Brevet FR2632970A1 — publié le 19891222

La présente invention est relative à un -procédé et à une installation pour l'obtention de plasmides et cosmides entiers. Les plasmides sont des molécules d'ADN double brin, circulaires, extrachromosomales, que l'on trouve dans beaucoup de souches bactériennes. Leur taille varie de 1 kbase à 200-300 kbases et est' beaucoup plus petite que celle des chromosomes, par exemple. Dans l'Art antérieur, il est connu de séparer les plasmides présents dans diverses bactéries, par cen- trifugation. La centrifugation des cellules bactériennes, ne permet d'obtenir qu'un rendement faible en plasmides, de l'ordre de 20 %. Or, les plasmides présentent, à l'heure actuelle, de nombreuses applications, notamment comme 1 sondes d'hybridation ou comme vecteurs. Le besoin en plas- mides devenant de plus en plus important, la possibilité d'obteni'r des plasmides entiers avec un rendement très é'levé, présente donc un intérêt pratique certain pour les industries concernées. La Demanderesse s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un procédé spécifique d'obtention de plasmides et cosmides entiers, qui ne présente pas les inconvénients des procédés proposés dans l'Art antérieur, notamment en ce qur'il permet d'obtenir un' rendement proche de 100 % en plasmides et cosmides entiers, et en ce qu'il est facile à mettre'en oeuvre et peu coQteux, et à une ins- tallation automatisée pour la mise en oeuvre de ce procédé. La présente invention- a pour objet un procédé d'obtention de plasmides et de cosmides entiers présents 3o dans des cellules bactériennes, cultivées dans un milieu approprié, caractérisé en ce qu'au cours d'une première étape lesdites cellules sont séparées de leur milieu de culture, en ce qu'au cours d'une deuxième étape, lesdites cellules sont incluses dans un gel approprié,- leurs parois étant alors lysées par mise en contact avec un réactif ap- proprié, puis lesdites cellules incluses sont solubilisées à l'aide d'au moins un réactif approprié, et en ce qu'au cours d'une troisième étape, lesdites cellules solublli- sées, incluses dans ledit gel, sont soumises à un champ électrique approprié, provoquant leur migration élec- trophorétlque, laquelle isole spécifiquement les plasmides et cosmides entlers présents dans lesdites cellules. La lyse des parois cellulaires est réalisée de manière connue et classique à l'aide de lysozyme. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé, la lyse des parois cellulaires est réalisée avant la solidifi- cation du gel d'inclusion. Selon un autre mode de mise en oeuvre du pro- cédé, la lyse des parois cellulaires est réalisée après so- lidiflcatlon du gel d'inclusion. Selon un autre mode de mise en oeuvre, le gel d'inclusion est de l'agarose à une concentration comprise entre 0,1 % et 5%, sans que ces indications aient, bien en- tendu, quelque caractère limitatif que ce soit. Selon un autre mode de mise en oeuvre du pro- cédé, la solubilisation est réalisée chimiquement ou bio- chimiquement à l'aide d'un réactif choisi dans le groupe qui comprend des enzymes protéolytiques appropriées et des détergents solvants des lipides. On peut citer notamment comme enzyme, la protéinase K, la pronase, ou toute autre protéase appro- priée; on peut citer comme détergent approprié, notamment le dodécyl sulfate de sodium (SDS); l'association protél- nase K-SDS, par exemple, est très avantageuse. Selon une disposition avantageuse de ce mode de 0 mise en oeuvre, ladite soluilisation est réalisée avant solidification du gel. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ladite solubilisation est réalisée après solidification du gel. -. Selon un autre mode de mise en oeuvre du pro- cédé, la durée de migration électrophorétlque est comprise entre deux et douze heures. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la migration electrophorétique est réalisée de manière connue en champs pulsés. Dans un tel mode d'ekecution, on prévoit, bien entendu, le refroidissement du système de migration par des moyens de réglage thermique, lesquels servent avantageuse- ment aussi, en cas de besoin, lors de la solubllisation des cellules, lorsque ceci est nécessaire. La présente invention a également pour objet une installation pour l'obtention de plasmides et cosmides entiers présents dans des cellules bactériennes, carac- térlsée en ce qu'elle comprend au moins un moyen de sépara- tion des cellules de leur milieu de culture, au moins une enceinte de traitement, au moins un gel d'électrophorèse servant de milieu demigration électrophorétique, adjacent et associé à ladite enceinte de traitement, au moins un moyen d'application d'un champ électrique provoquant la migration électrophorétique, des moyens amovibles et/ou éclipsables de mise en- communication dudit gel d'électrophorèse avec ladite enceinte de traitement et un microprocesseur d'automatisation pour ia commande séquen- tlelle dudit moyen de séparation, desdits moyens de mise en communication et dudit moyen d'application du champ élec- trique. Selon un mode de réalisation avantageux, l'installation comprend en outre au moins une enceinte de 3o culture desdites cellules et un moyen de transfert desdites cellules de l'enceinte de culture dans l'enceinte de trai- tement, ledit moyen de transfert comportant des tubes de transfert reliés d'une part, à l'enceinte de culture, et d'autre part, à l'enceinte de traitement et un dispositif à pression différentielle entre ladite enceinte de culture et ladite enceinte de traitement. Selon une disposition de ce mode de réalisa- tlon, ledit dispositif est une pompe péristaltique. Selon une autre disposition de ce mode de réa- lisation, ledit dispositif est un surpresseur relié à l'enceinte de culture. Selon encore une autre disposition de ce mode de réalisation, ledit dispositif est une pompe à vide re- liée à l'enceinte de traitement. Selon un autre mode de réalisation de l'installation, l'enceinte de traitement est avantageuse- ment un bac, dont le fond comporte le moyen de séparation constitué par une membrane de porosité appropriée à la sé- paratlon de molécules de poids moléculaire supérieur à 80 kDa. Dans un tel mode de réalisation, le bac com- prend trois parois fixes dont l'une, adjacente à une des électrodes du moyen d'application d'un champ électrique, est une membrane de dialyse et les moyens amovibles de mise en communication du gel d'électrophorèse avec le bac de traitement sont alors, le plus simplement, une réglette matérialisant la quatrième paroi dudlt bac, mise en place pour la coulée du gel dans le bac de traitement. Dans une variante, le bac est limité par quatre réglettes amovibles simultanément, mises en place pour -la coulée du gel et une des électrodes du moyen d'application d'un champ électrique est alors, éventuellement, adjacente & une membrane de dialyse. Dans une réalisation préférée, la pompe à vide assurant le transfert des cellules de l'enceinte de culture ú0 audit bac de traitement fournit simultanément la dépression d'aspiration du milieu de culture au travers de ladite mem- brane. L'invention comprend avantageusement un détec- teur localisant l'emplacement des plasmides et cosmides en- z5 tiers après ladite migration électrophorétique. On-obtient ainsi, par la combinaison de moyens de la présente invention, une séparation automatisée rapide et facile à mettre en oeuvre de plasmides et de cosmldes entlers. Outre les dispositions qui précèdent, l'inven- tlon comprend encore d'autres dispositions, qui res- sortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à l'in- vention et 'à une description 'détaillée de l'installation o avec référence au dessin annexé, dans lequel: - la figure 1 représente une vue schématique illustrant le procédé de l'invention - la figure 2 représente une vue très schéma- tique, en coupe longitudinale, illustrant un mode de réali- 1_ sation d'une partie de l'installation; - la figure 3 représente une vue très schéma- tlque, en coupe longitudinale, illustrant un autre mode de réalisation d'une partie de l'installation. Il doit être bien entendu, toutefois, que ce dessin et les parties descriptives correspondantes, ainsi que les exemples, sont donnés uniquement à titre d'illus- tration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitationD. Le procédé selon l'invention, d'obtention de plasmides et de cosmides est illustré sur la figure 1. Des bactéries hôtes de plasmides ou de cosmides sont sélec- tionnées et cultivées de manière appropriée, dans une en- ceinte de culture cellulaire 1 comportant un certain nombre de compartiments 1 à ln permettant la croissance en paral- tèle de cellules bactériennes différentes hébergeant des plasmides ou cosmides différents. Après avoir obtenu une concentration cellulaire convenable, lesdites cultures sont. transférées dans le bac de traitement 4 par l'intermédiaire des moyens de transfert 2, qui dans la réalisation repré- sentée sont constitués par des tubes 21 et une pompe à vide 6, le bac de traitement 4 étant alors muni d'un couvercle t non représenté. La détermination de la concentration cellu- laire peut être réalisée de diverses manières et notamment, mals non limitatlvement, par une mesure colorimétrique. Les cellules sont ensuite séparées de leur milieu de culture, le moyen de séparation étant représenté par le fond du bac de traitement 4 qui est une membrane appropriée 5, par exemple, et de manière non llmitatlve, une membrane d'ul- trafiltratlon en "Teflon" (une marque déposée de la Société Du Pont de Nemours) qui retient notamment les éléments de plus de 80 kDa. La pompe à vide 6 assure à la fois le transfert des cellules de l'enceinte de culture au bac de traitement et fournit également la dépression d'aspiration et d'éva- cuatlon du milieu de culture au travers de ladite membrane. Une série de pipettes 3 i à 3 n reliée aux tubes 21 permet l'introduction des réactifs et notamment de l'agarose, qul est alors introduit à chaud, à une température d'environ C et permet l'inclusion desdltes cellules; les parois cellulaires sont ensuite lysées, par exemple à l'aide de lysozyme; ce dernier est maintenu en contact avec lesdites cellules pendant 5 à 10 minutes. Cette lyse peut être réa- lisee indifféremment avant solidification du gel d'inclusion, à une température de l'ordre de 37 C ou après solidification du gel d'inclusion. Les cellules sont alors solubilisées, la solu- bilîsatlon pouvant être réalisée indifféremment avant ou après solidification du gel d'inclusion, à l'aide d'une enzyme appropriée, éventuellement associée à un détergent, par exemple, mais non lîmitativement de la protéinase K et du SDS. Après la solubilisation, la migration électrophorétique, en champs pulsés ou non, est réalisée; le bac de traitement 4 est alors relié à la plaque de gel d'électrophorèse 7 par le retrait de la paroi mobile 11 qui dans la réalisation représentée est une des parois amo- vibles du bac de traitement 4, et l'espace entre le gel contenant les cellules traitées et le gel d'électrophorèse est rempli par du gel d'électrophorèse. La paroi 12 du bac- de traitement 4 est une membrane de dialyse. Des électrodes 8 permettent l'obtention d'un champ électrique approprié à la migration électrophorétique recherchée. Le bac de traitement 4 et la plaque de gel d'électrophorèse 7 sont placés dans un récipient 30, dan.s lequel se trouve le tampon d'électrophorèse et les élec- trodes 8. Un détecteur 9 permet de localiser l'emplacement de migration des plasmides et des cosmides. Le procédé conforme àa l'invention permet dans un temps court, compris entre deux et douze heures, d'obtenir spécifiquement les plasmides et les cosmides, ceux-ci migrant sur le gel alors que, d'une part, les chro- mosomes restent au niveau du dépôt et que; d'autre part, les produits de la solubilisation (peptides,...). ne sont pas retenus par le gel. La figure 2 représente une vue très schéma- tlque, en coupe longitudinale, d'un mode de réalisation d'une partie de l'installation et comporte un bac de trai- tement 4 comprenant une paroi amovible 11 et trois parois fixes, dont celle, qui est adjacente -à l'électrode 8 se trouvant près du bac de traitement 4, est une membrane de dialyse 12. Le réceptacle 30 du bac de traitement 4 et du gel d'électrophorèse 7 comprend: - un support approprié 13, sur lequel se trouve le fond du bac de traitement 4, sous forme d'une membrane appropriée 5, par exemple et de manière non limitative, une o membrane d'ultrafiltration en "Teflon" qui retient notam- ment les éléments de plus de 80 kDa; - le moyen d'application du champ électrique, représenté par les électrodes 8. Au moyen de séparation 5 des cellules de leur milieu de culture, est ass6ciée la pompe à vide 6. 2632'970 Un détecteur 9 permet de locallser -l'emplace- ment de migration des plasmides et des cosmldes. La figure 3 represente une vue tres schéma- tique, en coupe longitudinale, d'un autre mode de réallsa- tion d'une partie de l'installation et comporte un bac-de traitement 4 comprenant deux parois amovibles 11 et deux parois fixes. Le réceptacle 30 du bac de traitement 4 et du gel d'électrophorèse 7 comprend: - un support approprié 13, sur lequel se trouve le fond du bac de traitement 4, sous forme d'une membrane appropriée 5, par exemple et de manière non limitative, une membrane d'ultraflltration en "Teflon" qui retient notam- ment les éléments de plus de 80 kDa; l - e moyen d'application du champ électrique, représenté par les électrodes 8. Au moyen de séparation 5 des cellules de leur milieu de culture, est associée la pompe à vide 6. Un détecteur 9 permet de localiser l'emplace- 2 ment de migration des plasmides et des cosmides. De telles installations permettent la mise en oeuvre du procédé d'obtention de plasmides et de cosmides conforme à l'invention. Exemple 1: 21- On cultive des bactéries contenant- le plasmide à isoler, dans un milieu LB (bactotryptone, bacto yeast extract et NaCl) contenant un antibiotique, à 37'C dans l'enceinte de culture 1, puis on transfère lesdites bacté- ries dans le bac de traitement 4 et on élimine le milieu de culture en filtrant par passage sur la membrane 5, en faisant agir la pompe à vide 6. On coule de l'agarose à 1 %, maintenu à 37VC dans le b.c de traitement 4; on laisse refroidir 15 minutes, afin que l'agarose contenant les bactéries polymérise et on incube le bloc obtenu 10 minutes à température ambiante dans une solution de lysozyme à 6 mg/ml. On ajoute une solution de protéinase K & 5 mg/ml et du sodium dodécyl sulfate à 10 % et par mise en oeuvre des moyens de réglage thermique, on incube 1- heure a 42-C. Les cellules, ainsi traitées, sont prêtes à la migration élec- trophorétlque qui est effectuée pendant 3 heures à 70 volts (environ 60 mA); on obtient alors, les plasmides désirés, comme représentés sur la Figure 4a (flèches); la colonne 4b représente un marqueur de taille (phage lambda digéré par HindIII). Exemple 2: *= On procède comme dans. l'Exemple 1, la migration. étant effectuée.pendant douze heures à 10 volts (environ 9 mA); on obtient alors les-plasmides désirés comme repré- sentés sur la Figure 5b (flèches); la colonne 5a repré- sente un- marqueur de taille (phage lambda -digéré par - HindIII)_. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, * l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'applications qui vien- nent d'être décrits de façon pl.us explicite; elle en em- G brasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. 1$ REVENDICATIONS 1) Procédé d'obtention de plasmides et de cos- mides entiers présents dans des cellules bactériennes, cul- tlvées dans un milieu approprié, caractérisé en ce qu'au cours d'une première étape lesdites cellules sont séparées de leur milieu de culture, en ce qu'au cours d'une deuxième étape, lesdites cellules sont incluses dans un gel appro- prié, leurs parois étant alors lysées par mise en contact avec un réactif approprié, puis lesdites cellules incluses sont solubilisées à l'aide d'au moins un réactif approprié, et en ce qu'au cours d'une troisième. étape, lesdites cel- lules solubilisées, incluses dans ledit gel, sont soumises à un champ électrique approprié provoquant leur migration électrophorétlque, laquelle isole spécifiquement les plas- mides et cosmides entiers présents dans lesdites cellules. 2) Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la lyse des parois cellulaires est réalisée avant la solidification du gel d'inclusion. 3;) Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la lyse des parois cellulaires est réalisée après solidification du gel d'inclusion. 4:) Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que le gel d'inclusion est de l'agarose à une concentration comprise entre 0,1 % et %. ) Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce que la solubilisation est réalisée chimiquement ou biochimiquement à l'aide d'un ré- actif choisi dans le groupe qui comprend des enzymes pro- o téolytiques appropriées et des détergents solvants des li- pides. 6V) Procédé selon la revendication 5, caracté- risé en ce que ladite solubilisation est réalisée avant solidification du gel. ii 7:) Procédé selon la revendication 5, caracté- risé en ce que ladite solubilisation est réalisée après solidification du gel. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7, caractérisé en ce que la durée de migration électrophorétique est de deux à six heures. 9 ) Procédé selon la revendication 8, caracté- risé en ce que la migration électrophorétique est réalisée de manière connue en champs pulsés. O O10') Installation pour l'obtention de plasmides et cosmides entiers présents dans des cellules bacté- riennes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un moyen de séparation (5) des cellules de leur milieu de cul- ture, au moins une enceinte de traitement (4), au moins un lb gel d'électrophorèse (7) servant de milieu de migration électrophorétique, adjacent et associé à ladite enceinte de traitement, au moins un moyen d'application d'un champ électrique (8) provoquant la migration. électrophorétique, des moyens amovibles et/ou éclipsables (11) de mise en com- munication dudit gel d'électrophorèse avec ladite enceinte de traitement et un microprocesseur d'automatisation pour la commande séquentielle dudit moyen de séparation, desdits moyens de mise en communication et du moyen d'application du champ électrique. 11) Installation selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une enceinte de culture (1) desdites cellules et un moyen de transfert (2) desdites cellules de l'enceinte de culture dans l'enceinte de traitement, ledit moyen de transfert _ comportant des tubes de transfert (21) reliés d'une part, à l'enceinte de culture, et d'autre part, à l'enceinte de traitement et un dispositif à pression différentielle entre l'enceinte de culture et l'enceinte de traitement. 12') Installation selon la revendication 11i, -35 caractérisée en ce que ledit dispositif est une pompe péri- staltique. 13') Installation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit dispositif est un surpresseur relié à l'enceinte de culture. 14') Installation selon la revendication 11, caractérisée en ce que, ledit dispositif est une pompe à vide reliée à l'enceinte de traitement. ') Installation selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, caractérisée en ce que l'enceinte de traitement est avantageusement un bac, dont le fond com- porte le moyen de séparation (5) constitué par une membrane de porosité appropriée à la séparation de molécules de poids moléculaire supérieur à 80 kDa. 16) Installation selon la revendication 15, caractérisée en ce que le bac comprend trois parois fixes dont l'une, adjacente à une des électrodes (8) du moyen d'application d'un champ électrique, est une membrane de dialyse (12) et les moyens amovibles de mise en communlca- tlon du gel d'électrophorèse avec le bac de traitement sont alors une réglette (11) matérialisant la quatrième paroi dudit bac, mise en place pour la coulée du gel dans le bac de traitement. 17) Installation selon la revendication 15, caractérisée en ce que le bac est limité par quatre réglettes (11) amovibles simultanément, mises en place pour la coulée du gel et en ce qu'une des électrodes (8) du moyen d'application d'un champ électrique est alors éventuellement adjacente à une membrane de dialyse (12). 18 ) Installation selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que la pompe à 0 vide (6) assurant le transfert des cellules de l'enceinte de culture audit bac de traitement fournit simultanément la dépression d'aspiration du milieu de culture au travers de ladite membrane. 19 ) Installation selon l'une quelconque des revendications 10 à 18, caractérisée en ce qu'elle comprend un détecteur (9)- localisant l'emplacement des plasmides et cosmides entiers après ladite migration électrophorétique. ) Installation selon l'une quelconque des revendications 10 à 19, caractérisée en ce qu'elle comprend des moyens de réglage thermique de chauffage de l'enceinte de traitement (4) et/ou de refroidissement lors *de la migration électrophorétique.