Brevet FR2633398A1 — publié le 19891229

La présente invention a pour objet un ensemble de test pour ana lyse biochimique au moyen d'une membrane sur laquelle sont fixées par adsorption des molécules biologiques. L'adsorption de protéines, acides nucléiques et autres molécules biologiques sur des supports solides est utilisée dans de nombreuses techniques d'analyse biochimique. Les supports poreux, se présentant sous La forne de membranes, permettent d'adsorber des nacronolecules par interactions hydrophobes, électrostatiques ou covalentes. Ces membranes sont cependant souvent fragiles et difficiles à manipuLer. Dans les ana Lyses biochimiques où Les réactions ont lieu en phase solide, on recherche en général La pre- sence, dans l'échantillon à tester, d'une ou plusieurs molécules d'un ligand capable de réagir avec les macromolécules bioLogiques fixées sur La membrane. La détection de La présence du ligand se fait à L'aide d'une sonde (radioactive, couplée à une enzyme, colorée, fLuorescente, etc.) soit directement, soit par compéti- tion. La plupart des techniques requièrent des incubations successives alternant ayec des Lavages. Le même test est souvent pratiqué sur des séries d'échantil- Lons. Dans ce cas, il est important de noter qu'en général une seule incubation, celle de La dilution du matériel à analyser, est specifique pour un échantiLLon donné.Par contre, Lors des Lavages et autres incubations, tous Les tests sont traites en parallèle et de lanière identique. On utilise généralement à cet effet des plaques en ea- tière synthetique de dimensions normaLisées, connues sous Le non de plaques à ELISA (Enzyme Linked Immuno- sorbent Assay), dans Lesquelles sont formées 8 x 12 puits de 7 mm de diamètre. Les molécules biologiques sont adsorbées par Le plastique. Toutes Les étapes de la réaction ont Lieu individuellement dans chaque puits, ce qui rend Les ana lyses en grande série tongues et fastidieuses. La pressente invention a pour but d'offrir un ensemble de test permettant de tester des séries d'échantillons de façon beaucoup plus rationneLLe et rapide qui avec Les moyens connus. L'ensemble de test selon L'invention est caractérisé par te fait qu'il comprend un support plan rigide sur lequel est fixée une couche de mousse synthétique à cellules fermées d'épaisseur uniforme, sur laquelle est elle-même fixée Ladite membrane sur laquelle Les molé- cules bictogiques sont fixées par adsorption selon une configuration géonétrique particuLière, une plaque perforée de trous cyLindrique ouverts à Leurs deux extré- mités et disposés seLon une configuration correspondant à La configuration des moLécuLes bioLogiques sur La membrane, la plaque perforée étant destinée à etre appliquée et pressée sur La nousse de manière à former des puits sans communication Les uns avec Les autres. La configuration seLon Laquelle tes molécules biologiques sont fixées sur La membrane peut etre par exemple un ensemble de Lignes parallèles ou une matrice de points à laquelle correspondent Les trous de La plaque perforée. L'ensemble de test seLon L'invention permet d'effectuer des réactions en grandes séries de façon particulière- ment rationneLLe. Par rapport à L'utilisation d'ELISA conventionneLLe en nicroplaque, l'ensemble de test se Lon L'invention présente en outre plusieurs avantages Le support peut etre coupé sur nesure et adapte au nonbre d'échantiLLons à analyser. A La position du puits ayant contenu l'échantillon on détecte un signal specifique du Ligand de l'échantillon sur Les macromolécules bioLogiques fixées sur La mem- brane, ainsi que Le bruit de fond do aux adsorptions non spécifiques du Ligand et des autres réactifs dans La zone de La membrane ne contenant pas Les macromolé- cules spécifiques au test. Des réactifs ou macromolécules permettant de controler Le fonctionnement du test peuvent etre appliques sur La membrane. Auprès L'incubation spécifique, tous Les échantillons sont traites en parallèle dans des incubations communes, accélérant ainsi tes manipulations par économie de pipettage et améLiorant La comparaison des résultats de différents échantillons. Les résuLtats peuvent etre évalués visueLLement ou par photométrie. Le support peut etre conservé comme document. Le dessin annexé représente, à titre d'exenpLe, une forme d'exécution de L'invention. La figure I est une vue en pLan du support rigide avec sa membrane dans laquelle on a représenté schématique- ment La répartition des macromolécules biologiques. La figure 2 est une vue en élévation et en coupe, à plus grande échelle, du support de la figure 1 et de La plaque perforée avant son application sur Le support. La figure 3 est une vue en plan de La plaque perforée appLiquée sur Le support. La figure 4 est une vue, à pLus grande échelle, en élé- vation et en coupe de L'ensembLe représenté à La figure 3. La figure 5 représente Le support apres réaction. Le support représente aux figures 1 et 2 est constitué d'une plaque rigide 1, de préférence en matière synthétique, susceptibLe d'etre découpée avec une paire de ciseaux, et sur laquelLe est collée une couche de mousse synthétique 2 à cellules fermées, d'une épaisseur de 1,5 mm,adhésive sur ses deux faces, sur LaqueLLe est ette-meme collée une membrane poreuse 3. Cette membrane poreuse est constituée, par exemple,par un filtre en nitroceLLuLose de 0,2 ij de SCHLEICHER et SCHUELL BA 83. Les macromolécules biOLogiques fixées par adsorption sur La membrane poreuse 3 sont réparties seLon des ti- gnes paralleles 4. Sur une partie Libre la de La plaque 1 sont imprimées des indications sur la nature et La position des macromolécules bioLogiques. L'ensembLe de test comprend en outre une plaque 5 en matière synthétique percée de trous cylindriques paraLlèles 6 disposés en matrice, La distance séparant les rangées de trous correspondant à La distance entre deux Lignes 4 de macromolécules bioLogiques sur Le support. La densité de La mousse ainsi que La densité du sous ensemble constitué par la plaque 1, la mousse 2 et la membrane 3 est inférieure à 1 g/cm3 de manière à permettre à L'ensembLe des éléments 1, 2 et 3 de flotter à La surface du Liquide pendant Les incubations non spé- cifiques, minimisant ainsi La quantité de réactifs nécessaires aux incubations. Pour proceder à L'incubation spécifique des échantiLtons, on applique La pLaque perforée 5 sur La membrane poreuse 3, en La maintenant pressée sur Le support, comme représenté à La figure 4, de manière à forner des puits 6 complètement sépares Les uns des autres, La mousse 2, comprimée, assurant L'étanchéité à l'extrémi- té des trous de la plaque, pour empécher la contamination d'un échantiLLon par un autre pendant L'incubation specifique. La pression peut etre assurée par une paire de pinces à ressort usuelle@ Les échantillons à anaLyser sont introduits sous forne diluée 7 dans chacun des puits 6 qui fonctionnent conne autant de chambres d'incubation individuelles pour Les différents échantiLLons à analyser. Après L'incubation spécifique, La matrice de tubes 5 est séparée du support 1 et celui-ci est ensuite incube avec Les réactifs communs à tous Les échantillons (Lavages, conjugés, substrats, etc.). A cet effet Le support et sa membrane sont déposes à L'envers, membrane 3 vers Le bas, sur Les réactifs correspondants sur les- quels Le support 1 et sa membrane 3 flottent en raison de La faible densité de La mousse 2. La Lecture du résultat se fait visueLLement ou par photométrie en évaluant La réaction ayant eu Lieu dans La zone où Les macromclécules bioLogiques sont adsorbées. Cette visualisation est illustrée à La figure 5, où L'on a représenté des segments colores 8, 9, 10 et Il correspondant à des puits 6 déterminés. La réaction ayant eu lieu sur Les molécules de contrôle appLiquées en d'autres configurations sur La membrane permet de juger du bon fonctionnement du test. L'ensenbLe seLon L'invention est susceptibLe de nonbreuses variantes d'éxecution. En particuLier, les ma- cromoLécuLes bioLogiques pourraient etre fixées sur La membrane 3 seLon une matrice de points correspondant à La matrice des trous de La plaque perforée 6 ou selon toute autre configuration particulière à LaqueLLe correspondrait une configuration sembLabLe des trous. La pLaque perforée pourrait etre égaLement réalisée d'une autre manière. La membrane 3 ne doit pas nécessairement etre poreuse, un film non poreux peut convenir REVENDICATIONS 1. Ensemble de test pour analyse biochimique au moyen d'une membrane sur laquelle sont fixées par adsorption des molécules bioLogiques, caractérisé par Le fait qu'iL comprend, d'une part, un support plan rigide (1) sur lequeL est fixée une couche de rousse synthétique (2) à ceLLuLes fermées d'épaisseur uniforme, sur Laquelle est eLLe-ere fixée Ladite membrane (3) sur laquelle les molécules bioLogiques sont fixées par adsorption seLon une configuration géométrique particulière (4), et, d'autre part, une plaque perforée de trous cy Lindriques (5, 6) ouverts à Leurs deux extrémités et disposés seLon une configuration correspondant à La configuration des molécules biologiques sur la plaque perforée étant destinée à etre appliquée et pressée sur La mousse de manière à forner des puits (6) sans commu- nication Les uns avec Les autres. 2. EnsembLe seLon La revendication 1, caractérisé par le fait que La configuration des molécules bioLogiques adsorbées est un ensemble de Lignes droites parallèles (4) et que La configuration des trous (6) est une ma- trice dont Les rangees correspondent auxdites Lignes droites. 3. EnsembLe selon la revendication 1, caractérisé par Le fait que La configuration des molécules bioLogiques adsorbes est une matrice de points et que La configuration des trous est une matrice senbLabLe. 4. Ensemble selon La revendication 2 ou 3, caracterisé par Le fait que le support rigide, rectanguLaire (1), dépasse latéralement La mousse, Le bord dépassant (la) portant des indications sur La nature et La position des macromolécules bioLogiques fixées sur Le membrane. 5. EnsenbLe selon L'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que La densité du sous-ensemble constitué de La plaque rigide, de La mousse et de la membrane est inférieure à la densité de t'eau.