Brevet FR2633036A1 — publié le 19891222

La présente invention se rapporte aux domaines de la cryobiologie et de la cryomédecine, et elle a plus pré- cisément trait à un appareil pour le refroidissement et la congélation d'objets biologiques. L'invention peut être utilisée avec le plus d'avantage pour la conservation à basse température d'objets biologiques sous la forme de suspensions, de tis- sus liquides ou solides et d'organes, dont on peut avoir besoin dans la pratique clinique. l1 Par ailleurs, l'appareil selon l'invention peut trouver une application pour le refroidissement à basse température et la congélation d'objets biologiques dans le domaine de l'agriculture,en particulier dans l'élevage. L'invention pourra également être utilisée pour la conservation à basse température d'objets biologiques de toute espèce et dont la viabilité doit être préservée à long terme en conditions de basses températures. L'invention pourra de même être utilisée dans tous les cas o il s'avère indispensable de diminuer signi- ficativement le temps de refroidissement de l'objet, ce qui ne peut pas être réalisé par d'autres procédés. L'accroissement des besoins de la santé publique et de l'économie nationale en matériel biologique cryocon- servé de haute qualité implique la nécessité de perfection- ner les procédés de cryoconservation en haussant l'effica- cité des congélateurs et en simplifiant leur construction. Compte tenu de ce que les tentatives de cryoconservation des objets biologiques par la voie de leur rapide refroi- dissement en les immergeant directement dans l'azote li- quide ne sont pas assez efficaces, et que le fonctionne- ment des congélateurs qui existent actuellement, fondé sur le développement de processus de cristallisation, apporte une importante lésion des cellules, il s'est avéré néces- saire de mettre au point un appareil de construction sim- pie et de fonctionnement efficace pour le refroidissement et la congélation, permettant d'obtenir un effect de vitri- fication des objets biologiques. Tous les procédés de congélation à basse tempéra- ture des objets biologiques se fondent sur le principe du refroidissement programmé. Dans le but de- prévenir les manifestations négatives du processus de cristallisation, la congélation est réalisée au sein d'un cryoconservant, et les cryoprotecteurs entrant dans la composition de celui- ci ne sont pas indifférents pour les structures biologi- ques. Dans telle ou autre mesure,lesdits cryoprotecteurs sont toxiques et octroient une action lésionnelle sur les biomacromolécules, particulièrement dans les conditions de haute concentration de ces cryoprotecteurs, relevant de la congélation de l'eau sous forme de glace. Les concen- trations eutectiques des cryoprotecteurs atteignent 60 à %. On réalise avec une haute précision la congéla- tion des embryons au moyen d'un appareil pour la congéla- tion et décongélation programmées des embryons animaux (SU, A, 989272), comportant un réservoir calorifuge pour l'implantation des conteneurs avec les embryons, des porte- conteneurs, des dispositifs pour le mélange de l'agent caloporteur intermédiaire et un système de commande du pro- cessus de congélation. Le réservoir est muni d'un couver- cle, et le dispositif destiné à maintenir la température de l'agent caloporteur intermédiaire a la forme d'un ser- pentin qui se trouve sur la face interne dudit réservoir, et dont le pas de la spire augmente au fur et à mesure que l'on se rapproche du fond, les porte-conteneurs étant fixés sur le couvercle. Il convient de noter que la cryoprotection des embryons lors de leur cryoconservation au moyen de l'ap- pareil susmentionné est réalisée par le procédé d'initia- tion de la cristallogénèse, dont le développement apporte la déshydratation des cellules. Cela permet d'éviter le développement d'une cristallisation intracellulaire lors- que l'on transfère les embryons dans l'azote liquide pour leur conservation. La nécessité d'une déshydratation régu- lière des cellules oblige à réaliser leur refroidissement de façon lente avec une longue évolution du processus de cristallisation. Au cours de cette période qui dure de 1i à 2 heures, toutes les biostructures sont soumises à l'action de facteurs extrêmes liés à la congélation de l'eau et aux phénomènes qui s'y associent, tels que la hausse de la concentration des électrolytes, la modification du pH, la croissance des cristaux de glace et autres. Dans de telles conditions de conservation à basse température, il devient indispensable de recourir à de fortes concentra- tions (1A-3 moles) de cryoprotecteurs qui, en conditions de développement lent de la cristallisation et donc de sé- jour prolongé des cellules en phase liquide, ont sur ces dernières une action toxique et pseudotoxique. D'autre part, l'appareil susmentionné ne dispose que d'une échelle restreinte de vitesse de refroidisse- ment - de 0,3 à 1,OOC/mn, ce qui limite les possibilités du procédé de cryoconservation en obligeant d'utiliser essentiellement les cryoconservants standards, dont la com- position rend difficile l'optimisation des procédés qui existent. C'et inconvénient est d'autant plus considérable que les méthodes de routine de la cryoconservation des em- bryons ne sont pas en mesure d'assurer leur haute et sta- ble survie. Cela se reflète de façon négative sur les résultats de la transplantation dans l'élevage en race pure et dans la santé publique, lors de l'utilisation des embryons contre l'infécondité. De plus, la construction de l'appareil susmen- tionné est compliquée et il comporte des pièces coûteuses et en général indisponibles dans les services de répara- tion. La commande de l'appareil exige un personnel hau- tement qualifié possédant non seulement la technique de cryoconservation, mais aussi les acquis de spécialistes de réglage de tel équipement. Il est connu que le refroidissement de différen- tes matières, par exemple des produits alimentaires, peut être réalisé par le biais de leur immersion dans l'azote liquide, les fréons ou l'oxyde d'azote (Grande Encyclo- pédie soviétique, ed. 3, V.9, 1972, Sovetskaya entsiklope- dia (Moscou), page 327), et, à ces fins, des appareils 4. divers sont proposés. Cependant, les appareils qui réalisent les procé- dés de refroidissement rapide des biostructures se basant sur l'immersion directe des conteneurs contenant le maté- riel biologique dans l'agent frigorifique ne permettent pas d'atteindre des vitesses de refroidissementsupérieures à400-500 C/mn, ce qui est insuffisant pour éviter le déve- loppement du processus de cristallisation et pour produire une vitrification dans l'échantillon biologique, même de taille très petite. Pour cette raison, on se voit obligé, dans ces cas, d'introduire, dans le cryoconservant, de fortes con- centrations du cryoprotecteur, allant jusqu'à 50-60%, ce qui permet de produire, aux vitesses susmentionnées de refroidissement, un processus de vitrification. Cependant l'utilisation des concentrations sus- mentionnées de cryoprotecteurs entraîne des lésions pro- fondes des structures biologiques aux étapes d'addition des cryoconservants ou d'élimination de ces derniers après la décongélation. Les basses vitesses précitées de refroidissement de l'échantillon biologique, lors de son immersion directe dans l'azote liquide, sont liées au fait qu'autour des conteneurs de l'échantillon biologique, il se forme une couche calorifuge composée des vapeurs de l'agent frigo- rifique, par exemple d'azote, aux dépens de la différence de température entre le conteneur non refroidi et l'azote liquide à une température de -196 C. La présence d'une telle couche calorifuge réduit la vitesse de refroidissement de l'objet biologique à un dégré tel qu'il se développe un processus de cristalli- sation, ce qui entraîne à son tour la nécessité d'intro- duire dans la composition du cryoconservant de fortes con- centrations de cryoprotecteur afin d'inhiber ce processus. Le problème posé dans la présente invention con- siste à mettre au point un appareil pour le refroidisse- ment et la congélation d'objets biologiques, dont la cons- truction contribuerait au développement de la vitrification. Ce problème se voit résolu par le fait qu'un ap- pareil pour le refroidissement et la congélation d'objets biologiques comportant un réservoir calorifuge pour l'agent frigorifique et un conteneur pour les objets biologiques, selon l'invention, comporte également un récipient préparé en un matériau de haute conductibilité thermique, qui est placé dans ledit réservoir et rempli de matière pulvérulente de haute conductibilité thermique qui sert pour disposer le conteneur avec les objets biologiques. L'appareil selon l'invention permet d'exclure la formation d'une couche calorifuge de vapeurs d'azote au- tour du conteneur portant les objets biologiques, ce qui à son tour permet, en fonction du type de la poudre, de son degré de dispersion et de la forme de ses particules, de hausser la vitesse de refroidissement des objets jus- qu'à plusieurs dizaines de milliers de degrés par minute. Il en résulte que les molécules de l'eau n'ont pas le temps de s'organiser en un réseau cristallin et que la congélation de l'eau se réalise par le biais de sa vi- trification, ce qui exclut ou réduit au minimum l'action négative, sur les structures biologiques, des facteurs ex- trêmes liés à l'évolution du processus de cristallisation; cette action se traduisant par le traumatisme mécanique des biomacromolécules par les cristaux de glace, l'action dénaturante des solutions salines hyperconcentrées et leur effet osmotique, et la déshydratation exagérée des structures biologiques produisant des- lésions irréversibles dans lesdites structures biologiques. Selon la variante préférentielle de réalisation de la présente invention, on utilise, à titre de matière pulvérulente de haute conductibilité thermique, un métal. - Selon une variante de réalisation de la présente invention, on utilise, à titre de matière pulvérulente de haute conductibilité, un oxyde métallique. Selon une autre variante de réalisation de la présente invention, on utilise, à titre de matière pulvé- rulente de haute conductibilité thermique, un alliage mé- tallique. Selon encore une autre variante de réalisation de la présente invention on utilise, à titre de matière pulvé- rulente de haute conductibilité thermique, un mélange com- posé de métal, d'oxyde métallique et d'alliage métallique en diverses proportions. Le choix de la matière pulvérulente appropriée est déterminé par le temps nécessaire pour le développe- ment de la vitrification dans l'objet biologique soumis à la congélation dans les conditions d'utilisation d'un cryo- conservant de composition donnée. Les autres buts et avantages de la présente inven- tion apparaîtront mieux à la lecture de la description ex- plicative qui va suivre d'exemples non limitatifs de sa réalisation, en référence aux dessins schématiques non limitatifs annexés,dans lesquels: la figure 1 représente un schéma de principe d'un appareil selon l'invention au moment de la prise du conteneur avec les objets biologiques; - la figure 2 le montre au moment du transfert du conteneur avec les objets biologiques,vers le réservoir contenant l'agent frigorifique; - la figure 3 représente le processus d'immersion du conteneur avec les objets biologiques dans le bac con- tenant une matière pulvérulente de haute conductibilité thermique; - la figure 4 le montre au moment de la récupéra- tion du conteneur avec les objets biologiques du bac con- tenant une matière pulvérulente de haute conductibilité thermique; et - la figure 5 le montre au moment de l'immersion du conteneur avec les objets biologiques congelés dans un réservoir rempli d'un agent frigorifique pour le stockage. L'appareil selon l'invention comporte un réservoir 1 (figure 1) préparé en un matériau calorifuge, par exemple en mousse plastique, et qui doit être rempli d'un agent frigorifique 2. Dans le réservoir 1 se trouvent deux réci- pients 3 et 4 en un matériau de haute conductibilité ther- mique, par exemple, en métal. Le récipient 3 est destiné à être rempli de matière pulvérulente de haute conductibi- lité thermique 5, alors que le récipient 4, de l'agent frigorifique 2. Le récipient 3 porte un agitateur 6 avec un actionneur électrique 7. Le réservoir 1 est muni d'un couvercle 8 avec deux orifices débouchants 9 et 10 disposésau-dessus des récipients 3 et 4, respectivement. L'appareil selon l'invention est muni d'un méca- nisme 11 pour saisir le conteneur 12 avec les objets biolo- giques et d'actionneurs 13 et 14 pour son déplacement linéaire horizontal et vertical. le conteneur 12 peut être préparé, par exemple, en une feuille d'aluminium. A titre de matière pulvérulente de haute conduc- tibilité thermique 5, on peut utiliser un métal, un oxyde métallique ou un alliage métallique, pris soit séparément, soit ensemble,en différentes proportions. L'appareil selon l'invention fonctionne comme suit. Avant le commencement du travail, on enlève le couvercle 8 et on remplit le réservoir 1 et le récipient 4 de l'agent frigorifique 2, par exemple d'azote liquide à une température de -196 C, et l'on remplit le récipient 3 d'un agent pulvérulent à haute conductibilité thermique 5, après quoi on enclenche l'actionneur 7 de l'agitateur 6 pour l'égalisation de la température de la matière 5 dans le récipient 3, et on ferme le réservoir 1 avec le cou- vercle 8. Après refroidissement du matériau 5 à la tempé- rature de l'agent frigorifique, on saisit le conteneur 12 rempli des objets biologiques à l'aide du mécanisme 11 (figure 1) et, au moyen des actionneurs 13, 14,on l'intro- duit, par le biais de l'orifice 9, dans la matière pulvé- rulente de haute conductibilité thermique 5 qui se trouve dans le récipient 3 (figures 2 et 3).- A l'échéance de 5 à secondes, on retire le conteneur 12, avec les objets biologiques congelés, du réservoir l,en utilisant les actionneurs 13 et 14 (figure 4) et on l'apporte près de l'autre orifice 10, à travers lequel on l'introduit dans le récipient 4 (figure 5) pour un stockage de bref délai (quelques jours). Dans le but de confirmer l'aptitude de fonctionner de l'appareil selon l'invention, on a réalisé le refroidis- sement et la congélation d'échantillons d'eau jusqu'à une température de 50 C. On remplit le conteneur 12 d'une capacité de 0,1 ml, préparé en feuille métallique alimen- taire de 0,03 mm d'épaisseur, d'eau,et on l'immerge dans le récipient 3 contenant de la poudre d'oxyde d'aluminium (A1203) refroidie à la température de l'agent frigorifique 2. La température de -50 C est atteinte en 0,95 seconde. L'échantillon biologique témoin est immergé dans le réci- pient 4, contenant de l'azote liquide; le temps nécessaire pour atteindre la température de -50 C est égal à 1,87 se- condes. Les résultats obtenus à la suite de l'utilisation d'autres matières pulvérulentes sont rapportés au tableau. T A B LE A U Temps de solidification de l'eau à la suite de l'immersion du conteneur dans des matières pulvérulentes de haute conductibilité thermique et dans l'azote liquide Temps de solidifica- tion de l'eau dans No Matière pulvérulente le conteneur (seconde) 1 Cuivre 0,85 2 Fer 0,3 3 Zinc 0,15 4 Oxyde de zinc 0,75 5 Aluminium (à gros grains de 100-200Pm) 0,6 6 Oxyde d'aluminium 0,95 7 Bronze (90% de cuivre, 10%, d'étain) 0,35 8 Laiton (80% de cuivre, 20% d'étain) 0,5 9 Mélange A1203 et ZnO (50: 50) 0,9 10 Mélange A1203 35%, Zn 35%, bronze 30% 0,75 11 Mélange A1203 25,, Zn 50%, bronze 25% 0,4 12 Azote liquide (pour référence) 1,87 Les résultats obtenus montrent que l'introduction, dans l'agent frigorifique du récipient 3, de la poudre 5 qui représente l'agent réfrigérant pour l'objet biologique dans le container 12 permet de réduire le temps de solidi- fication de 2 à 15 fois, ce qui confirme la possibilité d'utiliser l'appareil selon l'invention en cryobiologie et en cryomédecine. R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Appareil pour le refroidissement et la congé- lation d'objets biologiques,du type comportant un réser- voir calorifuge pour un agent frigorifique et un conte- neur pour les objets biologiques, caractérisé en ce qu'il est muni d'un récipient (3) réalisé en un matériau de haute conductibilité thermique, qui est placé dans le réservoir (1) et rempli d'une matière pulvérulente de haute conductibilité thermique (5), o l'on introduit le conteneur (12) avec les objets biologiques. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise, à titre de matière pulvérulente de haute conductibilité thermique (5), du métal. 3. Appareil selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'on utilise, à titre de matière pulvérulente de haute conductibilité thermique (5), de l'oxyde métal- lique. 4. Appareil selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'on utilise, à titre de matière pulvérulente de haute conductibilité thermique (5), un alliage métal- lique. 5. Appareil selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'on utilise, à titre de matière pulvérulente de haute conductibilité thermique (5), un mélange composé de métal, d'oxyde métallique et d'alliage métallique en différentes proportions.