midine et un procédé de synthèse de ces dérivés. L'invention vise en outre à fournir des compo- sitions à effet antirétroviral. Les dérivés selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils répondent & la structure (I): o-alc O O HO vv OH dans laquelle: - R' représente un atome d'hydrogène ou un groupe azido, - -al représente un radical hydrocarbon' saturé ou insaturé de 5 à 30 atomes de carbone, le cas échéant substitué. Les groupes de substitution du radical -al représentent avantageusement un groupe alcoyle de 1 & 4 atomes de carbone, un groupe alcoxy de 1 & 4 atomes de carbone, un groupe amino. Les phosphodiesters, précurseurs des glucosyl phosphotriesters ci-dessus, entrent également dans la portée de l'invention. Les glucosyl phosphodiesters répondent & la structure (II): 0 ow 09 0 - P. HN C;4> O O $I O OH OH. dans laquelle R est tel que défini ci-dessus. Selon une variante de synthèse, ces dérivés sont obtenus en mettant en oeuvre les étapes suivantes: On fait réagir un dérivé de glucose-6phosphate de formule (III): 263 1964 OH QH - O-P-OH a OO RO&oe OR dans laquelle les radicaux R, identiques ou différents les uns des autres, représentent des groupes protecteurs de fonction hydroxyle, ce dérivé étant avantageusement sous forme de sel, avec un dérivé de thymidine de formule (IV): HN fCH3 7 F' ce qui conduit au phosphodiester de formule (V): O O P-OH 0 | 00 *OR )Oy/ - on élimine les groupements protecteurs et, pour obte- nir les glucosyl phosphotriesters, on fait réagir le phosphodiester (V) avec un dérivé réactif renfermant le groupe -alc, ce qui conduit au dérivé de phosphotriester de formule (VI): O-alc O-HN-A CH3 JOÄ OkN (OH O N R' et alc présentant dans les formules ci-dessus les significations données en rapport avec la structure (I). Les dispositions qui précèdent permettent d'obtenir des dérivés liposolubles de nucléotides capables de traverser une membrane, par exemple l'en- veloppe d'une cellule ou la barrière méningée, dotés d'un effet anti-viral & l'égard des rétrovirus. La réaction de couplage entre les dérivés (III) et (IV) est réalisée & une température supérieure & l'ambiante, plus spécialement de 30 à 100C en milieu solvant organique. Des solvants appropriés comprennent la pyridine, le trichloroéthane. Lorsqu'on utilise la pyridine comme solvant réactionnel, on obtient le couplage désiré en opérant à une température de 60 à 80C, notamment voisine de 70C. La réaction est effectuée sous atmosphère de gaz inerte tel que l'azote ou l'argon. On utilise avantageusement un excès de dérivé (III). Un excès en moles de 1,5 à 2 permet de réaliser le couplage dans des conditions satisfaisantes. Pour catalyser la réaction de formation du' phosphodiester, on a recours à un composé tel que le TPSCl, DCCI (Warren C.D. et Jeanloz R.W. (1973) Bioche- mistry 12 '5038-5045 ou Warren C.D. et Jeanloz R.W. (1972) Biochemistry 11 2565-2572) ou le trichloroacé- tonitrile (Cramer F. et Weimann G. (1961) Chem. Ber. 94 996-1007). Le dérivé de formule (III) utilisé dans la réaction de couplage est sous forme de sel dont la réactivité favorise le couplage. Il s'agit notamment de sel de pyridinium de morpholine/de tétraéthylammonium. Les groupes protecteurs sont éliminés préala- blement à la fixation d'une chaine alcoyle. Parmi les groupes convenant pour la mise en oeuvre de l'invention, on citera les groupes acyle, notamment acétyle, alcoyle substitué tel que benzyle, benzoyle. L'élimination de ces groupes. est réalisée selon les techniques classiques de chimie organique, en opérant dans des conditions n'altérant pas la structure du phosphodiester (V) et ses substituants. Les groupements acyle d'un mélange sont éliminés parexempleàl'aide de solutions de soude ou d'un mélange NH3/MeOH. Le dérivé réactif renfermant le groupe alc est avanta- geusement un halogénure, en particulier un bromure ou un iodure, ou encore un tosylate, ou un sel de sulfonium. La réaction est réalisée avec avantage en milieu solvant organique, à une température supérieure & l'ambiante, notamment de 50 à 100'C. Parmi les solvants organiques utilisables, on citera l'acétonitrile. Le phosphodiester est de préfé- rence sous forme d'un sel de haute réactivité et utilisé en excès d'au moins environ 10 -fois Plus. en mole. Dar rapport au dérivé réactif renfermant le groupe -alc. Selon une autre variante de synthèse, on fait réagir un dérivé de 6glucose cyanoéthylphosphate de formule (VII): O -CR-4t Cy-L.CN oO-P-OH 00 OR OR dans laquelle R est tel que défini en rapport avec la formule (III), ce dérivé étant avantageusement sous forme de sel, avec un dérivé de thymidine de formule (IV) ci-dessus, puis on élimine les groupes de blocage des fonctions hydroxyle. La réaction de couplage est effectuée avanta- geusement dans un solvant organique, & température ambiante en présence de TPSNT. Le dérivé de formule (VII) est avantageusement obtenu par réaction du dérivé de glucose correspondant avec du cyanoéthylphosphate sous forme de sel réactif. L'étude des dérivés de formules (I) et (II) ci-dessus a montré qu'à des doses non toxiques pour les lymphocytes T humains, ces dérivés sont capables d'in- hiber in vitro l'effet cytopathogène des rétrovirus. Ces dérivés sont donc avantageusement utili- sables pour élaborer des compositions antivirales. De telles compositions sont caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité efficace d'au moins un dérivé de formule (I) ou (II) en association avec un véhicule pharmacologique. Ces compositions sont particulièrement utiles pour traiter le SIDA et les maladies apparentées. Ces compositions se présentent sous des formes appropriées pour l'administration par voie orale, nasale, topique, rectale, vaginale, souscutanée, intraveineuse, intramusculaire ou intradermique. Les compositions administrables par voie orale comprennent des tablettes, comprimés, granules, so- lutions ou suspensions en milieu aqueux ou non aqueux. Pour l'administration par voie rectale, on utilise des suppositoires et par voie vaginale des crèmes ou des mousses. Les formulations utilisées pour l'administration par voie parentérale sont avantageusement formées par des solutions ou des suspensions stériles, isotomiques, aqueuses ou non-aqueuses. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront en se reportant aux exemples qui suivant et aux figures 1 et 2 qui représentent respectivement - la figure 1, la croissance cellulaire, en fonction du temps dans le cas de cellules témoins et de cellules traitées avec des dérivés selon l'invention; - la figure 2, l'effet des dérivés de nucléotide sur le pouvoir infectieux de HIV-1 pour des lymphocytes humains T. EXEMPLE 1: Préparation de dérivés de l'azido-3'- thymidine ou AZT. 1. Préparation du sel de pyridinium du 1,2,3,4- tétra-O-acétyl 6-D-glucose phosphate, de formule: OH OO-P--OH R& OR dans laquelle R = acétyle. Le 1,2,3,4-tétra-O-acétyl 6-D-glucose phosphate est préparé selon Whistler R.L., Doner L.W. et Kosik M. (1972) Methods in Carbohyd. Chem. Vol. VI, 711-712 Academic Press NY ou Lardy H.A. et Fischer H.O.L. (1946) J. Biol. Chea. 164 513-519. On soumet à agitation pendant 16 h à température ambiante 5 g (16,44 mmoles) de sel de sodium du 6-D- glucose phosphate et 18 ml (190,4 mmoles) d'anhydride acétique distillée dans 20 ml de pyridine. On obtient une solution orangée avec un précipité blanc: la réaction est contrôlée par CCM (CH2Cl2/MeOH/H20: 60/35/5) Rf départ = O, Rf produit acétylé: 0,61. Le précipité est filtré et dans le filtrat on ajoute avec précaution environ 100 ml de glace -et 10 ml d'eau pour hydrolyser l'anhydride en excès. On laisse l'hydrolyse se poursuivre 30 minutes. Le mélange est évaporé & sec sous vide et coévaporé plusieurs fois ensuite avec du toluène. On reprend par de l'eau et on lave plusieurs fois la phase aqueuse avec du dichlorométhane. La phase aqueuse est ensuite réduite de volume avant d'être passée sur une colonne de résine Dowex 50WX8 préala- blement échangée sous forme pyridinium. La sortie de colonne est contrôlée par CCM et les bonnes fractions sont lyophilisées. m = 6,54 g, Rdt = 68 %. 2. Préparation du 1,2,3,4-tétra-O-acétyl 6-glucosyl 5'-(azido-3') thymidinyl phosphate (Composé 1 dans la formule ci-dessous): O O-;P-OH 1 R = CH3CO OR 3OR RO OR O O" 2 R - H Ns On soumet à une co-évaporation & trois reprises, avec de la pyridine anhydre, 200 mg (0,75 mmoles) d'azido-3' thymidine (AZT) et 656 mg (0,75 mmoles x 1,5 excès) de 1,2,3,4-tétra O-acétyl 6-D-glucose phosphate sous forme pyridinium. On ajoute environ 15 ml de pyridine anhydre et 2,56 ml de trichloroacétonitrile (0,75 mmoles x 35 excès). On chauffe le mélange à 70'C en agitant bien et en maintenant sous atmosphère d'azote pendant 16 h. On évapore à sec sous vide puis on reprend le mélange par un minimum de dichlorométhane et on précipite par l'éther de pétrole. On décante l'éther de pétrole et le précipité est chromatographié sur colonne de silice Merck 7734 V éluée avec du dichlorométhane enrichi en méthanol. Le composé est élué vers un mélange à 10 % de méthanol. m = 540 mg Rdt: 95 %, Rf = 0,54 (CH2Cl2/MeOH/H20 13/5/1). 3. Préparation du 6-glucosyl 5'-(azido-3')- thymidinyl phosphate (composé. 2 dans la formule ci- dessus). Ce composé sera désigné ci-après par le code 6715. On utilise 540 mg de produit 1 obtenu précédem- ment. On élimine les groupes acétyle dans du méthylate de sodium à 1 % dans du méthanol pendant 10 minutes à température ambiante. Il apparait un léger trouble. On vérifie par CCM que la réaction est complète. On neutralise par addition de résine Dowex 50WX8 H+ I. A pH = 7, on filtre la résine et le précipité et on évapore la phase méthanolique à sec. On reprend par un minimum d'eau et passe sur colonne de Biogel P2 200/400 mesh a éluée à l'eau. La sortie de colonne est dé- tectée par UV à 254 nm. Après vérification par CCM, les fractions contenant le composé cherché sont lyophilisées avant d'être repassées sur une colonne de silice C-18 éluée à l'eau afin d'achever la purification. m = 283 mg Rdt = 67 %, Rf. = 0,65, isopropanol/NH4/OH/H20 7/1/2. 4. Préparation du sel de pyridinium du 1,2,3,4 tétra-O-acétyl 6-D-glucose P-cyanoéthyl phosphate. On échange le sel de baryum du cyanoéthyl phosphate en sel de pyridinium en le passant sur colonne de Dowex H+ (3 et en recueillant le produit dans de la pyridine. L'échange porte sur 2,5 g de cyanoéthyl phos- phate. On évapore à sec après passage sur la colonne. On obtient 7,75 mM de sel de pyridinium que l'on co-évapore trois fois avec de la pyridine. On ajoute 2,58 aM de 1,2,3,4 tétracétyl glucose, soit 900 mg. On coévapore 2 fois avec de la pyridine. On reprend dans 20 ml de pyridine anhydre, puis on ajoute 7 ml (58 mM) de trichloroacétonitrile fraichement distillé. On dégaze avec de l'azote et on laisse à 75'C sous azote durant 14 26'31964 heures environ. La solution est évaporée à sec, reprise dans un minimum de CH2C12 et précipitée avec de l'éther de pétrole. La purification est effectuée sur colonne de lice (9385 Merck a. On élue avec du CH2Cl2 enrichi en MeOH. On obtient 760 mg de produit (61 %). Rf: 0,51; CH2Cl2/MeOH (8/1). 5. Préparation du 6-glucosyl 5'-(azido-3') thy- midinyl phosphate 2 (6715) à partir du 6-glucosyl cyano- éthyl phosphate. mg (0,75 mmoles) d'AZT et 469 mg (0,97 mmoles) de 1,2,3,4 tétra acétyl-6glucose cyanoéthyl phosphate sont coévaporés trois fois avec la pyridine. On ajoute 4 ml de pyridine anhydre et 616 mg de TPSNT (2 éq.). On laisse 3 h & température ambiante. Après lavage avec une solution de NaHCO saturée puis H20, la phase organique est séchée sur Na2SO4 et évaporée & sec. La purification se fait: 1) sur une colonne de silice Merck 9385, 2) sur une colonne de Séphadex LH 20 ( éluée avec le mélange THF/MeOH 95/5. On obtient 312 mg (55 %) du phosphotriester dont on élimine les groupes acétyle avec du méthylate de sodium 1 % pendant 15 minutes, à température ambiante. Le même traitement que précédemment, après neutralisation avec une résine Dowex donne le composé 21 (165 mg) identique'à celui obtenu sous 3. 6. Echange du sel de pyridinium en sel de tétrabutyl-ammonium. On prépare une colonne de résine Dowex 5OWX-que l'on a équilibrée sous forme tétrabutyl-ammonium en mettant à échanger de la résine Dowex 50WX8 H+ ( sous agitation pendant deux heures dans l'hydroxyde de tétrabutylammonium concentré puis en le lavant jusqu'& pH neutre des eaux de lavage. , Les 283 mg de 2 obtenus précédemment sont passés sur cette colonne. On recueille les fractions absorbant & 254 nm qui sont lyophilisées. 308 mg, Rdt: 85 %, Rf: inchangé, Masse FAB 508 (M+1), HPLC: 2 pics 5,00 et 5,33 mm. 7. Préparation du 6-glucosyl hexadecyl 5'- (azido-3')thymidinyl phosphate l désigné ci-après par le code 6651. O o HO& O -O- N- - I UO C 3 (6651) OH W N3 On évapore sous vide avec de l'acétonitrile anhydre 2,80 mg de diester sous forme tétrabutylammonium 0,372 mmoles) et 2,11 ml de 1-idohexadecane (0,372 mmoles x 18 excès). Puis on ajoute environ 15 ml d'acé- tonitrile anhydre et on chauffe & 80'C pendant 16 à 20 heures. On contrôle alors la réaction par CCM. On éva- pore à sec le mélange, on reprend par un minimum de dichlorométhane et on dépose la solution sur colonne de silice Merck 7734 a. L'élution se fait au dichloro- méthane pur pour enlever la chaine en excès. Ensuite, on enrichit en méthanol. Les fractions contenant le phosphotriester sortent à une concentration de 10-15 % en méthanol. Après concentration, ces fractions sont repassées sur une colonne de Séphadex LH 20 a éluée avec un mélange THF/MeOH 80/20. On obtient 150 mg, 55 %, Rf = 0,695 isopropanol/NH4OH/H20 7/1/2, Masse FAB+ 734 (M+1), HPLC temps de rétention 13,77 min et 14,11. EXEMPLE 2. Préparation de dérivés de dérivés de 3'-désoxy- thymidinyle. Les produits dont la synthèse est rapportée ci-après présentent les formules correspondantes données dans l'exemple 1, le nucléotide étant remplacé par le 3'-désoxy thymidinyl. 1. Préparation du 1,2,3,4 tétra-O-acétyl 6-glu- cosyl 5',(3'-désoxy)thymidinyl phosphate. On opère comme précédemment. 100 mg de 3'-déso- xy-thymidine (ddT) (0,442 mmoles) et 388 mg de tétra- acétyl 6-D-glucose phosphate (0,442 mmoles x 1,5 excès) traités avec 1,5 ml CCl3CN, (0,442 x 34 excès) ont donné 215 mg, Rdt: 68 %, Rf = 0,6 (CH2Cl2/MeOH/H20 13/5/1). 2. Préparation du 6-glucosyl 5'-(3'-désoxy)- thymidinyl phosphate (désigné sous le code 6714). On opérant comme précédemment en purifiant sur Biogel et silice C-18 (, on obtient les résultats suivants: m = 72 mg, Rdt = 44 %, Rf = 0,58 (isopropanol/NH4OH/H20 7/1/2). Echange en sel N(Bu)+4, m = 90 mg, Rdt = 96 %, Rf inchangé, masse FAB = 468 (M - 1), HPLC temps réten- tion = 10,77 min. 3. Préparation du 6-glucosyl hexadecyl 5'-(3- -désoxy)thymidinyl (désigné sous le code 6650). Sur 137 mg de diester N(Bu+) (0,193 mmoles) et 1,091 ml d'iodo-1hexadecane (0,193 mmoles x 18 excès), on obtient m = 28 mg, Rdt = 21 %, Rf = 0,63 (isopropa- nol/NH4OH/H20 7/1/2). masse FAB = 693 (M + 1), HPLC temps rétention 3 pics (12,71 min, 13,04 min, 13,38 min). Les mesures en HPLC rapportées dans les exemples sont effectuées en utilisant des colonnes en phase inverse Nucléosil C18 C (1/4" x 15 cm) analytique, (1/2" x 25 cm) préparative. Les conditions sont les suivantes, A représentant l'acétonitrile, et B l'acétate de triéthylammonium 10-2, pH 7: triester: 50 % A 20 mn4 95 % A dans A + B (en 20 mn) diester: 5 % A 20 25 % A dans A + B (en 20 mn) útude in vitro du transDort transmembranaire L'étude du comportement du phosphotriester de la thymidine comme modèle sur des vésicules unilamellaires de 200 nm de diamètre, en spectroscopie RMN du 31p et 3 C a montré que le phosphotriester traverse la couche lipidique et se retrouve intact & l'intérieur des vésicules, alors que les phosphodiesters correspondants soit ne traversent pas, soit font -éclater les vésicules (effet détergent) aux concentrations utilisées. EXEMPLE 3: Etude des produits à action rétro- virus. Le virus utilisé est un rétrovirus recombinant d'origine murine (MoMLV) o un gène reporter (LacZ) a été introduit. Il est produit dans des lignées transcromplémentantes qui ne produisent pas de virus sauvages. Des quantités fixes de rétrovirus recombinants LacZ sont mises en présence de cellules testrices infectables de souris (3T3) avec ou sans le produit & tester. A chaque rétrovirus recombinant correspond un clone de cellules gal+. Le nombre de clones de cellules B gal+ est lu 48 heures après l'infection. Le % du virus résiduel (non inhibé par le produit) est indiqué dans le tableau 2 suivant (moyenne de plusieurs manipulations indépendantes): Tableau 2 -4M 10-5M 10-6 10-7 AZT 0% 0% 0% 1% 6715 0% 0% 3% 6651 11% 65% 94% ddt 78% 87% 101% 6714.4% 12%.. 66% 6650 79% 78% 96% Les produits AZT, 6714 sont actifs par eux- mêmes. EXEMPLE 4: Etude de l'effet des dérivés de phosphodiesters et de phosphodiesters sur le pouvoir infectieux du virus HIV1, in vitro. a) Produits testés On rapporte ci-après les résultats obtenus avec les produits des exemples appelés 6651 et 6714. Chaque produit a été dissous dans du DMSO & une concentration de 10- 3M (solution-mère), puis, dans le milieu de culture immédiatement avant l'emploi. La solution ainsi obtenue a été stérilisée par filtration sur Millipore O.22. puis des dilutions successives ont été réalisées dans du milieu de culture. b) Milieu de culture Les cultures de lymphocytes T humains sont maintenues dans du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau foetal (Seromed), 1% de glutamine (Gibco), 1% d'antibiotiques (PSN, Gibco), 10% d'interleukine Il (Biotest), 2 pg/ml de polybrène (Sigma) et une dilution 1/2500 de sérum-interféron a humain. Ce milieu est appelé milieu complet. La lignée de cellules MT4 est cultivée à raison de 3 x 105 cellules/ml dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau foetal, 1% d'antibiotiques et 1% de glutamine. c) Cellules La cytotoxicité des produits a été étudiée sur des lymphocytes T humains obtenus à partir du sang périphérique d'un donneur séro-négatif. Préalablement au traitement, ces lymphocytes sont stimulés par de la phytohémagglutinine p (pHAp) (Difco) pendant 3 jours. L'effet des produits sur la multiplication du virus HIV1 a été éudié sur des lymphocytes T humains obtenus à partir du sang périphérique d'un donneur séronégatif. les lymphocytes ont été isolés par gradient de Ficoll (Pharmacia) puis stimulés pendant 3 jours par de la phytohémagglutinine p (pHAp) (Difco) avant d'être utilisés pour le traitement et l'infection par le virus HIV1. L'action des produits sur l'effet cytopathogène du virus HIV1 a été étudiée à l'aide de la lignée de cellules MT4. Cette lignée est une lignée de cellules T humaines transformées par le virus HTLV1. Ces cellules sont particulièrement sensibles au virus HIV1 puisque 6 à 7 jours après surinfection par des quantités infimes de virus HIV1, elles montrent un effet cytopathogène important conduisant 10 à +80% des cellules vers la mort. L'effet cytopathogène est directement corrélé à l'infection des cellules par le virus, à sa réplication intracellulaire et à l'expression des antigènes viraux par les cellules. Une inhibition de cet effet correspond donc à une inhibition de la multiplication du virus HIV1. d) virus Il s'agit de surnageants de cellules T lymphoblastoides (lignée CEM) infectés par le virus HIV1 (souche LAV). l'activité de la préparation virale non diluée, utilisée pour les lymphocytes humains était de 200.00 cpm/ml. 2) Méthodes a) Etude de la cytotoxicité des produits pour des cellules T. 106 lymphocytes stimulés par de la pHAp ont été traités pendant 10 jours par des doses croissantes de i6 produit (10 5M; 5 X 10-6M; 10-6M). Le produit a été ajouté à chaque passage cellulaire effectué tous les 3 ou 4 jours. A chaque passage, les cellules ont été comptées après coloration au bleu trypan puis remises en suspension à 106 cellules par ml dans du milieu complet contenant ou non des doses croissantes de produit. Cette expérience a été réalisée dans une plaque à 24 puits (Nunc). b) Action des produits sur le pouvoir infectieux du virus HIV1 pour des lymphocytes T humains. - Action d'un traitement après adsorption virale-. Des lymphocytes humains préalablement stimulés par de la pHAp ont été infectés par du virus HIV1 (activité transcriptase inverse: 5000 cpm/106 cellules). Après 1 heure d'adsorption virale à 37'C, les lymphocytes ont été resuspendus & 106 cellules par ml dans du milieu de culture contenant ou non des doses croissantes de chaque produit (10 5M; 5 x 10 6M; 10-6M). Tous les 3 ou 4 jours (passages cellulaires), les cellules ont été centrifugées puis resuspendues à 10 cellules par ml dans du milieu de culture contenant le produit. La production virale a été suivie à chaque' passage (et cela pendant 13 jours) en mesurant l'activité trandcriptase inverse présente dans 1 ml de surnageant de culture. La production 'virale par les cellules traitées a pu être ainsi comparée à celle observée pour les cultures témoins non traitées. c) Mesure de l'activité transcriptase inverse La production du virus HIVI par des cellules T humaines traités ou non par chaque produit été régulièrement suivie en mesurant l'activité transcriptase inverse présente dans 1 ml de surnageant de culture. Cette méthode est décrite par Rey et al dans B.B.R.C. (1984), 124, 121-133. I ml de surnageant est concentré 100 fois par ultracentrifugation, puis l'activité enzymatique de cet échantillon est déterminée dans 50pl d'un mélange réactionnel contenant SOmM Tris pH 7,9, 2OmM KCl, 5mM MgC12, lmM dithiotreitol, 0,05 OD/ml Poly A, 0,05 OD/ml oligodtl2-18, 5pCi3HTTP et 0,1% triton X100. Après 1 heure d'incubation & 37*C, les produits acido-insolubles sont précipités par de l'acide trichloracétique 20%, filtrés sur Millipore 0, 45p puis la radioactivité P contenue dans ces produits de réaction est mesurée à l'aide d'un compteur à scintilla- *tion Kontron. d) Action des produits sur l'effet cytopathogène du virus HIV1 pour les cellules MT4. - Etude du traitement après adsorption virale-. Les cellules MT4 ont été infectées par 100pl de virus HIV1 pour 3.105 cellules dans un volume de 1 al. Après 30 minutes d'adsorption virale à 37'C, les cellules ont été lavées puis remises en suspension à raison de 3.105 cellules/ml dans du milieu contenant chaque produit aux concentrations suivantes: 10 5M; 45 x 10-6M et 10-6M. Au jour +3, les suspensions cellulaires ont été ramenées à 3.105 cellules/ml après dilution avec du milieu frais. le produit a été rajouté aux doses correspondantes. Au jour +7, l'effet cytopathogène a été évalué au microscope après coloration au bleu trypan. II - Résultats 1) Etude de la cytotoxicité des produits pour des lymphocytes T humains. Sur la figure 1, on a rapporté la variation de la croissance cellulaire (x106 cellules/ml) en fonction du temps, en jours. Les représentation utilisées ont les significations suivantes:_ témoin cellules; cellules traitées avec les produits obtenus dans l'invention à des concentrations de 10 3MM 5X10-6M et 10-6MT. Comme le montre cette figure 1, un traitement de jours par le produit 6651 est sans effet significatif sur la croissance de cellules T in vio aux doses utilisées. Lorsque les cellules sont traitées par le produit 6714 aux mêmes doses pendant 3 jours, aucun effet n'est observé sur la multiplication cellulaire. 2) Effet des produits sur le pouvoir infectieux du virus HIV1 pour des lymphocytes T humains. La figure 2 montre que le produit 6651 à la dose de 10-5M entraîne une inhibition totale de la multiplication du virus. Un traitement par le produit 6714 provoque une inhibition partielle proportionnelle & la dose de produit utilisée. 3) Action des produits sur l'effet cytopathogène du virus HIV1 pour les cellules MT4. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 1 ci-après: Effet cvtoDathogêne au jour +7 Produit Concentrations Expérience N'I Expérience N'2 6651 10-5M x10-6M + Â0-6M + 7 x10' M + + 6714 10-5M NT - x10-6M NT + -6M NT + 0 + + + = 100% de mort des cellules au jour +7 - = inhibition totale de l'effet cytopathogène NT = non testé Le produit 6651 inhibe cet effet cytopathogène à 10-6M dans une première expérience et à 10 5M dans une seconde expérience. Le produit 6714 à 10O 5 s'est révélé inhiber le pouvoir cytopathogène du virus lors d'une expérience. Sur la figure 2, on a rapporté l'activité RTx104 (cpm x 106cellules) la fonction du temps, en jours. La courbe _ ' représente les résultats avec le virus témoin; les résultats obtenus en utilisant les produits testés à des concentrations respectivement de 10 5M, x10 6M et 10 6M sont représentés par.---, -.- et *._ REVENDICATIONS 1. Dérivés de thymidine, caractérisés en ce qu'il s'agit de glucosyl phosphotriesters de structure I: I O-alc f\OH \ OH VOj HOv( V-J OH nO-H dans laquelle: - R' représente un atome d'hydrogène ou un groupe azido, alc représente un radical hydrocarboné saturé ou insaturé de 5 à 30 atomes de carbone, le cas échéant substitué. 2. Dérivés selon la revendication 1, caracté- risés en ce que le groupe alc représente un groupe alcoyle de I à 4 atomes. carbone, un groupe alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone oL un groupe amino. 3. Glucosyl phosphotriester caractérisé en ce qu'il s'agit du 6-glucosyl hexadécyl 5'-(azido-3') thymidinyl phosphate ou du 6-glucosyl-hexadécyl-5'- (3'-désoxy)thymidinylephosphate. 4. Glucosyl phosphodiesters de dérivés de thy- midine, caractérisé en ce qu'ils répondent à la struc- ture II: OH 0 HN- HO O'O OH p" dans laquelle E est tel que défini ci-dessus. 5. Procédé de synthèse des dérivés de thymidine selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé de glucose-6-phosphate de formule (III): OH O-P-OH ROT. OR dans laquelle les radicaux R, identiques ou différents les uns des autres, représentent des groupes protecteurs de fonction hydroxyle, ce dérivé étant avantageusement sous forme de sel, avec un dérivé de thymidine de formule (IV): HO MN&CH3 HN6 o- oL.) V A' ce qui conduit au phosphodiester de formule (V): o 0 O OR O, o - on élimine les groupements protecteurs et, pour obte- nir les glucosyl phosphotriesters, on fait réagir le phosphodiester (V) avec un dérivé réactif renfermant le groupe -alc, ce qui conduit au dérivé de phosphotriester de formule (VI): 22 2631964 O Alc R' R' et ale présentant dans les formules ci-dessus les significations données en rapport avec la structure (1), ou qu'en variante, on fait réagir un dérivé de 6-glucose cyanoéthyl phosphate de formule (VII): 0 - cm- zzcm t. C.a %00 OR dans laquelle P est tel que défini en rapport avec la formule (III), ce dérivé étant avantageusement sous forme de sel, avec un dérivé de thymidine de formule (IV) ci-dessus. 6. Compositions antivirales caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 & 4, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.