Brevet FR2631974A1 — publié le 19891201

La présente invention est relative à un baculo- virus modifié possédant un seul site de coupure derrière le promoteur du polypeptide majeur de l'inclusion virale de baculovirus, la polyédrine, et/ou de la protéine P 10, à un procédé pour l'obtention d'un tel baculovirus modifié et à son application en tant que vecteur d'expression de gènes. Le génie génétique utilise des systèmes de vec- teurs viraux eucaryotes pour introduire par transduction des ADN exogènes dans des cellules animales ou végétales. Les principaux virus eucaryotes qui sont susceptibles de servir de vecteurs de transduction d'ADN dans des cellules de mammifères (SV40 et polyome, par exemple) et dans des cellules végétales (virus de la mosaïque du chou-fleur, par exemple) ne peuvent recevoir que de l'ADN exogène ("étranger") dont la longueur est limitée, en raison de la morphologie de la structure de leur nucléocapside. Du fait que la taille des génomes est considérablement augmentée par la présence des séquences introduites, il s'est avéré absolument nécessaire de pouvoir disposer de vecteurs sus- ceptibles de "loger'" plus d'ADN exogène, "étranger", d'autant plus que le génie génétique, en se développant, tend à chercher à insérer dans une cellule-hôte plus d'un gène étranger, dans le but, par exemple, d'obtenir une ex- pression coordonnée et, si possible, une activité coordon- née des produits des gènes étrangers. Le vecteur viral idéal devrait, en outre, permettre l'introduction d'un long segment d'ADN étranger dans des cellules, à une fréquence élevée et permettre la conversion de la biosynthèse de toutes les protéines cellulaires en l'expression du ou des gène(s) étrangers). Un virus paraissant remplir toutes ces conditions est le baculovirus suivant: virus de la poly- édrose nucléaire, Autographa californica (AcNPV) qui, selon Lois K. MILLER (Chapitre 14 "A virus vector for genetic engineering in invertebrates" du Manuel "GENETIC ENGINEERING IN PLANT SCIENCES" (1981) N.J. PANOPOULOS, ED.,. PRAEGER PUBL. NEW-YORK, pages 203-223), constitue un excel- lent vecteur de propagation et d'expression de nombreux gènes étrangers dans un environnement eucaryote. Selon cette Etude, l'AcNPV présente deux formes, virus non in- clus, NOV, et virus inclus, OV, qui jouent des rôles diffé- rents dans le processus d'infection par baculovirus, et les gènes qui codent pour la polyédrine ne sont pas nécessaires et pourraient être éliminés et remplacés par de l'ADN étranger introduit dans la séquence nucléotidique codant pour la polyédrine, pour procurer un système vecteur ca- pable de donner un taux élevé d'expression des gènes étran- gers. Il est également indiqué dans cette Etude que la po- lyédrine qui est la protéine cristalline qui forme la ma- trice du corps d'inclusion de l'AcNPV,et dont le poids mo- léculaire est de 30KD, est synthétisée en très grandes quantités par l'OV, sans qu'il y ait amplification du gène de la polyédrine dans le processus de replication, ce qui laisse à penser que le promoteur de la synthèse de l'ARNm de la polyédrine est exceptionnellement puissant et qu'il-1 pourrait être utilisé pour obtenir des taux élevés d'expression d'un gène étranger. L'Auteur indique, en outre, qu'il a été établi précédemment que le génome, lui- même identifié, de l'AcNPV, code pour le gène de la poly- édrine. De plus, un certain nombre de variants génotypiques de l'AcNPV ont été observés et des variations des sites d'endonucléases de restriction pour plusieurs des variants qui se forment naturellement, ont été cartographiées. Dans cette Etude, L. MILLER rappelle que le gé- nome (ADN) de l'AcNPV est infectieux dans des cultures cel- lulaires et que l'aptitude de ce génome à transfecter des cultures cellulaires est de nature à permettre de lier de l'ADN étranger à l'ADN viral, d'insérer l'ADN recombinant dans des cellules en culture par un processus de transfec- tion et d'obtenir un virus contenant les séquences d'ADN additionnelles et que cette aptitude est également de na- ture à permettre la manipulation in vitro de 1'ADN de l'AcNPV ou d'un recombinant et sa réinsertion aisée dans des cellules, la grande taille du génome de l'AcNPV - qui, selon les estimations, aurait un poids moléculaire de 82-88 millions de daltons ou un poids moléculaire de 92 millions de daltons- constituant un avantage dans la perspective de l'introduction de grands segments d'ADN étranger dans les cellules-hôtes. Il est indiqué dans cette Etude qu'en rai- son des grandes quantités de polyédrine produites dans les cellules infectées, il y a avantage à remplacer le gène de la polyédrine par de l'ADN étranger, en utilisant, pour l'expression, le promoteur de la polyédrine. Un Article de K.N. POTTER et L. K. MILLER paru dans ANIMAL VIRUS GENETICS, 6, GENETIC MUTATIONS OF A BACU- LOVIRUS, ACADEMIC PRESS (1980), pages 71 - 80, décrit la méthode du "marker rescue" (récupération des marqueurs) d'établissement de la carte génétique de mutants ts d'AcNPV sur la base de la carte de restriction des sites de plu- sieurs endonucléases de restriction, laquelle méthode consiste à recombiner in vivo un génome d'ADN mutant avec un fragment de restriction d'ADN d'AcNPV sauvage. Un certain nombre de Publications font applica- tion des données exposées par L.MILLER dans son Etude. C'est ainsi que les Demandes de Brevet européen N' 0127 839 au nom de THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM (avec MM. G.E. SMITH et D. SUMMERS mentionnés comme Inventeurs), N' 0228 036 au nom de MICROGENESYS (avec M. M. COCHRAN men- tionné comme Inventeur) et N' 0260 090 aux noms de D.H.L. BISHOP et C.Y. KANG, qui sont déposants et Inventeurs, ont toutes trois pour objet de produire un vecteur d'expression d'un baculovirus recombinant, qui est ensuite utilisé pour infecter une cellule d'insectehâte sensible. Selon ces procédés, on isole d'abord d'un baculovirus approprié, tel qu'Autographa californica (AcMNPV), un fragment d'ADN qui comprend le promoteur de la polyédrine et des séquences d'ADN codant pour la protéine de polyédrine. Selon la pre- mière de ces trois Publications, le fragment isolé est in- séré dans un vecteur de clonage tel que le plasmide pUC 8, pour former un vecteur de transfert constitué par un véhi- cule de clonage (le plasmide) qui contient obligatoirement le promoteur de polyédrine (mais pas obligatoirement des séquences d'ADN codant pour la polyédrine) et un site disponible pour cloner un gène sélectionné qui se trouvera sous le contrôle transcriptionnel dudit promoteur; puis un vecteur de transfert recombinant est formé par insertion dans le site de clonage disponible susdit, d'un gène sélec- tionné, en utilisant les techniques d'ADN recombinant, et enfin, à partir de ce vecteur de transfert recombinant, on forme un vecteur d'expression recombinant en incorporant, par transfection, dans l'ADN de baculovirus, un fragment du vecteur de transfert recombinant. Le vecteur d'expression de baculovirus recombinant formé, est capable d'exprimer le gène sélectionné inséré dans le vecteur de transfert recombinant. La deuxième de ces trois Publications vise à produire un polypeptide tel que l'antigène de surface du virus de l'hépatite B, dans une cellule-hôte infectée par un virus, en isolant d'un baculovirus (virus capable d'infecter une cellule-hôte d'insecte), un premier segment d'ADN incluant un promoteur viral tel que le promoteur de polyédrine, puis en isolant d'une source appropriée, un se- cond segment d'ADN qui contient la séquence qui code pour le polypeptide et en combinant ces deux segments d'ADN pour former un brin continu d'un troisième segment d'ADN qui contient de l'ADN vecteur dans lequel le second segment d'ADN est adjacent au promoteur du premier segment d'ADN et contient des signaux de fin de transcription; on forme en- suite un vecteur recombinant en recombinant le troisième segment susdit avec de l'ADN génomique de baculovirus, après quoi le vecteur recombinant est mis en contact avec des cellules-hôtes d'insecte dans des conditions qui provo- quent l'incorporation du segment de vecteur recombinant dans lesdites cellules-hôtes, pour les infecter; elles sont ensuite mises en culture pour isoler des cellules ou des surnageants de culture, l'antigène de surface du virus de l'hépatite B. La troisième de ces Publications (Demande de Brevet européen 0260090) a pour objet un procédé de production d'un polypeptide qui comprend au moins une frac- tion antigénique de la protéine de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg) ou de la protéine Pre-S2, par infection d'insectes ou de cellules d'insectes sensibles, par un vecteur d'expression constitué par un baculovirus recombinant comportant un segment d'ADN qui code pour. le polypeptide recherché (HBsAg), sous le contrôle d'expression d'un promoteur de polyédrine, le baculovirus recombinant étant lui-même obtenu par cotransfection de cultures de cellules d'insectes par de l'ADN de baculovirus infectieux et des plasmides vecteurs de transfert de bacu- lovirus contenant des gènes représentant les antigènes du virus de l'hépatite B, qui sont places à l'emplacement des séquences initiales 5' codantes du gène de polyédrine de baculovirus, mais sous le contrôle du promoteur de poly- edrine. Ces trois Publications ont en commun la néces- sité d'utiliser pour obtenir le vecteur d'expression, un vecteur de transfert qui est un véhicule qui est chargé d'un gène étranger (gène de l'interféron e dans la Demande de Brevet européen 0127-839; gène de l'HBsAg dans les deux autres Demandes de Brevets européens 0228 036 et 0260 090). Lorsque le vecteur de transfert est chargé, il est néces- saire de procéder au transfert du gène étranger dans le vi- rus, ce qui est réalisé, conformément à ces Demandes de Brevets, par cotransfection, après quoi on recherche et isole les virus recombinants qui constituent les vecteurs d'expression, que ceux-ci soient efficaces ou non. Ces opé- rations de transfert et de sélection sont longues et déli- cates: la séquence étrangère est chargée sur une construc- tion intermédiaire constituée par un vecteur plasmidique de transfert (ou de transplacement) et il faut, pour obtenir le vecteur d'expression, passer par la cotransfection et, donc, par-la méthode de "marker-rescue". Il y a lieu de noter, par ailleurs, que dans un Article de SMITH, VLACK et SUMMERS intitulé "PHYSICAL ANALYSIS OF AUTOGRAPHA CALIFORNICA NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS TRANSCRIPTS FOR POLYHEDRIN AND 10000-MOLECULAR-WEIGHT PROTEIN" paru dans JOURNAL OF VIROLOGY, Janvier 1983, pages 215-225, ces Auteurs décrivent les dimensions, la direction de transcription et l'emplacement des séquences d'ADN qui spécifient les extrémités 5' et 3' de l'ARNm de la polyédrine de 1' AcMNPV (virus de la polyédrose nucléaire d'Autographa Californica), laquelle polyédrine est le polypeptide structural majeur de l'inclusion virale; il est question, dans cet Article, d'une protéine de l'AcMNPV de bas poids moléculaire dans des gels SDS-PAGE, de l'ordre de 10 KDa, qui est produite dans des cellules- hôtes infectées, en quantités (élevées) comparables à celles de la polyédrine. Selon cet Article, la protéine P10 est, au même titre que la polyédrine, un gène de l'AcMNPV; à 24 heures post-infection, on trouve dans les cellules infectées par l'AcMNPV une grande quantité de poly(A)+ ARN qui s'hybride aux régions du génome o se trouvent localisés les gènes de la polyédrine et de la protéine P10; l'ARNm et les protéines de ces deux gènes qui s'accumulent dans les cellules infectées permettent de com- prendre le contrôle de l'expression de ces gènes dans les cellules d'insectes dont l'étude est effectuée en utilisant comme modèles les séquences d'ADN responsables de l'expression préférée de la polyédrine et de la protéine P10 à un stade tardif de l'infection. La Demande de Brevet européen 0127 839 THE TEXAS A & M UNIVERSITY SYSTEMS analy- sée plus haut et dans laquelle SMITH & SUMMERS sont men- tionnés en tant qu'Inventeurs, énonce et revendique au de- meurant que le gène (ou fragment de gène) inséré dans le véhicule de clonage (tel qu'un plasmide), lui-même préala- blement modifié. par insertion d'un fragment d'ADN obtenu par clivage d'ADN de baculovirus et comprenant un gène de baculovirus (ou un fragment de gène), pour former le vec- teur de baculovirus recombinant de transfert recherché, est un gène de polyédrine ou une fraction de celui-ci incluant le promoteur de polyédrine ou est un gène de protéine P10 incluant le promoteur de protéine P10. Les emplacements S respectifs du gène de la polyédrine et du gène de la pro- téine P10 dans le génome de l'AcMNPV sont indiqués dans cette Demande de Brevet. Il est également mentionné dans cette dernière que c'est parce que le génome de l'AcMNPV n'a pas de sites de restriction uniques connus dans les- lO quels des gènes sélectionnés peuvent être effectivement in- troduits d'une manière site-spécifique, qu'il est néces- saire de construire des vecteurs plasmidiques chimériques (ou vecteurs de transfert) qui servent de véhicule intermé- diaire pour le transfert des gènes. La présente invention a en conséquence pour but de pourvoir à un vecteur d'expression qui puisse être ob- tenu sans avoir à passer par l'intermédiaire d'un vecteur de transfert. Elle a également pour but de pourvoir à un vec- teur d'expression non chargé, dans lequel il est possible de charger pratiquement n'importe quelle séquence. Elle a, de plus, pour but de pourvoir à un vecteur d'expression apte à être chargé d'une séquence étrangère directement in vitro par manipulation génétique. La présente invention a pour objet un procédé de production d'un baculovirus modifié susceptible d'être utilisé en tant que vecteur d'expression de gènes exogènes, lequel procédé est caractérisé en ce qu'on insère directe- ment dans le génome complet ou incomplet d'un baculovirus, un site de restriction approprié, en aval du promoteur tardif fort du gène d'au moins l'une des protéines qui constituent des formations associées au baculovirus - qu'il s'agisse d'inclusions virales de baculovirus, telles que la polyédrine, ou de protéines associées au baculovirus, autres que des inclusions virales, telles que la protéine P10 - pour obtenir un virus modifié qui constitue un vecteur d'expression non chargé, prêt à recevoir au moins une séquence d'au moins un gène étranger que l'on désire faire exprimer. Parmi -les gènes de telles protéines, l'on compte plus particulièrement'le gène de la polyédrine et le gène de la protéine P10. Selon un mode de réalisation du procédé conforme à l'invention, pour la construction d'un.baculovi- rus modifié qui constitue un vecteur d'expression non chargé prêt à recevoir un fragment d'ADN étranger que l'on désire faire exprimer, on met en oeuvre un baculovirus dé- pourvu de site de restriction pour au moins une enzyme don- née, sur lequel on installe au moins un site de restriction unique pour au moins l'enzyme considérée. 1i5 Selon un mode de réalisation avantageux du pro- cédé de production d'un baculovirus modifié, conforme à la présente invention, le baculovirus origine dépourvu de site de restriction par une enzyme donnée, mis en oeuvre, es-t un baculovirus naturellement dépourvu dudit site de res- triction, tel, notamment, que le baculovirus de la poly- édrose nucléaire de Sod.upiLera Lruiperda (Sf). Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de production d'un baculovirus modifié, conforme à la présente invention, le baculovirus origine dépourvu de site de restriction pour une enzyme donnée, mis en oeuvre, est un baculovirus dont on a au préalable supprimé le ou les site(s) de restriction mal placé(s) sur son génome. Selon un mode de réalisation avantageux du pro- cédé de production d'un baculovirus modifié, dans le cas o l'on veut supprimer un site de restriction mal placé, la suppression est réalisée par cotransfection de l'ADN du ba- culovirus origine considéré, avec un plasmide dans lequel a été cloné le fragment de l'ADN qui renferme le site de res- triction qui a été coupé par une enzyme pour être linéa- risé et auquel on a ligué un linker, puis que l'on a trans- formé, après ligation, en un plasmide dépourvu du site de 263 1974 restriction supprimé, ladite cotransfection donnant lieu à un virus recombinant dépourvu de ce site Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de production d'un baculovirus modifié conforme à la présente invention, l'introduction d'un site de restriction pour une enzyme donnée, en aval du promoteur tardif fort du gène d'au moins l'une des protéines qui constituent des formations associées au baculovirus, et notamment en aval du promoteur du gène de la polyédrine ou/et du polypeptide P10O de baculovirus, est réalisée par cotransfection d'une culture cellulaire de cellules permis- sives au baculovirus, avec un plasmide approprié dans le- quel a été cloné le fragment qui contient le site de res- triction placé en aval du promoteur tardif fort, laquelle cotransfection aboutit à la formation de virus recombiné modifié, qui correspond au vecteur d'expression non chargé de séquence étrangère, prêt à recevoir au moins une sé- quence étrangère en vue de son expression sur cellules d'insectes. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé conforme à la présente invention, pour la construction d'un baculovirus modifié qui constitue un vec- teur d'expression non chargé prêt à recevoir au moins deux fragments d'ADN étrangers que l'on désire faire exprimer, on installe sur un baculovirus convenablement choisi, au moins deux sites de restriction pour au moins deux enzymes identiques ou différentes. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, dans le cas o le baculovirus origine est dé- pourvu de deux sites de restriction pour deux enzymes iden- tiques ou différentes, ces deux sites de restriction sont successivement introduits par cotransfection avec un pre- mier plasmide dans lequel a été cloné le fragment qui contient- le premier site -de restriction que l'on souhaite installer sur le bacuiovirus, puis avec un second plasmide dans lequel a été cloné le fragment qui contient le second site de restriction que l'on cherche à installer sur le baculovirus. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, dans le cas o le baculovirus origine comporte des sites de restriction mal placés sur son gé- nome, ces sites sont successivement supprimés par cotrans- fection successivement avec des plasmides dépourvus de cha- cun des sites de restriction à supprimer. Selon un mode de réalisation avantageux du pro- cédé de production d'un baculovirus modifié constituant un vecteur d'expression non chargé, celui-ci est caractérisé en ce qu'il comporte un site de restriction unique installé à proximité du gène d'une protéine associée au baculovirus ou installé à proximité d'un promoteur tardif fort de ce gène. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de production d'un baculovirus modifié consti- tuant un vecteur d'expression non chargé, celui-ci est ca- ractérisé en ce qu'il comporte deux sites identiques ou différents installés respectivement à proximité du gène d'une protéine associée au baculovirus et à proximité d'un promoteur tardif fort de ce gène. La présente invention a également pour objet un baculovirus modifié comportant un site de restriction unique, installé en aval du promoteur tardif fort approprié du gène d'une protéine associée au baculovirus, apte à constituer un vecteur d'expression non chargé. Selon un mode de réalisation avantageux d'un tel baculovirus modifié, susceptible de constituer un vec- teur d'expression non chargé, celui-ci est constitué par un baculovirus modifié comportant un site de restriction unique, installé à proximité du codon ATG du gène d'au moins une protéine associée au baculovirus, ou d'un promo- teur tardif fort de ce gène. Selon un autre mode de réalisation avantageux du baculovirus modifié conforme à la présente invention, il 1} comporte au moins deux sites de restriction installés res- pectivement à proximité du codon ATG du gène d'au moins une protéine associée au baculovirus et à proximité d'un autre promoteur tardif fort de ce virus. La présente invention a en outre pour objet un vecteur d'expression de gènes, non chargé,'constitué par un baculovirus modifié tel que défini dans ce qui précède. La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de chargement d'un vecteur d'expression non chargé, en au moins une séquence étrangère, caractérisé en ce qu'au moins une séquence étrangère est introduite di- rectement in vitro dans ledit vecteur d'expression, par ma- nipulation génétique. Selon un mode de réalisation dudit procédé de chargement, au moins une séquence étrangère est introduite directement dans le génome viral modifié qui constitue le vecteur d'expression initialement non chargé. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, pour l'introduction directe d'au moins une sé- quence étrangère, le génome viral est préalablement linéa- risé par action d'une enzyme de restriction. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit procédé de chargement, un fragment d'ADN étranger est introduit directement dans un premier site de-.restriction dudit vecteur d'expression non chargé, puis un second frag- ment d'ADN identique au premier ou différent de celui-ci, est introduit directement dans un second site de restric- tion dudit vecteur d'expression, les deux sites de restric- tion étant tous deux des sites de restriction uniques pour des enzymes différentes. Selon encore un autre mode de réalisation avan- tageux dudit procédé de chargement, des fragments d'ADN étrangers identiques ou différents sont chargés dans des sites de restriction uniques, c'est-à-dire définis comme étant deux sites de restriction différents pour une enzyme identique, par digestion partielle dudit vecteur d'expression non chargé, pour ouvrir un site, dans lequel est alors introduit un premier fragment d'ADN, ledit vec- teur étant soumis à une seconde digestion partielle pour ouvrir un second site unique identique au précédent, dans lequel est chargé un second fragment d'ADN, La présente invention a, de plus, pour objet un virus chargé, qui est caractérisé en ce qu'il est formé d'un baculovirus modifié constituant un vecteur d'expression initialement non chargé, dans lequel a été in- sérée directement, in vitro, au moins une séquence d'ADN étranger qu'on désire faire exprimer. La présente invention a en outre pour objet un processus d'expression de gènes étrangers qui est caracté- risé en ce qu'il met en oeuvre un virus chargé tel que dé- fini plus haut. Le vecteur d'expression conforme à l'invention peut être chargé de, pratiquement, n'importe quelle sé- quence attendu que lesdites séquences ne doivent pas com- porter de sites de restriction particuliers. C'est ainsi que sont susceptibles d'être expri- més par le vecteur d'expression conforme à l'invention, tous gènes codant pour des protéines d'origine procaryote et eucaryote, toutes séquences codant pour des gènes de biosynthèse, des antigènes protéiniques viraux et en particulier, à titre d'exemples non limitatifs, les gènes des acétylcholinestérases d'invertébrés et de vertébrés. Les Publications citées précédemment et notam- ment les Demandes de Brevets européens citées plus haut, mentionnent que le gène de l'interféron B est exprimé d'autant plus efficacement s'il est inséré quelques nu- cléotides en amont du codon ATG initial du gène Pn, c'est- à-dire à proximité de ce codon ATG. Elles mentionnent éga- lement que les plasmides vecteurs recombinants obtenus contiennent la région du promoteur de polyédrine, avec, par exemple, un site BamHI unique en aval du site de départ transcriptionnel, c'est-à-dire situé environ 10 nucléotides en amont de l'emplacement du codon ATG du type sauvage, dans le vecteur d'insertion. En d'autres termes, l'Art an- térieur propose la construction de vecteurs de clonage qui contiennent des sites de clonage uniques dans une position en aval d'un promoteur de baculovirus défini, qui sont flanqués de séquences homologues du génome viral, de façon à diriger l'insertion par recombinaison homologue. Ces connaissances sont appliquées, conformément à la présente invention, à la production d'un vecteur d'expression non chargé. La possibilité qu'offre la présente invention d'éviter le recours à un vecteur de transfert simplifie considérablement le procédé d'obtention d'un baculovirus recombiné chargé susceptible d'exprimer une protéine étran- gère: en effet, alors que les procédés qui sont dans l'obligation de recourir à un vecteur de transfert requiè- rent plusieurs semaines pour produire un baculovirus recom- biné chargé, le procédé conforme à la présente invention permet d'obtenir un baculovirus chargé, en quelques jours. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui res- sortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré- sente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.. EXEMPLE 1: Suppression du site SmaI du génome du S1KNPV. Pour construire le vecteur d'expression non * chargé, c'est-à-dire le baculovirus modifié prêt à rece- voir une séquence étrangère, on sélectionne un baculovirus dépourvu de site de restriction par une enzyme donnée: c'est le cas, exceptionnel, du baculovirus de la polyédrose nucléaire de Spodopte:a.frugiperda qui ne possède pas de site de restriction SmaI. L'on peut aussi supprimer le ou les site(s) de restriction mal placé(s) sur le génome du baculovirus: no- tamment on supprime le site unique SmaI localisé dans le fragment Pst-I-G du baculovirus de la polyédrose nucléaire de Spodoptera littoralis, en procédant comme suit: Le fragment Pst-I-G du S1MNPV cloné dans un plasmidede type pAT153 est coupé par SmaI, puis un linker KpnI est ligué au plasmide linéarisé. Les plasmides obtenus pas transformation après ligation et dépourvus de site SmaI sont cotransfectés avec le SlMNPV origine en vue d'obtenir des virus recombinants dépourvus de site SmaI. Dans la des- cendance des virus obtenus après cotransfection, on trie les virus recombinants. Ces virus auront, par rapport au virus origine, perdu un site SmaI, c'est-à-dire n'auront plus de site SmaI et auront par contre acquis un site KpnI et posséderont donc au total 7 + 1 = 8 sites KpnI. Pour sélectionner ces virus recombinants, on procède de la ma- nière suivante: les polyèdres récoltés après la mort des chenilles transfectées sont source d'ADN qui sert pour une nouvelle transfection. Préalablement à cette nouvelle transfection, l'ADN est coupé par SmaI. Ce traitement à pour effet d'interdire la multiplication des virus d'origine car leur génome est ouvert, et de ne permettre que la multiplication des virus recombinants. Plusieurs cycles de multiplication des virus selon ce principe peu- vent être nécessaires pour éliminer la descendance des vi- rus d'origine ayant échappé à la coupure par SmaI. Ce processus de suppression d'un site de res- triction SmaI mal placé est illustré dans la figure I an- nexée. _--__________ _______ ___________=_______________________ EXEMPLE 2: Installation d'un site SmaI en aval du promoteur de la polyédrine sur un baculovirus dépourvu de site de restriction SmaI: Le site unique, qu'il s'agisse de SmaI ou de tout autre site, doit être placé dans la région de l'ATG qui est le codon initial du gène de la polyédrine (ou de P10O). Quand on place ce site avant l'ATG, ceci permet l'expression du gène étranger sous le contrôle de son propre ATG (la position du site de chargement est dite en amont de l'ATG: c'est-à-dire du côté 5' de l'ATG). Cette situation est la situation la plus fréquemment souhaitée. Quand on place le site après l'ATG (en aval de l'ATG, soit en 3' par rapport à ce même ATG) la situation permet de produire des protéines dites fusionnées qui sous le contrôle de l'ATG de la polyédrine comportent en partie N- terminale des acides aminés correspondant à la séquence de la polyédrine et dans la partie C-terminale des acides ami- nés correspondant à la séquence étrangère fusionnée. La ré- gion d'installation du site s'étend à titre indicatif de - 10n à +10n. Il est convenu que le A de l'ATG est numéroté +1, le T +2 et le G +3, les bases avant l'ATG sont numéro- tées avec le signe (-); la base qui précède A porte le numéro -1 et ainsi de suite. Le choix de SmaI est conditionné par la rela- tive rareté des sites SmaI chez les baculovirus. Le fait que l'ADN viral soit coupé à ce site de reconnaissance par l'endonucléase SmaI avec production d'extrémités franches est certes un avantage dans la mesure o les extrémités franches constituent une entrée universelle pour des sé- quences étrangères. Cet avantage n'est pas déterminant dans le choix car il est de pratique courante de rendre franches des extrémités qui ne le sont pas au départ. Toute endonu- cléase de restriction capable de reconnaître un site unique de restriction positionné convenablement en aval d'un pro- moteur, permet l'introduction de séquences -étrangères, en vue de l'expression de gènes chargés, au prix de modifica- tions parfois mineures des extrémités de celles-ci. Conformément à l'invention, il faut, sur un vi- rus dépourvu de site de restriction par SaI par exemple, soit NPV de Spodoptera fruiiPrd.a, soit NPV de Spodoptera littorais traité conformément à l'Exemple 1, installer un site SmaI (qui devient pour le génome viral un site unique) en aval du promoteur du gène de la polyédrine (ou de tout autre promoteur tardif fort comme celui de la protéine P10). L'intallation du site SmaI au meilleur endroit sup- pose l'établissement préalable de la séquence du gène de la polyédrine (notamment de la région promotrice). Pour installer le site SmaI il faut disposer d'un site de restriction unique qui permette d'ouvrir le génome dans une partie restreinte du gène de la polyédrine. Les sites uniques chez le virus entier sont rares. La pro- babilité de trouver un site unique augmente lorsqu'on ré- duit la taille de la séquence. Cette introduction peut se faire par plusieurs méthodes. Parmi celles-ci, on peut citer la mutation diri- gée avec création de site unique, suivie de l'introduction dans ces sites de linker SmaI. Une autre méthode consiste à procéder à des dé- létions induites par Bal31 à la suite de la coupure de la séquence virale au niveau du site SacI. Comme il existe un second site SacI dans le polylinker du plasmide, il est né- cessaire, préalablement à la digestion par Ba131, de faire sauter du polylinker, ce site SacI. Le polylinker a, initialement, la composition suivante: EcoRI; Sac1; Kpnl; Smai; BamH1; Xbal; Sall; PstI; SphI; HindIII Après le clonage du fragment HindII dans le pUCI9, on procède à une délétion dirigée avec le système ExoIII-Mung bean. Le site de blocage est le site PstI contenu en 5' du polylinker et le site de digestion un site HpaI situé entre le polylinker et le site XbaI du fragment HindIII-K. Cette délétion fait disparaître un segment com- pris entre le site PstI et le site HpaI d'une part et un segment situé entre ce même site HpaI et le site XbaI viral. Le plasmide délété est préparé pour un séquen- çage direct (donc simplement pour des raisons de commodité) des plasmides délétés ultérieurement autour du site XbaI de la séquence virale. A ce stade le polylinker a la composi- tion suivante: EcoRI;SacI;KpnI;SmaI;BamHI;XbaI;SalI et le premier site significatif viral en 3' est XbaI. On élimine alors le site SacI du polylinker par une double digestion EcoRI-BamHI qui fait subsister du polylinker uniquement les sites XbaI et SalI. De cette ma- nière on peut à la fois procéder à une délétion autour du site viral SacI et installer, à la place de cette délétion, un linker SmaI qui sera site unique dans ce plasmide. La position du site SmaI doit être de -30 à +10 puisque XbaI est en position -40 par rapport au A de l'ATG. Les plasmides p13.21XSS sont cotransfectés.sur culture cellulaire de S. littoralis et les virus recombinés qui correspondent aux vecteurs d'expression non chargés de séquence étrangère sont repérés par le phénotype "P moins". Ce phénotype est celui des virus responsables de foye-rs in- fectieux par la méthode des plages dans lesquelles les po- lyèdres ne peuvent être mis en évidence. Ce processus d'installation d'un site de res- triction SmaI est illustré dans la figure 2 annexée. ___________________________________________________________ _- -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - EXEMPLE 3: Chargement de séquence étrangère en amont immédiat de l'ATG. Cette étape de la construction du vecteur d'expression présuppose la possession du baculovirus modi- fié conformément à l'invention, c'est-à-dire du virus pos- sédant un site unique situé par exemple à -4 (la référence de numérotation étant toujours +1 pour le A de l'ATG ini- tial du gène de la polyédrine). Ledit virus modifié est en fait amputé des bases qui s'étendent de -3 à environ +280 puisque le site SacI à partir duquel Bal31 digère, est si- tué à +140. L'obtention du vecteur suppose la préparation d'une séquence étrangère apte à être exprimée. Séquence chargée: Séquence de l'acétylcholinestérase de Drosophila melanoRgastr. La séquence à exprimer est issue de la forme réplicative du plasmide pEMBL-Ache de l'acétylcholinestérase de D.melanogaster (plasmide pE6 ob- tenu par Fournier et al. INRA, Antibes). La séquence pu- bliée à l'origine par Hall et Spierer /CMBO. J: (1986), page 29527 est longue de 3481 bases. Le segment NruI-SacI qui s'étend de +869 à +3181 peut être utilement souscloné dans un pUC19 en SmaI-SacI. NruI coupe le gène de l'acétylcholinestérase 127 bases en amont de l'ATG de ce gène. Un site unique AatII à +921 permet la récupération du fragment AatII-SacI qui comporte la totalité du gène Ache (soit une séquence leader de 72 bases, un ORF de 1947 bases et une séquence en 3' de 241 bases comprenant un signal de polyadénylation à +3050). Afin d'éviter la présence de la séquence codant pour la queue d'ancrage et de faciliter la purification de l'acétylcholinestérase, l'emploi du segment AatII-XmnI (+921 - +2856) qui donne une protéine tronquée de 28 acides aminés sur 649 acides aminés de drosophile en aval du gène Ache, est très favorable. Le résultat de ce montage conduit à une protéine fusionnée en 3'. La nature de la protéine fusionnée est fonction des résidus obtenus par la délétion induite par Bal31. Après la séquence AGTGGG formée du der- nier codon de l'Ache et du codon GGG qui est un demi site SmaI suit, soit les bases du gène de la polyédrine dans le bon cadre de lecture auquel cas la protéine fusionnée com- porte environ 120 acides aminés de polyédrine, soit des bases dans un mauvais cadre de lecture et il apparaît des codons stop après une trentaine de codons sens. Les extrémités du fragment d'ADN double-brin à insérer dans le virus modifié au niveau du site SmaI sont rendues franches si nécessaire par l'action de Mung-bean pour les sites SacI et AatII. Après transfection de cellules de Spodoptera litoralij., l'activité acétylcholinestérasi4ue est mesurée à partir d'une série de surnageants et/ou de broyats prove- nant de X cellules isolées à 48 heures post-infection et est maintenue 48 heures supplémentaires pour la production d'acétylcholinestérase. Les lots associés à une activité enzymatique élevée donnent lieu à un clonage par dilution limite. La présence de clones positifs est recherchée par hybridation avec une sonde pUC-Ache. EXEMPLE 4: Chargement en aval de l'ATG (cas des protéines fusionnées). Expression du gène de la béta- galactosidase. Cet exemple, comme le précédent, suppose l'existence du baculovirus modifié. Dans ce cas la délétion produite par Ba131 à partir du site SacI respecte l'ATG. Le fragment SmaI-SalI du plasmide pMC1871 de Casadaban (plasmide distribué par Pharmacia) est inséré dans le site SmaI du virus transformé après modification de l'extrémité SalI par Mung bean. Cette construction présente la structure: CCC GTC----LacZ----AAA TAA TAA TAA CCG GGC AGG GGG GAT CCG- >--- extrémité 3' de l'ORF de la polyédrine.----> Les virus recombinés ayant cette structure sont reconnus en culture cellulaire par la coloration bleue.avec X-gal. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention de ne se limite nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter 0 du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1') Procédé de production d'un baculovirus modifié susceptible d'être utilisé en tant que vecteur d'expression de gènes exogènes, lequel procédé est caracté- risé en ce qu'on insère directement dans le génome complet ou incomplet d'un baculovirus, un fragment de restriction approprié, sous contrôle d'un promoteur tardif fort du gène d'au moins l'une des protéines qui constituent des formations associées au baculovirus - qu'il s'agisse d'inclusions virales de baculovirus, telles que la polyédrine, ou de protéines associées au baculovirus, autres que des inclusions virales, telles que la protéine P10 - pour obtenir un virus modifié qui constitue un vec- teur d'expression non chargé, prêt à recevoir au moins une séquence d'au moins un gène étranger que l'on désire faire exprimer. 2) Procédé selon la Revendication 1, caracté- risé en ce que, pour la construction d'un baculovirus modifié qui constitue un vecteur d'expression non chargé prêt à recevoir un fragment d'ADN étranger que l'on désire faire exprimer, on met en oeuvre un baculovirus dépourvu de site de restriction pour au moins une enzyme donnée, sur lequel on installe au moins un site de restriction unique pour au moins l'enzyme considérée. 3') Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que le baculovirus origine dépourvu de site de restriction par une enzyme donnée, mis en oeuvre, est un baculovirus naturellement dépourvu dudit site de restric- tion tel, notamment, que le baculovirus de la polyédrose nucléaire de Spodoptera frugiverda (Sf). 4) Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que le baculovirus origine dépourvu de site de restriction pour une enzyme donnée, mis en oeuvre, est un baculovirus dont on a au préalable supprimé le ou les site(s) de restriction mal placé(s) sur son génome. ) Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce que, dans le cas o l'on veut supprimer un site de restriction mal placé, la suppression est réalisée par cotransfection de l'ADN du baculovirus origine considéré, avec un plasmide dans lequel a été cloné le fragment de l'ADN qui renferme ce site de restriction, qui a été coupé par une enzyme pour être linéarisé et auquel on a ligué. un linker, puis que l'on a transformé, après ligation, en un plasmide dépourvu du site de restriction à supprimer, la- dite cotransfection donnant lieu à un virus recombinant dé- pourvu de ce site. 6') Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 5, caractérisé en ce que l'introduction d'un site de restriction pour une enzyme donnée, en aval d'un' promoteur tardif fort du gène d'au moins l'une des pro- téines qui constituent des formations associées au baculo- virus, et notamment en aval du promoteur du gène de la polyédrine ou du polypeptide P10 de baculovirus, est réali- sée par cotransfection d'une culture cellulaire de cellules permissives au baculovirus, avec un plasmide approprié dans lequel a été cloné le fragment qui contient le site de restriction placé en aval du promoteur tardif fort, la- quelle cotransfection aboutit à la formation de virus re- combiné modifié, qui correspond au vecteur d'expression non chargé de séquence étrangère, prêt à recevoir une séquence étrangère en vue de son expression sur cellules d'insectes. 7) Procédé selon l'une quelconque des Revendi- cations 1 à 6, caractérisé en ce que, pour la construction d'un baculovirus modifié qui constitue un vecteur d'expression non chargé prêt à recevoir au moins deux frag- ments d'ADN étrangers que l'on désire faire exprimer, on installe sur un baculovirus convenablement choisi, au moins deux sites de restriction pour au moins deux enzymes iden- tiques ou différentes. 8') Procédé selon la Revendication 7, caracté- risé en ce que, dans le cas o le baculovirus origine est dépourvu de deux sites de restriction pour deux enzymes identiques ou différentes, ces deux sites de restriction sont successivement introduits par cotransfection avec un premier plasmide dans lequel a été cloné le fragment qui contient le premier site de restriction que l'on souhaite installer sur le baculovirus, puis avec un second plasmide dans lequel a été cloné le fragment qui contient le second site de restriction que l'on cherche à installer sur le ba- culovirus. 9-) Procédé selon la Revendication 7, caracté- - risé en ce que, dans le cas o le baculovirus origine com- porte des sites de restriction mal placés sur son génome, ces sites sont successivement supprimés par cotransfection, respectivement avec des plasmides dépourvus de chacun des sites de restriction à supprimer. ') Procédé selon l'une quelconque des Reven- dications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte un site de restriction unique installé à proximité du gène d'une protéine associée au baculovirus, ou installé à proximité d'un promoteur tardif fort de ce gène. 11') Procédé selon l'une quelconque des Reven- dications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte deux sites identiques ou différents installés respectivement à proximité du gène d'une protéine associée au bgculovirus et à proximité d'un promoteur tardif fort de ce gène. 12) Baculovirus modifié caractérisé en ce qu'il comporte un site de restriction unique installé en aval d'un promoteur tardif fort du gène d'au moins l'une des protéines associées au baculovirus, lequel baculovirus est apte à constituer un vecteur d'expression non chargé. 13') Baculovirus modifié, selon la revendica- tion 12, caractérisé en ce qu'il est constitué par un bacu- lovirus modifié comportant un site de restriction installé à proximité du codon ATG du gène d'au moins une protéine associée au baculovirus ou d'un promoteur tardif fort de ce gène. 14') Baculovirus modifié, caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux sites de restriction installés respectivement à proximité du codon ATG du gène d'au moins une protéine associée au baculovirus et -à proximité d'un promoteur tardif fort de ce virus. ') Vecteur d'expression de gènes, non chargé, caractérisé en ce qu'il est constitué par un baculovirus modifié selon l'une quelconque des Revendications 12 à 14. 16') Procédé de chargement d'un vecteur d'expression non chargé, en au moins une séquence étran- gère, caractérisé en ce qu'au moins une séquence étrangère est introduite directement in vitro dans ledit vecteur d'expression, par manipulation génétique. 17') Procédé de chargement- selon la revendica- tion 16, caractérisé en ce qu'au moins une séquence étran- gère est introduite directement dans le génome viral modi- fié qui constitue le vecteur d'expression initialement non chargé selon la Revendication 15. 18') Procédé de chargement selon la revendica- tion 17, caractérisé en ce que pour l'introduction directe d'au moins une séquence étrangère, le génome viral est préalablement linéarisé par action d'une enzyme de restric- tion. 19') Procédé de chargement selon l'une quel- conque des Revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'un fragment d'ADN étranger est introduit directement dans un premier site de restriction dudit vecteur d'expression non chargé, puis un second fragment d'ADN identique au premier ou différent de celui-ci, est introduit directement dans un second site de restriction dudit vecteur d'expression, les deux sites de restriction étant tous deux des sites de res- triction uniques pour des enzymes différentes. ') Procédé de chargement selon l'une quel- conque des Revendications 16 à 18, caractérisé en ce que des fragments d'ADN étrangers identiques ou différents sont chargés dans des sites de restriction uniques, c'est-à-dire définis comme étant deux sites de restriction différents pour une enzyme identique, par digestion partielle dudit vecteur d'expression non chargé, pour ouvrir un site, dans lequel est alors introduit un premier fragment d'ADN, ledit vecteur étant soumis à une seconde digestion partielle pour ouvrir un second site unique identique au précédent, dans lequel est chargé un second fragment d'ADN. 21') Virus chargé, caractérisé en ce qu'il est formé d'un baculovirus modifié constituant un vecteur d'expression initialement non chargé, dans lequel a été in- sérée directement, in vitro, au moins une séquence d'ADN étranger qu'on désire faire exprimer. 22 ) Processus d'expression de gènes étrangers, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un virus chargé selon la Revendication 21.-