Brevet FR2634785A1 — publié le 19900202

METHODE D'INCLUSION DANS UN GEL DE MICROORGANISMES OU DE PARTIES DE CEUX-CI, UTILISABLES DANS LES PROCEDES DE FERMENTATION L'invention concerne une méthode perfectionnée d'inclusion dans un gel de microorganismes ou de parties de ceux-ci,utilisables dans les procédés de fermentation. Comme on le sait, les procédés de fermentation peuvent être réalisés très avantageusement avec des micro- organismes immobilisés ou des parties de ces derniers (notamment, suspensions de spores, fragments cellulaires, mycéliums aériens, cultures cellulaires végétatives com- plètes, cultures en état de croissance, etc.). Le but de l'immobilisation est de localiser dans le réacteur les microorganismes ou des parties de microorganismes utilisés comme biocatalvseurs dans la fermentation, et de les empêcher d'être entrainés par le flux s'écoulant par le réacteur. Lorsque des microorganismes ou des parties de microorganismes sont utilisés sous une forme immobilisée, la stabilité (durée de vie) du biocatalyseur peut être améliorée, la productivité de la réaction cata- lysée calculée par unité de volume peut être augmentée et la fermentation peut ainsi être effectuée en continu. Une des méthodes possibles d'immobilisation est d'inclure le biocatalyseur dans des cavités de fibres ou de gels. Des gels synthétiques (tels que le polyacrylamide) et des substances gélifiantes d'origine naturelle peuvent également être utilisés à cette fin. Ainsi, c'est un fait connu que des conidies, des mycéliums et des protoplastes de Penicillium chrysogenum, lorsqu'ils sont inclus dans un gel, peuvent être utilisés dans la biosynthèse de péni- cilline G. Selon les méthodes connues, le èarragénate de potassium (Biotechnol. Bioeng. 26, /1984/), le polyacryl- amide (Biotechnoi. Bioeng. 21, 261 /1979/) et le gel d'alginate de calcium (Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. , 211 /1982/) sont utilisés comme gels d'inclusion. On sait également que des cellules d'Escherichia coli in- cluses dans le polyacrylamide peuvent être utilisées dans la biosynthèse de l'acide 6-amino-pénicillanique (Eur. J. Appl. Microbiol. 2, 153 /1976/) . L'utilisation de cellules de Pleurotus osteatus, incluses dans le kitozane, dans la biosynthèse de l'acide 6-amino-pénicil- lanique a également été décrite (Biotechnol. Lett. 4, 293 /1982/). Selon Biotechnol. Bioeng. 23, 2747 (1981), les cellules de Streptomyces clavuligerus, incluses dans le polyacrylamide, sont utilisées dans la production de cephalosporine C. L'utilisation de cellules de Bacillus sp., incluses dans un gel de polyacrylamide, dans la pro- duction de bacitracine a été décrite dans Antimicrob. Agents Chemother. 15, 126 (1979) et Biotechnol. Bioeng. 22, 1015 (1980). On sait également que des cellules de Streptomyces, incluses dans l'alginate de calcium, peuvent être utilisées dans la production de tylosine et de nikkomycine (Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 15, 206 /1982/). L'utilisation de conidies de Penicillium urticae, incluses dans le carragénate de potassium, dans la production de patuline à partir de glucose a été dé- crite dans Biotechnol. Lett. 5, 125 et 785 (1983). Lorsque le polyacrylamide est utilisé comme agent d'inclusion, les radicaux libres qui se forment dans le processus de gélification peuvent entraîner de sérieuses détériorations cellulaires ou encore ils peuvent inhiber les fonctions de certaines enzymes. L'inconvénient que présentent les agents gélifiants ionotropes, comme les alginates et les carragénates, consiste en ce que les ions métalliques nécessaires pour l'étape de formation du gel peuvent être cytotoxiques. C'est pourquoi, les méthodes connues discutées plus haut ne peuvent être appliquées avec succès qu'à un groupe relativement étroit de microorganismes ou de parties de microorganismes uti- lisables dans les procédés de fermentation. Il serait très avantageux d'immobiliser des micro- organismes ou des parties de microorganismes, utilisables dans les procédés de fermentation, grâce à leur inclusion dans un gel d'agar. C'est un fait bien connu que le gel d'agar, qui est l'un des composants les plus courants des milieux nutritifs utilisés dans la culture de mico- organismes, n'exerce pas d'effets nuisibles sur les micro- organismes, assure des conditions de vie optimales pour les cellules vivantes et les spores, et la structure du gel est telle qu'elle permet le développement in situ des mycéliums. L'inclusion de microcrganismes dans un gel d'agar a été décrite dans Biotechnol. Bioeng. 17, 1729 (1975) et dans Microbiologiya 49, 479 (1980). Selon les méthodes décrites dans les références citées, une solution aqueuse contenant.2-4%-en poids d'agar, refroidie à une tempéra- ture proche du point de gélification, est homogénéisée avec une suspension de cellules d'Escherichia coli ou de Methylomonas, et le mélange obtenu est versé dans de l'eau distillée froide ou dans un tampon de phosphate ou encore on le laisse se solidifier sous forme de bloc et il est ensuite broyé. Un inconvénient des méthodes connues consiste en ce que le gel, lorsqu'il est versé dans l'eau, se solidifie en particules de forme et de dimensions extrêmement va- riables. L'utilisation des particules de gel ainsi ob- tenues avec une distribution extrêmement hétérogène en ce qui concerne la forme (fibreuse, hémisphérique, irré- gulière, etc.) et les dimensions présente l'inconvénient qui consiste en ce qu'en présence de ces particules de gel, le flux uniforme du milieu de fermentation ne peut être assuré et le courant de liquide peut entraîner les particules de gel qui sont très difficiles à séparer du liquide. Les blocs d'agar solidifiés sont très difficiles et encombrants à broyer. Des particules de gel avec une forme sphérique régulière et des dimensions se situant dans d'étroites limites, qui pourraient être utilisées pour les procédés de fermentation avec des résultats opti- maux, ne peuvent pas être préparées par ces méthodes connues. Nous avons effectué une importante étude sur la for- mation de gels et avons trouvé que les caractéristiques physiques du liquide utilisé comme milieu dans le processus de formation du gel sont décisives en ce qui concerne la forme et les dimensions des particules de gel formées. Nous avons observé que des particules de gel avec une forme sphérique régulière et des dimensions se situant dans d'étroites limites (généralement 1 à 5 mm) peuvent être obtenues lorsque le mélange de microorganismes ou de parties de microorganismes utilisables dans les pro- cédés de fermentation, formé avec une solution d'agar liquide chaude (45-500C) est versé dans un solvant orga- nique ou un mélange de solvants, qui n'a pas d'effets nuisibles sur les microorganismes, possède les caracté- ristiques physiques suivantes: solubilité dans l'eau: inférieure à 10 g/100O g densité: inférieure à 1,2 g/cm3 viscosité mesurée à 20 C: 10-100 cP point d'ébullition: 75-250 C et dans lequel la vitesse de précipitation des goutte- lettes est supérieure à 0,01 cm/sec. L'expression "microorganisme ou partie de microorga- nisme utilisable dans les procédés de fermentation", telle qu'elle est utilisée dans la description et les revendi- cations, couvre toutes les formes possibles du microorga- nisme utilisables à des fins de fermentation, telles que culture végétative, suspension de spores, cellules isolées, conidies, mycéliums, fragments cellulaires, cultures en état de croissance, constituants cellulaires, etc. du microorganisme en question. Le solvant organique ou le mélange de solvants devant être utilisé comme milieu liquide dans la formation du gel a de préférence une densité de 0, 8-1,1 g/cm3 et sa solubilité dans l'eau est de préférence de 0,1-10 g/100 g d'eau. Une autre condition importante consiste en ce que les gouttelettes de gel versées dans le solvant organique ne doivent pas flotter dans le solvant, c'est-à-dire que la vitesse de précipitation des gouttelettes doit être supérieure à 0,01 cm/sec. La vitesse de précipitation est de préférence de 0,05 à 10 cm/sec. Conformément à la méthode de- l'invention, par exemple l'acétate d'éthyle, l'isooctanol, l'alcool n-amylique, l'alcool benzylique, l'acétoacétate d'éthyle, un mélange de ces solvants ou l'acétoacétate d'éthyle comprenant 10% en volume de méthylisobutylcétone peuvent être uti- lisés comme milieu liquide pour la formation du gel. Pour accélérer la formation des perles de gel, il est préférable de refroidir le milieu liquide à 0-10 C. Si on le désire, un gaz inerte peut être introduit en un lent courant dans le milieu liquide afin d'empêcher les particules de gel formées d'adhérer les unes aux autres. Les perles de gel séparées sont lavées avec de l'eau distillée exempte de solvant, puis séchées si on le désire. La méthode de l'invention est élucidée en détail à l'aide des exemples non exhaustifs suivants: Exemple 1 Une suspension de spores contenant 5 x 107 spores/cm3 est obtenue avec de l'eau distillée stérile à partir d'une culture sur gélose inclinée de Streptomyces lavan- dulae ATCC 12950. 10 cm3 de la suspension de spores ob- tenue sont ajoutés à 90 cm3 d'une solution aqueuse d'agar à 4% en poids, stérilisée auparavant à 121 C pendant 30 minutes, puis refroidie à 50 C. Le mélange obtenu est versé goutte à goutte à l'aide d'une pompe péristaltique dans 1000 cm3 d'isooctanol (2-éthyl hexanol) froid (5 C). Des instruments stérilisés sont utilisés pour ces opéra- tions. On fait passer de l'azote en un lent courant à travers le milieu d'isooctanol afin d'empêcher les perles de gel d'adhérer les unes aux autres. L'introduction d'azote est poursuivie pendant 4-5 minutes après la fin de l'écoulement goutte à goutte, puis les perles de gel sont séparées par filtration et lavées avec de l'eau dis- tillée stérile exempte de solvant contenant 0,02% en poids de Tween 80. Des perles de gel de forme sphérique régu- èlire, de 1-5 mm de diamètre, sont obtenues. Des résultats analogues sont obtenus lorsque l'iso- octanol est remplacé dans le processus ci-dessus par de l'acétate d'éthyle, du cyclohexanone, de l'alcool n-amy- lique, de l'alcool benzylique ou de l'acétoacétate d'éthyle. Exemple 2 Une suspension de spores de Streptomycezlagrillaceum ATCC 12956, cultivé sur un milieu de gélose inclinée, contenant 0,5% en poids de poudre de sqja, 1,0% en poids de glucose et 2,0% en poids d'agar fibreux, est utilisée pour inoculer un milieu de culture, stérilisé au préalab- le à 121 C pendant 20 minutes, puis refroidi à tempéra- ture ambiante, ayant la composition suivante: farine de noisettes 2,0O en poids caséine hydrolysée 0,2% " " glycérol 4,0% " " chlorure de sodium 0, 3%" " carbonate de calcium 0,5%" " " (Le pH du milieu de culture complété avec de l'eau de robinet est de 7,0 avant stérilisation). La culture est agitée pendant 48 heures à 320C à 360 t/min. 10 cm3 de la culture végétative obtenue sont ajoutés à 90 cm3 de solution aqueuse d'agar à 4% d'une température de 45 C et les perles de gel soi.t formées à partir du mélange obtenu comme décrit dans l'Exemple 1. 2634?85 Exemple 3 Streptomyces diastatochromogenes var. R0-31 (MNG 00366) est sporulé sur un milieu de gélose inclinée ayant la composition suivante: extrait de levure 0,1% en poids extrait de viande 0,1% " tripton 0,2% " " FeSO4 3x10- 4 glucose 1,0% " " Na2HPO4 0,713% KH2PO4 0,363% agar fibreux lavé 2,0% " (Le pH du milieu de culture complété avec de l'eau de robinet est de 7,0 avant stérilisation). La culture sporulée d'environ 7-8 jours est entraînée avec de l'eau distillée stérile ou du sérum physiologique et la concentration de la suspension de spores est ajustée 6 3 à 3 x 10 spores/cm. La suspension de spores obtenue est traitée ensuite comme décrit dans l'Exemple 1 pour former des perles de gel d'agar. Exemple 4 Une suspension cellulaire contenant 8 x 106 cellules/ cm d'eau distillée stérile est préparée à partir d'une culture de Rhodococcus sp. NCAIM 8001003 sur gélose incli- née de 4 jours. 10 cm3 de la suspension de spores sont ajoutés à 90 cm3 de solution aqueuse d'agar à 4%, stérile et chaude (45 C), et des perles de gel sont formées à partir du mélange comme décrit dans l'Exemple 1. Un milieu de culture ayant la composition suivante cholestérol 1,0% en poids sucre 0,5O " " farine de soja 0,7% "f lécithine de tournesol brute 0,5% c" " Tween 60 0,2% " " KH2 PO4 0,1% " " CaCO3 0,1 NaCI 0,1% " " MgSO4.7H20 0,05% Struktol B-2020 0,1% " est stérilisé à 121 C, puis refroidi à la température ambiante. (Le pH du milieu de culture est de 6,0 avant stérilisation). Le milieu de culture est inoculé avec les perles de verre obtenues comme décrit plus haut, puis il est agité sur un agitateur plan pendant 3 jours à 30 C et à 300 t/min. Le taux de cholestérol oxydase du bouillon obtenu est déterminé par la méthode de Allain et al. Exemple 5 Une souche de Streptomyces rubrifaciens est sporulée sur un milieu de gélose inclinée ayant la composition décrite dans l'Exemple 1. La culture sporulée d'environ 4-5 jours est entraînée avec de l'eau distillée stérile ou du sérum physiologique et la concentration de la sus- pension de spores est ajustée à environ 5 x 106 spores/cm3. Des perles de gel d'agar sont formées à partir de la sus- pension de spores obtenue comme décrit dans l'Exemple 1. Un milieu de culture ayant la composition suivante extrait de levure 0, 1%' en poids extrait de viande 0,1% " tripton 0,2% " " FeSO4 3x10-4 glucose 1,0% en poids agar 2,0%"" est stérilisé à 121 C pendant 25 minutes, puis refroidi à la température ambiante. (Le pH du milieu de culture est de 7,2 avant stérilisation). Le milieu de culture est inoculé avec les perles de gel obtenues comme décrit plus haut et la culture est agitée sur un agitateur plan pendant 5-6 jours à 28 C et à 280 t/min. L'antibiotique produit est détecté par la méthode connue de chromato- graphie en couche mince. Exemple 6 Une souche de Micromonospora inyoensis ATCC 27600 est sporulée sur un milieu de gélose inclinée ayant la composition donnée dans l'Exemple 3. La culture d'environ 7-8 jours est entraînée avec de l'eau distillée stérile ou du sérum physiologique et une suspension de spores d'une concentration d'environ 6 x 106 spores/cm3 est préparée. Des perles de gel d'agar sont formées à partir de cette suspension de spores comme décrit dans l'Exemple 1. Les perles de gel obtenues sont utilisées pour inoculer un milieu de culture liquide stérile ayant la composition donnée dans l'Exemple 5, et la culture est agitée sur un agitateur plan pendant 5-6 jours à 28 C et à une vitesse de 280 t/min. L'antibiotique produit est détecté par une méthode connue utilisant Bacillus subtilis comme microorganisme de mesure. 1 1 REVENDICATIONS: 1. Méthode d'inclusion dans un gel de microorganismes ou de parties de microorganismes, utilisables dans les porcédés de fermentation, en mélangeant des microorga- nismes ou des parties de microorganismes avec une solution d'agar liquide de 40-500C et en versant goutte à goutte le mélange obtenu dans un milieu liquide gélifiant, caractérisée en ce qu'en qualité de milieu liquide géli- fiant est utilisé un solvant organique ou un mélange de solvants qui n'a pas d'effets nuisibles sur les microor- ganismes, possède les caractéristiques physiques suivantes: solubilité dans l'eau: inférieure à 10 g/100 g densité: inférieure à 1,2 g/cm3 viscosité mesurée à 20OC: 10-100 cP point d'ébullition: 75-250 C et dans lequel la vitesse de précipitation des goutte- lettes est supérieure à 0,01 cm/sec. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'un solvant organique ou un mélange de solvants avec une solubilité dans l'eau de 0,110 g/100 g est utilisé comme milieu liquide gélifiant. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caracté- risée en ce qu'un solvant organique ou un mélange de sol- vants avec une densité de 0,8-1,1 g/cm3 est utilisé comme milieu liquide gélifiant. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'un solvant organique ou un mélange de solvants dans lequel la vitesse de précipita- tion des gouttelettes est de 0,05-10 cm/sec est utilisé comme milieu liquide gélifiant. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'acétate d'éthyle, l'iso- octanol, le cyclohexanone, l'alcool n-amylique, l'alcool benzylique ou l'acétoacétate d'éthyle est utilisé comme milieu liquide gélifiant. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le mélange contenant l'agar est versé goutte à goutte dans un solvant organique ou un mélange de solvants de 0-10 C.