Brevet FR2634023A1 — publié le 19900112

-1- 2534023 La présente invention a pour objet un réactif sous forme de support solide sur lequel sont fixées des chaînes latérales hydrophiles réactives, sa préparation et son application, notamment comme réactif biologique. L'invention a en particulier pour objet un réactif sous forme de support solide permettant de fixer par covalence un ligand biologique aminé, ainsi que le réactif obtenu après fixation dudit ligand biologique. Il est connu de fixer des ligands biologiques sur des supports solides, notamment pour obtenir des réactifs permettant de révéler la présence ou de doser des molécules en solution ayant une affinité pour ledit ligand. Par exemple, la fixation d'anticorps ou d'antigènes à la surface de particules de latex est un moyen simple et rapide de visualiser la formation du complexe antigène-anticorps en amplifiant sa taille. Généralement, les molécules d'anticorps ou d'antigène sont adsorbées physiquement sur les particules par liaisons hydrophobes. On ne peut cependant pas éviter une désorption au moins partielle au cours du temps. Il en.résulte une variation de la sensibilité du réactif. La fixation de ligands par liaison covalente sur des supports solides portant en surface des fonctions réactives permet de remédier partiellement à cette difficulté. Il faut remarquer toutefois que le phénomène d'adsorption du ligand subsiste. En outre, cette méthode présente certains inconvénients. Le problème de l'accessibilité des sites actifs du ligand fixé n'est pas résolu car il dépend de la position aléatoire du site de fixation du ligand. Il en résulte que les réactifs obtenus ne sont pas homogènes de ce point de vue. En outre, la fixation du ligand nécessite généralement l'intervention d'agents activateurs ou d'agents de couplage tels que les dialdéhydes, le bromure de cyanogène, les carbodiimides, la benzoquinone, etc..., afin de créer une fonction réactive nécessaire au couplage par covalence du ligand. D'autres difficultés observées à propos de la fixation de ligands biologiques sur des supports de polymères hydrophobes tels que le polystyrène sont évoquées notamment dans l'article de R.COUTURIER et al., Makromol. Chem. 187, 1603-1610 (1986). La présente invention permet de remédier à ces inconvénients en fournissant un réactif sous forme de support solide dans lequel la fonction réactive, qui réagit avec le ligand sans utilisation d'un agent de couplage ou d'un activateur, est fixée à l'extrémité d'un bras espaceur hydrophile. La fonction réactive se trouve ainsi éloignée du'support solide proprement -2- 25 340 23 dit, et cet éloignement, lié à la souplesse du bras espaceur, permet une meilleure accessibilité des sites réactifs du ligand après fixation de celui-ci par covalence. En outre, la présence des bras hydrophiles permet d'éviter ou de réduire fortement le phénomène d'adsorption du ligand et/ou de la molécule à détecter sur le support hydrophobe. Le bras espaceur a de préférence une structure moléculaire linéaire. La présente invention a donc pour objet un réactif, caractérisé par le fait qu'il est constitué essentiellement par un support solide, en polymère hydrophobe, à la surface duquel sont fixées par covalence des chaînes latérales hydrophiles de formule I -Z-CHZ' (I) " dans laquelle Z est un bras espaceur organique hydrophile non hydroxylé dont la chaîne comporte de 4 à 70 atomes de carbone, Z' et Z" représentent ensemble =0, un groupement protecteur du groupement carbonyle, ou un groupement =YL dans lequel Y représente =N- ou =N= et L représente le reste d'un ligand aminé de formule schématique L-NH2 ou L=NH, ou bien Z" représente H et Z' représente -NH-L, L étant le reste dudit ligand. Dans des modes de réalisation particuliers, le réactif de l'invention peut encore présenter les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison: - le groupement Z est un groupement polyoxyéthyléné comportant au moins deux motifs oxyéthylène, et en particulier de 2 à 30 motifs; - ledit polymère hydrophobe est le polystyrène, le poly-vinyl- toluène, le polypropylène, le chlorure de polyvinyle, le chlorure de polyvinylidène, ou leurs copolymères; - le groupement protecteur du groupement carbonyle est par exemple un groupement acétal, ou un groupement oxazine ou oxazoline; dans le cas d'un acétal, Z' et Z" peuvent représenter chacun un groupement alcoxy inférieur (notamment méthoxy ou éthoxy) ou représenter ensemble un groupement éthylènedioxy. Lorsque le réactif de l'invention contient des cha!nes latérales de formule I à terminaison = YL ou -NH-L, il contient également des chaînes latérales de formule I, pour lesquelles Z' et Z' représentent =0, et/ou des chaînes latérales de formule II -Z-CH-Z1 Z2 -3- 2634023 dans laquelle Z est défini comme précédemment, Z1 représente H et Z2 représente -OH ou -NER, ou bien Z et Z2 représentent ensemble le groupement -N-R, R étant un alkyle inférieur, éventuellement hydroxylé, ayant I à 4 atomes de carbone. Le substituant R est de préférence tel que l'amine RNH2 est la méthylamine, ltéthylamine, l'éthanolamine ou le 2amino.1-propanol. La raison de la présence éventuelle de chaînes latérales de formule II, dans le réactif de l'invention, sera exposée ci- après à l'occasion de la description du procédé d'obtention de ce réactif.; Lorsque le réactif de l'invention ne contient pas de chaînes latérales de formule I à terminaison -YL ou -NE-L, il contient des chaînes latérales de formule I avec Z' et Z" représentant -0 ou un groupement protecteur du carbonyle, tel que défini précédemment, et éventuellement des chaînes latérales de formule II avec Z1=H et Z2'0H, étant entendu que lesdites chaînes de formule I représentent au moins 25% de la totalité des chaînes latérales présentes sur le réactif. Les réactifs pour lesquels Z' et Z" représentent un groupement protecteur sont des précurseurs du réactif aldéhydique correspondant. Dans le réactif de l'invention, la densité de la totalité des chaînes latérales hydrophiles de formules I et II, rapportée à la surface du -5 -10 réactif, peut varier par exemple de 105 à 1010 mole de chaînes z -5 -7 latérales I et II par m2 environ, et en particulier de 10 à 10- mole/m2. - Le réactif de l'invention se présente notamment sous forme de billes, et en particulier sous la forme de microbilles dont les dimensions peuvent aller de 0,2 à 1 micromètre environ et notamment de 0,25 à 0,8 micromètre. De préférence, ces microbilles sont calibrées et présentent un indice de polydispersité faible, par exemple inférieur à 1,005. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un réactif tel que défini précédemment. Ce procédé est caractérisé par le fait que l'on prépare ledit support solide par polymérisation ou copolymérisation d'un ou plusieurs monomères insaturés hydrophobes, selon les méthodes de polymérisation usuelles, et qu'avant la fin-de la polymérisation, on ajoute au milieu réactionnel un monomère à chaîne hydrophile dont une extrémité comporte une double liaison copolymérisable avec lesdits monomères insaturés hydrophobes et dont l'autre extrémité comporte un groupement terminal de formule -Z-CHZs(Z4), dans-laquelle Z (constituant la chaîne hydrophile) est défini comme ci-dessus, et Zs et Z4 représentent =0 ou un groupement protecteur du carbonyle, tel que défini précédemment, ledit monomère hydrophile étant éventuellement en mélange avec un monomère hydrophile -4- 2634023 analogue à groupement terminal -Z-CH20H, que, dans le Cas o Z3 et-Z4 représentent un groupement protecteur du carbonyle, on effectue une réaction de déprotection, que, si désiré, on fait réagir le réactif obtenu, qui comporte des chatnes latérales de formule III -Z-CH=O (III) avec un ligand aminé, selon les méthodes connues, pour obtenir un réactif correspondant dans lequel une partie des chatnes latérales répondent à la formule IV: -Z-CHY'L (IV) dans laquelle Z est défini comme précédemment, Y' représente un groupement -N- lié par sa double liaison au groupement CH, ou Y' représente un + groupement =N=, et L représente le reste de la molécule de ligand, que, si désiré, on fait réagir le réactif obtenu avec une amine primaire de formule RNH2, R étant un alkyle inférieur éventuellement hydroxylé ayant 1 à 4 atomes de carbone, de façon à transformer les chaînes latérales -Z-CH=O, qui n'ont pas réagi avec le ligand, en chaînes correspondantes de formule V: -Z-CH=N-R (V), et que, dans le cas o le réactif comporte des chaînes latérales de formule IV et éventuellement de formule V, on soumet, si désiré, le réactif obtenu à l'action d'un agent réducteur capable de réduire les groupements imine ou imminium, pour obtenir un réactif correspondant comportant des chaînes latérales de formule VI: -Z-CH2-NH-L (VI) et le cas échéant des chatnes latérales de formule VII: - Z - CH2-NH-R (VII). On voit que dans la formule IV, L est le reste d'un ligand qui peut etre représenté par la formule L-NH2 (lorsque le ligand a réagi avec l'aldéhyde par un groupement amine primaire), ou L est le reste d'un ligand qui peut être représenté par la formule L=NH, dans laquelle =NH est l'imine d'un groupement de type guanidine contenu dans le ligand (lorsque le ligand a réagi avec l'aldéhyde par ledit groupement de type guanidine). -5- 2534023 Dans le cas de la réaction de l'aldéhyde sur un groupement + guanidine du ligand, le cation =-N= est accompagné de l'anion OH formé, qui est toutefois échangeable par tout autre anion désiré, par exemple un aniop halogénure. Dans le cas o l'on ne fait pas réagir le réactif comportant des chaînes latérales de formule V avec l'amine RN'2, et o l'on soumet le réactif à l'action d'un agent réducteur, les chaînes latérales de formule III présentes sur le réactif peuvent alors être simultanément réduites en chaînes latérales de formule VIII: -Z-CH2-OH (VIII). Dans le procédé décrit ci-dessus, le monomère à chaîne hydrophile peut être ajouté sous la forme d'un mélange avec le monomère hydrophobe. Le monomère A chaîne hydrophile est par exemple un composé de formule IX: C2-C-(Ar) a-CH2-Z-CH-Z3 i | (IX) z XI' Z4 dans laquelle Z, Zs3 et Z4 sont définis comme précédemment, X1 représente H ou CHs3, Ar est un groupement m- ou p- phénylène éventuellement substitué par un groupement méthyle, et a=O ou 1. Dans le cas o Z est un groupement polyoxyéthyléné, Z est lié au groupement -CH2- par une liaison éther. Le monomèreIX fournit des réactifs correspondants dans lesquels la chaTne latérale de formule I est rattachée au polymère hydrophobe par l'intermédiaire d'un groupement -Ce2-CHX -(Ar) -CH2-. Le monomère de formule IX peut être préparé par exemple par réaction d'un composé de formule X: CH2=C-(Ar)a-CH2-X2 a 22 (X) X1 o X2 est un halogène (notamment chlore ou brome), et Xlest défini comme ci-dessus, avec un composé de formule XI: X4-Z-X3 (XI) 4 3XI -6- -6- 2634023 o Z est défini comme ci-dessus, X3 représente un groupement --CH=0 ou un précurseur de celui-ci, et X4 est un groupement réactif capable de réagir avec X2 pour former une liaison entre X et Z. Lorsque Z est un groupement polyoxéthyléné, X4 est l'hydrogène de l'hydroxyle terminal du produit XI, qui par réaction avec l'halogène représenté par X2du produit (X), va former une liaison éther entre les groupements -CH2- et Z. Le précurseur du groupement -CH=O est notament un groupement -CE20H qui peut être oxydé en aldéhyde correspondant selon les méthodes usuelles, pour donner un composé de formule IX (avec Z3 et Z4 représentant ensemble = 0). Par exemple, lorque X4-Z-X est le composé 4 3 H-(OCH 2CH 2)n-1OCH2-CH2OH (XI A), n étant un nombre au moins égal à 2, pouvant varier de 2 à 30 par exemple, la réaction avec le composé X fournit un composé de formule XII: CH C-(Ar) CH (OCH CH OCH2 2 2 a2(O 2CH2)n-1O CH OH (XII) X1 qui par oxydation donne le composé correspondant IX A: CH 2C-(Ar) a-CH2- (OCH2CH2)n1 OCH2 | (IX A). X1 On peut également préparer un composé de formule IX au départ d'un composé XII (sous forme d'alcoolate) par réaction avec un dérivé de formule XIII: X2-(CH2)b-CHZ3(Z4) (XIII) dans laquelle X2 est un halogène, b=l ou 2 et Z3 et Z4 sont définis comme précédemment, pour obtenir un composé correspondant de formule IX B: CH2= (Ar)a-CH2-(OCH2CH2)nO (CH2)b CHZ3(Z4) (IX) 2I2) Y.IB -7- En comparant les formules IX, IX A et IX B, on voit que les composés de formule IX, et en conséquence lès composés de formules I à VIII, sont notamment ceux pour lesquels Z représente (0CH2C H2)n lOCH2- ou 2( z n ( 2) b Les composés X, XI et XIII sont des composés connus ou pouvant être facilement préparés selon les méthodes connues. La réaction de polymérisation du monomâre hydrophobe et de copolymération du monomère hydrophobe et du monomère à chatne hydrophile est effectuée selon les méthodes usuelles. En particulier, dans le cas de la préparation d'un réactif sous forme de mièrobilles, on opère selon la technique connue de polymérisation en émulsion. La quantité de monomère à chaTne hydrophile ajoutée pendant la réaction de polymérisation est.une quantité suffisante pour obtenir la densité souhaitée de chaTnes hydrophiles à la surface du réactif. Cette quantité peut être déterminée dans chaque cas par de simples expériences de routine. A la fin de la réaction de polymérisation, on obtient un réactif portant à sa surface des chaînes latérales de formule III. Il s'agit d'un réactif intermédiaire, qui permet de fixer sur le support hydrophobe du réactif, divers ligands aminés par réaction du groupement aldéhyde sur l'amine du ligand. Pour cela, on met en contact ledit réactif avec une solution d'un ligand aminé comportant des groupements amine primaire et/ou des groupements de type guanidine, pour obtenir un réactif modifié comportant des chaînes latérales de formule IV: -Z-CH Y'L (IV) dans laquelle L est le reste de la molécule du ligand, Y' est un groupement -N- lié par sa double liaison au groupement CH lorsque l'aldéhyde a réagi avec un groupement amine primaire du ligand, + et Y' représente un groupement =N= lorsque l'aldéhyde a réagi avec l'imine d'un groupement de type guanidine du ligand. Si désiré, on soumet en outre ledit réactif modifié à l'action d'un agent réducteur, tel qu'un borohydrure ou un cyanoborohydrure, capable -8- 2634023 + de réduire les groupements =N- ou =N= en groupements amine correspondants. Les ligands biologiques aminés qui peuvent être fixés sur les réactifs de l'invention selon la méthode décrite ci-dessus sont notamment des protéines, par exemple des anticorps (notamment IgG, IgM, IgE), y compris des anti-anticorps, des antigènes, des haptènes, des hormones peptidiques, des enzymes, ou encore des oligonucléotides, des lectines, des neurotransmetteurs ou des drogues synthétiques ou naturelles analogues à ces derniers (agonistes ou antagonistes). La quantité de ligand fixée sur le réactif dépend évidemment de l'encombrement du ligand. On cherche généralement à fixer le maximum de ligand sur le réactif. La quantité de ligand à employer est déterminée facilement dans chaque cas par des expériences de routine. La réaction avec l'agent réducteur n'est pas obligatoire, car le réactif portant les chaînes latérales de formule IV peut être utilisé tel quel, par exemple comme réactif pour détecter la présence du récepteur ou d'un partenaire du ligand. Bien que cela ne soit généralement pas nécessaire, on peut neutraliser (afin d'éviter toute réaction parasite de fixation du récepteur ou d'un partenaire du ligand, lors de l'utilisation ultérieure du réactif) les groupements aldéhyde restants, sur les chaînes latérales qui n'ont pas réagi avec le ligand, en les faisant réagir avec une amine primaire de faible poids moléculaire RNH2 (de préférence une alcanolamine), de façon à transformer les chaînes latérales de formule III en chaînes de formule V qui peuvent être réduites, si désiré, en chaînes de formule VII. L'agent réducteur utilisé est le même que pour la réduction des chaînes de formule IV en chaînes de formule VI, et ces réductions peuvent évidemment être effectuées simultanément. Pour neutraliser les groupements aldéhyde restants, on peut également les réduire en groupements alcool primaire correspondants en utilisant une quantité suffisante d'agent réducteur lors du stade de réduction des bases de Schiff. Les réactifs de l'invention sur lesquels sont fixés un ligand peuvent être utilisés comme réactifs biologiques ou biochimiques, selon les méthodes connues en soi, par exemple pour rechercher la présence éventuelle du récepteur ou d'un partenaire du ligand dans une solution ou dans un fluide biologique à examiner. Par exemple lorsque le ligand est un anticorps, notamment un anticorps monoclonal, les réactifs de l'invention permettent de détecter la présence de l'antigène correspondant selon les méthodes connues de sérodiagnostic. Parmi les anticorps susceptibles d'être fixés sur le réactif, on citera en particulier les anticorps spécifiques reconnaissant des antigènes correspondant,des états pathogènes, et notamment les anticorps anti-PDF, anti-mnéingocoque A, anti-méningocoque B, etc... Lorsque le réactif est sous forme de microbilles, la présence du partenaire du ligand se traduit par une agglutination. Dans les autres cas, on révèle la présence du partenaire à l'aide de réactifs marqués, par exemple fluorescents ou radioactifs, selon les méthodes usuelles. On va maintenant décrire plus en détail la réalisation de réactifs selon l'invention, en faisant référence plus spécialement à l'obtention de réactifs de polystyrène portant des bras espaceurs hydrophiles du type polyoxyalkylène, les réactifs étant en particulier sous forme de microbilles. Les spécialistes comprendront toutefois que le réactif de l'invention peut également être préparé sous la forme de billes, de bandelettes ou de disques, y compris sous la forme de disques constituant des plaques de mitcrotitration, et que d'autres matériaux hydrophobes, ainsi que d'autres bras hydrophiles, peuvent tre utilisés. Pour réaliser ces réactifs, il convient d'abord de préparer le monomére à cha!ne hydrophile. Pour cela, on peut partir d'un dérivé du styrène capable de réagir avec les alcools primaires, par exemple un halogénométhylstyrène tel que le chlorométhylstyrène ou le bromométhyl- styrène (isomère méta ou para, ou mélange d'isomères méta et pard. Ces dérivés du styrène peuvent réagir avec un polyalkylèneglycol en milieu basique pour former un monomère à chatne hydrophile selon la réaction suivante: CH2=CH-C6H4-CH2Cl+H- (OAlk) -OH------> 2 642 n CH2=CH-C6 H4-CH2(OAlk)n OH + HCl Composé (1) On voit que le composé (1) est un cas particulier des composés de formule XII. En réalité, dans le milieu basique (hydroxyde de sodium ou de potassium) il ne se formea pas d'acide chlorhydrique mais le sel alcalin correspondant. Dans la réaction ci-dessus, Alk représente un groupement éthylène, et n est un nombre au moins égal à 2, pouvant varier par exemple de 2 à 30. Le composé (1) formé est copolymérisable avec le styrène. -10- 2534023 La réaction d'oxydation de l'alcool primaire terminal du composé (1) est effectuée selon les méthodes connues. On utilise en particulier une méthode d'oxydation mettant en oeuvre le diméthylsulfoxyde (DMSO) activé. Cette technique, très employée pour l'oxydation des alcools en dérivés carbonylés, implique l'attaque du DMSO par un dérivé électrophile pour donner un complexe DMSO "activé": (CH3)2S±0-+ E ---> (CH3)2-S+ -O-E, E représente le dérivé électrophile. L'attaque par un nucléophile, dans le cas présent un alcool primaire du type R'CH2OH, R' étant le reste de la molécule d'alcool primaire, est alors facilitée: (CH3)2S -O-E + HO-CH2-R' ----> (CE3)2S -O-CH2-R'+OE 3 2 2 (C3)2 2 L'action d'une base sur l'alkoxysulfoxonium formé donne le composé carbonylé selon la réaction: (CH3)2S -O-CH2-R'+ base ----> CH3-S-CH3 + O = CH-R'. Les agents électrophiles qui activent le DMSO sont relativement nombreux. On peut citer par exemple l'anhydride trifluoroacétique, l'anhydride acétique, le chlorure de benzoyle, le chlorure d'oxalyle, les carbodiimides tels que la dicyclohexylcarbodiimide (DCC), etc... La base utilisée est par exemple une amine tertiaire telle que la triétylamine. Les réactions d'oxydation des alcools primaires avec le DMSO activé sont décrites par exemple dans les documents suivants: A.J. MANCUSO et al., Synthesis, 1981, pp.165-185, et K.E. PFITZNER et al., J.Am.Chem.Soc., 87 (24), 1965, pp.5662-5678. La réaction d'oxydation permet donc d'obtenir le monomère ayant la formule suivante (2): CH2 CH-C6H4-CH2-(OAlk) 1niOCH2-CH-O (2). Lorsque la réaction d'oxydation n'est pas totale, le produit (2) est obtenu en mélange avec le produit (1) de départ. De tels mélanges peuvent être utilisés pour la réaction de copolymérisation ultérieure. De préférence, ces mélanges doivent comporter au moins 25% de produit (2). -11- 2534023 La copolymérisation du produit (2) avec le polystyrène conduit à l'obtention d'un copolymère dont les motifs dérivés de (2) comportent, en position méta ou para, un substituant -CH2-Z-CH-O, Z étant défini comme précédemment. Autrement dit, la réactif obtenu est alors constitué d'un support solide en polystyrène à la surface duquel sont fixées des chaînes latérales -CH2-Z-CH=Q. Lorsqu'on utilise pour la copolymérisation des mélanges de produits (1) et (2), le réactif obtenu est un réactif dont une partie des chadnes latérales auront une terminaison -CH20Hau lieu de -CH=O. Pourréaliser des miciobilles à la surface desquelles sera greffé le bras porté par le monomère (2), on effectue une polymérisation en émulsion avec le monomàre de base, par exemple le'styrène. Puis, avant que la réaction de polymérisation soit terminée, par exemple lorsque 75 à 95% (de préférence 85 à 95%) du monomrre de base sont polymérisés, on ajoute le monomère (2) en quantité suffisante pour obtenir par copolymérisation avec le styrène restant, des microbilles à la surface desquelles sont greffés des bras hydrophiles du type. -(OAlk) n-OCH2-CH=O n-i 2 De préférence, le monomère (2) est ajouté sous le forme d'un mélange avec le monomère de base, tel que le styrène. Le principe des réactions de polymérisation en émulsion est connu an soi. Ce procédé consiste à réaliser une émulsion aqueuse du monomère à l'aide d'un agent tensioactif, et à effectuer la polymérisation par addition d'un générateur de radicaux libres soluble en phase aqueuse. Il se forme une dispersion de particules submicroniques de polymère, appelées latex. Le générateur de radicaux libres peut être un persulfate, par exemple K2S208, ou un dérivé azo hydrosoluble tel que l'acide 4,4'-azobis 4-cyanopentano!que. -- Pour obtenir des particules de latex ayant une bonne homogénéité de dimensions, il convient d'opérer en présence d'une quantité contr8lée d'agent tensioactif. La concentration d'agent tensioactif à utiliser peut être déterminée dans chaque cas par des expériences de routine. Les conditions de polymérisation an émulsion sont décrites par exemple par D.C. BLACKLEY dans "Emulsion Polymerisation", Applied Science Publishers, (1975), et par J.W. VANDERHOFF et al, J. Macromol. Sci.-Chem., A7 (3), pp.667-670 (1973>. Parmi les agents tensioactifs utilisables, on peut citer par exemple les tensioactifs antoniques ou, de préférence, zwitterioniques, en particulier des bgta!nes telles que les sulfob8taines décrites dans le -12- 2634023 brevet US n 4.704.229, et en particulier l'acétyl-4 aza-4 (N,N-diméthyl- octadécyl ammonium)-6 hexane sulfonate. Pour fixer un ligand biologique aminé sur les réactifs obtenus selon l'invention, qui comportent, après déprotection éventuelle, des chaînes latérales à terminaison aldéhyde, on met en contact le réactif avec une solution du ligand. Le groupement aldéhyde agit sur les groupements amines primaires du ligand pour former une base de Schiff que l'on réduit, si désiré, en amine secondaire à l'aide d'un agent réducteur tel qu'un borohydrure ou cyanoborohydrure de métal alcalin ou d'ammonium. Si le ligand comporte d'autres fonctions azotées telles que la fonction guanidine (ou son sel de guanidinium), la condensation avec l'aldéhyde donnera une base de Schiff comportant une fonction iminium susceptible d'être réduite en amine secondaire à l'aide des mêmes agents réducteurs; voir par exemple KING, Biochemistry, Vol.5,3454 (1966), et NAKAYA et al., J.BIOCHEM. Tokyo, 61, 345 (1967). Pour faire réagir le réactif avec le ligand, on opère généralement en solution aqueuse à une température pouvant aller par exemple de 4 à 60 C. La fin de la réaction de couplage avec le ligand est généralement signalée par une stabilisation du signal de lumière diffusée par les particules. Les réactifs contenant le ligand fixé par covalence peuvent être utilisés, par exemple, selon les méthodes connues, dans le domaine de la biologie ou de la biochimie, en particulier dans le domaine du diagnostic médical fondé sur des tests sérologiques, tels que ceux utilisant la formation de complexes antigène-anticorps. Lorsque le ligand fixé est une enzyme, le réactif peut être employé comme catalyseur dans les réactions biologiques, chimiques ou biochimiques catalysées par cette enzyme. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. -13- 2534023 EXEMPLE 1: Préparation du monomère à chatne hydrophile terminée par une fonction alcool primaire. a) Préparation d'un monomère avec chatne hydrophile de masse molaire moyenne Mn = 600 terminée par une fonction alcool primaire On sèche 0,29 mole de polyéthylèneglycol ayant une masse molaire moyenne de 600 (PEG 600) par entraînement azéotropique de l'eau par le benzène (point d'ébullition de l'azéotrope = 69 C) ou le toluène (point diébullition de l'azéotrope - 85 C). Dans un tricol, on place 0,275 mole (11g) de NaOH et 0,25 mole (150 g) de PEG 600 séché. On agite jusqu'à complète disparition de la soude. La température est amenée à 40 C et on ajoute goutte à goutte 0,3 mole de chlorométhylstyrène (42,3 ml, mélange d'isomères 40% para et 60% méta). La température est maintenue à 40'C maximum pendant 18 heures. La solution est diluée dans du chloroforme, filtrée pour éliminer le sel formé (NaCl), lavée successivement par une solution d'acide chlorhydrique à 1,5 % (500ml), puis à l'eau distillée jusqu'à pH neutre, séchée par du sulfate de sodium anhydre et filtrée. Après évaporation du solvant, le produit est lavé par l'heptane afin d'éliminer le chlorométhylstyrène résiduel. L'heptane est éliminé par évaporation et le produit final (rendement 80%; Mn = 716) est caractérise par H - RMN et spectroscopie infrarouge. Il peut 9tre stocké à -20 Cpendant plusieurs mois. Dans le mode opératoire ci-dessus, on peut remplacer la soude par de la potasse (0,275 mole, 15,4 g), le chloroforme par le dichlorométhane ou le benzène, et l'heptane par l'hexane ou le pentane. Le produit.final est appelé le VOE 600. b) Préparation de monomères analogues à ceux de l'exemple la, avec d'autres chaTnes hydrophiles de masse moyenne Mn inférieure à 600. Selon une méthode analogue à celle décrite à l'exemple la, on sèche 0,29 mole de PEG dont les masses moyennes sont: 106, 200, 300 et 400 respectivement. Les conditions de couplage et de purification sont semblables à celles de l'exemple la. On obtient les produits finals suivants: VOE 106 (Mn - 222), VOE (Mn 316), VOE 300 (Mn '= 416) et VOE 400 (Mn 516) que l'on caractérise par 1H - RMN et spectroscopie infrarouge. Les VOE 106 et VOE 200 ne sont pas lavés par l'heptane car ils sont solubles dans ce solvant ou les analogues (hexane, pentane). Le chlorométhylstyrène résiduel est éliminé dans ces cas par évaporation à 50 C sous pression réduite (0,5 mm Hg, soit environ 65 Pa). -14- 2534023 c) Préparation de monomères analogues à ceux de l'exemple la, avec chatne hydrophile de masse moyenne Mn supérieure à 600. A la différence des précédents, les PEG de masse supérieure à 600 (1.000, 1.500...) sont solide à température ambiante. Le PEG 1.500 est séché comme décrit dans l'exemple la. On place 0,133 mole de PEG 1.500 (200g) dans une ampoule de coulée à double enveloppe thermostatée à 50 C, montée sur un tricol chauffé à 50 C et contenant 0,147 mole d'hydrure de sodium (4,224 g de NaH avec 10% de paraffine) dans 100 ml de tétrahydrofuranne (THF) sec, fratchement distillé. Le PEG 1.500 est ajouté goutte à goutte, de manière à éviter un trop fort dégagement d'hydrogène. Après 18 heures d'agitation, on ajoute 0,16 mole (22,55 ml) de chlorométhylstyrène et l'agitation est maintenue pendant 24 heures à 50 C. Le mélange est dilué dans le THF et filtré à chaud. On ajoute de l'héptane au filtrat, jusqu'à fin de précipitation. On filtre. Le précipité est repris dans le THF et reprécipité plusieurs fois. Après évaporation du solvant, le produit est caractérisé comme précédemment (VOE 1.500, Mn = 1.616). On peut remplacer le PEG 1.500 par d'autres PEG de masses supérieures à 600, et obtenir les macromères correspondants selon le même principe. EXEMPLE 2: Préparation de monomères à chatne hydrophile terminée par une fonction aldéhyde. EXEMPLE 2.1: Oxydation par le complexe DMSO/Anhydride Acétique a) Oxydation du VOE 600 On ajoute 7ml d'anhydride acétique à 198 g de diméthylsulfoxyde. On agite pendant 30 minutes à température ambiante. On ajoute 0,021 mole (15,4 g) du monomère obtenu à l'exemple la et on maintient l'agitation pendant 40 heures. b) Oxydation selon le même procédé, des monomères obtenus aux exemples lb et lc On obtient de la même manière, les monomères analogues à ceux décrits aux exemples lb et lc porteurs d'un groupement aldéhyde terminal. -15- 2534023 EXEMPLE 2.2:Autre préparation des monomères à chaîne hydrophile terminée par une fonction aldéhyde a) Oxydation du VOE 600 A 60mmoles de diméthylsulfoxyde (4,255ml dans 25ml de CH2Cl2) préalablement séché sur alumine basique, on ajoute lentement, à -60"C, mmoles de chlorure d'oxalyle (4,8ml dans 125ml de CH2C12). Après 10 minutes d'agitation on ajoute 50mmoles du produit de l'exemple la en solution dans 50ml de CH2C12, de façon à ne pas dépasser la température de -60 C, et on maintient l'agitation pendant 15 minutes. On ajoute alors 250 =moles (35ml) de triéthylamine. On laisse remonter la température à 20"C et ajoute 150ml d'eau distillée. On sépare la phase aqueuse. La phase organiqueest lavée Successivement par 200mi d'eau distillée, par une solution saturée en chlorure de sodium, par une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 1%, à nouveau par l'eau distillée, par une solution à 5Z de K2CO0, et enfin à l'eau distillée. Après séchage et évaporation du solvant, le produit est caractérisé en EIH-RMN et infrarouge. b) Oxydation selon le même procédé, des monomères obtenus à l'exemple lb. On obtient selon le mime procédé, les monomères à groupement terminal aldéhyde analogues des VOE 106, VOE 200, VOE 300 et VOE 400. EXEMPLE 2.3: Autre préparation du monomère de l'exemple 2.1 -) Oxydation du VOE 600 On ajoute 6,19g (30mmoles) de dicyclohexylcarbodiimide à 15ml de diméthylsulfoxyde (210 moles). On agite pendant 2 heures, puis ajoute 10 mmoles du produit de l'exemple la. Après 5 minutes d'agitation on ajoute 5 mmoles d'acide phosphorique. La solution est agitée pendant 24 heures puis filtrée afin d'éliminer le précipité de dicyclohexylurée formé. Le résidu est repris dans le chlorure de méthylène et lavé plusieurs fois à l'eau. Le solvant est éliminé et le résidu est repris dans l'acétone. On filtre plusieurs fois jusqu'à ne plus obtenir de cristaux de dicyclohexylurée. La fonction aldéhyde est caractérisée en infrarouge (C=O à 1710 cm i) et en 1H-RMN (pic à 9,9-10 ppm). -16- 2634023 b) Oxydation selon le même procédé, des monomères obtenus à l'exemple lb. On obtient selon le même procédé, les analogues à groupement terminal aldéhyde des monomères VOE 106, VOE 200, VOE 300 et VOE 400. c) Oxydation selon le même procédé, des monomères obtenus à l'exemple Ic On obtient selon le même procédé, les analogues à groupement terminal aldéhyde des monomères VOE 1.000, VOE 1.500 et de masses supérieures, à la différence que le résidu est repris dans le THF, filtré à chaud et précipité plusieurs fois à l'heptane, l'hexane ou le pentane. EXEMPLE 3: Synthèse de particules de latex comportant des chaines latérales hydrophiles à groupement aldéhyde terminal EXEMPLE 3.1: Synthèse de particules de latex comportant des chatnes hydrophiles provenant du produit décrit dans l'exemple 2.1a. A 826g d'eau distillée dégazée on ajoute 0,1g d'acétyl-4 aza-4 (N,Ndiméthyloctadécyl ammonium)-6 hexane sulfonate (tensioactif) et 0,3g d'hydrogénocarbonate de sodium. On agite pendant 45 minutes à 70 C sous courant d'azote puis ajoute 104,15g de styrène. Après agitation à 70 C pendant 60 minutes, on ajoute 0,7g de persulfate de potassium (initiateur) et on maintient l'agitation à 70 C pendant 3 heures. On ajoute alors 25g d'un mélange 50/50, en poids, de styrène et du produit de l'exemple 2.1a, ainsi qu'une nouvelle quantité (0,2g) d'initiateur. On maintient l'agitation à 70OC pendant 12 heures. On obtient ainsi des microsphères calibrées d'un copolymère poly (styrène/VOE 600 oxydé) portant des chaTnes hydrophiles terminées par une fonction aldéhyde (densité surfacique moyenne de chatnes: 3,3/nm2). Les particules sont caractérisées par mesure de diffusion de la lumière et par microscopie électronique. Ces particules ont des tailles comprises entre 250 et 350nm, avec un très faible indice de polydispersité (inférieur à 1,005). La présence des chatnes latérales hydrophiles à la surface du latex est mise en évidence par analyse infrarouge et par analyse ESCA. La présence d'aldéhyde est mise en évidence par une coloration rose obtenue par le réactif de Schiff spécifique des aldéhydes. Le nombre moyen de chaînes latérales hydrophiles par particule peut être déterminé par réaction avec une molécule aminée radioactive (par -17- 2634023 14 exemple 5I-triiodothyronine, I4C-éthanolamine, immunoglobuline marquée à l'iode 125). b) Selon le même procédé, on prépare des particules de latex de polystyrène calibrées portant en surface des chaînes hydrophiles terminées par une fonction aldéhyde, de densité surfacique moyenne: 1,6 chatne/nm2, an remplaçant le mélange 50/50 par un mélange 75/25 (en poids) de styrène et du produit de l'exemple 2.1a. c) Selon le mime procédé, on prépare des particules de latex de polystyrène calibrées, portant en surface des chaTnes hydrophiles terminées par une fonction aldéhyde, de densité surfacique moyenne = 0,8 chatne/nm2, en utilisant 25g d'un mélange 87,5/12,5 (en poids) de styrène et du produit de l'exemple 2.1a. * d) Selon le m9me procédé, on prépare des particules de latex de polystyrène, calibrées, portant en surface des chaînes hydrophiles terminées par une fonction aldéhyde, de densité surfacique moyenne= 0,3 chaine/nm2 en utilisant 25g d'un mélange 95/5 (en poids) de styrène et du produit de l'exemple 2.1a. EXEMPLE 3.2: Synthèse de latex comportait des chaînes latérales hydrophiles provenant des produits décrits dans l'exemple 2.lb a) On obtient selon un procédé analogue à celui décrit dans l'exemple 3.1a des latex correspondants, portant des chalnes hydrophiles à groupement terminal aldéhyde sous la forme de particules calibrées de copolymères poly (styrène/VOE 106), poly(styrène/VOE 200), poly(styrène/VOE 300) et poly(styrène/VOE 400), de densité surfacique moyenne environ 3,3 chaînes hydrophiles/nm2, en ajoutant respectivement, au stade final, 25g d'un des mélanges suivants: :Sty (g): VOE x(g): : poly (sty / VOE 106): 21,1: 3,9: : poly (sty / VOE 200): 19,5: 5,5: : poly (sty / VOE 300): 17,7: 7,3: : poly (sty / VOE 400): 16: 9: Sty est l'abréviation de styrène. -: sueATns ssuuflu sap unp 2 Sz 'ITîu apips nB luumaATeadsa= eugnopB ua 'uo.tAua zmu/aTqdoipXq auleqa ú'0:auuaXom anbtaeans paisuap ap (00 9oA/aua/LC s)XTod a (00E SoA/UaXuaas)úI d '(0oZ SoA/auailjs)XIod '(90î3o aua.Ls)wIod saamiLodoD ap sapzqTlai sainallavd ap amuo; snos 4apXqgpwl IUutmlal quemadnoa2 e stallqdoapúq seulvq sap queliod 'squvpuodseizoz xail sap Pl-g aldmaxaT suBp Twiap TnIaz B engolBuî appaoad un uolas zlIaTzqo uo : 'Z: L' ZZ: (00o 20A / 4s) Xlod: : 8'I: Z'8Z: (00E MOA / iCs) lod: : '1c: 9'gZ: (OOZ MOA / Ks) XIod: : I: Z: (901 0A / 4s) k0od: :()x 30A: (2) &S: : siuAfns sagul[am sap unp 2 çz 'IUT; apvps nu quamaATiadsai IuBnojB ua 'uoiTAue zmu/ aITqdoipAq auleqi 8'0 = auuaXom anbTzD;Lns aisuap ap (00o SOA/aua'XZs)Xlod la (00 MOA/UaaXzS)XIOd '(0OZ jOA/aua.aLs)XIod '(90IooA/auaaL&s)Xlod saiamklodoz ap saaaqtIa saInDTIavd ap auuo; ur snos 'apKqppI IBuTmael juamadnozZ v saITqdoapXq $saulsq sap iuviaod 'siuvpuodsaaoz xalI sep il- aldmaxafl ap jnIaD g anSoleu apppoad un uolas luatlqo uO (a ç'17 5 Z: (00o SOA / 4s) XIod: : 9'g ú ?'IZ: (00E qOA / 4s) XIod: : 8'Z: Z'ZZ: (OOZ SOA / ks) Xiod Z g: g:(901 30A / 4s) XIod (2)x OA: (3) úS: : susAtns sauelIam sap un1p 2 çZ IvUTj apvis nu '"uamaAIaDedsaa auvino[B ua 'zmu/aITqdoipXq auivqr 9'1 uolaua: anbtpijxns 9aisuap ap (00q aOA/uais)XIod la (00g aOA/auaaXzs?)lod '(ooZ qoà/ausaaús)Klod '(901 ZAO/au aXIs))XIod saIamULIodoD ap sasaqTisa saln2t;izd ap amuoj snos 'apXqapls IîuTmla luamadnoz2 saTiqdoipXq saulvqa sap juvizod 'sluupuodseiazo xaluT sap qv-' aldmaxa1l suep Tziap TnIaa B an2oiuv apppoid un uolas quaTzqo uo (q -19- 2634023 :Sty (g): VOE x(g): : poly (sty / VOE 106): 24,6: 0,4: : poly (sty / VOE 200): 24,5: 0,5: : poly (sty f VOE 300): 24,3: 0,7: : poly (sty/ /VOE 400) : 24,1: 0,9: EXEMPLE 4: Fixation d'anticorps Préparation d'un réactif latex-anticorps anti-PDF L'anticorps anti-produits de dégradation du fibrinogène (anti-PDF) est un anticorps monoclonal de type IgGl produit par BIO MERIEUX S.A. On opère de la façon suivante: 12 mg d'anticorps sont placés en solution dans 18 ml de tampon Tris 0,1M pH 9,0, NaCI 1,25.10-M. On ajoute sous agitation 600 mg (6ml d'une suspension à 10%) du latex (poly(sty/VOE 200) à groupement terminal aldéhyde préparé à l'exemple 3.2c. Après 3 heures d'agitation, le latex est amené à 1% en poids par addition de 36 ml de tampon tris 0,1 M pH 8,2 NaCl 1,25.102 M, albumine 1,67%, azide de sodium 0,167%. Pour caractériser la présence de PDF à l'aide du réactif obtenu, on opère par exemple de la façon suivante: Sur une lame de verre propre et sèche, on dépose 30 pil de sérum à tester et 30pl du réactif. Après mélange des deux gouttes à l'aide d'un bâtonnet en plastique, la lame est agitée par un mouvement de rotation. La présence éventuelle de PDF dans le sérum est révélée par une agglutination visible en moins de deux minutes. Ce réactif détecte des 'quantités aussi faibles que 500ng/ml de produits de dégradation de la fibrine. EXEMPLE 5: Préparation d'un réactif latex-anticorps anti-méningocoque A (dit aiti-Méningo A) L'anticorps utilisé est un anticorps monoclonal de type IgG3 produit par BIO MERIEUX S.A. - Méthode I A 100 mg de latex obtenu à l'exemple 3.2a (poly(styrène/VOE 106)), on ajoute Img d'anticorps anti-Méningo A dans un tampon acide acétique/acétate 0,1M, pH 5,5, NaCl 0,1M, albumine bovine 0,2%. -20- 2534023 Après 5 heures d'agitation, on ajoute lml d'une solution de cyanoborohydrure de sodium 8.10-3M dans un tampon Tris 0,1M pH 8,2, NaCl 0,1M. On agite pendant 18 heures, puis la solution est centrifugée à 10. 000 rpm pendant 20 minutes et le culot de centrifugation est repris par un tampon Tris 0,1M, NaCI 0,1M, albumine bovine 0,5%, azide de sodium 0, 1%, pH 8,2. - Ce réactif détecte des quantités aussi faibles que 10 nanogrammes d'antigène polysaccharidique de Méningo A. Méthode II: A 50mg de latex de l'exemple 3.2c (poly(styrène/VOE 200)), on ajoute 0,5mg d'anticorps antiMéningo A dans un tampon carbonate/bicarbonate 0,1M pH 9,0 NaCl 0,1M contenant 0,1% d'albumine bovine. Après 5 heures d'agitation, on ajoute 0, 5ml d'une solution de borohydrure de sodium 8.10 3M dans un tampon Tris 0,1M, NaCl 0,1M, pH 8,2. Après agitation pendant 18 heures, la solution est centrifugée à 12.500 rpm pendant 15 minutes et reprise dans un tampon Tris 0,1M NaCl 0,1M, albumine 0,5%, azide de sodium 0,1%, pH 8,2. Ce réactif permet de détecter des quantités aussi faibles que 10 nanogrammes d'antigène polysaccharidique de Méningo A. EXEMPLE 6: Préparation d'un réactif latex-anticorps anti-Méningocoque B (dit antiMéningo B) L'anticorps utilisé est un anticorps monoclonal de type IgM, produit par BIO MERIEUX S.A. A 20mg de latex obtenu à l'exemple 3.1c (poly(styrène/VOE 600), on ajoute 800 microgrammes d'anticorps en solution dans un tampon acide acétique/acétate 0,1M, pH 5,5, NaCl 5.10 -2M, albumine bovine 0,3%, azide de sodium 0,1%. On agite pendant 2 heures. Ge réactif détecte des quantités aussi faibles que 10 nanogrammes d'antigène polysaccharidique de Méningo B. -21- 2634023 REVENDICATIONS 1. Réactif caractérisé par le fait qu'il est constitué essentiellement par un support solide, en polymère hydrophobe, à la surface duquel sont fixées par covalence des chaînes latérales hydrophiles de formule I -Z- CHz' (I) Z" It? dans laquelle Z est un bras espaceur organique hydrophile non hydroxylé dont la chaîne comporte de 4 à 70 atomes de carbone, Z' et Z" représentent ensemble =0, un groupement protecteur du groupement carbonyle, ou un + groupement =YL dans lequel Y représente =N- ou =N= et L représente le reste d'un ligand aminé de formule schématique L-NH2 ou L=-NH, ou bien Z" représente H et Z' représente -NH-L, L étant le reste dudit ligand. 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il contient des chaînes latérales de formule I à terminaison =YL ou -NH-L, et qu'il contient également des chaînes latérales de formule I, pour lesquelles Z' et Z" représentent =0, et/ou des chaînes latérales de formule II (II) -Z-CH-Zi Z2 dans laquelle Z est défini comme dans la revendication 1, Z1 représente H et Z2 représente -OH ou -NER, ou bien Z1 et Z2 représentent ensemble le groupement =N-R, R étant un alkyle inférieur,-éventuellement hydroxylé, ayant 1 à 4 atomes de carbone. 3. Réactif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'il contient des chaînes latérales de formule I, avec Z' et Z" représentant ensemble =0, le reste des chaînes latérales présentes sur le réactif étant des chaînes latérales de formule II, avec Z1HE et Z2=OH, étant entendu que lesdites chaînes de formule I représentent au moins 25% de la totalité des chaînés latérales présentes sur le réactif. 4. Réactif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les chaînes latérales de formule I sont telles que Z' et Z" représentent ensemble =0 ou un groupement protecteur du carbonyle. -22- 2634023 5. Réactif selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ledit groupement protecteur est un groupement acétal, oxazine ou oxazoline. 6. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que la densité de la totalité des chaînes latérales de formule I et II, rapportée à la surface du réactif, est de 10-5 à -10 2 1010 mole/m environ. 7. Réactif selon la revendication 6, caractérisé par le fait que ladite densité est de 10-5 à 10-7 mole/m2 environ. 8. Réactif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que Z est un groupement polyoxyéthyléné comportant au moins 2 motifs oxyéthylène. 9. Réactif selon la revendication 8, caractérisé par le fait que Z représente -(OCH2CH2)n OCH2- ou -(OCH2CH2)nO -(CH2)b, n étant un membre au moins égal à 2 et b étant égal à 1 ou 2. 10. Réactif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit polymère hydrophobe est choisi dans le groupe constitué par le polystyrène, le polyvinyl toluène, le polypropylène, le chlorure de polyvinyle, le chlorure de polyvinylidène, et leur copolymères. 11. Réactif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit polymère hydrophobe est le polystyrène et que lesdites chaînes latérales sont des chaînes -CH2-Z-CHZ'(Z") et éventuellement -CH2-Z-CHZ1(Z2), Z, Z' et Z" étant définis comme dans la revendication 1, et Z1 et Z2 étant définis comme dans la revendication 2. 12. Réactif selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 6 à 11, caractérisé par le fait qu'il contient des chaînes latérales à terminaison =YL ou -NH-L, Y étant défini comme dans la revendication l et L étant le reste d'un ligand aminé choisi parmi les protéines, en particulier les anticorps, les antigènes, les haptènes, les hormones peptidiques, les enzymes ou encore les oligonucléotides, les lectines, les neurotransmetteurs ou les drogues naturelles ou synthétiques agonistes ou antagonistes d'un neurotransmetteur. - 13. Réactif selon la revendication 12, caractérisé par le fait que ledit anticorps est un anticorps spécifique reconnaissant des antigènes correspondant à des états pathogènes. -23- 2634023 14. Réactif selon la revendication 10, caractérisé par le fait que ledit anticorps est choisi dans le groupe constitué par les anticorps antiproduits de dégradation du fibrinogène, les anticorps anti-méningocoque A et les anticorps anti-méningocoque B. 15. Réactif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il se présente sous la forme de billes. 16. Réactif selon la revendication 15, caractérisé par le fait qu'il seprésente sous la forme de microbilles ayant des dimensions pouvant aller de 0,2 à-1 micromètre environ. 17, Réactif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les chatnes latérales de formule I sont rattachées au polymère hydrophobe par l'intermédiaire d'un groupement -CE 4MM (Ar) -CE C2} a. 2 o Ar est un groupement m- ou p- phénylène éventuellement substitué par un groupement méthyle, a est un nombre égal à 0 ou 1, et X1 représente H ou CH3. 18. Procédé de préparation d'un réactif tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on prépare ledit support solide par polymérisation ou copolymérisation d'un ou plusieurs monomères insaturés hydrophobes, selon les méthodes de polymérisation usuelles, et qu'avant la fin de la polymérisation, on ajoute au milieu réactionnel un monomère à chaîne hydrophile dont une extrémité comporte une double liaison copolymérisable avec lesdits monomères insaturés hydrophobeset dont l'autre extrémité comporte un groupement terminal de formule -Z-CHZ3(Z4), dans laquelle Z (constituant la chaTne hydrophile) est défini co=mme dans la revendication 1, et Zs et Z4 représentent 0 ou un groupement protecteur du carbonyle, ledit monomère hydrophile étant éventuellement en mélange avec un monomère hydrophile analogue à groupement terminal -Z-CH20H, que, dans le cas o Zs et Z4 représentent un groupement protecteur du carbonyle, on effectue une réaction de déprotection, que, si désiré, on fait réagir le réactif obtenu, qui comporte des chaTnes latérales de formule III: -Z-CH=O (III) avec un ligand aminé, selon les méthodes connues, pour obtenir un réactif correspondant dans lequel une partie des chatnes latérales répondent à la formule IV: -Z-CHY'L (IV) dans laquelle Z est défini comme précédemment, Y' représente un groupement -N- lié par sa double liaison au groupement CH, ou Y' représente un -24- 2634023 + groupement =N=, et L représente le reste de la molécule de ligand, que, si désiré, on fait réagir le réactif obtenu avec une amine primaire de formule RNH2, R étant un alkyle inférieur éventuellement hydroxylé ayant 1 à 4 atomes de carbone, de façon à transformer les chaînes latérales -ZCH=O, qui n'ont pas réagi avec le ligand, en chaÂnes correspondantes de formule V: -Z-CH=N-R (V), et que, dans le cas o le réactif comporte des chaînes latérales de formule IV et éventuellement de formule V, on soumet, si désiré, le réactif obtenu à l'action d'un agent réducteur capable de réduire les groupements imine ou imminium, pour obtenir un réactif correspondant comportant des chaînes latérales de formule VI: -Z-CH2-NH-L (VI) et le cas échéant des chaines latérales de formule VII: - Z - CH2-NH-R (VII). 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé par le fait que, pour préparer un réactif sous forme de microbilles, on effectue la polymérisation selon la technique de polymérisation en émulsion. 20. Procédé selon la revendication 18 ou 19, caractérisé par le fait que l'on utilise un monomère hydrophile de formule IX: CH2=C-(Ar) a-CH27Z-CHZ3s 1 C(IX) X1 Z4 x1 z4 dans laquelle Z, Z3 et Z4 sont définis comme dans la revendication 18 et Ar, X1 et a sont définis comme dans la revendication 17. 21. Utilisation d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée par le fait que: a) dans le cas o le réactif ne comporte pas de chaînes latérales de formule I à terminaison =YL ou -NH-L, on met en contact le réactif, comportant des chatnes latérales à terminaison aldéhyde, avec une solution d'un ligand aminé pour obtenir un réactif comportant des chatnes latérales de formule IV: -25- -25- *2634023 -Z-CHY'L (IV) dans laquelle Z et L sont définis comme dans la revendication 1, et Y' est défini comme dans la revendication 18 que, si désiré, on neutralise les groupements aldéhyde restants, sur les chatnes latérales qui n'ont pas réagi avec le ligand, par réaction avec une amine primaire R-NH2, R étant défini comme dans la revendication 2, et que, si désiré, on soumet le réactif obtenu à l'action d'un agent réducteur capable de réduire les groupements imine ou iminium en groupements amine correspondant; et/ou b) à-l'aide du réactif contenant des chatnes latérales à terminaison -YL ou NH-L, L, Y et L étant définis comme dans la revendication 1, on recherche; selon les méthodes connues en soi, la présence éventuelle du récepteur ou d'un partenaire dudit ligand dans une solution ou dans un fluide biologique à examiner; -ou c) lorsque le ligand fixé sur le réactif est une enzyme, on utilise ledit réactif comme catalyseur dans les réactions biologiques, chimiques ou biochimiques catalysées par ladite enzyme.