Brevet FR2623505A1 — publié le 19890526

La présente invention a pour objet un procédé de séparation d'ADN ou de molécules contenant des fragments d'ADN. On sait que l'ADN est soluble presqu'exclusivement dans l'eau, ce qui rend très difficile, voire impossible, de lui faire subir des transformations chimiques faisant intervenir des réactions dans des solvants non miscibles à l'eau. On connaît également les difficultés rencontrées dans l'obtention d'ADN purifié, les procédés mis au point à ce jour faisant appel à une succession d'extractions en phases liquides qui présentent l'inconvénient d'être longues, délicates et difficilement automatisables. Parmi ces procédés, l'un des plus récents consiste à fixer l'ADN en solution aqueuse sur les particules d'une poudre de verre au moyen d'un agent chaiotropique tel que l'iodure de sodium ou le perchlorate de potassium. Cette fixation se faisant sélectivement permet de séparer l'ADN des protéines et de l'AkN en solution qui l'accompagnent généralement, et conduit à l'obtention d'un produit de fixation de l'ADN sur la poudre de verre, dont on sépare l'ADN par une élution pratiquée au moyen d'une solution aqueuse. La solution d'ADN ainsi obtenue doit être ensuite soumise à une succession d'opérations de purification, qui consistent généralement en des traitements successifs à la RNase, à la protéinase K, au phénol et au chloroforme, tous opérés en phases liquides. Le traitement de l'ADN et sa purification se heurtent à de nombreuses difficultés, en particulier compte tenu du grand nombre d'opérations successives à mettre en oeuvre, ce qui nuit à la rentabilité du traitement, empêchant en particulier la mise au point d'appareillages automatiques. Dans le but d'améliorer le traitement, en particulier la mise en réaction chimique ou physique de l'ADN, la Demanderesse a mis au point récemment un procédé qui consiste à mettre en oeuvre ladite réaction sur l'ADN fixé de façon réversible et non covalente sur un support insoluble, à la fois dans le solvant de la réaction et dans l'eau. Selon ce procédé, le support utilisé peut être un support finement divisé, tel que la poudre de verre par exemple, dont les particules sont de dimension égale ou inférieure à 5 llm. On obtient alors, par addition de solvant, une suspension ADN fixé sur poudre de verre, ce qui permet de traiter directement l'ADN en phase hétérogène dans le solvant choisi, sans avoir à effectuer de séparation de phase liquide-liquide. L'un des problèmes auquel on se heurte toutefois lors du traitement de l'ADN par ce procédé est que lorsque l'on souhaite automatiser le processus ou bien lorsque l'on souhaite le présenter sous forme de trousse de diagnostic par exempe, la poudre de verre présente de nombreux inconvénients. La poudre de verre peut être utilisée en suspension où elle ne présente aucun inconvénient mais si on souhaite l'utiliser sous forme de garnissage pour une colonne, alors on se heurte à de grandes difficultés. En effet, la taille des particules de verre actives (5 pm maximum) et leur nature anguleuse font qu'elles présentent un coefficient de vide très faible ce qui impose l'utilisation de pressions énormes pour passer des fluides au travers de colonnes de poudre de verre (HPLC) et l'ADN est alors rapidement dégradé par les pressions appliquées et les forces de cisaillement. La présente invention a pour but de proposer un procédé de traitement de l'ADN qui rende aisée la manipulation de l'ADN à des fins de purification ou de modification chimique ou enzymatique de la molécule d'ADN, ledit procédé pouvant être applicable à des techniques facilement automatisables, par exemple des techniques de type technique chromatographie basse pression. La présente invention concerne un procédé de fixation et de séparation de molécules comportant au moins un fragment d'ADN naturel ou synthétique à partir d'un mélange liquide contenant lesdites molécules, caractérisé en ce que a) ledit mélange liquide est mis en présence d'un substrat présentant une composition et une structure telle qu'il assure avec l'ADN une liaison non covalente, réversible et sélective, ledit substrat pouvant être utilisé en chromatographie basse pression, b) en ce que, après liaison de 1'ADN, le mélange résiduel est éliminé, c) l'ADN lié est ensuite élué, éventuellement après avoir été soumis à une ou plusieurs réactions physiques et/ou chimiques. Parmi les molécules comportant au moins un fragment d'ADN naturel ou synthétique, il faut citer 1'ADN cellulaire lui-même, mais également les oligonucléotides naturels ou synthétiques ainsi que les ADN ayant subi des modifications chimiques ou physiques telles que marquage chimique, présence d'agent intercalant ou liaison physico-chimique telle qu'une fixation par le couple avidine-biotine. Le substrat mis en oeuvre peut être composé de matériaux divers, notamment des verres, des céramiques ou des métaux ou bien des composés mixtes tels que vitro-céramiques pourvu qu'ils soient capables de fixer l'ADN par une liaison non covalente, réversible et sélective. Parmi ces matériaux, il faut citer les matériaux contenant du bore tels que les verres borosilicatés, notamment le verre Pyrex 732-01 commercialisé par Corning France. Dans le cas de la technique antérieure, les études ont montré l'influence de granulométrie de la poudre de verre sur sa sélectivité, dans le cas présent la porosité du substrat doit être supérieure à 1 micron, les éléments du substrat étant éventuellement jointifs, mais on utilisera de préférence des porosités de l'ordre de 2 à 10 microns, par exemple de 2 à 5 microns. Ce substrat peut se présenter sous une forme unitaire ou sous une forme divisée. Lorsqu'il est sous forme unitaire, il s'agira de préférence d'un produit sous forme frittée, par exemple un fritté de verre ou métallique. Lorsqu'il s'agira d'un substrat divisé, celui-ci sera sous forme de fibres ou de billes. Les fibres pourront être enchevêtrées comme dans une laine type laine de verre, ou bien réunies en tresses par exemple. Dans le cas de billes, les diamètres seront adaptés à la mise en oeuvre envisagée. L'utilisation de fritté est particulièrement avantageuse dans la réalisation de trousse de diagnostic ou bien pour des usages uniques. En effet, un fritté à base de particules de verre comprimées et soudées entre elles présente une résistance mécanique qui permet de l'utiliser directement comme colonne. Bien que la porosité d'un tel support soit faible (inférieure à 10 clam), elle permet cependant de faire passer des fluides avec des pressions très faibles et des débits de plusieurs millilitres par minute, par exemple il est possible d'utiliser une trompe à vide. Le mélange liquide mis en présence du substrat peut être d'origine quelconque, il peut s'agir d'un milieu obtenu après craquage de cellule ou bien un milieu d'origine synthétique par exemple ; de préférence, ce milieu sera un milieu aqueux contenant un agent chaiotropique tel que l'iodure de sodium ou le perchlorate de potassium. Bien entendu, le substrat utilisé devra être insoluble dans ledit milieu. L'élution des molécules fixées à partir du substrat est effectuée de préférence avec une solution aqueuse qui pourra, éventuellement contenir au moins un sel minéral, un agent tampon, un agent chélatant et/ou un agent antioxydant. Ce procédé permet également de soumettre les molécules fixées à une ou plusieurs réactions physiques et/ou chimiques dans un solvant dans lequel 1'ADN et le substrat sont insolubles. Le solvant mis en oeuvre, dans ce cas, peut être n'importe quel solvant organique ou minéral présentant la particularité de ne pas solubiliser l'ADN ou le substrat. I1 peut être additionné d'eau ou d'une solution aqueuse d'au moins un sel minéral pouvant renfermer également au moins un agent tampon, un agent chélatant et/ou un agent antioxydant. A titre d'exemple de solvants utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer le chloroforme, l'éthanol, I'isopropanol, le butanol ou encore une solution de phénol saturé d'eau. L'eau susceptible d'être ajoutée au solvant peut être additionnée, par exemple, d'une faible quantité de chlorure de sodium, d'EDTA ou de Tris HCI. Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, le complexe ADN-substrat est soumis à un traitement dans un solvant en vue d'une modification chimique ou enzymatique de la molécule au moyen d'un réactif convenable. Dans un autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le complexe ADN-substrat est soumis à un traitement en vue de l'obtention d'ADN ou de molécules purifiés. Dans ce cas, le traitement à l'aide de solvants vise essentiellement à séparer de 1'ADN les molécules contaminantes qui s'y trouvent fixées. Ces molécules contaminantes peuvent être entre autres des protéines, de l'agrose, des corps gras ou des agents fluorescents tels que le bromure d'éthidium, utilisés pour le marquage des molécules d'ADN. Le choix du solvant est, dans ce cas, fonction de l'origine de l'ADN à purifier : ainsi dans le cas où 1'ADN est contaminé en majeure partie par des protéines, on utilisera avantageusement du phénol saturé d'eau, tandis que dans le cas où le contaminant est essentiellement constitué de corps gras, le solvant sera de préférence du chloroforme. L'invention concerne, enfin, l'application desdits substrats en chromatographie à basse pression, ainsi que lesdits substrats comportant une molécule d'ADN fixée. L'exemple ci-après est destiné à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages du procédé selon la présente invention. Purification d'ADN sur fritté de verre Dans le protocole décrit ci-dessous, I'ADN à purifier peut être contaminé notamment par des protéines, de l'agarose et/ou de L'ART par exemple. Le fritté utilisé est obtenu à partir de poudre de verre 732.01 Pyrex commercialisé notamment par Corning France, broyée jusqu'à une granulométrie moyenne de 5 microns. Dans L'exemple donné ci-dessous, 1'ADN est essentiellement contaminé par des protéines et de L'ART (80 % d'ARN, ribonucléotide, ribonucléoside). A la solution d'ADN sont ajoutés 2 volumes de NaI 8 M (volume final 3 ml, ADN 315 llg). Cette solution est passée sur le fritté (diamètre 3 cm, épaisseur 2 mm, porosité inférieure à 2 llm) (aspiration sous vide à la trompe à eau). Le fritté est lavé avec 10 ml de NaI 8 M puis par - 50 ml de phénol saturé en H2O (ceci pour décrocher les protéines fixées à l'ADN, - 50 ml de chloroforme, - 50 ml de solution d'éthanol à 50 %, NaCI 0,3 M. Le fritté est légèrement séché par aspiration 2 à 3 minutes. L'ADN est alors élué par 2 fois 2 ml de Tris HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8. Des échantillons sont déposés sur gel d'agarose 1 %. - piste 1 : échantillon de l'ADN à purifier, on voit bien l'ARN (au niveau de la flèche), - piste 2 : 1ère élution, - piste 3 : 2ème élution. On retrouve 70 % de l'ADN dans la 1ère élution (220 pg) 25 % de 1'ADN dans la 2ème élution (80 pg). Sur la photo on note bien la disparition de l'ARN des élutions 1 et 2. L'ARN ne s'est pas fixé, seul l'ADN s'est fixé et a été élué. Les protéines solubles n'ont pas été fixées et celles qui étaient accrochées à l'ADN ont été décrochées par les traitements au phénol. REVENDICATIONS 1) Procédé de fixation et de séparation de molécules comportant au moins un fragment d'ADN naturel ou synthétique à partir d'un mélange liquide contenant lesdites molécules, caractérisé en ce que: a) ledit mélange liquide est mis en présence d'un substrat présentant une composition et une structure telle qu'il assure avec l'ADN une liaison non covalente, réversible et sélective, ledit substrat pouvant être utilisé en chromatographie basse pression b) en ce que, après liaison de l'ADN, le mélange résiduel est éliminé c) I'ADN lié est ensuite élué, éventuellement après avoir été soumis à une ou plusieurs réactions physiques et/ou chimiques. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit substrat est constitué d'un verre, d'une céramique, d'un métal ou de composants mixtes de ces compositions. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la porosité du substrat est supérieure à 1 micron. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le substrat à une porosité de l'ordre de 2 à 10 microns. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le substrat est sous forme de fritté, de fibres ou de billes. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le substrat est un verre 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le substrat est un verre borosilicaté. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le substrat est un fritté de verre. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le mélange liquide contenant lesdites molécules est un milieu aqueux. 10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le mélange contenant lesdites molécules contient un agent chaiotropique. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'agent chaiotropique est choisi parmi l'iodure de sodium et le perchlorate de potassium. 12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'ADN lié est soumis à une ou plusieurs réactions physiques et/ou chimiques dans un solvant dans lequel l'ADN et le substrat sont insolubles. 13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ltélution est effectuée par une solution aqueuse. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la solution aqueuse peut également comporter au moins un composé choisi parmi les sels minéraux, les agents tampon, les agents chélatants et les agents antioxydants.