Brevet FR2628440A1 — publié le 19890915

La présente invention concerne un procédé en vue de la préparation à l'échelle industrielle d'acide désoxyrîbonu cléique à poids moléculaire élevé. On sait que les acides désoxyribonucléiques qui constituent l'armature chromosomique de la cellule, sont utilises pour des nombreux produits à action ou application biologique notamment sur le plan de la régénération cutanée en cosmétologie etc... Cependant les acides désoxyribonucléiques constituent une longue chaine et leur extraction qui implique une agression du milieu physiologique de départ, entraine souvent une rupture de la chaîne c'est-à-dire un sectionnement de l'acide dont on ne récupère que des segments. Or il est intéressant sur le plan de l'utilisation ultérieure du produit de récupérer l'acide dans sa totalité ou dans une section la plus longue possible, donc de poids moléculaire élevé. On connait des procédés partant d'une matière biologique de départ riche en acide désoxyribonucléique et constitués des cellules séminales d'animaux notamment de poissons. L'extraction à partir par exemple de laitance de poissons notamment de harengs implique par conséquent la lyse du substrat interstitiel protidique des cellules séminales pour laisser subsister autant que possible la struture de 1'ADN en vue de sa récupération. On a ainsi cherché à assurer la destruction ou la lyse des acides aminés constituant le substrat protidique des cellules par une action enzymatique notamment en utilisant l'action protéolitique bien connue de la papaïne. On a également décrit dans le brevet français publié nO 2 133 634 une attaque du substrat protidique des cellules séminales de laitance de poissons par le phénol. Cependant ces procédés rencontrent des contraintes dans le cadre d'une application industrielle en vue de la récupé- ration d'acide désoxyribonucléique de poids moléculaire élevé notamment en raison de la durée élevée de leur mise en oeuvre. En outre pour l'obtention d'acide desoxyribonucléique de poids moléculaire élevé à partir de matière animale les processus de décomposition des tissus notamment sous l'action des enzymes présentes sur le site et activées dès le début de la phase létale seront à éviter. De sorte que le matériau de départ traité en vue d'en extraire l'acide desoxyribonucléique est nécessairement, notamment dans le cas d'animaux marins, dans un état plus ou moins dégradé suivant la période de temps à laquelle remonte la pêche, c'est-à-dire la mort de l'animal. La présente invention permet de remédier à ces difficultés et à ces inconvénients et représente des perfectionnements dans la mise en oeuvre des procédés antérieurs, permettant d'aboutir à une récupération maximale de la chaine ou d'une partie importante de la channe de l'ADN en assurant ainsi l'obtention de produits valorisés en un temps le plus court. A cet effet l'invention concerne un procédé d'extraction performant d'acide désoxyribonucléique notamment partir d'organismes animaux tels que laitance de poissons et caractérisé par la succession des opérations suivantes. a) après broyage de la laitance, celle-ci est mise en suspension dans un bain d'une solution saline de concentration molaire en NaCl inférieure à 1 M. b) la suspension est soumise à l'action d'une enzyme protéolytique notamment de papaïne en présence d'un détergent ionique. c) on additionne à ladite suspension dans son milieu constitué de la solution aqueuse saline, du phénol pour compléter l'action de la lyse des protides. d) on élimine la phase phénolique contenant les produits de dégradation des protides par séparation physique en recueillant ainsi une liqueur contenant les acides désoxyribonucléiques. e) lesdits acides sont précipités par un alcool tel que lréthanol ou l'isopropanol. Selon une autre caractéristique de l'invention l'action enzymatique à base de papaine est prolongée pendant une période de temps de 1 à 4 heures et à une température de 37"C. La suspension des produits de traitement dans une solution saline reçoit l'ajout d'un détergent ionique. De préférence encore l'action phénolique complémentaire est conduite par incorporation d'une solution de phénol saturée en eau dans la suspension de départ. Selon une mise en oeuvre plus particulière la séparation des produits résultant de la dégradation des protides est conduite par un procédé physique choisi parmi la sédimentation, la filtration sur filtre presse, la centrifugation. Et selon une variante la séparation physique ainsi conduite est facilitée par incorporation de matière minérale pulvérulente telles que la bentonite, la celite ou terre d'infusoire. La précipitation de l'acide désoxyribonucléique polymérisé est obtenue par addition à la liqueur, après séparation physique des produits de dégradation des protides, d'alcools sous forme d'éthanol à 950 volumique ou dtisopropanol. Et les fibrilles représentant l'acide désoxyribonucléique précipité, sont lavés par des solutions alcooliques de titres croissants pour éliminer les traces de NaCl et de phénol. On a décrit ci-après un exemple de mode opératoire à titre simplement illustratif. 20 g. de laitance de poisson congelée sont broyés et mis en suspension dans 50 cm3 environ d'eau (la concentration en NaCl devra toujours être inférieure à 1M). 0,2 g. de papaïne mise en suspension dans 5 cm3 d'eau est ajouté au mélange initial, à 200C, sous agitation modérée pendant 2 minutes. 0,2 g. de Dodecyl sulfate de sodium (agent dispersant) mis en solution dans 20 cm3 d'eau sont versés dans le mélange précédent sous agitation modérée. Le volume total du mélange est amené à 100 cm3 et la température de l'ensemble est maintenue à 370C. Cette température et une faible agitation seront entretenues pendant 4 heures ; puis la température du mélange réactionnel est ramenée à 4 C. 10 cm3 d'une solution de phénol saturée en eau est ajoutée sous agitation modérée. L'agitation et la température de 40C sont maintenues pendant 15 minutes. Les protéines dégradées en suspension sont éliminées par centrifugation ou filtration sur tissu. Un volume d'éthanol (concentration azéotropique de distillation) égal au volume de la solution filtrée précédemment récupérée est ajouté graduellement en 15 minutes sous agitation faible, la température du milieu réactionnel étant de 15 à 18 C. L'ADN ainsi précipité est filtré en évitant tout compactage ; des lavages successifs sont effectués avec 1) 50 cm3 d'une solution 80% éthanol - 20% eau 2) 50 cm3 " " 85% " 15% 3) 50 cm3 " " 90% " 10% " 4) 50 cm3 d'éthanol à composition azéotropique. L'ADN ainsi lavé est séché sous vide partiel, à une température toujours inférieure à 300C jusqu'à siccité partielle (la teneur en eau de l'ADN restant comprise entre 12 et 20%). Selon une variante à la place d'Ethanol, l'isopropanol peut être employé et ce dans le rapport 1 à 4 en volume d'alcool isopropylique ajouté et-en volume de solution aqueuse contenant 1'ADN. Le procédé ainsi décrit se distingue de façon particulièrement nette, tant dans les moyens mis en oeuvre que dans les résultats obtenus, des procédés d'extraction d'acide désoxyribonucléique antérieurement connus. On a déjà proposé d'utiliser l'action de la papaïne pour détruire la structure du tissu protidique afin de libérer l'acide désoxyribunucléique ; cependant dans les techniques actuellement connues cette action nécessite deux traitements successifs s'étendant sur une période de 24 heures, alors que dans le cadre de la présente invention l'ensemble du traitement, conduit dans un. même réacteur, sans transvasement de produites, peut entre ramené à 4 heures. On connait également l'action du phénol, utilisé seul comme prévu dans le brevet français précédemment cité ; cependant la concentration qui était nécessaire dans le cadre de' la technique connue utilisant exclusivement du phénol et fondamentalement différente des niveaux de concentration préconisés dans le cadre de la présente invention. En réalité il apparait que l'utilisation successive mais dans une seule et même charge, maintenue par conséquent dans un même récipient ou réacteur, dans un premier temps de la papaïne, et dans un deuxième temps du phénol, représente une combinaison synergétique de moyens, aboutissant à des résultats très supérieurs en quantité et en qualité à la simple addition des résultats obtenus par la mise en oeuvre de ces moyens considérés isolément. Cette action synergétique se traduit notamment par le fait que dans un premier-temps la papaïne permet une lyse préliminaire des tissus protidiques, limitée dans le temps lorsque l'action de la papaïne a été suffisante pour entrainer une première dégradation du tissu protidique, et risque alors de s'attaquer à l'armature de l'acide désoxyribonucléique, l'action de la papaïne dans le cadre de la présente invention est interrompue de façon ponctuelle, à une période de temps précise, cette interruption étant marquée et déclenchée par le changement de température, la température du milieu étant abaissée à un niveau de l'ordre de 40C. A ce niveau l'action de là papaïne est inhibée et l'on sauvegarde alors la longue chaîne de l'acide désoxyribonucléique à préserver en vue de sa récupération. . Le phénol introduit alors un complément de dénaturation qui s'exerce sur les résidus protidiques déjà dégradés par la papaïne ; de sorte que le phénol complète et poursuit l'action de la papaïne mais dans des conditions permettant de sauvegarder au maximum la channe de l'ADN. L'ensemble du traitement peut ainsi etre conduit dans un seul et même milieu de réaction sans nécessiter par conséquent de transvasement, opération coûteuse en main d'oeuvre et en temps de traitement, sans compter les risques de perturbation dans la conduite des réactions. En outre si le procédé de l'invention se distingue des techniques antérieurement connues par les moyens mis en oeuvre, les résultats obtenus marquent également un seuil considérable par rapport aux produits résultant des traitements antérieurs. On obtient en effet dans le cadre de la présente invention, pour une période de traitement réduite au 6ème, un excellent rendement en ADN de poids moléculaire élevé et par conséquent de grande pureté. En outre et selon une autre particularité de mise en oeuvre de l'invention, la matière traitée, constituée de laitance fraîche de poissons, est prélevée immédiatement sur le lieu de pêche et elle est soumise dès la phase initiale de la pêche à une opération de congélation, jusqu'à la phase de traitement d'extraction. Selon cette particularité, la matière traitée, dont-le processus de dégradation post mortem, ainsi bloqué se trouve proche de l'état de la matière vivante, les tissus étant ainsi très faiblement dégradés et les chaînes d'ADN étant ainsi susceptibles d'être récupérées intactes ou dans un état proche de leur intégrité au niveau de l'état vivant. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'extraction d'acides désoxyribonucléiques notamment à partir d'organismes animaux tels que laitance de poissons et caractérisé par la succession des opérations suivantes. a) après broyage de la laitance, celle-ci. est mise en suspension dans un bain d'une solution saline. b) la suspension est soumise à l'action d'une enzyme protéolytique en présence d'un détergent ionique. c) on additionne à ladite suspension dans son milieu constitué de la solution aqueuse saline, du phénol pour compléter l'action de la lyse des protides. d) on élimine la phase phénolique et contenant les produits de dégradation des protides par séparation physique en recueillant ainsi une liqueur contenant les acides désoxyribonucléiques. e) lesdits acides sont précipités dans l'éthanol. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration molaire de Nacl dans la suspension est égale ou inférieure à 1 M. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme protéolytique est la papaïne. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'action enzymatique à base de papaïne est limitée à une période de temps de 1 à 4 heures et à une température de 370, après quoi l-'action de la papaïne est inhibée par refroidissement du milieu de réaction jusqu'à une température de l'ordre de h C. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la suspension des produits de traitement dans une solution saline reçoit l'ajout d'un détergent ionique. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'action phénolique complémentaire est conduite par incorporation d'une solution de phénol saturée en eau dans la suspension de départ, cette action étant prolongée pendant une durée de l'ordre de 10 à 20 minutes à une température de 40C sous agitation modérée. 7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séparation des produits résultant de la dégradation des protides est conduite par un procédé physique choisi parmi la sédimentation, la filtration sur filtre presse, la centrifugation, ou leur combinaison. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la précipitation de l'acide désoxyribonucléique polymérisé est obtenue par addition à la liqueur, après séparation physique des produits de dégradation des protides, d'alcool sous forme d'éthanol à 950 volumique. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les fibriles représentant l'acide désoxyribonucléique précipité, sont lavés par des solutions alcooliques de titres croissants pour éliminer les traces de NaCl et de phénol. 10 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en outre en ce que on prélève sur le lieu de pêche la laitance fraiche et on la soumet immédiatement à une phase de congélation, puis on conserve la laitance à l'état congelé jusqu'à la phase de traitement à terre.