Brevet FR2634786A1 — publié le 19900202

La présente invention est relative à un procédé de dosage enzymatique spécifique et sensible de concentrations extrêmement faibles de peroxyde d'hydrogène présent dans un milieu ou libéré à partir d'un composé organique par un processus enzymatique, permettant ainsi un dosage enzymatique spécifique et sensible de concentrations extrêmement faibles de composés organiques. On entend par concentrations extrêmement faibles d'un produit dans un échantillon donné, des concentrations autour du pM. c'est-à-dlre de 10-2 2 pM à 102 pM. Dans l'Art antérieur, de nombreux procédés de dosage de l'eau oxygénée sont proposés : les ions titane IV réagissent avec le peroxyde d'hydrogène, pour donner un zom- plexe orangé stable (P. BONET-MAURY, CRAS 218 (1944, p.117). Les ions Fe2+ sont oxydés par le peroxyde d'hydrogène en milieu acide (R. BAILEY et D.F. BOLTZ, Anal. Chem. 31 (1959) p. 117). Les ions I- sont également oxydés par le peroxyde d'hydrogène en présence de molybdène (Mo VI) (W.A. PATRICK et H.B. WAGNER, Anal. Chem. 21 (1949) p. 1279). Le peroxyde d'hydrogène peut également être oxydé par les ions permanganates ou cériques (E.C. HURDIS et H. ROMEYN, Anal. Chem. 26 (1954) p. 320). Tous ces procédés de dosage ont une sensi bilité de l'ordre de 1 ppm, c'est-à-dire 1 mgjml = 3.10-5 M. (G. CHARLOT, "Chimie analytique quantitative", Vol.II, Masson, 1974, p. 473). L'utilisation de boucles réactionnelles dans les dosages afin d'amplifier la détection et donc d'en améliorer la sensibilité a déjà été signalée à plusieurs reprises dans la littérature. Parmi les nombreuses publications, on peut citer des procédés basés sur l'utilisation de déshydrogénases pour améliorer la sensibilité des détections de NAD ou NADH (C. BERNOFSKI et M. SWAN, Anal. Biochem., 53 (1973) p. 452), (M.M.Y. CHI, C.V. LOWRY et O.H. LORRY, Anal. Biochem. 89 (1978) p. 119) ou NADP-NADPH (B.M. JORGENSEN et H.N. RASMUSSEN, Anal. Biochem. 99 (1979) p. 297) ou même la Galac tosylceramide Galactosidase (T. - KATO et Y. SUZUKI, Anal. Biochem. 126 (1982) p. 44). Dans certains systèmes, l'ampliflca- tion atteint 350.000 et la sensibilité 50 fmol/ml. Le brevet français 2 359 850 décrit une nouvelle NADH-peroxydase et son utilisation pour doser l'eau oxygénée (H202), en particulier dans une réaction couplée, en présence d'une oxydase spécifique. Dans ce brevet, l'utilisation de NADH peroxydase donne un rapport stoechiométrique entre la quantité de NADH consommé et la quantité initiale de peroxyde d'hydrogène au maximum égal à 1. ce qui ne permet pas de doser des concentrations très faibles d'un produit. La sensibilité de la méthode décrite dans ce Brevet est de l'ordre de 10-5 M. B. HETIlWELL et ai., dans Free radicals in Blo- logy (Oxford Univ. Press, New York, 1985, p. 81) -ont décrit une réaction appelée "réaction oxydase de peroxydase", dans laquelle le peroxyde d'hydrogène associé à la peroxydase joue un rôle de catalyseur. Les réactions intervenant dans ce processus peuvent s'écrire (B. HALLIWELL & ai., "Photochemistry and Photo biolog '. 1978, 28, p. 757-763 ; B. HALLIWELL & al., "Free Radicals in Biology and Medecine", Oxford Univ. Press, New York, 1985, p. 79-81) (1) Peroxydase + H202 --- > Composé 1 (2) Composé 1 + NADH --- > NAD + Composé 2 + H+ (3) Composé 2 + NADH --- > NAD + Peroxydase + H+ (4) 2 NAD + 2 02 --- > 2 NAD+ + 2 O-2 (5) 2 O- 2 + 2 H+ --- > H202 + 02 dont le bilan global est une transformation (6) 2 NADH + 02 --- > 2 NAD+. Cette réaction a lieu parce que le radical libre NAD peut directement réduire l'oxygène. Dans cet ensemble de réactions, H2O2 associé à la peroxydase a un rôle de catalyseur et donc tout le NADH présent est transformé en NAD. Le procédé, selon l'invention, a l'avantage de fournir une réaction de terminaison emp8chant la régénération totale de l'H2O2. VIRION A. et al. (Eur. J. Biochem, 1985 148, 239-243) décrit l'oxydation du NADPH, catalysée par le système peroxydase/H202. Il est connu qu'un tel système requiert la présence de molécules médiatrices. Les Auteurs de cet ar ticle ont montré que l'oxydatlon du NADPH, catalysée par un système lactoperoxydase/H202, , est médiatisée par de l'iode. Le produit de réaction obtenu est, dans ce dosage, un NADP iodé et non pas du NADP*. Dans cette réaction la stoechlomé- trie NADPH : H2O2 est de 1. Les procédés de dosage du peroxyde d'hydrogène proposés dans l'Art antérieur ne présentent pas une sensibilité suffisante, ils ne peuvent pas être utilisés dans le cadre de dosages de composés organiques présents dans un milieu liquide à de très faibles concentrations. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un procédé de dosage du peroxyde d'hydrogène plus sensible et plus spécifique que les procédés proposés dans l'Art antérieur et utilisable dans le cadre de dosages de composés organiques présents dans un milieu liquide à de très faibles concentrations. De plus, ce nouveau procédé présente également l'avantage d'être un procédé simple, facile à mettre en oeuvre et d'un coût faible. La présente invention a pour objet un procédé de dosage du peroxyde d'hydrogène, caractérisé en ce que l'on dose le peroxyde d'hydrogène présent à de très faibles concentrations dans un échantillon liquide, en présence de NADH et d'une peroxydase dans une solution de tampon appropriée, en déterminant la consommation de NADH par spectrophotométrie, le rapport stoechiométrique entre la quantité de NADH consommé et la quantité initiale de peroxyde d'hydrogène étant supérieur ou égal à 2, permettant ainsi, par amplifica tion, la détection de concentrations très faibles de peroxyde d'hydrogène. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux, préalablement au dosage proprement dit, l'échantillon liquide est dilué lorsque celui-ci est susceptibie de contenir des concentrations supérieures à 102 zM en peroxyde d'hydrogène. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, la peroxydase est choisie dans le groupe qui comprend la peroxydase de raifort et la lactoperoxydase. Selon encore un autre mode de mise e oeuvre du procédé, ledit dosage est réalisé à un pH compris entre 6. et 9. Selon une disposition préférée de ce mode de mlse en oeuvre le pH est avantageusement de 7,5. Le tampon approprié est avantageusement un tampon de stabilisation du pH. On peut citer, notamment, mais de manière non limitative, le tampon phosphate, le tampon cystéine et le tampon barbital, le tampon Tris, le tampon glycine. Selon un aspect de ce procédé de dosage, la détermination par spectrophotométrie de la consommation de NADH est réalisée par l'observation de la diminution totale de l'absorption à une longueur d'onde appropriée, la quantité de NADH consommé étant fonction de la concentration initiale en peroxyde d'hydrogène. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le rapport entre la quantité de NADH consommé et la quantité intiale de peroxyde d'hydrogène est de préférence égal ou supérieur à 7. Selon un autre aspect de ce procédé de dosage, la détermination par spectrophotométrie de la consommation de NADH est réalisée par la merure de la vitesse initiale de la consommation en NADH, ladite vitesse initiale de consommation du NADH étant fonction de la concentration initiale en peroxyde d'hydrogène. Conformément à l'invention, la longueur d'onde est avantageusement 340 nm. La présente invention a également pour obJet un procédé de dosage de composés organiques, caractérisé en ce que lesdits composés, présents dans un échantillon liquide à des concentrations très faibles, sont soum;s à un processus enzymatique spécifique, de manière à libérer du peroxyde d'hydrogène et en ce que l'on dose le peroxyde d'hydrogène formé en mettant en oeuvre le procédé conforme à l'invention, le rapport entre la quantité de NADH consommé et la concentration initiale en composé organique étant égal ou supérieur à 2, permettant ainsi une ampliflcation et la détection de traces dudit composé organique, la quantité totale de NADH consommé étant dtrectement proportionnelle à la concentration en composé organique. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le processus enzymatique est un processus d'oxydation enzymatique. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, on effectue l'oxydation enzymatique en présence d'oxydases spécifiques, notamment la sarcosine oxydase, l'aldéhyde oxydase, la xanthine oxydase, la pyruvate oxydase, l'oxalate oxydase, la glyoxalate oxydase, la dihydro-orotate oxydase, la cyclohexylamine oxydase, la N-méthylaminoacide oxydase, la N-méthyllysine oxydase, la 6-hydroxy-L-nicotine oxydase, la sulfite oxydase, l'aspartate oxydase, les L amino-acide oxydases, les D-amino-acide oxydases, l'amine oxydase, la pyridoxamine phosphate oxydase, la D-L glutamate oxydase, l'éthanolamine oxydase, la tyramine oxydase, la putrescine oxydase, la glycollate oxydase, la glucose oxydase, l'hexose oxydase, la cholestérol oxydase, l'arylalcool oxydase, la gluconolactone oxydase, la galactose oxydase, la pyranose oxydase, la sorbose oxydase la pyridoxyne-4 oxydase, l'alcool oxydase, la catéchol oxydase, la L-2 hydroxy acide oxydase, l'ecdysone oxydase, la choline oxydase. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé, les composés organiques sont pris dans le groupe qui comprend les composés organiques susceptibles de libérer du peroxyde d'hydrogène au cours d'un processus enzymatique monoenzymatique ou multienzymatique, et notamment le L. lactate, le L. malate, les sucres, en particulier le glucose, les hexpses, le galactose, le pyranose et le sorbose, le cholestérol, les aldéhydes, la xanthine, l'oxalate, les L et D amino-acides, les amines, la sarcosine, la créatinine, le pyruvate, le glyoxalate, le dihydro-orotate, le lathostérol, la cyclohexylamine, le N-méthylamlnoaclde, le N-méthyl lysine, la 6 hydroxy-L-Nicotine, le n1troéthane, les sulfites, 1 r aspartate, le pyr;;doxam ne phosphate, le DL glutamate, l'éthanolamine, la tyramine, la putresc1ne, le glycollate, les arylalcools, la gluconolactone, la pyridoxine-4, les alcools, les catéchols, le L-2-Hyaroxy acide, l'ecdysonecholine. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux, préalablement au dosage proprement dit, l'échantillon liquide est dilué, lorsque celui-ci est susceptible de contenir des concentrations supérieures à 102 zM en composé organique. En variante à ce procédé de dosage, on associe au processus enzymatique spécifique de llbératlon du peroxyde d'hydrogène, un deuxième processus enzymatique recyclant partiellement le composé organique de départ, créant ainsi une boucle réactionnelle, le dosage du peroxyde d'hydrogène formé, étant réalisé par mise en oeuvre du procédé selon 1' invention. Selon un mode de mise en oeuvre de cette variante, le deuxième processus enzymatique, recyclant partiellement le composé organique, comprend une déshydrogénase appropriée. La présente invention a également pour objet un kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de dosage du peroxyde d'hydrogè ne, conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend - une quantité appropriée de NADH, dans un réci pient convenable - une quantité appropriée de peroxydase appropriée, dans un récipient convenable - des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre dudit procédé. La présente invention, a en outre pour objet, un kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de dosage de composés organiques conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend - une quantité appropriée de NADH, dans un réci pient convenable - une quantité appropriée de peroxydase appropriée, dans un récipient convenable - une quantité appropriée d'oxydase appropriée au composé organique à doser, dans un récipient convenable - des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre dudit procédé. Selon un mode de réalisation avantageux de ce kit de dosage, il comprend, en outre, une quantité appropriée de déshydrogénase appropriée au composé organique à doser,--dans un récipient convenable. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui comprend un exemple de détection du peroxyde d'hydrogène selon l'invention ainsi qu'une application de ce procédé au glucose et à la sarcosine. Exemple 1 - Dosage du peroxyde d'hydrogène 1 - On ajoute successivement, dans une cuve de spectrophotomètre (cuve quartz lOmm), 2 ml d'une solution tamponnée (phosphate 100 mM, pH 7,58) contenant la peroxydase (2 pM), 100 pl de NADH (2mM) dans un tampon phosphate 10 mM à pH 8,4 (concentration finale : 100 zM), (100 - x) pl de la même solution tamponnée et x- zl du peroxyde d'hydrogène (Figure 1 ou Figure 2), volume appropriée pour obtenir les concentrations finales indiquées sur l'axe des abscisses desdites Figures. 2 - On suit la densité optique à 340 nm en double faisceau contre 2100 pl de solution équivalente sans peroxyde d' hydrogène. 3 - La lecture se fait au spectro-photomètre à 340 nm, comme précisé en 2 ; il y a alors une stricte proper- tionnalité entre la concentration du peroxyde d'hydrogène et l) la quantité de NADH consommé (figure 2), mesurée par l'écart de densité optique et/ou (ii) la vitesse initlale de consommation du NADH (Figure 1). La Figure 1 comporte en abscisse les concentrations d'H202 en zM et en ordonnée la vitesse ;itiâ:e de NADH en nMol/sec. Elle correspcnd à une courbe d'étalonnage avec des quantités différentes d'eau oxygénée (de concentrations connues, obtenues par dilution d'une solution à 30 % en volume). Cette Figure 1 montre que la réponse est parfaitement linéaire dans un domaine de faibles concentrations allant de 0,05 zM à 0,5 zM. Cette Figure 2 précise les rapports entre les quantités de NADH consommé et les concentrations de peroxyde d'hydrogène. En abscisse, on a les concentrations en peroxyde d'hydrogène, en zM et en ordonnée on a les concentrations de NADH consommé en zM. La pente visualise le rapport d'amplification : dans le cas présent, 9 molécules de NADH par molécule de H202. La Figure 2 montre que la réponse est parfaitement linéaire dans un domaine de faibles concentrations allant de 0,05 pM à 1 M. Dans les deux cas, la sensibilité est proche de 0,05 M pour un volume de 2 ml et la réponse est linéaire en fonction de la concentration en H2O2. Exemple 2 : Dosage du glucose Ce dosage est basé sur la réaction suivante Glucose + O2 Glucose-oxydase Gluconolactone + H202 Les mesures s effectuent comme précisé dans l'exemple 1. 1 - On ajoute successivement dans une cuve de spectro-photomètre (cuve quartz, 10 mm) 2 ml de solution tamponnée (tampon phosphate 100 mM, pH 7,58) contenant la glucose oxydase (0,28 pM), la peroxydase (1,25 zM) et le NADH (120 pM) ; on aboute ensuite diverses quantités connues de glucose, déterminées par pesée, et l'on suit l'évolution de l'absorption à 340 nm. 2 - La lecture est effectuée dans un spectrophotomètre en double faisceau. La cinétique obtenue est semblable à celle du peroxyde d'hydrogène ; le rapport d'amplification est dans les présentes conditions du même ordre de grandeur (=7) et la courbe de calibration montre une réponse (figure 3) tout à fait linéaire dans un domaine de concentration allant de 0,07 pM à 7 pM, la linéarité ayant été vérifiée jusqu'à 30 pM, alors que les limites de sensibilité sont de 1 pM pour les procédés spectro-photométriques actuellement utilisés et de llordre de 10-' M pour certains procédés potentiométriques. La figure 3 comporte en abscisse les concentrations de glucose en zM, et en ordonnée la vitesse initiale de décroissance de l'absorption à 340 nm. La quantité totale de NADH ayant réagi est également proportionnelle à la concentration du glucose et le rapport d'amplification est de l'ordre de 7 à 10. Exemple 3 : Dosage de la sarcosine : Le dosage est basé sur la réaction suivante Sarcosine + H2O2 Sarcosine oxydase glycine + H202 + HCHO Les mesures s'effectuent comme précisé dans l'exemple 1. 1 - On aboute successivement, dans une cuve de spectrophotomètre (cuve quartz, 10 mm), 2 ml de solution tamponnée (phosphate 100 mM, pH 7,58) contenant la sarcosine oxydase (concentration finale de 6,25 U/ml), la peroxydase (1,25 zM), le NADH (120 zM) ; on ajoute ensuite diverses quantités connues de sarcosine et l'on suit l'évolutlon de l'absorption à 340 nm. 2 - La lecture est effectuée dans un spectrophotomètre en double faisceau. La Figure 4 comporte en abscisse les concentrations de sarcosine en zM et en ordonnée, les concentrations en NADH consommé en M. La quantité totale de NADH ayant réagi est pro- portionnelle à la concentration de la sarcosine et le rapport d'amplification est de l'ordre de 8. Exemple 4 : Dosage du glucose en présence de glucose oxydase et de glucose déshydrogénase On ajoute successivement, dans une cuve de spectrophotomètre (cuve quartz, 10 m. 2 mi de solution tampon née (phosphate 100 mM pH 7,58 " contenant la péroxydase (1,25 1M), le NADH (120 zM), le glucose oxydase (0,28 zM), on aJoute X pl de glucose et 100 zl de glucose déshydrogénase (concentration finale de 25 U/ml) et on suit l'évolution de l'absorption à 340 nm. La Figure 5 comporte en abscisse les concentrations de glucose en M et en ordonnée, la disparition du NADH en pM. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement d ceux de ses modes de mise en oeuvre et d'application qui viennent d'être décrits de façon explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 15 ) Procédé de dosage du peroxyde d'hydrogène, caractérisé en ce que l'on dose le peroxyde d'hydrogène présent à de très faibles concentrations dans un échantillon liquide, en présence de NADH et d'une peroxydase dans une solution de tampon appropriée, en déterminant la consommation de NADH par spectrophotométrie, le rapport stoechiométrique entre la quantité de NADH consommé et la quantité initiale de peroxyde d'hydrogène étant supérieur ou égal à 2, permettant ainsi, par amplification, la détection de concentrations très faibles de peroxyde d'hydrogène. 2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, préalablement au dosage proprement dit, l'échan tiller; liQuide est dilué lorsque celui-ci. est susceptible de contenir des concentrations supérieures à 102 zM en peroxyde d'hydrogène. 3 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la peroxydase est choisie dans le groupe qui comprend la peroxydase de raifort et la -'actcperoxydase. 4') Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit dosage est réalisé à un pH compris entre 6 et 9. 5') Procédé selon l'une quelconque des revendicat;ons 1 à 4, caractérisé en ce que le pH est avantageusement de 7,5. 6') Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la détermination par spectrophotométrie de la consommation de NADH est réalisée par l'observation de la diminution totale de l'absorption à une longueur d'onde appropriée, la quantité de NADH consommé étant fonction de la concentration initiale en peroxyde d'hydrogène. 7") Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le rapport entre la quantité de NADH consommé et la quantité intiale de peroxyde d'hydrogène est de préférence égal ou supérieur à 7. 8 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la détermination par spec trophotométrie de la consommation de NADH est réalisée par la mesure de la vitesse initiale de la consommation en NADH, ladite vitesse initiale de consommation du NADH étant fonction de la concentration initiale en peroxyde d'hydrogène. 9') Procédé de dosage de composés organiques, ca caractérisé en ce que lesdits composés, présents dans un échantillon liquide à des concentrations très faibles, sont soumis à un processus enzymatique spéciìque, de manière à libérer du peroxyde d'hydrogène et en ce que l'on dose le peroxyde d'hydrogène formé en mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, le rapport entre la quantité de NADH consommé et la concentration initiale en composé organique étant égal ou supérieur à 2, permettant ainsi une amplification et la détection de traces dudit composé organique, la quantité totale de NADH consommé étant directement proportionnelle à la concentration en composé organique. 10") Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le processus enzymatique est un processus d'oxydation enzymatique. 11') Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce qu'on effectue ltoxydation enzymatique en présence d'oxydases spécifiques, notamment la sarcosine oxydase, l'aldéhyde oxydase, la xanthine oxydase, la pyruvate oxydase, l'oxalate oxydase, la glyoxalate oxydase, la dihydro-orotate oxydase, la cyclohexylamine oxydase, la N-méthylaminoacide oxydase, la N-méthyllysine oxydase, la 6-hydroxy-L-nicotine oxydase, la sulfite oxydase, l'aspartate oxydase, les L amino-acide oxydases, les D-amino-acide oxydases, l'amine oxydase, la pyridoxamine phosphate oxydase, la D-L glutamate oxydase, l'éthanolamine oxydase, la tyramine oxydase, la putrescine oxydase, la glycollate oxydase, la glucose oxydase, l'hexose oxydase, la cholestérol oxydase, l'arylalcool oxydase, la gluconolactone oxydase, la galactose oxydase, la pyranose oxydase, la sorbose oxydase, la pyridoxyne-4 oxydase, l'alcool oxydase, la catéchol oxydase, la L-2 hydroxy acide oxydase, ltecdysone oxydase, la choline oxydase. 12') Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que les composés organiques sont pris dans le groupe qui comprend les composés organiques susceptibles de libérer du peroxyde d'hydrogène, et notamment le L. lactate, le L. malate, ies sucres, en particulier le glucose, les hexoses, le galactose, le pyranose et le sorbose, le cholestérol, les aldéhydes, la xanthine, l'oxalate, les L et D amino-acides, les amines, la sarcosine, la créatinine, le pyruvate, le glyoxalate, le dihydro-orotate, le lathostérol, la cyclohexylamine, le N-methylaminoacide, le Nméthyl lysine, la 6 hydroxy-t-nicotine, le nitroéthane, les sulfites, l'aspartate, le pyridoxamine phosphate, le DL glutamate, l'éthanolamine, la tyramine, la putrescine, le glycollate, les arylalcools, le gluconolactone, la pyridoxine-4, les alcools, les catéchols, le L-2-Hydroxy acide, 1 ' ecdysone-choline. 13') Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 å 12, caractérisé en ce que, préalablement au dosage proprement dit, l'échantillon liquide est dilué, dans le cas où celui-ci est susceptible de contenir des concentrations supérieures à 102 pM en composé organique. 14') Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce qu'on associe au processus enzymatique spécifique de libération du peroxyde d'hydrogène, un deuxième processus enzymatique recyclant partiellement le composé organique de départ, créant ainsi une boucle réactionnelle, le dosage du peroxyde d'hydrogène formé, étant réalisé par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 15') Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 a 14, caractérisé en ce que le deuxième processus enzymatique, recyclant partiellement le composé organique, comprend une déshydrogénase appropriée. 16-) Kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emplol, pour la mise en oeuvre du procédé de dosage du peroxyde d'hydrogène, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend - une quantité appropriée de NADH, dans un réci pient convenable - une quantité appropriée de peroxydase appropriée, dans un récipient convenable - des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre dudit procédé. 17') Kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de dosage de composés organiques, selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend - une quantité appropriée de NADH, dans un récipient convenable - une quantité appropriée de peroxydase appropriée, dans un récipient convenable - une quantité appropriée d'oxydase appropriée au composé organique à doser, dans un récipient convenable - des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre dudit procédé. 18') Kit selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une quantité appropriée de déshydrogénase appropriée au composé organique à doser, dans un récipient convenable.