Brevet FR2634485A1 — publié le 19900126

*2634485 L'invention concerne des glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés, leur procédé de préparation ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant et leur usage en thérapeutique. Par le terme "glycosaminoglycane" on entend des substances constituées d'enchainements d'acides uroniques (acide D-glucuronique ou acide Liduronique) et de sucres aminés, ces derniers étant des glucosamines ou des galactosamines. Les glycosaminoglycanes d'origine naturelle sont constitués par des mélanges plus ou moins homogènes d'enchaînements d'unités disaccharidiques formées par une sous-unité uronique (acide glucuronique ou acide iduronique) et par une sous-unité osamine (glucosamine ou galactosamine) unies par une liaison l-->4 ou 1-w-3. Dans les glycosaminoglycanes, les groupements hydroxyles sont diversement substitués par des groupements fonctionnels, en particulier des groupes sulfates, les groupements aminés des osamines étant substitués par des groupes sulfates et/ou acétyles. Les glycosaminoglycanes considérés ici comprennent 6 types de produit: héparine, héparane sulfate, chondroîtine sulfate A, chondroitine sulfate C, chondroitine sulfate B, plus précisément dénommée dermatane sulfate, et acide hyaluronique. Ils sont caractérisés par les deux structures disaccharidiques de base (A) et (B) suivantes: coo CH2oH O O -Ce-OH > OOH OH NHR __n dans laquelle R est un groupe S0% et/ou un groupe acétyle et le signe indique que le groupe carboxyle peut être au-dessous du plan du cycle (unité iduronique) ou au-dessus du plan du cycle (unité glucuronique), 2 et - o COO-H O __ n Les glycosaminoglycanes ayant la structure de base (A) ci-dessus sont dénommés glycosaminoglycanes (ou GAGs) de type héparinique et comprennent les héparines et les héparanes sulfates et les glycosaminoglycanes ayant la structure de base (B) ci-dessus sont dénommés GAGs de type chondroîtine sulfate et comprennent les chondroîtines sulfates A et C et le dermatane sulfate. L'acide hyaluronique a la structure de base (B) dans laquelle la galactosamine est remplacée par une glucosamine. Comme mentionné ci-dessus, tant dans les GAGs de type héparinique que dans les GAGs de type chondroîtine sulfate, un pourcentage plus ou moins élevé des groupes hydroxyles des n unités disaccharidiques est présent sous forme d'esters de l'acide sulfurique. Ainsi, l'héparine peut être représentée par la structure de base (A) cidessus, dans laquelle n peut varier de 1 à 80, R étant dans une majorité des n unités un groupe S0O et, dans le reste des cas, un groupe acétyle, les groupes OH en position 6 de la glucosamine et en position 2 de l'acide uronique sont dans la majorité des espèces sulfatés, alors que le groupe OH en position 3 de la glucosamine n'est sulfaté que dans une minorité des espèces; le OH en position 3 de l'acide uronique est pratiquement non sulfaté, ledit acide uronique étant dans la majorité des espèces un acide iduronique. Les produits ayant la structure de base (A) comprennent également l'héparine N-désulfatée N-acétylée qui peut être préparée comme décrit -3dans Nagasawa K. et Inoue Y., Methods in Carbohydrate Chemistry, Academic Press, 1980, Vol.8, pp. 291-294. Cette héparine est représentée par la formule (A) dans laquelle R est un groupe acétyle. L'héparine contient également des espèces ayant la structure (A), avec n variable de 3 à 15 et le même profil chimique. Lesdites espèces pouvant être isolées par fractionnement selon des méthodes connues (par exemple US 4,692,435) et sont nommées héparines de bas poids moléculaire (b.p.m.). Des héparines b.p.m. ayant la distribution moléculaire et les propriétés biologiques essentiellement identiques à celles des héparines b.p.m. obtenues par fractionnement ont été préparées par fragmentation de l'héparine selon les méthodes suivantes: - méthode de dépolymérisation nitreuse et réduction (par exemple EP 37 319 ou US 4,686,288) qui coupe la molécule en attaquant les sous-unités glucosamines N-sulfate pour donner une terminaison 2,5- anhydromannitol -O 0 (A') O CH2OH CF.20H éventuellement sulfatée sur l'hydroxyle primaire en position 6; - méthode de dépolymérisation enzymatique (par exemple EP 244 235 et 244 236) ou alcaline (par exemple EP 40 144) qui coupe la molécule en attaquant les sous-unités uroniques pour donner une terminaison acide uronique a-E insaturé COO ! O O - (A") \ j/ OH éventuellement 2-sulfaté; -4 - - méthode de dépolymérisation oxydative (par exemple US 4,281,108 et EP 121067) qui coupe la molécule par oxydation tout en conservant les terminaisons "naturelles". D'autres héparines b.p.m. qui ont une distribution moléculaire différente de celle de l'héparine naturelle et des propriétés biologiques particulières peuvent être préparées par oxydation periodique de l'héparine naturelle suivie de dépolymérisation par 8-élimination ou hydrolyse acide. L'oxydation periodique coupe les motifs acide uronique non sulfatés entre les carbones en position 2 et 3. On sait que de tels motifs sont présents dans le site de fixation à l'antithrombine III (AT IIi), innibiteur plasmatique de diverses sérine-protéases de la coagulation, et dont l'activité est fortement -accrue par l'héparine agissant comme co-facteur. L'oxydation periodique permet donc d'obtenir des produits dépourvus des sites de fixation à l'AT III, et donc essentiellement déoourvus d'activité anticoagulante. Des héparines b.p.m. de ce type peuvent être obtenues en particulier en mettant en oeuvre le procédé comprenant les étapes suivantes: l'oxydation ménagée de l'hèparine réalisée en faisant réagir de l'héparine, en solution aqueuse à une concentration finale de 0,5 à 5 % (p/v) avec un sel de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 à 1 % (p/v), à un pH situé entre 4,5 et 6,5, de préférence à un pH- de 5, à une température de 0 à l10 C, durant environ 15 à 48 heures, à l'abri de la lumière; - la dépolymêrisation des chaînes d'héparine obtenues, par addition d'une base forte telle que la soude, à un pH supérieur à ll environ, notamment compris entre Il et 12, avantageusement de 11,2 à 11,6, de préférence aux environs de 11,5; - la réduction des fragments de dépolymérisation à l'aide d'un agent réducteur et, après élimination le cas échéant de l'agent réducteur n'ayant pas réagi, - la récupération des fragments d'héparine réduits, par précipitation à l'aide d'un solvant dans lequel ils sont insolubles; - l'isolement des fragments recherchés par fractionnement à l'aide - d'alcool, en présence d'un sel minéral, d'une solution aqueuse obtenue en remettant en solution dans l'eau le précipité précédemment isolé et en récupérant le précipité formé. Ces héparines b.p.m. répondent à la formule (C) ci-dessous: CH2OH Cao l0 I 0 OH OSO. NHR n dans laquelle n peut varier de 6 à 15, R est dans environ au moins 90 % des n unités un groupe SO et, dans le reste des cas, un groupe acétyle, les groupes OH en position 3 de la glucosamine pouvant être sulfatés, et les groupes OH en position 6 de la glucosamine étant sulfatés dans 70 % des espèces. De plus, à raison de 1 motif pour 2 chaînes au moins de cette héparine b.p.m., l'acide iduronique est remplacé par un motif acide uronicue (D-glucuronique ou L-iduronique) non sulfaté ouvert entre les carbones en position 2 et 3,-de formule suivante: COO Do CH20H CH2OH D'autres glycosaminoglycanes de type héparinique sont constitués par des GAGs de formule (A) ou (C), dans lesquels la fonction carboxylique portée par l'acide uronique est estérifiée, par exemple par condensation d'un alcool en présence d'un agent de condensation de type carbodiimide, comme décrit dans le Brevet FR n 2 159 724, ou encore par alkylation du carboxyle à l'aide d'un halogénure d'alkyle en présence d'une base faible. -6- De même, des glycosaminoglycanes de type chondroîtine sulfate sont constitués par des glycosaminoglycanes de formule (B) dans lesquels les fonctions carboxyliques des acides uroniques sont estérifiées, par exemple par alkylation du carboxyle à l'aide d'un halogénure d'alkyle en présence d'une base faible. L'obtention de tels esters pour l'acide hyaluronique est décrite, dans le brevet EP n0 215 453, par traitement de l'acide hyaluronique sous forme de sel d'ammonium quaternaire par un alcool en présence d'un catalyseur ou par un agent éthérifiant. L'hêparane sulfate est représenté par la formule (A) ci-dessus, dans laquelle n peut varieer de 1 à 80, R représente dans la majorité des espèces un groupe acétyle et dans une minorité d'espèces S03. En outre, dans la grande majorité des espèces, les groupes OH en position 6 de la glucosamine sont sulfatés, l'acide uronique étant dans la majorité des espèces l'acide glucuronioue. Les chondroîtines sulfates A et C sont représentées par la formule (B) cidessus dans laquelle n peut varier de 1 à 80 et, respectivement, les groupes 4-OH et 6-OH de la glucosamine sont sulfatés, l'acide uronique étant dans la majorité des espèces un acide glucuronique. Le dermatane sulfate a une structure substantiellement identique à celle de la chondroîtine sulfate A, mais la sous-unité acide uronique est un acide iduronique dans la majorité des espèces. Des fragments de dermatane sulfate, répondant à la formule (B) ci-dessus, dans laquelle n peut varier de I à 20, peuvent être obtenus par oxydation periodique suivie d'une réduction au borohydrure de sodium et d'une hydrolyse acide, comme décrit dans Fransson L.A. et Carlstedt i., Carbohydr. Res., 36, (1974), 349-358. Les glycosaminoglycanes possèdent de nombreuses activités biologiques, parmi lesquelles on peut citer leurs activités vis-à-vis des facteurs de la coagulation, qui peuvent s'exercer par l'intermédiaire de diverses protéines plasmatiques. En ce qui concerne l'héparine, il est également connu dans la littérature que l'héparine ou certains de ses dérivés possédant ou non une activité anticoagulante peuvent avoir une activité régulatrice de la prolifération des cellules -7- musculaires lisses de la paroi vasculaire (Guyton et al., Circ. Res., 46, (1980), 625-634) ou encore une activité inhibitrice de l'héparanase, enzyme impliqué dans les mécanismes de dissémination métastasique (Demande EP n 254 067). Dans la suite du texte, on utilisera le terme GAG pour désigner un glycosaminoglycane, celui-ci ayant soit une structure naturelle telle qu'obtenue par extraction, hémi-synthèse ou synthèse, soit une structure chimiquement modifiée sur les groupements fonctionnels carboxyles ou aminés, préalablement à la réaction d'acylation donnant les GAGs sélectivement O-acylés. Malgré leurs activités pharmacologiques de grand intérêt, les GAGs naturels présentent l'inconvénient d'avoir une demi-vie relativement courte, obligeant à des administrations répétées. Cet inconvénient a été en partie pallié 'par l'utilisation, dans la prévention et le traitement des thromboses veineuses, de dérivés d'héparine de faible masse moléculaire, par voie sous-cutanée, abaissant ainsi la fréquence d'administration à une injection par jour. Néanmoins, il est d'un grand intérêt de pouvoir disposer de dérivés possédant une action retard, qui permettrait de diminuer encore la fréquence d'administration de ces produits en augmentant leur durée d'action. Il peut également être de grand intérêt de disposer de dérivés retard non anticoagulants tels que ceux de l'héparine N-désulfatée Nacétylée dont l'activité comme inhibiteur d'héparanase, enzyme impliqué dans les phénomènes de dissémination métastasique, est rappelée plus haut. La littérature décrit de nombreux dérivés de glycosaminoglycanes modifiés de façon à améliorer leur pharmacocinétique, notamment des esters de la fonction carboxylique des acides uroniques ou des fonctions hydroxyles. On a utilisé en particulier l'estérification partielle ou totale des fonctions carboxyles de l'héparine, traitée sous forme de sel d'ammonium quaternaire, en solvant inerte, par un alcool ou un dérivé halogéné, en présence éventuellement d'un agent de condensation (Br. FR 8 - n 2 159 724 et EP n 44 228). Des dérivés d'acide hyaluronique obtenus par estérification à l'aide d'alcool en présence d'un catalyseur ou par réaction avec un agent éthérifiant ont également été décrits (Br. EP n 216 453). Par ailleurs, différents moyens ont été décrits dans la littérature en vue d'estérifier les GAGs sur les fonctions hydroxyles primaires et secondaires. La publication Can. J. Res., 25B, (1947), 472-476, décrit un dérivé acétylé de l'.héparine correspondant à une mole de groupe acétyle pour quatre unités saccharidiques. Le produit est préparé par action du cétène sur l'héparine dans l'acétone. Bien que dans cette publication il soit spécifié aue le produit obtenu est un dérivé 0-acétylé, il est bien connu que le céténe en présence de groupes carboxyliques donne des anhydrides. (cf. J. March, Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanismrs and Structure, J. Willy and Sons Eds., 1985, pp.686-687: "With ketenes, carDocxylic acids give annydrides ana acetic anhydride is prepared industrially in this manner: 2 -=C0 3- C OOH -C- - C= 0 0 - COCH3 ") Par conséquent, cette publication décrit en fait une héparine dans laquelle des groupes O-acétyles sont associés à des anhydrides mixtes entre le groupe COC- de l'acide uronique et le groupe acétyle provenant du cétène, ce qui peut expliquer leur instabilité dans l'eau. Le brevet FR 2 100 735 décrit des esters partiels hydrolysables d'héparine et d'un acide organique non toxique, notamment l'acide 4chlorophénoxyisobutyrique, l'acide 4-chlorophénoxyacétique, l'acide cholique, l'acide nicotinique, l'acide N-oxy-nicotinique, l'acide pyridylacétique, l'acide N-oxy-pyridylacétique ou l'acide linoléique. La méthode de préparation décrite dans le brevet ci-dessus, qui -est caractérisée par la réaction d'un sel quaternaire de l'héparine avec l'acide activé par un carbodiimide, donne non seulement le dérivé O-acylé, mais également en quantité importante un produit secondaire stable sous forme d'un dérivé ester 0-acylisourée. En outre, un tel type de réaction est susceptible de favoriser l'obtention d'anhydrides et des -9- réactions intramoléculaires entre les fonctions acides et les fonctions hydroxyles de l'héparine. Le brevet JP 74/048533 décrit des O-esters de chondroYtine sulfate avec des acides aromatiques, arylaliphatiques ou hétérocycliques éventuellement substitués dotés d'activité prolongée. La méthode de préparation décrite dans ce document, qui est caractérisée par la réaction de l'acide chondroîtinsulfurique avec un chlorure d'acide, donne comme réaction secondaire une N-acylation. Le brevet WO 83/00150 décrit de façon générale des prodrogues de médicaments préparées en utilisant les différentes fonctions des GAGs, dont l'hydroxyle et, de façon spécifique, un O-ester du chondroïtinsulfate avec la pénicilline V. La préparation de ce produit est effectuée via carbodiimide et comporte donc les réactions secondaires mentionnées ci-dessus. Le brevet EP 46 828 décrit des V-esters de l'héparine avec des acides insaturés, notamment l'acide acrylique ou métacrylique qui, greffés sur des matériaux biomédicaux, leur confèrent une activité antithrombotique de longue durée. Ce greffage est effectué par liaison covalente au niveau des liaisons c-G insaturées de ces esters avec la surface desdits matériaux qui entrent en contact avec le sang. Selon ce document, les O- esters alpha, béta-insaturés sont préparés par réaction de l'héparine avec le chlorure ou l'anhydride d'un acide carboxylique alpha, béta- insaturé. De plus, le descriptif qui indique indifféremment l'utilisation des chlorures ou des anhydrides des acides alpha, béta-insaturés comme réactifs ne spécifie pas quels types d'O-esters de l'héparine sont ainsi obtenus. Le brevet EP 256 880 décrit l'estérification d'héparine ou d'héparine de bas poids moléculaire par l'action de chlorures d'acide dans le formamide et la pyridine afin de donner des dérivés à perméabilité transmembranaire accrue. Or, cette méthode conduit à des dérivés qui subissent une désulfatation partielle et sont O- mais également N-acétylés, et dans lesquels le rapport sulfate/carboxyle est altéré. - 10 - On a maintenant trouvé qu'en faisant réagir un sel soluble en milieu organique d'un GAG, tel qu'un sel d'ammonium tertiaire ou quaternaire, avec l'anhydride d'un acide carboxylique dans un solvant organique aprotique polaire, on obtient une acylation sélective- des hydroxyles libres, sans altérer les groupes fonctionnels carboxyliques ou aminés du GAG mis en oeuvre. De plus, le taux d'acylation est aisément modulable et peut être élevé sans que cela entraîne d'altération sur le reste de la molécule. Notamment, on a trouvé qu'aucun dérivé N-acyle ne se forme et que, lorsque de petites quantités d'anhydrides sont présentes, celles-ci peuvent être aisément retransformées en acide libre par action d'une base faible. - On a finalement trouvé que les GAGs O-acylés ainsi obtenus ont une activité pharmacologique de très longue durée. Ainsi, la présente invention a pour objet, selon un de ses aspects, des glycosaminoglycanes sélectivement O-acylés, répondant à la formule I suivante: A-LG-- B (I dans laquelle: - G représente un groupe (a) de formule: O R1 O NHR2 ou un groupe (a') de formule: -ORa e I (a') 1 NHCOCH, - ll - ou un groupe (b) de formule: - FORi- (b) R10 NHCOCH- - U représente un groupe (c) de formule: COOR, -C E'C ou un grouDe (d) de formule: aDC9 - OR1 ou l e résidu du groupe (c) ou du groupe (d) après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - A représente un groupe R1, un groupe R -(c), ou un groupe Rl-(d), ou un groupe (e) de formule: COOR3 C 305 11 OR1 - 12 - ou le résidu du groupe (c) ou du groupe (d) après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - B représente un groupe O-R1, un groupe (a)-OR1, un groupe (a')-OR1, un groupe (b)-ORI, un groupe (f) de formule: on OR0 R ou un groupe (g) de formule: -ORl, (g)> ou représente un groupe (a), un groupe (a'), ou un groupe (b) auxquels reste accroché un résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxyda- tion periodique suivie d'une S-élimination ou d'une hydrolyse acide; - Ri représente H, SO_ ou acyle, acyle étan; le résidu d'un acide carboxylique non a-B insaturé choisi parmi: 25. un groupe alcanoyle de 1 à 18 atomes de carbone; un groupe alcanoyle de 2 à 3 atomes de carbone substitué par - un groupe cycloalkyle de 3 à 7 atomes de carbone, - un groupe phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alkyles de 1 à 14 atomes de carbone, atomes d'halogène ou groupements NO2 ou OCH3, - un radical hydrocarboné aliphatique insaturé de 4 à 16 atomes de carbone un groupe benzoyle éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alkyles de 1 à 4 atomes de carbone, atomes d'halogène ou - 13 - groupements N2 ou OCH3; un groupe cycloalkyle (3-7 C) carbonyle; - R2 représente S03 et/ou un radical acétyle, sous réserve que la proportion de N-acétyl glucosamine soit au plus égale à celle de l'héparine lorsque R1 représente un radical acétyle; -R3 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à lO atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin; - n est un nombre entier de 1 à 80. R1 étant acyle dans une proportion d'au moins 0,1 à 3 groupes acyles par unité disaccharidique, de préférence de 0,5 à 1 groupe acyle, et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Dans un mode préféré de l'invention, les glycosaminoglycanes choisis sont des glycosaminoglycanes de type héDarinique, c'est-à-dire l'héparine, l'nhéparane sulfate et leurs dérivés obtenus soit par fractionnement à partir de l'héparine ou de l'héparane sulfate, soit par hémi-synthèse ou synthèse. Les glycosaminoglycanes de ce type, sélectivement O-acylés selon la présente invention répondent à la formule Il suivante: OR o O (1I) NHR2 OR dans laquelle: - A a les significations données plus haut dans la formule (I); - R1 représente H et/ou S03 et/ou un groupe acyle tel que défini dans la formule (I); - R2 représente S03 et/ou un radical acétyle, sous réserve que la - 14 - proportion de N-acétyl glucosamine soit au plus égale à celle de l'héparine lorsque R1 représente un radical acétyle; - R3 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin; - B représente (a)OR1 ou (f), (a) et (f) étant tels que définis dans la formule (I), ou OR1, ou un groupe (a) auquel reste accroché un résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - n est un nombre entier de 1 à 80. Des composés avantageux de l'invention sont des composés répondant à la formule (II), dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin. Un autre groupe de composés avantageux correspond aux composés de formule (Ii), dans laquelle R3 représente un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone. Dans un aspect préféré de l'invention, on utilise des mélanges de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire inférieure à lO.000 daltons, en particulier soit ceux ayant une masse moléculaire moyenne se situant entre 2.000 et 7.0S0 daltons, soit ceux ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4.500 daltons, soit encore ceux ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 2.500 daltons. On peut avantageusement utiliser pour les obtenir un procédé de dépolymérisation à l'acide nitreux, comme décrit dpar exemple dans le brevet EP 37 319. Les glycosaminoglycanes sélectivement O-acylés de l'invention sont alors représentés par la formule III suivante: 30. OR O R3 OR1 O o o A- O OR1 O R1 O OR(0 NHR2 OR n R1 - 15 - dans laquelle: - A représente R1, ou Rl-(c) ou Rl-(d), tels cue définis dans la formule (I); - R1 représente H, et/ou S03 et/ou un groupe acyle tel que défini dans la formule (); - R2 représente -S03, et/ou un radical acétyle, sous réserve que la proportion de N-acétyl glucosamine soit au plus égale à celle de l'héparine lorsque R1 représente un radical acétyle; - R3 représente un atome d'hydrogène, et/ou un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin; - n est un nombre entier de 3 à 12. Des composés préférés de l'invention correspondent aux composés de formule (III) dans lesquels R. est un radical alcancyle de 4 à 10 atomes i de carbone. Pour obtenir des mélanges de fragments d héparine ayant une masse moléculaire inférieure à 10.000 daltons, on peut également utiliser une méthode de dépolymérisation enzymatique, par exemple comme décrit dans les brevets EP 244 235 et 244 236, ou de dépolymérisation alcaline, par exemple comme décrit dans le brevet EP 40 144. Dans ce cas, les glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'invention sont représentés par la formule IV suivante: r - COOR3 OR COOR3 X \1 A B (IV) OR1 NHR OR 2 1 OR1 L- N HR2 TI}I dans laquelle: - R1 représente H, et/ou 503, et/ou un groupe acyle tel que défini dans la formule (1); - 16 - - R2 représente SO_, et/ou un radical acétyle, sous réserve que la 2 3 proportion de N-acétyl glucosamine soit au plus égale à celle de l'héparine lorsque R1 représente un radical acétyle - R3 représente un atome d'hydrogène, et/ou un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin - B représente (a)-0R1, tel que défini dans la formule (I), ou OR1; - n est un nombre entier de 2 à 20. Parmi les composés de formule (IV), des composés avantageux sont ceux dans lesquels R1 est un radical alcanoyle de 4 à 10 atomes de carbone. Dans un autre aspect avantageux de l'invention, on peut utiliser un mélange de fragments d'héparine homogènes au regard de leur masse moléculaire, un fragment d'héparine obtenu par synthèse, homogène tant en ce qui concerne sa masse moléculaire qu'en ce -qui concerne sa fonctionnalisation. Dans un autre aspect Intéressant de l'invention, on peut choisir comme glycosaminoglycane des dérivés de l'héparine dépourvus de site de fixation à l'antithrombine 11. (AT III), soit que les chaînes d'héparine aient été fractionnées de manière à éliminer les chaînes oligosaccharidiques comportant le site de fixation à l'AT III en ayant recours par exemple à une chromatographie d'affinité sur résine Sépharose- AT III ou à des chromatographies d'échange d'ions, comme il est décrit dans E. Sache et ai., Thromb. Res., 25, (1932), pp. 443-458, soit que ces sites aient été détruits par exemple par dépolymérisation au periodate suivie d'une G-élimination ou d'une hydrolyse acide. De tels composés peuvent répondre à la formule V suivante: OR1 A O OR o OR B (V) NHR2 0S03 -17 - dans laquelle: - A représente R1-(c), R,-(d) ou le résidu de (c) ou de (d) après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - B représente (a)-OR1, ou OR1, ou un groupe (a) auquel reste accroché un résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - R1 a les significations données dans la formule (I); - R2 représente SO0, ou un radical acétyle, la proportion de S0O étant 2 3 d'environ 90 ; - R3 représente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin; - n est un nombre entier de 1 à 80. Des composés particulièrement avantageux peuvent être obtenus à partir de composés préparés par le procédé mettant en oeuvre une oxydation periodique suivie de B-élimination alcaline, d'une réduction et d'un fractionnement comme décrit plus haut. Ces composés répondent à la formule V: suivante: 0F OP. AX C^ ^. U (VI) NHR2 dans laquelle: - A représente R1, R1-(c), R1-(d), ou le résidu de (c) , ou de (d) après oxydation periodique suivie d'une e-élimination - U représente: O I _ oso - 18 - ou, à raison de un motif pour deux chaines au moins, un acide uronique (Dglucuronique ou L-iduronique) non sulfaté ouvert entre les carbones en positions 2 et 3, de formule: COOR3 o 04X O CH20H CH2OH - B représente (a)-0R1, ou OR1, ou un groupe (a) auquel reste accroché un résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxydation periodique suivie d'une B-élimination; - R a les significations données dans la formule (I);I - R2 représente SO,, ou un radical acétyle, la proportion de S03 étant d'environ au moins 90; - R3 reorésente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin - n est un nombre entier de 7 à 15. Des composés avantageux répondant aux formules (V) et (VI) sont ceux dans lesquels R1 est un radical alcanoyle de 4 à 10 atomes de 22 carbone. Parmi les composés de structure héparinique dépourvus de site de fixation à l'AT II, et donc dépourvus d'activité anticoagulante, une famille de composés avantageux correspond à des dérivés dthéparine N-désulfatée Nacétylée sélectivement 0-acylés répondant à la formule VII suivante: OR1 COOR3 l- O] A -0o O R B NHCOCH3 OR1 n ú634485 - 19 - dans laquelle: - A représente R1, Rl-(c), ou R1-(d), tels que définis dans la formule (1); - R1 représente un radical alcanoyle de 2 à 18 atomes de carbone; - R3 représente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin; - B représente (a)-OR1, tel que défini dans la formule (I), ou OR1; - n est un nombre entier de 1 à 80. Dans un autre aspect avantageux de l'invention, les glycosaminoglycanes choisis sont de type chondroitine-sulfate, à savoir les chondroitines 4et 6-sulfate, le dermatane sulfate, et leurs fragments. Les glycosaminoglycanes de ce type, sélectivement 0-acylés selon l'invention sont représentés par la formule VIII suivante: RC CO OP. 3 A NHCCH CRCE, n dans laquelle - A a les significations de la formule (T) - R1 représente H, et/ou S0O, et/ou un groupe acyle tel que défini dans la formule (1); R3 représente un atome d'hydrogène, et/ou un radicalk alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin; - B représente (b)-ORI, ou (g), tels que définis dans la formule (X) ou OR,, ou un groupe (b) auquel reste accroché le résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxydation périodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide - n est un nombre entier de 1 à 80. - 20 - Parmi les composés de formule (VIII), une famille avantageuse correspond aux composés dans lesquels R3 représente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin. D'autres composés avantageux de formule (VIII) sont ceux dans lesquels R3 représente un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué dE. 7 à 12 atomes de carbone. Une autre famille avantageuse de composés de formule (VIII} correspond aux composés dans lesquels R1 est un radical alcanoyle de 4 à 10 atomes de carbone. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des glycosaminoglycanes sélectivement O-acylés. Le procédé de la présente invention est caractérisé en ce que l'on transforme le glycosaminoglycane en un sel soluble en milieu organique- et en ce que l'on traite ce sel par un agent d'acylation capable d'acyler sélectivement les groupements hydroxyles primaires et secondaires de ce glycosaminoglycane, sans altérer les groupements fonctionnels NHR2, ou COOR3 présents sur ce glycosaminoglycane avant la réaction d'acylation, la réaction s'effectuant dans un solvant aprotique polaire en présence d'un catalyseur et en présence d'une base susceptible de capter l'acide libéré lors de l'acylation, à une température de 0O C à 100 C. D'une manière avantageuse, le procédé de l'invention est mis en oeuvre selon les étapes suivantes: (1) on transforme un glycosaminoglycane de formule IX suivante: B0 (IX> n dans laquelle: - G représente un groupe (a) de formule: OR0 -c OR NHR2..... - 21 - ou un groupe (a') de formule: OR1F i NHCOCH, ou un groupe (b) de formule: (bi R1O NHCCCH, - Uc représente un groupe (c) de formule: C ou un groupe (d' de formule: Do (a C0R OR; ou le résidu du groupe (c) ou du groupe (d) après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - A représente un groupe R1 , un groupe R1%(c) , un groupe Rl -(d) , ou un groupe (e) 0 de formule: COOR3 3(e) OR;..... - 22 - ou le résidu du -groupe (c) ou du groupe (d) après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide - B représente un groupe OR1 , un groupe (a) -OR:, un groupe (a') -ORl, un groupe (b) -OR , ou un groupe (f) de formule: 5 OR; o ORO l (eo OR 'CR' ou un groupe (g)9 de formule: OR' L R ou représente les groupes (a):, (a'):, ou (b)- auxquels reste accroché un résidu de (c)c ou de (d) tel que présent après oxydation periodiaue suivie d'une R-élimination ou d'une hydrolyse acide; - R, représente H ou S3; - R2 représente S03, ou un radical acétyle, sous réserve que la proportion de N-acètyl glucosamine soit au plus égale à celle de l'héparine lorsque R1 représente un radical acétyle; - R3 représente un atome d'hydrogène, ou un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin; - n est un nombre entier de 1 à 80. en un sel dudit glycosaminoglycane soluble dans un solvant organique aprotique polaire; (2) on traite ce sel par un anhydride de formule: Acyle - 0 - Acyle dans laquelle Acyle est tel que défini dans la formule (I), dans ledit solvant organique aprotique polaire, en présence de quantités - 23 - catalytiques de pyridine ou d'une dialkylaminopyridine et d'un accepteur de protons; (3) on précipite le produit ainsi obtenu par action d'une solution d'acétate de sodium dans l'éthanol; et (4) on isole le glycosaminoglycane sélectivement 0-acylé par dissolution dans l'eau du précipité ainsi obtenu et par dialyse, et l'on transforme éventuellement le sel de sodium du glycosaminoglycane sélectivement 0-acylé ainsi obtenu en un autre sel pharmaceutiquement acceptable. Dans un aspect avantageux du procédé de l'invention, le glycosaminoglycane mis en oeuvre dans l'étape (1) est choisi dans le groupe constitué par l'héparine, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire inférieure à 10.000 daltons, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne se situant entre 2.000 et 7.000 daltons, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4.500 daltons, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 2.500 daltons, un mélange de fragments d'héparine homogènes au regard de leur masse moléculaire, un fragment d'héparine obtenu par synthèse, homogène tant en ce qui concerne sa masse moléculaire qu'en ce qui concerne sa fonctionnalisation. Dans un autre aspect avantageux du procédé de l'invention, le glycosaminoglycane mis en oeuvre dans l'étape (1) est de l'héparine, une fraction ou un fragment d'héparine dépourvus de site de fixation à l'antithrombine III. Le glycosaminoglycane mis en oeuvre dans l'étape (1) du procédé de l'invention peut encore avantageusement être choisi dans le groupe constitué par le dermatane sulfate et ses fragments, ou les chondroitines 4- et 6-sulfate et leurs fragments. D'une manière avantageuse, le sel de glycosaminoglycane mis en oeuvre dans l'étape (1) du procédé de l'invention est un sel d'amine tertiaire, en particullier un sel de tributylammonium, ou un sel d'ammonium quaternaire, en particulier un sel de têtrabutylammonium. Dans un autre aspect avantageux du procédé de l'invention, l'anhydride mis en oeuvre dans l'étape (2) est l'anhydride d'un acide alcanoYque contenant de 4 à 10 atomes de carbone. - 24 - Le solvant aprotique polaire dans lequel est conduite l'étape (2) du procédé de l'invention peut être avantageusement choisi -parmi le groupe constitué par le diméthylformamide,l'hexaméthylphosphorotriamide, la pyridine, ou encore un mélange de ces solvants entre eux ou avec le dichlorométhane, et le catalyseur parmi le groupe constitué par des amines telles que la pyridine, et la diméthylaminopyridine. La base destinée à neutraliser l'acidité peut être la pyridine fqui peut servir à la fois de solvant, de catalyseur et de base), la triéthylamine ou la tributylamine. De manière avantageuse, la température et la durée de la réaction' peuvent varier, en fonction du taux d'acylation souhaité, respectivement de 0c C à 100 C, en particulier de 0 C à 50 C, et avantageusement à température ambiante, pendant 1 à 24 heures par exemple. Les composés de l'invention, sélectivement 0-acylés, présentent in vivo une activité prolongée. Par exemple, lorsque ces composés sont des composés de type héparinique pcssédant le site de fixation à l'AT III, et sont donc susceptibles d'exercer une activité antithrombotique, cette activité est nettement prolongée dans -le temps par rapport au même composé n'ayant pas subi une 0-acylation sélective. * Lorsque ces dérivés hépariniques sélectivement 0-acylés ne possèdent pas le site de fixation à l'AT III et sont donc pratiquement dépourvus d'activité anticoagulante, ils peuvent néanmoins exercer in vivo avec un effet retard les activités inhérentes aux dérivés hépariniques non anticoagulants, telle que en particulier l'inhibition des cellules musculaires lisses. L'invention a donc également pour objet des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de substance active une quantité efficace d'au moins un glycosaminoglycane 0-acylé selon l'invention, en association avec un véhicule pharmaceutiquement aceptable. De manière avantageuse, le glycosaminoglycane sélectivement Oacylé se trouve sous forme d'un sel dpharmaceutiquement acceptable,.tel qu'un sel de sodium, de magnésium ou de calcium. Dans une réalisation avantageuse de l'invention, les compositions pharmaceutiques sont caractérisées en ce que le véhicule pharmaceutique - 25 - est approprie pour l'administration par voie orale, et qu'elles se présentent sous forme de gélules gastrorésistantes, de comprimés ou tablettes, de pilules, ou encore sous forme de solutions buvables, renfermant avantageusement de 50 mg à 5 g par unité de prise, de préférence de 100 à 1000 mg pour des gélules, tablettes ou pilules, et de 10 à 150 mg pour les solutés buvables, par exemple une à trois fois. par jour; ou encore en ce Que ces compositions se présentent sous forme de solution injectable, stérile ou stérilisable, pour l'administration par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée, ces solutions renfermant avantageusement de 50 à 200 mg/ml de glycosaminoglycane sélectivement 0-acylé lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée ou de 20 à 200 mg/ml de glycosaminoglycane sélectivement 0acylé lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion. Ces intervalles de doses n'ont Qu'une valeur indicative, les doses administrées devant, dans chaque cas, étre évaluées par le clinicien, compte tenu de l'état du malade et de sa réactivité personnelle à l'égard des médicaments. L'invention concerne également à titre de réactif biologique les glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés de l'invention, qui peuvent être utilisés comme références ou étalons dans des études comparatives pour des études de relations structure/activité dans différents systèmes physiologiques dans lesquels les glycosaminoglycanes peuvent être impliqués. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples d'application qui suivent, et qui ne possédent aucun caractère limitatif. - 26 - EXEMPLE 1: Préparation d'héparine O-acétylée (IC 1938) à partir du sel de tétrabutylammonium de l'héparine a) Préparation du sel de tétrabutylammonium de l'héparine: Le sel de sodium de l'héparine (10 g) dissous dans l'eau (500 ml) est percolé au travers d'une colonne de résine échangeuse de cations (Dowex 50 W x 4, sous forme H +). La solution obtenue est neutralisée par de l'hydroxyde de tétrabutylammonium. Après lyophilisation on obtient le sel de tétrabutylammonium de l'héparine (19,55 g). b) Acétylation: 1,05 g d'héparinate de tétrabutylammonium est dissous dans du diméthylformamide anhydre (5 ml). Après refroidissement à 0 C, on ajoute goutte à goutte de l'anhydride acétique (I mil; 10,46 mmoles) puis de la triéthylamine (1,45 ml; 10,46 mmoles) et de la diméthylami- nopyridine (64 mg; 0,5 mmole). Le mélange est abandonné 24 heures à température ambiante. Aprês addition d'eau (5 ml}, la solution est dialysée pendant 72 heures contre de l'eau distillée. Le sel de tétrabutylammonium est converti en sel de sodium par passage sur une résine Dowex 50, H+ à 0 C, suivie de neutralisation par de la soude lN. Après lyophilisation, on obtient 0,49 g d'héparinate de sodium sélectivement 0-acétylé présentant les caractéristiques suivantes: Rapport sulfate/carboxyle: 2,28 meq/g (produit de départ: 2,20 meq/g) Titre APTT: 91 ui/mg Spectre 13C RMN (methanol 51,6 ppm, standard interne) - signal à 23,4 ppm: CH3 de CH3-CO-0- - signal à 24,5 ppm (faible): CH3 de CH3-CO-NH- 3 3 (identique au produit de départ) Le spectre RMN indique la présence d'environ deux groupes acétyles par unité disaccharidique. EXEMPLE 2: Préparation d'héparine O-acétylée (IC 1938) à partir du sel de tributylammonium de l'héparine a) Préparation du sel de tributylammonium de l'héparine Le sel de sodium de l'héparine (10. g) est dissous dans l'eau (500ml) puis percolé au travers d'une colonne de résine échangeuse de - 27 - cations (Dowex 50 W x 4, sous forme H+). La solution est neutralisée par addition d'une solution de tributylamine à 10 % dans l'éthanol. Apres lavage à l'éther et lyophilisation, on obtient le sel de tributylammonium de l'héparine (14,77 g). S b) Acétylation: A une solution refroidie à 0 C du sel ci-dessus (4 g) dans du diméthylformamide anhydre (50 ml), on ajoute de la diméthylaminopyridine- (250 mg), de l'anhydride acétique (3,9 ml) et de la tributylamine (9,7 ml) . Après 24 heures à température ambiante, de l'eau (1,5 ml) est ajoutée. Le mélange est ensuite versé dans une solution d'éthanol saturé en acétate de sodium. Aprés lavage par l'éthanol, le précipité est dissous dans l'eau, puis dialysé contre du bicarbonate à 5 % dans l'eau, puis contre de l'eau. On obtient, après lyophilisation, l'héparinate de sodium O-acétylé (1,81 g). Le spectre infra-rouge présente une forte bande ester à 1730 cm1 Apres saponification, le Droduit présente: - un rapport sulfate/carboxyle de 2, 38 meo/g (produit de départ: 2,40 meq/g) - un titre APTT de: 85 ui/mg EXEMPLE 3: Préparation d'héparine O-acétylée (IC 1938) en utilisant la catalyse par la pyridine Le sel de tétrabutylammonium de l'héparine (0,58 g) est dissous dans un mélange (1/1; v/v) de pyridine et de diméthylformamide (10 ml). De l'anhydride acétique est ajouté (0,5 ml), puis le mélange est abandonné à température ambiante. Après 24 heures, on ajoute une solution aqueuse d'acétate de sodium (1 M, 15 ml) puis on verse le mélange dans de l'éthanol (80 ml) refroidi à 0 C. Après centrifugation le précipité est redissous dans l'eau (10 ml), puis de l'éthanol est ajouté (160 ml) suivi d'acétate de sodium aqueux (1 M, 10 ml). Le précipité est ensuite repris par l'eau et lyophiiisé, donnant l'héparine O-acétylée (0,22 g). EXEMPLE 4: Préparation d'héparine O-propionylée (IC 1939) à des degrés divers A une solution, refroidie à 0 C, d'héparinate de tétrabutyl- - 28 - butylammonium (1,85 g) obtenu comme décrit dans l'exemple 1, dans le diméthylformamide (10 ml), on ajoute goutte à goutte de l'anhydride propionique (2,7 ml), puis de la triéthylamine (2,9 ml) et de la diméthylaminopyridine (128 mg). Aux temps 1 h. 2 h, 4 h, 8 h et 24 h, une partie du mélange réactionnel est prélevée, diluée par un égal volume d'eau et dialysée pendant 24 heures dans de l'eau distillée. Après passage sur une résine Dowex 50 H+ et neutralisation par la soude, les produits obtenus sont lyophilisés et présentent les caractéristiques suivantes: Temps de Sulfate/Carboxyle APTT réaction j Masse meq/g (ui/mg) 24 h 49.6 mg 2,31 80 8 h 138 mg 2,35 88 4h 122 mg 2,33 94 2 h 120 mg 2,42 109 1 h 120 rng 2,33 120 produit de départ)! 2,40! 150 Le spectre RMN du proton ces produits a été enregistré dans l'eau avec le 3,3,3triméthylsilylpropionate (TSP) comme standard interne. Il présente des signaux à--lt ppm et a-2,4 ppmr caractéristiques respectivement des résidus CH3 et CH2 de CH3-CH2-C0-0 et des signaux entrer,.j3 eta- 5 ppm caractéristiques des protons du seuelette osidique. La comparaison de l'intensité des signaux du propionyl- et du squelette entre le produit traité pendant 1 heure et celui soumis à 24 heures de réaction illustre l'influence de la durée de la réaction: en effet, on observe une décroissance des signaux des protons du squelette, ce qui indique une augmentation du taux de substitution. Le spectre du carbone (méthanol 5i,6 ppm, standard interne) des signaux à. 10,8 et,e-30 ppm, caractéristiques des radicaux CH3 et CH2 des esters propionates. EXEMPLE 5: Préparation d'héparine 0-butyrylée (IC 1940) A) Utilisation du sel de tétrabutylammonium de l'héparine: A une solution du sel de tétrabutylammonium de l'héparine (0,55 g) obtenu comme décrit dans l'exemple 1, dans le diméthylformamide (5 ml) - 29 - on ajoute, à Oc C de l'anhydride butyrique et de la diméthylaminopyridine. Après 24 heures à température ambiante, de l'eau (5 ml) est ajoutée, puis le mélange réactionnel est dialysé pendant 72 heures contre de l'eau distillée. Après échange sur Dowex 50 H, neutralisation par la soude et lyophilisation, on obtient de l'héparine O-butyrylée sous forme de sel de sodium (0,32 g). Rapport sulfate/carboxyle: 2,15 meq/g (produit de départ: 2,20 meq/g) Titre APTT: 59 ui/mg Le spectre de RMN du proton (TSP, standard interne) montre la présence de signaux à 0,9 ppm; 1,6 ppm et 2,4 ppm, caractéristiques des groupements CH3-CH2 de CH3-CH2-CH2-CO-O- et des signaux entre 3 et 6 ppm, caractéristiques du squelette osidique. L'analyse du spectre RMN indique la présence d'environ une chaine butyryle par unité disaccharidique. B) Utilisation du sel de tributylammonium de l'héparine: A une solution, refroidie à Oc C, d'héparinate de tributylamine (4 g) obtenu comme décrit dans l'exemple 2 dans le diméthylformamide (50 mi), on ajoute de la diméthylaminopyridine (0,25 g), de l'anhydride butyrique (6,7 ml) et de la tributylamine (9,7 ml). On laisse le mélange réactionnel à température ambiante pendant 24 heures. De l'eau est ajoutée (1,5 ml) puis, après 30 minutes, une solution saturée d'acétate de sodium dans l'éthanol (250 ml). Le précipité est ensuite lavé trois fois à l'éthanol, puis dialysé contre une solution à 5 % de bicarbonate, puis contre de l'eau. On obtient, après lyophilisation, le sel de sodium de l'héparine O-butyrylée (2,1 g). Titre APTT: 29 ui/mg Aprés saponification des esters par la soude 0,5 M pendant 2 heures à 0 C, le produit obtenu présente un rapport sulfate/carboxyle de 2,36 meq/g (2,40 meq/g dans le produit de départ). EXEMPLE 6: Préparation d'héparine O-hexanoylée IC 1941) A) Utilisation du sel de tétrabutylammonium de l'héparine: A une solution du sel de tétrabutylammonium de l'héparine (0,55 g) obtenu comme décrit dans l'exemple 1, dans le diméthylformamide (5 ml), - 30 - on ajoute à 0 C de l'anhydride capro7que (1 ml; 6 mmoles), de la triéthylamine (0,84 ml, 6 mmolesi et de la diméthylaminopyridine. Apres 24 heures à température ambiante, de l'eau (5 ml) est ajoutée, puis le mélange réactionnel est dialysé pendant 72 heures contre une solution de bicarbonate à 5 %, puis contre de l'eau distillée. Après échange sur Dowex 50 H+, neutralisation par la soude et lyophilisation, on obtient- l'héparine 0-hexanoylée sous forme de sel de sodium (0,30 g). Titre APTT: 25 ui/mg Le spectre RMN du proton (TSP, standard interne) présente des signaux à 0,8; 1,2; 1,5; 2,3 ppm, caractéristiques des CH3CH2 de CH -(CH2)8-CO-0- B) Utilisation du sel de tributylammonium de l'héparine: A une solution, refroidie à Q C, d'héparinate de tributylammonium (4 g) obtenu comme décrit dans l'exemple 2 dans le diméthylformamide (50 ml), on ajoute de la diméthylaminopyridine (0,25 g), de la tributylamine (9,7 ml) et de l'anhydride hexanoïque (10,6 ml). Après 24 heures à 20 C, de l'eau est ajoutée (1,5 ml), suivie d'une solution saturée d'acétate de sodium dans l'éthanol. Après lavage à l'éthanol, dialyse et lyophilisation, on obtient l'héparine 0-hexanoylée (2,5 g). EXEMPLE 7: Préparation d'héparine O-octanoylée (IC 1942) A une solution, refroidie à 0 C, d'héparinate de tributylammonium (4 g) obtenu comme décrit dans l'exemple 2 dans le diméthylformamide (50 ml), on ajoute de la diméthylaminopyridine (0,25 g), de l'anhydride octanoique (12,1 ml) et de la tributylamine (9,7 ml). Après 24 heures à température ambiante, de l'eau (1,5 ml) est ajoutée suivie, après 30 minutes, d'une solution saturée d'acétate de sodium dans l'éthanol. Après dialyse contre une solution à 20 % d'éthanol, puis contre l'eau distillée et ultrafiltration, le produit est soumis à un échange de cations par passage sur Dowex 50 H, suivi de neutralisation par la soude. Après lyophilisation, on obtient l'héparine 0-octanoylée (2,5 g). EXEMPLE 8: Préparation d'héparine O-décanoylée IC 1943) A) Utilisation du sel de tétrabutylammonium de l'héparine: A une solution du sel de tétrabutylammonium de l'héparine (0,55 g) - 31 - obtenu comme décrit dans l'exemple 1 dans le diméthylformamide (5 ml), on ajoute à 0 C de l'anhydride caprique (1 ml; 6 mmoles), de la triéthylamine (0,84 ml, 6 mmoles) et de la diméthylaminopyridine. Après 24 heures à température ambiante, de l'eau (5 ml) est ajoutée, puis le mélange réactionnel est dialysé pendant 72 heures contre une solution de bicarbonate à 5 %, puis contre de l'eau distillée. Après échange sur Dowex 50 H, neutralisation par la soude et lyophilisation, on obtient l'héparine 0-décanoylée sous forme de sel de sodium (0,30 g). Le spectre RMN du proton (TSP, standard interne) présente des signaux à 0, 8; 1,2; 1,5 et 2,4 ppm, caractéristiques des CH et CH de 3 2. CH3-(CH2)8-CO-O- B) Utilisation du sel de tributylammonium de l'héparine: A une solution, refroidie à 0 C, d'héparinate de tributylammonium (4 g) obtenu comme décrit dans l'exemple 2 dans le diméthylformamide (50 ml), on ajoute de la diméthylaminopyridine (0,25 g), de l'anhydride décanoîque (13,3 g dissous dans 20 ml de diméthylformamide), et de la tributylamine (9,7 ml). Après 24 heures à température ambiante, de l'eau (1,5 ml) est ajoutée, suivie d'une solution saturée d'acétate de sodium dans l'éthanol. Le précipité est dissous dans du diméthylsuifoxyde puis dialysé contre de l'eau, du bicarbonate de sodium et à nouveau de l'eau. Après lyophilisation, on obtient l'héparine 0-décanoylée (2,38 g). EXEMPLE 9: Préparation d'héparine 0-benzoylée (IC 1944) Le sel de tétrabutylammonium de 1 'héparine, obtenu comme décrit dans l'exemple 2, est benzoylé par l'anhydride benzoîque dans les conditions décrites précédemment pour la préparation de l'héparine 0-décanoylée. Le spectre RMN du carbone du produit obtenu présente des signaux à 131; 132 et 136 ppm caractéristiques des groupements benzoyles. Le produit est dépourvu d'activité anticoagulante in vitro. EXEMPLE 10: Préparation d'une héparine de faible passe moléculaire (PM moyen,.4.500 daltons), intervalle de PMl 1.800-8.000 daltons) O-acétylée (IC 1945) Cette héparine de faible masse moléculaire a été obtenue par dépolymérisation nitreuse partielle et fractionnement alcoolique comme Ec. 634485 - 32 - décrit dans le brevet EP 181 252 et est dénommée ci-après CY 216. Le sel de sodium du CY 216 (1 g) est converti en sel de tétrabutylammonium par passage au travers d'une colonne de résine Dowex H+ suivi de neutralisation par l'hydroxyde de tétrabutylammonium. Le sel ainsi obtenu (1,7 g) est séché sous vide pendant trois heures à 50 C puis dissous dans du diméthylformamide anhydre (10 ml). Après refroidissment à 0 C, de l'anhydride acétique (1,7 ml) est ajouté goutte à goutte, suivi de triéthylamine (2,4 ml) et de diméthylaminopyridine (102 mg). Après 20 heures de réaction, le produit est chromatographié sur une colonne de Séphadex G-25 éluée par l'eau. On obtient, après conversion en sel de sodium et lyophilisation, le CY 216 O-acétylé (0,89 g). Son spectre de RMN du carbone (méthanol 51,6 ppm, standard interne) présente un signal à 23 ppm caractéristique des acétates. Le signal du CH3 de CH3-CO-NH-, à 24,5 ppm, est identique à celui du produit de départ. Le rapport sulfate/carboxyle est de 2,09 meq/g (produit de départ: 2,05 meq/g) - Titre APTT: 18 ui/mg - Tlitre anti-Xa: 205 u/mg (Dosage de Yin et al., J. Lab. Clin. Med., 1973, 81, 298-310) EXEMPLE 11: Préparation d'une héparine de faible masse moléculaire (PM moyen2.500 daltons, intervalle de PM--dl.500-8.000 daltons) O-acétylée (IC 1946) Cette héparine de faible masse moléculaire a été obtenue par dépolymérisation nitreuse partielle selon le procédé décrit dans le brevet EP 37 319 et est dénommée ci-après CY 222. Le sel de sodium du CY 222 est converti en sel de tributylammonium ' par passage au travers d'une colonne de résine Dowex 50 H+, suivi de neutralisation par la tributylamine. Le sel obtenu après lyophilisation (1,5 g) est dissous dans du diméthylformamide (5 ml) puis, après refroidissement à 0 C, de l'anhydride acétique (1,35 ml) est ajouté goutte à goutte, suivi de - 33 - triéthylamine (2 ml) et de diméthylaminopyridine (85 mg). Apres 18 heures de réaction, de l'eau est ajoutée (20 ml) puis le mélange est dialysé pendant 3 jours contre de l'eau distillée. Apres conversion en sel de sodium et lyophilisation, on obtient le CY 222 O-acétylé (0,86 g). Le produit présente un rapport sulfate/carboxyle de 1,98 meq/g.. (produit de départ: 1,97 meq/g). Le spectre de RMN du carbone (méthanol 51,6 ppm, standard interne) du produit contient un signal à 23 ppm caractéristique des 0-acetyl. La comparaison des intensités des signaux des N-acetyl (à,-,24,5 ppm) entre le produit de départ et le produit d'arrivée démontre que l'acétylation a été sélective. - Titre APTT: 8 ui/mg - Titre anti-Xa: 191 u/mg (Dosage de Yin et al., J. Lab. Clin. Med., 19i3, 81, 293-310) EXEMPLE 12: A/ Préparation d'un fragment d'héparine dépourvu d'affinité pour l'antithrombine III (IC 1772) 1/ Coupure des chaînes d'héparine à l'aide d'acide periodique: 10 g d'héparine injectable de mucus de porc, sous forme de sel de sodium, titrant 157 ui/mg dans le dosage Codex et 155 u/mg dans le dosage antifacteur Xa de Yin et al. sont mis en solution dans 250 ml d'eau déminéralisée à 40 C. Le pH de la solution est ajusté à 5,0 par de l'acide chlorhydrique concentré. 10 g de métaperiodate de sodium (NaI04, PM: 213,89) en solution dans 250 ml d'eau déminéralisée à 4 C sont ajoutés sous agitation modérée. Le pH de l'ensemble est ajusté à 5,0 par del'acide chlorhydrique concentré. La solution est abandonnée 24 heures, à l'obscurité, en chambre froide à + 4 C. 2/ Elimination du periodate résiduel: On répartit ensuite la solution réactionnelle dans trois boyaux de dialyse NOJAX 40R, (porosité de 3 à 4.000 Da) et on la soumet à une dialyse 15 heures contre de l'eau déminéralisée courante. 3/ Dépolymérisation en milieu basique: Aux 780 ml de solution obtenue après dialyse,, sont ajoutés 16 ml de soude 10 N, et l'ensemble est soumis à agitation 3 heures à - 34 - température ambiante (de l'ordre de 18-21 C). 4/ Réduction: 500 mg de borohydrure de sodium NaBH4, PM: 37,83) sont alors ajoutés et la solution est agitée de nouveau 4 heures à température ambiante. Son pH est ensuite amené à 4 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré. Apres 15 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 7 à l'aide de soude concentrée. Aux 820 ml de solution ainsi obtenue sont ajoutés 16,4 g de NaCl puis 1270 ml d'éthanol. L'ensemble est laissé au repos 3 heures, puis centrifugé à 2.500 t/minute pendant 20 minutes. Le précipité est recueilli, remis en suspension dans 200 ml d'éthanol pur, broyé à R l'Ultra-Turrax et finalement récupéré par filtration sur buchner fritté. Il est alors séché sous vide à 40 C pendant 5 heures. On récupère ainsi 8,9 g de produit. 5/ Fractionnement alcoolique: Ces 8,9 g sont dissous dans environ 120 ml d'eau déminéralisée à température ambiante. On ajoute 1,78 g de NaCl et le pH de la solution est abaissé à 3,5 à l'aide d'acide chlorhydrique. Le volume de la solution est ajusté à 178 ml à l'aide d'eau déminéralisée. 151 ml d'éthanol pur sont ajoutés sous agitation. L'agitation est maintenue 15 minutes après la fin de l'addition, puis l'ensemble est laissé au repos heures, à température ambiante. Le précipité formé est recueilli par centrifugation 20 minutes à 2.500 t/minute. Il est remis en suspension dans 150 ml d'éthanol pur, R - broyé à l'Ultra-TurraxR, récupéré par filtration sur buchner fritté, lavé par 300 ml d'éthanol pur et finalement séché sous vide à 40 C pendant 24 heures. On récupère ainsi sous forme de poudre blanche 5 grammes du produit IC 1772, ayant les caractéristiques suivantes: - S03: 3,55 meq/g - COQ-: 1, 54 meq/g - S + C: 5,09 meq/g - S/C: 2,31 meq/g Il est pratiquement dépourvu de N-acetyl glucosamine (absence de signal à - 24,5 ppm sur le spectre du carbone). - 35 - - Titre Codex: Il ui/mg - Titre APTT: 9 ui/mg - Titre anti-Xa: 12 u/mg B/ Préparation d'un fragment d'héparine dépourvu d'affinité pour l'antithrombine III O-acétylé (IC 1924) Le produit obtenu à l'étape A/ est converti en sel de tétrabutylammonium par passage sur une résine Dowex 50 H+, suivi de neutralisation à l'aide d'hydroxyde de tétrabutylammonium. A partir de 9,5 g de sel de sodium, on obtient 18 g de sel de tétrabutylammonium. A une solution de 6 g du sel ainsi obtenu, dans le diméthylformamide (55 ml) on ajoute, après refroidissement à 0O C, de l'anhydride acétique (6,2 ml; 65,6 mmoles) puis de la triétnylamine (9 ml; 65,5 mmoles) et de la diméthylaminopyridine (403 mg; 3,3 mmoles). Apres 24 heures, une solution saturée d'acétate de sodium dans l'éthanol est ajoutée (250 ml). Apres centrifugation et lavage du précipité à l'éthanol, le solide est dessalé sur Séphadex G-25, puis soumis à un échange d'ions par passage sur Dowex 50 H +, suivi de neutralisation par la soude. Après lyophilisation, on obtient le produit IC 1924 (3 g). Ce produit présente les caractéristiques suivantes: - rapport sulfate/carboxyle: 2,28 meq/g. Le spectre de RMN du carbone (méthanol 51,6 ppm, standard interne) montre clairement que le produit a été 0-acylé. Le signal caractéristique du C2 de la N-acétyl-glucosamine, aux environs de 56 ppm, est tout comme dans le produit de départ, absent du spectre. EXEMPLE 13: Préparation d'un fragment d'héparine dépourvu d'affinité pour l'antithrombine III 0-butyrylé (IC 1925) 6 g du sel de tétrabutylammonium de IC 1772, obtenu comme décrit dans l'exemple 12, sont butyrylés par l'anhydride butyrique dans les conditions décrites pour l'acétylation. On obtient le produit IC 1925 (2,96 g) qui présente les caractéristiques suivantes: - rapport sulfate/carboxyle: 2,31 meq/g. Le spectre 13C-RMN (méthanol 51,6 ppm, standard interne) contient les signaux caractéristiques du groupe butyle à 15,6, 20,4 et 38,4 ppm. - 36 - EXEMPLE 14: Préparation d'un fragment d'héparine dépourvu d'affinité pour l'antithrombine III O-hexanoylé (IC 1926) 6 g du sel de tétrabutylammonium de IC 1772, obtenu comme décrit dans l'exemple 12, sont traités par l'anhydride hexanoîque de la même façon que pour l'acétylation. On obtient le produit IC 1926 (3 g) qui présente les caractéristiques suivantes: rapport sulfate/carboxyle: 2,20 mea/g Le spectre de RMN du carbone (méthanol 51,6 ppm, standard interne) présente les signaux caractéristiques des CH3 et CH2 du groupe hexyl à 15,5, 23,9, 26,2, 32,7 et 36,1 ppm. Le spectre de RMN du proton indique la présence d'environ un groupe hexyl par unité disaccharidique. EXEMPLE 15: Préparation de dermatane sulfate O-acétylé (IC 1947) A une solution, refroidie à O' C, de sel de têtrabutylammonium de dermatane sulfate (O,91 g), obtenu dans les mêmes conditions que celles décrites pour l'obtention d'héparinate de tétraDutylammonium dans l'exemple 1, dans le diméthylformamide (20 ml), on ajoute, goutte à goutte, de l'anhydride acétique (1,35 ml; 14,2 mmoles) puis de la triéthylamine (1, 97 ml; 14,2 mmoles) et de la diméthylaminopyridine (0,7 mmole).-Après 24 heures à température ambiante, on ajoute de l'eau ml), puis dialyse pendant 72 heures. Le sel de sodium est obtenu par passage au travers d'une colonne Dowex 50 H+, à 0 C, suivie de neutralisation par la soude. On obtient, après lyophilisation, une poudre beige (0,52 g). Le dermatane sulfate O-acétylé présente les caractéristiques suivantes: rapport sulfate/carboxyle: 0,99 meq/g (produit de départ: 1,05 meq/g) spectre 13C-RMN (méthanol 51,6 ppm, standard interne) signal à 25,2 ppm CH3 de CH3-CO-NH- (identique au produit de départ) signal à 23,0 ppm CH3 de CH3-CO-O 3 3 - 37 - EXEMPLE 16: Préparation d'héparine O-butyrylée, préalablement Ndésulfatée et N-acétylée (IC 1948) L'héparine est N-désulfatée puis Nacétylée selon la technique décrite par Nagasawa et Inoue (Methods Carbohydr. Chem. Vol.VIII, pp. 291-294). Le sel de tributylammonium (1 g) est obtenu par passage sur une résine Dowex 50 H+, suivi de neutralisation par une solution de tributylamine dans l'éthanol. Apres lyophilisation et séchage, ce sel est dissous dans le diméthylformamide (10 ml) puis, après refroidissement à 0 C, de l'anhydride butyrique (2 ml), de la tributylamine (2 ml) et de la diméthylaminopyridine (65 mg) sont ajoutés. Après 24 heures, de l'eau (5 ml) est ajoutée, puis le mélange est dialysé contre une solution à 5 de bicarbonate de sodium, puis contre de l'eau. Après passage sur Dowex 50 H+ , suivi de neutralisation par la soude, on obtient le sel de sodium de l'héparine N-acétylée O-butyrylée. Le spectre de RMN du carbone (méthanol 51,6 ppm, stanoard interne) présente un signal à 24,6 ppm caractéristique du N-acétyl et des signaux à 16, 20 et 38 ppm caractéristiques des esters butyriques. L'expérience peut être répétée avec une héparine partiellement Ndésulfatée N-acétylée et conduire à un produit partiellement N-désulfaté N-acétylé et O-butyrylé. EXEMPLE 17: Préparation de dermatane sulfate peracetylé (IC 1950) Le sel de tétrabutylammonium du dermatane sulfate (0,8 g) dissous dans du diméthylformamide (20 ml) est acétylé par addition de diméthylaminopyridine (76 mg), d'anhydride acétique (1,2 ml) et de triéthylamine (1,7 ml). Le mélange est chauffé à 80 C pendant 1 heure. Après retour à température ambiante, de l'eau (0,45 ml) est ajoutée, suivie d'une solution 0,3 M d'acétate de sodium dans l'éthanol (100 ml). Aprés centrifugation, le précipité est dissous dans l'eau puis dialysé contre l'eau distillée. Le sel de sodium est obtenu par échange sur une colonne Dowex 50 H +, suivi de neutralisation par la soude. On obtient, après lyophilisation, le dermatane sulfate peracetylé (0,51 g). - 38 - Ce produit présente un rapport sulfate/carboxyle de 1,07 meq/g (produit de départ: 1,05 meq/g) et contient environ trois groupes acétyles par unité disaccharidique. EXEMPLE 18: Préparation d'héparine benzylester O-acétylée (IC 1949) A une solution d'héparinate de tétrabutylammonium (1 g) dans le diméthylformamide (10 ml), on ajoute du bromure de benzyle (0,17 ml). Apres 24 heures à température ambiante, on ajoute de l'acétate de tétrabutylammonium (220 mg). Apres 24 heures, on procède à l'acétylation du benzylester formé. Pour cela, de la diméthylaminopyridine est introduite (57 mg), suivie de triéthylamine (1,3 ml) et d'anhydride acétique (0,9 ml). Apres retour à température ambiante, le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures. De l'eau est alors ajoutée, puis le produit est précipité par une solution saturée d'acétate de sodium dans l'éthanol. Après dialyse contre de l'eau distillée, passage sur Dowex 50 H +, neutralisation par la soude et lyophilisation, on obtient le sel de sodium de l'héparine benzylester 0-acétylée (0,57 g). Le produit présente un rapport sulfate/carboxyle de 3,6 meq/g (produit de départ non benzylé: 2,20 meq/g). Le spectre du carbone (méthanol 51,6 ppm, standard interne} présente des signaux à 23,3 ppm (0-acétyle) et à 131,6 ppm (benzyie). Le signal du CH3 de CH3-CO-NH, à'-24,5 ppm, est identique à celui du produit de départ. EXEMPLE 19: Préparation de dermatane sulfate benzyl ester O-acétylé (IC 1953) Le sel de tétrabutylammonium du dermatane sulfate (1 g) est dissous dans du diméthylformamide anhydre (15 ml). A cette solution, refroidie à 0 C, on ajoute du bromure de benzyle (0,25 ml), puis on laisse pendant 24 heures à température ambiante. De l'acétate de tétrabutylammonium (0,32 g) est alors ajouté, puis, après 24 heures à température ambiante, on procède à l'acétylation. De l'anhydride acétique (1,5 ml) est introduit, suivi de triéthylamine (2, 2 ml) et de diméthylaminopyridine (96 mg). Après 24 - 39 - heures, de l'eau (0,6 ml) est ajoutée, puis le produit est précipité par addition d'une solution éthanolique saturée d'acétate de sodium. Le produit est dialysé contre du chlorure de sodium à 10 %', puis de l'eau. On obtient, après lyophilisation, l'ester benzylique du dermatane sulfate O-acétylé (0,63 g). EXEMPLE 20: Mise en évidence de l'O-acylation sélective par te procéde de l'invention et comparaison avec d'autres procédés d'acylation Le procédé de la présente invention a été comparé aux procédés des Brevets FR 2 100 735 et EP 256 880. En particulier, les caractéristiques de l'ester acétique de l'héparine préparé selon le procédé de l'invention (IC 1938, exemple 1) ont été comparées à celles de l'ester acétique de l'héparine obtenu en appliquant des conditions opératoires décrites dans le Brevet FR 2 100 735 (produit A) et aux esters acétiques de l'héparine obtenus selon les modes opératoires des exemples 3 et 4 du Brevet EP 256 880 (produits B et C). (a) Préparation du produit A: Dans une solution d'héparinate de tétrabutylammonium (1 g) dissous dans du diméthylformamide anhydre (10 ml), on introduit du dichlorohexyl- carbodiimide (4,2 g) dissous dans du diméthylformamide (15 ml), puis de l'acide acétique (1,16 ml) dissous dans du diméthylformamide (25 ml) est ajouté goutte à goutte en 45 minutes à + 4 C. Après 24 heures à température ambiante, le mélange réactionnel est filtré et concentré sous vide. Le résidu est remis en suspension dans l'éther. Après filtration et lavage, le précipité est dialysé contre de l'eau distillée. Le sel de sodium est obtenu par passage sur une colonne + de résine Dowex H, puis neutralisation par la soude. On obtient 0,493 g de produit A. Cette préparation a également été réalisée pendant 48 heures à. + 4 C. (b) Préparation des produits B et C: Les produits B et C ont été préparés par acétylation de l'héparine dans un mélange de formamide et de pyridine par du chlorure d'acétyle, - 40 - en utilisant 2 ml de chlorure d'acétyle pour le produit B et 40 ml pour le produit C, dans les conditions décrites dans les exemples 3 et 4 du brevet EP 256 880. L'ester acétique est ensuite repris dans l'eau et dialysé contre du chlorure de sodium. (c) Résultats: Les caractéristiques des produits sont données dans le Tableau 1... Les caractéristiques de l'héparine de départ utilisée dans chaque essai sont données à titre de référence. Tableau 1: Produit Rapport Titre APTT* Titre YW* Sulfate/Carboxyle ui/mg u/mg (meq/q) IC 1936 2,28 91 70 Hép. départ 2,20 160 160 A 3,40 42 41 Hép. départ 2,40 160 160 B 2,10 57 39 C 1,15 2 0,6 Hép. départ 2,40 160 160 * Les titres APTT et Yin et Wessler sont mesurés in vitro. Les résultats montrent que, bien que les titres APTT et YW soient inférieurs pour tous les produits à ceux de 1 'héparine de départ, et ceci plus fortement pour les produits A,. B et C, seul le produit IC 1938 conserve un rapport sulfate/carboxyle pratiquement identique à celui de l'héparine de départ. Ceci résulte du fait que le procédé de l'invention permet d'acyler sélectivement les fonctions hydroxyles sans altérer les groupements fonctionnels de l'héparine, ce qui est confirmé par l'analyse chimique des produits. Les produits IC 1938, A, B et C ont été analysés en RMN du carbone (méthanol 51,6 ppm, standard interne). Les spectres de ces produits ainsi que celui de l'héparine de départ sont donnés comme suit: - 41 - Figure 1: Héparine de départ Figure 2: IC 1938 Figure 3: Produit A après 24 heures de réaction Figure 4: Produit A après 48 heures de réaction Figure 5: Produit B Figure 6: Produit C Les résultats sont les suivants: 1. Le produit IC 1938 présente dans le spectre du carbone (Fig. 2): - un signal à 23,4 ppm correspondant au CH3 de CH3 - CO - 0 - un signal à 24,4 ppm correspondant au CH3 de CH3 - CO NH, identique au signal présent dans l'héparine de départ. Ces signaux montrent que les groupements aminés et carboxyles ont été respectés et qu'il y a bien eu acétylation sélective au niveau des groupements hydroxyles. !5 2. L'analyse du produit A en spectroscopie RMN du carbone montre que le produit obtenu en majorité, aussi bien après 24 heures qu'après 48 heures (Fig. 3 et 4), est un dérivé isourée de l'héparine, dont les fonctions carboxyles sont substituées par un groupement NHH-C = N ri -- I du fait de l'utilisation du dicyclohexylcarbodiimide. En effet, on observe des signaux importants correspondant aux atomes de carbone du groupe ci-dessus vers 28, 34, 54 et 156 ppm, alors que le signal correspondant au CH3 de CH3 -CO-0 vers 23 ppm est très faible. Le procédé ne permet donc pas d'obtenir une 0-acylation sélective et entraine une altération des fonctions carboxyles, que reflète l'augmentation du rapport sulfate/carboxyle. 3. Le produit B présente dans le spectre du carbone (Fig. 3): - un signal à 23,1 ppm correspondant au CH3 de CH3- CO-O - un signal à 24,8 ppm correspondant au CH3 de CH - Co -NH, nettement plus intense que ceux de l'héparine de départ et de IC 1938. Ces signaux montrent qu'on observe non seulement une 0-acétylation, mais également une forte N-acétylation. Le procédé d'acylation utilisé, - 42 - non sélectif, entraîne une N-désulfatation partielle, suivie d'une acétylation des amines, ce qui entraine également une diminution du rapport sulfate/carboxyle. 4. Le produit C présente dans le spectre du carbone: - un signal à 22 ppm correspondant au CH3 de CH3 -Co - 0 * - un signal à 24 ppm correspondant au CH3 de CH3 -CO -NH,. nettement plus intense que ceux de l'héparine de départ et de IC 1938. Comme pour le produit B, on observe à la fois une O- et une N-acétylation. La N-désulfatation, plus importante que pour le produit B, entraine une forte diminution du rapport sulfate/carboxyle. ACTIVITE PHARMACOLOGIQUE DES PRODUITS DE L'INVENTION A/ Activité anticoagulante in vitro: 1. Evalutation du titre in vitro par rapport à une gamme-étalon: Cette mesure a été effectuée à l'aide du test "temps de cephaline kaolin sensibilisé" (Diagnostica Stago, Assnières,France), sur plasma humain. Les résultats sont donnés dans le Tableau 2: Tableau 2: Produit Titre (ui/mg) IC 1940 113 IC 1941 28 IC 1943 7 Héparine 160 IC 1940 = héparine 0-'butyrylée préparée comme décrit dans l'exemple 5 IC 1941 = héparine 0-hexanoylée préparée comme décrit dans l'exemple 6 IC 1943 = héparine O-décanoylée préparée comme décrit dans l'exemple 8 Les résultats obtenus montrent que les produits sélectivement 0-acylés de l'invention ont un titre in vitro inférieur à celui de l'héparine, leur activité anticoagulante décroissant lorsque la longueur - 43 - de la chaîne acylante augmente. 2. Mesure de l'activité anticoagulante in vitro des produits de l'invention sur sang humain: Les essais sont effectués à deux doses des produits de l'invention, 2,mg/ml et 4)Jg/ml sur 5 ml de sang humain. Un essai témoin est également effectué pour chaque produit en remplaçant le produit à tester par du soluté isotonique de NaCl. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante, le sang est centrifugé pendant-20 minutes à 3000 tours/minute. Le plasma déplaquetté est décanté pour permettre de réaliser les tests suivants: - TCK (Temps de Céphaline Kaolin) à l'aide du kit "temps de céphaline kaolin sensibilisé" (Diagnostica Stago, Asnières, France);. - Heptest O(Hemachem, St Louis, USA). Les résultats sont donnés dans le Tableau 3. ChaQue résultat correspond à la moyenne de trois essais. Tableau 3: Produit Dose (g/mI) TCK (S) HEPTEST (S) Témoin 48,00 21,50 + 2,70 + 1,73 IC 1942 2 208,75 + 61,00 + 45,54 + 8,52 IC 1940 4 428,00 301,00 + 103,43 28,35 Témo i n 45,00 23,66 + 5,00 + 2,08 IC 1941 2 53,00 + 40,33 + 5,19 + 7,63 IC 1941 4 84,66 61,33 + 15,01 + 11,01 Témoin 49,66 23,00 + 8,50 + 4,35 IC 1943 2 50,00 23,00 + 9,54 + 4,58 IC 1943 4 56,00 24,00 t 10,00 5,29 - 44 - Les résultats montrent dans les deux méthodes un allongement du temps de coagulation pour les produits IC 1940 et IC 1941. Cet allongement est proportionnel à la dose. En revanche, dans ces méthodes in vitro, le produit IC 1943 n'a montré qu'une très faible action sur l'allongement du temps de coagulation. 3. Mesure de l'activité anticoagulante in vitro des produits de l'invention par thromboélastographie sur sang humain: Les produits de l'invention, aux doses de 2 ug/ml et 4 pg/ml sont mis en présence de 5 ml de sang humain comme décrit dans l'essai précédent, un tube témoin étant réalisé pour chaque produit en remplaçant le produit à tester par du soluté isotonique de NaCl. Apres les 30 minutes d'incubation à température ambiante, un tracé thromboélastographique est réalisé à l'aide d'un thromboélastographe Hellige sur 0,25 ml de sang recalcifié par 0,1 ml de CaCl2 0,058 M. Les résultats sont donnés dans le Tableau 4. Tableau 4 Dose _ Produit (g/ml) r k r + k amx IPT Témoin 13,00 8,25 21,25 48,00 11, 2E t 0,81 + 1,25 + 1,50 + 2,44- 2,3E IC 1940 2 33,50 22,25 55,75 35,50 2,57 2,88 + 4,03 + 5,85 + 3,69 * 0,77 IC 1940 4 78,75 44,00 122,75 27,00 0,82 + 17,34 + 8,68 + 13,02 + 16 + 0,27 Témoin 10,50 4,50 15,00 57,00 37,OC 0,70 + 2,12 - 2,82 + 8,48 + 28,2E IC 1941 2 14,00 10,33 24,33 51,66 21,33 + 3,00 + 6,50 + 6,00 + 10,96 + 19,85 IC 1941 4 20,33 15,00 35,33 40,33 4,66 + 3,51 + 4,58 + 5,03 + Z,51 * 2,08 Témoin 13,33 9,00 22,33 47,00 10,33 2,30 + 2,64 + 4,93 + 4,58 4,04 IC 1943 2 12,66 8,00 20,66 47,00 12,00 + 2,08 + 2,64 + 4,72 + 5,29 + 5,29 IC 1943 4 12,66 9,83 22,50 45,66 9,33 + 2,08 + 3,01 t 5,07 t 5,77 + 4,04 - L 634485 - 45 - *r = temps de réaction k = temps de coagulation correspondant à une amplitude du tracé de 20 mm amx = amplitude maximale IPT = indice de potentiel thrombodynamique Les résultats montrent que IC 1940 et IC 1941 entraînent une augmentation du r + k, une diminution de l'amx et de l'IPT, ce qui correspond à une hypocoagulation accrue. Cette hypocoagulation augmente à la fois en fonction de la dose utilisée et de la longueur de la chaîne acylante. IC 1943, dans ce test, ne provoque pas de modification sensible des paramètres. B/ Activité anticoagulante in vivo: 1. Mesure de l'activité anticoagulante in vivo des produits de l'invention chez le lapin (voie i. v.): Les essais ont été réalisés sur des lapins néo-zélandais màles. Un prélèvement sanguin est effectué au niveau de l'artère médiane de l'oreille avant l'injection du produit. On injecte ensuite dans la veine marginale de l'oreille une solution du produit à tester de 25 mg de produit dans 5 ml de soluté isotonique de NaCl. Le test du TCK et l'HEPTEST sont réalisés sur le prélèvement sanguin effectué avant l'injection des produits, et sur des prélèvements effectués 6 h., 24 h., 48 h. et 96 h. après l'injection. Les résultats sont donnés sur les figures 7 et 8. Ils montrent un net allongement dans le temps de l'activité anticoagulante, cet allongement augmentant avec la longueur de la chaîne acylante. En effet, l'activité anticoagulante du produit IC 1940 est encore nette plus de 6 heures après l'injection, alors qu'elle est encore nette 24 heures après l'injection pour le produit IC 1941 et qu'elle se prolonge jusqu'à 96 heures pour le produit IC 1943. 2. Mesure de l'activité anticoagulante in vivo des produits de l'invention par thromboélastographie: z634485 - 46 - Les produits à tester sont injectés par voie i.v. comme décrit dans l'essai précédent (25 mg dans 5 ml de soluté isotonique NaCl). Un tracé thromboélastographique est réalisé à l'aide d'un theomboélastographe Hellige sur 0,25 ml des échantillons de sang prélevésavant l'injection et 6 h., 24 h., 48 h. et 96 h. après l'injection, des prélèvements supplémentaires étant effectués lorsque l'activité anticoagulante persiste au-delà de 96 heures. Les-résultats sont donnés dans les Tableaux 5, 6 et 7. Tableau 5: Produit testé: IC 1940 r k r + k amx IPT Avant Injection 13 6 19 67 33 6 h. après 91 5 2,1 Injection 12,1 24 h. après 12 17 67 40 Injection 1 96 h. après 1 96 h. après 8 i 3 il 70 I 77 Injection Tableau 6: Produit testé: IC 1941 r. k I r + k amx IPT I Avant I 13 5 18 67 40 Injection i I 6 h. après 135 31 166 45 2,6 Injection 2 24 h. après 3024 h. aprs 19 12 31 58 11,5 Injection 48 h. aprèsi!j 48 h. après 22 t 10 32! 72 25 Injection ú634485 - 47 - Tableau 7: Produit testé: IC 1943 r k r + k amx IPT Avant Injection 12 4 16 69 55 6 h. après Injection40 27 67 > 40 24 h.apres 13 7 20 72 36 Injection 48 h. après 48eh. aprs 53 34 87 54,5 4,7 Injection 72 h. après Injection 112 185 297 > 38 96 h. après Injection 82 45 127 62 3,6 168 h. après Injection 19 9 28 68 23 192 h. après 17 5 22 70 46 Injection Les résultats obtenus montrent que pour tous les produits, on note une forte augmentation du r + k et une diminution de l'IPT à la 6ème heure, ce qui indique un allongement de l'hypocoagulabilité. Celui-ci se prolonge jusqu'à au moins 24 heures après l'injection pour le produit IC 1941 et est encore mesurable 96 heures après l'injection pour le produit IC 1943. On constate donc que tous les produits ont une forte activité anticoagulante in vivo, que cette activité est prolongée dans le temps et que IC 1943 qui n'avait été que peu ou pas actif dans les essais in vitro s'avère très actif et fortement retard dans les essais in vivo. - 48 - REVENDICATIONS 1. Glycosaminoglycanes sélectivement O-acylés répondant à la formule I suivante: AL[G-jA B (I) dans laquelle: - G représente un groupe (a) de formule: OR (a) CoI NHR2 ou un groupe (a') de formule: - OR1 (a') O NHCOCH-3 ou un groupe (b) de formule,: GO (b) R1/ 0 C. NHCOCH3 - U représente un groupe (c) de formule: COOR3 (c) o OR1 -0O OR1 ú634485 - 49 - ou un groupe (d) de formule: o (d) C XR, OROR OR1 ou le résidu du groupe (c) ou du groupe (d) après oxydation periodique suivie d'une Bélimination ou d'une hydrolyse acide; - A représente un groupe R1, un groupe Ri-(c), un groupe Rl-(d), ou un groure (e) de formule:- COOR3 le)} \CR1 / OR. ou le résidu du groupe (c) ou du groupe (d) après oxydation periodique suivie d'une R-élimination ou d'une hydrolyse acide - B représente un groupe 0-R1, un groupe (a)-0R!, un groupe (a')-0R1 un groupe (b)-OR,, un groupe (f) de formule: OR1 (f) O OR OR1 ou un groupe (g) de formule: R (g) O R 10 OR1 t./* - 50 - ou représente un groupe (a), un groupe (a'), ou un groupe (b) auxquels reste accroché un résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une - hydrolyse acide; - R1 représente H, SO- ou acyle, acyle étant le résidu d'un acide 1 3 carboxylique non a-B insaturé choisi parmi: un groupe alcanoyle de 1 à 18 atomes de carbone; un groupe alcanoyle de 2 à 3 atomes de carbone substitué par - un groupe cycloalkyle de 3 à 7 atomes de carbone, - un groupe phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alkyles de I à 14 atomes de carbone, atomes d'halogène ou groupements NO2 ou OCH3, - un radical hydrocarboné aliphatique insaturé de 4 à 16 atomes de carbone; 15. un groupe benzoyle éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alkyles de I à 4 atomes de carbone, atomes d'halogène ou groupements NO ou OCH3; 2 3 un groupe cycloalkyle (3-7 C) carbonyle; - R représente S03 et/ou un radical acétyle, sous réserve que la proportion de N-acétyl glucosamine soit au plus égale à celle de l'héparine lorsque R1 représente un radical acétyle; - R3 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin - n est un nombre entier de 1 à 80. R1 étant acyle dans une proportion d'au moins 0,1 à 3 groupes acyles par unité disaccharidique, de préférence de 0,5 à 1 groupe acyle, et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. 2. Glycosaminoglycanes sélectivement O-acylés, selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule II suivante: 35.../ E634485 - 51 - O COOR3 O (II) A OO 1 o O1 BX 5 NHR2 OR1 n dans laquelle: - A a les significations de la revendication 1; - R1 représente H et/ou S03 et/ou un groupe acyle tel que défini dans la 1 3 revendication 1; - R2 représente 503 et/ou un radical acétyle, sous réserve que la 2 3 proportion de N-acetyl glucosamine soit au plus égale à celle de l'héparine lorsque R1 représente un radical acétyle; - R3 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, un radical alkyle substitué de 7 à 12 atroes de carDone, ou un cation métallique alcalin; - B représente (a)0R1 ou (f), (a) et (f) étant tels que définis dans la revendication 1, ou OR,, ou un groupe (a) auquel reste accroché un résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - n est un nombre entier de 1 à 80. 3. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule II suivante: OR COOR3 NHR2 OR1 n - 52 - dans laquelle: - A, B, R1, R2 et n ont les significations de la revendication 2; - R3 représente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin; 4. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule II suivante:- OR COOR3 A O O 1i B OR1 n dans laqueli: - A, B, R1, R2 et n ont les significations de la revendication 2; - R représente un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone. 5. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 ou 4, caractérisés en ce que le glycosaminoglycane est choisi dans le groupe constitué par l'héparine; un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire inférieure à 10.000 daltons, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne se situant entre 2.000 et 7.000 daltons, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4. 500 daltons, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 2.500 daltons, un mélange de fragments d'héparine homogènes au regard de leur masse moléculaire, un fragment d'héparine obtenu par synthèse, homogène tant en ce qui concerne sa masse moléculaire qu'en ce qui concerne sa fonctionnalisation; le groupe acyle étant dans une proportion d'au moins 0,1 à 3 groupes par unité disaccharidique, de préférence de 0,5 & 1 groupe acyle. - 53 - 6. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule III suivante: OR1 OR o o A o OR R1 OOR ( NHR2 ORJ R1 dans laquelle: - A représente R1 ou R 1-(c) ou R -(d), tels que définis dans la revendication 1.; - R1 représente H, et/ou S03 et/ou un groure acyle tel que défini dans la revendication 1; - R2 représente -SG3, et/ou un radical acétyle, sous réserve que la proportion de N-acétyl glucosamine soit au plus égale à celle de l'héparine lorsque R1 représente un radical acétyle; - R3 représente un atome d'nydrogène, et/ou un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin; - n est un nombre entier de 3 à 12. 7. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule IV suivante: COOR3 OR C 3 R 0 X) (IV) ORI NHR2 OR1 n - 54 - dans laquelle: - R1 représente H, et/ou S0O, et/ou un groupe acyle tel que défini dans la revendication 1; - R2 représente SO3, et/ou un radical acétyle, sous réserve que la proportion de N-acetyl glucosamine soit au plus égale à celle de l'héparine lorsque R 1représente un radical acétyle; - R3 représente un atome d'hydrogène, et/ou un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin; - B représente (a)-OR1, tel que défini dans la revendication 1, ou OR1; - n est un nombre entier de 2 à 20. 8. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que le glycosaminoglycane choisi est de l 'héparine, une fraction ou un fragment d'héparine dépourvus de site de fixation à l'antithrombine I.I. 9. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 et 8, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule V suivante: _ A fO ORt B (V) NHR2 OS03 n dans laquelle: - A représente R1 ou R1-(c), R1(d) ou le résidu de (c) ou de (d) après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide - B représente (a)-0R1, ou OR1, ou un groupe (a) auquel reste accroché un résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - 55 - - R a les significations données dans la revendication 1 - R2 représente SO-, ou un radical acétyle, la proportion de S03 étant 2 3 3 d'environ 90 %'; - R3 représente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin; - n est un nombre entier de 1 à 80. 10. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque-- des revendications l, 2, 3 et 8, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule VI suivante: rORl IU B (VI) H n dans laquelle: - A représente R1, R1-(c), R1-(d), ou le résidu de (c), ou de (d) après oxydation periodique suivie d'une B-élimination; - U représente: OO coo o OR1 oso0503 ou, à raison de un motif pour deux chaines au moins, un acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique) non sulfaté ouvert entre les carbones en positions 2 et 3, de formule: COOR3 o CH2OH CH2 - 56 - - B représente (a)-OR1, ou OR1, ou un groupe (a) auquel reste accroché un résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxydation periodique suivie d'une B-élimination; - R1 a les significations données dans la revendication 1; i - R2 représente SO, ou un radical acétyle, la proportion dg S03 étant - d'environ au moins 90 % - R3 représente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin - n est un nombre entier de 7 à 15. 11. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 et 8, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule VII suivante: OR1 CC-OR3 T4 B (VIl) A ORRoc B NHCoCHB OR1 n dans laquelle: - A représente R1, R1(c) ou R1-(d), tels que définis dans la revendication 1; - R1 représente un radical alcanoyle de 2 à 18 atomes de carbone; - R3 représente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin; - B représente (a)-0O1, tel que défini dans la revendication 1, ou OR10 - n est un nombre entier de 1 à 80. 12. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule VIII suivante: OR COOR3 R1O B OCO OR A HOC3O1 /..(VIII. A NHCOCH3 OR __ - 57 - dans laquelle: - A a les significations de la revendication 1; - R1 représente H. et/ou SO, et/ou un groupe acyle tel que défini dans la revendication 1; - R3 représente un atome d'hydrogène, et/ou un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle substitué de 7 à 12 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin; - B représente (b)-OR1 ou (g), tels que définis à la revendication 1, ou OR1, ou un groupe(b) auquel reste accroché un résidu de (c) ou de (d) tel que présent après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - n est un nombre entier de 1 à 80. 13. Glycosaminoglycanes sélectivement O-acylés. selon la revendication 12, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule VIII suivante: r OR1 COOPi R 0 B (VIII) A L NHCOCH3 OR dans laquelle: - A, B, R1 et n ont les significations données à la revendication 12; - R3 représente un atome d'hydrogène ou un cation métallique alcalin; 14. Glycosaminoglycanes sélectivement O-acylés selon la revendication 12, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule VIII suivante: cooR3 R10 O O B O R (VIII) A NHCOCH3 OR1 n - 58 - dans laquelle: - A, B, R1 et n ont les significations données à la revendication 12; - R3 représente un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un radical alkyle subs.titué de 7 à 12 atomes de carbone. 15. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque des revendications 1, 12, 13 et 14, caractérisés en ce que le glycosaminoglycane est choisi parmi le groupe constitué par le dermatane sulfate et ses fragments, ou les chondroîtines 4- et 6-sulfate et leurs fragments, le groupe acyle étant dans une proportion d'au moins 0,1 à 3 groupes acyles par unité disaccharidique, de préférence de 0,5 à 1 groupe acyle. 16. Glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans lesquelles R est un radical alcanoyle de 4 à 10 atomes de carbone. 17. Procédé de préparation de glycosaminoglycanes sélectivement 0-acylés selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que (1) on transforme un glycosaminoglycane de formule IX suivante: A [G0I - BD (IX) dans laquelle: - G représente un groupe (a)' de formule: OR' o (a)' -OJ OR'/ NHR2 ou un groupe (a') de formule: -OR1O NHCOCH3 3... - 59 - ou un groupe (b) de formule: OR: (bu' R.0o É y o / NHCOCH3 - U représente un groupe (c) de formule: COOR3 (c) /' -o OR. ou un groupe (de de formule: CODR -o ORI ou le résidu du grouoe (c)0 ou du groupe (d)0 après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - A représente un groupe R1 , un groupe R -(c) 0, un groupe R -(d) ou un groupe (e) de formule: COOR3 OR OR' ou le résidu du groupe (c) ou du groupe (d) après oxydation periodique suivie d'une 8-élimination ou d'une hydrolyse acide; - 60 - - B représente un groupe OR1 , un groupe (a) -ORi , un groupe (a') -OR! , un groupe (b) -OR1 , un groupe (f) de formule: OR! (f)0 O 0 i LOR ou un groupe (g) de formule: OR! (g) 0 - R o LR ou représente les groupes (a)c, (a')0 ou (b) auxquels reste accroché un résidu de (c)0 ou de (d) tel que présent après oxydation periodique suivie d'une B-élimination ou d'une hydrolyse acide; - R1 représente H ou S03; - représente S03, ou un radical acétyle, sous réserve que la proportion de N-acétyl glucosamine soit au plus égale à -celle de l'héparine lorsque R1 représente un radical acétyle; - R représente un atome d'hydrogène, ou un radical alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, ou un cation métallique alcalin; - n est un nombre entier de 1 à 80. en un sel dudit glycosaminoglycane soluble dans un solvant organique aprotique polaire; (2) on traite ce sel par un anhydride de formule: Acyle - 0 - Acyle dans laquelle Acyle est tel que défini dans la revendication l, dans ledit solvant organique aprotique polaire, en présence de quantités catalytiques de pyridine ou d'une dialkylaminopyridine et d'un accepteur de protons; (3) on précipite le produit ainsi obtenu par action d'une solution d'acétate de sodium dans l'éthanol; et - 61 - (4) on isole le glycosaminoglycane sélectivement 0-acylé par dissolution dans l'eau du précipité ainsi obtenu et par dialyse, et l'on transforme éventuellement le sel de sodium du glycosaminoglycane sélectivement 0-acylé ainsi obtenu en un autre sel pharmaceutiquement acceptable. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le glycosaminoglycane mis en oeuvre dans l'étape (1) est choisi dans le groupe constitué par l'héparine, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire inférieure à 10.000 daltons, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne se situant o10 entre 2.000 et 7.000 daltons, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4.500 daltons, un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 2.500 daltons, un mélange de fragments d'héparine homogènes au regard de leur masse moléculaire, un fragment d'héparine obtenu par synthèse, homogène tant en ce qui concerne sa masse moléculaire qu'en ce qui concerne sa fonctionnalisation. 19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le glycosaminoglycane mis en oeuvre dans l'étape(1) est de l'héparine, une fraction ou un fragment d'héparine dépourvus de site de fixation à l'antithrombine III. 20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le glycosaminoglycane mis en oeuvre dans l'étape (1) est choisi parmi le groupe constitué par le dermatane sulfate et ses fragments, ou les chondroitines 4- et 6-sulfate et leurs fragments. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que le sel de glycosaminoglycane de l'étape(1) est un sel d'amine tertiaire, en particulier un sel de tributylamine, ou un sel d'ammonium quaternaire, en particulier un sel de tétrabutylammonium. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à. 21, caractérisé en ce que l'anhydride mis en oeuvre dans l'étape (2) est l'anhydride d'un acide alcanoîque contenant de 4 à 10 atomes de carbone. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, caractérisé en ce que l'étape(2) est conduite dans un solvant aprotique - 62 - polaire choisi parmi le groupe constitué par le diméthylformamide, l'hexaméthylphosphorotriamide, la pyridine, ou un mélange de ces solvants entre eux ou avec le dichlorométhane. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à -23, caractérisé en ce que, comme accepteur de protons, lors de l'étape 2., l'on utilise une base choisie parmi le groupe constitué par ta pyridine,- la triéthylamine, la tributylamine. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 24, caractérisé en ce que l'étape 2. est effectuée à une température située entre 0 C et 100 C, plus particulièrement entre 50 C et 100 C. 26. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle renferme à titre de substance active une quantité efficace d'au moins un glycosaminoglycane sélectivement 0-acylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 en association avec un véhicule pharmaceutique. 27. Composition pharmaceutique selon la revendication 26, caractérisée en ce que le glycosaminoglycane sélectivement 0-acylé se trouve sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable tel qu'un sel de sodium, de magnésium ou de calcium. 28. Composition pharmaceutique selon les revendications 26 et 27, caractérisée en ce que le véhicule pharmaceutique est approprié pour l'administration par voie orale, et qu'elle se présente sous forme de gélules gastrorésistantes, de comprimés ou tablettes, de pilules, ou encore sous forme de solutions buvables, renfermant avantageusement de mg à 5 g par unité de prise, de préférence de 100 à 1000 mg pour des gélules, tablettes ou pilules, et de 10 à 150 mg pour les solutés buvables. 29. Composition pharmaceutique selon les revendications 26 et 27, caractérisée en ce qu'"elle se présente sous forme de solution injectable, stérile ou stérilisable, pour l'administration par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée, ces solutions renfermant avantageusement de 50 à 200 mg/ml de glycosaminoglycane sélectivement 0-acylé lorsqu'elle est destinée à l'injection par voie sous-cutanée, ou de 20 à 200 mg/ml de glycosaminoglycane sélectivement 0-acylé lorsqu'elle est destinée à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion.