Brevet FR2634784A1 — publié le 19900202

La présente invention est relative & des lignées de cellules épithéliales intestinales immortali suées, b leurs procédés de préparation et & leurs applica tions en tant que système de production de facteurs de croissance et en tant que modèle d'étude de la physiopathologie digestive fonctionnelle et cancéreuse. Il est difficile, à l'heure actuelle, de disposer de systèmes permettant l'analyse des manifestations génomiques, immunologiques et biochimiques tant des méca mises physiologiques de prolifération cellulaire intesti- nale, de différenciation et de vieillissement des cellules intestinales que d'une tumeur d'origine intestinale. En dépit des travaux effectués dans le domaine de la culture de cellules, l'étude des cellules digestives normales est encore difficile à l'heure actuelle en rai son - de la faible prolifération et de la durée de vie limitée de ces cellules en culture, conduisant, de plus, å des changements phénotypiques considérables avant que le vieillissement cellulaire ne se produise - la dépendance de ces cellules vis-a-vis des facteurs de croissance, tels que l'insuline, 1'EGF et la gastrine - la nécessité de cultiver ces cellules épithéliales en présence de cellules mésenchymateuses ou de fi broblastes. En particulier, en ce qui concerne le tractus digestif, il est connu que ces cancers sont très fréquents dans l'épithélium de l'estomac et du colon chez 1'Homme l'étude de ces différents cancers est effectuée, à l'heure actuelle, a partir de cellules cancéreuses caractérisées par des remaniements chromosomiques très importants et une derégulation complète de l'expression génétique et phénotypique des cellules gastriques et intestinales. Certains de ces inconvénients ont été contournés par l'établissement de lignées cellulaires cancéreuses de cellules épithéliales d'origine intestinale (ZWEIBAUM A. et al., Handbook of physiology, Intestinal transport of the Gastrointestinal system, Am. Physiol. Soc., 1988 ; MARTIN F. et al., Int. J. Cancer, 1983, 32, 623-627). Des lignées spontanément immortalisées ont été mises en évidence (QUARONI A. et al., 1979, J. Cell. Biol., 80, 248-265 ; NEGREL R. et al., 1983, Exp. Cell. Res., 143, 427-437 ; BLAY J. et al., 1984, Cell. Biol. Inter. Rep., 8, 551-560). Le mécanisme de la division cellulaire et de l'immortalisation de ces cellules est inconnu ; ces lignées ne peuvent donc pas entre utilisées comme modèle d'étude. Les modèles d'étude antérieurement décrits ont pour inconvénient de présenter des anomalies chromosomiques et un dysfonctionnement (proto)oncogénique, excluant a possibilité d'une comparaison avec le programme génétique intrinsèque des cellules normales (MONNAT M. et al., Int. J. Cancer, 1987, 40, 293-299). De plus, ces modèles ne sont pas assez sélectifs. Les Inventeurs se sont, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un nouveau modèle d'étude des cellules épithéliales intestinales, ne présentant pas les inconvénients des modèles antérieurs, ledit modèle permettant l'étude des manifestations physiologiques, physiopathologiques des cellules épithéliales intestinales normales ainsi que l'analyse des manifestations génomiques, immunologiques et biochimiques inhérentes a la progression tumorale. La lignée cellulaire, selon l'invention, présente des applications tant dans l'étude de la fonction, que dans la différenciation des cellules épithéliales intestinales. La présente invention a pour objet une lignée de cellules épithéliales intestinales de mammifère, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par transfection de cellules épithéliales intestinales fétales de mammifère, par un (proto)oncog8ne viral ou cellulaire immortalisant approprié, en ce que la lignée ainsi transfectée est immortali sée et en ce qu'elle n'est pas tumorigène. Conformément à l'invention, le (proto)oncogène viral ou cellulaire immortalisant est sélectionné dans le groupe qui comprend notamment, l'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain, l'oncogène E1A de l'adénovirus 5 humain, l'oncogène large T de polyome, l'oncogène large T de SV40, l'oncogène v-myc, l'oncogène c-myc et l'oncogène p53. Selon un mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire est obtenue par transfection de cellules épithéliales intestinales fétales d'origine murine par L'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain. Cette lignée cellulaire a été dénommée SLC-11 par les Inventeurs. Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le n 1-791 en date du 22 juillet 1988 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur. Ladite lignée SLC-11 est immortelle et proche des cellules normales de l'épithélium intestinal, non tumorigène et possède une activité de prolifération illimitée. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de la lignée cellulaire selon l'invention, caractérisé en ce qu'on isole les cellules épithéliales intestinales à partir de foetus de mammifère, en ce que l'on électro-perméabilise lesdites cellules et en ce qu'son les transfecte par un (proto)oncogène viral ou cellulaire iomortalivant approprié. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux, l'oncogène viral iortalisant est sélectionné dans le groupe qui comprend notamment 1'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain, l'oncogène ElA de l'adénovirus 5 humain, l'oncogène large T de polyome, l'oncogène large T du SV40, l'oncogène v-myc, l'oncogène c-myc et l'oncogène p53. En ce qui concerne les oncogènes large T, on peut utiliser différents plasmides recombinés avec lesdits oncogènes. Ceux-ci sont ainsi inclus dans différentes constructions. En particulier, il existe un mutant NG18 du polyome, codant uniquement pour la région large T du virus il existe également une construction de SV40 qui s'appelle PAS, dite SV40 (Ori-), car délétée de son origine de réplication. Lesdits oncogènes sont recombinés, de manière connue, dans des plasmides appropriés. L'oncogène EA1 est recombiné dans le plasmide pUCl3, l'oncogène large T de polyome est recombiné dans le plasmide pBR 322, l'oncogène large T du SV40 est recombiné dans le plasmide pUC13. La présente invention a également pour objet l'application de la lignée conforme à l'invention en tant que système de production de protéines spécifiquès de l'épithélium intestinal, tels que les facteurs de croissance. Ledit système permet la production en quantités importantes de protéines spécifiques de l'épithélium intestinal, telles que les facteurs de croissance, lesdites protéines étant excrétées dans le milieu de culture. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention desdites protéines spécifiques de l'épithélium intestinal, caractérisé en ce qu'on cultive la lignée cellulaire, conforme à l'invention sur un milieu approprié à base de sels inorganiques, de glucose, de rouge de phénol, d'amino-acides, de vitamines, et comprenant, en outre de l'insuline et/ou de la transferrine et/ou de la toxine cholérique et/ou du facteur de croissance épithéliale (EGF) et/ou des extraits hypophysaires et/ou de la dexaméthasone et/ou du sélénium et/ou des albumines sériques, pendant un temps approprié, en ce qu'on extrait lesdites protéines du milieu de culture et en ce qu'on les purifie. La présente invention a également pour objet l'application de la lignée conforme à l'invention en tant que modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaires des cellules épithéliales intestinales. Conformément à la présente invention, pour une telle application, ladite lignée cellulaire est mise en oeuvre dans une méthode d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire des cellules épithéliales intestinales, qui est caractérisée en ce que (1) ladite lignée est cultivée sur un milieu à base de sels inorganiques de glucose, de rouge de phénol, d'amino-acides, de vitamines, comprenant, en outre de l'insuline et/ou de la transferrine et/ou de la toxine cholérique et/ou du facteur de croissance épithéliale (EGF) et/ou des extraits hypophysaires et/ou de la dexaméthasone et/ou du sélénium et/ou des albumines sériques, pendant un temps approprié, (2) on ajoute éventuellement dans ledit milieu des inducteurs chimiques, (3) on cultive ladite lignée sur un support approprié. Les inducteurs chimiques utilisés sont connus et agissent au niveau membranaire ou nucléaire et induisent une différenciation cellulaire. On peut citer, comme inducteur chimique, et ce de manière non limitative, le DMSO, le butyrate de métal alcalin ou alcalino-terreux, le phorbolmyristate acétate (PMA), le tétradécanoyl phorbolacétate (TPA), l'acide réti nique. Selon un autre aspect de ladite méthode, le support est constitué de cellules vivantes en co-culture, prises notamment dans le groupe qui comprend les cellules mésenchymateuses et les fibroblastes d'origine intestinale. Selon encore un autre aspect de ladite méthode, ledit support est constitué d'une matrice extracellulaire appropriée secrétée par des cellules de l'endothélium de cornée de boeuf et/ou des boîtes de culture surfactées par des facteurs d'adhésion cellulaire : laminine et/ou fibronectine et/ou collagène et/ou glycosaminoglycanes. Ladite méthode permet d'étudier des facteurs de croissance ou d'interférence (lymphokines) capables de réguler la prolifération et la différenciation des cellules intestinales. Elles permet également d'étudier l'expression des (proto)oncogènes cellulaires impliqués dans la prolifération et la différenciation cellulaire. Elle permet, en outre, l'étude du métabolisme et de la toxicité de substances diverses qui peuvent être ingérées, notamment de médicaments, d'aliments. Elle permet, de plus, l'étude des cellules épithéliales présentant un déficit génétique, par exemple, dans la mucoviscidose Selon encore un autre aspect de ladite méthode, elle comprend en outre une étape de transformation de ladite lignée traitée obtenue, en cellules tumorales par (4) transfection secondaire par un (proto)oncogène cellulaire normal ou muté approprié et (5) sélection en milieu de culture contenant un antibiotique approprié. Selon une disposition avantageuse de cette méthode, ledit oncogène cellulaire est choisi parmi les onco gène s connus pour être fréquemment exprimés dans les cancers coliques chez l'Homme, comme c'est le cas, notamment de l'oncogène ras, l'oncogène myc, l'oncogène fos. Selon une autre disposition ledit oncogène cellulaire est recombiné dans un plasmide porteur d'une ré gion régulatrice et d'un marqueur de sélection, notamment un gène de résistance a un antibiotique. Selon encore une autre disposition, l'antibiotique est la néomycine et/ou l'un de ses analogues. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, l'antibiotique est de la généticine. La lignée cellulaire conforme à l'invention, transformée selon le procédé décrit ci-dessus, est un modèle d'étude adapté aux médicaments anticancéreux et permet de réaliser une comparaison entre les deux modèles (lignées non transformées versus lignées transformées). Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention. Il doit etre bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Préparation d'une lignée cellulaire conforme a l'invention, avec comme oncogène immortalisant, l'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain Des cellules épithéliales intestinales sont obtenues à partir de foetus de rat Wistar a 19 jours de gestation, par le procédé décrit dans CHASTRE E. et al. (Endocrinol., 1987, 121, 2211-2221). Les cellules isolées sont alors lavées et mises en suspension dans un milieu S MEM (Gibco) contenant 0,5 t de SVF (sérum de veau fêtai), supplémenté en antibiotique (100 unités de pénicilline et 100 pg de streptomycine) et 4 mM de L-glutamine et un minimum d'ions Ca2+ libres (milieu dit d'électro-perméabilisation, faible concentration ionique). Les cellules ir.testi- nales (107/ml) sont mises en contact pendant 10 minutes å C avec le plasmide E1A Ad2 - pUC13 (oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain recombiné dans le plasmide pUC13), a une concentration de 25 pg/ml. Les cellules sont perméabilisées en les plaçant entre les deux électrodes d'un électro-pulsateur (8 chocs de 100 ps & 1000-1500 V). Les cellules traitées sont maintenues 10 minutes dans la glace après les chocs, puis incubées 20 minutes a 37'C dans un incubateur a C02. Après les chocs électriques, l'augmentation de la perméabilité des cellules peut être visualise par le test d'exclusion au bleu Trypan, ladite augmentation étant obtenue chez 50 % des cellules. Les cellules sont ensuite diluées dans un milieu de culture classique. Les cellules transfectées sont sélectionnées selon leurs caractéristiques morphologiques : elles présen- tent une morpholige épithéliale de cellules polygonales adJacentes. On obtient ainsi la lignée SLC-11. Exemple 2 : Préparation d'une autre lignée cellulaire conforme à l'invention, avec comme oncogène immortalisant, l'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain Des cellules épithéliales intestinales sont obtenues à partir de foetus humain porteur d'une maladie génétique dont la cible est l'épithélium intestinal, la mucoviscidose, par exemple. Les cellules isolées sont alors lavées et mises en suspension dans un milieu S-MEM (Gibco) contenant 0,5 % de SVF (sérum de veau fatal), supplémenté en antibiotique (100 unités de pénicilline et 100 mg de streptomycine) et 4 mM de L-glutamine et un minimum d'ions Ca2+ libres (milieu dit d'électro-perméabilisation, faible concentration ionique). Les cellules intestinales (107/ml) sont mises en contact pendant 10 minutes à 4 C avec le plasmide E1A Ad2 - pUC13 (oncogène ElA de l'adénovirus 2 humain recombiné dans le plasmide pUC13), à une concentra- tion de 25 g/ml. Les cellules sont perméabilisées en les plaçant entre les deux électrodes d'un électro-pulsateur (8 chocs de 100 ps a 1000-1500 V). Les cellules traitées sont main tenues 10 minutes dans la glace après les chocs, puis incubées 20 minutes à 37 C dans un incubateur à CO2. Après les chocs électriques, l'augmentation de la perméabilité des cellules peut être visualisée par le test d'exclusion au bleu Trypan, ladite augmentation étant obtenue chez 50 % des cellules. Les cellules sont ensuite diluées dans un milieu de culture classique. De telles cellules permettent une analyse dynamique de la cellule pathologique, non seulement au niveau des sécrétions hydro-electrolytiques mais aussi de l'expression du gène responsable de la maladie, dans des conditions de viabilité cellulaire optimale. Exemple 3 : Préparation d'une lignée cellulaire avec comme oncogène immortalisant, l'oncogène large T de polyome On procède comme dans l'exemple 1, en utilisant le plasmide recombinant Py NG18-pBR 322 (oncogène large T de polyome présent chez le mutant NG18 de polyome, recombine dans le plasmide pBR 322). Exemple 4 : Préparation d'une lignée cellulaire avec comme oncogène immortalisant, l'oncogène large T de SV40 On procède comme dans l'exemple 1, en utilisant le plasmide recombinant SV40 LP-pUC13 (oncogène large T de SV4O, recombiné dans le plasmide pUC13). Exemple 5 : Caractéristiques de la lignée SLC-11 La lignée cellulaire obtenue dans l'exemple 1 possède des caractéristiques de l'épithélium intestinal d'origine. 1 ), Morphologle - Les cellules SLC-11 ont une morphologie épithéliale tant au microscope à contraste de phase qu'au microscope électronique et entretiennent des jonctions de contact serres entre elles. Ces cellules présentent une morphologie épithéliale de cellules polygonales adjacentes. Les cellules SLC-11 ne forment que des monocouches et poussent à basse densité d'ensemencement, puisqu'on a pu cloner ces cellules. - Etude des courbes de croissance Le taux de croissance des cellules SLC-11 a été déterminé au 9ème, 20ème, 26ème, 44ème et 47ème passage. Les cellules SLC-11 ont été mises en milieu de culture à une concentration de 5.10' cellules/5 ml de milieu de culture dans des boites de 25 cm2. Le milieu est changé tous les deux jours. Les cellules sont comptées dans deux boîtes à 24 heures d'intervalle. A chacun des passages, on étudie la croissance de cellules par comptage cellulaire pendant la phase de croissance exponentielle et jusqu'a obtention de la confluence, caractérisée par une inhibition de contact et un arrêt de la prolifération cellulaire. La période de doublement de la population cellulaire est de 17 heures, pendant la phase de croissance exponentielle. Les caractéristiques ultrastructurales de ces cellules incluent la présence de grandes et nombreuses mitochondries, la présence de microvilli allongés et rares sur toute la surface du milieu et de fréquents contacts cellules-cellules. 2) Immortalité des cellules Les cellules SLC-11 sont immortalisées par l'oncogène viral ElA, comme le montre l'analyse des ARNm transcrits par Northern blot et l'identification des oncoprotéines codées par le gène E1A, révélées par ;mmunofluorescence indirecte dans le noyau des cellules intestinales SLC-11. - Analyse Northern blot L'ARN total est extrait à partir de 108 cellules SLC-11 en croissance exponentielle, en utilisant le procédé au thiocyanate de guanidine de CHIRGWIN (Biochem., 1979, 18, 5294-5299). L'ARN est fractionné par électrophorèse sur un gel d'agarose a 1,5 % dans 2,2 n de formaldéhyde et trans féré sur des filtres de nitrocellulose. L'hybridation est réalisée par une sonde correspondant au gène E1A marqué au 32P, multiamorce, ayant une activité spécifique de 0,7.10 cpm/pg d'ADN. Les filtres de nitrocellulose sont lavés deux fois à température ambiante avec un tampon SSC, puis & 50-C pendant une heure dans un tampon SSC-SDS à 0,1 %. La Figure 1 montre l'analyse par Northern blot des ARNm de la lignée SLC-11 (pistes c et d, 15 et 5 pg d'ARN, respectivement), en comparaison avec la lignée 293 transformée par l'adénovirus 5 (témoin positif), qui a la propriété de présenter de grandes quantités d'ÀRN d'ElA 13S et 12S (piste b, 7 pg d'ARN), alors que les cellules SLC-11 présentent un ARNm 15S de taille supérieure. Dans des fibroblastes d'embryons de rat FR 3T3, utilisés comme témoins négatifs, aucune hybridation ne se produit entre la sonde E1A marquée et les ARN (piste a, 7 pg d'ARN). L'hybridation avec la sonde est évidente avec le contrôle positif (piste b) et avec la lignée SLC-11 (piste c). - Longévité de la culture Les cellules SLC-11 ont les propriétés de cellules épithéliales immortelles, elles sont en culture depuis deux ans, et 77 passages ont déjà été effectués. - Immunofluorescence indirecte correspondant a la présence de la protéine nucléaire codée par le gène EiA. Des cellules SLC-11 en confluence sont fixées dans du paraformaldéhyde a 3 % et perméabilisées avec du Triton X-100 (marque déposée) a 0,1 8, incubées avec un anticorps monoclonal 73, spécifique des protéines de la région antérieure E1A de l'adénovirus 2, puis avec des IgG anti-souris, marquées à la fluorescéine, comme deuxième anticorps. Chaque incubation est de trente minutes à température ambiante. Les préparations sont observées à l'aide d'un microscope a épifluorescence. En accord avec le Northern blot ( détection de 1'ARNm 15S codé par le gène E1A de l'adénovirus 2 dans les cellules SLC-11), l'anticorps 73 détecte les antigènes E1A dans le noyau de la population totale de cellules SLC-11 entre le passage 15 et le passage 32 (figure 2A). L'oncogène E1A est donc bien intégré de façon fonctionnelle dans le patrimoine génétique des cellules SLC-11. 3) Mise en évidence de substances caractéris- tiques de l'épithélium intestinal dans les cellules SLC-11 : Les cellules SLC-11 présentent certaines des caractéristiques des cellules épithéliales normales, en particulier, la présence de villine cytoplasmique, d'enképhalinase et de récepteurs membranaires fonctionnels du VIP et des catécholamines. Dans l'intestin mature, l'enképhalinase et la villine, protéine du cytosquelette sont localisées dans la bordure en brosse apicale, longeant le lumen. - Villine Les cellules sont fixées dans du paraformaldéhyde à 3 4 et perméabilisées avec du Triton-X100 (marque déposée) à 0,1 %, incubées avec des anticorps polyclonaux de la villine pAb 1-120 et ensuite avec, comme second anticorps, une lgG anti-lapin couplée à de la rhodamine. Chaque incubation est de trente minutes å température ambiante. Au microscope à épifluorescence, une immunofluorescence est détectée après le 3ème passage et au 25ème passage dans le cytoplasme des cellules SLC-11 (figure 2B). - Enképhalinase On procède comme pour la villine, le premier anticorps étant l'anticorps 85A2, contre l'enképhalinase de la bordure en brosse rénale de lapin. Les cellules SLC-11 sont colorées positivement (figure 2C), confirmant ainsi la nature épithéliale de ces cellules intestinales immortelles. - VIP La présence de récepteurs fonctionnels au VIP est mise en évidence par la production d'AMP cyclique. Le VIP est un neurotransmetteur connu pour réguler les sécrétions d'eau et d'électrolytes de l'épithélium intestinal. L'AMPc est mesurée dans des cellules SLC-11 (3 å 6.104 cellules/ml), après trente minutes d'incubation à 20'C dans 0,5 ml de tampon Tris-HCl 35 mM (pH 7,5) contenant 1 mM d'IBMX comme inhibiteur de la phosphodiestérase, 1,4 % d'albumine bovine sérique et 50 mM de NaCl. L'AMPc est déterminée par RIA. Comme montré dans le Tableau I, ci-après, les cellules SLC-11 sont sensibles au VIP et à l'isoprotérénol. Les stimulations maximales par 0,1 M de VIP et 1 pM d'isoprotérénol sont, respectivement, 4,5 et 9 fois supérieures à l'activité basale. TABLEAU I ADDITIONS AMPc S/B ECso (pmol/106 cellules) RIEN 28 + 5 VIP VIP (0,1 M) 126 + 6 4,5 0,3 nM ISO ISO (1 pM) 251 + 11 9 0,1 pM Les taux d'AMPc présentés dans le tableau I et le rapport stimulation/production basale (S/B) sont la moyenne de onze expériences effectuées en double. Dans les mêmes conditions les agents suivants ne peuvent pas élever la production d'AMPc dans les cellules SLC-11 : lmM d'histamine, 0,1-1 M de peptide inhibiteur gastrique (GIP), du glucagon pancréatique, de l'oxyntomoduline et des peptides apparentés au glucagon tels que GLP-1, TGLP-1 et GLP-2. Le VIP stimule l'activité de l'adénylate cyclase dans les cellules SLC-11, avec une puissance ECso = 0,3 nM, versus 0,25 nM dans l'épithélium intestinal d'origine. 4) Tumorigénicité : Ces cellules ne sont pas tumorigènes chez la souris nude et les rats Wistar syngenéiques - environ 107 cellules dans 100 ;1 de tampon PBS sont injectées en sous-cutanée a 30 souris nude athymiques agées de 4 à 6 semaines et à il rats Wistar nouveaux-nés syngénéiques agés de 4 jours - chez la souris, la tumorigénicité est activée par de l'estradiol implanté en sous-cutanée (implant à 0,1 mg) ; - comme témoin positif on utilise 2.106 cellules issues de la lignée cellulaire tumorale de rats PROb, injectés aux souris nude dans les mêmes conditions - tous les animaux sont controlés toutes les semaines pendant douze mois. Il n'y a pas formation de tumeur en présence de cellules SLC-11 même après un traitement prolongé à l'estradiol. Tout les animaux sont en vie un an après les injections. Les témoins positifs présentent la formation d'une tumeur dans les quatre semaines qui suivent. 5) ryotype : Ces cellules sont cultivées sur milieu DMEM additionné de sérum foetal de veau à 10 % inactivé par la chaleur ; au 118me passage, l'analyse du caryotype montre un remaniement minime de la carte chromosomique : les cellules sont diploïdes ; les modifications incluent une tri somie du chromosome 3 et une translocation impliquant les chromosomes 13 et 8. Exemple 6 : Application à l'identification des systèmes biochimiques (1) On cultive les cellules SLC-11 sur un milieu, conforme & l'invention, par exemple, un milieu DMEM comprenant de l'insuline, de la toxine cholérique, de l-'EGF et des extraits hypophysaires, de la dexaméthasone, de la transferrine, du sélénium et des albumines sériques, pendant un temps approprié. (2) On ajoute, dans le milieu de culture, du butyrate de sodium, à une concentration comprise entre 1 mM et 5mM ; le temps d'expositicn des cellules au butyrate de sodium peut varier entre une et trois semaines. (3) On co-cultive, lesdites cellules traitées par le butyrate de sodium, en présence de mésenchyme d'origine intestinale. Ces cellules peuvent être entretenues deux à trois semaines sur des monocouches de cellules mésenchymateuses. Exemple 7 : Transformation des cellules SLC-11 en cellules cancéreuses (transfection par électro-perméabilisation) Les étapes (1), (2) et (3) sont réalisées comme dans l'exemple 6, puis (4) On transforme éventuellement la lignée SLC-11 en cellule tumorale en procédant à une transfection cellulaire par un oncogène cellulaire tel que l'oncogène ras, myc ou fos, recombiné dans un plasmide porteur d'une région régulatrice et d'un marqueur de sélection, par électro-perméabilisation ; les conditions de la seconde transfection par électro-perméabilisation seront ajustées aux caractéristiques de la cellule SLC-11, quant à sa perméabilisation et å la conservation de son intégrité cellulaire, a la suite des chocs électriques. (5) Les cellules transfectées sont sélectionnées par la généticine. Seules les cellules SLC-11 qui ont été transfectées par le deuxième plasmide seront capables de proliférer en présence de cet antibiotique. Exemple 8 : Transformation des cellules SLC-11 en cellules cancéreuses (transfection par précipitation) On procède comme dans l'exemple 7, la transfection cellulaire étant réalisée par précipitation par le phosphate de calcium ou le polybrène. Exemple 9 : Application à la production de facteurs de croissance Les cellules intestinales immortalisées sont cultivées en milieu défini dans des flacons de culture de 150 cm2. Pendant la phase de croissance exponentielle et après la phase de confluence, les milieux de culture sont récupérés et testés quant à leur effet mitotique sur des cellules intestinales humaines HT-29 quiescentes. Ceci permet de mettre en évidence les facteurs de croissances endo gènes sécrétés par les cellules de ltépithélium lntesti- nale. Les cellules HT-29 sont issues d'une lignée de colon humain et sont rendues quiescentes par privation totale de sérum de veau foetal pendant 2-3 jours. L'activité mitotique est mesurée par l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN. Les facteurs de croissance produits seront isolés et purifiés à l'aide de méthodes biochimiques classiques utilisant la chromatographie de filtration sur gel, échangeuse d'ions, 1'HPLC (high performance liquid chromatography) et l'électrophorèse en gel de polyacrylamide. Lesdits facteurs peuvent jouer un rôle très important dans différentes pathologies consécutives a des résections massives de l'intestin (accidentés de la route, traumatismes, maladie de Crohn, cancer) ainsi que pour la réanimation des nouveaux-nes prématurés. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation, de mise en oeuvre et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite : elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1') Lignée de cellules épithéliales intestinales de mammifère, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par transfection de cellules épithéliales intestinales fétales de mammifère, par un (proto)oncogène viral ou cellulaire immortalisant approprié, en ce que la lignée ainsi transfectée est immortalisée et en ce qu'elle n'est pas tumorigène. 2 ) Lignée selon la revendication 1, caractérisée en ce que le (proto)oncogène viral ou cellulaire immortalisant est sélectionné dans le groupe qui comprend l'on- cogène E1A de ltadénovirus 2 humain et/ou l'oncogène E1A de l'adénovirus 5 humain et/ou l'oncogène large T de polyome et/ou l'oncogène large T de SV40 et/ou l'oncogène v-myc et/ou l'oncogène c-myc et/ou l'oncogène p53. 3 ) Lignée selon la revendicatin 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par transfection de cellules épithéliales intestinales fétales d'origine murine par l'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain. 4') Lignée selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle a été dénommée SLC-11 et en ce qu'elle a été déposée sous le n I-791 en date du 22 juillet 1988 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur. 5-) Procédé d'obtention de la lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on isole les cellules épithéliales intestinales à partir de foetus de mammifère, en ce que l'on électro-perméabilise lesdites cellules et en ce qu'on les transfecte par un (proto)oncogène viral ou cellulaire immortalisant approprié. 6 ) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'oncogène viral immortalisant est sélectionné dans le groupe qui comprend l'oncogène E1A de l'adénovirus 2 humain et/ou l'oncogène E1A de l'adénovîrus 5 humain et/ou l'oncogène large T de polyome et/ou l'oncogène large T du SV40 et/ou l'oncogène v-myc, l'oncogène c-myc et/ou l'oncogène p53. 7') Application de la lignée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, en tant que système de production de protéines spécifiques de l'épithélium intestinal telles que les facteurs de croissance. 8 ) ) Procédé d'obtention des protéines spéci- fiques de l'épithélium intestinal, caractérisé en ce qu'on cultive le système selon la revendication 7, sur un milieu approprié å base de sels inorganiques, de glucose, de rouge de phénol, d'amino-acides, de vitamines, comprenant, en outre de l'insuline et/ou de la transferrine et/ou de la toxine cholérique et/ou du facteur de croissance épithéliale (EGF) et/ou des extraits hypophysaires et/ou de la dexaméthasone et/ou du sélénium et/ou des albumines sériques, pendant un temps approprié, en ce qu'on extrait lesdites protéines du milieu de culture et en ce qu'on les purifie. 9') Hodèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmi que ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaires des cellules épithéliales intestinales, caractérisé en ce qu'il est constitué par une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 10.) Méthode d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire des cellules épithéliales intestinales, qui est caractérisée en ce que (1) le modèle selon la revendication 9, est cultivé sur un milieu à base de sels inorganiques de glucose, de rouge de phénol, d'amino-acides, de vitamines, comprenant, en outre, de l'insuline et/ou de la transferrine et/ou de la toxine cholérique et/ou du facteur de croissance épithéliale (EGF) et/ou des extraits hypophysaires et/ou de la dexaméthasone et/ou du sélénium et/ou des albumines sériques, pendant un temps approprié. (2) on ajoute éventuellement dans ledit milieu des inducteurs chimiques, (3) on cultive ladite lignée sur un support approprié. 11 ) Méthode selon la revendication 10, caractérisée en que le support est constitué de cellules vivantes en co-culture, prises notamment dans le groupe qui comprend les cellules mésenchymateuses et les fibroblastes d'origine intestinale. 12") Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit support est constitué d'une matrice extracellulaire appropriée secrétée par des cellules l'endothélium de cornée de boeuf et/ou des boites de culture surfactées par des facteurs d'adhésion cellulaire : laminine et/ou fibronectine et/ou collagène et/ou glycosaminoglycanes. 13") Méthode selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape de transformation de ladite lignée traitée obtenue, en cellules tumorales par (4) transfection secondaire par un (proto)oncogène cellulaire normal ou muté approprié et (5) sélection en milieu de culture contenant un antibiotique approprié. 14-) Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit oncogène cellulaire est choisi parmi les oncogènes connus pour être fréquemment exprimés dans les cancers coliques chez l'Homme, tels que l'oncogène ras et/ou l'oncogène myc et/ou l'oncogène fos. 15g) Méthode selon la revendication 13 ou la revendication 14, caractérisée en ce que ledit oncogène cellulaire est recombiné dans un plasmide porteur d'une ré gion régulatrice et d'un marqueur de sélection, notamment un gène de résistance a un antibiotique. 16-) Méthode selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que l'antibiotique est la néomycine et/ou l'un de ses analogues. 17-) Méthode selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'antibiotique est de la généticine.