Brevet FR2625321A1 — publié le 19890630

La présente invention concerne un réactif pour le diagnostic de Staohvlococcus aureus par ag- glutination. On connait déjà divers réactifs pour le diagnostic de Staohvlococcus aureus. Ces réactifs sont basés sur la recherche soit de la protéine A du Sta- phylocoque, soit du facteur d'affinité pour le fibri- nogéne, soit des deux simultanément. La protéine A est un antigène de nature protéique, constituant externe de la paroi de la ma- jorité des souches de StaDhvlococcus aureus d'origine humaine (85 à 95Z). La protéine A fixe, par un procédé -non immunologique, le fragment Fc des immunoglobines, laissant libre la partie Fab. Si l'on met en présence des souches de Sta- phvlococcus aureus possédant la protéine A et des hématies de mouton, ou des particules de latex, sen- sibilisées, par exemple avec du sérum de lapin anti- hématies de mouton, on observe en quelques minutes, une agglutination visible à l'oeil nu. Le facteur d'affinité pour le fibrinogène, qui est fixé à la surface de Staphvlococcus aureus réagit directement avec le fibrinogène. Ce facteur d'affinité pour le fibrinogène peut être recherché, en quelques secondes, en mettant en contact la souche à étudier et des hématies de mouton (hémagglutination passive) ou des particules de latex, les unes ou les autres recouvertes de fibrinogène. Différentes études publiées montrent qu'un certain nombre de souches de Staohvlococcus aureus ne sont pas identifiées par ces réactifs. Leur pourcen- tage varie de 1 à 5Z lorsque ces études sont réalisées sur l'ensemble des Staphylocoques dorés isolés. Mais ce pourcentage d'échec est plus important lorsque seules les souches résistantes à l'oxacilline (ou la méticilline) sont prises en considération et ce pour- centage atteint 25% dans une étude récente réalisée avec 73 souches de Staphylococcus aureus résistantes à l'oxacilline (voir P. J. Ruane et al, J. Clin. Micro- biol. 24, 490, 1986). Dans une étude réalisée, sous la direction de l'un des inventeurs, sur 183 souches de StaDhvlo- coccus aureus isolées de malades dans 5 h6pitaux de Paris et de la région parisienne, on a trouvé que 11 souches (6%) ne sont pas agglutinées par un ou plu- sieurs des trois réactifs utilisés (Staphyslide , Sta- phaurexe et Pastorex Staph). Si on ne considère que les 46 souches résistantes à l'oxacilline, on constate que 10 souches (22%) sont faussement négatives avec ces réactifs. Ces résultats sont donc en accord avec ceux décrits dans la littérature. Mais, cette étude a révélée que toutes les souches faussement négatives possèdent du polyoside capsulaire. Il est donc vraisemblable que ce polyoside capsulaire, qui recouvre toute la bactérie dans cer- taines conditions (isolement récent, conditions de culture), masque les antigènes (protéine A, facteur d'affinité pour le fibrinogène) reconnus par ces réac- tifs, et empêche ainsi l'agglutination bactérienne. C'est à partir de ces constatations que la présente invention a été conçue. La présente invention a pour objet un réac- tif pour le diagnostic de Staphvlococcus aureus par agglutination, du type comprenant des particules en suspension sur lesquelles sont fixés des anticorps ayant une affinité pour la protéine A du staphylocoque et du fibrinogène, caractérisé en ce qu'il comprend des particules en suspension sur lesquelles sont fixés au moins des anticorps reconnaissant de façon spécifi- que un polyoside capsulaire de Staphvlococcus aureus. A ce jour 11 types de polyosides capsulaires ont été identifiés par des méthodes essentiellement immunologiques. Voir à ce sujet: W. W. Karakawa et al. Capsular polysaccharides of Staphvylococcus aureus p. 285-293. In 3.B. Robbins, 3.C. Hill, and 3.C. Sa- doff (ed.) Seminars in infectious disease. vol. 4. Bacterial vaccines. Thieme Stratton. Inc. New York; W. W. Karakawa et al. 3. Clin. Microbiol. 22: 445-447, 1985; Sompolinsky et ai, 3. Clin. Microbiol. 22: 828- 834, 1985. La purificationn et la caractéristique bio- chimique et immunologique du polyoside capsulaire de type 8 ont été réalisées en 1984 (J.M. Fournier et al, Infect. Immun. 45: 87-93) et celles du type 5 en 1987 (3. M. Fournier et al, Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 138: 561-567). Des anticorps monoclonaux spécifiques des polyosides capsulaires 5 et 8 ont été décrits (H.K. Hochkeppel et al.. J. Clin. Microbiol. 25: 526-530, 1987, et M. 3. Nelles et ai. Infect. Immun. 49: 14- 18, 1985). Par ailleurs des études épidémiologiques réalisées sur un grand nombre de souches de Staohv- lococcus aureus isolées de malades, ont montré que 70 à 80X de ces souches possédaient l'un ou l'autre des polyosides capsulaires 5 et 8 (par exemple R.D. Arbeit et al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2: 85-91, 1984). Aussi dans la présente invention les anti- corps reconnaissant un polyoside capsulaire de Sta- ohvlococcus aureus sont constitués avantageusement au moins par des anticorps reconnaissant un polyoside capsulaire de type 5 ou 8 et de préférence à la fois par des anticorps reconnaissant un polyoside capsu- laire de type 5 et des anticorps reconnaissant un polyoside capsulaire du type 8. Mais il va de soi que le réactif de diag- nostic le plus faible comprend un ensemble d'anticorps reconnaissant les différents types de polyosides capsulaires. Dans le réactif selon l'invention, les dif- férents anticorps et le fibrinogène peuvent être fixés sur une suspension unique de particules ou bien être fixés sur différentes suspensions de particules (à raison d'un ou plusieurs types de constituant par sus- pension de particules) qui sont ensuite mélangées pour constituer le réactif. Les particules en suspension utilisées dans le réactif selon l'invention sont notamment des par- ticules de latex telles que des billes de polystyrène ou des particules similaires, ayant de préférence une taille inférieure à 2 micromètres. A titre d.'exemple on peut citer les particules ESTAPOR commercialisées par la société Rhone-Poulenc telles que - des particules de polystyrène K 109, ayant un diamètre de 0,8 micromètre, - et des particules de polystyrène ayant des groupes carboxyliques, PSI 480, ayant un diamètre de 0,8 micromètre. On peut également utiliser des gels magnéti- ques tels que les gels de polyacrylamide et/ou d'aga- rose contenant des particules magnétiques qui sont décrits dans FR-A-2 334 106. On peut en outre utiliser des gels tels que Ultroger- et Magnogel de la Société IBF. 262532 1 Les anticorps utilisés dans la présente in-vention peuvent être des anticorps animaux ou humains, polyclonaux ou monoclonaux. Les anticorps ayant une affinité pour la protéine A du staphylocoque sont notamment des anti- corps de classe IgG. Ils peuvent être remplacés-par des fragments Fc de ces immunoglobulines. Dans le cas d'anticorps polyclonaux, ont peut utiliser pour la préparation du réactif un plasma humain ou animal, normal ou immunisé, contenant ces anticorps ou des anticorps purifiés selon les techni- ques classiques. Dans le cas d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser un surnageant de culture d'hybridome ou de liquide d'ascite préparé sur souris, ou des anticorps à l'état purifié. Pour fixer le fibrinogène, on peut utiliser un plasma humain ou animal, normal ou hyperimmunisé, ou du fibrinogène purifié selon les techniques clas- siques. La fixation de ces molécules sur les parti- cules en suspension, généralement un latex, peut être réalisée de diverses façons: - la fixation peut être spontanée au cours d'une incubation des particules de latex dans une solution contenant ces molécules, par exemple une incubation de 30 minutes à 56'C est souvent suffi- sante. - cette fixation peut aussi être réalisée en créant une liaison covalente entre les anticorps et les groupements carboxyliques présents sur certaines particules de latex (ESTAPOR PSI 480). Il est possible d'utiliser par exemple un carbodiimide pour créer la liaison covalente. La concentration des molécules à fixer sur les particules de latex, qui doit être déterminée pour chaque molécule selon les méthodes connues, est habi- tuellement inférieures à 200 microgrammes par mg de latex. Dans le cas de l'utilisation de molécules en tant que constituants d'un plasma, une dilution de ce plasma au 1/1000 peut être utilisée. Les exemples suivants illustrent la présente invention. Exemple 1 a) Préparation de particules de latex sensi- bilisées avec du fibrinogène et des anticorps contenus dans du plasma humain, y compris des IgG. Une suspension de latex (ESTAPOR, K 109) est aménée à la concentration de 2% dans un tampon glycine (0,27 M) - chlorure de sodium (0,15 M) - azide de so- dium (0,04 g/litre) dit CGA, pH 8. Un volume de cette suspension est mélangé avec un volume égal de plasma humain dilué à 1/-1000 dans le même tampon, puis incubé 30 minutes à 56'C avec agitation. Apres lavage, les particules de latex sensibilisées sont remises en sus- pension dans un tampon CGA contenant 0,05 % de plasma humain. b) Préparation de particules de latex sensi- bilisées avec des anticorps monoclonaux purifiés reconnaissant le polyoside capsulaire de type.8. Une suspension de latex (ESTAPOR, réf. K 109) est amenée à la concentration de 2% dans un tam- pon glycine (0,17 M) - chlorure de sodium (0,15 M) - azide de sodium (0,04 g/litre) dit CGA, pH 9,2. Un volume de cette suspension est mélangé avec un volume égal d'anticorps purifiés, solubilisés dans le même tampon. La concentration finale d'anticorps est de 100 microgrammes d'anticorps par mg de latex. Après 30 minutes d'incubation à 56'C, les particules de latex sensibilisées sont lavées puis remises en suspension dans le tampon CGA contenant 0,1. de sérum albumine bovine. c) Préparation du réactif. On mélange la suspension obtenue en a et la suspension obtenue en b dans des proportions égales pour constituer le réactif. ExemDle 2 On opère comme à l'exemple 1 mais en uti- lisant dans le stade b un mélange d'anticorps mono- clonaux reconnaissant de façon spécifique les polyo- - sides de types 8 et 5. Exemple 3 On opère comme à l'exemple 1 mais en uti- lisant dans le stade b un mélange de 11 anticorps reconnaissant de façon spécifique les 11 polyosides capsulaires connus de Staohvlococcus aureus. Les réactifs selon l'invention peuvent être utilisés pour une identification rapide de l'espèce Staphvlococcus aureus par agglutination: - avant isolement de la bactérie: dans un liquide biologique (sécrétion, suppuration, etc...), 25. dans un milieu de culture (hémoculture, etc...), - après isolement de la bactérie. Les réactifs selon l'invention permettent de reconnaître toutes les souches de Staohvlococcus au- reus qui ne sont pas reconnues par les réactifs agglu- tinants existant actuellement sur le marché, et parmi lesquelles prédominent les souches résistantes à l'oxacilline. Ils présentent donc un intérêt majeur compte tenu des problèmes que posent ces souches qui sont aussi le plus souvent multirésistantes. REVENDICATIONS 1. Réactif pour le diagnostic de StaDhvl- ococcus aureus par agglutination, du type comprenant des particules en suspension sur lesquelles sont fixés des anticorps ayant une affinité pour la protéine A du staphylocoque et du fibrinogène, caractérisé en ce qu il comprend des particules en suspension sur les- quelles sont fixés au moins des anticorps reconnais- sant de façon spécifique un polyoside capsulaire de Staphvlococcus aureus. 2. Réactif selon la revendication 1, carac- térisé en ce que les anticorps reconnaissant un poly- oside capsulaire de Staphvylococcus aureus sont des anticorps reconnaissant un polyoside capsulaire de type 5 ou 8. 3. Réactif selon la revendication 2, carac- térisé en ce que les anticorps reconnaissant un po- lyoside capsulaire de Staphylococcus aureus sont à la fois des anticorps reconnaissant un polyoside capsu- laire de type 5 et des anticorps reconnaissant un polyoside capsulaire de type 8. 4. Réactif selon la revendication 3, carac- térisé en ce que les anticorps reconnaissant un polyo- side capsulaire de StaDhvlococcus aureus comprennent un ensemble d'anticorps reconnaissant les différents types de polyosides capsulaires. 5. Réactif selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé en ce que les particules en suspension sont des particules de latex. 6. Réactif selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce que les particules ont une taille inférieure à 2 micromètres. 7. Réactif selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé en ce que les particules en suspension sont des gels magnétiques.