Brevet FR2630456A1 — publié le 19891027

Milieu de culture, notamment utilisable en culture in vitro et en bactériologie ; son procédé de préparation. La présente invention a pour objet un nouveau milieu de culture, notamment utilisable en culture in vitro et en bactériologie. On sait que la culture de cellules isolées (procaryotes ou eucaryotes), ou de groupes de cellules végétales ou animales, en milieu stérile peut être réalisée, suivant le développement et la croissance recherchés, soit en milieu liquide, soit sur milieu solide. Les milieux solides utilisés doivent être translucides, de façon â permettre une détection rapide de tout développement de micro-organismes infectieux ou parasites à la culture, qui se produirait dans ce milieu, ou à sa surface. Pendant longtemps, on a utilisé des milieux de culture constitués essentiellement d'agar-agar ou gélose, qui est un extrait d'algue rouge, et d'éléments nutritifs choisis selon le type de culture. Cependant, la gélose est un produit de composition variable, qui ne permet pas d'obtenir des résultats de culture constants, notamment en raison de la présence résiduelle d'éléments minéraux ou d'autres molécules qui dépend de l'origine et de la fabrication de cette gélose. Ceci constitue un inconvénient majeur, notamment pour la multiplication des végétaux en culture in vitro. En outre, la préparation d'un milieu de culture 9 base de gélose est longue et délicate. En effet, l'agar-agar se présente sous forme d'une poudre qui doit être dissoute dans un milieu liquide contenant les éléments nutritifs nécessaires å la culture, puis cuite, pour former un gel liquide qui doit être réparti dans les différents flacons de culture et qui, après refroidissement, donne un gel solide. Les flacons de culture ainsi remplis doivent être ensuite stérilisés å l'autoclave avant d'être ensemencés, pour éliminer tout germe pathogène, qui nuirait au bon développement de la culture. Ces opérations de préparation, longues et complexes, du milieu de culture sont inutilisables en pratique, pour une culture- industrielle automatisée par multiplication des végétaux. En bactériologie, ces opérations de préparation sont réalises de façon automatique par des machines. Cependant, ces machines sont très coûteuses. En outre, pour certaines cultures bactériennes, le milieu nutritif contient certaines protéines qui ne peuvent pas être soumises à la stérilisation par autoclave car elles subissent une dénaturation à la chaleur. Un autre inconvénient des milieux de culture à base de gélose est dû å son prix, qui est d'autant plus élevé que le degré de purification est élevé. De nombreuses recherches ont donc été menées pour remplacer les milieux gélifiés à base de gélose et de nouveaux milieux de culture sont apparus récemment sur le marché, sans toutefois pouvoir pallier tous les inconvénients de la technique traditionnelle. Parmi ces nouveaux produits, on distingue essentiellement les poudres gélifiantes, les plaques rêhydratables, et les milieux préformés à base de fibres. Poudres gélifiantes Parmi les poudres gélifiantes, on trouve la gélatine, la pectine, le gelrite et le plantgar. La gélatine, utilisée å l'origine avant la gélose, se liquéfie å une température inférieure mais présente une plus grande biodégradabilité. Son utilisation est limitée actuellement à certaines préparations en bactériologie. La pectine forme, en présence dation Ca2+, un milieu solide pour la culture de micro-organismes, ne nécessitant pas de chauffage. Un tel milieu de culture est notamment décrit dans le brevet américain n" 4 282 317. Cependant, comme pour la gélatine, les milieux à base de pectine sont consistants pour de fortes concentrations en gélifiant. Le gelrite est un polysaccharide, pratiquement insoluble à froid, et ses propriétés gélifiantes sont obtenues par action de la température, puis refroidissement. Il présente donc les mêmes inconvénients que l'agar, en étant encore plus coûteux. Le plantgar est un amidon greffé qui gélifie à froid. Ce produit est également coûteux. En outre, la prise en gel très rapide de ce milieu nécessite d'une part une bonne agitation pour une répartition homogène des éléments, et d'autre part elle doit être distribuée par un système sous pression. Un tel milieu nécessite par conséquent l'utilisation d'un équipement spécial complexe et coûteux. Plaque réhydratable Selon cette technique, le milieu de culture est reconstitué au contact de l'eau froide. De telles plaques sont notamment décrites dans le brevet français n 75 00922 et dans la demande internationale wo 82 02563. Selon cet art antérieur, des plaques de gel sont obtenues soit par séchage d'un film de gel aqueux a base d'agarose et de gélose (FR 75 00922), soit par dépôt uniforme d'une poudre hydrogélifiante sur une surface adhésive (WO 82 02563). Milieu å base de fibres Ces milieux sont en général préformés, et donc de mise en oeuvre aise. Cependant, ils sont opaques et ne peuvent donc pas être utilisés en bactériologie. Ces milieux peuvent être réalisés à base de fibres de tourbe pressée, ou encore å base de fibres synthétiques, sous forme de tampons ou micromottes. Les micromottes à base de fibres de tourbe pressée sont trop rigides et difficilement stérilisables. Les micromottes à base de fibres synthétiques ont été décrites par exemple dans la demande de brevet européenne 0171160. Selon ce document, des tampons sensiblement cylindriques sont réalisés par enroulement sur elle-même d'une bande de matière constituée de fibres synthétiques disposées de façon ordonnée, ladite bande étant cousue pour former un cylindre dont lé diamètre est sensiblement égal au diamètre du tube de culture. Cependant, en raison de la couture précitée, une telle motte présente une structure qui étouffe le collet de la plante lorsque celle-ci grossit. De plus, la structure en fibres ne permet pas un bon développement de la plante . Enfin, ces matériaux sont très coûteux. La présente invention a donc pour but de résoudre le problème technique consistant en la fourniture d'un nouveau milieu de culture, notamment utilisable en culture in vitro et en bactériologie, qui soit d'une mise en oeuvre industrielle ai-sée, d'un coût réduit, et qui permette de résoudre e.ficacement les divers inconvénients des milieux de culture connus jusqu'à présent. La solution, conforme à la présente invention, pour résoudre ce problème technique consiste en milieu de culture caractérisé en ce qu'il est constitué d'un gel solide, contenant de O à 80 % en poids d'eau, éventuellement additionnée d'éléments nutritifs, préformé, notamment par moulage aux formes du récipient de culture, et susceptible de former, sans chauffage, par addition d'une quantité prédéterminée d'eau éventuellement additionnée d'éléments nutritifs, un gel continu conservant sa forme initiale. Selon une caractéristique particulière de l'invention, ce milieu de culture est obtenu par polymérisation d.'un ou plusieurs monomères tels que des dérivés acryliques - en particulier acrylate, méthacrylate, acrylamide - la vinylpyrrolidone, l'oxyde d'éthylène, les sulfonates en présence d'un agent réticulant. Il peut être également obtenu par greffage de ces mêmes monomères sur un polysaccharride. Selon un mode de réalisation particulier, le gel solide précité est un polymère réticulé d'acrylate de métal alcalin, alcalino-terreux, ou de dérivés aminés. Ces milieux de culture sont transparents et clairs et permettent la détection rapide de tout développement non souhaité de micro-organismes infectieux, dans-ce milieu. En outre, ces milieux présentent une surface lisse qui est propice, en microbiologie, au bon développement des colonies bactériennes. Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un milieu de culture, tel que décrit précédemment,. caractérisé en ce qu'il consiste à préparer une solution de monomères, et å réaliser la polymérisation d'un mélange de cette solution de monomères et d'un agent de réticulation dans un moule adapté aux formes du récipient de culture. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description explicative qui va suivre, faite en référence à plusieurs exemples non limitatifs, de mise en oeuvre de l'invention. L'originalité de la présente invention consiste en la préparation d'un milieu de culture prêt à l'emploi, et préalablement conformé au récipient de culture utilisé. Ainsi, ce milieu peut se présenter sous forme de petits bâtonnets pour la culture en tube, sous forme de pastilles pour la culture en boîte de Pétri, ou sous toute autre forme, selon les récipients utilisés ; en culture sur milieu solide, en atmosphère stérile. La structure solide du gel conforme à l'invention permet sa manipulation. en particulier dans des procédés automatisés de préparation de milieu de culture. En outre, ce milieu peut être directement réalisé sous emballage stérile, ce qui permet d'éliminer la phase de stérilisation, notamment dans la mise en oeuvre industrielle de l'invention. Les milieux de culture conformes à l'invention peuvent être réalisés sous forme de gel solide, soit 9 l'état sec, soit å l'état hydraté, suivant que l'on procède au séchage du produit préparé, celui-ci conservant toujours sa forme initiale. Lorsqu'il est å l'état sec, ce gel solide peut contenir les éléments nutritifs nécessaires pour la culture in vitro ou la croissance des micro-organismes. A l'état hydraté, ce gel peut contenir jusqu' & 80 X en poids d'eau, de préférence de 10 å 50 %. Une fois introduits dans les récipients de culture, les gels peuvent être additionnés, le cas échéant, d'éléments nutritifs, sous forme de solution, apportée aseptiquement, par pipetage, par exemple automatique. Le gel solide, conforme à l'invention, est susceptible de former sans chauffage, par addition d'une quantité prédéterminée d'eau, éventuellement additionnée d'éléments nutritifs, un gel continu, conservant sa forme initiale, et de structure similaire å celle de la gélose. Le procédé conforme à l'invention, pour la préparation d'un milieu de culture, consiste à polymériser une solution de monomères comprenant un agent réticulant, et un amorceur choisi suivant le type de polymérisation souhaité, dans un moule adapté aux formes du récipient de culture. On choisira un ou plusieurs monomères par exemple parmi les dérivés acryliques, en particulier acrylate, méthacrylate, acrylamide ; la vinylpyrrolidone ; l'oxyde d'éthylène ; les sulfonates. L'agent réticulant sera ajouté à la solution de monomères dans des proportions de 0,01 a 5 % en poids, de préférence de 0,1 å 1 % par rapport au poids du ou des monomères présents dans la solution de monomères. Le choix du polymère, ainsi que la concentration en agent réticulant pourront être aisément déterminés par l'homme de métier, en vue d'obtenir des produits présentant une forte absorption d'eau. 1 gramme de produit peut ainsi absorber 150 grammes de solution nutritive à 1,5 grammes par litre ou encore absorber 500 grammes d'eau déminéralisée. Comme on l'a vu, cette absorption d'eau s'effectue avec une variation du volume du gel qui conserve cependant apures absorption de liquide sa forme initiale. Le milieu de culture peut entre ainsi obtenu en apportant la quantité suffisante d'eau et d'éléments nutritifs au gel solide préformé. Bien entendu, ces éléments nutritifs peuvent etre incorporés au moment de la préparation du gel final, ce qui permet de reconstituer le milieu de culture par simple réhydratation.. EXEMPLE 1 8,9 g de potasse en pastille sont dissous dans 20 ml d'eau. Cette solution est additionnée lentement à 14,5 g d'acide acrylique sous agitation et refroidissement. 30 mg de méthylène-bis-acrylamide sont ajoutés à cette - solution de monomères. On y introduit ensuite 150 mg de persulfate de potassium dissous dans 10 ml d'eau. La solution finale est alors versée dans un tube de verre d'un diamètre de 6 mm. Le tube est placé à l'étuve à 70 o C pendant 30 min. Dès que la réaction de polymérisation démarre, un sûrchauffement apparait dans le tube. Après refroidissement du tube de verre, celui-ci est cassé pour récupérer le gel solide. Ce gel est séché à 90 C pendant quelques heures. Le tube rigide obtenu peut alors être découpé aux dimensions voulues, si nécessaire. EXEMPLE 2 25 g d'une solution ammoniacale à 11 % sont ajoutés lentement à 14,5 g d'acide acrylique sous agitation et refroidissement. On y introduit ensuite 32 mg de méthylène-bis-acrylamide, puis 150 mg de persulfate de potassium dissous dans 10 ml d'eau. La solution est alors versée dans un tube de verre et le tube est placé à l'étuve & 700 C pendant 30 min. Un gel solide est récupéré de la même façon que celle décrite à l'exemple 1. EXEMPLE 3 42 g d'une solution 9 80 % de diméthylaminoéthylacrylate quaternisé sont mélangés avec 3 g d'acide acrylique et 32 mg de méthylène-bis-acrylamide. On ajoute à cette solution 15 ml d'eau et 160 mg de persulfate de potassium dissous dans 10 ml d'eau. La solution est alors versée dans un tube de verre et le tube est placé à l'étuve à 70 C pendant 1 heure. Le gel est récupéré de la même façon que celle décrite à l'exemple 1. EXEMPLE 4 15 g de peptones sont dissous à chaud dans 10 ml d'eau. 25 ml de solution de monomères préparée comme dans l'exemple 1 sont ajoutés à la solution aqueuse peptonée. Le mélange est alors introduit dans un tube de verre et placé à l'étuve à 70 o C jusqu'à polymérisation complète. Le gel solide peptoné est récupéré de la même façon que celle décrite à l'exemple 1 et séché à 90 C pendant quelques heures. REVENDICATIONS 1) Milieu de culture, notamment utilisable en culture in vitro et en bactériologie, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un gel solide, contenant de O à 80 % en poids d'eau éventuellement additionnée d'éléments nutritifs, préformé notamment par moulage, aux formes du récipient de culture, et susceptible de former sans chauffage, par addition d'une quantité prédéterminée d'eau éventuellement additionnée d'éléments nutritifs, un gel continu, conservant sa forme initiale. 2) Milieu de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu par polymérisation d'un ou de plusieurs monomères tels que des dérivés acryliques - en particulier acrylate, méthacrylate, acrylamide - la vinylpyrrolidone, l'oxyde d'éthylène, les sulfonates, en présence d'un agent réticulant, ou bien par greffage desdits monomères sur un polysaccharide. 3) Milieu de culture selon la tevendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le gel solide précité est un polymère réticulé d'acrylate de métal alcalin, alcalino-terreux ou de dérivé d'amine. 4) Milieu de culture selon la revendication 2, caractérisés en ce que l'agent réticulant précité est présent en des proportions -de 0,01 à 5 /. en poids, de préférence de 0,1 9 1 r, par rapport au poids du ou des monomères. 5) Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le gel solide précité est à l'état sec et contient des éléments nutritifs nécessaires pour la culture in vitro ou la croissance des micro-organismes. 6) Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le gel précité contient de 10 à 50 % en poids d'eau. 7) Procédé de préparation d'un milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 6, caractérise en ce qu'il comprend la préparation d'une solution de monomères comprenant un agent de réticulation et la polymérisation de cette solution de monomères dans un moule adapté aux formes du récipient de culture