Brevet FR2632969A1 — publié le 19891222

PROCEDE DE SYNTHESE PAR VOIE ENZYMATIOUE- D'ACIDES L-ALPHA-AMINES OU L-ALPHA-AMINO-N-HYDROXYLES L'invention a pour objet un procédé de synthèse par bioconversion d'acides L-alpha-aminés ou L-alpha-amino-N-hydroxyl-és. La synthèse d'analogues d alpha-amino-acides d'une très grande pureté optique ou d'acides L-alpha-aminés n'appartenant pas aux 20 acides aminés naturels revêt une grande importance, notamment pour l'incorporation de ces dérivés à des oligopeptides, en synthèse peptidique, ou pour leur utilisation sous- forme isolée, comme inhibiteurs enzymatiques. L'obtention de ces acides aminés est -habituellement réalisée par synthèse organique. Dans ïe cas de composés chiraux, il est alors nécessaire de disposer, préalablement, de composés de départ possédant eux-mêmes un centre de chiralité, à savoir un atome de carbone -ayant quatre substituants différents, dont la synthèse n'est pas toujours- aisée Des méthodes biotechnologiques ont été également proposées, par exemple le dédoublement de racémiques sous l'action d'une enzyme comme la carboxypeptidase pancréatique. Il s'agît toutefois de techniques difficiles à mettre en oeuvre à l'échelle industrielle. Des techniques de bioconversion d'acides catalysée par des enzymes produites par des microor- ganismes ont été rapportés, mais uniquement pour obtenir des acides aminés naturels. Ainsi, dans le brevet FR 2262 110 au nom de Pfizer Zinc., on décrit la production de L-phénylalanine par voie enzymatique de l'acide trans-cinnamique à l'aide de microorganismes capables de produire de la phénylalanine ammonia-lyase, notamment du genre Rhodotorula rubra, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula texensis, Rhodotorula marina, Rhodotorula minuta et Fusarium oxysporum. Dans le brevet JP 8643993 au nom de Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., on décrit également la bioconversion par voie enzymatique de l'acide cinnamique, de l'acide p-coumarique ou de l'acide fumarique pour produire de la L-phénylalanine, de la L-tyrosine et de l'acide L-aspartique à l'aide de cellules de Sporobolomyces roseus, IFO 1040. La bioconversion est réalisée dans une colonne, les cellules de microorganismes étant immobilisées sur du carageenan-KCl. Les inventeurs ont constaté qu'il est possible d'utiliser une ammonia-lyase pour la synthèse d'acides aminés autres que les vingt acides aminés naturels, en particulier des acides aminés à carbone chiral quaternaire, c'est-à-dire actifs sur la lumière polarisée, en ayant recours comme produits de départ à certains dérivés d'acide acrylique. L'invention a donc pour but de fournir un procédé de synthèse, par voie enzymatique, de mise en oeuvre aisée, d'acides L-alpha aminés ou L-alphaamino-N-hydroxylés, de structure S, non naturels, c'est-à-dire différents des vingt acides aminés naturels. Elle vise également à fournir un procédé d'obtention d'acides aminés chiraux. Le procédé de synthèse de l'invention est caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé de l'acide trans-acrylique de formule (I) dans une solution aqueuse d'ammoniaque ou d'hydroxylamine, en présence d'ammonia lyase microbienne, et on sépare du mélange réactionnel l'acide L-alpha-aminé formé de formule (II) puis on le soumet, éventuellement, à au moins une étape de purification. Les substituants R1 et R3 présentent dans les formules (I) et -(II) les significations suivantes - R1 : atome d'hydrogène, radical alcoyle notamment de C1 à C4, en particulier radical méthyle, - R2 atome d'hydrogène ou groupe hydroxyle, - R3 : radical aromatique ou pseudo-aromatique, notamment radical phényle, le cas échéant substitué en position ortho et/ou méta et/ou para par un atome d'halogène ou un groupe nitro, un radical 2-thiényle, -2-furyle ou 3-pyridyle, alpha-naphtyle, étant entendu que, lorsque R3 représente un radical phényle non substitué et R2 un atome d'hydrogène, R1 représente un radical alcoyle. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on effectue la bioconversion de l'acide trans-acrylique de formule (I) avec les cellules-d'une souche de microorganismes présentant une activité -L-pseudo-aromatique ou L-aromatique d' ammonia-lyase microbienne. D'une manière inattendue, l'ammonia-lyase microbienne qui catalyse dans la souche de microo ganisme la synthèse de produits naturels, s'avère capable d'assurer la bioconversion de produits qui ne sont pas naturellement synthétisés par la cellule. Avantageusement, il s'avère que l'utilisation d'un dérivé d'acide acrylique comportant comme groupe R3, c'est-à-dire en position trans par rapport au groupe carboxyle, un groupement à caractère aromatique ou pseudo-aromatique, permet de disposer d'un acide convertible par voie enzymatique et d'obtenir un acide alpha-aminé ou alpha-aminé-N-hydroxylé de grande pureté optique. On notera également que le dérivé d'acide acrylique de départ peut comporter un groupe R1 présentant une signification alcoyle. Le procédé de l'invention permet ainsi d'obtenir des acides aminés qui ne font pas partie des vingt acides aminés naturels, à carbone chiral quaternarisé, inaccessibles par les méthodes de transamination ou par les méthodes à l'amino-oxydase en mode reverse. Pour réaliser la bioconversion, on utilise des souches provenant de cultures sur milieux riches en acides aminés variés, mais pauvres en sels minéraux, particulièrement en chlorures, et pauvres en hydrates de carbone. La souche de microorganisme utilisée qui doit être compatible avec le dérivé acrylique à transformer qui pénètre dans ses cellules et doit assurer l'excrétion du produit transformé, présente avantageusement une activité ammonia lyase d'au moins 3 U/mg de cellules sèches (environ 0,5 U/mg de cellules humides) notamment de 3 à 18 U/mg de cellules sèches. Comme souche de microorganismes, on utilise de préférence une souche du genre Rhodotorula, en particulier Rhodotorula gracilis ou glutinis. Une souche convenant particulièrement pour la mise en oeuvre de l'invention est constituée par la souche de Rhodotorula gracilis ou glutinis NRRI, Y1091 Les cellules de la souche mise en oeuvre sont lavées et mises en suspension dans une solution isotonique. Il s'avère particulièrement approprié d'utiliser une solution d'hydrogénocarbonate de sodium. Pour perméabiliser la membrane, on ajoute un détergent tel que le chlorure de cétyl-pyridinum. Les cellules peuvent être libres. En variante, elles peuvent être immobilisées par exemple selon la méthode au karageenan telle que décrite dans le brevet JP 8643993 qui permet de conserver les propriétés cellulaires pendant au moins 18 mois. Conformément à l'invention, la bioconversion est réalisée en présence d'ammoniaque ou d'hydroxylamine. Ces réactifs sont- avantageusement ajoutés au milieu réactionnel avant d'introduire le dérivé d'acide acrylique (I). L'utilisation d'hydroxylamine à la place de l'ammoniaque permet d'obtenir avec une plus grande souplesse l'acide aminé recherché; à des pH basiques. En effet, l'hydroxylamine n'est pas volatile à la température ambiante, sa récupération est plus aisée que celle de l'ammoniaque lors de l'évaporation et le milieu récupéré peut être réutilisé immédiatement pour une nouvelle bioconversion avec éventuellement un ajustement du pH. De plus, la vitesse de formation de l'acide aminé recherche stavère plus rapide. D'une manière avantageuse, il est possible de synthétiser des hydroxylamines substituées chirales lorsqu'on utilise l'hydroxylamine à pH acide, notamment inférieur à 6. Pour préparer des dérivés dans lesquels R2 est un atome d'hydrogène, c'est-à-dire des acides alpha-aminés, on utilise de l'ammoniaque ou de l'hydroxylamine, en ramenant le pH du milieu de bioconversion, avant l'addition du dérivé d'acide acrylique (I), respectivement entre 10,2 et 10,8, ou entre 9,0 et 10,5. A cet effet, on utilise avantageusement du dioxyde de carbone ou de l'acide acétique. Lorsqu'on souhaite préparer des dérivés d'acides alpha-aminés-N-hydroxylés, on utilise de l'hydroxylamine et on ramène le pH à des valeurs acides, de l'ordre de 5 à 6. Le produit d'addition qui se forme en présence de l'ammoniaque ou de l'hydroxylamine, après avoir ajouté le dérivé d'acide acrylique -(I) au milieu réactionnel, répond à la formule (III) Le contre-ion A provient du milieu réactionnel et est avantageusement formé par un acétate ou un carbamate. La bioconversion est avantageusement réalisée dans des conditions anaérobies à une température supérieure à l'ambiante notamment de l'ordre de 30 à 40'C et plus spécialement sous agitation. Une température de 30iC donne une bioconversion plus lente, mais préserve la solidité de la cellule. Une température de 40'C permet une réaction plus rapide, mais accroît les déchet cellulaires. Le dérivé d'acide aminé recherché de formule (II) est séparé du milieu de bioconversion et soumis avantageusement à au moins une étape de purification. Les déchets cellulaires, peu abondants, ainsi que le dérivé d'acide acrylique et, le cas échéant, des peptides, sont éliminés. Une séparation satisfaisante du dérivé d'acide aminé de formule (II) est obtenue en soumettant le milieu de bioconversion à une centrifugation puis après élimination du surnageant, en traitant le culot de centrifugation. Selon un aspect de grand intérêt, la stéréospécifite extrêmement étroite du site d'action conduit à 'isomère L strict de structure (S) sans trace d'isomère D. En raison de leur pureté optique élevée., les acides L-alpha aminés- et L-alpha-amino-hydroxylés obtenus selon l'invention sont particulièrement utiles notamment en synthèse peptidiquè. L'incorporation de ces acides aminés non naturels dans un enchaînement d'acides aminés s 'avère ainsi particulièrement intéressante pour la fabrication notamment d'hormones peptidiques, spécialement à usage vétérinaire et de leurres peptidiques. On peut opérer par exemple comme décrit par Nestor J. Xo et al dans "Peptides synthesis, structure, function", D.H. Rich and E. Gross, Illinois, edsr p.109-112, 1981 ou dans Int. J. Peptide, Protein Res., 29, 1987, 118-125. Les acides aminés à carbone chiral quaternaire, utiles en eux-mêmes, peuvent également constituer des intermédiaires de synthèse de grand intérêt. En effet, la décarboxylation fournit l'amine correspondante dont la synthèse par d'autres voies s'avère difficile. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples de synthèse qui suivent. EXEMPLE 1 Obtention de L-3-(2-thiényl)-alanine ou acide (S)-2-amino-3-(2-thiényl)-propionique de formule Bioconversion 1 A 6 ml d'une suspension cellulaire de R. glutinis présentant une activité pseudo-aromatique ammonia-lyase, décongelées, lavées et équilibrées avec NaHCO3 1,3%, contenant 3 g de cellules humides et 3 ml de NaHCO3 1,3%, on ajoute 0,1 ml d'une solution de chlorure de cétylpyridinium 0,2% dans l'eau et l'on agite pendant 10 minutes à température ambiante. On ajoute 24 ml d'une solution d'ammoniaque 8 M, ramenée à pH 10,2 à 10,8 environ, par bullage de dioxyde de carbone, et 100 mg d'acide trans-3-(2-thiényl)acrylique. La bioconversion est réalisée dans un flacon de 50 ml bouché hermétiquement et agité dans un incubateur entre 30 et 37-C, à 200 tours/min. Après 15 h de bioconversion, le mélange est centrifugé pour éliminer les cellules, et le surnageant chassé sous vide à 35-C sous 0,5 mm de Hg jusqu'à siccité. Après reprise par 15 ml d'eau, le pH est abaissé de 8 à 5 par addition d'HCl 12 M sous agitation énergique. Le précipité, filtré sur millipore, ne contient pratiquement que de l'acide 3-(2-thiényl)-acrylique n'ayant pas réagi et des peptides en petite quantité provenant du milieu cellulaire.Après abaissement du pH du filtrat à 3, et élimination du léger précipité apparu, la solution est déposée sur une colonne échangeuse de cations de 2 g de Séphadex SP-C25i, lavée à l'acide chlorhydrique à pH 3. L'élution par de l'eau saturée par .le dioxyde de carbone à froid (pH 3,96) élimine les dernières fractions de l'acide acrylique n ayant pas réagi Par addition de NH4C03H jusqu'à pH 6 du solvant -d'élution, récupère à pH 4,9, 47,9 mg de L-3(2-thiényl)-alanine ou acide (S)-2-amino3-(2-thiényl)-propionique tel que décrit par Ferger et al dans J. Biol. Chem., 174, 214-242 (1948), Beil.E III/IV 18 H631 p.8191, identifié par son spectre de masse en FAB, son spectre de résonance magnétique nucléaire du proton en milieu D26, l'unicité de la tache vert-bleu foncé par coloration à la ninhydrine en chromatographie sur couche mince sur plaque chîrale MACHEREY-NAGEL, All-enmark, J. Biochem. Biophys. Methods, 9 1-25 (1984), avec un Rf de 0,66 pour le solvant d'élution methanol-eau-acétonitrile (50150/200), (la D-3-(2-thiényl)-alanine ayant dans les mêmes conditions un Rf de 0,51), et enfin un pouvoir rotatoire spécifique dans l'eau à 25-C pour la raie D du sodium (c = 2) de -41,3-. Bioconversion 2 Les conditions de la bioconversion sont reprises à l'exception du dioxyde de carbone remplacé par l'acide acétique pour ramener entre 10,2 et 10,8 le pH de la solution d'ammoniaque 6 M. On obtient 44 mg de L-3-(2-thiényl)-alanine. Bioconversion 3 Dans une autre variante, les conditions de la bioconversion 2 sont reprises à l'exception de la solution d'ammoniaque remplacée par une solution dans l'eau d'hydroxylamine 8 M ramenée à pH entre 9 r O eut 10,4 par l'acide acétique pour conduire à 40 mg de L-3-(2-thiényl)-alanine. EXEMPLE 2 Obtention de l'acide (S)-2-amino-N-hydroxyl3-(2-thiényl) propionique de formule Les conditions de la bioconversion 3 sont reprises, mais le pH est abaissé entre 5 et 6 par l'acide acétique pour conduire à 25 mg d'un produit identifié en C.C.M. comme l'acide (S)-2-amino-N-hydr oxyl-3-(2-thiényl) propionique, sans L-3-(2-thiényl)alanine. On indique ci-après différentes synthèses effectuées en opérant selon les conditions de la bioconversion 1, mais en remplaçant l'acide 3-(2-thiényl)-acrylique par les- acides acryliques appropriés. Pour chacun de ces acides, on indique respectivement le produit formé - acide trans-3-(2-furyl)acrylique : L-3-t2-furyl)-alanine ou acide (S)-2-amino-3-(2-furyl) propionique - acide trans-3-(3-pyridyl) acrylique L-3-(3-pyridyl)-alanine ou acide (S)-2-amino-3-(3-pyridyl)-propionique - acide o-chloro trans-cinnamique L-béta-(o-chlorophényl)-alanine - acide p-chloro trans-cinnamique L-béta- (p-chlorophényl ) -alanine - acide o-nitro trans-cinnamique L-béta-(o-nitrophény)-alanine - acide alpha-méthyl trans-cinnamique L-alpha-méthyl béta-phényl alanine, ou acide (S)-2amino, 2-méthyl, 3-phényl propionique. REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse d'un acide L-alpha-aminé- différent -des vingt acides- aminés essentiels, ou d'un acide L-alpha-aminé-N-hydroxylé, à l'aide d'ammoniå-lyase, caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé de l'acide trans-acrylique de formule (I) dans une solution aqueuse d'ammoniaque ou d'hydroxylamine, en présence dlammonia-lyase microbienne, et on sépare du mélange de bioconversion l'acide L-aminé formé, de formule (tut) puis on le.soumet éventuellement à au moins une étape de purification, les substituants R1 et R3 présentant dans les formules (I) et (II) les significations suivantes - R1 : atome d'hydrogène, radical alcoyle notamment de C1 à C4, en particulier radical méthyle, ~ R2 : atome d'hydrogène ou groupe hydroxyle, - R3 : radical aromatique ou pseudo-aromatique, notamment radical phényle, le cas échéant substitué en position ortho et/ou méta et/ou para par un atome d'halogène ou un groupe nitro, radical 2-thiényle, -2-furyle ou 3-pyridyle, alpha-naphtyle, étant entendu que, lorsque R3 représente un groupe phényle et R2 un atome d'hydrogène, R1 est un radical alcoyle. 2. Procédé de synthèse d'un acide L-alpha-aminé différent des vingt acides aminés naturels, ou d'un acide L-alpha-aminé-N-hydroxylé, caractérisé en ce qu'on fait réagir un dérivé de l'acide trans-acrylique de formule (I) dans une solution aqueuse d'ammoniaque ou d'hydroxylamine, en présence de cellules d'une souche de microorganismes présentant notamment une activité L-pseudo-aromatique ou L-aromatique d'ammonia lyase microbienne, et on sépare du mélange de bioconversion l'acide Aminé formé, de formule (II) puis on le soumet éventuellement à au moins une étape de purification, les substituants R1 et R3 présentant dans les formules (I) et (II) les significations suivantes - R1 : atome d'hydrogène, radical alcoyle notamment de C1 à C41 en particulier radical méthyle, - R2 atome d'hydrogène ou groupe hydroxyle, - R3 radical aromatique ou pseudo-aromatique, notamment radical phényle, le cas échéant substitué en position ortho et/ou méta et/ou para par un atome d'halogène ou un groupe nitro, radical 2-thiényle, -2-furyle ou 3-pyridyle, alpha-naphtyle, étant entendu que, lorsque R3 représente un groupe phényle et R2 un atome d'hydrogène, R1 est un radical alcoyle-. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise une souche de microorganismes ayant une activité ~ammonia lyase, avantageusement d'au moins 3U/mg de cellules seches, notamment de 3 à 18 U/mg de cellules sèches, cette souche étant choisie notamment dans le genre Rhodotorula, en particulier Rhodotorula gracilis ou glutinis, de préférence de souche NRRL Y1091. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que pour préparer des dérivés de formule II dans lesquels R2 est un atome d'hydrogène, on utilise une solution aqueuse d'ammoniaque ou d'hydroxylamine, en ramenant le pH du milieu de bioconversion -respectivement entre 10,2 et 10,8 mu entre 9,0 et 10,5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que pour préparer les dérivés de formule II dans lesquels R1 est un groupe hydroxyle, on utilise une solution aqueuse d'hydroxylamine en ramenant le pH du milieu de bioconversion entre 5 à 6 environ. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le dérivé de formule (II) récupéré du milieu de bioconversion est soumis à au moins une étape de purification notamment à l'aide de colonnes échangeuses de cations. 7. Produit intermédiaire répondant à la formule (III) dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus et A est un acétate ou un carbamate.