Brevet FR2624274A1 — publié le 19890609

La présente invention, qui a été réalisée dans le cadre du Laboratoire de Biotechnologie de l'Ecole Nationale supérieure de Biologie Appliquée à la Nutrition et a' l'Alimentation (ENSBANA), concerne un nouveau procédé pour la détection de la contamination microbiologique de produits liquides contenus dans un récipient formant emballage. Dans de nombreuses industries, notamment les industries alimentaires, pharmaceutiques, et électroniques, il est essentiel de pouvoir évaluer le degré de contamination microbiologique (levurienne et/ou fongique en particulier) d'un certain nombre de liquides. Les procédés classiques de détection de la contamination font appel à la mise en culture sur milieux spéciaux en boîtes de Pétri (avec ou sans passage préalable dans une solution de culture accélérée, dite solution starter), d'un échantillon du produit à contrôler. Le passage dans une solution starter permet de diminuer le temps de latence entre le moment du prélèvement de l'échantillon et celui du démarrage de la croissance des microorganismes. Cette technique permet une identification de différentes souches contaminantes ainsi que leur comptage éventuel. Elle présente néanmoins l'inconvenient de devoir être mise en pratique dans un milieu équipé (laboratoire) par un personnel qualifié. Une autre méthode est celle de la filtration sur membrane. Cette méthodé consiste à filtrer l'échantillon sur une membrane stérile, préalablement déposée sur un support poreux et sur lequel on a fixé de manière étanche un entonnoir pour ia réception de cet échantillon, support et entonnoir ayant été tous deux décontaminés. Après la filtration qui s'effectue généralement par l'intermédiaire d'une fiole à vide, et un rinçage, on prélève la membrane avec une pince stérile et on la dépose sur un milieu de culture gélosé contenu dans une boîte de Pétri. La boîte de Pétri est alors mise à incuber à la température adéquate et pendant le temps nécessaire pour que les microorganismes puissent se développer et se multiplier suffisamment sous forme de colonies visibles à l'oeil nu que l'on -pourra identifier et compter. Une telle méthode présente elle aussi les inconvénients de nécessiter un appareillage important et un personnel qualifié. Dans les industries où des produits liquides susceptibles d'être contaminés sont placés dans des récipients d'emballage scellés, on utilise une méthode très simple, ne nécessitant que très peu de matériel et de personnel qualifié. Cette méthode consiste à maintenir le produit dans son emballage étanche à 25"C pendant environ 5 jours. Au terme de ce délai, on constate éventuellement un gonflement de l'emballage, ce gonflement signalant la présence et la croissance de microorganismes contaminants, notamment de levures et de fungi. Néanmoins, cette dernière méthode, bien que présentant l'avantage d'un investissement minimum en personnel et en équipement, est peu sûre et prend du temps. En effet, certains microorganismes contaminants ne se développent pas tant que l'emballage reste clos et présentent une croissance rapide après ouverture de l'emballage. Le produit devient alors impropre à la consommation, bien qu'aucune contamination n'ait pu être décelée auparavant. Ceci survient avec certaines levures par exemple. Bien qu'appliquée actuellement aux jus de fruits, cette méthode est longue et peu sûre, surtout en ce qui concerne les jus d'oranges du fait de la viscosité et de l'acidité importante de ces derniers. La présente invention a pour but de fournir un procédé de détection spécifique de la contamination d'un produit liquide sous emballage par des levures et/ou des fungi, efficace en moins de 50 heures, de préférence en 30 à 36 heures, même quand la contamination est très faible au départ (moins de 100 cellules par litre), ladite détection pouvant être effectuée par un personnel non qualifié hors d'un milieu spécialisé et/ou de manière automatisée. Un tel procédé peut être mis en oeuvre sans manipulation directe du produit à contrôler et sans procédure d'ensemencement, ceci permettant de limiter à leur minimum les risques extrinsèques de contamination dudit produit à contrôler. Il présente en outre le très grand avantage de pouvoir être mis facilement en oeuvre dans des conditions industrielles, par exemple sur une chaîne d'emballage. Enfin, le procédé selon l'invention peut être appliqué aux techniques de détection par impédance ou dosage de l'ATP microbien, ou à toute autre technique permettant d'abaisser le seuil de détection de la contamination. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a. Addition au produit liquide contenu dans un emballage non rigide et/ou transparent d'une composition propre à favoriser la croissance des levures ou des fungi (composition "starter"), b. fermeture de l'emballage, c. mise en incubation pendant moins de 50 heures à une température comprise entre 20"C et 350C, d. mise en évidence de la contamination par détection d'un changement d'état du produit emballé, et notamment * du gonflement de l'emballage non rigide et/ou * du changement d'aspect (couleur et/ou consistance) du produit liquide quand l'emballage est transparent. Le procédé selon l'invention est applicable à la détection de la contamination par les levures et/ou les fungi de nombreux produits liquides et notamment les produits alimentaires, pharmaceutiques ou autres. Avantageusement, le procédé selon l'invention permet la détection de la contamination dans des jus de fruits, ou des boissons aux fruits particulièrement le jus d'orange. La composition "starter" utilisée dans le procédé de l'invention contient, en solution dans l'eau, de l'acide pyruvique ou un équivalent, une polypeptone, de l'extrait de levure, de l'azote ammoniacal, de l'azote uréique, et un constituant polyphénolique. Par équivalent de l'acide pyruvique, on entend tout produit hydrosoluble produisant, en se dissociant, un anion CH3COCOO-. La polype?tone peut être n'importe quelle peptone ou tout produit constitué de composés partiellement hydrolysés, ou toute préparation obtenue après hydrolyse de protéines animales ou végétales (d'une farine riche en protéine - soja, par exemple). Les polypeptones préférées sont la bactopeptone, la néopeptone et la bactosoypeptone. On peut penser utiliser aussi toute autre peptone ; tout produit constitué de composés protéiques partiellement hydrolysés ; toute préparation obtenue après hydrolyse (de protéines animales ou végétales, d'une farine riche en protéines-soja par exemple, d'un extrait de tissu animal). L'extrait de levure consiste en une préparation obtenue à partir d'hydrolysats d'un ou plusieurs types de levures. Le composé polyphénolique peut être constitué par la (+) catéchine et de manière plus générale par un flavane 3-ols, un flavane 3, 4- diols, un désoxyflavane 3-ols, ou un composé polyphénolique constitué de 2 à 4 molécules phénoliques élémentaires. Selon une mise en oeuvre avantageuse du procédé selon l'invention, la vitesse de croissance des levures et des fungi est maximale quand le pH du mélange (produit liquide + composition ajoutée) est compris entre 6 et 7 de préférence égal à 6,5. La composition-type peut être donnée comme suit acide pyruvique 0,04 - 0,4 g/l polypeptone 10 - 30 g/l extrait de levure 2 - 15 g/l azote ammoniacal 0,2 - 1,5 g/l azote uréique 0,2 g/l (+) catéchine 0,02 - 0,1 g/l. Dans le cas où le procédé selon l'invention est appliqué à la détection de la contamination de jus de fruits ou boissons de fruits par des levures et/ou des fungi, la composition ajoutée peut avantageusement contenir un antibiotique. En effet les jus de fruits et boissons aux fruits peuvent être contaminés par des bactéries acidophiles, tels que les lactobacilles et les leuconostocs. En outre, la pasteurisation peut entraîner la formation de spores bactériennes susceptibles de germer, induisant ainsi un facteur d'erreur dans la détection de la contamination par les levures ou par les fungi. Selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé, l'antibiotique ajouté peut être le chloramphénicol ou une tétracycline, et la pénicilline. Dans une chaîne de remplissage-emballage, la composition est introduite dans quelques emballages sélectionnés et repérés (par exemple 1 sur cent ou 1 sur mille) en un point quelconque de la chaîne. Puis ces emballages témoins ayant une solution starter sont mis en incubation à une température comprise entre 200C et 35"C, de préférence égale à 25"C. La durée d'incubation inférieure à 50 heures peut avantageusement être réduite à une durée comprise entre 30 et 36 heures. Au terme de l'incubation, la contamination est mise en évidence par la détection d'un changement d'état du produit emballé. On peut d'abord détecter le gonflement de l'emballage contenant le produit contaminé. La détection de ce gonflement peut être effectué par un opérateur humain ou au moyen d'un détecteur de forme appropriée. On peut aussi détecter l'aspect du produit contenu dans un emballage transparent. Une telle détection peut être faite par obserxation directe. ou bien par un senseur optique. Le procédé selon l'invention permet ainsi de détecter une contamination ayant pour origine moins de 100 cellules par litre lors de la mise en incubation. On peut aussi soumettre le mélange après incubation dans les conditions précitées, à un dosage de l'ATP par bioluminescence, selon les méthodes classiques. On peut alors détecter une contamination ayant pour origine une seule cellule contaminante par litre lors de la mise en incubation. Le procédé selon la présente invention permet ainsi de détecter la contamination levurienne et/ou fongique d'un produit liquide par moins de 100 cellules par litre lors de l'incubation, entre 30 et 36 heures sans l'aide d'un personnel qualifié et en dehors d'un milieu spécialisé. Il s'avère ainsi très supérieur aux procédés de la technique antérieure pratiqués sur une chaîne de remplissage, mais sans utilisation d'une solution "starter". On va maintenant décrire à titre d'exemple détaillé l'ensemble des travaux menés pour la mise au point d'une solution "starter" perrnettant la détection rapide des levures susceptibles de contaminer les jus de fruits et les boissons aux fruits au bout de 48 h. Les différentes étapes de recherche ont été les suivantes - isolement des levures susceptibles de contaminer les jus de fruits et les boissons aux fruits et leur identification - étude de composés susceptibles d'activer la croissance des levures et détermination de leurs concentrations optimales - essai d'élaboration de la solution "starter" par un mélange des composés retenus aux concentrations optimales. Les résultats obtenus ont montré une certaine amélioration de la croissance par rapport aux composés testés pris individuellement - optimisation de la solution "starter" en appliquant la méthodologie de la recherche expérimentale. Dans cette dernière partie des recherches, une matrice comportant 32 expériences a été mise en oeuvre pour chaque souche étudiée.Les résultats obtenus après réalisation de la matrice ont permis de modéliser le phénomène pour chaque souche. A partir de l'équation mathématique, les effets principaux des facteucs ainsi que leurs interactions ont été étudiés et il est apparu qu'une optimisation est possible pour chaque souche, dans le domaine expérimental (domaine de variation des différents composés dans lequel les croissances obtenues peuvent être optimales pour chaque composé). L'optimisation n'a d'intérêt dans ce cas que si elle s'applique à l'ensemble des souches à la fois. C'est ainsi qu'au lieu d'utiliser les méthodes de surface de réponse ou l'analyse de régression pour l'optimisation, on a appliqué les méthodes de recherche du chemin optimal dont le principe est de chercher à partir de l'équation de régression le sens de variation de chaque facteur pour optimiser la réponse de chaque souche.Cette méthode a donc permis de dégager, pour l'ensemble des souches, les compositions de la solution dont les composés sont à des concentrations définies et qui permettra d'obtenir une croissance optimale moyenne. Il est apparu que pour l'échantillon de levures étudiées, l'optimisation de la croissance se fait lorsque l'acide pyruvique est à un niveau très élevé dans le domaine expérimental, c'est-à-dire 0,16 g/l. L'azote ammoniacal et la (+) catéchine devant être à des niveaux plus faibles. On a retenu la concentration û,72 g/l pour l'azote ammoniacal et 0,05 g/l pour la (+) catéchine. L'extrait de levure et la polypeptone doivent être pris à des niveaux moyens. Afin de préciser les concentrations à utiliser pour ces deux derniers composés, une matrice à trois niveaux correspondant à neuf expériences, a été réalisée pour chaque souche. Les niveaux des trois autres facteurs ont été maintenus constants et égaux aux concentrations précédemment retenues. Cette étude a été effectuée pour 21 souches et les résultats obtenus ont montré que les meilleures croissances sont obtenues lorsque l'extrait de levure est utilisé à la concentration 4,41 g/l et les polypeptones à 17,88 g/l. Toutes ces étiides ont été menées dans des microvolumes et les résultats ont montré qu'avec un ensemencement initial de 150 cellules/ml, ont peut d'une part, détecter la croissance au bout d'un temps plus court qu'avec le milieu témoin et, d'autre part, que le nombre de cellules atteint est plus important avec la solution "starter". Par ailleurs, avec certaines souches, la croissance est très fortement améliorée d'un facteur 3 à 6. Afin de se rapprocher le plus possible des conditions de volume dans lesquelles les jus de fruits et les boissons aux fruits sont distribués, une étude de l'influence de la solution starter a été entreprise dans 50 ml de milieu. Les résultats obtenus ont corroboré nos conclusions sur l'amélioration et l'activation de la croissance des levures par la solution "starter". L'ensemencement initial, dans ce cas, a été de 40 cellules par ml. L'étape suivante des recherches a été l'étude de l'influence de la solution "starter" sur la croissance des levures replacées dans leur milieu naturel. Cette étude a été réalisée avec 50 ml de jus de fruit. Notons toutefois que, lors de l'optimisation de la solution "starter", le facteur important que constitue le pH n'a pas été étudié. En elfe, on a travaillé à pH 6,5, car à ce pH, la croissance levurienne est maximale. Or ce pH ne correspond pas à celui des jus de fruits et boissons aux fruits qui est beaucoup plus bas (3 à 4,5 selon les produits). Une étude de l'influence du pH par rapport à l'efficacité de la solution "starter" s' imposait donc. De plus, parmi les jus et boissons aux fruits, le jus d'orange est celui qui pose le plus de problèmes quant à la détection de contaminations dont il peut être le siège. Ceci est lié à sa viscosité élevée et à la pulpe qu'il contient. Ce sont les raisons pour lesquelles on s'est attaché à expérimenter la solution "starter" sur ce jus. Le pH du jus d'orange utilisé étant de 3,27, une étude comparative de la croissance a été menée à pH 6,5 et 3,27 en présence de starter et en milieu synthétique. On a limité cette étude aux levures les plus redoutées dans l'industrie des jus de fruits et de boissons aux fruits, à cause des altérations dont elles sont responsables et de leur osmotolérance.Il s'agit de - Candida sake RC2 (isolée du jus de raisin et du sirop de sucre) - Hanseniaspora valbyensis RC1 (isolée du jus de raisin) - Hansenula 'beijerinckii C1 (isolée de l'eau) - Pichia membranaefaciens 225 (isolée des boissons à l'orange) - Saccharomyces cerevisiae 217 (isolée du concentré d'orange, du sirop de sucre, du jus de raisin et de l'eau) - Saccharomyces kluyveri 233 (isolée de boissons à l'orange) - Torulaspora delbrueckii 209 (isolée -du concentré d'orange) - Zygosaccharomyces rouxii 208 (isolée du concentré d'orange). Les résultats obtenus ont montré qu'à pH 3,27, la majorité des souches étudiées ne présentent pas de croissance décelable au bout de 48h, alors que ces souches présentent une forte croissance à pH 6,5. On a noté que les souches pour lesquelles une croissance est obtenue à 48h à pH 3,27 (Cl et 223), la phase de latence est plus grande (10 à 20h) et que la productivité est fortement diminuée à pH 3,27. Il est donc apparu que la croissance levurienne est très fortement inhibée à pH 3,27, même en présence de la solution "starter". L'obtention d'une forte croissance nécessite donc que le pH du jus soit ramené de 3,27 à 6,5. On n'a pas oublié que les jus de fruits et les boissons aux fruits peuvent être contaminés par des bactéries acidophiles comme les lactobacilles et les leueonostocs. I es produits subissent une pasteurisation qui pourrait entraîner la formation de spores bactériennes susceptibles de germer lorsque le pH est ramené à 6,5. C'est pourquoi, à la solution starter, on a additionné un antibiotique afin d'inhiber la germination éventuelle des spores qui gênerait la détection de levures contaminantes. Une addition de chloramphenicol ou d'une tétracycline et d'une pénicilline donne de bons résultats. Le dosage de l'ATP par bioluminescence pour évaluer la croissance levurienne a permis de suivre la croissance des levures dans les jus de fruits. Cette technique a donc permis de résoudre les problèmes posés par le jus d'orange : la viscosité et la présence de pulpe empêchent la détection d'une contamination par les méthodes classiques. Les mêmes souches que précédemment ont été utilisées pour cette étude. L'ensemencement initial est d'environ 5 cellules par 50 ml de jus. Trois milieux ont été utilisés - un milieu témoin ne contenant que le jus à pH 6,5 - un milieu contenant le starter + le jus - un milieu contenant le starter + des vitamines + le jus. Ce dernier milieu se justifie par le fait que dans l'élaboration de la solution "starter", les vitamines n' ont pas été prises en compte, alors qu'on a démontré que certaines d'entre elles ont de l'influence sur la croissance des levures. Mais c'est essentiellement à cause de la pauvreté des jus de fruits et des boissons aux fruits en général qu'on a cru nécessaire de voir dans quelles mesures l'adjonction de vitamines améliore les résultats obtenus avec le "starter". D'après les résultats, en présence de starter, la contamination est détectée en général entre 30 et 36h en partant de 5 cellules. L'amélioration de la croissance, du fait de l'ajout de vitamines, n'est observé que pour très peu de souches. Par ailleurs, avec le témoin, au bout du même temps, aucune croissance n'est détectée. L'étape suivante des recherches a été l'experimentation de la solution starter sur des packs de Il de jus d'orange avec un ensemencement initial de 5 cellules. Les résultats obtenus ont montré qu'associés à la méthode de bioluminescence, on peut détecter une contamination à partir de 36h pour certaines souches. Pour d'autres souches, cette détection se fait à 40h. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la détection de la contamination levurienne ou fongique d'un produit alimentaire liquide contenu dans un emballage comportant les étapes suivantes - addition au produit contenu dans l'emballage d'une composition propre à favoriser la croissance des microorganismes susceptibles de contaminer le produit - mise en incubation pendant moins de 50 heures à une température comprise entre 20"C et 35"C - constatation de la contamination par détection d'un changement d'état du produit emballé et notamment du gonflement de l'emballage fermé ou du changement d'aspect du produit à travers un emballage transparent. 2. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que l'incubation dure de 30 à 36 heures. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le produit alimentaire liquide est un jus de fruit ou une boisson aux fruits. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la composition ajoutée au produit alimentaire liquide contient, en solution dans l'eau - un produit hydrosoluble se dissociant en donnant l'anion CH3COCOO - une polypeptone - un extrait de levure - un constituant phénolique - de l'azote ammoniacal - de l'azote uréique - un ou plusieurs antibiotiques. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le produit hydrosoluble se dissociant en donnant l'anion CH3COCOO est l'acide pyruvique. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la polypeptone est choisie parmi le groupe constitué par la bactopeptone, la néopeptone, la bactosoypeptone. 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'extrait de levure est une préparation obtenue à partir d'hydrolysats d'un ou plusieurs types de levure. 8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le constituant phénolique est choisi parmi le groupe constitué par les flavanes 3-ols, les flavanes 3,4-diols, les désoxyflavanes 3-ols, et les constituants polyphénoliques composés de 2 à 4 molécules phénoliques élémentaires. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le composé phénolique est la (+) catéchine. 10. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les antibiotiques sont le chloramphénicol ou une tétracycline et la pénicilline. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on l'applique sur une chaîne de remplissage à des produits emballés témoins.