Brevet FR2623519A1 — publié le 19890526

La présente invention concerne un procédé pour fixer une enzyme, la créatine kinase, sur un polysaccharide hydrosoluble en vue de stabiliser l'enzyme. Les dosages de l'activité enzymatique de protéines sériques sont nécessaires lors de nombreuses analyses biologiques. Ces dosages sont, le plus souvent effectués à laide de réactifs ou sérums de contrôle comportant -une solution protéique témoin. Ladite solution protéique témoin est utile non seulement pour comparer les valeurs, mais aussi, pour cali- brer un instrument d'analyse enzymatique ou vérifier périodiquement que l'instrument est encore opérationnel à l'intérieur des limites de tolérance acceptées. Un des problèmes que l'on rencontre fréquemment lors de la manipulation de ces réactifs ou sérums de contre concerne la stabilisation de la solution enzymatique qui y est contenue ; de nombreuses enzymes sont instables et perdent leur activité par digestion autolytique, ou inactivation thermique. En outre, la plupart des compositions enzymatiques, présentes sur le marché, nécessitent une reconstitution au moment de l'emploi, par addition d'eau distillée, par exemple. La présente invention concerne un procédé permettant de stabiliser une enzyme, la créatine kinase, en vue d'obtenir une préparation enzymatique liquide prête à etre employée comme solution témoin lors d'un dosage enzymatique. La créatine kinase est l'enzyme catalysant la réaction suivante créatine phosphate + ADP créatine kinase créatine ATP Le dosage de cette enzyme présente un intérêt majeur pour les diagnostic et suivi des infarctus du myocarde. Le procédé selon la présente invention permet de fixer la créatine kinase sur un polysaccharide soluble en milieu aqueux en vue de la stabilisation de l'enzyme. Ce procédé comporte les étapes successives suivantes a) on active le polysaccharide en solution aqueuse basique par addition d'un halogénure de cyanogène et agitation jusqu'à stabilisation du pH à une valeur comprise entre 10 et 12. b) on ramène le pH de la solution aqueuse comportant le polysaccharide acitvé à une valeur comprise entre 8 et 10. c) on met en présence une solution tampon dans laquelle la créatine kinase a été entièrement solubilisée et la solution aqueuse comportant le polysaccharide activé issue de l'étape b. d) le cas échéant, on dialyse la solution obtenue à l'issue de l'étape c contre une solution tampon. Le polysaccharide utilisé de préférence dans le cadre de la présente invention est du dextran. De préférence, selon la présente invention, l'étape b est réalisée en dialysant le polysaccharide activé contre de l'eau puis contre une solution tampon dont le pH est compris entre 8 et 9. Mais il est possible de réaliser l'étape b par la simple adjonction d'acide, notamment l'acide chlorhydrique. De préférence, l'halogène utilisé pour l'activation du polysaccharide est le bromure. La quantité de bromure utilisée dépend, bien évidemment de la quantité de dextran C'est ainsi que l'on utilise environ 0,4 grammes de bromure de cyanogène pour une quantité de dextran d'environ 2,5 grammes. La température de travail est aussi importante. De préférence l'étape c , à savoir l'étape permettant de fixer la créatine kinase sur le polysaccharide active, est conduite à environ + 4 C. A l'issue de ladite fixation réalisée selon le procédé de la présente invention, il se peut que certains sites activés du polysaccharide soient encore libres. C'est pourquoi, de préférence selon l'invention, on bloque les sites activés, éventuellement encore libre, par l'adjonction de glycine. Enfin, la présente invention concerne l'utilisation de la créatine kinase stabilisée selon la présente invention pour la préparation d'une solution enzymatique stable destinée à servir de contrôle lors d'un dosage biologique. Une telle solution, prête à l'emploi, ne nécessite pas de reconstitution lors du dosage. La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants illustrés par - la figure 1 représente l'activité enzymatique (en %) de la créatine kinase en fonction des tubes d'échantillonage. - les figures 2a et 2b représentent l'activité enzy matique (%) de la créatine kinase en fonction du temps (en jours). - les figures 3a et 3b représentent l'activité résiduelle enzymatique (%) de la créatine kinase à différentes températures et en fonction du temps (en jours). EXEMPLE 1 Stabilisation de la créatine kinase par fixation sur du dextran a) Activation du dextran - on pèse 2,5 g de dextran T70, on les solubilise à température ambiante dans 50 ml d'eau déminéralisée. - on place le récipient comportant le dextran solubilisé dans de la glace (température comprise entre 2 et 60C) sous une hotte aspirante. On ajoute sous agitation constante quelques gouttes de soude 0,4 N de facon à ramener le pH à 10,5. - 0,4 g de CNBr sont ajoutés sous agitation au milieu, le pE étant maintenu à 10,8 + 0,3 par adjonction de NaOE 0,4 N. Une fois le pE stabilisé, on laisse encore le mélange sous agitation pendant 30 minutes. Remarques * La quantité du CNBr ajoutée est fonction de la pureté du CNBr. En conséquence, il faut doser le CNBr avant de s'en servir. * Procédé utilisé pour le dosage du CNBr En milieu acide le CNBr est titré par iodométrie. CNBr + 21- CN + I2 + Br 12 + 2 S2 3 2 2 - S4 O6 + 21 2 moles de thiosulfate correspondent à 105,93 g de CNBr. * La quantité de CNBr que l'on utilise est donnée pour un CNBr ayant une pureté de 97 %. Pour une pureté de 68 %, il faut ajouter à la même quantité de dextran 0,625 g de CNBr. * La durée de l'activation est fonction de la température. Plus la température est élevée et plus l'activation est rapide ; pour avoir une activation reproductible et facile à mettre en oeuvre, on opère dans de la glace. b) A partir de ce moment deux étapes sont possibles b.i.) Le dextran activé est dialysé pendant 2 heures, contre 100 fois son volume d'eau déminéralisée à +40C puis 2 heures contre 40 -fois son volume de tampon borate 25mM pE 8,5 à + 40C. b.2.) Ou le dextran activé est ramené à pH 8,5 par HCI 0,1 N. c) Fixation de la créatine kinase sur le dextran activé L'enzyme doit être entièrement solubilisée dans le tampon borate avant d'être ajoutée au polysaccharide activé. On pèse 5 mg de créatine kinase, on les dissout dans 10 ml de tampon borate 25 mM pH 8,5 puis on ajoute sous agitation à +40C 10 ml de dextran activé. Le mélange réactionnel est contenu dans un récipient clos et ambré ; La durée de la fixation est de 1 à 3 jours à + 40C. Les sites activés restants sont bloqués par adjonction de tampon glycine. EXEMPLE 2 Contrôle de la fixation de la créatine kinase sur le dextran par chromatographie de gel filtration On effectue une chromatographie de gel filtration dans les conditions suivantes GEL FILTRATION AcA 34 colonne : 23/50 eluant : Tris-HCL 50 mM pH 8,5 débit : 13,6 ml/h hauteur : 45 cm volume des fractions : 3,5 ml La figure 1 représente l'activité de la créatine kinase en fonction des numéros des tubes. Sur cette figure, le pic 1 correspond à l'enzyme fixée sur le polysaccharide, le pic 2 à l'enzyme à l'état libre ; la comparaison des profils d'élution permet de conclure à la fixation totale de l'enzyme sur le polysaccharide selon le procédé de la présente invention. EXEMPLE 3 Etude de stabilité La créatine kinase stabilisée par le procédé de l'exemple 1 a été placée dans un milieu contenant des protéines (enzymes : transaminases, phosphate alcaline, gammaglutamyl transférase, amylase, lactate deshydrogénase et albumine bovine) des sels et substrats (phosphates, chlorures, calcium, glycérol, créatinine, acide urique, urée, fer, glucose, magnésium). On effectue une étude de stabilité en temps réel (figure 2) et une étude de stabilité par stress (figure 3). 3.1. La figure 2 représente l'activité de la créatine kinase en fonction du temps de stockage. La figure 2a concerne la créatine kinase préalablement stabilisée selon le procédé de la présente invention (sérum liquide à + 40 C). La figure 2b concerne la créatine kinase dans une solution témoin, à savoir un sérum contrôle lyophylisé disponible dans le commercer reconstitué avant chaque détermination. - De la comparaison de ces figures 2a et 2b il ressort à l'évidence que l'activité enzymatique de la créatine-kinase enzymatique fixée selon le procédé de la présente invention a été stabilisée de manière importante par rapport au contrôle. 3.2. La figure 3 représente l'activité résiduel le en % de la créatine kinase soumise aux températures suivantes en fonction du temps (en jours) + 41 degréC + 37 degréC + 25 degréC + 15 degréC - 20 degréC - La figure 3a concerne l'enzyme stabilisée de la présente invention - La figure 3b concerne une enzyme dans un sérum de contrôle du commerce. - De la comparaison des figures 3a et 3b, il ressort à l'évidence que l'enzyme stabilisée selon la présente invention résiste beaucoup mieux aux stress provoqués par des températures variées que l'enzyme présente dans le sérum de contr6le. 3.3. Enfin le tableau 1 suivant présente une comparaison de la constante de cinétique Km entre la créatine kinase stabilisée selon la présente invention et celle du sérum humain contrôle. TABLEAU 1 1 Enzyme . Substrat Km (mmol. L- ) ~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~ Stabilisation par le procédé sérum contrôle: : : zde l'invention : de l'invention Activité enzymatique :Elevée Normale Elevée Normale: Créatine : Créatine kinase phosphate :2,62 3,1 0,58 1,62 Pour conclure, la technique de stabilisation selon la présente invention s'avère préserver de manière efficace la créatine kinase de la dénaturation.Comme le montre la fig. 2, l'activité résiduelle est encore proche de 100 % après plus de 400 jours de conservation à + 40C. Les dérives que l'on peut constater sur le graphe de la fig. 2 sont essentiellement dues à des variations analytiques puisqu'elles sont de sens identique à celles observées avec le sérum lyophilisé du-commerce, reconstitué juste avant chaque détermination. L'étude accélérée de vieillissement (figure 3) confirme la bonne résistance de la préparation enzymatique de la présente invention à la dénaturation thermique (84 % d'activité résiduelle après 8 jours de conservation à 41 C), On peut également remarquer que l'enzyme stabilisée selon la Présente invention a des constantes de Michaelis (Km) proches de celles de l'enzyme sérique contrôle et ce aussi bien pour des taux élevés que des taux normaux d'enzyme (tableau 1). REVENDICATIONS 1. Procédé permettant de fixer la créatine kinase sur un polysaccharide soluble en milieu acqueux caractérisé en ce qu'il comporté les étapes succesives suivantes a) on active le polysaccharide en solution aqueuse basique par addition d'un halogènure de cyanogène et agitation jusqu'd stabilisation du pH à une valeur comprise entre 10 et 12. b) on ramène le pH de la solution aqueuse comportant le polysaccharide activé à une valeur comprise entre 8 et 10. c) on met en présence une solution tampon dans laquelle la créatine kinase a été entièrement solubilisée et la solution aqueuse comportant le polysaccharide activé issu de l'étape b. d) le cas échéant, on dialyse la solution obtenue à l'issue de l'étape c contre une solution tampon. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le polysaccharide est du dextran. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape b est réalisée en dialysant le polysaccharide activé contre de l'eau puis contre une solution tampon dont le pH est compris entre 8 et 9. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape b est réalisée par addition d'acide. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'halogènure de cyanogène est le bromure de cyanogène. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le bromure de cyanogène est utilisé à raison d'environ 0,4 grammes pour une quantité de dextran d'environ 2-,5 grammes. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à .6 caractérisé en ce que l'étape c est réalisée à une température environ égale à + 40 C. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'on bloque les sites activés libres du polysaccharide par l'adjonction de glycine. 9. Utilisation de la créatine kinase fixée par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la préparation d'une solution enzymatique stable prête à 1 remploi.