Brevet FR2627508A1 — publié le 19890825

La présente invention concerne une nouvelle méthode pour l'amplification et la stabilisation du nombre de copies de gènes choisis dans un microorganisme. L'invention est illustrée au moyen d'exemples cités plus loin dans lesquels la séquence codant pour une enzyme, la béta-galactosidase, et les gènes codant pour trois enzymes intervenant dans la biosynthèse de la L-thréonine sont transférés à l'intérieur du chromosome d'un microorganisme. Ces gènes se sont avérés être fixés de façon stable dans le chromosome. Les souches résultantes sont alors de meilleures productrices, des enzymes correspondantes pour le premier cas ou d'acides aminés L-thréonine pour le second cas, que les souches parentales. Les bactéries sont capables de synthétiser des principes actifs utiles tels que des enzymes et des acides aminés. La production par fermentation fait intervenir des processus biochimiques complexes contrôlés par de multiples gènes et produits de gènes. Les produits de la fermentation sont fabriqués en quantités relativement faibles. Pour améliorer cette production par fermentation, il serait utile d'augmenter le - nombre de copies des gènes intervenant, d'une manière telle que le nombre de ces copies puisse être contrôlé et stabilisé dans le chromosome ou les épisomes du microorganisme. Plusieurs méthodes ont été décrites dans la littérature scientifique selon lesquelles le nombre de copies d'un gène peut être amplifié dans un microorganisme, en particulier au moyen de vecteurs circulaires plasmidiques. Néanmoins, le nombre de copies obtenues par ces méthodes est hautement variable et dépend du vecteur particulier, de là longueur du gène choisi et des conditions physiologiques particulières du microorganisme. Aucune de ces méthodes ne concerne l'amplification du gène jusqu'à un niveau choisi, en évitant un excès non indispensable de copies, et ceci avec une fixation stable de ces copies dans le chromosome. Un but de l'invention est de décrire une méthode pour amplifier et fixer de manière stable les copies de gènes choisis dans un microorganisme avec plus de flexibilité et plus de sécurité que ce qui était possible jusqu'à présent. Ce but ainsi que d'autres objectifs de l'invention tels qu'envisagés plus loin ont été réalisés en fournissant, par exemple, à la bactérie Escherichia coli un élément transposable à large spectre d'hôtes dérivé du phage Mu et dans lequel les gènes de la transposase ne peuvent s'exprimer ou sont délétés. Un tel transposon est un transposon désarmé. Dans des conditions génétiques réversibles particulières, faciles à reproduire pour des organismes du même genre ou d'un genre différent, ce transposon et les gènes, qui peuvent y être introduits par les technologies de génie génétique, peuvent être conçus pour se multiplier au sein du chromosome du microorganisme. Quand les conditions génétiques particu- lières sont supprimées, les différentes copies du transposon restent fixées de manière stable à l'intérieur du chromosome. La présente invention concerne un procédé pour l'intégration d'un gène choisi ou d'une séquence d'ADN déterminée (à l'intérieur d'une bactérie) dans une séquence d'ADN telle qu'un chromosome ou un épisome dans lequel: a) ledit gène choisi, ou la séquence d'ADN choisie, est cloné à l'intérieur d'un transposon, à l'extérieur des parties essentielles du transposon, b) ledit transposon est intégré dans la séquence d'ADN à l'intérieur de la bactérie. Selon l'invention, on peut utiliser tout transposon qui transpose à l'intérieur d'un site quelconque dans l'ADN bactérien. Des transposons préférés sont Tn3, Tn5, Tn7, TnlO, Tn903, TnHoHo, IS 1, IS 10, IS 50 et les phages MudI et MudlI. On préfère tout particulièrement les phages MudI et MudlIl. Pour obtenir une intégration stable, un mode de réalisation préféré de l'invention est l'utilisation de transposons désarmés qui sont des transposons incapables de transposer par eux-mêmes. Pour un tel usage, les transposons utilisés n'ont pas de gènes pour la transposase ou ces gènes ne sont pas actifs dans ladite bactérie. On préfère tout particulièrement un transposon dépourvu des gènes codant pour les transposases, mais il est aussi possible d'utiliser un transposon dans lequel les transposases, agissant en trans, sont réprimées ou inactives dans des conditions normales. Selon l'invention on peut utiliser n'importe quelle bactérie dans laquelle les transposons décrits ci-dessus peuvent transposer. Les bactéries préférées sont des membres de la famille des Entérobactériacées, par exemple Escherichia coli, Citrobacter freundii, Erwinia herbicola, Salmonella thyphimurium, Shigel-la sonneii, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens ou des membres de la famille des Rhizobiacées tels que Agrobacterium tumefaciens ou des membres de la famille Pseudomonas tels que Pseudomonas putida par exemple. Par gène choisi, on définit un gène.qui n'est pas normalement présent dans ledit transposon ou qui n'est pas présent dans la bactérie hôte. Comme gène choisi, on peut utiliser un gène cloné ou un gène hybride, un segment de gène ou un gène fabriqué par synthèse. Le gène peut s'exprimer dans la bactérie hôte et être d'origine animale, végétale ou microbienne. Plusieurs gènes peuvent être insérés dans le transposon. Le gène choisi peut être sous contrôle d'un promoteur qui est, lui aussi, à l'intérieur du transposon et qui assure l'expression dudit gène dans ladite bactérie. Les gènes clonés sont insérés par des techniques connues de génie génétique ou selon le procédé décrit ci-dessous. Pour plus de facilité, il est plus simple de partir d'un plasmide contenant le transposon désarmé. Le transposon est désarmé par délétion ou mutation. Le plasmide contenant le transposon est isolé de la bactérie et clivé avec des enzymes de restriction appropriées. Les gènes choisis sont aussi extraits de leur hôte puis purifiés après clivage au moyen d'enzymes de restriction. Le clonage d'un gène marqueur tel qu'un gène de résistance à un antibiotique (npt par exemple) ou un autre gène "reporter" (lacZ par exemple) en même temps que les gènes insérés est préférable pour la sélection des évènements de transposition. On évalue le nombre de transpositions par la détermination de l'expression du gène marqueur. Ladite expression du gène marqueur peut être déterminée-par la résistance à un antibiotique quand le gène marqueur est un gène de résistance à un antibiotique; l'expression du gène marqueur peut aussi être déterminée par la coloration d'un substituant quand le gène marqueur code pour une activité enzymatique qui peut être évaluée par un essai colorimétrique. Les différents fragments sont recombinés par ligation in vitro et transformés dans la bactérie réceptrice appropriée. Les transformants sont sélectionnés et ensuite analysés pour déterminer que la construction est convenable. Le transposon désarmé- composite résultant peut être placé dans d'autres souches par transformation ou transduction. Des méthodes conventionnelles de génie génétique sont décrites dans "Molecular cloning, a laboratory manual" (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1986). Le procédé de l'invention peut être utilisé aussi pour amplifier le nombre de copies du gène choisi. En conséquence, l'invention concerne aussi un procédé pour l'intégration d'un nombre déterminé de copies dudit gène choisi. dans lequel, au cours du procédé décrit ci-dessus utilisant un transposon désarmé et après l'intégration, ledit transposon incapable de transposer est complémenté de manière à pouvoir transposer plusieurs fois et la complémentation est ensuite arrêtée après un nombre déterminé de transpositions. Ladite complémentation peut être réalisée de différentes manières. Si le transposon est réellement désarmé, c'est-à-dire s'il né possède pas de transposase, cette dernière peut être introduite dans la cellule hôte grâce à un plasmide ou un phage codant pour ladite transposase. Si l'expression des transposases est réprimée, il est possible d'inactiver le répresseur, dans le cas d'un répresseur sensible à la. chaleur l'élévation de la température aura pour résultat l'expression des transposases., Une fois inséré dans l'ADN receveur, le transposon fabriqué peut être amplifié par transposition sur le génome au moyen de l'inactivation du répresseur conduisant à l'expression des gènes de la transposase. Le transposon dans lequel les gènes de la transposase manquent peut être amplifié par introduction d'un plasmide ou d'un phage contenant des gènes de transposase agissant en trans. Les transposons amplifiés restent de manière stable dans I'ADN bactérien dans les conditions de culture habituelles. On préfère utiliser un transposon désarmé pour stabiliser les gènes choisis. N'importe quel ADN dans une cellule bactérienne peut être la cible de la transposition. On préfère tout particulièrement les ADN qui restent de manière stable dans la cellule bactérienne telle que le chromosome ou un plasmide stable. Selon une réalisation préférée de l'invention, le transposon désarmé utilisé est MudII1734 (Castilho et al., 3. Bact., 158, 488, 1984) qui est présent comme prophage défectif dans une souche d'E. coli (POII1734) déjà lysogène pour un phage mutant Mucts. Cette souche cultivée à basse température est brièvement chauffée et le lysat résultant est utilisé pour la transduction avec une souche réceptrice convenable. Les bactéries résistantes à l'antibiotique adéquat et qui ne produisent pas de phage Mucts ne contiennent que le transposon dans leur chromosome. Le MudI1734 est inséré sur un plasmide, puis l'intérieur du Mud peut être modifiée (selon la partie de la description ci-dessus page 3 ligne 27 à page 4 ligne 9). Le plasmide contenant le Mud modifié est transformé dans une souche lysogénique pour Mucts. Le lysat de phage est obtenu après élévation de la température. Ce lysat de phage est utilisé pour transduire le Mud modifié sur le chromosome d'une bactérie déterminée. Pour amplifier le Mud modifié, la souche qui porte le transposon défectif sur son chromosome est transformée avec un plasmide qui contient les deux gènes de transposase, à savoir les gènes A et B, ou est infectée par le phage. Mu. Dans le cas d'amplification par un plasmide, le plasmide contenant les gènes A et B est maintenu dans la bactérie par l'utilisation d'une sélection (résistance à un antibiotique). Les bactéries qui poussent en présence de cet antibiotique et en même temps synthétisent en grande quantité le produit d'un gène situé dans le transposon sont sélectionnées. Les bactéries qui expriment ces, deux phénotypes peuvent contenir plusieurs copies supplémentaires du transposon sur leur chromosome. -Les bactéries qui ont perdu le plasmide ou qui ne sont pas lysogéniques pour le phage peuvent être obtenues naturellement. La détermination du nombre de copies de transposon peut être effectuée par sélection des bactéries décrites ci-dessus selon le niveau d'expression d'un gène marqueur dans le transposon. Le nombre de copies du transposon contenant un gène de résistance à un antibiotique peut être estimé selon la résistance de la bactérie à l'antibiotique. Le nombre de copies du transposon incluant l'operon lac peut être estimé selon l'intensité de la coloration de colonies bactériennes après dégradation d'un substrat tel que le X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- béta-D-galactoside). Le nombre de copies du transposon peut être déterminé en utilisant le "Southern blotting" et les techniques d'hybridation ADN-ADN avec des sondes appropriées. Les gènes choisis amplifiés à l'aide du transposon restent de manière stable dans la mesure o les gènes de transposase ne sont pas présents ou sont inactifs dans la souche bactérienne. On préfère aussi, dans ce but, introduire des mutations de l'ADN polymérase I ou de l'exonucléase 5' 3' ou une mutation déficiente en HU dans la bactérie hôte après l'amplification. Un aspect important de cette invention est que les souches obtenues sont très stables. Le transposon désarmé ne peut ni transposer davantage ni être délété par aucun mécanisme efficace. Après une culture pendant de nombreuses générations sans pression sélective, les transposons désarmés occupent toujours la même position dans le chromosome. De plus aucun transfert du transposon désarmé n'est détectable au cours des expériences de coculture. La présente invention concerne aussi ladite bactérie qui peut être obtenue par le procédé selon l'invention et concerne également un procédé pour la préparation du produit du gène hétérologue comprenant la culture de la bactérie selon l'invention dans un milieu de culture convenable et la récupération dudit produit. Bien que le gène choisi puisse coder pour un peptide ou une protéine ayant une utilité thérapeutique ou industrielle, une des mises en oeuvre du procédé concerne la préparation de métabolites grâce à l'utilisation de la bactérie obtenue selon le procédé décrit ci-dessus utilisant un transposon désarmé contenant un, plusieurs ou la totalité des gènes pour la biosynthèse des métabolites. La bactérie ayant la capacité de produire une ou plusieurs enzymes, ou un ou plusieurs acides aminés ou des produits voulus, ainsi obtenue peut être cultivée de manière quasi habituelle. On emploie des milieux de culture ordinaires contenant des sources de carbone, d'azote, des ions inorganiques et, si nécessaire, des micronutriments organiques tels que des acides aminés et des vitamines. Comme source de carbone conyenable, on trouve le glucose, le sucrose, le lactose, l'hydrolysat d'amidon contenant ces sucres, le petit lait et la mélasse. Parmi les sources d'azote, on préfère l'ammoniac, l'ammoniaque et les sels d'ammonium. La culture est menée dans des conditions aérobiques, sous pH et température contrôlés jusqu'à ce que les cellules cessent pratiquement de produire le produit voulu. Pour une production telle que celle d'un acide aminé ou d'une protéine, la souche qui produit déjà le produit voulu est préférable comme souche hôte pour la production envisagée. Les exemples suivants ainsi que les figures illustreront d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. - Figure I: Représente schématiquement la carte de restriction' du transposon MudII1734 à large spectre d'hôtes. - Figure 2: Représente schématiquement la construction et la carte de restriction des plasmides pBR322 (MudIIl681) et pPR30. - Figure 3 Montre les résultats de l'électrophorèse suivie par la technique de "blot" hybridation de: l 'ADN d'une souche dans laquelle le nombre de copies de transposon a été amplifié (trace f), 5. l'ADN de 5 souches isolées après 170 générations (canaux a à e), (la sonde est pCE1134; l'ADN a été digéré par EcoRI). - Figure 4: Représente schématiquement la construction et la carte de restriction du plasmide pCE1134. - Figure 5: Représente schématiquement la construction et la carte de restriction du plasmide pAM9. - Figure 6: Montre les résultats de l'électrophorèse suivie par "blot" hybridation de l'ADN des souches A311332, EL1001, EL1002, et EL1003 respectivement pour les canaux A à D; (la sonde est un petit fragment EcoRI de pAM9; l'ADN des souches a été digéré par HindlI). EXEMPLE I: PRODUCTION D'UNE ENZYME AYANT UNE ACTIVITE BETA-GALACTOSIDASE PAR AMPLIFICATION DE LA REGION CODANTE RESPONSABLE DE LA PRODUCTION PAR FERMENTATION DE BETA-GALACTOSIDASE Préparation d'une souche contenant dans son chromosome une copie supplémentaire du gène Béta-galactosidase cloné à l'intérieur d'un transposon désarmé La souche d'E. coli P0111734: F,.araD139, ara:: (Mucts 3, 4 (lac)X74, galU, galK, rpsL (Sm R), (MudII1734) contenant Mud11734 (Fig. 1) (Castilho et al., J. Bacteriol., 158, 488, 1984) a eté cultivée dans 2 ml de milieu LB pendant 2 heures à 30 C, a ensuite subi un choc thermique à C pendant 15 minutes puis a été cultivée à 37 C pendant 2 heures, ceci menant à un lysat de phage. Pour obtenir la solution de phage, ce lysat a été mélangé avec plusieurs gouttes de chloroforme et ensuite centrifugé. Le surnageant a été utilisé comme solution de phage pour infecter la souche de bactérie. La souche d'E. coli MC4100: F-araD139, L(argF-lac), U169, psLI150, relAl, fib5301, ptsF25, deoCl (Casabadan, 1975) telle que décrite par Castilho et al. (1984) a été cultivée pendant une nuit sur milieu LB. On ajoute ensuite du CaCI2 et du MgSO4 jusqu'à une concentration finale de 1 mM et 2,5 mM respectivement. 200 Il de cette culture et de la solution de phage décrite ci-dessus sont mélangés et laissés à température ambiante pendant 15 minutes. Après addition de 2 ml de 'nilieu LB et incubation pendant 2 heures à 30 C, cette suspension de cellules est étalée sur boite de milieu LB contenant 20 pg/ml de kanamycine (Km) et 10 mM de X-gal et ensuite mise en incubation pendant 24 heures à 30 C pour sélectionner les transductants. On identifie les colonies qui ne produisent pas de Mucts après vérification par étalement des répliques sur une souche d'E. coli sensible au Mu et on conserve une souche MC4100 (MudlI1734). Cette souche ne produit pas de Béta-galactosidase comme le montre la couleur blanche des colonies sur les boîtes de milieu LB supplémenté en X-gal, une substance qui passe de l'incolore au bleu quand elle est hydrolysée à la Béta- galactosidase. L'ADN est extrait, scindé avec l'enzyme de restriction EcoRI et les fragments obtenus séparés sur un gel et absorbés sur nitrocellulose. Après hybridation avec l'ADN du transposon marqué, deux bandes sont visibles sur l'autoradioagramme obtenu indiquant la présence d'une copie du transposon dans la souche. Clonage des gènes de transposase A et B du Mu phage sur un plasmide multicopie L'ADN extrait du plasmide pAB8155 contenant le phage désarmé MudIII681 est scindé avec les enzymes de restriction EcoRI et EcoRV. Le fragment de 8,3 kb qui contient les gènes A et B de la transposase est purifié par électrophorèse sur gel et cloné dans le vecteur circulaire pUC19 linéarisé avec SnmaI et EcoRI. Le plasmide reconstitué est transformé dans une bactérie réceptrice convenable. Les colonies résistant aux antibiotiques sont sélectionnées et on montre qu'elles contiennent le plasmide pPR30 (Fig. 2). MC4100 (MudII1734) est transformé avec pPR30 après traitement des cellules au chlorure de calcium (Mandel et Higa, J. Mol. Biol., 53, 159, 1970). Après 2 heures à 30 C sur milieu LB les cellules sont étalées sur des boîtes contenant 20 pg/ml de Km, 25 pIg/ml d'ampicilline (Ap) et 10 pg/ml de X-gal. On incube pendant 48 heures à 30 C et on voit apparaître des colonies colorées en bleu d'intensité variable. Ces colonies sont purifiées sur le même milieu et sélectionnées. L'ADN total est extrait de colonies indépendantes, digéré avec EcoRI puis soumis à électrophorèse et transféré sur membrane de nylon. Après hybridation avec l'ADN du transposon radiomarqué, on détecte plusieurs bandes sur l'autoradiogramme mettant en évidence l'amplification du transposon. Le plasmide pPR30 est éliminé de ces souches par plusieurs transferts successifs sur milieu LB sans Ap. La souche AMI a été particulièrement étudiée: après que I'ADN ait été isolé, digéré par EcoRI et ait subi une électrophorèse, les fragments d'ADN sont transférés sur membrane de nylon. On peut voit 4 bandes d'hybridation sur la figure 3 (bande f) quant on utilise comme sonde un pCE1134 radiomarqué. Ces 4 bandes d'hybridation correspondent à deux insertions du MudI11734. Stabilité du nombre de copie de MudI11734 La souche AMI: MC4100 (MudII1734) qui a deux copies dé MudII1734 sur son chromosome est cultivée pendant 170 générations sur milieu liquide LB sans Km. Puis le nombre de copie de MudIl734 sur le chromosome est mesuré par hybridation ADN-ADN (fig. 3, bandes a à e). Le nombre de copies dans cette souche est resté stable, aucun changement dans les schémas de restriction n'a pu être détecté, ce qui indique une grande stabilité des insertions. Production de beta-galactosidase La souche ainsi obtenue est capable de produire de la Béta-galactosidase. Les souches MC4100 (MudlIl734) et AM1 produisent respectivement 7.10 1 et 10 nMole/mn/mg de protéine ayant une activité Béta-galactosidase. 11. EXEMPLE 2: PRODUCTION DE L-THREONINE PAR AMPLIFICATION DES GENES RESPONSABLES DE LA PRODUCTION DE L-THREONINE PAR FERMENTATION La souche POII1734 (Castilho et al., 3. Bacteriol., 158, 488, 1984), construction de pCE1134, est transformée avec pCEIOO (2,1 kb, CmR, Fig. 4) après traitement des cellules avec du chlorure de calcium (Mandel A. et Higa M., 3. Mol. Biol., 53, (1970)). Les transformants sont sélectionnés sur des boîtes de milieu LB contenant du 25 pg/ml de chloramphénicol (Cm) après 24 heures d'incubation à 30 C. Le transformant POII1734/pCEI00 est cultivé pendant 2 heures à 30 C dans 3 ml de milieu LB, soumis ensuite à un choc thermique pendant 15 minutes à 45 C puis cultivé à 37 C pendant 2 heures, conduisant à un lysat de phage. Pour obtenir la solution de phage, ce lysat est mélangé avec plusieurs gouttes de chloroforme et ensuite centrifugé. Le surnageant est appelé solution de phage I. E. coli M8820 (Mu) (Castilho et al., 3. Bacteriol., 158, 488, 1984) est cultivé pendant une nuit sur un milieu LB, auquel on ajoute du chlorure de calcium et du sulfate de magnésium à une concentration finale de I mM et 2,5 mM respectivement. 200 pl de cette culture et de la solution de phage I sont mélangés et laissés à température ambiante pendant 15 minutes. Après addition de 2 ml de milieu LB et incubation à C pendant 2 heures, cette suspension de cellules est étalée sur des boîtes de milieu LB contenant 20 pg/ml de Km et 25 pg/ml de Cm, puis mise en incubation à 30 C pendant 24 heures. On récolte les 20 clones qui sont apparus sur les boîtes et on procède à une extraction de plasmide par la méthode de mini-préparation (Birnboim et Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513, 1979). L'analyse de la carte de restriction a montré que tous les clones présentaient un plasmide dans lequel MudII1734 était inséré. Un d'entre eux a été nommé pCE1134 (Fig. 4). Construction de MudAM9 comprenant l'opéron Thr pCE1134 a été complètement clivé par les enzymes de restriction BamHI et ensuite Sall. On isole le fragment d'ADN, dans lequel l'opéron lac est manquant, par électrophorèse sur gel d'agarose et on l'extrait à partir de ce gel. Le plasmide pAJ294 (Miwa et al., Agric. Biol. Chem., 47, 2329, 1983) a été complètement clivé par les enzymes de restriction BamHI puis SalI. Après une électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment d'ADN qui contient l'opéron thr est extrait du gel. Les deux fragments d'ADN sont mélangés et on procède à la ligation à 10 C pendant 16 heures au moyen de T4-ADN ligase, d'ATP et de dithiothréitol. Après transformation de la souche mutante thrB avec le mélange de ligation, les transformants ont été sélectionnés sur un milieu minimum contenant 25 pg/ml de Cm et pas de thréonine. Le plasmide est extrait d'un des transformants et s'avère contenir Mud avec le gène npt et l'opéron thr (pAM9, Fig. 5). Transposition de MudAM9 sur l'ADN chromosomique La souche d'E. coli 3M109 (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119 (1985)) (Mucts) est transformée avec pAM9 après traitement au chlorure de calcium. Les transformants sont sélectionnés sur des boîtes dé milieu LB contenant 20 pg/ml de Km et 25 pig/ml de Cm, après incubation à 300C pendant 24 heures. Les plasmides sont extraits de 20 colonies indépendantes et s'avèrent être pAM9. JM109 (Mucts)/pAM9 est cultivé à C pendant 2 heures après avoir subi un choc thermique à 450C pendant minutes. On maintient la culture à 37 C pendant 2 heures. Ensuite, on mélange la culture avec quelques gouttes de chloroforme et on laisse à température ambiante pendant 15 minutes. On obtient la solution de phage II après 10 minutes de centrifugation à 5 000 tours/minute. A la culture de JM109 (Mucts) laissée une nuit à 30 C sur milieu LB, on ajoute du CaCI2 et du MgSO4 jusqu'à une concentration finale de I mM et 2, 5 mM, respectivement. 200 pl de cette solution et de la solution de phage II sont mélangés et laissés à température ambiante pendant 15 minutes. Après addition de 2 ml de -milieu LB, on laisse en incubation à 30 C pendant 2 heures et on étale cette suspension de cellules sur des boîtes de milieu LB contenant 20 pg/ml de Km. Après incubation à C pendant 24 heures, on récolte 100 colonies et on vérifie leur sensibilité au Cm. 95 % d'entre elles sont sensibles au Cm et s'avèrent être des 3M109 (Mucts) (MudAM9). Apres culture de JM109 (Mucts) (MudAM9) à 30 C pendant 2 heures sur milieu LB, on procède à un choc thermique pendant 15 minutes à 45 C et on poursuit par une incubation à 37 C pendant 2 heures. On ajoute ensuite quelques gouttes de chloroforme et on centrifuge à 5 000 tours/minute pendant 10 minutes. Le surnageant obtenu est la solution de phage III. A la souche d'E. coli AJ11332 (Shiio et al., Agric. Biol. Chem., 33, 1152, 1969), cultivée pendant une nuit, on ajoute du CaCI2 et du MgSO4 jusqu'à des concentrations finales de I mM et de 2,5 mM, respectivement. On mélange 200 pl de cette solution et la solution de phage III, on laisse à température ambiante pendant 15 minutes. Après addition de 2 ml de milieu LB on continue l'incubation à 30 C pendant 2 heures. La suspension de cellules est étalée sur des boîtes de milieu LB contenant 20 Ig/ml de Km et on met ensuite en incubation à 30 C pendant 24 heures. On récolte 100 colonies et on teste leur lyse à 45 C et leur sensibilité au phage Mu. % des colonies ne lysent pas et sont sensibles -à Mu. Une de ces souches est appelée EL1001. Amplification de MudAM9 sur l'ADN chromosomique et choix du nombre de copie (i) Amplification de MudAM9 par pPR30: On transforme la souche ELIOO1 avec pPR30. Les transformants sont sélectionnés sur des boîtes de milieu LB contenant 25 pg/ml d'Ap et une quantité variable de Km et/ou de Néomycine (Nm). (ii) Amplification par lysat de Mucts La souche ELI001 est infectée par un lysat de Mucts tel que décrit ci-dessus et ensuite étalée sur des boîtes de milieu LB contenant des quantités variables de Km. Les clones obtenus à partir de pPR30 dans le cas de (i) et ceux obtenus à partir de Mu dans le cas de (ii) sont sélectionnés pour fabriquer un nombre stable de copies de MudAM9. Après incubation à 30 C pendant 48 heures, on récolte les colonies et on mesure le nombre de MudAM9 sur l'ADN chromosomique par la méthode d'hybridation décrite ci-dessus. On étudiera plus particulièrement les souches EL1002 et EL1003. L'ADN est extrait des souches A311332, EL1001, EL1002 et EL1003. Après digestion par l'enzyme de restriction HindIII, on soumet l'ADN à une électrophorèse et on le transfère sur membrane de nylon. L'ADN est ensuite hybridé avec des petits fragments de pAM9 radiomarqués digérés par EcoRI. Les résultats sont présentés sur la figure 6. Les bandes A, B, C et D correspondent respectivement aux souches A311332, EL1001, EL1002 et EL1003. La lettre a correspond au type sauvage de l'opéron thr, la lettre b correspond à une bande non identifiée que l'on voit sur les bandes B, C et D. Les chiffres correspondent aux bandes spécifiques de MudAM9. Selon ces résultats, les souches EL1001, EL1002 et EL1003 ont 1, 4 et 10 copies (au moins) de MudAM9. La relation entre le nombre de copie de MudAM9 dans la souche et la concentration d'antibiotiques auxquels la souche.est résistante est résumée dans le tableau I TABLEAU I Relation entre le nombre de copies de MudAM9- et la résistance à l'antibiotique Nbre de copies de MudAM9 Résistance Sensibilité 0 20 pg/ml Km 1 200 Ig/ml Km 250 pg/ml de Km et Nm 2 (ou plus) 250 IJg/ml de Km et Nm Production de L-thréonine Les souches ayant MudAM9 amplifié sont rafraîchies sur boîtes de milieu LB à 30 C pendant 24 heures et inoculées dans 20 ml du milieu de production décrit ci-dessous. Composition du milieu de production- Glucose - 30 g/l, (NH4)2 SO4: 10 g/l, KH2 PO4:1 g/l, MgSO4 7H20: 1 g/l, FeSO4 7H20: 10 mg/l, MnSO4 4-6H20: 10 mg/l, L-Met: 0,1 g/l, L-Ile: 0,1 g/l, L-Pro: 0,45 g/1, ARN: 2 g/l, Thiamine HCI: I mg/l et CaCO3: 40 g/l (pH: 7,0). La culture est agitée à 30 C pendant 72 heures. La quantité de thréonine dans le milieu est mesurée grâce à un analyseur d'acide amine. Les résultats sont rassemblés dans le tableau II: TABLEAU II Production de L-Thréonine par des souches contenant MudAM9 Souche Estimation du nombre de copie de MudAM9 L-Thr (g/l) AJ11332 0 3 ELII001 I (au moins) 3,3 EL1002 4 (au moins) 8,9 EL1003 10 (au moins) 12 Stabilité du nombre de copies de Mu. dAM9 et productivité en L-thréonine La souche EL1002 contenant 4 copies de MudAM9 est transférée plusieurs fois successives sur boîtes de milieu LB sans antibiotiques et après chaque transfert on teste la productivité en L-thréonine en appliquant la méthode décrite ci-dessus. Les résultats sont rassemblés dans le tableau III: TABLEAU III Stabilité de la production de L-thréonine après transferts répétés sur milieux LB sans antibiotiques avec la souche EL1002 Nombre de transferts 0 2 4 6 8 10 Production de L-Thr 8,5 8,6 8,5 8,8 8,8 8,9 Le tableau IV montre les activités spécifiques des enzymes de la biosynthèse de L-Thr des souches contenant MudAM9 TABLEAU IV Production en grande quantité des enzymes de la biosynthèse de la Lthréonine par AJ11332 (mudAM9) Souche Activités spécifiques. (*) AKI HDHI A311332 2,5 4,8 ELI001 4,0 10,1 EL1002 12,5 25,0 EL 1003 22,5 37,4 (*) Les activités spécifiques sont données en pmole/min/mg de protéine 26 2 75 0 8 Les souches suivantes ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur-Roux à paris (15ème) le 25 janvier 1988: - Escherichia coli K12 POI11681 sous le n 1-727 - Escherichia coli K12 POIII734 sous le n 1-728 - Escherichia coli K12 EL1001 sous le n 1-729 - Escherichia coli K12 EL1002 sous le n 1-730 - Escherichia coli K12 EL1003 sous le rin' 1-731. REVENDICATIONS 1) Procédé pour l'intégration d'un gène choisi ou d'une séquence d'ADN déterminée dans une séquence d'ADN telle que le chromosome ou l'épisome d'une bactérie, caractérisé en ce que: a) ledit gène choisi, ou la séquence d'ADN choisie, est cloné à l'intérieur d'un transposon à l'extérieur des parties essentielles du transposon, b) ledit transposon est intégré dans la séquence d'ADN telle que le chromosome ou l'épisome de ladite bactérie. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit i transposon est désarmé. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit transposon n'est pas capable de transposer. 4) Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le transposon est dépourvu de transposase. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le transposon n'a pas les gènes codant pour ses transposases. 6) Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en:ce que l'expression des transposases est réprimée dans ledit transposon. 7) Procédé selon l'une des revendications I à 6, caractérisé en ce que ledit transposon est inséré sur un plasmide et ledit transposon est introduit dans la bactérie par transformation avec ledit plasmide. 8) Procédé selon l'une des revendications I à 6, caractérisé en ce que ledit transposon est contenu dans un bactériophage et ledit- transposon est introduit dans la bactérie par transduction avec ledit phage. 9) Procédé pour l'intégration stable d'un nombre déterminé de copies du gène choisi, caractérisé en ce que, au cours du procédé selon l'une des revendications 3 à 8, après l'intégration, ledit transposon incapable de transposer est complémenté de manière à pouvoir transposer plusieurs fois et ensuite la complémentation est stoppée après un nombre déterminé de transposition. ) Procédé selon la revendication 9,.caractérisé en ce que le transposon est complémenté par transformation de ladite bactérie avec un plasmide exprimant les transposases ou par transduction avec ledit phage. 11) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le transposon est activé après inactivation du répresseur conduisant à l'expression des gènes des transposases. 12) Procédé selon l'une des revendications I à 11, caractérisé en ce que ledit gène choisi est sous le contrôle d'un promoteur qui est aussi à l'intérieur du transposon et qui autorise l'expression dudit gène dans ladite bactérie. 13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit transposon est choisi parmi le groupe constitué par Tn3, Tn5, Tn7, TnlO, Tn903, TnHoHo, IS 1, IS10, IS 50, les phages MudI et MudlI. 14) Procédé selon l'une des revendications I à 13, caractérisé en ce que ladite bactérie appartient à la famille des Enterobacteriacées, des Rhizobiacées ou des Pseudomonas. ) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite bactérie est choisie parmi le groupe constitué par: Escherichia coli, Citrobacter freundii, Erwinia herbicola, Salmonella thyphimurium, Shigella sonneii, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas putida. 16) Procédé selon l'une des revendications I à 15, caractérisé en ce que ledit transposon code aussi pour un gène marqueur. 17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit gène marqueur est un gène de résistance à un antibiotique s'exprimant dans ladite bactérie. 18) Procédé selon l'une des revendications 9 à 17, caractérisé en ce que le nombre de transpositions est évalué par la détermination de l'expression du gène marqueur. 19) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'expression du gène marqueur est déterminée par la résistance à un antibiotique quand ledit gène marqueur est un gène de résistance à un antibiotique. ) Procédé selon la revendication 18, caractérisé. en ce que l'expression du gène marqueur est déterminée par la coloration d'Un substituant quand le gène marqueur (tel que l'opéron lac) est un gène dont le produit peut être visualisé par un marqueur colorant. 21) Procédé selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que: ledit gène choisi et son promoteur actif dans ladite bactérie hôte sont clones à l'intérieur d'un phage Mud qui est dépourvu en gènes pour les transposases, dans une partie non essentielle du transposon, ledit transposon est intégré à l'intérieur du chromosome d'une bactérie hôte compatible, ledit transposon est complémenté par transformation de l'hôte avec un plasmide codant pour les transposases ou par infection par le phage Mu, 10. après un nombre déterminé de transpositions les souches naturellement guéries (sans plasmide ou phage Mu) sont sélectionnées. 22) Souche de bactérie obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications I à 21. 23) Procédé selon l'une des revendications I à 21, caractérisé en ce que lesdits gènes choisis sont un ou plusieurs gènes de la voie de biosynthèse de la L-thréonine. 24) Bactérie selon la revendication 22 produisant la thréonine en grande quantité qui comprend dans son chromosome plusieurs copies d'un transposon ayant à l'intérieur tout ou partie des gènes de la biosynthèse de la thréonine. ) Bactérie selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'il s'agit de E. coli. 26) Procédé selon l'une des revendications I à 21, caractérisé en ce que ledit gène choisi code pour un peptide ou une protéine. 27) Procédé pour la préparation des produits des gènes choisis comprenant la culture d'une bactérie selon l'une des revendications 22, 24 et 25 sur un milieu de culture convenable et la récupération desdits produits. 28) Procédé pour la production d'un peptide ou d'une protéine selon l'une des revendications 21 et 26 sur un milieu de culture convenable et récupération dudit produit.