Brevet FR2635683A1 — publié le 19900302

2?635683 La présente invention a pour objet un nouveau composé marqué au tritium apparenté aux rétinoldes, sa préparation et son application notamment dans la détermination de l'affinité des rétinoldes pour leurs récepteurs nucléaires et leur protéine de liaison cytosolique et/ou dans la détermination de la teneur cellulaire en récepteurs nucléaires et en protéine de liaison cytoscrique. On sait q-fes rétinoides constituent une classe connue de composés qui agissent notamment sur la prolifération et la différenciation de nombreux types de cellules; voir par exemple B.A. Pawson et coll., Journal of Medicinal Chemistry, vol.25, n 11, pages 1269-1277 (1982). Les rétinoldes ont été utilisés en particulier dans le traitement de diverses maladies dermatologiques dans lesquelles un dérèglement des mécanismes de contr8le de la prolifération et de la différenciation des cellules épidermiques est impliqué; voir par exemple l'ouvrage "Update: Dermatology in General Medicine, edited by Thomas B.Fitzpatrick et al. (MacGraw-Hill Book Company), publié en 1983, en particulier le chapitre de D.B.Windhorst et al., The Retinoids, pages 226-237. Le mode d'action des rétinotdes est analogue à celui des stéroIdes et d'autres effecteurs interagissant avec dés récepteurs nucléaires (Chytil & Ong, 1979). Des récepteurs nucléaires de l'acide rétinolque (RARs) ont été isolés (Daly & Redfern, 1987) et les ADN complémentaires correspondants clones et séquencés (Petkovich et al., 1987; Brand et al., 1988). Jusqu'à présent, deux récepteurs ont été identifiés chez l'homme, RARa (462 résidus) et RARb (448 résidus). Il a d'autre part été montré qu'il existe dans le cytosol une protéine de liaison appelée CRABP (cellular retinoic acid binding protein), mais son r8le est mal connu. La détermination de l'affinité d'un rétinolde pour les RARs constitue un moyen particulièrement intéressant d'évaluation biologique potentielle dudit rétinolde. La détermination de l'affinité pour la CRABP apporte un élément d'évaluation supplémentaire. Plusieurs méthodes expérimentales permettent de déterminer l'affinité d'un ligand pour ses récepteurs ou protéines de liaison. On peut en particulier opérer par une méthode directe si le ligand considéré est marqué radioactivement, ou encore par compétition avec un ligand radioactif si le ligand considéré n'est pas marqué radioactivement. Un bon ligand radioactif doit d'une part présenter une affinité élevée pour ses récepteurs et protéines de liaison et, d'autre part, présenter une faible fixation sur toute autre molécule. En outre, il doit être suffisamment stable pour permettre une utilisation commode. -2- a 635683 Dans le cas des rétinoides acides, le ligand radioactif généralement utilisé est le plus souvent l'acide rétinoIque tritié, soit en position 2 (J.Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals XVIII, p.1099 (1980)), soit en position 4 (demande de brevet allemand n 3.142.945). L'acide rétinoIque présente certes une excellente affinité pour les RARs et la CRABP, avec une fixation non spécifique faible, mais la molécule présente l'inconvénient de se dégrader rapidement, par radiolyse, oxydation et photolyse. On a maintenant découvert que l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro- ,5,8,8-tétraméthyl-2-anthracenyl) benzolque tritié constitue un nouveau ligand radioactif qui présente une excellente affinité pour les RARs et la CRABP, avec une fixation non spécifique faible. De plus, ce nouveau ligand est très stable et peut être obtenu avec une haute activité spécifique, ce qui le rend particulièrement utile pour la mesure de l'affinité des rétinoldes pour les RARS et la CRABP. La présente invention a donc pour objet l'acide 4-(5,6,7,8- tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-anthracenyl) benzolque marqué au tritium. L'invention a notacent pour objet un nouveau ligand radioactif, tel que défini ci-dessus, ayant une activité spécifique supérieure à 30 Ci/mmole et de préférence au moins égale à 50 Ci/mole, soit environ 1875 GBq/mmole. L'invention a également pour objet un procédé de préparation du nouveau ligand radioactif tel que défini ci-dessus. Ce procédé est principalement caractérisé par le fait que l'on prépare un alkyl ester multihalogéné de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl- 2-anthracenyl) benzo!que. En fonction du nombre d'équivalents de l'agent d'halogénation choisi, on peut introduire jusqu'à cinq atomes d'halogène. On soumet ensuite l'alkyl ester halogéné à l'action d'un agent réducteur tritié. L'agent réducteur est par exemple du tritium utilisé en présence de palladium sur charbon à 10%, et de triéthylamine. La réduction du dérivé halogéné est effectuée de préférence à température et sous pression ambiante, par exemple à 15-30 C sous une pression de 1 bar (soit environ 105Pa). L'alkyl ester est ensuite saponifié en milieu méthanolique, en présence de soude. Le dérivé halogéné utilisé comme produit de départ est de préférence le dérivé bromé. L'alkyl ester utilisé est de préférence l'ester éthylique. -3- 26356 3 -3- L'alkyl ester halogéné de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8- tétraméthyl-2-anthracenyl) benzolque peut lui-même être préparé à partir de l'alkyl ester de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2- anthracenyl) benzolque par l'action d'un agent d'halogénation (en particulier de bromation). Par exemple, le dérivé bromé peut être obtenu pr l'action du brome dans l'acide acétique à température ambiante et sous atmosphère d'azote. L'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-anthracenyl) benzoique est un produit connu (appelé ci-après composé I) et peut être obtenu selon le procédé décrit par exemple dans la demande de brevet européen n'86.401671 (210.929) déposée le 25 Juillet 1986. Le ligand radioactif de l'invention peut également être obtenu au départ de l'alkyl ester de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8tétraméthyl- 2-anthracenyl) benzo!que par échange isotopique avec de l'eau tritiée en présence de platine et d'acide acétique à une température allant de préférence de 60 à 150 C. Dans ce cas l'échange isotopique se fait préférentiellement avec les protons aromatique du ligand. L'invention a également pour objet l'utilisation de l'acide 4-(5,6,7,8tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-anthracenyl) benzolque tritié comme marqueur radioactif notamment dans la détermination de l'affinité, de la présence ou de la teneur des rétinoldes et/ou dans la quantification des RARs et de la CRABP desdits rétinoldes. Par exemple, le marqueur radioactif de l'invention peut être utilisé lors de la purification des RARs et de la CRABP par les méthodes classiques de chromatographie d'exclusion sous basse ou haute pression: il suffit d'ajouter aux cellules (cas des RARs) ou à l'extrait tissulaire (cas de la CRABP) utilisés comme produits de départ, une quantité déterminée du ligand radioactif. Les RARs et la CRABP se trouvent ainsi marqués et on peut facilement repérer leur présence ou leur absence dans une fraction donnée. La connaissance des courbes de fixation sur les RARs ou la CRABP permet également l'utilisation du marqueur de l'invention dans la quantification des RARs ou de la CRABP. L'invention a également pour objet l'utilisation du composé I tritié: comme marqueur. radioactif pour repérer, doser ou marquer les récepteurs nucléaires de l'acide rétinolque; - comme marqueur radioactif pour mesurer l'affinité des rétinoldes pour les RARs (expériences de compétition) et avoir ainsi une estimation de leur activité biologique; -4-Z 56 3 - comme marqueur radioactif pour repérer, doser ou marquer la CRABP; ou pour doser un rétino!de connu par compétition pour la fixation sur la CRABP; - comme marqueur radioactif pour mesurer l'affinité des rétinoides pour la CRABP. Le marqueur radioactif de l'invention peut également être utilisé dans la caractérisation d'anticorps contre le composé I, ces anticorps (obtenus selon les méthodes classiques d'obtention d'anticorps anti-haptènes) étant eux-mêmes utilisables dans la détermination de la quantité du produit I fixé ou non sur les RARs et/ou la CRABP. Les anticorps marqué sont utilisés pour réaliser un radioimmunodosage. Le marqueur radioactif de l'invention peut aussi être utilisé dans l'étude du mécanisme d'action intracellulaire et du métabolisme général du composé I in vivo et dans les cellules et extraits cellulaires, et aussi pour étudier la distribution in vivo ainsi que cellulaire et subcellulaire de ce composé et des rétinoldes en général. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 Acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-anthracenyl) benzolque marqué au tritium: a) L'ester éthylique correspondant à l'acide cité (250 mg; 0,644 mole) est mis en solution dans 25ml d'acide acétique sous atmosphère d'azote. On ajoute Iml d'une solution de brome dans l'acide acétique (230 mg de brome par ml1, soit 2,2 équivalents). Le mélange est agité 4 heures à température ambiante, versé sur ml d'eau, puis extrait au dichlorométhane (100ml). La phase organique est séparée, lavée à l'eau puis à l'aide d'une solution saturée d'hydrogènocarbonate de sodium et enfin de thiosulfate de sodium. On sèche sur sulfate de magnésium anhydre, puis le solvant est évaporé sous pression réduite. On obtient 350mg d'un solide jaune clair correspondant à un produit bromé d'après son spectre de masse. b) Le composé bromé obtenu est ensuite tritié. 19,3mg de précurseur bromé sont solubilisés dans un mélange composé de 2ml d'éthanol et 1ml de THF. 2t35683 On ajoute 17p1 de triéthylamine, et 14mg de palladium sur charbon à 10%. Le milieu réactionnel est agité pendant 2 heures sous atmosphère de tritium (1 atmosphère), puis le catalyseur est filtré, les labiles éliminés par 2 fois 10ml d'un mélange composé de 50% d'éthanol et 50% d'acétonitrile. Le produit est repris par 10Oml d'éthanol. On obtient 1.500 mCi d'ester éthylique tritié. c) Le produit tritié précédent (1,5 Ci) est solubilisé dans 5ml de méthanol, lml de soude 5N est ajouté et le mélange résultant est chauffé à reflux pendant 2 heures, refroidi, acidifié à l'aide de 2ml d'acide chlorhydrique 6N, puis extrait par 50ml d'éther éthylique. La phase éthérée est décantée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium anhydre, et les solvants évaporés sous pression réduite. Le résidu obtenu est dissous dans le minimum de dichlorométhane et purifié par chromatographie liquide à haute performance (éluant: dichlorométhane/mé- thanol 9:1). Le produit final est dissous dans 10ml de méthanol. Sa pureté est vérifiée par chromatographie sur couche mince (Silice; éluant care ci- dessus). Une seule tache est apparente sous irradiation UV (254 et 366 nm) et lors du comptage bêta. Par EPLC (phase inverse, colonne ZORBAX ODS, éluant: acétonitrile/eau/acide trifluoracétique 95:4,9:0,1), un seul pic est détecté par UV (254 nm) et par détection bêta (scintillation liquide en continu). L'activité spécifique déterminée par spectrophotométrie UV, puis comptage bêta, est de 52,8 Ci/mmole. L'activité totale obtenue, mesurée par comptage au scintillateur liquide, est de 1,35 Ci. Caractéristiques de la fixation du composé de l'exemple 1 sur les récepteurs nucléaires RARs Des cultures de cellules F9 de carcinome embryonnaire murin 7. (habituellement 4 bottes'de 90 mm contenant au total 2-4x107 cellules par condition d'incubation) sont lavées une fois avec du PBS (tampon phosphate salin) et incubées pendant 3 heures en milieu sans sérum supplémenté.avec le rétinolde marqué en absence ou en présence de rétinolde froid homologue ou hétérologue (pour vérifier la spécificité et pour les expériences de compétition). Les cellules sont alors détachées avec un mélange -6- 2b35683 trypsine-EDTA et numérées avec un hémocytomètre de Burker. Le nucléosol contenant des RARs est extrait à partir des noyaux purifiés selon la méthode décrite par Daly et Redfern (1987), (c'est-à-dire après traitement par l'ADNase et le NaCl 0, 6M) et analysé par chromatographie d'exclusion de haute performance (HPSEC). 50p1 d'extrait marqué sont injectés sur une colonne GF250 (Dupont de Nemours) de 9x250 mm. L'élution est réalisée dans un tampon 0, 3M KH2PO4 pH 7,8 à un débit de iml/min. Le contenu en protéine est suivi par mesure de densité optique à 280nm. 28 fractions de 0.3 ml chacune sont collectées et comptées dans du scintillant Picofluor (Packard). Pour chaque concentration de rétinolde le nombre de molécules liées est déterminé à partir de la surface du pic de radioactivité et la concentration de demi-saturation (C50) calculée. Dans les expériences de compétition on calcule les concentrations inhibitrices 50% (IC50), le composé radioactif de l'exemple I étant utilisé à une concentration de 2. I0 9M. La calibration de poids moléculaire de la colonne est effectuée à l'aide d'albumine humaine (67kDa), d'ovalbumine (45kDa) et de myoglobine (16,8kDa). Les courbes dose-réponse et les courbes de compétition sont analysées de manière informatique par régression non-linéaire en utilisant les diverses formes de l'équation de Clark. La figure 1 représente le profil d'HPSEC dans la détection des récepteurs nucléaires de l'acide rétinoique (RARs) dans une fraction d'approximativement 45kDa dans le nucléosol des cellules F9, et permet d'étudier la spécificité de la fixation. Les cellules F9 ont été incubées avec 200nM d'acide rétinolque tritié (A) ou du composé de l'exemple 1 tritié (B) en absence (C - C) ou présence ( - *) de 20.000 HM de ligand homologue froid. Quand la méthode décrite ci-dessus est utilisée et que les cellules F9 sont incubées avec le composé de l'exemple I à une concentration de 200iM, un pic unique de radioactivité est observé dans l'extrait nucléaire (Figure lB). Le poids moléculaire correspondant à-la fraction moyenne du pic est de 45kDa approximativement, un chiffre proche du poids moléculaire des RARs humains, ainsi qu'il est déduit de la séquence de leurs ADNc (Petkovich et al., 1987; Brand et al., 1988), et compatible avec le coefficient de sédimentation 4S des récepteurs murins. (Daly & Redfern, 1987). La fixation est spécifique puisqu'elle est abolie quand les cellules sont coincubées avec un excès de 100 fois du composé I froid (Figure IB). On ne trouve pas de CRABP dans l'extrait nucléosolique de F9, comme déjà souligné par Daly et Redfern (1987). 7- 2.Z635683 --7-- Comparaison avec la fixation de l'acide rétinoIque tritié sur les récepteurs nucléaires RARs La figure 1A montre le profil d'HPSEC obtenu après traitement des cellules avec 200nM d'acide rétinoIque tritié (activité spécifique = 52,5 Ci/mmole). On peut noter que le pic radioactif élue à la mime position qu'avec le composé de l'exemple 1. D'autre part, le pic n'est pas observé quand les cellules ont été coincubées avec 20000nM d'acide rétinoIque froid. La figure 2 donne les résultats concernant la fixation de l'acide rétinoIque et du composé de l'exemple 1 sur les RARs. Les deux composés ont été utilisés à une concentration de 200 rM. La quantité de ligand liée aux RARs est exprimée en molécules par cellule. Si on normalise les résultats d'HPSEC en fonction du nombre de cellules, c'est-à-dire en les exprimant par molécules de ligand fixés aux RARs par cellule, le composé de l'exemple 1 et l'acide rétinoique donnent un pic de même surface correspondant à approximativement 4.000 molécules par cellule (Fig.2). Pour déterminer la concentration du composé de l'exemple 1 donnant %Z desaturation des RARs (C50), une courbe de saturation a été tracée en exprimant la surface du pic radioactif en fonction de concentrations variées du composé de l'exemple 1. La C50 est comprise entre 0,5 et 2 nM. Détermination de l'affinité des rétinoldes pour les RARs par compétition avec le composé de l'exemple 1 tritié Compte-tenu de sa stabilité et de son excellente affinité pour les RARs, le composé de l'exemple 1 permet en principe de déterminer par compétition l'affinité de n'importe quel rétinolde pour les RARs. La'figure 3 montre des expériences de compétition réalisées avec une concentration fixe de 2 nM du composé de l'exemple 1 et des concentrations variables -6 -10 d'autres rétinoldes (10 M à 10 M). Les exemples de rétinoldes cités n'ont pas un caractère limitatif. Les profils d'HPSEC sont obtenus après incubation des cellules F9 avec 2x10 M du composé de l'exemple 1 en absence (*-#) ou en présence -9 -8 -7. -6 de 1 ( (9M-a*), O-) (A-A) de compétiteurs froids. I = composé de l'exemple 1 non marqué. RA-acide rétinoIque. Les sigmo!des d'inhibition rapportées en encarts ont permis de déterminer les IC50 rapportées dans la table 1. Pour chaque concentration de compétiteur, la surface du pic est exprimée en pourcentage de la surface obtenue avec le composé de l'exemple 1 sans compétiteur. En mesurant la surface du pic radioactif pour chaque concentration de compétiteur froid, il est possible de tracer des sigmoldes de compétition. Un traitement informatique de ces courbes permet de déterminer l'IC50 (concentration inhibitrice 50Z) de chaque rétinolde. A titre de contrôle, on a aussi mesuré l'IC50 du composé I froid, et on a aussi utilisé un rétinolde inactif biologiquement (composé VIII). Le Tableau I montre les valeurs d'IC50 obtenues. On remarque que le composé I a une affinité pour les RARs 6 fois meilleure que celle de l'acide rétinolque lui-même. Corrélation entre l'activité biologique des rétinoides et leur affinité pour les RARs telle qu'elle est déterminée par compétition à l'aide du composé de l'exemple 1 L'activité biologique des rétinoldes peut être mesurée sur les cellules F9 en quantifiant la production d'activateur du plasminogènei sécrété consécutivement à la différenciation de ces cellules, provoquée par les rétinoldes. La CPA50 est la concentration de rétinoides provoquant une induction de 50Z du maximum d'activateur du plasminogène sécrété. En compararant les valeurs d'IC50 et de CPA50 du Tableau 1, on peut remarquer qu'il existe une excellente corrélation entre l'affinité des rétinoldes pour les RARs et leur activité biologique (voir aussi la droite de régression de la Figure 4). La seule exception est l'acide rétinoIque lui-même. Ce fait s'explique par la grande instabilité de ce produit. En effet, la mesure d'IC50 s'effectue après incubation de 3 heures tandis que la mesure de CPA50 s'effectue après incubation de 3 jours. Sur la Figure 4 on a représenté la régression linéaire montrant une excellente corrélation entre l'activité biologique des rétinoldes (CPA50) et leur affinité pour les RARs. Les valeurs correspondant à l'acide rétinolque (RA =) n'ont pas été utilisées. L'affinité pour les RARs et l'activité biologique du composé VIII sont en dessous du seuil de détection. Caractéristiques de la fixation du composé de l'exemple 1 sur la protéine de liaison CRABP Les résultats concernant la fixation du composé I et de l'acide rétinolque sur la CRABP sont représentés à la Figure 5. On étudie la fixation directe de concentrations croissantes du composé de l'exemple 1 (b) et d'acide rétinolque (a) à du cytosol de testicule de rat contenant la CRABP en absence ( - -) ou en présence de 1000 nM de ligand froid homologue. La différence (a ->) représente la liaison spécifique. 6zi35683 --9-- La fixation du composé revendiqué sur la CRABP a été caractérisée par des expériences de saturation (voir Figure 5b). La fixation totale (non spécifique + spécifique (1 - 1) est obtenue par incubation de concen- trations croissantes (jusqu'à un maximum de 125 nM) du composé revendiqué avec une quantité constante (0,3 ml) d'un homogénat de testicules de rat (organe riche en CRABP). La fixation non spécifique du composé tritié est déterminée en parallèle, par la mesure de la fixation avec des concentrations croissantes du ligand radioactif en présence d'un large excès (1 MM) de ligand froid homologue (O -CI). Un temps d'incubation de deux heures est nécessaire à l'établissement de conditions d'équilibre. Une fois l'équilibre atteint, le complexe CRABP-ligand tritié est séparé du ligand non lié par fltration sur colonne de gel d'exclusion Sephadex G25 (colonnes BIO-Rad econo, 0,5 x 20 cm): le complexe est élué (pic d'élution à 2,5 ml), tandis que le ligand non lié est retenu en totalité sur la colonne. Il en résulte une séparation totale entre produit lié et non lié. L'élution est faite directement dans des tubes à scintillation et la radioactivité est mesurée par comptage. Les résultats ainsi obtenus sont analysés par régression non-linéaire utilisant comme modèle l'équation de Clark (A.J. Clark, The mode of action of drugs on cells; A. Arnold and Co., London, 1933). Sur la figure 1, on a représente en abscisses les concentrations initiales du ligand étudié, et en ordonnées, les concentrations à l'équilibre du complexe ligand-protéine de liaison. La différence entre la courbe de fixation totale ( - *) et de fixation non spécifique (C -C) donne la courbe de fixation spécifique (M -M). L'analyse de cette courbe permet d'obtenir la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) qui est la concentration de produit nécessaire pour saturer 50% de la CRABP. Cette constante est une mesure de l'affinité du ligand pour sa protéine de liaison, le Kd étant inversement proportionnel à l'affinité (plus le Kd est faible, plus l'affinité est grande). Cette analyse donne une valeur de Kd de 4 ni. La fixation spécifique est saturable et réversible. La fixation non spécifique est linéaire et non saturable dans la gamme de concentrations utilisées, et représente moins de 10% de la fixation totale. La concentration de CRABP dans le cytosol de testicule de rat utilisé pour l'expérience peut être déterminée dans les expériences de liaison o les rétinoldes marqués sont utilisés à concentration saturante. On trouve une valeur de 10-12 pmol/mg protéine aussi bien avec le composé revendiqué qu'avec l'acide rétinolque. -I0- i 2635683 D'autre part, on peut déterminer par HPSEC que ces deux ligands se fixent sur une molécule d'un poids moléculaire de 15 kDa (poids moléculaire de la CRABP) avec le même profil d'élution. Comparaison avec l'acide rétinoique tritié Dans les mêmes conditions, on peut étudier la fixation de l'acide rétinotque, sur la CRABP (Figure 5a). La valeur du Kd de l'acide rétinolque est 2 nM, la fixation non spécifique représentant approximativement 25Z de la fixation totale. Détermination de l'affinité d'un rétinoIque pour la CRABP par compétition avec le composé revendiqué marqué Ces expériences de compétition sont effectuées de la façon suivante: on mélange une quantité fixe de ligand radioactif (correspondant sensiblement à la demi-saturation, dans notre cas 4 nM), avec des quantités croissantes de ligand froid (non radioactif) . Puis on ajoute la protéine de liaison et on détermine la quantité de ligand radioactif fixée à l'équilibre (en Z de la fixation initiale en l'absence de ligand froid, pour la quantité de CRABP considérée). A partir des courbes de compétition, on détermine dans chaque cas la IC50 (concentration de ligand froid réduisant l'attachement du ligand tritié de 50%). Cette valeur IC50 permet de calculer dans chaque cas la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) pour le ligand froid. Le Tableau 1 indique les valeurs qui ont été déterminées pour les différents composés étudiés. Des valeurs identiques ont été déterminées si au lieu du composé revendiqué, l'acide rétinoIque lui-même marqué a été utilisé dans les expériences de compétition. -opXtle-B'ú'9J)-9-ToTq-j-T6Zqm-- 9p$o . IIIA ?sodmoD -nblozuaq (oprmzqdiuZ -l64z?=wzX-8$8s5sS-osP4él%?%-8sLs985)-t ep;oP - IA ?9sodmoD anbT; TJoqIwa ueIn;(q)ozuoq 9-(TXzqdu-Z ,Pwvlàj 9BoduoyJ anbtozqduu-Z-TzqdIu-Z -Itlrexwll-B'B'f'5-oaptell-8'ú'9'g)-9 aploY - A gsodmo3 anbT$Txoqai eue doTlq(q)ozuaq 9-(T-4lqdwu-Z -I'lvll2-8-'!' S' -olptq -12- 2635683 -12- REVENDICATIONS 1. Acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-anthracényl) benzoique marqué au tritium. 2. Acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-anthracényl) benzolque tritié, tel que défini dans la revendication précédente, caractérisé par le fait qu'il possède une activité spécifique d'au moins 1875 GBq/mmole. 3. Procédé de préparation d'un produit tritié tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait. que: - soit l'on prépare un alkyl ester multihalogéné d'acide 4-(5,6,7,8tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-anthracényl) benzoXque et le soumet à l'action d'un agent réducteur tritié ou du tritum en présence d'un catalyseur puis à une saponification; - soit l'on soumet l'alkyl ester d'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro- ,5,8,8- tétraméthyl-2-anthracényl) benzolque à une réaction d'échange isotopique avec de l'eau tritiée en présence de platine et d'acide acétique à une température de 600 à 150 C. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'agent réducteur est le tritium. 5. Procédé selon selon l'une quelconque des revendications 3 et 4, caractérisé par le fait que le produit halogéné est obtenu par l'action d'un agent d'halogénation sur un alkyl ester de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro- ,5,8,8-tétraméthyl-2-anthracényl) benzolque. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait que l'agent d'halogénation est un agent de bromation. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait que l'alkyl ester utilisé est l'ester éthylique. 8. Utilisation de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra- méthyl-2-anthracényl) benzolque tritié comme marqueur radioactif pour repérer, doser ou marquer les récepteurs nucléaires de l'acide rétinoIque. 9. Utilisation de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra- - méthyl-2-anthracényl) benzolque tritié comme marqueur radioactif pour mesurer l'affinité des rétinoldes pour les RARs (expériences de compétition) et avoir une estimation de leur activité biologique. ; Utilisation de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra- méthyl-2-anthracényl) benzo!que tritié conmme marqueur radioactif pour repérer, doser ou marquer la CRABP. -13- I1. Utilisation de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra- méthyl-2-anthracényl) benzoIque tritié comme marqueur radioactif pour mesurer l'affinité des rétinoides pour la CRABP. 12. Utilisation de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra- méthyl-2-anthracényl) benzoique tritié comme marqueur radioactif pour doser un rétinoide connu par compétition pour la fixation sur la CRABP. 13. Utilisation de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra- méthyl-2-anthracényl) benzotque tritié comme marqueur radioactif pour la caractérisation d'anticorps dirigés contre ce composé et l'utilisation conjointe du composé et des anticorps pour réaliser un radioimmunodosage. 14. Utilisation de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra- méthyl-2-anthracényl) benzo!que tritié comme marqueur radiocatif pour étudier la distribution in vivo ainsi que cellulaire et subcellulaire de ce composé et des rétinoldes. 15. Utilisation de l'acide 4-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra- méthyl-2-anthracényl) benzo!que tritié comme marqueur radioactif pour étudier le métabolisme de ce composé in vivo et dans les cellules et extraits cellulaires.