Brevet FR2634378A1 — publié le 19900126

La présente invention a pour objet un procédé de mise ezi évidexlce, in vivo, de la capacité d'un composé à provoquer ulîe prolifération peroxymale hépatique. Il est connu que certa ines classes de composés, notamment certaizîes substances hypolipidémiantes et certains plastifiants alimelltaires, sont susceptibles de provoquer une prolifération des peroxysomes. Cette prolifération apparait généralement 24 heures après le premier contact avec la substance en question, atteint un état stationnaire qui dépend de la durée de l'administration et disparait plus ou moins rapidement, après le dernier contact, selon la dose reçue par le sujet. La prolifération des peroxysomes se traduit par - un accroissement de l'hépatomégalie, - une prolifération du réticulum endoplasmique lisse, et - une augmentation du nombre et du volume des peroxysomes. A l'heure actuel Le, pour mettre en évLdezice la capacité d'un composé à provoquer une prolifération peroxymale hépatique chez l'aziimal de laboratoire, il est nécessaire de le sacrifier. On procède ensuite à un dosage enzymatique, celui de la CN palmitoyl CoA oxydase (palmitoyl CoA oxydase insensible au cyallure), sur des fractions sub-cellulaires du foie des animaux sacrifiais Lé > , selon la méthode de Lazarow (1981) modifie (Bronfman et Coll, 1970 ; Mitchell et Coll, 1983). La présezite invention a donc pour but de remédier å cette situatiozî en apportait un procédé qui soit utilisable izi vivo. A cette fini, elle propose un procédé qui tire profit d'une altération du métabolisme constatée en cas de prolifération peroxymale. Plus précisément, elle exploite le fait que, en situation de prolifération peroxymale hépatique, le métabolisme hépatique du phtalate d di(éthyl-2-hexyle) (DEHP) est profondément modifié en débuchant préférentiellement sur un métabolite révélateur. Le DEHP est un composé connu utilisé comme plastifiant alimentaire et l'on sait qu'il a une capacité potentielle à provoquer une prolifération des peroxysomes. Au cours de son métabolisme hépatique, le DEHP est tout d'abord transformé ezi son métabolite actif le MEHP (phtalate de mono(sthyl-2-hexyle )). Lorsque le DEHP est administré à un dose non prolifératrice, et en l'absence d'une prolifération peroxymale existante; le MEHP est dégradé préférentiellement par la voie #-1-oxydative débouchant sur le phtalate de mono(carboxy-5-éthyl-2-pentyle) dit MCEPeP. Par contre, à une dose prolifératrice, le métabolisme du MEHP utilise préférentiellement la voie #-oxydative puis ss -oxydative pour déboucher sur le phtalate de mono-(carbo- xy-3-éthyl-2-propyle) dit MCEPrP. Les différentes vo Les de dégradation du DEHP sont indiquées dates Le tableau I ci-dessous. TABLEAU I L' invention repose sur la découverte que le DEHP, administre à une dose non prolifératrice, est métabolisé selon cette voie préférentielle # -oxydative puis ss -oxydative s'il existe une prolifération peroxymale provoquée par un autre composé. Le procédé de mise en évidence de la capacité d'un composé à provoquer une prolifération peroxymale hépatique consiste donc à administrer, au sujet ayant reçu ledit composé, une dose noii prolifératrice de DEHP et à doser le MCEPrP urinaire qui est le métabolite révélateur de l'état de prolifération peroxymale. Chez le rat, ou autre animal de laboratoire du même genre, la dose nozi prolifératrice du DEHP, administrée dans le cadre du procédé selon L' invention, est comprise entre- 10 et 50 mg de DEHP par kg de poids corporel du sujet. Le procédé peut être appliqué à l'homme comme moyen de contrôle de l'inocuité par exemple d'ulve substance hypolipidémiante et, dazis ce cas, la dose non prolifératrice de DEHP pourra être comprise entre 0,5 et 2,5 mg par kg de poids corporel. Le MCEPrP est extrait de l'uriiie par une succession d'étapes de dissolution dans des solvants organiques et d'évaporation, puis il peut être dosé par chromatographie ou toute autre méthode approprie. Le procédé selon 1 @ invention convient au contrôle de la prolifération peroxymale hépatique éventuelle provoquée par des hypolipidémiants, tels que le clofibrate, le ciprofibrate et le fénofibrate, ou de plastifiants alimentaires, tels que l'adipate de di(éthyl-2-hexyle) dit DEHA. L1 invention sera mieux comprise à la lecture de la description c i-après illustrant le procédé selon 1' inven- tioii. Dans l' exemple de mise ezi oeuvre ci-après, la substaiice provoquant La prolifération peroxymale hépatique est 1 acide clofibrique. L'objectif de l'expérimentation est de montrer - qu'à la dose utilisée, l'acide clofibrique est effectivement une substance proliferatrice, - qu'à la dose utilise, le DEHP n'induit pas de prolifiération, - que les résultats révélés par le dosage du MCEPrP sont cohérents avec ceux trouvés par le dosage classique de la CN palmitoyl CoA oxydase sur des fractions sub-cellulaires de foie d'animaux sacrifiés. 1) Traitement des animaux L'expérimentation est menée sur des rats mâles Wistar pesant de 180 à 200 g. Les animaux sont placés, pour les uns dans des cages à métabolisme permettant la collecte séparée des urines et des fèces et, pour les autres, dans des cages métalliques. Les animaux sont gavés à l'aide d'une sonde oesophagieane Pour leur administration, le DEHP et l'acide clofibrique Sozit dissous dans de L'huile de mais ; des rats témoins reçoivent de l'huile de maïs pure. La quantité de produit actif ou d'huile de maïs donnée est proportionnelle au poids corporel de l'aiiimal. Elle est de 250 mg/kg/jour pour l'acide clofibrique, de 50 mg/kg/jour pour le DEHP et de 5 ml/kg/jour pour 1 ' huile de maïs. La chronologie de l'expérimentation se fait comme indiqué dans le tableau II ci-après. TABLEAU II Cages å abtabolisme : huile huile huile DEHP t Tmoins/ac.clofibrique nlJ ac.clo ac.clo ac.clo I I I DHP t INDUITS n-3 Cages normales : huile huile huile DEHP t Temoins/ac.cloFibrique n.3 ac.clo ac.clo ac.clo huile 4 Témoins/DEHP n-3 ac.clo ac.clo ac.clo DEHP IDIDUITS I I I n13 I i I t I I I I JO JI J2 J3 J4 J5 J6 JW ac.clofibrique (ac.clo):250 mg/kg/j DEHP : 50 mg/kg/j huile : 5 mg/kg/j n : nombre d'animaux en expérimentation 4 : sacrifice des animaux CHRONOLOGIE DE L'EXPERIMENTATIOL Les urizies des animaux des cages à métabolisme sont recueillies et les métabolites uriziaires sont extraits et "dérives" selon le tableau III ci-après (méthode de Daxliel et Bratt (1974) reprise par Lhugueziot et coll. (1985)). TABLEAU III urine (5 11) dilution. (50:50) avec H20 ajout de l'étalon interne (acide benzoyl-2 benzoïque) (0,61mu, dissous dans le méthanol) ajustement du pH à 2 3 extractions avec du dithyl éther (E .OH) (2x80 rl) ; (lux40 1) I phase aqueuse phase organique (métabolites conjugués) (métabolites libres) hydrolyse alcaline séchage au Na2S04 anhydre partielle (pH 12 ; 10 mn) filtration évaporation sous vide à 350C (évaporateur rotatif) récupération de l'extrait sec dans Et.OH évaporation sous azote l'extrait sec est redissous dans 2 mi de méthanol -I 200 iul de cet extrait méthylation avec du diazométhane (CH2N2) contact 2h 22 évaporation sous azote l'extrait est repris dans 200 pi de pethanol échantillon prît à injecter Extraction et dérivation des métabolites urinaires Par dérivation, on entend le masquage des fonctions carboxyliques éventuellement présentes pour obtenir une meilleure élutioii chromatographique. A cet effet, on utilise la méthode de dérivation au diazométhane recommandée par Albro et coil (1973). Une prise d'essai de I microlitre de chaque échantillon issu des opérations d'extraction et de dérivation des métabolites urinaires est soumise ensuite à une chromatographie gaz/liquide dont les résultats pondéraux sont rapportés dans le tableau IV ci-dessous. TABLEAU IV Témoins Met 5 Met 1 Met 6 Met 9 Met (1,5,6,9) Témoins/ac.clo n=3 0,56#0,16 0,40#0,07 0,63#0,14 0,53#0,14 1,98#1 Induits n=3 0,30#0,15 0,89#0,09* 0,43#0,12 0,56#0,07 2,18#0,86 Induits x 100 53,6#25,0 222,5#112 110#122,2 88#18,2 110#32,7 Témoins * . Valeurs significativement différentes de celles des témoins (p n : Nombre de rats Met 1,5,6,9 , métabolites 1,5,6,9 tel qu'identifiés sur le tableau I Comme 011 l'a vu plus haut, le procédé connu implique le sacrifice des animaux et a préparation des fractions sub-cellulaires du foie en vue du dosage enzymatique précité. A cette fin, les animaux sont sacrifiés par dislocatio cervicale. Le foie est immédiatement prélevé, pesé et perfusé à j'aide d'une solution tampon. On en prélève S g qui sont homogénéisés avec l'appareil de Potter à piston en Téflon, avec 1 g de foie pour 4 ml de liquide. A partir de l'homogénat, des peroxysomes sont séparés par centrifugation préférentielle. Le surnageant post-mitochondrial est obtenu en centrifugeant l'homogénat à 1500g pendant 15 minutes à 40C. Le culot (contenant les nucléoles, lysosomes, mitochondries et peroxysomes) est remis en suspension par homogé néisatiozi au Potter avec le quart du volume initial de la solution tampon. Les échantillons des fractions peroxymales sont congelés à -70 C dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml. Toutes les manipulations sozit effectuées entre 0 et 40C. Le dosage de la CN palmitoyl CoA oxydase est effectua selon la méthode de Lazarow (1981) modifiée (Bronfman et Coll 1970 @ Mitchell et Coll, 1983). Les résultats obtenus sont exprimés dans le tableau V ci-après. TABLEAU V Traitement nmoles NAD .min-1 .mg-1 prot Témoins/ac.clo 14.69 + 1,60 n=6 Témoins/DEHP 35,34 # 12,25 n=3 Induits n-5 38.28 # 7,1 * Induits xlOO '60 #40,4 Témoins/ac.clo * : Valeurs significativement différentes de celles des témoins. (P 0,05) n - noabre de rats Il ressort du tableau V ci-dessus que le traitement subi a induit une augmentation de la ss -oxydation peroxymale de 260 % par rapport aux témoins acide clofibrique et que l'administration du DEHP n'a pas eu d'incidence significative sur la prolifération peroxymale. De la comparaison des tableaux V et IV, il ressort une corrélation satisfaisante entre la valeur trouvée par dosage de la CN palmitoyl CoA oxydase sur les fractions sub-cellulaires du foie (260 %) et la valeur trouvée d'après le dosage par chromatographie de la quantité de métabolite 1 (MCEPrP) présent dans les urines (222 %). Des résultats comparables sont obtenus en utilisait le clofibrate, le ciprofibrate, le fénofibrate et l'adipate d'(éthyl-2-hexyte) à La place de l'acide clofibrique. REVENDICATIONS 1- Procédé de mise ezi évidence, in vivo, de la capacité d'un composé à provoquer une prolifération peroxymale hépatique, caractérisé en ce qu'il consiste à administrer, au sujet ayant reçu ledit composé, une dose non prolifératrice de phtalate de di(éthyl-2-hexyle) dit 'DEHP" et à doser le phtalate de mono(carboxy-3-éthyl-2-propyle) urinaire, dit "MCEPrP" qui est l'un des métabolites possibles du DEHP. 2- Procédé selon la revendication 1 appliqué à l'animal de laboratoire, tel que le rat, caractérisé en ce que la dose non prolifératrice de DEHP est comprise entre 10 et 50 mg/kg de poids corporel. 3- Procédé selon la revendication 1 appliqué à l'être humain, caractérisé en ce que la dose non prolifératrice de DEIIP est comprise entre 0,5 et 2,5 mg/lcg de poids corporel. 4- Procédé selon l'une quelcorlque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le MCEPrP est dosé après avoir été extrait de l'urine par ube succession d'étapes de dissolut Loti dans des solvants orgarliques et d'évaporation. 5- Application du phtalate de di(éthyl-2-hexyle) à la mise en évidence, in vivo, de la capacité d'un composé à provoquer Iirte prolifération peroxymale hépatique. 6- Application se Loti La revelldicatiorl 5, @ caractérisée ezi ce que ledit composé est un hypolipidémiant. 7- Application selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'hypolipidémiant est choisi entre le clofibrate, le ciprofibrate et le fénofibrate. S- Applicatioll selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit composé est un plastifiant alimentaire. 9- Applicatioll selon la revendication 8, caractérisée en ce que le plastifiazit est l'adipate de di(éthyl-2-hexyle) dit "DEHA".