Brevet FR2627506A1 — publié le 19890825

La présente invention concerne un procédé pour réaliser des cultures de masse axéniques et un appareil pour l'exécution d'un tel procédé. Elle concerne plus particulièrement un appareil et un procédé pour réaliser rapidement des cultures de cellules en masse, et elle a trait plus précisément à un appareil de culture axénique très efficace qui est utilisable comme appareil d'expérience ou de production dans un organisme de recherche ou dans une installation industrielle, ainsi qu'= un procédé de culture axénique utilisant un tel appareil. Avec les progrès réalisés en ingénierie biologique, en biologie expérimentale et en technologie de cultures cellulaires il est apparu une demande croissante pour la création d'une technologie permettant de cultiver des cellules biotiques en grande quantité et avec un rendement élevé. En ce qui concerne la culture de masse de cellules biotiques on croyait jusqu'ici qu'il entait très difficile de maintenir des conditions stables pour la survie et la croissance d'organismes sur une échelle relativement grande. S'il en est ainsi c'est notamment parce que les mécanismes de survie et de croissance d'organismes et de cellules n'ont pas encore été élucidés jusqu'à présent et parce qu'on n'a pas fait suffisamment de progrès dans la mise au point d'un appareil ou d'unsystème applicable pour l'étude de ces mécanismes dans des conditions optimales d'une façon stable et sur une échelle relativement grande. Par exemple dans le domaine des recherches que le présent inventeur a effectuées sur le mécanisma bidiogique de l'apparition de "maréesrougeJ il était difficile de faire de la prévision ou de la prévention correctes à propos de l'apparition de marées rouges dans des conditions naturelles, cela parce qu'on ne disposait pas d'un équipement permettant la culture de masse à grande vitesse.Des recherches sur les marées rouges furent engagées après qu'on eutsouvent observé une croissance anormale de Heterosigma akashiwo et Chattonella antiqua dans la mer intérieure de Seto. I1 est cependant difficile de prévoir une telle croissance anormale dans des eaux réelles à partir des résultats d'une expérience de laboratoire ou d'une étude effectuée à l'échelle du flacon ou de la paillasse,parce que, dans des eaux de mer réelles, 1 'in- densité du rayonnement reçu, la température, la concentration en éléments nutritifs et d'autres conditions varient énormément, et que les algues génératrices de marées rouges migrent dans la direction verticale.Afin de clarifier le mécanisme suivant lequel les marées rouges prennent naissance, avec ces changements et la migration verticale, il était absolument nécessaire de mettre au point un système de culture permettant la réalisation d'un environnement plus proche des conditions naturelles en ce qui concerne les facteurs d'environnement, et ayant une étendue spatiale appropriée. Cette situation n'est pas limitée au cas de la recherche sur les marées rouges. Dans la culture des cellules biotiques on avait besoin d'un appareil ou d'un système permettant de cultiver efficacement des cellules sur une grande échelle pour différentes études expérimentales et pour la production de matières intéressantes. Cela étant, la présente invention a pour objet un nouvel appareil de culture de masse à grande vitesse qui permet d'effectuer une culture avec-un rendement élevé et une grande vitesse, qui résout les problèmes suscités par les systèmes de culture usuels, et qui a une plus grande échelle spatiale. Elle a également pour objet un procédé de culture axénique utilisant un tel appareil. le procédé de culture de masse axénique qui fait l'objet de la présente invention est caractérisé en ce que, pour réaliser l'objet mentionné ci-dessus, on expose à un rayonnement toute la surface du liquide contenu dans le réservoir de culture, cn procède à un ensemencement axénique avec des algues et des bactéries, et on effectue une pure culture axénique et une récolte axénique. Sur le dessin annexé la figure 1 représente un diagramme d'ensemble qui illustre un mode d'exécution de la présente invention. La figure 2 est une vue en coupe à travers le réservoir de culture et la partie éclairante. La figure 3 est une courbe représentative des variations de la concentration en cellules en fonction du temps, courbe qui montre les résultats d'une culture d' Heterosigma akashiwo. Le procédé de la présente invention et l'appareil qui permet d'exécuter ce procédé sont essentiellement caractérisés en ce qu'on envoie un rayonnement lumineux sur la totalité de la surface d'un liquide contenu dans le réservoir de culture, l'incorporation de cette particularité, comme partie de l'ensemble du système de l'appareil, permettant de cultiver des cellules biotiques à grande vitesse et en grandes quantités. Le procédé de culture de la présente invention et l'appareil permettant d'exécuter ce procédé sont décrits ci-dessous avec référence au dessin. La figure 1 représente un schéma d'ensemble d'un mode de réalisation de la présente invention. L'appareil de culture comprend un réservoir (1) pour le stockage du liquide mère destiné à la culture, un réservoir de mélange (2) pour l'introduction d'additifs, un filtre stérilisant (3), un réservoir de culture (4), et une partie éclairante (5). Le réservoir de culture (4) est équipé d'un filtre strilisant-(6) pour l'air admis, d'une enveloppe (7) pour le réglage de la température du liquide, et d'un bain (8) réglant la température du liquide. Il est important d'assurer une stérilisation à la vapeur convenable dans l'assemblage du filtre stérilisant (6) et entre ce filtre (6) et le réservoir de culture (4). La figure 2 représente une vue agrandie du réservoir de culture (4) et de la source de rayonnement (5). Comme on le voit sur cette figure 2, l'enveloppe (7) de réglage de la température du liquide est montée sur le réservoir de culture (4), lequel comporte en outre un orifice d'admission (9) pour le liquide de culture, un orifice d'en trée d'air (10), un orifice de sortie (11) pour la circulation du liquide de culture, et un orifice de trop plein (12) pour le liquide de culture, et est de plus muni de différents moyens tels qu'un débitmètre, un thermomètre un manomètre et un échantillonneur de cellules biotiques pour la mesure de l'état de la culture. L'ouverture supérieure du réservoir de culture est équipée de fenêtres en verre (13) à travers lesquelles le rayonnement lumineux peut passer pour aller irradier la totalité de la surface du liquide de culture (14). L'irradiation est réalisée au moyen d'une source de rayonnement (15), d'un miroir (16) à réflexion totale et, si cela est nécessaire, d'une lentille divergente (47) pour l'élargissement du faisceau lumineux. Il est toujours possible d'éclairer la totalité de la surface du liquide, suivant la dimension des fenêtres de verre, en réglant la distance entre la source de rayonnement (15) et le miroir å réflexion totale (16), la distance entre la source de rayonnement (15).et la lentille divergente (17), eut la distance de ces fenêtres de verre (13). La surface du liquide peut être irradiée partiellement, Si cela est nécessaire, par un réglage tel que décrit ci-dessous. Il va de soi que l'appareil de culture de la présente invention n'est pas limité aux exemples donnés ci-dessous. La forme et la structure du réservoir de culture et la configuration du système de culture dans son ensemble seront choisies convenablement selon l'organisme particulier à cultiver. Une source de rayonnement et un miroir à réflexion totale placé derrière cette source ne sont pas toujours nécessaires, tandis qu'une partie éclairante envoyant un rayonnement sur toute la surface du liquide est essentielle, dans la. methode et l'appareil de culture de la présente invention, pour réaliser une culture rapide sur une grande quantité. Comme source de rayonnement dans la partie éclairante on pourra utiliser, indifféremment, une lampe à mercure,une lampe à halogène, une lampe à xénon etc... On peut également avoir recours à la lumière naturelle arrivant par une fibre optique. La surface intérieure du réservoir de -culture peut être revêtue de verre d'un alliage, d'un métal, tel que le titane, ou d'une matière plastique, telle que le le lon, suivant le système de culture à utiliser. On va maintenant décrire l'appareil de culture de la présente invention en prenant pour exemple le cas où l'appareil est utilisé pour la culture d'algues, cela dans le but de clarifier le mécanisme de l'apparition de marées rouges. Appareil de culture On conserve de l'eau de mer dans le. réser 3 voir de stockage (î) (capacité : 10 m ; surface intérieure revêtue de verre) de l'appareil représenté sur les figures 1 et 2. A l'eau de mer stockée on ajoute, dans le réservoir de mélanoe (capacité : 0,2 m3) , des substances nutritives, telles que de l'acide nitrique, de l'acide phosphorique et des vitamines. Le liquide de culture est introduit, par le filtre stérilisant (3), dans le réservoir de culture (4). Comme filtre stérilisant (3) on utilise un filtre Rogard 5 sm, un filtre Milliard 0,22 sm ou un filtre Millidisk 0,22 Am (fabriqués par MilliporeCo.). Le réser voir- de culture (4) a une hauteur de 2 m -et un diamètre 3 intérieur de 1 m, il est capable de contenir 1 m3 de milieu de culture, et il est possible de laisser, dans sa partie supérieure, une couche d'air de 0,4 m3. La conduite reliant le filtre stérilisant (3) au réservoir de culture (4) peut être en Teflon ou être revêtue intérieurement de Teflon, de telle sorte qu'elle puisse résister suffisamment bien à la stérilisation par la vapeur et à la corrosion. Le réservoir de culture (4), le filtre stérilisant (3), le filtre à air (6) et les conduites peuvent être stérilisés à la vapeur pendant 30 minutes à 1 heure, avant emploi. Cette opération sera effectuée par exemple à une température d'environ 1100C et sous une pression d'environ 0,5 bar. La fenêtre en verre (13) sur la, surface supérieure du réservoir de culture (4) a un diamètre qui est par exemple de 30 cm ; sur cette fenêtre on projette, d'en haut, le rayonnement émis par une lampe à xénon c de 150-A. Cela reproduit des conditions proches de celles de la lumière solaire d'une journée d'été, avec une longueur d'onde comprise entre 400 et 700 nm. L'intensité du rayonnement dans le réservoir est alors d'environ 1/5 a' 1/3 de cElle de la lumière solaire d'un jour d'été. La température de l'eau dans le réservoir de culture (4) est ajustée par l'enveloppe de réglage de la température du liquide (enveloppe qui a par exemple une hauteur de 35 cm et une épaisseur de 5 cm) r montée 0 1 'extéreur du reservoir, 2U moyen d'eau s'écoulant à un débit de 2 à 6 litres/minutes, de telle façon qu une valeur maximale de la différence de température entre la couche de surface et la couche d fond soit constamment maintenue à environ 150C. Les mesures dans le réservoir de culture peuvent-etre effectuées automatiquement à partir d'un enregistreur automatique de données commandé par un microordinateur et un programme séquentiel. La température de l'eau peut être mesurée à l'aide d'une résistance en platine. Conditions de la culture Dans le réservoir de culture mentionné ci-dessus on cultive Heterosigma akashiwo, qui est l'espèce génératrice de marées rouges dans la baie d'Osaka. Les conditions sont par exemples les suivantes Méthode de mélange avec exposition à l'air Lumière/obscurité : cycle 12/12 Température de culture : 20 + 20C Milieu de culture f/2 (+P1,5 k'mol/l). Résultat de la culture Le résultat du développement cellulaire que l'on observe au cours de la culture effectuée dans l'appareil dans les conditions indiquées ci-dessus est représenté sur la figure 3. Celle-ci montre que les cellules croissent rapidement en un temps tres court. On voit, sur cette figure, qu'on atteint un taux de croissance spéci figues (d ), c'est-à-dire une concentration cellulaire par par unité de temps de mesure (nombre de cellules.l ), de 1,06. Etant donné que le taux de croissance spécifique air est d'environ 0,4 d lorsqu'on opère, à peu près à la même échelle, dans un réservoir de culture éclairé de type classique, le taux qui peut être atteint par la méthode et dans l'appareil de la présente invention dépasse de beaucoup le plus haut niveau atteint antérieurement. On réalise donc une culture rapide sur une grande quantité. Ce résultat prouve que la méthode d'éclairement de la présente invention, qui aoit de façon synergique avec la stabilité du gradient de température vertical dans le réservoir de culture et avec d'autres particularités, constitue un environnement de culture vraiment excellent. Conformément à la présente invention, telle qu'elle est décrite ci-dessus en détail, il est possible de réaliser une culture très rapide sur une grande quantité. Cette invention fournit un procédé et un appareil permettant d'exécuter celui-ci, pour une culture axénique rapide du type à éclairement, l'appareil en question étant du plus haut intérêt en tant qu'appareil expérimental et en tant qu équipement de production. REVENDICATIONS 1.- Procédé de culture de masse axénique caractérisé en ce qu'on éclaire la totalité de la surface du liquide contenu dans un réservoir de culture (4), on ensemence dans des conditions axéniques avec des algues et des bactéries, et on exécute en continu une pure culture axénique et une récolte axénique. 2. - Appareil de culture de masse axénique caractérisé en ce qu'il comprend une source de rayonnement (15) permettant d'éclairer la totalité de la surface du liquide, dans un réservoir de culture. 3.- Appareil de culture de masse axénique selon la revendication 2, dans lequel la source de rayonnement (15) est une lampe à xénon, ou une lumière naturelle arrivant par une fibre optique. 4.- Appareil de culture de masse axénique caractérisé en ce qu'il comporte une fenêtre en verre (13) à la surface supérieure d'un réservoir de culture (I) ,- une source de rayonnement (15) montée au-dessus de cette fenêtre, Et un miroir à reflex-on totale (16) place dsrriàra la source de rayonnement. 5.- Appareil culture de masse axénique selon l'une des rev-endications 2 et 4, appareil qui est muni de conduites d'alimentation en air et en liquide de culture, lesdites conduites étant équipées d'un filtre stérilisant (6, 3). 6.- Appareil de culture de masse axénique selon la revendication 5, appareil dans lequel la conduite reliant ledit filtre audit réservoir de culture est stérilise à la vapeur. 7.- Appareil de culture de masse axénique selon l'une des revendications 2 et 4, appareil dont la surface intérieure est munie d'un revêtement.