Brevet FR2633938A1 — publié le 19900112

DNA DE CODAGE DE POLYPEPTIDE PRESENTANT UNE ACTIVITE DE NITRILE HYDRATASE ET PROCEDE DE PRODUCTION D'AMIDES A PARTIR DE NITRILES AVEC UN TRANSFORMANT LES CONTENANT La présente invention a pour objet une DNA de codage d'un polypeptide actif, dérivant de Rhodococcus sp. N-774, ayant une activité de nitrile hydratase et présentant la capacité de convertir les nitriles en les amides correspondants et se rapporte à un procédé pour produire des amides à partir de nitriles à l'aide d'un agent de transformation ou transfor- mant les contenant. Les nitriles d'hydratation d'enzyme pour former des amides correspondants sont connus sous la forme de nitrilase ou de nitrile hydratase. A titre d'exemple de micro-organismes produisant cette enzyme, il faut citer les micro-organismes appartenant au genre Bacillus, Bacteridium, Micrococcus et Brevibacterium (cf. brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 001 081), Corynebacterium et Nocardia (cf. brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 248 968), Pseudomonas (cf. brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 637 982) et Rhodococcus, Arthrobacter et Microbacterium (cf. demande de brevet européen non examinée et publiée sous le n 0 188 316), etc. Dans l'hydratation des nitriles par un gène de nitrile hydratase préparé par le clonage selon l'engineering géné- tique, de nombreuses copies de gènes du nitrile hydratase peuvent être révélées chez un micro-organisme. Par conséquent, on peut s'attendre que la capacité catalytique d'un micro- organisme est augmentée par bonds par comparaison avec les méthodes classiques. Par conséquent, les présents inventeurs ont procédé à des recherches intensives o ils ont fait de très grands efforts aux fins de parvenir àune séquence de DNA de codage d'un polypeptide présentant une activité nitrile hydratase à partir de micro-organismes appartenant au genre Rhodococcus, pour former un DNA recombinant par intégration de la séquence de DNA dans un vecteur, la transformation d'un micro-organisme avec un DNA recombinant pour former un transformant présentant une activité nitrile hydratase supérieure et produire effica- cement des amides par usage de ce transformant. C'est ainsi qu'ils sont parvenus à la présente invention. Cela constitue un objet de la présente invention d'obte- nir une DNA de codage d'un polypeptide présentant une activité nitrile hydratase. Un autre objet de la présente invention réside dans une méthode de production d'amides à partir de nitriles par emploi d'un agent de transformation ou transformant contenant une DNA de codage de polypeptide présentant une activité nitrile hydratase. Selon la présente invention, on parvient à une séquence de DNA de codage d'un polypeptide portant des séquences d'amino- -acides spécifiques de sous-unités a et B qui sera décrit ci-dessous et qui présente une activité de nitrile hydratase et on obtient un plasmide d'expression contenant ce DNA et un agent de transformation ou transformant résultant d'une trans- formation par le plasmide d'expression. De plus, le nitrile hydratase peut être produit par culture de ce transformant et, en outre, des amides peuvent être obtenus par action de ce transformant sur les nitriles. - la fig. 1(1) montre les résultats d'échantillons de séquençage d'aminoacides dans la DNA et des séquences amino-acides utilisées dans ces synthèses d'échantillons (partie souli- gnée); - la fig. 1(2) montre les séquences de DNA des échantil- lons; - la figure 2 montre une charte de restriction d'endo- nucléase d'un plasmide recombinant pYUK120; - la figure 3 montre la séquence de DNA de fragment de DNA dérivant de Rhodococcus sp. N-774 conte- nu dans le plasmide recombinant pYUKl21 et une séquence amino-acide qui en résulte; - la figure 4 montre un procédé de préparation du plas- mide d'expression pYUK121. Ainsi qu'il a été mentionné précédemment, la présente invention a pour objet: (1) une DNA de codage d'un polypeptide portant les séquences amino-acides suivantes des sous-unités a et 8 et présen- tant une activité nitrile hydratase. Sous-unité a À..O 1 SerValThrlleAspHisThrThrGluAsnAlaAlaProAlaGln AlaAlaValSerAspArgAlaTrpAlaLeuPheArgAlaLeuAsp GlyLysGlyLeuValProAspGlyTyrValGluGlyTrpLysLys ThrPheGluGluAspPhgSerProArgArgGlyAlaGluLeuVal AlaArgAlaTrpThrAspProGluPheArgGlnLeuLeuLeuThr AspGlyThrAlaAlaValAlaGlnTyrGlyTyrLeuGlyProGln M,1" 1 GlyGluTyrIleValAlaValGluAspThrProThrLeuLysAsn ValIleValCysSerLeuCysSerCysThrAlaTrpProIleLeu ig a.1" 13as GlyLeuProProThrTrpTyrLysSerPheGluTyrArgAlaArg 148 IFO ValValArgGluProArgLysValLeuSerGluMetGlyThrGlu 188 18" 16& IleAlaSerAspIleGluIleArgValTyrAspThrThrAlaGlu ThrArgTyrMetValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluGly 1*8 181 158 TrpSerGlnGluGlnLeuGlnGluIleValThrLysAspCysLeu ,#rGlVlPo m IleGlyValAlaIlsProGlnValProThrVal Sous-unité 8 a Il 18 MetAspGlyValHisAspLeuAlaGlyValGlnGlyPheGlyLys * " ValProHisThrValAsnAlaAspIleGlyProThrPheHisAla 46 48 GluTrpGluHisLeuProTyrSerLeuMetPheAlaGlyValAla s 5 0 GluLeuGlyAlaPheSerValAspGluValArgTyrValValGlu ArgMetGluProArgHisTyrMetMetThrProTyrTyrGluArg7 7 ArgMetGluProArgHl sTyrMetMetThrProTyrTyrGluArg TyrValIleGlyValAlaThrLeuMetVaiGluLysGlyIleLeu fi 100 38* ThrGlnAspGluLeuGluSerLeuAlaGlyGlyProPheProLeu SerArgProSerGluSerGluGlyArgProAlaProValGluThr 3 Il.li ThrThrPheGluValGlyGlnArgValArgValArgAspGluTyr 3 IO 20 10 4 TCAGTAACGATCGACCACACAACGGAGAACGCCGCACCGG . 0 >0.0 CCCAGGCGGCGGTCTCCGACCGGGCGTGGGCACTGTTCCG 80340 330 320 CGCACTCGACGGTAAGGGATTGGTACCCGACGGTTACGTC S $40 130 1&0 GAGGGATGGAAGAAGACCTTCGAGGAGGACTTCAGTCCAA 3?0 18 BO0 2X0 GGCGCGGAGCGGAATTGGTAGCGCGCGCATGGACCGACCC 120 1$0... CGAGTTCCGGCAGCTGCTTCTCACCGACGGTACCGCCGCA 2, >0 3,o au0 GTTGCCCAGTACGGATACCTGGGCCCCCAGGGCGAATACA 14 100.. ale0 TCGTGGCAGTCGAAGACACCCCGACACTCAAGAACGTGAT CGTGTGCTCGCTGTGTTCATGCACCGCGTGGCCCATCCTC avé Es 1uc 400 GGTCTGCCACCCACCTGGTACAAGAGCTTCGAATACCGTG 420 4>0 440 CGCGCGTGGTCCGCGAACCACGGAAGGTTCTCTCCGAGAT 4. 00 64 40 400 GGGAACCGAGATCGCGTCGGACATCGAGATTCGCGTCTAC GACCACCACCGCCGAAACTCGCTACATGGT CCTCCCGCAG C a. 848 "a4 880 GTCCCGCCGGCACCGAAGGCTGGAGCCAGGAACAACTGCA 8an 980 800 GGAAATCGTCACCAAGGACTGCCTGATCGGGGTTGCAATC CCGCAGGTTCCCACCGTC Sous-unité 8 18 2F 84 40 ATGGATGGAGTACACGATCTTGCCGGAGTACAAGGCTTCG 8* 7T 0 GCAAAGTCCCGCATACCGTCAACGCCGACATCGGCCCCAC CTTTCACGCCGAATGGGAACACCTGCCCTACAGCCTGATG TTCGCCGGTGTCGCCGAACTCGGGGCCTTCAGCGTCGACG 260 28280 AAGTGCGATACGTCGTCGAGCGGATGGAGCCGCGCCACTA 218 220 230 240 CATGATGACCCCGTACTACGAGAGGTACGTCATCGGTGTC -8 280 a o270 28 GCGACATTGATGGTCGAAAAGGGAATCCTGACGCAGGACG " 800oo 81 120 AACTCGAAAGCCTTGCGGGGGGACCGTTCCCACTGTCACG GCCCAGCGAATCCGAAGGGCGGCCGGCACCCGTCGAGACG ACCACCTTCGAAGTCGGGCAGCGAGTACGCGTACGCGACG 424 42a 8 440 AGTACGTTCCGGGGCATATTCGAATGCCTGCATACTGCCG 480 4&o 470 486 TGGACGAGTGGGAACCATCTCTCATCGAACTACCGAGAAG 480 8004 810 828 TGGCCGTTTCCCGACGCAATCGGCCACGGGCGCAACGACG CCGGCGAAGAACCGACGTACCACGTGAAGTTCGCCGCCGA GGAATTGTTCGGTAGCGACACCGACGGTGGAAGCGTCGTT di," 4 34 GTCGACCTCTTCGAGGGTTACCTCGAGCCTGCGGCC, (3) un DNA recombinant dans lequel le DNA (1) ou (2) précité est intégré; (4) un transformant obtenu par transformation avec un DNA recombinant du produit (3) précité; (5) un procédé de production de nitrile hydratase par incu- bation du transformant obtenu en (4) ci-dessus; (6) un procédé de production d'amides à partir de nitriles par incubation d'un transformant tel qu'obtenu dans l'étape (4) ci-dessus, puis conversion du nitrile en amides par action de nitrile hydratase à obtenir; et (7) un procédé de fabrication des amides par incubation d'un transformant obtenu dans l'étape (4) ci-dessus puis la formation d'une solution de culture, les isolats, les cellules ou leurs produits immobilisés obtenus à partir du transformant agissant sur les nitriles pour produire les amides correspondants. Ci-dessous, la présente invention sera décrite en détail. La présente invention est mise en oeuvre par utilisation des étapes (1) à (8) suivantes: (1) Détermination partielle de la séquence amino-acide de nitrile hydratase et formation des échantillons de DNA dans lesquelles: La nitrile hydratase est extraite et purifiée à partir des Rhodococcus sp. N-774 incubés et recueillis puis séparée en deux sous-unités par une chromatographie liquide haute performance. Puis, une partie de la séquence amino-acide de chacune des sous-unités est déterminée sur la base de laquelle les échantillons portant les séquences DNA que les séquences amino-acides permettent de s'attendre, sont formées (figure 1). (2) Préparation de fragment de DNA contenant des gènes de nitrile hydratase: Une DNA chromosomale est isolée de Rhodococcus sp. N-774. Après digestion de la DNA chromosomale isolée dans une enzyme de restriction, un fragment de DNA contenant le gène prévu est détecté par emploi d'échantillons (1) précités obtenus selon la technique d'hybridisation dite de Southern (E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503, 1975; cette note sera considéré à nouveau ci-dessous); (3) Insertion du fragment de DNA chromosomale dans le vec- teur: Un fragment de DNA chromosomale préparé dans l'étape (2> est inséré dans un vecteur pour former une bibliothèque de DNA recombinant. (4) Formation d'un transformation et sélection du DNA recom- binant: Des transformants sont obtenus par emploi de la biblio- thèque de DNA recombinant préparée dans l'étape (3) à partir de laquelle un transformant contenant le DNA recombinant précité est choisi par utilisation des échantillons effectués dans l'étape (1) selon la méthode d'hybridisation en colonie (R. Bruce Wallace et coll., Nuc. Aci. Res. 9, 879, 1981; document qui sera encore utilisé ci-dessous). Ensuite la reconfirmation du DNA recombinant recherché est obtenue selon la technique d'hybridization dite de Southern. Le DNA recombinant choisi dans cette étape est appelé pYUK120. (5) Purification du DNA recombinant et construction d'une charte d'endonucléase de restriction: Après purification de la pYUK120 obtenue dans l'éta- pe (4), une charte d'endonucléase de restriction (fi- gure 2) est réalisée pour déterminer la position o se trouve le gène recherché; (6) Détermination de la séquence de DNA: A partir d'un fragment de DNA chromosomale, dérivé d'une souche apparenté à pYUKl20, des parties non nécessaires sont éliminées par utilisation d'une enzyme de restric- tion. Ensuite, toutes les séquences de DNA du fragment de DNA obtenu (figure 3) sont déterminées pour reconfir- mer que le fragment de DNA contient la séquence DNA que l'on souhaitait obtenir à partir de la séquence d'amino- acide déterminée dans l'étape (1); (7) Préparation du plasmide d'expression et formation du transformant: Le fragment de DNA contenant le gène recherché obtenu dans l'étape (6) est lié par ligase à pUCl9 (fabriqué par Takara Shuzo Co., Ltd) comportant un promoteur de lac en aval du promoteur pour former un plasmide d'ex- pression que l'on appelle pYUK121 (figure 4). Ce plas- mide est transformé en E. Coli 105 (fabriqué par Amersham Inc.). -8 (8) Production du nitrile hydratase par emploi du transfor- mant et conversion des nitriles en amides: Le transformant contenant pYUK121 obtenu dans l'éta- pe (7) est incubé. A partir de cette culture, on prépare une enzyme brute. Cette enzyme brute est mélangée à une solution de substrat contenant des nitriles pour produire des amides. Incidemment, Rhodococcus sp. N-774 (cette souche a été classifiée comme étant un membre du genre Corynebacterium dans la huitième édition, 1974, du Manual of Determina- tive Bacteriology de Bergy et a été déposée à l'Institut dit Fermentation Research Institute sous le numéro d'enregistrement FERM-P n 4446, cf. brevet des Etats- Unis d'Amérique n 4 248 968) et un transformant JM105/pYUK121 obtenu dans l'étape (7) a été déposé dans le même Fermentation Research Institute sous les numéros d'enregistrement respectifs FERM BP-1936 et FERM BP-1937. En tant que vecteurs pouvant être utilisés dans les étapes précitées, il est possible d'utiliser n'importe quels vecteurs plasmides (par exemple, pACYC177, pSC101, etc.), des vecteurs phagiques (par exemple, Xgtll, fabriqué par Toyobo Co., Ltd), Charon4A (fabriqué par Amersham Inc.), etc., convien- dront. De plus, tout promoteur susceptible d'être commandé autre que le lac peut être utilisé dans les étapes précitées. Une souche hôte pouvant être utilisée pour la transformation ne devra pas être particulièrement limitée à E. coli JM105. Dans la conversion des nitriles en amides, non seulement les enzymes purifiées mais également une solution de culture, des isolats, des cellules traitées, leurs produits immobili- sés, etc., d'un transformant peuvent être utilisés à la place de l'enzyme brute. Les nitriles sont, en général, représentés par la for- mule R-(CN)n et comporter des ramifications de type mono- nitrile (n=l) et polynitrile (n>2) correspondant à la valeur n. De plus, R dans la formule est un atome d'hydrogène ou une chaîne linéaire ramifiée ou cyclique d'un résidu d'hydrocar- bures saturé ou insaturé avec un nombre de carbones pouvant varier, un résidu d'hydrocarbures présentant un substituant tel qu'un groupe amino, hydroxyle, un atome d'halogène, un groupe carboxyle ou similaire, ce qui implique par conséquent un grand nombre de composés. A titre d'exemple spécifique, on peut citer acétonitrile, propionitrile, n-butylonitrile, 1-butylonitrile, n-valéroni- trile, acrylonitrile, méthacrylonitrile, benzonitrile, cyano- pyridine, malononitrile, succinonitrile, fumaronitrile, chloro- acétonitrile, 0-hydroxypropionitrile, aminoacétonitrile C-amino- propionitrile, etc. Ci-dessous, la présente invention sera décrite en réfé- rence aux exemples. Dans les exemples, les abréviations suivantes seront utilisées: TE TrisHCl (10 mM, pH 7,8), EDTA (1 mM, pH 8,0) TNE Tris-HCl (50 mM, pH 8,0),. EDTA (1 mM, pH 8,0), NaCl (50 mM); STE Tris-HCl (50 mM, pH 8,0), EDTA (5 mM, pH 8,0), sucrose (35 mM); milieu 2XYT: 1,6% de tryptone, 1,0% d'extrait de levure, 0,5% de NaCl. EXEMPLE (1) Détermination partielle de la séquence amino-acide de nitrile hydratase et synthèse de l'échantillon de DNA de sorte que: Après incubation de Rhodococcus sp. N-774 dans un milieu (glucose 10 g/l; peptone 5 g/l; extrait de levure 3 g/l; extrait de malt 3 g/l; sulfate ferreux 0,01 g/l; eau 1 1, pH 7,2) à 30 C durant 48 heures, on recueille les cel- lules. Ensuite, ces cellules sont pulvérisées, soumises à un fractionnement au sulfate d'ammonium et dialysées. Le dialysat est centrifugé et le surnageant est séparé par pipette et soumis à une chromatographie de type dit DEAE-cellulofine, une chromatographie phényl-sépharose, une chromatographie Sephadex G-150 et une chromatogra- phie octyl-sepharose pour obtenir les fractions actives. Les fractions actives sont alors dialysées pour obtenir une solution d'enzyme. L'enzyme est séparée en deux sous-unités (a et O) par une chromatographie liquide sous performance élevée faisant emploi d'une colonne à phase inverse (Senshu Pak VP-304-1251 fabriqué par Senshu Scientific Co., Ltd), des séquences amino-acides (a1 et 61) des Nterminaisons des sous-unités et sé- quences amino-acides (a2 et 82) des Nextrémités du - fragment peptide obtenu par la digestion dans le lysyl- endopeptidase sont déterminés à l'aide d'un séquenceur amino-acide (470A fabriqué par Applied Bio System, Inc.). Ensuite, quatre espèces ((a1, a2' e1 et B2) d'échantillons ayant des séquences DNA pouvant être obtenus à partir des séquences amino-acides précitées sont préparées par synthèse à l'aide d'un auto-synthé- tiseur DNA (Système 1 plus, fabriqué par Beckmann Instru- ments, Inc.). Les résultats de ce séquençage amino-acide, les séquen- ces amino-acides utilisées pour la synthèse des échan- tillons et les séquences DNA des échantillons sont considérés dans la figure 1. (2) Préparation d'un fragment DNA contenant le gène nitrile hydratase: Rhodococcus sp. N-774 est inoculé et incubé dans 100 ml d'un milieu de culture (préparé par addition de 1% de glycine ou de 0,2 gg/ml d'ampicilline à un milieu MY) puis on récolte les cellules. Après lavage à l'aide de TNE, les cellules sont mises en suspension dans 10 ml de TE, après quoi 4 ml de 0,25M EDTA, 10 à 20 mg de lyso- zyme, 10 à 20 mg d'achromoprotéase et 10 ml de SDS à 10% sont alors ajoutés. La suspension est maintenue au repos à 37 C durant 3 heures, après quoi on lui ajoute 15 ml de phénol (60 C). La solution résultante est maintenue au repos à 60 C durant 15 minutes, après quoi on lui fait subir une centrifugation. Ensuite la couche supé- rieure de la solution est recueillie, on lui ajoute 0,7 ml d'une solution d'acétate de sodium 2,5M, puis de l'éther diéthylique. Après centrifugation de ladite solution, la couche supérieure de la solution résultante est rejetée. Puis, 2 volumes d'éthanol sont ajoutées à il la couche inférieure restante et on retire la DNA à l'aide d'une tige de verre. La DNA obtenue est absorbée successivement par des solutions 2/8, 1/9 et 0/10 TE/étha- nol pendant 5 minutes chaque fois, puis dissoute dans 2 à 4 ml de TE (37 C). A cette solution, on ajoute 10 Il d'un mélange de RNases A et T1 à 37 C puis un volume égal de phénol. Après centrifugation de la solution résultante, la couche supérieure est recueillie et un volume au moins égal d'éther lui est ajouté. Ensuite, la solution résultante est centrifugée, la couche supé- rieure est rejetée et la couche inférieure restante est dialysée pendant la durée d'une nuit contre 2 1 de TE contenant un petit volume de chloroforme. Ensuite, la seconde dialyse est mise en oeuvre en 3 à 4 heures pour obtenir environ 4 ml d'une préparation de DNA chromoso- male brute. Après obtention de 15 il de cette préparation de DNA chromosonale brute, on la fait réagir par addition de 1l d'une enzyme de restriction Sph I, 3 il de tampon de restriction pour SphI (concentration 10 fois) et il de TE à 37 C durant 1 heure, le milieu de réaction est soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose (60 V, 3 heures). Ensuite, on met en oeuvre l'hybridi- sation dite de Southern par utilisation d'échantillons de DNA synthétisés dans l'étape (1). Il en résulte que l'on constate que des fragments de DNA auxquels les échantillons ai, a2' e2 obtenus par synthèse précités sont fortement hybridisés en la position 4,4 kb approxi- mativement. Après digestion de 15 autres il de DNA chromosomale brute avec une enzyme de restriction Sph I (fabriqué par Takara Shuzo Co., Ltd) de la même façon que précitée, la DNA digérée est soumise à une électrophorèse sur un gel d'agarose et un gel contenant des fragments de DNA 4,4 kb est séparé. Après solubilisation du gel par addition de trois fois des volumes d'une solution de NaClO4 8M, on adsorbe la DNA sur un papier filtre GF/C ayant un diamètre de 6 mm (fabriqué par Whatman Corp.). A ce papier filtre ayant adsorbé de la DNA, on ajoute goutte à goutte 100 ml de TE contenant NaClO4 6M, puis 100 g1 d'éthanol à 95% respectivement à dix reprises. Ensuite, le papier filtre traité est séché dans un courant d'air durant 3 minutes puis passé dans un tube d'Eppendorf de 0,5 ml, ce que l'on fait suivre d'une addition de 40.1 de TE. Après repos à 37 C durant 30 minutes, le tube est centrifugé puis on en retire environ 40 g1 du surnageant. De cette solution, on recueille des fragments de DNA 4,4 kb contenant le DNA chromosomale de nitrile hydratase précité. (3) Insertion du fragment de DNA chromosomale dans le vec- teur: A 10 1 du plasmide pBR322 (fabriqué par Takara Shuzo Co., Ltd), on ajoute 20 g1 d'une enzyme de restriction Sph I, 3 g1 du tampon de restriction pour Sph I (concen- tration dix fois) et 10 g1 de TE. La solution résultante est incubée à 30 C durant 1 heure, puis on interrompt la réaction par addition de 2.1 d'EDTA 0,25M. Ensuite, 7 u1 de Tris-HCl 1M (pH 9) et 3 Il de BAP (phosphatase alcaline bactérienne) sont ajoutés au milieu réactionnel et la solution résultante est incubée à 65 C durant 1 heure. On ajoute alors TE au milieu réactionnel pour obtenir un volume total de 100 i1 et la solution résul- tante subit trois extractions successives avec un volume égal de phénol. Ensuite, un volume égal d'éther est ajouté à l'extrait de façon à recueillir la couche inférieure, ce que l'on fait suivre d'une addition de u1 d'une solution d'acétate de sodium 3M et de 250 g1 d'éthanol à la couche. Après repos à -80 C durant 30 mi- nutes, la solution résultante est centrifugée. Les pellets obtenus sont séchés et dissous dans TE. g1 de pBR322 digéré par Sph I et traité par BAP ainsi que décrit cidessus et 40 g1 d'une solution de fragments de DNA de 4,4 Kb récupérée dans l'étape (2) so:t alors mélangés. Ensuite, 6 -1 du tampon de ligatior 6 P1 d'une solution d'ATP 6 mg/ml et 1050 u1 de T4-DNA ligase (fabriqué par Takara Shuzo Co., Ltd) sont ajoutés à la solution obtenue, ce que l'on fait suivre d'une incuba- tion pendant la durée d'une nuit (12 heures) à 4 C. On obtient ainsi 60 gl d'un plasmide recombinant dans lequel des fragments de DNA de 4,4 Kb sont insérés dans pBR322. Le plasmide recombinant est considéré comme étant une bibliothèque DNA. (4) Fabrication du transformant et sélection du DNA recombi- nant E. coli TG1 (fabriqué par Amersham Corp.) est inoculé dans 10 ml du milieu 2XYT à 37 C. Après une incubation pendant 12 heures, 1% de la culture est inoculé sur un nouveau milieu 2XYT et incubé à 37 C durant 2 heures. Après récupération des cellules par centrifugation, on ajoute aux cellules 5 ml d'une solution froide de CaCl2 50 mM. Après maintien au repos à 0 C durant 40 minutes, la solution de cellules résultante est centrifugée à nouveau. Ensuite, 0,25 ml d'une solution de CaCl2 50 mM froide et 60 g1 de la solution de plasmide recombinant préparé dans l'étape (3), sont ajoutés aux pellets. Après maintien au repos à 0 C durant 40 minutes, la solution résultante subit un choc thermique à 42 C durant 2 minutes puis on la laisse au repos à nouveau à 0 C durant 5 minutes. Après addition de 10 ml du mi- lieu 2XYT, la solution résultante est incubée à 37 C durant 90 minutes puis on récupère les cellules par centrifugation. On met les cellules ainsi récupérées en suspension homogène dans 1 ml d'un milieu de 2XYT et place des portions de 10 il de la suspension sur deux plaques d'agar de 50 gl/ml du milieu 2XYT contenant l'ampicilline et incube le tout à 37 C. Les colonies de transformants se développent sur la plaque, les trans- formants présentant le gène nitrile hydratase étant choisis par la technique d'hybridisation par colonie. C'est-à-dire que les transformants incubés sur les plaques sont déplacés sur un filtre de nitrocellulose et que des cellules y sont lysées pour immobiliser DNA. Ensuite, la DNA immobilisée est traitée par des échan- tillons synthétiques et les colonies contenant le DNA recombinant recherché sont choisies par autoradiographie. A partir des colonies choisies, des plasmides recombi- nants sont préparés et hybridisés avec quatre espèces d'échantillons synthétiques par la technique d'hybridi- * zation dite de Southern, de façon à reconfirmer que les colonies choisies sont des transformants contenant le gène recherché. - (5) Purification du plasmide recombinant et formation de la charte d'endonucléase de restriction: Les transformants choisis dans l'étape (4) sont inoculés dans 100 ml du milieu 2XYT (contenant 50.g/ml d'ampi- cilline) et incubés pendant la durée d'une nuit (12 heu- res) à 37 C. Après récupération des cellules, on ajoute TNE et sépare à nouveau les cellules. Ensuite, 8 ml de STE et 10 mg de lysozyme sont ajoutés aux cellules et cette solution est incubée à 0 C durant 5 minutes. Après achèvement de la réaction, on obtient tout d'abord 4 ml d'EDTA 0, 25% puis 2 ml de SDS à 10% et 5 ml de NaCl 5M à température ambiante que l'on ajoute à la solution résultante, ce que l'on fait suivre d'un repos entre 0 et 4 C durant 3 heures. La solution résultante est ultracentrifugée. Après addition dans 1/2 équivalent de PEG6000 à 30% au surnageant, la solution résultante est maintenue au repos pendant la durée d'une nuit (12 heures) entre 0 et 4 C puis à nouveau centrifugée. Le pellet obtenu est dissous dans TNE de façon à obtenir un volume de 7,5 ml. Après addition de CsCl, la solution résultante est centrifugée pour éliminer la protéine. Ensuite, 300 à 500 mg/ml de solution de bromure d'éthidium est ajoutée à la solution. La solution résultante est versée dans un tube de centrifugation puis il est scellé à la chaleur et ultracentrifugé. Ensuite, du cccDNA est repris par une pompe péristaltique et du bromure d'éthidium est éliminé du cccDNA par addition d'un volume au moins égal d'alcool isopropylique saturé par de l'eau. Le cccDNA ainsi traité est dialysé à nouveau à l'encontre de TE pour obtenir environ 3 ml de plasmide recombinant purifié que l'on appelle pYUK120. Le plasmide recombinant obtenu est digéré dans des enzymes de restriction telles que EcoR I, Hind II, Kpn I, Pst I, Sal I et Sph I (toutes fabriquées par Takara Shuzo Co., Ltd) pour former la charte d'endo- nucléase de restriction montrée dans la figure 2. (6) Détermination de la séquence DNA: Le lieu o le gène recherché se trouve dans le fragment de DNA dérivé de pYUK120 est déterminé par la charte d'endonucléase de restriction obtenue dans l'étape (5) et la technique d'hybridisation dite de Southern. Ensuite, les parties non nécessaires sont séparées à l'aide d'enzymes de restriction Sph I et Sal I pour réduire la longueur des chaînes de 4,4 Kb à 2,07 Kb. Toutes les séquences DNA de ces fragments de DNA ainsi obtenus sont déterminées selon la méthode de Sanger (F. Sanger, Science 214, 1205-1210, 1981) faisant emploi d'un vec- teur phagique M13. Il en résulte que la séquence DNA de ce fragment de DNA de 2,07 kB dérivant de Rhodococcus sp. N-774 est semblable à celle que l'on a montré dans la figure 3. En fait, on a confirmé que cette séquence de DNA contient la totalité des séquences de DNA auxquelles on s'attend en partant de la séquence aminoacide déterminée dans l'étape (1) et il devient apparent que tant les sous- unités a que les sous-unités e existent dans ce fragment de DNA. (7) Préparation du plasmide d'expression et formation du transformant: Des fragments de DNA de 2,07 Kb formés dans l'étape (6) sont unis par ligase à leurs extrémités au plasmide pUC19 digéré par l'endonucléase de restriction Sph I et Sal I pour former environ 3 ml de plasmide d'expression appelé pYUK121 (figure 4). Grâce à l'emploi de ce plasmide pYUK121, on obtient de la même façon que dans l'étape (6) un transformant JM105/pYUK121 (n d'enregistrement FERM BP-1937) (dont l'hôte est E. coli JM105). (8) Production du nitrile hydratase par utilisation du transformant et conversion des nitriles en amides: E. coli JM105 contenant pYUK121 est incubé pendant la durée d'une nuit dans 10 ml du milieu 2XYT (contenant 50 gg/ml d'ampicilline) à 30 C. Ensuite, des portions de 1% de cette culture sont inoculées dans 100 ml du milieu 2XYT (contenant 50 gg/ml d'ampicilline, 10 mg/l de FeSO4,7H20 et de pyrro-quinoline-quinone) et incubées à C durant 2 heures. Après addition de IPTG pour obtenir une concentration finale de 2 mM, la culture résultante subit une nouvelle incubation à 30 C durant 15 heures. Après récupération des cellules de la culture précitée, ces cellules sont mises en suspension dans 3 ml d'un tampon de phosphate 1/20M (contenant 0, 35% de n-lactate de sodium, pH 7,7). La suspension est soumise à sonica- tion puis à centrifugation. Les pellets sont dissous dans 20 ml du tampon de phosphate précité contenant de l'urée 8M, suivi d'une addition de 0, 585 g de chlorure de sodium. La solution résultante est ajustée à un pH de l'ordre de 10, ce que l'on fait suivre d'une dialyse à l'encontre de 3 1 d'un tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,7) durant 3 heures. Le dialysat subit une nouvelle dialyse pendant la durée d'une nuit à l'encontre de 3 1 d'un tampon de phosphate 1/20M (pH 7,7) pour obtenir environ 35 ml d'enzyme brute. 2 ml de cette enzyme brute sont mélangés dans 2 ml de solution de substrat (contenant 5% d'acrylonitrile, 0,35% de n-lactate de sodium, 10 mg/l de FeSO4,7H2O, 1 gg/l de PQQ et du tampon phosphate 50 mM, pH 7,7), suivi d'une incubation à 20 C pendant 20 minutes sois exposition à la lumière. La réaction est arrêtée par addition de 2 ml de HC1 1N. Le milieu réactionnel est soumis à une chromatographie liquide haute performance pour détecter l'acrylamide formé et l'acrylonitrile n'ayant pas réagi qu'il contient. I1 en résulte que l'acrylamide ne peut être détecté dans l'extrait brut de l'hôte E. coli JM105 alors qu'il est détecté dans E. coli JM105 contenant pYUK121 selon la présente invention. L'activité spécifique de l'acrylamide est de 13,2 U par litre de milieu, 1 U signifiant 1 gmole d'acrylamide se formant en une minute. Une déclaration de dépot de la culture de Rhodococcus sp. N-774 auprès d'un organisme habilité, en l'espèce le Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology du Ministery of international Trade and Industry du Japon, est jointe aux pièces de dépot. Le numéro d'enregistrement auprès de cet organisme (Accession Number) est Bikoken-Joki: No 1936 soit en abrégé FERM BP-1936. REVENDICATIONS 1.- Une DNA de codage d'un polypeptide portant les séquences amino-acides de sous-unités a et B suivantes et présentant en outre une activité de nitrile hydratase: Sous-unité a SerValThrlleAspHisThrThrGluAs'nAlaAlaProAlaGln 21 M AlaAlaValSerAspArgAlaTrpAlaLeuPheArgAlaLeuAsp 3 46 4.' GlyLysGlyLeuValProAspGlyTyrValGluGlyTrpLysLys 88 60 ThrPheGluGluAspPheSerProArgArgGlyAlaGluLeuVal .... AlaArgAlaTrpThrAspProGluPheArgGlnLeuLeuLeuThr 60.. 84 AspGlyThrAlaAlaValAlaGlnTyrGlyTyrLeuGlyProGln 394 165 GlyGluTyrIleValAlaValGluAspThrProThrLeuLysAsn l10 1 1o2 ValIleValCysSerLeuCysSerCysThrAlaTrpProIleLeu !28 t0 123 GlyLeuProProThrTrpTyrLysSerPheGluTyrArgAlaArg 340 l41 li0 ValValArgGluProArgLysValLeuSerGluMetGlyThrGlu 331 360 368 IleAlaSerAspIleGluIleArgValTyrAspThrThrAlaGlu 1 0 17..,0 ThrArgTyrMetvalLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluGly 13 le0 sI TrpSerGlnGluGlnLeuGlnGluIleValThrLysAspCysLeu IleGlyValAlaIleProGlnValProThrVal Sous-unité E 6 10 1 MetAspGlyValHisAspLeuAlaGlyValGlnGlyPheGlyLys ValProHisThrValAsnAlaAspIleGlyProThrPheHisAla GluTrpGluHisLeuProTyrSerLeuMetPheAlaGlyValAla " GluLeuGlyAlaPheSerValAspGluValArgTyrValValGlu ArgMetGluProArgHisTyrMetMetThrProTyrTyrGluArg TyrValIleGlyValAlaThrLeuMetValGluLysGlyIleLeu *& 104 168 ThrGlnAspGluLeuGluSerLeuAlaGlyGlyProPheProLeu 136 326 SerArgProSerGluSerGluGlyArgProAlaProValGluThr "à^ 130 138 12ThrThrPheGluValGlyG nArgValArgValArgAspGluTyr ThrThrPheGluValGlyGlnArgVa lArgValArgAspGluTyr 141 141 180 ValProGlyHisIleArgMetProAlaTyrCysArgGlyArgVal GlyThrIleSerHisArgThrThrGluLysTrpProPheProAsp I. M M la* AlaIleGlyHisGlyArgAsnAspAlaGlyGluGluProThrTyr 118 210 111 HisValLysPheAilaAlaGluGluLeuPheGlySerAspThrAsp 210 208 210 GlyGlySerValValValAspLeuPheGluGlyTyrLeuGluPro AlaAla 2.- Une DNA selon la revendication 1, dans laquelle les séquences de DNA de codage des sous-unités a et 8 sont respec- tivement les suivantes: Sous-unité a - 20 30 40 TCAGTAACGATCGACCACACAACGGAGAACGCCGCACCGG 0 *0.0 *0 CCCAGGCGGCGGTCTCCGACCGGGCGTGGGCACTGTTCCG *0,00 *.0...0 CGCACTCGACGGTAAGGGATTGGTACCCGACGGTTACGTC 0 1.0 *..i.160 GAGGGATGGAAGAAGACCTTCGAGGAGGACT.TCAGTCCAA 170110 110 200 GGCGCGGAGCGGAATTGGTAGCGCGCGCATGGACCGACCC 210 220 240 CGAGTTCCGGCAGCTGCTTCTCACCGACGGTACCGCCGCA 20.270 280O GTTGCCCAGTACGGATACCTGGGCCCCCAGGGCGAATACA ,00,.0 "20 TCGTGGCAGTCGAAGACACCCCGACACTCAAGAACGTGAT 3,40 280 230 CGTGTGCTCGCTGTGTTCATGCACCGCGTGGCCCATCCTC al& à0 a 400 GGTCTGCCACCCACCTGGTACAAGAGCTTCGAATACCGTG III 410 430 440 CGCGCGTGGTCCGCGAACCACGGAAGGTTCTCTCCGAGAT 430" 400* 470 4S0 GGGAACCGAGATCGCGTCGGACATCGAGATTCGCGTCTAC 480."51.00...10 *. GACACCACCGCCGAAACTCGCTACATGGTCCTCCCGCAGC e o* o -GTCCCGCCGGCACCGAAGGCTGGAGCCAGGAACAACTGCA 100 0804 4000 GGAAATCGTCACCAAGGACTGCCTGATCGGGGTTGCAATC CCGCAGGTTCCCACCGTC Sous-unité 6 20 14 40 ATGGATGGAGTACACGATCTTGCCGGAGTACAAGGCTTCG &0 &O 10 GCAAAGTCCCGCATACCGTCAACGCCGAC-ATCGGCCCCAC " 1 lie CTTTCACGCCGAATGGGAACACCTGCCCTACAGCCTGATG 1 40 2k 16 TTCGCCGGTGTCGCCGAACTCGGGGCCTTCAGCGTCGACG 270 & 160 11420 AAGTGCGATACGTCGTCGAGCGGATGGAGCCGCGCCACTA CATGATGACCCCGTACTACGAGAGGTACGTCATCGGTGTC Iao 2&o!?o 28 GCGACATTGATGGTCGAAAAGGGAATCCTGACGCAGGACG 214 144 110 11 AACTCGAAAGCCTTGCGGGGGGACCGTTCCCACTGTCACG GCCCAGCGAATCCGAAGGGCGGCCGGGACCCGTCGAGACG 270 2.04 100 4*0 ACCACCTTCGAAGTCGGGCAGCGAGTACGCGTACGCGACG 41o 420 420 440 AGTACGTTCCGGGGCATATTCGAATGCCTGCATACTGCCG 410 o40 4740 40 TGGACGAGTGGGAACCATCTCTCATCGAACTACCGAGAAG TGGCCGTTTCCCGACGCAATCGGCCACGGGCGCAACGACG o0 040 00 S00 CCGGCGAAGAACCGACGTACCACGTGAAGTTCGCCGCCGA 114 SOI 0o *0" & GGAATTGTTCGGTAGCGACACCGACGGTGGAAGCGTCGTT 620 820 414 GTCGACCTCTTCGAGGGTTACCTCGAGCCTGCGGCC 3.- Un DNA recombinant dans lequel une DNA selon la revendication 1 ou 2 est intégrée dans un vecteur. 4.- Un DNA recombinant selon la revendication 3, dans lequel le DNA recombinant est pYUK121. 5.- Un transformant obtenu par transformation d'un micro-organisme hôte avec un DNA recombinant selon la revendi- cation 3 ou 4. 6.- Un transformant selon la revendication 5, dans lequel le micro-organisme hôte est Escherichia coli. 7.- Un transformant selon la revendication 5, dans lequel le transformant est JM105-pYUK121 (FERM BP-1937) dont la souche hôte est E. coli JM105. 2.633938 8.- Un procédé de production de nitrile hydratase, comprenant l'incubation d'un transformant selon la revendica- tion 5, dans un milieu pour produire le nitrile hydratase et la récupération du nitrile hydratase qui s'est accumulé dans ledit milieu. 9.- Un procédé de production d'amides, comprenant l'in- cubation d'un transformant selon la revendication 5, pour produire le nitrile hydratase et la conversion du nitrile en les amides correspondants par action du nitrile hydratase obtenu. 10.- Un procédé de production d'amides comprenant l'incu- bation d'un transformant selon la revendication 5 et la forma- tion d'une solution de culture, les isolats, les cellules traitées ou leurs produits immobilisés obtenus à partir des transformants agissant sur les nitriles pour produire les amides correspondants.