Brevet FR2625751A1 — publié le 19890713

La présente invention concerne un milieu biolo gique spécialement adapté au domaine des analyses des mycoplasmes en pathologie humaine, et en particulier un milieu présentant une stabilité au stockage permettant le transport des prélèvements à analyser et pouvant servir aussi bien au dépistage qu'à la numération, à l'identification et à l'antibiogramme desdits mycoplasmes. On sait qu'à l'heure actuelle, l'analyse des prélèvements par exemple uro-génitauxquant au dépistage, à la numération, à l'identification et à l'antibiogramme des mycoplasmes, nécessite un certain nombre de milieux et la succession de'plusieurs manipulations faisant intervenir des milieux différents. La présente invention se propose de fournir un milieu unique permettant de procéder à ces analyses de façon simple et ne nécessitant qu'un nombre restreint de manipulations. On entend, dans la présente demande, par milieu unique, aussi bien le milieu réactif proprement dit sous forme lyophilisée qui est régénéré ou qui est à régénérer au moyen d'un milieu de dilution, que ce même milieu réactif stabilisé en présence de son diluant. Ainsi, le milieu unique selon l'invention se compose d'une première phase dite réactive, comprenant des éléments connus nécessaires à la culture des mycoplasmes du type cholestérol, extraits de levure, sérum de poulain des éléments de visualisation du métabolisme des mycoplasmes du type urée, arginine ou glucose un indicateur de virage (Rouge de Phénol) et, au moins un antibiotique et d'une seconde phase, comprenant un milieu de dilution servant aussi de véhicule de l'échantillon à analyser, ce milieu étant essentiellement constitué d'un bouillon connu spécifique des mycoplasmes additionné de 1 g/1000 d'agar-agar et pouvant également contenir un antibiotique. Suivant d'autres caractéristiques : . Le ou les antibiotiques présents dans la première phase se retrouve (ouste retrouvent) également dans la seconde phase de dilution Le ou lesdits antibiotiques sont choisis parmi les antibiotiques du type ampicilline, triméthoprime et nystatine et de préférence parmi les antibiotiques agissant sur la synthèse de l'acide folique, totalement inactif sur les mycoplasmes Le milieu de dilution est exempt de tout élément instable, le rendant ainsi apte à être utilisé comme milieu de transport et de conservation d'un prélèvement donné à analyser à +40C. La description qui va suivre fera mieux comprendre la portée et l'intérêt de l'invention, cette description faisant état du ou des modes opératoires suivis ou à suivre avec les phases du milieu selon l'invention. L'échantillon à analyser prélevé sur un patient (prélèvement uro-génital pris ici comme exemple) est introduit dans une quantité aliquote du milieu dit de dilution et conservé dans un flacon. Si la phase active se présente sous forme lyophilisée, le milieu dit réactif est flrégénéréfl par addition du milieu de dilution. Bien entendu, si le milieu réactif est lui-même déjà dilué et stabilisé, il est utilisé tel quel. Une partie aliquote du milieu contenant l'échàn- tillon du prélèvement est versée dans une partie aliquote du milieu réactif. Le dépistage, c'est-à-dire la visualisation de la présence de la bactérie recherchée, est mis en évidence par le virage de l'indicateur (du jaune au rouge), le milieu restant par ailleurs limpide du fait que les mycoplasmes uro-génitaux, à la différence des autres bactéries, ne troublent pas ledit milieu. Pour ce qui est de la numération des mycoplasmes dont la présence a été ainsi mise en évidence, elle pourra se faire par tout procédé comme, par exemple par dilutions en cascade mais elle se fera de préférence par la cinétique enzymatique utilisée pour ce type de numération et décrite dans la demande de brevet nO 87.13703. Cette technique sera mise à profit dans le milieu actif (régénéré) selon l'invention pour établir un diagnostic différentiel entre les souches présentes à des taux suprapathologiques ( > , 103 U.C.C./ml : virage en 24 h) et celles présentes à des taux infra-pathologiques (Q 102 U.C.C./ml virage en 48 h ou plus). Dans les cas où la numération ne présente guère d'intérêt (recherche de mycoplasmes à des taux très faibles comme, par exemple dans les cas de surveillance de fécondation in vitro, d'examen de sperme, dans le cas d'hémoculture, ou dans les prélèvements per-opératoires de salpingites), l'observation du virage du milieu se fera au-delà des 24 premières heures. Dans tous les autres cas de figures, la technique utilisée pour la numération,et en particulier la technique de cinétique enzymatique, orientera le praticien sur le nombre de mycoplasmes présents dans le prélèvement. Quant à l'identification et à l'antibiogramme, ils se feront sur une même galerie regroupant des caractères d'identification et des antibiotiques à tester grâce à une seconde fraction aliquote d'un autre milieu réactif identique au premier auquel on ajoute le milieu précédemment utilisé aussitôt le virage de l'indicateur constaté, milieu toujours limpide (24 h pour les prélèvements uro-génitaux classiques, urètre, vagin, endocol et au-delà de 24 h pour les autres cas cités ci-dessus). On observera et notera alors le profil de cette galerie comme cela est bien connu dans la technique, ce qui permettra de diffdrencier Uréaplasma de Mycoplasma (Hominis ou fermentans)et d'apprécier la sensibilité de la souche isolée aux antibiotiques présents dans ladite galerie (résultats de 24 à 48 heures). On voit ainsi qu'avec un milieu unique, complété par une galerie d'antibiogramme spécifique, il est possible de réaliser, de 48 à 72 h, le transport d'un prélèvement, le dépistage, l'appréciation quantitative, l'identification et la la sensibilité aux antibiotiques de plus de 98 % des souches de mycoplasmes uro-génitaux responsables d'infections (Mycoplasma fermentans représente moins de 2 % de la pathologie ; il est toutefois dépisté, mais assimilé à Hominis par son caractère arginine +). L'intérêt du milieu selon l'invention réside donc dans 1. La simplicité de la technique. 2. L'absence de faux positif (les contaminants expriment rarement leurs caractères enzymatiques en 24 h; au-delà, le milieu semi-gélosé permettra de caractériser par le trouble la présence d'éventuels contaminants résistant à l'association ampicilline, triméthoprime et nystatine). Si toutefois certaines souches sensibles au mélange antibiotiques présent dans le milieu de l'invention (liquide restant clair) expriment leur caractère enzymatique urée ou arginine + (bouillon rouge limpide), il sera impossible de rendre un résultat faussement positif, étant donné le profil aberrant que présentera la galerie antibiogramme et l'éventuel virage de la cupule "contaminants" présente sur cette galerie. 3. La possibilité d'avoir un milieu de transport stable (séparation des facteurs labiles présents dans le lyophilisat). 4. La possibilité d'introduire systématiquement dans le diagnostic des mycoplasmes une étude de sensibilité aux antibiotiques qui est d'autant plus justifiée que 15 % de souches sont résistants aux tetracyclines et que plus de 30 % d'uréaplasma uréalyticum et 97 % de mycoplasma hominis sont résistants à l'érythrpmycine (Congrès I.C.A.A.C. New York 1987). 5. La possibilité de diagnostiquer de façon précise les 10 % de souches poussant préférentiellement en milieu liquide, qu'il était impossible jusqu'à présent de différencier d'éventuels contaminants (urée ou arginine + et sensibles aux antibiotiques présents dans le milieu milieux limpides ayant viré au rouge, exemple campylobacter, certains anaérobies ou microaérophiles de la flore vaginale). Ces 10 % de souches ne poussant pas sur les géloses d'isolement solides, le diagnostic était toujours délicat. 6. La possibilité d'éliminer totalement les conditions d'anaérobiose en jarres ou en sachets, relativement coûteux et parfois délicats à mettre en oeuvre pour des laboratoires non spécialisés. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification utile pourra y être apportée au niveau des équivalences sans sortir de son cadre. C'est ainsi en particulier que le milieu unique selon l'invention peut aussi être utilisé pour le diagnostic des mycoplasmes pneumoniers (dont les pneumopathies atypiques) moyennant l'utilisation du glucose à la place de l'urée et de l'arginine et d'un indicateur approprié (Bleu de Thymol). REVENDICATIONS 1. Milieu biologique unique spécialement adapté au domaine des analyses. des mycoplasmes en pathologie humaine, caractérisé en ce qu'il se compose d'une première phase dite réactive comprenant des éléments connus nécessaires à la culture des mycoplasmes du type cholestérol, extraits de levure, sérum de poulain des éléments de visualisation du métabolisme des mycoplasmes du type urée, arginine ou glucose un indicateur de virage (Rouge de Phénol) et, au moins un antibiotique, et d'une seconde phase, comprenant un milieu de dilution servant aussi de véhicule de l'échantillon à analyser, ce milieu étant essentiellement constitué d'un bouillon connu spécifique des mycoplasmes additionné de 1 g/1000 d'agar-agar et pouvant également contenir un antibiotique. 2. Milieu biologique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ou les antibiotiques présents dans la première phase se retrouve (ou se retrouvent) également dans la seconde phase de dilution. 3. Milieu biologique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le ou lesdits antibiotiques sont choisis parmi les antibiotiques du type ampicilline, triméthoprime et nystatine et de préférence parmi les antibiotiques agissant sur la synthèse de l'acide folique, totalement inactif sur les mycoplasmes. 4. Milieu biologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le milieu de dilution est exempt de tout élément instable, le rendant ainsi apte à être utilisé comme milieu de transport et de conservation d'un prélèvement donné à analyser à +40C.