Brevet FR2628751A1 — publié le 19890922

La présente invention concerne un procédé de production en continu de L;aminoacides par réduction enzymatique d'Ccétoacides correspondants en présence d'une source d'ions ammonium, d'un coenzyme du type -nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et d'un réducteur. Il a été décrit dans la demande -de brevet EP-206904 un mode de réalisation en "batch" ou "fed batch" de cette réaction utilisant, comme source unique d'enzyme, des cellules d'une souche de Bacillus, ces cellules possédant à la fois une activité aminoacide déshydrogénase et une activité glucose déshydrogénase considérées comme indispensables. Par opération en "batch", on entend une opération totalement discontinue : les réactifs sont introduits en totalité au départ. Dans une opération en "fed batch", au moins l'un des réactifs est introduit en totalité au départ, l'autre (ou les autres) réactifs étant introduits progressivement, au fur et à mesure du déroulement de la réaction, sans soutirage. Dans les deux cas, le milieu demeure confiné dans le réacteur. Après chaque opération selon EP-206904, on pouvait penser réutiliser les -cellules comme source des deux enzymes dans une opération subséquente mais on devait prévoir de rajouter dans cette opération en fed batch, du coenzyme qui est une matière coûteuse. Par ailleurs, du fait de la solubilité du NAD dans le milieu, on ne pouvait pas envisager une opération en continu sauf à remettre continuellement du NAD, ce qui s'avérait à priori peu économique. En outre, il a été décrit dans le brevet US 4304858 un procédé enzymatique continu de synthèse de L- a -aminoacide à partir d'o'-cétoacide dans un réacteur à membrane avec le coenzyme nicotinamide adénine dinucléotide sous forme de dérivé à haut poids moléculaire soluble en milieu aqueux et avec deux enzymes purifiées, une L-aminoacide déshydrogénase pour la réduction de l'o'-cétoacide et une formiate déshydrogénase pour la régénération du coenzyme. Ce procédé présente plusieurs inconvénients - on utilise deux enzymes intracellulaires provenant de deux microorganismes différents Candida boidinii ou Pseudomonas oxalaticus pour la formiate déshydrogénase et Bacillus subtilis pour la L-aminoacide déshydrogénase, ce qui implique deux cultures différentes et le cassage des cellules pour obtenir les extraits contenant les enzymes intracellulaires et deux étapes de purification de ces enzymes. - Il est d'autre part nécessaire de procéder au greffage du coenzyme sur le polymère (polyoxyéthylène), étape dont le rendement avoisine environ 50 %, ce NAD greffé ayant par la suite une réactivité moins bonne que le NAD natif. Le procédé de la présente invention qui remédie aux inconvénients précités, permet d'obtenir un rendement accru en L- -aminoacides pour une même quantité de cellules- de Bacillus, par un procédé en continu tout en catalysant simultanément la régénération de nicotinamide adénine dinucléotide sous forme réduite nécessaire à la réaction. Un autre objet est l'utilisation de cellules de Bacillus dans un procédé en continu après que ces cellules aient été prétraitées ex situ en présence de coenzyme. De manière plus précise, l'invention concerne un procédé de production en continu de L-Waminoacides dans lequel on met en culture une souche de Bacillus dans des conditions telles que l'on produit des cellules contenant une composition enzymatique comprenant de l'aminoacide déshydrogénas e et une enzyme susceptible de catalyser la régénération du nicotinamide adénine dinucléotide, on maintient confinées lesdites cellules dans une zone de réaction, et on soumet dans ladite zone de réaction un milieu d'alimentation comprenant au moins un -cétoacide ou au moins un de ses sels, une source d'ions ammonium et un réducteur à l'action desdites cellules en présence d'un coenzyme de type nicotinamide adénine dinucléotide sous forme réduite ou oxydée.Ce procédé est caractérisé en ce qu'on procède à un soutirage d'un effluent contenant ledit L-S-aminoacide produit, on règle le débit d'admission de l'O(-cétoacide dudit milieu d'alimentation dans la zone de réaction, la concentration en -cétoacide dans le milieu d'alimentation et le débit de soutirage dudit effluent de manière à maintenir une concentration en L- aminoacide comprise entre 1 et 200 mmoles. par litre dans la zone de réaction et de manière à maintenir une concentration en e[-cétoacide dans la zone de réaction au plus égale à 150 mmoles par litre. On obtient une meilleure productivité en L-o On a constaté que lorsque la concentration en L-gaminoacides dépasse 200 mmoles/l dans la zone de réaction et lorsque la concentration en a(-cétoacide dans la zone de réaction dépasse 150 mmoles/l, il se produit une chute de la productivité en L-daminoacides, probablement due à une inhibition partielle voire totale des activités enzymatiques par la présence excessive de substrat ou de produit dans le milieu réactionnel. Un des avantages du procédé selon l'invention concerne sa durée de vie, qui peut être concrétisee par la notion de nombre de recyclages du coenzyme, qui est le rapport du nombre de moles de L-Kaminoacides forme par mole de NAD introduit. Le fonctionnement du procédé en continu permet d'augmenter sensiblement la productivité du procédé tout en utilisant une quantité de NAD moindre qu'en "fed batch" ou en "batch". On peut introduire 1.' -cétoacide et soutirer le L- X aminoacide de façon continue ou périodique. Le milieu d'alimentation peut être compose d'une solution unique généralement aqueuse, contenant l'ensemble des trois substrats de la réaction (&alpha;-cétoacide, reducteur et ions ammonium), ou par le mélange de deux ou trois solutions selon que l'un des substrats est seul ou en mélange avec un des deux autres. On utilise de préférence le produit de culture d'une souche de Bacillus megaterium et de maniere encore plus préféree le produit de culture de la souche de Bacillus megaterium ATCC 39118 en raison des rendements particulierement éleves en L-&alpha;-aminoacides. Cette souche est un mutant de sporulation de la souche de la collection du laboratoire Bacillus megaterium IFP 188 décrite dans le brevet FR 2526442. Selon un mode préféré de réalisation du procédé, on peut soumettre ex situ les cellules à un prétraitement comprenant une mise en incubation de ces cellules en présence du coenzyme sous forme oxydée ou reduite dans des conditions telles que lesdites cellules' contiennent une quantité substantielle dudit coenzyme sous forme intracellulaire, suffisante pour la production des -aminoacides. Puis on soumet ces cellules ainsi prétraitées à la bioconversion proprement dite, apportant ainsi au milieu réactionnel le coenzyme nécessaire à la réaction.Par quantité substantielle de coenzyme, on entend une quantité de coenzyme retenue suffisamment longtemps à l'intérieur de la cellule pour pouvoir réaliser, notamment en continu, des réactions de synthèse de produits à partir de substrat correspondant sans rajout de coenzyme, par exemple de 0,01 à 2 mmoles de NAD intracellulaire par gramme de poids sec de cellule. La cellule ainsi prétraitée contient en son intérieur, les deux enzymes, l'un servant pour la conversion du précurseur l'autre pour la régénération simultanée du coenzyme. Elle renferme en outre, et ceci est inattendu, le coenzyme qui une fois introduit, et de façon surprenante, ne ressort sensiblement pas. La cellule peut alors fonctionner comme un réacteur à membrane contenant les enzymes nécessaires à la réaction en continu et le coenzyme et ne les laissant pas s'échapper tout en permettant la diffusion libre des substrats et produits des deux réactions dans la cellule. Le procédé est alors rendu encore plus économique parce qu on peut récupérer le NAD non incorporé dans les cellules lors de l'incubation et réaliser une meilleure valorisation du coenzyme (nombre de recyclages). Il est alors possible de fonctionner en continu durant une période de temps substantiellement longue sans avoir à rajouter d'enzyme et de coenzyme du moment que l'on sait maintenir ces cellules confinées dans un espace réactionnel, ce qui peut être réalisé par l'utilisation soit d'un réacteur à membrane avec des microorganismes libres, soit d'un réacteur à membrane ou d'une colonne avec des cellules fixées ou adsorbées selon des techniques bien connues de l'homme de l'art notamment - les techniques d'adsorption des microorganismes sur des support tels que du kieselguhr, de la brique pilée, des résines échangeuses d'ions, des billes de verre, des copeaux de bois, de la céramique, etc, - les techniques d'inclusion des microorganismes dans des gels de polymères tels que l'agar, l'alginate de calcium, le carrageenane, le polyacrylamide, etc., - les techniques de couplage des microorganismes sur différents supports, billes de silice, verres frittés, par liaison covalente avec des agents tels que du glutaraldéhyde, des isocyanates, etc. Selon un premier mode de réalisation, on peut procéder, après l'étape de culture à une récolte des cellules consistant à séparer les cellules du moût de fermentation et procéder ensuite à l'étape d'incubation avec le coenzyme puis récolter de nouveau ces cellulés imprégnées de coenzyme. Ceci permet d'ajuster sensiblement, suite à'la première récolte1 la quantité de coenzyme par rapport aux cellules et suite à la seconde récolte, d'une part d'ajuster la quantité de cellules imprégnées qui va être mise en oeuvre pour la conversion, et d'autre part de récupérer le coenzyme en excès dans la solution d'incubation. Selon un autre mode de réalisation, on peut, après l'étape de culture, procéder à la mise en contact du coenzyme'avec le moût de fermentation sans récolte préalable des cellules, celles-ci étant alors récoltées après l'incubation en présence de coenzyme. On évite ainsi la première étape de récolte des cellules suite à la culture. On peut également, selon encore un autre mode de réalisation, après l'étape de culture, procéder à l'incubation du coenzyme avec le moût de fermentation sans récolte préalable des cellules, et utiliser directement cette solution pour la conversion désirée. Le procédé de l'invention comprend - la culture des microorganismes par fermentation, les conditions de culture étant telles que les cellules microbiennes contiennent les activités enzymatiques désirées et présentent une perméabilisation membranaire spontanée sans que l'on ait à effectuer de traitement de perméabilisation des cellules. Ces conditions sont décrites dans la demande de brevet publié sous le nO EP 206904. L'état de perméabilisation des cellules est largement conditionné par les conditions de culture, en particulier la composition du milieu, la température et surtout le temps de culture. Ces conditions de culture sont généralement les suivantes : température 20 à 400C, pH 5,5 à 8,0. Un excellent niveau d'activité a été obtenu à une température comprise entre 27 et 320C et dans un intervalle de pH de 6,5 à 7,5, par exemple une activité L-aminoacide déshydrogénase et glucose déshydrogénase en proportion de 0,1 : 1 à i0 : 1. Les temps de culture sont en général d'au moins 15 heures, avantageusement de 20 à 50 heures et de préférence de 25 à 40 heures. Le milieu peut être agité et aéré de façon à avoir un taux d'oxygène dissous qui ne soit jamais nul. A partir des cultures de microorganismes, on peut récolter avantageusement les cellules par centrifugation, filtration ou décantation. Pour vérification, on mesure à partir d'un extrait, les activités enzymatiques intracellulaires aux températures, force ionique et pH optimaux pour chaque enzyme avec des concentrations de substrats saturantes. Les cellules ainsi récoltées peuvent être ajoutées au milieu réactionnel avec le substrat nécessaire à la bioconversion. Le coenzyme NAD+ ou NADH est amené dans ce milieu réactionnel à une concentration au moins égale à 0,05 mmole.l-l de solution du milieu réactionnel tandis que les cellules de Bacillus sont en général introduites dans le milieu réactionnel à raison de 1 à 200 grammes, comptés en poids sec, par litre de mélange réactionnel et de préférence à raison de 2,5 à 50 g/l. Par contre, suivant le mode préféré décrit ci-haut, les cellules prétraitées en présence de coenzyme peuvent être avantageusement utilisées telles quelles pour la bioconversion, sans rajout par la suite de coenzyme dans le milieu réactionnel. L'imprégnation des cellules par le coenzyme se fait par simple mise en contact des cellules et du NAD ou de manière équivalente de NADH. On met les cellules préparées et récoltées dans les conditions décrites ci-dessus en suspension dans une solution tamponnée à un pH compris entre 5 et 10, de préférence entre 7,5 et 9 qui contient du coenzyme, à raison de 0,5 à 50 g de poids sec de cellule par mmole de coenzyme, de préférence de 1 à 50 g/mmole et à une température comprise entre 4 et 700C, de préférence entre 10 et 400C. Le temps d'incubation varie en général de 0,5 à 100 heures. Après cette incubation, la solution peut avantageusement être centrifugée, ou filtre afin de récupérer d'une part les cellules imprégnées au coenzyme et d'autre part le coenzyme restant dans le surnageant ou le filtrat, coenzyme qui peut être réutilisé. La quantité de cellules prétraitées mise en jeu lors de la bioconversion est comprise entre 1 g de poids sec de cellules par litre et 200 g/l de solution nécessaire à la bioconversion, de préférence entre 2,5 g/l et 50 g/l. La synthèse proprement dite s'effectue généralement dans un réacteur maintenu à une température de 10 à 60 C, de préférence de 20 à 450C, que les cellules soient prétraitées ou pas. Le pH est choisi en fonction de l'optimum de l'activité des enzymes et de leur stabilité, et la synthèse se fait en général dans un milieu tamponné. Il peut être nécessaire de réguler le pH par l'apport d'acide ou de base. Un pH situé entre 6,5 et 8,5 est particulièrement favorable à la stabilité des enzymes utilisées et du NAD . Le choix du pH est en effet important pour ce dernier composé dont la forme réduite est instable en milieu acide et la forme oxydée instable en milieu alcalin. La présence dans le milieu d'un tampon contenant des ions NH4+ est en règle générale préconisée car l'ion ammonium est un des substrats de la réaction de synthèse d'aminoacide. Il est cependant tout à fait possible d'utiliser un tampon à base par exemple d'un sel soluble de l'acide phosphorique qui est utile à maintenir le pH et à stabiliser les enzymes. Le pH est maintenu à la valeur choisie par addition de préférence d'ammoniaque. Celui-ci intervient à la fois pour maintenir le pH et comme réactif de l'amination réductrice. Un mode opératoire préféré est décrit ci-dessous : on introduit dans le réacteur les éléments choisis, à savoir le tampon et les cellules de Bacillus megaterium ayant été incubées en présence de coenzyme qui ont été ou non immobilisées au préalable. Une partie seulement ou totalité du réducteur, par exemple le glucose, nécessaire à la réaction est introduite en début de réaction. Dans certains cas, on préfère éviter la présence dans le réacteur de concentrations trop fortes en glucose qui peuvent avoir une action inhibitrice sur l'activité enzymatique L-aminoacide déshydrogénase. De la même façon, on préfère éviter la présence dans le réacteur de concentrations élevées end-cétoacides qui peuvent avoir une action inhibitrice sur l'activité enzymatique L-aminoacide déshydrogénase.C'est pourquoi, il est souvent avantageux d'injecter progressivement et de préférence en continu dans le réacteur ces deux composés sous forme d'une solution aqueuse dont la quantité de réducteur (glucose par exemple) est de 1 à 2 moles pour 1 mole d'-cétoacide. L' -cétoacide peut être introduit sous forme d'acide ou de l'un de ses sels, notamment un sel de Na K+, NH4+, Li+. Sa concentration molaire est choisie de manière à éviter une trop forte inhibition par l'acide aminé formé sachant que la réaction est stoechiométrique. Le débit d'admission est, de préférence réglé afin que le paramètre limitant de la réaction soit l'apport de l'-cétoacide, ce dernier composé étant alors transformé en L-aminoacide sensiblement au fur et à mesure de son introduction. Il pourra par exemple être compris entre 0,01 et 25 mmoles.h-1. (litre de volume réactionnel)-1 et de préférence entre 0,1 et 10 mmoles.h-1. (litre de volume réactionnel)-l de façon à obtenir une productivité suffisamment élevée et à ne pas avoir une vitesse d'injection trop rapide qui provoquerait une accumulation de substrat et par la même, un arrêt presque total de la réaction à partir d'une concentration en cétoacide dans la zone de réaction supérieure à 150 mmoles par litre. On se maintient donc à une concentration enK-cétoacide au plus égale à 150 mmoles/l de volume reactionnel, avantageusement comprise entre O et 100 mmoles/l de volume réactionnel et de préférence comprise entre 0 et 50 mmoles/l et une concentration en L-Vaminoacide comprise' entre 1 et 200 mmoles/l de volume réactionnel. Il est possible de modifier le débit d'alimentation ou sa composition en fonction de l'évolution des concentrations en produits et substrats dans le milieu réactionnel.Ainsi dans le cas de solutions d'alimentation très concentrées en -cétoacide, il est souvent nécessaire de baisser le débit d'admission ou de diluer la solution d'alimentation de façon à éviter de trop fortes inhibitions, c'est-à-dire de se maintenir à des concentrations en -cétoacide et en aminoacide telles que définies ci-dessus. En général, le débit de soutirage sera réglé de façon à être sensiblement égal au débit d'alimentation afin de maintenir un volume réactionnel compatible avec le volume du réacteur. Il est possible de fonctionner en continu dans un réacteur à membrane. La membrane peut être une membrane d'ultrafiltration ou bien de microfiltration, du moment que le diamètre des pores soit inférieur à 0,8 micromètre. On utilisera de préférence des membranes de diamètre de pores compris entre 0,2 et 0,8 micromètre qui colmatent moins facilement que les membranes d'ultrafiltration. En général, le milieu d'alimentation comprend glucose et -cétoacide ou son sel. La concentration respective des deux substrats est de 1 à 2 moles de glucose pour 1 mole d' -cétoacide. En général, la concentration d'o'-cétoacide dans le milieu d'alimentation est choisie telle que si le rendement de la réaction égale 100 %, on reste en dessous du seuil d'inhibition par l' -aminoacide correspondant.L'alimentation en ions ammonium est en général assurée par la régulation de pH par l'ammoniaque. Si l'on veut travailler en continu avec des cellules immobilisées ou fixées, il est plus facile de confiner le catalyseur à l'intérieur du réacteur (membranes de filtration classiques, grilles) et il est tout à fait envisageable de fonctionner en réacteur colonne. Selon un autre mode de réalisation, on peut fonctionner d'abord en mode fed batch au début de la synthèse en alimentant au moins une fois en cr-cétoacide ou en l'un de ses sels, de façon à amener progressivement le réacteur en régime jusqu'à atteindre la concentration comprise entre 1 et 200 mmoles.1 1 en L-aminoacide. On commence alors le soutirage du milieu selon le procédé de l'invention. Ce système est préféré dans le cas où l'on utilise des cellules sans prétraitement, la durée du fedbatch permettant de charger les cellules en coenzymé tout en amenant le milieu à'la concentration désirée. On évite ainsi une partie des pertes en coenzyme qui sont inévitables dans le cas où l'on fonctionne avec des cellules n'ayant pas subi d'incubation dans le coenzyme-préalablement à la conversion. Le L-&num;aminoacide formé au cours de la réaction peut être dosé par des techniques connues de l'homme de l'art par exemple par chromatographie liquide haute performance apres derivatisation ou bien enzymatiquement. De même, il est possible de déterminer les teneurs en NAD et NADH par des méthodes enzymatiques. Les produits des réactions sont récoltés puis extraits et purifiés selon les techniques classiques qui dépendent du type de produit fabriqué. Par exemple, le L-aminoacide peut être extrait par passage sur une résine échangeuse de cations, puis l'éluat peut être évaporé sous vide. Bacillus, et en particulier Bacillus megaterium ATCC 39118, est capable de produire à la fois L- Les produits ainsi synthétisés sont particulierement intéressants pour les industries chimique et pharmaceutique. Les exemples suivants qui illustrent l'invention sont donnés à titre non limitatif. Exemple 1 : Synthèse de L-valine en continu par des cellules imprégnées de NAD La souche de Bacillus megaterium ATCC 39118 est cultivée en fiole de Fernbach dans un milieu dont la composition est la suivante - hydrolysat trypsique de caséine 17 g - peptone papalnique de soja 3 g - chlorure de sodium 5 g - phosphate bipotassique 2,5 g - glucose 2,5 g - Eau distillée 1 litre Ce milieu est stérilisé avant ensemencement, 30 minutes à 1150C. La culture est réalisée à 300C, pH = 7,0, pendant 30 heures, les fioles étant placées sur une table d'agitation à mouvement alternatif. Ensuite, les cellules sont récoltées par centrifugation. A partir de 300 ml de culture, on récolte 4;5 g de cellules humides (soit environ 1,0 g en poids sec) que l'on lave une fois avec du tampon phosphate 0,1 M, pH 7 et on les met en suspension dans 50 ml de tampon NH4Cl NH40H, 1 M, pH 8,2 contenant 6 mmoles.l de NAD. On peut vérifier l'activité enzymatique des cellules par un prélèvement d'un échantillon des cellules récoltées ; ces cellules sont cassées au cours d'un traitement aux ultra-sons afin de déterminer les activités enzymatiques aminoacides déshydrogénases et glucose déshydrogénase. L'activité enzymatique de la valine déshydrogénase est trouvée égale à 0,47 unité par mg de protéines de l'extrait, celle de la glucose déshydrogénase est de 0,82 unité par mg de protéines de l'extrait. Une unité enzymatique est définie comme la quantité d'enzymes permettant la transformation d'une micromole de substrat (le glucose dans le cas de la glucose déshydrogénase, l'acide cr-cétoisovalérique ou l'un de ses sels dans le cas de la valine déshydrogénase) par minute dans les conditions de l'essai. On peut alors estimer l'activité enzymatique par gramme de cellules humides qui est dans ce cas de 33,8 U/g pour la valine déshydrogénase et de 50,9 U/g dans le cas de la glucose déshydrogénase. Les cellules en suspension dans la solution de NAD+ sont laissées sous faible agitation pendant 24 heures à température ambiante puis sont récupérées par centrifugation. Dans le surnageant, on ne détecte aucune activité glucose déshydrogénase ou valine déshydrogénase et on trouve 3,9 mmoles.l de NAD+, ce qui montre que 2,1 mmoles.l sont passées dans les cellules. L'intégralité des cellules récupérées est utilisée pour la synthèse de L-valine qui est effectuée dans un réacteur contenant 50 ml de milieu réactionnel initial. Ce milieu est constitué de 4,5 g de cellules humides (imprégnées de telle façon que l'on ait 2,1 mmoles de NAD par litre de milieu) en suspension dans 50 ml de tampon NH4C1-NH40H 1 M, pH 8,2 contenant 0,6 mole l-1 de glucose. Le pH est régulé à 8,2 à l'aide d'une solution d'ammoniaque 2N. La température est maintenue à 300C et le milieu est agité modérément. Le réacteur est une cellule d'ultrafiltration AMICON de volume de 20Q ml équipée ici d'une membrane de microfiltration de diamètre égal à 62 mm, de porosité 0,2 micron , la sortie de l'effluent s'effectuant en aval de la membrane. Pendant les premières 24 heures, une solution d' -cétoisovalérate de sodium 0,3 mole.l est injectée par l'intermédiaire d'une pompe péristaltique à un débit de 0,5 ml.h 1 sans que l'on ne soutire de milieu, ce qui correspond à une alimentation dite "fed batch". Par la suite, on fonctionne en continu en soutirant un effluent en aval de la membrane à l'aide d'une pompe péristaltique. La solution d'alimentation est alors composée d'i-cétoisovalérate de sodium à 35 mmoles.l et de glucose à 100 mmoles.l-1. Les débits d'alimentation et de soutirage sont égaux à 3 ml.h1. Au bout des 24 premières heures correspondant au "fed batch", le volume de milieu dans le réacteur est de 68 ml, la concentration de L-valine est de 44 mmoles.l , c'est-à-dire un taux de conversion molaire de 80 %. Le taux de conversion molaire est défini comme le rapport de la quantité -d'aminoacide formé sur la quantité d'o'-cétoacide injecté. Au cours des 24 heures suivantes (continu), la concentration en L-valine passe à 38,5 mmoles.l-1, ce qui correspond à un taux de conversion molaire de 94 % par rapport au précurseur injecté. Aucune trace de NAD ou NADH n'a été trouvée dans les surnageants de bioconversion, ce qui montre que le coenzyme reste intracellulaire. D'autre part, aucune lyse des cellules n'a été observée.Ceci montre que le NAD qui est passé à l'intérieur des cellules, ne ressort pas et qu'il fonctionne selon le schéma de synthèse des L-aminoacides par l'aminoacide déshydrogénase avec régénération du coenzyme par la glucose déshydrogénase. La récupération de la L-valine à partir de l'effluent du réacteur s'effectue de la manière suivante le milieu réactionnel est versé en haut d'une colonne de résine échangeuse de cations Amberlite ER 151 préalablement mise sous forme par lavage avec de l'acide chlorhydrique 1N suivi d'un lavage à l'eau. Après introduction de l'échantillon, la colonne est à nouyeau lavée par de l'eau puis éluée avec de l'ammoniaque 2N.Après le passage d'un volume de la solution d'élution correspondant au volume "mort" de la colonne, on commence à récupérer les fractions éluées jusqu a ce que leur volume total représente 1,5 fois le volume mort de la colonne. L'élut est ensuite évaporé sous vide, redissous dans l'eau et à nouveau évaporé. Le rendement de la purification est de 98 %. Exemple 2 : Synthèse en continu de L-valine avec différentes concentrations d'&alpha;-cétoisovalérate dans la solution d'alimentation Les cellules de Bacillus megaterium ATCC 39118 sont cultivées, récoltées et prétraitées avant conversion dans des conditions identiques à celles de l'exemple 1. Les 24 premières heures de synthèse sont effectuées en "fed batch" dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1. Ensuite, le fonctionnement est continu (alimentation et soutirage) pendant une dizaine de jours, l'installation utilisée pour la conversion étant la même que celle de l'exemple 1. Le milieu d'alimentation contient alors 600 mmoles.l-1 de glucose et des concentrations variables d'&num;-cétoisovalérate de sodium (tableau 1).Le volume de milieu réactionnel est maintenu constant à 70 ml par le réglage des pompes d'alimentation et de soutirage au même débit. La concentration en L-valine dans le volume réactionnel à la fin du fed batch est d'environ 50 mmoles.l . Dans le cas des alimentations à 35 mmoles.l et 100 mmoles.l-1, les concentrations en L-valine passent progressivement de la concentration obtenue en fin de fedbatch à la concentration indiquée.Dans le cas de l'alimentation à 200 mmoles.l , la concentration en L-valine atteint 125 mmoles.l après 72 heures de continu puis diminue ensuite progressivement jusqu'à 95 mmoles.l , les enzymes fonctionnant moins vite d'abord à cause de l'inhibition par la L-valine et ensuite à cause également de l'accumulation d'-cétoisovalérate dans le milieu d'alimentation. Ces effets sont encore plus marqués dans le cas de solutions d'alimentation à 250 mmoles.1 de cétoacide où la concentration résiduelle en1(-cétoisovalérate provoque un ralentissement prématuré de la réaction. A partir du moment où la concentration résiduelle en cétoacide atteint environ 130 mmoles.l , le taux de conversion chute brutalement (cf. tableau 1, colonne relative aux 50 dernières heures). Dans le cas où la concentration en cétoisovalérate dans le milieu -1 d'alimentation est de 400 mmoles.l , la teneur en L-valine atteint un TABLEAU 1 Concentration Débit Concentration Concentration Taux de conversion Productivité Nombre de d'acétoisovialérate d'alimentation en L-valine résiduelle en molaire en L-valine recyclages dans le milieu dans le milleu acétolsovalérate (calculés sur du coenzyme d'alimentation réactionnel dans le millieu au bout de au cours des les 300 heures au bout de 300 h réactionnel 300 h 50 dernières de continu) de continu (au bout de 300 h) heures mM/1 m1/h mM/1 mM/1 % % mM/1.h 35 3 33 2 94 94 1,4 305 100 3 90 5 94 93 2,6 574 200 2 95 89 52 48 2,7 606 250 2 50 180 22 6,5 1,4 320 400 2 20 360 5 0 0,6 128 TABLEAU 2 Concentration en Débit Concentration Concentation Taux de conversion Productivité Nombre de asétoisovali6rate d'alimentation en L-valine résiduelle en molaire en L-valine recyclages dans le millieu dans le milieu &alpha;cétoisovaliérste du NAD d'alimentation réactionnel dans le millieu au bout de au cours des au bout de 400 h réactionnel 400 h 50 dernières de continu (au bout de 400 h) heures mM/1 m1/h mM/1 mM/1 % % mM/1.h 35 1,0 30 3,5 90 88 1,80 357 100 2,5 90 5,0 94 92 4,50 900 200 0,5 150 10,0 94 93 1,50 355 250 0,4 170 20,0 89 80 1,36 340 400 0,2 180 70,0 72 65 0,72 220 maximum égal à 125 mmoles.l après 12 heures de continu. Cette valeur diminue ensuite, toute synthèse s'arrêtant après 35 heures de continu, la L-valine préalablement formée étant ensuite progressivement lessivée ; là encore, l'effet inhibiteur de la L-valine diminue l'activité des enzymes, ce qui provoque une accumulation d' -cétoacide qui engendre une inhibition totale des activités enzymatiques. Dans une seconde série d'expériences, on a cherché à ajuster le débit d'alimentation de manière à éviter les inhibitions liées à une accumulation de substrat (tableau 2). Le débit est réglé à une valeur telle que l'on n'ait pratiquement pas d'd-cétoacide résiduel dans le milieu réactionnel. Les valeurs indiquées correspondent à celles obtenues après 400 heures d'opération continue, le volume réactionnel étant maintenu constant à 50 ml et le continu étant lancé sans fed batch préliminaire. On constate que, bien que le rendement de conversion reste élevé, la productivité chute sensiblement ainsi que le nombre de recyclages du NAD, ceci étant principalement dû aux teneurs élevées en L-valine qui se rapprochent de la concentration inhibitrice du procédé selon l'invention. Exemple 3 : Synthèse en continu de L-valine par des cellules imprégnées de NAD (sans fed batch préalable) Les conditions de culture, récolte et incubation en présence de NAD+ sont identiques à celles de l'exemple I. Les cellules sont mises en conversion de la même manière que dans l'exemple 1 abstraction faite de la période fed batch (la conversion est démarrée directement en continu). Après 24 heures, le taux de conversion est égal à 85 % et on ne trouve pas de coenzyme dans l'effluent. Après 200 h de continu, le taux de conversion est égal à 80 %. Exemple 4 : Synthèse en continu de L-valine par des cellules entières non prétraitées avec un fed batch préalable Les conditions de culture de Bacillus megaterium et de récolte sont identiques à celles de l'exemple 1. Les cellules ne sont pas soumises à une incubation en présence de NAD+ avant d'être utilisées en bioconversion. L'activité des cellules récoltées est similaire à celle de l'exemple 1 et le milieu réactionnel est identique à celui de l'exemple 1, sauf qu'il renferme du NAD+ à une concentration de 3 mmoles.l . La conversion est ensuite effectuée dans des conditions identiques à celles de l'exemple 1 (24 heures de fed batch, puis continu avec un milieu d'alimentation exempt de coenzyme). Après les 24 heures de fedbatch, on trouve une concentration extracellulaire en NAD+ qui n'est plus que de 1 mmole.l . Le NAD+ est ensuite dilué et lessivé dans l'effluent. Le rendement de conversion est de 90 % lors du fed batch et de 80 % pendant les 24 heures du procédé en continu. Il est de 72 % après 200 heures d'opération en continu. Exemple 5 : Synthèse en continu de L-valine par des cellules entières non prétraitées et sans fed batch préalable Les conditions de culture et de récolte ainsi que le milieu initial sont identiques à celles de l'exemple 3. La conversion est démarrée sans batch ou fed batch initial.- Le milieu d'alimentation contient 50 mM.l1 d'-cétoisovalérate et 100 mmoles.l -l de glucose. Les débits d'injection et de soutirage sont égaux à 3 ml.h1. Après 24 heures de continu, la concentration en L-valine dans le réacteur correspond à un taux de conversion égal à 70.%. Dans l'effluent, on trouve une quantité de NAD correspondant à une teneur extracellulaire de 1,5 mmole.1 .Il y a donc une perte de coenzyme plus importante que dans l'exemple 4. Le taux de conversion après 200 heures d'opération continue est de 60 %. Exemple 6 : Synthèse de L-valine par des cellules entières sans prétraitement On opère comme dans l'exemple 4 et le milieu réactionnel contient comme dans l'exemple 4 du NAD+ à une concentration de 3 mmoles.l . On fait varier la concentration en substrat comme dans la première série d'expériences de l'exemple 2. On obtient des résultats, présentés dans le tableau 3, sensiblement identiques à ceux de l'exemple 2, le nombre de recyclages de coenzyme étant cependant inférieur. Exemple 7 : Essai de synthèse de L-valine par des cellules sans mise en contact de ces cellules avec du NAD+ Les conditions de culture et de récolte des cellules sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1. Les activités valine déshydrogénase et glucose déshydrogénase des cellules sont respectivement de 32,1 U par g de cellule humide et de 79,1 U par g de cellule humide. La totalité des cellules récoltées à partir d'une fiole de Fernbach (2,88 g humides) est intégrée dans le milieu réactionnel habituel (tampon NH40H-NH4Cl 1M, pH 8,2, glucose 0,6 mo1e.l1) sans mise en incubation préalable avec du NAD. La conversion est effectuée comme dans l'exemple 1. La production de L-valine n'est alors que de -1 2 mmoles.l en 24 heures, soit un taux de conversion quasiment nul. Ceci montre que le NAD (NADH) intracellulaire initial ne suffit pas pour assurer le fonctionnement des enzymes impliquées dans la synthèse d'aminoacides et qu'il y a bien passage du coenzyme à l'intérieur de la cellule puis, rétention de celui-ci. TABLEAU 3 Concentration Débit Concentration Concentration Taux de conversion Productivité en Nombre de en acétoisovalérate d'alimentation en L-valine résiduelle en molaire L-valine recyclage dans le milieu dans le milieu &alpha;;cétoisovalérate (calculeé sur du coenzymes d'alimentation réactionnel dans le milieu au bout de au cours des les 300 heures (au bout de 300 h réactionnel 300 h 50 dernières de continu) de continu) (au bout de 300 h) heures mM/1 m1/h mM/1 mM/1 % % mM/1.h 100 2 89 5 94 93 2,5 402 200 2 94 90 51 46 2,6 420 250 2 48 182 21 5 1,4 220 400 2 20 360 5 0 0,5 90 Exemple 8 :Synthèse de L-valine par des cellules imprégnées de NAD puis immobilisées Les conditions de culture et de récolte des cellules sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1. A partir de 300 ml de milieu de culture, on récolte 2,96 g de cellules (poids humide) ayant des activités valine déshydrogénase et glucose déshydrogénase respectives de 54 U et 102 U par gramme de cellule humide. Ces cellules sont mises 24 heures en agitation dans 50 ml de tampon NH4Cl-NH4OH, 1 M, pH = 8,2 contenant 3 mmoles.l NAD. Le surnageant restant après centrifugation de cette solution est à 2,48 mmoles.l en NAD. Les cellules ainsi préparées sont immobilisées dans des billes de gel d'alginate de calcium. La méthode consiste à préparer une suspension cellulaire à 20 % dans de l'alginate de sodium à 2 %. Le mélange est extrudé goutte à goutte à l'aide d'une pompe à seringue dans une solution de CaC12 0,1 M agitée. Les billes sont laissées dans CaCl2 pendant environ 2 heures puis récupérées par filtration sur un creuset filtrant. La synthèse de L-valine est réalisée dans des conditions identiques a celles décrites dans l'exemple 1 à l'exception du catalyseur qui ici correspond aux billes d'alginate de calcium renfermant les cellules imprégnées de NAD. Après 30 heures d'injection de cétoacide en continu, la production de valine est de 10 mmoles.l et le taux de conversion molaire en continu de 15 %. Après 200 heures d'opération en continu, ce taux de conversion est égal à 12 %. Exemple 9 : Synthèse de L-valine par des cellules immobilisées puis imprégnées de NAD Les conditions de culture et de récolte des cellules sont identiques à celles de l'exemple 1. On récolte ici 4 g de cellules humides ayant 43,7 U valine déshydrogénase et 117,3 U glucose déshydrogénase par gramme de cellules humides. Ces cellules sont ensuite immobilisées dans des billes d'alginate de calcium par utilisation de la même procédure que celle décrite dans l'exemple 8. Après immobilisation, les billes de gel contenant les cellules de Bacillus megaterium sont mises en agitation dans 50 ml d'une solution tampon NH4Cl-NH4OH 1 M, pH = 8,2 contenant 3 mmoles.l de NAD+ pendant 24 heures. La suspension est ensuite filtrée afin de récupérer les cellules immobilisées puis incubées en présence de NAD+. Le filtrat ne contient plus que 0,525 mmole.l-1 de NAD+. Ces billes sont mises en bioconversion en utilisant des conditions identiques à celles décrites dans l'exempie 1 à l'exception de la concentration en précurseur dans l'alimentation qui est égale à 50 mmoles.l . Après 48 heures de conversion (24 h fed batch et 24 h continu), la concentration en L-valine est de 45 mmoles.l , ce qui correspond à un rendement de conversion molaire de 90 % par rapport au précurseur injecté lors du continu. Aucune trace de NAD+ ou NADH n'est détectée dans le milieu extracellulaire tout au long de la conversion qui est poursuivie pendant encore 200 heures. Le taux de conversion final est de 80 %. Exemple 10 : Mise en évidence de l'entrée de NAD puis sa rétention par les cellules Après mise en culture et récolte de cellules de Bacillus megaterium ATCC 39118 dans des conditions identiques à celles décrites dans l'exemple 1, ces cellules sont remises en suspension à raison de 0,094 g de cellules humides par ml de solution dans un tampon NH4Cl-NH4OH 1 M, pH = 8,2 contenant différentes concentrations de NAD+. Les concentrations en NAD trouvées dans le surnageant après 22 et 45 heures d'incubation figurent dans le tableau 4. TABLEAU 4 Durée NAD+ NAD+ NAD+ 3 mM/l 6 mM/l 10 mM/1 O heure 2,70 5,S2 9,79 22 heures 1,75 4,08 7,96 45 heures 1,41 3,44 7,74 RR Exemple il : Synthèse de L-valine en continu avec Bacillus subtilis imprégné en NAD+ La souche de Bacillus subtilis 168 M est cultivée, récoltée et mise en incubation avec du NAD dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1. Les activités par gramme de cellules humides sont de 3,2 unités/g pour le glucose déshydrogénase et de 3,7 u/g pour la valine déshydrogénase et on introduit 3 g de cellules humides dans les 50 ml de milieu réactionnel initial.On procède ensuite de la même manière que dans l'exemple 1 à l'exception de la concentration en O(-cêtoisovalêrate de sodium dans le milieu d'alimentation que l'on fixe à 50 mmoles.l-1. Au bout de 24 heures de conversion en continu, la concentration en L-valine trouvée correspond à un taux de conversion de 23 %. Au bout de 100 heures d'opération continue, le taux de conversion est de 15 %. Exemple 12 : Synthèse en continu de L-leucine avec Bacillus megaterium ATCC 39118 imprégné de NAD La préparation des cellules de Bacillus megaterium ATCC 39118 est effectuée dans des conditions identiques à celles de l'exemple 1. Après incubation dans une solution de NAD+ à 3 mmoles 1-1, les cellules sont récoltées puis mises en bioconversion dans des conditions identiques à celles de l'exemple 1, à l'exception du précurseur qui est une solution d'o(cêtoisocaproate de sodium à 50 mmoles 1-1 pour la phase de continu. Le rendement de conversion de l'&alpha;-cétoisocaproate en L-leucine est egal à 80 % au bout de 48 heures et à 70 % au bout de 100 heures d'opération continue. Exemple 13 : Synthèse de divers L-,(-aminoacides On réalise trois opérations continues comme dans l'exemple 1 mais au lieu d'utiliser comme -précurseur de 1'o(-cétoisovalérate, on utilise dans un cas du pyruvate de sodium, dans un second cas du -hydroxypyruvate de lithium et dans un troisième cas de l'&alpha;-cétossméthylvalérate de sodium. On obtient respectivement de la L-alanine, de la L-serine et de la L-isoleucine avec un taux de conversion molaire sensiblement identique à celui de l'exemple 1. Exemple 14 : Utilisation de cellules issues du moût de fermentation complété en NAD+ Des cellules de Bacillus megaterium ATCC 39118 ont été mises en culture dans des conditions identiques à celles de l'exemple 1. Après 30 heures, on rajoute au moût de fermentation contenant 1 g en poids sec de cellules, du NAD+ de manière à obtenir une concentration finale en NAD+ égale à 5 mmoles.l 1- Le milieu est laissé à température ambiante en agitation pendant 24 heures, le pH du milieu étant de 6,5, puis les cellules sont récoltées par centrifugation et mises en bioconversion dans des conditions identiques à celles de l'exemple 1. Le rendement de conversion molaire en L-valine est égal à 61 % après 24 heures de continu et à 52 % après 150 heures de continu. Exemple 15 : Comparaison entre le taux de recyclage du NAD en fed batch et en continu Les cellules de Bacillus megaterium ATCC 39118 sont cultivées, récoltées avant conversion dans des conditions identiques à celles décrites dans l'exemple 1. On réalise d'une part une synthèse continue de L-valine dans les conditions décrites dans l'exemple 2 avec une concentration dPTcétoisovalérate de sodium dans le milieu d'alimentation égale à 100 mmoles.l pendant 350 heures. D'autre part, on réalise une conversion en fed batch pendant 180 heures dans des conditions identiques à celles de la période fed batch décrites dans l'exemple 1. Pour le continu, après 350 heures, la concentration en L-valine est de 90 mmoles.l et le nombre de recyclages du NAD est de 660. En fed batch, on trouve une concentration de L-valine égale à 110.mmoles 1 après 140 heures de synthèse, soit un nombre de recyclage de NAD égal à 128, ce taux de recyclage restant aux alentours de cette valeur, même en continuant l'alimentation, la synthèse de L-valine ne s'effectuant pâtis ensuite à cause des effets inhibiteurs conjugués des concentrations en cétoacide et en L-valine. On a par ailleurs observé qu'avec des cellules non prétraitées, suivant l'exemple 4, on obtenait sensiblement le même rapport entre les nombres de recyclage de NAD en continu et de NAD en fed batch que celui obtenu avec les cellules prétraitées. REVENDICATIONS 1. Procédé de production en continu de L- aminoacides dans lequel on met en culture une souche de Bacillus dans des conditions telles que l'on produit des cellules contenant une composition enzymatique comprenant de l'aminoacide déshydrogénase et une enzyme susceptible de catalyser la régénération du nicotinamide adénine dinucléotide , on maintient confinees lesdites cellules dans une zone de réaction, on soumet dans ladite zone de réaction un milieu d'alimentation comprenant au moins un i-cétoacide ou au moins un de ses sels, une source d'ions ammonium et un réducteur à l'action desdites cellules en présence d'un coenzyme de type nicotinamide adénine dinucléotide sous forme reduite ou oxydée, caractérisé en ce qu'on procède à un soutirage d'un effluent contenant ledit L-Kaminoacide produit, on regle le débit d'admission de l'd-cétoacide dudit milieu d'alimentation dans la zone de réaction, la concentration en i-cétoacide dans le milieu d'alimentation et le débit de soutirage dudit effluent de manière à maintenir une concentration en L-aminoacide comprise entre 1 et 200 mmoles par litre dans la zone de réaction et de manière à maintenir une concentration en i-cétoacide dans la zone de réaction au plus égale à 150 mmoles par litre. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le débit d' -cétoacide dudit milieu d'alimentation dans la zone de réaction est compris entre 0,01 et 25 mmoles par heure et par litre de volume réactionnel et de préférence entre 0,1 et 10 mmoles par heure et par litre de volume réactionnel. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2 dans lequel ledit coenzyme est apporté dans ladite zone de réaction par un prétraitement ex-situ des cellules comprenant une mise en incubation de ces cellules en présence dudit coenzyme sous forme oxydée ou réduite dans des conditions telles que lesdites cellules contiennent une quantité substantielle dudit coenzyme sous forme intracellulaire, suffisante pour la production desdits aminoacides. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel la souche est celle de Bacillus megaterium et de préférence celle de Bacillus megaterium ATCC 39118. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 à 4 dans lequel l'incubation en présence dudit coenzyme est effectuée dans une solution tamponnée à un pH compris entre 5 et 10, à raison de 0,02 à 2 mmoles de coenzyme par gramme de poids sec de cellules durant un temps de 0,5 à 100 heures et à une température de 4 à 700C. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel la quantité de cellules mises en jeu est comprise entre 1 g et 200 g de poids sec par litre de volume réactionnel. 7. Procédé selon l'une des revendications 1, 2, 4 et 6 dans lequel la quantité de coenzyme par litre de volume réactionnel est d'au moins 0,05 mmoles. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 dans lequel on réalise une étape préliminaire consistant à alimenter dans la zone de réaction au moins une fois ena-cétoacide ou en l'un de ses sels et on soutire ledit effluent lorsqu'on obtient dans la zone de réaction des concentrations molaires en L-aaminoacide définies dans la revendication 1. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 dans lequel ladite production de L-o'aminoacide est mise en oeuvre à une température de 10 à 700C, à un pH de 6 à 10 et dans lequel on met en oeuvre de 1 à 2 moles de réducteur et de 1 à 3 moles exprimées en ammoniaque de la source d'ions ammonium pour 1 mole d'&alpha;-cétoacide. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 dans lequel le réducteur est le glucose et dans lequel l'&alpha;-cétoacide est soit l'acide pyruvique, soit l'acide hydroxypyruvique, soit l'acide &alpha;-cétoisocaproique, soit l'acide &alpha;-céto- ss méthylvalérique soit, l'acide&alpha;-cétoisovalérique ou l'un de leurs sels.