Brevet FR2631239A1 — publié le 19891117

I ANTICORPS MONOCLONAL HUMAIN ET HYBRIDOME LE PRODUISANT La présente invention concerne un anticorps monoclonal humain dirigé contre Pseudomonas aeruginosa (désigné ci-après par '"P aeruginosa"), ainsi que sa préparation et son utilisation. En particulier, elle concerne un anticorps monoclonal humain qui peut reconnaitre un oligosaccharide d'une fraction de "core"externe du lipopolysaccharide de P aeruginosa, qui est commune à, différentes souches de P. aeruginosa de différents sérotypes, et qui présente une propriété de liaison à P. aeruginosa de deux ou plusieurs sérotypes, et son utilisation. Elle concerne également un hybridome capable de produire ledit anticorps, et un procédé pour la production de l'anticorps. L'anticorps monoclonal humain selon l'invention est utilisable pour la prévention et le traitement de maladies infectieuses provoquées par P. aeruginosa Les types de bactéries provoquant des maladies infectieuses, c'est-a-dire les bactéries pro-inflammatoires, se sont modifiés avec le développement et les modifications des antibiotiques à usage clinique. Il en résulte que les maladies infectieuses provoquées par la bactérie, qui n'était antérieurement que faiblement pathogène ou virulente, ont augmenté. Ainsi, P. aeruginosa est couramment une des bactéries pathogènes majeures provoquant des maladies infectieuses, dont les symptômes sévères entrainent souvent la mort des malades, en particulier lorsque leur immunité est déficiente en raison de l'administration continue d'immunosuppresseurs, ces patients étant par exemple atteints dun cancer ou de brûlures. 263123 9 Parmi diverses methodes preventives ou therapeutiques des infections bactériennes, la plus couramment utilisée est la chimiothérapie, utilisant des antibiotiques ou des agents antimicrobiens. En fait, divers antibiotiques ont été développés, comprenant la streptomycine, la kanamycine, la pénicilline, la céphalosporine, etc., auxquels sont sensibles pratiquement toutes les bactéries Gram-positives ( par exemple les staphylocoques) et Gram-négatives (par exemple E. coli) et dont l'effet clinique est remarquable. Toutefois, on ne connait que peu de produits pharmaceutiques actifs vis-à-vis de P. aeruginosa. De plus, l'action de ces produits sur P. aeruginosa n'est que bactériostatique et non bactéricide. Ainsi, ils peuvent empêcher la croissance de P. aeruginosa - mais ne présentent pas d'action thérapeutique remarquable au point de vue clinique. L'autre méthode préventive ou thérapeutique est le traitement par les anticorps, comprenant l'administration d'immunoglobuline. Cette méthode est souvent mise en oeuvre en association avec la chimiothérapie et attire actuellement l'attention comme un substitut à la chimiothérapie. Un sérum à teneur élevée en anticorps peut être obtenu par immunisation active d'animaux tels que le cheval ou le lapin, et un traitement par les anticorps peut être effectue par administration d'un tel sérum. En fait, son action thérapeutique remarquable a été prouvée à l'aide d'infections expérimentales sur différents animaux. Pour la toxine diphtérique et la toxine de vipère, l'expérience a montré que le traitement par les anticorps utilisant des sérums d'origine animale est tout à fait efficace même chez l'homme. Toutefois, l'introduction d'une protéine hétérologue, obtenue à partir d'un animal, dans l'organisme humain provoque de sérieux effets secondaires tels l'anaphylaxie ou une autre réaction allergique. Il est donc fortement souhaitable de disposer d'une immunoglobuline humaine ayant une teneur élevée en anticorps dirigés contre les bactéries et présentant une action remarquable sur les infections bactériennes. Les préparations d'immunoglobulines humaines conventionnelles sont fabriquées par recueil de sang de sujets sains ou de patients atteints d'une infection bactérienne, fractionnement du sang pour obtenir une fraction d'immunoglobuline, purification de la fraction d'immunoglobuline et élimination des substances agglutinées par addition d'éthylène-glycol, traitement avec une protease, sulfonation, chromatographie sur colonne DEAE, etc., suivi de la formulation du produit résultant en préparations injectables par voie intramusculaire ou intraveineuse. Ces préparations sont avantageuses en ce qu'elles ne provoquent pas d'anaphylaxie ni autre effet secondaire tel qu'observé lors de l'administration d'immunoglobuline d'origine animale, mais présentent d'autres inconvénients. Un de ces inconvénients est que leur teneur en anticorps dirigés contre la bactérie est faible, de sorte qu'une action thérapeutique suffisante ne sera pas forcément obtenue. Un autre inconvénient est que leur obtention en grande quantité, et en qualité constante, avec une teneur élevée en anticorps, est difficile parce qu'ils sont fabriqués parutilisation de sang recueilli chez des sujets sains ou des patients porteurs d'une infection bactérienne, de sorte que la production continue de serum ayant une teneur élevée en.anticorps est assez difficile. Un autre inconvénient est qu'ils peuvent être contaminés par un virus de l'hépatite (par exemple le virus HB), un virus de la leucémie des lymphocytes T de l'adulte (ATLV, HTLV), etc., car le sang utilisé comme produit de départ est obtenu à partir d'un grand nombre de sujets inconnus. Afin de surmonter ces inconvénients, il serait fortement souhaitable de produire un anticorps monoclonal humain, qui serait utilisable au point de vue prophylactique et thérapeutique contre les infections bactériennes et pourrait remplacer les préparations d'immunoglobulines humaines conventionnelles et d'anticorps monoclonaux de souris. Lorsqu'un anticorps se fixe a la surface d'une cellule bactérienne, la phagocytose de la cellule bactérienne par un macrophage est accélérée (accélération de la phagocytose due a l'opsonisation), ou bien la cellule bactérienne est lysée par le complément. Comme antigène cible à la surface de la cellule bactérienne de P. aeruginosa on connait des lipopolysaccharides (LPS), des protéines de la membrane externe, les flagelles, le pili, etc. Sawada et al. ont montre qu'une assez grande quantité d'anticorps monoclonaux de souris, reconnaissant la protéine de la membrane externe, est nécessaire pour combattre des bactéries, en comparaison avec un anticorps monoclonal de souris qui reconnait le LPS (J. Infect. Dis., 150 570-576 (1984)). Le LPS est constitué de polysaccharides 0 qui représentent l'antigene 0 d'un oligosaccharide de "core" externe qui est commun à diverses espèces dans une certaine mesure, d'un oligosaccharide de "core" interne qui est généralement commun à toutes les entérobactéries, et de lipide A L'antigene polysaccharidique 0 présent dans "core" la plus externe de la cellule bactérienne, est constitué de motifs répétitifs formés de 2 à 5 résidus de sucre, et sa structure varie dans une grande mesure. Les structures de presque tous les antigènes 0 des souches 263 1239 standards de sérotype de P. aeruRinosa ont déjà été déterminées (Acta Microbiol.Hung., 35,3-24,1988). Du fait que la détermination de la structure de l'antigène O par analyse chimique nécessite beaucoup de temps et de travail, on utilise des antisérums ou des anticorps monoclonaux de souris anti-antigene O des souches standards pour la classification des souches de P. aeruginosa. En d'autres termes, une souche connue de P. aeruginosa est classée en fonction de sa réactivité immunologique avec les anticorps ou les antisérums connus. Cette classification est connue sous le nom de sérotype, et des exemples typiques de sérotypes sont les suivants: types 1 à 17 selon la classification de Homma et ai. (Japan. J. Exp. Med. 44, 1 (1974)); types 1 à 7 selon la classification de Fisher et al. (J. Bacteriol., 9 835 (1969)); types de A à M selon la classification du Serotyping Committee for the Japan Pseudomonas aeruginosa Society (désigné ci-après "Comité Japonais") (Japan. J. Exp. Med., 5, 329 (1976)); types I à 17 selon la classification de l'International Antigenic Typing System (IATS) (Int. J. Syst-Bacteriol.,3, 256-264, 1983) etc. Ces classifications et les relations entre elles sont représentées dans le Tableau 1 (Japan. J. Exp. Med., 46 329 (1976). Tableau I Classification sérotypique de P. aeruginosa Comité Hommna et al IATS Fisher et al Japonais 1974 1983 1969 1 9 7 6 A 1 3 - B 2, 7, 13, 16 2, 5, 16 3, 7 C 3 8 6 D 4 9 - E 5 11 2 F 6 4 - G 8 6 1 HI 9 10 5 I 10 1 4 J 11 15 - K 12 13 - L 14 - - M 15, 17 - - -- 7, 12, 14, 17 - On sait que l'anticorps spécifique d'un antigène O donné présente une puissante action préventive ou thérapeutique sur les infections provoquées par P. aeruRinosa du sérotype auquel appartient ledit antigène 0, mais ne présente aucune activité vis-à-vis de P. aeruRinosa d'aucun autre sérotype. L'utilisation d'un mélange contenant 13 ou 17 anticorps monoclonaux qui sont respectivement sensibles.à des souches de P. aeruginosa de 13 ou 17 serotypes serait efficace dans le traitement d'infections provoquées par n'importe quelle souche. Toutefois, la préparation de ces mélanges est extrêmement complexe et leur utilisation clinique est difficile à mettre en oeuvre. Diverses études effectuées sur des animaux infectés à titre expérimental et des études cliniques ont été menées jusqu'à présent et ont révélé que divers antisérums et anticorps monoclonaux spécifiques du glycolipide de paroi des bactéries Gram-négatives sont efficaces dans la prévention d'infections Gram- négatives, en particulierdu chocendotoxinique (wO 8404 4 5 8; W;o, 8 501659; EP-A-0174204; JA-A-61-130300; Mutharia et al.: Inf.Immun., 45, 631 - 636 (1984); Teng et al: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 1790 - 1794 (1985); Gigliotti & Shenep: J.Inf.Dis., 151, 1005 - 1011 (1985); Braude et al: J.Inf.Dis., 136 (Suppl), S167 - 173 (1977); Nellesand Niswander: Inf.Immun., 46, 677 - 681 (1984); Pollack et al: J. Clin. Invest., 72, 1874 - 1881 (1983); Young et al: Clin. Res., 30, 522A (1982); Young et al: Clin. Res., 32, 518A (1984)). Les antisérums ou anticorps monoclonaux mentionnés ci-dessus, qui sont préparés à partir de l'antigène de glycolipide de "core". se fixent sur diverses bactéries Gram-négatives. Cela montre apparamment que l'épitope associé est présent dans une fraction de "core" interne comprenant l'heptose, le KDO, etc., ou dans le lipide A. Savada et al. ont obtenu un anticorps monoclonal reconnaissant un antigène de "core" de P. aeruginosa (Annual reports of the Zlst Meeting of the Japan Pseudomonas aeruginosa Society 16, 1987). Toutefois, les expériences sur des animaux ont revélé que l'anticorps monoclonal n'est pas efficace pour protéger de l'infection les animaux soumis à l'infection expérimentale. et que l'anticorps 263123 9 monoclonal dirigé contre la fraction de "core" interne ou de lipide A n'est que faiblement efficace pour la protection des animaux contre ladite infection. Comme mentionné plus haut, un anticorps monoclonal dirigé contre une protéine de la membrane externe, aussi bien que les anticorps conventionnels dirigés contre le LPS de "core", n'ont pas d'efficacité thérapeutique, bien que leurs spectres de liaison soient très larges dans P. aeruginosa. D'autre part, un anticorps monoclonal anti-antigène O ne peut être utilisé que de manière extrêmement limitée, car il n'est efficace que contre P. aeruRinosa d'un certain sérotype. En conséquence, le développement de préparations d'immunoglobuline, qui ont des spectres de liaison plus larges et qui présentent une activité préventive et thérapeutique importante contre les infections à P. aeruginosa, est fortement souhaité. Une solution à ce problème consiste à trouver un antigène commun a toutes les souches de P. aeruginosa et à développer un anticorps monoclonal humain qui reconnait l'antigène commun et présente des spectres de laison larges, et qui est efficace au point de vue prophylactique et thérapeutique contre les infections provoquées par P. aeruginosa de divers sérotypes. Une étude approfondie a été effectuée pour mettre au point un procédé de production industriel d'un anticorps monoclonal humain efficace pour la prévention et le traitement de maladies infectieuses à P aeruginosa. et aussi de préparations d'immunoglobulines humaines à titre élevé contenant l'anticorps monoclonal. Les inventeurs de la présente invention ont porté une attention particulière à une fraction oligosaccharide de "core" externe dans le LPS qui est commune aux P. aeruinosa et ils ont tenté d'établir une lignée cellulaire produisant un anticorps humain reconnaissant ladite fraction d'oligosaccharide, par utilisation de lymphocytes B. Comme résultat de l'étude, il a été obtenu un anticorps monoclonal humain qui reconnait de manière spécifique l'oligosaccharide de "core" externe ayant une structure chimique spécifique et qui est efficace pour la prévention et le traitement des maladies infectieuses à P. aeruginosa de divers sérotypes, L'anticorps monoclonal selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il se fixe sur des souches de P. aeruginosa appartenant aux sérotypes A, Fi-G, HN K et M, et diffère des anticorps monoclonaux connus, spécifiques de serotypes qui reconnaissent le polysaccharide de l'antigène O et ne peuvent se fixer que sur la souche spécifique de P. aeruginosa de sérotype correspondant. De plus, l'anticorps monoclonal selon l'invention se fixe egalement sur la souche E. coli de sérotype 026 dont il reconnait le LPS. Plus particulièrement, le déterminant antigénique ou épitope de l'anticorps monoclonal selon l'invention est localisé près du résidu de rhamnose ou de galactosamine dans la fraction LPS de "core" externe du LPS de P. aeruginosa L'anticorps monoclonal selon l'invention est également caractérisé en ce qu'il présente une activité prophylactique et thérapeutique chez une souris soumise à une infection expérimentale. Des anticorps monoclonaux connus dirigés contre le "core" de LPS se fixent sur diverses bactéries Gram-négatives, ce qui laisse supposer que leurs épitopes sont localisés dans la fraction de "core" interne ou de lipide A du LPS. Les activités prophylactiques des anticorps connus sont relativement faibles sur des animaux soumis à une infection expérimentale.. Comme le montre ce qui précède, l'anticorps monoclonal selon la présente invention est nettement différent des anticorps anti-glycolipidiques de "core" mentionnés ci-dessus, en ce que le premier réagit avec la fraction de "core" externe qui se trouve généralement dans les souches de P. aeruginosa, et présente une action prophylactique et thérapeutique remarquable chez les animaux soumis à une infection expérimentale.. L'anticorps monoclonal humain préparé par Savada et ai (cité plus haut), qui reconnait un antigène de "core" de P. aeruginosa. se lie à 75% des P. aeruginosa de sérotype A, 100% de B, 0% de E, 100% de H. et 60% de I, et ses spectres de liaison différent de ceux de l'anticorps monoclonal selon la présente invention. Ainsi, l'anticorps de Savada et al reconnait apparamment un épitope différent de celui reconnu par l'anticorps selon l'invention. D'autre part, l'anticorps de Savada et al ne présente pas d'activité prophylactique chez les animaux soumis à une infection expérimentale.. En conséquence, l'anticorps monoclonal selon la présente invention, qui reconnait la fraction de "core" externe de LPS de P. aeruginosa. est différent de l'anticorps monoclonal humain anti-"core" de Sawada et al. En conséquence, le principal objet de la présente invention est un anticorps monoclonal humain qui peut reconnaitre un oligosaccharide de la fraction de "core" externe du LPSde P. aeruginosa et se fixe sur les souches de P. aeruginosa de divers sérotypes avec une fréquence élevée, et qui est efficace dans la prévention et le traitement de maladies infectieuses provoquées par P aeru2inosa. Un autre objet de la présente invention est une lignée cellulaire 263 1239 humaine qui est capable de produire ledit anticorps monoclonal en continu. Encore un autre objet de la présente invention est de fournir des préparations d'immunoglobuline et en particulier, des préparations d'immunoglobuline à titre élevé utilisables comme agent prophylactique ou thérapeutique pour la prévention ou le traitement de maladies infectieuses à P. aeruginosa, qui comprennent au moins un anticorps monoclonal selon la présente invention. Encore un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé de production dudit anticorps monoclonal et de ladite lignée cellulaire humaine, Ces objets et d'autres apparaitront clairement aux spécialistes à la lecture de la présente description. L'anticorps monoclonal selon l'invention, qui reconnait l'oligosaccharide de la fraction de "core" externe du LPS de P. aeruginosa, désigne un anticorps monoclonal humain produit par un clone producteur d'anticorps unique, lequel anticorps est capable de se fixer sur des souches de P. aeruginosa de divers sérotypes, en particulier les sérotypes A, G, F, H, K et M, avec une fréquence élevée. L'anticorps monioclonal selon l'invention peut être préparé par exemple par les procédés suivants. Des lymphocytes B humains, sensibilisés par (1) P. aeruginosa ( bactéries vivantes ou bactéries tuées.par le formol ou la chaleur), ou (2) mutant R de P.- aeruginosa qui ne possède pas de polysaccharide antigénique 0, ou (3) de préférence, LPS dérivé du mutant R, sont soumis à une fusion cellulaire avec une cellule de myélome ou une cellule de lymphoblastoïde B, et l'hybridome obtenu est cultivé in vitro, ce qui permet d'établir une lignée cellulaire de production en continu de l'anticorps souhaité. La lignée cellulaire établie est cultivée in vitro, et l'anticorps sécrété dans le milieu de culture est extrait et purifié pour obtenir l'anticorps souhaité en grandes quantités. Le sérotype utililisé ici est, conforme à la classification selon le Comité Japonais, qui est déterminée selon la différence de réaction immunologique en utilisant des antisérums ou des anticorps monoclonaux de souris, réagissant chacun spécifiquement avec une souche standard de P. aeruginosa d'un sérotype donné. Le LPS est un lipopolysaccharide qui est un constituant majeur de la "core" cellulaire externe des bactéries Gramnégatives Le LPS est constitué de (1) un glycolipide appelé lipide A, (2) un oligosaccharide de "core" interne, comprenant l'acide 2-céto-3désoxyoctonique, l'heptose, l'éthanolamine, un phosphate, etc.. comme constituants, (3) un oligosaccharide de "core" externe dont les constituants diffèrent selon les espèces et qui comprend, en ce qui concerne P. aeruinosa. le glucose, le rhamnose, la galactosamine, l'alanine, etc., comme constituants, et (4) un polysaccharide appelle antigène O qui détermine le sérotype, ledit lipide A étant lié audites fractions de "core" interne et externe et ledit antigène O étant lié à ladite fraction de "core" externe. L'oligosaccharide de "core" externe du LPS, qui constitue un antigène commun à de nombreuses souches de P. aeruginosal est localisé à l'endroit auquel est fixé le polysaccharide 0. Ainsi, l'oligosaccharide de "core" externe semble localisé à proximité du polysaccharide O qui est placé sur la couche la plus externe de la surface de la cellule bactérienne. On sait que la structure chimique et la composition de l'oligosaccharide de "core" externe varie en fonction des souches (Wilkinson, Rev. Infect. Dis. 5, S941- S949 (1983)). Toutefois, les constituants de l'oligosaccharide sont communs à de nombreuses souches de P. aeruginosa et comprennent le glucose, le rhamnose, la galactosamine, l'alanine, etc., comme constituants principaux. Le terme "anticorps monoclonal" utilisé ici désigne un anticorps qui présente une structure moléculaire uniforme et qui est produit par un clone producteur d'anticorps unique, qui est obtenu à son tour par fusion cellulaire (Nature, 256, 495, (1975) ou par transformation avec le virus EB (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70 190 (1973)).- La production d'anticorps monoclonaux humains selon l'invention comprend les étapes suivantes: (1) préparation de lymphocytes B humains sensibilises par l'antigène; (2) établissement d'une lignée cellulaire qui produit un anticorps monoclonal spécifique par immortalisation de cellules préparées en (1); (3) culture des lignées cellulaires établies en (2); (4) purification de l'anticorps monoclonal spécifique à partir de la culture obtenue en (3); et (5): production de la préparation d'immunoglobine à titre élevé comprenant un anticorps monoclonal spécifique purifié selon (4). En particulier, le procédé peut consister à préparer un hybridome par fusion cellulaire de lymphocytes B humains capables de produire l'anticorps (c'est-à-dire sensibilisés par l'antigène correspondant) avec des cellules d'héteromyelome provenant par exemple de cellules humaines et murines (hétéromyelome homme-souris). à cultiver ledit 263 1239 hybridome et à recueillir l'anticorps produit à partir du surnageant de culture. Chacune de ces étapes sera décrite en détail ci-après. Etape (1): Comme lymphocytes B humains, on peut utiliser des cellules lymphocytaires humaines produisant un anticorps dirigé contre l'oligosaccharide de "core" externe du LPS de P. aeruginosa, qui peut être séparé du sang périphérique par centrifugation, à l'aide d'un liquide de séparation des lymphocytes tel que LymphoprepO ou Mono-Poly Resolving MediumO (Flow Lab.) . On peut également utiliser des lymphocytes provenant de tissus ou d'organes (par exemple les ganglions lymphatiques, la rate) extraits à des fins de diagnostic ou de traitement d'affections, le sang du cordon ombilical ou autre. Il est souhaitable d'obtenir des cellules de sujets qui ont été contaminés par P. aeruginosa dans le passé, et dont les cellules sont sensibilisées par l'infection. Les sujets appropries - dont les cellules peuvent être prélevées, peuvent être sélectionnés par mesure préalable du titre de leur sérum en anticorps obtenu contre des cellules de P. aeruinosa traitées au formol ou du LPS provenant de P. aeruginosa. Des lymphocytes B humains peuvent aussi être obtenus, de tout sujet, indépendamment de son passé médical. Ces lymphocytes sont mélangés avec P aeruginosa traité par le formol, ou de préférence avec le LPS provenant de P. aeruginosa avant l'utilisation pour la fusion cellulaire. Notamment, P. aeruginosa tué par traitement au formol ou de préférence le LPS provenant de P. aeruginosa est ajouté aux lymphocytes B en qualité d'antigène. De plus, des solutions contenant des lymphokines telles que les facteurs de prolifération des cellules B et les facteurs de différenciation des cellules B (par exemple les lectines végétales telles que le phytolaque mitogène (PWM), les composants bactériens tels que Covan I, une culture mixte lymphocytaire humaine, une culture de cellules de rate, de thymus ou de sang du cordon ombilical) peuvent être ajoutés aux lymphocytes B humains pour une sensibilisation in vitro, suivi de la prolifération et de la différenciation pour donner des cellules productrices d'anticorps. Les lymphocytes B humains ainsi obtenus présentent une molécule d'anticorps à la surface, peuvent libérer une faible quantité d'anticorps pendant une certaine période limitée, mais ne sont pas immortels. Etape (2) Pour transformer les lymphocytes B humains sensibilisés cidessus en lignées cellulaires immortelles à prolifération continue, les lymphocytes humains Il sensibilisés et les cellules de myélome sont soumis à une fusion cellulaire en présence de polyéthylene-glycol. Les cellules de myélome utilisées sont des mutants déficients en hypoxanthine- guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT) ( par exemple P3X63-Ag 8 (P3), P3X63-Ag 8.653) provenant de cellules de myélome de souris, des mutants déficients en HGPRT provenant de cellules de myélome humain U-266, des mutants déficients en HGPRT provenant de cellules d'hétéromyélome souris- homme, qui sont obtenus par fusion cellulaire entre une cellule de myélome murin et une cellule de myélome humain, ou des cellules de myélome murin telle que SHM D-33 et des cellules de lymphocytes B humain. Des mutants déficiants en HGPRT provenant de cellules de lymphoblastoïdes B humain peuvent être utilisés à la place de la cellule de myélome. Comme polyéthylène-glycol (PEG), on peut utiliser par exemple un PEG 1000 à 6000, en une concentration de 30 à 50% (poids/volume). Le rendement de la fusion peut être élevée par incorporation de iectine, de poly-L-lysine. de diméthylsulfoxyde, etc. La fusion peut être effectuée par exemple de la même manière que celle décrite dans l'article de Kohler et al (Nature, 256, 495 (1975)), selon lesquels des cellules de souris sont fusionnées entre elles de manière à obtenir un hybridome produisant un anticorps monoclonal murin. Par exemple, les lymphocytes humains sensibilisés et les cellules de myélome déficientes en HGPRT ou les cellules d'hétéromyélome homme-souris sont mélangées en une proportion de 3- 1:1, puis 45% (pds/v) de PEG 1500-6000 sont ajoutés par fractions en 0,5 à 1 minute, et le mélange résultant est laissé au repos pendant 0,5 à 3 minutes. Au mélange obtenu, 10 à 50 ml d'un milieu de culture ne contenant pas de sérum sont ajoutés en 5 à 10 minutes, ensuite, 2 ml de FCS sont ajoutés, et le mélange est incubé à 37'C pendant 10-60 minutes. Après centrifugation, un milieu de culture frais est encore introduit dans le mélange de manière à amener la concentration cellulaire à 105- 106/ml. La suspension cellulaire ainsi obtenue est inoculée sur une microplaque à 96 puits à un taux de 2x104 à 2x105 cellules par puits. Le, lendemain, la moitié du milieu est remplacée par un milieu contenant hypoxanthine- aminopterine-thymidine (milieu HAT) ou par un milieu contenant hypoxanthine- azasérine (milieu HAz). et la culture est conduite à 32-37 C sous 5% de C02. Pendant environ 10 à 20 jours. le milieu de culture est remplacé par un milieu HAT ou HAz, et ensuite, par un milieu hypoxanthine-thymidine (milieu HT) ou un milieu hypoxanthine (milieu H) pendant environ 3 à 5 jours Le remplacement est effectué sur la moitié, à des intervalles de 3 jours pendant 2 ou 3 semaines, de manière à obtenir une colonie proliférative, c'est-à-dire des hybridomes. Il est également possible de sélectionner un hybridome par l'utilisation combinée d'inhibiteurs du métabolisme sans utilisation de mutant déficient en HGPRT. Les teneurs du milieu de culture en anticorps dirigés contre dix sept souches de P. aeruginosa tuées par traitement au formol, ou contre leur LPS, lesdites souches constituant un éventail de dix sept sérotypes, sont mesurées par ELISA ou par dosage radioimmunologique, et la cellule souhaitée qui produit l'anticorps spécifique de la fraction de "core" externe du LPS de P. aeruginosa est sélectionnée à l'aide de la méthode de Western blotting. Le clonage est répété 2 à 3 fois par la méthode des dilutions limitantes ou par la méthode à l'agarose, de manière à obtenir une lignée cellulaire stable ayant un taux de prolifération élevé et une productivité d'anticorps spécifique élevée. Les lignées cellulaires établies à partir de lymphocytes B humains sensibilisés selon la méthode de fusion cellulaire (hybridome), peuvent proliférer en continu et produire de manière stable l'anticorpsspécifique, en une grande quantite. Bien entendu, l'invention s'étend à toute lignée cellulaire dérivant de l'hybridome ainsi obtenu. Etape (3): Les hybridomes ainsi obtenus (0,5 - 5 x 105 cellules/ml) sont cultivés dans une culture sédimentée ou une culture centrifugée, à l'aide d'un milieu de culture habituel pour des cellules animales dans un récipient tel qu'un flacon ou sur une plaque pour culture cellulaire, au moyen d'un incubateur à C02 à 32-37'C sous 2 à 10% de C02. En particulier, lorsque la culture est effectuée sur une grande échelle, on peut utiliser un récipient à fermentation, un système à fibres creuses ou autre, conçu pour des cellules animales. Le milieu de culture habituel peut être par exemple un milieu (par exemple RPMl 1640, Eagle's MIEM) contenant 2 à 20% de sérum de feotus bovin, de veau. de vache, de cheval, humain ou autre, un milieu exempt de sérum contenant des suppléments nécessaires pour la croissance cellulaire (par exemple. insuline, transferrine, éthanolamine, sélénite, albumine bovine, lipide) ou similaire. La culture de l'hybridome peut également être conduite, au lieu de la culture in vitro mentionnée ci-dessus, par inoculation intrapéritonéale et culture de l'hybridome chez les animaux tels que la souris nue. Lorsqu'on utilise une souris ou une souris nue, on inocule 0,5 à 2,5x107 cellules par souris. Avant l'inoculation, il est préférable d'introduire le pristane ou de l'anticorps anti-asialo GMI. L'irradiation avec des rayonsX ou l'extraction de la rate peut être également utile pour une inoculation réussie. Etape (4): La purification de l'anticorps peut être conduite par des procédés biochimiques conventionnels (par exemple précipitation par sulfate d'ammonium, précipitation à l'éthanol, fractionnement au PEG, chromatographie par échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie d'affinité, chromatographie en phase liquide à haute performance, électrophorèse). Dans le procédé de purification, il faut veiller à éviter l'agglutination ou la dépression de l'activité de l'anticorps. A cet effet, la sérum-albumine humaine (HSA) peut être ajoutée en une proportion de 0,05 à 2%. L'addition d'acides aminés tels la glycine ou l'alanine, en particulier d'acides aminés basiques tels que la lysine, l'arginine 1 5 ou l'histidine, d'hydrates de carbone tels que le glucose ou le mannitol, de sels tels que le chlorure de sodium, etc., peut être parfois préférable. Des agglutinations tendent à se produire en particulier dans le cas d'anticorps IgM, et le traitement avec la p- propionolactone, l'anhydride acétique ou similaire est efficace pour empêcher une telle agglutination. Dans ce cas, l'administration intraveineuse des anticorps obtenus est rendue possible. Etape (5): L'anticorps monoclonal purifié peut être formulé en une préparation biologique par un procédé classique eh soi, comprenant par exemple la filtration sur une membrane pour éliminer les bactéries, l'introduction dans des flacons stériles avec des stabilisants et la lyophilisation. La préparation d'anticorps monoclonal humain selon l'invention peut comprendre un seul type d'anticorps monoclonal humain dirigé contre la fraction de "core" externe du LPS de P aerug.noa pour l'utilisation comme agent de prévention ou de traitement des infections àt P. aeruiinosa. De préférence, la préparation comprend en outre au moins un type d'anticorps monoclonal humain qui. peut reconnaitre un épitope différent ayant une structure chimique différente présent dans l'oligosaccharide de "core" externe du LPS de P. aeruginosa. La préparation peut également contenir un anticorps monoclonal humain qui peut reconnaitre tout autre antigène de surface de P. aeruginosa tel que l'antigène 0, des protéines de la membrane externe, les flagelles et les pili; des facteurs pathogènes de P. aeruginosa tels que les exotoxines, ou des exoenzymes tels que l'élastase et les protéases. La préparation selon l'invention peut être utilisée après combinaison avec toute préparation conventionnelle d'immunoglobuline humaine. La préparation peut être également utilisée après combinaison avec tout anticorps monoclonal humain dirigé contre des bactéries autres que P. aeruRinosa. contre des virus, champignons, protozoaires, cellules cancéreuses, et toute préparation conventionnelle d'immunoglobuline humaine. D'autre part, l'anticorps monoclonal humain selon l'invention peut être incorporé dans une préparation conventionnelle d'immunoglobuline humaine pour obtenir une préparation à titre élevé en immunoglobuline contre P. aeruginosa L'anticorps monoclonal humain selon la présente invention se fixe à la surface des cellules de P. aeruainosa. en particulier à la fraction de "core" externe du LPS de la surface cellulaire qui constitue un antigène commun à de nombreuses souches de P. aeruginosa. La fixation de l'anticorps conduit à l'opsonisation de la cellule de P. aeruginosa, ce qui stimule la phagocytose et bactériolyse des phagocytes sur la cellule et l'activation des compléments, ce qui accélère la lyse de la cellule. En conséquence, les infections expérimentales des souris par P. aeruginosa peuvent être traités par administration de l'anticorps monoclonal humain selon l'invention. Pour la prévention et le traitement des maladies infectieuses à P. aeruginosa ou des infections par des bactéries contenant P aeruginosa, l'anticorps monoclonal humain selon l'invention peut être administré à un patient adulte en une quantité d'environ 0,5 à 500 mg, de préférence de 5 à 50 mg. Comme mentionné plus haut, les principaux avantages de l'anticorps monoclonal humain selon l'invention est qu'il présente un titre élevé en anticorps vis-à-vis de l'antigène, et présente une action thérapeutique excellente dans le système des infections expérimentales de souris par divers. aruginosa de différents serotypes. Les autres avantages de l'anticorps selon l'invention sont les suivants. Etant donné que c'est une protéine d'origine humaine, tout effet secondaire (par exemple anaphylaxie), tel qu'il s'en produit par suite de l'administration d'une protéine hetérologue, est évité. Etant donné qu'elle est produite à partir d'une certaine lignée cellulaire spécifique, la possibilité d'une contamination par des substances inconnues biologiquement toxiques est bien plus faible que dans le cas d'immunoglobulines conventionnelles préparées à partir de sang humain provenant d'un certain nombre de sujets inconnus. * L'anticorps monoclonal humain selon l'invention est produit avec un titre élevé en anticorps, in vitro, avec une bonne stabilité et en grande quantité, et son procédé de production est plus avantageux que les procédés de production conventionnels utilisant du sang humain, en ce qui concerne la facilité du contrôle de qualité. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. 1 0 Exemole I Etablissement d'une lignée cellulaire produisant l'anticorps monoclonal humain MH-4H7 Fusion (1) Préparation de lymphocytes humains à partir du sang périphérique et leur culture. Du sang périphérique (100 ml) ayant une teneur élevée en anticorps dirigés contre les antigènes de surface de P. aeruginosa a été prélevé chez un volontaire sain (donneur). Dans un tube à centrifugation (50 ml. Sumitomo Bakelite) on a introduit du Mono-Poly Resolving Medium (Fow Lab.) et on a fait passer dessus doucement du sang périphérique (20 ml), puis on a centrifugé à une faible vitesse (BS-20BH, Tommy Precision Ind.) à 1500 tpm et (Roters-TS-7) à la température ambiante pendant 30 minutes, ce qui a permis de séparer les érythrocytes et les lymphocytes. La fraction contenant les lymphocytes a été recueillie et lavée trois fois avec le milieu essentiel minimum d'Eagle modifié par Dulbecco (appelle ci-après D-MEM), suivi par le calcul du nombre des cellules pour obtenir 1,2x108 cellules lymphocytaires. Les lymphocytes (6x107) ont été mis en suspension dans un milieu de culture de lymphocytes (66 ml) contenant des cellules de P. aeruginosa tuées au formol (IDIDOl1 (type A) & IID1020 (type G), 0;0002% chacun), et la suspension a été répartie sur des microplaques à 24 puits (Costar, #3424) à un taux de 1,5x106 lymphocytes/puits, et cultivée à 37'C sous 5% de C02 pendant 6 jours. Le milieu de culture de lymphocytes mentionné désigne un milieu RPMI-1640 qui contient 20% (v/v) de sérum de foetus de veau inactive (FCS), 0,05 mg/ml de pyruvate de sodium, x10-5M de 2-mercaptoéthanol, 30 gg/ml de transferrine provenant de plasma de 263 12 3 9 veau (United States Biochemichal Corp.) et 0,01% (v/v) de lectine végétale provenant de phytolaque (Gibco Lab.). (2) Fusion cellulaire Des sous-cultures de cellules d'hétéromyélome humain-murin (SHM- D33,ATCC n'CRL1668) ont été faites dans D-MEM contenant 15% de FCS, et 2, 5xl07 cellules ont été lavées deux fois avec D-MEM. D'autre part, des lymphocytes de sang périphérique, cultivés pendant 6 jours sur des microplaques à 24 puits, selon l'Exemple l-(l), ont été récupérés pour donner 7,4x107 cellules lymphocytaires. Les cellules ont été lavées avec D-MEM trois fois et mélangées avec les cellules d'hétéromyélome humain-murin dans un tube de centrifugeuse, puis la centrifugation a été effectuée pour donner des précipités. Aux précipités se trouvant dans le tube de centrifugeuse, on a ajouté I ml d'une solution de polyéthylèneglycol (PEG) (0,45 g de PEG 4000 (Merck), 0,45 ml de PBS(-) et 0,1 ml de diméthylsulfoxyde) en environ une minute, le tube étant en rotation, et on laisse le mélange au repos à température ambiante pendant une minute. D-MEM a été alors ajouté dans le tube à une vitesse de 2 ml/minute, le tube étant en rotation, cette opération étant répétée quatre fois. Ensuite, cette même opération a été répétée trois fois, mais en utilisant du D-MEM contenant 10% de FCS à la place du D-MEM. Enfin, 1,5 ml de FCS a été introduit dans le tube, et le mélange a été laissé au repos pendant 20 minutes à 37 C. Les cellules ont été recueillies par centrifugation et mises en suspension dans 40 ml de D-MEM contenant du FCS (15%), du pyruvate de sodium (0,05 mg/ml), de l'insuline (0,2 U/ml), de l'acide oxaloacétique (0,15 mg/ml), de l'azasérine (1 tg/ml), et de l'hypoxanthine (100 FM), ledit milieu étant appelé ci-après "milieu sélectif HAz". La suspension a été répartie sur des microplaques à 96 puits (Falcon # 3040), à raison de 100 FI par plaque, de façon que chaque puits puisse contenir 6,5x104 cellules de myélome. Chacune des microplaques a été chargée préalablement avec 100 pl de la suspension à la place du milieu mentionné précédemment, de sorte que chaque puits puisse contenir des cellules de rate de souris BALB/c (lx105) et des cellules d'exsudat péritonéal de souris BALB/c (lx104), et les plaques ont été incubées à 37C pendant une journée sous 5% de C02. Les microplaques ont été incubées à 37' C sous 5% de C02 et la moitié du milieu de culture a été remplacée par le milieu de sélection HAz à 2 ou 3 jours d'intervalle. Au bout d'une semaine, la moitié du milieu de culture a été remplacée par le milieu H qui correspond à un milieu 263 1239 sélectif HAz exempt d'azasérine. Apres cela. la moitié du milieu a été remplacée par le milieu D-MEM de culture d'hybridome exempt d'azasérine & d'hypoxanthine. qui est un milieu D-MEM contenant FCS (15%). du pyruvate de sodium (0,05 mg/ml), de l'insuline (0,2 U/ml), et de l'acide oxaloacétique (0,15 mg/ml), à 2 ou 3 jours d'intervalle. La production de l'anticorps dirigé contre l'antigène de surface de P. aeruginosa a été déterminée par test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) sur des surnageants de cultures des puits qui ont présenté une croissance de cellules trois semaines après la fusion cellulaire, en utilisant des microplaques à 96 puits (Falcon # 3912) sur lesquelles P. aeruginosa a été fixé par glutaraldéhyde. Les souches standards de P. aeruginosa de 17 sérotypes différents selon la classification de Homma ont été employées dans ce test, ces souches pouvant être obtenues auprès de l'Institut de science médicale, Univ. de Tokyo, Japon ou de l'ATCC. Les tests ont révélé qu'un puits a produit un anticorps IgM qui réagit fortement avec plusieurs souches standards de P. aeruginosa de différents sérotypes. L'hétérohybridome du puits a été cultivé et clone par la méthode des dilutions limitantes, ce qui a permis d'obtenir une lignée cellulaire désignée par MH-4H7, qui produit d'une manière stable l'anticorps IgM humain. Le terme "MH- 4H7" peut être également utilisé ici pour désigner l'anticorps monoclonal humain produit par la lignée cellulaire MH-4H7. L'hybridome MH-4H7 a été déposé sous le numéro d'accèsFERM P-9996 le 19 Avril 1988., au Fermentation Research Institute, Agencyof Industrial Science and Technology, à Tsukuba, Ibaraki-ken, Japon, puis ce dépôt a été converti en dépôt selon le Traité de Budapest sous le nouveau numéro d'accès FERM BP-2402 le 26 avril 1989. L'anticorps monoclonal humain MH-4H7 est une IgM (i,0M. L'hybridome produisant l'IgM similaire à celui ci-dessus a été obtenu d'un autre donneur, dont le sérum présentait un titre élevé en anticorps dirigé contre l'antigène de surface de P. aeruginosa, par la séparation des lymphocytes, l'activation des cellules B spécifiques in vitro, et la fusion cellulaire comme mentionnée ci-dessus. Exemple 2 Etude du Spectre de Liaison de l'anticorps monoclonal humain MH- 4H7 Dar ELISA (1) Mesure de l'anticorps anti-P. aeruaikosa par ELISA Le titre en anticorps dirigé contre l'antigène de surface de P. aeruginosa a été mesuré comme suit. P. aeruginosa a été mis en suspension dans une solution 263 1239 physiologique tamponnée au phosphate (pH 7,2; contenant NaCI (8g/l), KCI (0,2 g/l), NaHPO4.12H20 (2,99 g/l et KH2PO4 (0,2 g/l)) (PBS) pour donner une absorbance de 0,2 à une longueur d'onde de 600 nm. La suspension a été chargée sur des microplaques à 96 puits (Falcon # 3912) à raison de 50 il/puits, puis centrifugée à 2000 tpm pendant 15 minutes. 2% de glutaraldéhyde ont été ajoutés à chaque puits à raison de 50 gl/puits, pour fixer les cellules bactériennes sur la microplaque. Après enlèvement de la suspension bactérienne des microplaques, une solution de PBS à 3% contenant de la sérum-albumine bovine (BSA) a été chargée sur la microplaque à raison de 120 l/ puits et l'incubation a été effectuée à 37' C pendant 30.minutes pour bloquer la partie non liée de la plaque d'essai. La microplaque obtenue a été utilisée comme plaque revêtue d'antigène dans l'opération subséquente. Lorsqu'on le souhaite, cette microplaque peut être conservée à -20'C. Avant l'essai, la microplaque a été lavée trois fois avec une solution de PBS contenant du Tveen 20 à 0,05% (PBST). Du PBST a été chargé dans les puits à raison de 50 gl/puits, et un échantillon (sérum, ascites ou surnageant de culture), éventuellement dilué avec du PBST y a été ajouté à raison de 50 gl/puits, puis on a effectué une incubation à 37'C pendant 2 heures. L'échantillon a été enlevé de la plaque qui a été lavée trois fois avec PBST. Un anticorps de chèvre anti- immunoglobuline humaine, purifié par affinité, et conjugué à la phosphatase alcaline (Kirkegaard & Perry Lab. Inc.) (anticorps secondaire) , dilué 500 à 1000 fois avec une solution de PBS contenant 1% de BSA, a été ajouté à la microplaque à raison de 100 Wl/puits, pour une incubation à 37'C pendant 2 heures. Pour mesurer le titre d'anticorps IgG et le titre d'anticorps IgM, on a utilisé respectivement un anticorps de chèvre anti-IgG humaine, conjugué à la phosphatase alcaline et un anticorps de chèvre anti-IgM humaine, conjugué à la phosphatase alcaline. Après élimination de i'anticorps secondaire, la microplaque a été lavée trois fois avec PBST, et une solution de substrat, c'est-à-dire une solution aqueuse contenant du p-nitrophénylphosphate de sodium (3 mg/ml) dans un tampon diéthanolamine à 10% (pH 9,1) contenant NaN3 (0,2 mg/ml) et MgCI2 6H20 (0,1 mg/ml), a été ajoutée à la microplaque, à raison de 100 kl/puits, suivie d'une réaction à 37'C. L'activité de liaison de l'anticorps (0D405) a été mesurée sur Multiskan (Titertek). (2) Propriété de liaison de MH-4H7 à des souches standards de sérotypes de P. aeruginosa La propriété de liaison de MH-4H7 aux souches standards de sérotypes de P. aeruginosa a été examiné par ELISA, comme décrit dans l'Exemple 2-(l). Les souches ont été obtenues de l'Institut de science médicale, Université de Tokyo. Japon, et cultivées sur un milieu agar d'infusion de coeur. Les résultats des tests sont représentés dans le Tableau 2. Tableau 2 Activité de liaison de MH-4H7 aux souches standards de sérotypes de P. aeruginosa selon la classification du Comité Japonais. 1 0 Sérotype Souche Valeur ELISA A IID 1001 (ATCC27577) 1,78 B IID 1002 (ATCC27578) 0 B IID 1007 (ATCC27583) 0 B IID 1013 (ATCC27589) 0 B IID 5004 0 C IID 1021 0 D IID 1004 (ATCC27580) 0 E IID 1130 0 F IID 1006 (ATCC27582) 1,77 G IID 1008 (ATCC27584) 1,88 G IID 1020 1,98 - H IID 1009 (ATCC27585) 1,33 I IID 1010 (ATCC27586) 0 J IID 1011 (ATCC27587) 0 K IID 1012 (ATCC27588) 1,80 L IID 5141 0 M IID 5018 0 M IID 1015 0 Le tableau montre que MH-4H7 a éte liée selectivement aux souches sérotypiques standards des types A, F. G. H et K de P. aerueinosa (3) Propriété de liaison de MH-4H7 à des isolats cliniques 26 3 1 2 3 9 Le test ci-dessus a montré que MH-4H7 peut se lier à des sérotypes de souches standard de types A, F. G. H et K. En conséquenc, la propriété de liaison de MH-4H7 à divers isolats cliniques de ces sérotypes, ainsi qu'à ceux des types B. E, I et M, qui sont isolés cliniquement avec une fréquence élevée, a été examinée. Il en résulte que MH-4H7 s'est lié avec des isolats cliniques du type A (70%), du type F (80%), du type G (86%), du type H (60%), du type K (75%) et du type M (45%), comme représenté dans le Tableau 3. Les isolats cliniques des types B. E et I (chaque fois 20 souches) ne se sont pas liés à MH-4H7. Tableau 3 Activité de liaison de MH-4H7 aux isolats cliniques Sérotype Souche Valeur ELISA (OD405) A sp 6745 0,53 sp 6746 1 46 sp 6783 1,10 sp 6818 2,03 sp 6830 0,13 sp 6840 1,17 sp 6708a 1.;82 sp 9710 1767 sp 9711 1707 sp 9731 0 sp 9762 0 np 9763 0 sp 9768 1,26 sp 9780 1 175 sp 10029 0133 263 1239 sp 10040 0 sp 10060 0,39 sp 10648 1778 6p 10676 0 F sp 6770 2 15 sp 6771 0 sp 6808 0749 sp 6851 2724 sp 6921 1,53 G sp 9701 2723 sp 9709 2731 sp 9712 0 sp 9714 2 729 sp 9717 0706 sp 9718 2,28 sp 9738 2723 sp 9785 1729 sp 9743 2,31 sp 9792 1198 sp 9755 2726 sp 9761 o sp 9767 2,45 sp 9772 2,33 GN 11187 2,44 TL 2378 2133 TL 2424 2,43 sp 6788 2,44 sp 9728a 2144 H sp 6896 0 sp 6931 0 sp 7503 2.23 sp 7507 2. 44 Zo 0 8069 du 0 S689 de 51TZ Z689 dg 0 0689 ds 1ú ZS89 de 0 út89 de 0 P6L9 dg S8'0 Z8L9 ds ZZ ZS9L9 ds PZ ' 9L9 ds 6zE4 ú9L9 ds 0 SL901 de 61 i L9001 ds 0 SLL6 de 0 ZSL6 dg t 0o 6PL6 de o 89L6 ds ú0 O PPL6 ds 0 0OL6 de 0 91L6 ds 96 1 úL8.L de '0 198L de 96'1 ISL6 ds IL I T890T ds i 8L901 de P0 O 89001 ds 0 bSooI de Z SSSL ds O ZúSL dg 0 ZZL do O0Z OZSL ds Zb' Z TISL de ZZ Exemple 3 Etude de l'activité agglutinante de l'anticorps monooclonal humain MH-4H7 contre des sérotypes de souches standards de P. aeru ginosa L'activité agglutinante de MH-4H7 sur les sérotypes de souches standards de P. aeruginosa traités au formol a été mesurée et exprimée au moyen de la concentration agglutinante minimale de l'anticorps. Chacune des souches standards énumérées dans le Tableau 4 a été cultivée en milieu agar d'infusion de coeur, traitée au formol à 1%, et laissée au repos à 37' C pendant une nuit. Les cellules tuées obtenues ont été mises en suspension dans le PBS (-) de manière à donner une absorbance de 0,2 à une longueur d'onde de 600 nm, et des fractions de 50 gl de la suspension ont été chargées sur des microplaques à 96 puits en forme de U (Sumitomo Bakelite). Onaintroduit sur les plaques des solutions de MHI-4H7 ( de p1) sous forme de dilutions en série de moitié. Commne témoin, des solutions contenant un anticorps monoclonal humain, c'est-à-dire un hMcAb anti-type B (IgM) qui reconnait l'antigène O de type B. ont été ajoutées à la place des solutions de MH-4H7. Les mélanges réactionnels ont été laissés au repos pendant une nuit à. 4'C, et la présence ou l'absence d'agglutination a été examinée. Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 4. Tableau 4 Concentration minimale agglutinante de MH-4H7 Anticorps. Souches (sérotypes) Concentration minimale agglutinante MH-4H7 IID 1001 (A) 2,5 Pg/ml IID 1006 (F) 2,5 IID 1020 (G) 5,0 IID 1009 (H) 2,5 IID 1012 (K) 1,25 hMcAb IID 1002 (B) n)d. hMcAb detypeanti-B IID 1002 (B) 1 25 n.d.; >25 pg/ml MH-4H7 a présenté une activité agglutinante, vis-a-vis des souches positives pour la liaison selon le test ELISA du Tableau 2, de la même importance que celle de hMcAb du type anti-B vis-à-vis de la souche de sérotype B, bien que l'activité diffère quelquepeu d'une souche à l'autre. Exemole 4 Caractérisation du site reconnu par l'anticoros monoclonal ) humain MH-4H7 par analyse de Western blotting (1) Analyse de Western blotting de lipopolysaccharides Des lipopolysaccarides ont été recueillis à partir de souches standards de P. aeruginosa., IIDIOO1 (type A) et IID1020 (type G), selon la méthode décrite par Westphal & Jann (Methods Carbohydr. Chem., 5 83-91 (1965)). Ainsi, P. aeruginosa a été cultivé jusqu'en fin de phase exponentielle dans un milieu de bouillon d'infusion de coeur (Nisuui Pharmaceuticals), et les cellules ont été recueillies par centrifugation. Les cellules humides ont été traitées avec le phénol à 45% à 68'C et centrifugées à 3000 tpm pendant 15 minutes à une température de 10'C, ce qui a permis d'extraire des lipopolysaccharides dans une couche aqueuse. La couche aqueuse a été traitée avec du bromure de cétyltriméthylammonium pour éliminer les acides nucléiques, et précipitée à l'éthanol pour donner les lipopolysaccharides. Les lipopolysaccharides obtenus à partir de IIDIOO1 et IID1020 ont été traités chacun avec un tampon échantillon comprenant du tampon Tris (31 mM), pH 6,8, du SDS (1,5%), du glycérol (5%), du mercaptoéthanol (2,5%) et du bleu de bromophénol (BPB) (0,005%) à 100'C pendant 5 minutes, soumis à l'électrophorése sur un gel de polyacrylamide à 12,5%, contenant 0,2% de SDS, et transférés sur un filtre Durapore (Millipore). Sur la membrane, le site de liaison reconnu par l'anticorps monoclonal humain MH- 4H7 a été identifié par une méthode de coloration d'anticorps marqué par une enzyme, utilisant un anticorps de chèvre anti-IgM humaine conjugué à la phosphatase alcaline (Kirkegaard & Gaithersburg Perry Lab. Inc.). Pour la détection du comportement électrophorétique du LPS, le même échantillon d'essai a été soumis à une électrophorèse de la même manière, et le gel a été développé par coloration à l'argent, à l'aide d'un kit Bio Rad. La coloration à l'argent a montré, dans une région de poids moléculaire élevé, la présence d'un groupe de bandes en forme d'échelle doe au LPS du. type lisse qui contient du polysaccharide O. Les bandes caractéristiques peuvent être attribuées à l'hétérogénéité du nombre des motifs répétitifs du polysaccharide O. Une bande unique large ou quelques bandes observées dans la région de plus 263 1239 faible poids moléculaire. sont attribuées au LPS du type R ou du type SR qui est exempt de polysaccharide O ou qui n'en comporte que quelques motifs. Comme résultat, on a observé un développement de couleur intense dans les deux souches IIDI001 et IID1020 i la position des lipopolysaccharides du type R ou du type SR qui sont exempts de polysaccharide O complètement ou ne comprend qu'un polysaccharide 0 court. On n'a pas observé de réaction positive avec le MH- 4H7 et seul un faible développement de couleur a été observé dans la région correspondant aux bandes en forme d'échelle, détectées par la coloration à l'argent, qui comprennent du LPS de type lisse ayant une structure répétitive de 1 0 polysaccharide O. (2) Analyse de Western blotting des cellules traitées au SDS Le Western blotting a été conduit sur des cellules traitées au SDS de souches standard de sérotypes de P. aeruginosa IID1001 (type A), 11D1006 (type F), 11D1008 (type G), IID1020 (type G), IID1009 (type H), et IID1012 (type K). Les 1 5 cellules ont été cultivées chacune dans un milieu de culture d'infusion de coeur, mises en suspension dans le tampon échantillon décrit dans l'Exemple 3-(1), et soumises au traitement par SDS à 100'C pendant 30 minutes. L'échantillon ainsi obtenu a été soumis à l'électrophorèse sur du gel de polyacrylamide à 12,5% contenant 0,2% de SDS, avec une quantité appliquée de l'échantillon correspondant à 2 mg de cellules humides, et transféré sur un filtre Durapore 0 de la môme manière que dans l'Exemple 3-(1). La coloration d'anticorps marque à, l'enzyme a été effectuée sur ce filtre. Pour chaque souche, le développement de la coloration par l'action de MH4H7 a été observé seulement dans la région correspondant au liposaccharide du type R ou du type SR, et la région des poids moléculaires plus élevés n'a pas donné de coloration. Exemole 5 Séparation et fractionnement des fractions de oolysaccharide et de lipide A du LPS de P. aeruginosa et étude des orooriétés de liaison des fractions résultantes avec l'anticorps monoclonal humain MH-4H7 (1) Séparation de la fraction polysaccharidiqut, du LPS de P. aeruginosa IID1001 Selon la méthode de Wilkinsion & Galbraith (Eur. J. Biochem., 52. 331 (1975)), la fraction polysaccharidique a été séparée du LPS de P. aeruginosa IID1001 et le polysaccharide obtenu a été fractionné. Plus precisement, le LPS (10 mg) a été dissous dans de l'acide acétique à 1% et chauffé à 100'C pendant 90 minutes pour hydrolyser sélectivement la liaison cétosidique dans le résidu de 2- 2631239- céto-3-désoxyoctonate (KDO) présent dans le LPS de "core" interne. Le mélange réactionnel a été extrait au chloroforme pour obtenir la préparation de lipide A. Pour le fractionnement, la liqueur mère, dont le lipide A libre a été ainsi éliminé, a été soumise à une chromatographie sur colonne Sephadex G-50 (Pharmacia, Uppsala) (dimensions de la colonne: lx70cm) équilibrée avec 50 mM d'un tampon pyridine/acétate, pH 5, 5. L'élution du polysaccharide 0, de l'oligosaccharide de "core" SR et de l'oligosaccharide de "core" R a été détectée par la détermination colorimétrique décrite ci-après. Les sucres neutres ont été détectés par la méthode au phénol-acide sulfurique (M. Dubois et al, Anal. Chem. 28, 350 (1956)). Les sucres aminés ont été détectés par hydrolyse de l'échantillon avec H2S04 2N à 100'C pendant 2 heures et en traitant le produit hydrolyse selon la méthode au MBTH (chlorhydrate de 3- méthyl-2-benzothiazolinone-hydrazone) (A.Tsuji et al, Chem. Pharm. Bull. 17 217 (1969)). Le polysaccharide, et les oligosaccharides de "core" du type R et du type SR ont été récupérés par lyophilisation des fractions concernées. (2) Propriété de liaison de MH-4H7 à chaque fraction dérivée du lipopolysaccharide Une réaction compétitive en test ELISA a été 'utilisée pour étudier la propriété de liaison de MH-4H7 aux fractions respectivescontenant le polysaccharide, l'oligosaccharide de "core" du type R, l'oligosaccharide de "core" du type SR, et le lipide A provenant de P. aeruginosa IID1001, qui ont été tous obtenus dans l'Exemple 4-(l). Ainsi, un mélange du compétiteur et de l'anticorps.a été incubé à 37'C pendant une heure et soumis à l'essai ELISA sur des * microplaques à 96 puits sur lesquelles des cellules de P. aeruginosa ont été étalées, ce qui a permis de mesurer le taux d'inhibition. La quantité de compétiteurs était celle correspondant à 100 nmoles de sucres neutres selon la détermination au phénol-acide sulfurique mentionnée dans l'Exemple 4-(l). Les résultats sont représentés dans le Tableau 5. Tableau 5 Propriété de liaison de MH-4H7 aux fractions de polysaccharide et d'oligosaccharides de "core" du type R et du type SR Substance compétitrice Taux d'inhibition (%) Polysaccharide 0 Oligosaccharide de "core" 1 0 de type SR 72 Oligosaccharide de "core" de type R 99 Lorsque le lipide A est utilisé comme compétiteur à des doses élevées. de 50 sg/ml, l'inhibition en test ELISA n'est pas observée. Ce résultat indique que MH- * 4H117 ne se lie pas au lipide A. Le test ci-dessus révèle que MH-4H7 se lie à l'oligosaccharide de "core" du type R. qui est exempt de polysaccharide O, et à l'oligosaccharide de "core" du type SR, qui ne possède qu'un motif répétitif de polysaccharide 0, et en conséquence, le déterminant antigénique (épitope) de MH-4H7 est localisé dans la fraction de "core" du LPS de P. aeruginosa Comme indiqué dansl'Exemple 5-(l), le résidu de KDO a été hydrolysé par l'acide acétique pendant le processus de séparation des polysaccharides. En conséquence, la liaison de MH-4H7 à la fraction de "core" montre que l'épitope de MH-4H7 n'est pas associé au résidu de KDO dans la fraction de "core" interne. Exemple 6 Propriété de liaison de l'anticorps monoclonal humain MH-4H7 au LPS de diverses bactéries Gram-négatives. La propriété de liaison de MH-4H7 au LPS de diverses bactéries Gram- négatives autres que P. aeruginosa a été examinée par réaction compétitive en. test ELISA décrite dans l'Exemple 5-(2). Comme antigène solide, on a utilisé des microplaques à 96 puits sur lesquelles des cellules de P. aeruginosa IIDI020 (type G) ont été fixees. Les résultats de l'essai sont rassemblés dans le Tableau 6-(1) L'intensité de la liaison est indiquée par le taux d'inhibition du développement de couleur en test ELISA. La concentration en compétiteur est de 50 ig/ml. Les LPS 263 1239 provenant de Escherichia coli J5, E. coli Ol l:B4, Salmonella minnesota R595 et S.minnesota du type sauvage ont été obtenus auprès de List Biological Laboratories Inc. Campbell. Les LPS de P. aeruginosa IID1001 (type A) et IID1020 (type G) ont été préparés par extraction phénolique, comme illustré par l'Exemple 4-(l), Tableau 6-(l) Propriété de liaison de MH-4H7 aux LPS provenant de diverses bactéries Gram-négatives (1). 0 Origine du LPS Chemotype Concent- 1 0 Origine du LPS ration (tjg/ml})Taux d'inhibition (% E. coli J5 R 50 0 c E. coli 0001:B4 S 50 0 S. minnesota R595 R 50 0 -- e S. minnesota wild S 50 0 P. aeruqinosa IID 1001 (Type A) S 50 91 P. aeruginosa IID 1020 (Type G) S 50 98 Le Tableau 6-(l) montre que MH-4H7 ne se lie pas au LPS de type R dérivé de E. coli 15 et de S. minnesota. R 595. ni au LPS de type S dérivé de leur souche parente. Compte tenu des résultats d'essai de l'Exemple 5-(2), on peut conclure que l'épitope de MH-4H7 n'est pas localisé dans la fraction de LPS commune aux Entérobactériacées, telle que la fraction de "core" interne constituée d'heptose et de KDO ou la fraction lipidique, mais dans la fraction de "core" externe caractéristique de P. aeruginosa. Selon le mode opératoire mentionné ci-dessus, un examen supplémentaire a ete effectué en utilisant d'autres bactéries Gram-négatives énumérées dans le Tableau 6-(2). Les échantillons de LPS utilisés ont été obtenus auprès de List Biological Laboratories Inc. (Campbell), et Pseudomonas fluorescens a été acheté chez Ribi Immunochem Research Inc. (Hamilton). La concentration en LPS était de 50 ktg/ml, sans exception. Les résultats du test sont rassemblés dans le Tableau 6-(2). 263 123 9 Tableau 6-(2) Propriété de liaison de MH-4H7 au LPS provenant de diverses bactéries Gram-négatives (2) Or igne d ltPS 'fTat d inhihlttin (%) Escherichia coli D31m4 0 Escherichia coli K235 0 Escherichia coli 026:B6 98 Escherichia coli 055:B5 l Escherichia coli 0127:B8 0 Salmonella typhiînurium 0 Klebsiella pneumoniae. 0 Yersinia enterocholitica 2 Vibrio cholerae Inaba 569B 0 Serratia marcescens 0 Pseudomonas fluorescens 0 Pseudomonas aeruqinosaCF-D Type 1) 100 Comme le montre le tableau cidessus, MH-4H7 entre en réaction croisée forte avec LPS de E. coli 026:B6 et faible avec E. coli 055:B5, mais ne réagit pas avec le LPS d'autres bactéries. Cela signifie que les deux souches ci-dessus de E. coli, en particulier les souches de E. coli de sérotype (026), présentent une structure chimique dans la fraction LPS commune avec celle de la fraction de "core" externe du LPS de P. aeruginosa laquelle structure est capable de se lier à l'anticorps monoclonal MHI-4H7. Exemple7 Effet thérapeutique de l'anticoros MH-4H7 sur des infections expérimentales à P. aeruginosa chez lasouris. L'effet thérapeutique de l'anticorps monoclonal humain MH-4H7 sur des infections expérimentales, chez la souris, provoquées par des isolats cliniques de P. aeruginosa., deux souches du type A et quatre souches du type G. a éte examine Des souris IRC-slc (agees de 4 semaines! mâles: 10 animaux par groupe) ont subi une inoculation intraperitonéale avecuitne suspension contenant les cellules et 5. de mutine. Au bout d'une heure, l'anticorps MH-4H7 (0,1 pg/téte) a ete administre par voie intraperitonéale. L'évaluation de l'action thérapeutique a été faite sur le taux de survie au bout d'une semaine. Les résultats des essais sont rassemblés dans le Tableau 7, qui montre que l'anticorps MH-4H7 est efficace dans le traitement des infections expérimentales provoquées par plusieurs souches de P. aeruginosa des sérotypes A et G. Tableau 7-(1) Action thérapeutique de MH-4H7 sur des isolats cliniques de P. aeruginosa de sérotype A Taux de survie (%) (quantité inoculée CFU/téte) sp 6818 IID 1001 Dose ( Dg/ tte) 45 x 10 1,8 x 105 1,5 6 x 1 0 73 x 10 0,1 80 70 80 40 _- 50 10 20 10 Tableau 7-(2) Action thérapeutique de MH-4H7 sur des isolats cliniques de P. aeruginosa de sérotype G (1) Taux de survie (%) (quantité inoculée CFU/téte) sp 6788 sp 9701 Dose 4 6 (lig/'tête 1) 3,0 x 10 1,2 x 10 1,3 x 10 5,1 x 10 071 100 90 100 90 - 30 0 60 20 263 1 239 Tableau 7-(3) Action thérapeutique de MH-4H7 sur des isolats cliniques de _-P. aeruginosa.de sôrotype G (2) Taux de survie (%) (quantité inoculée: CFU/tête) _ sp 9785 sp 9755 Dose (ug/ tête) 13 x 106 51 x 106 4,6 x 103 1, 1 x 105 0,1 100 50 90 70 -60 20 30 20 Exemple S Identification de l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal humain MH-4H7 (1) Propriété de liaison de MH-4H7 à un groupe de mutants de P. aeruginosa qui présentent une déficience en fraction LPS, provenantde P. aeruginosa PACl. L'épitope qui est localisé dans la fraction de "core" externe du LPS et reconnu par MH-4H7, a été identifié à l'aide des souches de P. aeruginosa PAC 608, PAC 556 et PAC 611, qui sont exemptes d'une partie de la fraction de "core" externe, dérivant de P aeruginosa. souche PACI ou PACIR, qui dérive de PACI. Les souches PACI, PACIR et les mutants déficients ont été obtenus auprès de Pouline M. Meadow (London University College). Les souches ont été étalées chacune sur des microplaques à 96 puits selon l'Exemple 2-(l), et soumises à l'essai ELISA pour examiner l'activité de liaison au MH-4H7. Les résultats sont représentés dans le Tableau 8-(1). 26 3 1 23 9 Tableau 8-(l) Propriété de liaison de MH-4H7 aux mutants de P. aeruginosa qui présentent une déficience dans la fraction de "core" externe du LPS. Souche Chemotype Valeur ELISA (0D405) PAC 1 S 0.30 PAC 1R S 0,25 PAC 608 SR 1,11 PAC 557 R 1,13 PAC 556 R 0,02 PAC 611 R 0,06 IID 1001 S 0,68 + Témoin normal Les structures de la fraction de "core" externe des LPS de PACIR et des mutants mentionnés ci-dessus sont connues (P.S.N. ROWE & P.M.Meadow, Eur. J. Biochem.. 132, 329-333 (1983)). Le "core" externe de LPS trouvé dans la souche parente PACIR, est constitué de galactosamine, alanine, glucose et rhamnose. Le mutant PAC556, qui ne présente pas de réaction avec MH-4H7, est déficient en rhamnose seulement. En conséquence, on peut conclure que l'épitope de MH-4H7 est localisé à proximité du résidu de rhamnose ou du résidu de galactosamine dont le résidu de rhamnose est substituant. (2) Propriété de liaison de MH-4H7 aux monosaccharides et à leurs dérivés Afin de poursuivre l'étude sur la participation du résidu de rhamnose dans l'épitope, la propriété de liaison de MH-4H7 aux monosaccharides et à leurs dérivés a été examinée par réaction compétitive en ELISA selon l'Exemple 5-(2). Comme antigène immobilisé, on a utilisé des microplaques a 96 puits sur lesquelles a été fixé P. aeruainosa IID1001 (type A). Le méthylrhamnoside, un des compétiteurs utilisés, aété obtenu par chauffage d'un mélange de rhamnose et de méthanol en présence d'acide chlorhydrique à 1% pendant 4 heures à 100'C. Le méthylrhamnoside ainsi obtenu contenait environ 90% d'e-anomère. Les résultats des essais sont représentés dans le Tableau 8-(2). Tableu 8-(2) Propriété de liaison de MH-4H7 aux monosaccharides et à. leurs derivés Monosaccharide Concentration Taux d'inhibition(%) (mM> Methy1-L-rhamnoside 500 100 22 L-Rhamnose 500 50 9 D)-Glucose 500 0 Pourcentage de lavaleurELISA (0D405) en présence d'un inhibiteur par rapport à, celle en l'absence de celui-ci. Le Tableau 8-(2) indique que MH-4H7 se lie de manière spécifique au méthylrhamnoside et au rhamnose. En conséquence, on peut en conclure de manière définitive que l'épitope de MH-4H7 est profondément associé au résidu de rhamnose dans le "core" externe du lipopolysaccharide de certaines souches de P. aeruginosa. 263 1239 REVENDICATIONS 1. Anticorps monoclonal humain, caractérisé en ce qu'il présente une action prophylactique et thérapeutique sur des maladies infectieuses provoquées par Pseudomonas aeruginosa, et dont l'épitope est localisé dans la fraction de "core" externe du LPS de Pseudomonas aeruginosa. 2. Anticorps monoclonal humain selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il reconnait un épitope du LPS commun aux souches de P. aeruginosa des sérotypes A, F. G, H, K et M, classées selon la classification du Comité Japonais. 3. Anticorps monoclonal humain selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'épitope est localisé à proximité du résidu de rhamnose ou de galactosamine dans la fraction de "core" externe du LPS de P. aeruginosa. 4. Anticorps monoclonal humain selon les revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il est réactif vis-à-vis du LPS provenant des souches de Esherichia coli de sérotype 026. 5. Anticorps monoclonal humain selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, qui est une IgM. 6. Anticorps monoclonal humain MH-4H7. 7. Préparation d'immunoglobuline humaine caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace d'au moins un anticorps monoclonal humain selon l'une quelconque des revendications! à 6. 8. Agent prophylactique ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'au moins un anticorps monoclonal humain selon l'une quelconque des revendications I à 6. 9. Hybridome capable de produire l'anticorps monoclonal humain selon l'une quelconque des revendications I à 5, et toute lignée cellulaire dérivé de cet hybridome. 10. Hybridome MH-4H7 (FERM BP-2402) et toute lignée cellulaire dérivé de cet hybridome. 11. Procédé pour la préparation d'un anticorps monoclonal humain, tel que défini dans l'une quelconque des revendications I à 6, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation d'un hybridome par fusion cellulaire de lymphocytes B humain capables de produire ledit anticorps avec des cellules d'hétéromyélome, la culture dudit hybridome et la récupération de l'anticorps produit à. partir du surnageant de culture. 263 1239 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que ledit hétéromyélome est un hétéromyélome homme-souris.