Brevet FR2629916A1 — publié le 19891013

La présente invention est relative à un support solide pour diagnostic immunologique, à son procédé de traitement et à l'application au diagnostic immunologique. Conformément à l'Art antérieur, des anticorps ou des antigènes peuvent être fixés sur un support solide, notamment en polystyrène, pour la mise en évidence d'anti- gènes, d'anticorps ou de micro-organismes, éventuellement présents dans un milieu liquide, en réalisant la liaison de l'antigène, de l'anticorps ou du micro-organisme à détec- o10 ter avec l'anticorps ou l'antigène fixé sur le support solide; la lecture de la réaction se fait généralement par comptage d'une radioactivité, mesure d'une activité enzy- matique ou mesure physique. Toutefois, les supports proposés dans l'Art antérieur présentent un certain nombre d'inconvénients et notamment ils fournissent une grande dispersion des résul- tats lors de la révélation de la réaction, ce qui ne permet pas une bonne reproductibilité, ni une bonne répétabilité des tests diagnostics. Afin d'améliorer la fixation de l'antigène ou de l'anticorps sur lesdits supports solides, on a proposé un traitement par irradiation du support, de manière à obtenir de meilleurs résultats d'enduction et notamment d'adsorption de l'anticorps ou de l'antigène à la surface du support solide. En particulier, la Demande de Brevet européen n 61 167 au nom de BEHRINGWERKE, décrit un pro- cédé de traitement de support par irradiation au moyen de rayons gamma; ce procédé améliore l'adsorption d'un ligand ou anti-ligand, à sa surface, dans le cadre d'une réaction immunologique. Néanmoins, les techniques industrielles d'irradiation ne permettent pas d'effectuer un traitement homogène du support solide à des coûts peu onéreux. La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un nouveau support solide, à usage de diagnostic -immunologique, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les moyens utilisés]usqu'à présent, notamment en ce qui concerne le coût, la reproduc- tibilité et la répétabilité des tests effectués en série. C'est également un but de l'invention de four- nir un procédé de traitement desdits supports solides. C'est, en outre, un but de l'invention d'appli- quer lesdits supports traités à des tests diagnostics immu- nologiques. La présente invention a pour objet un support solide à usage biologique, caractérisé en ce que ledit sup- port solide présente une polarité de surface modifiée par la fixation sur ladite surface d'un composé chimique entraînant la formation de radicaux libres et/ou de chaînes carbonées aliphatiques dérivées de structures cycliques métastables, ledit composé chimique étant de formule I, OH R R2 R R3 dans laquelle: Ri peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe N02, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant i à 4 atomes de carbone, une amine; R2 peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe NO2, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant i à 4 atomes de carbone, une amine; R3 peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe N02, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant 1 à 4 atomes de carbone, une amine, un groupe NO; R4 peut être un atome d'hydrogène, un groupe N02, un halogène, un groupe hydroxyle; R5 peut être un atome d'hydrogène, un groupe N02, un halogène, un groupe alkyleinférieur comprenant 1 à 4 atomes de carbone, un groupe hydroxyle. Les composés chimiques conformes à la présente invention, peuvent notamment être le phénol, le 2,4-dini- trophénol, le 2,5-dinitrophénol, le 2,6-dinitrophénol, le 2,4,6trinitrophénol, l'hydroquinone, le pyrocatechol, le pyrogallol, le resorcinol, le 2-bromophénol, le 3-bromophé- nol, le 4-bromophénol, le 2,4-dinitrorésorcinol, le dini- trocrésol, le 2-amino 4,6 dichlorophénol, l'iodophénol, le 2-aminophénol, le 3-aminophénol, le 4-aminophénol, le 1,2,4-benzenetriol, le chlorophénol, le méthylphénol, le 2- nitrophénol, le 3-nitrophénol, le 4-nitrophénol, le 4- nitrosophénol, le pentachlorophénol, le 2-amino 4,6-dini- trophénol, le 3,4,5,6-tétrabomo-o-crésol, le 2,4,6-tri- bromo-3-méthylphénol, le 2,4,6-tribromophénol, le 2,4,6- tri-chloro-3-méthylphénol, le 2,3,6-trichloro-4-méthylphé- nol, le 2,3,4-trichloro-6-méthylphénol, le 3,4,6-trichloro- 2-nitrophénol, le 2,4,5-trichlorophénol, le 2;4,6-trichlo- rophénol. Conformément à l'invention, lorsque le support solide est en plastique, il est choisi dans le groupe qui comprend les polystyrènes, les copolymères styréniques, le chlorure de polyvinyle, le polyméthacrylate de méthyle. L'invention trouve application avantageuse pour tout support solide choisi dans le groupe qui comprend les plaques à cuves multiples isolées et isolables les unes des autres, les tubes, les tubes à essai, les tiges et les billes. La présente invention a également pour objet un procédé de traitement d'un support solide à usage biolo- gique, en particulier dans le cadre de dosages immunolo- giques, caractérisé en ce que ledit support est mis en contact avec un composé chimique de formule I: OH R oH RSR R4-Y R R3 dans laquelle: Ri peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe N02, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant 1 à 4 atomes de carbone, une amine; R2 peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe N02, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant 1 à 4 atomes de carbone, une amine; R3 peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe NO2, un halogène, un groupe alkyle- inférieur comprenant 1 à 4 atomes de carbone, une amine, un groupe NO; R4 peut être un atome d'hydrogène, un groupe N02, un halogène, un groupe hydroxyle; R5 peut être un atome d'hydrogène, un groupe N02, un halogène, un groupe alkyleinférieur comprenant 'l à 4 atomes de carbone, un groupe hydroxyle. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, le support solide est mis en contact avec ledit composé chimique pendant un temps approprié et à une température appropriée, puis lavé et séché.. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, le temps de contact est de 2 à 10 minutes. Selon une autre disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, la température de traitement est com- prise entre la température ambiante et 85 C. Selon un autre mode de mise en oeuvre du pro- cédé conforme à la présente invention, le support solide est soumis à la fois à un traitement par ledit composé chi- mique et à un traitement d'irradiation, notamment par les rayons gamma. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le traitement d'irradiation est réalisé préalablement à la mise en contact avec le composé chi- mique. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le traitement d'irradiation est 26 29.916 réalisé postérieurement à la mise en contact avec le com- posé chimique. Un tel traitement du support solide a l'avan- tage, lors de l'application desdits supports au dosage immunologique, de permettre l'enduction du support par un antigène ou un anticorps à fixer, de manière reproductible et contrôlée, de sorte que lesdits supports trouvent une application avantageuse dans les procédés de détection d'un anticorps, d'un antigène ou d'un micro-organisme éven- tuellement présents dans un milieu liquide, suivant les- quels procédés, un anticorps ou un antigène fixé sur un support solide traité conformément au procédé de l'invention, est incubé avec ledit milieu liquide, la révélation de la réaction antigène-anticorps étant réali- sée, de manière connue par comptage d'une radio-activité, mesure d'une activité enzymatique ou mesure physique. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples du procédé conforme à l'invention ainsi qu'à des études comparatives avec les supports du commerce. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. La mise en contact du composé chimique et du support peut avoir lieu sur les surfaces préférentielles de celui-ci, soit par remplissage, soit par immersion du support. La mise en contact est de préférence de deux à dix minutes et à une température comprise entre la tempéra- ture ambiante et 85'C. Le support solide est ensuite lavé, afin d'éliminer un possible dépôt puis séché soit à température ambiante, soit à l'étuve. 2629.916 Exemple 1: Support solide en polystyrène traité au 2,4 dinitrophénol. Le polystyrène utilisé est notamment du poly- styrène cristal pour applications médicales et biochi- miques. La concentration du 2,4 dinitrophénol est de 3 g/l dans l'eau; le temps de contact entre le support solide et le 2,4 dinitrophénol est de 5 minutes à 80'C; on met en contact le support solide en poly- styrène avec le 2,4 dinitrophénol en immergeant ledit sup- port dans un bain de 2,4 dinitrophénol; le support solide est ensuite lavé trois fois de suite à l'eau et séché à température ambiante. Exemple 2: Support solide en polystyrène traité au 2,4,6 trinitrophénol. Le support est identique à celui de l'Exemple 1. La concentration du 2,4,6 trinitrophénol est de 12 g/l dans l'eau; le temps de contact est de 15 minutes à tem- pérature ambiante; le support solide est ensuite lavé à l'eau et séché à température ambiante. Exemple 3: Comparaison entre un support solide conforme à l'invention, enduit avec des anticorps antiapo- lipoprotéines B et d'un support du commerce, dans la détec- tion d'apolipoprotéine B. Un support selon l'Exemple 1, en polystyrène QE 716/20020 NJW lot 8C071 de BP Chimie, est enduit avec des concentrations de 1,25 - 2,5 - 5 et 10 pg/ml d'anti- corps antiapolipoprotéines B. Ces supports sont dénommés, ci-après, Support A. Les plaques de microtitration du commerce sont dénommées ciaprès Support X La révélation de la réaction est réalisée à l'aide d'un conjugué avec la peroxydase et d'un chromogène avantageusement constitué par l'orthophényldiamine; la lecture de l'absorbance étant réalisée au spectrophotomètre A 492 nm. Les résultats obtenus dans ces conditions sont résumés dans les tableaux I et II; ces résultats, pour une concentration donnée, sont la moyenne de 96 mesures. La répétabilité est mesurée par le coefficient de variation; elle est d'autant meilleure que le coeffi- cient est faible. Le bruit de fond étant négligeable, on ne considère ci-après que les absorbances. Premier essai: TABLEAU I |t I SUPPORT A SUPPORT i concontratlon oif t ceff t d'enduction au absorbanc cffCit bsorbnce coffct / _ de variation de variation en % en% 1,25 0,321 8,4 0,235 2,50 0,742 6,0 0,587 13,9 S.0 1,002 6,6 0,857 12,3 ,00 1,185 5,11,041 10,3 Deuxième essai: Il diffère du premier en ce que le matériau plastique utilisé pour la réalisation du support A, s'il est du polystyrène QE 716/20020 NJW, est un lot différent (lot 7F145). Le support X, pris en comparaison a été prélevé sur le même lot que celui du premier essai. TABLEAU II SUPPORT A SUPPORT X concentration d'enduction en absorbance coefficient absorbance coefficient pg/el de variation de variatlon en % en % 1,25 0,332 7,0 0,227 9,9 2,50 0,775 6,2 0,581 9,4 ,0 1,007 3,9 0,875 6,7 ,00 1,147 4,3 1,106 8,7 La comparaison des tableaux I et II permet de voir la bonne reproductibilité des tests réalisés avec les Supports A; en effet, les tests réalisés avec les supports A présentent moins de variations, moins de dispersions, une meilleure fiabilité et permettent une meilleure interpréta- tion des résultats que les supports X. Exemple 4: Comparaison d'une détection de meningocoques A au moyen d'un support conforme à l'Exemple 2 enduit d'anticorps antimeningocoques et au moyen d'un support du commerce: - un support selon l'Exemple 2 est enduit avec des concentrations de 0,15 à 10 mg/ml d'antimeningo- coques A; ces supports sont ci-après dénommés supports A, - les supports du commerce sont dénommés support X. TABLEAU III i concentration d'enductlon e SUPPORT A SUPPORT X en mg/ml absorbance coefficient absorbance coefficient de variation de variation en % en % 0,15 0,235 9,1 0,042 8,9 O0,30 0,302 8,2 0,123 9,0 0,60 0,318 7,5 0,204 9,0 1,25 0,264 7,0 0,282 8,4 2,5 0,212 3,4 0,333 8,5 S 0,161 4,3 0,274 6,5 10 0,132 3,9 0,202 3,9 Les résultats du Tableau III montrent que pour les concentrations d'enduction les plus faibles, on obtient, avec les supports A, une absorbance élevée, alors que pour les supports X, l'absorbance est plus faible à de telles concentrations. Il en résulte une sensibilité accrue des dosages utilisant comme supports, les supports A. De plus, en ce cas, l'utilisation de concentrations faibles en produit d'enduction présente un intérêt économique certain. On constate également qu'avec les supports A, les coeffi- cients de variation sont plus faibles que ceux obtenus avec les supports X. Il en résulte une meilleure répétabilité des mesures faites avec les supports A. Exemple 5: Etude de la conservation de l'activité du support solide conforme à l'invention: Un support dit A en polystyrène cristal à usage médical et biochimique (STYRON 648267 de DOW CHEMICAL, marque déposée) est traité au 2,4-dinitrophénol dans les mêmes conditions que dans l'Exemple 1. Des anticorps antiapolipoprotéines B sont fixés à deux, quatre et six mois après le traitement des supports A. Les supports X témoins, après stockage dans les mêmes conditions que les supports A sont enduits et révélés parallèlement. / / I /, / /i / / I A./ / TABLEAU IV e f Le Tableau IV montre que la répétabilité des tests utilisant les supports A (coefficient de -variation faible) est stable au cours du temps. Ào fible eststabe a cur du temps Exemple 6: Rôle de l'irradiation avant ou après le traitement chimique: Dés supports en polystyrène cristal STYRON 648267 de DOW CHEMICAL (marque déposée) subissent différents traitements: - les supports A sont traités au 2,4 dinitro- phénol dans les mêmes conditions que celles de l'Exemple 1, - les supports B sont irradiés par des rayons gamma à 2,5 Mrad, - les supports C subissent, dans un premier temps, un traitement au 2,4 dinitrophénol, dans les mêmes conditions que celles de l'Exemple 1, puis dans un deuxième temps, sont irradiés de la même manière que les supports B, - les supports D sont dans un premier temps, irradiés de la même manière que les supports B, puis dans un deuxième temps sont traités au 2,4 dinitrophénol dans les mêmes conditions que celles de l'Exemple 1. Les différents supports A, B, C et D sont enduits d'anticorps antiapolipoprotéines B comme précisé dans l'Exemple 3. / / TABLEAU V . i!À O' O NON C s O N._ u> 44: Ci. de variation,ell e est d'autant meilleure que le coeffi- cient est faible. Seuls les supports B ne subissent aucun traitement chimique conforme à l'invention;ceux-ci pré- 2 4 - oc = c N N ' so - 'I n La abiite stmsreprl ofiin de variation; elle est d'autant meilleure que le offi- centest aibe. eulslessuport e '-suisnaun trateencimqu cofome 'ivetio;cexi rc sentent, notamment aux concentrations d'enduction faibles, des absorbances faibles. Les supports A, C et D (ayant subis un traitement chimique conforme à l'invention) pré- sentent une absorbance élevée, donc une sensibilité de mesure supérieure à celle des supports B. Comme le montrent les résultats obtenus avec les supports C et D, il importe peu que l'irradiation soit réalisée avant ou après le trai- tement chimique. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes.de réalisation, de mise en oeuvre et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar- ter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1') Support solide à usage biologique, caracté- risé en ce que ledit support solide présente une polarité de surface modifiée par la fixation sur ladite surface d'un composé chimique entraînant la formation de radicaux libres et/ou de chaînes carbonées aliphatiques dérivées de struc- tures cycliques métastables, ledit composé chimique étant de formule I, OH R5 R1 R R 2 S R! R3 dans laquelle: Ri peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe NO2, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant i à 4 atomes de carbone, une amine; R2 peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe NO2, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant 1 à 4 atomes de carbone, une amine; R3 peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe NOz, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant i à 4 atomes de carbone, une amine, un groupe NO; R4 peut être un atome d'hydrogène, un groupe NO2, un halogène, un groupe hydroxyle; Rs peut être un atome d'hydrogène, un groupe NO2, un halogène, un groupe alkyleinférieur comprenant 1 à 4 atomes de carbone, un groupe hydroxyle. 2') Support solide, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, lorsqu'il est en plastique, il est choisi dans le groupe qui comprend les polystyrènes, les copolymères styréniques, le chlorure de polyvinyle, le polyméthacrylate de méthyle. 3') Procédé de traitement d'un support solide à usage biologique, en particulier dans le cadre de dosages immunologiques, caractérisé en ce que ledit support est mis en contact avec un composé chimique de formule I: OH R R k R "R 4 2 R R3 dans laquelle: Ri peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe NO2, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant I à 4 atomes de carbone, une amine; R2 peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe N02, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant 1 à 4 atomes de carbone, une amine; R3 peut être un atome d'hydrogène, un groupe hydroxyle, un groupe NO2, un halogène, un groupe alkyle inférieur comprenant 1 à 4 atomes de carbone, une amine, un groupe NO; R4 peut être un atome d'hydrogène, un groupe N02, un halogène, un groupe hydroxyle; Rs peut être un atome d'hydrogène, un groupe N02, un halogène, un groupe alkyleinférieur comprenant i à 4 atomes de carbone, un groupe hydroxyle. 4') Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que le support solide est mis en contact avec ledit composé chimique pendant un temps approprié et à une température appropriée, puis lavé et séché. ) Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce que le temps de contact est de 2 à 10 minutes. 6") Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce que la température de traitement est comprise entre la température ambiante et 85 C. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 3 à 6, caractérisé en ce que le support solide est soumis à la fois à un traitement par ledit composé chimique et à un traitement d'irradiation, notamment par les rayons gamma. 8') Procédé selon la revendication 7, caracté- risé en ce que le traitement d'irradiation est réalisé préalablement à la mise en contact avec le composé chi- mique. 9') Procédé selon la revendication 7, caracté- risé en ce que le traitement d'irradiation est réalisé pos- térieurement à la mise en contact avec le composé chimique.