Brevet FR2627507A1 — publié le 19890825

Procédé de diminution de la viscosité des milieux en cas d'excré- tion de polymères viscosifiants annexes dans les procédés de fermentation La présente invention concerne un procédé de diminution de la viscosité des milieux dans les procédés de fermentation, lorsque cette viscosité est due à la sécrétion de polymères visco- sifiants annexes, notamment de polysaccharides, par les micro- organismes en culture. On sait que certains microorganismes qui sécrètent, dans des conditions de culture convenables, des produits d'intérêt industriel: enzymes, protéines ou antibiotiques par exemple, sécrètent simultanément des produits annexes, tels que des poly- saccharides de grande masse moléculaire dont la présence augmente sensiblement la viscosité du milieu de fermentation; ce phénomène diminue les échanges entre les cellules et le milieu de culture, l'agitation devenant de moins en moins efficace au cours de la fermentation malgré une consomation accrue d'énergie; il gêne l'isolement du produit recherché que ce soit lors de la séparation de la biomasse par filtration, par centrifugation ou par microfil- tration tangentielle ou lors de la concentration du filtrat qui contient le produit recherché; l'élimination préalable du poly- saccharide du milieu en fin de fermentation par précipitation avec un nonsolvant du polysaccharide, tel qu'un alcool, ne peut, en effet, être pratiquée sans perte importante du produit cherché. Parmi ces fermentations, on peut citer par exemple celle du champignon de l'espèce Endothia parasitica pour la production d'une protéase coagulant le lait, comme décrit dans Le brevet FR 1 401 474 ou la fermentation de Streptomyces erythreus pour la production d'érythromycine, ou celle de Leuconostoc mesenteroides pour la production de dextrane-saccharase. Le procédé selon l'invention consiste à introduire dans les milieux lors de la fermentation une enzyme agissant sur le polymère viscosifiant annexe produit par le microorganisme. L'enzyme peut être introduite dès le début de la fermen- tation, au cours de la fermentation ou seulement lors du traitement final du milieu de fermentation, avant la filtration de la biomasse ou au cours de la concentration du filtrat par ultrafiltration ou microfiltration. L'enzyme mise en oeuvre est fonction du polysaccharide produit et/ou de l'étape du procédé o elle est introduite et elle sera choisie par le spécialiste après des essais préalables, ou en fonction de la structure du polysaccharide, si elle est connue. On peut aussi introduire dans le milieu différentes enzymes, simultanément ou séparément,.-à différentes étapes du procédé. Dans le procédé de production de protéase coagulante par fermentation d'Endothia parasitica, on peut utiliser des gluca- nases, telles que la bêta-1,3 glucanase de basidiomycètes décrite dans US 3 423 288, les bêta-1,3 bêta-1,6 glucanases, comme celle commercialisée par NOVO sous la marque Glucanex ou celle commer- cialisée par Gist-Brocades sous la dénomination Rapidase GL 150 ou encore des alpha-amylases fongiques, comme la Fungamyl commer- cialisée par NOVO, ou l'amylase P 200 commercialisée par Gist- Brocades. Dans le procédé de production de dextrane-saccharase,. on peut utiliser des dextranases. Dans le cas de la fermentation d'Endothia parasitica, on n'introduira en général l'enzyme dans le milieu de fermentation qu'après une durée de culture supérieure à 50 % de la durée totale et de préférence à 75 %; dans ces conditions, la viscosité du milieu n'atteint pas une valeur trop élevée et la production de protéase n'est pas diminuée ou peut même être améliorée; la visco- sité du moût en fin de culture est nettement inférieure à celle d'une culture sans enzyme, de 2 à 4 fois, sans diminution de la biomasse. Le filtrat, obtenu dans ce cas après séparation. des cellules, est moins visqueux et peut être concentré par ultra- filtration dans un dispositif classique jusqu'à une concentration supérieure à 30 g/l d'enzyme et même jusqu'à 40 g/l, alors qu'après une fermentation classique on n'atteint que 10 g/l environ; enfin, la filtration finale sur membrane de faible porosité est facilitée. Selon un autre aspect, le procédé selon l'invention consiste à traiter Les moûts de fermentation avant leur filtration, pendant 1 à 5 heures, avec 50 mg/L à 1 g/l d'une préparation enzy- matique active sur les polysaccharides; la viscosité du moût est diminuée de 2 à 5 fois; le temps de filtration pour séparer la biomasse du milieu contenant le produit recherché est aussi diminué. Selon un dernier aspect, le procédé selon l'invention consiste à traiter le filtrat obtenu après séparation des cellules, par une enzyme hydrolysant le polysaccharide annexe au cours de la concentration de ce filtrat par ultrafiltration, ce qui permet d'obtenir une solution présentant une forte concentration en produit recherché, lorsque celui-ci ne peut être isolé directement par précipitation ou évaporation du solvant sans dénaturation. Dans le cas de la protéase d'Endothia parasitica, on préfère alors utiliser une alpha-amylase. Dans ce qui suit, on décrit des exemples de mise en oeuvre de l'invention, pour la fermentation d'Endothia parasitica. Les inoculums sont préparés à partir de spores congelées d'Endothia parasitica, de la souche ATCC 14729, par culture à 28 C dans un milieu aqueux stérilisé contenant du glucose, de la farine de soja, des sels minéraux, et des extraits autolytiques de levures. La production est effectuée à 28 C dans un milieu aqueux stérile du même type que celui défini ci-dessus. Les viscosités sont mesurées au viscosimétre Brookfield; les activités coagulantes ont été déterminées par La méthode pré- conisée par la Fédération*Internationale de Laiterie et publiée dans le Journal Officiel de la République Française du 20 mars 1981. Exemple 1: Traitements enzymatiques en cours de fermentation Les essais ont été réalisés avec le Glucanex ou l'amylase P 200 introduits à différents moments de la fermentation, la durée totale de celle-ci étant voisine de 90 heures. L'amylase P 200 contient une alpha-amylase fongique d'Aspergillus oryzae et se présente sous forme d'une poudre, de titre FAU: 4540/g, un FAU 2627507- correspondant à une quantité d'enzyme hydrolysant 5,26 g d'amidon soluble en 1 heure, à 37 C et pH 4,7. Le Glucanex est une. poudre contenant une enzyme sécrétée par une souche de Trichoderma; elle présente 300 unités bêta- glucanase/gramme. Les quantités d'enzyme ajoutées, les temps d'addition ainsi que la viscosité du milieu de fermentation et l'activité coagulante du concentrat sont indiqués dans le tableau I. TABLEAU I Essai Enzyme Concentration Heures d'addi- Activité coaguLante de l'enzyme tion Viscosités du milieu (mPa.s) du concentrat Viscosité du concentrat N (mg/l) 40 h 47 h 64 h 72 h, 88 h g/l (mPa.s) 1 Glucanex 20 0 1000 1140 15 2...... 20 42 950 68b 28 3 Témoin 0 1900 2600 3750 3700 200 8,2 93 4 Glucanex 20 65 1900 2500 3050 1600 890 30 8 5.... 50 65 2250 2700 750 420 41 9 6 "" " 100 65 2250 2700 400 380 43 9 7 Témoin 0 1100 1700 - 1900 1000 8 ' Glucanex 10 45 et 68 950 1300 - 1100 650 9 Témoin 0 720 920 640 - 800 Glucanex 200 23 240 240 106 - 400 11 Amylase P200 20 45 et 65 1300 800 820 1000 850 12,.. 40 65 1300 1250 1250 900 13 Témoin 0 0 1500 1900 2200 2800 2100 14 GLucanex 42 72 1900 1800 1600 2700 900 ru __ __ __ __ __ __ _ __ __ __ __ __ _ __ __ __ __ __ _ __ __ __ __ _ - __ __ -__ _ __ - _ __ __ _ ___,2700__ _ __ __ _ 9 0 0 __ _ i 14 Glucnaex i' Les moûts des essais 13 et 14 ont été traités après heures de fermentation: filtration sur toile pour séparer le mycélium, puis concentration du filtrat par ultrafiltration avec une membrane perméable aux composés de masse moléculaire inférieure à 10000 environ. Les résultats obtenus figurent dans le tableau II. L'essai 13 a été effectué de façon classique sans addi- tion d'enzyme; dans l'essai 14, on a ajouté 40 mg de GLucanex par litre de moût après 72 heures de fermentation. TABLEAU II Essai Visco- Poids Durée Poids Visco- Activité Viscosité o n sité du filtra- mycé- sité du coagu- du con- Moût moût tion lium filtrat Lante du centrat (mPa.s) concen- trat 13 1600 158 kg 24 min 31 kg 5 10 g/l 120 mPa.s 14 900 142 kg 19 min 30,5 kg 4 38 g/L 120 mPa.s Exemple 2: Traitements enzymatiques du moût en fin de fermentation Les moûts ont été traités après 88 heures de culture; ils contenaient environ 7,5 g/kg de polysaccharide et avaient une viscosité de 1000 mPa.s. On a ajouté 200 mg/l de différentes prépa- rations enzymatiques en poudre ou 10 ml/l de préparations enzyma- tiques liquides. Les résultats obtenus pour différents temps de contact à température ambiante figurent dans le tableau III. TABLEAU III Viscosité du moût Préparation Fournisseur Activité (mPa.s) après enzymatique enzymatique 0,5h 1h 2h 5h Hémicellulase Pectinase+galac- Reg 2 Gist-Brocades tanase+galacto- 920 770 520 550 mannase Fungamyl Novo Alpha-amylase 690 550 550 450 Amylase P 200 Gist-Brocades Alpha-amylase 850 600 680 550 Glucanex Novo Bêta-1,3 bêta- 650 420 280 150 1,6 glucanase Rapidase Gist-Brocades Bêta-1,3 bêta- 850 600 520 480 GL 150 1, 6 glucanase Finizym Novo Bêta-1,3 bêta- 920 900 880 850 1,4 glucanase Exemple 3: Traitements enzymatiques du filtrat de fermentation, après séparation du mycélium. L'addition d'enzyme a été effectuée avant le début de l'ultrafiltration. Le Fungamyl est une préparation liquide, d'alpha-amylase fongique de titre 800 FAU/g; le Maxamyl et le BAIF, commercialisés par Gist-Brocades, sont des amylases bacté- riennes. Le tableau IV indique la chute de la viscosité au cours du temps d'un filtrat préconcentré, dans lequel ont été intro- duites différentes enzymes, en quantités variables. Le filtrat, préconcentré par ultrafiltration, ayant un pH de 4,3, avait une viscosité de 70 mPa.s; les quantités des prépa- rations enzymatiques sont exprimées en g pour 100 g de protéase dans le fiLtrat préconcentré. TABLEAU IV Préparation Quantité Viscosité (mPa.s) après enzymatique g/100 g 25 min 50 min 100 min 150 min 175 min Maxamyl 4,76 58 46 38 32 BAIF.3,8 46 32 26 24 Amylase P 200 4,76 5 5 5 5 5 - 0,95 7,5 5 5 5 5 0,095 22 18 16 15 14 Fungamyl 4,76 10 10 10 0,095 28 20 16 Glucanex 0,95 63 62 63 62 Dextranase 4,76 70 68 65 Novo Pectinase 4,76 70 68 65 SP 249 Novo Exemple 4: Traitements enzymatiques au cours de la concentration du filtrat L'ensemble du procédé a été effectué de façon classique: fermentation, séparation du ferment par filtration et concentration du filtrat par ultrafiltration. Cette dernière opération a-été arrêtée Lorsque le débit est devenu pratiquement nul. Le concentrat, de pH 3,9, contenait alors 9 g/l de protéase. On a introduit 40 mg d'amylase P 200 ou 40 mg de Fungamyl pour 10 kg de concentrat et repris l'ultrafiltration après avoir laissé les méLanges 2h15 à température ambiante. Après 45 minutes de concentration, on a obtenu un concen- trat dont la concentration en protéase était de 45 g/L dans le cas du traitement à l'amylase P 200 et de 42 g/l dans le cas du traitement au Fungamyl. REVENDICATIONS 1. Procédé de diminution de la viscosité des milieux dans les procédés de fermentation, caractérisé en ce que l'on introduit dans ces milieux une enzyme ou un mélange d'enzymes agissant sur le polymère viscosifiant annexe, produit par le microorganisme. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère viscosifiant annexe est un polysaccharide. 3. Procédé selon L'une des revendications 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'enzyme est introduite dans le milieu pendant la fermentation. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'enzyme est introduite dans le moût en fin de fermentation avant la séparation des microorganismes. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'enzyme est introduite dans le milieu, après séparation des microorganismes, avant sa concentration par ultra- filtration ou microfiltration. 6. Procédé selon l'une des revendications I ou 2, carac- térisé en ce que l'enzyme est introduite dans le milieu au cours de la concentration par ultrafiltration. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que le microorganisme est un champignon de l'espèce Endothia parasitica, producteur d'une protéase, coagulant le lait. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que l'enzyme est une bêta-1,3 glucanase, une bêta-1,3 bêta-1,6 glucanase ou une alpha-amylase. 9. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, carac- térisé en ce que le microorganisme est un champignon de l'espèce Endothia parasitica et l'enzyme est une bêta-1,3 bêta-1,6 glucanase. 10. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, carac- térisé en ce que le microorganisme appartient à l'espèce Endothia parasitica et l'enzyme est une alpha-amylase.