Brevet FR2626979A1 — publié le 19890811

La présente invention est relative à un procédé et à un équipement pour la détermination rapide du compte de cellules de spermies et/ou du taux de spermies vivantes dans des échantillons de spermes. Les travaux de recherche associés aux spermes ne peuvent pas être séparés des points de vue économiques, des intérêts de la production de l'insémination artificielle et de l'élevage pratique ainsi que des nécessités d'augmentation de la production. De nombreux programmes de recherche ont donc été o10 orientés vers une détermination objective de la qualité du sperme, plus particulièrement vers le développement de procédés permettant de prédire en pratique l'utilité biologique du sperme. En plus des méthodes de coloration traditionnelles, les chercheurs disposent maintenant de plusieurs méthodes qui permettent d'observer de très fines modifications des caractéristiques qualitatives, morphologiques et physiologiques du sperme, comme la microscople électronique [J.H. Bedford: Rm. J. Anat. 123, 329 (1968); Saacke: J. RAmin. Sci. 115, 143 (1964)], l'analyse enzymologique [Acta Uet. Scand. 17, 83 (1976)] et des méthodes reposant sur des techniques au laser [oagyar Rlotorvosok Lapja 38, 38 (1983); Biophys. J. 31, 147 (1983)]. Des cellules se trouvant dans diverses conditions physiologiques sont présentes dans le sperme et le taux de ces sous-populations joue un rôle décisif dans l'insémination. L'étude microscopique est encore actuellement la méthode d'examen de routine la plus largement utilisée pour estimer la concentration, la mobilité et donc le taux de spermies vivantes; le chercheur estime subjectivement l'utilité biologique du sperme testé en fonction du mouvement des spermies en utilisant un grossissement approprié et en observant les spermies dans le champ de vision. Cette méthode n'est pas précise et présente une erreur d'environ 25% [Tech. Conf. Rrt. Ins. Reprod. Proc. p. 3 (1973)]. Cette détermination de la qualité peut être complétée par diverses techniques de coloration. R savoir, la sous-population vivante peut être distinguée de celle qui est morte par la coloration dite vitale, puisque le colorant n'est pas pris par les cellules initialement vivantes. Dans ce cas, I'imprécision de cette méthode réside en ce qu'on qualifie une population contenant plusieurs millions de cellules en examinant quelques centaines de cellules. De plus, cette méthode est longue et ne peut pas être adaptée à la technologie de production. Une autre méthode connue repose sur Il'observation selon laquelle un composant modulé par la fréquence dépendant de la vitesse est contenu dans la lumière dispersée par la section de tête des spermies lorsque l'échantillon de sperme est illuminé par la lumière monochromatique d'un laser He-Ne. La distribution de vitesse des spermies peut être ensuite traitée par transformation de Fourier du spectre de fréquence du signal Doppler. Cette méthode est aussi utile pour mesurer la concentration des spermies (dispositif LRAZYMOT de BIG Biotechnik GmbH., Mônchengladbach, RFR, utilisé pour l'étude de la mobilité). D'un côté, les méthodes connues ne conviennent pas pour assurer un résultat précis et reproductible et, d'un autre côté, elles sont trop compliquées et coûteuses pour être largement utilisées dans des procédés Industriels pour le traitement du sperme. Le but de la présente invention est de fournir un procédé et un équipement pour déterminer la qualité d'un sperme de façon simple et relativement peu coûteuse avec une précision satisfaisant aux exigences de production. L'invention repose sur la constatation selon laquelle les caractéristiques de fluorescence de l'iodure de propidium, comme la distribution spectrale et l'efficacité quantique de la fluorescence de la lumière émise, sont modifiées par l'interaction du colorant avec des acides nucléiques et leur liaison avec ceux-ci. La liaison des molécules de colorant apparaît sous la forme d'une augmentation notable du taux de fluorescence qui est caractéristique du colorant libre. La qualité des échantillons de sperme est déterminée grâce au fait que, contrairement à ce qui se passe avec les cellules Intactes, l'iodure de propidlum est très rapidement pris par les cellules mortes ayant une membrane de plus grande perméabilité, si bien qu'une augmentation de l'intensité est observée par rapport à celle du colorant libre. Ceci constitue un procédé particulièrement rapide, par lequel on obtlent une intensité de fluorescence encore supérieure qui est proportionnelle au compte total de spermies. La présente invention est donc relative à un procédé pour déterminer rapidement le compte de cellules de spermles d'échantillons de sperme et/ou le taux de spermies vivantes, selon lequel on dissout l'iodure de propidium colorant fluorescent dans un tampon et l'on mesure l'intensité (Fi), puis on ajoute l'échantillon de sperme et, après avoir mesuré i'intensité (F1) et ajouté un agent rendant perméable la membrane cytoplasmique, on détermine l'intensité (F2), puis l'on ajoute un tampon et un agent perméabilisant au tampon et l'on mesure l'lntensité (F3) et ensuite l'intensité (FI) du tampon pur et enfin l'lntensité (F5) du mélange de sperme ajouté au tampon, et l'on calcule la concentration cellulaire au moyen de la formule: (F2-F3)-- (F5-F4) concentration cellulaire a. millions/mm3s Fo dans laquelle " est le produit de multiplication de la pente de la courbe d'étalonnoge par le taux de prédilution; et l'on calcule le taux de cellules vivantes avec la formule; (FI-Fo) - (F5-F4) % de cellules uivantes = 100 -.I00 (F2-F3) - (F5-F4) R titre d'agent perméabilisant la membrane cytoplas- mique, on peut de préférence ajouter de la saponine, de la digitonine ou de la nystotine ô l'échantillon de cellules colorées pour rendre perméable la membrane de choque cellule. De plus, I'inuention est relative aussi à un équipement pour réaliser le procédé ci-dessus, lequel comprend: une unité (1) de support de cuve; une source lumineuse (5) reliée à celle-cl; une optique d'entrée comprenant un filtre optique (4) et deux lentilles (3) qui, la gamme spectrale appropriée étant choisie, projette la lumière de la source lumineuse sur l'échantillon placé dans le support de cuve (2) thermostatable; une optique de sortie qui est perpendiculaire à l'axe de l'optique O10 d'entrée et comprend un filtre optique (7) et deux lentilles (6), qui projette à travers le détecteur de lumière (8) relié à l'unité de support de cuve, l'émission de l'échantillon (11) placé dans le support de cuve; une unité d'alimentation haute tension (9) pour le détecteur de lumière; et un système électronique (10) de détection recevant les signaux du détecteur de lumière. La Figure 1 montre un schéma de l'équipement selon la présente invention. L'équipement fonctionne de la façon suivante: on fait démarrer le dispositif en le mettant en circuit et en ajustant une valeur de tension élevée sur l'unité d'alimentation haute tension (9) alimentant le détecteur de lumière (8). Cette tension élevée assure un affichage d'intensité d'émission qui est bien mesurable avec le champ amplificateur choisi par le système électronique (10) de détection recevant les signaux du détecteur de lumière. Pour mesurer l'intensité d'émission des échantillons utilisés pour les déterminations, l'échantillon d'essai placé dans la cuve est introduit dans le support de cuve (2), puis l'intensité d'émission est affichée automatiquement par le système électronique de détection (10) de l'équipement. Pour effectuer une série complète de mesures, c'est-à-dire pour déterminer le taux de cellules vivantes d'un échantillon de sperme dont ola qualité doit être déterminée, on doit mesurer l'intensité d'émission de six échantillons préparés de diverses façons. Ensuite, on fait l'évaluation en déterminant le taux de cellules vivantes ainsi que la concentration cellulaire absolue de l'échantillon à qualifier. L'importance de l'amplification ainsi que du filtrage diminuant le bruit de fond électronique peut être modifiée selon plusieurs degrés. La valeur de la haute tension envoyée.sur le multiplicateur photoélectronique utilisé comme détecteur est convenablement laissée appaitre sur Il'enregistreur. Les principaux avantages du procédé et de l'équipement de l'invention peuvent être résumés de la façon suivante. a) Ceux-ci sont plus simples et moins coûteux que de quelconques procédé et équipement de Il'art antérieur. b) On obtient rapidement des résultats précis et reproductibles qui peuvent être ainsi insérés dans la technologie de traitement du sperme. c) Ils sont utiles pour déterminer l rapportprécis des cellules vivantes aux cellules mortes. d) Il est ainsi possible d'établir objectivement la résistance d'un éventuel éjaculat et de prédire de façon décisive la valeur biologique du sperme testé en procédant à des examens en série des échantillons de sperme soumis à un test de charge. e) La mesure de la concentration absolue des spermies devient aussi possible. f) Le procédé est plus sensible que ceux de l'art antérieur. g) La fluorescence augments notablement lors de la liaison de l'iodure de propidium colorant, ce qui aboutit d un pouvoir de résolution supérieur. Le procédé de l'invention est davantage illustré par les exemples non limitotifs suivants. La Figure 2 représente la courbe d'étalonnage du sperme de verrat et la Figure 3 celle du sperme de taureau. ExemRile Le taux des cellules vivantes est déterminé de la façon suivante. 1. L'intensité de la fluorescence (Fo) de l'iodure de propidium (IP) dissous dans un tampon est mesurée sur 1600 pI d'une solution de colorant ayant une concentration de 25 mg/litre de IP et servant aussi d'étalon. 2. L'échantillon de sperme ô tester prédilué avec 40 pl du tampon est ajouté et l'intensité (F1) est mesurée. 3. 40 pl d'une solution éthanolique contenant 5 mg/ml de digitonine à titre d'agent perméabilisant, sont ajoutés à 1o l'échantillon de cellules et l'intensité (F2) est mesurée. 4. R la place de l'échantillon de sperme, 40 pl de PBS (solution saline de tampon phosphate) et ensuite l'agent perméabilisant sont ajoutés à la solution de colorant et l'intensité de la fluorescence (F3) de la solution ainsi préparée (1600 pI de solution de IP + 40 pl de tampon + 40 pl de solution éthanolique de digitonine) est alors mesurée. 5. L'intensité (F4) de 1600 pl de la solution tampon est mesurée. 6. L'intensité (F5) est déterminée après addition de 40 pi du sperme prédilué au tampon. Le taux de cellules intactes est calculé à partir des intensités mesurées au moyen de la formule: (Fl-Fo) - (Fs-F1) X de cellules vivantes = 100 1. 00 (F2-F3) - (F5-F4) Le compte de cellules est déterminé de la façon suivante: le compte de cellules contenues dans l'échantillon peut être simultanément déterminé à partir des intensités mesurées plus haut dans les mesures en série effectuées pour la détermination du taux de cellules vivantes. En fait, la différence entre les intensités mesurées F2 et F3, c'est-à-dire la voleur de (F2-F3) provient des cellules permnéabilisées totales et elle est donc proportionnelle au compte de cellules de l'échantillon. La valeur de (F2-F3) est reliée linéairement à la concentration cellulaire, dans la gamme de 1x105 à 1,5x106 cellules/ml. On peut donc obtenir dans cette gamme au moyen de la courbe d'étalonnage, le compte de cellules de l'échantillon à partir de la valeur de (F2-F3) mesurée pendant le procédé. L'augmentation d'intensité non-spécifique de (F5-F4) résultant des spermies doit être considéré dans ce cas, également. Le calcul est effectué comme suit: (F2-F3) - (F5-F4) concentration des spermies, millions/mm3 = a. Fo o t est tel que défini plus haut. La courbe d'étalonnage peut être préparée avec un cytomètre et un échantillon de cellules marqué avec du IP comme suit. La suspension de cellules à tester est diluée à une concentration de O,5x106 à 2x106 cellules/ml avec du tampon PBS. Tout en refroidissant avec de la glace, on traite 1 mi de la suspension diluée avec 1 ml de solution de NP-40 à 1% (Nonidet P-40, SIGMR, Deisenhofen, RFR). Sous l'effet de ce traitement, toutes les cellules périssent et leur membrane devient perméable pour IP. Rprès ce traitement, l'échantillon est coloré par addition de IP dans un tampon phosphate à une concentration finale de 30 pi/ml du colorant. L'échantillon coloré est analysé dans un cytomètre, par exemple un dispositif Dlckinson FRCS type fil avec un débit de 1500 cellules/seconde. L'excitation est obtenue par un laser ô ion argon à une longueur d'onde de 488 nm, tandis que l'émission est enregistrée par insertion d'un filtre de suppression qui a une perméabilité de surface dans la gamme supérieure à 620 nm. Lors de l'analyse, les cellules traversant le système sont dénombrées par le dispositif en fonction de l'enregistrement de l'intensité de la fluorescence de IP. Comme cet IP est prél1evé uniformément par les spermies de l'échantillon sous l'effet du traitement, ce compte correspond au compte absolu de cellules. En effectuant la mesure en retour précise de la quantité d'échantillon consommée dans la mesure et en tenant compte des facteurs de dilution, on obtient la concentration cellulaire d'origine de l'échantillon, qui est égale au quotient des intensités de fluorescence (F2-F3) - (F5-F4) Fo mesurées sur le même échantillon dans le spectrofluorimètre. En préparant une série de dilutions à partir de l'échantillon et en utilisant une série de mesures cytométriques et spectrofluorimétriques parallèles, on détermine les comptes absolus de cellules correspondant au quotient des intensités mesurées dans le spectrofluorimètre dans diverses goammes de concentrations, la précision étant assurée par des examens répétés plusieurs fois aux mêmes points de mesures. Comme la valeur des quotients des intensités de fluorescence est reliée linéairement au compte de cellules, on peut tracer une ligne de régression des mesures pour une quelconque espèce de sperme, à partir de laquelle on peut déterminer le compte de cellules pour un quotient d'intensités défini. Le produit de multiplication de la pente de la ligne de régression par la dilution de l'échantillon de sperme d'essai, donne le coefficient t qui, par multiplication avec le quotient des intensités de fluorescence mesurées, fournit la concentration initiale des cellules de l'échantillon. La courbe d'étalonnage peut aussi être construite par comptage hématocytométrique. Les calculs peuvent être de préférence effectués sur un ordinateur. REUEMDICRTIONS 1. Procédé pour déterminer rapidement le compte de cellules de spermies d'échantillons de sperme et/ou le taux de spermies vivantes,' caractérisé en ce que l'on dissout l'iodure de propidlum colorant fluorescent dans un tampon et l'on mesure l'intensité (Fo), puis l'on ajoute l'échantillon de sperme et, après avoir mesuré l'intensité (F1) et ajouté un agent rendant perméable la membrane cytoplasmique, on détermine l'intensité (F2), puis l'on ajoute un tampon et un agent perméabilisant au tampon et o10 I'on mesure l'intensité (F3) et ensuite l'intensité (FI) du tampon pur et enfin l'intensité (F5) du mélange de sperme ajouté au tampon, et que l'on calcule la concentration cellulaire au moyen de la formule: (F2-F3) - (F5-F4) concentration cellulaire -. millions/mm3 Fo dans laquelle a est le produit de multiplication de la pente de la courbe d'étalonnage par letaux de prédilution; et l'on calcule le taux de cellules vivantes avec la formule: (F!-Fo) - (F5-F4) X de cellules vivantes - 100 -. 100 (F2-F3) - (Fs-F4) 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise l'iodure de propidium à une concentration de 12,5 mg/litre à 25 mg/litre. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise de la saponine, de la digitonine ou de la nystotine comme agent perméabilisant la membrane cytoplasmique. 1. Equlpement pour mettre en oeuvre le procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: une unité (1) de support de cuve; une source lumineuse (5) reliée à celle-ci; une optique d'entrée comprenant un filtre optique (1) et deux lentilles (3) qui, la gamme spectrale appropriée étant choisie, projette la lumière de la source lumineuse sur l'échantillon placé dans le support de cuve (2) thermostatable; une optique de. sortie qui est perpendiculaire à l'axe de l'optique d'entrée et comprend un filtre optique (7) et deux lentilles (6), qui projette à travers le détecteur de lumière (8) relié à l'unité de support de cuve, l'émission de l'échantillon (11) placé dans le support de cuve; une unité d'alimentation haute tension (9) pour le détecteur de lumière; et un système électronique (10) de détection recevant les signaux du détecteur de lumière.