Brevet FR2633397A1 — publié le 19891229

DISPOSITIF ET PROCEDE DE PARTAGE CHROMATOGRAPHIQUE La présente invention se rapporte à un dispositif et à un procédé de partage chromatographique, en vue d'une utili- sation dans le domaine des analyses et des préparations. Des dispositifs destinés à la chromatographie liquide, à l'aide de lits solides constitués de particules sèches (corps de garnissage) fortement compactées, sont universelle- ment connus dans de nombreuses variantes. A titre d'exemples, l'on citera la chromatographie à couches minces et l'utilisa- tion de poudres dans des colonnes de dessiccation (par exem- ple, G. -J. Krauss et G. Krauss, "Experimente zur Chromatogra- phie", VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin, 1979). Un avantage de dispositifs à lits solides secs (voir, par exem- ple, le brevet DE-C-30 43 608) consiste en ce que la phase mobile fluide se meut par capillarité, sans forces extérieu- res résultant de la cohésion et de l'adhérence, à travers le trajet de séparation poreux et auto-absorbant. Toutefois, l'utilisation chromatographique de lits solides secs soulève des difficultés en présence de matériaux de séparation à fort pouvoir d'absorption pour la phase mobile fluide, par exemple en présence de nombreux xérogels, car l'expansion des lits chromatographiques se traduit, lors d'un trop fort gonflement des corps de garnissage, par la déstabilisation et la disso- ciation de l'ensemble compacté d'avec un substrat superfi- ciel. L'on connait bien la difficulté consistant en ce que des couches minces chromatographiques,en un matériau suscepti- ble de gonfler, se rompent lors du séchage. Des colonnes de dessiccation en un matériau susceptible de gonfler ne sont pas utilisables à cause de la pression de gonflement, et de l'expansion unilatérale du garnissage de la colonne lors du processus de gonflement. Pour ces raisons, il était jusqu'à présent impossible de combiner, dans un dispo- sitif chromatographique ou dans un procédé chromatographique, les avantages susmentionnés des trajets de séparation secs avec les avantages de corps de garnissage susceptibles de gonfler (grand espace de répartition interne, efficacité d'exclusion chromatographique, grande surface interne). A l'aide des dispositifs et procédés connus jusque-là, il n'est en particulier pas possible de séparer intégralement et sans aucune perte, ni sans aucune dilution considérable, une sub- stance à poids moléculaire élevé ou un groupe de substances à poids moléculaire élevé de substances d'accompagnement à fai- ble poids moléculaire, selon le principe de l'exclusion. L'on connaît différents "procédés dissociés", dans lesquels les composants exclus à poids moléculaire élevé d'un mélange flui- de sont sélectivement concentrés dans le volume de granulomé- trie intermédiaire par gonflement d'un xérogel (cf. Determann, H., "Gelchromatographie", Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1967), ou bien de corps de garnissage.esiculaires incomplètement gonflés (DD-247 570). Dans ce cas cependant, les composants à faible poids moléculaire du mélange de sub- stances ne sont pas complètement séparés, et il en résulte soit des pertes dues à la non-complétude avec laquelle le fluide de granulométrie intermédiaire est séparé, soit des effets de dilution lors du post-lavage de l'ensemble compacté. L'invention vise à perfectionner la technique chromato- graphique en vue du nettoyage et de la séparation de substan- ces, quant à l'économie et à la qualité du processus de par- tage. L'invention a pour objet de fournir un dispositif et un procédé de chromatographie, qui possèdent ou exploitent res- pectivement les avantages de corps de garnissage à forte pro- pension au gonflement et les avantages d'un trajet de sépara- tion sec, et autorisent en particulier un nettoyage chromato- graphique exclusif de macromolécules, exempt de dilution ou accusant une faible dilution. Conformément à l'invention, cet objet est atteint par le fait que le dispositif est caractérisé par un ensemble com- pacté chromatographique sec à espaces capillaires intraparti- culaires et extraparticulaires emplis de gaz, le volume de ces espaces capillaires emplis de gaz excédant 80 % du vo- lume total de l'ensemble compacté, cet ensemble compacté chro- matographique étant constitué, pour plus de 50 pour cent en volume,par des corps de garnissage connus, respectivement vé- siculaires ou à structure cellulaire, et la largeur des espa- ces capillaires intraparticulaires étant principalement com- prise entre 0,5 pim et 100 pim. Une variante avantageuse du dispositif conforme à l'in- vention réside dans une colonne chromatographique fermée qui est emplie d'une poudre sèche et aérée en des corps de garnissage vésiculaires lyophilisés, selon le brevet précité DD-247 570. Une deuxième variante avantageuse du dispositif susmentionné réside dans une plaque ou une feuille sur la- quelle un ensemble compacté en des corps de garnissage vési- culaires et lyophilisés, assurant la chromatographie, repose en tant que trajet de séparation ouvert. Une autre variante avantageuse du dispositif précité est caractérisée par le fait que l'ensemble chromatographique compacté et sec renfer- me, outre le substrat vésiculaire, un autre agent pulvérulent présentant des propriétés d'adsorption déterminées. Le procédé conforme à l'invention, pour le nettoyage de macromolécules exempt de dilution ou à faible dilution, à l'aide du dispositif susmentionné, est caractérisé par le fait qu'une partie du lit solide et sec est tout d'abord sa- turée par le liquide utilisé en tant que phase mobile, de telle sorte que ce lit solide soit humidifié d'un côté, après quoi le mélange fluide est introduit dans le lit solide, à partir du côté humide, avec les macromolécules devant être nettoyées, ensuite de quoi la phase mobile chromatographique est réintroduite dans le lit solide, à partir du même côté, jusqu'à ce que le front d'humidification ait franchi tout le lit solide; et par le fait qu'au moins un échantillon liqui- de de la partie du lit solide qui a été humidifiée en dernier est soumis à élution. Il s'est étonnamment révélé que les lits solides chroma- tographiques, constitués d'un substrat vésiculaire sec ren- fermant respectivement une forte teneur en gaz ou en air, sont d'un volume stable et auto-absorbants avec de forts débits, lors du processus d'humidification, indépendamment de leur fort pouvoir d'absorption de liquides. Dans ce cas, à l'in- verse des expériences actuelles avec un matériau propre à une trop grande absorption de liquide, la modification microsco- pique de la structure, due au gonflement et affectant le front d'humidification, se déroule sans aucun compactage gênant l'écoulement, ni aucun processus de gonflement macroscopique détruisant le caractère fermé du lit solide. Grace au procédé chromatographique ainsi exposé, il est possible, pour la première fois, de séparer sans aucune perte des substances à poids moléculaire élevé d'avec des substances à faible poids moléculaire, sans pour autant les diluer. Pour que la séparation des substances à faible poids moléculaire s'opère complètement, le trajet de séparation, déjà humide avant le dépôt de l'échantillon de mélange, doit présenter une longueur suffisante. En revanche, la longueur de la partie du trajet de séparation qui est encore sèche lors du dépôt de l'échantillon est décisive pour la concentration des compo- sants macromoléculaires soumis à élution. Si le rapport volu- mique entre la partie sèche et la partie humide du lit solide excède 0,8 après le dépôt de l'échantillon, le procédé susdé- crit permet également de concentrer une substance à poids mo- léculaire élevé ou un groupe de macromolécules, dans le contexte du nettoyage de substances à faible poids moléculai- re. Il est alors possible de soumettre à élution les macromo- lécules concentrées, sans aucune perte. Une variante du procé- dé, favorable quant à la concentration des macromolécules sou- mises à élution, consiste en ce que, préalablement à l'intro- duction du mélange expérimental, le lit solide est saturé par la phase mobile pour au moins 20 % de son volume; et en ce que la part volumique sèche du lit solide représente encore au moins 30 Z après l'introduction du mélange liquide avec les macromolécules devant être nettoyées. L'invention est commentée plus en détail ci-après à l'appui du dessin annexé. sur lequel les figures 1 à 3 représentent respectivement trois pha- ses fonctionnelles successives dans un dispositif conforme à l'invention. Exemple 1. Utilisation en tant que colonne de dessiccation Un échantillon d'un substrat vésiculaire, fabriqué à par- tir d'aggrégàats cellulaires végétaux selon le brevet DD-247 570, a été lyophilisé. 330 mg de la poudre sèche ainsi obtenue ont été compactés dans une colonne de chromatographie (V = 7 ml, i = 7 cm). Le processus opératoire est mis en évidence par le dessin. Sur l'ensemble compacté sec, l'on a déposé 2 ml d'un tampon de phosphate à 0,1 M selon Sbrensen, d'un pH de 7,0. Apres l'absorption de la solution tampon, 0,4 ml d'un mélange fluide de Blue Dextran 2000 (Pharmacia) et de rouge au phénol, ces deux substances se présentant en une concentration de 0,025 % dans une solution aqueuse, a été déposé sur la partie déjà humide du lit solide auto-absorbant (voir figure 1). Apres la pénétration de l'échantillon, le lit solide a été revêtu par le tampon d'élution. Lors de l'absorption des li- quides l'on n'a constaté aucune génération de bulles gazeu- ses dans la partie humidifiée du lit solide. Au cours de l'absorption du mélange expérimental et de la pénétration consécutive du tampon d'élution, il s'est produit un partage visible entre la bande de rouge au phénol (voir figure 2. petits points), qui se déplaçait aussi rapidement que le front d'humidification, et la bande de Blue Dextran macromoléculaire (points plus gros), qui parcourait plus rapidement la partie humide du lit solide et atteignait le front d'humidification avant que ce dernier soit parvenu à l'extrémité inférieure de l'ensemble compacté ( voir figure 3). La substance colo- rée macromoléculaire a été concentrée sur le front d'humidi- fication et n'a pu, quantitativement, être absorbée que dans 0,2 ml de la première fraction d'élution. La concentration de la fraction de 0,2 ml en Dextran était de 0,05 % (déterminée photométriquement). La séparation d'avec le rouge au phénol était complète. Similairement, l'on a obtenu une séparation complète entre des protéines (x-amylase provenant de la sé- crétion stlivaire humaine, ferritine) et le sulfate d'ammo- nium, avec une nette concentration des protéines. Toute la quantité de protéines déposée dans 0,4 ml a été obtenue, sans aucun sulfate, dans le premier lot de 0,2 ml du produit d'élu- tion. Exemple 2. Utilisation en tant que lit superficiel Sur une plaque en verre (2 x 7 cm), l'on a déposé une couche de la poudre sèche citée à l'exemple 1, de 2 mm d'épais- seur. Le trajet de séparation a été délimité, aux extrémités, par l'intermédiaire d'une étroite bande de carton chromato- graphique par l'intermédiaire duquel l'agent d'élution et la solution expérimentale étaient délivrés. Apres l'absorption de 1 ml d'un tampon de phosphate selon Sbrensen de pH 7 (0,1 M), le mélange de Blue Dextran et de rouge au phénol, mentionné à l'exemple 1, a été déposé sur la partie déjà humide du lit solide auto-absorbant. Dans l'enchainement, le tampon précité a été absorbé dans le lit solide. Le lit superficiel conser- vait une forme stable sur le front d'humidification, et a été saturé en 30 min par la solution aqueuse, avec un front d'hu- midification rectiligne, sans aucun gonflement macroscopique ni formation de fissures. Le partage entre le Blue Dextran et le rouge au phénol est alors devenu visible. Le Blue Dextran s'est concentré sur le front d'humidification, comme dans le garnissage de colonne illustré dans l'exemple 1. Exemple 3. Utilisation en tant que lit mitigé Un substrat sec, respectivement vésiculaire ou à structu- re cellulaire, a été mélangé à de la diétylaminocellulose dans un rapport de 1: 1. La poudre ainsi obtenue a été compactée dans une colonne chromatographique, comme illustré à l'exem- ple 1. Le dépôt de l'agent d'élution et de la solution expé- rimentale s'est déroulé comme décrit à l'exemple 1. De l'eau distillée a été employée en tant qu'agent d'élution. Le mélan- ge expérimental se composait de 0,2 mg de Blue Dextran 2000 et de 0,2 mg de Dextran T 250, dans 0,4 ml d'eau distillée. Le Dextran T 250 neutre s'est concentré sur le front d'humi- dification, comme décrit à l'exemple 1, tandis que le Blue Dextran, dérivé par du Cibachrom Blue F 3G-A et par conséquent anionique, a été immobilisé par asorption dès le stade de la pénétration dans l'ensemble compacté. Le Dextran T 250 neutre a été quantitativement séparé par les molécules de Blue Dextran anioniques, et simultanément concentré. Il va de soi que de nombreuses modifications peuvent être apportées à l'invention telle que décrite et représen- tée, sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Dispositif de partage chromatographique, caractérisé Dar le fait qu'il renferme un lit chromatographique solide et sec comprenant un substrat vésiculaire connu assurant la chro- matographie, ainsi que des cavités intraparticulaires et ex- traparticulaires emplies de gaz, le volume de ces cavités em- plies de gaz excédant 80 % du volume total du lit solide, et la largeur des cavités intraparticulaires étant principale- ment comprise entre 0,5 um et 100 pm. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le lit chromatographique solide.et sec se trouve dans une colonne chromatographique fermée. 3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le lit chromatographique solide et sec repose, en tant que couche ouverte ou ensemble compacté, sur une feuille ou une plaque. 4. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le lit chromatographique solide et sec renferme, outre le substrat vésiculaire, d'autres agents pulvérulents ayant une part volumique du matériau non vésiculaire qui est inférieure à 50 % du mélange sec. 5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'agent pulvérulent non vésiculaire possède des propriétés d'adscrption sélectives. 6. Procédé de partage chromatographique, caractérisé par le fait que, dans un dispositif selon la revendication 1, une partie du lit solide est tout d'abord humidifiéepar un liquide utilisé en tant que phase mobile, ce qui donne un lit solide humidifié d'un côté, après quoi le mélange fluide est introduit ou absorbé dans le lit solide, à partir du même côté, avec des macromolécules devant être nettoyées, ensuite de quoi la phase mobile chromatographique est à nouveau in- troduite ou absorbée dans l'ensemble compacté, à partir du même côté, jusqu'à ce que le front d'humidification ait fran- chi tout le lit solide; et par le fait qu'au moins un échan- tillon liquide de la partie du lit solide qui a été humidi- fiee en dernier est soumis à élution. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que, préalablement à l'introduction du mélange fluide avec les macromolécules devant être nettoyées, le lit solide est humidifie d'un côté par la phasemobile, pour au moins % du volume de ce lit solide; et par le fait que la part volumique sèche du lit solide représente au moins 30 Z après l'introduction du mélange liquide avec les macromolécules de- vant être nettoyées.