Brevet FR2635019A1 — publié le 19900209

uaeualqg;j apTJiqDDvsXlod no auuaxap un a^ev;uaeuwvlou aJ-aTud l: saAissaDDns suoT-;vuggjdw; xnap suTow ne %Tqns xnaeJod.1JvuTw %xoddns un 'uoT;uaau;d uolas '%uasiid v,nbsnp aJ4oddev9i v T nb aD 9:uaeweaJ;ouoo O s191InsaJ s*D axpua;a.e,p;awjad uo;Tuauu; a;uasgzd QI uawanb;uijq saelqv; s a 'alqçsaaai; uo5ej ap sgx;; 'anb;jDpds q;%uT;;; a%;o. saq s sap auasqxd ';jgd ai;nv,p '%a 'atq;sJanJ uop;dJospg,p 5Z Sa;1s ap svd auaspud au ';%Jd aunp 'anbTueDgw aDuesTsgsJ apug.Jx aun,p sJoqap ua;'%oddns al anb %ng; IT; sanbIgoloTq saeInDgio sap 9,;uT;j igd uo$Jeds ap sanbTuqDea sap saDua2Txa xnv au$vs;;%s jnod 'sinalIT9 jud *6 no 8 q sajna;jgdns oz Hd ap sinalmn sap 9 alqvs svd %sa,u aDjIîs QI 'a%no u3,;;u;jje1p a;qdgx3o; vwoJqD QI;uauaS Tnb sa;tsvjQd suo-;sva.uT sap q naT%;uvuuop %uawaa$%Squ s2JgqD loudITs sadnoi ap asna% od {sa alta Qo ansaui el susp 'alq;ssod svd %sa,u j$;%u %QI. 9 uo;%es;î;%n uos ';urpuadaO sr Àasvq ap %Joddns uoq un %sa alduaxa Jad aeîI;s vi lanA ap %u$od aD aO 'pPios aDJ;%am gl ap anbTuçeD, aPua;s;sg. g1 %sa saTIaT;-snpu; su;) sap q ap;nb;r a;dgp2onwobq z! ap uo$QsTI%;;n,I ap s9%nDF;;p sap aun,1 À a;$nIot saDugsqns ap alqTsJa^Ag uo$sOlqoUua,1 01 Jnod anb >suTg 'sanbT2oloTq saDug;sqns sa;Tpsal jajodgs no -a;jTnd;nod aDuQmjojJad anzq e;%u;$;e,p ap;nbuI a;qdm.9o;mmoJ2q ap;%oddns awumo uoT; %s;T;in uos anb Tsulq 6L OSú9Z cation.ce mochié par l'introduction sur ie dextranr.e ou le pciysaccharide d'une faible prcportion ce fonct.ons cetioriio"es, telles qste lA fonct1on diéehy7emno4-hyl (DEAEi, ces charges cationiques devant pratiquement compenser exactement les charges anionicues des groupes silanol de la silice native, ce qui constitue une originalité de la présente invention; la deuxième (cu la dernière) est effectuée par couplage chimique irréversible sur la couche de DEAE dextrane, par exemple, d'un polymère soluble fonctionnalisé pour avoir une affinité spécifique pour telle ou telle substance biologique, protéines diverses, acides nucléiques, cellules, etc. La pr4sence intermédiaire conduit à des résultats améliorés, notamment à une élution certaine de la substance biologique, avec une résolution plus élevée. La présente invention a donc d'abord pour objet un matériau granulaire, capable de fixer des substances' biologiques. caractérisé par le fait qu'il est constitué d'un support poreux granulaire, porteur de-charges négatives ou positives, revêtu sur sa surface par des coucnes successives, à savoir: - une première couche d'imprégnation d'un polymère hydrophile, porteur de charges opposées à celles du suppcrt, la quantité desdites charges présentes sur ledit polymère étant sensiblement égale à celle des charges présentes à la surface du support; et - une autre couche, fixée à la première par couplage chimique irréversible, d'un autre polymère hydrophile, fonctionnel, à savoir portant des fonctions conférant audit polymère hydrophile fonctionnel une affinité spécifique mais réversible pour au moins une substance biologique (polymère biofonctionnel>. La présente invention a également pour objet un matériau granulaire, capable de fixer des substances biologiques, caractérisé par ie fait qu'il est constitué d'un support poreux granulaire, porteur de charges négatives ou pcsitives, revet sur se surface Dar des couches successives, à-savoir une premire touch-e dir at cn C''n M-ZYsaccha rde, porteur de charges opposées à celles du support, la quantité desdites charges présentes sur ledit polysaccharide étant sensiblement égale à celle des charges présentes & la surface du support; et - au moins une autre couche, fixée à la première par couplage chimique irréversible, d'un autre polymère hydrophile, fonctionne!, à savoir portant des fonctions conférant audit polymère hydrophile fonctionnet une affinité spécifique m5is réversible pour au moins une substance biologique (polymère biofonctionnel). Selon une autre forme de réalisation de l'invention, au moins une couche intermédiaire d'un polymère hydrophile est insérée et fixée à la première couche (ou à la couche précédente) par couplage chimique, avant fixation de la couche du polymère biofonctionnel. Le support poreux granulaire est avantageusement un support minéral, lequel peut être choisi parmi la silice, l'alumine, les dérivés synthétiques ou naturels des verres, les silicates et le kaolin. A titre d'exemple de support poreux minéral, on peut mentionner une silice native porteuse de groupes silanol chargés négativement, le polymère hydrophile ou le polysaccharide constituant la première couche d'imprégnation étant alors porteurs de fonctions cationiques capables de compenser les charges anioniques de la silice native. La silice native présente avantageusement une taille moyenne comprise entre 5 et 300;m, un diamètre moyen de pores compris entre 5 et 400 nm, et une surface moyenne spécifique comprise entre 5 et 500 m 2/g. Les fonctions cationiques portées par le polymère hydrophile ou le polysaccharide constituant la première couche sont, par exemple, des fonctions diéthylaminoéthyle (DEAE). Le polymère hydrophile constituant la prer.mre couche et les couches intermédiaires éventuelles, peut être ré:t.u.. ou non. On prefre, en génÉral, que le plymè?e soit réticulé, ce qui assure une bonne imprégnat on du support minéral. Le polysaccharide constituant la première couche. et les couches intermédiaires éventuelles. est avantageu- sement choisi parmi les dextranes, les agaroses et autres polysaccharides naturels ou synthétiques, hydrosolubles. De tels polysaccharides peuvent être réticulés, après irnprégnation, par exemple, à l'aide de l'éther digElycidylique du butanediol-1,4 (BDDE), de i'ézpichlorhydrine ou de la glutaraldéhyde. Le polymère biofonctionnel est fixé au polymère constituant la couche précédente au moyen d'un agent de couplage. tel que les bis-époxirannes, le carbonyl- diimidazole quinoléine (EEDQ), un tel agent pouvant également être utilisé pour fixer entre elles les couches intermédiaires dans le cas o de telles couches sont envisagées. Le polymère biofonctionnel, hydrosoluble, présente une affinité vis-à-vis des substances biologiques, soit par sa nature même, soit par suite de modifications chimiques. Ainsi, les fonctions conférant l'affinité vis-&-vis des substances biologiques peuvent être de type carboxylique et/ou sulfonate et/ou aminoacides et leurs dérivés, en proportions variables. Le polysaccharide peut cependant garder des unités glucosyle non substituées, telles que les motifs (A) de la formule (I) donnée ci-après,.dans la mesure o l'affinité recherchée est suffisante. Le polymère blofonctionnel est réticulé, après imprégnation, par exemple, & l'aide des mêmes agents de réticulation que ceux indiqués ci-dessus pour la première couche et les couches intermédiaires éventuelles. Le polymère biofonctionnel hydrosoluble est choisi parmi les polysaccharides tels que les héparines, les (3>) BJT;Ou sap.vd s agzldtaj; uos 'aluapgzgjd alnwoj el suvp s uasqJd '( ) sJ;ow sal Io auvjxep np 9;PA p un ai9;ned alqnlosoJpxq lauuoî;;uojoTq ajewxlod ae 0O alq;JgA sa () a () '(;) '(V) sjT;ou sap uo;$3odoJd gI 3uop (<> N'OS È o I I HN HN 03 ZHD 7H O Z H/ Cl G 0 0 01 X,0 e 01 C 0 5 HO" o o-t0 H HO - MHD - : ) spum2;l ap Isap;;dad ap 'sSp D-outv,p sana4;od sazJXod sal la sauuvq;ljnXod sel saugTpXlod sal no sa;lXzjvAXlod sal 'au;1XjsXlod no slaen;vu sap;JqzzsX{od sez;nQ la sa} jIns sugJgdgq SD 'a3Q;yns ugZZUIJap a 'sau2Df} l a 3t 's3aq;jpoU sau1Jt.d; P 6LOSE9Z - - CH2 i2 O OH CH2 (E) Co z t 2 1ó o I r - Z représente une simple liaison ou une chaine d'espacement telle oue - - avec m = entier supérieur ou égai à 1; et - Y représente un ou plusieurs restes d'amrino-acides ou de!eurs dérivés. Le polymère biofonctionnel hydrosoluble peut aussi étre l'héparine, mod-fiée ou non, qui est un glycosamino- giycanne naturel présent dans le règne animal. Les polymères biofonctionnels hydrosolubles peuvent également être des fucanes, produits naturels dérivés des algues marines. Egalement, le polymère biofonctionnel peut.étre le dermatan sulfate ou un héraran sulfate, polysaccharides naturels hydrosolubles. Le polymère biofonctionnel hydrosoluble peut être un polymère vinylique, par exemple, un dérivé du polystyrène correspondant à la formule générale suivante: [- CH2-- (CH W o - W représente un ou plusieurs restes de molécules, el-3 cue d'finies 'a-- la dem.ande de brevet français n' 87-11813 du 21 août 1987, ou encore au moins un reste -0S3, ou -S02-R (R représentant le reste d'un amino-acide ou de ses dérivés>. Les molécules biologiques sont les protéines, les protéases, les anticorps, les antigènes, les enzymes, et les hormones. Les matériaux selon l'invention présentent une grande stabilité chimique. dans une large gamme de pH (3 6 environ) et thermique (jusqu'à 0O'C). Ils peuvent être introduits à sec en colonne, lavés par de l'eau, des solutions tamponnées, puis par des solutions aqueuses de chlorure de sodium (jusqu'à 3M NaCl). Ils peuvent aussi être introduits en colonne par voie humide et percolation de la dispersion. La capacité de ces matériaux est élevée. Elle peut atteindre 200 mg de ligand par gramme de support sec. Les matériaux selon la présente invention sont prépares des fcaçons suivantes: On imprègne un support de base sous forme de billes ou perles (silice) avec une solution concentrée du polymère de première couche (passivation de la silice); une fois l'imprégnation réalisée, on procède habituellement à la réticulation de cette première couche d'une façon connue en sol et on sèche, puis, de la même façon, on fixe la couche suivante, ou successivement les couches suivantes. Conformément à un premier mode de réalisation, on utilise un polymère de deuxième ou dernière couche qui est lui-même biologiquement actif (c'est le cas notamment de la préparation décrite aux Exemples 1 et 2). Ccnforr=4ment à un second mode de réalisation de l'invention, cn utilise un polymère de deuxième ou dernière couche qui est en lui-même non biologiquemnent actif, puis on effectue la fonctionnalisation (c'est le cas notanmm.ent de la préparation décrite à l'Exemple 3).. La présente invention porte également sur l'application du matériau tel que défini ci-dessus à la purification ou à la séparation de substances biologiques, cette application étant caractérisée par le fait que l'on O élue sur ledit matériau une solution contenant les substances biologiques que l'on souhaite purifier ou isoler, la couche de polymère biofonctionnel étant telle que le matériau fixe sélectivement soit les molécules que l'on souhaite purifier ou isoler, soit les impuretés non désirées. On peut ainsi mentionner: - la séparation et la purification d'antithrombine III à partir d'un matériel biologique contenant cette protéine, tel que sang, placenta, fractions plasmatiques, sérum; - la séparation et la purification des facteurs de la coagulation, tels que les facteurs II, VII, VIII, IX, X, pa protéine C et la protéine S, et de protéines telles que le cytochrome C, le plasminogène, le lysozyme et la fibronectine, à partir d'un matériel biologique contenant ces facteurs ou protéines, tel que sang, placenta, fractions plasmatiques, sérum; - la séparation des facteurs activés de la coagulation, tels que les facteurs II activé, IX active, X activé, dans des solutions contenant lesdits facteurs non activés; - la concentration d'une solution de protéines très diluée en milieu aqueux etl'élimination de l'eau; - la purification et la concentration des facteurs de croissance présentant une affinité pour l'héparine ou ses homologues, à partir d'extraits aqueux, par exemple el ans 'ld aun.p ';ueljod sli 'as9od gl Ja;UzT ue uQnug inod sues 'uo$;ueAuT s;uassJd Ql s2gguoAp JaJsnu; inod s%;uesgjd %uos suATnss seIdmexe sel alduaxe jad 'ewXzosAXl el a sugSou;wseld el auoJ4DsolAo al anb selle; tsaul;poJd ap slq;ssax--; suo;;dJospQ;sap Q Tssnu %;npuoa 'seAn;Tsod se2gsqD ap luapgDxa un sJolq;uv;uaseid 'il;e amwoD aue%;xep -3v3ga ap eqonoz eun,p uol;%x;j.id agil-il amu 'aDznls aunnb s;wlsuoD uo uo;usnus,t a;uemgmuIoJuoz sgS}Spom uou ailTls ap saoddns sep ins sIqIsJanJ; aJSTuau ap snua;aj;uos s9sodmom sad enb siolv 'suTqmoJql el no III auTquoJmfTug,I anb alla; 'enblîolosq asuv;sqns aun sasAel9 uo;;nlosaJ eun DsAn 'ind;g;i, l Q 'salosl J;oAnod ap aseQ;uvA,l apessod uo$%uaAu;,t '%;jd aj;nQ,p - -! Ja;m np eurwmoq, ap nuuoD ase ITnb Tsuv 'ssallaj;snpu; suoTw;jdo sep q us;q %ug9;pd es 'san%;JdgJd atqd42oaoJLp @p no (odH)o uo;ssaJd alnvq aqdgJaJogOtUD ap sgppzoJd sap sugp aJAnao ua sT1 asa;3,p %uv;%aWJsd;nl enb;uetmw anue; aun m uo%;uasAu;, ap aJsaInuvJ3 nTJ% g em 'el1;ed aun,p - UQATt1S : %ugAIns aSvUVAv atqnop al @passod uo%;ueuT asuassjd e -sainlle@> sep aeJ-;ueauls292 uaAnad xng;Jgem sel.*ns aJuaDuoD q no Ja;j.jnd q sazug;sqns sse 'uoi;uesu;,1 uoliS saemXzua;a sdJoi;ug 'ssau%2;lue,nb saele; saJTmnDqtom saDuvi;sqns ap alqisjaeaj uo;.;s;;Iqowm;, inod snssap$; tuTjp anb eal nQXje;Qm np uoT;gs$l;n,l ans %uesalszt aejod uo;;ueAu; asuesgd QI À,nn Jgs 'sanb;T;,wsvId suo;;Qjj 'w;uazvid '2ugs anb le; '; ugualuo el anb;2oloTq Ta;Tuiwm un,p j;;jgd q 'euliediq,l ap jnes;:lzo atuî;xnep np uo;$QD;,;jnd ge le uoTlgJegds 1 - :L s2na9ss;;psI zueuslou 'sgud' u;n @p 61 05ú9Z rara:ion ce matériaux selon i 'invention. et, d'autre part. sur l'application de tels matériaux & titre de supports de chrnomato6r.hie d'affinité. Dans un souci de simplification et de clarté, les matériaux selon l'invention sont désignés par les substances qui constituent le support couches successives, dans leur ordre d'introduction. Exemple 1.: Préparation du matériau silice-DEAE dextrane réticuléhéparine (Si-DEAE Dext.-Hép.) lère étae: Préoaration du diéthylaminoéthyl dextrane (DEA dext.) On agite une solution de 40 g (1 mole) de NaOH dans 80 m! d'eau bidistillée, avec 20 g (0,122 mole) de dextrane (Pharmacia France), de masse molaire comprise entre 10 000 et 50 000 dans 80 ml d'eau, pendant 30 minutes, à 4'C. Ensuite, on ajoute, en plusieurs fractions, 21 g (0, 122 mole) de chlorhydrate de chlorure de DEAE. On agite le mélange à 4 C, pendant 10 minutes, puis on le chauffe à 60'C, pendant une durée de 15 à 60 minutes. Apres la réaction, on refroidit le mélange dans un bain de glace, et on ajuste son pH à une valeur.de 9,0 à l'aide d'HCl concentré. On fait précipiter le DEAE-dextrane par le méthanol, et on filtre la suspension avec aspiration douce dans un entonnoir fritté. Enfin, on lave le gâteau de filtration avec de l'éthanol, que l'on soutire à travers le filtre. Le produit partiellement séché est broyé pour donner une poudre et l'alcool restant est éliminé sous vide à 40'C. Les caractéristiques du DEAE-dextrane obtenu ont été déterminées par titrage et par analyse élémentaire. Le pourcentage d'unités dextrane portant des groupes DEAE a varié de 0.3 à 24% suivant le dextrane employé. On a plus particulièrement retenu les dextranes portant 3 à 10% environ de groupes DEAE. 2ème ta:e: Préearation de perles de s i!ce enrobées (entre 3 et 5% de carbone) obtenu par analyse élémentaire. 3ème étape: Préparation du matériau de l'intitulé On ajoute 2 g de perles de silice revêtues par du DEAE-dext., telles que préparées ci-dessus, dans 10 ml de dioxanne sec; on aJoute 0,5 g de CDI et on agite le mélange pendant 2 heures. On récupère par filtration le produit solide ainsi activé, et on le lave avec 30 ml de dioxanne sec, puis avec 50 ml d'une solution de carbonate de sodium 0,1 M dans l'eau (pH 8,7) (tampon de couplage). On met en suspensicr.ie produit sol ce dans 10 m. de tampon de couplage (pH: 8,7>,-et on aJoute 8 g d'héparine brute (Lot PHR 08Si-Choay). On agite le mélange pendant 48 heures à la température ambiante. On ajoute alors 10 ml de solution aqueuse de chlorure de sodium (4 M)>, et on agite pendant 30 minutes. On filtre le produit solide et on le lave successivement avec 50 ml de solution de NaCl 2 M 50 mi d'eau distillée, et 10 mi de solution de tampon Tris-HC! 0,1 M (pH: 8,7), afin de désactiver les groupes actifs non couplés et finalement on réalise l'équilibre dans le tampon d'élution ou dens l'eau bidistillée. Le taux d'héparine fixée est déterminé par mesure de l'activité du filtrat et est égal à 67% de la quantité initiale d'héparine utilisée pour le couplage (11,6 m/g.de support sec>. Exemple 2: Préparation du matériau silice-DEAE dextrane-CDBS dextrane (Si-DEAE dext.CI-3BS dext; > La couche externe est ici constituée par un carboxymêthylbenzylsulfonate de dextrane noté CMDBS dext., de formule (Ia): 4 CH2 -CH2 -CH2 -CH2 CH- CH2 CH2 O i OO OH O-'O o,-'- OH]-0H I l C00wa Co Co oH 0OH H 0!I I CH2 CH2 CH2 I II (A (B)COONa CO CO (D) I I (laS Nil NH. I I. C H yH2 i2 (A> (C> D SO o les motifs (A), (B), (C) et (D) présentent les pourcentages respectifs de 30, 53, 3 et 17%, ce cormos ayanrt 4té proparr S lgn mode opératoire décrit dan le brevet francais n' 2 555 569. On prépare des perles de silice enrob4es de DEAE- dext. comme indiqué à l'Exemple 1 (première et seconde étapes). Ensuite, on met en suspension 2 g de ces perles sèches dans 15 ml d'éther éthylique préalablement séché. On aJoute 15 pl de BDDE. On agite le mélange à 40'C pendant 40 minutes, et on élimine le solvant par évaporation. On sèche le produit solide sous vide à 80'C pendant 30 minutes. On lave le produit activé avec 20 ml de NAOH O, 1 M, puis avec 50 ml de NaCl, 2 M. Ensuite, on le met en suspension dans 10 ml de solution aqueuse de soude (pH: 11) et on ajoute 400 mg de CMDBS dext. On agite le mélange à 40'C pendant 40 minutes. On récupère le produit par filtration, on le sèche sous vide. puis on le lave avec 50 ml de solution aqueuse de NaCl 2 M, et on le reprend avec 10 ml de solution de tampon Tris-HC1 0,1 M (pH: 8,7), afin de désactiver les groupes actifs non couples. Le taux de CMDBS dext. fixé, déterminé par microanalyse, est de 90% du CJbBS dext. ajouté, correspondant à environ 90 mg/g de support sec. Exemple 3: Préparation du matériau silice-DEAE dextrane - phénylalanine sulfonate dextrane réticulé Première étape: Préparation du matériau Si-DEAE dext. réticulé-dextrane réticulé 2 g de perles sèches de Si-DEAE dext.rane réticulé, préparées selon le mode opératoire décrit à l'Exemple 1, sont mis en suspension dans 15 ml d'éther éthylique sec avec pl de BDDE. Le mélange est arité à 40*C pendant 40 minutes, et le solvant est éliminé par évaporation. Le produit solide est séché coes vide L 80QC. Le suz'r-t einsi activé est mis en suspension dans 25 ml de solution aqueuse de soude pH 1l contenant 6% de dextrane T 500 (Pharmacia-France>. Le mélange est agité pendant 40 minutes. Le produit sec est filtré, séché sous vide à 80'C, puis lavé sucessivement par des solutions de soude 0,1 M, de NaCl 2 M et, finalement, par de l'eau bidistillée. Ce matériau Si-DEAE dextrane réticulé-dextrane réticulé contient environ 5,4 g de C par g de support sec. Deuxième étape: Préparation du matériau de l'intitulé 2 g du matériau obtenu à la première étape sont i5 mis en suspension dans 10 ml de dioxanne. On ajoute 0,5 mg de CDI. Le mélange est agité pendant 2 heures, à la température ambiante. Le produit ainsi activé est récupéré par filtration, lavé successivement avec de l'eau, puis avec une solution de Na2CO3 0,1 M (pH 8,7). PO0 Le produit solide est mis en suspension dans 10 ml du tampon de couplage (Na2CO3 0,1 M, pH 8,7). On aJoute mg de L-phénylalanine. Le mélange est agité pendant 48 heures à la température ambiante. On ajoute aLors mmoles de chlorure de sodium et on agite pendant minutes. Le produit solide est récupéré par filtration et lavé avec de l'eau, une solution aqueuse de NaCl 2 M et ml de solution de tampon Tris-HCl 0,1 M (pH 8,7), afin de désactiver les groupe actifs non couplés, puis, finalement, il est lavé & l'eau et séché. $0 Le produit sec, contenant environ 10 mg de L-phénylalanine couplée par g de support sec, est mis en suspension dans 50 ml de chlorure de méthylène sec. On ajoute 0,5 m..ole d'acide chlorosulfonique. Le mélange est agité doucement à 40'C pendant 4 heures. Le solide est récupéré par filtration, lavé avec 50 ml de chlorure de méthylène, puis avec 50 ml d'un mélange eau-dioxanne. Les : aIg4v;ns arInwoj gl jgd vxues9JdaJ;sa 1T; ta 4au;uT2J2,i ap ranb;p auv^xap Gy- gIn0;; euo À;Xep sc-aDilTs ngTjg;Qw np uoalCJgawc: ; aIdax3 OZ QS -KIAh3 - H 14N 9 Q 4 t4Q 014 : auo^ns alna^oj l jgd a;uasgjdax;sa eIauuo;:uo;ogq;Tnpoud ae *%g ap U;sTo^ sa uo;Q;uojynsojoItq: ap xnm% ael nb aj;uoui sainjoimD suo; saep ea2gop igd aljuoJlnsoJoIqD sednoS sap uoT;eu;Tjalep Q I ea nça.l y 9^gl ae;nsue;sa;Tnpojd al *saenaq oz a3uz; un,D Im O5 suep;joddns al %uTSiQ ua sgsXloJpq iuos anb %.,ozj nçG.ou at %uQn$;%sqns aeeo noJoluD sdnoA 6 L OS 9 i; Sú93 26350 1 9 --H O O O O I CH2 CH2 CH2 i0 I I I COONa CO CO I I NH NH I I CH CH I2 I \ (CH2)3 COOCH3 NH I \ HN NH2 2O Exemple 5: Préparation du matériau silice-DEAE agarose réticulé-fucane. Première étape: Modification d'un ararose par des groupements DEAE On utilise les agaroses commercialisés par la Société IBF sous les dénominations Indubioses A 37 HAA et A 37 NA. Ces agaroses sont modifiés par introduction.-de groupements DEAE de la manière suivante: 9,2 g d'agarose sont mis en solution.dans 210 ml d'eau distillée, et le mélange est chauffé à 60'C, pendant 2 heures. 40 ml de solution aqueuse de NaCl (5,5 M), puis 11,5 g de chlorhydrate de chlorure de DEAE sont aJoutés au milieu. Après 15 mn, le produit est précipité par addition d'une solution méthanol-HCl (2% en volume>, filtré et séché sous vide à 40'C pendant 15 heures. Le taux de substitution est déterminé par dosage acide-base et par analyse élémentaire, il est volsin de 10 me.4 de fcncticns DEAE par gramme de produit sec. Deuxième étepe: Préparation du matériau silice-DEAE ararose S réticulé. Les silices XO 075 et XO 015, telles cue définies cl-dessus, sont enrobées par le DEAE-agarose préparé à la première étape. g de silice sont ajoutés doucement dans 25 ml de solution aqueuse alcaline (pH 11) de DE.AE-ag7rose 4% de C/g de support sec). Troisième étape: Préparation du matériau de l'intitulé. Le matériau obtenu à la deuxième étape est activé, puis couplé avec des fucanes selon le mode opératoire suivant: 2 g dudit matériau sont aJoutés dans 10 ml de dioxanne sec avec 0,5 g de CDI. On agite le mélange pendant 2 heures. Le produit solide est filtré et lavé avec 25 ml de dioxanne sec, puis avec 50 ml d'une solution aqueuse de carbonate de sodium 0,1 M (pH 8,7). Le produit est ensuite mis en suspension dans 10 ml de ce même tampon carbonate (pH 8, 7) et on ajoute 100 mg de' fucane (Sigma). Le mélange est agité pendant 48 heures à température ambiante. On 2 6 3 5 0 1 9 ajoute alors 2O0 mg de chlorure de sodium. Après 30 minutes. le produit solide est récupéré par filtration, lavé successivement --ar 50 m. de solution aqueuse de NaCi 2 M, ml d'eau distillée, 10 ml de solution de tampon Tris-HC 0, 1 M (pH 8,7) afin de désactiver les groupes activés non couplés et finalement avec 50 ml d'eau distillée. Le taux de fucane fixé déterminé par dosage des fucanes libres dans le filtrat est voisin de 80% de la quantité de fucane initiale (43 mg de fucane par gramme de support sec). Exemple 6: Préoaration du matériau silice-DEAE dextrane réticulé-dermatan sulfate. 4 g de silice enrobée par un DEAE-dextrane, préparée selon le mode opératoire décrit à l'Exemple 1, sont mis en suspension dans 30 ml d'éther éthylique sec, avec pi de BDDE. Le mélange est agité à 40'C pendant minutes. Le solvant est éliminé par évaporation douce. Le support ainsi activé est mis en suspension dans 30 ml d'une solution aqueuse alcaline (pH 10,5) contenant 500 mg de dermatan sulfate et agité pendant 1 heure. Le produit solide est récupéré par filtration, séché sous vide, puis lavé successivement avec 50 ml de solution de soude 0,1 M, ml de NaCl 2 M et plusieurs fois avec 50 ml d'eau bidistillée. La quantité de dermatan sulfate fixée est déterminée par analyse élémentaire; elle correspond 6 , 1 mg de dermatan sulfate par gramme de support sec... Exemple d'Application 1: Purification de l'antithrombine III à oartir de sérum ou de plasma humains ou animaux. On a utilisé des matériaux tels que ceux des Exemples 1 et 2, le support de silice contenant de 10 à mg d'héparine par gramme de gel sec (cas des matériaux du type de celui de l'Exemple 1) et de 60 à 200 mg de dextrane modifié par gramme de gel sec (cas des matériaux du type de celui de l'Exemple 2); Avec une colonne d'un volume ze T saing.n$ sep ella'9 enb$%uap;:ú eJnSg gr @p epU@@f7 *III auTqmoJuqTuwI p $nlaD lse 'IOWN Hg'0 uo;TAua,p anbTuoT aeDoj vl 9 pnlg '4zaisqo D;d el oc anbTdX; aDuaT;.gdxa aun suvp uoT;nTg,p aqJnoz aun ae;uasIJdaeJ xauuw uTssap np ú aJnsTd i $a% anbmld ua aJanwd uïnmnq guwsQlc np uo;nt3: uo;; Tlddvp aciuax3 SZ -t aJnTJ I ap allam 9 anb;$uapT: ausaedp- 'xap-._ _ -axl:Ts ans auTqwoaq% eTap uonfl: z JnfSj gr ep apue.S7 ÀaDua-i;dxa aun suep uo;nlg,p aqJnoD aun auas$adaj,xauue uTssap np z ajn3Tel oz ausquioaq; %e ap uo$%mD;;$n: Z uo7%moz.,P alduax %ugnll suep TOWN ap a;ejTou uoTej;%uaouoo (l aqanoD> mu 09Z 9 oa anbT;do 9%Tsuea: saeuuopio 51 1 ue sa *C7,;-II/:D';;a- Zn%--; 'Sl. %,N ua uoTla-'.o. aun W TD-a Ia9 janig,p %a I13N N 1'0 uo;;nlos ua EauuoloD g1 nrs Iuia a6Ous.l uaJ ap alqTs$od %sa iT 'iu Z ap 6 [ O S ú 9 Z xe.le &'A;iiceat!cn 4:Purification du facteur de crozsesrnce du tvie "Fibroblest Grcwth Factor" acide (aFGF) à pArtir d' un entrant brut de cerveau de boeuf. Avec une colonne contenant 1,6 ml de gel constitué de même type de support que précédemment, on fait passer sur ce gel, à la température ambiante, 15 ml de l'extrait brut en solution 0,1 M NaCl. Un gradient de concentration de sel est alors appliqué sur la colonne, et le facteur de croissance présentant une activité biologique sur cellules transformées marGuées à la thymidine tritiée est élué par augmentation de la concentration saline: cette concentration est en fait de 1,2 M NaCl avec le support de silice à base d'héparine et 1,3 M NaCl avec le support à base du Cm--BS dext. Exemple d'apilication 5: Sénaration des facteurs de croissance acide et basique issus du cerveau de boeuf. - 25 mi d'extrait de cerveau de boeuf sont injectés dans un système chromatographique comprenant une colonne HLC (0,7 x 3 cm) remplie du matériau de l'Exemple 1. Le tampon d'élution initial est une solution de Tris-HCl 0,01 M, NaCl 0,5 M NaCl 2M puis NaCl 3M, afin d'éluer toutes les protéines- fixées sur le support. Une dernière étape permet de rééquilibrer le support dans le tampon initial. La Figure 4 du dessin annexé représente le chromatograrne de aFGF sur le matériau-support de LUgende de la Figure 4 Colonne: 0,7 x 0,3 cm Débit: 1 ml/minute Echantillon: 25 ml d'extrait Tampon A: 0,01M Tris-HCl, 0,5M NaCl pH 7,0 Tampon B: " ", 3, OM " " Abscisses et ordonnées: comme sur les figures 1 à 3 L'étude par électrophorèse sur gel de polyecrylamide montre que les fractions collectées lors du gradient contiennent les facteurs de croissance. Le taux d'enrichissement de ces protéines, présentes en faible quantité dans l'extrait de cerveau de boeuf, est important, et la purification est obtenue sans dégradation apparente des facteurs de croissance, lesquels conservent leur activité biologique thymidine tritiée). Exemple d'application 6: Séparation du deuxième co-facteur de l'héparine (HC II). Une colonne HPLC 0,05 M, (pH 7,4). On injecte 5 ml de plasma humain normal. Le pic important obtenu 26 3 5019 fraction montre qu'elle contient essentiellement du OC II (4,8 unités) et une très faible proportion d'AT III quantité initiale de HC II présent dans les 5 ml de plasma. L'activité spécifique de la protéine ainsi purifiée est de 4,15 U/mg, ce qui correspond à un enrichissement très important de cette protéine en une seule étape de purification. Exemple d'application 7: Pur fication du facteur II activé à partir d'un plasma humain ou d'une fraction issue du plasma humain. Le suopport présente une couche bifonctionnelle constituée d'un dextrane tel que défini à l'Exemple 4 ou bien d'un polymère tel que décrit dans le brevet français ns 2 548 193. Le support de silice contient de 10 à 100 mg de polymère biofonctionnel par gramme de gel sec. Avec une colonne d'un volume de 2 ml, il est possible d'isoler la thrombine d'un mélange de 5 ml constitué du facteur Il totalement activé en facteur Iia, et des facteurs VII, IX et X. Le mélange des protéines est déposé sur la colonne. Après des lavages en solution tampon initiale (Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 7,4), un gradient linéaire de force ionique de 0,1 M à 2,5 M NaCI est appliqué sur la colonne. La fraction éluée à concentration 0,8 M NaCl contient 70% de l'activité biologique de la thrombine- déposée. La thrombine ainsi isolée a une activité spécifique de 3000 u NIH (National Institute for Health) par mg de protéine sèche. Le procédé permet donc, soit d'éliminer les traces de facteur IIa présentes dans la solution constituée des facteurs II, VII, IX et X (pour le traitement des hémophiles B), soit de purifier la thrombine. Exemp!e c'A;plication 8: D'une manière similaire à celle fe "'exempie 7, on peut effectuer la séparation du facteur X activé è partir d'un plasma humain, d'une fraction issue du plasma humain ou d'une solution de facteur X contenant des traces de facteur Xa. - Le support utilisé présente alors une couche de polymère biofonctionnel constitué: - soit d'héparine ou de polysaccharides, - soit de dextranes modifiés par des groupes carboxyliques et sulfonates ou sulfonates et amino- acides (sulfamide ou amide d'amino-acides. de type -SO02-NH-CHR-COOH ou CH2-CO-NH-CHR-COOH) avec R = chaine latérale d'un amino-acide. 26350 19 _4 R--VEND:CAT IONS ! - Matériau granulaire, capable de fixer des u...tsr._. - _ogicues, caractérisé par le fait qu' 'l est constitué d'un support poreux granulaire, porteur de charges négatives ou positives, revêtu sur sa surface par des couches successives, à savoir: - une première couche d'imprégnation d'un polymère hydrophile, porteur de charges opposées & celles du support, la quantité desdites charges présentes sur ledit polymere étant sensiblement égale à celle des charges présentes à la surface du support; et - une autre couche, fixée à la première par couplage chimique irréversible, d'un autre polymère hydrophile, fonctionnel, à savoir portant des fonctions conférant audit polymère hydrophile fonctionnel une affinité spécifique mais réversible pour au moins une substance biologique (polymère biofcnctionnel). 2 - Matériau granulaire, capable de fixer des substances biologiques, caractérisé par le fait qu'il est O20 constitué d'un support poreux granulaire, porteur de charges négatives ou positives, revêtu sur sa surface par des couches successives, à savoir: - une première couche d'imprégnation d'un polysaccharide, porteur de charges opposées à celles du support, la quantité desdites charges présentes sur ledit polysaccharide étant sensiblement égale à celle des charges présentes à la surface du support; et - une autre couche, fixée à la première par couplage chimique irréversible, d'un autre polymère hydrophile, fonctionnel, à savoir portant des fonctions conférant audit polymère hydrophile fonctionnel une affinité spécifique mais réversible pour au moins une substar-e biolegique (polymère biofonctionnel). 3 - Matériau selon l'une des revendications-1 et 2, caractérisé par le fait qu'au moins une couche intermédiaire d'un polymère hydrophile est insérée et fixée -.d - L ÀafT;zu aDTITs;Q ap senbTuoTu; saagt seal Jasuadwoa ap salqgdoD sanbTuoT;gi suoT;zuoj ap s9nae;od s$olz uo, uo;çu2gJduT,p aqonoD aJTuaed Sl UT;u;nvTsuoD a epTJmDQSXlod al no aIq;dojpxq aejwxlod al '4;uaiaT;Qagu sgJauqz touQlTs sadnoj2 ap asnea;Jod A;Tu a;TITs aun;sa xnejod;joddns ael anb;TQj al jgd ps-i,?}Do-D 'S uo;;;gTpueAaJ g1 uoles nzTj,;ç. - 9 uçIo;H al e a $saQTI$; s sel sajaa. Ol sap slaJn%;u no senbT;gq;uXs spaTJgp saet 'auTmnQ.,I 'aTITs QI $;md TsToqz;sa gaguTn %joddns ael anb %TQj al jQd qs;Jxp;Dvjvz '. uoT;;z;pueAeJ QI uoles ng;Jq;vw - S Àg jguTu %roddns un sa aetulnumg xna-od;joddns al anb %;gj al jud gs;zv:iD S C g I suoT;%mTpuaaeJ sap aun,t uotes ngTJ;jg - ejwgXlod np agqnoD et ap.uo;X;x};ugA^ 'enb;w;Tq agidnoD Jzd (aeuapDgJd aeq noD ' r.o> aqenoD aeI1aJd a 6 1 LOSú9Z 263 5 0 1 9 1,2-dihydrocuinol!ine (EEDQ), un tel agent pouvant également être utilisé pour fixer entre elles les couches interm-ditires dans le ces o de telles ccuches sont envisagées. 11 - Matériau selon l'une des revendications 1 à , caractérisé par le fait que le polymère biofonctionnel- présente une affinité vis-à-vis des substances biologiques, soit par sa nature même, soit par suite de modifications chimiques. 10. 12 - Matériau selon la revendication 11, caractérisé par le fait que les fonctions conférant l'affinité vis-à-vis des substances biologiques sont de type carboxylique et/ou sulfonate et/ou amino-acides et leurs dérivés, en proportions variables. 13 - Matériau selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait que le polymère biofonctionnel, hydrosoluble, est choisi parmi les polysaccharides, tels que les héparines, les héparines modifiées, les fucanes, le dermatan sulfate, les héparans sulfates, et autres polysaccharides naturels ou modifiés, les polymères vinyliques, tels que dérivés de polystyrène, les polyacrylates ou les polydiènes, les polyuréthannes, et les polymères porteurs d'amino-acides, de peptides, de ligands, de récepteurs cellulaires et de colorants. 14 - Matériau selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé par le fait que le polymère constituant au moins l'une parmi la première couche et les couches intermédiaires éventuelles est réticulé, après imprégnation, par exemple, à l'aide de l'éther diglycidylique du butanediol-1,4 (BDDE), de l'épichlorhydrine ou de la glutaraldéhyde, l'agent de réticulation mis en oeuvre pour réticuler le polymère biofonctionnel pouvant également être choisi parmi les agents de réticulation précités. - Matériau selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé par le fait que les substances biologiques sont les protéines, les protéases, les anticorps, les antigènes, les enzymes. les hormones et les cellules. 16 7 Application du matériau tel que défini à l'une des revendications 1 et 15. à la purification ou à la séparation de substances biologiques, caractérisée par le fait que l'on élue sur ledit matériau une solution contenant les substances biologiques que l'on souhaite purifier ou isoler, la couche de polymère biofonctionnel étant telle que le matériau fixe sélectivement, soit les molécules que l'on souhaite purifier ou isoler, soit les impuretés non désirées. * 17 - Application selon la revendication 16, pour la séparation et la purification d'antithrombine III à partir d'un matériel biologique contenant cette protéine, tel que sang, placenta, fractions plasmatiques; sérum. 18 - Application selon la revendication 16, pour la séparation et la purification des facteurs de la coagulation, tels que les facteurs II, VII, VIII, IX, X, la protéine C et la protéine S, et de protéines telles que le cytochrome C, le plasminogène, le lysozyme et la fibronectine, à partir d'un matériel biologique contenant ces facteurs ou protéines, tel que sang, placenta, fractions plasmatiques, sérum. 19 - Application selon la revendication 16, pour la séparation des facteurs activés de la coagulation, tels que les facteurs II activé, IX activé, X activé, dans des solutions contenant lesdits facteurs non activés. - Application selon la revendication 16, pour la concentration d'une solution de protéines très diluée en milieu aqueux et élimination de l'eau. 21 - Application selon la revendication 16, pour la purification et la concentration des facteurs de croissance présentant une affinité pour l'héparine ou ses homologues, à partir d'extraits aqueux, par exemple de solutions tamponnées, contenant lesdits facteurs. 22 - Application selon la revendication 16, pour la séparation et la purification du deuxième cofacteur de 2a 1'héarir.e. & Dartir c'un matériel biologique le contenant, tel que sant. placenta, fractions plasmatiques, sérum. 2R - A-rlication selon la revendication 16, caractérisée par le fait que les substances à purifier ou à concentrer sur les matériaux sont des cellules. 24 - Utilisation du matériau tel que défini à l'une des revendications 1 à 15, pour l'immobilitation réversible de substances moléculaires, telles qu'antigènes, anticorps, enzymes.