Brevet FR2633296A1 — publié le 19891229

Molécules peptidiques à action sur les germes à Gram positif La présente invention concerne les domaines de la médecine humaine et vétérinaire, phytosanitaire et de l'industrie alimentaire et a pour objet des molécules peptidiques à action sur les germes à Gram positif. Il est connu, depuis longtemps, que les insec- tes sont capables de réactions immunitaires très effica- ces. A titre d'exemple, il est possible de réaliser tou- tes sortes d'interventions chirurgicales sur des insec- tes sans prendre les moindres précautions d'asepsie, ces opérations n'entraînant jamais de septicémie. Ceci est dû au fait que la réponse immunitaire des insectes fait intervenir, dans un délai court, à savoir de l'ordre de quatre à six heures, la production de plusieurs peptides antibactériens présentant généralement un large spectre d'action. Ainsi, il a été isolé et caractérisé, chez des Lépidoptères, deux familles de peptides antibactériens induits au cours de la réponse immunitaire, à savoir les cécropines et les attacines. Un travail sur un autre groupe d'insectes, les Diptères, a permis d'isoler et de caractériser trois mo- lécules, très voisines entre elles et très différentes des cécropines, ces molécules étant des antibiotiques tout à fait nouveaux qui sont synthétisées par lesdits insectes dans les heures suivant une blessure. Ces trois molécules sont connues sous la dénomination diptéricine A, B et C et sont des peptides antibactériens basiques de 9 K dont le spectre d'action est large au sein des bactéries à Gram négatif (à titre d'exemple, la masse moléculaire de la diptéricine A est de 8621 Da). Cependant, ces nouvelles molécules, à l'état purifié, ne sont pas ou sont seulement faiblement acti- ves sur les germes à Gram positif. Les diptéricines tuent les bactéries en phase exponentielle de croissance et le résultat de leur action est une lyse cellulaire. La présente invention a pour objet des molécu- les peptidiques à action sur les germes à Gram positif. Conformément à l'invention, ces molécules pré- sentent la définition suivante: peptides basiques de 40 acides aminés compor- tant 6 cystéines engagées dans 3 ponts disulfure, syn- thétisées par des larves de l'insecte Phormia terranovae après immunisation, ces molécules ayant une activité contre des germes à Gram positif. L'invention sera mieux comprise grâce à la des- cription ci-après, qui se rapporte à un mode de réalisa- tion préféré, donné à titre d'exemple non limitatif, et expliqué avec référence aux dessins schématiques annexés, dans lesquels: la figure 1 est un diagramme représentant la séparation par chromatographie échangeuse de cations des protéines à activité anti-Micrococcus luteus, synthétisées par des larves de Phormia terranovae immunisées; les figures 2 et 3 sont des diagrammes représentant la purification de deux molécules peptidiques par chromato- graphie liquide à haute performance en phase inverse, et la figure 4 représente un spectre antibactérien d'une molécule conforme à l'invention. L'isolement et la caractérisation des nouvelles molécules peptidiques conformes à l'invention s'effec- tuent de la manière suivante: Des larves de troisième stade du Diptère Phormia terranovae sont blessées par piqûre à l'aide d'une aiguille préalablement contaminée dans une culture bactérienne, par exemple Enterobacter cloacae en phase exponentielle de croissance, afin qu'elles entament leur processus d'immunisation. Au bout de 24 heures, du sang est prélevé par incision de la cuticule et les cellules sanguines sont enlevées par centrifugation à 36000 g pendant 20 minutes à 4 C. Le surnageant obtenu est chauffé, ensuite, pendant 4 minutes à 100 C, après addi- tion d'acide acétique. Après centrifugation des protéi- nes thermolabiles précipitées, le surnageant est appli- qué sur une colonne de chromatographie échangeuse de ca- tions équilibrée avec un tampon d'acétate d'ammonium de mM et de pH 6,8. Après rinçage de la colonne avec le même tampon, les protéines fixées sont éluées par un gradient linéaire d'une solution d'acétate d'ammonium de molarité comprise entre 40mM et 500mM. Par cette techni- que connue, il est possible d'isoler des peptides actifs contre Micrococcus luteus par test d'étalement sur agar ou sur gélose ensemencés de germes bactériens. La figu- re 1 des dessins annexés représente le diagramme de sé- paration correspondant, dans lequel l'activité antibac- térienne en millimètres de diamètre d'étalement est in- diquée sur l'ordonnée de gauche, la concentration en tampons, en mm. 10 2 sur l'ordonnée de droite et le volume de tampons, en ml. 10 2 en abscisse. Ensuite, les molécules obtenues sont filtrées sur cartouche connue sous la dénomination commerciale Sep Pack C18 Waters et purifiées en chromatographie li- quide à haute performance en phase inverse, couramment appelée HPLC phase inverse sur une colonne connue du ty- pe Baker-Bond C18 WP avec élution par gradient linéaire d'acétonitrile. Les figures 2 et 3 des dessins annexés représentent l'évolution des diagrammes de purification de deux molécules conformes à l'invention en fonction du temps de rétention indiqué en abscisse et du taux d'acé- tonitrile. Le procédé décrit ci-dessus permet l'obtention, sous forme pure, de protéines anti-Micrococcus luteus représentées par les pics A et B aux figures 1 à 3. Conformément à une caractéristique de l'inven- tion, la molécule présente la séquence peptidique sui- vante: 1 10 20 30 * 40 ATCDLLSGTG INHSACAAHC LLRGNRGGYC NGKGVCVCRN (A) Selon une autre caractéristique de l'invention, la molécule présente la séquence peptidique suivante: i 10 20 30 * 40 ATCDLLSGTG INHSACAAHC LLRGNRGGYC NRKGVCVCRN (B) Les séquences peptidiques représentées ci-dessus se caractérisent par la présence de six cys- téines en position homologue, tous les résidus étant identiques à l'exception du résidu 32 désigné par un *, qui est une glycine dans la première molécule et une ar- ginine dans la deuxième molécule. Ce remplacement expli- que le comportement différentiel des molécules précitées (A) et (B) en chromatographie échangeuse de cations, la dernière molécule (B) citée présentant un résidu, l'ar- ginine, ayant plus de charges positives. Les pics A et B. de la figure 1 des dessins annexés correspondent respec- tivement à la première et à la seconde molécules préci- tées. Une mesure de la masse chimique des molecules précitées (A) et (B) a été réalisée par spectrométrie de masse en mode à bombardement par atome rapide positif en utilisant une résolution suffisamment basse, R étant égal à 1000, afin que le massif pseudo-moléculaire pro- toné apparaisse comme un pic homogène. Dans ces condi- tions, la masse moléculaire mesurée pour la molécule (A) s'est établie à 4060,22 Da pour une masse attendue (cal- culée) de 4060,21 Da et celle mesurée pour la molécule (B) s'est établie à 4159,16 Da pour une masse attendue de 4159,35 Da. Cette mesure correspond à la'forme oxydée des six cystéines, à savoir comporte six unités de masse en moins par rapport à la structure moléculaire calculée à partir de la structure primaire établie, prouvant que trois ponts cystéines sont formés. Une mesure de masse mono-isotopique, pour la molécule (A) a permis d'établir une masse de 4057,90 Da pour une masse attendue de 4057,81 Da. L'activité des molécules peptidiques conformes à l'invention a été testée sur différentes souches bac- tériennes par un test d'ensemencement sur agar ou gélo- se, A cet effet, un spectre antibactérien de la molécu- le (A) a été réalisé à raison de 800 ng par essai sur les germes à Gram positif suivants: 1. Micrococcus luteus, et 2. Bacillus megaterium 3. à 7. Bacillus subtilis, suivant souches S3, Mo201, 6633, QB122 et QB935, r 8. à 10. Bacillus thuringiensis, suivant souche Sm r Rif r et 53137, et 11. Staphylococcus aureus, ainsi que sur 12. à 14. Escherichia coli, suivant souche D 31, BZB1011 et 7624, 15. Enterobacter cloacae (souche 12) et 16. Pseudomonas aeruginosa. Le spectre antibactérien obtenu, représenté à la figure 4 des dessins annexés, a permis de constater que les molécules conformes à l'invention sont actives sur les germes à Gram positif: Micrococcus luteus et Bacillus megaterium, de manière très efficace et, avec une efficacité un peu moindre sur les autres germes à Gram positif, à savoir Bacillus subtilis, Bacillus thu- ringiensis et Staphylococcus aureus, alors qu'elles ne sont pas actives sur les germes à Gram négatif: Escherichia coli, Enterobacter cloacae et Pseudomonas aeruginosa. Les nouvelles molécules peptidiques conformes à l'invention peuvent avantageusement être utilisées pour l'obtention d'un médicament. Un tel médicament peut a- vantageusement servir comme agent antibactérien. Selon une autre caractéristique de l'invention, les nouvelles molécules peptidiques ont une action bac- téricide sur les germes à Gram positif. Cette caracté- ristique a été démontrée par une série d'expériences in vitro. La cible principale des molécules conformes à l'invention est la membrane cytoplasmique des bactéries. Ces molécules sont bactéricides mais ne sont pas bacté- riolytiques. Les molécules conformes à l'invention, qui pourraient avantageusement être appelées phormicines (du nom de l'insecte Phormia terranovae), sont de nouveaux antibiotiques de taille relativement petite à spectre d'action spécifique pour les germes à Gram positif. Ces molécules sont plus particulièrement applicables dans les domaines de l'industrie alimentaire, phytosanitaire et de la médecine humaine et vétérinaire. Leur utilisa- tion dans le domaine agro-alimentaire, en particulier comme peptides antibactériens inductibles d'insectes est particulièrement intéressante. Les gènes des molécules peptidiques conformes à l'invention peuvent également être clones et les gènes (ou les ADN complémentaires)peuvent être introduits dans plusieurs systèmes d'expression tels que la levure ou le baculovirus, ou être produites en masse en fermenta- teurs. Ces molécules peuvent également être utilisées dans des procédés de mutagénèse afin d'isoler des mu- tants ayant de nouvelles propriétés antibactériennes. De même, les gènes codant pour ces molécules peuvent être introduits dans des plantes afin d'augmenter leur résis- tance à des agents pathogènes. Les molécules peptidiques selon l'invention constituent, en outre, les compléments indispensables d'une stratégie biotechnologique basée sur l'utilisation des cécropines et des diptéricines qui agissent sur des germes à Gram négatif. Par ailleurs, leur faible taille et leur résistance au traitement à la chaleur et aux conditions acides présentent également un aspect très favorable pour une utilisation biotechnologique. De plus, ces nouvelles molécules peuvent agir, dans le do- maine de l'industrie alimentaire, comme agent empêchant la contamination par des germes à Gram positif, pendant la fabrication et, après la fabrication, comme agent conservateur. Dans le domaine phytosanitaire, ces molé- cules peuvent être utilisées en lieu et place des pro- duits chimiques usuels. Dans le cas de sélection d'analogues, après mutagénèse du gène, pour une adaptation à des besoins spécifiques des industries agro-alimentaires et pharma- ceutiques, ces analogues peuvent être intégrés dans des souches de levure ou de bactéries lactiques couramment utilisées en production, afin d'éliminer les contamina- tions bactériennes nocives parfois présentes dans ces produits. Dans le domaine phytosanitaire, les gènes cor- respondant aux mutants donnant des peptides efficaces, peuvent éventuellement être intégrés dans le génome de plantes choisies afin de les rendre plus résistantes à des maladies d'origine bactérienne. Bien entendu, la présente invention ne se limi- te nullement aux indications et aux applications décri- tes. D'autres indications et applications sont possi- bles, ainsi que des modifications aux indications et aux applications décrites, sans sortir pour autant du domai- ne de protection de l'invention. REVENDICATIONS 1. Molécules peptidiques caractérisées en ce qu'elles présentent la définition suivante: peptides basiques de 40 acides aminés compor- tant 6 cystéines engagées dans 3 ponts disulfure, syn- thétisées par des larves de l'insecte Phormia terranovae après immunisation, ces molécules ayant une activité contre des germes à Gram positif. 2. Molécule suivant la revendication 1, carac- térisée en ce qu'elle présente la séquence peptidique suivante: 1 10 20 30 * 40 ATCDLLSGTG INHSACAAHC LLRGNRGGYC NGKGVCVCRN (A) 3. Molécule suivant la revendication 1, carac- térisée en ce qu'elle présente la séquence peptidique suivante: 1 10 20 30 * 40 ATCDLLSGTG INHSACAAHC LLRGNRGGYC NRKGVCVCRN (B) 4. Utilisation de molécules suivant l'une quel- conque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un médicament. 5. Utilisation de molécules suivant l'une quel- conque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un produit de traitement phytosanitaire. 6. Utilisation de molécules suivant l'une quel- conque des revendications 1 à 3 comme agent antibacté- rien. 7. Utilisation de molécules suivant l'une quel- conque des revendications 1 à 3 comme agent antibacté- rien sur les germes à Gram positif. 8. Utilisation de molécules suivant l'une quel- conque des revendications 1 à 3 comme agent bactéricide. 9. Utilisation de molécules suivant l'une quel- conque des revendications 1 à 3 comme agent antibacté- rien sur les germes à Gram positif dans le domaine de l'industrie alimentaire.