Brevet FR2632656A1 — publié le 19891215

La présente invention concerne une méthode de détection de la présence d'un locus inconnu de longueur variable dans une séquence d'ADN comprenant au moins un locus connu. La méthode peut être utilisée en particulier pour détecter des loci d'information, par exemple des régions de minisatellites ou régions VNTR. L'invention concerne également des loci nouveaux de longueur variable détectés par la même méthode, de même que des sondes d'hybridation correspondantes. On peut les utiliser dans des méthodes de caractérisation génétique et dans le diagnostic et le traitement de troubles génétiques et du cancer. L'utilisation potentielle de loci très variables comme marqueurs d'information pour la production de cartes détaillées de liaison du génome humain est appréciée depuis des années (1). Il a été montré récemment que le premier locus hypervariabie dont la description a été donnée, D14S1 (2,3), était composé d'une courte séquence (4) répétée en tandem. Plusieurs autres loci de minisatellites hypervariables, à répétition en tandem, ont ensuite été mis en évidence par hasard dans l'ADN humain, comprenant les minisatellites 5' du gène (5) relatif à l'insuline, les minisatellites 3' relatifs au gène (6) c- Ha-rasl et au gène (7) du collagène du type II de même que trois minisatellites du groupe ou proche du groupe de gènes de l'a-globine (810). Plus récemment, une séquence "centrale" de 10-16 pb commune à de nombreux minisatellites humains a été identifiée et utilisée pour produire des sondes d'hybridation capables de détecter des mini- satellites multiples dans l'ADN humain (brevet britannique N 2 166 445) (11). Les sondes à plusieurs noyaux détectent loci hypervariables et produisent une configuaration en "fingerprint" de l'ADN propre à l'individu (12). Ces sondes détectent également 1000 loci additionnels dans le génome, comme on peut l'apprécier d'après l'abondance des clones qui s'hybrident en sondes à noyaux multiples dans les ensembles de cosmides humains (A.J. Jeffreys, informations non publiées). Ces minisatellites additionnels tendent à être courts et n'apportent pas de contribution au système de minisatellites grands et variables qui constituent les "fingerprints" de l'ADN. L'analyse de la ségrégation de fragments d'ADN hypervariables détectés dans des "fingerprints" d'ADN humain a permis d'établir que les loci détectés avaient un caractère autosomal et s'assortissaient indépendamment (11, 13). Une autre preuve de ce que des minisatellites sont dispersés dans le génome a été donnée par des analyses de ségrégation des fragments de "fingerprints" d'ADN dans des souches recombinantes de souris consanguines (14). Sur les 13 loci de minisatellites de souris ainsi définis, 8 ont pu être localisés à des chromosomes de souris dans des positions interstitielles des chromosomes. Toutefois, les loci restants n'ont pas présenté de liaison notable à des loci connus de souris et s'inscrivent vraisemblablement dans des régions déficientes en marqueurs du génome de souris. Cela accentue la probabilité selon laquelle des minisatellites pourraient ne pas être dispersés entièrement au hasard dans le génome de souris. Des minisatellites individuels ont été clones à partir des "fingerprints" d'ADN humain pour produire des sondes spécifiques des loci, pour des loci individuels extrêmement variables avec des degrés d'hétérozygotie de 85 à 99 % (demande de brevet européen publiée sous le N 238 329) (15, 16). De plus vastes ensembles de sondes qui détectent des loci humains variables (VNTR) (hétérozy- gotie moyenne. 70 %) ont été obtenus par l'exploration systématique de banques de cosmides humains par hybridation avec des oligonucléotides fondés sur des séquences connues de répétition de minisatellites (17). La Demanderesse vient de trouver que des loci variables détectés -par des sondes à noyaux multiples présentaient une localisation préférentielle, mais non exclusive, aux bandes G terminales d'autosomes humains, dans des régions du génome qui se montrent riches en loci Àhypervariables. Une cartographie détaillée et l'analyse des séquences d'une région de minisatellites détectée par une sonde spécifique envers les loci ont révélé de façon inattendue la présence. de deux loci de minisatellites étroitement liés. Ces deux loci de minisatellites, bien qu'étroitement liés, se sont révélés être les résultats d'événements d'amplification indépendants. On a pu découvrir ainsi qu'une différence anormale des longueurs alléliques, par exemple des -longueurs alléliques de fragments d'ADN non attribuables -à une différence de longueur des allèles au niveau d'un locus connu, par exemple dans une région connue à minisatellites, pouvait être utilisée pour détecter des régions nouvelles de longueur variable. Conformément à un premier aspect de la présente invention, il est proposé une méthode pour détecter la présence d'un locus de longueur variable dans une séquence d'ADN comprenant au moins un locus connu, méthode qui consiste à identifier, dans deux ou plus de deux séquences nucléotidiques d'ADN non identiques, des points équivalents aux extrémités opposées de chacune desdites séquences de nucleotides, chacune de ces séquences comprenant le locus de longueur variable devant être détecté et le locus connu, et à détecter la présence ou l'absence d'un locus de longueur variable par comparaison des distances respectives entre des points équivalents. La méthode de la présente invention peut donc être mise en application par identification de la présence ou de l'absence d'une différence anormale de longueur allélique, par exemple une différence de longueur d'un fragment d'ADN allélique non attribuable à une différence de longueur allélique au niveau du locus connu. En outre, la méthode de la présente invention comprend avantageuse- ment l'étape de caractérisation desdites séquences nucléotidiques d'ADN, par exemple par référence à leurs poids moléculaires respectifs. Une telle caractérisation peut être effectuée par tout moyen convenable, par exemple par électrophorèse sur gel. Le locus connu peut être, par exemple, une région à minisatellites, éventuellement de longueur variable, par exemple un locus d'information (tel que défini ci-après). Lorsque le locus connu est une région à minisatellites de longueur variable, la présence d'un autre locus lié de longueur variable peut être détectée par l'identification d'une différence de longueur allelique non attribuable à une différence de longueur des allèles dans la région connue des minisatellites. Le locus connu et le locus de longueur variable à détecter peuvent avoir n'importe quelle distance de séparation convenable, par exemple leur distance peut aller jusqu'à 1000 kilobases (kb), avantageusement jusqu'à 100 kb et de préférence jusqu'à 10 kb. La méthode de la présente invention constitue une méthode utile de détection d'un locus nouveau de longueur variable, de préférence à caractère d'information. Dans le présent mémoire, on définit un locus génétique à caractère d'information comme étant un locus au niveau duquel au moins 3 allèles différents peuvent être distingués dans n'importe quel échantillon de 100 individus sans lien de parenté qui n'ont pas été préalablement choisis. On peut exprimer cela en considérant que le locus a une variation allélique d'au moins 3(100). L'échantillon d'individus sans lien de parenté est avantageusement égal à 500, de préférence égal à 1000, et la capacité de distinc- tion d'au moins 3 allèles différents dans de tels échantil- lons peut alors être posée, respectivement, égale à 3(500) et 3(1000). Il est essentiel que l'échantillon de 100, 500 ou 1000 individus sans lien de parenté soit effectivement choisi au hasard, attendu qu'il est habituellement possible d'identifier-100, 500 ou 1000 individus qui ont moins de 3 allèles au niveau d'un locus génétique d'information donné par exploration systématique d'un nombre suffisamment grand de représentants de la population totale. Plus ce polymorphisme est grand au niveau d'un locus génétique d'information donné, plus la sonde spécifique du locus est utile et distinctive dans la caractérisation génétique, par exemple dans l'identifica- tion individuelle pour la recherche de paternité ou pour l'expertise légale. Un point équivalent dans des séquences nucléotidiques d'ADN non identiques peut être considéré comme un marqueur qui est situé dans une région commune a toutes les séquences. Une région commune à toutes les séquences peut n'avoir qu'une longueur de deux nucleotides adjacents et elle n'est pas limitée en ce qui concerne sa longueur totale, mais elle va avantageusement de quatre à six résidus. Un point commun peut être idertifié commodé- ment par l'utilisation d'enzymes, de sondes, ou de groupes de signalisation. Le clivage de l'ADN est un moyen pratique de constituer un marqueur, l'extrémité ou les extrémités clivées de la séquence d'ADN constituant donc le ou les marqueurs. On effectue le clivage en utilisant toute technique pratique, en utilisant de préférence un clivage enzymatique, notamment par-des endonucléases de restric- tion. On peut utiliser n'importe quelle endonucléase de restriction pratique. Des exemples individuels d'endo- nucléases de restriction comprennent les endonucléases indiquées en détail dans Nucleic Acids Research, Sequences Supplement, Volume 16, 1988, pages r271-r313 et dans "Current Protocols in Molecular Biology", 1987- 1988, publié sous la direction de F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman et K. Struhl, Wiley Interscience, Section 3, tableau 3.1-1. Des endonucléases de restriction particulières comprennent Nco I, Eco RI et Eco RV. On comprend immédiatement que le point de clivage est choisi de manière que le locus connu, par exemple le locus connu d'identification, ne soit pas fragmenté ni ne subisse d'interférence. Par conséquent, selon un autre aspect de la méthode de la présente invention, les points équivalents sont définis par des sites de clivage et l'ADN de l'échan- tillon est clivé en donnant lesdites séquences nucléotidi- ques d'ADN non identiques et la présence ou l'absence d'un locus de longueur variable est détectée par comparaison des longueurs des séquences nucléotidiques d'ADN non identiques clivées. Comme on le montrera de façon plus détaillée dans la description qui suit, une comparaison des distances entre les points équivalents permet d'identifier toute différence de longueur. Il y a lieu de remarquer -que lorsque le locus connu est de longueur variable, cette variation doit être prise en considération. L'identification dés- points équivalents peut nécessiter la conduite d'essais classiques pour déterminer si ces points se trouvent au-delà des extrémités opposées de la séquence désirée de nucléotides. Si l'on choisit, par exemple, des points équivalents qui apparaissent fréquem- ment dans la séquence polynucléotidique de l'ADN, il peut ne pas être possible de satisfaire au critère selon lequel ils doivent être au-delà des extrémités opposées des séquences nucléotidiques d'ADN comprenant une région ou un locus connu commun et la région de longueur variable a identifier. Si, toutefois, on choisit des points équi- valents qui ne sont pas trop éloignés, il peut arriver que, outre le locus connu commun à toutes les séquences, il "t 2632656 existe plus d'une région de longueur variable ou plus d'un locus hypervariable entre les points communs. Un ou plusieurs autres points -équivalents plus rapprochés du locus commun connu peuvent alors être identifiés pour situer plus précisément une ou plusieurs régions ou des loci variables très fortement liés au locus connu. L'ADN peut provenir de n'importe quel source convenable, par exemple il peut s'agir d'ADN génomique. Des exemples de sources particulières d'ADN que l'on peut utiliser dans la méthode de l'invention comprennent l'ADN humain. Le cas échéant, liADN de l'échantillon peut être amplifié, par exemple par l'utilisation de la réaction en chaîne sous l'action d'une polymérase (PCR) décrite dans, les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 4 683 195 et N 4 683 202, pour produire des séquences nucléotidiques d'ADN destinées à être utilisées dans la méthode de l'invention. L'amplification de régions à minisatellites est décrite dans Nucleic Acids Research, 1988, volume 16, pages 10953-10971, A.J. Jeffreys et collaborateurs. A titre de variante, l'ADN de l'échantillon peut être amplifié par une méthode d'amplification linéaire dans laquelle un modèle d'orientation structurale de l'ADN de l'échantillon est toujours utilisé pour préparer des copies complémen- taires de la séquence nucléotidique de l'ADN de l'échantil- lon. Lorsque les séquences nucléotidiques d'ADN devant être utilisées dans la méthode de l'invention ont été préparées par amplification de l'ADN de l'échantillon, des points équivalents peuvent être offerts à titre facultatif par les extrémités opposées de chacune des séquences nucléotidiques d'ADN. Un clivage de l'ADN n'est alors pas exigé. En- conséquence, selon un autre aspect de la méthode de la présente invention, lesdites séquences nucléotidiques non identiques sont amplifiées et les longueurs des produits amplifiés sont comparées de manière à détecter la présence ou l'absence d'un locus de longueur variable. Les séquences nucléotidiques d'ADN non identiques devant être comparées peuvent être une matière clonée, comme en comporte, par exemple, une banque d'ADNc. Les séquences à comparer sont commodément identifiées par hybridation avec un polynucleotide comprenant au moins un locus connu. En conséquence, selon un autre aspect de la présente invention, lesdites séquences nucleotidiques d'ADN non identiques consistent en un matériel clone. Des régions ou loci d'information dans l'ADN ont déjà été identifiés, par exemple dans 1'ADN génomique comme indiqué dans les références bibliographiques. Des régions du génome qui conviennent pour l'investigation sont considérées comme étant des régions pro-terminales d'autosomes, en particulier d'autosomes humains, notamment les bandes G terminales d'autosomes humains. Des régions d'informations peuvent avantageusement être identifiées par hybridation avec des sondes poly- nucléotidiques connues. Des conditions convenables pour l'hybridation sont évidentes pour l'homme de l'art. Les sondes sont détectées après hybridation par des méthodes connues, par exemple par l'inclusion d'un marqueur ou indicateur radio-actif dans les sondes, qui peut être détecte par des moyens classiques. Des exemples de sondes convenables sont donnés dans les références précitées et comprennent les sondes à minisatellites clones appelées lambda MS31, lambda MS1, lambda MS8, lambda MS32 et p lambda g3. Des sondes à minisatellites dont on apprécie l'utilisation dans la méthode de l'invention comprennent les sondes lambda MS43 et p lambda g3. D'autres loci d'information peuvent être identifiés conformément à la méthode présentée dans la demande de brevet britannique (publiée sous le N 2 188 323). Il y a lieu de remarquer que lorsque de 1'ADN provenant d'un certain nombre d'individus est utilisé, l'information que l'on peut obtenir en ce qui concerne le polymorphisme de la région de longueur variable du locus est d'autant plus grande. Lorsqu'un point équivalent est créé par clivage de 1'ADN, des fragments sont produits. Si, en outre, une sonde d'hybridation est utilisée pour identifier un locus connu, par exemple un locus d'information, on peut faire intervenir la sonde avant ou après le clivage de l'ADN, de préférence après. 'La méthode de l'invention est mise en oeuvre par restriction de deux ou plus de deux séquences nucléotidiques d'ADN non identiques pour obtenir relative- ment à chaque séquence un fragment comprenant un locus de longueur variable devant être détecté et le locus connu, chaque fragment se terminant en des points équivalents, en sorte que la présence d'un locus de longueur variable peut être détectée par identification d'une différence de longueurs de fragments alléliques non attribuable à une différence de longueur d'alleles dans'le locus connu. - Des fragments d'ADN destinés à être utilisés dans la méthode ci-dessus 'peuvent être préparés par tout procédé commode, par exemple comme indiqué ci-dessus. Ainsi, des fragments d'ADN se terminant chacun en des points équivalents peuvent être obtenus par exposition de chaque séquence nucléotidique d'ADN non identique à une restriction en utilisant la même endonucléase de restric- tion. La région ou le locus détecté par les méthodes ci-dessus peut ensuite être caractérisé plus avant par détermination de la séquence nucléotidique d'ADN, par des méthodes connues dans l'art antérieur. On peut utiliser avantageusement un analyseur de séquences nucléotidiques d'ADN, de type automatique de préférence. Selon un autre aspect de la présente invention, il est proposé un site ou locus nouveau d'ADN de longueur variable détecté par la méthode de l'invention. La méthode de la présente invention a déjà identifié des régions nouvelles de longueur variable dans l'ADN de génome. L'utilisation d'une sonde d'ADN appelée lambda MS43, décrite dans la demande de brevet britannique publiée sous le N 2 188 323, a permis de détecter et de séquencer un minisatellite lié, appelé lambda MS43B. La région du minisatellite indiquée ci-dessus peut être identifiée commodément par des séquences de nucléotides capables d'identifier cette region par hybridation et portant par exemple un composant indicateur ou marqueur. Ces séquences de nucléotides peuvent compren- dre n'importe quel nombre pratique de nucléotides complé- mentaires, pourvu que l'hybridation permette l'identifica- tion de la région du minisatellite. La séquence nucléotidi- que présente une homologie d'au moins 70 %, 80 %, 90 % ou % avec la région correspondante du minisatellite. En conséquence, selon une autre particularité de la présente invention, il est proposé une séquence de nucleotides qui comprend au moins huit nucléo- tides successifs choisis dans la séquence TGGTGATGGGGCTGGACGGGGGCG ou ses répétitions en tandem ou des séquences qui en sont complémentaires. La séquence nucléotidique comprend avantageuse- ment au moins 10 nucléotides successifs et de préférence la totalité des nucleotides représentés. Il y a lieu de remarquer que les répétitions en tandem sont avantageuse- ment identiques, mais il ne s'agit pas là d'une condition absolue. Dansla séquence isolée, 42 répétitions étaient présentes. La séquence a été liée à celle qui est appelée ici MS43A et qui est décrite dans la demande de brevet britannique N 8706401. 2632-656 1i Une autre région polymorphe de longueur variable a été identifiée par l'utilisation de la sonde d'ADN appelée p lambda g3 décrite dans la demande de brevet britannique publiée sous le N 2 188 323. Le minisatellite d'ADN nouveau de grande variabilité est caractérisé par sa localisation entre les sites d'endonucléases de restriction Nco I et Pvu II les plus proches du-locus p lambda g3. La séquence de cette région ou de ce locus peut être mise en lumière par des méthodes connues dans l'art antérieur, comme indiqué ci-dessus. Conformément à un autre aspect de la présente invention, 'il est proposé une séquence nucléotidique capable d'identifier par hybridation le locus nouveau mentionné ci-dessus. D'autres régions polymorphes de longueur variable ont été identifiées par l'utilisation de la sonde d'ADN -appelée ci-après pMS 228 (non divulguée antérieure- ment). En utilisant cette méthode de la présente invention, on a trouvé que le minisatellite compris.dans cette région polymorphe de longueur variable comportait deux mini- satellites liés appelés ci-après pMS 228A et pMS 228B. D'autres aspects de la présente invention comprennent des séquences nucléotidiques capables dridentifier par hybridation l'un des loci nouveaux mentionnés ci-dessus. En conséquence, selon une autre particularité de la présente invention, il est proposé une séquence nucléotidique qui comprend au moins huit nucléotides successifs choisis dans Ia séquence ou ses répétitions en tandem ou des séquences qui en sont complémentaires. La séquence de nucléotides comprend avantageusement au moins 10 nucléotides successifs et de préférence la totalité des nucléotides représentés. Selon une autre particularité de la présente invention, il est donc proposé une séquence nucléotidique qui comprend au moins huit nucléotides successifs choisis dans la séquence GGGGGACAGGGCGRGA ou ses répétitions en tandem ou des séquences qui en sont complémentaires. La séquence nucléotidique comprend avantageusement au moins 10 nucleotides successifs et de préférence la totalité des nucléotides représentés. Selon encore un autre aspect de la présente invention, il est proposé des sondes d'ADN qui comprennent une séquence nucléotidique correspondant à l'un quelconque des aspects de l'invention présentés ci-dessus, conjointe- ment avec un composant indicateur ou marqueur. D'autres détails de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui suit, donnée à titre non limitatif. Matériels et méthodes Marquage de sondes au 3H. L'ADN flanquant les minisatellites clones a été éliminé par digestion des insertions en Sau3A de XMS31, XMS1, XMS8, kMS32, \MS43 et pXg3 (15, 16) avec une ou plusieurs des endonucleases de restriction AluI, HaeIII, HinfI. Des fragments d'ADN de minisatellite ont été purifiés par électrophorèse sur gel (18) et oligo-marqués en présence de 0,3 nmole de 3H-dATP, 3H-dCTP et 3H-dTTP à la dose de 2-8x107 cpm/pg (19). Des minisatellites provenant des sondes recombinantes 33.6 et 33.15 à loci multiples M13 revendiquées dans le brevet britannique N 2 166 445 (Lister Institute of Preventive Medicine) ont été excisés d'ADN RF M13 avec les endo- nucleases respectives BamHI et KpnI ou BamHI et EcoRI et marqués au 3H comme ci-dessus. Hybridation in situ. Les sondes marquées issues de AMS31, >MS1, XMS8, ÀMS32, AMS43 et pAg3 ont été hybridees avec des métaphases de lymphocytes humains normaux qui avaient été cultivées en présence de 100 pg/ml de Brd Urd (20, 21), et en présence de 240 Mg/ml d'ADN de saumon dénaturé de bas poids moléculaire, comme décrit précédemment (21, 22). Les sondes à loci multiples 33.6 et 33.15 ont été hybridées comme indique ci-dessus, mais sans aucun ADN en compétition. Des lames ont été exposées -à la Nuclear Research Emulsion Ilford K2 à 4 C pendant 7- 14 jours, puis les bandes G ont été localisées par la méthode Hoechst 33258/UV/Giemsa (20). ADN humain. On s'est procuré de l'ADN de leucocytes d'individus de la région septentrionale de l'Europe, sans lien de parenté (12). D'autres ADN ont été fournis par le Centre du Polymorphisme Humain. -Hybridations par transfert Southern. On a fait digérer des ADN génomiques avec des endonucléases de restriction et on a procédé à l'électrophorèse de la manière décrite (13). L'ADN a été transféré sur Hybond-N (Amersham International) et hybridé avec des sondes d'ADN marquées au 32p conformément à Church et Gilbert (23). pMS228 De l'ADN génomique humain digéré par l'enzyme Sau3A1 a été sélectionné en fonction de sa longueur et incorporé par ligation à ÀL47.1. La banque résultante a été explorée avec des sondes 33.6 et 33.15; des clones d'hybridation positive (série,MS) ont reconnu des loci très variables lorsqu'elles ont été utilisées pour explorer de l'ADN de génome humain. La même méthode a été utilisée pour isoler >MS228, duquel l'insertion Sau3A1 a été subclonée au site BamHI de pUCl3 en donnant pMS228. Une caractérisation détaillée de pMS228 est donnée dans la partie intitulée "résultats" et est récapitulée dans le tableau 3. L'hybridation in situ a été effectuée comme décrit en (50). Le sécuencacie d'ADN a été effectué par la méthode de terminaison de chaîne didéoxy, (51) avec la polymérase T7 modifiée à fragment de Klenow (52) ou la polymérase d'ADN dérivée de Thermus acuaticus (53). Résultats Localisation de minisatellites humains par hybridation in situ Six minisatellites clones appelés pg3, XMS1, MS8, XMS31, MS32 et XMS43, détectant chacun un seul locus très variable (tableau 1) (15, 16) ont été hybridés in situ avec des chromosomes humains en métaphase. On a déjà montré que ces sondes sont très sensibles par des analyses par transfert Southern, ce qui est vraisemblablement dû à la nature répétitive en tandem à la fois de la sonde et du locus cible. Comme on pouvait s'y attendre, les signaux d'hybridation in situ ont été intenses, la majorité des métaphases montrant un ou plusieurs grains d'argent sur le locus concerné (figure 1). On a donc pu obtenir la localisation en analysant relativement peu de cellules (tableau I). La figure 2 (2A à 2C) illustre la distribution de grains d'argent après hybridation in situ pour chacune des six sondes de minisatellite. Chaque sonde détecte un seul locus prédominant, et les localisations régionales de ces loci sur des chromosomes, 1, 5, 7 et 12 (tableau I), sont en concordance totale avec des attributions chromoso- miques préalables provenant de l'analyse d'hybrides de cellules somatiques (16). L'analyse de l'hybridation in situ avec la sonde 'MS32 a montré un arrière-plan relativement accentué de grains à distribution statistique, bien que la localisation à lq42-43 se révèle nette. La distribution de grains d'argent après hybridation avec %MS8 montre un second pic mineur à 12q24.3-qter en plus du locus principal à 5q35-qter. Ce pic secondaire peut représenter un autre locus présentant une similitude notable de séquence avec le locus D5S43 reconnu par XMS8. 4 des 6 loci de minisatellite, de même que le second locus détecté par AMS8, sont localisés à des bandes G terminales (tableau I). Les minisatellites 2MS1 et XMS32 restants sont tous deux localisés vers les extrémités du chromosome 1, mais ne sont pas terminaux. Cette localisa- tion préférentielle bien que non exclusive aux bandes G terminales est significative du point de vue statistique. Des cellules en métaphase avec environ 400 bandes G par génome haploide ont été utilisées dans ces analyses. Si l'ADN est uniformément distribué le long de chromosomes, 11 % du génome et, par conséquent, 11 % des minisatellites à dispersion statistique doivent alors être localisés dans des bandes G terminales. La localisation de 4 des 6 mini- satellites à des bandes G terminales est donc significative (P =-0,002 pour la dispersion aléatoire). Cette dispersion nôn aléatoire de mini- satellites a été étayée par l'hybridation in situ avec les sondes 33.6 et 33.15 de "fingerprint" de l'ADN' à. loci multiples, qui détectent ensemble1000 loci dans le génome humain. Une proportion de 26 à 32 % de la totalité des grains d'argent sur des chromosomes a été localisée sur des. bandes G terminales (tableau 2), comparativement à la proportion de 11 %, attendue pour une distribution statistique des grains. Toutefois, étant donné que le rendement de détection de différents minisatellites avec ces sondes varie notablement d'un locus à l'autre, il n'est pas encore possible d'estimer la proportion de tous les minisatellites, ni la proportion des loci hypervariables, qui montrent une localisation pro-terminale. Les minisatellites pro-terminaux ne sont pas télomériques Le télomère du bras court des chromosomes humains X et Y a été identifié par la sonde 29C1 qui définit la cartographie des loci DXYSl4 très près du télomère; des fragments de restriction appropriés comprenant DXYS14 et le télomère montrent une variation de longueur de 14 kb chez un individu, résultant de l'hétéro- généité de longueur du télomère, produisant une bande d'hybridation "étalée" sur des diagrammes Southern (25). Des essais similaires effectués avec pXg3, >MS8, \MS31 et >MS43 sur de l'ADN génomique digéré avec une gamme de 14 endonucléases de restriction différentes n'ont montré aucune bande "étalée" qui puisse indiquer une liaison physique étroite à un télomère (résultats non représentés). Il semble donc probable que ces minisatellites pro- terminaux ne soient pas télomériques et soient localisés à une distance d'au moins 12 kb de télomères. La distance maximale d'un télomère est de 8 mb, qui est la longueur approximative de l'ADN dans une bande G terminale. Association d'autres loci hypervariables à des mini- satellites Dro-terminaux La localisation préférentielle de mini- satellites dans des bandes G terminales suggère que ces régions peuvent être riches en loci hypervariables. Deux ordres de preuves soutiennent cette possibilité. Il a déjà été montré que >MS43 détectait un second locus variable en plus du locus hypervariable principal (16). Des études par familles ont montré que ces deux loci étaient étroitement liés (résultats non repré- sentés). Une cartographie détaillée et l'analyse des séquences du fragment d'ADN humain Sau3A clone dans \MS43 ont révélé la présence d'un second minisatellite MS43B localisé à une distance de 1,0 kb du minisatellite principal MS43A (figure 3A). Ce second minisatellite est constitué de 43 fragments répétés d'une séquence riche en G de 24 paires de bases qui contient une région très analogue à la fois à la séquence "centrale" et à la sonde de "fingerprint" d'ADN 33.6 qui a été utilisée pour identifier iMS43. En contraste avec ce qui précède, le minisatellite principal riche en G, avec une longueur de motif répété de paires de bases, montre peu de similitude de séquence avec la séquence centrale ou la sonde 33.6 (16). Des essais ultérieurs ont montré que >MS43 était isolé par détection de MS43B, non de MS43A, avec la sonde 33.6 (résultats non représentés). Il n'y a pas de similitude importante entre ces deux minisatellites, et ils sont orientés, en terme de brin riche en G, dans des directions opposéees. Ces deux minisatellites, bien qu'étroitement liés, paraissent donc provenir d'amplifications indépendantes. Le second minisatellite MS43B agit comme sonde spécifique d'un locus (figure 3B). Le locus détecté montre au moins 7 allèles de longueur différente, qui répètent des nombres de copies variant de 24 à 50, avec une hétéro- zygotie associée de 35 % (figure 3C). En revanche, le principal minisatellite détecté par >MS43 montre plus de allèles de longueur différente et une hétérozygotie de 96 % (16). Pour étendre la recherche de minisatellites liés, on a hybridé chaque minisatellite cloné à de 1'ADN humain clivé avec une gammne de 14 endonucléases de restriction différentes; l'existence d'une hétérozygotie de longueur au niveau d'un locus lié apparaîtrait comme une différence anormale dans les longueurs des fragments alléliques ne pouvant pas être attribuée à une différence de longueur des allèles dans le minisatellite détecté par la sonde. Cette approche a révélé l'existence d'une seconde région polymorphe de longueur très variable près du locus hypervariable détecté par pXg3 (figure 4A). Des endo- nucléases de restriction qui effectuent un clivage près du site p Xg3 produisent des fragments alléliques dont la différence de longueur peut être entièrement attribuée à une variation allélique au niveau de pXg3. En contraste avec ce qui précède, des endonucléases de restriction NcoI, EcoRI ou EcoRV ont produit des fragments alléliques présentant uneanomalie de longueur, indiquant la présence d'une seconde région variable distale par rapport à pXg3. La cartographie génomique a localisé cette seconde région variable à un intervalle NcoI-PvuII de 2 kilobases à partir de p g3 (figure 4B). Cet intervalle montre des allèles multiples dont la longueur varie de 4 à 36 kilobases dans un échantillonnage de 21 allèles provenant d'individus appartenant au groupe expérimental CEPH. Il n'existe aucune corrélation significative entre la longueur d'un allèle de pXg3 et la longueur du second locus hypervariable lié (figure 4C). Des études ultérieures ont montré que deux loci étaient détectés avec une grande rigueur par la sonde pMS228. Des analyses par familles ont montré que ces loci étaient étroitement liés. La cartographie de restriction de l'ADN clone, confirmée par la suite par l'analyse des séquences, a démontré la présence de deux régions dis- tinctes de répétitions en tandem, désignées par 228A et 228B (figure 4). Un nouveau sondage d'ADN humain avec des sous-clones provenant de la sonde pMS228 a montré que la région 228A détectait le locus le plus grand, le plus intensément hybridant, et que la région 228B détectait les allèles les plus petits, effectuant une hybridation plus faible. Ces minisatellites ont été localisés, au moyen d'hybrides de cellules somatiques et par hybridation in situ, en 17p13-pter. Les propriétés des loci détectés par pMS51 et pMS228 et par les autres minisatellites commentés dans le présent mémoire sont récapitulées dans le tableau I. Les deux minisatellites dans la sonde pMS228 ont des hétérozygoties supérieures à 80 %. Le minisatellite 228B (figure 5, tableau 3) allie une haute hétérozygotie (85 %) à une plage limitée de longueurs d'allèles (0,6- ,5 kilobases); cette alliance en fait un locus très utile pour l'analyse de minisatellites par la réaction en chaîne d'une polymérase. En général, les loci les plus variables ont une large plage de longueurs d'allèles, en sorte que de nombreux allèles excèdent la longueur maximale habituelle- ment amplifiable par cette méthode, en donnant ainsi un profil incomplet. En revanche, au niveau du locus détecté par 228B,- l'examen de 48 individus sans lien de parenté a montré que 95 % d'allèles étaient inférieurs à 2 kilobases, et que l'allèle le plus grand (5,5 kilobases) était bien en deçà de la plage susceptible d'amplification (J. Armour et A. Jeffreys, non publié). La Demanderesse a même établi la perspective d'un profil complet et donnant cependant une information utile à partir d'une amplification en un seul locus. Dans un intervalle de moins de 6,5 kilobases de séquence voisine, on a trouvé sept éléments répétés dispersés (quatre éléments Alu, un élément Ll-(kpn), un LTR rétroviral et un élément court entremêlé récemment décrit). Bien que des variations locales puissent avoir lieu, on doit s'attendre à ce qu'un élément Alu apparaisse toutes les 5 ou 6 kilobases et un élément L1 toutes les 30 kilo- bases dans l'ADN humain. Ainsi, la fréquence des éléments Alu et L1 suggère à elle seule un excès de répétitions dispersées près de minisatellites. Il est intéressant de noter qu'une fréquence du même ordre de grandeur de répétitions dispersées a été décrite dans l'ADN non codant du gène de l'activateur du plasminogène de tissu humain (t- PA), dans lequel 28 éléments Alu complets ou partiels et un élément Ll partiel ont été observés -dans 36,6 kilobases, conjointement avec un bloc important (570 paires de bases) d'une répétition en tandem de 5 paires de bases). Des essais similaires effectués avec des minisatellites pro-terminaux XMS8 et XMS32 et avec des sondes interstitielles XMS1 et ÀMS31-n'ont montré aucun signe d'hétérozygotie quant à la longueur deskfragments de restriction dans l'ADN au voisinage de chaque miniisatellite chez le seul individu testé. - La localisation de 4 sur 6 minisatellites hypervariables à des bandes G terminales d'autosomes humains par hybridation in situ constitue un écart significatif du point de vue statistique par rapport à une distribution aléatoire, étayé par la ségrégation de 26 à 32 % de grains d'argent au niveau de télomères apres l'hybridation in situ avec les sondes 33.6 et 33.15 a loci multiples. La proportion exacte de minisatellites hyper- variables qui s'intègre dans des régions pro-terminales n'est pas encore connue, pas plus que l'on ne connaît leurs positions physiques par rapport a des télomères. Il existe d'autres exemples de loci hyper- variables qui se localisent aux bandes terminales G, comprenant la région hypervariable (RHV) c-Ha-ras1 3' dans la position lp15.5 (6) et le minisatellite d'hybridation croisée VTR4.1 dans la position 10q26 (30), la RHV 5' de l'insuline dans la position lp15.5 (5), le locus détecté par la sonde CR1 S194 dans la position 7q36 (31) et la RHV de la chaîne lourde d'immunoglobuline JH 5' dans la position 14q32.3 (32). De même, le seul locus très variable pouvant être identifié dans une collection statistique de segments d'ADN du chromosome 5 s'est localisé lui aussi aux bandes G terminales du bras court (33,34). Plus récemment, une carte préliminaire des liaisons du génome humain a montré qu'une proportion importante (11/28) de loci présentant des hétérozygoties supérieures à 70 % apparais- sait également dans les 5 % terminaux de cartes de liaisons autosomiques (35); toutefois, les positions cytogénétiques de la plupart de ces loci hypervariables ne sont pas connues. Bien qu'il existe une position terminale préféren- tielle de minisatellites, il existe des positions intersti- tielles, comprenant D1S7 et D1S8 (présent mémoire), D14Sl dans la position 14q32.1-32.2 (3), les trois régions hypervariables dans le groupement de gènes de l'a-globine qui sont dans la position 16p13.1 (36) d'après la carto- graphie de structure fine, et la région hypervariable du collagène 3' du type II riche en AT dans la position 12q13.1-14.3 (7). En contraste avec l'homme, au moins 8 des 13 loci de minisatellites hypervariables détectés dans les 2i "fingerprints" d'ADN de souris sont localisés dans des positions interstitielles (14). On ne sait pas encore exactement si cela représente une différence importante dans la distribution des minisatellites entre les deux espèces. Les minisatellites humains occupent non seulement des situations préférentielles dans des bandes G terminales, mais ces régions sont susceptibles d'être riches en minisatellites groupés. Ainsi, le clone de minisatellites XMS43A contient deux minisatellites étroitement liés mais distincts qui paraissent être les produits d'événements d'amplification indépendants. De même, une seconde région très variable est localisée à 2 kilobases des loci hypervariables D7S22 détectés par la sonde pXg3. Ce groupement pro- terminal de mininisatellites autosomaux évoque la région d'appariement pseudo-autosomal pro-terminal des chromosomes sexuels chez l'homme et la souris, qui contiennent aussi une haute densité de segments d'ADN hypervariables (37-39) dont certains au moins sont des minisatellites à répétitions- en tandem (38) et dont l'un, DXYS14, est situé très près du télomère (25). Cela suggère une certaine similitude dans l'organisation des pro-terminus des-autosomes et des chromosomes sexuels. Il a été suggéré. que la séquence centrale partagée par de nombreux minisatellites humains riches en GC pouvait être impliquée dans des processus inégaux d'enjambement au niveau de loci hypervariables (11), point de vue étayé par la présence d'une séquence en rapport avec la partie centrale au niveau ou au voisinage d'un "hotspot'" de recombinaison méiotique dans le gène Ep MHC de souris (40). Il est donc intéressant de noter que dans la méiose mâle chez l'homme, la distribution de chiasmata (41, 42) et de nodules de recombinaison associés à des complexes d'appariement (43) montre de même une localisation préférentielle aux régions pro-terminales d'autosomes humains. Une preuve plus directe de la capacité de recombinaison de régions pro-terminales résulte de l'observation de l'expansion de la carte de liaisons dans la région pseudo-autosomale des chromosomes sexuels humains dans la méiose mâle, mais non femelle (37) et dans l'expansion de la carte des liaisons terminales apparais- sant chez le nématode Caenorhabditis eleqans (44), chez Drosophila melanoaaster (45, 46) et, provisoirement, sur les chromosomes humains 10 et 21 (35). Chez l'homme, il existe aussi des cas d'expansion de la carte de liaisons terminales des autosomes apparaissant préférentiellement dans la méiose mâle (35, 47), reflétant vraisemblablement une différence dans la fréquence des événements de recombinaison terminale dans la méiose du mâle et de la femelle, analogue à ce que l'on observe dans la région d'appariement pseudo-autosomal des chromosomes sexuels. Des minisatellites hypervariables peuvent montrer une très grande vitesse de mutation vers des allèles de longueur nouvelle (48), concordant avec la suggestion selon laquelle des minisatellites sont des hotspots recombinants (11). Il est donc tentant d'associer la tendance à la recombinaison des régions pro-terminales de chromosomes humains à la haute densité de minisatellites dans ces régions. Toute- fois, des minisatellites hautement instables ne sont pas exclusivement situés dans les bandes G terminales, et en fait les deux minisatellites humains les plus instables que l'on ait identifié jusqu'à présent, à savoir DlS7 et DlS8 (48, I. Patel et A. Jeffreys, résultats non publiés) montrent tous deux des localisations interstitielles. La relation qui existe entre des minisatellites et la recombinaison pro-terminale reste donc obscure, avec la possibilité d'apparition de minisatellites proterminaux comme un sous-produit de la recombinaison générale favorisée près de termini chromosomiques plutôt que leur implication directe dans une recombinaison et/ou dans un -, 2632656 synapsis dans ces régions. Des loci marqueurs à haut pouvoir d'information et très localisés quant à la région, tels que ceux qui sont décrits dans le présent mémoire, constituent des loci essentiels d'ancrage pour la construction de cartes précises de liaisons en génétique humaine qui peuvent être rattachées à des cartes cytogénétiques. En outre, la position pro-terminale de nombreux minisatellites donne l'assurance qu'une expansion de la carte des régions terminales ne conduise pas à des régions déficientes en marqueurs de la carte des liaisons du génome humain, comme on le voit chez C.elecans (44). Des marqueurs hyper- variables terminaux conviennent aussi de façon idéale à la détection de la perte de marqueurs dans des tumeurs, en particulier lorsque cela provient de la recombinaison mitotique qui aboutit à l'homozygotisation de tous les marqueurs en position distale par rapport au point de recombinaison (49). Il reste encore à voir si des loci interstitiels à haut caractère. d'information existent en nombre suffisant pour rendre réalisable l'édification de cartes de liaison du génome humain basées sur des mini- satellites, à haute résolution. TA3FIAU 1 iocalisation de minisatelites hvpervariables par hvybridatio in situ Clone Locus Hétérozy- Iocalisa- Localisation Nombre d'in- Ncmbre de Nombre de Nombre de Nombre de gotie, % tion par par hybrida- dividus cellules grains grains sur grains dans HCS* tion in situ analysés analysées le chromo- la position same con- repérée sur oerné la carte pXg3 D7S22 97 7q31.3-qter 7q36-qter 1 12 82 47 41 XMS1 D1S7 99 lp lp33- p35 1 19 158 41 27 XMS8 D5S43 87 5 5q35-qter 2 23 126 33 26 XMS31 D7S21 98 7p22-pter 7p22-pter 1 34 121 41 33 1MS32 D1S8 97 lq lq42-q43 1 11 263 50 39 1MS43 D12Sll 96 12 12q24.3-qter 2 30 105 49 44 *HCS = hybrides de cellules somatiques (16). 0% Ln Co TABLEAU.2 Distribution de qrains d'argent sur des chromosomes humains après hybridation in situ avec des sondes "fingerDrint" d'ADN à loci multiples Sonde* -33.6 33.15 Nombre de cellules analysées+ 45 36 Nombre de grains d'argent sur les chromosomes -119I 1026 Nombre de grains d'argent sur des bandes G terminales 309 332 Pourcentage de grains d'argent terminaux 26 32 * On a observé une réduction du signal d'hybrida- tion avec des sondes à loci multiples hybridées en présence d'ADN compétiteur de hareng. (24, I. Patel, R. Kelly et A.J. Jeffreys, résultats non publiés). En conséquence, tout 1'ADN compétiteur a éte omis dans l'hybridation in situ avec les sondes 33.15 et 33.6. * + Des lames de deux individus ont été analysées pour chaque sonde. A titre comparatif, des hybridations témoins avec des sondes classiques à locus 'unique ont montré la disposition de seulement 15 % de grains d'arrière-plan sur des bandes G terminales (résultats non repré- sentés). TAIMU 3 Propriéts de loci de minisatellites dtetés prw des clones spcifiqqes des loci Sorde Locs Heterozygotie Position sur pb sequerées d'ADN % lechrcmosxoe 5' 3' pXg3 D7S22 97,4 7q36-qter 438 309 pSl D1S7 99,4 lp33p35 1284 434 pS31 D7S21 98,0 7p22-pter 399 12 pMS32 D1S8 97,5 lq42-q43 207 429 pW>43 D12S11 95,9 (A) 12q24.3-qter 14 780 (B)O (780)- 373 pMS51 DllS97 77 lq13 113 194 pMS228 - 94 (A) 17p13-pter - - 85 (B) 400 1057 Figure 1. Deux cellules en métaphase montrant des grains d'argent après hybridation in situ à XMS43 et XMS31. Les flèches indiquent des grains d'argent dans les positions 12q24.3-qter et 7p22-pter après hybridation in situ de XMS43 à D12Sll et, respectivement, de \MS32 à D7S21. Figure 2. Histogrammes de la distribution des grains d'argent sur des chromosomes humains à bandes G après hybridation in situ avec les sondes XMSl, XMS32, XMS31, p >g3, AMS43 et \MS8, avec pour résultat des localisations respectives à lp33-p35, lp42-q43, 7p22-pter, 7q36-qter, 12q2.4.3-qter et 5q35-qter. Figure 3. Le clone de minisatellite humain XMS43 contient deux minisatellites variables. A.) Le fragment d'insertion Sau3A de 8,3 kilobases dans A MS43 (16) a été sous-cloné dans le site BamTHI de pUC13 (26) et analysé par cartographie de restriction détaillée; des minisatellites (encadrés noircis) et des sites de clivage AluI (1) sont représentés. Un fragement AluI de 1,5 kilo- base contenant le second minisatellite MS43B a été sous- cloné dans le site SmaI de M13mpl9 (27) et le motif répété. du minisatellite a été établi par séquençage du didéoxy- nucleotide (28, 29). La séquence répétée du minisatellite hypervariable principal MS43A a déjà été rapportée (16). B.) Le fragement de AluI marqué au 32p contenant le minisatellite MS43B agit comme sonde spécifique d'un locus lorsqu'il est hybridé avec les produits de digestion de AluI d'ADN humain. Le locus de minisatellite détecté montre une variabilité chez les 8 individus testés sans lien de parenté. C.) Distribution de fréquence d'allèles du minisatellite MS43B chez des Européens nordiques, déter- minée sur 29 individus sans lien de parenté. Figure 4. Un second locus très variable est situé près du locus hypervariable D7S22 détecté par la sonde p>g3. A.) Des échantillons d'ADN d'individus CEPH 136201 (1) et 136202 (2) ont été digérés par les enzymes HinfI (H), PvuII (P), BclI (B), NcoI (N) ou EcoRV (E), soumis à une électrophorèse-sur un gel d'agarose à 0,6 % et hybrides (Southern blot) avec le minisatellite pag3. Des fragments alléliques (0,0) dans chaque produit digéré ont été identifiés en suivant la ségrégation dans la descen- dance de 136201 et 136202 (non représenté). Il y a lieu de remarquer que les différences de longueur des allèles dans les produits de digestion P et B concordent avec la différence de longueur dans H, qui est clivée près du minisatellite D7S22 (pXg3), et résultent par conséquent de la variation allélique de D7S22. En revanche, l'augmenta- tion de longueur des allèles dans les produits de digestion N et E varie d'un allèle à l'autre, indiquant la présence d'une seconde région polymorphe quant à la longueur, contenue dans ces fragments d'ADN. B.) Cartes de restric- tion génomique haplotypique des quatre allèles de 136201 et 136202, déterminées à partir de fragments d'ADN détectés par la sonde p>g3 dans les produits de digestion P, B, N, E et R de l'enzyme de restriction (EcoRI). Le second locus variable (^A/) est localisé à un intervalle P-N situé à 2 kilobases du minisatellite de pXg3 (encadré noirci). C.) Relation dimensionnelle entre la dimension du second locus variable, définie par la longueur de l'intervalle P-N, et la longueur du minisatellite de pÀg3 déterminée pour 21 haplotypes caucasiens pris au hasard. Fiqure 5. Caractérisation de pMS228.- (A) ADN d'un groupe d'individus parents [F = père, M = mère, S = fils, D = fille], digére sous l'effet de AluI et sondé avec pMA228. On voit les allèles qui s'hybrident fortement et ceux qui s'hybrident faiblement; les allèles forts et les allèles faibles dont la ségrégation s'effectue en paires liées parmi les enfants sont représentés entre crochets chez les parents. (B) Distributions des longueurs d'allèles AluI de 228A et de 48 (228B) individus sans lien de parenté issus de parents CEPH. Dans les histogrammes, des classes de longueurs de 0,25 kilobase sont attribuées aux allèles; étant donné que chaque classe de longueur peut contenir de nombreux allèles susceptibles de résolu- tion, le nombre d'alleles au niveau de chaque locus est très supérieur au nombre de classes représenté. (C) Structure de clone plasmidique pMS228. Les régions encadrées représentent les agencements des minisatellites, audessous desquels sont représentées les séquences correspondantes de motifs répétés. 228A détecte les bandes qui s'hybrident le plus fortement et 228B désigne les bandes plus faibles dans l'hybridation très rigoureuse d'ADN humain. R représente A ou G. Références bibliocraphiques 1. D. Botstein, M. Skolnick, R.L. White & R.W. Davis (1980) Am. J. Hum. Genet. 32, 314-331. 2. A.R. Wyman & R. White (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 6754-6758. 3. I. Balazs, M. Purrello, P. Rubinstein, B. Alhadeff & M.Siniscalco (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 7395-7399. 4. J. Mulholland & D. Botstein (1986) Am. J. Hum. Genet. 39, Extrait A226. 5. G.I. Bell, M.J. Selby & W.J. Rutter (1982) Nature (Londres) 295, 31-35. 6. D.J. Capon, E.Y. Chen, A.D. Levinson, P.H. Seeburg & D.V. Goedel (1983) Nature (Londres)302, 33-37. 7. N.G. Stoker, K.S.E. Cheah, J.R. Griffin, F.M. Pope & E. Solomon (1985) Nucl. Acid Res. 13, 4613-4622. 8. N.J. Proudfoot, A. Gil & T. Maniatis (1982). Cell 31, 553-563. 9. S.E.Y. Goodbourn, D.R. Higgs, J.B. Clegg & D.J. Weatherall (1983) Proc. Natl. Acad Sci. USA. 80, 5022-5026. 10. A.P. Jarman, R.D. Nicholls, D.J. Weatherall, J.B. Clegg & D.R. Higgs (1986) J. EMBO.5, 1857-1863. 11. A.J. Jeffreys, V. Wilson & S.L. Thein (1985) Nature (Londres) 314 67-73. 12. A.J. Jeffreys, V. Wilson & S.L. Thein (1985) Nature (Londres) 316, 76-79. 13. A.J. Jeffreys, V. Wilson, S.L. Thein, D.J. Weatherall & B.A.J. Ponder (1986) Am. J. Hum. Genet. 39, 11-24. 14. A.J. Jeffreys, V. Wilson, R. Kellyr B.A. Taylor & G. Bulfield-(1987) Nucl. Acid Res. 15, 2823-2836. 15. Z. Wong, V. Wilson, A.J. Jeffreys & S.L. Thein (1986) Nucl. Acid Res. 14, 4605-4616. 16. 'Z. Wong, V. Wilson, I. Patel, S. Povey & A.J. Jeffreys, (1987) Ann. Hum. Genet. 51, 269-288. 17. Y. Nakamura, M. Leppert, P. O'Connell, R. Wolff, T. Holm, M. Culver, C. Martin, E. Fujimoto, M. Hoff, E. Kumlin & R. White (1987) Science 235, 1616-1622. 18. R.C. - A. Yang, J. Lis & R. Wu (1979) Meth. Enzymol. 68, 176-182. 19. A.P. Feinberg & B. Vogelstein (1984) Anal. Biochem. 137, 266,267. 20. C.C. Lin, P.N. Draper & M. DeBrackeleer (1985) Cytogenet. Cell Genet. 39, 269-274. 21. N.J. Royle, D.M. Irwin, M.O. Koschinsky, R.T.A. MacGillivray & J. L. Hamerton (1987) Som. Cell Mol.Genet. 13, 285-292. 22. M.A. Harper & G.F. Saunders (1981) Chromosoma 83, 431-439. 23. G.M. Church & W. Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 1991-1995. 24. G. Vassart, M. Georges, R. Monsieur, H. Brocas, A.S. Lequarre & D. Christophe (1986) Science 235, 683- 684. 25. H.J. Cooke, W.R.A. Brown & G.A. Rappold (1985) Nature (Londres) 317, 687-692. 26. J. Vieira & J. Messing (1982) Gene 19, 259-268. 27. C. Yanis-Perron, J. Vieira & J. Messing (1985) Gene 33. 103-119. 28. F. Sanger, S. Nicklen & A.R. Coulson (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467. 29. M.D. Biggin, T.J. Gibson & H.F.Hong (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 3963-3965. 30. M. Colb, T. Yang-Feng, U. Franke, B. Mermer, D.R. Parkinson & G. Krontiris, (1986) Nucl. Acid Res. 14, 7929-7937. 31. D. Barber, P. Green, R. Knowlton, J. Schumm, E. Lander, A. Oliphant, H. Willard, G. Akots, V. Brown, T. Gravius, C. Helms, C. Nelson, C. Parker, K. Rediker, M. Rising, D. Watt, B. Weiffenbach & H. Donis-Keller, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8006-8010. - 32. A.J. Silva, J.P. Johnson & R.L. White (1987) Nucl. Acid Res. 15, 3845-3857. - 33. J. Overhauger, J. McMahan & J.J. Wasmuth (1987) Nucl. Acid. Res. 15, 4617-4627. 34. J. Overhauser, A.L. Beaudet & J.J. Wasmuth (1987) Nucl. Acid Res. 15, 1345. 35. H. Donis-Keller, P. Green, C. Helms, S. Cartinhour, B. Weiffenbach, K. Stephens, T.P. Keith, D.W. Bowden, D.R. Smith, E.S. Lander, D. Botstein, G. Akots, K.S. Rediker,- T. Gravius, V.A. Brow, M.B. Rising, C. Parker, J.A. Powers, D.E. Watt, E.R. Kauffman, A. Bricker, P. Phipps, H. Muller-Kahle, T.R. Fulton, S. Ng, J.W. Schumm, J.C. Braman, R.G Knowlton, D.F. Barker, S.M. Crooks, S.E. Lincoln, M.J. Daly & J-. Abrahamson (1987) Cell 51, 319-337. 36. R.D. Nicholls, J.A. Jonasson, J.O. McGee, S. Patil, V.V. Ionasescus, D.J. Weatherall & D.R. Higgs (1987) J. Med. Genet. 24, 39-46. 37. R. Rouyer, M.C. Simmler, C. Johnsson, G. Vergnaud, H.J. Cooke & J. Weissenbach (1986) Nature (Londres) 319, 291-295. 38. M.C. Simmler, C. Johnson, C. Petit, F. Rouyer, G. Vergnaud & J. Weissenbach (1987) EMBO J. 6, 963-969. 39. S.M. Gartler & R. Jaenisch (1987) Mouse Newsletter 79, Extrait 69. 40. M. Steinmnetz, D. Stephan & K.F. Lindahai (1986) Cell 44, 895-904. 41. M. Hulten, (1974) Hereditas 76, 55-78. 42. D.A. Laurie & M.A. Hulten (1985) Ann. Hum. Genet. 49, 203-214. 43. A.J. Solari, (1980) Chromosoma 81, 307-314. 44. R.K. Herman (1987) Genetics. Dans le nématode Caenorhabditis elegans, publié sous la direction de W.B. Woods (Cold Spring Harbor, New York), sous presse. 45. N.E. Morton, D.C. Rao & S. Yee (1976) Heredity 37, 405-411. 46. D.L. Lindsley & L. Sandler (1977) Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. B. 277, 295-312. 47. R. White, M. Leppert, D.T. Bishop, D. Baker, J. Berkowitz, C. Brown, P. Callahan, T.Holm & L. Jeromiuski (1985) Nature (Londres) 313, 101-105. 48. A.J. Jeffreys, N.J. Royle, V. Wilson & Z. Wong (1987) Nature (Londres), sous presse. 49. W.K. Cavenee, T.P. Dryja, R.A. Phillips, W.F. Benedict, R. Godbout, B.L. Gallie, A.L. Murphee, L.C. Strong & R.L. White (1983) Nature (Londres) 305, 779-784. 50. N.J. Royle, R.E. Clarkson, Z. Wong et A.J. Jeffreys, (1988) Genomics 3, 352-360. 51. P. Gill, A.J. Jeffreys et D.J. Werrett (1985) Nature 318, 577-579. 52. S. Tabor et C.C. Richardson, (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 84, 4767-4771. 53. M.G. Peterson (1988) Nucleic Acids Res. 16, 10915. REVENDICATIONS 1. Méthode de détection de la présence d'un locus de longueur variable dans une séquence d'ADN comprenant au moins un locus connu, caractérisée en ce qu'elle consiste a identifier, dans deux ou plus de deux séquences nucléotidiques d'ADN non identiques, des points équivalents à des extrémités opposées de chacune desdites séquences nucléotidiques, chacune de ces séquences comprenant le locus de longueur variable devant être détecté et le locus connu, et à détecter la présence ou l'absence d'un locus de longueur variable par comparaison des distances respectives entre points équivalents. 2. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le locus connu est une région à minisatellites. 3. Méthode suivant la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que le locus de longueur variable est un locus porteur d'information. 4. Méthode suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques d'ADN non identiques sont un matériel clone. 5. Méthode suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les séquences nucleotidiques d'ADN non identiques sont amplifiées et les longueurs des produits amplifiés sont comparées de manière à détecter la présence ou l'absence d'un locus de longueur variable. 6. Méthode suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les points équivalents sont définis par des sites de clivage et l'ADN échantillon est clivé en donnant lesdites séquences nucléotidiques d'ADN non identiques, et la présence ou l'absence d'un locus de longueur variable est détectée par comparaison des longueurs des séquences nucléotidiques d'ADN non identiques clivées. 7. Séquence de nucléotides capable d'identifier par hybridation une région d'ADN ou un locus d'ADN détecté par la méthode suivant l'une quelconque des revend:cations 1 à 6. 8. Séquence de nucléotides suivant la reven- dication 7, qui comprend des nucléotides complémentaires à au moins 70 % de la région ou du locus d'ADN. 9. Séquence de nucléotides capable d'identifier par hybridation l'un des minisatellites du groupe com- prenant le minisatellite d'ADN pMS228A, le minisatellite d'ADN pMS228B, le minisatellite d'ADN MS43B et le mini- satellite d'ADN, caractérisée en ce qu'elle est située entre les sites d'endonucléases de restriction NcoI et PvuII les plus proches du locus du minisatellite p\g3. 10. Séquence de nucleotides, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 8 nucleotides successifs choisis dans la séquence ou ses répétitions en tandem ou les séquences qui en sont complémentaires. 11. Séquence de nucleotides, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 8 nucléotides successifs choisis dans la séquence GGGGGACAGGGCGRGA dans laquelle R représente A ou G. 12. Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 8 nucléotides successifs choisis dans la séquence TGGTGATGGGGCTGGACGGGGGCG ou ses répéti- tions en tandem ou des séquences qui en sont complémen- taires. 13. Sonde polynucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de nucléotides suivant l'une quelconque des revendications 7 à 12 en association avec un composant indicateur ou marqueur. 14. Utilisation- d'une séquence nucléotidique suivant l'une quelconque des revendications 7 à 12 ou d'une sonde suivant la -revendication 13 pour le diagnostic d'une maladie héréditaire ou du cancer. 15. Utilisation d'une séquence. nucléotidique suivant l'une quelconque des revendications 7 à 12 ou d'une sonde suivant la revendication 13 dans la caractérisation génétique.