Brevet FR2623817A1 — publié le 19890602

SONDES POUR LA DETECTION D'ENTEROVIRUS PAR HYBRIDATION MOLECULAIRE ET POUR LA DISCRIMINATION ENTRE DES POLIO VIRUS ET D'AUTRES ENTEROVIRUS. Les entérovirus comportent des virus dont un certain nombre provoquent de graves maladies chez l'homme. Parmi les entérovirus, les plus étudiés sont les trois types de poliovirus ; les autres membres, comme les coxsackievirus, le virus de l'hépatite A Les laboratoires de diagnostic utilisent des tests immunologiques assez simples (micro-tests de neutralisation, ELISA..) pour caractériser les entérovirus isolés. Dans la majorité des cas, si on dispose d'une batterie d'anticorps de spécificité étroite (il n'existe pas de spécificité de groupe), on parvient à distinguer sans équivoque différentes souches virales. Dans quelques cas cependant, les méthodes sérologiques sont en défaut car elles n'explorent que les protéines de capside et uniquement sous l'-angle de leurs épitopes. L'analyse du génome viral réalisée par les méthodes biochimiques apparait comme un outil complémentaire sinon plus sensible. Les hybridations moléculaires des acides nucléiques ont été appliquées avec succès dans la détection rapide de différents virus à DNA ou'RNA. Dans les tests d'hybridation, les acides nucléiques sont fixés sur le support solide et détectés par les sondes radioactives ou non radioactives, alors dites 'froides". On a ainsi développé comme sondes l'utilisation des fragments de restriction du cDNA des virus à RNA, que l'on peut hautement marquer par "nick-translation" (translation de coupure) ou encore des oligonucléotides de synthèse marqués en 5' ou 3'. Ceci étant, les sondes obtenues ne permettent pas, dans de nombreux cas, soit d'identifier un entérovirus dans les échantillons ou prélèvements biologiques en raison d'une sensibilité insuffisante de la sonde, soit d'identifier la catégorie d'entérovirus à laquelle l'espèce identifiée appartient dans le cas où une hybridation est détectée. L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients, notamment de fournir des sondes à la fois plus sensibles et plus spécifiques. Les sondes d'hybridation moléculaire selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont constituées par des ARN (acides ribonucléiques aussi désignées ci-après par l'abréviation RNA) résultant notamment de la transcription des cDNA correspondants (eux-mêmes dérivés de RNA d'entérovirus) en présence d'une RNApolymérase, en présence des quatre ribonucléotides. Ces derniers RNA sont ci-après désignés "cRNA". Bien que le HAV (dont le génome a été séquencé : voir demande de brevet européen n 86.302465.9/199 480) ne constitue pas à proprement parler un entérovirus, il sera considéré comme en faisant partie, pour les besoins de la présente description. A titre d'autres exemples d'entérovirus pris en considération dans le cadre de la présente invention, on mentionnera - le poliovirus de type 1 (PV1),notamment les sondes de la souche Mahoney, - les poliovirus de types.2 et 3 (PV2 et PV3), - les Coxsackievirus, notamment les Coxsackievirus A, par exemple de types 7, 9 et 21 (CA7, CA9 et CA21) et les Coxsackievirus B, par exemple de types 1, 3 et 4 (CB1, CB3 et CB4), - les échovirus, par exemple de types 9, 11 et 33 (ECHO9, ECHO1? et ECHO33), - les rhinovirus, par exemple de type 2 (HRV2) etc... L'invention concerne plus particulièrement - les cRNA correspondant à la région de VPl des poliovirus, - les cRNA correspondant aux régions 5' non codantes des génomes des entérovirus, plus particulièrement des poliovirus de types 1, 2 et 3, et - les cRNA de HAV, correspondant aux régions 5' non codante, centrale et 3' terminale. Les sondes cRNA selon l'invention se sont avérées non seulement plus sensibles que les cDNA correspondant dans des essais d'hybridation moléculaire appliqués à la détection de la présence d'ARN d'entérovirus dans des échantillons biologiques, notamment des selles de sujets infectés, mais également capables, du moins pour certains d'entre eux, de discriminer certaines catégories d'entérovirusentre elles. Il a en particulier été constaté que: - les cRNA correspondant aux régions 5' non codantes des poliovirus permettent la détection de la présence d'entérovirus dans des échantillons biologiques, notamment de selles, avec un grand degré de sensibilité, néanmoins sans les distinguer entre eux. - en revanche, les cRNA correspondant à la région VP1 du poliovirus permettent de différencier en cas de réponse positive les poliovirus des autres entérovirus, à l'exception de CA21 du fait de sa grande homologie de séquence avec les poliovirus. - les cRNA de HAV permettent la détection des HAV et leur discrimination avec d'autres entérovirus, là où les techniques antérieures échouaient souvent dans des opérations de diagnostic visant à identifier une hépatite A ou une infection à entérovirus chez les malades infectés avec les virus correspondants. Les constatations qui précèdent découlent en particulier des essais dont une description est donnée ci-après à titre d'exemples. Auparavant l'on indique brièvement les conditions dans lesquelles les différentes sondes cRNA ont été obtenues. 1/ Synthèse des sondes cRNA Les fragments de cDNA du poliovirus de type 1 (souche Mahoney) corespondant aux régions génomiques 5' non codantes (nucléotides 221-670), régions de protéines de la capside VP1 (nucléotides 3064-3417), VP3 (nucléotides 1809-2243), de la région centrale 2C (nucléotides 4601-4886) et de la région 3' (nucléotides 6500-7443), ont été insérés dans les vecteurs Gemini 1 ou 2 commercialisés par la société PROMEGA-BIOTECH, entre les promoteurs SP6 et T7 de ces vecteurs. Le plasmide contenant l'insérat de cDNA est linéarisé par un enzyme de restriction approprié. La séquence du cDNA inséré est alors transcrite en cRNA à l'aide de la SP6 - ou T7-RNA-polymérase, en présence de 4 nucléotides triphosphate, dont l'un est marqué par un radioélément l'a 32P-UTP. On obtient une sonde hautement radioactive (activité spécifique > à 2 x 108 cpm/pg). Selon l'orientation de l'insérat par rapport aux promoteurs de SP6 ou T7, on synthétise des cRNA de polarité négative ou positive. Les exemples qui suivent illustrent plus complètement encore les conditions dans lesquelles les sondes cRNA selon l'invention peuvent être utilisées. 2/ Test d'hybridation Par taches (Dot-hvbridation). Des échantillons de lysats cellulaires ou de surnageants d'échantillons de selles reprises dans un milieu nutritif (BME de Eagle) ont été incubés en présence de protéinase K (100 pg/ml) pendant 1 heure à 37ex. Les aliquots d'échantillons ont été dilués avec 20 x SSC et directement appliqués sur un filtre de cellulose (0,45 pm SCLEICHER AND SCHUE) en utilisant un appareil permettant le dépôt d'échantillon par aspiration sous vide (hybridot manifold apparatus de BRL par exemple). 100 pl de lysat de cellules infectées avec des entérovirus avec un titre infectieux connu (5 x 106-107- TCID50/ml) ou 100 pl d'une suspension brute de selles ont été introduits dans les puits de l'appareil. Les filtres ont été chauffés au four pendant 2 heures à 80-C. L'hybridation a été réalisée pendant la nuit à 42iC dans une solution : 50 % de formamide, 5xSSC, 3xDenhardt, 0.05 M tampon de phosphate de sodium pH 7,2; EDTA 0,001 MT et 100 pg/ml de DNA dénaturé de sperme de saumon et 106 cpm/ml de cRNA radioactif.Les filtres ont été lavés à 65vC dans une solution 2xSSC, SDS 0,1 %, puis dans une solution 1xSSC, SDS 0,1 % et enfin deux fois dans une solution O,5xSSC, SDS 0,1 %. Les filtres ont été séchés à l'air et exposés avec un film de marque FUJI RX pendant 20-48 heures à -70-C 3/ Etude comparée de sondes cDNA et cRNA La sensibilité des sondes cDNA. marquées par "nick translation" et celle de sondes cRNA synthétisées et marquées in vitro sont comparées. Les RNA purifiés ont été hybridés avec les sondes cDNA et cRNA marquées au P32 correspondant à la séquence de VP3 du poliovirus. Les résultats (figures 1 et 2) montrent que la sonde cDNA détecte très spécifiquement le RNA de la souche homologue (PVî), beaucoup plus faiblement les poliovirus 2 et 3 et pas du tout les RNA des autres entérovirus testés. En revanche, la sonde cRNA de polarité négative, de la même région VP3, donne un signal d'hybridation beaucoup plus fort avec les trois types de poliovirus, bien que dans les dilutions successives de RNA, on puisse déceler des différentes homologies entre les trois types de virus. Cette sonde permet, par ailleurs, la détection de RNA, de Coxsackie B4 et d'ECHOvirus 9 montrant ainsi les homologies des séquences de cette région entre certains entérovirus. Toutefois, le RNA de Coxsackie B3 ne donne aucun signal, comme les témoins (extraits des cellules non infectées). Ces résultats, conformes avec d'autres sondes, conduisent à la conclusion que les sondes cRNA synthétisées et marquées in vitro, de polarité négatives, sont plus sensibles dans les hybridations moléculaires avec les RNAs viraux que les sondes cDNA homologues. 4/ Détection des entérovirus dans les lysats cellulaires La présence de RNA de différents entérovirus dans les lysats de cellules infectées a été recherchée par hybridation moléculaire. 1s) Avec la sonde cRNA de VP1, on détecte les 3 types de poliovirus et, bien que plus faiblement, le coxsackievirus A 21. Cette sonde VP1 spécifique de poliovirus n'a pas été capable de détecter d'autres entérovirus cependant présents dans les lysats cellulaires étudiés (mise en évidence par séroneutralisation). Ces résultats (fig. 3) montrent la faible homologie de la séquence VP1 avec le RNA de ces virus. Cette "sonde VP1" est donc spécifique des poliovirus. 2') En revanche, la sonde cRNA de la région 5' non codante de PV1 est capable de détecter les 3 types de poliovirus, Coxsackie virus B1, B4, A7, A9, A21, ECHOvirus 9, ECHOvirus 11, ECHOvirus 33 et le rhinovirus type 2. Cette sonde n'hybride pas avec certains autres entérovirus : ni avec le virus Theiler de l'encéphalite murine (TMEV), ni avec le HAV, (fig. 4). D'ailleurs, aucune sonde cRNA, PV1 n'a hybridé avec le HAV, confirmant ainsi l'absence d'homologie nucléotidique entre ces deux virus : la sonde 5' non-codante du PV1 peut être utilisée comme sonde à large spectre dans la détection des entérovirus. 5/ Détection des entérovirus dans des extraits de selles. La présence de certains entérovirus (fig. 5) dans des extraits bruts (PO), ou après un premier (P1) ou deuxième passage (P2) dans des cellules permissives a pu être montrée. L'utilisation de la SONDE 2C ou 5' noncodante a permis de mettre en évidence la présence des poliovirus type 3, Coxsackie B5 et ECHO 1 dans des extraits de selles et lors de passages successifs sur des cellules permissives. Certains virus n'ont été détectés qu'après le premier ou le deuxième passage. 6/ Détection du virus HAV L'utilisation d'une sonde cRNA spécifique HAV permet la détection de ce virus. Des cRNA peuvent être produits à partir de vecteurs de transcription (Gemini)avec des insérats de cDNA du HAV. Le RNA de polarité négative et hautement radioactif peut être synthétisé selon le même procédé que celui décrit ci-dessus pour les cRNA de PV1. Elle permet la détection par hybridation du RNA de HAV. Le virus- éventuellement présent, dans des cellules infectées, dans des selles ou dans des échantillons d'eaux polluées peut être recherché avec cette méthode. L'intérêt d'une nouvelle technique utilisable pour le diagnostic rapide d'une hépatite ou d'une gastroentérite sur des échantillons de selles n'est pas à souligner surtout si cette recherche de virus HAV est couplée avec celles d'autres entérovirus (virus de la poliomyélite, Coxsackies, ECHO) à l'aide de sonde cRNA spécifiques et sensibles correspondantes. Il est important de connaitre combien la technique d'isolement des virus sur cultures cellulaires est longue et aléatoire. L'isolement des Coxsackies A mais surtout celui de l'hépatite A en sont des exemples : la réplication de l'HAV en culture n'entraine pas d'effet cytopathogène et l'apparition de virions complets intracellulaires ne survient jamais avant la troisième ou la quatrième semaine après l'inoculation de l'échantillon clinique sur cellules PLC/PRF/5, qui sont actuellement les plus sensibles. Cette technique de détection de virus par hybridation sur nitrate de cellulose est aussi extrêmement utile pour détecter dans les surnageants de cultures infectées la présence éventuelle d'HAV. Actuellement, seule une technique immunoenzymatique ou radioimmunologique peut être utilisée. La spécificité de la réaction doit toujours être confirmée par réaction du blocage par compétition (utilisation d'un anticorps monoclonal par exemple). L'utilisation des sondes cRNA selon l'invention permet une détection plus rapide, significative et précoce d'une infection par HAV. Il résulte donc de ce qui précède que les sondes cRNA selon l'invention permettent - une détection plus sensible de la présence d'entérovirus dans un échantillon biologique, notamment grace à l'utilisation de sondes cRNA correspondant à la région 5' du génome des entérovirus, et en particulier du poliovirus. - une discrimination plus facile des poliovirus et entérovirus qui leur sont étroitement apparentés, (notamment grâce à l'utilisation de sondes cRNA correspondant à une région VP1 de l'un des poliovirus PV1, PV2 ou PV3, plus particulièrement PV1), - une identification plus sensible et spécifique des HAV, gracie à l'utilisation de sondes cRNA dérivées de HAV. L'invention concerne encore les kits ou nécessaires de diagnostic in vitro contenant - des sondes de cRNA correspondant aux régions 5' des génomes d'un entérovirus, notamment d'un poliovirus, - des sondes cRNA correspondant à la région VP1 d'un poliovirus, plus particulièrement et, le cas échéant - des sondes cRNA dérivées du génome de HAV, et - le cas échéant, les tampons ou constituants de ces tampons nécessaires à des réactions d'hybridation mettant en oeuvre lesdits cRNA. Dans ce qui précède les sondes utilisées étaient des sondes radioactives. Il va de soi que tout autre type de marqueur peut être mis en oeuvre, par exemple un marqueur enzymatique détectable par son action sur un substrat spécifique de l'enzyme ou un marqueur fluorescent. Les techniques de marquage enzymatique ou fluorescent sont suffisamment connues pour qu'il ne soit pas nécessaire d'insister davantage sur le sujet. REVENDICATIONS 1. Sonde cRNA d'un entérovirus 2. Sonde selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est dérivée d'un poliovirus 3. Sonde selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle correspond à la région d'extrémité 5', non codante, du génome d'un poliovirus. 4. Sonde selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle correspond à une région VP1 d'un poliovirus, tel que PVî. 5. Sonde selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est dérivée d'un HAV. 6. Sonde selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est dérivée de la région 5' non codante centrale et 3' terminale. 7. Procédé de détection d'un entérovirus dans un échantillon biologique, notamment de selles, caractérisé en ce que l'on met en contact les DNA et RNA contenus dans l'échantillon, ces RNA ayant, le cas échéant, préalablement été amenés dans un état où ils sont accessibles à l'hybridation, avec une sonde d'hybridation constituée par une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, et ce dans des conditions autorisant l'hybridation entre la sonde et l'ARN d'entérovirus éventuellement présent dans l'échantillon biologique, et en ce que l'on détecte le produit d'hybridation entre la sonde et le RNA d'entérovirus. 8. Procédé de détection selon la revendication 7, caractérisé en ce que la sonde est un cRNA correspondant à l'extrémité 5' du génome d'un poliovirus. 9. Procédé de détection selon la revendication 7, caractérisé en ce que la sonde est un cRNA correspondant à la région VPî d'un poliovirus notamment du type PV1. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, dans une première étape, on réalise l'essai de détection avec un cRNA correspondant à l'extrémité 5' du génome d'un poliovirus et, en cas de réponse positive, on répète l'essai de détection avec un cRNA correspondant à la région VP1 d'un poliovirus, notamment du type PV1, de sorte qu'en cas de réponse positive renouvelée, on peut en conclure que l'entérovirus détecté au terme de la première étape est un poliovirus ou un entérovirus apparenté à un poliovirus. 11. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la sonde cRNA utilisée est dérivée de HAV. 12. Kit ou nécessaire de diagnostic in vitro de la présence d'entérovirus dans un échantillon ou prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il contient - au moins une sonde cRNA correspondant à la région 5' du génome d'un poliovirus, notamment de type PV1, - au moins une sonde cRNA correspondant soit à la région VPl d'un poliovirus, notamment de type PVî, - le cas échéant, une sonde cRNA dérivée de HAV - le cas échant aussi, les tampons ou constituants nécessaires à la réalisation des tampons permettant la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation entre ces sondes et l'ARN d'un rétrovirus contenu dans un échantillon ou prélèvement biologique présumé contenir un entérovirus.