Brevet FR2628601A1 — publié le 19890922

La présente invention concerne le développement de nouvelles lignées parentales de Brassica oleracea. Les lignées paren- tales sont utilisées pour produire une graine hybride. Spé- cifiquement, cette invention permet à un reproducteur de plantes d'incorporer la qualité souhaitable de stérilité mâle cytoplasmique (CMS) dans une variété de B oleracea souhaitable pour le commerce. La stérilité des mâles présente un intérêt dans la re- production des graines hybrides de B oleracea car les fleurs i0 normales sont autopollinitricés. Les lignées stériles mâles ne produisent pas de pollen viable et ne peuvent pas s'auto- polliniser. En éliminant le pollen d'une variété parentale dans un croisement, un reproducteur de plantes est assuré d'obtenir une graine hybride de qualité uniforme. Actuelle- ment, la stérilité mâle cytoplasmique n'est pas facilement disponible dans les variétés de B oleracea. Les producteurs commerciaux de graines hybrides utilisent des systèmes d'auto-incompatibilité nucléaire pour éviter l'autopollini- sation pendant la production des graines. Ce système manque d'exactitude et conduit à des lots de graines hybrides im- pures. De plus, il prend beaucoup de temps, il est laborieux et ainsi coûteux d'introduire ce système génétique dans toutes les lignées. Dans Raphanus sativus, on a découvert un cytoplasme qui confère la stérilité mâle. Ce cytoplasme est connu sous le nom de cytoplasme CMS Ogura et l'ADN provenant des mitochondries et des chloroplastes contenus dans le cy- toplasme est génotypiquement différent de l'ADN contenu dans le cytoplasme des plantes B oleracea fertiles. Le cytoplasme CMS de type Ogura peut être introduit dans B oleracea par des croisements en retour répétés. Dans les plantes B olera- cea CMS Ogura résultantes, les mitochondries de R sativus conduisent à un phénotype CMS. La présence des chloroplastes de R sativus résulte cependant en une chlorose lorsque l'on cultive les plantes à basse température, ce qui conduit donc à des pertes de rendement. Cela confère à ce type de plante B oleracea CMS Ogura peu d'utilité dans la production des graines hybrides du commerce. La présente invention fournit des plantes B oleracea comportant des mitochondries du cytoplasme CMS Ogura et des chloroplastes tolérants au froid de B oleracea fertile nor- mal. Les plantes selon l'invention ont une stérilité mâle cytoplasmique mais ne présenteront pas de chlorose lors- qu'elles seront cultivées à basse température. La présente invention fournit en outre un procédé de préparation d'un matériel végétal B oleracea ayant une sté- rilité mâle cyt0plasmique et des caractéristiques nucléaires appro- priées d'un point de vue commercial, qui ne présente pas de chlorose lorsqu'il est cultivé à basse température. Ces plantes B oleracea CMS s'obtiennent par fusion de proto- plastes de B oleracea ayant des caractéristiques nucléaires ap- priées d'un point de vue commercial avec des protoplastes inactivés ou sans noyau d'une plante B oleracea CMS Ogura, suivie de la régénération en plantes des cellules allogènes ainsi obtenues. La présente invention convient particulièrement à la production de CMS dans les variétés de B oleracea sui- vantes: 1 Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. botrytis L. (chou-fleur) 2 Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. alba DC (chou blanc) 3 Brassica oleracea L. convar. oleracea var. gemmifera DC (choux de Bruxelles) 4 Brassica oleracea L. convar. acepha]a (DC.) Alef. var. sabellica L. (chou frisé) Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. sabauda L. (chou de Milan) 6 Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. rubra DC. (chou rouge) 7 Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. var. gongylodes (chou-rave) 8 Brassica oleracea L. convar. botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch (broccoli) et plus particulièrement dans les choux fleurs, les choux blancs, les choux de Bruxelles et les broccolis tels que dé- finis ci-dessus. Le terme cytoplasme CMS Ogura tel qu'il est utilisé ici désigne un cytoplasme provenant de Raphanus sativus compre- nant un ADN mitochondrial qui confère une stérilité mâle aux plantes. Le terme plante ou cellule végétale Brassica olera- cea CMS Ogura, tel qu'il est utilisé ici, désigne une plante ou une cellule végétale Brassica oleracea comprenant un cy- toplasme CMS Ogura. La fusion des protoplastes selon l'invention peut être accomplie grâce à l'emploi de polyéthylèneglycol (PEG) cau- sant une agglutination, en présence d'un tampon de fusion, c'est-à-dire d'une solution à pH élevé permettant la fusion des membranes. Cette hybridation somatique peut être effec-- tuée dans les conditions décrites par Sundberg et coll [Plant Science 43 (1986) 155] pour la production d'hybrides interspécifiques ou de modifications de ceux-ci. Un mode opératoire approprié est le suivant. La fusion des protoplastes selon l'invention est avan- tageusement réalisée dans une solution de fusion des proto- plastes (FS-1) contenant un tampon comme le chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, un osmoticum, par exemple un hydrate de carbone comme le mannitol, le sorbitol, le glucose ou le saccharose, et des sels de potassium et de calcium. Le pH peut s'échelonner de 5,2 à 10 et est de pré- férence d'environ 7,2. Les protoplastes d'origine différente sont mélangés et concentrés, avantageusement jusqu'à une densité finale de 105 à 106 protoplastes par millilitre. Le mélange de protoplastes doit ensuite être laissé au repos pendant au moins 10 minutes pour permettre le dépôt des cellules au fond de la boîte de Petri. Le mélange est ensuite traité avec du polyéthylèneglycol (PEG), ayant de préférence une masse moléculaire de 1500 à 6000. En général, on obtient de bons résultats lorsqu'on emploie par exemple une solution aqueuse comprenant 40% en poids de PEG (FS-2) dans un rapport volumique de FS-1 à FS-2 de 10:1 à 1:1. FS-2 comprend avantageusement un osmoticum et un sel de calcium. Les cellules sont mises à incuber dans FS-2 pendant 1 à 20 minutes, suivant la fragilité des cellules. La fusion est réalisée par lavage, par exemple deux fois, avec des solutions de fusion contenant du PEG, dans une concentration plus faible que dans FS-2, un osmoticum (par exemple le glucose ou le sorbitol) en une concentration donnant une osmolarité plus faible que FS-2 et un sel de magnesium. Les températures auxquelles l'opération de fusion est avantageusement réalisée s'échelonnent entre 20 et 24:C, de préférence 22 C. La concentration du PEG dans les "solutions de lavage" est progressivement réduite avec chaque étape de lavage consécutive (voir, par exemple, l'exemple 9 et les solutions de fusion 3 et 4). - Chaque étape de lavage doit prendre au moins 2 minutes pour que les protoplastes puissent s'ajuster lentement à l'osmolarité inférieure du milieu, afin d'éviter l'éclate- ment des cellules. A l'issue des étapes de lavage, on place les proto- plastes fusionnés dans un milieu de culture approprié. La densité des protoplastes doit être dans l'intervalle de 105 à 106 protoplastes par millilitre. On peut en variante réaliser la fusion des protoplastes en employant un courant électrique. Pour effectuer l'électrofusion, on soumet des chaînes de protoplastes, constituées de lignées de 8 cellules au maximum, exemple 5 cellules, à une impulsion en courant continu allant de, par exemple, 400 à 1000 V/cm, avec une durée des impulsions de, par exemple, 10 à 50 gs. Les proto- plastes fusionnés ainsi formés sont avantageusement mainte- nus pendant un certain temps dans le champ électrique, par exemple 1 à 2 secondes, avant que l'on supprime le champ électrique, pour donner aux protoplastes quelque temps pour retrouver leur forme ronde. On peut préparer les chaînes de protoplastes d'une ma- nière connue en soi en soumettant les protoplastes à un champ électrique en courant alternatif. On détermine les conditions optimales en faisant varier la fréquence du champ alternatif, par exemple aux alentours de 1 MHz, et la ten- sion jusqu'à 150 V/cm, de manière que les cellules s'ali- gnent en quelques minutes. Les produits de fusion ainsi obtenus peuvent être régé- nérés en présence de protoplastes parentaux non fusionnés, ou après une sélection optique à partir de la culture. Cette sélection optique peut être réalisée par micro-manipulation des cellules, par exemple selon le mode opératoire décrit par Patnaik et coll., Plant Science Letters 24 (1982) 105, pour permettre l'isolement et l'identification manuels des hétérocaryons, ou au moyen d'un classeur de cellules, par exemple selon le mode opératoire décrit par Glimelius et coll., Plant Science 45 (1986) 133, pour la sélection et l'enrichissement d'hétérocaryons de protoplastes végétaux par classement de cellules. Lorsqu'on emploie la stratégie de la sélection, on co- lore par exemple les protoplastes parentaux avec des colo- rants fluorescents, par exemple l'isothiocyanate de fluores- céine, ce qui permet d'utiliser, pour la sélection, l'auto- fluorescence de la chlorophylle lorsque l'un des partenaires de la fusion est d'origine folliaire. Les produits de fusion ainsi obtenus sont cultivés dans un milieu de culture approprié comprenant un apport de nu- triant bien équilibré pour la croissance des protoplastes, contenant des micro-éléments et des macro-éléments, des vi- tamines, des acides aminés et de faibles quantités d'hydra- tes de carbone, par exemple divers sucres comme le glucose. Le glucose sert de source de carbone ainsi que d'osmoticum. Le milieu de culture comprend des hormones végétales (auxi- nes et cytokinines) qui sont capables de réguler la division cellulaire et la régénération des pousses. Des exemples d'auxines convenables sont l'acide naphtylacétique (NAA), l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) et l'acide in- dole-acétique (IAA). Des exemples de cytokinines convenables englobent la benzylaminopurine (BAP) et la zéatine (Zea). En général, on utilise NAA et 2,4-D en combinaison avec BAP pour amorcer la division cellulaire. Le rapport auxine/cy- tokinine doit alors être élevé, par exemple supérieur à 1. Après 7 à 10 jours, la concentration des auxines est avantageusement diluée par addition du même milieu de cul- ture, mais sans ou avec sensiblement moins d'auxines. Les microcals en forme d'étoile typiques se seront en général développés au bout de 3 à 4 semaines. Ces microcals seront ensuite transférés dans un milieu de régénération servant à amorcer la formation des pousses, de préférence après adap- tation, dans un milieu de régénération intermédiaire, aux différences de composition et de propriétés physiques entre le milieu de culture et le milieu de régénération. Pour permettre la formation des pousses, le rapport auxine/cytokinine dans le milieu de régénération doit être avantageusement faible, par exemple inférieur à 1:10. En gé- néral, on préférera employer l'auxine IAA en combinaison avec les cytokinines Zea et BAP pour la régénération des pousses. Les milieux de régénération, BR-1 et BR-2, sont des mi- lieux relativement pauvres en comparaison du milieu de cul- ture. Ils contiennent moins de vitamines, leur teneur en source de carbone est inférieure, ils ne comprennent que du saccharose et du xylose comme source de carbone et ne contiennent pas d'acides aminés ni de lait de noix de coco. Les milieux de régénération ont également une viscosité su- périeure à celle du milieu de culture. BR-1 est un semi-so- lide et contient les régulateurs de croissance NAA, 2,4-D et BAP, le rapport de l'auxine à la cytokinine étant inférieur à 1. BR-2 contient Zea et BAP, et éventuellement IAA. Au bout de 4 à 6 semaines de régénération dans le mi- lieu BR-1, on transfère les cals d'environ 3 mm de diamètre dans un milieu de régénération BR-2 contenant une faible concentration de saccharose. A ce stade, les pousses se dé- velopperont en 2 à 3 semaines. On fait ensuite pousser les racines sur les pousses ob- tenues, sur un milieu basique, MS, sans hormones addition- nelles. L'ADN nucléaire et l'ADN d'organite cellulaire des plants ainsi obtenus peuvent être identifiés d'une manière connue en soi, par exemple grâce à l'emploi d'endonucléases de restriction convenables et à la comparaison de l'aspect du produit de digestion par l'ADN obtenu des produits de fu- sion avec celui des lignées parentales. Les protoplastes de Brassica oleracea et les protoplas- tes inactivés ou sans noyau d'une plante Brassica oleracea CMS Ogura, employés ici comme matière première, peuvent être obtenus d'une manière connue en soi à partir des cellules végétales correspondantes. Les cellules sans paroi cellulaire, c'est-à-dire les protoplastes, sont obtenues à partir d'un matériel végétai vert, par exemple d'un matériel folliaire, et/ou à partir d'un matériel végétal blanc, par exemple de jeunes plants étiolés, de cultures de cellules en suspension, de racines ou de matériel végétal blanchi, selon des procédés connus, par exemple selon le procédé décrit par Glimelius, Physiolo- gia Plantarum 61 (1984) 38, pour la régénération de proto- plastes hypocotylés. Lorsqu'on souhaite réaliser la sélection optique des produits de fusion, on sélectionne avantageusement les ma- tières premières à partir d'une plante verte ou, si on le fait à partir d'une matière végétale blanche, on les colore avantageusement pour faciliter la sélection. Les protoplastes inactivés ou sans noyau d'une plante Brassica oleracea CMS Ogura s'obtiennent d'une manière connue en soi à partir de cellules végétales ou de proto- plastes de Brassica oleracea CMS Ogura correspondants, par exemple par irradiation ou par des procédés normalisés connus pour l'élimination du noyau d'un matériel cellulaire, tel la centrifugation. L'inactivation du noyau par irradiation peut être ef- fectuée à l'aide de rayons gamma, UV ou X. Lorsqu'on effectue une irradiation avec une source de rayons X, on obtient en général l'inactivation du noyau en appliquant une dose de, par exemple, 10 krad/minute pendant 3 à 20 minutes. La dose de rayons X appropriée peut être, par exemple, établie grâce à la détermination du niveau minimum d'irra- diation aux rayons X tuant 100% de la population des proto- plastes: on estime le pourcentage des cellules mortes en comptant le nombre de colonies formées au bout de 10 à 20 jours de culture. Pour obtenir les conditions optimales pour le développement de colonies cellulaires à une faible den- sité, il est souhaitable d'utiliser une couche nourricière, un milieu de culture pré-conditionné ou un mode opératoire approprié de sauvetage des cellules. Lors de la détermina- tion de la dose minimale nécessaire pour l'inactivation des divisions cellulaires, on expose les protoplastes à 5 ni- veaux de rayons X augmentant progressivement les doses par paliers: la dose minimale, 10 et 20 krad au-dessus et au- dessous de la dose minimale. Les protoplastes ainsi obtenus sont ensuite introduits dans le procédé de l'invention. On peut également obtenir une inactivation satisfai- sante des noyaux, en général, par irradiation gamma avec Co, à une dose de 3-30 krad. L'élimination des noyaux peut également être réalisée par incubation des protoplastes dans un milieu hautement os- motique pour donner des sous-protoplastes essentiellement sans noyau. Un procédé approprié d'élimination des noyaux par ul- tracentrifugation convenant à la préparation de la matière première des protoplastes sans noyau de l'invention est dé- crit par Spangenberg dans EUROPEAN JOURNAL OF CELL BIOLOGY 39 (1985) 41-45. On ajoute avantageusement de la cytochala- sine-B pour faciliter l'expulsion des noyaux hors des cel- lules. On peut obtenir des plantes Brassica oleracea CMS Ogura par des techniques de reproduction classiques, à partir de B oleracea et de Raphanus sativus CMS (voir préambule de cette demande). On appréciera que les plantes Brassica de l'invention peuvent être employées comme matière première pour préparer d'autres variétés de Brassica oleracea comportant les mito- chondries souhaités du cytoplasme CMS Ogura et des chlo- roplastes de B oleracea fertile normal, et éventuellement des traits additionnels souhaitables, par des techniques in vitro et/ou par des techniques de croisement. Le reproduc- teur compétent connaît dans le domaine de telles techniques in vitro et de croisement. Solutions employées dans les expériences: a) Solution TVL 0,3M de sorbitol 0,05M de CaCl2,2H20 pH = 5,6-5,8 b) Solution d'enzyme 0,6-1% de cellulysine 0,1% de macérase dissoute dans BR-1, mais avec une concentration double de saccharose, pas d'agarose et une concentration de 2,4-D x 10 pH = 5,4-5,8 c) Solution W5 (1 1) 18,4 g de CaCl2,2H20 9,0 g de NaCl 1,0 g de glucose 0,8 g de KC1 pH = 5,6-5,8 d) CPW16s (1 1) 16% de saccharose 0,0272 g de KH2PO4 0,1010 g de KNO3 1,4800 g de CaCl2,2H20 0, 2460 g de MgSO4,2H2O 0,00016 g de KI 0,000025 g de CuSO4,5H20, pH = 5,5-5, 8 e) Solution de fusion 1 (FS-1) 0,15M de sorbitol O,03M de CaC12,2H20 0, 075M de KCl 0,05M de chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométha- ne pH = 7,2 f) Solution de fusion 2 (FS-2) -40% de PEG (masse moléculaire 1550) 0,3M de glucose mM de CaC12,2H2O g) Solution de fusion 3 (FS-3) 13, 3% g de PEG (masse moléculaire 1500) 0,1M de glucose 0,067M de sorbitol 0, 067M de CaC12,2H20 h) Solution de fusion 4 (FS-4) 6,7% de PEG (masse moléculaire 1500) 0,05M de glucose 0,083M de sorbitol 0,083M de CaCl2, 2H20 là Tableau 1: COMPOSITION DES MILIEUX (mgl)/1 MS BC-1 BC-2 BR-1 BR-2 KN03 1900 1900 1900 2500 2500 NH4NO3 1650 600 600 250 250 MgS04,2H20 370 300 300 250 250 KH2PO4 170 170 170 - - CaC12,2H20 440 600 600 300 300 KC1 - 300 300 - - NaH2P04,H20 - - - 150 150 (NH4)2S04 - - - 134 134 RKI 0,83 0;75 0T75 0775 0r75 MnSO4,4H20 22,3 10 10 10 10 H3B03 6,2 3 3 3 3 ZnSO4,2H20 8t6 2 2 2 2 NaMoO4,2H20 0125 0,25 0125 0125 0r25 CuSO4,5H20 0, 025 0,025 0/025 01025 0,025 MS BC-1 BC-2 BR-1 BR-2 COC12.6H20 0,025 0X025 0j025 01025 0X025 Fe-EDTA 43 43 43 43 43 ThiamineHCl 0l1 10 10 10 10 Pyridoxine-HCl 015 1 1 1 1 Acide nicotinique 015 1 1 1 1 Acide ascorbique - 2 2 - - Pyruvate de sodium - 20 20 - - Acide citrique - 40 40 - - Acide maléique - 40 40 - - Acide fumarique -. 40 40 - - Glycine 2 - - - Fructose - 250 250 - - Ribose - 250 250 - - Xylose - 250 250 250 250 Mannose - 250 250 - - Rhamnose - 250 250 - - Cellobiose - 250 250 - - Sorbitol - 250 250 - - Mannitol - 250 250 - - Inositol 100 100 100 100 100 Saccharose ** 250 250 70000 5000 Glucose - 68400 68400 - - Casaminoacide - 250 250 - - Eau de noix de coco* - 20 20 - - Agarose - - - 2000 4000 Gélose 6000 - - - - NAA - 01 0,il 01 - 2,4-D - 1 - 01 - IAA - - - (0,1) Zéatine - - - - l BAP - 05 0,5 0;5 015 * ml/l ** voir exemples - 2628601i EXEMPLES Exemple 1: Stérilisation des graines et germination On plonge brièvement dans de l'alcool à 20% des graines de Brassica oleracea, chou-fleur de type Delira avec un cy- toplasme CMS de Raphanus sativus CMS Ogura (désigné dans la suite par B oleracea A 61043) et on les stérilise dans une solution d'hypochlorite de sodium à 1% pendant 20 minutes sur un agitateur gyrotatoire à 160 t/min à 22 C. Ensuite, un rinçage complet avec de l'eau distillée stérile est néces- saire. Les graines sont placées sur le milieu nutritif MS (voir tableau 1), avec 1% de saccharose et sans hormone. Pour obtenir des plants stériles verts, on fait pousser les graines sur des plaques en plusieurs exemplaires à la lu- mière (3M00 lux), durée d'illumination de 16 heures à 22 C. * Des pousses stériles sont sous-cultivées dans les mêmes conditions dans des récipients en matière plastique. Pour obtenir le tissu blanc pour l'isolement des proto- plastes, par exemple les hypocotyles, on cultive les graines dans des boîtes de Petri à l'obscurité à 22 C. Exemple 2: D'une manière analogue au mode opératoire de l'exemple 1, on stérilise et on fait germer des graines de Brassica oleracea, cultivar SG 121(a) (chou-fleur). (a) déposé le 8 décembre 1987 à l'American Type Culture Col- lection, sous le numéro ATCC 40399. Exemple 3: Isolement des protoplastes On découpe en petits morceaux des pousses stériles âgées de 4 semaines de matériel végétal selon l'exemple 1 et on les soumet à une pré-plasmolyse pendant environ 1 heure dans la solution TVL à l'obscurité. On retire la solution TVL et on effectue un contrôle de contamination bactérienne du matériel végétal en cultivant une partie de la solution TVL incubée pendant une nuit dans un milieu bactérien à 22 C. On ajoute au matériel une solution d'enzyme contenant 0,6-1% de cellulysine et 0,1% de macérase et on fait incuber le matériel pendant 16 heures à l'obscurité à 22 C. On filtre ensuite la suspension à travers une toile de nylon (70 lm) et on la lave avec 1/2 volume de solution de CPW16s par centrifugation à 750 t/ mn pendant 7 minutes. Cela conduit à la flottation des protoplastes intacts. On recueille les protoplastes et on les rince d'abord avec une solution de W5, puis on les lave avec la solution de fusion 1 par centrifugation à 500 t/mn pendant 5 minutes. Exemple 4: On isole des hypocotyles du matériel végétal âgés de 8 jours selon l'exemple 1, en suivant le procédé de l'exemple 3, sauf que, pendant le traitement à l'enzyme, on ajoute 1 gg/ml d'isothiocyanate de fluorescéine. De cette manière, on obtient des protoplastes colorés convenant à une sélection manuelle ou mécanique. Exemple 5: On stérilise et on fait germer des graines de Brassica oleracea, cultivar SG 121 (chou-fleur) selon le mode opéra- toire de l'exemple 1, et on traite ensuite des pousses sté- riles âgées de 4 semaines de celles-ci selon le mode opéra- toire de l'exemple 3 pour obtenir des protoplastes de B ole- racea, cultivar SG 121. Exemple 6: On stérilise et on fait germer des graines de B olera- cea, cultivar SG 121 (chou-fleur) selon le mode opératoire de l'exemple 1, et on traite ensuite des hypocotyles âgés de 8 jours de celles-ci selon le mode opératoire de l'exemple 3, sauf que, pendant le traitement à l'enzyme, on ajoute 1 lg/ml d'isothiocyanate de fluorescéine pour obtenir des pro- toplastes colorés convenant à une sélection manuelle ou mécanique. Exemple 7: Irradiation des protoplastes Des protoplastes fraîchement isolés selon l'exemple 3 sont mis en culture dans une boîte de Petri de 6 cm, dans une solution W5 (2 ml). Les protoplastes sont irradiés au moyen d'une source de rayons X (Baltobloc CE 100), à une dose de 10 krad/ mn pendant 5 à 20 minutes. Après l'irra- diation, on dilue les protoplastes inactivés dans la solu- tion de fusion 1 avant de les utiliser pour les expériences de fusion. Exemple 8: Isolement des cytoplastes par ultracentrifuga- tion Un gradient constitué par 10 ml d'eau saturée de sac- charose et une couche supérieure de 4 ml de sorbitol 1,5M, contenant 0,5% de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 30 gg/ml de cytochalasine-B, et 2 ml (= 1 x 106) de protoplastes selon l'exemple 3 dans la solution de fusion 1 sont chargés sur le dessus de celle-ci. Le matériel est soumis à une cer.trifuga- tion pendant 15 minutes à 40 000 x g, à 250C, pour donner des cytoplastes sans noyau de B oleracea A 61043. Exemple 9: Protocole de fusion Des protoplastes selon les exemples 5 et 7 sont mélan- gés (1:1) à une concentration finale de 5 x 105 protoplastes (pps)/ml de solution de fusion 1, dans une enceinte stérile, sous une circulation d'air stérile. Des gouttelettes de 200 gl sont placées dans une boîte de Petri non enduite (5-7 gouttelettes par boîte de Petri de 6 cm) et on les laisse se déposer pendant 15 minutes. (On stoppe l'écoulement d'air stérile pour éviter de perturber le dépôt des protoplastes). On ajoute de la solution de fu- sion 2 (25-100 il par gouttelette) pour amorcer l'agglutina- tion pendant 3-7 minutes. On rétablit l'écoulement d'air stérile et on remplace la solution par de la solution de fusion 3 pendant 5 mi- nutes. Ensuite, on remplace la solution par la solution de fusion 4 pendant 5 minutes. Enfin, on remplace les solutions de fusion par 1,5 ml du milieu de culture (BC-1). Exemple 10: Sélection et culture des produits de fusion On prélève, à l'aide d'un micromanipulateur, des cel- 2628601' lules fusionnées, que l'on peut reconnaître visuellement par la présence de fluorescence double. On cultive des hybrides ou des cybrides dans des mem- branes de filtration Biopor, de diamètre 1,1 cm ou 3 cm, de largeur de pores 0,45-3 im, contenant 100 à 105 cellules par millilitre de milieu de culture 1. On place les filtres dans une boîte de Petri contenant 2-2,5 ml de cellules nourri- cières (105 par millilitre) et on incube le matériel à 22 C à l'obscurité. Lorsque 20% des cellules se sont divisées, on ajoute le milieu de culture 2. Lorsque les microcals en forme d'étoile typiques se sont développés, on les transfère vers le milieu de régéné- ration 1 (BR-1) dans des boîtes de Petri enduites et on les cultive à 22 C et sous 500 lux pendant 4-6 semaines. Exemple 11: On irradie des protoplastes hypocotylés colorés selon le mode opératoire de l'exemple 4, en suivant le mode opéra- toire de l'exemple 7. Les protoplastes colorés inactivés ainsi obtenus sont fusionnés avec les protoplastes selon l'exemple 5 et les protoplastes fusionnés sont ensuite sé- lectionnés au moyen d'un classeur de cellules équipé d'une lampe à mercure (HB 100) pour classement par fluorescence à deux paramètres. Le rayon d'excitation de fluorescence du classeur de cellules est réglé entre 488 nm et 500 nm. Le rayon d'émis- sion provenant des cellules excitées est séparé, à l'aide de miroirs "dichroïques" en deux rayons lumineux: l'un ayant des longueurs d'onde comprises entre 560 et 610 nm, repré- sentant l'autofluorescence des chloroplastes, et l'autre ayant des longueurs d'onde comprises entre 500 et 560 nm, représentant la fluorescence à l'isothiocyanate de fluores- céine. On utilise deux photomultiplicateurs pour mesurer ces signaux. Le fluide d'enveloppe (véhicule fluide utilisé dans le classeur de cellules pour diluer l'échantillon de proto- plastes dans un courant liquide continu) contient du milieu W5 autoclavé et dégazé. Le classement est basé sur le principe que la fluores- cence de cellules mères non fusionnées ne présente qu'une seule fluorescence (fluorescence rouge des protoplastes de mésophylle ou fluorescence jaune/verte à l'isothiocyanate de fluorescéine des protoplastes hypocotylés colorés), tandis que les cellules fusionnées présenteront une double fluores- cence (rouge et jaune/verte). Les hybrides ou les cybrides classés sont cultivés d'une manière identique à celle utilisée pour les cellules sélectionnées par micromanipulation. Exemple 12: On conserve la totalité du mélange de fusion selon l'exemple 9 dans la boîte de Petri dans laquelle la fusion a été réalisée et on le cultive à l'obscurité à 22 C. Après 1- 2 jours, on prélève les cellules à la pipette et on les transfère dans une boîte de Petri enduite. Après environ 7- 14 jours, lorsque 10% des cellules se divisent, on ajoute deux volumes de milieu de culture 2 (BC-2). Au bout de 10 jours, on ajoute un autre volume de BC-2. On poursuit.la culture des cellules à l'obscurité à 22 C. Au bout de 2-4 semaines, lorsque les cellules ont formé des microcals en forme d'étoile typiques, on les transfère dans le milieu de régénération 1. On cultive les microcals sous une faible in- tensité lumineuse (500 lux), durée d'illumination de 16 heures, à 22 C. Exemple 13: Régénération des plantes Les cals selon l'exemple 10 et l'exemple 12 qui se sont développés jusqu'à une dimension de 2-5 mm de diamètre sont transférés dans le milieu de régénération 2 (BR-2) et culti- vés à 22 C et sous 3000 lux, durée d'illumination de 16 heures. Les pousses d'environ 1 cm sont transférées dans le milieu MS contenant 1% de saccharose et sans hormones et on fait pousser les racines sur le même milieu MS. 62 U6U0 Exemple 14: analyse moléculaire des produits de fusion a) Composition d'ADN nucléaire On effectue la caractérisation de la composition nu- cléaire des produits de fusion en utilisant des sondes d'ADN spécifiques. Un fragment Kpn I/Bam HI de 0,9 kb du gène D- tubuline de Arabidopsis thaliana s'hybride avec diverses bandes en un profil des produits de digestion par l'endonu- cléase d'ADN nucléaire du donneur CMS, B oleracea A 61043. Ce profil est spécifique de B oleracea A 61043 et diffère des lignées de B oleracea qui sont utilisées comme accepteur pour le trait CMS (figure 1A). b) Composition d'ADN mitochondrial La caractérisation est effectuée avec l'ADN pBO 604, qui est un clone contenant un fragment Sac I de 1,5 kbp pro- venant de l'ADN mitochondrial du cytoplasme CMS Ogura de Ra- phanus sativus. Ce clone donne des signaux d'hybridation avec les produits de digestion à l'endonucléase de restric- tion de l'ADN mitochondrial provenant des cytoplasmes CMS Ogura de B oleracea, A 61043, mais pas avec l'ADN mitochon- drial provenant du cytoplasme fertile des lignées de B ole- racea (figure lB). c) Composition de l'ADN des chloroplastes L'ADN présent dans les chloroplastes sensibles à la chlorose du cytoplasme CMS Ogura est caractérisé par la sonde lambda Bcp 17. Ce clone contient un fragment Xho I/Sac I de 4,5 kbp provenant d'ADN de chloroplaste CMS Ogura. Le clone s'hybride avec une bande de 57,5 kbp dans le produit de digestion par Sal I de l'ADN des chloroplastes CMS Ogura et avec une bande de 9,9 kbp dans le produit de digestion par Sal I de l'ADN des chloroplastes provenant des cyto- plasmes fertiles dans les lignées de B oleracea (figure 1C). Les figures 1A, lB et 1C sont des copies exactes, faites à la main, de photographies. 2 628 601 REVENDICATIONS 1.Espéce de plantes Brassica oleracea CMS, carac- térisée en ce qu'elle contient des mitochondries du cytoplas- me CMS Ogura et des chloroplastes de Brassica oleracea fertile normal. 2.Procédé de préparation de l'espèce de plantes Brassica oleracea CMS selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: a) la fusion des protoplastes de B.oleracea ayant des carac- téristiques appropriées du point de vue commercial avec des protoplastes inactivés ou des protoplastes sans noyau d'une plante B.oleracea CMS, suivie de la régénération des cellu- les allogènes ainsi obtenues; b)l'emploi des cellules ou des plantes B.oleracea CMS obte- nues selon le procédé a) de cette revendication ou de leurs descendants comme matière première pour la préparation de plantes B.oleracea CMS selon la revendication 1 par des techniques in vitro et/ou des techniques de croisement: