Brevet FR2633182A1 — publié le 19891229

Le nombre des cancers solides, du sang ou du système lymphatique stagne et même augmente cependant que les trai- tements par la chimiothérapie donnent des résultats très insuffisants. La difficulté majeure vient du fait que les agents chimiothérapeutiques sont toxiques et mêmes parfois léthaux. Ils inhibent la prolifération non seulement des cellules malignes mais également celle des cellules normales, ce qui rend nécessaire la découverte d'agents sélectifs capable d'agir par eux mêmes, ou en combinaison, afin que l'effet inhibiteur soit prédominant vis à vis des cellules indési- rables. Disposer d'agents hautement sélectifs tout en ayant le minimum d'effet secondaire est un objectif important de la recherche sur le cancer. Le même problème d'absence de sélectivité et d'effets secondaires indésirables se manifeste aussi lors de l'utili- sation de la radiothérapie. Des efforts considérables sont également déployés afin de trouver des entités chimiques qui seraient actives contre les virus, cause de maladies des hommes, animaux et plantes. Les antitées antivirales connues sont également non sélectives et en nombre bien inférieur à celles connues pour agir contre les bactéries et les champignons. Dans les cas de malignité ou des virus, il est souhaitabl de trouver des entités actives et sélectives agissant au niveau des cellules anormales, c'est à dire affectant l'ADN ou les enzymes impliqués dans la prolifération de la cellule maligne ou virosée. Brève description de l'invention J'ai trouvé que la Naringine, Naringenineou leurs dérivés acceptables sur le plan pharmaceutique, inhibent la croissance des cellules cancéreuses. J'ai aussi trouvé que ces composés ne portent pas de préjudice conséquent aux cellules normales. Cette sélectivité entre les cellules cancéreuses et normales font de Naringine et Naringenine des agents thérapeutiques efficaces pour le traitement des cancers. Pour être concret, Na ringine, Naringenineou leurs esters, sels et dérivés sous une forme pharmaceutique accep- table, ou un mélange de l'un ou de plusieurs d'entre eux sont amalgamés avec un support pharmaceutique acceptable. La composition pharmaceutique résultante est alors séparée en unité de dosage et une ou plusieurs unités sont administrées aux patients à un temps donné. Le dosage, le mode d'adminis- tration ainsi que sa fréquence et durée, varient selon le patient, et sont choisis par le médecin afin d'assurer le meilleur contact entre les cellules cancéreuses et le produit agissant en concentration efficace. Un autre aspect de l'invention porte sur le traitement d'un patient dont les cellules cancéreuses sont résistantes à la chimiothérapie ou à la radiothérapie par un des agents de l'invention. J'ai trouvé que ces agents peuvent aussi être efficaces contre les cellules cancéreuses qui sont résistantes à la chimiothérapie et/ou à la radiothérapie. Dans un autre aspect de l'invention, il a été trouvé que la Naringine et la Naringenine, ou leurs dérivés, présentent un effet synergique lorsqu'ils sont administrés aux animaux ou aux patients subissant la chimiothérapie conventionnelle. Un autre aspect de l'invention réside dans la mise en évidence que la Naringine et la Naringenine provoquent la contraction, c'est à dire la fermeture des chaines d'ADN des cellules cancéreuses mais non celle des chaines d'ADN des cellules normales. Les agents de cette invention agissent sur les sites d'initiation de l'ADN des cellules cancéreuses et arrêtent également leur élongation. On peut concevoir que cela cause en totalité ou en partie l'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses. La fermeture des chaines d'ADN prévient ou inhibe l'addition d'unités de désoxyribonucleo- tides à la molécule d'ADN. Le fait que la Naringine et la Naringenine contractent les chaines d'ADN des cellules cancéreuses suggère que dans le Syndrome de l'Immuno dépression (SIDA) provoqué par le virus HIV, la Naringine et la Naringenine peuvent prévenir la I! formation de particules virales à partir des proto--oncogènes qui doivent être modifiés pendant l'infection en vue de la production de virus. Ainsi, Naringine et Naringenire peuvent être utiles dans le traitement du SIDA. En ce qui concerne les plantes et les animaux subissant l'infection virale, Naringine et Naringenine administrées à l'hôte inhibent la prolifération virale.Ceci peut être du à leur activité inhibitrice de certaines enzymes présentes ou produites par le virus. Ainsi une autre considération de l'invention comporte une méthode pour l'extraction de la Naringine et de la Narin- genine à partir de souces végétales naururelles. Les illustrations Figure 1 représente le spectre d'absorption en lumière ultraviolette de la Naringine commerciale et celui de la Naringine préparée selon la méthode exposée dans la présente invention. Figure 2 montre les effets de la Naringin lorsqu'elle est testée sur des cellules en culture in vitro, cellules humaines cancéreuses et normales Figure 3 montre l'effet-de la Naringine sur la synthèse in vitro de l'ADN provenant des cellules normales et cancé- reuses. Figure 4 montre l'effet de la Naringine sur la synthèse in vitro de l'ADN cancéreux lorsqu'elle est ajoutée au temps zero de la réaction et lorsqu'elle est ajoutée après que la réaction de synthèse ait démarrée Figure 5 montre l'effet de la Naringine et de la NaringeninE dans la contraction des chaines d'ADN des cellules cancéreuses alors qu'elles sont sans effet sur la contraction-des ADN des cellules normales, le degré de contraction étant démontré par l'hypochromicité. Figure 6 montre l'effet de la Naringine et de la Naringenin sur l'activité de la Terminal desoxynucleotidyl transferase (TdT). Figure 7 montre une feuille de Tabac infectée par le virus de la mosalque du Tabac (VMT), un côté de la feuille ayant été traité et l'autre pas. Figure 8 montre la structure chimique de la Naringine et celle de la Naringenine, toutes deux étant connues dans la littérature chimique. Figure 9 et 10 montrent la synergie d'action entre des antimito- tiques classiques et la Naringine isolée selon la méthode exposée dans la présente invention (Exemple 1). 5-FU = 5-fluorouracile; JO-1 = Naringine exemple 1; ARA-C = arabinoside cytosine; Endoxan = cyclophosphamide; HU = hydroxy-urée. Tableau 1 illustre la survie des souris porteuses de cellules cancéreuses (lymphome YC8), non traitées et traitées par la Naringine commerciale ( voie i.p.) et Naringineexemple 1. Tableau 2 illustre la survie des souris porteuses de cellules cancéreuses (lymphome YC8) non traitées et traitées par la Naringine Exemple 1 ( voie i.m.). Tableau 3 illustre la survie des souris porteuses de cellules cancéreuses (ascite d'Ehrlich), non traitées et traitées par la Naringine selon l'Exemple 1 (voie i.p.) Tableau 4 illustre la survie des souris porteuses de cellules cancéreuses ( lymphome YC8), non traitées et traitées par la Naringenine commerciale ( voie i.p.). 2633182 6 Description détaillée de l'Invention Comme leurs dérivés, la Naringine et la Naringenine semblent agir de deux façons différentes sur l'ADN des cellules cancéreuses. Premièrement, ces substances contractent, voire ferment les chaines de ce type d'ADN au niveau des points d'initiation, lors de la synthèse de la chaine. Deuxièmement, elles contractent, ou ferment, les chaines d' ADN en voie de synthèse (élongation). Ces effets sont probablement dus au fait que les chaines complémentaires de l'ADN fixent la Naringine ou la Naringenine en liaisos hydrogènes (ou covalentes). La fermeture des chaines d'ADN des cellules normales ne se produit pas. On peut penser que ces phénomènes sont la cause essentielle de l'inhibition sélective de la croissance des cellules cancéreuses, phénomènes qui ne se produisent pas lorsque des cellules normales sont exposées à l'action de la naringine et de la naringenine. Cependant, je ne souhaite pas être lié par cette théorie, ni par aucune autre théorie. Une quantité de Naringine, de Naringenine, ou d'ester ou de sels de ces substances, en cela active pour inhiber la croissance, c'est à dire la prolifération des cellules can- céreuses, est administrée à l'animal infecté par des cellules cancéreuses. Une solution de ces produits peut être administrée par voie intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou par voie orale sous forme de comprimés ou de gélules, ainsi que par voie rectale, mais en laissant au médecin traitant le soin de choisir le mode d'administration le plus souhaitable selon les circonstances. Pour les humains, les dosages seront généralement dans les limites suivantes, mais le médecin peut, selon des cas particuliers, augmenter ou diminuer ces doses. Per os, c'est à dire par voie oralle, 1 à 3 grammes de produit/jour. L'extrait acétonique de naringine peut être mélangé avec la poudre de cellulose, séché à 60 - 80 C pendant plusieurs heures, puis pulvérisé dans un "mixer et placé dans les gélules, chacune contenant environ 0.5 gramme de Naringine. Deux à six gélules peuvent être prises par jour sans aucun inconvénient durant plusieurs mois. Les dosages seront à peu près les mêmes pour la voie rectale. La Naringinepeut être administrée par voie intramusculaire sans inconvénient aussi bien chez les animaux que chez les humains. Pour ces derniers, une dose intramusculaire et journalière de 500 - 1000 milligrammes pendant plusieurs jours consécutifs peut être utilisée. La Naringinepeut être aussi utilisée en solution contenant de faibles quantités d'alcool éthylique ou autre solvent, tel le dimethylsulfoxide (DMSO). Pour l'injection ou perfusion intraveneuses, 250-1000 milligrammes seront généralement bien tolérés. Le produit peut être dissous dans une solution fraiche de DMSO puis dilué avec une solution aqueuse physiologique jusqu'à une concentration finale de DMSO de 5 à 10 %. Des dosages du même ordre que ceux utilisés pour lutter contre les cellules cancéreuses seront utilisées pour lutter contre les affections virales; les mêmes modes d'administration pourront être employés. L'utilisation de filtres millipores comme décrit dans l'Exemple 1 est pratiqué avant toute injection intraveineuse ou perfusion. Pour l'utilisation orale ou rectale, il suffit d'utiliser l'extrait soluble (phase acétone et/ou ether, après qu'ait été ajusté le pH à des valeurs neutres. En effet,.il n'y a pas de toxicité du sirop commercial utilisé comme source de substance, l'extrait de Naringine(phase acétone et/ou ether) ne présente pas d'effet toxique chez les animaux. L'extrait de Naringineconcentré peut être mé.langé avec la poudre de cellulos séché puis pulvérisé et mis directement en gélules de manière à ce que chaque gélule contienne une unité de dosage appropriée ( voie orale), ou amalgamé à des cires prévues à cet usage pour la forme suppositoire (voie rectale). En prévention d'infections virales des plantes ou en traite- ment post-infection, le produit actif pourrait être appliqué avec un transporteur physiologique acceptable, liquide ou solide, 2633f82 particulièrement adapté afin de favoriser l'adhésion sur les feuilles ou autres parties de la plante ( 50 à 200 microgrammes par feuille). Extraction de Naringinedes plantes Exemple 1 Hippophae Rhamnoides Un sirop commercial contenant de fortes quantités d'extrait de baies de la plante Hippophae Rhamnoides a été utilisé comme matériel de départ A 500 millilitres de sirop, on ajoute de l'acide chlorhy- drique (concentration finale 1 N) et le mélange est chauffé dans un bécher pendant quinze minutes à 100 C. Après refroidis- sement, le matériel hydrolysé est additionné d'un excès d'acétone (3 à 4 fois le volume). Le mélange est agité à la température du laboratoire (agitation mécanique). Après quelques instants de repos, deux phases apparaissent. La phase supérieure (acé- tone) est devenued'un brun-jaune soutenu. Elle est prélevée et gardée. Le traitement de la phase aqueuse par de l'acétone est répété plusieurs fois jusqu'à ce que l'acétone devienne très pale. Ensuite, plusieurs extractions sont pratiquées de la même manière avec de l'éther en vue d'extraire le maximum d'agent actif (Naringineet naringenine). Les phases acétones sont réunies entre elles, et distillées. Les phases éther sont réunies entre elles et distillées, les sol- vents pouvant servir à d'ultérieures extractions Les résidus acétone et éther sont réunis, le pH ajusté au voisinage de 7,0 ( NaOH ou KOH). 2633 42 Selon la forme qui sera donnée au produit et le mode d'administration, celui-ci sera ou non ultérieurement purifié. Si l'on décide de le purifier davantage, les résidus acétone/ether sont repris par un mélage eau-ethanol (1: 1), le pH ajusté à 10 - 12 et le matériel filtré sur des filtres millipores de 0.45. Le matériel restant sur millipore contient l'essentiel de la Naringirë/Naringenine. Les filtres sont alors incubés avec de 1 alcool ethylique à 95 dans un bécher et légèrement chauffés.L'extraction par l'alcool ethylique est répétéeplusieurs fois. La quantité de Naringinedissoute dans l'éthanol est déterminée par l'absorption en -lUmière ultraviolette (UV) à différentes longueursd'onde (nm) et donne un spectre caracté- ristique, illustré dans la figure 1. La préparation contient essentiellement la naringineet la naringenineest en faible quantité. Peu ou pas de vitamine C, de sucre ou de lipides sont présents dans une telle préparation. La comparaison avec la Naringinecommercialeutilisée comme étalon (dissolution dans l'alcool ethylique) est faite selon plusieurs critères. Le spectre ultraviolet d'absorption de 220 à 310 nm est déterminé en utilisant 4 à 20 pg (microgramme) de naringine/millilitre. Le spectre du produit isolé selon l'exemple 1 coincide essentiellement avec celui obtenu avec le produit de référence. Illustration dans la figure 1. La Naringenine a pratiquement le même spectre eu maximum d'absor- ption (290 nm) que la solution de référence. Sur papier de chromatographie ou sur plaque de gel de Silice, la naringine isolée selon l'exemple 1 migre comme le fait la naringinecommerciale en utilisant l'alcool ethylique comme solvent. Les spots (taches) sont détectés par la lumière UV et sont, dans les deux cas, proches du front de solvent. Le même procédé d'extraction et de purification a été direc- tement appliqué aux fruits de l'Hippophae. La préparation selon l'exemple 1 est plus soluble dans l'eau et possède une meilleure activité biologique, comparaison faite avec les composés commerciaux. Cette différence est probablement due à la présence de petites quantités de sucre ou lipides dans la préparation. La Naringinepréparée selon la méthode illustrée dans cet exemple porte le nom de " JO-1 "et les tests ont été réalisés sous ce même nom. Exemple 2. Citrons verts La peau de citrons verts est prélevée, broyée au "mixer en mélange aqueux. Pour l'isolement de la Naringinó, le même procédé que celui cité ci-dessus (exemple 1) a été utilisé. Certains pamplemousse5peuvent aussi servir de source d'extraction de la Naringenineou de la Naringine. Exemple 3. Racines d'endives (chicorum endivia) Les racines d'endives poussées en terre sont lavées puis la couche externe noire est enlevée (grattage). Les racines sont lavées, coupées en morceaux, broyées avec de l'eau afin de 263318t produire un mélange épais qui est mis à bouillir 30 min (100 C); Le liquide est alors filtré sur tissus, les débris végétaux sont réextraits dans les mêmes conditions à plusieurs reprises. Les filtrats sont réunis, concentrés, puis hydrolysés avec l'acide chlorhydrique (concentration finale 1 N) pendant 10 min à 100 C, puis refroidis. Les étapes suivantes de purification sont les mêmes que celles décrites dans l'exemple 1. Dans tous les exemples cités dans la présente invention, la Naringineprovient de baies d'hyppophae Ramnoides ( une préparation commerciale) à partir de-laquelle nous avons extrait le produit selon l'exemple 1. Exemple 4 L'effet de la Naringineet/ou de la Naringenine a été détecté selon une méthode in vitro mise au point et permettant de montrer l'action d'une substance donnée dans le processus de réplication de l'ADN provenant soit de tissus normaux soit de tissus cancéreux, comme décrit dans le brevet français d'application n 7728208 du 19 septembrel977, ce qui correspond au brevet américain n 4,264,729 délivré le 28 avril 1981. Les résultats concernant la Naringinesont présentés dans la figure 3. Ils montrent que ce produit inhibe in vitro forte- ment la synthèse des ADN de différents tissus cancéreux humains c'est à dire sein, colon et foie, alors que ce même produit n'a pratiquement pas d'action sur la synthèse de l'ADN des tissus sains: moelle osseuse et rate humaines et cerveau de singe Cela montre que la Naringine interagit spécifiquement avec l'ADN des tissus cancéreux et non pas avec 1'ADN polymérase. Il en est de même avec la Naringe- nine. Les ADN utilisés ont été isolés à partir de tissus cancéreux et normaux humains, fournis par différents hopitaux comme indiqué dans IRCS Medical Science 14: 809-810,1986. Le tissu sain du cerveau de singe provient d'un Macaca mulatta. Exemple 5 La même méthode est appliquée à la détermination du taux d'ADN marqué au tritium et synthétisé durant un temps défini afin de montrer l'effet d'introduction de Naringineà différents moments de la réaction. Les résultats, présentés dans la figure 4, montrent que la Naringineagit sur les sites d'ini- tiation de l'ADN lorsqu'elle est introduite au temps zero de l'incubation, et qu'elle arrête aussi l'élongation de la chaine d'ADN si elle est introduite après le début de la réaction Exemple 6 La Naringineest préparée selon la méthode décrite dans l'exemple 1, et un échantillon commercial de Naringine(préparé par la Maison Roth, France), est utilisé comparativement. Les résultats, présentés dans la figure 5, montrent que les deux échantillons de Naringine(et/ou de Naringenire) contractent les chaines d'ADN des cellules cancéreuses mais n'ont pas d'effet - ou n'ont qu'un très faible effet - sur l'ADN des cellules normales. Les résultats sont exprimés en diminution de l'absorption en lumière ultraviolette (hypochromicité) en présence de différentes concentrations de produit. L'hypochro- micité correspond à la contraction des chaine d'ADN tandis que l'hyperchromicité correspond à son ouverture, c'est à dire à la rupture des liaisons hydrogènes qui normalement tiennent ensemble les deux brins d'ADN. L'ADN de la rate et celui de la moelle osseuse, utilisés dans ce test provenaient de cellules de tissus sains humains, rate et moelle osseuse L'absorption en lumière ultraviolette à la longueur d'onde de 260 nm de différents ADN provenant de cellules saines et cancéreuses s'effectue à la température du laboratoire. pg (microgrammes) d'ADN (acide désoxyribonucléique)sont dissout dans 1 ml de tampon Tris-HCl ( 10- 2 molaire, pH ajusté à 7.3, solution faite en utilisant de l'eau distillée stérile). L'absorption est mesurée avant et après addition soit de Narin- gine, soit de Naringenine. La cuvette témoin contient un taux équivalent de Naringineou de Naringeninemais pas d' ADN. Le contact entre l'ADN et la substance dure environ une minute (agitation très douce). L'absorption à 260 nm est alors mesurée encore. Les résultats sont exprimés sous forme de diminution de l'absorption U.V. (%) Exemple 7 La Naringinepréparée selon l'Exemple 1 fut utilisée pour déterminer son effet sur des cellules en culture in vitro, cellules saines et cancéreuses d'origine humaine selon la méthode Shoemaker R.H. et al. Cancer Research 45: 2145-2153,1985).Le milieu de culture contenait 100 pg de penicilline et de streptomycine afin d'éviter toute contami nation. La figure 2 présente les résultats de ce test, montrant l'effet différentiel de différentes concentrations de Naringine. La Naringineinhibe fortement la croissance des différentes cellules cancéreuses humaines et n'a que très peu d'effet sur les cellules saines provenant de la moelle osseuse humaine, et ceci malgré la grande sensibilité que présentent les cellules hématologiques face à l'action des agents chimiotherapeutiques en général. Il est important de noter que les cellules cancéreuses de l'ovaire ainsi que les cellules leucémiques utilisées dans cet exemple étaient des cellules résistantes à la chimiothérapie, Ces résultats pourraient indiquer que la Naringinepeut sensibiliser les cellules chimio/ radiorésistantes vis à vis des agents thérapeutiques conventionnels et qu'en tout cas ces cellules peuvent être détruites par l'utilisation de la Narin- gineet/ou de la Naringenine, ou leurs dérivés. Exemple 8 La Naringinepréparée selon l'Exemple 1 ainsi que celle provenant du commerce ont été testées sur des feuilles de Tabac infectées par le virus de la mosaïque du tabac (VMT). Dans cette expérience, une suspension virale contenant 2pg/ml de virus en solution eau distillée, a été incubée à 30 C pendant 30 minutes avec chacun des composés cités ci-dessus (20-50 microgrammes/ millilitre)puiS 20pl sont déposés sur une moitié de feuille de tabac ("Xanthy") La même concentration de virus, non traité cette fois, étant déposée sur l'autre moitié de la feuille L'apparition de la maladie virale survient 2-3 jours plus tard. Le comptage des plages unitaires (PFU), chacune correspondant à environ 0lO6 particules virales, montre que chacun des échantillonsde Naringine ajoute à la suspension virale inhibe la multiplication des virus. La Figure 7 montre les résultats de ce test en utilisant la Naringineisolée selon l'Exemple 1. La Naringenine ou la Naringine commerciales donnent des résultats similaires Exemple 9 Toutes deux, Naringine et Naringenine inhibent in vitro l'activité de la desoxynucleotidyl transférase terminale (TdT), enzyme impliquée dans l'intégration du génome viral dans la cellule hôte. Cette enzyme est présente dans le vaccin de la leucose du chat préparé par le génie génétique (vaccin leucocell Engerix) , vaccin très purifié. J'ai précédemment montré que cette enzyme catalyse la polymérisation de d-TMP et d-CMP provenant de d-TTP et d-CTP utilisés respectivement comme substrats Pour l'essai d'activité TdT, le milieu d'incubation (O,O1 ml de volume final) contient: 25 jmol d'une solution fraiche de tampon Tris-HCl pH 7,70; 2}mol de MgCl2; un (3H)-d-NTP (desoxynucleoside-5'-triphosphate, lO0.000 CPM). Des quantités croissantes de vaccin Leucocell (comme indiqué dans la figure 6) sont utilisées. Incubation 10 min à 36 C puis addition d'un égal volume d'acide trichlor.acétique (ATC 5%>. Le matériel acido-précipitable est filtré sur millipore (Whatman GF/C), lavé à l'ATC 5% puis à l'alcool à 95 . Après séchage du millipore, la radioactivité du matériel acido insoluble est mesurée dans un spectromètre à scintillation Packard. Les résultats sont exprimés en CPM (coups/minute)/échantillon. La Figure 6 montre que la Naringine et/ou la Naringenine inhibent l'activité de la TdT qui se trouve comme contaminant dans le vaccin commercial préparé à partir d'un virus à ARN, responsable de la leucose du chat. En revanche, l'activité de la TdT qui contamine aussi le vaccin EngerixR antigène B ( Med.Sci.Res. 1987, vol. 15 pp.529-530), antigène préparé à partir d'un virus à ADN, n'est pas inhibée, dans les mêmes conditions, par la Naringine ou par la Naringenine. Ainsi, toutes deux, Naringineet Narin- genine interfèrent sélectivement avec la prolifération des virus à ARN mais non avec le virus à ADN. Cependant, comme l'ARN des virus à ARN est transcrit en ADN par la transcriptase inverse avant d'être intégré au génome de la cellule (rôle potentiel de la TdT), Naringineet Naringeninesont des agents utiles également dans le traitement de touteinffection à ADN également. Exemple 10 L'effet de la Naringinesur l'activité in vitro de la trans- criptase inverse fut déterminée. La transcriptase inverse commer- ciale provenant du virus de l'erythroblastose (virus à ARN) fut utilisée Le test fut pratiqué comme suit: Le milieu réactionnel (150 pl de volume final) contenait: 25 pM de tampon Tris-HCl pH 7.7; 2 pM de MgC12; 0,6 nM de chacun des désoxyribonucleoside-5'-triphosphates: desoxyadénosinetriphosphate (dATP), desoxycytidine-triphosphate (dCTP), desoxyguanosine-triphos- phate (dGTP) et 0,6 nM de 3H-TTP (thymidine triphosphate)(100,000 CPM); 0, 2 à 0,5 pg de mRNA de la globine du lapin (Hg), solution fraichement préparée: 0,1 pg d'oligo dT12 18 et 1 à 5 pg de protéine enzymatique. Après 10 min. d'incubation à 37 C la réaction est arrêtée par addition d'un égal volume d'acide trichloracétique froid (10%ATC) contenant 0,02 M de pyrophosphate de Na. L'ensemble est filtré sur filtre de verre Whatman (GF/A ou GF/C), le précipité lavé par 1'ATC 5% contenant 0,02 M de pyrophosphate puis par alcool éthylique à 95 et enfin séché. La radioactivité est mesurée dans ml de liquide à scintillation dans un compteur Beckman. La radio- activité du matériel acido-précipitable est déterminée. Le tableau montre le taux d'inhibition produit par la présence de Naringine dans le milieu réactionnel,en présence de mRNA de globine. Tableau CPM de 3H-TMP incorporé en 10 min % d'inhibition milieu complet 1676 + Naringine (Exemple 1): pg....... 836 50 pg........ 520 70 150 g........ 501 71 Exemple 11 Cet exemple illustre l'absence de toxicité de différntes doses-de Naringine ou Naringenine injectées par voie intraveineuse à des souris BALB C.La fragilité des veines des souris ne 26331 t permettait pas de pratiquer des injections plus répétées, soit pour la toxicité, soit pour le traitement des tumeurs par cette voie. Naringiie(ou Naringenine)voie i. v. (DMSO 10%) 125 mg/kg........ aucun effet toxique 250 mg/kg......... " " " I! m l I! 500 mg/kg......... On peut donc conclure que la Naringineou la Naringenine peuvent être administrées soit par injection i.v. soit par perfusion, à des doses de 250 - 1000 mg/kg, doses bien tolérées Exemple 12 La faible affinité de la Naringinepour l'ADN des cellules normales d'une part, pour les cellules en culture in vitro d'autre part ainsi que l'absence de toxicité chez la souris sont autant de faits qui suggèrent une absence de toxicité envers les cellules du sang, globules blancs et plaquettes en particulier Une solution de Naringine (10% deDMSO en serum physiologique) est injectée a raison de 50 mg, trois fois par semaine par voie intraveineuse, pendant deux mois consécutifs à des lapins. Aucun changement de la formule sanguine de l'animal ainsi traité n'a pu être détecté, pas plus qu'une perte de poids Exemple 13 Des souris O BALB C porteuses du lymphome YC8 (forme ascitique) et des souris Swiss porteuses de cellules ascitiques d'Ehrlich (20-22 gr, élevage Charles River) sont réparties au hasard en lot de 10. Chaque lot reçevait respectivement: Lot 1: Témoins, ayant reçu des cellules tumorales et une solu- tion isotonique de NaCI (0,2 ml/souris, 2 fois/jour, voie i.p.) Lot 2: Souris porteuses de cellules tumorales reçevant (JO-1= Naringine exemple l)(0,2 ml/souris 2 fois/jour).Pour les concentrations de JO-1, voir tableaux et figures). Voie i.p.) Lot III: Souris porteuses de cellules tumorales, reçevant Na- ringin. (J0-1) (0,2 ml/souris 2 fois/jour,(concentrations, voir les illustrations) et en même temps ces souris reçoivent un des produits de la chimiothérapie (concentrations, voir illustration) voie i.p. Les cellules tumorales ascitiques sont prélévées en milieu stérile sur souris portant ces cellules depuis 15-20 jours. 0.1 ml de suspension d'ascite est mélangé avec 10 ml de solution isotonique tamponnée (pH 7.2): (NaCI, 7,2 g/l; Na2HPO4, 4,3 g/1 et KH2P04, 0,4 g/1l). Une numération des cellules est effec- tuée (cellule de Malassez) et la suspension cellulaire diluée afi que le nombre de cellules soit d'environ 40.000-50.000/ml. 0,1 ml de cette suspension est immédiatement injecté par voie i.p. aux souris des lots I, II et III. Traitement: 48 h après injection des cellules tumorales, les souris du lot II reçoivent (i.p.) JO-1 réchauffé à 37 et filtré sur millipore. Traitement 5 jours consécutifs. Les souris du lot II sont traitées par le mélange de JO-1 et d'un des antimi- totiques pendant 5 jours consécutifs tandis que le lot I témoin ne reçoit que du sérum physiologique pendant 5 jours. Les souris sont observées pendant les deux mois qui suivent après la cessation du traitement. Les survivants en excellente condition physique sont seuls pris en considération. 2633182 21 Il faut toutefois préciser que les cellules ascitiques d'Ehrlich sont moins sensibles à l'action de Naringine que les cellules du lymphome YC8. Revendications 1. Une composition pharmaceutique renfermant un des composeS sélectionnés du groupe constitué par la Naringine, naringenine leurs esters ou sels, et cela en présence d'un support pharmaceutique acceptable. 2. Une composition selon la revendication 1 dans laquelle la naririgine est présente. 3. Une composition selon la revendication 1 dans laquelle la naringenine est présente. 4. Une composition pharmaceutique renfermant un melange de naringine, naringenine et un support pharmaceutique acceptable. 5. Une composition selon la revendication 1, sous forme d'unité de dosage. 6. Une composition selon la revendication 2, sous forme d'unité de dosage. -7. Une composition selon la revendication 3, sous forme d'unité de dosage. 8. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 a 7 pour l'obtention d'un médicament destiné à l'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses sensibles à la naringine qui comporte le contact de telles cellules avec des concentrations efficaces de naringine. 9. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 a 7 pour l'obtention d'un médicament destiné à l'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses sensibles à la naringenine qui comporte un contact entre ce type de cellules et une concentration efficace de narinierine. 10. Utilisation d'une composition selon une des revendications I a 7 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement d'un mammifère porteur de cellules cancéreuses comportant l'administration de naringineet ceci en quantité telle que la croissance des cellules cancereuses sensibles a la naringine soit inhibee plus fortement que n'est inhibée la croissance des cellules normales hématopoiétiques. 11. Utilisation d'une composition selon une des revendications i à 7 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement d'un rnarnmmifère porteur de cellules cancereuses comportant l'administration de naringenine et ceci en quantité telle que la croissance des cellules cancéreuses sensibles à la naringenine est inhibée à un degré plus fort que n'est inhibée la croissance des cellules normales hématopoiétiques. 12. Utilisation selon la revendication 10 dans laquelle lesdites cellules cancéreuses sont résistantes à la chimiothérapie ou a la radiothérapie. 13. Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle lesdites cellules cancéreuses sont résistantes à la chimiothérapie ou à la radiothérapie. 14. Utilisation d'une composition selon une des revendications i à 7 pour l'obtention d'un médicament destiné à augmenter l'efficacité du traitement chimiothérapeutique d'un mammifère porteur de cellules cancéreuses et comprenant en additif un traitement supplémentaire avec une quantité synergique de naringine 15. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 à 7 pour l'obtention d'un médicament destiné à augmenter l'efficacité du traitement chirniothérapeutique d'un mammifère porteur de cellules cancereuses et comprenant en additif un traitement supplementaire avec une quantité synergique de naringenine. 16. Utilisation d'une substance selon une des revendications i à 7 pour l'obtention d'un médicament destiné à l'inhibition des effets enzymatiques de la terminale désoxynucleotidyl transferase du virus a ARN ou de la transcriptase inverse retrovirale qui comporte l'utilisation de naringine dans un système biologique o se trouvent de telles enzymes. 17. Utilisation d'une substance selon une des revendications 1 a 7 pour l'obtention d'un médicament destiné à l'inhibition des effets enzymatiques de la terminale désoxynucléotldyl transférase du virus à ARN ou de la transcriptase inverse retrovirale qui comporte l'utilisation de naringenine dans un système biologique ou se trouvent de telles enzymes. 18. Utilisation d'une substance selon une des revendications I à 7 pour l'obtention d'un rmédicarnent destiné à combattre l'infection virale chez l'homme et l'animal qui comporte l'administration au sujet subissant une telle infection d'une quantité active d'un des composs sélectionnés du groupe consistant en naringine, narlngenine, leurs esters ou sels acceptables sous forme pharmaceutique. 19. Utilisation d'une substance selon une des revendications 1 a 7 pour l'obtention d'un médicament destiné à combattre l'infection virale chez une plante qui comporte l'administration à la plante subissant une telle Infectlorn d'une quantité active d'un des composes sélectionnés du groupe constitue palr narninll-e, larinqienine, leurs esters et leurs sels, en for'lfie acceptable sur le plan pharmaceutiques 20. Procéde d'extraction de la naringine à partir de sources végétales naturelles contenant ces mêmes produits, ce qui comporte: a/ préparer un extrait aqueux de la source végétale b! soumettre i'extralt a i'hydrolyse ac ide c/ ramener le pH à la neutralité si nécessaire d/ extraire le matériel aqueux par des solvents organiques afin de récupérer la nriaringine en solution e/ evaporer facultativement le solvent laissant un residu, reprendre le résidu par un mélange eau-ethanol, ramener le pH vers la neutralité et filtrer afin de récupérer la naringine sur le filtre. 21. Procédé selon la revendication 20 dont la source végétale est HHppophae Rhamnoldes 22. Procédé selon la revendication 20 dont la source végétale est le fruit citron, le pamplemousse ou l'orange. 23. Procédé selon la revendication 20 dont la source végétale est les racines d'endives 24. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 a 7 pour l'obtention d'un médicament destiné à la contraction sélective des chaines d'ADN des cellules cancéreuses, alors que la contraction des chaînes dADN des cellules normales saines rie se fait pas, ce qul comporte de soumettre un système biologique contenant de telles chaines a l'action d'une concentration efficace de naringinrie. 25. Utilisation d'une composition selon une des revendications 1 a 7 pour l'obtention d'un médicament destiné a la contraction sélective des chaines d'ADN des cellules cancéreuses alors que ceci ne se produit pas avec les chaines d'ADN des cellules normales, ce qui comporte de soumettre un système biologique efficace de naringenine. TABLEAU 1 Survie des souris A(BALBC) porteuses du lymphome YC8, non traitées et traitées par la Naringine commerciale (voie i.p.) et Naringine exemple 1. Survie(jours) non traitées Naringinecommerciale NaringineExemple 1 2 mg x 2/j Survie % 2 mgx 2/j Survie % O 10 10 100 10 100 10 10 100 10 100 7 8 80 10 100 2 5 50 8 80 0 5 50 7 70 0 5 50 7 70 os TABLEAU'2 Survie des souris (BALBC) porteuses du lymphome YC8 non traitées et traitées par la Naringine( voie i.m.) Survie( jours) non traitées Naringine(Exemple 1) Survie (%) 3 mg x 2/j durant 15 jours 0 20 20 100 20 20 100 12 20 100 0 17 85 0 17 85 % Co TABLEAU 3 Survie des souris 0 Swiss porteuses de cellules ascitiques d'Ehrlich, non traitées et traitées par la Naringine(Exemple 1) (voie i.p. ) Survie (jours) non traitées NARINGINE exemple 1 1,5mgx2/j Survie% 3. 0mgx2/j Survie % 0 10 10 100 10 100 10 10 100 10 100 8 4 40 10 100 4 4 40 7 70 1 4 40 5 50 0 4 40 5 50 ro ce La TABLEAU 4 Survie des souris 6BALB C porteuses de cellules ascitiques du lymphome YC8, non traitées et traitées par la Naringeninecommerciale (voie i.p.) Survie jours non traitées NARINGENINE commerciale 0,5 mg x 2/j survie % 1 mg x 2/j survie %' 0 10 10 100 10 100 10 10 100 10 100 10 10 100 I0 80 6 7 70 8 50 2 3 30 S 50 0 3 30 5 50 0% -o