Brevet FR2632068A1 — publié le 19891201

Procede de fixation de molécules biologiques sur un support en polymère carboné. Le domaine de l'invention est celui de la fixation et de l'insolubilisation de molécules biologiques ou à usage biologique, notamment d'anticorps, sur un support en polymère carboné, et notamment sur un support en matière plastique macromoléculaire. Dans une application préférentielle, mais non limitative de l'invention, .le procédé s'applique à la fabrication de pièces moulées ou injectées, notamment de plaques destinées à être utilisées lorssde tests cliniques et biolo- giques. Le principe de l'invention permet d'insolubiliser des anticorps ou des protéines sur le plastique dans une opération de revêtement appelée aussi "coating". Etat de la Technique On connait déjà le principe de réaliser ce type de revêtement par des liaisons ioniques sur du plastique moulé ou injecté, ou par des liaisons chimiques covalentes grâce notamment à l'utilisation de gels d'agarose. Cependant, les inconvénients de ces procédés sont les suivants - la fixation n'est pas homogène sur la surface, - la fixation n'est pas stable, - les procédés aux gels d'agarose sont chers. - de nombreux anticorps ou protéines ne peuvent être fixés par ces procédés et ne sont donc pas mis en oeuvre industriellement. La fixation par insolubilisation apparait comme non maîtrisée. On a essayé de contourner cette difficulté en tentant de réaliser des géométries adaptées à la fixation (billes, tubes cylindriques ou à ailettes). On a essayé de traiter la surface plastique par des bains chimiques liquides, notamment aux sels de chrome. Mais le problème reste. L'insolubilisation des anticorps ou des protéines s'effectue mal, ou est hétérogène, ou les deux à la fois. Les mêmes difficultés existent pour les supports utilisés pour les techniques de purification par chromatographie d'affinité. I1 s'agit ici des techniques dites HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) ou chromatographie liquide haute pression, des techniques FPLC (Fast Protéin Liquid Chromatography), et des techniques de chromatographie liquide à basse pression. L'objectif de l'invention est de pallier les inconvénients des procédés existants. - Un premier objectif de l'invention est de favoriser la fixation de molécules biologiques sur un support en polymère carboné au moyen de liaisons ioniques. - un second objectif est de réaliser des liaisons chimiques entre la molécule biologique et le support en polymère carboné, - un troisième objectif de l'invention est de fournir un processus gêné rique permettant de fixer non seulement des anticorps monoclonaux, mais aussi des anticorps aligoclonaux, des protéines naturelles ou de synthèse, notamment des peptides de synthèse. - un quatrième objectif de l'invention est de fournir un processus à paramètres variables permettant une adaptation de l'efficacité du revêtement: - à la molécule à fixer, - à l'environnement d'utilisation du support revêtu, - à la nature du support revêtu; Caractéristiques du procédé Selon ltinvention, ces objectifs ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite sont atteints à l'aide d'un procédé de fixation de molécules biologiques sur une surface de polymère carboné traitée au préalable au moyen de plasmas froids d'azote, appelés aussi plasmas différés d'azote. Le traitement par plasmas froids d'azote est obtenu en plaçant le support en polymère carboné dans une enceinte sous vide partiel. Un flux de plasma froid d'azote est alors introduit dans l'enceinte. Ledit plasma est obtenu en excitant les atomes d'un flux de gaz azote additionné ou non de gaz chloré ou fluoré dnas une onde électromagnétique de type micro-onde de longueur d'onde comprise entre 300 mégaherz et 3 000 mégaherz. Le dit support carboné traité par ledit plasma d'azote présente une mouillabilité de surface meilleure que la surface avant le traitement. I1 comprend aussi dans ses couches atomiques de surface des radicaux carboneazote de type cyanogènes (nitriles), des radicaux carbone hydrogène de type amine et imine. Selon l'invention, la surface du support est alors nettoyée au moyen d'une solution d'un tampon chimique de type PBS (Phosphate Buffer Salin). Selon l'invention, des molécules de type anticorps monoclonaux, anticorps-polyclonaux, naticorps oligoclonaux, protéines naturelles ou de synthèse, notamment peptides de synthèse, sont appliquées en solution sur le support en polymère carboné, de façon à faire apparaître des liaisons physico-chimiques entre au moins certains groupements chimiques des molécules biologiques, et au moins certains groupements non saturés du support. Les groupements concernés sur les molécules biologiques à fixer sont les radicaux ou groupements fonctionnels de type amine, carboxylique, phénolique, les groupements hydrophobes, aliphatiques ou les groupements hydrophobes aromatiques. L'invention sera mieux comprise à la lecture quiva suivre d'un mode de réalisation de l'invention et de shéma annexé dans lequel - la figure 1 représente le traitement d'une plaque de polymère carboné par les plasmas froids d'azote. - la figure 2 représente l'opération de fixation ou "coating" d'anticorps sur ladite plaque. - La figure 3 représente un détail microscopique de la fixation de la molécule d'anticorps sur la plaque. Le support en polymère ou copolymère carboné est placé dans une enceinte cylindrique horizontale en verre, sous un vide partiel de 15 Torrs. Ce support subit durant cinq minutes un traitement par le plasma froid d'azote. Ce plasma est produit par l'action de micro-ondes à la fréquence industrielle de 433 mégaherz t 10 mégaherz, ou à la fréquence industrielle de 2 450 mégaherz + 50 mégaherz, sur un fkux de gaz azote additionné de gaz chloré ou fluoré. Le débit total de gaz est de 0,88 litres par minute. Suite à ce traitement, la surface du support en.polymère carbone présente des groupements cyanogènes, des groupements fluorés ou chlorés, des groupements amine et imine. Une autre conséauence du traitement est l'augmentation de la mouillabilité de la surface du support. Cette dernière propriété explique l'utilisation du plasma froid d'azote pour améliorer l'adhe- rence des peintures et des colles sur une surface plastique. Le traitement par les plasmas d'azote n'a semble-t-il pas été utilsié jusqu'à présent pour les propriétés chimiques des radicaux greffés sur la surface du plastique. Dans le mode de réalisation décrit, la surface du polymère carboné est alors nettoyée au moyen d'eau distillée et d'un tampon chimique de type PBS (Phosphate Buffer Salin). Dans ce mode de réalisation, le support est une plaque transparente en polymère carboné, percé de 96 trous cylindriques. L'opération d'insolubilisation est effectuée dans l'un ou plusieurs de ces trous. La solution des molécules biologiuqes à fixer, ici des anticorps, est versée dans le ou les trous du support, qui est laissé ainsi tremper par la solution durant 12 heures à température ambiante ou durant 3 heures à 370 C. Cette opération d'insolubili sation, aussi appelée "coating", s'achève par l'enlèvement par pompage ou par déversement de la solution contenant les molécules d'anticorps non fixées par l'opération. Avant ou après l'opération d'insolubilisation, le support peut être placé dans un gaz neutre, comme de l'azote ou de l'argon, pour être mis en conservation pour un usage ultérieur. La suite des opération est connue sous le nom de procédé de fixation utilisé pour les tests dits "ELISA" (entre LINKED Immuno SORBENT Assey), qui permettent la mise en évidence et la mesure d'un antigène dans une solution ou un sérum contenant de nombreux autres produits biologiques. L'opération suivante consiste à verser dans le ou les tubes un sérum contenant l'antigène à isoler, et à laisser le mélange incuber durant deux heures 370 C. Des molécules de l'antigène considéré seront fixées par l'anticorps insolubilisé sur le support dans l'opération de "coating". Les autres molécules contenues dans le sérum sont éliminées par l'opération de rinçage par une solution tampon effectuée ensuite. On verse amors dans le ou les tubes un conjugué d'anticorps et d'enzyme, que l'on laisse incuber durant deux heures à la température de 370 C. L'enzyme considéré est destiné à permettre une réaction de type coloré chromophore-chromogène. Après l'incubation, le ou les tubes sont nettoyés par un mélange tampon afin d'éliminer les molécules conjuguées qui ne sont pas fixées, par déversement ou par pompage. Un substrat chromogène est alors ajouté dans le ou les tubes. Après une demi-heure, le substrat devient chromophore, c'est-à-dire coloré. Cette coloration, qui met en évidence l'antigène recherché, est alors renforcée et bloquée par le déversement d'une solution d'acide chlorhydrique. REVENDICATIONS 1) Procédé de fixation de molécules biologiques sur un support en matière carbonée, caractérisé en ce qu'il consiste à : a) faire subir sur au moins certaines parties dudit support un traitement sous plasmas froids d'azote, applelés aussi plasmas différés d'azote, de façon à fiare apparaitre sur ledit support des groupements non saturés de surface, notamment cyano gènes. b) Appliquer les molécules biologiques sur ledit support, de façon à faire apparaitre les liaisons physico-chimiques entre au moins certains groupements chimiques des molécules biologiques, et au moins certains groupements non saturés du support. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les groupements chimiques concernés par le procédé sont - sur la surface du support les groupements amine, imine, cyanogénés, - sur les molécules biologiques à fixer les radicaux ou groupements fonctionnels du type amine, carboxyliques, phénoliques, goupements hydrophobes aliphatiques, groupements hydrophobes aromatiques. 3) Procédé selon la revencication 1, caractérisé en ce que l'étape b) est précédée d'une étape de nettoyage dudit support traité au moyen d'une solution tampon de type PBS. 4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape b est suivi d'une étape de mise en conservation du support dans un gaz neutre (azote, argon, hélium.). 5) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit support appartient au groupe comprenant plaque, tubes, tubes ailetés, billes libres ou fixes, de type notamment utilisés pour léanalyse clinique et biologique, et aussi pour les techniques de purification par chromatographie d'affinité, qu'elle soit de type HPLC (High Pressure Liquid Chromatography), de type FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography), ou de type chromatographie liquide à basse pression. 6) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les molécules biologiques ou à valeur biologiuqe utilisées appartiennent au troupe comprenant les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux, les anticorps oligoclonaux, les protéines naturelles ou de synthèse, notamment les peptides de synthèse. 7) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit plasma froid d'azote contient aussi un gaz halogène (chlore ou fluor). 8) Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'on fait varier la concentration ou la présence de gaz fluoré ou chloré de façon à optimiser le rendement de l'étape b en fonction d'au moins un des paramètres suivants - spécificité du support carbone, - spécificité de la molécule à fixer sur ledit support, - spécificité du milieu d'utilisation du support revêtu.