Brevet FR2631830A1 — publié le 19891201

La présente invention concerne l'obtention d'un concentré de Facteur IX de haute pureté par des techniques de chromatographie d'échange d'ions et de chromatographie d'affinité, utilisant comme produit de départ une fraction plasmatique quelconque contenant du Facteur IX, et éventuellement les Facteurs II, VII et X. La demande de brevet français no.87 14665 du 23 octobre 1987 décrit un procédé de préparation de concentré de Facteur IX et d'autres protéines plasmatiques par chromatographie d'échange d'ions d'un surnageant de cryoprécipité de plasma suivie d'une chromatographie d'affinité. La Demanderesse a maintenant découvert qu'un procédé analogue, c'est-à-dire faisant simplement appel à des techniques chromatographiques classiques, pouvait être mis en oeuvre sur toute fraction plasmatique contenant du Facteur IX pour donner, après traitement approprié de celleci, un Facteur IX de haute pureté c'est-â-dire d'activité spécifique supérieure à 20 UI/mg. l'invention concerne donc un procédé de préparation de Facteur =X de haute pureté caractérisé en ce qu'on soumet une fraction de plasma huma n à une étape de prépurrication pour éliminer des contaminants lipidiques et protéiques puis on soumet cette fraction prépurifiée à un traitement par voie chromatographique, associant notamment une chromatographie d'échange d'ions et une chromatographie d'affinité. Comme indiqué ci-dessus le procédé de l'invention s'applique à toute fraction plasmatique contenant du Facteur IX et en particulier aux fractions qui contiennent également les Facteurs TI, X et VII de même que l'inhibiteur d'inter- trypsine, la protéine S et la protéine C, qui peuvent alors être également séparés par ledit procédé. Parmi les traitements que peut subir ia fraction plasmatique on peut citer - l'adsorption sur des résines échangeuses d'ions, molles ou rigides, - le traitement par le phosphate tricalcique, - le traitement par le sulfate de baryum ou le chlorure de baryum, - la précipitation au sulfate d'ammonium, - l'adsorption sur gel d'alumine. Lorsqu'on utilise une résine échangeuse d'anions elle adsorbe le Facteur IX, ainsi que les Facteurs II, VII et X éventuellement présents, qui sont désorbés avant de subir les étapes chromatographies ultérieures. Le traitement de prépurification est destiné à l'obtention d'une fraction dans laquelle l'activité spécifique du Facteur IX est supérieur ou égale à 0,5 UI/mg. En général une activité spécifique de 1 UI/mg environ permet un déroulement satisfaisant du procédé et l'obtention d'un Facteur IX ayant la pureté recherché. Les étapes ultérieures de chromatographie sont réalisées très préférentiellement en utilisant une chromatographie d'échanges d'ions par exemple sur DEAE Sepharose suivie d'une chromatographie d'affinité particulièrement sur héparine immobilisée. On peut bien entendu prévoir à un stade quelconque du procédé un traitement d'inactivation virale par une technique bien connue de l'homme de l'art. I1 s'est toutefois avéré que l'on obtenait des résultats particulièrement satisfaisants en soumettant la fraction de plasma prépurifiée à un traitement au solvantdétergent, tel que décrit par exemple dans la demande de brevet européen no. 0 131 740. La mise en oeuvre de ce procédé permet, en partant par exemple d'un surnageant de cryoprécipité renfermant du Facteur IX en quantité correspondant à une activité spécifique de 0,014 UI/mg, d'obtenir un Facteur IX de haute pureté à 130 UI/mg. Le produit ainsi obtenu peut être avantageusement utilisé en thérapeutique, notamment pour le traitement de l'hémophilie B. Par rapport aux produits équivalents obtenus par l'immunoaffinité, il présente l'avantage d'etre nécessairement exempt de toute contamination par des protéines animales. Pour favoriser la stabilité du Facteur IX on peut prévoir un ou plusieurs stabilisants qui le protègent d'une dégradation et évitent la perte de l'activité coagulante. On ajoute de préférence ces stabilisants au tampon d'élution. Parmi divers produits évalués, l'arginine s'est révélée particulièrement efficace pour stabiliser le Facteur IX. On l'utilise de préférence à une dose minimale de 1 g/l, par exemple comprise entre 1 et 5 g/l. Par ailleurs, il peut être également judicieux de protéger le Facteur IX, notamment relativement à sa lyophilisation, en ajoutant un autre stabilisant sitôt son élution de la colonne chromatographique. Dans ce cas on utilise de préférence la lysine, à une concentration d'au moins 0,5 g/l, par exemple comprise entre 0,5 et 2 g/l. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE On utilise comme matière de-départ un surnageant de cryoprécip té que l'on obtient par décongélation et centrifugation à 0 - 20C de plasma frais congelé. Ce produit contient du Facteur IX (activité spécifique 0,014 UI/mg). On fait passer le surnageant sur une colonne de DEAF Sephadex A 50 en présence ae sérum physiologique. Après lavage au chlorure de sodium 0,20 M dans un tampon citrate 0,01 M à pH 7,0, on élue au chlorure de sodium 2 M dans un tampon citrate 0,01 M à pH 7,0. On élimine ensuite le sel par ultrafiltration. L'activité spécifique ou Facteur IX dans cette fraction prépurifiée est de 1 UI/mg. Le produit désorbé contenant le Facteur IX et les Facteurs II, VII et X est additionné de 1 UI/ml d'héparine (concentration finale) et injecté sur une colonne de DEAE Sepharose CL 6B (Phermacia) équilibrée par un tampon phosphate à pH 6,0. Pour assurer l'inactivagion virale on peut effectuer, avant l'injection sur la colonne, un traitement de type solvant-détergent en utilisant 0,3 % de phosphate de tri-n-butyle et 1 % de Tween 80 (Merck), lequel traitement étant mis en oeuvre à 240C pendant 6 heures. Après passage sur la colonne de DEAE Sepharose on récupère d'abord la fraction riche en Facteur VII par élution au chlorure de sodium 0,19 M dans un tampon 6 mM phosphate et en présence de 5 mM de citrate de sodium. Pour récupérer la fraction contenant les Facteurs II, IX et X on injecte du tampon phosphate-citrate-mais à pH 8,0 et renfermant du chlorure de sodium 0,36 M. Le Facteur IX est présent dans le produit récupéré en quantité correspondant à une activité spécifique de 5 UI/mg. Cette fraction est injectée sur une colonne renfermant un gel chromatographique d'héparine-Sepharose équilibré dans un tampon citrate 20 mM, pH 7,4. On récupère alors un filtrat contenant le Facteur II et, par élution au tampon citrate enrichi en NaCl 0,25 M, on récupère le Facteur X. Par élut ion plus poussée par le tampon renfermant du chlorure de sodium 0,45 M, auquel on a ajouté 3,5 g/l d'arginine comme stabilisant, on récupère le concentré de Facteur IX. Dès son élution on y ajoute comme stabilisant 1 g/l de lysine et éventuellement de l'héparine au taux final de 5 UI/ml. Le produit est alors concentré par ultrafiltration, filtré, stérilisé et lyophilisé. Les caractéristiques biochimiques moyennes du produit sont indiquées ci-dessous Protéines (g/l) 0,19 + 0,03 Facteur IX : C(UI/ml) 25 + 3 Activité spécifique Facteur IX (UI/mg) - 130 + 10 Facteur Il : C(UI:ml) Facteur X : C(UI/ml) (o,i Facteur VII : C(UI/ml) Facteur IXa (%) 0 AT III (UI/ml) 0 Ce concentré de Facteur IX ne contient pas d'autres facteurs de coagulation en quantité décelable (Facteurs XI, XII, prékallikréine, KMW kininogène...) ni de facteurs activés (thrombine, Xa, pka...). Son activité thrombogénique, telle que déterminée par le modèle de stase sur lapin Wessler est très faible DE50 > 450 UI/kg. Grâce aux stabilisants le taux de Facteur IX est, après reconstitution, stable au moins deux heures à température ambiante, sans aucune perte d'activité.. Les injections, sur l'homme indiquent une récupération de Facteur IX de 40 à 45 % et une demi-durée de vie de 20 à 25 heures, soit des valeurs comparables à celles obtenues à l "njection de PPSB. Ce concentré s 'avère être un produit de grande qualité pour le traitement des hémophiliques B, en particulier pour le maintien de leurs fonctions immunologlques. REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation en trois étapes d'un concentré de Facteur IX de haute pureté caractérisé en ce qu'on soumet une fraction de plasma contenant cette protéine à une prépurification puis on soumet la fraction prépurifiée à une étape chromatographique d'échange d'ions suivie d'une étape chromatographique d'affinité. 2.- Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'activité spécifique du Facteur IX dans la fraction prépurifiée est de 0,5 UI/mg au moins. 3.- Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'activité spécifique du Facteur IX dans la fraction prépurifiée est de 1 UI/mg environ. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la prépurification est effectuée par chromatographie d'échange d'anions. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la deuxième étape de purification est réalisée sur une résine DEAE-Sépharose. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la troisième étape est une chromatographie d'affinité réalisée à l'aide d 'héparine. 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'on ajoute un stabilisant du Facteur IX aux tampons d'élution. 8.- Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le stabilisant est l'arginine. 9.- Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'on ajoute l'arginine à une dose minimale de 1 g/l. 1G.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'on ajoute de la lysine au concentré de Facteur IX sitôt après son élution comme stabilisant de lyophilisation. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'on soumet la fraction prépurifiée à une inactivation virale par traitement au solvant-détergent. 12.- Concentré de Facteur IX de haute puretécaractérisé en ce qu'il est obtenu par traitement chromatographique d'une fraction de plasma prépurifiée. 13.- Concentré selon la revendication 12 caractérisé en ce que son activité spécifique est supérieure à 120 UI/mg. 14.- Concentré selon la revendication 12 ou 13 caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 15.- Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un concentré selon l'une quelconque des revendications 12 à 14.