Brevet FR2631829A1 — publié le 19891201

La présente invention concerne des exopolysaccharides fongique ayant une activité immunostimulante chez les vertébrés qui peut tre utilisée notamment dans le traitement des tumeurs. On connait déjà des glucanes ayant une activité immunostimulante qui sont utilisés dans le traitement de cancers. Parmi ces glucanes on peut citer le schizophyllane qui est produit par Schizoohvllum commune (T. Matsuo et al, Drug Res. 32, 647, 1982). Ce produit est décrit comme étant un béta 1,6; béta 1,3 glucane ayant une masse moléculaire de 4,5 105 . Il a déjà été utilisé dans le traitement de différents types de cancer. On a maintenant trouve des exopolysaccharides qui présentent une activité supérieure à celle du Schîzophyllane. La présente invention a ainsi pour objet des exopolysaccharides fongiques ayant une activité immunostimulante, comprenant des chaines de type glucane de formule -D-Glcp 1 I 6 [ D-Glcp-(1e 3)-1X-D-Glcp-(1-+3) -D-Glcp-(17^3)~]n qui présentent-entre elles des pontages, et éventuellement des chaines de type mannane et ayant une masse moléculaire au moins égale à 5.105. Les exopolysaccharides selon 1 invention peuvent entre notamme-nt produits par des souches de Nomuraea rilevi qui est un champignon imparfait. pa thogéne de nombreux lepidoptéres défoliateurs, et notamment par des souches déposées ATCC 46372 et ATCC 52631. Toutefois plus généralement ils peuvent entre produits par des champignons pathogènes d'invertébrés capables d'excréter un polysaccharide stimulant les réactions de défense d'un invertébré. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d un exopolysaccharide selon 1 invention qui consiste à cultiver une souche productrice de l'exopolysaccharide, à séparer par filtration le milieu de culture et à séparer par précipitation ou ultrafiltration les exopolysaccharides du milieu de culture. Le milieu de culture utilisé avec Nomuraea rilevi peut etre constitué de glucose (3 à 6Z en poids) et d'extrait de levure (1 à 2X en poids). Mais on peut également utiliser d'autres sources de carbone telles que des sirops de mais et d'autres sources d'azote telles que des hydrolysats de protéine du type peptone. La séparation par précipitation peut etre réalisée notamment par de l'éthanol. La présente invention a en outre pour objet une composition thérapeutique comprenant les exopolysaccharides à titre de principe actif. Les compositions thérapeutiques selon l'invention peuvent etre administrées à l'homme ou aux animaux par voie topique ou parentérale, et notamment par voie intramusculaire. Elles peuvent etre sous la forme de prépara- tions solides, semi-solides ou liquides. Comme exemples, on peut citer les solutions ou suspensions injectables, les pommades, les collyres huileux ou aqueux, les col,lutoires, les solutions nasales et otologiques, ainsi que les formes retard. Dans ces compositions le principe actif est généralement mélangé avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables habituels bien connus de l'homme de l'art. Les compositions thérapeutiques administra bles par voie topique peuvent contenir notamment de 0,1 à 57 en poids du principe actif. Les compositions thérapeutiques administra bles par voie orale ou parentérale peuvent contenir notamment de 17 à 60Z en poids de principe actif. La quantité de principe actif administré dépend évidemment du patient qui est traité, de la voie d'administration et de la sévérité de la maladie. On décrira ci-aprés plus en détail l'obten tion des exopolysaccharides selon l'invention, leurs caractéristiques et leurs propriétés. 1) Culture de Nomuraea rilevi et séparation -des exopolysaccharides. On cultive une souche de Nomuraea rilevi (ATCC 46372) dans un milieu de culture comprenant 3Z de glucose et 17 d'extrait de levure dans des condi tions de fermentation submergée. A cet effet, on opère dans un fermenteur en culture discontinue dans les conditions suivantes : 600 tpm, 0,1-1,0 vvm (volume d'air/volume de milieu/minute), 25 C. Après 48 h de croissance, le milieu de cul ture et le mycélium sont séparés par filtration. Le filtrat de culture est précipité par éthanol (3-4 vo lumes d'éthanol/7 vol. filtrat). Après plusieurs la vages à l'alcool, le précipité est conservé à -20-C en présence d alcool. 2) Composition et caractéristiques des exo polysaccharides. Les exopolysaccharides sont exclusivement composés d 'hexoses (avec, en fonction des opérations, des doses variables mais toujours très faibles de protéines a) Composition des monosaccharides. La teneur en hexose a été mesurée sur des échantillons non hydrolysés en utilisant des méthodes au phénol et à l'anthrone. (JP Latgé et al, Can. J. Microbiol, 30, 1507, 1984) . La composition en monosaccharide a été déterminée après méthanolyse ( HCl 0,5M/méthanol pendant 24 heures à 80'C). Les méthylglycosides ont été identifiés sous forme de dérivés trifluoroacétylés par chromatographie en phase gazeuse et liquide selon la méthode décrite par Zanetta et al (J. Chromatog. 69, 291, 1972). b) Méthylation. L'acétolyse et l'oxydation périodique des échantillons d'exopolysaccharide ont été réalisées comme décrit par Dubourdieu et al. (Carbohydr. Res. 93, 294, 1981). Des échantillons d'exopolysaccharides intacts ou ayant subi une acétolyse ou une oxydation périodique ont été méthylés par la méthode décrite par Finne (Carbohydr. Res. 80, 336, 1980) puis méthano lysés avec un mélange méthanol/HCl n, 5M à 80 C pendant 24 heures. Les dérivés méthylés sont identifiés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spec trométrie de masse comme décrit par Fournet et al (Anal. Biochem. 116, 486, 1981) : colonne OV 101 30 m x 0,30 mm, 110 à 230-C 2' par minute: mode d'ionisa tion électronique avec un potentiel d'ionisation de 70 eV. c) Analyse enzymatique. Le glucane peut être dégradé par un extrait de Trichoderma (Novozym 1161). La digestion enzymatique du glucane nécessite la présence simultanée d exo et d'endo (133] glucanase. L'adjonction de (136) glucanase, accélère la dégradation (compositions enzymatiques préparées selon le protocole décrit par Du bourdieu. Thèse Université de Bordeaux, 1982). Les exopolysaccharides comprennent des chaines de type bêta (133)(136) glucane de formule Q-D-Glcp 1 6 6 C-P-D-tlcp-(l- 3)-p-D-G;cp-(1- 3)-#-D-Glcp-(1 il existe aussi des liaisons interchaines ainsi que le prouve l'identification de 4,6-diméthylglucopyranoside et de 4- et 6-monométhylglucopyranosides dans les produits de méthylation après méthanolyse. La présence de mannanes a aussi été détectée dans certaines préparations d 'exopolysaccharides. Les chaines principales contiennent des mannoses liés en Les branchements entre chaines sont au niveau des carbones 2 et 6 de résidus mannose. Le pourcentage de mannane varie suivant les souches et les opérations entre 0 et 75 7 des exopolysaccharides. La masse moléculaire des exopolysaccharides est > 2.106. Ainsi sur Superose 6, les exopolysaccharides sont élues à l'exclusion au même endroit que le dextrane de référence T2000 layant une masse moléculaire voisine de 2 x 106). En microscopie électronique à transmission (ombrage C-Pt à 5-7 après incubation des sucres en présence d'acétate d'uranyle) , les exopolysaccharides dans leur milieu de culture apparaissent comme un faisceau de plusieurs fibrilles (largeur totale comprise entre 2 et 4 nm, longueur impossible à mesurer) résultant de l'accouplement de fibrilles. Cet arrangement fibrillaire explose après ultrasonication des exopolysaccharides. Solubilité des exopolysaccharides A saturation, après filtration stérilisante sur filtre 0,45 um, la solubilité est de 600-700 ug/ml d'eau ou d eau physiologique (NaCl 0,97 > . 4. Activité biologique. Les exopolysaccharides ont des propriétés antitumorales dues à une stimulation globale du sys thème immunitaire. a) Activité antitumorale. Les exopolysaccharides à activité antitumorale ont été inoculés chaque jour à des souris avant inoculation de la tumeur à partir de J-11 jusqu à J-1 ou après inoculation de la tumeur de J+1 à J+11. - Sarcome 1B0/CD1 A J+30, pour des doses de 0,2 à 5 mg/kg d'exopolysaccharìdes de Nomuraea rilevi, la tumeur est totalement inhibée. Dans les animaux témoins, la tumeur pèse 4,2 g. L'inhibition totale de la tumeur nécessite des doses de schizophyllane de 1 à 5 mg/kg. A 0,2 mg/kg de schizophyllane, l'inhibition de la tumeur est voisine de 60 à 70%. - Fibrosarcome DBA2/McScl A J+38, le poids de la tumeur des animaux témoins est i,2 g, celui de ceux traités par le schizophyllane 5 mg/kg est de 2,9 g (toutes les souris ayant la tumeur). En revanche cinq animaux sur 10 traités avec 5 mg/kg de 1 exopolysaccharides de Nomurae rilevi ne présentent plus de tumeur (poids moyen de la tumeur sur tous les animaux traités : 0,9 g). b) Activité anti-microbienne les exopolysaçcharides de Nomuraea rilevi ont été inoculés à des souris Swiss à la dose de 1 mg/kg à J-7, J-3 et J-1 avant inoculation de AsDer cilles fumicatus et Candida albicans. A J+15, 9 souris/10 du lot témoin sont tuées par Aspergillus fumisatus alors que 3/10 seulement sont mortes dans le lot où les souris ont reçu l'exopolysaccharide de Nomuraea rilevi. A J+15, 8 souris/10 sont tuées par Candida dans le lot témoin alors que 1 souris/10 seulement est morte dans le lot ayant reçu les 3 injections de l exopolysaccharide de Nomuraea rilevi. REVENDICATIONS 1. Exopolysaccharides fongiques ayant une activité immunostimulante, comprenant des chaines de type glucane de formule 13- D-Glcp 6 C-P-D-Glcp-(1- 3)-B-D-Glcp-(l- 3)-P-D-Glcp-(1- 3)-2 n qui présentent entre elles des pontages, et éventuellement des chaines de type mannane et ayant une masse moléculaire au moins égale à 2. Exopolysaccharides selon la revendication 1, qui sont produits par Nomuraea rilevi 3. Procédé d'obtention d'un exopolysaccharide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche productrice de l'exopolysaccharide, à séparer par filtration le milieu de culture et à séparer par précipitation ou ultrafiltration les exopolysaccharides du milieu de culture. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on effectue une culture de Nomuraea rilevi dans un milieu de culture comprenant de 3 à 6Z en poids de glucose et 1 à 27 en portion d'extrait de levure. 5. Procédé selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérise en ce qu'on sépare les exopolysaccharides du milieu de culture par précipitation par l'éthanol. 6. Composition thérapeutique comprenant à titre de principe actif un exopoly sa ccha ride selon la revendication 1 ou la revendication 2.