Brevet FR2626289A1 — publié le 19890728

La presente invention concerne un Àprocédé de préparation d'acides aryl-2 alkanoiques optiquement actifs de formule générale: I Ar - CE - COo) par hydrolyse érantiosélective des amides racmiques correspondants. Dans la formule génerale (I), Ar represente un radical aromatique éventuellement substitué et R représente un radical éthyle, propyle ou isopropyle. Plus particuliètrement, la présente invention concerne la preparation des énantioméres S (+) des acides aryl-2 alkanoïques de f3 ormule générale (1}. Plus particulièrement encore, la presente invention concer- ne la preparation des énantioméres S {+) des acides phenyl-2 méthyl-3 butyriques de formule generale: EC3 2 .'-.s -coos 11 CODE Z.!) dans laquelle X représente un atome dthalogéne, de préférence un atome de chlore, ou un radical méthyle. I1 est connu [Y. Kawakami, J. Synth. Org. Chem., 38, 574 (1980)] que les esters de formule générale s CH(CH3}2 0-C6Hs -4xIy1 H - Co - O - Z(IlI) dans laquelle X est défini comme prêcédemment, possedent des proprie- tes irsecticzdes remarquables. Dans la formule generale {IIIt', la presence de 2 carbones asymétriques conduit a l'ex!stence possible de 4 isomères optiques. Parmi -r isomeres, ceux qui dérivent des isomtres S 1+) des acides de formule générale (II) ont une activité supérieure à celle des produits racémiques correspondants (DE 2 737 297), Il est connu [H. Nohira et uol!. ., Agric. Biol. Ohem., 50, 676 {1986}] de préparer les isomères optiquement actifs des produits de formule générale (Il} par cristallisation préférentielle du sel de l'aclde de formule générale (II) avec la diéthylamine. Iú a maintenant été trouve, et c'est ce qui fait i'objet de la présente invention, que les acides aryl-2 alkanoúques de formule générale (I) sous forme S peuvent être obtenus par hydrolyse ênantio- séelective des amides rac mques correspondants au moyen de microorga- nismes ou d'enzymes sélectionnés en fonction de leur capacité a hydrolyser l'"-phénylpropionamide racèmique en acide x-phenylpropio- nique S. La selection des agents permettant l'hydrolyse enantiosé- lective des amides des acides aryl-2 alkanoXques de formule générale (I) racémiques est effectuée en mettant en contact l'agent avec xphénylpropionamide en milieu convenable jusqu'a ce que 2O% du produit soit converti puis en mesurant l'excès énantiomérique, Sont sélectionnés les agents qui hydrolysent, dans ces conditions, l' -phé- nylpropionamide racémique en acide l-phénylpropionique S avec un exces énantiomérique supérieur à 65%. Parmi les microrganismes qui conviennent particulièrement bien peuvent être cities des souches appartenant au genre Brevibacterutu ou, Corynebacterium et plus particulièrement Brevibagterium n 312 (CBS 717.73) et Corynebacterium N 771 (ERM P 444$) ou Corynebacterium N 774 (FERM P 4446) qui permettent d'obtenir des acides aryl-2 alkanoiques S avec un exc^s énantiomé- rique en isomère S généralement supérieur a 90%. Il est surprenant de noter que, parmi ces microorganlsmes, Srevîibacterium R 312, qui est décrit dans FR 7 901 803/2 447 359 et dans Advances in Biochemical Engineering, Vol. 14, p. 1-32 (1980)} comme possedent -ne amidase generale non stereospeclfîque hydrolyse steréospecificuement les arldes des acides ary"-" akanoiques de formule génerale [l) racemiques alors que son mutant 4 qui posséde une amidase L stereospecifque n'hydrolyse pas les amides des acides aryl-2 alkanoiques de formuie genérale (1) racémiques. Il y a lieu de noter que Corynebacterium N 771 et CorYnebacterium N 774, qui sont décrits dans EP O 187 680, hydroly- sent par exemple le lacton1trile erz acide D,L lactique et l'a-amino- phenylpropionitrile en D.L-phenylalanine sans observer de stéréosé- lectlvité. Selon la presente invention, le procedé est généralement mis en oeuvre en milieu aqueux ou hydroorganique homogene ou hétéro- gène, dans des conditions de temperature et de pH déterminées en fonction de la nature du microorganisme et de l'enzyme, en agitant une suspension de cellules ou d'extraits cellulalres du microorganis- me et de l'amide de l'acide aryl-2 alkanoïque racêmique. Le procédé conduit à un mélange de l'acide aryl-2 alka- noique S et de l'amide de l'acide aryl-Z alkanoïque U, ce dernier pouvant être racémisé selon des techniques connues en amide de l'acide aryl-2 alkanoique racémique quli peut à nouveau être hydrolysé en aclde aryl-2 alkanoique S dans le conditions données précedem- ment. Par exemple la racémisation peut être effectuée par chauf- fage avec de l'ammoniaque a une température comprise entre 80 et 1600C. Lorsque le microorganisme utilise posséde la propriété d'hydrolyser les nitriles associée à la propriete d'hydrolyser énantiosélectivement l'x-phénylpropionamide, il est possible d'obte- nir un acide aryl-2 alkanolque S soit à partir du nitrile de l'acide aryl2 alkanoique racemique soit à partir de l'amide de l'acide aryl-2 alkanoique racémique. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment 1' invention peut être mise en pratique. EXHt4PLE 1 a La souche Brev1bacterium R 312 tCBS 717.732 est cultivée en fiole agitee a 2SOC pendant 14 heures dans un malieu dont la composition est 'a suivante - glucose 10 g - (NH 2 SO g - -2"]D? C.rs 0,0012 g - Fe SO4, 7H0, 0,0012 g nsO Ho 0,0012ol g - MgSO4, 7O 0,5 g. - Chlorhydrate de thiamine 0,002 g - eau q.s.p. 1000 cm3. Cette préculture est utilisée pour ensemencer un milieu de culture ayant la même composition mais contenant en plus du N-méthyl- acêtamide à a a oncentration de 20mM. La culture est efectuée en fiole agitee pendant 24 heures à 280C. La biomasse obtenue est séparee par centrifugation puis elle est lavée deux fois par une solution de chlorure de sodium & 9 g/litre. b) Un culot de centrifugation contenant 13 mg de cellules de Breviba terium R 312, exprimés en matières seches, est mis en suspension dans 2 cm3 de tampon phosphate (50 mM) à pH = 7. On ajoute mg de phényl-2 propionitrile' rachmique (190 pmoles).. Après 24 heures d'agtation à 25'C, le mélange réactionnel est dilue par addithn de 23 cm3 d'un mélange acétonitrile-acide chlorhydrique N (90-10 en volumes). Les bactéries sont éliminées par centrifugation 0 La composition du surnageant est déterminee par chromatographie liquide à haute performance (CLHP}). Le surnageant contient. 119 gmoles de phényl-2 propionamide 62.moles d'acide phényl-2 propionique. On ajoute du chlorure de sodium pour favoriser la sépara- tion des phases aqueuses ou organiques. Apres évaporation à sec de la phase organique, le residu est reprIs par 20 cm3 d'un mélange chloro- forme-soude O,1N (1-1 en volumes.. La phase basique est acid.fiee puis extraite au chlorofor- me. La mesure du pouvoir rotatoire montre que l'excès énantio- merique en isomere S {() est de 100%. Apres derivation de l'acide phenyl-2 propionúque avec la R ll} amethylbenzylamine, l'analyse par CLHP montre que l'excès enantiomérique est de 96,4%. Un culot de centrifugatln contenant 320 mg de cellules de Brevibacterlum R 312, exprlmes en mateières sèches, est mis en suspen- sion dans 5 cm3 de tampon phosphate 50 mN) a pH = 7,0. on ajoute 71,2 mg de {chloro-4 phènyl)-2 méthyl-3 butyramide racémique (337 moles). Après 117 heures d'agitation à 25*C, le mélange réac- tionnel est dilue par addition de 45 cm3 d'un mélange acétonitrile - acide chlorhydrique N (90-10 en volumes). Les bactéries sont élimi- nées par centrifugation. La composition du melange est déterminèe par chromatographie liquide à haute performance {CLP). Le surnageant contient 258 pmoles de (chloro-4 phényl)-2 méthyl-3 butyramide 73 wmoles d'acide (chloro-4 phényl)-2 mthyl-3 butyrique. On ajoute du chlorure de sodium pour favoriser la sépara- tion des phases aqueuses et organiques. A la phase organique séparée par decantation. on ajoute un mélange éther - soude 0,1 N (3-1 en volumes}. Apres séparation des phases aqueuses et organiques par decantation et acidification de la phase aqueuse, l'acide (chloro-4 phényl)-2 methyl-3 butyrique est extrait au chloroforme. La mesure du pouvoir rotatoire montre que l'excès énantio- merique en isomère S (+) est de 97,5%. Après dérivation de l'acide avec la R {e) a-méthylbenzyl- amine, l'analyse par CLHP? montre que l'exces énantiomérique est superieur a 90%. EXEMIPLE 3 Un culot de centrifugation contenant 321 mg de cellules de Brev3bactrium R 312, exprimês en matières sèches, est mis en suspen- sion dans 5 ci3 d'un tampon phosphate (0 mrM} a pH = 7,0. on ajoute 7,9 mg de (chloro-4 phenyl)-2 méthyl-3 butyronitrile racémique (392 jmoles). Apres 117 heures d'agitation à 25 0C, le mélange réac- tionnel est dilue par addition de 46 am3 d'un mélange acétonitrile - acide chlorhydrique N (g90-10 en volumes). Les bactéries sont élimi- nees par centrifugation. La composition du mélange est déterminée par LRP. Le surnageant contient: 289 Wmoles de (chloro-4 phényl-2 méthyl-3 butyramide 78 pmolies d'acide (chloro-4 phényl)-2 méthyl-3 butyrique. L'aclide est extrait dans les conditions décrites dans l'exemple 2. Après dérivation de l'acide avec la R (+) i-méthylbenzyl- amine, l'analyse du mélange par CLEP montre que l'excès énantiome- rique de l'acide (chloro-4 phényl)-2 méthyl-3 butyrique est de-97% en isomère S (). R E V E N D I C A T I O-N s i - Procede de.reparation des enantiomeres S 5) des acides aryl-2 alkanoïques de formule generale: I Ar - CH - COOH dans laquelle Ar représente. un radical aromatique éventuellement substitue et R représente un radical éthyle, propyle ou isopropyle, caractérise en ce que l'on hydrolyse énantiosélectivement les amides des acides ary.-2 alkanoiques racémiques correspondants, éventuel- lement préparés in situ, en présence d'un microorganisme ou d'une enzyme issue de ce microorganisme selectionné en fonction de sa capacitée a hydrolyser sélectivement l'"-phénylpropionamide racémique en acide aphenylpropionique S avec un excès énantiomérique supérieur à 65%, puis sépare i'acide aryl-2 alkanoïque S de l'amide de l'acide aryl-2 alkanoique R. 2 - Procède selon la revendication 1 caracterisé en ce que les microorganismes sont choisis parmi les Brevibacterium et les Coryne- bacterium. 3 - Procede selon la revendication 2 caractérise en ce que les microorganismes sont choisis parmi Brevibacterium R 312 (BS.717.73), Corynebacterium N 771 (FERM P 4445) et Corynebacterium N 774 (FMM P 4446). 4 - Procédé selon la revendication 1 caractérise en ce qqe le micro- organisme possede une activité nitrilase associée a la capacité d'hydrolyser énantiosélectivement la'-phénylpropionamide racémique en acide "-phénylpropionique S. - Procéde selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'on hydrolyse directement le nitrile de l'acide aryl-2 alkanoique racémi- que en acide aryl-2 alkanoique S. 6 - Procd& selon l'une des revendications 4 ou 5 caract4rise en ce que les mlcrooQrganismes sont choisis parmi les Brevibacterium et les Corynebacterium. 7 - Procedé selon la revendication 6 caractérise en ce que les microorganismes sont choisis parmi Brevibacterium R 312 (CB$ 717. 73), Corynebacterium N 771 (FERM P 4445) et Coryinebacterium N 774 (FERM P 4446), a - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 pour la preparation des acides de formule génerale: H(CH3)2 Io0 X: l H -COoE dans laquelle X représente un atome d'halogène au le radical-méthyle, sous forme S (Q).