Brevet FR2632821A1 — publié le 19891222

i L'invention se rapporte à la cryobiologie, et plus précisément, à un procédé de conservation à basse température des embryons. La présente invention sera le plus avantageuse- -5 ment utilisée pour la congélation profonde des embryons dans le but de créer, par la suite, une banque à basse température d'embryons des espèces d'animaux en voie de disparition et rares ainsi qu'une banque à basse température extrêmement nécessaire pour maintenir les lignées génétiques de valeur des souris, dont l'utilisation conditionne les succès dans le développement de la reproductologie, de la pharmacologie, de l'immunologie, de la virologie et de la médecine expérimentale et clinique. L'invention pourra trouver son application dans d'autres domaines de la cryobiologie, par.exemple, dans la santé publique o la transplantation réussie d'un embryon à une patiente représente aujourd'hui le moyen le plus radical de lutte contre l'infertilité, et la transplantation du tissu ovarien sert comme méthode efficace de correction de l'état hormonal général de la patiente dans diverses pathologies d'étiologie différente. D'autre part, dans le traitement des inhibitions de l'hémopoièse des patientes, la perfusion de moelle osseuse embryonnaire, dont l'immunogénicité est réduite, peut s'avérer promettrice. Lors de la réalisation des mesures thérapeutiques susmentionnées, il faut détenir une quantité suffisante de-matière biologique,-ce qui n'est possible que dans les conditions de sa conservation prolongée en état de profonde congélation.. L'invention peut également trouver un champ d'application dans l'agriculture, o la cryoconservation des embryons est largement utilisée pour la sélection de 35. nouvelles races, dans l'élevage commercial du bétail, la pisciculture, pour la cryoconservation des embryons de poissons, en particulier des esturgeons et des cyprinidés. De cette façon, l'utilisation de basses températures et, en particulier, de la profonde congélation pour conserver les embryons après leur isolation de l'organisme-mère embrasse un nombre de plus en plus grand de domaines de l'activité économique de l'homme, y compris la sphère de la santé publique. A l'heure actuelle, l'idée qui a obtenu son plus fort développement est la création de banques à basse température pour la conservation des ressources génétiques, et en particulier, des embryons de différentes espèces d'animaux agricoles de valeur commerciale, dans le but d'intensifier l'élevage. La large utilisation des embryons de mammifères dans la pratique médicale et l'élevage hausse les exigences à l'égard du matériau de transplantation, de la qualité duquel dépend le résultat définitif de la transplantation, nécessaire pour la lutte contre l'infertilité et pour la sélection rapide des animaux de haute productivité. Les procédés connus de cryoconservation des embryons ne donnent pas la possibilité d'obtenir une haute préservation des cellules congelées, ce qui a pour conséquence une forte perte de matière biologique de valeur. Les expériences portant sur la cryoconservation montrent que l'optimisation des procédés susmentionnés relève de la possibilité du développement d'une vitrification dans l'échantillon biologique à congeler au cours d'un refroidissement extrarapide à une étape. On connait un procédé de congélation des embry'ons de souris dans un milieu de 1,0 mole de diméthylsulfoxyde (DMSO), comportant l'initiation de la cristallisation à -3,5 C et le refroidissement à une vitesse de 0,2 à 2,0 C/mn jusqu'à une température de -40 C et l'immersion ultérieure dans un agent frigorifique, l'azote liquide. Après décongélation, la survie des embryons atteint 65% (Experimental Cell Research, v. 89, No. 1, 1974. S.P. Leibo-, P.M. Mazur, S.C. Jackowski "Factors affecting survival of mouse embryos during freezing and thawing", pages 79 à 89). L'inconvénient de cette méthode consiste en la basse survie des embryons soumis à la crydconservation, et en la nette détérioration des résultats de la congélation à la suite des très petites déviations des paramètres du processus de congélation-décongélation par rapport aux valeurs optimales. On connait un procédé de cryoconservation des embryons de souris en tampon phosphatique salin (PBS), contenant 1,45 moles de DMSO. Introduction et excrétion du cryoprotecteur des embryons: goutte à goutte, vitesse de refroidissement: 0,3 C/mn, viabilité: 67 à 68%. Les inconvénients du procédé connu consistent en la basse survie des embryons, la mauvaise reproductibilité du procédé, en ce que le processus de refroidissement est fondé sur une commande manuelle en conditions d'existence d'un grand nombre de parties mobiles dans l'appareil, ce qui complique la synchroni- sation de la commande du processus de cristallisation, et réduit la reproductibilité des résultats. Il faut attribuer, aux inconvéniernts dudit procédé la longue durée du cycle de cryoconservation, la complexité, et la quantité de travail nécessité-e par le procédé (Cryobiology, v. 16, 1979, G.H. Reilmaker, C.M.P.M. Verhamme "A simplified method for Freezing mouse Embryos"', pages 6 à 10). On connait un procédé de cryoconservation des embryons de souris dans un milieu de 2,0 moles de glycérine + 0,5 mole de saccharose. Après une incubation de 15 minutes, les embryons sont placés dans un tube de polystyrène d'un diamètre interne de 4 mm, qui, après étanchéisation, est immergé dans l'azote liquide. Après décongélation, la viabilité des embryons atteint 84%. Les inconvénients de ce procédé sont le développement de processus de cristallisation, la haute osmose du cryoconservant, conditionnant la lésion latente des cellules, ce qui se réfléchit négativement sur leur développement dans la culture après décongélation. La vitesse peu importante (près de 20 C/mn) de refroidis- sement dans ce procédé, conditionnant la formation d'une couche thermofuge autour du tube, contribue au développement du processus de cristallisation et diminue la probabilité d'une vitrification de la partie liquide du système cryobiologique. (Thermogenology, v. 23, No. 1, 1985, T.T. Williams, S.E. Tohnson "Quickfreezing of day four mouse embryos", page 235). On connait encore un procédé de cryoconservation des embryons de souris dans un milieu de 3,5 moles de glycérine + 0,5 mole de saccharose. Après addition fractionnée du cryoconservant aux embryons, ces derniers sont placés dans des tubes de polystyrène, qui, après étanchéification, sont immergés dans l'azote liquide, ce qui permet d'obtenir une survie des embryons de 85%. Les inconvénients du procédé susmentionné consistent en la concentration excessive des produits osmotiquement actifs dans le cryoconservant et la petite vitesse de refroidissement des embryons, déterminant l'apparition de lésions latentes dans la membrane cellulaire, qui se manifestent négativement sur le développement des cellules dans la culture après la décongélation (Thermogenology, v. 25, No. 1, 1986, K.A. Biery, G.E. Seildel, Jr. and R.P. Elsden "Cryopreservation of mouse Embryos by direct pluging into liquide nitrogen", page 140). On connait également un procédé de cryoconservation -des embryons, d'après lequel, après l'isolation de l'organisme des souris, les embryons sont placés à l'intérieur d'un tube de polystyrène pendant 25 à 30 minutes dans un milieu de 1,4 moles de glycérine et 1,1 moles de saccharose, les tubes étant ensuite étanchéifiés et immergés dans l'azote liquide (Thermogenology, v. 23, No. 1, 1985 K.T. Krag, J.M. Koehler, R.W. Wright "A method for freezing early murine embryos by plunging directly into liquid nitrogen", page 199). La décongélation des embryons s'effectue à 37 C. Le contenu des tubes est versé dans des boîtes de Pétri et lavé trois fois dans plusieurs portions de 0,5 mole de saccharose, puis cultivé en milieu nutritif. De 40 à 67% des embryons décongelés se développent jusqu'au stade du blastocyste. Les hautes concentrations de cryoprotecteurs, en particulier de la glycérine, qui pénètre mal dans les embryons et de la saccharose qui n'y pénètre pas du tout, poursuivent' le but de provoquer une déshydratation des cellules afin de créer des conditions pour leur vitrification après un refroidissement rapide (près de 20 C/mn). Les inconvénients du procédé susmentionné consistent en l'obtention de résultats insatisfaisants, dûs à la haute concentration de cryoprotecteurs dans le milieu de cryopréservation, qui, même dans les conditions d'addition fractionnée, à trois reprises, aux embryons, provoque leur lésion par les facteurs osmotiques. Pour - une concentration totale de 48,6% des cryoprotecteurs utilisés, on ne peut exclure l'action toxique des composés cryoprotecteurs sur l'embryon. Enfin, la vitesse du refroidissement des embryons, obtenu par l'immersion directe desdits embryons dans l'azote liquide, n'est pas suffisante pour le développement de la vitrification, même dans des conditions d'utilisation de hautes concentrations des cryoprotecteurs, car la couche thermofuge qui se forme entre le tube et l'azote liquide et qui est constituée par les vapeurs d'azote s'oppose à l'extraction rapide de la chaleur des embryons. Le problème, posé dans la présente invention, consiste à mettre au point un procédé de refroidissement des embryons, dans lequel leur refroidissement se réaliserait à une vitesse suffisante pour. le développement de la vitrification de la partie essentielle de l'eau extraet intracellulaire, tout en assurant une réduction de l'intensité de manifestation de l'action lésionnelle de la recristallisation sur les structures biologiques des embryons au cours de leur réchauffement. Ce problème se voit résolu par le fait que, dans le procédé de conservation à basse température des embryons, comportant leur refroidissement jusqu'à la température de l'agent frigorifique en milieu de tampon salin, contenant, comme cryoprotecteur, de la glycérine, selon l'invention, le refroidissement est mené dans un produit pulvérulent de haute conductibilité thermique, préablement refroidi à la température de l'agent frigorifique, et le milieu de tampon salin contient de plus des cryoprotecteurs tels que diméthylsulfoxyde (DMSO) et un dérivé d'alcool biatomique. Le procédé selon l'invention de conservation à basse température des embryons permet de hausser la survie des embryons grâce au refroidissement par le biais du produit pulvérulent de haute conductibilité thermique, ce qui donne la possibilité d'atteindre une vitesse de 263ZZI refroidissement de plusieurs dizaines de milliers de degrés par minute et conditionne le développement du processus de vitrification. Par ailleurs, le procédé selon l'invention permet de réduire l'intensité de la manifestation de l'action lésionnelle sur les structures biologiques de la -recristallisation au cours du réchauffement des embryons, grâce à la présehce, dans la composition du cryoconser- vant, du cryoprotecteur DMSO et du dérivé d'alcool biatomique, jouant le r8le de tampon antisalin, s'opposant à la migration des cristaux et à l'accroissement de leur dimensions et augmentant la couche d'hydrate autour- des biomacromolécules et des centres catalytiques des protéines. Les cryoprotecteurs utilisés de trois types de degrés différents de pénétration à travers la membrane cellulaire (glycérine, DMSO, dérivé d'alcool biatomique) en basse concentration totale. (14,75 à 15,25%) ne produisent pas de lésions osmotiques ni de toxicité, tout en contribuant au développement de la vitrification et à la protection multiforme des embryons au cours de la cryoconservation et de la décongélation. En outre, l'extraction du mélange utilisé de cryoprotecteurs n'est pas traumatisante pour les cellules. Le procédé selon l'invention permet de simplifier nettement le processus de conservation à-basse température des embryons-à cause du minimum d'opérations simples qui y sont engagées et qui n'exigent pas de formation professionnelle spéciale de la part de l'opérateur. Cela permet, à son tour, de réduire significativement le temps nécessaire pour réaliser le cycle de conservation à basse température aux dépens de la réduction du nombre d'opérations et du temps nécessaire pour chacune d'elles, ce qui conditionne une importante augmentation de la capacité de production du procédé selon l'invention et une diminution de son prix de revient. Dans la forme préférentielle d'exécution de la présente invention, on utilise le zinc à titre de produit pulvérulent de haute conductibilité thermique. Le choix de ce produit pulvérulent s'explique par sa plus haute conductibilité thermique par rapport aux autres matières pulvérulentes à prix raisonnable, ce qui assure une haute vitesse de refroidissement des embryons. Il est avantageux d'utiliser, à titre de l'un des dérivés d'alcool biatomique, le 1,2-propanediol. Son association au DMSO est choisie compte tenu de ce que le DMSO est le cryoprotecteur qui pénètre le plus facilement dans la cellule de l'embryon en assurant ainsi la préservation des biostructures endocellulaires au cours de la congélation et du réchauffement, alors que le 1,2-propanediol, grâace à sa vitesse modérée de pénétration par rapport aux autres cryoprotecteurs utilisés dans ledit procédé, protège efficacement, non seulement les structures endocellulaires, mais aussi l'appareil membraneux de la cellule. D'après l'une des variantes de la présente invention, en conditions d'utilisation à titre d'agent frigorifique de l'azote liquide, chacun des trois cryoprotecteurs est pris à l'une des concentrations dans la gamme de 4,75 à 5,25%. A ces concentrations, les cryoprotecteurs déploient, de façon la plus efficace, leurs propriétés cryoprotectrices, sont pratiquement exempts de toxicité et démontrent des propriétés osmotiques insignifiantes. Dans une autre variante de la présente invention, chacun des cryoprotecteurs est pris à un rapport de 1:1. Un tel rapport permet d'escompter une 263282 I cryoprotection égale pour les formations endo- et exocellulaires et l'appareil membraneux de la cellule relevant de la localisation uniforme des cryoprotecteurs dans les sphères susmentionnées du système cryobiologique, compte tenu de la différence de pénétration des cryoprotecteurs dans les cellules. Dans la forme préférentielle d'exécution de l'invention, le milieu tampon salin comporte une substance biologiquement active. L'utilisation d'une substance biologiquement active hausse significativement la survie des cellules par le biais de la protection de leur membrane cytoplasmatique contre un choc thermique et "l'effet de solution" au cours de la transformation de phase en glace. La substance biologiquement active stabilise la structure native des membranes, prévenant leur endommagement au cours de la recristallisation. Il est-très avantageux d'utiliser, à titre de substance biologiquement active, une solution de chlorure de choline, qui participe aux processus naturels de méthylation des biostructures et, au compte de ses radicaux méthyliques, stabilise la structure native de la membrane. En accord avec l'une des variantes de la présente invention, la solution de chlorure de choline est utilisée à la concentration de 0,4%. Le choix de ladite concentration relève du fait que son augmentation entraîne une perturbation de l'organisation structurale des membranes aux dépens des propriétés d'activité - superficielle de ce composé, alors qu'à la suite de sa réduction, l'effet de stabilisation ne se manifeste plus. De toute façon, les autres objectifs et avantages de la présente invention seront bien compris à l'aide des exemples non limitatifs qui suivent de sa réalisation. 1O Le procédé de conservation à basse température des embryons comporte leur refroidissement au moyen de l'agent frigorifique, jusqu'à la température de ce dernier, en milieu de tampon salin. Le refroidissement est réalisé dans un produit pulvérulent de haute conductibilité thermique, préalablement refroidi à la température de l'agent frigorifique. Le milieu tampon salin contient un mélange de cryoprotecteurs: glycérine, diméthylsulfoxyde (DMSO) et dérivé d'alcool biatomique, ainsi qu'une substance biologiquement active, par exemple, une solution à 0,4% de chlorure de choline. A titre de produit pulvérulent à haute conductibilité thermique, on peut utiliser le zinc. L'un des dérivés d'alcool biatomique peut être le 1,2-propanediol. Quand on utilise, à titre d'agent frigorifique, de l'azote liquide, on prend chacun des trois cryoprotecteurs à une concentration de 4,75 à 5, 25%, le rapport de chacun d'entre eux à chacun des deux autres étant égal à 1:1. Le procédé selon l'invention est réalisé lors de la cryoconservation des embryons de souris au stade de 32 blastomères. Exemple 1. 60 embryons sont répartis en 6 lots à raison de embryons dans chacun (dans 5 gouttes dans chaque lot). On additionne, dans chaque lot, 5 gouttes de milieu phosphate-salin de Dulbekko, contenant 10,5% de glycérine, 10,6% de propylèneglycol, 10,5% de DMSO et 0,8% de chlorure de choline, la concentration de chaque cryoprotecteur étant égale à 5,25%, et celle du chlorure de choline à 0, 4%. Toutes les manipulations sont menées à à une température de 4 C. Les embryons avec le milieu contenant les cryoprotecteurs sont transférés dans des conteneurs en feuille métallique de 0,03 mm d'épaisseur, - 263282 1 ayant pour dimensions lxl,5 cm, et un volume de 0,1 ml. Les bords libres des conteneurs sont dudgeonnés, ils sont immergés pendant 10 secondes dans un récipient métallique, rempli de poudre de zinc refroidie à la température de l'azote liquide. Après quoi, les conteneurs sont transférés dans l'azote liquide o ils sont conservés pendant 3 semaines. La décongélation des conteneurs s'effectue au bain- marie à 40 0C. La viabilité des embryons décongelés est de 94,2% (évaluée d'après leur développement en culture). Pour l'argumentation de la concentration des cryoprotecteurs, des expériences ont été réalisées de la même façon que dans l'exemple 1, mais les cryoprotecteurs ont été pris à différentes concentrations. La viabilité des embryons a également été établie d'après les données de leur développement jusqu'au stade de blastocyste. Les résultats des expériences figurent dans le tableau 1. Dans les tableaux 1 à 5, le développement des embryons après leur culture à la suite d'une conservation à basse température est calculé par rapport au développement d'un'même nombre d'embryons natifs. Tableau 1. Viabilité des embryons à la suite d'une conservation à basse température, en fonction de différentes concentrations totales des cryoprotecteurs. Concentration des cryoprotecteurs (%) Viabilité des ------------------------------------------ embryons (%) Glycérine Propylèneglycol DMSO 5,75 5,75 5,75 71,8 + 1,45 ,5 5,5 5,5 85,4 + 1,91 ,25 5,25 5,25 94,2 + 0,62 ,0 5,0 5,0 94,8 + 1,06 4,75 4,75 4,75 93,9 + 0,18 4,5 4,5 4,5 86,6 + 0,16 4,25 4,25 4,25 78,1 + 1,2 ______________________________________________________________. Comme il ressort du tableau 1, la plus haute viabilité des embryons est obtenue à la suite de l'utilisation de cryoprotecteurs à une concentration de 4,74 à 5,25% (concentration totale de 14,25 à 15,75%). Afin de justifier les proportions de concentration des cryoprotecteurs dans le milieu cryopréservatif des expériences similaires à celles de l'exemple 1 furent réalisées, mais en prenant les cryoprotecteurs à différentes proportions et de façon à ce que leur concentration totale dans le cryoconservant soit égale à 14,25 à 15,75%. Les résultats de ces expériences figurent dans les tableaux 2 à 4. Tableau 2. Viabilité.des embryons à la suite d'une conservation à basse température, en fonction de différentes proportions des cryoprotecteurs et pour une concentration totale égale à 15,75%. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Concentration des cryoprotecteurs (%) Viabilité des ------------------------------------------ embryons (%) Glycérine Propylèneglycol DMSO 5,25 5,0 5,5 80,1 + 1,16 ,0 5,25 5,5 83,2 + 0,18 ,5 5,0 5,25 84,2 + 2,18 ,0 5,5 5,25 83,4 + 1,06 ,5 5,25 5,0 82,3 + 1,06 5,25 5,5 5,0 82,2 + 2,12 Tableau 3. Viabilité des embryons à la suite de la conservation à basse température, en fonction de différentes proportions des trois cryoprotecteurs et pour une concentration totale de 15%. Concentration des cryoprotecteurs(%) Viabilité des ------------------------------------------ embryons (%) Glycérine Propylèneglycol DMSO --à_ à--- ,0 4,75 5,25 81,6 + 1,42 4,75 5,0 5,25 80,1 + 2,12 ,25 4,75 5,0 78,6 +0,19 4,75 5,25 5,0 79,8 + 0,26 5,25 5,0 4,75 82,6 ± 1,21 ,0 5,25 4,75 83,5 + 1,21 Tableau 4. Viabilité des embryons à la suite d'une conservation à basse température, en fonction de différentes proportions des trois c oprotecteurs pour une concentration totale égale à 14,25%. Concentration des cryoprotecteurs (%) Viabilité des ------------------------------------- embryons (%) Glycérine Propylèneglycol DMSO 5,0 4,5 4,75 76,8 + 2,14 4,5 5,0 4,75 74,9 + 0,18 4,75 4,5 5,0 79,1 + 1,28 4,5 4,75 5,0 81,3 + 0,19 4,75 5,0 4,5 77,5 + 0,26 5,0 4,75 4,5 79,6 + 2,18 On peut voir, d'après les tableaux 2 à 4, qu'à la suite du changement du rapport de concentration des cryoprotecteurs dans le milieu de congélation, pour un même taux de chlorure de choline (0,4%) et une même concentration totale desdits cryoprotecteurs (14,25 à ,75%), la viabilité des embryons décroît. Pour l'argumentation de la concentration du chlorure de choline, le procédé selon l'invention a été réalisé de la même façon que dans l'exemple 1, à l'exception que la concentration de chlorure de choline a été établie à 0,3 et 0,5%. Les résultats figurent dans le tableau 5. Tableau 5. Viabilité des embryons à la:suite de la conservation à basse température, en fonction de la concentration de chlorure de cholir. et des cryoprotecteurs dans le cryoconservant. Concentration des cryopro- Viabilité des embryons tecteurs (%) (%) Glycérine Propylène- DMSO Concentra- Concentration glycol tion de de chlorure chlorure de choline de choline 0,5% O, 3% - 5,75 5,75 5,75 60,1 + 1,18 65,3 + 1,12 ,5 5,5 5,5 71,6 + 2,19 76,2 + 0,16 ,25 5,25 5,25. 76,9 + 1,04 84,6 + 0,21 ,0 5,0 5,0 74,8 + 0,86 72,1 + 1,12 4,75 4,75 4,75 70,1 + 0,91 68,9 + 1,41 4,5 4,5 4,.5 76,6 + 0,36 69,5 + 2,1 4,25 4,25 4,25 63,5 + 1,18 54,2 + 1,12 On peut voir, dans le tableau 5, que pour une concentration de chlorure de choline supérieure ou inférieure à 0,4%0, le taux de viabilité des embryons tombe. Exemple 2. Le procédé, suivant l'invention, est exécuté de même que dans l'exemple 1, mais à la seule différence que l'on utilise, à titre de milieu de cryoconservation, le milieu du procédé connu constituant l'antériorité la plus proche de l'invention, c'est-à-dire un milieu de phosphate salin, contenant 1,4 moles de glycérine et 1,1 moles de saccharose. Dans une série, les embryons sont congelés dans des conteneurs en feuille métallique, et dans une autre, dans des tubes de polystyrène. Après la décongélation, le développement des embryons dans la culture était égal à 69,0 + 1,06% et 10,0 + 1,2%, respectivement. Par conséquent, la haute viabilité des embryons ne peut être obtenue que dans le cas o la congélation dans la poudre de zinc s'effectue dans le milieu, proposé selon l'invention. Exemple 3. Le procédé suivant l'invention a été réalisé de la même façon que dans l'exemple 1, à la seule différence que les embryons sont congelés, non pas dans la poudre de zinc, mais dans l'azote liquide. Après la décongélation, le taux de développement des embryons dans la culture était égal à 30,0 + 0,18/0. La haute viabilité des embryons n'est donc assurée que dans le cas o la congélation s'effectue dans la poudre de zinc et dans le milieu proposé dans l'invention. Ainsi donc, le procédé suivant l'invention permet de hausser la survie des emuryons après leur décongélation de 27,8%. 2632-82 1 REVENDICATIONS 1. Procédé de conservation à basse température -des embryons, comportant le refroidissement des embryons jusqu'à la température de l'agent frigorifique en milieu tampon'salin, contenant, comme cryoprotecteur, de la glycérine, caractérisé en ce que le refroidissement est mené dans un produit pulvérulent de haute conductibilité thermique, préalablement refroidi à la'température de l'agent frigorifique, et en ce que le milieu tampon salin contient en supplément des cryoprotecteurs tels que le diméthylsulfoxyde et un dérivé d'alcool biatomique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à titre de produit pulvérulent de haute conductibilié thermique, on utilise le zinc. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à titre de dérivé d'alcool biatomique, on utilise le 1,2-propanediol. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'en utilisant, à titre d'agent frigorifique, de l'azote liquide, chacun des trois cryoprotecteurs est pris à une concentration de 4,75 à 5,25%. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que chacun des trois cryoprotecteurs est pris à un rapport del1:1 avec chacun des deux autres. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en-ce que le milieu tampon salin contient une substance biologiquement active. 7. Procédé selon la revendication.6, caractérisé en ce qu'à titre de substance biologiquement active, on utilise une solution de chlorure de choline. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la solution de chlorure de choline est utilisée à une concentration de 0,4%.