Brevet FR2626472A1 — publié le 19890804

La présente invention a pour objet L'utilisation des protéines du Lait, notamment celLtes capables de fixer le fer, pour ta fabrication d'un médicament antiviral. Les protéines du Lait, notamment celles capables de fixer te fer, d'origines animale ou humaine sont connues depuis de nombreuses années pour Leurs propriétés antibactériennes. De nombreux procédés d'obtention de ces protéines ont été décrits dans La litterature. On peut notamment citer L'articLe de CHERON paru dans (C.R. Acad. Sc Paris t.284 14 Février 1977) et les demandes de brevets français Nu Z505615 et Z584727. En poursuivant L'étude des protéines du Lait, notamment ceLLes capables de fixer Le fer, La demanderesse a découvert de manière tout à fait inattendue que ceLtes-ci présentaient en outre de remarquabLes propriétés antivirales; propriétés qui, à La connaissance de la demanderesse n'avaient jamais été mises en évidence jusqu'aLors. La-présente demande a ainsi pour objet L'utiLisation des protéines du Lait, notamment celles capables de fixer Le fer, pour la fabrication d'un médicament antiviral. L'invention a égaLement pour objet L'utiLisation des protéines du lait, notamment celLtes capables de fixer Le fer, pour la fabrication d'un médicament inhibant Les virus enveLoppés. L'invention a plus particuLièrement pour objet l'utilisation des Lactotransferrines pour ta fabrication d'un médicament inhibant Les virus enveLoppés En raison de Leurs remarquables propriétés antivirales iLLustrées plus Loin dans la partie expérimentaLe, Les médicaments antiviraux renfermant Les protéines du lait, notamment celLtes capables de fixer le fer. seLon L'invention, peuvent être administrés à titre préventif ou curatif. Ils trouvent Leur empLoi dans te traitement des affections viraLes, notamment dans te traitement des affections a virus enveLoppés Les médicaments selon t'lnvention peuvent ainsi être utiLisés à titre de médicaments inhibant notamment Les HERPESVIRIDAE [virus de L'herpes simplex type 1 et 2 (HSVl et HSV2). cytomégalovirus] ou les RHABDOVIRIDAE (virus de la stomatite vésicuteuse VSV). La dose usueltte, variable selon-te produit utilisé, Le sujet traité et l'affection en cause, peut varier de 0,1 mg à 50 mg par jour chez L'homme, en fonction de la voie utilisée. Dans le cas des lactotransferrines on peut par exempte administrer chaque jour des compositions pharmaceutiques renfermant de 1 à 10 mgde principe actif par voie cutanée chez L'homme; un tet traitement devant aLos être répété pendant plusieurs jours, voire plusieurs semaines., 2 26 2626472 A titre de médicaments, les produits définis ci-dessus, peuvent,tre incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinées â la voie digestive, parentérale ou locale. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exempte, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utiLisées en médecine humaine, comme par exemple, Les comprimés, simples ou dragéifi6s, Les géluLes, les granules, Les sirops, les aérosoLs, Les coltutoires, les collyres, Les suppositoires, Les ovules, les préparations injectabLes, Les pommadest, Les crèmes, Les Lotions; elles sont préparées seLon Les méthodes usueLles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que Le talc, La gomme arabique, Le lactose. L'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, Les corps gras d'origine animale ou végétale, Les dérivés paraffiniques, les gLycolse Les divers agents mouiLLants, dispersants ou émuLsifiants, Les conservateurs. Les protéines du Lait, notamment celltes capables de fixer Le fer. peuvent itre préparées par exempte comme indiqué dans La demande de brevet français publiée sous le Ne 2.584.727. Il va être donné maintenant à titre non Limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. Exemple 1: On a préparé des aérosots délivrant des doses contenant chacune - - Lactotransferrine 2.......... a mg - Emulsifiant........................ .. 0,15 mg - Propulseur......................... 50 mg..DTD: Exemple 2: On a préparé un collutoire renfermant: - Lactotransferrine.. ....... *. 50 mg - Excipient aqueux qsp......, 100 mg Exempte 3 t On a préparé des comprimés renfermant: - Lactotransferrine. ........................ 5-mg Excipient (lactose, taLc, amidon, stéarate de magnésium qs pour un comprimé terminé à.... 100 mg ETUDE DE L'ACTIVITE ANTIVIRALE DE LA LACTOTRANSFERRINE L'activité de la lactotransferrine a été étudiée vis à vis de virus appartenant aux HERPESVIRIDAE, (HSVI, HSV2, CMV murin) et aux RHABDOVIRIDAE (CVSV). Deux méthodes ont été utilisées: - Réduction de L'effet cytopathique produit par tes virus ou - Réduction du nombre et de ta taitLe des pLages formées par Les virus. REDUCTION DE L'EFFET CYTOPATXTQUE 1. 4ATERIELS ET METHODES Virus Virus de L'herpes type 1 et type 2 (HSVI et HSV2) cultivés sur celluLes VERO. Virus de La stomatite vésicuteuse CVSV) cuLtivé sur ceLLules L 929. Méthode Les essais sont réaLisés en micropLaques de 96 cupuLes sur des cetLuLes en tapis étabLi de 24 heures. La Lactotransferrine en solution à 6 mg/mL est diluée de 3 en 3 (2 mg/mL - 0,666 mg/mL 0,222 mg/ml). Les celLuLes sont infectées par Le virus (50 DICC 50) par un contact de 10 mn. Puis 0,1 mL des dilutions de La Lactotransferrine est ajouté. Des témoins "ceLLutes", "virus', "cytotoxicité du produit" sont effectués. Les microptaques sont placées pendant 72 h à 37xC sous une atmosphère enrichie de 5 Z de CO2. L'effet cytopathique est évalué au microscope inversé selon une échelte de O à 4: 0 tapis celLuLaire intact 4 tapis ceLlulaire complètement détruit. 2. RESULTATS Les concentrations de lactotransferrine réduisant de 50 X l'effet cytopathique des virus sont de: O,222 mg/ml pour L'herpes type I et type 2. 0,666 mg/ml pour te virus de La stomatite vésicuteuse. REDUCTZON DU NOMBRE ET DE LA TAILLE DES PLAGES 1. MATERIELS ET METHODES - Herpes virus type 1 Les cettlluLes VERO sont cuLtivées pendant 24 heures dans une plaque à Z4 puits. Le tapis ceLluLaire, est infecté pendant I heure par une suspension viraLe d'herpes virus type 1 donnant 10 à 30 pLages comptabLes par cupute. La suspension viraLe est alors étminée et te tapis ceLLulaire infecté est recouvert par un milieu contenant 1,6 X de tragacanth et La Lactotransfer- rine à la concentration finale voulue (Z mg/mL - 0666 mg/ml 0,222 mg/ml), Les cupules "témoins virus" reçoivent du milieu sans lactotransferrine. Les cupuLes "ltémoins cellules" ne reçoivent que du milieu de culture. Après 5 jours. 37xC sous atmosphère enrichie de 5 Z de C02z, le milieu est éliminé et Le tapis cellulaire est Lavé puis les cellules sont fixées avec une solution de formol à 10 X et colorées par une solution de bleu de méthyLène et rincées. Les pLages peuvent 6tre observées et comptées à l'oeil nu ou à la toupe binoculaire ou au microscope inverse. - Cytomégalovlrus murin Le protocoLe opératoire est légèrement différent du précédent. La suspension virale est placée sur la couche cellulaire constituée de fibrobLastes de souris pendant 1 h à 37xC puis éliminée, la solution de lactotransferrine h La concentration étudiée est alors placée sur les. cellutes infectées pendant 1 heure à 37aC puis éliminée. La couche cellulaire est alors recouverte d'un milieu contenant 1,e6 % de tragacanth. Après 5 jours d'incubation à 37xC en atmosphère enrichie de 5 X de C0;, La lecture est effectuée h la loupe binoculaire ou au microscope inversé. 2. RESULTATS Pour l1herpes virus type I la concentration de lactotransferrine qui réduit de 50 Z le nombre des plages est de 2 mg/ml,. Une concentration de 0,22 mg/ml réduit encore La taille des plages. Pour le cytomêgalovirus murin la concentration de Lactotransferrine qui réduit de 50 % le nombre des plages est de 0,66 mg/ml. CONCLUSION La Lactotransferrine présente une activité antivirale "in vitro" sur des virus appartenant aux Herpesviridae (HSV1. HSV2, CMV murin) et aux Rhabdoviridae (VSV). REVENDICATIONS 1) UtiLisation des protéines du Laite notamment celles capabLes de fixer Le fer, pour La fabrication d'un médicament antiviratL 2) Utitisation des protéines du Lait, notamment ceLltes capables de fixer Le fer, pour La fabrication d'un médicament pouvant être empLoyé dans Le traitement des affections & virus enveLoppés. 3) UtiLisation des protéines du Lait, notamment ceLles capables de fixer Le fer, pour La fabrication d'un médicament inhibant Les virus enveloppés. 4) UtiLisation des Lactotransferrînes pour La fabrication d'un médicament inhibant Les virus enveLoppées,. 5) Utitisation des dérivés teLs que définis à L'une queLconque des revendications 1 à 4, pour La fabrication d'un médicament inhibant Les HERPESVIRIDAE. 6) Utitisation des dérivés teLs que définis à L'une quelconque des revendications 1 à 4, pour La fabrication d'un médicament inhibant Les RHABDOVIRIDAE. 7) UtiLisation des dérivés teLs que définis à L'une queLconque des revendications 1 à 4, pour La fabrication d'un médicament inhibant les virus de L'herpes simplex type 1 et Z (HSVI et HSV2>), cytomégaLovirus. 8) UtiLisation des dérivés tels que définis à L'une queLconque des revendications 1 à 4, pour La fabrication d'un médicament inhibant Le virus de La stomatite vésicuteuse, VSV).