Brevet FR2628744A1 — publié le 19890922

La présente invention est relative à des isoformes de la trophoblastine correspondant å des interférons a de Classe Il doués, entre autres, de propriétés antivirales, constitués par au moins l'une desdites isoformes. Un Article paru dans J. REPROD. FERT. (1979) 56, p. 63-73 sous la signature de J. MARTAL, M.C. LACROIX, C. LOUDES, M. SAUNIER et S. WINTENBERGER-TORRES, a décrit l'identification d'un composant antilutéolytique sécrété par l'embryon chez la brebis, appelé trophoblastine ; il a établi également la nature protéique de la trophoblastine, qui est thermolabile et sensible aux protéases il a de plus établi que la période durant laquelle la trophoblastine est secrétée est très restreinte puisque sa présence semble critique à partir du jour 12 de la gestation seulement et n'est plus détectable après les jours 21-23. Il a énoncé, en outre, deux hypothèses concernant le mécanisme d'action de la trophoblastine dont il a privilégié celle qui lui paraissait confirmée par les expérimentations conduites, selon laquelle l'action de la trophoblastine serait essentiellement locale. Un Article de GODKIN, BAZER, THATCHER et ROBERTS paru dans J. REPROD. FERT. (1984), 71, p. 57-64, étudie des protéines libérées par le conceptus durant la culture de celui-ci et non pas comme chez MARTAL et al. des extraits d'homogénats de tissus de conceptus. La protéine de trophoblaste ovin identifiée par ltéquipe ROBERTS et al, oTP-l, sécrétée par le conceptus de brebis entre les jours 13 et 21 de la gestation, a été purifiée pour être ensuite injectée dans le tractus utérin et a fait l'objet d'une expérimentation afin de déterminer si elle est effectivement impliquée dans la fonction lutéale pendant la phase précoce de la gestation. Après avoir rappelé une précédente publication dans laquelle ils ont décrit l'identification par élec trophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide,de protéines produites in vitro par le conceptus de brebis entre les jours 13 et 23 de la gestation et la purification des deux polypeptides majeurs secrétés, les Au- teurs ont cherché, dans les travaux dont cette Publication rend compte, à déterminer si l'oTP-l, libérée dans le milieu d'incubation par des conceptus aux jours 15 - 16, est capable de prolonger la durée de vie fonctionnelle du CL lorsqu'elle est injectée dans la lumière utérine de brebis cycliques. Ils ont établi alors, que cette oTP-l d'origine ovine n'est pas aussi active que les protéines totales de conceptus et qu'elle ne "prolonge" le cycle que de 4 jours en moyenne. Ils ont en outre suggéré que l'oTP-l était susceptible de prolonger la durée de vie fonctionnelle du CL en agissant conjointement avec l'endométre utérin. Dans un article paru dans THERIOGENOLOGY de Janvier 1985, vol. 23, NO 1, p. 129-143, l'Equipe ROBERTS et al. a étudié les protéines secrétées par le conceptus (CSP) de vaches dans le milieu de culture elle a établi que l'administration intra-utérine de CSP à des vaches cycliques prolonge la fonction CL de 8 jours au-delà de celle de la 5ss-P(5ss-pregnan-3 -ol-20-one) et de vaches témoins.Les polypeptides principaux,produits dans le milieu de culture de conceptus de jour 16,ont été identifiés en électrophorèse bidimensionnelle comme présentant des poids moléculaires de 22 à 26 kDa (par mobilité électrophorétique en présence de SDS) et une migration dans une gamme de points isoélectriques de 6,8 à 5,6 ; des polypeptides mineurs de P.M. 40 - 50 et de pointsisoélectriques 6,2 à 7,4 ont également été identifiés dans le milieu. Cette Publication rapporte, en outre, l'hypothèse avancée selon laquelle l'étude, après purification, des protéines produites par le conceptus de bovins, devrait permettre d'élucider leurs rôles respectifs dans le processus du maintien du CL et de mettre en évidence que des protéines similaires produites par le conceptus ovin pourraient être actives chez les bovins. Pour vérifier cette hypothèse, du sérum de lapin-oTP-l a été utilisé pour la caractérisation immunologique de protéines sécrétées par le conceptus de bovins. L'analyse par double immunodiffusion par la méthode d'Ouchterlony, avec du sérum anti-oTP-l, a produit une double-bande contre les protéines non fractionnées sécrétées par du conceptus bovin. L'une de cers deux bandes présente une identité partielle aussi bien avec l'oTP-l purifiée qu'avec les protéines non fractionnées sécrétées par du conceptus ovin. D'autres expériences, menées en présence d'un amino-acide radioactif, confirment l'homologie partielle entre les protéines produites par les conceptus ovin et bqvin et confirment les travaux de l'Equipe MARTAL et al. sur les transferts de vésicules trophoblastiques interspécifiques chez les brebis et les vaches, rapportés dans J. REPROD. FERT. (1984), 70, p. 533 - 540 et Proc. îOth Intern. Congr. on Anim. Reprod. and A.I., Urbana Champaign, USA I11;, No 510, 3 p. L'Equipe ROBERTS et al. (ENDOCRINOLOGY (1984), 114, 120 - 130) montrent que l'oTP-l peut stimuler sélectivement quelques protéines de l'endométre et formule l'hypothèse que certaines pourraient inhiber la biosynthèse de la prostaglandine F2 dans ltendométre, bien qu'une telle hypothèse n'ait été vérifiée ni en ce qui concerne les protéines sécrétées par le conceptus bovin, ni en ce qui concerne les protéines sécrétées par le conceptus ovin. Dans un Article paru dans ENDOCRINOLOGY (1985), 117, NO 4, p. 1424 - 1430, l'Equipe ROBERTS et al. décrit la traduction d'ARNm de conceptus de brebis âgé de 16 jours, à l'aide d'un lysat acellulaire de germe de blé. L'immunoprécipitation de l'oTP-l du mélange de traduction, à l'aide d'un anti-sérum spécifique de lapin; montre que l'oTP-l synthétisée a un poids moléculaire de 21 kDa, alors que, selon les Auteurs, l'oTP-l sécrétée par des conceptus intacts dans du milieu de culture, aurait un poids moléculaire de 17 kDa. Dans un Article paru dans LIVESTOCK PRODUCTION SCIENCE, (1987), 17, p. 193 - 210, l'Equipe MARTAL et al. fait le point des connaissances sur la trophoblastine, dont elle montre l'identité avec l'oTP-l, qui est sécrétée par le trophectoderme et a été mise en évidence uniquement chez la brebis et la vache. Cette Pu- blication établit que la trophoblastine inhibe la lutéolyse par action directe sur l'endométre en affectant le CL non pas directement, mais par l'intermédiaire soit de-petits peptides qu'elle a induits, soit des prostaglandines lutéotrophiques endométriales. Un Abrégé'paru dans J. CELL. BIOL., 105 (4) PART. 2 (1987) sous la signature de l'Equipe ROBERTS et al. relate l'établissement d'une séquence de nucléotides d'une série de clones d'ADNc d'oTP-l, à partir d'une banque d'ADNc de lambda gtll construite à partir d'ARNm poly(A+) de conceptus de J 16. La structure primaire qui est déduite de l'ADNc de l'oTP-l présente une homologie de l'ordre de 50 % avec les interférons a de classe I d'homme, de boeuf, de porc, de souris et de rat, et d'environ 75 % avec celle d'interféron a bovin de classe II et avec celle d'interféron ss humain. Cet Abrégé indique, en outre, que l'oTP-l comporte à la fois des cystéines en position 1, 29, 99 et 139 et une séquence Cys-Ala-Trp-Gly-Ile-Val-Val-Arg que l'on retrouve dans 139 146 la plupart des interférons - a .Cet Abrégé indique éga lement que les Auteurs ont démontré que l'oTP-l possède les propriétés antivirales et antiprolifératives d'un interféron, ce qui les conduit à suggérer que l'oTP-l non seulement correspond à un signal de reconnaissance maternelle de gestation ("maternal recognition of pregnancy") chez la brebis, mais pourrait également jouer le rôle d'immunomodulateur local. Un Article paru dans NATURE (1987) Vol. 330, 26 Novembre 1987 sous la signature de l'Equipe ROBERTS et al. rapporte la séquenceenamino-acides de l'oTP-l telle que déduite d'un ADNc cloné et démontre que la protéine est très probablement un interféron a .L'une des figures de cet Article reproduit la séquence nucléotidique et la séquence d'amino-acides qui en est déduite, de la totalité de la longueur d'ADNc d'oTP-l de clones kaz-6 et kaz-2 ; elle comporte 972 bases, la séquence d'amino-acides déduite identifiée comporte 172 amino acides, dont la séquence 139 - 146 Cys-Ala-Trp-Glu-Ile-Val-Arg-Val 139 146 Cet Article rapporte la verification de l'identité de la formule avec l'oTP-l purifiée et l'homologie de celleci avec celle des interférons - a de divers mammifères, y compris l'homme, ce qui suggèrerait que les isoformes de ltoTP-l pourraient être des interférons très spécialisés, qui pourraient participer à l'immunoprotection du foetus eu égard au fait que les interférons peuvent retarder le rejet d'allogreffes et inhiber l'activation des lymphocytes par les lectines et les antigènes. Ces isoformes ont été identifiées commé suit : l'oTP-l consiste en 3 - 4 variants isoélectriques de points isoélectriques 5,5 - 5,8, de masse moléculaire de 18 kDa et l'oTP-l obtenue par traduction in vitro (pré-OTP-1) à partir d'ARN polyadénylé, consiste en plusieurs poly peptides dont chacun présente une masse moléculaire de l'ordre de 21 kDa. Un Article paru dans FEBS LETTERS, Vol. 228, NO 1, p. 12 - 16 de Février 1988, sous la signature de l'Equipe MARTAL et al. décrit la purification de la trophoblastine, ou oTP-l (ovine trophoblastic protein 1) ou encore oTPB (ovine trophoblastic protein B) par HPLC analytique et la détermination des 45 premiers amino-acides. Les Auteurs ont, en outre, démontré par comparaison des séquences, une homologie significative entre l'oTPB (qui est identique à l'oTP-l) et les interférons a bovins de classe II : 64 % des amino-acides sont identiques et 75 % sont homologues ; la région 23 - 44 présente une homologie de 82 %.De plus, en raison de l'identité de 55 % entre l'oTPB et l'interféron -a I.9 humain, d'une part, et l'interféron a -I.1 murin, d'autre part, à partir de l'extrémité N-terminale, les Auteurs considèrent que l'oTPB (ou oTP-l ou trophoblastine) devrait être un interféron embryonnaire. La séquence de 45 amino-acides représentée dans cette publication ne se distingue de la séquence correspondante représentée dans la Publication de NATURE que par le fait qu'elle comporte un résidu Gln en position 5 et un résidu Arg en position 6, alors que la séquence d'amino-acides correspondante publiée dans NATURE comporte dans ces deux positions successives respectivement un résidu Arg et un résidu flwLs. Ainsi que cela ressort des publications citées dans ce qui précède, le signal embryonnaire que constitue la trophoblastine est sécrété au moment de la différenciation de l'embryon ; sa sécrétion commence à J 9, alors que l'embryon n'est qu'un amas de llu- les indifférencié et elle disparaît au 22ème jour de la gestation , alors que l'embryon est déjà formé.L'approfondissement des connaissances relatives à la protéine désignée sous le nom de trophoblastine, permettrait d'abaisser le seuil de détection du signal embryonnaire en question, ce qui revêt une importance particulière dans les techniques de transfert et de transplantation d'embryons, dans lesquelles il est indispensable de détecter aussi précocement que possible si l'embryon transféré est vivant, et dans lesquelles il serait plus favorable encore de pouvoir détecter la viabilité des embryons dans des milieux synthétiques dans lesquels il est de plus en plus fréquent de les conserver avant implantation. L'approfondissement des connaissances relatives à cette protéine, dont l'homologie avec des interférons de classe a récemment été mise en évidence, permettrait probablement, du fait qu'il mettrait à disposition un modèle de système physiologique bien identifié, capable de donner des informations sur le mode de fonctionnement d'un interféron embryonnaire dans une cellule normale, de comprendre le comportement d'un interféron dans une cellule infecte par un virus et d'améliorer les propriétés des interférons. La présente invention a pour objet des isoformes de la trophoblastine caractérisées par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à une formule générale commune I Cys-Tyr-Leu-Ser-(X)-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu 20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-(Y)-Phe-Gly-Leu-Pro-Glu-Glu-Met-Val-(Z)-Gly 35 40 45 (I) dans laquelle (X5) représente :Glu ou Gln (Y35) représente Lys ou Asp et (Z44) représente Glu ou Asp Selon un mode de -réalisation avantageux d'une isoforme de la trophoblastine, 1'isoforme Ti est caractérisé sée par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à la formule li ci-après:: Cys-Tyr-Leu-Ser-Glu-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu 20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-Lys-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly 35 40 44 45 (Ii) Selon un autre mode de réalisation avantageux d'une isoforme de la trophoblastine, l.'isoforme T2 est caractérisée par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à la forme 12 ci-après Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu 20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly 35 40 4.4 45 (I2) Selon encore un autre mode de réalisation avantageux d'une isoforme de la trophoblastine, l'isoforme T3 est caractérisée par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond a la formule I3 ci-après Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu 20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Asp-Gly 35 40 44 45 (I3) La présente invention a également pour objet un procédé d'isolement des formes isoélectriques T1, T2, T3 de la trophoblastine par chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC), caractérisé en ce que l'on soumet un milieu de culture obtenu à la suite d'une incubation de conceptus ovins pendant un temps approprié, à une chromatographie sur colonne échangeuse d'anions équilibrée par un tampon cationique, puis à l'action d'un gradient salin dans un tampon cationique, en l'espace d'un intervalle de temps approprié, suivi d'une élution isocratique pendant laquelle les isof ormes sont successivement recueillies. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, le milieu de collecte des conceptus destinés à être mis en culture est constitué par un tampon approprié dépourvu de sérumalbumine et contenant de la polyvinylpyrrolidone à une concentration d'environ 0,05 % à 0,5 % poids/volume. Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, les conceptus sont mis en culture dans un milieu de culture synthétique dépourvu de sérumalbumine et de sérum sanguin et contenant la polyvinylpyrrolidone à une concentration d'environ 0,05 % à 0,5 % poids/volume. La polyvinylpyrrolidone est choisie de préférence parmi les polyvinylpyrrolidones de poids moléculaire élevé, afin de favoriser son élimination par exclusion sur colonne de chromatographie ou par insolubilisation à pH acide. Conformément à l'invention ces isoformes, dont chacune présente un poids moléculaire de l'ordre de 20 kDa, ont un point isoélectrique d'environ 5,4 pour la forme Ti, environ 5,3 pour la forme T2 et d'environ 5,2 pour la forme T3. La présente invention a, de plus, pour objet un agent présentant des activités antivirales, antitumorales, immunomodulatrics, d'inhibition de rejet, de différenciation cellulaire et d'inhibition de la lutéolyse en début de gestation chez les mammifères, ainsi que de sélection gené- tique, caractérisé en ce qu'il est constitué par un interféron de classe II, qui est l'une des isoformes Tz, T2, T3 de la trophoblastine telles qu'identifiées par leurs séquences N-terminales de formules li, 12, 13 ou leurs mélanges. La présente invention a, en outre, pour objet, les séquences nucléotidiques d'ADNc de chacune des isoformes de la trophoblastine, ainsi que les séquences d'amino-acides qui en sont déduites. Conformément à l'invention, la séquence nucléotidique d'ADNc de l'isoforme T2, et la séquence déduite en amino-acides, est constituée par un polypeptide dont le poids moléculaire est de l'ordre de 23 kDa et qui répond à la formule II ci-après CCCCCTGACCCCATCTCAGCCAGCCCAGCAGCAGCCGCATCTTCCC ATC GCC 53 Met Ala -23 TTC GTG CTC TCT CTA CTG ATG GCC CTG GTG CTG GTC AGC TAT GGC 98 Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu-Val Leu Val Ser Tyr Gly CCA GGA GGA TCT CTG GGT TGT TAC CTA TCT CAG AGA CTC ATG CTG 143 Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Gin Arg Leu Met Leu -1 +1 GAT GCC AGG GAG AAC CTC AAG CTC CTG GAC CGA ATG AAC AGA CTC 188 Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu TCC CCT CAT TCC TGT CTG CAG GAC AGA AAA GAC TTT GGT CTT CCC 233 Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro CAG GAG ATG GTG GAG GGC GAC CAG CTC CAG AAG GAC CAG GCC TTC 278 Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe 45 CCT GTG CTC TAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC TAC 323 Pro Val Leu Tyr Glu Het Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe Tyr ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG 368 Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln CTC TGC ,ACT GGA CTC CAA CAG CAG CTG GAC CAC CTG GAC ACC TCG 413 Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu Asp Thr Cys AGG GGT CAA GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GM CTG GGT AAC ATG 458 Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met GAC CCC ATT GTG ACC GTG AAG MO TAC TTC CAG GGC ATC TAT GAC 503 Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp TAC CTG CAA GAG AAG GGA TAC AGC GAC TGC GCC TGG GAA ATC GTC 548 Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val AGA GTC GAG ATG ATG AGA GCC CTC ACT GTA TCA ACC ACC TTG CAA 593 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln AAA AGG TTA ACA AAG ATG GGT GGA GAT CTG AAC TCA CCT TGATGACT 640 Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 172 CTTGCCGACTAAGATGCCACATCAGCCTCCTACACCCGCCSGTGTTCATTTCAGAAGACT 700 CTGATTTCTGCTCCAGCCACCAAATTCATTGAATTACTTTAGCTGATACTTTGTCAGTAG 760 TAAAAAGCAAGTAGATATAAAAGTATTCAOCTOTAGOGOCATGAGTCCTGAOGTOTOATG 820 CCTTCCCTGATGTTATCTGTTGCTGATTTATTTATACCTTCTAGCATTTAACATACTT M 880 AATATTAGGAAATTTGTTAAGTTACATTTCATCTGTACATCATATTAAAATTTCTAAAAC 940 ATG 943 (II) La présente invention a, en outre, pour objet une sonde oligodéoxynucléotidique pour la caractérisation de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine. Selon un mode de réalisation de ladite sonde, elle est caractérisée en ce qu'elle correspond aux résidus 34 à 43 de la séquence N-terminale de la trophoblastine et répond à la formule III ci-après 34 35 40 43 Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val (III) 3' TTC CTI AAI CCI IAI GGI GTC CTC TAC CA 5' T T T les I pouvant être remplacées par A, G ou C. L'invention englobe bien entendu, toute sonde, équivalente déduite de la séquence de formule II ou des séquences de formules li, I2, 13., apte à caractériser des clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine ou le gène de celle-ci. La présente invention a, de plus, pour objet un procédé d'obtention par clonage de l'ADNc de l'ARNm des isoformes T1, T2, T3 de la trophoblastine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes - isolement des ARN poly(A)+ totaux embryonnaires, à partir d'embryons de mammi-fères, notamment ovins âgés de moins de 22 jours, par une méthode appropriée - mesure de l'activité biologique des ARN poly(A)+ embryonnaires isolés au cours de l'étape précédente, par traduction in vitro dans un système acellulaire approprié et estimation par électrophorèse-SDS de la quantité de trophoblastine synthétisée, suivie d'une immunoprécipitation à l'aide d'un sérum anti-trophoblastine monospécifique, et détection d'un polypeptide de poids moléculaire d'environ 23 kDa, correspondant au précurseur de la trophoblastine - construction d'une banque d'ADN complémentaires d'embryons de mammifères, notamment d'ovins âgés de 16 jours, par synthèse des ADNc à partir d'une reverse-transcriptase et insertion de ces ADNc dans un vecteur d'expression, puis clonage dans des souches bactériennes appropriées. - recherche de clones contenant l'ADNc de 1'ARNm de l'isoforme T1, T2 ou T3 de la trophoblastine, par tous moyens appropriés. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé de clonage de la trophoblastine, conforme à la présente invention, la recherche de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine est réalisée à l'aide d'immunsérum monospécifique anti-trophoblastine. Selon un autre mode de mise en oeuvre de ce procédé, la recherche desdits clones est réalisée à l'aide d'une sonde oligodéoxynucléotidique qui répond à la formule III ci-dessus, par hybridation desdits clones avec ladite sonde, suivie de l'isolement des inserts de taille appropriée et du sous-clonage dans un plasmide approprié (notamment pUC18) pour déterminer que l'un des clones s'hybride avec un ARN unique de 1,1 kb codant pour un polypeptide d'environ 23 kDa correspondant au précurseur de la trophoblastine et que l'autre des clones sthybríde avec l'ARNm correspondant à l'ADNc de l'une des isoformes Ti, T2, Ta de la trophoblastine. La présente invention a également pour objet un kit de détection d'un signal embryonnaire pour contrôler la viabilité d'un embryon à un stade précoce de son développement, caractérisé en ce qu'il comprend en tant qu'agent de détection, au moins une isoforme de la trophoblastine de formule I ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la Description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention. I1 doit être bien -entendu toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 a) conditions de purification semi-préparative La trophoblastine est purifiée à un haut degré de pureté par chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC) sur une colonne d'échange d'anions semipréparative rtAE-5 PW de 21,5 mm de diamètre sur 150 mm de longueur, éluée avec un débit de 4 ml/mn, par un gradient de 0 à 0,15 M KC1 dans un tampon 0,05 M Tris-HCl pH 6,00, en l'espace de 60 minutes, suivie d'une élution isocratique à 0,15 M KC1 dans le même tampon. b) Conditions de purification analytique La trophoblastine est purifiée à un haut degré de pureté par chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC) sur une colonne DEAE 5 PW de 7;5 mm de diamètre sur 75 mm de longueur, éluée à un débit de 0,5 ml/mn par un gradient de 0 à 0,15 M KC1 dans un tampon 0,05 M Tris-HCl pH 6,00, en l'espace de 40 mn, suivie d'une élution isocratique à 0,15 M KC1 dans le même tampon. La figure 1 annexée montre l'isolement des polypeptides T1, T2, T3 dans la partie isocratique du gradient voisine de 0,15 M KC1. La trophoblastine purifiée présente un poids moléculaire apparent de 20 kDa et un point isoélectrique d'environ 5,3. Elle se lie spécifiquement aux récepteurs membranaires endométriaux, ce qui démontre le maintien de son activité biologique après les étapes de purification. Le récepteur utérin de ce signal embryonnaire existe dès la fin de la phase lutéale du cycle oestrien alors que l'embryon est absent. Les trois formes isoélectriques de la trophoblastine, T1, T2, T3, isolées conformément à la présente invention, sont des variants de celle-ci, comme le démontre le séquençage de ltextrémité N-terminale de ces trois protéines, tel qu'il ressort des Formules I, I1, 12 et 13 ci-dessus. Propriétés antivirales de la trophoblastine. Les Inventeurs ont démontré que la trophoblas tine ovine possède l'activité antivirale des interférons, en présence de cellules bovines MDBK infectées par le virus bovin de la stomatite vésiculeuse. La trophoblastine ovine manifeste une activité sensiblement comparable à celle des interférons &alpha; de classe I témoins sur les cellules ovines et bovines, mais aussi humaines et porcines, ainsi que cela ressort du Tableau I ci-après TABLEAU I Activite antivirale de la trophoblastine (T) Cellules Cellules Cellules Cellules Cellules Cellules bovines ovine s ovine s porcines hixtaines de souris (MDBK 59) (NM6) endométriales (PD5) (WISH) (L929) T 1 ++++ +++ ++++ ++ ++ 2 ++++ +++ ++++ ++ ++ + 3 ++++ +++ ++++ ++ ++ + IFN&alpha;I +++ +++ +++ + ++ ++ porc (1 (1 000 UI) Ordre de grandeur ::T milieu brut # 2,7.108 UI/mg T purifié # 8.106 UI/mg IFNaI recombinant = 107 UI/mg Par conséquent, la trophoblastine ne présente pas seulement une forte homologie structurale avec les interférons, comme indiqué dans la publication EEBS LETTERS précitée, mais elle possède aussi l'activité antivirale caractéristique de toutes les familles d'interférons. Par séroneutralisation, les Inventeurs ont pu confirmer que la trophoblastine ovine est bien un interféron a de classe II : un immunsérum antiinterféron a de classe I ne reconnaSt pas la trophoblastine et réciproquement un immunsérum monospécifique anti-trophoblastine ne reconnaît pas les interférons a de classe I. La trophoblastine est le premier interféron a de classe II isolé, naturellement exprimé dans un tissu de mammifère. Jusqu'ici, les rares interférons a de classe II connus (bovin, humain, équin, porcin) n'ont été mis en évidence qu'à l'aide de sondes moléculaires d'ADN. il en résulte que les propriétés des interférons a de classe II sont particulièrement peu connues De plus, la structure d'un interféron naturel peut différer sensiblement par ses parties glycosylées des interférons obtenus par génie génétique. La trophoblastine présente l'originalité pour un interféron de ne pas être sécrétée àla suite d'une infection virale. De plus, elle est produite en quantité exceptionnellement élevée par rapport à celle de tous les interférons naturellement exprimées. En raison des activités immunomodulatrices des interférons, on peut suspecter une participation de la trophoblastinedans la tolérance immunologique de la mère vis à vis de l'embryon. Alors que l'activité antilutéolytique de la trophoblastine n'a été démontrée que chez les ruminants, la possibilité de l'existence de molécules identiques dans de nombreuses autres espèces pourra être recherchée par leur propriété antivirale éventuelle, ainsi qu'à l'aide de sondes d'ADNc de la trophoblastine. Les milieux de culture de conceptus bovins et caprins présentent une activité anti-virale comparable à celle de la trophoblastine ovine. Exemple 2 : Clonage de la trophoblastine. L'obtention de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine comprend les étapes suivantes. 1. Isolement des ARN poly(A) totaux embryonnaires, en utilisant la méthode de l'isothiocyanate de guanidine à partir d'embryons ovins agés de 16 jours (CATHALA et al., 1983). Afin de posséder un témoin '1négatif" correspondant à un stade tardif pendant lequel la trophoblastine n'est plus sécrétée, des ARNm ont également été isolés à partir d'embryons agés de 29 jours. Après purification sur colonne d'affinité (oligo dT cellulose), environ 50 à 60 pg d'ARN poly(A) + ont été obtenus à partir d'une vingtaine d'embryons agés de 16 jours, prélevés chirurgicalement. - Caractérisation du précurseur de la trophoblastine et quantification de l'ARNm correspondant. L'activité biologique des ARN poly(A) embryonnaires a été mesurée par traduction in vitro dans deux systèmes acellulaires (lysat de réticulocytes et germe de blé) en présence de 35S-méthionine. Dans ces deux cas, la quantité de trophoblastine synthétisée a été estimée par électrophorèse-SDS, suivie d'une immunoprécipitation respectivement à l'aide d'un immunsérum antitrophoblastine monospécifique préparé par les Inventeurs. Dans ces conditions, un polypeptide de poids moléculaire apparent de - 23 kDA a été détecté ; il correspond au précurseur de la trophoblastine et représente environ 1 à 2 % des ARNm totaux.Ce type de molécule n'a pu être détecté à partir des ARN poly(A)+ d'embryons plus tardifs (29 jours), ce qui confirme la brève expression de la trophoblastine. Lorsque les ARN poly(A) d'embryons agés de 16 jours sont traduits en présence de membranes microsomiales, une protéine immunoprêcipitable de poids moléculaire apparent identique à la trophoblastine native (20 kDa) est observée en électrophorèse sur gel d'acrylamide en milieu dénaturant (cf. Figure 2 annexée). 2. Construction d'une banque d'ADN comDlémen- taures n'embryons ovins âaés de 16 hours Les ADNc ont été synthétisés selon le procédé de GUBLER et HOFFMAN (1983) qui permet d'obtenir des ADNc de longueur voisine de celle des ARNm. Après addition de "linkers" EcoRI, ces ADNc ont été insérés respectivement dans les sites EcoRI d'un vecteur plasmidique (pUC8) et d'un vecteur d'expression, le bactériophage Lambda gt i1 (#gt11), puis clonés dans les souches (DH5 et Y1088) de colibacilles (Escherichia coli). Les banques plasmidique et phagique contenaient respectivement 4.105 et 1,2.106 recombinants par g d'ADN. 3. Recherche de clones contenant l'ADNc de nucléotidiques synthétiques. Un oligodéoxynucléotide de 29 bases partiellement dégénéré, complémentaire de l'ARNm de la trophoblastine et correspondant aux résidus d'acides aminés 34 à 43 de la séquence de la trophoblastine, a été synthétisé. Afin de limiter le problème posé par la dégénérescence du code génétique, certaines bases variables de la sonde étaient remplacées par l'inosine qui a la propriété de ne pas déstabiliser les hybrides Lys - Asp - Phe - Gly - Leu - Pro - Gln - Glu - Met - Val 3'TTC - CTI - AAI - CCI - IAI - GGI - GTC - CTC - TAC - CA5 T T T Parmi les 300 000 phages recombinants, trois clones positifs ont été détectés par hybridation avec cette sonde. Après réétalements successifs à faible densité, deux d'entre eux donnent encore un signal permanent. L'ADN de ces deux clones a été digéré par EcoRI et deux inserts de taille voisine (""1 kb), dénommés mdp 7 et mdp 13, ont été isolés et sous-clonés dans le plasmide pUC18. 4.Caractérisation des clones isolés et analyse structurale de l'ADNc de la trophoblastine. L'homologie de ces inserts a été mise en évidence après marquage de l'un d'entre eux par nick-translation et analyse par Southern-blot. Mdp 7 s'hybridait avec un ARNm unique de 1,1 kb (technique de Northern-blot) cette taille était compatible avec celle d'un ARSm codant pour un polypeptide de = 23 kDa(précurseur de-la trophoblastine). C'est la raison pour laquelle l'analyse plus approfondie de ces clones a été entreprise. L'hybridation-traduction de l'ARNm complémentaire de ces clones, suivie de l'immunoprécipitation et de l'électrophorèse en gel dénaturant de la protéine synthétisée, a démontré que l'on était bien en présence de l'ADNc de la trophoblastine. L'ensemble de ces résultats a, par ailleurs, été confirmé par la détermination de la séquence de l'ADNc de mdp 7 selon la technique de SANGER (1977). I1 a été identifié 943 nucléotides. La séquence codante est de 585 nucléotides qui déterminent 195 amino-acides du précurseur de la trophoblastine (23 kDa)-. La structure primaire de la trophoblastine correspond à 172 amino-acides comme celle des interférons a de classe II (IFNaII), alors que les IFNa de classe I présentent une séquence de 166 résidus. La séquence en acides aminés qui en a été déduite coincide parfaitement avec la séquence N-terminale de la protéine (isoforme 2) . Aucun site de N -glycosylation (ASN-X-THR ou SER) n'est observé. Seules des O - glycosylations (THR ou SER) post-traductionnelles qui ne présentent que peu d'importance dans la conformation stérique, ne peuvent toutefois entre écartées. Par ailleurs, la région correspondant au peptide-signal présente une homologie de plus de 95 % au niveau nucléotidique et de 100 % au niveau de la structure primaire avec celle de l'interféron a bovin de classe II (CAPCN SHEPARD et GOEDDEL, 1985), ce qui suggère que ces deux molé- cules pourraient dériver d'un gène ancestral commun. Ainsi que cela ressort-du Tableau II ci-après, l'identité entre les séquences nucléotidiques de la trophoblastine ovine et l'IFN&alpha; bovin de classe II est de 80 % (et de 71 % avec l'IFNa humain), alors qu'elle n'est que de 64 % avec l'IFNa bovin de classe I.L'identité entre les structures primaires de la trophoblastine ovine et de l'IFN&alpha; bovin de classe II est de 71 % (et de 56 % avec l'INFNaII humain), alors qu'elle n'est que de 48 % avec l'IFNa bovin de classe I. I1 en résulte que la trophoblastine correspond à un interféron embryonnaire a de classe II. Ces résultats sont résumés dans le Tableau II ci-dessous TABLEAU II COMPARAISON DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE (-) et de la STRUCTURE PRIMAIRE (##) DE LA TROPHOBLASTINE AVEC CELLES DES INTERFERONS a DE CLASSE I ET II BOVINS ET HUMAINS. Trophoblastine IFNoI bovin IFNoII bovin IFNtII > ! ovine humain ovine humain Trophoblastinc 64,2 80,4 -70,7 IFNvI bovin 48,1 ~ 68,3 65,1 IFNaII bovin | 70,8 54,3 IFNaII humain | 55,9 50,3 63,1 L'analyse par Northern-blot d'ARN totaux d'embryons âgés de 15 à 18 jours de differentes espèces (Chèvre, Vache, Truie) à l'aide d'une sonde trophoblastine ovine conforme à l'invention, a permis l'identification d'ARNm de longueur similaire dans deux de ces espèces (Chèvre, Vache). Ces résultats signent d'une part une homologie de structure très importante et, d'autre part1 l'existence d'une chronologie similaire dans l'expression de ce gène. Dans l'espèce ovine, ce gène devient très rapidement silencieux, puisqu'à partir du 22ème jour de développement, l'ARNm de la trophoblastine n'est plus détectable, ce qui précise et confirme rigoureusement les résultats des expériences d'injections intra-utérines d'homogénats de conceptus âgés de 21-23 jours. Les isoformes de la trophoblastine qui font l'objet de la présente invention ou leurs analogues peuvent, en outre, être utilisables pour toutes les productions d'interféronsa(de classe II par des procédés de génie génétique (expression bactérienne, cellulaire ou par l'intermédiaire d'animaux transgéniques). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Isoformes de la trophoblastine caractérisées par une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à une formule générale commune I Cys-Tyr-Leu-Ser-(X)-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu 20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-(Y)-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-(Z)-Gly 35 40 45 (I) dans laquelle (X5) représente : Glu ou Gln (Y35) représente Lys ou Asp et (Z44) représente Glu ou Asp. 2") Isoforme de la trophoblastine, selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'isoforme Ti comprend une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à la formule Ii ci-après: Cys-Tyr-Leu-Ser-Glu-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu 20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-Lys-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly 35 40 44 45 (I1) 3 ) Isoforme de la trophoblastine selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'isoforme T2 comprend une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond à la forme 12 ci-après Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Ser-Cys-Leu 20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-Val-Glu-Gly 35 (I2) 40 44 45 4-) Isoforme de la trophoblastine, selon la revendication 1, caractérisée en ce que î'isoforme T3 comprend une séquence d'amino-acides N-terminale qui répond a la formule 13 ci-après Cys-Tyr-Leu-Ser-Gln-Arg-Leu-Met-Leu-Asp-Ala-Arg-Glu-Asn-Leu 1 5 10 15 Lys-Leu-Leu-Asp-Arg-Met-Asn-Arg-Leu-Ser-Pro-His-Sèr-Cys-Leu 20 25 30 Gln-Asp-Arg-Lys-Asp-Phe-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Met-VaI-Asp-Gly 35 40 44 45 (I3) 5 ) Procédé d'isolement des formes isoélectriques T1, T2, T3 de la trophoblastine par chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC), caractérisé en ce que l'on soumet un milieu de culture, obtenu à la suite d'une incubation de conceptus ovins pendant un temps approprié, à une chromatographie sur colonne échangeuse d'anions équilibrée par un tampon cationique, puis à l'action d'un gradient salin dans un tampon cationique, en l'espace d'un intervalle de temps approprié, suivie d'une élution saline isocratique pendant laquelle les isoformes sont successivement recueillies. 6 ) Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce que le milieu de collecte des conceptus destinés à être mis en culture est constitué par un tampon approprié dépourvu de sérumalbumine et contenant de la polyvinylpyrrolidone à une concentration d'environ 0,05 % à 0,5 % poids/volume. 7 ) Procédé selon la Revendication 5, caractérisé en ce que les conceptus sont mis en culture dans un milieu de culture synthétique dépourvu de sérumaîbumine et de sérum sanguin et contenant la polyvinylpyrrolidone à une concentration d'environ 0,05 % à .0,5 S poids/volume. 8 ) Agent présentant des activités antivirales, antitumorales, immunomodulatrices, d'inhibition de rejet, de différenciation cellulaire et d'inhibition de la lutéolyse en début de gestation chez les mammifères, ainsi que de sélection génétique, caractérisé en ce qu'il est constitué par un interféron a de classe II, qui est l'une des isoformes Ti, T2, T3 de la trophoblastine telles qu'identifiées par leurs séquences N-terminales de formules I1, 12, 13 ou leurs mélanges. 9 ) Séquence nucléotidique d'ADNc d'une isoforme de la trophoblastine et séquence déduite en aminoacides, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un polypeptide dont le poids moléculaire est de l'ordre de 23 kDa et qui répond à la formule II ci-après, qui est celle de l'isoforme T2 CCCCCTGACCCCATCTCAGCCAGCCCAGCAGCAGCCGCATCTTCCCC ATC GCC 53 Met Ala -23 TTC GTG CTC TCT CTA CTG ATG GCC CTG GTG CTG GTC AGC TAT GGC 98 Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr Gly CCA GGA GGA TCT CTG GGT TGT TAC CTA TCT CAG AGA CTC ATG CTG 143 Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Gln Ara Leu Met Leu -1 +1 GAT GCC AGO GAG AAC CTC MG CTC CTG GAC CGA ATG AAC AGA CTC 188 Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Ara Met Asn Ara Leu TCC CCT CAT TCC TGT CTG CAG GAC AGA AAA GAC TTT GOT CTT CCC 233 Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro CAG GAG ATG GTG GAG GGC GAC CAO CTC CAG AAG GAC CAS GCC TTC 278 Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe 45 CCT GTG CTC TAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC TAC 323 Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe Tyr ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG 368 Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln CTC TGC ACT GGA CTC CAA CAG CAG CTG GAC CAC CTG GAC ACC TCG 413 Leu Cys Thr Gly Leu Gin Gln Gln Leu Asp His Leu Asp Thr Cys AGG GGT CAA GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GAA CTG GGT AAC ATG 458 Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met GAC CCC ATT GTG ACC GTG AAG AAG TAC TTC CAG GGC ATC TAT GAC 503 Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp TAC CTG CAA GAG AAG GGA TAC AGC OAC TGC GCC TGG GAA ATC GTC 548 Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val AGA GTC GAG ATG ATG AGA GCC CTC ACT GTA TCA ACC ACC TTG CAA 593 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln AAA AGG TTA ACA AAG ATG GGT GGA GAT CTG AAC TCA CCT TGATGACT 640 Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 172 CTTGCCGACTAAGATGCCACATCAGCCTCCTACACCCGCCTGTGTTCATTTCAGAAGACT 700 CTGATTTCTGCTCCAGCCACCAAATTCATTGAATTACTTTAGCTGATACTTTGTCAGTAG 760 TAAAAAGCAAGTAGATATAAAAGTATTCAGCSGTAGGGGCATGAGTCCTGkGGTGTGATG 820 CCTTCCCTGATGTTATCTGTTGCTGATTTATTTATACCTTCTAGCATTTAACATACTTAA 880 AATATTAGGAAATTTGTTAAGTTACATTTCATCTGTACATCATATTAAAATTTCTAAAAC 940 ATG 943 (II) 10) ) Sonde oligodéoxynucléotidique pour la caractérisation de clones contenant 1'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine et de ses isoformes Ti, T2, T3, caractérisée en ce qu'elle correspond aux résidus 34 à 43 de la séquence N-terminale de la trophoblastine et répond à la formule III ci-après 34 35 40 43 Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val (III) 3' TTC CTI AAI CCI IAI GGI GTC CTC TAC CA 5' T T T Les I pouvant être remplacées par A, G ou C. 11 ) Procédé d'obtention par clonage de l'ADNc de l'ARNm des isoformes T1, T2, T3 de la trophoblastine, et notamment de l'ADNC de formule II, selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes - isolement des ARN poly(A)+ totaux embryonnaires, à partir d'embryons de mammifères, notamment ovins âgés de moins de 22 jours, par une méthode appropriée - mesure de l'activité biologique des ARN poly(A)+ embryonnaires isolés au cours de l'étape précédente, par traduction in vitro dans un système acellulaire approprié et estimation par électrophorèse-SDS de la quantité de trophoblastine synthétisée, suivie d'une immunoprécipitation à l'aide d'un sérum anti-trophoblastine monospécifique, et détection d'un polypeptide de poids moléculaire d'environ 23 kDa, correspondant au précurseur de la trophoblastine - construction d'une banque d'ADN complémentaires d'embryons de mammifères, notamment d'ovins âgés de 16 jours, par synthèse des ADNc à partir d'une reverse-transcriptase et insertion de ces ADNc dans un vecteur d'expression (-de préférence le bactériophage ,kgtll), puis clonage dans des souches appropriées de colibacilles (tels qu'E.coli, en particulier) - recherche de clones contenant l'ADNc de l?ARNm de l'isoforme Tz, T2 ou T3 de la trophoblastine, par tous moyens appropriés. 12') Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la recherche de clones contenant l'ADNc de l'ARNm de la trophoblastine est réalisée à l'aide d immunsérum monospécifique anti-trophoblastine. 13 ) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la recherche desdits clones est réalisée à l'aide d'une sonde oligodéoxynucléotidique qui répond à la formule III selon la revendication 10; par hybridation desdits clones avec ladite sonde, suivie de l'isolement des inserts de taille appropriée et du sousclonage dans un plasmide approprié (notamment pUC18) pour déterminer que l'un des clones s'hybride avec un ARN unique de 1,1 kb codant pour un polypeptide d'environ 23 kDa correspondant au précurseur de la trophoblastine et que l'autre des clones s'hybride avec l'ARNm correspondant à l'ADNc correspondant à l'une des isoformes Ti, T2, T3 de la trophoblastine. 14 ) Kit de détection d'un signal embryonnaire pour contrôler la viabilité d'un embryon à un stade précoce de son développement, caractérisé en ce qu'il comprend en tant qu'agent de détection. au moins l'une des isoformes de la trophoblastine de formule I selon la revendication 1.