Brevet FR2625566A1 — publié le 19890707

Des substrats enzymatiques chromogènes ou des mélanges de substrats chromogènes sont largement utilisés et très importants dans les domaines de la biologie et de la médecine. Des enzymes du corps sont détectées et mesu- rées en chimie clinique en tant qu'élément du diagnostic de maladies métaboliques et autres. Des enzymes sont utilisées comme marqueurs dans des essais biologiques et des trousses ou kit de dosage, qui reposent sur des paires de récepteur et d'analyte (par exemple voir les brevets U.S 4 193 983 et 4 391 904). Dans de tels cas, le système de substrats chro- mogènes génère le signal de l'essai. Dans certains cas, le système biologique ou la conception du dosage ou de l'essai garantit la génération d'un produit coloré insoluble comme signal. Les exemples 1 les plus fréquemment utilisés de tels cas seront l'hlstochimie, des essais en points, des "western blots", et des trousses d'essai basées sur des dispositifs d'immunoconcentration (Brevet U.S. 4 632 901). L'une des enzymes les plus souvent mises en oeuvre dans le domaine des essais biologiques est la phos- phatase alcaline (A. VOLLER et D. BIDWELL "Enzyme - Linked Immunosorbent Assay, dans: N.R. ROSE, H. FRIEDMAN et J.L. FAHEY (eds) "Manual of Clinical Laboratory Immunology" 3ème édition, American Society of Microbiology, Washington D.C., 1986, p 99-109). Cette enzyme a un grand nombre de sub- strats, qui produisent un produit coloré insoluble. Cer- tains de ces substrats et la méthode pour les utiliser sont présentés dans le livre "Enzyme Histochemistry" - A Labo- ratory Manual " par Z. LOJDA, R. GOSSRAU et T.H. SCHIEBLER, c. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New-York, 1979. La mé- thode au colorant tétrazolium est particulièrement intéres- sante; elle implique deux étapes de réaction qui apparais- sent toutes les deux dans la même solution: 1 - Réaction primaire (spécifique de l'enzyme) Phosphate d'indoxyle Enzyme b Indoxyle + phosphate disodique 2 - Réaction secondaire (réduction du tétrazolium) Chlorure de tétrazolium + Indoxyle_-)colorant formazan + blanc indigo + HCl Le colorant formazan préclplte au site de la réaction. Cette méthode est rapide, sensible et le colorant formé est stable. Pour préparer le mélange réactionnel, on dis- sout le phosphate d'indoxyle et le sel de tétrazolium dans un solvant approprié, comme du diméthylformamide, et on les incorpore ensuite dans un tampon Tris ou veronal ayant un pH de 9 à 10. Le mélange ainsi formé n'est pas stable et s'altère en quelques minutes par précipitation spontanée du colorant formazan. L'invention est relative à un mélange stable, prêt à l'emploi de phosphate d'indoxyle et de sel de tétra- zolium, à son procédé de préparation et à son utilisation dans des trousses diagnostiques et autres trousses biolo- giques. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un mélange stable de phosphate d'indoxyle ou de sel de tétrazolium, caractérisé par les étapes suivantes: a) Un phosphate d'indoxyle, de préférence du phosphate de bromochloroindoxyle (BCIP) est dissous dans du diméthyl- formamide à des concentrations de 10 à 75 mg/ml, de préfé- rence de 50 mg/ml. b) La suspension est versée dans du Tris HCl 0,1 M pH 9,0- ,5, de préférence pH 9,5 contenant 5mM de chlorure de ma- gnésium et agitée vigoureusement pendant 10 minutes. c) Un sel de tétrazolium, de préférence le chlorure de "nitrobleu tétrazolium", est dissous dans du diméthylforma- mide à 70 % à des concentrations de 10 à 100 mg/ml, de pré- férence de 75 mg/ml. d) Cette suspension est ajoutée sous vigoureuse agitation à la solution de BCIP. L'agitation est poursuivie pendant de préférence 10 minutes. e) La solution achevée est stockée à l'obscurité, avec une réfrigération mécanique normale (4 à 15'C), de préférence à 4-8:C. Dans de telles conditions, la durée de vie dé- r passe une année. La solution peut être stockée pendant quelques mois à la température ambiante (20-30'C). Le sto- ckage à l'obscurité est obligatoire pour la stabilité du produit. La solution de substrat se dégrade très souvent à la suite de contaminations par des bactéries ou une acti- vité enzymatique résiduelle dans les récipients dans les- quels le mélange est préparé et stocké. La durée de vie est accrue lorsque des récipients stérilisés à la chaleur ou à la vapeur et des pipettes stériles à jeter sont utilisés. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une solution stable d'indoxyle tétrazolium dans la détection et la mise en évidence de l'activité en- zymatique sur des surfaces solides. L'objet solide revêtu de phosphatase alcaline (une préparation tissulaire sur une lamelle, une tache ou un point sur une membrane - filtre, un point sur du plas- tique), est plongé dans la solution d'indoxyl-tétrazolium pendant une période de i à 30 minutes (de préférence 5 à 30 minutes) à 19-37-C, de préférence à la température ambiante (20-30'C). La couleur se développe et précipite spontané- ment au site de l'enzyme. La réaction est arrêtée par la- vage de l'objet dans l'eau et séchage à l'air. Une procé- dure complète de préparation est décrite dans l'exemple 1. Exemple 1: Préparation d'une solution stable de BCIP-NBT. Do Etape 1: on dissout 0,2 g de sel toluidique du phosphate de 5-bromo-4chloro-3-indolyle (BCIP, provenant de Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) dans 4 ml de diméthyl formamide (DMF). Etape 2: la solution obtenue dans l'étape 1 est ajoutée à 1 litre de Tris HCl 0,lM, pH 9,5, contenant mM de chlorure de magnésium, puis vigoureusement agitée pendant environ 10 minutes. Etape 3: on dissout 300 mg de chlorure de nltrobleu tétrazolium (NBT; provenant aussi de Sigma Che- micals, dans 4 ml de DMF à 70 % et on les ajoute à 1 litre de la solution de BCIP provenant de l'étape 2, puis on pro- cède immédiatement à une vigoureuse agitation, stockage à froid et à l'obscurité. Exemple 2: Utilisation du mélange BCIP-NBT dans un essai 1c diagnostlque. 1. De l'antigène standard d'hémagglutination du virus de la rubéole, comme celui qui peut être obtenu chez Wellcome Diagnostics ou Behring Diagnostics, est dilué à raison de 1:20 dans une solution saline tamponnée de phosphate de Dulbecco (PBS). On sèche des gouttes de 3 à 6 microlitres de la solution d'antigène sur des feuilles de nitrocellulose ou de polystyrène. Après le séchage, les feuilles sont bloquées par immersion dans une solution de 1 % de BSA et 10 % de sérum de cheval (provenant par exemple de GIBCO) dans du PBS et lavées à l'eau. 2. Des spécimens de sérum humain sont dilués dans un di- luant consistant en 1 % de BSA, 10 % de sérum de cheval et 0,85 % de chlorure de sodium à une dilution finale d'au moins 1:15. Des morceaux de feuilles de polystyrène ou de nitrocellulose portant des taches d'antigène de rubéole sont plongés dans les spécimens dilués et incubés pendant à 30 minutes à la température ambiante (environ 20'C). 3 - Après un lavage dans une solution détergente à 0,05 % (Tween-20 ou Brij 35T), les feuilles traitées de la façon 3.& ci-dessus sont plongées dans une solution d'un conjugué de phosphatase alcaline-anti humain anti IgG Fc (provenant de divers fournisseurs comme Sigma Chemicals, KPL, BioMakor) dilué à 1:100 - 1:500 dans le diluant des spécimens. L'incubation se déroule pendant 10 à 30 minutes à la tempé- rature ambiante. 26ú5566 4 - A la fin de la période d'incubation, les feuilles sont lavées soigneusement à l'eau courante et plongées dans le mélange de BCIP-NBT pendant une période de 5 à 20 minutes à la température ambiante. Des taches gris-pourpre apparais- sent au site des taches d'antigène, qui ont réagi avec des spécimens positifs. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- O nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em- brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un mélange de sub- strats chromogènes stable de phosphate d'indoxyle et de sel de tétrazolium, caractérisé par les étapes suivantes: a) le phosphate d'indoxyle est dissous dans du diméthyl formamide à une concentration de 10-75 mg/ml et bi le phosphate d'indoxyle dissous est vigou- reusement agité avec du Tris HCl 0,lM pH 9,0-10,5 contenant mM de chlorure de magnésium; et c) le sel de tétrazolium est dissous dans du diméthyl formamide à 70 % à des concentrations de 10 à 100 mg/ml. d) la solution (b) est mélangée à la solution (c) avec une agitation vigoureuse; et e) ce mélange est stocké à froid et à l'obscurité. 2. Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que ledit phosphate d'indoxyle est le phosphate de bromo-chloro-indoxyle. 3. Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que ledit sel de tétrazolium est le chlorure de nitro bleu tétrazolium. 4. Substrat d'enzyme chromogène, caractérisé en ce qu'il est un mélange de substrats chromogènes stable de phosphate d'indoxyle et de sel de tétrazolium préparé sui- vant l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Méthode d'utilisation du mélange de sub- strats chromogènes stable suivant la revendication 4, pour C la détection de l'activité enzymatique dans des essais bio- logiques et diagnostiques, caractérisée par les étapes sui- vantes: a) la plongée d'une surface solide sur laquelle est fixée une enzyme, dans ce mélange de substrats chromo- gènes stable à la température ambiante jusqu'au développe- ment de taches de couleur; b) le lavage et le séchage à l'air de cette so- lution a); c) la mesure de l'activité enzymatique.