Brevet FR2624614A1 — publié le 19890616

MOYENS DE DETECTION IMMUNOLOGIQUE D'UNE ENZYME DE LA LIGNEE MEGACARYOCYTAIRE HUMAINE L'invention a pour objet des moyens pour la reconnaissance d'une enzyme specifique de .la lignée mégacaryocytaire humaine par une réaction immunologique. On sait que divers anticorps, tant monoclonaux que polyclonaux, reconnaissent des antigènes spécifiques de la lignée mégacaryocytaire humaine, qu'ils soient dirigés contre des glycoprotéines membranaires ou contre des constituants du granule a. Ils sont utilisables en immunofluorescence indirecte et ont trouvé leur application dans certaines pathologies. Ces anticorps permettent de reconnattre la lignée. mégacaryocytaire humaine quel que soit le degré de maturation des cellules, mais non des précurseurs. A ce jour, aucun de ces anticorps n'a permis de révéler une spécificité enzymatique du mégacaryocyte humain. Une activité enzymatique spécifique de cette lignée et permettant sa reconnaissance a été décrite par J. Breton Gorius, dans Am. J. of Pathol.,1972, 66-277, mais sa mise en évidence est lourde puisqu'elle nécessite une revélation par la diaminobenzidine, puis une visualisation en microscope électronique. Les travaux des inventeurs dans ce domaine ont montré que la présence d'une protéine douée d'une activité enzymatique spécifique de la lignée mégacaryocytaire humaine peut être révélée par immunofluorescence lorsqu'on utilise comme marqueurs un certain type d'anticorps. Le terme anticorps sera utilisé dans la suite du texte qu'il s'agisse de l'IgG purifiée ou du sérum immun. La méthode de révélation in vitro de l'invention comprend l'incubation d'un anticorps anti ATPase, ~~~~~~ en présence de l'échantillon biologique susceptible de renfermer des mégacaryocytes ou des plaquettes, puis l'utilisation des moyens classiques de révélation immunologique. L'anticorps mis en oeuvre selon l'invention est dirigé contre l'ATPase Ca2+, Mg2+ dépendante du réticulum sarcoplasmique D'une manière classique, les anticorps sont fabriqués en injectant à plusieurs reprises à un animal de l'ATPase et en recueillant ensuite le sérum riche en anticorps. L'ATPase utilisée est purifiée, puis dénaturée avec un agent tel que le dodécylsulfate de sodium. L'ATPase est ensuite débarrassée de l'agent dénaturant, par des techniques de purification, notamment par chromatographie. Les anticorps anti ATPase sont séparés du sérum prélevé sur l'animal immunisé par contact avec une ATPase. Cette étape de mise en contact est avantageusement réalisée dans une colonne de chromatographie d'affinité contenant de 1 'ATPase couplée à un support. Ce support est en particulier-à base de Sépharose. Les anticorps sont récupérés par élut ion a pB acide. En variante, l'antisérum peut être utilisé tel quel dans la méthode de detection de l'invention. Selon une. disposition préférée de L'iLvention~on- utilise comme marqueur de la lignée mégacaryocytaire humaine, 2+ un anticorps anti Ca ATPase formé contre une ATPase de réti- culum sarcoplasmique. De manière inattendue, l'anticorps préparé contre une Ca2+ ATPase d'un animal tel que le lapin reconnait de manière spécifique la lignée mégacaryocytaire humaine. Au contraire les mégacaryocytes de porc ou de lapin ne sont pas marqués par cet anticorps anti ATPase. L'anticorps anti ATPase a été testé notamment sur des frottis de moelle osseuse humaine par une technique de double marquage en immuno-tluorescence indirecte et en utilisant, pour la reconnaissance des mégacaryocytes, un anticorps monoclonal dirigé contre la GPIIIa plaquettaire. Les résultats obtenus ont montré que cet anticorps reconnaît uniquement les mégacaryocytes parmi les lignées myélodes humaines. Sur les lignées sanguines, on obtint un marquage des plaquettes en immuno-fluorescence mais aucune activité n'a été détectée dans les lignées granuleuse, monocytaire et lymphol- de. Des résultats identiques ont été obtenus en utilisant la méthode dtimmunoempreinte. Cet anticorps permet ainsi la reconnaissance simple d'une enzyme spécifique de la lignée mégacaryocytaire et pla quettaire chez l'homme. Les anticorps anti ATPase constituent donc des -marqueurs de grand intéret pour étudier les variations de l'ATPase dans les mégacaryocytes humains. Il est ainsi possible d'étudier l1ATPase dans les mégacaryocytes activés par la thrombine, l'ADP, le collagène, certains anticorps, ou au contraire inhibés par des peptides de la caséine, du fibrinogène ou de la lactotransferrine. Ils constituent également des outils de marquage particulièrement précieux pour reconnaître une pathologie mégacaryocytaire dans les maladies mégacaryocyto-plaquettaires dès lors que cette pathologie modifie I'ATPase des mégacaryocytes. Les anticorps anti Ca2+ ATPase peuvent permettre ainsi de reconnaître des anomalies dans les désordres plaquettaires, qu'ils soient quantitatifs (thombocytémies ou au contraire thrombopénies d'origine centrale ou périphérique) ou qualitatifs (thrombopathies). D'autres applications, selon l'invention, de l'anticorps anti Ca2+ ATPase comprennent la reconnaissance de clones mégacaryocytaires qui ne peuvent pas être reconnus normalement dans les maladies rares de la myéloporèse, telles que les dysmyélopoSèses et certaines formes de transformations des leucémies chroniques et également dans certaines lignées cellulaires continues qui expriment les antigènes mégacaryocytaires. D'une manière avantageuse, les anticorps anti ATPase sont également utilisables selon l'invention pour reconnattre des mégacaryocytes à un stade très précoce de maturation alors que les anticorps monoclonaux actuellement disponibles marquent les glycoprotéines, les protéoglycanes, le facteur 4 et ne peuvent reconnaitre des mégacaryocytes qu'à un stade inter. médiaire de maturation. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description des exemples qui suivent, relatifs à la préparation d'anticorps anti ATPase et à leur utilisation comme marqueurs de mégacaryocytes. EXEMPLE i : PREPARATION D'ANTICORPS ANTI ATPase 1) Préparation de l'immunogène Une fraction microsomale, enrichie en réticulum sarcoplasmique longitudinal et donc en Ca2+ ATPase, est préparée selon la méthode décrite par Saito et al. dans J. Cell. Biol. (i984), 99, 875-885. Les différents constituants de ces microsomes sont séparés par électrophorèse préparative en gel de polyacrylamide à 7,5 % en présence de sodium-dodécyl-sulfate (SDS). La bande migrant à 100 kD est électroéluée et la protéine congelée en aliquot. 2) Immunisation Avant chaque immunisation, la protéine est débarrassée de l'excès de SDS par chromatographie sur Séphadex G1O selon la technique décrite par Lompré et al. dans J. Immunol. Meth. (1979), 28, 143-148. La protéine dénaturée ainsi récupérée est immédiatement mélangée à part égale à de l'adjuvant de Freund et injectée par voie sous-cutanée en plusieurs points à des cobayes adultes. 330 vg de protéines ont été injectés à chaque animal au jour J=0, puis à J=8, J=15, J=115, de 60 à 120pg ont été injectés à chaque animal. Les animaux ont été sacrifiés à J=60. Le sérum est prélevé et congelé à -700C. 3) Caractérisation et purification des immunoglobulines La positivité du sérum est contrôlée par réaction avec une fraction microsomale dont les constituants ont été séparés par électrophorèse et transférés sur membrane de nitrocellulose (Immuno-empreinte). Le sérum réagit avec une seule protéine de poids moléculaire 100 kD. Les sérums sont ensuite purifiés par chromatographie d'affinité sur une colonne de Ca2+ ATPase couplée à du Sépharose 4B-CNBr (Pharmacia). La protéine utilisée pour faire cette colonne a été préparée par la technique décrite par Mac Lennan et al. dans J. Biol. Chem. (1970), 245, 4508-4518, ceci afin de réduire les risques de contamination des immunoglobulines par des anticorps dirigés contre une protéine de poids moléculaire identique à celui de la Ca2+ ATPase. Les immunoglobulines retenues sur cette colonne sont électroél-uées à pH 2,8 et utilisées pour l'étude immunocytochimique. EXEMPLE 2 : UTILISATION DE L'ANTICORPS ANTI Ca2+ ATPase COMME MARoUEUR~oE~MEdACARYoCYE- MARQUEUR DE MEGACARYOCYTES. Un frottis de moelle osseuse d'origine humaine est fixé à l'aide de p-formaldéhyde à 1%, puis lavé à trois reprises en PBS. L'anticorps est mis à incuber pendant une nuit à la concentration de 0,25 mg de protéine par ml. Un double marquage est effectué avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre la GPIIIa plaquettaire, pour la reconnaissance des cellules. Après trois lavages en PBS les anticorps fixés sont révélés par des antiglobulines spécifiques couplées l'une à la fluorescéine, l'autre à la rhodamine. La réaction immunologique ainsi révélée apparatt sur la photo de la figure unique. Les résultats obtenus mettent en évidence 1'intérêt de la méthode de l'invention dont la mise en oeuvre est avantageusement réalisée en ayant à sa disposition une trousse de 2+ diagnostic comprenant un anticorps anti Ca ATPase et une antiglobuline couplée à un agent fluorescent tel que la fluo resceine ou la rhodamine. REVENDICATIONS 1. Méthode de détection in vitro de la lignée mégacaryocytaire huumaine, caractérisée par le fait qu'elle comprend l'incubation d'un échantillon biologique à tester, susceptible de renfermer des mégacaryocytes, avec un anticorps anti ATPase et qu'on utilise de-s moyens classiques pour révéler la réaction -immunologique éventuellement obtenue. 2. Méthode selon la revendicati-on 1, caractérisée en ce que l'anticorps est un anticorps anti Ca2+ ATPase. 3. Méthode selon la revendication 2, earacterisée en ce que l'anticorps anti Ca2+ est formé contre de la Ca2+ ATPase de réticulum sarcoplasmique injecté à des animaux aux fins d' immunisation. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que la Ca2+ ATPase est soumise préalablement à l'injection à l'action d'un agent dénaturant et purifiée pour éliminer une contamination par cet agent. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ee qu'on utilise un anticorps anti Ca2+ ATPase purifié par adsorption sur une ATPase et récupéré par par désorption à partir du complexe formé. 6. Utilisation d'un anticorps anti ATPase tel que mis en oeuvre dans la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour reconnaître les précurseurs de mégacaryo cytes durant leur phase de maturation. 7. Utilisation d'un anticorps anti ATPase tel que mis en oeuvre dans la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour reconnaître une pathologie mégacaryocytaire dans des maladies mégacaryocyto-plaquettaires 8. Utilisation d'un anticorps anti ATPase tel que mis en oeuvre dans la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour reconnattre des clones mégacaryocytaires dans des maladies de la myéloporèse. 9. Utilisation d'un anticorps anti ATPase tel que mis en oeuvre dans la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour l'étude de l'ATPase après l'activation ou l'inhibition des mégacaryocytes. 10. Trousse de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps anti Ca2+ ATPase et une antiglobuline couplée à un agent fluorescent tel que la fluorescéine ou la rhodamine.