Brevet FR2632863A2 — publié le 19891222

FR 2632863 A2 19891222 FR 8808226 A 19880620 La présente addition concerne l'utilisation d'un virus du Fowlpox recombinant comme vaccin. Dans le brevet principal, on a montré que un virus du Fowlpox dérivant d'une souche atténuée pouvait être utilisé comme vecteur d'expression de protéines hétérologues. La présente addition vise a mettre plus précisément en évidence les possibilités d'utilisation du virus du Fowlpox pour la préparation de vaccins, c'est à dire que la protéine hétérologue est une protéine induisant une réponse immunitaire contre un virus hétérologue. La présente addition concerne plus particulièrement l'utilisation du virus du Fowlpox, tel qu'il est décrit dans le brevet principal, pour la préparation de vaccins contre les Morbillivirus. La présente addition a donc pour objet un virus du Fowlpox selon l'une des revendications 1 à 7 du brevet principal, caractérisé en ce que la séquence d'ADN-code pour une protéine induisant une réponse immunitaire contre un Morbillivirus. Parmi les virus appartenant à la famille des Morbillivirus, on peut citer le virus de la rougeole, le virus de la maladie de Carré, le virus de la peste bovine et le virus de la peste de petits ruminants. L'étude des différents Morbillivirus a permis de mettre en évidence les relations immunologiques entre les protéines de surface du virus de la rougeole et celles des autres Morbillivirus, ainsi que des homologies de séquences entre les ADN codant pour certaines de ces protéines. Ces anologies permettent d'envisager l'utilisation d'antigènes du virus de la rougeole pour la vaccination contre la maladie de Carré, la peste bovine et la peste des petits ruminants.Il est également possible de prévoir l'utilisation des antigènes de surface provenant de chacun des Morbillivirus en système de vaccination homologue ou hétérologue. Les protéines de surface telles que la protéine hémagglutinante (HA) et la protéine de fusion (F) sont plus plus particulièrement intéressantes, mais d'autres protéines de structure telles que la nucléoprotéine (NP) pourraient être utilisées. Les séquences d'ADN correspondantes peuvent coder pour la protéine de longueur totale ou bien pour des fragments suffisants pour induire in vitro la sythèse des anticorps neutralisant le Morbillivirus. Il est également possible de prévoir la mise en oeuvre d'une séquence d'ADN codant pour plusieurs protéines ou plusieurs fragments de celles-ci. L'addition concerne également les cultures de cellules eucaryotes que l'on infecte avec le virus recombinant et qui permettent sa réplication. Parmi les cellules envisageables, on peut citer notamment les cellules aviaires. Enfin, l'addition concerne des vaccins obtenus à partir de ces virus recombinants, sous forme de virus vivants ou inactivés. Les méthodes de préparation des vaccins sont connues de l'homme de métier et ne seront pas rappelées ici. La description détaillée suivante, accompagnée des figures 1 et 2 illutre l'invention. Figure: Construction de deux vecteurs permettant le transfert du gène codant pour la protéine F du virus de la rougeole dans le génome du virus du Fowlpox. Les séquences d'ADN du génome du Fowlpox sont représentées par des arcs de cercle au trait double annotés selon les cadres de lecture qu'elles renferment soit F6-F7, soit F9. L'arc de cercle au trait unique représente le vecteur bactérien pPolyII. Le promoteur P7,5 est schématisé par une flèche épaisse indiquant la direction de la transcription Les gènes codant pour la p-galactosidase d'E. coli et la protéine F du virus de la rougeole sont annotés lac Z et F measles respec- tivement et leur direction de lecture normale est la même que celle du promoteur P7 5 situé en aval de chaque gène. Les sites désignés B correspondent à l'endroit d'une ligation entre un site BglII et un site BamHI. Figure2: Mise en évidence de la synthèse de la protéine F du virus de la rougeole dans des cellules infectées par le virus FPV3113. Les protéines de cellules de poulet infectées par la souche sauvage du Fowlpox (piste annotée T) ou trois isolats de la souche recombinante FPV3113 (pistes annotées 1,2 et 3) ont été immunoprécipitées avec un sérum de cobaye antirougeole puis analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. L'autoradiographie du gel séché est présentée. Les différentes formes de la protéine F (F0or F1, F2) sont désignées par des flèches. Exemple 1 Insertion d'un gène étranger distinct du gène de la e-galactosidase dans le génome du Fowlpox et expression dans des cellules infectées par des virus recombinants du Fowlpox. A. Construction des virus recombinants La construction d'un vecteur (pTG2137) qui permet de transférer dans le génome du Fowlpox le gène de la p-galacto- sidase et de reconnaître les virus recombinants grâce à la couleur bleue des plages du Fowlpox en présence d'un substrat chromogène (X-gal) a été décrite dans le brevet principal. On peut de plus sélectionner pour l'intégration d'un deuxième gène dans le génome du Fowlpox sans que celuici confère au virus un nouveau phénotype facilement détectable. Ceci est illustré pour le cas du gène codant pour la protéine F du virus de la rougeole. Les étapes sont les suivantes: Dans un premier temps un deuxième promoteur P7,5 a été ajouté au plasmide pTG2137 afin d'assurer la transcription d'un deuxième gène indépendant de la 5-galactosidase. Le promoteur P7,5 a été obtenu sous forme d'un fragment BglII-BamHI excisé du phage M13TG2119 décrit auparavant. Le promoteur P7,5 a été intégré en aval du gène É-gal dans le site BamHI du vecteur pTG2137 soit dans la même orientation que le premier promoteur P7,5 pour donner le plasmide PTG2149 soit dans l'orientation opposée pour donner le plasmide pTG2150. Ensuite le cADN codant pour le gène F du virus de la rougeole a été inséré en aval du nouveau promoteur P7,5 dans les deux vecteurs pT32149 et pTG2150. D'abord le cADN codant pour la partie N-terminale de la protéine F a été excisé par coupure de pTG1172 avec les enzymes BglII et BamHI et le fragment obtenu a été inséré dans le site BamHI de pTG2149 ou pTG2150 de façon à respecter le sens de transcription correcte du gène F par rapport au promoteur P7,5 et donner naissance respectivement aux plasmides pTG2192 et pTG2193. Le cADN codant pour la partie C terminale du gène F a ensuite été isolé de pTG1173 par coupure avec l'enzyme BamHI et le fragment ajouté au pTG2192 préalablement coupé par le même enzyme de façon à reconstituer un gène F intact. La partie C-terminale du gène F dans le plasmide pTG1173 contient une région poly A qui avait été délétée dans le phage M13TG2143. Ce dernier a fourni la partie C-terminale du gène F sous forme d'un fragment BglII-BamHI ajouté au plasmide pTG2193 coupé par BamHI. Le plasmide formé lors de la ligation précédente est appelé pTG3113. Donc, les plasmides pTG2195 et pTG3113 contiennent chacun le gène F complet du virus de la rougeole sous le contr8le du promoteur P7,5 soit dans la même orientation que le premier promoteur P7,5 qui gouverne l'expression du gène de la g-galactosidase (pTG2195) soit dans l'orientation opposée. L'ensemble des clonages réalisés qui ont généré des plasmides recombinants est résumé dans la figure 1. Les plasmides recombinants pTG2195 et pTG3113 ont servi a transférer le gène de la p-galactosidase et le gène de la protéine F dans le génome du virus du Fowlpox selon les tech- niques décrites dans les exemples 2 et 5 du brevet principal. Des plages de virus recombinant du Fowlpox dénommées FPV2195 et FPV3113 ont été repérées grace à leur couleur bleue en présence de X-gal. Le virus contenu dans les plages a été repris, amplifié par infection de cellules d'embryons de pou- le" puis réétalé à nouveau. Des plages bleues ont été repérées et la procédure précédente répétée. Cette technique de clonage successif a montré que le virus FPV3113, après avoir été débarrassé du virus non recom- binant qui le contaminait initialement, présente un phénotype Bgalactosidase stable. Par contre, le virus FPV2195 soumis aux mêmes cycles de clonage successif se révèle instable à savoir qu'une plage bleue isolée donne environ 2 % de plages incolores, incapables de coder pour la p-galactosidase. Le virus FPV2195 isolé au départ a donc tendance à ségréger le gène É-gal tout en conservant le gène qui code pour la pro- téine F; le virus qui en résulte est appelé FPV2195 p-gal-. La perte du gène É-gal a lieu vraisemblablement à la suite d'évènements de recombinaison inter- ou intra-moléculaires entre les deux promoteurs P7,5 places en répétition directe par rapport au gène É-gal. Cette méthode a l'avantage de permettre la sélection initiale pour l'intégration d'un gène choisi (ici le gène F) grâce au marqueur p-gal qui y est associé physiquement puis l'élimination du marqueur par un mécanisme de recombinaison naturelle du virus et enfin la réutilisation éventuelle du marqueur pour l'insertion d'un autre gène ou du même dans une autre région du génome. B. Expression de la protéine F dans des cellules infectées par FPV2195 Bgal- et FPV3113 Des cellules d'embryons de poulet ont été infectées avec environ 1 ufp par cellule de FPV3113, FPV2195 p-gal- ou FPV de type sauvage. Après 40 heures d'infection les cellules ont été marquées à la méthionine 35S pendant 4 heures puis lysées avec un tampon d'immunoprécipitation. La protéine F contenue dans les lysats de cellules infectées avec les re- combinants a été immunoprécipitée avec un sérum polyclonal de cobaye dirigé contre l'ensemble des protéines du virus de la rougeole en présence de la protéine A de Staphylocoque aureus fixée au sepharose. Les protéines immunoprécipitées ont été analysées sur gel de polyacrylamide en pr6sence de SDS; le gel séché a été soumis à autoradiographie. Les résultats présentés (figure 2) pour le recombinant FPV3113 démontrent la présence du produit primaire de traduction de l'ARNm corres- pondant au gène F (F0) ainsi que les produits de clivage F1 et F2. REVENDICATIONS 1) Virus du Fowlpox recombinant selon l'une des revencations 1 à 7 du brevet principal caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour une protéine induisant une réponse immunitaire contre un Morbillivirus. 2) Virus du Fowlpox selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit Morbillivirus est choisi parmi le virus de la rougeole, le virus le la maladie de Carré, le virus de la peste bovine et le virus de la peste des petits ruminants. 3) Virus du Fowlpox selon la revendication 2 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour tout ou partie d'au moins une protéine de structure du virus de la rougeole. 4) Culture de cellules eucaryotes infectée par un virus du Folwpox recombinant selon l'une des revendications 1 à 3. ) Culture de cellules selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules aviaires. 6) Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un virus du Fowlpox selon l'une des revendications 1 à 3. 7) Vaccin selon la revendication 6 caractérisé en ce que le virus du Fowlpox est vivant. 8) Vaccin selon la revendication 6 caractérisé en ce que le virus du Fowlpox est inactivé. 9) Antisérum contenant les anticorps dresses contre le virus du Fowlpox selon l'une des revendications 1 à 3.