Brevet FR2629097A1 — publié le 19890929

SEQUENCE D'ADN COMPRENANT LA PARTIE FONCTIONNELLE DU LOCUS sacU DE B SUBTILIS, VECTEURS CONTENANT LA SE QUENCE CORRESPONDANTE, ET LEUR UTILISATION DANS DES PROCEDES DE PRODUCTION DE PROTEINES La présente invention concerne une séquence d'ADN comprenant une partie fonctionnelle du locus sacU situé sur le génome de B. subtilis, ainsi que les vecteurs contenant cette séquence, et l'application de cette séquence et des vecteurs à la stimulation de la production de protéine par B. subtilis ou tout autre micro-organisme approprié dans lesquels ils auront au préalable été incorporés. Il a déjà été fait référence, sous la désignation "géne sacU", à un gène de régulation de l'expres- sion de gènes structuraux codant pour des enzymes de dégradation chez B subtilis (LEPESANT et al, Mol. Gen. Genet., 118 : 135-160 (1972) ; KUNST et al, Biochimie 56 : 1481-1489 (1974) ; STEINMETZ et al, Mol. Gen. Genet., 148 : 281-285 (1.976) ; ZUKOWSKI et al, Gene., 46 247-255 (1986)). Il existe également chez B. subtilis au moins deux autres gènes de régulation de l'expression d'une classe de gènes structuraux codant pour des enzymes dégradatives, le gène DrtR (NAGAMI et al, J. Bacteriol., 166 : 20-28 (1986) : YANG et al, J. Bacteriol., 169 434-437 (1987)), et le gène sacO (LEPESANT et al (1972), précédemment cité, KUNST et al (1974), précédemment cité TOMIOKA et al, J. Biotechnol., 3 : 85-96 (1985) ; YANG et al, J. Bacteriol., 66 : 113-119 (1986) ; AMORY et al, J. Bacteriol., 169 : 324-333 (1987)). Ces trois types de gènes de régulation sont des gènes pléiotropes contrôlant l'expression d'un grand nombre de gènes codant pour la production d'enzymes dégradatives dans diverses souches de Bacillus. Parmi les enzymes codées par les gènes structuraux sous le contrôle de sacU, sacO et PrtR, et secrétées par B. subtilis dans le milieu de culture, on. dis- tingue principalement la lévane-saccharase, les protéases alcaline et neutre, l' -amylase, des glycanases (PRIEST, Bacteriol. Rev., 41 : 711-753 (1977)). Des mutations intervenant au niveau des loci sacU et sacO du génome de B. subtilis conduisent à l'hyperproduction par ce dernier des enzymes sus-mentionnées. De telles mutations, désignées par les génotypes sacU h et sacQh, peuvent confère aux souches de sacUh et ~~~~ peuvent conférer aux souches de B. subtilis les phénotypes Lvsh, Prth et Amyh se manifes- tant respectivement par des hyperproductions de lévanesaccharase, de protéases et d'a-amylase. A l'inverse, un autre type de mutation, mise en évidence uniquement au niveau du locus sacU, réduit considérablement les taux de synthèse de lévane-saccharase et de protéase chez B. subtilis. Cette dernière mutation confère aux souches de B. subtilis les phénotypes Lvs et Prt , et est désignée par le génotype sacU En résumé, les loci sacU et sacO seront décrits par sacU+, sacQ+ indiquant le niveau de synthèse de la souche de B subtilis Marburg 168 de référence et ses dérivés, ou par les génotypes mutés sacUh, sacph indiquant un niveau de synthèse augmenté ou par sacU indiquant un niveau de synthèse considérablement réduit. Au locus sacU, les mutations sacU et sacUh sont étroitement liées (6 à 9 % de recombinaison par transformation) et sont donc soit portées par le même gène soit portées par deux gènes étroitement liés (STEINMETZ et al, Mol. Gen. Genet., 148 : 281-285, (1976)). Les loci sacU et sacO semblent agir de manière dépendante. Le phénotype de l'hyperproduction d'enzymes (ou encore phénotype Sedh, synthèse d'enzymes dégradatives haut niveau) conféré par la présence, soit d'une mutation sacOh chromosomique, soit de multiple copies de sacO portées par un plasmide, dans la cellule hôte, est aboli par la présence d'une mutation sacU Par contre, le gène DrtR, introduit dans une cellule hôte sous forme de multiple copies par l'intermédiaire d'un plasmide, est de conduire à un phénotype d'hyperproduction en présence d'un allèle sacU (HENNER et al, Proceedings of the fifth international symposium on the genetics of industrial microorganisms, Split, Yugoslavia, pp 81-90, 1986). C'est donc en raison de leurs effets, dont on a montré qu'il s'exerçait au niveau transcriptionnel sur la synthèse de différentes enzymes chez Bacillus, que des loci sacU, sacO, ou autres séquences d'ADN d'activité comparable, issus de différentes souches de Bacillus suscitent beaucoup dlintérêt, notamment pour leur application dans le domaine de la synthèse d'enzymes particulièrement intéressantes au niveau industriel. Notamment, plusieurs équipes de recherche ont récemment décrit le clonage de fragments d'ADN, à partir de différentes souches de Bacillus, lesdits fragments permettant l'hyperproduction de protéase, ou d'autres enzymes, chez B. subtilis. Le brevet japonais déposé le 19/07/1983 par OKADA et al sous le n 60-30 685 décrit un ADN recombinant contenant une séquence d'insertion originaire du génome d'un B. licheniformis présenté comme codant pour une protéase de ce dernier type de micro-organisme. Les auteurs du brevet ont utilisé cet ADN recombinant pour transformer des cultures de Bacillus subtilis en vue d'accroître leur capacité à produire des protéases alcaline et neutre. OKADA et al (Appl. Microbiol. Biotechnol., 20 406-412, (1984)) ont cloné un fragment EcoRI de 3,6 kb à partir de B. licheniformis qui stimule aussi bien la secrétion de la protéase neutre que celle de la protéase alcaline (70x), mais n a qu'un faible effet sur les enzymes du type ct-amylase (2x) ; le phénotype observé est conservé à l'occasion du clonage d'un fragment PvuII de 1,25 kb et même d'un fragment Sau 3A1 de 0,37 kb obtenu à partir du fragment EcoRI. TOMIOKA et al (J. Biotechnol., 3 : 85-96; (1985))' ont aussi décrit la stimulation de la production des protéases neutre (10x) et alcaline (9x) avec un fragment EcoRI de 4 kb provenant de B. amvloliquefaciens ce fragment a pu être réduit à 1,75 kb comprenant des phases ouvertes de lecture non identifiées ; il ne permet pas la stimulation de la synthèse d'-amylase. Un fragment d'ADN issu de Bacillus natto a été décrit comme permettant une hyperproduction de protéases alcalines et neutres et de lévane-saccharase (J. Bacteriol., 166 20-29, (1986)). Les auteurs ont envisagé qu'un polypeptide de 60 acides aminés pouvait intervenir dans la stimulation de cette production. Des polypeptides de 46 acides aminés codés par le gène sacO de B. subtilis (polypeptide Sacs (J. Bacteriol., 166 : 113-119, (1986)), et de B. amyloliguefaciens (polypeptide Sac,) (J. Biotechnol., 3, 85-96, (1985)) ont été décrits comme étant des activateurs de la synthèse d'enzymes dégradatives. Le brevet français déposé le 18/08/1986 sous le n- 86.11826 aux noms de l'INSTITUT PASTEUR et du CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE décrit l'identification du gène SacO de B. licheniformis ainsi que du polypeptide Sacs, codé par ledit gène sac, et un procédé de stimulation de la production d'un polypeptide déterminé par une souche de B. subtilis dont le génome avait été modifié de manière à ce qu'il comprenne soit de manière intégrée dans le chromosome, soit sur un plasmide, une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide déterminé et à laquelle avait également auparavant été incorporé un fragment d'ADN, codant pour SacQL. Toutefois, le locus sacU n'a jamais été cloné et n'a, par conséquent, jamais été utilisé pour la mise en oeuvre d'un procédé de surproduction d'enzymes, par réintroduction dans une cellule-hote capable ou rendue capable de produire ces enzymes, ce procédé utilisant une séquence fonctionnelle de ce locus pour ses propriétés stimulantes à l'égard de cette production. L'objectif de la présente invention est le clonage du gène sacU, sous une forme sauvage ou portant une mutation sacUh, afin de permettre l'utilisation de ce locus sacU ou d'une séquence fonctionnelle de cé locus pour la mise en oeuvre d'un procédé de surproduction d'enzymes ou d'autres protéines par B. subtilis ou par tout autre micro-organisme approprié -avec un taux de surproduction aussi élevé que possible. En effet, les tentatives de clonage du gène sacU qui ont été antérieurement envisagées, ont échoué. Celle décrite dans l'article d'AUBERT et al paru en 1985 dans J. Bacteriol., 161 : 1182-1187, qui décrivait une tentative de clonage de sacU par l'intermédiaire de plasmides navettes capables de se répliquer à la fois dans Escherichia coli et Bacillus subtilis, a été reniée par les mêmes auteurs, dans un autre article en 1987, dans J. Bacteriol., 169 : 3393r au motif qu'elle était érronnée La stratégie décrite par DEBARBOUILLE et al, dans FEMS Microbiol. lett., 41 : 137-îAO (1987)) et qui a été appliquée avec succès au clonage du gène sacS, n'a pas pu être transposée au clonage et à l'identification de sacU. En particulier, il a été procédé à une tentative d'introduire une banque de gènes (sous forme de plas- mides recombinants les contenant et obtenus chez Escherichia coli), dans une souche de B subtilis dont le génome portait une mutation sacU ainsi qu'un gène de résistance à la kanamycine squs le contrôle du promoteur du gène sacB codant pour la lévane-saccharase. Sous l'effet de sacU , le gènesacB et celui codant pour la résistance à la kanamycine sont très faiblement exprimés.Il était espéré qu'un des plasmides recombinants qui pouvait contenir le locus sacU, serait capable de conférer à la souche de B. subtilis sacU , sus-mentionnée, un haut niveau de résistance à la kanamycine et de restaurer la production de lévane-saccharase chez cette même souche. Mais il n'a pas été possible d'isoler un plasmide comportant le locus sacU de cette'manière. La présente invention découle de l'hypothèse (qui semble s'être vérifiée) que ces divers échecs étaient peut-être dus à une toxicité du locus sacU à l'égard d'E. coli. Aussi, un des buts de la présente invention a été de proposer une méthode pour le clonage du locus sacU directement chez Bacillus. subtilis. Les caractéristiques essentielles du processus qui a conduit à l'invention seront plus aisément appréhendées à la lumière des dessins dans lesquels - la figure 1 est une représentation schématique du plasmide pBU3, avec dans la partie supérieure de la figure, le fragment BamHI de 13,5 kb, issu de B. subtilis BD1238, contenant le transposon Tn9171acZ à proximité du locus sacU, et dans la partie inférieure de la figure, le vecteur plasmidique utilisé pour le clonage de ce fragment BamHI, - la figure 2 est une représentation schématique du plasmide pBU14 avec dans la partie supérieure de la figure, un fragment SalI de 3,9 kb issu du plasmide pBU3 de la figure 1 contenant le locus sacU, et, dans la partie inférieure de la figure le vecteur plasmidique utilisé pour introduire pBU16 le clonage de ce fragment SalI, - la figure 3 représente schématiquement les plasmides pHV1431 et pHV1436 utilisés pour le clonage de sacU, - la figure 4 est une carte de restriction du locus sacU de B. subtilis délimité par les sites SalI et SalI, - la figure 5 représente la séquence complète et la carte de restriction d'un fragment de 2550 paires de bases comprenant le locus sacU, avec l'indication de ses sites de restriction, - la figure 6 représente la phase de lecture ouverte comprise dans le fragment de 2,55 kb de B. subtilis et codant pour le polypeptide SacU51 - la figure 7 représente la séquence en acides aminés du polypeptide SacU5, - la figure 8 représente la comparaison des parties N terminales des polypeptides SacU5, DyE, OmpR, SpoOF,. SpoOA. Au cours d'une analyse génétique effectuée sur B. subtilis Marburg 168 et ses dérivés (LEPESANT et al, Mol. Gen. Genet., 118 : 135-160 (1972)) il avait été montré par les inventeurs que la région sacU pouvait être située sur le génome à proximité du marqueur hisA1. Partant de ce résultat, leur attention devait être attirée par la souche de B subtilis BD1238 (décrite par HAHN et al, J. Bacteriol., 169 : 3104-3109 (1987), et ALBANO et al, J. Bacteriol., 169 : 3110-3117 (1987)) dans laquelle le transposon Tn9î7lacZ était introduit à proximité du marqueur hisAl. Le génome de B. subtilis BD1238 est en effet caractérisé par la mutation com-524 proche de bisAl; due à l'insertion dans son génome du transposon Tn917lacZ dont la carte de restriction apparait dans la figure 1. Cette région Tn9î7lacZ comprend le marqueur de résistance à l'érythromycine (PERKINS et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83 : 140-144 (1986) ; SHAW et al, J. Bacteriol., 164 : 782-796 (1985)). Les inventeurs devaient en déduire que chez B. subtilis BD1238 (de génotype sacU+), le locus sacU+ devait être à proximité de la région Tn917lacZ. Le clonage de la région correspondante du génome de B. subtilis BD1238 en utilisant le marqueur de résistance à l'érythromycine comme moyen de sélection, dans un plasmide capable de se répliquer dans B. subtilis, devait confirmer la validité de cette hypothèse. La présence d'un site BamHI unique à l'extrémité gauche de Tn9171acZ, a conduit les inventeurs à utiliser l'enzyme de restriction correspondante pour fragmenter le génome de B. subtilis BD1238. Les fragments BamHI obtenus ont été ligaturés dans des plasmides appropriés (figure 1); ces derniers ont été utilisés pour transformer des cellules de B. subtilis non résistantes à l'érythromycine, et les cellules de B. subtilis devenues résistantes à l'érythromycine ont été sélectionnées. Les inventeurs ont ainsi isolé un plasmide (plasmide pBU3) et l'ont utilisé pour transformer des cellules de B. subtilis porteuses d'une mutation sacU (phénotype Lvs ) (figure 1). Ils ont ainsi déterminé que ce plasmide contient un fragment BamHI de 13,5 kb issu de B. subtilis BD1238 capable de restaurer la synthèse de la lévane-saccharase (phénotype Lvs+) chez une souche de B. subtilis portant une mutation sacU (phénotype Lvs ). Un premier sous-clonage d'un fragment SalI qui comprend un fragment SalI-BamHI provenant de l'ADN de B.subtilis BD1238 de 3,6 kb et un fragment de 0,28 kb BamHI-SalI de pBR322 donne le plasmide pBU14 (figure 2) qui est aussi capable de restaurer la synthèse de la lévane-saccharase chez un mutant sacU L'élimination dans ce fragment de la séquence comprise entre les deux sites EcoRI et la religation conduit à un plasmide qui a perdu toute activité et ne complémente plus un souche sacU . D'autre part, le clonage du fragment compris entre les deux sites EcoRI dans le vecteur pHV1432 (S.D. EHRLICH et al, PARIS) conduit également à un plasmide qui ne complémente pas une souche sacU . Au contraire des expériences précédentes, le sous-clonage à partir du plasmide pBU14 par digestion avec l'enzyme de restriction SPhI a permis d'obtenir un plasmide pBU16 contenant un fragment SalI-SPhI de 2,55 kb issu de B.subtilis BD1238, capable de restaurer la synthèse de la lévane-saccharase chez un mutant sacU . Donc le fragment SalI-S > hI de 2,55 kb, porté par le plasmide pBU16, comprend le locus sacU et plus particulièrement la région fonctionnelle du locus sacU de B. subtilis. Il est caractérisé par la carte de restriction indiquée sur la figure 4.La séquence du nucléotide de ce fragment correspond pour l'essentiel à celle représentée à la figure 5. En outre, l'introduction de ce fragment de 2,55 kb par l'intermédiaire d'un vecteur. approprié, dans une souche de B. subtilis de phénotype Lvs+, conduit dans cette souche à une surproduction des enzymes exocellulaires qu'elle est normalement apte à synthétiser. En d'autres termes, cette séquence a la capacité de conférer le phénotype Sedh à ladite souche de B. subtilis. La méthode de clonage du gène sacU décrite cidessus est également applicable au clonage du gène sacUh en utilisant une souche de B. subtilis comportant une mutation sacUh, notamment à l'aide de la souche de B.subtilis QB136 décrite ci-après. L'invention concerne par conséquent toute séquence de nucléotides contenu dans un fragment SalI-SPhI de 2,55kb, issu du chromosome d'une souche de B.subtilis, ou d'une souche de B.subtilis comportant une mutation de type sacUh, ladite séquence étant capable, lorsqu'elle est introduite dans une souche de B. subtilis - ou dans tout autre micro-organisme capable d'exploiter à son profit l'information portée par .ce fragment - de conduire à une surproduction d'enzymes endo- ou exocellulaires ou de toute autre protéine. De façon générale, l'invention concerne tout séquence homologue du fragment SalI-SPhI de 2,5 kb susmentionné, cette séquence étant elle-même fonctionnelle pour conférer un phénotype Sedh à une souche de Bsubtilis, cette séquence étant en particulier apte à s'hybrider au fragment de 2,55 kb défini ci-dessus, et ce lorsque les opérations d'hybridation comporte les étapes suivantes - pré-traitement (pré-hybridation) du filtre de nitrocellulose supportant le fragment d'ADN à tester avec le tampon d'hybridation (5 x SSC, 1 x Denhardt, 0,1 SDS), cette opération étant effectuée à 42-C pendant 1 heure - remplacement du tampon d'hybridation au contact du support par du tampon d'hybridation de même composition, et addition de la séquence de 2,55 kb en tant que sonde, notamment marquée radioactivement, et préalablement dénaturée par un traitement à 100-C pendant 5 minutes - incubation de la séquence homologue à tester fixée sur le support dans ce tampon d'-incubation avec le fragment de 2,55 kb à 42-C pendant une durée de 16 à 24 heures, - l'élimination du tampon contenant la sonde non fixée, par lavages successifs 1 x 50 ml de 5 x SSC, 0,1 SDS 42"C pendant 20 minutes et 2 x 50 ml de 2 x SSC, 0,1 % SDS pendant 2 x 20 minutes à 42'C. Il est à rappeler que la composition de la solution de Denhardt est la suivante : 1- Ficoll, 1 % polyvinylpyrrolidone, 1 % BSA (albumine de sérum de boeuf), et que 1 x SSC est constitué de 0,15 M de NaCl et 0,015 M de citrate de sodium, pH 7. Les conditions qui précèdent correspondent en particulier à des conditions non stringentes. L'invention concerne plus particulièrement les séquences homologues conférant aux souches de B. subtilis un phénotype Sedh et qui s'hybrident dans des conditions stringentes avec le fragment de 2,55 kb, ces conditions d'hybridation comprenant les étapes suivantes - traitement de pré-hybridation du filtre de nitrocellulose supportant la séquence d'ADN à tester à 42"C pendant 1 heure avec un tampon ayant la composition suivante : 50 % formamide, 5 x SSC, 1 x Denhardt - remplacement du tampon d'hybridation au contact du support par du tampon d'hybridation de même composition, et addition de la séquence de 2,55 kb en tant que sonde notamment marquée radioactivement, et préalablement dénaturée par un traitement à 100C pendant 5 minutes - une incubation à 420C pendant une durée de 16 à 24 heures, et - lavages successifs avec les solutions suivantes 1 x 50 ml, 5 x SSC, 50 z. formamide, 20 minutes à 42"C 2 x 50 ml, 2 x SSC, 0,1 % SDS, 2 x 20 minutes à 42-C 1 x 50 ml, 0,2 x SSC, 0,1 % SDS, 20 minutes à 42'C. Le fait qu'une séquence d'ADN qui après ce traitement reste hybridée à la séquence d'ADN de 2,55 kb plus particulièrement définie en rapport avec la figure 5, indique que les deux séquences sus-mentionnées possèdent un certain degré d'homologie. En ce qui concerne le protocole à suivre avant de procéder aux expériences d'hybridation du fragment SalI-SPhI de 2,55 kb, on peut procéder de toute façon bien connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, on définit ci-après les conditions dans lesquelles cette fixation peut être effectuée : - le marquage radioactif du fragment par translation de césure (nick-translation), - transfert de l'ADN à tester sur un filtre de nitrocellulose, - dépôt de ce filtre sur du papier Whatmann n*3, imbibé de NaOH 0.5 N, NaCl 0.9 M et incuber 20 minutes à température ambiante, - répétition de l'opération sur papier imbibé de Tris-HCl M, pH 7, 10 minutes, - séchage bref, - répétition de l'opération sur papier imbibé de 2 x SSC, - - séchage sur papier, puis à l'étuve à 80*C pendant 2 heures, permettant la fixation de l'ADN à tester sur le filtre. Il est à remarquer que les opérations d'hybridation qui précèdent sont avantageusement directement effectuées dans des conditons stringentes, s'agissant h d'identifier la séquence sacU ou sacUh dans une souche de B. subtilis. Cette technique est appliquée particulièrement à l'isolement de la séquence sacUh d'une souche de B. subtilis sacuh. En revanche, les conditions non stringentes sont en tout cas recommandées dans les procédés opératoires s'agissant d'isoler une séquence fonctionnelle à partir d'un autre micro-organisme, notamment du type Bacillus, par exemple B. licheniformis. Il apparaitra immédiatement que l'homme de métier peut, soit par le traitement complémentaire soit du fragment de 2,55 kb sus-spécifié, soit d'une séquence homologue à ce fragment par les enzymes de restriction appropriées, soit par une digestion de ses extrémités au moyen d'une enzyme exonucleolytique telle que Bal31, produire des fragments plus petits à partir du fragment SalI-SDhI et tester à nouveau, notamment dans les conditions exposées plus loin, leur capacité à conférer le phénotype Sedh à une souche de B. subtilis. En d'autres termes, l'homme du métier est désormais à meme de localiser avec précision la partie active du locus sacU. L'étude de la séquence nucléotidique entière du susdit fragment d'ADN de 2,55 kb montre que le fragment d'ADN de 990 paires de bases délimité par les nucléotides situés aux positions 1320 et 2310 (correspondant respectivement aux sites de restriction Asu II et Nde I) de la figure 5, comprend au moins une phase ouverte de lecture soutenant l'hypothèse que cette phase code pour une protéine (ci-après dite "SacU" ou "SacU5') de 229 acides aminés (figure 7). Cette phase ouverte de lecture qui est délimitée par les nucléotides situés aux positions 1452 et 2139 (figure 6) est précédée par une séquence nucléotidique présumée fournir les signaux typiques de liaison de l'ARN messager aux ribosomes (dite séquence Shine-Dalgarno). Cette séquence semble être située dans la région délimitée par les nucléotides situés aux positions 1437 et 1443.La phase de lecture ouverte parait être suivie d'un terminateur de transcription compris entre les nucléotides situés aux positions 2151 et 2176 de la figure 5. On doit noter que cette phase ouverte de lecture est située de part et d'autre de l'un des sites EcoRI. On a montré que la délétion de la séquence comprise entre ces deux sites supprime l'activité sacU du fragment cloné. On voit que cette délétion élimine plus de la moitié de la séquence codante. D'après les triplets ou codons successifs de cette phase de lecture, on peut déduire la séquence théorique en acides aminés du peptide correspondant. Cette séquence montre une homologie avec celles de plusieurs protéines qui sont des activateurs de transcription, notamment des protéines de E. coli Dye, OmpR, une protéine de Salmonella tvPhimurium, CheY (DRURY et al, J. Biol. Chem., 260 : 4236-4242 (1985)) ou des protéines de B. subtilis, SpoOA, SpoOf (TRACH et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 82 : 7260-7264 (1985)). On peut en déduire que la protéine codée par cette séquence appartient vraisemblablement à cette famille de protéines, activateurs spécifiques de transcription. Pour les besoins de la représentation formelle des homologies de structure partielle entre sacU5 et les autres protéines apparaissent à la figure 8, certains acides aminés se trouvent quelquefois davantage écartés de ceux qui normalement les jouxtent, de façon à permettre la mise en évidence (grâce à des encadrements verticaux) desdites homologies partielles. L'examen de la séquence nucléotidique du susdit fragment d'ADN de 2,55 kb montre l'existence d'une autre phase de lecture ouverte entre les nucléotide situés aux positions 848 et 1366 de la figure 5. Cette séquence ne parait pas précédée d'une séquence typique de liaison aux ribosomes. Elle est entièrement incluse dans le fragment EcoRI-EcoRI dont on a montré l'inactivité. Cette séquence ne peut donc être active par elle-meme mais on ne peut éliminer le fait qu'elle puisse jouer un rôle dans l'expression de la protéine SacU5. L'invention concerne toute séquence d'ADN issue du fragment SalI-SPhI de 2,55 kb mentionné plus haut, séquence incluant en particulier la séquence codant pour le polypeptide SacU capable de conférer le phénotype Sedh ainsi que les Sedh, ainsi que les séquences nucléotidiques comprenant les éléments de régulation de l'expression de ce dernier. A titre d'exemples de fragments conformes à l'invention et satisfaisant à l'ensemble des conditions qui ont été rappelées dans la définition sus-indiguée du fragment d'ADN selon l'invention, on mentionnera - le polynucléotide délimité par des nucléotides situés aux positions 1 et 2310 respectivement de la figure 5, présumé comprendre le promoteur de transcription, le site de liaison ribosomique, le gène de structure du polypeptide SacU5 et le terminateur de transcription. - tout polynucléotide contenant le fragment délimité par des nucléotides d'extrémités correspondant aux positions 1 à 2310 respectivement de la figure 5, et comprenant, en outre, en-amont dudit fragment, une séquence suffisamment longue pour également inclure le promoteur endogène permettant la transcription dans la cellule hote, notamment par B. subtilis. L'invention concerne également tout fragment d'ADN capable de s'hybrider avec le fragment d'ADN SalI-SDhI de 2,55 kb sus-mentionné, dans des conditions stringentes ou non stringentes sus-mentionnées. L'invention concerne plus particulièrement tout fragment d'ADN issu d'une souche de B subtilis h comportant une mutation sacUh, notamment dans les conditions décrites ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider avec le fragment d'ADN de 2,55 kb de .la figure 5, et en ce qu'il confère le phénotype Sedh à la souche bactérienne , notamment de B. subtilis, dans laquelle il est incorpore. L'invention concerne aussi tout acide nucléique recombinant contenant la partie fonctionnelle de sacU contenue dans le fragment SalI-SPhI sus-défini en particulier le fragment du type sus-indiqué codant pour le polypeptide SacU5 conférant le phénotype Sedh associé avec des fragments d'acide nucléique hétérologues vis-àvis dudit fragment, c'est-à-dire des fragments d'acide. nucléique qui peuvent avoir un effet en combinaison avec la séquence codant pour le polypeptide, par exemple des séquences d'acide nucléique susceptibles de contenir un promoteur fort ou une séquence régulatrice ayant pour effet d'augmenter la production de la protéine SacU sauvage ou modifiée dans l'hôte utilisé. A ce titre, l'invention concerne tout ADN recombinant contenant un fragment d'ADN selon l'invention, conférant le phénotype Sedh associé avec un promoteur de transcription reconnu par une cellule hôte, autre que celle dont ledit fragment d'ADN est issu. Avantageusement, le susdit promoteur utilisé est un promoteur fort tel que le promoteur du gène sacB (A. KLIER et al, Molec. Microbiol., 1 : 233-241 (1987)), ou le promoteur Pn25 du bactériophage T5 (M. ZUKOWSKI et L. MILLER, Gene, 46 : 247-255 (1986)).Avantageusement, cet ADN recombinant comprend un fragment d'ADN selon l'invention, un promoteur, notamment un promoteur fort, et, le cas échéant, un terminateur de transcription hétérologue par rapport à l'ADN de B. subtilis, ce promoteur et, le cas échéant, ce terminateur étant néanmoins reconnu par la cellule hote, dans des conditions permettant au susdit fragment d'ADN selon l'invention d'y etre exprimé, lorsque ledit ADN recombinant y aura été introduit. Par exemple, cet ADN recombinant comprend un promoteur et, le cas échéant, un terminateur d'un autre microorganisme. A cet égard, l'invention concerne plus particulièrement les ADN recombinants consistant en des vecteurs, contenant un fragment d'ADN selon l'invention en l'un de leurs sites non essentiels pour leur réplication, notamment du type plasmide, qui sont aptes-a se répliquer dans une cellule hôte tout en permettant à la partie fonctionnelle du locus sacU de manifester son activité, notamment à permettre l'expression de la séquence codant pour le polypeptide SacU5. Avantageusement, le susdit promoteur de transcription est un promoteur inductible. A titre d'exemple de promoteur inductible, on citera le promoteur de sacB inductible par le saccharose (SHIMOTSU et HENNER, J. Bacteriol., 168 / 380-388 (1986), KLIER et al., Molec. Microbiol. (1987) précédemment cité), et le promoteur sPac (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 439-443, (1984)) inductible par l'IPTG (isopropyl 6-D-thiogalactoside). Les vecteurs selon l'invention peuvent être choisis parmi ceux capables de se répliquer dans la cellule hôte, c'est-à-dire sans pour autant modifier le chromosome de ladite cellule (tels que les plasmides multicopies capables de se multiplier en un grand nombre de copies à l'intérieur de la cellule hôte). La transformation d'une cellule hote par les vecteurs du type réplicatifs sus-mentionnés conduit à l'introduction d'une information génétique supplémentaire dans le génome de la cellule, mais pas dans son chromosome. Des vecteurs intégratifs capables de modifier le chromosome de la cellule hôte peuvent également être utilisés. De tels vecteurs permettent l'insertion d'un fragment d'ADN selon l'invention dans le chromosome de la cellule hôte, notamment par un mécanisme de simple ou de double recombinaison. D'une manière générale, l'ensemble des vecteurs faisant l'objet de la description qui suit sont soit du type réplicatif, soit du type intégratif. L'invention concerne également le polypeptide SacU5 et les fragments peptidiques actifs qui en découlent, en tant qu'ils sont capables d'activer l'expression d'un, ou de plusieurs gènes de structure de l'organisme, notamment de type Bacillacées qui les héberge. L'invention a également pour objet un polypeptide hybride construit par fusion de tout ou partie d'un fragment d'ADN selon l'invention, notamment toute ou partie de la séquence SacU5 et d'un fragment hétérologue de manière à produire dans la cellule hôte un polypeptide hybride composé de tout ou partie du polypeptide codé par le fragment d'ADN selon l'invention, notamment SacU5 et une séquence d'acides aminés hétérologue. L'invention concerne donc un procédé visant à accroitre la capacité de production de protéines, notamment d'enzymes ou de polypeptides, par un micro-organisme approprié, ce procédé comprenant la transformation des cellules dudit micro-organisme au moyen d'un des plasmides sus-indiqués, contenant un fragment d'ADN selon l'invention, la mise en culture des cellules hôtes transformées dans un milieu de culture approprié et la récupération desdites protéines, soit à partir de ces cellules (notamment par lyse des cellules dans le cas de la production de protéines endocellulaires), soit à partir du milieu de culture (dans le cas de la production d'enzymes exocellulaires) Parmi les micro-organismes transformables par le procédé sus-mentionné, ainsi que par les autres procédés selon l'invention décrits ci-après, on distinguera notammeht les bactéries Gram , telles que les genres Bacillus et Clostridium. Les protéines ainsi produites sont celles dont les gènes de structure sont naturellement sous le con trôle du gène sacU dans le chromosome des cellules bactériennes utilisées pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Par exemple, un tel procédé selon l'invention permet la surproduction, par B. subtilis, d'un grand nombre d'enzymes endo- ou exocellulaires, dont par exemple les protéases, la lévane-saccharase, l'a-amylase et des glycanases. L'invention vise également un procédé de production d'un polypeptide determiné par un micro-organisme approprié dont le génome, ou le chromosome, a été modifié de manière à ce que le génome, ou le chromosome, contienne une séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide dont la production doit etre stimulée, qui comprend la transformation des cellules dudit microorganisme au moyen d'un des plasmides sus-indiqués, contenant un fragment d'ADN selon l'invention, la mise en culture des cellules du micro-organisme ainsi transformées dans un milieu approprié, et la récupération dudit polypeptide à partir desdites cellules ou du milieu de culture. L'effet de contrôle par le locus sacU de la synthèse des enzymes chez les micro-organismes utilisés pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention susmentionnés, est probablement le résultat de l'action sur une séquence cible, comprise dans le génome desdits micro-organismes, soit du polypeptide codé par un fragment d'ADN selon l'invention, notamment du polypeptide SacU5, soit d'un autre produit exprimé sous le contrôle dudit polypeptide. Les séquences cibles sus-mentionnées sont généralement situées en amont des gènes de structure codant pour les enzymes secrétées par B. subtilis. A titre de séquence cible, on peut citer notamment : - celle comprise dans un fragment de 440 paires de bases, délimité par les sites de restriction Sau3A1- Rsal, et situé en amont du site de liaison avec ribosomes et de la séquence d'ADN codant pour la lévanesaccharase chez B. subtîlisr - celle comprise dans une région d'environ 200 paires de bases située en amont du début de la transcription du gène de la protéase alacline (HENNER et al, J.Bacteriol., 170 : 296-300 (1988)). La cellule hôte utilisée par la mise en oeuvre du procédé sus-mentionné est donc transformée, d'une part, au moyen d'un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide déterminé précédée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour permet l'expression de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, et, d'autre part, au moyen d'un des vecteurs sus-indiqués contenant un fragment d'ADN selon l'invention. Selon un autre mode de réalisation d'un tel procédé de production d'un polypeptide déterminé selon l'invention, la cellule hôte utilisée dans ledit procédé est transformée à l'aide d'un plasmide contenant à la fois, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, un fragment d'ADN selon l'invention et une séquence nucléotidique codante pour le polypeptide déterminé précédée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence codant pour la synthèse du polypeptide déterminé, plus particulièrement à l'intérieur de la cellule. D'une manière générale, toute protéine naturellement secrétée par une bactérie Gram+, notamment du genre Bacillus, est tout d'abord traduite sous forme d'un polypeptide précurseur dont la séquence en acides aminés correspond à celle d'un peptide signal suivie de celle de la protéine secrétée. Au moment de la secrétion cellulaire, seule la forme mature correspondant à la protéine elle-meme est secrétée hors de la cellule. Ainsi l'invention concerne également un procédé de production d'un polypeptide déterminé qui comprend la transformation de la cellule hôte de manière à ce que le génome, ou le chromosome, de cette dernière contienne une séquence codant pour un polypeptide déterminé précédée par une séquence signal, ainsi qu'un fragment d'ADN selon l'invention, la mise en culture desdites cellules dans un milieu approprié et la récupération du polypeptide déterminé à partir du milieu de culture dans lequel il est secrété par le micro-organisme utilisé dans ledit procédé. La cellule hôte utilisée pour la mise en oeuvre d'un tel procédé est transformée, d'une part, au moyen d'un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, la séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé, précédée d'une séquence signal, qui est elle-mme précédée par une séquence cible et par une séquence nucléotidique comprenant les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence signal et de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, et d'autre part par un des plasmides sus-indiqués contenant un fragment d'ADN selon l'invention. L'invention a également pour objet un procédé de production d'un polypeptide déterminé par un micro-organisme approprié qui comprend la transformation des cellules dudit micro-organisme au moyen d'un vecteur contenant . à la fois, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, un fragment d'ADN selon l'invention, codant pour un activateur du phénotype Sedh, et une séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé, cette dernière séquence d'ADN étant précédée par une séquence signal, qui est elle-même précédée par une séquence cible et par une séquence nucléotidique comprenant les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence signal et de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, la mise en culture des dites cellules transformées dans un milieu approprié, et la récupération dudit polypeptide à partir du milieu de culture. La séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé peut également être insérée.en aval d'une séquence signal endogène dans le chromosome de la cellule hôte utilisée à l'aide notamment d'un vecteur contenant une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide déterminé. Avantageusement les cellules hôtes utilisées pour la mise en oeuvre de l'ensemble des procédés de production de protéines sus-mentionnés, sont également transformées à l'aide d'un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une ou plusieurs séquences d'ADN codant pour un autre activateur conduisant au phénotype Sedh que celui codé par un fragment d'ADN selon l'invention, et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de ladite séquence d'ADN. Parmi les activateurs du phénotype Sedh indiqués indiqués ci-dessus, on citera notamment les polypeptides Sac,, SacQ5, SacQA, codés respectivement par les gènes sacs de B. licheniformis, B subtilis et B. amvloliauefaciens, et le polypeptide é 60 acides aminés codé par le géne DrtR de B. natto. Avantageusement, le vecteur sus-mentionné comprend une séquence d'ADN codant pour le polypeptide Sac, . Les tranformations de la cellule hôte de manière à ce que son génome, ou son chromosome, contienne une, ou plusieurs, séquence(s) d'ADN codant pour un activateur autre que celui codé par un fragment d'ADN selon l'invention, peut également être réalisée par l'intermédiaire de tout vecteur utilisé pour la mise en oeuvre de l'ensemble des procédés de l'insertion décrits ci-dessus, ledit vecteur contenant un autre fragment d'ADN codant pour un, ou plusieurs, des activateurs sus-mentionnés. A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement un vecteur, notamment plasmide, contenant, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, un fragment d'ADN selon l'invention, ainsi qu'un fragment d'ADN pour un, ou plusieurs, activateur(s) conduisant au phénotype Sedh autre(s) que celui codé pour le fragment d'ADN selon l'invention, et contenant les éléments nécesaires pour permettre l'expression de ce dernier fragment d'ADN. L'invention concerne aussi le vecteur sus-mentionné contenant également un fragment d'ADN contenant une séquence d'ADN codant pour un polypeptide déterminé précédée par une séquence d'ADN contenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour permettre l'ex- pression de la séquence codant pour ledit polypeptide. L'invention concerne plus particulièrement le vecteur tel que décrit ci-dessus et comprenant également en amont de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, une séquence signal ainsi que les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence signal et de celle codant pour ledit polypeptide. Avantageusement, le vecteur sus-mentionné comprend une séquence d'ADN codant pour le polypeptide activateur Sac,. Parmi les séquences signal utilisées, pour la construction des vecteurs de l'invention, on citera notamment celle permettant la secrétion de la protéase alcaline, de la lévane-saccharase, de la cellulase et de l'-amylase. D'une' manière générale, toute séquence pouvant jouer le rôle de séquence signal précédant la séquence d'ADN codant pour une enzyme par un micro-organisme approprié peut être utilisée. L'invention concerne également les cellules de B.subtilis, ou de tout autre micro-organisme approprié, transformées par les plasmides sus-mentionnés comprenant un fragment d'ADN selon l'invention conduisant au phénotype Sedh notamment un fragment d'ADN codant pour le polypeptide SacU5, ceux-ci étant capables de se répliquer dans ces cellules. L'invention concerne plus particulièrement les cellules bactériennes sus-mentionnées qui sont transformées par un plasmide contenant un fragment d'ADN selon l'invention et une, ou plusieurs, séquence(s) codant pour un autre activateur conduisant au phénotype Sedh que celui codé par le fragment d'ADN de l'invention. L'invention a également pour objet les cellules bactériennes transformées par un plasmide tel que décrit ci-dessus et contenant également une séquence codant pour un polypeptide déterminé, éventuellement précédée par une séquence signal, cette dernière étant avantageusement précédée par une séquence cible, tel que décrit plus haut. Ces cultures de cellules sont alors capables de produire des quantités accrues de protéines, notamment d'enzymes, et/ou du polypeptide déterminé. Bien entendu, l'homme du métier appéciera que les polypeptides recherchés, plus particulièrement le polypeptide déterminé, peuvent être purifiés de toute façon en soi connue, par exemple par électrophorèse sur gel et récupération du polypeptide recherché. On peut également encore avoir recours à toute autre technique par exemple à la chromatographie liquide sous haute pression. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit des vecteurs préférés et des conditions dans lesquelles ils peuvent être utilisés, étant entendu que cette description ne saurait être interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications. 1) Materiels et méthodes - Souches bactériennes et Plasmides Les souches de B. subtilis suivantes ont été utilisées : la souche de référence de B. subtilis 168 (trP C2) (sacs , phénotype Lvs+ Prt ) ; le mutant sacU QB254 (sacU42, sacA321, his Al, truc2) ne synthétisant pas de lévane-saccharase et de protéase (phénotype Lvs Prit ) (LEPESANT et al, Mol. Gen. Genet. 118 : 135-160 (1972)) ; le mutant sacUh QB136 (sacU32, leuA8r tri2) (KUNST et al, 1974, précédemment cité) la souche 1A510, qui est déficiente en recombinaison intermoléculaire (recE4, leuA8, arq-15 thrA5, stp) (OSTROFF ET PENE, J. Bacteriol., 156 : 934-936 (1983)) ; la souche BD 1238 (com-524 .. Tn9î7lacZ hisAl leu metB5) (HAHN et al, J. Bacteriol., 169 : 3104-3109 (1987) ; ALBANO et al, J. Bacteriol., 169 : 3110-3117, (1987)). Les vecteurs de clonage pHV1431 et pHV1436 (figure 3), permettent de maintenir de manière stable de larges fragments d'ADN chez B. subtilis. Le plasmide pHV1431 (10,8 kb ; résistant au chloramphenicol CmR) contient une origine de réplication provenant du plasmide pAMB1 (LEBLANC et LEE, J. Bacteriol., 157 445-453 (1984)) et est maintenu, à un grand nombre de copies, chez B. subtilis. Le plasmide pHV1431d est un dérivé de 8,3 kb de pHV1431 obtenu par délétion spontanée chez E. coli, éliminant un fragment d'ADN contenant les deux sites EcoRI de pHV1431. Le plasmide pHV1436 (8,7 kb, CmR) contient une origine de réplication provenant du plasmide pTB19 (IMANAKA et al, J. Bacteriol., 146 : 1091-1097 (1981)) et est maintenu à un faible nombre de copies chez B. subtilis. - Milieux et tests qualificatifs E. coli est cultivé dans un milieu L (tryptone 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, NaCl 5 g/l) et B. subtilis dans le milieu AM3 (Penassay, DIFCO) ou dans le milieu MMCH qui est composé de K 2HP04 60 mM, KH2P04 44 mM, (NH4)2S04 15 mM, citrate de Na3 3 mM, Mg S04 2 mM, NnCl2 0,01 mM, citrate d'ammonium ferrique 22 mg/l, hydrolysat de caséine 0,05 %, et de facteurs d'auxotrophie (100 mg/l). Les boites de Petri L ou Sp ont été préparées par addition de 17 g/l de Bacto-agar (DIFCO) au bouillon L ou au milieu S* (AMORY et al, J. Bacteriol., 169 324-333 (1987), LE ESANT et al (1972) précédemment cité). Les milieux sélectifs contiennent des antibiotiques aux concentrations suivantes ampicilline (Ap) 25 pg/ml : chloramphenicol (Cm) 5 pg/ml : erythromycine (Em) 1 pg/ml et 25 pg/ml de lincomycine. Les recombinants capables de produire de la lévane-saccharase (phénotype Lvs+) ont été identifiés sur des boites ST qui contiennent 20 g de saccharose stérilisé par filtration (BDH), 1 g de tryptone (DIFCO), 17 g/l d'agar purifié (DIFCO), 13 mM de KCl et 1 mM de MgS04. Les milieux STCm et STEm contiennent, respectivement, 5 pg/ml de chloramphenicol et 1 pg/ml d'erythromycine additionné de 25 pg/l de lincomycîne. L'aspect muqueux des lévanes entourant les clones Lvs sur les boites ST permet de distinguer ces clones Lvs des clones .Lvs - Détermination de l'activité lévane-saccharase Des dilutions appropriées de surnageants de cultures sur milieu MMCH sont incubés à 37"C en présence de 10 E de saccharose, et 50 mM de tampon phosphate de potassium (pH 6.0) dans un volume final de 1 ml. Les réactions sont arrêtées par ébullition.La quantité de glucose est mesuré à l'aide du réactif GOD-Perid (BOEHRINGER). Une unité correspond à 1 pmole de glucose produit par minute. La quantité totale de protéine est estimée à partir de la densité optique de la culture. - Transformation des cellules comPétentes Ces transformations sont réalisées à l'aide des méthodes décrites pour la transformation d'E. coli (COHEN et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69 2110-2114 (1972)), ou de B. subtilis (ANAGNOSTOPOULOS et SPIZIZEN, J. Bacteriol., 81 : 741-746 (1961) ; NIAUDET et EHRLICH, Plasmid, 2 : 48-58 (1979)). L'ADN donneur est incubé avec des cellules compétentes de B. subtilis pendant 20 minutes à 37'C. De l'extrait de levure et des facteurs d'auxotrophie sont alors additionnés à des concentrations finales de 10 mg/ml et 50 pg/ml, respectivement. Après incubation avec agitation à 37-C en présence d'antibiotiques (0,5 pg/ml de chloramphenicol pendant 45 minutes, et 0,5 pg/ml de chloramphenicol plus 0,15 pg/l d'érythromycine pendant 90 minutes), les cellules sont étalées sur des boites SP additionnées soit de chloramphenicol seul, soit de chloramphenicol, d'éry;hromy- cine et de lincomycine. - ManiDulations d'ADN et procédures de clonage. L'ADN plasmidique est extrait d'E. coli ou de B. subtilis par la méthode de la lyse alcaline (MANIATIS et al, Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York, (1982) ; AMORY et al (1987) précédemment cité), suivie d'une centrifugation en gradient de chlorure de césium dans le cas d'extrac- tions préparatives à partir de grands volumes de cultures. Les fragments d'ADN sont obtenus à partir de gels d'agarose, notamment par électro-élution. Les enzymes de restriction et l'ADN-ligase de T4 ont été utilisées suivant les recommandations de leur fabricant respectif. Les banques de gènes des plasmides recombinants contenant des fragments d'ADN de la souche de B. subtilis BD 1238, ont été construits par ligature in vitro en utilisant des concentrations élevées d'ADN (100 pg/ml), afin de promouvoir la formation de multimères d'ADN qui transforment efficacement les cellules de B. subtilis. Les plasmides sous forme de monomères ont une faible, voire aucune, activité de transformation (CANOSI et al, Mol. Gen. Genet., 166 : 259-267 (1978)). Deux pg d'ADN de pHV1436 ou pHV1431d linéarisés avec BamHI et 2 pg d'ADN issu de BD1238 digéré par BamHI sont ligaturés en présence d'ADN-ligase de T4 dans des volumes réactionnels de 20 til. Puisque les fragments d'ADN insérés dans les vecteurs plasmidiques et le chromosome de la souche réceptrice de B. subtilis sont homologues r des recombinaisons entre les deux peuvent avoir lieu dans des souches Rec . Pour cette raison, une souche 1A510 a été utilisez.En effet, la mutation recE de cette souche conduit à une déficience en recombinaison intermoléculaire (Rec ) mais n'affecte pas les mécanismes de recombinaison nécessaires à la transformation des plasmides multimères (entrant dans la cellule) en plasmides monomères (MICHEL et al, Embo. J., 1 : 1565-1571 (1982) ; TANAKA, J. Bacteriol., 139 : 775-782 (1979). Le plasmide pBU2 est obtenu en utilisant directement le mélange de ligature pour transformer la souche 1AS10. pBU3 dérive de pBU2 par transfert de l'insertion -BamHI (13,4 kb) de ce dernier au vecteur pHV1431d. Dans un volume réactionnel de 20 ijl, l'ADN de pHV1431d linéarisé au préalable par BamHI et l'ADN de pBU2 digéré au préalable par BamHI ont été ligaturés. Le plasmide pBU14 dérive de pBU3 par ligature de 2 wg d'ADN de pBU3 digéré par SalI dans un volume réactionnel de 20 pl. De même, le plasmide wpBU16 est construit à partir de pBU14 par ligature de l'ADN de pBU14 digéré par SPhI. Ces plasmides sont tous introduits dans deux souches de B. subtilis : la souche QB254 afin de tester leur capacité de restauration de la synthèse de lévane-saccharase dans cette souche sacU , et sacU- la souche 1A510, pour le maintien des plasmides et leur extraction préparative. 2) Isolement du locus sacU dans le plasmide Le clonage du locus sacU dans les vecteurs plasmidiques est réalisé à l'aide de la mutation com-524 (HAHN et al, (1987) ; ALBANO et al, (1987), précédemment cités). Cette mutation apparaît par insertion du transposon Tn9171acZ (PERKINS et al, (1986) ; SHAW et al, (1985), précédemment cités) dans une région proche du gène sacU. Afin de mesurer la liaison génétique existant entre com-524 et sacU, l'ADN de la souche BD1238 a été extrait et utilisé à une concentration finale non saturée pour transformer la souche sacU QB254. 50 % des transformants résistants à l'érythromycine, possédent la capacité de produire la lévane-saccharase (Lvs+) sur boites de Pétri STEm et ont donc hérités l'allèle sacU+, ce qui indique que le locus sacU et le marqueur de résistance à l'érythromycine com-524 sont très proches. La détermination de cette liaison génétique et le fait que la carte de restriction de Tn9î7lacZ est connue, ont été très utiles pour le clonage du locus sacU. Un site. BamHI est localisé à proximité de l'extrémité gauche de Tng17iacZ et deux sites Balîl sont localisés à la droite du marqueur érythromycine (figure 1). La procédure de clonage a donc été réalisée en insérant des fragments BamHI de l'ADN chromosomique de BD1238 dans le plasmide pHV1436. Un plasmide recombinant qui confère la résistance à l'érythromycine aux cellules hôtes (EmR) a été sélectionné en utilisant comme souche réceptrice 1A1510. Ainsi, le plasmide recombinant CmR EmR obtenu a été appelé pBU2. Le plasmide pBU2 contient un fragment BamH1 de l'ADN de BD1238 inséré au niveau du site BamH1 de pHV1436. Ce fragment comprend le transposon Tn9î7lacZ dans sa presque totalité et des séquences d'ADN situées à la droite de Tn9î7lacZ. Afin de déterminer si pBU2 contient l'allèle sacU à proximité du Tn9171acZ, ce plasmide a été utilisé pour transformer le mutant sacU QB254. Les cellules résistantes au chloramphenicol ont été sélectionnées. Il a ainsi été déterminé que le plasmide pBU2 contient au moins une partie de l'allèle sacU+, puisque ce plasmide est capable de conférer le phénotype Lvs+ à la souche QB254. Toutefois, le plasmide pBU2 est difficile à manipuler pour deux raisons. Premièrement, le rendement de ce plasmide est très faible. Après centrifugation en gradient de densité de chlorure de césium, environ 3 pg d'ADN plasmidique est obtenu par litre de culture. Deuxièmement, il n'est pas possible de transférer cé plasmide en entier chez E. coli. Par conséquent, le fragment BamHI contenant Tn9î7lacZ et le locus sacU est transféré dans un vecteur qui peut être maintenu à un nombre de copies élevé chez B.subtilis. Le vecteur sus-mentionné correspond au plasmide pHV1431 décrit dans ia figure 3. Toutefois, le plasmide pHV1431 est instable chez E. coli, et a par conséquent été remplacé par le plasmide pHV1431d. Ce dernier, est obtenu par élimination d'un fragment chevauchant les deux sites EcoRI de pHV1431, et se maintient de façon stable chez E. coli et chez B. subtilis. L'ADN de pHV1431d est linéarisé au niveau de son site unique BamHI et ligaturé au fragment BamHI contenant le locus sacU de pBU2 pour produire pBU3. Le rendement du plasmide pBU3 est bien meilleur que celui de pBU2 (50 à 100 pg/l de culture). Le locus sacU de pBU3 a été localisé en sousclonant un fragment SalI de 3,9 kb de pBU3. L'ADN de pBU3 est digéré avec SalI, les fragments religaturés, et utilisé pour transformer la souche QB254. 8 clones CmR Lvs ont été choisis et leurs plasmides ont été extraits. Un de ces plasmides recombinants, pBU14, qui contient un fragment SalI -unique de 3,9 kb en plus du fragment SalI de 8 kb du vecteur a été plus particulièrement étudié. Ce fragment SalI de 3r9 kb comprend un fragment SalI-BamHI de 0,28 kb de pBR322et un fragment SalI-BamHI de 3,6 kb (figure 2). Après une seconde étape de sous-clonage, le plasmide pBU16 a été isolé et il contient un fragment SalI-SDhI de 2,6 kb de l'ADN de B. subtilis. Ce plasmide restaure également l'activité de synthèse de la lévane-saccharase chez le mutant sacU QB2S4. De plus l'introduction soit de pBU14, soit de pBU16 dans une souche Rec 1A510 conduit à l'hyperproduction de lévane-saccharase (tableau I). Ces données montrent que le gène sacU, ou au moins une partie fonctionnelle de ce gène, est localisé à l'intérieur du fragment SalI-SphI de 2,6 kb. Il va naturellement de soi que toute séquence nucléotidique modifiée, mais qui se distingue de celle qui code pour SacU5 et, qui a été envisagée dans ce qui précède, uniquement par la substitution de nucléotides qui n'entraînent pas la modification de la structure polypeptidique correspondante, ou qui entraîne la modification sacU h doit être considérée comme faisant partie de l'invention et comme étant protégée par les revendications qui s'y réfèrent plus particulièrement. TABLEAU I Secrétion de lévane-saccharase par la souche 1A5 10 contenant les plasmides recombinants indiqués ci-dessus. : Plasmide Activité spécifique de lévane-saccha-: rase (U/mg x 103) + : : saccharose : saccharose : saccharose saccharose : pHV1431d La souche de B. subtilis 1A510 contenant les plasmides sus-indiqués est cultivée sur milieu MMCH additionné de chloramphenicol et soit de 1 % de glycerol (en poids/volume) ("saccharose+"), soit de 2 % de saccharose (en poids/volume). Les surnageants des cultures de cellules en - phase exponentielle de croissance ont été dialysés pendant une nuit contre TPK (tampon phosphate de potassium) 0,05 M; pH 6,0, et les activité enzymatiques de la lévane-saccharase ont été mesurées. Les activités spécifiques ont été quantifiées par unité de lévane-saccharase par mg de protéine totale. 3) Techniques d'hybridation sur filtre de nitrocellulose - purifier à partir du plasmide pBU16 le fragment SalI-SDhI (2,55 kb), - - marquer ce fragment radioactivement par translation de césure (nick-translation), - transférer l'ADN à tester sur un filtre de nitrocellulose, -déposer ce filtre sur du papier whatman n' 3 (marque déposée) imbibé de NaOH 0.5 N, NaCl 0.9 M et laisser 20 Minutes à température ambiante, - sécher brièvement sur papier, - répéter l'opétation sur papier imbibé de M Tris-HcL, pH 7, 10 minutes, - sécher brièvement, - répéter l'opération sur papier imbibé de 2 x SSC (1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0,015 M Na3citrate, pH 7), - sécher sur papier, puis à l'étuve à 80"C pendant 2 heures, Système homologue : poursuivre selon A (conditions stringentes), Système hétérologue : poursuivre selon B (conditions non stringantes). A) conditions strinaentes - Hybrider le filtre avec 20 à 40 ml de tampon d'hybridation (50 % formamider 5 x SSC, 1 x Denhardt ). Préhybrider pendant 2 heure à 42 C. - Changer le tampon d'hybridation et ajouter environ 4 x 106 c.p.m. de la sonde dénaturée (5 minutes à 100-C). - Incuber de 16 à 24 heures à 42-"C. - laver successivement avec 1 x 50 ml 5 x SSC, 50 % formamide 20 minutes à 42iC, 2 x 50 ml 2 x SSC, 0,1 % SDS 2 x 20 minutes à 42-C, 1 x 50 ml 0,2 x SSC, 0,1 % SDS 20 minutes à 42"C. B) Conditions non stringentes - Hybrider le filtre avec 20 à 40 ml de tampon d'hybridation (5 x SSC, 1 x Denhardt , à,1 % SDS, 0,1 % SDS), pré-hybrider pendant 1 heure à 42 C. - Changer le tampon d'hybridation et ajouter environ 4 X106 c.p.m. de la sonde dénaturée (5 minutes à 100-C). - Incuber de 16 à 24 heures à 42"C. - Laver successivement avec 1 x 50 ml 5 x SSC, 0,1 s SDS 20 minutes à 42je, 2 x 50 ml 2 x SSC, 0,1 % SDS 2 x 20 minutes à 42-C. solution de Denhardt 1 1 % Ficoll, 1 polyvinylpyrrolidOne, 1 % BSA. (WHAL et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA : 76, 3683-3687 (1979) ; MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, NEW YORK (1982). Les légendes correspondant aux figures illustrant les expériences et observations qui précèdent sont les suivantes - Figure 1 Carte de restriction du plasmide pBU3. La partie supérieure de la figure représente le fragment BamHI de i'ADN de B. subtilis BD1238. Les localisations du gène lacZ du marqueur de résistance à l'érhythromycine (erm), et de Tn 917 sont respectivement représentées par une bande hachurée, une bande noire et une autre bande hachurée. Le fragment SalI-SPhI qui contient le locus sacU est indiqué par une, bande blanche. La partie inférieure de la figure représente le vecteur plasmidique avec son origine de réplication chez B. subtilis (bande noire), le marqueur de résistance au chloramphénicol (Cm), et les séquences de pBR322 (bande blanche). - Figure 2 Carte de restriction du plasmide pBU14. La partie supérieure de la figure représente le fragment SalI qui comprend le fragment d'ADN SalI-BamHI de 3,6 kb de B. subtilis (en pointillé) et un fragment BamHI-SalHI de 0,28 kb de pBR322 (simple trait noir). Le plasmide pBU16, dérivé de pBU14 ne contient qu'un fragment de B.subtilis de 2,55 kb compris entre les sites SalI-SphI et indiqué par une bande blanche. La partie inférieure de la figure représente le vecteur plasmidique (symbôles identiques à ceux de la figure 1). figure 3 Représentation schématique du plasmide pHV1436 (8,7 kb), se répliquant à un faible nombre de copies, et du plasmide pHV1431 (10,8 kb) se répliquant à un nombre élevé de copies. Les origines de réplication fonctionnelle chez B. subtilis, sont indiquées par une bande pointillée (pHV1436) ou par une bande noire (pHV7431) ; le marqueur de résistance au chloramphenicol est représenté par une bande hachurée, et les séquences de pBR322 sont indiqués par une bande blanche. - Figure 4 Carte de restriction simplifiée d'un fragment d'ADN de 2550 paires de bases comprenant le locus sacU de B. subtilis. - Figure 5 Séquence nucléotidique et carte de restriction détaillées du fragment d'ADN comprenant le locus sacU de B: subtilis. - Figure 6 Représentation de la phase de lecture ouverte située entre les nucléotides correspondant aux positions 1452 et 2139 et codant pour le polypeptide SacU5 (ou protéine SacU). - Figure 7 Repésentation de la séquence de 229 acides aminés du polypeptide SacU5. - Figure 8 Comparaison de la protéine SacU (ou polypeptide SacU5) et des protéines DyE, OmpR, SpoOF, SpoOA. Les homologies de structure partielle de ces différentes protéines sont indiquées par des encadrements verticaux. Cette comparaison a été réalisée à partir de 120 acides aminés de la partie NH2 terminale de la protéine SacU. Les homologies sont nombreuses au niveau des parties NH2 terminales de ces protéines, et très faibles dans leurs parties COOH terminales. les souches de B. subtilis de génotypes sacU et sacUh utilisées pour le clonage des fragments d'ADN selon l'invention, ont été déposés à la COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICRO-ORGANISMES (C.N.C.M.) à l'INSTITUT PASTEUR de PARIS respectivement sous les numéros 1-741 et I-744. REVENDICATIONS 1. Fragment d'acide nucléique contenant une séquence fonctionnelle de nucléotides contenue dans un fragment SalI-SPhI de 2,55kb, issu du chromosome d'une souche naturelle de B. subtilis, ou d'une souche de B.subtilis présentant une mutation, notamment la mutation sacU h ladite séquence étant caractérisée en ce qu'elle est capable, lorsqu'elle est introduite dans un B. subtilis - ou dans un autre micro-organisme, capable d'exploiter à son profit l'information portée à ce fragment - d'y induire une surproduction de protéines ou de lui conférer un phénotype Sedh. 2. Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence fonctionnelle est contenue dans un fragment de 2,55 kb issu d'une souche de 8. h subtilis portant une mutation sacU , et en ce que la- dite séquence porte le locus sacUh codant pour le génotype sacUh. 3. Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence fonctionnelle est contenue dans un fragment de 2,55 kb issu du chromosome d'une souche naturelle de B. subtilis, et en ce que ladite séquence porte le locus sacU codant pour le génotype sacU+. 4. Fragment selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient la séquence de nucléotides délimitée par les nucléotides situés aux positions 1 et 2310 respectivement de la figure 5. 5. Fragment selon la revendication 3 ou la revendication 4, codant pour le polypeptide SacU s 6. Fragment de nucléotides selon la revendication 5, caractérisé par des substitutions de certains de ses nucléotides par d'autres, sans que soit pour autant modifiée l'activité du polypeptide SacU5 qui lui correspond. 7. Fragment selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il.comporte une séquence codant pour le polypeptide SacU5 associé avec un promoteur sous le con trôle duquel la transcription de la séquence codant pour SacU5 est susceptible d'être effectuée et, le cas échéant, une séquence codant pour des signaux de terminaison de la transcription. 8. Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce que le promoteur et, le cas échéant, la séquence codant pour les signaux de terminaison de la transcription sont hétérologues vis-à-vis de la séquence codant pour SacU5. 9. Fragment d'acide nucléique caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider avec le fragment SalI SPAHI de 2,55 kb caractérisé par la séquence de nucléotides de la figure 5, et ce lorsque les opérations d'hybridation comporte les étapes suivantes - pré-traitement (pré-hybridation) du filtre de nitrocellulose supportant le fragment d'ADN à tester avec le tampon d'hybridation (5 x SSC, 1 x Denhardt, 0,1 SDS), cette opération étant effectuée à 42C pendant 1 heure - remplacement du tampon d'hybridation au contact du support par du tampon d'hybridation de même composition, et addition de la séquence de 2,55 kb en tant que sonde, notamment marquée radioactivement, et préalablement dénaturée par un traitement à 100-C pendant 5 minutes - incubation de la séquence homologue à tester fixée sur le support dans ce tampon d'incubation avec le fragment de 2,55 kb à 42*C pendant une durée de 16 à 24 heures, - l'élimination du tampon contenant la sonde non fixée, par lavages successifs 1 x 50 ml de 5 x SSC, 0,1 SDS à 42-C pendant 20 minutes et 2 x 50 ml de 2 x SSC, 0,1 % SDS pendant 2 x 20 minutes à 42-C,dans des conditions non stringentes, ou - lavages successifs avec les solutions suivantes 1 x 50 ml, 5 x SSC, 50 % formamide, 20 minutes à 42-C 2 x 50 ml, 2 x SSC, 0,1 % SDS, 2 x 20 minutes à 42'C 1 x 50 ml, 0,2 x SSC, 0,1 % SDS, 20 minutes à 42in, dans des conditions stringentes. 10. Fragment selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il porte le locus sacUh codant pour le génotype sacUh. 11. Vecteur recombinant, notamment plasmide recombinant, du type réplicatif ou intégratif, capable'de transformer une souche d'un micro-organisme approprié, notamment de B. subtilis, ledit vecteur contenant un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases de ladite souche de micro-organisme. 12. Procédé visant à accroitré la capacité de production d'enzymes, de protéines ou de polypeptides, par un micro-organisme approprié, ce procédé comprenant la transformation des cellules dudit micro-organisme au moyen d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un vecteur, notamment plasmide selon la revendication 11, la mise en culture des cellules hôtes transformées dans' un milieu de culture approprié et la récupération desdites protéines à partir de ces cellules ou du milieu de culture. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le micro-organisme approprié est une souche de Bacillus, notamment de B: subtilis, et en ce que les protéines dont la production est stimulée sont celles codées par les gènes de structure naturels de ladite souche de Bacillus activable par le gène sacU. 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le génome, ou le chromosome, des cellules de la souche de micro-organisme utilisée, a été modifié de manière à contenir une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide déterminé dont la production doit être stimulée. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence codant pour le polypeptide déterminé dont l'expression doit etre stimulée est précédée d'une séquence cible pour le polypeptide codé par un fragment d'ADN selon les revendications 1 à 10. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la séquence cible contient celle qui est normalement comprise dans un fragment de 440 paires de bases, délimité par les sites de restriction Sau3A1- Rsal, et situé en amont du site de liaison avec les ribosomes et de la séquence d'ADN codant pour la lévanesaccharase chez B. subtilis. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que le polypeptide dont la production doit être stimulée est une protéine secrétée normalement synthétisée d'abord sous la forme d'un précurseur de cette protéine, et en ce que la séquence nucléotidique qui code pour cette protéine secrétée est précédée d'une séquence signal codant pour un peptide signal, dont le rôle est de permettre la secrétion dudit polypeptide 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite séquence signal est elle-meme précédée par une fragment de nucléotide comprenant une séquence cible. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 18, caractérisé en ce que le génome, ou le chromosome des cellules du micro-organisme utilisé, a été modifié de manière à contenir une séquence nucléotidique codant pour un autre activateur, conduisant au phénotype Sedh, que celui codé par un fragment d'ADN selon les revendications 1 à 10. 20. Procédé selon la revendication 19,caractérisé en ce que l'activateur autre que celui codé par un fragment d'ADN des revendications 1 à 10, est le polypeptide Sacs,. 21. Souche de micro-organisme, notamment de B. subtilis, caractérisée par le fait qu'elle est transformée par un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou par le vecteur selon la revendication 11. 22. Souche bactérienne selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle est transformée par le fragment d'ADN comprenant une séquence d'ADN codant pour un polypeptide déterminé précédée par une séquence nucléotidique contenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence codant pour la synthèse endocellulaire du polypeptide déteminé. 23. Souche bactérienne selon la revendication 22, caractérisée en ce que la séquence codant pour le polypeptide déterminé est précédée par une séquence signal qui est elle-même précédée par une séquence nucléotidique contenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence codant pour la synthèse exocellulaire du polypeptide déterminé.