Brevet FR2628743A1 — publié le 19890922

La présente invention est relative à une nouvelle protéine de reconnaissance de la gestation chez les Ruminants, et à son utilisation, notamment pour la détection précoce de la gestation, ainsi qu'à un procédé de préparation de ladite protéine. L'implantation d'un embryon chez la vache n'a pas lieu avant le 20ème jour de gestation. Toutefois, pour survivre, le conceptus doit envoyer avant le 17ème jour, un messagé à l'organisme maternel pour empêcher la régression du corps jaune. Il existe donc, selon toute apparence, des substances embryonnairés produites ou stimulées par le conceptus, qui sont impliquées dans les mécanismes de reconnaissance de la gestation. BUTLER, HAMILTON, SASSER, RUDER, HASS et WILLIAMS (BIOL.REPROD. 26, 925, 1982) ont identifié et isolé une protéine B spécifique de la gestation. Cette protéine, isolée d'extraits de membranes placentaires bovines de foetus âgés de 25.à 270 jours, présente un poids moléculaire de l'ordre de 47 à 53 kDa et un point isoélectrique de 4,0 à 4,4. Cette protéine B a été obtenue k partir de membranes placentaires d'embryons ayant de 16 à 280 jours de gestation, prélevées chez des vaches gravides abattues, puis congelées à -200C. Les membranes ont été finement émincées à l'aide d'une lame de rasoir et ont été homogénéisées, puis la préparation a été centrifugée à 10000 g pendant 30 minutes à + 40C. On a conservé le surnageant résultant. L'extrait placentaire a été placé dans un bain de glace et la fraction qui a précipité entre 50 et 65 % de saturation par le sulfate d'ammonium, est dissoute dans du tampon Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5 à 40C et dialysée pendant 48 heures à 40C contre ce tampon, avec une limite d'exclusion de 12 000-13 000 Da. Le dialysat est concentré, puis soumis à un processus de chromatographie par échange d'ions. Ce processus a été réalisé sur une colonne de DEAE-cellulose sur laquelle la protéine a été chargée dans du tampon Tris-HC1 0,01 M (pH 4,75) à un débit de 1 ml/min. et après élution des protéines non fixées, un gradient linéaire de NaC1 de 0 à 0,3 M est appliqué. Les fractions collectées sont éluées.Celles qui présentent une activité antigénique spécifique de la gestation sont réunies, congelées et stockées à -200C, une filtration sur gel est alors réalisée sur une colonne de Bio-Gel A-0,5 dont la limite d'exclusion est de 500 000 Daltons et la gamme-de fractionnement comprise entre 10 000 et 500 000 Daltons. La protéine spécifique de la gestation récupérée par chromatographie par échange d'ions,est concentrée par ultrafiltration. La Demande de Brevet européen 132 750 du 16 Juillet 1984, déposée en revendiquant une priorité américaine du 21 Juillet 1983, est limitée dans son objet à une méthode de détection de la gestation chez des mammifères, qui consiste à détecter la présence d'un immuncomplexe entre un anticorps anti-protéine B et un antigène, dans un fluide physiologique du mammifère gravide, extérieur au foetus, tandis que la protéine B est marquée, de préférence par conjugaison, de manière à fournir un signal détectable. Les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à une protéine de reconnaissance de la gestation chez les Ruminants qui présente un haut degré de pureté, parfaitement identifiée et dont la préparation est rigoureusement reproductible ; les Inventeur s se sont également donné pour but de mettre en place des moyens, et en particulier ladite protéine, pour la réalisation d'un diagnostic précoce et spécifique de la gestation et d'un diagnostic de mortalité embryonnaire t les Inventeurs se sont également donné pour but,en préparant une telle protéine pure et parfaitement identifiée,d'élucider les propriétés physiologiques de cette molécule. La présente invention a pour objet une protéine spécifique de la gestation, analogue à la PSPB Pregnancy Specific protéin B de Sasser - qui sera dénommée dans ce qui va suivre PSP , qui est caractérisée en ce qu'elle présente la séquence N-terminale en aminoacides représentée par la formule I ci-après : -X-Gly-Ser-X-Leu-Thr-Thr-His-Pro-Leu-Arg-Asn-Ile-Lys-Asp- 1 5 (I) 10 15 -Leu-Val-Tyr-Met-Gly-X-Ile-Thr-Ile-Gly-Thr-Pro-Pro-Gln- 20 28 -Gl u-Phe-Gln-Val-Val-Phe-Asp-Thr-Ala-Ser-X- (I) 30 35 40 (les X étant probablement des asparagines). Conformément à la présente invention, la PSP présente un poids moléculaire de 61 kDa environ (par analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant) et un point isoélectrique de 5,1 à 5,5 environ,après électrophorèse bidimensionnelle. La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de préparation de la PSP à partir de placentas de mammifères, qui est caractérisé en ce que des placentas homogénéisés et extraits dans un tampon appropri',sont soumis a une précipitation acide et le surnageant est soumis à une précipitation saline, puis le précipité est soumis à une chromatographie sur échangeur d'ions puis à une filtration sur gel, les fractions présentant une activité PSP sont purifiées par passage sur une colonne d'HPLC échangeuse de cations, suivi d'une élution par un gradient salin dans un tampon approprié à pH acide, ce qui permet d'isoler la PSP. Conformément à la présente invention, la PSP peut etre obtenue par d'autres voies, notamment par d'autres voies de purification des protéines ou par voie biotechnologique (y compris par génie génétique, synthèse bactérienne ou cellulaire, animaux transgénétiques, etc ..) La présente invention a en outre pour objet un kit de réalisation d'un test de diagnostic précoce de gestation, chez le ruminant, qui est caractérisé en ce que, outre les réactifs, tampons et/ou diluants usuels, il comprend une quantité utile d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux anti-PSP. Conformément à l'invention, les anticorps sont obtenus soit à partir de sérums de mammifères immunisés par la PSP, soit par fusion de cellules de mammifères immunisés par la PSP avec des cellules malignes de mammifères appropriées (tels que la souris, notamment). Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide de complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. La PSPB a été mise en évidence par une équipe américaine (BUTLER et al., 1982), mais de nombreux problèmes n'étaient pas résolus : fiabilité et limites de l'application du dosage de la PSPB au diagnostic de gestation, intérêt dans l'estimation de la mortalité embryonnaire, source réelle de sécrétion, caractéristiques biochimiques précises de la molécule dont les préparations les plus pures (préparations de radioiodation) étaient hétérogènes, des immunsérums dirigés contre des homogénats de trophoblaste ou des préparations protéiques insuffisamment purifiées, méthode de purification imprécise et/ou dénaturante (isoélectrofocalisation) présence mal connue dans la circulation du foetus et dans les liquides des enveloppes èmbryonnaires, propriétés biologiques totalement ignorées. Par ailleurs, on disposait d'un dosage radioimmunologique (cf. demande de brevet européen précitee utilisable pour le dosage de protéines mal définies, spécifique de la gestation chez les bovins. Le dosage de la PSPB présentait, cependant, un grand intérêt puisqu'il devait permettre d'effectuer des diagnostics spécifiques de gestation. En effet, le dosage de la progestérone, reflet de l'activité lutéale,largement répandu actuellement, constitue un excellent moyen de diagnostic de non gestation, mais il peut être à l'origine d'un certain nombre de faux diagnostics positifs de gestation dans le cas de corps jaunes persistants à la suite de mortalité embryonnaire (à partir du 16ème jour chez la vache).De plus, en raison de la sécrétion de la progestérone durant chaque phase lutéale du cycle oestrien, il est indispensable de connaître rigoureusement la date de la saillie ou de l'insémination artificielle, ce qui n'est pas toujours le cas (troupeaux bovins de races à viande, par exemple). Exemple 1 Purification de la PSP bovine par HPLC. Des cotylédons foetaux congelés ont été homogénéisés et extraits dans du tampon phosphate KC1 (0,1 M) pH 8,6. L'extrait placentaire a été soumis à une précipitation acide (à pH 4,5) et le surnageant a été précipité par du sulfate d'ammonium (40 % et 65 % de saturation pH 5,2).Le précipité a ensuite été dialysé et soumis à une chromatographie sur DEAE-Sephadex, puis à une filtration sur gel. La présence de PSP dans les fractions a été déterminée par radioimmunologie à l'aide de préparations de PSPB impures telles -que décrites dans la Publication BUTLER et al. Les fractions PSPpositives ont été appliquées sur une colonne d'HPLC échangeuse de cations (TSK SP 5 PW ; 75 mm x 7,5 mm diamètre intérieur) et des protéines ont été éluées par un gradient linéaire de KC1 dans du tampon phosphate 0,05 M à pH 5,4 en colonne analytique ou à pH 5,85 en colonne préparative.Un pic majeur distinct, (PSP) élué de la colonne d'HPLC à la concentration de 0,195M de KC1, présente une réactivité immunologique dans le test de dosage radioimmunologique de la PSPB proposé par SASSER et al.. Par analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dénaturant, ce pic de PSP correspond à- une seule bande et à un poids moléculaire apparent de 61 kDa environ. Après radioiodation, cette protéine précipite avec l'immunsérum anti-PSP et présente la même mobilité électrophorétique que l'une des protéines contenue dans la préparation de PSPB radioiodée, obtenue par BUTLER, SASSER et al. Cependant, les caractéristiques de la PSPB de BUTLER et al., - 47 - 53 kDa, point isoélectrique 4-4,4, font apparaître qu'il ne s'agit pas dans la présente invention de la même molécule, puisque la PSP a un P.M. de 61 kDa et un point isoélectrique de 5,1-5,5. Exemple 2 Caractérisation de la PSP bovine 2.1 Caractérisation physicochimique. Après analyse par électrophorèse sur gel d'acrylamide en milieu dénaturant, le pic de PSP purifiée par HPLC ne présente qu'une seule bande de PM apparent de 61 kDa (au lieu de 47 à 53 kDa par BUTLER et al., 1982). Cependant, dans les mêmes conditions expérimentales, la PSPB de G. SASSER présente, après radioiodation, une protéine de PM apparent de 59 kDa et une autre mineure de 51 kDa. Le point isoélectrique de la PSP purifiée par HPLC a été déterminé à 5,5 après isoélectrofocalisation. I1 diffère donc sensiblement de celui de la PSPB décrite par SASSER et BUTLER. La protéine PSP purifiée conformément à l'invention est néanmoins précipitable par l'immunsérum anti-PSPB de SASSER. 2.2 Caractérisation par système de traduction acellulaire La capacité synthétique d'ARNm poly(A) d'embryons ovins âgés de 29 jours dans un système acellulaire (lysat de réticulocytes ) en présence de 35S- méthionine a été déterminée. La quantité de PSP synthétisée a été estimée par immunoprécipitation spécifique à l'aide d'immunsérum anti-PSPB bovine, suivie d'électrophorèse-SDS : le précurseur de la PSP correspond à une protéine de 49 kDa, dont le PM apparent est nettement inférieur à celui de la PSP (61 kDa), ce qui signe très- probablement la nature glycoprotéique de la protéine native. Cette traduction de la PSP en milieu acellulaire suggère que sa fraction protéique sécrétée présente un PM apparent d'environ 46 kDa. La PSP identifiée et isolée conformément à la présente invention comporte de nombreuses applications, telles que : utilisation à des fins de diagnostic de gestation, de diagnostic de viabilité ou de mortalité embryonnaire, de détermination de la fertilité à des fins de sélection génétique. De plus, l'approfondissement des connaissances relatives à la PSP identifiée conformément à la présente invention permettra de préciser ses propriétés physiologiques et leurs éventuelles applications. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1: Protéine spécifique de la gestation chez les mammifères, dénommée PSP, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence N-terminale en amino-acides représentée par la formule I ci-après -X-Gly-Ser-X-Leu-Thr-Thr-His-Pro-Leu-Arg-Asn-Ile-Lys-Asp 1 5 (I) 10 15 -Leu-Val-Tyr-Met-Gly-X-Ile-Thr-Ile-Gly-Thr-Pro-Pro-Gln- 20 28 -Glu-Phe-Gln-Val-Val-Phe-Asp-Thr-Ala-Ser-X- (I) 30 35 40 2. Protéine spécifique de la gestation chez les mammifères, dénommée PSP, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire de 61 kDa environ (par analyse électrophorétique sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant), et un point isoélectrique d'environ 5,5 après électrophorèse bidimensionnelle. 3. Procédé de préparatipn de la PSP à partir de placentas de mammiterès, caractérisé en ce que des placentas homogénéisés et extraits dans un tampon approprié, sont soumis à une précipitation acide et le surnageant est soumis à une précipitation saline, puis le précipité est soumis à une chromatographie sur échangeur d'ions, puis à une filtration sur gel, les fractions présentant une activité PSP sont purifiées par passage sur une colonne d'HPLC échangeuse de cations, suivi d'une élution par un gradient salin dans un tampon approprié à pH acide, ce qui permet d'isoler la PSP. 4. Kit de réalisation d'un test de diagnostic précoce de gestation ou de diagnostic de mortalité embryonnaire, caractérisé en ce que, outre les réactifs, tampons et/ou diluants usuels, il comprend une quantité utile d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux anti-PSP.