Brevet FR2624342A1 — publié le 19890616

La présente invention concerne la lutte contre certains virus et notamment le virus de la mosaique du con- combre ou V.M.C. Le V.M.C. est un virus à ARN monocaténaireà nucléo- capside icosaédrique et non enveloppé. Ce virus est connu pour infec- ter plus de huit cents espèces végétales représentant pra- tiquement toutes les familles botaniques. Les problèmes, notamment économiques, engendrés par ces infestations n'ont pu être résolus à l'heure actuel- le; dans plus de 95 % des cas, en effet, il n'existe aucun moyen de lutte efficace contre le V.M.C. - En premier lieu, il existe très peu de plantes qui résistent naturellement à ce virus et qui permettraient par croisement, l'introduction d'une résistance efficace dans la majorité des plantes cultivées. Par conséquent, aucun moyen de lutte génétique n'est, à priori, envisageable. En second lieu, les pucerons transmettent la ma- ladie à grande échelle, selon un mode de transmission non persistant: par simple piqûre sur une plante malade, le V.M.C. est prélevé puis peut être retransmis directement à une autre plante, sans latence chez l'insecte. Ces infestations se produisent, non seulement à grande échelle, mais aussi chez de nombreuses plantes,- qu'elles soient sauvages ou cultivées et pendant toutes les saisons de l'année. Par conséquent, les procédés de désher- bage local ou d'élimination de plantes atteintes sont dé- risoires et ne pourraient conduire à une éradication de la maladie que s'ils étaient accompagnés d'un anéantissement total des pucerons. Ce qui est impossible. Certaines sou- ches de virus contiennent un composant ARN surnuméraire - 1i'ARNT satellite - qui se comporte comme un réel parasite du virus. Sa présence se traduit par une forte diminution de la teneur du virus et, par voie de conséquence, de la gravité des symptômes développés par l'hôte infecté. Un seul moyen de lutte efficace contre le V.M.C. consisterait à utiliser certaines molécules d'ARN satellite. Certains auteurs ont tenté d'infecter la plante simultanément par le virus pathogène et par l'ARN satellite dans le but de créer une tolérance audit virus. Une telle tentative est efficace mais très dangereuse du point de vue écologique, compte tenu des grandes capacités de mu- tation des souches virales. Le danger résulte de la dissé- mination des souches virales éventuellement mutées, indé- pendamment des molécules d'ARN satellites. On en arrive donc à une propagation provoquée de la maladie. Cette mé- thode n'est donc pas applicable à grande échelle. D'autres auteurs ont proposé la création de plan- tes transgéniques, à savoir des plantes dont le génome com- porte non seulement l'informatior nécessaire à l'expression du virus mais aussi celle permettant l'expression d'un fac- teur limitant la synthèse dudit virus. C'est ainsi que P.P. Abel et al. ("Delay of Disease Development in Transge- nic Plants That Express the Tobacco Mosaic Virus Coat Protein Gene", science, vol. 232, 9 Mai 1986) ont réussi à intro- duire un gène codant pour la protéine d'enveloppe du virus de la mosaique de tabac (VMT) dans le génome de plantes sensibles au VMT. Cette manipulation génétique a permis de créer un retard du développement de la maladie chez les plantes transgéniques ont été rendues tolérantes au virus de la mosaique de la luzerne par introduction d'un gène codant pour la protéine capsidique virale (R.P. Van Dun et al. "Expression of alfalfa Ysaic Virus and Tobacco Rattle Virus Coat- Protein Genes in Transgenic Tobacco Plants" virology 159, 299-305 (1987)) (L.S. Loesch-Fries et al., "expression of alfalfa mosaic virus RNA 4 in transgenic plants confers virus resistance", the EMEO Journal, vol 6, N 7 page 1845- 1851, 1987) (N.E. Tumer et al, "Expression of alfalfa mosaic virus coat protein gene confers cross protection in transge- nic tobacco and tomato plants", the EMBO Journal, vol. 6, N0 5 page 1181-1188, 1987). D'autres laboratoires enfin ont créé des plantes trans- géniques exprimant des gènes codant pour des ARN satellites. Cette stratégie a été adoptée par L.Gerlach et al. (1987) pour le virus des taches annulaires du tabac ("Construction of a plant disease résistance gene from the satellite R.NA of tobacco ringspot virus", Nature, Vol. 328, 27 AOUT 1987),et, pour le VMC, par C. Baulcombe et al ("Expression of biologically active viral satellite RNA from the nuclear genome of transformed plants", Nature, Vol. 321, 22 MAI 1986) et par D. Harrison et al(1987). ("Virus resistance in transgenic plants that express cucum- ber mosaic virus satellite RNA, nature, Vol. 328, 27 AOUT 1987). Ces auteurs ont, cependant, effectué des manipula- tions très complexes pour pouvoir intégrer un tel génome dans la mesure o ils se sont basés sur des hypothèses pré- disant qu'un ARN transcrit comportant la forme monomérique de l'ARN satellite ne serait pas répliquée efficacement par le virus. - Ces hypothèses sont basées sur la faible infectivi- té des formes monomériques des cADN de viroides ou ARN satel- lites dont on sait par ailleurs qu'ils se répliquent via des formes multimériques. C'est pourquoi ces auteurs ont construit des gènes codant pour des formes oligomériques de l'ARN: 3 copies pour Gerlach et al. (1987) et 1,3 ou 2,3 copies pour Harison et al. (1987) ou Baulcombe et al. (1986). Or les constructions de formes oligomériques re- lèvent d'une démarche complexe et longue. Une telle straté- gie ne peut donc pas être-envisagée pour exprimer un grand nombre de molécules différentes. Pourtant, cette situation se présentera nécessairement pour créer des variants de sa- tellites désarmés dont la dissémination entre plantes ne sera plus possible et qui ne pourront pas, par simple muta- tion, donner naissance à des molécules possédant des carac- tères néfastes pour un hâte particulier (nécrose de la to- mate). De plus, il est généralement admis que des sé- quences étrangères, ou les reliquats de constructions géné- tiques, placés aux extrêmités des molécules d'ARN viral peuvent affecter la réplication dudit ARN. Par conséquent, les nécessaires étapes de coupure, ligation et purification lors des constructions génétiques réalisées par ces auteurs, compliquent et rallongent considérablement le processus de préparation des plantes transgéniques. C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé simple et rapide permettant la création de plantes transgéniques, rendues tolérantes,de façon durable, aux phytovirus par l'intégration dans leur génome d'une in- formation génétique codant pour l'expression de molécules d'acide nucléique satellite. La simplicité du procédé selon la présente invention résulte notamment du fait que la séquence d'ADN codant pour l'expression de l'acide nucléique satellite est introduite dans le génome sous la forme d'une seule unité monomérique et que, en outre, cette unité mono- mérique possède, de préférence, à ses deux extrémités, des résidus de séquences étrangères, tels que les séquences poly (A) et/ou dG/dC, ou même des résidus de plasmides. Ainsi, la présente invention va à l'encontre des préjugés communément admis selon lesquels une unité mono- mérique ou la présence de molécules étrangères s'opposent à l'infectivité de molécules satellites. De préférence selon l'invention, les molécules satellites exprimées, sont des molécules d'ARN satellite. L'information génétique codant pour l'expression de cet ARN satellite est, de préférence, introduite dans le génome des plantes, sous la forme d'une molécule de cADN transcrit re- verse de l'ARN satellite. Ainsi, par exemple, on sait qu'il existe au moins deux groupes d'ARr satellites pouvant provoquer chez la tomate soit une atténuation des symptômes de filiformisme induits par le VMC (ARN "non nécrotique" (R)), soit le dé- veloppement de nécrose létale (10-12) (ARN "nécrotique" (I 17 N)). Indépendanmment de leurszcaractéristiques biolo- giques (nécrotiques et non nécrotiques), les formes monomé- riques des cADN présentent les mêmes activités biologiques et peuvent être utilisées pour les mêmes fins par la présente invention. Les ARN satellites appartenant à ces deux groupes ont été séquences (13-17) et partagent un important degré d'homologie excepté pour un. type japonais qui diffère dans sa région centrale (18). Aucune relation simple ne pouvant être établie entre la séquence nucléotidique des ARN satellites et leur fonction biologique, on a cloné et séquencé les ADN complé- mentaires satellites des deux ARN satellites isolés. Or, il s'est avéré que ces ADN complémentaires satellites sont in- fectieux, c'est-à-dire, qu'ils produisent après co-inoculation avec un génome helper, un ARN capable de réplication et pos- sédant les propriétés biologiques de l'ARN satellite natif. L'efficacité de l'ADN complémentaire dépend: - de sa forme dans l'inoculum (plasmide circulaire ou linéaire ou ADN complémentaire excisé), - de la forme du virus helper (APN viral ou virions). De préférence selon l'invention, le virus utilisé est le virus de la mosaique du concombre (VMC) mais de nom- breux virus peuvent être utilisés à condition qu'un ARN ou ADN satellite puissent leur être associés. Les vecteurs utilises par les constructions génétiques nécessaires au procédé de la présente invention peuvent être quelconques. De préférence, on utilise Agrobacteriumrhizoqenes ou Agrobacterium tumrefaciens. De même, comme on le verra dans la partie exemplifiée ci-après, les techniques utiles aux préparations des vecteurs sont connues de l'homme de l'art, et se caractérisent par leur simplicité. La présente invention est exemplifiée ci-après à l'aide des figures suivantes: La figure 1 représente la comparaison des séquences de cADNs satellites ú17 N, R et D. 4 copies de cADN de longueur totale de l'ARN satel- lite I 17 N ont été séquencées parmi elles, trois sont re- présentées par la séquence I 17 N (1) et l'une par la séquçnce I 17 N (2). R (1) et (2) correspondent à deux copies diffé- rentes de l'ARN satellite R. R (1) est une copie partielle s'allongeant à partir du résidu 28 jusque l'extrêmité 3'. R (3) est un clone recombinant construit à partir des clones (1) et (2) digéré par Sca I (la position de ce site à l'in- térieur de la séquence est soulignée) et porte l'extrémité 3' du cADN du clone (1) et l'extrémité 5' du cADN du clone (2). La séquence D, déduite de la séquence connue d'ARN (13) est utilisée à titre de référence. Une ligne horizontale si- gnifie aucun changement alors qu'une ligne interrompue indi- que une déletion. Les substitutions de base sont représentées par les lettres correspondantes. La figure 2 représente l'analyse de l'ARN produit après infection avec un inoculum comportant un cADN I 17 N. 2A correspond à l'électrophoregramme de l'ARN ex- trait à partir des nucléoprotéines récupérées et analysé dans un gel de polyacrylamide à 2,4 %. 2B correspond à l'analyse d'un ARN satellite par chro- matographie sur oligo (dT) cellulose. Les différentes fractions d'ARN ont subi une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 5 % dans l'urée 8 M. Ligne1: ARN viral total. Ligne2: 5ème composant purifié sur un gradient de saccharo- se. Lige_: fraction non retenue sur oligo (dT) cellulose. Line4: ARN satellite natif. La figure 3 représente des tabacs. Les tabacs témoins sont représentés sur la figure 3B. Les tabacs avec cADN satellite sont représentés sur la figure 3A. Sur ces deux figures, la feuille de gauche corres- pond à la tige inoculée, la feuille de droite correspond à la tige non inoculée. La figure 4 représente l'expression du précurseur de l'ARN satellite dans les tabac/362 et sa maturation après inoculation par le VMC. Sur cette figure, les électrophorèses réalisées mon- trent que: - avant l'inoculation du VMC, le transcrit, corres- pondant au précurseur de l'ARN satellite, possède environ 950 nucléotides (soit approximativement 1 kb). - Apres l'inoculation du VMC, le transcrit a subi une maturation et correspond à l'ARN satellite, il possède environ 335 nucléotides. La figure 5 représente la structure de l'ADN insé- ré dans les vecteurs d'expression pour créer des gènes co- dant pour des précurseurs d'ARN satellites. On compare la structure du pMARSAT 36 avec les vecteurs utilisés par Baulcombe et al. (1986) et Harrison et al. (1987) soit pT 104 et pT 105. Sur cette figure "nt" correspond à "nucléotides". Les 108 nt des vecteurs pT 104 et pT 105 proviennent de l'extrêmité 3' de l'ARN satellite. Le vecteur pMARSAT 36 est notamment caractérisé par les queues homopolymériques suivantes: 20 résidus C (C), 18 résidus A (A18) et 27 résidus G (G27). EXEMPLE A - MATERIEL ET METHODES 1 - Souches de virus La souche VMC I 17 N ne possède pas d'ARN satellite et induit chez la tomate de graves symptômes de filiformisme. La souche VMC I 17 N contient un ARN satellite "nécrotique" alors que la souche VMC R contient un satellite"non nécroti- que. Les purifications des virions, ARN viraux, ARN satelli- tes et electrophrorèse sur les gels de polyacrylamide à 2,4 % ont été décrits antérieurement (10). 2 - L'ARN satellite de la souche de VMC r 17 N a été isolé, pu_ oladenle d son extrémité 3'. Puis le cADN cor- respondant a été synthétisé. La polyadénylation d'ARN satellite a été effectuée dans un volume réactionnel de 100 il contenant 50 mM de Tris- Hcl (pH 7,9), 10 mM de MgCl2, 250 mM de NaCl, 2,5 mM de MnCl2, 0,25 mM d'ATP, 40 unités de RNasin, 45 pmoles d'ARN, 1,5 uni- tés de E. coli poly (A) polymérase pendant 10 min à 37 C. La synthèse du premier brin d'ADN a été réalisée selon la mé- thode de Cubler et Hoffman (19). La synthèse du second brin d'ADN complémentaire a été réalisée par la méthode de Okayman and Berg (20) avec seulement des légères modifica- tions. Le mélange réactionnel de 50 l comportait 20mM de Tris-HC1 TrisHC1 (pH 7,5), 5mM de MgCl2, 10 mM d'acétate de NH4, 100 mM de KCl, 40 mM de chaque dNTP, l'ensemble de la préparation ARN-ADN précédente, 9 unités de RNase H/ml, 240 unités d'E. coli ADN polymerase 1/ml et a été incubé successivement à 12 OC et 22 C pendant 1 heure chaque fois. Après chaque étape, la réaction a été stoppée par addition d'EDTA (concentration finale 20 mM) et les acides nucléiques ont été extraits avec du phénol, deux fois avec du phénol-chloroforme et précipités dans de l'acétate de NH4 2M avec de l'éthanol. 3 - Clonage_ _Des queues oligodConté_té_aoutées au cADN et des queues oliqo (dC) au vecteur pAT 153 au site EcoRV, _permettant le clonae du cADN Le vecteur pAT 153 a été totalement coupé avec EcoRV. L'ADN a été extrait par du phénol et sédimenté à tra- vers un gradient de saccharose dans le but d'assurer une très petite quantité d'ADN plasmidique non coupé dans la prépara- tion d'ADN recombinant (21). L'addition d'une queue homopoly- mérique dCTP au plasmide a été effectuée dans un volume réac- tionnel de 100 l comportant 28 mM d'acide cacodylique - mM de base Tris ajusté à pH 7,6 avec KOH, 5 mg/ml de BSA 0,1 mM de dCTP, 60 gg/ml d'ADN, 60 unités de déoxynucléotidyl transferase terminale/ml pendant 10 minutes à 22 C. La réac- tion a été stoppée par addition d'EDTA (concentration fina- le 5 mM). Une moyenne de 20 nucléotides a été ajoutée dans ces conditions. L'addition d'une queue homopolymérique dGTP à l'ADN complémentaire a été réalisée de manière similaire, en présence de 1 mM de dGTP et 540 unités d'enzyme/ml pen- dant 1 heure à 37 C. Le vecteur et l'ADN complémentaire ont été hybridés sans purification supplémentaire sous les con- ditions de Gubler et Hoffman (19). Les cellules compétentes d'E. Coli souche RR1 ont été préparées et transformées par la procédure de Hanahan (22). Les clones recombinants ont été choisis pour la résistance à l'ampicilline et la sensibilité à la tétracycline. L'insertion de l'ADN complé- mentaire dans le site EcoRV de pAT 153 par liaison homopoly- mérique G:C a généré un nouveau site BamEl à cette position (19). La digestion du plasmide recombinant avec BamEl a généré un fragment qui contenait l'ADN complémentaire plus 190 pb à partir du plasmide d'ADN et qui était long d'au moins 600 pb si les ADN complémentaires étaient une copie complète de l'AMI. 4 - Séguen aedu cADN La séquence de l'ADN complémentaire déduite des séquences d'APRN publiées montre un site ScaI unique et commun en position 151. Les deux fragments contenant l'ADN complémentaire obtenus par digestion du plasmide recombinant avec BamHl et ScaI ont été clones dans la forme réplicative de M 13 tg 131 (23) coupée par BamHl/EcoRV et séquences par la méthode de terminaison de chaîne de Sanger (24). - Tests biologigues: Pour démontrer l'activité biologi_ ducADN par coinfection de plantes sensibles avec du virus sans satellite. Dix plants de tomates jeunes, Lycopersicon esculen- tum v. Monalbo, (agés de 14-16 jours) ont été inoculés mé- caniquement avec un mélange comportant soit 40 gg/ml d'ARN viral purifié (ARN-1-4) soit 100 gg/ml de virions de la souche VMC et 17F, et de l'ADN. La nature de l'ADN(plasmide recombinant non coupé ou linéarisé, ADN complémentaire ex- cisé) et sa concentration ont été spécifiées pour chaque expérience. La présence d'un ARN satellite nécrotique a été révélée par le développement de la nécrose chez la to- mate. Celle de l'ARN non nécrotique est basée sur la capa- cité de ce satellite ARN de protéger la plante contre une infection ultérieure par un inoculum inducteur de nécrose (25). Les dix plants ont été suringectés avec une prépara- tion d'ARN total I 17 N (40 gg/ml) deux semaines après la première inoculation. Les résultats sont exprimés en pour- centages de plants nécrosés (% PN) ou plants protégés (% PP), respectivement. 6 - Creation de lantes transgnigues exprimant un gène codant pour un monomère d'ARN satellite: Le fragment BAmH I comportant le cADN additionné des 190 pb du plasmide a été cloné dans le vecteur d'ex- pression pMARCEL 19 décrit dans RDbaglia et al ((1987) Biochimie 69, 231-237). Le plasmide résultant, pMARSAT36, a été introduit dans l'ADN-T du plasmide Ri de la souche A4RS d'Agrobacté- rium rhizogenes par conjugaison triparentale pour créer la souche d'A. rhizogenes, Marsat 362 (voir figure 5 pour pMarsat 36). La souche Marsat362 a été utilisée pour inoculer des segments de tige de tabac (Nicotiana tabacum XHFD8); parmi les racines transformées induites et mises en culture, trois clones ont été étudiés plus en détail, Tab/362 (17), Tab/362 (18), Tab/362 (25). Les techniques utilisées dans les étapes précéden- tes sont décrites d'une manière générale dans Tepfer et Casse-Delbart ((1987) microbiological sciences, 4 (1), 24-27). Les ARN totaux des trois clones de racines trans- formées par Marsat 362 ont été extraits. L'analyse par les techniques classiques d'hybridation moléculaire (technique "Northern") a mis en évidence un transcrit d'approximative- ment 1 kb correspondant au précurseur de l'ARN satellite (voir figure 4). 7 - Etude du comportement des tabacs transformeés vis à vis du VMC: Des plantules de tabac ont régénérées à partir des racines transformées des trois clones, puis multipliées in vitro pour obtenir un nombre suffisant de plantules généti- * quement identiques pour les tests suivants. La réponse à l'infection par le VMC des plantules des trois clones Tab/362 a été comparée à celle de deux types de témoins (tabacs non transformés, tabacs trans- formés par la souche sauvage d'A. rhizogenes) selon plu- sieurs critères: a) taux de réplication du satellite, b) taux de réplication du virus, c) expression de sympt6mes de maladie après in- fection par une souche de VMC indemne de satellite. - B - RESULTATS 1 - Sguences des cADN. satellites Les séquences des cADN satellites I17N et R sont présentées sur la figure 1 en comparaison avec la séquence connue de l'isolat D(13) à titre de référence. En fonction des clones, 5 ou 6 substitutions ont été observées entre les cADN des deux ARN "nécrotiques" (117N et D) (positions 218, 224, 229, 326, 327 et 314). Parmi ces changements, trois ont été aussi notés dans la séquence de l'ARN R "non nécro- tique" (positions 218, 229, et 327). De plus, cet ARN pré- sentait des différences supplémentaires. Trois substitu- tions (positions 44, 126 ou 225 pour les clones 2 et 1 res- pectivement, 295) et une déletion d'une base (position 326). Alors que la copie partielle de cet ARN possède les mêmes 7 deniers résidus à l'extrémité 3' que le ADN de I 17 N, la copie totale présente une extrémité 3 ' modifiée: Ces 7 ré- sidus sont absents et 3T se trouvent aux positions 329 à 331. Dans le but de déterminer si ces modifications ont pré- senté une variation de i'ARN satellite R ou une mauvaise ini- tiation de la transcription reverse, on a construit un recom- binant entre les 2 copies du cADN. Le nouveau clone (3) con- tenait un cADN ayant la terminaison 5' de la copie de lon- gueur totale précédente et la terminaison 3' de la copie de longueur partielle. Finalement, ce cADN différait du cADN de I17N (1) par 3 substitutions (positions 44, 126 et 297) et par la déletion d'une base (position 326). 2 - Proprité biologiqgues des cADN satellites l'ARN satellite possède une activité biologique très élevée. Il est répliqué dans des conditions optimales lorsqu'il est présent à une concentration de 4,5 pM dans l'inoculum et provoque encore le développement de nécrose (ou symtres de filiformisme atténués) chez certaines des plantes infectées lorsqu'il est présent à des doses in- férieures (7). Pour la validité des tests biolgiques, il était nécessaire d'être sûr que les symptomes modifiés des tomates infectées ne résultaient pas d'une contamination des préparations d'ARN viraux ou de virions par un ARN satellite. Dans chaque expérience concernant un cADN d'un ARN "nécroti- que", 10 plants ont été inoculés avec l'une de ces prépara- tions seule et 10 autres avec le même inoculum comportant 5 à gg/ml d'une préparation purifiée de pAT 153. Aucun de ces contrôles n'a développé les symptômes caractéristiques de laprésence d'un ARN satellite de type quelconque. Pour l'étude des copies de cADN de l'ARN "non nécrotique", une troisième série de plants contrôles a été d'abord infectée avec la souche I17F,puis surinfectée avec la souche inductri- ce de nécrose. Toutes les plantes sont mortes de la nécrose, ce qui confirme que aucun ARN satellite "non nécrotique" n'a contaminé les préparations virales et ceci indique que la surinfection a été réalisée. avec succès. La co-inoculation du virus Helper et d'une copie de cADN de longueur totale de l'ARN satellite I17N peut induire la nécrose parmi les plantes infectées. Les résultats de plusieurs tests sont résumés dans le tableau 1. TABLEAU 1 Propriétés biologiaues du cADN de l'ARN satellite I 17 N Virus Helper ADN plasmidique ARN 40gg/ml Virions 100 gg/ml gg/ml Nb.Pa %IPa %Npa Nib.pa %IPa %NPa - - - 70 - 100 57,1 20 0 - 80 100 61,2 20 0 - 80 100 77,5 10 30- 86,7 15,4 80 100 67,5 52 100 17,3 60 100 48,3 a: Nb.P: Nombre de plantes inoculées; %IP: Pourcentage de plantes infectées; % NP: Pourcentage de nécrose parmi les plantes infectées. Les données obtenues avec les inoculums contenant l'une des 2 copies de longueur totale ne différaient pas significativement et ont été cumulées. L'une des caractéristiques inhabituelles des pré- parations d'ADN, à des concentrations supérieures à lC gg/ ml, était leur capacité d'inhiber l'infection par les ARN viraux. D'autre part, lorsque l'ADNc était à des concen- trations inférieures, peu de plantes seulement ont développé le symptôme caractéristique de la réplication et l'expres- sion de l'ARN nécrotique. Ce problème a été surmonté par l'utilisation de virions purifiés à la place d'ARN viraux. Dans ces conditions, l'infection de toutes les plan- tes a été assurée quelque soit la quantité d'ADN et l'activité biologique de l'ADN a été améliorée. Cependant, le cADN est apparu 8 000 fois moins actif que l'ARN satelli- te lui-même si l'on considère qu'un pourcentage similaire de plantes nécrosées a été obtenu par l'inoculation d'une so- lution comportant l'ARN satellite à 0,45 pM (7) ou 10 gg/ml de plasmide recombinant (approximativement à 3,8 nM de cADN). La réduction des proportions de plantes nécrosées lorsque l'ADN était présent à des concentrations supérieures à 20 gg/ml a constitué un résultat inattendu qu'il reste à expliquer. Dans tous les cas, il ne semble pas possible d'induire la nécrose de toutes les plantes dans les conditions rappor- tées ici. L'orientation de l'insert du cADN dans le vecteur pAT 153 n'a pas joué un rôle pour son expression (tableau 2). TABLEAU 2 Effet de l'orientation de l'insert du cADN et de la linéarisation du plasmide recombinant sur les _roriétés biolo2igues du cADN de i'ARN satellite r 17 N Orientation de l'inserta cADN I II Nb.Pb %NP Nb.P %NPb plasmide non coupé 20.g/mrl120 68,3 30 53,3 plasmide coupé EcoRI 20.g/ml 100 7,0 30 56,7 plasmide coupé Sphl 20 gg/mnl60 66,7 -c - plasmide coupé SalI 20 gg/ml100 55,0 30 13,3 fragment BamHL 2 gg/ml 60 10,0 - - Le virus a été apporté sous la forme de virions purifiés (100 $g/ml). a E E NII E: EcorI, B: BamHI, Sp:SphI, B I S:SalI. B La flèche indique l'orientation de la copie d'ADN dont la transcription Sp donnerait un brin d'ARN(+). S b: Nb.P: Nombre de plantes inoculées, % NP: Pourcentage de 3C plantes nécrosées. c: -: non testé. Des résultats similaires ont été obtenus avec le cADN du STNV(Virus satellite de la nécrose du tabac) (26) et de viroi- des (27, 28). Ainsi, aucune séquence particulière du vecteur plasmidique ne semblait être impliquée dans le procédé d'in- fection de ces cADN. Lorsque le cADN a été apporté comme plasmide recombinant linéarisé, le site de coupure était im- portant. Les résultats présentés dans le tableau 2 montrent que la linéarisation devait arriver près de l'extrémité 3' du brin (+) du cADN pour garder le cADN actif. Comme i'ARN satellite se réplique probablement en utilisant la voie rétaboliaqueAR-ARN, son cADN doit servir in vivo comme matrice pour une ARN-polymérase ADN-dépendante de l'hôte. En outre, les résultats suggèrent que l'ARN transcrit doit être un brin (+). Le fragment contenant le cADN généré par di- gestion totale avec BamHl s'est révélé moins actif que le plasmide non coupé (tableau 2). Bien que l'efficacité du pré- cédent pourrait être augmentée en réduisant la concentration des virions (50 Lg/ml) ou en le co-inoculant avec des ARN viraux, pas plus de 20 % des plantes ont développé des né- croses. Les tests de l'activité biologique du clone 2 du cADN satellite R étaient tous négatifs. Aucun ARN possédant l'une des deux fonctions de l'ARN satellite ne pouvait être récupéré à partir des tomates inoculées. Toutes ces plantes ont développé des symptômes de filiformisme sévères. Ceci suggerait que l'extrémité 3' modifiée de cette copie de cADN est due probablement à une mauvaise copie de trans- criptase reverse. De plus, l'inoculation des plants de tomate avec un inoculum comportant de cADN clone 3 a permis la pro- tection complète de certains d'eux contre une infection ul- térieure par la souche inductrice de nécrose. Cette possibi- lité est caractéristique de la présence d'un ARN satellite "non nécrotique" dans la plante protégée (25). Comme montré dans le tableau 3, le cADN de l'ARN satellite R a présenté une activité biologique comparable à celle des copies de lon- gueur totale d'ARN satellite I17N. En particulier, un maxi- mum d'efficacité a été observé lorsque le plasmide a été in- troduit à 20 gg/ml dans l'inoculum. TABLEAU 3 Proprits biologiques du cADN de l'ARN R protection contre un surinfection avec le VMC ADN plasmidique a b gg/ml Nb.P %PP g/ml 100 50 28 50 38 80 55 50 42 50 34 Le virus a été apporté sous la forme de virions pu- rifiés.(100 gg/ml). Pendant chaque expérience, pour contrô- ler l'expression du cADN, 10 plantes ont été infectées avec. un inoculum contenant 20 9g/ml de cADN I 17 F: une moyenne de 53,3 % des plantes ont développé dés nécroses. a: Nb.P: Nombre de plantes inoculées b: %PP: Pourcentage de plantes protégées après surinfection avec la souche I17 N. Les nucléoprotéines purifiées à partir des plants de tomate qui ont développé de la nécrose après infection avec un inoculum contenant du cADN I17N comprenaient un 5ème composant migrant comme l'ARN satellite pendant l'électro- phorèse à travers un gel de polyacrylamide de 2,4 % et re- présentant 18 % de l'ARN encapsidé (figure 2A). Cet ARN a été ensuite purifié par centrifugation sur gradient de saccha- rose et testé par sa capacité de liaison à l'oligo (dT) cel- lulose, il ne portait pas la queue poly (A) (lon- gue de 18 résidus) présente à l'extrémité 3' du brin (+) du cAD utilisé dans ce cas. Par conséquent, la queue poly (G) située en 3' du polv (A) serait aussi absente. De plus, après une électrophorése à travers un gel de polyacrylamide à 5 % dans des conditions dénaturantes qui lb permiettraient d'observer nettement une différence de 20 à 45 bases (longueur de chaque queue), l'ARN possède la même mobilité électrophorétique que l'ARN satellite natif (figu- re 2B). En outre, il a induit le même syndr8me de nécrose ty- pique sur les tomates que l'ARN satellite natif. L'analy- se de la descendance virale a aussi été effectuée à partir de tomates inoculées avec un inoculum comportant le cADN R. Dans une première expérience, 10 plante ont été ana- lysées pour la présence d'ARN satellite à l'intérieur des nucléoprotéines alors que 10 autres ont été surinfectées avec l'inoculum nécrotique. Un 5ème composant migrant comme l'ARN satellite sous des conditions dénaturantes a été ob- observé dans 8 préparations parmi 10 dans le premier cas alors que 7 plantes parmi 10 ont été protégées contre l'in- fect-ion dans le dernier cas. Dans une expérience indépen- dante, on a observé-que toutes les plantes protégées ont montré la présence d'un ARN type ARN satellite à l'intérieur des virions extraits. 3 - Comportementdes__lantes transniqiuesvis à vis du VMC a) Lors d'une infection par le VMC des Tab/362, le transcrit précurseur d'un kb est mature pour donner un ARN satellite de taille (335 b) et d'activité biologique norma- le, qui est très fortement répliquévoir figure 4). b) Le taux de réplication du virus lui-même, par contre, est fortement inhibé (réduit à 20 % du niveau des témoins). c) La gravité des symptômes est atténuée par rapport aux témoins. (figure 3). d) La protection conférée semble durable dans le temps. Il y a une diminution de la gravité de l'infection; il ne s'agit pas seulement d'un retard dans le développement de la maladie. Les résultats sont représentés dans le tableau 4 suivant. TABLEAU 4 Virus a) Capside virale b) mg/ g feuille gg/g tissu [687 Tabacs transformés avec le cAN 566 101 satellite _614 L614 Tabacs transformés sans ceMN satel.ite 1 900 880 Tabacs non transfoes 2 330 754 Tabacs non transformés 2 330 754 a) Rendement évalué après purification des nucléo-- protéines virales 7 jours après l'infection. L'analyse en gel de polyacrylamide de ces préparations montre que, dans le cas de plantes exprimant le cADN satellite, au moins 50 % de l'ARN viral encapsidé est de l'ARN satellite. b) Valeurs estimées par dosage immunoenzymatique de la protéine capsidique (ELISA). c,,JV _.CfoI! / '! q1: -t,. n'.q- Ln'. _' ,.C:cO. n- Dr, ( 1 mI- Ln r,.. /. u,,, Gg, i - j:," o,.-..L _; o0.-,- 1>o..: o' '' CU.,".E u'' u)'. - o-n''. c-%%O - Q Ln - If I v GO - -C4-. " ....c-.'-' ',m -n.>o - - - le.-."'--o: C'O. T - C'm-- -A >-. 0,'-0 -__1 o È:)F- Za Eco.,.,v:- v,0 LI) CmLi)10 L( cc "" . c:.... -e-,'-o'co ". -',-,'8 Co, --,. -. -z,, i o. (" Co Co o" REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de plantes transgéniques envue de les rendre tolérantes de façon durable aux phytovirus par intégration dans leur génome d'une information génétique codant pour l'expression de molécules d'acide nucléique satellite carac- térisé en ce que la séquence d'ADN codant pour l'expression de l'acide nucléique satellite est introduitedans le génome sous la forme d'une seule unité monomérique dont les extrê- mités possèdent éventuellement des séquences étrangères. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide nucléique satellite exprimé est une molécule d'ARN. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'information génétique codant pour l'expression de i'ARN satellite est introduitedans le génome de la plante, sous la forme d'une molécule de cADN transcrit reverse de l'ARN satellite. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les séquences étrangères sont des sé- quences dG/dC et/ou poly (A). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le phytovirus est le virus de la mosaique du concombre (VMC). 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'unité monomérique introduite dans le génome est ine molécule de cADN. 2A 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la molécule de cADN a été polyadénylée puis dotée de queues dG/dC à chacune de ses extrémités. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'information génétique est intégrée grâce à un vecteur d'intégration. 9. Vecteur d'intégration utile au procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'Agrobacte- rium rhizoqenes ou d'Agrobacterium tumefaciens. 10. Plantes transgéniques obtenues par le procédé selon l'une quelconque des-revendications 1 à 8.