Brevet FR2627192A1 — publié le 19890818

PROCEDE DE MARQUAGE DE CHROMOSOMES SPECIFIQUES UTILISANT L'ADN RECOMBINANT REPETITIF. La présente invention concerne l'identification de chromosomes et plus précisément, l'identification de séquences d'ADN répétitif qui s'hybrident à des chromosomes spécifiques. La présente invention est l'aboutissement d'un contrat signé avec Le Département de l'Energie des Etats-Unis (Contrat n W-7405-ENG-36). Comme cela est bien connu, Les cellules vivantes comportent des chromosomes, c'est-à-dire des structures porteuses de motifs génétiques d'ADN. Des ensembles particuliers de chromosomes déterminent les caractéristiques de la vie associées aux motifs génétiques d'ADN. C'est ainsi que les ceLlules humaines contiennent 24 types différents de chromosomes (22 autosomes, X et Y) et que le nombre et l'agencement des 26 2 7 1 9 2 2. chromosomes à l'intérieur de la cellule donnent une indication de divers développements anormaux et normaux. A titre d'exemple, les cellules normales contiennent une paire de chaque type d'autosome et La présence de 3 chromosomes (trisomie) peut être l'indication d'une condition anormale. La trisomie 9 (c'est-à-dire 3 chromosomes de numéro 9) indique la présence d'un syndrome qui est fatal peu de jours après la naissance. La trisomie 16 est observée dans un tiers de tous les avortements spontanés qui mettent en jeu des trisomies chromosomiques. La trisomie 21 est représentative du syndrome de Down. On a décrit des clones d'ADN répétitif qui s'hybrident à des groupes de chromosomes humains, souvent avec un site prédominant d'hybridation sur seulement un ou deux autosomes. On se référera par exemple à A.R. Mitchell et col., "Molecular hybridization to meiotic chromosomes in Man reveals sequence arrangement on the nO9 chromosome and provides clues to the nature of 'parameres'", Cytogenet. Cell. Genet. 41: 89-95 (1986), qui décrit ure sonde, désignée sous le nom de Xbl, qui s'hybride préférentiellement, bien que non exclusivement, avec le chromosome 9. Il a été suggéré que chaque chromosome humain peut être caractérisé par un ou plusieurs sous- ensembles distincts d'ADN satellite alpha. On se référera par exemple à P. Devilee et col., "Two Subsets of Human Alphoid Repetitive DNA Show Distinct Preferential Localization in thé Pericentric Regions of Chromosomes 13, 18, and 21", Cytogenet. Cell Genet. 41, 193-201 (1986); A. Lund Jorgensen et col., "Chromosome-Specific Subfamilies Within Human Alphoid Repetitive DNA", J. Mol. Biol. 18Z, 185-196 (1986). En effet, l'enrichissement d'une ou de quelques sous- familles dictinctes sur des chromosomes-individuels a été mentionné. Cependant, aucun procédé n'est décrit pour déterminer systématiquement les séquences de nucléotides qui donnent des sondes spécifiques des chromosomes. De plus, il n'a été décrit aucune sonde qui soit spécifique de chromosomes Lorsqu'une identification positive des chromosomes est exigée de façon normalement rigoureuse après une hybridation in situ de la sonde avec des chromosomes se trouvant à l'intérieur d'une cellule. Il est à noter que La spécificité vis-à-vis des chromosomes de sondes d'ADN préférentielles pour les chromosomes décrite dans l'art antérieur, peut être améliorée en augmentant La rigueuravec laquelle est tentée l'hybridation. Cependant, L'hybridation dans des conditions hautement rigoureuses peut ne pas conduire à des résultats reproductibles. Bien que les chromosomes spécifiques soient Les seuls à pouvoir être marqués, il se peut que ces chromosomes ne soient pas tous marqués, ce qui est clairement inacceptable pour une application clinique de routine. En outre, des niveaux élevés de rigueurs conduisent souvent à une diminution de la tailLe et/ou de L'intensité du site d'hybridation, ce qui exige une amplification accrue du- signal de fluorescence ou un temps d'exposition autoradiographique prolongé. Ces conditions augmentent les erreurs de fond non spécifiques à partir des mesures. Des sondes spécifiques des chromosomes après hybridation avec un niveau de rigueur normal, et une seule étape d'amplification ou une exposition courte, seraient plus utiles pour La plupart des applications, en particulier pour l'identification et la quantification de chromosomes dans des noyaux en interphase. La possibilité de marquer des chromosomes autosomiques humains spécifiques dans des noyaux en interphase permettrait une étude de la structure tridimensionnelle du noyau et fournirait une approche à l'analyse des chromosomes dans le cas o l'isolation de chromosomes en métaphase est peu commode, difficile ou impossible. Cependant, une éventuelle hybridation croisée entre une séquence de sonde "spécifique" de chromosomes et d'autres chromosomes diminue l'utilité de la sonde, en particulier pour l'hybridation avec des noyaux en interphase. La présente invention fournit un procédé permettant l'identification de séquences répétitives de nucleotides qui s'hybrident in situ sur des chromosomes spécifiques dans des conditions de rigueur normales de façon à pouvoir mener de telles études et analyses. Par conséquent, la présente invention a pour but d'identifier des séquences répétitives de nucleotides qui sont spécifiques de chromosomes dans des conditions normales de rigueur. La présente invention a également pour but de permettre une identification in situ de chromosomes contenus dans des noyaux cellulaires intacts. Un but supplémentaire de la présente invention est de fournir une méthode pour déterminer les séquences d'une sonde qui ne contiennent que la partie d'un motif répétitif qui est en plus grande concentration sur Le chromosome en cours d'identification ou unique à celui-ci. Un autre but de L'invention est d'identifier. des séquences de nucleotides spécifiques de chromosomes ayant une longueur pouvant être synthétisée. Pour atteindre les buts mentionnés ci-dessus ainsi que d'autres, conformément aux fins de la présente invention, de la façon présentée et décrite généralement ici, le procédé de l'invention peut comprendre une méthode pour déterminer une séquence répétitive de nucléotides permettant d'identifier un chromosome particulier dans des conditions normales de rigueur pour l'hybridation. Une première séquence répétitive de nucléotides est sélectionnée à partir d'une séquence variante au sein d'une séquence appartenant à une famille connue d'ADN répétitif. la première séquence répétitive de nucléotides est ensuite hybridée de façon à classer la séquence en tant que spécifique de chromosomes, préférentielle pour Les chromosomes ou non spécifique des chromosomes. Les séquences classées comme étant préférentieLLes des chromosomes sont ensuite examinées de manière à déterminer des régions qui présentent une faible homologie avec d'autres régions de la séquence préférentielle pour les chromosomes, ces régions de faible homologie ayant pour effet de s'hybrider avec un chromosome spécifique dans des conditions normales de rigueur. Selon un autre aspect de la présente invention, celle-ci fournit une méthode pour sélectionner des séquences d'ADN répétitif spécifiques de chromosomes dans une bibliothèque de clones d'ADN recombinant ayant des familles de séquences répétitives. Des premiers clones sont sélectionnés dans cette bibliothèque avec une faible homologie vis-à-vis de la séquence de familles d'ADN répétitif auxquelles les premiers clones appartiennent respectivement. Les premiers clones sélectionnés sont hybridés sur la totalité de L'ADN du génome et des clones variants sont sélectionnés qui ont un motif d'hybridation qui est différent d'un motif d'hybridation prédominant présenté par les familles respectives. Les clones variants sont ensuite hybridés avec des chromosomes et classes comme étant spécifiques des chromosomes, préférentiels pour Les chromosomes, ou non spécifiques des chromosomes. Les clones préférentiels pour les chromosomes sont ensuite séquences de façon à déterminer des régions ayant une séquence de faible homologie par rapport à des séquences connues d'autres membres de la famille et des séquences consensuelles des familles d'ADN répétitif pour les clones préférentiels pour les chromosomes. Les régions de faible homologie sont en outre hybridées de façon à déterminer des séquences spécifiques de chromosomes permettant de produire une spécificité in situ vis-à-vis des chromosomes à un niveau normal de rigueur. Selon un aspect supplémentaire de la présente invention, on utilise des oligomères ayant une séquence de nucleotides déterminée conformément aux procédés décrits ci-dessus. Ces oligomères permettent de réaliser une sonde qui s'hybride avec un chromosome particulier. Conformément à la présente invention, des séquences de nucleotides spécifiques de chromosomes sont déterminées par l'identification de divergences significatives entre des séquences Locales d'une famille d'ADN répétitif. Il a été découvert que certaines régions de motifs répétitifs préférentiels pour les chromosomes sont principalement responsables de l'hybridation spécifique des chromosomes. Comme cela est décrit ici, ces séquences variantes peuvent donner des sondes qui sont spécifiques vis-àvis des chromosomes à des niveaux de rigueur inférieurs ou égaux à 80%. Une sonde efficace contient des réseaux en tandem de la séquence sélectionnée pour s'hybrider avec un réseau en tandem du chromosome particulier afin de fournir une fluorescence localisée permettant une identification positive. L'ADN répétitif est la partie de L'ADN total d'une espèce, à savoir le génome, représenté par des 2627t92 séquences que L'on retrouve un grand nombre de fois, souvent sous la forme de réseaux en tandem. Lorsque L'ADN du génome est découpé en fragments relativement courts et Lorsque les deux filaments de la double hélice sont séparés (dénaturés), Les séquences d'ADN répétitif se réunissent (se réassocient) plus rapidement que les séquences qui ne sont présentes qu'une seule fois ou peu de fois à l'intérieur du génome, car elles ont davantage de chances de trouver Leur séquence complémentaire. Cette caractéristique permet la formation de bibliothèques de fragments d'ADN qui présentent un grand nombre de séquences répétitives. Le génome humain contient plusieurs familles d'ADN répétitif. Bien que présents sur -de nombreux sites à l'intérieur du génome,. des mélanges de séquences répétitives forment d'importants blocs sur le centromère de chaque chromosome. Les séquences répétitives ont la capacité d'évoluer rapidement;en effet, mime les homologues peuvent avoir des séquences répétitives différentes du fait d'une substitution, d'une insertion ou d'une élimination de bases individuelles dans les séquences. Par conséquent, des séquences répétitives en tandem doivent être disponibles pour identifier de façon unique chaque chromosome et pour s'hybrider de façon spécifique avec une sonde ayant un réseau en tandem suffisamment homologue. Les familles d'ADN répétitif peuvent être identifiées par l'agencement des bases d'ADN à l'intérieur du motif répété. A titre d'exemple, les séquences d'ADN satellite alpha sont des motifs ayant des nombres variables de séquences en tandem, d'.une Longueur d'environ 170 paires de bases, et les séquences satellites de 2 ADN ont des motifs répétés d'une longueur d'environ 26 paires de bases. La plupart des familles d'ADN répétif ont une forme prédominante. Lorsque la totalité de la famille est isolée, baucoup des séquences présentes sont très analogues (homologues). Le reste des séquences constitue les sous- familles. Il s'agit de groupes de séquences qui présentent le même agencement que la ' forme prédominante, mais qui ont subi des substitutions, des éliminations et/ou des insertions de bases. Ces modifications créent des sites au sein des séquences apparentées sur lesquels les brins complémentaires ne peuvent pas former des paires de bases avec d'autres séquences de la famille. La proportion de ces modifications détermine la relation entre deux séquences quelconques, c'est-à-dire qu'elle détermine s'il s'agit de séquences homologues (ressemblance) ou divergentes (différence). Certaines sous-familles sont identifiées comme étant des variantes, avec une divergence suffisante par rapport à la forme prédominante pour qu'elles ne puissent plus se réassocier ou s'hybrider avec La forme prédominante, dans Les conditions de rigueur normales de température, de concentration et de temps. L'aptitude des séquences apparentées à s'hybrider à une homologie donnée, peut être régulée par les conditions de rigueur imposées à la réassociation. Plus Les conditions de rigueur sont élevées, plus L'homoLogie exigée pour obtenir une correspondance avec chaque séquence est élevée. Dans des conditions normales, au moins 80X des bases d'une séquence doivent s'apparier pour que les deux brins puissent se réassocier. Tel qu'il est utilisé ici, Le terme de faible homologie désigne une homoLogie inférieure à celle qui est nécessaire pour une 2627t92 réassociation normale, c'est-à-dire inférieure à environ 80%X. Conformément à la présente invention, des séquences répétitives de nucleotides sont sélectionnées et comparées à des séquences d'ADN appartenant aux familles respectives d'ADN répétitif. Le présent procédé consiste à rechercher des séquences d'ADN qui présentent une faible homologie et par conséquent, une faible probabilité d'hybridation avec les membres de leur famille qui sont généralement présents dans plusieurs chromosomes du génome humain. Ces séquences de nucléotides présentent une probabilité relativement élevée de ne s'hybrider qu'avec des chromosomes particuliers, dans le cas o elles s'hybrident. Plus la séquence est variante, plus l'hybridation chromosomique est spécifique. Par conséquent, les sondes d'ADN contenant une ou plusieurs copies de la séquence de faible homologie, peuvent être utilisées pour identifier des chromosomes particuliers par hybridation in situ avec des chromosomes cellulaires. Une bibliothèque de séquence d'ADN répétitif humain a été réalisée par des techniques classiques. De l'ADN placentaire humain purifié a été physiquement cisaillé en fragments d'une longueur moyenne de 3000 à 4000 paires de bases. L'ADN a été dénaturé et admis à se réassocier dans des conditions favorisant la réassociation des séquences d'ADN répétitif. Les fragment obtenus ont été soumis à une digestion par la nucléase S1 et ont été traités de façon à donner de l'ADN répétitif à deux brins. L'ADN répétitif à deux brins ainsi obtenu a été soumis à un clonage sur le site Pstl du plasmide pBR322 par la terminaison des extrémités par G:C avec de la transférase terminale. Les plasmides ainsi obtenus ont ensuite été -amenés à croltre dans un système bactérien de façon à former un 2627 1 92 clone contenant de nombreux plasmides, comportant chacun la même séquence d'ADN répétitif. Les clones de bibliothèque ont été identifiés comme étant des clones pHuR (plasmid Human Repeat) et un numéro d'identification leur a été attribué. Tous les clones pHuR identifiés ici peuvent être trouvés dans la bibliotèque pHuR du Laboratoire National de Los Alamos, Los Alamos, Nouveau Mexique. Selon un mode de réalisation de la présente invention, des clones d'ADN recombinants sont sélectionnés dans la bibliothèque et des séquences spécifiques de chromosomes sont identifiées par le processus suivant: 1. Les inserts d'ADN répétitif sont retirés du plasmide par digestion de type Pstl et reclonés dans le vecteur Ml3. Lors d'une première sélection, les clones sont partiellement séquences par des techniques classiques pour déterminer la famille d'ADN répétitif représentée par un clone. Les clones contenant des séquences de faible homologie (c'est-à-dire ayant une homologie inférieure à environ 80%) avec la séquence du membre de la famille prédominant, sont sélectionnés en vue d'une étude plus poussée. 2. Les premiers clones sélectionnés sont ensuite hybridés sur l'ADN de la totalité du génome sur des gels de filtrat de type Southern. Le motif d'hybridation est comparé à celui de la séquence prédominante de la famille concernée. Les clones qui ne présentent pas le mimes motif que la séquence prédominante sont considérés comme étant des variants et sont sélectionnés en vue d'un test de spécificité chromosomique. 3. Les clones variants sont hybridés à des chromosomes dans des conditions pas plus rigoureuses que la normale puis classés comme étant spécifiques de 262 7 1 92 1 1 chromosomes (ne s'hybrident qu'à un seul chromosome), préférentiels vis-à-vis des chromosomes (s'hybrident principalement sur un chromosome, mais en partie sur d'autres), ou non spécifiques des chromosomes. a. Une méthode de caractérisation consiste à utiliser une technique d'hybridation sur des buvards à fente. Des chromosomes humains individuels sont triés par cytométrie à écoulement et placés dans des fentes séparées sur un filtre. De L'ADN radioactif provenant du clone variant (sonde) est hybridé avec La tâche du filtre, mais ne se réassociera qu'avec Les chromosomes qui contiennent des séquences d'ADN ayant une homologie de 70 à 80% avec La sonde. Le matériau en excès de la sonde est éliminé par lavage et la radioactivité résiduelle peut être détectée sur les fentes des chromosomes qui contiennent des séquences suffisamment homologues pour s'hybrider avec la sonde. b. Selon une autre méthode, le clone d'ADN répétitif est hybridé in situ sur des chromosomes. Le clone d'ADN répétitif est marqué par de La biotine et est hybridé avec des chromosomes humains métaphasiques. La sonde ne se réassociera qu'aux sites du. chromosome comportant des séquences complémentaires, généraLement au centromère ou à proximité de ceLui-ci. La sonde biotinylée qui s'est hybridée avec les chromosomes est détectée par des molécules d'avidine auxquelles est lié un colorant fluorescent. Les sites d'hybridation peuvent être observés au moyen d'un microscope à fluorescence. 4. Les clones à préférence chromosomique sont soumis à une analyse plus poussée pour déterminer s'il existe des séquences incluses dans un clone variant présentant une certaine spécificité chromosomique. La technique d'analyse dépend de la disponibilité de sites de restriction dans le cltone, pouvant être utilisés pour découper des fragments naturels. a. Si des sites de restriction sont présents, les séquences de régions situées entre les sites de restriction sont déterminées et comparées aux séquences connues d'autres membres de la famiLLe et à La séquence commune de La famille d'ADN répétitif. Une séquence commune est déterminée par comparaison de toutes Les bases de chaque position du motif répété pour tous Les membres connus de la famille ou de la sous-famiLLe, et par enregistrement de la base la plus souvent présente sur chaque position de base. Les fragments de restriction présentant une homologie inférieure à 75% avec La famiLLe connue et les séquences communes, sont découpés du cLone, réinsérés dans des plasmides, et hybridés sur des chromosomes métaphasiques afin d'évaluer de façon plus poussée la spécificité. b. Si Le nombre de sites de restriction disponibles est insuffisant, La totalité de La séquence du clone doit être comparée à une famille connue et à des séquences communes. Une région courte, par exempte de 20-50 nucléotides, présentant la plus faible homologie, est alors sélectionnée et cette séquence est synthétisée à l'aide d'un synthétiseur d'ADN pour produire la séquence spécifiée. L'ADN synthétique est terminé par une base biotinylée et hybridé à des chromosomes en métaphase de façon à évatuer La spécificité chromosomique. A L'aide d'un synthétiseur classique, des variantes de séquences connues ou des parties de séquences connues pour lesquelLes de t'ADN naturel n'est pas disponible, peuvent être simplement synthétisées et soumises à des tests de spécificité chromosomique. Deux clones d'ADN répétitif qui sont spécifiques de chromosomes ont été directement identifiés dans La bibliothèque. Le pHuR 98 s'est hybridé de façon spécifique sur la position chromosomique 9qh. La séquence répétitive de pHuR 98 est constituée par la séquence à 10 nucléotideS CCAACCCGAGT, suivie de motifs répétitifs divergents à 5 nucléotides GGAAT. Les espacements complets entre motifs présents dans ce clone ont une longueur de 54 et de 45 nucléotides, et sont séparés par un motif répété tronqué de 29 nucléotides. La totalité de la séquence du pHuR 98 est indiquée dans le tableau A. Un second clone d'ADN recombinant, le pHuR , présentait une hybridation spécifique à la position chromosomique 16qh après une hybridation in situ sur des chromosomes métaphasiques humains normaux. Le pHuR 195 est un variant du satellite 2 de L'ADN humain et présente une séquence "centrale" de six nucléotides CATCAT, suivie de quatre séquences divergentes GGAAT. Les séquences centrales sont séparées par des longueurs diverses de séquences d'ADN à forte divergence, allant de 0 à 49 nucteotides. La totalité de la séquence du pHuR 195 est indiquée dans le tableau B. L'aptitude du pHuR 98 et du pHuR 195 à s'hybrider sur des chromosomes particuliers montre que certains chromosomes contiennent des réseaux en tandem de séquences variantes qui permettraient d'identifier de façon unique le chromosome particulier. Une autre séquence d'ADN répétitif spécifique de chromosomes a ensuite été identifiée et synthétisée par un procédé conforme à la présente invention. Des-clones d'ADN satellite alpha ont été sélectionnés en vue d'#tre utilisés comme matériau de départ, des clones alpholdes étant isolés de la bibliothèque de motifs répétés de plasmides humains. Un premier clone, le pHuR 22, a ensuite été sélectionné car il ne conduisait pas à une hybridation croisée avec la forme dimère-tétramère 2627 1 92 prédominante de L'ADN alpho;de. Lorsqu'elle est hybridée avec une homologie limite de 70%, à un buvard fendu de chromosomes humains triés par cytométrie à écoulement, 30-35% de la sonde radiomarquee se sont fixes sur la fente du chromosome 17. Environ 2-5% de la sonde se sont également fixes à chacun de plusieurs autres chromosomes, mais la séquence du clone a été identifiée comme présentant un comportement préférentiel pour les chromosomes. Du pHuR 22 biotinylé a ensuite été hybridé sur des chromosomes en métaphase. Dans des conditions de rigueur normales (formamide à 50%, à 37 C), on a noté une localisation préférentielle de la sonde vers la région centromère du chromosome 17, mais des sites mineurs d'hybridation croisée ont pu être détectés sur les centromères des chromosomes 1, 9, 20 et X dans de nombreuses métaphases. Ces sites mineurs ont également été détectés dans les noyaux d'interphase. De légères modifications de la concentration de la sonde ou des conditions de rigueur ont conduit à une augmentation de l'hybridation croisée; c'est ainsi que le pHuR 22 s'est hybridé à la quasi totalité des centromères après hybridation dans des conditions de faible rigueur (formamide à 30%, à 37 C). La forme prédominante de l'ADN alpholde sur le chromosome 17 est un motif répétitif ayant un ordre supérieur de 2,7 kb constitué de 16 monomères d'environ pb chacun. Lorsque le clone de pHuR 22 a été retiré du vecteur plasmidique par digestion par du PstI avant le séquencement, deux sites de PstI internes ont produit des fragments ayant des longueurs de 2,7, 1, 5 et 0,2 kb. L'insert de 2,7 kb était un motif répété d'ordre supérieur entier. Le fragment de 1,5 kb était constitué par la dernière moitié du motif répété, et le fragment de 0,2 kb était principalement constitué par le monomère 1, c'est-à-dire le pHuR 22-1. L'hybridation in situ des sondes constituées à partir de ces fragments a montré que le fragment de 2,7 kb s'hybridait comme le pHuR 22, que le fragment de 1,5 kb n'était pas spécifique, alors que le fragment de 0,2 kb, c'est-à-dire le pHuR 22-1 s'hybridait de façon spécifique au chromosome 17 dans des conditions de rigueur modérées (formamide à 40%, à 37 C). Les monomères individuels de l'ADN alphorde sélectionnés ne partagent qu'une homologie de 65 à 94%. Le monomère 1 est l'un des plus divergents de ces monomères. IL présente également une faible homologie par comparaison à des monomères d'autres ADN alphordes connus et une homologie inférieure à 65% à la séquence alphorde connue. Par conséquent, l'hybridation spécifique du monomére 1 sur le chromosome 17 a confirmé le processus de sélection préliminaire. Il a ensuite été déterminé qu'au moins une région de la séquence du monomère I était suffisamment unique pour ne pas être sujette à une hybridation croisée avec d'autres alphas. La région allant des pb 141 à 151 du pHuR 22-1 contient un amas de bases qui diffère des séquences communes I et II de l'alpha humain. Un oligomère de 42 pb contenant cette région a été synthétisé, celui-ci couvrant les nucléotides 111- 152 du pHuR 22-1. L'oligonuctLéotide a été biotinylé par blocage des extrémités à L'aide de transférase terminale avec du bio-dCTP et a été hybridé à des chromosomes métaphasiques humains, avec du formamide à 30%, à 37 C, ces conditions correspondant à un niveau de rigueur normal. La sonde s'est liée de façon spécifique au chromosome 17. La totalité de la séquence du pHuR 22-1 avec la sonde spécifique du chomosome 17 (soulignée) est indiquée dans Le tableau C. La synthèse d'oligomères spécifiques de chromosomes n'est pas limitée à des séquences de régions divergentes de sondes d'ADN natives. Une séquence de nuléotides peut être sélectionnée parmi les séquences communes publiées de familles de motifs répétés. Un oligomère est synthétisé avec une séquence de motifs à partir d'une région hautement divergente de la séquence publiée. La préférence chromosomique de L'oLigomère synthétisé est ensuite déterminée de la façon décrite ci-dessus. La spécificité chromosomique peut encore être accrue par détermination de régions au sein de la séquence sélectionnée, qui ont une faible homologie avec d'autres régions de la séquence sélectionnée. Les marqueurs d'ADN répétitif spécifiques des chromosomes constituent un outil puissant pour identifier les chromosomes humains, mais la spécificité des sondes à ADN répétif dépend du degré d'homologie de la séquence de la sonde, avec Les séquences complexes des diverses sous-familles d'ADN présentes dans Les chromosomes humains. L'augmentation de concentration d'une sous-famille particulière sur un chromosome individuel peut ne pas, par elle-mime, conférer une spécificité chromosomique. La présence de cette mime sous-famille ou de sous-familles étroitement apparentées sur d'autres chromosomes peut conduire à une hybridation croisée dans des conditions de rigueur normales et diminuer l'efficacité de la sonde, en particulier pour l'hybridation à des noyaux d'interphase. Les sondes identifiées par la présente invention ne contiennent que la partie du motif répété en tandem, qui est unique au chromosome identifié. L'analyse de la séquence peut être utilisée pour déterminer lesquels des segments de la séquence de motif répété divergent le plus, et la sondepeut être raccourcie par restriction ou synthèse afin de s'hybrider de façon plus spécifique au chromosome cibLe, dans des conditions normales de rigueur. Les exemples ci-dessus ILlustrent le fait que des sondes spécifiques de chromosomes peuvent être formulées au moyen du processus d'identification décrit ci-dessus. Bien que des séquences spécifiques de chromosomes n'ont pas pu être identifiées pour chaque. chromosome, Le processus ci-dessus permet fondamentalement d'établir ces identifications. Par conséquent, la présente invention couvre les otigom*res identifiés par Les processus décrits ci-dessus et à partir desquels des sondes spécifiques de chromosomes peuvent être synthétisées. La description ci-avant des modes de réalisation préférés de L'invention a été présentée à des fins d'iLlustration et de description. Elle n'était pas censée être exhaustive ni Limiter L'invention à lta forme particuLtire décrite, et iL est cLair que de hombreuses modifications et variantes sont possibLes à La lum1ère des directives données ci-dessus. Les modes de réalisation ont été choisis et décrits de façon à mieux expliquer Les principes de base de L'invention et sa mise en pratique afin de permettre à L'homme de L'art d'expLoiter au mieux la présente invention sous diverses formes de réaLisation et en y apportant Les diverses modifications appropriées à l'utiLisation particulière envisagée. 26 2 7 1 9 2 TABLEAU A I pHuR 98 - Longueur de la séquence: 158 aatcaacccg agtgcaatcg aatggaatcg aatgaatgga atgcaatgga atggattcaa cttgaatgga atggaaagaa tggaatcaac acgagtggaa tggcatggat tggaatggaa tggaatggaa tcaacccgag tacaggaatg gaatggaa TABLEAU B 1 pHuR 195 - Longueur de La sequence: 545 atcatcaaat ggaatcgaat ggaatcatct aatgaacttg aaaggaatca tcatcaaatg aagtcaaatg gaataaccaa atcgacatga atggaatcat 1 01 cattgaatag a.atcgaatgg attcattaaa tgggctagaa tggaatcatc tgtgaacgga ttcaaaggga atcatcatcg aatggaatcg aatggaaatg 201 tcaaccaatt gaatcatcat ggaattgaat cgaatggctc actgtcgaat caaatcaaat ggaatcaatc aatccgtaat ggaattgaat ggaaacaatg aaaggaattg aatggaatca tcattgaatg gaacccgaat gaaatcatca - 351 acgaatggaa tccaatgtaa tcatcanngg taagcactta aggaatcatt atccgaatgg aattaaatga aatctataat ccgaatggaa tccgaatgga 451 atcatcatcg aatggaatgg a.atggaaacg ttattgaatg gaattaaatg aaattaccga aatgaatgaa atggattgat cattaaaggg aatta TABLEAU C I pHuR 22-1 - Longueur de La séquence: 214 ctgcagaatc tgcaagtgca tatttggacc tctgtgagga attcgttgga aacgggataa tttcagctga ctaaacagaa gcagtctcag aatcttcttt gtgatgtttg cttcaaatc cccgaqttga actttccttt caaagtt ca atttgaaaca ctctttttgc aggatctaca agtggatatt tggacactct 201 gtgtcctcct gcag REVENDICATIONS 1. Procédé pour sélectionner des séquences d'ADN répétitif spécifiques de chromosomes dans une bibliothèque de clones d'ADN recombinant contenant des familles de séquences répétitives, comprenant les étapes consistant à: sélectionner dans cette bibliothèque, des premiers clones ayant une faible homologie avec la sé- quence de familles d'ADN répétitif auxquelles ces premiers clones appartiennent respectivement; hybrider ces premiers clones sélectionnés sur la totalité de l'ADN du génome; sélectionner des clones variants ayant un motif d'hybridation différent d'un motif d'hybridation prédominant présenté par ces familles respectives; classer ces clones variants comme étant à spécificité chromosomique, à préférence chromosomique, ou à non spécificité chromosomique; déterminer des régions de ces clones à préférence chromosomique, ayant une séquence de faible homologie par rapport à des séquences connues d'autres membres. de la famille et des séquences communes des familles d'ADN répétitif pour ces clones à préférence chromosomique; et # hybrider ces régions de faible homologie avec des chromosomes pour sélectionner une séquence de nucléotides permettant de fournir in situ une spécificité chromosomique à un niveau de rigueur normal. 2. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que cette étape de classification des clones variants met en jeu une hybridation sur buvard fendu afin de détecter la présence de chacun desdits clones variants hybridés à des chromosomes particuliers. 3. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que cette étape de classification des clones variants met en jeu une hybridation in situ de chacun des clones variants à des chromosomes humains. 4. Procéde selon la revendication 1, carac- térisé en ce que cette étape de détermination des régions de faible homologie, comprend l'étape consistant à déterminer la séquence de régions entre des sites d'enzymes de restriction sur ces clones à préférence chromosomique, en vue d'une comparaison avec ces séquences connues des membres de la famille, et avec la séquence commune de cette famille. 5. Procéde selon la revendication 1, carac- térisé en ce que cette étape de détermination des régions de faible homologie comprend l'étape consistant à sélectionner une région de paires de bases ayant un nombre de bases relativement faible et ayant une homologie minimale avec cette famille connue et les séquences communes. 6. Procéde selon la revendication 2, carac- térisé en ce que cette étape de détermination des régions de faible homologie comprend l'étape consistant à déterminer la sequence de régionsentre des sites d'enzyme de restriction sur ces clones à préférence chromosomique en vue d'une comparaison avec ces séquences connues des membres de la famille, et la séquence commune de cette famille. 7. Procédé selon la revendication 2, carac- térisé en ce que cette étape de détermination des régions de faible homologie comprend l'étape consistant à sélectionner une région de paires de bases ayant un nombre de bases relativement faible et ayant une homologie minimale avec cette famille connue et les séquences communes. 8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que cette étape de détermination de ces régions de faible homologie comprend l'étape consistant à déterminer la séquence de régions située entre des sites d'enzymes de restriction sur ces clones à préférence chromosomique en vue d'une comparaison avec ces séquences connues de membres de la famille, et ces séquences communes de cette famille. 9. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que cette étape de détermination des régions de faible homologie comprend l'étape consistant à sélectionner une région de paires de bases ayant un nombre de bases relativement faible et ayant une homologie minimale avec cette famille connue et les séquences communes. 10. Procédé pour déterminer une séquence de nucleotides répétitive permettant d'identifier un chromosome particulier dans des conditions normales de rigueur pour l'hybridation, comprenant les étapes consistant à: sélectionner une première séquence de nucleotides répétitive parmi une séquence variante située dans une séquence d'une famille d'ADN répétitif connue; classer cette séquence de nucléotides répétitive comme étant à spécificité chromosomique, à préférence chromosomique ou à non spécificité chromosomique; et déterminer les régions d'une séquence à préférence chromosomique classée ayant une faible homologie avec d'autres régions de cette séquence à préférence chromosomique tout en étant capables de s'hybrider avec un chromosome particulier dans ces conditions de rigueur normales. 11. Procédé selon la revendication 10, comportant en outre l'étape consistant à synthétiser un oligomére contenant la séquence de faible homologie déterminée. 12. Oligomére permettant de constituer une sonde s'hybridant avec un chromosome particulier, comprenant une séquence de nucleotides déterminée conformément à la revendication 1. 13. Oligomère permettant de constituer une sonde qui s'hybride avec un chromosome particulier dans des conditions de rigueur normales, comprenant une sequence de nucléeotides déterminée conformément à la revendication 10.