Brevet FR2634126A1 — publié le 19900119

La présente invention concerne de fagon générale des anticorps monoclonaux et les hybridomes produisant ces anticorps, et plus particulièrement, des anticorps monoclonaux spécifiques pour un antigène exprimé par des cellules T humaines transformées par un rétrovirus et des cellules B humaines activées. Dans ce domaine technique, il est bien connu qu'au cours de la réponse immunitaire humorale, les cellules B au repos sont activées, se divisent plusieurs fois, et subissent une différentiation terminale en plasmocytes sécrétant différentes classes et sous classes d'immunoglobulines. Fréquemment, le changement d'état des cellules B, du stade de repos au stade de prolifération, du stade de prolifération au stade de sécrétion, peut être mis en corrélation avec les changements des molécules de surface, et ces derniers changements peuvent être identifiés par des anticorps monoclonaux spécifiques pour les molécules de surface ou antigène, comme décrit par exemple, dans Zola "Immunol. Today, Vol. 8, pages 308-315, 1987". De tels antigènes de surface peuvent quelquefois fournir une approche pour un diagnostic et un traitement, quand une maladie est associée à la présence de types de cellules exprimant des antigènes de surface particuliers, par exemple selon "Ramsay et al., Blood, Vol. 66, pages 508-513, 1985, Autologous bone marrow transplantation for patients with acute lymphoblastic leukemia in second or subsequent remission: results of bone marrow treated with monoclonal antibodies BA-1, BA-2, and BA-3 plus complement". Les cellules T représentent une classe de lymphocytes essentiels pour l'activation des cellules B au cours de la réponse immunitaire. Plusieurs maladies importantes sont associées à des déficiences quantitatives ou qualitatives des populations de cellules. Au moins deux maladies de ce type, le SIDA et la leucémie aiguë à lymphocytes T (ATL) sont causées par des rétrovirus désignés respectivement HTLV-III (maintenant HIV) et HTLV-I selon "Broder et al., Ann. Rev. Immunol., Vol. 3, pages 321-336, 1985". Les cellules ATL, comme beaucoup d'autres cellules néoplastiques, sont associées à des schémas distincts d'expression d'antigène de surface, ce qui fournit quelquefois un moyen pour établir un diagnostic ou un traitement, selon l'enseignement de "Jaffe et al., chapitre 120, dans Rose et al., eds., Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3ème Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1986". L'identification d'un antigène de surface supplémentaire associé à des stades particuliers d'une maladie et le développement d'anticorps monoclonaux spécifiques pour cet antigène, amélioreraient nettement les protocoles de diagnostic disponibles à ce Jour. La présente invention a pour objet un anticorps ( monoclonal spécifique pour un antigène de surface de cellules B activées et une lignée de cellules d'hybridomes produisant de tels anticorps. La lignée de cellules d'hybridomes selon cette invention est ci-après nommée clone 104, et l'anticorps monoclonal selon l'invention est ci-après nommé AcM 104. Un échantillon du clone 104 est déposé à l'European Collection of Animal Cell Cultures (EACC) sous le numéro d'accès 88062301. Un aspect de cette invention réside dans la découverte du fait que l'antigène de surface des cellules B reconnu par l'AcM 104 est exprimé par les cellules T infectées par I'HTLV-I. L'invention a ainsi également pour objet un anticorps monoclonal spécifique pour un antigène de surface des cellules T transformées par l'HTLV-I. En conséquence, cette invention a pour autre objet un procédé pour la détection de lymphocytes B activés et/ou de cellules T transformées par l'HTLV-I. Plus précisément, l'invention concerne un anticorps monoclonal AcM 104 qui est spécifique pour un antigène de surface exprimé sur les cellules B humaines activées par un anticorps anti-IgM. L'AcM 104 est utile comme marqueur pour les cellules T transformées par l'HTLV-I. La lignée de cellules d'hybridomes 104 a été produite de la manière suivante. Approximativement x 106 cellules JiJoye (une lignée cellulaire humaine du lymphome de Burkitt commercialisée par American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, sous le numéro d'accès CCL87) ont été injectées par voie intra péritonéale (i.p.) quatre fois à une semaine d'intervalle dans des souris BALB/c agées de 8 semaines. Trois Jours après la dernière injection, les cellules de la rate ont été prélevées et fusionnées avec des cellules du myélome NS1 (commercialisé par l'ATCC sous le numéro d'accès TIB 18) à un rapport 5:1 (cellules de rate par rapport aux cellules NS1) en utilisant du polyéthylène glycol 1000 (commercialisé par Merck, Darmstadt, R.F.A.). Après une nuit d'incubation à 37 C dans un flacon de culture de ml dans un milieu RPMI 1640 complet contenant 10% de sérum de veau foetal inactivé par chauffage, 2 mM de glutamine, 100 UI/ml de pénicilline et 100 pg/ml de streptomycine, (ce milieu étant commercialisé par Flow Labs, Irvine, Ecosse), la suspension cellulaire a été répartie dans des plaques de 24 puits chacune dans un milieu contenant notamment de l'hypoxanthine et de l'azasérine. Les surnageants d'hybridomes ont été criblés en testant leur capacité à se fixer aux cellules JiJoye, aux cellules mononucléaires d'amygdales et aux cellules B activées par l'anti-IgM, obtenues comme décrit ci-après. Les hybridomes sélectionnés ont été clones et sous clones par des techniques de dilution limite. Une lignée de cellules d'hybridomes 104 a été ainsi préparée. L'anticorps monoclonal selon l'invention, a été obtenu comme décrit ci-dessous. Pour la production d'ascites, 0,5 ml de pristane (Aldrich, Milwaukee, WI) a été injecté i.p. dans des souris BALB/c. Dix Jours plus tard, 107 cellules d'hybridomes ont été injectées i.p. et le fluide ascitique a été prélevé deux à trois semaines plus tard. Le fluide ascitique a été centrifugé à 30 000 x g, pendant 30 minutes à 4 C pour enlever les lipides et les débris cellulaires. Les anticorps monoclonaux ont été isolés du fluide ascitique par chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec une colonne échangeuse d'anions (DEAE 5PW: Waters Associates, Millipore, Corp. Milford, MA). De façon alternative, les anticorps monoclonaux ont été purifiés à partir de surnageants de culture par chromatographie d'affinité sur des colonnes de protéine A (Biorad, Richmond, CA) suivant les techniques classiques. L'isotype de l'AcM 104 a été déterminé par l'analyse Ouchterlony en utilisant des anticorps polyclonaux spécifiques pour des classes et sous classes d'Ig de souris, commercialisé par exemple par Zymed, San Francisco, CA). Les cellules utilisées pour l'immunisation et le criblage ont été obtenues comme suit. Des suspensions de cellules mononucléaires ont été obtenues à partir d'amygdales, de rates, de sang périphérique, de sang de cordon et de moelle osseuse d'origine humaine. Les amygdales et les rates ont été dissociées à travers un tamis métallique dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), à un pH de 7,2, pour obtenir des suspensions de cellules. Ces suspensions et le sang dilué ont été déposés sur un gradient de Ficoll-Hypaque et après centrifugation, les cellules ont été récoltées à l'interface et lavées trois fois dans du PBS. Pour obtenir des populations de cellules B purifiées, les cellules T ont été éliminées des cellules mononucléaires par double formation de rosettes avec des érythrocytes de mouton traité au bromure de 2-amino-éthyl-isothio- uronium. Les monocytes ont été déplétés en faisant adhérer 250 x 106 cellules déplétées de cellules T sur des bottes de culture en plastique (Corning, Oxnard, CA) contenant 25 ml de RPMI 1640 avec 10% de sérum de veau foetal, pendant 1 heure à 37 C. Les préparations de cellules B d'amygdales contenaient: plus de 95% de cellules B comme déterminé par marquage des cellules avec un anticorps de souris anti-humain qui se lie spécifi- quement aux cellules B, B1 (CD20) (Coulter, Hialeah, FL) et des fragments F(ab')2 de chèvre dirigés contre des immunoglobulines de souris et conJugués à la fluorescéine, moins de 1% de cellules T comme déterminé avec l'anticorps monoclonal Leu-5 (CD2) (Becton Dickinson, Mountain View, CA), moins de 1% de monocytes comme déterminé avec l'anticorps monoclonal Leu M3 (CD15) (Becton Dickinson). Les cellules B purifiées ont été séparées en cellules B préactivées in vivo (faible densité) et cellules B au repos (haute densité) en utilisant un gradient de Percoll discontinu (Pharmacia, Uppsala, Suède) consistant en quatre solutions avec des densités de 1,075; 1,070; 1,060 et 1,055 g/ml. Les cellules B au repos se retrouvent dans le culot, sous la solution de Percoll de plus haute densité. Les grosses cellules B préactivées in vivo se retrouvent à l'interface entre les densités de Percoll de 1,060 et 1,070 g/ml. Les cellules B préactivées par des anticorps anti-IgM ont été obtenues comme suit. Des cellules B purifiées (faible et haute densité) ont été cultivées à une concentration de 2 x 106 cellules/ml dans du milieu de Iscove enrichi avec 50 pg/ml de transferrine humaine, 0,5% d'albumine bovine, 5 pg/ml d'insuline bovine, 2% de sérum de veau foetal inactivé par chauffage, et des acides oléique, linoléique et palmitique (Sigma) comme décrit par "Defrance et al., J. Immunol., Vol. 139, pages 1135-1142, 1987". Les cultures ont été stimulées pendant 24 heures par un anticorps anti-IgM (10 pg/ml) insolubilisé par couplage à des billes (BIORAD, Richmond, CA). Après activation, les cellules B ont été récoltées et centrifugées sur un gradient Ficoll-Hypaque pour enlever les cellules non viables et les billes anti-IgM. Pour le criblage, les cellules B activées ont été remises en suspension à raison de i x 106 cellules/ml dans le milieu de Iscove enrichi qui a été distribué en aliquots de 50 pl dans les puits de plaques de microtitration. On a trouvé que l'AcM appartient à la sous classe des immunoglobulines IgG1. La spécificité de l'AcM 104 a été caractérisée par cytométrie de flux. Un panel de différents types de cellules a été marqué par immunofluorescence. Le marquage par fluorescence a été effectué dans des micro-plaques. Les cellules (5 x 105 dans 50 pl) ont été incubées avec pl de surnageant d'hybridomes ou 10 pl d'AcM purifié et dilué de façon appropriée. Après deux lavages, les cellules ont été incubées avec des fragments F(ab')2 d'immunoglobuline de chèvre dirigée contre les immunoglobulines de souris, marqués à la fluorescéine, pendant 30 minutes à 4 C (à une dilution au 1/100). Le marquage des cellules a été analysé avec un FACS 440 (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) équipé d'un laser à argon 5-W, à 488 nm, 0,5 W. Le tableau I montre la réactivité de l'AcM 104 avec différentes préparations de cellules mononucléaires. On peut voir qu'une fixation significative ne se produit qu'avec des cellules B activées. Le tableau II montre la réactivité de l'AcM 104 avec différentes lignées cellulaires humaines. Une forte fixation ne se produit qu'avec les cellules de lymphomes de Burkitt ou les lignées cellulaires lymphoblastoldes transformées par l'EBV. Le tableau III montre la réactivité de l'AcM 104 avec les lignées cellulaires T transformées par l'HTLV-I et les lignées cellulaires T non transformées par 1'HTLV-I. Une forte fixation n'a lieu que sur les cellules T transformées par 1'HTLV-I. Tableau I. REACTIVITE DE L'AcM 104 SUR PLUSIEURS PREPARATIONS DE CELLULES MONONUCLEAIRES a) b) AcM 104 CD 20 __________________________________________________________ Cellules mononucléaires du sang 3 + 2 10 + 4 PHA blastes de 3 joursc) 4 + 2 8 + 4 Cellules mononucléaires d'amygdales 5 + 4 56 + 4 Cellules B d'amygdales 9 + 5 98 + 2 Cellules B activées par l'anti-IgM 39 + 24 97 + 4 Cellules mononucléaires de rate 4 + 3 42 + 5 Cellules B de rate 11 + 3 97 + 2 Cellules mononucléaires de moelle osseuse 1 + 1 6 + 2- Cellules mononucléaires de sang de cordon 1 + 1 + 3 a) La réactivité a été déterminée comme un pourcentage moyen de cellules positives + déviation standard (SD), par immunofluorescence indirecte et cytométrie de flux. b) Anticorps B1 (Coulter, Hialeah, FLO) c) Cellules mononucléaires du sang stimulées pendant 3 jours cultivées avec de la phytohémagglutinine (PHA), suivant les protocoles classiques, par exemple, "ICarpenter, chapter 43, dans-Rose et al., eds" (cité précédemment). Tableau II. Lignées cellulaires Marquage a) avec l'AcM 104 Lignées cellulaires T: Molt 4 Jurkat CEM Lignées cellulaires myélomonocytaires: HL60 U937 KG1 Lignées cellulaires de lymphomes de Burkitt JiJoye +++ Daudi +++ Lignées cellulaires lymphoblastiques transformées par l'EBV: RPMI 8866 +++ Lignées cellulaires myélomateuses: RPMI 8226 + U266 a) - réactivité non détectée; + faible réactivité; +++ forte réactivité. TABLEAU III Lignées cellulaires Réactivité a) Exp. 1 Exp. 2 MLA 144 26,6% 20,3% (lymphome de gibbon ATCC TIB 201) HUT 102 96,6% 95,9% (lymphome de cellules T humaines infectées par l'HTLV-I, ATCC TIB 162) Clone T 827b) 3% 5% Clone T 827 transformé par l'HTLV-I 65% 68,6% a) La réactivité a été déterminée comme un pourcentage moyen de cellules positives mesuré par cytométrie de flux. b) Clone de cellules T dont la croissance est dépendante de l'interleukine 2. L'antigène pour lequel l'AcM 104 est spécifique, a été caractérisé de la façon suivante. Approximativement 5 x 107 cellules JiJoye ont été lavées deux fois dans du PBS contenant 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF:Sigma) et ont été ensuite remises en suspension dans 2 ml de PBS. 0,5 millicurie Na I (Oris, Saclay, France), 100 pl de lactoperoxydase à mg/ml (Calbiochem-Behring, La Jolla, CA), et 50 pl H202 (dilué à 0,03% dans de l'eau) ont été aJoutés. Après 3 minutes d'agitation modérée à température ambiante, 100 pl de lactoperoxidase et 50 pl de H202 ont été à nouveau aJoutés. La suspension a été ensuite agitée pendant 3 minutes à température ambiante. Cette étape a été répétée une fois de plus et les cellules ont finalement été lavées dans du PBS contenant 5 mM de KI. Les cellules marquées ont été à nouveau mises en suspension à raison de 5 x 106 cellules/ml dans du PBS contenant 0,5% de Nonidet p40 (NP-40), 1 mM PMSF, 0,01 M d'hydrochlorure de benzamidine, 0,05 M d'acide aminocaproïque, 20 mM d'iodoacétamide, 10 pg/ml de leupeptine, 1 ug/ml de pepstatine, et 100 pg d'inhibiteur de trypsine de soja ont été aJoutés et le mélange a été incubé à 0 C pendant minutes. Le lysat a été ensuite centrifugé à 3000 x g pendant 20 minutes, et le surnageant a été clarifié par centrifugation à 100.000 x g pendant 30 minutes. Les lysats ont été traités pendant la nuit avec un AcM non concerné. Ensuite, une immunoglobuline de lapin anti-souris couplée à des particules de Staphylococcus aureus Cowan formalinisées (Pansorbin, Calbiochem), a été aJoutée. Après centrifugation, le lysat a été immunoprécipité avec l'AcM concerné. L'immunoprécipitation a été effectuée en incubant 100 pl de lysat radiomarqué avec 4 pg d'AcM purifié pendant 14 heures à 40C. Les complexes immuns ont été précipités avec 20 pl d'Ig de lapin anti-souris couplées à des particules de Staphylococcus aureus Cowan formalinisées pendant 20 minutes à température ambiante et pendant une heure à 4 C. Les complexes ont été élués en portant à ébullition dans un tampon SDS à un pH de 6,8 contenant 3% de SDS, 15% de glycérol, et 0,01% de bleu de bromphénol, avec ou sans 5% de 2-mercaptoéthanol, et ont été soumis à électrophorèse sur gel de SDS-polyacry- lamide. Pour effectuer l'autoradiographie, des films Kodak XAR-5 ont été utilisés en combinaison avec des écrans intensificateurs (Kodak, Eastman, Paris, France). L'antigène reconnu par l'AcM 104 était sensible à la pronase mais pas à la trypsine, indiquant une nature protéique. L'antigène reconnu par l'AcM 104 a pu être précipité à partir de lysats de cellules RPMI 8866 ou Jijoye, marquées. L'antigène 104 a migré à la fois sous des conditions réductrices et non réductrices, comme une bande diffuse de 45000-60000 daltons, suggérant une hétérogénéité dans la glycosylation. Les anticorps monoclonaux de cette invention sont produits en cultivant le clone 104 suivant les procédures de culture classiques, par exemple celles décrites dans "Schreier, et al, Hybridoma Techniques, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980", "Hurrell, Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1982", "Campbell, Monoclonal Antibody Technology, Elsevier, New York, 1984" et dans le brevet américain No. 4 529 700 (Gratzner). Brièvement, le clone 104 peut être cultivé selon l'une ou l'autre des deux procédures classiques. Un échantillon de l'hybridome peut être injecté dans un animal histocom- patible du type qui a été utilisé pour fournir les lymphocytes et les cellules myélomateuses avec lesquelles l'hybridome a été créé. Les fluides corporels de l'animal, tel que sérum ou fluides ascitiques, peuvent être ponctionnés pour fournir les anticorps monoclonaux présents à forte concentration. De façon alternative, un hybridome peut être cultivé in vitro dans des récipients de culture; le milieu de culture, contenant aussi de fortes concentrations du seul anticorps monoclonal spécifique, peut être récolté et purifié suivant les protocoles classiques, par exemple selon "TiJssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, 1985". L'AcM 104 conjointement avec une technique de marquage, peut être utilisé comme un composant dans une variété de tests pour détecter les cellules T infectées par l'HTLV-I ainsi que des cellules B activées. Préféren- tiellement, l'AcM 104 est utilisé pour tester par cytométrie de flux la présence de cellules T transformées par l'HTLV-I et/ou des cellules B activées dans le sang périphérique. Les principes et le maniement de tels instruments sont bien établis, et plusieurs cytofluoro- graphes convenant à cet usage sont commercialisés tels que ceux décrits par exemple dans "Flow Cytometry and Sorting, Melamed et al., Eds., John Wiley & Sons, New York, 1979"; "Flow Cytometry; Instrumentation and Data Analysis, Van Dilla et al., Eds, Academic Press, New York, 1985"; "Mairhead et al., Flow Cytometry; Present and Future, Bio/Technology, Vol. 3, pages 337-356, 1985"; et dans les brevets américains No. 3 710 933, No. 3 380 584; et No. 4 325 706. D'autres types d'appareils comme ceux utilisés en cytologie analytique pourraient aussi convenir à cette invention, par exemple ceux mentionnés dans " Ploem et al., An Automated Microscope for Quantitative Cytology, Combining Television Image Analysis and Stage Scanning Microphotometry, J. Histochem. Cytochem., Vol. 27, pages 136-143, 1979". Lorsque l'AcM 104 est utilisé en cytométrie de flux, un marquage par fluorescence est préféré. Plusieurs marquages par fluorescence directe et indirecte sont disponibles, tels que ceux décrits dans le document suivant: "Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc., Junction City, OR, 1985" qui fournit une revue complète des molécules fluorescentes qui peuvent être conjuguées à des anticorps. Les colorants fluorescents les plus appropriés incluent la fluorescéine, le Texas Red, la tétraméthyl- rhodamine et la phycoérythrine. Ces colorants sont commercialisés et sont liés aux anticorps suivant les techniques classiques, par exemple celles décrites dans Wood et al., J. Immunol., Vol. 95, pages 225-229, 1965" et "Oi et al., J. Cell Biol.,Vol. 93, pages 981-986, 1982". Au moins deux modes de marquage indirect sont utilisés: (1) l'AcM 104 fixé est révélé par un second AcM hétérologue anti-Ig directement marqué, et (2) l'AcM 104 est lié de façon covalente à une ou plusieurs molécules de biotine, l'anticorps biotinylé réagit avec la cellule cible et ensuite l'AcM 104 fixé est révélé par l'avidine ou la streptavidine directement marquée. La technique avidine-biotine est bien connue comme par exemple, dans "Bayer et al., The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology, Glide, Ed., Methods of Biomedical Analysis, Vol. 26, pages 1-45, John Wiley, New York, 1980". La description détaillée qui précède a été présentée dans le but d'établir une illustration et une description de l'invention. Elle n'est pas exhaustive et ne limite pas la présente invention aux formes précises décrites, et il est évident que de nombreuses modifications et changements sont possibles à la lecture de l'enseignement précédent. Les démonstrations ont été choisies et décrites de façon à expliquer le mieux possible les principes de l'invention et son application pratique pour de ce fait permettre à l'homme du métier d'utiliser de la meilleure façon la présente invention, de manière différente et avec diverses modifications si nécessaire selon l'utilisation souhaitée. REVENDICATIONS 1. Anticorps monoclonal spécifique pour un antigène de surface des cellules B activées et/ou des cellules T transformées par l'HTLV-I, caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée de cellules d'hybridomes déposée à l'European Collection of Animal Cell Cultures (EACC) sous le numéro d'accès 88062301. 2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il appartient à la sous-classe des immunoglobulines IgG1. 3. Lignée de cellules d'hybridomes, caractérisée en ce qu'elle est déposée à l'European Collection of Animal Cell Cultures sous le No.88062301. 4. Procédé pour la détection de cellules T transformées par l'HTLV-I et/ou de cellules B activées dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il consiste à: a) conjuguer un anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2, par une méthode de marquage pour générer un signal, b) révéler l'anticorps monoclonal conJugué ainsi obtenu à un marqueur, et c) détecter les cellules de l'échantillon qui réagissent à l'anticorps monoclonal précité au moyen du signal généré par le marqueur. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste après l'étape c), à laver les cellules ne fixant pas l'anticorps monoclonal précité. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que le marqueur précité est un marqueur fluorescent directement ou indirectement conJugué à l'anticorps monoclonal selon la revendication 1 ou 2. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape c) est une détection par cytométrie de flux. 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter des cellules T transformées par l'HTLV-I et/ou des cellules B activées dans un échantillon de sang périphérique.